1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B TERZADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del27aprile 1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolli deglialimenti perglianimali
(72/199/CEE)
(GU L 123 del 29.5.1972, pag. 6)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva 81/680/CEE della Commissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Direttiva 84/4/CEE della Commissione del 20 dicembre 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Direttiva 93/28/CEE della Commissione del 4 giugno 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Direttiva 98/54/CE della Commissione del 16 luglio 1998 L 208 49 24.7.1998
►M5Direttiva 1999/79/CE della Commissione del 27 luglio 1999 L 209 23 7.8.1999
Rettificata da:
►C1Rettifica, GU L 320 del 27.11.1980, pag. 43 (72/199/CEE)
▼B
TERZADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del27aprile1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolli deglialimenti
perglianimali
(72/199/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
vista la direttiva del Consiglio, del 20 luglio 1970, concernente l'intro-
duzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisicomunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali (
1),
inparticolare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali, destinati a constatare l'osservanza delle
condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per gli animali, siano effettuati secondo i modi di preleva-mento di campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive n. 71/250/CEE e n. 71/393/CEE della
Commissione, del 15 giugno 1971 (
2) e del 18 novembre 1971(3),
hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari;che, tenuto conto dello stato d'avanzamento dei lavori sin qui effettuati,è necessario adottare una terza serie di metodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del Comitato permanente per gli alimenti per gli
animali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il loro contenuto in amido,
proteine gregge, proteine gregge solubilizzabili con la pepsina ed acidocloridrico ed ingossipolo libero e totale e per quan to riguarda l'attivitàdella pepsina, siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato Idella presente direttiva.
Articolo 2
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali ►M4 ◄per quanto riguarda il
contenuto degli alimenti in ►M4 ◄tilosina e virginia-
micina, siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato II dellapresente direttiva.
Articolo 3
Gli Stati membri curano l'entrata in vigore, al più tardi il 1oluglio
1973, delle disposizioni legislative, regolamentari o amministrativenecessarie per uniformarsi alle disposizioni della presente direttiva ene informano immediatamente la Commissione.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2.
(2) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(3) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Articolo 4
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 3
▼B
ALLEGATO I
1.DETERMINAZIONEDELL'AMIDO
METODO POLARIMETRICO
1.Finalità ecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto in amido ed in prodotti di
degradazione dell'amido ad alto peso molecolare negli alimenti per animali,
al fine di controllarne la conformità alla direttiva 86/174/CEE e alla direttiva
96/25/CE.
2.Principio
Il metodo comprende una doppia determinazione. Nella prima, il campione è
trattato a caldo con acido cloridrico diluito. Dopo chiarificazione e filtrazione
si misura per polarimetria il potere rotatorio della soluzione.
Nella seconda, il campione viene estratto con etanolo al 40 %. Dopo acidifi-
cazione del filtrato con acido cloridrico, defecazione e filtrazione, si misura il
potere rotatorio come nella prima determinazione.
La differenza tra le due misure, moltiplicata per un fattore noto, fornisce il
contenuto in amido del campione.
3.Reattivi
3.1. Acido cloridrico al 25 % (m/m), d: 1,1263.2. Acido cloridrico all' 1,128 % (m/v)
La concentrazione deve essere verificata per titolazione mediante una
soluzione di idrossido di sodio 0,1 N in presenza di rosso di metile allo
0,1 % (m/v) inetan olo al 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml di NaOH 0,1 N.
3.3. Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco
ZnCH
3COO ðÞ2:2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml
conacqua.
3.4. Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di
potassio K 4ðFe CNðÞ6/C2/C3
:3H2O:Portare a 100 ml conacqua.
3.5. Etanolo al 40 % (v/v), d: 0,948 a 20 ºC.
4.Apparecchiatura
4.1. Beuta da 250 ml a cono normalizzato, con refrigerante a ricadere.4.2. Polarimetro o saccarimetro
5.Mododioperare
5.1.Preparazione del campione
Macinare il campione in modo che passi tutto attraverso un setaccio a
maglie rotonde di 0,5 mm di diametro.
5.2.Determinazione del potere rotatorio totale (P o S)(cfr. osservazione
7.1)
Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2,5 g del campione macinato e
introdurli in un pallone tarato da 100 ml. Aggiungere 25 ml di acido
cloridrico (3.2), agitare per ottenere una buona ripartizione della
sostanza e aggiungere altri 25 ml di acido cloridrico (3.2). Immergere
il pallone in bagnomaria bollente, agitando energicamente e regolar-
mente per i primi tre minuti allo scopo di evitare la formazione di
grumi. La quantità d'acqua del bagnomaria deve essere sufficiente per
mantenere l'ebollizione quando vi è immerso il pallone. Quest'ultimo
non può essere tolto dal bagnomaria durante l'agitazione. Dopo 15
minuti esatti togliere il pallone dal bagnomaria, aggiungere 30 ml
d'acqua fredda e raffreddare immediatamente sino a 20 ºC.
Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I (3.3) e agitare per un minuto.
Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II (3.4) e agitare nuova-
mente per un minuto. Portare a volume con acqua, mescolare e filtrare.
Se il filtrato non è perfettamente limpido (caso poco frequente) ripetere1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
la determinazione usando una maggiore quantità di soluzione di Carrez I
e II, per esempio 10 ml.
Misurare quindi il potere rotatorio della soluzione, in tubo da 200 mm,
conunpolarimetro od unsaccarimetro.
5.3.Determinazione del potere rotatorio (P ′oS ′)delle sostanze solubili
nell'etanolo al 40 %
Pesare 5 g del campione con l'approssimazione di 1 mg, introdurli in un
pallone tarato da 100 ml e aggiungere circa 80 ml di etanolo (3.5) (cfr.
osservazione 7.2). Lasciar riposare il pallone per un'ora a temperatura
ambiente, agitando energicamente sei volte in modo che la sostanza sia
benmescolata conl'etan olo. Portare quin di a volume conetan olo (3.5),mescolare e filtrare. Pipettare 50 ml del filtrato (= 2,5 g del campione)
inunbeuta da 250 ml, aggiun gere 2,1 ml di acido cloridrico (3.1) e
agitare energicamente. Applicare un refrigerante a ricadere sulla beuta
e immergerla in bagnomaria bollente. Dopo 15 minuti esatti ritirare la
beuta dal bagno, travasarne il contenuto in un pallone tarato da 100 ml,
lavando con un poco di acqua fredda, e raffreddare sino a 20 ºC. Chia-
rificare quindi con le soluzioni di Carrez I (3.3) e II (3.4), portare a
volume conacqua, mescolare, filtrare e misurare il potere rotatorio
come indicato in 5.2, secondo e terzo capoverso.
