3)

È aggiunto il seguente allegato XVIII:



«ALLEGATO XVIII DETERMINAZIONE DEI TRIACILGLICEROLI CON ECN 42 (DIFFERENZE FRA I DATI HPLC E IL CONTENUTO TEORICO) 1. Campo di applicazione Determinazione della composizione dei triacilgliceroli (TAG) contenuti negli oli d'oliva, in funzione del loro numero di carbonio equivalente, per differenza fra i risultati analitici ottenuti per cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC) e il contenuto teorico, calcolato a partire dalla composizione in acidi grassi. 2. Campo di applicazione La norma è applicabile agli oli d'oliva. Il metodo è applicabile alla rivelazione della presenza di piccole quantità di oli di semi (ricchi in acido linoleico) in qualunque categoria di oli d'oliva. 3. Principio Per gli oli puri, il contenuto in triacilgliceroli con ECN 42, determinato per HPLC, corrisponde in una certa misura al contenuto teorico in triacilgliceroli con ECN 42, calcolato in base alla determinazione per GLC della composizione in acidi grassi. Una differenza superiore ai valori stabiliti nel regolamento per ciascun olio indica che l'olio contiene oli di semi. 4. Metodo Il metodo fondato sul calcolo del contenuto teorico di triacilgliceroli con ECN 42 e sulla differenza fra i dati HPLC e quelli teorici si basa essenzialmente sulla coordinazione dei dati analitici ottenuti mediante altri metodi. È possibile distinguere tre stadi: determinazione della composizione in acidi grassi per gascromatografia capillare, calcolo della composizione teorica dei triacilgliceroli con ECN 42, determinazione HPLC dei triacilgliceroli con ECN 42. 4.1. Apparecchiatura 4.1.1. Palloni a fondo arrotondato da 250 a 500 ml. 4.1.2. Beakers da 100 ml. 4.1.3. Colonna cromatografica in vetro (diametro interno: 21 mm, lunghezza 450 mm), provvista di cono normalizzato (femmina) alla sommità e di rubinetto. 4.1.4. Imbuti separatori da 250 ml con cono normalizzato (maschio) al fondo, adatto al collegamento con la sommità della colonna. 4.1.5. Bacchetta di vetro, lunghezza 600 mm. 4.1.6. Imbuto di vetro, diametro 80 mm. 4.1.7. Matracci volumetrici, 50 ml. 4.1.8. Matracci volumetrici, 20 ml. 4.1.9. Evaporatore rotativo. 4.1.10. Cromatografo in fase liquida ad alta prestazione, che permetta il controllo termostatico della temperatura della colonna. 4.1.11. Iniettore capace di erogare dosi da 10 μl. 4.1.12. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilità a fondo scala dev'essere pari almeno a 10−4 unità dell'indice di rifrazione. 4.1.13. Colonna: tubo in acciaio inossidabile della lunghezza di 250 mm e del diametro interno di 4,5 mm, riempito con particelle del diametro di 5 μm di silice contenente il 22-23 % di carbonio sotto forma di ottadecilsilano (nota 2). 4.1.14. Registratore e/o integratore. 4.2. Reattivi I reattivi debbono essere di purezza analitica. I solventi di eluizione debbono essere degassati e possono essere riciclati più volte senza effetti sulle separazioni. 4.2.1. Etere di petrolio 40-60 °C, qualità per cromatografia. 4.2.2. Etere etilico, esente da perossidi, distillato di fresco. 4.2.3. Solvente per eluizione cromatografica: miscela etere di petrolio/etere etilico 87/13 (v/v). 4.2.4. Gel di silice, 70-230, tipo Merck 7734, con un contenuto d'acqua standardizzato al 5 % (m/m). 4.2.5. Lana de vetro. 4.2.6. Acetone. 4.2.7. Acetonitrile. 4.2.8. Solvente per eluizione HPLC: acetonitrile + acetone (proporzioni da regolare in modo da ottenere la separazione desiderata: cominciare con una miscela 50:50). 4.2.9. Solvente di solubilizzazione: acetone. 4.2.10. Trigliceridi di riferimento: si possono usare i trigliceridi del commercio (tripalmitina, trioleina, ecc.), riportando su un grafico i rispettivi tempi di ritenzione in funzione del numero di carbonio equivalente, oppure utilizzare cromatogrammi di riferimento ottenuti impiegando olio di soia, miscele 30:70 olio di soia-olio di oliva e olio di oliva puro (vedi note 3 e 4 e figure 1, 2, 3, 4). 