02002D0657 — IT — 10.06.2021 — 003.001

Il presente testo è un semplice strumento di documentazione e non produce alcun effetto giuridico. Le istituzioni dell’Unione non assumono alcuna responsabilità per i suoi contenuti. Le versioni facenti fede degli atti pertinenti, compresi i loro preamboli, sono quelle pubblicate nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea e disponibili in EUR-Lex. Tali testi ufficiali sono direttamente accessibili attraverso i link inseriti nel presente documento

►B DECISIONE DELLA COMMISSIONE ►C1 del 14 agosto 2002 ◄ che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati [notificata con il numero C(2002) 3044] (Testo rilevante ai fini del SEE) (2002/657/CE) (GU L 221 del 17.8.2002, pag. 8)

Modificata da:





Rettificata da:









▼B

DECISIONE DELLA COMMISSIONE

►C1 del 14 agosto 2002 ◄

che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati

[notificata con il numero C(2002) 3044]

(Testo rilevante ai fini del SEE)

(2002/657/CE)

▼M3 —————









▼B

2. CRITERI DI RENDIMENTO E ALTRE PRESCRIZIONI PER I METODI ANALITICI

È possibile utilizzare i metodi analitici o le combinazioni di metodi diversi da quelli descritti in seguito ai fini di screening o di conferma solo se è possibile provare che essi rispettano le prescrizioni pertinenti stabilite nella presente decisione.

2.1. PRESCRIZIONI GENERALI

2.1.1. Manipolazione dei campioni

I campioni sono ottenuti, manipolati e trattati in modo tale che esista la massima possibilità di rilevare la sostanza. Le procedure per la manipolazione del campione escludono la possibilità di contaminazione o perdita accidentale di analiti.

2.1.2. Esecuzione delle prove

2.1.2.1. Recupero

Se viene impiegato un fattore fisso di correzione del recupero, il recupero deve essere determinato durante l'analisi dei campioni per ciascun lotto di campioni. Se il recupero è entro i limiti potrà essere impiegato il fattore di correzione fisso; in caso contrario si impiega il fattore di recupero ottenuto per quel lotto specifico, ameno che non si debba applicare il fattore di recupero specifico dell'analita nel campione, nel qual caso è utilizzato il metodo di addizione standard (vedere 3.5) o uno standard interno per la determinazione quantitativa di un analita in un campione.

2.1.2.2. Specificità

In condizioni sperimentali un metodo è in grado di distinguere tra l'analita e le altre sostanze. Deve essere fornita una stima della misura in cui ciò è possibile. Si devono adottare strategie per superare qualsiasi interferenza prevista con altre sostanze quando si utilizza la tecnica di misurazione descritta, ad esempio, prodotti omologhi, analoghi, prodotti metabolici del residuo in questione. È di fondamentale importanza studiare l'interferenza che potrebbe scaturire da componenti della matrice.

2.2. METODI DI SCREENING

In ottemperanza alla direttiva 96/23/CE, sono utilizzate per finalità di screening solo quelle tecniche analitiche la cui validazione può essere dimostrata in modo documentato e rintracciabile e che hanno un tasso di falsi conformi inferiore al 5 % (errore β) al livello di interesse. Nel caso di un sospetto risultato non conforme, tale risultato è confermato per mezzo di un metodo di conferma

2.3. METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGANICI

I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici forniscono informazioni sulla struttura chimica dell'analita. Di conseguenza, i metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi. Tuttavia, se una singola tecnica non dispone di sufficiente specificità, laspecificità desideratadeve essere ottenutaper mezzo di procedure analitiche consistenti in combinazioni adeguate di raffinazione, separazione cromatografica e rilevazione spettrometrica.

I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per l'individuazione di residui o contaminanti organici per i gruppi di sostanze indicati:







Tabella 1 Metodi di conferma adeguati per residui o contaminanti organici Tecnicadi misurazione Sostanze allegato I 96/ 23/CE Limitazioni LC o GC con rilevazione attraverso spettrometria di massa Gruppo A e B Solo in seguito a una separazione cromatograficaon-line o off-line Solo se vengono impiegate tecniche a scansione completa o si utilizzano almeno 3 (per il gruppo B) o 4 (per il gruppo A) punti di identificazione per le tecniche che non registrano gli spettri completi della massa LC o GC con rilevazione attraverso spettrometria a infrarossi Gruppo A e B Nella spettrometria a infrarossi è necessario rispettare le prescrizioni specifiche per l'assorbimento LC a scansione totale (DAD) Gruppo B Nella spettrometria a raggi ultravioletti è necessario rispettare requisiti specifici per l'assorbimento LC-fluorescenza Gruppo B Solo per le molecole che presentano unafluorescenza nativa e le molecole che presentano fluorescenza dopo trasformazione o derivazione 2-D TLC-UV/VIS ascansione completa Gruppo B La HPTLC bidimensionale e la co-cromatografia sono obbligatorie GC con rilevamento della cattura degli elettroni Gruppo B Solo se vengono utilizzate colonne di polarità differente LC-immunogramma Gruppo B Solo se vengono impiegati almeno due sistemi cromatografici differenti oppure un secondo metodo di rilevazione indipendente LC-UV/VIS (lunghezza d'ondaunica) Gruppo B Solo se vengono impiegati almeno due sistemi cromatografici differenti oppure un secondo metodo di rilevazione indipendente

2.3.1. Criteri di rendimento comuni e prescrizioni

I metodi di confermaforniscono informazioni sullastrutturachimica dell'analita. Il metodo non è in grado di discriminare tra composti che forniscono la stessa risposta. I metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi

Ove impiegato nel metodo, all'inizio della procedura di estrazione si aggiunge all'aliquota da analizzare uno standard interno adeguato. A seconda della disponibilità, sono impiegate forme stabili dell'analita marcate con isotopi, che sono particolarmente indicate per la rilevazione con la spettrometria di massa, oppure composti correlati in modo strutturale all'analita.

Ove non sia possibile impiegare alcuno standard interno adeguato, l'identificazione dell'analita è confermata dalla co-cromatografia. In tal caso si ottiene un solo picco, dato che l'altezza (o l'area) del picco ingrandito è equivalente alla quantità di analita aggiunto. Con la gascromatografia (GC) o la cromatografia liquida (LC), la larghezza del picco a metà dell'altezza massima si trova entro il 90-110 % della larghezza originale e i tempi di ritenzione devono essere identici entro un margine del 5 %. Per i metodi basati sulla cromatografia su strato sottile (TLC) si intensifica solo il punto che si presume sia dovuto all'analita; non compare un nuovo punto e l'aspetto visivo non cambia.

Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di analita, al limite consentito o al limite di decisione, o in prossimità di tali limiti (campione di controllo non conforme), nonché i materiali di controllo conformi e i reagenti bianchi sono di preferenza utilizzati simultaneamente durante l'intera procedura con ciascun lotto di campioni da analizzare. L'ordine per l'inserimento degli estratti nello strumento di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di controllo conforme, campione/i sottoposto/i a conferma, ancora campione di controllo conforme e, da ultimo, campione di controllo non conforme. È giustificata qualsiasi variazione rispetto a tale sequenza.

2.3.2 Criteri di rendimento aggiuntivi e altre prescrizioni per i metodi di analisi quantitativi

2.3.2.1. Esattezza dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute di un materiale di riferimento certificato, gli intervalli di riferimento per la deviazione della frazione di massa media determinata per via sperimentale e corretta per il recupero dal valore certificato sono i seguenti:







Tabella 2 Esattezza minima dei metodi quantitativi Frazione di massa Intervallo ≤ 1 μg/kg da– 50 % a+ 20 % Dameno di 1 μg/kg a10 μg/kg da– 30 % a+ 10 % 10 μg/kg da– 20 % a+ 10 %

Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle misure sia valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità note dell'analita, o degli analiti, ad una matrice bianca. I dati corretti con il recupero medio sono accettabili solo se rientrano negli intervalli riportati nella tabella 2

2.3.2.2. Precisione dei metodi quantitativi

Il coefficiente di variazione (CV) inter-laboratorio per l'analisi ripetuta di un materiale di riferimento o fortificato, in condizioni di riproducibilità non supera il livello calcolato per mezzo dell'equazione di Horwitz. L'equazione è la seguente:

dove C è la frazione di massa espressa come potenza (esponente) di 10 (ad esempio, 1 mg/g = 10-3). Nella tabella 3 sono riportati degli esempi.







