1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B OTTAVADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del15giugno1978
chefissaimetodid'analisicomunitariperilcontrolloufficiale deglialimentiperanimali
(78/633/CEE)
(GU L 206 del 29.7.1978, pag. 43)
Modificata da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Direttiva 81/680/CEE della Commissione del 30 luglio 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
OTTAVADIRETTIVADELLACOMMISSIONE
del15giugno1978
chefissaimetodid'analisicomunitariperilcontrolloufficialedegli
alimenti peranimali
(78/633/CEE)
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,vista la direttiva 70/373/CEE del Consiglio, del 20 luglio 1970, relativa
all'introduzione di modi di prelievo di campioni e di metodi d'analisi
comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali(
1), modi-
ficata da ultimo dall'atto di adesione, in particolare l'articolo 2,
considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali
degli alimenti per animali destinati a constatare l'osservanza dellecondizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamen-tari o amministrative, concernenti le qualità e la composizione deglialimenti per animali, siano effettuati secondo i modi di prelievo di
campioni ed i metodi di analisi comunitari;
considerando che le direttive della Commissione 71/250/CEE del 15
giugno 1971(
2), 71/393/CEE del 18 novembre 1971(3), 72/199/CEE
del 27 aprile 1972(4), 73/46/CEE del 5 dicembre 1972(5), 74/203/CEE
del 25 marzo 1974(6), 75/84/CEE del 20 dicembre 1974(7) e 76/372/
CEE del 1omarzo 1976(8) hanno già fissato un certo numero di metodi
di analisi comunitari; che, tenuto conto dello stato di avanzamento dei
lavori sin qui effettuati, è necessario adottare un'ottava serie di metodi;
considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono
conformi al parere del comitato permanente per gli alimenti per glianimali,
HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:
Articolo 1
1. Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali
degli alimenti per animali, per quanto riguarda il loro contenuto inzinco-bacitracina, flavofosfolipol, ferro, rame, manganese e zinco siano
effettuate secondo i metodi descritti nell'allegato della presente diret-
tiva.
Articolo 2
Gli Stati membri curano l'entrata in vigore, il 1ogennaio 1979, delle
disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie perconformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano
immediatamente la Commissione.
Articolo 3
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) GU n. L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2.
(2) GU n. L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13.
(3) GU n. L 279 del 20. 12. 1971, pag. 7.
(4) GU n. L 123 del 29. 5. 1972, pag. 6.
(5) GU n. L 83 del 30. 3. 1973, pag. 21.
(6) GU n. L 108 del 22. 4. 1974, pag. 7.
(7) GU n. L 32 del 5. 2. 1975, pag. 26.
(8) GU n. L 102 del 15. 4. 1976, pag. 8.▼M1
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ALLEGATO
1.DOSAGGIODELLAZINCO-BACITRACINA—PERDIFFUSIONEIN
AGAR
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente metodo permette di dosare la zinco-bacitracina nei mangimi,
nei concentrati e nelle premiscele. Il limite inferiore di dosaggio è di
5 mg/kg (5 ppm)(*). Il metodo non è valido in presenza di sostanze
interferenti, in particolare di forti quantità di rame o di acido ascorbico.
2. PRINCIPIO
Il campione viene estratto a pH 2 con una miscela metanolo/acqua/
acido cloridrico. L'estratto ottenuto viene portato a pH 6,5, concentrato
se necessario e diluito. La sua attività antibiotica è determinata misu-
rando la diffusione della zinco-bacitracina su terreno agarizzato,
insemenzato con il Micrococcus luteus (sinonimo: M. flavus). La diffu-
sione è rivelata dalla formazione di aloni di inibizione del
microrganismo. Si ammette che il diametro di tali aloni sia direttamente
proporzionale al logaritmo della concentrazione di antibiotico.
3. MICRORGANISMO: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Conservazionedelceppo
Insemenzare con il Micrococcus luteus il terreno colturale (4.1), distri-
buito in provette a becco di clarino. Incubare per 24 ore a 30—37 ºC,
conservare a + 4 ºC circa e trapiantare ogni due settimane.
3.2.Preparazione dellasospensionebatterica (a)
Mediante 2—3 ml della soluzione di cloruro di sodio (4.3), raccogliere
la patina di una agar-coltura (3.1), preparato di recente. Con tale
sospensione, insemenzare in superficie una bottiglia di Roux contenente
250 ml del terreno colturale (4.1); incubare per 18—20 ore a 30—37 ºC.
Raccogliere la patina con 25 ml di soluzione di cloruro di sodio (4.3) e
omogenizzare. Diluire la sospensione 1:10 con la soluzione di cloruro
di sodio (4.3). La trasmittanza della sospensione, misurata a 650 nm
sotto lo spessore di 1 cm, dev'essere del 75 % circa rispetto a quella
della soluzione di cloruro di sodio (4.3).
4. TERRENI COLTURALI E REATTIVI
4.1.Terrenodimantenimentodelceppo (b)
Peptone di carne 6,0 g
Triptone 4,0 g
Estratto di lievito 3,0 g
Estratto di carne 1,5 gGlucosio 1,0 gAgar 15,0 gAcqua 1 000 mlpH 6,5—6,6 (dopo sterilizzazione).
4.2Terrenobaseperildosaggio (
b)
Triptone 10,0 g
Estratto di lievito 3,0 gEstratto di carne 1,5 gGlucosio 1,0 gAgar 20,0 gTween 80 1 mlAcqua 1 000 mlpH 6,5 (dopo sterilizzazione).
