1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B TERZADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del27aprile 1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolli deglialimenti perglianimali
(72/199/CEE)
(GU L 123 del 29.5.1972, pag. 6)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva 81/680/CEE della Commissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Direttiva 84/4/CEE della Commissione del 20 dicembre 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Direttiva 93/28/CEE della Commissione del 4 giugno 1993 L 179 8 22.7.1993
Rettificata da:
►C1Rettifica, GU L 320 del 27.11.1980, pag. 43 (72/199/CEE)
▼B
TERZADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del27aprile1972
chefissaimetodid'analisicomunitaripericontrolli deglialimenti
perglianimali
(72/199/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
vista la direttiva del Consiglio, del 20 luglio 1970, concernente l'intro-
duzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisicomunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali (
1),
inparticolare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali, destinati a constatare l'osservanza delle
condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per gli animali, siano effettuati secondo i modi di preleva-mento di campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive n. 71/250/CEE e n. 71/393/CEE della
Commissione, del 15 giugno 1971 (
2) e del 18 novembre 1971(3),
hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari;
che, tenuto conto dello stato d'avanzamento dei lavori sin qui effettuati,
è necessario adottare una terza serie di metodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del Comitato permanente per gli alimenti per glianimali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il loro contenuto in amido,proteine gregge, proteine gregge solubilizzabili con la pepsina ed acidocloridrico ed ingossipolo libero e totale e per quan to riguarda l'attivitàdella pepsina, siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato Idella presente direttiva.
Articolo 2
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali in vista del rivelamento e della identificazione
degli antibiotici del gruppo delle tetracicline nonché per quanto
riguarda il contenuto degli alimenti in clorotetraciclina, ossitetraciclina,tetraciclina, oleandomicina, tilosina e virginiamicina, siano effettuatesecondo i metodi descritti all'allegato II della presente direttiva.
Articolo 3
Gli Stati membri curano l'entrata in vigore, al più tardi il 1oluglio
1973, delle disposizioni legislative, regolamentari o amministrativenecessarie per uniformarsi alle disposizioni della presente direttiva ene informano immediatamente la Commissione.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2.
(2) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(3) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Articolo 4
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 3
▼B
ALLEGATO I
1.DETERMINAZIONEDELL'AMIDO
— Metodo polarimetrico —
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto in amido ed in prodotti di
degradazione dell'amido ad alto peso molecolare degli alimenti degli animali,
eccettuati quelli che contengono fettucce, polpe esauste, foglie o colletti
essiccati di barbabietole, polpe di patate, lieviti disidratati, prodotti ricchi di
inulina (ad esempio fettucce e farina di patate dolci) o ciccioli.
2.Principio
Il metodo comprende una doppia determinazione. Nella prima, il campione è
trattato a caldo conl'acido cloridrico diluito. Dopo chiarificazion e e filtra-
zione si misura mediante polarimetria il potere rotatorio della soluzione.
Nella seconda, il campione viene estratto con etanolo al 40 %. Dopo acidifi-
cazione del filtrato con acido cloridrico, defecazione e filtrazione, si misura il
potere rotatorio nelle stesse condizioni della prima determinazione.
La differenza tra le due misure, moltiplicata per un fattore noto, dà il conte-
nuto in amido del campione.
3.Reattivi
3.1 Acido cloridrico al 25 % (p/p), d: 1,126
3.2 Acido cloridrico all'1,128 % (p/v)
La concentrazione deve essere verificata per titolazione mediante una
soluzione di idrossido di sodio 0,1 N in presenza di rosso di metile allo
0,1 % (p/v) inetan olo al 94 % (v/v). ml 10 = ml 30,94 di NaOH 0,1 N.
3.3 Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua g 21,9 di acetato di zinco
Zn(CH3COO)2·2H2O e g 3 di acido acetico glaciale. Completare a ml
100 conacqua.
3.4 Soluzione di Carrez II: Sciogliere in acqua g 10,6 di ferrocianuro di
potassio
K4[Fe(CN)6]·3H2O. Completare a ml 100 conacqua.
3.5 Etanolo al 40 % (v/v), d: 0,948 a 20º C.
4.Apparecchiatura
4.1 Matraccio di Erlenmeyer da ml 250 a smerigliatura unificata, con refri-
gerante a riflusso
4.2 Polarimetro o saccarimetro.
5.Mododioperare
5.1Preparazione del campione
Macinare il campione in modo che passi tutto attraverso un setaccio a
maglie rotonde di mm 0,5 di diametro.
5.2Determinazione del potere rotatorio totale (P o S) (v. osservazione 7.1)
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 2,5 del campione macinato e
introdurli in un pallone tarato da ml 100. Aggiungere ml 25 di acido
cloridrico (3.2), agitare per ottenere una buona ripartizione della sostanza
e aggiungere nuovamente ml 25 di acido cloridrico (3.2). Immergere il
pallone in un bagno d'acqua bollente e agitare energicamente e regolar-
mente per i primi tre minuti allo scopo di evitare la formazione di grumi.
La quantità d'acqua del bagno deve essere sufficiente per mantenerlo in
ebollizione quando vi è immerso il pallone. Quest'ultimo non può essere
tolto dal bagno durante l'agitazione. Dopo 15 minuti esatti, togliere il
pallone dal bagno, aggiungervi ml 30 d'acqua fredda e raffreddare imme-
diatamente sino a 20º C.
Aggiungere ml 5 di soluzione di Carrez I (3.3) e agitare per un minuto.
Aggiungere quindi ml 5 di soluzione di Carrez II (3.4) e agitare nuova-
mente per un minuto. Portare a volume con acqua, mescolare e filtrare.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 4
▼B
Se il filtrato non è perfettamente limpido (caso poco frequente) ripetere
la determinazione usando una maggiore quantità di soluzione di Carrez I
e II, per esempio ml 10.
Misurare quindi il potere rotatorio della soluzione, in tubo da mm 200,
conunpolarimetro od unsaccarimetro.
5.3Determinazione del potere rotatorio (P ′oS ′) delle sostanze solubili
nell'etanolo al 40 %
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 5 del campione, introdurli in un
pallone tarato da ml 100 e aggiungere circa ml 80 di etanolo (3.5) (v.
osservazione 7.2). Lasciare il pallone in attesa per un'ora a temperatura
ambiente agitando energicamente sei volte in modo che la sostanza sia
benmescolata conl'etan olo. Portare quin di a volume conetan olo (3.5),
mescolare e filtrare.
Con una pipetta, introdurre ml 50 del filtrato (= g 2,5 del campione) in
un matraccio di Erlenmeyer da ml 250, aggiungere ml 2,1 di acido clori-
drico (3.1) e agitare energicamente. Applicare un refrigerante a riflusso
sull'Erlenmeyer e immergere quest'ultimo in un bagno d'acqua bollente.
Dopo 15 minuti esatti, ritirare l'Erlenmeyer dal bagno, travasarne il
contenuto in un pallone tarato da ml 100, lavando con un poco di acqua
fredda, e raffreddare sino a 20º C.
Chiarificare quindi con soluzioni di Carrez I (3.3) e II (3.4), portare a
volume conacqua, mescolare, filtrare e misurare il potere rotatorio
come indicato in 5.2, secondo e terzo capoverso.
6.Calcolodeirisultati
Il contenuto in amido per cento di campione è calcolato come segue:
6.1Misurazioni effettuate con il polarimetro
percentuale di amido ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = potere rotatorio totale ingradi d'arco
P′ = potere rotatorio ingradi d'arco delle sostan ze solu-
bili nell'etanolo al 40 %
α½/C13820º
D = potere rotatorio specifico dell'amido puro
Per questo fattore sono accettati convenzionalmente i seguenti valori:+ 185,9º: amido di riso
+ 185,4º: amido di patata+ 184,6º: amido di granoturco
+ 182,7º: amido di frumento+ 181,5º: amido d'orzo+ 181,3º: amido d'avena
+ 184,0º: altri tipi di amido, nonché miscele di amidi degli alimenti
composti.
6.2Misurazioni effettuate con il saccarimetro
percentuale di amido ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = potere rotatorio totale ingradi saccarimetrici
S′= potere rotatorio ingradi saccarimetrici delle sostan ze solubili
nell'etanolo al 40 %
N = peso ing di saccarosio inml 100 di acqua che sotto lo spes-
sore di mm 200 dà unpotere rotatorio di 100º saccarimetrici:
g 16,29 per i saccarimetri francesig 26,00 per i saccarimetri tedeschig 20,00 per i saccarimetri misti
α½/C138
20º
D= potere rotatorio specifico dell'amido puro (v. 6.1).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 5
▼C1
▼B
▼B
6.3Ripetibilità
La differenza tra i risultati delle due determinazioni parallele effettuate
sullo stesso campione non deve essere superiore a 0,4 in valore assoluto
per i contenuti in amido inferiori al 40 per cento, 1 per cento in valore
relativo per i contenuti in amido uguali o superiori al 40 per cento.
7.Osservazioni
7.1 Quando il campione contiene più del 6 per cento di carbonati, espressi
come carbonato di calcio, i medesimi debbono essere eliminati mediante
trattamento con la quantità esattamente appropriata di acido solforico,
prima di determinare il potere rotatorio totale.
7.2 Nel caso di prodotti ad alto contenuto in lattosio, quali il siero di latte in
polvere, il latte scremato inpolvere, procedere come segue dopo aver
aggiunto gli 80 ml di etanolo (3.5). Adattare sul pallone un refrigerante
a riflusso, immergere il pallone per 30 minuti in un bagno d'acqua a 50º
C. Lasciare poi raffreddare e continuare l'analisi come indicato in 5.3.
2.DETERMINAZIONEDELLEPROTEINEGREGGE
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare il contenuto in proteine gregge dei
mangimi a partire dal contenuto in azoto, dosato secondo Kjeldahl.
2.Principio
Il campione viene digerito in acido solforico in presenza di un catalizzatore.
La soluzione acida viene alcalinizzata cjon una soluzione d'idrossido di
sodio. L'ammoniaca liberatasi viene isolata per distillazione e viene raccolta
in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con
una soluzione standard d'idrossido di sodio.
