1992R3942 — IT — 01.02.1993 — 001.001 — 1
Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni
►B REGOLAMENTO (CEE)N. 3942/92 DELLA COMMISSIONE
del 22 dicembre 1992
che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitosterolo e dello stigmasterolo nel
butteroil
(GU L 399 del 31.12.1992, pag. 29)
Modificato da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Regolamento (CEE) n. 2539/93 della Commissione del 15 settembre 1993 L 233 1 16.9.1993
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REGOLAMENTO (CEE)N. 3942/92 DELLA COMMISSIONE
del 22 dicembre 1992
che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitoste-
rolo e dello stigmasterolo nel butteroil
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il Trattato che istituisce la Comunità economica europea,
visto il regolamento (CEE) n. 804/68 del Consiglio, del 27 giugno 1968,
relativo all’organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e deiprodotti lattiero-caseari(
1), modificato da ultimo dal regolamento (CEE)
n. 2071/92 (2), in particolare l’articolo 6,
considerando che il butteroil deve essere marcato e che il butteroil
marcato deve essere controllato ai sensi del regolamento (CEE) n.3143/75della Commissione(
3), modificato da ultimo dal regolamento
(CEE) n. 1264/92 (4), in particolare gli articoli 5e 6,
considerando che il butteroil può essere marcato e che i prodotti marcati
devono essere controllati ai sensi del regolamento (CEE) n. 570/88 dellaCommissione(
5), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 124/
92 (6), in particolare gli articoli 3 e 6;
considerando che il butteroil deve essere marcato e che il butteroil
marcato deve essere controllato ai sensi del regolamento (CEE) n.429/90 della Commissione(
7), modificato da ultimo dal regolamento
(CEE) n. 1264/92, in particolare gli articoli 10 e 11;
considerando che uno stretto rispetto dei requisiti di marcatura del
butteroil è essenziale per prevenire il rischio di impieghi non autorizzatidel burro sovvenzionato;
considerando che, tenuto conto dell’importanza della marcatura ai fini
del corretto funzionamento di questi regimi, è necessario fissare metodicomuni per individuare tutti i traccianti richiesti dai regimi stessi daapplicare nello stesso modo in tutta la Comunità; che ciò garantirebbe inparticolare un equo trattamento di tutti gli operatori che si avvalgonodei suddetti regimi ed eliminirebbe le diverse condizioni di concorrenzache potrebbero risultare dai differenti metodi di analisi nazionali appli-cati;
considerando che è difficile fissare siffatti metodi di riferimento
contemporaneamente per tutti i traccianti; che la fissazione di unmetodo di riferimento per la determinazione dello stigmasterolo e delsitosterolo nel butteroil costituisce un primo passo in questa direzione;
considerando che le disposizioni di cui al presente regolamento sono
conformi al parere del comitato di gestione per il latte ed i prodottilattiero-caseari,
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
(1) GU n. L 148 del 28. 6. 1968, pag. 13.
(2) GU n. L 215del 30. 7. 1992, pag. 64.
(3) GU n. L 298 del 12. 11. 1985, pag. 9.
(4) GU n. L 135 del 19. 5. 1992, pag. 5.
(5) GU n. L 55 dell’1. 3. 1988, pag. 31.
(6) GU n. L 14 del. 21. 1. 1992, pag. 28.
(7) GU n. L 45del 21. 2. 1990, pag. 8.
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Articolo 1
▼M1
Il metodo d’analisi di riferimento per determinare il tenore di stigmaste-rolo nel butteroil a norma dell’articolo 6 del regolamento (CEE) n.3143/85, dell’articolo 6 del regolamento (CEE) n. 570/88 o dell’articolo11 del regolamento (CEE) n. 429/90 nonché il tenore di beta-sistoste-rolo nel butteroil a norma dell’articolo 6 del regolamento (CEE) n.570/88 è specificato nell’allegato.
▼
B
Il butteroil è stato marcato correttamente se i risultati ottenuti sonoconformi ai requisiti di cui al paragrafo 8 del presente allegato.
Articolo 2
Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla
sua pubblicazione sulla Gazzetta ufficiale delle Comunità europee .
