1991R2568 — IT — 09.08.2012 — 024.001

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▼B

REGOLAMENTO (CEE) N. 2568/91 DELLA COMMISSIONE

dell'11 luglio 1991

relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi attinenti







LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre 1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi ( 1 ), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 3577/90 ( 2 ), in particolare l'articolo 35 bis, considerando che l'allegato del regolamento n. 136/66/CEE prevede le denominazioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva commercializzati nei singoli Stati membri, nonché negli scambi intracomunitari e con i paesi terzi; considerando che per poter distinguere i vari tipi di olio è opportuno definire le caratteristiche fisico-chimiche di ciascuno di essi, nonché le caratteristiche organolettiche degli oli vergini, per garantire la purezza e la qualità dei prodotti in parola, salve le altre disposizioni vigenti in materia; considerando che è opportuno stabilire in modo uniforme in tutta la Comunità la presenza delle caratteristiche dei vari tipi di olio; che a tal fine occorre stabilire i metodi comunitari di analisi chimica e di valutazione organolettica; che occorre tuttavia autorizzare, durante un periodo transitorio, il ricorso ad altri metodi di analisi applicati negli Stati membri pur prevedendo che, in caso di divergenza dei risultati, saranno determinanti quelli ottenuti in base al metodo comune; considerando che la definizione delle caratteristiche fisico-chimiche degli oli d'oliva e dei metodi di analisi comporta l'adattamento delle note complementari del capitolo 15 della nomenclatura combinata; considerando che il metodo di valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli vergini implica la costituzione di comitati di assaggiatori selezionati ed esperti e che è pertanto opportuno prevedere il termine necessario per la realizzazione di siffatta struttura; che, tenuto conto delle difficoltà che taluni Stati membri dovranno affrontare per la costituzione dei comitati di assaggio, è opportuno autorizzare il ricorso ai comitati esistenti negli altri Stati membri; considerando che per garantire il corretto funzionamento del sistema dei prelievi applicabili all'importazione di sanse di oliva, è opportuno prescrivere un metodo unico per determinare il tenore in olio di questi prodotti; considerando che per non recare pregiudizio agli scambi è opportuno prevedere un periodo limitato per lo smaltimento dell'olio condizionato prima dell'entrata in vigore del presente regolamento; considerando che è opportuno abrogare il regolamento (CEE) n. 1058/77 della Commissione ( 3 ), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 1858/88 ( 4 ); considerando che il comitato di gestione per i grani non ha emesso alcun parere nel termine fissato dal suo presidente, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:







▼M20

Articolo 1

1. Sono considerati oli di oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a) e b), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate rispettivamente nei punti 1 e 2 dell'allegato I del presente regolamento.

2. È considerato olio di oliva lampante ai sensi del punto 1, lettera c), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 3, del presente regolamento.

3. È considerato olio di oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 4, del presente regolamento.

4. È considerato olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ai sensi del punto 3 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del presente regolamento.

5. È considerato olio di sansa di oliva greggio ai sensi del punto 4 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente regolamento.

6. È considerato olio di sansa di oliva raffinato ai sensi del punto 5 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del presente regolamento.

7. È considerato olio di sansa di oliva ai sensi del punto 6 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del presente regolamento.

▼B

Articolo 2

1. Le caratteristiche degli oli contemplati nell'allegato I sono determinate in base ai seguenti metodi di analisi:

— per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percentuale di acido oleico, il metodo di cui all'allegato II,

— per la determinazione dell'indice di perossido, il metodo di cui all'allegato III,

▼M19

— per la determinazione del tenore di cere, il metodo di cui all'allegato IV,

▼B

— per la determinazione del contenuto di steroli, il metodo di cui all'allegato V,

— per la determinazione dell'eritrodiolo + uvaolo, il metodo di cui all'allegato VI,

▼M21

— per la determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato, il metodo di cui all’allegato VII,

▼M20 —————

▼B

— per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui all'allegato IX,

— per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo di cui all'allegato X «A» e X «B»,

— per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di cui all'allegato XI,

— per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli d'oliva vergini, il metodo di cui all'allegato XII, applicato conformemente al paragrafo 2,

▼M20 —————

▼M11

— per la determinazione degli stigmastadieni, il metodo figurante nell'allegato XVII,

▼M13

— per la determinazione della composizione dei trigliceridi con ECN42, il metodo figurante nell'allegato XVIII,

▼M19

— per la determinazione del tenore in alcoli alifatici, il metodo di cui all'allegato XIX,

▼M23

— per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi mediante gascromatografia con colonna capillare, il metodo di cui all’allegato XX.

▼M19

2. La verifica delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti è compiuta da panel di assaggiatori riconosciuti dagli Stati membri.

Le caratteristiche organolettiche di un olio d'oliva vergine, di cui al primo comma, si considerano conformi alla categoria di olio di oliva dichiarata qualora il panel di assaggiatori riconosciuto dallo Stato membro ne confermi la classificazione.

Qualora il panel non confermi la dichiarazione della categoria di olio di oliva, sotto il profilo delle sue caratteristiche organolettiche, a richiesta dell'interessato le autorità nazionali o i loro rappresentanti incaricano altri panel riconosciuti di effettuare due controanalisi, di cui almeno una deve essere effettuata da un panel riconosciuto dallo Stato membro di produzione dell'olio. Le caratteristiche in questione sono considerate conformi a quelle dichiarate se le due controanalisi ne confermano la classificazione. Nel caso contrario il costo delle controanalisi, e fatte salve le sanzioni comminate, sono a carico dell'interessato.

▼M17

3. Per quanto riguarda la verifica delle caratteristiche degli oli da parte delle autorità nazionali o di loro rappresentanti, prevista al paragrafo 1, il prelievo dei campioni si effettua secondo le norme internazionali EN ISO 661 e EN ISO 5555 relative alla preparazione dei campioni per le prove e al campionamento. Tuttavia, in deroga al punto 6.8 della norma EN ISO 5555, per le partite costituite dai summenzionati oli, in imballaggi immediati di contenuto inferiore o uguale a 100 litri, il prelievo del campione si effettua conformemente all'allegato I bis del presente regolamento.

▼M19

Fatte salve le disposizioni della norma EN ISO 5555 e del capitolo 6 della norma EN ISO 661, i campioni prelevati sono messi immediatamente al riparo dalla luce e da fonti di calore elevato e sono inviati al laboratorio per le analisi entro al più tardi:

— il decimo giorno lavorativo successivo a quello del prelievo nei mesi da ottobre a maggio, e

— il quinto giorno lavorativo successivo a quello del prelievo nei mesi da giugno a settembre.

▼M17

4. ►M20 Ai fini della verifica prevista al paragrafo 3, le analisi di cui agli allegati II, III, IX, X e XII nonché, eventualmente, le controanalisi previste dalle normative nazionali, sono effettuate anteriormente alla data di durata minima. Qualora il prelievo del campione abbia luogo oltre quattro mesi prima di tale data, le summenzionate analisi sono effettuate entro e non oltre il quarto mese successivo alla data del prelievo. Nessun termine si applica per le altre analisi previste dal suddetto regolamento. ◄

Salvo qualora il campione sia stato prelevato meno di un mese prima della data di durata minima, nel caso in cui i risultati delle analisi non corrispondano alle caratteristiche della categoria di olio d'oliva o di olio di sansa di oliva dichiarata, l'interessato ne viene informato al più tardi un mese prima dello scadere del termine di cui al primo comma.

▼M19

5. Quando le caratteristiche degli oli d'oliva sono determinate secondo i metodi di cui al paragrafo 1, i risultati delle analisi sono direttamente confrontati con i limiti fissati dal presente regolamento.

▼M20

Articolo 2 bis

La verifica, da parte delle autorità nazionali o di loro rappresentanti, della conformità dei campioni degli oli di oliva e degli oli di sansa di oliva alla categoria dichiarata può essere effettuata:

a) mediante le analisi di cui all'allegato I, effettuate in qualunque ordine; oppure

b) secondo l'ordine previsto all'allegato I ter relativo allo schema decisionale, fino all'adozione di una delle decisioni contemplate dallo schema stesso.

▼M19 —————

▼M5

Articolo ►M19 3 ◄

Qualora si constati che le caratteristiche organolettiche di un olio sono diverse da quelle proprie alla sua denominazione, lo Stato membro interessato applica sanzioni pecuniarie amministrative, la cui entità è stabilita in base alla gravità dell'irregolarità accertata, ferme restando altre sanzioni eventuali.

Ai fini della valutazione dell'irregolarità si tiene conto, in particolare, dell'evoluzione naturale delle caratteristiche di un olio che sia stato conservato in condizioni normali.

All'inizio di ogni semestre gli Stati membri informano la Commissione in merito al numero e alla natura delle irregolarità constatate, nonché in merito alle sanzioni irrogate nel semestre precedente.

▼M5

Articolo 4

▼M19

1. Ai fini della valutazione e del controllo delle caratteristiche organolettiche da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti, gli Stati membri possono procedere al riconoscimento di panel di assaggiatori.

Le condizioni del riconoscimento sono stabilite dallo Stato membro in particolare in modo da:

— rispondere alle condizioni di cui all'allegato XII, punto 4,

— garantire che la formazione del capo del panel si compia presso un organismo riconosciuto e alle condizioni a tal fine stabilite dallo Stato membro,

— subordinare la validità del riconoscimento ai risultati ottenuti nell'ambito di un sistema di controllo annuale istituito dallo Stato membro.

