1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 1
Trattandosidiunsemplicestrumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B QUARTADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del5dicembre1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolliufficialideglialimentiperglianimali
(73/46/CEE)
(GU L 83 del 30.3.1973, pag. 21)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva81/680/CEE dellaCommissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Direttiva92/89/CEE dellaCommissione del 3 novembre 1992 L 344 35 26.11.1992
►M3Direttiva98/54/CE dellaCommissione del 16 luglio 1998 L 208 49 24.7.1998
▼B
QUARTADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del5dicembre1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolli ufficialidegli
alimentiperglianimali
(73/46/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
vistaladirettivadel Consiglio, del 20 luglio 1970, concernente l'intro-
duzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisi
comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali(1),
modificata dalla direttiva n. 72/275/CEE del 20 luglio 1972(2), in parti-
colare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali destinati a constatare l'osservanza delle
condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per gli animali, siano effettuati secondo i modi di preleva-mento di campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive n. 71/250/CEE, n. 71/393/CEE e n. 72/
199/CEE dellaCommissione, del 15 giugno 1971(
3), del 18 novembre
1971(4) e del 27 aprile 1972(5) hanno già fissato un certo numero di
metodi di analisi comunitari; che, tenuto conto dello stato d'avanza-
mento dei lavori sin qui effettuati, è necessario adottare una quarta
serie di metodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del Comitato permanente degli alimenti per gli
animali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il contenuto in umidità deigrassi e degli oli animali e vegetali e per quanto riguarda i contenuti in
magnesio e con cellulosa grezza degli alimenti, siano effettuate
secondo i metodi descritti all' allegato I della presente direttiva.
Articolo 2
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il loro contenuto in reti-nolo (vitamina A), ►
M3 ◄siano effettuate secondo i
metodi descritti all'allegato II della presente direttiva.
Articolo 3
Gli Stati membri mettono in vigore, non oltre il 1ogennaio 1974, le
disposizioni legislative, regolamentari o amministrative necessarie per1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag 2.
(2) GU n. L 171 del 29. 7. 1972, pag. 39.
(3) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(4) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.
(5) GU n. L 123 del 29. 5. 1972, pag. 6.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano
immediatamente la Commissione.
Articolo 4
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 3
▼B
ALLEGATO I
1.DETERMINAZIONE DELL'UMIDITÀ NEI GRASSI E NEGLI OLI
ANIMALIEVEGETALI
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto in umidità (acqua ed altre
materie volatili) dei grassi e degli oli animali e vegetali.
2.Principio
Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103ºC fino a cessazione della
diminuzione di massa. La perdita di massa viene determinata per pesata.
3.Apparecchiatura
3.1. Recipiente a fondo piano, di materiale resistente alla corrosione,
diametro: da cm 8 a 9, altezza: circa cm 3
3.2. Termometro a mercurio con bulbo rinforzato e camera di espansione
all'estremità superiore, graduato da circa 80ºC ad almeno 110ºC,
lunghezza: circa cm 10.
3.3. Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante
3.4. Essiccatore, contenente un efficace disidratante3.5. Bilancia analitica
4.Mododioperare
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, circa g 20 del campione omogeneiz-
zato nel recipiente (3.1), essiccato e tarato, contenente il termometro (3.2).
Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante (3.3), agitando
continuamente con il termometro, in modo da far salire la temperatura a
90ºC in circa7 minuti.
Ridurre l'intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le
bolle risalgono dal fondo del recipiente. La temperatura non deve superare i
105ºC. Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando
non si formano più bolle.
Per assicurare l'eliminazione completa dell'umidità, riscaldare più volte a
103ºC ± 2ºC, raffreddando a 93ºC tra i riscaldamenti successivi. Lasciar
quindi raffreddare nell'essiccatore (3.4), sino a temperatura ambiente e
pesare. Ripetere l'operazione fino a quando la perdita di massa tra due pesate
successive non superamg 2.
N.B.Un aumento della massa del campione dopo i ripetuti riscaldamenti
indica un'ossidazione del grasso. In questo caso, calcolare il risultato
basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che la massa
abbia incominciato ad aumentare.
