1991R2568 — IT — 16.10.2015 — 028.001

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▼B

REGOLAMENTO (CEE) N. 2568/91 DELLA COMMISSIONE

dell'11 luglio 1991

relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi attinenti







LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre 1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi ( 1 ), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 3577/90 ( 2 ), in particolare l'articolo 35 bis, considerando che l'allegato del regolamento n. 136/66/CEE prevede le denominazioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva commercializzati nei singoli Stati membri, nonché negli scambi intracomunitari e con i paesi terzi; considerando che per poter distinguere i vari tipi di olio è opportuno definire le caratteristiche fisico-chimiche di ciascuno di essi, nonché le caratteristiche organolettiche degli oli vergini, per garantire la purezza e la qualità dei prodotti in parola, salve le altre disposizioni vigenti in materia; considerando che è opportuno stabilire in modo uniforme in tutta la Comunità la presenza delle caratteristiche dei vari tipi di olio; che a tal fine occorre stabilire i metodi comunitari di analisi chimica e di valutazione organolettica; che occorre tuttavia autorizzare, durante un periodo transitorio, il ricorso ad altri metodi di analisi applicati negli Stati membri pur prevedendo che, in caso di divergenza dei risultati, saranno determinanti quelli ottenuti in base al metodo comune; considerando che la definizione delle caratteristiche fisico-chimiche degli oli d'oliva e dei metodi di analisi comporta l'adattamento delle note complementari del capitolo 15 della nomenclatura combinata; considerando che il metodo di valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli vergini implica la costituzione di comitati di assaggiatori selezionati ed esperti e che è pertanto opportuno prevedere il termine necessario per la realizzazione di siffatta struttura; che, tenuto conto delle difficoltà che taluni Stati membri dovranno affrontare per la costituzione dei comitati di assaggio, è opportuno autorizzare il ricorso ai comitati esistenti negli altri Stati membri; considerando che per garantire il corretto funzionamento del sistema dei prelievi applicabili all'importazione di sanse di oliva, è opportuno prescrivere un metodo unico per determinare il tenore in olio di questi prodotti; considerando che per non recare pregiudizio agli scambi è opportuno prevedere un periodo limitato per lo smaltimento dell'olio condizionato prima dell'entrata in vigore del presente regolamento; considerando che è opportuno abrogare il regolamento (CEE) n. 1058/77 della Commissione ( 3 ), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 1858/88 ( 4 ); considerando che il comitato di gestione per i grani non ha emesso alcun parere nel termine fissato dal suo presidente, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:







▼M20

Articolo 1

1. Sono considerati oli di oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a) e b), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate rispettivamente nei punti 1 e 2 dell'allegato I del presente regolamento.

2. È considerato olio di oliva lampante ai sensi del punto 1, lettera c), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 3, del presente regolamento.

3. È considerato olio di oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 4, del presente regolamento.

4. È considerato olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ai sensi del punto 3 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del presente regolamento.

5. È considerato olio di sansa di oliva greggio ai sensi del punto 4 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente regolamento.

6. È considerato olio di sansa di oliva raffinato ai sensi del punto 5 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del presente regolamento.

7. È considerato olio di sansa di oliva ai sensi del punto 6 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del presente regolamento.

▼M26

Articolo 2

1. Le caratteristiche degli oli figuranti nell'allegato I sono determinate in base ai seguenti metodi di analisi:

(a) per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percentuale di acido oleico, il metodo di cui all'allegato II;

(b) per la determinazione dell'indice di perossidi, il metodo di cui all'allegato III;

(c) per la determinazione del contenuto di cere, il metodo di cui all'allegato IV;

(d) per la determinazione della composizione e del contenuto di steroli e dialcoli triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare, il metodo di cui all'allegato V;

(e) per la determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato, il metodo di cui all’allegato VII;

(f) per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui all'allegato IX;

▼M28

(g) per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo di cui all'allegato X;

▼M26

(h) per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di cui all'allegato XI;

(i) per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini, il metodo di cui all'allegato XII;

(j) per la determinazione degli stigmastadieni, il metodo di cui all'allegato XVII;

(k) per la determinazione dei trigliceridi con ECN42, il metodo di cui all'allegato XVIII;

▼M28

(l) per la determinazione del contenuto di alcoli alifatici e triterpenici, il metodo di cui all'allegato XIX;

▼M26

(m) per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi, il metodo di cui all’allegato XX.

▼M28 —————

▼M26

2. La verifica delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti è effettuata da panel di assaggiatori riconosciuti dagli Stati membri.

Le caratteristiche organolettiche di un olio, ai sensi del primo comma, si considerano conformi alla categoria di olio di oliva dichiarata se il panel di assaggiatori riconosciuto dallo Stato membro ne conferma la classificazione.

Qualora il panel non confermi la categoria dichiarata, sotto il profilo delle sue caratteristiche organolettiche, a richiesta dell'interessato le autorità nazionali o i loro rappresentanti incaricano altri panel riconosciuti di effettuare quanto prima due controanalisi, di cui almeno una deve essere effettuata da un panel riconosciuto dallo Stato membro di produzione dell'olio. Le caratteristiche in questione sono considerate conformi a quelle dichiarate se le due controanalisi confermano la classificazione dichiarata. In caso contrario il costo delle controanalisi è a carico dell'interessato.

3. Per quanto riguarda la verifica delle caratteristiche degli oli da parte delle autorità nazionali o di loro rappresentanti, prevista al paragrafo 1, il prelievo dei campioni si effettua secondo le norme internazionali EN ISO 661 relativa alla preparazione dei campioni per le prove e EN ISO 5555 relativa al campionamento. Tuttavia, in deroga al punto 6.8 della norma EN ISO 5555, per le partite di oli in imballaggi immediati il prelievo del campione si effettua conformemente all'allegato I bis del presente regolamento. Nel caso degli oli sfusi per i quali il campionamento non può essere eseguito conformemente alla norma EN ISO 5555, i campioni sono prelevati secondo le istruzioni impartite dall'autorità competente dello Stato membro.

Fatte salve le disposizioni della norma EN ISO 5555 e del capitolo 6 della norma EN ISO 661, i campioni prelevati sono messi quanto prima al riparo dalla luce e da fonti di calore elevato e sono inviati al laboratorio per le analisi entro il quinto giorno lavorativo successivo a quello del prelievo; altrimenti i campioni sono conservati in modo da evitarne il degrado o il danneggiamento durante il trasporto o lo stoccaggio in attesa di essere inviati al laboratorio.

4. Ai fini della verifica prevista al paragrafo 3, le analisi di cui agli allegati II, III, IX, XII e XX nonché, eventualmente, le controanalisi previste dalla legislazione nazionale, sono effettuate anteriormente alla data di durata minima per quanto riguarda i prodotti condizionati. In caso di campionamento di oli sfusi, tali analisi sono effettuate entro il sesto mese successivo a quello del prelievo del campione.

Per le altre analisi previste dal presente regolamento non si applica nessun termine.

Salvo se il campione sia stato prelevato meno di due mesi prima della data di durata minima, nel caso in cui i risultati delle analisi non corrispondano alle caratteristiche della categoria di olio di oliva o di olio di sansa di oliva dichiarata, l'interessato ne viene informato al più tardi un mese prima dello scadere del termine di cui al primo comma.

5. Ai fini della determinazione delle caratteristiche degli oli di oliva secondo i metodi di cui al paragrafo 1, primo comma, i risultati delle analisi sono direttamente confrontati con i limiti fissati dal presente regolamento.

▼M25

Articolo 2 bis

1. Ai fini del presente articolo, si intende per«olio d’olivacommercializzato» ilquantitativo totale di olio d’oliva e di olio di sansa di uno Stato membro cheè consumato in tale Stato membro oppure esportato da tale Statomembro.

2. Gli Stati membri fanno in modo che i controlli di conformitàsiano effettuati selettivamente, in base ad un’analisi di rischio e conadeguata frequenza, onde garantire che l’olio d’oliva immesso in commerciocorrisponda alla categoria dichiarata.

3. I criteri di valutazione del rischio possono includere:

a) la categoria dell’olio, il periodo di produzione, il prezzo degli oli rispetto a quello di altri oli vegetali, le operazioni di miscelazione e confezionamento, gli impianti e le condizioni di stoccaggio, il paese d’origine, il paese di destinazione, il mezzo di trasporto o il volume della partita;

b) la posizione degli operatori nella catena di commercializzazione, il volume e/o il valore nonché la gamma di categorie di oli che commercializzano, il tipo di attività economica svolta quali la molitura, l’immagazzinamento, la raffinazione, la miscelazione, il confezionamento e la vendita al minuto;

c) le risultanze che emergono da controlli precedenti, segnatamente per quanto riguarda il numero e il tipo di carenze accertate, la qualità abituale degli oli commercializzati e il livello di prestazione delle attrezzature tecniche adoperate;

d) l’affidabilità dei sistemi di assicurazione della qualità degli operatori o dei loro sistemi di autocontrollo rispetto alla conformità alle norme di commercializzazione;

e) il luogo in cui il controllo viene effettuato, in particolare se si tratta del primo punto di ingresso nell’Unione, dell’ultimo punto di uscita dall’Unione o del luogo in cui gli oli sono prodotti, confezionati, caricati o venduti al consumatore finale;

f) qualsiasi altra informazione da cui si possa evincere un rischio di non conformità.

4. Gli Stati membri stabiliscono in anticipo:

a) i criteri di valutazione del rischio di non conformità delle partite;

b) sulla base di un’analisi del rischio per ogni singola categoria di rischio, il numero minimo di operatori o di partite e/o di quantitativi minimi che saranno soggetti ad un controllo di conformità.

Almeno un controllo annuale di conformità è effettuato permille tonnellate di olio d’oliva commercializzato annualmente nello Statomembro.

5. Gli Stati membri verificano la conformità:

a) procedendo, in un ordine qualsiasi, alle analisi di cui all’allegato I; o

b) nell’ordine previsto dall’albero decisionale di cui all’allegato I ter, fino a raggiungere una delle decisioni figuranti nel suddetto albero decisionale.