Ogni Stato membro comunica alla Commissione l'elenco dei panel riconosciuti e le misure adottate conformemente al presente paragrafo.

▼M5

2. Lo Stato membro che incontri difficoltà per la costituzione di un comitato di assaggio sul proprio territorio può ricorrere ad un comitato di assaggio riconosciuto da un altro Stato membro.

3. Ogni Stato membro compila l'elenco dei comitati di assaggio istituiti da associazioni professionali o interprofessionali in conformità del paragrafo 1 e controlla il rispetto di dette norme.

▼M19 —————

▼B

Articolo 6

1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione dell'olio (codice NC 2306 90 11 e 2306 90 19) è determinato conformemente al metodo che figura nell'allegato XV.

2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del suo peso rispetto a quello della sostanza secca.

▼M20

Articolo 7

Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di contaminanti.

Per quanto riguarda il tenore di solventi alogenati, i limiti per tutte le categorie di oli di oliva sono i seguenti:

— tenore massimo di ciascun solvente alogenato rilevato: 0,1 mg/kg

— tenore massimo della somma dei solventi alogenati rilevati: 0,2 mg/kg.

▼B

Articolo 8

1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misure adottate per l'applicazione del presente regolamento.

2. Ogni Stato membro comunica alla Commissione, alla fine di ogni semestre, un riassunto dei dati analitici delle determinazioni effettuati nel corso del semestre precedente.

Detti risultati sono esaminati dal comitato di gestione dei grassi secondo la procedura prevista all'articolo 39 del regolamento n. 136/66/CEE.

Articolo 9

Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.

Articolo 10

1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo a quello della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decorrere dal ►M1 1o novembre 1992 ◄ , salvo per quanto riguarda le operazioni legate all'intervento.

▼M5

Questo metodo non si applica all'olio d'oliva vergine condizionato anteriormente al 1o novembre 1992.

▼B

2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di sansa d'oliva condizionati anteriormente all'entrata in vigore del presente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre 1992.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.









ALLEGATI

Sommario







Allegato I: Caratteristiche degli oli di oliva Allegato I bis: Campionatura delle partite di olio d'oliva o di olio di sansa d'oliva in imballaggi immediati di contenuto non superiore a 100 litri Allegato I ter: Schema decisionale Allegato II: ►M21 Determinazione degli acidi grassi liberi, metodo a freddo ◄ Allegato III: Determinazione del numero di perossidi Allegato IV: ►M6 Determinazione del contenuto di cere mediante gascromatografia con colonna capillare ◄ Allegato V: Determinazione della composizione e del contenuto di steroli mediante gascromatografia con colonna capillare Allegato VI: Determinazione dell'eritrodiolo e dell'uvaolo Allegato VII: ►M21 Determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato ◄ ▼M20 ————— ▼B Allegato IX: Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto Allegato X «A»: Analisi gascromatografica degli esteri metilici degli acidi grassi Allegato X «B»: Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi in conformità all'allegato VI — punti I e II del regolamento (CEE) n. 72/77 della Commissione oppure in alternativa il metodo seguente Allegato XI: Determinazione del tenore dei solventi alogenati Allegato XII: Valutazione organolettica dell'olio di oliva vergine ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Allegato XV: Metodo di determinazione del tenore in olio d'oliva delle sanse Allegato XVI: Determinazione del numero di iodio Allegato XVII: Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali Allegato XVIII: Metodo di determinazione della composizione dei trigliceridi con ECN42 Allegato XIX: Metodo per la determinazione del tenore in alcoli alifatici ▼M23 Allegato XX: Metodo per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi mediante gascromatografia con colonna capillare

▼M23









ALLEGATO I

CARATTERISTICHE DEGLI OLI DI OLIVA







Categoria Metil esteri degli acidi grassi (MEAG) ed etil esteri degli acidi grassi (EEAG) Acidità (%) (*) Numero dei perossidi mEq O2/kg (*) Cere mg/kg (**) 2 gliceril monopalmitato (%) Stigmastadiene mg/kg (1) Differenza: ECN42 (HPLC) e ECN42 (calcolo teorico) K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) ►C6 Valutazione organolettica Mediana del difetto (Md) (*) ◄ Valutazione organolettica Mediana del fruttato (Mf) (*) 1. Olio extra vergine di oliva ►C7 Σ MEAG + EEAG ≤ 75 mg/kg o 75 mg/kg <Σ MEAG + EEAG ≤ 150 mg/kg e (EEAG/MEAG) ≤ 1,5 ◄ ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 2. Olio di oliva vergine — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 3. Olio di oliva lampante — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 se % acido palmitico totalē ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14 % 4. Olio di oliva raffinato — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14 % 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 6. Olio di sansa di oliva greggio — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Olio di sansa di oliva raffinato — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olio di sansa di oliva — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Categoria Composizione acidica (1) Somma degli isomeri transoleici (%) Somma degli isomeri translinoleici + translinolenici (%) Composizione in steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiolo e uvaolo (%) (**) Miristico (%) Linolenico (%) Arachidico (%) Eicosenoico (%) Beenico (%) Lignocerico (%) Colesterolo (%) Brassicasterolo (%) Campesterolo (%) Stigmasterolo (%) Betasitosterolo (%) (2) Delta-7-stigmastenolo (%) 1. Olio extra vergine di oliva ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Olio di oliva vergine ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Olio di oliva lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Olio di oliva raffinato ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Olio di sansa di oliva greggio ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Olio di sansa di oliva raffinato ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olio di sansa di oliva ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









ALLEGATO I bis

Campionatura delle partite di olio di oliva o di olio di sansa di oliva consegnate in imballaggi immediati di contenuto non superiore a 100 litri

Il presente metodo di campionatura si applica alle consegne di olio di oliva o di olio di sansa di oliva non superiori a 125 000 litri, condizionate in imballaggi immediati di contenuto non superiore a 100 litri.

Qualora la consegna sia costituita da più di 125 000 litri, essa viene suddivisa in partite di quantità approssimativamente pari o inferiore a 125 000 litri. Qualora la consegna sia costituita da meno di 125 000 litri, essa costituisce una partita. In tali casi il metodo si applica a ciascuna partita.

Il numero minimo di prelievi elementari è fissato in funzione della dimensione della partita, conformemente alla tabella riportata al punto 1.

L'entità del prelievo elementare è determinata in funzione della capacità degli imballaggi immediati, secondo la tabella riportata al punto 2.1.

Le definizioni di consegna, prelievo elementare (incremento) e campione di laboratorio sono quelle della norma EN ISO 5555.

Si intende per «partita» un insieme di unità di vendita prodotte, fabbricate e condizionate in circostanze tali che l'olio contenuto in ciascuna di queste unità di vendita è considerato omogeneo per tutte le caratteristiche analitiche.

1. NUMERO DI PRELIEVI ELEMENTARI

Il numero minimo di prelievi elementari è fissato in funzione della dimensione della partita, conformemente alla tabella seguente:







Partita (litri) inferiore a Numero minimo di prelievi elementari 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Gli imballaggi immediati facenti parte dello stesso prelievo elementare devono essere scelti tra imballaggi contigui della partita.

In caso di dubbio, lo Stato membro aumenta il numero di prelievi elementari da effettuare.

2. CONTENUTO DEL PRELIEVO ELEMENTARE

2.1 Il prelievo elementare è costituito:







In caso di imballaggi immediati aventi una capacità: Il prelievo elementare riguarda l'olio di: a) Superiore o uguale a 5 litri a) 3 imballaggi immediati b) Superiore o uguale a 3 litri ma inferiore a 5 litri b) 3 imballaggi immediati c) Superiore o uguale a 2 litri ma inferiore a 3 litri c) 3 imballaggi immediati d) Superiore o uguale a 1 litro ma inferiore a 2 litri d) 6 imballaggi immediati e) Superiore o uguale a 0,75 litri ma inferiore a 1 litro e) 6 imballaggi immediati f) Inferiore a 0,75 litri f) 3 volte l'olio del numero minimo di imballaggi la cui capacità totale supera 1,5 litri

2.2 I prelievi elementari devono essere mantenuti negli imballaggi immediati fino al momento delle analisi. In seguito, l'olio dei prelievi elementari è suddiviso eventualmente in tre campioni di laboratorio allo scopo di effettuare:

a) le analisi di cui agli allegati II, III, IX e X;

b) l'analisi di cui all'allegato XII;

c) le altre analisi.

2.3 Gli imballaggi che costituiscono un prelievo elementare sono suddivisi secondo le procedure di controllo previste dalle legislazioni nazionali.

3. ANALISI E RISULTATI

a) Ciascuno dei prelievi elementari di cui al punto 1 è suddiviso in campioni di laboratorio, conformemente al punto 2.5 della norma EN ISO 5555, e sottoposto alle analisi seguenti: — determinazione degli acidi grassi liberi, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, primo trattino, — determinazione dell'indice di perossidi, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, secondo trattino, — analisi spettrofotometrica, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, ottavo trattino, — composizione di acidi grassi, di cui all'articolo 2, paragrafo 1, nono trattino.

b) Qualora, per almeno uno dei prelievi elementari sulla stessa partita, uno dei risultati delle analisi di cui alla lettera a) non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è dichiarata non conforme. Qualora, per ciascuno dei prelievi elementari sulla stessa partita, i risultati delle analisi di cui alla lettera a) non siano tutti omogenei, tenuto conto delle caratteristiche di ripetibilità dei metodi utilizzati, l'insieme della partita è dichiarata non omogenea e ciascun prelievo elementare deve essere sottoposto alle altre analisi richieste. In caso contrario, uno solo dei prelievi elementari su detta partita è sottoposto alle altre analisi richieste.

c) Qualora uno dei risultati delle analisi di cui alla lettera b), secondo comma, non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita è dichiarata non conforme. Qualora tutti i risultati delle analisi di cui alla lettera b), secondo comma, siano conformi alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita è dichiarata conforme.