4.3. Preparazione del campione Poiché un certo numero di sostanze capaci di interferire può dar luogo a risultati falsamente positivi, il campione dev'essere sempre purificato secondo il metodo IUPAC 2.507 (determinazione delle sostanze polari negli oli ossidati). 4.3.1. Preparazione della colonna cromatografica Riempire la colonna (4.1.3) con 30 ml circa di solvente di eluizione (4.2.3), introducendo poi nella colonna un poco di lana di vetro (4.2.5), spingendola al fondo della colonna mediante la bacchetta di vetro (4.1.5). In un Beakers da 100 ml, sospendere 25 g di gel di silice (4.2.4) in 80 ml di miscela di eluizione (4.2.3), trasferendola quindi nella colonna mediante un imbuto di vetro (4.1.6). Per assicurare il completo trasferimento del gel di silice nella colonna, lavare il Beakers con la miscela di eluizione e trasferire nella colonna anche le porzioni di lavaggio. Aprire il rubinetto e lasciar eluire il solvente dalla colonna fin quando il suo livello superi di circa 1 cm quello del gel di silice. 4.3.2. Cromatografia su colonna In un matraccio tarato da 50 ml (4.1.7), pesare, con la precisione di 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g di olio previamente filtrato, omogeneizzato e se necessario disidratato. Disciogliere in 20 ml circa di solvente di eluizione (4.2.3), se necessario riscaldando leggermente per facilitare la dissoluzione. Raffreddare a temperatura ambiente e portare a volume col solvente di eluizione. Con una pipetta volumetrica, introdurre 20 ml di soluzione all'interno della colonna preparata come al punto 4.3.1, aprire il rubinetto e lasciar defluire il solvente fino al livello dello strato di gel di silice. Eluire con 150 ml di solvente di eluizione (4.2.3), regolando la velocità di passaggio del solvente a 2 ml/min. circa (per passare attraverso la colonna, 150 ml impiegheranno 60-70 minuti circa). Recuperare l'eluato in un matraccio a fondo arrotondato da 250 ml (4.1.1), precedentemente tarato in stufa e pesato con esattezza. Eliminare il solvente sotto depressione (Rotavapor) e pesare il residuo che verrà impiegato per preparare la soluzione per l'analisi HPLC e per la preparazione dell'estere metilico. Il recupero del campione dalla colonna non dovrà essere inferiore al 90 % per le categorie olio extravergine, olio vergine, olio corrente, olio raffinato e olio d'oliva, ed all'80 % per l'olio lampante e per l'olio di sansa. 4.4. Analisi HPLC 4.4.1. Preparazione dei campioni per l'analisi cromatografica Preparare una soluzione del 5 % del campione da analizzare pesando 0,5 ± 0,001 g del campione in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con il solvente di solubilizzazione (4.2.9). 4.4.2. Procedimento Montare il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (4.2.8) alla portata di 1,5 ml/min, in modo da spurgare l'intero sistema. Attendere finché la linea di base sia stabile. Iniettare 10 μl del campione preparato come indicato in 4.3. 4.4.3. Calcolo ed espressione dei risultati Impiegare il metodo di normalizzazione, vale a dire ammettere che la somma della aree dei picchi corrispondenti ai TAG da ECN 42 ad ECN 52 sia uguale al 100 %. Calcolare la percentuale relativa di ciascun trigliceride impiegando la formula: % di trigliceride = area del picco × 100/somma delle aree dei picchi. I risultati debbono essere espressi con almeno due cifre decimali. Nota 1: L'ordine di eluizione può essere determinato calcolando i numeri di carbonio equivalente, definiti spesso dalla relazione ECN = CN-2n, dove CN è il numero di carbonio ed n è il numero di doppi legami, esso può essere calcolato precisamente tenendo conto dell'origine del doppio legame. Se no, nl e nln sono i numeri di doppi legami attribuiti rispettivamente agli acidi oleico, linoleico e linolenico, il numero di carbonio equivalente può essere calcolato mediante la relazione data dalla formula: ECN = CN − dono − dlnl − dlnnln dove i coefficienti do, dl e dln possono essere calcolati mediante i trigliceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente metodo, la relazione ottenuta sarà vicina a: ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln) Nota 2:



Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333 Lichrosphere o equivalente (Merck) 100 CH18 Art 50377 Nota 3: con diversi trigliceridi di riferimento è anche possibile calcolare la risoluzione rispetto alla trioleina: α = RT' / RT trioleina impiegando il tempo corretto di ritenzione RT' = RT − RT solvente. Il grafico di log α in funzione di f (numero di doppi legami) permette di determinare i valori di ritenzione per tutti i trigliceridi degli acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento (cfr. figura 2). Nota 4: l'efficienza della colonna dovrebbe permettere una chiara separazione del picco della trilinoleina da quelle dei trigliceridi con un RT immediatamente prossimo. L'eluizione viene effettuata fino al picco corrispondente ad ECN 52. Nota 5: una misura corretta delle aree di tutti i picchi aventi interesse per la presente determinazione è assicurata quando l'altezza del secondo picco della serie ECN 50 è pari al 50 % del fondo scala di registrazione. 4.5. Calcolo della composizione in triacilgliceroli (moli %) dai dati GLC relativi agli acidi grassi 4.5.1. Determinazione della composizione in acidi grassi La composizione in acidi grassi viene determinata secondo il metodo gascromatografico CEE riportato nell'allegato X A del regolamento (CEE) n. 2568/91, mediante una colonna capillare. La preparazione degli esteri metilici viene eseguita conformemente all'allegato X B (soluzione alcolica di sodio metilato). 4.5.2. Acidi grassi per il calcolo I gliceridi sono raggruppati secondo i loro numeri di carbonio equivalente (ECN), tenendo conto delle equivalenze fra ECN ed acidi grassi riportate qui di seguito. Sono stati presi in considerazione soltanto gli acidi grassi con 16 e 18 atomi di carbonio, poiché sono i soli che abbiano importanza per l'olio d'oliva.



Acidi grassi (FA) Abbreviazione Peso molecolare (PM) ECN Acido palmitico P 256,4 16 Acido palmitoleico Po 254,4 14 Acido stearico S 284,5 18 Acido oleico O 282,5 16 Acido linoleico L 280,4 14 Acido linolenico Ln 278,4 12 4.5.3. Trasformazione dell'area % in moli per tutti gli acidi grassi

4.5.4. Riconduzione degli acidi grassi al 100 %

Il risultato esprime la percentuale di ciascun acido grasso in moli % sulla posizione complessiva (1, 2, 3) dei TAG. Si calcola quindi la somma degli acidi grassi saturi P e S (SFA) e degli acidi grassi insaturi Po, O, L e Ln (UFA):

4.5.5. Calcolo della composizione in acidi grassi nelle posizioni 2- e 1,3- dei TAG Gli acidi grassi sono distribuiti in tre gruppi, nel modo seguente: due identici per le posizioni 1- e 3-, ed uno per la posizione 2-, con coefficienti diversi per gli acidi saturi (P e S) e gli acidi insaturi (Po, O, L e Ln). 4.5.5.1. Acidi grassi saturi in posizione 2 [P(2) e S(2)]

