1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B REGOLAMENTO(CEE)n.2568/91DELLACOMMISSIONE
dell'11luglio1991
relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi
attinenti
(GU L 248 del 5.9.1991, pag. 1)
Modificato da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Regolamento (CEE) n. 3682/91 della Commissione del 17 dicembre
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Regolamento (CEE) n. 1429/92 della Commissione del 26 maggio 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Regolamento (CEE) n. 1683/92 della Commissione del 29 giugno 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Regolamento (CEE) n. 1996/92 della Commissione del 15 luglio 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Regolamento (CEE) n. 3288/92 della Commissione del 12 novembre
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Regolamento (CEE) n. 183/93 della Commissione del 29 gennaio 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7modificato dal regolamento (CEE) n. 826/93 della Commissione del 6
aprile 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Regolamento (CEE) n. 620/93 della Commissione del 17 marzo 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Regolamento (CE) n. 177/94 della Commissione del 28 gennaio 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Regolamento (CE) n. 2632/94 della Commissione del 28 ottobre 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Regolamento (CE) n. 656/95 della Commissione del 28 marzo 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Regolamento (CE) n. 2527/95 della Commissione del 27 ottobre 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Regolamento (CE) n. 2472/97 della Commissione dell'11 dicembre 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Regolamento (CE) n. 282/98 della Commissione del 3 febbraio 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Regolamento (CE) n. 2248/98 della Commissione del 19 ottobre 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Regolamento (CE) n. 379/1999 della Commissione del 19 febbraio 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Regolamento (CE) n. 455/2001 della Commissione del 6 marzo 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Regolamento (CE) n. 2042/2001 della Commissione del 18 ottobre 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Regolamento (CE) n. 796/2002 della Commissione del 6 maggio 2002 L 128 8 15.5.2002
Rettificato da:
►C1Rettifica, GU L 289 del 19.10.1991, pag. 38 (2568/91)
►C2Rettifica, GU L 347 del 28.11.1992, pag. 69 (2568/91)
►C3Rettifica, GU L 176 del 20.7.1993, pag. 26 (183/93)
▼B
REGOLAMENTO(CEE)n.2568/91DELLACOMMISSIONE
dell'11luglio1991
relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa
d'olivanonchéaimetodiadessiattinenti
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre
1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati
nel settore dei grassi(1), modificato da ultimo dal regolamento (CEE)
n. 3577/90(2), in particolare l'articolo 35 bis,
considerando che l'allegato del regolamento n. 136/66/CEE prevede le
denominazioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansad'oliva commercializzati nei singoli Stati membri, nonché negli scambiintracomunitari e con i paesi terzi;
considerando che per poter distinguere i vari tipi di olio è opportuno
definire le caratteristiche fisico-chimiche di ciascuno di essi, nonchéle caratteristiche organolettiche degli oli vergini, per garantire lapurezza e la qualità dei prodotti in parola, salve le altre disposizionivigenti in materia;
considerando che è opportuno stabilire in modo uniforme in tutta la
Comunità la presenza delle caratteristiche dei vari tipi di olio; che a
tal fine occorre stabilire i metodi comunitari di analisi chimica e divalutazione organolettica; che occorre tuttavia autorizzare, durante unperiodo transitorio, il ricorso ad altri metodi di analisi applicati negliStati membri pur prevedendo che, in caso di divergenza dei risultati,saranno determinanti quelli ottenuti in base al metodo comune;
considerando che la definizione delle caratteristiche fisico-chimiche
degli oli d'oliva e dei metodi di analisi comporta l'adattamento dellenote complementari del capitolo 15 della nomenclatura combinata;
considerando che il metodo di valutazione delle caratteristiche organo-
lettiche degli oli vergini implicalacostituzione di comita ti diassaggiatori selezionati ed esperti e che è pertanto opportuno prevedere
il termine necessario per la realizzazione di siffatta struttura; che,
tenuto conto delle difficoltà che taluni Stati membri dovranno affron-tare per la costituzione dei comitati di assaggio, è opportunoautorizzare il ricorso ai comitati esistenti negli altri Stati membri;
considerando che per garantire il corretto funzionamento del sistema
dei prelievi applicabili all'importazione di sanse di oliva, è opportuno
prescrivere un metodo unico per determinare il tenore in olio di questi
prodotti;
considerando che per non recare pregiudizio agli scambi è opportuno
prevedere un periodo limitato per lo smaltimento dell'olio condizionatoprima dell'entrata in vigore del presente regolamento;
considerando che è opportuno abrogare il regolamento (CEE) n. 1058/
77 dellaCommissione(
3), modificato da ultimo dal regolamento (CEE)
n. 1858/88(4);
considerando che il comitato di gestione per i grani non ha emesso
alcun parere nel termine fissato dal suo presidente,1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 2
(1) GU n. 172 del 30. 9. 1966, pag. 3025/66.
(2) GU n. L 353 del 17. 12. 1990, pag. 23.
(3) GU n. L 128 del 24. 5. 1977, pag. 6.
(4) GU n. L 166 dell'1. 7. 1988, pag. 10.
▼B
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1
1. Sono considerati oli d'oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a),
b) e c) dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui carat-
teristiche sono conformi a quelle indicate rispettivamente nei punti 1, 2
e 3 dell'allegato I del presente regolamento.
2. È considerato olio d'oliva vergine lampante ai sensi del punto 1,
lettera d) dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cuicaratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 4,del presente regolamento.
3. È considerato olio d'oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'alle-
gato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sonoconformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del presente regola-mento.
4. È considerato olio d'oliva ai sensi del punto 3 dell'allegato del
regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi
a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente regolamento.
5. È considerato olio di sansa d'oliva greggio ai sensi del punto 4
dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristichesono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del presenteregolamento.
6. È considerato olio di sansa d'oliva raffinato ai sensi del punto 5
dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche
sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del presente
regolamento.
7. E considerato olio di sansa d'oliva ai sensi del punto 6 dell'alle-
gato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sonoconformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 9, del presente regola-mento.
8. Tuttavia, per le ►
M18campagne di commercializzazione dal
1998/1999 al 2002/2003 ◄sono parimenti considerati oli d'oliva
vergini ai sensi del punto 1, lettere a), b), c) o d) dell'allegato del rego-lamento n. 136/66/CEE gli oli sfusi o condizionati in imballaggi
immediati aventi un contenuto netto pari o superiore a 100 chilo-
grammi, totalmente originari del Marocco, che presentinocaratteristiche conformi a quelle indicate nell'allegato I, punti 1, 2, 3 e4 del presente regolamento e che, in deroga ai paragrafi 1 e 2, abbianoun tenore in acido linolenico al massimo dell'1,0 %.
Articolo 2
1. Le caratteristiche degli oli contemplati nell'allegato I sono deter-
minate in base ai seguenti metodi di analisi:
— per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percen-
tuale di acido oleico, il metodo di cui all'allegato II,
— per ladetermina zione dell'indice di perossido, il metodo di cui
all'allegato III,
— per la determinazione del tenore di cere, il metodo di cui all'alle-
gato IV,
— per ladetermina zione del contenuto di steroli, il metodo di cui
all'allegato V,
— per la determinazione dell'eritrodiolo + uvaolo, il metodo di cui
all'allegato VI,
— per la determinazione degli acidi grassi saturi in posizione 2 del
trigliceride, il metodo di cui all'allegato VII,
— per ladetermina zione del tenore di trigliceridi, il metodo di cui
all'allegato VIII,1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 3
▼M15
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▼B
— per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui all'allegato IX,
— per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo
di cui all'allegato X «A» e X «B»,
— per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di
cui all'allegato XI,
— per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli
d'oliva vergini, il metodo di cui all'allegato XII, applicato confor-
memente al paragrafo 2,
— per la prova di raffinazione, il metodo di cui all'allegato XIII,
— per la determinazione degli stigmastadieni, il metodo figurante
nell'allegato XVII,
— per ladetermina zione dellacomposizione dei trigliceridi con
ECN42, il metodo figurante nell'allegato XVIII,
— per la determinazione del tenore in alcoli alifatici, il metodo di cui
all'allegato XIX.
2. La verifica delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva
vergini da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti ècompiuta da panel di assaggiatori riconosciuti dagli Stati membri.
Le caratteristiche organolettiche di un olio d'oliva vergine, di cui al
primo comma, si considerano conformi alla categoria di olio di olivadichiarata qualora il panel di assaggiatori riconosciuto dallo Stato
membro ne confermi la classificazione.
Qualora il panel non confermi la dichiarazione della categoria di olio di
oliva, sotto il profilo delle sue caratteristiche organolettiche, a richiestadell'interessato le autorità nazionali o i loro rappresentanti incaricanoaltri panel riconosciuti di effettuare due controanalisi, di cui almenouna deve essere effettuata da un panel riconosciuto dallo Stato membro
di produzione dell'olio. Le caratteristiche in questione sono considerate
conformi a quelle dichiarate se le due controanalisi ne confermano laclassificazione. Nel caso contrario il costo delle controanalisi, e fattesalve le sanzioni comminate, sono a carico dell'interessato.
3. Per quanto riguarda la verifica delle caratteristiche degli oli da
parte delle autorità nazionali o di loro rappresentanti, prevista al para-grafo 1, il prelievo dei campioni si effettua secondo le normeinternazionali EN ISO 661 e EN ISO 5555 relative alla preparazionedei campioni per le prove e al campionamento. Tuttavia, in deroga al
punto 6.8 della norma EN ISO 5555, per le partite costituite dai
summenzionati oli, in imballaggi immediati di contenuto inferiore ouguale a 100 litri, il prelievo del campione si effettua conformementeall'allegato I bis del presente regolamento.
Fatte salve le disposizioni della norma EN ISO 5555 e del capitolo 6
della norma EN ISO 661, i campioni prelevati sono messi immediata-
mente al riparo dalla luce e da fonti di calore elevato e sono inviati allaboratorio per le analisi entro al più tardi:
— il decimo giorno lavorativo successivo a quello del prelievo nei
mesi daottobre ama ggio, e
— il quinto giorno lavorativo successivo a quello del prelievo nei mesi
dagiugno asettembre.
4. Ai fini della verifica prevista al paragrafo 3, le analisi di cui agli
allegati II, III, IX e XII nonché, eventualmente, le controanalisi
previste dalle normative nazionali, sono effettuate anteriormente alla
data di durata minima. Qualora il prelievo del campione abbia luogooltre quattro mesi prima di tale data, le summenzionate analisi sonoeffettuate entro e non oltre il quarto mese successivo alla data delprelievo. Nessun termine si applica per le altre analisi previste dalsuddetto regolamento.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 4
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▼M17
▼M17
Salvo qualora il campione sia stato prelevato meno di un mese prima
della data di durata minima, nel caso in cui i risultati delle analisi noncorrispondano alle caratteristiche della categoria di olio d'oliva o di
olio di sansa di oliva dichiarata, l'interessato ne viene informato al più
tardi un mese prima dello scadere del termine di cui al primo comma.
5. Quando le caratteristiche degli oli d'oliva sono determinate
secondo i metodi di cui al paragrafo 1, i risultati delle analisi sonodirettamente confrontati con i limiti fissati dal presente regolamento.
Articolo ►M193◄
Qualora si constati che le caratteristiche organolettiche di un olio sono
diverse da quelle proprie alla sua denominazione, lo Stato membrointeressato applica sanzioni pecuniarie amministrative, la cui entità è
stabilita in base alla gravità dell'irregolarità accertata, ferme restando
altre sanzioni eventuali.
Ai fini della valutazione dell'irregolarità si tiene conto, in particolare,
dell'evoluzione naturale delle caratteristiche di un olio che sia statoconservato in condizioni normali.
All'inizio di ogni semestre gli Stati membri informano la Commissione
in merito al numero e alla natura delle irregolarità constatate, nonché inmerito alle sanzioni irrogate nel semestre precedente.
Articolo 4
1. Ai fini della valutazione e del controllo delle caratteristiche orga-
nolettiche da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti, gli
Stati membri possono procedere al riconoscimento di panel di assaggia-tori.
Le condizioni del riconoscimento sono stabilite dallo Stato membro in
particolare in modo da:
— rispondere alle condizioni di cui all'allegato XII, punto 4,
— garantire che la formazione del capo del panel si compia presso un
organismo riconosciuto e alle condizioni a tal fine stabilite dalloStato membro,
— subordinare la validità del riconoscimento ai risultati ottenuti
nell'ambito di un sistema di controllo annuale istituito dallo Stato
membro.
Ogni Stato membro comunica alla Commissione l'elenco dei panel
riconosciuti e le misure adottate conformemente al presente paragrafo.
2. Lo Stato membro che incontri difficoltà per la costituzione di un
comitato di assaggio sul proprio territorio può ricorrere ad un comitato
di assaggio riconosciuto da un altro Stato membro.
3. Ogni Stato membro compila l'elenco dei comitati di assaggio isti-
tuiti da associazioni professionali o interprofessionali in conformità delparagrafo 1 e controlla il rispetto di dette norme.
Articolo 6
1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione
dell'olio (codice NC 2306 90 11 e 2306 90 19) è determinato conforme-mente al metodo che figura nell'allegato XV.
2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del
suo peso rispetto a quello della sostanza secca.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 5
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Articolo 7
Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di
sostanze indesiderabili diverse da quelle di cui all'allegato XI.
Articolo 8
1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misure adot-
tate per l'applicazione del presente regolamento.
2. Ogni Stato membro comunica alla Commissione, alla fine di ogni
semestre, un riassunto dei dati analitici delle determinazioni effettuati
nel corso del semestre precedente.
Detti risultati sono esaminati dal comitato di gestione dei grassi
secondo la procedura prevista all'articolo 39 del regolamento n. 136/66/CEE.
Articolo 9
Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.
Articolo 10
1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo
aquello dellapubblica zione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità
europee.
Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decor-
rere dal ►
M11onovembre 1992 ◄, salvo per quanto riguarda le
operazioni legate all'intervento.
Questo metodo non si applica all'olio d'oliva vergine condizionato ante-
riormente al 1onovembre 1992.
2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di
sansa d'oliva condizionati anteriormente all'entrata in vigore del
presente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre 1992.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e diretta-
mente applicabile in ciascuno degli Stati membri.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
ALLEGATI
Sommario
Allegato I: Caratteristiche degli oli di oliva …
Allegato I bis: Campionatura delle partite di olio d'oliva o di olio di sansa
d'oliva in imballaggi immediati di contenuto non superiore
a100 litri …
Allegato II: Determinazione dell'acidità …
Allegato III: Determinazione del numero di perossidi …
Allegato IV: ►M6Determinazione del contenuto di cere mediante
gascromatografia con colonna capillare ◄…
Allegato V: Determinazione della composizione e del contenuto di
steroli mediante gascromatografia con colonna capillare …
Allegato VI: Determinazione dell'eritrodiolo e dell'uvaolo …
Allegato VII: Determinazione degli acidi grassi in posizione 2 nel trigli-
ceride …
Allegato VIII: Determinazione del contenuto di trilinoleina …
Allegato IX: Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto …
Allegato X «A»: Analisi gascromatografica degli esteri metilici degli acidi
grassi …
Allegato X «B»: Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi in
conformità all'allegato VI — punti I e II del regolamento
(CEE) n. 72/77 della Commissione oppure in alternativa il
metodo seguente …
Allegato XI: Determinazione del tenore dei solventi alogenati …
Allegato XII: Valutazione organolettica dell'olio di oliva vergine …Allegato XIII: ►
M6Neutralizzazione e decolorazione dell'olio d'oliva in
laboratorio ◄…
Allegato XV: Metodo di determinazione del tenore in olio d'oliva delle
sanse …
Allegato XVI: Determinazione del numero di iodio …
Allegato XVII: Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli
vegetali ...
Allegato XVIII: Metodo di determinazione della composizione dei triglice-
ridi con ECN42 ...
Allegato XIX: Metodo per la determinazione del tenore in alcoli alifatici ...1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 7
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ALLEGATO I
CARATTERISTICHEDEGLIOLID'OLIVA
CategoriaAcidità
(%) (*)Indice di
perossidi
mEq 02/
kg (*)Solventi
alogenati
mg/kg(*) (1)Cere
mg/kg (**)Acidi saturi
in posizione
2 del trigli-
ceride
(%)Stigmasta-
dieni
mg/kg (2)Differenza
ECN42 —
HPLC e
calcolo
teorico di
ECN42K232(*) K270(*)K270con
allumina (3)Delta-K (*)Valutazione
organolet-
tica
Mediana del
difetto
(Md) (*)Valutazione
organolet-
tica
Mediana de
fruttato
(Mf) (*)
1. Olio extravergine di
oliva≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Olio di olivavergine ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Olio di olivavergine
corrente≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0 (4)—
4. Olio di olivavergine
lampante> 3,3 > 20 > 0,20 ≤300 (5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 > 0,25 ≤0,11 — Md > 6 —
5. Olio di oliva raffinato ≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6. Olio di oliva ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7. Olio di sansa di oliva
greggio> 0,5 (**) — — >350 (6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Olio di sansa di oliva
raffinato≤0,5 ≤5 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9. Olio di sansa di oliva ≤1,5 ≤15 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Limite massimo per i composti totali alogenati rivelati dal rivelatore a cattura di elettroni.
Per i componenti accertati singolarmente il limite massimo è 0,10 mg/kg.
(2) Somma degli siomeri che potrebbero (o meno) essere separati mediante colonna capillare.
(3) Per la verifica della presenza di oli raffinati, se il K270supera il limite della categoria corrsipondente, si deve procedere alla determinazione del K270dopo passaggio su allumina.
(4) Se la mediana del fruttato è uguale a 0, la mediana del difetto deve essere inferiore o ugual a 2,5.
(5) Gli oli con un tenore in cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferi ori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è pari o inferiore a
3,5.
(6) Gli oli con un teneore in cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono supe riori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è superiore a
3,5.▼M191991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 8
CategoriaComposizione acidica
Somma
degli
isomeri
transo-
leici
(%)Somma
degli
isomeri
translino-
leici e
translino-
lenici
(%)Coleste-
rolo
(%)Brassi-
casterolo
(%)Campe-
sterolo
(%)Stigma-
sterolo
(%)Betasito-
sterolo
(%) (1)Delta-7-
Stigma-
stenolo
(%)Steroli
totali
(mg/kg)Eritro-
diolo e
uvaolo
(%) (**)Miristico
(%)Linole-
nico
(%)Arachido
(%)Eicosa-
noico
(%)Beenico
(%)Lignoce-
rico
(%)
1. Olio extra
vergine di oliva≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Olio di oliva
vergine≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Olio di oliva
vergine corrente≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
4. Olio di oliva
vergine lampante≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (2)
5. Olio di oliva
raffinato≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Olio di oliva ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
7. Olio di sansa di
olivagreggio≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (3)
8. Olio di sansa di
oliva raffinato≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
9. Olio di sansa di
oliva≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Somma di: Delta-5,23-Stigmastodienolo + Clerosterolo + Beta-Sitosterolo + Sitostanolo + Delta-5-Avenasterolo + Delta-5,24-Stigmastadienolo .
(2) Gli oli con un tenore in cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferi ori a 350 mg/kg o se la percentuale di citrodiolo e uvaolo è pari o inferiore a
3,5.
(3) Gli oli con un tenore in cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono super iori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritodiolo e uvaolo è superiore a 3,5.
Nota:
a) I risultati delle analisi devono essere espressi con un numero di decimali uguale a quello previsto per ogni caratteristica.
L'ultimacifradeve essere a umenta tadi unaunità se lacifrasuccessivaè superiore a4.
b) È sufficiente che una sola caratteristica non sia conforme ai valori indicati perché l'olio venga cambiato di categoria o dichiarato non conforme r iguardo la sua purezza.
c) Le caratteristiche contrassegnate con (*) e riguardanti la qualità dell'olio implicano che:
— per l'olio d'oliva vergine lampante, corrispondenti valori limite (eccetto il K232) possono non essere rispettati simultaneamente,
— per gli altri oli d'oliva vergini, l'inosservanza di almeno uno di questi valori limite comporta il cambiamento di categoria, pur rimanendo classif icati in una delle categorie degli oli d'oliva vergini.
d) Le caratteristiche contrassegnate con (**) implicano che per tutti gli oli di sansa di oliva i corrispondenti valori limite possono non essere risp ettati simultaneamente.▼M191991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 9
▼M17
ALLEGATO I bis
Campionaturadellepartitedioliod'olivaodioliodisansad'olivainimbal-
laggiimmediatidicontenutononsuperiorea100litri
Il presente metodo di campionatura si applica a partire di olio di oliva o di olio
di sansa di oliva non superiori a 125 000 litri, condizionate in imballaggi imme-
diati di contenuto non superiore a 100 litri.
Qualora la partita sia costituita da più di 125 000 litri, essa viene suddivisa in
sottopartite di quantità approssimativamente pari o inferiore a 125 000 litri. Il
metodo si applica in tal caso a ciascuna partita così definita.
1. Contenuto del prelievo elementare
Il prelievo elementare è costituito:
a) qualora gli imballaggi immediati abbiano capacità superiore o uguale a 6
litri, dall'olio di un imballaggio immediato, ripartito in almeno 6 recipienti
daun litro, di cui
— un recipiente per le analisi di cui agli allegati II, III, IX e XII,
— uno per le altre analisi e— i rimanenti per le eventuali controanalisi;
b) qualora gli imballaggi immediati abbiano capacità superiore o uguale a 2
litri ma inferiore a 6 litri, dall'olio di 4 imballaggi immediati, di cui
— un imballaggio immediato per le analisi di cui agli allegati II, III, IX e
XII,
— un terzo di un altro imballaggio per le altre analasi e— il resto dell'olio per le eventuali controanalisi;
c) qualora gli imballaggi immediati abbiano capacità superiore o uguale a
0,75 litri ma inferiore a 2 litri, dall'olio di 6 imballaggi immediati, di cui
— un imballaggio immediato per le analisi di cui agli allegati II, III, IX e
XII,
— uno per le altre analisi e— il resto dell'olio per le eventuali controanalisi;
d) qualora gli imballaggi immediati abbiano capacità inferiore a 0,75 litri,
dall'olio del numero minimo di imballaggi la cui capacità totale supera
4,5 litri, ripartito come segue:
— l'olio del numero minimo di imballaggi la cui capacità supera 0,75 litri
è riservato alle analisi di cui agli allegati II, III, IX e XII,
— la stessa quantità è riservata alle altre analisi e— il resto dell'olio è riservato alle eventuali controanalisi.
2. Numero di prelievi elementari
Il numero minimo di prelievi elementari è fissato in funzione della dimen-
sione della partita, conformemente alla tabella seguente:
Partita (litri) inferiore a Numero minimo di prelievi elementari
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Gli imballaggi immediati facenti parte dello stesso prelievo elementare
devono essere scelti tra imballaggi contigui della partita.
In caso di dubbio, lo Stato membro aumenta il numero di prelievi elementari
daeffettua re.
3. Analisi e risultati
Per quanto possibile, gli oli dovranno essere mantenuti nei recipienti originali
fino al momento delle analisi.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 10
▼M17
a) Ciascuno dei prelievi elementari è suddiviso in campioni di laboratorio,
conformemente al punto 2.5 della norma EN ISO 5555, e sottoposto alle
analisi seguenti:
— determinazione degli acidi grassi liberi, di cui all'articolo 2, paragrafo
1, primo trattino,
— determinazione dell'indice di perossido, di cui all'articolo 2, paragrafo
1, secondo trattino,
— analisi spettrofotometrica, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, ottavo trat-
tino,
— composizione di acidi grassi, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, nono
trattino.
b) Qualora, per almeno uno dei prelievi elementari sulla stessa partita, uno
dei risultati delle analisi di cui alla lettera a) non sia conforme alle carat-
teristiche della catgoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è
dichiarata non conforme.
Qualora, per ciascuno dei prelievi elementari sulla stessa partita, tutti i
risultati delle analisi di cui alla lettera a) siano omogenei, tenuto conto
delle caratteristiche di ripetibilità dei metodi utilizzati, e conformi alle
caratteristiche della categoria di olio dichiarata, uno dei prelievi elemen-
tari su detta partita è sottoposto alle altre analisi.
c) Qualora uno dei risultati delle analisi di cui alla lettera b), secondo
comma, non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio
dichiarata, l'intera partita è dichiarata non conforme.
Qualora tutti i risultati delle analisi di cui alla lettera b), secondo comma,
siano conformi alla categoria di olio dichiarata, l'intera partita è dichiarata
conforme.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 11
▼B
ALLEGATO II
DETERMINAZIONEDELL'ACIDITÀ
1. OGGETTO
Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi
grassi liberi viene espresso mediante l'acidità calcolata in modo conven-
zionale.