▼M20









ALLEGATO I ter

SCHEMA DECISIONALE PER LA VERIFICA DELLA CONFORMITÀ DI UN CAMPIONE DI OLIO DI OLIVA ALLA CATEGORIA DICHIARATA

L'analisi della conformità di un olio di oliva o di un olio di sansa di oliva alla categoria dichiarata può essere effettuata:

a) mediante le analisi previste per la verifica del rispetto delle caratteristiche di cui all'allegato I, effettuate in qualunque ordine; oppure

b) mediante le analisi previste dallo schema decisionale, effettuate secondo l'ordine ivi indicato, fino all'adozione di una delle decisioni contemplate dallo schema stesso.

Le analisi relative ai contaminanti e ai solventi alogenati, necessarie per verificare la conformità alle norme dell'Unione europea, devono essere effettuate separatamente.

Lo schema decisionale si applica a tutte le categorie di olio di oliva o di olio di sansa di oliva. Esso è costituito da tabelle, numerate da 1 a 11, che devono essere seguite nell'ordine indicato nella tabella generale in funzione della categoria di olio dichiarata.

Legenda per l'interpretazione della tabella generale e delle tabelle da 1 a 11:

— La linea doppia (=) indica il percorso da seguire in caso di conformità (esito positivo) alle condizioni previste nel caso precedente. La linea punteggiata (…) indica, viceversa, il percorso da seguire in caso di non conformità.

— I titoli delle caselle che figurano nelle tabelle da 1 a 11 si riferiscono alle analisi previste dal presente regolamento, secondo le corrispondenze di cui all'appendice 1 del presente allegato.

— Le lettere che figurano nei cerchi relativi alla decisione negativa nelle tabelle da 1 a 11 rinviano ad informazioni indicative riportate nell'appendice 2 del presente allegato e non implicano di per sé l'obbligo di effettuare ulteriori analisi o la certezza delle presunzioni menzionate.

Tabella generale

Tabella 1

Tabella 2

►(1) C4

Tabella 3

Tabella 4

Tabella 5

Tabella 6

Tabella 7

Tabella 8

Tabella 9

Tabella 10

Tabella 11









Appendice 1

Corrispondenza tra gli allegati del presente regolamento e le analisi previste nello schema decisionale







— Acidità Allegato II Determinazione degli acidi grassi liberi, metodo a freddo ▼M20 — Indice di perossidi Allegato III Determinazione dell'indice di perossido — Spettrofotometria a raggi ultravioletti Allegato IX Analisi spettofotometrica — Valutazione organolettica Allegato XII Valutazione organolettica dell'olio di oliva vergine — Stigmasta-3,5-diene: Allegato XVII Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali — Isomeri trans degli acidi grassi Allegato X a e Analisi mediante cromatografia in fase gassosa degli esteri metilici di acidi grassi. Allegato X b Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi — Composizione di acidi grassi Allegato X a e Analisi mediante cromatografia in fase gassosa degli esteri metilici di acidi grassi Allegato X b Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi — ΔECN42 Allegato XVIII Determinazione della composizione dei trigliceridi con ECN42 (differenza tra composizione reale e composizione teorica) — Composizione di steroli e steroli totali Allegato V Determinazione della composizione e del contenuto di steroli mediante cromatografia in fase gassosa con colonna capillare — Eritrodiolo e uvaolo Allegato VI Determinazione del tenore di eritrodiolo e di uvaolo — Cere Allegato IV Determinazione del tenore di cere mediante cromatografia in fase gassosa con colonna capillare — Alcoli alifatici Allegato XIX Determinazione del contenuto di alcoli alifatici mediante cromatografia in fase gassosa con colonna capillare ▼M21 — Acidi grassi saturi in posizione 2 Allegato VII Determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato ▼M20









Appendice 2

Tabella 1

a) Cfr. olio di oliva vergine o lampante (criteri di qualità tabella 2, o criteri di qualità e di purezza tabella 4)

b) Cfr. olio di oliva lampante (criteri di qualità e di purezza tabella 4)

Tabella 2

a) Cfr. olio di oliva lampante (criteri di qualità e di purezza tabella 4)

b) Cfr. olio di oliva extravergine (criteri di qualità tabella 1)

Tabella 3

a) Presenza di olio raffinato (di oliva o altri)

b) Presenza di olio di sansa di oliva

Tabella 4

a) Cfr. olio di oliva extravergine e olio di oliva vergine (criteri di qualità tabella 1 e tabella 2)

b) Presenza di olio raffinato (di oliva o altri)

c) Presenza di olio di sansa di oliva

d) Presenza di oli esterificati

Tabella 7

a) Presenza di olio di sansa di oliva

b) Presenza di oli esterificati

Tabella 8

a) Presenza di olio raffinato (di oliva o altri)

b) Cfr. olio di oliva lampante (criteri di qualità e di purezza tabella 4)

c) Presenza di oli esterificati

Tabella 11

a) Presenza di oli esterificati

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ALLEGATO II

▼M21

DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI LIBERI, METODO A FREDDO

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1. OGGETTO

Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi grassi liberi viene espresso mediante l'acidità calcolata in modo convenzionale.

1.1. Principio

Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una soluzione etanolica di idrossido di potassio.

1.2. Reattivi

Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua impiegata dev'essere acqua distillata o di purezza equivalente.

1.2.1. Etere dietilico — etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 - 1 in volume. Nota: l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplosivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari. Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di idrossido di potassio (1.2.2) in presenza di 0,3 ml della soluzione di fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela. Nota: se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una miscela di solventi costituita da etanolo e da toluene. Se necessario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.

1.2.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata c(KOH) all'incirca 0,1 mol oppure, se necessario, c( ►C2 KOH ◄ ) 0,5 mol circa. La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio deve essere nota e verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve essere incolore o giallo pallida. Nota: una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere preparata come segue. Portare e mantenere per un'ora all'ebollizione a ricadere 1 000 ml di etanolo con 8 g di idrossido di potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente. Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio. La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come segue. A 1 000 ml di etanolo aggiungere 4 ml di butilato di alluminio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Questa soluzione è pronta per l'uso.

1.2.3. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alcalino (nel caso di sostanze grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l nell'etanolo al 95-96 % (V/V).

1.3. Apparecchiatura

Materiale corrente da laboratorio, in particolare:

1.3.1. Bilancia analitica.

1.3.2. Beuta, avente una capacità di 250 ml.

1.3.3. Buretta, avente una capacità di 10 ml, graduata in 0,05 ml.

1.4. Modo di operare

1.4.1. Preparazione del campione da analizzare. La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità + impurezze è inferiore all'1 %, sul campione tal quale.

1.4.2. Sostanza da analizzare Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero di acidità presunto, secondo le indicazioni della seguente tabella.



Numero di acidità presunto Massa della sostanza da analizzare (in g) Precisione della pesata della sostanza da analizzare (in g) < 1 20 0,05 1 a 4 10 0,02 4 a 15 2,5 0,01 15 a 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).

1.4.3. Determinazione Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50—150 ml della miscela etere etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata. Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l (1.2.2) ( ►C2 vedi nota 2 ◄ ) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s). Nota 1: La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può essere sostituita con una soluzione acquosa di idrossido di potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non comporta una separazione di fasi. Nota 2: Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l supera i 10 ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l. Nota 3: Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (1.2.1) per ottenere una soluzione chiara.

1.5. Espressione dell'acidità come % di acido oleico.

L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:

dove:

V = è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

c = è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

M = è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per l'espressione del risultato (acido oleico = 282);

m = è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare.

Prendere come risultato la media aritmetica ►M6 di due determinazioni ◄ .









ALLEGATO III

DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI PEROSSIDI

1. OGGETTO

Si tratta di un metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli e grassi.

2. CAMPO D'APPLICAZIONE

Oli e grassi animali e vegetali.

3. DEFINIZIONE

Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossidano lo ioduro di potassio nelle condizioni che vengono descritte.

4. PRINCIPIO

Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio, con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con soluzione di tiosolfato di sodio standardizzata.

5. APPARECCHIATURA

Tutta l'apparecchiatura usata dev'essere esente da sostanze riducenti od ossidanti.

Nota:

Non ungere le superfici smerigliate.

5.1. Ditale di vetro da 3 ml.

5.2. ►C2 Palloni a collo e tappo smerigliato ◄ , aventi una capacità di circa 250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto o, di preferenza, anidride carbonica).

5.3. Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml.

6. REAGENTI

6.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.

6.2. Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas puro e secco.

6.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati.

6.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente standardizzata immediatamente prima dell'uso.

6.5. Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione da amido naturale solubile.

7. CAMPIONE

Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati ermeticamente con tappi a smeriglio o di sughero.

8. PROCEDIMENTO

La prova dev'essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce artificiale. Pesare in un ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:







Numero di perossidi previsto (meq) Peso della sostanza da analizzare (in g) 0 — 12 5,0 — 2,0 12 — 20 2,0 — 1,2 20 — 30 1,2 — 0,8 30 — 50 0,8 — 0,5 50 — 90 0,5 — 0,3

Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3). Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al riparo dalla luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25 °C.

Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) (soluzione 0,002 N per valori previsti inferiori a 12 e soluzione 0,01 N per valori previsti superiori a 12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come indicatore.

Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.

Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del bianco supera 0,05 ml di soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (6.4), sostituire i reagenti impuri.

9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il numero di perossidi (P.V.), espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, viene dato dalla formula:

dove:

V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio (6.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della prova in bianco.

T = è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) usata.

m = è il peso in g della sostanza da analizzare.

Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni eseguite.

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ALLEGATO IV

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di cere negli oli d’oliva. Le cere sono separate in funzione del numero di atomi di carbonio. Il metodo può essere impiegato in particolare per differenziare l’olio d’oliva di pressione da quello di estrazione (olio di sansa).

2. PRINCIPIO

La sostanza grassa, addizionata di opportuno standard interno, viene frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato; la frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità inferiore a quella dei trigliceridi) viene recuperata e quindi analizzata direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Colonna in vetro per gascromatografia con diametro interno 15,0 mm e altezza 30-40 cm, provvista di rubinetto.

3.3. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da: 3.3.1. Camera termostatica per le colonne a temperatura programmabile. 3.3.2. Iniettore a freddo per introduzione diretta in colonna. 3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore. 3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile. (Possono essere utilizzati anche sistemi informatici che consentono l’acquisizione di dati di gascromatografia mediante computer). 3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido di ripartizione, di spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm. (Si trovano in commercio due liquidi di ripartizione adatti all’uso, del tipo SE52 o SE54).

3.4. Microsiringa per introduzione diretta in colonna da 10 μl con ago cementato.

3.5. Vibratore elettrico.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Forno a muffola.

3.8. Bilancia analitica in grado di garantire una precisione di misura di + 0,1 mg.

3.9. Normale vetreria da laboratorio.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 60 e 200 μm. Il gel di silice è posto in muffola a 500 °C per almeno 4 ore. Dopo raffreddamento è addizionato del 2 % di acqua rispetto alla quantità di gel di silice prelevata. Si agita bene allo scopo di omogeneizzare la massa. Si conserva al buio per almeno 12 ore prima dell’uso.

4.2. n-esano per cromatografia.

4.3. Etere etilico per cromatografia.

4.4. n-eptano per cromatografia.

4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (v/m) in esano (standard interno). (Si può utilizzare anche palmitil palmitato o miristil stearato). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftolo).

4.6. Gas vettore: idrogeno o elio puro per gascromatografia.

4.7. Gas ausiliari: — idrogeno puro per gascromatografia, — aria pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione della colonna cromatografica

Mettere in sospensione 15 g di gel di silice (4.1) in n-esano (4.2) e introdurla in colonna (3.2). Dopo assestamento spontaneo, completare lo stesso con l’ausilio di un vibratore elettrico per rendere più omogeneo il letto cromatografico. Percolare 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze. Pesare esattamente, nella beuta da 25 ml (3.1), circa 500 mg di campione con la bilancia (3.8), addizionare l’opportuna quantità di standard interno (4.5) in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio aggiungere 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva, e da 0,25 a 0,50 mg nel caso di olio di sansa. Immettere il campione così preparato nella colonna cromatografica con l’ausilio di due porzioni da 2 ml ciascuna di n-esano (4.2).

Lasciar fluire il solvente fino a 1 mm sopra l’assorbente, quindi percolare altri 70 ml di n-esano allo scopo di eliminare gli n-alcani naturalmente presenti. Iniziare quindi l’eluizione cromatografica raccogliendo 180 ml di miscela n-esano/etere etilico in rapporto 99:1, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 secondi. L’eluizione del campione deve essere effettuata a una temperatura ambiente di 22 °C ± 4.

NB:

— La miscela n-esano/etere etilico (99:1) deve essere preparata ogni giorno.

— Per controllare visivamente la corretta eluizione delle cere, è possibile aggiungere al campione in soluzione 100 μl di sudan 1 all’1 % nella miscela di eluizione. Il colorante ha una ritenzione intermedia tra le cere e i trigliceridi, pertanto quando la colorazione raggiunge il fondo della colonna cromatografica bisogna sospendere l’eluizione, in quanto tutte le cere sono state eluite.

Essiccare la frazione così ottenuta mediante evaporatore rotante (3.6) fino ad eliminazione quasi completa del solvente. Eliminare gli ultimi 2 ml di solvente mediante un debole flusso di azoto; aggiungere quindi 2-4 ml di n-eptano.

5.2. Analisi gascromatografica

5.2.1. Operazioni preliminari

Installare la colonna nel gascromatografo (3.3), collegando il terminale di ingresso al sistema «on column» e il terminale di uscita al rivelatore. Eseguire i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.).

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Far fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna, quindi avviare il complesso gascromatografico. Riscaldare gradualmente fino a raggiungere, dopo circa 4 ore, la temperatura di 350 °C. Mantenere tale temperatura per almeno 2 ore, quindi portare il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico (3.3.4), regolazione della temperatura della camera per colonna, del rivelatore, ecc.) e registrare il segnale ad una sensibilità almeno due volte superiore a quella prevista per l’esecuzione dell’analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.

Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

5.2.2. Scelta delle condizioni operative

Le condizioni operative di massima sono le seguenti:

— temperatura della colonna: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min inizio a 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— quantità di sostanza iniettata: 1 μl della soluzione (2-4 ml) di n-eptano,

— gas vettore: elio o idrogeno alla velocità lineare ottimale per il gas prescelto (cfr. appendice),

— sensibilità strumentale: idonea a soddisfare le sottostanti condizioni.

Tali condizioni possono essere variate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da avere una separazione di tutte le cere, una risoluzione soddisfacente dei picchi (cfr. figura) e una ritenzione dello standard interno C32 di 18 ± 3 minuti. Il picco delle cere più rappresentativo deve avere un’altezza superiore al 60 % del fondo scala.

I parametri di integrazione dei picchi devono essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.

NB:Vista l’elevata temperatura finale, è ammessa una deriva positiva che non deve superare il 10 % del fondo scala.

5.3. Esecuzione dell’analisi

Prelevare 1 μl di soluzione con la microsiringa da 10 μl; estrarre lo stantuffo della siringa in modo che l’ago resti vuoto. Introdurre l’ago attraverso il dispositivo di iniezione e, dopo 1-2 secondi, iniettare rapidamente; estrarre quindi lentamente l’ago dopo circa 5 secondi.

Effettuare la registrazione fino a completa eluizione delle cere.

La linea di base deve rispondere sempre ai requisiti richiesti.

5.4. Identificazione dei picchi

L’identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e in confronto a miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni.

Nella figura è riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva vergine.

5.5. Valutazione quantitativa

Procedere al calcolo delle aree dei picchi dello standard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46 per mezzo dell’integratore.

Calcolare il contenuto di cere in ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza grassa, secondo la formula seguente:

in cui:

Ax = area del picco del singolo estere, in millimetri quadrati

As = area del picco dello standard interno, in millimetri quadrati

ms = massa di standard interno aggiunta, in milligrammi

m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DI RISULTATI

Riportare la somma dei contenuti delle singole cere da C40 a C46 in mg/kg di sostanza grassa (ppm).

NB:I componenti da quantificare si riferiscono ai picchi a numero di carbonio pari compresi tra gli esteri C40 e C46, secondo l’esempio di cromatogramma delle cere dell’olio di oliva riportato nella figura seguente. Se l’estere C46 risulta sdoppiato, si consiglia, ai fini della sua identificazione, di analizzare la frazione cerosa di un olio di sansa dove il picco C46 risulta facilmente individuabile in quanto nettamente maggioritario.

I risultati si esprimono con due cifre decimali.

Figura

Cromatogramma delle cere di un olio d’oliva ( 5 )

Legenda:

I.S. = Lauril arachidato

1. = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5. = Esteri C46

6. = Esteri steroli e alcoli triterpenici.









Appendice

Determinazione della velocità lineare del gas

Iniettare nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, da 1 a 3 μl di metano (o propano). Cronometrare il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell’iniezione al momento dell’uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in secondi.

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ALLEGATO V

DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE E DEL CONTENUTO DI STEROLI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di steroli, singoli e totali, delle sostanze grasse.

2. PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa, addizionata di α-colestanolo quale standard interno, è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione sterolica mediante cromatografia su placca di gel di silice basica; gli steroli recuperati dal gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a smeriglio.

3.2. Imbuti separatori da 500 ml.

3.3. Matracci da 250 ml.

3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre di vetro 20 × 20 cm.

3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.

3.6. Microsiringhe da 100 μl e 500 μl.

3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 μm) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtrazione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.

3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adattabile all'imbuto filtrante (3.7.).

3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.

3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di splittaggio, costituito da: 3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura desiderata con la precisione di ± 1 °C. 3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporizzante in vetro persilanizzato. 3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore. 3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.10.3.), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro interno 0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm.

3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 μl con ago cementato.

4. REAGENTI

4.1. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.

4.2. Etere etilico, puro per analisi.

4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.

4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).

4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo.

4.6. Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.7. Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.8. Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.9. Etere etilico, per cromatografia.

4.10. Cloroformio, puro per analisi.

4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o fitosteroli, soluzione al ►M6 2 % ◄ in cloroformio.

