1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni
►B SETTIMA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE
del 1omarzo 1976
che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali
(76/372/CEE)
(GU L 102 del 15.4.1976, pag. 8)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva 81/680/CEE della Commissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Direttiva 92/95/CEE della Commissione del 9 novembre 1992 L 327 54 13.11.1992
▼B
SETTIMA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE
del 1omarzo 1976
che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali
(76/372/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,vista la direttiva del Consiglio, del 20 luglio 1970, concernente l'intro-
duzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisi
comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali(
1),
modificata da ultimo dall'atto di adesione(2), in particolare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali destinati a constatare l'osservanza dellecondizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per gli animali, siano effettuati secondo i modi di preleva-
mento di campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE,
73/46/CEE, 74/203/CEE e 75/84/CEE della Commissione, rispettiva-mente del 15 giugno 1971(
3), del 18 novembre 1971(4), del 27 aprile
1972(5), del 5 dicembre 1972(6), del 25 marzo 1974(7) e del 20
dicembre 1974(8), hanno già fissato un certo numero di metodi di
analisi comunitari; che, tenuto conto dello stato d'avanzamento dei
lavori sin qui effettuati, è necessario adottare una settima serie dimetodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del comitato permanente per gli alimenti per glianimali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il loro contenuto in afla-
tossina B1siano effettuate secondo i metodi descritti nell'allegato della
presente direttiva.
Articolo 2
Gli Stati membri provvedono all'entrata in vigore, non oltre il 1o
ottobre 1976, delle disposizioni legislative, regolamentari e amministra-
tive necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva
e ne informano immediatamente la Commissione.
Articolo 3
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2.
(2) GU n. L 73 del 27. 3. 1972, pag. 14.
(3) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(4) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.
(5) GU n. L 123 del 29. 5. 1972, pag. 6.
(6) GU n. L 83 del 30. 3. 1973, pag. 21.
(7) GU n. L 108 del 22. 4. 1974, pag. 7.
(8) GU n. L 32 del 5. 2. 1975, pag. 26.▼M1
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ALLEGATO
DETERMINAZIONE DELL'AFLATOSSINA B1
A. METODO PER CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONALE SU
STRATO SOTTILE
1. Scopo e campo d'applicazione
Il metodo permette di determinare il tasso di aflatossina B1delle
materie prime e dei prodotti per l'alimentazione semplici degli
animali. Questo metodo non si applica in presenza di polpe di
agrumi. Il limite inferiore del dosaggio è di 0,01 mg/kg (10 ppb).
In presenza di sostanze interferenti che intralciano le determina-
zioni, occorre ripetere l'analisi secondo il metodo B (cromatografia
liquida ad alta pressione)
2. Principio
Il campione è sottoposto ad estrazione con cloroformio. L'estratto
viene filtrato e un'aliquota viene prelevata e purificata mediante
cromatografia su colonna di gel di silice. L'eluato viene evaporato
e il residuo ripreso con un volume determinato di cloroformio o di
una miscela di benzene e acetonitrile. Un'aliquota della soluzione è
sottoposta a cromatografia su strato sottile. La quantità di aflatos-
sina B1è determinata sotto irradiazione UV del cromatogramma,
sia visualmente sia mediante fluorodensitometria, in rapporto a
quantità note di aflatossina B1.
L'identità dell'aflatossina B1estratta dall'alimento deve essere
confermata con i procedimenti indicati
3. Reattivi
Nota:Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni, devono
essere del tipo «per analisi»
3.1. Acetone
3.2. Cloroformio, stabilizzato con 0,5 — 1,0 % di etanolo al 96 % (v/v)
3.3. n-Esano3.4. Metanolo3.5. Etere dietilico anidro, esente da perossidi3.6. Miscela di benzene e acetonitrile: 98/2 (v/v)3.7. Miscela di cloroformio (3.2) e di metanolo (3.4): 97/3 (v/v)3.8. Gel di silice, per cromatografia su colonna, granulometria: 0,05/
0,20 mm
3.9. Cotone idrofilo, preventivamente sgrassato col cloroformio, o lana
di vetro
3.10. Solfato di sodio, anidro, granulato3.11. Gas inerte, ad esempio azoto3.12. Acido cloridrico 1 N3.13. Acido solforico al 50 % (v/v)3.14. Terra di diatomee (Hiflosupercel), lavata con acido3.15. Gel di silice G-HR o equivalente, per cromatografia su strato sottile
3.16. Soluzione campione a 0,1 µg circa di aflatossina B
1per ml nel
cloroformio (3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile (3.6), prepa-
rata e controllata come indicato al punto 7
3.17. Soluzione campione qualitativa a 0,1 µg circa di aflatossine B1eB2per ml nel cloroformio (3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile
(3.6). Tali concentrazioni sono riferite a titolo indicativo. Devono
essere adattate in modo da ottenere la stessa intensità di fluore-
scenza per le due aflatossine1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼M2
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3.18. Solventi di sviluppo:
3.18.1. Cloroformio (3.2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v), vaschetta non saturata
3.18.2. Etere dietilico (3.5)/metanolo (3.4)/acqua: 96/3/1/ (v/v/v), vaschetta
non saturata
3.18.3. Etere dietilico (3.5)/metanolo (3.4)/acqua: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
vaschetta saturata
3.18.4. Cloroformio (3.2)/metanolo (3.4): 94/6/(v/v), vaschetta saturata3.18.5. Cloroformio (3.2)/metanolo (3.4): 97/3 (v/v), vaschetta saturata
4. Apparecchiatura
4.1. Tritatore mescolatore4.2. Scuotitore o agitatore magnetico
4.3. Filtri a pieghe, Schleicher e Schül, n. 588 o equivalente, diametro
24 cm.