5.Calcolodeirisultati
Il contenuto in umidità, in per cento del campione, è dato dalla seguente
formula:
(M
1−M2)·Mo100
in cui:M
o= massa, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi
M1= massa, in grammi, del recipiente con il suo contenuto prima del
riscaldamento
M2= massa, in grammi, del recipiente con il suo contenuto dopo il riscal-
damento.
I risultati inferiori a 0,05 % debbono essere riportati con la dizione «meno di
0,05 %».
Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele, effettuate sullo
stesso campione, non deve oltrepassare 0,05 % in valore assoluto.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 4
▼B
2.DETERMINAZIONEDELMAGNESIO
— per spettrofotometria d'assorbimento atomico —
1.Scopoecampodiapplicazione
Il metodo permette di determinare il magnesio nei mangimi. Esso è partico-
larmente adatto per determinare i contenuti di magnesio inferiori al 5 %.
2.Principio
Il campione viene incenerito e sciolto nell'acido cloridrico diluito. Se non
contiene sostanze organiche, viene sciolto direttamente all'acido cloridrico
diluito. Lasoluzione viene diluitae il contenuto di ma gnesio viene determi-
nato con la spettrofotometria d'assorbimento atomico a 285,2 nm, per
raffronto con soluzioni tipo.
3.Reattivi
3.1. Acido cloridrico p.a., d: 1,163.2. Acido cloridrico p.a., d: 1,19
3.3. Magnesio, in nastro o filo, o solfato di magnesio MgSO
4·7H2O p.a.
essiccato nel vuoto a temperatura ambiente
3.4. Soluzione di sale di stronzio (cloruro o nitrato) al 2,5 % (p/v) di stronzio
(= 76,08 g di SrCl2·6H2O p.a./1 o 60,38 g di Sr (NO3)2p.a./1).
3.5. Soluzione tipo di magnesio: pesare, con la precisione di mg 1, g 1 di
magnesio (3.3) liberato con cura della pellicola di ossido od una quantità
corrispondente di solfato di magnesio (3.3), introdurlo in un pallone
tarato da ml 1 000, aggiungere ml 80 di acido cloridrico (3.1), lasciare
sciogliere e portare a ml 1 000 aggiungendo acqua; ml 1 di tale solu-
zione contiene mg 1,000 di magnesio.
4.Apparecchiatura
4.1. Crogiolo da incenerimento di platino, quarzo o porcellana
4.2. Forno elettrico a muffola, provvisto di termostato4.3. Spettrofotometro d'assorbimento atomico
5.Mododioperare
5.1Preparazione della soluzione
5.1.1.Alimenti costituiti esclusivamente da sostanze minerali
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 5 del campione, intro-
durli in un pallone tarato da ml 500 con ml 250 a 300 d'acqua.
Aggiungere ml 40 di acido cloridrico (3.1). Portare ad ebollizionee lasciare bollire lentamente il liquido per 30 minuti. Lasciare
raffreddare, portare a volume con acqua, mescolare e filtrare su
filtro di carta a pieghe asciutto. Scartare i primi ml 30 di filtrato.
In presenza di silice trattare g 5 di campione con una quantità
sufficiente (ml 15 a 30) di acido cloridrico (3.2) ed evaporare a
secco a bagnomaria. Proseguire come indicato in 5.1.2 a partire
dal 3º periodo.
5.1.2.Alimenti costituiti essenzialmente da sostanze minerale
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 5 del campione in un
crogiolo daincenerimento ed incenerire a550ºC in un forno a
muffola, sino ad ottenere ceneri esenti da particelle carboniose.
Per eliminare la silice, aggiungere alle ceneri una quantità suffi-
ciente (ml 15 a 30) di acido cloridrico (3.2), ed evaporare a
secco su bagnomaria. Essiccare poi per un'ora in stufa a 105ºC.
Riprendere il residuo con ml 10 di acido cloridrico (3.1) e trasfe-
rire, mediante acqua calda, in pallone tarato da ml 500. Portare
all'ebollizione, lasciar raffreddare e portare a volume con acqua.