4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende leggermente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di idrossido di potassio.

4.13. Piridina anidra, per cromatografia.

4.14. Esametildisilazano.

4.15. Trimetilclorosilano.

4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento dell'impiego partendo da steroli puri o da miscele di steroli ottenute da oli che li contengano.

4.17. α-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard interno).

4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.

4.19. Gas ausiliari: — idrogeno, puro per gascromatografia — aria, pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione dell'insaponificabile. 5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da 500 μl, un volume di soluzione di α-colestanolo allo 0,2 % in cloroformio (4.17.) che contenga una quantità di α-colestanolo corrispondente a circa il 10 % del contenuto di steroli nell'aliquota di campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di campione si aggiungano 500 μl della soluzione di α-colestanolo allo 0,2 % se trattasi di un olio di oliva e 1 500 μl se trattasi di ►M6 ————— ◄ olio di sansa di oliva. Si evapora in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso matraccio si pesano esattamente 5 g di campione secco e filtrato. In caso di oli ►M6 ————— ◄ contenenti quantità notevoli di colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione sterolica in doppio con e senza standard interno ►M6 oppure utilizzare betulinolo al posto del colesterolo ◄ . 5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N, si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30 °C. 5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese, impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa 80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si lascia stratificare (nota 1). Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70 ml di etere etilico. Nota 1 — Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo, mediante spruzzetta, piccole quantità di alcool etilico o metilico. 5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque di lavaggio. Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico. 5.1.5. Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100 °C per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa.

5.2. Separazione della frazione sterolica. 5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice (4.4.), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100 °C per 1 ora. Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni). Nota 2 Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del trattamento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così la banda degli steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e triterpenici. 5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-acetone 95:5 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35 (V/V). Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei componenti. Nota 3: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili la miscela di sviluppo deve essere sostituita ad ogni prova. 5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in cloroformio e, con la microsiringa da 100 μl si depositano su una placca cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-3 μl della soluzione di riferimento degli steroli (4.11.), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli. 5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in 5.2.2. La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 °C. Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca per un pò di tempo sotto cappa. 5.2.5. Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si individua la banda degli steroli per allineamento con la macchia ottenuta con la soluzione di riferimento; si delimitano con una matita nera i limiti della banda lungo i margini di fluorescenza. 5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di cloroformio caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) collegata all'imbuto filtrante. Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previamente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 °C indi si lascia raffreddare in essiccatore e si pesa. Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione sterolica.

5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri. 5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per la sililazione, costituito da una miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 4) in ragione di 50 μl per ogni milligrammo di steroli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 5). Nota 4 — Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire son uno stesso volume di piridina anidra. 5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione degli steroli. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica. Nota 5 — L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcun disturbo. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio della presenza di umidità o di alterazione del reattivo. In questo caso la prova dovrà essere ripetuta.

5.4. Analisi gascromatografica. 5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna. 5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso all'evaporatore connesso col sistema di splittaggio e il terminale di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.). 5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 °C superiore a quella di esercizio (nota 6). Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna. Nota 6 — La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 °C alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato. 5.4.2. Scelta delle condizioni operative. 5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti: — temperatura della colonna: 260 °C ± 5 °C — temperatura dell'evaporatore: 280 °C — temperatura del rivelatore: 290 °C — velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno 30 + 50 cm/s — rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100 — sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima — sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV f.s. — velocità della carta: 30 + 60 cm/ora — quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 μl di soluzione di TMSE. Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti: — il tempo di ritenzione del β-sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti — il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto medio 3 %) 15 ± 5 % del fondo scala, per l'olio di soia (contenuto medio 20 %) 80 ± 10 % del fondo scala — si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario che i picchi oltre che separati siano anche completamente risolti cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima dell'uscita del picco successivo. È tuttavia tollerata anche una risoluzione incompleta a condizione però che sia quantificabile secondo la perpendicolare il picco a TRR 1,02. 5.4.3. Esecuzione dell'analisi. 5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 μl si preleva 1 μl di esano, si aspirano 0,5 μl di aria e successivamente 0,5 + 1 μl della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi. 5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli steroli presenti. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.4.1.2.). 5.4.4. Identificazione dei picchi. L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli steroli, analizzate nelle medesime condizioni. Gli steroli vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, brassicasterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo, stigmasterolo, Δ7-campesterolo, Δ5,23-stigmastadienolo, clerosterolo, β-sitosterolo, sitostanolo, Δ5 — -avenasterolo, Δ5,24-stigmastadienolo, Δ7-stigmastenolo, Δ7-avenasterolo. Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al sitosterolo per le colonne SE 52 e SE 54. Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli. 5.4.5. Valutazione quantitativa. 5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'α-colestanolo e degli steroli. Non vengono considerati i picchi di eventuali componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella I. Il coefficiente di risposta dell'α-colestanolo si deve intendere unitario. 5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza grassa, come segue: in cui: Ax = area del picco dello sterolo x ►M6 ————— ◄ ; As = area del picco dell'α-colestanolo ►M6 ————— ◄ ; ms = massa di α-colestanolo aggiunta, in milligrammi; m = massa del campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1 Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza grassa e, come steroli totali, la loro somma.

6.2 Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi degli steroli. in cui: Ax = Area del picco x, A = Sommatoria delle aree di tutti i picchi.









APPENDICE

Determinazione della velocità lineare dei gas

Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1 + 3 μl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometato in secondi.







Tabella I Tempi di ritenzione relativi degli steroli Picco Identificazione Tempo di ritenzione relativo Colonna SE 54 Colonna SE 52 1 colesterolo Δ-5-colesten-3β-olo 0,67 0,63 2 colestanolo 5α-colestan-3β-olo 0,68 0,64 3 brassicasterolo [24S]-24-metil-Δ-5,22-colestadien-3β-olo 0,73 0,71 4 24-metilencolesterolo 24-metilen-Δ-5,24-colestadien-3β-olo 0,82 0,80 5 campesterolo [24R]-24-metil-Δ-5-colesten-3β-olo 0,83 0,81 6 campestanolo [24R]-24-metil-colestan-3β-olo 0,85 0,82 7 stigmasterolo [24S]-24-etil-Δ-5,22-colestadien-3β-olo 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterolo [24R]-24-metil-Δ-7-colesten-3β-olo 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil-Δ-5,23-colestadien-3β-olo 0,95 0,95 10 clerosterolo [24S]-24-etil-Δ-5,25-colestadien-3β-olo 0,96 0,96 11 β-sitosterolo [24R]-24-etil-Δ-5-colesten-3β-olo 1,00 1,00 12 sitostanolo 24-etil-colestan-3β-olo 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-5-colesten-3β-olo 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil-Δ-5,24-colestadien-3β-olo 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenolo [24R,S]-24-etil-Δ-7-colesten-3β-olo 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-Δ-7-colesten-3β-olo 1,16 1,16

Figura 1

Gascromatogramma della frazione sterolica di un olio di oliva grezzo

Figura 2

Gascromatogramma della frazione sterolica di un olio di oliva raffinato









ALLEGATO VI

DETERMINAZIONE DELL'ERITRODIOLO E DELL'UVAOLO

PREMESSA

L'eritrodiolo (convenzionalmente inteso come l'insieme dei dioli eritrodiolo ed uvaolo) è un costituente dell'insaponificabile, caratteristico di alcune specie di sostanze grasse. La sua concentrazione risulta notevolmente più elevata negli oli di oliva di estrazione rispetto ad altri oli che lo contengono (oli di oliva di pressione, oli di vinaccioli) e pertanto la sua determinazione può servire per accertare la presenza di olio di oliva di estrazione.

1. OGGETTO

Il metodo descrive il procedimento per la determinazione dell'eritrodiolo nelle sostanze grasse.

2. PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa viene saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi si estrae l'insaponificabile con etere etilico e lo si purifica per passaggio su colonna di allumina.

Si procede al frazionamento dell'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile su placca di gel di silice e si isolano la banda della frazione sterolica e quella dell'eritrodiolo.

Gli steroli e l'eritrodiolo, recuperati dalla placca vengono trasformati in trimetilsilileteri, la miscela è quindi analizzata mediante gascromatografia.

Il risultato è espresso in percento di eritrodiolo rispetto all'insieme eritrodiolo + steroli.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Apparecchiature prescritte nel metodo all'allegato V (Determinazione del contenuto degli steroli).

4. REAGENTI

4.1. Reagenti prescritti nel metodo all'allegato V (determinazione del contenuto degli steroli).

4.2. Soluzione di riferimento di eritrodiolo, allo 0,5 % in cloroformio.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione dell'insaponificabile.

Si procede come descritto al paragrafo 5.1.2. del metodo all'allegato V.

5.2. Separazione dell'eritrodiolo e degli steroli.

5.2.1. Vedi paragrafo 5.2.1. del metodo all'allegato V.

5.2.2. Vedi paragrafo 5.2.2. del metodo all'allegato V.

5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % in cloroformio dell'insaponificabile. Con la microsiringa da 0,1 ml, si depositano su una placca cromatografica, a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. Ad una estremità della placca si depositano, come riferimento, alcuni microlitri delle soluzioni di colesterolo e di eritrodiolo.

5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto al paragrafo 5.2.1. La temperatura ambiente deve essere di circa 20 °C. Si chiude subito col coperchio e si eluisce fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda.