▼M19 —————

▼M25

Articolo 3

Qualora si constati che un olio non corrisponde alla descrizione della sua categoria, lo Stato membro interessato applica sanzioni effettive, proporzionate e dissuasive stabilite in base alla gravità dell’irregolarità accertata, ferme restando altre sanzioni eventuali.

Se dai controlli emergono irregolarità sostanziali, gli Stati membri aumentano la frequenza dei controlli relativi alla fase di commercializzazione, alla categoria dell’olio, all’origine o ad altri criteri.

▼M5

Articolo 4

▼M19

1. Ai fini della valutazione e del controllo delle caratteristiche organolettiche da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti, gli Stati membri possono procedere al riconoscimento di panel di assaggiatori.

Le condizioni del riconoscimento sono stabilite dallo Stato membro in particolare in modo da:

— rispondere alle condizioni di cui all'allegato XII, punto 4,

— garantire che la formazione del capo del panel si compia presso un organismo riconosciuto e alle condizioni a tal fine stabilite dallo Stato membro,

— subordinare la validità del riconoscimento ai risultati ottenuti nell'ambito di un sistema di controllo annuale istituito dallo Stato membro.

Ogni Stato membro comunica alla Commissione l'elenco dei panel riconosciuti e le misure adottate conformemente al presente paragrafo.

▼M5

2. Lo Stato membro che incontri difficoltà per la costituzione di un comitato di assaggio sul proprio territorio può ricorrere ad un comitato di assaggio riconosciuto da un altro Stato membro.

3. Ogni Stato membro compila l'elenco dei comitati di assaggio istituiti da associazioni professionali o interprofessionali in conformità del paragrafo 1 e controlla il rispetto di dette norme.

▼M19 —————

▼B

Articolo 6

1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione dell'olio (codice NC 2306 90 11 e 2306 90 19 ) è determinato conformemente al metodo che figura nell'allegato XV.

2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del suo peso rispetto a quello della sostanza secca.

▼M20

Articolo 7

Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di contaminanti.

Per quanto riguarda il tenore di solventi alogenati, i limiti per tutte le categorie di oli di oliva sono i seguenti:

— tenore massimo di ciascun solvente alogenato rilevato: 0,1 mg/kg

— tenore massimo della somma dei solventi alogenati rilevati: 0,2 mg/kg.

▼M25

Articolo 7 bis

Le persone e i gruppi di persone fisiche o giuridiche che detengono, ai fini dell’esercizio della loro professione o a fini commerciali, olio d’oliva ed olio di sansa, dalla fase dell’estrazione al frantoio fino all’imbottigliamento incluso, hanno l’obbligo di tenere registri di entrata e di uscita per ogni categoria di questi oli.

Gli Stati membri assicurano che l’obbligo di cui al primo paragrafo sia debitamente rispettato.

▼M25

Articolo 8

1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misureadottate per l’applicazione del presente regolamento. Lo Stato membro comunicaalla Commissione qualsiasi ulteriore modifica di dette misure.

2. Entro il 31 maggio di ogni anno, lo Stato membro trasmette alla Commissione una relazione sull’applicazione del presente regolamento nel corso dell’anno civile precedente. La relazione contiene almeno i risultati dei controlli di conformità effettuati sugli oli d’oliva, presentati in base ai modelli figuranti nell’allegato XXI.

3. Le notifiche di cui al presente regolamento sono effettuate anorma del regolamento (CE) n. 792/2009 della Commissione ( 5 )

▼B

Articolo 9

Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.

Articolo 10

1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo a quello della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decorrere dal ►M1 1o novembre 1992 ◄ , salvo per quanto riguarda le operazioni legate all'intervento.

▼M5

Questo metodo non si applica all'olio d'oliva vergine condizionato anteriormente al 1o novembre 1992.

▼B

2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di sansa d'oliva condizionati anteriormente all'entrata in vigore del presente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre 1992.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.









ALLEGATI

Sommario







Allegato I: Caratteristiche degli oli di oliva Allegato I bis: Campionatura delle partite di olio di oliva o di olio di sansa di oliva consegnate in imballaggi immediati Allegato I ter: Schema decisionale per la verifica della conformità di un campione di olio di oliva alla categoria dichiarata Allegato II: ►M21 Determinazione degli acidi grassi liberi, metodo a freddo ◄ Allegato III: Determinazione del numero di perossidi Allegato IV: ►M6 Determinazione del contenuto di cere mediante gascromatografia con colonna capillare ◄ Allegato V: Determinazione della composizione e del contenuto di steroli e dialcoli triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare Allegato VII: ►M21 Determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato ◄ ▼M20 ————— ▼B Allegato IX: Analisi spettrofotometrica nell’ultravioletto ▼M28 Allegato X: Determinazione degli esteri metilici degli acidi grassi mediante gascromatografia ▼B Allegato XI: Determinazione del tenore dei solventi alogenati Allegato XII: Metodo del consiglio oleicolo internazionale per la valutazione organolettica degli oli di oliva vergini ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Allegato XV: Metodo di determinazione del tenore in olio d'oliva delle sanse Allegato XVI: Determinazione del numero di iodio Allegato XVII: Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali Allegato XVIII: Determinazione della differenza tra il contenuto effettivo e il contenuto teorico di triacilgliceroli con ECN 42 Allegato XIX: ►M28 Determinazione del contenuto di alcoli alifatici e triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare ◄ ▼M23 Allegato XX: Metodo per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi mediante gascromatografia con colonna capillare ▼M28 ————— ▼M25 Allegato XXI: Risultati dei controlli di conformità eseguiti sugli oli di oliva di cui al paragrafo 2 dell’articolo 8

▼M27









ALLEGATO I

CARATTERISTICHE DEGLI OLI DI OLIVA







Categoria Etil esteri degli acidi grassi (EEAG) (*) Acidità (%) (*) Numero dei perossidi mEq O2/kg (*) Cere mg/kg (**) 2 gliceril monopalmitato (%) Stigmastadieni mg/kg (1) Differenza: ECN42 (HPLC) e ECN42 (calcolo teorico) K232 (*) K268 o K270 (*) Delta-K (*) Valutazione organolettica Mediana del difetto (Md) (*) Valutazione organolettica Mediana del fruttato (Mf) (*) 1. Olio extra vergine di oliva EEAG ≤ 40 mg/kg (campagna 2013-2014) (2) EEAG ≤ 35 mg/kg (campagna 2014-2016) EEAG ≤ 30 mg/kg (campagne successive al 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 2. Olio di oliva vergine — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 3. Olio di oliva lampante — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14 % 4. Olio di oliva raffinato — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14 % 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14 % 6. Olio di sansa di oliva greggio — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Olio di sansa di oliva raffinato — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olio di sansa di oliva — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Somma degli isomeri che potrebbero (o non potrebbero) essere separati mediante colonna capillare. (2) Questo limite si applica agli oli di oliva prodotti a decorrere dal 1o marzo 2014. (3) Gli oli con un tenore di cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferiori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è pari o inferiore a 3,5 %. (4) La mediana del difetto può essere pari o inferiore a 3,5 e la mediana del fruttato uguale a 0. (5) Gli oli con un tenore di cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono superiori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è superiore a 3,5 %.







Categoria Composizione in acidi grassi (1) Somma degli isomeri transoleici (%) Somma degli isomeri translinoleici + translinolenici (%) Composizione in steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiolo e uvaolo (%) (**) Miristico (%) Linolenico (%) Arachico (%) Eicosenoico (%) Beenico (%) Lignocerico (%) Colesterolo (%) Brassicasterolo (%) Campesterolo (2) (%) Stigmasterolo (%) β — sitosterolo apparente (3) (%) (**) Delta-7-stigmastenolo (2) (%) 1. Olio extra vergine di oliva ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Olio di oliva vergine ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Olio di oliva lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Olio di oliva raffinato ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Olio di sansa di oliva greggio ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Olio di sansa di oliva raffinato ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olio di sansa di oliva ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Tenore di altri acidi grassi (%): palmitico: 7,50-20,00; palmitoleico: 0,30-3,50; eptadecanoico: ≤ 0,30; eptadecenoico: ≤ 0,30; stearico: 0,50-5,00; oleico: 55,00-83,00; linoleico: 2,50-21,00. (2) V. Appendice del presente allegato. (3) β-sitosterolo apparente: delta-5,23-stigmastadienolo + clerosterolo + beta-sitosterolo + sitostanolo + delta-5-avenasterolo + delta-5,24-stigmastadienolo. (4) Gli oli con un tenore di cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferiori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è pari o inferiore a 3,5 %. (5) Gli oli con un tenore di cera compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono superiori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è superiore a 3,5 %.

Note:

a) I risultati delle analisi devono essere espressi con un numero di decimali uguale a quello previsto per ogni caratteristica. L'ultima cifra deve essere aumentata di una unità se la cifra successiva è superiore a 4.

b) È sufficiente che una sola caratteristica non sia conforme ai valori indicati perché l'olio venga cambiato di categoria o dichiarato non conforme riguardo alla sua purezza ai fini del presente regolamento.

c) Le caratteristiche contrassegnate con un asterisco (*) e riguardanti le qualità dell'olio implicano che: — per l'olio di oliva lampante, i due corrispondenti valori limite possono non essere rispettati simultaneamente, — per gli oli di oliva vergini, l'inosservanza di almeno uno di questi valori limite comporta il cambiamento di categoria, pur rimanendo classificati in una delle categorie degli oli di oliva vergini.

d) Le caratteristiche contrassegnate con due asterischi (**) implicano che per tutti gli oli di sansa di oliva i due corrispondenti valori limite possono non essere rispettati simultaneamente.









Appendice

Schema decisionale

Schema decisionale per il campesterolo nell'olio di oliva vergine e nell'olio extra vergine di oliva.

Gli altri parametri devono rispettare i limiti fissati dal presente regolamento.

Schema decisionale per il delta-7-stigmastenolo.

— Nell'olio di oliva vergine e nell'olio extra vergine di oliva —

Gli altri parametri devono rispettare i limiti fissati dal presente regolamento.