Tabella 3 Esempi di CV di riproducibilità per metodi quantitativi a intervalli di frazioni di massa dell'analita Frazione di massa CV di riproducibilità 1 μg/kg (*1) 10 μg/kg (*1) 100 μg/kg 23 1 000 μg/kg (1 mg/kg) 16 ( *1 ) Per frazioni di massa inferiori a 100 μg/kg l'applicazione dell'equazione di Horwitz fornisce risultati eccessivamente elevati. Pertanto i CV per concentrazioni inferiori a 100 μg/kg sono i più bassi possibile.

Per le analisi eseguite in condizioni di ripetibilità, il CV intra-laboratorio sarà compreso in genere tra la metà e i due terzi dei valori riportati in precedenza. Per le analisi eseguite in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio, il CV intra-laboratorio non supera il CV di riproducibilità.

Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito, il metodo consegue una riproducibilità intra-laboratorio non superiore al corrispondente CV di riproducibilità ad una concentrazione di 0,5 × il limite consentito.

2.3.3. Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la rilevazione per mezzo della spettrometria di massa

I metodi di spettrometria di massa possono essere presi in considerazione come metodi di conferma solo previa separazione cromatografica on-line o off-line.

2.3.3.1 Separazione cromatografica

Per le procedure GC-MS la separazione gas-cromatografica deve essere eseguita utilizzando colonne capillari. Per le procedure LC-MS la separazione cromatografica è eseguita utilizzando colonne LC adeguate. In ogni caso, il tempo di ritenzione minimo accettabile per l'analita sotto esame è pari al doppio del tempo di ritenzione corrispondente al volume vuoto dellacolonna. Il tempo di ritenzione (o tempo di ritenzione relativo) dell'analita nell'aliquota da analizzare corrisponde a quello dello standard di calibrazione entro una finestra del tempo di ritenzione specificata. La finestra del tempo di ritenzione deve essere commisurata al potere di risoluzione del sistema cromatografico. Il rapporto tra il tempo di ritenzione cromatografica dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, corrisponde a quello della soluzione di calibrazione con una tolleranzadi 0,5 % per laGC e 2,5 % per laLC.

2.3.3.2 Rilevazione con tecniche di spettrometria di massa

La rilevazione con tecniche di spettrometria di massa è eseguita utilizzando tecniche MS quale la registrazione degli spettri della massa completi (scansioni complete) oppure la SIM (Selected Ion Monitoring), nonché tecniche MS-MS quali la SRM (Selected Reaction Monitoring), o altre tecniche MS o MS-MS in combinazione con modalità di ionizzazione appropriate. Nella spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) la risoluzione (R) è in genere superiore a 10 000 per l'intero intervallo di massa al 10 % della valle.

Scansione totale: quando la determinazione con tecniche di spettrometria di massa viene eseguita registrando gli spettri a scansione totale, è obbligatoria la presenza di tutti gli ioni diagnostici misurati (lo ione molecolare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammentati caratteristici e gli ioni isotopi), con un'intensità relativa di oltre il 10 % nello spettro di riferimento dello standard di calibrazione.

SIM: quando la determinazione per mezzo della spettrometria di massa è eseguita con tecniche di frammentografia, è preferibile che lo ione molecolare sia uno degli ioni diagnostici selezionati (lo ione molecolare, addotti caratteristici dello ione molecolare, ioni frammentati caratteristici e tutti i loro ioni isotopi). Gli ioni diagnostici selezionati non devono avere origine esclusivamente dalla stessa parte della molecola. Il rapporto segnale-rumore per ciascuno ione diagnostico è ≥ 3:1.

Scansione totale e SIM: le intensità relative degli ioni rilevati, espresse come percentuale dell'intensità dello ione o della transizione più intensa, corrispondono a quelle dello standard di calibrazione, provenienti da soluzioni dello standard di calibrazione o da campioni drogati, a concentrazioni paragonabili, misurate nelle stesse condizioni, entro le seguenti tolleranze:







Tabella 4 Tolleranze massime consentite per intensità di ioni relative utilizzando una gamma di tecniche di spettrometria di massa Intensità relativa (% del picco di base) EI-GC-MS (relativa) CI-GC-MS, GC-MSn LC-MS, LC-MSn (relativa) > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 % – 50 % ± 10 % ± 25 % > 10 % – 20 % ± 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 % ± 50 %

Interpretazione dei dati della spettrometria di massa: le intensità relative degli ioni diagnostici e/o delle coppie di ioni precursore/prodotto devono essere identificate confrontando gli spettri oppure integrando i segnali delle singole tracce della massa. Ogni volta che si applica la correzione del fondo (background), questa è applicata in modo uniforme nell'intero lotto (Cfr. 2.3.1, paragrafo 4) ed è chiaramente indicata.

Scansione completa: quando si registrano spettri a scansione totale in una singola spettrometria di massa, sono presenti almeno quattro ioni con un'intensità pari o superiore al 10 % del picco di base. Se presente nello spettro di riferimento con un'intensità relativa pari o superiore al 10 %, lo ione molecolare è incluso. Almeno quattro ioni si trovano entro le tolleranze massime consentite per le intensità relative degli ioni (tabella 5). È possibile eseguire ricerche computerizzate all'interno della libreria. In tal caso, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria di massa sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione superano un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in seguito. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

SIM: quando i frammenti di massa sono misurati utilizzando tecniche diverse dalla scansione totale, per interpretare i dati sarà utilizzato un sistema di punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze elencate nel gruppo A dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE sono richiesti almeno quattro punti di identificazione. Per la conferma delle sostanze elencate nel gruppo B dell'allegato I alla direttiva 96/23/CE, sono richiesti almeno tre punti di identificazione. Nella tabella sottostante è riportato il numero di punti di identificazione che ciascuna tecnica di spettrometria di massa di base può ottenere. Tuttavia, per poter ricevere i punti di identificazione richiesti per la conferma ed il totale dei punti di identificazione da calcolare:

a) è misurato almeno un rapporto di ioni e

b) tutti i rapporti di ioni pertinenti misurati rispettano i criteri descritti in precedenza e

c) è possibile combinare un massimo di tre tecniche separate per conseguire il numero minimo di punti di identificazione.







Tabella 5 La relazione tra una gamma di classi di frammenti di massa ed i punti di identificazione ottenuti Tecnica MS Punti di identificazione ottenuti per ione Spettrometria di massa a bassa risoluzione (LR) 1,0 LR-MSn, Ione precursore 1,0 LR-MSn Prodotti di transizione 1,5 HRMS 2,0 HR-MSn Ione precursore 2,0 HR-MSn Prodotti di transizione 2,5 Note: (1) Ogni ione può essere contato una sola volta. (2) La GC-MS con impiego di ionizzazione ad impatto di elettroni è considerata una tecnica differente dalla GC-MS con impiego della ionizzazione chimica. (3) È possibile utilizzare analiti differenti per aumentare il numero di punti di identificazione solo se i derivati impiegano chimiche di reazione differenti. (4) Per le sostanze nel gruppo A dell'allegato 1 alla direttiva 96/23/CE, se si impiega nella procedura analitica una delle seguenti tecniche: la HPLC accoppiata alla DAD (Diode Array Spectrophotometry) a scansione totale; oppure la HPLC accoppiata alla rilevazione a fluorescenza; oppure la HPLC accoppiata a un immunogramma; oppure la TLC bidimensionale accoppiata alla rilevazione spettrometrica; queste tecniche posso apportare al massimo un punto di identificazione, a patto che vengano rispettati i criteri pertinenti per tali tecniche. (5) I prodotti di transizione comprendono prodotti figlia e nonna







Tabella 6 Esempi del numero di punti di identificazione ottenuti da una gamma di tecniche e per le loro combinazioni (n = un intero) Tecnica/che Numero di ioni Punti di identificazione GC-MS (EI o CI) N n GC-MS (EI e CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GC-MS (EI o CI) 2 derivati 2 (Derivato A) + 2 (Deri- vato B) 4 LC-MS N n GC-MS-MS 1 precursore e 2 figlie 4 LC-MS-MS 1 precursore e 2 figlie 4 GC-MS-MS 2 ioni precursori, ciascuno con 1 figlia 5 LC-MS-MS 2 ioni precursori, ciascuno con 1 figlia 5 LC-MS-MS-MS 1 precursore, 1 figlia e 2 nonne 5,5 HRMS N 2 n GC-MS e LC-MS 2 + 2 4 GC-MS e HRMS 2 + 1 4

2.3.4. Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la cromatografia accoppiata alla rilevazione con tecniche agli infrarossi

Picchi adeguati: i picchi adeguati sono i massimi di assorbimento di uno standard di calibrazione nello spettro dell'infrarosso che rispettano i requisiti che seguono.

2.3.4.1. Rilevazione all'infrarosso

Assorbimento massimo: avviene su un numero d'onda compreso tra 4 000 e 500 cm-1.