4.4. Colonne per cromatografia, in vetro (diametro interno: 22 mm,
lunghezza: 300 mm), con rubinetto di teflon e serbatoio da 250 ml
4.5. Evaporatore rotante sotto vuoto, provvisto di pallone a fondo
rotondo da 500 ml
4.6. Beute da 500 ml, a tappo smerigliato
4.7. Apparecchiatura per cromatografia su strato sottile
4.8. Lastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 200 × 200 mm,
preparate come segue (le quantità indicate sono sufficienti per rico-
prire cinque lastre): introdurre 30 g di gel di silice G-HR (3.15) in
una beuta, aggiungere 60 ml di acqua, tappare e agitare per un
minuto. Stendere la sospensione sulle lastre in modo da ottenere
uno strato uniforme di 0,25 mm di spessore. Lasciar asciugare
all'aria e conservare in seguito in essiccatoio munito di gel di silice.
Al momento dell'uso, attivare le lastre ponendole per un'ora nella
stufa a 110 ºC
Le lastre in commercio pronte per l'uso possono essere impiegate se
danno risultati simili a quelli delle lastre preparate come sopra indi-
cato
4.9. Lampada UV a onde lunghe (360 mm). L'intensità di irradiazione
deve consentire di distinguere nettamente una macchia di 1,0 ng
di aflatossina B
1su una lastra per cromatografia su strato sottile,
ad una distanza di 10 cm dalla lampada
4.10. Cilindri graduati da 10,0 ml con tappi in polietilene
4.11. Spettrofotometro UV
4.12. Fluorodensitometro (eventualmente)
5. Modo di operare
5.1. Preparazione dal campione (vedi note, parte C, punto 1)
Macinare il campione in modo che passi integralmente attraverso
un setaccio a maglie di 1 mm (conforme alla raccomandazione
ISO R 565)
5.2. Estrazione
Introdurre 50,0 g del campione macinato e omogeneizzato in una
beuta da 500 ml (4.6). Aggiungere 25 g di terra di diatomee
(3.14), 25 ml di acqua e 250 ml di cloroformio (3.2). Tappare la
beuta, scuotere o agitare per 30 minuti con l'apposito apparecchio
(4.2) e filtrare con filtro a pieghe (4.3). Eliminare i primi 10 ml di
filtrato e raccogliere quindi 50 ml
5.3. Purificazione su colonna
Munire di un tampone di cotone o di lana di vetro (3.9) l'estremità
inferiore di una colonna per cromatografia (4.4), riempire di cloro-
formio (3.2) i due terzi della colonna e aggiungere 5 g di solfato di
sodio (3.10)
Controllare che la superficie superiore dello strato di solfato di
sodio sia piana, quindi aggiungere un poco alla volta 10 g di gel
di silice (3.8). Scuotere la colonna con precauzione dopo ogni1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 4
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aggiunta per eliminare le bolle d'aria. Lasciar depositare per 15
minuti e aggiungere quindi con precauzione 15 g di solfato di sodio
(3.10). Lasciare scendere il liquido fino a vicinanza immediata
della superficie superiore dello strato di solfato di sodio
Mescolare i 50 ml di estratto raccolti al punto 5.2 con 100 ml di n-
esano (3.3) e travasare quantitativamente la miscela nella colonna.
Lasciare scendere il liquido sino alla superficie superiore dellostrato di solfato di sodio. Eliminare il liquido defluito. Aggiungere
quindi 100 ml di etere dietilico (3.5) e lasciare nuovamente scen-
dere il liquido sino alla superficie superiore dello strato di solfato
di sodio. Durante queste operazioni, controllare che i liquidi deflui-
scano ad un ritmo di 8/12 ml al minuto e che la colonna non
rimanga asciutta. Eliminare i liquidi defluiti. Eluire quindi con
150 ml della miscela cloroformio/metanolo (3.7) e raccogliere tutto
l'eluato
Evaporare l'eluato quasi a secco, in corrente di gas inerte (3.11) e
ad una temperatura non superiore a 50 ºC, con l'evaporatore rotante
sotto vuoto (4.5). Portare quantitativamente il residuo, usando il
cloroformio (3.2) o la miscela benzene/acetonitrile (3.6), in un
cilindro graduato da 10,0 ml (4.10). Concentrare la soluzione in
corrente di gas inerte (3.11) e portare quindi il volume a 2,0 ml
con cloroformio (3.2) o con la miscela benzene/acetonitrile (3.6)
5.4. Cromatografia sustrato sottile
Deporre sotto forma di punti su una lastra per cromatografia su
strato sottile (4.8), a 2 cm dal bordo inferiore e ad intervalli di
2 cm, i volumi sotto indicati della soluzione campione e dell'e-
stratto:
— 10, 15, 20, 30 e 40 µl della soluzione campione di aflatossina
B
1(3.16)
— 10 µl dell'estratto ottenuto al punto 5.3 e, in sovrapposizione
sullo stesso punto , 20 µl della soluzione campione (3.16)
— 10 e 20 µl dell'estratto ottenuto al punto 5.3
Sviluppare il cromatogramma al riparo dalla luce, impiegando uno
dei solventi di sviluppo (3.18). La scelta del solvente deve essere
stabilita preventivamente, deponendo sulla lastra 25 µl della solu-
zione campione qualitativa (3.17) e accertando che, all'atto dello
sviluppo, le aflatossine B1eB2siano completamente separate
Lasciar evaporare i solventi al riparo dalla luce ed irradiare quindi
con la luce UV, collocando la lastra a 10 cm della lampada (4.9).
