2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B DECISIONEDELLACOMMISSIONE
del►C1 14agosto2002 ◄
cheattualadirettiva96/23/CEdelConsigliorelativaalrendimentodeimetodianaliticieall'inter-
pretazionedeirisultati
[notificata con il numero C(2002) 3044]
(Testorilevante aifinidelSEE)
(2002/657/CE)
(GU L 221 del 17.8.2002, pag. 8)
Rettificata da:
►C1Rettifica, GU L 239 del 6.9.2002, pag. 66 (2002/657/CE)
▼B
DECISIONEDELLACOMMISSIONE
del►C1 14agosto2002 ◄
cheattualadirettiva96/23/CEdelConsigliorelativaalrendimento
deimetodianaliticieall'interpretazione deirisultati
[notificata con il numero C(2002) 3044]
(Testorilevante aifinidelSEE)
(2002/657/CE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità europea,
vistaladirettiva96/23/CE del Consiglio, del 29 a prile 1996, concer-
nente le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli
animali vivi e nei loro prodotti e che abroga le direttive 85/358/CEE e86/469/CEE e le decisioni 89/187/CEE e 91/664/CEE(
1) in particolare
l'articolo 15, paragrafo 1, seconda frase,
considerando quanto segue:
(1)La presenza di residui nei prodotti di origine animale è oggetto
di preoccupazione per la salute pubblica.
(2)Ladecisione 98/179/CE dellaCommissione, del 23 febbra io1998, recante modalità d'applicazione per il prelievo ufficiale dicampioni al fine della sorveglianza su talune sostanze e sui loro
residui negli animali vivi e nei prodotti di origine animale(
2),
recita che l'analisi dei campioni deve essere effettuata esclusiva-mente presso laboratori per il controllo ufficiale dei residuiriconosciuti dall'autorità competente.
(3)È necessario assicurare la qualità e la comparabilità dei risultatianalitici prodotti dai laboratori per il controllo ufficiale deiresidui riconosciuti dall'autorità competente. Tale obiettivo deveessere conseguito attraverso l'impiego dei sistemi di controllodella qualità e in modo particolare applicando i metodi certificati
in base a procedure e a criteri di rendimento comuni e garan-
tendo la rintracciabilità rispetto a parametri comuni ocomunemente accettati.
(4)Ladirettiva93/99/CEE del Consiglio, del 29 ottobre 1993,
riguardante misure supplementari in merito al controllo ufficiale
dei prodotti alimentari e la decisione 98/179/CE(3) richiedono
che a partire dal gennaio 2002 i laboratori di controllo ufficialisiano certificati in base alla ISO 17025 (1). In ottemperanzaalla decisione 98/179/CE, i laboratori autorizzati sono tenuti apartecipare a un programma esterno, riconosciuto sul piano inter-
nazionale, di valutazione qualitativa e di accreditamento. I
laboratori autorizzati debbono inoltre dimostrare la propriacompetenza partecipando regolarmente e con successo ad appo-siti programmi di verifica, riconosciuti od organizzati dailaboratori di riferimento nazionali o comunitari.
(5)Una rete di laboratori comunitari di riferimento, laboratori nazio-nali di riferimento e laboratori nazionali di controllo opera inforza della direttiva 96/23/CE per migliorare il coordinamento.
(6)In conseguenzadei progressi compiuti nel ca mpo dellachimicaanalitica dopo l'adozione della direttiva 96/23/CE il concetto dimetodi di routine e metodi di riferimento è stato sostituitodall'impostazione basata sui criteri nella quale si istituisconocriteri di rendimento e procedure per laconva lidadei metodi discreening e di conferma.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 2
(1) GU L 125 del 23.5.1996, pag. 10.
(2) GU L 65 del 5.3.1998, pag. 31.
(3) GU L 290 del 24.11.1993, pag. 14.
▼B
(7)È necessario determinare criteri comuni per l'interpretazione dei
risultati delle prove dei laboratori di controllo ufficiali al fine di
garantire l'attuazione armonizzata della direttiva 96/23/CE.
(8)È necessario prevedere l'istituzione progressiva di limiti minimidi rendimento richiesti (LMRR) dei metodi analitici per lesostanze per le quali non è stato definito alcun limite consentitoed in particolare per quelle sostanze il cui impiego non è auto-rizzato oppure espressamente vietato all'interno della Comunità,
al fine di garantire un'attuazione armonizzata della direttiva 96/
23/CE.
(9)Ladecisione 90/515/CE dellaCommissione, del 26 settembre1990, che stabilisce i metodi di riferimento per la ricerca diresidui di metalli pesanti e arsenico(
1), ladecisione 93/256/CE
della Commissione, del 14 maggio 1993, che stabilisce i metodida impiegare per la ricerca dei residui di sostanze ad azione
ormonica e di sostanze ad azione tireostatica(
2) e ladecisione
93/257/CE della Commissione, del 15 aprile 1993, che stabiliscei metodi di riferimento e l'elenco dei laboratori di riferimentonazionali per la ricerca dei residui(
3), modificata da ultimo dalla
decisione 98/536/CE(4), sono state in primo luogo sottoposte a
riesame al fine di prendere in considerazione gli sviluppi nelle
conoscenze scientifiche e tecniche, sono state giudicate sorpas-
sate in termini di sfera di applicazione e disposizioni e devonodi conseguenza essere abrogate dalla presente decisione.
(10)Per consentire l'adattamento dei metodi di analisi dei campioniufficiali alle disposizioni della presente decisione deve esserecontemplato un periodo di transizione.
(11)Le misure previste dalla presente decisione sono conformi alparere del comitato permanente per la catena alimentare e la
salute degli animali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:
Articolo 1
Materia esferadiapplicazione
La presente decisione stabilisce le norme per i metodi analitici da
utilizzare nelle analisi di campioni ufficiali prelevati in ottemperanza
all'articolo 15, paragrafo 1, seconda frase, della direttiva 96/23/CE e
riporta criteri comuni per l'interpretazione dei risultati analitici prove-nienti dai laboratori di controllo ufficiali per tali campioni.
La presente decisione non si applica alle sostanze per le quali siano
state stabilite norme più particolari in altra legislazione comunitaria.
Articolo 2
Definizioni
Ai fini della presente decisione si applicano le definizioni di cui alla
direttiva 96/23/CE e all'allegato della presente decisione.
Articolo 3
Metodianalitici
Gli Stati membri garantiscono che i campioni ufficiali prelevati a
norma della direttiva 96/23/CE siano analizzati con l'impiego di metodiche:
a) sono documentati nelle istruzioni dell'analisi, preferibilmente in
ottemperanza alla ISO 78-2 (6);2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 3
(1) GU L 286 del 18.10.1990, pag. 33.
(2) GU L 118 del 14.5.1993, pag. 64.
(3) GU L 118 del 14.5.1993, pag. 75.
(4) GU L 251 dell'11.9.1998, pag. 39.
▼B
b) rispettano la parte 2 dell'allegato alla presente decisione;
c) sono stati convalidati in ossequio alla procedure descritte nella parte
3 dell'allegato;
d) rispettano i pertinenti limiti minimi di rendimento richiesti (LMRR)
da stabilire in ossequio all'articolo 4.
Articolo 4
Limiti minimidirendimentorichiesti
La presente decisione sarà rivista per stabilire progressivamente i limiti
minimi di rendimento richiesti (LMRR) dei metodi analitici da utiliz-zare per le sostanze per le quali non è stato stabilito alcun limiteconsentito.
Articolo 5
Controllodiqualità
Gli Stati membri garantiscono la qualità dei risultati delle analisi dei
campioni prelevati a norma della direttiva 96/23/CE, in particolareattraverso la sorveglianza delle analisi e/o la calibrazione dei risultatiin ossequio al capitolo 5.9 della ISO 17025 (1).
Articolo 6
Interpretazione deirisultati
1. Il risultato di un'analisi sarà considerato non conforme se viene
superato il limite di decisione del metodo di conferma per l'analita.
2. Se per una sostanza è stato stabilito un limite consentito, il limite
di decisione è la concentrazione oltre la quale è possibile stabilire conunacertezzasta tisticadi 1 - αche il limite consentito è stato effettiva-
mente superato.
3. Se per una sostanza non è stato stabilito un limite consentito, il
limite di decisione è il livello di concentrazione più basso al quale unmetodo è in grado di stabilire con una certezza statistica di 1 - αche
quel particolare analita è effettivamente presente.
4. Per le sostanze elencate nel gruppo A dell'allegato I alla direttiva
96/23/CE, l'errore αè pari o inferiore all'1 %. Per tutte le altre sostanze
l'errore αè pari o inferiore al 5 %.
Articolo 7
Abrogazione
Sono abrogate le decisioni 90/515/CEE, 93/256/CEE e 93/257/CEE.
Articolo 8
Disposizionitransitorie
I metodi per l'analisi dei campioni ufficiali delle sostanze elencate nel
gruppo A dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE, che soddisfano i criteri
stabiliti nelle decisioni 90/515/CEE, 93/256/CEE e 93/257/CEE
possono essere utilizzati fino a due anni dopo l'entrata in vigore dellapresente decisione. I metodi attualmente impiegati per le sostanze elen-cate nel gruppo B dell'allegato I alla decisione 96/23/CE devono essereconformi alla presente decisione al più tardi cinque anni dopo la data diapplicazione della presente decisione.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 4
▼B
Articolo 9
Datadiapplicazione
La presente decisione si applica dal 1osettembre 2002.
Articolo 10
Destinatari
Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 5
▼B
ALLEGATO
CRITERI DI RENDIMENTO, ALTRE PRESCRIZIONI E PROCEDURE
PERIMETODIANALITICI
1.DEFINIZIONI
1.1. Per accuratezza si intende lo scostamento tra il risultato di una prova e
il valore di riferimento convenuto (2). L'accuratezza è determinata
dall'esattezza e dalla precisione.
1.2. L'errore alfa ( α)rappresenta la probabilità che il campione sottoposto
ad analisi sia conforme, sebbene sia stata ottenuta una misura non
conforme («decisione di falsa non conformità»).
1.3. Per analita si intende la sostanza che si deve rilevare, individuare e/o
quantificare, nonché i derivati che emergono durante la sua analisi.
1.4. L'errore beta( β)rappresenta la probabilità che il campione sottoposto
ad analisi sia effettivamente non conforme, sebbene sia stata ottenuta
unamisuraconforme («decisione di fa lsaconformità»).
1.5. Per distorsione si intende ladifferenzatrail risulta to previsto di una
provaed un va lore di riferimento convenuto (2).
1.6. Per standard di calibrazione si intende un dispositivo per le misurazioni
che rappresenta la quantità della sostanza di interesse in modo da colle-
garne il valore a una base di riferimento.
1.7. Per materiale di riferimento certificato (MRC) si intende un materiale al
quale è stato assegnato un contenuto di analita specificato.
1.8. La co-cromatografia è una procedura nella quale, prima delle fasi
cromatografiche, l'estratto viene diviso in due parti. Una parte viene
sottoposta a cromatografia tale e quale; la seconda parte è miscelata
con l'analita standard che deve essere misurato; quindi la miscela è
sottoposta a cromatografia. La quantità di analita standard aggiunto
deve essere simile alla quantità stimata dell'analita nell'estratto. Tale
metodo è studiato per migliorare l'identificazione di un analita quando
vengono impiegati metodi cromatografici, in particolare quando non si
può utilizzare alcuno standard interno adeguato.
1.9. Per studio collaborativo si intende l'analisi dello stesso campione per
mezzo dello stesso metodo al fine di determinare le caratteristiche di
rendimento del metodo. Lo studio copre gli errori di misurazione
casuali e le distorsioni di laboratorio.
1.10. I metodi di confermasono metodi che forniscono informa zioni
complete o complementari atte ad identificare la sostanza in modo
univoco e, se necessario, quantificarla al livello di interesse.
