1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 1
Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni
►B DECISIONE DELLA COMMISSIONE
del 15 luglio 1994
che stabilisce le norme sanitarie e di certificazione veterinaria per l’importazione di sperma bovino
da paesi terzi
(94/577/CE)
(GU L 221 del 26.8.1994, pag. 26)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Decisione 1999/495/CE della Commissione del 1oluglio 1999 L 192 56 24.7.1999
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DECISIONE DELLA COMMISSIONE
del 15 luglio 1994
che stabilisce le norme sanitarie e di certificazione veterinaria per
l’importazione di sperma bovino da paesi terzi
(94/577/CE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità europea,
vista la direttiva 88/407/CEE del Consiglio, del 14 giugno 1988, che
stabilisce le esigenze di polizia sanitaria applicabili agli scambi intraco-munitari ed alle importazioni di sperma di animali della speciebovina (
1), modificata da ultimo dalla direttiva 93/60/CEE (2), in parti-
colare gli articoli 10 e 11,
considerando che l’elenco dei paesi terzi da cui gli Stati membri auto-
rizzano l’importazione di sperma surgelato di animali della speciebovina, in prosieguo denominato «l’elenco», è definito dalla decisione90/14/CEE della Commissione (
3), modificata dalla decisione 91/
276/CEE (4);
considerando che la situazione sanitaria in Israele ha condotto a vietare
le importazioni da quel paese con decisione 91/277/CEE della Commis-sione (
5);
considerando che le decisioni 91/479/CEE (6), 91/549/CEE (7), 92/
123/CEE (8), 92/124/CEE (9), 92/125/CEE (10), 92/126/CEE (11), 92/
127/CEE (12), 92/128/CEE (13), 92/386/CEE (14), 92/387/CEE (15)e 92/
445/CEE (16) della Commissione fissano le norme sanitarie e di certifi-
cazione veterinaria per l’importazione di sperma bovino rispettivamentedagli Stati Uniti d’America, dal Canada, dalla Polonia, dalla Finlandia,dalla Nuova Zelanda, dall’Austria, dalla Svizzera, dalla Svezia, dall’Un-gheria, dalla Norvegia e dalla Cecoslovacchia;
considerando che la direttiva 93/60/CEE del Consiglio, che deve essere
attuata negli Stati membri prima del 1
oluglio 1994, modifica la direttiva
88/407/CEE e impone pertanto la necessità di modificare le predettedecisioni concernenti i paesi terzi; che per semplificare la legislazionecomunitaria in materia ed eliminare ambiguità è necessario unificare lepredette decisioni ed abrogare quelle relative ad ogni singolo paese;
considerando che, attese le disposizioni dell’accordo sullo Spazio
economico europeo, non è più necessario prevdere certificati di poliziasanitaria per le importazioni di sperma bovino in provenienza daAustria, Finlandia, Norvegia e Svezia;
considerando che, secondo il parere del comitato scientifico veterinario,
è richiesto un test supplementare per la malattia emorragica epizootica;
considerando che, limitatamente al Canada, vengono effettuati test di
routine preraccolta per questa malattia con periodicità semestrale; che èpertanto necessario prevedere un periodo transitorio per l’applicazionedella presente decisione nei confronti del Canada, onde accordare alle
(1) GU n. L 194 del 22. 7. 1988, pag. 10.
(2) GU n. L 186 del 28. 7. 1993, pag. 28.
(3) GU n. L 8 dell’11. 1. 1990, pag. 71.
(4) GU n. L 135 del 30. 5. 1991, pag. 58.
(5) GU n. L 135 del 30. 5. 1991, pag. 60.
(6) GU n. L 258 del 16. 9. 1991, pag. 1.
(7) GU n. L 298 del 29. 10. 1991, pag. 6.
(8) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 1.
(9) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 10.
(10) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 19.
(11) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 28.
(12) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 37.
(13) GU n. L 48 del 22. 2. 1992, pag. 46.
(14) GU n. L 204 del 21. 7. 1992, pag. 13.
(15) GU n. L 204 del 21. 7. 1992, pag. 22.
(16) GU n. L 247 del 27. 8. 1992, pag. 1.