Intensità dell'assorbimento: non è inferiore a

(a) un'assorbanza molare specifica di 40 rispetto alla linea base del picco; oppure

(b) un'assorbanza relativa del 12,5 % dell'assorbanza del picco più intenso nell'intervallo 4 000-500 cm-1,

quando entrambe sono misurate rispetto all'assorbanza zero, e 5 % dell'assorbanza del picco più intenso nell'intervallo 4 000-500 cm-1 quando entrambe sono misurate rispetto alla linea base del picco.

Nota:

sebbene picchi adeguati in base al punto a) possano essere preferibili da un punto di vista teorico, quelli calcolati in base al punto b) risultano di più facile determinazione.

Viene determinato il numero di picchi nello spettro infrarosso dell'analita le cui frequenze corrispondono ad un picco adeguato nello spettro dello standard di calibrazione, entro un margine di ± 1 cm-1.

2.3.4.2. Interpretazione dei dati dello spettro all'infrarosso

L'assorbimento è presente in tutte le regioni dello spettro dell'analita al quale corrisponde un picco sufficiente nello spettro di riferimento dello standard di calibrazione. Sono richiesti almeno sei picchi sufficienti nello spettro infrarosso dello standard di calibrazione. Se sono presenti meno di sei picchi adeguati (7) lo spettro risultante non può essere utilizzato come spettro di riferimento. Il «punteggio», vale a dire la percentuale di picchi sufficienti trovati nello spettro infrarosso dell'analita, deve essere almeno 50. Quando non esiste una corrispondenza precisa per un picco sufficiente, la regione pertinente dello spettro dell'analita è coerente con la presenza di un picco corrispondente. La procedura si applica solo ai picchi di assorbimento nello stesso spettro del campione con un intensità almeno tripla rispetto al rumore tra un picco ed il successivo.

2.3.5. Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di un analita utilizzando la LC con altre tecniche di rilevazione

2.3.5.1. Separazione cromatografica

Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno standard interno. È preferibilmente uno standard correlato con un tempo di ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al tempo di ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente alle stesse condizioni sperimentali. Il tempo di ritenzione minimo accettabile per un analita è pari a due volte il tempo di ritenzione corrispondente al volume vuoto della colonna. Il rapporto tra il tempo di ritenzione dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, è identico a quello dello standard di calibrazione nella matrice appropriata, con un margine di ± 2,5 %.

2.3.5.2. Rilevazione UV/VIS a scansione totale

Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.

I massimi di assorbimento nello spettro dell'analita avvengono alle stesse lunghezze d'onda di quelli dello standard di calibrazione entro un margine determinato dalla risoluzione del sistema di rilevazione. Per la rilevazione a schiera di diodi (diode array) tale margine è in genere di ± 2 nm. Al di sopra dei 220 nm lo spettro dell'analita non è visivamente differente dallo spettro dello standard di calibrazione per le parti dei due spettri aventi un'assorbanza relativa pari o superiore al 10 %. Tale criterio è rispettato, in primo luogo, quando sono presenti gli stessi massimi e, in secondo luogo, quando la differenza osservata tra i due spettri non è superiore, in alcun punto, al 10 % dell'assorbanza dello standard di calibrazione. Nel caso di ricerche computerizzate all'interno della libreria, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione supera un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in precedenza. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

2.3.5.3. Criteri di rendimento per la rilevazione fluorimetrica

Devono essere rispettati i criteri di rendimento per i metodi LC.

Ciò si applica alle molecole che presentano una fluorescenza nativa e alle molecole che presentano fluorescenza dopo trasformazione o derivazione. La scelta delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione combinate alle condizioni cromatografiche è compiuta in modo tale da ridurre al minimo l'insorgenza di componenti interferenti negli estratti dei campioni bianchi.

Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.

2.3.5.4. Criteri di rendimento per la determinazione di un analita per mezzo di un immunogramma LC

Un immunogramma LC non può essere utilizzato autonomamente come metodo di conferma.

Devono essere rispettati i criteri pertinenti per i metodi LC.

I parametri predefiniti per il controllo della qualità, vale a dire il legame non specifico, il legame relativo dei campioni di controllo, il valore di assorbanza del bianco, devono ricadere entro i limiti ottenuti durante la validazione del campione da analizzare.

L'immunogramma deve essere costituito da almeno cinque frazioni.

Ciascuna frazione è inferiore alla metà della larghezza del picco.

La frazione con il massimo contenuto di analita deve essere identica a quella per il campione sospetto, il campione di controllo non conforme e lo standard.

2.3.5.5. Determinazione di un analita utilizzando la LC con rilevazione UV/VIS (lunghezza d'onda singola)

La LC con rilevazione UV/VIS (lunghezza d'onda singola) non è adeguata per essere impiegata autonomamente come metodo di conferma.

Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita.

2.3.6. Criteri di rendimento e altre prescrizioni per la determinazione di un analita per mezzo della TLC bidimensionale accoppiata alla rilevazione UV/VIS spettrometrica a scansione completa

La HPTLC bidimensionale e la co-cromatografia sono obbligatorie

I valori RF dell'analita corrispondono ai valori RF degli standard entro una tolleranza di ±5 %.

L'aspetto visivo dell'analita è indistinguibile da quello dello standard.

Per punti dello stesso colore, il centro del punto più vicino è separato dal centro del punto dell'analita di almeno la metà della somma del diametro dei punti.

Lo spettro dell'analita non è visivamente differente dallo spettro dello standard, come descritto per la rilevazione UV/VIS a scansione completa.

Nel caso di ricerche computerizzate all'interno della libreria, il raffronto dei dati provenienti dalla spettrometria sui campioni da analizzare con quelli sulla soluzione di calibrazione supera un fattore di corrispondenza critico. Per ogni analita tale fattore sarà determinato nel corso del processo di validazione sulla base degli spettri per i quali sono rispettati i criteri descritti in precedenza. È controllata la variabilità nello spettro provocata dalla matrice semplice e dal rendimento dello strumento di rilevazione.

2.3.7. Criteri di rendimento e prescrizioni per la determinazione di un analita per mezzo della GC in combinazione con l'ECD (electron capture detection, rilevazione con cattura degli elettroni)

Se è disponibile un materiale adeguato a tale fine si utilizza uno standard interno. Questo è preferibilmente una sostanza correlata con un tempo di ritenzione prossimo a quello dell'analita. L'analita eluisce al tempo di ritenzione tipico per lo standard di calibrazione corrispondente alle stesse condizioni sperimentali. Il rapporto tra il tempo di ritenzione dell'analita e quello dello standard interno, vale a dire il tempo di ritenzione relativo dell'analita, è identico a quello dello standard di calibrazione nella matrice appropriata, con un margine dello 0,5 %. Il picco massimo più vicino nel cromatogramma è separato dal picco dell'analita designato di almeno una larghezza di picco completa al 10 % dell'altezza massima del picco dell'analita. Per ottenere ulteriori informazioni si potrà ricorrere alla co-cromatografia.

2.4. METODI DI CONFERMA PER GLI ELEMENTI

Le analisi di conferma per gli elementi chimici si basano sul concetto di identificazione inequivocabile e quantificazione accurata e precisa per mezzo delle proprietà fisico-chimiche uniche dell'elemento chimico studiato (ad esempio, lunghezza d'onda della radiazione emessa o assorbita caratteristica dell'elemento, massa atomica) al livello d'interesse.

I metodi o le combinazioni di metodi che seguono sono considerati adeguati per l'identificazione degli elementi chimici:







Tabella 7 Metodi di conferma adeguati per gli elementi chimici Tecnica Parametro misurato Voltammetria di ridissoluzione anodica differenziale ad impulsi Segnale elettrico Spettrometria dell'assorbimento atomico Fiamma Lunghezza d'onda di assorbimento Generazione di idruri Lunghezza d'onda di assorbimento Vapore freddo Lunghezza d'onda di assorbimento Atomizzazione elettrotermica (fornace di grafite) Lunghezza d'onda di assorbimento Atomic Emission Spectrometry, spettrometria di emissione atomica Plasma induttivo Lunghezza d'onda di emissione Spettrometria di massa vPlasma induttivo Rapporto massa-carica

2.4.1. Criteri di rendimento comuni e altre prescrizioni per i metodi di conferma

Il materiale di riferimento o fortificato contenente quantità note di analita, al limite massimo consentito o al limite di decisione (campione di controllo non conforme), nonché i materiali di controllo conformi e i reagenti bianchi devono di preferenza essere utilizzati simultaneamente durante l'intera procedura con ciascun lotto di campioni da analizzare. L'ordine raccomandato per l'inserimento degli estratti nello strumento di analisi è il seguente: reagente bianco, campione di controllo conforme, campione/i da confermare, campione di controllo conforme e, da ultimo, campione di controllo non conforme. Viene giustificato qualsiasi scostamento.