3.Reattivi
3.1 Sulfato di potassio
3.2 Catalizzatore: ossido rameico CuO p.a., o solfato di rame (II) pentai-
drato, CuSO4·5H2O
3.3 Zinco in granelli
3.4 Acido solforico ρ20= 1.84 g/ml
3.5 Acido solforico c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Acido solforico c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Indicatore al rosso di metile: sciogliere mg 300 di rosso di metile in
ml 100 di etanolo, σ= 95-96 % (v/v)
3.8 Soluzione d'idrossido di sodio (è possibile usare quello di purezza
tecnica), β= 40 g/100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Soluzione d'idrossido di sodio c = 0,25 mol/l
3.10 Soluzione d'idrossido di sodio c = 0,1 mol/l
3.11 Pietra pomice in granelli, lavata con acido cloridrico e calcinata
3.12 Acetanilide (p.m. = 114 ºC, N = 10,36 %)
3.13 Saccarosio (esente da azoto)
4.Apparecchiatura
Apparecchi di mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo
di Kjeldahl
5.Metododioperare
5.1Mineralizzazione
Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel
pallone dell'apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere g 15 di solfato
di potassio (3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (3.2) [da g 0,3
a g 0,4 di ossido rameico, oppure da g 0,9 a g 1,2 di solfato di rame (II)
pentaidrato], ml 25 di acido solforico (3.4) e qualche granello di pietra1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 6
▼M3
▼M3
pomice (3.11). Mescolare. Riscaldare il pallone prima moderatamente,
agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione della
massa ed a scomparsa della schiuma; quindi più intensamente sino a
ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l'acido
bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si
surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano. Quando la solu-
zione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l'ebollizione
ancora per due ore. Lasciar quindi raffreddare.
5.2Distillazione
Aggiungere con precauzione un quantitativo d'acqua sufficiente a scio-
gliere completamente i solfati; lasciar raffreddare. Aggiungere quindi
qualche granello di zinco (3.3).
Introdurre nel matraccio collettore dell'apparecchio di distillazione ml 25
esattamente misurati di acido solforico (3.5) oppure (3.6) a seconda del
contenuto di azoto che si presume e qualche goccia di indicatore al rosso
di metile (3.7).
Collocare il pallone al condensatore dell'apparecchio di distillazione ed
immergere l'estremità di quest'ultimo per almeno cm 1 nel liquido del
matraccio collettore (cfr. osservazione 8.3). Versare lentamente nel
pallone ml 100 di soluzione di idrossido di sodio (3.8) senza perdita di
ammoniaca (cfr. osservazione 8.1).
Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell'ammoniaca.
5.3Titolazione
Titolare nel matraccio collettore l'eccesso di acido solforico per mezzo di
una soluzione di idrossido di sodio (3.9) o (3.10), secondo la concentra-
zione dell'acido solforico utilizzato, sino a raggiungimento del punto
finale.
5.4Prova in bianco
Per controllare se i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in
bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) usando g 1 di sacca-
rosio (3.13) invece del campione.
6.Calcolodeirisultati
Calcolare il tenore di proteine gregge con la formula seguente:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
dove:
V0= volume di NaOH (3.9 o 3.10) usato nella prova in bianco
V1= volume (ml) di NaOH (3.9 o 3.10) usato nella titolazione del
campione
c = concentrazione (mol/l) di idrossido di sodio (3.9 o 3.10)m = massa (g) del campione
7.Verifica delmetodo
7.1Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate
sullo stesso campione non deve oltrepassare:
— 0,2 % in valore assoluto, per contenuti in proteine gregge inferiore al
20 %
— 1,0 % sul risultato più elevato, contenuti compresi tra 20 e 40 %
— 0,4 % in valore assoluto, per contenuti superiori al 40 %.
7.2Accuratezza
Eseguire l'analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su 1,5 —
2,0 g di acetanilide (3.12) in presenza di g 1 di saccarosio (3.13): g 1 di
acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico (3.5). Il recupero deve
essere di almeno il 99 %.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 7
▼M3
8.Osservazioni
8.1 Gli apparecchi possono essere del tipo manuale, semiautomatico od auto-
matico. Se un apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione
e distillazione, in questo caso il travasamento deve essere effettuato
senza perdite. Se il pallone dell'apparecchio di distillazione non è prov-
visto di un imbuto separatore, aggiungere la soluzione d'idrossido di
sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante,
lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti.
8.2 Se il prodotto mineralizzato si solidifica, ricominciare la determinazione
usando un quantitativo di acido solforico (3.4) superiore a quello specifi-
cato inpreceden za.
8.3 Per i prodotti poveri di sostanze azotate, il volume di acido solforico
(3.6) da introdurre nel matraccio può essere ridotto, se necessario, a
ml 10 o 15 e portato a ml 25 conacqua.
3DETERMINAZIONE DELLE PROTEINE GREGGE SOLUBILIZZA-
BILICONLAPEPSINAEDACIDOCLORIDRICO
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di determinare la frazione delle proteine gregge solubiliz-
zabili con la pepsina ed acido cloridrico in condizioni determinate. Esso è
applicabile a tutti gli alimenti.
2.Principio
Il campione è sottoposto ad un trattamento con una soluzione cloridrica di
pepsina per 48 ore a 40º C. La sospensione viene filtrata e il contenuto in
azoto del filtrato viene determinato secondo il metodo descritto per la deter-
minazione delle proteine gregge.
3.Reattivi
3.1 Acido cloridrico, d: 1,125
3.2 Acido cloridrico 0,075 N3.3 Pepsina a 2,0 U/mg. Questa attività è definita e dev'essere controllata
secondo il metodo che forma oggetto della parte 4 del presente allegato.
3.4 Soluzione allo 0,02 % circa (p/v) di pepsina nell'acido cloridrico (3.2),
preparata di recente
3.5 Emulsione antischiuma (per esempio, silicone)
3.6 Tutti i reattivi indicati nel punto 3 del metodo per la determinazione
delle proteine gregge.
4.Apparecchiatura
4.1 Bagno d'acqua o stufa di incubazione, regolata a 40º C ± 1º C
4.2 Apparecchi di mineralizzazione e di distillazione secondo Kjeldahl.
5.Mododioperare
5.1Preparazione della soluzione (v. osservazione 7.2)
Pesare, con l'approssimazione di mg 1, g 2 del campione, introdurli in un
pallone tarato da ml 500 e aggiungere ml 450 di soluzione cloridrica di
pepsina (3.4) preliminarmente portata a 40º C. Agitare in modo da
evitare la formazione di agglomerati. Verificare che il pH della sospen-
sione sia inferiore a 1,7. Porre il pallone nel bagno d'acqua o nella stufa
di incubazione (4.1) e mantenervelo per 48 ore. Agitare dopo 8, 24 e 32
ore. Trascorse 48 ore, aggiungere ml 15 di acido cloridrico (3.1), raffred-
dare sino a 20º C, portare a volume con acqua e filtrare.
5.2Mineralizzazione
Prelevare ml 250 del filtrato e introdurli nel pallone dell'apparecchio di
distillazione (4.2). Aggiungere i reattivi necessari alla mineralizzazione
come indicato nel metodo per la determinazione delle proteine gregge,
punto 5.1, seconda frase.
Mescolare e riscaldare all'ebollizione. Se si forma della schiuma, aggiun-
gere qualche goccia di emulsione antischiuma (3.5). Lasciare bollire1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 8
▼B
▼B
vivacemente sino ad evaporazione quasi completa dell'acqua. Eliminare
le ultime tracce d'acqua con precauzione, riducendo l'intensità del riscal-
damento. Quando la soluzione è limpida e incolore (verde chiaro in
presenza di catalizzatore a base di rame) far bollire ancora per un'ora.
Lasciare quindi raffreddare.
5.3Distillazione e titolazione
Procedere come indicato nel metodo per la determinazione delle proteine
gregge, punti 5.2 e 5.3.
5.4Prova in bianco
Effettuare una prova in bianco applicando il modo di operare senza il
campione da analizzare.
6.Calcolodeirisultati
Detrarre il volume di acido solforico consumato nella prova in bianco da
quello consumato nella prova con la sostanza; ml 1 di acido solforico 0,1 N
corrisponde a mg 1,4 d'azoto.
Moltiplicare la quantità di azoto per il fattore 6,25. Esprimere il risultato in
per cento della sostanza.
Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve essere superiore a
— 0,4 in valore assoluto per i contenuti inferiori al 20 %;
— 2,0 % in valore relativo per i contenuti compresi tra 20 e 40 %;
— 0,8 in valore assoluto per i contenuti superiori al 40 %.
7.Osservazioni
7.1 I valori ottenuti con il presente metodo non hanno una relazione diretta
conla digeribilità in vivo.
7.2 I prodotti il cui contenuto in materie grasse è superiore al 10 % debbono
essere preliminarmente sgrassati mediante estrazione con etere di petrolio
(ebollizione da 40 a 60º C).
4.DETERMINAZIONEDELL'ATTIVITÀDELLAPEPSINA
1.Scopoecampod'applicazione
Il metodo permette di controllare l'attività della pepsina utilizzata per la
determinazione delle proteine gregge solubilizzabili con la pepsina ed acido
cloridrico.
2.Principio
L'emoglobina viene trattata, in determinate condizioni, con pepsina in
ambiente cloridrico. La frazione non idrolizzata delle proteine viene precipi-
tata con acido tricloroacetico. Il filtrato viene addizionato di idrossido di
sodio e del reattivo secondo Folin-Ciocalteu. La densità ottica di questa solu-
zione viene misurata a mu 750 e la quantità di tirosina che le corrisponde
viene letta su un diagramma di taratura.
Definizione: L'unità di pepsina si definisce come la quantità di questo enzima
che libera in un minuto, nelle condizioni del metodo, una quantità di gruppi
idrossiarile la cui colorazione con il reattivo secondo Folin-Ciocalteu ha unadensità ottica corrispondente a quella di una µmole di tirosina, nelle stesse
condizioni.
3.Reattivi
3.1 Acido cloridrico 0,2 N
3.2 Acido cloridrico 0,06 N
3.3 Acido cloridrico 0,025 N
3.4 Soluzione al 5 % (p/v) di acido tricloroacetico3.5 Soluzione di idrossido di sodio 0,5 N
3.6 Reattivo secondo Folin-Ciocalteu. Introdurre g 100 di tungstato di sodio
(Na
2WO4·2H2O), g 25 di molibdato di sodio (Na2MoO4·2H2O) e ml1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 9
▼B
700 di acqua in un pallone a fondo rotondo da l 2 a smerigliatura norma-
lizzata. Aggiungere ml 50 di acido fosforico (d: 1,71) e ml 100 di acido
cloridrico concentrato (d: 1,19), collegare al pallone un refrigerante a
riflusso, riscaldare fino ad ebollizione e far bollire adagio la soluzione
per 10 ore. Lasciar raffreddare, staccare il refrigerante a riflusso, aggiun-
gere g 175 di solfato di litio (Li2SO4·2H2O), ml 50 d'acqua e ml 1 di
bromo. Far bollire per 15 minuti per eliminare l'eccesso di bromo.
Lasciar raffreddare, travasare la soluzione in un pallone tarato da 1 l,
portare a volume conacqua, mescolare e filtrare. Nondeve aversi un a
colorazione verdastra. Prima dell'impiego, diluire 1 volume del reattivo
con2 volumi d'acqua.
3.7 Soluzione di emoglobina: pesare una quantità di emoglobina, substrato
proteico secondo Anson (circa g 2), corrispondente a mg 354 d'azoto (1)
ed introdurla in un pallone da ml 200 a smerigliatura normalizzata.