5.2.5. Si spruzza la placca uniformemente con la soluzione alcolica di 2′,7′ -diclorofluoresceina. Esaminando la placca alla luce ultravioletta si individuano le bande degli steroli e dell'eritrodiolo in base all'allineamento con i riferimenti, e si delimitano con una punta leggermente al di fuori dei margini di fluorescenza.

5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nelle aree delimitate. Il materiale asportato dalla placca viene riunito in bevuta da 50 ml; si aggiungono 15 ml di cloroformio caldo, si agita bene e si filtra sull'imbuto a setto poroso trasferendo il gel di silice sul filtro stesso. Si lava per tre volte con porzioni di 10 ml di cloroformio caldo per volta, raccogliendo il filtrato in palloncino da 100 ml. Si evapora fino ad un volume di 4-5 ml, si trasferisce in provetta da centrifuga a fondo conico da 10 ml previamente tarata, si porta a secco con blando riscaldamento in corrente di azoto e si pesa.

5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.

Si procede come descritto al paragrafo 5.3 del metodo all'allegato V.

5.4. Analisi gascromatografica. Si procede come descritto al paragrafo 5.4 del suddetto metodo. Le condizioni operative dell'analisi gascromatografica devono essere tali che, oltre a soddisfare i requisiti richiesti per l'analisi degli steroli, portino anche alla separazione dei TMSE dell'eritrodiolo e dell'uvaolo. Iniettato il campione si lascia svolgere la carta fino a che siano stati eluiti gli steroli presenti, l'eritrodiolo e l'uvaolo; si identificano quindi i picchi (l'eritrodiolo e l'uvaolo hanno tempi di ritenzione relativi, rispetto al β-sitosterolo, di circa 1,45 e 1,55 rispettivamente) e se ne calcolano le aree come detto per gli steroli.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

in cui:

A1 = area del picco dell'eritrodiolo ►M6 ————— ◄ ,

A2 = area del picco dell'uvaolo ►M6 ————— ◄ ,

Asteroli = somma delle aree degli steroli presenti ►M6 ————— ◄ .

Il risultato si esprime con una cifra decimale.

▼M21









ALLEGATO VII

DETERMINAZIONE DELLA PERCENTUALE DI 2 GLICERIL MONOPALMITATO

1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE

Il metodo descrive il procedimento analitico per la determinazione della percentuale di acido palmitico in posizione 2 nei trigliceridi mediante valutazione del 2-gliceril monopalmitato.

Esso si applica agli oli vegetali liquidi a temperatura ambiente (20 °C).

2. PRINCIPIO

Una volta preparato, il campione di olio è sottoposto all’azione della lipasi pancreatica: un’idrolisi parziale e specifica nelle posizioni 1 e 3 della molecola di trigliceride determina la comparsa dei monogliceridi in posizione 2. La percentuale di 2-gliceril monopalmitato nella frazione monogliceridica è determinata, previa sililazione, mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA E MATERIALE

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Beakers da 100, 250 e 300 ml.

3.3. Colonna di vetro per cromatografia, con diametro interno 21-23 mm e lunghezza 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto.

3.4. Provette tarate da 10, 50, 100 e 200 ml.

3.5. Matracci da 100 e 250 ml.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Provette da centrifuga a fondo conico da 10 ml con tappo smerigliato.

3.8. Centrifuga per provette da 10 e 100 ml.

3.9. Termostato in grado di mantenere una temperatura di 40 °C + 0,5 °C.

3.10. Pipette tarate da 1 e 2 ml.

3.11. Siringa ipodermica da 1 ml.

3.12. Microsiringa da 100 μl.

3.13. Imbuto da 1 000 ml.

3.14. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione «on column» a freddo per l’introduzione diretta del campione nella colonna e di stufa in grado di mantenere la temperatura desiderata con l’approssimazione di 1 °C.

3.15. Iniettore a freddo «on column» per introduzione diretta in colonna.

3.16. Rivelatore a ionizzazione di fiamma ed elettrometro.

3.17. Registratore-integratore adatto all’elettrometro, con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.18. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, ricoperta di metilpolisilossano o di fenilmetilpolisilossano al 5 %, di spessore compreso fra 0,10 e 0,30 μm, resistente a una temperatura di 370 °C.

3.19. Microsiringa da 10 μl con ago cementato lungo almeno 7,5 cm, per iniezione diretta in colonna.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparato nel modo seguente: mettere il gel di silice in una capsula di porcellana, essiccare nella stufa a 160 °C per 4 ore, quindi lasciar raffreddare a temperatura ambiente in essiccatore. Aggiungere un volume d’acqua equivalente al 5 % del peso del gel di silice, procedendo come segue: in una beuta da 500 ml pesare 152 g di gel di silice e aggiungere 8 g di acqua distillata, tappare e agitare delicatamente per ottenere una ripartizione uniforme dell’acqua. Lasciare a riposo per almeno 12 ore prima dell’uso.

4.2. n-esano per cromatografia.

4.3. Isopropanolo.

4.4. Isopropanolo in soluzione acquosa 1:1 (v/v).

4.5. Lipasi pancreatica avente un’attività compresa tra 2,0 e 10 unità di lipasi per mg (esistono in commercio lipasi pancreatiche con attività compresa tra 2 e 10 unità per mg di enzima).

4.6. Soluzione tampone di tris-idrossimetilamminometano: soluzione acquosa 1 M portata a pH 8 (controllare con il potenziometro) mediante aggiunta di acido cloridrico concentrato (1:1 v/v).

4.7. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa allo 0,1 % (la soluzione deve essere utilizzata entro i 15 giorni successivi alla preparazione).

4.8. Cloruro di calcio, soluzione acquosa al 22 %.

4.9. Etere etilico per cromatografia.

4.10. Solvente di sviluppo: miscela n-esano/etere etilico (87/13) (v/v).

4.11. Idrossido di sodio, soluzione al 12 % in peso.

4.12. Fenolftaleina, soluzione etanolica all’1 %.

4.13. Gas vettore: idrogeno o elio per gascromatografia.

4.14. Gas ausiliari: idrogeno (minimo 99 %), esente da umidità e sostanze organiche, e aria per gascromatografia della stessa purezza.

4.15. Reagente di silanizzazione: miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9/3/1 (v/v/v) (Esistono in commercio soluzioni pronte per l’uso. Possono essere utilizzati anche altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire con uno stesso volume di piridina anidra).

4.16. Campioni di riferimento: monogliceridi puri o miscele di monogliceridi a composizione percentuale nota, simile a quella del campione.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione del campione

5.1.1. Gli oli la cui acidità libera è inferiore al 3 % non devono essere neutralizzati prima della cromatografia su colonna di gel di silice. Gli oli la cui acidità libera è superiore al 3 % devono essere sottoposti a neutralizzazione secondo il procedimento descritto al punto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Versare nell’imbuto da 1 000 ml (3.13) 50 g di olio e 200 ml di n-esano. Aggiungere 100 ml di isopropanolo e una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % (4.11) corrispondente all’acidità libera dell’olio maggiorata del 5 %. Agitare energicamente per un minuto. Aggiungere 100 ml di acqua distillata, agitare nuovamente e lasciare a riposo. A decantazione avvenuta, eliminare lo strato inferiore contenente i saponi. Eliminare eventuali strati intermedi (mucillagine e sostanze insolubili). Lavare la soluzione esanica dell’olio neutralizzato con porzioni consecutive di 50-60 ml della soluzione di isopropanolo/acqua 1:1 (v/v) (4.4), fino alla scomparsa della colorazione rosea dovuta alla fenolftaleina. Eliminare la maggior parte dell’esano mediante distillazione sotto vuoto (utilizzando per esempio l’evaporatore rotante) e travasare l’olio in un matraccio da 100 ml (3.5). Essiccare l’olio sotto vuoto fino ad eliminazione completa del solvente. Ultimata questa operazione, l’acidità dell’olio deve risultare inferiore allo 0,5 %.

5.1.2. Introdurre nella beuta da 25 ml (3.1) 1,0 g di olio preparato nel modo sopra indicato e scioglierlo in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Lasciare a riposo la soluzione per almeno 15 minuti prima di procedere alla cromatografia su colonna di gel di silice. Se la soluzione è torbida, centrifugarla per garantire condizioni ottimali per la cromatografia. (Si possono utilizzare cartucce di gel di silice SPE da 500 mg pronte per l’uso).

5.1.3. Preparazione della colonna cromatografica Versare nella colonna (3.3) circa 30 ml di solvente di sviluppo (4.10); introdurre un batuffolo di cotone nella parte inferiore della colonna con l’ausilio di una bacchetta di vetro; comprimere per far uscire l’aria. Preparare in un beaker una sospensione di 25 g di gel di silice (4.1) in circa 80 ml di solvente di sviluppo e versarla nella colonna attraverso un imbuto. Verificare che tutto il gel di silice sia stato immesso nella colonna; lavare con solvente di sviluppo (4.8), aprire il rubinetto e lasciar fluire il liquido fino a circa 2 mm sopra il livello superiore del gel di silice.