In genere la maggior parte delle tecniche di analisi richiede la completa digestione della matrice organica per ottenere soluzioni prima della determinazione dell'analita. Ciò può essere ottenuto utilizzando procedure di mineralizzazione a microonde che riducono al minimo il rischio di perdita e/o contaminazione degli analiti da analizzare. Sono utilizzati contenitori in Teflon decontaminati di buona qualità. Se si ricorre ad altri metodi di digestione a secco o con presenza di liquido, sono disponibili prove documentate che escludano potenziali fenomeni di perdita o di contaminazione. In talune circostanze, quale alternativa alla digestione, per separare gli analiti dai componenti della matrice e/o concentrare gli analiti al fine di introdurre i campioni nello strumento di analisi si potranno scegliere procedure di separazione (ad esempio, estrazione).

Per quanto riguarda la calibrazione, sia esterna che basata sul metodo di aggiunta dello standard, si presta attenzione a non superare l'intervallo di lavoro definito per l'analisi. Nel caso di calibrazione esterna, gli standard calibranti devono obbligatoriamente essere preparati in una soluzione che corrisponda il più possibile alla composizione della soluzione campione. Si applica inoltre la correzione del fondo se richiesto dalla circostanza analitica specifica.

2.4.2. Criteri di rendimento aggiuntivi e altre prescrizioni per i metodi di analisi quantitativi

2.4.2.1. Esattezza dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute degli elementi di un materiale di riferimento certificato, la deviazione del contenuto medio determinato per via sperimentale dal valore certificato non ricade al di fuori del limite di ± 10 %. Quando tali MRC non sono disponibili, si accetta che l'esattezza delle misure venga valutata per mezzo del recupero di aggiunte di quantità note dell'elemento a campioni non conosciuti. Si attira l'attenzione sul fatto che, a differenza dell'analita, l'elemento aggiunto non è legato chimicamente nella vera matrice e che, pertanto, i risultati ottenuti con questa impostazione hanno validità inferiore a quelli ottenuti con l'uso degli MRC. I dati del recupero sono accettabili solo quando si trovano entro ± 10 % dal valore bersaglio.

2.4.2.2. Precisione dei metodi quantitativi

Nel caso di analisi ripetute di un campione eseguite in condizioni di riproducibilità in laboratorio, il coefficiente di variazione (CV) intra-laboratorio della media non supera i seguenti valori:







Tabella 8 CV per metodi quantitativi a intervalli di frazioni di massa dell'elemento Frazione di massa CV (%) ≥ 10 μg/kg a 100 μg/kg 20 da meno di 100 μg/kg a 1 000 μg/kg 15 ≥ 1 000 μg/kg 10

2.4.3. Prescrizioni specifiche per la DPASV (Differential Pulse Anodic Stripping Voltametry)

La completa distruzione della materia organica nei campioni prima delle analisi DPASV ha un'importanza assoluta. Nei voltamogrammi non sono visibili segnali ampi dovuti alla presenza di materiali organici. I costituenti della matrice inorganica possono influenzare le altezze dei picchi nella DPASV. La quantificazione è pertanto eseguita attraverso il metodo delle aggiunte di standard. Con il metodo sono forniti campioni di voltamogrammi tipici di una soluzione campione.

2.4.4. Prescrizioni specifiche per l'AAS (Atomic Absorption Spectrometry)

Si tratta fondamentalmente di una tecnica ad elemento singolo che richiede, pertanto, un'ottimizzazione delle regolazioni sperimentali a seconda dell'elemento specifico da quantificare. Ogniqualvolta ciò sia possibile i risultati sono verificati qualitativamente e quantitativamente ricorrendo a linee di assorbimento alternative (idealmente, sono selezionate due linee differenti). Gli standard di calibrazione sono preparati in una matrice di soluzione che corrisponda il più possibile a quella della soluzione del campione da analizzare (ad esempio, concentrazione degli acidi o composizione dell'agente modificatore). Per ridurre al minimo i valori dei bianchi, tutti i reagenti sono della più elevata purezza disponibile. A seconda della modalità scelta per vaporizzare e/o atomizzare i campioni è possibile distinguere vari tipi di AAS.

2.4.4.1. Prescrizioni specifiche per l'AAS con fiamma

Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun elemento. In particolare sono verificate le velocità di flusso e la composizione del gas. Per evitare interferenze provocate dall'assorbimento nel fondo, è impiegato un correttore di sorgente continuo. Nel caso di matrici sconosciute, si verifica se la correzione del fondo è richiesta o meno.

2.4.4.2. Prescrizioni specifiche per l'AAS con fornace a grafite

Quando si lavora a livelli di tracce estremamente ridotte nella fornace a grafite la contaminazione in laboratorio spesso inficia l'accuratezza. Per la manipolazione del campione e dello standard si utilizzano pertanto reagenti ad elevata purezza, acqua deionizzata e oggetti in plastica inerte. Le regolazioni per gli strumenti sono ottimizzate per ciascun elemento. In particolare, occorre verificare le condizioni di pretrattamento e atomizzazione (temperatura, tempo) nonché le modifiche alla matrice.

Lavorando in condizioni di atomizzazione isotermica (ad esempio, tubo trasversale in grafite riscaldato con piattaforma Lvov integrata) (8) si ridurrà l'influenza della matrice sull'atomizzazione dell'analita. Oltre alla modifica della matrice e alla correzione Zeeman (9) del fondo è consentita la quantificazione per mezzo di una curva di calibrazione basata sulla misurazione di soluzioni standard acquose.

2.4.5. Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento atomico con generazione di idruri

I composti organici che contengono elementi quali arsenico, bismuto, germanio, piombo, antimonio, selenio, stagno e tellurio possono risultare estremamente stabili e possono richiedere una decomposizione ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale degli elementi. Si consiglia pertanto la digestione a microonde oppure l'incinerazione ad alta pressione in condizioni fortemente ossidanti. La massima cura è prestata alla conversione completa e riproducibile degli elementi nei loro idruri corrispondenti.

La formazione di idruro di arsenico in soluzione di acido cloridrico con NaBH4 dipende dalla stato di ossidazione dell'arsenico (As III: formazione rapida, As V: periodo di formazione più lungo). Per evitare una perdita di sensibilità per la determinazione di As V con tecniche di iniezione del flusso, provocate dal breve tempo di reazione in questo sistema, As V deve essere ridotto ad As III dopo la decomposizione ossidante. Lo ioduro di potassio/acido ascorbico o la cisteina sono adeguati a tale fine. I bianchi, le soluzioni di calibrazione e le soluzioni campione sono trattate nello stesso modo. L'utilizzo di un sistema a lotti consente di determinare entrambe le specie di arsenico senza compromettere l'accuratezza. A causa della formazione ritardata dell'idruro As V, la calibrazione è eseguita attraverso l'integrazione dell'area di picco. Sono ottimizzate le impostazioni per gli strumenti; il flusso del gas, che trasferisce l'idruro all'atomizzatore, è particolarmente importante e viene verificato.

2.4.6. Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'assorbimento atomico con vapore freddo

Il vapore freddo è utilizzato solo in caso di mercurio. A causa della volatilizzazione e delle perdite di adsorbimento del mercurio elementare, si deve prestare particolare attenzione durante l'intera analisi. Si deve fare attenzione ad evitare la contaminazione da parte dei reagenti o dell'ambiente.

I composti organici che contengono mercurio richiedono una decomposizione ossidante per ottenere risultati corretti per il contenuto totale di mercurio. Per la decomposizione devono essere impiegati sistemi sigillati con digestione a microonde o incineratori ad alta pressione. Particolare cura è prestata alla pulitura delle apparecchiature venute a contatto con il mercurio.

L'utilizzo della tecnica di iniezione del flusso presenta alcuni vantaggi. Per i limiti di decisione inferiori si raccomanda l'adsorbimento del mercurio elementare su un adsorbitore in oro/platino seguito da desorbimento termico. Il contatto tra l'adsorbitore o la cella e l'umidità compromette la misurazione ed è evitato.

2.4.7. Prescrizioni specifiche per la spettrometria dell'emissione atomica con plasma induttivo (ICP-AES)

La spettrometria dell'emissione atomica con plasma induttivo (10) è un metodo multi-elemento che consente la misurazione simultanea di più elementi. Per utilizzare l'ICP-AES, i campioni devono essere innanzitutto digeriti per decomporre le matrici organiche. Sono utilizzati sistemi sigillati con digestione a microonde oppure l'incinerazione ad alta pressione. La calibrazione degli strumenti e la scelta dell'elemento o della lunghezza d'onda svolgono un ruolo essenziale in un'analisi ICP-AES significativa. Per la calibrazione degli strumenti, nel caso di curve di calibrazione lineari, è in genere necessario misurare soluzioni di calibrazione di quattro sole concentrazioni, in quanto le curve di calibrazione dell'ICP-AES sono in genere lineari su quattro-sei ordini di grandezza di concentrazione. La calibrazione del sistema ICP-AES è eseguita, in genere, con uno standard multi-elemento a sua volta preparato in una soluzione che contiene la stessa concentrazione di acido della soluzione di misurazione. Si verificano le concentrazioni degli elementi per la curva lineare.