Mescolare e filtrare su filtro di carta asciutto in un bicchiere
asciutto. Scartare i primi ml 30 di filtrato.
5.1.3.Alimenti costituiti essenzialmente da sostanze organiche
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 5 del campione in un
crogiolo daincenerimento e incenerire a550ºC in un forno a
muffola, sino a ottenere ceneri esenti da particelle carboniose.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 5
▼B
Riprendere le ceneri con ml 5 di acido cloridrico (3.2), evaporare
a secco in bagno maria ed essiccare quindi per un'ora in una stufa
a105ºC per insolubilizza re lasilice. Riprendere il residuo con ml
5 di acido cloridrico (3.1), trasferire, con l'ausilio di acqua calda,
in un pallone tarato da ml 250, portare all'ebollizione, lasciar
raffreddare e portare a volume con acqua. Mescolare e filtrare su
filtro di carta asciutto in un bicchiere asciutto. Scartare i primi ml
30 di filtrato.
5.2Misura dell'assorbimento atomico
Preparare almeno 5 soluzioni di riferimento a concentrazioni crescenti,
scelte in funzione dellazonadi misura zione optimum dello spettrofoto-
metro, diluendo con acqua la soluzione campione (3.5). Aggiungere a
ciascuna soluzione ml 10 di soluzione di sale di stronzio (3.4) e comple-
tare quindi il volume a ml 100 mediante aggiunta d'acqua.
Diluire con acqua una parte del filtrato ottenuto in 5.1.1, 5.1.2 o in 5.1.3
in modo da ottenere una concentrazione di magnesio compresa fra i
limiti di concentrazione delle soluzioni di riferimento. La concentrazione
di acido cloridrico di questa soluzione non deve essere superiore a 0,4 N.
Aggiungere ml 10 di soluzione di sale di stronzio (3.4) e completare
quindi il volume a ml 100 mediante aggiunta d'acqua.
Misurare l'assobimento della soluzione da determinare e delle soluzioni
di riferimento alla lunghezza d'onda di 285,2 nm.
6.Calcolodeirisultati
Determinare la quantità di magnesio del campione riferendosi alle soluzioni
campione. Esprimere il risultato in percento del campione.
Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate su di
uno stesso campione non deve essere superiore al 5 %, in valore relativo.
3.DETERMINAZIONEDELLAFIBRAGREZZA
1.Scopoecampodiapplicazione
Questo metodo rende possibile la determinazione nei mangimi della quota di
sostanza organica, esente da lipidi, insolubile in mezzi acidi e alcalini e
convenzionalmente denominata fibra grezza.
2.Principio
Il campione sgrassato, quando necessario, è trattato in sequenza con soluzioni
bollenti di acido solforico e idrossido di potassio a determinate concetrazioni.
Il residuo è separato per filtrazione su filtro di vetro sinterizzato, lavato,
seccato, pesato ed incenerito tra 475 e 500 ºC. La perdita di peso, dopo ince-
nerimento, corrisponde alla fibra grezza presente nel campione in esame.
3.Reattivi
3.1. Acido solforico, c = 0,13 moli/l.
3.2. Antischiuma(per esempio n-otta nolo).
3.3. Aiuto-filtrazione (Celite 545 o equivalente) trattato a 500 ºC per 4 ore
(8.6).
3.4. Acetone.3.5. Etere di petrolio (per esempio 40-60 ºC).
3.6. Acido cloridrico, c = 0,5 moli/l.
3.7. Idrossido di potassio, c = 0,23 moli/l.
4.Apparecchiature
4.1. Unità al caldo per il trattamento del campione in esame con la soluzione
di acido solforico o di idratato di potassio, munita di un supporto per il
crogiolo filtrante (4.2) e di un condotto con la valvola a più vie per lo
scarico del liquido e per il collegamento al vuoto e possibilmente ad un
sistema di aria compressa.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 6
▼M2
▼M2
Prima dell'uso, ogni giorno, preriscaldare per cinque minuti l'acqua della
caldaia, annessa all'unità per il lavaggio del residuo per il preriscalda-
mento dei reattivi.