1.11. Il limite di decisione (CC α)è il limite al quale e oltre il quale è possi-
bile concludere con una probabilità di errore pari ad αche un campione
è non conforme.
1.12. Capacità di rilevazione (CC β)rappresenta il contenuto più piccolo della
sostanza che è possibile rilevare, identificare e/o quantificare in un
campione con una probabilità di errore di β.Se per unasosta nzanon
è stato stabilito un limite consentito, la capacità di rilevazione è il
livello di concentrazione più basso al quale un metodo è in grado di
rilevare campioni effettivamente contaminati con una certezza statistica
di 1 - β.Per le sostanze per le quali è stato stabilito un limite consen-
tito, ciò significa che la capacità di rilevazione è la concentrazione alla
quale il metodo è in grado di rilevare le concentrazioni limite consentite
con unacertezzasta tisticadi 1 - β.
1.13. Il campione da analizzare fortificato è un campione arricchito con una
quantità nota dell'analita da rilevare.
1.14. Per studio inter-laboratorio (raffronto) si intende l'organizzazione, la
realizzazione e la valutazione di prove sullo stesso campione da parte
di due o più laboratori secondo condizioni predeterminate volte a valu-
tare il rendimento della prova. In base alle sue finalità, lo studio può
essere classificato come studio collaborativo o studio di competenza.
1.15. Lo standard interno (SI) è una sostanza non contenuta nel campione
avente proprietà fisico-chimiche il più possibile simili a quelle dell'ana-
lita da identificare e che viene aggiunta ad ogni campione nonché ad
ogni soluzione di calibrazione.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 6
▼B
1.16. Campione di laboratorio è il campione preparato per l'invio in labora-
torio e che deve essere sottoposto ad esame o ad analisi.
1.17. Per livello di interesse si intende la concentrazione della sostanza o
dell'analita in un campione che è significativa per determinare la sua
conformità alla legislazione.
1.18. Il limite minimo di rendimento richiesto (LMRR) è il contenuto minimo
di analita in un campione che deve essere rilevato e confermato. Tale
limite è volto ad armonizzare il rendimento analitico dei metodi per le
sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito.
1.19. La caratteristica di rendimento è la qualità funzionale che può essere
attribuita ad un metodo analitico. Può riguardare, ad esempio, la speci-
ficità, l'accuratezza, l'esattezza, la precisione, la ripetibilità, la
riproducibilità, il recupero, la capacità di rilevazione e la robustezza.
1.20. Per criteri di rendimento si intendono le prescrizioni per una caratteri-
stica di rendimento in base alla quale è possibile stabilire che il metodo
analitico è adeguato e che genera risultati affidabili.
1.21. Il limite consentito è il limite massimo del residuo, il livello massimo o
altra tolleranza massima per le sostanze stabiliti nella legislazione
comunitaria.
1.22. Per precisione si intende la concordanza tra i risultati di prove indipen-
denti ottenuti in condizioni concordate (predeterminate). La misura
dellaprecisione è espressa , in genere, in termini di imprecisione e
calcolata quale deviazione standard del risultato della prova. Una
minore precisione è determinata da una deviazione standard più ampia
(2).
1.23. Per studio di competenza si intende l'analisi dello stesso campione,
consentendo ai laboratori di scegliere il proprio metodo, a patto che
tali metodi siano utilizzati in condizioni di routine. Lo studio deve
essere condotto in base alla guida ISO 43-1 (3) e 43-2 (4) e può essere
utilizzato per valutare la riproducibilità dei metodi.
1.24. Per metodo qualitativo si intende un metodo analitico che identifica una
sostanza sulla base delle sue proprietà chimiche, biologiche o fisiche.
1.25. Per metodo quantitativo si intende un metodo analitico che determina la
quantità o la frazione di massa di una sostanza in modo che possa
essere espressa come valore numerico di unità appropriate.
1.26. Il dosaggio in bianco del reagente è la procedura analitica completa
applicata senza l'aliquota da analizzare oppure utilizzando invece dell'a-
liquota da analizzare una quantità equivalente di solvente adeguato.
1.27. Per recupero si intende la percentuale della concentrazione effettiva di
una sostanza recuperata durante la procedura analitica. Il recupero è
determinato durante la validazione, se non è disponibile alcun materiale
di riferimento certificato.
1.28. Per materiale di riferimento si intende un materiale del quale sono state
confermate una o più proprietà per mezzo di un metodo validato e che
per questo motivo può essere impiegato per calibrare un apparato o per
verificare un metodo di misura.
1.29. Per ripetibilità si intende precisione in condizioni di ripetibilità (2).1.30. Per condizioni di ripetibilità si intendono condizioni alle quali si otten-
gono risultati di prove indipendenti con lo stesso metodo su elementi di
prova identici nello stesso laboratorio con lo stesso operatore che
utilizza la stessa apparecchiatura (2).
1.31. Per riproducibilità si intende laprecisione in condizioni di riproduci-
bilità (2) (4).
1.32. Per condizioni di riproducibilità si intendono condizioni alle quali si
ottengono risultati di prove con lo stesso metodo su elementi di prova
identici in laboratori differenti con differenti operatori che utilizzano
apparecchiature differenti (2) (4).
1.33. Per robustezza si intende la sensibilità di un metodo analitico alle varia-
zioni nelle condizioni sperimentali che possono essere espresse come un
elenco di materiali da analizzare, analiti, condizioni di conservazione,
condizioni ambientali e/o di preparazione del campione in base alle
quali il metodo può essere applicato come specificato oppure con
piccole modifiche segnalate. Per tutte le condizioni sperimentali che
possono essere soggette nella pratica ad oscillazione (ad esempio,
stabilità dei reagenti, composizione del campione, pH, temperatura)2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 7
▼B
deve essere indicata qualsiasi variazione che possa influenzare il risul-
tato dell'analisi.
1.34. Per dosaggio in bianco del campione si intende la procedura analitica
completa applicata ad un'aliquota da analizzare presa da un campione
dal quale l'analita è assente.
1.35. Per metodo di screening si intende il metodo utilizzato per rilevare la
presenza di una sostanza o di una classe di sostanze al livello di inte-
resse. Tali metodi consentono di analizzare un elevato numero di
campioni in tempi brevi e vengono impiegati per vagliare campioni
molto numerosi alla ricerca di potenziali risultati non conformi. Sono
progettati specificamente per evitare falsi risultati conformi.
1.36. Per studio di laboratorio singolo (convalida interna) si intende uno
studio analitico che coinvolge un unico laboratorio che utilizza un
metodo per analizzare lo stesso materiale di prova o materiali differenti
in condizioni differenti nel corso di ampi intervalli di tempo di durata
giustificata.
1.37. Per specificità si intende la capacità di un metodo di distinguere tra
l'analita che si intende misurare e le altre sostanze. Tale caratteristica
è prevalentemente una funzione della tecnica di misura descritta, ma
può variare in base alla classe del composto o della matrice.
1.38. Per addizione standard si intende una procedura nella quale il campione
da analizzare viene suddiviso in due (o più) aliquote da analizzare.
Un'aliquota viene analizzata tale e quale, mentre prima dell'analisi
vengono aggiunte alle altre aliquote da analizzare quantità note dell'ana-
lita standard. La quantità dell'analita standard aggiunta deve essere
compresa tra due e cinque volte la quantità stimata dell'analita nel
campione. Tale procedura è studiata per determinare il contenuto di un
analita in un campione, prendendo in considerazione il recupero della
procedura analitica.
1.39. Per analita standard si intende un analita di contenuto e purezza noti e
certificati da utilizzare come riferimento nell'analisi.
1.40. Per sostanza si intende una materia di composizione chimica specifica o
definitaed i suoi meta boliti.
1.41. Per aliquota da analizzare si intende la quantità di materiale prelevata
dal campione da analizzare sulla quale viene svolta la prova o l'osserva-
zione.
1.42. Per campione da analizzare si intende un campione preparato dal
campione di laboratorio e dal quale vengono tratte le aliquote da analiz-
zare.
1.43. Per esattezza si intende la concordanza tra il valore medio ottenuto da
un'ampia serie di risultati e un valore di riferimento accettato. L'esat-
tezzaviene in genere espressacome distorsione (2).
1.44. Per unità si intendono le unità descritte nellaISO 31 (20) e nelladiret-
tiva71/354/CE (19).
1.45. Per validazione si intende la conferma attraverso il controllo e la forni-
tura di prove efficaci circa il rispetto delle prescrizioni particolari per
un uso specifico previsto (1).
1.46. Per riproducibilità intra-laboratorio si intende la precisione ottenuta
nello stesso laboratorio in condizioni convenute (predeterminate) (rela-
tive, ad esempio, al metodo, ai materiali della prova, agli operatori,
all'ambiente) nel corso di ampi intervalli di tempo di durata giustificata.
2.CRITERI DI RENDIMENTO E ALTRE PRESCRIZIONI PER I
METODIANALITICI
È possibile utilizzare i metodi analitici o le combinazioni di metodi diversi da
quelli descritti in seguito ai fini di screening o di conferma solo se è possibile
provare che essi rispettano le prescrizioni pertinenti stabilite nella presente deci-
sione.
2.1. PRESCRIZIONI GENERALI
2.1.1.Manipolazionedeicampioni
I campioni sono ottenuti, manipolati e trattati in modo tale che esista la
massima possibilità di rilevare la sostanza. Le procedure per la manipo-
lazione del campione escludono la possibilità di contaminazione o
perdita accidentale di analiti.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 8
▼B
2.1.2.Esecuzionedelleprove
2.1.2.1.Recupero
Se viene impiegato un fattore fisso di correzione del recupero, il recu-
pero deve essere determinato durante l'analisi dei campioni per ciascun
lotto di campioni. Se il recupero è entro i limiti potrà essere impiegato
il fattore di correzione fisso; in caso contrario si impiega il fattore di
recupero ottenuto per quel lotto specifico, ameno che non si debba
applicare il fattore di recupero specifico dell'analita nel campione, nel
qual caso è utilizzato il metodo di addizione standard (vedere 3.5) o
uno standard interno per la determinazione quantitativa di un analita in
un campione.
2.1.2.2.Specificità
In condizioni sperimentali un metodo è in grado di distinguere tra l'ana-
lita e le altre sostanze. Deve essere fornita una stima della misura in cui
ciò è possibile. Si devono adottare strategie per superare qualsiasi inter-
ferenza prevista con altre sostanze quando si utilizza la tecnica di
misurazione descritta, ad esempio, prodotti omologhi, analoghi, prodotti
metabolici del residuo in questione. È di fondamentale importanza
studiare l'interferenza che potrebbe scaturire da componenti della
matrice.
2.2. METODI DI SCREENING
In ottemperanza alla direttiva 96/23/CE, sono utilizzate per finalità di screening
solo quelle tecniche analitiche la cui validazione può essere dimostrata in modo
documentato e rintracciabile e che hanno un tasso di falsi conformi inferiore al
5 % (errore β)al livello di interesse. Nel caso di un sospetto risultato non
conforme, tale risultato è confermato per mezzo di un metodo di conferma.
2.3. METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGA-
NICI
I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici forniscono informa-
zioni sulla struttura chimica dell'analita. Di conseguenza, i metodi basati
esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettro-
metrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il
ricorso ad altri metodi. Tuttavia, se una singola tecnica non dispone di suffi-
ciente specificità, laspecificità desidera tadeve essere ottenutaper mezzo di
procedure analitiche consistenti in combinazioni adeguate di raffinazione, sepa-
razione cromatografica e rilevazione spettrometrica.