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autorità canadesi un lasso di tempo sufficiente per introdurre il nuovotest nel loro programma di routine;
considerando che inoltre, sulla scorta dei recenti progressi epidemiolo-
gici della febbre catarrale, può essere ora autorizzata l’importazione disperma bovino dall’Australia;
considerando che la situazione sanitaria degli animali nei paesi terzi
indicati nell’elenco risulta essere buona e controllata da servizi veteri-nari ben strutturati ed organizzati per quanto riguarda le malattietrasmissibili attraverso lo sperma;
considerando che le competenti autorità veterinarie dei paesi terzi di cui
all’elenco si sono impegnate a comunicare alla Commissione e agli Statimembri, per telex o telefax entro le 24 ore successive, la conferma dellacomparsa di una delle malattie indicate nell’elenco A dell’Ufficio inter-nazionale delle epizoozie (UIE) ovvero qualsiasi modifica deiprogrammi di vaccinazione relativi alle suddette malattie oppure, intempo opportuno, la comparsa di malattie elencate nell’elenco Bdall’UIE nonché le eventuali proposte di modifica delle norme inmateria di importazione di animali domestici o di loro sperma oembrioni;
considerando che le competenti autorità veterinarie dei paesi terzi indi-
cati si sono impegnate a controllare ufficialmente il rilascio dei certifi-cati previsti dalla presente decisione e a garantire che tutti i pertinenticertificati, le deroghe ed i risultati di laboratorio sui quali è basata lacertificazione siano conservati su un registro ufficiale almeno per i 12mesi successivi alla spedizione dello sperma cui si riferiscono;
considerando che le competenti autorità veterinarie dei paesi terzi indi-
cati nell’elenco si sono impegnate a riconoscere ufficialmente i centri diraccolta di sperma bovino destinato all’esportazione nella Comunitàeuropea come previsto all’articolo 9 della direttiva 88/407/CEE;
considerando che le norme sanitarie e di certificazione veterinaria
devono essere adeguate alla situazione sanitaria degli animali nel paeseterzo in questione;
considerando che le misure previste dalla presente decisione sono
conformi al parere del comitato permanente veterinario,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:
Articolo 1
Gli Stati membri autorizzano le importazioni di sperma bovino solo se
accompagnate da certificati conformi ai modelli di cui alla parte 1 degliallegati A, B ,CeDe solo se provenienti dai paesi terzi indicati
rispettivamente nella parte 2 degli allegati A, B ,CeD .
Tuttavia, essi autorizzano fino al 31 dicembre 1994 l’importazione in
provenienza dal Canada di sperma bovino raccolto e trattato conforme-mente alla decisione 91/549/CEE.
Articolo 2
Le decisioni 91/479/CEE, 92/123/CEE, 92/124/CEE, 92/125/CEE, 92/
126/CEE, 92/127/CEE, 92/128/CEE, 92/386/CEE, 92/387/CEE e 92/445/CEE sono abrogate. La decisione 91/549/CEE è abrogata dal 1
o
gennaio 1995.
Articolo 3
Le disposizioni dell’articolo 1, primo comma riguardanti il Canada si
applicano a decorrere dal 1ogennaio 1995.
Articolo 4
Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.
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ALLEGATO A
PARTE 1
CERTIFICATO DI POLIZIA SANITARIA
per l’importazione di sperma bovino

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13. Il sottoscritto veterinario ufficiale, in perfetta conoscenza delle disposizioni della direttiva 88/407/CEE de l
Consiglio modificata, certifica che:
a) ............................................................................................................................. .....
(nome del paese esportatore)
è stato indenne da peste bovina e da afta epizootica negli ultimi 12 mesi precedenti la raccolta dello sperm a
da esportare e sino alla data della sua spedizione; in questo stesso periodo non sono state praticat e
vaccinazioni contro le suddette malattie;
b) il centro di raccolta di sperma presso il quale è stato raccolto lo sperma da esportare:
i) è stato autorizzato conformemente all’allegato A, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) ha operato ed è stato controllato conformemente all’allegato A, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
iii) è stato indenne da rabbia, tubercolosi, brucellosi, antrace e pleuropolmonite contagiosa dei bovini ne l
periodo avente inizio 30 giorni prima della data di raccolta dello sperma da esportare e avente termin e
30 giorni dopo la raccolta (in caso di sperma fresco, sino al giorno della spedizione);
c) i bovini presenti nel centro di raccolta dello sperma:
i) provengono da allevamenti e/o sono nati da genitrici che soddisfano le condizioni specificat e
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) sono stati sottoposti, prima del loro isolamento, ai test specificati nell’allegato B, capitolo I dell a
direttiva 88/407/CEE;
iii) hanno soddisfatto i requisiti relativi all’isolamento precedente la loro entrata e relativi ai test specificat i
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
iv) sono stati sottoposti, qualora residenti da almeno un anno nel centro, ai test di routine conformement e
all’allegato B, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
d) lo sperma da esportare:
i) è stato ottenuto da donatori che hanno soggiornato in
.............................................................................................................................
