1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni
►B SETTIMA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE
del 1omarzo 1976
che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali
(76/372/CEE)
(GU L 102 del 15.4.1976, pag. 8)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva81/680/CEE dellaCommissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
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SETTIMA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE
del 1omarzo 1976
che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali
(76/372/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,vistaladirettivadel Consiglio, del 20 luglio 1970, concernente l'intro-
duzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisi
comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali(
1),
modificata da ultimo dall'atto di adesione(2), in particolare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per gli animali destinati a constatare l'osservanza dellecondizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per gli animali, siano effettuati secondo i modi di preleva-
mento di campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE,
73/46/CEE, 74/203/CEE e 75/84/CEE dellaCommissione, rispettiva -mente del 15 giugno 1971(
3), del 18 novembre 1971(4), del 27 aprile
1972(5), del 5 dicembre 1972(6), del 25 marzo 1974(7) e del 20
dicembre 1974(8), hanno già fissato un certo numero di metodi di
analisi comunitari; che, tenuto conto dello stato d'avanzamento dei
lavori sin qui effettuati, è necessario adottare una settima serie dimetodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del comitato permanente per gli alimenti per glianimali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli
alimenti per gli animali, per quanto riguarda il loro contenuto in afla-
tossinaB1siano effettuate secondo i metodi descritti nell'allegato della
presente direttiva.
Articolo 2
Gli Stati membri provvedono all'entrata in vigore, non oltre il 1o
ottobre 1976, delle disposizioni legislative, regolamentari e amministra-
tive necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva
e ne informano immediatamente la Commissione.
Articolo 3
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2.
(2) GU n. L 73 del 27. 3. 1972, pag. 14.
(3) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(4) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.
(5) GU n. L 123 del 29. 5. 1972, pag. 6.
(6) GU n. L 83 del 30. 3. 1973, pag. 21.
(7) GU n. L 108 del 22. 4. 1974, pag. 7.
(8) GU n. L 32 del 5. 2. 1975, pag. 26.▼M1
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ALLEGATO
DETERMINAZIONE DELL'AFLATOSSINA B1
A. METODO PER CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONALE SU
STRATO SOTTILE
1. Scopo e campo di applicazione
Il metodo consente di determinare il contenuto di aflatossina B1dei
seguenti alimenti: panelli di arachidi, di copra, di lino, di soia, di
sesamo, di babassu e di germi di granturco, cereali e prodotti a
base di cereali, farina di piselli, polpa e fecola di patate. Il limite
inferiore di determinazione è di 0,01 mg/kg (10 ppb)
In presenza di sostanze interferenti che intralciano le determina-
zioni, occorre ricominciare l'analisi secondo il metodo B
(cromatografia bidimensionale su strato sottile)
2. Principio
Il campione è sottoposto ad estrazione con cloroformio. L'estratto
viene filtrato e un'aliquota viene prelevata e purificata mediantecromatografia su colonna di gel di silice. L'eluato viene evaporato
e il residuo ripreso con un volume determinato di cloroformio o di
una miscela di benzene e acetonitrile. Un'aliquota della soluzione è
sottoposta a cromatografia su strato sottile. La quantità di aflatos-
sinaB
1è determinata sotto irradiazione UV del cromatogramma,
sia visualmente sia mediante fluorodensitometria, in rapporto a
quantità note di aflatossina B1.
