1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B SECONDADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del14maggio1982
per il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative ai metodi di analisi necessari
percontrollare lacomposizionedeiprodotticosmetici
(82/434/CEE)
(GU L 185 del 30.6.1982, pag. 1)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva 90/207/CEE della Commissione del 4 aprile 1990 L 108 92 28.4.1990
▼B
SECONDADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del14maggio1982
per il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative
ai metodi di analisi necessari per controllare la composizione dei
prodotticosmetici
(82/434/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
vista la direttiva 76/768/CEE del Consiglio, del 27 luglio 1976, concer-
nente il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative aiprodotti cosmetici(
1), modificata dalla direttiva 79/661/CEE(2), in
particolare l'articolo 8, paragrafo 1,
considerando che la direttiva 76/768/CEE prevede l'esecuzione di
controlli ufficiali al fine di accertare che siano osservate le condizioniprescritte dalle disposizioni comunitarie per quanto concerne la compo-sizione dei prodotti cosmetici;
considerando che è opportuno stabilire il più rapidamente possibile tutti
i metodi di analisi necessari; che una prima tappa verso tale meta èstata raggiunta con la prescrizione di taluni metodi nella direttiva 80/1335/CEE della Commissione(
3), e che il passaggio alla seconda tappa
è segnato dalla prescrizione dei metodi d'identificazione degli agenti
ossidanti e di dosaggio del perossido di idrogeno nei prodotti per lacura dei capelli, d'identificazione e di dosaggio semiquantitativo ditaluni coloranti d'ossidazione nelle tinture per capelli, d'identificazionee di dosaggio dei nitriti, d'identificazione e di dosaggio della formal-
deide libera, di dosaggio della resorcina negli shampoo e nelle lozioni
per capelli, di dosaggio del metanolo in rapporto all'etanolo ed alpropanolo-2;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del comitato per l'adeguamento al progresso tecnicodella direttiva 76/768/CEE,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri adottano le misure necessarie affinché, nei controlli
ufficiali dei prodotti cosmetici
— l'identificazione degli agenti ossidanti e il dosaggio del perossido di
idrogeno nei prodotti per la cura dei capelli,
— l'identificazione e il dosaggio semiquantitativo di taluni coloranti
d'ossidazione nelle tinture per capelli,
— l'identificazione e il dosaggio dei nitriti,— l'identificazione e il dosaggio della formaldeide libera,
— il dosaggio della resorcina negli shampoo e nelle lozioni per capelli,
— il dosaggio del metanolo in rapporto all'etanolo ed al propanolo-2,
siano effettuati secondo i metodi descritti nell'allegato.
Articolo 2
Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legislative, regola-
mentari ed amministrative necessarie per conformarsi alla presentedirettiva entro e non oltre il 31 dicembre 1983. Essi ne informanoimmediatamente la Commissione.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 2
(1) GU n. L 262 del 27. 9. 1976, pag. 169.
(2) GU n. L 192 del 31. 7. 1979, pag. 35.
(3) GU n. L 383 del 31. 12. 1980, pag. 27.
▼B
Articolo 3
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 3
▼B
ALLEGATO
I.IDENTIFICAZIONE DI ALCUNI OSSIDANTI E DOSAGGIO DEL
PEROSSIDO DI IDROGENO NEI PRODOTTI PER LA CURA DEI
CAPELLI
SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
La determinazione iodometrica del perossido di idrogeno nei prodotti cosmetici
è possibile in assenza di altri ossidanti, che reagiscono con gli ioduri formando
iodio. Pertanto, prima di procedere alla determinazione iodometrica del peros-
sido di idrogeno, è necessario rilevare e identificare gli altri ossidanti
eventualmente presenti. Questa identificazione si suddivide in due fasi: la prima
fase riguarda i persolfati, i bromati e il perossido di idrogeno, la seconda il
perossido di bario.
A. IDENTIFICAZIONE DEI PERSOLFATI, DEI BROMATI E DEL PEROS-
SIDO DI IDROGENO
1. PRINCIPIO
Il persolfato di sodio, di potassio e di ammonio, il bromato di potassio e
di sodio, nonché il perossido di idrogeno — derivato o meno dal peros-
sido di bario — vengono identificati per cromatografia discendente su
carta con l'impiego di due solventi di sviluppo.
2. REATTIVI
Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica.
2.1. Soluzioni acquose di riferimento allo 0,5 % (m/v) dei seguenti
composti:
2.1.1. Persolfato di sodio
2.1.2. Persolfato di potassio
2.1.3. Persolfato di ammonio
2.1.4. Bromato di potassio
2.1.5. Bromato di sodio
2.1.6. Perossido di idrogeno
2.2. Eluente A: etanolo 80 % (v/v)
2.3. Eluente B: benzene — metanolo — alcole isoamilico — acqua (34-38-
18-10 v/v)
2.4. Reattivo A: soluzione acquosa di ioduro di potassio al 10 % (m/v)
2.5. Reattivo B: salda d'amido all'1 % (m/v)
2.6. Reattivo C: acido cloridrico al 10 % (m/m)
2.7. Acido cloridrico 4 N.
3. APPARECCHIATURE E STRUMENTI
3.1. Carta per cromatografia (Whatman n. 3 e n. 4 o equivalente)
3.2. Micropipetta da 1 µl
3.3. Matracci tarati da 100 ml
3.4. Filtri a pieghe
3.5. Normali attrezzature per l'esecuzione della cromatografia discendente su
carta.
4. TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
4.1.Prodottisolubiliinacqua
Per ciascun campione preparare due soluzioni sciogliendo rispettiva-
mente 1 e 5 g del prodotto in 100 ml di acqua. Per effettuare la1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 4
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cromatografia su carta descritta al punto 5, utilizzare 1 µl di ciascuna di
queste due soluzioni.
4.2.Prodottipocosolubiliinacqua
4.2.1. Pesare 1 e 5 g del campione, sospenderli in 50 ml di acqua, aggiungere
acqua fino a 100 ml e mescolare. Filtrare le due sospensioni per filtro a
pieghe (3.4) ed utilizzare 1 µl di ciascuno dei due filtrati per effettuare
la cromatografia su carta descritta al punto 5.
4.2.2. Preparare per ciascun campione due altre sospensioni di 1 e 5 g in 50 ml
di acqua, acidificare con acido cloridrico diluito (2.7), portare a volume
di 100 ml con acqua e mescolare. Filtrare le sospensioni per filtro a
pieghe (3.4) ed utilizzare 1 µl di ciascuno dei due filtrati per effettuare
la cromatografia su carta descritta al punto 5.
4.3.Creme
Omogeneizzare rispettivamente 5 e 20 g di ciascun prodotto in 100 ml
di acqua ed utilizzare le sospensioni per effettuare la cromatografia su
carta descritta al punto 5.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Versare in due recipienti per cromatografia discendente su carta una
determinata quantità dei solventi di sviluppo A (2.2) e B (2.3). Saturare
i recipienti con i vapori dei solventi almeno per 24 ore.
5.2. Depositare su ciascun punto di partenza di una striscia di carta per
cromatografia (Whatman n. 3 o equivalente) di 40 × 20 cm (3.1) o di
altro formato idoneo 1 µl di una delle soluzioni di campione e di riferi-
mento preparate secondo i punti 4 e 2.1, e lasciar evaporare il solvente
all'aria.
5.3. Mettere la striscia di carta (5.2) nella vaschetta riempita con solvente A
(5.1) e cromatografare fino a che il fronte di sviluppo abbia percorso
35 cm (circa 15 ore).
5.4. Ripetere le operazioni descritte ai punti 5.2 e 5.3 con carta per croma-
tografia (Whatman n. 4 o equivalente) (3.1) e con solvente B.
Cromatografare fino a che il fronte di sviluppo abbia percorso 35 cm(circa 5 ore).
5.5. Dopo lo sviluppo togliere le strisce di carta dai recipienti e lasciarle
essiccare all'aria.
5.6. Rilevare le macchie spruzzando:
5.6.1. il reattivo A (2.4) e subito dopo il reattivo B (2.5). Sul cromatogramma
appaiono dapprima le macchie dei persolfati e quindi le macchie di
perossido di idrogeno.
Segnare queste macchie con una matita,
5.6.2. il reattivo C (2.6) sui cromatogrammi ottenuti secondo il punto 5.6.1.
La presenza di bromati è indicata da macchie grigio-blu sui cromato-
grammi.
5.7. Nelle condizioni sopra indicate per i solventi A (2.2) e B (2.3), i valori
Rf delle soluzioni di riferimento (2.1) sono i seguenti:
Solvente A (2.2) Solvente B (2.3)
Persolfato di sodio 0,40 0,10
Persolfato di potassio 0,40 0,02 + 0,05Persolfato di
ammonio0,50 0,10 + 0,20
Bromato di sodio 0,40 0,20
Bromato di potassio 0,40 0,10 + 0,20
Perossido di idrogeno 0,80 0,801982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 5
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B. IDENTIFICAZIONE DEL PEROSSIDO DI BARIO
1. PRINCIPIO
La presenza di perossido di bario è messa in evidenza
— come perossido di idrogeno mediante acidificazione del campione
(A. 4.2),
— per identificazione degli ioni bario.
In assenza di persolfati (A), si aggiunge acido solforico diluito ad una
parte della soluzione di campione acida (B. 4.1), in modo da formare un
precipitato bianco di solfato di bario. La presenza di ioni di bario nella
soluzione di campione (B. 4.1) è confermata mediante cromatografia su
carta eseguita nel modo indicato al precedente punto 5.
In caso di presenza simultanea di perossido di bario e di persolfati (B.
4.2): dopo fusione alcalina e soluzione in acido cloridrico si rivela la
presenza di ioni bario mediante cromatografia su carta e/o mediante
precipitazione allo stato di solfati.
2. REATTIVI
2.1. Metanolo
2.2. Acido cloridrico concentrato al 36 % (m/m)2.3. Acido cloridrico 6 N2.4. Acido solforico 4 N
2.5. Rodizonato disodico
2.6. Cloruro di bario (BaCl
22H2O)
2.7. Carbonato di sodio anidro
2.8. Soluzione acquosa di cloruro di bario all'1 % (m/v)
2.9. Eluente metanolo — acido cloridrico concentrato al 36 % — acqua (80 -
10 - 10 v/v)
2.10. Rivelatore, soluzione acquosa di rodizonato disodico allo 0,1 % (m/v);
preparare la soluzione subito prima dell'uso.