4.2. Crogiolo di vetro filtrante, capacità 50 ml con setto di vetro filtrante
sinterizzato di porosità 40-90 ìm, condizionato a 500 ºC per breve
tempo, e raffreddato prima dell'uso.
4.3. Cilindro della capacità di almeno 270 ml portante un refrigerante a rica-
dere per l'ebollizione.
4.4. Stufa di essiccazione con termostato.4.5. Forno amuffolacon termosta to.4.6. Unità di estrazione a freddo consistente di un supporto per il crogiolo
filtrante (4.2) e munita di condotto con valvola per il vuoto e per lo
scarico dei liquidi.
4.7. Anelli di connessione in gomma per collegare all'unità a caldo (4.1) il
crogiolo (4.2) e il cilindro (4.3) e per collegare all'unità di estrazione a
freddo (4.6) il crogiolo.
5.Procedimento
Pesare, con la precisione di 1 mg, 1 g del campione preparato e introdurlo
nel crogiolo (4.2) (vedere le osservazioni 8.1, 8.2 e 8.3) ed aggiungere 1 g
di aiuto-filtrazione (3.3).
Sistemare il crogiolo nell'unità a caldo (4.2), collegarlo poi al cilindro (4.3).
Introdurre nel cilindro a crogiolo, già collegati, 150 ml di acido solforico
(3.1) preriscaldato vicino al punto di ebollizione e poche goccie di anti-
schiuma (3.2). Portare il liquido all'ebollizione entro 5 ± 2 minuti e far
bollire in modo vigoroso esattamente per 30 minuti.
Aprire la valvola di scarico e filtrare l'acido solforico sotto vuoto (4.1) attra-
verso il crogiolo filtrante. Lavare il residuo raccolto sul crogiolo tre volte
consecutive con porzioni di acqua bollente, impiegandone ogni volta 30 ml,
cercare di eliminare sotto vuoto il liquido fino a secchezza dopo ciascun
lavaggio.
Disinserire il vuoto e introdurre 150 ml di idrossido di potassio (3.7) preri-
scaldato vicino al punto di ebollizione, nel cilindro e crogiolo collegati,
aggiungere poche gocce di antischiuma (3.2). Portare il liquido all'ebollizione
5 ± 2 minuti e fare bollire in modo vigoroso esattamente per 30 minuti.
Filtrare e ripetere le operazioni di lavaggio usate per il trattamento con acido
solforico.
Dopo il lavaggio finale e l'essiccazione sotto vuoto, scollegare il crogiolo
contenente il residuo e collegarlo all'unità di estrazione a freddo (4.6). Appli-
care il vuoto e lavare il residuo nel crogiolo 3 volte con acetone (3.4),
impiegandone ogni volta 25 ml. Dopo ciascun lavaggio fare sempre in
modo che tutto il residuo sia raccolto sul filtro, mantenendo il vuoto fino a
completa eliminazione dell'acetone.
Essiccare il crogiolo in stufa a 130 ºC fino a peso costante. Raffreddarlo poi
in essiccatore e pesarlo rapidamente. Trasferire il crogiolo in muffola ed
incenerire il contenuto a475-500 ºC per a lmeno 30 minuti, sino apeso
costante.
Dopo ogni incenerimento raffreddare il crogiolo prima in muffola e poi in
essiccatore prima della pesata.
Eseguire una prova in bianco con solo i reattivi. La perdita di peso risultante
dopo l'incenerimento non deve superare i 4 mg.
6.Calcolodeirisultati
Il contenuto percentuale di fibra grezza nel campione è dato dall'espressione:
b/C0c½/C138 /C2 100
a
dove
a = massa del campione in g.
b = perditadellama ssadopo incenerimento a475-500 ºC del residuo del
campione essiccato a 130 ºC in g.
c = perdita della massa dopo incenerimento del residuo del bianco essic-
cato a 130 ºC in g.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 7
▼M2
7.Ripetibilità
La differenza tra due determinazioni parallelamente effettuate sullo stesso
campione non deve eccedere:
— 0,3 valore assoluto per contenuto in fibra grezza più basso del 10 %,
— 3 % sul risultato più elevato, per contenuto in fibra grezza uguale o
maggiore di 10 %.