L'identità dell'aflatossina B1estratta dall'alimento deve essere
confermata con i procedimenti indicati
3. Reattivi
Nota:Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni, devono
essere del tipo «per analisi»
3.1. Acetone
3.2. Cloroformio, stabilizzato con 0,5 — 1,0 % di etanolo al 96 % (v/v)3.3. n-Esano3.4. Metanolo
3.5. Etere dietilico anidro, esente da perossidi
3.6. Misceladi benzene e a cetonitrile: 98/2 (v/v)3.7. Misceladi cloroformio (3.2) e di meta nolo (3.4): 97/3 (v/v)3.8. Gel di silice, per cromatografia su colonna, granulometria: 0,05/
0,20 mm
3.9. Cotone idrofilo, preventivamente sgrassato col cloroformio, o lana
di vetro
3.10. Solfato di sodio, anidro, granulato3.11. Gas inerte, ad esempio azoto
3.12. Acido cloridrico 1 N
3.13. Acido solforico al 50 % (v/v)3.14. Terra di diatomee (Hiflosupercel), lavata con acido3.15. Gel di silice G-HR o equivalente, per cromatografia su strato sottile3.16. Soluzione campione a 0,1 µg circa di aflatossina B
1per ml nel
cloroformio (3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile (3.6), prepa-
rata e controllata come indicato al punto 7
3.17. Soluzione campione qualitativa a 0,1 µg circa di aflatossine B1eB2per ml nel cloroformio (3.2) o nellamiscelabenzene/a cetonitrile
(3.6). Tali concentrazioni sono riferite a titolo indicativo. Devono
essere adattate in modo da ottenere la stessa intensità di fluore-
scenza per le due aflatossine
3.18. Solventi di sviluppo:1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 3
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3.18.1. Cloroformio (3.2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v), vaschetta non saturata
3.18.2. Etere dietilico (3.5)/metanolo (3.4)/acqua: 96/3/1/ (v/v/v), vaschetta
non saturata
3.18.3. Etere dietilico (3.5)/metanolo (3.4)/acqua: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
vaschetta saturata
3.18.4. Cloroformio (3.2)/metanolo (3.4): 94/6/(v/v), vaschetta saturata
3.18.5. Cloroformio (3.2)/metanolo (3.4): 97/3 (v/v), vaschetta saturata
4. Apparecchiatura
4.1. Tritatore mescolatore
4.2. Scuotitore o agitatore magnetico
4.3. Filtri a pieghe, Schleicher e Schül, n. 588 o equivalente, diametro
24 cm.
4.4. Colonne per cromatografia, in vetro (diametro interno: 22 mm,
lunghezza: 300 mm), con rubinetto di teflon e serbatoio da 250 ml
4.5. Evaporatore rotante sotto vuoto, provvisto di pallone a fondo
rotondo da500 ml
4.6. Beute da 500 ml, a tappo smerigliato
4.7. Apparecchiatura per cromatografia su strato sottile4.8. Lastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 200 × 200 mm,
preparate come segue (le quantità indicate sono sufficienti per rico-
prire cinque lastre): introdurre 30 g di gel di silice G-HR (3.15) in
una beuta, aggiungere 60 ml di acqua, tappare e agitare per un
minuto. Stendere lasospensione sulle la stre in modo daottenere
uno strato uniforme di 0,25 mm di spessore. Lasciar asciugare
all'aria e conservare in seguito in essiccatoio munito di gel di silice.
Al momento dell'uso, attivare le lastre ponendole per un'ora nella
stufaa110 ºC
Le lastre in commercio pronte per l'uso possono essere impiegate se
danno risultati simili a quelli delle lastre preparate come sopra indi-
cato
4.9. Lampada UV a onde lunghe (360 mm). L'intensità di irradiazione
deve consentire di distinguere nettamente una macchia di 1,0 ng
di aflatossina B
1su una lastra per cromatografia su strato sottile,
ad una distanza di 10 cm dalla lampada
4.10. Cilindri graduati da 10,0 ml con tappi in polietilene
4.11. Spettrofotometro UV
4.12. Fluorodensitometro (eventualmente)
5. Modo di operare
5.1. Preparazione dal campione (vedi note, parte C, punto 1)
Macinare il campione in modo che passi integralmente attraverso
un setaccio a maglie di 1 mm (conforme alla raccomandazione
ISO R 565)
5.2. Estrazione
Introdurre 50,0 g del campione macinato e omogeneizzato in una
beutada500 ml (4.6). Aggiungere 25 g di terradi dia tomee
(3.14), 25 ml di acqua e 250 ml di cloroformio (3.2). Tappare la
beuta, scuotere o agitare per 30 minuti con l'apposito apparecchio
(4.2) e filtrare con filtro a pieghe (4.3). Eliminare i primi 10 ml di
filtrato e raccogliere quindi 50 ml
5.3. Purificazione su colonna
Munire di un tampone di cotone o di lana di vetro (3.9) l'estremità
inferiore di una colonna per cromatografia (4.4), riempire di cloro-
formio (3.2) i due terzi della colonna e aggiungere 5 g di solfato di
sodio (3.10)
Controllare che la superficie superiore dello strato di solfato di
sodio sia piana, quindi aggiungere un poco alla volta 10 g di gel
di silice (3.8). Scuotere lacolonnacon preca uzione dopo ogni
aggiunta per eliminare le bolle d'aria. Lasciar depositare per 15
minuti e aggiungere quindi con precauzione 15 g di solfato di sodio1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 4
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(3.10). Lasciare scendere il liquido fino a vicinanza immediata
della superficie superiore dello strato di solfato di sodio
Mescolare i 50 ml di estratto raccolti al punto 5.2 con 100 ml di n-
esano (3.3) e travasare quantitativamente la miscela nella colonna.
