01991R2568 — IT — 20.10.2019 — 032.001

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▼B

REGOLAMENTO (CEE) N. 2568/91 DELLA COMMISSIONE

dell'11 luglio 1991

relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi attinenti







▼M20

Articolo 1

1. Sono considerati oli di oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a) e b), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate rispettivamente nei punti 1 e 2 dell'allegato I del presente regolamento.

2. È considerato olio di oliva lampante ai sensi del punto 1, lettera c), dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 3, del presente regolamento.

3. È considerato olio di oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 4, del presente regolamento.

4. È considerato olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ai sensi del punto 3 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del presente regolamento.

5. È considerato olio di sansa di oliva greggio ai sensi del punto 4 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente regolamento.

6. È considerato olio di sansa di oliva raffinato ai sensi del punto 5 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del presente regolamento.

7. È considerato olio di sansa di oliva ai sensi del punto 6 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del presente regolamento.

▼M26

Articolo 2

1. Le caratteristiche degli oli figuranti nell'allegato I sono determinate in base ai seguenti metodi di analisi:

(a) per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percentuale di acido oleico, il metodo di cui all'allegato II;

(b) per la determinazione dell'indice di perossidi, il metodo di cui all'allegato III;

(c) per la determinazione del contenuto di cere, il metodo di cui all'allegato IV;

(d) per la determinazione della composizione e del contenuto di steroli e dialcoli triterpenici mediante gascromatografia con colonna capillare, il metodo di cui all'allegato V;

(e) per la determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato, il metodo di cui all’allegato VII;

(f) per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui all'allegato IX;

▼M28

(g) per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo di cui all'allegato X;

▼M26

(h) per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di cui all'allegato XI;

(i) per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini, il metodo di cui all'allegato XII;

(j) per la determinazione degli stigmastadieni, il metodo di cui all'allegato XVII;

(k) per la determinazione dei trigliceridi con ECN42, il metodo di cui all'allegato XVIII;

▼M32

(l) per la determinazione della composizione e del contenuto di steroli e per la determinazione dei composti alcolici mediante gascromatografia con colonna capillare, il metodo di cui all'allegato XIX;

▼M26

(m) per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi, il metodo di cui all’allegato XX.

▼M28 —————

▼M26

2. La verifica delle caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti è effettuata da panel di assaggiatori riconosciuti dagli Stati membri.

Le caratteristiche organolettiche di un olio, ai sensi del primo comma, si considerano conformi alla categoria di olio di oliva dichiarata se il panel di assaggiatori riconosciuto dallo Stato membro ne conferma la classificazione.

▼M32

Qualora il panel non confermi la categoria dichiarata, sotto il profilo delle sue caratteristiche organolettiche, a richiesta dell'interessato le autorità nazionali o i loro rappresentanti incaricano altri panel riconosciuti di effettuare quanto prima due controanalisi. Almeno uno dei panel è un panel riconosciuto dallo Stato membro di produzione dell'olio. Le caratteristiche in questione sono considerate conformi a quelle dichiarate se le due controanalisi confermano la classificazione dichiarata. In caso contrario, a prescindere dal tipo di difetti constatati durante le controanalisi, la classificazione è dichiarata incoerente con le caratteristiche e il costo delle controanalisi è a carico dell'interessato.

▼M26

3. Per quanto riguarda la verifica delle caratteristiche degli oli da parte delle autorità nazionali o di loro rappresentanti, prevista al paragrafo 1, il prelievo dei campioni si effettua secondo le norme internazionali EN ISO 661 relativa alla preparazione dei campioni per le prove e EN ISO 5555 relativa al campionamento. Tuttavia, in deroga al punto 6.8 della norma EN ISO 5555, per le partite di oli in imballaggi immediati il prelievo del campione si effettua conformemente all'allegato I bis del presente regolamento. Nel caso degli oli sfusi per i quali il campionamento non può essere eseguito conformemente alla norma EN ISO 5555, i campioni sono prelevati secondo le istruzioni impartite dall'autorità competente dello Stato membro.

Fatte salve le disposizioni della norma EN ISO 5555 e del capitolo 6 della norma EN ISO 661, i campioni prelevati sono messi quanto prima al riparo dalla luce e da fonti di calore elevato e sono inviati al laboratorio per le analisi entro il quinto giorno lavorativo successivo a quello del prelievo; altrimenti i campioni sono conservati in modo da evitarne il degrado o il danneggiamento durante il trasporto o lo stoccaggio in attesa di essere inviati al laboratorio.

4. Ai fini della verifica prevista al paragrafo 3, le analisi di cui agli allegati II, III, IX, XII e XX nonché, eventualmente, le controanalisi previste dalla legislazione nazionale, sono effettuate anteriormente alla data di durata minima per quanto riguarda i prodotti condizionati. In caso di campionamento di oli sfusi, tali analisi sono effettuate entro il sesto mese successivo a quello del prelievo del campione.

Per le altre analisi previste dal presente regolamento non si applica nessun termine.

Salvo se il campione sia stato prelevato meno di due mesi prima della data di durata minima, nel caso in cui i risultati delle analisi non corrispondano alle caratteristiche della categoria di olio di oliva o di olio di sansa di oliva dichiarata, l'interessato ne viene informato al più tardi un mese prima dello scadere del termine di cui al primo comma.

5. Ai fini della determinazione delle caratteristiche degli oli di oliva secondo i metodi di cui al paragrafo 1, primo comma, i risultati delle analisi sono direttamente confrontati con i limiti fissati dal presente regolamento.

▼M25

Articolo 2 bis

1. Ai fini del presente articolo, si intende per «olio d’oliva commercializzato» il quantitativo totale di olio d’oliva e di olio di sansa di uno Stato membro cheè consumato in tale Stato membro oppure esportato da tale Stato membro.

2. Gli Stati membri fanno in modo che i controlli di conformità siano effettuati selettivamente, in base ad un’analisi di rischio e con adeguata frequenza, onde garantire che l’olio d’oliva immesso in commercio corrisponda alla categoria dichiarata.

3. I criteri di valutazione del rischio possono includere:

a) la categoria dell’olio, il periodo di produzione, il prezzo degli oli rispetto a quello di altri oli vegetali, le operazioni di miscelazione e confezionamento, gli impianti e le condizioni di stoccaggio, il paese d’origine, il paese di destinazione, il mezzo di trasporto o il volume della partita;

b) la posizione degli operatori nella catena di commercializzazione, il volume e/o il valore nonché la gamma di categorie di oli che commercializzano, il tipo di attività economica svolta quali la molitura, l’immagazzinamento, la raffinazione, la miscelazione, il confezionamento e la vendita al minuto;

c) le risultanze che emergono da controlli precedenti, segnatamente per quanto riguarda il numero e il tipo di carenze accertate, la qualità abituale degli oli commercializzati e il livello di prestazione delle attrezzature tecniche adoperate;

d) l’affidabilità dei sistemi di assicurazione della qualità degli operatori o dei loro sistemi di autocontrollo rispetto alla conformità alle norme di commercializzazione;

e) il luogo in cui il controllo viene effettuato, in particolare se si tratta del primo punto di ingresso nell’Unione, dell’ultimo punto di uscita dall’Unione o del luogo in cui gli oli sono prodotti, confezionati, caricati o venduti al consumatore finale;

f) qualsiasi altra informazione da cui si possa evincere un rischio di non conformità.

4. Gli Stati membri stabiliscono in anticipo:

a) i criteri di valutazione del rischio di non conformità delle partite;

b) sulla base di un’analisi del rischio per ogni singola categoria di rischio, il numero minimo di operatori o di partite e/o di quantitativi minimi che saranno soggetti ad un controllo di conformità.

Almeno un controllo annuale di conformità è effettuato permille tonnellate di olio d’oliva commercializzato annualmente nello Statomembro.

5. Gli Stati membri verificano la conformità:

a) procedendo, in un ordine qualsiasi, alle analisi di cui all’allegato I; o

▼M32

b) nell'ordine previsto dal diagramma di flusso di cui all'allegato I ter, fino a raggiungere una delle decisioni figuranti nel suddetto diagramma.

▼M19 —————

▼M25

Articolo 3

Qualora si constati che un olio non corrisponde alla descrizione della sua categoria, lo Stato membro interessato applica sanzioni effettive, proporzionate e dissuasive stabilite in base alla gravità dell’irregolarità accertata, ferme restando altre sanzioni eventuali.

Se dai controlli emergono irregolarità sostanziali, gli Stati membri aumentano la frequenza dei controlli relativi alla fase di commercializzazione, alla categoria dell’olio, all’origine o ad altri criteri.

▼M5

Articolo 4

▼M19

1. Ai fini della valutazione e del controllo delle caratteristiche organolettiche da parte delle autorità nazionali o dei loro rappresentanti, gli Stati membri possono procedere al riconoscimento di panel di assaggiatori.

Le condizioni del riconoscimento sono stabilite dallo Stato membro in particolare in modo da:

— rispondere alle condizioni di cui all'allegato XII, punto 4,

— garantire che la formazione del capo del panel si compia presso un organismo riconosciuto e alle condizioni a tal fine stabilite dallo Stato membro,

— subordinare la validità del riconoscimento ai risultati ottenuti nell'ambito di un sistema di controllo annuale istituito dallo Stato membro.

Ogni Stato membro comunica alla Commissione l'elenco dei panel riconosciuti e le misure adottate conformemente al presente paragrafo.

▼M5

2. Lo Stato membro che incontri difficoltà per la costituzione di un comitato di assaggio sul proprio territorio può ricorrere ad un comitato di assaggio riconosciuto da un altro Stato membro.

3. Ogni Stato membro compila l'elenco dei comitati di assaggio istituiti da associazioni professionali o interprofessionali in conformità del paragrafo 1 e controlla il rispetto di dette norme.

▼M19 —————

▼B

Articolo 6

1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione dell'olio (codice NC 2306 90 11 e 2306 90 19 ) è determinato conformemente al metodo che figura nell'allegato XV.

2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del suo peso rispetto a quello della sostanza secca.

▼M20

Articolo 7

Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di contaminanti.

Per quanto riguarda il tenore di solventi alogenati, i limiti per tutte le categorie di oli di oliva sono i seguenti:

— tenore massimo di ciascun solvente alogenato rilevato: 0,1 mg/kg

— tenore massimo della somma dei solventi alogenati rilevati: 0,2 mg/kg.

▼M25

Articolo 7 bis

Le persone e i gruppi di persone fisiche o giuridiche che detengono, ai fini dell’esercizio della loro professione o a fini commerciali, olio d’oliva ed olio di sansa, dalla fase dell’estrazione al frantoio fino all’imbottigliamento incluso, hanno l’obbligo di tenere registri di entrata e di uscita per ogni categoria di questi oli.

Gli Stati membri assicurano che l’obbligo di cui al primo paragrafo sia debitamente rispettato.

▼M25

Articolo 8

1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misure adottate per l’applicazione del presente regolamento. Lo Stato membro comunica alla Commissione qualsiasi ulteriore modifica di dette misure.

2. Entro il 31 maggio di ogni anno, lo Stato membro trasmette alla Commissione una relazione sull’applicazione del presente regolamento nel corso dell’anno civile precedente. La relazione contiene almeno i risultati dei controlli di conformità effettuati sugli oli d’oliva, presentati in base ai modelli figuranti nell’allegato XXI.

