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Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni
►B REGOLAMENTO (CE)N. 86/94 DELLA COMMISSIONE
del 19 gennaio 1994
che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitosterolo e dello stigmasterolo nel
burro
(GU L 17 del 20.1.1994, pag. 7)
Modificato da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Regolamento (CE) n. 175/1999 della Commissione del 26 gennaio 1999 L20 22 27.1.1999
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REGOLAMENTO (CE)N. 86/94 DELLA COMMISSIONE
del 19 gennaio 1994
che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitoste-
rolo e dello stigmasterolo nel burro
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità europea,
vistoilregolamento(CEE)n.804/68delConsiglio,del27giugno1968,
relativoall’organizzazionecomunedeimercatinelsettoredellatteedeiprodottilattiero-caseari(
1),modificatodaultimodalregolamento(CEE)
n. 2071/92(2), in particolare l’articolo 6, paragrafo 7,
considerando che il burro può essere tracciato e che i prodotti tracciati
devono essere controllati a norma degli articoli 3 e 6 del regolamento
(CEE) n. 570/88 della Commissione(3), modificato da ultimo dal rego-
lamento (CE) n. 3049/93(4);
considerando che è di importanza fondamentale l’osservanza rigorosa
dei requisiti di tracciatura del burro per prevenire il rischio di impieghinon autorizzati del burro sovvenzionato;
considerando che, tenuto conto dell’importanza della tracciatura ai fini
del corretto funzionamento del regime in esame, è necessario fissaremetodi comuni da applicare in modo uniforme in tutta la Comunità perindividuaretuttiitracciantidaessocontemplati;checiògarantirebbeinparticolare un uguale trattamento di tutti gli operatori che si avvalgonodei suddetti regimi ed eliminerebbe eventuali disparità di concorrenzaconnesseattualmenteall’applicazionedidiversimetodidianalisinazio-nali;
considerando che il regolamento (CEE) n. 3942/92 della Commis-
sione(
5)hafissatounmetododiriferimentoperladeterminazionedello
stigmasterolo e del sitosterolo nel butteroil; che lo stesso metodo puòessere applicato in una versione leggermente modificata per la determi-nazione degli steroli usati per la tracciatura del burro;
considerando che è necessario determinare la precisione del metodo e i
limiti di tolleranza;
considerando che le misure previste dal presente regolamento sono
conformi al parere del comitato di gestione per il latt e e i prodotti
lattiero-caseari,
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1
Il metodo d’analisi di riferimento per la determinazione del tenore di
stigmasteroloodi β-sitosterolocontenutinelburro,aisensidell’articolo
6 del►M1regolamento (CE) n. 2571/97 ◄, è descritto nell’allegato.
Il burro è stato tracciato correttamente se i risultati ottenuti sono
conformi ai requisiti di cui al punto 8 dell’allegato.
Articolo 2
Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla
pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee .
Esso si applica a decorrere dal 1oaprile 1994.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e diretta-
mente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
(1) GU n. L 148 del 28. 6. 1968, pag. 13.
(2) GU n. L 215 del 30. 7. 1992, pag. 64.
(3) GU n. L 55 dell’1. 3. 1988, pag. 31.
(4) GU n. L 273 del 5. 11. 1993, pag. 7.
(5) GU n. L 399 del 31. 12. 1992, pag. 29.
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ALLEGATO
DETERMINAZIONE DEL SITOSTEROLO OPPURE DELLO STIGMA-
STEROLO NEL BURRO MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON
COLONNA CAPILLARE
1. FINALITÀ E CAMPO D’APPLICAZIONE
Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa
delsitosteroloodellostigmasterolonelburro.Ilsitosterolovieneconsi-derato come la somma del βsitosterolo e del 22-diidro- β-sitosterolo, in
quantoglialtrisitosterolivengonoconsideratiirrilevanti.Essosiapplicaai campioni ricevuti ai sensi del regolamento (CEE) n. 570/88.