4.3. Soluzione allo 0,8 % (p/v) di cloruro di sodio: sciogliere in acqua 8 g di
cloruro di sodio p. a., portare a 1 000 ml e sterilizzare.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 3
(*) 1 mg di zinco-bacitracina (qualità per alimenti animali) equivale a 42 unità internazio-
nali (UI).
(a) Si possono impiegare altri metodi, purché sia dimostrato che essi diano una sospensione
batterica simile.
(b) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio di composizione analoga
purché dia gli stessi risultati.
▼B
4.4. Miscela metanolo puro/acqua/acido cloridrico p. a. (d: 1,18—1,19): 80/
17,5/2,5 (v/v/v).
4.5.Tamponefosfato,pH6,5
Fosfato bipotassico K2HPO4p. a. 22,15 g
Fosfato monopotassico KH2PO4p. a. 27,85 g
Acqua, q. b. a 1 000 ml.
4.6. Acido cloridrico p. a., d: 1,18—1,19.4.7. Acido cloridrico p. a. 0,1 N.
4.8. Soluzione 1 N di idrossido di sodio p. a.
4.9. Soluzione allo 0,04 % (p/v) di bromocresolporpora:
sciogliere 0,1 g di porpora di bromocresolo in 18,5 ml di soluzione
0,01 N di idrossido di sodio. Portare con acqua a 250 ml e omogeniz-
zare.
4.10 Sostanze di riferimento: zinco-bacitracina ad attività nota (espressa in
UI).
5. SOLUZIONI DI RIFERIMENTO
Pesare una quantità di zinco-bacitracina di riferimento (4.10) corrispon-
dente a 1 050 UI (secondo il titolo indicato). Aggiungere 5 ml di acido
cloridrico 0,1 N (4.7) e lasciar riposare 15 minuti. Aggiungere 30 ml
d'acqua, portare il pH a 4,5 con tampone fosfato pH 6,5 (4.5), impie-
gandone 4 ml circa, portare con acqua a 50 ml ed omogenizzare (1 ml
= 21 UI).
A partire da questa soluzione, preparare con diluizioni successive con il
tampone fosfato pH 6,5 (4.5) le seguenti soluzioni:
S
80,42 UI/ml
S40,21 UI/ml
S20,105 UI/ml
S10,0525 UI/ml.
6. PREPARAZIONE DELL'ESTRATTO
6.1.Estrazione
6.1.1.Concentrati, premiscele ed alimenti minerali
Pesare una quantità di campione da 2,0 a 5,0 g, aggiungere 30 ml della
miscela (4.4) ed agitare brevemente. Verificare che il pH si aggiri
intorno a 2. Agitare per 10 minuti, aggiungere 30 ml di tampone fosfato
(4.5) e agitare per 15 minuti. Diluire col tampone fosfato (4.5) fino ad
ottenere una concentrazione presunta in zinco-bacitracina pari a 0,12 UI/
ml (= U8).
6.1.2.Concentrati proteici
Pesare una quantità di campione di 10,0 g, aggiungere 50 ml della
miscela (4.4) ed agitare brevemente. Verificare che il pH si aggiri
intorno a 2. Agitare per 10 minuti, aggiungere 50 ml di tampone fosfato
pH 6,5 (4.5) ed agitare per 15 minuti. Diluire col tampone fosfato (4.5)
fino ad ottenere una concentrazione presunta in zinco-bacitracina pari a
0,42 UI/ml (= U8).
6.1.3.Altri alimenti
Pesare una quantità di campione di 10,0 g (20,0 g se si vuole ottenere
una concentrazione presunta in zinco-bacitracina pari a 5 mg/kg),
aggiungere 25 ml della miscela (4.4) ed omogenizzare per 10 minuti
circa. Aggiungere 25 ml di tampone fosfato pH 6,5 (4.5), agitare per
15 minuti e centrifugare. Prelevare 20 ml del supernatante, portare il
pH a 6,5 mediante la soluzione 1 N di idrossido di sodio (4.8), adope-
rando come indicatore la soluzione di bromocresolporpora (4.9).
Evaporare fino al volume di 4 ml circa in un evaporatore rotante a
temperatura non superiore a 35 ºC. Diluire il residuo con acqua fino
ad ottenere una concentrazione presunta in zinco-bacitracina pari a
0,42 UI/ml (= U8).
6.2.Soluzionidell'estratto
A partire dalla soluzione U8, preparare con diluizioni successive (1 + 1)
col tampone fosfato (4.5) le soluzioni U4(concentrazione presunta:
0,21 UI/ml), U2(concentrazione presunta: 0,105 UI/ml) ed U1(concen-
trazione presunta: 0,0525 UI/ml).1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
7. MODALITÀ DI DOSAGGIO
7.1.Inoculazionedelterrenodicoltura
Con la sospensione batterica (3.2) insemenzare il terreno base per il
dosaggio (4.2), raffreddato a 50 ºC circa. Mediante saggi preliminari
su piastra col terreno (4.2) determinare la quantità di sospensione batte-
rica che consente di ottenere, per le differenti concentrazioni in zinco-
bacitracina, aloni d'inibizione che abbiano la maggiore estensione possi-bile e che siano ancora netti.
7.2.Preparazione dellepiastre
La diffusione in agar si effettua su piastre, con le quattro concentrazioni
della soluzione di riferimento (S
8,S4,S2,S1) e le quattro concentrazioni
dell'estratto (U8,U4,U2,U1). Ogni piastra deve necessariamente conte-
nere le quattro concentrazioni della sostanza di riferimento e
dell'estratto. A tale scopo, impiegare piastre di dimensioni tali che
possano contenere nel terreno agarizzato almeno 8 pozzetti del diametro
di 10—13 mm, i cui centri non siano distanti fra loro meno di 30 mm.