1.1.Principio
Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela
di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una
soluzione etanolica di idrossido di potassio.
1.2.Reattivi
Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua
impiegata dev'essere acqua distillata o di purezza equivalente.
1.2.1. Etere dietilico — etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 - 1 in volume.
Nota:l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplo-
sivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari.
Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di
idrossido di potassio (1.2.2) in presenza di 0,3 ml della soluzione di
fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela.
Nota:se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una
misceladi solventi costituitadaeta nolo e datoluene. Se neces-
sario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.
1.2.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata c(KOH) all'incirca
0,1 mol oppure, se necessario, c( ►C2KOH◄) 0,5 mol circa.
La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio
deve essere nota e verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare
una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un
flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve
essere incolore o giallo pallida.
Nota:una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere
preparata come segue. Portare e mantenere per un'ora all'ebolli-
zione a ricadere 1 000 ml di etanolo con 8 g di idrossido di
potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente.
Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di
potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido
chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio.
La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come
segue. A 1 000 ml di etanolo aggiungere 4 ml di butilato di allu-
minio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il
liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idro-
ssido di potassio. Questa soluzione è pronta per l'uso.
1.2.3. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alca-
lino (nel caso di sostanze grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l
nell'etanolo al 95-96 % (V/V).
1.3.Apparecchiatura
Materiale corrente da laboratorio, in particolare:
1.3.1. Bilancia analitica.1.3.2. Beuta, avente una capacità di 250 ml.
1.3.3. Buretta, avente una capacità di 10 ml, graduata in 0,05 ml.
1.4.Mododioperare
1.4.1. Preparazione del campione da analizzare.
La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità
+ impurezze è inferiore all'1 %, sul campione tal quale.
1.4.2. Sostanza da analizzare1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 12
▼B
Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero
di acidità presunto, secondo le indicazioni della seguente tabella.
Numero di acidità
presuntoMassa della sostanza da
analizzare
(in g)Precisione dellapesa ta
della sostanza da analiz-
zare
(in g)
< 1 20 0,05
1 a4 10 0,024 a15 2,5 0,01
15 a75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).
1.4.3. Determinazione
Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50—150 ml della
miscela etere etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata.
Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l
(1.2.2) ( ►
C2vedi nota2 ◄) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione
rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s).
Nota 1: La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può
essere sostituitacon unasoluzione a cquosadi idrossido di
potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non comporta
una separazione di fasi.
Nota 2: Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio
di 0,1 mol/l superai 10 ml, usa re unasoluzione di 0,5 mol/l.
Nota 3: Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere
un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (1.2.1) per
ottenere una soluzione chiara.
1.5.Espressionedell'acidità come%diacidooleico.
L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
dove:
V = è il volume, in millilitri, dellasoluzione titola tadi idrossido di
potassio usata;
c = è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata
di idrossido di potassio usata;
M = è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per
l'espressione del risultato (acido oleico = 282);
m = è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare.
Prendere come risultato la media aritmetica ►M6di due determina-
zioni◄.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 13
▼B
ALLEGATO III
DETERMINAZIONEDELNUMERODIPEROSSIDI
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli
e grassi.
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Oli e grassi animali e vegetali.
3. DEFINIZIONE
Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel
campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossi-
dano lo ioduro di potassio nelle condizioni che vengono descritte.
4. PRINCIPIO
Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio,
con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con
soluzione di tiosolfato di sodio standardizzata.
5. APPARECCHIATURA
Tutta l'apparecchiatura usata dev'essere esente da sostanze riducenti od
ossidanti.
Nota:Non ungere le superfici smerigliate.
5.1. Ditale di vetro da 3 ml.5.2.►
C2Palloni a collo e tappo smerigliato ◄, aventi una capacità di circa
250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto
o, di preferenza, anidride carbonica).
5.3. Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml.
6. REAGENTI
6.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facen-
dovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.
6.2. Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facen-
dovi gorgogliare una corrente di gas puro e secco.
6.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione,
esente daiodio e daioda ti.
6.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente stan-
dardizzata immediatamente prima dell'uso.
6.5. Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione
da amido naturale solubile.
7. CAMPIONE
Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco
e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati erme-
ticamente con tappi a smeriglio o di sughero.
8. PROCEDIMENTO
La prova dev'essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce
artificiale. Pesare in un ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un
pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione
conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 14
▼B
Numero di perossidi previsto
(meq)Peso della sostanza da analizzare
(in g)
0 — 12 5,0 — 2,0
12 — 20 2,0 — 1,220 — 30 1,2 — 0,830 — 50 0,8 — 0,5
50 — 90 0,5 — 0,3
Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la
sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere
la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido
acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3). Ritappare
rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al
riparo dalla luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25 ºC.
Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con
una soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) (soluzione 0,002 N per valori
previsti inferiori a12 e soluzione 0,01 N per va lori previsti superiori a
12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come indi-
catore.
Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.
Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del
bianco supera 0,05 ml di soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (6.4), sosti-
tuire i reagenti impuri.
9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il numero di perossidi (P.V.), espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo
per kg, viene dato dalla formula:
P:V:¼
V/C2T
m/C21000
dove:
V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di
sodio (6.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della
provain bia nco.
T = è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4)
usata.
m = è il peso in g della sostanza da analizzare.
Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni
eseguite.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 15
▼M6
ALLEGATO IV
DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE MEDIANTE
GASCROMATOGRAFIACONCOLONNACAPILLARE
1. OGGETTO
Il metodo descrive un procedimento per ladetermina zione del conte-
nuto di cere di alcune sostanze grasse, nelle condizioni di prova.
Il metodo può essere impiegato in particolare per differenziare l'olio di
oliva di pressione da quello di estrazione (olio di sansa).
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di opportuno standard interno, viene
frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato;
la frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità
inferiore a quella dei trigliceridi) viene recuperata e quindi analizzata
direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Beutada25 ml.
3.2. Colonna in vetro per cromatografia avente diametro interno 15,0 mm e
altezza 30-40 cm.
3.3. Gascromatografo adeguato con colonna capillare, dotato di sistema di
introduzione direttain colonnacostituito da :
3.3.1. Forno a termostato per le colonne, idoneo a mantenere la temperatura
desiderata con la precisione di ± 1 ºC.
3.3.2. Iniettore afreddo per introduzione direttain colonna .
3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-
amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 s, e con
velocità della carta variabile.
3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, ►C3lunga10-15 m ◄,
diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-
52 o SE-54 equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30
µm.
3.4. Microsiringaper on-column da10 µl con ago cementato.
4. REAGENTI
4.1. Gel di silice 70-230 mesh art. 7754 Merck.
Il gel di silice è posto in muffola a 500 ºC per 4 h. Dopo raffredda-
mento è addizionato del 2 % di acqua. Si agita bene allo scopo di
omogeneizzare la massa. Si conserva al buio almeno per 12 h prima
del suo impiego.
4.2. n-Esano, per cromatografia.
4.3. Etere etilico, per cromatografia.4.4. n-Eptano, per cromatografia.4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (m/v) in esano
(standard interno).
4.6. Gas vettore: idrogeno, puro per gascromatografia.
4.7. Gas ausiliari:
— idrogeno, puro per gascromatografia;
— aria, pura per gascromatografia.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 16
▼M6
5. PROCEDIMENTO
5.1. Separazione della frazione delle cere.
5.1.1. Mettere in sospensione 15 g di gel di silice idratato al 2 % in n-esano
anidro e introdurli nella colonna.
Dopo assestamento spontaneo si completa lo stesso mediante l'uso di un
vibratore elettrico per rendere più omogeneo il letto cromatografico. Si
percolano 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impu-
rezze.
5.1.2. Conduzione della cromatografia su colonna.
Nella beuta da 25 ml si pesano esattamente circa 500 mg di campione,
si addiziona dell'opportuna quantità di standard interno, in funzione del
presunto contenuto di cere. Ad esempio si aggiungono 0,1 mg di lauril
arachidato nel caso di olio di oliva e 0,25-0,50 mg nel caso di olio di
sansa.
Il campione così preparato viene trasferito nella colonna cromatografica
preparata come a 5.1.1., aiutandosi con due porzioni da 2 ml cadauna di
n-esano.
Si lascia fluire il solvente fino ad un battente di 1 mm. A questo punto
inizia l'eluizione cromatografica raccogliendo 140 ml di miscela n-
esano/etere-etilico nel rapporto 99:1, rispettando un flusso di circa 15
gocce ogni 10 s (2,1 ml/min).
La frazione così ottenuta viene evaporata mediante evaporatore rotante
sino quasi a secchezza, si allontanano gli ultimi 2 o 3 ml con l'aiuto di
un debole flusso di azoto e si riprende il tutto con 10 ml di n-eptano.
5.2. Analisi gascromatografica.5.2.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.
5.2.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di
ingresso connesso col sistema on column, e il terminale di uscita al
rivelatore.
Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico
(tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di
registrazione, ecc.).
5.2.1.2. Se lacolonnaè messain usò per laprimavoltaè consiglia bile proce-
dere al suo condizionamento.
Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi
si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento
graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 ºC superiore
a quella di esercizio (nota). Si mantiene tale temperatura per almeno 2
h, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (rego-
lazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il
registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per
la colonna, del rivelatore, ecc.) e si registra il segnale ad una sensibilità
almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi.
Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di
qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.
Unaderivarettilineanega tivaindicaimperfettatenutadelle connessioni
della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condiziona-
mento dellacolonna .
Nota:La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere
inferiore di almeno 20 ºC alla temperatura massima prevista per
il liquido di ripartizione impiegato.
5.2.2. Sceltadelle condizioni opera tive.
5.2.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
— temperatura della colonna: inizio a 80 ºC, quindi incremento di 30
ºC/min fino a 120 ºC, poi programmata di 5 ºC/min fino a 340 ºC;
— temperatura del rilevatore: 350 ºC;— velocità lineare del gas di trasporto: idrogeno 20-35 cm/s;
— sensibilità strumentale: da 4 a 16 vole l'attenuazione minima;
— sensibilità di registrazione: 1-2 mV fondo scala;— velocità della carta: 30 cm/h;— quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 µl di soluzione.
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo (in modo da ottenere1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 17
▼M6
cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti: il tempo di riten-
zione dello standard interno C32 deve essere 25 ± 2 min e il picco delle
cere più rappresentativo deve essere contenuto tra il 60 e il 100 %
fondo scala).
5.2.2.2. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in
modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che
vengono presi in considerazione.
5.2.3. Esecuzione dell'analisi.
5.2.3.1. Con lamicrosiringada10 µl si preleva1 µl di soluzione; si alza lo
stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago
attraverso il dispositivo di iniezione e dopo 1-2 s si inietta rapidamente
e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 s.
5.2.3.2. Si effettualaregistra zione fino acompletaeluizione delle cere.
La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti
(5.2.1.2).
5.2.4. Identificazione dei picchi
L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di
ritenzione e per paragone con miscele di cere a tempi di ritenzione noti,
analizzate nelle medesime condizioni.
Nella fig. 1 è riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva
vergine.
5.2.5. Valutazione quantitativa.
5.2.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore delle aree dei picchi dello stan-
dard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46.
5.2.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza
grassa come segue:
singolo estere (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
dove:
Ax= area del picco del singolo estere;
As= area del picco del lauril arachidato;
ms= massa di lauril arachidato aggiunta, in milligrammi;
m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Si riportano i contenuti delle singole cere, e la loro somma in mg/kg di
sostanza grassa.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 18
▼M6
APPENDICE
Determinazione della velocità lineare del gas
Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1-3
µl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percor-
rere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del picco
(tM).
La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna
in centimetri e tM è il tempo cronometrato in s.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 19
▼M61991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 20
▼B
ALLEGATO V
DETERMINAZIONEDELLACOMPOSIZIONEEDELCONTENUTODI
STEROLI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA
CAPILLARE
1. OGGETTO
Il metodo descrive un procedimento per ladetermina zione del conte-
nuto di steroli, singoli e totali, delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di α-colestanolo quale standard interno,
è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi
l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.
Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione sterolica mediante
cromatografia su placca di gel di silice basica; gli steroli recuperati dal
gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati
mediante gascromatografia in colonna capillare.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a
smeriglio.
3.2. Imbuti separatori da 500 ml.
3.3. Matracci da 250 ml.3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per
lastre di vetro 20 × 20 cm.
3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.3.6. Microsiringhe da100 µl e 500 µl.
3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 µm) di
diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtra-
zione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.
3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adatta-
bile all'imbuto filtrante (3.7.).
3.9. Provettada10 ml afondo conico con ta ppo atenuta .
3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare,
dotato di sistema di splittaggio, costituito da:
3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura
desiderata con la precisione di ± 1 ºC.
3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporiz-
zante in vetro persilanizzato.
3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-
amplificatore (3.10.3.), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo
e con velocità della carta variabile.
3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro
interno 0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o
SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e
0,30 µm.
3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 µl con ago cementato.
4. REAGENTI
4.1. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto
raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in
200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La
soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.
4.2. Etere etilico, puro per analisi.
4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 21
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4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluore-
scenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per
l'uso).
4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idro-
ssido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con
etanolo.
4.6. Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2).4.7. Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.8. Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.9. Etere etilico, per cromatografia.4.10. Cloroformio, puro per analisi.4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o
fitosteroli, soluzione al ►
M62%◄in cloroformio.
4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende legger-
mente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di
idrossido di potassio.
4.13. Piridina anidra, per cromatografia.
4.14. Esametildisilazano.
4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al
momento dell'impiego pa rtendo dasteroli puri o damiscele di steroli
ottenute daoli che li contenga no.
4.17. α-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard
interno).
4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.4.19. Gas ausiliari:
— idrogeno, puro per gascromatografia
— aria, pura per gascromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione dell'insaponificabile.
5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da
500 µl, un volume di soluzione di α-colestanolo allo 0,2 % in cloro-
formio (4.17.) che contengaunaqua ntità di α-colestanolo
corrispondente acircail 10 % del contenuto di steroli nell'a liquotadi
campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di
campione si aggiungano 500 µl della soluzione di α-colestanolo allo
0,2 % se trattasi di un olio di oliva e 1 500 µl se trattasi di
►
M6 ◄olio di sansa di oliva.
Si evapora in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso
matraccio si pesano esattamente 5 g di campione secco e filtrato.
In caso di oli ►M6 ◄contenenti quantità notevoli di
colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione
identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione stero-
lica in doppio con e senza standard interno ►M6oppure utilizzare
betulinolo al posto del colesterolo ◄.
5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N,
si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su
bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione
avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento
ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata
facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e
si raffredda il matraccio a circa 30 ºC.
5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto
separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese,
impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa
80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si
lascia stratificare (nota 1).
Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo
imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estra-
zioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70 ml di etere
etilico.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 22
▼B
Nota 1— Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo,
mediante spruzzetta, piccole quantità di alcool etilico o meti-
lico.
5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano
con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque
di lavaggio.
Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si
filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente
pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico.
5.1.5. Si distillal'etere fino apochi ml, quindi si portaasecco sotto leggero
vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100 ºC
per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa.
5.2. Separazione della frazione sterolica.5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice
(4.4.), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di
potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa
per 2 ore ed infine si pongono in stufaa100 ºC per 1 ora .
Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio
fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere
impiegate entro 15 giorni).
Nota 2Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle
lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del tratta-
mento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono
trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura
acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così la banda degli
steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e
triterpenici.
5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-
acetone 95:5 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può
essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35 (V/V). Si chiude la
camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora
in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici
interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro
che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di
circa1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere unapiù uniforme e regola re
eluizione dei componenti.
Nota 3: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente ripro-
ducibili lamisceladi sviluppo deve essere sostituitaa d ogni
prova.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in
cloroformio e, con la microsiringa da 100 µl si depositano su una placca
cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml di detta
soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento
con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-
3 µl dellasoluzione di riferimento degli steroli (4.11.), a llo scopo di
identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in
5.2.2. La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 ºC.
Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il
fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della
placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si
evapora il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca
per un pò di tempo sotto cappa.
5.2.5. Si spruzzalapla ccadebolmente ed uniformemente con lasoluzione di
2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si
individua la banda degli steroli per allineamento con la macchia otte-
nuta con la soluzione di riferimento; si delimitano con una matita nera
i limiti della banda lungo i margini di fluorescenza.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area
delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene intro-
dotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di cloroformio
caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra
aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) colle-
gata all'imbuto filtrante.
Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml
per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata
all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si
trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previa-1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 23
▼B
mente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera
corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta
ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 ºC indi si lascia
raffreddare in essiccatore e si pesa.
Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione sterolica.
5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per
la sililazione, costituito da una miscela di piridina-esametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 4) in ragione di 50 µl per ogni
milligrammo di steroli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 5).
Nota 4— Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono
inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il
bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da
diluire son uno stesso volume di piridina anidra.
5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a
completa solubilizzazione degli steroli. Si lascia a sé per almeno 15
minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti:
la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.
Nota 5— L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è
normale e non è causa di alcun disturbo. La formazione di un
flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono
indizio della presenza di umidità o di alterazione del reattivo.
In questo caso la prova dovrà essere ripetuta.
5.4. Analisi gascromatografica.5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di
ingresso all'evaporatore connesso col sistema di splittaggio e il termi-
nale di uscita al rivelatore.
Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico
(tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del
sistemadi splitta ggio e del sistemadi registra zione, ecc.).
5.4.1.2. Se lacolonnaè messain uso per laprimavoltaè consiglia bile proce-
dere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas
attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromato-
grafico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una
temperatura di almeno 20 ºC superiore a quella di esercizio (nota 6).
Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il
complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei
gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il
registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per
la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad
unasensibilità a lmeno 2 volte superiore aquellaprevistaper l'esecu-
zione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare,
esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.
Unaderivarettilineanega tivaindicaimperfettatenutadelle connessioni
della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condiziona-
mento dellacolonna .
Nota 6— La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere
inferiore di almeno 20 ºC alla temperatura massima prevista per
il liquido di ripartizione impiegato.
5.4.2. Sceltadelle condizioni opera tive.5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
— temperatura della colonna: 260 ºC ± 5 ºC
— temperatura dell'evaporatore: 280 ºC— temperatura del rivelatore: 290 ºC— velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno
30 + 50 cm/s
— rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100— sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima— sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV f.s.— velocità della carta: 30 + 60 cm/ora— quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 µl di soluzione di TMSE.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 24
▼B
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere
cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:
— il tempo di ritenzione del β-sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti
— il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto
medio 3 %) 15 ± 5 % del fondo scala, per l'olio di soia (contenutomedio 20 %) 80 ± 10 % del fondo scala
— si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario
che i picchi oltre che separati siano anche completamente risolti
cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima
dell'uscita del picco successivo. È tuttavia tollerata anche una riso-
luzione incompleta a condizione però che sia quantificabile secondo
laperpendicola re il picco aTRR 1,02.
5.4.3. Esecuzione dell'analisi.
5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 µl di esano, si aspirano 0,5 µl
di aria e successivamente 0,5 + 1 µl della soluzione del campione; si
alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si
introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e
dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente
l'ago dopo circa 5 secondi.
5.4.3.2. Si effettualaregistra zione fino acompletaeluizione dei TMSE degli
steroli presenti.
La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti
(5.4.1.2.).
5.4.4. Identificazione dei picchi.
L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di
ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli steroli, analizzate
nelle medesime condizioni.
Gli steroli vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, bras-
sicasterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo,
stigmasterolo, ∆
7-campesterolo, ∆5,23-stigmastadienolo, clerosterolo, β-
sitosterolo, sitostanolo, ∆5— -avenasterolo, ∆5,24-stigmastadienolo, ∆7-
stigmastenolo, ∆7-avenasterolo.
Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al sitosterolo
per le colonne SE 52 e SE 54.
Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli.
5.4.5. Valutazione quantitativa.
5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell' α-cole-
stanolo e degli steroli. Non vengono considerati i picchi di eventuali
componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella I. Il coeffi-
ciente di rispostadell' α-colestanolo si deve intendere unitario.
5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza
grassa, come segue:
sterolo x =Ax·ms· 100
As·m
in cui:
Ax= area del picco dello sterolo x ►M6 ◄;
As= area del picco dell' α-colestanolo ►M6 ◄;
ms= massa di α-colestanolo aggiunta, in milligrammi;
m = massa del campione prelevato per la determinazione, in
grammi.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
6.1 Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza
grassa e, come steroli totali, la loro somma.
6.2 Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto
fra l'area del picco corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi
degli steroli.
% dello sterolo x =Ax
ΣA· 1001991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 25
▼B
in cui:
Ax= Areadel picco x,
ΣA = Sommatoria delle aree di tutti i picchi.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 26
▼B
APPENDICE
Determinazione della velocità lineare dei gas
Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano
1 + 3 µl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a
percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del
picco (tM).
La velocità lineare in cm/s è data da L/tMin cui L è lalunghezzadellacolonna
in centimetri e tMè il tempo cronometato in secondi.
TabellaI
Tempi di ritenzione relativi degli steroli
Pi-
cc-
oIdentificazioneTempo di ritenzione
relativo
Colonna
SE 54Colonna
SE 52
1 colesterolo ∆-5-colesten-3 β-olo 0,67 0,63
2 colestanolo 5 α-colestan-3 β-olo 0,68 0,64
3 brassicasterolo [24S]-24-metil- ∆-5,22-colestadien-3 β-olo 0,73 0,71
4 24-metilencolesterolo 24-metilen- ∆-5,24-colestadien-3 β-olo 0,82 0,80
5 campesterolo [24R]-24-metil- ∆-5-colesten-3 β-olo 0,83 0,81
6 campestanolo [24R]-24-metil-colestan-3 β-olo 0,85 0,82
7 stigmasterolo [24S]-24-etil- ∆-5,22-colestadien-3 β-olo 0,88 0,87
8 ∆-7-campesterolo [24R]-24-metil- ∆-7-colesten-3 β-olo 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil- ∆-5,23-colestadien-3 β-olo 0,95 0,95
10 clerosterolo [24S]-24-etil- ∆-5,25-colestadien-3 β-olo 0,96 0,96
11 β-sitosterolo [24R]-24-etil- ∆-5-colesten-3 β-olo 1,00 1,00
12 sitostanolo 24-etil-colestan-3 β-olo 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-5-colesten-3 β-olo 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil- ∆-5,24-colestadien-3 β-olo 1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenolo [24R,S]-24-etil- ∆-7-colesten-3 β-olo 1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterolo [24Z]-24-etiliden- ∆-7-colesten-3 β-olo 1,16 1,161991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 27
▼B
Figura1
Gascromatogramma della frazione sterolica di un olio di oliva grezzo
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 28
▼B
Figura2
Gascromatogramma della frazione sterolica di un olio di oliva raffinato
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 29
▼B
ALLEGATO VI
DETERMINAZIONEDELL'ERITRODIOLOEDELL'UVAOLO
PREMESSA
L'eritrodiolo (convenzionalmente inteso come l'insieme dei dioli eritro-
diolo ed uvaolo) è un costituente dell'insaponificabile, caratteristico di
alcune specie di sostanze grasse. La sua concentrazione risulta notevol-
mente più elevata negli oli di oliva di estrazione rispetto ad altri oli che
lo contengono (oli di oliva di pressione, oli di vinaccioli) e pertanto la
sua determinazione può servire per accertare la presenza di olio di oliva
di estrazione.
1. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per ladetermina zione dell'eritrodiolo
nelle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa viene saponificata con idrossido di potassio in solu-
zione etanolica, quindi si estrae l'insaponificabile con etere etilico e lo si
purifica per passaggio su colonna di allumina.
Si procede al frazionamento dell'insaponificabile mediante cromatografia
su strato sottile su placca di gel di silice e si isolano la bandadella
frazione sterolica e quella dell'eritrodiolo.
Gli steroli e l'eritrodiolo, recuperati dalla placca vengono trasformati in
trimetilsilileteri, la miscela è quindi analizzata mediante gascromato-
grafia.
Il risultato è espresso in percento di eritrodiolo rispetto all'insieme eritro-
diolo + steroli.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Apparecchiature prescritte nel metodo all'allegato V (Determinazione del
contenuto degli steroli).
4. REAGENTI
4.1. Reagenti prescritti nel metodo all'allegato V (determinazione del conte-
nuto degli steroli).