6.Calcolodeirisultati
Il contenuto in amido per cento di campione è calcolato come segue:
6.1.Misurazioni effettuate con il polarimetro
Percentuale in amido ¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = potere rotatorio totale ingradi d'arco
P′= potere rotatorio in gradi d'arco delle sostanze solubili nell'eta-
nolo
α½/C13820º
D= potere rotatorio specifico dell'amido puro. Per questo fattore
sono accettati convenzionalmente i seguenti valori:
+ 185,90: amido di riso
+ 185,40: amido di patata
+ 184,60: amido di granoturco
+ 182,70: amido di frumento
+ 181,50: amido d'orzo
+ 181,30: amido d'avena
+ 184,00: altri tipi di amido, nonché miscele di amidi degli
alimenti composti
6.2.Misurazioni effettuate con il saccarimetro
Percentuale in amido ¼2000
α½/C13820º
D/C22N/C20;665 ðÞ /C2 S-S0ðÞ
100-26;6N/C2S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = potere rotatorio totale ingradi saccarimetrici
S′= potere rotatorio ingradi saccarimetrici delle sostan ze solubili
nell'etanolo
N = peso ing di saccarosio in100 ml di acqua che sotto lo spes-
sore di 200 mm dà unpotere rotatorio di 100 saccarimetrici
16,29 g per i saccarimetri francesi
26,00 g per i saccarimetri tedeschi
20,00 g per i saccarimetri misti
α½/C13820º
D= potere rotatorio specifico dell'amido puro (cfr. 6.1)
6.3.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo
sullo stesso campione non deve superare 0,4 in valore assoluto per i
contenuti in amido inferiori al 40 % ed 1,1 % in valore relativo per i
contenuti in amido uguali o superiori al 40 %.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
7.Osservazioni
7.1. Se il campione contiene più del 6 % di carbonati, espressi come carbo-
nato di calcio, prima di determinare il potere rotatorio totale essi vanno
distrutti per trattamento con la quantità esattamente necessaria di acido
solforico.
7.2. Nel caso di prodotti ad alto contenuto in lattosio, quali il siero di latte in
polvere o il latte scremato inpolvere, dopo aver aggiun to gli 80 ml di
etanolo (3.5) procedere come segue. Adattare sul pallone un refrigerante
a ricadere, immergere il pallone per 30 minuti in bagnomaria a 50 ºC,
poi lasciar raffreddare e proseguire come indicato sotto 5.3.
7.3. Quando la determinazione del contenuto in amido viene effettuata col
metodo polarimetrico, le materie prime appresso elencate, se presenti
negli alimenti per animali in quantità significative, possono dar luogo
ad interferenze capaci di condurre a risultati inesatti:
— prodotti della barbabietola (da zucchero), come polpa di barbabietola
(da zucchero), melasse di barbabietola (da zucchero), polpa di barba-
bietola (da zucchero) melassata, borlanda di barbabietola (da
zucchero), zucchero di barbabietola;
— pastazzo di agrumi;— semi di lino, panello di lino, farina di estrazione di lino;— seme di colza, panello di colza, farina di estrazione di colza,
corteccia di colza;
— semi di girasole, farina di estrazione di girasole, farina di estrazione
di girasole, parzialmente decorticato;
— panello di copra, farina di estrazione di copra;— polpa di patate;— lievito disidratato;— prodotti ricchi di inulina (ad esempio fettucce e farina di topi-
nambur);
— ciccioli.
2.DETERMINAZIONEDELLEPROTEINEGREGGE
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto in proteine gregge dei
mangimi a partire dal contenuto in azoto, dosato secondo Kjeldahl.
2.Principio
Il campione viene digerito in acido solforico in presenza di un catalizzatore.
La soluzione acida viene alcalinizzata cjon una soluzione d'idrossido di
sodio. L'ammoniaca liberatasi viene isolata per distillazione e viene raccolta
in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con
una soluzione standard d'idrossido di sodio.
3.Reattivi
3.1 Sulfato di potassio
3.2 Catalizzatore: ossido rameico CuO p.a., o solfato di rame (II) pentai-
drato, CuSO
4·5H2O
3.3 Zinco in granelli
3.4 Acido solforico ρ20= 1.84 g/ml
3.5 Acido solforico c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Acido solforico c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Indicatore al rosso di metile: sciogliere mg 300 di rosso di metile in
ml 100 di etanolo, σ= 95-96 % (v/v)
3.8 Soluzione d'idrossido di sodio (è possibile usare quello di purezza
tecnica), β= 40 g/100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Soluzione d'idrossido di sodio c = 0,25 mol/l
3.10 Soluzione d'idrossido di sodio c = 0,1 mol/l
3.11 Pietra pomice in granelli, lavata con acido cloridrico e calcinata3.12 Acetanilide (p.m. = 114 ºC, N = 10,36 %)1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
3.13 Saccarosio (esente da azoto)
4.Apparecchiatura
Apparecchi di mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo
di Kjeldahl
5.Metododioperare
5.1Mineralizzazione
Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel
pallone dell'apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere g 15 di solfato
di potassio (3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (3.2) [da g 0,3
a g 0,4 di ossido rameico, oppure da g 0,9 a g 1,2 di solfato di rame (II)
pentaidrato], ml 25 di acido solforico (3.4) e qualche granello di pietra
pomice (3.11). Mescolare. Riscaldare il pallone prima moderatamente,
agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione dellamassa ed a scomparsa della schiuma; quindi più intensamente sino a
ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l'acido
bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si
surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano. Quando la solu-
zione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l'ebollizione
ancora per due ore. Lasciar quindi raffreddare.
5.2Distillazione
Aggiungere con precauzione un quantitativo d'acqua sufficiente a scio-
gliere completamente i solfati; lasciar raffreddare. Aggiungere quindi
qualche granello di zinco (3.3).
Introdurre nel matraccio collettore dell'apparecchio di distillazione ml 25
esattamente misurati di acido solforico (3.5) oppure (3.6) a seconda del
contenuto di azoto che si presume e qualche goccia di indicatore al rosso
di metile (3.7).
Collocare il pallone al condensatore dell'apparecchio di distillazione ed
immergere l'estremità di quest'ultimo per almeno cm 1 nel liquido del
matraccio collettore (cfr. osservazione 8.3). Versare lentamente nel
pallone ml 100 di soluzione di idrossido di sodio (3.8) senza perdita di
ammoniaca (cfr. osservazione 8.1).
Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell'ammoniaca.
5.3Titolazione
Titolare nel matraccio collettore l'eccesso di acido solforico per mezzo di
una soluzione di idrossido di sodio (3.9) o (3.10), secondo la concentra-
zione dell'acido solforico utilizzato, sino a raggiungimento del punto
finale.
5.4Prova in bianco
Per controllare se i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in
bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) usando g 1 di sacca-
rosio (3.13) invece del campione.
