Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni  
►B REGOLAMENTO (CE) N. 440/2008 DELLA COMMISSIONE  
del 30 maggio 2008  
che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento 
europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la 
restrizione delle sostanze chimiche (REACH)  
(Testo rilevante ai fini del SEE)  
(GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1)  
Modificato da:  
Gazzetta ufficiale  
n. pag.  data  
►M1 Regolamento (CE) n. 761/2009 della Commissione del 23 luglio 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Regolamento (UE) n. 1152/2010 della Commissione dell’8 dicembre 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Regolamento (UE) n. 640/2012 della Commissione del 6 luglio 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Regolamento (UE) n. 260/2014 della Commissione del 24 gennaio 
2014  L 81  1  19.3.2014  
Rettificato da:  
►C1 Rettifica, GU L 11 del 16.1.2014, pag. 12 (440/2008)  2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1
REGOLAMENTO (CE) N. 440/2008 DELLA COMMISSIONE  
del 30 maggio 2008  
che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) 
n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle 
sostanze chimiche (REACH)
 
(Testo rilevante ai fini del SEE)  
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,  
visto il trattato che istituisce la Comunità europea,  
visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del 
Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valu ­
tazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (RE ­
ACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che 
modifica la direttiva 1999/45/CE e abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Com ­
missione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (
 1 ) e, in particolare, l'articolo 13, paragrafo 3, del medesi ­
mo, 
considerando quanto segue:  
(1) A norma del regolamento (CE) n. 1907/2006, ai fini dello svol ­
gimento di test sulle sostanze occorre adottare metodi di prova a livello comunitario qualora tali test siano finalizzati ad acquisire informazioni sulle proprietà intrinseche delle sostanze.
 
(2) La direttiva 67/548/CEE del Consiglio, del 27 giugno 1967, con ­
cernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regola ­
mentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballag ­
gio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (  2 ) istituiva, all'al ­
legato V, i metodi per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze e dei preparati. L'allegato V della direttiva 67/548/CEE è stato soppresso dalla direttiva 2006/121/CE del Parlamento europeo e del Consiglio a decorrere dal 1
 o giugno 2008.  
(3) I metodi di prova contenuti nell'allegato V della direttiva 
67/548/CEE devono essere integrati nel presente regolamento.  
(4) Questo regolamento non esclude l'uso di altri metodi di prova, a 
condizione che il loro uso sia conforme all'articolo 13, paragrafo 3, del regolamento (CE) n. 1907/2006.  ▼
B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 2  
( 1 ) GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1, rettifica nella GU L 136 del 29.5.2007, 
pag. 3. 
( 2 ) GU 196 del 16.8.1967, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 
2006/121/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, rettifica nella GU 
L 136 del 29.5.2007, pag. 281, (GU L 396 del 30.12.2006, pag. 850) [ da 
aggiornare con i riferimenti corretti al momento della pubblicazione del 30
 o adeguamento al progresso tecnico ].
 (5) Nella concezione dei metodi di prova occorre tener conto dei 
principi finalizzati a rimpiazzare, ridurre e raffinare le tecniche per l'uso degli animali nelle procedure, in particolare quando diventano disponibili opportuni metodi convalidati per sostituire, ridurre o raffinare la sperimentazione sugli animali.
 
(6) Le disposizioni di cui al presente regolamento sono conformi al 
parere del comitato istituito dall'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,
 
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:  
Articolo 1  
I metodi di prova applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006 
sono definiti nell'allegato al presente regolamento.  
Articolo 2  
La Commissione riesamina, ove opportuno, i metodi di prova contenuti 
nel presente regolamento al fine di sostituire, ridurre o raffinare i test sugli animali vertebrati.
 
Articolo 3  
I riferimenti all'allegato V della direttiva 67/548/CEE si intendono fatti 
al presente regolamento.  
Articolo 4  
Il presente regolamento entra in vigore il giorno successivo alla pub ­
blicazione nella  Gazzetta ufficiale dell'Unione europea . 
Esso si applica a decorrere dal 1  o giugno 2008.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 3
 
ALLEGATO  
PARTE A: METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLE PROPRIETÀ 
FISICO-CHIMICHE  
INDICE 
A.1. TEMPERATURA DI FUSIONE/CONGELAMENTO 
A.2. TEMPERATURA DI EBOLLIZIONE 
A.3. DENSITÀ RELATIVA 
A.4. TENSIONE DI VAPORE A.5. TENSIONE SUPERFICIALE 
A.6. IDROSOLUBILITÀ 
A.8. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE A.9. PUNTO D'INFIAMMABILITÀ 
A.10. INFIAMMABILITÀ (SOLIDI) 
A.ll INFIAMMABILITÀ (GAS) A.12 INFIAMMABILITÀ (CONTATTO CON L'ACQUA) A.13 PROPRIETÀ PIROFORICHE DI SOLIDI E LIQUIDI 
A.14 PROPRIETÀ ESPLOSIVE 
A.15 TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE (LIQUIDI E GAS) A.16 TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE RELATIVA DEI 
SOLIDI 
A.17 PROPRIETÀ OSSIDANTI (SOLIDI) 
A.18. PESO MOLECOLARE MEDIO NUMERICO E DISTRIBU ­
ZIONE DEL PESO MOLECOLARE DI POLIMERI 
A.19. CONTENUTO DI FRAZIONI A BASSO PESO MOLECOLARE 
IN POLIMERI 
A.20. COMPORTAMENTO DI SOLUZIONE/ESTRAZIONE DEI PO ­
LIMERI IN ACQUA 
A.21. PROPRIETÀ COMBURENTI (LIQUIDI) 
A.22. DIAMETRO GEOMETRICO MEDIO DELLE FIBRE PONDE ­
RATO RISPETTO ALLA LUNGHEZZA
 
▼M4 
A.23. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (1-OTTANOLO/ACQUA): 
METODO DELL’AGITAZIONE LENTA  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 4
 
A.1. TEMPERATURA DI FUSIONE/CONGELAMENTO  
1. METODO  
La maggior parte dei metodi descritti si basano sulle linee diret ­
trici OCSE (1). I principi fondamentali sono riportati nei riferi ­
menti (2) e (3).  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi e le apparecchiature qui illustrati si applicano alla determi ­
nazione della temperatura di fusione di sostanze senza alcuna limi ­
tazione rispetto al loro grado di purezza.  
La scelta del metodo più idoneo dipende dalla natura delle sostanze in 
esame. Di conseguenza, il fattore limitante sarà inerente ai fatto che la 
sostanza sia facilmente, difficilmente o per nulla polverizzabile.  
Per alcune sostanze, la determinazione della temperatura di congela ­
mento o di solidificazione risulta più appropriata e pertanto in questo 
metodo sono state incluse anche le norme per queste determinazioni.  
Dove, a motivo delle particolari proprietà della sostanza, non sia 
possibile misurare in modo adatto alcuni dei parametri suddetti, 
può essere appropriato un punto di scorrimento.  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
La temperatura di fusione è definita come la temperatura alla quale si 
verifica la transizione di fase dallo stato solido allo stato liquido a 
pressione atmosferica, e questa temperatura nel caso ideale corri ­
sponde alla temperatura di congelamento.  
Poiché per molte sostanze la transizione di fase si verifica in un 
intervallo di temperatura ampio, questo viene spesso descritto come intervallo di fusione.
 
Conversione delle unità (da K a  o C): 
t = T - 273,15  
t: temperatura Celsius, gradi Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinamica, kelvin (K)  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si 
esamina una nuova sostanza. Esse devono principalmente venire 
impiegate per controllare periodicamente i risultati ottenuti col me ­
todo e per permettere confronti con i risultati ottenuti con altri me ­
todi. 
Alcune sostanze di riferimento sono elencate nel riferimento biblio ­
grafico (4).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 5
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Si determina la temperatura (o l’intervallo di temperatura) della tran ­
sizione di fase dallo stato solido allo stato liquido o dallo stato liquido allo stato solido. In pratica si determina la temperatura di 
fusione/congelamento incipiente e di fusione/congelamento finale 
curante il riscaldamento/raffreddamento di un campione della so ­
stanza in esame a pressione atmosferica. Sona descritti 5 metodi, e precisamente il metodo del capillare, il metodo degli elementi riscal ­
danti, la determinazione del punto di congelamento, i metodi di 
analisi termica e la determinazione del punto di scorrimento (come è stata sviluppata per gli olii di origine petrolifera).
 
In alcuni casi, può essere conveniente misurare la temperatura di 
congelamento invece della temperatura di fusione.  
1.4.1.  Metodo del capillare  
1.4.1.1.  Apparecchi per la determinazione del punto di fusione tramite bagno 
liquido  
Una piccola quantità della sostanza finemente macinata viene intro ­
dotta in un tubo capillare e compattata fortemente. Il tubo viene 
riscaldato, insieme ad un termometro, e l'aumento di temperatura viene regolato in modo che sia inferiore a circa 1 K/min durante la fusione propriamente detta. Si determinano quindi le temperature 
iniziale e finale di fusione.
 
1.4.1.2.  Apparecchi per la determinazione del punto di fusione a blocco 
metallico  
Si procede come indicato al punto 1.4.1.1, salvo il fatto che i tubo 
capillare ed il termometro sono collocati in un blocco di metallo 
riscaldante, attraverso alcuni fori del quale è possibile la loro osser ­
vazione.  
1.4.1.3.  Determinazione tramite fotocellula  
Il campione contenuto nel tubo capillare viene riscaldato auto ­
maticamente in un cilindro metallico. Attraverso un foro prati ­
cato nel cilindro un raggio luminoso viene convogliato sulla 
sostanza e raggiunge poi una fotocellula accuratamente tarata. 
Per la maggior parte delle sostanze le proprietà ottiche si mo ­
dificano durante la fusione, passando dall'opacità alla trasparenza. 
L'intensità della luce che raggiunge la fotocellula aumenta fino 
ad inviare un segnale di arresto all'indicatore numerico di un termometro a resistenza di platino collocato nella camera di riscaldamento. Questo metodo non è adatto per alcune sostanze 
fortemente colorate.
 
1.4.2.  Elementi riscaldanti  
1.4.2.1.  Banco riscaldante di Kofler  
Il banco riscaldante di Kofler fa uso di due corpi metallici di 
diversa conducibilità termica, riscaldati elettricamente; la sbarra è progettata in modo tale che per tutta la sua lunghezza il gra ­
diente di temperatura è virtualmente costante. La temperatura 
dell'elemento riscaldante può variare da 283 K a 573 K; essa viene letta su un apposito strumento costituito da un cursore provvisto di indice e di linguetta specificamente realizzati per 
ogni banco. Per determinare una temperatura di fusione, la so ­
stanza viene distribuita in uno strato sottile direttamente sulla superficie dell'elemento riscaldante. In pochi secondi appare una linea di separazione netta tra la fase solida e quella liquida. La 
temperatura corrispondente a questa linea di separazione viene 
letta facendovi coincidere l'indice dello strumento.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 6
 
1.4.2.2.  Microscopio di fusione  
Numerosi sono gli elementi riscaldanti forniti di microscopio utiliz ­
zati per la determinazione del punto di fusione con quantità molto piccole di materiale. Nella maggioranza di questi strumenti, la tem ­
peratura viene determinata mediante una termocoppia sensibile, ma 
talvolta si usano anche termometri a mercurio. La versione tipica di un apparecchio per la determinazione del punto di fusione ad ele ­
mento riscaldante con microscopio è dotata di una camera di riscal ­
damento contenerne una piastra metallica sopra la quale si pone il 
campione, distribuito su un vetrino. Al centro della piastra metallica si trova un foro che permette il passaggio della luce proveniente 
dallo specchio di illuminazione del microscopio. Durante la misura 
la camera viene chiusa da una piastra di vetro in modo da escludere l'aria dalla zona del campione.
 
Il riscaldamento del campione è regolato da un reostato. Per misure 
di grande precisione e nel caso di sostanze otticamente anisotrope, si può utilizzare luce polarizzata.
 
1.4.2.3.  Metodo del menisco  
Questo metodo è specifico per le poliammidi.  
Si determina visivamente la temperatura alla quale si verifica lo 
spostamento di un menisco di olio siliconico compreso tra un ele ­
mento riscaldante e un copri-oggetti sostenuto dal campione di po ­
liammide in esame.  
1.4.3  Metodo per determinare la temperatura di congelamento  
Il campione viene posto in una provetta speciale e inserito in 
un apparecchio per la determinazione della temperatura di con ­
gelamento. Il campione viene agitato con delicatezza e conti ­
nuità durante il raffreddamentoe la temperatura viene misurata ad intervalli adatti. Non appena la temperatura si mantiene 
costante per qualche lettura, si registra tale temperatura (cor ­
retta per l'errore termometrico) come temperatura di congela ­
mento.
 
Si deve evitare un sovraraffreddamento mantenendo l'equilibrio tra le 
fasi solida e liquida.  
1.4.4.  Analisi termica  
1.4.4.1.  Analisi termica differenziale (ATD)  
Questa tecnica registra la differenza di temperatura tra la sostanza e 
un materiale di riferimento in funzione della temperatura stessa men ­
tre la sostanza e il materiale di riferimento sono sottoposti allo stesso 
programma controllato di temperatura. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di entalpia, tale varia ­
zione è indicata da una deviazione endotermica (fusione) o esoter ­
mica (congelamento) dalla linea di base del tracciato della tempera ­
tura.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 7
 
1.4.4.2.  Calorimetria differenziale a scansione (CDS)  
Questa tecnica registra la differenza tra l'energia introdotta in una 
sostanza e quella introdotta in un materiale di riferimento, in fun ­
zione della temperatura, mentre la sostanza e il materiale di riferi ­
mento sono sottoposti allo stesso programma controllato di tempera ­
tura. Questa energia è l'energia necessaria per mantenere nulla la differenza di temperatura tra la sostanza e il materiale di riferimento. Quando il campione subisce una transizione che implica una varia ­
zione di entalpia, tale variazione è indicata da una deviazione endo ­
termica (fusione) o esotermica (congelamento) dalla linea di base del tracciato del flusso termico.
 
1.4.5.  Punto di scorrimento  
Questo metodo è stato sviluppato per l'uso con gli olii di origine 
petrolifera ed è adatto per l'uso con sostanze oleose aventi una bassa 
temperatura di fusione.  
Dopo un riscaldamento preliminare, il campione viene raffreddato ad 
una velocità specifica mentre, ad intervalli di 3 K, se ne esaminano le caratteristiche di scorrimento. La temperatura più bassa alla quale si osserva un movimento della sostanza viene registrata come punto 
di scorrimento.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
L'applicabilità e l'accuratezza dei vari metodi impiegati per la deter ­
minazione della temperatura di fusione/intervallo di fusione sono indicate nella seguente tabella.
 
TABELLA: APPLICABILITÀ DEI METODI  
A. Metodi con impiego di capillare  
Metodo di misura Sostanze polve ­
rizzabili Sostanze difficil ­
mente polverizza ­
bili Intervallo di tem ­
peratura Accuratezza 
stimata (  1 ) Norme esistenti  
Apparecchi per il 
punto di fusione a 
bagno liquido Sì Soltanto per al ­
cune Da 273 a 
573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Apparecchi per il 
punto di fusione 
con blocco metal ­
lico Sì Soltanto per al ­
cune Da 293 a > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Determinazione 
con fotocellula Sì Svariate, con 
uso di accessori Da 253 a 
573 K ± 0,5 K  
( 1 ) In funzione del tipo di strumento e del grado di purezza della sostanza.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 8
 
B. Metodi con impiego di elementi riscaldanti e metodi di congelamento  
Metodo di misura Sostanze polve ­
rizzabili Sostanze difficil ­
mente polverizza ­
bili Intervallo di tem ­
peratura Accuratezza 
stimata (  1 ) Norme esistenti  
Banco riscaldante 
di Kofler Sì No Da 283 a > 
573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
345176 
Microscopio di 
fusione Sì Soltanto per al ­
cune Da 273 a > 
573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Metodo del meni ­
sco No Specifico per le 
poliammidi Da 293 a > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Metodo del punto 
di congelamento Sì Sì Da 223 a 
573 K ± 0,5 K per esempio BS 
4695  
( 1 ) In funzione del tipo di strumento e del grado di purezza della sostanza.  
C. Analisi termica  
Metodo di misura Sostanze polve ­
rizzabili Sostarne difficil ­
mente polverizza ­
bili Intervallo di tem ­
peratura Accuratezza 
stimata (  1 ) Norme esistenti  
Analisi termica 
differenziale Sì Sì Da 173 a 
1 273 K Fino a 600 K 
± 0,5 K Fino a 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 53776 
Calorimetria diffe ­
renziate a scan ­
sione Sì Sì Da 173 a 
1 273 K Fino a 600 K 
± 0,5 K Fino a 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 53776  
( 1 ) In funzione del tipo di strumento e del grado di purezza della sostanza  
D. Punto di scorrimento  
Metodo di misura Sostanze polve ­
rizzabili Sostanze difficil ­
mente polverizza ­
bili Intervallo di tem ­
peratura Accuratezza 
stimata (  1 ) Norme esistenti  
Punto di scorri ­
mento Per olii di 
origine petro ­
lifera e so ­
stanze oleose Per olii di ori ­
gine petrolifera 
e sostanze 
oleose Da 223 a 
323 K ± 0,3 K ASTM D 9766  
( 1 ) In funzione del tipo di strumento e del grado di purezza della sostanza.  
1.6. DESCRIZIONE DEI METODI  
Le procedure relative a quasi tutti i metodi di determinazione sono 
state descritte in varie norme internazionali nazionali (vedi appen ­
dice 1).  
1.6.1.  Metodi con tubo capillare  
Quando vengono sottoposte ad un lento aumento di temperatura, 
sostanze finemente polverizzate mostrano solitamente gli stadi di 
fusione mostrati in figura 1.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 9
 
figura 1.
  
Durante la determinazione della temperatura di fusione viene regi ­
strata la temperatura all'inizio delia fusione e nello stadio finale.  
1.6.1.1.  Apparecchi per il punto di fusione a bagno liquido  
La figura 2 presenta un tipo di apparecchio normalizzato, realizzato 
in vetro, per la temperatura di fusione (JIS K0064): tutte le quote sono date in mm.
 
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 10
 
Bagno liquido:  
Si deve scegliere un liquido adatto. La scelta del liquido dipende 
dalla temperatura di fusione da determinare, per esempio paraffina 
liquida per temperature di fusione non superiori a 473 K, olio di silicone per temperature di fusione non maggiori di 573 K.
 
Per temperature di fusione superiori a 523 K, si può usare una 
miscela costituita da 3 parti di acido solforico e 2 parti di solfato 
di potassio (rapporto in peso). Se si usa una miscela di questo tipo 
occorre prendere opportune precauzioni.  
Termometro:  
Vanno impiegati soltanto termometri che soddisfano le prescrizioni 
delle norme ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001, o di norme 
equivalenti.  
ASTM E 1671, DIN 12770, JIS K 8001.  
Modalità operative:  
La sostanza secca va polverizzata finemente in un mortaio e posta in 
un tubo capillare, chiuso per fusione ad una estremità, in modo che, dopo assestamento nella maniera più compatta possibile, l'altezza del 
riempimento sia di 3 mm circa. Per ottenere un assestamento uni ­
forme del campione, il tubo capillare deve essere lasciato cadere attraverso una canna di vetro su un vetro da orologio da un'altezza di circa 700 mm.
 
Il capillare riempito viene posto nel bagno in modo tale che la parte 
centrale del bulbo del termometro a mercurio sia in contatto con il 
tubo capillare nella zona dove è collocato il campione. Il tubo ca ­
pillare viene di solito introdotto nell'apparecchio a temperatura infe ­
riore di circa 10 K a quella della temperatura di fusione.  
Il bagno liquido viene riscaldato in modo che l'aumento di tempera ­
tura corrisponda a circa 3 K/min. Il liquido va mantenuto sotto 
agitazione. A circa 10 K al di sotto della temperatura prevista di fusione, la velocità di incremento della temperatura va regolata ad un massimo di 1 K/min.
 
Calcolo:  
La temperatura fusione si calcola con la formula seguente:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E )n 
dove:  
T = temperatura di fusione corretta, in K,  
T D = temperatura letta sul termometro D, in K,  
T E = temperatura letta sul termometro E, in K,  
n = numero di graduazioni della colonnina di mercurio sul ter ­
mometro D sulla parte di stelo emergente.  
1.6.1.2.  Apparecchi per la temperatura di fusione con blocco metallico  
Apparecchiatura:  
La strumentazione consiste in:  
— un blocco cilindrico di metallo, la cui parte superiore è cava e 
forma una camera (vedi figura 3);  
— un tappo metallico provvisto di due o più fori per permettere 
l'inserimento dei tubi capillari nel blocco metallico;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 11
 
— un sistema di riscaldamento per il blocco metallico realizzato, per 
esempio, tramite una resistenza elettrica incorporata nel blocco;  
— un reostato per la regolazione della potenza applicata, se si fa uso 
del riscaldamento elettrico;  
— quattro finestre di vetro resistente al calore sulle pareti laterali 
della camera, disposte diametralmente ad angolo retto l'una ri ­
spetto all'altra. Di fronte ad una di esse è montato un oculare per 
l'osservazione del capillare. Le altre tre finestre vengono usate 
per illuminare l'interno per mezzo di lampade;  
— un capillare di vetro resistente al calore chiuso ad una estremità 
(vedi punto 1.6.1.1).  
Termometro:  
Vedi norme citate al punto 1.6.1.1. Possono utilizzarsi anche stru ­
menti di misura termoelettrici di analoga accuratezza.  
Figura 3
  
1.6.1.3.  Determinazione tramite fotocellula  
Apparecchiatura e modalità operative:  
La strumentazione consiste in una camera metallica con un sistema 
automatico di riscaldamento. Si riempiono tre capillari secondo le 
indicazioni del punto 1.6.1.1 e si pongono nella camera.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 12
 
Per la taratura dell'apparecchio sono disponibili diverse velocità di 
incremento lineare della temperatura e l'aumento di temperatura op ­
portuno viene regolato elettricamente su una velocità costante e li ­
neare preselezionata. La temperatura effettiva nel forno e la tempe ­
ratura della sostanza nei tubi capillari sono indicare da registratori.  
1.6.2.  Elementi riscaldanti  
1.6.2.1.  Banco riscaldante di Kofler  
Vedi appendice.  
1.6.2.2.  Microscopio di fusione  
Vedi appendice.  
1.6.2.3.  Metodo del menisco (per poliammidi)  
Vedi appendice.  
La velocità di riscaldamento nella zona di passaggio attraverso la 
temperatura di fusione deve essere inferiore a 1 K/min.  
1.6.3.  Metodi per la determinazione della temperatura di congelamento  
Vedi appendice.  
1.6.4.  Analisi termica  
1.6.4.1.  Analisi termica differenziale  
Vedi appendice.  
1.6.4.2.  Calorimetria differenziale a scansione  
Vedi appendice.  
1.6.5.  Determinazione del punto di scorrimento  
Vedi appendice.  
2. DATI  
In alcuni casi si rende necessaria una correzione della lettura termo ­
metrica.  
3. RELAZIONE  
La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni:  
— metodo utilizzato;  
— descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) ed even ­
tuale stadio preliminare di purificazione;  
— stima dell'accuratezza.  
Come temperatura di fusione viene riportata la media di almeno due 
misure che cadano nel campo di accuratezza stimata (vedi tabelle).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 13
 
Se la differenza tra la temperatura all'inizio e allo stadio finale della 
fusione ricade nei limiti di accuratezza del metodo, si prende come 
punto di fusione la temperatura dello stadio finale della fusione; altrimenti vengono riportate ambedue le temperature.
 
Se la sostanza si decompone o sublima prima del raggiungimento 
della temperatura di fusione, si riporterà la temperatura alla quale si 
osserva l'effetto.  
Devono essere riportate tutte le informazioni e osservazioni utili per 
l'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials, from national laboratories, Pure and applied chemi ­
stry, 1976, vol, 48, 505-515.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 14
 
Appendice  
Per ulteriori particolari tecnici, si possono consultare ad esempio le seguenti 
norme:  
1. Metodi basati sull'impiego di capillari  
1.1. Apparecchi per la determinazione del punto di fusione a bagno li ­
quido 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of mel ­
ting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2. Apparecchi per la determinazione della temperatura di fusione a 
blocco di metallo 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyarnides — determina ­
tion of «melting point»  
2. Apparecchi ed elementi riscaldanti  
2.1. Banco riscaldante di Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing; polymeric powder coatings  
2.2. Microscopio di fusione 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
2.3. Metodo del menisco (poliammidi) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyarnides — determina ­
tion of «melting point»  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 15
 
ANSI/ASTM D2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection; moulding and extrusion ma ­
terials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du «point de fusion». Méthode du mé ­
nisque  
3. Metodi per la determinazione della temperatura di congelamento  
BS 4633 Method for the determination of cry ­
stallizing point 
BS 4695 Method for determination of melting 
point of petroleum wax (Cooling Cur ­
ve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsauren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines 
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristalisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point  
4. Analisi termica  
4.1. Analisi termica differenziale 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Calorimetria differenziale a scansione 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Determinazione del punto di scorrimento  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monste ­
meming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 17
 
A.2. TEMPERATURA DI EBOLLIZIONE  
1. METODO  
La maggior parte dei metodi descritti sono basati sulle linee 
direttrici OCSE (1). I principi fondamentali sono riportati nei 
riferimenti (2) e (3).  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi e le apparecchiature qui illustrati possono essere applicati a 
sostanze liquide e a bassa temperatura di fusione, purché queste non siano soggette a reazioni chimiche al di sotto della temperatura di ebollizione (per esempio: autoossidazione, trasposizione, degradazio ­
ne, ecc.). I metodi possono essere applicati a sostanze liquide sia 
pure che impure.
 
Si dà particolare risalto ai metodi che utilizzano la determinazione 
tramite fotocellula e l'analisi termica perché questi metodi permet ­
tono la determinazione sia della temperatura di fusione che della 
temperatura di ebollizione. Inoltre, le misure possono essere eseguite in automatico.
 
Il «metodo dinamico» ha il vantaggio di poter essere applicato anche 
alla determinazione della tensione di vapore e di non richiedere la 
correzione della temperatura di ebollizione per riferirla alla pressione normale (101,325 kPa) dal momento che la pressione normale può essere regolata durante la misura mediante un manostato.
 
Osservazioni:  
L'influenza delle impurezze sulla determinazione della temperatura di 
ebollizione dipende in notevole misura dalla natura delle impurezze. Quando il campione contiene impurezze volatili che possono alterare i risultati, la sostanza può venire purificata.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
La temperatura di ebollizione normale è definita come la temperatura 
alla quale la tensione di vapore di un liquido è di 101,325 kPa.  
Se la temperatura di ebollizione non viene misurata alla pressione 
atmosferica normale, la dipendenza della tensione di vapore dalla temperatura può essere descritta mediante l'equazione di Clausius- 
Clapeyron:
 
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ cost : 
dove:  
p = tensione di vapore della sostanza in Pascal,  
Δ H v = calore di evaporazione in J mol  -1 , 
R = costante universale dei gas = 8,314 J mol  -1 K -1 , 
T = temperatura termodinamica in K.  
La temperatura di ebollizione è riferita alla pressione ambiente al 
momento della misura.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 18
 
Fattori di conversione  
Pressione (unità: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(«bar» è ancora ammissibile, ma non raccomandato).  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(le unità «mm Hg» e «Torr» non sono permesse).  
1 atm = atmosfera standard = 101 325 Pa 
(l'unità «atm» non è permessa).  
Temperatura (unità: K)  
t = T - 273,15  
t: temperatura Celsius, gradi Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinamica, Kelvin (K)  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento in tutti i casi in 
cui si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per controllare periodicamente l'accuratezza del metodo e per permettere 
un confronto coi risultati ottenuti con altri metodi.
 
Alcune sostanze di riferimento sono elencate nei metodi riportati in 
appendice.  
1.4. PRINCIPIO DEI METODI  
Cinque metodi per la determinazione della temperatura di ebollizione 
(intervallo di ebollizione) sono basati sulla misura della temperatura di ebollizione, altri due sono basati sull'analisi termica.
 
1.4.1.  Determinazione tramite ebulliometro  
Gli ebulliometri sono stati originariamente concepiti per la determi ­
nazione del peso molecolare tramite l'innalzamento della temperatura di ebollizione, ma si prestano anche per accurate misure della tem ­
peratura di ebollizione. Una apparecchiatura molto semplice è de ­
scritta nella norma ASTM D 1120-72 (vedi appendice). Con questo 
strumento il liquido viene riscaldato fino all'ebollizione in condizioni di equilibrio a pressione atmosferica.
 
1.4.2.  Metodo dinamico  
Questo metodo implica la misura della temperatura di ricondensa ­
zione del vapore mediante un appropriato termometro nella zona di 
riflusso durante l'ebollizione. Questo metodo permette di variare la pressione.
 
1.4.3.  Metodo della distillazione per la temperatura di ebollizione  
Il metodo si basa sulla distillazione del liquido e sulla misura della 
temperatura di ricondensazione del vapore con determinazione della 
quantità di distillato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 19
 
1.4.4.  Metodo di Siwoloboff  
Il campione viene riscaldato in una provetta immersa a sua volta nel 
liquido di un bagno riscaldante. Nella provetta contenente il cam ­
pione viene introdotto un capillare, chiuso per fusione ad un estremo 
e contenente una bollicina d'aria nella parte inferiore.  
1.4.5.  Determinazione tramite fotocellula  
Si impiega il metodo Siwoloboff, applicando tuttavia la misura fo ­
toelettrica della fase di emissione delle bollicine.  
1.4.6.  Analisi termica differenziale  
Questa tecnica registra la differenza di temperatura tra la sostanza e 
un materiale di riferimento, in funzione della temperatura, mentre la 
sostanza e il materiale di riferimento sono sottoposti allo stesso programma controllato di variazione della temperatura. Quando il campione subisce una transizione che implica una variazione di en ­
talpia, tale variazione è indicata da un allontanamento endotermico 
(ebollizione) dalla linea di base nella registrazione della temperatura.
 
1.4.7.  Calorimetria differenziale a scansione  
Questa tecnica registra la differenza di energia introdotta in una 
sostanza e in un materiale di riferimento in funzione della tempera ­
tura mentre la sostanza e il materiale di riferimento vengono sotto ­
posti allo stesso programma controllato di variazione della tempera ­
tura. Questa energia è l'energia necessaria per mantenere a zero la 
differenza di temperatura tra la sostanza e il materiale di riferimento. Quando il campione subisce una transizione che implica una varia ­
zione di entalpia, tale variazione è indicata da un allontanamento 
endotermico (ebollizione) dalla linea di base della registrazione del 
flusso di calore.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La tabella 1 riporta l'applicabilità e l'accuratezza dei vari metodi 
utilizzati per la determinazione della temperatura di ebollizione/ ­
intervallo di ebollizione.  
Tabella 1  
Confronto dei metodi  
Metodo di misura Accuratezza stimata Norme esistenti  
Ebulliometro ± 1,4 K (fino a 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (fino a 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Metodo dinamico ± 0,5 K (fino a 600 K) (  2 ) 
Processo di distillazione (intervallo 
di ebollizione) ± 0,5 k (fino a 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Metodo di Siwoloboff ± 2 K (fino a 600 K) (  2 ) 
Rivelazione mediante fotocellula ± 0,3 K (a 373 K) (  2 ) 
Analisi termica differenziale ± 0,5 K (fino a 600 K) 
± 2,0 K (fino a 1 273 K) ASTM E 537-76 
Calorimetria differenziale a scan ­
sione ± 0,5 K (fino a 600 K) 
± 2,0 K (fino a 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Questo livello di accuratezza è valido soltanto nel caso di una strumentazione semplice, come ad esempio quella 
descritta nella norma ASTM D 1120-72; esso può essere migliorato con ebulliometri più perfezionati. 
( 2 ) Valida solo per sostanze pure. L'uso in altre circostanze deve essere giustificato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 20
 
1.6. DESCRIZIONE DEI METODI  
I procedimenti relativi ad alcuni dei metodi citati sono descritti in 
varie norme internazionali e nazionali (vedi appendice).  
1.6.1.  Ebulliometro  
Vedi appendice.  
1.6.2.  Metodo dinamico  
Vedi metodo A.4. per la determinazione della tensione di vapore.  
Si assume come temperatura di ebollizione quella misurata in corri ­
spondenza di una pressione di 101,325 kPa.  
1.6.3.  Metodo della distillazione (intervallo di ebollizione)  
Vedi appendice.  
1.6.4.  Metodo di Siwoloboff  
Il campione viene riscaldato in una apparecchiatura per il punto di 
fusione in una provetta di diametro approssimato di 5 mm (figura 1).  
La figura 1 presenta un tipo di apparecchiatura standardizzata per la 
determinazione della temperatura di fusione e di ebollizione (JIS K 0064) (realizzata in vetro; tutte le quote sono in mm).
 
Figura 1
  
Nella provetta viene posto un tubo capillare (capillare di ebollizione) 
fuso a circa 1 cm dall'estremità inferiore. Il livello di riempimento 
della sostanza in esame deve essere tale che la parte fusa del capil ­
lare si trovi al di sotto della superficie del liquido. La provetta contenente il capillare di ebollizione può essere assicurata al termo ­
metro con un elastico oppure fissata tramite un sostegno laterale 
(vedi figura 2).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 21
 
Figura 2  
Principio secondo Siwoloboff  Figura 3  
Principio modificato
  
Il liquido per il bagno va scelto in funzione della temperatura di 
ebollizione. Per temperature fino a 573 K si può impiegare olio di silicone. La paraffina liquida può essere impiegata solo fino a 473 K. Il riscaldamento del bagno liquido deve essere regolato in modo che 
l'incremento di temperatura sia inizialmente di circa 3 K/min. Il 
liquido del bagno va tenuto in agitazione. A circa 10 K al di sotto della temperatura di ebollizione prevista, il riscaldamento va dimi ­
nuito in maniera da ridurre la velocità di aumento della temperatura a 
meno di 1 K/min. In prossimità della temperatura di ebollizione, dal 
capillare in ebollizione incominciano a emergere rapidamente delle bollicine.
 
La temperatura di ebollizione è la temperatura alla quale, per raf ­
freddamento temporaneo, la serie di bollicine s'arresta e il fluido 
inizia improvvisamente a risalire nel capillare. La corrispondente lettura termometrica rappresenta la temperatura di ebollizione della sostanza.
 
Secondo il principio modificato (vedi figura 3) la temperatura di 
ebollizione viene determinata in un capillare per la temperatura di fusione. Questo viene sfinato per circa 2 cm (a) e con esso si aspira una piccola quantità del campione. L'estremità aperta della parte 
sfinata viene chiusa alla fiamma in modo da far restare una bollicina 
d'aria in vicinanza della punta. Durante il riscaldamento nell'apparec ­
chio per la temperatura di fusione (b) la bolla d'aria si dilata. La temperatura di ebollizione corrisponde alla temperatura alla quale il 
menisco superiore della sostanza raggiunge il livello della superficie 
del bagno liquido (c).
 
1.6.5.  Determinazione tramite fotocellula  
Il campione viene riscaldato in un tubicino capillare all'interno di un 
blocco metallico riscaldante.  
Tramite opportune aperture sul blocco, un raggio di luce viene fatto 
passare attraverso la sostanza e colpisce una fotocellula accurata ­
mente tarata.  
Durante l'aumento della temperatura del campione, dal capillare di 
ebollizione emergono bollicine d'aria isolate. Quando viene raggiunta la temperatura di ebollizione, il numero di bollicine aumenta enor ­
memente. Ciò fa variare l'intensità della luce misurata dalla fotocel ­
lula, inviando un segnale di arresto all'indice di un termometro a resistenza di platino collocato nel blocco.
 
Questo metodo risulta particolarmente vantaggioso poiché permette de ­
terminazioni al di sotto della temperatura ambiente fino a 253,15 K 
(- 20  o C) senza modifiche dell'apparecchiatura. È semplicemente neces ­
sario porre lo strumento in un bagno di raffreddamento.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 22
 
1.6.6.  Analisi termica  
1.6.6.1.  Analisi termica differenziale  
Vedi appendice  
1.6.6.2.  Calorimetria differenziale a scansione  
Vedi appendice  
2. DATI  
Per piccole deviazioni dalla pressione normale (max. ± 5 kPa), le 
temperature di ebollizione vengono normalizzate a T  n mediante la 
seguente equazione numerica di Sidney-Young:  
T n = T + (f  T × Δ p) 
dove:  
Δ p = (101,325 — p) [notare il segno],  
p = valore misurato della pressione, in kPa,  
f T = coefficiente di correzione della temperatura di ebollizione 
con la pressione, in K/kPa,  
T = valore misurato della temperatura, in K,  
T n = temperatura di ebollizione corretta a pressione normale, 
in K.  
Per molte sostanze i coefficienti di correzione della temperatura f  T e 
le equazioni per il calcolo approssimativo sono indicati nelle norme internazionali e nazionali prima citate.
 
A titolo di esempio, il metodo DIN 53171 cita i seguenti coefficienti 
approssimativi per i solventi contenuti nelle vernici:  
Tabella 2  
Coefficienti di correzione della temperatura f  T 
Temperatura T in K Coefficiente di correzione f  T (K/kPa  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 23
 
3. RELAZIONE  
La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni:  
— metodo usato;  
— descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) e del ­
l'eventuale stadio preliminare di purificazione;  
— una stima dell'accuratezza.  
Come temperatura di ebollizione viene riportata la media di almeno 
due misure che ricadano nel campo dell'accuratezza stimata (vedi tabella 1).
 
Devono essere riportate le temperature di ebollizione misurate e la 
loro media, e le pressioni alle quali sono state effettuate le misure 
devono essere riportate in kPa. La pressione deve preferibilmente essere prossima alla normale pressione atmosferica.
 
Vanno fornite tutte le informazioni e osservazioni utili per l'inter ­
pretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impu ­
rezze e lo stato fisico della sostanza.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 24
 
Appendice  
Per ulteriori particolari tecnici, si possono ad esempio consultare le seguenti 
norme:  
1. Ebulliometro  
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Metodo della distillazione (intervallo di ebollizione)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Analisi termica differenziale e calorimetria differenziale a scan ­
sione  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 25
 
A.3. DENSITÀ RELATIVA  
1. METODO  
I metodi descritti si basano sulle linee direttrici (OCSE) (1). I prin ­
cipi fondamentali sono riportati nel riferimento (2).  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi qui illustrati si applicano alle sostanze solide e liquide senza 
alcuna limitazione rispetto al loro grado di purezza. I vari metodi da 
utilizzare sono elencati nella tabella 1.  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
La densità relativa, D  20 4 , di solidi o liquidi è il rapporto tra la massa 
di un determinato volume della sostanza in esame, misurata a 20  o C, 
e la massa di un ugual volume di acqua, misurata a 4  o C. La densità 
relativa è una grandezza adimensionale.  
La densità, ρ, di una sostanza è il rapporto tra una determinata massa 
m e il volume corrispondente v.  
In unità SI la densità, ρ, viene espressa in kg/m  3 . 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO (1) (3)  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento in rutti i casi in 
cui si esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per 
controllare periodicamente l'accuratezza del metodo e per permettere un confronto con risultati ottenuti con altri metodi.
 
1.4. PRINCIPIO DEI METODI  
Si utilizzano quattro classi di metodi.  
1.4.1.  Metodi per galleggiamento  
1.4.1.1.  Idrometro  (per sostanze liquide)  
Determinazioni rapide e sufficientemente accurate della densità pos ­
sono essere eseguite per mezzo di idrometri galleggianti, che per ­
mettono di dedurre la densità di un liquido dal grado di immersione 
desunto da una scala graduata.  
1.4.1.2.  Bilancia idrostatica  (per sostanze solide e liquide)  
La differenza tra il peso di un campione in aria e quello in un liquido 
adatto (per esempio acqua) può essere utilizzata per determinare la 
densità.  
Nel caso dei solidi, la densità cosi misurata va considerata valida 
solo per il particolare campione in esame. Per la determinazione della densità dei liquidi, un corpo di volume V noto viene pesato 
prima in aria e poi nel liquido stesso.
 
1.4.1.3.  Metodo ad immersione di sfera  (per sostanze liquide) (4)  
In questo metodo la densità di un liquido viene determinata in base 
alla differenza tra i valori ottenuti pesando il liquido prima e dopo 
l'immersione di una sfera di volume noto nel liquido stesso.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 26
 
1.4.2.  Metodi picnometrici  
Per solidi o liquidi possono impiegarsi picnometri di varia forma e di 
volume noto. La densità si calcola in base alla differenza di peso tra il picnometro pieno e quello vuoto ed in base al suo volume noto.
 
1.4.3.  Picnometro di comparizione ad aria  (per solidi)  
La densità di un solido di forma qualsiasi può essere determinata a 
temperatura ambiente con il picnometro di comparazione a gas. Il volume di una sostanza viene misurato in aria o in un gas inerte all'interno di un cilindro tarato di volume variabile. Per il calcolo 
della densità va effettuata una misura di massa successivamente a 
quella di volume.
 
1.4.4.  Densimetro oscillante  (5) (6) (7)  
La densità di un liquido può essere determinata per mezzo di un 
densimetro oscillante. Un oscillatore meccanico costruito a forma di un tubo a U viene fatto vibrare alla frequenza di risonanza dell'oscil ­
latore, che dipende dalla sua massa. L'introduzione di un campione 
modifica! a frequenza di risonanza dell'oscillatore. L'apparecchio deve essere calibrato mediante due sostanze liquide di densità nota. Tali sostanze vanno preferibilmente selezionate in modo da coprire 
l'intervallo di densità in cui si effettuano le misure.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
L'applicabilità dei vari metodi impiegati per la determinazione della 
densità relativa è indicata nella tabella.  
1.6. DESCRIZIONE DEI METODI  
Nell'appendice sono riportate a titolo di esempio alcune delle norme 
da consultare per ulteriori dettagli tecnici.  
Le prove vanno eseguite a 20  o C effettuando almeno due misure.  
2. DATI  
Vedi norme  
3. RELAZIONE  
La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni:  
— metodo usato;  
— descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze) e del ­
l'eventuale stadio preliminare di purificazione;  
La densità relativa  D 4 20 deve essere indicata secondo quanto pre ­
scritto al punto 1.2., insieme allo stato fisico della sostanza esami ­
nata.  
Vanno fomite tutte le informazioni ed osservazioni utili per l'inter ­
pretazione dei risultati, in modo particolare per quel che riguarda le 
impurezze e lo stato fisico della sostanza.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 27
 
Tabella  
Applicabilità dei metodi  
Metodi di misura Densità Viscosità dinamica 
massima possibile Norme esistenti 
solidi liquidi  
1.4.1.1. Idrometro sì 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. bilancia idrostatica a) solidi sì ISO 1183 (A) b) liquidi sì 5 Pa s ISO 901 e 758 
1.4.1.3. metodo della sfera im ­
mersa sì 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. picnometro ISO 3507 
a) solidi sì ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) liquidi sì 500 Pa s ISO 758 1.4.3. picnometro di compara ­
zione ad aria sì DIN 55990 parte 3, 
DIN 53243 
1.4.4. densimetro oscillante sì 5 Pa s
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry. Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inter ­
science Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, 
vol. 48, 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427- 430.
 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeu ­
gnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Pro ­
dukten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.
 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Bra ­
uereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253—255.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 28
 
Appendice  
Per ulteriori particolari tecnici, possono essere consultate, a titolo d'esempio, le 
seguenti norme:  
1. Metodi per galleggiamento  
1.1. Idrometro 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers: construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers: standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use. De ­
termination of density of liquids — Areo ­
metric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Bilancia idrostatica  
Per sostanze solide  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use — 
Determination of the density of solids 
other than powders and cellular products 
— Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density  
Per sostanze liquide  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method  
1.3. Metodo della sfera immersa 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of densi ­
ty; immersed body method  
2. Metodi picnometrici  
2.1. Per sostanze liquide 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a ki ­
nematìc viscosity of less than 100,10  -6 m 2 
s -1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than 100,10  - 
6 m 2 s -1 at 20  o C, applicable in particular 
also to hydrocarbons and aqueous solu ­
tions as well as to liquids with higher 
vapour pressure, approximately 1 bar at 
90 o C) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have a too high 
vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol-water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pyc ­
nometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and rela ­
ted materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic com ­
pounds 
BS 4699 Method for determination of specific gra ­
vity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer me ­
thod) 
BS 5903 Method for determination of relative den ­
sity and density of petroleum products by 
the capillary-stoppered pycnometer me ­
thod 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric me ­
thod
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 31
 
2.2. Per sostanze solide 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics. 
NT T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in 
powder and liquids — Pycnometric me ­
thod 
DIN 19683 Determination of the density of soils  
3. Picnometro di comparazione ad aria  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 32
 
A.4. TENSIONE DI VAPORE  
1. METODO  
Questo metodo è equivalente al metodo OCSE TG 104 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
La presente versione riveduta del metodo A.4 (1) comprende un 
metodo supplementare, il metodo di effusione mediante termogravi ­
metria isotermica, ideato per sostanze chimiche con livelli di pres ­
sione molto bassi (fino a 10  –10 Pa). Alla luce della necessità di 
disporre di procedure atte a ricavare la tensione di vapore, specie 
nel caso di sostanze con bassa tensione di vapore, le altre procedure di questo metodo sono state riesaminate rispetto ad altri intervalli d'applicazione.
 
All'equilibrio termodinamico, la tensione di vapore di una sostanza 
pura è funzione della sola temperatura. I principi fondamentali sono illustrati altrove (2)(3).
 
Non esiste un unico procedimento di misura che sia applicabile 
all’intero spettro di tensione di vapore compreso tra valori inferiori a 10
 –10 e 10  5 Pa. Il metodo qui illustrato comprende otto procedure 
per misurare la tensione di vapore, utilizzabili in diversi intervalli di 
tensione di vapore. La tabella 1 offre un quadro sinottico dei vari 
metodi sotto il profilo dell'applicazione e dei relativi intervalli di misura. I metodi possono essere utilizzati unicamente per quei com ­
posti che non subiscono decomposizione nelle condizioni di prova. 
Qualora per ragioni tecniche non sia possibile effettuare misure spe ­
rimentali, la tensione di vapore può essere stimata. Un metodo con ­
sigliato è illustrato nell'appendice.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ DI MISURA  
La tensione di vapore di una sostanza è definita come la pressione di 
saturazione al di sopra di un solido o di un liquido.  
Deve essere utilizzata l'unità SI di pressione, che è il pascal (Pa). 
Altre unità impiegate in passato sono qui di seguito elencate con i 
relativi fattori di conversione: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
L'unità SI di temperatura è il kelvin (K). La conversione dei gradi 
Celsius in kelvin è eseguita mediante la formula:  
T = t + 273,15  
dove T rappresenta la temperatura kelvin o termodinamica, mentre t 
è la temperatura Celsius.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 33
 
Tabella 1  
Metodo di misura Sostanze Ripetibilità sti ­
mata Riproducibilità 
stimata Intervallo raccoman ­
dato Solide Liquide  
Metodo dinamico basso- fon ­
denti sì fino al 25 % 
1-5 % fino al 25 % 
1-5 % da 10  3 Pa a 2 × 
10 3 Pa 
da 2 × 10  3 Pa a 
10 5 Pa 
Metodo statico sì sì 5-10 % 5-10 % da 10 Pa a 10  5 Pa 
da 10  –2 Pa a 10  5 
Pa (  1 ) 
Metodo isotenisco ­
pico sì sì 5-10 % 5-10 % da 10  2 Pa a 10  5 
Pa 
Metodo di effusio ­
ne: bilancia a ten ­
sione di vapore sì sì 5-20 % fino al 50 % da 10  –3 a 1 Pa 
Metodo di effusio ­
ne: cellula di Knudsen sì sì 10-30 % — da 10
 –10 a 1 P 
Metodo di effusio ­
ne: termogravime ­
tria isotermica sì sì 5-30 % fino al 50 % da 10  –10 a 1 Pa 
Metodo di satura ­
zione del gas sì sì 10-30 % fino al 50 % da 10  –10 a 10  3 Pa 
Metodo del rotore sì sì 10-20 % — da 10  –4 a 0,5 Pa  
( 1 ) Utilizzando un manometro capacitivo.  
1.3. PRINCIPIO DELLA PROVA  
Generalmente la tensione di vapore è determinata a varie tempera ­
ture. In un intervallo di temperatura ristretto, il logaritmo della ten ­
sione di vapore di una sostanza pura è funzione lineare del reciproco della temperatura termodinamica, secondo l'equazione semplificata di 
Clausius-Clapeyron:
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ costante  
dove:  
p = tensione di vapore in pascal  
ΔHv = calore di vaporizzazione in J mol  –1 
R = costante universale dei gas 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura in K  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 34
 
1.4. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non occorre utilizzare sostanze di riferimento. Queste servono prin ­
cipalmente a controllare periodicamente la prestazione del metodo e a permettere il confronto tra i risultati ottenuti con metodi differenti.
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.5.1.  Metodo dinamico (metodo di Cottrell)  
1.5.1.1.  Principio  
La tensione di vapore è determinata misurando la temperatura di 
ebollizione della sostanza a varie pressioni prestabilite comprese approssimativamente tra 10
 3 e 10  5 Pa. Questo metodo è raccoman ­
dato anche per la determinazione della temperatura di ebollizione e a 
tal fine è utilizzabile fino a 600 K. La temperatura di ebollizione dei liquidi rilevata a 3-4 cm di profondità è di circa 0,1 °C superiore a quella rilevata in superficie, a causa della pressione idrostatica eser ­
citata dalla colonna di liquido. Con il metodo di Cottrell (4) il 
termometro è posto nel vapore sopra la superficie del liquido; il liquido in ebollizione è pompato continuamente sul bulbo del termo ­
metro, sul quale forma un sottile strato di liquido in stato di equili ­
brio con il vapore a pressione atmosferica. Il termometro rileva 
quindi il vero punto di ebollizione, senza gli errori causati dal surri ­
scaldamento o dalla pressione idrostatica. La pompa originariamente usata da Cottrell è illustrata in figura 1. Il tubo A contiene il liquido 
in ebollizione. Un filo di platino B incorporato nel fondo favorisce 
l'uniformità dell'ebollizione. Il tubo laterale C conduce ad un con ­
densatore e la guaina D impedisce al condensato freddo di entrare in contatto con il termometro E. Quando il liquido in A bolle, le bol ­
licine e il liquido intrappolati dall'imbuto si riversano sul bulbo del 
termometro attraverso i due bracci della pompa F.  
Figura 1
 Figura 2
  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 35
 
Pompa Cottrell (4)  
A: Termocoppia  
B: Polmone per il vuoto  
C: Manometro  
D: Al vuoto  
E: Punto di misura  
F: Elemento riscaldante (150 W circa)  
1.5.1.2.  Apparecchiatura  
La figura 2 mostra un'apparecchiatura molto accurata che sfrutta il 
principio di Cottrell. La sezione di ebollizione è nella parte inferiore 
del tubo, mentre il dispositivo di raffreddamento è in quella centrale. Nella parte superiore si trovano un'uscita ed una flangia. La pompa Cottrell è posta nella sezione di ebollizione, che è riscaldata me ­
diante una cartuccia elettrica. La temperatura è misurata con una 
termocoppia incamiciata o un termometro a resistenza infilato attra ­
verso la flangia in alto. L'uscita è collegata al sistema di regolazione della pressione, composto da una pompa da vuoto, un polmone, un 
manostato attraverso il quale è introdotto l'azoto per regolare la 
pressione ed un manometro.
 
1.5.1.3.  Procedimento  
La sostanza è posta nella sezione di ebollizione. Con i solidi che si 
presentano in forma diversa dalla polvere è possibile incontrare dei problemi, che tuttavia possono essere talvolta risolti riscaldando la 
camicia di raffreddamento. L'apparecchio viene sigillato in corrispon ­
denza della flangia e la sostanza viene degassata. Questo metodo non è adatto per effettuare misure su sostanze schiumogene.
 
Si imposta quindi la pressione minima desiderata e si aziona il 
riscaldamento, attivando contemporaneamente il collegamento del 
sensore di temperatura ad un registratore.  
L'equilibrio è raggiunto quando si registra una temperatura di ebol ­
lizione costante a pressione costante. Bisogna prestare molta atten ­
zione al fine di evitare la formazione di grosse bolle durante l'ebol ­
lizione. Inoltre, sul refrigerante deve avvenire una condensazione 
completa. Quando si determina la tensione di vapore di solidi bas ­
so-fondenti, occorre stare attenti ad evitare il blocco del condensa ­
tore. 
Dopo aver registrato tale punto di equilibrio, si regola la pressione su 
un valore più elevato. Tale operazione è ripetuta fino a raggiungere una pressione di 10
 5 Pa (per un totale di circa 5-10 punti di misura). 
A titolo di controllo, la determinazione dei punti di equilibrio deve 
essere ripetuta a pressioni decrescenti.  
1.5.2.  Metodo statico  
1.5.2.1.  Principio  
Nel metodo statico (5), si determina la tensione di vapore ad una 
data temperatura in condizioni di equilibrio termodinamico. Questo metodo si presta sia per sostanze che per solidi e liquidi multicom ­
ponenti nell'intervallo da 10
 –1 a 10  5 Pa, nonché nell'intervallo da 1 a 
10 Pa, purché si proceda con attenzione.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 36
 
1.5.2.2.  Apparecchiatura  
La strumentazione consiste in un bagno mantenuto a temperatura 
costante (tolleranza pari a ± 0,2 K), un contenitore per il campione collegato ad una linea da vuoto, un manometro ed un sistema per 
regolare la pressione. La camera del campione (figura 3a) è collegata 
alla linea da vuoto mediante una valvola ed un manometro differen ­
ziale (un tubo ad U contenente un opportuno fluido manometrico), che funge da indicatore di zero. Per il manometro differenziale è 
possibile utilizzare mercurio, fluidi siliconici e ftalati, a seconda del ­
l'intervallo di pressione e del comportamento chimico della sostanza esaminata. Tuttavia, sulla base di considerazioni di ordine ambien ­
tale, l'uso del mercurio, se possibile, dovrebbe essere evitato. È 
necessario che la sostanza di prova non si sciolga in modo apprez ­
zabile nel fluido contenuto nel tubo ad U o che non reagisca con esso. Il tubo ad U può essere sostituito da un manometro (figura 3b). 
Per il manometro, nell'intervallo compreso tra pressione normale e 
10
 2 Pa può essere utilizzato il mercurio, mentre i fluidi siliconici e 
gli ftalati sono adatti per l'uso nell'intervallo da 10  2 Pa a 10 Pa. 
Esistono poi altri misuratori di pressione che possono essere utilizzati 
per pressioni inferiori a 10  2 Pa. I manometri capacitativi a membrana 
riscaldabile possono essere impiegati anche al di sotto di 10  –1 Pa. La 
temperatura è misurata sulla parete esterna del recipiente contenente il campione oppure nel recipiente stesso.
 
1.5.2.3.  Procedimento  
Servendosi della strumentazione descritta in figura 3a, riempire il 
tubo ad U con il liquido scelto, che deve essere degassato a tempe ­
ratura elevata prima di effettuare le letture. La sostanza di prova è 
posta nell'apparecchiatura e degassata a temperatura ridotta. Nel caso di campioni multicomponenti, la temperatura deve essere sufficien ­
temente bassa da assicurare che la composizione del materiale non 
venga alterata. L'equilibrio può essere raggiunto più rapidamente 
mediante agitazione. Il campione può essere raffreddato con azoto liquido o ghiaccio secco, avendo cura tuttavia di non far condensare l'aria o il fluido della pompa. L'aria viene eliminata attivando l’aspi ­
razione per diversi minuti, mantenendo aperta la valvola posta al di 
sopra del recipiente del campione. Se necessario, l'operazione di degassaggio può essere ripetuta varie volte.  
Figura 3a
 Figura 3b
  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 37
 
Quando il campione è riscaldato con la valvola chiusa, la tensione di 
vapore aumenta. Ciò altera l'equilibrio del fluido contenuto nel tubo 
a U. Per compensare questo effetto, si immette azoto o aria nell'ap ­
parecchio fino a che l'indicatore di pressione differenziale è nuova ­
mente a zero. La pressione richiesta a questo scopo può essere letta 
dal manometro o da uno strumento di maggiore precisione. Tale 
pressione corrisponde alla tensione di vapore della sostanza alla temperatura di misura. Utilizzando la strumentazione illustrata in figura 3b, la tensione di vapore è letta direttamente.
 
La tensione di vapore è determinata ad intervalli adeguatamente 
ridotti (per un totale di circa 5-10 punti di misura) fino al massimo 
valore di temperatura desiderato.  
Le letture a bassa temperatura devono essere ripetute per verifica. Se 
i valori ottenuti dalla ripetizione delle letture non coincidono con la curva ottenuta a temperatura crescente, la ragione può essere una delle seguenti:
 
i) il campione contiene ancora aria (come nel caso, per esempio, di 
materiali ad elevata viscosità) o sostanze basso-bollenti, che è/ ­
sono liberata/e durante il riscaldamento;  
ii) la sostanza subisce una reazione chimica nell'intervallo di 
temperatura considerato (per esempio decomposizione, polimerizzazione).
 
1.5.3.  Metodo isoteniscopico  
1.5.3.1.  Principio  
L'isoteniscopio (6) è basato sul principio del metodo statico. Il me ­
todo prevede che il campione sia posto in un bulbo tenuto a tempe ­
ratura costante, collegato ad un manometro e ad una pompa da 
vuoto. Le impurezze più volatili della sostanza sono eliminate degassando a pressione ridotta. La tensione di vapore del campione in corrispondenza dei valori di temperatura prescelti è 
bilanciata da una pressione nota di gas inerte. Benché sia stato messo 
a punto per misurare la tensione di vapore di alcuni idrocarburi liquidi, l'isoteniscopio si presta anche per l'esame di solidi. Il metodo non è solitamente adatto per sistemi multicomponenti. I risultati sono 
soggetti solo a lievi errori qualora i campioni contengano impurezze 
non volatili. L'intervallo raccomandato è da 10
 2 a 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Apparecchiatura  
Un esempio di dispositivo di misura è illustrato in figura 4. Per la 
descrizione completa si consulti la norma ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 38
 
1.5.3.3.  Procedimento  
Nel caso di liquidi, la sostanza medesima funge da fluido per il 
manometro differenziale. Una quantità di liquido sufficiente a riempire il bulbo ed il ramo corto del manometro viene introdotta nell'isoteniscopio. Questo è quindi collegato ad un sistema da 
vuoto e svuotato, per poi essere successivamente riempito con 
azoto. Lo svuotamento e la pulizia del sistema sono ripetuti due volte per eliminare l'ossigeno residuo. Una volta riempito, l'isoteni ­
scopio è messo in posizione orizzontale, in modo che il campione 
si sparga in uno strato sottile nel bulbo del campione e nella 
sezione manometrica. La pressione del sistema è ridotta a 133 Pa ed il campione è riscaldato delicatamente, fino a quando inco ­
mincia a bollire (eliminazione dei gas disciolti). L'isoteniscopio 
viene poi disposto in modo che il campione ritorni nel bulbo e 
riempia il ramo corto del manometro. La pressione viene mante ­
nuta a 133 Pa. L'estremità del bulbo portacampione viene riscal ­
data con una piccola fiamma, fino a quando i vapori del campione 
liberati si espandono al punto da spostare parte del campione dalla 
parte superiore del bulbo e del braccio manometrico nella sezione manometrica dell'isoteniscopio, creando uno spazio riempito di va ­
pore ed esente da azoto. L'isoteniscopio è quindi posto in un 
bagno a temperatura costante e la pressione dell'azoto viene rego ­
lata fino a coincidere con quella del campione. All'equilibrio, la pressione dell'azoto è uguale alla tensione di vapore della sostanza.
 
Figura 4
  
Nel caso di solidi, ed in funzione degli intervalli di pressione e 
temperatura, sono usati come liquidi manometrici fluidi siliconici e 
ftalati. Il liquido manometrico degassato viene introdotto in una boccia sul braccio lungo dell'isoteniscopio. Il solido da analizzare è quindi posto nel bulbo portacampione e degassato a temperatura 
elevata. Dopo questa operazione, l'isoteniscopio è inclinato così 
che il liquido manometrico possa defluire nel tubo ad U.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 39
 
1.5.4.  Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore  (7) 
1.5.4.1.  Principio  
Un campione della sostanza di prova è riscaldato in un piccolo forno e 
posto in una campana evacuata. Il forno è coperto mediante un coperchio 
recante dei piccoli fori di diametro noto. Il vapore della sostanza che 
fuoriesce da uno dei fori è convogliato sul piatto di una bilancia ad alta sensibilità, anch'essa racchiusa nella campana evacuata. In alcuni mo ­
delli, il piatto è collocato in una cassetta di refrigerazione, che provvede 
alla dissipazione del calore verso l'esterno per conduzione termica, ed è 
raffreddato per irraggiamento così che il vapore che fuoriesce dal forno si condensi sul piatto. La quantità di moto del getto di vapore agisce come 
una forza sulla bilancia. La tensione di vapore può essere ricavata in due 
modi: direttamente dalla forza esercitata sul piatto della bilancia oppure dalla velocità di evaporazione applicando l'equazione di Hertz- Knudsen (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
dove:  
G = velocità di evaporazione (kg s  –1 m –2 ) 
M = massa molare (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K)  
R = costante universale del gas (J mol  –1 K –1 ) 
p = tensione di vapore (Pa)  
L'intervallo raccomandato è da 10  –3 a 1 Pa.  
1.5.4.2.  Apparecchiatura  
Il principio generale dell'apparecchiatura è illustrato in figura 5.  
Figura 5
  
A: Piastra di base F: Cassetta di refrigerazione e barra di raf ­
freddamento 
B: Strumento a spirale mobile G: Forno evaporatore 
C: Campana H: Dewar con azoto liquido 
D: Bilancia con piatto I: Misura della temperatura del campione 
E: Vacuometro J: Sostanza di prova  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 40
 
1.5.5.  Metodo ad effusione: cella di Knudsen  
1.5.5.1.  Principio  
Il metodo è basato sulla stima della massa della sostanza di prova 
liberata per unità di tempo da una cella di Knudsen sotto forma di 
vapore, attraverso un micro-orifizio in condizioni di vuoto spinto (8). 
La massa di vapore effuso può essere ricavata misurando la perdita di massa della cella oppure facendo condensare il vapore a bassa temperatura e determinando la quantità di sostanza volatilizzata me ­
diante cromatografia. La tensione di vapore è calcolata tramite la 
relazione di Hertz-Knudsen (cfr. punto 1.5.4.1), applicando dei fat ­
tori di correzione definiti in funzione dei parametri dell'apparecchia ­
tura (9). L'intervallo raccomandato è da 10
 –10 a 1 Pa (10)(11)(12) ­
(13)(14).  
1.5.5.2.  Apparecchiatura  
Il principio generale della strumentazione è illustrato in figura 6.  
Figura 6
  
1: Collegamento al vuoto 7: Coperchio a vite 
2: Pozzetti per il termometro a resistenza di 
platino o per la misura e il controllo della temperatura 8: Dadi ad alette 
3: Coperchio del recipiente da vuoto 9: Bulloni 
4: O-ring 10: Celle di effusione in acciaio inossidabile 
5: Recipiente da vuoto in alluminio 11: Cartuccia riscaldante 6: Dispositivo per installare e rimuovere le 
celle di effusione
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1.5.6.  Metodo di effusione: termogravimetria isotermica  
1.5.6.1.  Principio  
Il metodo è basato sulla determinazione della velocità di evapora ­
zione accelerata della sostanza di prova a temperature elevate e 
pressione ambiente mediante termogravimetria (10)(15)(16)(17)(18) ­
(19)(20). La velocità di evaporazione v  T è ricavata esponendo il 
composto scelto ad un lento flusso di gas inerte e controllando la perdita di peso a definiti valori di temperatura costante T in kelvin, 
per opportuni lassi di tempo. La tensione di vapore p
 T è calcolata dai 
valori di v  T utilizzando la relazione lineare tra il logaritmo della 
tensione di vapore ed il logaritmo della velocità di evaporazione. 
Se necessario, i valori a temperatura di 20 e 25 °C possono essere 
estrapolati mediante analisi di regressione del logaritmo log p  T vs. 
1/T. Questo metodo si presta per quelle sostanze che hanno tensione di vapore pari a 10
 –10 Pa (10  –12 mbar) e la cui purezza è il più 
possibile prossima al 100 %, onde evitare che le perdite di peso 
misurate siano interpretate in modo erroneo.  
1.5.6.2.  Apparecchiatura  
Il principio generale della strumentazione è illustrato in figura 7.  
Figura 7
  
Il piatto portacampione, appeso ad una microbilancia all'interno di 
una camera a temperatura controllata, è investito da un flusso di gas 
di azoto secco che trasporta le molecole vaporizzate della sostanza di prova. All'uscita della camera, il flusso di gas è purificato da un'unità di adsorbimento.
 
1.5.6.3.  Procedimento  
La sostanza di prova è distribuita sotto forma di strato omogeneo su 
un piatto di vetro ruvido. Qualora la sostanza sia solida, il piatto è bagnato in modo uniforme con una soluzione della sostanza in un opportuno solvente ed è poi asciugato in atmosfera inerte. Il piatto 
così ricoperto è sospeso in un analizzatore termogravimetrico, che 
misura la perdita di peso in modo continuo in funzione del tempo.
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La velocità di evaporazione v  T ad una determinata temperatura è 
calcolata dalla perdita di peso Δm del piatto del campione mediante 
la formula  
v T ¼ Δm 
F Ö t Ê 
gcm  –2 h –1 Ì 
dove F è l'area superficiale dello strato della sostanza di prova, che 
solitamente corrisponde all'area superficiale del piatto del campione, 
mentre t è il tempo durante il quale è osservata la perdita di peso 
Δm. 
La tensione di vapore p  T è calcolata in funzione della velocità di 
evaporazione v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
dove C e D sono costanti specifiche del dispositivo sperimentale 
utilizzato che dipendono dal diametro della camera di misura e dalla velocità del flusso del gas. Tali costanti devono essere stabilite una volta per tutte misurando una serie di composti di cui si conosce la 
tensione di vapore e mediante regressione del logaritmo log p
 T vs. 
log v  T (11)(21)(22).  
La relazione tra la tensione di vapore p  T e la temperatura T in kelvin 
è data da  
Log p  T = A + B 1/T  
dove A e B sono costanti ricavate mediante regressione del logaritmo 
log p  T vs. 1/T. Questa equazione permette di estrapolare la tensione 
di vapore a qualsiasi altra temperatura.  
1.5.7.  Metodo di saturazione del gas  (23)  
1.5.7.1.  Principio  
Un flusso di gas inerte, di cui si conosce la portata, viene fatto 
passare a temperatura ambiente sopra o attraverso un campione della sostanza di prova a velocità sufficientemente ridotta da assicurare la 
saturazione. È determinante che si raggiunga la saturazione nella fase 
gassosa. La sostanza trasportata è intrappolata, solitamente mediante un adsorbente; se ne determina poi la quantità. In alternativa all'uso di trappole adsorbenti ed alla successiva analisi, è possibile determi ­
nare la quantità di sostanza trasportata mediante tecniche analitiche a 
flusso continuo, quali la gascromatografia. La tensione di vapore è calcolata partendo dall'ipotesi che sia soddisfatta la legge dei gas ideali e che la pressione totale di una miscela gassosa sia uguale 
alla somma delle pressioni esercitate dai singoli gas che la compon ­
gono. La pressione parziale della sostanza di prova, ossia la tensione di vapore, è ricavata dal volume complessivo noto del gas e dalla massa del materiale trasportato.
 
Il metodo di saturazione del gas può essere utilizzato sia per sostanze 
solide che liquide e per valori di tensione di vapore fino a 10  –10 Pa 
(10)(11)(12)(13)(14). Il metodo offre la massima affidabilità per va ­
lori inferiori a 10  3 Pa. Al di sopra di 10  3 Pa, la tensione di vapore è 
di solito sovrastimata, probabilmente a causa della formazione di aerosol. Essendo le misure della tensione di vapore effettuate a tem ­
peratura ambiente, non occorre estrapolare i dati a temperature ele ­
vate, evitando un'operazione che è spesso fonte di gravi errori.
 
1.5.7.2.  Apparecchiatura  
Il metodo richiede l'impiego di una cassetta mantenuta a temperatura 
costante. Lo schema riportato in figura 8 mostra una cassetta dotata di tre portacampioni per solidi e di altrettanti portacampioni per liquidi, tale da consentire l’analisi in triplo di un campione liquido 
o solido. La temperatura è controllata con una tolleranza pari a 
± 0,5 °C o inferiore.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 43
 
Figura 8
  
Generalmente come gas inerte di trasporto è utilizzato l'azoto, ma 
alle volte può essere richiesto l'impiego di un altro gas (24). Il gas 
vettore deve essere secco. Il flusso di gas, ripartito in sei flussi 
regolati da valvole ad ago (aventi un foro di circa 0,79 mm) entra nella cassetta attraverso un tubo di rame avente un diametro interno di 3,8 mm. Equilibrata la temperatura, il gas attraversa il campione e 
la trappola adsorbente, per poi fuoriuscire dalla cassetta.
 
I campioni solidi sono introdotti in un tubo con un diametro interno 
di 5 mm, tra due strati di lana di vetro (cfr. figura 9). La figura 10 mostra un portacampione per liquidi ed il sistema di adsorbimen ­
to. Il modo più riproducibile per misurare la tensione di vapore di 
liquidi consiste nel ricoprire con uno strato di liquido delle palline di vetro o un materiale adsorbente inerte, quale la silice, con cui riem ­
pire il portacampione. In alternativa, è possibile far passare il gas di 
trasporto in una fritta ruvida ed una bolla attraverso una colonna 
della sostanza di prova liquida.  
Figura 9
 Figura 10
  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 44
 
Il dispositivo di adsorbimento consta di due sezioni adsorbenti: una 
anteriore ed una posteriore con funzione di riserva. Nel caso di valori 
di tensione di vapore molto bassi, l'adsorbente trattiene solo piccole quantità. In tal caso l'adsorbimento sulla lana di vetro e sul tubo di vetro nella sezione tra il campione e l'adsorbente può rappresentare 
un grave problema.
 
Un modo altrettanto efficiente per raccogliere il materiale vaporiz ­
zato consiste nell'impiego di trappole raffreddate con CO  2 solida. 
Non producono alcuna contropressione sulla colonna del saturatore ed inoltre consentono con facilità di rimuovere completamente il materiale intrappolato.
 
1.5.7.3.  Procedimento  
La portata del flusso in uscita del gas di trasporto è misurata a 
temperatura ambiente. Durante l'esperimento, la portata del flusso 
deve essere controllata frequentemente per garantire un valore esatto 
del volume totale del gas di trasporto. È preferibile un controllo continuo mediante un flussimetro di massa. La saturazione della fase gassosa può richiedere un tempo di contatto considerevole, 
per cui i valori della portata del flusso del gas possono essere al ­
quanto bassi (25).
 
Al termine dell'esperimento, sia la sezione adsorbente anteriore che 
la sezione di riserva sono analizzate separatamente. Il composto depositato su ciascuna sezione è desorbito aggiungendo un solvente. Le soluzioni così ottenute sono sottoposte ad analisi quantitativa per 
determinare la massa di sostanza desorbita da ciascuna sezione. La 
scelta del metodo di analisi (nonché dell'adsorbente, così come del solvente per il desorbimento) dipende dalle caratteristiche del mate ­
riale analizzato. L'efficienza del desorbimento è determinata iniet ­
tando una quantità nota di campione sull'adsorbente, procedendo 
quindi al suo desorbimento ed analizzando il quantitativo recuperato. È importante che la verifica dell'efficienza del desorbimento sia ef ­
fettuata allo stesso livello di concentrazione del campione nelle con ­
dizioni di prova, o in prossimità di esso.
 
Per essere sicuri che il gas di trasporto sia saturo della sostanza di 
prova, sono utilizzate tre diverse portate del flusso. Il gas è ritenuto saturo quando la tensione di vapore calcolata non manifesta alcuna dipendenza dalla portata.
 
La tensione di vapore è calcolata mediante l'equazione:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
dove:  
p = tensione di vapore (Pa)  
W = massa della sostanza di prova evaporata (g)  
V = volume del gas saturo (m  3 ) 
R = costante universale dei gas 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K)  
M = massa molare della sostanza di prova (g mol  –1 ). 
I volumi misurati devono essere corretti per tenere conto delle dif ­
ferenze di temperatura e pressione tra il flussimetro e il saturatore.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 45
 
1.5.8.  Rotore  
1.5.8.1.  Principio  
Questo metodo si avvale di un viscosimetro a rotore, il cui elemento 
di misura è costituito da una piccola sfera d'acciaio che, sospesa in 
un campo magnetico, viene fatta ruotare su se stessa da campi rotanti 
(26)(27)(28). La velocità di rotazione è misurata mediante bobine di trasduzione. Quando la sfera raggiunge una certa velocità di rotazio ­
ne, solitamente 400 giri al secondo, la fornitura di energia viene 
interrotta ed ha luogo una decelerazione dovuta all'attrito col gas. 
La diminuzione della velocità di rotazione è misurata in funzione del tempo. La tensione di vapore è ricavata dal rallentamento del moto 
della sfera d'acciaio, che è appunto dipendente dalla pressione. L'in ­
tervallo di pressione raccomandato è compreso tra 10
 –4 e 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Apparecchiatura  
La strumentazione è illustrata schematicamente in figura 11. La te ­
stina di misurazione è collocata in un recipiente termostatato, con una tolleranza di regolazione di 0,1 °C. Il contenitore del campione è 
posto in un recipiente a parte, anch'esso termostatato con una tolle ­
ranza di regolazione di 0,1 °C. Tutte le altre parti dell'apparecchia ­
tura sono tenute ad una temperatura più elevata per impedire la condensazione. L'intera apparecchiatura è collegata ad un sistema 
per alto vuoto.
 
Figura 11
  
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
La tensione di vapore ottenuta mediante uno qualunque dei metodi 
precedenti deve essere determinata ad almeno due temperature. Per verificare la linearità della curva di tensione di vapore sono preferi ­
bili tre o più temperature nell'intervallo tra 0 e 50 °C. Nel caso in cui 
siano utilizzati i metodi di effusione (cella di Knudsen e termogra ­
vimetria isotermica) e di saturazione del gas, sono raccomandati valori di temperatura di misura compresi tra 120 e 150 °C, anziché 
nell'intervallo 0-50 °C.
 
2.2. RELAZIONE DELLA PROVA  
La relazione della prova deve comprendere le seguenti informazioni:  
— metodo usato,  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 46
 
— descrizione precisa della sostanza (identità ed impurezze) ed 
eventuale stadio preliminare di purificazione,  
— almeno due valori di tensione di vapore e temperatura — prefe ­
ribilmente tre o più — richiesti nell'intervallo da 0 a 50 °C (o da 
120 a 150 °C),  
— almeno uno dei due valori di temperatura dovrebbe essere pari o 
inferiore a 25 °C, se tecnicamente possibile in base al metodo 
scelto,  
— tutti i dati originali,  
— una curva log p contro 1/T,  
— una stima della tensione di vapore a 20 o 25 °C.  
Qualora si osservi una transizione (cambiamento di stato, decompo ­
sizione), devono essere fornite le informazioni seguenti:  
— la natura del cambiamento,  
— la temperatura a cui il cambiamento si verifica a pressione atmo ­
sferica,  
— la tensione di vapore a 10° C e a 20° C al di sotto della tem ­
peratura di transizione, nonché a 10° C e a 20° C al di sopra di 
tale temperatura (a meno che la transizione non consista nel 
passaggio dallo stato solido allo stato gassoso).  
Devono essere riportate tutte le informazioni e osservazioni signifi ­
cative ai fini dell'interpretazione dei risultati, in particolare per 
quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza.  
3. BIBLIOGRAFIA  
1. Gazzetta ufficiale delle Comunità europee  L 383 A del 1992, 
pagg. 26-47.  
2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B. e Vodar, B. (a cura di) Butterworths, London.  
3. Weissberger R., a cura di (1959). Technique of Organic Che ­
mistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3  a ed., Vol. I, 
Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2  a ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
5. NF T 20-048 AFNOR (settembre 1985). Chemical products for 
industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
7. NF T 20-047 AFNOR (settembre 1985). Chemical products for 
industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521-532.  
11. Tomlin, C.D.S. (a cura di), The Pesticide Manual, Twelfth 
Edition (2000).  
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28.  
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 N. 1 (1987), 117-122.  
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science  4 (1973) 137-147.  
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400.
 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relation ­
ship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168.
 
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27-31.
 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.
 
21. Lide, D.R. (a cura di), CRC Handbook of Chemistry and 
Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C.
 
22. Meister, R.T. (a cura di), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002).  
23. 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Regi ­
ster, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
26. Messer G., Röhl, P., Grosse G. e Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
27. Comsa G., Fremerey J.K. eLindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), 642.  
28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 49
 
Appendice  
Metodo di stima  
INTRODUZIONE  
I valori stimati della tensione di vapore possono essere usati:  
— per decidere quale tra i metodi sperimentali sia appropriato,  
— per fornire una stima o un valore limite nei casi in cui il metodo sperimentale 
non possa essere applicato per ragioni tecniche.  
METODO DI STIMA  
La tensione di vapore di liquidi e solidi può essere stimata utilizzando la corre ­
lazione di Watson modificata (a). L'unico dato sperimentale richiesto è il punto di ebollizione normale. Il metodo può essere applicato nell'intervallo di pressione da 
10
 5 Pa a 10  –5 Pa. 
Per informazioni particolareggiate sul metodo si consulti il testo «Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods» (b). Si rinvia inoltre a «OECD Envi ­
ronmental Monograph No.67» (c).  
PROCEDURA DI CALCOLO  
La tensione di vapore è calcolata come segue:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b " 
1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î m – 1 
ln T 
T b # 
dove:  
T = temperatura d'interesse  
T b = punto di ebollizione normale  
P VP = tensione di vapore alla temperatura T  
ΔH Vb = calore di vaporizzazione  
ΔZ b = fattore di comprimibilità (stimato a 0,97)  
m = fattore empirico dipendente dallo stato fisico alla temperatura d'inte ­
resse  
inoltre,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
dove K  F è un fattore empirico che tiene conto della polarità della sostanza. Per 
alcuni tipi di composti, i fattori K  F sono elencati nel riferimento b).  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 50
 
Frequentemente sono disponibili dati per i quali è fornito il punto di ebollizione a 
pressione ridotta. In tal caso, la tensione di vapore è calcolata nel seguente modo:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m – 1 
ln T 
T 1 " #  
dove T  1 è il punto di ebollizione a pressione ridotta P  1 . 
RELAZIONE  
Qualora si usi il metodo di stima, la relazione deve includere la documentazione 
completa del calcolo.  
BIBLIOGRAFIA  
a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993).  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 51
 
A.5. TENSIONE SUPERFICIALE  
1. METODO  
I metodi descritti si basano sulle linee direttrici OCSE (1) I principi 
fondamentali sono presentati nel riferimento (2).  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi qui illustrati si applicano alla misura della tensione super ­
ficiale di soluzioni acquose.  
Prima di effettuare le prove, è utile disporre di dati preliminari su 
alcune caratteristiche della sostanza in esame, quali la solubilità in 
acqua, la struttura, il comportamento all’idrolisi e la concentrazione 
critica per la formazione di micelle.  
I metodi qui illustrati si applicano alla maggior parte delle sostanze 
chimiche senza alcuna limitazione rispetto al loro grado di purezza.  
La misura della tensione superficiale col metodo del tensiometro ad 
anello può essere effettuata soltanto su soluzioni acquose con visco ­
sità dinamica inferiore a 200 mPa s circa.  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
Per tensione superficiale si intende l'entalpia libera superficiale per 
unità di area.  
La tensione superficiale si misura in:  
N/m (unità SI) oppure in  
mN/m (sottomultipli della unità SI);  
1 N/m = 10  3 dine/cm,  
1 mN/m = 1 dine/cm nel vecchio sistema cgs.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si 
esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per con ­
trollare periodicamente l'attendibilità del metodo e per permettere il 
confronto dei risultati ottenuti con altri metodi.  
Nei riferimenti bibliografici (1) e (3) sono citate varie sostanze di 
riferimento in grado di coprire un ampio campo di valori della tensione superficiale.
 
1.4. PRINCIPIO DEI METODI  
I metodi si basano sulla misura della massima forza che è necessario 
esercitare in senso verticale ad una staffa o ad un anello a contatto con la superficie del liquido in esame posto in un recipiente di misura affinché detto liquido si distacchi dalla superficie stessa, ov ­
vero ad una lamina che abbia un bordo a contatto con la superficie 
suddetta per sollevare la pellicola che si è formata.
 
Le sostanze che sono solubili in acqua ad una concentrazione di 
almeno 1 mg/l sono esaminate in soluzione acquosa ad un'unica 
concentrazione.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
I metodi descritti permettono misure più precise di quanto possa 
essere necessario per valutazioni di ordine ambientale.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 52
 
1.6. DESCRIZIONE DEI METODI  
Si prepara una soluzione della sostanza in acqua distillata. La 
concentrazione di questa soluzione dovrebbe essere il 90 % del valore corrispondente alla concentrazione di saturazione della 
sostanza in acqua; quando questa concentrazione supera 1 g/l, 
si usa per la prova una concentrazione di 1 g/l. Non è neces ­
sario eseguire il saggio su sostanze con una solubilità in acqua minore di 1 mg/1.
 
1.6.1.  Metodo della lamina  
Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione 
della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole liquide).
 
1.6.2.  Metodo della staffa  
Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione 
della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole 
liquide).  
1.6.3.  Metodo dell'anello  
Vedi ISO 304 e NF T 73-060 (Tensioattivi — Determinazione 
della tensione superficiale attraverso il sollevamento di pellicole 
liquide).  
1.6.4.  Metodo armonizzato dell'anello secondo l'OCSE  
1.6.4.1.  Apparecchiatura  
I tensiometri reperibili in commercio risultano adeguati a questo tipo 
di misura. Essi consistono delle parti seguenti:  
— tavolo mobile per il campione,  
— sistema di misurazione della forza,  
— elemento di misura (anello),  
— recipienti di misura.  
1.6.4.1.1. T a v o l o m o b i l e p e r i l c a m p i o n e  
Il tavolo mobile per il campione viene usato come piano d'appoggio 
per il recipiente di misura termostatato contenente la soluzione in esame. Detto tavolo è montato su di un sostegno assieme al sistema 
di misurazione della forza.
 
1.6.4.1.2. S i s t e m a d i m i s u r a z i o n e d e l l a f o r z a  
Il sistema di misurazione della forza (vedi la figura) è collocato al 
di sopra del tavolo che sostiene il campione. L'errore nella misura 
della forza non deve essere maggiore di ± 10  -6 N, corrispondente 
ad un limite d'errore di ± 0,1 mg in unità di massa. Nella mag ­
gioranza dei casi, la scala di misura dei tensiometri reperibili in commercio è tarata in mN/m, in modo che la tensione superficiale 
possa essere direttamente letta in mN/m con una incertezza di 0,1 
mN/m.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 53
 
1.6.4.1.3. E l e m e n t o d i m i s u r a ( a n e l l o )  
L'anello è generalmente costituito da un filo di platino-iridio di 
circa 0,4 mm di spessore ed avente una circonferenza media di 
60 mm. L'anello è sospeso orizzontalmente ad uno stelo metallico e ad una forcella di supporto in filo metallico che costituiscono il collegamento con il sistema di misurazione della forza (vedi la 
figura).
 
Figura  
Elemento di misura  
(Tutte le quote sono in mm)
  
1.6.4.1.4. R e c i p i e n t e d i m i s u r a  
Il recipiente di misura contenente la soluzione in esame deve essere 
in vetro e permettere la termostatazione. Esso deve essere progettato 
in modo che, durante la misura, la temperatura della soluzione li ­
quida in esame e della fase gassosa sovrastante la sua superficie rimanga costante e che il campione non possa evaporare. Sono ac ­
cettabili recipienti cilindrici in vetro di diametro interno non inferiore 
a 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 54
 
1.6.4.2.  Preparazione dell'apparecchiatura  
1.6.4.2.1. P u l i z i a  
I recipienti di vetro devono essere accuratamente puliti. Se necessa ­
rio, essi vanno lavati con miscela solfo-cromica bollente, poi con acido fosforico sciropposo (dall'83 al 98 % in peso di H
 3 PO 4 ), 
abbondantemente risciacquati con acqua di rubinetto, lavati con ac ­
qua bidistillata fino a reazione neutra ed infine asciugati o risciac ­
quati con parte del campione liquido in esame.  
L'anello deve essere innanzitutto abbondantemente risciacquato con 
acqua per eliminare ogni sostanza idrosolubile, poi immerso per breve tempo nella miscela solfo-cromica, lavato con acqua bidistil ­
lata fino a reazione neutra ed infine riscaldato brevemente su una 
fiamma a metanolo.
 
Nota:  
Eventuali sostanze contaminanti che non possano essere disciolte o 
distrutte dalla miscela solfo-cromica o dall'acido fosforico, come ad 
esempio siliconi, vanno eliminate mediante un opportuno solvente 
organico.  
1.6.4.2.2. T a r a t u r a d e l l ' a p p a r e c c h i o  
La convalida dell'apparecchiatura consiste nel controllo del punto di 
zero e nella regolazione dello strumento in modo che esso permetta 
determinazioni attendibili in mN/ra.  
Montaggio:  
La base dell'apparecchio deve essere posta perfettamente in piano, 
per esempio utilizzando una livella a bolla d'aria e regolando le apposite viti di livellamento.
 
Azzeramento dell'apparecchio:  
Dopo aver montato l'anello sull'apparecchio e prima di immergerlo 
nel liquido, il tensiometro deve essere azzerato, controllando inoltre il parallelismo dell'anello con la superficie della soluzione. A tale scopo la superficie della soluzione può essere usata come uno spec ­
chio.
 
Taratura:  
La taratura può essere effettuata tramite uno dei due procedimenti 
seguenti:  
a) per mezzo di una massa: il procedimento si basa sull'impiego di 
cavalieri di massa nota compresa tra 0,1 e 1,0 g, da collocare 
sull'anello. Il fattore di calibrazione Φ a , per il quale tutte le letture 
dell'apparecchio devono essere moltiplicate, va determinato con la seguente equazione (1):
 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
dove:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = massa del cavaliere (in g),  
g = accelerazione di gravità (981 cm.s-  2 al livello del mare),  
b = circonferenza dell'anello (in cm),  
σ a = lettura al tensiometro dopo collocamento del cavaliere 
sull'anello (in mN/m);  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 55
 
b) per mezzo dell'acqua: il procedimento si basa sull'impiego di 
acqua pura, la cui tensione superficiale è nota; per esempio, a 
23 o C essa è di 72,3 mN/m. Questo metodo è più rapido della 
taratura con pesi, ma comporta sempre il rischio che la tensione superficiale dell'acqua risulti alterata a causa della contaminazione 
con tensioattivi in traccia.
 
Il fattore di taratura Φ b , per il quale tutte le letture dell'apparec ­
chio devono essere moltiplicate, va determinato con la seguente equazione (2):
 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
dove:  
σ o = valore riportato in letteratura per la tensione superficiale 
dell'acqua (in mN/m),  
σ g = valore misurato della tensione superficiale dell'acqua (in 
mN/m) entrambi riferiti alla stessa temperatura.  
1.6.4.3.  Preparazione dei campioni  
Vanno preparate soluzioni acquose delle sostanze da esaminare alle 
concentrazioni richieste ed in assenza di alcun corpo di fondo.  
La soluzione deve essere mantenuta a temperatura costante 
(± 0,5  o C). Poiché la tensione superficiale di una soluzione 
nel recipiente di misura varia con il tempo, devono essere ef ­
fettuate più misure a distanza l'una dall'altra, in modo da poter 
tracciare un grafico rappresentante le variazioni della tensione superficiale in funzione del tempo. Lo stato di equilibrio si considera raggiunto quando non si riscontrano più variazioni.
 
La polvere e la contaminazione gassosa ad opera di altre sostanze 
interferiscono con le misure. Queste devono pertanto essere effettuate sotto una copertura di protezione.
 
1.6.5.  Condizioni sperimentali  
Le misure vanno eseguite a 20  o C circa con variazioni non superiori 
a ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Esecuzione della prova  
Le soluzioni da sottoporre a misura devono essere trasferite nel 
recipiente di misura accuratamente pulito, avendo cura di evitare la 
formazione di schiuma, e successivamente il recipiente di misura va 
collocato sul tavolo dell'apparecchio di prova. Il piano dei tavolo va alzato insieme ai recipiente fino ad immergere l'anello sotto la su ­
perficie della soluzione in esame. Il piano del tavolo va poi abbas ­
sato gradualmente ed uniformemente (ad una velocità di circa 
0,5 cm/min), in modo da staccare l'anello dalla superficie, fino a raggiungere il massimo della forza. Lo strato liquido attaccato al ­
l'anello non deve separarsi da esso. Al termine della misura, l'anello 
va nuovamente immerso sorto la superficie della soluzione ed il 
procedimento ripetuto finché si ottenga un valore costante della ten ­
sione superficiale. In ciascuna determinazione va registrato il tempo trascorso dal trasferimento della soluzione nel recipiente di misura. Le 
letture devono essere effettuate in corrispondenza dello sforzo massimo 
necessario per distaccare l'anello dalla superficie del liquido.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 56
 
2. DATI  
Per calcolare la tensione superficiale, il valore in mN/m letto sull'ap ­
parecchio va innanzitutto moltiplicato per il fattore di calibrazione Φ a 
o Φ b , (secondo il procedimento di taratura adottato). Si otterrà così 
un valore approssimativo, che deve essere a sua volta opportuna ­
mente corretto.  
Harkins e Jordan (4) hanno determinato alcuni fattori di correzione 
empirici per i valori della tensione superficiale misurata col metodo dell'anello, i quali dipendono dalle dimensioni dell'anello, dalla den ­
sità del liquido e dalla sua tensione superficiale.
 
Poiché la determinazione del fattore di correzione con le tabelle di 
Harkins e Jordan per ciascuna singola misura di tensione superficiale 
risulta troppo laboriosa, per le soluzioni acquose può applicarsi un 
metodo semplificato, consistente nel desumere la tensione superfi ­
ciale corretta direttamente dalla tabella qui di seguito riportata (per valori compresi tra quelli tabulati si può ricorrere all'interpolazione).
 
Tabella  
Correzione dei valori sperimentali della tensione superficiale  
Valida soltanto per soluzioni acquose con p = 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (raggio medio dell'anello). 
r = 0,185 mm (spessore medio del filo metallico).  
Valore sperimentale (mN/m) Valore corretto (mN/m) 
Taratura con pesi (vedi punto 
1.6.4.2.2, lettera a) Taratura con acqua (vedi punto 
1.6.4.2.2, lettera b)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
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Valore sperimentale (mN/m) Valore corretto (mN/m) 
Taratura con pesi (vedi punto 
1.6.4.2.2, lettera a) Taratura con acqua (vedi punto 
1.6.4.2.2, lettera b)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Questa tabella è stata compilata sulla base della correzione secondo 
Harkins e Jordan, in modo analogo alla norma DIN 53914 per l'ac ­
qua e le soluzioni acquose (densità p = 1 g/cm  3 ) e per anelli repe ­
ribili in commercio aventi dimensioni di R = 9,55 mm (raggio medio 
dell'anello) e r = 0,185 mm (spessore del filo metallico). La tabella fornisce i valori corretti per le misure di tensione superficiale effet ­
tuate dopo taratura con pesi o con acqua.
 
In alternativa, la tensione superficiale può essere calcolata senza 
taratura preliminare ricorrendo alla formula seguente:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
dove:  
F = forza misurata al dinamometro al punto di rottura della pelli ­
cola,  
R = raggio dell'anello,  
f = fattore di correzione (1).  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— metodo usato;  
— tipo d'acqua o soluzione impiegata;  
— descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze);  
— risultati delle misure: tensione superficiale (lettura), indicando sia 
le singole letture e la loro media che la media corretta (tenendo 
conto del fattore specifico dell'apparecchio e della tabella di 
correzione);  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 58
 
— concentrazione della soluzione;  
— temperatura di esecuzione delle prove;  
— età della soluzione impiegata; in particolare il tempo trascorso tra 
la preparazione della soluzione e le misure;  
— descrizione della variazione della tensione superficiale col tempo 
dopo il trasferimento della soluzione nel recipiente di misura;  
— tutte le informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei 
risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato 
fisico della sostanza.  
3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Considerando che l'acqua distillata ha una tensione superficiale di 
72,75 mN/m a 20  o C, le sostanze che presentano una tensione su ­
perficiale minore di 60 mN/m nelle condizioni di misura previste da questo metodo devono essere considerate come materiali tensioattivi.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Chapter 
XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter ­
science Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.  
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 59
 
A.6. IDROSOLUBILITÀ  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove 
sulle sostanze chimiche n. 105 (1995) Questo metodo di prova è una ver ­
sione riveduta della linea guida originale n. 105 adottata nel 1981. Non vi 
sono differenze significative tra l’attuale versione e quella del 1981, in 
quanto è stato modificato soprattutto il formato. La revisione si basa sul metodo di prova dell’UE «Idrosolubilità» (
 1 ). 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
2. L’idrosolubilità di una sostanza può essere considerevolmente alterata dalla 
presenza di impurità. Il presente metodo di prova riguarda la determinazione dell’idrosolubilità di sostanze fondamentalmente pure che sono stabili in acqua e non volatili. Prima di determinare l’idrosolubilità è utile disporre 
di alcune informazioni preliminari sulla sostanza in esame, come la formula 
strutturale, la tensione di vapore, la costante di dissociazione e l’idrolisi in funzione del pH.
 
3. In questo capitolo sono descritti due metodi: il metodo dell’eluizione su 
colonna e il metodo del matraccio che riguardano rispettivamente solubilità inferiori e superiori a 10
 –2 g/l. Viene anche descritta una semplice prova 
preliminare che consente di determinare approssimativamente la quantità 
adeguata di campione da utilizzare nella prova finale e il tempo necessario per raggiungere la saturazione.
 
DEFINIZIONI E UNITÀ  
4. L’idrosolubilità di una sostanza è la concentrazione massica di saturazione 
della sostanza in acqua ad una determinata temperatura.  
5. L’idrosolubilità è espressa in massa di soluto per volume di soluzione. 
L’unità SI è kg/m  3 (ma si può anche far uso di g/l).  
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
6. Per questo metodo non è necessario utilizzare sostanze chimiche di riferi ­
mento quando si esamina una sostanza.  
DESCRIZIONE DEI METODI  
Condizioni sperimentali  
7. La prova deve essere preferibilmente effettuata a 20 ± 0,5 ° C, mantenendo 
costante la temperatura scelta in tutte le parti dell’apparecchiatura.  
Prova preliminare  
8. Nell’ambito di una procedura in più fasi successive (stepwise), in un cilindro 
graduato da 10 ml con tappo di vetro vengono versati volumi crescenti di acqua a temperatura ambiente su circa 0,1 g di campione (le sostanze in 
esame solide devono essere polverizzate). Dopo ciascuna aggiunta di acqua, 
la miscela viene agitata per 10 minuti e controllata visivamente per verifi ­
care la presenza di particelle non disciolte del campione. Se, dopo l’aggiunta di 10 ml d’acqua, il campione, o parte di esso, resta indisciolto, 
l’esperimento deve essere proseguito in un cilindro graduato da 100 ml. 
La solubilità approssimativa è indicata nella tabella 1 in corrispondenza
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 60
 
del volume d’acqua necessario per ottenere la dissoluzione completa del 
campione. Quando la solubilità è bassa, può occorrere più tempo per scio ­
gliere la sostanza in esame e si devono prevedere almeno 24 ore. Se dopo 24 ore la sostanza in esame non è ancora disciolta, occorre aspettare più a lungo (fino a 96 ore) o tentare un’ulteriore diluizione per stabilire se occorre 
utilizzare il metodo di eluizione su colonna o il metodo del matraccio.
 
Tabella 1  
ml di acqua per 0,1 g di 
campione 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
solubilità approssimativa in g/l > 1 000 Da 1 000 
a 200 Da 200 a 
100 Da 100 a 
50 Da 50 a 
10 Da 10 a 
1 < 1 
Metodo dell’eluizione su colonna  
Principio  
9. Questo metodo si basa sull’eluizione della sostanza in esame con acqua in 
una microcolonna caricata con un materiale di supporto inerte, precedente ­
mente rivestito con un eccesso della sostanza stessa (2). L’idrosolubilità è data dalla concentrazione massica dell’eluato quando questo ha raggiunto un 
plateau in funzione del tempo.
 
Apparecchiatura  
10. L’apparecchiatura è costituita da una microcolonna (figura 1) mantenuta a 
temperatura costante, collegata ad una pompa di ricircolo (figura 2) o a un recipiente di livellamento (figura 3). La microcolonna contiene un supporto 
inerte tenuto fermo da un piccolo tampone di lana di vetro che serve anche 
per filtrare le particelle. Il materiale di supporto può essere costituito da perline di vetro, farina fossile o altri materiali inerti.
 
11. La microcolonna di cui alla figura 1 è adatta alla configurazione con la 
pompa di ricircolo. È caratterizzata da uno spazio di testa pari ad almeno cinque volte il volume di letto (eliminato all’inizio dell’esperimento) e il volume di cinque campioni (eliminati dall’analisi nel corso dell’esperimen ­
to). In alternativa, le dimensioni possono essere ridotte se è possibile ag ­
giungere acqua nel corso dell’esperimento per sostituire i primi cinque volumi di letto, scartati perché contenenti impurità. La colonna è collegata con giunti in materiale inerte alla pompa di ricircolo, che consente una 
velocità di flusso pari a circa 25 ml/h. La pompa di ricircolo può essere, 
ad esempio, una pompa peristaltica o a membrana. Occorre fare in modo che non ci sia contaminazione e/o adsorbimento con il materiale del tubo.
 
12. La rappresentazione schematica di una configurazione con recipiente di 
livellamento è riportata nella figura 3. In questa configurazione la microco ­
lonna è munita di un rubinetto ad una via. Il collegamento con il recipiente di livellamento consiste in un giunto di vetro smerigliato e un tubo in 
materiale inerte. La velocità del flusso proveniente dal recipiente di livella ­
mento deve essere pari a circa 25 ml/h.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 61
 
Figura 1
  
Dimensioni in mm  
A. Connessione per giunto di vetro smerigliato  
B. Spazio di testa  
C. Diametro interno 5  
D. Diametro esterno 19  
E. Tampone di lana di vetro  
F. Rubinetto  
Figura 2
  
A. Equilibrio atmosferico  
B. Flussimetro  
C. Microcolonna  
D. Pompa di circolazione termocontrollata  
E. Pompa di ricircolo  
F. Valvola a due vie per il campionamento  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 62
 
Figura 3
  
A. Recipiente di livellamento (per esempio bottiglia da 2,5 litri)  
B. Colonna  
C. Collettore di frazione  
D. Termostato  
E. Tubo in teflon  
F. Giunto in vetro smerigliato  
G. Tubi per l’acqua (tra il termostato e la colonna, diametro interno 8 mm 
circa)  
13. Circa 600 mg del materiale di supporto sono trasferiti in un matraccio da 50 
ml. Una quantità adeguata della sostanza in esame è sciolta in un solvente 
volatile di purezza analitica e una quantità adeguata di questa soluzione viene aggiunta al materiale di supporto. Il solvente è completamente evapo ­
rato, utilizzando ad esempio un evaporatore rotante, perché altrimenti non si 
ottiene la saturazione dell’acqua del supporto nel corso della fase di elui ­
zione per via della partizione in superficie. Il materiale di supporto così impregnato viene lasciato a bagno per due ore in 5 ml circa di acqua, e quindi la sospensione viene versata nella microcolonna. Altrimenti, si può 
versare il materiale di supporto impregnato a secco nella microcolonna 
riempita di acqua lasciando poi il tutto a riposo per due ore per raggiungere l’equilibrio.
 
14. Il caricamento del materiale di supporto può causare problemi, dando luogo 
a risultati erronei, se la sostanza di prova si deposita sotto forma di olio. 
Occorre valutare questi problemi e riportare i dettagli nella relazione.  
Procedura con pompa di ricircolo  
15. Si avvia il flusso attraverso la colonna. Si raccomanda di usare un flusso di 
approssimativamente 25 ml/h (che corrisponde a 10 volte il volume di letto 
della colonna descritta per ora). Per eliminare le impurità solubili in acqua, 
si devono scartare almeno i primi cinque volumi di letto. Successivamente si attiva la pompa fino al raggiungimento dell’equilibrio, che è dimostrato da cinque campioni successivi, le cui concentrazioni non differiscono tra loro 
più del ± 30 % in una distribuzione casuale. Questi campionamenti devono 
essere separati l’uno dall’altro da intervalli di tempo corrispondenti almeno al passaggio di un volume corrispondente a dieci volte il volume di letto della colonna. In funzione del metodo analitico utilizzato, può risultare 
preferibile stabilire una curva concentrazione/tempo per evidenziare che è 
stato raggiunto l’equilibrio.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 63
 
Procedura con recipiente di livellamento  
16. Vanno prelevate ed analizzate con il metodo prescelto frazioni di eluato 
successive. Per determinare la solubilità si utilizzano le frazioni provenienti dalla fase centrale di eluizione, dove le concentrazioni sono costanti (con 
uno scarto masso di ± 30 %) in almeno cinque frazioni consecutive.
 
17. L’eluente più indicato è l’acqua bidistillata, ma si può utilizzare anche acqua 
deionizzata, caratterizzata da una resistività superiore a 10 megaohm/cm e 
un tenore totale di carbonio organico inferiore a 0,01 %.  
18. Nell’ambito di entrambe le procedure, l’operazione viene ripetuta una se ­
conda volta dimezzando la velocità di flusso. Se i risultati delle due opera ­
zioni concordano, la prova è riuscita. Se la solubilità misurata è superiore 
con il flusso inferiore, occorre proseguire con il dimezzamento del flusso fino a quando due serie successive non forniscano lo stesso valore di solu ­
bilità.
 
19. Nell’ambito di entrambe le procedure, occorre esaminare le frazioni per 
controllare la presenza di materiale colloidale mediante l’esame dell’effetto 
Tyndall. La presenza di particelle invalida la prova che deve essere ripetuta 
dopo aver migliorato l’azione filtrante della colonna.  
20. Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine 
indicatrici speciali.  
Metodo del matraccio  
Principio  
21. La sostanza in esame (polverizzata, se solida) è disciolta in acqua a una 
temperatura leggermente superiore alla temperatura di prova. Quando viene 
raggiunta la saturazione, la miscela viene raffreddata e mantenuta alla tem ­
peratura di prova. In alternativa, la misurazione può essere eseguita diretta ­
mente alla temperatura di prova se, mediante un appropriato campionamen ­
to, si è sicuri di avere raggiunto l’equilibrio di saturazione. Successivamente, 
si determina mediante un metodo analitico adeguato la concentrazione mas ­
sica della sostanza in esame nella soluzione acquosa che non deve contenere particelle indisciolte (3).
 
Apparecchiatura  
22. Occorre il materiale seguente:  
— normale strumentazione e vetreria da laboratorio,  
— un apparecchio per l’agitazione delle soluzioni a temperatura costante 
controllata,  
— se necessario per le emulsioni, una centrifuga (preferibilmente termo ­
statata), e  
— apparecchiatura analitica.  
Procedura  
23. Sulla base della prova preliminare viene valutata la quantità di sostanza 
necessaria per saturare il volume di acqua stabilito. Una quantità di sostanza 
pari a cinque volte la suddetta quantità viene pesata direttamente in tre recipienti di vetro (per esempio, provette da centrifuga, matracci) provvisti di tappi di vetro. In ciascun recipiente viene aggiunto un volume d’acqua, 
scelto in funzione del metodo analitico e del «range» di solubilità. I reci ­
pienti sono chiusi ermeticamente e poi agitati a 30 ° C. Si deve utilizzare un apparecchio di agitazione o di mescolamento che funzioni a temperatura costante, per esempio un agitatore magnetico in un bagnomaria termostatato. 
Dopo un giorno, uno dei recipienti viene equilibrato per 24 ore alla tempe ­
ratura di prova, con agitazione saltuaria. Il contenuto del recipiente viene
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successivamente centrifugato alla temperatura di prova, e viene misurata, 
con un opportuno metodo analitico, la concentrazione della sostanza in 
esame nella fase acquosa limpida. Gli altri due matracci vengono trattati in modo analogo dopo un’equilibrazione iniziale a 30 ° C per due e tre giorni, rispettivamente. Se le concentrazioni misurate almeno negli ultimi 
due recipienti non divergono di più del 15 %, la prova è riuscita. Se invece i 
risultati relativi ai recipienti 1, 2 e 3 evidenziano una tendenza verso valori crescenti, l’intera prova deve essere ripetuta utilizzando tempi di equilibra ­
zione più lunghi.
 
24. La prova può essere effettuata anche senza la preincubazione a 30 ° C. Per 
calcolare la velocità con cui si raggiunge l’equilibrio di saturazione, si prelevano dei campioni fino a quando il tempo di agitazione non influisce 
più sulle concentrazioni.
 
25. Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine 
indicatrici speciali.  
Determinazioni analitiche  
26. Per queste determinazioni è preferibile ricorrere a un metodo analitico spe ­
cifico per la sostanza in esame, poiché piccole quantità di impurità solubili possono causare grandi errori nella misura della solubilità. Esempi di metodi 
sono: gascromatografia, cromatografia liquida, titolazione, fotometria e vol ­
tammetria.
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
Metodo dell’eluizione su colonna  
27. Per ciascuna serie si deve calcolare il valore medio di almeno cinque cam ­
pioni consecutivi, prelevati in corrispondenza del plateau di saturazione, nonché la deviazione standard. I valori medi ottenuti in due prove con velocità di flusso diverse non devono divergere di oltre il 30 %.
 
Metodo del matraccio  
28. Occorre calcolare la media dei risultati ottenuti da ognuno dei tre matracci, 
che tra loro non deve differire di più del 15 %.  
Relazione sulla prova  
Metodo dell’eluizione su colonna  
29. La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
— risultati della prova preliminare,  
— identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del 
caso),  
— concentrazioni, flussi e pH individuali di ciascun campione,  
— medie e deviazioni standard di almeno cinque campioni dal plateau di 
saturazione per ciascuna serie,  
— media di almeno due serie successive,  
— temperatura dell’acqua durante il processo di saturazione,  
— metodo di analisi utilizzato,  
— natura del materiale di supporto,  
— impregnazione del materiale di supporto,  
— solvente utilizzato,  
— indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la 
prova,  
— tutte le informazioni attinenti all’interpretazione dei risultati, in partico ­
lare per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in 
esame.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 65
 
Metodo del matraccio  
30. La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
— risultati della prova preliminare,  
— identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del 
caso),  
— singole determinazioni analitiche e rispettivo valore medio nel caso sia 
stato determinato più di un valore per ciascun matraccio,  
— pH di ciascun campione,  
— media dei valori per vari matracci i cui risultati siano concordanti,  
— temperatura di prova,  
— metodo analitico,  
— indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la 
prova,  
— tutte le informazioni utili per l’interpretazione dei risultati, in particolare 
per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in esame.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Direttiva 92/69/CEE della Commissione, del 31 luglio 1992, recante dicias ­
settesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, rego ­
lamentari ed amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e 
all’etichettatura delle sostanze pericolose (GU L 383 del 29.12.1992, 
pag. 113).
 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.
 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flaskmethod.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 66
 
A.8. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE  
1. METODO  
Il metodo del «dibattimento in pallone» descritto è basato sulle linee 
direttrici OCSE (1).  
1.1. INTRODUZIONE  
Per eseguire questa prova è utile disporre di informazioni preliminari 
sulla formula di struttura, la costante di dissociazione, la solubilità in acqua, l'idrolisi, la solubilità in n-ottanolo e la tensione superficiale della sostanza.
 
La misura sulle sostanze ionizzabili deve essere eseguita solo nella 
loro forma non ionizzata (acido libero o base libera), prodotta me ­
diante l'uso di un tampone appropriato con un pH di almeno una unità inferiore (acido libero) o superiore (base libera) al pK.
 
Questo metodo di prova include due procedure separate — il metodo 
dell'agitazione in pallone e la cromatografia liquida ad alte presta ­
zioni (HPLC). Il primo può essere applicato quando il valore di log 
P oa (per le definizioni si veda più avanti) ricade nel campo da — 2 a 
4 e il secondo nel campo da 0 a 6. Prima di eseguire una delle due procedure sperimentali, si deve ricavare una stima preliminare del coefficiente di ripartizione.
 
Il metodo del dibattimento in pallone vale solo per sostanze essen ­
zialmente pure, solubili in acqua e in n-ottanolo. Non è applicabile a materiali tensioattivi (per i quali si deve fornire un valore calcolato o una stima basata sulle solubilità individuali in n-ottanolo e in acqua).
 
Il metodo HPLC non è applicabile ad acidi e basi forti, complessi 
metallici, materiali tensioattivi o sostanze che reagiscono con l'eluen ­
te. Per questi materiali, si deve fornire un valore calcolato o una stima basata sulle solubilità individuali in n-ottanolo e acqua.
 
Il metodo HPLC è meno sensibile alla presenza di impurezze nei 
composto in esame che non il metodo dell'agitazione in pallone. Tuttavia, in alcuni casi, le impurezze possono rendere difficile l'in ­
terpretazione dei risultati perché l'assegnazione dei picchi diventa 
incerta. Per le miscele che forniscono una banda non risolta, si 
devono indicare i limiti inferiore e superiore di log P,
 
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
Il coefficiente di ripartizione (P) si definisce come il rapporto tra le 
concentrazioni all'equilibrio (C  i ) di una sostanza disciolta in un si ­
stema costituito da due solventi pressoché immiscibili. Nel caso del 
n-ottanolo e dell'acqua: 
P ow ¼ c n Ä octanol 
c water 
Il coefficiente di ripartizione (P) è pertanto il quoziente di due con ­
centrazioni e viene generalmente espresso sotto forma del suo loga ­
ritmo decimale (log P).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 67
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Metodo del dibattimento in pallone  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si 
esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per con ­
trollare periodicamente l'attendibilità del metodo e per permettere il 
confronto con risultati ottenuti mediante altri metodi.  
Metodo HPLC  
Allo scopo di correlare i dati di un composto misurati per HPLC con 
il suo P, si deve tracciare un grafico di taratura di log P contro i dati 
cromatografici utilizzando almeno 6 punti di riferimento. Sta all'uti ­
lizzatore selezionare le sostanze di riferimento appropriate. Se pos ­
sibile, almeno un composto di riferimento deve avere un P  oa al di 
sopra di quello della sostanza in esame e un altro un P  oa al di sotto 
di quello della sostanza in esame. Per valori di log P minori di 4, la taratura può essere basata su dati ottenuti mediante il metodo del dibattimento in pallone. Per valori di log P maggiori di 4, la taratura 
può essere basata su valori di letteratura convalidati, purché siano in 
accordo con i valori calcolati. Per una migliore accuratezza, è pre ­
feribile scegliere composti di riferimento strutturalmente simili alla sostanza in esame.
 