4.2. Soluzione di riferimento di eritrodiolo, allo 0,5 % in cloroformio.
5. PROCEDIMENTO5.1.Preparazione dell'insaponificabile.
Si procede come descritto al paragrafo 5.1.2. del metodo all'allegato V.
5.2.Separazionedell'eritrodiolo edeglisteroli.
5.2.1. Vedi paragrafo 5.2.1. del metodo all'allegato V.5.2.2. Vedi paragrafo 5.2.2. del metodo all'allegato V.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % in cloroformio dell'insaponificabile.
Con la microsiringa da 0,1 ml, si depositano su una placca cromatogra-
fica, a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, 0,3 ml di detta soluzione, in
strisciail più possibile sottile ed uniforme. Ad unaestremità dellapla cca
si depositano, come riferimento, alcuni microlitri delle soluzioni di cole-
sterolo e di eritrodiolo.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto al para-
grafo 5.2.1. La temperatura ambiente deve essere di circa 20 ºC. Si
chiude subito col coperchio e si eluisce fino ache il fronte del solvente
sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove la
placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria
calda.
5.2.5. Si spruzza la placca uniformemente con la soluzione alcolica di 2 ′,7′-
diclorofluoresceina. Esaminando la placca alla luce ultravioletta si indivi-
duano le bande degli steroli e dell'eritrodiolo in base all'allineamento con1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 30
▼B
i riferimenti, e si delimitano con una punta leggermente al di fuori dei
margini di fluorescenza.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nelle aree
delimitate. Il materiale asportato dalla placca viene riunito in bevuta da
50 ml; si aggiungono 15 ml di cloroformio caldo, si agita bene e si filtra
sull'imbuto asetto poroso tra sferendo il gel di silice sul filtro stesso. Si
lava per tre volte con porzioni di 10 ml di cloroformio caldo per volta,
raccogliendo il filtrato in palloncino da 100 ml. Si evapora fino ad un
volume di 4-5 ml, si trasferisce in provetta da centrifuga a fondo conico
da 10 ml previamente tarata, si porta a secco con blando riscaldamento in
corrente di azoto e si pesa.
5.3.Preparazione deitrimetilsilileteri.
Si procede come descritto al paragrafo 5.3 del metodo all'allegato V.
5.4. Analisi gascromatografica.
Si procede come descritto al paragrafo 5.4 del suddetto metodo. Le
condizioni operative dell'analisi gascromatografica devono essere tali
che, oltre a soddisfare i requisiti richiesti per l'analisi degli steroli, portino
anche alla separazione dei TMSE dell'eritrodiolo e dell'uvaolo.
Iniettato il campione si lascia svolgere la carta fino a che siano stati eluiti
gli steroli presenti, l'eritrodiolo e l'uvaolo; si identificano quindi i picchi
(l'eritrodiolo e l'uvaolo hanno tempi di ritenzione relativi, rispetto al β-
sitosterolo, di circa 1,45 e 1,55 rispettivamente) e se ne calcolano le
aree come detto per gli steroli.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Eritrodiolo, % =A1+A2
A1+A2+ΣAsteroli· 100
in cui:
A1= area del picco dell'eritrodiolo ►M6 ◄,
A2= area del picco dell'uvaolo ►M6 ◄,
ΣAsteroli= sommadelle a ree degli steroli presenti
►M6 ◄.
Il risultato si esprime con una cifra decimale.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 31
▼B
ALLEGATO VII
DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI IN POSIZIONE 2 NEL
TRIGLICERIDE
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo per la determinazione della composizione di quella
frazione degli acidi grassi di un olio o di un grasso che viene esterificata
nellaposizione 2 (oppure posizione interna ) del glicerolo.
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo è applicabile agli oli e ai grassi aventi un punto di
fusione inferiore ai 45 ºC, a causa delle caratteristiche dell'azione della
lipasi pancreatica.
Esso non si può applicare indiscriminatamente agli oli e ai grassi conte-
nenti quantitativi sostanziali di: acidi grassi con 12 atomi di carbonio o
meno (oli di noci di cocco e di semi di palma, grasso butirrico), o acidi
grassi insaturi (con oltre quattro doppi legami) contenenti 20 o più atomi
di carbonio (oli di pesce e di animali marini), oppure acidi grassi conte-
nenti gruppi ossigenati diversi dal gruppo acido.
3. PRINCIPIO
Eventuale neutralizzazione di oli e grassi acidi in un solvente. Purifica-
zione filtrando attraverso una colonna di allumina. Idrolisi parziale dei
trigliceridi a opera della lipasi pancreatica in un periodo determinato.
Separazione dei monogliceridi formatisi mediante cromatografia su strato
sottile e metanolisi degli stessi. Analisi di questi esteri metilici mediante
cromatografia gas-liquido.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Pallone a fondo arrotondato, da 100 ml.
4.2. Pallone a fondo arrotondato, da 25 ml, con giunto smerigliato.4.3. Condensatore ad aria, di 1 m di lunghezza, idoneo ad essere montato sul
pallone a 4.2.
4.4. Beutada250 ml.
4.5. Bicchiere da50 ml.4.6. Imbuto separatore da 500 ml.4.7. Colonna di vetro per cromatografia, avente un diametro interno di 13 mm,
unalunghezzadi 400 mm, provvistadi disco di vetro sinterizza to e di
rubinetto.
4.8. Provetta da centrifuga di 10 ml, provvista di tappo di vetro smerigliato.4.9. Buretta da 5 ml, graduata in 0,05 ml.
4.10. Siringaipodermicada1 ml, provvistadi a go sottile.
4.11. Microsiringa, idonea a rilasciare gocce di 3-4 µl.4.12. Diffusore per cromatografia su strato sottile.4.13. Piastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 20 × 20 cm.4.14. Vaschetta di sviluppo in vetro per cromatografia su strato sottile, con
coperchio asmeriglio, idoneo per le pia stre 20 × 20.
4.15. Spray per cromatografia su strato sottile.4.16. Stufaregola taa103 ± 2 ºC.4.17. Termostato regolabile tra 30 e 45 ºC con un'approssimazione di 0,5 ºC.
4.18. Evaporatore rotante.
4.19. Vibratore elettrico, che consenta un'agitazione vigorosa delle provette da
centrifuga.
4.20. Lampada a ultravioletto per l'esame delle piastre di strato sottile.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 32
▼B
Inoltre, per il controllo dell'attività della lipasi:
4.21. pH metro.
4.22. Agitatore a spirale.
4.23. Burettada5 ml.
4.24. Cronometro.
Inoltre, per l'eventuale preparazione della lipasi:
4.25. Agitatore da laboratorio, idoneo per la dispersione e la miscela di mate-
riali eterogenei.
5. REAGENTI
5.1. n-esano oppure, in mancanza di quest'ultimo, etere di petrolio (p. eb. 30-
50 ºC), di qualità per cromatografia.
5.2. 2-propanolo, oppure etanolo, al 95 % (V/V), di qualità per reagente anali-
tico.
5.3. 2-propanolo, oppure etanolo, soluzione acquosa 1/1.
5.4. Etere etilico, esente daperossidi.5.5. Acetone.
5.6. Acido formico, almeno al 98 % (m/m).
5.7. Solvente di sviluppo: miscela di n-esano (5.1), etere etilico (5.4) ed acido
formico (5.6) in proporzioni 70/30/1 (V/V/V).
5.8. Allumina attivata per cromatografia, neutra, grado Brockmann I.
5.9. Polvere di silice, con legante, di qualità idonea alla cromatografia su
strato sottile.
5.10. Lipasi pancreatica di qualità adeguata (nota 1, nota 2).
5.11. Idrossido di sodio, soluzione acquosa di 120 g/l.5.13. Cloruro di calcio (CaCl
2), soluzione acquosa di 220 g/l.
5.14. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 1 g/l.
5.15. Soluzione tampone: soluzione acquosa 1 M di tris-idrossimetilamminome-
tano, portata a pH 8 mediante aggiunta di acido cloridrico (5.12)
(controllare col potenziometro).
5.16. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95 % (V/V).
5.17. 2′,7′-diclorofluoresceina, soluzione di 2 g/l in etanolo al 95 % (V/V), resa
leggermente alcalina mediante aggiunta di 1 goccia di soluzione di idro-
ssido di sodio 1 N per 100 ml.
Inoltre, per il controllo dell'attività lipasica:
5.18. Olio neutralizzato.
5.19. Idrossido di sodio, soluzione acquosa 0,1 N.
5.20. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 200 g/l.
5.21. Gomma arabica, soluzione acquosa di 100 g/l.
6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Se il campione ha un'acidità inferiore al 3 %, determinata conformemente
all'allegato II, purificare direttamente su allumina conformemente al punto
6.2. Se il campione ha un'acidità superiore al 3 %, determinata conforme-
mente all'allegato II, neutralizzare con alcali in presenza di un solvente
conformemente al punto 6.1, quindi passare su allumina conformemente
al punto 6.2.
6.1. Neutralizzazione con alcali in presenza di solvente.
In un imbuto separatore (4.6) introdurre circa 10 g dell'olio grezzo e
aggiungere 100 ml di esano (5.1), 50 ml di 2-propanolo (5.2), poche gocce
di soluzione di fenolftaleina (5.16) e un quantitativo di soluzione di idro-
ssido di sodio (5.11) corrispondente all'acidità libera dell'olio, oltre a uno
0,3 % in eccesso. Agitare vigorosamente per 1 minuto, aggiungere 50 ml
di acqua distillata, agitare di nuovo e lasciar riposare.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 33
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Dopo la separazione, rimuovere lo strato di sapone che si trova sul fondo.
Rimuovere altresì eventuali strati intermedi (mucillagine, sostanza insolu-
bile). Lavare la soluzione di esano dell'olio neutralizzato
con successive porzioni da25-30 ml dellasoluzione di 2-propa nolo (5.3)
finché il colore rosa della fenolftaleina scompare. Eliminare la maggior
parte dell'esano mediante distillazione sotto vuoto nell'evaporatore rotante
(4.18), essiccare l'olio a 30-40 ºC sotto vuoto con l'ausilio di una corrente
di azoto puro finché l'esano è stato completamente rimosso.
6.2. Purificazione mediante allumina.
Preparare una sospensione di 15 g di allumina attivata (5.8) in 50 ml di
esano (5.1) e versarla, agitando, sulla colonna cromatografica (4.7).
Lasciare che l'allumina si depositi uniformemente e che il solvente scenda
ad 1-2 mm sopra l'assorbente. Versare cautamente sulla colonna una solu-zione di 5 g di olio in 25 ml di esano (5.1); raccogliere la totalità
dell'effluente dalla colonna in un pallone a fondo arrotondato (4.1).
7. PREPARAZIONE DELLE PIASTRE CROMATOGRAFICHE
Pulire accuratamente le piastre di vetro (4.13) con etanolo, etere di
petrolio ed acetone per eliminare qualsiasi traccia di sostanza grassa. In
unabeuta(4.4) versa re 30 g di polvere di silice (5.9). Aggiungere 60 ml
di acqua distillata. Tappare ed agitare fortemente per 1 minuto. Trasferire
immediatamente l'impasto nel diffusore (4.12) e coprire le piastre pulite
con uno strato di 0,25 mm.
Essiccare le piastre all'aria per 15 minuti e successivamente per un'ora
nella stufa (4.16) a 103 ± 2 ºC. Raffreddare le piastre in un essiccatore a
temperatura ambiente prima dell'uso.
Sono disponibili in commercio piastre preparate.
8. PROCEDIMENTO
8.1. Idrolisi con lipasi pancreatica.
In una provetta da centrifuga (4.8) pesare circa 0,1 g del campione prepa-
rato: se si tratta di grasso solido, si scioglie con 0,2 ml di esano (5.1),
scaldando leggermente se necessario. Aggiungere 20 mg di lipasi (5.10)
e 2 ml della soluzione tampone (5.15). Agitare energicamente, ma con
cautela e aggiungere successivamente 0,5 ml della soluzione di colato di
sodio (5.14) e 0,2 ml dellasoluzione di cloruro di ca lcio (5.13). Chiudere
la provetta con il tappo smerigliato, agitare con cautela (evitare di bagnare
il tappo), inserire la provetta immediatamente nel termostato (4.17) mante-
nuto a 40 ± 0,5 ºC ed agitare manualmente ►
C2esattamente 1
minuto ◄.
Togliere la provetta dal termostato ed agitare vigorosamente mediante
agitatore elettrico (4.19) ►C2esattamente per 2 minuti ◄.
Raffreddare immediatamente in acqua corrente; aggiungere 1 ml di acido
cloridrico (5.12) ed 1 ml di etere etilico (5.4). Tappare e agitare vigorosa-
mente mediante l'agitatore elettrico. Lasciar riposare e rimuovere lo strato
organico per mezzo della siringa (4.10), se necessario dopo aver centrifu-
gato.
8.2. Separazione dei monogliceridi mediante cromatografia su strato sottile.
Applicare l'estratto sulla piastra cromatografica con la microsiringa (4.11),
acirca1,5 cm da l bordo inferiore, in unalineasottile, uniforme, il più
stretta possibile. Sistemare la piastra nella vaschetta di sviluppo ben satu-
rata (4.14) e sviluppare col solvente di sviluppo (5.7) a circa 20 ºC, fino a
circa 1 cm dal bordo superiore della piastra.
Essiccare la piastra all'aria alla temperatura della vaschetta e spruzzare
con lasoluzione di 2 ′,7′-diclorofluoresceina (5.17). Identificare la banda
del monogliceride (Rfcirca0,035) sotto luce ultra violetta(4.20).
8.3. Analisi dei monogliceridi mediante cromatografia gas-liquido.
Rimuovere la banda ottenuta al punto 8.2 mediante una spatola (evitare di
rimuovere i componenti che restano sulla linea di base) e trasferire nel
pallone di metilazione (4.2).
Trattare la silice raccolta direttamente come descritto all'allegato X-B
alternativo in modo da trasformare i monogliceridi in esteri metilici ed
esaminare quindi gli esteri mediante gascromatografia come descritto
all'allegato X-A.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 34
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9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Calcolare la composizione dell'acido grasso nella posizione 2 con una
decimale (nota 3).
10. NOTE
Nota 1: Controllo dell'attività della lipasi
Preparare una emulsione oleosa agitando una miscela di 165 ml
della soluzione di gomma arabica (5.21), 15 g di ghiaccio tritato
e 20 ml di un olio neutralizzato (5.18) in un agitatore adeguato.
In un bicchiere (4.5) versare 10 ml di questa emulsione, seguiti
da0,3 ml dellasoluzione di cola to di sodio (5.20) e 20 ml di
acqua distillata.
Sistemare il bicchiere in un termostato mantenuto a 37 ± 0,5 ºC
(nota 4); inserire gli elettrodi di un pHmetro (4.21) e un agitatore
a spirale (4.22). Mediante una buretta (4.23) aggiungere goccia a
goccialasoluzione di idrossido di sodio (5.19) fino apH 8,5.
Aggiungere un quantitativo sufficiente di una sospensione
acquosa della lipasi (vedasi sotto). Non appena il pHmetro indica
un pH di 8,3, avviare il cronometro (4.24) e farvi gocciolare la
soluzione di idrossido di sodio (5.19) in modo dama ntenere il
pH a 8,3. Leggere il volume di soluzione alcalina consumata
ogni minuto.
Registrare le osservazioni sotto forma di grafico, indicando le
letture di tempo nelle ascisse e i ml di soluzione alcalina neces-
sari per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere
un grafico lineare.
La sospensione di lipasi di cui sopra è una sospensione in acqua
all'1 per mille (m/m). Per ciascuna prova dev'essere usato un
quantitativo sufficiente di questa sospensione in modo che venga
consumato in 4 o 5 minuti circa 1 ml della soluzione alcalina. Di
solito sono necessari da 1 a 5 mg della polvere. L'unità di lipasi
viene definita come il quantitativo di enzima che libera 10 µ-
equivalenti di acido per minuto. Pertanto l'attività A della polvere
usata, misurata in unità di lipasi per mg, è indicata dalla formula
seguente:
A¼V/C210
m
dove V è il numero dellasoluzione di idrossido di sodio (5.19)
consumato per minuto, desunto dal grafico; m è la massa, in
mg, dell'aliquota della polvere da analizzare.
Nota 2: Preparazione della lipasi
Sono disponibili in commercio lipasi aventi un'attività lipasica
soddisfacente. Tuttavia è possibile prepararle in laboratorio come
segue: Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 ºC; rimuo-
vere il grasso solido circostante e il tessuto connettivo e triturare
in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Mesco-
lare questa pasta con l'agitatore (4.25) per 4-6 ore con 2,5 l di
acetone anidro e centrifugare. Esterarre il residuo altre tre volte
con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela
1 / 1 (V/V) di acetone e di etere etilico e due volte con etere
etilico. Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da
ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero.
Nota 3: In ogni caso è consigliabile determinare la composizione degli
acidi grassi totali dello stesso campione, dato che il confronto
con quelli degli acidi nella posizione 2 contribuirà all'interpreta-
zione dei dati ottenuti.
Nota 4: La temperatura di idrolisi è fissata a 37 ºC, dato che si usa un
olio liquido. Tuttavia essa viene fissata a 40 ºC per il campione
da analizzare, in modo da consentire l'esame di grassi aventi
punti di fusione superiori a45 ºC.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 35
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ALLEGATO VIII
DETERMINAZIONEDELCONVENUTODITRILINOLEINA
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo di separazione e determinazione quantitativa della
composizione di trigliceridi degli oli vegetali a seconda del loro peso mole-
colare e grado di insaturazione, in funzione del rispettivo numero di
carbonio equivalente (vedi nota 1).
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo si applica a tutti gli oli vegetali contenenti trigliceridi di
acidi grassi a catena lunga. Il metodo si applica soprattutto per individuare
la presenza di piccoli quantitativi di oli semisiccativi (ricchi di acido lino-
leico) in oli vegetali contenenti acido oleico come acido grasso insaturo
predominante, quale l'olio d'oliva.
3. PRINCIPIO
Separazione di trigliceridi, a seconda del loro numero di carbonio equiva-
lente, mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni (polarità di fase
inversa) ed interpretazione dei cromatogrammi.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Cromatografo liquido ad alte prestazioni, che consente un controllo termo-
statico della temperatura della colonna.
4.2. Unità di iniezione da10 µl.
4.3. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilità su tutta la scala non
deve essere inferiore a10−4unità di indice di rifrazione.
4.4. Colonna: tubo in acciaio inossidabile da 250 mm di lunghezza e 4,5 mm di
diametro interno, riempito di particelle di silice aventi un diametro di 5 µm,
con il 22-23 % di carbonio sotto forma di octadecilsilano (nota 2).
4.5. Registratore e/o integratore.
5. REAGENTI
I reagenti devono essere di purezza per analisi. I solventi di eluizione
devono essere degassati e possono essere riciclati parecchie volte senza
ripercussioni sulle separazioni.
5.1. Cloroformio.5.2. Acetone.
5.3. Acetonitrile.
5.4. Solvente di eluizione: Acetonitrile + acetone (proporzioni da modificare in
modo da ottenere la separazione desiderata; cominciare con miscela 50:
50).
5.5. Solvente di solubilizzazione: acetone oppure miscela acetone-cloroformio
1: 1.
5.6. Trigliceridi di riferimento: è possibile usare o trigliceridi commerciali
(tripalmitina, trioleina ecc.) e, in questo caso, i tempi di ritenzione vengono
portati in grafico in conformità con il numero di carbonio equivalente
oppure, alternativamente, è possibile ottenere un cromatogramma di riferi-
mento dall'olio di soia (vedi note 3, 4 e figure 1 e 2).
6. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Una soluzione al 5 % dei campioni da analizzare viene preparata pesando
0,5 ± 0,001 g del campione in un pallone graduato da 10 ml e portando a
10 ml con il solvente di solubilizzazione (5.5).
7. PROCEDIMENTO
7.1. Allestire il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (5.4)
alla velocità di 1,5 ml/mm in modo da pulire l'intero sistema. Aspettare
finché la linea di base rimane stabile.
Iniettare 10 µl del campione preparato come al punto (6).1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 36
▼B
8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Usare il metodo di standardizzazione interno, cioè assumere che la somma
delle aree dei picchi corrispondente ai vari trigliceridi sia eguale al 100 %.
Calcolare la percentuale relativa di ciascun trigliceride usando la seguente
formula:
% di trigliceride =area del picco
sommadelle a ree dei picchi× 100,
esprimendo il risultato con una decimale.
Nota 1: L'ordine di eluzione può essere determinato calcolando i numeri di
carbonio equivalente, spesso definiti dalla relazione ECN = CN −
2n, dove CN è il numero di carbonio ed n è il numero di doppi
legami; esso può essere calcolato più precisamente tenendo conto
dell'origine del legame doppio.
Se no,n1en1nsono i numeri di legami doppi attribuibili rispettiva-
mente all'acido oleico, linoleico e linolenico, il numero di carbonio
equivalente può essere calcolato mediante una relazione del tipo:
ENC = CN − dono−d1n1−d1nn1n
dove i coefficienti do,d1ed1npossono essere calcolati mediante i
trigliceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente
metodo la relazione ottenuta sarà strettamente simile a:
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 n1] − [2,17 n1n]
Nota 2: Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, o similari.
Nota 3: Con parecchi trigliceridi di riferimento è possibile altresì calcolare
la risoluzione rispetto alla trioleina,
α=R T′/R T′di oleinausando il tempo di ritenzione corretto RT ′=
RT − RTsolvente
Il grafico del log αin funzione di f (numero di doppi legami)
consente di determinare i valori di ritenzione di tutti i trigliceridi
di acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento — vedi
figura2.
Nota 4: L'efficienzadellacolonnadeve permettere lanettasepa ra zione del
picco della LLL (trilinoleina) da quelli dei trigliceridi con Tr adia-cente.
Nota 5: Per gli oli vergini lampanti e per gli oli di sansa d'oliva greggi, al
fine di ottenere una buona separazione del picco della trilinoleina
da quelli adiacenti o di eventuali sostanze interferenti, è necessario
purificare preventivamente gli oli conformemente alla metodologia
seguente:
si fanno assorbire 200 ml di olio, senza diluirli, su una colonnina
di silice per estrazione liquido-solido (tipo SEP PAK silica
cartridge-waters part. n. 51900).
I trigliceridi vengono eluiti con 20 ml di esano anidro per HPLC in
un tempo massimo di 20 sec.
Il prodotto eluito viene essiccato in corrente d'azoto e ripreso in
isopropanolo o acetone (5 ml). Si iniettano 10-20 ml in HPLC. È
necessario controllare che la composizione di acidi grassi dell'olio
sialastessaprimae dopo lapurifica zione nei limiti di errore del
metodo analitico adottato.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 37
▼M11
▼B
Figura 1
Cromatogramma di un campione di olio di soia
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 38
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Figura 2
Grafico del log αin funzione di f (numero di doppi legami)
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ALLEGATO IX
ANALISISPETTROFOTOMETRICANELL'ULTRAVIOLETTO
PREMESSA
L'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto può fornire indicazioni sulla
qualità di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modi-
ficazioni indotte da processi tecnologici.
Gli assorbimenti alle lunghezze d'onda previste nel metodo sono dovuti alla
presenza di sistemi dienici e trienici coniugati. I valori di tali assorbimenti
sono espressi come estinzione specificaE 1 % 1 cm (estinzione di una
soluzione della sostanza grassa all'1 % nel solvente prescritto, in spessore
di 1 cm) convenzionalmente indicata con K, (detto anche coefficiente di
estinzione).
1. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per l'esecuzione dell'esame spettrofoto-
metrico nell'ultravioletto delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene disciolta nel solvente richiesto, quindi si
determinal'estinzione dellasoluzione a lle lunghezze d'ondaprescritte, in
riferimento al solvente puro. Dalle letture spettrofotometriche si calcolano
le estinzioni specifiche.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Spettrofotometro per misure di estinzione nell'ultravioletto fra 220 e
360 nm, con possibilità di lettura per ogni unità nanometrica.
3.2. Vaschette di quarzo prismatiche, con coperchio, di percorso ottico da 1 cm.
Le vaschette, riempite di acqua o altro solvente idoneo, non devono presen-
tare fra di loro differenze superiori a 0,01 unità di estinzione.
3.3. Matracci tarati da 25 ml.
3.4. Colonna per cromatografia con una parte superiore avente lunghezza di 270
mm e diametro di 35 mm e una parte inferiore avente lunghezza di 270
mm e diametro di 10 mm.