6.Calcolodeirisultati
Calcolare il tenore di proteine gregge con la formula seguente:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
dove:
V0= volume di NaOH (3.9 o 3.10) usato nella prova in bianco
V1= volume (ml) di NaOH (3.9 o 3.10) usato nella titolazione del
campione
c = concentrazione (mol/l) di idrossido di sodio (3.9 o 3.10)m = massa (g) del campione1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
7.Verifica delmetodo
7.1Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate
sullo stesso campione non deve oltrepassare:
— 0,2 % in valore assoluto, per contenuti in proteine gregge inferiore al
20 %
— 1,0 % sul risultato più elevato, contenuti compresi tra 20 e 40 %— 0,4 % in valore assoluto, per contenuti superiori al 40 %.
7.2Accuratezza
Eseguire l'analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su 1,5 —
2,0 g di acetanilide (3.12) in presenza di g 1 di saccarosio (3.13): g 1 di
acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico (3.5). Il recupero deve
essere di almeno il 99 %.
8.Osservazioni
8.1 Gli apparecchi possono essere del tipo manuale, semiautomatico od auto-
matico. Se un apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione
e distillazione, in questo caso il travasamento deve essere effettuato
senza perdite. Se il pallone dell'apparecchio di distillazione non è prov-
visto di un imbuto separatore, aggiungere la soluzione d'idrossido di
sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante,
lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti.
8.2 Se il prodotto mineralizzato si solidifica, ricominciare la determinazione
usando un quantitativo di acido solforico (3.4) superiore a quello specifi-
cato inpreceden za.
8.3 Per i prodotti poveri di sostanze azotate, il volume di acido solforico
(3.6) da introdurre nel matraccio può essere ridotto, se necessario, a
ml 10 o 15 e portato a ml 25 conacqua.
3DETERMINAZIONE DELLE PROTEINE GREGGE SOLUBILIZZA-
BILICONLAPEPSINAEDACIDOCLORIDRICO
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare la frazione delle proteine gregge solubiliz-
zabili con la pepsina ed acido cloridrico in condizioni determinate. Esso è
applicabile a tutti gli alimenti.
2.Principio
Il campione è sottoposto ad un trattamento con una soluzione cloridrica di
pepsina per 48 ore a 40º C. La sospensione viene filtrata e il contenuto in
azoto del filtrato viene determinato secondo il metodo descritto per la deter-
minazione delle proteine gregge.
3.Reattivi
3.1 Acido cloridrico, d: 1,1253.2 Acido cloridrico 0,075 N
3.3 Pepsina a 2,0 U/mg. Questa attività è definita e dev'essere controllata
secondo il metodo che forma oggetto della parte 4 del presente allegato.
3.4 Soluzione allo 0,02 % circa (p/v) di pepsina nell'acido cloridrico (3.2),
preparata di recente
3.5 Emulsione antischiuma (per esempio, silicone)3.6 Tutti i reattivi indicati nel punto 3 del metodo per la determinazione
delle proteine gregge.
4.Apparecchiatura
4.1 Bagno d'acqua o stufa di incubazione, regolata a 40º C ± 1º C4.2 Apparecchi di mineralizzazione e di distillazione secondo Kjeldahl.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 8
▼B
▼B
5.Mododioperare
5.1Preparazione della soluzione (v. osservazione 7.2)
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 2 del campione, introdurli in un
pallone tarato da ml 500 e aggiungere ml 450 di soluzione cloridrica di
pepsina (3.4) preliminarmente portata a 40º C. Agitare in modo da
evitare la formazione di agglomerati. Verificare che il pH della sospen-
sione sia inferiore a 1,7. Porre il pallone nel bagno d'acqua o nella stufa
di incubazione (4.1) e mantenervelo per 48 ore. Agitare dopo 8, 24 e 32
ore. Trascorse 48 ore, aggiungere ml 15 di acido cloridrico (3.1), raffred-
dare sino a 20º C, portare a volume con acqua e filtrare.
5.2Mineralizzazione
Prelevare ml 250 del filtrato e introdurli nel pallone dell'apparecchio di
distillazione (4.2). Aggiungere i reattivi necessari alla mineralizzazione
come indicato nel metodo per la determinazione delle proteine gregge,
punto 5.1, seconda frase.
Mescolare e riscaldare all'ebollizione. Se si forma della schiuma, aggiun-
gere qualche goccia di emulsione antischiuma (3.5). Lasciare bollire
vivacemente sino ad evaporazione quasi completa dell'acqua. Eliminare
le ultime tracce d'acqua con precauzione, riducendo l'intensità del riscal-
damento. Quando la soluzione è limpida e incolore (verde chiaro in
presenza di catalizzatore a base di rame) far bollire ancora per un'ora.
Lasciare quindi raffreddare.
5.3Distillazione e titolazione
Procedere come indicato nel metodo per la determinazione delle proteine
gregge, punti 5.2 e 5.3.
5.4Prova in bianco
Effettuare una prova in bianco applicando il modo di operare senza il
campione da analizzare.
6.Calcolodeirisultati
Detrarre il volume di acido solforico consumato nella prova in bianco da
quello consumato nella prova con la sostanza; ml 1 di acido solforico 0,1 N
corrisponde a mg 1,4 d'azoto.
Moltiplicare la quantità di azoto per il fattore 6,25. Esprimere il risultato in
per cento della sostanza.
Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve essere superiore a
— 0,4 in valore assoluto per i contenuti inferiori al 20 %;
— 2,0 % in valore relativo per i contenuti compresi tra 20 e 40 %;— 0,8 in valore assoluto per i contenuti superiori al 40 %.
7.Osservazioni
7.1 I valori ottenuti con il presente metodo non hanno una relazione diretta
conla digeribilità in vivo.
7.2 I prodotti il cui contenuto in materie grasse è superiore al 10 % debbono
essere preliminarmente sgrassati mediante estrazione con etere di petrolio
(ebollizione da 40 a 60º C).
4.DETERMINAZIONEDELL'ATTIVITÀDELLAPEPSINA
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di controllare l'attività della pepsina utilizzata per la
determinazione delle proteine gregge solubilizzabili con la pepsina ed acido
cloridrico.
2.Principio
L'emoglobina viene trattata, in determinate condizioni, con pepsina in
ambiente cloridrico. La frazione non idrolizzata delle proteine viene precipi-
tata con acido tricloroacetico. Il filtrato viene addizionato di idrossido di1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 9
▼B
sodio e del reattivo secondo Folin-Ciocalteu. La densità ottica di questa solu-
zione viene misurata a mu 750 e la quantità di tirosina che le corrisponde
viene letta su un diagramma di taratura.
Definizione: L'unità di pepsina si definisce come la quantità di questo enzima
che libera in un minuto, nelle condizioni del metodo, una quantità di gruppi
idrossiarile la cui colorazione con il reattivo secondo Folin-Ciocalteu ha una
densità ottica corrispondente a quella di una µmole di tirosina, nelle stesse
condizioni.