8.Osservazioni
8.1. I mangimi contenenti più del 10 % di lipidi grezzi debbono essere,
prima dell'analisi, sgrassati con etere di petrolio (3.5). A tale scopo,
porre il crogiolo (4.2) contenente il campione pesato nell'unità di estra-
zione a freddo (4.6), applicare il vuoto a lavare per tre volte consecutive
con 30 ml di etere di petrolio (3.5). Mantenere il crogiolo sotto vuoto
fino a completa eliminazione del solvente dal campione, e trasferirlo
poi nell'unità di estrazione a caldo (4.1) e continuare come descritto al
punto 5.
8.2. I mangimi, contenenti lipidi che non possono essere estratti direttamente
con etere di petrolio (3.5), debbono essere sgrassati come indicato al
punto 8.1 e sgrassati un'altra volta dopo ebollizione con acido.
Dopo ebollizione con acido e successivo lavaggio, collegare il crogiolo
nell'unità di estrazione a freddo (4.6) e lavarlo tre volte con acetone
impiegandone ogni volta 30 ml. Lavare poi con etere di petrolio sempre
3 volte con aliquote di 30 ml. Mantenere il campione sotto vuoto fino a
completa eliminazione del solvente e continuare l'analisi come descritto
al punto 5 iniziando con il trattamento con idrossido di potassio.
8.3. Se i mangimi contengono più del 5 % di carbonati, espressi come carbo-
nato di calcio, porre il crogiolo contenente il campione (4.2) nell'unità di
estrazione a caldo (4.1) e lavare il campione tre volte con acido clori-
drico (3.6) usando aliquote di 30 ml. Dopo ciascuna addizione lasciare
riposare il campione per almeno 1 minuto prima della filtrazione. Lavare
una volta con acqua e poi continuare come descritto al punto 5.
8.4. Se viene impiegato un apparecchio a più posti (diversi crogioli posti
nellastessaunità aca ldo) non deve essere eseguitanellastessaserie di
analisi la determinazione in doppio dello stesso campione.
8.5. Se dopo ebollizione è difficile filtrare la soluzione acida o basica, intro-
durre aria compressa attraverso il condotto di scarico dell'unità a caldo
proseguendo poi lafiltra zione.
8.6. La temperatura di incenerimento non deve superare i 500 ºC allo scopo
di allungare la vita dei filtri di vetro dei crogioli. Evitare con attenzione
di procurare sbalzi termici durante i cicli di riscaldamento e raffredda-
mento ai crogioli.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 8
▼B
ALLEGATO II
1.DETERMINAZIONEDELRETINOLO(VITAMINAA)
1.Scopoecampodiapplicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto di retinolo (vitamina A) nei
mangimi, nei concentrati e nelle premiscele. Il limite inferiore di determina-
zione è 10 000 UI/kg per gli alimenti fortemente pigmentati, e di 4 000 UI/kg
per gli altri prodotti(1). I prodotti sono suddivisi in due gruppi asecondadel
loro presunto contenuto in retinolo:
Gruppo A: contenuto inferiore a200 000 UI/kg
Gruppo B: contenuto uguale o superiore a 200 000 UI/kg
2.Principio
Il campione viene idrolizzato a caldo con una soluzione di idrossido di
potassio in mezzo etanolico ed in presenza di una sostanza antiossidante o
in atmosfera di azoto. La miscela è estratta con 1,2-dicloroetano. L'estratto
è evaporato a secco e ripreso con etere di petrolio. La soluzione viene croma-
tografata su colonna di ossido di alluminio (per i prodotti di cui al gruppoB
la cromatografia è necessaria solo in alcuni casi). Il retinolo è determinato
per spettrofotometria a 610 nm dopo la formazione di un complesso colorato
con la reazione di Carr-Price, nel caso dei prodotti di cui al gruppo A; per
spettrofotometrianell'UV a325 nm per quelli del gruppo B.