5.1.4. Cromatografia su colonna Nella beuta da 25 ml (3.1.) pesare esattamente 1,0 g di campione preparato secondo il procedimento descritto al punto 5.1. Sciogliere il campione in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Versare la soluzione nella colonna cromatografica preparata nel modo indicato al punto 5.1.3. Evitare di agitare la superficie della colonna. Aprire il rubinetto e lasciar fluire la soluzione campione fino al livello del gel di silice. Sviluppare con 150 ml di solvente di sviluppo. Regolare il flusso a 2 ml/min (in modo che i 150 ml passino attraverso la colonna in 60-70 minuti circa). Recuperare l’eluato in un matraccio da 250 ml previamente tarato. Far evaporare il solvente sotto vuoto ed eliminarne le ultime tracce con una corrente di azoto. Pesare il matraccio e calcolare l’estratto raccolto. [Se si utilizzano cartucce di silice SPE pronte per l’uso, procedere come segue: introdurre 1 ml di soluzione (5.1.2) nelle cartucce previamente preparate con 3 ml di n-esano. Una volta percolata la soluzione, sviluppare con 4 ml di n-esano/etere etilico 9:1 (v/v). Recuperare l’eluato in una provetta da 10 ml e sottoporlo a evaporazione in corrente di azoto fino a essiccazione completa. Sottoporre il residuo secco all’azione della lipasi pancreatica (5.2). È essenziale che la composizione in acidi grassi sia verificata prima e dopo passaggio su cartuccia SPE].

5.2. Idrolisi con lipasi pancreatica

5.2.1. Pesare nella provetta della centrifuga 0,1 g di olio preparato nel modo descritto al punto 5.1. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone (4.6), 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (4.7) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio, agitando bene dopo ogni aggiunta. Chiudere la provetta con il tappo smerigliato e inserirla nel termostato a 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Aggiungere 20 mg di lipasi, agitare accuratamente (evitando di bagnare il tappo), mettere la provetta nel termostato per esattamente 2 minuti, quindi ritirarla, agitare vigorosamente per esattamente 1 minuto e lasciar raffreddare.

5.2.3. Aggiungere 1 ml di etere etilico, tappare e agitare vigorosamente, quindi centrifugare e travasare la soluzione in una provetta pulita e asciutta con la microsiringa.

5.3. Preparazione dei derivati silanizzati e della gascromatografia

5.3.1. Introdurre con la microsiringa 100 μl di soluzione (5.2.3) in una provetta da 10 ml a fondo conico.

5.3.2. Eliminare il solvente con una leggera corrente di azoto, aggiungere 200 μl di reagente di silanizzazione (4.15), tappare la provetta e lasciare a riposo per 20 minuti.

5.3.3. Dopo 20 minuti, aggiungere da 1 a 5 ml di n-esano (in funzione delle condizioni cromatografiche): la soluzione così ottenuta è pronta per la gascromatografia.

5.4. Gascromatografia

Le condizioni operative sono le seguenti:

— temperatura dell’iniettore (iniettore «on column») inferiore alla temperatura di ebollizione del solvente (68 °C),

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— temperatura della colonna: temperatura della stufa programmata a 60 °C per 1 minuto, quindi incrementata di 15 °C al minuto fino a 180 °C, poi di 5 °C al minuto fino a 340 °C e mantenuta a 340 °C per 13 minuti,

— gas vettore: idrogeno o elio regolato alla velocità lineare adeguata per ottenere la risoluzione rappresentata nella figura 1; il tempo di ritenzione del trigliceride C54 deve essere di 40 + 5 minuti (cfr. figura 2). (Le condizioni operative sopra indicate sono proposte a titolo indicativo. L’operatore provvederà ad ottimizzarle per ottenere la risoluzione desiderata. Il picco corrispondente al 2-gliceril monopalmitato deve avere un’altezza minima pari al 10 % della scala del registratore.),

— quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 μl della soluzione (5 ml) di n-esano (5.3.3).

5.4.1. Identificazione dei picchi

I singoli monogliceridi sono identificati in base ai tempi di ritenzione, in confronto a quelli ottenuti con miscele standard di monogliceridi analizzate nelle medesime condizioni.

5.4.2. Valutazione quantitativa

L’area dei picchi è calcolata mediante un integratore elettronico.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La percentuale di 2-gliceril monopalmitato è calcolata in base al rapporto tra l’area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi di tutti i monogliceridi (cfr. figura 2), applicando la seguente formula:

gliceril monopalmitato (%):

in cui:

Ax = area del picco corrispondente al gliceril monopalmitato

ΣA = somma delle aree di tutti i picchi dei monogliceridi.

Il risultato si esprime con una cifra decimale.

7. RAPPORTO DI ANALISI

Il rapporto di analisi deve recare:

— il riferimento al metodo descritto,

— ogni indicazione utile per la completa identificazione del campione,

— il risultato dell’analisi,

— ogni deviazione dal metodo indicato, sia essa dovuta ad una decisione delle parti interessate o a qualsiasi altro motivo,

— gli estremi per l’identificazione del laboratorio, la data dell’analisi e la firma dei responsabili.

Figura 1

Cromatogramma dei prodotti della reazione di silanizzazione ottenuti dall’azione della lipasi su un olio d’oliva raffinato addizionato del 20 % di olio esterificato (100 %).

Legenda: «acides gras libres» = acidi grassi liberi; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = olio d’oliva raffinato + 20 % olio esterificato; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleina; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturi

Figura 2

Cromatogramma di:

(A) olio d’oliva non esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

Cromatogramma di:

(B) olio esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

8. NOTE

PREPARAZIONE DELLA LIPASI

Esistono in commercio lipasi con attività soddisfacente. Si possono anche preparare in laboratorio con il seguente procedimento.

Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 °C. Rimuovere il grasso solido e il tessuto connettivo circostanti e triturare in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Agitare questa pasta per 4-6 ore con 2,5 l di acetone anidro e centrifugare. Estrarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela 1:1 (v/v) di acetone e di etere etilico e due volte con etere etilico.

Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero al riparo dall’umidità.

CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ LIPASICA

Preparare un’emulsione di olio d’oliva nel modo seguente:

Agitare per 10 minuti in un mescolatore una miscela di 165 ml di soluzione di gomma arabica a 100g/l, 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio d’oliva neutralizzato.

In un beaker da 50 ml versare 10 ml di questa emulsione, quindi 0,3 ml di soluzione di colato di sodio a 0,2 g/ml e 20 ml di acqua distillata.

Mettere il beaker in un termostato regolato a 37 °C; introdurre gli elettrodi del pHmetro e l’agitatore ad elica.

Mediante una buretta aggiungere goccia a goccia una soluzione di idrossido di sodio 0,1 N fino ad ottenere un pH 8,3.

Aggiungere un volume di soluzione acquosa di polvere di lipasi (0,1 g/ml di lipasi). Non appena il pHmetro indica un pH 8,3, avviare il cronometro e aggiungere goccia a goccia la soluzione di idrossido di sodio in modo da mantenere il pH a 8,3. Annotare il volume di soluzione consumato ogni minuto.

Riportare i dati in un diagramma indicando le letture di tempo nelle ascisse e i millilitri di soluzione alcalina 0,1 N consumati per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un grafico lineare.

L’attività della lipasi, misurata in unità di lipasi per mg, è data dalla formula seguente:

in cui:

A è l’attività in unità di lipasi/mg

V è il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N/min, desunto dal diagramma

N è la normalità della soluzione di idrossido di sodio

m è la massa in mg della lipasi utilizzata per la prova.

L’unità di lipasi è definita come la quantità di enzima che libera 10 microequivalenti di acido al minuto.

▼M20 —————

▼B









ALLEGATO IX

ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL'ULTRAVIOLETTO

PREMESSA

L'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto può fornire indicazioni sulla qualità di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte da processi tecnologici.

Gli assorbimenti alle lunghezze d'onda previste nel metodo sono dovuti alla presenza di sistemi dienici e trienici coniugati. I valori di tali assorbimenti sono espressi come estinzione specifica E 1 % 1 cm (estinzione di una soluzione della sostanza grassa all'1 % nel solvente prescritto, in spessore di 1 cm) convenzionalmente indicata con K, (detto anche coefficiente di estinzione).

1. OGGETTO

Il metodo descrive il procedimento per l'esecuzione dell'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto delle sostanze grasse.

2. PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene disciolta nel solvente richiesto, quindi si determina l'estinzione della soluzione alle lunghezze d'onda prescritte, in riferimento al solvente puro. Dalle letture spettrofotometriche si calcolano le estinzioni specifiche.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Spettrofotometro per misure di estinzione nell'ultravioletto fra 220 e 360 nm, con possibilità di lettura per ogni unità nanometrica.

3.2. Vaschette di quarzo prismatiche, con coperchio, di percorso ottico da 1 cm. Le vaschette, riempite di acqua o altro solvente idoneo, non devono presentare fra di loro differenze superiori a 0,01 unità di estinzione.

3.3. Matracci tarati da 25 ml.

▼M6

3.4. Colonna per cromatografia con una parte superiore avente lunghezza di 270 mm e diametro di 35 mm e una parte inferiore avente lunghezza di 270 mm e diametro di 10 mm.

▼B

4. REAGENTI

4.1. Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 60 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm; oppure — Cicloesano spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 40 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm. oppure ▼M6 ————— ▼B

4.2. Allumina basica per cromatografia su colonna, preparata e controllata come descritto in Appendice I.

4.3. n-Esano, per cromatografia.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Il campione in esame deve essere perfettamente omogeneo ed esente da impurezze sospese. Gli oli liquidi a temperatura ambiente si filtrano su carta alla temperatura di circa 30 °C, i grassi concreti vengono omogeneizzati e filtrati a temperatura superiore di non oltre 10 °C alla temperatura di fusione.

5.2. Del campione così preparato si pesano esattamente circa 0,25 g in matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida. Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente su carta.