Sono disponibili elenchi estesi di valori di log P  oa per molti gruppi di 
composti chimici (2) (3). Se non sono disponibili dati di coefficienti di ripartizione di composti strutturalmente simili, si può allora usare 
una taratura più generale basata su altri composti di riferimento.
 
In appendice 2 è fornito un elenco di sostanze di riferimento racco ­
mandate e dei loro valori di P  oa . 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
1.4.1.  Metodo del dibattimento in pallone  
Per determinare il coefficiente di ripartizione è necessario raggiun ­
gere l'equilibrio tra tutti i componenti che interagiscono nel sistema, e si devono determinare le concentrazioni delle sostanze disciolte nelle due fasi. Un esame della letteratura sull'argomento indica che 
si possono utilizzare varie tecniche per risolvere questo problema, 
cioè l'accurata miscelazione delle due fasi seguita dalla loro separa ­
zione per poter determinare la concentrazione all'equilibrio della so ­
stanza in esame.
 
1.4.2.  Metodo HPLC  
La misura viene eseguita su colonne analitiche impaccate con una 
fase solida disponibile in commercio contenente idrocarburi a catena lunga (ad esempio C
 8 , C 18 ) chimicamente legati su silice. I prodotti 
chimici iniettati su una colonna si muovono lungo di essa a velocità 
differenti a causa del differente grado di ripartizione tra la fase 
mobile e la fase stazionaria idrocarbonica. Miscele di composti chi ­
mici vengono eluite nell'ordine della loro idrofobicità, dove i com ­
posti chimici solubili in acqua sono eluiti per primi e i composti 
chimici liposolubili per ultimi, in proporzione al loro coefficiente di 
ripartizione idrocarburo-acqua. Questo permette di stabilire la rela ­
zione esistente tra il tempo di ritenzione su tale colonna (a fase inversa) e il coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua. Il coeffi ­
ciente di ripartizione viene dedotto dal  fattore di capacità  k, fornito 
dall'espressione:
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
in cui t  r = tempo di ritenzione della sostanza in esame e t  o = tempo 
medio richiesto perché una molecola di solvente passi attraverso la 
colonna (tempo morto).  
Non sono richiesti metodi analitici quantitativi, ed è necessaria solo 
la determinazione dei tempi di eluizione.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
1.5.1.  Ripetibilità  
Metodo del dibattimento in pallone  
Per assicurare l'accuratezza del coefficiente di ripartizione, vanno 
eseguite determinazioni in doppio in tre diverse condizioni sperimen ­
tali, così da poter variare la quantità della sostanza considerata non ­
ché il rapporto tra i volumi dei solventi. I valori determinati per il 
coefficiente di ripartizione, espressi come logaritmi decimali, devono essere compresi in un intervallo di ± 0,3 unità logaritmiche.
 
Metodo HPLC  
Al fine di aumentare la validità della misura, si devono eseguire 
determinazioni in doppio. I valori di log P derivati dalle singole misure devono essere compresi in un intervallo di ± 0,1 unità loga ­
ritmiche.
 
1.5.2.  Sensibilità  
Metodo del dibattimento in pallone  
L'intervallo di misura del metodo è definito dal limite di rivelabilità 
del procedimento analitico. Questo deve essere sufficiente per per ­
mettere la valutazione dei valori di log P  oa nel campo da — 2 a 4 
(occasionalmente, quando si verificano le opportune condizioni, que ­
sto intervallo può essere esteso ad un log P  oa fino a 5) quando la 
concentrazione del soluto in una delle due fasi non è superiore a 0,01 
mol/l.  
Metodo HPLC  
Il metodo HPLC permette di stimare i coefficienti di ripartizione nel 
campo di log P  oa da 0 a 6.  
Normalmente, il coefficiente di ripartizione di un composto può 
essere stimato entro ± 1 unità logaritmica del valore ottenibile con il metodo del dibattimento in pallone. In letteratura è possibile tro ­
vare correlazioni tipiche (4) (5) (6) (7) (8). Un'accuratezza più ele ­
vata si può in genere ottenere con grafici di correlazione basati su 
composti di riferimento di struttura simile (9).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 69
 
1.5.3.  Specificità  
Metodo del dibattimento in pallone  
La legge di ripartizione di Nernst si applica esclusivamente a solu ­
zioni diluite a temperatura, pressione e pH costanti. Essa è rigoro ­
samente valida solo per una sostanza pura dispersa tra due solventi 
puri. Qualora in una delle due fasi, od in ambedue, siano presenti più 
soluti diversi, ciò può alterare i risultati.  
La dissociazione o l'associazione delle molecole disciolte portano a 
deviazioni dalla legge di ripartizione di Nernst. Tali deviazioni sono 
evidenziate dal fatto che il coefficiente di ripartizione varia in fun ­
zione della concentrazione della soluzione.  
Dati gli equilibri multipli che hanno luogo, questo metodo non può 
essere applicato a composti ionizzabili senza ricorrere ad opportuni 
fattori di correzione. Per tali composti si deve prendere in conside ­
razione l'uso di soluzioni tampone invece di acqua; il pH del tam ­
pone deve differire di almeno un'unità di pH dal pKa della sostanza, tenendo presente la significatività di questo pH per l'ambiente.
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Stima preliminare del coefficiente di ripartizione  
II coefficiente di ripartizione viene stimato preferibilmente utiliz ­
zando un metodo di calcolo (si veda l'appendice 1), o, dove appro ­
priato, dal rapporto delle solubilità della sostanza in esame nei sol ­
venti puri (10).  
1.6.2.  Metodo del dibattimento in pallone  
1.6.2.1.  Preparazione  
n-ottanolo: la determinazione del coefficiente di ripartizione deve 
essere eseguita con reattivi per analisi di elevata purezza.  
Acqua: va impiegata acqua distillata o bidistillata in apparecchi di 
vetro o quarzo. Per i composti ionizzabili, si devono usare soluzioni tampone al posto dell'acqua, se giustificato.
 
Nota:  
Non si deve usare acqua prelevata direttamente da uno scambiatore 
di ioni.  
1.6.2.1.1. P r e s a t u r a z i o n e d e i s o l v e n t i  
Prima di determinare il coefficiente di ripartizione, le fasi del sistema 
di solventi devono essere mutuamente saturate mediante agitazione alla temperatura della determinazione. Per far ciò è vantaggioso agi ­
tare per 24 ore con un agitatore meccanico due grandi bottiglie di 
riserva contenenti rispettivamente n-ottanolo ed acqua, entrambi di grande purezza, addizionati ciascuno di una adeguata quantità del ­
l'altro solvente, e poi lasciate riposare abbastanza a lungo da con ­
sentire la separazione delle fasi ed il raggiungimento dello stato di 
saturazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r e p a r a z i o n e p e r l a d e t e r m i n a z i o n e  
L'intero volume del sistema bifasico deve riempire quasi completa ­
mente il recipiente di misura. Ciò permetterà di evitare le perdite di 
materiale per volatilizzazione. I rapporti in volume e le quantità delle sostanze da impiegare devono essere stabilite tenendo conto:
 
— della valutazione preliminare del coefficiente di ripartizione (si 
veda sopra),  
— della quantità minima di sostanza da esaminare per il procedi ­
mento analitico,  
— della limitazione della concentrazione ad un massimo di 0,01 
mol/l per ognuna delle due fasi.  
Si eseguono tre determinazioni. Nella prima, si usa il rapporto in 
volume calcolato di n-ottanolo ad acqua; nella seconda, questo rap ­
porto viene diviso per due; e nella terza questo rapporto viene mol ­
tiplicato per due (ad esempio 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. S o s t a n z a d a e s a m i n a r e  
Si prepara una soluzione di riserva in n-ottanolo presaturato con 
acqua. La concentrazione di questa soluzione di riserva deve essere 
determinata con precisione prima di impiegarla nella determinazione 
del coefficiente di ripartizione. Questa soluzione deve essere conser ­
vata in condizioni che assicurino la sua stabilità.  
1.6.2.2.  Condizioni sperimentali  
La temperatura della determinazione deve essere mantenuta costante 
(± 1  o C) ed essere compresa nell'intervallo 20-25  o C. 
1.6.2.3.  Procedimento di misura  
1.6.2.3.1. R a g g i u n g i m e n t o d e l l ' e q u i l i b r i o d i r i p a r t i z i o n e  
Per ciascuna condizione sperimentale si devono preparare in doppio i 
recipienti contenenti la quantità richiesta dei due solventi, esatta ­
mente misurata, insieme all'opportuna quantità della soluzione di 
riserva.  
Le fasi in n-ottanolo devono essere misurate in volume. I recipienti 
per la determinazione devono essere collocati in un opportuno agi ­
tatore o essere agitati manualmente. Un metodo raccomandato è 
quello di fare ruotare rapidamente di 180  o la provetta da centrifuga 
intorno al suo asse trasversale in modo che l'eventuale aria intrap ­
polata risalga attraverso le due fasi. L'esperienza ha mostrato che 50 rotazioni così effettuate sono in generale sufficienti per raggiungere 
l'equilibrio di ripartizione. Per sicurezza sono raccomandate 100 ro ­
tazioni in 5 minuti.
 
1.6.2.3.2. S e p a r a z i o n i d e l l e f a s i  
Quando è necessario, allo scopo di separare le fasi si deve effettuare 
una centrifugazione della miscela. Ciò dovrebbe essere fatto me ­
diante una centrifuga da laboratorio mantenuta a temperatura am ­
biente o, se si usa una centrifuga non termostatata, le provette da 
centrifuga devono essere riequilibrate alla temperatura di determina ­
zione per almeno 1 ora prima dell'analisi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analisi  
Per la determinazione del coefficiente di ripartizione è necessario 
misurare la concentrazione della sostanza in esame in ambedue le fasi. Ciò può essere fatto prelevando un'aliquota di entrambe le fasi 
da ciascuna provetta per ciascuna condizione sperimentale ed analiz ­
zando ciascuna aliquota mediante il procedimento prescelto. La quantità totale delle sostanze presenti in ambedue le fasi deve essere calcolata e confrontata con la quantità della sostanza inizialmente 
introdotta.
 
Il prelievo di un campione della fase acquosa va eseguito con un 
procedimento che renda minimo il rischio di inclusione di tracce di n-ottanolo; a tal fine si può impiegare una siringa in vetro con ago 
asportabile. All'inizio, la siringa deve essere parzialmente riempita 
d'aria. L'aria deve essere espulsa cautamente mentre si inserisce l'ago attraverso lo strato di ottanolo. Si aspira nella siringa un adeguato volume di fase acquosa. Si toglie rapidamente la siringa dalla solu ­
zione e si rimuove l'ago. Il contenuto della siringa può quindi essere 
impiegato come campione della fase acquosa. La concentrazione nelle due fasi separate va determinata preferibilmente attraverso un metodo specifico per la sostanza. Esempi di determinazioni chimico- 
fisiche che possono essere adatte sono i seguenti:
 
— metodi fotometrici,  
— gascromatografia,  
— cromatografia liquida ad alte prestazioni.  
1.6.3.  Metodo HPLC  
1.6.3.1.  Preparazione  
Apparecchiatura  
È necessario un cromatografo liquido equipaggiato con pompa esente 
da pulsazioni e con un adatto dispositivo di rivelazione. Si racco ­
manda di usare una valvola di iniezione con serbatoi di iniezione. La presenza di gruppi polari nella fase stazionaria può peggiorare gra ­
vemente le prestazioni della colonna HPLC. Pertanto, le fasi stazio ­
narie devono contenere una percentuale minima di gruppi polari (11). 
Si possono usare riempimenti commerciali a fase inversa a micro ­
particelle o colonne preimpaccate. Si può posizionare una colonna di protezione tra il sistema di iniezione e la colonna analitica.
 
Fase mobile  
Per preparare il solvente di eluizione si usano metanolo per HPLC e 
acqua per HPLC e il solvente viene degassato prima dell'uso. Si deve 
ricorrere all'eluizione isocratica. Si devono usare rapporti metanolo/ ­
acqua con un contenuto minimo d'acqua del 25 %. Normalmente, una miscela metanolo/acqua 3:1 (v/v) è soddisfacente per eluire composti con log P 6 in un'ora ad una portata di 1 ml/min. Per 
composti con log P elevato, può essere necessario abbreviare il 
tempo di eluizione (e quello dei composti di riferimento) diminuendo la polarità della fase mobile oppure la lunghezza della colonna.
 
Sostanze con solubilità molto bassa in n-ottanolo tendono a fornire 
dei valori anormalmente bassi di log P  oa con il metodo HPLC; i 
picchi di tali composti accompagnano talvolta il fronte del solvente. 
Ciò è probabilmente dovuto al fatto che il processo di ripartizione è troppo lento perché raggiunga l'equilibrio nel tempo normalmente richiesto da una separazione mediante HPLC. Una diminuzione del 
flusso e/o una diminuzione del rapporto metanolo/acqua può essere 
efficace per arrivare ad un valore affidabile.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 72
 
Il composto in esame e i composti di riferimento devono essere 
solubili nella fase mobile in concentrazioni sufficienti per permet ­
terne la rivelazione. Solo in casi eccezionali si possono usare degli additivi con la miscela metanolo-acqua perché questi modificano le proprietà della colonna. Per i cromatografi con additivi, è obbligato ­
rio usare una colonna separata dello stesso tipo. Se la miscela 
metanolo/acqua non è appropriata, si possono usare altre miscele solvente organico/acqua, ad esempio etanolo/acqua o acetonitrile/ ­
acqua.
 
Il pH dell'eluente è critico per i composti ionizzabili. Esso deve 
rientrare nel campo operativo di pH della colonna, che di solito è compreso tra 2 e 8. Si raccomanda di tamponare la soluzione. Oc ­
corre aver cura di evitare la precipitazione di sali e il deterioramento 
della colonna che si verificano con alcune miscele di fase organica/ ­
tampone. Le misure mediante HPLC con fasi stazionarie a base di silice al di sopra di pH 8 non sono consigliabili perché l'uso di una 
fase mobile alcalina può provocare un rapido scadimento delle pre ­
stazioni della colonna.
 
Soluti  
I composti di riferimento devono essere i più puri disponibili. I 
composti da usare a scopo di prova o di taratura devono, se possi ­
bile, essere disciolti nella fase mobile.  
Condizioni sperimentali  
La temperatura durante le misure non deve variare di oltre ± 2 K.  
1.6.3.2.  Misure  
Calcolo del tempo morto t  o 
Il tempo morto t  o può venire determinato usando o una serie omo ­
loga di sostanze (ad esempio n-alchilmetilchetoni) o composti orga ­
nici non trattenuti (ad esempio tiourea o formammide). Per il calcolo del tempo morto t
 o mediante l'uso di una serie omologa, si inietta 
una successione di almeno 7 elementi di una serie omologa e si 
determinano i rispettivi tempi di ritenzione. I tempi di ritenzione 
grezzi t  r(nc +1)  sono riportati in grafico in funzione di t  r(nc) , determi­
nano la intercetta a e il coefficiente angolare b della equazione di regressione:
 
t r(nc +1) = a + b t  r(nc) 
(n c = numero di atomi di carbonio). Il tempo morto  o è rappresentato 
allora da:  
t 0 = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 73
 
Grafico di taratura  
La fase successiva consiste nella costruzione di un tracciato di cor ­
relazione di log k contro log P per appropriati composti di riferi ­
mento. Nella pratica, si effettua la determinazione su un gruppo di 5- 10 composti standard di riferimento, il cui log P cade nei dintorni 
dell'intervallo previsto, iniettandoli simultaneamente ed effettuando 
preferibilmente la determinazione con un registratore integratore col ­
legato al sistema di rivelazione. I logaritmi dei fattori di capacità corrispondenti, log k, vengono calcolati e riportati sul tracciato in 
funzione del log P determinato mediante il metodo del dibattimento 
in pallone. La taratura viene eseguita a intervalli regolari ed almeno una volta al giorno, in modo da tenere conto di possibili variazioni delle prestazioni della colonna.
 
Determinazioni del fattore di capacità della sostanza in esame  
La sostanza in esame viene iniettata nella più piccola quantità pos ­
sibile di fase mobile. Viene determinato il tempo di ritenzione (in 
doppio) e questo permette il calcolo del fattore di capacità k. Dal grafico di correlazione dei composti di riferimento, si può interpolare il coefficiente di ripartizione della sostanza in esame. Per coefficienti 
di ripartizione sia molto bassi che molto elevati è necessario ricorrere 
alla estrapolazione. In tali casi bisogna porre particolare attenzione ai limiti di validità della retta di regressione.
 
2. DATI  
Metodo del dibattimento in pallone  
L'affidabilità dei valori di P determinati può essere controllata con ­
frontando le medie delle determinazioni in doppio con la media 
globale.  
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— indicazione precisa della sostanza (identità e impurezze),  
— quando i metodi non siano applicabili (ad esempio materiale 
tensioattivo), deve essere fornito un valore calcolato o una stima basata sulle singole solubilità in n-ottanolo e acqua,
 
— ogni informazione e osservazione significativa per l'interpreta ­
zione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze 
e lo stato fisico della sostanza.  
Per il metodo del dibattito in pallone:  
— il risultato dell'eventuale stima preliminare,  
— la temperatura di determinazione,  
— i dati sui procedimenti analitici impiegati per determinare le 
concentrazioni,  
— il tempo e la velocità di centrifugazione, se quest'ultima è stata 
applicata,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 74
 
— le concentrazioni misurate in ambedue le fasi per ciascuna deter ­
minazione (ciò significa che dovrà essere riportato un totale di 12 
concentrazioni),  
— il peso della sostanza in esame, il volume di ciascuna fase im ­
piegata in ciascun recipiente di prova e la quantità totale calco ­
lata della sostanza in esame presente in ciascuna fase dopo equi ­
librazione,  
— i valori calcolati per il coefficiente di ripartizione (P), e le medie 
per ciascuna serie di condizioni sperimentali, nonché la media 
per tutte le determinazioni. Se esiste il sospetto di una dipen ­
denza dalla concentrazione del coefficiente di ripartizione, ciò va menzionato nella relazione,
 
— la deviazione standard dei singoli valori di P rispetto alla loro 
media,  
— il valore medio di P risultante da tutte le determinazioni deve 
pure essere espresso come logaritmo (base 10),  
— il valore teorico calcolato per P  oa quando esso è stato determinato 
o quando il valore misurato è > 10  4 , 
— il pH dell'acqua impiegata e della fase acquosa durante l'esperi ­
mento,  
— se vengono usati dei tamponi, giustificazione del loro uso al 
posto dell'acqua, composizione, concentrazione, e pH dei tampo ­
ni, pH della fase acquosa prima e dopo l'esperimento.  
Per il metodo HPLC:  
— il risultato dell'eventuale stima preliminare,  
— sostanze in esame e di riferimento e loro purezza,  
— intervallo di temperatura delle determinazioni,  
— pH al quale vengono effettuate le determinazioni,  
— dettagli relativi alla colonna analitica e di protezione, alla fase 
mobile e al dispositivo di rivelazione,  
— dati di ritenzione e valori di log P desunti dalla letteratura per i 
composti di riferimento usati nella taratura,  
— dettagli della curva di regressione risultante (log k contro log P),  
— dati di ritenzione media e valore interpolato di log P per il 
composto in esame,  
— descrizione dell'apparecchiatura e delle condizioni operative,  
— profili di eluizione,  
— quantità delle sostanze in esame e di riferimento introdotte nella 
colonna,  
— tempo morto e metodo secondo il quale questo è stato misurato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 75
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substiruent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphe ­
re, 1981, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
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(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr, 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liquid, Chromat., 1984, vol. 7, 
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(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houbenm Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/l, 223—339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ, Sci, Te ­
chnol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologi ­
sche Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Am ­
sterdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 77
 
Appendice 1  
Metodi di calcolo/stima  
INTRODUZIONE  
Un'introduzione generale ai metodi di calcolo, dati ed esempi si trova nello 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).  
I valori calcolati di P  oa possono essere usati:  
— per decidere quale dei metodi sperimentati sia appropriato (intervallo del 
metodo di dibattimento in pallone: log P  oa da — 2 a 4, intervallo del metodo 
in HPLC: log P  oa da 0 a 6),  
— per scegliere le condizioni sperimentali appropriate (ad esempio, sostanze di 
riferimento per i procedimenti HPLC, rapporto in volume n-ottanolo/acqua per il metodo del dibattimento in pallone),
 
— come verifica interna di laboratorio per possibili errori sperimentali,  
— per ottenere una stima di P  oa nei casi in cui i metodi sperimentali non 
possano essere applicati per ragioni tecniche.  
METODO DI STIMA  
Stima preliminare del coefficiente di ripartizione  
Il valore del coefficiente di ripartizione può essere stimato mediante l'uso delle 
solubilità della sostanza in esame nei solventi puri: a tale scopo:  
P estimate ¼ saturation c  nÄoctanol  
saturation c  water 
METODI DI CALCOLO  
Principio dei metodi di calcolo  
Tutti i metodi di calcolo sono basati sulla frammentazione formale della molecola 
in sottostrutture adatte per le quali sono noti incrementi di log P  oa affidabili. Il 
log P  oa della molecola intera viene poi calcolato come somma dei valori corri ­
spondenti dei suoi frammenti più la somma di termini di correzione per le 
interazioni intramolecolari.  
Sono disponibili elenchi delle costanti di frammentazione e dei termini di corre ­
zione (b) (c) (d) (e). Alcuni di questi vengono regolarmente aggiornati (b).  
Criteri di qualità  
In generale, l'affidabilità del metodo di calcolo diminuisce al crescere della com ­
plessità del composto in esame. Nel caso di molecole semplici di basso peso 
molecolare e con uno o due gruppi funzionali, ci si può attendere una deviazione da 0,1 a 0,3 unità di log P
 oa tra i risultati dei metodi di frammentazione e il 
valore misurato. Nel caso di molecole più complesse, il margine d'errore può 
essere più grande. Questo dipenderà dall’affidabilità e disponibilità delle costanti 
dei frammenti, nonché dalla capacità di riconoscere le interazioni intramolecolari (ad esempio i legami idrogeno) e dall'uso corretto dei termini di correzione (problema di non difficile soluzione utilizzando un elaboratore di calcolo e il 
programma CLOGP-3) (b). Nel caso di composti che si ionizzano, è importante 
considerare correttamente la carica e il grado di ionizzazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 78
 
Procedure di calcolo  
Metodo del π di Hansch  
La costante del sostituente idrofobo originale, π, introdotta da Fujita et al. (f) è 
definita come:  
π x = log P  oa (PhX) - log P  oa (PhH)  
dove P  oa (PhX) è il coefficiente di ripartizione di un derivato aromatico e P  oa 
(PhH) quello del composto capostipite  
(e.g. π Cl = log P  oa (C 6 H 5 Cl) - log P  oa (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
Secondo la sua definizione, il metodo del π può essere applicato principalmente 
per la sostituzione aromatica. Valori di π per un gran numero di sostituenti sono 
stati tabulati in (b) (c) (d). Essi vengono usati per il calcolo di log P  oa di 
molecole o sottostrutture aromatiche.  
Metodo di Rekker  
Secondo Rekker (g), il valore di log P  oa viene calcolato come segue:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðtermini di interazione Þ 
dove f, rappresenta la costante dei differenti frammenti molecolari e a, la fre ­
quenza con cui essi si presentano nella molecola in esame. I termini di correzione possono essere espressi come multiplo intero di una costante singola C
 m (la 
cosiddetta «costante magica»). Le costanti di frammento f  i e C  m sono state 
ricavate da un elenco di 1 054 valori sperimentali di P  oa (825 composti) utiliz ­
zando l'analisi di regressione multipla (c) (h). La determinazione dei termini di interazione viene eseguita secondo regole fisse descritte in letteratura (e) (h) (i).
 
Metodo di Hansch-Leo  
Secondo Hansch e Leo (c), il valore di log P  oa si calcola dalla relazione:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
in cui f  i , rappresenta la costante per differenti frammenti molecolari, F  j il termine 
di correzione e a  i , b j le corrispondenti frequenze con cui essi si presentano. Una 
serie di valori di frammenti costituiti da atomi e gruppi e una serie di termini di 
correzione F  j (i cosiddetti «fattori») sono stati determinati per approssimazioni 
successive derivandoli da valori sperimentali di P  oa . I termini di correzione sono 
stati ordinati in varie classi (a) (c). E relativamente complicato e lungo tener conto di tutte le regole e dei termini di correzione. Sono stati sviluppati a tale 
scopo dei pacchetti di programma (b).
 
Metodo combinato  
Il calcolo del log P  oa di molecole complesse può venire migliorato considerevol ­
mente se la molecola viene divisa in strutture più semplici per le quali sono 
disponibili valori affidabili di log P  oa ottenuti o da tabelle (b) (c) o da proprie 
misure. Tali frammenti (ad esempio sostanze eterocidiche, antrachinoni, azoben ­
zene) possono poi venire combinati con i valori di π di Hansch o con le costanti 
di frammento di Rekker o Leo.  
Osservazioni  
i) I metodi di calcolo possono essere applicati a composti parzialmente o com ­
pletamente ionizzati solo quando è possibile tener conto dei necessari fattori 
di correzione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 79
 
ii) Se si può assumere che vi siano dei legami idrogeno intramolecolari, i corri ­
spondenti termini di correzione (approssimativamente da + 0,6 a + 1,0 unità 
di log P  oa ) devono venire aggiunti (a). Indicazioni della presenza di tali 
legami si possono ottenere da modelli tridimensionali o da dati spettroscopici della molecola.
 
iii) Se sono possibili varie forme tautomere, sì deve assumere come base di 
calcolo la forma più probabile.  
iv) È opportuno seguire con attenzione le revisioni degli elenchi delle costanti di 
frammento.  
Relazione  
Quando si utilizzano metodi di calcolo/stima, la relazione deve, se possibile, 
includere le seguenti informazioni:  
— descrizione della sostanza (miscela, impurezze, e così via),  
— indicazione di ogni possibile legame idrogeno intramolecolare, dissociazione, 
carica e altri effetti insoliti (ad esempio tautomeria),  
— descrizione del metodo di calcolo,  
— identificazione o fornitura della base di dati,  
— peculiarità della scelta dei frammenti,  
— documentazione completa del calcolo.  
BIBLIOGRAFIA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Che ­
mistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chill. Ther., 1979, vol. 
14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 80
 
Appendice 2  
Sostanze di riferimento raccomandate per il metodo HPLC  
N. Sostanza di riferimento log P  oa pKa 
1 2-butanone 0,3 
2 4-acetilpiridina 0,5 
3 anilina 0,9 4 acetanilide 1,0 
5 alcool benzilico 1,1 
6 p-metossifenolo 1,3 pKa = 10,26 7 acido fenossiacetico 1,4 pKa = 3,12 
8 fenolo 1,5 pKa = 9,92 
9 2,4-dinitrofenolo 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitrile 1,6 
11 fenilacetonitrile 1,6 12 alcool 4-metilbenzilico 1,6 
13 acetofenone 1,7 
14 2-nitrofenolo 1,8 pKa = 7,17 
15 acido 3-nitrobenzoico 1,8 pKa = 3,47 
16 4-cloroanilina 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzene 1,9 
18 alcool cinnamico 1,9 
19 acido benzoico 1,9 pKa = 4,19 
20 p-cresolo 1,9 pKa = 10,17 
21 acido cinnamico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisolo 2,1 
23 metilbenzoato 2,1 
24 benzene 2,1 25 acido 3-metilbenzoico 2,4 pKa = 4,27 
26 4-clorofenolo 2,4 pKa = 9,1 
27 tricloroetilene 2,4 
28 atrazina 2,6 
29 etilbenzoato 2,6 30 2,6-diclorobenzonitrile 2,6 
31 acido 3-clorobenzoico 2,7 pKa = 3,82 
32 toluene 2,7 
33 1-naftolo 2,7 pKa = 9,34 
34 2,3-didoroanilina 2,8 35 clorobenzene 2,8 
36 allilfenil etere 2,9 
37 bromobenzene 3,0
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 81
 
N. Sostanza di riferimento log P  oa pKa 
38 etilbenzene 3,2 
39 benzofenone 3,2 40 4-fenilfenolo 3,2 pKa = 9,54 
41 timolo 3,3 
42 1,4-diclorobenzene 3,4 43 difenilammina 3,4 pKa = 0,79 44 naftalene 3,6 45 fenilbenzoato 3,6 46 isopropilbenzene 3,7 
47 2,4,6-triclorofenolo 3,7 pKa = 6 
48 bifenile 4,0 49 benzilbenzoato 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec.butilfenolo 4,1 51 1,2,4-triclorobenzene 4,2 52 acido dodecanoico 4,2 53 difeniletere 4,2 54 n-burilbenzene 4,5 55 fenantrene 4,5 
56 fluorantene 4,7 
57 dibenzile 4,8 58 2,6-difenilpiridina 4,9 59 trifenilammina 5,7 60 DDT 6,2 
Altre sostanze di riferimento di basso P
 oa 
1 acido nicotinico - 0,07  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 82
 
A.9. PUNTO D'INFIAMMABILITÀ  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Prima di procedere all'esecuzione della prova sarà utile disporre di 
informazioni preliminari sulla infiammabilità della sostanza. Il me ­
todo è applicabile a sostanze liquide i cui vapori possono infiam ­
marsi mediante sorgenti di accensione. I metodi sperimentali elencati in questo testo sono affidabili solo per gli intervalli del punto di 
infiammabilità specificati nei singoli metodi.
 
Quando si sceglie il metodo da usare, bisogna considerare la possi ­
bilità di reazioni chimiche tra la sostanza e il porta campioni.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Il punto di infiammabilità è la temperatura più bassa, corretta alla 
pressione di 101,325 kPa, alla quale un liquido sviluppa vapori, nelle 
condizioni definite nel metodo sperimentale, in quantità tali da pro ­
durre una miscela vapore/aria infiammabile nel recipiente di prova.  
unità:  o C 
t = T - 273,15  
(t in  o C e T in K)  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non è necessario utilizzare sostanze di riferimento ogni volta che si 
esamina una nuova sostanza. Esse servono principalmente per con ­
trollare periodicamente la precisione del metodo e per permettere il 
confronto con risultati ottenuti mediante altri metodi.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza viene posta in un recipiente di prova e riscaldata o 
raffreddata alla temperatura sperimentale secondo la procedura de ­
scritta nei singoli metodi sperimentali. Vengono eseguite delle prove di accensione allo scopo di accertare se il campione si infiamma o 
non si infiamma alla temperatura di prova.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
1.5.1.  Ripetibilità  
La ripetibilità varia secondo l'intervallo del punto di infiammabilità 
e secondo il metodo sperimentale usato; massimo 2  o C. 
1.5.2.  Sensibilità  
La sensibilità dipende dal metodo sperimentale applicato.  
1.5.3.  Specificità  
La specificità di alcuni metodi sperimentali è limitata a particolari 
intervalli di punto di infiammabilità e dipende dalle caratteristiche 
delle sostanze (come ad esempio una elevata viscosità).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 83
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Preparazioni  
Un campione della sostanza in esame viene posto in un apparecchio 
di prova in conformità a quanto indicato nei punti 1.6.3.1 e/o 1.6.3.2.  
Per ragioni di sicurezza, si raccomanda di usare un metodo che 
utilizzi un campione di piccole dimensioni, circa 2 cm  3 , per le so ­
stanze di elevato contenuto energetico o tossiche.  
1.6.2.  Condizioni di prova  
L'apparecchio, nei limiti in cui ciò sia in linea con le esigenze di 
sicurezza, deve essere collocato lontano da correnti d'aria.  
1.6.3.  Esecuzione della prova  
1.6.3.1.  Metodo dell'equilibrio  
Vedi norme ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 e ISO 3679.  
1.6.3.2.  Metodo basato sul non equilibrio  
Apparecchio di Abel:  
Vedi norme BS 2000, parte 170, NF M07-011 e NF T66-009.  
Apparecchio di Abel-Pensky:  
Vedi norme EN 57, DIN 51755 — parte 1 — (per temperature 
comprese tra 5  o C e 65  o C) e DIN 51755 — parte 2 — (per tem ­
perature al di sotto di 5  o C), NF M07-036  
Apparecchio di Tag:  
Vedi norma ASTM D 56.  
Apparecchio di Pensky-Martens:  
Vedi norme ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000- 
34 e NF M 07-019.  
Osservazioni:  
Quando il punto di infiammabilità, determinato mediante un metodo 
non di equilibrio scelto tra quelli elencati al punto 1.6.3.2, risulta 
essere pari a 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C, o 55 ± 2  o C, occorre confermarlo 
con un metodo all'equilibrio, utilizzando la stessa apparecchiatura.  
Ai fini della notifica possono applicarsi solo i metodi che forniscono 
la temperatura del punto di infiammabilità.  
Per determinare il punto di infiammabilità di liquidi viscosi (vernici, 
gomme e prodotti analoghi) contenenti solventi, possono impiegarsi soltanto apparecchiature e metodi di prova adatti alla determinazione 
del punto di infiammabilità di liquidi viscosi.
 
Vedi norme ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 e DIN 53213, parte 1.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 84
 
2. DATI  
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— la descrizione precisa della sostanza (identità e impurezze pre ­
senti),  
— l'indicazione del metodo impiegato e di eventuali deviazioni da 
esso,  
— i risultati e tutte le osservazioni aggiuntive utili ai fini dell'inter ­
pretazione dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Nessuna.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 85
 
A.10.  INFIAMMABILITÀ (SOLIDI)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Prima di effettuare la prova sarà utile disporre di informazioni pre ­
liminari sulle eventuali proprietà esplosive della sostanza.  
La presente prova dovrebbe essere applicata esclusivamente a so ­
stanze in polvere, granulari e pastose.  
Evitando di considerare tutte le sostanze capaci di infiammarsi e 
limitandosi soltanto a quelle che bruciano rapidamente o il cui com ­
portamento alla combustione presenta particolari pericoli di qualsiasi 
genere, si considerano come facilmente infiammabili soltanto le so ­
stanze la cui velocità di combustione supera un certo valore limite.  
Può essere particolarmente pericoloso se l'incandescenza si propaga 
lungo una polvere metallica a motivo della difficoltà di estinguere l'incendio. Le polveri metalliche sono da considerarsi facilmente 
infiammabili se sostengono la diffusione dell'incandescenza attra ­
verso la massa entro un tempo specificato.
 
1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ  
La velocità di combustione è espressa in secondi.  
1.3. COMPOSTI DI RIFERIMENTO  
Non specificati.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza viene sagomata in una striscia continua o in una miccia 
di polvere della lunghezza di circa 250 mm e si esegue una prova 
preliminare orientativa per determinare se, all'accensione mediante una fiamma gassosa, si verifica la propagazione per combustione con fiamma o senza fiamma. Se entro un tempo specificato si veri ­
fica la propagazione su 200 mm della massa di campione, allora si 
esegue un programma completo di prova per determinare la velocità di combustione.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Non definiti.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 86
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Prova preliminare orientativa  
La sostanza viene sagomata in una striscia continua o in una miccia 
di polvere per una lunghezza di circa 250 mm per 20 mm di lar ­
ghezza per 10 mm di altezza su una lastra di base non combustibile, 
non porosa e di bassa conducibilità termica. Ad una estremità della miccia in polvere si applica una fiamma di alta temperatura generata da un bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm) fino a che la polvere 
si accende oppure per un massimo di 2 minuti (5 minuti per polveri 
di metalli o leghe metalliche). Ciò che deve essere osservato è se la combustione si propaghi per 200 mm della miccia entro un tempo di 
prova di 4 minuti (o 40 minuti per polveri metalliche). Se la sostanza 
non si accende e non propaga la combustione bruciando con fiamma o senza fiamma su 200 mm della miccia di polvere entro 4 minuti (o 40 minuti) nel periodo di prova, allora la sostanza non è da consi ­
derarsi come facilmente infiammabile e non sono richieste ulteriori 
prove. Se la sostanza propaga la combustione per un tratto di 200 mm della miccia di polvere in meno di 4 minuti o in meno di 40 minuti per le polveri metalliche, si deve eseguire il procedimento 
descritto di seguito (punto 1.6.2. e successivi).
 
1.6.2.  Prova della velocità di combustione  
1.6.2.1.  Preparazione  
Le sostanze in polvere o granulari vengono introdotte in modo sfuso 
in uno stampo della lunghezza di 250 mm con sezione trasversale triangolare ed altezza interna di 10 mm e larghezza di 20 mm. Su 
ambedue i lati dello stampo, in senso longitudinale, sono montate 
due lastrine di metallo, con la funzione di limiti laterali; esse devono sporgere di 2 mm oltre il bordo superiore della sezione triangolare (vedi figura). Lo stampo viene poi lasciato cadere per tre volte su 
una superficie solida, dall'altezza di 2 cm. Se necessario, lo stampo 
viene nuovamente riempito. I limiti laterali vengono poi rimossi e la sostanza in eccesso viene asportata. Sopra allo stampo si pone una 
piastra non combustibile, non porosa e con una bassa conducibilità 
termica che funge da piastra di base, si rovescia l'apparecchio e si rimuove lo stampo.
 
Le sostanze pastose sono sparse su una piastra di base non combu ­
stibile, non porosa e di bassa conducibilità termica in forma di un 
cordone della lunghezza di 250 mm con una sezione trasversale di circa 1 cm
 2 . 
1.6.2.2.  Condizioni sperimentali  
Nel caso di una sostanza sensibile all'umidità, la prova deve essere 
effettuata con la massima rapidità possibile subito dopo aver tolto la 
sostanza stessa dal recipiente.  
1.6.2.3.  Esecuzione della prova  
Disporre il campione nella corrente di una cappa per l'aspirazione dei 
fumi.  
La velocità dell'aria deve essere sufficiente per impedire ai fumi di 
sfuggire verso il laboratorio e non deve venire modificata durante la 
prova. L'apparecchio deve essere schermato dalla corrente d'aria.  
Per accendere l'ammasso ad una estremità, si utilizza una fiamma 
calda di un bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm). Quando 
l'ammasso è bruciato per un tratto di 80 mm, si misura la velocità 
di combustione sui successivi 100 mm.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 87
 
L'esperimento viene eseguito sei volte usando ogni volta una piastra 
pulita e fredda, salvo che si osservi prima un risultato positivo.  
2. DATI  
Il tempo di combustione risultante dalla prova preliminare orientativa 
(1.6.1) e il minimo tempo di combustione su un massimo di sei 
prove (1.6.2.3) sono i dati utili ai fini della valutazione.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— l'indicazione esatta della sostanza (identificazione e impurezze),  
— una descrizione della sostanza esaminata e dei suo stato fisico, 
incluso il contenuto di umidità,  
— i risultati della prova preliminare orientativa e della prova della 
velocità di combustione, se eseguita,  
— tutte le osservazioni aggiuntive significative ai fini dell'interpre ­
tazione dei risultati.  
3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Le sostanze in polvere, granulari o pastose sono da considerarsi 
facilmente infiammabili se il tempo di combustione in una qualunque delle prove eseguite secondo la procedura sperimentale descritta al punto 1.6.2. è minore di 45 secondi. Le polveri di metalli o leghe 
metalliche sono considerate facilmente infiammabili quando sono 
suscettibili di accensione e la fiamma o la zona di reazione si pro ­
paga sull'intero campione in 10 minuti o meno.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 88
 
Appendice  
Figura  
Stampo e accessori per la preparazione del campione  
(Tutte le dimensioni sono espresse in mm)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 89
 
A.11.  INFIAMMABILITÀ (GAS)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo metodo permette di determinare se gas miscelati con aria a 
temperatura ambiente (circa 20  o C) e pressione atmosferica sono 
infiammabili e, in tale caso, in quale intervallo di concentrazioni. Miscele a concentrazioni crescenti del gas in esame con l'aria ven ­
gono esposte a una scintilla elettrica e si osserva se ha luogo l'ac ­
censione.
 
1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ  
L'intervallo d'infiammabilità è l'intervallo di concentrazione com ­
preso fra il limite minimo e il limite massimo di esplosione. I limiti 
minimo e massimo di esplosione sono quei limiti di concentrazione del gas infiammabile in miscela con l'aria ai quali non si verifica la propagazione della fiamma.
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non specificate  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La concentrazione del gas nell'aria viene aumentata gradualmente e 
ad ogni livello di concentrazione la miscela viene esposta ad una scintilla elettrica.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Non stabiliti  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Apparecchiatura  
Il recipiente di prova è costituito da un cilindro verticale di vetro con 
un diametro interno di almeno 50 mm ed un’altezza di 300 mm. Gli elettrodi di accensione, separati da una distanza di 3-5 mm, sono 
collocati 60 mm al di sopra del fondo del cilindro. Il cilindro è 
provvisto di un'apertura per lo sfogo della pressione. L'apparecchio deve essere schermato in modo da limitare gli eventuali danni dovuti ad esplosione.
 
Come fonte di accensione si impiega una scintilla ad induzione 
permanente della durata di 0,5 s, generata da un trasformatore ad 
alto voltaggio con una tensione di uscita compresa fra 10 e 15 kV (potenza massima di entrata: 300 W). Un esempio di un apparecchio adatto è descritto nel riferimento bibliografico (2).
 
1.6.2.  Condizioni sperimentali  
La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente (circa 20  o C). ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 90
 
1.6.3.  Esecuzione della prova  
Usando pompe dosatrici, si introduce nel cilindro di vetro una mi ­
scela gas/aria di concentrazione nota. Si fa passare una scintilla attraverso la miscela e si osserva se si stacca o no dalla fonte di 
accensione una fiamma che si propaga indipendentemente. La con ­
centrazione del gas viene variata per incrementi dell'1 % in volume fino a quando si verifica l'accensione sopra descritta.
 
Se la struttura chimica del gas indica che esso non dovrebbe essere 
infiammabile e si può calcolare la composizione della miscela ste ­
chiometrica con aria, si effettua allora la prova solo su miscele nell'intervallo dal 10 % al di sotto della composizione stechiometrica al 10 % al di sopra di questa composizione in incrementi dell'1 %.
 
2. DATI  
La propagazione della fiamma è l'unico fenomeno significativo per la 
determinazione di questa proprietà.  
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— la descrizione esatta della sostanza (identità e impurezze presenti),  
— la descrizione dell'apparecchiatura utilizzata con l'indicazione 
delle dimensioni,  
— la temperatura alla quale la prova è stata eseguita,  
— le diverse concentrazioni impiegate e i risultati ottenuti,  
— il risultato della prova: gas non infiammabile o gas facilmente 
infiammabile,  
— se si conclude che il gas non è infiammabile, si deve allora 
dichiarare l'intervallo di concentrazioni nel quale esso è stato provato in incrementi dell'1 %;
 
— tutte le informazioni e osservazioni significative per l'interpreta ­
zione dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthoid, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, 
T. Redeker und H. Schacke «Entwicklung einer Standard-Ap ­
paratur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.- 
Tech. 1984, vol. 56, 2, 126-127.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 91
 
A.12.  INFIAMMABILITÀ (CONTATTO CON L'ACQUA)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo metodo sperimentale può essere usato per determinare se la 
reazione di una sostanza con acqua o aria umida porta allo sviluppo 
di quantità pericolose di gas che possono essere facilmente infiam ­
mabili.  
Il metodo è applicabile alle sostanze solide e liquide. Questo metodo 
non è applicabile a sostanze che si infiammano spontaneamente a 
contatto con l'aria.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Facilmente infiammabili: sostanze che, a contatto con l'acqua o con 
l'aria umida, sviluppano gas facilmente infiammabili in quantità pe ­
ricolose ad una velocità minima di 1 l/kg per ora.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza viene saggiata secondo il procedimento per gradi de ­
scritto nel seguito; se ad uno qualsiasi dei livelli si verifica l'accen ­
sione, non è necessario proseguire nella prova. Se è noto che la 
sostanza non reagisce violentemente con l'acqua, procedere allora 
al livello 4 (1.3.4).  
1.3.1.  Livello 1  
La sostanza in esame viene versata in un recipiente contenente acqua 
distillata a 20  o C e si osserva se il gas sviluppato si infiamma o 
meno.  
1.3.2.  Livello 2  
La sostanza in esame viene posta su un foglio di carta da filtro 
galleggiante sulla superficie di un recipiente contenente acqua distil ­
lata a 20  o C e si osserva se il gas sviluppato si infiamma o meno. La 
carta da filtro ha semplicemente la funzione di evitare la dispersione della sostanza in acqua, aumentando così le possibilità di accensione.
 
1.3.3.  Livello 3  
La sostanza in esame viene disposta in forma approssimativamente 
cilindrica di circa 2 cm di altezza e 3 cm di diametro. Si aggiungono 
alcune gocce di acqua e si osserva se il gas sviluppato si infiamma.  
1.3.4.  Livello 4  
La sostanza in esame viene mescolata con acqua distillata a 20  o C e 
si misura la velocità di sviluppo del gas per un periodo di 7 ore ad 
intervalli di un'ora. Se la velocità di formazione del gas non è co ­
stante, o è ancora in aumento dopo 7 ore, si deve prolungare il tempo di misurazione fino ad un massimo di 5 giorni. La prova 
può essere sospesa in qualsiasi momento se la velocità di sviluppo 
del gas supera 1 l/kg per ora.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 92
 
1.4. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Non specificata.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Non stabiliti.  
1.6. DESCRIZIONE DEI METODI  
1.6.1.  Livello 1  
1.6.1.1.  Condizioni di prova  
La prova va eseguita a temperatura ambiente (circa 20  o C). 
1.6.1.2.  Esecuzione della prova  
Una piccola quantità (2 mm circa di diametro; della sostanza da 
esaminare viene posta in un recipiente contenente acqua distillata. 
Si deve osservare: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica 
l'accensione del gas. Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie ulteriori prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.
 
1.6.2.  Livello 2  
1.6.2.1.  Apparecchiatura  
Un foglio di carta da filtro viene fatto galleggiare sulla superficie di 
acqua distillata contenuta in un qualsiasi recipiente idoneo, ad esem ­
pio una capsula da evaporazione del diametro di 100 mm.  
1.6.2.2.  Condizioni di prova  
La prova va eseguita a temperatura ambiente (circa 20  o C). 
1.6.2.3.  Esecuzione della prova  
Una piccola quantità della sostanza in esame (2 mm circa di diame ­
tro) viene posta al centro del foglio di carta da filtro. Si deve osser ­
vare: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica l'accensione del gas. 
Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie ulteriori 
prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.  
1.6.3.  Livello 3  
1.6.3.1.  Condizioni di prova  
La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente.  
1.6.3.2.  Esecuzione della prova  
La sostanza da esaminare viene disposta in forma approssimativa ­
mente cilindrica di circa 2 cm d'altezza e 3 cm di diametro, con una leggera concavità sulla cima. Si aggiungono alcune gocce di acqua e si osserva: i) se si ha sviluppo di gas; ii) se si verifica l'accensione 
del gas. Se si verifica l'accensione del gas, non sono necessarie 
ulteriori prove, poiché la sostanza deve essere considerata pericolosa.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 93
 
1.6.4.  Livello 4  
1.6.4.1.  Apparecchiatura  
L'apparecchiatura viene montata come mostrato in figura.  
1.6.4.2.  Condizioni di prova  
Controllare il contenitore della sostanza da esaminare per accertare 
l'eventuale presenza di polveri al di sotto di 500 μm (dimensioni 
delle particelle). Se il contenuto in polvere supera l'1 % (p/p) del totale, o se il campione è friabile, tutta la sostanza deve essere ridotta in polvere prima della prova, per tener conto della riduzione di 
formato delle particelle durante l'immagazzinamento e la manipola ­
zione; in caso contrario, la sostanza deve essere saggiata così come ricevuta. La prova deve essere eseguita a temperatura ambiente (circa 20
 o C) e a pressione atmosferica.  
1.6.4.3.  Esecuzione della prova  
Si introducono da 10 a 20 ml d'acqua nel contagocce dell'apparec ­
chiatura e 10 g di sostanza nella beuta. Il volume del gas sviluppato può essere misurato mediante qualsiasi mezzo opportuno. L'imbuto del contagocce viene aperto per immettere l'acqua nella beuta e si 
avvia un cronometro. Lo sviluppo del gas viene misurato ogni ora 
per un periodo di 7 ore. Se durante questo periodo lo sviluppo del gas è irregolare o se, al termine di questo periodo, la velocità di 
sviluppo del gas è in aumento, le misure devono essere continuate 
fino a 5 giorni. Se in qualunque momento durante la misura la velocità di sviluppo del gas è superiore a 1 l/kg per ora, la prova può essere interrotta. La prova va eseguita in triplo.
 
Se l'identità chimica del gas è sconosciuta, il gas deve essere ana ­
lizzato. Quando il gas contiene componenti facilmente infiammabili e non si sa se l'intera miscela sia facilmente infiammabile, si deve preparare e saggiare secondo il metodo A.11 una miscela avente la 
stessa composizione.
 
2. DATI  
La sostanza viene considerata pericolosa se:  
— a qualsiasi livello della procedura sperimentale si verifica l'ac ­
censione spontanea,  
o 
— avviene uno sviluppo di gas infiammabile ad una velocità mag ­
giore dì 1 l/kg della sostanza per ora.  
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),  
— dettagli dell'eventuale preparazione iniziale della sostanza in esa ­
me, ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 94
 
— i risultati delle prove (livelli 1, 2, 3 e 4),  
— l'identità chimica del gas sviluppato,  
— la velocità di sviluppo del gas se viene eseguito il livello 4 
(1.6.4),  
— ogni ulteriore osservazione significativa ai fini dell'interpreta ­
zione dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 95
 
Appendice  
Figura  
Apparecchiatura
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 96
 
A.13.  PROPRIETÀ PIROFORICHE DI SOLIDI E LIQUIDI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
La procedura sperimentale può essere applicata a sostanze solide o 
liquide che, in piccole quantità, si accendano spontaneamente poco 
tempo dopo essere venute in contatto con l'aria a temperatura am ­
biente (circa 20  o C). 
Questo metodo di prova non considera le sostanze che devono essere 
esposte all'aria per ore o giorni a temperatura ambiente o a tempe ­
rature elevate prima che si verifichi l'accensione.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Si considera che una sostanza presenti proprietà piroforiche se si 
accende o carbonizza nelle condizioni descritte in 1.6.  
Può anche essere necessario controllare l'autoinfiammabilità dei li ­
quidi usando il metodo A.15 (Temperatura di autoaccensione liquidi 
e gas).  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Non specificate.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza solida o liquida viene aggiunta ad un veicolo inerte e 
portata in contatto con aria a temperatura ambiente per un periodo di 
5 minuti. Se le sostanze liquide non si accendono, esse vengono assorbite su carta da filtro ed esposte all'aria a temperatura ambiente (circa 20
 o C) per 5 minuti. Se un solido o un liquido si infiammano, 
o se un liquido provoca l'accensione o la carbonizzazione della carta 
da filtro, la sostanza è considerata piroforica.  
1.5. CRITERIO DI QUALITÀ  
Ripetibilità: per motivi di sicurezza, un singolo risultato positivo è 
sufficiente perché la sostanza sia considerata piroforica.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.6.1.  Apparecchiatura  
Una capsula di porcellana del diametro di circa 10 cm viene riempita 
con farina di diatomee per un'altezza di circa 5 mm a temperatura 
ambiente (circa 20  o C). 
Nota:  
La farina di diatomee, o qualsiasi altra sostanza inerte paragonabile 
facilmente reperibile, sarà considerata rappresentativa di un suolo su cui può riversarsi, in caso di incidente, la sostanza in esame.
 
Per l'analisi di liquidi che non si accendono a contatto con l'aria 
quando siano in contatto con un veicolo inerte, è necessaria carta 
da filtro asciutta.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 97
 
1.6.2.  Esecuzione della prova  
a) Solidi in polvere  
Da 1 a 2 cm  3 della sostanza in polvere da esaminare vengono versati 
da un'altezza di circa 1 m su una superficie non combustibile e si 
osserva se la sostanza si infiamma durante la caduta o entro 5 minuti 
dopo la caduta.  
La prova viene eseguita fino a quando si verifica l'accensione, per un 
massimo di 6 volte.  
b) Liquidi  
Circa 5 cm  3 del liquido in esame vengono versati nella capsula di 
porcellana preparata e si osserva se la sostanza si infiamma entro 
5 minuti.  
Se nelle 6 prove non si verifica accensione, eseguire la prova se ­
guente:  
un campione da 0,5 ml viene applicato mediante siringa su una carta 
da filtro dentellata e si osserva se avviene l'accensione o la carbo ­
nizzazione della carta da filtro entro 5 minuti dall'aggiunta del liqui ­
do. La prova viene eseguita fino a quando si verifica l'accensione o la carbonizzazione, per un massimo di tre volte.
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
La prova può essere interrotta non appena si verifichi un risultato 
positivo in una qualunque delle prove.  
2.2. VALUTAZIONE  
Se la sostanza si accende entro 5 minuti da quando viene aggiunta ad 
un veicolo inerte ed esposta all'aria, oppure se una sostanza liquida carbonizza o provoca l'accensione di una carta da filtro entro 5 minuti da quando è stata aggiunta ed esposta all'aria, tale sostanza 
viene considerata piroforica.
 
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),  
— i risultati delle prove,  
— ogni ulteriore osservazione significativa ai fini dell'interpreta ­
zione dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids 
and liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 98
 
A.14.  PROPRIETÀ ESPLOSIVE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il metodo fornisce uno schema di prove per determinare se una 
sostanza solida o pastosa presenti un pericolo di esplosione quando 
viene sottoposta all'effetto di una fiamma (sensibilità termica) o ad urti o sfregamenti (sensibilità agli stimoli meccanici) e se una so ­
stanza liquida presenti un pericolo di esplosione quando viene sot ­
toposta all'effetto di una fiamma o di un urto.
 
Il metodo comprende tre parti:  
a) una prova di sensibilità termica (1);  
b) una prova di sensibilità meccanica relativa agli urti (1);  
c) una prova di sensibilità meccanica relativa allo sfregamento (1).  
Il metodo fornisce dei dati per valutare la probabilità che certe 
sollecitazioni comuni possano dar luogo ad una esplosione. Il me ­
todo non è previsto per stabilire se una sostanza sia in grado di 
esplodere in qualsiasi condizione.  
Il metodo è appropriato per determinare se una sostanza presenti un 
pericolo di esplosione (sensibilità termica e meccanica) nelle parti ­
colari condizioni specificate nella direttiva. Questo metodo è basato su un certo numero di tipi di apparecchi ampiamente usati a livello internazionale (1) e che danno normalmente dei risultati significativi. 
Si riconosce che il metodo non è definitivo. Apparecchi alternativi a 
quelli specificati possono essere usati purché siano internazional ­
mente riconosciuti e i risultati possano adeguatamente venire corre ­
lati con quelli ricavabili dall'apparecchio specificato.
 
Non è necessario eseguire le prove quando le informazioni termodi ­
namiche disponibili (ad esempio il calore di formazione, calore di decomposizione) e/o l'assenza di certi gruppi reattivi (2) nella for ­
mula di struttura permettano di stabilire al di là di ogni ragionevole 
dubbio che la sostanza non è soggetta a rapida decomposizione con sviluppo di gas o liberazione di calore (cioè che il materiale non presenta alcun rischio di esplosione). Per i liquidi non è richiesto un 
saggio di sensibilità allo sfregamento.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Esplosivi:  
Sostanze che possono esplodere sotto l'effetto di una fiamma o che 
sono sensibili agli urti o all'attrito nell'apparecchiatura specificata (o che presentano una sensibilità meccanica maggiore dell’1,3-dinitro ­
benzene in un apparecchio alternativo).
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
1,3-dinitrobenzene tecnico cristallino passante un setaccio da 0,5 mm 
per il metodo dello sfregamento e dell'urto.  
Peridro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, esogeno, ciclonite — CAS 
121-82-4), ricristallizzata da cicloesanone acquoso, setacciata a umido attraverso un setaccio da 250 μm e trattenuta su un setaccio 
da 150 μm, essiccata a 103 ± 2
 o C (per 4 ore) per la seconda serie di 
prove di sfregamento e urto.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 99
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Per stabilire le condizioni di sicurezza per l'esecuzione delle tre 
prove di sensibilità sono necessarie delle prove preliminari.  
1.4.1.  Prove di sicurezza di manipolazione (3)  
Per ragioni di sicurezza, prima di eseguire le prove principali cam ­
pioni molto piccoli (circa 10 mg) della sostanza vengono sottoposti a 
riscaldamento senza restrizioni fisiche in una fiamma gassosa, ad urti 
in qualunque tipo di apparecchio adatto e allo sfregamento con l'im ­
piego di un mazzuolo contro un incudine o qualsiasi altro tipo di 
macchina che produca attrito. Obiettivo della prova è di stabilire se 
la sostanza sia sensibile ed esplosiva in misura tale che le prove di sensibilità prescritte, in particolare quella della sensibilità termica, debbano essere eseguite con precauzioni particolari per evitare danni 
all'operatore.
 
1.4.2.  Sensibilità termica  
Il metodo prevede di riscaldare la sostanza in un tubo d'acciaio 
chiuso con piastre forate di differente diametro del foro per determi ­
nare se la sostanza tenda ad esplodere nelle condizioni di intensa sollecitazione termica e delimitazione spaziale definita.
 
1.4.3.  Sensibilità meccanica (urti)  
Il metodo prevede di sottoporre la sostanza all'urto di una massa 
specificata lasciata cadere da un'altezza specificata.  
1.4.4.  Sensibilità meccanica (sfregamento)  
Il metodo prevede di sottoporre le sostanze solide o pastose ad attrito 
tra superfici standard in condizioni specificate di carico e movimento relativo.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Non stabiliti.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Sensibilità termica (effetto di una fiamma)  
1.6.1.1.  Apparecchiatura  
L'apparecchiatura è costituita da un tubo d'acciaio non riutilizzabile 
con il suo dispositivo di chiusura riutilizzabile (figura 1), installato in un dispositivo di riscaldamento e protezione. Ciascun tubo è ottenuto per imbutitura da una lamiera d'acciaio (vedi appendice) e presenta 
un diametro interno di 24 mm, una lunghezza di 75 mm e uno 
spessore delle pareti di 0,5 mm. I tubi sono flangiati all'estremità aperta per permetterne la chiusura mediante la piastra forata. Questa è costituita da una piastra forata resistente alle alte pressioni, dotata 
di un foro centrale, saldamente fissata ad un tubo con un giunto a 
vite a due parti (dado e collare filettato). Il dado e il collare filettato sono in acciaio al cromo-manganese (vedi appendice) che non genera scintille fino a 800
 o C. Le piastre forate hanno uno spessore di 
6 mm, sono in acciaio resistente al calore (vedi appendice) e sono 
disponibili con aperture di vario diametro.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 100
 
1.6.1.2.  Condizioni di prova  
Normalmente la sostanza viene controllata cosi come fornita, benché 
in certi casi, ad esempio se è pressata, colata o altrimenti condensata, possa essere necessario triturarla prima di esaminarla.
 
Per i solidi, la massa di materiale da usarsi in ciascuna prova viene 
determinata secondo un procedimento a secco in due stadi. Un tubo tarato viene riempito con 9 cm
 3 di sostanza e la sostanza viene 
compattata con una forza di 80 N applicata alla sezione trasversale 
totale del tubo. Per ragioni di sicurezza o nei casi in cui la forma fisica del campione possa essere modificata per compressione, si possono usare differenti procedure di riempimento; ad esempio, se 
la sostanza è molto sensibile all'attrito la pigiatura non è appropriata. 
Se il materiale è comprimibile, se ne aggiunge dell'altro e lo si pigia fino a che il tubo è riempito fino a 55 mm dal bordo. Si determina la 
massa totale usata per riempire il tubo fino al livello di 55 mm e se 
ne aggiungono due ulteriori aliquote, pigiata ciascuna con una forza di 80 N. Poi, secondo le necessità, si aggiunge ulteriore materiale pigiandolo oppure lo si toglie per lasciare il rubo riempito fino a 
15 mm dal bordo. Si esegue una seconda prova a secco partendo con 
una quantità pigiata pari a un terzo della massa totale trovata nella prima prova a secco. Si aggiungono altre due di queste aliquote pigiandole a 80 N e il livello della sostanza nel tubo viene regolato 
a 15 mm dal bordo mediante l'aggiunta o la sottrazione di 
materiale secondo le necessità. La quantità di solido usata in cia ­
scuna prova è quella determinata nella seconda prova a secco; il riempimento viene eseguito in tre quantità uguali, compresse cia ­
scuna a 9 cm
 3 con la forza necessaria, qualunque essa sia. (Ciò 
può essere facilitato mediante l'uso di anelli distanziatori.)  
I liquidi e i gel sono caricati nel tubo fino ad un'altezza di 60 mm 
ponendo particolare attenzione con i gel per impedire la formazione 
di vuoti. Il collare filettato viene fatto scivolare sul tubo dal basso, si inserisce l'appropriato piatto forato e si serra il dado dopo aver applicato un po' di lubrificante a base di disolfuro di molibdeno. È 
essenziale controllare che non vi sia sostanza intrappolata tra la 
flangia e la piastra né nella filettatura.
 
Per il riscaldamento si utilizza propano prelevato da una bombola 
industriale dotata di regolatore di pressione (60-70 mbar), passandolo 
attraverso un manometro e distribuendolo in modo uniforme (come indicato dall'osservazione visiva delle fiamme uscenti dai bruciatori) a 4 bruciatori mediante un collettore. I bruciatori sono disposti in ­
torno alla camera di prova come mostrato in figura 1. I quattro 
bruciatori hanno un consumo totale di circa 3,2 litri di propano al minuto. È possibile usare gas combustibili e bruciatori alternativi, ma la velocità di riscaldamento deve essere quella specificata in figura 
3. Per tutte le apparecchiature, si deve controllare periodicamente la 
velocità di riscaldamento con l'uso di tubi riempiti di dibutilftalato, come indicato in figura 3.
 
1.6.1.3.  Esecuzione delle prove  
Ciascuna prova viene eseguita fino a quando il tubo si frammenta o 
è stato riscaldato per 5 minuti. Una prova che dia come risultato la 
frammentazione del tubo in tre o più pezzi, che in alcuni casi pos ­
sono essere collegati uno all'altro da sottili strisce di metallo come è illustrato in figura 2, viene valutata come esplosione. Se una prova 
dà come risultato un minor numero di frammenti o nessuna fram ­
mentazione, si considera che non abbia dato luogo ad esplosione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 101
 
Si esegue inizialmente una serie di tre prove con una piastra con 
orificio da 6,0 mm di diametro e, se non si ottengono esplosioni, si 
esegue una seconda serie di tre prove con una piastra avente un orificio del diametro di 2,0 mm. Se avviene un'esplosione durante una delle serie di prova non sono necessarie prove ulteriori.
 
1.6.1.4.  Valutazione  
II risultato della prova è considerato positivo se si verifica un'esplo ­
sione in una delle serie di prove sopra descritte.  
1.6.2.  Sensibilità meccanica (urti)  
1.6.2.1.  Apparecchiatura (figura 4)  
Le parti essenziali di una tipica apparecchiatura a martello cadente 
sono un blocco d'acciaio fuso con base, incudine, colonna, guide, pesi cadenti, dispositivo di rilascio e porta campione. L'incudine d'acciaio da 100 mm di diametro per 70 mm di altezza è avvitata 
su un blocco d'acciaio da 230 mm di lunghezza per 250 mm di 
larghezza per 200 mm d'altezza con una base fusa da 450 mm di lunghezza per 450 mm di larghezza per 60 mm d'altezza. Sul retro del blocco d'acciaio è avvitato un sostegno nel quale è fissata una 
colonna in tubo d'acciaio trafilato senza saldatura. Quattro viti anco ­
rano l'apparecchio ad un blocco massiccio di cemento da 60 × 60 × 60 cm in modo che le guide siano assolutamente verticali e il peso cadente possa cadere liberamente. Per l'uso sono disponibili pesi di 
acciaio massiccio da 5 e 10 kg. La testa di impatto dei pesi è di 
acciaio temprato da 60 a 63 HRC e presenta un diametro minimo di 25 mm.
 
Il campione da esaminare viene posto in un dispositivo per prove 
d'urto costituito da due cilindri massicci d'acciaio coassiali e sovrap ­
posti in un cilindro cavo d'acciaio che funge da guida. I cilindri 
d'acciaio massiccio devono avere un diametro di 10 (- 0,003, - 0,005) mm e un'altezza di 10 mm e superfici levigate, spigoli arro ­
tondati (raggio di curvatura 0,5 mm) e una durezza HRC da 58 a 
65. Il cilindro cavo deve avere un diametro esterno di 16 mm, un 
foro levigato di 10 (+ 0,005, + 0,010) mm e un'altezza di 13 mm. Il dispositivo per le prove d'urto è montato su un'incudine intermedia d'acciaio (diametro 26 mm, altezza 26 mm) e centrato mediante un 
anello con fori di sfogo dei fumi.
 
1.6.2.2.  Condizioni sperimentali  
Il volume del campione dovrebbe essere di 40 mm  3 , o un volume 
adatto per eventuali apparecchi alternativi. Le sostanze solide do ­
vrebbero essere provate allo stato secco e preparate come segue:  
a) le sostanze in polvere sono setacciate (maglie da 0,5 mm); per le 
prove si usa tutto il materiale passato attraverso il setaccio;  
b) le sostanze pressate, fuse o altrimenti condensate vengono rotte in 
pezzettini e setacciate. Per le prove si usa la frazione di setaccia ­
tura compresa tra 0,5 e 1 mm di diametro, e questa deve essere rappresentativa della sostanza originale.
 
Le sostanze che si presentano normalmente sotto forma di pasta 
dovrebbero essere saggiate per quanto possibile alla stato secco o 
comunque dopo aver rimosso la maggior quantità possibile di di ­
luente.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 102
 
1.6.2.3.  Esecuzione delle prove  
Si esegue una serie di 6 prove lasciando cadere la massa di 10 kg da 
0,40 m (40 J). Se durante le sei prove a 40 J si ottiene un'esplosione, si deve eseguire una serie ulteriore di 6 prove lasciando cadere una 
massa di 5 kg da 0,15 m (7,5 J). In altri apparecchi, il campione 
viene confrontato con la sostanza di riferimento scelta usando una procedura di provata validità (ad esempio tecnica «su e giù», ecc.).
 
1.6.2.4.  Valutazione  
Il risultato della prova viene considerato positivo se si verifica 
un'esplosione (l'accensione violenta e/o un colpo sono equivalenti a 
un'esplosione) almeno una volta in qualsiasi delle prove con l'appa ­
recchio per prove d'urto specificato oppure se il campione è più sensibile dello 1,3-dinitrobenzene o della RDX in una prova d'urto 
alternativa.
 
1.6.3.  Sensibilità meccanica (attrito)  
1.6.3.1.  Apparecchiatura (figura 5)  
L'apparecchiatura per le prove d'attrito è costituita da una piastra di 
base d'acciaio fuso sulla quale è montato il dispositivo di sfregamen ­
to, costituito da una barra fissa di porcellana con una piastra mobile 
di porcellana. La piastra di porcellana è tenuta in una slitta che corre su due guide. La slitta è collegata ad un motore elettrico mediante un'asta di collegamento, un eccentrico e una trasmissione adatta 
perché la piastra di porcellana venga spostata, una sola volta, avanti 
e indietro sotto la barra di porcellana per un tratto di 10 mm. La barra di porcellana può essere sottoposta ad un carico per esempio di 120 o 360 newton.
 
Le piastre di porcellana piatte sono fatte di porcellana tecnica bianca 
(ruvidità da 9 a 32 μm) e hanno le seguenti dimensioni: 25 mm di 
lunghezza × 25 mm di larghezza × 5 mm di altezza. La barra cilin ­
drica di porcellana è fatta anch'essa di porcellana bianca tecnica ed 
ha una lunghezza di 15 mm, un diametro di 10 mm e superfici 
terminali sferiche irruvidite con un raggio di curvatura di 10 mm.  
1.6.3.2.  Condizioni sperimentali  
Il volume del campione dovrebbe essere di 10 mm  3 o un volume 
adatto ad eventuale apparecchio alternativo.  
Le sostanze solide sono controllate allo stato secco e preparate come 
segue:  
a) le sostanze in polvere sono setacciate (maglie da 0,5 mm); per la 
prova si utilizza tutto il materiale passato attraverso il setaccio;  
b) le sostanze pressate, fuse o altrimenti condensate vengono rotte in 
pezzettini e setacciate. La frazione di setacciatura < 0,5 mm viene usata per le prove.
 
Le sostanze che si presentano normalmente sotto forma di pasta 
devono essere provate per quanto possibile allo stato secco. Se la sostanza non può essere preparata allo stato secco, la pasta (dopo rimozione della maggior quantità possibile di diluente) viene provata 
in forma di una pellicola da 0,5 mm di spessore, 2 mm di larghezza 
e 10 mm di lunghezza preparata con un attrezzo opportuno.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 103
 
1.6.3.3.  Esecuzione delle prove  
La base di porcellana viene portata sul campione in esame e si 
applica il peso. Durante l'esecuzione della prova, la struttura spu ­
gnosa superficiale della piastra di porcellana deve giacere trasversal ­
mente rispetto alla direzione di movimento. Bisogna fare attenzione 
che la barra sia appoggiata sul campione, che vi sia una quantità sufficiente di materiale in esame sotto alla barra e inoltre che la piastra si muova correttamente sotto la barra. Per le sostanze pastose 
si usa un calibro dello spessore di 0,5 mm con una fessura da 2 × 
10 mm per applicare la sostanza alla piastra. La piastra di porcellana deve muoversi 10 mm avanti e indietro sotto alla barra di porcellana 
in un tempo di 0,44 secondi. Ciascuna parte della superficie della 
piastra e della barra deve essere usata una sola volta; le due estremità di ciascuna barra serviranno per due prove e le due superfici di una piastra serviranno ciascuna per tre prove.
 
Si esegue una serie di sei prove con un carico di 360 N. Se in queste 
sei prove si ottiene un evento positivo, si deve eseguire un'ulteriore serie di sei prove con un carico di 120 N. In altri apparecchi, il 
campione viene confrontato con la sostanza di riferimento scelta 
usando una procedura di provata validità (ad esempio tecnica «su e giù», ecc.).
 
1.6.3.4.  Valutazione  
Il risultato della prova viene considerato positivo se si verifica 
un'esplosione (crepitio e/o una accensione violenta o una fiammata sono equivalenti ad un'esplosione) almeno una volta in una qualun ­
que delle prove con l'apparecchio di attrito specificato o se soddisfa i 
criteri equivalenti in una prova di attrito alternativa.
 
2. DATI  
In linea di principio, si considera che una sostanza presenti un pe ­
ricolo di esplosione ai sensi della direttiva se si ottiene un risultato 
positivo nella prova di sensibilità termica, agli urti o all'attrito.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— identità, composizione, purezza, umidità e così via della sostanza 
esaminata,  
— la forma fisica del campione e se esso sia o no stato macinato, 
triturato e/o setacciato,  
— osservazioni effettuate durante le prove di sensibilità termica (ad 
esempio massa del campione, numero di frammenti),  
— osservazioni eseguite durante le prove di sensibilità meccanica 
(ad esempio la formazione di quantità considerevoli di fumo o la 
decomposizione completa senza accensione violenta, fiamme, 
scintille, crepitii, ecc.),  
— risultati di ciascun tipo di prova,  
— se è stato usato un apparecchio alternativo, bisogna fornire una 
giustificazione scientifica e una prova della correlazione tra i 
risultati ottenuti con l'apparecchio specificato e quelli ottenuti 
con l'apparecchio equivalente,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 104
 
— qualsiasi commento utile, come riferimenti a prove con prodotti 
simili, che possono essere significativi per una corretta interpre ­
tazione dei risultati,  
— tutte le osservazioni addizionali significative per l'interpretazione 
dei risultati.  
3.2. INTERPRETAZIONE E VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
La relazione di prova deve citare gli eventuali risultati considerati 
falsi, anormali o non rappresentativi. Se qualcuno dei risultati deve 
essere scartato, deve essere fornita una spiegazione e i risultati di 
prove alternative o complementari. I risultati anormali, salvo che essi possano venire spiegati, devono essere accettati con i valori speri ­
mentali e usati per classificare conformemente la sostanza.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4  th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial 
use — Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 105
 
Appendice  
Esempi di specifiche dei materiali per la prova di sensibilità termica (vedi 
DIN 1623)  
(1) Tubo: specifica materiali numero 1.0336.505 g  
(2) Piastra forata: specifica materiali numero 1.4873  
(3) Collare filettato e dado: specifica materiali numero 1.3817  
Figura 1  
Apparecchio per la prova della sensibilità termica  
(quote espresse in millimetri)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 106
 
Figura 2  
Prova di sensibilità termica  
(esempi di frammentazione)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 107
 
Figura 3  
Taratura della velocità di riscaldamento per la prova di sensibilità termica
  
Curva temperatura/tempo ottenuta riscaldando dibutilftalato (27 cm  3 in un tubo chiuso (piastra 
forata da 1,5 mm) con propano ad una portata di 3,2 litri al minuto. La temperatura viene misurata con una termocoppia cromel/alumel con guaina d'acciaio inossidabile del diametro di 1 mm disposta centralmente 43 mm al di sotto del bordo del tubo. La velocità di riscalda ­
mento tra 135
 o C e 285  o C deve essere compresa tra 185 e 215 K/min.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 108
 
Figura 4  
Apparecchio per le prove d'urto  
(quote espresse in millimetri)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 109
 
Figura 4  
(segue)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 110
 
Figura 5  
Apparecchio per la sensibilità all'attrito
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE (LIQUIDI E GAS)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
A questa prova non devono essere sottoposte le sostanze esplosive e 
le sostanze che si accendono spontaneamente a contatto con l'aria a 
temperatura ambiente. La procedura d'esame è applicabile a gas, liquidi e vapori che in presenza dell'aria possono essere infiammati da una superficie calda.
 
La temperatura di autoaccensione può essere ridotta considerevol ­
mente dalla presenza di impurezze catalitiche, dal materiale della 
superficie o da un maggiore volume del recipiente di prova.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Il grado di autoinfiammabilità è espresso in termini di temperature di 
autoaccensione. La temperatura di autoaccensione è la temperatura 
minima alla quale la sostanza in esame si infiamma quando sia miscelata con aria nelle condizioni definite nel metodo di prova.
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Le sostanze di riferimento sono citate nelle norme (vedi 1.6.3). Que ­
ste sostanze servono principalmente per verificare periodicamente la precisione del metodo e per permettere il confronto coi risultati 
ottenuti mediante altri metodi.
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Il metodo determina la temperatura minima della superficie interna di 
un recipiente chiuso che da luogo all'accensione di un gas, vapore o 
liquido iniettato nel recipiente chiuso.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La ripetibilità varia secondo l'intervallo delle temperature di autoac ­
censione e il metodo di prova usato.  
La sensibilità e la specificità dipendono dal metodo di prova utiliz ­
zato.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Apparecchiatura  
L'apparecchiatura è descritta nel metodo di cui al punto 1.6.3.  
1.6.2.  Condizioni di prova  
Un campione della sostanza in esame viene saggiato in conformità al 
metodo di cui al punto 1.6.3.  
1.6.3.  Esecuzione della prova  
Vedi IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 112
 
2. DATI  
Registrare la temperatura di prova, la pressione atmosferica, la quan ­
tità di campione usato e l'intervallo di tempo dopo il quale si verifica l'accensione.
 
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— l'indicazione precisa della sostanza (identificazione e impurezze),  
— la quantità di campione usato, la pressione atmosferica,  
— l'apparecchiatura usata,  
— i risultati delle misure (temperature di prova, risultati relativi 
all'accensione, e corrispondenti ritardi temporali),  
— tutte le osservazioni aggiuntive significative per l'interpretazione 
dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Nessuna.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 113
 
A.16.  TEMPERATURA DI AUTOACCENSIONE RELATIVA DEI 
SOLIDI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Non devono essere sottoposte a questa prova le sostanze esplosive e 
le sostanze che si infiammano spontaneamente a contatto con l'aria a temperatura ambiente.
 
Lo scopo della prova è di fornire informazioni preliminari sull'au ­
toinfiammabilità di sostanze solide a temperature elevate.  
Se il calore sviluppato dalla reazione della sostanza con l'ossigeno o 
dalla sua decomposizione esotermica non viene ceduto con suffi ­
ciente rapidità all'ambiente circostante, si ha un autoriscaldamento 
che porta all'autoaccensione. L'autoaccensione si verifica quindi quando la velocità di produzione di calore supera quella della sua dispersione.
 
Il procedimento è utile come saggio preliminare per le sostanze 
solide. Data la complessità dei processi di accensione e di combu ­
stione dei solidi, la temperatura di autoaccensione determinata con questo metodo deve essere utilizzata soltanto a scopo di confronto.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
La temperatura di autoaccensione ottenuta secondo il presente me ­
todo è la minima temperatura, espressa in  o C, alla quale un dato 
volume di una sostanza si infiamma in determinate condizioni.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
In un forno a temperatura ambiente viene posto un certo volume 
della sostanza da esaminare; si registra la curva temperatura/tempo 
relativa alle condizioni esistenti al centro del campione mentre la temperatura del forno viene aumentata fino a 400
 o C o fino al punto 
di fusione, se inferiore, ad una velocità di 0,5  o C/min. Ai fini di 
questa prova, la temperatura del forno alla quale la temperatura del 
campione raggiunge i 400  o C per autoriscaldamento è detta tempe ­
ratura di autoaccensione.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Apparecchiatura  
1.6.1.1.  Forno  
Forno da laboratorio a temperatura programmata (volume circa 2 
litri) con circolazione d'aria naturale e sfogo per esplosioni. Per evitare un rischio potenziale di esplosione, si deve impedire che 
eventuali gas di decomposizione vengano in contatto con gli ele ­
menti riscaldanti elettrici.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 114
 
1.6.1.2.  Cubo di rete metallica  
Ritagliare un pezzo di rete d'acciaio inossidabile con luce di 
0,045 mm secondo il modello della figura 1. Piegare la rete e fissarla con filo metallico in forma di cubi con la faccia superiore aperta.
 
1.6.1.3.  Termocoppie  
Termocoppie adatte.  
1.6.1.4.  Registratore  
Qualsiasi registratore a due canali tarato da 0 a 600  o C o tensione 
corrispondente.  
1.6.2.  Condizioni di prova  
Le sostanze vengono sottoposte a prova nella forma in cui vengono 
ricevute.  
1.6.3.  Esecuzione della prova  
Il cubo viene riempito con la sostanza da esaminare e battuto leg ­
germente, aggiungendo ulteriore sostanza fino a quando è completa ­
mente pieno. Il cubo viene poi sospeso al centro del forno a tempe ­
ratura ambiente. Una termocoppia viene posta al centro del cubo e l'altra tra il cubo e la parete del forno per registrare la temperatura del forno.
 
Le temperature del forno e del campione vengono registrate in con ­
tinuo mentre la temperatura del forno viene aumentata fino a 400  o C 
o fino al punto di fusione, se inferiore, ad una velocità di 0,5  o C/min.  
Quando la sostanza si infiamma, la temperatura del campione pre ­
senterà un aumento brusco della temperatura al di sopra di quella del forno.
 
2. DATI  
Rilevante ai fini della valutazione è la temperatura del forno alla 
quale la temperatura del campione raggiunge i 400  o C per autori ­
scaldamento (vedi figura 2).  
3. RELAZIONE  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— descrizione della sostanza in esame,  
— risultati delle misure, inclusa la curva temperatura/tempo,  
— tutte le osservazioni aggiuntive significative per l'interpretazione 
dei risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 115
 
Figura 1  
Sviluppo di un cubo di prova da 20 mm
  
Figura 2  
Curva tipica temperatura/tempo
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 116
 
A.17.  PROPRIETÀ OSSIDANTI (SOLIDI)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
È utile avere informazioni preliminari sulle potenziali proprietà 
esplosive della sostanza prima di effettuare la prova.  
Questa prova non si applica ai liquidi e ai gas, alle sostanze esplo ­
sive o altamente infiammabili, e ai perossidi organici.  
Non occorre eseguire questa prova quando l'esame delle formule di 
struttura stabilisce, al di là di ogni ragionevole dubbio, che la so ­
stanza non è suscettibile di reagire esotermicamente con materiale 
combustibile.  
Per appurare se la prova debba essere condotta con precauzioni 
particolari, è opportuno effettuare un test preliminare.  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
Tempo di combustione: tempo di reazione, in secondi, riferito allo 
spostamento della zona di reazione lungo il cumulo, seguendo la procedura descritta nel punto 1.6.
 
Velocità di combustione: espressa in mm/s.  
Velocità di combustione massima: il valore più elevato della velocità 
di combustione ottenuto con miscele contenenti dal 10 % al 90 %, in 
peso, di ossidante.  
1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Per la prova e per la prova preliminare si usa il nitrato di bario 
(grado analitico) come sostanza di riferimento.  
La miscela di riferimento è costituita da una miscela di nitrato di 
bario e di polvere di cellulosa, preparata secondo il punto 1.6, che presenta la massima velocità di combustione (di solito una miscela 
con il 60 % in peso di nitrato di bario).
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Per sicurezza si esegue una prova preliminare. Quando la prova 
preliminare indica chiaramente che la sostanza in esame presenta 
proprietà ossidanti, non sono necessarie prove ulteriori. Quando ciò 
non si verifica, la sostanza deve essere sottoposta alla prova com ­
pleta.  
Nella prova completa, la sostanza da esaminare e una sostanza com ­
bustibile definita vengono miscelate in vari rapporti. Si formano altrettanti cumuli con le varie miscele e si procede all'accensione di un'estremità di ognuno di essi. La velocità massima determinata 
viene poi confrontata con la velocità massima di combustione di una 
miscela di riferimento.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Qualsiasi metodo di macinazione e mescolamento è valido a condi ­
zione che la differenza fra le velocità massime di combustione in 
ciascuna delle 6 prove non differisca dal valore della media aritme ­
tica di oltre il 10 %.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 117
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Preparazione  
1.6.1.1.  Sostanza in esame  
Ridurre il campione da esaminare ad una granulometria < 0,125 mm 
usando la seguente procedura: setacciare la sostanza di prova, maci ­
nare la frazione rimanente, ripetere la procedura fino a quando tutta la porzione di prova è passata dal setaccio.
 
Per la macinatura e la setacciatura si può usare qualsiasi apparecchio 
che soddisfi i criteri di qualità.  
Prima di preparare la miscela, la sostanza viene essiccata a 105  o C 
fino a peso costante. Se la temperatura di decomposizione della 
sostanza da esaminare è inferiore a 105  o C, la sostanza deve essere 
essiccata ad una temperatura opportunamente inferiore.  
1.6.1.2.  Sostanza combustibile.  
Come sostanza combustibile si usa la cellulosa in polvere del tipo 
impiegato per la cromatografia a strato sortile o in colonna. È risul ­
tato idoneo un tipo di cellulosa con fibre di lunghezza compresa per 
l'85 % tra 0,020 mm e 0,075 mm. La polvere di cellulosa viene fatta passare attraverso un setaccio a maglia da 0,125 mm. Per tutta la prova deve essere usata la stessa partita di cellulosa.
 
Prima di preparare la miscela, la cellulosa in polvere deve essere 
essiccata a 105  o C fino a peso costante.  
Se nella prova preliminare si usa farina di legno, preparare farina di 
legno dolce raccogliendo la porzione che passa attraverso un setaccio 
da 1,6 mm, miscelare accuratamente e poi essiccare a 105  o C per 4 
ore in uno strato di spessore non superiore a 25 mm. Raffreddare e conservare in un contenitore a tenuta d'aria riempito il più possibile 
fino a quando serva, preferibilmente entro 24 ore dall'essiccazione.
 
1.6.1.3.  Fonte di ignizione  
Come fonte di ignizione si dovrebbe usare una fiamma calda di un 
bruciatore a gas (diametro minimo 5 mm). Se si usa un'altra fonte di ignizione (ad esempio quando si effettua la prova in atmosfera iner ­
te), devono essere riportate la descrizione e la giustificazione.
 
1.6.2.  Esecuzione della prova  
Nota:  
Le miscele di ossidanti con cellulosa o farina di legno devono essere 
trattate come potenzialmente esplosive e maneggiate con la dovuta 
attenzione.  
1.6.2.1.  Prova preliminare  
La sostanza essiccata viene accuratamente miscelata con cellulosa o 
farina di legno essiccata nel rapporto 2 parti di sostanza in esame/1 
parte di cellulosa o farina di legno (in peso) e la miscela viene ammucchiata in forma di un piccolo cono con un diametro di base di 3,5 cm × 2,5 d'altezza, riempiendo, senza compattazione, un re ­
cipiente di forma conica, (ad esempio un imbuto da laboratorio con il 
gambo tappato).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 118
 
Il mucchietto viene posto su una piastra di base fredda, non combu ­
stibile, non porosa e di bassa conducibilità termica. La prova deve 
essere eseguita sotto cappa di aspirazione dei fumi come indicato al punto 1.6.2.2.
 
La sorgente di ignizione viene posta in contatto con il cono, e si 
osservano e registrano il vigore e la durata della reazione risultante.  
La sostanza deve essere considerata ossidante se la reazione è vigo ­
rosa.  
Nei casi in cui il risultato sia dubbio, è necessario completare l'intera 
sequenza di prova descritta di seguito.  
1.6.2.2.  Prova sequenziale  
Preparare miscele ossidante/cellulosa contenenti dal 10 al 90 % in 
peso di ossidante in incrementi del 10 %. Per i casi limite, usare miscele ossidante/cellulosa intermedie per ottenere con maggior pre ­
cisione la massima velocità di combustione.
 
Il mucchietto viene formato mediante uno stampo di metallo, che 
presenta una lunghezza di 250 mm e una sezione trasversale trian ­
golare con altezza interna di 10 mm e larghezza interna di 20 mm. Su ambedue i lati dello stampo, nella direzione longitudinale, sono 
montate due lastre metalliche come limitazioni laterali che sporgono 
di 2 mm sopra al bordo superiore della sezione triangolare (figura). Questo dispositivo viene riempito con un leggero eccesso di miscela. Dopo aver lasciato cadere una volta lo stampo da un'altezza di 2 cm 
su una superficie solida, la sostanza in eccesso rimanente viene 
rimossa con un foglio disposto obliquamente. Le delimitazioni late ­
rali vengono rimosse e la polvere rimanente viene lisciata con l'uso di un rullo. Sopra allo stampo si pone poi una piastra di base non 
combustibile, non porosa, e di bassa conducibilità termica, l'apparec ­
chio viene invertito e lo stampo rimosso.
 
Disporre il mucchietto nella corrente d'aria in una cappa.  
La velocità dell'aria deve essere sufficiente per impedire ai fumi di 
propagarsi nel laboratorio e non deve venire variata durante la prova. Intorno all'apparecchio deve essere montato uno schermo per la cor ­
rente.
 
Data l'igroscopicità della cellulosa e di alcune sostanze da esaminare, 
la prova deve essere eseguita più velocemente possibile.  
Accendere un'estremità del cumulo toccandolo con la fiamma.  
Misurare il tempo di reazione su una distanza di 200 mm dopo che 
la zona di reazione si è propagata per una distanza iniziale di 30 mm.  
La prova viene eseguita con la sostanza di riferimento e almeno una 
volta con ciascuna miscela di sostanze di prova e cellulosa della 
serie.  
Se si trova che la velocità massima di combustione è significativa ­
mente maggiore di quella della miscela di riferimento, la prova può essere interrotta. Altrimenti la prova deve essere ripetuta 5 volte per 
ciascuna delle 3 miscele che danno la velocità di combustione più 
elevata.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 119
 
Se si sospetta che il risultato sia un falso positivo, ripetere la prova 
usando una sostanza inerte con granulometria simile, come farina 
fossile, al posto della cellulosa. In alternativa, la miscela sostanza in esame/cellulosa che presenta la velocità di combustione più ele ­
vata deve essere ricontrollata in atmosfera inerte (contenuto d'ossi ­
geno < 2 % v/v).
 
2. DATI  
Per ragioni di sicurezza, deve essere considerato come caratteristica 
della proprietà ossidante della sostanza in prova il valore massimo 
della velocità di combustione e non il valore medio.  
Ai fini della valutazione si prende in considerazione il più alto valore 
della velocità di combustione rilevato su una serie di 6 prove su una determinata miscela.
 
Riportare in grafico il valore più elevato di velocità di combustione 
per ciascuna miscela contro la concentrazione dell'ossidante. Rica ­
vare dal grafico la velocità massima di combustione.  
I sei valori di velocità di combustione misurati in una prova effet ­
tuata sulla miscela che presenta la più elevata velocità di combu ­
stione non devono differire dalla loro media aritmetica per oltre il 
10 %; altrimenti deve essere migliorato il metodo di macinatura e 
miscelazione.  
Confrontare la velocità di combustione massima ottenuta con la 
massima velocità di combustione della miscela di riferimento (vedi 1.3.).
 
Se le prove vengono condotte in atmosfera inerte, la velocità di 
reazione massima viene confrontata con quella della miscela di rife ­
rimento in atmosfera inerte.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— l'identità, composizione, purezza, umidità ecc. della sostanza esa ­
minata,  
— eventuali trattamenti del campione in esame (per esempio maci ­
natura, essiccazione, ecc.),  
— la fonte di ignizione usata nelle prove,  
— i risultati delle misure,  
— la modalità di reazione (per esempio fiammata superficiale, com ­
bustione attraverso l'intera massa, eventuali informazioni relative 
ai prodotti di combustione, ecc),  
— ogni osservazione aggiuntiva significativa per l'interpretazione 
dei risultati, inclusa una descrizione del vigore (la miscela arde, produce scintille, esala fumi, brucia senza fiamma, ecc.) e la 
durata approssimata prodotta nella prova preliminare di 
sicurezza/vagliatura per la sostanza in esame e la sostanza di riferimento,
 
— i risultati delle prove eventuali con sostanze inerti,  
— i risultati delle prove eventuali in atmosfera inerte.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 120
 
3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Una sostanza è considerata come ossidante quando:  
a) nella prova preliminare c'è una reazione vigorosa;  
b) nella prova, la velocità massima di combustione delle miscele 
analizzate è maggiore o uguale alla velocità di combustione della 
miscela di cellulosa e di nitrato di bario.  
Al fine di evitare un falso positivo, i risultati ottenuti nella prova 
della sostanza miscelata con un materiale inerte e/o sotto atmosfera inerte devono essere tenuti in considerazione nell'interpretazione dei 
risultati.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 121
 
Appendice  
Figura  
Stampo e accessori per la preparazione del campione  
(Tutte le dimensioni sono espresse in mm)
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 122
 
A.18.  PESO MOLECOLARE MEDIO NUMERICO E 
DISTRIBUZIONE DEL PESO MOLECOLARE DI POLIMERI  
1. METODO  
Il presente metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde 
al metodo OCSE TG 118 (1996). I principi fondamentali e ulteriori 
informazioni tecniche sono riportati nel riferimento bibliografico (1).  
1.1. INTRODUZIONE  
Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere 
un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di sepa ­
razione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e speci ­
ficità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, 
sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromato ­
grafia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri me ­
todi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motiva ­
zione del metodo usato.
 
Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), nella quale 
si trovano informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono 
usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo 
descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga.
 
1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ  
Il peso molecolare medio numerico M  n e il peso molecolare medio 
ponderale M  w vengono determinati con le seguenti equazioni. 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
in cui  
H i è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di base per 
il volume di ritenzione V  i , 
M i è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispondenza 
del volume di ritenzione V  i , e 
n è il numero di punti.  
L'ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una misura 
della dispersità del sistema, è data dal rapporto M  w /M n . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 123
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A 
questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi M
 n e M  w noti e distribu ­
zione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata 
nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche.
 
Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di 
eluizione è valida solo nelle specìfiche condizioni del particolare 
esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione.
 
I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono 
valori relativi e sono descritti come «pesi molecolari equivalenti in 
polistirene». Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano 
altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, poli- 
metil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione.
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI ANALISI  
Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del 
peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (M  n , M  w ). 
La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli 
costituenti (2).
 
La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso 
una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi 
è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole 
di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio idrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste 
vengono eluite per ultime.
 
In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente 
dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peg ­
giorare la situazione (2).
 
La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di dif ­
frazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribu ­
zione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso mole ­
colare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente 
anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari stan ­
dard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, tal ­
volta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di 
vario peso molecolare eluite e l'asse orizzontale indica il logaritmo 
del peso molecolare.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 124
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La ripetibilità (deviazione standard relativa — Relative Standard 
Deviation: RSD) de! volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del 
tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi 
richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene 
valori tipici sono: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p è il peso molecolare dello standard in corrispondenza del mas ­
simo del picco)  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI ANALISI  
1.6.1.  Preparazione delle soluzioni di polistirene standard  
Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata misce ­
lazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener 
conto delle raccomandazioni del produttore.  
La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, 
per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la 
sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione 
deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono 
normalmente compresi tra 40 e 100 μl. Sono possibili volumi più 
elevati, ma non devono superare i 250 μl. Il rapporto ottimale tra il 
volume di iniezione e la concentrazione va determinato prima del ­
l'effettiva taratura della colonna.
 
1.6.2.  Preparazione della soluzione campione  
In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione 
valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto in un solvente adatto, per esempio, tetraidrofurano (THF), mediante un accurato 
sbattimento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno 
ad ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 μm.
 
Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di 
particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determi ­
nare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le 
soluzioni entro 24 ore.
 
1.6.3.  Apparecchiature  
— serbatoio del solvente,  
— degasatore (se del caso),  
— pompa,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 125
 
— ammortizzatore di pulsazioni (se del caso),  
— sistema di iniezione,  
— colonne per cromatografia,  
— rivelatore,  
— flussimetro (se del caso),  
— registratore-elaboratore dati,  
— recipiente di scarico.  
Assicurarsi che il sistema GPC sia inerte rispetto ai solventi utilizzati 
(p. es. mediante l'uso di capillari d'acciaio se come solvente si usa il 
THF).  
1.6.4.  Sistema di iniezione e di erogazione del solvente  
Caricare nella colonna un volume definito della soluzione campione 
utilizzando un autocampionatore oppure manualmente in una zona 
nettamente definita. Nel caso di una operazione manuale, se lo stan ­
tuffo della siringa viene tirato o spinto troppo rapidamente la distri ­
buzione dei pesi molecolari osservata può variare. Nei limiti del 
possibile il sistema di erogazione del solvente deve essere esente 
da pulsazioni e l'ideale sarebbe che vi fosse incorporato un attenua ­
tore delle pulsazioni. La portata è dell'ordine di 1 ml/min.  
1.6.5.  Colonna  
Secondo il campione, il polimero viene caratterizzato utilizzando una 
colonna semplice o più colonne collegate in serie. In commercio 
sono disponibili vari materiali porosi per colonne con proprietà (p. es. dimensione dei pori, limiti di esclusione) definite. La scelta del gel di separazione o della lunghezza della colonna dipende sia dalle 
proprietà del campione (volumi idrodinamici, distribuzione dei pesi 
molecolari) che dalle specifiche condizioni di separazione come il solvente, la temperatura e la portata (1) (2) (3).
 
1.6.6.  Piatti teorici  
La colonna o la combinazione di colonne utilizzata per la separa ­
zione deve essere caratterizzata mediante il numero di piatti teorici. Questo, nel caso venga utilizzato il THF come solvente di eluizione, implica di caricare una soluzione di etilbenzene o altro adatto soluto 
apolare su una colonna di lunghezza nota. Il numero di piatti teorici 
è dato dall'equazione seguente: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
o N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 2 
in cui  
N è = il numero di piatti teorici  
V c è = il volume di eluizione al massimo del picco  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 126
 
W è = la larghezza del picco alla linea di base  
W 1/2 è = la larghezza del picco a mezza altezza.  
1.6.7.  Efficienza di separazione  
Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina 
l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazio ­
ne, che è determinata dalla rapidità della curva di taratura. L'effi ­
cienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente rela ­
zione:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
in cui  
V e.Mx è = il volume di eluizione per polistirene di peso moleco ­
lare M  x 
V e(10M x) = è il volume di eluizione per polistirene di peso mole ­
colare dieci volte maggiore.  
La risoluzione del sistema è definita in generale come segue:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
in cui,  
V e1 , V e2 = sono i volumi di eluizione dei due standard di poli ­
stirene al massimo del picco  
W 1 , W  2 = sono le larghezze del picco alla linea di base  
M 1 , M  2 , = sono i pesi molecolari al massimo del picco (dovreb ­
bero differire di un fattore 10)  
Il valore di R del sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4).  
1.6.8.  Solventi  
Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si 
utilizza una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se neces ­
sario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi cam ­
pioni. Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna me ­
diante la pompa.
 
1.6.9.  Controllo della temperatura  
La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, 
colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con 
il solvente scelto.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 127
 
1.6.10.  Rivelatore  
La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la con ­
centrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della celia del rive ­
latore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a 
diffrazione della luce e rivelatori di viscosità, questo volume non deve superare i 10 μl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione 
è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà 
specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono uti ­
lizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori viscosimetrici, ecc.
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione 
dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati.  
Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che 
dovranno venire analizzati singolarmente.  
Per ogni misura si devono ottenere i valori di M  n , M  w , M  w /M n e M  p . 
È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato.
 
Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di 
ritenzione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i 
valori di log M  p (M p sono i massimi dei picchi dello standard di 
taratura) vengono riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso molecolare sono necessari almeno due punti 
di taratura e per la curva totale sono richiesti almeno cinque punti 
di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del cam ­
pione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o altro soluto apolare 
adatto. I pesi molecolari medi numerico e ponderale vengono in 
generale determinati mediante sistemi elettronici di elaborazione dati sulla base delle formule riportate nella sezione 1.2. Se si utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM D 
3536-91 (3).
 
La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come 
figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso moleco ­
lare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il mas ­
simo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % deve essere di circa 10 cm.
 
2.2. RELAZIONE D'ANALISI  
La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni:  
2.2.1.  Sostanza in esame:  
— informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additi ­
vi, impurezze),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 128
 
— descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi.  
2.2.2.  Strumentazione:  
— serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, compo ­
sizione dell'eluente, impurezze,  
— pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione,  
— colonne di separazione (fabbricante, tutte le informazioni sulle 
caratteristiche delle colonne, come dimensione dei pori, tipo di materiale di separazione ecc, numero, lunghezza e ordine delle 
colonne usate),
 
— numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colon ­
ne), efficienza di separazione (risoluzione del sistema),  
— informazioni sulla simmetria dei picchi,  
— temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura,  
— rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta),  
— flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione),  
— sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software).  
2.2.3.  Taratura del sistema:  
— descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di 
taratura,  
— informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (p. es. co ­
efficiente di correlazione, varianza ecc),  
— informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni 
fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati,
 
— tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono 
essere documentate in una tabella includente le seguenti informa ­
zioni per ciascun punto di taratura:  
— nome del campione,  
— produttore del campione,  
— valori caratteristici degli standard M  p , M  n , M  w , M  w /M n , 
forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme 
con dettagli relativi al metodo di determinazione,  
— volume di iniezione e concentrazione di iniezione,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 129
 
— valore di M  p usato per la taratura,  
— volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato 
in corrispondenza del massimo dei picchi,  
— M  p calcolato al massimo del picco,  
— errore percentuale dell' M  p calcolato e del valore di taratura.  
2.2.4.  Valutazione:  
— valutazione su base temporale: metodi usati per garantire la ri ­
producibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc),
 
— indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del 
volume di eluizione o del tempo di ritenzione,  
— informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non 
viene analizzato completamente,  
— descrizione dei metodi di lisciatura, se usati,  
— procedure di preparazione e pretrattamento del campione,  
— presenza di eventuali particelle indisciolte,  
— volume dì iniezione ( μl) e concentrazione di iniezione (mg/ml),  
— osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo 
GPC ideale,  
— descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle proce ­
dure di analisi,  
— dettagli sugli intervalli di errore,  
— qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpreta ­
zione dei risultati.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elution-smittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly. D.,D,. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phia, Pennsylvania.  
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pen ­
nsylvania.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 130
 
Allegato  
Esempi di altri metodi per la determinazione del peso molecolare medio 
numerico (MN) di polimeri  
La cromatografia a permeazione di gel (GPC) è il metodo preferito per la deter ­
minazione di M  n , in particolare quando sia disponibile una serie di standard la 
cui struttura è confrontabile con quella del polimero. Tuttavia, nel caso vi siano 
difficoltà pratiche per usare la GPC o si preveda già che la sostanza non rispetti un criterio normativo di M
 n (che richiede conferma), sono disponibili metodi 
alternativi come:  
1. Uso di proprietà colligative  
1.1. Ebullioscopia/crioscopia:  
prevede la misura dell'innalzamento del punto di ebollizione (ebul ­
lioscopia) o dell'abbassamento del punto di congelamento (criosco ­
pia) dì un solvente quando si aggiunge un polimero. Il metodo è basato sul fatto che l'effetto del polimero disciolto sul punto di 
ebollizione/congelamento del liquido dipende dal peso molecolare 
del polimero (1) (2).
 
Applicabilità: M  n < 20 000.  
1.2. Abbassamento della tensione di vapore:  
prevede la misura della tensione di vapore di un dato liquido 
di riferimento prima e dopo l'aggiunta di quantità note di 
polimero (1) (2).  
Applicabilità: M  n < 20 000 (in teoria; in pratica però di valore limi ­
tato).  
1.3. Qsometria su membrana:  
è basata sul principio dell'osmosi, cioè della tendenza naturale delle 
molecole di solvente a passare attraverso una membrana semiper ­
meabile da una soluzione diluita verso una soluzione concentrata fino a raggiungere l'equilibrio. Nel saggio, la soluzione diluita è a 
concentrazione zero, mentre la soluzione concentrata contiene il po ­
limero. L'effetto di aspirazione del solvente attraverso la membrana dà luogo ad un differenziale di pressione che dipende dalla concen ­
trazione e dal peso molecolare del polimero (1) (3) (4).
 
Applicabilità: M  n compreso tra 20 000 — 200 000.  
1.4. Osmometria in fase vapore:  
prevede il confronto della velocità di evaporazione di un aerosol del 
solvente puro con almeno tre aerosol contenenti il polimero a varie concentrazioni (1) (2) (4).
 
Applicabilità: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 131
 
2. Analisi dei gruppi terminali  
Per usare questo metodo è necessario conoscere sia la struttura com ­
plessiva del polimero che la natura dei gruppi terminali delle catene (che devono poter essere distinti dallo scheletro principale per esem ­
pio mediante NMR o titolazione/derivatizzazione). La determina ­
zione della concentrazione molecolare dei gruppi terminali presenti 
sul polimero può portare ad un valore del peso molecolare (7) (8) (9).
 
Applicabilità: M  n fino a 50 000 (con affidabilità decrescente).  
3. Bibliografia  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3  rd 
Edn, John Wiley, New York.  
(2) Glover, CA, (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Mem ­
brane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pag. 
25-52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl ­
vania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure Osmometry. In: De ­
termination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E. Muller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Cari Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 
3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed, Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S, et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139-2146.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 132
 
A.19.  CONTENUTO DI FRAZIONI A BASSO PESO MOLECOLARE 
IN POLIMERI  
1. METODO  
Questo metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde al 
metodo OCSE TG 119 (1996). I principi fondamentali e ulteriori 
informazioni tecniche sono presentati nei riferimenti bibliografici.  
1.1. INTRODUZIONE  
Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere 
un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di sepa ­
razione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e speci ­
ficità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, 
sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromato ­
grafia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri me ­
todi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motiva ­
zione del metodo usato.
 
Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), che con ­
tiene informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e 
valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni 
sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo 
descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la 
taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Un basso peso molecolare è definito arbitrariamente come un peso 
molecolare inferiore a 1 000 dalton.  
Il peso molecolare medio numerico M  n e il peso molecolare medio 
ponderale M  w vengono determinati con le seguenti equazioni: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i ÜM i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
in cui  
H i = è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di 
base per il volume di ritenzione V  i 
M i = è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispon ­
denza del volume di ritenzione V  i e n è il numero di punti.  
L' ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una mi ­
sura della dispersità del sistema, è data dal rapporto M  w /M n . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 133
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A 
questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi M
 n e M  w noti e distribu ­
zione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata 
nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche.
 
Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di 
eluizione è valida solo nelle specifiche condizioni del particolare 
esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione.
 
I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono 
valori relativi e sono descritti come «pesi molecolari equivalenti in 
polistirene». Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano 
altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, poli- 
metil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione.
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI ANALISI  
Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del 
peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (M  n , M  w ). 
La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli 
costituenti (2).
 
La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso 
una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi 
è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole 
di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio ìdrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste 
vengono eluite per ultime.
 
In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente 
dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peg ­
giorare la situazione (2).
 
La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di dif ­
frazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribu ­
zione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso mole ­
colare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente 
anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari stan ­
dard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, tal ­
volta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di 
vario peso molecolare eluite, e l'asse orizzontale ìndica il logaritmo 
del peso molecolare.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 134
 
Il contenuto di sostanze a basso peso molecolare si ricava da questa 
curva. Il calcolo può essere accurato solo se le specie di basso peso 
molecolare hanno una risposta, riferita alla massa, equivalente al polimero nel suo complesso.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La ripetibilità (deviazione standard relativa — Relative Standard 
Deviation: RSD) del volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi 
richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno 
standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene valori tipici sono: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p is the molecular weight of the standard at the peak maximum)  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI ANALISI  
1.6.1.  Preparazione delle soluzioni di polistirene standard  
Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata misce ­
lazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener 
conto delle raccomandazioni del produttore.  
La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, 
per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di 
evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni 
analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono normalmente compresi tra 40 e 100 μl. Sono possibili volumi più 
elevati, ma non devono superare i 250 μl. Il rapporto ottimale tra il 
volume di iniezione e la concentrazione deve essere determinato 
prima dell'effettiva taratura della colonna.
 
1.6.2.  Preparazione della soluzione campione  
In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione 
valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto accuratamente in un solvente adatto, per esempio tetraidrofurano (THF), per sbat ­
timento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno ad 
ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su 
un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 μm.
 
Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di 
particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determi ­
nare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le 
soluzioni entro 24 ore.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 135
 
1.6.3.  Correzione dell'errore dovuto a impurezze e additivi  
É di solito necessaria una correzione del contenuto di specie M < 
1 000 che tenga conto del contributo di componenti specifici non polimerici presenti (p. es. impurezze e/o additivi), salvo che il con ­
tenuto misurato sia già < 1 %. Questo si ottiene mediante l'analisi 
diretta della soluzione di polimero o dell'eluato della GPC.
 
Se, dopo il passaggio attraverso la colonna, l'eluato è troppo diluito 
per un'ulteriore analisi, occorre concentrarlo. Può essere necessario evaporare l'eluato a secchezza e scioglierlo di nuovo. La concentra ­
zione dell'eluato deve essere condotta in condizioni tali da garantire 
che non si abbiano cambiamenti nell'eluato. Il trattamento dell'eluato dopo lo stadio di GPC dipende dal metodo analitico usato per la determinazione quantitativa.
 
1.6.4.  Apparecchiature  
L'apparecchiatura GPC comprende i seguenti componenti:  
— serbatoio del solvente,  
— degasatore (se del caso),  
— pompa,  
— ammortizzatore di pulsazioni (se del caso),  
— sistema di iniezione,  
— colonne per cromatografia,  
— rivelatore,  
— flussimetro (se del caso),  
— registratore-elaboratore dati,  
— recipiente di scarico.  
Assicurarsi che il sistema GPC sia inerte rispetto ai solventi utilizzati 
(p. es. mediante l'uso di capillari d'acciaio se come solvente si usa il 
THF).  
1.6.5.  Sistema di iniezione e di erogazione del solvente  
Caricare nella colonna un volume definito della soluzione campione 
utilizzando un autocampionatore oppure manualmente in una zona nettamente definita. Nel caso di una operazione manuale; se lo stan ­
tuffo della siringa viene tirato o spinto troppo rapidamente, la di ­
stribuzione dei pesi molecolari osservata può variare. Nei limiti del 
possibile il sistema di erogazione del solvente deve essere esente da pulsazioni e l'ideale sarebbe che vi fosse incorporato un attenuatore delle pulsazioni. La portata è dell ordine di 1 ml/min.
 
1.6.6.  Colonna  
Secondo il campione, il polimero viene caratterizzato utilizzando una 
colonna semplice o più colonne collegate in serie. In commercio 
sono disponibili vari materiali porosi per colonne con proprietà (p. 
es. dimensione dei pori, limiti di esclusione) definite. La scelta del gel di separazione o della lunghezza della colonna dipende sia dalle proprietà del campione (volumi idrodinamici, distribuzione dei pesi 
molecolari) che dalle specifiche condizioni di separazione come il 
solvente, la temperatura e la portata (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 136
 
1.6.7.  Piatti teorici  
La colonna o la combinazione di colonne utilizzata per la separa ­
zione deve essere caratterizzata dal numero di piatti teorici. Questo, nel caso venga utilizzato il THF come solvente di eluizione, implica 
di caricare una soluzione di etilbenzene o altro adatto soluto apolare 
su una colonna di lunghezza nota. Il numero di piatti teorici è dato dall'equazione seguente: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
o N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 2 
in cui,  
N è = il numero di piatti teorici  
V e è = il volume di eluizione al massimo del picco  
W è = la larghezza del picco alla linea di base  
W 1/2 è = la larghezza del picco a mezza altezza  
1.6.8.  Efficienza di separazione  
Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina 
l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazio ­
ne, che è determinata dalla ripidità della curva di taratura. L'effi ­
cienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente rela ­
zione:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
cross sectional area of the column ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
in cui  
V eMx è = il volume di eluizione per polistirene di peso moleco ­
lare M  x 
V e,(10Mu)  è = il volume di eluizione per polistirene di peso moleco ­
lare dieci volte maggiore.  
La risoluzione del sistema è definita in generale come segue:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
in cui,  
V e1 , V e2 = sono i volumi di eluizione dei due standard di poli ­
stirene al massimo del picco  
W 1 , W  2 = sono le larghezze del picco alla linea di base  
M 1 , M  2 = sono i pesci molecolari al massimo del picco (dovreb ­
bero differire di un fattore 10).  
Il valore di R per il sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 137
 
1.6.9.  Solventi  
Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si usa 
una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se necessario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande 
per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi campioni. 
Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna mediante la pompa.
 