2. PRINCIPIO
Il burro viene saponificato con idrossido di potassio in soluzione etano-
lica e l’insaponificabile viene estratto con etere etilico.
Gli steroli vengono trasformati in eteri trimetil-sililici ed analizzati
mediante gascromatografia su colonna capillare usando come riferi-mento uno standard interno di betulino.
3. APPRECCHIATURA
3.1. Pallone di saponificazione da 150 ml provvisto di condensatore a rica-
dere con giunti in vetro smerigliato.
3.2. Imbuti separatori da 500 ml.3.3. Palloni da 250 ml.3.4. Imbuti livellatori di pressione, da 250 ml o simili, per la raccolta
dell’etere etilico di scarto.
3.5. Colonna di vetro, da 350 mm × 20 mm, provvista di setto in vetro
sinterizzato.
3.6. Bagnomaria o cuffia riscaldante.3.7. Fiale da 2 ml.3.8. Gascromatografo idoneo ad essere usato con una colonna capillare e
provvisto di un sistema di splitting costituito da:
3.8.1. camera termostatica per colonne, capace di mantenere la temperatura
desiderata con una precisione di ± 1 °C;
3.8.2. una camera di vaporizzazione termoregolabile;
3.8.3. unrivelatoreaionizzazionedifiammaedunconvertitore-amplificatore;3.8.4. un integratore-registratore idoneo ad essere usato con il convertitore-
amplificatore (3.8.3).
3.9. Una colonna capillare in silice fusa coperta interamente di 100 %
dimetilsilossano(BP1oequivalente)conunospessoreuniformedi0,25µm;lacolonnadeveesserecapacediseparareiderivatitrimetilsililicidilanosterolo e idonea a sitosterolo; è consigliabile un BP1 avente unalunghezza di 12 m ed un diametro interno di 0,2 mm.
3.10. Microsiringa per gascromatografia, da 1 µl, provvista di ago in acciaio
temperato.
4. REAGENTI
Tuttiireagentidevonoesseredipurezzaanaliticariconosciuta.L’acqua
che viene usata deve essere acqua distillata o acqua di purezza perlo-meno equivalente.
4.1. Etanolo, avente una purezza di almeno il 95 %.4.2. Idrossidodipotassio,soluzioneal60%:sciogliere600gdiidrossidodi
potassio (purezza minima a 85 %) in acqua e portare al volume di 1 lcon acqua.
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4.3. Betulino avente una purezza di almeno il 99 %.
4.3.1. Soluzioni di standard interno. Betulino in etere etilico (4.4).
4.3.1.1. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determina-
zione del sitosterolo deve essere pari a 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determina-
zione dello stigmasterolo deve essere pari a 0,4 mg/ml.
4.4. Etere etilico, di purezza analitica (esente da perossidi o da residui).4.5. Solfato di sodio anidro, granulare, preventivamente essiccato a 102 °C
per 2 ore.
4.6. Reagente sililante, ad esemplo TRI-SIL (disponibile presso la Pierce
Chemical Co., Cat No. 49001) o equivalente. (ATTENZIONE: ilTRI-SIL è infiammabile, tossico, corrosivo e forse cancerogeno. Ilpersonale di laboratorio deve conoscere i dati di sicurezza relativi alprodotto e prendere le relative precauzioni.)
4.7. Lanosterolo.4.8. Sitosterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).
Nota 1:La purezza dei materiali standard usati per la calibratura deve
essere determinata con il metodo di normalizzazione. Supporre che tuttiglisterolipresentinelcampionesianorappresentatisulcromatogramma,chel’areatotaledeipicchirappresentiil100%deicostituentisterolicieche gli steroli diano la stessa risposta al rivelatore. La linearità delsistema deve essere convalidata alle gamme di concentrazione che inte-ressano.
4.8.1. Soluzione standard di sitosterolo: preparare una soluzione contenente,
con l’approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,5 mg/ml (W
1) di sitoste-
rolo (4.8) in etere etilico (4.4).