La scelta delle lunghezze d'onda per la misura delle emissioni da parte degli analiti è adeguata alle concentrazioni degli elementi da determinare. Quando la concentrazione dell'analita ricade all'esterno dell'intervallo operativo di una linea di emissione si impiega una linea di emissione differente. Si sceglie innanzitutto la linea di emissione più sensibile (senza interferenze) e successivamente una linea meno sensibile. Quando si lavora in prossimità o al limite di rilevazione, la scelta migliore è rappresentata dalla linea più sensibile per il rispettivo analita. Le principali difficoltà nella ICP-AES sono provocate dalle interferenze dello spettro e del fondo. Le possibili interferenze sono, ad esempio, lo spostamento semplice del fondo (simple background shift), lo spostamento inclinato del fondo (sloping background shift), la sovrapposizione diretta degli spettri e lo spostamento complesso del fondo (complex background shift). Ciascuna di queste interferenze ha cause e rimedi specifici. A seconda delle matrici, si applicano correzioni alle interferenze e si devono ottimizzare i parametri operativi. Alcune interferenze possono essere evitate per mezzo della diluizione o adattando le matrici. Il materiale di riferimento e fortificato contenente quantità note dell'analita (o degli analiti), nonché il materiale bianco, è trattato in modo identico ai campioni da analizzare con ogni lotto di campioni analizzati. Se l'analisi è volta a riscontrare una deviazione, lo standard è verificato, ad esempio, dopo dieci campioni, Tutti i reagenti e il gas plasma sono della massima purezza disponibile.

2.4.8. Prescrizioni specifiche per la spettrometria di massa ad accoppiamento induttivo (ICP-MS) (11)

La determinazione di elementi di massa atomica media presenti in tracce, quali cromo, rame e nichel può essere soggetta a forti interferenze da parte di altri ioni isobarici e poliatomici. È possibile superare tali interferenze solo se è disponibile una potenza di risoluzione pari ad almeno 7 000-8 000. Le difficoltà collegate alle tecniche di MS comprendono la deviazione strumentale, gli effetti della matrice e l'interferenza degli ioni molecolari (m/z<80). Per correggere la deviazione degli strumenti e gli effetti della matrice è richiesta una standardizzazione interna multipla che copra lo stesso intervallo di massa degli elementi da determinare.

Prima delle misurazioni per mezzo della ICP-MS è richiesta la completa decomposizione della materia organica nei campioni. Come avviene per l'AAS, dopo la digestione in recipienti sigillati gli elementi volatili, ad esempio lo iodio, devono essere trasferiti ad uno stato di ossidazione stabile. Le combinazioni di ioni molecolari di argon (gas di plasma), idrogeno, carbonio, azoto ed ossigeno (acidi di dissoluzione, impurità del gas di plasma e gas atmosferici catturati) e la matrice del campione provocano interferenze particolarmente forti. Per evitare interferenze sono necessarie la digestione completa, le misurazioni del fondo, la scelta appropriata delle masse da analizzare, talvolta associata a una scarsa abbondanza (limite di rilevazione più basso) e degli acidi di dissoluzione, ad esempio l'acido nitrico.

Per gli elementi da determinare, le interferenze devono essere escluse dalla scelta appropriata di masse analitiche specifiche, compresa la conferma delle proporzioni di isotopi. Per ciascuna misurazione si verifica la risposta strumentale prendendo in considerazione fattori Fano, attraverso l'impiego di standard interni.

3. VALIDAZIONE

La validazione dimostra che il metodo analitico è conforme ai criteri applicabili per le caratteristiche di rendimento pertinenti.

Finalità di controllo differenti richiedono categorie di metodi differenti. Nella tabella che segue sono illustrate le caratteristiche di rendimento da verificare per ogni tipi di metodo.







Tabella 9 Classificazione di metodi analitici in base alle caratteristiche di rendimento che devono essere determinate Limite di rilevazione CCβ Limite di decisione CCα Esattezza/Recupero Precisione Selettività/Specificità Applicabilità/Robustezza/Stabilità Metodi qualitativi S + – – – + + C + + – – + + Metodi quantitativi S + – – + + + C + + + + + +

3.1. PROCEDURE DI VALIDAZIONE

Nel presente capitolo sono illustrati esempi e/o riferimenti per le procedure di validazione dei metodi analitici. Per dimostrare che il metodo analitico è conforme ai criteri di rendimento per le caratteristiche di rendimento possono essere utilizzati altri approcci, a patto che forniscano informazioni di pari livello e qualità.

La validazione può inoltre essere eseguita attraverso uno studio inter-laboratorio, quali quelli istituiti dal Codex Alimentarius, dall'ISO o dall'IUPAC (12) oppure in base a metodi alternativi, quali studi condotti in singoli laboratori o attraverso la validazione interna (13)(14). In questa parte ci si concentra sugli studi condotti in singoli laboratori (o validazione interna) utilizzando una strategia modulare. Questo approccio prevede:

1) un gruppo di caratteristiche di rendimento comuni indipendenti dal modello di validazione utilizzato; e

2) procedure dipendenti dal modello più specifiche descritte nella tabella 10.







Tabella 10 Parametri di rendimento dipendenti e indipendenti dal modello Validazione Parametri di rendimento indipendenti dal modello Parametri di rendimento dipendenti dal modello Caratteristiche di rendimento comuni (3.1.1) Approccio di validazione convenzionale (3.1.2) Approccio di validazione interno (3.1.3) Specificità Recupero Recupero Esattezza Ripetibilità Ripetibilità Robustezza: cambiamenti lievi Riproducibilità intralaboratorio Riproducibilità intralaboratorio Stabilità Riproducibilità Riproducibilità Limite di decisione (CCα) Limite di decisione (CCα) Capacità di rilevazione (CCβ) Capacità di rilevazione (CCβ) Curve di calibrazione Curva di calibrazione Robustezza: cambiamenti significativi Robustezza

3.1.1. Caratteristiche di rendimento indipendenti dal modello

Le caratteristiche di rendimento che seguono devono essere determinate a prescindere dall'approccio di validazione scelto. Per ridurre al minimo il carico di lavoro, per combinare gli esperimenti eseguiti per determinare parametri differenti potrà essere impiegato un approccio studiato con attenzione e valido dal punto di vista statistico.

3.1.1.1. Specificità

Per i metodi analitici riveste importanza la capacità di discriminazione tra l'analita e sostanze strettamente correlate (isomeri, metaboliti, prodotti di degradazione, sostanze endogene, componenti della matrice, ecc.). Per verificare la presenza di interferenze sono necessari due approcci.

Si scelgono pertanto due sostanze potenzialmente in grado di interferirsi e si devono analizzare i campioni bianchi pertinenti per rilevare la presenza di possibili interferenze e valutarne gli effetti:

— Selezionare una gamma di composti chimicamente correlati (metaboliti, derivati, ecc.) o altre sostanze che è probabile riscontrare con il composto in esame e che possono essere presenti nei campioni.

— Analizzare un numero adeguato di campioni bianchi rappresentativi (n ≥ 20) e verificare la presenza di eventuali interferenze (segnali, picchi, tracce di ioni) nella regione interessata alla quale l'analita in fase di studio deve eluire.

— In aggiunta, i campioni bianchi rappresentativi sono fortificati ad una concentrazione pertinente con sostanze che possono interferire con l'identificazione e/o la quantificazione dell'analita.

— Dopo l'analisi, verificare se: — la presenza può portare a una falsa identificazione, — l'identificazione dell'analita bersaglio è ostacolata dalla presenza di una o più interferenze, oppure — se la quantificazione è influenzata in modo percettibile.

3.1.1.2. Esattezza

Nel presente paragrafo si descrive la determinazione dell'esattezza (una componente dell'accuratezza) che può essere stabilita solo per mezzo di un materiale di riferimento certificato (MRC). Un MRC deve essere utilizzato ogniqualvolta sia disponibile. La procedura è descritta dettagliatamente nella ISO 5725-4 (5). Di seguito ne viene riportato un esempio:

— Analizzare sei duplicati dell'MRC in base alle istruzioni di test per il metodo.