(nome del paese esportatore)
durante i 6 mesi immediatamente precedenti la raccolta dello sperma destinato all’esportazione e ch e
soddisfano alle condizioni specificate nell’allegato C della direttiva 88/407/CEE;
ii) è stato ottenuto da donatori che:
— si trovano in un centro di raccolta nel quale tutti i bovini, nei 12 mesi precedenti la raccolta dell o
sperma destinato all’esportazione, sono stati sottoposti con esito negativo ad un test di sieroneutra -
lizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva (1),
oppure
— risultano negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvo -
vaginite pustolosa infettiva effettuato nei 12 mesi precedenti la raccolta dello sperma destinat o
all’esportazione (1),
oppure
— risultano sieropositivi dopo essere stati vaccinati a norma dell’allegato B, capitolo II della direttiv a
88/407/CEE e sono risultati negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa effettuato nel centr o
riconosciuto di raccolta di sperma prima della vaccinazione (1);
(1) Cancellare la voce non pertinente.
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►(1)◄
►(2)◄
iii) è stato trattato, conservato e trasportato in condizioni soddisfacenti al disposto della direttiva 88 /
407/CEE.
Fatto a...........................................................,
(luogo)il .................................................................
(data)
/SS74(Timbro) (2)Firma (2): .............................................................................
Nome (in stampatello): ............................................................
Qualifica ufficiale: ..................................................................
►(2)◄
(2) Il colore della firma e del timbro deve essere differente da quello del testo stampato.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTE 2
Elenco di paesi autorizzati ad usare il modello di certificato di polizia
sanitaria di cui all’allegato A, parte 1
REPUBBLICA CECAUNGHERIANUOVA ZELANDAPOLONIAROMANIASVIZZERAREPUBBLICA SLOVACCA
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ALLEGATO B
PARTE 1
CERTIFICATO DI POLIZIA SANITARIA
per l’importazione di sperma bovino proveniente dagli Stati Uniti d’America

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13. Il sottoscritto veterinario ufficiale, in perfetta conoscenza delle disposizioni della direttiva 88/407/CEE de l
Consiglio modificata, certifica che:
a) ............................................................................................................................. .....
(nome del paese esportatore)
è stato indenne da peste bovina e da afta epizootica negli ultimi 12 mesi precedenti la raccolta dello sperm a
da esportare e sino alla data della sua spedizione; in questo stesso periodo non sono state praticat e
vaccinazioni contro le suddette malattie;
b) il centro di raccolta di sperma presso il quale è stato raccolto lo sperma da esportare:
i) è stato autorizzato conformemente all’allegato A, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) ha operato ed è stato controllato conformemente all’allegato A, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
iii) è stato indenne da rabbia, tubercolosi, brucellosi, antrace e pleuropolmonite contagiosa dei bovini ne l
periodo avente inizio 30 giorni prima della data di raccolta dello sperma da esportare e avente termin e
30 giorni dopo la raccolta (in caso di sperma fresco, sino al giorno della spedizione);
c) i bovini presenti nel centro di raccolta dello sperma:
i) provengono da allevamenti e/o sono nati da genitrici che soddisfano le condizioni specificat e
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) sono stati sottoposti, prima del loro isolamento, ai test specificati nell’allegato B, capitolo I dell a
direttiva 88/407/CEE;
iii) hanno soddisfatto i requisiti relativi all’isolamento precedente la loro entrata e relativi ai test specificat i
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
iv) sono stati sottoposti, qualora residenti da almeno un anno nel centro, ai test di routine conformement e
all’allegato B, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
d) lo sperma da esportare:
i) è stato ottenuto da donatori che hanno soggiornato in
.............................................................................................................................
(nome del paese esportatore)
durante i 6 mesi immediatamente precedenti la raccolta dello sperma destinato all’esportazione e ch e
soddisfano alle condizioni specificate nell’allegato C della direttiva 88/407/CEE;
ii) è stato ottenuto da donatori che:
— si trovano in un centro di raccolta nel quale tutti i bovini, nei 12 mesi precedenti la raccolta dell o
sperma destinato all’esportazione, sono stati sottoposti con esito negativo ad un test di sieroneutra -
lizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva (1),
oppure
— risultano negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvo -
vaginite pustolosa infettiva effettuato nei 12 mesi precedenti la raccolta dello sperma destinat o
all’esportazione (1),
oppure
— risultano sieropositivi dopo essere stati vaccinati a norma dell’allegato B, capitolo II della direttiv a
88/407/CEE e sono risultati negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa effettuato nel centr o
riconosciuto di raccolta di sperma prima della vaccinazione (1);
(1) Cancellare la voce non pertinente.