4. REAGENTI
4.1. Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) spettrofotometricamente puro: deve avere,
in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 60 % a
220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm;
oppure
— Cicloesano spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento
all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 40 % a 220 nm e non
inferiore al 95 % a 250 nm.
4.2. Allumina basica per cromatografia su colonna, preparata e controllata come
descritto in Appendice I.
4.3. n-Esano, per cromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Il campione in esame deve essere perfettamente omogeneo ed esente da
impurezze sospese. Gli oli liquidi a temperatura ambiente si filtrano su
carta alla temperatura di circa 30 ºC, i grassi concreti vengono omogeneiz-
zati e filtrati a temperatura superiore di non oltre 10 ºC alla temperatura di
fusione.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 40
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.2. Del campione così preparato si pesano esattamente circa 0,25 g in
matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si
omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida.
Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente su carta.
5.3. Con la soluzione ottenuta si riempie una vaschetta e si misurano le estin-
zioni, usando come riferimento il solvente impiegato, alle lunghezze
d'ondasignifica tive comprese fra232 e 276 nm.
I valori di estinzione letti devono essere compresi nell'intervallo 0,1 ± 0,8;
in caso contrario è necessario ripetere le misure operando con soluzioni
opportunamente più concentrate o più diluite.
5.4. Qualora sia richiesta la determinazione dell'estinzione specifica dopo
passaggio su allumina si procede nel seguente modo: nella colonna croma-
tografica si introducono 30 g di allumina basica in sospensione in esano;
dopo assestamento dell'adsorbente si elimina l'eccesso di esano, sino ad
1 cm circa al disopra del livello superiore dell'allumina.
Si sciolgono 10 g di sostanza grassa, omogeneizzata e filtrata come
descritto in 5.1., in 100 ml di esano e si versa tale soluzione in colonna.
Si raccoglie l'eluato e si evapora totalmente il solvente sotto vuoto ad una
temperatura inferiore ai 25 ºC.
Sulla sostanza grassa così ottenuta si procede immediatamente come detto
in 5.2.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
6.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie
lunghezze d'onda calcolate come segue:
Kλ¼Eλ
c/C1s
in cui:
Kλ= estinzione specificaa llalunghezzad'ondaλ,
Eλ= estinzione misurata alla lunghezza d'onda λ,
c = concentrazione della soluzione in g/100 ml,s = spessore dellava schettain cm.
I risultati si esprimono con due cifre decimali.
6.2. L'esame spettrofotometrico dell'olio di oliva secondo il metodo ufficiale dei
Regolamenti della CEE prevede la determinazione dell'estinzione specifica,
in soluzione in isoottano, alle lunghezze d'onda di 232 e 270 nm e la deter-
minazione del ∆K inteso come:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
in cui Kmè l'estinzione specificaa llalunghezzad'ondam, lunghezzad'onda
di massimo assorbimento intorno a 270 nm.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 41
▼B
APPENDICE I
Preparazione dell'allumina e controllo dell'attività
A1.1. Preparazione dell'allumina
In un recipiente a chiusura ermetica si pone l'allumina preventivamente
essiccata in forno a 380-400 ºC per 3 ore, si aggiunge acqua distillata in
ragione di 5 ml per 100 g di allumina, si chiude subito il recipiente, si
agita ripetutamente, quindi si lascia a riposo per almeno 12 ore prima
dell'uso.
A1.2. Controllo dell'attività dell'allumina
Si prepara una colonna cromatografica con 30 g di allumina. Operando
come descritto al paragrafo 5.4. si fa passare attraverso la colonna una
miscelacostituitada :
— 95 % olio di olivavergine, a vente estinzione specificaa268 nm infe-
riore a0,18;
— 5 % olio di arachide trattato con terre nel processo di raffinazione,
avente estinzione specifica a 268 nm uguale o superiore a 4.
Se la miscela dopo passaggio in colonna presenta estinzione specifica a
268 nm superiore a 0,11 l'allumina è accettabile, altrimenti deve essere
aumentato il tasso di idratazione.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 42
▼B
APPENDICE II
Taratura dello spettrofotometro
A2. L'apparecchio deve essere controllato periodicamente (almeno ogni 6
mesi) siaper larispondenzadellalunghezzad'ondache per l'esa ttezza
dellarisposta .
A2.1. Il controllo della lunghezza d'onda può essere fatto mediante la lampada a
vapori di mercurio o mediante gli appositi filtri.
A2.2. Per il controllo dellarispostadellafotocellulae del fotomoltiplica tore si
procede come segue: si pesano 0,2000 g di potassio cromato puro per
spettrofotometria e si sciolgono, in matraccio tarato da 1 000 ml, in solu-
zione di idrossido di potassio 0,05 N diluendo poi a volume. Della
soluzione ottenuta si prelevano 25 ml esatti, si trasferiscono in matraccio
tarato da 500 ml e si diluisce ulteriormente a volume con la stessa solu-
zione di idrossido di potassio.
Dellasoluzione così ottenutasi misural'estinzione a275 nm, impiega ndo
lasoluzione di idrossido di pota ssio come riferimento. L'estinzione misu-
rata con vaschetta da 1 cm dovrà essere 0,200 ± 0,005.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 43
▼B
ALLEGATO X A
ANALISIGASCROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI
ACIDIGRASSI
1. OGGETTO
Il presente metodo dà un orientamento generale per l'applicazione della
gascromatografia, con l'uso di colonne a riempimento o capillari, per
determinare la composizione qualitativa e quantitativa di una miscela
di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta in conformità con il metodo
specificato nell'allegato X B.
Il metodo non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.
2. REAGENTI
2.1. Gas vettore
Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.) completamente essiccato
ed avente un tenore di ossigeno inferiore a 10 mg/kg.
Nota 1: L'idrogeno, che viene usato come gas vettore soltanto con
colonne capillari, può raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è
pericoloso; sono disponibili dispositivi di sicurezza.
2.2.Gasausiliari
2.2.1. Idrogeno (purezza ≥99,9 %), esente daimpurezze orga niche.
2.2.2. Ariaod ossigeno, esente daimpurezze orga niche.
2.3.Standarddiriferimento
Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un
grasso a composizione nota, di preferenza analogo a quello della
sostanza grassa da analizzare.
Sarà necessario l'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi.
3. APPARECCHIATURA
Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchia-
tura per gascromatografia, facendo uso di colonne a riempimento e/o
capillari nonché di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. È consiglia-
bile usare apparecchiatura in grado di garantire l'efficienza e la
risoluzione specificate al punto 4.1.2.
3.1.Gascromatografo
Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.
3.1.1. Sistemaa d iniezione
Usare un sistema ad iniezione:
a) con colonne a riempimento, aventi lo spazio morto minore possibile
(in questo caso il sistema di iniezione deve poter essere riscaldato a
una temperatura di 20-50 ºC superiore a quella della colonna)
oppure
b) con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve
essere appositamente progettato. Esso può essere del tipo a separa-
zione oppure del tipo non a separazione sull'iniettore della colonna.
Nota 2: In assenza di acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio,
può essere usato un iniettore ad ago mobile.
3.1.2. Stufa
La stufa deve essere atta a scaldare la colonna ad almeno 260 ºC e a
mantenere la temperatura desiderata con l'approssimazione di 1 ºC per
la colonna a riempimento e con l'approssimazione di 0,1 ºC per la
colonna capillare.
Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una
provettadi silice fusa .
Il ricorso al riscaldamento programmato è raccomandato in tutti i casi e
in particolare per gli acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 44
▼B
3.1.3. Col onnae riempimento
3.1.3.1. Colonna costruita in materiale inerte alle sostanze da analizzare (cioè
vetro o acciaio inossidabile) e avente le seguenti dimensioni:
a) lunghezza: 1-3 m. Se sono presenti acidi grassi a catena lunga (oltre
C20) dovrà essere usata una colonna relativamente corta. Se invece si
analizzano acidi a 4-6 atomi di carbonio, si raccomanda di usare una
colonnaa vente unalugnhezzadi 2 m.
b) diametro interno: da 2 a 4 mm.
Nota 3: Se sono presenti componenti poliinsaturi aventi più di tre
legami doppi, essi potranno essere decomposti in una colonna
di acciaio inossidabile.
Nota 4: Può essere usato un sistema di colonne a riempimento gemelle.
3.1.3.2. Riempimento, comprendente i seguenti elementi:
a)supporto: terra di diatomee lavata con acido e silanizzata, oppure
altro idoneo supporto inerte con una gamma ristretta di granulome-
tria (compresa tra 125 e 200 µm, con variazioni di ± 25 µm); la
granulometria media è correlata al diametro interno e alla lunghezza
dellacolonna ;
b)fase stazionaria: tipo di poliestere di liquido polare (ad es. polisuc-
cinato di dietilenglicole, polisuccinato di butandiolo, poliadipato di
etilenglicole ecc.), cianosiliconi o qualsiasi altro liquido che
consenta la separazione cromatografica richiesta (vedi clausola 5).
La fase stazionaria deve essere compresa tra il 5 % (m/m) e il 20 %
(m/m) del riempimento. Per alcune separazioni può essere usata una
fase stazionaria non polare.
3.1.3.3. Condizionamento della colonna
Con la colonna staccata, dalla parte del rivelatore, scaldare gradual-
mente la stufa a 185 ºC e far passare una corrente di gas inerte
attraverso la colonna di recente preparata ad un flusso compreso tra
20 ml/min e 60 ml/min per almeno 16 h a questa temperatura e per
ulteriori 2 h a195 ºC.
3.1.4. Col onnaca pilla re
3.1.4.1. Tubo costituito di materiale inerte alle sostanze da analizzare (di solito
vetro o silice fusa). Il diametro interno deve essere compreso tra 0,2 mm
e 0,8 mm. Lasuperficie internadeve esser sottopostaaun opportuno
trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima
di essere ricoperto con la fase stazionaria. Nella maggior parte dei casi
è sufficiente unalunghezzadi 25 mm.
3.1.4.2. Fase stazionaria, di solito del tipo poliglicole [poli(etilenglicole)
20 000], poliestere (polisuccinato di butandiolo) oppure polisilossano
polare (cianosiliconi). Sono adatte le colonne legate (cross-linked).
Nota 5: Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'i-
dentificazione e separazione dell'acido linolenico e degli acidi
aC20.
Le coperture devono essere sottili, ad esempio 0,1 µm-0,2 µm.
3.1.4.3. Montaggio e condizionamento della colonna
Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle
colonne capillari, ovvero sistemazione della colonna nella stufa
(supporto), scelta e collegamento di giunti (a tenuta stagna), sistema-
zione delle estremità dellacolonnanell'iniettore e nel rivela tore
(riduzione degli spazi morti). Sottoporre la colonna ad un flusso di gas
vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna avente una lunghezza
di 25 mm e un diametro interno di 0,3 mm].
Condizionare la colonna programmando la temperatura della stufa a
3 ºC/min dalla temperatura ambiente a una temperatura di 10 ºC infe-
riore al limite di decomposizione della fase stazionaria. Mantenere la
stufa a questa temperatura per 1 h fino a stabilizzazione della linea di
base. Riportarla a 180 ºC in modo da lavorare in condizioni di isoter-
micità.
Nota 6: Sono disponibili in commercio opportune colonne precondizio-
nate.
3.1.5. Rivelatore, di preferenza idoneo ad essere riscaldato a una temperatura
superiore aquelladellacolonna .1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 45
▼B
3.2.Siringa
La siringa deve avere una capacità massima di 10 µl ed essere graduata
in divisioni di 0,1 µl.
3.3.Registratore
Se la curva di registrazione deve essere usata per calcolare la composi-
zione della miscela analizzata, è necessario un registratore elettronico di
alta precisione compatibile con l'apparecchiatura usata. Detto registra-
tore deve avere le seguenti caratteristiche:
a) tasso di risposta, al di sotto di 1,5 s, di preferenza 1 s (il tasso di
risposta è il periodo necessario affinché la punta di registrazione
passi dallo 0 % al 90 % a seguito dell'introduzione improvvisa di
un segnale del 100 %);
b) ampiezza della carta, minimo 20 cm;
c) velocità della carta, adattabile a valori compresi tra 0,4 cm/min e
2,5 cm/min.
3.4.Integratoreocalcolatore (facoltativo)
Un calcolo rapido ed accurato può essere effettuato con l'ausilio di un
integratore o calcolatore elettronico. Quest'ultimo deve dare una
risposta lineare con una sensibilità adeguata e la correzione della devia-
zione dellalineadi ba se deve essere soddisfa cente.
4. PROCEDIMENTO
Nelle operazioni descritte dal paragrafo 4.1 al paragrafo 4.3 si fa
accenno all'uso di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.
Come alternativa può essere usato un gascromatografo munito di cata-
rometro (che funziona in base al principio della variazione di
conducibilità termica). Le condizioni di funzionamento vengono
pertanto modificate come descritto nella clausola 6.
4.1. Condizioni dell'analisi4.1.1. Selezione delle condizioni operative ottimali4.1.1.1. Colonnaariempimento
Nella scelta delle condizioni per effettuare la prova, devono essere
prese in considerazione le seguenti varianti:
a) la lunghezza ed il diametro della colonna;
b) la natura e la quantità della fase stazionaria;
c) la temperatura della colonna;
d) il flusso di gas vettore;
e) la risoluzione necessaria;
f) le dimensioni del campione da analizzare, scelto in modo che il
collegamento tra il rivelatore e l'elettrometro diano una risposta
lineare;
g) la durata dell'analisi.
In linea di massima i valori riportati nella tabella 1 e nella tabella 2
danno i risultati auspicati, cioè almeno 2 000 piatti teorici per metro di
lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato di metile, e
l'eluizione dello stesso entro 15 minuti circa.
Se l'apparecchiatura lo consente, l'iniettore deve trovarsi a una tempera-
tura di circa 200 ºC ed il rivelatore a una temperatura pari o superiore a
quelladellacolonna .
Di norma, il rapporto tra il flusso dell'idrogeno fornito al rilevatore a
ionizzatore di fiamma e quello del gas vettore varia tra 1:2 e 1:1 in
funzione del diametro della colonna. Il flusso dell'ossigeno è di circa
5-10 volte quello dell'idrogeno.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 46
▼B
Tabella 1
Diametro interno della colonna
mmFlusso del gas vettore
ml/min
2 da15 a25
3 da20 a40
4 da40 a60
Tabella 2
Concentrazione della fase stazionaria
% (m/m)Temperatura della colonna
ºC
5 175
10 180
15 18520 185
4.1.1.2. Colonna capillare
Le caratteristiche di efficienza e di permeabilità delle colonne capillari
indicano che la separazione tra i costituenti e la durata dell'analisi sono
ampiamente dipendenti dal flusso del gas vettore nella colonna. È
pertanto necessario ottimizzare le condizioni operative influenzando
questo parametro (o più semplicemente la pressione di testa della
colonna), a seconda che si desideri migliorare le separazioni o effet-
tuare un'analisi rapida.
4.1.2. Determinazione del numero di piatti teorici (efficacia) e risoluzione
(vedi figura1)
Effettuare l'analisi di una miscela di stearato di metile e di oleato di
metile in proporzioni più o meno equivalenti (ad es. esteri metilici del
burro di cacao).
Scegliere la temperatura della colonna e il flusso di gas vettore in modo
che il massimo del picco dello stearato di metile venga registrato circa
15 minuti dopo il picco del solvente. Usare un quantitativo sufficiente
della miscela di esteri metilici in modo che il picco dello stearato di
metile occupi circa tre quarti della scala intera.
Calcolare il numero dei piatti teorici, n (efficienza), con la formula:
n¼16drIðÞ
WIðÞ/C20/C21
2
e larisoluzione R usa ndo laformula :
R¼2∆
WIðÞþWIIðÞ
dove:
dr (I)= è la distanza di ritenzione, in millimetri, dall'inizio del
cromatogramma fino al massimo del picco dello stea-
rato di metile;
W(I)eW(II)= sono le ampiezze, in millimetri, del picchi rispettiva-
mente dello stearato di metile e dell'oleato di metile,
misurati tra i punti d'intersezione delle tangenti ai
punti di inflessione dellacurvacon lalineadi ba se;
∆ = è la distanza, in millimetri, tra i picchi massimi dello
stearato di metile e dell'oleato di metile;
e l'indice di risoluzione lr usando la formula:
a
b1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 47
▼M2
▼M2
dove:
a = l'altezza del picco più basso, misurata rispetto alla linea di base;
b = l'altezza del punto più basso dell'avvallamento compreso tra i due
picchi adiacenti, misurata rispetto alla linea di base.
Figura1
Cromatogramma per la determinazione del numero di piatti teorici (efficienza) e
risoluzione
Le condizioni operative da scegliere sono quelle idonee ad almeno2 000 piatti teorici per metro di lunghezza della colonna per quanto si
riferisce allo stearato di metile e una risoluzione di almeno 1,25.
4.2.Sostanzadaanalizzare
Usando la siringa (3.2) prendere 0,1 µl-2 µl della soluzione di esteri
metilici preparata conformemente all'allegato X B e iniettarli nella
colonna.
Nel caso di esteri non in soluzione, preparare una soluzione di circa
100 mg/ml in eptano di qualità cromatografica ed iniettare da 0,1 µl a
1 µl di questasoluzione.
Se l'analisi riguarda costituenti presenti soltanto in tracce, la quantità di
sostanza da analizzare può essere aumentata (fino a 10 volte).
4.3.Analisi
Di norma le condizioni operative sono quelle di cui al paragrafo 4.1.1.
È possibile tuttavia operare a una temperatura inferiore della colonna
quando si tratta di determinare acidi grassi aventi meno di 12 atomi di
carbonio oppure a una temperatura più elevata quando si tratta di deter-
minare acidi grassi con oltre 20 atomi di carbonio. All'occasione, è
possibile programmare la temperatura in entrambi questi casi. Ad
esempio, se il campione contiene gli esteri metilici degli acidi grassi
con meno di 12 atomi di carbonio, iniettare il campione a 100 ºC
(oppure da 50 ºC a 60 ºC se è presente acido butirrico) e raggiungere
immediatamente la temperatura a un tasso compreso tra 4 ºC/min e1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 48
▼B
▼B
8 ºC/min in condizioni ottimali. In taluni casi possono essere associati i
due procedimenti.
Dopo il riscaldamento programmato, continuare l'eluizione a tempera-
tura costante finché tutti i componenti sono stati eluiti. Se lo
strumento non prevede il riscaldamento programmato, usarlo a due
temperature fisse comprese tra 100 ºC e 195 ºC.
Se necessario, si raccomanda di effettuare un'analisi su due fasi fisse a
polarità differente per verificare l'assenza di picchi mascherati, ad
esempio nel caso della presenza contemporanea di C18:3eC20:0oppure
C18:3eC18:2associati.
4.4. Preparazione del cromatogramma di riferimento e dei grafici di riferi-
mento
Analizzare la miscela standard di riferimento (2.3) nelle stesse condi-
zioni operative di quelle usate per il campione e misurare i tempi di
ritenzione o le distanze di ritenzione per gli acidi grassi costituenti. Su
carta semilogaritmica, per qualsiasi grado di insaturazione, costruire i
grafici che mostrano il logaritmo del tempo o della distanza di riten-
zione in funzione del numero di atomi di carbonio. In condizioni
isotermiche, i grafici relativi ad acidi a catena lineare aventi lo stesso
grado di insaturazione devono essere linee rette. Queste linee devono
essere all'incirca parallele.
È necessario evitare condizioni in cui si possano verificare i «picchi
mascherati», ovvero nei quali la risoluzione è insufficiente a separare
due costituenti.
5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI5.1.Analisiqualitativa
Identificare i picchi dell'estere metilico del campione dai grafici prepa-
rati al paragrafo 4.4, se necessario per interpolazione.
5.2.Analisiquantitativa
5.2.1. Determinazione della composizione
A parte casi eccezionali, usare il metodo di normalizzazione interno,
cioè presumere che la totalità dei componenti del campione siano
rappresentati sul cromatogramma, in modo che il totale delle aree sotto
i picchi costituiscail 100 % dei costituenti (eluizione tota le).
Se nell'apparecchiatura è previsto un integratore, usare i dati da esso
ottenuti. In caso negativo, determinare l'area sotto ciascun picco molti-
plicando l'altezza del picco per l'ampiezza a metà altezza e, se
necessario, prendere in considerazione le varie attenuazioni usate
durante la registrazione.
5.2.2. Metodo di calcolo
5.2.2.1. Caso generale
Calcolare il contenuto di un dato componente I, espresso come percen-
tuale in massa degli esteri metilici, determinando la percentuale
rappresentata dall'area del picco corrispondente relativa alla somma
delle aree di tutti i picchi, usando la formula seguente:
Ai
ΣA/C2100
dove
Ai= è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
ΣA = è lasommadelle a ree sotto tutti i picchi.
Esprimere il risultato con l'approssimazione di una decimale.
Nota 7: In questo caso generale, si ritiene che il risultato del calcolo
basato sulle aree relative rappresenti una percentuale in massa.
Per i casi nei quali questa asserzione non è giustificata, vedi
5.2.2.2.
5.2.2.2. Uso dei fattori di correzione
In taluni casi, ad esempio in presenza di acidi grassi aventi meno di 8
atomi di carbonio oppure di acidi aventi gruppi secondari, quando si
usano rivelatori di conduttività termica oppure quando è necessario il1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 49
▼B
grado più elevato di accuratezza, devono essere usati fattori di corre-
zione che convertano le percentuali delle aree e dei picchi in
percentuali in peso dei componenti.
Determinare i fattori di correzione con l'ausilio di un cromatogramma
derivato dall'analisi di una miscela di riferimento di esteri metilici di
composizione nota, effettuata in condizioni operative identiche a quelle
usate per il campione.
Per questamisceladi riferimento, lapercentua le in peso del compo-
nente i è data dalla formula:
mi
Σm/C2100
dove
mi= è il peso del componente i nellamisceladi riferimento;
Σm = è il totale delle masse dei vari componenti della miscela di
riferimento.
Dal cromatogramma della miscela di riferimento (4.4) calcolare la
percentuale (area/area) del componente i come segue:
Ai
ΣA/C2100
dove
Aiè l'area sotto il picco corrispondente al componente i,
ΣA è lasommadelle a ree sotto tutti i picchi.
Il fattore di correzione viene quindi calcolato come segue:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Di norma i fattori di correzione vengono espressi facendo riferimento a
KC16sicché i fattori relativi diventano:
K0
i¼Ki
KC16
Per il campione il contenuto di ciascun componente espresso come
percentuale in degli esteri metilici è:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.
5.2.2.3. Uso di uno standard interno
In alcune analisi (ad es. quando non tutti gli acidi grassi sono quantifi-
cati, ad esempio quando sono presenti acidi con 4 e 6 atomi di carbonio
accanto ad acidi con 16 e 18 atomi di carbonio, oppure quando è neces-
sario determinare il quantitativo assoluto di un acido grasso in un
campione) è necessario ricorrere ad uno standard interno. Vengono
spesso usati acidi grassi con 5,15 o 17 atomi di carbonio. Deve essere
determinato l'eventuale fattore di correzione per lo standard interno.
Lapercentua le in peso del componente i, espressacome esteri metilici,
è data dalla formula:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
dove
Aiè l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
Asè l'area sotto il picco corrispondente allo standard interno;
K′iè il fattore di correzione per il componente i (relativo a KC16);
K′sè il fattore di correzione dello standard interno (relativo a KC16);
m è il peso, in milligrammi, della sostanza da analizzare;
msè il peso, in milligrammi, dello standard interno.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 50
▼B
Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.
6. CASO PARTICOLARE DELLA DETERMINAZIONE DEGLI
ISOMERI TRANS
Il contenuto degli isomeri trans degli acidi grassi, con il numero di
atomi di carbonio compreso tra 10 e 24, può essere determinato
mediante separazione degli esteri metilici, usando colonne cromatogra-
fiche capillari che presentino una particolare polarità.
6.1. Colonna capillare in silice, avente un diametro interno da 0,25 mm a
0,32 mm e unalunghezzadi 50 mm, ricopertadi cia nopropilsilicone,
lacui pellicolahauno spessore compreso tra0,1 e 0,3 µm (tipo SP
2340, tipo SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 e tipi simili).
6.2. Gli esteri metilici vengono separati con il procedimento B presentato
nell'altro allegato (X/B). Le sostanze grasse con acidità libera superiore
al 3 % devono essere prima neutralizzate conformemente al punto 6.1
dell'allegato VII.