— Negli oli di sansa di oliva (greggio e raffinato) —

▼M26









ALLEGATO I bis

CAMPIONATURA DELLE PARTITE DI OLIO DI OLIVA O DI OLIO DI SANSA DI OLIVA CONSEGNATE IN IMBALLAGGI IMMEDIATI

Il presente metodo di campionatura si applica alle partite di olio di oliva o di olio di sansa di oliva condizionate in imballaggi immediati. A seconda che la capacità dell'imballaggio immediato sia o no superiore a 5 litri si applicano metodi di campionatura diversi.

Si intende per «partita» un insieme di unità di vendita prodotte, fabbricate e condizionate in circostanze tali che l'olio contenuto in ciascuna di queste unità di vendita è considerato omogeneo per tutte le caratteristiche analitiche. La partita deve essere identificata conformemente alla direttiva 2011/91/UE del Parlamento europeo e del Consiglio ( 6 ).

Si intende per «incremento» la quantità di olio contenuta in un imballaggio immediato prelevata da un punto a caso della partita.

1. CONTENUTO DEL CAMPIONE ELEMENTARE

1.1. Imballaggi immediati di capacità non superiore a 5 litri

Nel caso degli imballaggi immediati di capacità non superiore a 5 litri si intende per «campione elementare» il numero di incrementi prelevati da una partita in conformità alla tabella 1.







Tabella 1 Dimensione minima del campione elementare In caso di imballaggi immediati aventi una capacità Il campione elementare deve essere costituito dall'olio proveniente da a) superiore o uguale a 1 litro a) 1 imballaggio immediato b) inferiore a 1 litro b) dal numero minimo di imballaggi la cui capacità totale è almeno pari a 1,0 litro

Il numero di imballaggi di cui alla tabella 1, che costituiscono un campione elementare, può essere aumentato dai singoli Stati membri, secondo le rispettive esigenze (ad esempio, valutazione organolettica da parte di un laboratorio diverso da quello che ha eseguito le analisi chimiche, controanalisi ecc.).

1.2. Imballaggi immediati di capacità superiore a 5 litri

Nel caso degli imballaggi immediati di capacità superiore a 5 litri si intende per «campione elementare» una parte rappresentativa del totale degli incrementi, ottenuta mediante un processo di riduzione in conformità alla tabella 2. Il campione elementare deve essere costituito da più esemplari.

Si intende per «esemplare» di un campione elementare ciascuno degli imballaggi che costituiscono il campione elementare.







Tabella 2 Numero minimo di incrementi da selezionare Numero di imballaggi del lotto Numero minimo di incrementi da selezionare Fino a 10 1 Da …. 11 a 150 2 Da …. 151 a 500 3 Da …. 501 a 1 500 4 Da …. 1 501 a 2 500 5 > 2 500 per 1 000 imballaggi 1 incremento supplementare

Per ridurre il volume degli imballaggi immediati da sottoporre a campionamento, il contenuto degli incrementi è omogeneizzato ai fini della preparazione del campione elementare. Le porzioni dei diversi incrementi sono versate in un contenitore comune per essere omogeneizzati mediante agitazione, in modo da essere protetti al meglio dall'aria.

Il contenuto del campione elementare deve essere versato in una serie di imballaggi della capacità minima di 1,0 litro, ciascuno dei quali costituisce un esemplare del campione elementare.

Il numero di campioni elementari può essere aumentato dai singoli Stati membri, secondo le rispettive esigenze (ad esempio, valutazione organolettica da parte di un laboratorio diverso da quello che ha eseguito le analisi chimiche, controanalisi ecc.).

Ciascun imballaggio deve essere riempito in modo tale ridurre il più possibile lo strato d'aria sovrastante e quindi idoneamente chiuso e sigillato per garantire che il prodotto non possa essere manomesso.

Gli esemplari in questione devono essere etichettati per identificarli con precisione.

2. ANALISI E RISULTATI

2.1. Ciascun campione elementare deve essere suddiviso in campioni di laboratorio, conformemente al punto 2.5 della norma EN ISO 5555, e sottoposto alle analisi nell'ordine indicato nello schema decisionale di cui all'allegato I ter o in qualunque altro ordine casuale.

2.2. Qualora tutti i risultati delle analisi siano conformi alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è dichiarata conforme. Qualora anche uno solo dei risultati non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è dichiarata non conforme.

3. VERIFICA DELLA CATEGORIA DELLA PARTITA

3.1. Per verificare la categoria della partita, l'autorità competente può aumentare il numero di campioni elementari effettuati in punti diversi della partita secondo la tabella seguente:



Tabella 3 Numero di campioni elementari determinati dalle dimensioni della partita Dimensione della partita (litri) Numero di campioni elementari Meno di 7 500 2 Da 7 500 a meno di 25 000 3 Da 25 000 a meno di 75 000 4 Da 75 000 a meno di 125 000 5 125 000 o più 6 + 1 ogni 50 000 litri supplementari Ciascun incremento che costituisce un campione elementare deve essere prelevato da punti contigui della partita; è necessario annotare l'ubicazione di ciascun campione elementare e identificarlo inequivocabilmente. La costituzione di ciascun campione elementare deve rispettare le procedure di cui ai punti 1.1 e 1.2. Ciascun campione elementare è quindi sottoposto alle analisi di cui all'articolo 2, paragrafo 1.

3.2. Qualora, per almeno uno dei campioni elementari, uno dei risultati delle analisi di cui all'articolo 2, paragrafo 1, non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita è dichiarata non conforme.









ALLEGATO I ter

SCHEMA DECISIONALE PER LA VERIFICA DELLA CONFORMITÀ DI UN CAMPIONE DI OLIO DI OLIVA ALLA CATEGORIA DICHIARATA

Tabella 1

Tabella 2

Tabella 3









Appendice 1







Corrispondenza tra gli allegati del presente regolamento e le analisi previste nello schema decisionale — Acidità Allegato II Determinazione degli acidi grassi liberi, metodo a freddo — Indice di perossidi Allegato III Determinazione del numero di perossidi — Spettrometria a raggi ultravioletti Allegato IX Analisi spettrofotometrica — Valutazione organolettica Allegato XII Valutazione organolettica degli oli di oliva vergini — Etil esteri Allegato XX Metodo per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi mediante gascromatografia con colonna capillare — Stigmasta-3,5-diene Allegato XVII Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali ▼M28 — Isomeri trans degli acidi grassi Allegato X Determinazione degli esteri metilici degli acidi grassi mediante gascromatografia — Composizione di acidi grassi Allegato X Determinazione degli esteri metilici degli acidi grassi mediante gascromatografia ▼M26 — ΔECN42 Allegato XVIII Determinazione dei trigliceridi con ECN42 (differenze fra i dati HPLC e il contenuto teorico) — Composizione di steroli e steroli totali — Eritrodiolo e uvaolo Allegato V Determinazione della composizione e del contenuto di steroli e dialcoli triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare — Cere Allegato IV Determinazione del contenuto di cere mediante gascromatografia con colonna capillare ▼M28 — Alcoli alifatici e triterpenici Allegato XIX Determinazione del contenuto di alcoli alifatici e triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare ▼M26 — Acidi grassi saturi in posizione 2 Allegato VII Determinazione della percentuale di 2- gliceril monopalmitato

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ALLEGATO II

▼M21

DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI LIBERI, METODO A FREDDO

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1. OGGETTO

Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi grassi liberi viene espresso mediante l'acidità calcolata in modo convenzionale.

1.1. Principio

Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una soluzione etanolica di idrossido di potassio.

1.2. Reattivi

Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua impiegata dev'essere acqua distillata o di purezza equivalente.

1.2.1. Etere dietilico — etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 - 1 in volume. Nota: l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplosivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari. Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di idrossido di potassio (1.2.2) in presenza di 0,3 ml della soluzione di fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela. Nota: se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una miscela di solventi costituita da etanolo e da toluene. Se necessario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.

1.2.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata c(KOH) all'incirca 0,1 mol oppure, se necessario, c( ►C2 KOH ◄ ) 0,5 mol circa. La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio deve essere nota e verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve essere incolore o giallo pallida. Nota: una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere preparata come segue. Portare e mantenere per un'ora all'ebollizione a ricadere 1 000 ml di etanolo con 8 g di idrossido di potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente. Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio. La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come segue. A 1 000 ml di etanolo aggiungere 4 ml di butilato di alluminio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Questa soluzione è pronta per l'uso.

1.2.3. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alcalino (nel caso di sostanze grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l nell'etanolo al 95-96 % (V/V).

1.3. Apparecchiatura

Materiale corrente da laboratorio, in particolare:

1.3.1. Bilancia analitica.

1.3.2. Beuta, avente una capacità di 250 ml.

1.3.3. Buretta, avente una capacità di 10 ml, graduata in 0,05 ml.

1.4. Modo di operare

1.4.1. Preparazione del campione da analizzare. La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità + impurezze è inferiore all'1 %, sul campione tal quale.

1.4.2. Sostanza da analizzare Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero di acidità presunto, secondo le indicazioni della seguente tabella.



Numero di acidità presunto Massa della sostanza da analizzare (in g) Precisione della pesata della sostanza da analizzare (in g) < 1 20 0,05 1 a 4 10 0,02 4 a 15 2,5 0,01 15 a 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).

1.4.3. Determinazione Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50—150 ml della miscela etere etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata. Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l (1.2.2) ( ►C2 vedi nota 2 ◄ ) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s). Nota 1: La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può essere sostituita con una soluzione acquosa di idrossido di potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non comporta una separazione di fasi. Nota 2: Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l supera i 10 ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l. Nota 3: Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (1.2.1) per ottenere una soluzione chiara.

1.5. Espressione dell'acidità come % di acido oleico.

L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:

dove:

V = è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

c = è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

M = è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per l'espressione del risultato (acido oleico = 282);

m = è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare.

Prendere come risultato la media aritmetica ►M6 di due determinazioni ◄ .









ALLEGATO III

DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI PEROSSIDI

1. OGGETTO

Si tratta di un metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli e grassi.

2. CAMPO D'APPLICAZIONE

Oli e grassi animali e vegetali.