I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per
l'individuazione di residui o contaminanti organici per i gruppi di sostanze indi-
cati:
Tabella1
Metodidiconfermaadeguatiperresiduiocontaminantiorganici
Tecnicadi misura zioneSostanze allegato I 96/
23/CELimitazioni
LC o GC con rilevazione
attraverso spettrometria di
massaGruppo A e B Solo in seguito a una separazione cromatogra-
ficaon-line o off-line
Solo se vengono impiegate tecniche a scan-
sione completa o si utilizzano almeno 3 (per
il gruppo B) o 4 (per il gruppo A) punti di
identificazione per le tecniche che non regi-
strano gli spettri completi della massa
LC o GC con rilevazione
attraverso spettrometria a
infrarossiGruppo A e B Nella spettrometria a infrarossi è necessario
rispettare le prescrizioni specifiche per l'assor-
bimento
LC a scansione totale
(DAD)Gruppo B Nella spettrometria a raggi ultravioletti è
necessario rispettare requisiti specifici per
l'assorbimento
LC-fluorescenzaGruppo B Solo per le molecole che presenta no una fluo-
rescenza nativa e le molecole che presentano
fluorescenza dopo trasformazione o deriva-
zione
2-D TLC-UV/VIS asca n-
sione completaGruppo B La HPTLC bidimensionale e la co-cromato-
grafia sono obbligatorie2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 9
▼B
Tecnicadi misura zioneSostanze allegato I 96/
23/CELimitazioni
GC con rilevamento della
cattura degli elettroniGruppo B Solo se vengono utilizzate colonne di polarità
differente
LC-immunogramma Gruppo B Solo se vengono impiegati almeno due sistemi
cromatografici differenti oppure un secondo
metodo di rilevazione indipendente
LC-UV/VIS (lunghezza
d'ondaunica )Gruppo B Solo se vengono impiegati almeno due sistemi
cromatografici differenti oppure un secondo
metodo di rilevazione indipendente
2.3.1.Criteridirendimentocomunieprescrizioni
I metodi di confermaforniscono informa zioni sullastrutturachimica
dell'analita. Il metodo non è in grado di discriminare tra composti che
forniscono la stessa risposta. I metodi basati esclusivamente sull'analisi
cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono
adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri
metodi.
Ove impiegato nel metodo, all'inizio della procedura di estrazione si
aggiunge all'aliquota da analizzare uno standard interno adeguato. A
seconda della disponibilità, sono impiegate forme stabili dell'analita
marcate con isotopi, che sono particolarmente indicate per la rileva-
zione con la spettrometria di massa, oppure composti correlati in modo
strutturale all'analita.
Ove non sia possibile impiegare alcuno standard interno adeguato,
l'identificazione dell'analita è confermata dalla co-cromatografia. In tal
caso si ottiene un solo picco, dato che l'altezza (o l'area) del picco
ingrandito è equivalente alla quantità di analita aggiunto. Con la gas-
cromatografia (GC) o la cromatografia liquida (LC), la larghezza del
picco a metà dell'altezza massima si trova entro il 90-110 % della
larghezza originale e i tempi di ritenzione devono essere identici entro
un margine del 5 %. Per i metodi basati sulla cromatografia su strato
sottile (TLC) si intensifica solo il punto che si presume sia dovuto all'a-
nalita; non compare un nuovo punto e l'aspetto visivo non cambia.
Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di
analita, al limite consentito o al limite di decisione, o in prossimità di
tali limiti (campione di controllo non conforme), nonché i materiali di
controllo conformi e i reagenti bianchi sono di preferenza utilizzati
simultaneamente durante l'intera procedura con ciascun lotto di
campioni da analizzare. L'ordine per l'inserimento degli estratti nello
strumento di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di
controllo conforme, campione/i sottoposto/i a conferma, ancora
campione di controllo conforme e, da ultimo, campione di controllo
non conforme. È giustificata qualsiasi variazione rispetto a tale
sequenza.
2.3.2.Criteridirendimentoaggiuntiviealtreprescrizioni perimetodidi
analisiquantitativi
2.3.2.1.Esattezza dei metodi quantitativi
Nel caso di analisi ripetute di un materiale di riferimento certificato, gli
intervalli di riferimento per la deviazione della frazione di massa media
determinata per via sperimentale e corretta per il recupero dal valore
certificato sono i seguenti:
Tabella2
Esattezzaminimadeimetodiquantitativi
Frazione di massa Intervallo
≤1µg/kg da– 50 % a+ 20 %
Dameno di 1 µg/kg a10 µg/kg da– 30 % a+ 10 %
≥10µg/kg da– 20 % a+ 10 %
Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle
misure sia valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità note
dell'analita, o degli analiti, ad una matrice bianca. I dati corretti con il2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 10
▼B
recupero medio sono accettabili solo se rientrano negli intervalli ripor-
tati nella tabella 2.
2.3.2.2.Precisione dei metodi quantitativi
Il coefficiente di variazione (CV) inter-laboratorio per l'analisi ripetuta
di un materiale di riferimento o fortificato, in condizioni di riproduci-
bilità non supera il livello calcolato per mezzo dell'equazione di
Horwitz. L'equazione è la seguente:
CV = 2(1 - 0,5 log C)
dove C è la frazione di massa espressa come potenza (esponente) di 10
(ad esempio, 1 mg/g = 10-3). Nella tabella 3 sono riportati degli esempi.
Tabella3
EsempidiCVdiriproducibilitàpermetodiquantitativiaintervalli difrazioni dimassa
dell'analita
Frazione di massa CV di riproducibilità
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1 000 µg/kg (1 mg/kg) 16
(*) Per frazioni di massa inferiori a 100 µg/kg l'applicazione dell'equazione di Horwitz fornisce risultati
eccessivamente elevati. Pertanto i CV per concentrazioni inferiori a 100 µg/kg sono i più bassi possi-
bile.
Per le analisi eseguite in condizioni di ripetibilità, il CV intra-labora-
torio sarà compreso in genere tra la metà e i due terzi dei valori
riportati in precedenza. Per le analisi eseguite in condizioni di riprodu-
cibilità intra-laboratorio, il CV intra-laboratorio non supera il CV di
riproducibilità.
Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito, il
metodo consegue una riproducibilità intra-laboratorio non superiore al
corrispondente CV di riproducibilità ad una concentrazione di 0,5 × il
limite consentito.
2.3.3.Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la rilevazione per
mezzodellaspettrometriadimassa
I metodi di spettrometria di massa possono essere presi in considera-
zione come metodi di conferma solo previa separazione
cromatografica on-line o off-line.
2.3.3.1.Separazione cromatografica
Per le procedure GC-MS la separazione gas-cromatografica deve essere
eseguita utilizzando colonne capillari. Per le procedure LC-MS la sepa-
razione cromatografica è eseguita utilizzando colonne LC adeguate. In
ogni caso, il tempo di ritenzione minimo accettabile per l'analita sotto
esame è pari al doppio del tempo di ritenzione corrispondente al
volume vuoto dellacolonna . Il tempo di ritenzione (o tempo di riten-
zione relativo) dell'analita nell'aliquota da analizzare corrisponde a
quello dello standard di calibrazione entro una finestra del tempo di
ritenzione specificata. La finestra del tempo di ritenzione deve essere
commisurata al potere di risoluzione del sistema cromatografico. Il
rapporto tra il tempo di ritenzione cromatografica dell'analita e quello
dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'a-
nalita, corrisponde a quello della soluzione di calibrazione con una
tollera nzadi 0,5 % per laGC e 2,5 % per laLC.
2.3.3.2.Rilevazione con tecniche di spettrometria di massa
La rilevazione con tecniche di spettrometria di massa è eseguita utiliz-
zando tecniche MS quale la registrazione degli spettri della massa
completi (scansioni complete) oppure la SIM (Selected Ion Monitoring),nonché tecniche MS-MS quali la SRM (Selected Reaction Monitoring),
o altre tecniche MS o MS-MS in combinazione con modalità di ioniz-
zazione appropriate. Nella spettrometria di massa ad alta risoluzione
(HRMS) larisoluzione (R) è in genere superiore a10 000 per l'intero
intervallo di massa al 10 % della valle.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 11
▼B
Scansione totale: quando la determinazione con tecniche di spettro-
metria di massa viene eseguita registrando gli spettri a scansione totale,
è obbligatoria la presenza di tutti gli ioni diagnostici misurati (lo ione
molecolare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammen-
tati caratteristici e gli ioni isotopi), con un'intensità relativa di oltre il
10 % nello spettro di riferimento dello standard di calibrazione.
SIM: quando la determinazione per mezzo della spettrometria di massa
è eseguita con tecniche di frammentografia, è preferibile che lo ione
molecolare sia uno degli ioni diagnostici selezionati (lo ione moleco-
lare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammentati
caratteristici e tutti i loro ioni isotopi). Gli ioni diagnostici selezionati
non devono avere origine esclusivamente dalla stessa parte della mole-
cola. Il rapporto segnale-rumore per ciascuno ione diagnostico è ≥3:1.
Scansione totale e SIM: le intensità relative degli ioni rilevati,
espresse come percentuale dell'intensità dello ione o della transizione
più intensa, corrispondono a quelle dello standard di calibrazione,
provenienti da soluzioni dello standard di calibrazione o da campioni
drogati, a concentrazioni paragonabili, misurate nelle stesse condizioni,
entro le seguenti tolleranze:
Tabella4
Tolleranze massime consentite per intensità di ioni relative utilizzando una gamma di
tecniche dispettrometriadimassa
Intensità relativa
(% del picco di base)EI-GC-MS
(relativa)CI-GC-MS, GC-MSn
LC-MS, LC-MSn
(relativa)
>5 0% ±1 0% ±2 0%
>2 0%–5 0% ±1 5% ±2 5%
>1 0%–2 0% ±2 0% ±3 0%
≤10 % ± 50 % ± 50 %
Interpretazione dei dati della spettrometria di massa: le
intensità relative degli ioni diagnostici e/o delle coppie di ioni precur-
sore/prodotto devono essere identificate confrontando gli spettri oppure
integrando i segnali delle singole tracce della massa. Ogni volta che si
applica la correzione del fondo (background), questa è applicata in
modo uniforme nell'intero lotto (Cfr. 2.3.1, paragrafo 4) ed è chiara-
mente indicata.
Scansione completa: quando si registrano spettri a scansione totale
in una singola spettrometria di massa, sono presenti almeno quattro ioni
con un'intensità pari o superiore al 10 % del picco di base. Se presente
nello spettro di riferimento con un'intensità relativa pari o superiore al
10 %, lo ione molecolare è incluso. Almeno quattro ioni si trovano
entro le tolleranze massime consentite per le intensità relative degli
ioni (tabella 5). È possibile eseguire ricerche computerizzate all'interno
della libreria. In tal caso, il raffronto dei dati provenienti dalla spettro-
metria di massa sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di
calibrazione superano un fattore di corrispondenza critico. Per ogni
analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di valida-
zione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti
in seguito. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla
matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.
SIM: quando i frammenti di massa sono misurati utilizzando tecniche
diverse dalla scansione totale, per interpretare i dati sarà utilizzato un
sistema di punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze elen-
cate nel gruppo A dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE sono richiesti
almeno quattro punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze
elencate nel gruppo B dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE, sono
richiesti almeno tre punti di identificazione. Nella tabella sottostante è
riportato il numero di punti di identificazione che ciascuna tecnica di
spettrometria di massa di base può ottenere. Tuttavia, per poter ricevere
i punti di identificazione richiesti per la conferma ed il totale dei punti
di identificazione da calcolare:
a) è misurato almeno un rapporto di ioni e
b) tutti i rapporti di ioni pertinenti misurati rispettano i criteri descritti
in precedenzae
c) è possibile combinare un massimo di tre tecniche separate per
conseguire il numero minimo di punti di identificazione.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 12
▼B
Tabella5
Larelazionetraunagammadiclassidiframmentidimassaedipuntidiidentificazione
ottenuti
TecnicaMS Punti di identifica zione ottenuti per ione
Spettrometria di massa a bassa risoluzione
(LR)1,0
LR-MSn, Ione precursore 1,0
LR-MSnProdotti di transizione 1,5
HRMS 2,0
HR- MSnIone precursore 2,0
HR-MSnProdotti di transizione 2,5
Note:
(1) Ogni ione può essere contato una sola volta.