3. Le notifiche di cui al presente regolamento sono effettuate a norma del regolamento (CE) n. 792/2009 della Commissione ( 1 )

▼B

Articolo 9

Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.

Articolo 10

1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo a quello della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decorrere dal ►M1 1o novembre 1992 ◄ , salvo per quanto riguarda le operazioni legate all'intervento.

▼M5

Questo metodo non si applica all'olio d'oliva vergine condizionato anteriormente al 1o novembre 1992.

▼B

2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di sansa d'oliva condizionati anteriormente all'entrata in vigore del presente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre 1992.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

▼M32









ALLEGATI

SOMMARIO

Allegato I Caratteristiche degli oli di oliva Allegato I bis Campionatura delle partite di olio di oliva o di olio di sansa di oliva consegnate in imballaggi immediati Allegato I ter Diagramma di flusso per la verifica della conformità di un campione di olio di oliva alla categoria dichiarata Allegato II Determinazione degli acidi grassi liberi, metodo a freddo Allegato III Determinazione dell'indice di perossidi Allegato IV Determinazione del contenuto di cere mediante gascromatografia con colonna capillare Allegato VII Determinazione della percentuale di 2-gliceril monopalmitato Allegato IX Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto Allegato X Determinazione degli esteri metilici degli acidi grassi mediante gascromatografia Allegato XI Determinazione del tenore dei solventi alogenati nell'olio di oliva Allegato XII Metodo del consiglio oleicolo internazionale per la valutazione organolettica degli oli di oliva vergini Allegato XV Metodo di determinazione del tenore in olio di oliva delle sanse Allegato XVI Determinazione del numero di iodio Allegato XVII Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali Allegato XVIII Determinazione della differenza tra il contenuto effettivo e il contenuto teorico di triacilgliceroli con ECN 42 Allegato XIX Determinazione della composizione e del contenuto di steroli e del contenuto di composti alcolici mediante gascromatografia con colonna capillare Allegato XX Metodo per la determinazione del contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi mediante gascromatografia con colonna capillare Allegato XXI Risultati dei controlli di conformità eseguiti sugli oli di oliva di cui al paragrafo 2 dell'articolo 8









ALLEGATO I

CARATTERISTICHE DEGLI OLI DI OLIVA

Caratteristiche di qualità







Categoria Acidità (%) (*) Indice di perossidi (mEq O2/kg) K232 K268 o K270 Delta-K Valutazione organolettica Esteri etilici di acidi grassi (mg/kg) Mediana del difetto (Md) (*) Mediana del fruttato (Mf) 1. Olio extra vergine di oliva ≤ 0,80 ≤ 20,0 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0,0 Mf > 0,0 ≤ 35 2. Olio di oliva vergine ≤ 2,0 ≤ 20,0 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0,0 — 3. Olio di oliva lampante > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Olio di oliva raffinato ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — 6. Olio di sansa di oliva greggio — — — — — — — 7. Olio di sansa di oliva raffinato ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olio di sansa di oliva ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) La mediana del difetto può essere inferiore o pari a 3,5 quando la mediana del fruttato è pari a 0,0.

Caratteristiche di purezza







Categoria Composizione in acidi grassi (1) Somma degli isomeri transoleici (%) Somma degli isomeri translinoleici + translinolenici (%) Stigmasta-dieni (mg/kg) (2) Differenza: ECN42 (HPLC) e ECN42 (calcolo teorico) 2-gliceril monopalmitato (%) Miristico (%) Linolenico (%) Arachidico (%) Eicosenoico (%) Beenico (%) Lignocerico (%) 1. Olio extra vergine di oliva ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14,00 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14,00 2. Olio di oliva vergine ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14,00 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14,00 3. Olio di oliva lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ≤ |0,30| ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14,00 ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14,00 4. Olio di oliva raffinato ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤|0,30| ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14,00 ≤ 1,1 se % acido palmitico totale > 14,00 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤ |0,30| ≤ 0,9 se % acido palmitico totale ≤ 14,00 ≤ 1,0 se % acido palmitico totale > 14,00 6. Olio di sansa di oliva greggio ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ≤ |0,60| ≤ 1,4 7. Olio di sansa di oliva raffinato ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,4 8. Olio di sansa di oliva ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,2 (1) Tenore di altri acidi grassi (%): palmitico: 7,50-20,00; palmitoleico: 0,30-3,50; eptadecanoico: ≤ 0,40; eptadecenoico: ≤ 0,60; stearico: 0,50-5,00; oleico: 55,00- 83,00; linoleico: 2,50-21,00. (2) Somma degli isomeri che potrebbero (o non potrebbero) essere separati mediante colonna capillare.







Categoria Composizione in steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiolo e uvaolo (%) (**) Cere (mg/kg) (**) Colesterolo (%) Brassicasterolo (%) Campesterolo (1) (%) Stigmasterolo (%) β–sitosterolo apparente (2) (%) Delta-7-stigmastenolo (1) (%) 1. Olio extra vergine di oliva ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Olio di oliva vergine ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Olio di oliva lampante ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) 4. Olio di oliva raffinato ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Olio di sansa di oliva greggio ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (4) 7. Olio di sansa di oliva raffinato ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Olio di sansa di oliva ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (1) Si veda l'appendice al presente allegato. (2) β-sitosterolo apparente: Delta-5,23-stigmastadienolo+clerosterolo+beta-sitosterolo+sitostanolo+delta-5-avenasterolo+delta-5,24-stigmastadienolo. (3) Gli oli con un tenore di cere compreso fra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati oli di oliva lampanti se gli alcoli alifatici totali sono inferiori o pari a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è inferiore o pari a 3,5 %. (4) Gli oli con un tenore di cere compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono superiori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è superiore a 3,5 %.

Note:

a) I risultati delle analisi devono essere espressi con un numero di decimali uguale a quello previsto per ogni caratteristica. L'ultima cifra deve essere aumentata di una unità se la cifra successiva è superiore a 4.

b) È sufficiente che una sola caratteristica non corrisponda ai valori indicati perché l'olio venga cambiato di categoria o dichiarato non conforme ai fini del presente regolamento.

c) Per l'olio di oliva lampante, entrambe le caratteristiche di qualità contrassegnate da un asterisco (*) possono simultaneamente non rispettare i valori limite stabiliti per tale categoria.

d) Le caratteristiche contrassegnate con due asterischi (**) implicano che per l'olio di sansa di oliva greggio entrambi i corrispondenti valori limite possono non essere rispettati simultaneamente. Per l'olio di sansa di oliva e l'olio di sansa di oliva raffinato, uno dei corrispondenti valori limite può non essere rispettato.









Appendice

Schema decisionale

Schema decisionale per il campesterolo nell'olio di oliva vergine e nell'olio extra vergine di oliva.

Gli altri parametri devono rispettare i limiti fissati dal presente regolamento.

Schema decisionale per il Delta-7-stigmastenolo.

— Nell'olio di oliva vergine e nell'olio extra vergine di oliva —

Gli altri parametri devono rispettare i limiti fissati dal presente regolamento.

— Negli oli di sansa di oliva (greggi e raffinati) —

Gli altri parametri devono rispettare i limiti fissati dal presente regolamento.

▼M26









ALLEGATO I bis

CAMPIONATURA DELLE PARTITE DI OLIO DI OLIVA O DI OLIO DI SANSA DI OLIVA CONSEGNATE IN IMBALLAGGI IMMEDIATI

Il presente metodo di campionatura si applica alle partite di olio di oliva o di olio di sansa di oliva condizionate in imballaggi immediati. A seconda che la capacità dell'imballaggio immediato sia o no superiore a 5 litri si applicano metodi di campionatura diversi.

Si intende per «partita» un insieme di unità di vendita prodotte, fabbricate e condizionate in circostanze tali che l'olio contenuto in ciascuna di queste unità di vendita è considerato omogeneo per tutte le caratteristiche analitiche. La partita deve essere identificata conformemente alla direttiva 2011/91/UE del Parlamento europeo e del Consiglio ( 2 ).

Si intende per «incremento» la quantità di olio contenuta in un imballaggio immediato prelevata da un punto a caso della partita.

1. CONTENUTO DEL CAMPIONE ELEMENTARE

1.1. Imballaggi immediati di capacità non superiore a 5 litri

Nel caso degli imballaggi immediati di capacità non superiore a 5 litri si intende per «campione elementare» il numero di incrementi prelevati da una partita in conformità alla tabella 1.







Tabella 1 Dimensione minima del campione elementare In caso di imballaggi immediati aventi una capacità Il campione elementare deve essere costituito dall'olio proveniente da a) superiore o uguale a 1 litro a) 1 imballaggio immediato b) inferiore a 1 litro b) dal numero minimo di imballaggi la cui capacità totale è almeno pari a 1,0 litro

Il numero di imballaggi di cui alla tabella 1, che costituiscono un campione elementare, può essere aumentato dai singoli Stati membri, secondo le rispettive esigenze (ad esempio, valutazione organolettica da parte di un laboratorio diverso da quello che ha eseguito le analisi chimiche, controanalisi ecc.).

1.2. Imballaggi immediati di capacità superiore a 5 litri

Nel caso degli imballaggi immediati di capacità superiore a 5 litri si intende per «campione elementare» una parte rappresentativa del totale degli incrementi, ottenuta mediante un processo di riduzione in conformità alla tabella 2. Il campione elementare deve essere costituito da più esemplari.

Si intende per «esemplare» di un campione elementare ciascuno degli imballaggi che costituiscono il campione elementare.







Tabella 2 Numero minimo di incrementi da selezionare Numero di imballaggi del lotto Numero minimo di incrementi da selezionare Fino a 10 1 Da …. 11 a 150 2 Da …. 151 a 500 3 Da …. 501 a 1 500 4 Da …. 1 501 a 2 500 5 > 2 500 per 1 000 imballaggi 1 incremento supplementare

Per ridurre il volume degli imballaggi immediati da sottoporre a campionamento, il contenuto degli incrementi è omogeneizzato ai fini della preparazione del campione elementare. Le porzioni dei diversi incrementi sono versate in un contenitore comune per essere omogeneizzati mediante agitazione, in modo da essere protetti al meglio dall'aria.

Il contenuto del campione elementare deve essere versato in una serie di imballaggi della capacità minima di 1,0 litro, ciascuno dei quali costituisce un esemplare del campione elementare.

Il numero di campioni elementari può essere aumentato dai singoli Stati membri, secondo le rispettive esigenze (ad esempio, valutazione organolettica da parte di un laboratorio diverso da quello che ha eseguito le analisi chimiche, controanalisi ecc.).

Ciascun imballaggio deve essere riempito in modo tale ridurre il più possibile lo strato d'aria sovrastante e quindi idoneamente chiuso e sigillato per garantire che il prodotto non possa essere manomesso.

Gli esemplari in questione devono essere etichettati per identificarli con precisione.

2. ANALISI E RISULTATI

▼M32

2.1. Ciascun campione elementare deve essere suddiviso in campioni di laboratorio, conformemente al punto 2.5 della norma EN ISO 5555, e sottoposto alle analisi nell'ordine indicato nel diagramma di flusso di cui all'allegato I ter o in qualunque altro ordine casuale.