Si possono adoperare come piastre delle lastre di vetro piane, provviste
di un anello di alluminio o di materiale plastico del diametro di 200 mm
e dell'altezza di 20 mm. Versare nelle piastre una quantità di terreno
(4.2), insemenzato come indicato al punto 7.1, che permetta di ottenere
uno strato dello spessore di 2 mm circa (50 ml per una piastra di
200 mm di diametro). Lasciar solidificare, praticare i pozzetti e deporvi
dei volumi esattamente misurati delle soluzioni della sostanza di riferi-
mento e dell'estratto (da 0,10 a 0,15 ml per pozzetto a seconda del
diametro).
Le operazioni descritte vanno ripetute almeno quattro volte per ogni
concentrazione, in modo da ottenere per ciascuna determinazione 32
aloni di inibizione.
7.3.Incubazione
Incubare le piastre per 16—18 ore alla temperatura di 30 ºC circa.
8. VALUTAZIONE
Misurare il diametro degli aloni di inibizione con l'approssimazione di
0,1 mm. Per ogni concentrazione, registrare le misure medie su carta
semilogaritmica, riportando il logaritmo delle concentrazioni in
funzione del diametro dell'alone di inibizione. Tracciare le rette più
appropriate per la soluzione di riferimento e per estratto, procedendo
ad esempio come segue.
Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della solu-
zione di riferimento (SL) mediante la formula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della
soluzione di riferimento (SH) mediante la formula:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l'estratto al
livello più basso (UL) ed al livello più alto (UH) sostituendo nelle
formule sopra riportate i valori di S1,S2,S4eS8con quelli di U1,U2,
U4ed U8. Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico. Congiun-
gendo i due punti si ottiene la retta più appropriata per la soluzione
standard. Procedendo allo stesso modo per UL ed UH si ottiene la retta
più appropriata per l'estratto.
In mancanza di interferenze le rette dovrebbero essere parallele. In
pratica, esse sono considerate parallele allorché SH—SL ed UH—UL
non differiscono fra loro di più del 10 % della loro media.
Se le rette non sono parallele, è possibile eliminare sia U1ed S1, sia U8eS8. I valori SL, SH, UL ed UH che permettono di ottenere le rette più
appropriate vanno calcolati mediante le formule seguenti:1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
(a′)S L ¼5S1þ2S2/C0S4
6o5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H ¼5S4þ2S2/C0S1
6o5S8þ2S4/C0S2
6
e mediante formule analoghe per UL ed UH. Se si utilizza quest'alter-
nativa, bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo sopra
descritto. Se il risultato è stato ottenuto a partire da tre punti, ciò va
indicato sul certificato di analisi.
Quando le rette sono considerate parallele, calcolare il logaritmo
dell'attività relativa (log. A) con una delle formule seguenti:
Per 4 punti
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Per 3 punti
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Attività reale = attività presunta + attività relativa.
Allorché le rette non sono considerate parallele, ripetere la determina-
zione. Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile
ottenere il parallelismo, calcolare il logaritmo dell'attività relativa (log.
A) mediante la formula (c). Il risultato ottenuto dovrà tuttavia essere
considerato come approssimativo: ciò dovrà risultare dal certificato di
analisi.
9. RIPETIBILITÀ
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso
campione dallo stesso analista non dovrebbe eccedere:
il 20 % del risultato più elevato per i tenori in zinco-bacitracina
compresi fra 5 e 25 mg/kg;
5 mg/kg, in valore assoluto, per i tenori superiori a 25 mg/kg e fino a
50 mg/kg;
il 10 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 50 mg/kg.
2.DOSAGGIO DEL FLAVOFOSFOLIPOL — PER DIFFUSIONE IN
AGAR
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo permette di dosare il flavofosfolipol nei mangimi, nei
concentrati e nelle premiscele. Il limite inferiore di dosaggio è di 1 mg/
kg (1 ppm).
2. PRINCIPIO
Il campione viene estratto con metanolo diluito mediante riscaldamento
a riflusso. L'estratto viene centrifugato, purificato, se necessario su
resine a scambio ionico e diluito. La sua attività antibiotica è determi-
nata misurando la diffusione del flavofosfolipol in terreno agarizzato,
insemenzato con lo Staphylococcus aureus. La diffusione è rivelata
dalla formazione di aloni di inibizione del microrganismo. Si ammette
che il diametro di tali aloni sia direttamente proporzionale al logaritmo
della concentrazione di antibiotico.
3 MICRORGANISMO: STAPHYLOCOCCUS AREUS ATCC 6538 P
3.1.Conservazionedelceppo
Insemenzare con lo Staphylococcus aureus il terreno colturale (4.1),
distribuito in provette a becco di clarino. Incubare 24 ore a 37 ºC,
conservare a + 4 ºC e trapiantare ogni mese.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
3.2.Preparazione dellasospensionebatterica (a)
Prelevare due provette contenenti la coltura-madre (3.1) e trapiantare
tutte le settimane. Incubare per 24 ore a 37 ºC e conservare a + 4 ºC
circa.
24 ore prima del dosaggio, insemenzare con una di queste colture da
due a quattro provette con il terreno di coltura (4.1), distribuito a becco
di clarino. Incubare da 16 a 18 ore a 37 + ºC. Sospendere la patina in
soluzione di cloruro di sodio (4.3). La trasmittanza della sospensione,
misurata a 578 nm sotto uno spessore di 1 cm, dev'essere del 40 %
circa rispetto a quella della soluzione di cloruro di sodio.