Le macchie di aflatossina B1danno una fluorescenza blu
5.5. Determinazioni quantitative
Procedere alle determinazioni, sia visualmente sia mediante fluoro-
densitometria, come sotto indicato
5.5.1. Misurazioni visuali
Determinare la quantità di aflatossina B1dell'estratto confrontando
l'intensità di fluorescenza delle macchie dell'estratto con quella
delle macchie della soluzione campione. Interpolare se necessario.
La fluorescenza ottenuta con la sovrapposizione dell'estratto della
soluzione campione deve essere più forte di quella dei 10µl di
estratto e deve dar luogo alla percezione di una sola macchia. Se
l'intensità di fluorescenza data dai 10 µl di estratto è più forte di
quella dei 40 µl di soluzione campione, diluire l'estratto 10 o 100
volte con cloroformio (3.2) o con la miscela benzene/acetonitrile
(3.6) prima di sottoporlo ad una nuova cromatografia su strato
sottile
5.5.2. Misurazioni mediante fluorodensitometria
Misurare l'intensità di fluorescenza delle macchie di aflatossina B1con il fluorodensitometro (4.12), utilizzando una lunghezza d'onda
di eccitazione di 365 nm ed una lunghezza d'onda di emissione di
443 nm. Determinare la quantità di aflatossina B1dei depositi
dell'estratto confrontando le intensità di fluorescenza delle macchie
dell'estratto e della soluzione campione
5.6. Conferma dell'identità dell'aflatossina B1
Confermare l'identità dell'aflatossina B1dell'estratto con i seguenti
procedimenti:1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 5
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5.6.1. Trattamento con acido solforico
Polverizzare acido solforico (3.13) sul cromatogramma ottenuto al
punto 5.4. La fluorescenza delle macchie di aflatossina B1deve
volgere dal blu al giallo sotto irradiazione UV
5.6.2. Cromatografia bidimensionale implicante la formazione
di aflatossina B1-emiacetale (aflatossina B2a)
NB:Le operazioni sotto descritte devono essere effettuate
seguendo lo schema riprodotto nella figura 3
5.6.2.1. Applicazione delle soluzioni
Tracciare su una lastra (4.8) due rette parallele a due lati contigui
(a distanza di 6 cm da tali lati), destinate a delimitare la migrazione
dei fronti dei solventi. Deporre sulla lastra, con pipette capillari o
con microsiringhe, le soluzioni sotto indicate:
—nel punto A: un volume di estratto purificato del campione otte-
nuto al punto 5.3, contenente circa 2,5 nanogrammi di
aflatossina B1
—nei punti B e C: 25 µl della soluzione campione (3.16)
5.6.2.2. Sviluppo
Sviluppare il cromatogramma nella direzione I usando il solvente di
sviluppo (3.18.1) (strato di 1 cm in vaschetta non saturata), al
riparo dalla luce, finché il fronte del solvente non raggiunga la
linea di delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciarla
asciugare per 5 minuti al riparo dalla luce e a temperatura
ambiente. Polverizzare quindi acido cloridrico (3.12) su una striscia
di 2,5 cm di altezza che copra i punti A e B (tratteggiata nella
figura 3) sino ad imbrunimento, proteggendo il resto della lastra
con un vetro. Lasciar reagire per 10 minuti allo scuro ed asciugare
con una corrente d'aria a temperatura ambiente
Sviluppare quindi il cromatogramma nella direzione II usando il
solvente di sviluppo (3.18.1) (strato di 1 cm in vaschetta non satu-
rata), al riparo dalla luce, finché il fronte del solvente non
raggiunga la linea di delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta
e lasciarla asciugare a temperatura ambiente
5.6.2.3. Interpretazione del cromatogramma
Esaminare il cromatogramma sotto la lampada UV (4.9) e verifi-
care le osservazioni seguenti:
a) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1proveniente dalla soluzione campione deposta nel punto C
(migrazione nella direzione I)
b) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1(che non ha reagito con l'acido cloridrico) e di una macchia
fluorescente blu più intensa di aflatossina B1-emiacetale prove-
niente dalla soluzione campione deposta nel punto B
(migrazione nella direzione II)
c) Apparizione di macchie simili a quelle descritte al punto b),
provenienti dall'estratto di campione deposto nel punto A. La
posizione di tali macchie è definita dalla distanza di migrazione
dell'aflatossina B1a partire dal punto A nella direzione I
(distanza uguale a quella percorsa dalla soluzione campione
deposta nel punto C), seguita dalle distanze di migrazione
percorse nella direzione II dall'aflatossina B1(che non ha reagito
con l'acido cloridrico) e dall'aflatossina B1-emiacetale (distanze
uguali a quelle percorse dalla soluzione campione deposta nel
punto B). Le intensità di fluorescenza delle macchie di emiace-
tale proveniente dall'estratto e della soluzione campione deposta
nel punto B dovrebbero corrispondere
6. Calcolo dei risultati
6.1. Partendo da misurazioni visuali
Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1per kg di campione
(ppb) è dato dalla formula
S/C1Y/C1V
W/C1X1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 6
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dove:
Y e X sono rispettivamente i volumi in microlitri della soluzione
campione di aflatossina B1(3.16) e dell'estratto, aventi analoga
intensità di fluorescenza;
S = concentrazione in microgrammi di aflatossina B1per ml
della soluzione campione (3.16)
V = volume finale dell'estratto in microlitri, tenuto conto delle
eventuali diluizioni
W = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta ad