3. APPARECCHIATURE E STRUMENTI
3.1. Micropipetta da 5 µl3.2. Crogioli di platino
3.3. Palloni tarati da 100 ml
3.4. Carta per cromatografia (Schleicher e Schüll 2043 b o equivalente).
Porre la carta per una notte nella vaschetta per cromatografia discen-
dente su carta (A. 3.5) contenente il solvente B. 2.9, e
successivamente asciugarle
3.5. Filtri a pieghe3.6. Normali apparecchiature per la cromatografia ascendente su carta.
4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
4.1.Prodottinoncontenentipersolfati
4.1.1. Omogeneizzare o disciogliere 2 g del prodotto in 50 ml d'acqua e
portare il pH della soluzione al massimo a 1 per mezzo di acido clori-
drico (B. 2.3).
4.1.2. Versare la soluzione o la sospensione in un pallone tarato da 100 ml,
portare a segno con acqua e mescolare. Utilizzare questa soluzione per
effettuare la cromatografia su carta descritta al punto 5 e per identifi-
care il bario mediante precipitazione come solfato.
4.2.Prodotticontenentipersolfati
4.2.1. Omogeneizzare o disciogliere 2 g del prodotto in 100 ml di acqua e
filtrare.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 6
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4.2.2. Aggiungere al residuo essiccato da 7 a 10 volte il suo peso di carbonato
di sodio (B. 2.7), mescolare e riscaldare la miscela in un crogiolo di
platino (B. 3.2) fino a fusione, per una mezz'ora.
4.2.3. Raffreddare alla temperatura ambiente, sospendere il prodotto della
fusione in 50 ml di acqua e filtrare (B. 3.5).
4.2.4. Sciogliere nell'acido cloridrico 6 N (B. 2.3) e portare con acqua a
100 ml. Utilizzare questa soluzione per effettuare la cromatografia su
carta descritta al punto 5 e per identificare il bario mediante precipita-
zione come solfato.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Mettere in una vaschetta per cromatografia ascendente su carta una
certa quantità di solvente (B. 2.9) e saturare la vaschetta per almeno
15 ore.
5.2. Su un foglio di carta per cromatografia, pretrattato come indicato al
punto B. 3.4, depositare in tre punti alla partenza 5 µl rispettivamente
delle soluzioni di cui ai punti B. 4.1.2 e B. 4.2.4 e della soluzione di
riferimento (B. 2.8).
5.3. Fare asciugare le deposizioni all'aria, e cromatografare verticalmente
finché il fronte di sviluppo abbia percorso 30 cm.
5.4. Togliere la carta dalla vaschetta e farla essiccare all'aria.5.5. Rivelare le macchie sul cromatogramma, spruzzando la carta con il
reattivo B. 2.10.
In presenza di bario appaiono sul cromatogramma macchie rosse con un
Rf di 0,10 circa.
C. DOSAGGIO DEL PEROSSIDO DI IDROGENO
1. PRINCIPIO
La determinazione iodometrica del perossido di idrogeno è basata sulla
seguente reazione:
H
2O2+2 H++2 I−→I2+2 H2O
Tale reazione si svolge lentamente, ma è possibile accelerarla aggiun-
gendo molibdato di ammonio. L'iodio formatosi viene determinato per
titolazione con tiosolfato di sodio e permette di determinare il tenore
di perossido di idrogeno.
2. DEFINIZIONE
Il tenore di perossido di idrogeno del campione, determinato nel modo
descritto in appresso, viene espresso in percentuale di massa del prodot-
to.
3. REATTIVI
Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica.
3.1. Acido solforico 2 N
3.2. Ioduro di potassio3.3. Molibdato di ammonio
3.4. Soluzione di tiosolfato di sodio 0,1 N
3.5. Soluzione di ioduro di potassio al 10 % (m/v). Preparare la soluzione
subito prima dell'uso
3.6. Soluzione di molibdato di ammonio al 20 % (m/v)
3.7. Salda di amido all'1 % (m/v)
4. APPARECCHIATURE E STRUMENTI
4.1. Becher di vetro da 100 ml1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 7
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4.2. Buretta da 50 ml
4.3. Palloni tarati da 250 ml4.4. Cilindri graduati da 25 e 100 ml
4.5. Pipette tarate da 10 ml
4.6. Beute da 250 ml
5. PROCEDIMENTO
5.1. In un becher da 100 ml pesare una quantità (m) del prodotto, equiva-
lente a circa 0,6 g di perossido di idrogeno. Travasare
quantitativamente in un pallone tarato da 250 ml con l'aiuto di una
piccola quantità di acqua, portare a volume con acqua e mescolare.
5.2. Pipettare 10 ml della soluzione di campione (5.1) in una beuta da
250 ml (4.6) e aggiungere successivamente 100 ml di acido solforico
2N (3.1), 20 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.5) e tre gocce di
soluzione di molibdato di ammonio (3.6).
5.3. Titolare immediatamente lo iodio formatosi con tiosolfato di sodio 0,1 N
(3.4) e, subito prima di raggiungere il punto di equivalenza, aggiungere
alcuni ml di salda di amido come indicatore. Rilevare il consumo di
tiosolfato di sodio 0,1 N in ml (V).
5.4. Secondo il procedimento indicato ai punti 5.2 e 5.3, effettuare una
prova in bianco sostituendo i 10 ml di soluzione di campione con
10 ml di acqua. Rilevare il consumo in ml di tiosolfato di sodio 0,1 N
nella prova in bianco (Vo).
6. CALCOLO
Calcolare il tenore del prodotto in perossido di idrogeno in percentuale
di massa (% m/m) mediante la seguente formula:
% di perossido di idrogeno ¼
V/C0Vo ðÞ /C2 1;7008 /C2250/C2100
m/C210/C21000
uguale
V/C0Vo ðÞ /C2 4;252
m
in cui:
m = la quantità in grammi del prodotto esaminato (5.1),
Vo = il consumo in ml di soluzione di tiosolfato 0,1 N nella prova in
bianco (5.4),
V = il consumo in ml di soluzione di tiosolfato 0,1 N nella titola-
zione della soluzione di campione (5.3).
7. RIPETIBILITÀ(1)
Per un tenore in perossido di idrogeno di circa il 6 % la differenza tra i
risultati di due dosaggi paralleli effettuati su un medesimo campione
non deve superare lo 0,2 %.
II.IDENTIFICAZIONE E DOSAGGIO SEMIQUANTITATIVO DI
ALCUNI COLORANTI DI OSSIDAZIONE NELLE TINTURE PER
CAPELLI
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Questo metodo permette l'identificazione e il dosaggio semiquantitativo
nelle tinture per capelli in forma di crema o di liquido delle seguenti
sostanze:1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 8
(1) Secondo la norma ISO 5725.
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Sostanze Simbolo
Diaminobenzeni
1-2 diaminobenzene (o. fenilendiamina) (OPD)
1-3 diaminobenzene (m. fenilendiamina) (MPD)
1-4 diaminobenzene (p. fenilendiamina) (PPD)
Diaminotolueni
3-4 diaminotoluene (o. toluilendiamina) (OTD)
2-4 diaminotoluene (m. toluilendiamina) (MTD)
2-5 diaminotoluene (p. toluilendiamina) (PTD)
Diaminofenoli
2-4 diaminofenolo (DAP)
Idrochinone
1-4 diidrossibenzene (H)
α-Naftolo (αN)
Pirogallolo
1-2-3 triidrossibenzene (P)
Resorcina
1-3 diidrossibenzene (R)
2. PRINCIPIO
I coloranti di ossidazione sono estratti a pH 10 dalle tinture sotto forma
di crema o di liquido mediante etanolo a 96 % e identificati mediante
cromatografia in strato sottile; monodimensionale (5) e/o bidimensio-
nale (6).
Per il dosaggio semiquantitativo delle sostanze si raffronta il cromato-
gramma dei campioni, ottenuti mediante quattro sistemi di sviluppo,
con quello delle soluzioni delle sostanze di riferimento cromatografate
contemporaneamente.
3. REATTIVI
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica.
3.1. Etanolo assoluto3.2. Acetone3.3. Etanolo 96 % (v/v)
3.4. Idrossido di ammonio al 25 %
(d
420= 0,91)
3.5. L(+) acido ascorbico3.6. Cloroformio3.7. Cicloesano
3.8. Azoto tecnico
3.9. Toluene3.10. Benzene3.11. n-Butanolo3.12. Butan-2-olo3.13. Acido ipofosforoso al 50 %
3.14. Reattivo diazoico:1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 9
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potranno essere utilizzati:
— il 4-nitro-1-benzendiazonio salificato e stabilizzato con lo ione
clorobenzensolfonato (per esempio Rosso 2 JN della Francolor o
equivalente),
— il 2-cloro-4-nitro-1-benzendiazonio salificato e stabilizzato con lo
ione naftalenbenzoato (per esempio NNCD Reagent — Ref.
n. 74150 della FLUKA o equivalente).
3.15. Nitrato d'argento
3.16. p-Dimetilaminobenzaldeide
3.17. 2-5 Dimetilfenolo3.18. Cloruro ferrico esaidrato
3.19. Acido cloridrico 10 % (m/v)
3.20.Sostanzediriferimento
Le sostanze di riferimento sono quelle indicate al paragrafo 1 «Scopo e
campo di applicazione».
Nel caso degli aminocomposti la sostanza di riferimento deve essere
costituita esclusivamente dalla forma cloridrata (mono o di) o dalla
forma basica.
3.21.Soluzionediriferimento allo0,5%(m/v)
Preparare una soluzione allo 0,5 % (m/v) di ciascuna delle sostanze di
riferimento (3.20).
Pesare 50 mg ± 1 mg di sostanza di riferimento in un matraccio tarato
da 10 ml.
Aggiungere 5 ml di etanolo a 96 % (3.3).