4.9. Stigmasterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).4.9.1. Soluzionestandarddistigmasterolo:preparareunasoluzionecontenente,
con l’approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,2 mg/ml (W
1) di stigma-
sterolo (4.9) in etere etilico (4.4).
4.10. Miscela per la prova di risoluzione: preparare una soluzione contenente
0,05 mg/ml di lanosterolo (4.7) e 0,5 mg/ml di sitosterolo (4.8) in etereetilico (4.4).
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione di soluzioni standard per cromatografia: la soluzione di
standard interno (4.3.1) dev’essere aggiunta alla appropriata soluzionestandard di sterolo, nello stesso momento in cui viene aggiunta alcampione saponificato (cfr. 5.2.2).
5.1.1. Soluzionecromatograficastandarddisitosterolo:trasferire1mldisolu-
zione standard di sitosterolo (4.8.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) edallontanare l’etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml disoluzione di standard interno (4.3.1.1) e allontanare l’etere etilico incorrente di azoto.
5.1.2. Soluzione cromatografica standard di stigmasterolo: trasferire 1 ml di
soluzione standard di stigmasterolo (4.9.1) in ciascuna delle due fiale(3.7)edeliminarel’etereetilicoincorrentediazoto.Aggiungere1mldisoluzione di standard interno (4.3.1.2) ed eliminare l’etere etilico incorrente di azoto.
5.2. Preparazione degli insaponificabili.
5.2.1. Fondereilcampionediburroadunatemperaturanonsuperiorea35 °C,
agitare vigorosamente; pesare con l’approssimazione di 1 mg, circa 1 gdi burro (W
2) in un pallone da 150 ml (3.1). Aggiungere 50 ml di
etanolo (4.1) e 10 ml di soluzione di idrossido di potassio (4.2). Appli-care il condensatore a ricadere e scaldare a circa 75 °Cper 30 minuti.
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Staccare il condensatore e raffreddare il pallone a una temperatura
prossima a quella ambiente.
5.2.2. Aggiungere 1,0 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) al pallone
se si deve determinare il sitosterolo, oppure di soluzione (4.3.1.2) se sideve determinare lo stigmasterolo. Agitare accuratamente. Trasferirequantitativamente il contenuto dei palloni in un imbuto separatore da500ml(3.2),sciacquandoilpallonealternativamentecon50mld’acquae 250 ml di etere etilico (4.4). Agitare vigorosamente l’imbuto separa-toreperdueminutielasciaresepararelefasi.Eliminarelostatoacquosoinferiore e lavare lo strato etereo agitando con 4 successive aliquoted’acqua da 100 ml ciascuna.
Nota 2:Perevitarechesiformiun’emulsione,èessenzialecheiprimi
due lavaggi con acqua vengano effettuati delicatamente (10 inversioni).Il terzo lavaggio dev’essere effettuato agitando vigorosamente per 30secondi.Sesiformaun’emulsione,essapuòesseredissoltaaggiungendo5-10 ml di etanolo. Se si aggiungere l’etanolo, è essenziale effettuaredue ulteriori lavaggi vigorosi con acqua.
5.2.3. Far passare lo strato etereo limpido, esente da sapone, attraverso una
colonna di vetro (3.5) contenente 30 g di solfato di sodio anidro (4.5).Raccogliere l’etere in un pallone di 250 ml (3.3). Aggiungere granuliregolatori d’ebollizione ed evaporare quasi completamente su bagno-mariaocuffiariscaldanteavendocuradiraccogliereisolventidiscarto.
Nota 3:Se gli estratti di campione sono portati a completo essicca-
mentoaunatemperaturatroppoelevata,sipossonoverificareperditedisterolo.
5.3. Preparazione di eteri trimetilsililici.
5.3.1. Trasferire la soluzione eterea che resta nel pallone in una fiala da 2 ml
(3.7)aiutandosiconmassimo2mldietereetilicoedeliminarel’etereincorrente di azoto. Sciacquare il pallone per due volte con 2 ml di etereetilico, trasferendo nella fiala ed eliminando ogni volta l’etere incorrente di azoto.