6.3. Le condizioni operative per la cromatografia in fase gassosa sono
complessivamente le seguenti:
— temperatura della colonna programmata da 150 ºC a 230 ºC (ad
esempio 165 ºC per 15 minuti, aumentata poi di 5 ºC/minuto sino
a200 ºC);
— temperatura dell'iniettore: 250 ºC, con il sistema dell'iniettare divi-
sore, oppure temperatura iniziale della colonna, con il sistema «on
column»;
— temperatura del rivelatore: 260 ºC;— flusso del gas vettore (elio e idrogeno): 1,2 ml/minuto.
La quantità iniettata deve essere tale che nelle condizioni di sensibilità
utilizzate l'altezza del picco corrispondente all'estere metilico dell'acido
arachico sia pari o superiore al 20 % della parte inferiore della scala.
6.4. I diversi esteri metilici vengono identificati in base ai tempi di riten-
zione che vengono confrontati con quelli di miscele di riferimento
(come indicato al punto 2.3).
Gli esteri degli acidi grassi trans vengono eluiti prima degli isomeri
corrispondenti cis. Un esempio di cromatogramma è riportato nella
figura2.
Fig.2
Gascromatogramma tipo relativo alla determinazione degli isomeri trans degli
acidi con colonna capillare
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 51
▼M2
▼M2
6.5. L'efficienza della colonna determinata conformemente al punto 4.1.2
deve consentire la separazione di talune coppie critiche, ad esempio la
coppia formata dall'insieme degli acidi transisooleici e il picco dell'a-
cido oleico, trans C18: 1/cis C18: 1, con un indice di risoluzione
superiore a2.
6.6. La percentuale dei diversi acidi grassi trans è calcolata in base al
rapporto tra la superficie del picco attinente e la somma delle superfici
di tutti i picchi presenti.
Si considerano le percentuali degli acidi:
— trans ottadecenoici (T 18: 1), indicati nell'allegato I del presente
regolamento come somma degli isomeri transoleici;
— cis-trans e trans-cis ottadecadienoici [(CT/TC) 8: 2]: indicati nell'al-
legato I del presente regolamento come somma degli isomeri
translinoleici;
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, ottadecatrie-
noici [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3], indicati nell'allegato I
del presente regolamento come somma degli isomeri translinolenici.
Nota 8: viste le caratteristiche particolari di questo metodo, dare i risul-
tati con due decimali.
►M27.◄CASO SPECIALE — USO DI UN CATAROMETRO (FUNZIO-
NANTE IN BASE AL PRINCIPIO DEI MUTAMENTI DI
CONDUTTIVITÀ TERMICA)
Per la determinazione della composizione qualitativa e quantitativa di
una miscela di esteri metilici degli acidi grassi può essere usato altresì
un gascromatografo associato a un rivelatore funzionante in base al
principio dei mutamenti di conduttività termica (catarometro). Se
quest'ultimo viene usato, le condizioni specificate alle clausole 3 e 4
devono essere modificate come indicato nella tabella 3.
Per l'analisi quantitativa, usare i fattori di correzione definiti al para-
grafo 5.2.2.2.
Tabella 3
Variabile Valore/condizioni
ColonnaLunghezza : da 2 m a 4 m
Diametro interno: 4 mm
Supporto Granulometria compresa tra
160 µm e 200 µm
Concentrazione della fase stazio-
nariaDal 15 % (m/m) al 25 % (m/m)
Gas vettore Elio oppure, in mancanza di
quest'ultimo, idrogeno, col tenore
più basso possibile di ossigeno
Gas ausiliari Nessuno
Temperatura dell'iniettore Da 40 ºC a 60 ºC al di sopra di
quelladellacolonna
Temperatura della colonna Da 180 ºC a 200 ºC
Flusso del gas vettore Di norma tra 60 ed 80 ml/min
Entità del campione di sostanza
iniettatoDi normatra0,5 µl e 2 µl
►M28.◄RELAZIONE SULLA PROVA
La relazione sulla prova deve specificare i metodi usati per la prepara-
zione degli esteri metilici e per l'analisi gascromatografica nonché i
risultati tenuti. Essa deve citare altresì tutti i dettagli operativi non
specificati nella presente norma internazionale oppure considerati come
facoltativi, nonché i particolari di qualsiasi evento che possa avere
influenzato i risultati.
La relazione sulla prova deve comprendere tutti i dati necessari per la
completa identificazione del campione.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 52
▼B
▼M19
ALLEGATO X.B
PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI DA
OLIODIOLIVAEDISANSADIOLIVA
Per la preparazione degli esteri metilici di acidi grassi da oli di oliva e di sansa
di oliva si raccomandano i due metodi che seguono:
Metodo A: Transesterificazione a freddo con soluzione metanolica di idrossido
di potassio
Metodo B: Metilazione a caldo con metilato di sodio in metanolo seguita da
esterificazione in ambiente acido
La scelta del metodo avverrà in funzione del parametro analitico da determinare
e dellaca tegoriadell'olio, secondo lo schemache segue:
a) determinazione di ECN42 (differenza tra il valore teorico e sperimentale dei
trigliceridi ECN42):
— il metodo A si applica a campioni di oli di tutte le categorie dopo purifi-
cazione dell'olio mediante passaggio su una colonna di gel di silice;
b) determinazione della composizione in acidi grassi:
— il metodo A si applicherà direttamente ai campioni di olio delle seguenti
categorie:
— oli di olivavergini di a cidità inferiore a3,3 %,
— olio di oliva raffinato,
— olio di oliva(misceladi oli di olivavergini e olio di olivara ffina to),
— olio di sansa di oliva raffinato,— olio di sa nsadi oliva(misceladi oli di olivavergini e olio di sa nsadi
oliva raffinato),
— il metodo B si applica direttamente a campioni delle categorie di olio
indicate di seguito:
— olio di oliva vergine di acidità superiore al 3,3 %,
— olio di sansa di oliva grezzo;
c) determinazione degli isomeri trans degli acidi grassi:
— il metodo A si applicherà direttamente ai campioni di olio delle seguenti
categorie:
— oli di olivavergini di a cidità inferiore a3,3 %,
— olio di oliva raffinato,
— olio di oliva(misceladi oli di olivavergini e olio di olivara ffina to),
— olio di sansa di oliva raffinato,— olio di sa nsadi oliva(misceladi oli di olivavergini e olio di sa nsadi
oliva raffinato),
— il metodo A si applicherà agli oli delle seguenti categorie dopo purifica-
zione mediante passaggio su una colonna di gel di silice:
— olio di oliva vergine di acidità superiore al 3,3 %,
— olio di sansa di oliva grezzo.
PURIFICAZIONE DEI CAMPIONI DI OLIO
Se necessario, i campioni verranno purificati facendo passare l'olio su una
colonna di gel di silice, utilizzando come solvente di eluizione esano-ossido di
diethyle (87:13, v/v) secondo quanto descritto dal metodo IUPAC 2.507.
Come procedimento alternativo si può ricorrere all'estrazione in fase solida
utilizzando cartucce di gel di silice. Una cartuccia di gel di silice (1 g, 6 ml) sisistema in un apparecchio per l'eluizione sotto vuoto e si lava con 6 ml di esano.
Si interrompe il vuoto per evitare l'essiccamento della colonna. Si deposita nella
colonna una soluzione di olio (0,12 g circa) in 0,5 ml di esano e si opera il
collegamento con la pompa a vuoto. La soluzione si introduce così nella silice
e si eluisce con 10 ml di esano/ossido di diethyle (87:13 v/v) sotto vuoto. Si
omogeneizzano gli eluati totali e si dividono in due volumi simili. Si evapora
un'aliquota fino ad essiccamento in un evaporatore rotante, operando sotto pres-
sione ridotta, a temperatura ambiente. Si dissolve il residuo in 1 ml di eptano,
ottenendo una soluzione pronta per l'analisi degli acidi grassi mediante GC. Si
evapora la seconda aliquota e si dissolve il residuo in 1 ml di acetone, per l'ana-
lisi dei trigliceridi mediante HPLC.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 53
▼M19
METODI PER LA PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI
GRASSI
1. Metodo A: Transesterificazione a freddo con soluzione metanolica di
idrossido di potassio
1.1.Osservazionigenerali
Questo metodo rapido è applicabile agli oli di oliva e di sansa il cui
contenuto in acidi grassi liberi non sia superiore a 3,3 %. Gli acidi
grassi liberi non vengono esterificati dall'idrossido di potassio. Gli esteri
etilici degli acidi grassi vengono transesterificati più lentamente degli
esteri gliceridici, e possono essere metilati solo parzialmente.
1.2.Principio delmetodo
Gli esteri metilici si formano per transesterificazione con una soluzione
metanolica di idrossido di potassio come fase intermedia prima della
saponificazione (punto 5 di ISO-5509:2000, punto 5 del metodo IUPAC
2.301).
1.3.Reagenti
Metanolo dal contenuto in acqua non superiore allo 0,5 % (m/m).Eptano, puro per cromatografia.Idrossido di potassio, soluzione metanolica circa 2 N: sciogliere 11,2 g
di idrossido di potassio in 100 ml di metanolo.
1.4.Apparecchiatura
Provette con tappo a vite (volume 5 ml ) munito di giunto PTFE.Pipette tarate o automatiche da 2 ml e 0,2 ml.
1.5.Procedimento
Si pesano circa 0,1 g del campione di olio in una provetta da 5 ml con
tappo a vite. Si aggiungono 2 ml di eptano e si mescola. Si aggiungono
0,2 ml di soluzione metanolica di idrossido di potassio N2, si chiude
con il tappo munito di giunto PTFE, si stringe bene il tappo e si agita
energicamente per 30 secondi. Si lascia stratificare finché la soluzione
superiore diventa trasparente. Decantare lo strato superiore che contiene
gli esteri di metile. La soluzione di eptano ottenuta è adatta ad essere
iniettata nel gascromatografo. Si consiglia di conservare la soluzione
in frigorifero fino al momento dell'analisi gascromatografica. Non si
consiglia di conservare la soluzione per un periodo superiore alle 12
ore.
2. Metodo B: Metilazione a caldo con metilato di sodio in metanolo
seguita da esterificazione in ambiente acido
2.1.Osservazionigenerali
Questo metodo è applicabile a oli di oliva e oli di sansa di oliva il cui
contenuto in acidi grassi liberi è superiore a 3,3 %.
2.2.Principio delmetodo
Neutralizzazione degli acidi grassi liberi e metanolisi alcalina dei glice-
ridi, seguita da esterificazione degli acidi grassi in ambiente acido
(punto 4.2 del metodo IUPAC 2.301).
2.3.Reagenti
— Eptano, puro per cromatografia.
— Metanolo dal contenuto in acqua non superiore allo 0,05 % (m/m).— Metilato sodico, soluzione metanolica 0,2 N: sciogliere 5 g di sodio
in 1 000 ml di metanolo (può essere preparata a partire da soluzioni
commerciali).
— Fenolftaleina, 0,2 % soluzione metanolica.
— Acido solforico, 1 N in soluzione metanolica: aggiungere 3 ml di
acido solforico al 96 % a 100 ml di metanolo.
— Soluzione satura di cloruro di sodio in acqua.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 54
▼M19
2.4.Apparecchiatura
— Matraccio volumetrico da 50 ml con collo a smeriglio lungo e
stretto.
— Refrigerante a ricadere. Condensatore ad aria, di 1 m di lunghezza,
con giunto smerigliato idoneo ad essere montato sul matraccio.
— Granuli ebullioscopici.
— Imbuto di vetro.
2.5.Procedimento
Si trasferiscono 0,25 g circa del campione di olio in un matraccio volu-
metrico da 50 ml con il collo smerigliato. Con l'aiuto di un imbuto si
aggiungono 10 ml della soluzione metanolica 0,2 N di metilato sodico
e granuli ebullioscopici. Si applica il refrigerante a ricadere, si agita e si
porta a ebollizione. La soluzione dovrebbe diventare trasparente in circa
10 minuti. La reazione è completa in 15 minuti. Si toglie il matraccio
dalla fonte di calore, si attende che cessi il riflusso, si stacca il refrige-
rante e si aggiungono due gocce di soluzione di fenolftaleina. Si
aggiungono pochi ml di acido solforico 1 N in soluzione metanolica
finché lasoluzione diventaincolore e si a ggiunge 1 ml in eccesso. Si
applica il refrigerante e si fa bollire nuovamente per 20 minuti. Si
rimuove la fonte di calore e si raffredda il matraccio sotto acqua
corrente. Si stacca il refrigeratore, si aggiungono 20 ml di soluzione
satura di cloruro di sodio e si agita. Si aggiungono 5 ml di eptano, sitappa il matraccio e si agita energicamente per 15 secondi.
Si lascia sedimentare fino alla separazione delle due fasi. Si aggiunge
nuovamente la soluzione satura di cloruro di sodio finché lo strato
acquoso non raggiunge la base del collo del matraccio. Lo strato supe-
riore contenente gli esteri di metile riempie il collo del matraccio.
Questa soluzione è pronta per l'iniezione nel gascromatografo.
Avvertenza: La metilazione con il metodo B deve essere effettuata sottouna cappa.
2.6.AlternativealMetododimetalizaione B
2.6.1.Metodo C
2.6.1.1. Principio del metodo
La sostanza grassa in esame viene trattata con metanolo-acido clori-
drico, in fiala chiusa, a 100 ºC.
2.6.1.2. Apparecchiatura
— Fiala di vetro, a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm,
diametro 14-16 mm).
— Pipette tarate da 1 e 2 ml.
2.6.1.3. Reagenti
Soluzione di acido cloridrico in metanolo al 2 %. Si prepara con acido
cloridrico gassoso e metanolo anidro (nota 1).
Esano per gascromatografia.
Nota 1: Si possono impiegare le soluzioni di cloruro di idrogeno in
metanolo disponibili in commercio. È possibile preparare facil-
mente in laboratorio piccole quantità d'acido cloridrico
gassoso, modificando la soluzione disponibile in commercio
(p = 1,18) aggiungendo qualche goccia d'acido solforico
concentrato. Poiché l'acido cloridrico è rapidamente assorbito
dal metanolo, si raccomanda di prendere le precauzioni abituali
al momento della dissoluzione (ad esempio introducendo il gas
con una piccola fiala rovesciata il cui bordo sfiora la superficie
del liquido). La soluzione metanolica di acido cloridrico può
essere preparata in anticipo in grandi quantità, poiché si
conserva perfettamente in bottiglie con tappo di vetro conser-
vate nell'oscurità. In alternativa, questo reagente può essere
preparato dissolvendo cloruro di acetile in metanolo anidro.
2.6.1.4. Procedimento
— Si introducono nella fiala di vetro 0,2 g di sostanza grassa, preven-
tivamente disidratata su solfato sodico e filtrata, e 2 ml di soluzione
di acido cloridrico-metanolo. Si chiude la fiala alla fiamma.
— Si mantiene la fiala in bagno a 100 ºC per 40 minuti.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 55
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— Si raffredda la fiala sotto acqua corrente, si apre, si aggiungono 2 ml
di acqua distillata e 1 ml di esano.
— Si centrifuga e si preleva la fase esanica che è pronta per l'impiego.
2.6.2.Metodo D
2.6.2.1. Principio del metodo
La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con metanolo-
esano-acido solforico. Gli esteri metilici ottenuti si estraggono con etere
di petrolio.
2.6.2.2. Apparecchiatura
— Provetta da 20 ml circa, munita di refrigerante a ricadere ad aria,
dellalunghezzadi 1 m circa , con giunti asmeriglio.
— Pipetta tarata da 5 ml.
— Imbuto separatore da 50 ml.— Cilindri graduati da 10 e 25 ml.
— Provettada15 ml, afondo conico.
2.6.2.3. Reagenti
— Reagente di metilazione: metanolo anidro, esano, acido solforico
concentrato (p = 1,84) in rapporto 75:25:1 (V/V/V).
— Etere di petrolio 40-60 ºC.
— Sodio solfato anidro.
2.6.2.4. Procedimento
Nella provetta da 20 ml si introduce il materiale recuperato dalla placca
e si aggiungono 5 ml di reagente di metilazione.
Si collega il refrigerante a ricadere e si riscalda per 30 minuti a bagno-
maria bollente (nota 2).
Si trasferisce quantitativamente la miscela in un imbuto separatore da
50 ml, aiutandosi con 10 ml di acqua distillata e 10 ml di etere di
petrolio. Si agita energicamente, si lasciano separare le fasi. Si allon-
tana lo strato acquoso e si lava lo strato etereo per due volte con 20 ml
di acqua distillata. Si aggiunge nell'imbuto separatore una piccola
quantità di solfato sodico anidro, si agita, si lascia a riposo per qualche
minuto e si filtra, raccogliendo il filtrato in una provetta a fondo conico
da15 ml.
Si evapora il solvente su bagnomaria, in corrente di azoto.
Nota 2: Per controllare l'ebollizione introdurre una bacchetta di vetro
nella provetta e limitare la temperatura del bagnomaria a 90 ºC.
3. Parametri di precisione
La valutazione statistica della precisione dei metodi A e B è stata
pubblicata dal consiglio oleicolo internazionale nel suo metodo COI/
T.20/DOC n. 24.
RACCOMANDAZIONI PER L'ANALISI GASCROMATOGRAFICA DEGLI
ESTERI DEGLI ACIDI GRASSI DELL'OLIO DI OLIVA E DELL'OLIO DI
SANSA DI OLIVA
1. Procedimento
L'analisi mediante gascromatografia di soluzioni di esteri grassi in
esano verrà condotta secondo la norma ISO-5508, utilizzando una
colonna capillare (della lunghezza di 50 m e dal diametro interno di
0,25 o 0,32 mm) impregnata di cianopropilsilicone, come indicato per
la determinazione degli acidi grassi trans isomeri (COI/T.20/Doc. n.
17).
La figura 1 riproduce il tipico profilo gascromatografico di un olio di
sansa che contiene esteri metilici ed etilici degli acidi grassi, e isomeri
trans degli esteri metilici.
2. Calcoli
2.1. Per calcolare la composizione in acidi grassi e il ∆ECN42 devono
essere presi in considerazione i seguenti acidi grassi:
Miristico (C14:0).1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 56
▼M19
Palmitico (C16:0). Somma delle aree dei picchi che corrispondono agli
esteri metilici ed etilici.
Palmitoleico (C16:1). Somma delle aree dei picchi che corrispondono
agli isomeri ω9eω7dell'estere metilico.
Margarico (C17:0).Margaroleico (C17:1).
Stearico (C18:0).
Oleico (C18:1). Somma delle aree dei picchi che corrispondono agli
isomeri ω9eω7dell'estere metilico, dell'estere etilico e degli isomeri
trans dell'estere metilico.
Linoleico (C18:2). Somma delle aree dei picchi che corrispondono agli
esteri metilici ed etilici e agli isomeri trans dell'estere metilico.
Arachico (C20:0).Linolenico (C18:3). Sommadelle a ree dell'estere metilico e degli
isomeri trans dell'estere metilico.
Eicosanoico (C20:1).Beenico (C22:0).
Lignocerico (C24:0).
Lo squalene non viene preso in considerazione per il calcolo del totale
dell'area.
2.2. Per calcolare la percentuale di trans-C18:1 verrà utilizzato il picco che
corrisponde agli esteri metilici di questo acido grasso. Per la somma
[trans-C18:2 + trans-C18:3], verranno sommati tutti i picchi corrispon-
denti agli isomeri trans di questi due acidi grassi. Per calcolare l'area
totale si terrà conto di tutti i picchi menzionati in 2.1 (cfr. COI/T.20/
Doc. n. 17).
Il calcolo della percentuale di ogni acido grasso verrà effettuato in base
alla formula che segue:% X = (Area X x 100)/(area totale)
Figura 1: Profilo gascromatografico di un olio di sansa di oliva, otte-nuto con il metodo della metilazione a freddo. I picchi cromatografici
corrispondono agli esteri metilici, salvo altre indicazioni.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 57
▼B
ALLEGATO XI
DETERMINAZIONE DEL TENORE DI SOLVENTI ALOGENATI
VOLATILINELL'OLIODIOLIVA
1. PRINCIPIO
Analisi mediante cromatografia in fase gassosa secondo la tecnica dello
spazio di testa (head space).
2. APPARECCHIATURA
2.1. Apparecchio di cromatografia in fase gassosa, munito di rivelatore a cattura
di elettroni.
2.2. Apparecchiatura per spazio di testa.2.3. Colonna per cromatografia in fase gassosa, in vetro, di 2 m di lunghezza e
2 mm di diametro, fase stazionaria.
OV101 al 10 % o equivalente, impregnato su una terra di diatomee calci-
nata, lavata con acidi e silanizzata, di granulometria 80-100 Mesh.
2.4. Gas vettore e gas ausiliario; azoto per cromatografia in fase gassosa, idoneo
alla rivelazione per cattura di elettroni.
2.5. Bottiglie in vetro da10 a15 ml, munite di unagua rnizione in teflon e di un
tappo d'alluminio provvisto di un orifizio per prelievo a mezzo siringa.
2.6. Pinze achiusuraermetica .
2.7. Siringaper ga s da0,5 a2 ml.
3. REATTIVI
Solventi alogenati volatili di purezza idonea all'impiego per cromatografia
in fase gassosa.
4. PROCEDIMENTO
4.1. Pesare con precisione 3 g d'olio circa in una bottiglia di vetro (da non riuti-
lizzare) e chiudere la bottiglia ermeticamente. Riporre la bottiglia in un
termostato a 70 ºC per un'ora. Prelevare con precisione con la siringa un
volume da 0,2 a 0,5 ml dallo spazio di testa ed iniettarlo nella colonna
del cromatografo in fase gassosa regolato come segue:
— temperatura dell'iniettore: 150 ºC
— temperatura della colonna: 70-80 ºC— temperatura del rivelatore: 200-250 ºC
Si possono usare temperature diverse purché i risultati siano equivalenti.
4.2. Soluzioni di riferimento: preparare soluzioni standard, usando olio d'oliva,
raffinato senza traccia di solventi, a concentrazioni variabili tra 0,05 e 1 mg/
kg ed in relazione con il tenore presunto del campione. L'eventuale dilui-
zione deve essere fatta con pentano.
4.3. Valutazione quantitativa: fare il rapporto tra le superfici o le altezze dei
picchi del campione e della soluzione standard corrispondente alla concen-
trazione presunta più vicina. Se lo scarto relativo supera il 10 % occorre
ripetere l'analisi comparato con una nuova soluzione standard, fino a che
la sua concentrazione rientri nel suddetto scarto relativo. Il tenore è deter-
minato in base ad una media di iniezioni elementari.
4.4. Espressione dei risultati: i risultati sono espressi in mg/kg (ppm). Il limite
di rivelazione del metodo è di 0,01 mg/kg.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 58
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ALLEGATO XII
VALUTAZIONEORGANOLETTICADEGLIOLIDIOLIVAVERGINI
1. FINALITÀ E CAMPO D'APPLICAZIONE
Lo scopo del presente metodo è quello di stabilire i criteri necessari per la
valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli d'oliva vergini ai
sensi del punto 1 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE e di descri-
vere il metodo per la loro classificazione.
Il metodo descritto è applicabile soltanto alla classificazione degli oli
d'oliva vergini in funzione dell'esistenza del flavor fruttato e dell'intensità
dei difetti, determinati da un gruppo di assaggiatori selezionati e addestrati,
costituito in panel, conformemente al punto 4.
2. ASPETTI GENERALI
Per il vocabolario generale di base, la sala di degustazione, la metodologia
generale e il bicchiere di degustazione dell'olio, si raccomanda di confor-
marsi alle prescrizioni del consiglio oleicolo internazionale.
3. VOCABOLARIO SPECIFICO
3.1.Attributipositivi
Fruttato : insieme delle sensazioni olfattive, dipendenti dalla varietà delle
olive, e caratteristiche dell'olio ottenuto da frutti sani e freschi, verdi o
maturi, percepite per via diretta o retronasale.
Amaro: sapore caratteristico dell'olio ottenuto da olive verdi o invaiate.
Piccante : sensazione tattile pungente caratteristica di oli prodotti all'inizio
della campagna, principalmente da olive ancora verdi.
3.2.Attributinegativi
Riscaldo : flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive ammassate che
hanno sofferto un avanzato grado di fermentazione anaerobica.
Muffa-umidità : flavor caratteristico dell'olio ottenuto da frutti nei quali si
sono sviluppati abbondanti funghi e lieviti per essere rimasti ammassati
per molti giorni e in ambienti umidi.
Morchia : flavor caratteristico dell'olio rimasto in contatto con i fanghi di
decantazione in depositi sotterranei e aerei.