Aggiungere 250 mg di acido ascorbico (3.5).Alcalinizzare mediante soluzione ammoniacale (3.4) fino a un pH di 10
controllato con cartina indicatrice.
Portare a 10 ml con etanolo a 96 % e mescolare.Le soluzioni possono essere conservate per una settimana in un luogo
fresco riparato dalla luce.
In alcuni casi, al momento di aggiungere acido ascorbico e idrossido di
ammonio si può produrre del precipitato. È necessario allora lasciar
sedimentare prima di procedere al prelievo.
3.22.Solventidisviluppo
3.22.1. Acetone — cloroformio — toluene: 35-24-40 (v/v)
3.22.2. Cloroformio — cicloesano — etanolo assoluto — idrossido di ammonio
25 %; 80-10-10-1 (v/v)
3.22.3. Benzene — butan-2-olo — acqua: 50-25-25 (v/v). Agitare bene la
miscela e prelevare la fase superiore dopo aver decantato alla tempera-
tura di laboratorio (tra 20 e 25 ºC).
3.22.4. Butanolo-1 — cloroformio e reattivo M: 7-20-23 (v/v). Lasciare decan-
tare accuratamente a 20—25 ºC e prendere la fase inferiore.
Preparazione del reattivo M
NH
4OH al 25 % (v/v) (3.4) 24 parti (v/v)
Acido ipofosforoso al 50 % (3.13) 1 parte (v/v)
H2O 75 parti (v/v)
Osservazione
I solventi di sviluppo contenenti idrossido di ammonio devono essere
agitati bene immediatamente prima dell'uso.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 10
▼B
3.23.Rivelatori
3.23.1. Reattivo diazoico
Fare una soluzione acquosa al 5 % (m/v) del reattivo (3.14) prescelto.
Tale soluzione deve essere preparata al momento dell'impiego.
3.23.2. Reattivo di Ehrlich
Disciogliere 2 g di p-dimetilamminobenzaldeide (3.16) in 100 ml di
acido cloridrico al 10 % (m/v) (3.19).
3.23.3. 2—5 Dimetilfenolo-cloruro ferrico, esaidrato
Soluzione 1:sciogliere 1 g di dimetilfenolo (3.17) in 100 ml di etanolo a 96 % (3.3)
Soluzione 2:
sciogliere 4 g di cloruro ferrico esaidrato (3.18) in 100 ml di etanolo a
96 % (3.3)
Al momento della rivelazione si nebulizzano separatamente prima la
soluzione 1, poi la soluzione 2.
3.23.4. Nitrato d'argento ammoniacale
A una soluzione acquosa al 5 % (m/v) di nitrato d'argento (3.15)
aggiungere idrossido di ammonio al 25 % (3.4) fino alla dissoluzione
del precipitato. Questo reattivo verrà preparato al momento dell'im-
piego. Non conservare.
4. ATTREZZATURA
4.1. Normale attrezzatura di laboratorio per cromatografia su strato sottile.
4.1.1. Campana o cappa in plastica o vetro costruita in modo da consentire il
mantenimento della lastra cromatografica in atmosfera di azoto durante
il deposito delle soluzioni fino allo sviluppo. Questa precauzione è
necessaria per via della grande ossidabilità di alcuni coloranti.
4.1.2. Siringa da 10 µl, graduata per intervalli di 0,2 µl con un ago a sezione
perpendicolare all'asse longitudinale o meglio un «repeating dispenser»
da 50 µl montato su supporto in modo da consentire la sistemazione
della lastra in atmosfera di azoto.
4.1.3. Lastrine pronte per l'uso, di gel di silice, di 0,25 mm di spessore, di
dimensioni 20 × 20 cm (Macherey e Nagel, Silice G-HR, con supporto
in materiale plastico, o equivalenti).
4.2. Centrifuga da 4 000 giri/minuto.
4.3. Tubi per centrifuga da 10 ml con chiusura mediante tappo a vite.
5. MODO DI OPERARE
5.1.Trattamentodeicampioni
Eliminare i primi 2 o 3 centimetri di crema del tubo. In un tubo per
centrifuga (4.3) preliminarmente saturato con azoto introdurre:
300 mg di acido ascorbico
3 g di crema o 3 g di liquido omogeneizzato.
Qualora il pH fosse inferiore a 10 aggiungere qualche goccia di idro-
ssido di ammonio al 25 % (3.4) e portare a 10 ml con etanolo a 96 %
(3.3).
Omogeneizzare in atmosfera di azoto, tappare, poi centrifugare a 4 000
giri al minuto per 10 minuti.
Utilizzare la soluzione sovrastante.
5.2.Cromatografia
5.2.1. Deposizione della soluzione
Deporre, in atmosfera di azoto su una lastra cromatografica (4.1.3) su 9
punti di partenza 1 µl ciascuna delle soluzioni di riferimento descritte.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 11
▼B
Queste soluzioni di riferimento sono suddivise nel modo seguente:
123456789
R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD
MTD αN
Deporre quindi sul 10oe sull'11opunto 2 µl delle soluzioni campione
ottenute al punto 5.1. Conservare la lastra in atmosfera di azoto fino al
momento in cui viene cromatografata.
5.2.2. Sviluppo
Introdurre la lastra in una vaschetta saturata con uno dei quattro
solventi appropriati (3.22) in atmosfera di azoto e lasciare sviluppare a
temperatura ambiente (da 20 a 25 ºC) e al buio fino a che il fronte del
solvente abbia percorso circa 15 cm a partire dalla linea di partenza.
Estrarre la lastra e asciugarla in atmosfera di azoto a temperatura
ambiente.
5.2.3. Rivelazione
Nebulizzare subito la lastra con uno dei quattro rivelatori citati al punto
3.23.
5.2.4. Identificazione
Si confrontano gli Rf e i colori ottenuti per il campione con quelli delle
sostanze di riferimento.
Sono indicati nella tabella I, a titolo indicativo, gli Rf e le colorazioni
ottenute per ciascuna sostanza in funzione dei diversi solventi di
sviluppo e dei rivelatori.
In caso di identificazione dubbia si può, talvolta, ottenere una conferma
aggiungendo al campione in esame la sostanza di riferimento corrispon-
dente.
5.2.5. Dosaggio semiquantitativo
Si confronta visivamente l'intensità del colore della macchia corrispon-
dente alla sostanza identificata come in 5.2.4 con quella delle macchie
corrispondenti a deposizioni di soluzioni della sostanza di riferimento
aventi concentrazione nota ed appropriata.
Quando la concentrazione nel campione del componente da analizzare è
troppo alta, diluire convenientemente la soluzione da cromatografare edeffettuare un nuovo dosaggio.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 12
TABELLA I
Rfecolorazioni ottenuteimmediatamentedoporivelazione
Prodotti di rife-
rimento
(3.20)Solventi di sviluppo Rivelatori
Rf Colorazioni
3.22.1 3.22.2 3.22.3 3.22.4Reattivo diazoico
(3.23.1)Reattivo di Ehrlich
(3.23.2)Reattivo di dimetilfe-
nolo
(3.23.3)Reattivo di nitrato
d'argento
(3.23.4)
OPD 0,62 0,60 0,30 0,57 Marrone pallido — — Marrone pallido
MPD 0,40 0,60 0,47 0,48 Marrone violaceo* Giallo Marrone pallido Marrone pallido
PPD 0,20 0,50 0,30 0,48 Marrone Rosso vivo* Violetto Grigio
OTD 0,60 0,60 0,53 0,60 Marrone* Arancione pallido Marrone pallido Marrone-grigio
MTD 0,40 0,67 0,45 0,60 Marrone rosso* Giallo Marrone Nero
PTD 0,33 0,65 0,37 0,70 Marrone Arancione Violetto* Grigio
DAP 0,07 — 0 0,05 Marrone* Arancione Violetto Marrone
H 0,50 0,35 0,80 0,20 — Arancione Violetto Nero*
αN 0,90 0,80 0,90 0,75 Arancione
marrone— Violetto* Nero
P 0,37 — 0,67 0,05 Marrone Violetto chiaris-
simoMarrone chiaris-
simoMarrone*
R 0,50 0,37 0,80 0,17 Arancione* Violetto pallido Marrone chiaris-
simoMarrone pallido
Note:1. L'OPD è rivelato debolmente, l'eluente 3.22.3 deve essere utilizzato per separarlo nettamente dall'OTD.
2. * indica le rivelazione ottimale.▼B1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 13
▼B
6. ESAME MEDIANTE CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE SU
STRATO SOTTILE
La cromatografia bidimensionale su strato sottile qui descritta rende
necessario il ricorso ai reattivi e prodotti supplementari di seguito elen-
cati.
6.1.Sostanzeesoluzionidiriferimento
6.1.1. β-Naftolo ( β-N)
6.1.2. 2-Aminofenolo (OAP)
6.1.3. 3-Aminofenolo (MAP)
6.1.4. 4-Aminofenolo (PAP)
6.1.5. 2-Nitro-p-fenilendiamina (2 NPPD)
6.1.6. 4-Nitro-o-fenilendiamina (4 NOPD)
Preparare una soluzione allo 0,5 % (m/v) di ciascuna delle suddette
sostanze di riferimento, come indicato al punto 3.21.
6.2.Solventedisviluppo
6.2.1. Acetato di etile-cicloesano-idrossido di ammonio al 25 %: 65-35-0,5 (v/
v)
6.3.Rivelatore
Sistemare in una vaschetta per cromatografia su strato sottile circa 2 g
di iodio, contenuti in un opportuno recipiente e chiudere ermeticamente.
6.4.Cromatografia
6.4.1. Tracciare, come indicato nella figura 1, due linee sullo strato di silice di
una lastra cromatografica per strato sottile (4.1.3).
6.4.2. In atmosfera di azoto, deporre sul punto di partenza 1 (figura 1) da 1 a
4 µl di estratto (5.1). La quantità dipende dall'intensità delle macchie
ottenute sul cromatogramma (5.2).
6.4.3. Deporre, suddivisi tra i punti 2 e 3 (figura 1), i coloranti di ossidazione
identificati (o supposti identificati) al punto 5.2. Distanza tra le macchie
1,5 cm. Deporre 2 µl di ciascuna delle soluzioni di riferimento ad ecce-
zione del DAP di cui è necessario deporre 6 µl. Operare in atmosfera di
azoto (6.4.2).