3. DEFINIZIONE

Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossidano lo ioduro di potassio nelle condizioni che vengono descritte.

4. PRINCIPIO

Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio, con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con soluzione di tiosolfato di sodio standardizzata.

5. APPARECCHIATURA

Tutta l'apparecchiatura usata dev'essere esente da sostanze riducenti od ossidanti.

Nota:

Non ungere le superfici smerigliate.

5.1. Ditale di vetro da 3 ml.

5.2. ►C2 Palloni a collo e tappo smerigliato ◄ , aventi una capacità di circa 250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto o, di preferenza, anidride carbonica).

5.3. Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml.

6. REAGENTI

6.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.

6.2. Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas puro e secco.

6.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati.

6.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente standardizzata immediatamente prima dell'uso.

6.5. Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione da amido naturale solubile.

7. CAMPIONE

Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati ermeticamente con tappi a smeriglio o di sughero.

8. PROCEDIMENTO

La prova dev'essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce artificiale. Pesare in un ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:







Numero di perossidi previsto (meq) Peso della sostanza da analizzare (in g) 0 — 12 5,0 — 2,0 12 — 20 2,0 — 1,2 20 — 30 1,2 — 0,8 30 — 50 0,8 — 0,5 50 — 90 0,5 — 0,3

Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3). Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al riparo dalla luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25 °C.

Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) (soluzione 0,002 N per valori previsti inferiori a 12 e soluzione 0,01 N per valori previsti superiori a 12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come indicatore.

Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.

Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del bianco supera 0,05 ml di soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (6.4), sostituire i reagenti impuri.

9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il numero di perossidi (P.V.), espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, viene dato dalla formula:

dove:

V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio (6.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della prova in bianco.

T = è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) usata.

m = è il peso in g della sostanza da analizzare.

Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni eseguite.

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ALLEGATO IV

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di cere negli oli d’oliva. Le cere sono separate in funzione del numero di atomi di carbonio. Il metodo può essere impiegato in particolare per differenziare l’olio d’oliva di pressione da quello di estrazione (olio di sansa).

2. PRINCIPIO

La sostanza grassa, addizionata di opportuno standard interno, viene frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato; la frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità inferiore a quella dei trigliceridi) viene recuperata e quindi analizzata direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Colonna in vetro per gascromatografia con diametro interno 15,0 mm e altezza 30-40 cm, provvista di rubinetto.

3.3. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da: 3.3.1. Camera termostatica per le colonne a temperatura programmabile. 3.3.2. Iniettore a freddo per introduzione diretta in colonna. 3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore. 3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile. (Possono essere utilizzati anche sistemi informatici che consentono l’acquisizione di dati di gascromatografia mediante computer). 3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido di ripartizione, di spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm. (Si trovano in commercio due liquidi di ripartizione adatti all’uso, del tipo SE52 o SE54).

3.4. Microsiringa per introduzione diretta in colonna da 10 μl con ago cementato.

3.5. Vibratore elettrico.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Forno a muffola.

3.8. Bilancia analitica in grado di garantire una precisione di misura di + 0,1 mg.

3.9. Normale vetreria da laboratorio.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 60 e 200 μm. Il gel di silice è posto in muffola a 500 °C per almeno 4 ore. Dopo raffreddamento è addizionato del 2 % di acqua rispetto alla quantità di gel di silice prelevata. Si agita bene allo scopo di omogeneizzare la massa. Si conserva al buio per almeno 12 ore prima dell’uso.

4.2. n-esano per cromatografia.

4.3. Etere etilico per cromatografia.

4.4. n-eptano per cromatografia.

4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (v/m) in esano (standard interno). (Si può utilizzare anche palmitil palmitato o miristil stearato). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftolo).

4.6. Gas vettore: idrogeno o elio puro per gascromatografia.

4.7. Gas ausiliari: — idrogeno puro per gascromatografia, — aria pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione della colonna cromatografica

Mettere in sospensione 15 g di gel di silice (4.1) in n-esano (4.2) e introdurla in colonna (3.2). Dopo assestamento spontaneo, completare lo stesso con l’ausilio di un vibratore elettrico per rendere più omogeneo il letto cromatografico. Percolare 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze. Pesare esattamente, nella beuta da 25 ml (3.1), circa 500 mg di campione con la bilancia (3.8), addizionare l’opportuna quantità di standard interno (4.5) in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio aggiungere 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva, e da 0,25 a 0,50 mg nel caso di olio di sansa. Immettere il campione così preparato nella colonna cromatografica con l’ausilio di due porzioni da 2 ml ciascuna di n-esano (4.2).

Lasciar fluire il solvente fino a 1 mm sopra l’assorbente, quindi percolare altri 70 ml di n-esano allo scopo di eliminare gli n-alcani naturalmente presenti. Iniziare quindi l’eluizione cromatografica raccogliendo 180 ml di miscela n-esano/etere etilico in rapporto 99:1, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 secondi. L’eluizione del campione deve essere effettuata a una temperatura ambiente di 22 °C ± 4.

NB:

— La miscela n-esano/etere etilico (99:1) deve essere preparata ogni giorno.

— Per controllare visivamente la corretta eluizione delle cere, è possibile aggiungere al campione in soluzione 100 μl di sudan 1 all’1 % nella miscela di eluizione. Il colorante ha una ritenzione intermedia tra le cere e i trigliceridi, pertanto quando la colorazione raggiunge il fondo della colonna cromatografica bisogna sospendere l’eluizione, in quanto tutte le cere sono state eluite.

Essiccare la frazione così ottenuta mediante evaporatore rotante (3.6) fino ad eliminazione quasi completa del solvente. Eliminare gli ultimi 2 ml di solvente mediante un debole flusso di azoto; aggiungere quindi 2-4 ml di n-eptano.

5.2. Analisi gascromatografica

5.2.1. Operazioni preliminari

Installare la colonna nel gascromatografo (3.3), collegando il terminale di ingresso al sistema «on column» e il terminale di uscita al rivelatore. Eseguire i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.).

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Far fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna, quindi avviare il complesso gascromatografico. Riscaldare gradualmente fino a raggiungere, dopo circa 4 ore, la temperatura di 350 °C. Mantenere tale temperatura per almeno 2 ore, quindi portare il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico (3.3.4), regolazione della temperatura della camera per colonna, del rivelatore, ecc.) e registrare il segnale ad una sensibilità almeno due volte superiore a quella prevista per l’esecuzione dell’analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.

Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

5.2.2. Scelta delle condizioni operative

Le condizioni operative di massima sono le seguenti:

— temperatura della colonna: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min inizio a 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— quantità di sostanza iniettata: 1 μl della soluzione (2-4 ml) di n-eptano,

— gas vettore: elio o idrogeno alla velocità lineare ottimale per il gas prescelto (cfr. appendice),

— sensibilità strumentale: idonea a soddisfare le sottostanti condizioni.

Tali condizioni possono essere variate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da avere una separazione di tutte le cere, una risoluzione soddisfacente dei picchi (cfr. figura) e una ritenzione dello standard interno C32 di 18 ± 3 minuti. Il picco delle cere più rappresentativo deve avere un’altezza superiore al 60 % del fondo scala.

I parametri di integrazione dei picchi devono essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.

NB:Vista l’elevata temperatura finale, è ammessa una deriva positiva che non deve superare il 10 % del fondo scala.

5.3. Esecuzione dell’analisi

Prelevare 1 μl di soluzione con la microsiringa da 10 μl; estrarre lo stantuffo della siringa in modo che l’ago resti vuoto. Introdurre l’ago attraverso il dispositivo di iniezione e, dopo 1-2 secondi, iniettare rapidamente; estrarre quindi lentamente l’ago dopo circa 5 secondi.

Effettuare la registrazione fino a completa eluizione delle cere.

La linea di base deve rispondere sempre ai requisiti richiesti.

5.4. Identificazione dei picchi

L’identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e in confronto a miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni.

Nella figura è riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva vergine.

5.5. Valutazione quantitativa

Procedere al calcolo delle aree dei picchi dello standard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46 per mezzo dell’integratore.

Calcolare il contenuto di cere in ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza grassa, secondo la formula seguente:

in cui:

Ax = area del picco del singolo estere, in millimetri quadrati

As = area del picco dello standard interno, in millimetri quadrati

ms = massa di standard interno aggiunta, in milligrammi

m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DI RISULTATI

Riportare la somma dei contenuti delle singole cere da C40 a C46 in mg/kg di sostanza grassa (ppm).

NB:I componenti da quantificare si riferiscono ai picchi a numero di carbonio pari compresi tra gli esteri C40 e C46, secondo l’esempio di cromatogramma delle cere dell’olio di oliva riportato nella figura seguente. Se l’estere C46 risulta sdoppiato, si consiglia, ai fini della sua identificazione, di analizzare la frazione cerosa di un olio di sansa dove il picco C46 risulta facilmente individuabile in quanto nettamente maggioritario.

I risultati si esprimono con due cifre decimali.

Figura

Cromatogramma delle cere di un olio d’oliva ( 7 )

Legenda:

I.S. = Lauril arachidato

1. = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5. = Esteri C46

6. = Esteri steroli e alcoli triterpenici.









Appendice

Determinazione della velocità lineare del gas

Iniettare nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, da 1 a 3 μl di metano (o propano). Cronometrare il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell’iniezione al momento dell’uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in secondi.

▼M26









ALLEGATO V

DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE E DEL CONTENUTO DI STEROLI E DIALCOLI TRITERPENICI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di steroli e dialcoli triterpenici, singoli e totali, degli oli di oliva e degli oli di sansa di oliva.

2. PRINCIPIO

L'olio, addizionato di α-colestanolo quale standard interno, è saponificato con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

La frazione costituita da steroli e dialcoli triterpenici è separata dall'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile su una placca di gel di silice basica. Le frazioni recuperate dal gel di silice vengono trasformate in trimetilsilileteri e quindi analizzate mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA

La normale apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.

3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a smeriglio.

3.2. Imbuto separatore da 500 ml.

3.3. Matracci da 250 ml.

3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre di vetro 20 × 20 cm.

