A)

Il saggio ELISA blocking o competitivo deve essere effettuato secondo il metodo descritto qui di seguito. Il saggio ELISA competitivo con l'anticorpo monoclonale 3-17-A3 serve a individuare gli anticorpi nei confronti di tutti i sierotipi noti del virus della febbre catarrale degli ovini (BTV). Il principio su cui si basa il saggio consiste nell'interruzione della reazione tra l'antigene del virus della febbre catarrale degli ovini (antigene BTV) e un anticorpo monoclonale gruppo-specifico (3-17-A3) mediante aggiunta del siero da esaminare. Gli anticorpi anti-BTV presenti nel siero da esaminare bloccano la reattività dell'anticorpo monoclonale (Mab) e determinano una riduzione della colorazione prevista dopo l'aggiunta di anticorpi anti-topo marcati da enzima e di cromogeno/substrato. I sieri possono essere saggiati con una sola diluizione di 1:5 (saggio puntuale - appendice 1) o essere titolati (titolazione del siero - appendice 2) con diluizioni in serie fino al punto finale. Possono essere considerati positivi i campioni con valori di inibizione superiori al 50 %. Materiali e reagenti 1. Piastre da microtitolazione ELISA adeguate. 2. Antigene: fornito sotto forma di estratto di cellule concentrato, preparato secondo il metodo descritto di seguito e conservato a una temperatura di – 20 °C o – 70 °C. 3. Tampone bloccante: tampone fosfato salino (PBS) contenente 0,3 % di siero bovino adulto BTV-negativo e 0,1 % (v/v) di Tween-20 (fornito come sciroppo di poliossietilen-sorbitan-monolaurato) in PBS. 4. Anticorpo monoclonale: 3-17-A3 (sotto forma di supernatante di coltura tissutale di ibridoma) diretto contro il polipeptide VP7 gruppo-specifico, conservato a – 20 °C o liofilizzato e diluito a una diluzione di 1:100 con tampone bloccante prima dell'uso. 5. Coniugato: globulina di coniglio anti-topo (adsorbita ed eluita), coniugata con perossidasi di rafano e conservata al buio a 4 °C. 6. Cromogeno e substrato: ortofenilendiammina (cromogeno OPD) a una concentrazione finale di 0,4 mg/ml in acqua distillata sterile. Perossido di idrogeno (substrato al 30 % p/v), allo 0,05 % v/v aggiunto immediatamente prima dell'uso (5 μl H2 O2 per 10 ml OPD). (Maneggiare l'OPD con cautela, indossare guanti di gomma, sospetto mutageno). 7. Acido solforico 1 molare: 26,6 ml di acido aggiunti a 473,4 ml di acqua distillata. (Attenzione: aggiungere sempre l'acido all'acqua, mai l'acqua all'acido). 8. Agitatore orbitale. 9. Lettore di piastre ELISA (il test può essere letto visivamente). Struttura del test Cc: controllo del coniugato (assenza di siero e di anticorpo monoclonale); C++: controllo del siero fortemente positivo; C+: controllo del siero debolmente positivo; C-: controllo del siero negativo; Cm: controllo dell'anticorpo monoclonale (assenza di siero).