Lasciare scendere il liquido sino alla superficie superiore dello
strato di solfato di sodio. Eliminare il liquido defluito. Aggiungere
quindi 100 ml di etere dietilico (3.5) e lasciare nuovamente scen-
dere il liquido sino alla superficie superiore dello strato di solfato
di sodio. Durante queste operazioni, controllare che i liquidi deflui-
scano ad un ritmo di 8/12 ml al minuto e che la colonna non
rimanga asciutta. Eliminare i liquidi defluiti. Eluire quindi con
150 ml della miscela cloroformio/metanolo (3.7) e raccogliere tutto
l'eluato
Evaporare l'eluato quasi a secco, in corrente di gas inerte (3.11) e
ad una temperatura non superiore a 50 ºC, con l'evaporatore rotante
sotto vuoto (4.5). Portare quantitativamente il residuo, usando il
cloroformio (3.2) o lamiscelabenzene/a cetonitrile (3.6), in un
cilindro graduato da 10,0 ml (4.10). Concentrare la soluzione in
corrente di gas inerte (3.11) e portare quindi il volume a 2,0 ml
con cloroformio (3.2) o con lamiscelabenzene/a cetonitrile (3.6)
5.4. Cromatografia su strato sottile
Deporre sotto forma di punti su una lastra per cromatografia su
strato sottile (4.8), a 2 cm dal bordo inferiore e ad intervalli di
2 cm, i volumi sotto indicati della soluzione campione e dell'e-
stratto:
— 10, 15, 20, 30 e 40 µl della soluzione campione di aflatossina
B1(3.16)
— 10 µl dell'estratto ottenuto al punto 5.3 e, in sovrapposizione
sullo stesso punto , 20 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
— 10 e 20 µl dell'estratto ottenuto al punto 5.3
Sviluppare il cromatogramma al riparo dalla luce, impiegando uno
dei solventi di sviluppo (3.18). Lasceltadel solvente deve essere
stabilita preventivamente, deponendo sulla lastra 25 µl della solu-
zione campione qualitativa (3.17) e accertando che, all'atto dello
sviluppo, le aflatossine B1eB2siano completamente separate
Lasciar evaporare i solventi al riparo dalla luce ed irradiare quindi
con la luce UV, collocando la lastra a 10 cm della lampada (4.9).
Le macchie di aflatossina B1danno una fluorescenza blu
5.5. Determinazioni quantitative
Procedere alle determinazioni, sia visualmente sia mediante fluoro-
densitometria, come sotto indicato
5.5.1. Misurazioni visuali
Determinare la quantità di aflatossina B1dell'estratto confrontando
l'intensità di fluorescenza delle macchie dell'estratto con quella
delle macchie della soluzione campione. Interpolare se necessario.