4. TERRENI COLTURALI E REATTIVI
4.1.Terrenodimantenimentodelceppo (b)
Peptone di carne 6,0 g
Triptone 4,0 gEstratto di lievito 3,0 g
Estratto di carne 1,5 g
Glucosio 1,0 gAgar 15,0 g
Acqua 1 000 ml
pH 6,5 (dopo sterilizzazione).
4.2.Terrenobaseperildosaggio
4.2.1.Strato inferiore (
c)
Peptone di carne 6,0 g
Estratto di lievito 3,0 gEstratto di carne 1,5 g
Agar 10,0 g
Acqua 1 000 ml
pH 6,5 (dopo sterilizzazione).
4.2.2.Strato da insemenzare
Terreno (4.1), addizionato di 2,0 g di emulsione antischiuma al sili-
cone(
d).
4.3. Soluzione allo 0,4 % (p/v) di cloruro di sodio: disciogliere in acqua 4 g
di cloruro di sodio p.a. Portare a 1 000 ml e sterilizzare.
4.4. Metanolo puro.4.5. Metanolo al 50 %(v/v): diluire 500 ml di metanolo (4.4) con 500 ml di
acqua.
4.6. Metanolo all'80 % (v/v): diluire 800 ml di metanolo (4.4) con 200 ml
d'acqua.
4.7. Tris(idrossimetil)aminometano p.a.4.8. Soluzione metanolica all'1,5 % (p/v) di cloruro di potassio: sciogliere
1,5 g di cloruro di potassio p.a. in 20 ml d'acqua e portare a 100 ml
con metanolo (4.4).
4.9. Scambiatore di cationi: Dowex 50 WX8, 20—50 mesh, forma Na (cat.
Serva n. 41 600) o equivalente).
4.10. Scambiatore di anioni: Dowex lX2, 50—100 mesh, forma Cl (cat. Serva
n. 41 010) o equivalente. Prima dell'impiego, immergere per 12—14 ore
il prodotto in metanolo all'80 % (4.6).
4.11. Lana di vetro.4.12. Cartine indicatrici del pH (pH 6,6—8,1).
4.13. Acido ascorbico.
4.14. Sostanza di riferimento: flavofosfolipol ad attività nota.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 7
(a) Si possono impiegare altri metodi, purché sia dimostrato che essi diano una sospensione
batterica simile.
(b) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio di analoga composizione
che dia gli stessi risultati, come ad esempio Oxoid Antibiotic Medium 1 (CM 327),
addizionato di agar Oxoid N. 3 (L 13).
(c) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio di analoga composizione
che dia gli stessi risultati come ad esempio Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335),addizionato di agar Oxoid N. 3 (L 13).
(
d) Per esempio SE 2, della Wacker Chemie GmbH, Monaco.
▼B
5. APPARECCHIATURA
5.1. Colonna in vetro per cromatografia, del diametro interno di 9 mm e
della lunghezza di 150—200 mm, munita di un rubinetto nell'estremitàinferiore e di un giunto normalizzato (per il collegamento dell'imbuto
5.2) all'estremità superiore.
5.2. Imbuto di carico da 250 ml, provvisto di rubinetto e smerigliatura
normalizzata.
5.3. Beuta da 250 ml, a smerigliatura normalizzata.5.4. Refrigerante a ricadere, a smerigliatura normalizzata.
6. SOLUZIONI DI RIFERIMENTO
Sciogliere una quantità esattamente pesata di sostanza di riferimento
(4.14) in metanolo al 50 % (4.5) e diluire in modo da ottenere una solu-
zione-madre di flavofosfolipol contenente 100 µg/ml. Conservata in
bottiglia chiusa e alla temperatura di 4 ºC, la soluzione si mantiene
stabile per due mesi.
A partire da questa soluzione, preparare con diluizioni successive con
metanolo al 50 % (4.5) le seguenti soluzioni:
S
80,2 µ g/ml
S40,1 µ g/ml
S20,05 µ g/ml
S10,025µ g/ml.
7. PREPARAZIONE DELL'ESTRATTO
7.1.Estrazione
7.1.1.Concentrati, premiscele ed alimenti minerali
Pesare una quantità di campione dell'ordine di 2,0—5,0 g; addizionare
150 mg circa di acido ascorbico (4.13). Omogeneizzare con 150 ml di
metanolo al 50 % (4.5) in una beuta (5.3) e portare il pH a 8,1—8,2
aggiungendo 400 mg circa di tris(idrossimetil)aminometano (4.7). Veri-
ficare il pH con le cartine indicatrici (4.12). Lasciar riposare per 15
minuti, portare di nuovo il pH a 8,1—8,2 con ulteriore aggiunta di
tris(idrossimetil)aminometano (4.7), poi far bollire per 10 minuti a
riflusso (5.4), agitando continuamente. Lasciar raffreddare, poi centrifu-
gare e decantare l'estratto.
7.1.2.Altri alimenti
Pesare una quantità di campione dell'ordine di 5,0—30,0 g, contenente
almeno 30 g di flavofosfolipol. Omogeneizzare con 150 ml di metanolo
al 50 % (4.5) in una beuta (5.3) e portare il pH a 8,1—8,2 aggiungendo
400 mg circa di tris(idrossimetil)aminometano (4.7). Controllare il pH
con le cartine indicatrici (4.12). Lasciar riposare per 15 minuti, portare
di nuovo il pH a 8,1—8,2 per ulteriore aggiunta di tris (idrossimetil)
aminometano (4.7) e far poi bollire per 10 minuti a riflusso (5.4),
agitando continuamente. Lasciar raffreddare, poi centrifugare e decan-
tare l'estratto.