6.4.4. Ripetere l'operazione descritta al punto 6.4.3 per i punti di partenza 4 e
5 (figura 1) e conservare la lastra in atmosfera di azoto fino all'effettua-
zione della cromatografia.
6.4.5. Saturare una vaschetta per cromatografia con azoto e introdurre una
quantità appropriata di solvente di sviluppo (3.22.2). Sistemare la lastra
(6.4.4) nella vaschetta e cromatografare nella prima direzione d'elui-
zione (figura 1) al riparo dalla luce. Cromatografare fino al momento
in cui il fronte del solvente raggiunga la linea tracciata sullo strato
assorbente.
6.4.6. Estrarre la lastra dalla vaschetta a sistemarla nell'apparecchiatura (4.1)
sotto atmosfera di azoto per almeno 1 ora, allo scopo di allontanare il
solvente residuo.
6.4.7. Introdurre mediante un cilindro graduato, in una vaschetta dalla quale è
stata scacciata completamente l'aria con una corrente di azoto, una
quantità appropriata di miscela solvente (6.2.1). In tale vaschetta si
sistema la lastrina dopo averla ruotata di 90º rispetto alla prima dire-
zione di sviluppo. Si fa procedere la cromatografia in questa seconda
direzione, ed al buio, finché il fronte del solvente non raggiunga la
linea tracciata sullo strato di silice. Tale lastrina si asciuga quindi
all'aria.
6.4.8. Sistemare la lastra per 10 minuti nella vaschetta cromatografica in
atmosfera di vapori di iodio (6.3) e interpretare il cromatogramma bidi-
mensionale mediante i valori Rf e del colore delle sostanze di
riferimento cromatografate contemporaneamente (tabella II).
Osservazioni
Per ottenere una migliore colorazione delle macchie lasciare la lastrina,
dopo lo sviluppo, ad asciugare per trenta minuti all'aria.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 14
▼B
6.4.9. La presenza di coloranti di ossidazione trovati in 6.4.8 può essere
confermata inequivocabilmente ripetendo le operazioni descritte dal
punto 6.4.1 al punto 6.4.8 compreso, aggiungendo sul punto di partenza
1, accanto alla quantità di estratto prescritta in 6.4.2, 1 µl delle sostanze
di riferimento identificate in 6.4.8.
Se non viene trovata alcun'altra macchia, per raffronto col cromato-
gramma ottenuto in 6.4.8, l'interpretazione del cromatogramma 6.4.8 è
corretta.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 15
▼B
TABELLA II
Colore delle sostanze di riferimento cromatografate e rivelate mediante
vaporidiiodio
Sostanze di riferi-
mentoColorazione dopo rivelazione ai vapori di iodio
R Beige
P Marrone
α-N Violetto
β-N Marrone chiaro
H Violetto-marrone
MPD Giallo-marrone
PPD Violetto-marrone
MTD Marrone scuro
PTD Giallo-marrone
DAP Marrone scuro
AOP Arancione
MAP Giallo-marrone
PAP Violetto-marrone
2-NPPD Marrone
4-NOPD Arancione
Figura 1
1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 16
▼B
III.IDENTIFICAZIONEEDOSAGGIODEINITRITI
A. IDENTIFICAZIONE
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo descritto serve all'identificazione dei nitriti nei prodotti
cosmetici; esso è applicabile, in particolare, alle creme, ai prodotti
pastosi e ai dentifrici.
2. PRINCIPIO
La rilevazione dei nitriti ha luogo mediante il fenilidrazone della 2-
aminobenzaldeide.
3. REATTIVI
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica
3.1. Acido solforico diluito:
diluire 2 ml di acido solforico concentrato (d420= 1,84) in 11 ml d'acqua
distillata.
3.2. Acido cloridrico diluito:
diluire 1 ml di acido cloridrico concentrato (d420= 1,19) in 11 ml di
acqua distillata.
3.3. Metanolo3.4. Soluzione del fenilidrazone della 2-aminobenzaldeide (reagente Nitrina
R) in metanolo.
Pesare 2 g di Nitrina R e introdurli in un pallone tarato da 100 ml.
Aggiungere goccia a goccia 4 ml di acido cloridrico diluito (3.2) e
mescolare. Portare a volume con metanolo (3.3) e agitare finché la solu-
zione sia completamente limpida. Conservare la soluzione in un flacone
di vetro scuro (4.3).
4. ATTREZZATURA
4.1. Becher da 50 ml4.2. Pallone tarato da 100 ml4.3. Flacone di vetro scuro da 125 ml4.4. Lastra di vetro di 10 × 10 cm4.5. Spatola di materiale sintetico4.6. Carta da filtro 10 × 10 cm
5. PROCEDIMENTO
5.1. Spandere uniformemente una parte del campione da esaminare sulla
lastra di vetro (4.4). Fare attenzione che lo spessore dello strato non
sia superiore a 1 cm.
5.2. Immergere un foglio di carta da filtro (4.6) nell'acqua distillata e depo-
sitarlo sul campione facendolo aderire convenientemente per mezzo di
una spatola (4.5).
5.3. Attendere circa 1 minuto e versare al centro della carta da filtro:
— 2 gocce di acido solforico diluito (3.1) e poi
— 2 gocce della soluzione di Nitrina (3.4).
5.4. Dopo 5-10 secondi, togliere la carta da filtro ed esaminarla alla luce del
giorno. Una colorazione rosso-violetta indica la presenza di nitriti.
Quando il tenore di nitriti è poco elevato, il colore violetto vira al giallo
dopo 5-15 secondi. Quando il tenore di nitriti è più elevato, il cambia-
mento di colore ha luogo soltanto dopo 1-2 minuti.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 17
▼B
6. NOTA
L'intensità del colore violetto e il tempo per il viraggio al giallo può
dare una indicazione del tenore dei nitriti nel campione.
B. DETERMINAZIONE
1. SCOPO E CAMPO D'APPLICAZIONE
Il metodo descrive il dosaggio dei nitriti nei prodotti cosmetici.
2. DEFINIZIONE
Il tenore in nitriti del campione determinato in base al metodo indicato
è espresso come percentuale in massa di nitrito sodico.
3. PRINCIPIO
Dopo diluizione in acqua e chiarificazione del campione, si fa reagire il
nitrito presente con solfanilamide e N-1-naftil-etilendiammina. Si
sviluppa un colore la cui assorbanza si misura a 538 nm.
4. REATTIVI
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica.
4.1. Reattivi per la chiarificazione (tali reattivi non devono essere utilizzati
una settimana dopo la loro preparazione)
4.1.1. Reattivo CarrezI
Sciogliere 106 g di ferrocianuro (II) di potassio, K4Fe(CN)6·3H2O,
nell'acqua distillata e portare con acqua a 1 000 ml.
4.1.2. Reattivo CarrezII
Sciogliere 219,5 g di acetato di zinco, Zn(CH3COO)2·2H2O e 30 ml di
acido acetico glaciale nell'acqua distillata e portare con acqua a
1 000 ml.
4.2. Soluzione di nitrito sodico
In un pallone tarato da 1 000 ml sciogliere 0,500 g di nitrito sodico in
acqua distillata e portare a volume. Diluire con acqua 100 ml di questa
soluzione madre fino al volume di 500 ml; la concentrazione di questa
soluzione è tale che 1,0 ml corrisponde a 10 µg di nitrito di sodio.
4.3. Soluzione di idrossido di sodio 1N
4.4. Soluzione di cloridrato di solfanilammide allo 0,2 %
Sciogliere 2,0 g di solfanilammide in 800 ml di acqua, riscaldando.
Lasciar raffreddare e aggiungere 100 ml di HCl concentrato, agitando.Portare con acqua al volume di 1 000 ml.
4.5. Acido cloridrico 5 N
4.6. Reattivo N 1 naftile
La soluzione deve essere preparata il giorno stesso dell'impiego.
Sciogliere 0,1 g di dicloridrato di N-1-naftiletilendiammina in acqua e
portare al volume di 100 ml.
5. APPARECCHIATURE
5.1. Bilancia analitica5.2. Palloni tarati da 100, 250, 500 e 1 000 ml
5.3. Pipette tarate
5.4. Cilindri graduati da 100 ml
5.5. Filtro a pieghe, esente da nitriti, di 15 cm di diametro
5.6. Bagnomaria5.7. Spettrofotometro con celle di 1 cm di percorso ottico1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 18
▼B
5.8. pH metro
5.9. Microburette da 10 ml5.10. Becher da 50 ml
6. PROCEDIMENTO
6.1. Pesare con la precisione di 0,1 mg, circa 0,5 g (m) del campione
omogeneizzato, introdurlo dentro un pallone da 250 ml con acqua distil-
lata calda al volume di 150 ml circa. Tenere a bagnomaria a 80 º per
una mezzora, agitando di tanto in tanto il contenuto.
6.2. Lasciare raffreddare il contenuto alla temperatura ambiente e aggiun-
gere successivamente agitando 2 ml del reattivo CarrezI (4.1.1) e 2 ml
del reattivo CarrezII (4.1.2).
6.3. Portare il pH a 8,3 per mezzo di una soluzione 1 N di idrossido di sodio
(4.3). Usare un pH metro per la misurazione del pH della soluzione.
Trasferire quantitativamente il contenuto in un matraccio tarato da
250 ml e portare a volume con acqua distillata.
6.4. Agitare il contenuto e filtrare su filtro a pieghe (5.5).6.5. Pipettare un'opportuna quantità (V ml) di filtrato limpido, ma in ogni
caso non più di 25 ml, in un matraccio tarato da 100 ml e diluire con
acqua distillata a 60 ml.
6.6. Dopo aver mescolato, aggiungere 10,0 ml di soluzione di acido clori-
drico 5 N (4.5). Mescolare e lasciare riposare per 5 minuti.
Aggiungere 2,0 ml del reattivo N-1-naftile (4.6), mescolare e lasciar
riposare per 3 minuti. Portare con acqua al volume di 100 ml e mesco-
lare.