La fluorescenza ottenuta con la sovrapposizione dell'estratto della
soluzione campione deve essere più forte di quella dei 10µl di
estratto e deve dar luogo alla percezione di una sola macchia. Se
l'intensità di fluorescenza data dai 10 µl di estratto è più forte di
quella dei 40 µl di soluzione campione, diluire l'estratto 10 o 100
volte con cloroformio (3.2) o con lamiscelabenzene/a cetonitrile
(3.6) prima di sottoporlo ad una nuova cromatografia su strato
sottile
5.5.2. Misurazioni mediante fluorodensitometria
Misurare l'intensità di fluorescenza delle macchie di aflatossina B1con il fluorodensitometro (4.12), utilizzando una lunghezza d'onda
di eccitazione di 365 nm ed una lunghezza d'onda di emissione di
443 nm. Determinare la quantità di aflatossina B1dei depositi
dell'estratto confrontando le intensità di fluorescenza delle macchie
dell'estratto e della soluzione campione
5.6. Conferma dell'identità dell'aflatossina B1
Confermare l'identità dell'aflatossina B1dell'estratto con i seguenti
procedimenti:1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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5.6.1. Trattamento con acido solforico
Polverizzare acido solforico (3.13) sul cromatogramma ottenuto al
punto 5.4. La fluorescenza delle macchie di aflatossina B1deve
volgere dal blu al giallo sotto irradiazione UV
5.6.2. Cromatografia bidimensionale implicante la formazione
di aflatossina B1-emiacetale (aflatossina B2a)
NB:Le operazioni sotto descritte devono essere effettuate
seguendo lo schemariprodotto nellafigura3
5.6.2.1. Applicazione delle soluzioni
Tracciare su una lastra (4.8) due rette parallele a due lati contigui
(a distanza di 6 cm da tali lati), destinate a delimitare la migrazione
dei fronti dei solventi. Deporre sulla lastra, con pipette capillari o
con microsiringhe, le soluzioni sotto indicate:
—nel punto A: un volume di estratto purificato del campione otte-
nuto al punto 5.3, contenente circa 2,5 nanogrammi di
aflatossina B1
—nei punti B e C: 25 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
5.6.2.2. Sviluppo
Sviluppare il cromatogramma nella direzione I usando il solvente di
sviluppo (3.18.1) (strato di 1 cm in vaschetta non saturata), al
riparo dalla luce, finché il fronte del solvente non raggiunga la
linea di delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciarla
asciugare per 5 minuti al riparo dalla luce e a temperatura
ambiente. Polverizzare quindi acido cloridrico (3.12) su una striscia
di 2,5 cm di altezza che copra i punti A e B (tratteggiata nella
figura 3) sino ad imbrunimento, proteggendo il resto della lastra
con un vetro. Lasciar reagire per 10 minuti allo scuro ed asciugare
con una corrente d'aria a temperatura ambiente
Sviluppare quindi il cromatogramma nella direzione II usando il
solvente di sviluppo (3.18.1) (strato di 1 cm in vaschetta non satu-
rata), al riparo dalla luce, finché il fronte del solvente non
raggiunga la linea di delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta
e lasciarla asciugare a temperatura ambiente
5.6.2.3. Interpretazione del cromatogramma
Esaminare il cromatogramma sotto la lampada UV (4.9) e verifi-
care le osservazioni seguenti:
a) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1proveniente dalla soluzione campione deposta nel punto C
(migrazione nella direzione I)
b) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1(che non ha reagito con l'acido cloridrico) e di una macchia
fluorescente blu più intensa di aflatossina B1-emiacetale prove-
niente dalla soluzione campione deposta nel punto B
(migrazione nella direzione II)
c) Apparizione di macchie simili a quelle descritte al punto b),
provenienti dall'estratto di campione deposto nel punto A. La
posizione di tali macchie è definita dalla distanza di migrazione
dell'aflatossina B1a partire dal punto A nella direzione I
(distanza uguale a quella percorsa dalla soluzione campione
deposta nel punto C), seguita dalle distanze di migrazione
percorse nella direzione II dall'aflatossina B1(che non harea gito
con l'acido cloridrico) e dall'aflatossina B1-emiacetale (distanze
uguali a quelle percorse dalla soluzione campione deposta nel
punto B). Le intensità di fluorescenza delle macchie di emiace-
tale proveniente dall'estratto e della soluzione campione deposta