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►(1)◄
►(2)◄
iii) è stato trattato, conservato e trasportato in condizioni soddisfacenti al disposto della direttiva 88 /
407/CEE;
iv) è stato ottenuto da tori che sono stati sottoposti in un laboratorio riconosciuto per due volte e non d a
oltre 12 mesi ai seguenti test preraccolta e postraccolta con risultato negativo (il test postraccolt a
dev’essere effettuato su un campione di sangue prelevato dopo almeno 21 giorni dopo la raccolta dell o
sperma da esportare):
— prova di arresto Elisa per la febbre catarrale conformemente all’allegato E;
— reazione di immunodiffusione su gel di agar conformemente all’allegato E e prova di neutralizza -
zione del virus per tutti i sierotipi di malattia emorragica epizootica (EHD) riscontrati nel paes e
esportatore.
Fatto a...........................................................,
(luogo)il .................................................................
(data)
/SS74(Timbro) (2)Firma (2): .............................................................................
Nome (in stampatello): ............................................................
Qualifica ufficiale: ..................................................................
►(2)◄
(2) Il colore della firma e del timbro deve essere differente da quello del testo stampato.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTE 2
Elenco di paesi autorizzati ad usare il modello di certificato di polizia
sanitaria di cui all’allegato B, parte 1
STATI UNITI D’AMERICA
1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 12
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ALLEGATO C
PARTE 1
CERTIFICATO DI POLIZIA SANITARIA
per l’importazione di sperma bovino

1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 13
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13. Il sottoscritto veterinario ufficiale, in perfetta conoscenza delle disposizioni della direttiva 88/407/CEE de l
Consiglio modificata, certifica che:
a) ............................................................................................................................. .....
(nome del paese esportatore)
è stato indenne da peste bovina e da afta epizootica negli ultimi 12 mesi precedenti la raccolta dello sperm a
da esportare e sino alla data della sua spedizione; in questo stesso periodo non sono state praticat e
vaccinazioni contro le suddette malattie;
b) il centro di raccolta di sperma presso il quale è stato raccolto lo sperma da esportare:
i) è stato autorizzato conformemente all’allegato A, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) ha operato ed è stato controllato conformemente all’allegato A, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
iii) è stato indenne da rabbia, tubercolosi, brucellosi, antrace e pleuropolmonite contagiosa dei bovini ne l
periodo avente inizio 30 giorni prima della data di raccolta dello sperma da esportare e avente termin e
30 giorni dopo la raccolta (in caso di sperma fresco, sino al giorno della spedizione);
c) i bovini presenti nel centro di raccolta dello sperma:
i) provengono da allevamenti e/o sono nati da genitrici che soddisfano le condizioni specificat e
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) sono stati sottoposti, prima del loro isolamento, ai test specificati nell’allegato B, capitolo I dell a
direttiva 88/407/CEE;
iii) hanno soddisfatto i requisiti relativi all’isolamento precedente la loro entrata e relativi ai test specificat i
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
iv) sono stati sottoposti, qualora residenti da almeno un anno nel centro, ai test di routine conformement e
all’allegato B, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
d) lo sperma da esportare:
i) è stato ottenuto da donatori che hanno soggiornato in
.............................................................................................................................
(nome del paese esportatore)
durante i 6 mesi immediatamente precedenti la raccolta dello sperma destinato all’esportazione e ch e
soddisfano alle condizioni specificate nell’allegato C della direttiva 88/407/CEE;
ii) è stato ottenuto da donatori che:
— si trovano in un centro di raccolta nel quale tutti i bovini, nei 12 mesi precedenti la raccolta dell o
sperma destinato all’esportazione, sono stati sottoposti con esito negativo ad un test di sieroneutra -
lizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva (1),
oppure
— risultano negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva /
vulvovaginite pustolosa infettiva effettuato nei 12 mesi precedenti la raccolta dello sperma destinat o
all’esportazione (1),
oppure
— risultano sieropositivi dopo essere stati vaccinati a norma dell’allegato B, capitolo II della direttiv a
88/407/CEE e sono risultati negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa effettuato nel centr o
riconosciuto di raccolta di sperma prima della vaccinazione (1);
(1) Cancellare la voce non pertinente.
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►(1)◄
►(2)◄
iii) è stato trattato, conservato e trasportato in condizioni soddisfacenti al disposto della direttiva 88 /
407/CEE;
iv) è stato ottenuto da tori che:
— si trovano presso il centro riconosciuto il 1oluglio 1994,
oppure
— sono stati ammessi nel centro riconosciuto dopo il 1oluglio 1994 dopo essere stati sottoposti a i
seguenti test per la febbre catarrale e per la malattia emorragica epizootica in un laboratori o
riconosciuto con esito negativo prima della della loro ammissione nel centro e in entrambi i cas i
sono stati sottoposti ogni 6 mesi ai seguenti test in un laboratorio riconosciuto, con esito negativo:— prova di arresto Elisa per la febbre catarrale conformemente all’allegato E;— reazione di immunodiffusione su gel di agar conformemente all’allegato E e prova di neutraliz
-
zazione del virus per tutti i sierotipi di malattia emorragica epizootica (EHD) riscontrati ne l
paese esportatore.