▼M26

2.2. Qualora tutti i risultati delle analisi siano conformi alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è dichiarata conforme.

Qualora anche uno solo dei risultati non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita in questione è dichiarata non conforme.

3. VERIFICA DELLA CATEGORIA DELLA PARTITA

3.1. Per verificare la categoria della partita, l'autorità competente può aumentare il numero di campioni elementari effettuati in punti diversi della partita secondo la tabella seguente:







Tabella 3 Numero di campioni elementari determinati dalle dimensioni della partita Dimensione della partita (litri) Numero di campioni elementari Meno di 7 500 2 Da 7 500 a meno di 25 000 3 Da 25 000 a meno di 75 000 4 Da 75 000 a meno di 125 000 5 125 000 o più 6 + 1 ogni 50 000 litri supplementari

Ciascun incremento che costituisce un campione elementare deve essere prelevato da punti contigui della partita; è necessario annotare l'ubicazione di ciascun campione elementare e identificarlo inequivocabilmente.

La costituzione di ciascun campione elementare deve rispettare le procedure di cui ai punti 1.1 e 1.2.

Ciascun campione elementare è quindi sottoposto alle analisi di cui all'articolo 2, paragrafo 1.

3.2. Qualora, per almeno uno dei campioni elementari, uno dei risultati delle analisi di cui all'articolo 2, paragrafo 1, non sia conforme alle caratteristiche della categoria di olio dichiarata, l'intera partita è dichiarata non conforme.

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ALLEGATO I ter

DIAGRAMMA DI FLUSSO PER LA VERIFICA DELLA CONFORMITÀ DI UN CAMPIONE DI OLIO DI OLIVA ALLA CATEGORIA DICHIARATA

Tabella generale

Tabella 1 – Olio extra vergine di oliva – Criteri di qualità

Tabella 2 – Olio di oliva vergine – Criteri di qualità

Tabella 3 – Olio extra vergine di oliva e olio di oliva vergine – Criteri di purezza

Tabella 4 – Olio di oliva lampante – Criteri di qualità

Tabella 5 – Olio di oliva raffinato – Criteri di qualità

Tabella 6 – Olio di oliva (composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini) – Criteri di qualità

Tabella 7 – Olio di oliva raffinato e olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini – Criteri di purezza

Tabella 8 – Olio di sansa di oliva – Criteri di purezza

Tabella 9 – Olio di sansa di oliva raffinato – Criteri di qualità

Tabella 10 – Olio di sansa di oliva – Criteri di qualità

Tabella 11 – Olio di sansa di oliva raffinato e olio di sansa di oliva – Criteri di purezza

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ALLEGATO II

DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI LIBERI, METODO A FREDDO

1. OGGETTO E CAMPO D'APPLICAZIONE

Il presente metodo descrive la determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva e negli oli di sansa d'oliva. Il tenore in acidi grassi liberi viene espresso mediante l'acidità calcolata come percentuale di acido oleico.

2. PRINCIPIO

Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una soluzione di idrossido di potassio o idrossido di sodio.

3. REAGENTI

Tutti i reagenti devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua impiegata dev'essere acqua distillata o di purezza equivalente.

3.1 Etere etilico; etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 — 1 in volume. Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di idrossido di potassio (3.2) in presenza di 0,3 ml della soluzione di fenolftaleina (3.3) per 100 ml di miscela. Nota 1: l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplosivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari. Nota 2: se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una miscela di solventi costituita da etanolo e da toluene. Se necessario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.

3.2 Idrossido di potassio o idrossido di sodio, soluzione etanolica o acquosa titolata c(KOH) o [c(NaOH)] all'incirca 0,1 mol/l oppure, se necessario, c(KOH) [o c(NaOH)] 0,5 mol/l circa. Esistono in commercio soluzioni pronte per l'uso. La concentrazione esatta della soluzione di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) deve essere nota e verificata prima dell'uso. Impiegare una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve essere incolore o giallo pallida. Qualora si riscontri una separazione delle fasi utilizzando una soluzione acquosa di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio), questa dev'essere sostituita con una soluzione etanolica. Nota 3: una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) può essere preparata come segue. Portare e mantenere per un'ora all'ebollizione a ricadere 1 000 ml di etanolo o acqua con 8 g di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente. Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio). Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio (o di carbonato di sodio). La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come segue. A 1 000 ml di etanolo (o acqua) aggiungere 4 ml di butilato di alluminio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio). Questa soluzione è pronta per l'uso.

3.3 Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alcalino 6B o timolftaleina, soluzione di 20 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V). Nel caso di oli fortemente colorati, dev'essere utilizzato il blu alcalino o la timolftaleina.

4. APPARECCHIATURA

Materiale corrente da laboratorio, in particolare:

4.1 bilancia analitica;

4.2 beuta, avente una capacità di 250 ml;

4.3 buretta da 10 ml, classe A, graduata in divisioni di 0,05 ml, o buretta automatica equivalente.

5. PROCEDIMENTO

5.1 Preparazione del campione per l'analisi

Quando il campione è torbido, occorre filtrarlo.

5.2 Sostanza da analizzare

Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda dell'acidità presunta, secondo le indicazioni della seguente tabella.







Acidità prevista (acidità in acido oleico g/100 g) Massa della sostanza da analizzare (g) Precisione della pesata della sostanza da analizzare (g) da 0 a 2 10 0,02 da > 2 a 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (4.2).

5.3 Determinazione

Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (5.2) in 50-100 ml della miscela etere etilico/etanolo (3.1) precedentemente neutralizzata.

Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) di 0,1 mol/l (3.2) (cfr. nota 4) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione dell'indicatore colorato persistente per almeno 10 s).

Nota 4: se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) di 0,1 mol/l supera 10 ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l o modificare la massa della sostanza da analizzare a seconda dell'acidità libera prevista e alla tabella proposta.

Nota 5: se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (3.1) per ottenere una soluzione chiara.

Effettuare una seconda determinazione soltanto nel caso in cui il primo risultato sia superiore al limite specificato per la categoria dell'olio in questione.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

L'acidità, espressa come percentuale di acido oleico, è pari a:

dove:

V è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) usata;

c è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata di idrossido di potassio (o di idrossido di sodio) usata;

M è pari a 282 g/mol, la massa molare in g per mole di acido oleico;

m è la massa in g del campione.

L'acidità oleica è indicata come segue:

a) con due cifre decimali per i valori da 0 fino a 1 compreso;

b) con una cifra decimale per i valori da 1 fino a 100 compreso.

▼M30









ALLEGATO III

DETERMINAZIONE DELL'INDICE DI PEROSSIDI

1. Portata

Il presente allegato descrive un metodo per la determinazione dell'indice di perossidi degli oli e dei grassi di origine animale e vegetale.

2. Definizione

L'indice di perossidi è la quantità di quelle sostanze nel campione, espresso in termini di mille equivalenti di ossigeno attivo per chilogrammo che ossidano lo ioduro di potassio alle condizioni operative descritte.

3. Principio

Trattamento della porzione da sottoporre a test, in soluzione in acido acetico e cloroformio, con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio.

4. Apparecchiatura

Tutta l'apparecchiatura adoperata deve essere esente da sostanze riducenti od ossidanti.

Nota 1: non ungere le superfici smerigliate.

4.1. Ditale di vetro da 3 ml.

4.2. Palloni a collo e tappo smerigliati, aventi una capacità di circa 250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto o, di preferenza, anidride carbonica).

4.3. Buretta da 5-ml, 10-ml o da 25-ml, graduata almeno in 0,05 ml, di preferenza con aggiustamento automatico pari a zero, o equivalente buretta automatica.

4.4. Bilancia analitica.

5. Reagenti

5.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.

5.2. Acido acetico glaciale, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.

5.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati. Sciogliere circa 14 gr. di ioduro di potassio in circa 10 ml di acqua a temperatura ambiente.

5.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 mol/l (equivalente a 0,01 N) soluzione acquosa accuratamente standardizzata immediatamente prima dell'uso.

Preparare giornalmente la soluzione di tiosolfato di sodio da 0,1 mol/l da una soluzione standard di tiosolfato di sodio prima dell'uso, oppure determinare la molarità esatta. Come mostra l'esperienza, la stabilità è limitata e dipende dal valore del pH4 e dal contenuto di anidride carbonica libera. Per la soluzione adoperare soltanto acqua bollita immediatamente prima, se possibile pulita con azoto.

Per determinare l'esatta molarità della soluzione di tiosolfato di sodio si raccomanda di seguire la procedura descritta in appresso:

pesare, con l'approssimazione di 0,001 g, 0,27 g — 0,33 g di iodato di sodio (mKIO3) in un pallone tarato t (250 ml o 500 ml) e diluire fino al segno con acqua bollita di recente (V2), raffreddata fino a raggiungere la temperatura ambiente. Mediante una pipetta, trasferire 5 ml o 10 ml di tale soluzione di iodato di sodio (V1) in un matraccio di Erlenmeyer da 250 ml. Aggiungere 60 ml di acqua bollita di recente, 5 ml di acido cloridrico 4 mol/l, e 25 mg — 50 mg di ioduro di potassio oppure 0,5 ml della soluzione satura di ioduro di potassio. Titolare questa soluzione con la soluzione di tiosolfato di sodio (V3) per determinare l'esatta molarità della soluzione di tiosolfato di sodio.

Laddove:

mKIO3 è la massa dello iodato di sodio, in grammi

V1 è il volume della soluzione di iodato di sodio, in millilitri (5 ml o 10 ml)

V2 è il volume totale della soluzione di iodato di sodio, in millilitri (250 ml or 500 ml)

V3 è il volume della soluzione di tiosolfato di sodio, in millilitri

wKIO3 è la purezza dello iodato di sodio in g/100 g

MKIO3 è la massa molecolare dello iodato di sodio (214 g/mol)

T è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (mol/l).

5.5. Soluzione d'amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione da amido naturale solubile. Possono essere adoperati anche reagenti equivalenti.

6. Campione

Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati ermeticamente con tappi a smeriglio o di sughero.

7. Procedura

La prova deve essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce artificiale. Pesare in un ditale di vetro (4.1) oppure, in mancanza, in un pallone (4.2), con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:







Numero di perossidi previsto (meq) Peso della sostanza da analizzare (g) 0 — 12 5,0 — 2,0 12 — 20 2,0 — 1,2 20 — 30 1,2 — 0,8 30 — 50 0,8 — 0,5 50 — 90 0,5 — 0,3

Stappare un pallone (4.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (5.1). Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido acetico (5.2), poi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (5.3). Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto, e lasciar riposare per cinque minuti esatti al riparo dalla luce, ad una temperatura compresa fra 15 e 25 °C.

Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con la soluzione di tiosolfato di sodio 5.4) agitando energicamente, usando la soluzione di amido (5.5) come indicatore.

Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.

Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato della prova in bianco è superiore a 0,05 ml di soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (5.4), sostituire i reagenti impuri.

8. Espressione dei risultati

L'indice di perossidi (PV), espresso in Milli equivalenti di ossigeno attivo per chilogrammo, è dato dalla formula:

laddove:

V = il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio (5.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della prova in bianco.