1.6.10.  Controllo della temperatura  
La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, 
colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con il solvente scelto.
 
1.6.11.  Rivelatore  
La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la con ­
centrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile 
allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della cella del rive ­
latore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a diffrazione della luce e rivelatori a viscosità, questo volume non 
deve superare i 10 μl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione 
è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono uti ­
lizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori 
viscosimetrici ecc.
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione 
dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati.  
Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che 
dovranno venire analizzati singolarmente. In ogni caso è essenziale determinare i dati anche sui bianchi trattati nelle stesse condizioni del 
campione.
 
È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori 
relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato.  
Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di riten ­
zione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i valori di log M
 p (M p sono i massimi dei picchi dello standard di taratura) vengono 
riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso 
molecolare sono necessari almeno due punti di taratura e per la curva 
totale sono richiesti almeno cinque punti di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del campione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o 
altro soluto apolare adatto. Si determina la porzione della curva corri ­
spondente a pesi molecolari inferiori a 1 000 e, se necessario, la si corregge per compensare impurezze e additivi. In genere le curve di eluzione vengono valutate con sistemi elettronici di elaborazione. Se si 
utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM 
D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 138
 
Se eventuali polimeri insolubili vengono trattenuti sulla colonna, è 
probabile che il loro peso molecolare sia più elevato di quello della 
frazione solubile, e non considerandolo si sovrastimerebbe il conte ­
nuto di sostanze di basso peso molecolare. Nell'allegato sono fornite indicazioni per la correzione del contenuto di sostanze a basso peso 
molecolare per tener conto del polimero insolubile.
 
La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come 
figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro 
log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso moleco ­
lare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il mas ­
simo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % 
deve essere di circa 10 cm.
 
2.2. RELAZIONE D'ANALISI  
La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni:  
2.2.1.  Sostanza in esame  
— informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additi ­
vi, impurezze),  
— descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi.  
2.2.2.  Strumentazione  
— serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, compo ­
sizione dell'eluente, impurezze,  
— pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione,  
— colonne di separazione (fabbricante, tutte le informazioni sulle 
caratteristiche delle colonne, come dimensione dei pori, tipo di 
materiale di separazione ecc, numero, lunghezza e ordine delle colonne usate),
 
— numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colonne), 
efficienza di separazione (risoluzione del sistema),  
— informazioni sulla simmetria dei picchi,  
— temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura,  
— rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta),  
— flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione),  
— sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software).  
2.2.3.  Taratura del sistema  
— descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di 
taratura,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 139
 
— informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (coefficiente 
di correlazione, varianza ecc),  
— informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni 
fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati,
 
— tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono 
essere documentate in una tabella includente le seguenti informa ­
zioni per ciascun punto di taratura:  
— nome del campione,  
— produttore del campione,  
— valori caratteristici degli standard M  p , M  n , M  w , M  w /M n , 
forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme con dettagli relativi al metodo di determinazione,
 
— volume di iniezione e concentrazione di iniezione,  
— valore di M  p usato per la taratura,  
— volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato 
in corrispondenza del massimo dei picchi,  
— M  p calcolato al massimo del picco,  
— errore percentuale dell'M  p calcolato e del valore di taratura.  
2.2.4.  Informazioni sul contenuto di polimero a basso peso molecolare  
— descrizione dei metodi usati nell'analisi e del modo in cui sono 
stati condotti gli esperimenti,  
— informazioni sul contenuto percentuale (p/p) di specie di basso 
peso molecolare riferito al campione totale;  
— informazioni sulle impurezze, gli additivi e altre specie non po ­
limeriche in percentuale in peso riferita al campione totale.  
2.2.5.  Valutazione  
— valutazione su base temporale: metodi usati per garantire 
la riproducibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc),
 
— indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del 
volume di eluizione o del tempo di ritenzione,  
— informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non 
viene analizzato completamente,  
— descrizione dei metodi di lisciatura, se usati,  
— procedure di preparazione e pretrattamento del campione,  
— presenza di eventuali particelle indisciolte,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 140
 
— volume di iniezione ( μl) e concentrazione di iniezione (mg/ml),  
— osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo 
GPC ideale,  
— descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle proce ­
dure di analisi,  
— dettagli sugli intervalli di errore,  
— qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpreta ­
zione dei risultati.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) 
mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecu ­
lar Weight Averages and Molecular Weight Distribution by 
Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromato ­
graphy-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecu ­
lar Weight Averages and Molecular Weight Distribution of 
Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromato ­
graphy. American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phia, Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 141
 
Allegato  
Indicazioni per la correzione del contenuto di specie di basso peso 
molecolare in funzione della presenza di polimero insolubile  
Quando in un campione è presente polimero insolubile, si verifica una perdita di 
massa durante l'analisi GPC. Il polimero insolubile viene trattenuto in modo 
irreversibile sulla colonna o sul filtro del campione, mentre la porzione solubile 
del campione passa attraverso la colonna. Se l'incremento dell'indice di rifrazione (dn/dc) del polimero può essere stimato o misurato, si può stimare la massa di campione persa sulla colonna. In tal caso si effettua una correzione usando una 
taratura esterna con materiali standard di concentrazione nota e dn/dc noto per 
tarare la risposta del rifrattometro. Nel seguente esempio si usa uno standard di poli(metilmetacrilato) (pMMA).
 
Nella taratura esterna per l'analisi di polimeri acrilici, si analizza uno standard di 
pMMA di concentrazione nota in tetraidrofurano mediante GPC e i dati risultanti 
vengono usati per trovare la costante del rifrattometro secondo l'equazione:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
in cui:  
K = è la costante del rifrattometro (in microvolt secondi/ml),  
R = è la risposta dello standard di pMMA (in microvolt/secondi),  
C = è la concentrazione dello standard di pMMA (in mg/ml),  
V = è il volume di iniezione (in ml) e dn/dc è l'incremento di indice di 
rifrazione per il pMMA in tetraidrofurano (in ml/mg).  
I seguenti sono dati tipici di uno standard di pMMA:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg.  
II valore di K risultante, 3,05 × 10  11 viene poi utilizzato per calcolare la risposta 
teorica del rivelatore se il 100 % del polimero iniettato fosse stato eluito attra ­
verso il rivelatore.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 142
 
A.20.  COMPORTAMENTO DI SOLUZIONE/ESTRAZIONE DEI 
POLIMERI IN ACQUA  
1. METODO  
II metodo descritto corrisponde alla versione riveduta del metodo 
OCSE TG 120 (1997). Ulteriori informazioni tecniche sono fornite 
nel riferimento bibliografico (1).  
1.1. INTRODUZIONE  
Per certuni polimeri, come i polimeri in emulsione, può essere ne ­
cessario un lavoro di preparazione iniziale prima di poter utilizzare il metodo qui presentato. Il metodo non può essere applicato a polimeri 
liquidi e a polimeri che reagiscono con l'acqua nelle condizioni del 
saggio.
 
Quando il metodo non è pratico o è impossibile da applicare, il 
comportamento di soluzione/estrazione può essere studiato mediante 
altri metodi. In tal caso,. fornire dettagli completi e la motivazione 
del metodo usato.  
1.2. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.3. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
II comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in un ambiente 
acquoso viene determinato con il metodo del pallone (cfr. A.6. Solubilità in acqua, metodo del pallone) con le modifiche de ­
scritte nel seguito.
 
1.4. CRITERI DI QUALITÀ  
Nessuno.  
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.5.1.  Apparecchiatura  
Per il metodo occorre la seguente apparecchiatura:  
— dispositivo di triturazione, per esempio un macinino, per la pro ­
duzione di particelle di dimensioni note,  
— apparecchiature di scuotimento con possibilità di controllo della 
temperatura,  
— sistema di filtrazione su membrana,  
— apparecchiature analitiche appropriate,  
— setacci standardizzati.  
1.5.2.  Preparazione del campione  
Un campione rappresentativo deve innanzitutto venire ridotto ad una 
dimensione granulometrica compresa tra 0,125 e 0,25 mm con l'uti ­
lizzo di appropriati setacci. Può essere richiesto un raffreddamento ai 
fini della stabilità del campione o per la macinazione. Materiali di 
natura gommosa possono venire tritati alla temperatura dell'azoto liquido (1).
 
Se non è possibile ottenere la frazione di dimensione granulometrica 
richiesta, ridurre il più possibile le dimensioni delle particelle e 
indicare il risultato nella relazione. Nella relazione è necessario in ­
dicare come è stato conservato il campione tritato prima dell'analisi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 143
 
1.5.3.  Procedura  
Tre campioni da 10 g della sostanza in analisi vengono pesati in tre 
recipienti dotati di tappi di vetro e in ciascun recipiente si aggiun ­
gono 1 000 ml di acqua. Se ia manipolazione di una quantità di 10 g 
di polimero si dimostra irrealizzabile, utilizzare la massima quantità 
manipolabile e regolare in proporzione il volume d'acqua.  
I recipienti vengono tappati ermeticamente ed agitati a 20  o C. Usare 
un dispositivo di agitazione in grado di funzionare a temperatura 
costante. Dopo un periodo di 24 ore, il contenuto di ciascun reci ­
piente viene centrifugato o filtrato e si determina la concentrazione del polimero nella fase acquosa limpida mediante un adatto metodo analitico. Se non sono disponibili metodi analitici adatti per la fase 
acquosa, si può stimare la solubilità/estrattività totale del peso secco 
del residuo trattenuto sul filtro o del precipitato centrifugato.
 
Di solito è necessario distinguere quantitativamente le impurezze e 
gli additivi, da una parte, dalle specie di basso peso molecolare, dall'altra parte. Nel caso di una determinazione gravimetrica, è im ­
portante anche eseguire una prova in bianco senza sostanza in esame 
per tener conto di residui dovuti alla procedura sperimentale.
 
Il comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in acqua a 37  
o C a pH 2 e pH 9 può venire determinato come descritto per l'espe ­
rimento a 20  o C. Questi pH si possono ottenere mediante l'aggiunta 
di adatti tamponi o di acidi o basi appropriate, come acido cloridrico, 
acido acetico, idrossido di sodio o di potassio per analisi o NH  3 . 
Secondo il metodo di analisi usato, si devono eseguire una o due 
prove. Quando sono disponibili metodi sufficientemente specifici per 
determinare il componente polimerico mediante l'analisi diretta della 
fase acquosa, dovrebbe essere sufficiente una prova eseguita come descritto sopra. Se invece tali metodi non sono disponibili e la determinazione del comportamento di soluzione/estrazione del poli ­
mero è limitata all'analisi indiretta mediante la sola determinazione 
del carbonio organico totale (TOC) contenuto nell'estratto acquoso, si dovrebbe eseguire una prova addizionale. Anche questa prova addi ­
zionale deve essere eseguita in triplo utilizzando campioni di poli ­
mero dieci volte più piccoli e le stesse quantità di acqua usate nella 
prima prova.
 
1.5.4.  Analisi  
1.5.4.1.  Saggio condotto con una sola dimensione del campione  
Se disponibili, usare metodi per l'analisi diretta dei componenti po ­
limerici nella fase acquosa. In alternativa, si può prendere in consi ­
derazione anche un'analisi indiretta dei componenti de! polimero 
disciolti/estratti mediante determinazione del contenuto totale di parti solubili e correzione per tener conto dei componenti non specifici del polimero.
 
Per determinare le specie polimeriche totali è possibile effettuare 
l'analisi della fase acquosa: o  
mediante un metodo di sufficiente sensibilità, per esempio:  
— TOC mediante digestione con persolfato o dicromato a dare CO  2 , 
e stima mediante IR o analisi chimica,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 144
 
— spettrometria di assorbimento atomico (AAS) o il suo equivalente 
emissione a plasma accoppiato induttivamente (ICP) per polimeri 
contenenti silicio o metalli,  
— assorbimento UV o spettrofluorimetria per i polimeri acrilici,  
— LC-MS per campioni di basso peso molecolare,  
oppure mediante evaporazione a secchezza sotto vuoto dell'estratto 
acquoso e analisi spettroscopica (IR, UV, ecc.) o AAS/ICP del resi ­
duo. 
Se l'analisi della fase acquosa tal quale non è praticabile, l'estratto 
acquoso dovrebbe venire estratto con un solvente organico immisci ­
bile con l'acqua, per esempio un idrocarburo clorurato. Il solvente 
viene poi evaporato e il residuo viene analizzato come sopra per 
determinare il contenuto di polimero di cui sopra. I componenti di questo residuo identificati come impurezza o additivo devono venire 
sottratti per determinare così il grado di soluzione/estrazione del 
polimero stesso.
 
Quando tali sostanze sono presenti in quantità relativamente grandi, 
può essere necessario sottoporre il residuo per esempio ad un'analisi HPLC o GC per distinguere le impurezze dal monomero e dalle 
specie derivate dal monomero presenti, in modo che sia possibile 
determinare il reale contenuto di queste ultime.
 
In alcuni casi può essere sufficiente una semplice evaporazione a 
secchezza del solvente seguita dalla pesata del residuo secco.  
1.5.4.2.  Prova condotta con due differenti dimensioni del campione  
Si determina il TOC su tutti gli estratti acquosi.  
Eseguire una determinazione gravimetrica sulla parte indisciolta/non 
estratta del campione. Se, dopo centrifugazione o filtrazione del contenuto di ciascun recipiente, rimangono residui di polimero attac ­
cati alla parete del recipiente, risciacquarlo con il filtrato fino a 
rimuoverne tutti i residui visibili, dopo di che il filtrato viene di 
nuovo centrifugato o filtrato. I residui che rimangono sul filtro o nella provetta da centrifuga vengono essiccati a 40
 o C sotto vuoto 
e pesati. Continuare l'essiccazione fino a peso costante.  
2. DATI  
2.1. PROVA CONDOTTA CON UNA SOLA DIMENSIONE DEL 
CAMPIONE  
Indicare i singoli risultati di ciascuno dei tre palloni e valori medi, in 
unità di massa per volume della soluzione (tipicamente mg/1) o di massa per massa del campione di polimero (tipicamente mg/g). In ­
dicare anche la perdita di peso del campione (calcolata come peso 
del soluto diviso per il peso del campione iniziale). Si dovrebbero calcolare le deviazioni standard relative (RSD). Indicare i singoli valori per la sostanza totale (polimero più additivi essenziali ecc.) 
e per il solo polimero (cioè dopo aver sottratto il contributo di tali 
additivi).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 145
 
2.2. PROVA CONDOTTA CON DUE DIFFERENTI DIMENSIONI 
DEL CAMPIONE  
Fornire i singoli valori di TOC degli estratti acquosi dei due espe ­
rimenti in triplo e il valore medio di ciascun esperimento in unità di 
massa per volume della soluzione (tipicamente mg C/g), nonché in 
unità di massa per peso del campione iniziale (tipicamente mg C/g).  
Se non vi sono differenze tra i risultati ai rapporti campione/acqua 
alto e basso, questo può indicare che effettivamente sono stati estratti 
tutti i componenti estraibili. In tal caso normalmente non sarà neces ­
saria l'analisi diretta.  
Indicare i singoli pesi dei residui espressi in percentuale del peso 
iniziale dei campioni. Per ogni esperimento calcolare le medie. Le differenze tra 100 e le percentuali trovate rappresentano le percen ­
tuali di materiale solubile ed estraibile contenuto nel campione ori ­
ginario.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio deve includere le informazioni seguenti:  
3.1.1.  Sostanza esaminata:  
— informazioni disponibili sulla sostanza esaminata (identità, addi ­
tivi, impurezze, contenuto di specie di basso peso molecolare).  
3.1.2.  Condizioni sperimentali:  
— descrizione delle procedure usate e delle condizioni sperimentali,  
— descrizione dei metodi analitici e di rivelazione.  
3.1.3.  Risultati:  
— risultati di solubilità/estraibilità in mg/l; valori singoli e valori 
medi delle prove di estrazione nelle varie soluzioni, scomposti 
in contenuto di polimero e impurezze, additivi ecc.,  
— risultati di solubilità/estraibilità in mg/g di polimero,  
— valori di TOC per gli estratti acquosi, peso del soluto e percen ­
tuali calcolate, se misurati,  
— pH di ciascun campione,  
— informazioni riguardo ai valori del bianco,  
— se necessario, indicazioni sulla instabilità chimica della sostanza 
in esame sia durante il processo di saggio che durante il processo analitico,
 
— tutte le informazioni ritenute importanti per l'interpretazione dei 
risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
fùr Priifzwecke.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 146
 
A.21.  PROPRIETÀ COMBURENTI (LIQUIDI)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo di test è disegnato per misurare il potenziale che 
una sostanza liquida ha di aumentare la velocità o l'intensità di 
combustione di una sostanza combustibile, o di formare con una sostanza combustibile una miscela capace di autoaccensione, quando le due sostanze vengono perfettamente miscelate. Il metodo si basa 
sul test ONU per i liquidi comburenti (1) ed è equivalente ad esso. 
Poiché tuttavia il presente metodo A.21 deve fondamentalmente sod ­
disfare i requisiti del regolamento 1907/2006, esso può limitarsi a 
richiedere solo un confronto con un'unica sostanza di riferimento. 
L'analisi e il confronto con altre sostanze di riferimento possono risultare necessari quando occorre utilizzare i risultati del test per altri scopi. (
 1 ) 
Non occorre eseguire questo test quando l'esame della formula di 
struttura conferma oltre ogni ragionevole dubbio che la sostanza non è in grado di reagire esotermicamente con un materiale com ­
bustibile.
 
Prima di eseguire il test è utile possedere informazioni preliminari su 
eventuali potenziali proprietà esplosive della sostanza.  
Il test non è applicabile a solidi, gas, sostanze esplosive o altamente 
infiammabili, né a perossidi organici.  
L'esecuzione di questo test può essere evitata qualora la sostanza 
in esame sia già stata analizzata con il test ONU sui liquidi comburenti (1).
 
1.2 DEFINIZIONI E UNITÀ  
Per tempo medio di aumento della pressione si intende la media dei 
tempi misurati perché una miscela in esame produca un aumento della pressione da 690 kPa a 2 070 kPa in autoclave.
 
1.3 SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Come sostanza di riferimento si utilizza acido nitrico acquoso al 
65 % (p/p) (grado analitico) (  2 ). ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 147  
( 1 ) Come, per esempio, nell'ambito della normativa ONU sui trasporti. 
( 2 ) L'acido va titolato prima del test per confermarne la concentrazione.
 A scelta, se lo sperimentatore prevede che i risultati di questo test 
possano alla fine essere impiegati per altri scopi (  1 ), può risultare 
appropriato eseguire il test anche con altre sostanze di riferimento. (
 2 ) 
1.4 PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
Il liquido da sottoporre a test viene miscelato con cellulosa fibrosa in 
rapporto 1:1 (per massa) e introdotto in un recipiente a pressione. Se 
durante la miscelatura o il riempimento si verifica un'accensione 
spontanea non occorre proseguire il test.  
Se non si verifica un'accensione spontanea il test va eseguito intera ­
mente. Dopo aver riscaldato la miscela in un recipiente a pressione si misura il tempo medio di aumento della pressione da 690 kPa a 
2 070 kPa in autoclave, infine si confronta il risultato con il tempo 
medio di aumento della pressione rilevato per la miscela 1:1 della/e sostanza/e di riferimento con cellulosa.
 
1.5 CRITERI DI QUALITÀ  
In una serie di cinque prove eseguite su un'unica sostanza i risultati 
non devono differire di oltre il 30 % dalla media aritmetica; in caso 
contrario vanno scartati. Se ciò dovesse succedere, occorre provve ­
dere a migliorare la procedura di miscelazione e di riempimento prima di ripetere il test.
 
1.6 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1  Preparazione  
1.6.1.1  Sostanza combustibile  
Come materiale combustibile viene impiegata cellulosa essiccata fi ­
brosa con fibre di lunghezza compresa fra 50 e 250 μm e diametro 
medio di 25 μm (  3 ). L'essiccazione avviene a peso costante formando 
uno strato di spessore non superiore a 25 mm, ad una temperatura di 
105  o C per un periodo di 4 ore. La sostanza viene dunque conservata 
in un essiccatore in presenza di un essiccante nella fase di raffred ­
damento e comunque fino al momento del suo utilizzo. Il tenore di 
acqua della cellulosa essiccata deve essere inferiore allo 0,5 % della 
massa secca (  4 ), eventualmente, se necessario, prolungando il tempo 
di essiccazione (  5 ). Per tutto il test va utilizzato un unico lotto di 
cellulosa.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 148  
( 1 ) Come, per esempio, nell'ambito della normativa ONU sui trasporti. 
( 2 ) Ad es.: nello studio di cui alla voce bibliografica 1 vengono usati acido perclorico al 
50 % (p/p) e clorato di sodio al 40 % (p/p). 
( 3 ) Ad es. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, numero catalogo 
4021 050. 
( 4 ) Confermato (ad esempio) con titolazione di Karl-Fisher. 
( 5 ) In alternativa è possibile ottenere questo livello di umidità mediante (ad esempio) ri ­
scaldamento a 105  o C sotto vuoto per 24 h.
 1.6.1.2  Apparecchiatura  
1.6.1.2.1 R e c i p i e n t e a p r e s s i o n e  
Si utilizza un recipiente a pressione formato da un cilindro di acciaio 
lungo 89 mm e avente un diametro esterno di 60 mm (vedi figura 1). Sui lati opposti occorre lavorare due superfici piane (che riducono la sezione trasversale del recipiente a 50 mm) per facilitare la presa 
mentre si preparano la spina di accensione e il tappo-sfiatatoio. Il 
recipiente, che ha un diametro interno di 20 mm, presenta alle due estremità una smussatura interna per una profondità di 19 mm ed è filettato in modo da accomodare filettature British Standard Pipe 
(BSP) da 1" o l'equivalente metrico. Un limitatore di pressione, 
formato da un braccio laterale, è avvitato sul lato curvo del recipiente a pressione a 35 mm da una delle estremità e a 90
 o rispetto alle 
superfici piane lavorate. L'incavo per il limitatore è perforato per una 
profondità di 12 mm e filettato in modo da accomodare il filo del 
BSP da 1/2" (o l'equivalente metrico) all'estremità del braccio late ­
rale. Se necessario si inserisce un sigillo di materiale inerte per assicurare la tenuta stagna contro la fuoriuscita di gas. Il braccio 
laterale si estende per 55 mm oltre il corpo del recipiente a pressione 
e presenta un foro di 6 mm. L'estremità del braccio laterale è smus ­
sata e filettata in modo da accomodare un trasduttore di pressione del tipo a membrana. È possibile utilizzare qualunque tipo di misuratore 
di pressione, a condizione che non sia sensibile alla temperatura dei 
gas o ai prodotti della decomposizione e che sia in grado di rilevare l'aumento di pressione tra 690 e 2 070 kPa in meno di 5 millisecondi.
 
L'estremità del recipiente a pressione più lontana dal braccio laterale 
è chiusa con la spina di accensione provvista di due elettrodi, uno 
isolato dal corpo della spina e l'altro collegato a massa. L'altra estre ­
mità del recipiente a pressione è chiusa da un disco di rottura (pres ­
sione di scoppio di circa 2 200 kPa) mantenuto in sede con un tappo di ritenuta provvisto di un'apertura di 20 mm. Se necessario la spina 
di accensione può essere dotata di un sigillo di materiale inerte per 
assicurare la tenuta stagna contro la fuoriuscita di gas. Una base appoggio (figura 2) mantiene l'assemblato nella posizione corretta durante l'utilizzo. In genere si ricorre ad una piastra di base in 
acciaio dolce di 235 mm x 184 mm × 6 mm provvista di un profilato 
cavo di 185 mm di lunghezza a sezione quadra di dimensioni di 70 mm x 70 mm × 4 mm.
 
Da ciascuno dei lati opposti di un'estremità del profilato viene ta ­
gliata una sezione, in modo da formare una struttura a due gambe con i lati piatti sormontata da un tratto di profilato a sezione intatta 
della lunghezza di 86 mm. Le estremità di questi lati piatti sono 
tagliate ad angolo di 60
 o in orizzontale e sono saldate alla piastra 
di base. In un lato dell'estremità superiore della sezione della base viene eseguita una scanalatura di 22 mm di larghezza × 46 mm di 
profondità tale che, quando l'assemblato del recipiente a pressione 
viene calato dal lato dell'estremità della spina di accensione nel supporto del profilato squadrato, il braccio laterale possa inserirsi nella scanalatura. Un pezzo di acciaio largo 30 mm e spesso 
6 mm viene saldato al lato inferiore interno della sezione quadra 
per fungere da distanziatore. Due viti a testa piatta da 7 mm inserite nella faccia opposta servono a mantenere fisso in posizione il reci ­
piente a pressione. Due strisce d'acciaio larghe 12 mm e spesse 
6 mm, saldate alle parti laterali lungo la base della sezione quadra, 
sostengono il recipiente a pressione dal di sotto.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 149
 
1.6.1.2.2 S i s t e m a d i a c c e n s i o n e  
Il sistema di accensione è formato da un filo in Ni/Cr lungo 25 cm 
con diametro di 0,6 mm e resistenza di 3,85 ohm/m. Mediante 
un'asta del diametro di 5 mm, il filo è arrotolato a formare una bobina ed è collegato agli elettrodi della spina di accensione. La bobina deve avere una delle configurazioni mostrate nella figura 
3. La distanza fra il fondo del recipiente e la parte inferiore della 
bobina di accensione deve essere preferibilmente di 20 mm. Se gli elettrodi non sono regolabili, le estremità del filo di accensione fra la bobina e il fondo del recipiente vanno isolate con una guaina in 
ceramica. Il filo è riscaldato da un alimentatore a corrente continua 
di almeno 10 A.
 
1.6.2  Esecuzione del test  ( 1 ) 
L'apparecchiatura, assemblata con il trasduttore di pressione e il 
sistema di riscaldamento ma senza il disco di rottura posizionato, viene appoggiata con il lato della spina di accensione verso il basso. 
In un bicchiere di vetro si mescolano 2,5 g del liquido da esaminare 
con 2,5 g di cellulosa essiccata, utilizzando un agitatore in vetro (
 2 ). 
Per sicurezza, quando si miscelano le due sostanze occorre inserire uno schermo di protezione fra l'operatore e la miscela. Se la miscela 
si incendia durante il mescolamento o il riempimento, non occorre 
proseguire il test. La miscela va versata nel recipiente a pressione in piccole quantità, tamburellando sul contenitore e facendo in modo che essa si concentri intorno alla bobina di accensione e sia perfet ­
tamente a contatto con essa. È importante che durante questo pro ­
cesso di impaccamento la bobina non venga deformata per evitare risultati sfalsati (
 3 ). Il disco di rottura viene messo in posizione e il 
tappo di ritenuta viene avvitato saldamente. Il recipiente carico viene 
trasferito sulla base di appoggio per l'accensione, con il disco di 
rottura in alto e il tutto viene sistemato in un apposito armadio aspirato corazzato da laboratorio o in una camera di scoppio. L'ali ­
mentatore viene collegato ai terminali esterni della spina di accen ­
sione e impostato su 10 A. Il tempo fra l'inizio della miscelazione e 
l'accensione dell'alimentatore non deve superare i 10 minuti.
 
Il segnale prodotto dal trasduttore di pressione viene registrato me ­
diante sistema apposito che consenta sia la valutazione dei dati, sia la generazione di un registro permanente del profilo tempo-pressione 
ottenuto (ad esempio un registratore di segnali transitori unito a un 
registratore su carta). La miscela viene scaldata fino a rottura del disco o finché siano trascorsi almeno 60 s. Se la rottura del disco non si verifica, occorre lasciare raffreddare la miscela prima di smon ­
tare con cautela l'apparecchiatura, prendendo precauzioni per tenere 
conto dell'eventuale pressurizzazione. In totale vengono eseguite cin ­
que prove con la sostanza in esame e la/le sostanza/e di riferimento. Si rileva e registra il tempo impiegato dalla pressione per aumentare 
da 690 kPa a 2 070 kPa in autoclave. Infine si calcola il tempo 
medio di aumento della pressione.
 
In alcuni casi le sostanze possono generare un aumento di pressione 
eccessivamente alto o basso dovuto a reazioni chimiche che non 
caratterizzano le proprietà comburenti della sostanza in questione. 
In tali casi può essere necessario ripetere il test con una sostanza inerte, come la diatomite (terra a diatomee), in luogo della cellulosa, allo scopo di chiarire la natura della reazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 150  
( 1 ) Le miscele di ossidanti con cellulosa vanno trattate come potenzialmente esplosive e 
maneggiate con la dovuta cautela. 
( 2 ) In pratica occorre preparare una miscela 1:1 di liquido da esaminare e cellulosa in una 
quantità superiore a quella necessaria per il test e poi trasferirne 5 ± 0,1 g nel recipiente a 
pressione. La miscela deve essere preparata fresca per ciascun test. 
( 3 ) In particolare occorre evitare il contatto fra le spire adiacenti della bobina.
 2. DATI  
Tempi di aumento della pressione sia per la sostanza in esame che 
per la/le sostanze di riferimento. Tempi di aumento della pressione per la sostanza inerte eventualmente utilizzata.
 
2.1 TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Si calcolano i tempi medi di aumento della pressione, sia per la 
sostanza in esame che per la/le sostanze di riferimento.  
Si calcola il tempo medio di aumento della pressione per la sostanza 
inerte eventualmente utilizzata. La tabella 1 mostra alcuni esempi di 
risultati.  
preparata fresca per ciascun test.  
Tabella 1  
Esempi di risultati  ( a ) 
Sostanza (  b ) Tempo medio di aumento della pressione per una mi ­
scela 1:1 con cellulosa 
(ms) 
Dicromato di ammonio, soluzione acquosa satura 20 800 
Nitrato di calcio, soluzione acquosa satura 6 700 Nitrato di ferro, soluzione acquosa satura 4 133 
Perclorato di litio, soluzione acquosa satura 1 686 
Perclorato di magnesio, soluzione acquosa satura 777 Nitrato di nickel, soluzione acquosa satura 6 250 Acido nitrico, 65 % 4 767 (
 c ) 
Acido perclorico, 50 % 121 (  c ) 
Acido perclorico, 55 % 59 Nitrato di potassio, soluzione acquosa al 30 % 26 690 Nitrato di argento, soluzione acquosa satura (
 d ) 
Clorato di sodio, soluzione acquosa al 40 % 2 555 (  c ) 
Nitrato di sodio, soluzione acquosa al 45 % 4 133  
Sostanza inerte  
Acqua:cellulosa (  d ) 
( a ) Vedi voce bibliografica (1) per la classificazione in base al regime di trasporto ONU. 
( b ) Le soluzioni sature vanno preparate a 20  o C. 
( c ) Valore medio da studi comparativi interlaboratorio. 
( d ) Pressione massima di 2 070 kPa non raggiunta.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 151
 
3. RELAZIONE  
3.1 RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
— identità, composizione, purezza, ecc. della sostanza di prova,  
— concentrazione della sostanza di prova,  
— procedura di essiccazione della cellulosa,  
— contenuto di acqua della cellulosa,  
— risultati delle misurazioni,  
— risultati degli eventuali test con sostanza inerte,  
— tempi medi calcolati di aumento della pressione,  
— eventuali deviazioni dal metodo descritto e motivazioni,  
— qualunque informazione od osservazione rilevante per l'interpre ­
tazione dei risultati.  
3.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (  1 ) 
I risultati del test devono essere valutati in base ai seguenti criteri:  
a) eventuale accensione spontanea della miscela formata dalla so ­
stanza di prova e dalla cellulosa;  
b) confronto del tempo medio impiegato dalla pressione per aumen ­
tare da 690 kPa a 2 070 kPa con quello della/e sostanza/e di 
riferimento.  
Una sostanza liquida è considerata comburente quando:  
a) una miscela 1:1, per massa, di sostanza e cellulosa prende fuoco 
spontaneamente; oppure  
b) una miscela 1:1, per massa, di sostanza e cellulosa presenta un 
tempo medio di aumento della pressione inferiore o uguale al 
tempo medio di aumento della pressione di una miscela 1:1, 
per massa, di acido nitrico acquoso al 65 % (p/p) e cellulosa.  
Allo scopo di evitare un risultato falso positivo, in sede di interpre ­
tazione dei risultati occorre, se necessario, tenere conto anche dei risultati ottenuti testando la sostanza con un materiale inerte.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 152  
( 1 ) Vedi voce bibliografica 1 per l'interpretazione dei risultati in base alla normativa ONU 
sui trasporti con varie sostanze di riferimento.
 4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Ma ­
nual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test 
for oxidizing liquids.
 
Figura 1  
Recipiente a pressione
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 153
 
Figura 2  
Base d'appoggio
  
Figura 3  
Sistema di accensione
  
Nota: entrambe queste configurazioni possono essere utilizzate.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 154
 
A.22.  DIAMETRO GEOMETRICO MEDIO DELLE FIBRE 
PONDERATO RISPETTO ALLA LUNGHEZZA  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo descrive una procedura che permette di misurare 
il diametro medio geometrico ponderato rispetto alla lunghezza 
(DMGPL) di fibre minerali artificiali (FMA). Poiché il DMGPL della popolazione ha una probabilità del 95 % di essere compreso nei limiti di confidenza al 95 % (DMGPL ± due errori standard) del 
campione, il valore riportato (valore di prova) costituirà il limite 
inferiore di confidenza al 95 % del campione (cioè DMGPL — 2 errori standard). Il presente metodo si basa sull’aggiornamento di una bozza (del giugno 1994) di procedura concordata tra industria e HSE 
approvata nel corso di una riunione tra la ECFIA e la HSE a Chester 
il 26 settembre 1993 e sviluppata per e sulla base di un secondo confronto interlaboratoriale (1, 2). Questo metodo di misurazione può essere utilizzato per caratterizzare il diametro delle fibre di 
sostanze in massa o di prodotti contenenti FMA, comprese fibre 
ceramiche refrattarie (FCR), fibre vetrose artificiali (FVA) e fibre cristalline e policristalline.
 
La ponderazione in base alla lunghezza permette di compensare gli 
effetti sulla distribuzione del diametro dovuti alla rottura delle fibre lunghe durante il campionamento o la manipolazione del materiale. Per misurare la distribuzione dei diametri delle FMA sono utilizzate 
statistiche geometriche (media geometrica), giacché tali diametri 
hanno una distribuzione prossima alla distribuzione lognormale.
 
La misurazione della lunghezza e del diametro è un'operazione no ­
iosa e lunga ma, se sono misurate solo le fibre in contatto con una 
linea infinitamente sottile del campo di visione del microscopio elet ­
tronico a scansione (SEM), la probabilità di selezionare una deter ­
minata fibra è proporzionale alla sua lunghezza. Poiché questo me ­
todo tiene conto della lunghezza nei calcoli di ponderazione in base 
alla lunghezza, l’unica misurazione necessaria è quella del diametro, 
mentre il DMGPL-2ES può essere calcolato come descritto.  
1.2. DEFINIZIONI  
Particella : Oggetto il cui rapporto lunghezza/larghezza è in ­
feriore a 3:1.  
Fibra : Oggetto il cui rapporto lunghezza/larghezza (rapporto di al ­
lungamento) è di almeno 3:1.  
1.3. SCOPO E LIMITAZIONI  
Questo metodo è inteso ad esaminare la distribuzione dei diametri 
aventi un valore mediano compreso tra 0,5 e 6 μm. I diametri su ­
periori possono essere misurati utilizzando ingrandimenti inferiori del 
SEM, ma questo metodo tende ad essere sempre più limitato man mano che la distribuzione dimensionale delle fibre diventa più fine. Per contro, se il diametro mediano è inferiore a 0,5 μm si racco ­
manda di eseguire le misurazioni con un microscopio elettronico a 
trasmissione (MET).
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 155
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
Un certo numero di campioni rappresentativi sono prelevati da un 
materassino (o feltro) di fibre oppure da fibre sciolte in massa. La lunghezza delle fibre in massa è ridotta per compressione, quindi un 
subcampione rappresentativo è disperso in acqua. Ne vengono 
estratte delle aliquote, che sono filtrate tramite un filtro in policar ­
bonato con pori di 0,2 μm, prima di essere preparate per l'esame con 
la tecnica di microscopia elettronica a scansione (SEM). I diametri 
delle fibre sono misurati con un ingrandimento dello schermo di 
10 000 × o maggiore (
 1 ) utilizzando il metodo della linea trasversale, 
in modo da ottenere una stima non distorta del diametro medio. 
L'intervallo inferiore di confidenza al 95 % (sulla base di un test 
unilaterale) è calcolato per ottenere una stima del valore minimo del diametro medio geometrico delle fibre del materiale.
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.5.1.  Sicurezza/precauzioni  
L'esposizione del personale alle fibre in sospensione nell'atmosfera 
deve essere ridotta al minimo, e devono essere utilizzate una cappa d'aspirazione o un  glove box  in occasione della manipolazione delle 
fibre allo stato secco. Per determinare l'efficacia dei metodi di con ­
trollo dovranno essere eseguiti controlli periodici dell'esposizione del 
personale. In occasione della manipolazione delle FMA, il personale dovrà indossare guanti monouso per ridurre i rischi d'irritazione cutanea ed evitare qualsiasi contaminazione incrociata.
 
1.5.2.  Apparecchiatura/attrezzatura  
— Presse e matrici (capaci di produrre 10 MPa).  
— Filtri in policarbonato a pori capillari di 0,2 μm (25 mm di 
diametro).  
— Filtro a membrana in esteri misti di cellulosa (EMC) con porosità 
di 5 μm da utilizzare come filtro di supporto.  
— Apparecchio di filtrazione in vetro (o sistemi di filtrazione mo ­
nouso) disegnati per filtri di 25 mm di diametro (per esempio, kit 
di micro-analisi in vetro Millipore n. XX10 025 00).  
— Acqua distillata di recente e filtrata attraverso un filtro con po ­
rosità di 0,2 μm per eliminare i microrganismi.  
— Sistema di ricoprimento tramite bombardamento catodico ( sputter 
coater ) con sorgente in oro o oro/palladio.  
— Microscopio elettronico a scansione con una risoluzione che può 
scendere fino a 10 nm ed un ingrandimento 10 000 ×.  
— Varie: spatole, lama di bisturi di tipo 24, piccole pinze, supporti 
(stubs ) per SEM, adesivo o nastro adesivo al carbonio, argento 
colloidale.  
— Sonda ultrasonica o bagno a ultrasuoni da laboratorio  
— Una sonda di carotaggio, per prelevare campioni nei materassini 
(o feltri) di FMA  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 156  
( 1 ) questo valore d’ingrandimento è indicato per le fibre con diametri intorno a 3 μm. Per le 
fibre con diametro di 6 μm può essere più adatto un ingrandimento di 5 000 ×.
 1.5.3.  Procedura  
1.5.3.1.  Campionamento  
Per materassini o feltri, si utilizza una sonda di carotaggio da 25 mm 
per prelevare campioni dall’intero spessore. I prelievi devono essere 
effettuati ad intervalli uguali su tutta l’ampiezza di una porzione 
ridotta di tessuto o in zone scelte in modo casuale, se sono dispo ­
nibili materiali di maggiore lunghezza. La stessa attrezzatura può essere utilizzata per estrarre campioni casuali dalle fibre sciolte. 
Ove possibile, dovrebbero essere prelevati sei campioni in modo 
da riflettere le variazioni spaziali nel materiale in massa.
 
I sei campioni devono essere compressi in una pressa da 50 mm di 
diametro ad una pressione di 10 MPa. Il materiale viene successiva ­
mente mescolato con una spatola e compresso di nuovo a 10 MPa. Quindi il materiale viene tolto dalla pressa e conservato in una 
bottiglia in vetro a chiusura ermetica.
 
1.5.3.2.  Preparazione del campione  
Se necessario, i leganti organici possono essere eliminati mettendo il 
campione in muffola a 450 °C per circa un'ora.  
Utilizzare sistemi di partizione e quartatura per suddividere il cam ­
pione (l'operazione deve essere realizzata all'interno di una cappa aspirante per polveri).
 
Con una spatola, aggiungere una piccola quantità (< 0,5 g) di cam ­
pione a 100 ml di acqua distillata di recente e filtrata per mezzo di 
un filtro a membrana da 0,2 μm (può essere utilizzata acqua ultra ­
pura di diversa origine, a condizione che sia di qualità soddisfacen ­
te). Disperdere accuratamente con una sonda ultrasonica a 100 W, regolata in modo da produrre cavitazione. (Se non si dispone di 
sonda, si utilizzi il metodo seguente: agitare ed invertire ripetuta ­
mente per 30 secondi; sottoporre ad ultrasuoni in un bagno ad ul ­
trasuoni da laboratorio per cinque minuti: quindi agitare e invertire ripetutamente per altri 30 secondi).
 
Immediatamente dopo la dispersione delle fibre, prelevare un certo 
numero di aliquote (per esempio, tre aliquote di 3, 6 e 10 ml) per mezzo di una pipetta ad imboccatura larga (capacità di 2-5 ml).
 
Filtrare sotto vuoto ciascuna aliquota per mezzo di un filtro in po ­
licarbonato da 0,2 μm sostenuto da un filtro di supporto in EMC con 
porosità di 5 μm, utilizzando un imbuto di filtrazione in vetro da 
25 mm con un serbatoio cilindrico. Porre circa 5 ml d'acqua distillata filtrata nell'imbuto e inserire lentamente nell'acqua le aliquote con l’aiuto di una pipetta, tenendo la punta della pipetta di sotto del 
menisco. La pipetta ed il serbatoio devono essere accuratamente 
puliti dopo l’utilizzo giacché le fibre più fini tendono ad aderire di più sulle superfici.
 
Rimuovere delicatamente il filtro e separarlo dal filtro di supporto 
prima di metterlo ad asciugare in un contenitore.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 157
 
Operando con movimento rotatorio, tagliare una sezione pari alla 
metà o a un quarto del deposito filtrato con una lama di bisturi di 
tipo 24. Fissare accuratamente la sezione tagliata sullo stub per il SEM mediante dischetto adesivo al carbonio o collante al carbonio. L’argento colloidale deve essere applicato almeno in tre punti per 
migliorare il contatto elettrico tra i bordi del filtro e lo stub. Quando 
l'adesivo/l’argento colloidale è asciutto, ricoprire la superficie del deposito per mezzo dello  sputter coater  con uno strato di circa 
50 nm d'oro o d'oro/palladio.
 
1.5.3.3.  Taratura e funzionamento del SEM  
1.5.3.3.1. T a r a t u r a  
La taratura del SEM deve essere verificata almeno una volta alla 
settimana (idealmente una volta al giorno) per mezzo di una griglia 
di taratura certificata. I valori della taratura devono essere confrontati con uno standard certificato e se il valore misurato (SEM) non rientra entro ± 2 % del valore certificato, la taratura con il SEM 
deve essere aggiustata e ricontrollata.
 
Il SEM deve essere in grado di fornire una risoluzione tale da 
rendere visibile almeno un diametro minimo di 0,2 μm, utilizzando 
un campione in matrice reale con un ingrandimento di 2 000 ×.  
1.5.3.3.2. M o d a l i t à o p e r a t i v e  
Il SEM deve essere utilizzato con un ingrandimento di 10 000 (  1 ) in 
condizioni che offrono una buona risoluzione ed un'immagine accet ­
tabile a velocità di scansione ridotta (per esempio, 5 secondi per 
schermo). Benché le condizioni operative possano variare da un SEM all’altro, per ottenere la migliore visibilità e risoluzione possi ­
bile con materiali di peso atomico relativamente basso, occorre uti ­
lizzare in generale tensioni d'accelerazione di 5-10 keV con una dimensione dello spot ridotta ed una distanza minima. Quando si applica il metodo della linea trasversale, occorre utilizzare un tilt 
di 0
 o per ridurre al minimo la necessità di rimessa a fuoco o, se il 
SEM ha una base eucentrica, utilizzare la distanza di lavoro eucen ­
trica. Un ingrandimento inferiore può essere utilizzato se il materiale non contiene fibre di piccolo diametro ma fibre con diametri più 
grandi (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Misurazione  
1.5.3.4.1. E s a m e a d e b o l e i n g r a n d i m e n t o p e r v a l u t a r e i l 
c a m p i o n e  
Inizialmente, il campione deve essere esaminato con un debole in ­
grandimento per verificare l’esistenza di agglomerati di grandi fibre e per determinare la densità delle fibre.
 
In caso di eccessiva agglomerazione, si raccomanda di preparare un 
nuovo campione. Per garantire l'accuratezza delle statistiche, occorre misurare un numero minimo di fibre. È preferibile una densità ele ­
vata di fibre, giacché l'esame di campi vuoti richiede tempo e non 
contribuisce all'analisi. Tuttavia, se il filtro è sovraccarico, può di ­
ventare difficile dimensionare tutte le fibre misurabili. Inoltre, le fibre più piccole potrebbero passare inosservate perché nascoste da 
quelle più grandi.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 158  
( 1 ) Per fibre da 3 μm, cfr. la nota precedente.
 Una densità delle fibre superiore a 150 fibre per millimetro lineare 
trasversale può comportare una sopravvalutazione del DMGPL. D'al ­
tra parte, basse concentrazioni di fibre aumentano il tempo d'analisi. È inoltre spesso più efficiente in termine di costi preparare un cam ­
pione di una densità vicina al valore ottimale, piuttosto che contare 
filtri a bassa concentrazione. La densità di fibre ottimale deve corri ­
spondere ad una media di circa una o due fibre conteggiabili per campo visivo ad un ingrandimento di 5 000 ×. Tuttavia, poiché la densità ottimale dipende dalla dimensione (diametro) delle fibre, 
l'operatore dovrà decidere in base alla propria esperienza se la den ­
sità delle fibre è vicina al valore ottimale.
 
1.5.3.4.2. P o n d e r a z i o n e i n b a s e a l l a l u n g h e z z a d e i d i a m e t r i 
d e l l e f i b r e  
Solo le fibre che toccano (o attraversano) una linea (infinitamente) 
sottile tracciata sullo schermo del SEM sono contate. Per questo 
motivo viene tracciata una linea orizzontale (o verticale) attraverso 
il centro dello schermo.  
In alternativa, si può fissare un unico punto al centro dello schermo e 
procedere ad una scansione continua in una sola direzione attraverso il filtro. Si misura e registra il diametro di qualsiasi fibra il cui 
rapporto tra lunghezza e diametro è superiore a 3:1 e che tocca o 
incrocia tale punto.
 
1.5.3.4.3. M i s u r a z i o n e d e l l e f i b r e  
Si raccomanda di misurare almeno 300 fibre. Ogni fibra è misurata 
una sola volta, nel punto d'intersezione con la linea o con il punto 
tracciato sullo schermo (o vicino al punto d'intersezione se i bordi 
della fibra sono nascosti). Se sono presenti fibre di sezione variabile, deve essere utilizzata una misura rappresentativa del diametro medio della fibra. Si dovrà prestare la massima cura nella definizione del 
bordo e nella misurazione della distanza più breve tra i bordi delle 
fibre. La misura può essere fatta direttamente o su immagini o foto ­
grafie registrate. Si raccomanda di utilizzare sistemi di misura d'im ­
magine semiautomatici che trasferiscono direttamente i dati in un 
foglio di calcolo, giacché tale procedimento permette di guadagnare 
tempo, di evitare errori di trascrizione e di automatizzare i calcoli.
 
Le estremità delle fibre lunghe devono essere verificate con un in ­
grandimento più debole per assicurare che non ritornino nel campo di visione in cui è effettuata la misurazione e che siano misurate una 
sola volta.
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
In generale, i diametri delle fibre non hanno una distribuzione nor ­
male. È tuttavia possibile ottenere una distribuzione che si avvicina a quella normale effettuando una trasformazione logaritmica.
 
Calcolare la media aritmetica (media lnD) e la deviazione standard 
(DS  lnD ) dei valori logaritmici in base  e (lnD) dei diametri (D) delle n 
fibre. 
media lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
Σ ðlnD – media lnDÞ 2 
n–1 s 
(2) 
La deviazione standard è divisa per la radice quadrata del numero di 
misurazioni effettuate (n) per ottenere l’errore standard (ES  lnD ). 
ES lnD ¼ DS 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Sottrarre due volte l’errore standard dalla media e calcolare l'espo ­
nenziale di questo valore (media meno due errori standard) per ot ­
tenere la media geometrica meno due errori standard geometrici. 
DMGOPL – 2ES ¼ e ðmedia lnD – 2ES  lnd Þ (4) 
3. RELAZIONE SULL’ESECUZIONE DELLA PROVA  
RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova conterrà almeno le informazioni seguenti:  
— Il valore del DMGPL -2ES.  
— Tutte le eventuali modifiche procedurali, in particolare quelle che 
rischiano di influire sulla precisione e l'affidabilità dei risultati, 
nonché le relative giustificazioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett e G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Re ­
sults of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 160
 
A.23.  COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (1-OTTANOLO/ACQUA): 
METODO DELL’AGITAZIONE LENTA  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove 
sulle sostanze chimiche n. 123 (2006). Il metodo dell’agitazione lenta ha 
permesso di determinare con esattezza valori logaritmici del coefficiente di 
ripartizione 1-ottanolo/acqua (P  OW ) fino a 8,2 (1). Costituisce pertanto un 
approccio sperimentale adeguato per la determinazione diretta del P  OW di 
sostanze fortemente idrofobiche.  
2. Tra gli altri metodi per la determinazione del coefficiente di ripartizione 1- 
ottanolo/acqua (P  OW ) si annoverano il metodo «dell’agitazione in bottiglia» 
(shake flask) (2) e la determinazione del P  OW dal comportamento di riten ­
zione nell’HPCL (cromatografia liquida ad alta prestazione) a fase inversa (3). Il metodo «dell’agitazione in bottiglia» tende a falsare i risultati a causa 
del trasferimento di microgoccioline di ottanolo nella fase acquosa. Con 
l’aumento dei valori del P
 OW , la presenza di queste goccioline nella fase 
acquosa porta ad una crescente sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. L’applicazione di questo metodo è pertanto 
limitata alle sostanze con log P
 OW < 4. Il secondo metodo si basa su valori 
affidabili di P  OW determinati direttamente per calibrare la relazione tra il 
comportamento di ritenzione nell’HPLC e i valori P  OW misurati. Esisteva un 
progetto di linea guida OCSE per determinare i coefficienti di ripartizione 1- 
ottanolo/acqua di sostanze ionizzabili (4) che tuttavia è stato abbandonato.  
3. Il presente metodo di prova è stato messo a punto nei Paesi Bassi. La 
precisione dei metodi descritti è stata validata e ottimizzata nel corso di uno studio di validazione interlaboratorio (ring test) al quale hanno parteci ­
pato 15 laboratori (5).
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
Significato e utilizzo  
4. Nel caso di sostanze organiche inerti, sono state individuate relazioni molto 
significative tra i coefficienti di ripartizione 1-ottanolo/acqua (P  OW ) e il 
bioaccumulo di queste sostanze nei pesci. Inoltre, è stata anche dimostrata una correlazione tra il P
 OW e, da un lato, la tossicità per i pesci e, dall’altro, 
l’assorbimento di sostanze chimiche nei solidi, come suoli e sedimenti Il 
riferimento bibliografico (6) contiene un’ampia panoramica di queste rela ­
zioni.  
5. È stata accertata l’esistenza di una vasta gamma di relazioni tra il coeffi ­
ciente di ripartizione 1-ottanolo/acqua e altre proprietà delle sostanze, di 
interesse per la chimica e la tossicologia ambientali. Il coefficiente di ripar ­
tizione 1-ottanolo/acqua è pertanto diventato un parametro fondamentale ai fini della valutazione del rischio ambientale delle sostanze chimiche e della 
previsione del destino di tali sostanze nell’ambiente.
 
Ambito di applicazione  
6. Si ritiene che il metodo dell’agitazione lenta riduca la formazione di mi ­
crogoccioline dalle goccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa; di conse ­
guenza non si verifica la sovrastimazione della concentrazione in fase ac ­
quosa dovuta all’associazione di molecole della sostanza di prova a queste goccioline. Il metodo dell’agitazione lenta si presta in particolare alla deter ­
minazione del P
 OW di sostanze con log P  OW previsto uguale o superiore a 5, 
per le quali il metodo dell’agitazione in bottiglia (2) tende a fornire risultati 
erronei.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 161
 
DEFINIZIONI E UNITÀ  
7. Il coefficiente di ripartizione di una sostanza tra l’acqua e un solvente 
lipofilo (1-ottanolo) caratterizza la distribuzione in equilibrio della sostanza chimica tra le due fasi. Il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (P
 OW ) 
è definito come il rapporto tra la concentrazione in equilibrio della sostanza 
in esame in 1-ottanolo saturato con acqua (C  O ) e la concentrazione in 
equilibrio della sostanza in esame in acqua saturata con 1-ottanolo (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
In quanto rapporto tra due concentrazioni si tratta di un valore adimensio ­
nale. Generalmente è espresso con il suo logaritmo decimale (log P  OW ). 
Visto che il P  OW dipende dalla temperatura, la relazione sulla prova dovrà 
precisare la temperatura delle determinazioni.  
PRINCIPIO DEL METODO  
8. Al fine di determinare il coefficiente di ripartizione, l’acqua, l’1-ottanolo e la 
sostanza in esame devono essere portati in equilibrio tra loro a temperatura costante. Si procede successivamente a misurare le concentrazioni della 
sostanza in esame nelle due fasi.
 
9. Il metodo dell’agitazione lenta proposto permette di ridurre le difficoltà 
sperimentali associate alla formazione di microgoccioline che si verificano 
nel metodo dell’agitazione in bottiglia. Con il metodo dell’agitazione lenta, l’acqua, l’1-ottanolo e la sostanza in esame si equilibrano in un reattore termostatato sottoposto ad agitazione. Gli scambi tra le fasi sono accelerati 
dall’agitazione. Quest’ultima produce una leggera turbolenza che favorisce 
gli scambi tra 1-ottanolo e acqua senza provocare la formazione di micro ­
goccioline (1).
 
APPLICABILITÀ DELLA PROVA  
10. Dato che la presenza di sostanze diverse dalla sostanza in esame potrebbe 
influenzare il coefficiente di attività di quest’ultima, essa deve essere testata allo stato puro. Ai fini della determinazione del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua occorre utilizzare una sostanza che presenti il grado di 
purezza più elevato disponibile in commercio.
 
11. Il presente metodo si applica alle sostanze pure che non si dissociano né si 
associano e che non manifestano un’attività interfacciale significativa. Può 
essere utilizzato per determinare il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/ac ­
qua di tali sostanze e delle relative miscele. In quest’ultimo caso, i coeffi ­
cienti di ripartizione ottenuti variano in funzione della composizione chimica 
della miscela in esame e della composizione elettrolitica della fase acquosa. 
Adottando alcune misure supplementari, il metodo può essere applicato anche a sostanze che si dissociano o si associano (paragrafo 12).
 
12. A motivo della molteplicità di equilibri dell’acqua e dell’1-ottanolo presenti 
nella ripartizione 1-ottanolo/acqua delle sostanze dissociabili, come acidi organici e fenoli, basi organiche e composti organometallici, il coefficiente 
di ripartizione 1-ottanolo/acqua è una costante fortemente dipendente dalla 
composizione elettrolitica (7) (8). Ai fini della determinazione di questo coefficiente, è necessario controllare il pH e la composizione elettrolitica, i cui valori devono essere riportati nella relazione sulla prova. La valuta ­
zione di questi coefficienti di ripartizione deve essere effettuata da specialisti 
(«giudizio esperto»). Utilizzando i valori delle costanti di dissociazione, occorre scegliere valori di pH adeguati in modo da stabilire un coefficiente di ripartizione per ciascuno stato di ionizzazione. I composti organometallici 
devono essere testati usando tamponi non complessanti (8). Alla luce delle 
conoscenze attuali in materia di chimica in fase acquosa (costanti di com ­
plessazione e di dissociazione), le condizioni sperimentali devono essere scelte in modo da poter stimare la speciazione della sostanza in esame in 
fase acquosa. La forza ionica deve essere identica in tutti gli esperimenti, 
grazie all’utilizzo di un elettrolita di fondo.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 162
 
13. Le sostanze con bassa idrosolubilità o un elevato valore P  OW possono creare 
problemi in quanto le loro concentrazioni in acqua sono talmente deboli che 
diventa difficile determinarle con esattezza. Il presente metodo di prova fornisce indicazioni su come risolvere questo problema.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
14. Il livello di purezza dei reagenti chimici deve corrispondere almeno al grado 
analitico. Si raccomanda di utilizzare sostanze non marcate, di composizione 
chimica nota e di purezza pari almeno al 99 % o sostanze radiomarcate di composizione chimica e purezza radiochimica note. Nel caso di traccianti radioattivi a breve emivita, occorre applicare correzioni a fronte della de ­
gradazione. Se la sostanza in esame è radiomarcata, occorre usare un me ­
todo analitico specifico, in modo che la radioattività misurata sia correlata direttamente alla sostanza in esame.
 
15. La stima del valore log v può essere ottenuta utilizzando gli appositi soft ­
ware venduti in commercio, o basandosi sul rapporto tra le solubilità in entrambi i solventi.
 
16. Prima di applicare il metodo dell’agitazione lenta per la determinazione del 
P OW , occorre disporre delle seguenti informazioni sulla sostanza in esame:  
a) formula strutturale;  
b) metodi analitici adeguati per la determinazione della concentrazione della 
sostanza in acqua e in 1-ottanolo;  
c) costante o costanti di dissociazione di sostanze ionizzabili (Linea guida 
OCSE n. 112) (9);  
d) idrosolubilità (10);  
e) idrolisi abiotica (11);  
f) pronta biodegradabilità (12);  
g) tensione di vapore (13).  
DESCRIZIONE DEL METODO  
Materiale e apparecchiatura  
17. L’esperimento richiede un’apparecchiatura standard di laboratorio, in parti ­
colare:  
— agitatori magnetici e bacchette di agitazione magnetiche rivestite di Te ­
flon per agitare la fase acquosa,  
— strumenti analitici che permettono di determinare la concentrazione della 
sostanza in esame alle concentrazioni previste,  
— un agitatore dotato di rubinetto alla base. In funzione della stima del log 
P OW e del limite di rivelabilità ( Limit of Detection  — LOD) della 
sostanza in esame, occorre considerare l’utilizzo di un recipiente di 
reazione con la medesima geometria ma di volume superiore ad un litro, in modo da ottenere un volume di acqua sufficiente per l’estrazione e 
l’analisi chimiche. La concentrazione della sostanza in esame 
nell’estratto acquoso sarà pertanto più elevata, rendendo così più affida ­
bile la determinazione analitica. All’appendice 1 figura una tabella che riporta le stime del volume minimo necessario, il LOD del composto, la 
stima del valore log P
 OW e l’idrosolubilità del composto. La tabella si 
basa sulla relazione tra il log P  OW e il rapporto tra le solubilità in 
ottanolo e in acqua, secondo Pinsuwan et al. (14):  
log P  OW ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 163
 
dove:  
SR ¼ S oct=S w (concentrazione molare),  
e sulla relazione presentata da Lyman (15) per la stima dell’idrosolubi ­
lità. Le idrosolubilità calcolate con l’equazione riportata nell’appendice 1 
sono da considerarsi come una prima stima. Occorre rilevare che l’uti ­
lizzatore è libero di determinare l’idrosolubilità mediante qualsiasi altro rapporto che si ritenga rappresenti meglio il rapporto tra idrofobicità e 
solubilità. Per i composti solidi, ad esempio, si raccomanda di includere 
il punto di fusione nella previsione della solubilità. Se si utilizza un’equazione modificata, occorre accertarsi che l’equazione per il cal ­
colo della solubilità in ottanolo sia tuttora valida. L’appendice 2 riporta 
una rappresentazione schematica di un agitatore con rivestimento esterno 
in vetro, di capacità di circa un litro. Le proporzioni del contenitore rappresentato nell’appendice 2 si sono dimostrate ottimali e devono essere mantenute qualora si utilizzi un apparecchiatura di dimensioni 
diverse,
 
— è indispensabile disporre di un dispositivo per mantenere costante la 
temperatura durante l’esperimento di agitazione lenta.  
18. I recipienti devono essere in materiale inerte in modo che l’adsorbimento 
sulle loro superfici sia trascurabile.  
Preparazione delle soluzioni di prova  
19. La determinazione del P  OW deve essere eseguita utilizzando 1-ottanolo della 
qualità più pura disponibile in commercio (grado di purezza minima di 
99 %). Si raccomanda di purificare la soluzione mediante estrazione acida, basica e con acqua, seguita da essiccazione. L’1-ottanolo può, inoltre, essere purificato per distillazione. Le soluzioni standard delle sostanze in esame 
devono essere preparate con 1-ottanolo purificato. L’acqua usata per la 
determinazione del P
 OW deve essere distillata in apparecchi di vetro o quar ­
zo, o trattata con un sistema di purificazione o di qualità HPLC. La fil ­
trazione dell’acqua distillata deve essere eseguita mediante filtro di 0,22 μm; 
è altresì necessario prevedere delle prove in bianco per assicurarsi che gli 
estratti concentrati non contengano impurità che possano interferire con la sostanza in esame. Se si usa un filtro in fibra di vetro, occorre pulirlo lasciandolo almeno tre ore in un forno a 400 °C.
 
20. Entrambi i solventi devono essere reciprocamente saturati prima dell’espe ­
rimento, portandoli all’equilibrio in un recipiente sufficientemente grande. A tal fine occorre sottoporre il sistema a due fasi di agitazione lenta per due 
giorni.
 
21. Selezionare un’adeguata concentrazione della sostanza in esame e scioglierla 
in 1-ottanolo (saturato con acqua). È necessario determinare il coefficiente di 
ripartizione in soluzioni diluite in 1-ottanolo e acqua. Pertanto la concen ­
trazione della sostanza di prova non deve superare il 70 % della sua solu ­
bilità con una concentrazione massima di 0,1 M in ciascuna fase (1). Le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento devono essere prive della 
sostanza in esame in sospensione allo stato solido.
 
22. Sciogliere la quantità adeguata di sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato 
con acqua). Se la stima del valore logaritmico di P  OW è superiore a 5, ci si 
deve assicurare che le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento 
non contengano la sostanza in esame in sospensione allo stato solido. A tale fine, si esegue la procedura seguente per le sostanze chimiche il cui valore stimato di log P
 OW è > 5:  
— si scioglie la sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato con acqua),  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 164
 
— si lascia riposare la soluzione sufficientemente a lungo perché la so ­
stanza solida sospesa si depositi. Durante la decantazione, la concentra ­
zione della sostanza in esame è monitorata,  
— una volta che le concentrazioni misurate nella soluzione di 1-ottanolo 
hanno raggiunto un valore stabile, si diluisce la soluzione madre con un volume adeguato di 1-ottanolo,
 
— si misura la concentrazione della soluzione madre diluita. Se la concen ­
trazione misurata è coerente con la diluizione, la soluzione madre diluita 
può essere utilizzata nell’esperimento ad agitazione lenta.  
Estrazione e analisi di campioni  
23. L’analisi della sostanza in esame è effettuata mediante un metodo analitico 
convalidato. I ricercatori devono dimostrare che, durante la prova, le con ­
centrazioni nella fase di 1-ottanolo saturato con l’acqua e in fase acquosa saturata con 1-ottanolo sono superiori al limite di quantificazione del metodo 
analitico usato. Occorre stabilire prima dell’esperimento i recuperi analitici 
mediante analisi della sostanza in esame in fase acquosa e in fase 1-ottanolo, laddove siano necessari metodi di estrazione. Il segnale analitico deve essere 
corretto per tenere conto delle prove in bianco e si provvederà ad evitare 
qualsiasi trasferimento dell’analita da un campione all’altro.
 
24. Prima dell’analisi, in caso di basse concentrazioni delle sostanze di prova 
idrofobiche in fase acquosa, sarà probabilmente necessario estrarre la fase acquosa mediante un solvente organico e preconcentrare l’estratto. Per la 
stessa ragione, è necessario ridurre le concentrazioni delle eventuali prove in 
bianco. A tale scopo, si devono utilizzare solventi di estrema purezza, preferibilmente solventi utilizzati per l’analisi dei residui. Inoltre, una pulizia accurata (ad esempio lavaggio con solvente o essiccazione a temperatura 
elevata) degli strumenti in vetro prima dell’esperimento può diminuire il 
rischio di contaminazione incrociata.
 
25. È possibile ottenere una stima del log P  OW con un apposito programma o 
ricorrendo al parere di uno specialista. Se il suo valore è superiore a sei, è necessario prestare molta attenzione alle correzioni in funzione dei bianchi e 
ai trasferimenti dell’analita da un campione all’altro. D’altro canto, se il log 
P
 OW è superiore a 6, è obbligatorio uno standard surrogato per correggere il 
tasso di recupero, in modo da ottenere fattori di preconcentrazione elevati. Esistono in commercio diversi programmi software per il calcolo della stima 
del log P
 OW ad esempio, Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) e ACD 
log P (19) (  1 ). I riferimenti bibliografici (da 20 a 22) descrivono i vari 
metodi di stima.  
26. I limiti di quantificazione (limits of quantification — LOQ) della sostanza in 
esame in 1-ottanolo e in acqua sono stabiliti secondo metodi riconosciuti. 
Come principio di base, il limite di quantificazione di un metodo corri ­
sponde alla concentrazione in acqua o in 1-ottanolo che produce un rapporto segnale-disturbo pari a dieci. Occorre scegliere metodi di estrazione e di 
preconcentrazione adeguati e precisare i recuperi analitici. Occorre scegliere 
un fattore di preconcentrazione adeguato che produca un segnale dell’inten ­
sità richiesta nel corso della determinazione analitica.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 165  
( 1 ) Questa informazione è fornita soltanto a titolo indicativo. Possono essere utilizzati altri 
software equivalenti se è dimostrato che producono gli stessi risultati.
 27. In funzione dei parametri del metodo analitico e delle concentrazioni previ ­
ste, si stabilisce il volume approssimativo del campione che permetterà 
un’accurata determinazione della concentrazione della sostanza. Per ottenere un segnale analitico sufficiente, è opportuno non utilizzare campioni di acqua troppo esigui. D’altro canto, i campioni di acqua non devono neanche 
essere troppo grandi, poiché il volume di acqua restante rischia di essere 
insufficiente per il numero minimo di analisi necessario (n = 5). Nell’ap ­
pendice 1 sono riportati i volumi minimi dei campioni in funzione del volume del recipiente, il limite di quantificazione della sostanza in esame 
e la sua solubilità.
 
28. La quantificazione delle sostanze di prova si effettua per confronto con le 
curve di calibrazione dei loro composti. Le concentrazioni nei campioni analizzati devono essere comprese tra le concentrazioni degli standard.
 
29. Per le sostanze in esame il cui log P  OW stimato è superiore a sei, occorre 
aggiungere uno standard surrogato nel campione di acqua prima dell’estra ­
zione per rilevare le perdite che si verificano durante l’estrazione e la 
preconcentrazione dei campioni di acqua. Affinché la correzione del recu ­
pero sia accurata, gli standard surrogati devono avere proprietà molto simili o identiche a quelle della sostanza in esame. A tale scopo, si utilizzano preferibilmente analoghi marcati con isotopi (stabili) della sostanza di prova 
(perdeuterati o marcati
 13 C, ad esempio). Se l’utilizzo di analoghi marcati 
con isotopi stabili (  13 C o  2 H) risulta impossibile, si deve dimostrare, basan ­
dosi su dati affidabili tratti da pubblicazioni, che le proprietà fisico-chimiche dello standard surrogato sono molto vicine a quelle della sostanza in esame. 
Nel corso dell’estrazione liquido-liquido della fase acquosa possono for ­
marsi emulsioni, che possono essere ridotte con l’aggiunta di sale e la ­
sciando decantare l’emulsione tutta la notte. I metodi utilizzati per estrarre e preconcentrare i campioni devono essere riportati nella relazione sulla 
prova.
 
30. Prima di essere analizzati, i campioni prelevati dalla fase 1-ottanolo posso ­
no, se necessario, essere diluiti con un adeguato solvente. Inoltre, si racco ­
manda l’utilizzo di standard surrogati per correggere il tasso di recupero per 
le sostanze che hanno evidenziato un grado di variazione elevato nel corso 
delle prove di recupero (deviazione standard relativa > 10 %).  
31. La relazione sulla prova dovrà contenere i dettagli del metodo analitico, e 
includere: il metodo di estrazione, i fattori di preconcentrazione e di dilui ­
zione, i parametri degli strumenti, il processo di calibrazione, l’intervallo di calibrazione, il recupero analitico della sostanza in esame dall’acqua, l’ag ­
giunta di standard surrogati per correggere il tasso di recupero, i valori delle 
prove in bianco, i limiti di rivelabilità e i limiti di quantificazione.
 
Esecuzione della prova  
Rapporti volumetrici ottimali 1-ottanolo/acqua  
32. La scelta dei volumi di acqua e di 1-ottanolo deve avvenire in funzione 
degli elementi seguenti: il limite di quantificazione in 1-ottanolo e in acqua, 
i fattori di preconcentrazione applicati ai campioni di acqua, i volumi di campionamento prelevati in 1-ottanolo e in acqua nonché le concentrazioni previste. Per ragioni sperimentali, il volume di 1-ottanolo nel metodo 
dell’agitazione lenta deve essere scelto in modo che lo strato di 1-ottanolo 
sia sufficientemente spesso (> 0,5 cm) da non risultare alterato dopo un campionamento della fase 1-ottanolo.
 
33. Per determinare i composti il cui log P  OW è uguale o superiore a 4,5, il 
rapporto tra i volumi di ciascuna fase abitualmente utilizzati sono da 20 a 50 
ml di 1-ottanolo e da 950 a 980 ml di acqua in un recipiente da un litro.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 166
 
Condizioni sperimentali  
34. Durante la prova, al recipiente di reazione è applicato un termostato in modo 
da limitare la variazione di temperatura a meno di 1 °C. La prova deve essere effettuata a 25 °C.
 
35. Il sistema sperimentale deve essere protetto dalla luce del giorno, effet ­
tuando la prova in una camera oscura o coprendo il recipiente di reazione 
con un foglio di alluminio.  
36. La prova deve essere effettuata in un ambiente (per quanto possibile) privo 
di polvere.  
37. Il sistema 1-ottanolo/acqua è agitato fino al raggiungimento dell’equilibrio. 
Il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio è valutato in un esperimento pilota effettuando una prova ad agitazione lenta durante la quale l’acqua e 
l’1-ottanolo sono sottoposti periodicamente a campionamento. I campiona ­
menti devono avvenire ad intervalli di almeno cinque ore.
 
38. La determinazione del P  OW deve essere effettuata sulla base di almeno tre 
prove indipendenti di agitazione lenta.  
Determinazione del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio  
39. Si considera che l’equilibrio sia stato raggiunto quando la regressione del 
rapporto delle concentrazioni 1-ottanolo/acqua in funzione del tempo (in un arco temporale che comprende quattro punti) si traduce in una pendenza che non si discosta in modo significativo da zero per un livello p uguale a 0,05. 
Occorre raggiungere l’equilibrio almeno 24 ore prima di poter iniziare il 
campionamento. In linea di massima, il campionamento delle sostanze il cui log P
 OW stimato è < 5 può essere effettuato nel corso del secondo e terzo 
giorno. È possibile che il tempo necessario per giungere all’equilibrio sia più 
lungo per le sostanze maggiormente idrofobiche. Nel caso di una sostanza 
con log P  OW = 8,23 (decaclorobifenile), sono state sufficienti 144 ore per 
raggiungere l’equilibrio. L’equilibrio è valutato mediante una serie di cam ­
pionamenti effettuati dallo stesso recipiente.  
Inizio della prova  
40. All’inizio della prova, riempire il recipiente di reazione con acqua saturata in 
1-ottanolo; attendere quindi che il sistema raggiunga la temperatura termo ­
stata.  
41. Aggiungere con attenzione al recipiente di reazione la quantità voluta di 
sostanza in esame (disciolta nel volume richiesto di 1-ottanolo saturato con 
acqua). Si tratta di un momento critico della prova poiché si deve evitare una miscela turbolenta delle due fasi. A tal fine, la fase 1-ottanolo può essere versata delicatamente con una pipetta sulla parete del contenitore di 
prova, vicino alla superficie dell’acqua. In tal modo scorrerà lungo la parete 
formando una pellicola sopra la fase acquosa. Evitare accuratamente di decantare l’1-ottanolo direttamente nella bottiglia; le gocce di 1-ottanolo non devono cadere direttamente nell’acqua.
 
42. Una volta iniziata la fase di agitazione, aumentare lentamente la velocità. 
Qualora non sia possibile regolare adeguatamente i motori dell’agitatore, si 
consideri il ricorso ad un trasformatore. La velocità di agitazione deve essere 
regolata in modo da creare un vortice nell’interfaccia acqua/1-ottanolo di profondità massima compresa tra 0,5 e 2,5 cm. Occorre diminuire la velocità di agitazione se la profondità del vortice supera 2,5 cm; altrimenti si pos ­
sono formare microgoccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa che determi ­
nano una sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. Sulla base dei risultati di una prova interlaboratorio di convalida (5), si raccomanda di applicare una velocità massima di agitazione di 2,5 
cm. Ciò rappresenta un compromesso che permette di giungere rapidamente 
all’equilibrio pur limitando la formazione di microgoccioline di 1-ottanolo.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 167
 
Prelievo e trattamento dei campioni  
43. Prima di effettuare i prelievi, spegnere l’agitatore e attendere che i liquidi si 
immobilizzino. Una volta effettuato il campionamento, riavviare delicata ­
mente l’agitatore, come sopra descritto, e quindi aumentare progressiva ­
mente la velocità di agitazione.  
44. I campioni di fase acquosa sono prelevati da un rubinetto posto alla base del 
recipiente di reazione. Scartare sempre il volume morto di acqua contenuto nei rubinetti (circa 5 ml per il contenitore illustrato nell’appendice 2). L’ac ­
qua contenuta nei rubinetti non è stata sottoposta ad agitazione e non è 
pertanto in equilibrio con il resto del liquido. Prendere nota del volume 
dei campioni di acqua e, al momento di determinare il bilancio di massa, assicurarsi di tener conto della quantità di sostanza di prova presente nell’ac ­
qua eliminata. Ridurre al minimo le perdite dovute a evaporazione facendo 
scorrere delicatamente l’acqua nell’imbuto separatore in modo da non per ­
turbare lo strato acqua/1-ottanolo.
 
45. I campioni di 1-ottanolo sono ottenuti aspirando una piccola parte (circa 100 
μl) dello strato di 1-ottanolo con una siringa da 100 μl in vetro e metallo, 
evitando accuratamente di agitare l’interfaccia. Prendere nota del volume di liquido prelevato. È sufficiente una piccola quota, dato che il campione di 1- 
ottanolo sarà diluito.
 
46. Si devono evitare i trasferimenti inutili dei campioni. A tal fine è opportuno 
determinare il volume dei campioni mediante analisi gravimetrica. Nel caso 
di campioni di acqua, il volume è determinato mediante la raccolta del campione in un imbuto di separazione che contiene già il volume di solvente 
richiesto.
 
DATI E RELAZIONE  
47. Nel presente metodo di prova il valore P  OW è determinato effettuando tre 
esperimenti ad agitazione lenta (tre unità sperimentali) con il composto in 
esame, in condizioni sperimentali identiche. La regressione utilizzata per 
dimostrare il raggiungimento dell’equilibrio deve basarsi sui risultati di almeno quattro determinazioni C
 O /C W effettuate in momenti consecutivi. 
Ciò consente di calcolare la varianza, come misura dell’incertezza del valore 
medio ottenuto in ciascuna unità sperimentale.  
48. Il P  OW può essere caratterizzato dalla varianza dei dati ottenuti in ciascuna 
unità sperimentale. Tali informazioni sono utilizzate per calcolare il P  OW 
come la media ponderata dei risultati di ciascuna unità sperimentale. A tal 
fine, come coefficiente di ponderazione è utilizzato l’inverso della varianza dei risultati delle unità sperimentali. Di conseguenza, i dati che presentano 
una accentuata variazione (espressa in termini di varianza), e che sono 
pertanto meno affidabili, incideranno in misura minore sul risultato finale rispetto ai dati con varianza limitata.
 
49. La deviazione standard ponderata è calcolata in modo analogo. Caratterizza 
la ripetibilità della misurazione del P  OW . Una deviazione standard ponderata 
con valore basso sta a indicare una ripetibilità elevata della determinazione 
del P  OW in uno stesso laboratorio. L’elaborazione statistica formale dei dati 
è riassunta come illustrato qui di seguito.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 168
 
Trattamento dei risultati  
Dimostrazione del conseguimento dell’equilibrio  
50. Il logaritmo della relazione delle concentrazioni della sostanza in esame in 
1-ottanolo e in acqua (log C  O /C W ) è calcolato per ciascun tempo di prelievo. 
Il raggiungimento dell’equilibrio chimico si dimostra tracciando una curva di questa relazione in funzione del tempo. Una fase di plateau in questo 
tracciato, in corrispondenza di almeno quattro punti consecutivi sull’asse del 
tempo, indica che l’equilibrio è stato raggiunto e che il composto è com ­
pletamente disciolto in 1-ottanolo. In caso contrario, si deve proseguire la prova fino ad ottenere, per quattro punti consecutivi sull’asse del tempo, una 
pendenza non significativamente diversa da zero per un livello p uguale a 
0,05, che dimostra che il log C
 O /C W è indipendente dal tempo.  
Calcolo del log P  OW 
51. Il valore del log P  OW dell’unità sperimentale corrisponde alla media ponde ­
rata del logaritmo C  O /C W per la parte della curva del logaritmo C  O /C W in 
funzione del tempo per la quale è stato dimostrato che l’equilibrio è stato raggiunto. Questa media è calcolata ponderando i dati con l’inverso della varianza, in modo che l’influenza dei dati sul risultato finale sia inversa ­
mente proporzionale alla loro incertezza.
 
Media del log P  OW 
52. Il valore medio del log P  OW di varie unità sperimentali corrisponde alla 
media dei risultati di ciascuna unità sperimentale ponderati con le loro rispettive varianze.
 
Il calcolo è effettuato secondo la formula seguente:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
dove:  
log P  OW,i = valore log P  OW di ciascuna unità sperimentale i;  
log P  OW , Av = valore medio ponderato di ciascuna determinazione di log 
P OW ; 
w i = ponderazione statistica attribuita al valore log P  OW dell’unità 
sperimentale i.  
L’inverso della varianza del log P  OW,i è utilizzata come 
w i ½w i ¼ ðvarlog P  OW ;i –1 Þâ. 
53. La stima dell’errore della media del log P  OW corrisponde alla ripetibilità del 
log C  O /C W determinato durante la fase di equilibrio in ciascuna unità spe ­
rimentale. È espressa come la deviazione ponderata standard del P  OW,Av  
(σ log Pow,Av  ) che a sua volta misura l’errore associato al log P  OW,Av  . La 
deviazione ponderata può essere calcolata a partire dalla varianza ponderata (var
 log Pow,Av  ) nel modo seguente:  
var log Pow ;Av ¼ ðSw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðSw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
dove «n» rappresenta il numero di unità sperimentali.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 169
 
Relazione sulla prova  
54. La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:  
Sostanza in esame:  
— nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale (even ­
tualmente, con indicazione della posizione in caso di sostanze radiomar ­
cate) e proprietà fisico-chimiche pertinenti (cfr. paragrafo 17),  
— purezza (impurità) della sostanza in esame,  
— purezza radiochimica delle sostanze marcate e attività molare (se del 
caso),  
— stima preliminare del log P  OW e metodo utilizzato per calcolare questo 
valore.  
Condizioni sperimentali:  
— date di realizzazione degli studi,  
— temperatura nel corso dell’esperimento,  
— volumi di 1-ottanolo e di acqua all’inizio della prova,  
— volumi dei campioni di 1-ottanolo e di acqua prelevati,  
— volumi di 1-ottanolo e di acqua che restano nei recipienti di prova,  
— descrizione dei recipienti di prova e delle condizioni di agitazione (la 
geometria della barra di agitazione e del recipiente di prova, altezza del vortice in mm, e quando disponibile:
 
— metodi analitici utilizzati per determinare la sostanza in esame e loro 
limite di quantificazione,  
— tempi di campionamento,  
— pH della fase acquosa e tamponi utilizzati quando si regola il pH in 
presenza di molecole ionizzabili,  
— numero di ripetizioni.  
Risultati:  
— ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici usati,  
— concentrazioni della sostanza di prova determinate in 1-ottanolo e in 
acqua in funzione del tempo,  
— dimostrazione del bilancio di massa,  
— temperatura e deviazione standard della temperatura o intervallo delle 
temperature, durante la prova,  
— regressione del rapporto delle concentrazioni in funzione del tempo,  
— valore medio del log P  ow,Av  e suo errore standard,  
— analisi e interpretazione dei risultati,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 170
 
— esempi di dati grezzi di analisi rappresentative (tutti i dati grezzi devono 
essere conservati conformemente alle buone pratiche di laboratorio), in 
particolare il tasso di recupero dei surrogati, il numero di livelli utiliz ­
zato nella calibrazione (oltre ai criteri per il coefficiente di correlazione della curva di taratura) e risultati del GQ/CQ,
 
— se è disponibile: relazione di validazione del protocollo sperimentale (da 
citare nei riferimenti bibliografici).  
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(3) Capitolo A.8 del presente allegato, Coefficiente di partizione.  
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(10) Capitolo A.6 del presente allegato, Idrosolubilità.  
(11) Capitolo C.7 del presente allegato, Degradazione — Idrolisi della degrada ­
zione abiotica in funzione del pH.  
(12) Capitolo C.4 — parti da II a VII (Metodi da A a F) del presente allegato, 
Determinazione della pronta biodegradabilità.  
(13) Capitolo A.4 del presente allegato, Tensione di vapore.  
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Appendice 1  
Tabelle di calcolo dei volumi minimi di acqua richiesti per l’individuazione 
delle sostanze in esame con valori log P  OW diversi in fase acquosa  
Ipotesi:  
— Volume massimo di ciascuna aliquota = 10 % del volume totale; 5 aliquote = 
50 % del volume totale  
— Concentrazione delle sostanze in esame  ¼ 0; 7 Ü solubilità in ciascuna fase. 
Se le concentrazioni sono inferiori, si dovranno utilizzare volumi maggiori  
— Volume utilizzato per la determinazione del limite di rivelabilità (LOD) = 
100 ml  
— Il rapporto del log P  OW in funzione di log S  W e del log P  OW in funzione di 
SR (solubilità relativa, S  oct /S w ) sono rappresentazioni ragionevoli dei rapporti 
per le sostanze in esame  
Stima di S  w 
log P  ow equazione log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E-04  
Stima di S  oc 
log P  ow equazione S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 173
 
Massa totale della 
sostanza in esame 
(mg) Mass  oct /Mass  water Mass  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Mass  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Calcolo dei volumi  
Volume minimo richiesto per la fase H  2 O a ciascuna concentrazione del limite di 
rivelabilità (LOD)  
log K  ow LOD (microgrammi/ 
l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volume usato 
per LOD (l) 0,1 
Legenda  
Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equili ­
brazione da 1 litro.  
Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equili ­
brazione da 2 litri.  
Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equili ­
brazione da 5 litri.  
Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equili ­
brazione da 10 litri.  
Supera del 10 % anche il recipiente di equilibrazione da 10 litri.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 174
 
Tabella riassuntiva dei volumi necessari, in funzione della solubilità dell’acqua e del Log P  OW 
Volume minimo richiesto per la fase H  2 O ad ogni concentrazione LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (microgrammi/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (microgrammi/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volume usato per la de ­
terminazione del LOD (l) 0,1 
Appendice 2  
Esempio di recipiente di prova con rivestimento esterno in vetro per il 
metodo dell’agitazione lenta al fine di determinare il P  OW .
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 176
 
PARTE B: METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA TOSSICITÀ 
E DEGLI ALTRI EFFETTI SULLA SALUTE  
INDICE 
INTRODUZIONE GENERALE 
B.1 bis. TOSSICITÀ ORALE ACUTA — METODO A DOSE FISSA 
B.1 ter. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA ORALE — METODO DELLA 
CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA 
B.2. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE 
B.3. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA CUTANEA 
B.4. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE CUTA ­
NEA 
B.5. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE OCU ­
LARE 
B.6. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA B.7. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA 
ORALE NEI RODITORI 
B.8. TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 28 
GIORNI 
B.9. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA CU ­
TANEA 
B.10. MUTAGENICITÀ — TEST  IN VITRO  DI ABERRAZIONE 
CROMOSOMICA NEI MAMMIFERI 
B.11. MUTAGENICITÀ — TEST  IN VIVO  DI ABERRAZIONE CRO ­
MOSOMICA SUL MIDOLLO OSSEO DI MAMMIFERI 
B.12. MUTAGENICITÀ — TEST  IN VIVO  SUI MICRONUCLEI NE ­
GLI ERITROCITI DI MAMMIFERO 
B.13/14. MUTAGENICITÀ — TEST DI REVERSIONE SU BATTERI 
B.15. SAGGIO DI MUTAGENESI E PRESCREENING DI CANCE ­
ROGENESI MUTAZIONE GENICA:  SACCHAROMYCES CE ­
REVISIAE  
B.16. RICOMBINAZIONE MITOTICA:  SACCHAROMYCES CEREVI ­
SIAE  
B.17. MUTAGENICITÀ — TEST  IN VITRO  DI MUTAZIONE GE ­
NICA SU CELLULE DI MAMMIFERO 
B.18. DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA: SINTESI NON PRO ­
GRAMMATA DEL DNA — CELLULE DI MAMMIFERO  IN 
VITRO  
B.19. SAGGIO DEGLI SCAMBI TRA CROMATIDI FRATELLI  IN 
VITRO  
B.20. SAGGIO DEI LETALI RECESSIVI LEGATI AL SESSO:  DRO­
SOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 177
 
B.21. SAGGIO  IN VITRO  DI TRASFORMAZIONE DI CELLULE DI 
MAMMIFERO 
B.22. SAGGIO DEI LETALI DOMINANTI NEI RODITORI 
B.23. TEST DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA SUGLI SPERMA ­
TOGONI DI MAMMIFERO 
B.24. SAGGIO DELLE MACCHIE (SPOT TEST): TOPI 
B.25. TRASLOCAZIONI EREDITABILI: TOPO 
B26. TEST DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA STUDIO DELLA 
TOSSICITÀ ORALE CON SOMMINISTRAZIONE RIPETUTA DI DOSI PER 90 GIORNI SUI RODITORI 
B.27. TEST DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA STUDIO DELLA 
TOSSICITÀ ORALE CON SOMMINISTRAZIONE RIPETUTA DI DOSI PER 90 GIORNI SUI NON RODITORI 
B.28 SAGGIO DI TOSSICITÀ CUTANEA SUBCRONICA SAGGIO 
CON SOMMINISTRAZIONE CUTANEA RIPETUTA DI DOSI PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI RODITORI 
B.29 TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 90 
GIORNI 
B.30 STUDI DI TOSSICITÀ CRONICA B.31. STUDIO DI TOSSICITÀ PRENATALE 
B.32 STUDI DI CANCEROGENESI 
B.33 STUDI COMBINATI DI TOSSICITÀ CRONICA/CANCEROGE ­
NESI 
B.34. SAGGIO DI TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE: UNA GE ­
NERAZIONE 
B.35. STUDIO DI TOSSICITÀ RIPRODUTTIVA A DUE GENERA ­
ZIONI 
B.36. TOSSICOCINETICA B.37. NEUROTOSSICITÀ RITARDATA DI SOSTANZE ORGANO ­
FOSFORICHE DOPO ESPOSIZIONE ACUTA 
B.38. NEUROTOSSICITÀ RITARDATA DI SOSTANZE ORGANO ­
FOSFORICHE: STUDIO CON SOMMINISTAZIONE RIPE ­
TUTA PER 28 GIORNI 
B.39. TEST  IN VIVO  DI SINTESI NON PROGRAMMATA DI DNA 
(UDS) SU CELLULE EPATICHE DI MAMMIFERO 
B.40. CORROSIONE CUTANEA  IN VITRO:  TEST DI RESISTENZA 
ELETTRICA TRANSCUTANEA (TER) 
B.40 bis. CORROSIONE CUTANEA  IN VITRO:  TEST SU MODELLI DI 
PELLE UMANA
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 178
 
B.41. SAGGIO DI FOTOTOSSICITÀ  IN VITRO  3T3 NRU 
B.42. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY 
B.43. STUDI DI NEUROTOSSICITÀ NEI RODITORI 
B.44. ASSORBIMENTO CUTANEO: METODO  IN VIVO  
B.45. ASSORBIMENTO CUTANEO: METODO  IN VITRO  
B.46. IRRITAZIONE CUTANEA IN VITRO: TEST SU UN MO ­
DELLO DI EPIDERMIDE UMANA RICOSTITUITA 
B.47. SAGGIO DI OPACITÀ E PERMEABILITÀ DELLA CORNEA 
NEI BOVINI ( BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABI ­
LITY  – BCOP) PER L’IDENTIFICAZIONE DI SOSTANZE 
CORROSIVE E GRAVEMENTE IRRITANTI PER GLI OCCHI 
B.48. METODO DI PROVA SULL’OCCHIO ISOLATO DEI POLLI 
(ISOLATED CHICKEN EYE - ICE) PER L’IDENTIFICAZIONE 
DI SOSTANZE CORROSIVE E GRAVEMENTE IRRITANTI PER GLI OCCHI 
B.49. TEST DEL MICRONUCLEO IN VITRO CON CELLULE DI 
MAMMIFERO 
B.50. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY: DA 
B.51. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY: BrdU-ELISA
 
▼M4 
B.52. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE — METODO DELLA 
CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 179
 
INTRODUZIONE GENERALE  
A. CARATTERIZZAZIONE DELLA SOSTANZA IN ESAME  
Prima dell'inizio di qualsiasi studio di tossicità occorre conoscere la 
composizione della sostanza in esame, incluse le impurità principali 
e le proprietà fisico-chimiche pertinenti, compresa la stabilità.  
Le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame forniscono in ­
formazioni importanti per la scelta della via di somministrazione, per 
la progettazione dei vari studi e per il trattamento e la conservazione 
della sostanza in esame.  
L'elaborazione di un metodo analitico per la determinazione qualita ­
tiva e quantitativa della sostanza in esame (comprese, se possibile, le 
principali impurità) nel mezzo di dosaggio e nel materiale biologico 
deve precedere l'inizio dello studio.  
Tutte le informazioni relative all'identificazione, alle proprietà fisico- 
chimiche, alla purezza e al comportamento della sostanza devono 
essere riportate nella relazione del saggio.  
B. CURA DEGLI ANIMALI  
Nei saggi di tossicità è indispensabile esercitare un rigoroso controllo 
delle condizioni ambientali e utilizzare tecniche adeguate per la cura degli animali.
 
(i) Condizioni di alloggiamento  
Le condizioni ambientali nei locali o nei recinti degli animali da 
laboratorio devono essere appropriate per le specie sperimentali. 
Per ratti, topi e porcellini d'India è indicata una temperatura ambiente di 22
 o C ±3  o C con un'umidità relativa del 30-70 %. Per i conigli, la 
temperatura deve essere di 20 ± 3  o C con un'umidità relativa del 30- 
70 %.  
Talune tecniche sperimentali sono particolarmente sensibili agli ef ­
fetti della temperatura e, in tali casi, la descrizione del metodo di saggio comprende indicazioni precise sulle condizioni adeguate. In 
tutti gli studi di tossicità, la temperatura e l'umidità devono essere 
controllate, registrate e riportate nella relazione finale dello studio.
 
L'illuminazione deve essere artificiale ed alternare 12 ore di luce e 
12 ore di oscurità. Le condizioni di illuminazione devono essere 
dettagliatamente registrate e riportate nella relazione finale dello stu ­
dio. 
Salvo nel caso in cui venga diversamente specificato nel metodo, gli 
animali dovranno essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti 
piccoli gruppi dello stesso sesso. In questo caso il numero degli 
animali non dovrà essere superiore a cinque.  
Nelle relazioni sugli esperimenti effettuati su animali dovranno es ­
sere indicati il tipo di gabbie utilizzate e il numero di animali allog ­
giati in ogni gabbia sia durante l'esposizione alla sostanza chimica 
che durante tutto il periodo successivo di osservazione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 180
 
(ii) Condizioni di alimentazione  
La dieta deve soddisfare tutte le esigenze nutrizionali della specie 
utilizzata per il saggio. Qualora le sostanze in esame vengano som ­
ministrate agli animali nella loro dieta, il valore nutrizionale degli 
alimenti potrebbe essere ridotto per effetto dell'interazione tra la so ­
stanza ed un costituente dietetico. Nell'interpretazione dei risultati dei saggi si dovrà tener conto di questa possibilità. Gli animali potranno essere nutriti con diete convenzionali da laboratorio ed abbeverati con 
acqua a sazietà. La scelta della dieta potrà essere condizionata dalla 
necessità di garantire un apporto adeguato della sostanza in esame, qualora essa venga somministrata con gli alimenti.
 
I contaminanti dietetici suscettibili di influenzare la tossicità non 
dovrebbero essere presenti in condizioni tali da causare interferenze.  
C. METODI ALTERNATIVI  
L'Unione europea è impegnata a sviluppare e collaudare tecniche 
alternative che consentano di ottenere lo stesso livello di informazioni degli attuali esperimenti su animali, riducendo tuttavia il numero di animali utilizzati e le sofferenze ad essi inflitte o evi ­
tando del tutto il ricorso agli animali.
 
Non appena perfezionati, tali metodi dovranno costituire, ove possi ­
bile, la scelta d'elezione per gli studi miranti alla caratterizzazione dei rischi e alla conseguente classificazione ed etichettatura delle so ­
stanze in funzione dei rischi intrinseci.
 
D. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE  
Nella valutazione ed interpretazione dei saggi occorre tener conto dei 
limiti entro i quali i risultati di studi su animali e in vitro possono 
essere estrapolati direttamente all'uomo; laddove si abbia evidenza di effetti avversi per l'uomo, questa potrà essere utilizzata per confer ­
mare i risultati sperimentali.
 
E. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  
La maggior parte di detti metodi è stata messa a punto nell'ambito 
del programma per la definizione di linee guida elaborato dall'OCSE 
in materia di saggi. Essi dovranno essere applicati in conformità con i principi delle buone pratiche di laboratorio allo scopo di garantire il più possibile il «reciproco riconoscimento dei dati».
 
Ulteriori informazioni sono reperibili nei riferimenti citati nelle linee 
guida dell'OCSE e nell'ampia letteratura esistente in materia.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 181
 
B.1. bis. TOSSICITÀ ORALE ACUTA — METODO A DOSE FISSA  
1. METODO  
Questo metodo di prova è equivalente al metodo OCSE TG 420 
(2001)  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi tradizionali di valutazione della tossicità acuta utilizzano 
come  endpoint  la morte degli animali. Nel 1984, la  British Toxico ­
logy Society  ha proposto un nuovo metodo, basato sulla sommini ­
strazione di una serie di dosi fisse (1), che invece di utilizzare come  
endpoint  la morte degli animali prevede l'osservazione di segni evi ­
denti di tossicità in seguito alla somministrazione di una dose facente parte di una serie prestabilita. In seguito a studi di validazione  in 
vivo eseguiti nel Regno Unito (2) e a livello internazionale (3), il 
procedimento è stato adottato come metodo di prova nel 1992. Successivamente, le proprietà statistiche del metodo a dose fissa sono state oggetto di valutazione in una serie di studi basati 
sull'impiego di modelli matematici (4)(5)(6). Sia gli studi  in vivo  sia 
quelli di modellizzazione hanno dimostrato che il procedimento è riproducibile, utilizza un minor numero di animali provocando meno sofferenze rispetto ai metodi tradizionali, e permette di classi ­
ficare le sostanze in maniera analoga agli altri metodi di prova della 
tossicità acuta.
 
Per indicazioni sulla scelta del metodo di prova più adatto per un 
determinato scopo, si rimanda alle linee guida OCSE sui test di 
tossicità orale acuta (7), che contengono ulteriori informazioni sul ­
l'esecuzione e sull'interpretazione del metodo di prova B.1  bis. 
Il metodo prevede che nello studio principale si utilizzino solo dosi a 
moderata tossicità, evitando di somministrare dosi che possano avere 
un effetto letale. Inoltre non è necessario somministrare dosi che provocano notoriamente dolore e sofferenze gravi per effetto del ­
l'azione corrosiva o fortemente irritante. Gli animali moribondi o 
che manifestano dolore evidente o segni di sofferenza grave e persi ­
stente devono essere sottoposti a eutanasia e ai fini dell'interpreta ­
zione dei risultati devono essere assimilati agli animali morti durante lo svolgimento del test. I criteri da applicare per decidere la 
soppressione degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza 
sono oggetto di specifiche linee guida, che indicano anche come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (8).
 
Il metodo fornisce informazioni sulla pericolosità della sostanza 
esaminata, permettendone la classificazione secondo il GHS  (Glo­
bal Harmonized System),  sistema armonizzato su scala mondiale 
per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità 
acuta (9).  
Prima di effettuare lo studio, il laboratorio che esegue il test deve 
consultare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza di prova, tra cui l'identità e la struttura chimica, le proprietà chimico-fisiche, i 
risultati di eventuali altri test di tossicità  in vitro  o in vivo  eseguiti 
sulla sostanza, i dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini, l'impiego o gli impieghi previsti. Queste informazioni sono necessa ­
rie per provare a tutti i soggetti interessati l'adeguatezza del test per 
la protezione della salute umana e servono a scegliere la giusta dose 
iniziale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 182
 
1.2. DEFINIZIONI  
Tossicità orale acuta : effetti avversi che si verificano in seguito alla 
somministrazione orale di una singola dose o di più dosi di una sostanza nell’arco di 24 ore.
 
Morte tardiva : termine usato per indicare che l’animale non muore 
né appare moribondo nelle 48 ore successive alla somministrazione, 
ma muore successivamente, durante il periodo di osservazione di 14 
giorni.  
Dose : quantità di sostanza somministrata. Viene espressa in peso 
della sostanza di prova per unità di peso dell’animale sottoposto al test (ad es. mg/kg).
 
Tossicità manifesta : termine generale che indica la presenza di 
chiari segni di tossicità in seguito alla somministrazione della so ­
stanza di prova [per alcuni esempi, cfr. (3)], tali da far prevedere alla 
dose fissa immediatamente superiore manifestazioni di dolore intenso 
e segni persistenti di grave sofferenza, uno stato di agonia [i criteri che definiscono tale stato sono illustrati nelle linee guida OCSE citate in bibliografia al n. (8)] o la morte della maggior parte degli 
animali.
 
GHS (Globally Harmonized System):  sistema armonizzato globale 
per la classificazione delle sostanze e delle miscele chimiche. Si 
tratta di un'iniziativa congiunta dell'OCSE (salute umana e ambien ­
te), del Comitato di esperti delle Nazioni Unite sul trasporto delle merci pericolose (proprietà fisico-chimiche) e dell'Organizzazione 
internazionale del lavoro (comunicazione del rischio), coordinata 
dal programma IOMC per la gestione ottimale delle sostanze chimi ­
che (Inter-organization programme for the sound management of 
chemicals).
 
Morte imminente:  stato in cui si prevede l'agonia o la morte del ­
l'animale prima della successiva osservazione in programma. Per i 
roditori tra i segni indicativi di morte imminente figurano le convul ­
sioni, la posizione laterale o prona e il tremore [per maggiori indi ­
cazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia al n. (8)].  
DL 50 (dose letale 50):  la singola dose di sostanza, determinata stati ­
sticamente, capace di provocare la morte del 50 % degli animali a cui viene somministrata per via orale. Il valore della DL
 50 viene 
espresso in peso della sostanza di prova per unità di peso dell'ani ­
male usato per il saggio (mg/kg).  
Dose limite:  dose corrispondente al limite superiore fissato per il test 
(2 000 o 5 000 mg/kg).  
Stato di agonia:  fase in cui l'animale è moribondo o non è in grado 
di sopravvivere, nemmeno se sottoposto a trattamento [per maggiori indicazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia al n.(8)].
 
Morte prevedibile:  presenza di segni clinici, come ad esempio l'in ­
capacità di raggiungere il cibo o l'acqua, che indicano che l'animale morirà prima della conclusione programmata dell'esperimento [per 
maggiori indicazioni, cfr. le linee guida OCSE citate in bibliografia 
al n. (8)].
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 183
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
La sostanza viene somministrata a gruppi di animali dello stesso 
sesso seguendo un procedimento articolato in più fasi successive che prevede la somministrazione di dosi fisse di 5, 50, 300 e 
2 000 mg/kg (in casi eccezionali può essere prevista una dose fissa 
aggiuntiva di 5 000 mg/kg: cfr. punto 1.6.2). Il livello di dose ini ­
ziale è scelto sulla base di uno studio di osservazione, ed è la dose alla quale si prevede che si manifestino alcuni segni di tossicità, 
senza tuttavia causare effetti tossici gravi o la morte degli animali. 
I segni clinici e le condizioni associate a dolore, sofferenza e morte imminente sono descritti in apposite linee guida OCSE (8). 
A seconda della presenza o dell'assenza di segni di tossicità o mor ­
talità, la sostanza in esame può essere somministrata ad altri gruppi di animali a dosi superiori o inferiori. La procedura prosegue fino a quando viene identificata la dose che causa tossicità manifesta o la 
morte di un solo animale o fino alla somministrazione della dose più 
elevata, se non vengono riscontrati effetti, mentre viene immediata ­
mente interrotta se si verificano decessi alla dose più bassa.
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.4.1.  Scelta delle specie animale  
È preferibile utilizzare il ratto, ma è possibile ricorrere anche ad altre 
specie di roditori. Normalmente vengono utilizzati animali di sesso femminile (7), perché la letteratura esistente sui test convenzionali 
DL
 50 indica che, pur non essendovi grandi differenze di sensibilità 
tra i due sessi, nei casi in cui sono state osservate differenze in genere le femmine sono risultate leggermente più sensibili (10). Tuttavia se le informazioni disponibili sulle proprietà tossicologiche 
o tossicocinetiche di sostanze chimiche strutturalmente affini indi ­
cano la probabilità che i maschi siano più sensibili delle femmine, si devono utilizzare animali di sesso maschile. In quest'ultimo caso, 
occorre fornire un'adeguata giustificazione.
 
Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani, appartenenti a 
ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere 
nullipare e non gravide. All'inizio del trattamento ciascun animale deve avere un'età compresa tra 8 e 12 settimane ed un peso del ± 20 % del peso medio degli animali a cui è già stata somministrata la 
sostanza.
 
1.4.2.  Condizioni di stabulazione e di alimentazione  
La temperatura dello stabulario deve essere di 22  o C (± 3  o C). 
L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni 
caso non deve essere inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L'illuminazione deve essere artificiale, alternando 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per 
l'alimentazione si possono utilizzare diete convenzionali da laborato ­
rio con acqua ad libitum. Nelle gabbie, gli animali possono essere raggruppati in funzione della dose somministrata, ma il numero di animali per gabbia non deve impedire la corretta osservazione di 
ciascun esemplare.
 
1.4.3.  Preparazione degli animali  
Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire 
l'individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per al ­
meno 5 giorni prima dell'inizio del trattamento, in modo da consen ­
tirne l'acclimatazione alle condizioni di laboratorio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 184
 
1.4.4.  Preparazione delle dosi  
In genere la sostanza di prova va somministrata a volume costante 
per tutte le dosi, variando la concentrazione del preparato da som ­
ministrare. Tuttavia, se il test viene eseguito su prodotti o miscele 
allo stato liquido, ai fini della valutazione del rischio può essere 
opportuno usare la sostanza non diluita, cioè a concentrazione co ­
stante; alcune autorità di regolamentazione impongono obbligatoria ­
mente l'uso della sostanza non diluita. In ogni caso, non deve essere 
superato il volume massimo della dose somministrabile. Il volume 
massimo di liquido somministrabile in una sola volta dipende dalla taglia dell'animale, e nei roditori non deve di norma superare 1 ml/ ­
100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose, per 
le quali si possono prevedere 2 ml/100 g di peso corporeo. Quanto alla formulazione del preparato da somministrare, si raccomanda di usare ove possibile una soluzione/sospensione/emulsione acquosa, 
seguita in ordine di preferenza da una soluzione/sospensione/ ­
emulsione in olio (per esempio olio di mais) e infine da una solu ­
zione in altri veicoli. Per i veicoli diversi dall'acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Le dosi devono essere preparate poco 
prima della somministrazione, tranne nel caso in cui la stabilità del 
preparato nell'arco del periodo di utilizzo sia nota e ritenuta accet ­
tabile.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Somministrazione delle dosi  
La sostanza da esaminare viene somministrata in un'unica dose me ­
diante sonda gastrica o apposita cannula per intubazione. Nel remoto caso in cui non sia possibile somministrare l'intera quantità in un'unica dose, ques'ultima può essere frazionata e somministrata in 
un arco di tempo non superiore a 24 ore.
 
Prima della somministrazione della sostanza gli animali devono es ­
sere tenuti a digiuno (ad esempio, l'alimentazione, a esclusione del ­
l'acqua, deve essere sospesa a partire dalla sera precedente per i ratti 
e per 3-4 ore nei topi). Dopo il periodo di digiuno, si pesano gli animali e si somministra la sostanza da esaminare. A somministra ­
zione avvenuta, l'alimentazione può essere sospesa per altre 3-4 ore 
nei ratti o 1-2 ore nei topi. Qualora la dose venga frazionata e 
somministrata nell'arco di un certo periodo di tempo, a seconda della durata del periodo di somministrazione può essere necessario alimen ­
tare e abbeverare gli animali.
 
1.5.2.  Studio di osservazione  
Lo scopo dello studio di osservazione è di consentire la scelta della 
giusta dose iniziale per lo studio principale. La sostanza in esame viene somministrata in maniera sequenziale a singoli 
animali, secondo il diagramma di flusso riportato nell'allegato 
1. Lo studio di osservazione si conclude quando è possibile decidere la dose iniziale da utilizzare nello studio principale (o se la dose fissa più bassa provoca la morte di un animale).
 
La dose iniziale da utilizzare nello studio di osservazione, scelta tra i 
livelli di dose fissi di 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg, è la dose che si prevede possa provocare tossicità manifesta sulla base, ove possibile, 
di dati  in vivo  e in vitro  relativi alla stessa sostanza chimica e a 
sostanze di struttura affine. In mancanza di questi dati, si utilizza una dose iniziale di 300 mg/kg.
 
Tra le somministrazioni a ciascun animale devono trascorrere almeno 
24 ore. Tutti gli animali devono essere tenuti in osservazione per 
almeno 14 giorni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 185
 
In casi eccezionali, e solo se giustificato da specifiche esigenze 
normative, può essere previsto un ulteriore livello di dose fisso 
pari a 5 000 mg/kg (cfr. allegato 3). Per il benessere degli animali, si sconsiglia di effettuare sperimentazioni su animali alla dose stabi ­
lita per la categoria GHS 5 (2 000-5 000 mg/kg); l'utilizzo di questa 
dose va preso in considerazione solo se vi è una probabilità elevata 
che i risultati del test abbiano rilevanza diretta per la tutela della salute umana o animale o per la protezione dell'ambiente.
 
Se la somministrazione della dose fissa più bassa (5 mg/kg) provoca 
la morte dell'animale nel corso dello studio di osservazione, la pro ­
cedura normale prevede l'interruzione dello studio e l'assegnazione 
della sostanza alla categoria GHS 1 (cfr. allegato 1). Tuttavia, qua ­
lora sia necessaria un'ulteriore conferma della classificazione, può essere utilizzata la seguente procedura supplementare facoltativa: la sostanza viene somministrata a un secondo animale alla dose di 
5 mg/kg; se questo secondo animale muore, viene confermata la 
classificazione nella categoria GHS 1 e lo studio viene immediata ­
mente interrotto; se invece sopravvive, la sostanza viene sommini ­
strata alla dose di 5 mg/kg a non più di altri tre animali. A causa 
dell'elevato rischio di mortalità, per proteggere gli animali la sostanza 
esaminata deve essere somministrata in maniera sequenziale. L'inter ­
vallo di tempo tra le somministrazioni ai diversi animali deve essere sufficiente ad accertare che l'animale trattato in precedenza riesca a 
sopravvivere. Se si verifica un secondo decesso, la sequenza deve 
essere immediatamente interrotta e la sostanza non deve essere som ­
ministrata ad altri animali. Dal momento che il verificarsi di un secondo decesso (indipendentemente dal numero di animali a 
cui è già stata somministrata la sostanza al momento dell'interruzio ­
ne) rientra nel risultato A (2 o più decessi), si applica la regola di classificazione di cui all'allegato 2 alla dose fissa di 5 mg/kg (cate ­
goria 1 se vi sono 2 o più morti o categoria 2 se c'è un'unica morte). 
L'allegato 4 riporta la classificazione prevista dal sistema UE in 
attesa dell'applicazione del nuovo sistema GHS.
 
1.5.3.  Studio principale  
1.5.3.1.  Numero di animali e livelli di dose  
I diagrammi di flusso di cui all'allegato 2 illustrano le tappe da 
seguire dopo la somministrazione del livello di dose iniziale. Vi sono tre possibilità: interrompere il test e assegnare la sostanza alla classe di rischio appropriata; effettuare il test a una dose fissa supe ­
riore; effettuare il test a una dose fissa inferiore. Tuttavia, per sal ­
vaguardare gli animali, se un livello di dose ha causato la morte di un animale durante lo studio di osservazione, questo livello non deve più essere utilizzato nello studio principale (cfr. allegato 2). L'espe ­
rienza indica che dopo la somministrazione del livello di dose ini ­
ziale in genere è possibile classificare la sostanza senza bisogno di effettuare ulteriori test.
 