3.Reattivi
a)impiegati per l'analisi dei prodotti di cui ai gruppi A e B
3.1. Etanolo al 96 % (v/v)3.2. Soluzione al 10 % (p/v) di ascorbato di sodio p.a. oppure
3.3. Azoto, purificato
3.4. Soluzione al 50 % (p/v) di idrossido di potassio p.a.3.5. Soluzione di idrossido di potassio 1 N
3.6. Soluzione di idrossido di potassio 0,5 N
3.7. 1,2-dicloroetano p.a.
3.8. Etere di petrolio, puro, punto di ebollizione 30—50ºC. Se del caso,
purificarlo nel seguente modo. Sbattere ml 1 000 di etere di petrolioogni volta con ml 20 di acido solforico concentrato, fino a che
l'acido resta incolore. Eliminare l'acido e lavare l'etere successiva-
mente con ml 500 di acqua, due volte con ml 250 di una
soluzione al 10 % di idrossido di sodio e tre volte con ml 500 di
acqua. Eliminare la fase acquosa, essiccare l'etere per un'ora su
carbone attivo e solfato di sodio anidro, filtrare e distillare.
3.9. Ossido di alluminio standardizzato secondo Brockmann: calcinare
per 8 ore a 750ºC, raffreddare in essiccatore e conservare in flacone
di vetro scuro, con tappo smerigliato. Prima di utilizzarlo per la
cromatografia, inumidirlo nel seguente modo: si introducono in
unabeutadi vetro scuro g 10 di ossido di a lluminio e ml 0,7 di
acqua, si chiude ermeticamente e si scalda per 5 minuti a bagno-
maria bollente agitando di tanto in tanto energicamente. Lasciare
raffreddare, agitando. Verificare l'attività dell'ossido di alluminio
così preparato sottoponendo all'analisi secondo 5.3 e 5.4 una
quantità nota (500 UI) di retinolo tipo (3.17).
3.10. Ossido di alluminio basico, I grado di attività.3.11. Etere etilico, puro. Eliminare i perossidi e le tracce di acqua a
mezzo di cromatografia su colonna di ossido di alluminio basico
(3.10) (g 25 di ossido di alluminio per ml 250 di etere etilico).
3.12. Soluzioni di etere di petrolio (3.8) al 4 %, 8 %, 12 %, 16 % e 20 %
di etere etilico (3.11).
3.13. Soluzione di solfuro di sodio 0,5 M in glicerinaa l 70 % (v/v),
preparata a partire da solfuro di sodio p.a.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 9
(1) 1 UI = 0,3 µg di retinolo.
▼B
b)impiegati esclusivamente per l'analisi dei prodotti del gruppo A
3.14. Benzene p.a., cristallizzabile
3.15. Cloroformio p.a. Eliminare l'etanolo, il fosgene e le tracce di acqua
a mezzo di cromatografia su colonna di ossido di alluminio basico
(3.10) (g 50 di ossido di alluminio per ml 200 di cloroformio;
conviene cromatografare una seconda volta i primi ml 50 di eluato).
3.16. Reattivo di Carr-Price: agitare g 25 circa di tricloruro di antimonio
p.a. (conservato in essiccatore) con ml 100 di cloroformio (3.15)
fino a saturazione della soluzione. Un modico deposito di tricloruro
di antimonio non disturba. Aggiungere ml 2 di anidride acetica p.a.
Conservare in una bottiglia di vetro scuro con tappo smerigliato, in
frigorifero. Si conserva per parecchie settimane.
3.17. Retinolo tipo controllato spettrofotometricamente.
c)impiegati esclusivamente per l'analisi dei prodotti del gruppo B
3.18. Isopropanolo, per cromatografia
4.Apparecchiatura
4.1. Bagnomaria
4.2. Apparecchio rotativo per evaporazione sotto vuoto provvisto di palloni
di differenti capacità
4.3. Colonne da cromatografia, in vetro (lunghezza: mm 300, diametro
interno: circamm 13)
4.4. Spettrofotometro con vaschette da mm 10 (di quarzo nel caso di misure
nell'UV)
4.5. Lampada UV; 365 nm
5.Mododioperare
N.B.Tutte le operazioni debbono essere fatte in assenza di luce diretta ed
impiegando vetreria scura
5.1.Entità del campione
Prelevare una quantità di campione finemente macinato proporzionale al
presunto contenuto in vitamina A, e cioè:
g 0,1-1,0 per i concentrati (contenuti superiori a 20 000 UI/g);
g 3,0-5,0 per le premiscele (contenuti compresi tra400 e 20 000 UI/g);g 10-20 per le miscele minerali;
g 30 per i prodotti di cui al gruppo A.