nel punto B dovrebbero corrispondere
6. Calcolo dei risultati
6.1. Partendo da misurazioni visuali
Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1per kg di campione
(ppb) è dato dalla formula
S/C1Y/C1V
W /C1X1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
dove:
Y e X sono rispettivamente i volumi in microlitri della soluzione
campione di aflatossina B1(3.16) e dell'estratto, aventi analoga
intensità di fluorescenza;
S = concentrazione in microgrammi di aflatossina B1per ml
dellasoluzione ca mpione (3.16)
V = volume finale dell'estratto in microlitri, tenuto conto delle
eventuali diluizioni
W = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta ad
analisi, corrispondente al volume di estratto sottoposto a
purificazione su colonna
6.2. partendo da misurazioni fluorodensitometriche
Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1per kg di campione
(ppb) è dato dalla formula
S/C1V
W /C1Y
dove:
Y = volume in microlitri dell'estratto deposto sulla lastra (10 o
20 µl)
S = quantità in nanogrammi d'aflatossina B1del deposito dell'e-
stratto (tenuto conto del volume Y), dedotta dalle
determinazioni
V = volume finale dell'estratto in microlitri, tenuto conto delle
eventuali diluizioni
W = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta ad
analisi, corrispondente al volume di estratto sottoposto a
purificazione su colonna
7. Preparazione e controllo della soluzione campione (3.16)
7.1. Determinazione della concentrazione in aflatossina B1
Preparare una soluzione campione di aflatossina B1nel cloroformio
(3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile (3.6), con concentrazione
di 8/10 µg per ml. Determinare lo spettro di assorbimento tra 330 e
370 nm mediante lo spettrofotometro (4.11)
Rilevare la densità ottica (A) a 363 nm nel caso di soluzione cloro-
formica; a 348 nm nel caso di soluzione nella miscela benzene/
acetonitrile
Calcolare la concentrazione in microgrammi di aflatossina B1per
ml di soluzione, partendo dalle seguenti formule:
3:12 /C1A/C11000
20600per lasoluzione cloroformica
3:12 /C1A/C11000
19800per lasoluzione nellamiscelabenzene/a cetonitrile
Effettuare al riparo dalla luce le opportune diluizioni per ottenere
una soluzione campione di lavoro con concentrazione in aflatossina
B1di circa 0,1 µg per ml. Conservata nel refrigeratore a 4 ºC,
questa soluzione rimane stabile per due settimane
7.1. Controllo della purezza cromatografica
Deporre su una lastra (4.8) 5µl della soluzione campione a 8 —
10µg di aflatossina B1per ml (7.1). Sviluppare il cromatogramma
come indicato al punto 5.4. Sotto la luce UV, la fluorescenza deve
dar luogo alla percezione di una sola macchia e non deve percepirsi
alcuna fluorescenza nella zona del deposito originale1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 7
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8. Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in paral-
lelo sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe
superare:
— 25 % del risultato più elevato per i contenuti in aflatossina B1da10 a20 µg/kg
— 5 µg, in valore assoluto, per i contenuti superiori a 20 e
compresi fino a50 µg/kg
— 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 µg/
kg
9. Riproducibilità
Vedi note, parte C, punto 2,
B. METODO PER CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE SU STRATO
SOTTILE
1. Scopo e campo d'applicazione
Il metodo consente di determinare il contenuto di aflatossina B1degli alimenti per gli animali non rientranti nel campo d'applica-
zione del metodo A. Il limite inferiore di determinazione è di
0,01 mg/kg (10 ppb). Questo metodo non si applica agli alimenti
contenenti polpe di agrumi
2. Principio
Il campione è sottoposto ad estrazione con cloroformio. L'estratto
viene filtrato; un'aliquota viene prelevata e purificata mediante
cromatografia su colonna di gel di silice. L'eluato viene evaporato
o il residuo è ripreso con un volume determinato di cloroformio o
di una miscela di benzene e acetonitrile. Un'aliquota della soluzione
è sottoposta a cromatografia bidimensionale su strato sottile. La
quantità di aflatossina B1è determinata sotto irradiazione UV del
cromatogramma, sia visualmente sia mediante fluorodensitometria,
in rapporto a quantità note di aflatossina B1.