Aggiungere alcuni ml d'acido cloridrico (3.2), collegare il pallone alla
pompa a vuoto e agitare fino a dissoluzione completa dell'emoglobina.
Interrompere il vuoto e aggiungere, agitando nel contempo, acido clori-
drico (3.2) per portare a ml 100. Preparare la soluzione immediatamente
prima dell'impiego .
3.8 Soluzione tipo di tirosina: sciogliere mg 181,2 di tirosina in acido clori-
drico (3.1) e portare a l 1 conlo stesso acido (soluzion e madre).
Prelevare ml 20,0 e diluire a ml 100 conacido cloridrico (3.1); ml 1 di
questa soluzione contiene µmoli 0,2 di tirosina.
4.Apparecchiatura
4.1 Bagno d'acqua, regolato, mediante l'ultratermostato, a 25º C ± 0,1º C4.2 Spettrofotometro
4.3 Cronometro, precisione: 1 secondo
4.4 pH-metro.
5.Mododioperare
5.1Preparazione della soluzione (v. osservazione 7.1)
Sciogliere mg 150 di pepsina in ml 100 di acido cloridrico (3.2). Prele-
vare con la pipetta ml 2 di soluzione, introdurli in un pallone tarato da
ml 50 e portare a volume conacido cloridrico (3.3). Il pH con trollato
con il pH-metro deve essere 1,6 ± 0,1. Immergere il pallone nel bagno
d'acqua (4.1).
5.2Idrolisi
Pipettare in una provetta ml 5,0 di soluzione di emoglobina (3.7), portare
a 25º C nel bagno d'acqua (4.1), aggiungere ml 1,0 della soluzione di
pepsina ottenuta in 5.1 e mescolare con una bacchetta di vetro, appiattita
ad un'estremità, con circa 10 movimenti di va e vieni. Mantenere la
provetta nel bagno d'acqua a 25º C per 10 minuti esatti, calcolati a
partire dal momento dell'aggiunta della soluzione di pepsina (la durata e
la temperatura devono essere esattamente rispettate). Aggiungere quindi
ml 10,0 di soluzione di acido tricloroacetico (3.4), preliminarmente
portata a 25º C, mescolare e filtrare su unfiltro asciutto.
5.3Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica
Prelevare con la pipetta ml 5,0 del filtrato, introdurli in una beuta da ml
50, aggiungere ml 10,0 di soluzione d'idrossido di sodio (3.5) e, agitando
costantemente, ml 3,0 del reattivo diluito di Folin-Ciocalteu (3.6). Dopo
5 a 10 minuti, misurare la densità ottica della soluzione con lo spettrofo-
tometro a nm 750 in vaschette di cm 1 di spessore, rispetto all'acqua.
5.4Prova in bianco
Per ogni determinazione, eseguire una prova in bianco come indicato qui
di seguito.
Pipettare in una provetta ml 5,0 di soluzione di emoglobina (3.7), portare
a 25º C nel bagno d'acqua (4.1), aggiungere ml 10,0 di soluzione di
acido tricloroacetico (3.4) preliminarmente portata a 25º C, mescolare e1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 10
(1) Determinare il contenuto in azoto con un semi-microkjeldhal (contenuto teorico: 17,7 %
di azoto).
▼B
aggiungere quindi ml 1,0 della soluzione di pepsina ottenuto in 5.1.
Mescolare con una bacchetta di vetro e tenere la provetta per 10 minuti
esatti nel bagno d'acqua (4.1) a 25º C. Mescolare e filtrare su un filtro
asciutto. Proseguire il modo d'operare come indicato in 5.3.
5.5Diagramma di taratura
Introdurre in beuta da ml 50 dei volumi di ml 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 di
soluzione tipo di tirosina (3.8), corrispondenti rispettivamente a quantità
di tirosina di µmoli 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0. Completare la serie con un
testimone senza tirosina. Portare i volumi a ml 5,0 con acido cloridrico
(3.1). Aggiungere ml 10,0 di soluzione di idrossido di sodio (3.5) e,
agitando costantemente, ml 3,0 del reattivo diluito di Folin-Ciocalteu
(3.6). Misurare la densità ottica come indicato in 5.3, ultima frase. Trac-
ciare il diagramma di taratura riportando le densità ottiche rispetto alle
quantità di tirosina.
6.Calcolodelrisultato
Leggere sul diagramma di taratura la quantità di tirosina, in µmoli, corrispon-
dente alla densità ottica della soluzione colorata, corretta della prova in
bianco.
L'attività della pepsina, in µmoli di tirosina per mg e per minuto, a 25º C, è
data dalla formula:
Unit`a per mg U =mgðÞ ¼0;32 a
p
nella quale
a = quantità di tirosina, in µmoli, letta sul diagramma di taratura;
p = peso in mg della quantità di pepsina aggiunta in 5.2.
7.Osservazioni
7.1 La quantità di pepsina da disciogliere deve essere scelta in modo da otte-
nere, nella misura spettrofotometrica finale, una densità ottica di
0,35 ± 0,035.
7.2 Due unità ottenute con il presente metodo corrispondono a:
3,64 milliunità Anson/mg (µmoli di tirosina/mg. min. a 35,5º C)oppure
36.400 unità commerciali/g (µmoli di tirosina/g in 10 min. a 35,5º C).
5.DETERMINAZIONEDELGOSSIPOLOLIBEROETOTALE
1.Scopoecampodiapplicazione
Il metodo permette di determinare il gossipolo libero, il gossipolo totale e le
sostanze chimicamente affini nei semi, nelle farine e nei panelli di cotone e
negli alimenti composti che ne contengono.
Il limite inferiore di determinabilità del metodo è di 20 ppm.
2.Principio
Il gossipolo viene estratto, in presenza di 3-amino-1-propanolo, con una
miscela di isopropanolo-esano nel caso della determinazione del gossipolo
libero, e con la dimetilformamide nel caso della determinazione del gossipolo
totale. Il gossipolo è trasformato mediante anilina in gossipolo-dianilina, la
cui densità ottica è misurata a 440 nm.
3.Reattivi
3.1 Miscela isopropanolo-esano: mescolare 60 parti in volume d'isopropa-
nolo p.a. con 40 parti in volume di esano normale.
3.2 Solvente A: porre in un pallone tarato da l 1, circa ml 500 della miscela
isopropanolo-esano (3.1), ml 2 di 3-amino-1-propanolo, ml 8 d'acido
acetico glaciale e ml 50 d'acqua. Portare a volume conmiscela di isopro-
panolo-esano (3.1). Questo reattivo è stabile per una settimana.
3.3 Solvente B: pipettare in un pallone tarato da ml 100, ml 2 di 3-amino-1-
propanolo e ml 10 d'acido acetico glaciale. Raffreddare alla temperatura
ambiente e portare a volume con N,N-dimetilformamide. Questo reattivo
è stabile per una settimana.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 11
▼B
3.4 Anilina p.a.: se la densità ottica del saggio in bianco supera il valore
0,022dev'essere distillata su polvere di zinco eliminando la prima e
l'ultima frazione pari al 10 % del distillato. Posta in bottiglia chiusa di
vetro bruno ed in frigorifero si conserva per parecchi mesi.
3.5 Soluzione tipo A di gossipolo: porre in un pallone tarato da ml 250, mg
27,9 d'acetato di gossipolo. Sciogliere e portare a volume impiegando il
solvente A (3.2). Pipettare ml 50 di tale soluzione in un pallone tarato da
ml 250 e portare a volume con il solvente A. La concentrazione in gossi-
polo di tale soluzione è di mg 0,02/ml. Lasciar riposare per un'ora alla
temperatura ambiente prima dell'impiego.
3.6 Soluzione tipo B di gossipolo: porre in un pallone tarato da ml 50, mg
27,9 d'acetato di gossipolo. Sciogliere e portare a volume impiegando il
solvente B (3.3). La concentrazione in gossipolo di tale soluzione è di
0,5 mg/ml. Le soluzioni tipo A e B di gossipolo restano stabili per 24
ore se sono conservate al buio.
4.Apparecchiatura
4.1 Mescolatore rotativo a capovolgimento: circa 25 capovolgimenti al
minuto.
4.2 Spettofotometro.
5.Mododioperare
5.1Quantità di sostanza da sottoporre all'analisi
La quantità di sostanza da sottoporre all'analisi è in rapporto al presunto
contenuto in gossipolo del campione. È preferibile operare su una piccola
quantità di sostanza e su una parte aliquota del filtrato relativamente
importante, in modo da ottenere una quantità di gossipolo sufficiente
per effettuare una misura spettofotometrica precisa. Per la determina-
zione del gossipolo libero nei semi, nelle farine e nei panelli di cotone,
la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi non deve sorpassare g 1;
per gli alimenti composti potrà raggiungere g 5. Una parte aliquota di ml
10 di filtrato è sufficiente nella maggioranza dei casi; essa dovrà conte-
nere da µg 50 a 100 di gossipolo. Per la determinazione del gossipolo
totale, la quantità di sostanza da sottoporre ad analisi potrà variare da g
0,5 a 5 affinché una parte aliquota di ml 2 di filtrato contenga da µg 40 a
200 di gossipolo.
L'analisi deve essere effettuata ad una temperatura ambiente vicina a
20º C.
5.2Determinazione del gossipolo libero
Porre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi in un pallone da ml
250 a collo smerigliato il cui fondo è ricoperto di polvere di vetro.
Aggiungere, con una pipetta, ml 50 del solvente A (3.2), tappare il
pallone e porlo per un'ora nel mescolatore rotativo a capovolgimento.
Filtrare su unfiltro asciutto e raccogliere il filtrato inunpallon cin o a
collo smerigliato. Nel corso della filtrazione ricoprire l'imbuto con un
vetro da orologio. Introdurre con una pipetta, rispettivamente in due
palloni tarati da ml 25 (A e B), parti aliquote identiche di filtrato conte-
nenti da µg 50 a 100 di gossipolo. Completare eventualmente a ml 10
con il solvente A (3.2). Completare quindi a volume il contenuto del
pallone A con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Questa soluzione
sarà utilizzata come soluzione di riferimento per la misura della solu-
zione del campione.
Pipettare ml 10 del solvente A (3.2) rispettivamente in due altri palloni
tarati da ml 25 (C e D). Portare a volume il contenuto del pallone (C)
con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Questa soluzione sarà utilizzata
come soluzione di riferimento per la misura della soluzione del saggio in
bianco.
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) rispettivamente nei palloni (D) e (B).
Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la
colorazione. Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume
con miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora.
Determinare allo spettrofotometro a nm 440, in vaschette di vetro da cm
1, la densità ottica della soluzione del saggio in bianco (D) di confronto
con la soluzione di riferimento (C) e la densità ottica della soluzione del
campione (B) di confronto con la soluzione di riferimento (A).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 12
▼B
Sottrarre la densità ottica della soluzione del saggio in bianco da quella
della soluzione del campione (= densità ottica corretta). Calcolare a
partire da questo valore il contenuto in gossipolo libero come indicato
al punto 6.