3.Reattivi
3.1 Acido cloridrico 0,2 N3.2 Acido cloridrico 0,06 N3.3 Acido cloridrico 0,025 N3.4 Soluzione al 5 % (p/v) di acido tricloroacetico3.5 Soluzione di idrossido di sodio 0,5 N3.6 Reattivo secondo Folin-Ciocalteu. Introdurre g 100 di tungstato di sodio
(Na
2WO4·2H2O), g 25 di molibdato di sodio (Na2MoO4·2H2O) e ml
700 di acqua in un pallone a fondo rotondo da l 2 a smerigliatura norma-
lizzata. Aggiungere ml 50 di acido fosforico (d: 1,71) e ml 100 di acido
cloridrico concentrato (d: 1,19), collegare al pallone un refrigerante a
riflusso, riscaldare fino ad ebollizione e far bollire adagio la soluzione
per 10 ore. Lasciar raffreddare, staccare il refrigerante a riflusso, aggiun-
gere g 175 di solfato di litio (Li2SO4·2H2O), ml 50 d'acqua e ml 1 di
bromo. Far bollire per 15 minuti per eliminare l'eccesso di bromo.
Lasciar raffreddare, travasare la soluzione in un pallone tarato da 1 l,
portare a volume conacqua, mescolare e filtrare. Nondeve aversi un a
colorazione verdastra. Prima dell'impiego, diluire 1 volume del reattivocon2 volumi d'acqua.
3.7 Soluzione di emoglobina: pesare una quantità di emoglobina, substrato
proteico secondo Anson (circa g 2), corrispondente a mg 354 d'azoto (
1)
ed introdurla in un pallone da ml 200 a smerigliatura normalizzata.
Aggiungere alcuni ml d'acido cloridrico (3.2), collegare il pallone alla
pompa a vuoto e agitare fino a dissoluzione completa dell'emoglobina.
Interrompere il vuoto e aggiungere, agitando nel contempo, acido clori-
drico (3.2) per portare a ml 100. Preparare la soluzione immediatamente
prima dell'impiego .
3.8 Soluzione tipo di tirosina: sciogliere mg 181,2 di tirosina in acido clori-
drico (3.1) e portare a l 1 conlo stesso acido (soluzion e madre).
Prelevare ml 20,0 e diluire a ml 100 conacido cloridrico (3.1); ml 1 di
questa soluzione contiene µmoli 0,2 di tirosina.
4.Apparecchiatura
4.1 Bagno d'acqua, regolato, mediante l'ultratermostato, a 25º C ± 0,1º C4.2 Spettrofotometro4.3 Cronometro, precisione: 1 secondo4.4 pH-metro.
5.Mododioperare
5.1Preparazione della soluzione (v. osservazione 7.1)
Sciogliere mg 150 di pepsina in ml 100 di acido cloridrico (3.2). Prele-
vare con la pipetta ml 2 di soluzione, introdurli in un pallone tarato da
ml 50 e portare a volume conacido cloridrico (3.3). Il pH con trollato
con il pH-metro deve essere 1,6 ± 0,1. Immergere il pallone nel bagno
d'acqua (4.1).
5.2Idrolisi
Pipettare in una provetta ml 5,0 di soluzione di emoglobina (3.7), portare
a 25º C nel bagno d'acqua (4.1), aggiungere ml 1,0 della soluzione di
pepsina ottenuta in 5.1 e mescolare con una bacchetta di vetro, appiattita
ad un'estremità, con circa 10 movimenti di va e vieni. Mantenere la1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 10
(1) Determinare il contenuto in azoto con un semi-microkjeldhal (contenuto teorico: 17,7 %
di azoto).
▼B
provetta nel bagno d'acqua a 25º C per 10 minuti esatti, calcolati a
partire dal momento dell'aggiunta della soluzione di pepsina (la durata e
la temperatura devono essere esattamente rispettate). Aggiungere quindi
ml 10,0 di soluzione di acido tricloroacetico (3.4), preliminarmente
portata a 25º C, mescolare e filtrare su unfiltro asciutto.
5.3Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica
Prelevare con la pipetta ml 5,0 del filtrato, introdurli in una beuta da ml
50, aggiungere ml 10,0 di soluzione d'idrossido di sodio (3.5) e, agitando
costantemente, ml 3,0 del reattivo diluito di Folin-Ciocalteu (3.6). Dopo
5 a 10 minuti, misurare la densità ottica della soluzione con lo spettrofo-
tometro a nm 750 in vaschette di cm 1 di spessore, rispetto all'acqua.
5.4Prova in bianco
Per ogni determinazione, eseguire una prova in bianco come indicato qui
di seguito.
Pipettare in una provetta ml 5,0 di soluzione di emoglobina (3.7), portare
a 25º C nel bagno d'acqua (4.1), aggiungere ml 10,0 di soluzione di
acido tricloroacetico (3.4) preliminarmente portata a 25º C, mescolare e
aggiungere quindi ml 1,0 della soluzione di pepsina ottenuto in 5.1.
Mescolare con una bacchetta di vetro e tenere la provetta per 10 minuti
esatti nel bagno d'acqua (4.1) a 25º C. Mescolare e filtrare su un filtro
asciutto. Proseguire il modo d'operare come indicato in 5.3.
5.5Diagramma di taratura
Introdurre in beuta da ml 50 dei volumi di ml 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 di
soluzione tipo di tirosina (3.8), corrispondenti rispettivamente a quantità
di tirosina di µmoli 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0. Completare la serie con un
testimone senza tirosina. Portare i volumi a ml 5,0 con acido cloridrico
(3.1). Aggiungere ml 10,0 di soluzione di idrossido di sodio (3.5) e,
agitando costantemente, ml 3,0 del reattivo diluito di Folin-Ciocalteu
(3.6). Misurare la densità ottica come indicato in 5.3, ultima frase. Trac-
ciare il diagramma di taratura riportando le densità ottiche rispetto alle
quantità di tirosina.
6.Calcolodelrisultato
Leggere sul diagramma di taratura la quantità di tirosina, in µmoli, corrispon-
dente alla densità ottica della soluzione colorata, corretta della prova in
bianco.
L'attività della pepsina, in µmoli di tirosina per mg e per minuto, a 25º C, è
data dalla formula:
Unit`a per mg U =mgðÞ ¼0;32 a
p
nella quale
a = quantità di tirosina, in µmoli, letta sul diagramma di taratura;
p = peso in mg della quantità di pepsina aggiunta in 5.2.
7.Osservazioni
7.1 La quantità di pepsina da disciogliere deve essere scelta in modo da otte-
nere, nella misura spettrofotometrica finale, una densità ottica di
0,35 ± 0,035.
7.2 Due unità ottenute con il presente metodo corrispondono a:
3,64 milliunità Anson/mg (µmoli di tirosina/mg. min. a 35,5º C)
oppure
36.400 unità commerciali/g (µmoli di tirosina/g in 10 min. a 35,5º C).
5.DETERMINAZIONEDELGOSSIPOLOLIBEROETOTALE
1.Scopoecampodiapplicazione
Il metodo permette di determinare il gossipolo libero, il gossipolo totale e le
sostanze chimicamente affini nei semi, nelle farine e nei panelli di cotone e
negli alimenti composti che ne contengono.