6.7. Preparare un saggio in bianco ripetendo le operazioni descritte in 6.5 e
6.6 senza aggiunta del reattivo N-1-naftile (4.6).
6.8. Misurare (5.7) la densità ottica, a 538 nm, della soluzione campione
(6.6) in confronto con il «bianco» (6.7).
6.9. Leggere sulla curva di taratura (6.10) il tenore in nitrito di sodio in µg
per 100 ml di soluzione da misurare (m
1) che corrisponda all'estinzione
misurata per il campione (6.8).
6.10 Curva di taratura
Preparare, usando la soluzione di nitrito di sodio (4.2) una serie di solu-
zioni a differenti concentrazioni (0-20-40-60-80-100 µg di sodio nitrito
per 100 ml). Dopo reazione, misurare per ognuna di esse l'assorbanza a
538 nm e costruire una curva di taratura.
7. CALCOLO
Calcolare il tenore in nitrito di sodio del campione, come percentuale
della massa, per mezzo della seguente formula:
% NaNO 2¼250
V/C2m1/C210/C06/C2100
m¼m1
V/C2m/C240
in cui:
m = la massa in grammi del campione in esame (6.1),
m1= il tenore in nitrito di sodio in microgrammi riscontrato in base
alle indicazioni del punto 6.9,
V = il numero di ml di filtrato utilizzato per la misurazione (6.5).1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 19
▼B
8. RIPETIBILITÀ(1)
Per un contenuto di circa 0,2 % di nitrito di sodio la differenza tra i
risultati di due dosaggi paralleli effettuati sul medesimo campione non
deve superare lo 0,005 % in valore assoluto.
IV.IDENTIFICAZIONE E DOSAGGIO DELLA FORMALDEIDE
LIBERA
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo descrive l'identificazione e due dosaggi della formaldeide
libera a seconda o no della presenza di donatori di formaldeide. Esso è
applicabile a tutti i prodotti cosmetici.
1.1.Identificazione
1.2.Dosaggiocolorimetrico globaleconacetilacetone
Questo metodo si applica quando la formaldeide è usata da sola o con
altri conservanti che non cedano formaldeide.
In caso contrario e se il risultato ottenuto con tale metodo supera la
concentrazione massima autorizzata nel prodotto finito, si utilizza il
metodo successivo.
1.3.Dosaggioinpresenzadiprodottichecedonoformaldeide
Nel metodo precedente al momento della derivatizzazione le sostanze
che cedono formaldeide sono idrolizzate e conducono a risultati troppo
elevati (formaldeide libera e formaldeide liberata). È quindi obbliga-
torio separare la formaldeide libera con una cromatografia liquida.
2. DEFINIZIONE
Il contenuto di formaldeide libera nel campione determinato secondo
questo metodo viene espresso in percentuale di massa di formaldeide.
3. IDENTIFICAZIONE
3.1.Principio
In ambiente di acido solforico, la formaldeide libera e quella combinata
danno una colorazione rosa o malva in presenza di reattivo di Schiff.
3.2.Reattivi
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica e l'acqua deve essere
demineralizzata.
3.2.1. Fucsina3.2.2. Solfito di sodio eptaidrato con 7H
2O
3.2.3. Acido cloridrico concentrato (d=1,19)
3.2.4. Acido solforico, circa 1M
3.2.5. Reattivo di Schiff
In un beker pesare 100 mg di fucsina (3.2.1), solubilizzarla alla tempe-
ratura di 80 ºC con 75 ml di acqua demineralizzata. Raffreddare e
aggiungere 2,5 g di solfito di sodio (3.2.2) e 1,5 ml di acido cloridrico
(3.2.3). Portare a 100 ml.
Tempo di conservazione: 2 settimane.
3.3.Mododioperare
3.3.1. Versare, in un beker da 10 ml, circa 2 g di campione.
3.3.2. Aggiungere 2 gocce di H2SO4(3.2.4) e 2 ml di reattivo di Schiff (3.2.5).
Al momento dell'uso questo reattivo deve essere assolutamente inco-
lore.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 20
(1) Secondo la norma ISO 5725.▼M1
▼M1
Agitare e lasciare riposare per cinque minuti.
3.3.3. Se entro cinque minuti si nota una colorazione rosa o malva, la quantità
di formaldeide presente è superiore allo 0,01 %.
Procedere allora al dosaggio della formaldeide libera e di quella combi-
nata come descritto al punto 4, ed eventualmente al punto 5.
4. DOSAGGIO COLORIMETRICO GLOBALE CON ACETILACE-
TONE
4.1.Principio
In presenza di acetato di ammonio la formaldeide reagisce con acetila-
cetone per formare la 3,5 diacetil-1,4-diidrotoluidina, che viene estratta
con n-butanolo. Si misura quindi a 410 nm l'assorbanza dell'estratto
butanolico.
4.2.Reattivi
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica e l'acqua deve essere
demineralizzata.
4.2.1. Ammonio acetato anidro4.2.2. Acido acetico (d
204 = 1,05)
4.2.3. Acetilacetone distillato di recente sotto vuoto 25 mm Hg 25º e tale da
non presentare assorbanza a 410 nm
4.2.4. n-butanolo
4.2.5. Acido cloridrico M
4.2.6. Acido cloridrico, circa 0,1 M4.2.7. Idrossido di sodio M
4.2.8. Salda d'amido: preparata di fresco secondo la Farmacopea europea (1 g/
50 ml di acqua) 2
aedizione 1980, parte I-VII-1-1
4.2.9. Soluzione di formaldeide al 37-40 %
4.2.10. Soluzione titolata di iodio 0,05 M
4.2.11. Soluzione titolata di sodio tiosolfato 0,1 M
4.2.12. Reattivo all'acetilacetone
In un matraccio tarato da 1 000 ml sciogliere:
— 150 g di acetato di ammonio (4.2.1)
— 2 ml di acetilacetone (4.2.3)
— 3 ml di acido acetico (4.2.2)
Portare a volume con acqua (pH della soluzione circa 6,4).Questo reattivo deve essere stato preparato di recente.
4.2.13. Reattivo (4.2.12) senza acetilacetone
4.2.14. Soluzione di riferimento di formaldeide: soluzione madre
Introdurre 5 g di formaldeide (4.2.9) in un matraccio tarato da 1 000 ml
e portare a volume con acqua.
Determinare il titolo della soluzione madre:Prelevare 10,00 ml, aggiungere 25,00 ml della soluzione titolata di
iodio (4.2.10) e 10 ml di soluzione d'idrossido di sodio (4.2.7).
Lasciare a riposo per cinque minuti.
Acidificare con 11 ml di HCl (4.2.5) e dosare l'eccesso di iodio con una
soluzione titolata di tiosolfato di sodio (4.2.11) in presenza di salda
d'amido come indicatore.
1,00 ml di soluzione di iodio (4.2.10) corrisponde a 1,5 mg di formal-
deide.
4.2.15. Soluzione di riferimento di formaldeide diluita
Pipettare 5,00 ml di soluzione 4.2.14 in un matraccio tarato da 100 ml e
portare a volume con acqua.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 21
▼M1
Pipettare 5,00 ml della suddetta soluzione in un matraccio tarato da
500 ml e portare a volume con acqua.
1 ml di quest'ultima soluzione contene circa 1 µg di formaldeide.Questo titolo va controllato esattamente.
4.3.Apparecchiatura
4.3.1. Materiale comune di laboratorio4.3.2. Filtro «separatore di fasi» Whatman 1 PS o analogo4.3.3. Centrifuga
4.3.4. Bagnomaria con termostato a 60 ºC
4.3.5. Spettrofotometro4.3.6. Cellette di vetro con cammino ottico di 1 cm
4.4.Mododioperare
4.4.1. Soluzione campione
In un matraccio tarato da 100 ml pesare con la precisione di 0,001 g
una quantità (m espressa in g) di campione da analizzare, tale da conte-
nere circa 150 µg di formaldeide.
Portare a volume con acqua e mescolare (soluzione S). Verificare che il
pH sia prossimo a 6, in caso contrario effettuare la diluizione nella
soluzione di acido cloridrico (4.2.6).
Versare in una beuta da 50 ml:
— 10,00 ml di soluzione S
— 5,00 ml di reattivo all'acetilacetone (4.2.12)— acqua sino ad un volume totale di 30 ml
4.4.2. Soluzione di riferimento
Le possibili interferenze di un colore di fondo presente nel campione in
esame possono essere eliminate con questa soluzione di riferimento.
Porre in una beuta conica da 50 ml:
— 10,00 ml di soluzione S
— 5,00 ml del reattivo (4.2.13)— acqua sino ad un volume totale di 30 ml
4.4.3. Soluzione per la prova in bianco
Porre in una beuta da 50 ml:
— 5,00 di reattivo all'acetilacetone (4.2.12)
— acqua sino ad un volume totale di 30 ml
4.4.4. Dosaggio
4.4.4.1. Agitare le soluzioni preparate come indicato ai punti 4.4.1, 4.4.2 e
4.4.3.
Immergere le beute in bagnomaria alla temperatura di 60 ºC per dieci
minuti esatti.
Raffreddare poi tenendo le suddette beute per due minuti in un bagno di
acqua ghiacciata.
4.4.4.2. Trasferire separatamente il contenuto di ogni beuta in un imbuto sepa-
ratore da 50 ml contenente 10,0 ml esatti di n-butanolo (4.2.4). Lavare
ogni beuta con 3-5 ml di acqua,
Agitare vigorosamente ogni imbuto separatore per 30 secondi esatti,
Lasciare decantare.
4.4.4.3. Filtrare la fase butanolica con un filtro «separatore di fasi» (4.3.2) nelle
cellette di misura.
Si può anche ricorrere ad un centrifugazione della fase organica (3 000 g
per cinque minuti).
4.4.4.4. Misurare l'assorbanza A
1a 410 nm della fase organica della soluzione
(4.4.1) rispetto alla fase organica della soluzione (4.4.2).1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 22
▼M1
4.4.4.5. Analogamente misurare l'assorbanza A2della fase organica della solu-
zione (4.4.3) rispetto al n-butanolo.
NB: Queste operazioni devono avvenire entro 25 minuti dall'inizio
della termostatazione a 60 ºC.