Esso si applica a decorrere dal 1
ofebbraio 1993.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e diretta-
mente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
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ALLEGATO
DETERMINAZIONE DEL SITOSTEROLO OPPURE DELLO STIGMA-
STEROLO NEL BUTTEROIL MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA
CON COLONNA CAPILLARE
1. FINALITÀ E CAMPO D’APPLICAZIONE
Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa
del sitosterolo o dello stigmasterolo nel butteroil. Il sitosterolo vieneconsiderato come la somma del βsitosterolo e del 22-diidro- β-sitoste-
rolo, in quanto gli altri sitosteroli vengono considerati irrilevanti. Esso siapplica ai campioni ricevuti ai sensi dei regolamenti (CEE) n. 3143/85,(CEE) n. 570/88 e (CEE) n. 429/90.
2. PRINCIPIO
Il butteroil viene saponificato con idrossido di potassio in soluzione
etanolica e l’insaponificabile viene estratto con etere etilico.
Gli steroli vengono trasformati in eteri trimetil-sililici ed analizzati
mediante gascromatografia su colonna capillare facendo riferimento aduno standard interno a base di betulino.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Pallone di saponificazione da 150 ml provvisto di condensatore a rica-
dere con giunti in vetro smerigliato.
3.2. Imbuti separatori da 500 ml.3.3. Palloni da 250 ml.3.4. Imbuti livellatori di pressione, da 250 ml o simili, per la raccolta dell’e-
tere etilico di scarto.
3.5. Colonna di vetro, da 350 mm × 20 mm, provvista di tappo in vetro
sinterizzato.
3.6. Bagnomaria o cuffia riscaldante.3.7. Fiale da 2 ml.3.8. Gascromatografo idoneo ad essere usato con una colonna capillare e
provvisto di un sistema di splitting costituito da:
3.8.1. Camera termostatica per colonne, capace di mantenere la temperatura
desiderata con una precisione di ± 1 °C;
3.8.2. una unità di vaporizzazione termoregolabile;3.8.3. un rivelatore a ionizzazione di fiamma ed un convertitore-amplificatore;3.8.4. un integratore-registratore idoneo ad essere usato con il convertitore-
amplificatore (3.8.3).
3.9. Una colonna capillare in silice fusa coperta interamente di BP1 o equi-
valente con uno spessore uniforme di 0,25 µm; la colonna deve essere
capace di separare i derivati trimetilsililici di lanosterolo e sitosterolo edè consigliabile un BP1 avente una lunghezza di 12 m ed un diametrointerno di 0,2 mm.
3.10. Microsiringa per gascromatografia, da 1 µl, provvista di ago in acciaio
temperato.
4. REAGENTI
Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L’acqua
che viene usata deve essere acqua distillata o acqua di purezza perlo-meno equivalente.
4.1. Etanolo, avente una purezza di almeno il 95%.4.2. Idrossido di potassio, soluzione al 60 %: sciogliere 600 g di idrossido di
potassio (minimo 85%) in acqua e portare al volume di 1 l con acqua.
4.3. Betulino avente una purezza di almeno il 99 %.4.3.1. Soluzioni di standard interno. Betulino in etere etilico (4.4).4.3.1.1. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determina-
zione del sitosterolo deve essere pari a 1,0 mg/ml.
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4.3.1.2. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determina-
zione dello stigmasterolo deve essere pari a 0,4 mg/ml.
4.4. Etere etilico, di purezza analitica (esente da perossidi o da residui).4.5. Solfato di sodio anidro, granulare, preventivamente essiccato a 102 °C
per 2 ore.
4.6. Reagente sililante, ad esemplo TRI-SIL (disponibile presso la Pierce
Chemical Co., Cat No. 49001) o equivalente. (ATTENZIONE: ilTRI-SIL è infiammabile, tossico, corrosivo e forse cancerogeno. Ilpersonale di laboratorio deve conoscere i dati di sicurezza relativi alprodotto e prendere le relative precauzioni.)
4.7. Lanosterolo.4.8. Sitosterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).
Nota 1:La purezza dei materiali standard usati per la calibratura deve
essere determinata con il metodo di normalizzazione. Supporre che tuttigli steroli presenti nel campione siano rappresentati sul cromatogramma,che l’area totale dei picchi rappresenti il 100 % dei costituenti sterolici eche gli steroli diano la stessa risposta al rivelatore. La linearità delsistema deve essere convalidata alle gamme di concentrazione che inte-ressano.
4.8.1. Soluzione standard di sitosterolo: preparare una soluzione contenente,
con l’approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,5mg/ml (W
1) di sitoste-
rolo (4.8) in etere etilico (4.4).