Il limite inferiore di determinabilità del metodo è di 20 ppm.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 11
▼B
2.Principio
Il gossipolo viene estratto, in presenza di 3-amino-1-propanolo, con una
miscela di isopropanolo-esano nel caso della determinazione del gossipolo
libero, e con la dimetilformamide nel caso della determinazione del gossipolo
totale. Il gossipolo è trasformato mediante anilina in gossipolo-dianilina, la
cui densità ottica è misurata a 440 nm.
3.Reattivi
3.1 Miscela isopropanolo-esano: mescolare 60 parti in volume d'isopropa-
nolo p.a. con 40 parti in volume di esano normale.
3.2 Solvente A: porre in un pallone tarato da l 1, circa ml 500 della miscela
isopropanolo-esano (3.1), ml 2 di 3-amino-1-propanolo, ml 8 d'acido
acetico glaciale e ml 50 d'acqua. Portare a volume conmiscela di isopro-
panolo-esano (3.1). Questo reattivo è stabile per una settimana.
3.3 Solvente B: pipettare in un pallone tarato da ml 100, ml 2 di 3-amino-1-
propanolo e ml 10 d'acido acetico glaciale. Raffreddare alla temperatura
ambiente e portare a volume con N,N-dimetilformamide. Questo reattivo
è stabile per una settimana.
3.4 Anilina p.a.: se la densità ottica del saggio in bianco supera il valore
0,022dev'essere distillata su polvere di zinco eliminando la prima e
l'ultima frazione pari al 10 % del distillato. Posta in bottiglia chiusa di
vetro bruno ed in frigorifero si conserva per parecchi mesi.
3.5 Soluzione tipo A di gossipolo: porre in un pallone tarato da ml 250, mg
27,9 d'acetato di gossipolo. Sciogliere e portare a volume impiegando il
solvente A (3.2). Pipettare ml 50 di tale soluzione in un pallone tarato da
ml 250 e portare a volume con il solvente A. La concentrazione in gossi-
polo di tale soluzione è di mg 0,02/ml. Lasciar riposare per un'ora alla
temperatura ambiente prima dell'impiego.
3.6 Soluzione tipo B di gossipolo: porre in un pallone tarato da ml 50, mg
27,9 d'acetato di gossipolo. Sciogliere e portare a volume impiegando il
solvente B (3.3). La concentrazione in gossipolo di tale soluzione è di
0,5 mg/ml. Le soluzioni tipo A e B di gossipolo restano stabili per 24
ore se sono conservate al buio.
4.Apparecchiatura
4.1 Mescolatore rotativo a capovolgimento: circa 25 capovolgimenti al
minuto.
4.2 Spettofotometro.
5.Mododioperare
5.1Quantità di sostanza da sottoporre all'analisi
La quantità di sostanza da sottoporre all'analisi è in rapporto al presunto
contenuto in gossipolo del campione. È preferibile operare su una piccola
quantità di sostanza e su una parte aliquota del filtrato relativamente
importante, in modo da ottenere una quantità di gossipolo sufficiente
per effettuare una misura spettofotometrica precisa. Per la determina-
zione del gossipolo libero nei semi, nelle farine e nei panelli di cotone,
la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi non deve sorpassare g 1;per gli alimenti composti potrà raggiungere g 5. Una parte aliquota di ml
10 di filtrato è sufficiente nella maggioranza dei casi; essa dovrà conte-
nere da µg 50 a 100 di gossipolo. Per la determinazione del gossipolo
totale, la quantità di sostanza da sottoporre ad analisi potrà variare da g
0,5 a 5 affinché una parte aliquota di ml 2 di filtrato contenga da µg 40 a
200 di gossipolo.
L'analisi deve essere effettuata ad una temperatura ambiente vicina a
20º C.
5.2Determinazione del gossipolo libero
Porre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi in un pallone da ml
250 a collo smerigliato il cui fondo è ricoperto di polvere di vetro.
Aggiungere, con una pipetta, ml 50 del solvente A (3.2), tappare il
pallone e porlo per un'ora nel mescolatore rotativo a capovolgimento.
Filtrare su unfiltro asciutto e raccogliere il filtrato inunpallon cin o a
collo smerigliato. Nel corso della filtrazione ricoprire l'imbuto con un
vetro da orologio. Introdurre con una pipetta, rispettivamente in due
palloni tarati da ml 25 (A e B), parti aliquote identiche di filtrato conte-
nenti da µg 50 a 100 di gossipolo. Completare eventualmente a ml 101972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
con il solvente A (3.2). Completare quindi a volume il contenuto del
pallone A con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Questa soluzione
sarà utilizzata come soluzione di riferimento per la misura della solu-
zione del campione.
Pipettare ml 10 del solvente A (3.2) rispettivamente in due altri palloni
tarati da ml 25 (C e D). Portare a volume il contenuto del pallone (C)
con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Questa soluzione sarà utilizzata
come soluzione di riferimento per la misura della soluzione del saggio in
bianco.
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) rispettivamente nei palloni (D) e (B).
Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la
colorazione. Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume
con miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora.
Determinare allo spettrofotometro a nm 440, in vaschette di vetro da cm
1, la densità ottica della soluzione del saggio in bianco (D) di confronto
con la soluzione di riferimento (C) e la densità ottica della soluzione del
campione (B) di confronto con la soluzione di riferimento (A).
Sottrarre la densità ottica della soluzione del saggio in bianco da quella
della soluzione del campione (= densità ottica corretta). Calcolare a
partire da questo valore il contenuto in gossipolo libero come indicato
al punto 6.
5.3Determinazione del gossipolo totale
Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi, contenente da
mg 1 a 5 di gossipolo, in un pallone tarato da ml 50 ed aggiungere ml 10
di solvente B (3.3). Preparare simultaneamente un saggio in bianco,
introducendo ml 10 di solvente B (3.3) in un altro pallone tarato da ml
50. Riscaldare i due palloni per 30 minuti su un bagno d'acqua bollente.
Raffreddare alla temperatura ambiente e portare a volume il contenuto di
ciascun pallone con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Mescolare e
lasciar depositare per 10 a 15 minuti, quindi filtrare e raccogliere i filtrati
inpallon i a tappo smerigliato.
Pipettare ml 2 del filtrato del campione rispettivamente in due palloni
tarati da ml 25 e ml 2 del filtrato del saggio in bianco rispettivamente
in due altri palloni da ml 25. Prendere un pallone di ciascuna serie e
completare i rispettivi contenuti a ml 25 con la miscela isopropanolo-
esano (3.1). Queste soluzioni saranno utilizzate come soluzione di riferi-
mento.
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) rispettivamente negli altri due palloni.
Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la
colorazione. Raffreddare alla temperatura ambiente, completare il
volume a ml 25 con la miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e
lasciare riposare per un'ora.
Determinare la densità ottica come indicato in 5.2 per il gossipolo libero.