Avvinato-inacetito : flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda quella del
vino o dell'aceto. È dovuta fondamentalmente a un processo fermentativo
delle olive che porta alla formazione di acido acetico, acetato di etile ed
etanolo.
Metallico : flavor che ricorda il metallo. È caratteristico dell'olio mantenuto
a lungo in contatto con superfici metalliche durante i procedimenti di maci-
natura, gramolatura, pressione o stoccaggio.
Rancido : flavor degli oli che hanno subito un processo ossidativo.
Cotto o stracotto : flavor caratteristico dell'olio, dovuta ad eccessivo e/o
prolungato riscaldamento durante l'ottenimento, specialmente durante la
termo-impastatura, se avviene in condizioni termiche inadatte.
Fieno-legno : flavor caratteristico di alcuni oli provenienti da olive secche.
Grossolano : sensazione orale/tattile densa e pastosa prodotta da alcuni oli.
Lubrificanti : flavor dell'olio che ricorda il gasolio, il grasso o l'olio mine-
rale.
Acqua di vegetazione : flavor acquisito dall'olio a causa di un contatto
prolungato con le acque di vegetazione.
Salamoia : flavor dell'olio estratto da olive conservate in salamoia.
Sparto: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli
nuovi di sparto. Essa può essere diversa se il fiscolo è fatto con sparto
verde o con sparto secco.
Terra: flavor dell'olio ottenuto da olive raccolte con terra o infangate e non
lavate.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 59
▼M19
Verme: flavor dell'olio ottenuto da olive fortemente colpite da larve di
mosca dell'olivo (Bactrocera oleae).
Cetriolo : flavor che si produce caratteristicamente nell'olio durante un
condizionamento ermetico eccessivamente prolungato, particolarmente in
lattine, che è attribuita alla formazione di 2-6 nonadienale.
4. PANEL DI ASSAGGIATORI
Il panel è nominato dallo Stato membro ed è composto da un capo e da
otto a dodici assaggiatori. Tuttavia, per la campagna 2001/02 il numero di
assaggiatori può essere inferiore a otto.
Il capo del panel deve possedere una solida formazione ed essere un
esperto nei vari tipi di olio. Egli è responsabile del panel, della sua orga-
nizzazione, del funzionamento, della preparazione, della codificazione e
della presentazione dei campioni agli assaggiatori nonché del compendio
dei dati e del loro trattamento statistico.
Il capo panel seleziona gli assaggiatori e provvede al loro addestramento e
al controllo del loro operato in modo da garantire il mantenimento di un
adeguato livello attitudinale.
Gli assaggiatori per le prove organolettiche dell'olio di oliva devono essere
prescelti e addestrati in funzione della loro abilità a distinguere tra
campioni simili, conformemente alla guida del consiglio oleicolo interna-
zionale per la selezione, l'addestramento e il controllo degli assaggiatori
qualificati di olio di oliva vergine.
I panel devono impegnarsi a partecipare alle valutazioni organolettiche
previste a livello nazionale, comunitario o internazionale per il controllo
periodico e l'armonizzazione dei criteri percettivi. Essi devono inoltre
inviare ogni anno allo Stato membro interessato tutte le informazioni in
merito alla loro composizione e al numero di valutazioni realizzate in
quanto panel riconosciuto.
5. PROCEDURA DA SEGUIRE PER LA VALUTAZIONE ORGANOLET-
TICA E LA CLASSIFICAZIONE
5.1.Usodelfogliodiprofilodapartedell'assaggiatore
Il foglio di profilo che deve utilizzare l'assaggiatore figura nell'appendice A
del presente metodo.
Ogni assaggiatore facente parte del panel deve odorare, poi assaggiare(1)
l'olio sottoposto ad esame, contenuto nel bicchiere di assaggio, per analiz-
zarne le percezioni olfattive, gustative, tattili e cinestetiche. Deve poi
appuntare nel foglio di profilo a sua disposizione l'intensità alla quale
percepisce ciascuno degli attributi negativi e positivi.
Nel caso in cui fossero percepiti attributi negativi non enumerati, questi
devono essere indicati alla voce «altri» impiegando il o i termini che li
descrivono con la maggior precisione possibile, tra quelli definiti al punto
3.2 del presente metodo.
5.2.Usodeidatidapartedelcapopanel
Il capo panel deve raccogliere i fogli di profilo riempiti da ciascuno degli
assaggiatori; deve controllare le intensità attribuite; nell'ipotesi di un'ano-
malia constatata chiederà all'assaggiatore di rivedere il suo foglio di
profilo e, se necessario, di ripetere la prova.
Il responsabile del panel deve riprendere i dati di ogni giudice sul
programma informatico allegato al metodo (appendice B) per il calcolo
statistico della mediana. La ripresa dei dati per un campione deve essere
fatta servendosi della matrice composta di dieci colonne corrispondenti ai
dieci attributi sensoriali e n linee corrispondenti agli n giudici impiegati.
Quando un attributo negativo è riportato alla voce «altri» da almeno il 50 %
del panel, il responsabile del panel deve procedere al calcolo della mediana
di questo attributo e alla corrispondente classificazione.
Nel caso di analisi eseguite nel quadro di controlli di conformità alla norma
o di controperizie, il capo panel deve far procedere alla valutazione organo-
lettica dell'olio tre volte, ad almeno una giornata di intervallo; la mediana1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 60
(1) Potrà astenersi dall'assaggiare quando osservi qualche attributo negativo estremamente
intenso e appunterà nel foglio di profilo questa circostanza eccezionale.
▼M19
degli attributi sarà calcolata a partire dall'insieme dei dati dei fogli di
profilo delle tre prove.
5.3.Classificazionedeglioli
L'olio è classificato secondo le denominazioni sotto riportate, in funzione
della mediana dei difetti e della mediana dell'attributo fruttato. Per mediana
dei difetti si intende la mediana dell'attributo negativo percepito con
l'intensità più alta. Il valore del coefficiente di variazione robusto per tale
attributo negativo deve essere inferiore o pari al 20 %.
a)olio extra vergine di oliva : la mediana dei difetti è pari a 0 e la mediana
del fruttato è superiore a 0;
b)olio di oliva vergine : lamedia nadei difetti è superiore a0 e inferiore o
pari a 2,5 e la mediana del fruttato è superiore a 0;
c)olio di oliva vergine corrente : lamedia nadei difetti è superiore a2,5 e
inferiore o pari a 6,0; oppure la mediana dei difetti è inferiore o pari a
2,5 e la mediana del fruttato è pari a 0;
d)olio di oliva vergine lampante : lamedia nadei difetti è superiore a6,0.
Tuttavia, a partire dal 1onovembre 2003 le categorie c) e d) sono sostituite
dalla categoria:
c)olio di oliva lampante : lamedia nadei difetti è superiore a2,5; oppure la
mediana dei difetti è inferiore o pari a 2,5 e la mediana del fruttato è
pari a 0.
5.4.Casoparticolare
Quando la mediana di un attributo positivo diverso dal fruttato è superiore
a 5,0, il capo panel lo deve segnalare nel certificato di analisi dell'olio.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 61
▼M19
APPENDICE A
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 62
▼M19
APPENDICE B
METODODICALCOLODELLAMEDIANAEDEGLIINTERVALLIDI
CONFIDENZA
Mediana
La mediana è quel numero reale Xm caratterizzato dal fatto che la probabilità
(P) che i valori della distribuzione (X) siano minori a questo numero (Xm), è
minore e uguale a 0,5 e che contemporaneamente la probabilità (P) che i valori
della distribuzione (X) siano minori o uguali a Xm, è maggiore o uguale a 0,5.
Una definizione più operativa è quella che definisce la mediana come il 50 º
percentile di una distribuzione di numeri ordinata in modo crescente. In altri
termini, la mediana rappresenta il valore centrale di una serie ordinata di numeri
dispari, oppure la media dei due valori centrali di una serie ordinata di numeri
pari.
Deviazionestandardrobusta
Per avere una stima attendibile della variabilità intorno alla mediana ci si rifà
alla stima della deviazione standard robusta secondo Stuart e Kendall. La
formula della deviazione standard robusta S dipende da N e IQR. N è il numero
dei casi e IQR l'intervallo interquartile ovvero la stima robusta della variabilità
dei dati considerati (l'intervallo interquartile racchiude esattamente il 50 % dei
casi di una qualsiasi distribuzione probabilistica). Il calcolo dell'intervallo inter-
quartile si esegue calcolando la dimensione dello scarto tra il 75º e il 25º
percentile.
IQR = 75º percentile — 25º percentile
Il percentile è quel valore Xpc caratterizzato dal fatto che la probabilità (P) che i
valori della distribuzione siano minori a Xpc è minore e uguale a un determinato
centesimo e che contemporaneamente la probabilità (P) che i valori della distri-
buzione siano minori o uguali a Xpc è maggiore e uguale a quel determinato
centesimo. Il centesimo indica la frazione di distribuzione scelta. Nel caso della
mediana questa è pari a 50/100.
Operativamente il percentile è quel valore di distribuzione che corrisponde ad
una determinata area sottesa dalla curva di distribuzione o di densità. Ad
esempio il 25º percentile rappresenta il valore della distribuzione corrispondente
a un'area pari a 0,25 o 25/100.
Coefficiente divariazione %robusto
Le CVR rappresenta un numero puro, ovvero senza dimensione, che indica la
percentuale di variabilità della serie di numeri analizzata rispetto al valore Me
della mediana; per questo motivo risulta molto informativo sulla attendibilità
dei giudici del panel.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 63
▼M19
Intervallidiconfidenzaal95%sullamediana
Gli intervalli di confidenza (I.C.) al 95 % (valore dell'errore del primo tipo pari
a 0,05 o 5 %) rappresentano l'intervallo dove il valore della mediana potrebbe
variare se fosse possibile ripetere infinite volte un esperimento. In pratica indica
l'intervallo di variabilità della prova nelle condizioni operative adottate qualora
si potesse ripeterla parecchie volte. L'intervallo aiuta a valutare, come con i
CVR, l'attendibilità della prova.
I.C. Sup. = Me + (c.S)I.C. Inf. = Me - (c.S)Dove c nel caso della confidenza
pari a 0,95 è uguale a 1,96.
La classificazione avviene confrontando i valori della mediana con gli intervalli
determinati al punto 5.3 del metodo. Il programma informatico permette di
visualizzare la classificazione sulla tabella dei dati statistici e sul grafico.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 64
▼B
ALLEGATO XIII
NEUTRALIZZAZIONEE DECOLORAZIONEDELL'OLIO D'OLIVA IN
LABORATORIO
1. NEUTRALIZZAZIONE E DECOLORAZIONE DELL'OLIO D'OLIVA
IN LABORATORIO
1.1.Neutralizzazione dell'olio
1.1.1. Apparecchiatura
— bicchiere da 300 ml a forma alta,
— centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml,— bicchiere da250 ml,
— palloncini da 100 ml,
— imbuto separatore da 1 litro.
1.1.2. Reattivi
— soluzione acquosa di idrossido di sodio al 12 %,
— soluzione etilalcolica all'1 % di fenolftaleina,— esano puro per analisi,
— alcool isopropilico per analisi.
1.1.3. Modo di operare
a)Olio con acidità, espressa in acido oleico, inferiore al 30 %
In un bicchiere da300 ml aformaa ltasi pongono 50 g di olio greggio
e si riscalda a 65º su bagnomaria. Sotto lenta agitazione si aggiunge
una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % corrispondente
all'acidità libera dell'olio, con un eccesso del 5 %. Si prosegue l'agita-
zione per 5 minuti, mantenendo la temperatura a 65º.
Si trasferisce il tutto in provette da centrifuga aventi capacità di 100 ml
e si separano le paste saponose per centrifugazione. Si versa l'olio
decantato in un bicchiere da 250 ml e si lava con 50-60 ml di acqua
distillata bollente eliminando per sifonamento lo strato acquoso. Si
ripetono i lavaggi sino alla completa rimozione delle tracce di saponi
residui (scomparsa della colorazione rosea alla fenolftaleina).
Si centrifuga l'olio per eliminare le piccole quantità di acqua residua.
b)Oli con acidità, espressa in acido oleico, superiore al 30 %
In un imbuto separatore da 1 litro si pongono 50 g di olio greggio,
200 ml di esano, 100 ml di alcool isopropilico e una quantità della
soluzione di idrossido di sodio al 12 %, corrispondente all'acidità
liberadell'olio, con un eccesso dello 0,3 %.
Si agita energicamente per 1 minuto. Si aggiungono 100 ml di acqua
distillata, si agita nuovamente e si lascia a riposo. Dopo stratifica-
zione, si allontana lo strato inferiore contenente i saponi. In molti
casi fra i due strati (oleoso superiore, acquoso inferiore), si forma
uno strato intermedio, costituito da mucillagini è di sostanze insolubili
che devono parimenti essere allontanate.
Si procede quindi al lavaggio della soluzione esanica dell'olio neutro
con porzioni di 50-60 ml di una soluzione di alcool isopropilico/acqua
distillata 1/1 (v/v) fino a scomparsa della colorazione rosea alla
fenolftaleina.
Si allontana quindi completamente l'esano per distillazione sotto vuoto
(ad esempio in evaporatore rotavivo).
1.2.Decolorazione dell'olio neutralizzato
1.2.1. Apparecchiatura
— pallone da 250 ml a 3 colli, con attacchi a smeriglio per l'inserimento
di:
a) un termometro con divisioni in gradi, permettente misure fino a
90º;1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 65
▼M6
▼B
▼B
b) un agitatore meccanico con velocità di rotazione di 250-300 giri/
minuto equipaggiato per funzionare sotto vuoto;
c) un raccordo per la pompa a vuoto;
— pompa a vuoto, in grado di dare pressioni residue di 15-30 millibar e
relativo manometro.
1.2.2. Modo di operare
Nel pallone a 3 colli si pesano circa 100 g dell'olio neutralizzato. Si inse-
riscono il termometro e l'agitatore; si opera il collegamento con la pompa
per vuoto e si riscalda fino a 90º agitando, si mantiene tale temperatura,
sempre agitando, sino a quando l'olio in esame non risulti completamente
deacquificato (30 minuti circa).
Si interrompe quindi il vuoto e si aggiungono 2-3 g di terra attivata. Si
stabilisce il collegamento con il vuoto fino a raggiungere una pressione
residua di 15-30 millibar, sempre mantenendo la temperatura a 90º, si
agita per 30 minuti intorno ai 250 giri/minuto.
Si filtra poi a caldo in stufa termostatica (50-60º).1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 66
▼M19
▼B
ALLEGATO XV
1. METODO DI DETERMINAZIONE DEL TENORE IN OLIO D'OLIVA
DELLE SANSE
1.1.Materiale
— apparecchio da estrazione appropriato, munito di un pallone da 200-
250 ml,
— bagno a riscaldamento elettrico (bagno a sabbia, bagno ad acqua, ecc.)
o piastra riscaldante,
— bilancia analitica,— stufa regolata su un massimo di 80 ºC,— stufa a riscaldamento elettrico, provvista di un dispositivo di termorego-
lazione regolato su 103 ± 2 ºC e tale da consentire una insufflazione
d'aria o una depressione,
— frantoio meccanico facile da pulire, che permette la frantumazione dei
noccioli senza riscaldamento e senza modificazione sensibile del loro
tenore in acqua e in olio,
— ditale da estrazione e cotone idrofilo o carta da filtro, esenti da sostanze
estraibili con esano,
— essiccatore,— setaccio a maglie da 1 mm di diametro,— pietra pomice in granuli, previamente essiccata.
1.2.Reattivo
n-esano tecnico, il cui residuo all'evaporazione completa dev'essere infe-
riore a0,002 g/100 ml.
2. MODO DI OPERARE2.1.Preparazione delcampioneperl'analisi
Frantumare il campione contrattuale, se necessario, nel frantoio meccanico
ben pulito in precedenza, allo scopo di ridurlo in particelle che attraversino
completamente il setaccio.
Utilizzare
1/20circa del campione per completare la pulizia del frantoio,
scartare il prodotto di questa macinazione, frantumare il resto, raccoglierlo,
mescolarlo con cura e analizzarlo immediatamente.
2.2.Quantitàdisostanzadaanalizzare
Immediatamente dopo la fine della frantumazione, pesare con l'approssima-
zione di 0,01 g circa10 g del ca mpione.
2.3.Preparazione delditaledaestrazione
Porre la sostanza destinata all'analisi nella cartuccia, che va tappata con il
tampone di cotone idrofilo. Nel caso che si utilizzi una carta da filtro,
impacchettare le sanse frantumate in tale carta.
2.4.Preessiccazione
Se la sansa è molto umida (tenore in acqua ed in sostanze volatili superiore
al 10 %), effettuare un'essiccazione preliminare ponendo per un tempo
conveniente il ditale riempito (o la carta da filtro) nella stufa riscaldata ad
un massimo di 80 ºC, per ricondurre il tenore in acqua ed in materie vola-
tili al di sotto del 10 %.
2.5.Preparazione delpallone
Pesare con l'approssimazione di 1 mg il pallone contenente 1-2 granuli di
pomice, previamente essiccato in stufa a 103 ± 2 ºC e poi raffreddato per
almeno un'ora in essiccatore.
2.6.Primaestrazione
Porre nell'apparecchio da estrazione il ditale (o la carta da filtro) contenente
la sostanza da analizzare. Versare nel pallone la quantità necessaria di
esano. Adattare il pallone all'apparecchio da estrazione e porre il tutto sul
bagno a riscaldamento elettrico. Effettuare il riscaldamento in condizioni1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 67
▼B
tali che la portata del riflusso sia di almeno tre gocce al secondo (ebolli-
zione moderata, non tumultuosa).
Dopo quattro ore di estrazione, lasciar raffreddare. Togliere il ditale dall'ap-
parecchio di estrazione e porlo in una corrente d'aria, al fine di eliminare la
maggior parte del solvente che lo impregna.
2.7.Secondaestrazione
Vuotare il ditale nel microfrantoio e macinare il più finemente possibile.
Reintrodurre quantitativamente la miscela nel ditale e rimettere questo
nell'apparecchio da estrazione.
Ricominciare l'estrazione per altre due ore, utilizzando lo stesso pallone che
contiene la prima sostanza estratta.
La soluzione ottenuta nel pallone da estrazione dev'essere limpida. Se così
non fosse, filtrarla su carta, lavando più volte il primo pallone e la carta da
filtro con esano. Raccogliere filtrato e solvente di lavaggio in un secondo
pallone, previamente essiccato e tarato con l'approssimazione di 1 mg.
2.8.Eliminazione delsolventeepesatadell'estratto
Eliminare la maggior parte del solvente distillato su bagno a riscaldamento
elettrico. Eliminare le ultime tracce di solvente riscaldando il pallone instufa a 103 ± 2 ºC per 20 minuti. Facilitare questa eliminazione sia insuf-
flando ogni tanto dell'aria o, preferibilmente, del gas inerte, sia operando
sotto pressione ridotta.
Lasciar raffreddare il pallone in essiccatore per almeno un'ora, poi pesarlo
con l'approssimazione di 1 mg.
Riscaldare di nuovo per 10 minuti nelle stesse condizioni, poi raffreddare
in essiccatore e pesare.
La differenza fra i risultati di queste due pesate dev'essere inferiore od
uguale a 10 mg. In caso contrario, riscaldare di nuovo per periodi di 10
minuti, seguiti da raffreddamento e pesata, finché la differenza di massa
sia uguale tutt'al più a 10 mg. Adottare per il calcolo il valore dato dall'ul-
tima pesata.
Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.
3. ESPRESSIONE DEI RISULTATI3.1.Mododicalcoloeformula
a) L'estratto, espresso come massa percentuale sul prodotto tal quale, è
dato dalla formula:
S=m
1×100
m0
nellaqua le:
S = percentuale in massa sul prodotto tal quale,
m0= massa in grammi della quantità di sostanza prelevata per l'ana-
lisi,
m1= massa in grammi dell'estratto dopo essiccazione.
Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni, se
le condizioni di ripetibilità sono adempiute.
Esprimere il risultato con una sola cifra decimale.
b) L'estratto viene riferito alla sostanza secca utilizzando la formula
seguente:
S×100
100 − U= estratto in % grasso/secco
dove:
S = percentuale in massa di estratto sul prodotto tal quale (vedi
letteraa ),
U = suo tenore in acqua e in sostanze volatili.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 68
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3.2.Ripetibilità
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultanea-
mente o in rapida successione dallo stesso analista non deve eccedere i
0,2 g di estratto ottenuto con l'esano per ogni 100 g di campione.
In caso contrario, ripetere l'analisi su due altri quantitativi di sostanza. Se
ancora questa volta la differenza eccede gli 0,2 g, assumere come risultato
la media aritmetica delle quattro determinazioni effettuate.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 69
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ALLEGATO XVI
DETERMINAZIONEDELNUMERODIIODIO
1. OGGETTO
La presente norma internazionale definisce un metodo per la determina-
zione del numero di iodio nei grassi e negli oli di origine animale e
vegetale, qui di seguito denominati «grassi».
2. DEFINIZIONE
Ai fini della presente norma internazionale, si applica la seguente defini-
zione.
2.1.Numero di iodio: la massa di iodio assorbita dal campione nelle condizioni
specificate nella presente norma internazionale.
Il numero di iodio viene espresso in grammi di iodio per 100 g di
campione.
3. PRINCIPIO
Scioglimento della sostanza da analizzare nel solvente ed aggiunta di
reagente di Wijs. Trascorso un certo lasso di tempo, aggiunta di soluzione
di ioduro di potassio e di acqua e titolazione dello iodio liberato con solu-
zione di tiosolfato di sodio.
4. REAGENTI
Tutti i reagenti devono essere di grado analitico riconosciuto.
4.1. Ioduro di potassio, soluzione di 100 g/l, non contenente iodato o iodio
libero.
4.2. Amido, soluzione.
Versare 5 g di amido solubile in 30 ml d'acqua, aggiungere questa miscela
a 1 000 ml di acqua bollente, fare bollire per 3 minuti e lasciar raffreddare.
4.3. Tiosolfato di sodio, soluzione volumetrica standard c (Na2S2O3.5H2O)
= 0,1 mol/l, standardizzato non oltre 7 giorni prima dell'uso.
4.4. Solvente, preparato miscelando volumi eguali di cicloesano e di acido
acetico.
4.5. Reagente di Wijs, contenente monocloruro di iodio in acido acetico. È
opportuno usare il reagente di Wijs disponibile in commercio.
Nota:Il reagente contiene 9 g di ICl3+ 9 g di I in acido acetico.
5. APPARECCHIATURA
La consueta apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.
5.1. Ditali da pesata, in vetro, idonei per la sostanza da analizzare e per l'inse-
rimento nelle beute (5.2).
5.2. Beute, aventi una capacità di 500 ml, provviste di tappi in vetro smerigliato
e completamente asciutte.
6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI SOSTANZA DA ANALIZZARE
Il campione omogeneizzato è seccato su solfato sodico e filtrato.
7. PROCEDIMENTO
7.1. Sostanza da analizzare
Il peso della sostanza da analizzare varia a seconda del numero di iodio che
si prevede, come indicato nella tabella 1.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 70
▼B
Tabella 1
Numero di iodio previstomassa della sostanza da analizzare
g
inferiore a5 3,00
da5 a20 1,00
da21 a50 0,40
da51 a100 0,20
da101 a150 0,13
da151 a200 0,10
Pesare la sostanza da analizzare con l'approssimazione di 0,1 mg in un
ditale da pesata in vetro (5.1).
7.2. Determinazione
Versare la sostanza da analizzare in una beuta da 500 ml (5.2). Aggiungere
20 ml del solvente (4.4) in modo da sciogliere li grasso. Aggiungere esatta-
mente 25 ml del reagente di Wijs (4.5), inserire il tappo, agitare il
contenuto e riporre la beuta al buio. Per il reagente di Wijs non usare una
pipettaabocca .
Analogamente preparare un bianco col solvente ed il reagente, ma trala-
sciando la sostanza da analizzare.
Per le sostanze aventi un numero di iodio inferiore a 150, mantenere le
beute al buio per un'ora; per quelle aventi un numero di iodio superiore a
150 nonché per i prodotti polimerizzati oppure per i prodotti notevolmente
ossidati, lasciar riposare per due ore.
Trascorso il periodo necessario, aggiungere 20 ml della soluzione di ioduro
di potassio (4.1) e 150 ml di acqua a ciascuna delle beute.