7.2.Purificazione(questoprocedimentopuòessereomessopericoncen-
trati,lepremiscele eglialimenti minerali)
Miscelare 110 ml dell'estratto con 11 g dello scambiatore di cationi
(4.9); far bollire per un minuto a riflusso (5.4) agitando continuamente.
Separare la resina a scambio canonico per centrifugazione o filtrazione.
Miscelare 100 ml dell'estratto con 150 ml di metanolo (4.4) e lasciar
riposare la soluzione da 12 a 15 ore a 4 ºC. Eliminare il materiale floc-
culato per filtrazione a freddo.
Introdurre un tampone di lana di vetro (4.11) nell'estremità inferiore
della colonna (5.1), versare nella stessa 5 ml di resina a scambio anio-
nico (4.10) e lavarlo con 100 ml di metanolo all'80 % (4.6). Mediante
l'imbuto (5.2) travasare poi nella colonna un volume di filtrato, pari ad
almeno 100 ml, che contenga presumibilmente 16 µg di flavofosfolipol
(200 ml per un campione di 30 g di alimento contenente 1 ppm). Prima
di travasare il filtrato nella colonna, diluirlo se necessario con metanolo
all'80 % (4.6) in modo da ottenere una concentrazione presunta di
flavofosfolipol pari a 16 µ g in 100 ml. Far in modo che il liquido
defluisca a una velocità di 2 ml circa al minuto. Eliminare tutto il
filtrato. Lavare poi la colonna con 50 ml di metanolo all'80 % (4.6) ed
eliminare il filtrato.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
Eluire il flavofosfolipol con la soluzione metanolica di cloruro di
potassio (4.8), mantenendo la velocità di deflusso sui 2 ml al minuto.
Raccogliere 50 ml, di eluato in un recipente graduato, aggiungere
30 ml d'acqua ed omogeneizzare. Il tenore in flavofosfolipol di questa
soluzione dovrebbe essere di 0,2 µg/ml (= U8).
7.3.Soluzionidell'estratto
Se necessario (particolarmente nei casi in cui è stata omessa la purifica-
zione), diluire l'estratto ottenuto secondo il punto 7.1.1 con metanolo al
50 % (4.5), in modo da ottenere una concentrazione presunta in flavo-
fosfolipol pari a 0,2 µg/ml (= U8).
Partendo dalla soluzione U8, preparare con diluizioni successive (1:1)
con metanolo al 50 % (4.5) le soluzioni U4(concentrazione presunta:
0,1 µg/ml), U2(concentrazione presunta: 0,05 µg/ml) ed U1(concentra-
zione presunta: 0,025 µg/mlg.).
8. MODALITÀ DI DOSAGGIO
8.1.Inoculazionedelterrenodicoltura
Con la sospensione batterica (3.2) insemenzare a 50 ºC circa il terreno
di base del dosaggio (4.2.2). Mediante saggi preliminari su piastra col
terreno (4.2.2), determinare la quantità di sospensione batterica che
consente di ottenere, per le differenti concentrazioni di flavofosfolipol,
zone di inibizione che abbiano la maggiore estensione possibile e che
siano ancora nette (circa 30 ml per litro).
8.2.Preparazione dellepiastre
La diffusione in agar si effettua su piastre, con le quattro concentrazioni
della soluzione di riferimento (S8,S4,S2,S1) e le quattro concentrazioni
dell'estratto (U8,U4,U2,U1). Ogni piastradeve necessariamente conte-
nere le quattro concentrazioni delle sostanze di riferimento e
dell'estratto. A tale scopo, impiegare piastre di dimensioni tali che
possano contenere nel terreno agarizzato almeno 8 pozzetti del diametro
di 10—13 mm, i cui centri non siano distanti fra loro meno di 30 m. Si
possono utilizzare come piastre delle lastre di vetro piane, provviste di
un anello di alluminio o di materia plastica del diametro di 200 mm e
dell'altezza di 20 mm.
Versare nelle piastre una quantità del terreno (4.2.1) che permetta di
ottenere uno strato dello spessore di 1,5 mm circa (45 ml per una
piastra da 200 mm di diametro). Lasciar solidificare ed aggiungere una
quantità di terreno (4.2.2), insemenzata come indicato ad 8.1, che
permetta di ottenere uno strato dello spessore di 1 mm (30 ml per una
scatola da 200 mm di diametro). Lasciar solidificare, praticare i pozzetti
e deporvi dei volumi esattamente misurati della soluzione di riferimento
e dell'estratto (da 0,10 a 0,15 ml per pozzetto a seconda del diametro).
Le operazioni descritte vanno ripetute almeno quattro volte per ogni
concentrazione, in modo da ottenere per ciascuna determinazione 32
aloni di inibizione.
8.3.Incubazione
Incubare le piastre per 16—18 ore alla temperatura di 28—30 ºC.
9. VALUTAZIONE
Misurare il diametro delle zone di inibizione con l'approssimazione di
0,1 mm. Per ogni concentrazione, registrare le misure medie su carta
semilogaritmica riportando il logaritmo delle concentrazioni in funzione
del diametro delle zone di inibizione. Tracciare le rette più appropriate
per la soluzione di riferimento e per l'estratto, procedendo ad esempio
come segue.
Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della solu-
zione di riferimento (SL) mediante la formula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della
soluzione di riferimento (SH) mediante la formula:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
101978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l'estratto al
livello più basso (UL) ed al livello più alto (UH), sostituendo nelle
formule sopra riportate i valori di S1,S2,S4ed S8con quelli di U1,U2,
U4ed U8.
Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico. Congiungendo i due
punti si ottiene la retta più appropriata per la soluzione standard. Proce-
dendo allo stesso modo per UL ed UH si ottiene la retta più appropriata
per l'estratto.
In mancanza di interferenze le rette dovrebbero essere parallele. In
pratica, esse sono considerate parallele allorché SH—SL ed UH—UL
non differiscono più del 10 % della loro media.
Se le rette non sono parallele, è possibile eliminare sia U1ed S1, sia U8eS8. I valori SL, SH, UL ed UH che permettono di ottenere le rette più
appropriate vanno allora calcolati mediante le formule seguenti:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6o5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6o5S8þ2S4/C0S2
6
e mediante formule analoghe per UL ed UH. Se si utilizza quest'alter-
nativa, bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo sopra
descritto. Se il risultato è stato ottenuto a partire da tre punti, ciò va
indicato nel certificato di analisi.
Quando le rette sono considerate parallele, calcolare il logaritmo
dell'attività relativa (log. A) con una delle formule seguenti:
Per 4 punti
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Per 3 punti
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Attività reale = attività presunta × attività relativa.
Allorché le rette non sono considerate parallele, ripetere la determina-
zione. Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile
ottenere il parallelismo, calcolare il logaritmo dell'attività relativa (log.
A) mediante la formula (c). Il risultato ottenuto dovrà tuttavia essere
considerato approssimativo: ciò dovrà risultare dal certificato di analisi.
10. RIPETIBILITÀ
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso
campione dallo stesso analista non dovrebbe eccedere:
0,5 mg/kg, in valore assoluto, per i tenori in flavofosfolipol da 1 a 2 mg/
kg;
il 25 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 2 mg/kg e fino a
10 mg/kg;
il 20 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 10 mg/kg e fino
a 25 mg/kg;
5 mg/kg, in valore assoluto, per i tenori superiori a 25 mg/kg e fino a
50 mg/kg:
il 10 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 50 mg/kg.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
3.DETERMINAZIONE DEGLI OLIGOELEMENTI FERRO, RAME,
MANGANESEEZINCO
1. OGGETTO E CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo permette di determinare gli oligoelementi ferro,
rame, manganese e zinco contenuti negli alimenti per animali. I limiti
inferiori di determinazione sono i seguenti:
ferro (FE): 20 mg/kg,
rame (Cu): 10 mg/kg,
manganese (Mn): 20 mg/kg,
zinco (Zn): 20 mg/kg.
2. PRINCIPIO
Il campione viene disciolto in acido cloridrico dopo distruzione delle
sostanze organiche eventualmente presenti. La determinazione del ferro,
del rame, del manganese e dello zinco viene effettuata, dopo opportuna
diluizione, mediante spettrometria di assorbimento atomico.
3. REATTIVI
Osservazionipreliminari
Per la preparazione dei reattivi e delle soluzioni analitiche va impiegata
acqua esente dai cationi da determinare, preparata o per doppia distilla-
zione dell'acqua su vetro al borosilicato o di quarzo o per doppio
passaggio su resine a scambio ionico.
I reattivi debbono essere di purezza almeno «analitica» (p.a.). L'assenza
dell'elemento da determinare deve essere controllata mediante una
prova in bianco.
Se necessario, i reattivi dovranno essere ulteriormente purificati.
In luogo delle soluzioni standard appresso elencate è possibile impie-
gare soluzioni standard del commercio purché fornite di garanzia e
controllate prima dell'uso.
3.1. Acido cloridrico p.a., d = 1,19.
3.2. Acido cloridrico p.a., 6 N.
3.3. Acido cloridrico p.a., 0,5 N.
3.4. Acido fluoridrico al 38—40 % (v/v), con un contenuto in ferro inferiore
ad 1 mg Fe/l ed un residuo all'evaporazione (espresso in solfati) infe-
riore a 10 mg/1.
3.5. Acido solforico p.a., d = 1,84.3.6. Acqua ossigenata p.a., a 100 volumi circa di ossigeno (30 % in peso).
3.7. Soluzione standard di ferro (1 000 µg Fe/ml): sciogliere 1 g di fil di
ferro p.a. in 200 ml di acido cloridrico 6 N (3.2), aggiungere 16 ml di
acqua ossigenata (3.6) e portare ad un litro con acqua.
3.7.1. Soluzione standard diluita (100 µg Fe/ml): diluire un volume della solu-
zione standard (3.7) con 9 volumi d'acqua.
3.8. Soluzione standard di rame (1 000 µg Cu/ml): sciogliere 1 g di rame in
polvere (p.a.) in 25 ml di acido cloridrico 6 N (3.2), aggiungere 5 ml di
acqua ossigenata (3.6) e portare ad 1 litro con acqua.
3.8.1. Soluzione standard diluita (10 µg Cu/ml): diluire 1 volume della solu-
zione standard (3.8.) con 9 volumi d'acqua, poi ridiluire 1 volume della
soluzione ottenuta con 9 volumi d'acqua.
3.9. Soluzione standard di manganese(1 000 µg Mn/ml): sciogliere 1 g di
manganese in polvere (p.a.) in 25 ml di acido cloridrico 6 N (3.2) e
partare ad 1 litro con acqua.
3.9.1. Soluzione standard diluita (10 µg Mn/ml): diluire 1 volume della solu-
zione standard (3.9) con 9 volumi d'acqua, poi ridiluire 1 volume della
soluzione ottenuta con 9 volumi d'acqua.