T = la molarità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (5.4) usata, in mol/l.

m = il peso in g, della sostanza da analizzare.

Come risultato va presa la media aritmetica delle due determinazioni.

Ricondurre il risultato della determinazione al primo decimale.

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ALLEGATO IV

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di cere negli oli d’oliva. Le cere sono separate in funzione del numero di atomi di carbonio. Il metodo può essere impiegato in particolare per differenziare l’olio d’oliva di pressione da quello di estrazione (olio di sansa).

2. PRINCIPIO

La sostanza grassa, addizionata di opportuno standard interno, viene frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato; la frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità inferiore a quella dei trigliceridi) viene recuperata e quindi analizzata direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Colonna in vetro per gascromatografia con diametro interno 15,0 mm e altezza 30-40 cm, provvista di rubinetto.

3.3. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da: 3.3.1. Camera termostatica per le colonne a temperatura programmabile. 3.3.2. Iniettore a freddo per introduzione diretta in colonna. 3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore. 3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile. (Possono essere utilizzati anche sistemi informatici che consentono l’acquisizione di dati di gascromatografia mediante computer). 3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido di ripartizione, di spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm. (Si trovano in commercio due liquidi di ripartizione adatti all’uso, del tipo SE52 o SE54).

3.4. Microsiringa per introduzione diretta in colonna da 10 μl con ago cementato.

3.5. Vibratore elettrico.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Forno a muffola.

3.8. Bilancia analitica in grado di garantire una precisione di misura di + 0,1 mg.

3.9. Normale vetreria da laboratorio.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 60 e 200 μm. Il gel di silice è posto in muffola a 500 °C per almeno 4 ore. Dopo raffreddamento è addizionato del 2 % di acqua rispetto alla quantità di gel di silice prelevata. Si agita bene allo scopo di omogeneizzare la massa. Si conserva al buio per almeno 12 ore prima dell’uso.

4.2. n-esano per cromatografia.

4.3. Etere etilico per cromatografia.

4.4. n-eptano per cromatografia.

4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (v/m) in esano (standard interno). (Si può utilizzare anche palmitil palmitato o miristil stearato). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftolo).

4.6. Gas vettore: idrogeno o elio puro per gascromatografia.

4.7. Gas ausiliari: — idrogeno puro per gascromatografia, — aria pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione della colonna cromatografica

Mettere in sospensione 15 g di gel di silice (4.1) in n-esano (4.2) e introdurla in colonna (3.2). Dopo assestamento spontaneo, completare lo stesso con l’ausilio di un vibratore elettrico per rendere più omogeneo il letto cromatografico. Percolare 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze. Pesare esattamente, nella beuta da 25 ml (3.1), circa 500 mg di campione con la bilancia (3.8), addizionare l’opportuna quantità di standard interno (4.5) in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio aggiungere 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva, e da 0,25 a 0,50 mg nel caso di olio di sansa. Immettere il campione così preparato nella colonna cromatografica con l’ausilio di due porzioni da 2 ml ciascuna di n-esano (4.2).

Lasciar fluire il solvente fino a 1 mm sopra l’assorbente, quindi percolare altri 70 ml di n-esano allo scopo di eliminare gli n-alcani naturalmente presenti. Iniziare quindi l’eluizione cromatografica raccogliendo 180 ml di miscela n-esano/etere etilico in rapporto 99:1, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 secondi. L’eluizione del campione deve essere effettuata a una temperatura ambiente di 22 °C ± 4.

NB:

— La miscela n-esano/etere etilico (99:1) deve essere preparata ogni giorno.

— Per controllare visivamente la corretta eluizione delle cere, è possibile aggiungere al campione in soluzione 100 μl di sudan 1 all’1 % nella miscela di eluizione. Il colorante ha una ritenzione intermedia tra le cere e i trigliceridi, pertanto quando la colorazione raggiunge il fondo della colonna cromatografica bisogna sospendere l’eluizione, in quanto tutte le cere sono state eluite.

Essiccare la frazione così ottenuta mediante evaporatore rotante (3.6) fino ad eliminazione quasi completa del solvente. Eliminare gli ultimi 2 ml di solvente mediante un debole flusso di azoto; aggiungere quindi 2-4 ml di n-eptano.

5.2. Analisi gascromatografica

5.2.1. Operazioni preliminari

Installare la colonna nel gascromatografo (3.3), collegando il terminale di ingresso al sistema «on column» e il terminale di uscita al rivelatore. Eseguire i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.).

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Far fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna, quindi avviare il complesso gascromatografico. Riscaldare gradualmente fino a raggiungere, dopo circa 4 ore, la temperatura di 350 °C. Mantenere tale temperatura per almeno 2 ore, quindi portare il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico (3.3.4), regolazione della temperatura della camera per colonna, del rivelatore, ecc.) e registrare il segnale ad una sensibilità almeno due volte superiore a quella prevista per l’esecuzione dell’analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.

Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

5.2.2. Scelta delle condizioni operative

Le condizioni operative di massima sono le seguenti:

— temperatura della colonna: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min inizio a 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— quantità di sostanza iniettata: 1 μl della soluzione (2-4 ml) di n-eptano,

— gas vettore: elio o idrogeno alla velocità lineare ottimale per il gas prescelto (cfr. appendice),

— sensibilità strumentale: idonea a soddisfare le sottostanti condizioni.

Tali condizioni possono essere variate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da avere una separazione di tutte le cere, una risoluzione soddisfacente dei picchi (cfr. figura) e una ritenzione dello standard interno C32 di 18 ± 3 minuti. Il picco delle cere più rappresentativo deve avere un’altezza superiore al 60 % del fondo scala.

I parametri di integrazione dei picchi devono essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.

NB:Vista l’elevata temperatura finale, è ammessa una deriva positiva che non deve superare il 10 % del fondo scala.

5.3. Esecuzione dell’analisi

Prelevare 1 μl di soluzione con la microsiringa da 10 μl; estrarre lo stantuffo della siringa in modo che l’ago resti vuoto. Introdurre l’ago attraverso il dispositivo di iniezione e, dopo 1-2 secondi, iniettare rapidamente; estrarre quindi lentamente l’ago dopo circa 5 secondi.

Effettuare la registrazione fino a completa eluizione delle cere.

La linea di base deve rispondere sempre ai requisiti richiesti.

5.4. Identificazione dei picchi

L’identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e in confronto a miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni.

Nella figura è riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva vergine.

5.5. Valutazione quantitativa

Procedere al calcolo delle aree dei picchi dello standard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46 per mezzo dell’integratore.

Calcolare il contenuto di cere in ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza grassa, secondo la formula seguente:

in cui:

Ax = area del picco del singolo estere, in millimetri quadrati

As = area del picco dello standard interno, in millimetri quadrati

ms = massa di standard interno aggiunta, in milligrammi

m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DI RISULTATI

Riportare la somma dei contenuti delle singole cere da C40 a C46 in mg/kg di sostanza grassa (ppm).

NB:I componenti da quantificare si riferiscono ai picchi a numero di carbonio pari compresi tra gli esteri C40 e C46, secondo l’esempio di cromatogramma delle cere dell’olio di oliva riportato nella figura seguente. Se l’estere C46 risulta sdoppiato, si consiglia, ai fini della sua identificazione, di analizzare la frazione cerosa di un olio di sansa dove il picco C46 risulta facilmente individuabile in quanto nettamente maggioritario.

I risultati si esprimono con due cifre decimali.

Figura

Cromatogramma delle cere di un olio d’oliva ( 3 )

Legenda:

I.S. = Lauril arachidato

1. = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5. = Esteri C46

6. = Esteri steroli e alcoli triterpenici.









Appendice

Determinazione della velocità lineare del gas

Iniettare nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, da 1 a 3 μl di metano (o propano). Cronometrare il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell’iniezione al momento dell’uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in secondi.

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ALLEGATO VII

DETERMINAZIONE DELLA PERCENTUALE DI 2 GLICERIL MONOPALMITATO

1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE

Il metodo descrive il procedimento analitico per la determinazione della percentuale di acido palmitico in posizione 2 nei trigliceridi mediante valutazione del 2-gliceril monopalmitato.

Esso si applica agli oli vegetali liquidi a temperatura ambiente (20 °C).

2. PRINCIPIO

Una volta preparato, il campione di olio è sottoposto all’azione della lipasi pancreatica: un’idrolisi parziale e specifica nelle posizioni 1 e 3 della molecola di trigliceride determina la comparsa dei monogliceridi in posizione 2. La percentuale di 2-gliceril monopalmitato nella frazione monogliceridica è determinata, previa sililazione, mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA E MATERIALE

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Beakers da 100, 250 e 300 ml.

3.3. Colonna di vetro per cromatografia, con diametro interno 21-23 mm e lunghezza 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto.

3.4. Provette tarate da 10, 50, 100 e 200 ml.

3.5. Matracci da 100 e 250 ml.

3.6. Evaporatore rotante.

3.7. Provette da centrifuga a fondo conico da 10 ml con tappo smerigliato.

3.8. Centrifuga per provette da 10 e 100 ml.

3.9. Termostato in grado di mantenere una temperatura di 40 °C + 0,5 °C.

3.10. Pipette tarate da 1 e 2 ml.

3.11. Siringa ipodermica da 1 ml.

3.12. Microsiringa da 100 μl.

3.13. Imbuto da 1 000 ml.

3.14. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione «on column» a freddo per l’introduzione diretta del campione nella colonna e di stufa in grado di mantenere la temperatura desiderata con l’approssimazione di 1 °C.

3.15. Iniettore a freddo «on column» per introduzione diretta in colonna.

3.16. Rivelatore a ionizzazione di fiamma ed elettrometro.

3.17. Registratore-integratore adatto all’elettrometro, con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.18. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, ricoperta di metilpolisilossano o di fenilmetilpolisilossano al 5 %, di spessore compreso fra 0,10 e 0,30 μm, resistente a una temperatura di 370 °C.

3.19. Microsiringa da 10 μl con ago cementato lungo almeno 7,5 cm, per iniezione diretta in colonna.

4. REAGENTI

4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparato nel modo seguente: mettere il gel di silice in una capsula di porcellana, essiccare nella stufa a 160 °C per 4 ore, quindi lasciar raffreddare a temperatura ambiente in essiccatore. Aggiungere un volume d’acqua equivalente al 5 % del peso del gel di silice, procedendo come segue: in una beuta da 500 ml pesare 152 g di gel di silice e aggiungere 8 g di acqua distillata, tappare e agitare delicatamente per ottenere una ripartizione uniforme dell’acqua. Lasciare a riposo per almeno 12 ore prima dell’uso.

▼M32

4.2. n-esano (qualità per cromatografia). L'esano può essere sostituito da isoottano (2,2,4 trimetilpentano di qualità per cromatografia), a condizione che vengano raggiunti margini di precisione comparabili.

▼M21

4.3. Isopropanolo.

4.4. Isopropanolo in soluzione acquosa 1:1 (v/v).

4.5. Lipasi pancreatica avente un’attività compresa tra 2,0 e 10 unità di lipasi per mg (esistono in commercio lipasi pancreatiche con attività compresa tra 2 e 10 unità per mg di enzima).