analisi, corrispondente al volume di estratto sottoposto a
purificazione su colonna
6.2. partendo da misurazioni fluorodensitometriche
Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1per kg di campione
(ppb) è dato dalla formula
S/C1V
W/C1Y
dove:
Y = volume in microlitri dell'estratto deposto sulla lastra (10 o
20 µl)
S = quantità in nanogrammi d'aflatossina B1del deposito dell'e-
stratto (tenuto conto del volume Y), dedotta dalle
determinazioni
V = volume finale dell'estratto in microlitri, tenuto conto delle
eventuali diluizioni
W = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta ad
analisi, corrispondente al volume di estratto sottoposto a
purificazione su colonna
7. Preparazione e controllo della soluzione campione (3.16)
7.1. Determinazione della concentrazione in aflatossina B1
Preparare una soluzione campione di aflatossina B1nel cloroformio
(3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile (3.6), con concentrazione
di 8/10 µg per ml. Determinare lo spettro di assorbimento tra 330 e
370 nm mediante lo spettrofotometro (4.11)
Rilevare la densità ottica (A) a 363 nm nel caso di soluzione cloro-
formica; a 348 nm nel caso di soluzione nella miscela benzene/
acetonitrile
Calcolare la concentrazione in microgrammi di aflatossina B1per
ml di soluzione, partendo dalle seguenti formule:
3:12/C1A/C11000
20600per la soluzione cloroformica
3:12/C1A/C11000
19800per la soluzione nella miscela benzene/acetonitrile
Effettuare al riparo dalla luce le opportune diluizioni per ottenere
una soluzione campione di lavoro con concentrazione in aflatossina
B1di circa 0,1 µg per ml. Conservata nel refrigeratore a 4 ºC,
questa soluzione rimane stabile per due settimane
7.1. Controllo della purezza cromatografica
Deporre su una lastra (4.8) 5µl della soluzione campione a 8 —
10µg di aflatossina B1per ml (7.1). Sviluppare il cromatogramma
come indicato al punto 5.4. Sotto la luce UV, la fluorescenza deve
dar luogo alla percezione di una sola macchia e non deve percepirsi
alcuna fluorescenza nella zona del deposito originale1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 7
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8. Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in paral-
lelo sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe
superare:
— 25 % del risultato più elevato per i contenuti in aflatossina B1da 10 a 20 µg/kg
— 5 µg, in valore assoluto, per i contenuti superiori a 20 e
compresi fino a 50 µg/kg
— 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 µg/
kg
9. Riproducibilità
Vedi note, parte C, punto 2,
B. DETERMINAZIONE DELL'AFLATOSSINA B1— METODO PER
CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE
1. Scopo e campo di applicazione
Viene proposto un metodo per la determinazione dell'aflatossina B1negli alimenti di uso animale, inclusi quelli contenenti pastazzo di
agrumi. Il limite minimo di determinazione è 0,001 mg/kg (1 ppb)
2. Principio
Il campione viene estratto con cloroformio. L'estratto è filtrato ed
un'aliquota è purificata su cartuccia di florisil e poi su cartuccia di
C18. La separazione finale e determinazione sono ottenute per
cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) usando una
colonna C18in fase inversa, seguita da una reazione di derivatizza-
zione post-colonna con soluzione acquosa di iodio e rivelazione per
fluorescenza
Nota:Le microtossine sono sostanze molto tossiche. La determina-
zione si dovrebbe eseguire sotto cappa per fumi adibita a questo
scopo. Speciali precauzioni si dovrebbero prendere quando le
tossine si trovano allo stato secco a causa della loro natura elettro-
statica e la tendenza a disperdersi nell'area di lavoro
3. Reattivi
3.1. Cloroformio, stabilizzato con 0,5 %-1 % di etanolo, in peso.
Vedere osservazione al punto 10.2
3.2. Metanolo, grado HPLC, per la preparazione della miscela al punto
3.6
3.3. Acetone
3.4. Acetonitrile, grado HPLC
3.5. Solventi eluenti: da preparare 1 giorno prima dell'uso, oppure
degassarli mediante bagno ad ultrasuoni.
3.5.1. Miscela di acetone (3.3) e acqua, 98 + 2 (v + v)
3.5.2. Miscela di acqua e metanolo (3.2), 80 + 20 (v + v)3.5.3. Miscela di acqua e acetone (3.3), 85 + 15 (v + v)3.6. Fase mobile per HPLC
Miscela di acqua, metanolo (3.2) e acetonitrile (3.4), 130 + 70 + 40
( v+v+v )
N.B.:La composizione della fase mobile può essere modificata a
seconda delle caratteristiche dela colonna HPLC usata
3.7. Soluzione acquosa satura di iodio. Aggiungere 2 g di iodio a 400 ml
di acqua. Agitare mediante agitatore magnetico per almeno 90
minuti e filtrare attraverso filtro a membrana (4.15). Proteggere la
soluzione satura dalla luce per prevenire effetti dovuti a fotodegra-
dazione
3.8. Celite 545 o equivalente trattata con acidi
3.9. Cartuccia di florisil (Waters SEP-PAK), o equivalente1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼M2
▼M2
3.10. Cartuccia C18(Waters SEP-PAK) o equivalente
3.11. Gas inerte, per esempio azoto3.12. Soluzione standard di aflatossina B
1, in cloroformio, concentrazione
10 µg/ml. Controllare la concentrazione della soluzione come
segue: determinare lo spettro di assorbimento della soluzione fra
330 e 370 nm mediante spettrofotometro (4.23); misurare l'assor-
banza (A) al massimo vicino a 363 nm; calcolare la
concentrazione di aflatossina B1in microgrammi per millilitro di
soluzione mediante la formula:
concentrazione èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1. Soluzione standard stock in aflatossina B1in cloroformio.