Per ciascun livello di dose, normalmente si usano in tutto cinque 
animali dello stesso sesso: l'animale a cui nello studio di osserva ­
zione è stato somministrato lo stesso livello di dose, più altri quattro 
animali (tranne nel caso remoto in cui un livello di dose utilizzato 
nello studio principale non sia stato incluso nello studio di osserva ­
zione).  
L'intervallo di tempo tra le somministrazioni dei vari livelli di dose 
ai diversi animali viene determinato in funzione della comparsa, della durata e della gravità dei segni di tossicità, avendo cura di 
procedere alla somministrazione della dose successiva solo una volta 
accertata la sopravvivenza degli animali trattati precedentemente. Si consiglia di far trascorrere, se necessario, 3 o 4 giorni tra le sommi ­
nistrazioni per consentire l'osservazione di eventuali segni di tossicità 
tardiva. L'intervallo di tempo può essere modificato secondo neces ­
sità, ad esempio in caso di risposte non convincenti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 186
 
Quando si prevede di utilizzare una dose fissa superiore di 5 000 
mg/kg, è necessario attenersi alla procedura descritta nell'allegato 3 
(cfr. anche punto 1.6.2).  
1.5.3.2.  Saggio limite  
Il saggio limite viene utilizzato principalmente quando lo sperimen ­
tatore dispone di informazioni che indicano che la sostanza in esame 
non è probabilmente tossica, cioè causa tossicità solo in dosi supe ­
riori alle dosi limite previste per legge. Le informazioni sulla tossi ­
cità della sostanza in esame possono essere ricavate da test su com ­
posti, miscele o prodotti simili, tenendo conto dell'identità e della 
percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologi ­
ca. Se le informazioni sulla tossicità della sostanza sono scarse o nulle o si prevede che la sostanza in esame sia tossica occorre eseguire lo studio principale.
 
Ai fini delle presenti linee-guida, per il saggio limite si utilizza, 
seguendo il procedimento normale, una dose iniziale di 2 000 mg/kg (o in casi eccezionali 5 000 mg/kg) nello studio di osservazione, 
quindi si somministra la stessa dose ad altri quattro animali.
 
1.6. OSSERVAZIONI  
Dopo la somministrazione, gli animali sono esaminati individual ­
mente almeno una volta nei primi 30 minuti, quindi periodicamente nelle prime 24 ore, prestando particolare attenzione alle prime 4 ore, 
e successivamente una volta al giorno per 14 giorni, a meno che non 
muoiano o non sia necessario ritirarli dallo studio e sottoporli a eutanasia per risparmiare loro sofferenze eccessive. Tuttavia, la du ­
rata del periodo di osservazione non è tassativa, ma va stabilita in 
funzione della natura delle reazioni tossiche, del momento della loro 
comparsa e dei tempi di recupero e può quindi essere prolungata in caso di necessità. Un parametro importante è rappresentato dal mo ­
mento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, so ­
prattutto se questi ultimi tendono ad apparire tardivamente (11). 
Tutte le osservazioni devono essere sistematicamente registrate su schede individuali per ogni animale.
 
Qualora gli animali presentino segni persistenti di tossicità sono 
necessarie ulteriori osservazioni, che devono riguardare le modifica ­
zioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, 
dell'attività somatomotoria e del comportamento. Particolare atten ­
zione deve essere rivolta all'osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nelle linee guida 
OCSE citate in bibliografia al punto (8). Gli animali agonizzanti o 
che manifestano dolore intenso o segni di sofferenza grave e persi ­
stente devono essere sottoposti a eutanasia. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, occorre registrare con la 
massima precisione possibile il momento del decesso.
 
1.6.1.  Peso corporeo  
1 singoli animali devono essere pesati poco prima della sommini ­
strazione della sostanza di prova e in seguito almeno una volta alla settimana. Occorre calcolare e registrare le variazioni ponderali. Al 
termine del test, gli animali sopravvissuti devono essere pesati prima 
di essere sottoposti a eutanasia.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 187
 
1.6.2.  Esame patologico  
Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso del 
test e quelli che sono ritirati dallo studio per risparmiare loro ecces ­
sive sofferenze) devono essere sottoposti a necroscopia macroscopica. 
Per ogni animale devono essere registrate tutte le modificazioni pa ­
tologiche di rilievo. Per gli animali sopravvissuti almeno 24 ore, può essere opportuno l'esame microscopico degli organi recanti alterazioni patologiche evidenti, che potrebbe fornire indicazioni utili.
 
2. DATI  
Occorre fornire risultati individuali per ciascun animale. Tutti i dati 
devono essere riassunti in una tabella nella quale devono essere 
indicati per ciascun gruppo sottoposto al test il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni di tos ­
sicità, il numero di animali rinvenuti morti durante il test o sottoposti 
a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la 
descrizione degli effetti tossici, il loro decorso e l'eventuale reversi ­
bilità e i risultati della necroscopia.
 
3. PRESENTAZIONE DEI DATI  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere le seguenti informazioni, 
a seconda dei casi:  
Sostanza di prova:  
— natura fisica, purezza e (se pertinenti) proprietà fisico-chimiche 
(compresa 1'isomerizzazione),  
— dati identificativi, compreso il numero CAS.  
Veicolo (se pertinente):  
— motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall'ac ­
qua. 
Animali da esperimento:  
— specie/ceppo utilizzato,  
— condizioni microbiologiche degli animali, qualora siano note,  
— numero, età e sesso degli animali (compresa l'eventuale giustifi ­
cazione dell'uso di esemplari maschi anziché femmine),  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta ecc.  
Condizioni del test:  
— informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza di pro ­
va, comprese informazioni sullo stato fisico del preparato som ­
ministrato,  
— modalità di somministrazione della sostanza di prova, compreso 
il volume delle dosi e l'orario di somministrazione,  
— informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua (com ­
presi tipo di dieta/provenienza degli alimenti, provenienza del ­
l'acqua),  
— motivazione della scelta della dose iniziale.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 188
 
Risultati:  
— tabella con risposta e livello di dose per ciascun animale (animali 
che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa; natura, 
gravità e durata degli effetti),  
— tabella del peso corporeo e delle variazioni ponderali,  
— peso dei singoli animali nel giorno della somministrazione, e in 
seguito ad intervalli di una settimana e al momento della morte o del sacrificio,
 
— data e ora della morte, se questa avviene prima del sacrificio 
programmato,  
— momento della comparsa dei segni di tossicità, decorso ed even ­
tuale reversibilità per ciascun animale,  
— referto necroscopico e referto istopatologico per ciascun animale, 
se disponibili.  
Discussione e interpretazione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984).  
Special report: a new approach to the classification of sub ­
stances and preparations on the basis of their acute toxicity.  
Human Toxicol., 3, 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987).  Evaluation of the BTS approach to the testing of sub ­
stances and preparations for their acute toxicity.  Human To ­
xicol., 62, 79-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990).  The international validation of a fixed-dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992).  Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure.  Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995).  Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure.  Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 
323. Human Exptl. Toxicol.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002).  Statisti­
cal evaluation ofthe revised fixed dose procedure.  Hum. Exp. 
Toxicol., 21, 183-196.  
(7) OECD (2001).  Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing.  Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment N. 24. Paris  
(8) OECD (2000).  Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use ofClinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation.  Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 189
 
(9) OECD (1998).  Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances,  Approvato alla 28  a riunione congiunta del Chemi ­
cals Committee e del Working Party on Chemicals nel novem ­
bre 1998, parte 2, pag. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ ­
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no- 0,FF.html].  
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995).  Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures.  Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Cap. 16 Acute Toxicity and 
Eye Irritation, in A.W. Hayes (a cura di),  Principles and Me ­
thods of Toxicology,  terza edizione, Raven Press, Ltd. New 
York, USA.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 190
 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 191
 ▼B 
ALLEGATO 1:  
DIAGRAMMA DI FLUSSO DELLO STUDIO DI OSSERVAZIONE

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 193
 ▼B 
ALLEGATO 2:  
DIAGRAMMA DI FLUSSO DELLO STUDIO PRINCIPALE

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 194
 ▼B

 
Allegato 3  
CRITERI PER LA CLASSIFICAZIONE DI SOSTANZE CON VALORI 
PREVISTI DI LD  50 SUPERIORI A 2 000 MG/KG PER LE QUALI NON 
È NECESSARIO ESEGUIRE IL TEST DI TOSSICITÀ  
I criteri relativi alla categoria di rischio 5 servono a consentire l'identificazione di 
sostanze che presentano un rischio di tossicità acuta relativamente basso ma che 
in determinate circostanze possono rappresentare un pericolo per popolazioni vulnerabili. Si tratta di sostanze per le quali è prevista una DL
 50 orale o cutanea 
compresa fra 2 000 e 5 000 mg/kg o dosi equivalenti per altre vie di sommini ­
strazione. Una sostanza può essere classificata nella categoria di rischio definita 
da: 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 nel GHS) nei seguenti casi:  
a) se uno qualsiasi degli schemi di cui all'allegato 2 porta a inserire tale sostanza 
in questa categoria, sulla base delle incidenze di mortalità;  
b) se sono già disponibili prove attendibili che indicano che la DL  50 si situa nell'in ­
tervallo di valori della categoria 5 o se altri studi su animali o sugli effetti tossici 
nell'uomo indicano un rischio di tossicità acuta per la salute umana;  
c) per estrapolazione, stima o misurazione di dati se non è giustificata l'asse ­
gnazione ad una classe di rischio superiore, e se:  
— sono disponibili informazioni attendibili che indicano effetti tossici signi ­
ficativi nell'uomo, o  
— si osserva mortalità nei test eseguiti fino ai valori della categoria 4 per via 
orale, o  
— i pareri degli esperti confermano segni clinici significativi di tossicità nei 
test eseguiti fino ai valori della categoria 4, a esclusione di diarrea, piloe ­
rezione o aspetto non tolettato, o  
— i pareri degli esperti confermano l'esistenza di informazioni attendibili, 
ricavate dagli altri studi su animali, che indicano potenziali effetti acuti significativi.
 
ESECUZIONE DEL TEST A DOSI SUPERIORI A 2 000 MG/KG  
In casi eccezionali, e solo se specifiche esigenze normative lo giustificano, può 
essere previsto un ulteriore livello di dose fisso superiore pari a 5 000 mg/kg. Al fine di proteggere gli animali, si sconsiglia di utilizzare la dose di 5 000 mg/kg, 
che va presa in considerazione solo nel caso in cui sia molto probabile che i 
risultati del test abbiano rilevanza diretta per la protezione della salute degli animali o degli esseri umani.
 
Studio di osservazione  
Ai criteri decisionali che regolano la procedura sequenziale di cui all'allegato 1 
viene aggiunto un livello di dose di 5 000 mg/kg. Di conseguenza, quando nello studio di osservazione si utilizza una dose iniziale di 5 000 mg/kg, in caso di esito A (decesso) si effettua il test su un secondo animale a 2 000 mg/kg; in caso 
di esito B o C (tossicità manifesta o nessun segno di tossicità) si può scegliere la 
dose di 5 000 mg/kg come dose iniziale per lo studio principale. Analogamente, se si utilizza una dose iniziale diversa da 5 000 mg/kg, in caso di esito B o C a 2 000 mg/kg si procede con la dose di 5 000 mg/kg; a tale dose, in caso di esito 
A si utilizza la dose di 2 000 mg/kg come dose iniziale per lo studio principale; 
in caso di esito B o C si utilizza la dose di 5 000 mg/kg
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Studio principale  
Ai criteri decisionali che regolano la procedura sequenziale di cui all'allegato 2 viene 
aggiunto un livello di dose di 5 000 mg/kg. Di conseguenza, quando nello studio principale si utilizza una dose iniziale di 5 000 mg/kg, in caso di esito A ( ≥ 2 decessi) è 
necessario effettuare il test su un secondo gruppo a 2 000 mg/kg; in caso di esito B 
(tossicità evidente e/o ≤ 1 decesso) o C (nessun segno di tossicità) la sostanza non 
viene classificata nel sistema GHS. Analogamente, se si utilizza una dose iniziale diversa da 5 000 mg/kg, in caso di esito C a 2 000 mg/kg si procede con la dose di 5 000 mg/kg; a tale dose, in caso di esito A la sostanza è assegnata alla categoria 5 
GHS, in caso di esito B o C la sostanza non è classificata.
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 ▼B 
Allegato 4  
METODO DI PROVA B.1  bis 
Guida alla classificazione transitoria UE in attesa dell'effettiva attuazione del sistema di classificazione armonizzato su sca la mondiale (GHS) [cfr. riferimento bibliografico n. (8)]

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 198
 ▼B

 
B.1ter. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA ORALE — METODO DELLA 
CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA  
1. METODO  
Questo metodo di saggio è equivalente al metodo OCSE TG 423 
(2001).  
1.1 INTRODUZIONE  
Il metodo della classe di tossicità acuta (1) qui descritto è un pro ­
cedimento articolato in più fasi successive che prevede l'uso di 3 animali dello stesso sesso in ogni fase. In media, per valutare la 
tossicità acuta di una sostanza sono necessarie 2-4 fasi, in funzione 
del numero di animali morti e/o moribondi. Il procedimento è ripro ­
ducibile, utilizza un numero molto limitato di animali e permette di classificare le sostanze in maniera analoga agli altri metodi di deter ­
minazione della tossicità acuta. Il metodo della classe di tossicità 
acuta si basa su valutazioni biometriche (2)(3)(4)(5) e utilizza dosi fisse, opportunamente separate, per consentire la classificazione della sostanza ai fini dell'assegnazione a una particolare categoria e della 
valutazione dei rischi. Il metodo, adottato nel 1996, è stato ampia ­
mente convalidato  in vivo  mediante dati sulla DL
 50 ricavati dalla 
letteratura esistente, sia a livello nazionale (6) che a livello interna ­
zionale (7).  
Per indicazioni sulla scelta del metodo di prova più adatto per scopi 
specifici, si rimanda al documento orientativo sui saggi di tossicità acuta per via orale dell'OCSE (8). Tale documento contiene anche ulteriori informazioni sull'applicazione e sull'interpretazione del me ­
todo di saggio B.1  ter.
 
Non è necessario somministrare le sostanze da esaminare in dosi che 
provocano notoriamente dolore e sofferenze gravi per effetto delle proprietà corrosive o fortemente irritanti delle sostanze stesse. Ai fini 
dell'interpretazione dei risultati del saggio, gli animali moribondi o 
che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e assimilati agli ani ­
mali morti spontaneamente nel corso dell'esperimento. I criteri da 
applicare per decidere in merito al sacrificio degli animali moribondi 
o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno specifico docu ­
mento orientativo, che riporta anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (9).
 
Il metodo utilizza dosi prestabilite e i risultati che se ne ricavano 
permettono di classificare la sostanza esaminata conformemente al sistema armonizzato su scala mondiale (GHS) per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità acuta (10).
 
In linea di principio, il metodo non ha lo scopo di determinare una 
DL 50 precisa, ma consente di stabilire range di esposizione verosi ­
milmente letali: la morte di una certa percentuale di animali, infatti, costituisce ancora l'endpoint principale di questo saggio. Il metodo 
consente di determinare un valore di DL
 50 solo quando almeno due 
dosi provocano una mortalità superiore allo 0 % e inferiore al 100 %. L'uso di dosi prestabilite, indipendentemente dalla sostanza in esame, e la classificazione esplicitamente legata al numero di animali osser ­
vati in diversi stati favoriscono la congruenza e la ripetibilità dei dati 
presentati dai vari laboratori.
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Il laboratorio che esegue il saggio deve consultare tutte le informa ­
zioni disponibili sulla sostanza in esame prima di effettuare lo studio. 
Tali informazioni devono riguardare quantomeno l'identità e la strut ­
tura chimica; le proprietà chimico-fisiche; i risultati di eventuali altri saggi di tossicità  in vitro  o in vivo  eseguiti sulla sostanza; i dati 
tossicologici su sostanze di struttura affine; l'impiego o gli impieghi 
previsti. Queste informazioni sono necessarie per provare a tutti i soggetti interessati la rilevanza del saggio per la protezione della salute degli esseri umani, e sono utili per la scelta della dose iniziale 
più appropriata.
 
1.2 DEFINIZIONI  
Tossicità acuta per via orale:  effetti avversi che si verificano in 
seguito alla somministrazione orale di una singola dose di una so ­
stanza o di più dosi nell'arco di 24 ore.  
Morte tardiva:  termine usato per indicare che l'animale non muore 
né appare moribondo nelle 48 ore successive alla somministrazione, ma muore successivamente nei 14 giorni del periodo di osservazione.
 
Dose:  quantità di sostanza somministrata. Viene espressa in peso per 
unità di peso dell'animale usato per il saggio (p. es. mg/kg).  
GHS:  sistema armonizzato su scala mondiale per la classificazione 
delle sostanze chimiche e dei relativi miscugli. Si tratta di un'inizia ­
tiva congiunta dell'OCSE (salute degli esseri umani e ambiente), del 
Comitato di esperti delle Nazioni Unite sul trasporto delle sostanze 
pericolose (proprietà fisico-chimiche) e dell'ILO (comunicazione dei rischi), coordinata dal programma inter-organizzazioni per una ge ­
stione responsabile delle sostanze chimiche (IOMC).
 
Morte imminente:  stato in cui si prevede che l'animale sarà mori ­
bondo o morto prima della successiva osservazione in programma. Nei roditori, tra i segni indicativi di morte imminente sono compresi convulsioni, posizione laterale o prona e tremore [per maggiori in ­
dicazioni, vedi il documento orientativo sugli endpoint non 
crudeli (9)].
 
DL 50 (dose letale mediana):  la singola dose di sostanza, determi ­
nata statisticamente, che si prevede causi la morte del 50 % degli 
animali a cui viene somministrata per via orale. Il valore della DL  50 
viene espresso in peso per unità di peso dell'animale usato per il 
saggio (mg/kg).  
Dose limite:  dose corrispondente al limite superiore fissato per il 
saggio (2 000 o 5 000 mg/kg).  
Moribondo:  che sta morendo o non è in grado di sopravvivere, 
nemmeno se sottoposto a trattamento [per maggiori indicazioni, 
vedi il documento orientativo sugli endpoint non crudeli (9)].  
Morte prevedibile:  presenza di segni clinici, ad esempio incapacità 
di raggiungere il cibo o l'acqua, che indicano che l'animale morirà prima della conclusione programmata dell'esperimento [per maggiori 
indicazioni, vedi il documento orientativo sugli endpoint non 
crudeli (9)].
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1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Il metodo prevede l'applicazione di un procedimento articolato in fasi 
successive che richiede l'uso di un numero minimo di animali in ciascuna fase e permette di ricavare informazioni sufficienti per la 
classificazione della tossicità acuta della sostanza in esame. La so ­
stanza viene somministrata per via orale a un gruppo di animali da laboratorio in una delle dosi prestabilite. Il saggio viene effettuato seguendo un procedimento in fasi successive; in ciascuna fase ven ­
gono utilizzati tre animali dello stesso sesso (normalmente femmine). 
In funzione della presenza o assenza di mortalità riferibile alla so ­
stanza in esame tra gli animali trattati, per ciascuna fase si possono 
avere tre esiti diversi:
 
— interruzione del saggio  
— somministrazione della sostanza ad altri tre animali, alla stessa 
dose 
— somministrazione della sostanza ad altri tre animali al livello di 
dose immediatamente superiore o inferiore.  
Lo schema dettagliato del procedimento è riportato nell'allegato 1. Il 
metodo consente di valutare la sostanza allo scopo di assegnarla a 
una delle classi di tossicità definite da valori discriminanti fissi di 
DL 50 . 
1.4 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1  Scelta delle specie di animali  
La specie di roditori da preferirsi è rappresentata dal ratto, ma è 
possibile utilizzare anche altre specie di roditori. Normalmente ven ­
gono utilizzati animali di sesso femminile (9), perché la letteratura 
esistente circa i saggi convenzionali sulla DL  50 indica che, pur non 
essendovi grandi differenze di sensibilità tra i due sessi, nei casi in cui sono state osservate differenze in genere le femmine sono risul ­
tate leggermente più sensibili (11). Peraltro, se le informazioni di ­
sponibili sulle proprietà tossicologiche o tossicocinetiche di sostanze chimiche di struttura affine indicano che i maschi sono verosimil ­
mente più sensibili delle femmine, si devono usare animali di sesso 
maschile. Qualora vengano usati animali di sesso maschile, se ne deve fornire un'adeguata motivazione.
 
Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a 
ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere 
nullipare e non gravide. Ciascun animale, all'inizio del trattamento, deve essere di età compresa fra 8 e 12 settimane e di peso del ± 20 % del peso medio di eventuali animali a cui è stata precedente ­
mente somministrata la sostanza in esame.
 
1.4.2  Condizioni di stabulazione e di alimentazione  
La temperatura dello stabulario deve essere di 22  o C (± 3  o C). 
L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L'illuminazione deve 
essere artificiale e alternare 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per 
l'alimentazione si possono utilizzare diete convenzionali da laborato ­
rio con acqua ad libitum. Nelle gabbie, gli animali possono essere raggruppati in funzione della dose, ma il numero di animali per 
gabbia non deve essere tale da impedire la corretta osservazione di 
ciascun esemplare.
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1.4.3  Preparazione degli animali  
Gli animali devono essere scelti in modo casuale, marchiati per 
consentire l'individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell'inizio del trattamento, in modo da 
consentirne l'acclimatazione alle condizioni di laboratorio.
 
1.4.4  Preparazione delle dosi  
In genere le somministrazioni delle sostanze in esame devono avere 
un volume costante per tutte le dosi oggetto del saggio; a questo scopo, si varia la concentrazione del preparato da somministrare. 
Tuttavia, se il saggio viene eseguito su prodotti o miscugli che si 
presentano in forma liquida, ai fini della successiva valutazione del rischio può essere opportuno usare la sostanza non diluita, cioè a concentrazione costante; peraltro, l'uso della sostanza non diluita è 
prescritto da alcune autorità di regolamentazione. In ogni caso, non 
si deve superare il volume massimo somministrabile. Il volume mas ­
simo di liquido somministrabile in una sola volta dipende dalla taglia dell'animale. Nei roditori, di norma non deve superare 1 ml/100 g di 
peso corporeo tranne nel caso delle soluzioni acquose, per le quali si 
possono prevedere 2 ml/100 g di peso corporeo. Quanto alla formu ­
lazione del preparato da somministrare, si raccomanda di usare ove possibile una soluzione/sospensione/emulsione acquosa oppure, in 
ordine di preferenza, una soluzione/sospensione/emulsione in olio 
(per esempio olio di mais) o una soluzione in altri veicoli. Nel caso in cui si utilizzino veicoli diversi dall'acqua, devono essere note le caratteristiche di tossicità degli stessi. Le dosi devono essere 
preparate poco prima della somministrazione, tranne nel caso in cui 
la stabilità del preparato nell'arco del periodo di utilizzo sia nota e si sia dimostrata accettabile.
 
1.5 PROCEDIMENTO  
1.5.1  Somministrazione delle dosi  
La sostanza da saggiare viene somministrata in un'unica dose me ­
diante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Nel caso 
infrequente in cui non sia possibile somministrare l'intera quantità in un'unica dose, si può procedere al frazionamento della stessa e alla somministrazione delle varie frazioni nell'arco di un periodo non 
superiore a 24 ore.
 
Gli animali devono essere tenuti a digiuno prima della somministra ­
zione della sostanza (p. es. l'alimentazione, a esclusione dell'acqua, deve essere sospesa a partire dalla sera precedente nei ratti e per 3-4 
ore nei topi). Dopo il periodo di digiuno, si pesano gli animali e si 
somministra la sostanza da esaminare. A somministrazione avvenuta, il cibo può essere sospeso per altre 3-4 ore nei ratti o 1-2 ore nei topi. Qualora la dose venga frazionata e somministrata nell'arco di un 
certo periodo di tempo, può essere necessario alimentare e abbeve ­
rare gli animali in misura adeguata alla durata del periodo di som ­
ministrazione.
 
1.5.2  Numero di animali e livelli di dose  
Si utilizzano tre animali in ciascuna fase. La dose iniziale viene 
scelta fra quattro livelli fissi: 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg di peso 
corporeo. Il livello di dose iniziale deve essere quello che con mag ­
gior probabilità provoca la morte di una parte degli animali trattati. I diagrammi di flusso dell'allegato 1 illustrano il procedimento da seguire per ciascuna delle dosi iniziali, mentre l'allegato 4 riporta 
indicazioni sulla classificazione secondo il sistema UE in attesa del ­
l'applicazione del nuovo sistema GHS.
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Qualora, alla luce delle informazioni disponibili, la mortalità risulti 
improbabile al livello di dose iniziale più elevato (2 000 mg/kg di 
peso corporeo), si deve fare ricorso a un saggio limite. In mancanza di informazioni su una sostanza da esaminare, per il benessere degli animali si raccomanda di utilizzare la dose iniziale di 300 mg/kg di 
peso corporeo.
 
L'intervallo di tempo tra il trattamento dei diversi gruppi viene de ­
terminato in funzione dell'esordio, della durata e della gravità dei segni di tossicità, avendo cura di procedere al trattamento degli ani ­
mali alla dose successiva solo una volta accertata la 
sopravvivenza degli animali trattati precedentemente.
 
In casi eccezionali, e solo se specifiche esigenze normative lo giu ­
stificano, può essere previsto un ulteriore livello di dose fisso supe ­
riore pari a 5 000 mg/kg (vedi allegato 2). Per il benessere degli 
animali, si sconsiglia di effettuare sperimentazioni su animali alle 
dosi stabilite per la categoria GHS 5 (2 000-5 000 mg/kg); l'utilizzo di tali dosi è da prevedere solo se vi è una probabilità elevata che i risultati del saggio abbiano rilevanza diretta per la tutela della 
salute degli animali o dell'uomo o per la salvaguardia dell'ambiente.
 
1.5.3  Saggio limite  
Il saggio limite viene utilizzato principalmente quando lo sperimen ­
tatore dispone di informazioni che indicano che la sostanza in esame è verosimilmente non tossica, cioè causa tossicità solo in dosi supe ­
riori alle dosi limite previste per legge. Le informazioni sulla tossi ­
cità della sostanza in esame possono essere ricavate da conoscenze 
su composti, miscugli o prodotti simili esaminati, tenendo conto dell'identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Nel caso in cui le informazioni sulla tossicità 
della sostanza siano scarse o nulle, o in cui ci si attenda che la 
sostanza in esame sia tossica, il saggio principale deve essere ese ­
guito.
 
Il saggio limite si effettua con un unico livello di dose di 2 000 
mg/kg di peso corporeo su sei animali (tre animali per fase). In 
casi eccezionali, si può utilizzare un unico livello di dose di 5 000 
mg/kg su tre animali (vedi allegato 2). Se si osservano decessi rife ­
ribili alla sostanza in esame, può essere necessario eseguire un altro saggio al livello di dose immediatamente inferiore.
 
1.6 OSSERVAZIONE  
Dopo la somministrazione, gli animali sono esaminati individual ­
mente almeno una volta nei primi 30 minuti, quindi periodicamente 
nelle prime 24 ore, ponendo particolare attenzione nelle prime 4 ore, e successivamente una volta al giorno per 14 giorni in tutto, tranne nel caso in cui sia necessario ritirarli dallo studio e sottoporli a 
eutanasia per motivi legati al loro benessere, o nel caso in cui ven ­
gano rinvenuti morti. Tuttavia, la durata dell'osservazione non è tassativa, e va stabilita in funzione delle reazioni tossiche, del mo ­
mento della loro insorgenza e della durata del periodo di recupero; se 
necessario, quindi, è possibile prolungarla. Un parametro importante 
è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una ten ­
denza a manifestare segni di tossicità tardiva (12). Tutte le osserva ­
zioni devono essere sistematicamente registrate su schede individuali 
per ogni animale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 203
 
Ulteriori osservazioni sono necessarie qualora gli animali presentino 
segni persistenti di tossicità. Dette osservazioni devono comprendere 
le modificazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell'attività e del comportamento somatomotori. Particolare 
attenzione deve essere rivolta all'osservazione di tremori, convulsio ­
ni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento orienta ­
tivo sugli endpoint non crudeli (9). Gli animali moribondi o che 
manifestano dolore intenso o segni di sofferenza grave e persistente 
devono essere sottoposti a eutanasia. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.
 
1.6.1  Peso corporeo  
I singoli animali devono essere pesati poco prima della sommini ­
strazione della sostanza da saggiare e in seguito almeno una volta alla settimana. Le variazioni ponderali devono essere calcolate e registrate. Al termine del saggio, gli animali sopravvissuti devono 
essere pesati e sottoposti a eutanasia.
 
1.6.2  Esame patologico  
Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso 
del saggio e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a necroscopia macroscopica. 
Per ogni animale devono essere registrate tutte le modificazioni pa ­
tologiche di rilievo. Per gli animali sopravvissuti almeno 24 ore, l'esame microscopico degli organi recanti alterazioni patologiche evi ­
denti potrebbe fornire indicazioni utili ed essere quindi opportuno.
 
2. DATI  
Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, 
tutti i dati devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo del saggio, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni di tossicità, il numero di 
animali rinvenuti morti durante il saggio o sottoposti a eutanasia, 
il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e i risultati della necroscopia.
 
3. RELAZIONE  
3.1 Relazione sul saggio  
La relazione sul saggio deve contenere le seguenti informazioni, 
a seconda dei casi:  
Sostanza in esame:  
— natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche 
(compresa l'isomerizzazione);  
— dati identificativi, compreso il numero CAS.  
Veicolo (se del caso):  
— motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dal ­
l'acqua.  
Animali da esperimento:  
— specie/ceppo utilizzato;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 204
 
— condizioni microbiologiche degli animali, qualora siano note;  
— numero, età e sesso degli animali (compresa, se del caso, la 
motivazione dell'uso di esemplari maschi anziché femmine);  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.;  
Condizioni sperimentali:  
— informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza in esa ­
me, comprese informazioni sulla forma fisica del preparato som ­
ministrato;  
— modalità precise di somministrazione della sostanza in esame, 
compresi volumi e orari delle somministrazioni;  
— informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua (com ­
presi tipo di dieta/provenienza, provenienza dell'acqua);  
— motivazione della scelta della dose iniziale.  
Risultati:  
— tabella con risposta e livello di dose per ciascun animale (vale a 
dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità com ­
presa; natura, gravità e durata degli effetti);  
— tabella del peso corporeo e delle relative modificazioni;  
— peso dei singoli animali il giorno della somministrazione, quindi 
a intervalli di una settimana, e infine al momento della morte o del sacrificio;
 
— data e ora della morte, se questa avviene prima del sacrificio 
programmato;  
— momento della comparsa dei segni di tossicità, loro decorso ed 
eventuale reversibilità, per ciascun animale;  
— reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun 
animale.  
Discussione e interpretazione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Per ­
spectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. 
Lett., Suppl. 31, 86  
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.  
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Me ­
thods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A Na ­
tional Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An 
Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66,455-470.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Me ­
thod (Oral). Arch. Toxicol. 69,659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment N 19.  
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Che ­
mical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in 
November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ ­
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 24-no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology.  Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 206
 
Allegato 1  
PROCEDIMENTO DA SEGUIRE PER CIASCUNA DELLE DOSI 
INIZIALI  
OSSERVAZIONI GENERALI  
Il procedimento da seguire per ciascuna dose iniziale è indicato nei diagrammi di 
questo allegato.  
— Allegato 1a: dose iniziale 5 mg/kg di peso corporeo  
— Allegato 1b: dose iniziale 50 mg/kg di peso corporeo  
— Allegato 1c: dose iniziale 300 mg/kg di peso corporeo  
— Allegato 1d: dose iniziale 2 000 mg/kg di peso corporeo  
Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali 
sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 207
 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 208
 ▼B 
Allegato 1 A  
PROCEDIMENTO CON DOSE INIZIALE DI 5 MG/KG DI PESO CORPOREO

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 209
 ▼B 
Allegato 1 B  
PROCEDIMENTO CON DOSE INIZIALE DI 50 MG/KG DI PESO CORPOREO

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 210
 ▼B 
Allegato 1 C  
PROCEDIMENTO CON DOSE INIZIALE DI 300 MG/KG DI PESO CORPOREO

 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 211
 ▼B 
Allegato 1 D  
PROCEDIMENTO CON DOSE INIZIALE DI 2 000 MG/KG DI PESO CORPOREO

 Allegato 2  
CRITERI PER LA CLASSIFICAZIONE DI SOSTANZE CON VALORI DI 
DL 50 ATTESI SUPERIORI A 2 000 MG/KG SENZA BISOGNO DI 
ESEGUIRE UN SAGGIO DI TOSSICITÀ  
I criteri relativi alla categoria di rischio 5 hanno lo scopo di consentire l'identi ­
ficazione di sostanze che presentano un rischio di tossicità acuta relativamente 
basso ma che, in determinate situazioni, possono rappresentare un pericolo per popolazioni vulnerabili. Si tratta di sostanze che si prevede abbiano una DL
 50 
orale o cutanea compresa fra 2 000 e 5 000 mg/kg o dosi equivalenti per altre vie 
di somministrazione. Una sostanza può essere classificata nella categoria di ri ­
schio definita da: 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 nel GHS) nei 
casi seguenti:  
a) se uno qualsiasi degli schemi di cui all'allegato 1a-1d porta a inserire tale 
sostanza in questa categoria, sulla base delle incidenze di mortalità;  
b) se sono già disponibili dati obiettivi attendibili che indicano che la DL  50 si 
situa nell'intervallo di valori della categoria 5, o se altri studi su animali o 
effetti tossici nell'uomo indicano un rischio di tossicità acuta per l'uomo;  
c) per estrapolazione, stima o misurazione di dati se non è giustificata l'asse ­
gnazione a una classe di rischio maggiore, e se  
— sono disponibili informazioni attendibili che indicano effetti tossici signi ­
ficativi nell'uomo, o  
— si osserva mortalità nei saggi eseguiti fino ai valori della categoria 4 per 
via orale, o  
— valutazioni di esperti confermano segni clinici significativi di tossicità nei 
saggi eseguiti fino ai valori della categoria 4, a esclusione di diarrea, 
piloerezione o aspetto non tolettato, o  
— valutazioni di esperti confermano informazioni attendibili, ricavate dagli 
altri studi su animali, che indicano potenziali effetti acuti significativi.  
ESECUZIONE DEL SAGGIO A DOSI SUPERIORI A 2 000 MG/KG  
Data la necessità di tutelare il benessere degli animali, si sconsiglia di utilizzare 
la dose prevista per la categoria 5 (5 000 mg/kg); l'utilizzo di tale dose è da 
prevedere solo nel caso in cui sia molto probabile che i risultati del saggio abbiano rilevanza diretta per la protezione della salute degli esseri umani 
o degli animali (10). Non devono essere effettuati ulteriori saggi a livelli di 
dose superiori.
 
Quando è necessario effettuare un saggio di tossicità alla dose di 5 000 mg/kg, 
tale saggio deve essere eseguito in una sola fase (e quindi su tre animali). Se il primo animale a cui viene somministrata la sostanza muore, si procede sommini ­
strando la sostanza a 2 000 mg/kg, così come indicato nei diagrammi di flusso 
dell'allegato 1. Se il primo animale sopravvive, la sostanza viene somministrata alla stessa dose ad altri due animali. Se solo uno dei tre animali muore, si ritiene che il valore di DL
 50 sia superiore a 5 000 mg/kg. Se due animali muoiono, si 
procede somministrando la sostanza a 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 212
 
Allegato 3  
METODO DI SAGGIO B.1  ter: indicazioni sulla classificazione secondo lo schema UE nel 
periodo di transizione in attesa della piena applicazione del sistema di classificazione 
armonizzato su scala mondiale (GHS) [ricavate dalla voce bibliografica (8)]
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B.2. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove 
sulle sostanze chimiche n. 403 (2009) (1). La prima linea guida sulla tos ­
sicità acuta per inalazione n. 403 è stata adottata nel 1981. Questo metodo di 
prova rivisto B.2 (equivalente alla linea guida n. 403 rivista) è stato conce ­
pito per offrire una maggior flessibilità, ridurre l’utilizzo di animali e ri ­
spondere alle prescrizioni normative. Questo metodo di prova prevede due tipi di studi: un protocollo tradizionale di determinazione della LC
 50 e un 
protocollo «concentrazione × tempo» (C × t). Le caratteristiche principali di 
questo metodo di prova sono la capacità di ottenere un rapporto concen ­
trazione/risposta che va da «letale» a «non letale» al fine del calcolo della mediana della concentrazione letale (CL
 50 ), della soglia di concentrazione 
non letale (come la CL  01 ) e della pendenza, nonché la capacità di determi ­
nare un’eventuale sensibilità legata al sesso. Il protocollo C × t deve essere utilizzato quando sussiste una particolare esigenza scientifica o normativa che preveda una prova su animali per varie durate di esposizione, ad esem ­
pio per la pianificazione territoriale o la pianificazione della risposta di 
emergenza [per ottenere, ad esempio, i livelli guida di esposizione acuta (Acute Exposure Guideline Levels  — AEGL), le raccomandazioni per la 
pianificazione delle misure di emergenza ( Emergency Response Planning 
Guidelines  — ERPG), o i livelli soglia di esposizione acuta ( Acute Exposure 
Threshold Levels — AETL )].
 
2. Nel documento d’orientamento sulla prove di tossicità acuta per inalazione 
(documento d’orientamento n. 39) (2) sono riportate indicazioni sulla rea ­
lizzazione e l’interpretazione degli studi legati a questo metodo di prova.  
3. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono speci ­
ficate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2).  
4. Questo metodo di prova consente di caratterizzare le sostanze in esame, di 
sottoporle ad una valutazione quantitativa dei rischi e di classificarle a norma del regolamento (CE) n. 1272/2008 (3). Il documento di orienta ­
mento n. 39 (2) fornisce indicazioni per la scelta del metodo di prova 
adeguato per le prove di tossicità acuta. Quando sono necessarie solo infor ­
mazioni sulla classificazione e l’etichettatura, si raccomanda di far riferi ­
mento al capitolo B.52 del presente allegato (4) [cfr. documento d’orienta ­
mento n. 39 (2)]. Questo metodo di prova B.2 non è specificamente desti ­
nato a testare materiali speciali come le sostanze isometriche o fibrose poco 
solubili o i nanomateriali di sintesi.
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
5. Prima di decidere di avvalersi di questo metodo di prova, il laboratorio che 
esegue la prova deve esaminare tutte le informazioni disponibili sulla so ­
stanza chimica in esame, ivi compresi gli studi esistenti [ad esempio capitolo 
B.52 del presente allegato (4)] i cui risultati renderebbero inutili prove aggiuntive, al fine di ricorrere il meno possibile agli animali. Tra le infor ­
mazioni utili per la scelta della specie, del ceppo, del sesso, della modalità 
di esposizione e delle concentrazioni più adeguati, rientrano l’identità, la 
struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame; i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli impieghi previsti e il potenziale in termini di esposizione umana; dati (Q)SAR e dati 
tossicologici disponibili su sostanze chimiche di struttura affine [cfr. docu ­
mento d’orientamento n. 39 (2)].
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6. Occorre evitare il più possibile di testare sostanze chimiche corrosive o 
gravemente irritanti a concentrazioni che possono provocare dolore e soffe ­
renza intensi. Per stabilire se sia possibile evitare prove aggiuntive, occorre valutare il potenziale di corrosione/irritazione secondo i criteri degli specia ­
listi in funzione degli elementi seguenti: dati sperimentali sull’uomo e l’ani ­
male (provenienti, ad esempio, da prove a dosi ripetute realizzate a concen ­
trazioni non corrosive né irritanti), dati in vitro disponibili [ad esempio dai capitoli B.40 (5), B.40  bis (6) del presente allegato o dalla linea guida 
dell’OCSE n. 435 (7)], valori del pH, informazioni concernenti sostanze 
analoghe o qualsiasi altro dato pertinente. Per specifiche esigenze normative 
(ad esempio per la pianificazione di emergenza), questo metodo di prova può essere utilizzato per esporre animali a sostanze di questo tipo in quanto consente al responsabile dello studio o al ricercatore principale di scegliere 
le concentrazioni. Tuttavia le concentrazioni auspicate non devono avere 
effetti corrosivi/irritanti gravi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e normativo della prova. Occorre sempre giustificare le concentrazioni scelte 
[cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].
 
PRINCIPIO DELLA PROVA  
7. Questo metodo di prova rivisto B.2 è stato concepito per ottenere informa ­
zioni sufficienti sulla tossicità acuta di una sostanza chimica al fine di consentirne la classificazione e fornire dati sulla letalità (CL
 50 , CL  01 e 
inclinazione) per uno o entrambi i sessi. Questi dati sono necessari per le 
valutazioni quantitative dei rischi. Il metodo in questione prevede due pro ­
cedure diverse. La prima è un protocollo tradizionale in cui gruppi di animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o a una 
serie di concentrazioni secondo una procedura articolata in fasi successive 
per una durata prestabilita, di solito pari a 4 ore. Se necessario per motivi regolamentari, la durata dell’esposizione può essere diversa. La seconda procedura è un protocollo («C × t») in cui gruppi di animali sono esposti 
ad una concentrazione (concentrazione limite) o a una serie di concentra ­
zioni diverse per durate diverse.
 
8. Ai fini dell’interpretazione dei risultati della prova, gli animali moribondi o 
che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente 
devono essere sottoposti a eutanasia e considerati alla stregua degli animali morti naturalmente nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza 
sono oggetto di uno documento d’orientamento specifico, che contiene an ­
che indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o immi ­
nente (8).
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
9. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi co ­
munemente usati in laboratorio. La specie generalmente utilizzata è il ratto e 
occorre motivare l’eventuale scelta di una specie diversa.  
Preparazione degli animali  
10. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno dell’esposizio ­
ne, gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane il cui peso corporeo non deve superare, per ciascun sesso, 
± 20 % del peso medio degli animali di ciascun sesso della stessa età 
precedentemente esposti. Gli animali sono scelti a caso e marcati per l’iden ­
tificazione individuale. Affinché si adattino alle condizioni di laboratorio, devono essere lasciati nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio 
della prova e, poco prima della prova, vanno anche acclimatati alle apparec ­
chiature di prova per attenuare la tensione causata dal nuovo ambiente.
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Condizioni di allevamento degli animali  
11. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa 
va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposi ­
zione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e 
concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene 
unicamente per via nasale, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi 
di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli effetti misurati (en ­
dpoint) fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume 
respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali 
esposti «a corpo intero» ad un aerosol devono essere stabulati separatamente 
per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizio ­
ne, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certi ­
ficate da laboratorio, accompagnate da acqua a volontà. L’illuminazione 
deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.
 
Camere di inalazione  
12. La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza 
chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposi ­
zione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione «a naso 
solo» per gli studi di aerosol liquidi o solidi e per i vapori che si possono 
condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione «a corpo intero» può es ­
sere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità 
atmosferica di una camera di esposizione «a corpo intero», il volume com ­
plessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione «a corpo intero» e per sola via nasale, 
nonché i relativi vantaggi e svantaggi.
 
CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Somministrazione delle concentrazioni  
13. Le esposizioni «a naso solo» possono durare fino a 6 ore per i ratti. Nel 
caso dei topi, questa forma di esposizione deve durare al massimo 4 ore. 
Qualora siano necessari esposizioni di più lunga durata, occorre spiegarne il motivo [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Gli animali esposti agli aerosol in camere «a corpo intero» devono essere sistemati individualmente 
per evitare l’ingestione della sostanza in esame nel corso della pulizia degli 
altri animali presenti nella stessa gabbia. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa. Nel corso dell’esposizione «a corpo intero» si può continuare a somministrare acqua.
 
14. Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, 
aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà 
fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della sua manipolazione e del suo utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal 
punto di vista chimico devono essere saggiate in atmosfera secca. Occorre 
prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive.
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Distribuzione granulometrica  
15. La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che 
potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare de ­
gli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) com ­
preso tra 1 e 4 μm con una deviazione standard geometrica ( σ
 g ) compresa 
tra 1,5 e 3,0 (2) (9) (10). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario il parere di uno 
specialista. Ad esempio, le particelle dei fumi metallici possono essere più 
piccole del limite inferiore sopraindicato, e le particelle caricate, le fibre e i materiali igroscopici (le cui dimensioni aumentano nell’ambiente umido 
delle vie respiratorie) possono oltrepassare il limite superiore.
 
Preparazione della sostanza in esame in un veicolo  
16. Per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in 
esame nell’atmosfera si può utilizzare un veicolo. Di norma è preferibile 
utilizzare l’acqua. Le particelle possono essere sottoposte a processi mecca ­
nici per ottenere la distribuzione granulometrica voluta, tuttavia occorre prestare attenzione a non decomporre o alterare la sostanza in esame. Qua ­
lora si ritenga che i processi meccanici abbiano alterato la composizione 
della sostanza in esame (temperatura estrema dovuta alla frizione da ecces ­
siva macinazione), occorrerà verificare mediante analisi la composizione della sostanza in esame. Occorre prestare particolare attenzione a non con ­
taminare la sostanza in esame. Non è necessario testare le materie granulari 
non friabili, appositamente concepite per essere non inalabili. Per dimostrare 
che la manipolazione del materiale granulare non produce particelle respi ­
rabili, effettuare una prova di logorio per attrito. Se la prova di logorio produce sostanze respirabili, occorre effettuare una prova di tossicità per 
inalazione.
 
Animali di controllo  
17. Non è necessario un gruppo di controllo negativo (aria) in parallelo. Se per 
produrre l’atmosfera di prova si utilizza un veicolo diverso dall’acqua, è 
necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo solo se non si dispone 
di dati storici sulla tossicità. Se in uno studio di tossicità della sostanza in esame in un mezzo non si rileva tossicità, ciò significa che il mezzo non è tossico alla concentrazione in questione; pertanto non occorre un gruppo di 
controllo del veicolo.
 
MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Flusso d’aria nella camera di esposizione  
18. Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in 
continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio della concentrazione (o stabilità) dell’atmosfera di prova co ­
stituisce una misurazione permanente di tutti i parametri dinamici e un modo 
indiretto di controllare quelli che regolano la produzione dell’atmosfera di prova. Nelle camere d’esposizione «a naso solo», si farà il possibile, per evitare la reinalazione qualora il flusso d’aria attraverso il sistema di espo ­
sizione non sia in grado di garantire una circolazione dinamica dell’atmo ­
sfera di prova. Esistono metodi specifici cui si può ricorrere per dimostrare che non si verificano reinalazioni nelle condizioni sperimentali prescelte (2) (11). La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la 
concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si 
ritenga di non poter rispettare questi standard, è necessario misurarle.
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Temperatura e umidità relativa della camera  
19. La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. L’umi ­
dità relativa nella zona in cui respira l’animale, sia per le esposizioni «a naso solo» che per quelle «a corpo intero», è monitorata e registrata almeno 
tre volte (per le prove che durano fino a 4 ore) e tutte le ore per le durate 
più brevi. L’umidità relativa deve idealmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esem ­
pio, quando si testano miscele acquose) o che l’umidità non possa essere 
misurata per via delle interferenze della sostanza in esame con il metodo di 
prova.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale  
20. Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale 
nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divi ­
sione della massa generata dalla sostanza in esame per il volume totale di aria circolata nella camera. La concentrazione nominale non serve a carat ­
terizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione 
nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di pro ­
duzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi a questo livello.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale  
21. La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame nella 
zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentra ­
zioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio 
campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica 
è accettabile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico com ­
ponente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su oppor ­
tune caratterizzazioni, specifiche per la sostanza in esame, effettuate prima dello studio. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la 
concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma 
occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza 
in esame (idealmente sotto forma di aerosol) durante lo studio. Per gli agenti 
aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. Le concentrazioni bersaglio nominali e reali devono essere riportate nella relazione, ma 
nell’analisi statistica per il calcolo dei valori delle concentrazioni letali 
sono utilizzate solo le concentrazioni reali.
 
22. Si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il 
campione allo studio va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre 
caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se 
tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità di contaminanti e di impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area di picco, peso molecolare risultante dalla spet ­
troscopia di massa o dalla gascromatografia, o altre stime. Il laboratorio che 
effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione è opportuno che confermi almeno in parte la carat ­
terizzazione del cliente (colore, natura fisica ecc.).
 
23. L’atmosfera di esposizione è mantenuta il più costante possibile e monito ­
rata in continuo e/o in modo intermittente secondo il metodo di analisi. 
Quando si procede ad un campionamento intermittente, in uno studio di 
quattro ore si devono raccogliere campioni dell’atmosfera della camera al ­
meno due volte. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un solo 
campione nell’intero periodo di esposizione. Se si osservano evidenti flut ­
tuazioni da un campione all’altro, per le concentrazioni successive si devono
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prelevare quattro campioni per esposizione. Gli scarti di concentrazione in 
ogni camera e la concentrazione media non devono superare ± 10 % per i 
gas e i vapori o ± 20 % per gli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera di esposizione (t
 95 ) La durata di un’esposizione coincide con il tempo di 
produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per 
ottenere il t  95 . Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni 
per la stima di t  95 . 
24. Per le miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol 
(atmosfere di combustione o sostanze di prova propulse da prodotti/dispo ­
sitivi specializzati, ad esempio), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere una sostanza indicatrice (analita). Quando la sostanza in 
esame è una miscela, la concentrazione analitica dovrà essere indicata per la 
preparazione e non solo per la sostanza attiva o il componente (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel docu ­
mento d’orientamento n. 39 (2).
 
Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica  
25. La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata al ­
meno due volte nel corso di ciascuna esposizione di 4 ore, utilizzando un 
impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS ( Ae­
rodynamic Particle Sizer ). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e 
con un altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utiliz ­
zato nel corso dell’intero studio. Per confermare l’efficienza di estrazione 
dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, 
con scarti ragionevoli, a quella ottenuta mediante l’analisi su filtro [cfr. 
documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza viene stabilita nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misura ­
zioni di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più 
possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere 
un’esposizione. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che possono condensarsi e formare aerosol o se, in un’atmosfera di vapore, si rilevano particelle che si presume possano formare fasi miste (cfr. 
paragrafo 15).
 
PROCEDURA  
26. Qui di seguito sono descritti due tipi di studio: il protocollo tradizionale e il 
protocollo C × t. Entrambi i protocolli possono comprendere uno studio di osservazione, uno studio principale e/o una prova limite (protocollo tradi ­
zionale) o una prova a concentrazione limite (C × t). Se uno dei due sessi è 
notoriamente più sensibile, il responsabile dello studio può scegliere di 
effettuare queste prove solo con animali di questo sesso. Se per l’esposi ­
zione «a naso solo» s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è pos ­
sibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo 
stress tollerato dalla specie in causa. Prima di iniziare lo studio, è opportuno 
esaminare tutti i dati disponibili al fine di ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Ad esempio, i dati ottenuti sulla base del capitolo B.52 del presente allegato (4) possono rendere superfluo lo studio di osservazione e dimostrare 
anche se uno dei due sessi è più sensibile [cfr. documento di orientamento 
n. 39 (2)].
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PROTOCOLLO TRADIZIONALE:  
Osservazioni generali: Protocollo tradizionale  
27. In uno studio tradizionale, gruppi di animali sono esposti a una sostanza di 
prova per un periodo stabilito di tempo (generalmente 4 ore) in una camera di esposizione «a naso solo» o «a corpo intero». Gli animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o ad almeno tre concentrazioni in 
fasi successive (studio principale). Lo studio principale può essere preceduto 
da uno studio di osservazione, a meno che non si disponga già di alcune informazioni sulla sostanza in esame, tratte da uno studio B.52 precedente [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].
 
Studio di osservazione: Protocollo tradizionale  
28. Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in 
esame, di individuare le differenze tra i sessi in termini di sensibilità alla 
sostanza, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per lo 
studio principale o la prova limite. Al momento della scelta dei livelli di concentrazione per lo studio di osservazione, è opportuno utilizzare tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i dati (Q)SAR e i dati relativi a 
sostanze chimiche analoghe. Per ogni concentrazione, è opportuno esporre 
al massimo tre maschi e tre femmine (può essere necessario utilizzare tre animali per sesso per stabilire una differenza di sensibilità tra i sessi). Uno 
studio di osservazione può essere effettuato con un’unica concentrazione, 
ma se necessario si possono testare più concentrazioni. Questo studio non deve vertere su un numero di animali e di concentrazioni analogo a quello utilizzato per uno studio principale. Invece di effettuare uno studio di os ­
servazione, è possibile utilizzare i risultati di uno studio B.52 (4) precedente 
[cfr. documento di orientamento n. 39(2)].
 
Prova limite: Protocollo tradizionale  
29. Un prova limite viene effettuata quando si sa per certo o si prevede che la 
sostanza di prova sarà praticamente non tossica, ossia determinerà una rea ­
zione di tossicità solo al di sopra della concentrazione limite regolamentare. In una prova limite, un solo gruppo di tre maschi e tre femmine è esposto 
alla sostanza in esame ad una concentrazione limite. Le informazioni sulla 
tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da conoscenze relative a sostanze simili testate, tenendo conto dell’identità e della percen ­
tuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Nel caso in 
cui le informazioni sulla tossicità della sostanza siano scarse o nulle, o in cui 
ci si attenda che la sostanza in esame sia tossica, occorre eseguire la prova principale.
 
30. La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi nor ­
mativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentra ­
zioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 
ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiun ­
gibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le 
prove con aerosol, l’obiettivo principale è giungere ad una dimensione delle 
particelle che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm), il che è possibile 
con la maggior parte delle sostanze testate ad una concentrazione di 2 mg/l. [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) 
n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori 
alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali. Le prove con concentrazioni limite devono essere prese in considerazione solo quando è molto probabile che i loro risultati rivestano un interesse diretto per la 
protezione della salute umana (3) e, in tal caso, occorre spiegarlo nella 
relazione. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare il ricorso inutile ad animali, occorre effettuare una prova senza animali 
prima della prova limite, per accertarsi che sia possibile ottenere le condi ­
zioni di prova nella camera.
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31. Se alla concentrazione limite si registrano mortalità o stati di agonia, i 
risultati della prova limite possono fungere da studio di osservazione per 
ulteriori prove a concentrazioni diverse (cfr. studio principale). Se le pro ­
prietà fisiche o chimiche di una sostanza in esame impediscono di raggiun ­
gere una concentrazione limite, occorrerà testare la massima concentrazione 
raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 50 %, non 
occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spie ­
gazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima raggiungibile per 
un vapore non comporta tossicità, può essere necessario produrre la sostanza 
in esame sotto forma di aerosol liquido.
 
Studio principale: Protocollo tradizionale  
32. In uno studio principale di norma si utilizzano cinque maschi e cinque 
femmine (o cinque animali del sesso più sensibile, se noto) per livello di concentrazione, con almeno tre livelli diversi di concentrazione. Per effet ­
tuare un’adeguata analisi statistica, occorre prevedere un numero sufficiente 
di livelli di concentrazione. L’intervallo di tempo tra l’esposizione dei vari gruppi è determinato dalla comparsa, dalla durata e dalla gravità dei segni di 
tossicità rilevati. L’esposizione al livello di concentrazione superiore deve 
essere ritardata fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti. Il responsabile dello studio può in tal caso adeguare la concentrazione «bersaglio» per il gruppo 
successivo. Per gli studi sulla tossicità per inalazione, che richiedono tec ­
nologie sofisticate, non sarà sempre possibile procedere in questo modo; in tal caso l’esposizione degli animali alla concentrazione superiore si dovrà basare sull’esperienza acquisita e sui pareri di esperti. Per le prove riguar ­
danti le miscele, è opportuno fare riferimento al documento di orientamento 
n. 39 (2).
 
PROTOCOLLO «CONCENTRAZIONE × TEMPO» (C × T)  
Osservazioni generali: Protocollo C × t  
33. Uno studio sequenziale «concentrazione × tempo» (C × t) può costituire 
un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossi ­
cità per inalazione (12) (13) (14). Nell’ambito di questo approccio gli ani ­
mali sono esposti alla sostanza in esame a vari livelli di concentrazione e per 
durate di esposizioni variabili. Tutte le prove sono effettuate in camere di 
esposizione «a naso solo», in quanto le camere «a corpo intero» non sono adatte a questo protocollo. Il diagramma di flusso all’appendice 1 illustra questo protocollo. Un’analisi di simulazione ha evidenziato che il protocollo 
tradizionale e il protocollo C × t erano entrambi in grado di fornire valori 
affidabili della CL
 50 ma che il protocollo C × t consentiva generalmente di 
ottenere valori più affidabili per la CL  01 e la CL  10 (15).  
34. Un’analisi di simulazione ha evidenziato che generalmente è opportuno 
utilizzare due animali per intervallo di C × t (un animale di ciascun sesso o due animali del sesso più sensibile) per testare 4 concentrazioni e 5 durate di esposizione nel corso di uno studio principale. Il responsabile dello 
studio, in determinate circostanze, può decidere di utilizzare due ratti per 
sesso per intervallo di C × t (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo può contribuire a ridurre gli errori sistematici e la variabilità delle stime, aumentare il tasso di precisione delle 
stime e migliorare la copertura dell’intervallo di confidenza. Tuttavia in caso 
di correlazione insufficiente dei dati (quando si utilizza un animale di cia ­
scun sesso o due animali del sesso più sensibile), può bastare anche una quinta concentrazione di esposizione. Per ulteriori informazioni sul numero 
di animali e le concentrazioni da utilizzare per uno studio C × t, cfr. il 
documento di orientamento n. 39 (2).
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Studio di osservazione: Protocollo C × t  
35. Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in 
esame, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per l’espo ­
sizione nello studio principale. Uno studio di osservazione con al massimo 
tre animali per sesso e per concentrazione può essere utile per scegliere 
un’adeguata concentrazione di partenza per lo studio principale e ridurre il numero di animali utilizzati, [per maggiori informazioni cfr. l’appendice III del documento di orientamento n. 39 (2)]. Per stabilire la differenza di 
sensibilità tra i sessi possono essere necessari tre animali per sesso. Questi 
animali devono essere oggetto di una sola esposizione, in genere di 240 minuti. La possibilità di generare atmosfere di prova adeguate deve essere 
valutata nel corso di prove tecniche preliminari senza animali. Di norma non 
occorre effettuare uno studio di osservazione se i dati sulla mortalità sono già disponibili [tratti da uno studio B.52 (4)]. Nel selezionare la concen ­
trazione iniziale auspicata in uno studio B.2, il responsabile dello studio 
tiene conto dei profili di mortalità osservati in un qualsiasi studio B.52 
(4) disponibile, per entrambi i sessi e per tutte le concentrazioni testate [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)].
 
Concentrazione iniziale: Protocollo C × t  
36. La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) è una 
concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Dei gruppi formati da un animale di ciascun sesso sono esposti a questa concentrazione per periodi di durata 
variabile (15, 30, 60, 120 o 240 minuti) per un totale di 10 animali per 
quella che viene denominata «sessione di esposizione I» (appendice 1).
 
37. La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi nor ­
mativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentra ­
zioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 
ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiun ­
gibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le prove su aerosol, l’obiettivo è giungere ad una dimensione delle particelle 
che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm) a una concentrazione limite 
di 2 mg/l. Ciò è possibile con la maggior parte delle sostanze chimiche in esame. Le prove con aerosol a concentrazioni superiori a 2 mg/l sono eseguite solo se si è riusciti a generare particelle di dimensioni respirabili 
[cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) 
n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali (3). Le prove effettuate superando il limite di concentrazione vanno prese in con ­
siderazione solo se è altamente probabile che i loro risultati rivestano un 
interesse diretto per la protezione della salute umana (3) e occorre giustifi ­
care questa scelta nella relazione di studio. Nel caso di sostanze potenzial ­
mente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che 
favoriscano un’esplosione. Per evitare l’uso inutile di animali, occorre ef ­
fettuare una prova senza animali prima della prova alla concentrazione iniziale per accertarsi che è possibile ottenere nella camera le condizioni 
sperimentali di una prova a tale concentrazione.
 
38. Se alla concentrazione iniziale si verificano mortalità o agonie, i risultati a 
questa concentrazione possono fungere da punto di partenza per ulteriori 
prove ad altre concentrazioni (cfr. studio principale). Se la concentrazione limite non è raggiungibile per via delle proprietà fisiche o chimiche della sostanza in esame, si effettueranno le prove in questione alla concentrazione 
massima raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 
50 %, non occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spiegazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima 
raggiungibile per un vapore non comporta tossicità, può essere necessario 
produrre la sostanza in esame sotto forma di aerosol liquido.
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Studio principale: Protocollo C × t  
39. La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) testata 
nello studio principale è una concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Se 
nel corso o successivamente alla sessione di esposizione I si riscontrano casi 
di mortalità, l’esposizione minima (C × t) che ha provocato la mortalità funge da parametro per stabilire la concentrazione e i periodi di esposizione per la sessione di esposizione II. Ciascuna sessione di esposizione succes ­
siva dipenderà dalla sessione precedente (cfr. appendice 1).
 
40. Per molte sostanze i risultati ottenuti alla concentrazione iniziale, insieme a 
quelli ottenuti nelle tre sessioni di esposizione supplementari su una scala temporale più corta (la durata dei periodi di esposizione successivi secondo 
una progressione geometrica di fattore √2), sono sufficienti per stabilire il 
rapporto di mortalità C × t (15), anche se può essere utile ricorrere ad una quinta concentrazione di esposizione [cfr. appendice 1 e documento di orientamento n. 39 (2)]. Per il trattamento matematico dei risultati per il 
protocollo C × T, cfr. appendice 1.
 
OSSERVAZIONI  
41. Durante il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami 
clinici degli animali. Dopo l’esposizione, l’esame clinico va effettuato al ­
meno due volte il giorno stesso dell’esposizione, o più spesso a seconda della risposta degli animali al trattamento, e almeno una volta al giorno nei 
successivi 14 giorni. Il periodo di osservazione non ha durata fissa, in 
quanto dipende dalla natura dei segni clinici, dal momento della loro com ­
parsa e dalla durata del periodo di recupero. Un elemento importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di 
tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare 
segni di tossicità tardiva. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematica ­
mente e riportate singolarmente per ciascun animale. Gli animali moribondi o che manifestano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente 
devono essere sottoposti a eutanasia, per ragioni legate al loro benessere. 
Occorre fare attenzione, quando si effettuano gli esami clinici alla ricerca di segni di tossicità, a non confondere un cattivo aspetto iniziale e alterazioni 
respiratorie passeggere, imputabili al procedimento di esposizione, con la 
tossicità delle sostanze in esame che richiederebbe un’uccisione prematura degli animali. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri rias ­
sunti nel documento di orientamento OCSE (19) citato in bibliografia al 
punto (7). Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il 
momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.
 
42. Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e 
delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso 
autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Si annoterà, laddove possibile, l’eventuale differenziazione tra gli effetti locali e sistemici. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di 
tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura 
della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ ipertermia causate dal trattamento o dal confinamento.
 
Peso corporeo  
43. Il peso di ciascun animale è rilevato e annotato una volta durante il periodo 
di adattamento, il giorno dell’esposizione, prima che questa abbia inizio (giorno 0), e almeno nei giorni 1, 3 e 7 (e successivamente una volta la 
settimana), così come al momento del decesso o dell’eutanasia, se posteriore 
al giorno 1. Il peso corporeo è manifestamente uno degli indici fondamentali di tossicità, pertanto gli animali che mostrano un calo ≥ 20 % rispetto al 
peso anteriore allo studio devono essere monitorati attentamente. Alla fine 
del periodo post esposizione si pesano e si sottopongono a eutanasia gli 
animali sopravvissuti.
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Patologia  
44. Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova 
o che sono sottoposti a eutanasia e ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a autopsia macroscopica. Se non è 
possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’ani ­
male deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficiente ­
mente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni 
animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, pre ­
stando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie.
 
45. È possibile effettuare altri esami previamente inclusi nel disegno sperimen ­
tale, per ampliare il valore interpretativo dello studio, quali, ad esempio, la determinazione del peso polmonare nei ratti sopravvissuti e/o la ricerca, per esame microscopico, di irritazioni delle vie respiratorie. Si possono anche 
esaminare gli organi che mostrano macropatologie negli animali che soprav ­
vivono più di 24 ore, così come gli organi per i quali si ha la certezza o il sospetto che siano stati colpiti. L’esame microscopico dell’intero apparato respiratorio può fornire informazioni utili sulle sostanze in esame che reagi ­
scono con l’acqua, come gli acidi e le sostanze chimiche igroscopiche.
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
46. Si devono indicare il peso corporeo e i risultati dell’autopsia per ciascun 
animale. I dati degli esami clinici devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo sottoposto alla prova, il numero di animali uti ­
lizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossi ­
cità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a 
eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e l’esito dell’autopsia.
 
Relazione sulla prova  
47. La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:  
Animali sperimentali e condizioni di allevamento:  
— descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica 
del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,
 
— specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse 
dal ratto,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— metodo di randomizzazione,  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta e origine dell’acqua),  
— descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in parti ­
colare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 227
 
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa 
l’isomerizzazione),  
— dati di identificazione e numero CAS ( Chemical Abstract Services ), se 
noto.  
Veicolo:  
— motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione della scelta del 
veicolo utilizzato (se diverso dall’acqua),  
— dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con 
i risultati dello studio.  
Camera di inalazione:  
— descrizione della camera di inalazione, che includa le dimensioni e il 
volume,  
— provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposi ­
zione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,  
— apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granu ­
lometria e della concentrazione reale,  
— fonte dell’aria, trattamento dell’aria immessa/estratta e sistema di clima ­
tizzazione utilizzato,  
— metodi utilizzati per tarare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omo ­
geneità dell’atmosfera di prova,  
— differenza di pressione (positiva o negativa),  
— bocchette di esposizione per camera («a naso solo»); ubicazione degli 
animali nel sistema (camera di esposizione «a corpo intero»),  
— omogeneità/stabilità nel tempo dell’atmosfera di prova,  
— ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campio ­
namento dell’atmosfera di prova nella camera,  
— velocità del flusso d’aria, velocità del flusso d’aria in ogni bocchetta di 
esposizione («a naso solo») o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera («a corpo intero»),
 
— informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per misurare l’ossigeno e il 
diossido di carbonio, se applicabile,  
— tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t  95 ), 
— numero di ricambi del volume per ora,  
— dosatori (se applicabile).  
Dati sull’esposizione:  
— giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio 
principale,  
— concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in 
esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta 
circolare nella camera),  
— concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per 
le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, va ­
pori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 228
 
— esprimere le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, 
mg/l, mg/m  3 ecc.), indicando facoltativamente tra parentesi le unità di 
volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.),  
— distribuzione delle dimensioni delle particelle, diametro aerodinamico 
mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica ( σ g ), 
con relativi metodi di calcolo; devono essere indicate anche le singole 
analisi granulometriche.  
Condizioni sperimentali  
— ragguagli sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando 
le eventuali procedure impiegate per ridurre la granulometria delle so ­
stanze solide o per preparare soluzioni della sostanza in esame. Qualora i 
processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza, in ­
cludere i risultati delle analisi eseguite per verificare la composizione,  
— descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura 
utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,  
— ragguagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di 
tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in 
esame dal mezzo campionato),  
— giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.  
Risultati  
— tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,  
— tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,  
— tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul cam ­
pionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e 
della σ g, 
— tabella con i dati sulle risposte e il livello di concentrazione per ciascun 
animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),
 
— peso corporeo di ciascun animale oggetto dello studio; data e ora della 
morte se avviene prima dell’eutanasia prevista, momento dell’insorgenza 
e evoluzione dei segni di tossicità e, se del caso, loro reversibilità,  
— reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun ani ­
male,  
— stime della letalità (CL  50 , DL  01 ), con limiti di confidenza del 95 % e 
inclinazione (se fornita dal metodo di valutazione),  
— relazione statistica, ivi compresa la stima del fattore n (per il protocollo 
C × t). Occorre fornire il nome del software statistico utilizzato.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 229
 
Discussione e interpretazione dei risultati  
— dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per 
soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,
 
— esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati comples ­
sivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,  
— spiegare perché è stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che 
manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE 
citato in bibliografia al punto (8),
 
— se una prova in base al capitolo B.52 del presente allegato (4) ha dovuto 
essere interrotta in favore del presente metodo B.2 occorre spiegare il 
motivo,  
— nella valutazione globale dello studio, occorre tener conto della coerenza 
dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e 
del rapporto tra loro,  
— occorre esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo 
d’azione prevalente (sistemico o locale).  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OCSE (2009). Determinazione della tossicità acuta per inalazione. Linea 
guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 403, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(2) OCSE (2009). Documento di orientamento per la determinazione della 
tossicità acuta per inalazione. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 39, OCSE, Parigi. Disponibile 
all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(3) Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, 
del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’im ­
ballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).
 
(4) Capitolo B.52 del presente allegato. Tossicità acuta per inalazione — Me ­
todo della classe di tossicità acuta.  
(5) Capitolo B.40 del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: Test di 
resistenza elettrica transcutanea (TER).  
(6) Capitolo B.40  bis testguidelines del presente allegato, Corrosione cutanea 
in vitro: Test su modelli di pelle umana.  
(7) OCSE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corro ­
sion. Linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 435 OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguide ­
lines
 
(8) OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Appl. Toxicol. Toxicol. 18: 321-327.
 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167.  
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
(15) OCSE (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguide ­
lines
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
Londra/New York.  
DEFINIZIONE  
Sostanza chimica in esame:  Qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 231
 
Appendice 1  
Protocollo C × t  
1. Uno studio sequenziale «concentrazione × tempo» (C × t) può costituire 
un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossi ­
cità per inalazione (12) (13) (14). Va eseguito di preferenza quando sussiste una particolare esigenza normativa o scientifica che richiede prove su ani ­
mali per varie durate di esposizione, ad esempio per la pianificazione della 
risposta di emergenza o la pianificazione territoriale. Si inizia solitamente con una prova alla concentrazione limite (sessione di esposizione I) nel corso della quale gli animali sono esposti alla sostanza in esame per cinque 
durate diverse (ad esempio 15, 30, 60, 120 e 240 minuti) in modo da 
ottenere varie durate di esposizione nel corso di una stessa sessione (cfr. figura 1). Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concen ­
trazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 
ppm, 20 mg/l e 5 mg/l. Questi livelli possono essere superati solo se esi ­
stono motivi di carattere normativo o scientifico per effettuare delle prove a questi livelli di concentrazione (cfr. paragrafo 37 del capitolo B.2).
 
2. Qualora si abbiano poche o nessuna informazione sulla tossicità della so ­
stanza in esame, occorre seguire uno studio di osservazione in cui gruppi di almeno tre animali per sesso sono esposti a concentrazioni bersaglio sele ­
zionate dal responsabile dello studio, di norma per 240 minuti.
 
3. Se nel corso della sessione di esposizione I è saggiata una concentrazione 
limite e si osserva una mortalità inferiore al 50 %, non occorre effettuare 
prove aggiuntive. Se, per motivi regolamentari o scientifici, occorre stabilire 
la relazione concentrazione/tempo/reazione per livelli più elevati rispetto alla concentrazione limite indicata, l’esposizione successiva è effettuata, ad esempio, al doppio della concentrazione limite (2L nella figura 1).
 
4. Se, alla concentrazione limite, viene osservata una tossicità, sono necessarie 
prove aggiuntive (studio principale). Queste esposizioni aggiuntive sono effettuate a concentrazioni inferiori (figura 1: sessioni di esposizione II, 
III o IV) o a concentrazioni superiori per periodi più brevi (figura 1: ses ­
sione di esposizione IV) adeguati e meno distanziati.
 
5. La prova (concentrazione iniziale e concentrazioni aggiuntive) è realizzata 
con 1 animale di ciascun sesso per punto concentrazione/tempo o con due animali del sesso più sensibile alla sostanza in esame per punto concentrazione/tempo. Il responsabile dello studio, in determinate 
circostanze, può decidere di utilizzare 2 ratti di ciascun sesso per 
punto concentrazione/tempo (o 4 animali del sesso più sensibile per punto concentrazione/tempo) (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo generalmente riduce le distorsioni e la 
variabilità delle stime, aumenta il tasso di precisione delle stime e migliora 
la copertura dell’intervallo di confidenza legato al presente protocollo. Ul ­
teriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2).
 
6. Idealmente ciascuna sessione di esposizione è effettuata in una sola giornata. 
Ciò consente di ritardare l’esposizione successiva fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano so ­
pravvissuti e permette al responsabile dello studio di adattare la concentra ­
zione e la durata per la successiva sessione di esposizione. È consigliabile 
iniziare ogni sessione di esposizione con il gruppo che sarà esposto più a lungo, ossia il gruppo destinato ad un’esposizione di 240 minuti, seguito dal gruppo di 120 minuti e via dicendo. Se, ad esempio, gli animali del gruppo 
di 240 minuti dopo 90 minuti iniziano a morire o mostrano segni evidenti di 
tossicità (ad esempio variazioni estreme nel pattern respiratorio come la respirazione difficoltosa), non avrebbe senso esporre un gruppo per 120 minuti perché la mortalità sarebbe probabilmente del 100 %. In tal caso il 
responsabile dello studio deve optare per durate di esposizione più brevi per 
la concentrazione in questione (ad esempio, 90, 65, 45, 33 e 25 minuti).
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7. La concentrazione nella camera deve essere misurata spesso per determinare 
la concentrazione media ponderata per il tempo per ogni durata di esposi ­
zione. Laddove possibile, nell’analisi statistica occorre utilizzare l’orario della morte di ciascun animale (più che la durata di esposizione).
 
8. Occorre esaminare i risultati delle quattro prime sessioni di esposizione per 
individuare gli eventuali dati mancanti nella curva concentrazione-tempo 
(cfr. figura 1). Se mancano dei dati, si può realizzare un’esposizione sup ­
plementare (5  a concentrazione). La concentrazione e le durate di esposizione 
di questa 5  a esposizione sono scelte per colmare questa lacuna.  
9. Tutte le sessioni di esposizione (ivi compresa la prima) sono utilizzate per 
calcolare il rapporto concentrazione-tempo-risposta mediante un’analisi stati ­
stica (16). Se possibile, per ciascun intervallo C × t si utilizzerà la concen ­
trazione media ponderata in funzione del tempo e la durata di esposizione 
fino alla morte (se questa si verifica nel corso dell’esposizione).  
Figura 1  
Illustrazione ipotetica di un rapporto concentrazione-tempo-mortalità nei 
ratti
  
Simboli vuoti = animali sopravissuti. Simboli pieni = animali morti  
Triangoli = femmine; Cerchi = maschi  
Linea piena = valori di CL  50 (da 7,5 a 240 min.) per i maschi n = 1  
Linea tratteggiata = valori di CL  50 (da 7,5 a 240 min.) per le femmine n = 1  
Linee punteggiate = valori della CL  50 ipotetica per i maschi e le femmine se 
n fosse stato pari a 2 (12).  
Legenda  
Concentrazione:  
Tempo di esposizione:  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 233
 
10. Qui di seguito è riportato un esempio della procedura per fasi:  
Sessione di esposizione I — Prova alla concentrazione limite (cfr. figura 
1) 
— 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto (  a ) 
— Concentrazione bersaglio (  b ) = concentrazione limite  
— Esporre cinque gruppi di animali a questa concentrazione bersaglio per, 
rispettivamente, 15, 30, 60, 120 e 240 minuti.  
↓ 
Sessione di esposizione II  ( c ) — Studio principale  
— 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto  
— Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (  d ) 
(1/2L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).
 
↓ 
Sessione di esposizione III — Studio principale  
— 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto  
— Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (  d ) 
(1/4L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).
 
↓ 
Sessione di esposizione IV’ — Studio principale  
— 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto  
— Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (  d ) 
(1/8L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1).
 
oppure  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 234  
( a ) Se non sono disponibili informazioni sulla sensibilità di ciascun sesso, si utilizzeranno 
ratti di entrambi i sessi, ossia 1 animale di ciascun sesso per concentrazione. In base alle 
informazioni disponibili o se nel corso della sessione di esposizione risulta che uno dei 
due sessi è più sensibile, per le prove successive si utilizzeranno 10 animali di questo 
sesso (2 animali per punto concentrazione/tempo) a ciascun livello di concentrazione. 
( b ) Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i 
vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l. Qualora si 
preveda una tossicità o se i risultati dello studio di osservazione lo consigliano, si deve 
optare per concentrazioni iniziali inferiori. Per esigenze normative o scientifiche, si possono utilizzare concentrazioni più elevate. 
(
 c ) Idealmente, l’esposizione al livello di concentrazione superiore deve essere ritardata fino 
a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova 
siano sopravvissuti. Il responsabile dello studio può in tal caso adeguare la concentra ­
zione «bersaglio» per la sessione di esposizione successiva. 
( d ) La dose minima (concentrazione × tempo) che provoca mortalità nel corso della prova 
alla concentrazione iniziale (prima sessione di esposizione) fungerà da riferimento per 
stabilire la combinazione successiva di concentrazione e durate di esposizione. In genere 
la concentrazione è dimezzata (1/2L) e gli animali sono esposti per periodi meno di ­
stanziati, distribuiti in una serie geometrica di un fattore 1,4 ( √2; cfr. riferimento biblio ­
grafico 11) intorno al tempo corrispondente alla dose letale minima (tempo × concen ­
trazione) osservato nel corso della prima esposizione. Nella figura 1, nel corso della 
sessione di esposizione I la mortalità è stata osservata per la prima volta dopo 15 minuti. 
Le durate nel corso della sessione II sono pertanto incentrate su 30 minuti, e sono di 15, 
21, 30, 42 e 60 min. Dopo le prime due esposizioni, si raccomanda vivamente di 
tracciare i risultati in un grafico analogo a quello della figura 1, e di verificare se il 
rapporto tra concentrazione e tempo definisce un angolo di 45 gradi (n = 1) o se la curva 
del rapporto-concentrazione-tempo-risposta è meno ripida (n = 2, ad esempio) o più 
ripida (n = 0,8 ad esempio). In quest’ultimo caso, è vivamente consigliato di adeguare 
le concentrazioni e le durate successive.
 Sessione di esposizione IV — Studio principale  
— 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto  
— Esporre cinque gruppi animali ad una concentrazione superiore (  e ) (2L) 
per durate di esposizione leggermente più brevi (spaziatura di √2; cfr. 
figura 1).  
Trattamento matematico dei risultati per il protocollo C × t  
11. Una procedura C × t costituita da 4 o 5 concentrazioni di esposizione e 5 
durate di esposizione genera 20 o 25 valori, rispettivamente. Con questi 
valori, la relazione C × t può essere calcolata con un’analisi statistica (16):  
Equazione 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
in cui C = concentrazione; t = durata di esposizione, o  
Equazione 2:  
Risposta ¼ ƒðC n tÞ 
in cui  n ¼ b 1=b 2: 
Con l’equazione 1, il valore CL  50 può essere calcolato per un determinato 
periodo di tempo (ad esempio 4 ore, 1 ora, 30 minuti, o qualsiasi altro periodo compreso nell’intervallo dei periodi testati) utilizzando P = 5 (50 % di risposta). La regola di Haber si applica solo quando n = 1. La CL
 01 può 
essere calcolata con P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 235  
( e ) A volte può essere necessario aumentare la concentrazione (2L) su una scala temporale 
diversa, con periodi di esposizione ancora meno distanziati secondo una progressione 
geometrica di fattore 1,4 ( √2) incentrata sul tempo corrispondente al livello di dose letale 
minimo osservato al momento della prima esposizione. La durata minima di esposizione 
deve preferibilmente superare 5 minuti; la durata massima non deve superare 8 ore.
 B.3. TOSSICITÀ ACUTA PER VIA CUTANEA  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B (punto A).  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B (punto B).  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame viene applicata a livelli di dose graduati, un 
livello di dose per gruppo, sulla cute di vari gruppi di animali di saggio. Si procede poi all'osservazione degli effetti e degli eventi letali. Gli animali morti o sacrificati durante il saggio sono sottoposti 
a necroscopia e i sopravvissuti lo sono a conclusione del saggio.
 
Può essere necessario sottoporre a eutanasia gli animali che mostrano 
segni gravi e persistenti di sofferenza e di dolore; non bisogna ese ­
guire la somministrazione di dosi delle sostanze in esame in una 
maniera che notoriamente provoca dolore e sofferenza marcate a motivo delle proprietà corrosive o gravemente irritanti.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO ADOTTATO PER IL SAGGIO  
1.6.1.  Preparazioni  
Per almeno cinque giorni prima dell'esperimento, gli animali sono 
tenuti nelle gabbie usate per il saggio nelle stesse condizioni di 
stabulazione e di alimentazione dell'esperimento. Prima del saggio, 
gli animali che dovranno essere giovani adulti e sani, sono scelti con metodo casuale e assegnati ai gruppi sperimentali. Circa 24 ore prima del saggio, si effettua il taglio o la rasatura del pelo nella 
parte dorsale del corpo della cavia. Durante le operazioni di taglio 
o rasatura, si deve badare a non ledere la cute dell'animale per evitarne l'abrasione che potrebbe alterarne la permeabilità. Si dovrà preparare almeno il 10 % della superficie corporea per l'applicazione 
della sostanza in esame. Le sostanze solide, che potranno essere 
eventualmente ridotte in polvere, dovrebbero essere inumidite con acqua o, se necessario, con un veicolo adatto ad assicurare un buon contatto con la cute. Se viene utilizzato un veicolo, si dovrà 
tener conto dell'influenza dello stesso sulla penetrazione cutanea 
della sostanza in esame. Le sostanze liquide generalmente vengono saggiate senza diluizione.
 
1.6.2.  Condizioni del saggio  
1.6.2.1.  Animali da esperimento  
Possono essere utilizzati ratti o conigli adulti. Si possono utilizzare 
altre specie animali, ma il loro uso dovrebbe essere giustificato. Dovrebbero essere utilizzati ceppi di laboratorio comunemente usati. Per ciascun sesso, all'inizio della prova l'intervallo di variazione del 
peso degli animali utilizzati non dovrebbe essere superiore a ± 20 % 
del valore medio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 236
 
1.6.2.2.  Numero e sesso  
Per ciascun saggio vengono usati almeno 5 animali a ciascun livello 
di dosaggio. Essi dovrebbero essere tutti dello stesso sesso. Se si usano femmine, dovrebbero esse nullipare e non gravide. Nel caso 
siano disponibili informazioni che dimostrano che un sesso è netta ­
mente più sensibile, si dovrebbero usare animali di questo sesso.
 
Nota:  nei saggi di tossicità acuta con animali di ordine superiore ai 
roditori, si dovrà prendere in considerazione l'uso di un numero 
minore di animali. Le dosi devono essere accuratamente scelte e si 
deve fare ogni sforzo possibile per non superare dosi moderatamente tossiche. In tali prove si dovrebbe evitare la somministrazione di dosi letali della sostanza in esame.
 
1.6.2.3.  Livelli di dosaggio  
Questi dovranno essere in numero sufficiente, almeno 3, e adegua ­
tamente intervallati per produrre uno spettro di effetti tossici e di 
tassi di mortalità. Nel decidere i dosaggi occorre tener presente qualsiasi effetto irritante o corrosivo. I dati dovrebbero essere suffi ­
cienti per ottenere una curva dose-risposta e, quando possibile, per ­
mettere una determinazione accettabile della DL
 50 . 
1.6.2.4.  Saggio limite  
Si può eseguire un saggio limite ad un livello di dosaggio di almeno 
2 000 mg/kg peso corporeo su un gruppo di 5 animali maschi e 5 
femmine usando le procedure sopra descritte. Se si produce una mortalità dovuta al composto, può essere necessario considerare uno studio completo.
 
1.6.2.5.  Periodo di osservazione  
Il periodo di osservazione dovrebbe essere almeno di 14 giorni. 
Tuttavia tale durata non è tassativa. Essa dovrebbe dipendere dalla 
natura delle reazioni tossiche, dalla velocità della loro insorgenza e dalla lunghezza del periodo di guarigione; se necessario, quindi, essa potrà essere prolungata. Il momento in cui compaiono e spariscono i 
sintomi di tossicità, la loro durata e il momento in cui interviene il 
decesso, sono importanti soprattutto nel caso in cui la sostanza tenda a causare mortalità ritardata.
 
1.6.3.  Procedimento  
Ogni gabbia deve contenere un solo animale. La sostanza in esame 
dovrà essere applicata uniformemente su una superficie pari a circa il 10 % della superficie corporea totale. Per le sostanze altamente 
tossiche, la superficie può essere inferiore, ma dovrà essere ricoperta 
da uno strato per quanto possibile sottile e uniforme.
 
Durante il periodo di esposizione di 24 ore, le sostanze in esame 
dovranno essere tenute a contatto diretto della cute mediante una garza porosa e un cerotto non irritante. La parte su cui viene appli ­
cata la sostanza dovrebbe essere ulteriormente coperta in modo op ­
portuno per tenere ferma la garza e la sostanza in esame e assicurare che gli animali non ingeriscano la sostanza stessa. Dispositivi per la limitazione dei movimenti possono essere usati per impedire agli 
animali di ingerire la sostanza in esame, ma l'immobilizzazione com ­
pleta non è consigliabile.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 237
 
Alla fine del periodo di esposizione si dovrà rimuovere la sostanza 
residua utilizzando acqua, se possibile, o altri prodotti idonei per la 
pulizia della pelle.  
Le osservazioni dovranno essere registrate sistematicamente non ap ­
pena fatte, badando a tenere separati i dati per ciascun animale. 
Durante il primo giorno le osservazioni dovranno essere frequenti. Un attento esame clinico dovrà essere effettuato almeno una volta al giorno per 5 giorni per settimana. Le altre osservazioni dovrebbero 
essere effettuate quotidianamente, agendo appropriatamente per mi ­
nimizzare la perdita di animali da studiare, ad esempio necroscopia o refrigerazione degli animali trovati morti e isolamento o sacrificio degli animali deboli o moribondi.
 
Le osservazioni dovrebbero tener conto delle alterazioni riscontrate 
nel pelo, nella cute trattata, negli occhi e nelle membrane mucose e anche nel sistema respiratorio, circolatorio, nel sistema nervoso au ­
tonomo e centrale, nell'attività somatomotoria e nel comportamento 
dell'animale. Particolare attenzione dovrebbe essere rivolta all'osser ­
vazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Il momento in cui sopraggiunge il decesso deve essere regi ­
strato con la massima precisione possibile. Gli animali che muoiono 
durante il saggio e quelli che sopravvivono alla fine del saggio sono sottoposti a necroscopia. Tutte le variazioni patologiche macroscopi ­
che dovranno essere registrate. Ove del caso, dovrebbero essere 
prelevati tessuti per l'esame istopatologico.
 
Valutazione della tossicità nell'altro sesso  
Dopo il completamento dello studio su un sesso, si somministra 
almeno un intervallo di dose ad un gruppo di 5 animali dell'altro sesso per controllare che gli animali di questo sesso non siano net ­
tamente più sensibili alla sostanza in esame. In circostanze particolari 
può essere giustificato l'uso di un minor numero di animali. Nel caso 
in cui siano disponibili informazioni adeguate che dimostrano che gli animali del sesso controllato sono nettamente più sensibili, si può fare a meno di effettuare la prova su animali dell'altro sesso.
 
2. DATI  
I risultati dovranno essere riassunti in forma tabellare indicante per 
ogni singolo gruppo di saggio il numero di animali presenti all'inizio del saggio, il momento del decesso di ciascun animale, il numero di 
animali che presentano altri segni di tossicità, la descrizione degli 
effetti tossici e i risultati della necroscopia. Il peso di ciascun ani ­
male dovrà essere determinato e registrato poco prima dell'applica ­
zione della sostanza, poi settimanalmente e al momento del decesso; 
le variazioni ponderali dovranno essere calcolate e registrate quando 
la sopravvivenza sia superiore a un giorno. Gli animali che vengono sottoposti ad eutanasia in conseguenza di sofferenza e dolore dovuti al composto vengono registrati come morti in conseguenza del com ­
posto. La DL
 50 può essere determinata con un metodo riconosciuto.  
La valutazione dei dati dovrebbe includere il rapporto, se esistente, 
tra l'esposizione degli animali alla sostanza in esame e l'incidenza e 
gravità di tutte le alterazioni, incluse quelle comportamentali e clini ­
che, le lesioni macroscopiche, le variazioni del peso corporeo, la mortalità e qualsiasi altro effetto tossico.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 238
 
— specie, ceppo, origine degli animali, condizioni ambientali, dieta, 
ecc.; 
— condizioni sperimentali (inclusa la tecnica di pulizia della cute e 
il tipo di medicazione; occlusiva o non occlusiva);  
— livelli di dosaggio (col veicolo, se usato, e concentrazione);  
— sesso degli animali sottoposti a somministrazione;  
— tabulato dei dati di risposta per dose e livello di dosaggio (cioè il 
numero di animali morti o sacrificati durante la prova; numero di 
animali che presentano sintomi di tossicità; numero di animali 
esposti);  
— tempo intercorso tra la somministrazione della sostanza e la mor ­
te, ragioni e criteri usati per la eutanasia di animali;  
— tutte le osservazioni;  
— valore della DL  50 per il sesso sottoposto ad uno studio completo, 
determinato dopo 14 giorni, specificando il metodo di determi ­
nazione;  
— intervallo di confidenza statistica del 95 % per la DL  50 (se può 
essere fornito);  
— curva dose-mortalità e relativo coefficiente angolare (se il metodo 
di determinazione lo consente);  
— risultati necroscopici;  
— qualsiasi altro reperto istopatologico;  
— risultati di eventuali saggi sull'altro sesso;  
— discussione dei risultati (occorre dedicare una particolare atten ­
zione all'effetto che la eutanasia di animali durante la prova può avere sul valore calcolato della DL
 50 ); 
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B (punto D).  
4. BIBLIOGRAFIA  
Vedi introduzione generale, parte B (punto E).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 239
 
B.4. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE CUTANEA  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde al TG 404 (2002) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Nella preparazione di questo metodo aggiornato è stata dedicata 
particolare attenzione ai miglioramenti possibili in relazione al 
benessere degli animali e alla valutazione di tutte le informazioni 
disponibili sulla sostanza in esame, per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio. Il metodo comprende la raccomanda ­
zione di eseguire, prima di effettuare il saggio  in vivo  descritto per la 
corrosione/irritazione, un'analisi dell'importanza delle prove  (weight- 
of-the-evidence analysis)  sui dati pertinenti esistenti. Qualora i dati 
disponibili fossero insufficienti, si raccomanda di svilupparli me ­
diante l'applicazione di saggi sequenziali (1). La strategia di saggio 
raccomandata comprende l'esecuzione di saggi in vitro validati ed 
accettati ed è descritta nell'Allegato al presente metodo. Nel saggio iniziale  in vivo  si raccomanda inoltre di applicare, ove opportuno, 
all'animale i tre cerotti per il saggio da contatto uno dopo l'altro, 
anziché simultaneamente.
 
Nell'interesse sia dell'accuratezza scientifica, sia del benessere degli 
animali, non bisogna prendere in considerazione i saggi  in vivo  
finché non siano stati valutati, in un'analisi dell'importanza delle prove, tutti i dati disponibili pertinenti circa la potenziale 
corrosività/irritazione cutanea della sostanza. Tali dati devono com ­
prendere prove derivanti da studi esistenti su soggetti umani e/o animali da laboratorio, prove di corrosività/irritazione di una o più sostanze strutturalmente correlate o miscele di tali sostanze, dati 
dimostranti l'elevata acidità o alcalinità della sostanza (2)(3), nonché 
i risultati di test  in vitro  o ex vivo  validati ed accettati (4)(5)(5a). 
Questa analisi deve ridurre la necessità di eseguire test  in vivo  della 
corrosività/irritazione delle sostanze per le quali esistono già prove 
sufficienti derivanti da altri studi in relazione a questi due fattori.
 
Nell'Allegato al presente metodo è inclusa e consigliata una strategia 
a tappe, che prevede l'esecuzione di saggi validati  in vitro  o ex vivo  
per la corrosione/irritazione. Tale strategia è stata sviluppata e rac ­
comandata all'unanimità dai partecipanti a un workshop dell'OCSE (6), ed è stata adottata come strategia raccomandata di test nel GHS  
(Globally Harmonised System for the Classification of Chemical 
Substances)  (Sistema globale armonizzato per la classificazione delle 
sostanze chimiche) (7). Si raccomanda di adottare la strategia prima 
di passare ai saggi  in vivo . Nel caso di nuove sostanze, si racco ­
manda di adottare un approccio graduale per sviluppare dati scienti ­
ficamente validi sulla corrosività/irritazione della sostanza. Se per le sostanze esistenti i dati sulla corrosione/irritazione cutanea sono in ­
sufficienti, si può usare tale strategia per ottenere i dati mancanti. È 
necessario giustificare l'uso di una strategia o procedura di saggio differente, nonché l'eventuale decisione di non usare un approccio di saggio graduale.
 
Se non è possibile determinare la corrosività o il potere irritante 
usando un'analisi dell'importanza delle prove, coerente con la strate ­
gia di saggi sequenziali, va preso in considerazione un saggio  in vivo  
(cfr. Allegato).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 240
 
1.2 DEFINIZIONI  
Irritazione cutanea:  produzione di danni reversibili alla pelle in 
seguito all'applicazione di una sostanza in esame per un massimo di 4 ore.
 
Corrosione cutanea:  produzione di danni irreversibili alla pelle; in 
particolare, necrosi visibile attraverso l'epidermide e all'interno del derma, in seguito all'applicazione della sostanza in esame per un 
massimo di quattro ore. Le reazioni corrosive sono caratterizzate 
da ulcere, emorragie, escare sanguinanti e, alla fine dell'osservazione, il giorno 14, da alterazione del colore dovuta a pallore della cute, zone di completa alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie 
effettuare eventualmente un esame istopatologico.
 
1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame è applicata in un'unica dose sulla pelle della 
cavia; le zone di pelle non trattate dell'animale servono da controllo. 
A intervalli specificati si valuta e si attribuisce un punteggio al grado 
di irritazione/corrosione, che va ulteriormente descritto per fornire una valutazione completa degli effetti. La durata dello studio deve essere sufficiente a valutare la reversibilità o irreversibilità degli ef ­
fetti osservati.
 
Gli animali che presentano segni prolungati di grave sofferenza e/o 
dolore, in qualsiasi fase del saggio, vanno soppressi con metodi non 
cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Cfr. bibliografia per 
i criteri da seguire nel decidere di sopprimere gli animali moribondi o che soffrono gravemente (8).
 
1.4 DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.4.1  Preparazione per il saggio  in vivo  
1.4.1.1  Selezione delle specie  
L'animale da laboratorio di elezione è il coniglio albino; usare gio ­
vani adulti sani. Giustificare l'eventuale uso di altre specie.  
1.4.1.2  Preparazione degli animali  
All'incirca 24 ore prima del saggio occorre rasare il pelo nella zona 
dorsale del tronco degli animali evitando di scorticare la pelle. Usare 
solo animali la cui pelle è sana e intatta.  
Alcuni ceppi di coniglio presentano zone di pelo più denso che sono 
più evidenti in alcuni periodi dell'anno. Tali aree di crescita densa 
del pelo non vanno usate come punti per il saggio.  
1.4.1.3  Condizioni di alloggio e alimentazione  
Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura del locale 
deve essere di 20  o C (±  o 3 C) per i conigli. L'umidità relativa deve 
raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 %, 
tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, ma occorre puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per l'alimentazione, 
attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con una quantità 
illimitata di acqua potabile.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 241
 
1.4.2  Procedura  
1.4.2.1  Applicazione della sostanza in esame  
La sostanza in esame va applicata su una zona ridotta (circa 6 cm  2 ) 
di pelle e coperta con una garza fissata con un cerotto non irritante. 
Nei casi in cui non è possibile l'applicazione diretta (ad es. liquidi e 
alcune paste), la sostanza in esame va prima applicata sulla garza, che poi è a sua volta applicata sulla pelle. La garza va mantenuta a contatto con la pelle, ma allentata, mediante una fasciatura semioc ­
clusiva, per tutta la durata del periodo di esposizione. Se la sostanza 
in esame è applicata sulla garza, essa va appoggiata sulla pelle in modo che la sostanza sia bene a contatto e si distribuisca uniforme ­
mente. Occorre impedire che l'animale abbia accesso alla garza e 
ingerisca o inali la sostanza in esame.
 
Le sostanze sperimentali liquide si usano generalmente non diluite. 
Per l'esame dei solidi (che possono essere ridotti in polvere, se ritenuto necessario) la sostanza in esame va inumidita con la minor quantità d'acqua (o, ove necessario, di un altro eccipiente adeguato) 
sufficiente ad assicurare un buon contatto con la pelle. Se si impie ­
gano eccipienti diversi dall'acqua, la potenziale influenza dell'ecci ­
piente sull'irritazione della pelle da parte della sostanza in esame deve essere minima o nulla.
 
Al termine del periodo di esposizione, che è normalmente di 4 ore, la 
sostanza in esame residua va rimossa, ove possibile, usando acqua o 
un solvente adeguato senza alterare la risposta da essa provocata e l'integrità dell'epidermide.
 
1.4.2.2  Livello di dosi  
Sul punto prescelto per il saggio va applicata una dose di 0,5 ml di 
liquido o 0,5 g di solido o pasta.  
1.4.2.3  Saggio iniziale (Saggio di irritazione/corrosione cutanea in vivo su 
un solo animale)  
Si raccomanda caldamente di eseguire inizialmente il saggio  in vivo  
usando un solo animale, soprattutto quando si sospetta che la so ­
stanza sia potenzialmente corrosiva, in conformità alla strategia dei 
saggi sequenziali (cfr. Allegato 1).  
Quando una sostanza è stata giudicata corrosiva sulla base di un'ana ­
lisi dell'importanza delle prove, non è necessario eseguire ulteriori saggi su animali. Per la maggior parte delle sostanze sospettate di 
essere corrosive, non è normalmente necessario eseguire ulteriori 
saggi  in vivo . Tuttavia, nei casi in cui si ritiene giustificato ottenere 
altri dati, in quanto le prove sono insufficienti, è possibile effettuare saggi limitati su animali secondo l'approccio seguente: all'animale si 
applicano un massimo di tre cerotti con garza per il saggio da 
contatto, in sequenza. Il primo cerotto è tolto dopo tre minuti. Se non si osservano reazioni cutanee gravi, si applica un secondo ce ­
rotto, che è rimosso dopo un'ora. Se le osservazioni in questa fase 
indicano che è possibile estendere l'esposizione a quattro ore, senza 
causare sofferenze, si applica un terzo cerotto, che è rimosso dopo quattro ore, e si valuta la reazione.
 
Se dopo una qualsiasi delle tre esposizioni in sequenza si osserva un 
effetto corrosivo, il saggio va immediatamente interrotto. Se dopo la rimozione dell'ultimo cerotto non si osserva alcun effetto corrosivo, 
si mantiene l'animale sotto osservazione per 14 giorni, a meno che la 
corrosione non si manifesti più precocemente.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 242
 
Nei casi in cui non si prevede che la sostanza in esame produca 
corrosione, ma che possa essere irritante, applicare un unico cerotto a 
un solo animale per quattro ore.  
1.4.2.4  Saggio di conferma (saggio di irritazione cutanea in vivo con ulte ­
riori animali)  
Se nel saggio iniziale non si osservano effetti corrosivi, confermare 
la reazione irritante o negativa su due altri animali al massimo, ciascuno con un cerotto, per un periodo di esposizione di quattro ore. Se nel saggio iniziale si osserva un effetto irritante, il saggio di 
conferma può essere condotto in maniera sequenziale, oppure espo ­
nendo contemporaneamente due altri animali. Nel caso eccezionale in cui non sia eseguito il saggio iniziale, è possibile trattare due o tre animali con un solo cerotto, che è poi asportato dopo quattro ore. 
Quando si usano due animali, se entrambi evidenziano la stessa 
reazione, non sono necessari altri saggi, altrimenti si sottopone al saggio anche il terzo animale. È possibile che siano necessari altri animali per valutare le reazioni dubbie.
 
1.4.2.5  Periodo di osservazione  
La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a va ­
lutare completamente la reversibilità degli effetti osservati. Interrom ­
pere però l'esperimento in qualsiasi momento se l'animale mostra 
segni continui di dolore o sofferenza gravi. Per determinare la reversibilità degli effetti, gli animali vanno osservati per un massimo di 14 giorni dopo la rimozione dei cerotti. In caso di reversibilità 
prima dei 14 giorni, interrompere subito l'esperimento.
 
1.4.2.6  Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni cutanee  
Esaminare tutti gli animali per vedere se presentano segni di eritema 
e di edema e valutare le reazioni a 60 minuti e successivamente a 24, 
48 e 72 ore dopo la rimozione del cerotto. Per il saggio iniziale su un solo animale, esaminare subito la zona prescelta per il saggio dopo la rimozione del cerotto. Le reazioni cutanee sono classificate 
e registrate in base ai gradi indicati nella tabella allegata. Se la pelle 
presenta una lesione che non può essere identificata come irritazione o corrosione a 72 ore, può essere necessario proseguire le osserva ­
zioni fino al giorno 14, per determinare la reversibilità degli effetti. 
Oltre alle osservazioni dell'irritazione, descrivere e documentare tutti 
gli effetti tossici locali, come la perdita del grasso cutaneo, ed even ­
tuali effetti sistemici negativi (ad es. effetti sui segni clinici di tos ­
sicità e sul peso corporeo). Per chiarire le reazioni dubbie, valutare 
l'opportunità di eseguire un esame istopatologico.
 
La classificazione delle reazioni cutanee è necessariamente soggetti ­
va. Per favorirne l'armonizzazione e per assistere i laboratori e le 
persone che eseguono il saggio e interpretano le osservazioni, istruire adeguatamente il personale sul sistema di punteggio usato (cfr. ta ­
bella più avanti). Potrebbe essere utile una guida illustrata per la 
classificazione dell'irritazione cutanea e di altre lesioni (9).
 
2. DATI  
2.1 PRESENTAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati dello studio vanno riassunti sotto forma di tabella nella 
relazione finale sul saggio e devono coprire tutte le voci elencate al 
punto 3.1.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 243
 
2.2 VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
Valutare il grado di irritazione cutanea insieme alla natura e alla 
gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. Le reazioni individuali non rappresentano uno standard assoluto per 
le proprietà irritanti di un materiale, in quanto si valutano anche altri 
effetti del materiale in esame. I risultati individuali vanno invece considerati come valori di riferimento e devono essere valutati in ­
sieme a tutte le altre osservazioni emerse dallo studio.
 
Nella valutazione delle reazioni irritanti è necessario considerare la 
reversibilità delle lesioni cutanee. Quando reazioni quali alopecia 
(zona limitata), ipercheratosi, iperplasia e desquamazione persistono fino alla fine del periodo di osservazione di 14 giorni, la sostanza in esame va considerata irritante.
 
3. RAPPORTO  
3.1 RAPPORTO SUL SAGGIO  
Il rapporto deve contenere le seguenti informazioni:  
Giustificazione del saggio  in vivo : analisi dell'importanza delle prove 
di dati pre-esistenti, compresi i risultati della strategia dei saggi 
sequenziali:  
— descrizione dei dati pertinenti disponibili da saggi precedenti;  
— dati ricavati in ciascuna fase della strategia dei saggi;  
— descrizione dei saggi in vitro eseguiti, con i dettagli delle proce ­
dure, i risultati ottenuti con le sostanze in esame/di riferimento;  
— analisi dell'importanza delle prove per l'esecuzione dello studio  in 
vivo. 
Sostanza in esame:  
— dati di identificazione (ad es. numero CAS, origine, purezza, 
impurità note, numero di lotto);  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad es. pH, volatilità, 
solubilità, stabilità);  
— se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei 
componenti.  
Eccipiente:  
— identificazione, concentrazione (ove pertinente), volume usato;  
— giustificazione della scelta dell'eccipiente.  
Cavie:  
— specie/ceppo usato, motivazione per l'uso di animali diversi dal 
coniglio albino;  
— numero di animali di ciascun sesso;  
— peso di ciascun singolo animale all'inizio e alla conclusione del 
saggio;  
— età all'inizio dello studio;  
— origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 244
 
Condizioni del saggio:  
— tecnica di preparazione del punto di applicazione del cerotto;  
— dettagli relativi al materiale del cerotto e alla tecnica di applica ­
zione del cerotto;  
— dettagli relativi a preparazione, applicazione e rimozione della 
sostanza in esame.  
Risultati:  
— tabulazione dei punteggi delle reazioni di irritazione/corrosione 
per ciascun animale in tutti i momenti di misurazione;  
— descrizione di tutte le lesioni osservate;  
— descrizione della natura e del grado di irritazione o corrosione 
osservate e degli eventuali reperti istopatologici;  
— descrizione di altri effetti negativi locali (ad es. perdita del grasso 
cutaneo) e sistemici oltre all'irritazione e alla corrosione cutanea.  
Discussione dei risultati  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ver ­
haar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Wor ­
kshop Report 8. ATLA 23,410-429.  
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19-26.  
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, «Skin Irritation», Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
 
(5a) Metodo di prova B.40 Corrosione cutanea.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation 
and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Me ­
thods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996. (http:// ­
www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification Sy ­
stem for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Che ­
micals Committee and the Working Party on Chemicals, No ­
vember 1998. (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www1.oecd.org/ehs/test/ ­
monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
[Available from OECD Secretariat upon request].  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 246
 
Tabella I  
CLASSIFICAZIONE DELLE REAZIONI CUTANEE  
Eritema e formazione di escara  
Assenza di eritema 0 
Eritema molto lieve (appena percettibile) 1 Eritema ben definito 2 Eritema da moderato a grave 3 Eritema grave (rosso vivo) fino alla formazione di escara che impedisce 
la classificazione dell'eritema 4
 
Massimo possibile: 4  
Formazione di edema  
Assenza di edema 0 
Edema molto lieve (appena percettibile) 1 
Edema lieve (bordi dell'area ben definiti dal gonfiore) 2 Edema moderato (area sollevata di circa 1 mm) 3 Edema grave (area sollevata di oltre 1 mm ed estesa oltre la zona di 
esposizione) 4
 
Massimo possibile: 4  
Per chiarire le reazioni dubbie è possibile eseguire un esame istopatologico.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 247
 
Allegato  
Strategia dei saggi sequenziali per l'irritazione e la corrosione cutanee  
CONSIDERAZIONI GENERALI  
Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli animali, è impor ­
tante evitare l'uso non necessario di animali e ridurre al minimo i saggi atti a 
provocare reazioni gravi. Valutare tutte le informazioni relative alla potenziale 
irritazione/corrosività cutanea di una sostanza prima di prendere in considera ­
zione i saggi in vivo. È possibile che esistano già prove sufficienti per classifi ­
care il potenziale di irritazione o corrosione cutanea di una sostanza in esame, 
senza bisogno di effettuare saggi su animali da laboratorio. L'analisi dell'impor ­
tanza delle prove e una strategia dei saggi sequenziali ridurranno al minimo la necessità di eseguire saggi in vivo, soprattutto se è probabile che la sostanza provochi reazioni gravi.
 
Si raccomanda l'uso di un'analisi dell'importanza delle prove per valutare le 
informazioni esistenti sul potenziale di irritazione e corrosione cutanea delle 
sostanze e determinare se occorre eseguire altri studi, diversi da quelli cutanei 
in vivo, per caratterizzare meglio tale potenziale. Qualora tali studi fossero ne ­
cessari, si raccomanda di usare la strategia dei saggi sequenziali per sviluppare i dati sperimentali pertinenti. Per le sostanze senza una documentazione sperimen ­
tale, usare la strategia dei saggi sequenziali per sviluppare i dati necessari al fine 
di valutarne il potenziale di corrosività/irritazione cutanea. La strategia dei saggi descritta nel presente allegato è stata sviluppata nel corso di un workshop del ­
l'OCSE (1), ed è stata successivamente confermata ed ampliata nello  Harmonised 
Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental 
Effects of Chemical Substances  (Sistema di classificazione armonizzato integrato 
dei rischi per la salute umana e gli effetti ambientali delle sostanze chimiche), come approvato alla 28
 a riunione congiunta del comitato sulle sostanze chimiche 
e dal gruppo di lavoro sulle sostanze chimiche nel novembre 1998 (2).  
Questa strategia dei saggi sequenziali non è parte integrante del metodo di prova 
B.4., ma esprime l'approccio raccomandato per determinare le caratteristiche di 
irritazione/corrosione cutanea. Tale approccio rappresenta sia la migliore prassi che un punto di riferimento etico per l'esecuzione di saggi in vivo sull'irritazione/corrosione cutanea. Il metodo di prova fornisce indicazioni su 
come eseguire il saggio in vivo e riassume i fattori da valutare prima di prendere 
in considerazione tale saggio. La strategia dei saggi sequenziali fornisce un approccio per valutare i dati esistenti sulle caratteristiche di irritazione/corrosione cutanea delle sostanze e un approccio graduale per lo sviluppo di dati pertinenti 
sulle sostanze sulle quali sono necessari ulteriori studi o che non sono mai state 
oggetto di studio. Essa raccomanda inoltre l'esecuzione di saggi validati ed accettati  in vitro  o ex vivo  di irritazione/corrosione cutanea in circostanze specifi ­
che.
 
DESCRIZIONE DELLA STRATEGIA DI VALUTAZIONE E SAGGI  
Prima di effettuare saggi nell'ambito della strategia dei saggi sequenziali (Figura), 
occorre valutare tutte le informazioni disponibili, per determinare l'effettiva ne ­
cessità di saggi cutanei in vivo. Sebbene sia possibile trarre significative infor ­
mazioni dalla valutazione di singoli parametri (ad es. pH estremo), è necessario valutare la totalità delle informazioni esistenti. Nel prendere una decisione sul ­
l'importanza delle prove vanno valutati tutti i dati pertinenti sugli effetti della 
sostanza in questione e dei suoi analoghi strutturali e occorre giustificare tale decisione. Dare soprattutto importanza ai dati esistenti sulla sostanza riguardo a persone e animali, seguiti dal risultato dei saggi  in vitro  o ex vivo . Ove possibile, 
vanno evitati gli studi in vivo delle sostanze corrosive. I fattori considerati nella 
strategia di saggio sono:
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 248
 
Valutazione dei dati esistenti su soggetti umani e animali (Fase 1).  Considerare 
innanzi tutto i dati esistenti sulle persone (studi clinici e occupazionali, relazioni 
di casi, e/o dati relativi a saggi su animali, ad es. da studi di tossicità da esposizione cutanea singola o ripetuta) in quanto forniscono informazioni diret ­
tamente correlate agli effetti sulla pelle. Non occorre sottoporre a saggi in vivo le 
sostanze notoriamente irritanti o corrosive, nonché quelle che hanno dimostrato 
inequivocabilmente di non essere corrosive e di non avere potere irritante.
 