L'identità dell'aflatossina B1estratta dall'alimento deve essere
confermata con il procedimento indicato.
3. Reattivi
NB:Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni, devono essere
del tipo «per analisi»
3.1. Acetone
3.2. Cloroformio, stabilizzato con 0,5/1,0 % di etanolo al 96 % (v/v)3.3. n-Esano3.4. Metanolo
3.5. Etere dietilico anidro, esente da perossidi
3.6. Misceladi benzene e a cetonitrile: 98/2 (v/v)3.7. Misceladi cloroformio (3.2) e di meta nolo (3.4): 97/3 (v/v)3.8. Gel di silice, per cromatografia su colonna, granulometria: 0,05/
0,20 mm.
3.9. Cotone idrofilo, preventivamente sgrassato con cloroformio, o lana
di vetro
3.10. Solfato di sodio, anidro, granulato
3.11. Gas inerte, ad esempio azoto3.12. Acido cloridrico 1 N3.13. Terra di diatomee (Hiflosupercel), lavata con acido3.14. Gel di silice G/HR o equivalente, per cromatografia su strato sottile
3.15. Solventi di sviluppo:
3.15.1. Etere dietilico (3.5)/metanolo (3.4)/acqua: 94/4,5/1,5 (v/v/v)
vaschetta saturata1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 8
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3.15.2. Cloroformio (3.2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v), vaschetta non saturata
3.16. Soluzione campione a 0,1 µg circa di aflatossina B1per ml nel
cloroformio (3.2) o nella miscela benzene/acetonitrile (3.6), prepa-
rata e controllata come indicato al punto 7 del metodo A
4. Apparecchiatura
Vedi punto 4 del metodo A
5. Modo di operare
5.1. Preparazione del campione
vedi punti 5.1, 5.2 e 5.3 del
metodo A/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Estrazione
5.3. Purificazione su colonna
5.4. Cromatografia bidimensionale su strato sottile
5.4.1. Applicazione delle soluzioni (seguire lo schema riprodotto
nellafigura1)
Tracciare su una lastra (4.8) due rette parallele a due lati contigui
(a distanza di rispettivamente 5 e 6 cm da tali lati), destinate a deli-
mitare la migrazione dei fronti dei solventi. Deporre sulla lastra,
con pipette capillari o con microsiringhe, le soluzioni sottoindicate:
—nel punto A, 20 µl dell'estratto purificato del campione, ottenuto
al punto 5.3
—nel punto B, 20 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
—nel punto C, 10 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
—nel punto D, 20 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
—nel punto E, 40 µl dellasoluzione ca mpione (3.16)
Asciugare in leggera corrente d'aria o di gas inerte (3.11). Le
macchie ottenute devono avere un diametro di circa 5 mm
5.4.2. Sviluppo (seguire lo schemariprodotto nellafigura1)
Sviluppare il cromatogramma nella direzione I usando il solvente di
sviluppo (3.15.1) (strato di 1 cm in vaschetta saturata), al riparo
dalla luce, finché il fronte del solvente non raggiunga la linea di
delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciar asciugare
per 15 minuti al riparo dalla luce e a temperatura ambiente
Sviluppare quindi il cromatogramma nella direzione II usando il
solvente di sviluppo (3.15.2) (strato di 1 cm in vaschetta non satu-
rata), al riparo dalla luce, finché il fronte del solvente non
raggiunga la linea di delimitazione. Ritirare la lastra dalla vaschetta
e lasciar asciugare a temperatura ambiente
5.4.3. Interpretazione del cromatogramma (seguire lo schema
riprodotto nellafigura2)
Irradiare il cromatogramma con luce UV collocando la lastra a
10 cm dalla lampada (4.9). Localizzare la posizione delle macchie
di fluorescenza blu B, C, D ed E di aflatossina B
1provenienti dalla
soluzione campione e tracciare due rette immaginarie passanti per