4.6. Soluzione tampone di tris-idrossimetilamminometano: soluzione acquosa 1 M portata a pH 8 (controllare con il potenziometro) mediante aggiunta di acido cloridrico concentrato (1:1 v/v).

4.7. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa allo 0,1 % (la soluzione deve essere utilizzata entro i 15 giorni successivi alla preparazione).

4.8. Cloruro di calcio, soluzione acquosa al 22 %.

4.9. Etere etilico per cromatografia.

4.10. Solvente di sviluppo: miscela n-esano/etere etilico (87/13) (v/v).

4.11. Idrossido di sodio, soluzione al 12 % in peso.

4.12. Fenolftaleina, soluzione etanolica all’1 %.

4.13. Gas vettore: idrogeno o elio per gascromatografia.

4.14. Gas ausiliari: idrogeno (minimo 99 %), esente da umidità e sostanze organiche, e aria per gascromatografia della stessa purezza.

4.15. Reagente di silanizzazione: miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9/3/1 (v/v/v) (Esistono in commercio soluzioni pronte per l’uso. Possono essere utilizzati anche altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire con uno stesso volume di piridina anidra).

4.16. Campioni di riferimento: monogliceridi puri o miscele di monogliceridi a composizione percentuale nota, simile a quella del campione.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparazione del campione

5.1.1. Gli oli la cui acidità libera è inferiore al 3 % non devono essere neutralizzati prima della cromatografia su colonna di gel di silice. Gli oli la cui acidità libera è superiore al 3 % devono essere sottoposti a neutralizzazione secondo il procedimento descritto al punto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Versare nell’imbuto da 1 000 ml (3.13) 50 g di olio e 200 ml di n-esano. Aggiungere 100 ml di isopropanolo e una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % (4.11) corrispondente all’acidità libera dell’olio maggiorata del 5 %. Agitare energicamente per un minuto. Aggiungere 100 ml di acqua distillata, agitare nuovamente e lasciare a riposo. A decantazione avvenuta, eliminare lo strato inferiore contenente i saponi. Eliminare eventuali strati intermedi (mucillagine e sostanze insolubili). Lavare la soluzione esanica dell’olio neutralizzato con porzioni consecutive di 50-60 ml della soluzione di isopropanolo/acqua 1:1 (v/v) (4.4), fino alla scomparsa della colorazione rosea dovuta alla fenolftaleina. Eliminare la maggior parte dell’esano mediante distillazione sotto vuoto (utilizzando per esempio l’evaporatore rotante) e travasare l’olio in un matraccio da 100 ml (3.5). Essiccare l’olio sotto vuoto fino ad eliminazione completa del solvente. Ultimata questa operazione, l’acidità dell’olio deve risultare inferiore allo 0,5 %.

5.1.2. Introdurre nella beuta da 25 ml (3.1) 1,0 g di olio preparato nel modo sopra indicato e scioglierlo in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Lasciare a riposo la soluzione per almeno 15 minuti prima di procedere alla cromatografia su colonna di gel di silice. Se la soluzione è torbida, centrifugarla per garantire condizioni ottimali per la cromatografia. (Si possono utilizzare cartucce di gel di silice SPE da 500 mg pronte per l’uso).

5.1.3. Preparazione della colonna cromatografica Versare nella colonna (3.3) circa 30 ml di solvente di sviluppo (4.10); introdurre un batuffolo di cotone nella parte inferiore della colonna con l’ausilio di una bacchetta di vetro; comprimere per far uscire l’aria. Preparare in un beaker una sospensione di 25 g di gel di silice (4.1) in circa 80 ml di solvente di sviluppo e versarla nella colonna attraverso un imbuto. Verificare che tutto il gel di silice sia stato immesso nella colonna; lavare con solvente di sviluppo (4.8), aprire il rubinetto e lasciar fluire il liquido fino a circa 2 mm sopra il livello superiore del gel di silice.

5.1.4. Cromatografia su colonna Nella beuta da 25 ml (3.1.) pesare esattamente 1,0 g di campione preparato secondo il procedimento descritto al punto 5.1. Sciogliere il campione in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Versare la soluzione nella colonna cromatografica preparata nel modo indicato al punto 5.1.3. Evitare di agitare la superficie della colonna. Aprire il rubinetto e lasciar fluire la soluzione campione fino al livello del gel di silice. Sviluppare con 150 ml di solvente di sviluppo. Regolare il flusso a 2 ml/min (in modo che i 150 ml passino attraverso la colonna in 60-70 minuti circa). Recuperare l’eluato in un matraccio da 250 ml previamente tarato. Far evaporare il solvente sotto vuoto ed eliminarne le ultime tracce con una corrente di azoto. Pesare il matraccio e calcolare l’estratto raccolto. [Se si utilizzano cartucce di silice SPE pronte per l’uso, procedere come segue: introdurre 1 ml di soluzione (5.1.2) nelle cartucce previamente preparate con 3 ml di n-esano. Una volta percolata la soluzione, sviluppare con 4 ml di n-esano/etere etilico 9:1 (v/v). Recuperare l’eluato in una provetta da 10 ml e sottoporlo a evaporazione in corrente di azoto fino a essiccazione completa. Sottoporre il residuo secco all’azione della lipasi pancreatica (5.2). È essenziale che la composizione in acidi grassi sia verificata prima e dopo passaggio su cartuccia SPE].

5.2. Idrolisi con lipasi pancreatica

5.2.1. Pesare nella provetta della centrifuga 0,1 g di olio preparato nel modo descritto al punto 5.1. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone (4.6), 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (4.7) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio, agitando bene dopo ogni aggiunta. Chiudere la provetta con il tappo smerigliato e inserirla nel termostato a 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Aggiungere 20 mg di lipasi, agitare accuratamente (evitando di bagnare il tappo), mettere la provetta nel termostato per esattamente 2 minuti, quindi ritirarla, agitare vigorosamente per esattamente 1 minuto e lasciar raffreddare.

5.2.3. Aggiungere 1 ml di etere etilico, tappare e agitare vigorosamente, quindi centrifugare e travasare la soluzione in una provetta pulita e asciutta con la microsiringa.

5.3. Preparazione dei derivati silanizzati e della gascromatografia

5.3.1. Introdurre con la microsiringa 100 μl di soluzione (5.2.3) in una provetta da 10 ml a fondo conico.

5.3.2. Eliminare il solvente con una leggera corrente di azoto, aggiungere 200 μl di reagente di silanizzazione (4.15), tappare la provetta e lasciare a riposo per 20 minuti.

5.3.3. Dopo 20 minuti, aggiungere da 1 a 5 ml di n-esano (in funzione delle condizioni cromatografiche): la soluzione così ottenuta è pronta per la gascromatografia.

5.4. Gascromatografia

Le condizioni operative sono le seguenti:

— temperatura dell’iniettore (iniettore «on column») inferiore alla temperatura di ebollizione del solvente (68 °C),

— temperatura del rivelatore: 350 °C,

— temperatura della colonna: temperatura della stufa programmata a 60 °C per 1 minuto, quindi incrementata di 15 °C al minuto fino a 180 °C, poi di 5 °C al minuto fino a 340 °C e mantenuta a 340 °C per 13 minuti,

— gas vettore: idrogeno o elio regolato alla velocità lineare adeguata per ottenere la risoluzione rappresentata nella figura 1; il tempo di ritenzione del trigliceride C54 deve essere di 40 + 5 minuti (cfr. figura 2). (Le condizioni operative sopra indicate sono proposte a titolo indicativo. L’operatore provvederà ad ottimizzarle per ottenere la risoluzione desiderata. Il picco corrispondente al 2-gliceril monopalmitato deve avere un’altezza minima pari al 10 % della scala del registratore.),

— quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 μl della soluzione (5 ml) di n-esano (5.3.3).

5.4.1. Identificazione dei picchi

I singoli monogliceridi sono identificati in base ai tempi di ritenzione, in confronto a quelli ottenuti con miscele standard di monogliceridi analizzate nelle medesime condizioni.

5.4.2. Valutazione quantitativa

L’area dei picchi è calcolata mediante un integratore elettronico.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La percentuale di 2-gliceril monopalmitato è calcolata in base al rapporto tra l’area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi di tutti i monogliceridi (cfr. figura 2), applicando la seguente formula:

gliceril monopalmitato (%):

in cui:

Ax = area del picco corrispondente al gliceril monopalmitato

ΣA = somma delle aree di tutti i picchi dei monogliceridi.

Il risultato si esprime con una cifra decimale.

7. RAPPORTO DI ANALISI

Il rapporto di analisi deve recare:

— il riferimento al metodo descritto,

— ogni indicazione utile per la completa identificazione del campione,

— il risultato dell’analisi,

— ogni deviazione dal metodo indicato, sia essa dovuta ad una decisione delle parti interessate o a qualsiasi altro motivo,

— gli estremi per l’identificazione del laboratorio, la data dell’analisi e la firma dei responsabili.

Figura 1

Cromatogramma dei prodotti della reazione di silanizzazione ottenuti dall’azione della lipasi su un olio d’oliva raffinato addizionato del 20 % di olio esterificato (100 %).

Legenda: «acides gras libres» = acidi grassi liberi; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = olio d’oliva raffinato + 20 % olio esterificato; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleina; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturi

Figura 2

Cromatogramma di:

(A) olio d’oliva non esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

Cromatogramma di:

(B) olio esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Legenda: 1 = Acidi grassi liberi 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi * = 2-monopalmitina ** = Trigliceride C54

8. NOTE

PREPARAZIONE DELLA LIPASI

Esistono in commercio lipasi con attività soddisfacente. Si possono anche preparare in laboratorio con il seguente procedimento.

Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 °C. Rimuovere il grasso solido e il tessuto connettivo circostanti e triturare in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Agitare questa pasta per 4-6 ore con 2,5 l di acetone anidro e centrifugare. Estrarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela 1:1 (v/v) di acetone e di etere etilico e due volte con etere etilico.

Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero al riparo dall’umidità.

CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ LIPASICA

Preparare un’emulsione di olio d’oliva nel modo seguente:

Agitare per 10 minuti in un mescolatore una miscela di 165 ml di soluzione di gomma arabica a 100g/l, 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio d’oliva neutralizzato.

In un beaker da 50 ml versare 10 ml di questa emulsione, quindi 0,3 ml di soluzione di colato di sodio a 0,2 g/ml e 20 ml di acqua distillata.

Mettere il beaker in un termostato regolato a 37 °C; introdurre gli elettrodi del pHmetro e l’agitatore ad elica.

Mediante una buretta aggiungere goccia a goccia una soluzione di idrossido di sodio 0,1 N fino ad ottenere un pH 8,3.

Aggiungere un volume di soluzione acquosa di polvere di lipasi (0,1 g/ml di lipasi). Non appena il pHmetro indica un pH 8,3, avviare il cronometro e aggiungere goccia a goccia la soluzione di idrossido di sodio in modo da mantenere il pH a 8,3. Annotare il volume di soluzione consumato ogni minuto.

Riportare i dati in un diagramma indicando le letture di tempo nelle ascisse e i millilitri di soluzione alcalina 0,1 N consumati per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un grafico lineare.