Trasferire quantitativamente 2,5 ml della soluzione standard di afla-
tossina B1(3.12) in un matraccio tarato da 50 ml portando a
volume con cloroformio (3.1). Conservare questa soluzione, ben
chiusa ed avvolta in un foglio di alluminio, in un posto fresco
(4 ºC) al buio
3.13. Soluzione di calibrazione di aflatossina B1per HPLC.
N.B.:Per la preparazione di questa soluzione usare vetreria preven-
tivamente lavata con acido (vedi al punto 4, apparecchiatura)
3.13.1. Soluzione di calibrazione, 4 ng/ml
Lasciar condizionare per qualche ora a temperatura ambiente la
soluzione standard stock (3.12.1) avvolta in un foglio di alluminio.
Trasferire 400 µl di questa soluzione (200 ng di aflatossina B1)i n
un pallone tarato da 50 ml ed evaporare la soluzione fino a
secchezza per mezzo di una corrente di gas inerte (3.11). Sciogliere
il residuo ottenuto con circa 20 ml della miscela acqua-acetone e
miscelare bene, portare quindi a volume
3.13.2. Soluzione di calibrazione 3 ng/ml
Trasferire quantitativamente 7,5 ml della soluzione di calibrazione
(3.13.1) in un matraccio da 10 ml e portare a volume con la
miscela acqua-acetone (3.5.3) e miscelare bene
3.13.3. Soluzione di calibrazione, 2 ng/ml
Trasferire quantitativamente 25 ml della soluzione di calibrazione
(3.13.1) in un matraccio da 50 ml e portare a volume con la
miscela acqua-acetone (3.5.3) e miscelare bene
Questa soluzione viene usata anche durante l'analisi per HPLC
come standard di riferimento per le iniezioni ripetitive (5.5)
3.13.4. Soluzione di calibrazione 1 ng/ml
Trasferire quantitativamente 2,5 ml della soluzione di calibrazione
(3.13.1) in un matraccio da 10 ml e portare a volume con la
miscela acqua-acetone (3.5.3) e miscelare bene
3.14. Fiala contenente una miscela delle aflatossine B1,B2,G1eG2la cui
concentrazione è approssimativamente di 1, 0,5, 1 e 0,5 µg/ml
rispettivamente in 1 ml di cloroformio.
3.14.1. Soluzione per il controllo cromatografico
Trasferire il contenuto della fiala (3.14) in una provetta con tappo
di vetro o in una fiala con tappo a vite. Trasferire 40 µl di questa
soluzione in un matraccio da 10 ml o in una provetta con un tappo
di vetro (lavati con acido). Evaporare il cloroformio mediante una
corrente di gas inerte (3.11) e ridisciogliere in 10 ml della miscella
acqua-acetone (3.5.3)
3.15. Reagenti per la prova controllo di conferma (6)3.15.1. Soluzione acquosa satura di cloruro di sodio
3.15.2. Solfato di sodio anidro, granulare
4. Apparecchiatura
Attenzione: L'uso di vetreria non lavata con acidi può causare
perdite di aflatossina in soluzione acquosa. Particolare attenzione
necessitano la vetreria nuova, le pipette Pasteur e la vetreria dei1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼M2
dispensatori automatici come ad esempio le fiale degli autocampio-
natori. Per questa ragione la vetreria da usare con le soluzioni
acquose di aflatossina dovrà essere immersa in acidi diluiti (ad
esempio acido solforico 2 moli/l) per parecchie ore e sciacquata
poi bene con acqua distillata per rimuovere ogni traccia di acido
(ad esempio tre volte e controllo con cartine al tornasole). In
pratica, questo trattamento è necessario per i matracci a fondo
tondo (4.4), palloni tarati, cilindri graduati, fiale e provette per
soluzioni di calibrazione ed estratti finali (in particolare, fialette
per autocampionatori) e pipette Pasteur se usate per il prelievo di
soluzioni di calibrazione o di estratti
4.1. Mulino/miscelatore.
4.2. Setaccio con fori da 1,0 mm di diametro (ISO R 565)4.3. Agitatore meccanico.
4.4. Evaporatore rotante da vuoto, munito di pallone a fondo tondo da
150-250 ml
4.5. Apparecchiatura per cromatografia liquida ad alta risoluzione, iniet-
tore con un avvolgimento a spirale adatto per iniezione da 250 µl.
Vedere le istruzioni della ditta costruttrice per il parziale e
completo riempimento dell'avvolgimento a spirale
4.6. Colonna analitica per HPLC: C
18impaccata, granuli da 3 o 5 µm
4.7. Pompa a pulsazioni libere per l'erogazione post-colonna della solu-
zione di iodio
4.8. Tubo a T per volume morto Valco zero, acciaio inossidabile (1/16 ″
× 0,75 mm)
4.9. Sistema di reazione a spirale: teflon o acciaio inossidabile. Le
dimensioni da 3 000 × 0,5 mm a 5 000 × 0,5 mm sono risultateappropriate in combinazione con colonne HPLC da 3 o 5 µm
4.10. Bagno ad acqua con termostato regolato a 60 ºC, capace di una
regolazione di temperatura superiore a 0,1 ºC
4.11. Rivelatore a fluorescenza, regolato alla lunghezza d'onda di 365 nm
di eccitazione ed a 435 nm di emissione (per strumento a filtri
utilizzare un filtro con lunghezza d'onda maggiore di 400 nm).