Calcolare a partire da tale valore il contenuto in gossipolo totale come
indicato al punto 6.
6.Calcolodeirisultati
Il calcolo dei risultati può essere fatto sia inbase alla den sità ottica specifica
(6.1), sia riferendosi ad una curva di taratura (6.2).
6.1In base alla densità ottica specifica
Nelle condizioni descritte le densità ottiche specifiche sono le seguenti:
gossipolo libero: E1%
1c m¼625
gossipolo totale: E1%
1c m¼600
Il contenuto in gossipolo libero o totale del campione è dato dalla
formula seguente:
gossipolo percento ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
nella quale:
E = densità ottica corretta, determinata come indicato in 5.2,
p = quantità in g di sostanza analizzata,1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
a = parte aliquota del filtrato espressa inml.
6.2In base ad un diagramma di taratura
6.2.1 Gossipolo libero
Predisporre 2 serie di 5 palloni tarati da ml 25. In ogni serie pipet-
tare rispettivamente ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 della soluzione tipo
A di gossipolo (3.5). Completare i volumi a ml 10 conil solven te
A (3.2). Completare ogni serie con un testimone costituito da un
pallone tarato da ml 25 contenente soltanto ml 10 del solvente A
(3.2). Portare a ml 25 il volume dei palloni della prima serie
(compreso il testimone) con la miscela isopropanolo-esano (3.1)
(serie di riferimento).
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) in ciascuno dei palloni della
seconda serie (compreso il testimone). Riscaldare per 30 minuti
su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la colorazione.
Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume con la
miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora (serie tipo).
Determinare la densità ottica di ogni soluzione della serie tipo di
confronto con la soluzione corrispondente della serie di riferi-
mento, nelle condizioni indicate in 5.2. Tracciare graficamente il
diagramma di taratura riportando le densità ottiche in funzione
delle quantità di gossipolo (in µg).
6.2.2 Gossipolo totale
Predisporre 6 palloni tarati da ml 50. Porre nel primo ml 10 del
solvente B (3.3) e negli altri rispettivamente ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0;
10,0 della soluzione tipo B di gossipolo (3.6). Completare il conte-
nuto di ogni pallone a ml 10 con il solvente B (3.3). Riscaldare per
30 minuti su bagno d'acqua bollente. Raffreddare alla temperatura
ambiente, portare a volume con la miscela isopropanolo-esano
(3.1) e mescolare.
Porre ml 2,0 di queste soluzioni rispettivamente in due serie di 6
palloni tarati da ml 25. Completare a ml 25 il contenuto dei palloni
della prima serie con la miscela isopropanolo-esano (3.1) (serie di
riferimento).
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) in ciascuno dei palloni della
seconda serie. Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente.
Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume con la
miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora (serie tipo).
Determinare la densità ottica di ciascuna soluzione della serie tipo
di confronto con la soluzione corrispondente della serie di riferi-
mento, nelle condizioni indicate al punto 5.2. Tracciare
graficamente il diagramma di taratura riportando le densità ottiche
in funzione delle quantità di gossipolo (in µg).
6.3Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni in parallelo eseguite
sullo stesso campione non deve oltrepassare:
— 15 % in valore relativo per i contenuti in gossipolo inferiori a
500 ppm;
— 75 ppm in valore assoluto per i contenuti compresi tra 500 e 750 ppm;— 10 % in valore relativo per i contenuti superiori a 750 ppm.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
ALLEGATO II
4.DOSAGGIODELLATILOSINA
— per diffusione su agar —
1.Oggettoecampod'applicazione
Il metodo permette di dosare la tilosina nei mangimi, nei concentrati e nelle
premiscele Il limite inferiore di dosaggio è di ppm 2.
2.Principio
Il campione viene estratto con una soluzione tampone fosfato a pH 8, preven-
tivamente portato a 80º C, e sottoposto quindi all'estrazione con il metanolo.
Dopo centrifugazione, l'estratto viene diluito e la sua attività antibiotica è
determinata dalla misura della diffusione della tilosina su di un terreno coltu-
rale agarizzato insemenzato con Sarcina lutea . La diffusione è indicata dalla
formazione di zone di inibizione in presenza del microorganismo. Il diametro
di queste zone è direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione
dell'antibiotico.
3.Microorganismo:SarcinaluteaATCCn.9341
3.1Conservazione del ceppo
Seminare Sarcina lutea inuntubo di terren o colturale (4.1) portato a pH
7,0. Incubare per una notte a 35º C circa. Conservare il ceppo in frigori-
fero e trapiantarlo ogni mese.
3.2Preparazione della sospensione di germi
Raccogliere la patina di agar-coltura (3.1), preparata di fresco, con ml 2
a 3 di soluzione fisiologica (4.4). Seminare con questa sospensione una
bottiglia di Roux contenente ml 250 di terreno colturale (4.1) portato a
pH 7,0. Incubare per 24 ore a 35º C, raccogliere i germi con ml 25 di
soluzione fisiologica (4.4). Omogeneizzare e diluire questa sospensione
per ottenere una trasmissione luminosa del 75 % circa a nm 650.
Conservata in frigorifero, questa sospensione è utilizzabile una settimana.Mediante prove preliminari su piastra con il terreno base per la determi-
nazione (4.1), determinare la quantità di inoculo che consente di ottenere
per le diverse concentrazioni di tilosina utilizzate, le zone di inibizione
più estese, che siano ancora nette. La semina viene eseguita su terreno
fuso e raffreddato da 48 a 50º C.
4.Terreni colturali ereagenti
4.1Terreno base per il dosaggio (
1)
Glucosio g 1
Peptone tripsico g 10Estratto di carne g 1,5
Estratto di lievito g 3
Agar, secondo la qualità g 10 a 20Acqua distillata fino a ml 1000
Aggiustare al momento dell'uso il pH 7,0 per la conservazione del ceppo
e la preparazione della sospensione dei germi ed a pH 8,0 per il
dosaggio.
4.2Tampone fosfato, pH 8
Fosfato monopotassico KH
2PO4p.a. g 0,5231972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 15
(1) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.▼M4
▼B
▼B
Fosfato bipotassico K2HPO4p.a. g 16,730
Acqua distillata fino a ml 1000
4.3Tampone fosfato, pH 7
Fosfato monopotassico KH2PO4p.a. g 5,5
Fosfato bipotassico K2HPO4p.a. g 13,6
Acqua distillata fino a ml 1000
4.4 Soluzione fisiologica sterile
4.5 Metanolo, puro4.6 Metanolo a 40 % (v/v)4.7 Miscela tampone fosfato (4.2) / metanolo, puro: 60/40 in vol.4.8 Sostanza standard: tilosina di attività nota.
5.Soluzionestandard
Essiccare la sostanza standard (4.8) per 3 ore a 60º C in una stufa sotto vuoto
(mm 5 di mercurio). Pesare mg 10 a 50 inunpallon e tarato, scioglierli inml
5 di metanolo (4.5) e diluire la soluzione con il tampone fosfato, pH 7 (4.3)
per ottenere una concentrazione di tilosina base di µg 1000/ml.