Fatto a...........................................................,
(luogo)il .................................................................
(data)
/SS74(Timbro) (2)Firma (2): .............................................................................
Nome (in stamptello): .. ............................................................
Qualifica ufficiale: ..................................................................
►(2)◄
(2) II colore della firma e del timbro deve essere differente da quello del testo stampato.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 15
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PARTE 2
Elenco di paesi autorizzati ad usare il modello di certificato di polizia
sanitaria di cui all’allegato C, parte 1
CANADA: esclusa la regione Okanagan Valley della Columbia Britannica,
regione deliminatata da una linea tracciata da un punto sulla fron-tiera tra Canada e Stati Uniti longitudine 120 °15 /prime1latitudine 49 °
verso nord ad un punto longitudine 119 °35 /prime1latitudine 50 °30 /prime1verso
nordest ad un punto longitudine 119 °latitudine 50 °45 /prime1verso sud ad
un punto sulla frontiera tra Canada e Stati Uniti longitudine 118 °15 /prime1
latitudine 49 °.
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ALLEGATO D
PARTE 1
CERTIFICATO DI POLIZIA SANITARIA
per l’importazione di sperma bovino

1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 17
▼B
13. Il sottoscritto veterinario ufficiale, in perfetta conoscenza delle disposizioni della direttiva 88/407/CEE de l
Consiglio modificata, certifica che:
a) ............................................................................................................................. .....
(nome del paese esportatore)
è stato indenne da peste bovina e da afta epizootica negli ultimi 12 mesi precedenti la raccolta dello sperm a
da esportare e sino alla data della sua spedizione; in questo stesso periodo non sono state praticat e
vaccinazioni contro le suddette malattie;
b) il centro di raccolta di sperma presso il quale è stato raccolto lo sperma da esportare:
i) è stato autorizzato conformemente all’allegato A, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) ha operato ed è stato controllato conformemente all’allegato A, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
iii) è stato indenne da rabbia, tubercolosi, brucellosi, antrace e pleuropolmonite contagiosa dei bovini ne l
periodo avente inizio 30 giorni prima della data di raccolta dello sperma da esportare e avente termin e
30 giorni dopo la raccolta (in caso di sperma fresco, sino al giorno della spedizione);
c) i bovini presenti nel centro di raccolta dello sperma:
i) provengono da allevamenti e/o sono nati da genitrici che soddisfano le condizioni specificat e
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
ii) sono stati sottoposti, prima del loro isolamento, ai test specificati nell’allegato B, capitolo I dell a
direttiva 88/407/CEE;
iii) hanno soddisfatto i requisiti relativi all’isolamento precedente la loro entrata e relativi ai test specificat i
nell’allegato B, capitolo I della direttiva 88/407/CEE;
iv) sono stati sottoposti, qualora residenti da almeno un anno nel centro, ai test di routine conformement e
all’allegato B, capitolo II della direttiva 88/407/CEE;
d) lo sperma da esportare:
i) è stato ottenuto da donatori che hanno soggiornato in
.............................................................................................................................
(nome del paese esportatore)
durante i 6 mesi immediatamente precedenti la raccolta dello sperma destinato all’esportazione e ch e
soddisfano alle condizioni specificate nell’allegato C della direttiva 88/407/CEE;
ii) è stato ottenuto da donatori che:
— si trovano in un centro di raccolta nel quale tutti i bovini, nei 12 mesi precedenti la raccolta dell o
sperma destinato all’esportazione, sono stati sottoposti con esito negativo ad un test di sieroneutra -
lizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva (1),
oppure
— risultano negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa per la rinotracheite bovina infettiva/vulvo -
vaginite pustolosa infettiva effettuato nei 12 mesi precedenti la raccolta dello sperma destinat o
all’esportazione (1),
oppure
— risultano sieropositivi dopo essere stati vaccinati a norma dell’allegato B, capitolo II della direttiv a
88/407/CEE e sono risultati negativi al test di sieroneutralizzazione o Elisa effettuato nel centr o
riconosciuto di raccolta di sperma prima della vaccinazione (1);
(1) Cancellare la voce non pertinente.
1994D0577 — IT — 05.07.1999 — 001.001 — 18
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►(1)◄
►(2)◄
iii) è stato trattato, conservato e trasportato in condizioni soddisfacenti al disposto della direttiva 88 /
407/CEE;
iv) è stato ottenuto da tori che sono stati sottoposti in un laboratorio riconosciuto per due volte e non d a
oltre 12 mesi ai seguenti test preraccolta e postraccolta con esito negativo (il test postraccolt a
dev’essere effettuato su un campione di sangue prelevato dopo almeno 21 giorni dopo la raccolta dell o
sperma da esportare):
— prova di arresto Elisa per la febbre catarrale conformemente all’allegato E;
— reazione di immunodiffusione su gel di agar conformemente all’allegato E e prova di neutralizza -
zione del virus per tutti i sierotipi di malattia emorragica epizootica (EHD) riscontrati nel paes e
esportatore;
— test di sieroneutralizzazione per il virus di Akabane.