— Determinare la concentrazione dell'analita presente in ciascun campione dei duplicati.

— Calcolare la media, la deviazione standard ed il coefficiente di variazione (%) per tali concentrazioni.

— Calcolare l'esattezza dividendo la concentrazione media rilevata per il valore certificato (misurato come concentrazione) e moltiplicarlo per 100, per esprimere il risultato come una percentuale:

Esattezza (%) = concentrazione media rilevata corretta per il recupero × 100/valore certificato.

Se non è disponibile alcun MRC, anziché l'esattezza, il recupero potrà essere determinato come descritto al paragrafo 4.1.2.1 in seguito.

3.1.1.3. Robustezza/applicabilità (cambiamenti lievi)

Tali studi impiegano l'introduzione di lievi variazioni ragionevoli da parte del laboratorio e ne osservano le conseguenze.

Gli studi pre-investigativi devono essere svolti scegliendo fattori del pretrattamento, della pulitura e dell'analisi del campione che possono influenzare i risultati della misurazione. Tali fattori possono comprendere l'analista, l'origine e l'età dei reagenti, dei solventi degli standard e degli estratti del campione, la velocità di riscaldamento, la temperatura, il valore del pH, nonché numerosi altri eventi che possono verificarsi in laboratorio. Tali fattori devono essere modificati in un ordine di grandezza che corrisponde alle deviazioni riscontrate in genere nei laboratori.

— Identificare possibili fattori che potrebbero influenzare i risultati.

— Variare leggermente ciascun fattore.

— Eseguire un test di robustezza utilizzando l'approccio di Youden (15) (16). (A questo punto è possibile utilizzare anche altri metodi approvati. L'approccio di Youden, tuttavia, consente di ridurre al minimo il tempo e l'impegno richiesti). L'approccio di Youden è studiato come metodo fattoriale frazionale e non consente di rilevare le interazioni tra i differenti fattori.

— Quando si riscontra che un fattore influenza i risultati delle misurazioni in modo significativo, condurre ulteriori esperimenti per decidere i limiti accettabili per tale fattore.

— Nel protocollo del metodo devono essere indicati chiaramente i fattori che influenzano i risultati in modo significativo.

L'idea basilare non è quella di studiare un cambiamento alla volta, ma di introdurre numerose variazioni contemporaneamente. Ad esempio, si presuma che A, B, C, D, E, F, G indichino i valori nominali di sette fattori differenti che possono influenzare i risultati se i loro valori nominali vengono variati leggermente. Si presuma che i valori alternativi siano indicati dalle lettere minuscole corrispondenti a, b, c, d, e, f, g. Ciò produce 2 (7) o 128 diverse possibili combinazioni.

È possibile scegliere un sottoinsieme di otto di queste combinazioni che presentano un equilibrio tra lettere maiuscole e minuscole (tabella 11). È necessario eseguire otto determinazioni che utilizzeranno una combinazione dei fattori scelti (A-G). I risultati delle determinazioni sono riportati nella tabella 11 come S-Z.







Tabella 11 Progetto sperimentale per gli studi di robustezza (cambiamenti lievi) Valore di fattore F N. di combinazioni di determinazioni l 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a В/в В в В в В в В в C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D Е/е Е е е Е Е е е Е F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Risultato osservato R S T U V W X Y Z Per i calcoli si vedano gli esempi delle prove di robustezza al punto 3.3.

3.1.1.4. Stabilità

È stato osservato che un'insufficiente stabilità dell'analita o dei costituenti della matrice nel campione durante la conservazione o l'analisi può dare luogo a deviazioni significative nel risultato finale dell'analisi. Si deve inoltre verificare la stabilità dello standard di calibrazione nella soluzione. La stabilità dell'analita è in genere ben caratterizzata in svariate condizioni di conservazione. Il monitoraggio della condizione di conservazione sarà parte del normale sistema di accreditamento del laboratorio. Di seguito vengono riportati esempi di come determinare la stabilità quando la condizione di conservazione non è nota.

Stabilità dell'analita in soluzione:

— Preparare soluzioni di base fresche dell'analita/degli analiti e diluire secondo quando specificato nelle istruzioni del test per ottenere un numero di aliquote sufficiente (ad esempio, 40) di ciascuna concentrazione selezionata (a circa il limite minimo di rendimento richiesto per le sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito o a circa il limite consentito per le altre sostanze). Preparare entrambe le soluzioni dell'analita impiegate per la fortificazione e utilizzate nella soluzione finale da analizzare e qualsiasi altra soluzione che possa interessare (ad esempio, standard derivati).

— Misurare il contenuto di analita nella soluzione appena preparata attenendosi alle istruzioni del test.

— Versare volumi appropriati in contenitori adeguati, etichettarli e riporli seguendo lo schema:



Tabella 12 Schema per la determinazione della stabilità dell'analita in soluzione – 20 °C + 4 °C + 20 °C Buio 10 aliquote 10 aliquote 10 aliquote Luce 10 aliquote

— Per il tempo di conservazione si potrà scegliere 1, 2, 3 e 4 settimane o più, se necessario, vale a dire fino alla comparsa dei primi fenomeni di degrado durante l'identificazione e/o la quantificazione. Devono essere registrati il tempo di conservazione massimo e le condizioni di conservazione ottimali.

— Il calcolo della concentrazione dell'analita/degli analiti in ciascuna aliquota deve essere eseguito utilizzando la soluzione al 100 % dell'analita appena preparata al momento dell'analisi.

— C i concentrazione al tempo preso in esame C fresca concentrazione della soluzione fresca

— Ogniqualvolta sia possibile devono essere utilizzati campioni reali. Ove non sia disponibile alcun materiale di questo tipo, deve essere utilizzata la matrice fortificata con l'analita.

— Ove sia disponibile materiale di questo tipo, la concentrazione nel materiale deve essere determinata mentre il materiale è ancora fresco. Dopo 1, 2, 4 e 20 settimane devono essere prelevate ulteriori aliquote del materiale e si devono determinare le concentrazioni. Il tessuto deve essere conservato ad almeno -20 °C o a temperature inferiori, se richiesto.

— Se non è disponibile alcun materiale di tale tipo, prendere del materiale bianco e omogeneizzarlo. Dividere il materiale in 5 aliquote. Fortificare ciascuna aliquota con l'analita che deve preferibilmente essere preparato in una piccola quantità di soluzione acquosa. Analizzare un'aliquota immediatamente. Conservare le aliquote restanti ad almeno -20 °C, o a temperature inferiori, ed analizzarle dopo 1, 2, 4 e 20 settimane.

3.1.1.5. Curve di calibrazione

Quando per la quantificazione vengono impiegate curve di calibrazione:

— nella costruzione della curva devono essere utilizzati almeno cinque livelli (compreso lo zero),

— si deve descrivere la curva operativa della curva,

— si deve descrivere la formula matematica della curva e la bontà dell'adattamento dei dati sulla curva,

— si devono descrivere gli intervalli di accettabilità per i parametri della curva.

Ove sia necessaria una calibrazione seriale basata su una soluzione standard, si indicano gli intervalli accettabili per i parametri della curva di calibrazione che possono variare da serie a serie.

3.1.2. Procedure di validazione convenzionali

Il calcolo dei parametri in base ai metodi convenzionali richiede l'esecuzione di svariati esperimenti singoli. Per ciascuna modifica importante si deve determinare la caratteristica di rendimento (cfr. il paragrafo «Robustezza/applicabilità», in precedenza). Per i metodi ad analita multiplo è possibile analizzare contemporaneamente svariati analiti, previa esclusione di possibili interferenze specifiche. In tal modo è possibile determinare svariate caratteristiche. Pertanto, per ridurre il carico di lavoro è consigliabile combinare per quanto possibile gli esperimenti (ad esempio, ripetibilità e riproducibilità intra-laboratorio con la specificità, analisi dei campioni bianchi per determinare il limite di decisione e test della specificità).

3.1.2.1. Recupero

Se non esiste alcun MRC, il recupero deve essere determinato per mezzo di esperimenti che impiegano una matrice bianca fortificata ricorrendo, ad esempio, al seguente schema:

— selezionare 18 aliquote di un materiale bianco e fortificare 6 aliquote a 1, 1,5 e 2 volte ciascuna il limite di rendimento minimo richiesto oppure a 0,5, 1 e 1,5 volte il limite consentito,

— analizzare i campioni e calcolare la concentrazione presente in ciascun campione,

— utilizzando l'equazione che segue, calcolare il recupero per ciascun campione,

— calcolare il recupero medio e il CV derivante dai 6 risultati a ciascun livello,

— recupero % = 100 × Contenuto misurato/Livello di fortificazione.