APPENDICE 1 Struttura del test con una sola diluizione di 1:5 (40 sieri/piastra) Controlli Sieri da esaminare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



APPENDICE 2 Struttura del test con titolazione del siero (10 sieri/piastra) Controlli Sieri da esaminare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protocollo di riferimento Controllo del coniugato (Cc) : i pozzetti 1A e 1B rappresentano un controllo (bianco) costituito da antigene BTV e coniugato. Essi possono essere usati come bianco per il lettore ELISA. Controllo del Mab (Cm) : le colonne 1 e 2 e le righe G e H rappresentano il controllo dell'anticorpo monoclonale e contengono l'antigene BTV, l'anticorpo monoclonale e il coniugato. Questi pozzetti rappresentano la massima intensità di colore. La media delle letture di densità ottica effettuate su questa serie di controllo rappresenta il valore di inibizione pari allo 0 %. Controllo positivo (C++, C+) : colonne 1 e 2, righe C-D-E-F. Questi pozzetti contengono l'antigene BTV, l'antisiero BTV (rispettivamente) fortemente e debolmente positivo, il Mab e il coniugato. Controllo negativo (C-) : i pozzetti 2A e 2B rappresentano il controllo negativo e contengono l'antigene BTV, l'antisiero BTV negativo, il Mab e il coniugato. Sieri da esaminare : per indagini sierologiche su vasta scala e lo screening rapido, i sieri possono essere analizzati a una sola diluizione di 1:5 (appendice 1). In alternativa si possono analizzare 10 sieri nell'intervallo di diluizione compreso tra 1:5 e 1:640 (appendice 2): ciò fornisce una qualche indicazione sul titolo dell'anticorpo nei sieri da esaminare. Procedimento 1. Diluire l'antigene BTV alla concentrazione pretitolata in PBS, sottoporre a breve sonicazione per disperdere il virus aggregato (in assenza di sonicatore, pipettare vigorosamente) e aggiungere 50 μl in tutti i pozzetti della piastra ELISA. Dare leggeri colpi ai bordi della piastra per disperdere l'antigene. 2. Incubare a 37 °C per 60 minuti su agitatore orbitale. Lavare le piastre tre volte, immergendole e vuotando i pozzetti con PBS non sterile e asciugare su carta assorbente. 3. Pozzetti di controllo: aggiungere 100 μl di tampone bloccante ai pozzetti Cc. Aggiungere 50 μl di siero di controllo positivo e negativo, a una diluizione di 1:5 (10 μl di siero + 40 μl di tampone bloccante), rispettivamente ai pozzetti C-, C+ e C++. Aggiungere 50 μl di tampone bloccante ai pozzetti di controllo del Mab. Metodo della titolazione puntuale: aggiungere una diluizione 1:5 di ogni campione di siero a un tampone bloccante nei pozzetti in duplicato delle colonne da 3 a 12 (10 μl di siero + 40 μl di tampone bloccante), oppure metodo della titolazione del siero: preparare una serie di diluizioni doppie di ogni campione di siero (da 1:5 a 1:640) in tampone bloccante per otto pozzetti delle colonne singole da 3 a 12. 4. Immediatamente dopo l'aggiunta dei sieri da esaminare, diluire il Mab in tampone bloccante alla diluizione di 1:100 e aggiungere 50 μl a tutti i pozzetti della piastra, eccettuato il controllo (bianco). 5. Incubare a 37 °C per 60 minuti su agitatore orbitale. Lavare tre volte con PBS e asciugare con carta assorbente. 6. Diluire il concentrato di coniglio anti-topo a 1:5 000 in tampone bloccante e aggiungere 50 μl a tutti i pozzetti della piastra. 7. Incubare a 37 °C per 60 minuti su agitatore orbitale. Lavare tre volte con PBS e asciugare con carta assorbente. 8. Scongelare il dicloridrato di ortofenilendiammina (OPD) e, immediatamente prima dell'uso, aggiungere 5 μl di perossido di idrogeno al 30 % a ogni aliquota di 10 ml di OPD. Aggiungere 50 μl a tutti i pozzetti della piastra. Lasciar sviluppare il colore per circa 10 minuti e arrestare la reazione con acido solforico 1 M (50 μl per pozzetto). Il colore dovrebbe svilupparsi nei pozzetti di controllo del Mab e nei pozzetti contenenti siero senza anticorpi anti-BTV. 9. Esaminare e leggere le piastre visivamente oppure facendo uso di un lettore spettrofotometrico. Analisi dei risultati Usando un programma informatico, stampare i valori di densità ottica (DO) e di inibizione percentuale (IP) dei sieri da esaminare e dei sieri di controllo a partire dal valore medio registrato nei pozzetti di controllo dell'antigene. I dati espressi in valori DO e IP servono a stabilire se il test si colloca entro limiti accettabili. I limiti di controllo superiori (UCL – upper control limits) e inferiori (LCL – lower control limits) del controllo del Mab (antigene più Mab in assenza di siero da esaminare) si situano tra i valori di densità ottica 1,4 e 0,4. Devono essere escluse le piastre che non rispettano i suddetti criteri. Se non si dispone di un programma