Analisi delle relazioni struttura/attività (SAR) (Fase 2).  Si devono considerare i 
risultati dei saggi di sostanze chimiche strutturalmente correlate, ove disponibili. Quando sono disponibili dati su persone e/o animali riguardo a sostanze struttu ­
ralmente correlate o miscele di tali sostanze sufficienti a indicarne il potenziale di 
corrosione/irritazione cutanea, si può presumere che la sostanza in esame pro ­
durrà le stesse reazioni. In questi casi non è probabilmente necessario saggiare la sostanza. Dati negativi derivanti da studi di sostanze strutturalmente correlate o miscele di tali sostanze non costituiscono una prova sufficiente di non 
corrosività/non potere irritante di una sostanza nell'ambito della strategia dei 
saggi sequenziali. Per identificare il potenziale di corrosione e irritazione cutanea usare approcci SAR validati ed accettati.
 
Proprietà fisico-chimiche e reattività chimica (Fase 3).  Le sostanze che presen ­
tano un pH estremo, come ad es. ≤ 2,0 o ≥ 11,5, possono avere forti effetti locali. 
Se il pH estremo costituisce la base per l'identificazione di una sostanza come 
corrosiva per la pelle, si può prendere in considerazione anche il suo rapporto acido/alcalino (capacità tampone) (3)(4). Se la capacità tampone suggerisce che una sostanza può non essere corrosiva per la pelle, è necessario effettuare ulte ­
riori saggi a conferma di questo dato, di preferenza un saggio  in vitro  o ex vivo  
validato ed accettato (cfr. fasi 5 e 6).
 
Tossicità cutanea (Fase 4).  Se una sostanza chimica è risultata molto tossica per 
via cutanea, non è probabilmente praticabile uno studio di irritazione/corrosione cutanea in vivo, poiché la quantità di sostanza in esame normalmente applicata 
potrebbe superare la dose altamente tossica e, di conseguenza, provocare la morte 
o grave sofferenza degli animali. Inoltre, se sono già stati eseguiti studi di tossicità cutanea su conigli albini fino al livello limite di dose di 2 000 mg/kg di peso corporeo o superiori, e non è stata osservata irritazione o corrosione 
cutanea, diventano superflui ulteriori saggi per l'irritazione/corrosione cutanea. 
Quando si valuta la tossicità cutanea acuta in studi eseguiti in precedenza occorre tenere presenti numerose considerazioni. Per esempio, le informazioni riferite sulle lesioni cutanee possono essere incomplete. È possibile che i saggi e le 
osservazioni siano stati eseguiti su una specie diversa dal coniglio, e la sensibilità 
della reazione delle varie specie può essere molto diversa. Inoltre, è possibile che la forma della sostanza in esame applicata agli animali non fosse adeguata per la valutazione dell'irritazione/corrosione cutanea (ad es. diluizione delle sostanze per 
i saggi della tossicità cutanea) (5). Tuttavia, nel caso di studi di tossicità cutanea 
ben concepiti e ben condotti sui conigli, i risultati negativi possono essere con ­
siderati una prova sufficiente che la sostanza non è corrosiva o irritante.
 
Risultati dei saggi in vitro o ex vivo (Fasi 5 e 6).  Non occorre sperimentare sugli 
animali le sostanze che hanno dimostrato di avere proprietà corrosive o grave ­
mente irritanti in un saggio  in vitro  o ex vivo  (6)(7) concepito per la valutazione 
di questi effetti specifici. Si può presumere che tali sostanze produrranno effetti 
analogamente gravi anche in vivo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 249
 
Saggio in vivo nei conigli (Fasi 7 e 8).  Qualora in base all'analisi dell'importanza 
delle prove si arrivasse alla decisione di eseguire un saggio in vivo, esso deve 
cominciare con un saggio iniziale su un solo animale. Se i risultati di tale saggio indicano che la sostanza è corrosiva per la pelle, non si devono effettuare altri saggi. Se invece il saggio iniziale non rivela un effetto corrosivo, la reazione 
irritante o negativa va confermata usando al massimo due altri animali per un 
periodo di esposizione di quattro ore. Se il saggio iniziale rivela un effetto irritante, il saggio di conferma può essere condotto in maniera sequenziale, oppure esponendo contemporaneamente i due animali aggiuntivi.
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22- 
24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/tests/background/htm).
 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as en ­
dorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ ­
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19-26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 
1-56032-356-6, Chapter 31,411-436.  
(6) Metodo di prova B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 250
 
Figura  
STRATEGIA DI TEST E VALUTAZIONE DELL'IRRITAZIONE/CORROSIONE 
CUTANEA
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 251
 
B.5. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE OCULARE  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde al TG 405 (2002) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Nella preparazione di questo metodo aggiornato è stata dedicata 
particolare attenzione ai possibili miglioramenti, mediante la valuta ­
zione di tutte le informazioni disponibili circa la sostanza in esame, per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio e tener conto del benessere degli animali. Questo metodo include la racco ­
mandazione, prima di effettuare il saggio  in vivo  descritto per 
l'irritazione/corrosione oculare acuta, di una analisi accurata dei dati disponibili e pertinenti  (weight-of-the-evidence analysis)  (1) sui 
dati pertinenti esistenti. Qualora i dati disponibili fossero insufficien ­
ti, si raccomanda di ottenerli mediante l'applicazione di saggi sequen ­
ziali (2)(3). La strategia di saggio raccomandata comprende l'esecu ­
zione di saggio in vitro validati ed accettati ed è descritta nell'Alle ­
gato al metodo. Inoltre, si raccomanda l'uso di un saggio di 
irritazione/corrosione cutanea  in vivo  per prevedere la corrosione 
oculare prima di considerare un saggio oculare  in vivo .
 
Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli ani ­
mali, non bisogna prendere in considerazione i saggi  in vivo  finché 
non siano stati valutati, considerando l'importanza delle prove, tutti i 
dati disponibili pertinenti circa la potenziale corrosività/irritazione 
oculare della sostanza. Tali dati devono comprendere prove derivanti da studi esistenti su soggetti umani e/o animali da laboratorio, prove 
di corrosività/irritazione di una o più sostanze strutturalmente corre ­
late o miscele di tali sostanze, dati dimostranti l'elevata acidità o alcalinità della sostanza (4)(5), nonché i risultati di saggi in vitro o ex vivo validati ed accettati per la corrosione e l'irritazione cutanea 
(6)(6a). Gli studi possono essere stati condotti prima di un'analisi 
dell'importanza delle prove, o in conseguenza di essa.
 
Per alcune sostanze, un'analisi di questo tipo può indicare la neces ­
sità di studi  in vivo  del potenziale di corrosione/irritazione oculare. In 
tutti questi casi, prima di considerare l'uso del saggio oculare  in vivo , 
va preferibilmente condotto uno studio sugli effetti cutanei  in vivo  
della sostanza, e valutate in base al metodo B.4 (7). L'applicazione di un'analisi dell'importanza delle prove e la strategia dei saggi sequen ­
ziali dovrebbe ridurre la necessità di eseguire saggi  in vivo  della 
corrosività/irritazione delle sostanze per le quali esistano già prove 
sufficienti derivanti da altri studi. Qualora non sia possibile determi ­
nare il potenziale di corrosione o irritazione oculare usando la stra ­
tegia dei saggi sequenziali, anche dopo l'esecuzione di uno studio  in 
vivo della corrosione e dell'irritazione della cute, si può effettuare un 
saggio  in vivo  della corrosione/irritazione oculare.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 252
 
Nell'Allegato al presente metodo di prova è inclusa la strategia dei 
saggi sequenziali da preferirsi, che prevede l'esecuzione di saggi 
validati in vitro o ex vivo per la corrosione/irritazione. Tale strategia è stata sviluppata e raccomandata all'unanimità dai partecipanti a un workshop dell'OCSE (8), ed è stata adottata come strategia racco ­
mandata di saggio nel GHS  (Globally Harmonised System for the 
Classification of Chemical Substances)  (Sistema globale armonizzato 
per la classificazione delle sostanze chimiche) (9). Si raccomanda di seguire questa strategia prima di passare al saggio  in vivo . Per le 
nuove sostanze, si raccomanda di adottare una strategia a «tappesag ­
gio» (stepwise), per sviluppare dati scientificamente validi sulla corrosività/irritazione della sostanza. Se per le sostanze esistenti i dati sulla corrosione/irritazione oculare e cutanea sono insufficienti, 
si può usare tale strategia per recuperare i dati mancanti. È necessa ­
rio giustificare l'uso di una strategia o procedura di saggio differente, nonché l'eventuale decisione di non usare un approccio di saggio «per gradi.»
 
1.2 DEFINIZIONI  
Irritazione oculare:  produzione di alterazioni nell'occhio in seguito 
all'applicazione della sostanza in esame sulla superficie anteriore del ­
l'occhio, completamente reversibili entro 21 giorni dall'applicazione.  
Corrosione oculare:  produzione di lesioni del tessuto oculare o di 
un grave deterioramento fisico della vista, in seguito all'applicazione della sostanza in esame sulla superficie anteriore dell'occhio, non 
completamente reversibili entro 21 giorni dall'applicazione.
 
1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame è applicata in un'unica dose su uno degli occhi 
dell'animale sperimentale; l'occhio non trattato serve da controllo. Il grado di irritazione/corrosione è valutato dando un punteggio alle lesioni di congiuntiva, cornea e iride, a intervalli di tempo specifici. 
Sono descritti anche altri effetti sull'occhio ed effetti negativi siste ­
mici, con l'obiettivo di fornire una valutazione completa degli effetti. La durata dello studio deve essere sufficiente a valutare la reversi ­
bilità o irreversibilità degli effetti.
 
Gli animali che presentano segni prolungati di grave sofferenza e/o 
dolore, in qualsiasi fase del saggio, vanno soppressi con metodi non 
cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Cfr. bibliografia per i criteri da seguire nel decidere l'eutanasia di animali moribondi o che soffrono gravemente (10).
 
1.4 DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.4.1  Preparazione per il saggio  in vivo  
1.4.1.1  Selezione delle specie  
L'animale da laboratorio di elezione è il coniglio albino, del quale 
vanno utilizzati giovani adulti sani. Giustificare l'eventuale uso di altri ceppi o specie.
 
1.4.1.2  Preparazione degli animali  
Entro 24 ore dall'inizio del saggio è necessario esaminare entrambi 
gli occhi di ciascun animale sperimentale provvisoriamente selezio ­
nato per il saggio. Non vanno utilizzati animali che presentino irri ­
tazione oculare, difetti degli occhi o preesistenti lesioni corneali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 253
 
1.4.1.3  Condizioni di alloggio e alimentazione  
Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura del locale 
deve essere di 20  o C (± 3  o C) per i conigli. Sebbene l'umidità relativa 
debba raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 
70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, occorre 
puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artifi ­
ciale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per l'alimentazione, attenersi alle diete convenzionali da laboratorio con 
una quantità illimitata di acqua potabile.
 
1.4.2  Procedura  
1.4.2.1  Applicazione della sostanza in esame  
La sostanza in esame va posta nel sacco congiuntivale di un occhio 
di ciascun animale, dopo aver allontanato delicatamente la palpebra inferiore dal bulbo. Le palpebre vanno poi tenute unite con delica ­
tezza per circa un secondo, per evitare la fuoriuscita del materiale. 
L'altro occhio, che non viene trattato, serve da controllo.
 
1.4.2.2  Irrigazione  
Gli occhi degli animali sperimentali non vanno lavati per almeno 24 
ore dopo l'instillazione della sostanza in esame, tranne nel caso di 
saggio di sostanze solide (cfr. punto 1.4.2.3.2), e nel caso di effetti corrosivi o irritanti immediati. Dopo 24 ore è possibile effettuare un lavaggio, se lo si considera necessario.
 
Non si raccomanda l'uso di un gruppo satellite di animali per stu ­
diare l'influenza del lavaggio oculare, a meno che ciò non risulti 
scientificamente giustificato. Qualora sia necessario un gruppo satel ­
lite, vanno usati due conigli. Le condizioni del lavaggio vanno do ­
cumentate accuratamente: momento del lavaggio, composizione e 
temperatura della soluzione di lavaggio, durata, volume e velocità 
di applicazione.  
1.4.2.3  Livello di dosi  
1.4.2.3.1  Saggio di liquidi  
Per saggiare i liquidi usare una dose di 0,1 ml. Non usare spray per 
instillare la sostanza direttamente nell'occhio; lo spray liquido va 
spruzzato e raccolto in un contenitore prima di instillarne 0,1 ml 
nell'occhio.  
1.4.2.3.2  Saggio di solidi  
Nel saggio di sostanze solide, paste e sostanze particellari, la quantità 
impiegata deve avere un volume di 0,1 ml o un peso non superiore a 100 mg. Il materiale in esame va ridotto in polvere fine. Prima della 
misurazione del volume, il materiale solido va delicatamente com ­
pattato, ad esempio picchiettando sul contenitore per la misurazione. Se la sostanza in esame solida non è stata rimossa dall'occhio del ­
l'animale da meccanismi fisiologici, al primo tempo di osservazione 
un'ora dopo il trattamento, si può sciacquare l'occhio con soluzione 
salina o acqua distillata.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Saggio di aerosol  
Si raccomanda di raccogliere tutti gli spray e gli aerosol prima 
dell'instillazione nell'occhio. L'unica eccezione riguarda le sostanze 
in contenitori pressurizzati per aerosol, che non possono essere rac ­
colte a causa della vaporizzazione. In questi casi l'occhio va tenuto aperto e la sostanza va somministrata nell'occhio con un unico 
spruzzo di circa un secondo, da una distanza di 10 cm, direttamente 
davanti all'occhio. La distanza può variare a seconda della pressione dello spray e del suo contenuto. Evitare di danneggiare l'occhio con la pressione dello spray. In alcuni casi può essere necessario valutare 
il potenziale di danno «meccanico» all'occhio dovuto alla forza dello 
spray.
 
È possibile ottenere una stima della dose di un aerosol simulando il 
saggio come segue: spruzzare la sostanza attraverso un'apertura delle 
dimensioni dell'occhio di un coniglio posta esattamente di fronte ad 
un foglio di carta. L'aumento di peso della carta viene usato quindi per approssimare la quantità spruzzata nell'occhio. Per le sostanze volatili, la dose può essere stimata pesando un contenitore ricevente 
prima e dopo la rimozione del materiale in esame.
 
1.4.2.4  Saggio iniziale (saggio di irritazione/corrosione oculare in vivo su 
un solo animale)  
Come descritto nella strategia dei saggi sequenziali (cfr. Allegato 1), 
si raccomanda caldamente di eseguire inizialmente il saggio  in vivo  
usando un solo animale.  
Se con la procedura descritta, i risultati di tale saggio indicano che la 
sostanza è corrosiva o gravemente irritante per l'occhio, non eseguire altri saggi di irritazione oculare.
 
1.4.2.5  Anestetici locali  
È possibile applicare anestetici locali, valutandone la necessità caso 
per caso. Se l'analisi dell'importanza delle prove indica che la so ­
stanza può provocare dolore, e se il saggio iniziale dimostra che si verificherà una reazione dolorosa, prima dell'instillazione della so ­
stanza in esame si può applicare un anestetico locale. Il tipo, la 
concentrazione e la dose dell'anestetico locale vanno attentamente selezionati in modo da assicurare che il suo uso non modifichi la reazione alla sostanza in esame. Anche l'occhio di controllo va ane ­
stetizzato analogamente.
 
1.4.2.6  Saggio di conferma (saggio di irritazione oculare in vivo con ani ­
mali supplementari)  
Se nel saggio iniziale non si osservano effetti corrosivi, confermare 
la reazione irritante o negativa su un massimo di altri due animali. Se nel saggio iniziale è stato osservato un effetto fortemente irritante 
che indica un possibile effetto grave (irreversibile) si raccomanda di 
eseguire il saggio di conferma in maniera sequenziale su un solo animale per volta, anziché esporre contemporaneamente i due ani ­
mali. Se il secondo animale rivela effetti corrosivi o gravemente 
irritanti, interrompere il saggio. È possibile che siano necessari altri 
animali per confermare le reazioni irritanti deboli o moderate.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 255
 
1.4.2.7  Periodo di osservazione  
La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a va ­
lutare completamente l'entità e la reversibilità degli effetti osservati. Interrompere però l'esperimento in qualsiasi momento se l'animale 
mostra segni continui di dolore o sofferenza gravi (9). Per determi ­
nare la reversibilità degli effetti, gli animali vanno osservati di norma per 21 giorni successivamente alla somministrazione della sostanza in esame. In caso di reversibilità prima dei 21 giorni, interrompere 
subito l'esperimento.
 
1.4.2.7.1  Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni oculari  
Gli occhi vanno esaminati a 1, 24, 48 e 72 ore dopo l'applicazione 
della sostanza in esame. Gli animali devono essere sottoposti a sag ­
gio per il tempo minimo necessario per ottenere informazioni defi ­
nitive. Gli animali che presentano grave dolore o sofferenza vanno soppressi al più presto con metodi non cruenti e la sostanza va valutata di conseguenza. Sopprimere con metodi non cruenti gli 
animali che, dopo l'instillazione, presentano le seguenti lesioni ocu ­
lari: perforazione corneale o ulcerazione corneale di rilievo, com ­
preso stafiloma; sangue nella camera anteriore dell'occhio; opacità corneale di grado 4 che persista per 48 ore; assenza di riflesso 
pupillare alla luce (risposta dell'iride di grado 2) che persista per 
72 ore; ulcerazione della membrana congiuntivale; necrosi della con ­
giuntiva o della membrana nittitante; distacco epidermico. Tali le ­
sioni sono infatti generalmente irreversibili.
 
Gli animali che non sviluppano lesioni oculari possono essere sop ­
pressi non prima di 3 giorni dopo l'instillazione. Gli animali con lesioni lievi o moderate vanno tenuti sotto osservazione fino alla scomparsa delle lesioni, oppure per 21 giorni, momento in cui lo 
studio si conclude. Effettuare le osservazioni nei giorni 7,14 e 21, 
con l'obiettivo di determinare lo stato delle lesioni e la loro reversi ­
bilità o irreversibilità.
 
In occasione di ciascun esame, registrare i gradi della reazione ocu ­
lare (congiuntiva, cornea e iride) (Tabella I). Annotare anche qual ­
siasi altra lesione dell'occhio (ad es. panno corneale, macchie) e qualsiasi effetto sistemico negativo.
 
L'esame delle reazioni può essere facilitato usando una lente bino ­
culare, una lampada manuale a fessura, un biomicroscopio o altro 
dispositivo idoneo. Dopo aver registrato le osservazioni a 24 ore, è 
possibile esaminare ulteriormente gli occhi con l'ausilio di fluore ­
sceina.  
La classificazione delle reazioni oculari è necessariamente soggettiva. 
Per favorirne l'armonizzazione e per assistere i laboratori e le persone 
che eseguono e interpretano le osservazioni, istruire adeguatamente il personale sul sistema di punteggio utilizzato.
 
2. DATI  
2.2 VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
Valutare i punteggi dell'irritazione oculare insieme alla natura e alla 
gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. I 
punteggi individuali non rappresentano uno standard assoluto per le proprietà irritanti di un materiale, in quanto si valutano anche altri effetti del materiale in esame. I punteggi individuali vanno invece considerati 
come valori di riferimento e hanno significato solo se corredati da una 
descrizione e una valutazione complete di tutte le osservazioni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 256
 
3. RAPPORTO  
3.1 RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto deve contenere le seguenti informazioni:  
Motivazione per il saggio  in vivo : analisi dei dati relativi a saggi 
precedenti, compresi i risultati della strategia dei saggi sequenziali  
— descrizione dei dati pertinenti disponibili da saggi precedenti;  
— dati ricavati in ciascuna fase della strategia di saggio;  
— descrizione dei saggi in vitro eseguiti, con i dettagli delle proce ­
dure, i risultati ottenuti con le sostanze in esame/di riferimento;  
— descrizione dello studio di irritazione/corrosione cutanea  in vivo  
eseguito, con i risultati ottenuti;  
— analisi dell'importanza delle prove per l'esecuzione dello studio  in 
vivo 
Sostanza in esame:  
— dati di identificazione (ad es. numero CAS, origine, purezza, 
impurità note, numero di lotto);  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad es. pH, volatilità, 
solubilità, stabilità, reattività con l’acqua);  
— se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei 
componenti;  
— se si usa un anestetico locale, identificazione, purezza, tipo, dose 
e potenziale interazione con la sostanza in esame.  
Eccipiente:  
— identificazione, concentrazione (ove pertinente), volume usato;  
— giustificazione della scelta dell'eccipiente.  
Animali sperimentali:  
— specie/ceppo usato, motivazione dell'uso di animali diversi dal 
coniglio albino;  
— età di ciascun animale all'inizio dello studio;  
— numero di animali di ciascun sesso nei gruppi sperimentali e di 
controllo (ove necessario);  
— peso di ciascun singolo animale all'inizio e alla conclusione del 
saggio;  
— origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.  
Risultati:  
— descrizione del metodo usato per assegnare un punteggio all'irri ­
tazione in ciascun momento di osservazione (ad es. lampada 
manuale a fessura, biomicroscopio, fluoresceina);  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 257
 
— tabella dei dati relativi alla reazione irritante/corrosiva per cia ­
scun animale e in ciascun momento di osservazione fino alla fine 
del saggio  
— descrizione del grado e della natura dell'irritazione o della cor ­
rosione osservata;  
— descrizione di qualsiasi altra lesione osservata nell'occhio (ad es. 
vascolarizzazione, formazione di panno oculare, aderenze, macchie);  
— descrizione degli eventuali effetti negativi non oculari locali e 
sistemici e degli eventuali reperti istopatologici.  
Discussione dei risultati.  
3.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
L'estrapolazione dei risultati degli studi sull'irritazione oculare negli 
animali da laboratorio agli esseri umani ha un valore solo limitato. In 
molti casi, il coniglio albino è più sensibile dell'uomo alle sostanze irritanti o corrosive per l'occhio.
 
È necessario interpretare con attenzione i dati per escludere l'irrita ­
zione dovuta a infezione secondaria.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.
 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227-231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
 
(6a) Metodo di prova B.40 Corrosione cutanea.  
(7) Metodo di prova B.4. Tossicità acuta: irritazione/corrosione 
cutanea.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Me ­
thods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:// ­
www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmen ­
tal Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 259
 
Tabella I  
CLASSIFICAZIONE DELLE LESIONI OCULARI  
Cornea  
Opacità: grado di densità (le misure vanno prese dalle zone più dense) (*) 
Assenza di ulcerazione e opacità 0 
Zone di opacità sparse o diffuse (diverse dal lieve appannamento della 
normale lucentezza); dettagli dell'iride visibili chiaramente 1 
Zone traslucide facilmente individuabili; dettagli dell'iride lievemente 
offuscati 2 
Zona madreperlacea; nessun dettaglio visibile dell'iride; dimensioni 
della pupilla appena distinguibili 3 
Cornea opaca; iride non distinguibile attraverso l'opacità 4  
Massimo possibile: 4  
NOTE  
(*) Indicare l'area di opacità corneale  
Iride  
Normale 0 
Rughe notevolmente approfondite, congestione, edema, moderata ipere ­
mia circumcorneale; oppure iniezione; iride reattiva alla luce (una rea ­
zione lenta è considerata positiva) 1 
Emorragia, distruzione macroscopica, oppure assenza di reazione alla 
luce 2 
Massimo possibile: 2  
Congiuntive  
Rossore (relativo alla congiuntiva palpebrale e bulbare; escluse cornea e iride) 
Normale 0 
Alcuni vasi sanguigni iperemici (iniettati) 1 Colore cremisi diffuso; singoli vasi non facilmente distinguibili 2 Rosso acceso diffuso 3
 
Massimo possibile: 3  
Chemosi  
Edema (relativo alle palpebre e/o alle membrane nittitanti) 
Normale 0 
Edema appena superiore alla norma 1 Edema evidente, con parziale eversione delle palpebre 2 Edema, con palpebre semichiuse 3 Edema, con palpebre più che semichiuse 4
 
Massimo possibile: 4  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 260
 
Allegato  
Strategia dei saggi sequenziali per l'irritazione e la corrosione oculari  
CONSIDERAZIONI  
Nell'interesse dell'accuratezza scientifica e del benessere degli animali, è impor ­
tante evitare l'uso non necessario di animali e ridurre al minimo i saggi atti a 
provocare reazioni gravi. Valutare tutte le informazioni relative alla potenziale 
irritazione/corrosività oculare di una sostanza prima di prendere in considerazione i saggi  in vivo . È possibile che esistano già prove sufficienti per classificare il 
potenziale di irritazione o corrosione oculare di una sostanza in esame, senza 
bisogno di effettuare saggi su animali da laboratorio. L'analisi dell'importanza 
delle prove e l'uso di una strategia dei saggi sequenziali ridurranno al minimo la necessità di eseguire saggi  in vivo , soprattutto se è probabile che la sostanza 
provochi reazioni gravi.
 
Si raccomanda di svolgere un'analisi dell'importanza delle prove per valutare le 
informazioni esistenti sul potenziale di irritazione e corrosione oculare delle sostanze e determinare la necessità di altri studi, diversi da quelli  in vivo  sugli 
occhi, per meglio caratterizzare tale potenziale. Qualora tali studi fossero neces ­
sari, si raccomanda di applicare la strategia dei saggi sequenziali per sviluppare i 
dati sperimentali pertinenti. Per le sostanze senza una documentazione sperimen ­
tale, usare la strategia dei saggi sequenziali per sviluppare i dati necessari al fine di valutarne la corrosività/irritazione oculare. La strategia dei saggi descritta nel 
presente Allegato è stata sviluppata nel corso di un workshop dell'OCSE (1) e 
successivamente confermata ed ampliata nello  Harmonised Integrated Hazard 
Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances  (Sistema di classificazione armonizzato integrato dei rischi per la 
salute umana e gli effetti ambientali delle sostanze chimiche), come approvato 
alla 28
 a riunione congiunta del comitato sulle sostanze chimiche e dal gruppo di 
lavoro sulle sostanze chimiche nel novembre 1998 (2).  
Questa strategia di saggio non è parte integrante del metodo di prova B.5, ma 
esprime l'approccio raccomandato per la determinazione delle proprietà di irritazione/corrosione oculare. Tale approccio rappresenta sia la migliore prassi che un punto di riferimento etico per l'esecuzione di saggi  in vivo  sull'irritazione/ ­
corrosione oculare. Il metodo di prova fornisce indicazioni su come eseguire il 
saggio  in vivo  e riassume i fattori da valutare prima di prendere in considerazione 
tale saggio. La strategia dei saggi sequenziali fornisce un metodo di analisi dell'importanza delle prove per la valutazione dei dati esistenti sulle proprietà 
di irritazione/corrosione oculare delle sostanze e un approccio graduale per lo 
sviluppo di dati pertinenti sulle sostanze sulle quali sono necessari ulteriori studi o che non sono mai state oggetto di studio. La strategia prevede dapprima l'esecuzione di saggi validati ed accettati  in vitro  o ex vivo  e successivamente 
di studi di irritazione/corrosione cutanea in base al metodo di prova B.4 in 
circostanze specifiche (3)(4).
 
DESCRIZIONE DELLA STRATEGIA DI SAGGIO «PER GRADI»  
Prima di effettuare saggi nell'ambito della strategia dei saggi sequenziali (Figura), 
valutare tutte le informazioni disponibili, per determinare l'effettiva necessità di saggi oculari  in vivo . Sebbene sia possibile trarre significative informazioni dalla 
valutazione di singoli parametri (ad es. pH estremo), è necessario valutare la 
totalità delle informazioni esistenti. Nel prendere una decisione sull'importanza 
delle prove valutare tutti i dati pertinenti sugli effetti della sostanza in questione e dei suoi analoghi strutturali e giustificare tale decisione. Dare soprattutto impor ­
tanza ai dati esistenti sulla sostanza riguardo a persone e animali, seguiti dal 
risultato dei saggi  in vitro  o ex vivo . Ove possibile, evitare gli studi  in vivo  delle 
sostanze corrosive. I fattori considerati nella strategia di saggio sono:
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 261
 
Valutazione dei dati esistenti su soggetti umani e animali (Fase 1).  Considerare 
innanzitutto i dati esistenti sulle persone (studi clinici e occupazionali, relazioni 
di casi, e/o dati relativi a saggi su animali in studi sugli occhi), in quanto forniscono informazioni direttamente correlate agli effetti sugli occhi. Successi ­
vamente valutare i dati disponibili di studi su soggetti umani e/o animali sulla 
corrosione/irritazione cutanea. Non instillare negli occhi degli animali sostanze 
notoriamente corrosive o gravemente irritanti per l'occhio né sostanze che mo ­
strano effetti corrosivi o irritanti sulla pelle; tali sostanze vanno considerate corrosive e/o irritanti anche per gli occhi. Non saggiare  in vivo  sugli occhi 
sostanze che in precedenti studi oculari hanno presentato prove sufficienti di 
non essere corrosive e di non avere potere irritante.
 
Analisi delle relazioni struttura/attività (SAR) (Fase 2).  Prendere in considera ­
zione i risultati dei saggi di sostanze chimiche strutturalmente correlate, ove disponibili. Quando sono disponibili dati su persone e/o animali riguardo a sostanze strutturalmente correlate o miscele di tali sostanze sufficienti a indicarne 
il potenziale di corrosione/irritazione oculare, si può presumere che la sostanza in 
esame provocherà le stesse reazioni. In questi casi non è probabilmente neces ­
sario saggiare la sostanza. Dati negativi derivanti da studi di sostanze struttural ­
mente correlate o miscele di tali sostanze non costituiscono una prova sufficiente 
di non corrosività/non potere irritante di una sostanza nell'ambito della strategia 
dei saggi sequenziali. Per identificare il potenziale di corrosione e irritazione sia per gli effetti oculari che per quelli cutanei usare approcci SAR validati ed 
accettati.
 
Proprietà fisicochimiche e reattività chimica (Fase 3).  Le sostanze che presen ­
tano un pH estremo, come ad es. ≤ 2,0 o ≥ 11,5, possono avere forti effetti locali. 
Se il pH estremo costituisce la base per identificare una sostanza come corrosiva o irritante per gli occhi, si può prendere in considerazione anche il suo rapporto acido/alcalino (capacità tampone) (5)(6). Se la capacità tampone suggerisce che 
una sostanza può non essere corrosiva per l'occhio, è necessario effettuare ulte ­
riori saggi a conferma di questo dato, di preferenza un saggio  in vitro  o ex vivo  
validato ed accettato (cfr. punto Fasi 5 e 6).
 
Considerazione di altre informazioni esistenti (Fase 4).  Valutare in questa fase 
tutte le informazioni disponibili sulla tossicità sistemica per via cutanea. Consi ­
derare anche la tossicità cutanea acuta della sostanza in esame. Se essa si è 
dimostrata molto tossica per via cutanea, può non essere necessario saggiarla sull'occhio. Sebbene non vi sia necessariamente un rapporto fra la tossicità cu ­
tanea acuta e l'irritazione/corrosione oculare, si può presumere che se una so ­
stanza è molto tossica per via cutanea, presenterà anche elevata tossicità quando 
viene instillata nell'occhio. Questi dati possono essere valutati anche fra le fasi 2 e 3.
 
Risultati dei saggi in vitro o ex vivo (Fasi 5 e 6).  Non occorre sperimentare sugli 
animali le sostanze che hanno dimostrato di avere proprietà corrosive o grave ­
mente irritanti in un saggio  in vitro  o ex vivo  (7)(8) che è stato validato ed 
accettato per la valutazione specifica della corrosività/irritazione oculare o cuta ­
nea. Si può presumere che tali sostanze produrranno effetti analogamente gravi anche  in vivo . Qualora non siano disponibili saggi  in vitro /ex vivo  validati ed 
accettati, si salteranno le Fasi 5 e 6 e si procederà direttamente alla Fase 7.
 
Valutazione del potere irritante o della corrosività cutanea in vivo della sostanza 
(Fase 7).  Quando le prove esistenti non sono sufficienti ad effettuare un'analisi 
dell'importanza delle prove conclusiva della potenziale irritazione/corrosività ocu ­
lare di una sostanza, sulla base dei dati degli studi sopra elencati, occorre valutare per prima cosa il potenziale di irritazione/corrosione cutanea  in vivo , usando il 
metodo di prova B.4 (4) e il suo Allegato (9). Qualora si dimostri che la sostanza 
provoca corrosione o grave irritazione cutanea, essa va considerata un irritante oculare corrosivo, a meno che altre informazioni non vadano a sostegno di una conclusione alternativa. Pertanto, non è necessario eseguire un saggio oculare  in 
vivo. Se la sostanza non è corrosiva o gravemente irritante per la pelle, va 
eseguito un saggio oculare  in vivo .
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Saggio in vivo nei conigli (Fasi 8 e 9).  Gli studi oculari  in vivo  devono comin ­
ciare con un saggio iniziale su un solo animale. Se i risultati di questo saggio 
indicano che la sostanza è gravemente irritante o corrosiva per gli occhi, non si devono effettuare altri saggi. Se invece il saggio non rivela effetti corrosivi o gravemente irritanti, si esegue un saggio di conferma con altri due animali.
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22- 
24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as en ­
dorsed by the 28  th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.  
(4) Metodo di prova B.4. Tossicità acuta: irritazione/corrosione cutanea.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In  Vitro,  2, 
19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  in Vitro  
12, pp. 483-524.
 
(8) Metodo di prova B.40 Corrosione cutanea.  
(9) Allegato al metodo di prova B.4: Una strategia dei saggi sequenziali per 
l'irritazione e la corrosione cutanee.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 263
 
Figura  
STRATEGIA DI SAGGIO E VALUTAZIONE DELL'IRRITAZIONE/CORROSIONE 
OCULARE
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 265
 
B.6 SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Note:  
La sensibilità dei saggi e la loro efficacia nell'individuazione di 
potenziali sensibilizzatori della cute umana costituiscono parametri importanti in un sistema di classificazione della tossicità per la tutela della salute pubblica.
 
Non esiste un unico metodo sperimentale atto a identificare corret ­
tamente tutte le sostanze dotate di un potenziale sensibilizzante per la 
cute umana e quindi sistematicamente applicabile.  
Nella scelta del metodo occorre tener conto di fattori quali le carat ­
teristiche fisiche di una sostanza, compresa la sua capacità di pene ­
trazione cutanea.  
Sono stati elaborati due tipi di saggio su porcellini d'India: il saggio 
con utilizzo di adiuvanti, nel quale uno stato allergico viene poten ­
ziato sciogliendo o sospendendo la sostanza in esame in adiuvante completo di Freund (ACF), e il saggio senza utilizzo di adiuvante.
 
I saggi con utilizzo di adiuvante offrono generalmente un più elevato 
grado di precisione nell'individuare un potenziale di sensibilizzazione 
cutanea nell'uomo rispetto ai metodi che non prevedono l'uso del ­
l'adiuvante completo di Freund. Essi sono pertanto preferibili.  
Il «Guinea-Pig Maximisation Test» (GPMT) è un test con utilizzo di 
adiuvante ampiamente usato. Malgrado esistano diversi altri metodi 
per identificare il potenziale di sensibilizzazione cutanea di una so ­
stanza, il GPMT è considerato il metodo con adiuvante d'elezione.  
Per molte classi di sostanze chimiche, i saggi senza utilizzo di adiu ­
vante (fra cui il più diffuso è quello di Buehler) sono considerati 
meno sensibili.  
In alcuni casi il saggio di Buehler, che prevede un'applicazione 
topica della sostanza, può risultare preferibile all'iniezione intrader ­
mica utilizzata nel Guinea-Pig Maximisation Test. Qualora si opti per il saggio di Buehler, si dovrà fornire una giustificazione scien ­
tifica.
 
Il Guinea-Pig Maximisation Test (GPMT) e il saggio di Buehler 
sono descritti nel presente metodo. È possibile il ricorso ad altri metodi, purché siano debitamente convalidati e venga fornita una 
giustificazione scientifica.
 
In caso di risultato positivo di un saggio di screening riconosciuto, la 
sostanza in esame può essere considerata un potenziale sensibiliz ­
zante e non è necessario condurre un ulteriore test GPMT. Tuttavia in caso di risultato negativo del saggio di screening è necessario 
condurre un test GPMT attenendosi alla procedura descritta nel pre ­
sente metodo di saggio.
 
Vedi anche introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 266
 
1.2. DEFINIZIONI  
Sensibilizzazione cutanea:  (dermatite allergica da contatto) è una 
reazione cutanea a una sostanza mediata da fattori immunologici. Nell'uomo la reazione può essere caratterizzata da prurito, eritema, 
edema, papule, vescicole, bolle o da una combinazione di queste 
manifestazioni. In altre specie le reazioni possono differire e limitarsi alla comparsa di eritemi e di edemi.
 
Esposizione di induzione:  esposizione sperimentale di un soggetto 
alla sostanza in esame al fine di indurre uno stato di ipersensibilità.  
Periodo di induzione:  periodo della durata minima di una settimana, 
successivo all'esposizione di induzione, entro il quale può manife ­
starsi uno stato di ipersensibilità.  
Esposizione di provocazione:  in un soggetto già trattato, esposizione 
sperimentale alla sostanza in esame, effettuata successivamente al periodo di induzione al fine di accertare se il soggetto sviluppa 
una reazione di ipersensibilità.
 
1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
La sensibilità e l'attendibilità della tecnica sperimentale utilizzata 
devono essere verificate ogni sei mesi utilizzando sostanze notoria ­
mente dotate di proprietà di sensibilizzazione cutanea di grado leg ­
gero-medio.  
In un saggio eseguito correttamente, per sensibilizzanti di tipo leg ­
gero-medio si dovrebbe avere una risposta pari ad almeno il 30 % 
con il metodo con adiuvanti e ad almeno il 15 % con il metodo 
senza adiuvanti.  
Si farà preferibilmente ricorso alle seguenti sostanze:  
Numero CAS- Numero EINECS- Denominazione EINECS Denominazione corrente  
101-86-0 202-983-3 α-esilcinnamaldeide α-esilcinnamaldeide 
149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-tiolo (mercapto- 
benzothiaziolo) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocaina norcaina  
Qualora le circostanze lo giustifichino, potranno essere utilizzate 
altre sostanze di controllo conformi ai criteri suelencati.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
In un primo tempo gli animali vengono esposti alla sostanza da 
saggiare con iniezioni intradermiche e/o applicazione epidermica (esposizione di induzione). Dopo un periodo di riposo di 10-14 
giorni (periodo di induzione), in cui si può sviluppare una risposta 
immunitaria, essi vengono esposti alla dose di provocazione. L'esten ­
sione e la gravità della reazione cutanea all'esposizione di provoca ­
zione vengono confrontate con la reazione sviluppata dagli animali 
di controllo trattati con un placebo nella fase di induzione e sottopo ­
sti all'esposizione di provocazione.
 
1.5. DESCRIZIONE DEI METODI DI SAGGIO  
Se lo si ritiene necessario, si procederà alla rimozione della sostanza 
da saggiare utilizzando acqua o un solvente appropriato, in modo da 
non alterare la reazione in corso, né intaccare l'integrità dell'epider ­
mide.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 267
 
1.5.1.  Guinea-Pig Maximistlion Test (GMPT)  
1.5.1.1. P r e p a r a z i o n i  
Porcellini d'India albini, giovani e sani, vengono acclimatati alle 
condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'inizio del 
saggio. Prima dell'esperimento, gli animali vengono suddivisi in 
modo casuale ed assegnati al gruppo da trattare o al gruppo di controllo. In funzione del metodo di saggio utilizzato, il pelo verrà tagliato, rasato o rimosso con una sostanza depilatoria, avendo cura 
di non danneggiare la cute. Gli animali vengono pesati all'inizio e 
alla fine del saggio.
 
1.5.1.2. C o n d i z i o n i s p e r i m e n t a l i  
1.5.1.2.1. Animali da esperimento  
Si utilizzano porcellini d'India albini di ceppi comunemente usati in 
laboratorio.  
1.5.1.2.2. Numero e sesso  
Si utilizzano animali di sesso maschile e/o femminile. Le femmine 
dovranno essere nullipare e non gravide.  
Il gruppo sottoposto a trattamento deve essere composto da almeno 
10 animali, il gruppo di controllo da un minimo di 5. Qualora il primo gruppo comprenda meno di 20 esemplari ed il secondo meno 
di 10 e non sia possibile concludere che la sostanza in esame è un 
sensibilizzante, si consiglia di proseguire lo studio fino a disporre di almeno 20 animali trattati e 10 di controllo.
 
1.5.1.2.3. Livelli di dosaggio  
La concentrazione della sostanza in esame utilizzata per ogni espo ­
sizione di induzione deve essere ben tollerata a livello sistemico e 
corrispondere alla dose massima suscettibile di produrre un'irrita ­
zione cutanea di grado leggero-medio. La concentrazione utilizzata per l'esposizione di provocazione deve corrispondere alla dose mas ­
sima che non cagioni irritazione. Se necessario, la concentrazione 
appropriata può essere determinata con uno studio pilota condotto su due o tre animali. A questo scopo è preferibile utilizzare animali trattati con l'adiuvante completo di Freund.
 
1.5.1.3. P r o c e d i m e n t o  
1.5.1.3.1. Induzione  
Giorno 0 — gruppo trattato  
Nella regione della spalla, debitamente depilata, si praticano tre serie 
di due iniezioni intradermiche da 0,1 ml ciascuna. Le due iniezioni 
di ciascuna serie devono essere praticate l'una a sinistra e l'altra a destra della linea mediana.
 
Iniezione 1: miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiolo ­
gica 
Iniezione 2: la sostanza in esame in un veicolo adatto alla concen ­
trazione selezionata  
Iniezione 3: la sostanza in esame alla concentrazione desiderata, 
formulata in una miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina 
fisiologica.  
Nell'iniezione 3, le sostanze idrosolubili vengono disciolte nella fase 
acquosa prima di essere miscelate con l'ACF. Le sostanze liposolu ­
bili o insolubili vengono messe in sospensione nell'ACF prima di essere combinate con la fase acquosa. La concentrazione finale della 
sostanza in esame deve essere uguale a quella utilizzata 
nell'iniezione 2.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 268
 
Le iniezioni 1 e 2 vengono praticate l'una accanto all'altra e quanto 
più possibile in prossimità della testa, mentre la 3 è praticata verso la 
parte caudale della zone d'esame.  
Giorno 0 — gruppo di controllo  
Tre serie di due iniezioni intradermiche, ciascuna del volume di 0,1 
ml, sono praticate negli stessi punti scelti per gli animali trattati.  
Iniezione 1: miscela 1:1 (v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiolo ­
gica 
Iniezione 2: il veicolo non diluito  
Iniezione 3: formulazione 50 % p/v del veicolo in una miscela 1:1 
(v/v) ACF/acqua o soluzione salina fisiologica.  
Giorno 5-7 — gruppo trattato e gruppo di controllo  
Circa 24 ore prima dell'applicazione topica di induzione, se la so ­
stanza non è un irritante cutaneo, l'area di prova, debitamente tosata e/o rasata, viene trattata con 0,5 ml di laurilsoliato di sodio al 10 % in vaselina, al fine di provocare un'irritazione locale.
 
Giorno 6-8 — gruppo trattato  
L'area di prova viene nuovamente depilata. Una carta da filtro (2 × 
4 cm), impregnata della sostanza in esame incorporata in un veicolo adatto, viene applicata sull'area di prova e tenuta in contatto con la cute per 48 ore mediante una medicazione occlusiva. La scelta del 
veicolo deve essere motivata. Le sostanze solide vengono ridotte in 
polvere e incorporate in un veicolo adatto. I liquidi, se del caso, possono essere applicati direttamente.
 
Giorno 6-8 — gruppo di controllo  
L'area di prova viene nuovamente depilata. Il solo veicolo viene 
applicato con le stesse modalità sull'area di prova e tenuto a contatto per 48 ore mediante una medicazione occlusiva.
 
1.5.1.3.2. Provocazione (challenge)  
Giorno 20-22 — gruppo trattato e gruppo di controllo  
Si rimuove il pelo dai fianchi degli animali trattati e degli animali di 
controllo. Su un fianco si applica una garza o una compressa impre ­
gnata della sostanza in esame e, se opportuno, sull'altro si applica una garza o una compressa impregnata del solo veicolo. Le com ­
presse vengono tenute a contatto con la cute per 24 ore mediante una 
medicazione occlusiva.
 
1.5.1.3.3. Osservazione e valutazione: gruppo trattato e gruppo di controllo  
— circa 21 ore dopo la rimozione della compressa, la zona sottopo ­
sta a «challenge» viene pulita e tosata e/o rasata e depilata, se 
necessario;  
— circa 3 ore più tardi (approssimativamente 48 ore dall'inizio del ­
l'applicazione di provocazione) la reazione cutanea viene esami ­
nata e classificata in base alla scala di valutazione riportata in 
appendice;  
— circa 24 ore dopo detto esame si procede a una seconda osser ­
vazione (72 ore) e a una nuova classificazione delle reazioni cutanee.
 
È consigliabile procedere ad una lettura cieca nei due gruppi di 
animali.  
Qualora sia necessario chiarire i risultati ottenuti nel primo «challen ­
ge», una seconda esposizione di provocazione, ove del caso con un nuovo gruppo di controllo, potrà essere effettuata a circa una setti ­
mana di distanza dalla prima. Il nuovo «challenge» potrà essere 
realizzato anche sul gruppo di controllo iniziale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 269
 
Tutte le reazioni cutanee e qualsiasi risultato insolito, comprese le 
reazioni sistemiche, derivanti dall'esposizione di induzione e di pro ­
vocazione, dovranno essere osservate e classificate in base alla scala di valutazione di Magnusson/Kligman (vedi appendice). Per chiarire eventuali reazioni dubbie si potrà far ricorso ad altre tecniche, quali 
l'esame istopatologico o la misurazione dello spessore delle pieghe 
cutanee.
 
1.5.2.  Saggio di Buehler  
1.5.2.1. P r e p a r a z i o n i  
Porcellini d'India albini, giovani e sani, vengono acclimatati alle 
condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'inizio del 
saggio. Prima dell'esperimento, gli animali vengono suddivisi in 
modo casuale ed assegnati al gruppo da trattare o al gruppo di controllo. In funzione del metodo di saggio utilizzato, il pelo verrà tagliato, rasato o rimosso con una sostanza depilatoria, avendo cura 
di non danneggiare la cute. Gli animali vengono pesati all' inizio e 
alla fine del saggio.
 
1.5.2.2. C o n d i z i o n i s p e r i m e n t a l i  
1.5.2.2.1. Animali da esperimento  
Si utilizzano porcellini d'India albini di ceppi comunemente usati in 
laboratorio.  
1.5.2.2.2. Numero e sesso  
Si utilizzano animali di sesso maschile e/o femminile. Le femmine 
dovranno essere nullipare e non gravide.  
Il gruppo sottoposto a trattamento deve essere composto da almeno 
20 animali, il gruppo di controllo da un minimo di 10.  
1.5.2.2.3. Livelli di dosaggio  
La concentrazione della sostanza in esame utilizzata per ogni espo ­
sizione di induzione deve corrispondere alla dose massima suscetti ­
bile di produrre un'irritazione cutanea moderata e non eccessiva. La concentrazione utilizzata per l'esposizione di provocazione deve cor ­
rispondere alla dose massima che non cagioni irritazione. Se neces ­
sario, la concentrazione appropriata può essere determinata con uno studio pilota condotto su due o tre animali.
 
Nel caso di sostanze idrosolubili, l'acqua o una soluzione diluita non 
irritante di surfactante rappresentano il veicolo più appropriato. Per le 
altre sostanze si preferiranno una miscela di etanolo all'80 % ed acqua per la fase di induzione e dell'acetone per la fase di provoca ­
zione.
 
1.5.2.3. P r o c e d i m e n t o  
1.5.2.3.1. Induzione  
Giorno 0 — gruppo trattato  
Gli animali vengono tosati su un fianco. La compressa utilizzata per 
il saggio viene impregnata della sostanza in esame incorporata in un 
veicolo idoneo (la scelta del veicolo deve essere motivata; se del caso, le sostanze liquide possono essere applicate non diluite).
 
La compressa viene applicata sull'area di prova e tenuta a contatto 
con la pelle per sei ore mediante un cerotto occlusivo e una fascia ­
tura adeguata.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 270
 
La medicazione deve essere occlusiva. Si potrà ricorrere a un tam ­
pone d'ovatta, rotondo o quadrato e di circa 4-6 cm  2 . Per garantire 
l'occlusione, è opportuno limitare la libertà di movimento degli ani ­
mali con un sistema adeguato. Se si utilizza una fasciatura, possono essere necessarie esposizioni supplementari.
 
Giorno 0 — gruppo di controllo  
Gli animali vengono tosati su un fianco. Il solo veicolo viene ap ­
plicato con modalità analoghe a quelle utilizzate per il gruppo trat ­
tato. La compressa viene tenuta a contatto con la pelle per sei ore 
mediante un cerotto occlusivo e una fasciatura adeguata. Se si dimo ­
stra che non è necessario disporre di un gruppo di controllo cui sia stato somministrato un placebo, si potrà utilizzare un gruppo di controllo non sottoposto a tale trattamento.
 
Giorni 6-8 e 13-15 — gruppo trattato e gruppo di controllo  
Si esegue la stessa applicazione del giorno 0 sulla medesima area di 
prova (rasata, se necessario) sulla stesso fianco il giorno 6-8 e nuo ­
vamente il giorno 13-15.  
1.5.2.3.2. Provocazione (challenge)  
Giorno 27-29 — gruppo trattato e gruppo di controllo  
Il fianco non trattato degli animali trattati e degli animali di controllo 
viene tosato. Si procede quindi all'applicazione di un cerotto occlu ­
sivo o di una compressa contenente un'adeguata quantità della so ­
stanza in esame, alla massima concentrazione non irritante, sulla 
parte posteriore del fianco non trattato in entrambi i gruppi di ani ­
mali.  
Se necessario, si applica inoltre un cerotto occlusivo o una com ­
pressa contenente il solo veicolo sulla parte anteriore del fianco 
non trattato di entrambi i gruppi di animali. Il cerotto o la compressa 
vengono tenuti a contatto con la pelle per 6 ore mediante un'adeguata medicazione.
 
1.5.2.3.3. Osservazione e valutazione  
— Circa 21 ore dopo la rimozione del cerotto, la zona sottoposta a 
«challenge» viene depilata;  
— circa tre ore più tardi (approssimativamente 30 ore dopo l'appli ­
cazione di provocazione) le reazioni cutanee vengono esaminate 
e classificate in base alla scala di valutazione riportata in appen ­
dice;  
— circa 24 ore dopo detto esame (approssimativamente 54 ore dopo 
l'applicazione di provocazione) si procede a una seconda osser ­
vazione e a una nuova classificazione delle reazioni cutanee.  
È consigliabile procedere ad una lettura cieca nei due gruppi di 
animali.  
Qualora sia necessario chiarire ulteriormente i risultati ottenuti nel 
primo «challenge», una seconda esposizione di provocazione, ove del caso con un nuovo gruppo di controllo, potrà essere effettuata 
a circa una settimana di distanza dalla prima. Il nuovo «challenge» 
potrà essere realizzato anche sul gruppo di controllo iniziale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 271
 
Tutte le reazioni cutanee e qualsiasi risultato insolito, comprese le 
reazioni sistemiche, derivanti dall'esposizione di induzione e di pro ­
vocazione, dovranno essere osservate e classificate in base alla scala di valutazione di Magnusson/Kligman (vedi appendice). Per chiarire eventuali reazioni dubbie si potrà far ricorso ad altre tecniche, quali 
l'esame istopatologico o la misurazione dello spessore delle pieghe 
cutanee.
 
2. DATI (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER)  
I dati saranno riassunti in forma tabulare, indicando, per ogni ani ­
male, le reazioni cutanee rilevate nel corso di ogni osservazione.  
3. RELAZIONE (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER)  
Se il saggio sul porcellino d'India è preceduto da una prova preli ­
minare, si avrà cura di fornirne la descrizione o il riferimento [per es. 
Local Lymph Node Assay (LLNA), Mouse Ear Swelling Test 
(MEST)], compreso il procedimento particolareggiato, insieme ai risultati ottenuti con le sostanze da saggiare e le sostanze di riferi ­
mento.
 
Relazione sul saggio (GPMT E SAGGIO DI BUEHLER)  
La relazione sul saggio deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni:  
Animali da esperimento  
— ceppo di porcellino d'India utilizzato;  
— numero, età e sesso degli animali;  
— origine, condizioni di alloggiamento, dieta, ecc;  
— peso di ogni singola cavia all'inizio dell'esperimento.  
Condizioni sperimentali:  
— tecnica di preparazione dell'area di applicazione della compressa;  
— materiali utilizzati e tecnica di preparazione e di applicazione 
della compressa;  
— risultato dello studio pilota e conclusioni relative alle concentra ­
zioni di induzione e di provocazione da utilizzare nel saggio;  
— modalità di preparazione, applicazione e rimozione della sostanza 
in esame;  
— motivazione della scelta del veicolo;  
— concentratzioni del veicolo e della sostanza utilizzate per le espo ­
sizioni di induzione e di provocazione, nonché quantità totale di sostanza applicata per l'induzione e la provocazione.
 
Risultati:  
— un riepilogo dei risultati dell'ultimo controllo di sensibilità e 
attendibilità (vedi 1.3), comprese le informazioni sulla sostanza, 
la concentrazione e il veicolo utilizzato;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 272
 
— tutte le osservazioni effettuate su ogni singolo animale, compreso 
il sistema di classificazione;  
— la descrizione della natura e dell'entità degli effetti osservati;  
— tutti i reperti dell'esame istopatologico.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. RIFERIMENTI  
Il presente metodo corrisponde al metodo OCSE TG 406.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 273
 
Appendice  
TABELLA:  
scala di Magnusson/Kligman per la classificazione delle reazioni al saggio di 
provocazione cutanea  
0 = assenza di modificazioni visibili  
1 = eritema localizzato o a distribuzione irregolare  
2 = eritema modesto e confluente  
3 = eritema intenso associato a tumefazione  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 274
 
B.7. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA ORALE 
NEI RODITORI  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 407 (2008). La prima linea guida n. 407 è 
stata adottata nel 1981. Nel 1995 è stata adottata una versione rivista per 
ottenere informazioni aggiuntive dagli animali utilizzati nello studio, in particolare in materia di neurotossicità e immunotossicità.
 
2. Nel 1998 l’OCSE ha avviato un’attività prioritaria relativa alla revisione 
delle linee guida esistenti e all’elaborazione di nuove linee guida per lo screening e le prove dei potenziali interferenti endocrini (8). Uno degli 
obiettivi era aggiornare la linea guida dell’OCSE n. 407 «Tossicità a dose 
ripetuta (28 giorni) per via orale nei roditori» introducendo dei parametri adatti per l’individuazione dell’attività endocrina delle sostanze in esame. 
Questo protocollo è stato sottoposto a un programma internazionale mirante 
a valutare la pertinenza e la praticabilità dei parametri addizionali, la pre ­
stazione di questi parametri per le sostanze chimiche con attività (anti)estro ­
genica, (anti)androgenica e (anti)tiroidea, la loro riproducibilità intra e 
inter-laboratori e la loro interferenza con i parametri richiesti dalla versione 
precedente della linea guida n. 407. I numerosi dati ottenuti sono stati raccolti e valutati attentamente in una relazione esaustiva dell’OCSE (9). Il presente metodo di prova B.7 (equivalente alla linea guida n. 407) è frutto 
dell’esperienza e dei risultati ottenuti nel corso del programma internazio ­
nale di prova. Consente di contestualizzare alcuni effetti endocrino-mediati con altri effetti tossicologici.
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI  
3. Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossiche di una sostanza 
chimica è possibile determinare la tossicità orale utilizzando dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità mediante test di tossicità acuta. Il presente metodo di prova mira a studiare gli effetti su una gamma 
molto ampia di potenziali bersagli di tossicità. Fornisce informazioni sui 
potenziali rischi per la salute che un’esposizione ripetuta può comportare in un arco di tempo relativamente limitato, tra cui gli effetti sul sistema nervoso, immunologico ed endocrino. In relazione a questi endpoint speci ­
fici, il metodo deve consentire di individuare le sostanze chimiche poten ­
zialmente neurotossiche che potrebbero giustificare studi più approfonditi di questo aspetto, e le sostanze chimiche che interferiscono con la fisiologia 
della tiroide. Questo metodo può inoltre fornire dati sulle sostanze chimiche 
che incidono sugli organi riproduttivi maschili e/o femminili dei giovani animali adulti, evidenziando anche eventuali effetti immunologici.
 
4. I risultati del metodo di prova B.7 devono essere utilizzati per individuare i 
pericoli e valutare i rischi. I risultati ottenuti per quanto riguarda i parametri endocrini devono essere interpretati alla luce del «Quadro concettuale 
dell’OCSE per le prove e la valutazione delle sostanze chimiche che alte ­
rano il sistema endocrino» (11). Il metodo prevede uno studio di base della tossicità a dosi ripetute che può essere utilizzato per le sostanze chimiche per le quali uno studio di 90 giorni non si giustifica (ad esempio quando il 
volume di produzione non supera determinate quantità) o prima di uno 
studio a lungo termine. Il periodo di esposizione deve essere di 28 giorni.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 275
 
5. Il programma internazionale realizzato per la convalida di parametri in grado 
di individuare l’attività endocrina di una sostanza in esame ha evidenziato 
che la qualità dei dati ottenuti con questo metodo di prova dipende in ampia misura dall’esperienza del laboratorio che effettua le prove. Ciò vale soprat ­
tutto per la determinazione istopatologica di cambiamenti ciclici negli organi 
riproduttori femminili e la determinazione del peso dei piccoli organi 
ormono-dipendenti che sono difficili da dissecare. È stato messo a punto un documento di orientamento sull’istopatologia (19), che è disponi ­
bile sul sito dell’OCSE nella rubrica relativa alle linee guida per le prove 
sulle sostanze chimiche. Il documento è destinato ad aiutare i patologi nelle 
loro analisi e a migliorare la sensibilità delle prove. Nel metodo di prova sono stati integrati svariati parametri indicativi di una tossicità per il sistema endocrino. Gli endpoint per i quali non sono disponibili dati sufficienti a 
dimostrane l’utilità o che, nell’ambito del programma di convalida, hanno 
dimostrato una scarsa capacità di individuare gli interferenti endocrini sono proposti come endpoint opzionali (cfr. appendice 2).
 
6. Sulla base dei dati generati nel corso del processo di validazione, occorre 
sottolineare che la sensibilità di questo saggio non è sufficiente per indivi ­
duare tutte le sostanze caratterizzate da un’attività (anti)androgenica o (an ­
ti)estrogenica (9). Il presente metodo di prova deve essere eseguito in una 
fase della vita estremamente sensibile alle interferenze endocrine. Tuttavia questo metodo ha permesso, nel corso del processo di convalida, di indivi ­
duare delle sostanze con un forte o un debole impatto sulla funzione tiroidea 
e delle sostanze che agiscono fortemente o in misura ridotta sul sistema 
endocrino mediante recettori dell’estrogeno o dell’androgeno; nella maggior parte dei casi, tuttavia, non ha consentito di individuare le sostanze con effetti endocrini che incidono in misura limitata su questi recettori. Questo 
metodo non può pertanto essere descritto come prova di screening dell’at ­
tività endocrina.
 
7. Di conseguenza l’assenza di effetti legati a questi meccanismi di azione non 
può essere considerata una prova dell’assenza di effetti sul sistema endo ­
crino. Per quanto riguarda gli effetti endocrini-mediati, la caratterizzazione delle sostanze non deve basarsi unicamente sui risultati del presente metodo di prova ma deve essere utilizzata nell’ambito di un approccio fondato 
sull’«onere della prova» che integri tutti i dati esistenti su una sostanza 
chimica per caratterizzarne la potenziale attività endocrina. Per questa ragio ­
ne, le decisioni di tipo regolamentare relative all’attività endocrina delle sostanze chimiche (caratterizzazione dei composti) devono avvalersi di un 
approccio di ampio respiro, e non fondarsi solo sui risultati di questo me ­
todo di prova.
 
8. Naturalmente tutte le procedure che prevedono l’utilizzo di animali rispet ­
teranno le norme locali in materia di cura degli animali. Le descrizioni delle cure e dei trattamenti riportate qui di seguito corrispondono a norme di prestazione minime che, se del caso, sono sostituite dalla regolamentazione 
locale, qualora questa sia più rigorosa. Ulteriori indicazioni sul trattamento 
umano degli animali sono fornite dall’OCSE (14).
 
9. L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente 
metodo.  
PRINCIPIO DELLA PROVA  
10. Ogni giorno, per un periodo di 28 giorni, si somministra per via orale la 
sostanza in esame in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento, 
laddove ad ogni gruppo corrisponde un determinato livello di dose. Durante 
il periodo di somministrazione gli animali vengono esaminati attentamente e quotidianamente al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o oggetto di eutanasia durante la prova vengono sottoposti a au ­
topsia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e 
sottoposti a autopsia. Uno studio a 28 giorni fornisce informazioni sugli
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 276
 
effetti di un’esposizione ripetuta per via orale e può dimostrare la necessità 
di condurre ulteriori studi a più lungo termine. Può inoltre fornire informa ­
zioni sulla selezione delle concentrazioni in vista di studi a più lungo ter ­
mine. I dati tratti dal metodo di prova devono permettere di caratterizzare la tossicità della sostanza in esame, avere un’indicazione sul rapporto 
dosaggio-risposta e determinare il NOAEL ( no-observed-adverse effects  — 
livello fino al quale non si osservano effetti dannosi).
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
11. Il ratto è la specie preferita, ma sono ammesse anche altre specie di roditori. 
Se i parametri specificati nel metodo di prova B.7 sono studiati in un’altra 
specie di roditori occorre fornire una giustificazione dettagliata. Benché dal punto di vista biologico sia plausibile che altre specie rispondano ai prodotti tossici in modo simile ai ratti, l’utilizzo di specie più piccole può causare 
una maggiore variabilità dei risultati vista la difficoltà tecnica a sezionare 
organi di dimensioni inferiori. Nel programma internazionale di convalida per l’individuazione degli interferenti endocrini, il ratto è stata l’unica specie animale utilizzata. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appar ­
tenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere 
nullipare e non gravide. La somministrazione deve iniziare il più presto possibile dopo lo svezzamento e comunque prima che gli animali abbiano raggiunto le nove settimane di vita. All’inizio dello studio la variazione di 
peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso 
medio per ciascun sesso. Se uno studio di tossicità orale a dose ripetuta costituisce una tappa preliminare di uno studio a lungo termine, si utilizzano di preferenza animali provenienti dallo stesso ceppo e aventi la medesima 
origine in entrambi gli studi.
 
Stabulazione e alimentazione  
12. Tutte le procedure devono attenersi agli standard locali in materia di cura 
degli animali da esperimento. La temperatura dello stabulario deve essere di 22
 o C (± 3  o C). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferi ­
bilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio, ma 
l’obiettivo da raggiungere è un’umidità del 50-60 %. L’illuminazione deve 
essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile. La scelta della dieta 
può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della 
sostanza in esame, se somministrata con questo metodo. Gli animali devono essere sistemati nelle gabbie in piccoli gruppi dello stesso sesso; possono essere sistemati in gabbie individuali se necessario per ragioni scientifiche. 
Ciascuna gabbia non deve ospitare più di cinque animali.
 
13. L’alimentazione deve essere analizzata periodicamente per verificare la pre ­
senza di contaminanti. Un campione del mangime somministrato deve essere conservato fino al completamento della relazione.
 
Preparazione degli animali  
14. Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi di 
controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere sistemate in modo da 
ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali 
devono essere identificati in modo univoco e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio dello studio, in modo da consentirne l’adattamento alle condizioni di laboratorio.
 
Preparazione delle dosi  
15. La sostanza di prova viene somministrata per via intragastrica, oppure con la 
dieta o l’acqua. Il metodo di somministrazione orale dipende dallo scopo 
dello studio e dalle caratteristiche fisiche/chimiche/tossico-cinetiche della 
sostanza in esame.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 277
 
16. Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo 
adeguato. Si raccomanda di prendere in considerazione, in primis e ogni 
qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in se ­
conda battuta l’uso di una soluzione/sospensione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Se si usano 
veicoli diversi dall’acqua è necessario conoscerne le caratteristiche tossiche. 
È necessario determinare la stabilità della sostanza di prova nel veicolo.
 
PROCEDURA  
Numero e sesso degli animali  
17. Per ciascun livello di dosaggio dovranno essere utilizzati almeno 10 animali 
(5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile). Se si prevedono sacrifici 
intermedi, il numero deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sottoporre a eutanasia prima del completamento dello studio. Si può considerare di includere un gruppo satellite supplementare di dieci 
animali (5 per sesso) nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con la 
dose più elevata al fine di monitorare la reversibilità, la persistenza, l’insor ­
genza ritardata di effetti tossici, per almeno 14 giorni dopo il trattamento.
 
Dosaggio  
18. In genere si devono utilizzare almeno tre gruppi di trattamento e un gruppo 
di controllo; tuttavia, se la valutazione di altri dati porta a prevedere l’as ­
senza di effetti a una dose ripetuta di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno, 
può essere eseguito un saggio limite. Per stabilire le dosi da utilizzare, in 
mancanza di dati adeguati si può effettuare uno studio preliminare di tipo «range finding». Fatta eccezione per la somministrazione della sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo 
identico agli esemplari del gruppo di trattamento. Se si usa un veicolo per la 
somministrazione della sostanza in esame, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo veicolo nel volume massimo utilizzato.
 
19. I livelli di dosaggio devono essere selezionati tenendo conto di tutti i dati 
esistenti sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche della sostanza in 
esame o di sostanze affini. Il livello massimo di dosaggio deve essere tale da indurre effetti tossici senza cagionare la morte o sofferenze gravi. Deve inoltre essere selezionata una serie decrescente di dosaggi al fine di indivi ­
duare eventuali risposte dosi-correlate e il livello fino al quale non si os ­
servano effetti dannosi (NOAEL). In genere, per determinare i livelli decre ­
scenti di dosaggio si consiglia un intervallo con un fattore compreso tra 2 e 4 e spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che 
avere un intervallo eccessivamente lungo (ad esempio superiore a un fattore 
10) fra un dosaggio e l’altro.
 
20. Nel caso di tossicità generale osservata (ad esempio riduzione del peso 
corporeo, effetti a livello epatico, cardiaco, polmonare o renale ecc.) o di altri cambiamenti che potrebbero non essere dovuti ad effetti tossici (dimi ­
nuzione dell’assunzione di alimenti, dilatazione del fegato), gli effetti rilevati 
sugli endpoint neurologici, endocrini o legati al sistema immunitario devono essere interpretati con cautela.
 
Prova limite  
21. Se una prova, effettuata secondo le procedure descritte per il presente studio, 
con un livello di dose di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o in caso di somministrazione con gli alimenti o l’acqua, ad una concentrazione 
equivalente (in funzione del peso corporeo), non produce effetti tossici 
osservabili e se i dati relativi a sostanze di struttura analoga non indicano tossicità, si può considerare che non è necessario eseguire uno studio com ­
pleto utilizzando tre livelli di dose. Si effettua il saggio limite, tranne 
quando i dati sull’esposizione umana indicano la necessità di utilizzare un 
livello di dose più elevato.
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Somministrazione delle dosi  
22. La sostanza in esame è somministrata agli animali giornalmente, sette giorni 
su sette, per un periodo di 28 giorni. Se viene effettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in dose singola mediante sonda gastrica o 
idonea cannula per intubazione. Il volume massimo di liquido somministra ­
bile in una volta sola dipende dalla taglia dell’animale, ma non deve supe ­
rare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose per le quali si possono prevedere fino a 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo 
nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma 
tendono a esacerbarsi con l’aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concen ­
trazione, in modo da mantenere un volume costante per tutti i livelli di dose.
 
23. Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua è importante impedire 
che la quantità della sostanza in esame interferisca con la normale alimen ­
tazione o il normale bilancio dei liquidi. Se la sostanza in esame è sommini ­
strata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dose costante in funzione del peso corporeo di ciascun animale, avendo cura di specificare quale sia l’alternativa prescelta. Se la 
sostanza è somministrata per via intragastrica, la dose deve essere sommini ­
strata ogni giorno alla stessa ora e all’occorrenza modificata per mantenere costante il livello di dose rispetto al peso dell’animale. Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio preliminare a dose ripetuta, 
la dieta degli animali deve essere identica nei due studi.
 
Osservazioni  
24. Il periodo di osservazione ha una durata di 28 giorni. Gli animali del gruppo 
satellite destinato al monitoraggio di follow up devono essere esaminati per almeno ulteriori 14 giorni senza alcun trattamento, al fine di individuare 
l’insorgenza tardiva, la persistenza o la scomparsa degli effetti tossici.
 
25. Le osservazioni cliniche generali devono essere effettuate almeno una volta 
al giorno, preferibilmente alla stessa ora e tenendo conto del periodo di 
massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Si regi ­
strano le informazioni concernenti le condizioni di salute degli animali. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di 
determinare la morbilità e la mortalità.
 
26. Una volta prima dell’esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo 
stesso soggetto) e, successivamente, almeno una volta la settimana tutti gli 
animali vengono sottoposti ad osservazioni cliniche particolareggiate. Queste 
osservazioni devono essere eseguite fuori dalle gabbie, collocando gli ani ­
mali in un recinto standard, di preferenza sempre alla stessa ora. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di pun ­
teggio statistico definiti appositamente dal laboratorio di prova. Si avrà cura 
di ridurre al minimo le variazioni delle condizioni sperimentali; le osserva ­
zioni devono essere effettuate da persone che non sono a conoscenza del trattamento somministrato. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni 
della cute, del pelo, degli occhi, delle mucose, della comparsa di secrezioni 
ed escrezioni e dell’attività autonomica (per esempio lacrimazione, piloere ­
zione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Vanno inoltre regi ­
strati cambiamenti dell’andatura, della postura e della risposta alla manipo ­
lazione, nonché la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipie (ad 
esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in cerchio) o comportamenti insoliti (ad esempio automutilazione, marcia a ritroso) (2).
 
27. Nella quarta settimana di esposizione si procede alla valutazione della reat ­
tività sensoriale a diversi tipi di stimolo (2) (per esempio uditivi, visivi e propriocettivi) (3) (4) (5), della forza prensile (6) e dell’attività motoria (7). Ulteriori indicazioni sulle procedure utilizzabili sono contenute nelle voci 
bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate procedure alternative 
non indicate nella bibliografia.
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28. Le osservazioni funzionali previste per la quarta settimana di esposizione 
possono essere evitate nel caso di uno studio preliminare ad un successivo 
studio subcronico (90 giorni). In questa eventualità, le osservazioni funzio ­
nali devono essere incluse nello studio complementare. D’altro canto, le informazioni ricavate dalle osservazioni funzionali nel corso dello studio a 
dose ripetuta possono essere utili nella determinazione dei livelli di dosaggio 
per un successivo studio subcronico.
 
29. Eccezionalmente è possibile omettere le osservazioni funzionali per i gruppi 
che evidenzino comunque segni di tossicità tali da interferire in modo si ­
gnificativo con l’esecuzione degli esami funzionali.  
30. Nel corso dell’autopsia, si può (eventualmente) determinare il ciclo estrale 
per tutte le femmine mediante un Paptest. Queste osservazioni forniscono 
informazioni sullo stadio del ciclo estrale al momento dell’eutanasia e age ­
voleranno la valutazione istologica dei tessuti sensibili agli estrogeni [cfr. Linee guida sull’istopatologia (19)].
 
Peso corporeo e consumo di cibo/acqua  
31. Tutti gli animali devono essere pesati almeno una volta la settimana e il 
consumo di cibo deve essere determinato almeno una volta la settimana. Se 
la sostanza in esame viene somministrata con l’acqua, anche il consumo di 
acqua va misurato almeno una volta la settimana.  
Ematologia  
32. Al termine del periodo di prova, occorre procedere agli esami ematologici 
seguenti: ematocrito, concentrazioni di emoglobina, conteggio degli eritroci ­
ti, reticulociti, conteggio totale e differenziale dei leucociti, numero di plac ­
chette e misura del tempo e del potenziale di coagulazione. Se la sostanza in 
esame o i suoi metaboliti putativi hanno o possono avere proprietà ossidanti 
occorre effettuare altre analisi, relative tra l’altro alla concentrazione di metaemoglobine o ai corpi di Heinz.
 
33. I campioni di sangue devono essere prelevati da un determinato sito imme ­
diatamente prima o durante l’eutanasia degli animali e conservati in condi ­
zioni adeguate. Gli animali devono essere a digiuno la notte prima dell’eu ­
tanasia (  1 ). 
Biochimica clinica  
34. Gli esami biochimico-clinici finalizzati allo studio dei principali effetti tos ­
sici sui tessuti e, in particolare, sui reni e sul fegato devono essere effettuati su campioni di sangue prelevati da tutti gli animali immediatamente prima o 
durante la loro soppressione (eccetto gli animali trovati moribondi e/o sop ­
pressi nel corso dello studio). Le analisi sul plasma o sul siero comprende ­
ranno il sodio, il potassio, il glucosio, il colesterolo totale, l’urea, la crea ­
tinina, le proteine totali e l’albumina, almeno due enzimi indicatori degli 
effetti epatocellulari (come l’alanina aminotransferasi, l’aspartato aminotran ­
sferasi, la fosfatasi alcalina, la gamma-glutamil transpeptidasi e la glutammato-deidrogenasi). Le determinazioni di altri enzimi (di origine epa ­
tica o di altro tipo) e della bilirubina possono talvolta fornire indicazioni 
utili.
 
35. A titolo facoltativo, nel corso dell’ultima settimana dello studio, si possono 
effettuare le seguenti analisi delle urine su campioni raccolti in momenti specifici: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glu ­
cosio e sangue/cellule ematiche.
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( 1 ) Per svariate misurazioni del siero e del plasma, e soprattutto per il glucosio, sarebbe 
preferibile mantenere il digiuno per tutta la notte. Il motivo principale è che l’aumento 
della variabilità dovuto inevitabilmente al mancato digiuno tenderebbe a mascherare 
effetti meno evidenti rendendo più difficile l’interpretazione. D’altro lato, però, il digiuno 
notturno può interferire con il metabolismo generale degli animali e, soprattutto negli 
studi sull’alimentazione, può incidere sull’esposizione quotidiana alla sostanza in esame. 
Se si opta per il digiuno notturno, gli esami biochimico-clinici dovranno essere effettuati 
dopo le osservazioni funzionali della quarta settimana.
 36. È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sul plasma o 
sui marker sierologici dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni 
dovranno essere eseguite qualora si abbia motivo di ritenere o di sospettare che le proprietà della sostanza in esame possano alterare i profili metabolici riguardanti il calcio, il fosfato, i trigliceridi, gli ormoni specifici e la coline ­
sterasi. Queste analisi vanno effettuate per alcune classi di sostanze chimiche 
oppure caso per caso.
 
37. Anche se la valutazione internazionale degli endpoint legati al sistema en ­
docrino non è riuscita a stabilire in modo chiaro il vantaggio dell’analisi degli ormoni tirodei (T3, T4) e della TSH, potrebbe essere utile conservare 
dei campioni di plasma o di siero per misurare la T3, la T4 e la TSH 
(opzionale) se vi sono indicazioni di un effetto sull’asse ipofiso-tiroideo. Per lo stoccaggio questi campioni possono essere congelati a - 20°. I fattori seguenti possono influenzare la variabilità e le concentrazioni assolute delle 
analisi ormonali:
 
— momento dell’eutanasia, per via della variazione diurna delle concen ­
trazioni ormonali,  
— metodi di eutanasia, evitando di stressare inutilmente gli animali in 
quanto ciò potrebbe incidere sulle concentrazioni ormonali,  
— kit per le analisi ormonali che possono differire per le loro curve stan ­
dard.  
L’identificazione definitiva delle sostanze chimiche che agiscono sul sistema 
tiroideo è più affidabile se si fonda sull’analisi istopatologica più che sui 
livelli ormonali.  
38. I campioni di plasma destinati specificatamente all’analisi ormonale devono 
essere prelevati nelle stesse ore della giornata. Si raccomanda di tenere conto dei tassi di T3, T4 e TSH provocati da alterazioni dell’istopatologia della tiroide. I valori numerici ottenuti dalle analisi delle concentrazioni 
ormonali differiscono in funzione dei kit disponibili in commercio utilizzati. 
Pertanto non è sempre possibile fornire criteri di prestazione fondati su dati storici omogenei. In alternativa, i laboratori devono fare il possibile per mantenere i coefficienti di variazione al di sotto di 25 per la T3 e la T4 
e di 35 per la TSH. Tutte le concentrazioni devono essere annotate in ng/ml.
 
39. Se i dati di riferimento storici sono inadeguati, occorre tenere conto delle 
variabili ematologiche e di biochimica clinica prima di iniziare i dosaggi, di preferenza su un gruppo di animali diverso dal gruppo in esame.
 
PATOLOGIA  
Autopsia macroscopica  
40. Tutti gli animali dello studio vanno sottoposti ad un’autopsia macroscopica 
completa e dettagliata che comprenda un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addo ­
minale e del loro contenuto. Il fegato, i reni, le ghiandole surrenali, i 
testicoli, gli epididimi, l’insieme composto dalla prostata e le vescicole seminali con le ghiandole della coagulazione, il timo, la milza, il cervello e il cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati 
prima del completamento dello studio) vanno opportunamente liberati da 
eventuali tessuti aderenti e pesati immediatamente dopo l’ablazione, per evitare l’essiccamento. Occorre prelevare con cautela l’insieme della prostata in modo da evitare di perforare le vescicole seminali piene di liquido. In 
alternativa si può liberare la vescicola seminale e la prostata dai tessuti 
aderenti e pesarli previa fissazione.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 281
 
41. Eventualmente, per evitare il disseccamento, subito dopo la dissezione si 
possono pesare due altri organi: le due ovaie (peso a umido) e l’utero, ivi 
compreso il collo dell’utero [gli orientamenti sull’ablazione e la prepara ­
zione dei tessuti uterini ai fini del loro peso sono contenuti nella linea guida dell’OCSE n. 440 (18)].
 
42. Il peso della tiroide (facoltativo) può essere stabilito dopo la fissazione. 
Anche in questo caso l’ablazione deve essere eseguita con cautela e solo 
previa fissazione per evitare di danneggiare i tessuti. L’eventuale danneg ­
giamento dei tessuti infatti potrebbe compromettere l’analisi istopatologica.  
43. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato 
sia per il tipo di tessuto, sia per l’esame istopatologico che si intende 
effettuare successivamente (cfr. paragrafo 47): tutte le lesioni macroscopi ­
che, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto, bulbo e ponte), midollo spinale, occhi, stomaco, intestino tenue e crasso 
(comprese le placche di Peyer), fegato, reni, ghiandole surrenali, milza, 
cuore, trachea e polmoni (conservati con dilatazione mediante fissativo e poi immersione), gonadi (testicoli e ovaie), organi sessuali accessori (utero e collo dell’utero, epididimi, prostata + vescicole seminali con ghiandole della 
coagulazione), vagina, vescica e linfonodi [oltre al linfonodo più vicino un 
altro linfonodo, in funzione dell’esperienza del laboratorio (15)], nervo pe ­
riferico (sciatico o tibiale) preferibilmente in prossimità del muscolo, mu ­
scolo e osso dello scheletro con il midollo osseo (una sezione/o un preparato 
fresco di midollo osseo aspirato). Si raccomanda di fissare i testicoli me ­
diante immersione in un fissativo di Bouin o di Davidson modificato (16) (17). La tunica albuginea deve essere perforata, con un ago, con delicatezza e superficialmente in entrambi i poli dell’organo per consentire la rapida 
penetrazione del fissativo. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare 
la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame.
 
44. I tessuti elencati qui di seguito possono apportare informazioni utili sugli 
effetti endocrini: gonadi (ovaie e testicoli), organi sessuali accessori (utero, collo dell’utero, epididimi, vescicole seminali con ghiandole di coagulazio ­
ne, prostata dorso laterale e ventrale), vagina, ipofisi, ghiandola mammaria 
maschile, tiroide e ghiandola surrenale. Non ci sono sufficienti riscontri di 
alterazioni nelle ghiandole mammarie maschili, ma questo parametro può essere molto sensibile alle sostanze con attività estrogenica. L’osservazione degli organi/tessuti non ripresi nel paragrafo 43 è facoltativa (cfr. 
appendice 2).
 
45. Il documento di orientamento sull’istopatologia (19) fornisce informazioni 
supplementari sulla dissezione, la fissazione, l’asportazione e l’istopatologia dei tessuti endocrini.
 
46. Nel corso del programma internazionale di prove, è stato rilevato che gli 
effetti endocrini poco evidenti, dovuti a sostanze chimiche in grado di 
squilibrare leggermente l’omeostasi degli ormoni sessuali, possono essere individuati dalla loro capacità di interferire sulla sincronizzazione del ciclo estrale in vari tessuti più che da evidenti alterazioni istopatologiche degli 
organi sessuali femminili. Sebbene non vi siano prove inconfutabili in tal 
senso, si raccomanda di tenere conto, nell’interpretazione dell’esame istolo ­
gico delle ovaie, di una possibile asincronia del ciclo estrale (cellule folli ­
colari, tecali e della granulosa). Se si esamina la fase del ciclo mediante un 
Paptest, si può tenere conto anche di questo dato come elemento di con ­
fronto aggiuntivo.
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Esame istopatologico  
47. Gli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali del gruppo di controllo e 
del gruppo trattato con la dose più elevata vanno sottoposti a un esame istopatologico completo. Si procede a questi esami anche sugli animali degli 
altri gruppi se nel gruppo cui viene somministrata la dose più elevata si 
osservano alterazioni correlate al trattamento.
 
48. Si procederà all’esame di tutte le lesioni macroscopiche.  
49. Quando si utilizza un gruppo satellite l’esame istopatologico va eseguito sui 
tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati.  
DATI E RELAZIONE  
Dati 
50. Devono essere riportati i dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i 
dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo di 
trattamento il numero di animali all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante la prova o sottoposti a eutanasia per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che manife ­
stano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati con 
indicazione del momento dell’insorgenza, della durata e della gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali che manifesta ciascun tipo di lesione.
 
51. Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un 
metodo statistico appropriato e comunemente accettato. I confronti degli 
effetti osservati nell’ambito di un intervallo di dosaggio deve rendere inutile 
l’utilizzo di prove t multiple. I metodi statistici devono essere selezionati durante la fase di progettazione dello studio.
 
52. Ai fini del controllo di qualità, si suggerisce di raccogliere dati di controllo 
storici e di calcolare i coefficienti di variazione per i dati numerici, in particolare per i parametri legati all’individuazione degli interferenti endo ­
crini. Questi dati possono essere utilizzati, a fini di confronto, in fase di 
valutazione degli studi effettivamente realizzati.
 
Relazione sulla prova  
53. La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi.  
Veicolo (se del caso):  
— motivazione della scelta del veicolo, se diverso dall’acqua.  
Animali sperimentali:  
— specie/ceppo impiegati,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— provenienza, stabulazione, dieta ecc.,  
— peso di ciascun animale all’inizio della prova,  
— qualora non siano stati utilizzati ratti, occorre spiegarne il motivo.  
Condizioni sperimentali:  
— criteri di selezione delle dosi,  
— informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza chimica in 
esame/preparazione della dieta, sulla concentrazione utilizzata, sulla sta ­
bilità e sull’omogeneità del preparato,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 283
 
— modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame,  
— se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella dieta o 
nell’acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno),  
— informazioni dettagliate sulla qualità degli alimenti e dell’acqua.  
Endpoint facoltativi esaminati:  
— elenco degli endpoint facoltativi esaminati.  
Risultati:  
— peso corporeo/variazioni del peso corporeo,  
— assunzione di cibo, ed eventualmente di acqua,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi segni di 
tossicità,  
— natura, gravità e durata degli effetti clinici (sia reversibili che non rever ­
sibili),  
— valutazione dell’attività sensoriale, della forza prensile e dell’attività 
motoria,  
— test ematologici con i relativi valori basali,  
— test biochimici clinici con i relativi valori basali,  
— peso corporeo al momento dell’eutanasia e dati sul peso degli organi,  
— referti autoptici,  
— descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici,  
— dati sull’assorbimento, se disponibili,  
— elaborazione statistica dei risultati, se del caso.  
Discussione dei risultati  
Conclusioni  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 284
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Androgenicità : la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone 
androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero.  
Antiandrogenicità : la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un 
ormone androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero.  
Antiestrogenicità : la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un 
ormone estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero.  
Attività antitiroidea : la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di 
un ormone tiroideo naturale (ad es T  3 .) in un mammifero.  
Dosaggio : termine generale che indica la dose, la frequenza e la durata della 
somministrazione.  
Dose : quantità di sostanza somministrata. La dose è espressa col peso della 
sostanza in esame per unità di peso corporeo dell’animale testato per giorno 
(mg/kg peso corporeo/giorno) o come una concentrazione costante nella dieta.  
Tossicità evidente : termine generale che designa i segnali evidenti di tossicità a 
seguito della somministrazione di una sostanza. Questi segni devono essere suf ­
ficienti per consentire la valutazione dei pericoli ed essere tali che si possa 
prevedere che l’aumento della dose somministrata comporti la comparsa di segni di tossicità grave e probabilmente la mortalità.
 
NOAEL  è l’abbreviazione di  no-observed-adverse-effect level , ossia la dose più 
elevata alla quale non si osservano effetti avversi legati al trattamento.  
Estrogenicità : la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone 
estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero.  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il 
presente metodo di prova.  
Attività tiroidea : la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone 
tiroideo naturale (ad es T  3 .) in un mammifero.  
Validazione  è un processo scientifico destinato a caratterizzare le prescrizioni e i 
limiti operativi di un metodo di prova e a dimostrarne l’affidabilità e la perti ­
nenza per un obiettivo specifico.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 285
 
Appendice 2  
Endpoint raccomandati nel metodo di prova B.7 per 
l’individuazione degli interferenti endocrini  
Endpoint obbligatori Endpoint facoltativi 
Peso 
— Testicoli 
— Epididimi 
— Ghiandole surrenali 
— Prostata + vescicole seminali con 
ghiandole della coagulazione — Ovaie 
— Utero, ivi compreso il collo 
dell’utero 
— Tiroide  
Esame istopatologico  
— Gonadi: 
— Testicoli e — Ovaie 
— Organi sessuali accessori: 
— Epididimi, — Prostata + vescicole seminali 
con ghiandole della coagula ­
zione 
— Utero, ivi compreso il collo 
dell’utero 
— Ghiandole surrenali 
— Tiroide — Vagina — Paptest 
— Ghiandole mammarie maschili — Ipofisi
 
Dosaggi ormonali  
— Livelli di T3 e T4 circolanti 
— Livelli di TSH circolante  
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B.8. TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 28 
GIORNI  
SINTESI  
Il presente metodo di prova rivisto B.8 è stato concepito per caratterizzare pie ­
namente la tossicità per inalazione della sostanza in esame a seguito di un’espo ­
sizione ripetuta per un periodo di tempo limitato (28 giorni) e fornire dati per valutazioni quantitative dei rischi legati all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 5 maschi e 5 femmine, sono esposti per 6 ore al giorno 
per 28 giorni a: a) la sostanza in esame a tre o più livelli di concentrazione; b) 
all’aria filtrata (controllo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che 
femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei 
due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratte ­
rizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite 
(reversibilità), lavaggio bronchioalveolare, esami neurologici e ulteriori valuta ­
zioni istopatologiche o di patologia clinica.
 
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 412 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità acuta per inalazione n. 412 è stata adottata nel 
1981 (1). Questo metodo di prova B.8 (che corrisponde alla linea guida n. 
412 rivista) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future.
 
2. Il presente metodo consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da 
un’esposizione quotidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 28 
giorni. I dati tratti da uno studio sulla tossicità subacuta per inalazione (a 28 giorni) possono essere utilizzati per le stime quantitative dei rischi [se lo studio non è seguito da una prova di tossicità subcronica per inalazione a 90 
giorni (capitolo B.29 del presente allegato)]. Questi dati possono fornire 
informazioni che consentono di determinare le concentrazioni per studi a più lungo termine come lo studio sulla tossicità subcronica per inalazione a 90 giorni. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai 
test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo 
di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orienta ­
mento n. 39 (2).
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
3. Il laboratorio incaricato della prova deve tenere conto di tutte le informa ­
zioni disponibili sulla sostanza in esame prima di svolgere lo studio, in 
modo da migliorare la qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo 
di animali. Tre le informazioni utili per la scelta delle concentrazioni ade ­
guate saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove 
di tossicità in vitro o in vivo; l’impiego o gli impieghi previsti per l’espo ­
sizione umana, dati (Q)SAR disponibili e dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; e dati tratti da prove sulla tossicità acuta per inalazione. Se si prevedono o si constatano effetti neurotossici nel 
corso dello studio, il responsabile dello studio può decidere di includere le 
valutazioni ritenute necessarie come una serie di osservazioni funzionali (functional observational battery  — fob) e la misurazione dell’attività mo ­
toria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non interferisce con l’impo ­
stazione di base dello studio, anche se la durata delle esposizioni può essere 
fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 288
 
4. Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a 
concentrazioni che non consentono di conseguire il grado di tossicità au ­
spicato [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere suffi ­
cientemente basse da non provocare dolore e stress intensi, pur essendo 
sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a dei livelli 
corrispondenti all’obiettivo scientifico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo «range finding» adeguatamente impostato che fornisca 
informazioni sull’endpoint, l’eventuale soglia di irritazione e il momento 
dell’insorgenza (cfr. punti da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni.
 
5. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e 
persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli 
animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno do ­
cumento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3).
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
6. Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi co ­
munemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di 
utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta.  
Preparazione degli animali  
7. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della rando ­
mizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età com ­
presa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % 
del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, 
marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si adattino alle condizioni di laboratorio.
 
Condizioni di allevamento degli animali  
8. Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente me ­
diante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche 
se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. 
Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e 
deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se 
l’esposizione avviene «a naso solo», potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli endpoint 
fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respira ­
torio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adatta ­
mento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti 
«a corpo intero» ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la 
durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da 
laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve 
essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.
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Camere di inalazione  
9. La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza 
chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposi ­
zione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente 
della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via 
nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione «a corpo intero» può es ­
sere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta 
deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità 
atmosferica di una camera di esposizione «a corpo intero», il volume com ­
plessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del 
volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i 
principi delle tecniche di esposizione «a naso solo»e «a corpo intero», nonché i relativi vantaggi e svantaggi.
 
STUDI DI TOSSICITÀ  
Concentrazioni limite  
10. A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subacuta 
per inalazione a 28 giorni non è definita la concentrazione massima. La concentrazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione 
massima raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al 
«peggiore dei casi»; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossigeno; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 
(13) (ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l 
per i vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare 
questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara 
tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).
 
Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi ( range finding ) 
11. Prima di iniziare lo studio principale, occorre generalmente effettuare uno 
studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più 
completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio pos ­
sono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per de ­
terminare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni 
tecniche sul metodo di analisi, la granulometria delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC (concentrazione massima 
tollerata) nello studio principale. Il responsabile dello studio può decidere 
di utilizzare uno studio di tipo range finding per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità polmonare e lavaggi bron ­
coalveolari), la concentrazione massima tollerata dagli animali senza che 
risentano uno stress eccessivo e i parametri che consentono di caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame.
 
12. Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare 
uno o più livelli di concentrazione. Per ogni livello di concentrazione sono esposti al massimo tre maschi e tre femmine. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 14 giorni. Nella relazione 
sullo studio è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni 
per lo studio principale, il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensi ­
bile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la 
concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza cau ­
sare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).
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13. Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di 
concentrazione, occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, an ­
che quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti so ­
stanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’intervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint 
più sensibili secondo criteri meccanicistici, come l’inibizione della coline ­
sterasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T
 3 e T  4 ) nel caso degli agenti i 
tireotossici, le proteine, la LDH, la presenza di neutrofili nei lavaggi bron ­
coalveolari nel caso di particelle inoffensive scarsamente solubili o di aero ­
sol irritanti per i polmoni.  
Studio principale  
14. Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli 
di concentrazione e un controllo negativo (aria) e/o un controllo del veicolo, 
se necessario (cfr. paragrafo 17). Per scegliere i livelli di esposizione ade ­
guati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi sistemici di tossicità, il metabolismo e la cinetica (oc ­
corre fare il possibile per evitare i livelli di concentrazione elevati caratte ­
rizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende almeno 10 roditori (5 maschi e 5 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 4 settimane (per una durata 
totale dello studio di 28 giorni). Gli animali possono anche essere esposti 
per 7 giorni la settimana (ad esempio nel caso di prove su prodotti farma ­
ceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla so ­
stanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso 
al fine di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se per l’esposizione solo per via nasale s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’espo ­
sizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La 
scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va 
sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel 
corso dell’esposizione «a corpo intero» si può continuare a somministrare acqua.
 
15. Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare 
l’organo o gli organi bersaglio e evidenziare una concentrazione-risposta chiara.
 
— Il livello di concentrazione elevato deve ridurre gli effetti tossici senza 
provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione 
significativa dei risultati  
— Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo 
da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione
 
— Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo 
produrre effetti poco rilevanti.  
Studio satellite (studio di reversibilità)  
16. Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere 
reversibile, persistente o ritardato della tossicità, per un periodo 
post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. 
I gruppi satellite sono costituiti da cinque maschi e cinque femmine esposti contemporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio princi ­
pale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata 
della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di 
controllo (aria) e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 17).
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Animali di controllo  
17. Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli 
animali del gruppo soggetto alla prova, ad eccezione del fatto che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre 
l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare 
nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere 
esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo 
in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informa ­
zioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può 
utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di 
controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del 
veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame incorporata in un veicolo non rileva nessuna tossicità, significa che il vei ­
colo non è tossico alla concentrazione in questione e che si deve utilizzare 
questo gruppo di controllo del veicolo.
 
CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Somministrazione delle concentrazioni  
18. Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, 
aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà 
fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o 
dalla forma fisica nella quale è più probabile che essa si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre 
prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la 
granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi mec ­
canici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2).
 
Distribuzione granulometrica  
19. La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che 
potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di 
tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare de ­
gli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 3 μm con una deviazione standard geometrica ( σ
 g ) compresa tra 1,5 e 3,0 
(4). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qua ­
lora non ci si riuscisse è necessario presentare il parere di un esperto. Ad 
esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indicato, mentre le particelle caricate e le fibre possono superare questo standard.
 
Preparazione della sostanza in esame in un veicolo  
20. Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia 
necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulo ­
metria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. 
Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabi ­
lità. 
MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Flusso d’aria nella camera di esposizione  
21. Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in 
continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura integrale di tutti i parametri 
dinamici e un modo indiretto di controllare tutti i parametri dinamici di 
inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la frequenza
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di misurazione dei flussi d’aria può essere diminuita ad un’unica misura ­
zione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle camere d’esposi ­
zione «a naso solo», per evitare la reinalazione. La concentrazione di ossi ­
geno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare 
queste concentrazioni, è necessario misurare le concentrazioni di ossigeno e 
di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il primo giorno di espo ­
sizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni.
 
Temperatura e umidità relativa della camera  
22. La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel 
caso delle esposizioni «a naso solo» che per le esposizioni «a corpo intero», 
l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente moni ­
torata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, nel caso 
delle miscele acquose) o che l’umidità non possa essere misurata per via 
delle interferenze della sostanza con il presente metodo di prova.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale  
23. Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale 
nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla massa della sostanza in esame generata divisa per il volume di aria che è passato 
nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nominale non 
serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’ef ­
ficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare 
eventuali problemi di produzione.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale  
24. La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prele ­
vata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chi ­
mica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, 
come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravi ­
metrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi 
su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate 
prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione 
del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di 
partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare perio ­
dicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, 
occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo pre ­
scelto.
 
25. Nel corso dell’intero studio, è opportuno utilizzare, se possibile, un unico 
lotto della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che 
ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo 
studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati 
seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare 
risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione il laboratorio potrebbe confer ­
mare almeno una parte delle caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, 
natura fisica ecc.).
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26. L’atmosfera di esposizione deve essere mantenuta costante nei limiti del 
possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può 
utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concen ­
trazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di 
ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è 
possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse con ­
centrazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Idealmente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di espo ­
sizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non 
deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera 
di esposizione raggiunga l’equilibrio (t
 95 ). La durata di un’esposizione copre 
il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio delle concentrazioni nella camera (t
 95 ) e il loro declino. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene 
indicazioni per la stima di t  95 . 
27. Per miscele molto complesse costituite da gas/vapori e aerosol (ad esempio, 
atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da 
appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente 
nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), normalmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in 
esame è una miscela, nella relazione dovrà essere indicata la concentrazione 
analitica per l’intera miscela e non solo quella del principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2).
 
Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica  
28. La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata al ­
meno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un 
impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS ( Ae­
rodynamic Particle Sizer ). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e 
con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato 
nel corso dell’intero studio.  
29. Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre 
utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico 
o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi 
granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella 
fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misurazioni di 
conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio.
 
30. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che 
rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste.
 
OSSERVAZIONI  
31. Prima e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami 
clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere utili in fun ­
zione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’os ­
servazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nella camere «a corpo intero» o da atmosfere opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le osservazioni 
fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’even ­
tuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici.
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32. Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun 
animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il 
momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile.
 
33. Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e 
delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, 
letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare 
una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni riguardanti: cineti ­
ca, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di materiali scarsa ­
mente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e variazioni com ­
portamentali.
 
PESO CORPOREO  
34. Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima 
dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad 
esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di valutare la tossicità sistemica) e al momento della morte o dell’eutanasia. 
In assenza di effetti nel corso delle prime 2 settimane, il peso corporeo può 
essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, 
tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il 
calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo.
 
CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA  
35. Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, 
anche il consumo di acqua può essere misurato.  
PATOLOGIA CLINICA  
36. Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi 
satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’in ­
tervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve 
essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb).
 
37. Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente 
necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità 
prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in 
esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parame ­
tri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eri ­
troide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, 
glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi).
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Tabella 1  
Parametri standard di patologia clinica  
Ematologia  
Conteggio eritrocitario 
Ematocrito 
Concentrazione dell’emoglobina 
Tenore globulare medio in emoglobina Volume medio corpuscolare 
Concentrazione di emoglobina corpu ­
scolare media 
Reticolociti Conta totale dei globuli bianchi 
Conta differenziale dei globuli 
bianchi 
Conta delle piastrine Coagulabilità (scegliere un para ­
metro): 
— Tempo di protrombina 
— Tempo di coagulazione — Tempo di tromboplastina par ­
ziale attivata
 
Chimica clinica  
Glucosio (*) 
Colesterolo totale 
Trigliceridi Azoto ureico ematico Bilirubina totale 
Creatinina 
Proteina totale Albumina 
Globulina Alanina-aminotransferasi 
Aspartato amminotransferasi 
Fosfatasi alcalina Potassio Sodio 
Calcio 
Fosforo Cloruro
 
Esame delle urine (facoltativo)  
Aspetto (colore e torbidità) 
Volume 
Densità relativa o osmolalità 
pH Proteina totale 
Glucosio 
Sangue/cellule ematiche  
(*) Il responsabile dello studio deciderà se per gli animali è necessario un periodo di 
digiuno, in quanto un lungo periodo di digiuno può portare a misurazioni del 
glucosio parzialmente errate negli animali esposti rispetto agli animali del gruppo 
di controllo. Se si ricorre al digiuno, occorre che il periodo sia adeguato in 
funzione della specie utilizzata; per il ratto può essere di 16 ore (digiuno nottur ­
no). La determinazione della glicemia a digiuno può essere effettuata dopo il 
digiuno notturno, nel corso dell’ultima settimana di esposizione, o dopo la notte 
di digiuno notturno precedente l’autopsia (in tal caso insieme a tutti gli altri 
parametri di patologia clinica).  
38. Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il 
principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativa ­
mente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’al ­
veolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame con ­
sente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido del lavaggio può 
essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, 
proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi, e infiamma ­
zione irritativa o allergica che può comprendere la determinazione di cito ­
chine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effet ­
tuare il lavaggio dei polmoni.
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PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI  
39. Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della 
prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benes ­
sere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e au ­
topsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ul ­
tima esposizione di ogni animale e il loro sacrificio. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa 
da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena 
possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando parti ­
colare attenzione a quelle delle vie respiratorie.
 
40. Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere con ­
servati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini 
dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra 
parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in  grassetto  devono essere 
espiantati e pesati allo stato umido, appena possibile dopo la dissezione, 
per evitare l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati 
solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valuta ­
zione istopatologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autop ­
sia e non meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo 
utilizzato.
 
Tabella 2  
Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica  
Ghiandole surrenali  
Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo)  
Cervello  (incluse le sezioni di cervello, cer ­
velletto, bulbo/ponte)  
[Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre]  
Cuore  
Reni  
Laringe (3 livelli, 1 livello per comprendere 
la base dell’epiglottide)  
Fegato  
Polmone  (tutti i lobi ad un livello, compresi i 
bronchi principali)  
Linfonodi della regione ilare del polmone, so ­
prattutto per il particolato di sostanze chimi ­
che poco solubile. Per esami più approfonditi 
e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, 
si possono esaminare anche altri linfonodi, ad esempio quelli delle regioni mediastinale, cer ­
vicale/submandibolare e/o auricolare.
 
Tessuti nasofaringei (almeno 4 livelli; 1 li ­
vello per comprendere il dotto nasofaringeo 
e il tessuto associato al naso —  Nasal Asso ­
ciated Lymphoid Tissue  — NALT)  
Esofago  
[Bulbo olfattivo]  
Ovaie  Vescicole seminali  
Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e 
lombare)  
Milza  
Stomaco  
Testicoli  
Timo  
Tiroide  
Trachea almeno a 2 livelli, ivi comprese 1 
sezione longitudinale attraverso la carena e 1 sezione trasversale)
 
[Vescica]  
Utero  
Tutte le lesioni macroscopiche  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 297
 
41. I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo 
idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura 
dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non 
sezioni in serie)
 
42. Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali 
deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un 
esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non ci ­
gliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della larin ­
ge, tra cui uno che comprenda la base dell’epiglottide (12). Occorre esami ­
nare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extrapolmonari e una sezione trasversale.
 
ESAME ISTOPATOLOGICO  
43. Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 
2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concen ­
trazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eu ­
tanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’ap ­
parato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il 
responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologi ­
che anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valu ­
tazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali 
sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la 
concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti prema ­
ture o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concen ­
trazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osserva ­
zioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici.
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
44. Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il 
consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso 
degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere 
riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottopo ­
sti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione 
degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e la reversibilità, e i risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo 
statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere stabiliti 
nella fase di concezione dello studio.
 
Relazione sulla prova  
45. La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:  
Animali sperimentali e condizioni di allevamento:  
— descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica 
del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, 
temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 298
 
— specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse 
dal ratto; Possono essere forniti dati di origine e storici se riguardano 
animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili,
 
— numero, età e sesso degli animali,  
— metodo di randomizzazione,  
— descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in parti ­
colare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa 
l’isomerizzazione),  
— dati di identificazione e numero CAS ( Chemical Abstract Services ), se 
noto.  
Veicolo:  
— motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del 
veicolo (se diverso dall’acqua),  
— dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con 
i risultati dello studio.  
Camera di inalazione:  
— descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il vo ­
lume e un diagramma,  
— provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposi ­
zione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,  
— apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granu ­
lometria e della concentrazione reale,  
— fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato,  
— metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire 
l’omogeneità dell’atmosfera di prova,  
— differenza di pressione (positiva o negativa),  
— bocchette di esposizione per camera («a naso solo»); ubicazione degli 
animali nella camera («a corpo intero»),  
— stabilità dell’atmosfera di prova,  
— ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campio ­
namento dell’atmosfera della prova nella camera,  
— trattamento dell’aria fornita/estratta,  
— portate dell’aria, portata dell’aria in ogni punto di esposizione («a naso 
solo») o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della 
camera («a corpo intero»),  
— tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t  95 ), 
— numero di sostituzioni del volume per ora,  
— dispositivi di misurazione (se applicabile).  
Dati sull’esposizione:  
— giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio 
principale,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 299
 
— concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in 
esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta 
circolare nella camera),  
— concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per 
le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, va ­
pori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,  
— riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, 
mg/l, mg/m  3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb 
ecc.),  
— distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico 
mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica ( σ g ), 
con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi 
granulometriche.  
Condizioni sperimentali:  
— indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, preci ­
sando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame,
 
— una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparec ­
chiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,
 
— ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, 
l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione),
 
— informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per 
la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimen ­
sione delle particelle nella camera,  
— dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale 
metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal 
mezzo campionato),  
— metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi 
sperimentali e di controllo,  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta, origine dell’acqua),  
— giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.  
Risultati:  
— tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,  
— tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,  
— tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul cam ­
pionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e 
della σ g, 
— tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun 
animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità 
compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 300
 
— tabella con il peso dei singoli animali,  
— tabella con il consumo di cibo,  
— tabella con i dati clinico-patologici,  
— reperti necroscopici ed reperti istopatologici per ciascun animale, se 
disponibili,  
— tabella con altri eventuali parametri misurati.  
Discussione e interpretazione dei risultati:  
— occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati 
per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,
 
— occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati 
complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati 
soddisfatti,  
— si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coe ­
renza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e 
reali e considerare il rapporto tra di esse,  
— si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo 
d’azione prevalente (sistemico o locale),  
— occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre 
ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3),
 
— occorre individuare gli organi bersaglio,  
— occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti 
dannosi (NOAEL) e la dose minima con effetto avverso osservabile (LOAEL).
 
BIBLIOGRAFIA:  
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(2) OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
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(3) OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
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Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
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(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
phoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, 
del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’im ­
ballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 
67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 302
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 303
 
B.9. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA 
CUTANEA  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B (punto A).  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B (punto B).  
1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame è applicata ogni giorno sulla pelle di alcuni 
gruppi di animali da esperimento, in dosi graduate, un livello di dose 
per gruppo, per un periodo di 28 giorni. Durante il periodo di ap ­
plicazione, gli animali vengono osservati quotidianamente per rile ­
vare i sintomi di tossicità. Si sottopongono a necroscopia gli animali morti durante la prova e al termine del saggio vengono sottoposti a 
necroscopia gli animali sopravvissuti.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.6.1.  Preparazioni  
Per un periodo di almeno 5 giorni prima della prova gli animali sono 
mantenuti nelle stesse condizioni di stabulazione e di alimentazione del saggio. Prima del saggio gli animali, che dovranno essere giovani 
e sani, sono scelti con metodo casuale e assegnati ai gruppi previsti 
per il trattamento e per il controllo. Poco prima dell'esperimento si effettua il taglio del pelo nella parte dorsale del corpo degli animali. Si può procedere alla rasatura, ma essa dovrebbe essere effettuata 
circa 24 ore prima dell'esperimento. Di norma è necessario ripetere il 
taglio o la rasatura a intervalli di circa una settimana. Durante il taglio o la rasatura si dovrà badare a non ledere la cute dell'animale. Per l'applicazione della sostanza in esame, si dovrebbe preparare 
almeno il 10 % della superficie corporea. Nel determinare l'entità 
dell'area da preparare e le dimensioni della copertura è opportuno tenere presente il peso dell'animale. Le sostanze solide, che possono essere ridotte in polvere se appropriato, dovranno essere inumidite 
sufficientemente con acqua o, se necessario, con un veicolo adatto ad 
assicurare un buon contatto con la pelle. In generale le sostanze liquide sono saggiate in forma non diluita. Dal punto di vista otti ­
male, applicazioni quotidiane vengono effettuate sulla base di 5-7 
giorni per settimana.
 
1.6.2.  Condizioni per il saggio  
1.6.2.1.  Animali per l'esperimento  
Possono essere utilizzati ratti adulti, conigli o porcellini d'India. Si 
possono utilizzare altre specie animali, ma il loro uso dovrà essere 
giustificato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 304
 
All'inizio dello studio l'intervallo di variazione di peso degli animali 
non dovrebbe superare ± 20 % del valore medio  
1.6.2.2.  Numero e sesso  
Per ciascun livello di dosaggio dovrebbero essere utilizzati almeno 
10 animali (5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile) con cute 
sana. Le femmine dovrebbero essere nullipare e non gravide. Qua ­
lora siano stati programmati sacrifici intermedi di alcuni animali, il numero degli animali dovrà essere aumentato per includere quello degli animali da sacrificare prima del termine della prova. 
Inoltre, un altro gruppo (gruppo satellite) di 10 animali (5 animali 
per sesso) può essere sottoposto al trattamento con il livello massimo di dosaggio per 28 giorni e tenuto in osservazione per 14 giorni dopo il trattamento per rilevare la reversibilità, la persistenza o l'insorgenza 
ritardata degli effetti tossici. Inoltre si utilizzerà in tale caso pure un 
gruppo satellite di 10 animali di controllo (5 animali per sesso).
 
1.6.2.3.  Livelli di dosaggio  
Sono richiesti almeno 3 livelli di dosaggio, almeno 6 ore al giorno, 
con un gruppo di controllo oppure, nel caso venga usato un veicolo, con un gruppo di controllo del veicolo. L'applicazione della sostanza in esame dovrebbe essere effettuata ogni giorno alla stessa ora e 
modificata ad intervalli (settimanali e bisettimanali) al fine di man ­
tenere un livello di dosaggio costante in funzione del peso dell'ani ­
male. Gli animali del gruppo di controllo dovranno essere trattati in modo identico agli animali del saggio, ad eccezione che per l'appli ­
cazione delle sostanze da saggiare. Se, per facilitare il dosaggio, 
viene utilizzato un veicolo, al gruppo di controllo dovrà essere som ­
ministrato il veicolo allo stesso modo che ai gruppi trattati e nella stessa quantità somministrata al gruppo con il dosaggio più elevato. 
Il livello di dosaggio più elevato della sostanza in esame dovrebbe 
causare effetti tossici ma senza causare mortalità oppure causando una mortalità molto limitata. Il livello di dosaggio più basso non dovrebbe provocare alcun sintomo di tossicità. Nei casi in cui vi 
sia una stima utilizzabile dell'esposizione umana, il livello di dosag ­
gio più basso dovrebbe superarla. Dal punto di vista ottimale, il livello intermedio dovrebbe provocare effetti tossici osservabili mi ­
nimi. Nei casi in cui siano usati più livelli di dosaggio intermedi, essi 
dovrebbero essere intervallati al fine di causare una graduazione di 
effetti tossici. Nei gruppi a livello di dosaggio basso e medio e di controllo, l'incidenza dei decessi dovrebbe essere bassa per consen ­
tire una valutazione significativa dei risultati.
 