Titolare con la soluzione volumetrica standard di tiosolfato di sodio (4.3)
finché la colorazione gialla dovuta allo iodio non sia quasi scomparsa.
Aggiungere alcune gocce della soluzione di amido (4.2) e continuare latitolazione finché la colorazione blu sia appena scomparsa a seguito di
agitazione molto vigorosa.
Nota — È consentita la determinazione potenziometrica del punto finale.
7.3. Numero di determinazioni
Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.
8. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il numero di iodio viene dato dalla seguente espressione:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
Dove:
c = è il numerico della concentrazione esatta, in moli per litro, della
soluzione di Tiosolfato di sodio Titolata (5.4) utilizzata;
V1= è il valore numerico del volume, in ml, della soluzione di Tiosol-
fato di sodio Titolata (5.4) utilizzata;
V2= è il valore numerico del volume, in ml, delle soluzioni di Tiosol-
fato di sodio (5.4) utilizzato per la determinazione;
m = è il valore numerico del peso, in g, della sostanza da analizzare
(7.1).
Prendere come risultato la media aritmetica di due determinazioni.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 71
▼M11
ALLEGATO XVII
METODO DI DETERMINAZIONE DEGLI STIGMASTADIENI NEGLI
OLIVEGETALI
1. SCOPO
Determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali contenenti basse
concentrazioni di questi idrocarburi, soprattutto oli d'oliva vergini e oli
di sansa d'oliva grezzi.
2. OGGETTO
Il metodo può essere applicato a tutti gli oli vegetali, ma è attendibile
soltanto se il tenore di questi idrocarburi è compreso tra 0,01 e 4,0 mg/
kg. Esso è particolarmente adatto a rivelare la presenza di oli vegetali
raffinati (oliva, sansa, girasole, palma, ecc.) nell'olio di oliva vergine,
dato che gli oli raffinati contengono stigmastadieni, mentre gli oli vergini
non li contengono.
3. PRINCIPIO
Isolamento dell'insaponificabile. Separazione della frazione costituita
dagli steroidi a carattere di idrocarburi mediante cromatografia su colonna
di gel di silice e analisi mediante gascromatografia su capillare.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Palloni idonei da 250 ml, con condensatore a riflusso.
4.2. Imbuti separatori da 500 ml.
4.3. Palloni a fondo rotondo da 100 ml.4.4. Evaporatore rotante.
4.5. Colonna per cromatografia in vetro (1,5-2,0 cm di diametro interno, della
lunghezzadi 50 cm) provvistadi rubinetto in teflon e di ta ppo in fibradi
lana di vetro o disco di vetro sinterizzato all'estremità inferiore. Per
preparare la colonna di gel di silice versare l'esano nella colonna croma-
tografica fino a raggiungere uno spessore di circa 5 cm e riempire quindi
con un impasto di gel di silice in esano (15 g in 40 ml) aiutandosi con
porzioni di esano. Lasciar depositare completando poi il deposito con
leggere vibrazioni. Aggiungere solfato di sodio anidro fino all'ottenimento
di uno spessore di circa0,5 cm ed infine eluire l'esa no in eccesso.
4.6. Gascromatografo provvisto di rilevatore a ionizzazione di fiamma, iniet-
tore a separazione o a freddo, lungo la colonna e stufa programmabile
con l'approssimazione di ± 1 ºC.
4.7. Colonna capillare di silice fusa per gascromatografia (0,25 o 0,30 mm di
diametro interno, della lunghezza di 25 m) ricoperte di fase di fenilmetil-
silicone al 5 %, spessore 0,25 mm.
Nota 1.
Possono essere usate altre colonne di polarità equivalente o inferiore.
4.8. Registratore-integratore con possibilità d'integrazione da valle a valle.
4.9. Microsiringa per gascromatografia da 5-10 ml con ago cementato.4.10. Camicia di riscaldamento o piastra termica, elettrica.
5. REAGENTI
Tutti i reagenti debbono essere puri per analisi se non specificato diversa-
mente. L'acqua usata dev'essere distillata oppure di purezza per lo meno
equivalente.
5.1. Esano o miscela di alcani con intervallo di ebollizione a 65-70 ºC, distil-
lato su colonna di rettificazione.
Nota 2.
Il solvente dev'essere distillato in modo da eliminare le impurezze.
5.2. Etanolo al 96 % v/v.
5.3. Solfato di sodio anidro.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 72
▼M11
5.4. Soluzione alcolica di idrossido di potassio al 10 %. Aggiungere 10 ml
d'acqua a 50 g di idrossido di potassio, agitare e sciogliere quindi la
miscelain eta nolo fino a500 ml.
Nota 3.
La potassa alcolica vira al bruno se lasciata riposare. Dev'essere preparata
di fresco ogni giorno e tenuta in bottiglie di vetro scure ben tappate.
5.5. Gel di silice 60 per cromatografia su colonna 70-230 mesh (Merck, ref.
7734 o simili).
Nota 4.
Di regola il gel di silice può essere usato prelevandolo direttamente dal
contenitore senza alcun trattamento preliminare. Tuttavia alcune partite
di silice sono scarsamente attive e determinano separazioni cromatogra-
fiche di cattiva qualità. In casi del genere, il gel di silice dev'essere
disattivato scaldandolo per almeno quattro ore a 550 ºC; successivamente,
sistemarlo in un essiccatore fino a raffreddamento e trasferirlo quindi in
un pallone provvisto di tappo. Aggiungere il 2 % di acqua e agitare fino a
scomparsa dei grumi e libero flusso della polvere. Il gel di silice dev'es-
sere trattato come sopra se le partite di gel di silice danno
cromatogrammi con picchi di interferenza. Come alternativa, può essere
usato gel di silice 60 extra puro (Merck, ref. 7754).
5.6. Soluzione madre (200 ppm) di colesta-3,5-diene (Sigma, purezza 99 %)
in esano (10 mg in 50 ml).
5.7. Soluzione standard di colesta-3,5-diene in esano alla concentrazione di
20 ppm, ottenutadiluendo lasoluzione di cui sopra .
Nota 5.
Le soluzioni 5.6 e 5.7 non si deteriorano per almeno 4 mesi se conservate
a una temperatura inferiore ai 4 ºC.
5.8. Soluzione di n-nonacosano in esano ad una concentrazione di circa
100 ppm.
5.9. Gas vettore per cromatografia: idrogeno o elio puro al 99,9990 %.
5.10. Gas ausiliari per il rivelatore a ionizzazione di fiamma: idrogeno puro al
99,9990 % ed aria purificata.
6. PROCEDIMENTO
6.1.Preparazione dell'insaponificabile:
6.1.1. Pesare 20 g, con l'approssimazione di ± 0,1 di olio in un pallone da
250 ml (4.1), aggiungere 1 ml della soluzione standard di colesta-3,5-
diene (20mg) e 75 ml di potassa alcolica al 10 %, preparare il condensa-
tore a riflusso e portare a leggera ebollizione per 30 minuti. Allontanare il
pallone contenente il campione dalla fonte di calore e lasciare raffreddare
leggermente la soluzione (non far raffreddare completamente, altrimenti il
campione si depositerebbe). Aggiungere 100 ml d'acqua e trasferire la
soluzione in un imbuto a decantazione (4.2) con l'ausilio di 100 ml di
esano. Agitare la miscela vigorosamente per 30 secondi e lasciar stratifi-
care.
Nota 6.
Se si forma un'emulsione che non scompare rapidamente, aggiungere
piccoli quantitativi di etanolo.
6.1.2. Trasferire la fase acquosa inferiore in un secondo imbuto separatore ed
estrarre nuovamente con 100 ml di esano. Eliminare ancora la fase infe-riore e lavare gli estratti di esano (raccolti in un altro imbuto separatore)
tre volte con tre porzioni, di 100 ml ciascuna, di una miscela etanolo-
acqua (1: 1) fino a raggiungimento di pH neutro.
6.1.3. Far passare la soluzione di esano attraverso del solfato di sodio anidro
(50 g), lavare con 20 ml di esano a far evaporare in evaporatore rotante
a30 ºC e ba ssapressione fino asecchezza .
6.2.Separazionedellafrazionediidrocarburosteroidico:
6.2.1. Trasferire il residuo nella colonna di frazionamento con l'ausilio di due
porzioni di esano da 1 ml, far passare il campione attraverso la colonna
lasciando che la soluzione scenda fino alla somità del solfato di sodio e
avviare l'eluizione cromatografica con esano ad una velocità di efflusso di
1 ml/min. circa. Eliminare i primi 25-30 ml dell'eluizione e raccogliere1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 73
▼M11
quindi la rimanente frazione di 40 ml. Dopo averla raccolta, trasferirla in
un pallone a fondo rotondo da 100 ml (4.3).
Nota 7.
La prima frazione contiene idrocarburi saturi (figura 1a), la seconda
quelli steroidici. Continuando l'eluizione si ottiene squalene e composti
connessi. Ai fini di una buona separazione tra idrocarburi saturi e steroi-
dici, è necessario ottimalizzare le frazioni di volume. A questo scopo il
volume della prima frazione dev'essere regolato in modo che, quando
viene analizzata la seconda frazione, i picchi che rappresentano gli idro-
carburi saturi siano bassi (vedasi figura 1c); se essi non compaiono, ma
l'intensità del picco standard è bassa, il volume dev'essere ridotto. In
ogni caso non è necessaria una separazione completa dei componenti
della prima e seconda frazione, dato che durante l'analisi gascromatogra-
fica non vi è sovrapposizione di picchi, se detta analisi viene eseguita
nelle condizioni precisate al paragrafo 6.3.1. In generale non è necessaria
l'ottimalizzazione della seconda frazione in volume, data la buona separa-
zione degli altri componenti. Tuttavia la presenza di una grosso picco per
un tempo di ritenzione inferiore di circa 1,5 minuti rispetto allo standard
è dovuta allo squalene e sta ad indicare una cattiva separazione.
6.2.2. Evaporare la seconda frazione in un evaporatore a 30 ºC e bassa pres-
sione fino a secchezza e sciogliere immediatamente il residuo in 0,2 ml
di esano. Conservare la soluzione in frigorifero fino all'analisi.
Nota 8.
I residui 6.1.3 e 6.2.2 non devono essere lasciati asciugare, né tenuti a
temperatura ambiente. Non appena essi vengono ottenuti, è necessario
aggiungere il solvente e conservare le soluzioni in frigorifero.
6.3.Gascromatografia:
6.3.1. Condizioni operative per l'iniezione a separazione:
— Temperatura dell'iniettore: 300 ºC.
— Temperatura del rivelatore: 320 ºC.
— Registratore-integratore: i parametri di integrazione devono essere
fissati in modo che forniscano una corretta valutazione delle aree. Si
raccomanda un'integrazione da valle a valle.
— Sensibilità: circa 16 volte l'attenuazione minima.
— Quantitativo di soluzione iniettato: 1ml.
— Temperature di programmazione della stufa: inizialmente 235 ºC per
6 min. e successivamente aumento di 2 ºC/min. fino a 285 ºC.
— Iniettore provvisto di separatore di flusso a 1: 15.
— Vettore: elio o idrogeno aunapressione di circa120 kPa .
Queste condizioni possono essere adeguate alle caratteristiche del croma-
tografo e della colonna in modo da ottenere cromatogrammi che
rispettino i seguenti requisiti: picco dello standard interno entro 5 min.
circa dei tempi definiti al paragrafo 6.3.2; detto picco dev'essere pari ad
almeno l'80 % della scala completa.
Il sistema gascromatografico deve essere verificato iniettando una miscela
della soluzione madre di colestadiene (5.6) con la soluzione di n-nonaco-
sano (5.8). Il picco del colesta-3,5-diene deve comparire prima di quello
dell'n-nonacosano (figura 1c); se ciò non succede, si hanno due possi-
bilità: abbassare la temperatura della stufa e/o usare una colonna meno
polare.
6.3.2. Identificazione del picco
Il picco dello standard interno compare dopo circa 19 min. e lo stigmasta-
3,5-diene, aun tempo di ritenzione rela tivo di circa1,29 (cfr. figura1b).
Lo stigma-3,5-diene è associato a piccoli quantitativi di un isomero e di
solito entrambi danno origine a un unico picco cromatografico. Tuttavia,
se lacolonnaè troppo pola re oppure mostraun forte potere risolvente,
l'isomero può comparire sotto forma di piccolo picco prima e accanto a
quello dello stigmasta-3,5-diene (Figura 2). Per essere certi che gli stig-
mastadieni vengano eluiti in un picco unico, è consigliabile sostituire lacolonnacon unameno pola re oppure con unadi dia metro interno supe-
riore.
Nota 9.
Gli stigmastadieni di riferimento possono essere ottenuti dall'analisi di un
olio vegetale raffinato usando un quantitativo inferiore di campione ( 1-2
g). Gli stigmastadieni danno un picco significativo e facilmente identifi-
cabile.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 74
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6.3.3. Analisi quantitativa
Il tenore di stigmastadieni viene determinato con la formula seguente:
mg/kg di stigmastadieni =As/C2Mc
Ac/C2Mo
dove: As= area del picco dello stigmastadiene (se il picco è ripar-
tito in due isomeri, sommadelle a ree dei 2 picchi).
Ac= area dello standard interno (colestadiene)
Mc= massa di standard aggiunto, in microgrammi
Mo= massa di olio prelevata, in grammi
Limite di rivelazione: circa 0,01 mg/kg.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 75
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Figura1
Gascromatogrammi ottenuti da campioni di olio d'oliva analizzati su
colonna capillare di silice fusa (0,25 mm di diametro interno, della
lunghezzadi 25 m) ricoperti di fenilmetilsilicone a l 5 %, con uno spes-
sore 0,25 mm.
a) Prima frazione (30 ml) di olio vergine, addizionata intenzionalmente
con lo standard.
b) Secondafra zione (40 ml) di olio d'olivacontenente 0,10 mg/kg di
stigmastadieni.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 76
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c) Secondafra zione (40 ml) contenente unapiccolaproporzione della
primafra zione.
Figura2
Gascromatogramma ottenuto da un campione di olio di oliva raffinato
analizzato su colonna DB-5 che mostra l'isomero dello stigmasta-3,5-diene.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 77
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ALLEGATO XVIII
DETERMINAZIONE DEI TRIACILGLICEROLI CON ECN 42 (DIFFE-
RENZEFRAIDATIHPLCEILCONTENUTOTEORICO)
1.Campodiapplicazione
Determinazione della composizione dei triacilgliceroli (TAG) contenuti
negli oli d'oliva, in funzione del loro numero di carbonio equivalente,
per differenza fra i risultati analitici ottenuti per cromatografia in fase
liquida ad alta prestazione (HPLC) e il contenuto teorico, calcolato a
partire dalla composizione in acidi grassi.
2.Campodiapplicazione
La norma è applicabile agli oli d'oliva. Il metodo è applicabile alla rive-
lazione della presenza di piccole quantità di oli di semi (ricchi in acido
linoleico) in qualunque categoria di oli d'oliva.
3.Principio
Per gli oli puri, il contenuto in triacilgliceroli con ECN 42, determinato
per HPLC, corrisponde in una certa misura al contenuto teorico in tria-
cilgliceroli con ECN 42, calcolato in base alla determinazione per GLC
della composizione in acidi grassi. Una differenza superiore ai valori
stabiliti nel regolamento per ciascun olio indica che l'olio contiene oli
di semi.
4.Metodo
Il metodo fondato sul calcolo del contenuto teorico di triacilgliceroli
con ECN 42 e sulla differenza fra i dati HPLC e quelli teorici si basa
essenzialmente sulla coordinazione dei dati analitici ottenuti mediante
altri metodi. È possibile distinguere tre stadi: determinazione della
composizione in acidi grassi per gascromatografia capillare, calcolo
della composizione teorica dei triacilgliceroli con ECN 42, determina-
zione HPLC dei triacilgliceroli con ECN 42.
4.1.Apparecchiatura
4.1.1. Palloni a fondo arrotondato da 250 a 500 ml.4.1.2. Beakers da 100 ml.4.1.3. Colonna cromatografica in vetro (diametro interno: 21 mm, lunghezza
450 mm), provvista di cono normalizzato (femmina) alla sommità e di
rubinetto.
4.1.4. Imbuti separatori da 250 ml con cono normalizzato (maschio) al fondo,
adatto al collegamento con la sommità della colonna.
4.1.5. Bacchetta di vetro, lunghezza 600 mm.4.1.6. Imbuto di vetro, diametro 80 mm.4.1.7. Matracci volumetrici, 50 ml.4.1.8. Matracci volumetrici, 20 ml.4.1.9. Evaporatore rotativo.4.1.10. Cromatografo in fase liquida ad alta prestazione, che permetta il
controllo termostatico della temperatura della colonna.
4.1.11. Iniettore capace di erogare dosi da 10 µl.
4.1.12. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilità a fondo scala
dev'essere pari almeno a 10
−4unità dell'indice di rifrazione.
4.1.13. Colonna: tubo in acciaio inossidabile della lunghezza di 250 mm e del
diametro interno di 4,5 mm, riempito con particelle del diametro di
5µm di silice contenente il 22-23 % di carbonio sotto forma di ottade-
cilsilano (nota 2).
4.1.14. Registratore e/o integratore.
4.2.Reattivi
I reattivi debbono essere di purezza analitica.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 78
▼M13
I solventi di eluizione debbono essere degassati e possono essere rici-
clati più volte senza effetti sulle separazioni.
4.2.1. Etere di petrolio 40-60 ºC, qualità per cromatografia.
4.2.2. Etere etilico, esente daperossidi, distilla to di fresco.
4.2.3. Solvente per eluizione cromatografica: miscela etere di petrolio/etere
etilico 87/13 (v/v).
4.2.4. Gel di silice, 70-230, tipo Merck 7734, con un contenuto d'acqua stan-
dardizzato al 5 % (m/m).
4.2.5. Lana de vetro.
4.2.6. Acetone.
4.2.7. Acetonitrile.
4.2.8. Solvente per eluizione HPLC: acetonitrile + acetone (proporzioni da
regolare in modo da ottenere la separazione desiderata: cominciare con
unamiscela50:50).
4.2.9. Solvente di solubilizzazione: acetone.4.2.10. Trigliceridi di riferimento: si possono usare i trigliceridi del commercio
(tripalmitina, trioleina, ecc.), riportando su un grafico i rispettivi tempi
di ritenzione in funzione del numero di carbonio equivalente, oppure
utilizzare cromatogrammi di riferimento ottenuti impiegando olio di
soia, miscele 30:70 olio di soia-olio di oliva e olio di oliva puro (vedi
note 3 e 4 e figure 1, 2, 3, 4).
4.3.Preparazione delcampione
Poiché un certo numero di sostanze capaci di interferire può dar luogo a
risultati falsamente positivi, il campione dev'essere sempre purificato
secondo il metodo IUPAC 2.507 (determinazione delle sostanze polari
negli oli ossidati).
4.3.1. Prepa ra zione dellacolonnacroma togra fica
Riempire lacolonna(4.1.3) con 30 ml circadi solvente di eluizione
(4.2.3), introducendo poi nellacolonnaun poco di la nadi vetro
(4.2.5), spingendola al fondo della colonna mediante la bacchetta di
vetro (4.1.5).
In un Beakers da 100 ml, sospendere 25 g di gel di silice (4.2.4) in
80 ml di misceladi eluizione (4.2.3), tra sferendolaquindi nellacolonna
mediante un imbuto di vetro (4.1.6).
Per assicurare il completo trasferimento del gel di silice nella colonna,
lavare il Beakers con la miscela di eluizione e trasferire nella colonna
anche le porzioni di lavaggio.
Aprire il rubinetto e lasciar eluire il solvente dalla colonna fin quando il
suo livello superi di circa1 cm quello del gel di silice.
4.3.2. Cromatografia su colonna
In un matraccio tarato da 50 ml (4.1.7), pesare, con la precisione di
0,001 g, 2,5 ± 0,1 g di olio previamente filtrato, omogeneizzato e se
necessario disidratato.
Disciogliere in 20 ml circadi solvente di eluizione (4.2.3), se neces-
sario riscaldando leggermente per facilitare la dissoluzione.
Raffreddare a temperatura ambiente e portare a volume col solvente di
eluizione.
Con una pipetta volumetrica, introdurre 20 ml di soluzione all'interno
della colonna preparata come al punto 4.3.1, aprire il rubinetto e lasciar
defluire il solvente fino al livello dello strato di gel di silice.
Eluire con 150 ml di solvente di eluizione (4.2.3), regolando la velocità
di passaggio del solvente a 2 ml/min. circa (per passare attraverso la
colonna, 150 ml impiegheranno 60-70 minuti circa).
Recuperare l'eluato in un matraccio a fondo arrotondato da 250 ml
(4.1.1), precedentemente tarato in stufa e pesato con esattezza. Elimi-
nare il solvente sotto depressione (Rotavapor) e pesare il residuo che
verrà impiegato per preparare la soluzione per l'analisi HPLC e per la
preparazione dell'estere metilico.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 79
▼M13
Il recupero del campione dalla colonna non dovrà essere inferiore al
90 % per le categorie olio extravergine, olio vergine, olio corrente,
olio raffinato e olio d'oliva, ed all'80 % per l'olio lampante e per l'olio
di sansa.
4.4.AnalisiHPLC
4.4.1. Preparazione dei campioni per l'analisi cromatografica
Preparare una soluzione del 5 % del campione da analizzare pesando
0,5 ± 0,001 g del campione in un matraccio tarato da 10 ml e portare
avolume con il solvente di solubilizza zione (4.2.9).
4.4.2. Procedimento
Montare il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione
(4.2.8) alla portata di 1,5 ml/min, in modo da spurgare l'intero sistema.
Attendere finché la linea di base sia stabile. Iniettare 10 µl del
campione preparato come indicato in 4.3.
4.4.3. Calcolo ed espressione dei risultati
Impiegare il metodo di normalizzazione, vale a dire ammettere che la
somma della aree dei picchi corrispondenti ai TAG da ECN 42 ad
ECN 52 sia uguale al 100 %. Calcolare la percentuale relativa di
ciascun trigliceride impiegando la formula:
% di trigliceride = area del picco × 100/somma delle aree dei picchi.
I risultati debbono essere espressi con almeno due cifre decimali.
Nota 1: L'ordine di eluizione può essere determinato calcolando i
numeri di carbonio equivalente, definiti spesso dalla relazione ECN =
CN-2n, dove CN è il numero di carbonio ed n è il numero di doppi
legami, esso può essere calcolato precisamente tenendo conto dell'ori-
gine del doppio legame. Se no,nlenlnsono i numeri di doppi legami
attribuiti rispettivamente agli acidi oleico, linoleico e linolenico, il
numero di carbonio equivalente può essere calcolato mediante la rela-
zione data dalla formula:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
dove i coefficienti do,dledlnpossono essere calcolati mediante i trigli-
ceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente metodo,
la relazione ottenuta sarà vicina a:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Nota 2: Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere o equivalente (Merck) 100 CH18 Art
50377
Nota 3: con diversi trigliceridi di riferimento è anche possibile calcolare
la risoluzione rispetto alla trioleina:
α= RT' / RT trioleina
impiegando il tempo corretto di ritenzione RT' = RT − RT solvente.
Il grafico di log αin funzione di f (numero di doppi legami) permette di
determinare i valori di ritenzione per tutti i trigliceridi degli acidi grassi
contenuti nei trigliceridi di riferimento (cfr. figura2).
Nota 4: l'efficienza della colonna dovrebbe permettere una chiara sepa-
razione del picco della trilinoleina da quelle dei trigliceridi con un RT
immediatamente prossimo. L'eluizione viene effettuata fino al picco
corrispondente ad ECN 52.
Nota 5: una misura corretta delle aree di tutti i picchi aventi interesse
per la presente determinazione è assicurata quando l'altezza del secondo
picco della serie ECN 50 è pari al 50 % del fondo scala di registra-
zione.
4.5.Calcolodellacomposizioneintriacilgliceroli(moli%)daidatiGLC
relativi agliacidigrassi
4.5.1. Determinazione della composizione in acidi grassi
La composizione in acidi grassi viene determinata secondo il metodo
gascromatografico CEE riportato nell'allegato X A del regolamento1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 80
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(CEE) n. 2568/91, mediante una colonna capillare. La preparazione
degli esteri metilici viene eseguita conformemente all'allegato X B
(soluzione alcolica di sodio metilato).