(2) La GC-MS con impiego di ionizzazione ad impatto di elettroni è considerata una tecnica differente
da llaGC-MS con impiego dellaionizza zione chimica .
(3) È possibile utilizzare analiti differenti per aumentare il numero di punti di identificazione solo se i
derivati impiegano chimiche di reazione differenti.
(4) Per le sostanze nel gruppo A dell'allegato 1 alla direttiva 96/23/CE, se si impiega nella procedura
analitica una delle seguenti tecniche: la HPLC accoppiata alla DAD (Diode Array Spectrophotometry)a scansione totale; oppure la HPLC accoppiata alla rilevazione a fluorescenza; oppure la HPLC accop-
piata a un immunogramma; oppure la TLC bidimensionale accoppiata alla rilevazione spettrometrica;
queste tecniche posso apportare al massimo un punto di identificazione, a patto che vengano rispettati icriteri pertinenti per tali tecniche.
(5) I prodotti di transizione comprendono prodotti figlia e nonna
Tabella6
Esempi del numero di puntidi identificazione ottenuti da una gamma di tecniche e per
lelorocombinazioni(n=unintero)
Tecnica/che Numero di ioni Punti di identificazione
GC-MS (EI o CI) N n
GC-MS (EI e CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GC-MS (EI o CI) 2 derivati 2 (Derivato A) + 2 (Deri-
vato B)4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 precursore e 2 figlie 4
LC-MS-MS 1 precursore e 2 figlie 4
GC-MS-MS 2 ioni precursori, ciascuno
con 1 figlia5
LC-MS-MS 2 ioni precursori, ciascuno
con 1 figlia5
LC-MS-MS-MS 1 precursore, 1 figliae 2
nonne5,5
HRMS N 2 n
GC-MS e LC-MS 2 + 2 4
GC-MS e HRMS 2 + 1 4
2.3.4.Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la cromatografia
accoppiataallarilevazione contecnicheagliinfrarossi
Picchi adeguati: i picchi adeguati sono i massimi di assorbimento di
uno standard di calibrazione nello spettro dell'infrarosso che rispettano i
requisiti che seguono.
2.3.4.1.Rilevazione all'infrarosso
Assorbimento massimo: avviene su un numero d'ondacompreso tra
4 000 e 500 cm-1.
Intensità dell'assorbimento: non è inferiore a
a) un'assorbanza molare specifica di 40 rispetto alla linea base del
picco; oppure2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 13
▼B
b) un'assorbanza relativa del 12,5 % dell'assorbanza del picco più
intenso nell'intervallo 4 000-500 cm-1,
quando entrambe sono misurate rispetto all'assorbanza zero, e 5 %
dell'assorbanza del picco più intenso nell'intervallo 4 000-500 cm-1
quando entrambe sono misurate rispetto alla linea base del picco.
Nota: sebbene picchi adeguati in base al punto a) possano essere prefe-
ribili da un punto di vista teorico, quelli calcolati in base al punto b)
risultano di più facile determinazione.
Viene determinato il numero di picchi nello spettro infrarosso dell'ana-
lita le cui frequenze corrispondono ad un picco adeguato nello spettro
dello standard di calibrazione, entro un margine di ± 1 cm-1.
2.3.4.2.Interpretazione dei dati dello spettro all'infrarosso
L'assorbimento è presente in tutte le regioni dello spettro dell'analita al
quale corrisponde un picco sufficiente nello spettro di riferimento dello
standard di calibrazione. Sono richiesti almeno sei picchi sufficienti
nello spettro infrarosso dello standard di calibrazione. Se sono presenti
meno di sei picchi adeguati (7) lo spettro risultante non può essere
utilizzato come spettro di riferimento. Il «punteggio», vale a dire la
percentuale di picchi sufficienti trovati nello spettro infrarosso dell'ana-
lita, deve essere almeno 50. Quando non esiste una corrispondenza
precisaper un picco sufficiente, laregione pertinente dello spettro
dell'analita è coerente con la presenza di un picco corrispondente. La
procedura si applica solo ai picchi di assorbimento nello stesso spettro
del campione con un intensità almeno tripla rispetto al rumore tra un
picco ed il successivo.
2.3.5.Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di
unanalitautilizzandolaLCconaltretecniche dirilevazione
2.3.5.1.Separazione cromatografica
Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno stan-
dard interno. È preferibilmente uno standard correlato con un tempo di
ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al tempo di
ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente alle
stesse condizioni sperimentali. Il tempo di ritenzione minimo accetta-
bile per un analita è pari a due volte il tempo di ritenzione
corrispondente al volume vuoto della colonna. Il rapporto tra il tempo
di ritenzione dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il
tempo di ritenzione relativo dell'analita, è identico a quello dello stan-
dard di calibrazione nella matrice appropriata, con un margine di
± 2,5 %.
2.3.5.2.Rilevazione UV/VIS a scansione totale
Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.I massimi di assorbimento nello spettro dell'analita avvengono alle
stesse lunghezze d'onda di quelli dello standard di calibrazione entro
un margine determinato dalla risoluzione del sistema di rilevazione.
Per la rilevazione a schiera di diodi (diode array) tale margine è in
genere di ± 2 nm. Al di sopra dei 220 nm lo spettro dell'analita non è
visivamente differente dallo spettro dello standard di calibrazione per le
parti dei due spettri aventi un'assorbanza relativa pari o superiore al
10 %. Tale criterio è rispettato, in primo luogo, quando sono presenti
gli stessi massimi e, in secondo luogo, quando la differenza osservata
tra i due spettri non è superiore, in alcun punto, al 10 % dell'assorbanza
dello standard di calibrazione. Nel caso di ricerche computerizzate
all'interno della libreria, il raffronto dei dati provenienti dalla spettro-
metria sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di
calibrazione supera un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita
tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla
base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in prece-
denza. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice
semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.
2.3.5.3.Criteri di rendimento per la rilevazione fluorimetrica
Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.Ciò si applica alle molecole che presentano una fluorescenza nativa e
alle molecole che presentano fluorescenza dopo trasformazione o deri-
vazione. La scelta delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione
combinate alle condizioni cromatografiche è compiuta in modo tale da
ridurre al minimo l'insorgenza di componenti interferenti negli estratti
dei campioni bianchi.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 14
▼B
Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco
dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al
10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.
2.3.5.4.Criteri di rendimento per la determinazione di un analita per mezzo di
un immunogramma LC
Un immunogramma LC non può essere utilizzato autonomamente come
metodo di conferma.
Devono essere rispettati i criteri pertinenti per i metodi LC.
I parametri predefiniti per il controllo della qualità, vale a dire il
legame non specifico, il legame relativo dei campioni di controllo, il
valore di assorbanza del bianco, devono ricadere entro i limiti ottenuti
durante la validazione del campione da analizzare.
L'immunogramma deve essere costituito da almeno cinque frazioni.
Ciascuna frazione è inferiore alla metà della larghezza del picco.
La frazione con il massimo contenuto di analita deve essere identica a
quella per il campione sospetto, il campione di controllo non conforme
e lo standard.
2.3.5.5.Determinazione di un analita utilizzando la LC con rilevazione UV/VIS
(lunghezza d'onda singola)
La LC con rilevazione UV/VIS (lunghezza d'onda singola) non è
adeguata per essere impiegata autonomamente come metodo di
conferma.
Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco
dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al
10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.
2.3.6.Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di
unanalitapermezzodellaTLCbidimensionaleaccoppiataallarile-
vazioneUV/VISspettrometrica ascansionecompleta
La HPTLC bidimensionale e la co-cromatografia sono obbligatorie.
I valori RF dell'analita corrispondono ai valori RF degli standard entro
unatollera nzadi ±5 %.
L'aspetto visivo dell'analita è indistinguibile da quello dello standard.
Per punti dello stesso colore, il centro del punto più vicino è separato
dal centro del punto dell'analita di almeno la metà della somma del
diametro dei punti.
Lo spettro dell'analita non è visivamente differente dallo spettro dello
standard, come descritto per la rilevazione UV/VIS a scansione
completa.
Nel caso di ricerche computerizzate all'interno della libreria, il raffronto
dei dati provenienti dalla spettrometria sui campioni da analizzare conquelli sulla soluzione di calibrazione supera un fattore di corrispon-
denza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso
del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono
rispettati i criteri descritti in precedenza. È controllata la variabilità
nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello
strumento di rilevazione.
2.3.7.Criteri di rendimento e prescrizioni per la determinazione di un
analita per mezzo della GC in combinazione con l'ECD(electron
capturedetection,rilevazione concatturadeglielettroni)
Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno stan-
dard interno. Questo è preferibilmente una sostanza correlata con un
tempo di ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al
tempo di ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente
alle stesse condizioni sperimentali. Il rapporto tra il tempo di ritenzione
dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di riten-
zione relativo dell'analita, è identico a quello dello standard di
calibrazione nella matrice appropriata, con un margine dello 0,5 %. Il
picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco
dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al
10 % dell'altezza massima del picco dell'analita. Per ottenere ulteriori
informazioni si potrà ricorrere alla co-cromatografia.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 15
▼B
2.4. METODI DI CONFERMA PER GLI ELEMENTI
Le analisi di conferma per gli elementi chimici si basano sul concetto di identi-
ficazione inequivocabile e quantificazione accurata e precisa per mezzo delle
proprietà fisico-chimiche uniche dell'elemento chimico studiato (ad esempio,
lunghezza d'onda della radiazione emessa o assorbita caratteristica dell'elemento,
massa atomica) al livello d'interesse.
I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per
l'identificazione degli elementi chimici:
Tabella7
Metodidiconfermaadeguatiperglielementichimici
Tecnica Parametro misurato
Voltammetria di ridissoluzione anodica differen-
ziale ad impulsiSegnale elettrico
Spettrometria dell'assorbimento atomico
Fiamma Lunghezza d'onda di assorbimento
Generazione di idruri Lunghezza d'onda di assorbimento
Vapore freddo Lunghezza d'onda di assorbimento
Atomizzazione elettrotermica (fornace di
grafite)Lunghezzad'ondadi a ssorbimento
Atomic Emission Spectrometry, spettrometriadi
emissione atomica
Plasma induttivo Lunghezza d'onda di emissione
Spettrometriadi ma ssa
Plasma induttivo Rapporto massa-carica
2.4.1.Criteri di rendimento comuni e altre prescrizioni per i metodi di
conferma
Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di
analita, al limite massimo consentito o al limite di decisione (campione
di controllo non conforme), nonché i materiali di controllo conformi e i
reagenti bianchi devono di preferenza essere utilizzati simultaneamente
durante l'intera procedura con ciascun lotto di campioni da analizzare.
L'ordine raccomandato per l'inserimento degli estratti nello strumento
di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di controllo
conforme, campione/i da confermare, campione di controllo conforme
e, da ultimo, campione di controllo non conforme. Viene giustificato
qualsiasi scostamento.
In genere la maggior parte delle tecniche di analisi richiede la completa
digestione della matrice organica per ottenere soluzioni prima della
determinazione dell'analita. Ciò può essere ottenuto utilizzando proce-
dure di mineralizzazione a microonde che riducono al minimo il
rischio di perdita e/o contaminazione degli analiti da analizzare. Sono
utilizzati contenitori in Teflon decontaminati di buona qualità. Se si
ricorre ad altri metodi di digestione a secco o con presenza di liquido,
sono disponibili prove documentate che escludano potenziali fenomeni
di perdita o di contaminazione. In talune circostanze, quale alternativa
alla digestione, per separare gli analiti dai componenti della matrice e/o
concentrare gli analiti al fine di introdurre i campioni nello strumento di
analisi si potranno scegliere procedure di separazione (ad esempio,
estrazione).