5.3Determinazione del gossipolo totale
Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi, contenente da
mg 1 a 5 di gossipolo, in un pallone tarato da ml 50 ed aggiungere ml 10
di solvente B (3.3). Preparare simultaneamente un saggio in bianco,
introducendo ml 10 di solvente B (3.3) in un altro pallone tarato da ml
50. Riscaldare i due palloni per 30 minuti su un bagno d'acqua bollente.
Raffreddare alla temperatura ambiente e portare a volume il contenuto diciascun pallone con la miscela isopropanolo-esano (3.1). Mescolare e
lasciar depositare per 10 a 15 minuti, quindi filtrare e raccogliere i filtrati
inpallon i a tappo smerigliato.
Pipettare ml 2 del filtrato del campione rispettivamente in due palloni
tarati da ml 25 e ml 2 del filtrato del saggio in bianco rispettivamente
in due altri palloni da ml 25. Prendere un pallone di ciascuna serie e
completare i rispettivi contenuti a ml 25 con la miscela isopropanolo-
esano (3.1). Queste soluzioni saranno utilizzate come soluzione di riferi-
mento.
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) rispettivamente negli altri due palloni.
Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la
colorazione. Raffreddare alla temperatura ambiente, completare il
volume a ml 25 con la miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e
lasciare riposare per un'ora.
Determinare la densità ottica come indicato in 5.2 per il gossipolo libero.
Calcolare a partire da tale valore il contenuto in gossipolo totale come
indicato al punto 6.
6.Calcolodeirisultati
Il calcolo dei risultati può essere fatto sia inbase alla den sità ottica specifica
(6.1), sia riferendosi ad una curva di taratura (6.2).
6.1In base alla densità ottica specifica
Nelle condizioni descritte le densità ottiche specifiche sono le seguenti:
gossipolo libero: E1%
1c m¼625
gossipolo totale: E1%
1c m¼600
Il contenuto in gossipolo libero o totale del campione è dato dalla
formula seguente:
gossipolo percento ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
nella quale:
E = densità ottica corretta, determinata come indicato in 5.2,
p = quantità in g di sostanza analizzata,a = parte aliquota del filtrato espressa inml.
6.2In base ad un diagramma di taratura
6.2.1Gossipolo libero
Predisporre 2 serie di 5 palloni tarati da ml 25. In ogni serie pipet-
tare rispettivamente ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 della soluzione tipo
A di gossipolo (3.5). Completare i volumi a ml 10 conil solven te
A (3.2). Completare ogni serie con un testimone costituito da un
pallone tarato da ml 25 contenente soltanto ml 10 del solvente A
(3.2). Portare a ml 25 il volume dei palloni della prima serie
(compreso il testimone) con la miscela isopropanolo-esano (3.1)
(serie di riferimento).
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) in ciascuno dei palloni della
seconda serie (compreso il testimone). Riscaldare per 30 minuti
su bagno d'acqua bollente per far sviluppare la colorazione.
Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume con la
miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora (serie tipo).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 13
▼B
Determinare la densità ottica di ogni soluzione della serie tipo di
confronto con la soluzione corrispondente della serie di riferi-
mento, nelle condizioni indicate in 5.2. Tracciare graficamente il
diagramma di taratura riportando le densità ottiche in funzione
delle quantità di gossipolo (in µg).
6.2.2Gossipolo totale
Predisporre 6 palloni tarati da ml 50. Porre nel primo ml 10 del
solvente B (3.3) e negli altri rispettivamente ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0;
10,0 della soluzione tipo B di gossipolo (3.6). Completare il conte-
nuto di ogni pallone a ml 10 con il solvente B (3.3). Riscaldare per
30 minuti su bagno d'acqua bollente. Raffreddare alla temperatura
ambiente, portare a volume con la miscela isopropanolo-esano
(3.1) e mescolare.
Porre ml 2,0 di queste soluzioni rispettivamente in due serie di 6
palloni tarati da ml 25. Completare a ml 25 il contenuto dei palloni
della prima serie con la miscela isopropanolo-esano (3.1) (serie di
riferimento).
Aggiungere ml 2 d'anilina (3.4) in ciascuno dei palloni della
seconda serie. Riscaldare per 30 minuti su bagno d'acqua bollente.
Raffreddare alla temperatura ambiente, portare a volume con la
miscela isopropanolo-esano (3.1), mescolare e lasciar riposare per
un'ora (serie tipo).
Determinare la densità ottica di ciascuna soluzione della serie tipo
di confronto con la soluzione corrispondente della serie di riferi-
mento, nelle condizioni indicate al punto 5.2. Tracciare
graficamente il diagramma di taratura riportando le densità ottiche
in funzione delle quantità di gossipolo (in µg).
6.3Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni in parallelo eseguite
sullo stesso campione non deve oltrepassare:
— 15 % in valore relativo per i contenuti in gossipolo inferiori a
500 ppm;
— 75 ppm in valore assoluto per i contenuti compresi tra 500 e 750 ppm;— 10 % in valore relativo per i contenuti superiori a 750 ppm.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 14
▼B
ALLEGATO II
1.RIVELAMENTOEDIDENTIFICAZIONEDEGLIANTIBIOTICIDEL
GRUPPODELLETETRACICLINE
1.Oggettoecampodiapplicazione
Il metodo permette di svelare ed identificare gli antibiotici del gruppo delle
tetracicline nei mangimi che ne contengano almeno ppm 0,1, nei concentrati
e nelle premiscele.
2.Principio
Il campione viene estratto con una miscela di metanolo ed acido cloridrico.
L'estratto è cromatografato su carta per via ascendente comparativamente a
delle soluzioni di referenza. Gli antibiotici vengono rivelati ed identificati
confrontando i loro Rf con quelli delle sostanze di referenza, sia per fluore-
scenza alla luce UV (forti concentrazioni in antibiotici), sia per bioautografia
inagar in oculato con B. cereus .
3.Reattivieterrenocolturale
3.1Tampone pH 3,5
Acido citrico monoidrato p.a. g 10,256
Fosfato disodico Na2HPO4·2H2O p.a. g 7,45
Acetone p.a. ml 300
Acqua distillata fino a ml 1000
3.2Tampone fosfato pH 5,5
Fosfato monopotassico KH2PO4p.a. g 130,86
Fosfato disodico Na2HPO4·2H2O p.a. g 6,947
Acqua distillata fino a ml 1000
3.3 Eluente I: Miscela nitrometano puro/cloroformio puro/ α-dicloridrina:
20/10/1,5 invol. Preparare al momen to dell'uso.
3.4 Eluente II: Miscela nitrometano puro/cloroformio puro/ α-picolina: 20/
10/3 invol. Preparare al momen to dell'uso.
3.5 Miscela metanolo puro/acido cloridrico (d: 1,19): 98/2 in vol.3.6 Acido cloridrico 0,1 N
3.7 Ammoniaca, d: 0,91
3.8 Sostanze standard: clorotetraciclina, ossitetraciclina, tetraciclina, la cui
attività è espressa incloridrato.
3.9Microorganismo: B. cereus ATCC n. 11.778
Conservazione del ceppo, preparazione della sospensione di spore ed
inoculazione del terreno colturale: seguire quanto prescritto ai punti
3.1 e 3.2 del metodo di dosaggio della clorotetraciclina, della ossitetra-
ciclina e della tetraciclina per diffusione in agar, secondo quanto èdescritto nella parte 2 del presente allegato.
3.10Terreno di coltura (
1)
Glucosio g 1
Peptone tripsico g 10Estratto di carne g 1,5
Estratto di lievito g 3
Agar g 201972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 15
(1) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.
▼B
Acqua distillata fino a ml 1000
aggiustare il pH a 5,8 al momento dell'uso.
3.11 Soluzione allo 0,1 % (p/v) di cloruro di 2, 3, 5-trifeniltetrazolio e 5 %
(p/v) di glucosio.
4.Apparecchiatura
4.1 Apparecchio per cromatografia ascendente su carta (altezza della carta:
cm 25). Carta Schleicher e Schüll 2040 b oppure 2043 b, o equivalente
4.2 Centrifuga
4.3 Termostato, regolato a 30º C4.4 Lampada UV per il rivelamento della fluorescenza
4.5 Piastre di vetro di cm 20 × 30 circa, che permettano il montaggio di una
piastra piana per bioautografia.
5.Soluzionidireferenza
5.1Soluzioni madri
Preparare a partire dalle sostanze standard (3.8) e con acido cloridrico
(3.6), delle soluzioni le cui concentrazioni corrispondano rispettivamente
a µg 500 di clorotetraciclina — HCl, di ossitetraciclina — HCl e di tetra-
ciclina — HCl per ml.
5.2Soluzioni di referenza per il rivelamento in luce UV
Diluire le soluzioni (5.1) con tampone fosfato (3.2) in modo da ottenere
delle soluzioni le cui concentrazioni corrispondano a µg 100 di clorote-
traciclina — HCl, ossitetraciclina — HCl e tetraciclina — HCl per ml.
5.3Soluzioni di referenza per il rivelamento per bioautografia
Diluire le soluzioni (5.1) con tampone fosfato (3.2) in modo da ottenere
delle soluzioni le cui concentrazioni corrispondano a µg 5 di clorotetraci-
clina — HCl, ossitetraciclina — HCl e tetraciclina — HCl per ml.
6.Estrazione
Quando il tenore presunto in antibiotico è inferiore a ppm 10, si può utiliz-
zare sia il campione omogeneizzato, sia la frazione fine separata per
setacciamento, dato che gli antibiotici si trovano di preferenza in questa
frazione.
Sospendere il campione nella miscela (3.5) e centrifugare. Raccogliere il
supernatante ed utilizzarlo tal quale o diluirlo, se necessario, con la miscela
(3.5) in modo da ottenere delle concentrazioni in antibiotico di µg 100 (6.1) e
µg 5 (6.2) circa per ml.
7.Rivelamentoedidentificazione
7.1Cromatografia
Immergere la carta nella soluzione tampone pH 3,5 (3.1). Eliminare
l'eccesso di liquido comprimendo la carta tra due fogli di carta da filtro.
Depositare quindi sulla carta deivolumi di ml 0,01 delle soluzioni di
referenza (5.2 e 5.3) e dell'estratto (6.1 e 6.2). Per ottenere una buona
separazione, il tenore approssimato di umidità della carta è determinante;
nel caso, lasciare seccare leggermente.
Sviluppare per cromatografia ascendente. Usare l'eluente I (3.3) per il
rivelamento per bioautografia; l'eluente II (3.4) per il rivelamento alla
luce UV. Quando il solvente è arrivato da cm 15 a 20 di altezza (circa
90 minuti), interrompere la cromatografia ed asciugare la carta.