Devono essere possibili rivelazioni di almeno 0,05 ng di aflatossina
B
1. Una leggera contropressione può essere consigliabile (ad
esempio per mezzo di restrizione o connessione dell'uscita del rive-
latore con una spirale di teflon o acciaio inossidabile) allo scopo di
evitare formazione di bolle d'aria nella fotocellula
4.12. Registratore con stampante4.13. Integratore elettronico (opzionale)4.14. Filtro di carta pieghettato di diametro 24 cm del tipo Macherey-
Nagel 617 1/4 o equivalente
4.15. Filtro a membrana con porosità 0,45 µm, (HAWP 04700) Millipore
o equivalente
4.16. Beuta da 500 ml con tappo a smeriglio4.17. Colonna di vetro (diametro interno circa 1 cm, lunghezza circa
30 cm) con serbatoio superiore da 50 ml.
4.18. Rubinetto di materiale resistente al cloroformio (per esempio Bio-
rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 o equivalente)
4.19. Siringa chimicamente resistente, capacità 10 ml
4.20. Siringa idonea per iniezioni in HPLC di 250 µl
4.21. Microsiringa da 100 µl per la preparazione delle soluzioni di cali-
brazione (controllare mediante pesata che l'accuratezza sia entro il
2% )
4.22. Palloncini tarati da 10 ml con tappo a smeriglio4.23. Spetrofotometro, idoneo per misure nella regione UV
4.24. Apparecchiatura per la prova di conferma (6)
4.24.1. Imbuto separatore da 100 ml, lavato con acidi, con rubinetto in
teflon
4.24.2. Piastra riscaldante, 40-50 ºC1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 10
▼M2
5. Procedimento
5.1. Preparazione del campione
Macinare il campione in modo che esso passi attraverso i fori da
1 mm di luce del setaccio (4.2)
5.2. Porzione di campione per l'analisi
Pesare 50 g del campione in esame in una beuta (4.16)
5.3. Estrazione
Aggiungere 25 g di celite (3.8), 250 ml di cloroformio (3.1) e 25 ml
di acqua. Tappare la beuta ed agitare per 30 minuti su agitatore
meccanico (4.3). Filtrare su carta da filtro pieghettata (4.14).
Raccogliere 50 ml del filtrato. Per campioni che richiedono dilui-
zioni prelevare un'aliquota del filtrato e diluire fino a 50 ml con
cloroformio in modo che la concentrazione di aflatossina B1non
superi i 4 ng/ml
5.4. Purificazione (il procedimento non dovrà subire significative inter-
ruzioni)
Attenzione: — proteggere adeguatamente il laboratorio dove viene eseguita
l'analisi dalla luce diurna con i seguenti accorgimenti:
1) Fogli assorbenti raggi UV sulla finestra in presenza di luce
attenuata (evitare la luce diretta del sole);
2) tende o persiane in combinazione con luce artificiale (sono
idonei anche i tubi fluorescenti),
— le soluzioni contenenti aflatossina debbono essere protette il più
possibile dalla luce (tenere al buio con fogli di alluminio)
5.4.1. Plurificazione con florisil SEP-PAK
5.4.1.1. Preparazione dell'assemblaggio colonna-cartuccia
Attaccare un rubinetto (4.18) al gambo più corto della cartuccia di
florisil (3.8) (vedi figura 1). Lavare la cartuccia e rimuovere l'aria
con 10 ml di cloroformio facendone passare 8 ml attraverso la
cartuccia con l'aiuto di una siringa (4.19). Collegare il gambo lungo
della cartuccia alla colonna (4.17) e far passare i rimanenti 2 ml
della cartuccia alla colonna. Chiudere il rubinetto. Rimuovere la
siringa
5.4.1.2. Purificazione
Aggiungere il filtrato raccolto in 5.3 alla colonna-cartuccia già
assemblate e scaricare per gravità. Lavare con 5 ml di cloroformio
(3.1) seguiti da 20 ml di metanolo (3.2). Scartare gli eluati. Durante
queste operazioni l'assemblaggio colonna-cartuccia non deve rima-
nere a secco. Eluire l'aflatossina B1con 40 ml della miscela
acetone-acqua (3.5.1) e raccogliere l'intero eluato nel pallone da
150 ml dell'evaporatore rotante (4.4). Concentrare l'eluato nell'eva-
poratore a 40-50 ºC sino al termine della distillazione dell'acetone
(NB:A questo punto rimangono nel pallone circa 0,5 ml di liquido.
Prove sperimentali hanno dimostrato che un'ulteriore evaporazione
è opportuna e che nei rimanenti 0,5 ml di liquido non c'è significa-
tiva traccia di acetone. Residui di acetone potrebbero causare
perdite di aflatossina B1nella cartuccia C18). Aggiungere 1 ml di
metanolo (3.2), agitare il pallone allo scopo di dissolvere l'aflatos-
sina sulle pareti nel pallone, aggiungere 4 ml di acqua e miscelare.
Disinserire e scartare la cartuccia. Lavare la colonna di vetro con
acqua e conservarla per la successiva purificazione su C18
5.4.2. Purficazione su SEP-PAK C18
5.4.2.1. Preparazione dell'assemblaggio colonna-cartuccia
Collegare un rubinetto (4.18) al gambo più corto di una cartuccia
C18(3.10) (vedi figura 1). Caricare la cartuccia rimuovendo l'aria e
facendo passare rapidamente 10 ml di metanolo (3.2) via rubinetto
con l'aiuto della siringa (4.19) (le bolle d'aria nella cartuccia sono
visibili come macchie di luce sul fondo altrimenti uniformemente
grigiastro). Aspirare 10 ml di acqua e farne passare 8 ml nella
cartuccia (nel passaggio da metanolo ad acqua evitare introduzioni
di aria nella cartuccia). Collegare il gambo più lungo della
cartuccia alla colonna di vetro (4.17) e far passare i rimanenti 2 ml
dalla cartuccia alla colonna. Chiudere il rubinetto. Rimuovere la
siringa
5.4.2.2. Purificazione1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 11
▼M2
Trasferire quantitàtivamente l'estratto raccolto in 5.4.1.2 nella
colonna di vetro (4.17) lavando due volte il matraccio con 5 ml
della miscela acqua-metanolo (3.5.2) e scaricare per gravità.