Questo metodo convenzionale per la determinazione del recupero è una variante del metodo di aggiunta dello standard descritto al punto 3.5, quando:

— il campione è considerato un campione bianco anziché un campione da analizzare,

— si considera che il componente finale ( 1 ) e il recupero ( 2 ) per le due porzioni di analisi siano simili,

— i campioni da analizzare hanno la stessa massa e gli estratti dell'aliquota hanno lo stesso volume,

— la quantità di standard di calibrazione aggiunta alla seconda aliquota (drogata) da analizzare è rilevata xADD. (xADD = ρA.VA),

— x1 è il valore misurato per il bianco e x2 è il valore misurato per la seconda aliquota (drogata) da analizzare,

— pertanto, % recupero = 100 (x2 - x1)/xADD.

Ove non sia soddisfatta (o si presuma) di non soddisfare una qualsiasi delle condizioni elencate in precedenza, si deve eseguire la procedura completa per la determinazione del recupero per mezzo del metodo di aggiunta dello standard, come descritto al punto 3.5.

3.1.2.2. Ripetibilità

— Preparare un gruppo di campioni di matrice identica, fortificata con l'analita in modo da produrre concentrazioni equivalenti a 1, 1,5 e 2 volte il limite di rendimento minimo richiesto oppure a 0,5, 1 e 1,5 volte il limite consentito.

— L'analisi deve essere eseguita con almeno sei duplicati ad ogni livello.

— Analizzare i campioni.

— Calcolare la concentrazione rilevata in ciascun campione.

— Trovare la concentrazione media, la deviazione standard e il coefficiente di variazione (%) dei campioni fortificati.

— Ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni.

— Calcolare le concentrazioni medie complessive ed i CV per i campioni fortificati.

3.1.2.3. Riproducibilità intra-laboratorio

— Preparare un gruppo di campioni del materiale da analizzare specificato (matrici identiche o differenti), fortificati con l'analita/gli analiti per produrre concentrazioni equivalenti a 1, 1,5 e 2 volte il limite minimo di rendimento richiesto oppure a 0,5, 1 e 1,5 volte il limite consentito.

— L'analisi deve essere eseguita con almeno sei duplicati ad ogni livello.

— Se possibile, ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni con operatori differenti ed in condizioni ambientali differenti, ad esempio, lotti di reagenti o di solventi differenti, ecc., temperature ambientali differenti, strumenti differenti, ecc.

— Analizzare i campioni.

— Calcolare la concentrazione rilevata in ciascun campione.

— Trovare la concentrazione media, la deviazione standard ed il coefficiente di variazione (%) dei campioni fortificati.

3.1.2.4. Riproducibilità

Quando si deve verificare la riproducibilità, i laboratori devono partecipare a studi collaborativi in base alla ISO 5725-2 (5).

3.1.2.5. Limite di decisione (CCα)

Il limite di decisione deve essere definito secondo i requisiti per l'identificazione o l'identificazione più la quantificazione in base alle definizioni contenute nella parte 2 «Criteri di rendimento e altre prescrizioni per i metodi analitici».

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCα:

— per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco che viene fortificato al livello di rendimento minimo richiesto, o al di sotto di tale livello, ad intervalli equidistanti. Analizzare i campioni. Dopo l'identificazione, tracciare il grafico del segnale rispetto alla concentrazione aggiunta. La concentrazione corrispondente al punto di intercettazione dell'asse y più 2,33 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-laboratorio del punto di intercettazione equivale al limite di decisione. Questo metodo si applica solo alle analisi quantitative (α = 1 %).

— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice per essere in grado di calcolare il rapporto segnale-rumore nell'intervallo di tempo al quale è previsto l'analita. Possono essere utilizzati come limite di decisione tre rapporti segnale-rumore. Questo metodo si applica alle analisi quantitative e qualitative.

Nel caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCα:

— Per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco che viene fortificato al limite consentito ad intervalli equidistanti. Analizzare i campioni. Dopo l'identificazione, tracciare il grafico del segnale rispetto alla concentrazione aggiunta. La concentrazione corrispondente al limite consentito più 1,64 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-laboratorio equivale al limite di decisione (α = 5 %).

— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice fortificati con l'analita/gli analiti al limite consentito. La concentrazione al limite consentito più 1,64 volte la deviazione standard corrispondente equivale al limite di decisione (α = 5 %).

Cfr. inoltre l'articolo 5 e il punto 3.2.

3.1.2.6. Capacità di rilevazione (CCβ)

La capacità di rilevazione deve essere determinata in base alle prescrizioni per lo screening, l'identificazione o l'identificazione più la quantificazione come definite in precedenza (cfr. la parte 2).

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCββ:

— Per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco rappresentativo, che viene fortificato al livello di rendimento minimo richiesto, o al di sotto di tale livello, ad intervalli equidistanti. Analizzare i campioni. Dopo l'identificazione, tracciare il grafico del segnale rispetto alla concentrazione aggiunta. La concentrazione corrispondente al limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-laboratorio del contenuto medio misurato al limite di decisione equivale alla capacità di rilevamento (β = 5 %).

— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice fortificati con l'analita/gli analiti al limite di decisione. Analizzare i campioni ed identificare gli analiti. Il valore del limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-laboratorio del contenuto misurato equivale alla capacità di rilevazione (β = 5 %).

— Quando non sono disponibili risultati quantitativi la capacità di rilevazione può essere determinata dallo studio del materiale bianco fortificato al limite di decisione e oltre. In questo caso il livello di concentrazione, dove rimangono solo ≤ 5 % di falsi risultati conformi, equivale alla capacità di rilevazione del metodo. Al fine di garantire una base affidabile per tale determinazione si devono pertanto eseguire almeno 20 studi per almeno un livello di concentrazione.

Nel caso di sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito è possibile stabilire il CCβ:

— per mezzo della procedura della curva di calibrazione in base alla ISO 11843 (17) (qui denominato valore critico della variabile netta di stato). In questo caso è impiegato materiale bianco rappresentativo, che viene fortificato al limite consentito ad intervalli equidistanti. Analizzare i campioni ed identificare l'analita/gli analiti. Calcolare la deviazione standard del contenuto medio misurato al limite di decisione. La concentrazione corrispondente al valore del limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard della riproducibilità intra-laboratorio equivale alla capacità di rilevazione (β = 5 %).

— In alternativa, analizzando almeno 20 materiali bianchi per matrice fortificati con l'analita/gli analiti al limite di decisione. Il valore del limite di decisione più 1,64 volte la deviazione standard corrispondente equivale alla capacità di rilevazione (β = 5 %).

Cfr. inoltre la sezione 3.2.

3.1.2.7. Robustezza (cambiamenti significativi)

Il metodo analitico deve essere testato in condizioni sperimentali differenti che comprendono, ad esempio, specie differenti, matrici differenti o condizioni di campionatura differenti. I cambiamenti introdotti devono essere importanti. L'importanza di tali cambiamenti può essere valutata, ad esempio, utilizzando l'approccio di Youden (15) (16). Si deve determinare la caratteristica di rendimento per tutti i cambiamenti significativi che hanno dimostrato di avere un effetto significativo sul rendimento dell'analisi.

3.1.3. Validazione in base a modelli alternativi

Ove si applichino procedure di validazione alternative, sono definiti nel protocollo di validazione il modello e la strategia di base con i rispettivi requisiti, ipotesi, e formule o si riportano almeno riferimenti circa la loro disponibilità. In seguito viene presentato un esempio di un approccio alternativo. Quando si applica, ad esempio, il modello di validazione interno, le caratteristiche di rendimento sono determinate in modo da consentire la validazione per cambiamenti significativi entro la stessa procedura di validazione. Ciò comporta la necessità di progettare un piano sperimentale per la validazione.

3.1.3.1. Piano sperimentale

Un piano sperimentale deve essere progettato in base al numero delle varie specie e dei differenti fattori in corso di studio. Come primo passo dell'intera procedura di validazione si considerano pertanto le popolazioni campione che verranno analizzate in futuro in laboratorio al fine di selezionare le specie più importanti e quei fattori che potrebbero influenzare i risultati delle misurazioni. In seguito si sceglie l'intervallo di concentrazione in modo adeguato allo scopo in base al livello di interesse.

— Con il metodo analitico in corso di validazione è possibile studiare svariati analiti contemporaneamente.

— Sono state individuate due variazioni del fattore principale (A e B). I fattori principali costituiscono la base sulla quale vengono combinati i livelli dei fattori. Tali fattori principali possono comprendere fattori quali specie o matrice. Nell'esempio che segue il fattore principale ha subito una variazione su due livelli, vale a dire sono state considerate due specie differenti (specie A e specie B). In generale è possibile variare i fattori principali su più di due livelli e questo non fa altro che aumentare il numero di analisi da eseguire.