5.3.2. Sililare il campione aggiungendo 1 ml di TRI-SIL (4.6). Chiudere la
fialaedagitarevigorosamentefinoascioglimento.Seloscioglimentoèincompleto, scaldare a 65-70 °C. Far riposare per almeno 5 minuti
prima di iniettare nel gascromatografo. Sililare gli standard nello stessomododeicampioni.Sililarelamiscelaperlaprovadirisoluzione(4.10)nello stesso modo dei campioni.
Nota 4:La sililazione deve essere effettuata in ambiente anidro. La
sililazioneincompletadelbetulinoèindicatadaunsecondopiccovicinoa quello del betulino.
La presenza di etanolo nella fase di sililazione interferisce con la silila-
zionestessa.Ciòpuòderivaredaunrisciacquoinsufficientenellafasediestrazione. Se questo problema persiste, nella fase di estrazione si puòeffettuare un quinto lavaggio, agitando vigorosamente per 30 secondi.
5.4. Analisi gascromatografica.
5.4.1. Scelta delle condizioni operative.
Regolare il gascromatografo conformemente alle istruzioni del fabbri-
cante.
Le condizioni operative sono le seguenti:
— temperatura della colonna: 265 °C
— temperatura dell’iniettore: 280 °C
— temperatura del rivelatore: 300 °C
— flusso del gas vettore: 0,6 ml/min— pressione dell’idrogeno: 84 kPa— pressione dell’aria: 155 kPa
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— rapporto di splittagio da 10: fino a 50: 1; il rapporto di splittagio
deveessereottimizzatoconformementealleistruzionidelfabbricanteela linearità della risposta del rivelatore deve essere convalidata sullagamma di concentrazione che interessa.
Nota 5:È importante soprattutto che l’iniettore venga regolarmente
pulito.
— Quantitativo di sostanza iniettata, 1 µl di soluzione di TMSE.
Prima di dare inizio a qualsiasi analisi, verificare che il sistema sia in
equilibrio in modo da ottenere una risposta sufficientemente stabile.
Queste condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stichedellacolonnaedelgascromatografoinmododaottenerecromato-grammi che rispettino i seguenti requisiti:
— il picco del sitosterolo deve essere opportunamente separato da
quello del lanosterolo. La figura 1 mostra un tipico cromatogrammache dovrebbe essere ottenuto da una miscela sililata per la prova dirisoluzione (4.10),
— itempidiritenzionerelativideglisterolisottoindicatidevonoessere
all’incirca i seguenti:
Colesterolo: 1,0
Stigmasterolo: 1,3Sitosterolo: 1,5Betulino: 2,5,
— il tempo di ritenzione relativo al betulino deve essere di circa 24
minuti.
5.4.2. Procedimento analitico.
Iniettare1µldisoluzionestandardsilitata(stigmasteroloositosterolo)e
regolare i parametri di calibrazione dell’integratore.
Iniettareunaltroµldisoluzionestandardsilitataperdeterminareifattori
di risposta relativi al betulino.
Iniettare 1 µl di soluzione di campione sililata e misurare le aree dei
picchi.Ognicromatografiaeffettuatadeveessereprecedutaeseguitadauna iniezione di standard. A titolo indicativo, ogni cromatologia devecomprendere sei iniezioni di campione.
Nota 6:L’integrazionedelpiccodellostigmasterolodevecomprendere
le eventuali «code», come definito ai punti 1 ,2e3della figura 2 b).
L’integrazione del picco del sitosterolo deve comprendere l’area del
picco del 22-diidro- β-sitosterolo (stigmastanolo) che eluisce immediata-
mentedopoilsitosterolo(vedifigura3b)almomentodellavalutazionedel sitosterolo totale.