Se l'applicazione della sostanza in esame dovesse causare una grave 
irritazione della cute, sarà opportuno ridurne le concentrazioni, e ciò può causare una diminuzione oppure l'assenza degli altri effetti tos ­
sici al livello di dosaggio più elevato. Inoltre, se la cute à stata 
gravemente danneggiata, può essere necessario interrompere il saggio e iniziarne uno nuovo a concentrazioni più basse.
 
1.6.2.4.  Saggio limite  
Qualora un saggio preliminare, effettuato con un livello di dosaggio 
di 1 000 mg/kg di peso corporeo, oppure con una dose superiore in relazione all'eventuale esposizione umana, se nota, non causi effetti 
tossici, ulteriori saggi possono essere considerati non necessari.
 
1.6.2.5.  Periodo di osservazione  
Gli animali da esperimento dovrebbero essere esaminati quotidiana ­
mente al fine di rilevare i segni della tossicità. Il momento del 
decesso e quello in cui appaiono e scompaiono i sintomi di tossicità 
dovrebbero essere registrati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 305
 
1.6.3.  Procedimento  
Ogni gabbia dovrebbe contenere un solo animale. Da un punto di 
vista ottimale, la sostanza in esame viene applicata agli animali 7 giorni la settimana per un periodo di 28 giorni. Gli animali di ogni 
eventuale gruppo satellite previsto per proseguire le osservazioni 
dovrebbero essere tenuti per altri 14 giorni, senza subire trattamenti, al fine di rilevare l'eventuale guarigione o la persistenza degli effetti tossici, La durata dell'esposizione dovrebbe essere almeno di 6 ore/ ­
giorno.
 
La sostanza in esame dovrebbe essere applicata uniformemente su 
un'area pari a circa il 10 % della superficie corporea totale. Per le 
sostanze altamente tossiche, la superficie coperta può essere inferio ­
re, ma la maggior parte dell'area trattata dovrebbe essere ricoperta da uno strato per quanto possibile sottile e uniforme.
 
Durante il periodo di esposizione, la sostanza in esame viene tenuta a 
contatto della cute mediante una garza porosa e un cerotto non 
irritante. La parte su cui viene applicata la sostanza dovrà essere 
ulteriormente coperta in modo opportuno per tenere ferma la garza e la sostanza in esame e affinché gli animali non possano ingerire la sostanza stessa. Dispositivi per la limitazione dei movimenti possono 
essere utilizzati per impedire agli animali di ingerire la sostanza in 
esame, ma non è consigliabile l'immobilizzazione completa dell'ani ­
male. Come alternativa si può usare un «dispositivo protettivo a collare».
 
Alla fine del periodo di esposizione, la sostanza residua dovrà essere 
rimossa utilizzando acqua, se possibile, o altri prodotti idonei per la 
pulizia della pelle.  
Tutti gli animali dovranno essere esaminati quotidianamente e do ­
vranno essere registrati i segni di tossicità, inclusi il momento del ­
l'insorgenza, il loro grado e durata. Le osservazioni dovrebbero in ­
cludere le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mem ­
brane mucose, e anche dei sistemi respiratorio, circolatorio, nervoso 
autonomo e centrale, dell'attività somatomotoria e del comporta ­
mento dell'animale. La misura del peso degli animali dovrà essere effettuata ogni settimana. Si raccomanda, inoltre, che il consumo sia anche misurato ogni settimana. L'esame periodico degli animali è 
necessario per impedire la perdita degli animali dello studio, dovuta 
a cause come cannibalismo, autolisi dei tessuti o errata collocazione. Al termine del saggio, tutti gli animali sopravvissuti, ad eccezione del gruppo satellite, sono sottoposti a necroscopia. Gli animali mo ­
ribondi e gli animali in condizioni di grave sofferenza o dolore 
dovranno essere rimossi appena notati, soppressi umanamente e sot ­
toposti a necroscopia.
 
Al termine del saggio tutti gli animali, compresi quelli di controllo, 
saranno sottoposti ai seguenti esami:  
i) ematologia, comprendente almeno l'ematocrito, la concentrazione 
di emoglobina, la conta degli eritrociti, la conta totale e differen ­
ziale dei leucociti e una misura del potenziale di coagulazione;  
ii) biochimica clinica del sangue, comprendente almeno un parame ­
tro della funzionalità epatica e renale nel siero: alanina aminotran ­
sferasi (prima conosciuta come glutammico-piruvico transamina ­
si), aspartato aminotransferasi (prima conosciuta come glutammi ­
co-ossalacetico transaminasi), azoto ureico, albumina, creatinina ematica, bilirubina totale e proteine seriche totali.
 
Altre determinazioni, che possono risultare necessarie per un'ade ­
guata valutazione tossicologica, comprendono il calcio, il fosforo, il cloruro, il sodio, il potassio, il glucosio a digiuno, l'analisi dei 
lipidi, gli ormoni, l'equilibrio acido/base, la metaemoglobina, l'atti ­
vità colinesterasica.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 306
 
Per estendere l'indagine degli effetti osservati, se necessario, si pos ­
sono utilizzare ulteriori esami biochimico-clinici.  
1.6.4.  Necroscopia  
Tutti gli animali dello studio dovranno essere sottoposti a necrosco ­
pia completa. Per evitare la disidratazione, il fegato, i reni, le ghian ­
dole surrenali e i testicoli dovrebbero essere pesati umidi al più 
presto possibile dopo la dissezione. Gli organi e i tessuti, cioè la 
cute normale e trattata, il fegato, i reni, la milza, i testicoli, le ghiandole surrenali, il cuore e gli organi bersaglio (cioè gli organi che presentano lesioni macroscopiche o variazioni di dimensioni) 
dovranno essere conservati in un mezzo adatto per l'eventuale futuro 
esame istopatologico.
 
1.6.5.  Esame istopatologico  
Gli organi e i tessuti degli animali del gruppo ad alto dosaggio e del 
gruppo di controllo opportunamente preservati dovranno essere sot ­
toposti ad esame istologico. Gli organi e i tessuti che presentano 
lesioni attribuibili alla sostanza in esame somministrata al dosaggio più elevato dovranno essere esaminati anche per i gruppi a dosaggio inferiore. Gli animali dell'eventuale gruppo satellite dovranno essere 
sottoposti ad esame istologico, in particolare per gli organi e i tessuti 
che risultano colpiti da effetti tossici negli altri gruppi trattati.
 
2. DATI  
I risultati dovranno essere riassunti in una tabella indicante, per ogni 
gruppo trattato, il numero di animali all'inizio del saggio e il numero 
di animali che mostra ciascun tipo di lesione.  
Tutti i risultati osservati dovranno essere valutati con un adeguato 
metodo statistico. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico riconosciuto.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione di prova deve, se possibile, includere le seguenti infor ­
mazioni:  
— dati sugli animali (specie, ceppo, origine, condizioni ambientali, 
dieta, ecc.);  
— condizioni di prova (incluso il tipo di medicazione: occlusiva o 
non occlusiva);  
— livello di dosaggio (incluso il veicolo, se usato) e concentrazioni;  
— livello senza effetti, dove possibile;  
— effetti tossici per sesso e dosaggio;  
— il momento del decesso durante il saggio, oppure se gli animali 
sono sopravvissuti sino al termine;  
— effetti tossici o altri effetti;  
— momento dell'osservazione di ciascun sintomo anomalo e suo 
successivo decorso;  
— dati relativi al consumo di alimenti e al peso corporeo;  
— esami ematologici effettuati e loro risultati;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 307
 
— esami biochimico-clinici effettuati e loro risultati;  
— risultati della necroscopia;  
— descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici;  
— elaborazione statistica dei risultati, ove possibile;  
— discussione dei risultati;  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B (punto D).  
4. BIBLIOGRAFIA  
Vedi introduzione generale, parte B (punto E)  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENICITÀ — TEST IN VITRO DI ABERRAZIONE 
CROMOSOMICA NEI MAMMIFERI  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 473, In Vitro Mammalian 
Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il saggio in vitro di aberrazione cromosomica è destinato ad identi ­
ficare gli agenti che causano aberrazioni cromosomiche strutturali in una coltura di cellule di mammifero (1) (2) (3). Le aberrazioni strut ­
turali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. La 
maggior parte dei mutageni chimici induce aberrazioni cromatidiche, benché si verifichino anche aberrazioni cromosomiche. Un aumento della poliploidia può indicare che una sostanza chimica ha la capa ­
cità di indurre aberrazioni numeriche. Questo metodo tuttavia non è 
inteso a misurare le aberrazioni numeriche e non viene usato di norma per tale scopo. Le mutazioni cromosomiche e i fenomeni ad esse correlati sono causa di molte malattie genetiche umane e vi sono 
prove concrete che mutazioni cromosomiche e fenomeni ad esse 
correlati, che causano alterazioni degli oncogeni e dei geni soppres ­
sori dei tumori nelle cellule somatiche, sono implicati nella comparsa delle neoplasie umane come in quelle sperimentalmente indotte negli 
animali da laboratorio.
 
Nei test in vitro sulle aberrazioni cromosomiche si possono usare 
colture di linee cellulari stabilizzate, ceppi cellulari o colture cellulari primarie. Le cellule sono scelte in funzione della capacità di crescita in coltura, della stabilità del cariotipo, del numero e della diversità 
dei cromosomi e della frequenza di aberrazioni cromosomiche spon ­
tanee.
 
I test in vitro richiedono in generale l'uso di una fonte esogena di 
attivazione metabolica. Tale sistema di attivazione metabolica non può simulare perfettamente le condizioni  in vivo  nel mammifero. Si 
evitino accuratamente condizioni che porterebbero a risultati positivi 
che non riflettono una mutagenicità intrinseca ma che possono avere origine da cambiamenti di pH o dell'osmolalità o da livelli elevati di citotossicità (4) (5).
 
Questi test sono utilizzati per individuare potenziali mutageni e can ­
cerogeni per i mammiferi. Molti composti che risultano positivi al 
test sono cancerogeni per i mammiferi; tuttavia la correlazione tra il test e la cancerogenicità non è assoluta: dipende dalla classe chimica e vi sono sempre più elementi che inducono a ritenere che esistono 
cancerogeni non rivelati da questi test, perché sembrano agire attra ­
verso meccanismi diversi dal danno diretto al DNA.
 
Cfr. anche Introduzione generale parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Aberrazione cromatidica:  danno cromosomico strutturale che si 
manifesta nella rottura di un singolo cromatide o nella rottura e ricongiunzione di cromatidi.
 
Aberrazione cromosomica:  alterazione cromosomica strutturale, che 
si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, di en ­
trambi i cromatidi in uno stesso punto.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 309
 
Endoriduplicazione:  processo nel quale, dopo una fase S di repli ­
cazione del DNA, il nucleo non inizia la mitosi ma inizia una nuova 
fase S. Ne risultano cromosomi con 4, 8, 16, ... cromatidi.  
Gap:  lesione acromatica, di ampiezza inferiore a un cromatide, con 
minimo disallineamento dei cromatidi.  
Coefficiente mitotico:  numero delle cellule in metafase diviso per il 
numero totale di cellule della popolazione: costituisce un'indicazione del grado di proliferazione della popolazione cellulare.
 
Aberrazione numerica:  variazione del numero di cromosomi ri ­
spetto al numero diploide caraneristico della specie.  
Poliploidia:  numero di cromosomi multiplo superiore a due del 
numero aploide (cioè 3n, 4n ecc.).  
Aberrazione strutturale:  alterazione della struttura cromosomica 
visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase, che si pre ­
senta con delezioni, perdita di segmenti, scambi intercromosomici e intracromosomici.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
L'azione della sostanza in esame è saggiata sulle colture cellulari, 
con e senza attivazione metabolica. Dopo l'esposizione alla sostanza in esame, le colture cellulari sono trattate, a determinati intervalli, con un inibitore della metafase (per esempio Colcemid® o colchici ­
na), raccolte, sottoposte a un processo di colorazione e le cellule in 
metafase sono esaminate al microscopio per determinare la presenza di aberrazioni cromosomiche.
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Cellule  
Si possono usare varie linee cellulari, ceppi o colture cellulari pri ­
marie, fra cui cellule umane (per esempio fibroblasti del criceto 
cinese, linfociti del sangue periferico umano o di altri mammiferi).  
1.4.1.2.  Terreni e condizioni di coltura  
Si usino terreni di coltura e condizioni di incubazione (recipienti per 
coltura, concentraazione di CO  2 , temperatura e umidità) adeguati alle 
colture. Si controlli periodicamente la stabilità del numero modale 
dei cromosomi e l'assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari stabilizzate e nei ceppi; non si usino ceppi contaminati. Dovrebbero essere note la durata normale del ciclo cellulare e le 
condizioni di coltura utilizzate.
 
1.4.1.3.  Preparazione delle colture  
Linee cellulari stabilizzate e ceppi: le cellule provenienti da colture 
primarie vengono inoculate in un terreno di coltura ad una densità 
tale da impedire che le colture raggiungano la confluenza prima della 
raccolta, e incubate a 37  o C. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 310
 
Linfociti: sangue intero trattato con un anticoagulante (per esempio 
eparina) o linfociti isolati, prelevati da soggetti sani, sono posti in un 
terreno di coltura contenente un mitogeno (per esempio fitoemoag ­
glutinina) e incubati a 37  o C. 
1.4.1.4.  Attivazione metabolica  
Le cellule dovrebbero essere esposte alla sostanza in esame sia in 
presenza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione meta ­
bolica. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mito ­
condriale integrata di cofattori (S9) ricavata dal fegato di roditori 
trattati con induttori enzimatici, per esempio: Aroclor 1254 (6) (7) 
(8) (9), o con un combinazione di fenobarbitone e/3-naftoflavone (10) (11) (12).
 
La frazione post-mitocondriale viene di solito usata a concentrazioni 
comprese tra 1 e 10 % v/v nel terreno di coltura. Le condizioni del sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utiliz ­
zare varie concentrazioni della frazione post-mitocondriale.
 
Vari nuovi procedimenti, tra cui la creazione di linee cellulari mo ­
dificate mediante ingegneria genetica che esprimono enzimi attivatori 
specifici, possono fornire il potenziale di attivazione endogena. La 
scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (per esempio in funzione dell'importanza dell'isoenzima del citocromo P450 nel metabolismo della sostanza in esame).
 
1.4.1.5.  Sostanza in esame/Preparazione  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono es ­
sere aggiunte direttamente alla coltura o diluite prima del trattamen ­
to. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conserva ­
zione è accettabile.
 
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
Il solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la 
sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza 
delle cellule e con l'azione di S9, L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in conside ­
razione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. 
Nell'esame di sostanze instabili in acqua, si usi un solvente organico anidro. L'acqua può essere rimossa mediante un setaccio molecolare.
 
1.4.2.2.  Concentrazioni di esposizione  
Fra i criteri da considerare nel determinare la concentrazione mas ­
sima si citano la citotossicità, la solubilità nel sistema di prova e le variazioni di pH o di osmolalità.
 
La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione me ­
tabolica nel test principale, sulla base di un'indicatore adeguato del ­
l'integrità e della moltiplicazione cellulare, come il grado di con ­
fluenza, il conteggio delle cellule vitali o il coefficiente mitotico. 
Può essere utile determinare la citotossicità e la solubilità in un 
esperimento preliminare.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 311
 
Si usino almeno tre concentrazioni analizzagli. In caso di sostanze 
citotossiche, le concentrazioni devono andare dalla tossicità massima 
ad una tossicità assente o modica; le concentrazioni devono cioè essere di norma separate al massimo da un fattore compreso tra 2 e
 v 10. Al momento della raccolta la concentrazione più elevata deve 
presentare una riduzione significativa (superiore al 50 %) del grado 
di confluenza, del numero delle cellule o del coefficiente mitotico. Il coefficiente mitotico è solo una misura indiretta di effetti citotossici/ ­
citostatici e dipende dal tempo trascorso dopo il trattamento. È tut ­
tavia accettabile per colture in sospensione, per le quali altre misure 
della tossicità possono essere complesse e poco pratiche. Dati relativi alla cinetica cellulare, per esempio il tempo medio di moltiplicazio ­
ne, possono fornire informazioni supplementari. Il tempo medio di 
moltiplicazione tuttavia è una media generale, che non sempre rivela 
l'esistenza di sottopopolazioni con ritardi di crescita, e anche piccoli aumenti di esso possono essere associati ad un ritardo sostanziale del tempo di comparsa delle aberrazioni.
 
Per sostanze a basso grado di citotossicità la concentrazione massima 
di prova dovrebbe essere pari a 5 ul/ml, 5 mg/ml o 0,01 M (si scelga il valore più basso).
 
Per sostanze difficilmente solubili e non tossiche a concentrazioni 
inferiori al limite di solubilità, la dose massima dovrebbe essere una concentrazione superiore al limite di solubilità nel terreno di coltura, 
al termine del trattamento. In alcuni casi (per esempio quando si 
verifica tossicità solo a concentrazioni superiori alla concentrazione minima insolubile) è opportuno eseguire prove a più di una concen ­
trazione, con precipitazione visibile. Può essere utile valutare la so ­
lubilità all'inizio e al termine del trattamento, perché questa può 
variare nel corso dell'esposizione durante il saggio, per la presenza di cellule, S9, siero ecc. L'insolubilità può essere rilevata ad occhio nudo. Il precipitato non deve interferire con la valutazione.
 
1.4.2.3.  Controlli negativi e positivi  
Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente o 
mezzo disperdente) trattati in parallelo, con e senza attivazione me ­
tabolica. Quando si usa l'attivazione metabolica, la sostanza usata per 
i controlli positivi deve esigere attivazione per dare una risposta mutagenica.
 
Come controllo positivo si utilizzi un clastogeno noto, a livelli ai 
quali ci si attende un aumento riproducibile e individuabile rispetto ai valori normali, che dimostri la sensibilità del test.
 
La concentrazione del controllo positivo deve essere tale che gli 
effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'iden ­
tità dei vetrini codificati. Esempi di sostanze di controllo positive:  
Condizione di attivazione metabolica Sostanza N. CAS N. Einecs  
Assenza di attivazione metabo ­
lica esogena Metansolfonato di metile 66-27-3 200-625-0 
Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 312
 
Condizione di attivazione metabolica Sostanza N. CAS N. Einecs  
Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomicina C 50-07-7 212-072-2 
4-Nitrochinolina-N-ossido 56-57-5 200-281-1 
Presenza di attivazione metabo ­
lica esogena Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 
Ciclofosfammide 
Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Si possono usare altre adeguate sostanze per i controlli positivi. Si 
usino, se disponibili, sostanze di una classe chimica correlata.  
Si effettuino anche controlli negativi, con solvente o mezzo disper ­
dente usati da soli sul terreno di coltura; i controlli vanno trattati come le colture di trattamento, per ogni fase di raccolta. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che dati precedenti provino che 
il solvente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.
 
1.4.3.  Procedura  
1.4.3.1.  Trattamento con la sostanza in esame  
Le cellule in proliferazione sono trattate con la sostanza in esame in 
presenza e in assenza di un sistema di attivazione metabolica. 11 trattamento dei linfociti deve iniziare circa 48 ore dopo la stimola ­
zione mitogenica.
 
1.4.3.2. Dovrebbero essere usate di norma colture in doppio per ogni concen ­
trazione, anche per le colture di controllo con solo solvente. Se 
esistono precedenti dati che provano che le variazioni tra colture 
in doppio sono minime (13) (14), si può accettare l'uso di una sola coltura per concentrazione.
 
1 test con sostanze gassose o volatili devono essere condotti 
con metodi adeguati, per esempio in recipienti di coltura 
ermetici (15) (16)  
1.4.3.3.  Raccolta delle colture  
Nel primo esperimento si espongano le cellule alla sostanza in esa ­
me, sia con che senza attivazione metabolica, per 3-6 ore e si pro ­
ceda al campionamento quando sia trascorso un periodo equivalente a circa una volta e mezza la durata del ciclo cellulare normale 
dall'inizio del trattamento (12). Se i risultati sono negativi, sia con 
che senza attivazione, si esegua un ulteriore esperimento senza atti ­
vazione, con trattamento continuo fino al campionamento, dopo un periodo equivalente a circa una volta e mezzo la durata del ciclo 
cellulare normale. Alcune sostanze chimiche possono essere indivi ­
duate più facilmente con tempi di trattamento/campionamento supe ­
riori a una volta e mezzo la durata del ciclo cellulare. I risultati negativi nei testi con attivazione metabolica devono essere confer ­
mati caso per caso. Se non si ritiene necessaria la conferma dei 
risultati negativi, se ne fornisca la motivazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 313
 
1.4.3.4.  Preparazione dei cromosomi  
Le colture cellulari sono trattate con Colcemid  8 o colchicina, di 
norma per un periodo variabile da una a tre ore prima della raccolta. Ogni coltura cellulare viene raccolta e trattata separatamente per la 
preparazione dei cromosomi. La preparazione dei cromosomi com ­
prende il trattamento ipotonico delle cellule, il fissaggio e la colora ­
zione.
 
1.4.3.5.  Analisi  
Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, de ­
vono essere codificati individualmente prima dell'esame al microsco ­
pio. Poiché le procedure di fissaggio provocano spesso la rottura di una parte delle cellule in metafase, con perdita di cromosomi, le 
cellule classificate devono contenere un numero di centromeri pari 
al numero modale ± 2 per tutti i tipi di cellule. Per ogni concen ­
trazione e per ogni controllo si devono valutare almeno 200 cellule in metafase ben distribuite e adeguatamente suddivise, se possibile 
tra le prove in doppio. Tale numero può essere ridotto quando si 
osserva un gran numero di aberrazioni.
 
Anche se il test è destinato a rivelare aberrazioni cromosomiche 
strutturali, è importante registrare eventuali casi di poliploidia e di 
endoriduplicazione.  
2. RISULTATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
L'unità sperimentale è la cellula; pertanto si deve valutare la percen ­
tuale di cellule che presentano una o più aberrazioni cromosomiche 
strutturali. Per le colture sperimentali e per le colture di controllo si 
indichino i vari tipi di aberrazioni cromosomiche strutturali, con numero e frequenza. I gap vanno registrati separatamente e indicati nella relazione, ma non vanno inclusi nella frequenza totale delle 
aberrazioni.
 
Si riportino anche le misure di citotossicità condotte in parallelo per 
tutte le colture trattate e i controlli negativi nei principali test di aberrazione.
 
1 dati saranno presentati separatamente per le singole colture e rias ­
sunti in tabelle.  
Non è necessario verificare le risposte positive inequivocabili. I ri ­
sultati ambigui devono essere chiariti mediante prove ulteriori, pre ­
feribilmente modificando le condizioni di esperimento. La necessità 
di confermare i risultati negativi è stata discussa al punto 1.4.3.3. Nei test successivi si dovrebbero modificare i parametri di studio, per estendere la gamma delle condizioni valutate. Fra i parametri di 
studio modificabili si citano l'intervallo fra i livelli di concentrazione 
e le condizioni di attivazione metabolica.
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per 
esempio un aumento correlato alla concentrazione o un aumento 
riproducibile del numero di cellule che presentano aberrazioni cro ­
mosomiche. Si consideri in primo luogo la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (3) (13). ma la 
significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determi ­
nante di una risposta positiva.
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Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che la 
sostanza in esame è in grado di inibire processi miratici e di indurre 
aberrazioni numeriche nei cromosomi. Un aumento del numero di cellule con cromosomi endoriduplicati può indicare che la sostanza in esame è in grado di inibire il ciclo cellulare (17) (18).
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
palesemente positivi o negativi, ma in alcuni casi i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione 
della sostanza in esame. 1 risultati possono rimanere ambigui nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.
 
Risultati positivi del saggio di aberrazione cromosomica in vitro 
indicano che la sostanza in esame induce aberrazioni cromosomiche strutturali in colture di cellule somatiche di mammifero. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni di test, la sostanza in esame 
non induce aberrazioni cromosomiche in colture di cellule somatiche 
di mammifero.
 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente,  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se nota.  
Cellule:  
— tipo e origine delle cellule,  
— caratteristiche del cariotipo e idoneità del tipo di cellula usato,  
— assenza di micoplasma, se del caso,  
— informazioni sulla durata del ciclo cellulare,  
— sesso dei donatori di sangue, sangue intero o linfociti isolati, 
mitogeno usato,  
— eventuale numero di passaggi in coltura, se del caso,  
— metodi usati per la conservazione della coltura cellulare, se del 
caso,  
— numero modale dei cromosomi.  
Condizioni di esperimento:  
— natura e concentrazione dell'inibitore della metafase, durata di 
esposizione delle cellule,  
— criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, 
per esempio dati sulla citotossicità e sui limiti di solubilità, se 
disponibili,  
— composizione del terreno di coltura, concentrazione di CO  2 se 
del caso,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 315
 
— concentrazione della sostanza in esame.  
— volume del mezzo disperdente e della sostanza in esame aggiunti,  
— temperatura di incubazione,  
— tempo di incubazione,  
— durata del trattamento,  
— densità delle cellule al momento dell'inoculazione, se del caso,  
— tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, com ­
presi i criteri di accettabilità.  
— controlli positivi e negativi,  
— metodi di preparazione dei vetrini,  
— criteri di conteggio delle aberrazioni,  
— numero di metafasi analizzate,  
— metodi di misura della tossicità,  
— criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, negativi o 
ambigui.  
Risultati:  
— indizi di tossicità, per esempio grado di confluenza, dati sul ciclo 
cellulare, conta delle cellule, coefficiente mitotico,  
— segni di precipitazione,  
— dati sul pH e sull'osmolalità del terreno di trattamento, se deter ­
minati,  
— definizione delle aberrazioni, compresi i salti,  
— numero di cellule con aberrazioni cromosomiche e tipi di aber ­
razioni, indicati separatamente per ciascuna coltura trattata e di 
controllo,  
— eventuali cambiamenti di ploidia,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— eventuali analisi statistiche,  
— dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi 
paralleli,  
— precedenti dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) 
e positivi, con variazioni, medie e deviazioni standard.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
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B.11.  MUTAGENICITA — TEST  IN VIVO  DI ABERRAZIONE 
CROMOSOMICA SUL MIDOLLO OSSEO DI MAMMIFERI  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 475, Mammalian Bone 
Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
I testi di aberrazione cromosomica  in vivo  nei mammiferi sono de ­
stinati ad individuare aberrazioni cromosomiche strutturali indotte 
dalla sostanza in esame nelle cellule del midollo osseo di animali, 
di solito roditori (1) (2) (3) (4). Le aberrazioni cromosomiche strut ­
turali possono essere di due tipi: cromosomiche o cromatidiche. Un aumento della poliploidia può significare che una sostanza chimica è 
in grado di indurre aberrazioni numeriche. La maggior parte dei 
mutageni chimici induce aberrazioni cromatidiche, ma si verificano anche aberrazioni cromosomiche. Le mutazioni cromosomiche e i fenomeni ad esse correlati sono causa di molte malattie genetiche 
umane e vi sono prove concrete che mutazioni cromosomiche e 
fenomeni ad esse correlati, che causano alterazioni degli oncogeni e dei geni soppressori di tumori, sono implicati nella comparsa delle neoplasie umane e di quelle sperimentalmente indotte negli animali 
da laboratorio.
 
Per i test si usano solitamente roditori. Il midollo osseo è il tessuto 
bersaglio, in quanto è altamente vascolarizzato e contiene una popo ­
lazione di cellule a ciclo rapido, che possono essere agevolmente 
isolate e trattate. Altre specie e altri tessuti bersaglio non sono og ­
getto della presente metodica.  
Il test di aberrazione cromosomica è particolarmente idoneo a valu ­
tare il rischio mutagenico, in quanto per mette di considerare fattori 
del metabolismo  in vivo , aspetti farmacocinetici e processi di ripara ­
zione del DNA, che peraltro possono variare in funzione della specie e del tipo di tessuto. Un test  in vivo  è utile anche per verificare 
l'effetto mutageno rivelato da un test in vitro.
 
Se è evidente che la sostanza in esame, o un metabolita reattivo, non 
raggiungono il tessuto bersaglio, il test non è idoneo.  
Cfr. anche Introduzione generale parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Aberrazione cromatica:  danno strutturale dei cromosomi che si 
manifesta nella rottura di un singolo cromatide o nella rottura e 
ricongiunzione di cromatidi.  
Aberrazione cromosomica:  alterazione cromosomica strutturale, che 
si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, di en ­
trambi i cromatidi in uno stesso punto.  
Endoriduplicazione:  processo nel quale, dopo una fase S di repli ­
cazione del DNA, il nucleo non inizia la mitosi ma inizia una nuova fase S. Ne risultano cromosomi con 4, 8, 16, ... cromatidi.
 
Gap:  lesione acromatica, di ampiezza inferiore a un cromatide, con 
minimo disallineamento dei cromatidi.  
Coefficiente mitotico:  numero delle cellule in metafase diviso per il 
numero totale di cellule della popolazione: costituisce un'indicazione 
del grado di proliferazione della popolazione cellulare.  
Aberrazione numerica:  variazione del numero di cromosomi ri ­
spetto al numero diploide caraneristico della specie.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 319
 
Poliploidia:  numero di cromosomi multiplo superiore a due del 
numero aploide (cioè 3n, 4n, ecc).  
Aberrazione strutturale:  alterazione della struttura cromosomica 
visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase, che si pre ­
senta con perdita di segmenti, riordinamenti intercromosomici e in ­
tracromosomici.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Gli animali sono esposti alle sostanze in esame per una via adeguata 
e vengono quindi sacrificati a tempo debito, dopo somministrazione di un inibitore della metafase (per esempio colchicina o Colcemid
 05 ). 
Sono poi approntate e sottoposte a un processo di colorazione le 
preparazioni cromosomiche delle cellule di midollo osseo, e se ne analizzano le cellule in metafase per determinare le aberrazioni cro ­
mosomiche.
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Scelta delle specie animali  
Ratti, topi e criceti cinesi sono gli animali più comunemente usati, 
ma si può usare qualsiasi specie adeguata di mammifero. Si scelgano individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di 
animali da laboratorio. All'inizio dello studio le variazioni di peso tra 
gli animali devono essere minime e non superare il ±20 % del peso medio per sesso.
 
1.4.1.2.  Condizioni di stabulazione e alimentazione  
Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla 
parte B; l'umidità ideale è pari al 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preparazione degli animali  
Gli animali adulti, sani e giovani sono suddivisi a caso in gruppi di 
controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in modo 
da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli animali 
vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.
 
1.4.1.4.  Preparazione delle dosi  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite 
prima del trattamento degli animali. Le sostanze liquide possono 
essere somministrate direttamente o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano dispo ­
nibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è 
ammissibile.
 
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
11 solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle 
dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esa ­
me. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilita. Si raccomanda di 
prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un 
solvente/mezzo disperdente acquoso.
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1.4.2.2.  Controlli  
Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente/ ­
mezzo disperdente), trattati in parallelo per ciascun sesso. Gli animali dei gruppi dovranno essere trattati in modo identico, salvo per la 
somministrazione della sostanza in esame,
 
I controlli positivi dovrebbero indurre aberrazioni strutturali  in vivo  a 
livelli di esposizione ai quali è previsto un aumento rilevabile ri ­
spetto alla media. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente 
al lettore l'identità dei vetrini codificati. E ammissibile che le so ­
stanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa dalla sostanza in esame ed e sufficiente un solo prelievo per cam ­
pione. È anche ammissibile l'uso per i controlli positivi di sostanze di 
una classe chimica correlata, se ne esistono. Fra gli esempi di so ­
stanze per i controlli positivi si citano:
 
Sostanza N. CAS N. Einecs  
Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 
Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
Ciclofosfammide 
Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilenmelammina 51-18-3 200-083-5  
In ogni fase del campionamento si proceda a controlli negativi, cui 
sia somministrato solo il solvente o il mezzo disperdente, senza altre 
differenze di trattamento, salvo che dati precedenti dimostrino che la variabilità intraspecifica e la frequenza di cellule con aberrazioni cromosomiche sono accettabili. Se per i controlli negativi si procede 
ad un solo campionamento, il momento più adeguato è quello del 
primo prelievo. Si ricorra anche a controlli negativi non trattati, salvo che dati precedenti dimostrino che il solvente/mezzo disperdente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.
 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Numero e sesso degli animali  
Ogni gruppo trattato e ogni gruppo di controllo deve essere compo ­
sto di almeno 5 animali analizzabili per sesso. Se al momento della sperimentazione sono disponibili dati relativi a sperimentazioni sulla stessa specie, con la medesima via di esposizione, che dimostrano 
che non vi sono sostanziali differenze di tossicità tra i sessi, sarà 
sufficiente effettuare i test su un solo sesso. Qualora l'esposizione umana alle sostanze chimiche sia specifica per un sesso, come per esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, i test devono essere 
eseguiti su animali di tale sesso.
 
1.5.2.  Protocollo di trattamento  
Le sostanze in esame sono somministrate di preferenza in un'unica 
dose. Possono essere somministrate anche in dosi frazionate, per esempio in due dosi nello stesso giorno, a distanza di qualche ora al massimo, per agevolare la somministrazione, trattandosi di dosi di 
volume elevato. Se si usa una posologia diversa, se ne fornisca la 
motivazione scientifica.
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Dopo il trattamento si proceda al prelievo dei campioni in due mo ­
menti diversi dello stesso giorno. Per i roditori il primo prelievo 
dopo il trattamento è effettuato quando sia trascorso un periodo equivalente ad una volta e mezza la durata del ciclo cellulare (che è di norma di 12-18 ore). Poiché il tempo necessario affinché la 
sostanza in esame sia assorbita e metabolizzata e produca effetti sulla 
cinetica del ciclo cellulare può influire sul momento ottimale per l'individuazione delle aberrazioni cromosomiche, si raccomanda di prelevare un altro campione 24 ore dopo. Se il protocollo di tratta ­
mento è più lungo di un giorno, si proceda ad un unico campiona ­
mento quando sia trascorso un periodo equivalente ad una volta e mezza la durata normale del ciclo cellulare dopo l'ultima sommini ­
strazione.
 
Prima di sacrificare gli animali si inietti per via interperitoneale una 
dose adeguata di un inibitore della meta-fase (per esempio Colce ­
mid® o colchicina). Gi animali saranno quindi sacrificati dopo un 
adeguato lasso di tempo: 3-5 ore circa per i topi, 4-5 ore circa per i criceti cinesi. Si prelevino quindi le necessarie cellule del midollo osseo e si rilevino le aberrazioni cromosomiche.
 
1.5.3.  Dosi  
Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non 
essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello 
stesso laboratorio, sulla stessa specie, ceppo e sesso, con il mede ­
simo protocollo usato nel test principale (5). In caso di tossicità si usino per la prima fase di campionamento tre dosi diverse, che 
vadano dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica. 
Per il campionamento successivo si usi solo la dose massima. La dose massima è definita come dose che produce segni di tossicità tali che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibil ­
mente letali. Sostanze con azione biologica specifica, a dosi basse 
non tossiche (come ormoni e mitogeni) possono costituire eccezione rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. La dose massima può essere definita anche come dose che 
produce qualche segno di tossicità nel midollo osseo (per esempio 
una riduzione del coefficiente mitotico superiore al 50 %).
 
1.5.4.  Saggio con dose limite  
Se la somministrazione di una quantità di sostanza pari ad almeno 
2 000 mg per kg di peso corporeo in dose unica o in due dosi nello stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non vi sono 
ragioni di sospettare un'azione genotossica sulla base di dati relativi a 
sostanze strutturalmente correlate, si può considerare che non è ne ­
cessario procedere alla sperimentazione completa con tre dosi diver ­
se. Per studi di maggiore durata la dose limite è pari a 2 000 mg/kg 
di peso corporeo al giorno, da somministrare per 14 giorni al mas ­
simo; è pari a 1 000 mg/kg di peso corporeo al giorno per un trattamento più lungo. Sulla base della esposizione umana prevista per la sostanza in esame, può essere necessario usare una dose più 
elevata nel test con dose limite.
 
1.5.5.  Somministrazione  
La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda ga ­
strica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperi ­
toneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragio ­
ne. Il volume massimo di liquido somministrabile in un'unica volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'ani ­
male da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corpo ­
reo. L'uso di volumi più elevati deve essere motivato. Salvo per sostanze irritanti o corrosive, che di norma riveleranno effetti esa ­
cerbati a concentrazioni più elevate, le variazioni di volume devono 
essere minimizzate, regolando la concentrazione in modo da garan ­
tire un volume costante a tutte le dosi.
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1.5.6.  Preparazione dei cromosomi  
Non appena l'animale è stato sacrificato, si prelevi il midollo osseo, 
lo si esponga ad una soluzione ipotonica e lo si fissi. Le cellule siano poi poste su vetrini e sottoposte a un processo di colorazione.
 
1.5.7.  Analisi  
Si determini il coefficiente mitotico come misura della citotossicità in 
almeno 1 000 cellule per animale, in tutti gli animali trattati (com ­
presi i controlli positivi) e nei controlli negativi, non trattati.  
Per ogni animale si analizzino almeno 100 cellule. Tale numero può 
essere ridotto qualora si rilevi un alto numero di aberrazioni. Tutti i 
vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono es ­
sere codificati indipendentemente prima dell'esame al microscopio. Poiché le procedure di preparazione dei vetrini causano spesso la rottura di un parte delle cellule in metafase, con perdita di cromo ­
somi, le cellule trattate devono contenere un numero di centromeri 
pari a 2n ± 2.
 
2. RISULTATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati relativi ai singoli animali vanno presentati in forma di tabelle. 
L'unità sperimentale è l'animale. Per ciascun animale si indichi il 
numero di cellule analizzate e si valuti il numero di aberrazioni 
per cellula e la percentuale di cellule con una o più aberrazioni cromosomiche strutturali. Per i gruppi di trattamento e di controllo si elenchino i vari tipi di aberrazioni cromosomiche strutturali, il loro 
numero e la loro frequenza. I gap devono essere registrati separata ­
mente e indicati nella relazione, ma non inclusi nella frequenza totale delle aberrazioni. Se non c'è un'evidente differenza di risposta tra i sessi, i dati relativi ai due sessi possono essere combinati nell'analisi 
statistica.
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per 
esempio un aumento del numero relativo di cellule che presentano aberrazioni cromosomiche, correlato alla dose somministrata, o un palese aumento del numero di cellule con aberrazioni nei campioni, 
prelevati alla stessa fase di campionamento e provenienti da un 
gruppo cui è stata somministrata la stessa dose della sostanza in esame. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio 
nella valutazione dei risultati sperimentali (6), ma la significatività 
statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Eventuali risultati ambigui possono essere chiariti mediante test ulteriori, preferibilmente in condizioni sperimentali 
modificate.
 
Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che la 
sostanza in esame è in grado di indurre aberrazioni numeriche nei cromosomi. Un aumento del numero di cellule che presentano en ­
doriduplicazione può significare che la sostanza in esame è in grado 
di inibire il ciclo cellulare (7) (8).
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 323
 
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti 
non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.
 
Risultati positivi del saggio di aberrazione cromosomica  in vivo  
indicano che una sostanza induce aberrazioni cromosomiche nel mi ­
dollo osseo della specie usata per i test. Risultati negativi indicano che nelle condizioni di test la sostanza in esame non induce aberra ­
zioni cromosomiche nel midollo osseo della specie usata per i test.
 
Si vaglino le probabilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti 
entrino in circolo o specificamente raggiungano il tessuto bersaglio 
(tossicità sistemica).  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente,  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se nota.  
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo usato,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc,  
— peso dei singoli animali all'inizio degli esperimenti, con range, 
valore medio e deviazione standard per ciascun gruppo.  
Condizioni di esperimento:  
— controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente),  
— risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effet ­
tuato.,  
— criteri di selezione delle dosi,  
— illustrazione particolareggiata della preparazione della sostanza in 
esame,  
— illustrazione particolareggiata della somministrazione della so ­
stanza in esame,  
— metodi di misura della tossicità,  
— criteri di selezione della via di somministrazione,  
— metodi usati per verificare che la sostanza in esame sia entrata in 
circolo o abbia raggiunto il tessuto bersaglio, se del caso,  
— conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame 
nel cibo o nell'acqua potabile nella dose effettiva (mg/kg di peso 
corporeo/giorno), se del caso,  
— dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,  
— descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e di campio ­
namento,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 324
 
— natura e concentrazione dell'inibitore della metafase, durata del 
trattamento,  
— metodi di preparazione dei vetrini,  
— criteri di conteggio delle aberrazioni,  
— numero di cellule analizzate per animale,  
— criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, negativi o 
ambigui.  
Risultati:  
— segni di tossicità,  
— coefficiente mitotico,  
— tipo e numero delle aberrazioni, indicati separatamente per cia ­
scun animale,  
— numero totale delle aberrazioni per gruppo, con medie e devia ­
zioni standard,  
— numero di cellule che presentano aberrazioni per gruppo, con 
medie e deviazioni standard,  
— eventuali cambiamenti del numero cromosomico,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— eventuali analisi statistiche,  
— dati sui controlli negativi paralleli,  
— dati sui controlli negativi precedenti, con range, medie e devia ­
zioni standard,  
— dati sui controlli positivi paralleli.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in:  Muta­
genicity Testing: a Practical Approach,  S. Venitt and J. M. 
Parry (eds.). 1RL Press, Oxford, Washington D. C., 275-306.  
(2) Preston, R. J,, Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H,, McFee, 
A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow 
Cells,  Mutation  Res., 189, 157-165.  
(3) Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Boot ­
man, J. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, 
in: D. J. Kirkland, (ed.),  Basic Mutagenicity Tests, UKEMS 
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lines for Mutagenicity Testing Report. Part 1 revised,  Cam­
bridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 115-141.  
(4) Tice, R. R, Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., 
F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., 
Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the  In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test,  Mutation R es., 312, pp. 305-312.
 
(5) Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., 
Doe, J., Esdaile, D.]., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays,  Mutagenesis . 7, pp. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays, in:  UKEMS Sub-Committee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data,  D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, pp. 184-232.  
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest,  Mutation Res . 
119, pp. 403-413.  
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res.,  43, pp. 1363-1364.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENICITÀ — TEST  IN VIVO  SUI MICRONUCLEI 
NEGLI ERITROCITI DI MAMMIFERO  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 474, Mammalian Ery ­
throcyte Micronucleus Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il test  in vivo  sui micronuclei dei mammiferi è usato per individuare i 
danni indotti dalla sostanza in esame ai cromosomi o all'apparato mitotico degli eritroblasti; si effettua analizzando gli eritrociti prove ­
nienti dal midollo osseo e/o dalle cellule del sangue periferico di 
animali, di norma roditori.
 
È destinato a identificare sostanze che provocano danni citogenetici, 
che si manifestano nella formazione di micronuclei contenenti fram ­
menti di cromosomi o cromosomi interi.  
Quando da un eritroblasto del midollo osseo si sviluppa un eritrocita 
policromatico, il nucleo principale viene espulso; i micronuclei for ­
matisi possono rimanere nel citoplasma che non contiene più il nucleo principale, cosa che rende più agevole la visualizzazione 
dei micronuclei. L'aumento della frequenza di eritrociti policromatici 
contenenti micronuclei negli animali trattati è un'indicazione di danno cromosomico indotto.
 
In questo test si usa solitamente il midollo osseo di roditori: il 
midollo osseo è il tessuto in cui sono prodotti gli eritrociti policro ­
matici. Il conteggio degli eritrociti immaturi (policromatici) conte ­
nenti micronuclei nel sangue periferico è ugualmente accettabile nelle specie in cui è stata provata l'incapacità della milza di svolgere 
la funzione emocatecretica sugli eritrociti contenenti micronuclei o 
che sia risultata particolarmente sensibile per l'individuazione di agenti che provocano aberrazioni cromosomiche strutturali o numeri ­
che. Per distinguere i micronuclei si possono usare vari criteri, tra cui 
la presenza o l'assenza del cinetocore, o del centromero, nei micro ­
nuclei. L'elemento conclusivo è la frequenza degli eritrociti immaturi (policromatici) contenenti micronuclei. Quando gli animali vengono trattati in continuo per quattro settimane o più, come elemento con ­
clusivo si può usare anche la percentuale di eritrociti maturi (orto ­
cromatici) del sangue periferico che contengono micronuclei.
 
L'esame dei micronuclei dei mammiferi  in vivo  è particolarmente 
idoneo a valutare il rischio mutagenico, in quanto permette di pren ­
dere in considerazione elementi del metabolismo, della farmacocine ­
tica e dei processi di riparazione del DNA  in vivo , anche se questi 
possono variare in funzione della specie, dei tessuti e dell'effetto genetico indagato. 1 test  in vivo  sono utili anche ad approfondire 
gli studi di un effetto mutagenico rilevato in vitro.
 
Qualora risulti che la sostanza in esame, o un suo metabolita reatti ­
vo, non raggiungono il tessuto bersaglio, il test non è adeguato.  
Cfr. anche Introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 327
 
1.2. DEFINIZIONI  
Centromero (cinetocoro):  regione/i di un cromosoma sede di at ­
tacco del fuso durante la divisione cellulare, che permette il corretto movimento dei cromosomi figli verso i poli delle cellule figlie.
 
Micronuclei:  piccoli nuclei sovrannumerari, separati dal nucleo prin ­
cipale delle cellule, prodotti durante la telofase della mitosi (meiosi) 
da frammenti residui di cromosomi o da cromosomi interi.  
Eritrocita ortocromatico:  eritrocita maturo in cui mancano i ribo ­
somi, che può essere distinto dagli eritrociti policromatici immaturi mediante coloranti selettivi per i ribosomi.
 
Eritrocita policromatico:  eritrocita immaturo, in uno stadio di svi ­
luppo intermedio, che contiene ancora ribosomi e che pertanto può 
essere distinto dagli eritrociti ortocromatici maturi mediante coloranti selettivi per i ribosomi.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Gli animali sono esposti alla sostanza in esame tramite una via 
adeguata. Se si utilizza il midollo osseo, gli animali sono sacrificati 
a tempo debito dopo il trattamento; il midollo osseo viene quindi prelevato, preparato e colorato (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Se si utilizza sangue periferico, questo viene raccolto a tempo debito 
dopo il trattamento, si preparano quindi gli strisci e si colorano (4) 
(8) (9) (10). Per i test eseguiti con sangue periferico l'intervallo fra l'ultima esposizione della sostanza e la raccolta delle cellule do ­
vrebbe essere minimo. Si individuano quindi i micronuclei nei pre ­
parati.
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Scelta delle specie animali  
Se si usa il midollo osseo si raccomanda di servirsi di topi o ratti, 
benché si possa usare qualsiasi specie adeguata di mammifero. Se si 
usa il sangue periferico si raccomanda di servirsi di topi, ma si può 
utilizzare qualsiasi specie adeguata di mammifero, purché sia una specie in cui la milza non espleta la funzione emocateretica sugli eritrociti micronucleati e che si è rivelata sufficientemente sensibile 
per l'individuazione degli agenti che causano aberrazioni cromoso ­
miche strutturali o numeriche. Si scelgano individui giovani e in buona salute provenienti da ceppi di animali da laboratorio. All'inizio dell'esperimento le variazioni di peso fra gli animali devono essere 
minime: non possono superare il 20 % del peso medio per sesso.
 
1.4.1.2.  Condizioni di stabulazione e alimentazione  
Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla 
parte B: l'umidità ideale è pari al 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 328
 
1.4.1.3.  Preparazione degli animali  
Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi 
di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in modo da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli 
animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle con ­
dizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.
 
1.4.1.4.  Sostanza in esame/Preparazione  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite 
prima del trattamento degli animali. Le sostanze liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura o diluite prima del tratta ­
mento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano 
disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conserva ­
zione è ammissibile.
 
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle 
dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esa ­
me. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un 
solvente/mezzo disperdente acquoso.
 
1.4.2.2.  Controlli  
Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente/ ­
mezzo disperdente), trattati in parallelo per ciascun sesso. Gli animali 
dei due gruppi dovranno essere trattati in modo identico, salvo per la 
somministrazione della sostanza in esame.  
I controlli positivi dovrebbero produrre micronuclei  in vivo  a livelli 
di esposizione che provocano un aumento rilevabile rispetto alla 
media. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo 
che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'identità dei vetrini codificati. È ammissibile che le sostanze per i controlli positivi siano somministrate per una via diversa dalla so ­
stanza in esame ed è sufficiente un solo prelievo per campione. È 
anche ammissibile l'uso per i controlli positivi di sostanze di una classe chimica correlata, se ne esistono. Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano:
 
Sostanza N: CAS N. Einecs  
Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 
N-ethil-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 Ciclofosfammide 
Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilenmelammina 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 329
 
In ogni fase del campionamento si proceda a controlli negativi, cui 
sia somministrato solo il solvente o il mezzo disperdente, senza altre 
differenze di trattamento, salvo che dai dati precedenti risulti che la variabilità intraspecifica e la frequenza di cellule con micronuclei sono accettabili. Se per i controlli negativi si procede ad un solo 
campionamento, lo si effettui al momento del primo prelievo. Si 
ricorra anche a controlli negativi non trattati, salvo che dati prece ­
denti dimostrino che il solvente/mezzo disperdente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.
 
Se si usa sangue periferico come controllo negativo parallelo è am ­
missibile anche un campione prelevato prima del trattamento, solo 
però negli studi brevi sul sangue periferico (che vanno per esempio 
da 1 a 3 somministrazioni), qualora i dati ottenuti rientrino nel range previsto in letteratura.
 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Numero e sesso degli animali  
Ogni gruppo trattato e ogni gruppo di controllo deve essere compo ­
sto di almeno 5 animali analizzabili per sesso (11). Se al momento 
della sperimentazione sono disponibili dati relativi a sperimentazioni 
sulla stessa specie e con la medesima via di esposizione, che dimo ­
strano che non vi sono sostanziali differenze di tossicità tra i sessi, sarà sufficiente effettuare i test su un unico sesso. Qualora l'esposi ­
zione umana alle sostanze chimiche sia specifica per un sesso, come 
per esempio nel caso di alcuni prodotti farmaceutici, i test devono essere eseguiti su animali di tale sesso.
 
1.5.2.  Protocollo di trattamento  
Non si può raccomandare un protocollo standard (cioè 1, 2 o più 
somministrazioni a intervalli di 24 ore). I campioni ottenuti dopo somministrazione protratta sono accettabili purché sia comprovato 
un effetto positivo o, per uno studio negativo, ne sia stata dimostrata 
la tossicità o sia stata usata la dose limite, continuando la sommini ­
strazione fino al prelievo dei campioni. La sostanza in esame può essere somministrata anche in dosi frazionate, per esempio a due 
riprese nello stesso giorno, a intervalli non superiori a qualche ora, 
per agevolarne la somministrazione, trattandosi di un prodotto di grande volume.
 
Il test può essere eseguito in due modi:  
(a) la sostanza è somministrata agli animali in un'unica dose. Sono 
prelevati campioni di midollo osseo almeno due volte, ad ade ­
guati intervalli, la prima volta almeno 24 ore dopo il trattamento, l'ultima non dopo 48 ore. Se il prelievo è effettuato meno di 24 
ore dopo la somministrazione se ne fornisca la ragione. I cam ­
pioni di sangue periferico vanno prelevati almeno due volte, ad adeguati intervalli, la prima volta almeno 36 ore dopo la som ­
ministrazione, l'ultima non dopo 72 ore. Quando in una delle fasi 
si abbia una risposta positiva non è necessario procedere ad altri 
prelievi;
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 330
 
(b) se si procede a due o più somministrazioni giornaliere (per 
esempio due o più somministrazioni ad intervalli di 24 ore), i 
campioni vanno prelevati un'unica volta, fra le 18 e le 24 ore dopo l'ultima somministrazione per il midollo osseo e tra le 36 e le 48 ore dopo l'ultima somministrazione per il sangue 
periferico (12).
 
Se del caso, possono essere effettuati ulteriori campionamenti.  
1.5.3.  Dosi  
Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non 
essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello 
stesso laboratorio, sulla stessa specie, ceppo e sesso, con il mede ­
simo protocollo usato nel test principale (13). In caso di tossicità si usino per la prima fase di campionamento tre dosi diverse, che vanno dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica. Per il 
campionamento successivo si usi solo la dose massima. La dose 
massima è definita come dose che produce segni di tossicità tali che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibil ­
mente letali. Sostanze con azione biologica specifica, non tossiche a 
dosi basse (come ormoni e mitogeni) possono costituire un'eccezione 
rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. La dose massima può essere definita anche come dose che produce qualche segno di tossicità nel midollo osseo (per esempio 
una riduzione della percentuale di eritrociti immaturi nel midollo 
osseo o nel sangue periferico).
 
1.5.4.  Test con dose limite  
Se la somministrazione di una quantità di sostanza pari ad almeno 
2 000 mg per kg di peso corporeo in dose unica o in due dosi nello 
stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non vi sono ragioni di sospettare un'azione genotossica sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente correlate, si può considerare che non è ne ­
cessario procedere alla sperimentazione completa con tre dosi diver ­
se. Per studi di maggiore durata la dose limite è pari a 2 000 mg/kg di peso corporeo al giorno, da somministrare per 14 giorni al mas ­
simo; per un trattamento più lungo è pari a 1 000 mg/kg di peso 
corporeo al giorno. Sulla base della esposizione umana prevista per 
la sostanza in esame, può essere necessario usare una dose più elevata nel test con dose limite.
 
1.5.5.  Somministrazione  
La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda ga ­
strica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperi ­
toneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragio ­
ne. Il volume massimo di liquido somministrabile in una volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale 
da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corporeo. 
L'uso di volumi più elevati deve essere motivato. Salvo per sostanze irritanti o corrosive, che di norma riveleranno effetti esacerbati a concentrazioni più elevate, le variazioni di volume devono essere 
minimizzate, regolando la concentrazione in modo da garantire un 
volume costante a tutte le dosi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 331
 
1.5.6.  Preparazione di midollo osseo/sangue  
Le cellule del midollo osseo vengono di solito prelevate dal femore o 
dalla tibia immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato. Le cellule sono prelevate, preparate e sottoposte a un processo di colo ­
razione con metodi di accertata validità. Il sangue periferico è pre ­
levato dalla vena caudale o da altro vaso sanguigno adeguato. Le cellule ematiche vengono immediatamente sottoposte a un processo di colorazione in condizioni sopravitali (8) (9) (10), oppure si pre ­
parano strisci che sono poi colorati. L'uso di un colorante specifico 
per il DNA [per esempio arancio acridina (14) o Hoechst 33258 più pironina-Y (15)] può eliminare alcuni degli artefatti dovuti all'uso di 
un colorante non specifico per il DNA. Ciò non esclude l'uso di 
coloranti convenzionali (per esempio Giemsa). Si possono usare an ­
che altri sistemi [per esempio colonne di cellulosa per la rimozione delle cellule nucleate (16)], se ne è provata l'efficacia per la prepa ­
razione dei micronuclei in laboratorio.
 
1.5.7.  Analisi  
La percentuale degli eritrociti immaturi rispetto al totale 
(immaturi + maturi) viene determinata per ciascun animale contando 
in tutto almeno 200 eritrociti per il midollo osseo e 1 000 per il sangue periferico (17). Tutti i vetrini, compresi i controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima del ­
l'esame al microscopio. Si esaminino almeno 2 000 eritrociti imma ­
turi per animale per determinare la frequenza degli eritrociti immaturi micronucleati. Informazioni ulteriori si possono ottenere dal conteg ­
gio dei micronuclei negli eritrociti maturi. Nell'analisi dei vetrini, la 
proporzione degli eritrociti immaturi sugli eritrociti totali non deve 
essere inferiore al 20 % del valore dei controlli. Quando gli animali sono trattati in continuo per 4 settimane o più, si può anche deter ­
minare la frequenza degli eritrociti con micronuclei su almeno 2 000 
eritrociti maturi per animale. In alternativa alle tecniche manuali, si 
possono accettare sistemi di analisi automatica (analisi dell'immagine e citometria a flusso continuo su cellule in sospensione), se adegua ­
tamente motivati e di provata efficacia.
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati relativi a ciascun animale vanno presentati sotto forma di 
tabella. L'unità sperimentale è l'animale. Il numero degli eritrociti 
immaturi e degli di eritrociti immaturi con micronuclei, nonché la percentuale degli eritrociti immaturi, devono essere elencati separa ­
tamente per ciascun animale. Quando gli animali sono trattati in 
continuo per 4 settimane o più, si forniscano anche i dati relativi 
agli eritrociti maturi, se sono stati rilevati. Si indichi per ciascun animale la percentuale degli eritrociti immaturi sul totale e, se rite ­
nuta utile, la percentuale degli eritrociti micronucleati. Se non c'è 
un'evidente differenza di risposta tra i sessi, i dati dei due sessi 
possono essere combinati nell'analisi statistica.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 332
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per 
esempio un aumento correlato alla dose somministrata del numero di cellule contenenti micronuclei, o un evidente aumento del numero di 
cellule contenenti micronuclei nei campioni prelevati alla medesima 
fase di campionamento e provenienti da un gruppo cui è stata som ­
ministrata la stessa dose. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi stati ­
stici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (18) 
(19), ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico fat ­
tore determinante di una risposta positiva. Eventuali risultati ambigui 
possono essere chiariti mediante test ulteriori, preferibilmente in con ­
dizioni sperimentali modificate.
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti 
non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione 
della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.  
Risultati positivi del saggio significano che la sostanza induce la 
formazione di micronuclei, che sono il risultato di un danno cromo ­
somico o di un danno all'apparato mitotico negli eritroblasti della specie in esame. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni di 
esperimento, la sostanza in esame non produce micronuclei negli 
eritrociti immaturi della specie in esame.
 
Si vagli la possibilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti 
entrino in circolo o raggiungano specifica-mente il tessuto bersaglio 
(tossicità sistemica).  
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione deve comprendere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente,  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se noto.  
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo usato,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso dei singoli animali all'inizio degli esperimenti, con range, 
valore medio e deviazione standard per ciascun gruppo.  
Condizioni di esperimento:  
— controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente),  
— risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effet ­
tuato,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 333
 
— criteri di selezione delle dosi,  
— illustrazione particolareggiata della preparazione della sostanza in 
esame,  
— illustrazione particolareggiata della somministrazione della so ­
stanza in esame,  
— criteri di selezione della via di somministrazione,  
— metodi usati per verificare che la sostanza in esame sia entrata in 
circolo o abbia raggiunto il tessuto ber saglio, se del caso,  
— conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame 
nel cibo o nell'acqua potabile nella dose effettiva (mg/kg di peso 
corporeo/giorno), se del caso,  
— dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,  
— descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e campiona ­
mento,  
— metodi di preparazione dei vetrini,  
— metodi di misura della tossicità,  
— criteri di conteggio degli eritrociti immaturi contenenti micronu ­
clei, 
— numero di cellule analizzate per animale,  
— criteri in base a cui i risultati sono giudicati positivi, negativi o 
ambigui.  
Risultati:  
— segni di tossicità,  
— proporzione degli eritrociti immaturi sugli eritrociti totali,  
— numero di eritrociti immaturi contenenti micronuclei per animale,  
— media ± deviazione standard degli eritrociti immaturi contenenti 
micronuclei per gruppo,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— analisi statistiche e metodi applicati,  
— controlli negativi paralleli e in letteratura,  
— controlli positivi paralleli.  
— Discussione dei risultati.  
— Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENICITÀ — TEST DI REVERSIONE SU BATTERI  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 471 Bacterial Reverse 
Mutation Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
I1 saggio di retromutazione su batteri utilizza ceppi di Salmonella 
typhimurium e Escherichia coli auxotrofi nei confronti di un ammi ­
noacido per identificare mutazioni puntiformi che implicano sostitu ­
zione, addizione o delezione di una o più paia di basi del DNA (1) (2) (3). Il principio su cui è basato questo saggio è la sua capacità di 
rivelare, nei ceppi sperimentali, retromutazioni che ripristinano la 
capacità funzionale dei batteri di sintetizzare un amminoacido essen ­
ziale. I batteri retromutanti sono individuati in base alia capacità di crescere in assenza dell'amminoacido di cui ha invece bisogno il 
ceppo sperimentale progenitore.
 
Le mutazioni puntiformi sono causa di molte malattie genetiche 
umane e vi sono prove concrete che mutazioni puntiformi in onco ­
geni e geni soppresori dei tumori di cellule somatiche sono implicate nella comparsa delle neoplasie umane come in quelle sperimental ­
mente indotte negli animali da laboratorio. Il saggio di retro-muta ­
zione batterica è rapido, poco costoso e relativamente facile da ese ­
guire. Molti ceppi sperimentali presentano caratteristiche che le ren ­
dono più sensibili per l'identificazione di mutazioni, in particolare 
sequenze di DNA sensibili nei siti di reversione, maggior permeabi ­
lità cellulare per le grandi molecole e assenza dei sistemi di ripara ­
zione del DNA, o rafforzamento dei sistemi soggetti a errore. La specificità dei ceppi sperimentali può fornire informazioni utili sul 
tipo di mutazioni indotte da agenti genotossici. Per i testi di retro ­
mutazione batterica esiste una vastissima base dati, che contiene i risultati per una grande varietà di strutture e sono stati sviluppati metodi ormai classici per l'analisi chimica di prodotti con proprietà 
chimico-fisiche diverse, compresi i composti volatili.
 
Vedi anche introduzione generale parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Un test di reversione  in Salmonella typhimurium o Escherichia coli 
rivela in un ceppo auxotrofo, che necessita l'apporto di un amminoa ­
cido (rispettivamente istidina o triptofano), una mutazione che lo trasforma in un ceppo che non necessita l'apporto dell'amminoacido.
 
Mutageni che provocano la sostituzione di coppie di basi  sono 
agenti che provocano un cambiamento di basi nel DNA. In un test di reversione questo cambiamento può verificarsi nel sito della muta ­
zione originale o in un altro sito del genoma batterico.
 
Mutageni che provocano la mutazione della fase di lettura  sono 
agenti che provocano l'inserzione o la delezione di una o più basi nel 
DNA, modificando cosi la fase di lettura nell'RNA.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 337
 
1.3. CONSIDERAZIONI INIZIALI  
Nel saggio di reversione batterica si usano cellule procariote, che 
differiscono dalle cellule dei mammiferi in fattori come l'assorbimen ­
to, il metabolismo, la struttura cromosomica e i meccanismi di ripa ­
razione del DNA. I test in vitro richiedono in genere una fonte 
esogena di attivazione metabolica, i sistemi di attivazione metabolica in vitro non sono in grado di simulare perfettamente le condizioni  in 
vivo nei mammiferi. Il test, pertanto, non fornisce informazioni di ­
rette sul potenziale mutageno e cancerogeno di una sostanza nei 
mammiferi.
 
Il saggio di reversione batterica è comunemente impiegato come 
prima tappa per individuare l'azione genotossica e, in particolare, la capacità di indurre mutazioni puntiformi. Numerosi dati dimo ­
strano che molte sostanze chimiche che risultano positive a questo 
saggio presentano attività mutagena anche in altri test. Vi sono 
esempi di agenti mutageni che non sono rivelati da questo test; le ragioni di questi insuccessi possono essere ricondotte alla natura specifica della mutazione, a differenze di attivazione metabolica o 
a differenze di biodisponibilità. D'altra parte, i fattori che aumentano 
la sensibilità del test possono indurre a sopravvalutare l'azione mu ­
tagena.
 
Il test di retromutazione batterica può non essere adatto per la valu ­
tazione di alcune classi di sostanze chimiche, per esempio i composti fortemente battericidi (come alcuni antibiotici) e quelli di cui si 
suppone (o si sa) che interferiscano specificamente con il sistema 
di moltiplicazione cellulare nei mammiferi (per esempio, alcuni ini ­
bitori delle topoisomerasi e alcuni analoghi di nucleosidi). In tali casi possono essere più adeguati test su mammiferi.
 
Molti composti che risultano positivi al test sono cancerogeni nei 
mammiferi, tuttavia la correlazione non è assoluta: dipende dalla 
classe chimica. Inoltre vi sono cancerogeni che non sono rivelati 
da questo saggio, perché agiscono con meccanismi diversi, non ge ­
notossici, o con meccanismi assenti nelle cellule batteriche.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Le cellule batteriche in sospensione sono esposte alla sostanza in 
esame in presenza e in assenza di un sistema esogeno di attivazione metabolica. Nel metodo di incorporazione su piastra, tali sospensioni 
sono miscelate con un agar di copertura e piastrate immediatamente 
su terreno minimo. Nel metodo di preincubazione, il composto di trattamento è posto in incubazione, mescolato ad un agar di coper ­
tura, poi piastrato su terreno minimo. In entrambe le tecniche, dopo 
due o tre giorni di incubazione si contano le colonie revertanti e se ne confronta il numero con quello delle colonie revertanti spontanee su piastre di controllo esposte al solo solvente.
 
Per i test di reversione batterica sono state descritte varie procedure. 
Quelle più comunemente usate sono: il metodo di incorporazione su piastra (1) (2) (3) (4), il metodo di preincubazione (2) (3) (5) (6) (7) 
(8), il metodo di fluttuazione (9) (10) e il metodo di sospensione 
(11). Sono state descritte modifiche per i test su gas o vapori (12).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 338
 
Le procedure descritte riguardano principalmente i metodi di incor ­
porazione su piastra e di preincubazione. Sono entrambi ammissibili 
per l'esecuzione di esperimenti con e senza attivazione metabolica. Per alcune sostanze è più efficace il metodo di preincubazione. Si tratta di sostanze appartenenti alle classi chimiche che includono le 
nitrosammine alifatiche a catena corta, i metalli bivalenti, a aldeidi, i 
coloranti azoici e i composti diazoici, gli alcaloidi pirollizidinici, i composti allilici e i nitrocomposti (3). È noto anche che alcune classi di mutageni non sono sempre identificabili con procedure standard 
come il metodo di incorporazione su piastra o il metodo di preincu ­
bazione. Devono essere considerate «casi speciali» e si raccomanda vivamente di usare altri metodi di rilevazione. Sono stati identificati i seguenti «casi speciali» (con esempi di possibili metodi di rilevazio ­
ne): coloranti azoici e composti diazoici (3) (5) (6) (13), gas e 
sostanze chimiche volatili (12) (14) (15) (16) e glicosidi (17) (18). Le deviazioni dalla procedura standard devono essere scientifica ­
mente motivate.
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.5.1.  Preparazioni  
1.5.1.1.  Butteri  
Si lascino sviluppare le colture fresche di batteri fino alla fase espo ­
nenziale tardiva o alla fase stazionaria precoce (approssimativamente 
10 9 cellule per ml). Non si usino colture in fase stazionaria tardiva. E 
essenziale che le colture usate nell'esperimento contengano un titolo elevato di batteri vitali. Il titolo può essere provato sulla base di dati di controllo precedenti sulle curve di crescita, oppure, nei singoli 
saggi, determinando il numero di cellule vitali mediante un test di 
piastramento.
 
La temperatura di incubazione raccomandata è di 37  o C. 
Si usino almeno cinque ceppi di batteri, tra cui quattro ceppi di S. 
typhimurium (TA 1535; TA 1537 o TA97a o TA97; TA98; e 
TA100) la cui affidabilità è provata e che forniscono risposte ripro ­
ducibili. I ceppi di S. typhimurium contengono paia di basi GC sul sito di reversione primario ed è noto che non permettono di identi ­
ficare alcuni mutageni ossidanti, agenti che provocano cross-linking 
e idrazine. Tali sostanze possono essere individuate con ceppi di E. coli YVP2 o da S. typhimurium TA102 (19) che hanno una coppia di basi AT sul sito di reversione primaria. La combinazione di ceppi 
raccomandata è pertanto:
 
— S. typhimurium TA1535, e  
— S. typhimurium TA1537 o TA97 o TA97a, e  
— S. typhimurium TA98, e  
— S. typhimurium TA100, e  
— E. coli WP2 uvrA. o E. coli WP2 uvtA (pKM101), o S. typhi ­
murium Ta102.  
Al fine di rilevare mutageni che provocano cross-linking, può essere 
preferibile includere TA102 o aggiungere un ceppo di E. coli con 
sistema di riparazione del DNA privo di errore [per esempio, E. coli 
WP2 o E. Coli WP2 (pKM101)]  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 339
 
Si usino metodi di provata validità per la preparazione delle colture 
primarie, la verifica dei marcatori e la conservazione. La necessità 
dell'amminioacido in supplemento nutritivo per la crescita deve es ­
sere dimostrata per ciascuna delle colture congelate (istidina per ceppi di S. typhimurium, e triptofano per ceppi di E. coli). Si con ­
trollino anche altre caratteristiche fenotipiche, e cioè: la presenza o 
l'assenza di plasmidi R [resistenza all'ampicillina nei ceppi TA98, TA100 e TA97a o TA97, WP2 uvtA e WP2 uvrA (pKM101), e resistenza a ampicillina + tetraciclina nel ceppo TA102], se del caso; 
la presenza di mutazioni caratteristiche (cioè la mutazione rfa in S. 
typhimurium attraverso la sensibilità al cristalvioletto e la mutazione uvtA in E. coli o la mutazione uvtB in S. typhimurium, attraverso la sensibilità all'ultravioletto) (2) (3). I ceppi devono produrre un certo 
numero di colonie retromutanti spontanee per piastra, situato entro il 
range di frequenze rapportato ai valori precedenti ottenuti nel labo ­
ratorio e, possibilmente, ai valori del range riportati in letteratura.
 
1.5.1.2.  Terreno di coltura  
Si usi una minima quantità di agar adeguato (per esempio contenente 
una minima quantità di terreno E di Vogel-Bonner e glucosio) e un agar di copertura contenente istidina e biotina o triptofano, tale da 
permettere un certo numero di divisioni cellulari (1) (2) (9).
 
1.5.1.3.  Attivazione metabolica  
i batteri dovrebbero essere esposti alla sostanza in esame sia in 
presenza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione meta ­
bolica. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mito ­
condriale integrata di cofattore (S9), prelevata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (1) (2), o una 
combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (18) (20) (21). La 
frazione post-mitocondriale viene usata di solito a concentrazioni comprese fra 5 e 30 % v/v nel composto S9. La scelta e le condi ­
zione di un sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe 
chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno 
utilizzare più di una concentrazione della frazione post-mitocondria ­
le. Per coloranti azoici e composti diazoici, può essere più adeguato un sistema di attivazione metabolica riduttivo (6) (13).
 
1.5.1.4.  Sostanza in esame/Preparazione  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite 
prima del trattamento dei batteri. Le sostanze liquide possono essere 
aggiunte diretta-mente alla coltura o diluite prima del trattamento. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità, che dimostrino che la conservazione è accet ­
tabile.
 
Il solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la 
sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza 
dei batteri e con l'attività di S9 (22). L'uso di solventi/mezzi disper ­
denti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di prendere in primo luogo in con ­
siderazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente ac ­
quoso. Se si procede all'esame di sostanze instabili in acqua, si usino 
solventi organici anidri.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 340
 
1.5.2.  Condizioni di esperimento  
1.5.2.1.  Ceppi sottoposti a test (vedi 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Concentrazione di esposizione  
l criteri da considerare per determinare la quantità massima di so ­
stanza da usare sono la citotossicità e la solubilità nel composto di 
trattamento finale.  
Può essere utile determinare la tossicità e l'insolubilità in un esperi ­
mento preliminare. La citotossicità può essere rivelata da una ridu ­
zione del numero di colonie revertanti, dalla comparsa di una crescita 
anormale del fondo, o dal grado di sopravvivenza delle colture trat ­
tate. La citotossicità di una sostanza può risultare alterata in presenza di sistemi di attivazione metabolica. L'insolubilità è dimostrata dalla presenza di un precipitato nel composto finale, visibile ad occhio 
nudo nelle condizioni di esperimento effettive.
 
La concentrazione massima raccomandata per sostanze non citotos ­
siche solubili è di 5 mg/piastra o 5 μl/piastra. Per sostanze non 
citotossiche insolubili a 5 mg/piastra o 5 pi/piastra, una o più con ­
centrazioni devono essere insolubili nelle ultime miscele di tratta ­
mento. Le sostanze citotossiche a concentrazione inferiori a 5 mg/ ­
piastra o 5 μl/piastra devono essere saggiate fino ad una concentra ­
zione citotossica. Il precipitato non deve interferire con la valuta ­
zione dei risultati.  
Si usino almeno cinque diverse concentrazioni analizzabili della so ­
stanza in esame, ad intervalli approssimativamente semilogaritmici 
(cioè 10) per i primi esperimenti. Per l'analisi della relazione concen ­
trazione-rispo-sta, può essere necessario ridurre gli intervalli. Nella valutazione di sostanze che contengono quantità sostanziali di impu ­
rezza potenzialmente mutagene si possono prendere in considera ­
zione concentrazioni superiori a 5 mg/piastra o 5 (il/piastra.
 
1.5.2.3.  Controlli negativi e positivi  
Ogni test dovrà comportare controlli positivi e negativi (solvente o 
mezzo disperdente) paralleli, con e senza attivazione metabolica. Per i controlli positivi, si scelgano concentrazioni che dimostrino la va ­
lidità di ogni test.
 
Quando si usa un sistema di attivazione metabolica, le sostanze per i 
controlli positivi di riferimento devono essere scelte in funzione del 
tipo di ceppo batterico.  
Le seguenti sostanze sono esempi di controlli positivi adatti per saggi 
con attivazione metabolica:  
Denominazione Numero CAS Numero Einecs  
9,10-dimetilanthracene 781-43-1 212-308-4 
7,1 2-dimetilbenz[a]antracene 57-97-6 200-359-5 
3enzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 
2-amminoantracene 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 341
 
Denominazione Numero CAS Numero Einecs  
ciclofosfammide 50-18-0 
ciclofosfammide monoidrato 6055-19-2 200-015-4  
Le seguente sostanza è un controllo positivo adatto per il metodo di 
attivazione metabolica riduttiva:  
Denominazione Numero CAS Numero Einecs  
Congo Red 573-58-0 209-358-4  
Il 2-amminoantracene non dovrebbe essere usato come unico indi ­
catore dell'efficacia del composto S9. Se si usa il 2-amminoantrace ­
ne, si caratterizzi ogni lotto di S9 anche con un mutageno che richiede attivazione metabolica da parte di enzimi microsomiali, 
per esempio benzo[a]pirene. dimetilbenzantracene.
 
Le seguenti sostanze sono esempi di controlli positivi a specificità di 
ceppo per esperimenti eseguiti senza sistema di attivazione metabo ­
lica esogeno:  
Denominazione Numero CAS Numero Einecs Ceppo  
sodio azide 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100 
2-nitrofluorene 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-amminoacridina 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97a 
1CR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97a 
idroperossido di 
cumene 80-15-9 201-254-7 TA 102 
mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA e TA 102 
N-ethil-N-nitro- 
N-nitrosoguani ­
dina 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA e- 
WP2uvrA(pKM101) 
4-nitrochinolina-l- 
ossido 56-57-5 200-281-1 WP2. WP2uvrA e- 
WP2uvrA(pKM101) 
furilfurammide 
(AF2) 3688-53-7 ceppi contenenti plasmidi  
Si possono usare altre adeguate sostanze di riferimento per i controlli 
positivi. Si usino, se disponibili, sostanze di una classe chimica correlata.
 
Si effettuino anche controlli negativi, usando solo il solvente o il 
mezzo disperdente sul terreno di coltura: i controlli vanno trattati come le colture che contengono la sostanza oggetto del test. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che esistano precedenti 
dati di controllo che dimostrano che il solvente scelto non induce 
effetti nocivi o mutageni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 342
 
1.5.3.  Procedura  
Per il metodo di incorporazione su piastra (1) (2) (3) (4), senza 
attivazione metabolica, di norma si mescolano 0,05 ml o 0,1 ml della soluzione, 0,1 ml di coltura batterica fresca (contenente approssima ­
tivamente 10
 8 cellule vitali) e 0,5 ml di tampone sterile con 2,0 ml di 
agar di copertura. Per i test con attivazione metabolica, si mescolano di norma 0,5 ml del composto di attivazione metabolica contenente una quantità adeguata di frazione post-mitocondriale (dal 5 al 30 % 
v/v) von l'agar di copertura (2,0 ml), i batteri e la sostanza in esame 
o la soluzione. Il contenuto di ciascuna provetta viene mescolato e piastrato su terreno minimo (agar). Prima dell'incubazione si lascia 
solidificare l'agar di copertura.
 
Per il metodo di preincubazione (2) (3) (5) (6), la sostanza in esame/ ­
soluzione è preincubata con il ceppo batterico (contenente approssi ­
mativamente 10  8 cellule vitali) e con un tampone sterile o con il 
sistema di attivazione metabolica (0,5 ml), di norma per 20 minuti o più, a 30-37
 o C: è quindi mescolata all'agar di copertura e piastrata 
su terreno minimo (agar). Di norma si mescolano 0,05 o 0,1 ml di 
sostanza in esame/soluzione, 0,1 ml di batteri e 0,5 ml di composto 
S9 o di tampone sterile con 2,0 ml di agar di copertura. Durante la preincubazione le provette vanno aerate con un agitatore.
 
Per una valida stima della variazione, si usino piastre in triplo a 
ciascuna dose. L'uso di piastre in doppio è accettabile se scientifica ­
mente motivato. La perdita occasionale di una piastra non invalida necessariamente il test.
 
I test con sostanze gassose o volatili devono essere con ­
dotti con metodi adeguati, per esempio in recipienti erme ­
tici (12) (14)  (15)  (16).  
1.5.4.  Incubazione  
Tutte le piastre di un esperimento devono essere poste in incuba ­
zione a 37  o C per 48-72 ore; si rilevi quindi il numero di colonie 
revertanti per piastra.  
2. RISULTATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati devono essere presentati come numero di colonie revertanti per 
piastra. Si fornisca anche il numero di colonie revertanti sulle piastre dei controlli negativi (controllo trattato con solo solvente e controllo non trattato, se effettuato) e positivi. Per la sostanza in esame e per i 
controlli, positivi e negativi (non trattati o con solo solvente), si 
indichino le cifre per le singole piastre, il numero medio di colonie revertanti per piastra e la deviazione standard.
 
In caso di risposta inequivocabilmente positiva non sono necessarie 
verifiche. I risultati ambigui devono essere chiariti mediante prove ulteriori, preferibilmente in condizioni di esperimento modificate. I riusultati negativi devono essere confermati caso per caso. Se non si 
ritiene necessaria la conferma dei risultati negativi, se ne indichino le 
ragioni. Nei test successivi si dovrebbero modificare i parametri di studio per estendere la gamma delle condizioni in esame. Fra i parametri modificabili si citano l'intervallo tra le concentrazioni, il 
metodo di trattamento (incorporazione su piastra o preincubazione in 
ambiente liquido) e le condizioni di attivazione metabolica.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 343
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per 
esempio un aumento, correlato con la concentrazione, per tutte le concentrazioni sottoposte a esame e/o un aumento riproducibile, ad 
una o più concentrazioni, del numero di colonie revertanti per piastra 
per almeno un ceppo, con o senza sistema di attivazione metabolica (23). Si consideri in primo luogo la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio 
nella valutazione dei risultati sperimentali (24), ma la significatività 
statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva.
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
palesemente positivi o negativi, ma in alcuni casi i dati ottenuti 
non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione 
della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui, nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.  
Risultati positivi del saggio di retromutazione batterica dimostrano 
che la sostanza induce mutazioni puntiformi per sostituzioni di basi o mutazione della fase di lettura nel genoma di Salmonella typhimu ­
rium o Escherichia coli. Risultati negativi indicano che, nelle condi ­
zioni di test, la sostanza in esame non induce mutazioni nella specie sottoposta al test.
 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione dovrà contenere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del solvente/mezzo disperdente;  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se nota.  
Ceppi:  
— ceppi usati:  
— numero per cellule per coltura:  
— caratteristiche dei ceppi.  
Condizioni di esperimento:  
— quantità della sostanza in esame per piastra (mg/piastra o ( μl/­
piastra/e criteri di selezione della concentrazione e del numero di piastre per concentrazione;
 
— terreni usati;  
— tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, criteri 
di accettabilità;  
— procedura di trattamento.  
Risultati:  
— segni di tossicità,  
— segni di precipitazione,  
— conteggi per le singole piastre,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 344
 
— numero medio di colonie revertanti per piastra e deviazione stan ­
dard,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— eventuali analisi statistiche,  
— dati sui controlli paralleli negativi (solvente/mezzo disperdente) e 
positivi, con intervalli, medie e devia zioni standard,  
— dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi 
precedenti, con intervalli, medie e devia zioni standard.  
Discussione dei risultati  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
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(14) Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mor ­
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(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and 
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(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
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typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
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Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
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Guidelines for Mutagenicity  Testing. Part ( II. Statistica!  liva­
luation of Mutagenicity Test Data,  ed. Kirkland, D. J., Cam ­
bridge University Press, pp. 28-65.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 347
 
B.15  SAGGIO DI MUTAGENESI E PRESCREENING DI CANCERO ­
GENESI MUTAZIONE GENICA: SACCHAROMYCES CEREVI ­
SIAE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Per misurare l'induzione di mutazioni geniche indotte da agenti chi ­
mici, con e senza attivazione metabolica, può essere fatto uso di una varietà di ceppi aploidi e diploidi del lievito Saccharomyces cerevi ­
siae.
 
Sono stati utilizzati sistemi di mutazione in avanti in ceppi aploidi, 
come la misura della mutazione da mutanti rossi, richiedenti adenina 
(ade-I, ade-2), a doppi mutanti bianchi richiedenti adenina; e sistemi 
selettivi come l'induzione della resistenza alla canavanina.  
Il sistema di retromutazione più largamente convalidato comporta 
l'uso del ceppo aploide XV 185-14C che porta le mutazioni di 
tipo «senza senso» (ochre) ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 e trp 5-48, le quali possono essere revertite da mutageni che inducono sostitu ­
zioni di base nel sito specifico o mutazioni che sopprimono «ochre». 
Il ceppo XV 185-14C porta altresi il marcatore his 1-7, mutazione di 
tipo «senso sbagliato» revertita principalmente da mutazioni nel secondo sito, e il marcatore hom 3-10 che viene revertito da mutageni che inducono mutazioni del tipo «inserzione-delezione».
 
Fra i ceppi diploidi del S. cerevisiae il solo largamente convalidato è 
il ceppo D  7 , omozigote per ilv 1-92.  
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparati  
È opportuno preparare le soluzioni delle sostanze in esame e dei 
composti di controllo o di riferimento, servendosi di un veicolo 
appropriato, al momento dell'effettuazione del test. Con i composti 
organici non solubili in acqua si devono usare soluzioni di solventi organici quali l'etanolo, l'acetone e il dimetilsolfossido (DMSO) a non più del 2 % in volume (v/v). La concentrazione finale del 
solvente non dovrebbe influenzare in modo significativo la vitalità 
cellulare e le caratteristiche di crescita.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 348
 
A t t i v a z i o n e m e t a b o l i c a  
Le cellule vanno esposte alle sostanze in esame sia in presenza che 
in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica eso ­
gena.  
Il sistema più comunemente usato è una frazione postmitocondriale 
integrata con cofattori, ottenuta dai fegati di roditori pretrattati con agenti che inducono enzimi. Per l'attivazione metabolica può essere appropriato anche l'uso di altre specie, di altri tessuti, di altre frazioni 
postmitocondriali o di altri procedimenti.
 
Condizioni di effettuazione del saggio  
C e p p i  
I ceppi più largamente usati negli studi sulle mutazioni geniche sono 
il ceppo aploide XV 185-14C e il ceppo diploide D  7 . Possono essere 
appropriati anche altri ceppi.  
T e r r e n i d i c o l t u r a  
Per la determinazione della sopravvivenza delle cellule e del numero 
dei mutanti è fatto uso di terreni di coltura appropriati.  
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
È opportuno procedere in parallelo a controlli positivi, non trattati e 
con il solo solvente. Per ciascun evento genetico specifico vanno 
usate appropriate sostanze di controllo positivo.  
C o n c e n t r a z i o n i  
Occorre far uso di almeno 5 concentrazioni adeguatamente interval ­
late della sostanza in esame. Per le sostanze tossiche la concentra ­
zione più elevata usata nel test non deve ridurre la sopravvivenza a meno del 5-10 %. Le sostanze relativamente insolubili in acqua 
vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti 
appropriati. Per le sostanze non tossiche completamente solubili in acqua la concentrazione massima va determinata caso per caso.
 
C o n d i z i o n i d i i n c u b a z i o n e  
Le piastre vengono incubate per 4-7 giorni a temperatura da 28  o a 30  o C 
nell'oscurità.  
F r e q u e n z e d e l l e m u t a z i o n i s p o n t a n e e  
È opportuno usare subcolture con frequenze delle mutazioni sponta ­
nee entro i limiti accettati come normali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 349
 
N u m e r o d e l l e r e p l i c h e  
Per la determinazione dei prototrofi che si inducono per mutazione 
genica e della sopravvivenza cellulare è opportuno fare uso di al ­
meno tre piastre di replica per concentrazione. Nel caso di esperi ­
menti nei quali si usino marcatori a bassa frequenza di mutazione, 
quali hom 3-10, per poter ottenere dati aventi rilevanza statistica è 
necessario aumentare il numero delle piastre.  
Procedimento  
Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene normalmente 
effettuato secondo un procedimento di test in sospensione liquida 
con impiego di cellule quiescenti o in crescita. Gli esperimenti ini ­
ziali dovrebbero essere condotti su cellule in crescita. Si espongono alla sostanza in esame per una durata fino a 18 ore a temperatura da 
28
 o a 37  o C e in agitazione 1-5 X 1O  7 cellule/mi; in casi opportuni, 
nel corso del trattamento si aggiunge una quantità adeguata di un sistema di attivazione metabolica. Al termine del trattamento si pro ­
cede alla centrifugazione ed al lavaggio delle cellule ed alla loro 
semina su un terreno di coltura appropriato. Dopo incubazione si 
analizzano le piastre per la determinazione della sopravvivenza e dell'induzione della mutazione genica. Se il primo esperimento è negativo il secondo esperimento dovrebbe essere condotto su cellule 
quiescenti; se il primo esperimento è positivo, viene confermato in 
un appropriato esperimento indipendente.
 
2. DATI  
1 dati devono essere presentati in forma di tabelle, con indicazione 
del numero delle colonie contate, del numero di mutanti, della so ­
pravvivenza e della frequenza dei mutanti. Tutti i risultati devono 
essere confermati in un esperimento indipendente. I dati devono 
essere stabiliti secondo metodi statistici appropriati.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— ceppo usato,  
— condizioni di effettuazione del test: cellule in fase stazionaria o in 
crescita, composizione dei terreni, temperatura e durata dell'incu ­
bazione, sistemi di attivazione metabolica,  
— condizioni del trattamento: livelli di esposizione, procedimento e 
durata del trattamento, temperatura di trattamento, controlli posi ­
tivi e negativi,  
— numero delle colonie contate, numero di mutanti, sopravvivenza 
e frequenza dei mutanti, relazione dose/risposta se disponibile, valutazione statistica dei dati,
 
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 350
 
B.16  RICOMBINAZIONE MITOTICA: SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
La ricombinazione mitotica in Saccharomyces cerevisiae può essere 
rilevata fra geni (o in linea più generale fra un gene e il suo cen ­
tromero) e all'interno dei geni. La prima delle due eventualità è denominata crossing-over mitotico e genera prodotti reciproci, men ­
tre la seconda eventualità è per lo più non reciproca ed è denominata 
conversione genica. Il crossing-over viene generalmente determinato mediante la produzione di colonie o settori recessivi omozigoti in un 
ceppo eterozigote, mentre la conversione genica viene determinata 
attraverso la produzione di revertanti prototrofici in un ceppo auxo ­
trofico eteroallelomorfo portante due diversi alleli del medesimo gene. I ceppi più comunemente usati per la rilevazione della conver ­
sione genica mitotica sono i ceppi D
 4 (eteroallelomorfo irí ade 2 e 
trp5),D  7 (eteroallelomorfo in trp 5),BZ  34 (eteroallelomorfo in arg 4)e 
JDl (eteroallelomorfo in his 4 e trp 5). Il crossing-over mitotico producente settori omozigoti di colore rosso e rosa può essere deter ­
minato nel ceppo D
 5 o in D  7 (che misura anche la conversione 
genica mitotica e la retromutazione in ilv 1-92), essendo entrambi i ceppi eteroallelomorfi per alleli complementanti di ade 2.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
È opportuno preparare le soluzioni della sostanza in esame e dei 
composti di controllo o di riferimento, facendo uso di un solvente appropriato, al momento di procedere all'effettuazione del test. Con i composti organici non solubili in acqua è opportuno usare solventi 
organici come l'etanolo, l'acetone e il dimetilsolfossido (DMSO) a 
non più del 2 % (v/v). La concentrazione finale del solvente non dovrebbe alterare significativamente la vitalità cellulare e le caratteri ­
stiche di crescita.
 
A t t i v a z i o n e m e t a b o l i c a  
Le cellule devono essere esposte alle sostanze in esame sia in pre ­
senza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione meta ­
bolica esogena. Il sistema più comunemente usato è una frazione 
postmitocondriale supplementare con cofattori e ottenuta dai fegati di roditori pretrattati con agenti che inducono enzimi. Per l'attiva ­
zione metabolica può essere appropriato anche l'impiego di altre 
specie, di altri tessuti, di altre frazioni postmitocondriali o di altri 
procedimenti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 351
 
Condizioni sperimentali  
C e p p i  
I ceppi più frequentemente usati sono i ceppi diploidi D  4 , D 5 , D 7 , e 
JD1. Può essere appropriato anche l'impiego di altri ceppi.  
T e r r e n i d i c o l t u r a  
Per la determinazione della sopravvivenza e della frequenza della 
ricombinazione mitotica si devono usare terreni di coltura appropriati.  
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
È opportuno effettuare in parallelo controlli positivi, controlli non 
trattati o trattati con solo solvente. Per ciascun tipo specifico di ricombinazione devono essere usate le appropriate sostanze di con ­
trollo positivo.
 
C o n c e n t r a z i o n i  
È opportuno fare uso di almeno cinque concentrazioni della sostanza 
in esame adeguatamente intervallate. Tra i fattori da prendere in 
considerazione vi sono la citotossicità e la solubilità. La concentra ­
zione più bassa non deve produrre alcun effetto sulla vitalità cellu ­
lare. Per le sostanze tossiche, la più alta concentrazione saggiata non 
deve ridurre la sopravvivenza a meno del 5-10 %. Le sostanze 
relativamente insolubili in acqua devono essere saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti appropriati. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione 
massima del test va determinata caso per caso.
 
Le cellule possono essere esposte alle sostanze in esame in fase 
stazionaria o in fase di crescita per periodi fino a 18 ore. Nel caso di tempi di trattamento prolungati occorre tuttavia accertare mediante esame microscopico che nelle culture non vi sia formazione di spore, 
la cui presenza invaliderebbe il test.
 
C o n d i z i ó n i d i i n c u b a z i o n e  
Le piastre vengono incubate nell'oscurità per 4-7 giorni a tempera ­
tura da 28  o a 30  o C. Le piastre usate per l'analisi dei settori omo ­
zigoti di colore rosso e roseo derivanti dal crossing-over mitotico vanno tuttavia tenute in frigorifero (4
 o C) per un altro ciclo di uno o 
due giorni prima dell'analisi, per dare tempo allo sviluppo del pig ­
mento nelle colonie ricombinanti.  
F r e q u e n z e d e l l a r i c o m b i n a z i o n e m i t o t i c a s p o n ­
t a n e a  
È opportuno usare subcolture con frequenze di ricombinazione mi ­
totica spontanea entro i limiti accettati come normali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 352
 
N u m e r o d e l l e r e p l i c h e  
Per la determinazione dei prototrofi prodotti dalla conversione genica 
mitotica e per quella della sopravvivenza è opportuno fare uso di un minimo di tre piastre di replica per concentrazione. Nella determina ­
zione della omozigosi recessiva derivante dal crossing-over mitotico 
il numero delle piastre va aumentato in modo da ottenere un numero 
adeguato di colonie.
 
Procedimento  
Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene normalmente effettuato 
in un procedimento di test in sospensione liquida con cellule in fase stazionaria o in fase di crescita. Esperimenti iniziali dovrebbero es ­
sere condotti su cellule in fase di crescita. Si espongono alla sostanza 
in esame per una durata fino a 18 ore a temperatura da 28
 o a 37  o C 
con scuotimento 1-5 × 10  7 cellule/mi; nel corso del trattamento, nei 
casi opportuni si aggiunge una quantità adeguata di un sistema di 
attivazione metabolica. Al termine del trattamento si procede alla 
centrifugazione ed al lavaggio delle cellule ed alla loro semina su un terreno di coltura appropriato. Dopo l'incubazione si analizzano le piastre per la determinazione della sopravvivenza e dell'induzione 
della ricombinazione mitotica.
 
Se il primo esperimento è negativo il secondo dovrebbe essere ese ­
guito su cellule quiescenti; se il primo esperimento è positivo, il secondo viene confermato in un esperimento indipendente appro ­
priato.
 
2. DATI  
I dati devono essere presentati in forma di tabelle, con indicazione 
del numero dei ricombinanti, della sopravvivenza e della frequenza 
dei ricombinanti.  
Tutti i risultati devono essere confermati in un esperimento indipen ­
dente.  
I dati vanno stabiliti per valutazione secondo metodi statistici appro ­
priati.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile;  
— ceppo usato,  
— condizioni di effettuazione del test: cellule in fase stazionaria o di 
crescita, composizione dei terreni, temperatura e durata dell'incu ­
bazione, sistemi di attivazione metabolica,  
— condizioni del trattamento: concentrazione di esposizione, proce ­
dimento e durata del trattamento, tempera tura di trattamento, controlli positivi e negativi,
 
— numero di colonie contate, numero dei ricombinanti, frequenza 
della sopravvivenza e della ricombinazione, relazione dose/ ­
risposta se possibile, valutazione statistica dei dati,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 353
 
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENICITÀ — TEST IN VITRO DI MUTAZIONE 
GENICA SU CELLULE DI MAMMIFERO  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 476, In Vitro Mammalian 
Cell Gene Mutation Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il test in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero permette 
di identificare mutazioni geniche indotte da sostanze chimiche. Fra le linee cellulari adeguate si citano le cellule di linfoma di topo 
L5178Y, le linee CHO, CHO-AS52 e V79 di cellule di criceto 
cinese, le cellule linfoblastoidi umane TK6 (1). In queste linee cel ­
lulari di norma si misurano le mutazioni sui loci della timidina chinasi (TK) e dell'ipoxantina-guanina fosfori-bosil trasferasi (HPRT) 
e su un transgene della xantina-guanina fosforibosil trasferasi 
(XPRT). 1 saggi di mutazione TK, HPRT e XPRT rivelano varie categorie di fenomeni genetici. La posizione autosomica di TK e XPRT può permettere di individuare effetti genetici (per esempio 
grandi delezioni) non individuati sul locus HPRT dei cromosomi 
X (2) (3) (4) (5) (6).
 
Nel test in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero si 
possono usare colture di linee cellulari stabilizzate o ceppi cellulari. Le cellule sono scelte in base alla capacità di crescita in coltura e alla 
stabilità della frequenza di mutazioni spontanee.
 
I saggi in vitro richiedono in generale l'uso di una fonte esogena di 
attivazione metabolica. Tale sistema di attivazione metabolica non può simulare perfettamente le condizioni  in vivo  nel mammifero. Si 
evitino condi zioni che porterebbero a risultati che non riflettono una 
mutagenicità intrinseca. Risultati positivi che non riflettono una mu ­
tagenicità intrinseca possono avere origine da cambiamenti di pH e di osmolalità o da ele vati livelli di citotossicità (7).
 
II saggio è usato per individuare potenziali mutageni e cancerogeni 
per i mammiferi. Molti composti positivi a questo test sono cance ­
rogeni per i mammiferi, tuttavia la correlazione non è assoluta, ma 
dipende dalla classe chimica: vi sono sempre più elementi che indu ­
cono a ritenere che esistono cancerogeni che non sono rivelati da questi test perché sembrano agire attraverso altri meccanismi, non 
genotossici.
 
Cfr. anche Introduzione generale parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Mutazione «in avanti»:  una mutazione genica in cui dal tipo pa ­
rentale alla forma mutante si ha alterazione o perdita dell'attività enzimatica o della funzione della proteina codificata.
 
Mutageni che provocano la sostituzione di coppie di basi:  so­
stanze che provocano la sostituzione di una o più coppie di basi 
del DNA.  
Mutageni che provocano la mutazione della fase di lettura:  So­
stanze che provocano l'inserzione o la delezione di una o più coppie 
di basi nella molecola di DNA.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 355
 
Tempo di espressione fenotipica:  il periodo durante il quale i pro ­
dotti genici inalterati scompaiono dalle cellule recentemente mutate.  
Frequenza dei mutanti:  numero di cellule mutanti diviso per il 
numero di cellule vitali.  
Crescita totale relativa:  aumento del numero di cellule nel tempo, 
in confronto con una popolazione di cellule di controllo: si calcola moltiplicando la crescita in sospensione rispetto al controllo negativo 
per l'efficienza di clonazione del controllo negativo.
 
Crescita relativa in sospensione:  aumento del numero di cellule nel 
corso del periodo di espressione rispetto al controllo negativo.  
Vitalità:  l'efficienza di clonazione delle cellule trattate al momento 
del piastramento in condizioni selettive dopo il periodo di espressio ­
ne. 
Sopravvivenza:  l'efficienza di clonazione delle cellule trattate al 
momento del piastramento, al termine del trattamento; il tasso di sopravvivenza viene espresso di solito in relazione alla sopravvi ­
venza della popolazione di cellule di controllo.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Le cellule carenti di timidina chinasi (TK) a causa della mutazione 
TK +/- —> TK  -/- sono resistenti agli effetti citotossici dell'analogo 
pirimidinico trifluorotimidina (TFT). Le cellule capaci di produrre la timidina chinasi sono sensibili alla TFT, che provoca l'inibizione 
del metabolismo cellulare e arresta la divisione cellulare. Di conse ­
guenza, le cellule mutanti sono in grado di proliferare in presenza di TFT, mentre le cellule normali, che contengono timidina chinasi, non lo sono. Analogamente le cellule carenti di HPRT o XPRT sono 
selezionate in base alla resistenza alla 6-tioguanina (TG) o alla 8- 
azaguanina (AG). Le proprietà della sostanza in esame devono essere studiate accuratamente quando in uno dei test di mutazione genica su cellule di mammifero si sperimenta un analogo di una base o un 
composto correlato all'agente selettivo. Per esempio, è necessario 
controllare la sospetta tossicità selettiva della sostanza in esame nei confronti di cellule mutanti e non mutanti. Quando sono sottoposte a test sostanze chimiche strutturalmente correlate all'agente selettivo 
(8). deve quindi essere confermata l'efficacia del sistema o del ­
l'agente selettivo.
 
Le cellule in sospensione o in coltura monostrato sono esposte alla 
sostanza in esame, con e senza attivazione metabolica, per un tempo adeguato, poi reinoculate per determinare la citotossicità e permettere 
l'espressione fenotipica prima della selezione dei mutanti (9) (10) 
(11) (12) (13). La citotossicità è determinata di norma misurando l'efficacia relativa di clonazione (sopravvivenza) o la crescita totale relativa delle colture dopo il trattamento. Le colture trattate sono 
mantenute nel terreno di coltura per un periodo sufficiente, specifico 
per ciascun locus e tipo cellulare, per permettere l'espressione feno ­
tipica ottimale delle mutazioni indotte. La frequenza di mutanti è determinata mediante inseminazione di un numero noto di cellule 
in terreno contenente l'agente selettivo, per rilevare le cellule mutan ­
ti, e in terreno non contenente l'agente selettivo, per determinare l'efficacia di clonazione (vitalità). Dopo un adeguato periodo di in ­
cubazione le colonie sono contate. La frequenza dei mutanti è co ­
stituita dal rapporto tra il numero di colonie mutanti nel terreno 
selettivo e in quello non selettivo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 356
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Cellule  
I tipi di cellule adatti sono molti, per esempio i subcloni delle cellule 
L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 o TK6. Le cellule usate per questo 
test devono essere notoriamente sensibili ai mutageni chimici e pre ­
sentare elevata efficienza di clonazione e frequenza stabile delle mutazioni spontanee. Si controlli che non siano contaminate da mi ­
coplasma: non si usino i ceppi contaminati.
 
Il test deve essere impostato in modo da avere sensibilità ed efficacia 
predeterminate. Il numero di cellule, di colture e di concentrazioni 
della sostanza in esame deve riflettere tali parametri predefiniti (14). Ad ogni sta dio del test il numero minimo di cellule vitali che sopravvivono al trattamento deve essere basato sulla fre quenza delle 
mutazioni spontanee. Come regola generale si può usare un numero 
di cellule pari almeno al decuplo dell'inverso della frequenza di mutazioni spontanee. Si raccomanda comunque di utilizzare almeno 10
 6 cellule. Dovrebbero essere disponibili risultati di precedenti espe ­
rienze sul sistema cellulare, che indichino che le prestazioni del test 
sono costanti.  
1.4.1.2.  Terreni e condizioni di coltura  
Si usino adeguati terreni di coltura e condizioni di incubazione (re ­
cipienti di coltura, temperatura, concentrazione di CO  2 , e umidità). I 
terreni devono essere scelti in funzione dei sistemi selettivi e del tipo di cellule. E particolarmente importante che le condizioni di coltura 
siano scelte in modo da garantire la crescita ottimale delle cellule 
durante il periodo di espressione e la capacità di formare colonie da parte delle cellule mutanti e non mutanti.
 
1.4.1.3.  Preparazione delle colture  
Le cellule provenienti da colture primarie sono inoculate in un ter ­
reno di coltura e incubate a 37  o C. Prima di iniziare il test può 
rivelarsi necessario asportare dalle colture eventuali cellule mutanti preesistenti.
 
1.4.1.4.  Attivazione metabolica  
Le cellule dovrebbero essere esposte alla sostanza in esame sia in pre ­
senza che in assenza di un adeguato sistema di attivazione metabolica. Il 
sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale inte ­
grata di cofattore (S9), ricavata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18), o una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (19) (20).
 
La frazione post-mitocondriale è di solito usata a concentrazioni finali 
dell'1-10 % v/v nel terreno di coltura. La scelta e le condizioni di un sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica 
della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utilizzare 
più di una concentrazione della frazione post-mito-condriale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 357
 
Vari nuovi procedimenti, tra cui la creazione mediante ingegneria 
genetica di linee cellulari che esprimono enzimi attivatori specifici, 
possono fornire le risorse potenziali per l'attivazione endogena. La scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (per esempio dall'importanza dell'isoenzima del citocromo P450 per il 
metabolismo della sostanza in esame).
 
1.4.1.5.  Sostanza in esame/Preparazione  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite 
prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono es ­
sere aggiunte diretta-mente alla coltura o diluite prima del trattamen ­
to. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano 
disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conserva ­
zione è accettabile.  
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
11 solvente/mezzo disperdente non deve reagire chimicamente con la 
sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza delle cellule e con l'azione di S9. L'uso di solventi/mezzi disperdenti 
poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la 
compatibilita. Si raccomanda di prendere in primo luogo in conside ­
razione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Nell'esame di sostanze instabili in acqua, si usi un solvente organico 
anidro. L'acqua può essere rimossa mediante un setaccio molecolare.
 
1.4.2.2.  Concentrazioni di esposizione  
Fra i criteri da considerare nel determinare la concentrazione mas ­
sima si citano la citotossicità, la solubilità nel sistema di prova e le 
variazioni di pH o di osmolalità.  
La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione me ­
tabolica nel test principale, sulla base di un indicatore adeguato 
dell'integrità e della moltiplicazione cellulare, come l'efficacia rela ­
tiva di clonazione (tasso di sopravvivenza) o la crescita totale rela ­
tiva. Può essere utile determinare la citotossicità e la solubilità in un 
esperimento preliminare.  
Si usino almeno quattro concentrazioni analizzabili. In caso di so ­
stanza citotossica, le concentrazioni devono andare dalla tossicità 
massima ad una tossicità assente o modica; in altri termini, di norma le concentrazioni devono essere separate al massimo da un fattore compreso tra 2 e 10. Se la concentrazione massima è basata sulla 
citotossicità, il tasso di sopravvivenza relativa (efficacia relativa di 
clonazione) o la crescita totale relativa dovrebbero essere pari al 10- 20 % circa (e in ogni caso non inferiori al 10 %). Per sostanze a basso grado di citotossicità, la concentrazione massima di prova 
dovrebbe essere pari a 5 μl/ml, 5 mg/ml o 0,01 M (si scelga il valore 
più basso).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 358
 
Le sostanze difficilmente solubili devono essere sottoposte a test 
nelle condizioni di coltura fino al limite di solubilità e oltre. L'even ­
tuale insolubilità va provata nel terreno finale in cui sono trattate le cellule. Può essere utile valutare la solubilità all'inizio e alla fine del trattamento, in quanto essa può modificarsi nel corso del- l'esperi ­
mento a causa della presenza di cellule, S9, siero, ecc. L'insolubilità 
è rilevabile ad occhio nudo. Il precipitato non deve interferire con la valutazione.
 
1.4.2.3.  Controlli  
Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente o 
mezzo disperdente) trattati in parallelo, con e senza attivazione me ­
tabolica. Quando si usa l'attivazione metabolica, la sostanza usata per i controlli positivi deve esigere attivazione per dare una risposta 
mutagenica.
 
Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano:  
Condizione di attiva ­
zione metabolica Locus Sostanza Numero CAS Numero EINECS  
Assenza di attiva ­
zione metabolica 
esogena HPRT Metansolfonato di etile 62-50-0 200-536-7 
Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (colonie 
piccole e 
grandi) Metansolfonato di metile 66-27-3 200-625-0 
XPRT Metansolfonato d'etile 62-50-0 200-536-7 
Etilnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Presenza di attiva ­
zione metabolica esogena HPRT 3-Metilcolantrene 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimentilammina 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantracene 57-97-6 200-359-5 
TK (colonie 
piccole e 
grandi) Ciclofosfammide 50-18-0 200-015-4 
Ciclofosfammide monoidrato 6055-19-2 Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5 3-Metilcolantrene 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodimetilammina (per li ­
velli elevati di S-9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pirene 50-32-8 200-028-5
 
Si possono usare altre sostanze adeguate per i controlli positivi, per 
esempio, la 5-bromo 2'-deossiuridina (CAS n. 59-14-3, EINECS n. 200-415-9) se il laboratorio dispone di una base dati su tale sostanza, desunti da precedenti esperimenti. Per i controlli positivi 
si usino, se possibile, sostanze chimiche di una classe chimica cor ­
relata alla sostanza saggiata.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 359
 
Si effettuino anche controlli negativi, con solvente o mezzo disper ­
dente usato da solo sul terreno di coltura; i controlli vanno trattati 
come le colture che contengono la sostanza sottoposta al test. Si proceda inoltre a controlli non trattati, salvo che precedenti esperi ­
menti dimostrino che il solvente scelto non induce effetti nocivi o 
mutageni.
 
1.4.3.  Procedura  
1.4.3.1.  Trattamento con la sostanza in esame  
Le cellule in proliferazione sono esposte alla sostanza in esame con e 
senza attivazione metabolica. L'esposizione deve protrarsi per un periodo adeguato (si considera che di norma tre-sei ore danno buoni 
risultati). Il tempo di esposizione può corrispondere a uno o più cicli 
cellulari.
 
Si possono usare colture in doppio o in singolo per ciascuna delle 
concentrazioni. Quando si usano colture singole, il numero di con ­
centrazioni deve essere aumentato, per garantire un adeguato numero 
di colture per l'analisi (per esempio, almeno 8 concentrazioni analiz ­
zabili). Le colture dei controlli negativi (solvente) devono essere in doppio.
 
1 test con sostanze gassose o volatili devono essere condotti con metodi 
adeguati, per esempio in recipienti di coltura ermetici (21) (22).  
1.4.3.2.  Misura del tasso di sopravvivenza, della vitalità e della frequenza 
delle mutazioni  
Al termine del periodo di esposizione, le cellule sono lavate e messe 
in coltura per determinare la sopravvivenza e permettere l'espressione 
del fenotipo mutante. La misura della citotossicità mediante determi ­
nazione dell'efficacia relativa di clonazione (sopravvivenza) o della crescita totale relativa delle colture inizia di solito dopo il periodo di trattamento.
 
A ciascun locus corrisponde un determinato tempo minimo, neces ­
sario per permettere l'espressione subottimale del fenotipo dei mu ­
tanti neoindotti (HPRT e XPRT richiedono almeno 6-8 giorni, e TK almeno 2 giorni). Le cellule sono coltivate in terreno con e senza 
agenti selettivi per determinare rispettivamente il numero di mutanti 
e l'efficacia di clonazione. La vitalità (usata per il calcolo della frequenza di mutanti) si misura al termine del tempo di espressione, piastrando le colture in terreno non selettivo.
 
Se la sostanza in esame è positiva a test su L5178Y TK  +/- , la di­
mensione delle colonie deve essere rilevata almeno su una delle 
colture trattate (quella con la concentrazione positiva più alta) e sui controlli negativi e positivi. Se la sostanza in esame è negativa al test su L5178Y TK
 +/- , la dimensione va rilevata sui controlli 
negativi e positivi. Anche negli studi condotti su TK6TK  +/- , si può 
rilevare la dimensione delle colonie mutanti.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 360
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati devono comprendere la determinazione di citotossicità e di 
vitalità, il conteggio delle colonie e la fre quenza dei mutanti nelle 
colture trattate e di controllo. In caso di risposta positiva al test su 
L5178Y TK  +/- , si contino le colonie, distinguendo fra piccole e 
grandi, almeno per una concentrazione della sostanza in esame (con ­
centrazione positiva massima) e per i controlli negativi e positivi. La 
natura molecolare e citogenetica dei due tipi di mutanti (quelli che 
producono colonie grandi e quelli che producono colonie piccole) è stata stu diata particolareggiatamente (23) (24). Nel saggio TK
 +/- , le 
colonie sono recensite sulla base del criterio della crescita: normale 
(colonie grandi) e lenta (colonie piccole) (25). Le cellule mutanti che hanno subito altera zioni genetiche più gravi hanno tempi di dupli ­
cazione più lunghi e formano di conseguenza colonie piccole.
 