4.9. Stigmasterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).4.9.1. Soluzione standard di stigmasterolo: preparare una soluzione contenente,
con l’approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,2 mg/ml (W
1) di stigma-
sterolo (4.9) in etere etilico (4.4).
4.10. Miscela per la prova di risoluzione: preparare una soluzione contenente
0,05mg/ml di lanosterolo (4.7) e 0,5mg/ml di sitosterolo (4.8) in etereetilico (4.4).
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione di soluzioni standard per cromatografia: la soluzione di
standard interno (4.3.1) dev’essere aggiunta alla soluzione standard disterolo adeguata, nello stesso momento in cui viene aggiunta alcampione saponificato (cfr. 5.2.2).
5.1.1. Soluzione cromatografica standard di sitosterolo: trasferire 1 ml di solu-
zione standard di sitosterolo (4.8.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) edallontanare l’etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml di solu-zione di standard interno (4.3.1.1) e allontanare l’etere etilico in correntedi azoto.
5.1.2. Soluzione cromatografica standard di stigmasterolo: trasferire 1 ml di
soluzione standard di stigmasterolo (4.9.1) in ciascuna delle due fiale(3.7) ed eliminare l’etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml disoluzione di standard interno (4.3.1.2) ed eliminare l’etere etilico incorrente di azoto.
5.2. Preparazione degli insaponificabili.5.2.1. Pesare con l’approssimazione di 1 mg, circa 1 g di butteroil (W
2)i nu n
pallone da 150 ml (3.1). Aggiungere 50 ml di etanolo (4.1) e 10 ml disoluzione di idrossido di potassio (4.2). Applicare il condensatore aricadere e scaldare a circa 75 °C per 30 minuti. Staccare il condensatore
e raffreddare il pallone a una temperatura prossima a quella ambiente.
5.2.2. Aggiungere 1,0 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) al pallone
se si deve determinare il sitosterolo, oppure di soluzione (4.3.1.2) se sideve determinare lo stigmasterolo. Agitare accuratamente. Trasferirequantitativamente il contenuto dei palloni in un imbuto separatore da500 ml (3.2), sciacquando il pallone alternativamente con 50 ml d’acquae 250 ml di etere etilico (4.4). Agitare vigorosamente l’imbuto separa-tore per due minuti e lasciar separare le fasi. Eliminare lo strato acquosoinferiore e sciacquare lo strato etereo agitando con 4 successive aliquoted’acqua da 100 ml.
Nota 2:Per evitare che si formi un’emulsione, è essenziale che i primi
due risciacqui con acqua vengano effettuati delicatamente (10 inver-sioni). Il terzo risciacquo dev’essere effettuato agitando vigorosamenteper 30 secondi. Se si forma un’emulsione, essa può essere dissolta
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aggiungendo 5—10 ml di etanolo. Se si aggiunge l’etanolo, è essenziale
effettuare ulteriori due risciacqui vigorosi con acqua.
5.2.3. Far passare lo strato etereo limpido, esente da sapone, attraverso una
colonna di vetro (3.5) contenente 30 g di solfato di sodio anidro (4.5).Raccogliere l’etere in un pallone di 250 ml (3.3). Aggiungere granuliregolatori d’ebollizione ed evaporare quasi completamente su bagno-maria o cappa isotermica avendo cura di raccogliere i solventi di scarto.
Nota 3: Se gli estratti di campione sono portati a completo essicca-
mento a una temperatura troppo elevata, si possono verificare perdite disterolo.
5.3. Preparazione di eteri trimetilsililici.5.3.1. Trasferire la soluzione eterea che resta nel pallone in una fiala da 2 ml
(3.7) con 2 ml di etere etilico ed eliminare l’etere in corrente di azoto.Sciacquare il pallone con altri 2 ml di etere etilico, trasferendo nellafiala ed eliminando ogni volta l’etere in corrente di azoto.
5.3.2. Sililare il campione aggiungendo 1 ml di TRI-SIL (4.6). Chiudere la
fiala ed agitare vigorosamente in modo da sciogliere. Se lo scioglimentoè incompleto, scaldare a 65—70 °C. Far riposare per almeno 5minuti
prima di iniettare nel gascromatografo. Sililare gli standard nello stessomodo dei campioni. Sililare la miscela per la prova di risoluzione (4.10)nello stesso modo dei campioni.