4.4.5. Curva di taratura
4.4.5.1. Porre in una beuta da 50 ml:
— 5,00 ml di soluzione di riferimento diluita (4.2.15)
— 5,00 ml di reattivo all'acetilacetone (4.2.12)
— acqua sino ad un volume totale di 30 ml
4.4.5.2. Continuare il procedimento analitico come descritto in (4.4.4) e misu-
rare l'assorbanza usando n-butanolo (4.2.4) come riferimento.
4.4.5.3. Ripetere il procedimento con 10, 15, 20, 25 ml di soluzione standard
diluita (4.2.15).
4.4.5.4. Per ottenere il valore del punto 0 (corrispondente alla colorazione dei
reattivi) procedere come descritto al punto 4.4.4.5).
4.4.5.5. Costruire la curva di taratura dopo la sottrazione del valore dell'assor-
banza del punto 0 al valore di ogni assorbanza ottenuta ai punti
4.4.5.1 e 4.4.5.3.
La legge Beer è rispettata per una quantità di formaldeide che non
superi i 30 µg.
4.5.Calcoli
4.5.1. Sottrarre il valore di A2da A1e leggere sulla curva di taratura (4.4.5.5)
la quantità C espressa in µg di formaldeide contenuta nella soluzione
(4.4.1).
4.5.2. Il contenuto di formaldeide del campione (% m/m) si calcola con la
seguente formula:
% Formaldeide ¼C
103/C1m
m: massa in grammi del campione da analizzare.
4.6.Ripetibilità (1)
Per un contenuto di formaldeide dello 0,2 %, la differenza tra i risultati
di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non
deve superare 0,005 % per il dosaggio colorimetrico con acetilacetone.
Se con il dosaggio della formaldeide libera si ottengono valori superiori
a quelli previsti dalla direttiva 76/768/CEE, e cioè:
a) compresi tra 0,05 % e 0,2 % per prodotti non etichettati;
b) superiore allo 0,2 % per prodotti etichettati o non: si deve operare
con il metodo descritto al paragrafo 5.
5. DOSAGGIO IN PRESENZA DI SOSTANZE CHE CEDONO
FORMALDEIDE
5.1.Principio
La formaldeide separata è trasformata in derivato lutidinico con acetila-
cetone in un reattore postcolonna. Il derivato formato viene identificato
mediante assorbimento a 420 nm.
5.2.Reattivi
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica e l'acqua deve essere
demineralizzata.
5.2.1. Acqua per HPLC
5.2.2. Acetato di ammonio anidro
5.2.3. Acido acetico concentrato1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 23
(1) Secondo la norma ISO 5725.
▼M1
5.2.4. Acetilacetone (conservato a 4 ºC)
5.2.5. Fosfato disodico anidro5.2.6. Acido ortofosforico all'85 % (d = 1,7)
5.2.7. Metanolo
5.2.8. Diclorometano5.2.9. Soluzione di formaldeide al 37-40 %5.2.10. Idrossido di sodio M
5.2.11. Acido cloridrico M
5.2.12. Acido cloridrico 0,002 M5.2.13. Salda d'amido preparata di fresco secondo la Farmacopea europea
5.2.14. Soluzione titolata di iodio 0,05 M
5.2.15. Soluzione titolata di sodio tiosolfato 0,1 M
5.2.16. Fase mobile
Soluzione acquosa di fosfato disodico (5.2.5) 0,006 M portata a pH 2,1
con acido ortofosforico (5.2.6).
5.2.17. Reattivo postcolonna
Disciogliere in una beuta tarata da 1 000 ml:
— 62,5 g di acetato di ammonio (5.2.2)
— 7,5 ml di acido acetico (5.2.3)
— 5 ml di acetilacetone (5.2.4)
Portare a volume con acqua (5.2.1).
Mantenere questo reattivo al riparo della luce a 25 ºC (conservazione: 3
giorni): non si devono evidenziare cambi di colore.
5.2.18. Soluzione di riferimento di formaldeide: soluzione madre
In un matraccio tarato da 1 000 ml, introdurre 10 g di soluzione di
formaldeide (5.2.9) e portare a volume con acqua. Determinazione del
titolo in formaldeide di tale soluzione:
Prelevare 5,00 ml, aggiungere 25,00 ml della soluzione titolata di iodio
(5.2.14) e 10 ml di soluzione di idrossido di sodio (5.2.10).
Lasciare a riposo per cinque minuti. Acidificare con 11 ml di HCl
(5.2.11) e titolare l'eccesso di iodio con una soluzione titolata di sodio
tiosolfato (5.2.15) usando come indicatore salda d'amido (5.2.13).
1,00 ml di soluzione di iodio 0,1 N corrisponde a 1,5 mg di formal-
deide.
5.2.19. Soluzione di riferimento di formaldeide: soluzione diluita
Diluire a 1/100 la soluzione madre nella fase mobile (5.2.16).
1 ml di tale soluzione contiene circa 37 µ di formaldeide.Questo titolo va controllato esattamente.
5.3.Apparecchiatura
5.3.1. Materiale comune di laboratorio5.3.2. Una pompa HPLC senza pulsazioni5.3.3. Una pompa a bassa pressione senza pulsazioni per il reattivo (o una
seconda pompa HPLC avente le stesse caratteristiche della prima)
5.3.4. Una valvola di iniezione munita di un loop da 10 µl
5.3.5. Il reattore postcolonna è costituito dai seguenti componenti:
un pallone a tre colli da 1 l
+ un riscaldatore per palloni da 1 l+ 2 colonne Vigreux con un minimo di 10 piatti (refrigerante ad aria)1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 24
▼M1
+ tubo inox (per scambio termico) da 1,6 mm - Ø interno 0,23 mm;
L = 400 mm
+ tubo in Teflon da 1,6 mm - Ø interno 0,30 mm; L = 5 m (vedere
allegato I)
+ 1 raccordo a T senza volume morto (Valco o equivalente)+ 3 raccordi Union senza volume mortoÈ possibile utilizzare un modulo postcolonna (Applied Biosystems
PCRS 520 o equivalente) munito di un reattore da 1 ml.
5.3.6. Membrana filtrante da 0,45 µm (Gelman o equivalente)
5.3.7. Cartuccia filtrante SEP PAKR C 18 o equivalente
5.3.8. Colonne pronte per l'uso
— Bischoff hypersil RP 18 (tipo NC rif C 25.46 1805)
(5 µm - L = 250 mm - Ø interno = 4,6 mm), oppure Dupont, Zorbax
ODS (5 µm - L = 250 mm - Ø interno = 4,6 mm), oppure Phase
SEP, spherisorb ODS 2 (5µm - L = 250 mm — Ø interno = 4,0 mm)
5.3.9. Precolonna
— Bischoff K
1hypersil RP 18 (Rif K1G 6301 1805)
5µm - L = 10 mm, o equivalente
5.3.10. La colonna e la precolonna sono collegate con un sistema Ecotube (rif.
A 15020508 Bischoff) equivalente.
5.3.11. Effettuare il montaggio dell'apparecchiatura 5.3.5 secondo lo schema
riportato nell'appendice 2
I collegamenti dopo la valvola ad iniezione devono essere i più corti
possibile. In questo caso il tubo inossidabile inserito tra l'uscita del reat-
tore e l'entrata del rivelatore ha lo scopo di raffreddare la miscela prima
della rivelazione. La temperatura non è nota, ma costante.
5.3.12. Rivelatore UV visibile5.3.13. Registratore5.3.14. Centrifuga5.3.15. Bagno ad ultrasuoni
5.3.16. Agitatore oscillante (tipo Vortex o equivalente)
5.4.Mododioperare
5.4.1. Curva di taratura
Viene effettuata usando il valore dell'altezza dei picchi ottenuti in
funzione delle concentrazioni corrispondenti. Si preparano le soluzionistandard per diluizione della soluzione di riferimento di formaldeide
(5.2.19) con la fase mobile (5.2.16).
— 1,00 ml di soluzione di riferimento (5.2.19) diluita a 20,00 ml corri-
sponde a circa 185 µg/100 ml
— 2,00 ml di soluzione di riferimento (5.2.19) diluita a 20,00 ml corri-
sponde a circa 370 µg/100 ml
— 5,00 ml di soluzione di riferimento (5.2.19) diluita a 25,00 ml corri-
sponde a circa 740 µg/100 ml
— 5,00 ml di soluzione di riferimento (5.2.19) diluita a 20,00 ml corri-
sponde a circa 925 µg/100 ml
Le soluzioni standard sono conservate per circa un'ora alla temperatura
di laboratorio e devono essere preparate di recente.
Si ha una buona linearità della curca di taratura per concentrazioni
comprese fra 100 e 1 500 µg/100 ml.
5.4.2. Preparazione dei campioni
5.4.2.1. Emulsioni (creme — fondi tinta — eyelliners)
Pesare in una beuta tappata da 100 ml con la precisione di 0,001 g, una
massa (m) del campione da esaminare (in g) corrispondente ad una
quantità di formaldeide che si suppone di circa 100 µg.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 25
▼M1
Aggiungere 20,00 ml di diclorometano (5.2.8) e 20,00 ml di acido clori-
drico (5.2.12).
Mescolare con l'agitatore oscillante (5.3.16) e con gli ultrasuoni
(5.3.15). Separare le due fasi per centrifugazione (3 000 g. per 2
minuti).
Lavare quindi una cartuccia filtrante (5.3.7) con 2,00 ml di metanolo
(5.2.7) e condizionarla con 5 ml di acqua (5.2.1). Far passare 4 ml della
fase acquosa dell'estratto attraverso la cartuccia condizionata, eliminare
i primi 2 ml e recuperare la frazione successiva.
5.4.2.2. Lozioni e shampoo
Pesare con la precisione di 0,001 g una massa (m) del campione in
esame (in g) corrispondente ad una quantità di formaldeide che si
suppone di circa 500 µg.
Completare a 100 ml con la fase mobile (5.2.16) filtrare la soluzione su
un filtro (5.3.6) e iniettarla o farla passare attraverso una cartuccia
(5.3.7) come descritto precedentemente al 5.4.2.1. Tutte le soluzioni
vanno iniettate subito dopo essere state preparate.