L’attività della lipasi, misurata in unità di lipasi per mg, è data dalla formula seguente:

in cui:

A è l’attività in unità di lipasi/mg

V è il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N/min, desunto dal diagramma

N è la normalità della soluzione di idrossido di sodio

m è la massa in mg della lipasi utilizzata per la prova.

L’unità di lipasi è definita come la quantità di enzima che libera 10 microequivalenti di acido al minuto.

▼M20 —————

▼M28









ALLEGATO IX

ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL'ULTRAVIOLETTO

PREMESSA

L'analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto può fornire informazioni sulla qualità di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte da processi tecnologici. L'assorbimento alle lunghezze d'onda specificate nel metodo è dovuto alla presenza di sistemi dienici e trienici coniugati derivanti da processi di ossidazione e/o da pratiche di raffinazione. I valori di tale assorbimento sono espressi come estinzione specifica

(estinzione di una soluzione della sostanza grassa all'1 % (p/v) nel solvente prescritto, in una cuvetta di 10 mm) convenzionalmente indicata con K (detto anche «coefficiente di estinzione»).

1. OGGETTO

Il presente allegato descrive il procedimento per l'esecuzione dell'analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto dell'olio d'oliva.

2. PRINCIPIO DEL METODO

Un campione viene disciolto nel solvente stabilito e l'assorbanza della soluzione è misurata alle lunghezze d'onda prescritte, in riferimento al solvente puro.

Si determinano i valori dell'estinzione specifica alle lunghezze d'onda di 232 e 268 nm nell'isoottano o di 232 e 270 nm nel cicloesano, per una concentrazione dell'1 % p/v in una cuvetta di 10 mm.

3. APPARECCHIATURA

3.1. Spettrofotometro per misurazioni a lunghezze d'onda dell'ultravioletto (da 220 a 360 nm), con possibilità di lettura per ogni unità nanometrica. Si raccomanda l'esecuzione di controlli regolari in relazione all'accuratezza e alla riproducibilità delle scale di lunghezza d'onda e di assorbanza, nonché alla luce parassita. 3.1.1. Scala delle lunghezza d'onda: questo controllo può essere effettuato mediante materiale di riferimento costituito da un filtro di vetro ottico contenente ossido di olmio o una soluzione di ossido di olmio (sigillata o no), che presenta bande di assorbanza separate. I materiali di riferimento sono destinati alla verifica e alla taratura della scala delle lunghezze d'onda di spettrofotometri UV-visibile con ampiezza di banda spettrale nominale uguale o inferiore a 5 nm. Le misurazioni sono effettuate rispetto a una prova in bianco all'aria su un intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 640 e 240 nm, secondo le istruzioni accluse ai materiali di riferimento. Ad ogni alterazione della larghezza della fessura (slit) si esegue una correzione della linea di base con un percorso ottico libero. Le lunghezze d'onda della norma sono elencate nel certificato del materiale di riferimento. 3.1.2. Scala di assorbanza: tale controllo può essere eseguito utilizzando materiali di riferimento sigillati reperibili in commercio, costituiti da soluzioni acide di dicromato di potassio a determinate concentrazioni e con valori certificati di assorbanza a λmax (quattro soluzioni di dicromato di potassio in acido perclorico, sigillate in quattro cuvette UV in quarzo utilizzate per misurare la linearità e l'accuratezza fotometrica di riferimento nell'ultravioletto). Le soluzioni di dicromato di potassio sono misurate rispetto a una prova in bianco dell'acido utilizzato, previa correzione della linea di base, conformemente alle istruzioni accluse al materiale di riferimento. I valori di assorbanza sono elencati nel certificato del materiale di riferimento. Per verificare la risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore è inoltre possibile procedere come segue: pesare 0,2000 g di potassio cromato puro per spettrofotometria e scioglierlo in una soluzione di idrossido di potassio 0,05 N in un matraccio tarato da 1 000 ml e portare a volume. Prelevare esattamente 25 ml della soluzione ottenuta, trasferirla in un matraccio tarato da 500 ml e portare a volume con la stessa soluzione di idrossido di potassio. Misurare l'estinzione della soluzione così ottenuta a 275 nm, utilizzando come riferimento la soluzione di idrossido di potassio. L'estinzione misurata con cuvetta da 1 cm deve essere di 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuvette in quarzo rettangolari, con coperchio, adatte per misurazioni a lunghezze d'onda dell'ultravioletto (da 220 a 360 nm), con un percorso ottico di 10 mm. Riempite di acqua o con altro solvente idoneo, le cuvette non devono presentare fra loro differenze superiori a 0,01 unità di estinzione.

3.3. Matracci volumetrici tarati da 25 ml, classe A.

3.4. Bilancia analitica, idonea a fornire una lettura con l'approssimazione di 0,0001 g.

4. REAGENTI

Salvo indicazione contraria, durante l'analisi utilizzare soltanto reagenti di qualità analitica riconosciuta e acqua distillata o demineralizzata o acqua di purezza equivalente.

Solvente: Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) per misurazioni a 232 nm e 268 nm o cicloesano per misurazioni a 232 nm e 270 nm, con assorbanza inferiore a 0,12 a 232 nm e a 0,05 a 270 nm rispetto all'acqua distillata, misurata in una cuvetta di 10 mm.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Il campione deve essere perfettamente omogeneo ed esente da impurezze sospese. In caso contrario deve essere filtrato su carta alla temperatura di circa 30 °C.

5.2. Del campione così preparato si versano circa 0,25 g (con un'approssimazione di 1 mg) in un matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida. Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente con carta. NOTA: in generale, è sufficiente una massa di 0,25-0,30 g per misurare l'assorbenza di oli di oliva vergini ed extra vergini a 268 nm e 270 nm. Per misurazioni a 232 nm occorrono di norma 0,05 g di campione; in tal caso si preparano generalmente due soluzioni distinte. Per misurare l'assorbanza di oli di sansa d'oliva, oli d'oliva raffinati e oli d'oliva adulterati, che presentano un'assorbanza più elevata, è generalmente sufficiente un campione di quantità inferiore (ad esempio 0,1 g).

5.3. Se necessario, si corregge la linea di base (220-290 nm) con solvente in entrambe le cuvette di quarzo (campione e riferimento), quindi si riempie con la soluzione di prova la cuvetta di quarzo del campione e si misurano le estinzioni a 232, 268 o 270 nm rispetto al solvente utilizzato come riferimento. I valori di estinzione registrati devono essere compresi tra 0,1 e 0,8 o nell'intervallo di linearità dello spettrofotometro (che deve essere verificato). In caso contrario è necessario ripetere le misurazioni utilizzando soluzioni più concentrate o più diluite, a seconda del caso.

5.4. Dopo aver misurato l'assorbanza a 268 o 270 nm, si misura l'assorbanza a λmax, λmax + 4 e λmax – 4. Questi valori di assorbanza sono utilizzati per determinare la variazione dell'estinzione specifica (ΔΚ). NOTA: il valore di λmax è fissato a 268 nm per l'isoottano utilizzato come solvente e a 270 nm per il cicloesano.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie lunghezze d'onda calcolate come segue: in cui: Kλ = estinzione specifica alla lunghezza d'onda λ; Eλ = estinzione misurata alla lunghezza d'onda λ; c = concentrazione della soluzione in g/100 ml; s = spessore della cuvetta di quarzo in cm; il valore è espresso con due cifre decimali.

6.2. Variazione dell'estinzione specifica (ΔΚ) La variazione del valore assoluto dell'estinzione (ΔΚ) è data da: in cui Km è l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda di massimo assorbimento a 270 nm e 268 nm, a seconda del solvente utilizzato. Il valore è espresso con due cifre decimali.









ALLEGATO X

DETERMINAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA

1. OGGETTO

Il presente allegato fornisce orientamenti per la determinazione mediante gascromatografia degli acidi grassi liberi e legati nei grassi e negli oli vegetali dopo la loro conversione in esteri metilici di acidi grassi (FAME).

Gli acidi grassi legati dei triacilgliceroli (TAG) e, a seconda del metodo di esterificazione, gli acidi grassi liberi (FFA), sono convertiti in esteri metilici di acidi grassi (FAME), determinati mediante gascromatografia con colonna capillare.

Il metodo descritto nel presente allegato consente di determinare gli esteri metilici degli acidi grassi da C12 a C24, compresi quelli saturi, monoinsaturi cis e trans e polinsaturi cis e trans.

2. PRINCIPIO

La gascromatografia (GC) è utilizzata per l'analisi quantitativa dei FAME. I FAME sono preparati conformemente alla parte A. Essi sono successivamente iniettati e vaporizzati nell'iniettore. La separazione dei FAME viene eseguita su colonne analitiche di polarità e lunghezza specifiche. Un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è utilizzato per il rilevamento dei FAME. Le condizioni di analisi figurano nella parte B.

L'idrogeno o l'elio possono essere utilizzati come gas vettore (fase mobile) nella gascromatografia dei FAME con FID. L'idrogeno accelera la separazione e produce picchi più marcati. La fase stazionaria consiste in un microscopico strato di una sottile pellicola liquida su una superficie solida inerte di silice fusa.

Mentre passano attraverso la colonna capillare i composti volatili in esame interagiscono con la fase stazionaria che riveste la superficie interna della colonna. A causa di tale differenza di interazione dei diversi composti, la loro eluizione avviene in un momento diverso, detto «tempo di ritenzione» del composto per un determinato insieme di parametri analitici. La comparazione dei tempi di ritenzione serve a identificare i diversi composti.

PARTE A

PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI DA OLIO DI OLIVA E DA OLIO DI SANSA DI OLIVA

1. OGGETTO

La presente parte illustra la preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi e include metodi di preparazione degli esteri metilici di acidi grassi da oli di oliva e di oli di sansa di oliva.

2. CAMPO DI APPLICAZIONE

La preparazione degli esteri metilici di acidi grassi da oli di oliva e oli di sansa di oliva avviene mediante transesterificazione con soluzione metanolica di idrossido di potassio a temperatura ambiente. La necessità di depurare il campione prima della transesterificazione dipende dal tenore di acidi grassi liberi del campione e dal parametro analitico da determinare; il metodo può essere scelto secondo la seguente tabella:







Categoria di olio Metodo Olio di oliva vergine di acidità ≤ 2,0 %, 1. Acidi grassi 2. Acidi grassi trans 3. ΔECN 42 (dopo purificazione tramite estrazione su fase solida (SPE) con gel di silice) Olio di oliva raffinato Olio di oliva composto da oli d'oliva raffinati e da oli d'oliva vergini Olio di sansa di oliva raffinato Olio di sansa di oliva Olio di oliva vergine con acidità > 2,0 % Olio di sansa di oliva greggio 1. Acidi grassi (dopo purificazione tramite estrazione su fase solida (SPE) con gel di silice) 2. Acidi grassi trans (dopo purificazione tramite estrazione su fase solida (SPE) con gel di silice) 3. ΔECN 42 (dopo purificazione tramite estrazione su fase solida (SPE) con gel di silice)

3. METODOLOGIA

3.1. Transesterificazione in soluzione metanolica di idrossido di potassio a temperatura ambiente

3.1.1. Principio

Gli esteri metilici si formano per transesterificazione in una soluzione metanolica di idrossido di potassio come fase intermedia prima della saponificazione.