L'insieme colonna-cartuccia non deve rimanere mai secco. (Se le
bolle d'aria si sviluppano in prossimità della cartuccia interrompere
il flusso e picchiettare la sommità della colonna per rimuovere le
bolle d'aria. Poi continuare). Eluire con 25 ml della miscela
acqua-metanolo. Scaricare l'eluato. Eluire l'aflatossina B1con 50 ml
della miscela acqua/acetone (3.5.3), e raccogliere l'intero eluato in
un palloncino tarato da 50 ml. Portare a volume con acqua ed
agitare: questa soluzione è usata per la cromatografia (5.5).
Attenzione: Generalmente non è necessaria la filtrazione di questo
estratto finale. In caso contrario non usare filtri di
cellulosa perché causerebbero perdite di aflatossina
ma, per esempio, filtri di teflon
5.5. Comatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC)
(Vedi figura 2 per la messa in opera dell'apparecchiatura). Prima
dell'uso far condizionare per un tempo sufficiente lo strumento
Nota 1:
Le velocità di flusso indicata per i solventi ed i reagenti post-
colonna sono indicative. Esse possono essere variate in dipendenza
del tipo di colonna disponibile.
Nota 2:
I picchi della aflatossina B1dipendono dalla temperatura, quindi si
dovrà effettuare una compensazione della deriva (vedi figura 3).
Iniettando ad intervalli regolari una quantità fissa dello standard di
riferimento di aflatossina (3.13.3) (per esempio ogni tre iniezioni), i
valori dei picchi di aflatossina B1tra due successive iniezioni di
standard possono essere corretti usando il valore medio dei risultati,
sempreché la differenza fra i due valori delle risposte sia molto
piccola (< 10 %). Perciò debbono essere fatte iniezioni senza inter-
ruzioni. Se è necessaria un'interruzione, l'ultima iniezione prima
dell'interruzione e la prima iniezione dopo l'interruzione devono
essere considerate standard di riferimento (3.13.3). Dato che la
curva di calibrazione è lineare e passa per l'origine, le quantità di
aflatossina B1nei campioni estratti sono determinate direttamente
riferendosi agli standards adiacenti.
5.5.1. Messa in funzione della pompa HPLC
Regolare la pompa HPLC (4.5) per avere un flusso di 0,5 o 0,3 ml/
min per una colonna HPLC, rispettivamente di µm o 3 µm (4.6)
usando la fase mobile indicata al punto 3.6
5.5.2. Messa in funzione della pompa post-colonna
Regolare la pompa (4.7) in modo da avere un flusso di 0,2-0,4 ml/
min della soluzione acquosa satura di iodio (3.7). Come guida
approssimativa: Flussi di circa 0,4 o 0,2 ml/min circa sono consi-
gliati in combinazione con flussi della fase mobile (3.6) di 0,5 o
0,3 ml/min rispettivamente
5.5.3. Rivelatore a fluorescenza
Regolare il rivelatore e fluorescenza (4.11) ad un'eccitazione
= 365 nm ed un'emissione = 435 nm (per strumenti a filtri,
lunghezza d'onda > 400 nm). Regolare l'attenuatore del rivelatore
in modo da ottenere, per 1 ng di aflatossina B1, circa l'80 % di
deflessione dell'intera scala del pennino del registratore
5.5.4. Iniettore
Iniettare, per tutte le soluzioni, 250 µl seguendo sempre le indica-
zioni della ditta costruttrice dello strumento
5.5.5. Controllo della separazione cromatografica
Iniettare la soluzione di controllo cromatografico (3.14.1). Le valli
dei picchi dovrebbero essere meno del 5 % della somma delle
altezze dei picchi adiacenti
5.5.6. Controllo della stabilità del sistema
Prima di ogni serie di analisi iniettare ripetutamente lo standard di
riferimento (3.14.3) sino al raggiungimento della stabilità del valore
delle aree dei picchi ( NB:la risposta dei picchi per l'aflatossina B11976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼M2
tra due iniezioni consecutive dovrà essere meno del 6 %. Procedere
senza ritardo con il controllo della linearità) (5.5.7)
5.5.7. Controllo della linearità
Iniettare le soluzioni di calibrazione dell'aflatossina B1(3.13.1-
3.13.4). Ogni 3 iniezioni usare lo standard di riferimento (3.13.3)
per la correzione della deriva nella risposta ( NB:in 90 minuti i
valori del picchi degli standards di riferimento non devono differire
più del 10 %). Correggere per la deriva secondo le indicazioni delle
formule al punto 7. Il grafico di calibrazione dovrebbe essere
lineare e passare per l'origine entro 2 × l'errore standard del valore
di Y stimato. I valori trovati non devono differire più del 3 % dei
valori teorici. Se quanto richiesto è soddisfatto, proseguire senza
ritardo. Se non, identificare e quindi correggere le cause dell'ano-
malia prima di continuare
5.5.8. Iniezione dei campioni estratti
Iniettare gli estratti dei campioni purificati (5.4.2.2). Dopo ogni due
campioni estratti ripetere l'iniezione dello standard di riferimento
(3.13.3) secondo tale sequenza: standard di riferimento, estratto,
estratto, standard di riferimento, estratto, estratto, standard di riferi-
mento, ecc.
6. Prova di conferma
6.1. Ulteriore trattamento dell'estratto (5.4.2.2)
Aggiungere 5 ml della soluzione di cloruro di sodio (3.15.1) all'e-
stratto finale ottenuto al punto 5.4.2.2. Estrarre 3 volte con 2 ml di
cloroformio (3.1) per 1 minuto, usando un imbuto separatore
(4.24.1).