4.5.2. Acidi grassi per il calcolo
I gliceridi sono raggruppati secondo i loro numeri di carbonio equiva-
lente (ECN), tenendo conto delle equivalenze fra ECN ed acidi grassi
riportate qui di seguito. Sono stati presi in considerazione soltanto gli
acidi grassi con 16 e 18 atomi di carbonio, poiché sono i soli che
abbiano importanza per l'olio d'oliva.
Acidi grassi (FA)Abbrevia-
zionePeso moleco-
lare (PM)ECN
Acido palmitico P 256,4 16
Acido palmitoleico Po 254,4 14Acido stearico S 284,5 18Acido oleico O 282,5 16Acido linoleico L 280,4 14
Acido linolenico Ln 278,4 12
4.5.3. Trasformazione dell'area % in moli per tutti gli acidi grassi
moli P ¼
area % P
PM Pmoli S ¼area % S
PM Smoli Po ¼area % Po
PM Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
moli O ¼
area % O
PM Omoli L ¼area % L
PM Lmoli Ln ¼aera % Ln
PM Ln
4.5.4. Riconduzione degli acidi grassi al 100 %
moli % P 1 ;2;3 ðÞ ¼moli P /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)moli % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
moli S /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moli % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼moli Po /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moli % O 1 ;2;3 ðÞ ¼moli O /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moli % L 1 ;2;3 ðÞ ¼moli L /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moli % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼moli Ln /C3100
moli P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Il risultato esprime la percentuale di ciascun acido grasso in moli %
sullaposizione complessiva(1, 2, 3) dei TAG.
Si calcola quindi la somma degli acidi grassi saturi P e S (SFA) e degli
acidi grassi insaturi Po, O, L e Ln (UFA):
moli % SFA = moli % P + moli % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)moli % UFA = 100 − % moli SFA
4.5.5. Calcolo della composizione in acidi grassi nelle posizioni
2- e 1,3- dei TAG
Gli acidi grassi sono distribuiti in tre gruppi, nel modo seguente: due
identici per le posizioni 1- e 3-, ed uno per laposizione 2-, con coeffi-
cienti diversi per gli acidi saturi (P e S) e gli acidi insaturi (Po, O, L e
Ln).1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 81
▼M13
4.5.5.1. Acidi grassi saturi in posizione 2 [P(2) e S(2)]
moli % P(2) = moli % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)moli % S(2) = moli % S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Acidi grassi insaturi in posizione 2 [Po(2), O(2), L(2) e Ln(2)]:
moli % Po 2 ðÞ ¼moli % Po 1 ;2;3 ðÞ
moli % UFA/C3100 /C0moli % P 2 ðÞ /C0moli % S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)moli % O 2 ðÞ ¼
moli % O 1 ;2;3 ðÞ
moli % UFA/C3100 /C0moli % P 2 ðÞ /C0moli % S 2 ðÞ ½/C138
moli % L 2 ðÞ ¼moli % L 1 ;2;3 ðÞ
moli % UFA/C3100 /C0moli % P 2 ðÞ /C0moli % S 2 ðÞ ½/C138
moli % Ln 2 ðÞ ¼moli % Ln 1 ;2;3 ðÞ
moli % UFA/C3100 /C0moli % P 2 ðÞ /C0moli % S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Acidi grassi in posizione 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]:
moli % P 1 ;3ðÞ ¼moli % P 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % P 2 ðÞ
2þmoli % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)moli % S 1 ;3ðÞ ¼
moli % S 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % S 2 ðÞ
2þmoli % S 1 ;2;3 ðÞ
moli % Po 1 ;3ðÞ ¼moli % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % Po 2 ðÞ
2þmoli % Po 1 ;2;3 ðÞ
moli % O 1 ;3ðÞ ¼moli % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % O 2 ðÞ
2þmoli % O 1 ;2;3 ðÞ
moli % L 1 ;3ðÞ ¼moli % L 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % L 2 ðÞ
2þmoli % L 1 ;2;3 ðÞ
moli % Ln 1 ;3ðÞ ¼moli % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 moli % Ln 2 ðÞ
2þmoli % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Calcolo dei triacilgliceroli
4.5.6.1. TAG con un solo acido grasso (AAA, in questo caso LLL, PoPoPo)
moli % AAA ¼moli % A 1 ;3ðÞ /C3 moli % A 2 ðÞ/C3moli % A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG con due acidi grassi (AAB, in questo caso, PoPoL, PoLL)
moli % AAB ¼moli % A 1 ;3ðÞ /C3 moli % A 2 ðÞ/C3moli % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
moli % ABA ¼
moli % A 1 ;3ðÞ /C3 moli % B 2 ðÞ/C3moli % A 1 ;3ðÞ
100001991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 82
▼M13
4.5.6.3. TAG con tre acidi grassi diversi (ABC, in questo caso OLLn, PLLn,
PoOLn, PPoLn)
moli % ABC ¼moli % A 1 ;3ðÞ /C3 moli % B 2 ðÞ/C3moli % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) moli % BCA ¼
moli % B 1 ;3ðÞ /C3 moli % C 2 ðÞ/C3moli % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
moli % CAB ¼moli % C 1 ;3ðÞ /C3 moli % A 2 ðÞ/C3moli % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
4.5.6.4. Triacilgliceroli con ECN42
I seguenti triacilgliceroli con ECN42 sono calcolati secondo le equa-
zioni 7, 8 e 9 per ottenere l'eluizione attesa in HPLC (normalmente
soltanto tre picchi).
LLL
PoLL e isomero di posizione LPoLOLLn e isomeri di posizione OLnL e LnOL
PoPoL e isomero di posizione PoLPo
PoOLn e isomeri di posizione OPoLn e OLnPoPLLn e isomeri di posizione LLnP e LnPL
PoPoPo
SLnLn e isomero di posizione LnSLnPPoLn e isomeri di posizione PLnPo e PoPLn
I triacilgliceroli con ECN42 sono espressi dalla somma dei nove triacil-
gliceroli, compresi i loro isomeri di posizione. I risultati debbono essere
espressi con almeno due cifre decimali.
5.Valutazionedelrisultato
Si confrontano il contenuto teorico calcolato e il contenuto determinato
per HPLC. Se la differenza fra i dati HPLC e i dati teorici è superiore
ai valori indicati nel regolamento, il campione contiene olio di semi.
Nota:i risultati vanno espressi con una sola cifra decimale.
6.Esempio (Il numero si riferisce alle sezioni nel testo del metodo)
4.5.1. Calcolo delle moli % di acidi grassi a partire dai dati GLC
(area %)
I dati che seguono sono ottenuti per la composizione in acidi grassi per
GLC:
FA
PMP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
area % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Trasformazione dell'area % in moli per tutti gli acidi grassi
moli P ¼10
256 ;4¼0;03900 moli PP Vedi formula(1)
moli S ¼3
284 ;5¼0;01054 moli S Vedi formula(1)
moli Po ¼1
254 ;4¼0;00393 moli Po Vedi formula(1)
moli O ¼75
282 ;5¼0;26549 moli O Vedi formula(1)1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 83
▼M13
moli L ¼10
280 ;4¼0;03566 moli L Vedi formula(1)
moli Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 moli Ln Vedi formula(1)
Somma= 0,35822 moli TAC
4.5.4. Normalizzazione degli acidi grassi al 100 %
moli % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 moli P /C3100
0;35822 moli¼10;888% Vedi formula(2)
moli % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 moli S /C3100
0;35822 moli¼2;944% Vedi formula(2)
moli % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 moli Po /C3100
0;35822 moli¼1;097% Vedi formula(2)
moli % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 moli O /C3100
0;35822 moli¼74;113% Vedi formula(2)
moli % L1 ;2;3¼0;03566 moli L /C3100
0;35822 moli¼9;956% Vedi formula(2)
moli % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 moli Ln /C3100
0;35822 moli¼1;003% Vedi formula(2)
Totale moli % = 100,0 %
Somma degli acidi grassi saturi e insaturi nella posizione 1,2,3 dei
TAG:
moli % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Vedi formula(3)
moli % UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Vedi formula(3)
4.5.5. Calcolo della composizione in acidi grassi nelle posizioni 2
e1 , 3d e iT A G
4.5.5.1. Acidi grassi saturi in posizione 2 [P(2) e S(2)]
moli % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moli % Vedi formula(4)
moli % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moli % Vedi formula(4)
4.5.5.2. Acidi grassi insaturi in posizione 1, 3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]
moli % Po 2 ðÞ¼1;097%
86;169%/C3100 /C0/C00;659 /C00;177 ðÞ ¼1;263 moli % Vedi
formula(5)
moli % O 2 ðÞ ¼74;113%
86;169%/C3100 /C0/C00;659 /C00;177 ðÞ ¼ 85;295 moli % Vedi
formula(5)
moli % L 2 ðÞ ¼9;956%
86;169%/C3100 /C0/C00;659 /C00;177 ðÞ ¼ 11;458 moli % Vedi
formula(5)
moli % Ln 2 ðÞ ¼1;003%
86;169%/C3100 /C0/C00;659 /C00;177 ðÞ ¼ 1;154 moli % Vedi
formula(5)
4.5.5.3. Acidi grassi in posizione 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]
moli % P 1 ;3ðÞ ¼10;888 /C00;659
210;888 ¼16;005 moli % Vedi formula(6)1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 84
▼M13
moli % S 1 ;3ðÞ ¼2;944 /C00;177
22;944 ¼4;327 moli % Vedi formula(6)
moli % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097 /C01;263
21;097 ¼1;015% moli Vedi formula(6)
moli % O 1 ;3ðÞ ¼74;113 /C085;295
274;113 ¼68;522% moli Vedi formula(6)
moli % L 1 ;3ðÞ ¼9;956 /C011;458
29;956 ¼9;205 moli % Vedi formula(6)
moli % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003 /C01;154
21;003 ¼0;927 moli % Vedi formula(6)
4.5.6. Calcolo dei triacilgliceroli
Dalla composizione calcolata in acidi grassi nelle posizioni sn-2 e sn-
1,3 (cfr. più sopra):
FA in posiz. 1,3- posiz. 2
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Somma100,0 % 100,0 %
si calcolano i seguenti triacilgliceroli:
LLL
PoPoPoPoLL con 1 isomero di posizione
SLnLn con 1 isomero di posizione
PoPoL con 1 isomero di posizionePPoLn con 2 isomeri di posizioneOLLn con 2 isomeri di posizione
PLLn con 2 isomeri di posizione
PoOLn con 2 isomeri di posizione
4.5.6.1. TAG con un solo acido grasso (LLL, PoPoPo) Vedi formula (7)
moli % LLL ¼
9;205% /C311;458% /C39;205%
10000= 0,09708 moli LLL
moli % PoPoPo ¼1;015% /C31;263 % /C31;015%
10000= 0,00013 moli PoPoPo
4.5.6.2. TAG con due acidi grassi (PoLL, SLnLn, PoPoL) Vedi formula (8)
moli % PoLL þLLPo ¼1;015% /C311;458% /C39;205% /C32
10000= 0,02141
moli % LPoL ¼9;205% /C31;263% /C39;205%
10000= 0,01070
0,03211 moli PoLL
moli % SLnLn þLnLnS ¼4;327% /C31;154% /C30;927% /C32
10000= 0,000931991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 85
▼M13
moli % LnSLn ¼0;927% /C30;177% /C30;927%
10000 = 0,00002
0,00095 moli SLnLn
moli % PoPoL þLPoPo ¼1;015% /C31;263% /C39;205% /C32
10000= 0,00236
moli % PoLPo ¼1;015% /C311;458% /C31;015%
10000= 0,00118
0,00354 moli PoPoL
4.5.6.3. TAG con tre diversi acidi grassi (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Vedi
formula(9)
moli % PPoLn ¼16;005% /C31;263% /C30;927% /C32
10000= 0,00375
moli % LnPPo ¼0;927% /C30;653% /C31;015% /C32
10000= 0,00012
moli % PoLnP ¼1;015% /C31;154% /C316;005% /C32
10000= 0,00375
0,00762 moli PPoLn
moli % OLLn ¼68;522% /C311;458% /C30;927% /C32
10000= 0,14577
moli % LnOL ¼0;927% /C385;295% /C39;205% /C32
10000= 0,14577
moli % LLnO ¼9;205% /C31;154% /C368;522% /C32
10000= 0,14577
0,43671 moli OLLn
moli % PLLn ¼16;005% /C311;458% /C30;927% /C32
10000= 0,03400
moli % LnPL ¼0;927% /C30;653% /C39;205% /C32
10000= 0,00111
moli % LLnP ¼9;205% /C31;154% /C316;005% /C32
10000= 0,03400
0,06911 moli PLLn
moli % PoOLn ¼1;015% /C385;295% /C30;927% /C32
10000= 0,01605
moli % LnPoO ¼0;927% /C31;263% /C368;522% /C32
10000= 0,001605
moli % OLnPo ¼68;522% /C31;154% /C31;015% /C32
10000= 0,01605
0,04815 moli PoOLn
ECN42 = 0,69540 moli TAG1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 86
▼M14
Figura1: Grafico del log αin funzione di f (numero di doppi legami)
Nota:La: acido laurico; Mi: acido miristico; P: acido palmitico; St:
acido stearico; O: acido oleico; L: acido linoleico; Ln: acido
linolenico.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 87
▼M14
Figura2: Olio di soia
Figura3: Olio di soia/olio d'oliva 30/70
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 88
▼M14
Figura 4: Olio d'oliva
1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 89
▼M19
ALLEGATO XIX
DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI ALCOLI ALIFATICI
MEDIANTEGASCROMATOGRAFIACONCOLONNACAPILLARE
1. PREMESSA
Il metodo descrive un procedimento per ladetermina zione del conte-
nuto di alcoli alifatici, singoli e totali, delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di 1-eicosanolo quale standard interno,
è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi
l'insaponificabile viene estratto con etere etilico. Dall'insaponificabile
estratto è separata la frazione degli alcoli mediante cromatografia su
placca di gel di silice basica; gli alcoli recuperati dal gel di silice
vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati mediante gascro-
matografia in colonna capillare.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a
smeriglio.
3.2. Imbuto separatore da 500 ml.3.3. Matracci da 250 ml.3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per
lastre di vetro 20 × 20 cm.
3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.3.6. Microsiringhe da100 e 500 microlitri.3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 micro-
metri) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo
per filtrazione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.
3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adatta-
bile all'imbuto filtrante (3.7).
3.9. Provettada10 ml afondo conico con ta ppo atenuta .
3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare,
dotato di sistema di splittaggio, costituito da:
3.10.1. Camera termostatica per la colonna, idonea a mantenere la temperatura
desiderata con la precisione di circa 1 ºC.
3.10.2. Complesso di iniezione termoregolabile con elemento vaporizzante in
vetro persilanizzato.
3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-
amplificatore (3.10.3), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo
e con velocità della carta variabile.
3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro
interno 0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o
SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30
micrometri.
3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 microlitri con ago cementato.3.13. Bilancia di previsione con sensibilità di 1 mg (con indicazione 0,1 mg).
4. REATTIVI
4.1. Potassio idrossido, soluzione metanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto
raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in
200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La
soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.
4.2. Etere etilico, puro per analisi.4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 90
▼M19
4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluore-
scenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per
l'uso).
4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 0,2 N: si sciolgono 13 g di
idrossido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con
etanolo.
4.6. Benzene, per cromatografia (cfr. 5.2.2).4.7. Acetone, per cromatografia (5.2.2).
4.8. Esano, per cromatografia (cfr. 5.2.2).
4.9. Etere etilico, per cromatografia (cfr. 5.2.2).
4.10. Cloroformio, puro per analisi.
4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o
fitosteroli, soluzione a0,5 % in cloroformio.
4.12. 2,7-diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende legger-
mente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di
idrossido di potassio.
4.13. Piridina anidra, per cromatografia.
4.14. Esametildisilazano.
4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluzione etanolo di trimetilsilileteri degli alcoli alifatici da C
20aC28.
Si preparano al momento dell'impiego a partire da miscele di alcoli
puri.
4.17. 1-eicosanolo, soluzione allo 0,1 % (m/v) in cloroformio (standard
interno).
4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.
4.19. Gas ausiliare: azoto puro per gascromatografia.
5. PROCEDIMENTO5.1.Preparazione dell'insaponificabile
5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegando la microsiringa da
500 microlitri, un volume di soluzione di 1-eicosanolo allo 0,1 % in
cloroformio (4.17) che contenga una quantità di 1-eicosanolo corrispon-
dente a circa il 10 % del contenuto di alcoli alifatici nell'aliquota di
campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di
campione si aggiungano 250 microlitri della soluzione di 1-eicosanolo
allo 0,1 % se trattasi di oli di oliva e 1 500 microlitri se trattasi di olio
di sansa di oliva.
Si evapora il cloroformio in corrente di azoto fino a secchezza, quindi
nello stesso matraccio si pesano esattamente circa 5 g di campione
secco e filtrato.
5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N,
si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su
bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione
avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento
ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata
facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e
si raffredda il matraccio a circa 30 ºC.
5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto
separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese,
impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa
80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si
lascia stratificare (nota 1).
Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo
imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estra-
zioni, con le stesse modalità impiegando ogni volta 60-70 ml di etere
etilico.
Nota 1: Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo,
mediante spruzzetta, piccole quantità di alcool etilico o meti-
lico.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 91
▼M19
5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano
con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque
di lavaggio.
Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si
filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente
pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico.
5.1.5. Si distillal'etere fino apochi ml, quindi si portaasecco sotto leggero
vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100 ºC
per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa.
5.2.Separazionedellafrazionedeglialcoli
5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice
(4.4), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di
potassio (4.5) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa
per 2 ore ed infine si pongono in stufaa100 ºC per 1 ora .
Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio
fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere
impiegate entro 15 giorni).
Nota 2: Impiegando per la separazione della frazione alcolica delle
lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del tratta-
mento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono
trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura
acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così le bande degli
alcoli alifatici e terpenici nettamente separate dalla banda degli
steroli.
5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela esano-
etere etilico 65/35 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm(*).
Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno
mezz'ora in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle
superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di
carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette
di ridurre di circa1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere unapiù
uniforme e regolare eluizione dei componenti.
Nota 3: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente ripro-
ducibili lamisceladi sviluppo deve essere sostituitaa d ogni
prova.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5) in
cloroformio e, con lamicrosiringada100 microlitri si deposita no su
una placca cromatografica (5.2.1) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml
di dettasoluzione, in strisciail più possibile sottile ed uniforme. In a lli-
neamento con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si
depositano 2-3 microlitri della soluzione di riferimento degli alcoli
(4.11), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli
alcoli alifatici.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in
5.2.2. La temperatura dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 ºC. Si chiude
subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del
solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca.
Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il
solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca ad asciu-
gare per un po' di tempo sotto cappa.
5.2.5. Si spruzzalapla ccadebolmente ed uniformemente con lasoluzione di
2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si
individua la banda degli alcoli alifatici per allineamento con la macchia
ottenutacon lasoluzione di riferimento e si delimitacon unama tita
nera l'insieme della banda degli alcoli alifatici e della banda immedia-
tamente superiore corrispondente agli alcoli triterpenici.
Nota 4: La prescrizione di raccogliere insieme alla banda degli alcoli
alifatici anche la banda degli alcoli triterpenici è dettata dal
fatto che in questa, nelle condizioni del metodo, vengono
inglobate significative quantità di alcoli alifatici.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area
delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene intro-1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 92
(*) In questi casi, in particolare, si deve utilizzare la miscela eluente benzene-acetone 95/
5 (v/v) per ottenere una buona separazione delle bande.
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dotto nell'imbuto filtrante (3.7); si aggiungono 10 ml di cloroformio
caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra
aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8), colle-
gata all'imbuto filtrante.
Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml
per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata
all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si
trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9) previa-
mente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera
corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta
ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 ºC, indi si lascia
raffreddare in essiccatore e si pesa.
Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione alcolica.
5.3.Preparazione deitrimetilsilileteri
5.3.1. Nella provetta contenente la frazione alcolica si aggiunge il reattivo per
la sililazione, costituito da una miscela di piridina-esametildisilazanotri-
metilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 5) in ragione di 50 microlitri per
ogni milligrammo di alcoli alifatici, evitando ogni assorbimento di
umidità (nota6).
Nota 5: Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono
inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio
il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da
diluire con uno stesso volume di piridina anidra.
Nota 6: L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e
non è causa di alcun disturbo. La formazione di un flocculato
bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio della
presenza di umidità o di alterazione del reattivo. In questo caso
laprovadovrà essere ripetuta .
5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a
completa solubilizzazione degli alcoli alifatici. Si lascia a sé per almeno
15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni
minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.
5.4.Analisigascromatografica
5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna
5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di
ingresso all'iniettore connesso col sistema di splittaggio, e il terminale
di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso
gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore,
efficienzadel sistemadi splitta ggio e del sistemadi registra zione, ecc.).
5.4.1.2. Se lacolonnaè messain uso per laprimavoltaè consiglia bile proce-
dere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas
attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromato-
grafico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una
temperatura di almeno 20 ºC superiore a quella di esercizio (nota 7).
Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il
complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei
gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il
registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per
la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad
unasensibilità a lmeno 2 volte superiore aquellaprevistaper l'esecu-
zione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare,
esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una
derivarettilineanega tivaindicaimperfettatenutadelle connessioni
della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condiziona-
mento dellacolonna .
Nota 7: La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere
inferiore di almeno 20 ºC alla temperatura massima prevista
per il liquido di ripartizione impiegato.
5.4.2. Sceltadelle condizioni opera tive
5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
— temperatura della colonna: inizio isoterma 8 minuti a 180 ºC, quindi
programma 5 ºC/minuto fino a 260 ºC e ancora 15 minuti a 260 ºC,
— temperatura dell'evaporatore: 280 ºC,— temperatura del rivelatore: 290 ºC,1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 93
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— velocità lineare del gas vettore: elio da 20 a 35 cm/s; idrogeno da
30 a50 cm/s,
— rapporto di splittaggio: da 1/50 a 1/100,— sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima,— sensibilità di registrazione: da 1 a 2 mV su fondo scala,— velocità della carta: da 30 a 60 cm/ora,— quantità di sostanza iniettata: da 0,5 a 1 microlitri di soluzione di
TMSE.
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere
cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:
— il tempo di ritenzione dell'alcol C
26deve essere di 18 ± 5 minuti,
— il picco dell'alcol C22deve essere per l'olio di oliva80 ± 20 % del
fondo scala e per gli oli di semi 40 ± 20 % del fondo scala.
5.4.2.2. Per verificare i suddetti requisiti si effettuano ripetute iniezioni con le
miscele campione di TMSE degli alcoli e si ritoccano le condizioni
operative fino a raggiungere i migliori risultati.
5.4.2.3. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in
modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che
vengono presi in considerazione.
5.4.3. Esecuzione dell'analisi
5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 microlitri si preleva 1 ml di esano, si aspi-
rano 0,5 microlitri di aria e successivamente da 0,5 a 1 microlitri della
soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in
modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana
del complesso di iniezione e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e
si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi.
5.4.3.2. Si effettualaregistra zione fino acompletaeluizione dei TMSE degli
alcoli presenti. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai
requisiti richiesti (5.4.1.2).
5.4.4. Identificazione dei picchi
L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di
ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli alcoli, analizzate
nelle medesime condizione.
Nella figura 1 è riportato un cromatogramma della frazione alcolica di
un olio di olivavergine.
5.4.5. Valutazione quantitativa
5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'1-eico-
sanolo e degli alcoli alifatici da C22C24,C26,C28.
5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo alcool alifatico, in mg/1 000 g di
sostanza grassa come segue:
in cui:
Ax= area del picco dell'alcool x
As= area del picco dell'1-eicosanolo
ms= peso di 1-eicosanolo aggiunto, in milligrammi
m = peso del campione prelevato per la determinazione, in grammi.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Si riportano i contenuti dei singoli alcoli alifatici, in mg/1 000 g di
sostanza grassa e, come «alcoli alifatici totali», la loro somma.1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 94
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APPENDICE
Determinazione della velocità lineare dei gas
Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano da
1 a 3 ml di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a
percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del
picco (tM).
La velocità lineare in cm/s è data da L/tMin cui L è la lunghezza della colonna
in centimetri e tM è il tempo cronometato in secondi.
Figura 1 — Cromatogramma della frazione alcolica di un olio di oliva vergine
1 = Eicosanolo
2 = Docosanolo
3 = Tricosanolo4 = Tetracosanolo
5 = Pentacosanolo
6 = Esacosanolo7 = Eptacosanolo8 = Octacosanolo1991R2568 — IT — 22.05.2002 — 019.001 — 95