3.10. Soluzione standard di zinco (1 000 µg Zn/ml): sciogliere 1 g di zinco in
lamine o in fogli (p.a.) in 25 ml di acido cloridrico 6 N (3.2) e portare
ad 1 litro con acqua.
3.10.1. Soluzione standard diluita (10 µg Zn/ml): diluire 1 volume della solu-
zione standard (3.10) con 9 volumi d'acqua, poi ridiluire 1 volume
della soluzione ottenuta con 9 volumi d'acqua.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
3.11. Soluzione di cloruro di lantanio: sciogliere 12 g di ossido di lantanio in
150 ml d'acqua, aggiungere 100 ml di acido cloridrico 6 N (3.2) e
portare ad 1 litro con acqua.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Muffola a temperatura regolabile e controllata.
4.2. Vetreria resistente in borosilicato; si raccomanda di riservarla esclusiva-
mente alla determinazione degli oligoelementi.
4.3. Capsula di platino e crogiuolo di quarzo (quest'ultimo facoltativo).
4.4. Spettrofotometro di assorbimento atomico, corrispondente alle esigenze
del metodo per quanto riguarda la sensibilità e la precisione nell'inter-
vallo delle misurazioni richieste.
5. MODO DI OPERARE
5.1.Campionicontenentisostanzeorganiche
5.1.1.Incenerimento e preparazione della soluzione da analizzare (*)
(i) Porre 5—10 g di campione, pesato con l'approssimazione di 0,2 mg,
in una capsula di quarzo o di platino (4.3) [vedi nota (b)], essiccare
in stufa a 105 ºC ed introdurre la capsula nella muffola fredda
(4.1). Chiudere la muffola [vedi nota (c)] ed elevarne gradualmente
la temperatura in modo da raggiungere 450—475 ºC in 90 minuti
circa. Mantenere questa temperatura durante 4—16 ore (per
esempio durante la notte) in modo da eliminare la materia carbo-
niosa, poi aprire la muffola e lasciar raffreddare [vedi nota (d)].
Inumidire le ceneri con acqua e trasferirle in un becher da 250 ml.
Lavare bene la capsula con un totale di circa 5 ml di acido clori-
drico (3.1) e travasare lentamente ed accuratamente quest'ultimo
nel becher (si può avere un'energica reazione, per sviluppo di CO2.
Aggiungeregoccia a goccia acido cloridrico (3.1), agitando finché
l'effervescenza sia terminata. Evaporare a secchezza agitando ogni
tanto con un bacchetta di vetro.
Aggiungere al residuo 15 ml di acido cloridrico 6 N (3.2), seguiti
da circa 120 ml d'acqua. Rimescolare con la bacchetta di vetro, che
va lasciata nel becher, e coprire con un vetro da orologio. Portare la
soluzione a leggera ebollizione e mantenerla finché non si noti ulte-
riore dissoluzione delle ceneri. Filtrare su carta priva di ceneri e
raccogliere il filtrato in un matraccio tarato da 250 ml. Lavare il
becher ed il filtro prima con 5 ml di acido cloridrico 6 N caldo
(3.2), poi, per due volte, con acqua bollente. Portare a volume con
acqua (concentrazione dell'acido cloridrico: 0,5 N).
(ii) Se il residuo nel filtro è nero (presenza di carbone), rimetterlo nella
muffola ed incenerire di nuovo a 450—475 ºC. Questo inceneri-
mento, che richiede solo alcune ore (da 3 a 5 ore), è completo
allorché le ceneri appaiono bianche o quasi. Sciogliere di nuovo il
residuo con circa 2 ml di acido cloridrico (3.1), evaporare a
secchezza ed aggiungere 5 ml di acido cloridrico 6 N (3.2). Riscal-
dare la soluzione e filtrarla nel matraccio tarato e portare a volume
con acqua (concentrazione dell'acido cloridrico: 0,5 N circa).
Note
(a) Nella determinazione degli oligoelementi è importante ovviare ai
rischi di contaminazione, in particolare quella da zinco, rame e
ferro. L'attrezzatura impiegata nella preparazione dei campioni
deve quindi essere esente da tali metalli.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 12
(*) Nel foraggio verde (fresco od essiccato) possono essere presenti notevoli quantità di
silice vegetale, che è capace di trattenere gli oligoelementi e che va quindi eliminata.Ai campioni di tali prodotti va pertanto applicato il procedimento seguente. Eseguirele operazioni descritte al punto 5.1.1 (i), fino alla filtrazione. Lavare per due volte con
acqua bollente la carta da filtro contenente il residuo insolubile e porla in una capsula
di platino (4.3). Calcinare in muffola (4.1) a temperatura inferiore ai 550 ºC, fino ascomparsa completa delle sostanze carboniose. Lasciar raffreddare, aggiungerequalche goccia d'acqua, poi 10—15 ml di acido fluoridrico (3.4), quindi portare asecchezza a 150 ºC circa. Se nel residuo rimane ancora della silice, ridiscioglierla in
pochi ml di acido fluoridrico (3.4) e portare a secchezza. Aggiungere 5 gocce di acido
solforico (3.5) e riscaldare fino a scomparsa dei fumi bianchi. Addizionare 5 ml diacido cloridrico 6 N (3.2) e 30 ml circa d'acqua; riscaldare, filtrare la soluzione inun matraccio tarato da 250 ml e portare a volume con acqua (concentrazione dell'a-cido cloridico: 0,5 N circa). A questo punto, proseguire la determinazione a partire
dal punto 5.1.3.