Introdurre immediatamente la quantità di sostanze da sottoporre ad
analisi in un pallone da ml 500 a collo smerigliato.
5.2.Idrolisi ed estrazione (
1)
Aggiungere successivamente alla quantità di sostanza da sottoporre ad
analisi ml 40 di etanolo (3.1), ml 2 della soluzione di ascorbato di sodio
(3.2)(2), ml 10 dellasoluzione di idrossido di pota ssio (3.4) e ml 2 della
soluzione di solfuro di sodio (3.13). Scaldare il pallone, innestato su un
refrigerante a ricadere, per 30 min a 70—80 ºC, raffreddandolo poi sotto
acqua corrente. Aggiungere ml 50 di etanolo (3.1) e ml 100 (prelevato
con pipetta tarata) di 1,2-dicloroetano (3.7). Agitare energicamente e
travasare poi il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere,
nell'imbuto separatore, ml 150 della soluzione di idrossido di potassio
(3.5), agitare per 10 secondi e lasciare riposare fino alla separazione
delle fasi. Raccogliere la fase dicloroetanica (fase inferiore) in un altro
imbuto separatore, aggiungere ml 40 della soluzione di idrossido di
potassio (3.6), agitare per 10 secondi e lasciare riposare fino alla separa-
zione delle fasi. Raccogliere la fase dicloroetanica in imbuto separatore
e lavarla 6—8 volte con ml 40 di acqua per volta, fino alla scomparsa
della reazione alcalina (saggio alla fenolftaleina). Raccogliere la fase
dicloroetanica ed eliminare le ultime tracce di acqua a mezzo di strisce
di carta da filtro.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 10
(1) Per gli alimenti d'allattamento e per i prodotti che possono agglomerarsi o rigonfiare,
raddoppiare la quantità dei reattivi indicati in 5.2, primo e secondo comma.
(2) L'aggiunta di ascorbato di sodio non è necessaria quando si esegue l'idrolisi in atmo-
sferadi a zoto.
▼B
Evaporare a secco una parte aliquota della soluzione, su bagnomaria alla
temperatura di 40 ºC e sotto vuoto. Riprendere rapidamente il residuo
con ml 5 di etere di petrolio (3.8).
Per i prodotti di cui al gruppo A cromatografare come descritto al punto
5.3.1.
Per i prodotti di cui al gruppo B , trasferire la soluzione in un pallone
tarato da ml 50, portare a volume con etere di petrolio (3.8), omogeneiz-
zare e misurare la densità ottica come indicato al punto 5.4.2.
5.3.Cromatografia
5.3.1.Prodotti appartenenti al gruppo A
Riempire un tubo per cromatografia (4.3), fino all'altezza di mm
200, di g 10 di ossido di alluminio, preparato secondo (3.9),prece-
dentemente impregnato con etere di petrolio (3.8). Introdurre
nella colonna la soluzione ottenuta in 5.2 e aggiungere immedia-
tamente ml 20 di etere di petrolio (3.8). Eluire successivamente
con aliquote di ml 10 delle soluzioni di etere di petrolio al 4 %,
8 %, 12 %, 16 % e 20 % dietere etilico (3.12), sotto vuoto
parziale o sotto pressione in modo che la velocità di eluizione
siadi 2 a3 gocce a l secondo.