7.2Rivelamento alla luce UV
Quando il tenore in antibiotico è superiore a 1 µg/cm
2, si notano delle
macchie fluorescenti giallo-oro in seguito ad irradiazione sotto luce UV
(4.4) dopo trattamento del cromatogramma con vapori di ammoniaca
(3.7).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 16
▼B
7.3Rivelamento per bioautografia
Versare il terreno di coltura (3.10), precedentemente seminato con B.
cereus(3.9), sulla piastra di vetro (4.5) e posare la carta sul terreno di
coltura. Dopo 5 minuti di contatto, togliere la carta e posarla su un'altra
zona di terreno colturale, dove sarà lasciata durante il periodo d'incuba-
zione. Incubare quindi per una notte in termostato a 30º C. La presenza
di un antibiotico del gruppo delle tetracicline si evidenzia per la presenza
di una zona d'inibizione chiara nel terreno colturale torbido.
Per fissare i cromatogrammi, vaporizzare sulla carta, dopo incubazione,
la soluzione (3.11).
7.4Identificazione
I valori Rf relativi degli antibiotici del gruppo delle tetracicline vengono
riportati qui sotto. Questi valori possono variare leggermente a seconda
della qualità della carta e del suo tenore in umidità.
Clorotetraciclina (CTC) 0,60
Tetraciclina (TC) 0,40Ossitetraciclina (OTC) 0,204-epi-CTC 0,15
4-epi-TC 0,13
4-epi-OTC 0,10
I composti «epi» presentano un'attività antibiotica inferiore a quella dei
composti normali.
2.DOSAGGIO DELLA CLOROTETRACICLINA, DELLA OSSITETRA-
CICLINAEDELLATETRACICLINA
A. PER DIFFUSIONE SU AGAR
1.Oggettoecampodiapplicazione
Il metodo permette di dosare la clorotetraciclina (CTC), l'ossitetraciclina
(OTC) e la tetraciclina (TC) nei mangimi, nei concentrati e nelle premiscele.
Il limite inferiore di dosaggio è di ppm 5. I tenori inferiori a ppm 5 possono
essere valutati per interpolazione grafica.
2.Principio
Per le concentrazioni uguali od inferiori a ppm 50, il campione viene estratto
con formamide diluita. Per concentrazioni superiori a ppm 50, viene estratto
con una miscela acetone, acqua e acido cloridrico per il dosaggio della CTC
e con una miscela di metanolo e di acido cloridrico per il dosaggio dell'OTC
e della TC.
Gli estratti sono quindi diluiti e la loro attività antibiotica è determinata
misurando la diffusione della CTC, dell'OTC e della TC su un agar nutritivo
seminato con B. cereus . La diffusione è indicata dalla formazione di una
zona d'inibizione in presenza del microorganismo. Il diametro di queste
zone è direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione dell'anti-
biotico.
3.Microorganismo:B.cereusATCCn.11.778
3.1Conservazione del ceppo
Seminare B. cereus inuntubo di terren o colturale (4.1), privo di bleu di
metilene ed acido borico . Incubare per una notte a 30º C circa. Conser-
vare il ceppo in frigorifero e trapiantarlo ogni 14 giorni.
3.2Preparazione della sospensione di spore
Raccogliere la patina di una agar coltura (3.1) con ml 2 a 3 di soluzione
fisiologica (4.5). Seminare con questa sospensione una bottiglia di Roux
contenente ml 300 di terreno colturale (4.1), senza bleu di metilene ed
acido borico , la cui concentrazione in agar è del 3 a 4 %. Incubare per
3 a 5 giorni da 28 a 30º C, raccogliere quindi le spore con ml 15 di
etanolo (4.6) dopo aver controllato la sporificazione al microscopio, ed
omogeneizzare. Questa sospensione si può conservare in frigorifero per
oltre 5 mesi.
Mediante prove preliminari su piastra con il terreno per il dosaggio (4.1),
stabilire la quantità d'inoculo che produce per le differenti concentrazioni
di antibiotico usate, le zone di diffusione più estese, che siano ancora1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 17
▼B
nette. Questa quantità generalmente è di ml 0,2 a 0,3/1000 ml. La semina
viene eseguita su terreno fuso e raffreddato da 50 a 60º C.
4.Terreno colturale ereattivi
4.1Terreno base per il dosaggio (1)
Glucosio g 1
Peptone tripsico g 10
Estratto di carne g 1,5
Estratto di lievito g 3Agar, secondo la qualità g 10 a 20
Tween80 ml 1
Tampone fosfato pH 5,5 (4.2) ml 10Soluzione al 5 % (p/v) di acido borico ml 15
Soluzione etanolica allo 0,5 % di bleu di
metilene ml 4
Acqua distillata fino a ml 1000
Aggiustare il pH a 5,8 al momento dell'uso
4.2Tampone fosfato, pH 5,5
Fosfato monopotassico KH
2PO4p.a. g 130,86
Fosfato disodico Na2HPO · 2 H2O p.a. g 6,947
Acqua distillata fino a ml 1000
4.3 Tampone fosfato pH 5,5 diluito 1/10
4.4Tampone fosfato pH 8
Fosfato monopotassico KH2PO4p.a. g 1,407
Fosfato disodico Na2HPO4·2H2O p.a. g 57,539
Acqua distillata fino a ml 1000
4.5 Soluzione fisiologica sterile
4.6 Etanolo al 20 % (v/v)4.7 Acido cloridrico 0,1 N4.8 Formamide al 70 % (v/v): prepararla prima dell'uso ed aggiustare il pH
a 4,5 conacido solforico 2 N circa
4.9 Miscela acetone puro/acqua/acido cloridrico (d: 1,19): 65/33/2 in vol.
4.10 Miscela metanolo puro/acido cloridrico (d: 1,19): 98/2 in vol.4.11 Sostanze standard: CTC, OTC e TC la cui attività è espressa in clori-
drato
5.Soluzionistandard
5.1Clorotetraciclina
Preparare a partire dalla sostanza standard (4.11) con acido cloridrico
(4.7) una soluzione madre la cui concentrazione corrisponda a µg 500
di clorotetraciclina — HCl per ml. Questa si conserva per una settimana
infrigorifero.
A partire da questa soluzione, preparare una soluzione standard di lavoro
S
8la cui concentrazione corrisponda a µg 0,2 di clorotetraciclina—HCl
per ml. La diluizione viene fatta con tampone fosfato pH 5,5 diluito 1/
10 (4.3) addizionato dello 0,01 % di nero d'amido (2).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 18
(1) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.
(2) Il nero d'amido serve per caratterizzare le zone d'inibizione delle soluzioni standard
(anelli bleu).
▼B
Preparare quindi, per diluizioni successive (1 + 1), usando lo stesso
tampone (4.3), le seguenti concentrazioni:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,0125 µg/ml
5.2Ossitetraciclina
Operando come indicato in 5.1, preparare, a partire da una soluzione
madre la cui concentrazione corrisponda a µg 400 di ossitetracicli-
na—HCl per ml, una soluzione di lavoro S8a µg 1,6 di
ossitetraciclina—HCl per ml e le concentrazioni seguenti:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3Tetraciclina
Operando come indicato in 5.1, preparare, a partire da una soluzione
madre la cui concentrazione corrisponda a µg 500 di tetraciclina—HCl
per ml, una soluzione di lavoro S8a µg 1,0 di tetraciclina—HCl per ml
e le concentrazioni seguenti:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Estrazione
6.1Concentrazioni uguali od inferiori a ppm 50
Estrarre con formamide (4.8) una quantità di campione, secondo le indi-
cazioni date nella tabella sotto riportata. Agitare per 30 minuti su
agitatore a scuotimento. Diluire immediatamente dopo, con tampone
fosfato (4.3), secondo le indicazioni date nella tabella sotto riportata,
per ottenere la concentrazione U8. La concentrazione in formamide di
questa soluzione non deve superare il 40 %. Centrifugare o lasciare
decantare in modo da ottenere una soluzione limpida. Preparare quindi
le concentrazioni U4,U2eU1per diluizioni successive (1 + 1) con
tampone fosfato (4.3).
Antibiotico CTC OTC TC
Tenore presunto
inppm 10 50 10 50 10 50
Quantità di
campione g 10 10 24 9,6 20 10
ml di formamide
(4.8) 100 100 80 100 80 100
ml di tampone
fosfato (4.3)dil.
1: 5
(a)dil.
1: 25
(b)70 200 120dil.
1: 5
(a)
Concentrazione
U9inµg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) Prelevare ml 20 di estratto e portarli a ml 100 con il tampone in pallone tarato.
(b) Prelevare ml 4 di estratto e portarli a ml 100 con tampone in pallone tarato.
6.2Concentrazioni superiori a ppm 50
6.2.1Clorotetraciclina
Estrarre, secondo la concentrazione presunta in antibiotico o
secondo la garanzia di fabbricazione, un quantitativo di g 2 a 10
di campione con 20 volte il suo volume di miscela (4.9). Agitare1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 19
▼B
per 30 minuti in agitatore a scuotimento. Verificare che il pH resti
inferiore a 3 nel corso dell'estrazione; se necessario aggiustare il
pH a 3 (per i composti minerali, con acido acetico al 10 %). Prele-
vare una parte di estratto ed aggiustare il pH a 5,5 con tampone
fosfato a pH 8 (4.4) inpresen za di verde di bromocresolo (viraggio
dal giallo al bleu). Diluire contampon e fosfato pH 5,5 diluito 1/10
(4.3) per ottenere la concentrazione U8(v. 6.1). Preparare quindi le
concentrazioni U4,U2ed U1per diluizioni successive (1 + 1) con
tampone fosfato (4.3).
6.2.2Ossitetraciclina e tetraciclina
Procedere come indicato in 6.2.1 sostituendo la miscela (4.9) con
la miscela (4.10).
7.Modalitàdidosaggio
7.1Semina del terreno colturale
Seminare il terreno base colturale (4.1), fuso e raffreddato da 50 a 60º C
con la sospensione di spore (3.2).
7.2Preparazione delle piastre
La diffusione su agar si effettua in delle piastre con le 4 concentrazioni
della soluzione standard (S8,S4,S2eS1) e le 4 concentrazioni dell'estratto
(U8,U4,U2eU1). Ogni piastra deve necessariamente contenere le 4
concentrazioni dello standard e dell'estratto.
A tale scopo, scegliere delle piastre di dimensioni tali che si possano
praticare nell'agar almeno 8 cavità (pozzetti) di mm 10 a 13 di diametro.
Calcolare la quantità di terreno base inoculato (7.1) da utilizzare per otte-
nere uno strato di agar uniforme di circa mm 2 di spessore. È preferibile
utilizzare, come piastre, delle lastre di vetro piane munite di un anello di
alluminio o di materiale plastico perfettamente levigate di mm 200 di
diametro e di mm 20 di altezza.
Introdurre con pipetta nelle cavità delle quantità esattamente misurate
della soluzione dell'antibiotico comprese tra ml 0,10 a 0,15, a seconda
del diametro.
Per ciascun campione, fare almeno 4 repliche di diffusione per ciascuna
concentrazione, in modo che ogni dosaggio comporti la valutazione di 32
zone d'inibizione.