Per quanto riguarda la calibrazione, sia esterna che basata sul metodo di
aggiunta dello standard, si presta attenzione a non superare l'intervallo
di lavoro definito per l'analisi. Nel caso di calibrazione esterna, gli stan-
dard calibranti devono obbligatoriamente essere preparati in una
soluzione che corrispondail più possibile a llacomposizione dellasolu-
zione campione. Si applica inoltre la correzione del fondo se richiesto
dalla circostanza analitica specifica.
2.4.2.Criteridirendimentoaggiuntiviealtreprescrizioni perimetodidi
analisiquantitativi
2.4.2.1.Esattezza dei metodi quantitativi
Nel caso di analisi ripetute degli elementi di un materiale di riferimento
certificato, la deviazione del contenuto medio determinato per via speri-2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 16
▼B
mentale dal valore certificato non ricade al di fuori del limite di ± 10 %.
Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle
misure venga valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità
note dell'elemento a campioni non conosciuti. Si attira l'attenzione sul
fatto che, a differenza dell'analita, l'elemento aggiunto non è legato
chimicamente nella vera matrice e che, pertanto, i risultati ottenuti con
questa impostazione hanno validità inferiore a quelli ottenuti con l'uso
degli MRC. I dati del recupero sono accettabili solo quando si trovano
entro ± 10 % dal valore bersaglio.
2.4.2.2.Precisione dei metodi quantitativi
Nel caso di analisi ripetute di un campione eseguite in condizioni di
riproducibilità in laboratorio, il coefficiente di variazione (CV) intra-
laboratorio della media non supera i seguenti valori:
Tabella8
CVpermetodiquantitativiaintervalli difrazioni dimassadell'elemento
Frazione di massa CV (%)
≥10µg/kg a100 µg/kg 20
dameno di 100 µg/kg a1 000 µg/kg 15
≥1 000 µg/kg 10
2.4.3.Prescrizioni specifiche per la DPASV (Differential Pulse Anodic
StrippingVoltametry)
La completa distruzione della materia organica nei campioni prima
delle analisi DPASV ha un'importanza assoluta. Nei voltamogrammi
non sono visibili segnali ampi dovuti alla presenza di materiali organici.
I costituenti della matrice inorganica possono influenzare le altezze dei
picchi nella DPASV. La quantificazione è pertanto eseguita attraverso il
metodo delle aggiunte di standard. Con il metodo sono forniti campioni
di voltamogrammi tipici di una soluzione campione.
2.4.4.Prescrizioni specifiche per l'AAS (Atomic Absorption Spectro-
metry)
Si tratta fondamentalmente di una tecnica ad elemento singolo che
richiede, pertanto, un'ottimizzazione delle regolazioni sperimentali a
seconda dell'elemento specifico da quantificare. Ogniqualvolta ciò sia
possibile i risultati sono verificati qualitativamente e quantitativamente
ricorrendo a linee di assorbimento alternative (idealmente, sono selezio-
nate due linee differenti). Gli standard di calibrazione sono preparati in
unama trice di soluzione che corrispondail più possibile aquelladella
soluzione del campione da analizzare (ad esempio, concentrazione degli
acidi o composizione dell'agente modificatore). Per ridurre al minimo i
valori dei bianchi, tutti i reagenti sono della più elevata purezza dispo-
nibile. A seconda della modalità scelta per vaporizzare e/o atomizzare i
campioni è possibile distinguere vari tipi di AAS.
2.4.4.1.Prescrizioni specifiche per l'AAS con fiamma
Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun elemento.
In particolare sono verificate le velocità di flusso e la composizione del
gas. Per evitare interferenze provocate dall'assorbimento nel fondo, è
impiegato un correttore di sorgente continuo. Nel caso di matrici scono-
sciute, si verificase lacorrezione del fondo è richiestao meno.
2.4.4.2.Prescrizioni specifiche per l'AAS con fornace a grafite
Quando si lavora a livelli di tracce estremamente ridotte nella fornace a
grafite la contaminazione in laboratorio spesso inficia l'accuratezza. Per
la manipolazione del campione e dello standard si utilizzano pertanto
reagenti ad elevata purezza, acqua deionizzata e oggetti in plastica
inerte. Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun
elemento. In particolare, occorre verificare le condizioni di pretratta-
mento e atomizzazione (temperatura, tempo) nonché le modifiche alla
matrice.
Lavorando in condizioni di atomizzazione isotermica (ad esempio, tubo
trasversale in grafite riscaldato con piattaforma Lvov integrata) (8) si
ridurrà l'influenza della matrice sull'atomizzazione dell'analita. Oltre
alla modifica della matrice e alla correzione Zeeman (9) del fondo è
consentita la quantificazione per mezzo di una curva di calibrazione
basata sulla misurazione di soluzioni standard acquose.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 17
▼B
2.4.5.Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento
atomicocongenerazione diidruri
I composti organici che contengono elementi quali arsenico, bismuto,
germanio, piombo, antimonio, selenio, stagno e tellurio possono risul-
tare estremamente stabili e possono richiedere una decomposizione
ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale degli
elementi. Si consigliaperta nto ladigestione amicroonde oppure l'inci-
nerazione ad alta pressione in condizioni fortemente ossidanti. La
massima cura è prestata alla conversione completa e riproducibile degli
elementi nei loro idruri corrispondenti.
La formazione di idruro di arsenico in soluzione di acido cloridrico con
NaBH4 dipende dalla stato di ossidazione dell'arsenico (As III: forma-
zione rapida, As V: periodo di formazione più lungo). Per evitare una
perditadi sensibilità per ladetermina zione di As V con tecniche di inie-
zione del flusso, provocate dal breve tempo di reazione in questo
sistema, As V deve essere ridotto ad As III dopo la decomposizione
ossidante. Lo ioduro di potassio/acido ascorbico o la cisteina sono
adeguati a tale fine. I bianchi, le soluzioni di calibrazione e le soluzioni
campione sono trattate nello stesso modo. L'utilizzo di un sistema a lotti
consente di determinare entrambe le specie di arsenico senza compro-
mettere l'accuratezza. A causa della formazione ritardata dell'idruro As
V, la calibrazione è eseguita attraverso l'integrazione dell'area di picco.
Sono ottimizzate le impostazioni per gli strumenti; il flusso del gas, che
trasferisce l'idruro all'atomizzatore, è particolarmente importante e viene
verificato.
2.4.6.Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento
atomicoconvaporefreddo
Il vapore freddo è utilizzato solo in caso di mercurio. A causa della
volatilizzazione e delle perdite di adsorbimento del mercurio elemen-
tare, si deve prestare particolare attenzione durante l'intera analisi. Si
deve fare attenzione ad evitare la contaminazione da parte dei reagenti
o dell'ambiente.
I composti organici che contengono mercurio richiedono una decompo-
sizione ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale di
mercurio. Per ladecomposizione devono essere impiega ti sistemi sigil-
lati con digestione a microonde o incineratori ad alta pressione.
Particolare cura è prestata alla pulitura delle apparecchiature venute a
contatto con il mercurio.
L'utilizzo della tecnica di iniezione del flusso presenta alcuni vantaggi.
Per i limiti di decisione inferiori si raccomanda l'adsorbimento del
mercurio elementare su un adsorbitore in oro/platino seguito da desorbi-
mento termico. Il contatto tra l'adsorbitore o la cella e l'umidità
compromette la misurazione ed è evitato.
2.4.7.Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'emissione atomica
conplasmainduttivo(ICP-AES)
La spettrometria dell'emissione atomica con plasma induttivo (10) è un
metodo multi-elemento che consente la misurazione simultanea di più
elementi. Per utilizzare l'ICP-AES, i campioni devono essere innanzi-
tutto digeriti per decomporre le matrici organiche. Sono utilizzati
sistemi sigillati con digestione a microonde oppure l'incinerazione ad
alta pressione. La calibrazione degli strumenti e la scelta dell'elemento
o della lunghezza d'onda svolgono un ruolo essenziale in un'analisi ICP-
AES significativa. Per la calibrazione degli strumenti, nel caso di curve
di calibrazione lineari, è in genere necessario misurare soluzioni di cali-
brazione di quattro sole concentrazioni, in quanto le curve di
calibrazione dell'ICP-AES sono in genere lineari su quattro-sei ordini
di grandezza di concentrazione. La calibrazione del sistema ICP-AES
è eseguita, in genere, con uno standard multi-elemento a sua volta
preparato in una soluzione che contiene la stessa concentrazione di
acido della soluzione di misurazione. Si verificano le concentrazioni
degli elementi per lacurvalinea re.
Lasceltadelle lunghezze d'ondaper lamisuradelle emissioni dapa rte
degli analiti è adeguata alle concentrazioni degli elementi da determi-
nare. Quando la concentrazione dell'analita ricade all'esterno
dell'intervallo operativo di una linea di emissione si impiega una linea
di emissione differente. Si sceglie innanzitutto la linea di emissione più
sensibile (senzainterferenze) e successiva mente unalineameno sensi-
bile. Quando si lavora in prossimità o al limite di rilevazione, la scelta
migliore è rappresentata dalla linea più sensibile per il rispettivo analita.
Le principali difficoltà nella ICP-AES sono provocate dalle interferenze
dello spettro e del fondo. Le possibili interferenze sono, ad esempio, lo2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 18
▼B
spostamento semplice del fondo (simple background shift), lo sposta-
mento inclinato del fondo (sloping background shift), la
sovrapposizione diretta degli spettri e lo spostamento complesso del
fondo (complex background shift). Ciascuna di queste interferenze ha
cause e rimedi specifici. A seconda delle matrici, si applicano corre-
zioni alle interferenze e si devono ottimizzare i parametri operativi.
Alcune interferenze possono essere evitate per mezzo della diluizione
o adattando le matrici. Il materiale di riferimento e fortificato conte-
nente quantità note dell'analita (o degli analiti), nonché il materiale
bianco, è trattato in modo identico ai campioni da analizzare con ogni
lotto di campioni analizzati. Se l'analisi è volta a riscontrare una devia-
zione, lo standard è verificato, ad esempio, dopo dieci campioni, Tutti i
reagenti e il gas plasma sono della massima purezza disponibile.
2.4.8.Prescrizioni specifiche per la spettrometria di massa ad accoppia-
mentoinduttivo(ICP-MS)(11)
La determinazione di elementi di massa atomica media presenti in
tracce, quali cromo, rame e nichel può essere soggetta a forti interfe-
renze da parte di altri ioni isobarici e poliatomici. È possibile superare
tali interferenze solo se è disponibile una potenza di risoluzione pari ad
almeno 7 000-8 000. Le difficoltà collegate alle tecniche di MS
comprendono la deviazione strumentale, gli effetti della matrice e
l'interferenza degli ioni molecolari (m/z<80). Per correggere la devia-
zione degli strumenti e gli effetti dellama trice è richiestauna
standardizzazione interna multipla che copra lo stesso intervallo di
massa degli elementi da determinare.
Primadelle misura zioni per mezzo dellaICP-MS è richiestala
completa decomposizione della materia organica nei campioni. Come
avviene per l'AAS, dopo la digestione in recipienti sigillati gli elementi
volatili, ad esempio lo iodio, devono essere trasferiti ad uno stato di
ossidazione stabile. Le combinazioni di ioni molecolari di argon (gas
di plasma), idrogeno, carbonio, azoto ed ossigeno (acidi di dissoluzione,
impurità del gas di plasma e gas atmosferici catturati) e la matrice del
campione provocano interferenze particolarmente forti. Per evitare
interferenze sono necessarie la digestione completa, le misurazioni del
fondo, la scelta appropriata delle masse da analizzare, talvolta associata
a una scarsa abbondanza (limite di rilevazione più basso) e degli acidi
di dissoluzione, ad esempio l'acido nitrico.
Per gli elementi dadetermina re, le interferenze devono essere escluse
dalla scelta appropriata di masse analitiche specifiche, compresa la
conferma delle proporzioni di isotopi. Per ciascuna misurazione si veri-
fica la risposta strumentale prendendo in considerazione fattori Fano,
attraverso l'impiego di standard interni.