II danno può andare dalla perdita dell'intero gene ad aberrazioni 
cromosomiche che si manifestano nel cario tipo. La presenza di mutanti che producono colonie piccole è stata messa in relazione con sostanze chimiche che causano aberrazioni cromosomiche rile ­
vanti (26). Le cellule mutanti che hanno subito alterazioni meno 
gravi crescono a velocità simile a quella delle cellule parentali, for ­
mando colonie grandi.
 
Si indichi il tasso di sopravvivenza (efficacia relativa di clonazione) 
o la crescita totale relativa. La frequenza dei mutanti deve essere espressa come rapporto fra il numero delle cellule mutanti e quello delle cellule sopravvisute.
 
Si presentino i dati relativi alle singole colture. Tutti i dati inoltre 
vanno riassunti in una tabella. Non è necessario verificare una rispo ­
sta palesemente positiva. 1 risultati ambigui devono essere chiariti 
mediante prove ulteriori, preferibilmente in condizioni di esperi ­
mento modificate. I risultati negativi devono essere confermati caso per caso. Se non si considera necessaria la conferma di risultati negativi, se ne fornisca la ragione. Se si procede a test ulteriori in 
caso di risultati ambigui o negativi, si dovrebbero modificare i pa ­
rametri di studio, per ampliare la gamma delle condizioni valutate. Fra i parametri di studio modificabili si citano l'intervallo tra le dosi saggiate e le condizioni di attivazione metabolica.
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, per 
esempio un aumento correlato alla dose o un aumento riproducibile della frequenza dei mutanti. Si consideri per prima cosa la rilevanza 
biologica dei risultati. Si possono usare metodi statistici come ausilio 
nella valutazione dei risultati sperimentali, ma la significatività stati ­
stica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva.
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 361
 
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
chiaramente positivi o negativi, ma occasionalmente i dati ottenuti 
non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui, nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.
 
Risultati positivi del saggio in vitro di mutazione genica su cellule di 
mammifero indicano che la sostanza in esame induce mutazioni 
geniche nelle cellule di mammifero utilizzate nelle colture. Una ri ­
producibile correlazione fra l'entità della risposta positiva e la dose è maggiormente significativa. Risultati negativi significano che nelle 
condizioni del test la sostanza in esame non induce mutazioni geni ­
che nelle cellule di mammifero usate nella coltura.
 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente:  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se nota;  
Cellule:  
— tipo e origine delle cellule;  
— numero di colture cellulari;  
— eventuale numero di passaggi in coltura, se del caso;  
— metodi usati per la conservazione della cultura cellulare, se del 
caso;  
— assenza di micoplasma.  
Condizioni di esperimento:  
— criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, 
per esempio i dati relativi alla citotossicità e ai limiti di solubilità, 
se disponibili;  
— composizione del terreno, concentrazione di CO  2 ; 
— concentrazione della sostanza in esame;  
— volume del mezzo disperdente e della sostanza in esame aggiunto;  
— temperatura di incubazione;  
— tempo di incubazione;  
— durata del trattamento;  
— densità delle cellule durante il trattamento;  
— tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, com ­
presi i criteri di accettabilità;  
— controlli positivi e negativi;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 362
 
— durata del periodo di espressione (con numero di cellule insemi ­
nate, subcolture e protocolli di alimenta zione, se del caso):  
— agenti selettivi;  
— criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi 
o ambigui;  
— metodi usati per contare il numero di cellule vitali e mutanti;  
— definizione delle colonie considerate, per dimensione e tipo 
(compresi i criteri in base a cui le colonie sono considerate 
«piccole» o «grandi», se del caso).  
Risultati:  
— segni di tossicità;  
— segni di precipitazione;  
— dati sul pH e l'osmolalità durante l'esposizione alla sostanza in 
esame, se determinati;  
— dimensioni delle colonie, se registrate almeno per i controlli 
negativi e positivi;  
— idoneità del laboratorio a individuare mutanti in colonie piccole 
con il sistema L5178Y TK  +/- , se del caso;  
— relazione dose-risposta, se possibile;  
— eventuali analisi statistiche;  
— dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi 
paralleli;  
— dati sui precedenti controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) 
e positivi, con ranges, medie e devia zioni standard;  
— frequenza dei mutanti.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, 
K. R. (eds.) (1987),  Banbury Report 28: Mammalian Cell 
Mutagenesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell 
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B.18  DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA: SINTESI NON 
PROGRAMMATA DEL DNA — CELLULE DI MAMMIFERO 
IN VITRO  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Il test della sintesi non programmata del DNA — Unscheduled DNA 
Syntesis (UDS) — misura la sintesi di riparazione del DNA dopo l'escissione e la rimozione di un tratto di DNA contenente la zona del danno indotto da agenti chimici e fisici. Il test si basa sull'incor ­
parazione di timidina marcata con tritio (
 3 H-TdR) nel DNA di cellule 
di mammiferi che non si trovano nella fase S del ciclo cellulare. L'assunzione di
 3 H-TdR può essere determinata per autoradiografia 
oppure mediante conteggio per scintillazione in fase liquida — liquid 
scintillation counting (LSC) — del DNA dalle cellule trattate. Le 
cellule di mammiferi in coltura, salvo nel caso che si faccia uso di epatociti primari di topo, vengono trattate con l'agente all'esame con e senza un sistema di attivazione metabolica esogena. La UDS può 
essere misurata anche in sistemi  in vivo .
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
Le sostanze in esame e quelle di controllo o di riferimento vanno 
preparate in terreno di crescita ovvero disciolte o poste in sospen ­
sione in veicoli appropriati e poi ancora diluite in terreno di crescita prima di essere utilizzate per il test. La concentrazione finale del veicolo non deve produrre alcun effetto sulla vitalità delle cellule.
 
Nel test possono essere utilizzate colture primarie di epatociti di 
ratto, di linfociti umani o di linee cellulari stabilizzate (ad esempio fibroblasti diploidi umani).
 
È opportuno esporre le cellule alla sostanza in esame sia in presenza 
che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica.  
Condizioni sperimentali  
N u m e r o d i c o l t u r e  
Sono necessarie almeno due colture di cellule per l'autoradiografia e 
sei colture (o meno, se giustificato scientificamente) per le determi ­
nazioni LSC e UDS per ogni punto sperimentale.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 366
 
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
È opportuno includere in ciascun esperimento controlli simultanei 
positivi e negativi (non trattati e/o del solo veicolo), con e senza attivazione metabolica.
 
Esempi di controlli positivi per il test su epatociti di ratto sono il 
7,12-DMBA (7,12-dimetilbenzatracene) e il 2-AAF (2-acetilamino ­
fluorene). Nel caso delle linee cellulari stabilizzate un esempio di 
controllo positivo sia per le determinazioni autoradiografiche che per le determinazioni LSC effettuate senza attivazione metabolica è la 4- NQO (4-nitrochinolina-N-ossido); la N-dimetilnitrosamina è a sua 
volta un esempio di composto per controllo positivo quando sia fatto 
uso di sistemi di attivazione metabolica.
 
C o n c e n t r a z i o n i  
È opportuno fare uso di concentrazioni multiple della sostanza in 
esame in una gamma adeguata ai fini della determinazione della risposta. La concentrazione più elevata deve dar luogo a qualche effetto citotossico. I composti relativamente insolubili in acqua vanno 
saggiati fino al loro limite di solubilità. Per le sostanze non tossiche 
altamente solubili in acqua la concentrazione massima della sostanza in esame va determinata caso per caso.
 
C e l l u l e  
Per il mantenimento delle colture è opportuno fare uso di terreni di 
crescita, di concentrazioni di CO  2 e di condizioni di temperatura e di 
umidità appropriate. Le linee cellulari stabilizzate devono essere con ­
trollate periodicamente per escludere la presenza di contaminazione 
da micoplasma.  
A t t i v a z i o n e m e t a b o l i c a  
Con le colture primarie di epatociti non si fa uso di sistemi di 
attivazione metabolica. Le* linee cellulari stabilizzate ed i linfociti vengono esposti alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione metabolica.
 
Procedimento  
P r e p a r a z i o n e d e l l e c o l t u r e  
La linee cellulari stabilizzate vengono generate da coltura stock (ad 
esempio per tripsinizzazione o mediante separazione per scuotimen ­
to), seminate in recipienti di coltura a densità appropriata ed incubate a 37
 o C. 
Colture a breve termine di epatociti di ratto vengono preparate dando 
modo a epatociti dissociati di fresco in un terreno appropriato di 
attaccarsi alla superficie di crescita.  
Le colture di linfociti umani vengono preparate secondo tecniche 
appropriate.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 367
 
T r a t t a m e n t o d e l l e c o l t u r e c o n l a s o s t a n z a i n 
e s a m e  
Epatociti primari di ratto  
Gli epatociti di ratto isolati di fresco vengono trattati con la sostanza 
in esame in un terreno contenente  3 H-TdR per una durata appropria ­
ta. Al termine del periodo di trattamento le cellule vanno tolte me ­
diante filtraggio dal terreno, risciacquate, fissate ed essiccate. I ve ­
trini vanno immersi in emulsione autoradiografica (alternativamente si possono usare pellicole adatte), esposti, sviluppati, colorati ed 
enumerati.
 
Linee cellulari stabilizzate e linfociti  
Tecniche autoradiografiche:  Le colture di cellule vengono esposte 
alla sostanza in esame per una durata appropriata e successivamente trattate con
 3 H-TdR. La durata sarà determinata dalla natura della 
sostanza, dall'attività del sistema metabolizzante e dal tipo delle 
cellule. Per rilevare il valore massimo di UDS, è opportuno aggiun ­
gere  3 H-TdR contemporaneamente alla sostanza all'esame, ovvero 
entro pochi minuti dall'esposizione alla sostanza stessa. La scelta fra i suddetti due procedimenti sarà fatta in relazione alla possibilità 
di interazioni fra la sostanza all'esame e
 3 H-TdR. Al fine di poter 
distinguere fra UDS e la replicazione semi-conservativa di DNA si può inibire quest'ultima, ad esempio facendo uso di un terreno defi ­
ciente di arginina, a basso contenuto di siero o con idrossiurea nel 
mezzo di coltura.
 
Misure LSC di UDS:  Prima del trattamento con la sostanza in esame 
è opportuno bloccare nel modo che si è descritto sopra l'entrata delle 
cellule nella fase S. Le cellule vengono poi esposte alla sostanza in esame nel modo che si è descritto per l'autoradiografia. Al termine del periodo di incubazione si estrae il DNA dalle cellule e si deter ­
minano il contenuto totale di DNA e la misura della incorporazione 
di
 3 H-TdR.  
Occorre rilevare che quando si fa uso delle tecniche sopra descritte 
di linfociti umani, la soppressione della replicazione semi-conserva ­
tiva di DNA non è necessaria in colture non stimolate.  
Analisi  
D e t e r m i n a z i o n i a u t o r a d i o g r a f i c h e  
Nella determinazione di UDS nelle cellule in coltura non si contano i 
nuclei in fase S. È opportuno contare almeno 50 cellule per concen ­
trazione. Le lastrine vanno codificate prima del conteggio, È oppor ­
tuno contare su ciascuna piastrina diversi campi a caso interamente separati tra loro. Per la determinazione della quantità di incorpora ­
zione di
 3 H-J-TdR nel citoplasma è bene contare nel citoplasma di 
ciascuna cellula conteggiata tre aree delle dimensioni del nucleo.  
D e t e r m i n a z i o n i L S C  
Nelle determinazioni LSC UDS occorre fare uso di un numero ade ­
guato di colture per ogni concentrazione e per i controlli.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 368
 
Tutti i risultati dovrebbero essere confermati in un esperimento in ­
dipendente.  
2. DATI  
I dati devono essere presentati in forma di tabelle.  
2.1. DETERMINAZIONI AUTORADIOGRAFICHE  
Della entità dell'incorporazione di  3 H-TdR nel citoplasma e del nu ­
mero dei granuli osservati nel nucleo delle cellule va presa nota 
separatamente.  
Per descrivere la distribuzione dell'entità dell'incorporazione di  3 H- 
TdR nel citoplasma e del numero dei granuli per nucleo può essere fatto riferimento alla media, alla mediana ed al modo.
 
2.2. DETERMINAZIONI LSC  
Per le determinazioni LSC, l'incorporazione di  3 H-TdR va indicata in 
termini di dpm/ μg di DNA. Il valore medio di dpm/ μg di DNA con 
la deviazione standard può essere usato per descrivere la distribu ­
zione della incorporazione.  
I dati devono essere valutati secondo metodi statistici appropriati.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— cellule usate, densità e numero dei passagi al momento del trat ­
tamento, numero delle colture di cellule,  
— metodi usati per il mantenimento delle colture di cellule, con 
indicazione del terreno, della temperatura e della concentrazione 
di CO  2 , 
— sostanza in esame, veicolo, concentrazioni e ragioni della scelta 
delle concentrazioni usate nella determinazione,  
— dettagli riguardanti i sistemi di attivazione metabolica,  
— programmi di trattamento,  
— controlli positivi e negativi,  
— tecnica autoradiografica usata,  
— procedimenti usati per bloccare l'entrata delle cellule nella fase S,  
— procedimenti usati per l'estrazione di DNA e per la determina ­
zione del contenuto totale di DNA nelle determinazioni LSC,  
— relazione dose-risposta se del caso,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 369
 
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 370
 
B.19  SAGGIO DEGLI SCAMBI TRA CROMATIDI FRATELLI IN 
VITRO  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Quello degli scambi tra cromatidi fratelli — Sister chromatid ex ­
change (SEC) — è un test a breve termine per la rilevazione degli 
scambi reciproci di DNA fra due cromatidi fratelli di un cromosoma 
in duplicazione. Gli SCE rappresentano l'interscambio di prodotti della replicazione di DNA in corrispondenza di loci apparentemente omologhi. Il processo di scambio comporta presumibilmente la rot ­
tura e la riunione di DNA, ma sulla sua base molecolare non si 
conosce in realtà molto. La rilevazione degli SCE richiede qualche mezzo per marcare in modo differenziale i cromatidi fratelli, e questo può essere ottenuto mediante incorporazione di bromodeossiurtdina 
(BrdU) nel DNA cromosomico per due cicli cellulari.
 
Colture in vitro di cellule di mammiferi vengono esposte alla so ­
stanza in esame con e senza un sistema esogeno di attivazione me ­
tabolica dei mammiferi, se appropriato, e poste in coltura per due cicli di replicazione in terreno contenente BrdU. Dopo un trattamento con un inibitore del fuso (ad esempio la colchicina) per accumulare 
cellule in uno stadio di mitosi di tipo metafasico (c-metafase), le 
cellule vengono raccolte e si procede alle preparazioni cromosomi ­
che.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
— Nel saggio si possono usare colture primarie (linfociti umani) o 
linee cellulari stabilizzate (ad esempio cellule di ovario di ham ­
ster cinese). Le linee cellulari devono essere controllate per esclu ­
dere la presenza di contaminazione da Mycoplasma.  
— Vanno usati terreni di coltura e condizioni di incubazione (tem ­
peratura, recipienti di coltura, concentrazione di CO  2 ed umidità) 
appropriati.  
— Le sostanze in esame possono essere preparate in terreni di col ­
tura ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli appropriati 
prima del trattamento delle cellule. La concentrazione finale dei veicoli nei sistemi di coltura non deve influire in maniera signi ­
ficativa sulla vitalità o sul tasso di crescita delle cellule, ed è 
parallelamente opportuno verificare la frequenza degli SCE per 
mezzo di un controllo con solvente.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 371
 
— E opportuno esporre le cellule alla sostanza in esame sia in 
presenza che in assenza di un sistema esogeno di attivazione 
metabolica di mammiferi. Alternativamente, ove si faccia uso di tipi di cellule con attività metabolica endogena, l'intensità e la natura dell'attività devono essere appropriate per la classe 
chimica sottoposta all'esame.
 
Condizioni sperimentali  
N u m e r o d i c o l t u r e  
Per ciascun punto sperimentale dovrebbero essere usate colture al ­
meno in duplicato.  
U s o d i c o n t r o l l i p o s i t i v i e n e g a t i v i  
È opportuno includere in ciascun esperimento dei controlli positivi, 
facendo uso sia di un composto ad azione diretta che di un composto richiedente attivazione metabolica, ed è opportuno anche effettuare 
un controllo del veicolo.
 
Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere usate come con ­
trolli positivi si possono citare:  
— come composto ad azione diretta:  
— l'etilmetansulfonato,  
— come composto ad azione indiretta:  
— la ciclofosfamide.  
Se del caso, può essere incluso nell'esperimento un controllo positivo 
supplementare della medesima classe chimica della sostanza in 
esame.  
C o n c e n t r a z i o n i  
È opportuno fare uso di almeno tre concentrazioni adeguatamente 
intervallate della sostanza in esame. La concentrazione più elevata deve dar luogo ad un effetto tossico significativo, ma deve ancora 
consentire il verificarsi di una replicazione adeguata delle cellule. Le 
sostanze relativamente insolubili in acqua vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti appropriati. Per le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione massima 
della sostanza in esame va determinata caso per caso.
 
Procedimento  
P r e p a r a z i o n e d e l l e c o l t u r e  
Linee cellulari stabilizzate vengono generate da colture stock (ad 
esempio per tripsinizzazione o mediante distacco per scuotimento), seminate in recipienti di coltura a densità appropriata ed incubate a 37
 o C. Nel caso di coltura monostrato, il numero delle cellule per 
ogni recipiente di coltura va regolato in modo che le colture non 
siano confluenti in misura molto maggiore del 50 % al momento della raccolta. Alternativamente, le cellule possono essere usate in forma di coltura in sospensione. Le colture di linfociti umani sono 
ottenute da sangue eparinizzato secondo tecniche appropriate ed in ­
cubate a 37
 o C. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 372
 
T r a t t a m e n t o  
Vengono esposte alla sostanza in esame per una durata adeguata 
cellule in uno stadio di crescita esponenziale; nella maggior parte dei casi può essere efficace una durata da una a due ore, ma la durata del trattamento può in taluni casi essere prolungata fino a due cicli 
cellulari completi. Le cellule non aventi una sufficiente attività me ­
tabolica endogena vanno esposte alla sostanza in esame sia in pre ­
senza che in assenza di un sistema appropriato di attivazione meta ­
bolica. Al termine del periodo di esposizione le cellule vengono 
lavate da ogni traccia della sostanza in esame e coltivate per due 
cicli di replicazione in presenza di BrdU. In un procedimento alter ­
nativo si possono esporre le cellule contemporaneamente alla so ­
stanza in esame e al BrdU per la durata completa di coltura di 
due cicli cellulari.
 
Le colture di linfociti umani vengono trattate mentre si trovano in 
condizione semisincrona.  
Le cellule vengono analizzate alle loro seconda divisione dopo il 
trattamento, per assicurarsi che siano state esposte alla sostanza negli stadi più sensibili del ciclo cellulare. Tutte le colture alle quali si 
aggiunge BrdU, vanno manipolate nell'oscurità o in luce attenuata di 
lampade ad incandescenza fino al momento della raccolta delle cel ­
lule, allo scopo di ridurre per quanto possibile la fotolisi del DNA contenente BrdU.
 
R a c c o l t a d e l l e c e l l u l e  
Le colture di cellule vengono trattate con un inibitore del fuso (ad 
esempio colchicina) da 1 a 4 ore prima della raccolta. Ciascuna 
coltura viene raccolta e trattata separatamente per la preparazione 
dei cromosomi.  
P r e p a r a z i o n e e c o l o r a z i o n e d e i c r o m o s o m i  
I preparati di cromosomi vengono ottenuti secondo le tecniche cito ­
genetiche correnti. La colorazione dei vetrini per l'evidenziazione degli SCE può essere effettuata secondo diverse tecniche (ad esempio con il metodo della fluorescenza più Giemsa).
 
A n a l i s i  
Il numero di cellule analizzate deve essere basato sulla frequenza 
spontanea di controllo degli SCE. Normalmente si analizzano per gli 
SCE almeno 25 metafasi ben spaziate per coltura. I vetrini vengono 
codificati prima dell'analisi. Nei linfociti umani si analizzano soltanto metafasi contenenti 46 centromeri. Nelle linee cellulari stabilizzate si analizzano a loro volta soltanto metafasi contenenti ± 2 centromeri del 
numero modale. E opportuno indicare se il salto di marcatura a livello 
del centromero viene o non viene conteggiato come SCE. I risultati dovrebbero essere confermati in un esperimento indipendente.
 
2. DATI  
I dati devono essere presentati in forma di tabelle. Il numero degli 
SCE per metafase e il numero degli SCE per cromosoma vanno 
indicati separatamente per tutte le colture trattate e quelle di con ­
trollo.  
I dati devono essere definiti secondo metodi statistici appropriati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 373
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— cellule usate, metodi di mantenimento della coltura cellulare,  
— condizioni sperimentali: composizione dei mezzi, concentrazione 
di CO  2 , concentrazione della sostanza all'esame, veicolo usato, 
temperatura di incubazione, tempo di trattamento, inibitore del 
fuso usato, sua concentrazione e durata del trattamento connesso, tipo di sistema di attivazione di mammiferi usato, controlli posi ­
tivi e negativi,
 
— numero di colture di cellule per punto sperimentale,  
— dettagli della tecnica usata per la preparazione delle lastrine,  
— numero delle metafasi analizzate (indicazione separata dei dati 
per ciascuna coltura),  
— numero medio di SCE per cellula e per cromosoma (indicazione 
separata dei dati per ciascuna coltura),  
— criteri per il riscontro degli SCE,  
— criteri di selezione delle dosi,  
— relazione dose/risposta se del caso,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 374
 
B.20  SAGGIO DEI LETALI RECESSIVI LEGATI AL SESSO: 
DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Il saggio dei letali recessivi legati al sesso — sex-linked recessive 
lethal (SLRL) — nel quale è fatto uso della Drosophila melanoga ­
ster, permette di rilevare l'induzione sia di mutazioni puntiformi che 
di piccole delezioni nella linea germinale dell'insetto. Si tratta di un 
saggio capace di rivelare mutazioni in circa 800 loci sul cromosoma X; questa cifra rappresenta circa l'80 % di tutti i loci del cromosoma 
X; quest'ultimo rappresenta a sua volta circa un quinto dell'intero 
genoma aploide.
 
Le mutazioni nel cromosoma X nella D. melanogaster sono espresse 
fenotipicamente nei maschi portanti il gene mutante. Quando la mu ­
tazione è letale nella condizione emizigote, la sua presenza si desume 
dall'assenza di una delle due classi di discendenza maschile che sono 
normalmente prodotte da una femmina eterozigote. Il saggio SLRL si basa sulla disponibilità di cromosomi specificamente marcati.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
C e p p i  
Possono essere usati maschi di un ceppo ben definito di tipo selva ­
tico e femmine del ceppo Muller-5. Possono altresi essere usati altri 
ceppi di femmine marcate in modo appropriato con cromosomi X multipli invertiti.
 
S o s t a n z a i n e s a m e  
Le sostanze in esame vanno disciolte in acqua. Le sostanze non 
solubili in acqua possono essere disciolte o poste in sospensione in solventi appropriati (ad esempio una miscela di etanolo e Tween-60 o 80), e successivamente diluite in acqua o in soluzione salina prima 
della somministrazione. E opportuno evitare quale solvente il dime ­
tilsol-fossido (DMSO).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 375
 
N u m e r o d i a n i m a l i  
Il saggio va programmato con una sensibilità ed una potenza prede ­
terminati. Sul numero di cromosomi trattati che devono essere ana ­
lizzati influirà fortemente la frequenza delle mutazioni spontanee osservata nel controllo appropriato.
 
V i e d i s o m m i n i s t r a z i o n e  
L'esposizione può essere orale, per iniezione o per esposizione a gas 
o a vapori. La somministrazione della sostanza in esame può essere 
fatta in forma di soluzione zuccherina. Se necessario, le sostanze possono essere disciolte in soluzione di NaCl allo 0,7 % ed iniettate nel torace o nell'addome.
 
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
È opportuno includere nell'esperimento controlli negativi (del solvente) 
e positivi. Ove tuttavia siano disponibili appropriati dati storici di controllo del laboratorio, non sono necessari controlli concomitanti.
 
C o n c e n t r a z i o n i  
È opportuno fare uso di tre concentrazioni. Per una valutazione 
preliminare può essere fatto uso di una sola concentrazione della 
sostanza in esame, che può essere quella massima tollerata o quella che dà luogo ad una qualche indicazione di tossicità. Per le sostanze non tossiche è opportuno adottare l'esposizione alla concentrazione 
massima praticabile.
 
P r o c e d i m e n t o  
Maschi di tipo selvatico (di età da 3 a 5 giorni) vengono trattati con 
la sostanza in esame e accoppiati individualmente con un numero maggiore di femmine vergini dello stock Muller-5 o di altro stock 
marcato in maniera appropriata (con cromosomi X multipli invertiti). 
Le femmine vengono sostituite con vergini fresche ogni due, tre giorni cosi da coprire l'intero ciclo delle cellule germinali. Sulla prole di dette femmine viene effettuata l'analisi degli effetti letali corri ­
spondenti agli effetti sullo sperma maturo, sugli spermatidi di stadio 
medio o avanzato, sugli spermatidi precoci, sugli spermaticiti e sugli spermatogoni al momento del trattamento.
 
Le femmine eterozigoti F  1 , degli incroci di cui sopra sono fatte 
accoppiare individualmente (ossia in ragione di una femmina per bottiglietta) con i loro fratelli. Nella generazione F
 2 si procede su 
ciascuna coltura all'analisi dell'assenza di maschi del tipo selvatico. 
Se da una femmina F  1 appare essere derivata una coltura portante un 
letale nel cromosoma X dei genitori (ossia se non si osservano ma ­
schi con il cromosoma trattato) si devono mettere alla prova figlie di 
quella femmina con il medesimo genotipo per stabilire se la letalità 
si ripete nella generazione successiva.  
2. DATI  
I dati devono essere disposti in forma di tabelle con indicazione del 
numero dei cromosomi X saggiati, del numero dei maschi non fertili 
e del numero dei cromosomi letali per ciascuna concentrazione di esposizione e per ciascun periodo di accoppiamento per i singoli maschi trattati. Deve essere riportato per ciascun maschio il 
numero degli aggregati di differenti dimensioni, I risultati del test 
devono essere confermati in un esperimento a parte.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 376
 
Per la valutazione del saggio dei letali recessivi legati al sesso deve 
essere fatto uso di metodi statistici appropriati. L'agglomerazione di 
letali recessivi aventi origine da un medesimo maschio dev'essere considerata e valutata secondo criteri statistici appropriati.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— stock: stock o ceppi di Drosophila usati, età degli insetti, numero 
dei maschi trattati, numero dei maschi sterili, numero di colture 
F 2 costituite, numero di colture F  2 senza progenie, numero di 
cromosomi portanti un letale individuati per ciascuno stadio delle cellule germinali,
 
— criteri per la definizione delle dimensioni dei gruppi trattati,  
— condizioni di effettuazione del saggio: descrizione dettagliata dei 
programmi di trattamento e di campionatura, livelli di esposizio ­
ne, dati della tossicità, controlli negativi (del solvente) e positivi, 
se del caso,  
— criteri per il riscontro delle mutazioni letali,  
— relazione esposizione/effetto se del caso,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 377
 
B.21  SAGGIO IN VITRO DI TRASFORMAZIONE DI CELLULE DI 
MAMMIFERO  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Per la rilevazione di cambiamenti fenotipici in vitro indotti da so ­
stanze chimiche associate con una trasformazione maligna  in vivo  
può essere fatto uso di sistemi di coltura di cellule di mammiferi. Fra 
le cellule più largamente usate figurano le cellule C3H10T  1 / 2 , 3T3, 
SHE, le cellule di ratto Fisher; i saggi si fondano su cambiamenti 
della morfologia cellulare, sulla formazione di foci e sulla perdita 
della dipendenza da ancoraggio in agar semisolido. Esistono anche altri sistemi meno largamente usati i quali mettono in luce altri tipi di cambiamenti fisiologici o morfologici nelle cellule successivamente 
all'esposizione a sostanze chimiche carcinogene. Nessuno degli 
eventi finali dei test in vitro ha un legame meccanicistico accertato con il cancro. Alcuni fra i saggi sono in grado di evidenziare agenti promotori dei tumori. La citotossicità può essere determinata attra ­
verso la misura dell'effetto della sostanza in esame sulla capacità di 
formazione di colonie (efficienza di clonaggio) o sul tasso di crescita delle colture. La misurazione della citotossicità ha lo scopo di stabi ­
lire se l'esposizione alla sostanza in esame abbia avuto carattere 
rilevante dal punto di vista tossicologico, ma non può essere usata 
per calcolare la frequenza della trasformazione in tutti i saggi poiché alcuni di essi possono comportare un'incubazione prolungata e/o un ripiastramento delle cellule.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
C e l l u l e  
È disponibile tutta una varietà di linee cellulari o di cellule primarie, 
in relazione al saggio di trasformazione che si intende effettuare. Il 
ricercatore deve accertarsi che nel saggio che si sta effettuando le cellule presentino dopo esposizione a carcinogeni noti l'appropriato cambiamento fenotipico, e che il saggio nel suo laboratorio sia di 
provata e documentata validità e attendibilità.
 
T e r r e n i d i c o l t u r a  
Devono essere usati terreni di coltura e condizioni sperimentali ap ­
propriati per il saggio di trasformazione che si effettua.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 378
 
S o s t a n z a i n e s a m e  
Le sostanze in esame possono essere preparate in mezzi di coltura 
ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli appropriati, prima del trattamento delle cellule. La concentrazione finale del veicolo nel sistema di coltura non deve influire sulla vitalità o sul tasso di 
crescita delle cellule né sull'incidenza della trasformazione.
 
A t t i v a z i o n e m e t a b o l i c a  
Le cellule vanno esposte alla sostanza in esame sia in presenza che 
in assenza di un sistema esogeno di attivazione metabolica dei mam ­
miferi. Alternativamente, quando sia fatto uso di tipi di cellule che 
possiedono un'attività metabolica endogena deve essere accertato che la natura dell'attività stessa sia appropriata per la classe chimica sottoposta all'esame.
 
Condizioni sperimentali  
U s o d i c o n t r o l l i p o s i t i v i e n e g a t i v i  
È opportuno includere in ciascun esperimento dei controlli positivi, 
con impiego sia di un composto ad azione diretta che di un compo ­
sto richiedente attivazione metabolica; è altresì opportuno fare uso di 
un controllo negativo (del solvente).  
Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere usate come con ­
trolli positivi si possono citare:  
— sostanze ad azione diretta:  
— etilmetansulfonato,  
— β-propiolattone;  
— composti richiedenti un'attivazione metabolica:  
— 2-acetilaminofluorene,  
— 4-dimetilaminoazobenzene,  
— 7,12-dimetilbenzantracene.  
Se del caso, è opportuno includere un controllo positivo supplemen ­
tare della medesima classe chimica del composto in esame.  
C o n c e n t r a z i o n i  
È opportuno usare varie concentrazioni della sostanza in esame. 
Dette concentrazioni devono dar luogo ad un effetto tossico correlato con la concentrazione, nel senso che la concentrazione più elevata produce un livello ridotto di sopravvivenza, mentre alla concentra ­
zione più bassa la sopravvivenza è approssimativamente dello stesso 
ordine che nel controllo negativo. Le sostanze relativamente insolu ­
bili in acqua vanno saggiate fino al loro limite di solubilità secondo procedure appropriate. Per le sostanze non tossiche altamente solubili 
in acqua la concentrazione massima della sostanza va determinata 
caso per caso.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 379
 
Procedimento  
L'esposizione delle cellule deve avere una durata appropriata in re ­
lazione al sistema di saggio adottato, e questo, quando l'esposizione è prolungata, può comportare un ridosaggio con cambio del mezzo e, se necessario, con miscela di attivazione metabolica fresca. Le cel ­
lule non aventi un'attività metabolica endogena sufficiente vanno 
esposte alla sostanza in esame sia in presenza che in assenza di un sistema di attivazione metabolica appropriato. Al termine del periodo di esposizione le cellule vengono lavate da ogni traccia della so ­
stanza in esame e coltivate in condizioni appropriate per la comparsa 
del fenotipo trasformato che si sta studiando, e viene infine determi ­
nata l'incidenza della trasformazione. Tutti i risultati devono essere confermati in un esperimento indipendente.
 
2. DATI  
I dati vanno presentati in forma di tabella e possono assumere forme 
diverse a seconda del tipo di determinazione effettuato, ad esempio 
numero di foci o di colonie per piastre, piastre positive o numero delle cellule trasformate. La sopravvivenza va espressa quale percen ­
tuale dei livelli di controllo, e la frequenza della trasformazione sotto 
forma del numero di trasformanti in relazione al numero dei soprav ­
vissuti. I dati devono essere valutati secondo metodi statistici appro ­
priati.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— tipo di cellule usato, numero delle colture cellulari, metodi di 
mantenimento delle colture,  
— condizioni di effettuazione del saggio, concentrazione della so ­
stanza in esame, veicolo usato, temperatura di incubazione, du ­
rata dell'incubazione, durata e frequenza del trattamento, densità delle cellule durante il trattamento, tipo di sistema di attivazione metabolica esogena usato, controlli positivi e negativi, specifica ­
zione del fenotipo studiato, sistema selettivo usato (se del caso), 
criteri per la scelta delle dosi,
 
— metodo seguito per l'enumerazione delle cellule vitali e delle 
cellule trasformate,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 380
 
B.22  SAGGIO DEI LETALI DOMINANTI NEI RODITORI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Gli effetti dei letali dominanti provocano la morte dell'embrione o 
del feto. L'induzione di letali dominanti per effetto dell'esposizione ad una sostanza chimica indica che la sostanza in causa ha attaccato 
il tessuto germinale della specie all'esame. E generalmente ammesso 
che i letali dominanti sono dovuti a un danno cromosomico (anoma ­
lie strutturali e numeriche). La morte dell'embrione in femmine trat ­
tate può altresì essere il risultato di effetti tossici.
 
Come criterio generale si espongono animali maschi al composto in 
esame e si accoppiano i medesimi con femmine vergini non trattate. I diversi stadi delle cellule germinali possono essere saggiati sepa ­
ratamente mediante l'osservanza di intervalli in successione negli 
accoppiamenti. L'aumento degli impianti morti per femmina nel gruppo trattato in confronto con gli impianti morti per femmina nel gruppo di controllo rispecchia la perdita successiva all'impianto. 
La perdita anteriore all'impianto può essere stimata sulla base di 
conteggi dei corpi lutei oppure attraverso il raffronto del totale degli impianti per femmina nel gruppo trattato e in quello di controllo. L'effetto letale dominante complessivo è rappresentato 
dalla somma della perdita anteriore e successiva all'impianto. Il cal ­
colo dell'effetto letale dominante complessivo si basa sul raffronto fra gli impianti vivi per femmina nel gruppo trattato e gli impianti vivi per femmina nel gruppo di controllo. Una riduzione del numero 
di impianti a determinati intervalli può essere il risultato dell'ucci ­
sione di cellule (vale a dire, di spermatociti e/o di spermagoni).
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
In tutti i casi in cui ciò sia possibile, le sostanze in esame vanno 
disciolte o poste in sospensione in soluzione salina isotonica. Le sostanze non solubili in acqua possono essere disciolte o sospese in solventi appropriati. Il solvente usato non deve né interferire 
con la sostanza in esame né produrre effetti tossici. È opportuno 
fare uso di preparazioni fresche della sostanza in esame.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 381
 
Condizioni sperimentali  
V i e d i s o m m i n i s t r a z i o n e  
Il composto in esame va in generale somministrato una sola volta. 
Sulla base di informazioni tossicologiche può essere adottato un programma di trattamento ripetuto. Le vie di somministrazione cor ­
renti sono l'intubazione orale e l'iniezione intraperitoneale. Possono 
altresì essere appropriate altre vie di somministrazione.
 
A n i m a l i d a e s p e r i m e n t o  
Quali specie da sottoporre al saggio sono raccomandati i ratti o i 
topi. Animali sani nella piena maturità sessuale vengono randomiz ­
zati ed assegnati al gruppo per il trattamento e al gruppo di controllo.  
N u m e r o e s e s s o  
Occorre fare uso di un numero adeguato di maschi trattati in modo 
da tener conto della variazione spontanea del carattere biologico di 
cui si effettua la valutazione. Il numero scelto deve essere basato sulla sensibilità di rilevazione e sul valore di significatività determi ­
nati in precedenza. Ad esempio, in un esperimento tipico, il numero 
dei maschi per ciascun gruppo/dose deve essere sufficiente per dare 
da 30 a 50 femmine gravide per ogni intervallo di accoppiamento.
 
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
È opportuno in linea generale includere in ciascun esperimento dei 
controlli simultanei positivi e negativi (del veicolo). Quando siano disponibili risultati accettabili di controlli positivi relativi ad esperi ­
menti effettuati di recente nel medesimo laboratorio, al posto di un 
controllo positivo simultaneo può essere fatto uso di detti risultati. Le sostanze per i controlli positivi vanno usate a dosi opportunamente basse (ad esempio MMS, intraperitoneale, a 10 mg/kg) allo scopo di 
dimostrare la sensibilità del saggio.
 
L i v e l l i d e l l e d o s i  
Di norma va fatto uso di tre livelli di dosaggio. La dose più alta deve 
produrre segni di tossicità o di riduzione della fertilità negli animali trattati. In taluni casi può essere sufficiente un solo livello elevato di dosaggio.
 
S a g g i o d e l l i m i t e  
Le sostanze non tossiche vanno saggiate a 5 g/kg con una sola 
somministrazione o a 1 g/kg/giorno con somministrazione ripetuta.  
Procedimento  
Sono possibili vari schemi di trattamento. Il tipo di trattamento più 
largamente usato è quello della somministrazione singola della so ­
stanza in esame. Possono essere applicati anche altri schemi di trat ­
tamento.  
I singoli maschi vengono accoppiati in successione con una o due 
femmine vergini non trattate ad intervalli appropriati dopo il tratta ­
mento. Le femmine vanno lasciate con i maschi almeno per la durata di un ciclo di estro o fino a che sia avvenuto l'accoppiamento, da 
determinare in base alla presenza di sperma nella vagina o di un 
tappo vaginale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 382
 
II numero degli accoppiamenti successivi al trattamento è determi ­
nato in base al programma di trattamento e deve essere tale che 
vengano esaminati dopo il trattamento tutti gli stadi delle cellule germinali.
 
Le femmine vengono sacrificate nella seconda metà del periodo di 
gravidanza, e si procede all'esame del contenuto uterino per la de ­
terminazione del numero degli impianti morti e viventi. Si possono anche esaminare le ovaie per determinare il numero dei corpi lutei.
 
2. DATI  
I dati devono essere disposti in forma di tabelle con indicazione del 
numero dei maschi, del numero delle femmine gravide e del numero 
delle femmine non gravide. I risultati di ciascun accoppiamento, con 
indicazione dell'identità dei singoli soggetti maschi e femmine, vanno riportati individualmente. Per ciascuna femmina va indicata la settimana di accoppiamento, e per i maschi il livello di dosaggio, 
nonché rispettivamente le frequenze degli impianti vivi e degli im ­
pianti morti.
 
Il calcolo dell'effetto complessivo letale dominante si basa sul raf ­
fronto fra gli impianti vivi per femmina nel gruppo sottoposto al saggio e gli impianti vivi per femmina nel gruppo di controllo. Il rapporto' fra gli impianti morti e quelli vivi del gruppo trattato posto 
a raffronto con il rapporto corrispondente del gruppo di controllo 
viene analizzato ai fini dell'indicazione della perdita successiva al ­
l'impianto.
 
Se i dati sono registrati come morti precoci e morti tardive, ciò deve 
risultare dalle tabelle. Se la perdita anteriore all'impiantazione è sti ­
mata, ne deve essere dato ragguaglio. La perdita anteriore all'im ­
pianto può essere calcolata come discrepanza fra il numero dei corpi 
lutei e il numero degli impianti, ovvero come riduzione del numero 
medio di impianti per utero in confronto con gli accoppiamenti di controllo.
 
I dati vengono valutati secondo metodi statistici appropriati.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— specie, ceppo, età e peso degli animali usati, numero degli ani ­
mali dell'uno e dell'altro sesso nei gruppi sottoposti al saggio e 
nei gruppi di controllo,  
— sostanza in esame, solvente, livelli di dosaggio saggiati e ragioni 
della scelta delle dosi, controlli negativi e positivi, dati della tossicità,
 
— via e durata dell'esposizione,  
— ordine degli accoppiamenti,  
— metodo usato per stabilire l'avvenuto accoppiamento,  
— metodo del sacrificio,  
— criteri per l'analisi dei letali dominanti,  
— relazione dose/risposta, se del caso,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 383
 
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 384
 
B.23.  TEST DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA SUGLI 
SPERMATOGONI DI MAMMIFERO  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 483. Mammalian Sper ­
matogonial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il saggio  in vivo  di aberrazione cromosomica su spermatogoni di 
mammifero è destinato ad identificare sostanze che causano aberra ­
zioni cromosomiche strutturali nelle cellule spermatogoniche di mammifero (1) (2) (3) (4) (5). Le aberrazioni strutturali possono essere di due tipi, cromosomiche o cromatidiche. La maggior parte 
dei mutageni chimici induce aberrazioni del tipo cromatidico, ma si 
verificano anche aberrazioni di tipo cromosomico. Il metodo non è destinato a misurare le aberrazioni numeriche e di norma non è usato a tal fine. Le mutazioni cromosomiche ed i fenomeni ad esse corre ­
lati sono causa di numerose malattie genetiche umane.
 
Questo saggio misura fenomeni cromosomici negli spermatogoni e 
pertanto dovrebbe permettere di prevedere l'induzione di mutazioni 
ereditabili nelle cellule germinali.  
Per tale saggio si usano di norma roditori. Si tratta di test citogenetici  
in vivo , che rivelano aberrazioni cromo-somiche nelle mitosi degli 
spermatogoni. Altre cellule bersaglio non sono oggetto del presente saggio.
 
Per rilevare aberrazioni di tipo cromatidico in cellule spermatogoni ­
che, è necessario esaminare la prima divisione cellulare mitotica dopo il trattamento, prima che tali aberrazioni scompaiano nelle successive divisioni cellulari. L'analisi dei cromosomi allo stadio 
della meiosi, per individuare aberrazioni cromosomiche allo stadio 
della diacinesi-metafase I, quando le cellule trattate diventano sper ­
matociti, può fornire ulteriori informazioni sugli spermatogoni trat ­
tati.
 
Questo saggio  in vivo  è inteso a verificare se i mutageni delle cellule 
somatiche siano attivi anche nelle cellule germinali. Inoltre il saggio sugli spermatogoni è idoneo a valutare il rischio di mutagenicità in 
quanto permette di tener conto di fattori di metabolismo  in vivo , di 
farmacocinetica e di processi di riparazione del DNA.
 
I testicoli contengono varie generazioni di spermatogoni, che presen ­
tano sensibilità diverse al trattamento chi mico. Le aberrazioni indi ­
viduate rappresentano pertanto una risposta globale delle popolazioni di spermato- goni trattati, tra cui predominano le cellule spermato ­
goniche differenziate, più numerose. Le varie generazioni di sperma ­
togoni sono o non sono esposte alla circolazione generale in fun ­
zione della posizione all'interno del testicolo, a causa della barriera fisica e fisiologica costituita dalle cellule di Sertoli e dalla barriera 
ematotestico lare.
 
Il test non è idoneo se è evidente che la sostanza in esame o un 
metabolita reattivo non raggiungono il tes suto bersaglio.  
Cfr. anche Introduzione generale, pane B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 385
 
1.2. DEFINIZIONI  
Aberrazione di tipo cromatidico:  alterazione cromosomica struttu ­
rale che si manifesta nella rottura di un singolo cromatide o nella rottura e ricongiunzione di cromatidi.
 
Aberrazione di tipo cromosomico:  alterazione cromosomica strut ­
turale che si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, 
di entrambi i cromatidi in uno stesso punto.  
Gap:  lesione acromatica di ampiezza inferiore a un cromatide, con 
minimo disallineamento dei cromatidi.  
Aberrazione numerica:  variazione del numero di cromosomi ri ­
spetto al numero diploide caratteristico della specie.  
Poliploidia:  numero di cromosomi multiplo superiore a due del 
numero aploide (cioè 3n, 4n ecc).  
Aberrazione strutturale:  alterazione della struttura cromosomica 
visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase della divi ­
sione cellulare, che si presenta con delezioni, riordinamenti intercro ­
mosomici e intracro-mosomici.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Gli animali sono esposti alle sostanze in esame tramite una via di 
esposizione adeguata e sono quindi sacrificati a tempo debito, dopo 
somministrazione di un inibitore della metafase (p.es. colchicina o 
Colcemid  ® ). Sono poi approntate e sottoposte a un processo di co ­
lorazione preparazioni cromosomiche provenienti dalle cellule germi ­
nali, e se ne analizzano le cellule in metafase per determinare le 
aberrazioni cromosomiche.  
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Scelta delle specie animali  
Criceti cinesi e topi maschi sono gli animali più comunemente usati, 
ma si possono usare maschi di altre specie di mammiferi. Si scelgano individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di 
animali da laboratorio. All'inizio dello studio la variazione di peso tra 
gli animali deve essere minima e non superare ± 20 % del peso medio.
 
1.4.1.2.  Condizioni di stabulazione e alimentazione  
Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla 
parte B; l'umidità ideale è pari al 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preparazione degli animali  
Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi 
di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in modo da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli 
animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle con ­
dizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 386
 
1.4.1.4.  Preparazione delle dosi  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono es ­
sere aggiunte diretta-mente alla coltura o diluite prima del trattamen ­
to. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conserva ­
zione è ammissibile.
 
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
11 solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle 
dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esa ­
me. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se 
suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Si raccomanda di 
prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso.
 
1.4.2.2.  Controlli  
Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e negativi (solvente/ ­
mezzo disperdente). Gli animali dei vari gruppi dovranno essere 
trattati in modo identico, salvo per la somministrazione della so ­
stanza in esame.  
I controlli positivi dovrebbero produrre aberrazioni strutturali  in vivo  
negli spermatogoni a livelli di esposizione ai quali è previsto un aumento rilevabile rispetto alla media.
 
Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli 
effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l'iden ­
tità dei vetrini codificati. È ammissibile che le sostanze per i controlli 
positivi siano somministrate per una via diversa dalla sostanza in esame e che il campionamento venga effettuato una sola volta, È anche ammissibile l'uso per i controlli positivi di sostanze di una 
classe chimica correlata, se ne esistono. Fra gli esempi di sostanze 
per i controlli positivi si citano:
 
Sostanza N. CAS N. Einecs  
Ciclofosfammide 
Ciclofosfammide monoidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cicloesilammina 108-91-8 203-629-0 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
Acrilammide monomerica 79-06-1 201-173-7 
Trietilenmelammina 51-18-3 200-083-5  
In ogni fase del campionamento si proceda a controlli negativi, cui 
sia somministrato solo il solvente o il mezzo disperdente, senza altre 
differenze di trattamento, salvo che dati precedenti dimostrino che la 
variabilità intraspecifica e la frequenza di cellule con aberrazioni cromosomiche sono accettabili. Si ricorra anche controlli negativi non trattati, salvo che risultati di test precedenti o dati citati in 
letteratura dimostrino che il solvente/mezzo disperdente scelto non 
induce effetti nocivi o mutageni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 387
 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Numero degli animali  
Ogni gruppo trattato e ogni gruppo di controllo deve essere compo ­
sto di almeno 5 maschi analizzabili.  
1.5.2.  Protocollo di trattamento  
Le sostanze in esame sono somministrate di preferenza in un'unica 
volta, o in due volte. Possono essere somministrate anche in dosi 
frazionate, ad esempio in due volte nello stesso giorno, a distanza di qualche ora al massimo, per agevolare la somministrazione, trattan ­
dosi di un prodotto di grande volume. Se si usa una posologia 
diversa, se ne fornisca la motivazione scientifica.
 
Dopo il trattamento si proceda al prelievo di due campioni nel 
gruppo cui è stata somministrata la dose massima. Poiché la cinetica 
del ciclo cellulare può essere influenzata dalla sostanza in esame, si effettuino un campionamento precoce e uno tardivo, rispettivamente 24 e 48 ore dopo il trattamento. Per dosi diverse dalla dose massima 
è opportuno procedere al prelievo 24 ore dopo il trattamento, o dopo 
un periodo pari a 1,5 volte la durata del ciclo cellulare, salvo sia noto che un campionamento in un momento diverso è più idoneo a iden ­
tificare l'effetto ricercato (6).
 
Si possono effettuare ulteriori prelievi. Ad esempio, per sostanze 
chimiche che possono indurre perdita di cromosomi o che possono 
esercitare effetti indipendenti dalla fase S, può essere opportuno effettuare un campionamento più precoce (1).
 
L'opportunità di un protocollo di trattamento ripetuto deve essere 
valutata caso per caso. Dopo un protocollo ripetuto gli animali de ­
vono essere sacrificati 24 ore (1,5 volte la durata del ciclo cellulare) 
dopo l'ultima somministrazione. Si possono usare fasi di campiona ­
mento addizionali, se opportuno.  
Prima di sacrificare gli animali si inietti per via interperitoneale una 
dose adeguata di un inibitore della mitosi (ad esempio Colcemid  ® o 
colchicina). Gi animali saranno quindi sacrificati dopo un adeguato 
lasso di tempo. Per i topi si tratterà di circa 3-5 ore; per i criceti 
cinesi di circa 4-5 ore.  
1.5.3.  Dosi  
Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non 
essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello stesso laboratorio, sulla stessa specie e ceppo, con il medesimo protocollo usato nel test principale (7). In caso di tossicità si usino 
per la prima fase di campionamento tre dosi diverse, che vadano 
dalla tossicità massima ad una tossicità assente o modica. Per il campionamento successivo si usi solo la dose massima. La dose massima è definita come dose che produce segni di tossicità tali 
che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibil ­
mente letali.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 388
 
Sostanze con azione biologica specifica, a dosi basse non tossiche 
(come ormoni e mitogeni) possono costituire eccezione rispetto ai 
criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. La dose massima può essere definita anche come dose che produce qualche segno di tossicità negli spermatogoni (ad esempio una ridu ­
zione del coefficiente mitotico alla prima e alla seconda metafase 
meiotica; tale diminuzione non dovrebbe essere superiore al 50 %).
 
1.5.4.  Test con dose limite  
Se la somministrazione di una quantità di sostanza pari ad almeno 
2 000 mg/kg di peso corporeo in dose unica o in due dosi nello 
stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non vi sono ragioni di sospettare un'azione genotossica sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente correlate, si può considerare che 
non è necessario procedere alla sperimentazione completa con tre 
dosi diverse. Sulla base dell’esposizione umana prevista per la so ­
stanza in esame, può essere necessario usare una dose più elevata nel test con dose limite.
 
1.5.5.  Somministrazione  
La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda ga ­
strica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperi ­
toneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragio ­
ne. Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta 
con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'ani ­
male da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corpo ­
reo. L'uso di volumi più elevati deve essere motivato. Salvo per 
sostanze irritanti o corrosive, che di norma riveleranno effetti esa ­
cerbati a concentrazioni più elevate, le variazioni di volume devono essere minimizzate, regolando la concentrazione in modo da garan ­
tire un volume costante a tutte le dosi.
 
1.5.6.  Preparazione dei cromosomi  
Le sospensioni cellulari ottenute da uno o da entrambi i testicoli 
immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato sono esposte 
ad una soluzione ipotonica e fissate. Le cellule sono poi spalmate su 
vetrini e sottoposte a un processo di colorazione.  
1.5.7.  Analisi  
Per ogni animale si analizzino almeno 100 cellule in metafase cor ­
rettamente spalmate (cioè almeno 500 metafasi per gruppo). Tale 
numero può essere ridotto se si osservano numerose aberrazioni. Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, de ­
vono essere codificati indipendentemente prima dell'esame al micro ­
scopio. Poiché le procedure di fissaggio dei vetrini causano spesso la 
rottura di una parte delle cellule in metafase con perdita di cromo ­
somi, le cellule esaminate devono contenere un numero di centromeri pari a 2n ± 2.
 
2. RISULTATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati relativi ai singoli animali vanno presentati in forma di tabelle. 
L'unità sperimentale è l'animale. Per ciascun animale si valuti la 
percentuale di cellule con aberrazioni cromosomiche strutturali e il 
numero di aberrazioni per cellula. I vari tipi di aberrazioni cromo ­
somiche strutturali, il loro numero e la loro frequenza devono essere indicati per i gruppi di trattamento e di controllo. I gap devono 
essere registrati separatamente e indicati nella relazione, ma non 
vanno di norma inclusi nella frequenza totale delle aberrazioni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 389
 
Se si osservano tanto mitosi che meiosi, al fine di stabilire un even ­
tuale effetto citotossico si determini il rapporto fra le mitosi degli 
spermatogoni e la prima e seconda metafase meiotica per tutti gli animali trattati e per i controlli negativi, su un campione totale di 100 cellule in divisione per animale. Se si osservano solo mitosi, si 
determini il coefficiente mitotico in almeno 1 000 cellule per anima ­
le.
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, ad 
esempio un aumento del numero relativo di cellule che presentano aberrazioni cromosomiche, correlato alla dose somministrata, o un palese aumento del numero di cellule con aberrazioni nei campioni, 
prelevati alla stessa fase di campionamento e provenienti da un 
gruppo cui è stata somministrata la stessa dose della sostanza in esame. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Si possono usare metodi statistici come ausilio 
nella valutazione dei risultati sperimentali (8), ma la significatività 
statistica non dovrebbe essere l'unico fattore determinante di una risposta positiva. Eventuali risultati ambigui possono essere chiariti mediante test ulteriori, preferibilmente in condizioni di esperimento 
modificate.
 
Una sostanza che fornisca risultati non corrispondenti ai criteri di cui 
sopra è considerata non mutagena in questo test.  
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti 
non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.
 
Risultati positivi del saggio  in vivo  di aberrazione cromosomica negli 
spermatogoni indicano che una sostanza induce aberrazioni cromo ­
somiche nelle cellule germinali della specie sottoposta a test. Risul ­
tati negativi indicano che nelle condizioni del test la sostanza in esame non induce aberrazioni cromosomiche nelle cellule germinali della specie sottoposta a test.
 
Si vaglino le probabilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti 
raggiungano specificamente il tessuto bersaglio.  
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio deve contenere le seguenti informazioni:  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente,  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se note.  
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo usati,  
— numero ed età degli animali,  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso dei singoli animali all'inizio del test, con intervallo, media e 
deviazione standard per ciascun gruppo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 390
 
Condizioni di esperimento:  
— risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effet ­
tuato,  
— criteri di selezione delle dosi,  
— criteri di selezione della via di somministrazione,  
— illustrazione particolareggiata della preparazione della sostanza in 
esame,  
— illustrazione particolareggiata della somministrazione della so ­
stanza in esame,  
— criteri di determinazione del momento del sacrificio,  
— conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame 
nel cibo o nell'acqua potabile nella dose di cellule analizzate per animale,
 
— effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno), se del caso,  
— dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,  
— descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e campiona ­
mento,  
— metodi di misura della tossicità,  
— natura e concentrazione dell'inibitore della mitosi, durata del 
trattamento,  
— metodi di preparazione dei vetrini,  
— criteri di conteggio delle aberrazioni,  
— numero criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, 
negativi o ambigui.  
Risultati:  
— segni di tossicità,  
— coefficiente mitotico,  
— tasso di mitosi degli spermatogoni in rapporto alla prima 
e seconda metafase meiotica,  
— tipo e numero delle aberrazioni, indicati separatamente per cia ­
scun animale,  
— numero totale delle aberrazioni per gruppo,  
— numero di cellule con aberrazioni per gruppo,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— eventuali analisi statistiche,  
— dati sui controlli negativi paralleli,  
— dati sui precedenti controlli negativi con intervalli, inedie e de ­
viazioni standard,  
— dati sui controlli positivi paralleli,  
— eventuali cambiamenti di ploidia.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 391
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Adler, I.D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Spe ­
cifications, in:  Genetic Toxicology of Environmental Chemi ­
cals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis , Ramel, 
C., Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York. pp. 477-484.
 
(2) Adler, I.D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in:  Mutage­
nicity Testing: a Practical Approach,  ed. S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.  
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Te ­
stes, Cytogenetics and Cell Genetics , 3, pp. 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson L. (1990),  In Vìvo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.), Basic  Mutagenicily Tests, UKEMS Recommen ­
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tagenicity Testìng. Report. Part I revised,  Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes,  Mu­
tation Res., 52,  pp. 207-209.  
(6) Adler, I.D., Shelby, M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka, N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test 
Procedures. Summary Report of the Working Group on Mam ­
malian Germ Cell Tests,  Mutation  Res., 312, pp. 313-318.  
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland D.J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis,  7, pp. 313-319.
 
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage,].R.K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D.J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation  of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines far Mutagenicity Testing, report, Part III,  Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 392
 
B.24  SAGGIO DELLE MACCHIE (SPOT TEST): TOPI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
Quello qui considerato è un saggio  in vivo  nei topi, nel quale ven ­
gono esposti alle sostanze chimiche degli embrioni in corso di svi ­
luppo. Le cellule-bersaglio negli embrioni in corso di sviluppo sono i 
melanoblasti e i geni-bersaglio sono quelli che governano la pigmen ­
tazione del pelame dell'animale. Gli embrioni in corso di sviluppo sono eterozigoti per una serie di detti geni della colorazione del mantello. Una mutazione nell'allele dominante di un gene di questo 
tipo in un melanoblasto, o la sua perdita (tramite diversi eventi 
genetici) ha come risultato l'espressione del fenotipo recessivo nelle sue cellule discendenti, costituita da una macchia di colore cambiato nel mantello del topo risultante. Si riporta quindi il numero della 
prole con dette macchie o mutazioni, e se ne raffronta la frequenza 
con quella riscontrata nella prole risultante da embrioni trattati sol ­
tanto con il solvente. Il saggio delle macchie (spot test) nei topi rivela presunte mutazioni somatiche nelle cellule fetali.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
Quando ciò è possibile, le sostanze in esame vengono disciolte o 
poste in sospensione in soluzione salina isotonica. Le sostanze non solubili in acqua vengono disciolte o poste in sospensione in solventi 
appropriati. Il solvente usato non deve interferire con la sostanza in 
esame né produrre effetti tossici. È opportuno usare preparazioni fresche della sostanza in esame.
 
A n i m a l i d a e s p e r i m e n t o  
Si accoppiano topi del ceppo T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, 
c ch p/c hp; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, 
s/s) con il ceppo HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) o con C57 BL (nonagouti, a/a). Possono essere usati anche altri incroci appropriati, ad esempio fra 
NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) e DBA (nonagouti, a/a; brown, 
b/b; dilute d/d), a condizione che producano prole nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 393
 
N u m e r o e s e s s o  
Viene trattato un numero di femmine gravide sufficiente per ottenere 
un numero appropriato di prole sopravvivente per ciascun livello di dosaggio usato. Le dimensioni appropriate del campione sono deter ­
minate dal numero delle macchie osservate nei topi trattati e dalla 
scala dei dati di controllo. Un risultato negativo è accettabile soltanto 
quando si siano riscontrati almeno 300 figli di femmine trattate con la dose più alta.
 
C o n t r o l l i p o s i t i v i e n e g a t i v i  
È opportuno che siano disponibili dati di controllo simultanei otte ­
nuti su topi trattati soltanto con il solvente (controlli negativi). Even ­
tuali dati storici di controllo del medesimo laboratorio possono essere 
messi insieme con i dati di controllo nuovi in modo da accrescere la 
sensibilità del saggio, a condizione che essi siano omogenei. Se non si rileva alcuna mutagenicità per la sostanza in esame, dovrebbero essere disponibili dati di controllo positivo ottenuti di recente nel 
medesimo laboratorio in seguito a trattamento con una sostanza della 
quale sono noti gli effetti di mutagenicità con questo saggio.
 
V i e d i s o m m i n i s t r a z i o n e  
Le vie abituali di somministrazione sono l'intubazione orale e l'inie ­
zione intraperitoneale delle femmine gravide. Nei casi in cui ciò possa essere appropriato, si fa uso anche del trattamento per inala ­
zione o di altre vie di somministrazione.
 
L i v e l l i d i d o s e  
Si fa uso di almeno due livelli di dose, con uno dei livelli che dà 
luogo a segni di tossicità o ad una riduzione delle proporzioni della 
figliata. Per le sostanze non tossiche è opportuno ricorrere all'espo ­
sizione alla dose massima praticabile.  
Procedimento  
Viene di norma praticato un unico trattamento nel giorno 8, 9 o 10 
di gravidanza, contando come giorno 1 quello in cui si è osservato per la prima volta il tappo vaginale. Detti giorni corrispondono a 7,25, 8,25 e 9,25 giorni dopo il concepimento. Possono essere pra ­
ticati trattamenti successivi nel corso di detti giorni.
 
A n a l i s i  
La prole viene codificata e nel periodo fra tre o quattro settimane 
dopo la nascita si effettua su di essa l'analisi delle macchie pigmen ­
tale. Si distinguono tre categorie di macchie:  
a) macchie bianche a distanza fino a 5 mm dalla linea ventrale 
mediana, che si presume derivino dall'uccisione di cellule 
(WMVS);  
b) macchie gialle di tipo aguti, associate con le mammelle, gli or ­
gani genitali, le zone della gola, delle ascelle e dell'inguine e la parte mediana della fronte, che si presume derivino da difettoso 
differenziamento (MDS);
 
c) macchie pigmentate e bianche distribuite in disordine sul manto, 
che si presume derivino da mutazioni somatiche (RS).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 394
 
Devono essere osservate tutte e tre le categorie, ma ha rilevanza 
genetica soltanto l'ultima, RS. Eventuali problemi per quel che ri ­
guarda la distinzione fra MDS e RS possono essere risolti mediante microscopia fluorescente di peli presi come campione.
 
Va presa nota di evidenti anomalie morfologiche grossolane della 
prole.  
2. DATI  
I dati vengono presentati sotto forma del numero totale dei discen ­
denti esaminati e del numero dei discendenti che hanno una o più 
macchie da mutazione somatica presunta. I dati relativi ai trattamenti 
ed al controllo negativo vengono posti a raffronto secondo metodi statistici appropriati. I dati sono anche presentati su base per prole.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— ceppi usati nell'incrocio,  
— numero di femmine gravide nei gruppi trattati e nei gruppi di 
controllo,  
— dimensioni medie delle figliate nei gruppi trattati ed in quelli di 
controllo alla nascita ed allo svezzamento,  
— livelli di dose della sostanza in esame,  
— solvente usato,  
— giorno di gravidanza al quale è stato praticato il trattamento,  
— vie di somministrazione del trattamento,  
— numero complessivo dei discendenti esaminati, e numero dei 
discendenti con WMVS, MDS e RS nei gruppi trattati e in quelli 
di controllo,  
— anomalie morfologiche grossolane,  
— relazione dose/risposte di RS quando ciò sia possibile,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 395
 
B.25  TRASLOCAZIONI EREDITABILI: TOPO  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
I1 saggio delle traslocazioni ereditabili nel topo rivela cambiamenti 
strutturali e numerici dei cromosomi nelle cellule germinali di mam ­
miferi quali sono recuperate nella progenie della prima generazione. I tipi di mutazioni cromosomiche sono delle traslocazioni reciproche e, Se è compresa progenie femminile, la perdita del cromosoma X. I 
portatori di traslocazione e le femmine XO presentano fertilità ridotta 
e di ciò è fatto uso per la selezione di progenie F
 1 , per l'analisi 
citogenetica. Taluni tipi di traslocazioni (autosoma-X e tipo c-t) pro ­
vocano sterilità completa, Le traslocazioni sono citogeneticamente 
osservabili in cellule meiotiche alla diacinesi della metafase I di 
individui di sesso maschile, che sono o maschi F  1 , o figli di femmine 
F 1 . Le femmine XO sono identificate citogeneticamente dalla pre ­
senza di 39 cromosomi soltanto nelle mitosi del midollo osseo.  
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
Le sostanze chimiche in esame vengono disciolte in soluzione salina 
isoconica. Se insolubili esse vengono disciolte o poste in sospensione 
in solventi appropriati. È fatto uso di soluzioni della sostanza in 
esame preparate di fresco. Se si fa uso di un solvente per facilitare il dosaggio, esso non deve interferire con il composto in esame né dar luogo ad effetti tossici.
 
V i e d i s o m m i n i s t r a z i o n e  
Le vie di somministrazione sono solitamente l'intubazione orale o 
l'iniezione intraperitoneale. Possono essere appropriate altre vie di somministrazione.
 
A n i m a l i d a e s p e r i m e n t o  
Per la facilità della riproduzione e della verifica citologica, gli espe ­
rimenti in questione vengono effettuati sui topi. Non è necessario alcun ceppo di topi specifico. Tuttavia, nell'effettuazione di prove 
riguardanti la fertilità è opportuno che le dimensioni medie della 
figliata del ceppo usato siano di più di 8 neonati e siano inoltre relativamente costanti.
 
Sono usati animali sani sessualmente maturi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 396
 
N u m e r o d i a n i m a l i  
Il numero degli animali occorrenti dipende dalla frequenza delle 
traslocazioni spontanee, e dal tasso minimo di induzione necessario per un risultato positivo.
 
Il saggio si effettua normalmente mediante analisi della progenie 
maschile F  1 . E opportuno esaminare almeno 500 capi di progenie 
maschile F  1 per ciascun gruppo/dose. Se si include progenie femmi ­
nile F  1 , occorrono 300 maschi e 300 femmine.  
U s o d i c o n t r o l l i n e g a t i v i e p o s i t i v i  
Dovrebbero essere disponibili dati adeguati di controllo, derivati da 
controlli simultanei o storici. Qualora siano disponibili dati accetta ­
bili di controllo positivo da esperimenti condotti di recente nello stesso laboratorio, questi risultati possono essere usati in luogo del 
controllo positivo simultaneo.
 
L i v e l l i d i d o s e  
Si sperimenta un solo livello di dose, ossia solitamente la dose più 
alta associata con la produzione dei minimi effetti tossici, ma senza 
che sia influenzato il comportamento riproduttivo o la sopravvivenza. 
Per stabilire una relazione dose/risposta sono necessarie due dosi supplementari più basse. Per le sostanze non tossiche è opportuno adottare un'esposizione alla dose massima praticabile.
 
Procedimento  
T r a t t a m e n t o e a c c o p p i a m e n t o  
Sono possibili due schemi di trattamento. Nello schema più larga ­
mente usato è praticata un'unica somministrazione della sostanza in 
esame. Si può tuttavia procedere anche all'applicazione della so ­
stanza in esame 7 giorni per settimana per 35 giorni. Il numero degli accoppiamenti successivi al trattamento è determinato 
dal programma di trattamento adottato, e deve essere stabilito in 
modo che siano considerati tutti gli stadi delle cellule germinali trattate. Al termine del periodo di accoppiamento, le femmine ven ­
gono tenute in gabbie individuali. Quando le femmine partoriscono, 
si prende nota della data, del numero e del sesso della progenie. 
Tutta la progenie maschile viene svezzata, mentre tutta la progenie femminile viene scartata, salvo nel caso che la si includa nell'espe ­
rimento.
 
C o n t r o l l o d e l l a e t e r o z i g o s i d i t r a s l o c a z i o n e  
È praticato l'uno o l'altro di due metodi possibili:  
— analisi della fertilità della progenie F  1 e successiva verifica degli 
eventuali portatori di traslocazione mediante analisi citogenetica,  
— analisi citogenetica di tutta la progenie maschile F  1 senza sele ­
zione preliminare mediante analisi della fertilità.  
a) Analisi della fertilità  
La diminuzione della fertilità di un individuo F  1 può essere 
stabilita attraverso l'osservazione delle dimensioni della figliata e/o dell'analisi del contenuto uterino delle femmine accoppiate.
 
Devono essere stabiliti dei criteri specifici per la determinazione 
della fertilità normale e della fertilità diminuita nel ceppo di topi 
usato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 397
 
Osservazione dell'entità delle figliate: i maschi F  1 da sottoporre al 
saggio vengono posti in gabbia individualmente con femmine del 
medesimo esperimento o della colonia. Le gabbie vengono ispe ­
zionate giornalmente a partire da 18 giorni dopo l'accoppiamento. Viene presa nota alla nascita dell'entità della figliata e del sesso 
dalla progenie F
 2 e le figliate vengono successivamente scartate. 
Se si sottopone al saggio la progenie femminile F  1 , si tiene la 
progenie F  2 di piccole figliate per un'ulteriore sperimentazione. 
Le portatrici femmine di traslocazioni sono verificate mediante 
analisi citogenetica di una traslocazione in uno qualsiasi dei loro 
discendenti maschi. Le femmine XO si riconoscono dal cambia ­
mento del rapporto fra i sessi nella loro progenie (maschi/ ­
femmine da 1:1 a 1:2). In un procedimento in serie si escludono 
gli animali F  1 normali da sperimentazioni ulteriori se la prima 
figliata F  2 raggiunge o supera un valore normale predeterminato, 
altrimenti si osserva una seconda o una terza figliata F  2 . 
Gli animali F  1 che non possono essere classificati come normali 
dopo l'osservazione di un numero di figliate F  2 fino a tre ven ­
gono saggiati ulteriormente mediante l'analisi del contenuto ute ­
rino delle femmine con essi accoppiate, oppure sono direttamente sottoposti all'analisi citogenetica.
 
Analisi del contenuto uterino: la diminuzione dell'entità delle 
figliate nei portatori di traslocazioni è dovuta a morte dell'em ­
brione, e di conseguenza un numero elevato di impianti morti è indicativo della presenza di una traslocazione nell'animale all'esa ­
me. I maschi F
 1 da sottoporre al saggio vengono accoppiati con 
due, tre femmine ciascuno. Il concepimento viene determinato 
mediante ispezione giornaliera per l'osservazione di tappi vaginali fra le 8 e le 10 antimeridiane. Le femmine vengono uccise da 14 a 16 giorni dopo e viene presa nota degli impianti sia vivi che 
morti nei loro uteri.
 
b) Analisi citogenetica  
Si allestiscono preparati di testicoli con la tecnica dell'essicca ­
zione in aria. I portatori di traslocazioni sono identificati in base 
alla presenza di configurazioni multivalenti alla diacinesi di me ­
tafasi I degli spermatociti primari. L'osservazione di almeno due cellule con associazione multivalente costituisce la prova occor ­
rente che l'animale sottoposto al saggio è un portatore di traslo ­
cazione.
 
Se non si è proceduto ad alcuna selezione nell'allevamento, sono 
esaminati citogeneticamente tutti i maschi F  1 . Deve essere riscon ­
trato al microscopio un minimo di 25 diacinesi metafasi I per 
maschio. Per i maschi F  1 con testicoli piccoli e con degradazione 
meiotica prima della diacinesi e per le femmine F  1 sospette di 
XO è necessario l'esame delle metafasi mitotiche, degli sperma ­
togoni o del midollo osseo. La presenza di un cromosoma inso ­
litamente lungo e/o corto in ognuna di 10 cellule è il segno di 
una traslocazione particolare sterile del maschio (tipo c-t). Talune traslocazioni di autosoma X che provocano la sterilità del ma ­
schio possono essere identificate soltanto raggruppando l'analisi 
dei cromosomi mitotici. La presenza di 39 cromosomi nella to ­
talità di 10 mitosi è il segno di una condizione di XO in una femmina.
 
2. DATI  
I dati sono presentati in forma di tabelle.  
Sono riportati l'entità media delle figliate e il rapporto fra i sessi 
dagli accoppiamenti dei genitori alla nascita e allo svezzamento per 
ciascun intervallo di accoppiamento.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 398
 
Per la valutazione della fertilità degli animali F  1 sono presentate le 
entità medie delle figliate di tutti gli accoppiamenti normali e le 
entità delle figliate singole dei portatori di traslocazioni F  1 . Per 
l'analisi del contenuto uterino è dato ragguaglio del numero medio degli impianti vivi e morti degli accoppiamenti normali e 
del numero individuale degli impianti vivi e morti per ciascun ac ­
coppiamento di portatori di traslocazione F
 1 . 
Per l'analisi citogenetica della diacinesi metafase I sono elencati per 
ciascun portatore di traslocazione il numero di tipi di configurazioni multivalenti ed il numero totale delle cellule.
 
Per gli individui F  1 sterili sono riportati il numero totale degli ac ­
coppiamenti e la durata del periodo di accoppiamento. Sono forniti i pesi dei testicoli e dettagli delle analisi citogenetiche.
 
Per le femmine XO sono riportati l'entità media delle figliate, il 
rapporto fra i sessi della progenie F  2 e i risultati dell'analisi citoge ­
netica.  
Se possibile i portatori di traslocazioni vengono preselezionati per 
mezzo di analisi della fertilità; le tabelle devono in tal caso recare 
l'indicazione del numero di soggetti così selezionati che sono risultati eterozigoti di traslocazione confermati.
 
Sono parimenti riportati i dati dei controlli negativi e degli esperi ­
menti di controllo positivo.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— ceppo dei topi, età degli animali, pesi degli animali trattati,  
— numero di animali genitori dell'uno e dell'altro sesso nei gruppi 
sottoposti al saggio e nei gruppi di controllo,  
— condizioni di effettuazione del saggio, descrizione particolareg ­
giata del trattamento, livelli di dosaggio, solventi, programmi di accoppiamento,
 
— numero e sesso dei piccoli nati per femmina, numero e sesso dei 
piccoli allevati per l'analisi della traslocazione,  
— tempo e criteri dell'analisi della traslocazione,  
— numero e descrizione particolareggiata dei portatori di trasloca ­
zioni ivi compresi i dati riguardanti la procreazione e i dati sul 
contenuto uterino, se del caso,  
— procedimenti citogenetici e dettagli delle analisi microscopiche, 
di preferenza con illustrazioni,  
— valutazione statistica,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 399
 
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 400
 
B.26  TEST DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA — STUDIO 
DELLA TOSSICITÀ ORALE CON SOMMINISTRAZIONE 
RIPETUTA DI DOSI PER 90 GIORNI SUI RODITORI  
1. METODO  
Questo metodo di tossicità subcronica corrisponde al TG 408 (1998) 
dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Nella valutazione e nel giudizio delle caratteristiche tossiche di una 
sostanza chimica è possibile determinare la tossicità orale subcronica con dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità 
mediante test di tossicità acuta o con dosi ripetute per 28 giorni. Lo 
studio di 90 giorni fornisce informazioni sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall'esposizione ripetuta per un pe ­
riodo di tempo prolungato che copre la maturazione post-svezza ­
mento e la crescita, fino all'età adulta. Con questo studio si otter ­
ranno dati sui principali effetti tossici, sugli organi bersaglio e sulla possibilità di accumulo, mediante i quali si potrà stimare il livello di esposizione al quale non si osservano effetti avversi, che può essere 
utilizzato per scegliere i livelli delle dosi per gli studi cronici e per 
definire i criteri di sicurezza relativi all'esposizione di soggetti umani.
 
Il metodo pone ulteriore enfasi sugli endpoint neurologici e fornisce 
un'indicazione degli effetti immunologia e riproduttivi. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di infor ­
mazioni. Il presente studio dovrebbe permettere l'identificazione di 
sostanze chimiche che abbiano la capacità potenziale di provocare effetti neurotossici, o sul sistema immunologico) o sugli organi della riproduzione che potrebbero richiedere ulteriori indagini approfondite.
 
Cfr. anche introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Dose:  quantità della sostanza di prova somministrata. La dose si 
esprime in termini di peso (g, mg) o di peso della sostanza in esame 
per unità di peso dell'animale sperimentale (ad esempio mg/kg), 
oppure in termini di concentrazioni dietetiche costanti (ppm).  
Dosaggio:  termine generico che comprende la dose, la frequenza e la 
durata della somministrazione.  
NOAEL:  abbreviazione di «no observed adverse effect level» (li ­
vello al quale non si osservano effetti dannosi): il più alto livello di dose a cui non si osservano effetti avversi correlati al trattamento.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
Ogni giorno, per un periodo di 90 giorni, si somministra per via 
orale la sostanza in esame in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento, laddove ad ogni gruppo corrisponde un determinato 
livello di dose. Durante il periodo di somministrazione si tengono gli 
animali sotto attenta osservazione per individuare eventuali segni di tossicità. Gli animali che muoiono o vengono sacrificati durante il test sono sottoposti a esame necroscopico e, a conclusione del test, 
anche gli animali sopravvissuti vengono sacrificati e sottoposti a 
esame necroscopico.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 401
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.4.1.  Preparazione degli animali  
Si utilizzano solo animali sani che siano stati acclimatati alle condi ­
zioni di laboratorio per almeno 5 giorni e non siano stati sottoposti a 
precedenti procedure sperimentali. Gli animali in esame vanno ca ­
ratterizzati per specie, ceppo, origine, sesso, peso e/o età. L'assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. Le gabbie vanno disposte in 
modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla collocazione. 
A ogni animale deve essere assegnato un numero di identificazione esclusivo.
 
1.4.2.  Preparazione delle dosi  
La sostanza di prova viene somministrata mediante sonda gastrica, 
oppure con la dieta o l'acqua di abbeveraggio. Il metodo di sommini ­
strazione orale dipende dallo scopo dello studio e dalle caratteristiche fisico-chimiche del materiale da esaminare.
 
Se necessario, la sostanza di prova viene disciolta o posta in sospen ­
sione in un veicolo adeguato. Dove possibile, si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione la possibilità di utilizzare una 
soluzione/sospensione acquosa, indi una soluzione/emulsione in olio 
(ad esempio olio di mais) e infine una soluzione in altri veicoli. Se si usano veicoli diversi dall'acqua è necessario conoscerne le caratteri ­
stiche tossiche. Occorre inoltre determinare la stabilità della sostanza 
di prova nelle condizioni di somministrazione.
 
1.4.3.  Condizioni di esecuzione del test  
1.4.3.1.  Animali sperimentali  
La specie di elezione è il ratto, sebbene si possano utilizzare anche 
altre specie di roditori, come il topo. È bene usare ceppi di animali 
giovani adulti sani comunemente utilizzati in laboratorio. Le fem ­
mine devono essere nullipare e non gravide. La somministrazione dovrebbe iniziare al più presto possibile dopo lo svezzamento e 
comunque prima che gli animali abbiano raggiunto le nove settimane 
di vita. All'inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Per gli studi preliminari a studi della tossicità cronica 
a lungo termine, è necessario usare animali dello stesso ceppo e 
provenienti dalla stessa origine in entrambi gli studi.
 
1.4.3.2.  Numero e sesso  
Per ciascun livello di dose vanno usati almeno 20 animali (dieci 
femmine e dicci maschi). Qualora si preveda di sacrificare a inter ­
valli intermedi alcuni animali, il numero iniziale va aumentato del 
numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completa ­
mento dello studio. In base alle precedenti conoscenze sulla sostanza chimica o su una sostanza analoga, occorre valutare la possibilità di 
includere un ulteriore gruppo satellite di dieci animali (cinque per 
sesso) nel gruppo di controllo e in quello trattato col livello di dose più elevato, allo scopo di osservare, dopo il periodo di trattamento, la reversibilità o la persistenza di eventuali effetti tossici. La durata di 
tale periodo post-trattamento va stabilita adeguatamente tenendo 
conto degli effetti osservati.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 402
 
1.4.3.3.  Livelli di dose  
Occorre utilizzare almeno tre livelli di dose e un controllo concomi ­
tante, tranne quando si esegue un test limite (cfr. 1.4.3.4). 1 livelli di dose possono essere basati sui risultati di precedenti studi con dosi 
ripetute o di definizione del range e devono tenere conto dei dati 
tossicologici e tossicocinetici esistenti relativi alla sostanza in esame o a materiali analoghi. A meno che non sia limitato dalla natura fisico-chimica o dagli effetti biologici della sostanza in esame, il 
livello di dose più elevato va scelto con l'obiettivo di indurre tossi ­
cità, senza provocare il decesso o gravi sofferenze agli animali. Occorre scegliere una sequenza decrescente dei livelli di dose per 
poter eventualmente dimostrare la correlazione dosaggio/risposta e 
un NOAEL al livello di dose più basso. In genere, per definire i livelli decrescenti di dose si consiglia l'impiego di intervalli multipli di un numero compreso fra due e quattro e, spesso, l'aggiunta di un 
quarto gruppo sperimentale è preferibile all'uso di intervalli molto 
ampi (ad esempio, più di un fattore di circa 6-10) fra i dosaggi.
 
Il gruppo di controllo deve essere non trattato oppure, se per som ­
ministrare la sostanza di prova si impiega un veicolo, trattato solo 
con il veicolo. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di 
controllo deve riceverne il volume più elevato somministrato. Se la 
sostanza di prova viene somministrata con la dieta e concorre a ridurre l'assunzione di cibo da parte degli animali, per distinguere fra la riduzione dovuta a questo fatto e quella determinata dalle 
alterazioni tossicologiche può essere utile un gruppo di controllo 
pair-fed.
 
Occorre tenere conto delle seguenti caratteristiche del veicolo e di 
eventuali altri additivi: effetti su assorbimento, distribuzione, meta ­
bolismo o ritenzione della sostanza di prova; effetti sulle proprietà chimiche della sostanza di prova che potrebbero alterarne le caratte ­
ristiche tossiche; effetti sui consumo di cibo o di acqua o sulle 
condizioni nutrizionali degli animali.
 
1.4.3.4.  Test limite  
Se impiegando la procedura descritta per il presente studio, un test a 
un livello di dose equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso 
corporeo/die non produce effetti avversi e se, sulla base dei dati relativi a sostanze strutturalmente affini non si prevede tossicità, ci si può esimere dal condurre uno studio completo con tre livelli di 
dose. Il test limite non si applica quando l'esposizione di soggetti 
umani indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato.
 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Somministrazione delle dosi  
Le dosi della sostanza in esame devono essere somministrate quoti ­
dianamente, sette giorni alla settimana, per 90 giorni. Occorre giu ­
stificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio (ad esempio cinque giorni alla settimana). Se si utilizza una sonda gastrica o una 
cannula per intubazione, la somministrazione deve avvenire in dose 
unica. Il volume massimo di liquido somministrabile ogni volta di ­
pende dalle dimensioni dell'animale sperimentale, ma non deve su ­
perare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne in caso di soluzioni 
acquose per le quali si possono usare 2 ml/100 g di peso corporeo. 
Ad eccezione delle sostanze irritanti o corrosive, che in genere pro ­
ducono effetti più forti a concentrazioni più elevate, occorre ridurre al minimo la variabilità del volume da somministrare regolando! a 
concentrazione in modo da mantenere il volume costante a tutti i 
livelli di dose.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 403
 
Per le sostanze somministrate con la dieta o l'acqua di abbeveraggio 
è importante impedire che la quantità della sostanza in esame inter ­
ferisca con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liqui ­
di. Quando la sostanza in esame viene somministrata nella dieta si possono usare sia una concentrazione dietetica costante (ppm), sia un 
livello di dose costante in termini di peso corporeo dell'animale ed 
occorre motivare l'opzione scelta. Se si utilizza invece l'alimenta ­
zione forzata con sonda gastrica, la dose va somministrata ogni giorno più o meno alla stessa ora, regolandola adeguatamente per 
mantenere la dose a un livello costante rispetto al peso corporeo 
dell'animale. Se lo studio sul periodo di 90 giorni è preliminare ad uno studio sulla tossicità cronica a lungo termine, occorre utilizzare una dieta simile in entrambi.
 
1.5.2.  Osservazioni  
Il periodo di osservazione deve essere di almeno 90 giorni. Gli 
animali del gruppo satellite destinato a osservazioni di follow-up non vanno trattati per un periodo adeguato, allo scopo di individuare 
la persistenza o la remissione degli effetti tossici.
 
Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al giorno, 
preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di 
picco degli effetti previsti dopo la somministrazione. Occorre regi ­
strare le condizioni cliniche degli animali. Per identificare segni di morbilità e mortalità tutti gli animali vanno osservati almeno due volte al giorno, in genere all'inizio e alla fine della giornata.
 
Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche 
almeno una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all'interno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, una 
volta alla settimana. Le osservazioni vanno eseguite fuori dalla gab ­
bia di stabulazione, preferibilmente in un ambiente standard e sempre all'incirca allo stesso orario. Occorre registrare con cura le osserva ­
zioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti 
appositamente dal laboratorio che esegue l'esperimento. Occorre 
adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle con ­
dizioni di osservazione. I segni da osservare sono almeno i seguenti: cambiamenti a livello cutaneo, del pelo, degli occhi e delle mucose, 
presenza di secrezioni ed escrezioni e attività neurovegetativa (ad 
esempio lacrimazione, piloerezione, reazioni pupillari, alterazioni della respirazione). Vanno inoltre registrati cambiamenti dell'andatu ­
ra, della postura e della risposta alla manipolazione, nonché la pre ­
senza di movimenti tonici o clonici, stereotipie (ad esempio tendenza 
a pulirsi eccessivamente, a girare in cerchio) e comportamenti insoliti (ad esempio automutilazione, deambulazione a ritroso) (1).
 
Prima della somministrazione della sostanza in esame e a conclu ­
sione dello studio occorre eseguire un esame oftalmologico, me ­
diante un oftalmoscopio o analogo dispositivo idoneo, preferibil ­
mente su tutti gli animali o comunque almeno sul gruppo a cui viene 
somministrata la dose più elevata e sui controlli. Se si riscontrano 
alterazioni degli occhi è necessario esaminare tutti gli animali.  
Verso la fine del periodo di esposizione e comunque non prima 
dell’11  a settimana si valutano i seguenti parametri: reattività senso ­
riale a stimoli di vario tipo (1) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) (2), (3), (4), forza di presa (5) e attività motoria (6). Ulteriori particolari sulle procedure ammesse si trovano nei rispettivi 
riferimenti bibliografici, ma sono comunque accettabili procedure 
alternative.
 
Le osservazioni funzionali da effettuare verso la fine dello studio 
possono essere omesse se sono disponibili dati a questo riguardo 
derivati da altri studi e se le osservazioni cliniche quotidiane non 
hanno rivelato deficit funzionali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 404
 
Eccezionalmente è possibile omettere le osservazioni funzionali an ­
che per i gruppi che evidenzino comunque segni di tossicità tale da 
interferire in modo significativo con l'esecuzione dei test di funzio ­
nalità.  
1.5.2.1.  Peso corporeo e assunzione di cibo/acqua  
Tutti gli animali vanno pesati almeno una volta alla settimana. La 
misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza 
settimanale. Se la sostanza in esame viene somministrata con l'acqua di abbeveraggio, anche il consumo di acqua va misurato almeno a cadenza settimanale. È utile tener conto del consumo di acqua anche 
negli studi con somministrazione mediante dieta o sonda gastrica 
perché potrebbe risultare alterato.
 
l.5.2.2.  Ematologia e biochimica clinica  
Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico e conser ­
varli, se opportuno, in condizioni adeguate. Alla fine del test si 
raccolgono campioni di sangue subito prima o nel corso della pro ­
cedura di soppressione degli animali.  
I seguenti esami ematologici vanno eseguiti sui campioni prelevati 
alla fine e nel corso del test: ematocrito, concentrazione di emoglo ­
bina, conta degli eritrociti, conta totale e differenziale dei leucociti, 
conta delle piastrine e misurazione del potenziale di coagulazione (tempo).
 
Le determinazioni di biochimica clinica per lo studio degli effetti 
tossici gravi sui tessuti e, più specificatamente, degli effetti su reni e 
fegato, vanno condotte su campioni di sangue prelevati da ciascun animale subito prima o nel corso della procedura di 
soppressione degli animali (salvo gli esemplari moribondi e/o sacri ­
ficati nel frattempo). Analogamente agli esami ematologici, si pos ­
sono raccogliere campioni di sangue a intervalli intermedi per ese ­
guire test di biochimica clinica. Si raccomanda di lasciare gli animali 
a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (
 1 ). Le deter ­
minazioni, nel plasma o nel siero, devono comprendere sodio, po ­
tassio, glucosio, colesterolo totale, urea, azoto ureico, creatinina, proteine totali e albumina, ed almeno tre enzimi indicativi degli 
effetti epatocellulari (ad esempio alanina aminotransferasi, aspartato 
aminotransferasi, fosfatasi alcalina, gamma-glutamil-transpeptidasi e deidrogenasi del sorbitolo). Possono essere aggiunte anche misura ­
zioni di altri enzimi (epatici o di altra origine) e degli acidi biliari, 
che in alcune circostanze possono fornire utili informazioni.
 
A scelta, nel corso dell'ultima settimana di studio, è possibile ese ­
guire le seguenti analisi delle urine, raccolte in tempi prestabiliti: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glucosio 
e sangue/cellule ematiche.
 
È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sui 
marker sierologici dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni da eseguire se le proprietà note della sostanza possono, o si sospetta 
che possano, influire sui profili metabolici sono calcio, fosforo, tri ­
gliceridi a digiuno, ormoni specifici, metaemoglobina e colinesterasi. Queste determinazioni vanno effettuate per alcune classi di sostanze chimiche oppure caso per caso.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 405  
( 1 ) Per svariate misurazioni del siero e del plasma, e soprattutto per il glucosio, sarebbe 
preferibile mantenere il digiuno per tutta la notte. Il motivo principale è che l'aumento 
della variabilità dovuto inevitabilmente al mancato digiuno tenderebbe a mascherare 
effetti meno evidenti rendendo più difficile l'interpretazione. D'altro lato, però, il digiuno 
notturno può interferire con il metabolismo generale degli animali e, soprattutto negli 
studi sull'alimentazione, può incidere sull'esposizione quotidiana alla sostanza in esame. 
Se si adotta il digiuno notturno le osservazioni biochimiche cliniche vanno eseguite dopo 
le osservazioni funzionali.
 Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile in fun ­
zione delle specie e dell'effetto osservato e/o previsto relativo ad una 
data sostanza.  
Non disponendo di sufficienti dati pregressi occorre valutare se sia 
necessario determinare le variabili ematologiche e di biochimica cli ­
nica prima della somministrazione: in generale non è raccomandabile che tali dati siano generati prima del trattamento (7).
 
1.5.2.3.  Necroscopia macroscopica  
Tutti gli animali dello studio vanno sottoposti a completa e detta ­
gliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame 
della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Fegato, reni, 
ghiandole surrenali, testicoli, epididimi, utero, ovaie, timo, milza, 
cervello e cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da even ­
tuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la disse ­
zione, per evitare l'essiccamento.
 
I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più adat ­
to, sia per il tipo di tessuto, sia per il successivo esame istopatolo ­
gico che si intende effettuare: tutte le lesioni macroscopiche, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto, bulbo e/o ponte), midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e 
lombare), ghiandola pituitaria, tiroide, paratiroide, timo, esofago, 
ghiandole salivari, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, pancreas, reni, ghiandole surrenali, milza, 
cuore, trachea e polmoni (conservati con dilatazione e poi immer ­
sione in fissativo), aorta, gonadi, utero, annessi, ghiandola mammaria delle femmine, prostata, vescica, cistifellea (topo), linfonodi (prefe ­
ribilmente un linfonodo interessato dalla via di somministrazione e 
un altro distante dalla via di somministrazione per coprire gli effetti 
sistemici), un nervo periferico (sciatico o tibiale) preferibilmente in prossimità del muscolo, una sezione di midollo osseo (e/o un aspi ­
rato di midollo osseo fresco), cute e occhi (se gli esami oftalmologici 
hanno evidenziato alterazioni). I reperti clinici e di altro tipo possono 
evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre con ­
servati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle pro ­
prietà note della sostanza in esame.
 
1.5.2.4.  Esame istopatologico  
Gli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali del gruppo di 
controllo e del gruppo che riceve la dose più elevata vanno sottoposti 
a esame istopatologico completo. Si procede a questi esami anche sugli animali degli altri gruppi se nel gruppo a cui viene sommini ­
strata la dose più elevata si osservano alterazioni correlate al tratta ­
mento.
 
Vanno esaminate tutte le lesioni macroscopiche.  
Quando si utilizza un gruppo satellite l'esame istopatologico va ese ­
guito sui tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti 
nei gruppi trattati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 406
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
I dati devono essere forniti separatamente per ogni soggetto. Inoltre, 
tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per 
ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all'inizio 
della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi o soppressioni, il numero di animali che presentano segni di tossicità, 
una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento del ­
l'esordio, durata e gravita di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di 
animali rapportata al tipo di lesione.
 
I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico 
adeguato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da 
analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale.
 
2.2. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere le seguenti informazioni:  
2.2.1.  Sostanza di prova:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  
— veicolo (se utilizzato): motivazione per la scelta del veicolo, se 
diverso dall'acqua.  
2.2.2.  Specie di prova:  
— specie e ceppo usati,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— origine, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso dei singoli animali all'inizio del test.  
2.2.3.  Condizioni di esecuzione del test:  
— motivo della scelta del livello di dose,  
— dettagli sulla formulazione della sostanza in esame/preparazione 
dietetica, sulla concentrazione ottenuta, sulla stabilità e l'omoge ­
neità della preparazione,  
— dettagli sulla somministrazione della sostanza in esame,  
— dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/die) e fattore di conver ­
sione dalla concentrazione della sostanza di prova nella dieta/ ­
acqua di abbeveraggio (ppm) alla dose effettiva, se del caso,  
— particolari sulla qualità del cibo e dell'acqua.  
2.2.4.  Risultati:  
— peso corporeo e cambiamenti del peso corporeo,  
— assunzione di cibo ed eventualmente di acqua,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi i 
segni di tossicità,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 407
 
— natura, gravità e durata delle osservazioni cliniche (reversibili o 
meno),  
— risultati dell'esame oftalmologico,  
— valutazioni di attività sensoriale, forza di presa e attività motoria 
(se disponibili),  
— test ematologici con i relativi valori basali,  
— test biochimici clinici con i relativi valori basali,  
— peso corporeo terminale, peso degli organi e rapporti tra 
peso degli organi e peso corporeo,  
— risultati della necroscopia,  
— descrizione dettagliata di tutti i reperti istopatologici,  
— dati sull'assorbimento, se disponibili,  
— elaborazione statistica dei risultati, se del caso.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to.Chemicals, Envi ­
ronmental Health Criteria Document No. 60.  
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologie 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp.,.40, pp. 999-1003.  
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.  
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a.Functional Observatio ­
nal Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol.,.108, pp. 267-283.
 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore-and Hind-limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1. pp. 233-236.
 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
pp. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in.Toxicity and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 408
 
B.27.  TEST DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA — STUDIO 
DELLA TOSSICITÀ ORALE CON SOMMINISTRAZIONE 
RIPETUTA DI DOSI PER 90 GIORNI SUI NON RODITORI  
1. METODO  
Questo metodo di tossicità orale subcronica corrisponde al TG 409 
(1998) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Nella valutazione e nel giudizio delle caratteristiche tossiche di una 
sostanza chimica è possibile determinare la tossicità orale subcronica 
con dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità mediante test di tossicità acuta o con dosi ripetute per 28 giorni. Lo studio di 90 giorni fornisce informazioni sui possibili rischi per la 
salute che potrebbero derivare dall'esposizione ripetuta in un periodo 
di rapida crescita, fino alla giovane età adulta. Con questo studio si otterranno dati sui principali effetti tossici, sugli organi bersaglio e sulla possibilità di accumulo, mediante i quali si potrà stimare il 
livello di esposizione al quale non si osservano effetti avversi che 
può essere utilizzato per scegliere i livelli delle dosi per gli studi cronici e per definire i criteri di sicurezza relativi all'esposizione di soggetti umani.
 
Il metodo di test consente di identificare gli effetti avversi dell'espo ­
sizione a sostanze chimiche in specie di non roditori e va usato solo:  
— nei casi in cui gli effetti osservati in altri studi indichino la 
necessità di procedere ad un chiarimento o ad una caratterizza ­
zione in un secondo test su specie di non roditori, oppure  
— nei casi in cui gli studi tossicocinetici indichino che sia meglio 
utilizzare una particolare specie di non roditori, oppure  
— nei casi in cui altri motivi specifici giustifichino l'uso di una 
specie di non roditori.  
Cfr. anche introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Dose:  quantità della sostanza di prova somministrata. La dose si 
esprime in termini di peso (g, mg) o di peso della sostanza in esame 
per unità di peso dell'animale sperimentale (ad esempio mg/kg), oppure in termini di concentrazioni dietetiche costanti (ppm).
 
Dosaggio:  termine generico che comprende la dose, la frequenza e la 
durata della somministrazione.  
NOAEL:  abbreviazione di «no observed adverse effect level» (li ­
vello al quale non si osservano effetti dannosi): il più alto livello di 
dose a cui non si osservano effetti avversi correlati al trattamento.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
Ogni giorno, per un periodo di 90 giorni, si somministra per via 
orale la sostanza in esame in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento, laddove ad ogni gruppo corrisponde un determinato 
livello di dose. Durante il periodo di somministrazione si tengono gli 
animali sotto attenta osservazione per individuare eventuali segni di tossicità. Gli animali che muoiono o vengono sacrificati durante il test sono sottoposti a esame necroscopico e, a conclusione del test, 
anche gli animali sopravvissuti vengono sacrificati e sottoposti a 
esame necroscopico.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 409
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.4.1.  Selezione delle specie di animali  
La specie di non roditori comunemente utilizzata è il cane, preferi ­
bilmente di razza definita: spesso si utilizza la razza beagle, è pos ­
sibile utilizzare anche altre specie, come il maiale, il mini-pig ed 
altri. Si raccomanda di non utilizzare primati, la cui scelta va moti ­
vata. Si utilizzano animali giovani e sani e, nel caso del cane, la somministrazione deve iniziare preferibilmente a 4-6 mesi e comun ­
que entro il 9° mese di vita. Per gli studi preliminari a studi della 
tossicità cronica a lungo termine, è necessario usare la stessa specie o la stessa razza in entrambi gli studi.
 
1.4.2.  Preparazione degli animali  
Si utilizzano solo animali sani e giovani che siano stati acclimatati 
alle condizioni di laboratorio e non siano stati sottoposti a precedenti 
procedure sperimentali. La durata dell'acclimatazione dipende dalla specie selezionata per il test e dalla sua origine. Si raccomanda un periodo di almeno 5 giorni per cani o maiali di una colonia residente 
allevati a scopo sperimentale, e di almeno 2 settimane per gli stessi 
animali provenienti da fonti esterne. Gli animali sperimentali vanno caratterizzati per specie, ceppo, origine, sesso, peso e/o età. L'assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento 
avviene mediante randomizzazione. Le gabbie vanno disposte in 
modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro colloca ­
zione. A ogni animale deve essere assegnato un numero di identifi ­
cazione esclusivo.
 
1.4.3.  Preparazione delle dosi  
La sostanza in esame può essere somministrata nella dieta o nell'ac ­
qua di abbeveraggio, mediante sonda gastrica o in capsule. Il metodo di somministrazione orale dipende dallo scopo dello studio e dalle caratteristiche fisico-chimiche del materiale in esame.
 
Se necessario, la sostanza di prova viene disciolta o posta in sospen ­
sione in un veicolo adeguato. Dove possibile, si raccomanda di 
prendere anzitutto in considerazione la possibilità di utilizzare una soluzione/sospensione acquosa, indi una soluzione/emulsione in olio 
(ad esempio olio di mais) e infine una soluzione in altri veicoli. Se si 
usano veicoli diversi dall'acqua è necessario conoscerne le caratteri ­
stiche tossiche. Occorre determinare inoltre la stabilità della sostanza di prova nelle condizioni di somministrazione.
 
l.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Numero e sesso degli animali  
Per ciascun livello di dose vanno usati almeno otto animali (quattro 
femmine e quattro maschi). Qualora si preveda di sacrificare a inter ­
valli intermedi alcuni animali, il numero va aumentato del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completamento dello 
studio. Il numero di animali al termine dello studio deve essere tale 
da consentire di effettuare una valutazione significativa degli effetti tossici. In base alle precedenti conoscenze sulla sostanza chimica o su una sostanza analoga, occorre valutare la possibilità di includere 
un ulteriore gruppo satellite di otto animali (quattro per sesso) nel 
gruppo di controllo e in quello trattato col livello di dose più elevato, allo scopo di osservare, dopo il periodo di trattamento, la reversibi ­
lità o la persistenza di eventuali effetti tossici. La durata di tale 
periodo post-trattamento va stabilita adeguatamente tenendo 
conto degli effetti osservati.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 410
 
1.5.2.  Dosaggio  
Occorre utilizzare almeno tre livelli di dose e un controllo concomi ­
tante, tranne quando si esegue un test limite (cfr. 1.5.3). I livelli di dose possono essere basati sui risultati di precedenti studi con dosi 
ripetute o di definizione del rango e devono tenere conto dei dati 
tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi al composto in esame o a materiali analoghi. A meno che non sia limitato dalla natura fisico-chimica o dagli effetti biologici della sostanza in esame, 
il livello di dose più elevato va scelto con l'obiettivo di indurre 
tossicità, senza provocare il decesso o arrecare gravi sofferenze. Occorre scegliere una sequenza decrescente dei livelli di dose per 
poter eventualmente dimostrare la correlazione dosaggio/risposta e 
un NOAEL al livello di dose più basso. In genere, per definire i livelli decrescenti di dose è ottimale l'impiego di intervalli multipli di un numero compreso fra due e quattro e, spesso, l'aggiunta di un 
quarto gruppo sperimentale è preferibile all'uso di intervalli molto 
ampi (ad esempio, più di un fattore di circa 6-10) fra i dosaggi.
 
Il gruppo di controllo deve essere non trattato oppure, se per sommini ­
strare la sostanza di prova si impiega un veicolo, trattato solo con il 
veicolo. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali del 
gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo deve rice ­
verne il volume più elevato somministrato. Se la sostanza di prova viene 
somministrata con la dieta e concorre a ridurre l'assunzione di cibo da 
parte degli animali, per distinguere fra la riduzione dovuta a questo fatto e quella determinata dalle alterazioni tossicologiche può essere utile un gruppo di controllo pair-fed.
 
Occorre tenere conto delle seguenti caratteristiche del veicolo e di 
eventuali altri additivi: effetti su assorbimento, distribuzione, meta ­
bolismo o ritenzione della sostanza di prova; effetti sulle proprietà chimiche della sostanza di prova che potrebbero alterarne le caratte ­
ristiche tossiche; effetti sul consumo di cibo o di acqua o sulle 
condizioni nutrizionali degli animali.
 
1.5.3.  Test limite  
Se, impiegando la procedura descritta per il presente studio, un test a 
un livello di dose equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso 
corporeo/die non produce effetti avversi e se, sulla base dei dati relativi a sostanze strutturalmente affini, non si prevede tossicità, ci si può esimere dal condurre uno studio completo con tre livelli di 
dose. Il test limite non si applica quando l'esposizione di soggetti 
umani indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato.
 
1.3.4.  Somministrazione delle dosi  
Le dosi della sostanza in esame devono essere amministrate quoti ­
dianamente, sette giorni alla settimana, per 90 giorni. Occorre giu ­
stificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio (ad esempio 
cinque giorni alla settimana). Se si utilizza una sonda gastrica o una cannula per intubazione, la somministrazione deve avvenire in dose unica. Il volume massimo di liquido somministrabile ogni volta di ­
pende dalle dimensioni dell'animale sperimentale e di norma va 
mantenuto al minimo possibile. Ad eccezione delle sostanze irritanti o corrosive, che in genere producono effetti più forti a concentrazioni più elevate, occorre ridurre al minimo la variabilità del volume da 
somministrare regolando la concentrazione in modo da mantenere il 
volume costante a tutti i livelli di dose.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 411
 
Per le sostanze somministrate con la dieta o l'acqua di abbeveraggio 
è importante impedire che le quantità della sostanza in esame inter ­
feriscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. Quando la sostanza in esame viene somministrata nella dieta si possono usare sia una concentrazione dietetica costante (ppm), sia 
un livello di dose costante in termini di peso corporeo dell'animale 
ed occorre motivare l'opzione scelta. Se si utilizza invece l'alimen ­
tazione forzata mediante sonda gastrica o se si somministrano cap ­
sule, la dose va somministrata ogni giorno più o meno alla stessa 
ora, regolandola adeguatamente per mantenere la dose a un livello 
costante rispetto al peso corporeo dell'animale. Se lo studio sul pe ­
riodo di 90 giorni è preliminare ad uno studio sulla tossicità cronica a lungo termine, occorre utilizzare una dieta simile in entrambi.
 
1.5.5.  Osservazioni  
Il periodo di osservazione deve essere di almeno 90 giorni. Gli 
animali del gruppo satellite destinato a osservazioni di follow-up 
non vanno trattati per un periodo adeguato, allo scopo di individuare la persistenza o la remissione degli effetti tossici.
 
Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al giorno, 
preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di 
picco degli effetti previsti dopo la somministrazione. Occorre regi ­
strare le condizioni cliniche degli animali. Per identificare segni di morbilità e mortalità tutti gli animali vanno osservati almeno due 
volte al giorno, in genere all'inizio e alla fine della giornata.
 
Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche 
almeno una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all'interno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, una volta alla settimana. Le osservazioni vanno eseguite, se fattibile, 
fuori dalla gabbia di stabulazione, preferibilmente in un ambiente 
standard e sempre all'inarca allo stesso orario. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. I segni di tossicità, compresi il momento dell'esordio, il 
grado e la durata, vanno accuratamente registrati. I segni da osser ­
vare sono almeno i seguenti: cambiamenti a livello cutaneo, del pelo, degli occhi e delle mucose, presenza di secrezioni ed escrezioni e attività neurovegetativa (ad esempio lacrimazione, piloerezione, rea ­
zioni pupillari, alterazioni della respirazione). Vanno inoltre registrati 
cambiamenti dell'andatura, della postura e della risposta alla mani ­
polazione, nonché la presenza di movimenti tonici o clonici, stereo ­
tipie (ad esempio tendenza a pulirsi eccessivamente, a girare in cer ­
chio) e qualsiasi comportamento insolito.
 
Prima della somministrazione della sostanza in esame e a conclu ­
sione dello studio occorre eseguire un esame oftalmologico, me ­
diante un oftalmoscopio o analogo dispositivo idoneo, preferibil ­
mente su tutti gli animali o comunque almeno sul gruppo a cui viene 
somministrata la dose più elevata e sui controlli. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali.
 
1.5.5.1.  Peso corporeo e assunzione di cibo/acqua  
Tutti gli animali vanno pesati almeno una volta alla settimana. La 
misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza 
settimanale. Se la sostanza in esame viene somministrata con l'acqua di abbeveraggio, anche il consumo di acqua va misurato almeno con cadenza settimanale. È utile tener conto del consumo di acqua anche 
negli studi con somministrazione mediante dieta o sonda gastrica 
perché potrebbe risultare alterato.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 412
 
1.5.5.2.  Ematologia e biochimica clinica  
Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico e conser ­
varli, se opportuno, in condizioni adeguate. Alla fine del test si raccolgono campioni di sangue subito prima o nel corso della pro ­
cedura di soppressione degli animali.
 
Gli esami ematologici, compresi ematocrito, concentrazione di emo ­
globina, conta degli eritrociti, conta totale e differenziale dei leuco ­
citi, conta delle piastrine e una misurazione del potenziale di coagu ­
lazione scelta tra tempo dì coagulazione, tempo di protrombina o tempo di tromboplastina, vanno eseguiti all'inizio dello studio e suc ­
cessivamente a intervalli mensili o a metà del periodo di test e infine 
alla conclusione del test.
 
Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti 
tossici gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, 
vanno condotte su campioni di sangue prelevati da tutti gli animali 
all'inizio dello studio, poi a intervalli mensili o a metà del test, e infine a conclusione del periodo di test. Gli elementi da valutare sono l'equilibrio elettrolitico, il metabolismo dei carboidrati e la 
funzionalità epatica e renale. La scelta di test specifici sarà influen ­
zata dalle osservazioni sulla modalità di azione della sostanza di prova. Prima della raccolta dei campioni di sangue, gli animali vanno lasciati a digiuno per un periodo adeguato alla specie. Si consiglia di 
determinare calcio, fosforo, cloruro, sodio, potassio, glucosio a 
digiuno, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, ornitindecarbossilasi, gamma-glutamil-transpeptidasi, azoto ureico, albumina, creatininemia, bilirubina totale e proteine sieriche totali.
 
L'analisi delle urine va effettuata almeno all'inizio dello studio e 
successivamente a metà e alla conclusione, raccogliendo le urine in tempi prestabiliti. Le determinazioni da effettuare comprendono 
aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glucosio 
e sangue/cellule ematiche. Se necessario, per ampliare lo studio del ­
l'effetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori pa ­
rametri.
 
È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sui 
marker dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni che pos ­
sono rendersi necessario per un'adeguata valutazione tossicologica 
comprendono le analisi dei lipidi, degli ormoni, equilibrio acidi/basi, 
metaemoglobina e inibizione della colinesterasi. Se necessario, per ampliare lo studio degli effetti osservati è possibile effettuare ulte ­
riori esami biochimici clinici. Queste determinazioni vanno effettuate 
per alcune classi di sostanze chimiche oppure caso per caso.
 
Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in fun ­
zione delle specie e dell'effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza.
 