7.3Incubazione
Incubare le piastre per 18 ore circa da 28 a 30º C.
8.Valutazione
Misurare i diametri delle zone d'inibizione, preferibilmente, per proiezione.
Riportare le misure su carta semi-logaritmica, riportando il logaritmo delle
concentrazioni nei confronti dei diametri degli aloni di inibizione. Tracciare
le rette della soluzione standard e dell'estratto. In assenza d'interferenze, le
due rette devono essere parallele. Il logaritmo dell'attività relativa viene
calcolato utilizzando la formula seguente:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Attività reale = attività presunta × attività relativa.
9.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve sorpassare 10 % in valore relativo.
B. PER TURBIDIMETRIA
1.Oggettoecampod'applicazione
Il metodo permette di dosare la clorotetraciclina (CTC), la ossitetraciclina
(OTC) e la tetraciclina (TC) a concentrazioni superiori a 1 g/kg, nella misura
in cui nessuna altra sostanza interferisca dando luogo a degli estratti torbidi.
Questo metodo è più rapido di quello per diffusione su agar.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 20
▼B
2.Principio
Il campione è sottoposto ad estrazione con una miscela di acetone, acqua,
acido cloridrico per il dosaggio della CTC e con una miscela di metanolo e
acido cloridrico per il dosaggio della OTC e della TC.
Gli estratti sono quindi diluiti ed il loro effetto antibiotico è determinato
misurando la trasmissione luminosa d'un terreno colturale seminato con
Staphylococcus aureus ed addizionato dell'antibiotico. La trasmissione lumi-
nosa è in funzione della concentrazione dell'antibiotico.
3.Microorganismo:StaphylococcusaureusK141 (1)
3.1Conservazione del ceppo
Seminare Staphylococcus aureus inuntubo di terren o colturale (4.1)
addizionato di 1,5 a 3 % di agar (secondo la qualità). Incubare per una
notte a 37º C. Conservare il ceppo in frigorifero e trapiantarlo in agar
ogni 4 settimane. Preparare contemporaneamente delle subcolture per
l'uso di laboratorio.
3.2Preparazione dell'inoculo
24 ore prima dell'utilizzazione, trapiantare una subcoltura in un tubo di
agar ed incubarla per una notte a 37º C. Raccogliere la patina colturale
con ml 2 circa di terreno base (4.1) e trasferire quindi sterilmente la
sospensione in ml 100 dello stesso terreno base (4.1). Incubare a bagno-
maria a 37º C, finché la crescita del germe entri in fase logaritmica (90 a
120 minuti).
4.Terreno colturale ereattivi
4.1Terreno base di dosaggio (2)
Peptone g 5
Estratto di lievito g 1,5Estratto di carne g 1,5
Cloruro di sodio g 3,5
Glucosio g 1,0Fosfato monopotassico KH
2PO4p.a. g 1,32
Fosfato bipotassico K2HPO4p.a. g 3,68
Acqua distillata fino a ml 1000
pH dopo sterilizzazione: 6,8 a 7,0
4.2Tampone fosfato pH 4,5
Fosfato monopotassico KH2PO4p.a. g 13,6
Acqua distillata fino a ml 1000
4.3 Acido cloridrico 0,1 N
4.4 Miscela acetone puro/acqua/acido cloridrico (d: 1,19): 65/33/2 in vol.4.5 Miscela metanolo puro/acido cloridrico (d: 1,19): 98/2 in vol.4.6 Soluzione al 10 % circa (p/v) di formaldeide
4.7 Sostanze standard: CTC, OTC e TC, la cui attività è espressa in clori-
drato.
5.Soluzionistandard
Preparare a partire dalle sostanze standard (4.7) e con acido cloridrico (4.3)
una soluzione madre la cui concentrazione corrisponda a µg 400 a 500 di
CTC — HCl, OTC — HCl o TC — HCl per ml. Questa soluzione si
conserva per una settimana in frigorifero.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 21
(1) Questo ceppo, isolato presso la LUFA a Kiel, presenta uno sviluppo più rapido dello
Staph. aureus ATCC 6538 P.
(2) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.
▼B
6.Estrazione
6.1Clorotetraciclina
Introdurre in un pallone tarato da ml 200 o 250, g 1 a 2 di campione in
esame. Aggiungere ml 100 circa di miscela (4.4) e agitare per 30 minuti
in agitatore a scuotimento. Portare a volume con tampone fosfato pH 4,5
(4.2). Omogeneizzare e lasciare riposare.
6.2Ossitetraciclina e tetraciclina
Introdurre in un pallone tarato da ml 200 o 250, g 1 a 2 di campione in
esame. Aggiungere ml 100 circa di miscela (4.5) ed agitare per 30 minuti
in agitatore a scuotimento. Portare a volume con tampone fosfato pH 4,5
(4.2). Omogeneizzare e lasciare sedimentare.
7.Modalitàdidosaggio
7.1 Diluire appropriatamente con tampone pH 4,5 (4.2) la soluzione standard
(5.) e l'estratto (6.) in modo da ottenere una serie di concentrazioni che
permettano di stabilire, per ciascun dosaggio, una curva standard e
l'interpolazione, su questa curva, di almeno due valori relativi all'estratto.
Le diluizioni devono essere scelte in funzione delle condizioni di crescita
del ceppo, che pessono variare da un laboratorio ad un altro. General-
mente si procede come segue:
7.1.1Clorotetraciclina
Diluire la soluzione standard (5.) con tampone fosfato (4.2) in
modo da ottenere la soluzione standard di lavoro la cui concentra-
zione corrisponda a µg 0,2 di CTC—HCl per ml. Preparare quindi
con tampone fosfato (4.2), come sotto indicato e nei tubi destinati
al dosaggio, 6 diluizioni con una ripetizione di ciascuna diluizione.
ml di soluzione stan-
dard di lavoroml di tampone fosfato
(4.2)Conc. in CTC-HCl o
TC-HCl
(µg/ml/)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Diluire l'estratto (6.1) contampon e fosfato (4.2) inmodo da otte-
nere una concentrazione presunta in CTC — HCl di µg 0,12 ml.
Introdurre ml 1 di questa soluzione in 2 tubi e ml 0,75 (= µg
0,09) inaltri 2 tubi. Completare il volume degli ultimi due tubi a
ml 1 contampon e fosfato (4.2).
7.1.2Ossitetraciclina e tetraciclina
Diluire la soluzione standard (5.) con tampone fosfato (4.2) in
modo da avere una soluzione standard di lavoro la cui concentra-
zione corrisponda a µg 0,6 di OTC — HCl o di TC — HCl per ml.
Preparare quindi con tampone fosfato (4.2) come sotto indicato e
nei tubi destinati al dosaggio, 7 diluizioni con una ripetizione di
ciascuna diluizione.
ml di soluzione stan-
dard di lavoroml di tampone fosfato
(4.2)Conc. in CTC-HCl o
TC-HCl
(µg/ml/)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,121972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 22
▼B
Diluire l'estratto (6.2) con tampone fosfato (4.2) per ottenere una
concentrazione presunta in OTC — HCl o TC — HCl di µg 0,48/
ml. Introdurre ml 1 di questa soluzione in 2 tubi e ml 0,5 (= µg
0,24) inaltri due tubi. Completare il volume degli ultimi due tubi
a ml 1 contampon e fosfato (4.2).
7.2Semina del terreno di coltura
Seminare il terreno base di dosaggio (4.1) con l'inoculo (3.2) in modo da
ottenere al fotometro a nm 590 una trasmissione luminosa dell'85 % in
una vaschetta di cm 5 o del 92 % in una vaschetta di cm 2, l'apparecchio
è regolato al 100 % di trasmissione con terreno base (4.1) non seminato.
7.3Preparazione dei tubi di saggio
Introdurre in ciascun tubo (7.1.1 o 7.1.2) ml 9 di terreno di coltura semi-
nato (7.2). Il riempimento dei tubi deve essere fatto rapidamente ma non
necessariamente in condizioni di sterilità.
7.4Incubazione
L'incubazione deve farsi obbligatoriamente a bagnomaria (mantenendo la
temperatura costante per agitazione dell'acqua) a 37º C ± 0,1º C. I tempi
d'incubazione devono essere scelti in modo da poter tracciare delle curve
di trasmissione la cui pendenza sia appropriata per delle misure precise
(generalmente 2 ore e 30 minuti a 3 ore). Bloccare quindi lo sviluppo
mescolando rapidamente ml 1 di soluzione di formaldeide (4.6) in
ciascuntubo.
7.5Valutazione dello sviluppo
Misurare le trasmissioni al fotometro a nm 590, regolando l'apparecchio
a 100 % di trasmissione con la soluzione standard più limpida (corri-
spondente alla concentrazione più elevata in antibiotico). In ragione di
deboli differenze di torbidità presentate dai differenti tubi, è raccomanda-
bile utilizzare delle vaschette di almeno cm 2 e, di preferenza, di cm 5.
8.Calcolodeirisultati
Tracciare graficamente la curva di riferimento su carta millimetrata ponendo
la trasmissione fotometrica nei confronti della concentrazione dell'antibiotico.
Interpolare sulla curva le trasmissioni relative all'estratto. Calcolare il tenore
in antibiotico del campione.
9.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve sorpassare 10 % in valore relativo.
3.DOSAGGIODELL'OLEANDOMICINA
— Per diffusione su agar —
1.Oggettoecampodiapplicazione
Il metodo permette di dosare l'oleandomicina nei mangimi, nei concentrati e
nelle premiscele, anche in presenza di tetraciclina. Il limite inferiore di
dosaggio è di ppm 0,5.
2.Principio
Il campione viene estratto con una soluzione metanolica diluita di tri (idro-
ssimetile) amminometano. Dopo centrifugazione, l'estratto viene diluito e la
sua attività antibiotica è determinata dalla misura della diffusione dell'olean-
domicina su di un terreno colturale agarizzato insemenzato con B. cereus .L a
diffusione è indicata dalla formazione di zone di inibizione in presenza del
microorganismo. Il diametro di queste zone è direttamente proporzionale al
logaritmo della concentrazione dell'antibiotico.
3.Microorganismo:B.cereusK250TR (1) (resistente alle tetracicline)
3.1Conservazione del ceppo
Seminare B. cereus in un tubo di terreno colturale (3.1) al quale sono
stati aggiunti µg 100 di ossitetraciclina ogni ml 5 di terreno. Incubare1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 23
(1) Ceppo isolato presso la LUFA a Kiel.
▼B
per una notte a 30º C circa. Conservare il ceppo in frigorifero e trapian-
tarlo ogni 4 settimane.
3.2Preparazione della sospensione di spore
Raccogliere la patina di una agar coltura (3.1) con ml 3 circa di solu-
zione fisiologica (4.3). Seminare con questa sospensione una bottiglia di
Roux contenente ml 300 di terreno colturale (4.1), ma la cui concentra-
zione in agar è del 3 a 4 % . Incubare per 3 a 5 giorni da 28 a 30º C,
raccogliere quindi le spore con ml 15 di etanolo (4.4), dopo aver control-
lato la sporificazione al microscopio, ed omogeneizzare. Questa
sospensione si può conservare in frigorifero per oltre 5 mesi.