5.4.3. Condizioni cromatografiche
— Flusso della fase mobile: 1 ml/min
— Flusso del reattivo: 0,5 ml/min
— Flusso totale all'uscita del rivelatore: 1,5 ml/min— Volume iniettato: 10 µl
— Temperatura di eluizione: nelle separazioni difficili la colonna è
immersa in un bagno di ghiaccio fondente: attendere che si
raggiunga l'equilibrio termico.
— Temperature di reazione postcolonna: 100 ºC— Rivelazione: 420 nm
NB:Dopo l'uso il gruppo sistema cromatografico e postcolonna deve
essere sciacquato con acqua 5.2.1. Nel caso di arresto di più di
due giorni a tale risciacquo deve seguirne un altro effettuato con
metanolo. Prima di ricondizionare il sistema effettuare un
passaggio con acqua per evitare ricristallizzazioni.
5.5.Calcolo
Emulsioni (5.4.2.1)
Tenore di formaldeide % (m/m):
C/C110/C06/C1100
5m¼C/C110/C04
5/C1m
Lozioni e shampoo (5.4.2.2)
Tenore in formaldeide % (m/m):
C/C110/C06/C1100
m¼C/C110/C04
m
dove:
m = massa in g del campione in esame;
C = concentrazione in µg/100 ml in formaldeide letta sulla curca di
taratura (5.4.1).1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 26
▼M1
5.6.Ripetibilità (1)
Per un tenore di formaldeide dello 0,2 % la differenza tra i risultati di
due dosaggi paralleli effettuati su un medesimo campione non deve
superare lo 0,005 %.
Per un tenore di formaldeide dello 0,05 %, la differenza tra i risultati di
due dosaggi paralleli effettuati su un medesimo campione non deve
superare lo 0,001 %.
V.DETERMINAZIONE DELLA RESORCINA NEGLI SHAMPOO E
NELLELOZIONIPERCAPELLI
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente metodo descrive la determinazione gascromatografica della
resorcina negli shampoo e lozioni per capelli.
Esso è applicabile per concentrazioni di resorcina in prodotti finiti
oscillanti tra 0,1 % e 2 % in massa.
2. DEFINIZIONE
Il titolo di resorcina determinato secondo questo metodo si esprime in
percentuale di massa.
3. PRINCIPIO
La resorcina ed il 3,5-diidrossitoluene, aggiunto come standard interno,
vengono separati dal campione in esame mediante cromatografia su
strato sottile. I due composti vengono poi isolati raschiando via dalla
lastrina cromatografica le aree di gel di silice corrispondenti alle loro
macchie ed eluendole con metanolo. Infine i composti estratti vengono
essiccati, sililati e determinati gascromatograficamente.
4. REATTIVI
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica.
4.1. Acido cloridrico 25 % (m/m)
4.2. Metanolo
4.3. Etanolo 96 % (v/v)
4.4. Lastrine di gel di silice con indicatore di fluorescenza, pronte per l'uso,
supportate su fogli di alluminio o plastica, disattivate (dim. 20 × 20 cm).
Disattivare nel seguente modo: spruzzare le lastrine con acqua finché
assumano un aspetto brillante.
Asciugarle a temperatura ambiente per 1-3 ore.
NB: Se le lastrine non sono disattivate si può avere una perdita di
resorcina per adsorbimento irreversibile sulla silice.
4.5. Solvente di sviluppo: acetone-cloroformio-acido acetico (20-75-5 v/v)
4.6. Soluzione di riferimento di resorcina: solubilizzare 400 mg di resorcina
esattamente pesati in 100 ml di etanolo (4.3) (1 ml corrisponde a
4 000 µg di resorcina)
4.7. Soluzione di standard interno: solubilizzare 400 mg di 3,5-diidrossito-
luene (DIT) in 100 ml di etanolo (4.3) (1 ml corrisponde a 4 000 µg
di DIT)
4.8. Miscela standard: 10 ml di soluzione 4.6 e 10 ml di soluzione 4.7
vengono pipettati in un matraccio tarato da 100 ml. Si porta a volumecon etanolo (4.3) e si agita (1 ml corrisponde a 400 µg di resorcina e
400 µg di DIT)
4.9. Agenti sililanti
4.9.1. N, O-bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamide (BSTFA)
4.9.2. Esametildisilazano (HMDS)
4.9.3. Trimetilclorosilano (TMCS)1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 27
(1) Secondo la norma ISO 5725.▼B
▼B
5. APPARECCHIATURA
5.1. Attrezzatura comune per cromatografia su strato sottile ed in fase
gassosa
5.2. Vetreria comune di laboratorio
6. PROCEDIMENTO6.1.Preparazione deicampioni
6.1.1. Pesare accuratamente, in un becher da 150 ml, una quantità (M
grammi) di prodotto tale da contenere approssimativamente da 20 a
50 mg di resorcina.
6.1.2. Acidificare con acido cloridrico (4.1) (circa 2-4 ml). Aggiungere 10 ml
(40 mg di DIT) della soluzione di standard interno (4.7) e mescolare.
Trasferire in un matraccio tarato da 100 ml con l'ausilio di etanolo
(4.3), portare a volume con lo stesso solvente ed agitare.
6.1.3. Depositare 250 µl della soluzione 6.1.2 su di una lastrina di gel di silice
disattivata (4.4) su una linea continua di 8 cm di lunghezza. Assicurarsi
che tale deposizione sia il più possibile sottile.
6.1.4. Depositare nelle medesime condizioni (6.1.3) e sulla stessa lastra 250 µl
di miscela standard (4.8).
6.1.5. Depositare sempre su questa lastrina, parallelamente alle due deposi-
zioni descritte (6.1.3 e 6.1.4) in due punti diversi 5 µl di ciascuna
delle soluzioni 4.6 e 4.7 in modo da facilitare la localizzazione delle
macchie dopo lo sviluppo della lastra.
6.1.6. Sviluppare la lastrina in una vaschetta non saturata, contenente il
solvente di sviluppo 4.5 finché il fronte del solvente non abbia percorso
12 cm dalla linea di partenza (45 minuti). Asciugare la lastrina all'aria e
localizzare le macchie della resorcina e del DIT, con la luce di una
lampada UV a 254 nm. I due composti hanno all'incirca lo stesso valore
di Rf. Delimitare le aree di ciascuna macchia, raschiare via dalla
lastrina la silice corrispondente e raccoglierla separatamente in un
matraccio da 10 ml.
6.1.7. Estrarre la silice che contiene la miscela standard ed il campione da
analizzare nel modo seguente: aggiungere 2 ml di metanolo (4.2) ed
estrarre per 1 ora con agitazione continua. Filtrare e ripetere l'estrazione
per altri 15 minuti con 2 ml di metanolo (4.2).
6.1.8. Riunire gli estratti metanolici ed evaporare il solvente lasciando i
suddetti estratti in un essiccatore sotto vuoto per una notte in presenza
di un opportuno agente essiccante. Non riscaldare
6.1.9. Silicare i residui (6.1.8) come indicato in 6.1.9.1 e 6.1.9.2.
6.1.9.1. Aggiungere 200 µl di BSTFA (4.9.1) con una microsiringa e lasciare la
miscela in un recipiente chiuso per 12 ore a temperatura ambiente.
6.1.9.2. Aggiungere successivamente 200 µl di HMDS (4.9.2) e 100 µl di
TMCS (4.9.3) con una microsiringa e riscaldare a 60 ºC per 30 minuti
in un recipiente chiuso. Raffreddare successivamente.
6.2.Gascromatografia
6.2.1. Condizioni cromatografiche
La fase stazionaria contenuta nella colonna deve dare un fattore di riso-
luzione R uguale o superiore a 1,5
R¼2
d0R2/C0d0R1
W1þW2
in cui:
R1eR2sono i tempi di ritenzione di due picchi espressi in
minuti;
W1eW2sono le ampiezze degli stessi due picchi, misurate a metà
altezza ed espresse in mm;
d′ è la velocità di scorrimento della carta del registratore
espressa in mm/min.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 28
▼B
Le seguenti condizioni operative permettono di ottenere i risultati
voluti:
Materiale di costruzione della colonna: tubo di acciaio inossidabile
lunghezza: 200 cmdiametro interno: =3m m
supporto: Chromosorb WAW 100—120 mesh
riempimento: OV-17 al 10 %
Rivelatore: ionizzazione di fiamma
Temperature:
colonna: 185 ºC
iniettore: 250 ºC
rivelatore: 250 ºC
Gas di trasporto: azoto
Flusso dell'azoto: 45 ml/min.
Il flusso dell'idrogeno e dell'aria, che alimentano il rivelatore, deve
essere regolato in base alle specifiche del costruttore.
6.2.2. Iniettare per ogni soluzione ottenuta (6.1.9) una quantità compresa tra 1
e 3 µl. Per ogni soluzione ripetere cinque iniezioni. Misurare la super-
ficie dei picchi cromatografici che si ottengono, trovarne la media, e
calcolare il rapporto S:
S¼
superficie del picco della resorcina
superficie del picco del DIT
7. CALCOLO
La concentrazione della resorcina nel campione espressa come percen-
tuale di massa (% m/m) è data dalla seguente formula:
%ðm=mÞ¼4
M/C2Scampione
Smiscela standard
in cui:
M è il prelievo del campione espresso in g (6.1.1),
Scampioneè la media dei rapporti delle aree dei picchi per la
soluzione campione secondo 6.2.2,
Smiscela standardè la media dei rapporti delle aree dei picchi per la
miscela standard secondo 6.2.2.
8. RIPETIBILITÀ(1)
Per un contenuto in resorcina dell'ordine dello 0,5 % (m/m), la diffe-
renza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo
stesso campione, non deve essere superiore allo 0,025 %.
VI.DETERMINAZIONE DEL METANOLO IN RELAZIONE ALL'ETA-
NOLOOALL'ISOPROPANOLO
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Questo metodo descrive la determinazione gascromatografica del meta-
nolo in tutti i tipi di prodotti cosmetici compresi i prodotti aerosol. Esso
consente di determinare concentrazioni relative comprese tra lo 0 ed il
10 %.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 29
(1) Secondo la norma ISO 5725.