Fatto a...........................................................,
(luogo)il .................................................................
(data)
/SS74(Timbro) (2)Firma (2): .............................................................................
Nome (in stampatello): ............................................................
Qualifica ufficiale: ..................................................................
►(2)◄
(2) Il colore della firma e del timbro deve essere differente da quello del testo stampato.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTE 2
Elenco di paesi autorizzati ad usare il modello di certificato di polizia
sanitaria di cui all’allegato D, parte 1
AUSTRALIA
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ALLEGATO E
Protocollo relativo a un saggio di immunoassorbimento enzimatico bloccante
o competitivo eseguito con un anticorpo monoclonale specifico del gruppo
per la ricerca degli anticorpi del virus della febbre catarrale maligna
SAGGIO COMPETITIVO ELISA PER LA FEBBRE CATARRALE
MALIGNA MEDIANTE ANTICORPO MONOCLONALE 3-17-A3
Il saggio è atto a individuare anticorpi di tutti i sierotipi noti del virus della
febbre catarrale maligna (BTV).
Il principio su cui si basa detto saggio è l’interruzione della reazione tra l’anti-
gene BTV e un anticorpo monoclonale specifico del gruppo (3-17-A3) medianteaggiunta di diluizioni del siero in esame. Gli anticorpi del BTV presenti nel sieroin esame bloccano la reattività dell’anticorpo monoclonale (Mab) e determinanouna riduzione dello sviluppo di colore previsto dietro aggiunta di un substratoenzimatico.
MATERIALE E REATTIVI
1. Piastre per microtitolazioni a fondo piatto.
2. Antigene: preparato come descritto qui di seguito.3. Tampone di arresto: latte essiccato in polvere «Marvel» a l 5 % (p/v), Tween-
20 (fornito come sciroppo al poliossietilen-sorbitan-monolaurato) in soluzionesalina tamponata al fosfato.
4. Anticorpo monoclonale: 3-17-A3 (fornito come supernatante di coltura tissu-
lare di ibridoma) conservato a −20 °C o surgelato, diluito a 1/50 con tampone
bloccante prima dell’uso, diretto contro il polipeptide p7 specifico del gruppo.
5. Coniugato: globulina di coniglio anti-topo (absorbita ed eluita), coniugata con
perossidasi del rafano e tenuta al buio a 4 °C.
6. Substrato e cromogeno: 0,2 g di ortofenilendiamina (OPD) sciolta in un
tampone costituito da 2,553 g di acido critico e 4,574 g di idrogenortofosfatodisodico (fosfato monoacido di sodio) portati a un volume di 500 ml conacqua distillata, divisi in aliquote di 25 ml e tenuti al buio a − 20 °C con 12
µl/25 ml di acqua ossigenata (30 % p/v) aggiunta immediatamente prima
dell’uso.
TRATTARE L’OPD CON CAUTELA — INDOSSARE GUANTI DI
GOMMA — SOSPETTO MUTAGENO
7. Acido solforico 1 molare: 26,6 ml di acido aggiunti a 473,4 ml di acqua
distillata.
RICORDARSI DI AGGIUNGERE SEMPRE L’ACIDO ALL’ACQUA, MAI
L’ACQUA ALL’ACIDO
8. Agitatore orbitale.9. Lettore di piastra Elisa (la prova può essere letta visivamente).
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SCHEMA DELLA PROVA
PROTOCOLLO DI RIFERIMENTO
Controllo in bianco
La serie 1A - H è un termine di controllo in bianco consistente in antigene BTV
e coniugato. Essa può essere usata come bianco per il lettore Elisa.
Controllo Mab
La serie 2 A-Hèu n termine di controllo dell’anticorpo monoclonale ed è
costituito da antigene BTV, anticorpo monoclonale e coniugato. Esso rappresentaun termine di controllo negativo. La media delle letture di densità ottica daquesta serie di controllo rappresenta un valore di inibizione pari allo 0 %.
Controllo positivo
La serie 3A - H è un controllo positivo. Essa consiste in antigene BTV,
diluizione di antisiero positivo BTV, Mab e coniugato. Essa sta ad indicare che
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la prova funziona adeguatamente e che livelli analoghi di inibizione dovrebbero
essere ottenuti da prova a prova.