4.5.5.2. Acidi grassi insaturi in posizione 2 [Po(2), O(2), L(2) e Ln(2)]:

4.5.5.3. Acidi grassi in posizione 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)]:

4.5.6. Calcolo dei triacilgliceroli 4.5.6.1. TAG con un solo acido grasso (AAA, in questo caso LLL, PoPoPo)



moli % AAA = moli % A1,3 * moli % A2 * moli % A1,310 000 (7) 4.5.6.2. TAG con due acidi grassi (AAB, in questo caso, PoPoL, PoLL)

4.5.6.3. TAG con tre acidi grassi diversi (ABC, in questo caso OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)

4.5.6.4. Triacilgliceroli con ECN42 I seguenti triacilgliceroli con ECN42 sono calcolati secondo le equazioni 7, 8 e 9 per ottenere l'eluizione attesa in HPLC (normalmente soltanto tre picchi). LLL PoLL e isomero di posizione LPoL OLLn e isomeri di posizione OLnL e LnOL PoPoL e isomero di posizione PoLPo PoOLn e isomeri di posizione OPoLn e OLnPo PLLn e isomeri di posizione LLnP e LnPL PoPoPo SLnLn e isomero di posizione LnSLn PPoLn e isomeri di posizione PLnPo e PoPLn I triacilgliceroli con ECN42 sono espressi dalla somma dei nove triacilgliceroli, compresi i loro isomeri di posizione. I risultati debbono essere espressi con almeno due cifre decimali. 5. Valutazione del risultato Si confrontano il contenuto teorico calcolato e il contenuto determinato per HPLC. Se la differenza fra i dati HPLC e i dati teorici è superiore ai valori indicati nel regolamento, il campione contiene olio di semi. Nota: i risultati vanno espressi con una sola cifra decimale. 6. Esempio (Il numero si riferisce alle sezioni nel testo del metodo) 4.5.1. Calcolo delle moli % di acidi grassi a partire dai dati GLC (area %) I dati che seguono sono ottenuti per la composizione in acidi grassi per GLC:



FA PM P 256,4 S 284,5 Po 254,4 O 282,5 L 280,4 Ln 278,4 area % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0 4.5.3. Trasformazione dell'area % in moli per tutti gli acidi grassi



moli P = 10256,4= 0,03900 moli PP Vedi formula (1) moli S = 3284,5= 0,01054 moli S Vedi formula (1) moli Po = 1254,4= 0,00393 moli Po Vedi formula (1) moli O = 75282,5= 0,26549 moli O Vedi formula (1) moli L = 10280,4= 0,03566 moli L Vedi formula (1) moli Ln = 1278,4= 0,003594 moli Ln Vedi formula (1)

4.5.4. Normalizzazione degli acidi grassi al 100 %



moli % P1,2,3 = 0,03900 moli P * 1000,35822 moli = 10,888 % Vedi formula (2) moli % S1,2,3 = 0,01054 moli S * 1000,35822 moli = 2,944 % Vedi formula (2) moli % Po1,2,3 = 0,00393 moli Po * 1000,35822 moli = 1,097 % Vedi formula (2) moli % O1,2,3 = 0,26549 moli O * 1000,35822 moli = 74,113 % Vedi formula (2) moli % L1,2,3 = 0,03566 moli L * 1000,35822 moli = 9,956 % Vedi formula (2) moli % Ln1,2,3 = 0,00359 moli Ln * 1000,35822 moli = 1,003 % Vedi formula (2)

Somma degli acidi grassi saturi e insaturi nella posizione 1,2,3 dei TAG:



moli % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Vedi formula (3) moli % UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Vedi formula (3) 4.5.5. Calcolo della composizione in acidi grassi nelle posizioni 2 e 1,3 dei TAG 4.5.5.1. Acidi grassi saturi in posizione 2 [P(2) e S(2)]



moli % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moli % Vedi formula (4) moli % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moli % Vedi formula (4) 4.5.5.2. Acidi grassi insaturi in posizione 1, 3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)]