A partire da questa soluzione madre, preparare diluendo con la miscela (4.7)
una soluzione standard di lavoro S
8contenente µg 2 di tilosina base per ml.
Preparare quindi per diluizioni successive (1 + 1), mediante la miscela (4.7),
le seguenti concentrazioni:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Estrazione
Preparare un quantitativo di g 10 per i concentrati e di g 20 per le premiscele
e i mangimi. Aggiungere ml 60 di tampone fosfato, pH 8 (4.2), preventiva-
mente portato a 80º C, e omogeneizzare per due minuti (frullatore per uso
domestico. Ultra-turrax, ecc.).
Lasciare quindi riposare per 10 minuti, aggiungere ml 40 di metanolo (4.5) e
omogeneizzare per 5 minuti. Centrifugare, prelevare una certa aliquota dell'e-
stratto e diluire con la miscela (4.7) per ottenere una concentrazione presunta
di tilosina di µg 2/ml (= U8). Preparare quindi le concentrazioni U4,U2eU1per diluizioni successive (1 + 1) mediante la miscela (4.7). Per concentra-zioni inferiori a ppm 10, evaporare l'estratto a secco in un evaporatore a
rotazione a 35º C e riprendere il residuo con del metanolo al 40 % (4.6).
7.Modalitàdidosaggio
7.1Semina del terreno di coltura
Seminare il terreno base per il dosaggio (4.1) fuso e raffreddato da 48 a
50º C, e portato a pH 8,0 con la sospensione di germi (3.2).
7.2Preparazione delle piastre
La diffusione su agar si effettua su delle piastre con le 4 concentrazioni
dello standard (S
8,S4,S2,S1) e le 4 concentrazioni dell'estratto (U8,U4,
U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente contenere le 4 concentrazioni
dello standard e dell'estratto.
A tale scopo, scegliere delle piastre di dimensioni tali che si possano
praticare nell'agar almeno 8 cavità (pozzetti) da mm 10 a 13 di diametro.
Calcolare la quantità di terreno colturale seminato (7.1) da utilizzare per
ottenere uno strato di agar uniforme di circa mm 2 di spessore. È prefe-
ribile utilizzare come piastre delle lastre di vetro piano munite di un
anello di alluminio o di materiale plastico perfettamente piano di mm
200 di diametro e di mm 20 di altezza.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 16
▼B
Introdurre con pipetta nelle cavità delle quantità esattamente misurate
della soluzione di antibiotico comprese tra ml 0,10 e 0,15, a seconda
del diametro.
Per ogni campione fare almeno 4 repliche di diffusione con ciascuna
concentrazione, in modo che ogni determinazione comporti la valuta-
zione di 32 zone di inibizione.
7.3Incubazione
Incubare le piastre per una notte da 35 a 37º C.
8.Valutazione
Misurare il diametro delle zone di inibizione possibilmente per proiezione.
Trascrivere le misure su carta semilogaritmica, riportando il logaritmo delle
concentrazioni nei confronti delle zone di inibizione. Tracciare le rette della
soluzione standard e dell'estratto. In assenza di interferenza, le due rette
devono essere parallele.
Il logaritmo dell'attività relativa viene calcolato utilizzando la formula
seguente:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Attività reale = attività presunta × attività relativa.
9.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve sorpassare 10 % in valore relativo.
5.DOSAGGIODELLAVIRGINIAMICINA
— per diffusione in agar —
1.Oggettoecampodiapplicazione
Il presente metodo permette di dosare la virginiamicina nei mangimi e nelle
premiscele. Il limite inferiore di dosaggio è di 2 mg/kg (2 ppm)(1).
2.Principio
Il campione viene estratto con una soluzione metanolica di Tween 80.
L'estratto viene decantato o centrifugato, poi diluito. La sua attività antibio-
tica è determinata misurando la diffusione della virginiamicina su terreno
agarizzato, insemenzato con Micrococcus luteus . La diffusione è rivelata
dalla formazione di aloni di inibizione del microrganismo. Si ammette che
il diametro di tali aloni sia direttamente proporzionale al logaritmo della
concentrazione di antibiotico nel campo delle concentrazioni utilizzate.
3.Microrganismo: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Conservazione del ceppo
Insemenzare con Micrococcus luteus il terreno colturale (4.1) distribuito
in provette a becco di clarino. Incubare per 24 ore a 30 ºC, conservare in
frigorifero a 4 ºC circa e trapiantare ogni 15 giorni.
3.2.Preparazione della sospensione batterica (a)
Mediante 2-3 ml di soluzione di cloruro di sodio (4.3), raccogliere la
patina di una agar-coltura (3.1) preparata di recente. Con tale sospen-
sione, insemenzare una bottiglia di Roux contenente 250 ml del terreno
di coltura (4.1); incubare per 18-20 ore a 30 ºC. Raccogliere i germi con
25 ml di soluzione di cloruro di sodio (4.3) e omogeneizzare. Diluire a
1/10 la sospensione mediante la soluzione di cloruro di sodio (4.3). La
trasmittanza della sospensione, misurata a 650 nm sotto lo spessore di
1 cm in confronto con la soluzione di cloruro di sodio (4.3), deve essere1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 17
(1) 1 mg di virginiamicina equivale a 1 000 unità «UK».
(a) Possono essere impiegati altri metodi, purché sia dimostrato che essi diano sospensioni
di batteri analoghe.▼M2
▼M2
del 75 % circa. Questa sospensione può essere conservata per una setti-
mana alla temperatura di 4 ºC circa.
4.Terreni colturali ereattivi
4.1.Terreno di mantenimento del ceppo e di base del dosaggio (a)
Peptone di carne 6,0 g
Triptone 4,0 g
Estratto di lievito 3,0 g
Estratto di carne 1,5 g
Glucosio 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Acqua 1 000 ml
pH 6,5 (dopo sterilizza-
zione).
4.2.Tampone al fosfato, pH 6
Fosfato bipotassico, K2HPO42,0 g
Fosfato monopotassico, KH2PO48,0 g
Acqua q.b. a 1 000 ml
4.3. Soluzione allo 0,8 % (p/v) di cloruro di sodio: sciogliere in acqua 8 g di
cloruro di sodio, diluire a 1 000 ml e sterilizzare.
4.4. Metanolo.4.5. Miscela di tampone al fosfato (4.2) e di metanolo (4.4): 80/20 (v/v).4.6. Soluzione metanolica allo 0,5 % (p/v) di Tween 80: sciogliere 5 g di
Tween 80 in metanolo (4.4) e diluire a 1000 ml con metanolo.