3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 254 o 366 nm.

3.6. Microsiringhe da 100 μl e 500 μl.

3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 μm) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, idoneo per filtrazione sotto vuoto con giunto smerigliato maschio.

3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato, adattabile all'imbuto filtrante (punto 3.7.).

3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo di vetro a tenuta.

3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione di tipo split, costituito da: 3.10.1. camera termostatica per le colonne, in grado di mantenere la temperatura desiderata con la precisione di ± 1 °C; 3.10.2. complesso di iniezione termoregolabile con elemento vaporizzatore in vetro persilanizzato e sistema split; 3.10.3. rivelatore a ionizzazione di fiamma; 3.10.4. sistema di acquisizione di dati idoneo per il funzionamento con il rivelatore a ionizzazione di fiamma (punto 3.10.3.), integrabile manualmente.

3.11. Colonna capillare in silice fusa, lunga 20 - 30 m, diametro interno 0,25 - 0,32 mm, internamente ricoperta di una miscela costituita da 5% difenil - 95% dimetilpolisilossano (fase stazionaria SE-52 o SE-54 o equivalenti), fino a uno spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm.

3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 μl con ago cementato idonea all'iniezione split.

3.13. Essiccatore a cloruro di calcio.

4. REAGENTI

4.1. Idrossido di potassio, titolo minimo 85%.

4.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (punto 4.1) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo (punto 4.10). Si conserva la soluzione in bottiglie di vetro scuro ben tappate, per un massimo di due giorni.

4.3. Etere etilico, puro per analisi.

4.4. Idrossido di potassio, soluzione etanolica circa 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio (punto 4.1) in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo (punto 4.10).

4.5. Sodio solfato anidro, puro per analisi.

4.6. Lastre di vetro (20x20 cm) stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).

4.7. Toluene, per cromatografia.

4.8. Acetone, per cromatografia.

4.9. n-esano, per cromatografia.

4.10. Etere etilico, per cromatografia.

4.11. Etanolo per analisi.

4.12. Acetato di etile per analisi.

4.13. Soluzione di riferimento per la cromatografia su strato sottile: colesterolo o fitosteroli, e soluzione di eritrodiolo al 5% in acetato di etile (punto 4.11).

4.14. 2,7-diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2%. Si rende leggermente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di idrossido di potassio (punto 4.2).

4.15. Piridina anidra, per cromatografia (v. Nota 5).

4.16. Esametildisilazano per analisi.

4.17. Trimetilclorosilano per analisi.

4.18. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento dell'impiego partendo da steroli ed eritrodiolo ottenuti da oli che li contengano.

4.19. α-colestanolo, puro ad oltre il 99% (la purezza deve essere verificata mediante analisi gascromatografica).

4.20. α-colestanolo, soluzione di standard interno allo 0,2% (m/V) in acetato di etile (punto 4.11).

4.21. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo (punto 4.10).

4.22. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.

4.23. Gas ausiliari: idrogeno, elio, azoto e aria, puri per gascromatografia.

4.24. Miscela n-esano (punto 4.9)/etere etilico (punto 4.10) in rapporto 65:35 (V/V).

4.25. Reagente per la sililazione costituito da una miscela 9:3:1 (V/V/V) di piridina-esametildisilazano- trimetilclorosilano.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione dell'insaponificabile. 5.1.1. Nel matraccio da 250 ml (punto 3.1) si introduce, impiegando la microsiringa da 500 μl (punto 3.6), un volume di soluzione di standard interno α-colestanolo (punto 4.20) che contenga una quantità di colestanolo corrispondente a circa il 10% del contenuto di steroli del campione. Ad esempio, per 5 g di campione si aggiungano 500 μl della soluzione di α-colestanolo (punto 4.20) se trattasi di un olio di oliva e 1 500 μl se trattasi di olio di sansa di oliva. Si fa evaporare fino a secchezza in leggera corrente di azoto su bagnomaria caldo; dopo il raffreddamento, nello stesso matraccio si pesano 5±0,01 g di campione secco filtrato. Nota 1: In oli e grassi animali e vegetali contenenti quantità notevoli di colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione sterolica in doppio con e senza standard interno. 5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N (punto 4.2) e della pomice, si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione fino a saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30 °C. 5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml (punto 3.2), aiutandosi con acqua distillata, a più riprese (50 ml). Si aggiungono circa 80 ml di etere etilico (punto 4.10), si agita energicamente per circa 60 secondi, smettendo periodicamente di applicare pressione mediante capovolgimento dell'imbuto separatore e apertura del rubinetto. Si lascia quindi riposare fino alla completa separazione delle due fasi (Nota 2). A questo punto si raccoglie la maggior quantità possibile di soluzione saponificata in un secondo imbuto separatore. Sulla fase acquosa-alcolica si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando 60-70 ml di etere etilico (punto 4.10). Nota 2: Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo piccole quantità di etanolo (punto 4.11). 5.1.4. Si riuniscono i tre estratti eterei in un unico imbuto separatore contenente 50 ml di acqua e si continua il lavaggio con acqua (50 ml) finché quest'ultima non presenta più una colorazione rosa all'aggiunta di una goccia di soluzione di fenolftaleina (punto 4.21). Eliminata l'acqua di lavaggio, si filtra su sodio solfato anidro (punto 4.5) in un matraccio da 250 ml precedentemente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico (punto 4.10). 5.1.5. Si distilla il solvente in un evaporatore rotante a 30°C sotto vuoto. Si aggiungono 5 ml di acetone e si rimuove completamente il solvente volatile in una leggera corrente di aria. Il residuo viene essiccato in stufa a 103±2°C per 15 minuti, raffreddato in essiccatori e pesato approssimando a 0,1 mg.

5.2. Separazione della frazione costituita da steroli e dialcoli triterpenici (eritrodiolo + uvaolo) 5.2.1. Preparazione delle lastre basiche per la cromatografia su strato sottile: si immergono le lastre al gel di silice (punto 4.6) per circa 4 cm nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di potassio (punto 4.5) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa per due ore e infine si pongono in stufa a 100 °C per un'ora. Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio (punto 3.13) fino al momento dell'impiego (le lastre così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni). Nota 3: Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle lastre al gel di silice basiche si elimina la necessità del trattamento della frazione insaponificabile con allumina. In tal modo vengono trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così la banda degli steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e triterpenici. 5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela esano/etere etilico (punto 4.24) (Nota 4) fino all'altezza di circa 1 cm. Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora, in luogo fresco, in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei componenti. Nota 4: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili, la miscela di sviluppo deve essere sostituita a ogni prova; in alternativa è possibile utilizzare un solvente costituito da n-esano/etere etilico 50:50 (V/V). 5.2.3. Si prepara una soluzione al 5% circa di insaponificabile (punto 5.1.5) in acetato di etile (punto 4.12) e, con la microsiringa da 100 μl, si depositano sulla placca cromatografica, a 2 cm dall'estremità inferiore, 0,3 ml della soluzione in una striscia sottile e uniforme (punto 5.2.1). In allineamento con la linea di caricamento, si depositano 2-3 μl della soluzione di riferimento (punto 4.13), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli e dei dialcoli triterpenici. 5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come descritto al punto 5.2.2. La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20°C (Nota 5). Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si fa evaporare il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca per un po' di tempo sotto cappa. Nota 5: Una temperatura più elevata potrebbe peggiorare la separazione. 5.2.5. Si spruzza la placca debolmente e uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina (punto 4.14) e la si lascia asciugare. Osservando la placca alla luce ultravioletta si individuano le bande degli steroli e dei dialcoli triterpenici per allineamento con la macchia ottenuta con la soluzione di riferimento (punto 4.13); si delimitano con una matita nera i limiti delle bande lungo i margini di fluorescenza (v. placca cromatografica figura 3). 5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (punto 3.7); si aggiungono 10 ml di acetato di etile caldo (punto 4.12), si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra sotto vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (punto 3.8.), collegata all'imbuto filtrante. Si lava il residuo nella beuta per tre volte con etere etilico (punto 4.3) (circa 10 ml per volta), raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta attaccata all'imbuto; si fa evaporare il filtrato fino a un volume di circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml precedentemente pesata (punto 3.9), si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone (punto 4.8), si riporta ancora a secco mediante evaporazione, Il residuo contenuto nella provetta deve essere costituito dalle frazioni di steroli e dialcoli triterpenici.

5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri. 5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica e triterpenica si aggiunge il reagente per la sililazione (punto 4.25) (Nota 6), in ragione di 50 μl per ogni milligrammo di steroli e di dialcoli triterpenici, evitando ogni assorbimento di umidità (Nota 7). Nota 6: Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti per la sililazione, quali ad esempio il bis-trimetilsililtrifluorolacetammide + 1% di trimetilclorosilano da diluire in uno stesso volume di piridina anidra. La piridina può essere sostituita dalla stessa quantità di acetonitrile. 5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione dei composti. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica. Nota 7: L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcuna anomalia. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio della presenza di umidità o di alterazione del reagente. In questo caso la prova dovrà essere ripetuta (solo se si utilizza esametildisilazano/trimetilclorosilano).