moli % Po2 = 1,097 %86,169 %* 100 − − 0,659 − 0,177 = 1,263 moli % Vedi formula (5) moli % O2 = 74,113 %86,169 %* 100 − − 0,659 − 0,177 = 85,295 moli % Vedi formula (5) moli % L2 = 9,956 %86,169 %* 100 − − 0,659 − 0,177 = 11,458 moli % Vedi formula (5) moli % Ln2 = 1,003 %86,169 %* 100 − − 0,659 − 0,177 = 1,154 moli % Vedi formula (5) 4.5.5.3. Acidi grassi in posizione 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)]



moli % P1,3 = 10,888 − 0,659210,888 = 16,005 moli % Vedi formula (6) moli % S1,3 = 2,944 − 0,17722,944 = 4,327 moli % Vedi formula (6) moli % Po1,3 = 1,097 − 1,26321,097 = 1,015 % moli Vedi formula (6) moli % O1,3 = 74,113 − 85,295274,113 = 68,522 % moli Vedi formula (6) moli % L1,3 = 9,956 − 11,45829,956 = 9,205 moli % Vedi formula (6) moli % Ln1,3 = 1,003 − 1,15421,003 = 0,927 moli % Vedi formula (6) 4.5.6. Calcolo dei triacilgliceroli Dalla composizione calcolata in acidi grassi nelle posizioni sn-2 e sn-1,3 (cfr. più sopra):



FA in posiz. 1,3- posiz. 2 P 16,005 % 0,653 % S 4,327 % 0,177 % Po 1,015 % 1,263 % O 68,522 % 85,295 % L 9,205 % 11,458 % Ln 0,927 % 1,154 % Somma 100,0 % 100,0 % si calcolano i seguenti triacilgliceroli: LLL PoPoPo PoLL con 1 isomero di posizione SLnLn con 1 isomero di posizione PoPoL con 1 isomero di posizione PPoLn con 2 isomeri di posizione OLLn con 2 isomeri di posizione PLLn con 2 isomeri di posizione PoOLn con 2 isomeri di posizione 4.5.6.1. TAG con un solo acido grasso (LLL, PoPoPo) Vedi formula (7)



moli % LLL = 9,205 % * 11,458 % * 9,205 %10 000 = 0,09708 moli LLL moli % PoPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 1,015 %10 000 = 0,00013 moli PoPoPo 4.5.6.2. TAG con due acidi grassi (PoLL, SLnLn, PoPoL) Vedi formula (8)



moli % PoLL + LLPo = 1,015 % * 11,458 % * 9,205 % * 210 000 = 0,02141 moli % LPoL = 9,205 % * 1,263 % * 9,205 %10 000 = 0,01070 0,03211 moli PoLL moli % SLnLn + LnLnS = 4,327 % * 1,154 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00093 moli % LnSLn = 0,927 % * 0,177 % * 0,927 %10 000 = 0,00002 0,00095 moli SLnLn moli % PoPoL + LPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00236 moli % PoLPo = 1,015 % * 11,458 % * 1,015 %10 000 = 0,00118 0,00354 moli PoPoL 4.5.6.3. TAG con tre diversi acidi grassi (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Vedi formula (9)



moli % PPoLn = 16,005 % * 1,263 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00375 moli % LnPPo = 0,927 % * 0,653 % * 1,015 % * 210 000 = 0,00012 moli % PoLnP = 1,015 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,00375 0,00762 moli PPoLn moli % OLLn = 68,522 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,14577 moli % LnOL = 0,927 % * 85,295 % * 9,205 % * 210 000 = 0,14577 moli % LLnO = 9,205 % * 1,154 % * 68,522 % * 210 000 = 0,14577 0,43671 moli OLLn moli % PLLn = 16,005 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,03400 moli % LnPL = 0,927 % * 0,653 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00111 moli % LLnP = 9,205 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,03400 0,06911 moli PLLn moli % PoOLn = 1,015 % * 85,295 % * 0,927 % * 210 000 = 0,01605 moli % LnPoO = 0,927 % * 1,263 % * 68,522 % * 210 000 = 0,001605 moli % OLnPo = 68,522 % * 1,154 % * 1,015 % * 210 000 = 0,01605 0,04815 moli PoOLn ECN42 = 0,69540 moli TAG»