3.VALIDAZIONE
La validazione dimostra che il metodo analitico è conforme ai criteri applicabili
per le caratteristiche di rendimento pertinenti.
Finalità di controllo differenti richiedono categorie di metodi differenti. Nella
tabella che segue sono illustrate le caratteristiche di rendimento da verificare
per ogni tipi di metodo.
Tabella9
Classificazione di metodi analitici in base alle caratteristiche di rendimento che devono essere
determinate
Limite di
rilevazione
CCβLimite di
decisione
CCαEsattezza/
RecuperoPrecisioneSelettività/
SpecificitàApplica-
bilità/Robu-
stezza/
Stabilità
Metodi
qualitativiS+–––++
C++––++
Metodi
quantitativiS+––+++
C++++++
S = metodi di screening; C = metodi di conferma; + = la determinazione è obbligatoria.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 19
▼B
3.1. PROCEDURE DI VALIDAZIONE
Nel presente capitolo sono illustrati esempi e/o riferimenti per le procedure di
validazione dei metodi analitici. Per dimostrare che il metodo analitico è
conforme ai criteri di rendimento per le caratteristiche di rendimento possono
essere utilizzati altri approcci, a patto che forniscano informazioni di pari livello
e qualità.
La validazione può inoltre essere eseguita attraverso uno studio inter-laboratorio,
quali quelli istituiti dal Codex Alimentarius, dall'ISO o dall'IUPAC (12) oppure
in base a metodi alternativi, quali studi condotti in singoli laboratori o attraverso
la validazione interna (13)(14). In questa parte ci si concentra sugli studi
condotti in singoli laboratori (o validazione interna) utilizzando una strategia
modulare. Questo approccio prevede:
1) un gruppo di caratteristiche di rendimento comuni indipendenti dal modello
di validazione utilizzato; e
2) procedure dipendenti dal modello più specifiche descritte nella tabella 10.
Tabella10
Parametri direndimentodipendentieindipendentidalmodello
Validazione
Parametri di rendimento indipen-
denti dal modelloParametri di rendimento dipendenti dal modello
Caratteristiche di rendimento
comuni (3.1.1)Approccio di validazione
convenzionale (3.1.2)Approccio di validazione
interno (3.1.3)
Specificità Recupero Recupero
Esattezza Ripetibilità Ripetibilità
Robustezza: cambiamenti lievi Riproducibilità intralabora-
torioRiproducibilità intralaboratorio
Stabilità Riproducibilità Riproducibilità
Limite di decisione (CC α) Limite di decisione (CC α)
Capacità di rilevazione (CC β)Capacità di rilevazione (CC β)
Curve di calibrazione Curva di calibrazione
Robustezza: cambiamenti
significativiRobustezza
3.1.1.Caratteristiche direndimentoindipendentidalmodello
Le caratteristiche di rendimento che seguono devono essere determinate
a prescindere dall'approccio di validazione scelto. Per ridurre al minimo
il carico di lavoro, per combinare gli esperimenti eseguiti per determi-
nare parametri differenti potrà essere impiegato un approccio studiato
con attenzione e valido dal punto di vista statistico.
3.1.1.1.Specificità
Per i metodi analitici riveste importanza la capacità di discriminazione
tra l'analita e sostanze strettamente correlate (isomeri, metaboliti,
prodotti di degradazione, sostanze endogene, componenti della matrice,
ecc.). Per verificare la presenza di interferenze sono necessari due
approcci.
Si scelgono pertanto due sostanze potenzialmente in grado di interferirsi
e si devono analizzare i campioni bianchi pertinenti per rilevare la
presenza di possibili interferenze e valutarne gli effetti:
— Selezionare una gamma di composti chimicamente correlati (meta-
boliti, derivati, ecc.) o altre sostanze che è probabile riscontrare
con il composto in esame e che possono essere presenti nei
campioni.
— Analizzare un numero adeguato di campioni bianchi rappresentativi
(n≥20) e verificare la presenza di eventuali interferenze (segnali,
picchi, tracce di ioni) nella regione interessata alla quale l'analita in
fase di studio deve eluire.
— In aggiunta, i campioni bianchi rappresentativi sono fortificati ad
una concentrazione pertinente con sostanze che possono interferire
con l'identificazione e/o la quantificazione dell'analita.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 20
▼B
— Dopo l'analisi, verificare se:
— la presenza può portare a una falsa identificazione,
— l'identificazione dell'analita bersaglio è ostacolata dalla presenza
di unao più interferenze, oppure
— se la quantificazione è influenzata in modo percettibile.
3.1.1.2.Esattezza
Nel presente paragrafo si descrive la determinazione dell'esattezza (una
componente dell'accuratezza) che può essere stabilita solo per mezzo di
un materiale di riferimento certificato (MRC). Un MRC deve essere
utilizzato ogniqualvolta sia disponibile. La procedura è descritta detta-
gliatamente nella ISO 5725-4 (5). Di seguito ne viene riportato un
esempio:
— Analizzare sei duplicati dell'MRC in base alle istruzioni di test per
il metodo.
— Determinare la concentrazione dell'analita presente in ciascun
campione dei duplicati.
— Calcolare la media, la deviazione standard ed il coefficiente di
variazione (%) per tali concentrazioni.
— Calcolare l'esattezza dividendo la concentrazione media rilevata per
il valore certificato (misurato come concentrazione) e moltiplicarlo
per 100, per esprimere il risultato come una percentuale:
Esattezza (%) = concentrazione media rilevata corretta per il recupero ×
100/valore certificato.
Se non è disponibile alcun MRC, anziché l'esattezza, il recupero potrà
essere determinato come descritto al paragrafo 4.1.2.1 in seguito.
3.1.1.3.Robustezza/applicabilità (cambiamenti lievi)
Tali studi impiegano l'introduzione di lievi variazioni ragionevoli da
parte del laboratorio e ne osservano le conseguenze.
Gli studi pre-investigativi devono essere svolti scegliendo fattori del
pretrattamento, della pulitura e dell'analisi del campione che possono
influenzare i risultati della misurazione. Tali fattori possono compren-
dere l'analista, l'origine e l'età dei reagenti, dei solventi degli standard
e degli estratti del campione, la velocità di riscaldamento, la tempera-
tura, il valore del pH, nonché numerosi altri eventi che possono
verificarsi in laboratorio. Tali fattori devono essere modificati in un
ordine di grandezza che corrisponde alle deviazioni riscontrate in
genere nei laboratori.
— Identificare possibili fattori che potrebbero influenzare i risultati.
— Variare leggermente ciascun fattore.— Eseguire un test di robustezza utilizzando l'approccio di Youden
(15) (16). (A questo punto è possibile utilizzare anche altri metodi
approvati. L'approccio di Youden, tuttavia, consente di ridurre al
minimo il tempo e l'impegno richiesti). L'approccio di Youden è
studiato come metodo fattoriale frazionale e non consente di rile-
vare le interazioni tra i differenti fattori.
— Quando si riscontra che un fattore influenza i risultati delle misura-
zioni in modo significativo, condurre ulteriori esperimenti per
decidere i limiti accettabili per tale fattore.
— Nel protocollo del metodo devono essere indicati chiaramente i
fattori che influenzano i risultati in modo significativo.
L'idea basilare non è quella di studiare un cambiamento alla volta, ma
di introdurre numerose variazioni contemporaneamente. Ad esempio, si
presuma che A, B, C, D, E, F, G indichino i valori nominali di sette
fattori differenti che possono influenzare i risultati se i loro valori nomi-
nali vengono variati leggermente. Si presuma che i valori alternativi
siano indicati dalle lettere minuscole corrispondenti a, b, c, d, e, f, g.
Ciò produce 2 (7) o 128 diverse possibili combinazioni.
È possibile scegliere un sottoinsieme di otto di queste combinazioni che
presentano un equilibrio tra lettere maiuscole e minuscole (tabella 11).
È necessario eseguire otto determinazioni che utilizzeranno una combi-
nazione dei fattori scelti (A-G). I risultati delle determinazioni sono
riportati nella tabella 11 come S-Z.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 21
▼B
Tabella11
Progetto sperimentaleperglistudidirobustezza(cambiamentilievi)
Valore di
fattore FN. di combinazioni di determinazioni
12345678
A / aAAAAa a a a
B / b BBbBBBbb
C / c CcCcCcCc
D / d D DddddDD
E/e E e E e e E e E
F / f FffFFffF
G/g G g g G g G G g
Risultato
osservato RSTUV W XYZ
Per i calcoli si vedano gli esempi delle prove di robustezza al punto 3.3.
3.1.1.4.Stabilità
È stato osservato che un'insufficiente stabilità dell'analita o dei costi-
tuenti della matrice nel campione durante la conservazione o l'analisi
può dare luogo a deviazioni significative nel risultato finale dell'analisi.
Si deve inoltre verificare la stabilità dello standard di calibrazione nella
soluzione. La stabilità dell'analita è in genere ben caratterizzata in
svariate condizioni di conservazione. Il monitoraggio della condizione
di conservazione sarà parte del normale sistema di accreditamento del
laboratorio. Di seguito vengono riportati esempi di come determinare
la stabilità quando la condizione di conservazione non è nota.
Stabilità dell'analita in soluzione:
— Preparare soluzioni di base fresche dell'analita/degli analiti e diluire
secondo quando specificato nelle istruzioni del test per ottenere un
numero di aliquote sufficiente (ad esempio, 40) di ciascuna concen-
trazione selezionata (a circa il limite minimo di rendimento richiesto
per le sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito
o a circa il limite consentito per le altre sostanze). Preparare
entrambe le soluzioni dell'analita impiegate per la fortificazione e
utilizzate nella soluzione finale da analizzare e qualsiasi altra solu-
zione che possa interessare (ad esempio, standard derivati).
— Misurare il contenuto di analita nella soluzione appena preparata
attenendosi alle istruzioni del test.
— Versare volumi appropriati in contenitori adeguati, etichettarli e
riporli seguendo lo schema:
Tabella12
Schemaperladeterminazione dellastabilitàdell'analitainsoluzione
–2 0º C +4º C +2 0º C
Buio 10 aliquote 10 aliquote 10 aliquote
Luce 10 aliquote
— Per il tempo di conservazione si potrà scegliere 1, 2, 3 e 4 settimane
o più, se necessario, vale a dire fino alla comparsa dei primi feno-
meni di degrado durante l'identificazione e/o la quantificazione.
Devono essere registrati il tempo di conservazione massimo e le
condizioni di conservazione ottimali.
— Il calcolo della concentrazione dell'analita/degli analiti in ciascuna
aliquota deve essere eseguito utilizzando la soluzione al 100 %
dell'analita appena preparata al momento dell'analisi.
Analita restante (%) = Ci × 100/Cfresca
Ciconcentrazione al tempo preso in esame
Cfrescaconcentrazione della soluzione fresca2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 22
▼B
Stabilità dell'analita/degli analiti nella matrice
— Ogniqualvolta sia possibile devono essere utilizzati campioni reali.
Ove non sia disponibile alcun materiale di questo tipo, deve essere
utilizzata la matrice fortificata con l'analita.
— Ove sia disponibile materiale di questo tipo, la concentrazione nel
materiale deve essere determinata mentre il materiale è ancora
fresco. Dopo 1, 2, 4 e 20 settimane devono essere prelevate ulteriori
aliquote del materiale e si devono determinare le concentrazioni. Il
tessuto deve essere conservato ad almeno -20 ºC o a temperature
inferiori, se richiesto.
— Se non è disponibile alcun materiale di tale tipo, prendere del mate-
riale bianco e omogeneizzarlo. Dividere il materiale in 5 aliquote.
Fortificare ciascuna aliquota con l'analita che deve preferibilmente
essere preparato in una piccola quantità di soluzione acquosa.
Analizzare un'aliquota immediatamente. Conservare le aliquote
restanti ad almeno -20 ºC, o a temperature inferiori, ed analizzarle
dopo 1, 2, 4 e 20 settimane.