6. CALCOLO DEI RISULTATI
6.1. Determinare l’area dei picchi degli steroli e del betulino in entrambi gli
standard che precedono e seguono un campione e calcolare R
1:
R1=Area media del picco dello sterolo nello standard
Area media del picco del betulino nello standard
Determinare l’area del picco dello sterolo (stigmasterolo o sitosterolo) e
quello del betulino nel campione e calcolare R2:
R2=Area del picco dello sterolo nel campione
Area del picco del betulino nel campione
W1= quantità di sterolo dello standard (mg) contenuto in 1 ml di
soluzione standard (4.8.1 oppure 4.9.1)
W2= peso del campione (g) (5.2.1).
P = purezza dello sterolo standard (4.8 oppure 4.9).
Tenore di sterolo del campione (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
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7. PRECISIONE DEL METODO
7.1. Ripetibilità.
7.1.1. Stigmasterolo.
Ladifferenzatrairisultatididuedeterminazionieffettuateentrol’inter-
vallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessaapparecchiatura su un identico materiale di prova non deve superare19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterolo.
Ladifferenzatrairisultatididuedeterminazionieffettuateentrol’inter-
vallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessaapparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare23,0 mg/kg.
7.2. Riproducibilità.
7.2.1. Stigmasterolo.
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori
in diversi laboratori, usando diverse apparecchiature su un identicomateriale di prova non deve superare 31,9 mg/kg.
7.2.2. Sitosterolo.
La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori
di diversi laboratori, facendo uso di diverse apparecchiature su un iden-tico materiale di prova non deve superare l’8,7 % relativo della mediadelle determinazioni.
7.3. Fonte dei dati di precisione.
I dati di precisione sono stati determinati con un esperimento eseguito
nel 1992 e comprendente 8 laborator i e 6 campioni (3 prove in doppio
cieco) per lo stigmaterol o e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per il
sitosterolo.
8. LIMITE DI TOLLERANZA
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M1
8.1. Perverificarechel’incorporazionedeitracciantihaavutoluogocorretta-
mente, dal prodotto tracciato devono essere prelevati tre campioni.
▼B
8.2. Stigmasterolo.
8.2.1. Il tasso di incorporazione relativo allo stigmasterolo è di 150 g di
stigmasterolopuroadalmenoil95%pertonnellatadiburro,cioè142,5mg/kg oppure 170 g di stigmasterolo puro ad almeno l’85 % pertonnellata di burro cioè 144,5 mg/kg.
▼
M1
8.2.2. I risultati dell’analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati
per verificare il tasso e l’omogeneità di incorporazione del tracciante: ilrisultato più basso ottenuto dall’analisi del prodotto viene confrontatocon i sguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica peruna probabilità del 95% (CrD95)]:
— 116,0 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione per stig-
masterolo puro al 95%),
— 118,0 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione per stig-
masterolo puro all’85%),
— 81,0mg/kg(il70%deltassominimodiincorporazioneperstigma-
sterolo puro al 95%),
— 82,0mg/kg(il70%deltassominimodiincorporazioneperstigma-
sterolo puro all’85%).
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▼M1
La concentrazione di tracciante del campione che dà il risultato più
bassovieneutilizzataperinterpolazionetra116,0mg/kge81,0mg/kgorispettivamente tra 118,0 mg/kg e 82,0 mg/kg.
▼
B
8.3. Sitosterolo.
8.3.1. Iltassodiincorporazioneperilsitosteroloèdi600gdisitosterolopuro
ad almeno il 90 % per tonnellata di burro, ovvero di 540 mg/kg.
▼M1
8.3.2. I risultati dell’analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati
per verificare il tasso e l’omogeneità di incorporazione del tracciante: ilrisultato più basso ottenuto dall’analisi del prodotto viene confrontatoconiseguentilimiti[siprendeinconsiderazioneladifferenzacriticaperuna probabilità del 95% (CrD95)]:
— 486,0mg/kg(il95%deltassominimodiincorporazionepersitoste-
rolo puro al 90%),
— 358,0mg/kg(il70%deltassominimodiincorporazionepersitoste-
rolo puro al 90%).
La concentrazione di tracciante nel campione che dà il risultato più
bassovieneutilizzataperinterpolazionetra486,0mg/kge358,0mg/kg.
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