▼B
Per ridurre i rischi generali di contaminazione, lavorare in ambiente
esente da polvere con apparecchiature scrupolosamente pulite e
vetreria accuratamente lavata. La determinazione dello zinco è
particolarmente sensibile a molti tipi di contaminazione, per
esempio quella dovuta alla vetreria, ai reattivi, alla polvere, ecc.
(b) La pesata del campione da incenerire va calcolata in funzione del
contenuto approssimativo in oligoelementi del mangime in esame
e della sensibilità dello spettrofotometro adoperato. Per taluni
alimenti per animali a basso tenore di oligoelementi può essere
necessario partire da un campione del peso di 10—20 g e limitare
a soli 100 ml il volume della soluzione finale.
(c) L'incenerimento deve essere effettuato in muffola chiusa, senza
insufflazione d'aria o di ossigeno.
(d) La temperatura indicata dal pirometro non deve superare i 475 ºC.
5.1.2.Determinazione spettrofotometrica
5.1.2.1. Preparazione delle soluzioni per la curva di taratura.
Per ciascun oligoelemento da dosare, preparare una serie di soluzioni di
taratura a partire dalle soluzioni standard diluite 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 e
3.10.1, in modo che la concentrazione dell'acido cloridrico in ciascuna
di esse sia all'incirca 0,5 N, e, nel caso del ferro, del manganese e dello
zinco, la concentrazione del cloruro di lantanio corrisponda allo 0,1 %
di La (v/v). Le concentrazioni prescelte per gli oligoelementi debbono
trovarsi nell'intervallo di sensibilità dello spettrofotometro utilizzato. Le
tabelle seguenti riportano, a titolo di esempio, alcuni tipi di composi-
zione delle soluzioni di taratura; nondimeno a seconda del tipo e della
sensibilità dello spettrofotometro impiegato potrà essere necessario
scegliere altre concentrazioni.
Ferro
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml di soluzione
standard diluita
(3.7.1)
(1 ml = 100 µg/Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio (3.11); portare a 100 ml con
acqua.
Rame
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml di soluzione
standard diluita
(3.8.1)
(1 ml = 10 µg/Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Portare a 1 000 ml con acqua.
Manganese
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml di soluzione
standard diluita
(3.9.1)0124681 0
(1 ml = 10 µg Mn)
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio (3.11); portare a 100 ml con
acqua.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
Zinco
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml di soluzione
standard diluita
(3.10.1)0 0,5 1 2 4 6 8
(1 ml = 10 µg Zn)
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio (3.11); portare a 100 ml con
acqua.
5.1.2.2. Preparazione della soluzione da analizzare
Per il dosaggio del rame, la soluzione preparata secondo quanto indi-
cato al punto 5.1.1 può in linea generale essere utilizzata direttamente.
Se è necessario portare la sua concentrazione nell'intervallo di quelle
delle soluzioni di taratura, un'aliquota di essa può essere prelevata e
portata a volume in un pallone tarato da 100 ml con acido cloridrico
0,5 N (3.3).
Per il dosaggio del ferro, del manganese e dello zinco, pipettare un'ali-
quota della soluzione adoperata secondo 5.1.1 in un pallone tarato da
100 ml; aggiungere 10 ml di soluzione di cloruro di lantanio (3.11) e
portare a volume con acido cloridrico 0,5 N (3.3) (vedi anche punto 8,
«osservazione»).
5.1.2.3. Prova in bianco
Effettuare una prova in bianco comprendente tutte le operazioni
prescritte nel procedimento, escludendo la sola presenza del campione.
La soluzione di taratura «O» non deve essere utilizzata come «bianco».
5.1.2.4. Misurazione dell'assorbimento atomico
Misurare l'assorbimento delle soluzioni di taratura e della soluzione da
analizzare, impiegando una fiamma ossidante aria-acetilene, alle
lunghezze d'onda seguenti:
Fe: 248,3 nm,
Cu: 324,8 nm,Mn: 279,5 nm,Zn: 213,8 nm.
Ripetere ogni misurazione quattro volte.
5.2.Mangimiminerali
In assenza di materiali organici, l'incenerimento preliminare è super-
fluo. Operare come descritto al punto 5.1.1 (i), a partire dal secondo
paragrafo. L'evaporazione in presenza di acido fluoridrico può essere
tralasciata.
6. CALCOLO DEI RISULTATI
Dalla curva di taratura, calcolare la concentrazione degli oligoelementi
nella soluzione in esame ed esprimere il risultato in mg di oligoele-
mento per kg di campione (ppm).
7. RIPETIBILITÀ
La differenza fra i risultati di due determinazioni parallele effettuate
sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe eccedere:
— 5 mg/kg, in valore assoluto, per i tenori in oligoelementi fino a
50 mg/kg;
— il 10 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 50 e fino a
100 mg/kg;
— 10 mg/kg, in valore assoluto, per i tenori superiori a 100 e fino a
200 mg/kg;
— il 5 % del risultato più elevato per i tenori superiori a 200 mg/kg.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
8. OSSERVAZIONE
La presenza di elevate quantità di fosfati può interferire nel dosaggio
del ferro, del manganese e dello zinco. Si può ovviare a questa interfe-
renza aggiungendo opportune quantità di soluzione di cloruro di
lantanio (3.11). Se tuttavia nel campione il rapporto ponderale è
CaþMg
P>2;si può tralasciare l'aggiunta di soluzione di cloruro di
lantanio sia alla soluzione in esame che alle soluzioni di taratura.1978L0633 — IT — 19.08.1981 — 001.001 — 15