3.1.1.5.Curve di calibrazione
Quando per la quantificazione vengono impiegate curve di calibrazione:
— nellacostruzione dellacurvadevono essere utilizza ti a lmeno cinque
livelli (compreso lo zero),
— si deve descrivere la curva operativa della curva,
— si deve descrivere la formula matematica della curva e la bontà
dell'adattamento dei dati sulla curva,
— si devono descrivere gli intervalli di accettabilità per i parametri
dellacurva .
Ove sia necessaria una calibrazione seriale basata su una soluzione
standard, si indicano gli intervalli accettabili per i parametri della curva
di calibrazione che possono variare da serie a serie.
3.1.2.Procedure divalidazioneconvenzionali
Il calcolo dei parametri in base ai metodi convenzionali richiede l'ese-
cuzione di svariati esperimenti singoli. Per ciascuna modifica
importante si deve determinare la caratteristica di rendimento (cfr. il
paragrafo «Robustezza/applicabilità», in precedenza). Per i metodi ad
analita multiplo è possibile analizzare contemporaneamente svariati
analiti, previa esclusione di possibili interferenze specifiche. In tal
modo è possibile determinare svariate caratteristiche. Pertanto, per
ridurre il carico di lavoro è consigliabile combinare per quanto possibile
gli esperimenti (ad esempio, ripetibilità e riproducibilità intra-labora-
torio con la specificità, analisi dei campioni bianchi per determinare il
limite di decisione e test dellaspecificità).
3.1.2.1.Recupero
Se non esiste alcun MRC, il recupero deve essere determinato per
mezzo di esperimenti che impiegano una matrice bianca fortificata
ricorrendo, ad esempio, al seguente schema:
— selezionare 18 aliquote di un materiale bianco e fortificare 6
aliquote a 1, 1,5 e 2 volte ciascuna il limite di rendimento minimo
richiesto oppure a0,5, 1 e 1,5 volte il limite consentito,
— analizzare i campioni e calcolare la concentrazione presente in
ciascun campione,
— utilizzando l'equazione che segue, calcolare il recupero per ciascun
campione,
— calcolare il recupero medio e il CV derivante dai 6 risultati a
ciascun livello,
— recupero % = 100 × Contenuto misurato/Livello di fortificazione.
Questo metodo convenzionale per la determinazione del recupero è una
variante del metodo di aggiunta dello standard descritto al punto 3.5,
quando:
— il campione è considerato un campione bianco anziché un campione
da analizzare,2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 23
▼B
— si considerache il componente fina le(1) e il recupero(2) per le due
porzioni di analisi siano simili,
— i campioni da analizzare hanno la stessa massa e gli estratti dell'ali-
quotaha nno lo stesso volume,
— la quantità di standard di calibrazione aggiunta alla seconda aliquota
(drogata) da analizzare è rilevata xADD. (xADD = ρA.VA),
— x1 è il valore misurato per il bianco e x2 è il valore misurato per la
seconda aliquota (drogata) da analizzare,
— pertanto, % recupero = 100 (x2 - x1)/xADD.
Ove non sia soddisfatta (o si presuma) di non soddisfare una qualsiasi
delle condizioni elencate in precedenza, si deve eseguire la procedura
completaper ladetermina zione del recupero per mezzo del metodo di
aggiunta dello standard, come descritto al punto 3.5.
3.1.2.2.Ripetibilità
— Preparare un gruppo di campioni di matrice identica, fortificata con
l'analita in modo da produrre concentrazioni equivalenti a 1, 1,5 e 2
volte il limite di rendimento minimo richiesto oppure a0,5, 1 e 1,5
volte il limite consentito.
— L'analisi deve essere eseguita con almeno sei duplicati ad ogni
livello.
— Analizzare i campioni.
— Calcolare la concentrazione rilevata in ciascun campione.— Trovare la concentrazione media, la deviazione standard e il coeffi-
ciente di variazione (%) dei campioni fortificati.
— Ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni.— Calcolare le concentrazioni medie complessive ed i CV per i
campioni fortificati.
3.1.2.3.Riproducibilità intra-laboratorio
— Preparare un gruppo di campioni del materiale da analizzare speci-
ficato (matrici identiche o differenti), fortificati con l'analita/gli
analiti per produrre concentrazioni equivalenti a 1, 1,5 e 2 volte il
limite minimo di rendimento richiesto oppure a0,5, 1 e 1,5 volte il
limite consentito.
— L'analisi deve essere eseguita con almeno sei duplicati ad ogni
livello.
— Se possibile, ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni con
operatori differenti ed in condizioni ambientali differenti, ad
esempio, lotti di reagenti o di solventi differenti, ecc., temperature
ambientali differenti, strumenti differenti, ecc.
— Analizzare i campioni.— Calcolare la concentrazione rilevata in ciascun campione.
— Trovare la concentrazione media, la deviazione standard ed il coef-
ficiente di variazione (%) dei campioni fortificati.
3.1.2.4.Riproducibilità
Quando si deve verificare la riproducibilità, i laboratori devono parteci-
pare a studi collaborativi in base alla ISO 5725-2 (5).
3.1.2.5.Limite di decisione (CC α)
Il limite di decisione deve essere definito secondo i requisiti per l'iden-
tificazione o l'identificazione più la quantificazione in base alle
definizioni contenute nella parte 2 «Criteri di rendimento e altre prescri-
zioni per i metodi analitici».
Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consen-
tito è possibile stabilire il CC α:
— per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla
ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta
di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco che viene
fortificato al livello di rendimento minimo richiesto, o al di sotto
di tale livello, ad intervalli equidistanti. Analizzare i campioni.
Dopo l'identificazione, tracciare il grafico del segnale rispetto alla2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 24
(1) Componente finale: quella frazione di massa dell'analita contenuta nel campione che è
presente nell'estratto finale.
(2) Recupero (in questo contesto): quella frazione di massa dell'analita aggiunta al
campione, che è presente nell'estratto finale. Nel resto del documento si presume checomponente finale e recupero siano uguali e pertanto si impiegherà solo il termine
«recupero».
▼B
concentrazione aggiunta. La concentrazione corrispondente al punto
di intercettazione dell'asse y più 2,33 volte la deviazione standard
della riproducibilità intra-laboratorio del punto di intercettazione
equivale al limite di decisione. Questo metodo si applica solo alle
analisi quantitative ( α= 1 %).
— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice
per essere in grado di calcolare il rapporto segnale-rumore nell'inter-
vallo di tempo al quale è previsto l'analita. Possono essere utilizzati
come limite di decisione tre rapporti segnale-rumore. Questo
metodo si applica alle analisi quantitative e qualitative.
Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito è
possibile stabilire il CC α:
— Per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla
ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta
di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco che viene
fortificato al limite consentito ad intervalli equidistanti. Analizzare
i campioni. Dopo l'identificazione, tracciare il grafico del segnale
rispetto alla concentrazione aggiunta. La concentrazione corrispon-
dente al limite consentito più 1,64 volte la deviazione standard
della riproducibilità intra-laboratorio equivale al limite di decisione
(α= 5 %).
— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice
fortificati con l'analita/gli analiti al limite consentito. La concentra-
zione al limite consentito più 1,64 volte la deviazione standard
corrispondente equivale al limite di decisione ( α= 5 %).
Cfr. inoltre l'articolo 5 e il punto 3.2.
3.1.2.6.Capacità di rilevazione (CC β)
La capacità di rilevazione deve essere determinata in base alle prescri-
zioni per lo screening, l'identificazione o l'identificazione più la
quantificazione come definite in precedenza (cfr. la parte 2).
Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consen-
tito è possibile stabilire il CC ββ:
— Per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla
ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta
di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco rappresenta-
tivo, che viene fortificato al livello di rendimento minimo
richiesto, o al di sotto di tale livello, ad intervalli equidistanti.
Analizzare i campioni. Dopo l'identificazione, tracciare il grafico
del segnale rispetto alla concentrazione aggiunta. La concentrazione
corrispondente al limite di decisione più 1,64 volte la deviazione
standard della riproducibilità intra-laboratorio del contenuto medio
misurato al limite di decisione equivale alla capacità di rilevamento(β= 5 %).
— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice
fortificati con l'analita/gli analiti al limite di decisione. Analizzare i
campioni ed identificare gli analiti. Il valore del limite di decisione
più 1,64 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-labo-
ratorio del contenuto misurato equivale alla capacità di rilevazione
(β= 5 %).
— Quando non sono disponibili risultati quantitativi la capacità di rile-
vazione può essere determinata dallo studio del materiale bianco
fortificato al limite di decisione e oltre. In questo caso il livello di
concentrazione, dove rimangono solo ≤5 % di falsi risultati
conformi, equivale alla capacità di rilevazione del metodo. Al fine
di garantire una base affidabile per tale determinazione si devono
pertanto eseguire almeno 20 studi per almeno un livello di concen-
trazione.
Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consen-
tito è possibile stabilire il CC β:
— per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla
ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta
di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco rappresenta-
tivo, che viene fortificato al limite consentito ad intervalli
equidistanti. Analizzare i campioni ed identificare l'analita/gli
analiti. Calcolare la deviazione standard del contenuto medio misu-
rato al limite di decisione. La concentrazione corrispondente al
valore del limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard
della riproducibilità intra-laboratorio equivale alla capacità di rileva-
zione ( β= 5 %).2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 25
▼B
— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice
fortificati con l'analita/gli analiti al limite di decisione. Il valore del
limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard corrispon-
dente equivale alla capacità di rilevazione ( β= 5 %).
Cfr. inoltre lasezione 3.2.
3.1.2.7.Robustezza (cambiamenti significativi)
Il metodo analitico deve essere testato in condizioni sperimentali diffe-
renti che comprendono, ad esempio, specie differenti, matrici differenti
o condizioni di campionatura differenti. I cambiamenti introdotti
devono essere importanti. L'importanza di tali cambiamenti può essere
valutata, ad esempio, utilizzando l'approccio di Youden (15) (16). Si
deve determinare la caratteristica di rendimento per tutti i cambiamenti
significativi che hanno dimostrato di avere un effetto significativo sul
rendimento dell'analisi.
3.1.3.Validazioneinbaseamodellialternativi
Ove si applichino procedure di validazione alternative, sono definiti nel
protocollo di validazione il modello e la strategia di base con i rispettivi
requisiti, ipotesi, e formule o si riportano almeno riferimenti circa la
loro disponibilità. In seguito viene presentato un esempio di un
approccio alternativo. Quando si applica, ad esempio, il modello di
validazione interno, le caratteristiche di rendimento sono determinate
in modo da consentire la validazione per cambiamenti significativi
entro la stessa procedura di validazione. Ciò comporta la necessità di
progettare un piano sperimentale per la validazione.
3.1.3.1.Piano sperimentale
Un piano sperimentale deve essere progettato in base al numero delle
varie specie e dei differenti fattori in corso di studio. Come primo passo
dell'intera procedura di validazione si considerano pertanto le popola-
zioni campione che verranno analizzate in futuro in laboratorio al fine
di selezionare le specie più importanti e quei fattori che potrebbero
influenzare i risultati delle misurazioni. In seguito si sceglie l'intervallo
di concentrazione in modo adeguato allo scopo in base al livello di inte-
resse.
Esempio:— Con il metodo analitico in corso di validazione è possibile studiare
svariati analiti contemporaneamente.
— Sono state individuate due variazioni del fattore principale (A e B).
I fattori principali costituiscono la base sulla quale vengono combi-
nati i livelli dei fattori. Tali fattori principali possono comprendere
fattori quali specie o matrice. Nell'esempio che segue il fattore prin-
cipale ha subito una variazione su due livelli, vale a dire sono state
considerate due specie differenti (specie A e specie B). In generale
è possibile variare i fattori principali su più di due livelli e questo
non fa altro che aumentare il numero di analisi da eseguire.
— I fattori selezionati devono essere variati su due livelli (indicati
come + o -).