5.4. Analisi gascromatografica. 5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna capillare. 5.4.1.1. Si installa la colonna (punto 3.11) nel gascromatografo, collegando il terminale di ingresso all'iniettore del dispositivo split e il terminale di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di split e del sistema di registrazione, ecc.). 5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento: si fa scorrere un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 °C superiore a quella di esercizio (Nota 8). Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e del dispositivo split, accensione della fiamma, collegamento con l'elaboratore, regolazione della temperatura della colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale a una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, mentre una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna. Nota 8: La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 °C rispetto alla temperatura massima prevista per la fase stazionaria utilizzata. 5.4.2. Scelta delle condizioni operative. 5.4.2.1. Le condizioni operative di massima sono le seguenti: — temperatura della colonna: 260 ± 5°C — temperatura dell'iniettore: 280-300°C — temperatura del rivelatore: 280-300°C — velocità lineare del gas vettore: elio 20 - 35 cm/s; idrogeno 30 - 50 cm/s — rapporto di split: da 1:50 a 1:100 — sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima — sensibilità di registrazione: 1 - 2 mV f.s. — quantità di sostanza iniettata: 0,5 - 1 μl di soluzione di TMSE. Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo, in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti: — il tempo di ritenzione del picco di β-sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti — il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto medio 3%) 20 ± 5 % del fondo scala, per l'olio di soia (contenuto medio 20%) 80 ± 10% del fondo scala — si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario che i picchi oltre che separati siano anche completamente risolti cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima di risalire per il picco successivo. È tuttavia tollerata anche una risoluzione incompleta purché il picco TRR 1,02 (sitostanolo) sia quantificabile secondo la perpendicolare. 5.4.3. Esecuzione dell'analisi. 5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 μl si preleva 1 μl di esano, si aspirano 0,5 μl di aria e successivamente 0,5 - 1 μl della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana dell'iniettore e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi. È possibile utilizzare anche un iniettore automatico. 5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE dei dialcoli triterpenici presenti. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (punto 5.4.1.2). 5.4.4. Identificazione dei picchi. L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli steroli e dei dialcoli triterpenici, analizzate nelle medesime condizioni (v. Appendice). Gli steroli e i dialcoli triterpenici vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, brassicasterolo, ergosterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo, stigmasterolo, Δ7-campesterolo, Δ5,23-stigmastadienolo, clerosterolo, ß-sitosterolo, sitostanolo, Δ5-avenasterolo, Δ5,24-stigmastadienolo, Δ7-stigmastenolo, Δ7-avenasterolo, eritrodiolo e uvaolo. Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al ß-sitosterolo per le colonne SE-52 e SE-54. Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli. 5.4.5. Valutazione quantitativa. 5.4.5.1. Si procede al calcolo delle aree dei picchi di α-colestanolo, steroli e dialcoli triterpenici mediante l'elaboratore. Non vengono considerati i picchi di eventuali componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella I (non si deve calcolare l'ergosterolo). Il coefficiente di risposta dell'α-colestanolo si deve intendere unitario. 5.4.5.2. Si calcola la concentrazione di ogni singolo sterolo, in mg/kg di sostanza grassa, come segue: in cui: Ax = area del picco dello sterolo x, in unità di calcolo dell'elaboratore; As = area del picco dell'α-colestanolo, in unità di calcolo dell'elaboratore; ms = massa di α-colestanolo aggiunta, in milligrammi; m = massa del campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1. Si riportano le concentrazioni dei singoli steroli, in mg/kg di sostanza grassa e, come steroli totali, la loro somma. Il contenuto di ogni singolo sterolo, dell'eritrodiolo e dell'uvaolo deve essere espresso con una cifra decimale. Il contenuto totale di steroli deve essere espresso senza decimali.

▼M28

6.2. Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi degli steroli: in cui: Ax = area del picco x; ΣA = somma delle aree di tutti i picchi degli steroli.

▼M26

6.3. β-sitosterolo apparente: Δ5-23-stigmastadienolo + clerosterolo + β-sitosterolo + sitostanolo + Δ5-avenasterolo + Δ5-24-stigmastadienolo.

6.4 Si calcola il contenuto percentuale di eritrodiolo e uvaolo: in cui: ΣA = somma delle aree degli steroli in unità di calcolo dell'integratore; Er = area dell'eritrodiolo in unità di calcolo dell'integratore; Uv = area dell'uvaolo in unità di calcolo dell'integratore.









Appendice

Determinazione della velocità lineare del gas

Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1 - 3 μl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento della comparsa del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM, in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in secondi.







Tabella 1 Tempi di ritenzione relativi degli steroli Picco Identificazione Tempo di ritenzione relativo Colonna SE 54 Colonna SE 52 1 Colesterolo Δ-5-colesten-3ß-olo 0,67 0,63 2 Colestanolo 5α-colestan-3ß-olo 0,68 0,64 3 Brassicasterolo [24S]-24-metil-Δ-5,22-colestadien-3ß-olo 0,73 0,71 * Ergosterolo [24S] 24 metil Δ5-7-22 colestatrien 3ß-olo 0,78 0,76 4 24-metilencolesterolo 24-metilen-Δ-5,24-colestadien-3ß-o1o 0,82 0,80 5 Campesterolo (24R)-24-metil-Δ-5-colesten-3ß-olo 0,83 0,81 6 Campestanolo (24R)-24-metil-colestan-3ß-olo 0,85 0,82 7 Stigmasterolo (24S)-24-etil-Δ-5,22-colestadien-3ß-olo 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterolo (24R)-24-metil-Δ-7-colesten-3ß-olo 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienolo (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-colestadien-3ß-olo 0,95 0,95 10 Clerosterolo (24S)-24-etil-Δ-5,25-colestadien-3ß-olo 0,96 0,96 11 ß-sitosterolo (24R)-24-etil-Δ-5-colesten-3ß-olo 1,00 1,00 12 Sitostanolo 24-etil-colestan-3ß-olo 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterolo (24Z)-24-etiliden-Δ-colesten-3ß-olo 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienolo (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-colestadien-3ß-olo 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenolo (24R,S)-24-etil-Δ-7-colesten-3ß-olo 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterolo (24Z)-24-etiliden-Δ-7-colesten-3ß-olo 1,16 1,16 17 Eritrodiolo 5α olean-12en-3ß28 diolo 1,41 1,41 18 Uvaolo Δ12-ursen-3ß28 diolo 1,52 1,52

Figura 1

Gascromatogramma della frazione costituita da steroli e dialcoli triterpenici di un olio di oliva lampante (addizionato di standard interno)

Figura 2

Gascromatogramma della frazione costituita da steroli e dialcoli triterpenici di un olio di oliva raffinato (addizionato di standard interno)

Figura 3

Placca cromatografica di un olio di sansa di oliva con la zona da raschiare per la determinazione degli steroli e dei dialcoli triterpenici

1 – Squalene

2 – Alcoli triterpenici e alifatici

3 – Steroli e dialcoli triterpenici

4 – Acidi grassi iniziali e liberi

▼M26 —————

▼M21









ALLEGATO VII

DETERMINAZIONE DELLA PERCENTUALE DI 2 GLICERIL MONOPALMITATO

1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE

Il metodo descrive il procedimento analitico per la determinazione della percentuale di acido palmitico in posizione 2 nei trigliceridi mediante valutazione del 2-gliceril monopalmitato.

Esso si applica agli oli vegetali liquidi a temperatura ambiente (20 °C).

2. PRINCIPIO

Una volta preparato, il campione di olio è sottoposto all’azione della lipasi pancreatica: un’idrolisi parziale e specifica nelle posizioni 1 e 3 della molecola di trigliceride determina la comparsa dei monogliceridi in posizione 2. La percentuale di 2-gliceril monopalmitato nella frazione monogliceridica è determinata, previa sililazione, mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA E MATERIALE

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Beakers da 100, 250 e 300 ml.

3.3. Colonna di vetro per cromatografia, con diametro interno 21-23 mm e lunghezza 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto.

3.4. Provette tarate da 10, 50, 100 e 200 ml.

3.5. Matracci da 100 e 250 ml.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Provette da centrifuga a fondo conico da 10 ml con tappo smerigliato.

3.8. Centrifuga per provette da 10 e 100 ml.

3.9. Termostato in grado di mantenere una temperatura di 40 °C + 0,5 °C.

3.10. Pipette tarate da 1 e 2 ml.

3.11. Siringa ipodermica da 1 ml.

3.12. Microsiringa da 100 μl.

3.13. Imbuto da 1 000 ml.

3.14. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione «on column» a freddo per l’introduzione diretta del campione nella colonna e di stufa in grado di mantenere la temperatura desiderata con l’approssimazione di 1 °C.

3.15. Iniettore a freddo «on column» per introduzione diretta in colonna.

3.16. Rivelatore a ionizzazione di fiamma ed elettrometro.

3.17. Registratore-integratore adatto all’elettrometro, con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.18. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, ricoperta di metilpolisilossano o di fenilmetilpolisilossano al 5 %, di spessore compreso fra 0,10 e 0,30 μm, resistente a una temperatura di 370 °C.

3.19. Microsiringa da 10 μl con ago cementato lungo almeno 7,5 cm, per iniezione diretta in colonna.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparato nel modo seguente: mettere il gel di silice in una capsula di porcellana, essiccare nella stufa a 160 °C per 4 ore, quindi lasciar raffreddare a temperatura ambiente in essiccatore. Aggiungere un volume d’acqua equivalente al 5 % del peso del gel di silice, procedendo come segue: in una beuta da 500 ml pesare 152 g di gel di silice e aggiungere 8 g di acqua distillata, tappare e agitare delicatamente per ottenere una ripartizione uniforme dell’acqua. Lasciare a riposo per almeno 12 ore prima dell’uso.

4.2. n-esano per cromatografia.

4.3. Isopropanolo.

4.4. Isopropanolo in soluzione acquosa 1:1 (v/v).

4.5. Lipasi pancreatica avente un’attività compresa tra 2,0 e 10 unità di lipasi per mg (esistono in commercio lipasi pancreatiche con attività compresa tra 2 e 10 unità per mg di enzima).

4.6. Soluzione tampone di tris-idrossimetilamminometano: soluzione acquosa 1 M portata a pH 8 (controllare con il potenziometro) mediante aggiunta di acido cloridrico concentrato (1:1 v/v).

4.7. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa allo 0,1 % (la soluzione deve essere utilizzata entro i 15 giorni successivi alla preparazione).

4.8. Cloruro di calcio, soluzione acquosa al 22 %.

4.9. Etere etilico per cromatografia.

4.10. Solvente di sviluppo: miscela n-esano/etere etilico (87/13) (v/v).

4.11. Idrossido di sodio, soluzione al 12 % in peso.

4.12. Fenolftaleina, soluzione etanolica all’1 %.

4.13. Gas vettore: idrogeno o elio per gascromatografia.

4.14. Gas ausiliari: idrogeno (minimo 99 %), esente da umidità e sostanze organiche, e aria per gascromatografia della stessa purezza.