3.1.2. Reagenti

3.1.2.1. Metanolo con tenore di acqua non superiore allo 0,5 % (m/m).

3.1.2.2. Esano per cromatografia.

3.1.2.3. Eptano per cromatografia.

3.1.2.4. Etere dietilico, stabilizzato per analisi.

3.1.2.5. Acetone per cromatografia.

3.1.2.6. Solvente di eluizione per la purificazione dell'olio mediante cromatografia su colonna/estrazione su fase solida (SPE); miscela di esano/etere dietilico in proporzioni 87:13(v/v).

3.1.2.7. Idrossido di potassio, soluzione metanolica di circa 2M: sciogliere 11,2 g di idrossido di potassio in 100 ml di metanolo.

3.1.2.8. Cartucce di gel di silice, 1 g (6 ml), per l'estrazione in fase solida (SPE).

3.1.3. Apparecchiatura

3.1.3.1. Provette con tappo a vite (volume 5 ml) munito di guarnizione in PTFE.

3.1.3.2. Pipette graduate o automatiche da 2 ml e 0,2 ml.

3.1.4. Purificazione dei campioni di olio

All'occorrenza i campioni verranno purificati facendo passare l'olio su una cartuccia di gel di silice per estrazione in fase solida. Inserire una cartuccia di gel di silice (3.1.2.8) in un apparecchio di eluizione sotto vuoto e lavare con 6 ml di esano (3.1.2.2); effettuare il lavaggio senza vuoto. Quindi immettere nella colonna una soluzione d'olio (0,12 g circa) in 0,5 ml di esano (3.1.2.2). Far scendere la soluzione per eluizione con 10 ml di esano/etere dietilico (87:13 v/v) (3.1.2.6). Omogeneizzare tutti gli eluati e dividerli in due volumi simili. Fare evaporare un'aliquota fino ad essiccamento in un evaporatore rotante, a pressione ridotta e temperatura ambiente. Dissolvere il residuo in 1 ml di eptano: si ottiene una soluzione pronta per l'analisi degli acidi grassi mediante GC. Far evaporare la seconda aliquota e dissolvere il residuo in 1 ml di acetone per l'analisi dei trigliceridi mediante HPLC, se necessario.

3.1.5. Procedura

Pesare circa 0,1 g del campione di olio in una provetta da 5 ml con tappo a vite (3.1.3.1). Aggiungere 2 ml di eptano e mescolare (3.1.2.2). Aggiungere 0,2 ml di soluzione metanolica di idrossido di potassio (3.1.2.7), chiudere con il tappo munito di guarnizione in PTFE, stringere bene il tappo e agitare energicamente per 30 secondi. Lasciare depositare finché la parte superiore della soluzione diventa chiara. Far decantare lo strato superiore che contiene gli esteri metilici. La soluzione di eptano ottenuta è pronta per essere iniettata nel gascromatografo. Si consiglia di conservare la soluzione in frigorifero fino al momento dell'analisi gascromatografica. Non si consiglia di conservare la soluzione per un periodo superiore alle 12 ore.

PARTE B

ANALISI DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA

1. OGGETTO

La presente parte fornisce un orientamento generale per l'applicazione della gascromatografia con colonne capillari ai fini della determinazione della composizione qualitativa e quantitativa di una miscela di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta con il metodo specificato nella parte A.

La presente parte non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.

2. REAGENTI

2.1. Gas vettore

Gas inerte (elio o idrogeno) completamente essiccato ed avente un tenore di ossigeno inferiore a 10 mg/kg.

Nota 1: L'idrogeno può raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è pericoloso. Sono disponibili dispositivi di sicurezza.

2.2. Gas ausiliari

2.2.1. Idrogeno (purezza ≥ 99,9 %), esente da impurezze organiche.

2.2.2. Aria od ossigeno, esente da impurezze organiche.

2.2.3. Azoto (purezza > 99 %).

2.3. Standard di riferimento

Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un grasso di composizione nota, di preferenza analogo a quello della sostanza grassa da analizzare. Gli isomeri cis e trans di esteri metilici ottadecadienoici, ottadecenoici e ottadecatrienoici sono utili per l'identificazione degli isomeri trans degli acidi insaturi.

Si deve prestare attenzione a prevenire l'ossidazione degli acidi grassi polinsaturi.

3. APPARECCHIATURA

Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchiatura per gascromatografia, facendo uso di colonne capillari e di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.

3.1. Gascromatografo

Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.

3.1.1. Sistema d'iniezione

Utilizzare un sistema d'iniezione con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve essere appositamente progettato per l'utilizzo delle colonne. L'iniezione può essere del tipo split o splitless (iniezione on-column).

3.1.2. Forno

Il forno deve poter scaldare la colonna capillare ad almeno 260 °C e mantenere la temperatura desiderata con l'approssimazione di ± 0,1 °C. Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una provetta in silice fusa.

L'utilizzo di un apparecchio dotato di un programmatore di temperatura è raccomandato in tutti i casi e in particolare per gli acidi grassi con meno di 16 atomi di carbonio.

3.1.3. Colonna capillare

3.1.3.1. Tubo costituito di materiale inerte rispetto alle sostanze da analizzare (di solito vetro o silice fusa). Il diametro interno deve essere compreso tra 0,20 mm e 0,32 mm. La superficie interna deve esser sottoposta a un opportuno trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima di ricevere la pellicola della fase stazionaria. Una lunghezza di 60 m è sufficiente per gli acidi grassi e per gli isomeri cis e trans degli acidi grassi.

3.1.3.2. Fase stazionaria, polisilossano polare (cianopropilsilicone). Le colonne a fase legata (a legami reticolari) sono adeguate. Nota 2: Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'identificazione e separazione dell'acido linolenico e degli acidi a C20. Lo spessore delle pellicole deve essere sottile, ad esempio 0,1 μm-0,2 μm.

3.1.3.3. Montaggio e condizionamento della colonna Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle colonne capillari, ovvero sistemazione della colonna nel forno (supporto), scelta e collegamento dei giunti (a tenuta stagna), sistemazione delle estremità della colonna nell'iniettore e nel rivelatore (riduzione degli spazi morti). Far fluire attraverso la colonna un flusso di gas vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna di 25 m di lunghezza e di 0,3 mm di diametro interno]. Condizionare la colonna programmando la temperatura del forno a 3 °C/min dalla temperatura ambiente a una temperatura di 10 °C inferiore al limite di decomposizione della fase stazionaria. Mantenere il forno a questa temperatura per 1 h fino a stabilizzazione della linea di base. Riportarla a 180 °C in modo da lavorare in condizioni isotermiche. Nota 3: Sono disponibili in commercio adeguate colonne precondizionate.

3.1.4. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore

3.2. Siringa

La siringa deve avere una capacità massima di 10 μl ed essere graduata in divisioni di 0,1 μl.

3.3. Sistema di acquisizione dei dati

Sistema di acquisizione dei dati collegato online con i rilevatori e utilizzato con un software adeguato per l'integrazione e la normalizzazione dei picchi.

4. PROCEDURA

Le operazioni descritte dal paragrafo 4.1 al paragrafo 4.3 riguardano l'utilizzo di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.

4.1. Condizioni di prova

4.1.1. Selezione delle condizioni operative ottimali per colonne capillari

In considerazione delle caratteristiche di efficienza e di permeabilità delle colonne capillari, la separazione dei costituenti e la durata dell'analisi sono ampiamente dipendenti dal flusso del gas vettore nella colonna. Sarà pertanto necessario ottimizzare le condizioni operative adeguando questo parametro (o semplicemente la perdita di carico in testa alla colonna), a seconda che si voglia migliorare la separazione o accelerare l'analisi.

Le seguenti condizioni si sono rivelate adatte per la separazione dei FAME (da C4 a C26). Esempi di cromatogrammi figurano nell'appendice B:







Temperatura dell'iniettore: 250 °C Temperatura del rivelatore: 250 °C Temperatura del forno: da 165 °C (8 min) a 210 °C a 2 °C/min Gas vettore idrogeno: pressione in testa alla colonna: 179 kPa Flusso totale: 154,0 ml/min; Rapporto di partizione (split ratio): 1:100 Volume di iniezione: 1 μl

4.1.2. Determinazione della risoluzione (cfr. appendice A)

Calcolare la risoluzione, R, di due picchi vicini I e II, utilizzando la seguente formula:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

Oppure

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), (BP (British Pharmacopeia))

in cui:

d r(I) è la distanza di ritenzione del picco I;

d r(II) è la distanza di ritenzione del picco II;

t r(I) è il tempo di ritenzione del picco I;

t r(II) è il tempo di ritenzione del picco II;

ω(I) è la larghezza della base del picco I;

ω(II) è la larghezza della base del picco II;

ω0,5 è la larghezza del picco dello specifico composto, a metà altezza del picco;

Se ω(I) ≈ ω(II), calcolare R applicando le seguenti formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

in cui:

σ è la deviazione standard (cfr. appendice A, figura 1).

Se la distanza dr tra due picchi d r(II) – d r(I) è uguale a 4σ, il fattore di risoluzione R = 1.

Se due picchi non sono completamente separati, le tangenti ai punti di flesso dei due picchi si intersecano al punto C. Per separare completamente i due picchi, la distanza tra i due picchi deve essere pari a:

d r(II) – d r(I) = 6 σ da cui R = 1,5 (cfr. appendice A, figura 3).

5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1. Analisi qualitativa

Identificare i picchi dell'estere metilico del campione dal cromatogramma nell'appendice B, figura 1, se necessario per interpolazione, o dal raffronto con quelli delle miscele degli esteri metilici di riferimento (come indicato al punto 2.3).

5.2. Analisi quantitativa

5.2.1. Determinazione della composizione

Calcolare la frazione di massa wi dei singoli esteri metilici di acidi grassi, espressa come percentuale in massa degli esteri metilici, come segue:

5.2.2. Metodo di calcolo

5.2.2.1. Caso generale

Calcolare il contenuto di un dato componente i, espresso come percentuale in massa degli esteri metilici, determinando la percentuale rappresentata dal rapporto tra l'area del picco corrispondente e la somma delle aree di tutti i picchi, usando la formula seguente:

wi = (Ai/ΣA) × 100

in cui:

Ai è l'area del picco del singolo estere metilico di acidi grassi i;

ΣA è la somma delle aree dei picchi di tutti i singoli esteri metilici degli acidi grassi.

I risultati sono espressi con due cifre decimali.

Nota 4: Per oli e grassi, la frazione in massa degli esteri metilici di acidi grassi è pari alla frazione di massa dei triacilgliceroli in grammi per 100 g. Per i casi in cui tale ipotesi non è ammessa, cfr. 5.2.2.2.

5.2.2.2. Uso di fattori correttivi

In taluni casi, ad esempio in presenza di acidi grassi con meno di otto atomi di carbonio oppure di acidi con gruppi secondari, le aree devono essere corrette con specifici fattori di correzione (Fci). Questi fattori sono determinati per ogni singolo strumento. A tal fine vanno utilizzati materiali di riferimento appropriati con una composizione in acidi grassi certificata nel corrispondente intervallo.