Tabella13
Esempidifattoriconsideratiimportantiperunaproceduradivalidazione
Sesso dell'animale (fattore 1)
Razza (fattore 2)Condizioni di trasporto (fattore 3)
Condizioni di conservazione (fattore 4)
Freschezza del campione (fattore 5)Condizioni di ingrasso (fattore 6)
Operatori differenti con esperienza differente (fattore 7)2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 26
▼B
Tabella14
Possibilepianosperimentaleperl'esempioprecedente
Specie Fattore 1 Fattore 2 Fattore 3 Fattore 4 Fattore 5 Fattore 6 Fattore 7 Fattore 8
A ++++–+– 1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+ 3
A +––++++ 4
A– + + – + + + 5
A –+–+––+ 6
A ––+++–– 7
A –––––+– 8
B +++++–+ 9B+ + – – – + + 1 0
B +–+–++–1 1
B+ – – + – – – 1 2
B –++––––1 3
B –+–+++–1 4
B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+ 1 6
Dato che ciascun campione (ciascuna combinazione di livello di fattori)
deve essere drogato con 4 concentrazioni differenti al livello di inte-
resse e che è necessario analizzare un campione bianco per ciascun
livello, per l'intero esperimento di validazione si devono eseguire
5 × 16 = 80.
Da questi 80 risultati delle misurazioni è possibile calcolare (13) (14):Recupero
— Ripetibilità per livello di concentrazione (sir)
— Riproducibilità intra-laboratorio per livello di concentrazione (siR)— Limite di decisione (CC α)
— Capacità di rilevazione (CC β)
— Curvadi potenza(ta sso di errore βrispetto alla concentrazione) (cfr.
3.1.3.2)
— Robustezza rispetto a cambiamenti significativi; la robustezza
rispetto ai cambiamenti lievi può essere determinata in base al para-
grafo 3.1.1.3)
— 16 curve di calibrazione correlate al campione— 1 curva di calibrazione complessiva— Intervallo di previsione della curva di calibrazione complessiva— Deviazioni prodotte dalla matrice (smat)— Deviazioni prodotte dal ciclo operativo (srun)— Effetto dei singoli fattori sui risultati delle misurazioni
Tali caratteristiche di rendimento consentono una valutazione esauriente
del livello di rendimento del metodo, dato che viene studiato non solo
l'effetto dei singoli fattori, ma anche le combinazioni pertinenti di tali
fattori. Con l'aiuto di tale progetto sperimentale è possibile decidere se
occorre escludere dalla curva di calibrazione complessiva questo o quel
fattore selezionato, in quanto devia in modo significativo dalle devia-
zioni standard degli altri fattori.
3.1.3.2.Curva di potenza
La curva di potenza fornisce informazioni sulla capacità di rilevazione
del metodo entro l'intervallo di concentrazione scelto. Si riferisce al
rischio di errore βquando si applica il metodo studiato. La curva di
potenza consente di calcolare le capacità di rilevazione per le rispettive
categorie (screening, conferma) o per i rispettivi tipi (qualitativo o
quantitativo) di metodi per un determinato errore β(ad esempio, 5 %).2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 27
▼B
Figura1:
Curvadi potenza
Nella figura 1 è riportato un esempio della rappresentazione grafica
della capacità di rilevazione (CC β)di un metodo analitico. Questo
particolare metodo ha il rischio residuo del 5 % di prendere una deci-
sione falsa ad una concentrazione di 0,50 µg/kg. Ad unaconcentra zione
di 0,55 µg/kg il rischio di prendere unadecisione di fa lsaconformità
scende all'1 %.
3.1.3.3.Riproducibilità
La determinazione della riproducibilità di un metodo da parte degli
studi di laboratorio singolo (validazione interna) richiede la partecipa-
zione ripetuta a studi di competenza in base alle guide ISO 43-1(3) e
43-2(4). I laboratori hanno la facoltà di scegliere i propri metodi, a
patto che tali metodi vengano impiegati in condizioni di routine. La
deviazione standard del laboratorio può essere utilizzata per valutare la
riproducibilità del metodo.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 28
▼B
3.2. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEI DIVERSI LIMITI ANALITICI
Figura2:
Sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito
2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 29
▼B
Figura3:
Sostanze con un limite consentito stabilito
2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 30
▼B
3.3. ESEMPIO DI CALCOLO DEL TEST DI ROBUSTEZZA PER CAMBIA-
MENTI LIEVI SECONDO L'APPROCCIO DI YOUDEN (16)
Raffrontodellemedie(A)
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Fi)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Confrontare le medie delle lettere maiuscole (da AA a AG) con le medie delle
lettere minuscole corrispondenti (daAaaAg). Se un fa ttore haun effetto, la
differenza sarà significativamente superiore rispetto alle differenze degli altri
fattori.
Un metodo robusto non deve essere influenzato dai cambiamenti riscontrati
quasi certamente da un laboratorio all'altro.
Se non è presente alcuna differenza notevole, la misura più realistica dell'errore
casuale è data dalle sette differenze.
Differenze (Di) Quadrato delle differenze (Di2)
Da=A–a= Σ(Ai)–Σ(ai)
Db=B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C–c= Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd=D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E–e= Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F–f= Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg=G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= valore a
Db2= valore b
Dc2= valore c
Dd2= valore d
De2= valore e
Df2= valore f
Dg2= valore g
Deviazione standard delle differenze Di(SDi):
Quando la SDiè significativamente più grande della deviazione standard del
metodo eseguito in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio (cfr. in prece-
denza), è inevitabile concludere che tutti i fattori insieme hanno un effetto sul
risultato, anche se ciascun singolo fattore non mostra un'effetto significativo, e
che il metodo non è sufficientemente robusto rispetto alle modifiche scelte.
3.4. ESEMPI DI CALCOLI PER LA PROCEDURA DI VALIDAZIONE
INTERNA
Esempi e calcoli per il protocollo di validazione interna come descritto per la
validazione secondo modelli alternativi (3.1.3.) (13) (14).
3.5. ESEMPI DI CALCOLI PER IL METODO DI AGGIUNTA DELLO
STANDARD
Un campione da analizzare con un contenuto T dell'analita è diviso in due
aliquote da analizzare 1 e 2, di massa m1 e m2 rispettivamente. L'aliquota 2 è
drogata con un volume VAdi unasoluzione di concentra zione ρA dell'analita.
Dopo le fasi di estrazione e purificazione del metodo vengono ottenuti due
estratti delle aliquote aventi rispettivamente volume V1eV2. Il recupero dell'a-
nalita deve essere rc. Entrambi gli estratti sono saggiati con un metodo di
misurazione di sensibilità b e danno una risposta analitica, rispettivamente, di
x1 e x2.
Se si presume che rc e b siano identici per l'analita nel campione nativo e nel
campione addizionato, allora il contenuto T potrà essere calcolato come:
T=x1.V1.ρA.VA/(x2.V2.m1-x1.V1.m2)
Tale metodo consentirà la determinazione del recupero rc. Quindi, in aggiunta
all'analisi descritta in precedenza, parte dell'estratto dell'aliquota 1 (di volume
V3) è drogata con una quantità nota ρB.VBdell'analita e saggiata a sua volta.
La risposta analitica è x3ed il recupero è:2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 31
▼B
rc = x2.V1.V2.ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)-x2.V2.T.m1(V3-VB)]
È inoltre possibile calcolare la sensibilità b, come:
b= x1.V1/rc.T.m1
Sono state descritte tutte le condizioni di applicazioni e le informazioni detta-
gliate (18).
4.ABBREVIAZIONIUTILIZZATENELTESTO
AAS Atomic Absorption Spectrometry, spettrometriadell'a ssorbimento
atomico
AES Atomic Emission Spectrometry, spettrometriadi emissione a tomicaAOAC-I Association of Official Analytical Chemists InternazionaleB Frazione combinata (immunoassay)CI Ionizzazione chimicaMRC Materiale di riferimento certificatoCV Coefficiente di variazione
2 D Bidimensionale
DAD Diode array detection, rilevazione tramite serie di diodiDPASV Differential pulse anodic stripping voltametry, voltammetria di ridis-
soluzione anodica differenziale ad impulsi
ECD Electron capture detection, rilevazione della cattura degli elettroni
EI Electronic impact ionisation, ionizzazione ad impatto elettronicoGC Gas chromatography, gas cromatografiaHPLC High performance liquid chromatography, cromatografia liquida ad
alta efficienza
HPTLC High performance thin layer chromatography, cromatografia su
strato sottile ad alta risoluzione
HRMS High resolution (mass spectrometry), alta risoluzione (spettrometria
di massa)
ICP-AES Inductively coupled plasma- atomic emission spectrometry, spettro-
metria di emissione atomica a plasma induttivo
ICP-MS Inductively coupled plasma-mass spectrometry, spettrometria di
massa a plasma induttivo
IR Infrarosso
ISO International Standard Organisation, Organizzazione internazionale
per la standardizzazione
LC Liquid chromatography, cromatografia liquidaLR(MS) Low resolution (mass spectrometry), bassa risoluzione (spettrometria
di massa)
LMRC Limite minimo di rendimento richiestoMS Spettrometriadi ma ssam/z Rapporto massa/caricaRF Relative migration to the solvent front (TLC), migrazione relativa al
fronte del solvente (TLC)
RSDL Relative standard deviations of the laboratory, deviazioni standard
relative del laboratorio
SIM Selected ion monitoring, monitoraggio di ioni selezionatiTLC Thin layer chromatography, cromatografia su strato sottileUV Ultraviolet light, luce ultra violettaVIS Visible light, luce visibile
5.RIFERIMENTI
(1) ISO 17025:1999 General requirement for the competence of calibration
and testing laboratories.
(2) ISO 3534-1:1993 Statistical Methods for quality control — Vol. 1 voca-
bulary and symbols.
(3) ISO Guide 43-1:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 1: Development and operation of proficiency testing
schemes.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 32
▼B
(4) ISO Guide 43-2:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by
laboratory accreditation bodies.
(5) ISO 5725:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results — Part 1:General principles and definitions; ISO
5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic
methods for the determination of the trueness of a standard measure-
ment method.
(6) ISO 78-2:1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods
of chemical analysis.
(7) W.G de Ruig and J.M Weseman «A new approach to confirmation by
infrared spectrometry» J. Chemometrics 4 (1990) 61-77.
(8) Cfr., ad esempio, May, T.W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier
and L'vov platform for elimination of matrix interferences in the
analysis of fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption
spectrometry: Analytical Chemistry 54(7):1032-1037 (90353).
(9) Applications of Zeeman Graphite Furnace Atomic Absorption Spectro-
metry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S.
Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675.
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992.
(11) Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pag. 329.
(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of
method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.
(13) Jülicher, B., Gowik, P. und Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house
validation concept. Analyst, 120, 173.
(14) Gowik, P., Jülicher, B. und Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high perfor-
mance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method
description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr.,
716, 221.
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia
22201-3301, USA.
(16) W.J. Youden; Steiner, E.H.; «Statistical Manual of the AOAC – Asso-
ciation of Official Analytical Chemists», AOAC-I, Washington DC:
1975, p. 35 ff.
(17) ISO 11843:1997 Capability of detection — Part 1: Terms and defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case Part 2:
Methodology in the linear calibration case.
(18) R.W. Stephany & L.A. van Ginkel: «Yield or recovery: a world of
difference». Atti dell'8oEuro Food Chem, Vienna, Austria, 18-20
settembre, (1995) Federation of European Chemical Societies, Event
206. ISBN 3-900554-17X, pagine 2-9.
(19) Direttiva71/354/CEE del Consiglio, del 18 ottobre 1971, per il ra vvici-
namento delle legislazioni degli Stati membri relative alle unità di
misura(GU L 243 del 29.10.1971, pa g. 29).
(20) ISO 31-0:1992 Quantities and units — Part 0: General principles.2002D0657 — IT — 17.08.2002 — 000.001 — 33