Sieri di riferimento
Nello schema sperimentale di cui sopra 18 sieri possono essere analizzati ad un
tasso di diluizione di 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Ciò fornirà qualche indicazione sultitolo dell’anticorpo nel siero di riferimento. La gamma di diluizione potrebbeessere ulteriormente estesa per ottenere titoli finali della diluizione del siero.Alternativamente, per esami sierologici su vasta scala i sieri potrebbero essereanalizzati a una singola diluizione (1/4 ) o a due diluizioni (1/2 e 1/4) come una
rapida prova di selezione.
PROCEDIMENTO
1. Diluire l’antigene BTV a una concentrazione pretitolata in PBS, sottoporre
brevemente agli ultrasuoni per disperdere il virus aggregato (se gli ultrasuoninon sono disponibili, pipettare vigorosamente) e aggiungere 50 µl in tutti i
pozzetti della piastra Elisa. Picchiettare i bordi della piastra per disperderel’antigene.
2. Incubare a 37 °C per 60 minuti su un agitatore orbitale. Lavare le piastre tre
volte, immergendole e vuotando i pozzetti con PBS non sterile e asciugare sucarta assorbente.
3. Aggiungere 50 µl di tampone bloccante per pozzetto. Aggiungere i sieri di
riferimento ed il siero positivo negli opportuni pozzetti e diluire attraverso lapiastra usando una pipetta a più canali. Non aggiungere i sieri al controllo inbianco o al controllo del Mab.
4. Immediatamente dopo l’aggiunta dei sieri di riferimento, diluire il Mab in
tampone bloccante (alla diluizione pretitolata) ed aggiungere 50 µl a tutti i
pozzetti della piastra, eccettuato il controllo in bianco.
5. Incubare a 37 °C per 60 minuti su un agitatore orbitale. Lavare tre volte con
PBS e asciugare.
6. Diluire il concentrato di coniglio anti-topo a 1/5 000in tampone bloccante ed
aggiungere 50 µl a tutti i pozzetti della piastra.
7. Incubare a 37 °C per 60 minuti su agitatore orbitale. Lavare tre volte con PBS
e asciugare.
8. Sgelare l’OPD e immediatamente prima dell’uso aggiungere 12 µl di acqua
ossigenata al 30 % a ogni porzione di 25 ml di OPD. Aggiungere 50 µl a tutti
i pozzetti della piastra. Lasciar sviluppare il colore per circa 10 minuti einterrompere la reazione con acido solforic o1M( 5 0 µl per pozzetto). Il
colore dovrebbe svilupparsi nei pozzetti di controllo del Mab ed in queipozzetti che contengono siero nel quale NON vi sono anticorpi del BTV.
9. Esaminare e registrare le piastre visivamente oppure facendo uso di un lettore
spettrofotometrico.
ANALISI DEI RISULTATI
Calcolare la lettura media OD dai termini di riferimento Mab. Essa rappresenta
un valore di inibizione dello 0 %. Le letture di densità ottica (OD) dei sieri diriferimento vengono espresse come valori di inibizione percentuali usando laseguente formula:
Valore di inibizione percentuale = 100 − OD in presenza di siero di riferimen-
toOD in assenza di siero di riferimento × 100
Valori di inibizione superiori al 4 0 % a una diluizione di siero di 1/4 vengono
considerati positivi. La lettura visiva è possibile, dato che una inibizione del 40% è il valore più basso facilmente apprezzabile dall’occhio.
PREPARAZIONE DELL’ANTIGENE ELISA BTV
1. Lavare 10 unità di cellule confluenti BHK-21 tre volte con mezzo di Eagle
esente da siero ed infettare con sierotipo 1 del virus della febbre catarralemaligna in mezzo di Eagle esente da siero.
2. Incubare a 37 °C ed esaminare quotidianamente l’effetto citopatico (cpe).
3. Quando il cpe è evidente nell’80-90 % dello strato di cellule di ciascuna
unità, raccogliere il virus scuotendo dal recipiente eventuali cellule ancoraattaccate.
4. Centrifugare a 2 000-3 000 giri al minuto per agglomerare le cellule.5. Allontanare il supernatante e risospendere le cellule in circa 30 ml di PBS
contenente l’1 % di «Sarkosyl »e2m ld i fenilmetilsolfonilfluoruro (tampone
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di lisi). Ciò può far sì che le cellule formino un gel ed è possibile aggiungere
più tampone di lisi per ridurre questo effetto.
NOTA.Il fenilmetilsolfonilfluoruro è pericoloso: trattare con estrema
cautela.
6. Frantumare le cellule per 60 secondi usando una sonda ultrasonica ad una
ampiezza di 30 micron.
7. Centrifugare a 10 000 giri al minuto per 10 minuti.8. Conservare il supernatant ea+4 °C e risospendere l’agglomerato di cellule
in 10-20 ml di tampone di lisi.