Mediante prove preliminari su piastra con il terreno per il dosaggio (4.2),
determinare la quantità di inoculo che consente di ottenere per le diverse
concentrazioni di oleandomicina utilizzate, le zone di inibizione più
estese, che siano ancora nette. Questa quantità è generalmente di ml 0,1
a 0,2/ml 1000. La semina viene eseguita su terreno fuso e raffreddato a
60º C.
4.Terreni colturali ereagenti
4.1Terreno di trapianto del ceppo (1)
Glucosio g 1
Peptone tripsico g 10
Estratto di carne g 1,5Estratto di lievito g 3Agar, secondo la qualità g 10 a 20
Acqua distillata fino a ml 1000
Aggiustare il pH a 6,5 al momento dell'uso
4.2Terreno base per il dosaggio (
1)
Terreno (4.1) portato a pH 8,8
4.3 Soluzione fisiologica sterile
4.4 Etanolo al 20 % (v/v)4.5 Metanolo, puro
4.6 Soluzione allo 0,5 % (p/v) di tri (idrossimetile) amminometano p.a.
4.7Soluzione di estrazione
Metanolo, puro ml 50
Acqua distillata ml 50Tri (idrossimetile) ammino-
metano p.a.g 0,5
4.8 Sostanza standard: oleandomicina di attività nota
5.Soluzionistandard
Sciogliere la sostanza standard (4.8) in ml 5 di metanolo (4 5) e diluire con
la soluzione (4.6) per ottenere una concentrazione di oleandomicina di µg
100/ml.
A partire da questa soluzione madre, preparare diluendo con la soluzione
(4.6) una soluzione standard di lavoro S
8contenente µg 0,1 di oleandomicina
per ml. Preparare quindi per diluizioni successive (1 + 1) mediante la solu-
zione (4.6), le seguenti concentrazioni:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 24
(1) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.
▼B
6.Estrazione
Prelevare, secondo il contenuto presunto di oleandomicina, un quantitativo di
campione di g 2 a 10; aggiungere ml 100 della soluzione (4.7) e agitare per
30 minuti in agitatore a scuotimento.
Centrifugare; diluire una parte aliquota dell'estratto con la soluzione (4.6) per
ottenere una concentrazione presunta di oleandomicina di µg 0,1/ml. (=U8)
.Preparare qnuidi le concentrazioni U4,U2eU1per diluizioni successive
(1 + 1), mediante la soluzione (4.6).
7.Modalitàdidosaggio
7.1Semina del terreno di coltura
Seminare il terreno base per la determinazione (4.2), fuso e raffreddato a
60º C, con la sospensione di spore (3.2).
7.2Preparazione delle piastre
La diffusione su agar si effettua su delle piastre con le 4 concentrazioni
dello standard (S8,S4,S2,S1) e le 4 concentrazioni dell'estratto (U8,U4,
U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente contenere le 4 concentrazioni
dello standard e dell'estratto.
A tale scopo, scegliere delle piastre di dimensioni tali che si possano
praticare nell'agar almeno 8 cavità (pozzetti) da mm 10 a 13 di diametro.
Calcolare la quantità di terreno colturale seminato (7.1) da utilizzare per
ottenere uno strato di agar uniforme di circa mm 2 di spessore. È prefe-
ribile utilizzare come piastre delle lastre di vetro piano munite di un
anello di alluminio o di materiale plastico perfettamente piano di mm
200 di diametro e mm 20 di altezza.
Introdurre con pipetta nelle cavità delle quantità esattamente misurate
della soluzione di antibiotico comprese tra ml 0,10 e 0,15, a secondadel diametro. Per ogni campione fare almeno 4 repliche di diffusione
con ciascuna concentrazione, in modo che ogni determinazione comporti
la valutazione di 32 zone di inibizione.
7.3Incubazione
Incubare le piastre per 18 ore circa da 28 a 30º C.
8.Valutazione
Misurare i diametri delle zone di inibizione preferibilmente per proiezione.
Trascrivere le misure su carta semilogaritmica, riportando il logaritmo delle
concentrazioni nei confronti delle zone di inibizione. Tracciare le rette della
soluzione standard e dell'estratto. In assenza di interferenza, le due rette
debbono essere parallele.
Il logaritmo dell'attività relativa viene calcolato utilizzando la formula
seguente:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Attività reale = attività presunta × attività relativa.
9.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve sorpassare 10 % in valore relativo.
4.DOSAGGIODELLATILOSINA
— per diffusione su agar —
1.Oggettoecampod'applicazione
Il metodo permette di dosare la tilosina nei mangimi, nei concentrati e nelle
premiscele Il limite inferiore di dosaggio è di ppm 2.
2.Principio
Il campione viene estratto con una soluzione tampone fosfato a pH 8, preven-
tivamente portato a 80º C, e sottoposto quindi all'estrazione con il metanolo.
Dopo centrifugazione, l'estratto viene diluito e la sua attività antibiotica è1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 25
▼B
determinata dalla misura della diffusione della tilosina su di un terreno coltu-
rale agarizzato insemenzato con Sarcina lutea . La diffusione è indicata dalla
formazione di zone di inibizione in presenza del microorganismo. Il diametro
di queste zone è direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione
dell'antibiotico.
3.Microorganismo:SarcinaluteaATCCn.9341
3.1Conservazione del ceppo
Seminare Sarcina lutea inuntubo di terren o colturale (4.1) portato a pH
7,0. Incubare per una notte a 35º C circa. Conservare il ceppo in frigori-
fero e trapiantarlo ogni mese.
3.2Preparazione della sospensione di germi
Raccogliere la patina di agar-coltura (3.1), preparata di fresco, con ml 2
a 3 di soluzione fisiologica (4.4). Seminare con questa sospensione una
bottiglia di Roux contenente ml 250 di terreno colturale (4.1) portato a
pH 7,0. Incubare per 24 ore a 35º C, raccogliere i germi con ml 25 di
soluzione fisiologica (4.4). Omogeneizzare e diluire questa sospensione
per ottenere una trasmissione luminosa del 75 % circa a nm 650.
Conservata in frigorifero, questa sospensione è utilizzabile una settimana.
Mediante prove preliminari su piastra con il terreno base per la determi-
nazione (4.1), determinare la quantità di inoculo che consente di ottenere
per le diverse concentrazioni di tilosina utilizzate, le zone di inibizione
più estese, che siano ancora nette. La semina viene eseguita su terreno
fuso e raffreddato da 48 a 50º C.
4.Terreni colturali ereagenti
4.1Terreno base per il dosaggio (1)
Glucosio g 1
Peptone tripsico g 10
Estratto di carne g 1,5
Estratto di lievito g 3Agar, secondo la qualità g 10 a 20
Acqua distillata fino a ml 1000
Aggiustare al momento dell'uso il pH 7,0 per la conservazione del ceppo
e la preparazione della sospensione dei germi ed a pH 8,0 per il
dosaggio.
4.2Tampone fosfato, pH 8
Fosfato monopotassico KH
2PO4p.a. g 0,523
Fosfato bipotassico K2HPO4p.a. g 16,730
Acqua distillata fino a ml 1000
4.3Tampone fosfato, pH 7
Fosfato monopotassico KH2PO4p.a. g 5,5
Fosfato bipotassico K2HPO4p.a. g 13,6
Acqua distillata fino a ml 1000
4.4 Soluzione fisiologica sterile
4.5 Metanolo, puro4.6 Metanolo a 40 % (v/v)
4.7 Miscela tampone fosfato (4.2) / metanolo, puro: 60/40 in vol.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 26
(1) Si possono utilizzare tutti i terreni commerciali e di composizione analoga purché
forniscano gli stessi risultati.
▼B
4.8 Sostanza standard: tilosina di attività nota.
5.Soluzionestandard
Essiccare la sostanza standard (4.8) per 3 ore a 60º C in una stufa sotto vuoto
(mm 5 di mercurio). Pesare mg 10 a 50 inunpallon e tarato, scioglierli inml5 di metanolo (4.5) e diluire la soluzione con il tampone fosfato, pH 7 (4.3)
per ottenere una concentrazione di tilosina base di µg 1000/ml.
A partire da questa soluzione madre, preparare diluendo con la miscela (4.7)
una soluzione standard di lavoro S
8contenente µg 2 di tilosina base per ml.
Preparare quindi per diluizioni successive (1 + 1), mediante la miscela (4.7),
le seguenti concentrazioni:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Estrazione
Preparare un quantitativo di g 10 per i concentrati e di g 20 per le premiscele
e i mangimi. Aggiungere ml 60 di tampone fosfato, pH 8 (4.2), preventiva-
mente portato a 80º C, e omogeneizzare per due minuti (frullatore per uso
domestico. Ultra-turrax, ecc.).
Lasciare quindi riposare per 10 minuti, aggiungere ml 40 di metanolo (4.5) e
omogeneizzare per 5 minuti. Centrifugare, prelevare una certa aliquota dell'e-
stratto e diluire con la miscela (4.7) per ottenere una concentrazione presunta
di tilosina di µg 2/ml (= U8). Preparare quindi le concentrazioni U4,U2eU1per diluizioni successive (1 + 1) mediante la miscela (4.7). Per concentra-zioni inferiori a ppm 10, evaporare l'estratto a secco in un evaporatore a
rotazione a 35º C e riprendere il residuo con del metanolo al 40 % (4.6).
7.Modalitàdidosaggio
7.1Semina del terreno di coltura
Seminare il terreno base per il dosaggio (4.1) fuso e raffreddato da 48 a
50º C, e portato a pH 8,0 con la sospensione di germi (3.2).
7.2Preparazione delle piastre
La diffusione su agar si effettua su delle piastre con le 4 concentrazioni
dello standard (S
8,S4,S2,S1) e le 4 concentrazioni dell'estratto (U8,U4,
U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente contenere le 4 concentrazioni
dello standard e dell'estratto.
A tale scopo, scegliere delle piastre di dimensioni tali che si possano
praticare nell'agar almeno 8 cavità (pozzetti) da mm 10 a 13 di diametro.
Calcolare la quantità di terreno colturale seminato (7.1) da utilizzare per
ottenere uno strato di agar uniforme di circa mm 2 di spessore. È prefe-
ribile utilizzare come piastre delle lastre di vetro piano munite di un
anello di alluminio o di materiale plastico perfettamente piano di mm
200 di diametro e di mm 20 di altezza.
Introdurre con pipetta nelle cavità delle quantità esattamente misurate
della soluzione di antibiotico comprese tra ml 0,10 e 0,15, a seconda
del diametro.
Per ogni campione fare almeno 4 repliche di diffusione con ciascuna
concentrazione, in modo che ogni determinazione comporti la valuta-
zione di 32 zone di inibizione.