▼B
2. DEFINIZIONE
Il titolo in metanolo determinato con questo metodo è espresso in
percentuale di massa di metanolo rispetto alla massa di etanolo o di
isopropanolo.
3. PRINCIPIO
Il dosaggio si effettua per cromatografia in fase gassosa.
4. REATTIVI
Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica.
4.1. Metanolo
4.2. Etanolo assoluto
4.3. Isopropanolo
4.4. Cloroformio lavato con acqua per eliminare eventuali alcoli
5. APPARECCHIATURA
5.1. Cromatografo in fase gassosa munito di rivelatore a conducibilità
termica per campioni aerosol, e di rivelatore a ionizzazione di fiamma
per tutti gli altri campioni
5.2. Matracci tarati da 100 ml5.3. Pipette da 1, 2, 20 ml
5.4. Microsiringhe da 0-100 µl e da 0-5 µl
Per i soli campioni aerosol, siringa speciale da gas con valvola scorre-
vole (figura 5 del metodo di campionamento)(
1)
6. MODALITÀ OPERATIVE
6.1.Preparazione deicampioni
6.1.1. I prodotti in forma di aerosol sono trattati come indicato nel capitolo II
della direttiva 80/1335/CEE,del 22 dicembre 1980 (1), e quindi analiz-
zati per cromatografia in fase gassosa come descritto al punto 6.2.1.
6.1.2. Gli altri prodotti trattati come indicato nel succitato capitolo II, sono
diluiti con acqua fino ad una concentrazione compresa tra 1 e 2 % di
etanolo o di isopropanolo ed analizzati per cromatografia in fase
gassosa come descritto al punto 6.2.2.
6.2.Condizionigascromatografiche
6.2.1. Per campioni sotto forma di aerosol
6.2.1.1. La colonna gascromatografica viene riempita con Hallcomid M 18 al
10 % supportato su Chromosorb WAW 100-120 mesh. Si usi il rivela-
tore a conducibilità termica
6.2.1.2. La fase stazionaria deve fornire una risoluzione (R) uguale o superiore
a 1,5
R¼2d0R2/C0d0R1
W1þW2
in cui:
R1eR2sono i tempi di ritenzione di due picchi espressi in
minuti,
W1eW2sono le ampiezze degli stessi picchi misurate a metà
altezza ed espresse in mm,
d′ è la velocità di scorrimento della carta del registratore
espressa in mm/min.
6.2.1.3. Le seguenti condizioni permettono di ottenere questi risultati:1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 30
(1) GU n. L 383 del 31. 12. 1980, pag. 27.
▼B
Materiale di costruzione della colonna:
acciaio inossidabile
lunghezza: 350 cmdiametro: 3 mm
Rivelatore a conducibilità termica con un'in-
tensità di corrente pari a 150 mA
Gas di trascinamento:
elio
pressione di
entrata dell'elio:2,5 bar
flusso dell'elio: 45 ml/min
Temperature:
iniettore: 150 ºC
rivelatore: 150 ºCcolonna: 65 ºC
6.2.2. Per tutti i campioni (eccetto gli aerosol).
6.2.2.1. La colonna cromatografico si riempie con Chromosorb 105 o con
Porapak QS. Si usi il rivelatore a ionizzazione di fiamma.
6.2.2.2. La fase stazionaria deve fornire una risoluzione, R, maggiore o uguale a
1,5
R¼2
d0R2/C0d0R1
W1þW2
in cui:
R1eR2sono i tempi di ritenzione di due picchi espressi in
minuti,
W1eW2sono le ampiezze degli stessi picchi, misurate a metà
altezza, ed espresse in mm,
d′ è la velocità di scorrimento della carta del registratore
espressa in mm/min.
6.2.2.3. Le seguenti condizioni permettono di ottenere questi risultati:
Materiale di costruzione della colonna: acciaio inossidabile
lunghezza: 200 cmdiametro: 3 mm
Sensibilità dell'elettrometro: 8 · 10
−10A
Gas di trascinamento: azotopressione di entrata
dell'azoto:2,1 bar
flusso dell'azoto: 20 ml/min
Per regolare il flusso di idrogeno e di aria che alimentano il rivelatore a
ionizzazione di fiamma, seguire le specifiche del fabbricante
Temperature:
iniettore: 150 ºC
rivelatore: 230 ºC
colonna: 120 ºC-130 ºC1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 31
▼B
7. CURVE DI TARATURA
7.1. Nelle condizioni cromatografiche descritte al punto 6.2.1 (fase stazio-
naria di Hallcomid M 18), si usino le seguenti soluzioni di riferimento.
Si preparino queste soluzioni volumetricamente, ma per conoscere le
esatte quantità prelevate è più opportuno pesare il recipiente, nel quale
si prepara la soluzione di riferimento, immediatamente dopo ogni
aggiunta.
Concentrazione relativa
espressa in
% m/mMetanolo
mlEtanolo o
isopropa-
nolo
mlAggiunta di cloroformio
sino ad un volume di ml
2,5 % circa 0,5 20 100
5,0 % circa 1,0 20 100
7,5 % circa 1,5 20 100
10,0 % circa 2,0 20 100
Iniettare nel gascromatografo da 2 a 3 µl di ognuna di queste soluzioni
secondo quanto descritto al punto 6.2.1. Per ogni soluzione calcolare il
rapporto delle aree dei picchi metanolo/etanolo o metanolo/isopropa-
nolo. Tracciare la curva di taratura riportando:
in ascissa: la percentuale di metanolo riferita all'etanolo o all'iso-
propanolo;
in ordinata: il rapporto delle aree dei picchi ottenuti metanolo/
etanolo o metanolo/isopropanolo.
7.2. Nelle condizioni cromatografiche descritte al punto 6.2.2 (fase stazio-
naria Porapak QS o Chromosorb 105), si usino le seguenti soluzioni di
riferimento. Si preparino queste soluzioni volumetricamente, ma, per
conoscere esattamente le quantità prelevate, è più opportuno pesare il
recipiente, nel quale si prepara la soluzione di riferimento, immediata-
mente dopo ogni aggiunta
Concentrazione relativa
espressa in
% m/mMetanolo
µlEtanolo o
isopropa-
nolo
mlAggiunta di acqua sino
ad un volume di ml
2,5 % circa 50 2 100
5,0 % circa 100 2 100
7,5 % circa 150 2 100
10,0 % circa 200 2 100
Iniettare nel gascromatografo da 2 a 3 µl di ognuna di queste soluzioni
secondo quanto descritto al punto 6.2.2. Per ogni soluzione calcolare il
rapporto delle aree dei picchi metanolo/etanolo o metanolo/isopropa-
nolo. Tracciare la curva di taratura riportando:
in ascissa: la percentuale di metanolo riferita all'etanolo o all'iso-
propanolo;
in ordinata: il rapporto delle aree dei picchi ottenuti metanolo/
etanolo o metanolo/isopropanolo.
7.3. Nei due casi le curve di taratura dovranno essere rettilinee.
8. RIPETIBILITÀ(1)
Per contenuti di metanolo del 5 % riferiti all'etanolo o all'isopropanolo,
la differenza fra i risultati di due determinazioni parallele effettuate
sullo stesso campione non deve superare 0,25 %.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 32
(1) Secondo la norma ISO 5725.
▼M1
Appendice 1
PREPARAZIONE DELLA CAMERA DI REAZIONE MEDIANTE
BOBINADILEGNOATUBODITEFLON(«TRICOTIN»)
ACCESSORI NECESSARI PER LA REALIZZAZIONE DEL «TRICOTIN»
— 1 bobina di legno:
diametro esterno di 5 cm con al centro un foro da 1,5 cm. Piantare 4 chiodi
di acciaio equidistanti fra di loro (vedere lo schema della bobina in figura 1
e figura 2) in modo che ogni chiodo disti da quello adiacente 1,8 cm e sia
piantato a 0,5 cm di distanza dalla circonferenza del foro.
— 1 asta rigida (del tipo ad uncino) per realizzare gli occhielli con il tubo di
Teflon.
— Tubicino di Teflon da 1,6 mm — Ø interno: 0,3 mm — lunghezza: 5 m.
REALIZZAZIONE DEL «TRICOTIN»
Per realizzare il «Tricotin» occorre infilare il tubo di Teflon dall'alto verso il
basso nel foro centrale della bobina (lasciandolo fuoriuscire dall'estremità infe-
riore della bobina di circa 10 cm; ciò consentirà di tirare leggermente la
catenella durante la confezione); avvolgere quindi il tubicino attorno a ciascuno
dei 4 chiodi per fare il primo giro (vedi figura 3).
L'entrata e l'uscita del Tricotin saranno provviste di ferule e di viti di compres-
sione, avendo cura di non schiacciare il Teflon quando si effettua l'aggraffatura.
A partire dal secondo giro far passare il tubicino all'esterno di ciascun chiodo
per poter formare un occhiello nel modo seguente:
— far passare con l'aiuto dell'asta rigida il tubicino del giro inferiore sul tubi-
cino del giro superiore (vedi figura 4).
Ripetere l'operazione su ciascun chiodo rispettando l'ordine 1-2-3-4 fino a 5 m o
alla lunghezza desiderata.
Lasciare circa 10 cm di tubo per chiudere la catenella. Passare il tubo in
ciascuno dei quattro occhielli e tirare leggermente: la catenella si chiude.
NB:Esiste sul mercato un Tricotin confezionato per le reazioni postcolonna.1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 33
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Schema della bobina
1982L0434 — IT — 10.04.1990 — 001.001 — 34
▼M1
Appendice 2
1 = Pompa HPLC
2 = Valvola di iniezione
3 = Colonna con precolonna4 = Pompa reattivo
5 = Raccordo a T senza volume morto
5′= T (Vortex)
6-6′= Raccordo Union senza volume morto
7 = Tricotin
7′= Reattore
8 = Pallone a tre colli con acqua bollente9 = Sistema di riscaldamento
10 = Refrigerante
11 = Tubo inox scambiatore di calore11′= Scambiatore di calore
12 = Rivelatore UV visibile
13 = Modulo postcolonna PCRS 520
5.3.5.
5.3.6.
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