9. Sottoporre ad ultrasuoni e chiarificare, conservando il supernatante ogni
volta, per un totale di tre volte.
10. Raccogliere i supernatanti e centrifugare a 24 000 giri al minuto per 120
minuti a + 4 °C sopra uno strato costituito da 5 ml di saccarosio al 40 % (p/v
in PBS) usando provette da centrifuga Beckmann da 30 ml ed un rotore SW28.
11. Eliminare il supernatante, asciugare accuratamente le provette e risospendere
l’agglomerato in PBS mediante ultrasuoni. Conservare l’antigene in varieporzioni a − 70 °C.
TITOLAZIONE DELL’ANTIGENE ELISA BTV
L’antigene Elisa per la febbre catarrale maligna viene titolato mediante Elisa
indiretto. Diluizioni doppie di antigene vengono titolate rispetto a una diluizionecostante (1/50) di anticorpo monoclonale 3-17-A3. Il protocollo è il seguente:
PROCEDIMENTO
1. Diluire l’antigene BTV in PBS attraverso una piastra di microtitolazione in
una serie di diluizioni doppie (50 µl/pozzetto) usando una pipetta a molti
canali.
2. Incubare per un’ora a 37 °C su un agitatore orbitale.
3. Lavare le piastre tre volte con PBS.4. Aggiungere 50 µl di anticorpo monoclonale 3-17-A3 (diluito a 1/50) in
ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione.
5. Incubare per un’ora a 37 °C su agitatore orbitale.
6. Lavare tre volte le piastre con PBS.7. Aggiungere 50 µl di globulina di coniglio anti-topo coniugata con perossidasi
di rafano, diluita a una concentrazione ottimale pretitolata, in ciascun pozzettodella piastra di microtitolazione.
8. Incubare per un’ora a 37 °C su agitatore orbitale.
9. Aggiungere substrato e cromogeno come descritto in precedenza. Arrestare la
reazione dopo 10 minuti aggiungendo acido solforico 1 Molare (50 µl/
pozzetto).
Nella prova competitiva l’anticorpo monoclonale deve essere in eccesso, per cui
viene scelta una diluizione di antigene tale da ricadere sulla curva di titolazione(non sulla zona piatta) e da dare approssimativamente un valore di 0,8 OD dopo10 minuti.
Protocollo per una reazione di immunodiffusione su gel di agar per la
ricerca degli anticorpi della malattia emorragica epizootica
La reazione di immunodiffusione su gel di agar viene effettuata secondo il
seguente protocollo:
MATERIALI E REATTIVI
1. Antigene
L’antigene precipitante viene preparato in qualsiasi sistema di coltura cellu-
lare che favorisce la rapida moltiplicazione del (dei) sierotipo(i) opportuno(i)del virus della malattia emorragica epizootica. Si raccomandano le celluleBHK oppure Vero. L’antigene è presente nel liquido supernatante alla finedella crescita virale, ma richiede una concentrazione da 50 a 100 volte perpoter agire. Ciò può essere ottenuto mediante qualsiasi procedura standard diconcentrazione delle proteine; il virus dell’antigene può essere inattivatomediante aggiunta di beta-propiolattone allo 0,3 % (v/v).
2. Siero di controllo positivo noto
Facendo uso del siero di riferimento internazionale e dell’antigene viene
prodotto un nuovo siero di riferimento nazionale. Questo viene standardizzatoper trovare la proporzione ottimale rispetto al siero di riferimento internazio-
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nale, viene liofilizzato e usato in ciascuna prova come siero di riferimento
noto.
3. Siero in esame.
PROCEDIMENTO
1. Versare agarosio all’1 %, preparato in tampone borato o sodio barbital, pH
8,5-9,0, in una scatola di Petri a una profondità minima di 3 mm.
2. Ricavare nell’agar 7 pozzetti esenti da umidità, ciascuno avente 5,0 mm di
diametro. Di questi pozzetti uno deve trovarsi in centro e sei altri devonoessere sistemati attorno ad esso in un cerchio avente un raggio di 3 mm.
3. Riempire il pozzetto centrale di antigene standard. Riempire i pozzetti perife-
rici 2,4e6c o n siero positivo noto ed i pozzetti 1 ,3e5c o l siero in esame.
4. Incubare il sistema fino a 72 ore a temperatura ambiente in atmosfera confi-
nata ed umida.
INTERPRETAZIONE
Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di precipitine con
l’antigene e una linea completa di identità col siero di riferimento. Un siero inesame è negativo se non forma una linea specifica con l’antigene e se nonprovoca l’incurvamento della linea del siero di riferimento. Le scatole di Petridevono essere esaminate su sfondo scuro e usando illuminazione indiretta.