5.3. Con la soluzione ottenuta si riempie una vaschetta e si misurano le estinzioni, usando come riferimento il solvente impiegato, alle lunghezze d'onda significative comprese fra 232 e 276 nm. I valori di estinzione letti devono essere compresi nell'intervallo 0,1 ± 0,8; in caso contrario è necessario ripetere le misure operando con soluzioni opportunamente più concentrate o più diluite.

5.4. Qualora sia richiesta la determinazione dell'estinzione specifica dopo passaggio su allumina si procede nel seguente modo: nella colonna cromatografica si introducono 30 g di allumina basica in sospensione in esano; dopo assestamento dell'adsorbente si elimina l'eccesso di esano, sino ad 1 cm circa al disopra del livello superiore dell'allumina. Si sciolgono 10 g di sostanza grassa, omogeneizzata e filtrata come descritto in 5.1., in 100 ml di esano e si versa tale soluzione in colonna. Si raccoglie l'eluato e si evapora totalmente il solvente sotto vuoto ad una temperatura inferiore ai 25 °C. Sulla sostanza grassa così ottenuta si procede immediatamente come detto in 5.2.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie lunghezze d'onda calcolate come segue: in cui: Kλ = estinzione specifica alla lunghezza d'onda λ, Eλ = estinzione misurata alla lunghezza d'onda λ, c = concentrazione della soluzione in g/100 ml, s = spessore della vaschetta in cm. I risultati si esprimono con due cifre decimali.

6.2. L'esame spettrofotometrico dell'olio di oliva secondo il metodo ufficiale dei Regolamenti della CEE prevede la determinazione dell'estinzione specifica, in soluzione in isoottano, alle lunghezze d'onda di 232 e 270 nm e la determinazione del Δ K inteso come: in cui Km è l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda m, lunghezza d'onda di massimo assorbimento intorno a 270 nm.









APPENDICE I

Preparazione dell'allumina e controllo dell'attività

A1.1. Preparazione dell'allumina

In un recipiente a chiusura ermetica si pone l'allumina preventivamente essiccata in forno a 380-400 °C per 3 ore, si aggiunge acqua distillata in ragione di 5 ml per 100 g di allumina, si chiude subito il recipiente, si agita ripetutamente, quindi si lascia a riposo per almeno 12 ore prima dell'uso.

A1.2. Controllo dell'attività dell'allumina

Si prepara una colonna cromatografica con 30 g di allumina. Operando come descritto al paragrafo 5.4. si fa passare attraverso la colonna una miscela costituita da:

— 95 % olio di oliva vergine, avente estinzione specifica a 268 nm inferiore a 0,18;

— 5 % olio di arachide trattato con terre nel processo di raffinazione, avente estinzione specifica a 268 nm uguale o superiore a 4.

Se la miscela dopo passaggio in colonna presenta estinzione specifica a 268 nm superiore a 0,11 l'allumina è accettabile, altrimenti deve essere aumentato il tasso di idratazione.









APPENDICE II

Taratura dello spettrofotometro

A2. L'apparecchio deve essere controllato periodicamente (almeno ogni 6 mesi) sia per la rispondenza della lunghezza d'onda che per l'esattezza della risposta. A2.1. Il controllo della lunghezza d'onda può essere fatto mediante la lampada a vapori di mercurio o mediante gli appositi filtri. A2.2. Per il controllo della risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore si procede come segue: si pesano 0,2000 g di potassio cromato puro per spettrofotometria e si sciolgono, in matraccio tarato da 1 000 ml, in soluzione di idrossido di potassio 0,05 N diluendo poi a volume. Della soluzione ottenuta si prelevano 25 ml esatti, si trasferiscono in matraccio tarato da 500 ml e si diluisce ulteriormente a volume con la stessa soluzione di idrossido di potassio. Della soluzione così ottenuta si misura l'estinzione a 275 nm, impiegando la soluzione di idrossido di potassio come riferimento. L'estinzione misurata con vaschetta da 1 cm dovrà essere 0,200 ± 0,005.









ALLEGATO X A

ANALISI GASCROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI

1. OGGETTO

Il presente metodo dà un orientamento generale per l'applicazione della gascromatografia, con l'uso di colonne a riempimento o capillari, per determinare la composizione qualitativa e quantitativa di una miscela di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta in conformità con il metodo specificato nell'allegato X B.

Il metodo non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.

2. REAGENTI

2.1. Gas vettore Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.) completamente essiccato ed avente un tenore di ossigeno inferiore a 10 mg/kg. Nota 1: L'idrogeno, che viene usato come gas vettore soltanto con colonne capillari, può raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è pericoloso; sono disponibili dispositivi di sicurezza.

2.2. Gas ausiliari 2.2.1. Idrogeno (purezza ≥ 99,9 %), esente da impurezze organiche. 2.2.2. Aria od ossigeno, esente da impurezze organiche.

2.3. Standard di riferimento Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un grasso a composizione nota, di preferenza analogo a quello della sostanza grassa da analizzare. Sarà necessario l'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi.

3. APPARECCHIATURA

Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchiatura per gascromatografia, facendo uso di colonne a riempimento e/o capillari nonché di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. È consigliabile usare apparecchiatura in grado di garantire l'efficienza e la risoluzione specificate al punto 4.1.2.

3.1. Gascromatografo

Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.

3.1.1. Sistema ad iniezione

Usare un sistema ad iniezione:

a) con colonne a riempimento, aventi lo spazio morto minore possibile (in questo caso il sistema di iniezione deve poter essere riscaldato a una temperatura di 20-50 °C superiore a quella della colonna) oppure

b) con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve essere appositamente progettato. Esso può essere del tipo a separazione oppure del tipo non a separazione sull'iniettore della colonna.

Nota 2:

In assenza di acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio, può essere usato un iniettore ad ago mobile.

3.1.2. Stufa

La stufa deve essere atta a scaldare la colonna ad almeno 260 °C e a mantenere la temperatura desiderata con l'approssimazione di 1 °C per la colonna a riempimento e con l'approssimazione di 0,1 °C per la colonna capillare.

Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una provetta di silice fusa.

Il ricorso al riscaldamento programmato è raccomandato in tutti i casi e in particolare per gli acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio.

3.1.3. Colonna e riempimento

3.1.3.1. Colonna costruita in materiale inerte alle sostanze da analizzare (cioè vetro o acciaio inossidabile) e avente le seguenti dimensioni: a) lunghezza: 1-3 m. Se sono presenti acidi grassi a catena lunga (oltre C20) dovrà essere usata una colonna relativamente corta. Se invece si analizzano acidi a 4-6 atomi di carbonio, si raccomanda di usare una colonna avente una lugnhezza di 2 m. b) diametro interno: da 2 a 4 mm. Nota 3: Se sono presenti componenti poliinsaturi aventi più di tre legami doppi, essi potranno essere decomposti in una colonna di acciaio inossidabile. Nota 4: Può essere usato un sistema di colonne a riempimento gemelle.

3.1.3.2. Riempimento, comprendente i seguenti elementi: a) supporto: terra di diatomee lavata con acido e silanizzata, oppure altro idoneo supporto inerte con una gamma ristretta di granulometria (compresa tra 125 e 200 μm, con variazioni di ± 25 μm); la granulometria media è correlata al diametro interno e alla lunghezza della colonna; b) fase stazionaria: tipo di poliestere di liquido polare (ad es. polisuccinato di dietilenglicole, polisuccinato di butandiolo, poliadipato di etilenglicole ecc.), cianosiliconi o qualsiasi altro liquido che consenta la separazione cromatografica richiesta (vedi clausola 5). La fase stazionaria deve essere compresa tra il 5 % (m/m) e il 20 % (m/m) del riempimento. Per alcune separazioni può essere usata una fase stazionaria non polare.

3.1.3.3. Condizionamento della colonna Con la colonna staccata, dalla parte del rivelatore, scaldare gradualmente la stufa a 185 °C e far passare una corrente di gas inerte attraverso la colonna di recente preparata ad un flusso compreso tra 20 ml/min e 60 ml/min per almeno 16 h a questa temperatura e per ulteriori 2 h a 195 °C.

3.1.4. Colonna capillare

3.1.4.1. Tubo costituito di materiale inerte alle sostanze da analizzare (di solito vetro o silice fusa). Il diametro interno deve essere compreso tra 0,2 mm e 0,8 mm. La superficie interna deve esser sottoposta a un opportuno trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima di essere ricoperto con la fase stazionaria. Nella maggior parte dei casi è sufficiente una lunghezza di 25 mm.

3.1.4.2. Fase stazionaria, di solito del tipo poliglicole [poli(etilenglicole) 20 000], poliestere (polisuccinato di butandiolo) oppure polisilossano polare (cianosiliconi). Sono adatte le colonne legate (cross-linked). Nota 5: Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'identificazione e separazione dell'acido linolenico e degli acidi a C20. Le coperture devono essere sottili, ad esempio 0,1 μm-0,2 μm.

3.1.4.3. Montaggio e condizionamento della colonna Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle colonne capillari, ovvero sistemazione della colonna nella stufa (supporto), scelta e collegamento di giunti (a tenuta stagna), sistemazione delle estremità della colonna nell'iniettore e nel rivelatore (riduzione degli spazi morti). Sottoporre la colonna ad un flusso di gas vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna avente una lunghezza di 25 mm e un diametro interno di 0,3 mm]. Condizi