Nota 5: Questi fattori correttivi non sono identici ai fattori di correzione teorici FID, riportati nell'appendice A, poiché comprendono anche le prestazioni del sistema di iniezione ecc. Tuttavia, in caso di differenze maggiori, l'intero sistema dovrebbe essere controllato per verificarne le prestazioni.

Per questa miscela di riferimento, la percentuale in massa del FAME i è data dalla formula:

wi = (mi /Σm) × 100

in cui:

m i è la massa del FAME i nella miscela di riferimento;

Σm è il totale delle masse dei vari componenti come i FAME della miscela di riferimento.

Dal cromatogramma della miscela di riferimento calcolare la percentuale in area del FAME i come segue:

wi = (Ai/ΣA) × 100

in cui:

Ai è l'area del FAME i nella miscela di riferimento;

ΣA è la somma delle aree di tutti i FAME della miscela di riferimento.

Il fattore di correzione Fc è quindi

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Per il campione, la percentuale in massa di ciascun FAME i è:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

I risultati sono espressi con due cifre decimali.

Nota 6: Il valore calcolato corrisponde alla percentuale in massa dei singoli acidi grassi calcolata come triacilgliceroli per 100 g di grassi.

5.2.2.3. Uso di uno standard interno

In alcune analisi (ad es. quando non tutti gli acidi grassi sono quantificati e quando sono presenti acidi con 4 e 6 atomi di carbonio accanto ad acidi con 16 e 18 atomi di carbonio, oppure quando è necessario determinare il quantitativo assoluto di un acido grasso in un campione) è necessario ricorrere a uno standard interno. Vengono spesso usati acidi grassi con 5, 15 o 17 atomi di carbonio. Deve essere determinato l'eventuale fattore di correzione per lo standard interno.

La percentuale in massa del componente i, espressa in esteri metilici, è data dalla formula:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

in cui:

A i è l'area del FAME i;

A IS è l'area dello standard interno;

F i è il fattore di correzione dell'acido grasso i, espressa come FAME;

F IS è il fattore di correzione dello standard interno;

m è la massa in milligrammi della quantità di sostanza prelevata per l'analisi,

m IS è la massa in milligrammi dello standard interno.

I risultati sono espressi con due cifre decimali.

6. RELAZIONE SULLA PROVA

La relazione sulla prova deve specificare i metodi usati per la preparazione degli esteri metilici e per l'analisi gascromatografica. Essa deve citare altresì tutti i dettagli operativi non specificati nel presente metodo standard oppure considerati facoltativi, nonché i particolari di qualsiasi evento che possa avere influenzato i risultati.

La relazione sulla prova deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione.

7. PRECISIONE DEL METODO

7.1. Risultati del test interlaboratorio

Maggiori dettagli di un test interlaboratorio per verificare la precisione del metodo sono stabiliti nell'allegato C della norma COI/T.20/Doc. n. 33. I valori tratti da questa prova interlaboratorio potrebbero non essere applicabili a intervalli di concentrazioni e a matrici diverse da quelle date.

7.2. Ripetibilità

La differenza assoluta tra i risultati di due prove indipendenti, eseguite dallo stesso operatore entro un breve lasso di tempo, utilizzando la stessa attrezzatura e lo stesso metodo sul medesimo materiale di prova, nello stesso laboratorio, eccede in non più del 5 % dei casi il valore di ripetibilità (r) riportato nelle tabelle 1-14 dell'allegato C della norma COI/T.20/Doc. n. 33.

7.3. Riproducibilità

La differenza assoluta tra i risultati di due prove, eseguite da diversi operatori utilizzando lo stesso metodo su materiale di prova identico in laboratori diversi con diverse attrezzature, eccede in non più del 5 % dei casi il valore di riproducibilità (R) riportato nelle tabelle 1-14 dell'allegato C della norma COI/T.20/Doc. n. 33.









Appendice A

Figura 1

Con larghezza di ω0,5 a metà altezza del triangolo (ABC) e larghezza b a metà altezza del triangolo (NPM).







Figura 2 Figura 3









Appendice B

Figura 1

Profilo gascromatografico di un olio di sansa di oliva, ottenuto con il metodo della metilazione a freddo

I picchi cromatografici corrispondono agli esteri metilici ed etilici, salvo altre indicazioni.

▼B









ALLEGATO XI

DETERMINAZIONE DEL TENORE DI SOLVENTI ALOGENATI VOLATILI NELL'OLIO DI OLIVA

1. PRINCIPIO

Analisi mediante cromatografia in fase gassosa secondo la tecnica dello spazio di testa (head space).

2. APPARECCHIATURA

2.1. Apparecchio di cromatografia in fase gassosa, munito di rivelatore a cattura di elettroni.

2.2. Apparecchiatura per spazio di testa.

2.3. Colonna per cromatografia in fase gassosa, in vetro, di 2 m di lunghezza e 2 mm di diametro, fase stazionaria. OV101 al 10 % o equivalente, impregnato su una terra di diatomee calcinata, lavata con acidi e silanizzata, di granulometria 80-100 Mesh.

2.4. Gas vettore e gas ausiliario; azoto per cromatografia in fase gassosa, idoneo alla rivelazione per cattura di elettroni.

2.5. Bottiglie in vetro da 10 a 15 ml, munite di una guarnizione in teflon e di un tappo d'alluminio provvisto di un orifizio per prelievo a mezzo siringa.

2.6. Pinze a chiusura ermetica.

2.7. Siringa per gas da 0,5 a 2 ml.

3. REATTIVI

Solventi alogenati volatili di purezza idonea all'impiego per cromatografia in fase gassosa.

4. PROCEDIMENTO

4.1. Pesare con precisione 3 g d'olio circa in una bottiglia di vetro (da non riutilizzare) e chiudere la bottiglia ermeticamente. Riporre la bottiglia in un termostato a 70 °C per un'ora. Prelevare con precisione con la siringa un volume da 0,2 a 0,5 ml dallo spazio di testa ed iniettarlo nella colonna del cromatografo in fase gassosa regolato come segue: — temperatura dell'iniettore: 150 °C — temperatura della colonna: 70-80 °C — temperatura del rivelatore: 200-250 °C Si possono usare temperature diverse purché i risultati siano equivalenti.

4.2. Soluzioni di riferimento: preparare soluzioni standard, usando olio d'oliva, raffinato senza traccia di solventi, a concentrazioni variabili tra 0,05 e 1 mg/kg ed in relazione con il tenore presunto del campione. L'eventuale diluizione deve essere fatta con pentano.

4.3. Valutazione quantitativa: fare il rapporto tra le superfici o le altezze dei picchi del campione e della soluzione standard corrispondente alla concentrazione presunta più vicina. Se lo scarto relativo supera il 10 % occorre ripetere l'analisi comparato con una nuova soluzione standard, fino a che la sua concentrazione rientri nel suddetto scarto relativo. Il tenore è determinato in base ad una media di iniezioni elementari.

4.4. Espressione dei risultati: i risultati sono espressi in mg/kg (ppm). Il limite di rivelazione del metodo è di 0,01 mg/kg.

▼M26









ALLEGATO XII

METODO DEL CONSIGLIO OLEICOLO INTERNAZIONALE PER LA VALUTAZIONE ORGANOLETTICA DEGLI OLI DI OLIVA VERGINI

▼M28

1. OGGETTO E CAMPO D'APPLICAZIONE

Il presente metodo internazionale stabilisce una procedura che consente di valutare le caratteristiche organolettiche degli oli di oliva vergini ai sensi dell'allegato VII, parte VIII, punto 1, del regolamento (UE) n. 1308/2013 del Parlamento europeo e del Consiglio ( 4 ) e di classificarli in base a tali caratteristiche. Il metodo contiene inoltre indicazioni per un'etichettatura facoltativa.

Il metodo descritto è applicabile soltanto agli oli di oliva vergini e alla loro classificazione o etichettatura in funzione dell'intensità dei difetti percepiti e del flavor fruttato, determinata da un gruppo di assaggiatori selezionati, addestrati e controllati, costituito in panel.

Le norme COI citate nel presente allegato si intendono nell'ultima versione disponibile.

▼M26

2. VOCABOLARIO GENERALE DI BASE PER L'ANALISI SENSORIALE

V. norma COI/T.20/Doc. n. 4 "Analisi sensoriale: vocabolario generale"

3. VOCABOLARIO SPECIFICO

3.1. Attributi negativi

Riscaldo/Morchia Flavor caratteristico dell'olio ottenuto a partire da olive ammassate o depositate in condizioni che hanno favorito un forte sviluppo della fermentazione anaerobica, o flavor dell'olio rimasto in contatto con fanghi di decantazione in serbatoi o vasche, che abbiano anch'essi subito processi di fermentazione anaerobica.

Muffa-umidità-terra Flavor caratteristico dell'olio ottenuto da frutti nei quali si sono sviluppati abbondanti funghi e lieviti per essere rimasti ammassati in ambienti umidi per molti giorni o dell'olio ottenuto da olive raccolte con terra o infangate e non lavate.

Avvinato-inacetito-acido-agro Flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda quello del vino o dell'aceto. Esso è dovuto essenzialmente a un processo di fermentazione aerobica delle olive o dei resti di pasta di olive in fiscoli non lavati correttamente, che porta alla formazione di acido acetico, acetato di etile ed etanolo.

Rancido Flavor degli oli che hanno subito un processo ossidativo intenso.

Olive gelate (legno umido) Flavor caratteristico dell'olio estratto da olive che hanno subito una gelata sull'albero.

▼M28

3.1.1. Altri attributi negativi







Cotto o stracotto Flavor caratteristico dell'olio dovuto a eccessivo e/o prolungato riscaldamento, che si verifica in particolare durante la termo-gramolatura, se realizzata in condizioni termiche inadeguate. Fieno — Legno Flavor caratteristico di alcuni oli provenienti da olive secche. Grossolano Sensazione orale/tattile densa e pastosa prodotta da alcuni oli vecchi. Lubrificanti Flavor dell'olio che ricorda il gasolio, il grasso o l'olio minerale. Acqua di vegetazione Flavor acquisito dall'olio a causa di un contatto prolungato con le acque di vegetazione che hanno subito un processo di fermentazione. Salamoia Flavor dell'olio estratto da olive conservate in salamoia. Metallico Flavor che ricorda il metallo. È caratteristico dell'olio mantenuto a lungo in contatto con superfici metalliche durante i procedimenti di frangitura, gramolatura, pressione o stoccaggio. Sparto Flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli di sparto nuovi. Può presentare caratteristiche diverse a seconda dello sparto utilizzato per costruire i fiscoli (sparto verde o secco). Verme Flavor dell'olio ottenuto da olive fortemente colpite da larve di mosca dell'olivo (Bactrocera oleae). Cetriolo Flavor dell'olio che ha subito un condizionamento ermetico eccessivamente prolungato, particolarmente in lattine, e che viene attribuito alla formazione di 2-6 nonadienale.

3.2. Attributi positivi







Fruttato Insieme delle sensazioni olfattive, che dipendono dalla varietà delle olive, caratteristiche dell'olio ottenuto da frutti sani e freschi, verdi o maturi, percepite per via diretta e/o retronasale. Amaro Sapore elementare caratteristico dell'olio ottenuto d