4.15. Reagente di silanizzazione: miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9/3/1 (v/v/v) (Esistono in commercio soluzioni pronte per l’uso. Possono essere utilizzati anche altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire con uno stesso volume di piridina anidra).

4.16. Campioni di riferimento: monogliceridi puri o miscele di monogliceridi a composizione percentuale nota, simile a quella del campione.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione del campione

5.1.1. Gli oli la cui acidità libera è inferiore al 3 % non devono essere neutralizzati prima della cromatografia su colonna di gel di silice. Gli oli la cui acidità libera è superiore al 3 % devono essere sottoposti a neutralizzazione secondo il procedimento descritto al punto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Versare nell’imbuto da 1 000 ml (3.13) 50 g di olio e 200 ml di n-esano. Aggiungere 100 ml di isopropanolo e una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % (4.11) corrispondente all’acidità libera dell’olio maggiorata del 5 %. Agitare energicamente per un minuto. Aggiungere 100 ml di acqua distillata, agitare nuovamente e lasciare a riposo. A decantazione avvenuta, eliminare lo strato inferiore contenente i saponi. Eliminare eventuali strati intermedi (mucillagine e sostanze insolubili). Lavare la soluzione esanica dell’olio neutralizzato con porzioni consecutive di 50-60 ml della soluzione di isopropanolo/acqua 1:1 (v/v) (4.4), fino alla scomparsa della colorazione rosea dovuta alla fenolftaleina. Eliminare la maggior parte dell’esano mediante distillazione sotto vuoto (utilizzando per esempio l’evaporatore rotante) e travasare l’olio in un matraccio da 100 ml (3.5). Essiccare l’olio sotto vuoto fino ad eliminazione completa del solvente. Ultimata questa operazione, l’acidità dell’olio deve risultare inferiore allo 0,5 %.

5.1.2. Introdurre nella beuta da 25 ml (3.1) 1,0 g di olio preparato nel modo sopra indicato e scioglierlo in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Lasciare a riposo la soluzione per almeno 15 minuti prima di procedere alla cromatografia su colonna di gel di silice. Se la soluzione è torbida, centrifugarla per garantire condizioni ottimali per la cromatografia. (Si possono utilizzare cartucce di gel di silice SPE da 500 mg pronte per l’uso).

5.1.3. Preparazione della colonna cromatografica Versare nella colonna (3.3) circa 30 ml di solvente di sviluppo (4.10); introdurre un batuffolo di cotone nella parte inferiore della colonna con l’ausilio di una bacchetta di vetro; comprimere per far uscire l’aria. Preparare in un beaker una sospensione di 25 g di gel di silice (4.1) in circa 80 ml di solvente di sviluppo e versarla nella colonna attraverso un imbuto. Verificare che tutto il gel di silice sia stato immesso nella colonna; lavare con solvente di sviluppo (4.8), aprire il rubinetto e lasciar fluire il liquido fino a circa 2 mm sopra il livello superiore del gel di silice.

5.1.4. Cromatografia su colonna Nella beuta da 25 ml (3.1.) pesare esattamente 1,0 g di campione preparato secondo il procedimento descritto al punto 5.1. Sciogliere il campione in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Versare la soluzione nella colonna cromatografica preparata nel modo indicato al punto 5.1.3. Evitare di agitare la superficie della colonna. Aprire il rubinetto e lasciar fluire la soluzione campione fino al livello del gel di silice. Sviluppare con 150 ml di solvente di sviluppo. Regolare il flusso a 2 ml/min (in modo che i 150 ml passino attraverso la colonna in 60-70 minuti circa). Recuperare l’eluato in un matraccio da 250 ml previamente tarato. Far evaporare il solvente sotto vuoto ed eliminarne le ultime tracce con una corrente di azoto. Pesare il matraccio e calcolare l’estratto raccolto. [Se si utilizzano cartucce di silice SPE pronte per l’uso, procedere come segue: introdurre 1 ml di soluzione (5.1.2) nelle cartucce previamente preparate con 3 ml di n-esano. Una volta percolata la soluzione, sviluppare con 4 ml di n-esano/etere etilico 9:1 (v/v). Recuperare l’eluato in una provetta da 10 ml e sottoporlo a evaporazione in corrente di azoto fino a essiccazione completa. Sottoporre il residuo secco all’azione della lipasi pancreatica (5.2). È essenziale che la composizione in acidi grassi sia verificata prima e dopo passaggio su cartuccia SPE].

5.2. Idrolisi con lipasi pancreatica

5.2.1. Pesare nella provetta della centrifuga 0,1 g di olio preparato nel modo descritto al punto 5.1. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone (4.6), 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (4.7) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio, agitando bene dopo ogni aggiunta. Chiudere la provetta con il tappo smerigliato e inserirla nel termostato a 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Aggiungere 20 mg di lipasi, agitare accuratamente (evitando di bagnare il tappo), mettere la provetta nel termostato per esattamente 2 minuti, quindi ritirarla, agitare vigorosamente per esattamente 1 minuto e lasciar raffreddare.

5.2.3. Aggiungere 1 ml di etere etilico, tappare e agitare vigorosamente, quindi centrifugare e travasare la soluzione in una provetta pulita e asciutta con la microsiringa.

5.3. Preparazione dei derivati silanizzati e della gascromatografia

5.3.1. Introdurre con la microsiringa 100 μl di soluzione (5.2.3) in una provetta da 10 ml a fondo conico.

5.3.2. Eliminare il solvente con una leggera corrente di azoto, aggiungere 200 μl di reagente di silanizzazione (4.15), tappare la provetta e lasciare a riposo per 20 minuti.

5.3.3. Dopo 20 minuti, aggiungere da 1 a 5 ml di n-esano (in funzione delle condizioni cromatografiche): la soluzione così ottenuta è pronta per la gascromatografia.

5.4. Gascromatografia

Le condizioni operative sono le seguenti:

— temperatura dell’iniettore (iniettore «on column») inferiore alla temperatura di ebollizione del solvente (68 °C),

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— temperatura della colonna: temperatura della stufa programmata a 60 °C per 1 minuto, quindi incrementata di 15 °C al minuto fino a 180 °C, poi di 5 °C al minuto fino a 340 °C e mantenuta a 340 °C per 13 minuti,

— gas vettore: idrogeno o elio regolato alla velocità lineare adeguata per ottenere la risoluzione rappresentata nella figura 1; il tempo di ritenzione del trigliceride C54 deve essere di 40 + 5 minuti (cfr. figura 2). (Le condizioni operative sopra indicate sono proposte a titolo indicativo. L’operatore provvederà ad ottimizzarle per ottenere la risoluzione desiderata. Il picco corrispondente al 2-gliceril monopalmitato deve avere un’altezza minima pari al 10 % della scala del registratore.),

— quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 μl della soluzione (5 ml) di n-esano (5.3.3).

5.4.1. Identificazione dei picchi

I singoli monogliceridi sono identificati in base ai tempi di ritenzione, in confronto a quelli ottenuti con miscele standard di monogliceridi analizzate nelle medesime condizioni.

5.4.2. Valutazione quantitativa

L’area dei picchi è calcolata mediante un integratore elettronico.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La percentuale di 2-gliceril monopalmitato è calcolata in base al rapporto tra l’area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi di tutti i monogliceridi (cfr. figura 2), applicando la seguente formula:

gliceril monopalmitato (%):

in cui:

Ax = area del picco corrispondente al gliceril monopalmitato

ΣA = somma delle aree di tutti i picchi dei monogliceridi.

Il risultato si esprime con una cifra decimale.

7. RAPPORTO DI ANALISI

Il rapporto di analisi deve recare:

— il riferimento al metodo descritto,

— ogni indicazione utile per la completa identificazione del campione,

— il risultato dell’analisi,

— ogni deviazione dal metodo indicato, sia essa dovuta ad una decisione delle parti interessate o a qualsiasi altro motivo,

— gli estremi per l’identificazione del laboratorio, la data dell’analisi e la firma dei responsabili.

Figura 1

Cromatogramma dei prodotti della reazione di silanizzazione ottenuti dall’azione della lipasi su un olio d’oliva raffinato addizionato del 20 % di olio esterificato (100 %).

Legenda: «acides gras libres» = acidi grassi liberi; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = olio d’oliva raffinato + 20 % olio esterificato; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleina; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturi

Figura 2

Cromatogramma di:

(A) olio d’oliva non esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

Cromatogramma di:

(B) olio esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

8. NOTE

PREPARAZIONE DELLA LIPASI

Esistono in commercio lipasi con attività soddisfacente. Si possono anche preparare in laboratorio con il seguente procedimento.

Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 °C. Rimuovere il grasso solido e il tessuto connettivo circostanti e triturare in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Agitare questa pasta per 4-6 ore con 2,5 l di acetone anidro e centrifugare. Estrarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela 1:1 (v/v) di acetone e di etere etilico e due volte con etere etilico.

Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero al riparo dall’umidità.

CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ LIPASICA

Preparare un’emulsione di olio d’oliva nel modo seguente:

Agitare per 10 minuti in un mescolatore una miscela di 165 ml di soluzione di gomma arabica a 100g/l, 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio d’oliva neutralizzato.

In un beaker da 50 ml versare 10 ml di questa emulsione, quindi 0,3 ml di soluzione di colato di sodio a 0,2 g/ml e 20 ml di acqua distillata.

Mettere il beaker in un termostato regolato a 37 °C; introdurre gli elettrodi del pHmetro e l’agitatore ad elica.

Mediante una buretta aggiungere goccia a goccia una soluzione di idrossido di sodio 0,1 N fino ad ottenere un pH 8,3.

Aggiungere un volume di soluzione acquosa di polvere di lipasi (0,1 g/ml di lipasi). Non appena il pHmetro indica un pH 8,3, avviare il cronometro e aggiungere goccia a goccia la soluzione di idrossido di sodio in modo da mantenere il pH a 8,3. Annotare il volume di soluzione consumato ogni minuto.

Riportare i dati in un diagramma indicando le letture di tempo nelle ascisse e i millilitri di soluzione alcalina 0,1 N consumati per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un grafico lineare.