Nota 4: La sililazione deve essere effettuata in ambiente anidro. La
sililazione incompleta del betulino è indicata da un secondo picco vicinoa quello del betulino.
La presenza di etanolo nella fase di sililazione interferisce con la silila-
zione stessa. Ciò può derivare da un risciacquo insufficiente nella fase diestrazione. Se questo problema persiste, nella fase di estrazione si puòrisciacquare per la quinta volta, agitando vigorosamente per 30 secondi.
5.4. Analisi gascromatografica.5.4.1. Scelta delle condizioni operative
Regolare il gascromatografo conformemente alle istruzioni del fabbri-
cante.
Le condizioni operative sono le seguenti:
— temperatura della colonna: 265 °C
— temperatura dell’iniettore: 280 °C
— temperatura del rivelatore: 300 °C
— flusso del gas vettore: 0,6 ml/min.— pressione dell’idrogeno: 84 kPa— pressione dell’aria: 155 kPa— rapporto di splittagio da 10: 1 fino a 50: 1; il rapporto di splittagio
deve essere ottimizzato conformemente alle istruzioni del fabbricantee la linearità della risposta del rivelatore deve essere convalidata sullagamma di concentrazione che interessa.
Nota 5: È importante soprattutto che l’iniettore venga regolarmente
pulito.
— Quantitativo di sostanza iniettata, 1 µl di soluzione di TMSE.
Prima di dare inizio a qualsiasi analisi, far sì che il sistema si riequilibri
e che si ottenga una risposta sufficientemente stabile.
Queste condizioni possono essere modificate alla luce delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere cromato-grammi che rispettino i seguenti requisiti:
— il picco del sitosterolo deve essere opportunamente separato da
quello del lanosterolo. La figura 1 mostra un tipico cromatogrammache dovrebbe essere ottenuto da una miscela sililata per la prova dirisoluzione (4.10).
— i tempi di ritenzione relativi degli steroli sottoindicati devono essere
all’incirca i seguenti:
Colesterolo: 1,0
Stigmasterolo: 1,3Sitosterolo: 1,5
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Betulino: 2,5.
— il tempo di ritenzione relativo al betulino deve essere di circa
24 minuti.
5.4.2. Procedimento analitico.
Iniettare 1 µl di soluzione standard sililata (stigmasterolo o sitosterolo) e
regolare i parametri della taratura integrati).
Iniettare un altro µl di soluzione standard sililata per determinare i
fattori di risposta relativi al betulino.
Iniettare 1 µl di soluzione di campione sililata e misurare le aree dei
picchi. Ogni cromatografia effettuata deve essere preceduta da una inie-zione di standard. A titolo indicativo, ogni cromatografia deve compren-dere sei iniezioni di campione.
Nota 6:L’integrazione del picco dello stigmasterolo deve comprendere
le eventuali «code», come definito ai punti 1 ,2e3della figura 2 b).
L’integrazione del picco del sitosterolo deve comprendere l’area del
picco del 22-diidro- β-sitosterolo (stigmastanolo) che eluisce immediata-
mente dopo il sitosterolo (vedi figura 3 b) al momento della valutazionedel sitosterolo totale.
6. CALCOLO DEI RISULTATI
6.1. Determinare l’area dei picchi degli steroli e del betulino in entrambi gli
standard che inquadrano una partita e calcolare R
1;
R1=Area media del picco dello sterolo nello standard
Area media del picco del betulino nello standard
Determinare l’area del picco dello sterolo (stigmasterolo o sitosterolo) e
quello del betulino nel campione e calcolare R2:
R2=Area del picco dello sterolo nel campione
Area del picco del betulino nel campione
W1= quantità di sterolo dello standard (mg) contenuto in 1 ml di
soluzione standard (4.8.1 oppure 4.9.1).
W2= peso del campione (g) (5.2.1).
P = purezza dello sterolo standard (4.8 oppure 4.9).
Tenore di sterolo del campione mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0
7. PRECISIONE DEL METODO
7.1. Ripetibilità.7.1.1. Stigmasterolo.
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate entro l’inter-
vallo di tempo minimo possibile da un solo operatore che usa la stessaapparecchiatura su un identico materiale di prova non deve superare10,2 mg/kg.