informatico, stampare i valori DO usando la stampante ELISA. Calcolare il valore medio DO per i pozzetti di controllo dell'antigene, che equivale al valore al 100 %. Determinare il valore DO al 50 % e calcolare manualmente la positività e negatività di ciascun campione. Valore di inibizione percentuale (IP) = 100 – (DO di ciascun campione di controllo/DO media del Cm) × 100. I pozzetti di siero di controllo negativo in duplicato e i pozzetti del bianco in duplicato devono registrare valori IP compresi rispettivamente tra + 25 % e – 25 % e tra + 95 % e + 105 %. Il fatto che i valori non si situino entro questi limiti non significa che la piastra debba essere scartata, ma che si sta sviluppando un colore di fondo. I sieri di controllo fortemente e debolmente positivi devono registrare valori IP compresi rispettivamente tra + 81 % e + 100 % e tra + 51 % e + 80 %. La soglia diagnostica per i sieri da esaminare è del 50 % (IP 50 % o DO 50 %). I campioni che registrano valori IP > 50 % sono interpretati come negativi. I campioni che registrano valori IP al di sopra e al di sotto della soglia per i pozzetti in duplicato sono da considerare dubbi e possono essere nuovamente analizzati con il metodo puntuale e/o mediante titolazione. Anche i campioni positivi possono essere titolati per valutare il grado di positività. Lettura visiva: i campioni positivi e negativi sono facilmente distinguibili a occhio nudo; i campioni debolmente positivi o fortemente negativi possono essere di più difficile interpretazione a occhio nudo. Preparazione dell'antigene BTV per il saggio ELISA 1. Lavare tre volte 40-60 «Roux» di cellule confluenti BHK-21 con terreno di Eagle senza siero e infettare con sierotipo 1 del virus della febbre catarrale degli ovini in terreno di Eagle senza siero. 2. Incubare a 37 °C e verificare quotidianamente l'effetto citopatico (CPE). 3. Quando il CPE è osservato nel 90-100 % dello strato cellulare di ciascuna Roux, raccogliere il virus scuotendo dalle pareti eventuali cellule ancora adese. 4. Centrifugare a 2 000 -3 000 giri al minuto per ottenere un pellet di cellule. 5. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in circa 30 ml di PBS contenente l'1 % di «Sarkosyl» e 2 ml di fenil-metil-sulfonil-fluoruro (tampone di lisi). Se le cellule formano un gel, è possibile aggiungere un'ulteriore aliquota di tampone di lisi per ridurre questo effetto. (Attenzione: il fenil-metil-sulfonil-fluoruro è pericoloso: maneggiare con estrema cautela.) 6. Disgregare le cellule per 60 secondi con una sonda a ultrasuoni a una ampiezza di 30 micron. 7. Centrifugare a 10 000 giri al minuto per 10 minuti. 8. Conservare il supernatante a + 4 °C e risospendere il pellet di cellule residuo in 10-20 ml di tampone di lisi. 9. Sottoporre a sonicazione e chiarificazione per tre volte, conservando ogni volta il supernatante. 10. Raccogliere i supernatanti e centrifugare a 24 000 giri al minuto (100,000 g) per 120 minuti a + 4 °C su un cuscinetto di 5 ml di saccarosio al 40 % (p/v in PBS) usando centrifughe Beckman da 30 ml e un rotore SW 28. 11. Eliminare il supernatante, asciugare le provette e risospendere il pellet in PBS mediante sonicazione. Conservare l'antigene in aliquote a – 20 °C. Titolazione dell'antigene BTV per il saggio ELISA L'antigene BTV per il saggio ELISA viene titolato mediante ELISA indiretto. Diluizioni doppie di antigene vengono titolate rispetto a una diluizione costante (1:100) di anticorpo monoclonale 3-17-A3. Il protocollo è il seguente: 1. Titolare una diluizione 1:20 dell'antigene BTV in PBS su tutta la piastra da microtitolazione in una serie di diluizioni doppie (50 μl/pozzetto) usando una pipetta multicanale. 2. Incubare per un'ora alla temperatura di 37 °C su agitatore orbitale. 3. Lavare le piastre tre volte con PBS. 4. Aggiungere 50 μl di anticorpo monoclonale 3-17-A3 (diluito a 1:100) in ciascun pozzetto della piastra da microtitolazione. 5. Incubare per un'ora alla temperatura di 37 °C su agitatore orbitale. 6. Lavare le piastre tre volte con PBS. 7. Aggiungere in ciascun pozzetto della piastra di micro titolazione 50 μl di globulina di coniglio anti-topo coniugata con perossidasi di rafano, diluita a una concentrazione ottimale pretitolata. 8. Incubare per un'ora alla temperatura di 37 °C su agitatore orbitale. 9. Aggiungere substrato e cromogeno come precedentemente descritto. Arrestare la reazione dopo 10 minuti aggiungendo acido solforico 1 M (50 μl/pozzetto). Nel saggio competitivo l'anticorpo monoclonale deve essere in eccesso; per questo viene scelta una diluizione di antigene compresa nella curva di titolazione (non nella zona piatta) tale da dare approssimativamente una densità ottica di 0,8 dopo 10 minuti.