4.7. Sostanza di riferimento: virginiamicina ad attività nota.
5.Soluzionidiriferimento
Sciogliere nel metanolo (4.4) una quantità esattamente pesata della sostanza
di riferimento (4.7); diluire con metanolo (4.4) in modo da ottenere una solu-
zione madre contenente 1000 µg di virginiamicina/ml. Se conservata a 4 ºC
in bottiglia chiusa, questa soluzione è stabile per cinque giorni.
A partire da questa soluzione, preparare per diluizioni successive con la
miscela (4.5) le seguenti soluzioni:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Preparazione dell'estrattoedellesoluzioni
6.1.Estrazione
6.1.1. Prodotti con tenore in virginiamicina non superiore a 100 mg/kg
Pesare una quantità di 50,0 g di campione. Aggiungere 200 ml
della soluzione (4.6), agitare per 30 minuti, poi lasciar depositare
o centrifugare. Prelevare 20 ml del supernatante ed evaporare a
5 ml in evaporatore rotante, a temperatura non superiore a 40 ºC.
Diluire il residuo con la miscela (4.5), fino ad ottenere una
concentrazione presunta in virginiamicina pari a 1 µg/ml (= U8).
6.1.2. Prodotti il cui tenore in virginiamicina è superiore a 100 mg/kg
Pesare una quantità di campione non superiore a 10,0 g e conte-
nente da 1 a 50 mg di virginiamicina. Aggiungere 100 ml della
soluzione (4.6), agitare per 30 minuti, poi lasciar depositare o
centrifugare. Diluire il surnatante con la miscela (4.5) fino ad
ottenere una concentrazione in virginiamicina pari a 1 µg/ml (=
U8).1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 18
(a) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio che dia gli stessi risultati.
▼M2
6.2.Soluzioni dell'estratto
A partire dalla soluzione U8, preparare per diluizioni successive (1: 1)
conla miscela (4.5) le soluzion i U4(concentrazione presunta: 0,5 µg/
ml), U2(concentrazione presunta: 0,25 µg/ml) ed U1(concentrazione
presunta: 0,125 µg/ml).
7.Modalitàdidosaggio
7.1.Inoculazione del terreno di coltura
Con la sospensione di batteri (3.2), insemenzare il terreno base per il
dosaggio (4.1) alla temperatura di 50 ºC circa. Mediante saggi prelimi-
nari su piastra col terreno (4.1), determinare la quantità di sospensione
di batteri che consente di ottenere, per le diverse concentrazioni di virgi-
niamicina, aloni di inibizione che abbiano la maggiore estensione
possibile e che siano ancora netti.
7.2.Preparazione delle piastre
La diffusione in agar si effettua su piastre con le quattro concentrazioni
della soluzione di riferimento (S8,S4,S2,S1) e le quattro concentrazioni
dell'estratto (U8,U4,U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente conte-
nere le quattro concentrazioni della sostanza di riferimento e
dell'estratto. A tale scopo, impiegare piastre di dimensioni tali che si
possano praticare nel terreno agarizzato almeno otto pozzetti del
diametro di 10-13 mm, i cui centri non siano distanti tra loro meno di
30 mm. Si possono adoperare come piastre delle lastre di vetro piane,
provviste di un anello di alluminio o di materiale plastico del diametro
di 200 mm e dell'altezza di 20 mm.
Versare nelle piastre una quantità di terreno (4.1) insemenzato come
indicato al punto 7.1, che permetta di ottenere uno strato dello spessore
di 2 mm circa (60 ml per una piastra di 200 mm di diametro). Lasciar
solidificare, praticare i pozzetti e deporvi dei volumi esattamente misu-
rati delle soluzioni della sostanza di riferimento e dell'estratto (da 0,10 a
0,15 ml per pozzetto a seconda del diametro). Le operazioni descritte
vanno ripetute almeno quattro volte per ogni concentrazione, in modo
da ottenere per ciascuna determinazione 32 aloni di inibizione.
7.3.Incubazione
Incubare le piastre per 16-18 ore, alla temperatura di 30 ºC ± 2 ºC.
8.Valutazione
Misurare il diametro degli aloni di inibizione con l'approssimazione di
0,1 mm. Per ogni concentrazione, registrare le misue medie su carta semilo-
garitmica, riportando il logaritmo delle concentrazioni in funzione del
diametro dell'alone di inibizione. Tracciare le rette più appropriate per la
soluzione di riferimento e per l'estratto, procedendo ad esempio come segue.
Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della soluzione
di riferimento (SL) mediante la formula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della soluzione
di riferimento (SH) mediante la formula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l'estratto al livello
più basso (UL) ed al livello più alto (UH) sostituendo nelle formule sopra
riportate i valori S1,S2,S4eS8conquelli di U1,U2,U4eU8.
Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico. Congiungendo i due punti
si ottiene la retta più appropriata per la soluzione standard. Procedendo allo
stesso modo per UL e UH si ottiene la retta più appropriata per l'estratto.
In mancanza di interferenze, le rette dovrebbero essere parallele. In pratica,
esse sono considerate parallele allorché (SH — SL) e (UH — UL) non diffe-
riscono fra loro di più del 10 % della loro media.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 19
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Se le rette non sono parallele, è possibile eliminare sia U1eS1, sia U8eS8.I n
questo caso, i valori SL, SH, UL e UH che permettono di ottenere le rette più
appropriate vanno calcolati mediante le formule seguenti:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6o5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6o5s8þ2s4/C0s2
6
e mediante formule analoghe per UL e UH. Se si utilizza quest'alternativa,
bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo sopra descritto. Se il
risultato è stato ottenuto a partire da tre punti, ciò va indicato sul certificato
di analisi.
Quando le rette sono considerate parallele, calcolare il logaritmo dell'attività
relativa (log. A) con una delle formule seguenti:
Per 4 punti
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Per 3 punti
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C20;401
u4þs4/C0u1/C0s1
o
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Attività dell'estratto del campione = attività dello standard corrispondente ×
A:
(U8=S8×A )
Se l'attività relativa si trova al di fuori della gamma di valori compresi fra 0,5
e 2,0, ripetere la determinazione procedendo ad opportune regolazioni delle
concentrazioni dell'estratto o, eventualmente, delle soluzioni di riferimento.Quando tale attività non può essere ricondotta nella gamma di valori
richiesta, il risultato deve essere considerato approssimativo e tale indica-
zione deve figurare sul certificato di analisi.
Allorché le rette non sono considerate parallele, ripetere la determinazione.
Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile ottenere il
parallelismo, la determinazione deve essere considerata insoddisfacente.
Esprimere il risultato in mg virginiamicina/kg alimento.
9.Ripetibilità
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso
campione dallo stesso analista non deve eccedere:
— 2 mg/kg, in valore assoluto, per i contenuti in virginiamicina inferiori a
10 mg/kg;
— 20 % del risultato più elevato per i contenuti da 10 a 25 mg/kg;
— 5 mg/kg, in valore assoluto, per i contenuti da 25 a 50 mg/kg;
— 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 mg/kg.1972L0199 — IT — 27.08.1999 — 005.001 — 20