7.3Incubazione
Incubare le piastre per una notte da 35 a 37º C.
8.Valutazione
Misurare il diametro delle zone di inibizione possibilmente per proiezione.
Trascrivere le misure su carta semilogaritmica, riportando il logaritmo delle
concentrazioni nei confronti delle zone di inibizione. Tracciare le rette della
soluzione standard e dell'estratto. In assenza di interferenza, le due rette
devono essere parallele.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 27
▼B
Il logaritmo dell'attività relativa viene calcolato utilizzando la formula
seguente:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Attività reale = attività presunta × attività relativa.
9.Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo
stesso campione non deve sorpassare 10 % in valore relativo.
5.DOSAGGIODELLAVIRGINIAMICINA
— per diffusione in agar —
1.Oggettoecampodiapplicazione
Il presente metodo permette di dosare la virginiamicina nei mangimi e nelle
premiscele. Il limite inferiore di dosaggio è di 2 mg/kg (2 ppm)(1).
2.Principio
Il campione viene estratto con una soluzione metanolica di Tween 80.
L'estratto viene decantato o centrifugato, poi diluito. La sua attività antibio-
tica è determinata misurando la diffusione della virginiamicina su terreno
agarizzato, insemenzato con Micrococcus luteus . La diffusione è rivelata
dalla formazione di aloni di inibizione del microrganismo. Si ammette che
il diametro di tali aloni sia direttamente proporzionale al logaritmo della
concentrazione di antibiotico nel campo delle concentrazioni utilizzate.
3.Microrganismo: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Conservazione del ceppo
Insemenzare con Micrococcus luteus il terreno colturale (4.1) distribuito
in provette a becco di clarino. Incubare per 24 ore a 30 ºC, conservare in
frigorifero a 4 ºC circa e trapiantare ogni 15 giorni.
3.2.Preparazione della sospensione batterica (a)
Mediante 2-3 ml di soluzione di cloruro di sodio (4.3), raccogliere la
patina di una agar-coltura (3.1) preparata di recente. Con tale sospen-
sione, insemenzare una bottiglia di Roux contenente 250 ml del terreno
di coltura (4.1); incubare per 18-20 ore a 30 ºC. Raccogliere i germi con
25 ml di soluzione di cloruro di sodio (4.3) e omogeneizzare. Diluire a
1/10 la sospensione mediante la soluzione di cloruro di sodio (4.3). La
trasmittanza della sospensione, misurata a 650 nm sotto lo spessore di
1 cm in confronto con la soluzione di cloruro di sodio (4.3), deve essere
del 75 % circa. Questa sospensione può essere conservata per una setti-
mana alla temperatura di 4 ºC circa.
4.Terreni colturali ereattivi
4.1.Terreno di mantenimento del ceppo e di base del dosaggio (b)
Peptone di carne 6,0 g
Triptone 4,0 g
Estratto di lievito 3,0 g
Estratto di carne 1,5 g
Glucosio 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Acqua 1 000 ml
pH 6,5 (dopo sterilizza-
zione).1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 28
(1) 1 mg di virginiamicina equivale a 1 000 unità «UK».
(a) Possono essere impiegati altri metodi, purché sia dimostrato che essi diano sospensioni
di batteri analoghe.
(b) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio che dia gli stessi risultati.▼M2
▼M2
4.2.Tampone al fosfato, pH 6
Fosfato bipotassico, K2HPO42,0 g
Fosfato monopotassico, KH2PO48,0 g
Acqua q.b. a 1 000 ml
4.3. Soluzione allo 0,8 % (p/v) di cloruro di sodio: sciogliere in acqua 8 g di
cloruro di sodio, diluire a 1 000 ml e sterilizzare.
4.4. Metanolo.4.5. Miscela di tampone al fosfato (4.2) e di metanolo (4.4): 80/20 (v/v).
4.6. Soluzione metanolica allo 0,5 % (p/v) di Tween 80: sciogliere 5 g di
Tween 80 in metanolo (4.4) e diluire a 1000 ml con metanolo.
4.7. Sostanza di riferimento: virginiamicina ad attività nota.
5.Soluzionidiriferimento
Sciogliere nel metanolo (4.4) una quantità esattamente pesata della sostanza
di riferimento (4.7); diluire con metanolo (4.4) in modo da ottenere una solu-
zione madre contenente 1000 µg di virginiamicina/ml. Se conservata a 4 ºC
in bottiglia chiusa, questa soluzione è stabile per cinque giorni.
A partire da questa soluzione, preparare per diluizioni successive con la
miscela (4.5) le seguenti soluzioni:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Preparazione dell'estrattoedellesoluzioni
6.1.Estrazione
6.1.1.Prodotti con tenore in virginiamicina non superiore a 100 mg/kg
Pesare una quantità di 50,0 g di campione. Aggiungere 200 ml
della soluzione (4.6), agitare per 30 minuti, poi lasciar depositare
o centrifugare. Prelevare 20 ml del supernatante ed evaporare a
5 ml in evaporatore rotante, a temperatura non superiore a 40 ºC.
Diluire il residuo con la miscela (4.5), fino ad ottenere una
concentrazione presunta in virginiamicina pari a 1 µg/ml (= U8).
6.1.2.Prodotti il cui tenore in virginiamicina è superiore a 100 mg/kg
Pesare una quantità di campione non superiore a 10,0 g e conte-
nente da 1 a 50 mg di virginiamicina. Aggiungere 100 ml della
soluzione (4.6), agitare per 30 minuti, poi lasciar depositare o
centrifugare. Diluire il surnatante con la miscela (4.5) fino ad
ottenere una concentrazione in virginiamicina pari a 1 µg/ml (=
U8).
6.2.Soluzioni dell'estratto
A partire dalla soluzione U8, preparare per diluizioni successive (1: 1)
conla miscela (4.5) le soluzion i U4(concentrazione presunta: 0,5 µg/
ml), U2(concentrazione presunta: 0,25 µg/ml) ed U1(concentrazione
presunta: 0,125 µg/ml).
7.Modalitàdidosaggio
7.1.Inoculazione del terreno di coltura
Con la sospensione di batteri (3.2), insemenzare il terreno base per il
dosaggio (4.1) alla temperatura di 50 ºC circa. Mediante saggi prelimi-
nari su piastra col terreno (4.1), determinare la quantità di sospensione
di batteri che consente di ottenere, per le diverse concentrazioni di virgi-
niamicina, aloni di inibizione che abbiano la maggiore estensione
possibile e che siano ancora netti.
7.2.Preparazione delle piastre
La diffusione in agar si effettua su piastre con le quattro concentrazioni
della soluzione di riferimento (S8,S4,S2,S1) e le quattro concentrazioni
dell'estratto (U8,U4,U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente conte-1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 29
▼M2
nere le quattro concentrazioni della sostanza di riferimento e dell'e-
stratto. A tale scopo, impiegare piastre di dimensioni tali che si
possano praticare nel terreno agarizzato almeno otto pozzetti del
diametro di 10-13 mm, i cui centri non siano distanti tra loro meno di
30 mm. Si possono adoperare come piastre delle lastre di vetro piane,
provviste di un anello di alluminio o di materiale plastico del diametro
di 200 mm e dell'altezza di 20 mm.
Versare nelle piastre una quantità di terreno (4.1) insemenzato come
indicato al punto 7.1, che permetta di ottenere uno strato dello spessore
di 2 mm circa (60 ml per una piastra di 200 mm di diametro). Lasciar
solidificare, praticare i pozzetti e deporvi dei volumi esattamente misu-
rati delle soluzioni della sostanza di riferimento e dell'estratto (da 0,10 a
0,15 ml per pozzetto a seconda del diametro). Le operazioni descritte
vanno ripetute almeno quattro volte per ogni concentrazione, in modo
da ottenere per ciascuna determinazione 32 aloni di inibizione.
7.3.Incubazione
Incubare le piastre per 16-18 ore, alla temperatura di 30 ºC ± 2 ºC.
8.Valutazione
Misurare il diametro degli aloni di inibizione con l'approssimazione di
0,1 mm. Per ogni concentrazione, registrare le misue medie su carta semilo-garitmica, riportando il logaritmo delle concentrazioni in funzione del
diametro dell'alone di inibizione. Tracciare le rette più appropriate per la
soluzione di riferimento e per l'estratto, procedendo ad esempio come segue.
Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della soluzione
di riferimento (SL) mediante la formula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della soluzione
di riferimento (SH) mediante la formula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l'estratto al livello
più basso (UL) ed al livello più alto (UH) sostituendo nelle formule sopra
riportate i valori S1,S2,S4eS8conquelli di U1,U2,U4eU8.
Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico. Congiungendo i due punti
si ottiene la retta più appropriata per la soluzione standard. Procedendo allo
stesso modo per UL e UH si ottiene la retta più appropriata per l'estratto.
In mancanza di interferenze, le rette dovrebbero essere parallele. In pratica,
esse sono considerate parallele allorché (SH — SL) e (UH — UL) non diffe-
riscono fra loro di più del 10 % della loro media.
Se le rette non sono parallele, è possibile eliminare sia U1eS1, sia U8eS8.I n
questo caso, i valori SL, SH, UL e UH che permettono di ottenere le rette più
appropriate vanno calcolati mediante le formule seguenti:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6o5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6o5s8þ2s4/C0s2
6
e mediante formule analoghe per UL e UH. Se si utilizza quest'alternativa,
bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo sopra descritto. Se il
risultato è stato ottenuto a partire da tre punti, ciò va indicato sul certificato
di analisi.
Quando le rette sono considerate parallele, calcolare il logaritmo dell'attività
relativa (log. A) con una delle formule seguenti:
Per 4 punti
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s21972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 30
▼M2
Per 3 punti
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
o
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Attività dell'estratto del campione = attività dello standard corrispondente ×
A:
(U8=S8×A )
Se l'attività relativa si trova al di fuori della gamma di valori compresi fra 0,5
e 2,0, ripetere la determinazione procedendo ad opportune regolazioni delle
concentrazioni dell'estratto o, eventualmente, delle soluzioni di riferimento.
Quando tale attività non può essere ricondotta nella gamma di valori
richiesta, il risultato deve essere considerato approssimativo e tale indica-
zione deve figurare sul certificato di analisi.
Allorché le rette non sono considerate parallele, ripetere la determinazione.
Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile ottenere il
parallelismo, la determinazione deve essere considerata insoddisfacente.
Esprimere il risultato in mg virginiamicina/kg alimento.
9.Ripetibilità
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso
campione dallo stesso analista non deve eccedere:
— 2 mg/kg, in valore assoluto, per i contenuti in virginiamicina inferiori a
10 mg/kg;
— 20 % del risultato più elevato per i contenuti da 10 a 25 mg/kg;— 5 mg/kg, in valore assoluto, per i contenuti da 25 a 50 mg/kg;
— 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 mg/kg.1972L0199 — IT — 22.07.1993 — 003.001 — 31