Filtrare gli estratti di cloroformio su 1 gr circa di solfato di sodio
(3.15.2) e raccogliere in una provetta da 10 ml. Si può usare un
piccolo imbuto (diametro: 4 cm) ponendo un batuffolo di cotone
nel punto di restrizione dell'imbuto che viene coperto con 1 gr di
solfato di sodio. Lavare lo strato di solfato di sodio con pochi ml
di cloroformio che vengono raccolti nella stessa provetta e portati
a secco usando la piastra riscaldante (4.24.2) e riprendere con 1 ml
di cloroformio
6.2. Preparazione della derivativa e cromatografia sustrato sottile
Vedi direttiva 76/372/CEE del Consiglio, allegato, metodo A, punto
5.6.2
7. Calcolo dei risultati
Calcolare il contenuto dell'aflatossina B1(µg/kg) presente nel
campione usando la formula:
aflatossina B 1èmg =kg ðÞ ¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
dove:
m = quantità di aflatossina B1in ng, rappresentata dal
picco del campione e calcolata nel modo
seguente:
m¼P campioneðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22rs tðÞ
P(campione) = area picco aflatossina B1del campione
P(st1) = area picco aflatossina B1risultante dalla prece-
dente iniezione dello standard di riferimento
(3.13.3)
P(st2) = area picco aflatossina B1risultante dalla succes-
siva iniezione dello standard di riferimento
(3.13.3)
r(st) = quantità di aflatossina B1dello standard di riferi-
mento (3.13.3) iniettato in g1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼M2
Vm= volume del campione estratto iniettato in ml
Vext= volume finale dell'estratto del campione in ml,
conseguente ad ogni diluzione effettuata (vedipunto 5.3)
M = massa del campione in g
V
f= volume del filtrato trasferito sulla cartuccia di
florisil (5.4.1.2) in ml
Vc= volume del cloroformio, usato per l'estrazione del
campione, in ml
Se il procedimento seguito è lo stesso di questo protocollo, la
formula ridotta finale è la seguente:
il contenuto di aflatossina B1in (µg/kg) = 20 × m
7.1. Il calcolo dei risultati si può fare anche misurando l'altezza dei
picchi
8. Ripetibilità
Vedi al punto 10.1 (osservazioni)
9. Riproducibilità
Vedi al punto 10.1
10. Osservazioni
10.1. Precisazione
Un studio collaborativo(1), condotto a livello internazionale su
mangimi composti, ha fornito i valori relativi alla ripetibilità e
riproducibilità, i cui risultati sono indicati in tabella 1. Il termine
ripetibilità (r), qui usato, è definito come il rapporto più ampio
non significativo al livello di probabilità del 95 %, confrontando
due letture dello stesso campione nel medesimo laboratorio alle
stesse condizioni. Il termine riproducibilità (R) è definito allo stessomodo confrontando due diversi laboratori. In base a quanto stabilito
da ISO 3534-1977, 2.35(
2) e dalla decisone 89/610/CEE della
Commissione(3), r e R sono anche indicate in tabella 1 in termini
di coefficienti di variazione.
Tabella 1
Ripetibilità (r) e riproducibilità (R) espresse come rapporti e
coefficienti di variazione corrispondenti
(15 laboratori)
Livello r R CVr(*) CVR
(µg/kg) (%) (%)
8 e 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = coefficiente di variazione.
10.2. Stabilizzazione del cloroformio (3.1)
Le caratteristiche di assorbimento della cartuccia di florisil si
possono cambiare se vengono usati altri stabilizzatori diversi
dall'alcol. Ciò si può verificare in accordo al punto 10.3 quando
non è disponibile il cloroformio indicato
10.3. Accuratezza
La corretta applicazione del metodo dovrà essere verificata facendo
ripetute analisi su materiali di riferimento certificati. Se questi non
sono disponibili, l'idoneità del metodo si verificherà con altre prove
di recuperi effettuati su campioni di controllo. La deviazione della1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 14
(1) Egmond, H.P., van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3) GU n. L 351 del 2. 12. 1989, pag. 39.
▼M2
media dal valore reale, espressa come percentuale del valore reale,
non dovrà porsi fuori dai limiti − 20 %, + 10 %
Figura 1: Assemblaggio colonna-cartuccia
Figura 2: Diagramma di flusso del sistema di cromatografia
liquida (CL) e derivatizzazione post-colonna con iodio1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼M2
Figura 3: Compensazione per la deriva nella risposta di aflatossina
B1all'iniezione dello standard di riferimento (3.13.3) ad intervalli
regolari
C. NOTE SUI METODI A E B
1.Sgrassatura
I campioni contenenti più del 5 % di sostanze grasse devono essere sgrassati
con etere di petrolio (p.e. 40 — 60º) dopo la preparazione del campione indi-
cata al punto 5.1. In questi casi, i risultati devono essere riferiti al peso del
campione non sgrassato
2.Riproducibilità dei risultati
La riproducibilità dei risultati, cioè la variazione tra i risultati ottenuti da due
o più laboratori relativi allo stesso campione, è stata valutata a:
± 50 % del valore medio dei risultati per i valori medi in aflatossina B1da 10
a 20 µg/kg
± 10 µg/kg del valore medio per i valori medi superiori a 20 e compresi fino
a 50 µg/kg
± 20 % del valore medio per i valori medi superiori a 50 µg/kg1976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼B
▼B
ALLEGATO
Figura 1
Figura 21976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 17
▼B
Figura 31976L0372 — IT — 10.11.1992 — 002.001 — 18