L’attività della lipasi, misurata in unità di lipasi per mg, è data dalla formula seguente:

in cui:

A è l’attività in unità di lipasi/mg

V è il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N/min, desunto dal diagramma

N è la normalità della soluzione di idrossido di sodio

m è la massa in mg della lipasi utilizzata per la prova.

L’unità di lipasi è definita come la quantità di enzima che libera 10 microequivalenti di acido al minuto.

▼M20 —————

▼M28









ALLEGATO IX

ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL'ULTRAVIOLETTO

PREMESSA

L'analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto può fornire informazioni sulla qualità di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte da processi tecnologici. L'assorbimento alle lunghezze d'onda specificate nel metodo è dovuto alla presenza di sistemi dienici e trienici coniugati derivanti da processi di ossidazione e/o da pratiche di raffinazione. I valori di tale assorbimento sono espressi come estinzione specifica

(estinzione di una soluzione della sostanza grassa all'1 % (p/v) nel solvente prescritto, in una cuvetta di 10 mm) convenzionalmente indicata con K (detto anche «coefficiente di estinzione»).

1. OGGETTO

Il presente allegato descrive il procedimento per l'esecuzione dell'analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto dell'olio d'oliva.

2. PRINCIPIO DEL METODO

Un campione viene disciolto nel solvente stabilito e l'assorbanza della soluzione è misurata alle lunghezze d'onda prescritte, in riferimento al solvente puro.

Si determinano i valori dell'estinzione specifica alle lunghezze d'onda di 232 e 268 nm nell'isoottano o di 232 e 270 nm nel cicloesano, per una concentrazione dell'1 % p/v in una cuvetta di 10 mm.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Spettrofotometro per misurazioni a lunghezze d'onda dell'ultravioletto (da 220 a 360 nm), con possibilità di lettura per ogni unità nanometrica. Si raccomanda l'esecuzione di controlli regolari in relazione all'accuratezza e alla riproducibilità delle scale di lunghezza d'onda e di assorbanza, nonché alla luce parassita. 3.1.1. Scala delle lunghezza d'onda: questo controllo può essere effettuato mediante materiale di riferimento costituito da un filtro di vetro ottico contenente ossido di olmio o una soluzione di ossido di olmio (sigillata o no), che presenta bande di assorbanza separate. I materiali di riferimento sono destinati alla verifica e alla taratura della scala delle lunghezze d'onda di spettrofotometri UV-visibile con ampiezza di banda spettrale nominale uguale o inferiore a 5 nm. Le misurazioni sono effettuate rispetto a una prova in bianco all'aria su un intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 640 e 240 nm, secondo le istruzioni accluse ai materiali di riferimento. Ad ogni alterazione della larghezza della fessura (slit) si esegue una correzione della linea di base con un percorso ottico libero. Le lunghezze d'onda della norma sono elencate nel certificato del materiale di riferimento. 3.1.2. Scala di assorbanza: tale controllo può essere eseguito utilizzando materiali di riferimento sigillati reperibili in commercio, costituiti da soluzioni acide di dicromato di potassio a determinate concentrazioni e con valori certificati di assorbanza a λmax (quattro soluzioni di dicromato di potassio in acido perclorico, sigillate in quattro cuvette UV in quarzo utilizzate per misurare la linearità e l'accuratezza fotometrica di riferimento nell'ultravioletto). Le soluzioni di dicromato di potassio sono misurate rispetto a una prova in bianco dell'acido utilizzato, previa correzione della linea di base, conformemente alle istruzioni accluse al materiale di riferimento. I valori di assorbanza sono elencati nel certificato del materiale di riferimento. Per verificare la risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore è inoltre possibile procedere come segue: pesare 0,2000 g di potassio cromato puro per spettrofotometria e scioglierlo in una soluzione di idrossido di potassio 0,05 N in un matraccio tarato da 1 000 ml e portare a volume. Prelevare esattamente 25 ml della soluzione ottenuta, trasferirla in un matraccio tarato da 500 ml e portare a volume con la stessa soluzione di idrossido di potassio. Misurare l'estinzione della soluzione così ottenuta a 275 nm, utilizzando come riferimento la soluzione di idrossido di potassio. L'estinzione misurata con cuvetta da 1 cm deve essere di 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuvette in quarzo rettangolari, con coperchio, adatte per misurazioni a lunghezze d'onda dell'ultravioletto (da 220 a 360 nm), con un percorso ottico di 10 mm. Riempite di acqua o con altro solvente idoneo, le cuvette non devono presentare fra loro differenze superiori a 0,01 unità di estinzione.

3.3. Matracci volumetrici tarati da 25 ml, classe A.

3.4. Bilancia analitica, idonea a fornire una lettura con l'approssimazione di 0,0001 g.

4. REAGENTI

Salvo indicazione contraria, durante l'analisi utilizzare soltanto reagenti di qualità analitica riconosciuta e acqua distillata o demineralizzata o acqua di purezza equivalente.

Solvente: Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) per misurazioni a 232 nm e 268 nm o cicloesano per misurazioni a 232 nm e 270 nm, con assorbanza inferiore a 0,12 a 232 nm e a 0,05 a 270 nm rispetto all'acqua distillata, misurata in una cuvetta di 10 mm.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Il campione deve essere perfettamente omogeneo ed esente da impurezze sospese. In caso contrario deve essere filtrato su carta alla temperatura di circa 30 °C.

5.2. Del campione così preparato si versano circa 0,25 g (con un'approssimazione di 1 mg) in un matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida. Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente con carta. NOTA: in generale, è sufficiente una massa di 0,25-0,30 g per misurare l'assorbenza di oli di oliva vergini ed extra vergini a 268 nm e 270 nm. Per misurazioni a 232 nm occorrono di norma 0,05 g di campione; in tal caso si preparano generalmente due soluzioni distinte. Per misurare l'assorbanza di oli di sansa d'oliva, oli d'oliva raffinati e oli d'oliva adulterati, che presentano un'assorbanza più elevata, è generalmente sufficiente un campione di quantità inferiore (ad esempio 0,1 g).

5.3. Se necessario, si corregge la linea di base (220-290 nm) con solvente in entrambe le cuvette di quarzo (campione e riferimento), quindi si riempie con la soluzione di prova la cuvetta di quarzo del campione e si misurano le estinzioni a 232, 268 o 270 nm rispetto al solvente utilizzato come riferimento. I valori di estinzione registrati devono essere compresi tra 0,1 e 0,8 o nell'intervallo di linearità dello spettrofotometro (che deve essere verificato). In caso contrario è necessario ripetere le misurazioni utilizzando soluzioni più concentrate o più diluite, a seconda del caso.

5.4. Dopo aver misurato l'assorbanza a 268 o 270 nm, si misura l'assorbanza a λmax, λmax + 4 e λmax – 4. Questi valori di assorbanza sono utilizzati per determinare la variazione dell'estinzione specifica (ΔΚ). NOTA: il valore di λmax è fissato a 268 nm per l'isoottano utilizzato come solvente e a 270 nm per il cicloesano.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie lunghezze d'onda calcolate come segue: in cui: Kλ = estinzione specifica alla lunghezza d'onda λ; Eλ = estinzione misurata alla lunghezza d'onda λ; c = concentrazione della soluzione in g/100 ml; s = spessore della cuvetta di quarzo in cm; il valore è espresso con due cifre decimali.

6.2. Variazione dell'estinzione specifica (ΔΚ) La variazione del valore assoluto dell'estinzione (ΔΚ) è data da: in cui Km è l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda di massimo assorbimento a 270 nm e 268 nm, a seconda del solvente utilizzato. Il valore è espresso con due cifre decimali.









ALLEGATO X

DETERMINAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA

1. OGGETTO

Il presente allegato fornisce orientamenti per la determinazione mediante gascromatografia degli acidi grassi liberi e legati nei grassi e negli oli vegetali dopo la loro conversione in esteri metilici di acidi grassi (FAME).

Gli acidi grassi legati dei triacilgliceroli (TAG) e, a seconda del metodo di esterificazione, gli acidi grassi liberi (FFA), sono convertiti in esteri metilici di acidi grassi (FAME), determinati mediante gascromatografia con colonna capillare.

Il metodo descritto nel presente allegato consente di determinare gli esteri metilici degli acidi grassi da C12 a C24, compresi quelli saturi, monoinsaturi cis e trans e polinsaturi cis e trans.

2. PRINCIPIO

La gascromatografia (GC) è utilizzata per l'analisi quantitativa dei FAME. I FAME sono preparati conformemente alla parte A. Essi sono successivamente iniettati e vaporizzati nell'iniettore. La separazione dei FAME viene eseguita su colonne analitiche di polarità e lunghezza specifiche. Un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è utilizzato per il rilevamento dei FAME. Le condizioni di analisi figurano nella parte B.

L'idrogeno o l'elio possono essere utilizzati come gas vettore (fase mobile) nella gascromatografia dei FAME con FID. L'idrogeno accelera la separazione e produce picchi più marcati. La fase stazionaria consiste in un microscopico strato di una sottile pellicola liquida su una superficie solida inerte di silice fusa.

Mentre passano attraverso la colonna capillare i composti volatili in esame interagiscono con la fase stazionaria che riveste la superficie interna della colonna. A causa di tale differenza di interazione dei diversi composti, la loro eluizione avviene in un momento diverso, detto «tempo di ritenzione» del composto per un determinato insieme di parametri analitici. La comparazione dei tempi di ritenzione serve a identificare i diversi composti.

PARTE A

PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI DA OLIO DI OLIVA E DA OLIO DI SANSA DI OLIVA

1. OGGETTO

La presente parte illustra la preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi e include metodi di preparazione degli esteri metilici di acidi grassi da oli di oliva e di oli di sansa di oliva.

2. CAMPO DI APPLICAZIONE

La preparazione degli esteri metilici di acidi grassi da oli di oliva e oli di sansa di oliva avviene mediante transesterificazione con soluzione metanolica di idrossido di potassio a temperatura ambiente. La necessità di depurare il campione prima della transesterificazione dipende dal tenore di