Il carotene è eluito per primo(1). Il retinolo è generalmente eluito
amezzo dellasoluzione di etere di petrolio a l 20 % di etere
etilico (3.12). L'eluizione viene controllata in luce ultravioletta(irradiando per brevissimo tempo la colonna con una lampada a
mercurio). La banda fluorescente del retinolo è nettamente
distinta dalle bande gialle che la seguono e che sono le xantofil-
le.Raccogliere la frazione di eluato che contiene il retinolo in una
erlenmeyer.
5.3.2.Prodotti appartenenti al gruppo B
La cromatografia viene effettuata solo se le misure della densità
otticaottenute secondo 5.4.2 non sono conformi a lle prescrizioni
indicate in 5.4.2.
Se è necessaria la cromatografia, introdurre nella colonna croma-
tografica una parte aliquota della soluzione in etere di petrolio
ottenuta in 5.2, contenente all'incirca 500 UI di retinolo e croma-
tografare nel modo indicato in 5.3.1.
5.4.Misure della densità ottica
5.4.1.Prodotti appartenenti al gruppo A
Portare a secco sotto vuoto l'eluato contenente il retinolo, ottenuto
in 5.3.1. Riprendere il residuo con ml 2 di benzene (3.14). Prele-
vare ml 0,3 di questa soluzione ed aggiungervi ml 3 del reattivo
di Carr-Price (3.16). Si sviluppa una colorazione blu. Misurare la
densità ottica allo spettrofotometro a 610 nm, esattamente 30
secondi dopo l'inizio della reazione. Determinare il contenuto in
retinolo riferendosi ad una curva di taratura ottenuta a partire da
soluzioni benzeniche di retinolo tipo aconcentra zioni crescenti
trattate con il reattivo di Carr-Price (da 2 a 16 UI di retinolo
tipo (3.17) in ml 0,3 di benzene (3.14) + ml 3 di reattivo di
Carr-Price (3.16). La curva di taratura deve essere periodicamente
ricontrollata sulla scorta dello standard e della soluzione del reat-
tivo di Carr-Price preparato di fresco.
5.4.2.Prodotti appartenenti al gruppo B
Prelevare una parte aliquota della soluzione in etere di petrolio
ottenuta in 5.2 e contenente all'incirca 200 UI di retinolo. Portare
asecco sotto vuoto e riprendere il residuo con ml 25 di isopropa -
nolo (3.18). Misurarne la densità ottica allo spettrofotometro a
325, 310 e 334 nm. Il massimo di assorbimento è a 325 nm. Il
contenuto in retinolo della soluzione viene calcolato nel seguente
modo:
E
325·18,30 = UI di vitamina A/ml
I rapporti tra le densità ottiche1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 11
(1) Il contenuto in carotene può essere determinato misurando la densità ottica a 450 nm;
E1%
1c m¼2600 :
▼B
E310:E325ed E334:E325
debbono essere di 6:7 = 0,857.
Se uno di questi rapporti si scosta sensibilmente da questo valore
(< 0,830 o > 0,880), ladetermina zione delle densità ottiche deve
essere preceduta dalla cromatografia secondo le modalità indicatein 5.3.2. Se la misura delle densità ottiche effettuata dopo croma-
tografia fa rilevare che i rapporti sopraddetti si scostano ancora
sensibilmente dal valore di 0,857 (< 0,830 o > 0,880) la determi-
nazione deve essere effettuata seguendo il procedimento previsto
per i prodotti del gruppo A.
6.Calcolodelrisultato
Calcolare il contenuto in retinolo del campione tenendo conto del peso della
sostanza sottoposta ad analisi e delle diluizioni effettuate nel corso della
analisi. Esprimere i risultati in UI di retinolo per kg.
Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo
stesso campione non deve superare:
— 20 %, in valore relativo, per i contenuti inferiori a 75 000 UI/kg;
— 15 000 UI per i contenuti compresi tra75 000 e 150 000 UI/kg;— 10 %, in valore relativo, per i contenuti compresi tra 150 000 e
250 000 UI/kg;
— 25 000 UI per i contenuti compresi tra250 000 e 500 000 UI/kg;— 5 %, in valore relativo, per i contenuti che superano le 500 000 UI/kg.1973L0046 — IT — 13.08.1998 — 003.001 — 12
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