— I fattori selezionati devono essere variati su due livelli (indicati come + o -).







Tabella 13 Esempi di fattori considerati importanti per una procedura di validazione Sesso dell'animale (fattore 1) Razza (fattore 2) Condizioni di trasporto (fattore 3) Condizioni di conservazione (fattore 4) Freschezza del campione (fattore 5) Condizioni di ingrasso (fattore 6) Operatori differenti con esperienza differente (fattore 7)







Tabella 14 Possibile piano sperimentale per l'esempio precedente Specie Fattore 1 Fattore 2 Fattore 3 Fattore 4 Fattore 5 Fattore 6 Fattore 7 Fattore 8 A + + + + - + - 1 A + + - - + - - 2 A + - + - - - + 3 A + - - + + + + 4 A - + + - + + + 5 A - + - + - - + 6 A - - + + + - - 7 A - - - - - + - 8 B + + + + + - + 9 B + + - - - + + 10 B + - + - + + - 11 B + - - + - - - 12 B - + + - - - - 13 B - + - + + + - 14 B - - + + - + + 15 B - - - - + - + 16

Dato che ciascun campione (ciascuna combinazione di livello di fattori) deve essere drogato con 4 concentrazioni differenti al livello di interesse e che è necessario analizzare un campione bianco per ciascun livello, per l'intero esperimento di validazione si devono eseguire 5 × 16 = 80.

Da questi 80 risultati delle misurazioni è possibile calcolare (13) (14):

Recupero:

— Ripetibilità per livello di concentrazione (sir)

— Riproducibilità intra-laboratorio per livello di concentrazione (siR)

— Limite di decisione (CCα)

— Capacità di rilevazione (CCβ)

— Curva di potenza (tasso di errore β rispetto alla concentrazione) (cfr. 3.1.3.2)

— Robustezza rispetto a cambiamenti significativi; la robustezza rispetto ai cambiamenti lievi può essere determinata in base al paragrafo 3.1.1.3)

— 16 curve di calibrazione correlate al campione

— 1 curva di calibrazione complessiva

— Intervallo di previsione della curva di calibrazione complessiva

— Deviazioni prodotte dalla matrice (smat)

— Deviazioni prodotte dal ciclo operativo (srun)

— Effetto dei singoli fattori sui risultati delle misurazioni

Tali caratteristiche di rendimento consentono una valutazione esauriente del livello di rendimento del metodo, dato che viene studiato non solo l'effetto dei singoli fattori, ma anche le combinazioni pertinenti di tali fattori. Con l'aiuto di tale progetto sperimentale è possibile decidere se occorre escludere dalla curva di calibrazione complessiva questo o quel fattore selezionato, in quanto devia in modo significativo dalle deviazioni standard degli altri fattori.

3.1.3.2. Curva di potenza

La curva di potenza fornisce informazioni sulla capacità di rilevazione del metodo entro l'intervallo di concentrazione scelto. Si riferisce al rischio di errore β quando si applica il metodo studiato. La curva di potenza consente di calcolare le capacità di rilevazione per le rispettive categorie (screening, conferma) o per i rispettivi tipi (qualitativo o quantitativo) di metodi per un determinato errore β (ad esempio, 5 %).

Figura 1:

Curva di potenza

Nella figura 1 è riportato un esempio della rappresentazione grafica della capacità di rilevazione (CCβ) di un metodo analitico. Questo particolare metodo ha il rischio residuo del 5 % di prendere una decisione falsa ad una concentrazione di 0,50 μg/kg. Ad una concentrazione di 0,55 μg/kg il rischio di prendere una decisione di falsa conformità scende all'1 %.

3.1.3.3. Riproducibilità

La determinazione della riproducibilità di un metodo da parte degli studi di laboratorio singolo (validazione interna) richiede la partecipazione ripetuta a studi di competenza in base alle guide ISO 43-1(3) e 43-2(4). I laboratori hanno la facoltà di scegliere i propri metodi, a patto che tali metodi vengano impiegati in condizioni di routine. La deviazione standard del laboratorio può essere utilizzata per valutare la riproducibilità del metodo.

3.2. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEI DIVERSI LIMITI ANALITICI

Figura 2:

Sostanze per le quali non è stato stabilito un limite consentito

Figura 3:

Sostanze con un limite consentito stabilito

3.3. ESEMPIO DI CALCOLO DEL TEST DI ROBUSTEZZA PER CAMBIAMENTI LIEVI SECONDO L'APPROCCIO DI YOUDEN (16)







Raffronto delle medie (A) AA = Σ(Ai)/4 AB = Σ(Bi)/4 AC = Σ(Ci)/4 AD = Σ(Di)/4 AE = Σ(Ei)/4 AF = Σ(Ei)/4 AG = Σ(Gi)/4 Aa = Σ(ai)/4 Ab = Σ(bi)/4 Ac = Σ(ci)/4 Ad = Σ(di)/4 Ae = Σ(ei)/4 Af = Σ(fi)/4 Ag = Σ(gi)/4 Confrontare le medie delle lettere maiuscole (da AA a AG) con le medie delle lettere minuscole corrispondenti (da Aa a Ag). Se un fattore ha un effetto, la differenza sarà significativamente superiore rispetto alle differenze degli altri fattori. Un metodo robusto non deve essere influenzato dai cambiamenti riscontrati quasi certamente da un laboratorio all'altro. Se non è presente alcuna differenza notevole, la misura più realistica dell'errore casuale è data dalle sette differenze.







Differenze (Di) Quadrato delle differenze (Di 2) Da = A – a = Σ(Ai) – Σ(ai) Db = B – b = Σ(Bi) – Σ(bi) Dc = C – c = Σ(Ci) – Σ(ci) Dd = D – d = Σ(Di) – Σ(di) De = E – e = Σ(Ei) – Σ(ei) Df = F – f = Σ(Fi) – Σ(fi) Dg = G – g = Σ(Gi) – Σ(gi) Da 2 = valore a Db 2 = valore b Dc 2 = valore c Dd 2 = valore d De 2 = valore e Df 2 = valore f Dg 2 = valore g

Deviazione standard delle differenze Di (SDi):

Quando la SDi è significativamente più grande della deviazione standard del metodo eseguito in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio (cfr. in precedenza), è inevitabile concludere che tutti i fattori insieme hanno un effetto sul risultato, anche se ciascun singolo fattore non mostra un'effetto significativo, e che il metodo non è sufficientemente robusto rispetto alle modifiche scelte.

3.4. ESEMPI DI CALCOLI PER LA PROCEDURA DI VALIDAZIONE INTERNA

Esempi e calcoli per il protocollo di validazione interna come descritto per la validazione secondo modelli alternativi (3.1.3.) (13) (14).

3.5. ESEMPI DI CALCOLI PER IL METODO DI AGGIUNTA DELLO STANDARD

Un campione da analizzare con un contenuto T dell'analita è diviso in due aliquote da analizzare 1 e 2, di massa m1 e m2 rispettivamente. L'aliquota 2 è drogata con un volume VA di una soluzione di concentrazione ρA dell'analita. Dopo le fasi di estrazione e purificazione del metodo vengono ottenuti due estratti delle aliquote aventi rispettivamente volume V1 e V2. Il recupero dell'analita deve essere rc. Entrambi gli estratti sono saggiati con un metodo di misurazione di sensibilità b e danno una risposta analitica, rispettivamente, di x1 e x2.

Se si presume che rc e b siano identici per l'analita nel campione nativo e nel campione addizionato, allora il contenuto T potrà essere calcolato come:

Tale metodo consentirà la determinazione del recupero rc. Quindi, in aggiunta all'analisi descritta in precedenza, parte dell'estratto dell'aliquota 1 (di volume V3) è drogata con una quantità nota ρB.VB dell'analita e saggiata a sua volta. La risposta analitica è x3 ed il recupero è:

È inoltre possibile calcolare la sensibilità b, come:

Sono state descritte tutte le condizioni di applicazioni e le informazioni dettagliate (18).

▼M3 —————

▼M1









ALLEGATO II







Limiti minimi di rendimento richiesti Sostanza e/o metabolita Matrici LMRR Cloramfenicolo Carni Uova 0,3 μg/kg Latte Urina Prodotti dell'acquacultura Miele Acetato di Medrossiprogesterone Grasso di rognone di suino 1 μg/kg Metaboliti di nitrofurano: — Furazolidone Carni di pollame μg/kg per tutti — Furaltadone Prodotti dell'acquacultura — Nitrofurantoina — Nitrofurazone ▼M2 Somma di verde di malachite e di verde di leucomalachite Carni dei prodotti dell'acquacoltura 2 μg/kg