7.1.2. Sitosterolo
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell’inter-
vallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessaapparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare il3,6 % riferito alla media delle determinazioni.
7.2. Riproducibilità.7.2.1. Stigmasterolo.
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori
in diversi laboratori, usando diverse apparecchiature su un identicomateriale di prova non deve superare i 25,3 mg/kg.
7.2.2. Sitosterolo.
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori
di diversi laboratori, facendo uso di diverse apparecchiature su un iden-tico materiale di prova non deve superare l’8,9 % relativo della mediadelle determinazioni.
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7.3. Fonte dei dati di precisione.
I dati di precisione sono stati determinati con un esperimento eseguito
nel 1991 e comprendente 9 laborator i e 6 campioni (3 prove in doppio
cieco) per lo stigmasterol o e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per il
sitosterolo.
8. LIMITI DI TOLLERANZA
8.1. Dal prodotto tracciato devono essere prelevati tre campioni in modo da
controllare l’omogeneità.
8.2. Stigmasterolo8.2.1. Il tasso di incorporazione relativo allo stigmasterolo è di 150 g di
stigmasterolo puro ad almeno il 95% per tonnellata di butteroil, cioè142,5mg/kg oppure 170 g di stigmasterolo puro ad almeno l’85% pertonnellata di butteroil, cioè 144,5mg/kg.
8.2.2. Se si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità
del 95% (CrD
95), la media del 3 risultati non deve essere inferiore a:
128,3 mg/kg, nel caso che sia incorporato stigmasterolo puro al 95% e a130,3 mg/kg, nel caso che sia incorporato stigmasterolo puro all’85%.
8.2.3. In aggiunta ai criteri di cui al paragrafo 8.2.2 il risultato più basso
ottenuto dall’analisi del prodotto viene utilizzato per controllare l’omo-geneità della distribuzione del tracciante. Ciò viene effettuato medianteun confronto con i seguenti limiti:
— 120,4 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro al 95%, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95);
— 122,3 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro all’85%, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95);
— 99,0 mg/kg (l’80 % del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro al 95%, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95);
— 100,6 mg/kg (l’80 % del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro all’85%, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95).
La concentrazione di tracciante nel campione che dà il risultato più
basso viene ottenuta mediante interpolazione tra 120,4 mg/kg e99,0 mg/kg o rispettivamente tra 122,3 mg/kg e 100,6 mg/kg.
8.3. Sitosterolo.8.3.1. Il tasso di incorporazione per il sitosterolo è di 600 g di sitosterolo puro
ad almeno il 90 % per tonnellata di butteroil, ovvero di 540 mg/kg.
8.3.2. Se si prende in considerazione il CrD
95, la media dei 3 risultati non deve
essere inferiore a 513,0 mg/kg.
8.3.3. In aggiunta al criterio di cui al paragrafo 8.3.2, il risultato più basso
ottenuto dall’analisi del prodotto viene utilizzato per controllare l’omo-geneità della distribuzione del tracciante. Ciò viene effettuato medianteun confronto con i seguenti limiti:
— 484,4 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro al 90 %, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95).
— 403,4 mg/kg (l’80 % del tasso minimo di incorporazione per stigma-
sterolo puro al 90 %, prendendo in considerazione un singolocampione a CrD
95).
La concentrazione di tracciante nel campione che dà il risultato più
basso viene ottenuta mediante interpolazione tra 484,4 mg/kg e403,4 mg/kg.
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Figura 1 Cromatogramma della miscela per la prova di risoluzione
È preferibile la risoluzione completa, cioè la traccia del picco relativa
al lanosterolo deve raggiungere la linea di base prima di quella delpicco sitosterolo, anche se una risoluzione incompleta è ammissibile.

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Figura 2a
Standard di stigmasterolo

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Figura 2b
Campione di butteroil denaturatoccon:
Nota: L’integrazione del picco dello stigmasterolo deve comprendere anche
eventuali «code» come definito ai punti 1 ,2e3 .
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Figura 3a
Standard di sitosterolo

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Figura 3b
Campione di butteroil denaturato con β-sitosterolo
Nota: Il β-sitosterolo contiene spesso una impurezza (identificata come stigma-
stanolo) che eluisce immediatamente dopo il β-sitosterolo. Quando si valuta il
β-sitosterolo totale presente è necessario sommare le aree di questi due picchi.