tali macchie e perpendicolari alle direzioni di sviluppo. Il punto
d'intersezione B di tali rette rappresenta la posizione nella quale si
dovrebbe trovare la macchia di aflatossina B1proveniente dall'e-
stratto del campione deposto nel punto A (figura 1). La posizione
effettiva di questa macchia può comunque trovarsi in un punto Q
situato all'intersezione di due rette immaginarie formanti tra loro
un angolo di circa 100º e passanti rispettivamente per le macchie
B e C. Determinare la quantità di aflatossina B1dell'estratto del
campione come indicato al punto 5.5
5.4.4. Cromatografia complementare
Tracciare su una nuova lastra (4.8) due rette parallele e due lati
contigui, come indicato nello schema riprodotto nella figura 1, a
deporre nel punto A (figura 1) 20 µl dell'estratto purificato del
campione ottenuto al punto 5.3 e, in sovrapposizione , 20 µl della
soluzione campione (3.16). Sviluppare come indicato al punto
5.4.2. Irradiare il cromatogramma con la luce UV (4.9) e verificare
che
— le macchie di aflatossina B1dell'estratto e della soluzione
campione si sovrappongano1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
— lafluorescenzadi questama cchiasiapiù intensadi quelladella
macchia di aflatossina B1sviluppata nel punto Q della prima
lastra
5.5. Determinazioni quantitative
Procedere alle determinazioni sia visualmente sia mediante fluoro-
densitometriacome sotto indica to
5.5.1. Misurazioni visuali
Determinare la quantità di aflatossina B1dell'estratto confrontando
l'intensità di fluorescenza della macchia dell'estratto con quella
delle macchie C, D ed E dellasoluzione campione. Interpolare se
necessario. Se l'intensità di fluorescenza data dai 20 µl di estratto
è più forte di quelladei 40 µl di soluzione ca mpione, diluire
l'estratto 10 o 100 volte con cloroformio (3.2) o con la miscela di
benzene/acetonitrile (3.6) prima di sottoporlo ad una nuova croma-
tografia su strato sottile
5.5.2. Misurazioni mediante fluorodensitometria
Misurare l'intensità di fluorescenza delle macchie di aflatossina B1con il fluorodensitometro (4.12), utilizzando una lunghezza d'onda
di eccitazione di 365 nm e una lunghezza d'onda di emissione di
443 nm
Determinare la quantità di aflatossina B1del deposito dell'estratto
confrontando le intensità di fluorescenza delle macchie dell'estratto
con quelle delle macchie C, D ed E della soluzione campione
5.6. Conferma dell'identità dell'aflatossina B1
Vedi punto 5.6 del metodo A
6. Calcolo dei risultati
Vedi punto 6 del metodo A
7. Ripetibilità
Vedi punto 8 del metodo A
8. Riproducibilità
Vedi note, parte C, punto 2
C. NOTE SUI METODI A E B
1.Sgrassatura
I campioni contenenti più del 5 % di sostanze grasse devono essere sgrassati
con etere di petrolio (p.e. 40 — 60º) dopo la preparazione del campione indi-
cata al punto 5.1. In questi casi, i risultati devono essere riferiti al peso del
campione non sgrassato
2.Riproducibilità dei risultati
La riproducibilità dei risultati, cioè la variazione tra i risultati ottenuti da due
o più laboratori relativi allo stesso campione, è stata valutata a:
± 50 % del valore medio dei risultati per i valori medi in aflatossina B1da10
a20 µg/kg
± 10 µg/kg del valore medio per i valori medi superiori a 20 e compresi fino
a50 µg/kg
± 20 % del valore medio per i valori medi superiori a 50 µg/kg1976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
ALLEGATO
Figura 1
Figura 21976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Figura 31976L0372 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 12