1.5.5.3.  Necroscopia macroscopica  
Tutti gli animali dello studio vanno sottoposti a completa e dettagliata 
necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della super ­
ficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e 
addominale e del loro contenuto. Fegato (compresa la cistifellea), reni, 
ghiandole surrenali, testicoli, epididimi, ovaie, utero, tiroide (con para ­
tiroidi), timo, milza, cervello e cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente 
liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo 
la dissezione, per evitare l'essiccamento.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 413
 
I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più adat ­
to, sia per il tipo di tessuto, sia per il successivo esame istopatolo ­
gico che si intende effettuare: tutte le lesioni macroscopiche, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto, bulbo e/o ponte), midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e 
lombare), ghiandola pituitaria, occhi, tiroide, paratiroide, timo, eso ­
fago, ghiandole salivari, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, cistifellea, pancreas, reni, ghiandole surrenali, milza, cuore, trachea e polmoni, aorta, gonadi, utero, an ­
nessi, ghiandola mammaria delle femmine, prostata, vescica, linfo ­
nodi (preferibilmente un linfonodo interessato dalla via di sommini ­
strazione e un altro distante dalla via di somministrazione per coprire gli effetti sistemici), un nervo periferico (sciatico o tibiale) preferi ­
bilmente in prossimità del muscolo, una sezione di midollo osseo 
(e/o un aspirato di midollo osseo fresco) e cute. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio 
in base alle proprietà note della sostanza in esame.
 
1.5.5.4.  Esame istopatologico  
Vanno sottoposti a esame istopatologico completo gli organi e i 
tessuti conservati di almeno tutti gli animali del gruppo di controllo e del gruppo che riceve la dose più elevata. Si procede a questo esame anche sugli animali degli altri gruppi qualora nel gruppo a cui 
viene somministrata la dose più elevata si osservano alterazioni cor ­
relate al trattamento.
 
Vanno esaminate tutte le lesioni macroscopiche.  
Quando si utilizza un gruppo satellite l'esame istopatologico va ese ­
guito sui tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati.
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
I dati devono essere forniti separatamente per ogni soggetto. Inoltre, 
tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per 
ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all'inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/ ­
soppressioni, il numero di animali che presentano segni di tossicità, 
una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento del ­
l'esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di 
animali rapportata al tipo di lesione.
 
I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico ade ­
guato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale.
 
2.2. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere le seguenti informazioni:  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 414
 
2.2.1.  Sostanza di prova:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  
— veicolo (se utilizzato): motivazione per la scelta del veicolo, se 
diverso dall'acqua.  
2.2.2.  Specie di prova:  
— specie e ceppo usati,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— origine, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso dei singoli animali all'inizio del test.  
2.2.3.  Condizioni di esecuzione del test:  
— motivo della scelta del livello di dose,  
— dettagli sulla formulazione della sostanza in esame/preparazione 
dietetica, sulla concentrazione ottenuta, sulla stabilità e l'omoge ­
neità della preparazione,  
— dettagli sulla somministrazione della sostanza in esame,  
— dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/die) e fattore di conver ­
sione dalla concentrazione della sostanza di prova nella dieta/ ­
acqua di abbeveraggio (ppm) alla dose effettiva, se del caso,  
— particolari sulla qualità del cibo e dell'acqua.  
2.2.4.  Risultati:  
— peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo,  
— assunzione di cibo, ed eventualmente di acqua,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi 
segni di tossicità,  
— natura, gravità e durata delle osservazioni cliniche (reversibili o 
meno),  
— esame oftalmologico,  
— test ematologici con i relativi valori basali,  
— test biochimici cimici con i relativi valori basali,  
— peso corporeo terminale, peso degli organi e rapporti tra 
peso degli organi e peso corporeo,  
— risultati della necroscopia,  
— descrizione dettagliata di tutti i reperti istopatologici,  
— dati sull'assorbimento, se disponibili,  
— elaborazione statistica dei risultati, se del caso.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 415
 
B.28  SAGGIO DI TOSSICITÀ CUTANEA SUBCRONICA SAGGIO 
CON SOMMINISTRAZIONE CUTANEA RIPETUTA DI DOSI 
PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI RODITORI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza sperimentale viene applicata quotidianamente alle cute in 
dosi scalari a vari gruppi di animali da esperimento, una dose per 
gruppo per un periodo di 90 giorni. Durante il periodo di sommini ­
strazione, gli animali vengono giornalmente sottoposti ad osserva ­
zione per individuare segni di tossicità. Gli animali che muoiono durante il saggio vengono sottoposti a necroscopia, ed alla conclu ­
sione della prova anche gli animali superstiti vengono sottoposti a 
necroscopia.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
Gli animali sono tenuti nelle condizioni sperimentali di alloggia ­
mento ed alimentazione per almeno 5 giorni prima dell'inizio del saggio. Prima dell'esperimento, gli animali giovani e sani vengono 
mischiati con metodo casuale ed assegnati ai gruppi di trattamento e 
di controllo. Poco prima dell'inizio dell'esperimento gli animali da trattare vengono tosati nella zona dorsale del tronco. Si può usare la rasatura, ma questa dovrebbe essere effettuata circa 24 ore prima del 
saggio. La tosatura o la rasatura usualmente deve essere ripetuta ad 
intervalli approssimativamente settimanali. Durante la tosatura o la rasatura del pelo, occorre fare attenzione a non scorticare la pelle. La superficie corporea da trattare per l'applicazione della sostanza in 
esame non dovrebbe essere inferiore al 10 % del totale. Il peso 
dell'animale dovrebbe essere preso in considerazione quando si de ­
cidono le dimensioni delle superficie da liberare dal pelo e dalla copertura. Quando si saggiano solidi, che possono essere polverizzati 
se del caso, la sostanza in esame dovrebbe essere umidificata suffi ­
cientemente con l'acqua o, se necessario, con un veicolo adatto per assicurare un buon contatto con la pelle. Le sostanze in esame liquide sono in genere usate non diluite. L'applicazione quotidiana 
si estenderà da 5 a 7 giorni per settimana.
 
Condizioni sperimentali  
A n i m a l i d a e s p e r i m e n t o  
Si possono utilizzare esemplari adulti di ratto, coniglio o cavia. Altre 
specie possono essere utilizzate, ma il loro uso richiede una giusti ­
ficazione. All'inizio del saggio, la gamma di variazione del peso dovrebbe essere ± 20 % del peso medio. Quando uno studio di tossicità subcronica cutanea viene condotto come preliminare ad 
uno studio a lungo termine, in entrambi gli studi si dovrebbe usare 
la stessa specie e lo stesso ceppo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 416
 
N u m e r o e s e s s o  
Per ciascun livello di dose si dovrebbero utilizzare almeno 20 ani ­
mali (10 maschi e 10 femmine) con pelle sana. Le femmine dovreb ­
bero essere nullipare e non gravide. Se si prevede di sacrificare ad intervalli alcuni animali, il numero totale dovrebbe essere aumentato 
del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del com ­
pletamento dello studio. Inoltre, un gruppo satellite di 20 animali (10 animali per sesso) può essere trattato con il livello di dose elevato per 90 giorni e sottoposto ad osservazione per l'individuazione della 
reversibilità, della persistenza o dell'insorgenza ritardata di effetti 
tossici per 28 giorni dopo il trattamento.
 
L i v e l l i d i d o s e  
Almeno tre livelli di dose con un controllo o un controllo del vei ­
colo, se si utilizza un veicolo, sono richiesti. Il periodo di esposi ­
zione dovrebbe essere di almeno 6 ore al giorno. L'applicazione della sostanza in esame dovrebbe essere eseguita ogni giorno alla stessa 
ora e la quantità di sostanza applicata dovrebbe essere aggiustata a 
intervalli (settimanali o bisettimanali) per mantenere un livello co ­
stante di dose in termini di peso corporeo dell'animale. Eccezion fatta per il trattamento con la sostanza in esame, gli animali nel gruppo di 
controllo dovrebbero essere trattati in modo identico ai soggetti dei 
gruppi trattati. Quando per facilitare il dosaggio si usa un veicolo, il gruppo di controllo del veicolo dovrebbe essere sottoposto a dosag ­
gio come i gruppi trattati, e ricevere la stessa quantità che riceve il 
gruppo a livello di dose più elevata. Il livello di dose più elevato 
dovrebbe provocare effetti tossici ma produrre pochi o nessun de ­
cesso. Il livello di dose più basso non dovrebbe produrre effetti tossici. Quando esista una valutazione utile di esposizione umana, 
il livello più basso dovrebbe superare questo valore. Idealmente, il 
livello di dose intermedio dovrebbe produrre effetti tossici osserva ­
bili minimi. Se viene usata più di una dose intermedia, i livelli di dose dovrebbero essere intervallati per produrre una 
graduazione degli effetti tossici. Nei gruppi trattati con livello di 
dose basso, intermedio e nei controlli, l'incidenza delle morti dovrà essere bassa e tale da permettere una valutazione significativa dei risultati.
 
Se l'applicazione della sostanza in esame produce irritazioni gravi 
della pelle, le concentrazioni dovrebbero essere ridotte e ciò può provocare una riduzione, o l'assenza, di altri effetti tossici al livello di dose elevato. Sela pelle è stata gravemente danneggiata, può 
rendersi necessaria l'interruzione dello studio, Si procederà quindi a 
un nuovo studio con concentrazione più basse.
 
S a g g i o l i m i t e  
Se uno studio preliminare con livello di dose di 1 000 mg/kg o un 
livello di dose più elevato in relazione a una possibile esposizione umana, quando questa sia nota, non produce effetti tossici, ulteriori prove possono non essere considerate necessarie.
 
P e r i o d o d i o s s e r v a z i o n e  
Gli animali da esperimento dovrebbero essere osservati quotidiana ­
mente per individuare eventuali segni di tossicità. Il tempo della 
morte e quello dell'insorgenza o della scomparsa dei segni di tossi ­
cità dovrebbero essere registrati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 417
 
P r o c e d i m e n t o  
Gli animali dovrebbero essere ingabbiati individualmente e sottoposti 
a trattamento con la sostanza in esame, idealmente 7 giorni per settimana, per un periodo di 90 giorni.
 
Gli animali appartenenti a ciascun gruppo satellite previsto per ulte ­
riori osservazioni dovrebbero essere mantenuti ancora per 28 giorni per individuare i sintomi di guarigione oppure di persistenza degli effetti tossici. Il tempo di esposizione dovrebbe essere 6 ore/giorno.
 
La sostanza in esame dovrebbe essere applicata uniformemente su 
un'area che è approssimativamente il 10 % della superficie corporea totale. Con sostanze molto tossiche, la superficie coperta può essere 
inferiore, ma deve comunque essere coperta da uno strato più uni ­
forme e più sottile possibile.
 
Durante l'esposizione, la sostanza in esame viene tenuta a contatto 
con la pelle da una fascia porosa di garza e da un nastro non irritante. La superfìcie cutanea su cui è applicata la sostanza do ­
vrebbe essere coperta opportunamente in modo da trattenere la fascia 
e la sostanza in esame, per evitare un'eventuale ingestione da 
parte degli animali della sostanza in esame. Si può ricorrere a mezzi per limitare i movimenti dell'animale, ma l'immobilizzazione com ­
pleta non è un metodo raccomandato.
 
Alla fine del periodo di esposizione, la sostanza in esame residua 
dovrebbe essere rimossa, ove possibile, con l'uso di acqua o con qualche altro metodo appropriato per pulire la pelle.
 
Tutti gli animali dovrebbero essere quotidianamente sottoposti a os ­
servazione e si dovrebbe registrare i segni di tossicità, incluso il tempo d'insorgenza, l'intensità e la durata. Le osservazioni collaterali 
dovrebbero includere i cambiamenti della cute e del pelo, degli occhi 
e delle mucose, nonché del sistema nervoso centrale e autonomo, del sistema respiratorio e circolatorio, dell'attività somatomotoria e del quadro comportamentale. Si dovrebbe procedere settimanalmente alla 
misura del consumo alimentare e alla pesatura degli animali. L'os ­
servazione regolare degli animali è necessaria per assicurarsi che gli stessi non siano persi a causa di cannibalismo, autolisi dei tessuti o smarrimento. Alla fine del periodo di studio tutti gli animali soprav ­
vissuti dei gruppi di trattamento non satelliti sono sottoposti a necro ­
scopia. Gli animali moribondi dovrebbero essere rimossi e sottoposti a necroscopia.
 
I seguenti esami vengono effettuati abitualmente per tutti gli animali, 
compresi i controlli:  
a) l'esame oftalmoscopico, eseguito con un oftalmoscopio o attrez ­
zatura analoga, dovrebbe essere effettuato prima della sommini ­
strazione della sostanza sperimentale e alla conclusione dello stu ­
dio, preferibilmente su tutti gli animali, o perlomeno su quelli a 
cui vengono somministrati il dosaggio elevato, e infine al gruppo 
di controllo. Se vengono individuati cambiamenti negli occhi, tutti gli animali dovrebbero essere esaminati;
 
b) alla fine del periodo di saggio, si dovrebbero effettuare le se ­
guenti analisi: ematologia, incluso ematocrito, concentrazione di emoglobina degli eritrociti, conteggio totale e differenziale dei leucociti, misurazione del potenziale di coagulazione, quale il 
tempo di coagulazione, il tempo di protrombina, il tempo di 
tromboplastina o il conteggio delle piastrine;
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 418
 
c) la determinazione della biochimica clinica sul sangue dovrebbe 
essere effettuata alla fine del periodo di saggio. Le aree di studio, 
ritenute opportune per tutti gli studi sono: equilibrio degli elet ­
troliti, metabolismo dei carboidrati, funzione epatica e renale. La selezione di prove specifiche sarà determinata dalle osservazioni 
sul modo di azione della sostanza. Si suggerisce di determinare: 
calcio, fosforo, cloruro, sodio, potassio, glucosio a digiuno (con periodo di digiuno appropriato alla specie), glutamminico-piru ­
vica transaminasi serica (
 1 ), glutammico-ossalacetico transaminasi 
serica (  2 ), ornitina decarbossilasi, gamma glutammil transpeptida ­
se, azoto ureico, albumina, creatinina ematica, bilirubina totale e proteine totali del siero. Altre determinazioni che possono ren ­
dersi necessarie per una valutazione tossicologica adeguata, in ­
cludono: analisi dei lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metae ­
moglobina, attività della colinesterasi. Determinazioni biochimi ­
che supplementari possono essere usate, se necessarie, per esten ­
dere la ricerca di effetti osservati;
 
d) l'analisi delle urine non è richiesta routinariamente, ma solo 
quando vi sia una indicazione basata sulla tossicità prevista o osservata.
 
Se i dati storici di base sono insufficienti, prima di iniziare il do ­
saggio si dovrebbe prendere in considerazione la determinazione dei 
parametri ematologici e di biochimica clinica.  
N e c r o s c o p i a m a c r o s c o p i c a  
Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti a necroscopia macro ­
scopica completa, che include l'esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e dei loro contenuti. Il fegato, i reni, le ghiandole surrenali e i 
testicoli devono essere pesati umidi, appena possibile dopo la disse ­
zione, per evitare l'essiccamento. I seguenti organi e tessuti dovreb ­
bero essere conservati in mezzo adatto per possibili esami istopato ­
logici futuri: tutte le lesioni macroscopiche; cervello — comprese 
sezioni di midollo/ponte, corteccia cerebellare e corteccia cerebrale, 
pituitaria, tiroide/paratiroide, qualsiasi tessuto timico, (trachea), pol ­
moni, cuore, aorta, ghiandole salivari, fegato, milza, reni, ghiandole surrenali, pancreas, gonadi, utero, organi genitali accessori, cistifellea 
(se esiste), esofago, stomaco, duodeno, digiuno, ileo, intestino cieco, 
colon, retto, vescica urinaria, linfonodi rappresentativi, (ghiandole mammarie femminili), (muscolatura della coscia), nervo periferico (occhi), (sterno con midollo osseo), (femore — compresa superficie 
articolare), (midollo spinale a tre livelli — cervicale, emitoracico e 
lombare) e (ghiandole lacrimali esorbitali). I tessuti citati tra paren ­
tesi devono essere esaminati solo se presentano sintomi di tossicità o se vi siano indicazioni che sono l'organo bersaglio coinvolto.
 
E s a m e i s t o p a t o l o g i c o  
a) L'esame istopatologico completo dovrebbe essere effettuato sulla 
cute normale e sulla cute trattata, e sugli organi e tessuti degli 
animali nel gruppo trattato con dosaggio elevato e nel gruppo di 
controllo;  
b) tutte le lesioni macroscopiche dovrebbero essere esaminate;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 419  
( 1 ) Ora nota come alanina-aminotransferasi serica. 
( 2 ) Ora nota come appartato-aminotransferasi serica.
 c) gli organi bersaglio dovrebbero essere esaminati anche nei gruppi 
trattati con altre dosi;  
d) quando si usano i ratti, si dovrebbe eseguire l'esame istopatolo ­
gico dei polmoni degli animali dei gruppi trattati con dosaggi 
bassi e intermedi per l'individuazione di infezioni poiché ciò fornisce una valutazione appropriata dello stato di salute degli animali. Ulteriori esami istopatologici di routine possono non 
essere richiesti per gli animali di questi gruppi, ma devono sem ­
pre essere effettuati sugli organi che presentano lesioni nel gruppo trattato con dosi elevate;
 
e) quando si fa uso di un gruppo satellite, si dovrebbe eseguire 
l'esame istopatologico dei tessuti e degli organi che presentano 
lesioni in altri gruppi trattati.  
2. DATI  
I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma di tabelle, indicando 
per ogni gruppo sperimentale il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale degli animali che presentano ciascun tipo di lesione. 
I risultati dovrebbero essere valutati con un metodo statistico appro ­
priato. Qualsiasi metodo statistico riconosciuto può essere utilizzato.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— specie, ceppo, origine, condizioni ambientali, dieta,  
— condizione sperimentali,  
— livello di dose (veicolo compreso, se utilizzato) e concentrazioni,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e per dose,  
— livello senza effetto, quando possibile,  
— tempo della morte (durante l'esperimento) oppure specificare se 
gli animali sono sopravvissuti fino alla conclusione della prova,  
— descrizione degli effetti tossici o di altri effetti,  
— tempo di osservazione di ogni segno anormale e successivo de ­
corso,  
— dati di alimentazione e sul peso corporeo,  
— risultati oftalmologici,  
— analisi ematologiche usate e risultati completi,  
— analisi di biochimica clinica usati e risultati completi (compresi i 
risultati dell'analisi delle urine),  
— risultati della necroscopia,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 420
 
— descrizione particolareggiata di tutti di risultati istopatologici,  
— elaborazione statistica dei risultati, quando possibile,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 421
 
B.29.  TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 90 
GIORNI  
SINTESI  
Il presente metodo di prova rivisto B.29 è stato concepito per caratterizzare 
pienamente la tossicità per inalazione della sostanza per una durata subcronica 
(90 giorni) e fornire dati affidabili per valutazioni quantitative dei rischi legati 
all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 10 maschi e 10 fem ­
mine, sono esposti per 6 ore al giorno per 90 giorni (13 settimane) a: a) la sostanza in esame a tre livelli di concentrazione o più; b) all’aria filtrata (con ­
trollo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli 
animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni la settimana ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei 
due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratte ­
rizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite (reversibilità), sacrifici intermedi, lavaggio bronchioalveolare (BAL), esami neu ­
rologici e ulteriori valutazioni istopatologiche o di patologia clinica.
 
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche 413 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità subcronica per inalazione n. 413 è stata adottata nel 1981 (1). 
Questo metodo di prova B.29 (che corrisponde alla linea guida n. 413 rivista 
del 2009) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future.
 
2. Gli studi di tossicità subcronica per inalazione sono utilizzati principalmente 
per calcolare le concentrazioni stabilite dalla normativa per valutare i rischi per i lavoratori nell’ambiente professionale. Servono anche a valutare i rischi 
per le persone nelle abitazioni, i trasporti e l’ambiente. Il presente metodo 
consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da un’esposizione quo ­
tidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 90 giorni (che corri ­
sponde a circa 10 % della durata di vita di un ratto). I dati tratti dagli studi 
sulla tossicità subcronica per inalazione possono servire per le stime quan ­
titative dei rischi e la scelta delle concentrazioni negli studi di tossicità cronica. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai 
test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo 
di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orienta ­
mento n. 39 (2).
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
3. Il laboratorio deve tenere conto di tutte le informazioni disponibili sulla 
sostanza in esame prima di svolgere la prove, in modo da migliorare la 
qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Tre le infor ­
mazioni utili per la scelta delle concentrazioni adeguate si annoverano: l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza 
in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli 
impieghi previsti o i rischi di esposizione umana, i dati (Q)SAR disponibili e i dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; o dati tratti da altri studi di esposizione ripetuta. Se nel corso dello studio si 
prevedono o si constatano effetti neurotossici, il responsabile dello studio 
può decidere di includere le valutazioni ritenute necessarie e anche una serie di osservazioni funzionali ( functional observational battery  — fob) e misu ­
razioni dell’attività motoria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non 
interferisce con l’impostazione di base dello studio, anche se la durata delle 
esposizioni può essere fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 422
 
4. Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a 
concentrazioni che consentono di conseguire il grado di tossicità auspicato. 
Per ulteriori informazioni si invita a consultare il documento di orientamento n. 39 (2). Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere sufficientemente basse da non provocare dolore e 
stress intensi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva 
concentrazione-risposta fino a dei livelli corrispondenti all’obiettivo scienti ­
fico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo range 
finding adeguatamente impostato che fornisca informazioni sull’endpoint 
critico, le eventuali soglie di irritazione e il momento dell’insorgenza degli effetti (cfr. paragrafi da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni.
 
5. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e 
persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli 
animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di un docu ­
mento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3).
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
6. Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi co ­
munemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta.
 
Preparazione degli animali  
7. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della rando ­
mizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età com ­
presa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % 
del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si accli ­
matino alle condizioni di laboratorio,.
 
Condizioni di allevamento degli animali  
8. Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente me ­
diante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche 
se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. 
Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e 
deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se 
l’esposizione avviene «a naso solo», potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sui parametri 
fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respira ­
torio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adatta ­
mento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti 
«a corpo intero» ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la 
durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da 
laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve 
essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 423
 
Camere di inalazione  
9. La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza 
chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposi ­
zione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente 
della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via 
nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione «a corpo intero» può es ­
sere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta 
deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità 
atmosferica di una camera di esposizione «a corpo intero», il volume com ­
plessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del 
volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i 
principi delle tecniche di esposizione «a corpo intero» e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi.
 
STUDI DI TOSSICITÀ  
Concentrazioni limite  
10. A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subcro ­
nica per inalazione non è definita la concentrazione massima. La concen ­
trazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione massima 
raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al «peggiore 
dei casi»; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossige ­
no; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 (13) 
(ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l per i 
vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare 
questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara 
tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).
 
Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi ( range finding ) 
11. Prima di iniziare lo studio principale, è di norma necessario effettuare uno 
studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più 
completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio pos ­
sono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per de ­
terminare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni 
tecniche sul metodo di analisi, la dimensione delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC nello studio principale. Il responsa ­
bile dello studio può decidere di utilizzare uno studio di tipo range finding 
per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità pol ­
monare e lavaggi broncoalveolari), la concentrazione più alta tollerata dagli 
animali senza provocare stress eccessivo e i parametri che permetteranno di 
caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame.
 
12. Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare 
uno o più livelli di concentrazione. In funzione degli effetti da misurare 
selezionati si devono esporre da tre a sei maschi e da tre a sei femmine a ciascun livello di concentrazione. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 28 giorni. Nella relazione sullo studio 
è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni per lo 
studio principale. il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensi ­
bile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la 
concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza cau ­
sare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 424
 
13. Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di 
concentrazione occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, anche 
quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti sostanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’in ­
tervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint ritenuti 
più sensibili secondo criteri meccanicisti, come l’inibizione della colineste ­
rasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T
 3 e T 4 ) per i tireotossici, le proteine, 
la LDH, i neutrofili nei lavaggi broncoalveolari nel caso di particelle inof ­
fensive scarsamente solubili o di aerosol irritanti per i polmoni.  
Studio principale  
14. Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli 
di concentrazione e, parallelamente, controlli negativi (aria) e/o del veicolo, 
se necessario (cfr. paragrafo 18). Per scegliere i livelli di esposizione ade ­
guati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi di tossicità sistemica, studi sul metabolismo e la cinetica 
(occorre fare il possibile per evitare livelli di concentrazione elevati carat ­
terizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende 20 roditori (10 maschi e 10 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 13 settimane (per una durata 
totale dello studio di 90 giorni). Gli animali possono anche essere esposti 
per 7 giorni su 7 (ad esempio nel caso di prove su prodotti farmaceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla sostanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso al fine 
di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se 
per l’esposizione «a naso solo» s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di 
esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve 
essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel corso dell’esposizione «a 
corpo intero» si può continuare a somministrare acqua.
 
15. Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare 
l’organo o gli organi bersaglio e di evidenziare una concentrazione-risposta chiara.
 
— Il livello di concentrazione elevato deve produrre effetti tossici senza 
provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione 
significativa dei risultati  
— Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo 
da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione
 
— Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo 
effetti poco rilevanti.  
Sacrifici intermedi  
16. Se si prevedono sacrifici intermedi, ad ogni esposizione il numero di animali 
deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completamento dello studio. Occorre fornire la giustificazione del 
ricorso ai sacrifici intermedi di cui si deve tenere adeguatamente conto nelle 
analisi statistiche.
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Studio di gruppi satelliti (studio di reversibilità)  
17. Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere 
reversibile persistente o ritardato della tossicità, per un periodo post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. 
I gruppi satellite sono costituiti da 10 maschi e 10 femmine esposti con ­
temporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio principale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di con ­
trollo dell’aria e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 18).
 
Animali di controllo  
18. Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli 
animali del gruppo soggetto alla prova, con la sola differenza che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre 
l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare 
nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere 
esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo 
in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informa ­
zioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può 
utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del 
veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del 
veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame 
incorporata in un veicolo non evidenzia nessuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione testata e che si deve utilizzare questo gruppo di controllo del veicolo.
 
CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Somministrazione delle concentrazioni  
19. Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, 
aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà 
fisico-chimiche della sostanza in esame, dalle concentrazioni prescelte e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal 
punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre 
prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi mec ­
canici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento 
n. 39 (2).
 
Distribuzione granulometrica  
20. La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che 
potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare de ­
gli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 
3 μm, con una deviazione standard geometrica ( σ
 g ) compresa tra 1,5 e 3 (4). 
Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario fornire il parere di un esperto. Ad esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indi ­
cato, mentre le particelle caricate e le fibre possono essere più grandi ri ­
spetto a tale standard.
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Preparazione della sostanza in esame in un veicolo  
21. Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia 
necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulo ­
metria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. 
Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabi ­
lità. 
MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Flusso d’aria nella camera di esposizione  
22. Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in 
continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura permanente di tutti i parame ­
tri dinamici e un modo indiretto di controllarle tutti i parametri importanti 
per l’inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la fre ­
quenza di misurazione della portata dell’aria può essere diminuita ad un’unica misurazione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle 
camere d’esposizione «a naso solo», per evitare la reinalazione. La concen ­
trazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare queste concentrazioni, è necessario misurare le concentra ­
zioni di ossigeno e di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il 
primo giorno di esposizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni.
 
Temperatura e umidità relativa della camera  
23. La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel 
caso delle esposizioni «a naso solo» che per le esposizioni «a corpo intero», 
l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente moni ­
torata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando 
si studiano miscele acquose) o che non possa essere misurata per via delle 
interferenze della sostanza con il presente metodo di prova.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale  
24. Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale 
nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divi ­
sione della massa della sostanza in esame generata per il volume di aria che 
è passato nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nomi ­
nale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per 
individuare eventuali problemi di produzione.
 
Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale  
25. La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prele ­
vata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chi ­
mica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, 
come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravi ­
metrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi 
su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate 
prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 427
 
determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti 
in polvere, ma in tal caso occorrono dati analitici che dimostrino che la 
composizione del prodotto in sospensione nell’aria è analoga a quella del prodotto di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario riana ­
lizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione 
nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evapo ­
rare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto.
 
26. Nel corso dell’intero studio, si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto 
della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo 
studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la 
purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare 
risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre 
stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione potrebbe confermare almeno in parte le caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.).
 
27. L’atmosfera di concentrazione deve essere mantenuta costante nei limiti del 
possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può 
utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro 
per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concen ­
trazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è 
possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concen ­
trazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Ide ­
almente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di esposizio ­
ne. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve 
deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di 
gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposi ­
zione raggiunga l’equilibrio (t
 95 ). La durata di un’esposizione copre il tempo 
di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario 
affinché la camera raggiunga l’equilibrio (t  95 ) e la degradazione. Il docu ­
mento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t  95 . 
28. Per miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (ad 
esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per pro ­
pulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi 
diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e 
aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), usualmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione deve essere indicata la 
concentrazione analitica corrispondente alla miscela e non solo quella del 
principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni effettive sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2).
 
Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica  
29. La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata al ­
meno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS ( Ae­
rodynamic Particle Sizer ). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e 
con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato 
nel corso dell’intero studio.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 428
 
30. Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre 
utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico 
o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa 
equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella 
fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misure di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio.
 
31. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che 
rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in 
un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste.  
OSSERVAZIONI  
32. Prima, durante e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire fre ­
quenti esami clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere 
utili in funzione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’osservazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nelle camere «a corpo intero» o da atmosfere 
opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le 
osservazioni fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’eventuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici.
 
33. Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun 
animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il 
momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione 
possibile.  
34. Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e 
delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, e dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, 
diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può 
corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposi ­
zione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni ri ­
guardanti: cinetica, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di ma ­
teriali scarsamente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e va ­
riazioni comportamentali.
 
PESO CORPOREO  
35. Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima 
dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di 
valutare la tossicità sistemica) e al momento del decesso o dell’eutanasia. 
In assenza di effetti nel corso delle prime 4 settimane, il peso corporeo può essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a 
cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, 
tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo.
 
CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA  
36. Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, 
anche il consumo di acqua può essere misurato.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 429
 
PATOLOGIA CLINICA  
37. Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi 
satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’in ­
tervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve 
essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. 
Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb).
 
38. Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente 
necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità 
prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in 
esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parame ­
tri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, 
metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eri ­
troide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi).
 
Tabella 1  
Parametri standard di patologia clinica  
Ematologia  
Conta eritrocitaria 
Ematocrito Concentrazione dell’emoglobina 
Tenore globulare medio in emoglobina 
Volume medio corpuscolare Concentrazione di emoglobina corpu ­
scolare media 
Reticolociti Conteggio dei globuli bianchi 
Conta differenziale dei globuli 
bianchi 
Conta delle piastrine 
Coagulabilità (scegliere un para ­
metro): 
— Tempo di protrombina 
— Tempo di coagulazione 
— Tempo di tromboplastina par ­
ziale attivata
 
Chimica clinica  
Glucosio (*) 
Colesterolo totale Trigliceridi 
Azoto ureico ematico 
Bilirubina totale Creatinina 
Proteina totale 
Albumina Globulina Alanina-aminotransferasi 
Aspartato amminotransferasi Fosfatasi alcalina 
Potassio 
Sodio Calcio 
Fosforo 
Cloruro
 
Esame delle urine (facoltativo)  
Aspetto (colore e torbidità) 
Volume 
Densità relativa o osmolalità pH Proteina totale 
Glucosio 
Sangue/cellule ematiche
 
(*) Il responsabile dello studio deciderà se un periodo di digiuno è necessario per gli 
animali, in quanto un lungo periodo di digiuno può portare a misurazioni del 
glucosio parzialmente errate negli animali esposti rispetto agli animali del gruppo 
di controllo. Se si ricorre al digiuno, occorre che il periodo sia adeguato in 
funzione della specie utilizzata; per il ratto può essere di 16 ore (digiuno nottur ­
no). La determinazione della glicemia a digiuno può essere effettuata dopo il 
digiuno notturno, nel corso dell’ultima settimana di esposizione, o dopo la notte 
di digiuno notturno precedente l’autopsia (in tal caso insieme a tutti gli altri 
parametri di patologia clinica).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 430
 
39. Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il 
principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio 
broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativa ­
mente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’al ­
veolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame con ­
sente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e 
del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido di lavaggio può essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono 
quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi e infiammazione 
irritativa o allergica, che possono comprendere la determinazione di cito ­
chine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il 
documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effet ­
tuare il lavaggio dei polmoni.
 
ESAME OFTALMOLOGICO  
40. Prima della somministrazione della sostanza in esame e al termine dello 
studio per tutti i gruppi trattati con una concentrazione elevata, occorre effettuare, avvalendosi di un oftalmoscopio o di un dispositivo equivalente, 
un esame oftalmologico del fondo dell’occhio, dei mezzi di rifrazione, 
dell’iride, della congiuntiva. Se sono individuate delle alterazioni a livello degli occhi, occorre esaminare tutti gli animali degli altri gruppi, ivi com ­
preso il gruppo satellite (reversibilità).
 
PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI  
41. Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della 
prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benes ­
sere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e au ­
topsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ul ­
tima esposizione di ogni animale e il suo sacrificio. Se non è possibile 
eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere effettuata non appena 
possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si 
annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando parti ­
colare attenzione a quelle delle vie respiratorie.
 
42. Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere con ­
servati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini 
dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in  grassetto  devono essere 
esportati e pesati umidi, appena possibile dopo la dissezione, per evitare 
l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valutazione isto ­
patologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata 
al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autopsia e non 
meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo utilizzato.
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Tabella 2  
Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica  
Ghiandole surrenali  
Aorta  
Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo)  
Cervello  (incluse le sezioni di cervello, cer ­
velletto, bulbo/ponte)  
Intestino cieco  
Colon  
Duodeno  
[Epididimi ] 
[Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre]  
Femore e grassella  
Cistifellea (se presente)  
[Ghiandole di Harder]  
Cuore  
Ileo 
Digiuno  
Reni  
[Ghiandole lacrimali (extraorbitali)]  
Laringe (3 livelli, ivi compresa la base 
dell’epiglottide)  
Fegato  
Polmone  (tutti i lobi ad un livello, compresi i 
bronchi principali)  
Linfonodi della regione ilare del polmone, so ­
prattutto per il particolato di sostanze chimi ­
che poco solubile. Per esami più approfonditi e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, si possono esaminare anche altri linfonodi, ad 
esempio quelli delle regioni mediastinale, cer ­
vicale/submandibolare e/o auricolare.
 
Linfonodi (distali dal punto di ingresso)  
Ghiandola mammaria (femminile)  
Muscolo (coscia)  
Tessuti rinofaringei (almeno 4 livelli; 1 li ­
vello per comprendere il canale rinofaringeo e il tessuto associato al naso —  Nasal Asso ­
ciated Lymphoid Tissue  — NALT)
 Esofago  
[Bulbo olfattivo]  
Ovaie  
Pancreas  
Paratiroidi  
Nervo periferico (sciatico o tibiale, di prefe ­
renza vicino al muscolo)  
Pituitaria  
Prostata  
Retto  
Ghiandole salivari  
Vescicole seminali  
Pelle  
Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e 
lombare)  
Milza  
Sterno  
Stomaco  
Denti  
Testicoli  
Timo  
Tiroidi  
[Lingua]  
Trachea (almeno 2 livelli, tra cui 1 
sezione longitudinale attraverso la carena e 
1 sezione trasversale)  
[Uretere]  
[Uretra]  
Vescica  
Utero  
Organi bersaglio  
Tutte le lesioni macroscopiche e le masse  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 432
 
43. I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo 
idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura 
dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non 
sezioni in serie).
 
44. Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali 
deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un 
esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non ci ­
gliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della larin ­
ge, e uno di questi deve includere la base dell’epiglottide (12). Occorre 
esaminare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una 
sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extra ­
polmonari e una sezione trasversale.
 
ESAME ISTOPATOLOGICO  
45. Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 
2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concen ­
trazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eu ­
tanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’ap ­
parato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli 
organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologi ­
che anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle 
concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valu ­
tazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la 
concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti prema ­
ture o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concen ­
trazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osserva ­
zioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici.
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
46. Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il 
consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere 
riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di 
animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottopo ­
sti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione 
degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e i 
risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono es ­
sere stabiliti nella fase di concezione dello studio.
 
Relazione sulla prova  
47. La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:  
Animali sperimentali e condizioni di allevamento:  
— descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica 
del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, 
temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 433
 
— specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse 
dal ratto; possono essere forniti dati di origine o dati storici se riguar ­
dano animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili,
 
— numero, età e sesso degli animali,  
— metodo di randomizzazione,  
— descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in parti ­
colare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa 
l’isomerizzazione),  
— dati di identificazione e numero CAS ( Chemical Abstract Services ), se 
noto.  
Veicolo:  
— motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del 
veicolo (se diverso dall’acqua),  
— dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con 
i risultati dello studio.  
Camera di inalazione:  
— descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il vo ­
lume e un diagramma,  
— provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposi ­
zione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,  
— apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granu ­
lometria e della concentrazione reale,  
— fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato,  
— metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire 
l’omogeneità dell’atmosfera di prova,  
— differenza di pressione (positiva o negativa),  
— bocchette di esposizione per camera («a naso solo»); ubicazione degli 
animali nella camera («a corpo intero»),  
— stabilità dell’atmosfera di prova,  
— ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campio ­
namento dell’atmosfera della prova nella camera,  
— trattamento dell’aria fornita/estratta,  
— flussi d’aria, portata dell’aria in ogni bocchetta di esposizione («a naso 
solo») o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della 
camera («a corpo intero»),  
— tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t  95 ), 
— numero di sostituzioni del volume per ora,  
— dispositivi di misurazione (se applicabile).  
Dati sull’esposizione:  
— giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio 
principale,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 434
 
— concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in 
esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta 
circolare nella camera),  
— concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per 
le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, va ­
pori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,  
— riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, 
mg/l, mg/m  3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb 
ecc.),  
— distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico 
mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica ( σ g ), 
con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi 
granulometriche.  
Condizioni sperimentali:  
— indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, preci ­
sando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei materiali solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame,
 
— una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparec ­
chiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,
 
— ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, 
l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione),
 
— informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per 
la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimen ­
sione delle particelle nella camera,  
— dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale 
metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal 
mezzo campionato),  
— metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi 
sperimentali e di controllo,  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta, origine dell’acqua),  
— giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.  
Risultati:  
— tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,  
— tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,  
— tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul cam ­
pionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e 
della σ g, 
— tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun 
animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità 
compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti),  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 435
 
— tabella con il peso dei singoli animali,  
— tabella con il consumo di cibo,  
— tabella con i dati clinico-patologici,  
— reperti necroscopici e reperti istopatologici per ciascun animale, se di ­
sponibili.  
Discussione e interpretazione dei risultati:  
— occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati 
per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per 
quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria,  
— occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati 
complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,
 
— si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coe ­
renza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali ed 
effettive e considerare il rapporto tra esse,  
— si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo 
d’azione prevalente (sistemico o locale),  
— occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre 
ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di 
sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento 
di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3),  
— occorre individuare gli organi bersaglio,  
— occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti 
dannosi (NOAEL) e il livello più basso al quale si osserva un effetto avverso (LOAEL).
 
BIBLIOGRAFIA:  
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(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
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(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
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(13) Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, 
del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’im ­
ballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 
67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 437
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  Qualsiasi sostanza o miscela testata secondo il pre ­
sente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 438
 
B.30.  STUDI DI TOSSICITÀ CRONICA  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 452 (2009). La prima linea guida 452 è 
stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione 
riveduta del metodo di prova B.30 alla luce dei recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi normativi (1) (2) (3) (4). L’aggior ­
namento del presente metodo di prova B.30 si è svolto in parallelo alle 
revisioni del capitolo B.32 del presente allegato, studi di cancerogenesi, e 
del capitolo B.33 del presente allegato, studi combinati di tossicità cronica/ cancerogenesi, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle 
dosi. Il presente metodo di prova è concepito per testare un’ampia serie di 
sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali.
 
2. La maggior parte degli studi di tossicità cronica è svolta su specie di rodi ­
tori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare 
necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, 
con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione 
ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5), come indicato nel docu ­
mento di orientamento n. 116 dell’OCSE —  Design and Conduct of Chro ­
nic Toxicity and Carcinogenicity Studies  (6).
 
3. Le tre vie principali di somministrazione usate in relazione alla tossicità 
cronica sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di sommini ­
strazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della so ­
stanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori infor ­
mazioni in merito alla scelta della via di esposizione.
 
4. Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la 
via più usata negli studi di tossicità cronica. Gli studi sulla tossicità cronica che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana 
e/o possono essere richiesti da determinati quadri normativi, ma entrambe le 
vie di esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere impostato caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della tossicità 
cronica con somministrazione orale potrebbe costituire la base di un proto ­
collo per studi per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccoman ­
dazioni per i periodi di trattamento, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione 
di sostanze chimiche in esame per inalazione (6) (7) e per via cutanea (6). Il 
capitolo B.8 del presente allegato (8) e il capitolo B.29 del presente allegato (9), insieme al documento di orientamento dell’OCSE —  Acute inhalation 
testing  (7) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo 
termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del 
presente allegato (10) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 439
 
5. Lo studio della tossicità cronica fornisce informazioni sui possibili rischi per 
la salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un 
periodo considerevole della vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, oltre ad indicare gli organi bersaglio e la possibilità di accumulo. 
Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto  no-observed-adverse-ef ­
fect level  (livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) applicabile 
per la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni 
cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni.
 
6. Tra gli obiettivi degli studi condotti con questo metodo di prova figurano:  
— l’individuazione della tossicità cronica di una sostanza chimica in esame,  
— l’individuazione degli organi bersaglio,  
— la caratterizzazione del rapporto dose-risposta,  
— l’individuazione di un  no-observed-adverse-effect level  (NOAEL), ossia 
il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi, o di un punto di 
partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD),  
— la previsione degli effetti di tossicità cronica ai livelli di esposizione 
umana,  
— la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di 
azione (6).  
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
7. Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossicologiche di una 
sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla 
sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella 
maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Tre le informazioni utili per il dise ­
gno sperimentale saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le 
proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, le informazioni 
sulle modalità di azione, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR e i dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche 
di struttura affine, i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripe ­
tuta, laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La determinazione della tossicità cronica si effettua solamente una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 
giorni. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello 
svolgimento delle prove di tossicità svolti nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chi ­
mica in esame (11) (12) (13) (14).
 
8. I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del 
disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza e dell’analisi ef ­
fettuata in caso di morte prematura degli animali di uno o più gruppi. Il 
documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e il documento di orien ­
tamento dell’OCSE n. 35 —  Analysis and evaluation of chronic toxicity and 
carcinogenicity studies  (15) forniscono indicazioni sulle analisi statistiche 
appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a 
livello internazionale.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 440
 
9. Nella realizzazione di uno studio di tossicità cronica è opportuno seguire 
sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di 
orientamento dell’OCSE n. 19 —  Recognition, assessment, and use of cli ­
nical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation  (16), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che 
negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un ani ­
male manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va sop ­
pesato anche il valore delle informazioni che possono essere ottenute con ­
tinuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza 
pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la sommini ­
strazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto l’animale, oppure ancora ridurre le dosi.
 
10. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e due pubblicazioni 
dell’International Life Sciences Institute (17) (18) forniscono ragguagli det ­
tagliati in merito ai dibattiti sulla selezione delle dosi per gli studi di tos ­
sicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi 
dipende dal o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel 
selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equi ­
librio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratteriz ­
zazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare 
importanza nella situazione in cui si deve svolgere uno studio combinato di 
tossicità cronica e di cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) (paragrafo 11).
 
11. È opportuno valutare l’opportunità di svolgere uno studio combinato di 
tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) piut ­
tosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (il presente metodo di prova B.30) e uno studio di cancerogenesi (capitolo B.32 del 
presente allegato). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della 
gestione dei tempi e dei costi rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la croni ­
cità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno 
studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del 
presente allegato) occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 9 e 20-25). È inoltre ricono ­
sciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi 
ben distinti.
 
12. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono speci ­
ficate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE n. 
116 (6).  
PRINCIPIO DELLA PROVA  
13. La sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi graduali 
a diversi gruppi di animali sperimentali, di norma per un periodo di 12 mesi, ma a seconda degli obblighi normativi possono essere scelti anche periodi 
più lunghi o più corti (cfr. paragrafo 33). La durata scelta deve essere 
sufficientemente lunga da garantire la manifestazione degli effetti della tos ­
sicità cumulata senza che insorgano gli effetti distorsivi dei cambiamenti geriatrici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 
12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. 
La sostanza chimica in esame di norma è somministrata per via orale, ma può essere opportuno anche ricorrere alla via inalatoria o cutanea. Il disegno sperimentale può anche prevedere uno o più sacrifici intermedi, ad esempio 
dopo 3 e 6 mesi, e a tale fine possono essere introdotti nello studio ulteriori 
animali (cfr. paragrafo 19). Durante il periodo di somministrazione si ten ­
gono gli animali sotto attenta osservazione per individuare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono 
sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti ven ­
gono soppressi e sottoposti a necroscopia.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 441
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
14. Il presente metodo di prova riguarda innanzitutto la valutazione e l’esame 
della tossicità cronica nei roditori (cfr. paragrafo 2), sebbene sia riconosciuto che determinati regimi normativi possano richiedere studi analoghi su non roditori. La scelta delle specie deve essere motivata. Il disegno e lo svolgi ­
mento di studi di tossicità cronica su specie di non roditori, se richieste, 
vanno basate sui principi indicati nel presente metodo di prova e in quelli specificati nel capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5). Il 
documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informa ­
zioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo.
 
15. Nel presente metodo di prova la specie di roditore di elezione è il ratto, 
sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. I 
ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e 
della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste ca ­
ratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Occorre utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Lo studio di tossicità 
cronica va svolto su animali dello stesso ceppo e della medesima prove ­
nienza di quelli utilizzati in uno o più studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Le femmine devono essere nullipare e non gravide.
 
Condizioni di stabulazione e alimentazione  
16. Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti pic ­
coli gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata 
soltanto se scientificamente giustificata (19) (20) (21). Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 
3 °C). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferibilmente non 
superiore al 70 %; tranne durante la pulizia del laboratorio, con l’obiettivo del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono 
usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’ac ­
qua di abbeveraggio. La dieta deve corrispondere a tutti i requisiti nutrizio ­
nali delle specie in esame e il tenore di contaminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pe ­
santi e micotossine, che potrebbero influenzare l’esito della prova, deve 
essere il più basso possibile. Le informazioni analitiche sui livelli di nu ­
trienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, 
quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, 
e vanno riportate nella relazione finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una 
combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza 
di rispettare i requisiti nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata con il cibo.
 
Preparazione degli animali  
17. Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di 
laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti 
ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione 
delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali usati per la prova devono 
essere caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, 
peso ed età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali di
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 442
 
ciascun sesso utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del 
peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo 
a seconda del sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegna ­
zione randomizzata, non dovrebbero esserci più differenze significative nel 
peso medio corporeo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti diffe ­
renze statisticamente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possibile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identifica ­
zione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite 
tatuaggio, impianto di un microchip o un altro metodo analogo.
 
PROCEDURA  
Numero e sesso degli animali  
18. È opportuno usare animali di entrambi i sessi. E necessario impiegare un 
numero di animali tale da consentire che alla fine dello studio sia disponibile una quantità di animali in ogni gruppo sufficiente per effettuare una valu ­
tazione biologica e statistica. Per quanto riguarda i roditori, per ciascun 
livello di dose di norma si usano almeno 20 esemplari per sesso in ogni 
gruppo, mentre per i non roditori si raccomanda un minimo di 4 esemplari per sesso in ciascun gruppo. Negli studi che prevedono la presenza di topi potrebbero essere necessari ulteriori animali in ciascun gruppo-dose per 
poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso.
 
Disposizioni relative ai sacrifici intermedi, a gruppi satellite e ad ani ­
mali sentinella  
19. Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi (almeno 
10 animali/sesso/gruppo), ad esempio dopo 6 mesi, al fine di reperire infor ­
mazioni sull’evoluzione di alterazioni tossicologiche e dati meccanicistici. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi pos ­
sono non essere scientificamente giustificati. Ai fini del monitoraggio della 
reversibilità dei cambiamenti tossicologici indotti dalla sostanza chimica in esame possono essere previsti anche gruppi satellite. Tali gruppi di norma saranno limitati al livello di dose più elevato dello studio e ai gruppi di 
controllo. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario du ­
rante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (22). Se sono previsti sacrifici intermedi o inclusioni di gruppi satellite o di animali sentinella, il numero di animali 
previsto dal disegno sperimentale va aumentato della quantità di animali che 
si intende sacrificare prima della conclusione dello studio. Gli animali inte ­
ressati di norma sono sottoposti alle medesime osservazioni, tra cui il con ­
trollo del peso corporeo, il consumo di cibo/acqua, analisi ematologiche e 
biochimico-cliniche ed esami patologici degli animali coinvolti nella fase di esame della tossicità cronica dello studio principale, sebbene sia possibile disporre anche che (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello 
studio) le osservazioni siano limitate a parametri essenziali specifici, come 
la neurotossicità o l’immunotossicità.
 
Gruppi-dose e dosaggi  
20. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce indicazioni in 
merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli 
di dose. Occorre utilizzare almeno tre livelli di dose e un controllo parallelo, 
tranne quando si esegue una prova limite (cfr. paragrafo 27). I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere 
conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla 
sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche analoghe.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 443
 
21. A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza 
chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più 
elevato di norma va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. In considerazione dei fattori di cui al paragrafo 22 sottostante, il 
livello di dose più elevato è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad 
esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %).
 
22. Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può 
optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la 
tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccu ­
pante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso cor ­
poreo. La dose massima non può essere superiore a 1 000 mg/kg di peso 
corporeo/giorno (dose limite, cfr. paragrafo 27).  
23. I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per 
stabilire un rapporto dose-risposta e un NOAEL o altri risultati attesi dello 
studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD,  benchmark dose , cfr. 
paragrafo 25) al livello di dose più basso. Tra i fattori da tenere in consi ­
derazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del 
rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti 
nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi.
 
24. L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dalle caratteristiche della 
sostanza chimica di prova e non può essere imposto dal presente metodo di 
prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati 
delle prove se applicati per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 
6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e 
se vi si ricorre è opportuno giustificare tale scelta.
 
25. Come illustrato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 
116 (6), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti:
 
— non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva 
dose-risposta,  
— aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione 
metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne,  
— lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biolo ­
gici fondamentali sottostanti in corso,  
— aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi 
alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono pertur ­
bati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc.,  
— regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima partico ­
larmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento pre ­
vista o di una soglia ipotizzata,  
— considerazione dei livelli previsti di esposizione umana.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 444
 
26. Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo 
nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in 
esame. Salvo il trattamento con la sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il 
veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è 
somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà 
di più a tale scopo.
 
27. Se, basandosi sulle informazioni degli studi preliminari, è possibile preve ­
dere che una prova a un livello di dose equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno probabilmente non produce effetti avversi e se, sulla 
base dei dati relativi a sostanze chimiche strutturalmente affini, non si 
prevede tossicità, uno studio completo con tre livelli di dose può non essere ritenuto necessario. Si può applicare un limite di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno eccetto nei casi in cui l’esposizione umana indica la neces ­
sità di utilizzare un livello di dose più elevato.
 
Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in 
esame  
28. La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, 
l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orienta ­
mento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende 
dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza 
chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo pre ­
dominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute 
animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma va scelta solo 
per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o pre ­
senti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solita ­
mente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la 
somministrazione per altre vie.
 
29. Ove necessario, la sostanza chimica di prova è disciolta o sospesa in un 
veicolo adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle se ­
guenti caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica 
in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame 
che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una 
soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/ 
emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito 
alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle solu ­
zioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di sommi ­
nistrazione (ad esempio dieta).
 
30. Per le sostanze chimiche somministrate con la dieta o l’acqua di abbeve ­
raggio è importante impedire che le quantità della sostanza chimica in esame 
interferiscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concentrazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può 
superare la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli 
squilibri alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale 
(mg/kg di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di 
eventuali alternative va specificata.
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31. In caso di somministrazione per via orale, agli animali viene somministrata 
una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la setti ­
mana), di norma per un periodo di 12 mesi (cfr. anche paragrafo 33), sebbene a seconda degli obblighi normativi possa essere richiesta una durata superiore. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, 
ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via 
cutanea, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (10), per un periodo di 12 mesi. L’espo ­
sizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, 
ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 12 mesi. Se delle specie di roditori diverse dai ratti sono sottoposte a esposizione «a naso 
solo», è possibile adeguare la durata massima di esposizione per ridurre al 
minimo il loro stress. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (8).
 
32. Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via 
intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda gastrica o una cannula 
per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esem ­
pio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile 
mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte 
al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 
ml/100 g di peso corporeo (22). La variabilità dei volumi somministrati va 
ridotta al minimo regolando la concentrazione in modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite 
per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con 
concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto ga ­
strointestinale.
 
Durata dello studio  
33. Sebbene il presente metodo di prova sia impostato in primo luogo come uno 
studio di tossicità cronica della durata di 12 mesi, il disegno sperimentale rende possibile e può essere applicato anche a studi dalla durata più breve 
(ad esempio 6 o 9 mesi) o più lunga (ad esempio 18 o 24 mesi), a seconda 
delle disposizioni di regimi normativi specifici o dagli specifici fini mecca ­
nicistici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. I 
gruppi satellite inclusi nello studio per monitorare la reversibilità dei cam ­
biamenti a livello tossicologico indotti dalla sostanza chimica in esame sono tenuti senza trattamento per un periodo non inferiore a 4 settimane e non oltre un terzo della durata dello studio una volta terminata l’esposizione. Il 
documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori indica ­
zioni, tra cui considerazioni in merito alla sopravvivenza nello studio.
 
OSSERVAZIONI  
34. Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mor ­
talità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al gior ­
no, preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di picco 
degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa av ­
venga per via intragastrica.
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35. Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche almeno 
una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all’in ­
terno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, al termine della prima settimana dello studio e successivamente a cadenza mensile. Le osservazioni devono rispettare un protocollo che limiti al minimo indispensabile le dif ­
ferenze tra i singoli e non devono dipendere dai risultati del gruppo esami ­
nato. Le osservazioni del caso vanno eseguite fuori dalla gabbia di stabu ­
lazione, preferibilmente in un ambiente standard e all’incirca sempre allo stesso orario. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente 
usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio 
che esegue la prova. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della 
comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività del sistema nervoso 
autonomo (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come 
pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per esempio 
tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per esempio automutilazione, marcia a ritroso) (24).
 
36. Tutti gli animali devono essere sottoposti a un esame oftalmologico con un 
oftalmoscopio o un altro dispositivo idoneo, prima della prima sommini ­
strazione della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, questo 
esame deve essere condotto preferibilmente su tutti gli animali, ma almeno sui gruppi ad alta dose e di controllo. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali. Se da 
un’analisi strutturale o da altre informazioni si riscontra una tossicità ocu ­
lare, la frequenza degli esami oculari va intensificata.
 
37. Per le sostanze chimiche per cui prove precedenti di tossicità a dose ripetuta 
a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti neurotossici, possono essere svolte valutazioni facoltative della reattività sensoriale a 
stimoli di vario tipo (24) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) 
(25), (26), (27), della forza di presa (28) e dell’attività motoria (29) prima dell’inizio dello studio e a cadenza trimestrale dopo l’inizio dello studio fino al 12° mese incluso, così come alla fine dello studio (se più lungo di 12 
mesi). Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle 
voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure alternative non indicate nella bibliografia.
 
38. Le sostanze chimiche per cui prove di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni 
e/o a 90 giorni hanno indicato effetti potenzialmente immunotossici, alla 
fine dello studio possono essere sottoposte ad ulteriori analisi facoltative 
di tale parametro.  
Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare  
39. Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una 
volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimen ­
tare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 
settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza 
chimica è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della 
misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è 
alterato.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 447
 
Esami ematologici e biochimico-clinici  
40. Negli studi che prevedono la presenza di roditori, vanno svolti esami ema ­
tologici su almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, a 3, 6 e 12 mesi, così come alla fine dello studio 
(se di durata superiore a 12 mesi), sempre sugli stessi animali. Se sono 
previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso (cfr. paragrafo 18). Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali 
(ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a 
stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misu ­
razioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono 
necessariamente essere condotte se non è stato riscontrato nessun effetto 
in base ai parametri ematologici in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Occorre prelevare cam ­
pioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal 
seno retro-orbitale, sotto anestesia.
 
41. Vanno esaminati i seguenti parametri (30): conteggio totale e differenziato 
dei leucociti, conteggio degli eritrociti, conteggio delle piastrine, ematocrito (volume sanguigno occupato dalla componente eritrocitaria), volume corpu ­
scolare medio, emoglobina corpuscolare media, concentrazione di emoglo ­
bina corpuscolare media, tempo di prototrombina e tempo di tromboplastina parziale attivata. Possono essere misurati anche altri parametri ematologici come i corpi di Heinz o un’altra morfologia eritrocitaria atipica o metaemo ­
globina, se del caso, a seconda della tossicità della sostanza chimica in 
esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in fun ­
zione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chi ­
mica in esame. Se la sostanza chimica in esame ha un effetto sul sistema 
ematopoietico, possono essere indicati anche il conteggio dei reticolociti e la 
citologia del midollo osseo, sebbene questi non siano necessariamente esami di routine.
 
42. Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici 
gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, vanno condotte 
su campioni di sangue prelevati da almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, ai medesimi intervalli di tempo specificati per gli esami ematologici e sempre sugli stessi animali. Se sono 
previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter 
eseguire tutte le determinazioni biochimiche cliniche del caso. Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a 
stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misu ­
razioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri di biochimica clinica in uno studio precedente della durata di 90 
giorni condotto con livelli di dose comparabili. Si raccomanda di lasciare gli 
animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (ad eccezione dei topi). Vanno esaminati i seguenti parametri (30): glucosio, urea (azoto ureico), creatinina, proteine totali, albumina, calcio, sodio, potassio, cole ­
sterolo totale, almeno due esami idonei alla valutazione epatocellulare (ala ­
nina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, glutammato deidrogenasi, acidi biliari totali) (31) e almeno due esami idonei alla valutazione epato ­
biliare (fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, 5’-nucleotidasi, biliru ­
bina totale, acidi biliari totali) (31). Se opportuno possono essere misurati 
anche altri parametri di chimica clinica, come i trigliceridi a digiuno, ormoni specifici e colinesterasi, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in fun ­
zione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chi ­
mica in esame.
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43. L’esame delle urine va effettuato su almeno 10 esemplari di sesso maschile 
e 10 esemplari di sesso femminile per gruppo sui campioni raccolti se ­
guendo gli stessi intervalli applicati in ambito ematologico e di chimica clinica. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nes ­
sun effetto sull’esame delle urine in uno studio precedente della durata di 90 
giorni condotto con livelli di dose comparabili. I seguenti parametri sono stati inclusi in una raccomandazione di esperti su studi di patologia clinica (30): aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine totali e 
glucosio. Altre determinazioni riguardano il chetone, l’urobilinogeno, la 
bilirubina e il sangue occulto. Se necessario, per ampliare lo studio dell’ef ­
fetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori parametri.
 
44. Generalmente si considera necessario determinare le variabili di riferimento 
di natura ematologica e di biochimica clinica prima di iniziare un tratta ­
mento in studi che coinvolgono dei cani, ma ciò non è ritenuto necessario 
negli studi che prevedono l’uso di roditori (30). Tuttavia se non si dispone di dati storici di riferimento adeguati (cfr. paragrafo 50), si dovrebbe con ­
siderare di produrre tali dati.
 
Patologia  
Necroscopia macroscopica  
45. Di norma tutti gli animali dello studio vanno sottoposti a completa e detta ­
gliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della su ­
perficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Tuttavia si può anche disporre (per i 
gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio o per i gruppi satellite) 
che le osservazioni siano limitate a parametri specifici essenziali, come la neurotossicità o l’immunotossicità (cfr. paragrafo 19). Gli animali in oggetto non devono necessariamente essere sottoposti ad autopsia e alle procedure 
successive descritte nei seguenti paragrafi. Per gli animali sentinella, valu ­
tando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio.
 
46. Va misurato il peso degli organi di ciascun animale, tranne di quelli esclusi 
dall’ultima parte del paragrafo 45. Le ghiandole surrenali, il cervello, l’epi ­
didimo, il cuore, i reni, il fegato, le ovaie, la milza, i testicoli, la tiroide 
(pesata post-fissazione, con paratiroidi) e l’utero di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la 
dissezione, per evitare l’essiccamento. In studi che prevedono l’uso di topi, 
la misurazione del peso delle ghiandole surrenali è facoltativa.
 
47. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato 
sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (32) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): 
tutte le lesioni macroscopi ­
che cuore pancreas stomaco (prestomaco, sto ­
maco ghiandolare) 
ghiandole surrenali ileo ghiandola paratiroidea [denti] aorta digiuno nervo periferico testicoli 
cervello (incluse le sezioni 
di cervello, cervelletto, bul ­
bo/ponte) reni pituitaria timo 
intestino cieco ghiandola lacrimale 
(esorbitale) prostata tiroide 
cervice fegato retto [lingua]
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ghiandola della coagula ­
zione polmone ghiandola salivare trachea 
colon linfonodi (superficiali e 
profondi) vescicola seminale vescica 
duodeno ghiandola mammaria 
(obbligatoria per esem ­
plari di sesso femminile e, se visibile ai fini della 
la dissezione, anche per 
quelli di sesso maschile) muscolo scheletrico utero (cervice inclusa) 
epididimo [tratto respiratorio supe ­
riore, incluso il naso, i 
turbinati e i seni parana ­
sali] pelle [uretere] 
occhi (retina inclusa) esofago midollo spinale (a tre li ­
velli: cervicale, medio ­
toracico e lombare) [uretra] 
[femore con articolazione] [bulbo olfattivo] milza vagina 
cistifellea (eccetto per i to ­
pi) ovaia [sterno] sezione di midollo osseo e/o 
un aspirato di midollo osseo 
fresco 
ghiandola di Harder
 
In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evi ­
denziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti 
gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della 
sostanza chimica in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via cutanea, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, sono essenziali il campionamento e la conservazione 
della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono 
la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratorio deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e 
del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/tessuti (oltre ai 
tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale.
 
Esame istopatologico  
48. Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi 
di patologia tossicologica (32). Come minimo, gli esami istopatologici de ­
vono prevedere quanto segue:  
— tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo,  
— tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel 
corso dello studio,  
— tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche,  
— tessuti bersaglio o tessuti che hanno evidenziato cambiamenti legati al 
trattamento nel gruppo ad alta dose, di tutti gli animali in tutti gli altri gruppi-dose,
 
— in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
esaminati entrambi gli organi.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 450
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
49. Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati 
vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo speri ­
mentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il 
momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che presentano 
segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di 
animali rapportata al tipo di lesione. Le tabelle riassuntive dei dati devono 
fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continua ­
tiva) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni.
 
50. I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello 
studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli 
sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di 
controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati 
nei cinque anni che precedono lo studio in questione.
 
51. I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e 
generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti 
già in sede di determinazione del disegno sperimentale (paragrafo 8). Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di sopravvivenza, se necessario.
 
Relazione sulla prova  
52. La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  
— origine della sostanza chimica,  
— numero del lotto,  
— certificazione dell’analisi chimica.  
Veicolo (se del caso):  
— giustificazione della scelta del veicolo (se diverso dall’acqua).  
Animali sperimentali:  
— specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata,  
— numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 451
 
— origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc.,  
— peso di ciascun animale all’inizio della prova.  
Condizioni sperimentali:  
— criteri di scelta della via di somministrazione e della dose,  
— laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati,  
— dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la prepara ­
zione della dieta,  
— dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della 
preparazione,  
— via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in 
esame,  
— per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta 
tra esposizione «a naso solo» o «a corpo intero»,  
— dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di 
conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella 
dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva,  
— informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell’acqua.  
Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati 
individuali sugli animali):  
— dati sulla sopravvivenza degli animali,  
— peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo,  
— assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, non ­
ché consumo di acqua, se del caso,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi segni di 
tossicità,  
— natura, incidenza (e, se classificata, la gravità) e durata dei segni clinici 
(temporanei o permanenti),  
— esame oftalmologico,  
— esami ematologici,  
— esami di biochimica clinica,  
— esame delle urine,  
— risultati di tutti gli esami sulla neurotossicità o immunotossicità,  
— peso corporeo finale,  
— peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso),  
— referti autoptici,  
— descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al 
trattamento,  
— dati sull’assorbimento, se disponibili.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 452
 
Elaborazione statistica dei risultati, se del caso  
Discussione dei risultati, compreso:  
— rapporti dose-risposta,  
— esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione,  
— discussione su tutti gli approcci di modellizzazione,  
— determinazione BMD, NOAEL o LOAEL,  
— dati storici di controllo,  
— rilevanza per gli esseri umani.  
Conclusioni  
BIBLIOGRAFIA  
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(5) Capitolo B.27 del presente allegato, Test di tossicità orale subcronica Stu ­
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(8) Capitolo B.8 del presente allegato, Tossicità subacuta a dose ripetuta (28 
giorni) per inalazione.  
(9) Capitolo B.29 del presente allegato, Studio di tossicità subcronica a dose 
ripetuta (90 giorni) per inalazione  
(10) Capitolo B.9 del presente allegato, Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per 
via cutanea.  
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(19) Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 
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131. ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 455
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 456
 
B.31.  STUDIO DI TOSSICITÀ PRENATALE  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde al TG 414 (2001) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo metodo di test della tossicità prenatale è disegnato per fornire 
informazioni generiche riguardanti gli effetti dell'esposizione prena ­
tale a determinate sostanze sia su femmine gravide che sull'organi ­
smo che si sta sviluppando nell'utero. Il test può comprendere la valutazione degli effetti sulla madre e delle cause della morte o di 
anomalie fisiche strutturali o alterazioni della crescita del feto. I 
deficit funzionali, per quanto costituiscano una parte importante dello sviluppo, non sono parte integrante del presente metodo e possono essere valutati in uno studio separato o come segmento aggiuntivo a 
questo studio, usando il metodo di test della neurotossicità nella fase 
di sviluppo. Per ottenere dati sull'analisi dei deficit funzionali e di altri effetti postnatali si rimanda, a seconda dei casi, al metodo di test per lo studio della tossicità sulla riproduzione in due generazioni o a 
quello sulla neurotossicità in fase di sviluppo.
 
Questo metodo di test può richiedere un adattamento particolare in 
alcuni casi, ad esempio in funzione delle conoscenze specifiche circa 
le proprietà fisico-chimiche o tossicologiche della sostanza di saggio. 
Tale adattamento è accettabile laddove, in base ad opportuni riscontri scientifici, risulti utile ai fini della raccolta di dati più specifici. In questo caso tali prove scientifiche vanno attentamente documentate 
nella relazione sullo studio.
 
1.2. DEFINIZIONI  
Tossicologia prenatale:  studio degli effetti negativi sull'organismo 
che si sta sviluppando che possono derivare dall'esposizione prima del concepimento, durante lo sviluppo prenatale o successivamente 
alla nascita fino al momento della maturazione sessuale. Le manife ­
stazioni principali della tossicità sullo sviluppo comprendono 1) morte dell'organismo; 2) anomalia strutturale; 3) alterazione della crescita; e 4) deficit funzionali. L'espressione «tossicologia prenata ­
le» ha soppiantato il termine «teratologia», utilizzato in passato.
 
Effetto negativo:  qualsiasi alterazione rispetto al valore basale cor ­
relata al trattamento che riduca la capacità di un organismo di so ­
pravvivere, riprodursi o adattarsi all'ambiente. Per quanto concerne la 
tossicologia prenatale, nel senso più ampio tale termine comprende 
qualunque effetto che interferisca con il normale sviluppo del con ­
cepito, sia prima che dopo la nascita.  
Alterazione della crescita:  alterazione di un organo o del peso 
corporeo o delle dimensioni della prole.  
Alterazioni (anomalie):  alterazioni strutturali dello sviluppo, com ­
prendenti sia malformazioni che variazioni (28).  
Malformazione/anomalia grave:  modifica strutturale considerata 
dannosa per l'animale (può anche essere letale) e solitamente rara.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 457
 
Variazione/anomalia non grave:  modifica strutturale considerata 
scarsamente o per nulla dannosa per l'animale; può essere transitoria 
e può comparire con relativa frequenza nella popolazione di controllo.  
Concepito:  l'insieme dei derivati di un ovulo fertilizzato a qualsiasi 
stadio di sviluppo, dalla fecondazione fino alla nascita, comprendente 
le membrane extraembrionali nonché l'embrione o il feto.  
Impianto (annidamento):  attecchimento della blastocisti sul rivesti ­
mento epiteliale dell'utero, compresi la sua penetrazione attraverso 
l'epitelio uterino e il suo annidamento nell'endometrio.  
Embrione:  lo stadio precoce o di sviluppo di qualsiasi organismo, in 
particolare il prodotto in via di sviluppo della fecondazione di un uovo, dal momento in cui si individua l'asse longitudinale fino alla comparsa di tutte le strutture principali.
 
Embriotossicità:  insieme di caratteristiche dannose per la struttura 
anatomica di un embrione, per il suo sviluppo, la crescita e/o la vitalità.
 
Feto:  prodotto del concepimento nel periodo post-embrionale, prima 
della nascita.  
Fetotossicità:  insieme di caratteristiche dannose per la struttura ana ­
tomica di un feto, per il suo sviluppo, la crescita e/o la vitalità.  
Aborto:  espulsione prematura dall'utero dei prodotti del concepi ­
mento (ossia embrioni o feti non vitali).  
Riassorbimento:  un concepito che, dopo essersi impiantato nell'utero, 
muore e viene, o è stato, riassorbito.  
Riassorbimento precoce:  segni di avvenuto impianto in assenza di 
embrione o feto riconoscibili.  
Riassorbimento tardivo:  embrione o feto morto con 
alterazioni degenerative esterne.  
NOAEL:  abbreviazione di no-observed-adverse-effect level (livello 
al quale non si osservano effetti negativi) che indica la dose o il 
livello di esposizione massimi ai quali non si osservano effetti 
negativi correlati al trattamento.  
1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPIO DEL TEST  
Di norma la sostanza di saggio viene somministrata a femmine gra ­
vide di animali da laboratorio come minimo dal momento dell'im ­
pianto fino al giorno precedente la soppressione programmata, che 
deve avvenire quanto più in prossimità della normale data del parto, 
senza tuttavia rischiare di perdere utili dati a causa di un parto prematuro. Il metodo di test non è inteso a esaminare esclusivamente il periodo dell'organogenesi (cioè i giorni 5-15 nei roditori, e i giorni 
6-18 nei conigli), bensì anche gli effetti antecedenti all'impianto, se 
di pertinenza, lungo tutto il periodo di gestazione fino al giorno precedente l'isterotomia con taglio cesareo. Poco prima dell'inter ­
vento le femmine vengono soppresse, il contenuto dell'utero viene 
esaminato e i feti vengono valutati alla ricerca di anomalie visibili 
esteriormente e di alterazioni dei tessuti molli e dello scheletro.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 458
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI TEST  
1.5.1.  Selezione delle specie animali  
Si raccomanda di effettuare il test sulle specie più adeguate e di 
utilizzare le specie e i ceppi da laboratorio solitamente impiegati 
per i test di tossicità prenatale. La specie di roditori di elezione è 
il ratto, mentre tra i non roditori si preferirà il coniglio. In caso di utilizzo di un'altra specie è necessario motivarne la scelta.
 
1.5.2.  Condizioni di stabulazione e alimentazione  
La temperatura dello stabulario deve essere di 22  o C (± 3  o ) per i 
roditori e 18  o C (± 3  o ) per i conigli. Sebbene l'umidità relativa debba 
raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, occorre puntare a un valore del 50-60 %. L'illuminazione deve essere artificiale, con 
una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per quanto concerne 
l'alimentazione si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile.
 
Le procedure di accoppiamento vanno effettuate in gabbie adeguate 
allo scopo. Sebbene sia preferibile alloggiare singolarmente gli ani ­
mali accoppiati, è accettabile anche che vengano alloggiati in piccoli gruppi nella stessa gabbia.
 
1.5.3.  Preparazione degli animali  
Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni 
di laboratorio per almeno 5 giorni e non siano stati precedentemente 
sottoposti ad altre procedure sperimentali. Gli animali sottoposti al test vanno caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, prove ­
nienza, sesso, peso e/o età. Gli animali di tutti i gruppi del test 
devono essere, per quanto praticamente possibile, di età e peso uni ­
formi. Per ciascun livello di dose vanno usate giovani femmine adulte nullipare. Le femmine vanno fatte accoppiare con maschi della stessa specie e dello stesso ceppo, evitando l'accoppiamento 
fra consanguinei della stessa generazione. Nei roditori il giorno 0 
di gestazione è il giorno in cui si osserva un tappo vaginale e/o la presenza di spermatozoi; nei conigli il giorno 0 è in genere il giorno del coito o dell'inseminazione artificiale, qualora venga utilizzata 
questa tecnica. Le femmine accoppiate vanno assegnate a random 
ai gruppi di controllo e di trattamento. Le gabbie vanno sistemate in modo da ridurre al minimo i possibili effetti dovuti alla loro posi ­
zione nell'ambiente. A ciascun animale va assegnato un numero 
identificativo unico. Se le femmine vengono fatte accoppiare in lotti, 
gli individui di ciascun lotto vanno equamente distribuiti nei vari gruppi. Analogamente, le femmine fecondate dallo stesso maschio vanno equamente distribuite tra i vari gruppi.
 
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Numero e sesso degli animali  
Ciascun gruppo di trattamento e di controllo deve contenere un 
numero sufficiente di femmine da fornire all'incirca 20 femmine con siti di impianto all'autopsia. Gruppi con meno di 16 femmine che presentano siti di impianto potrebbero risultare inadeguati. La 
mortalità delle femmine gravide non invalida necessariamente lo 
studio, a condizione che non superi il 10 % circa.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 459
 
1.6.2.  Preparazione delle dosi  
Qualora per facilitare il dosaggio si impiegasse un veicolo o un altro 
additivo, occorre tenere conto delle seguenti caratteristiche: effetti su assorbimento, distribuzione, metabolismo e ritenzione o escrezione 
della sostanza di saggio; effetti sulle proprietà chimiche della so ­
stanza di saggio che possono alterarne le caratteristiche tossiche; effetti sul consumo di cibo o di acqua o sulle condizioni nutrizionali degli animali. Il veicolo non deve avere effetti tossici 
sullo sviluppo, né influire sulla riproduzione.
 
1.6.3.  Dosaggio  
Di norma la sostanza di saggio va somministrata quotidianamente dal 
momento dell'impianto (ad esempio il giorno 5 dopo l'accoppiamen ­
to) fino al giorno precedente l'isterotomia. Se studi preliminari, ove 
disponibili, non indicano un alto potenziale di perdita preimpianto, il 
trattamento può comprendere l'intero periodo di gestazione, dall'ac ­
coppiamento fino al giorno precedente la soppressione. È noto che la manipolazione inadeguata delle femmine gravide o la loro esposi ­
zione a stress può provocare la perdita del feto o dell'embrione. Per 
evitare aborti dovuti a fattori non correlati al trattamento occorre maneggiare le femmine gravide solo se strettamente necessario, pro ­
teggendole da stress causati da fattori esterni (ad esempio il rumore).
 
Si somministrano almeno tre diversi livelli di dose e un controllo 
corrispondente. Gli animali sani vanno assegnati per randomizza ­
zione ai gruppi di controllo e di trattamento. I livelli di dose vanno distanziati in modo che gli effetti tossici siano graduali. A meno che 
la natura fisico-chimica o le proprietà biologiche della sostanza di 
saggio non impongano limiti in tal senso, il livello della dose più elevata va scelto con l'obiettivo di indurre un determinato grado di tossicità sullo sviluppo dei feti e/o di tossicità materna (segni clinici 
oppure riduzione del peso corporeo), senza tuttavia provocarne il 
decesso o arrecare loro gravi sofferenze. Almeno un livello interme ­
dio di dose deve produrre effetti tossici minimi osservabili. Il livello della dose minima non deve produrre segni di tossicità né nella 
madre, né nel feto. I livelli di dose devono essere selezionati in 
sequenza decrescente allo scopo di dimostrare la correlazione tra il dosaggio e la risposta e determinare il NOAEL. Per fissare le dosi a livelli decrescenti è utile utilizzare fattori compresi tra due e quattro; 
spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di trattamento piut ­
tosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio un fattore superiore a 10) fra i dosaggi. Sebbene l'obiettivo sia determinare il NOAEL nelle femmine gravide, sono ritenuti comunque validi anche 
gli studi che non stabiliscono tale livello (1).
 
I livelli di dose vanno selezionati tenendo conto di eventuali dati 
esistenti sulla tossicità, oltre alle informazioni sul metabolismo e sulla tossicocinetica della sostanza di saggio o di sostanze ad essa 
correlate. Tali dati contribuiscono altresì a dimostrare l'adeguatezza 
del regime di dosaggio.
 
Occorre utilizzare al contempo un gruppo di controllo che va sotto ­
posto a trattamento simulato oppure, qualora si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza di saggio, un gruppo che va trattato col 
solo veicolo. La quantità della sostanza di saggio o del veicolo da 
somministrare a tutti i gruppi deve essere uguale. Gli animali di controllo devono essere manipolati esattamente come quelli sottopo ­
sti al test. La quantità del veicolo da somministrare ai gruppi di 
controllo deve essere equivalente a quella più elevata utilizzata 
(come nel gruppo di trattamento con dosaggio più basso).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 460
 
1.6.4.  Test limite  
Se, a seguito di somministrazione orale di un unico livello di dose di 
almeno 1 000 mg/kg peso corporeo/die, usando le procedure descritte nel presente studio, non si osservano effetti tossici nelle femmine 
gravide o nella loro progenie e qualora, sulla base di dati esistenti 
(ad esempio relativi a sostanze stutturalmente simili e/o metabolica ­
mente correlate) non si preveda alcun effetto, lo studio completo con tre livelli di dose può non essere considerato necessario. Il livello 
probabile di esposizione umana può suggerire la necessità di utiliz ­
zare un livello di dose orale più elevata nel test limite. Per altre vie di somministrazione (ad es. inalazione o applicazione cutanea) sono 
spesso le proprietà fisico-chimiche della sostanza di saggio a indicare 
e limitare il massimo livello di esposizione raggiungibile (ad esempio l'applicazione cutanea non deve provocare grave tossicità locale).
 
1.6.5.  Somministrazione delle dosi  
La sostanza di saggio o il veicolo vengono normalmente sommini ­
strati oralmente per intubazione. Volendo utilizzare un'altra via di somministrazione occorre motivare e argomentare tale scelta; in tal caso potrebbe essere necessario modificare opportunamente il proto ­
collo sperimentale (2)(3)(4). La sostanza di saggio va somministrata 
ogni giorno all'incirca alla stessa ora.
 
La dose somministrata ai singoli animali deve normalmente essere 
basata sulla determinazione più recente del peso corporeo individua ­
le. Occorre tuttavia prestare particolare attenzione nel regolare la dose durante l'ultimo periodo della gravidanza. Nel selezionare le 
dosi è utile ricorrere a dati disponibili per evitare il rischio di pro ­
vocare una eccessiva tossicità materna. Comunque, gli animali in cui si dovessero osservare effetti di eccessiva tossicità vanno soppressi con metodi non cruenti. Se diverse femmine gravide mostrano segni 
di eccessiva tossicità, occorre prendere in considerazione l'opportu ­
nità di sopprimere l'intero gruppo corrispondente alla dose in que ­
stione. Quando la sostanza viene somministrata mediante sonda, va data di preferenza in un'unica dose mediante sondino gastrico od 
opportuna cannula da intubazione. Il massimo volume di liquido 
che può essere somministrato in un'unica volta dipende dalle dimen ­
sioni dell'animale. Il volume non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere 
somministrate in quantità pari a 2 ml/100 g di peso corporeo. Se si 
utilizza olio di semi di mais come veicolo il volume non deve superare 0,4 ml/100 g di peso corporeo. La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando le concentrazioni in 
modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose.
 
1.6.6.  Osservazione delle femmine gravide  
Le osservazioni cliniche vanno eseguite e registrate almeno una volta 
al giorno e preferibilmente alla stessa ora, tenendo conto della fine ­
stra di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione. Si regi ­
strano le condizioni degli animali, compresi mortalità, agonia, alte ­
razioni pertinenti del comportamento e qualunque segno di evidente tossicità.
 
1.6.7.  Peso corporeo e consumo di cibo  
Le femmine vanno pesate il giorno 0 della gestazione o comunque 
entro il giorno 3 della gestazione, nel caso si tratti di animali accop ­
piati in una data prestabilita forniti da un allevatore esterno, oltre che 
il primo giorno di somministrazione, almeno ogni 3 giorni durante il 
periodo di somministrazione e il giorno della soppressione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 461
 
Il consumo di cibo va registrato a intervalli di tre giorni, in coinci ­
denza dei giorni in cui si determina il peso corporeo.  
1.6.8.  Esame autoptico  
Le femmine vanno soppresse un giorno prima della data prevista del 
parto. Le femmine che presentano segni di aborto o parto prematuro prima della soppressione programmata vanno soppresse e sottoposte 
a esame macroscopico completo.
 
Al momento della soppressione o del decesso durante lo studio le 
femmine vanno esaminate macroscopicamente alla ricerca di even ­
tuali anomalie strutturali o alterazioni patologiche. Per garantire la 
completa imparzialità nell'interpretazione dei dati è preferibile che la valutazione delle femmine durante l'isterotomia e le successive ana ­
lisi dei feti siano effettuate senza conoscere il gruppo di trattamento.
 
1.6.9.  Esame del contenuto uterino  
Immediatamente dopo la soppressione o appena possibile dopo il 
decesso occorre asportare l'utero e accertare lo stato di gravidanza degli animali. Gli uteri che non risultino gravidi vanno ulteriormente esaminati (ad esempio con colorazione mediante sol ­
furo di ammonio per i roditori e colorazione di Salewski o un me ­
todo alternativo adeguato per i conigli) per confermare l'assenza di una gravidanza (5).
 
Si procede a pesatura degli uteri gravidi e del collo cervicale. Il 
peso degli uteri gravidi non va invece rilevato per gli animali trovati morti durante lo studio.
 
Nelle femmine gravide occorre determinare il numero di corpi lutei.  
Il contenuto uterino va esaminato per determinare il numero di em ­
brioni o feti, sia morti che vitali. Occorre descrivere il grado di 
riassorbimento allo scopo di stimare il momento relativo della morte 
del concepito (vedi sezione 1.2).  
1.6.10.  Esame dei feti  
È necessario determinare sesso e peso corporeo di ciascun feto.  
Ciascun feto va esaminato alla ricerca di alterazioni esteriori (6).  
L'esame dei feti deve essere teso a individuare alterazioni scheletri ­
che e dei tessuti molli (ad esempio, variazioni e malformazioni o 
anomalie) (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21) ­
(22)(23)(24). La classificazione delle alterazioni fetali in categorie è preferibile ma non indispensabile. Quando si effettua tale classifi ­
cazione occorre specificare con chiarezza i criteri utilizzati per la 
definizione di ciascuna categoria. Particolare attenzione deve essere 
dedicata all'apparato riproduttore, che va esaminato alla ricerca di eventuali alterazioni dello sviluppo.
 
Per quanto concerne i roditori, circa la metà di ciascuna nidiata va 
preparata ed esaminata alla ricerca di alterazioni scheletriche. I re ­
stanti piccoli vanno preparati ed esaminati per l'analisi dei tessuti molli mediante sezionamento seriale secondo metodi adeguati o ac ­
cettati oppure procedendo con cautela alla dissezione macroscopica 
dei tessuti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 462
 
Per quanto riguarda i non roditori, ad esempio i conigli, tutti i feti 
vanno sottoposti ad analisi sia dei tessuti molli che dello scheletro. I 
corpi di questi feti vanno esaminati mediante cauta dissezione alla ricerca di eventuali alterazioni dei tessuti molli, compresa, ove op ­
portuno, la struttura cardiaca interna (25). Di metà dei feti esaminati 
in questo modo è necessario rimuovere la testa e trattarla per ana ­
lizzare ulteriormente i tessuti molli (compresi occhi, cervello, cavità nasali e lingua) con metodi di sezionamento seriale standard (26) o un metodo altrettanto sensibile. I corpi di questi feti, nonché i re ­
stanti feti intatti, vanno trattati ed esaminati alla ricerca di alterazioni 
scheletriche, utilizzando gli stessi metodi descritti per i roditori.
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati vanno riportati individualmente per ciascuna femmina gravida 
e per la loro prole e riassunti sotto forma di tabella, evidenziando per ciascun gruppo sperimentale il numero di animali all'inizio del test, il numero di animali trovati morti durante il test o soppressi per motivi 
umanitari, il momento di eventuali decessi o soppressioni, il numero 
di femmine gravide, il numero di animali che mostrano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, ivi compresi il momento dell'insorgenza, la durata e la gravità di eventuali effetti 
tossici, i tipi di osservazioni embrio/fetali, nonché tutti i dati di 
rilievo riguardanti le figliate.
 
È necessario valutare i risultati numerici mediante un metodo stati ­
stico adeguato, usando la nidiata come unità di base per l'analisi dei dati. Occorre utilizzare un metodo statistico generalmente accettato; i 
metodi statistici vanno selezionati come parte del disegno sperimen ­
tale e devono essere giustificati. Occorre riportare anche i dati sugli animali che non sono sopravvissuti fino alla soppressione program ­
mata, che peraltro possono essere inclusi nel calcolo delle medie del 
gruppo, se pertinenti. La pertinenza dei dati ottenuti da tali animali, e 
pertanto l'inclusione o l'esclusione dal calcolo delle medie del grup ­
po, va motivata e giudicata singolarmente.
 
2.2. VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati dello studio di tossicità sullo sviluppo prenatale vanno 
valutati in base agli effetti osservati. La valutazione deve includere le seguenti informazioni:
 
— risultati dei test sulle femmine gravide e sui feti/embrioni, ivi 
compresa la valutazione del rapporto, o la sua assenza, fra l'esposizione degli animali alla sostanza di saggio e l'incidenza 
e la gravità di tutti gli effetti,
 
— criteri applicati per l'eventuale suddivisione in categorie delle 
alterazioni fetali esteriori, a carico dei tessuti molli e dello sche ­
letro, ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 463
 
— se pertinenti, dati storici di controllo per una migliore interpre ­
tazione dei risultati dello studio,  
— numeri utilizzati per il calcolo delle percentuali o degli indici  
— adeguata analisi statistica dei reperti dello studio, se di pertinen ­
za; dati sul metodo di analisi per consentire ad un revisore/ ­
esperto di statistica indipendente di rivalutare e ricostruire l'ana ­
lisi. 
In assenza di effetti tossici a conclusione di uno studio occorre 
prendere in considerazione l'opportunità di eseguire ulteriori indagini per determinare l'assorbimento e la biodisponibilità della sostanza di 
saggio.
 
2.3. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Uno studio della tossicità sullo sviluppo prenatale deve fornire in ­
formazioni sugli effetti dell'esposizione ripetuta ad una sostanza du ­
rante la gravidanza, sulle femmine gravide e sullo sviluppo intraute ­
rino della prole. I risultati dello studio vanno interpretati insieme ai dati derivanti da studi subcronici, sulla riproduzione, di tossicocine ­
tica e altri studi disponibili. Poiché l'enfasi viene posta sia sulla 
tossicità generale, in termini di tossicità materna, che sugli endpoint 
di tossicità sullo sviluppo, i risultati dello studio consentiranno in parte di discriminare fra gli effetti sullo sviluppo che si verificano in assenza di tossicità generale e quelli che sono indotti solo a livelli 
che risultano tossici anche per le madri (27).
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione deve contenere le seguenti informazioni specifiche:  
Sostanza di saggio:  
— natura fìsica e, ove pertinenti, proprietà fisico-chimiche,  
— identificazione, compreso numero CAS se noto/stabilito,  
— purezza.  
Veicolo (se pertinente):  
— giustificazione per la scelta del veicolo, se diverso dall'acqua.  
Animali sperimentali:  
— specie e ceppo,  
— numero ed età degli animali,  
— origine, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso individuale degli animali all'inizio del test.  
Condizioni del test:  
— motivazione per la selezione del livello delle dosi,  
— dettagli sulla formulazione/preparazione della sostanza di saggio 
somministrata nella dieta, concentrazioni ottenute, stabilità e 
omogeneità della preparazione,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 464
 
— dettagli sulla somministrazione della sostanza di saggio,  
— conversione dalla concentrazione della sostanza di saggio in 
dieta/acqua potabile (ppm) alla dose vera e propria (mg/kg 
peso corporeo/die), se pertinente,  
— condizioni ambientali,  
— dettagli circa la qualità di cibo e acqua.  
Risultati:  
Dati sulla tossicità materna in funzione della dose (elenco non esau ­
stivo):  
— numero di animali all'inizio del test, numero di animali soprav ­
vissuti, numero di gravide e numero di femmine che hanno 
abortito, numero di femmine che hanno partorito precocemente,  
— giorno del decesso durante lo studio o indicazione del fatto che gli 
animali sono sopravvissuti fino alla soppressione programmata,  
— i dati sugli animali non sopravvissuti fino alla soppressione pro ­
grammata vanno riportati ma non inclusi nelle analisi statistiche di confronto fra i gruppi,
 
— giorno di osservazione di ciascun segno clinico anomalo e suo 
successivo decorso,  
— peso corporeo, modifica del peso corporeo e peso dell'utero gra ­
vido, compresa, facoltativamente, modifica del peso corporeo corretta in base al peso dell'utero gravido,
 
— consumo di cibo ed eventualmente di acqua,  
— reperti autoptici, compreso il peso dell'utero,  
— valori di NOAEL in riferimento agli effetti sulle genitrici e sullo 
sviluppo.  
Endpoint relativi allo sviluppo per ciascuna dose e nidiata (con 
impianti) ed inoltre:  
— numero di corpi lutei,  
— numero di impianti, numero e percentuale di feti vivi e morti e di 
riassorbimenti,  
— numero e percentuale di perdite pre- e post-impianto.  
Endpoint relativi allo sviluppo per ciascuna dose e figliata (con feti 
vivi) ed inoltre:  
— numero e percentuale di piccoli vivi,  
— rapporto fra i sessi,  
— peso corporeo fetale, preferibilmente per sesso e con i sessi 
combinati,  
— malformazioni esteriori, dei tessuti molli e scheletriche e altre 
alterazioni di rilievo,  
— criteri per la suddivisione in categorie, se pertinenti,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 465
 
— numero totale e percentuale di feti e nidiate con eventuali alte ­
razioni esteriori, dei tessuti molli o scheletriche, oltre ai tipi e 
all'incidenza delle singole anomalie e di altre alterazioni rilevanti.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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B.32.  STUDI DI CANCEROGENESI  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 451 (2009). La prima linea guida n. 451 sugli studi di carcinogenesi è stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario 
sviluppare questa versione riveduta del metodo di prova B.32 alla luce dei 
recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi norma ­
tivi (2) (3) (4) (5) (6). L’aggiornamento del presente metodo di prova B.32 si è svolto in parallelo alle revisioni del capitolo B.30 del presente allegato, 
studi di tossicità cronica, e del capitolo B.33 del presente allegato, studi 
combinati di tossicità cronica/cancerogenesi, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente metodo di prova B.32 è concepito 
per testare un’ampia serie di sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze 
chimiche industriali. Va tuttavia specificato che alcuni dettagli e requisiti possono essere diversi per i prodotti farmaceutici (cfr. Conferenza interna ­
zionale sull’armonizzazione,  Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity 
of Pharmaceuticals ).
 
2. La maggior parte degli studi di cancerogenesi è svolta su specie di roditori, 
pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo 
agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare neces ­
sario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente 
metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del 
presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (6). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 —  Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carci ­
nogenicity Studies  fornisce ulteriori orientamenti al riguardo (7).
 
3. Le tre vie principali di somministrazione negli studi di cancerogenesi sono: 
orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di 
orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito 
alla scelta della via di esposizione.
 
4. Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la 
via più usata negli studi di cancerogenesi. Gli studi sulla cancerogenesi che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o pos ­
sono essere richiesti da determinati regimi normativi, ma entrambe le vie di 
esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere impostato caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della cancerogenesi con 
somministrazione orale potrebbe costituire la base di un protocollo per studi 
per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamenti, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pub ­
blicato documenti di orientamento sulla somministrazione delle sostanze 
chimiche in esame per via cutanea (7) e per inalazione (7) (8). Il capitolo 
B.8 del presente allegato (9) e il capitolo B.29 del presente allegato (10), insieme al documento di orientamento dell’OCSE —  Acute inhalation te ­
sting  (8) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo 
termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del 
presente allegato (11) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 468
 
5. Lo studio della cancerogenesi fornisce informazioni sui possibili rischi per la 
salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un pe ­
riodo che può estendersi fino all’intero ciclo di vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, tra cui la potenziale cancerogenesi, oltre a dare 
indicazioni su organi bersaglio e sulla possibilità di accumulo. Esso può 
inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto  no-observed-adverse-effect level  
(livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) per gli effetti tossici e, nel caso di cancerogeni non genotossici, per le risposte tumorali, consen ­
tendo la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si 
sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni.
 
6. Tra gli obiettivi degli studi di cancerogenesi condotti con questo metodo di 
prova figurano:  
— l’individuazione delle proprietà cancerogene di una sostanza chimica in 
esame, che risultano in una maggiore incidenza di neoplasmi, una più 
grande proporzione di neoplasmi maligni o una riduzione nei tempi di 
latenza di neoplasmi, il tutto in confronto a gruppi di controllo,  
— l’individuazione di uno o più organi bersaglio di cancerogenesi,  
— l’individuazione dei tempi di latenza di neoplasmi,  
— la caratterizzazione del rapporto dose-risposta al tumore,  
— l’individuazione di un NOAEL ( no-observed-adverse-effect level  — li­
vello fino al quale non si osservano effetti dannosi), o di un punto di partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD),
 
— l’estrapolazione di effetti cancerogeni relativi a un’esposizione umana a 
basse dosi,  
— la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di 
azione (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
7. Nella valutazione e nell’esame della potenziale cancerogenesi di una so ­
stanza chimica in esame, prima di condurre lo studio, i laboratori che 
eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla 
sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Le informazioni e considerazioni 
relative alle modalità di azione di una presunta sostanza cancerogena (2) 
(7) (12) (13) (14) (15) sono particolarmente importanti, poiché l’imposta ­
zione ottimale potrebbe variare a seconda del fatto che una sostanza chimica 
sia una sostanza cancerogena genotossica nota o presunta. Il documento di 
orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni, tra cui considerazioni in merito alle modalità di azione.
 
8. Tra le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate 
l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in 
vivo, incluse delle prove di genotossicità, l’impiego o gli impieghi previsti 
per l’esposizione umana, dati (Q)SAR, di mutagenesi/genotossicità, cance ­
rogenesi e altri dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine; i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, 
laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La valutazione 
della cancerogenesi si effettua una volta ottenuti i primi risultati delle prove
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di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. Anche prove di 
iniziazione-promozione di tumori a breve termine possono fornire informa ­
zioni utili. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello svolgimento delle prove di cancerogenesi svolte nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare 
sostanza chimica in esame (16) (17) (18) (19).
 
9. I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del 
disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere 
conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza, dell’analisi dei 
rischi cumulati di tumore legati al tempo di sopravvivenza, dell’analisi dei tempi di latenza del tumore e dell’analisi effettuata in caso di morte prema ­
tura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento 
dell’OCSE n. 116 (7) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 —  
Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies  (20) 
forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale.
 
10. Nella realizzazione di uno studio di cancerogenesi è opportuno seguire 
sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 —  Recognition, assessment, and use of cli ­
nical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation  (21), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che 
negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un ani ­
male manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore 
peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione 
di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va anche soppesato il valore delle informazioni che possono essere ottenute conti ­
nuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se 
si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare 
la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la sommini ­
strazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto 
l’animale, oppure ancora ridurre le dosi.
 
11. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e due pubblicazioni 
dell’International Life Sciences Institute (22) (23) forniscono ragguagli detta ­
gliati in merito ai dibattiti sui principi nella scelta delle dosi per gli studi di 
tossicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dall’obiettivo o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un 
equilibrio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratteriz ­
zazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare importanza nella situazione in cui si deve svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e di cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) 
(paragrafo 12).
 
12. È opportuno valutare l’opportunità di svolgere uno studio combinato di 
tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) piut ­
tosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (il capitolo 
B.30 del presente allegato) e uno studio di cancerogenesi (il presente me ­
todo di prova B.32). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la 
cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno 
studio combinato di tossicità cronica e cancerogenicità (capitolo B.33 del presente alleato) occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 11 e 22-25). È inoltre ricono ­
sciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi 
ben distinti.
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13. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono 
specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE 
n. 116 (7).  
PRINCIPIO DELLA PROVA  
14. La sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi crescenti 
a vari gruppi di animali da esperimento per la maggior parte della loro vita, 
di norma per via orale. Può essere opportuna anche la somministrazione per inalazione o per via cutanea. Gli animali sono sottoposti ad attenta osser ­
vazione per accertare eventuali sintomi di tossicità e lo sviluppo di lesioni 
neoplastiche. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento ven ­
gono sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia.
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
15. Il presente metodo di prova è dedicato innanzitutto alla valutazione e 
all’esame della cancerogenesi nei roditori (paragrafo 2). L’uso di specie di non roditori può essere considerato se i dati disponibili indicano che ciò sia più appropriato per prevedere gli effetti sulla salute umana. La scelta della 
specie deve essere motivata. La specie di elezione tra i roditori è il ratto, 
sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. Nonostante l’uso di topi possa avere un’utilità limitata nelle prove di can ­
cerogenesi (24), (25) (26), nel quadro di alcuni programmi di natura nor ­
mativa le prove di cancerogenesi sui tipi sono tuttora previste, salvo nei casi 
in cui è stato appurato che una tale prova non è necessaria dal punto di vista scientifico. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso dif ­
fuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione 
di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Il documento di orientamento dell’OCSE 
n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e 
del ceppo.
 
16. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi co ­
munemente usati in laboratorio. Lo studio di cancerogenesi andrebbe prefe ­
ribilmente condotto su animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza 
rispetto a quelli utilizzati per studi preliminari di tossicità di durata inferiore. 
Ciononostante, se è appurato che animali dello stesso ceppo e della mede ­
sima provenienza presentano problemi nel soddisfare i criteri di sopravvi ­
venza normalmente riconosciuti per studi a lungo termine [cfr. il documento 
di orientamento dell’OCSE n. 116 (7)] si dovrebbe considerare l’utilizzo di 
un ceppo di animali che evidenzia un tasso di sopravvivenza accettabile per uno studio a lungo termine. Le femmine devono essere nullipare e non gravide.
 
Condizioni di stabulazione e alimentazione  
17. Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli 
gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (27) (28) (29). Le gabbie devono essere si ­
stemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro 
collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 C (± 3 C). L’umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, 
tranne durante la pulizia del laboratorio. L’illuminazione deve essere artifi ­
ciale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto con ­
cerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispon ­
dere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di con ­
taminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti
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organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potreb ­
bero influenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le 
informazioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione 
finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche 
sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti nutrizio ­
nali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata 
con il cibo.
 
Preparazione degli animali  
18. Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di 
laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti 
ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali 
raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali del test vanno caratterizzati 
per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso e/o età. All’ini ­
zio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso uti ­
lizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti 
gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del 
sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizza ­
ta, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio cor ­
poreo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statistica ­
mente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possi ­
bile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, im ­
pianto di un microchip o un altro metodo analogo.
 
PROCEDURA  
Numero e sesso degli animali  
19. È opportuno usare animali di entrambi i sessi. È opportuno utilizzare un 
numero sufficiente di animali, in modo tale da poter valutare in maniera approfondita l’evoluzione dei dati dal punto di vista biologico e statistico. 
Ogni gruppo-dose e gruppo di controllo parallelo devono pertanto essere 
composti da almeno 50 animali per sesso. A seconda della finalità dello studio, si può aumentare la potenza statistica delle stime principali ripar ­
tendo gli animali in maniera disomogenea tra i vari gruppi-dose, assegnando 
oltre 50 animali ai gruppi a bassa dose, ad esempio per stimare il potenziale 
cancerogeno a basse dosi. Tuttavia va riconosciuto che un aumento mode ­
rato della dimensione dei gruppi comporterà un aumento relativamente esi ­
guo della potenza statistica dello studio. Il documento di orientamento 
dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito al disegno 
statistico dello studio e alla scelta dei livelli di dose per sfruttare al massimo la potenza statistica.
 
Disposizioni relative sacrifici intermedi e ai gruppi satellite (sentinella)  
20. Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi, ad esem ­
pio dopo 12 mesi, al fine di reperire informazioni sull’evoluzione di altera ­
zioni neoplastiche e dati meccanicistici, se scientificamente giustificato. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose 
ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi possono non 
essere scientificamente giustificati. Se il disegno sperimentale prevede dei sacrifici intermedi, il numero di animali in ciascun gruppo-dose previsto a tale scopo sarà, di norma, pari a 10 animali per sesso e il numero com ­
plessivo di animali previsti dal disegno sperimentale dovrà aumentare del 
numero di animali che saranno sacrificati prima della conclusione dello studio. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario durante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (soli ­
tamente 5 esemplari per sesso) (30). Ulteriori elementi sono forniti nel 
documento di orientamento OCSE n. 116 (7).
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Gruppi-dose e dosaggi  
21. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce indicazioni in 
merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Si somministrano almeno tre diversi livelli di dose e un controllo 
parallelo. I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti 
studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche 
analoghe.
 
22. A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza 
chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli 
effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. 
In considerazione dei fattori di cui al paragrafo 23 sottostante, il livello di dose più elevato di norma è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %). Tuttavia, 
a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può optare per 
una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccupante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso corporeo.
 
23. I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per 
stabilire un rapporto dose-risposta e, a seconda delle modalità di azione della sostanza chimica in esame, un NOAEL o altri risultati attesi dello studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD,  benchmark dose , cfr. 
paragrafo 25) al livello di dose più basso. Tra i fattori da tenere in consi ­
derazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede 
una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza 
per un’estrapolazione a basse dosi.
 
24. L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dalle caratteristiche della 
sostanza chimica di prova e non può essere imposto dal presente metodo di prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati 
delle prove per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è pre ­
feribile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare inter ­
valli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è 
opportuno giustificare tale scelta.
 
25. Come precisato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 
116 (7), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti:
 
— non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva 
dose-risposta,  
— aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione 
metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne,  
— lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biolo ­
gici fondamentali sottostanti in corso,  
— aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi 
alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono pertur ­
bati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc.,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 473
 
— regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima partico ­
larmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento pre ­
vista o di una soglia ipotizzata,  
— considerazione dei livelli previsti di esposizione umana.  
26. Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo 
nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in 
esame. Salvo il trattamento con la sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il 
veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è 
somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà 
di più a tale scopo.
 
Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in 
esame  
27. La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, 
l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orienta ­
mento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza 
chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo pre ­
dominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma è scelta solo 
per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione 
corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o pre ­
senti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solita ­
mente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, 
ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la somministrazione per altre vie.
 
28. Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo 
adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti 
caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla 
distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di 
cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di pren ­
dere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una so ­
luzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/ emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile 
soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note 
le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle solu ­
zioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di sommi ­
nistrazione (ad esempio dieta).
 
29. Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è 
importante impedire che le quantità della sostanza in esame interferiscano 
con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concen ­
trazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare 
la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri 
alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg 
di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali 
alternative va specificata.
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30. In caso di somministrazione per via orale, agli animali viene somministrata 
una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la setti ­
mana), di norma per un periodo di 24 mesi (cfr. anche paragrafo 32) per i roditori. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via 
epidermica, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in 
esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come speci ­
ficato nel capitolo B.9 del presente allegato (11), per un periodo di 24 mesi. L’esposizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la 
settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la 
settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 24 mesi. Se delle specie di roditori diverse dai ratti sono sottoposte a esposizione «a naso solo», è possibile adeguare la durata massima di esposizione per ri ­
durre al minimo il loro stress. La scelta di una durata di esposizione infe ­
riore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (9).
 
31. Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via 
intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda o una cannula per 
intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene som ­
ministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esempio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la 
dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il 
massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica solu ­
zione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di 
peso corporeo (31). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al 
minimo regolando le concentrazioni in modo da assicurare un volume co ­
stante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare 
effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni 
che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto gastrointestinale.
 
Durata dello studio  
32. Per i roditori la durata della prova di norma è di 24 mesi, il che corrisponde 
alla maggior parte della vita normale degli animali sperimentali. La durata degli studi può essere più lunga o più breve a seconda della durata di vita 
del ceppo delle specie animali previste per lo studio, ma deve essere giu ­
stificata. Per determinati ceppi di topi, ad esempio AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, può essere più appropriata una durata di 18 mesi. Qui di seguito saranno forniti alcuni orientamenti relativi alla durata e alla conclusione 
dello studio e alla sopravvivenza. Il documento di orientamento dell’OCSE 
n. 116 —  Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity 
Studies  (7) fornisce ulteriori orientamenti in materia, tra cui le considera ­
zioni sull’accettabilità di ritenere negativo uno studio di cancerogenesi in 
relazione alla sopravvivenza degli animali.
 
— Va vagliata la possibilità di concludere lo studio quando la quantità di 
animali sopravvissuti nei gruppi a dose più bassa o del gruppo di con ­
trollo è più bassa del 25 %  
— Lo studio non va concluso in caso di morti premature dovute alla tos ­
sicità limitate al gruppo ad alta dose  
— Nella valutazione della sopravvivenza si deve distinguere a seconda del 
sesso degli animali  
— Lo studio non si deve prolungare oltre il momento in cui i dati resi 
disponibili in questo contesto non sono più sufficienti per giungere a una 
valutazione valida dal punto di vista statistico.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 475
 
OSSERVAZIONI  
33. Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mor ­
talità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Inoltre gli animali devono essere sottoposti a un controllo quotidiano 
dei segni di rilevanza tossicologica, tenendo conto del periodo di picco degli 
effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa avvenga per via intragastrica. Si dedicherà speciale attenzione all’insorgenza dei tumori: si registrerà la data di inizio, la posizione, le dimensioni, l’aspetto e la 
progressione di ogni tumore macroscopicamente visibile o palpabile.
 
Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare  
34. Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una 
volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimen ­
tare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 
settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza 
chimica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto 
della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ul ­
timo è alterato.
 
Ematologia, biochimica clinica e altre misurazioni  
35. Al fine di sfruttare al massimo le informazioni ottenute dallo studio, soprat ­
tutto per quando riguarda le considerazioni legate alle modalità di azione, a discrezione del responsabile scientifico dello studio è possibile effettuare dei 
prelievi di sangue ai fini di analisi ematologiche e di biochimica clinica. 
Potrebbe essere utile anche effettuare l’esame delle urine. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni sul valore di tali campionamenti nel quadro di uno studio di cancerogenesi. Se lo si 
ritiene opportuno, si può effettuare un campionamento del sangue per de ­
terminazioni ematologiche e di chimica clinica nonché per l’esame delle urine nel quadro di un sacrificio intermedio (paragrafo 20) e al termine dello studio, effettuandolo su un minimo di 10 animali per sesso e per 
gruppo. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad 
esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. Tali campioni vanno conservati, se del caso, in condizioni idonee. Per l’esame possono essere preparati anche degli strisci di sangue, in particolare 
se il midollo osseo sembra rientrare tra gli organi bersaglio, sebbene il 
valore di tale esame ai fini della valutazione del potenziale cancerogeno/ oncogeno non sia indiscusso (32).
 
PATOLOGIA  
Necroscopia macroscopica  
36. Tutti gli animali dello studio, ad eccezione degli animali sentinella (cfr. 
paragrafo 20) e altri animali satellite dovranno essere sottoposti ad una necroscopia dettagliata completa, che comprende un accurato esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi, della cavità cranica, toracica e 
addominale e del loro contenuto. Per gli animali sentinella e altri animali 
satellite, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a di ­
screzione del responsabile scientifico dello studio. Il peso degli organi di norma non rientra nello studio di cancerogenesi, poiché i cambiamenti ge ­
riatrici prima, e in fasi successive lo sviluppo di tumori hanno un effetto 
distorsivo sull’utilità dei relativi dati. Il peso degli organi potrebbe essere tuttavia importante ai fini della valutazione della forza probante dei dati e in particolare per considerazioni sulle modalità di azione. Se tali dati sono 
rilevati nel quadro di uno studio satellite, vanno raccolti a distanza di non 
oltre un anno dall’inizio dello studio.
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37. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato 
sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo 
(33) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi). 
tutte le lesioni macroscopi ­
che cuore pancreas stomaco (prestomaco, sto ­
maco ghiandolare 
ghiandole surrenali ileo ghiandola paratiroidea [denti] 
aorta digiuno nervo periferico testicoli 
cervello (incluse le sezioni 
di cervello, cervelletto, bul ­
bo/ponte) reni pituitaria timo 
intestino cieco ghiandola lacrimale 
(esorbitale) prostata tiroide 
cervice fegato retto [lingua] 
ghiandola della coagula ­
zione polmone ghiandola salivare trachea 
colon Linfonodi (superficiali e 
profondi) vescicola seminale vescica 
duodeno ghiandola mammaria 
(obbligatoria per esem ­
plari di sesso femminile e, se visibile ai fini della 
la dissezione, anche per 
quelli di sesso maschile) muscolo scheletrico utero (cervice inclusa) 
epididimo [tratto respiratorio supe ­
riore, incluso il naso, i 
turbinati e i seni parana ­
sali] pelle [uretere] 
occhi (retina inclusa) esofago midollo spinale (a tre li ­
velli: cervicale, medio ­
toracico e lombare) [uretra] 
[femore con articolazione] [bulbo olfattivo] milza vagina 
cistifellea (eccetto per i to ­
pi) ovaia [sterno] sezione di midollo osseo e/o 
un aspirato di midollo osseo fresco 
ghiandola di Harder
 
In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evi ­
denziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della 
sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per 
via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, sono essenziali il campionamento e la conserva ­
zione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che 
prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei 
tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratori deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nei capitoli B.8 e B.29 del presente allegato. Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specifi ­
camente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo 
alla via orale.
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Esame istopatologico  
38. Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi 
di patologia tossicologica (33). Come minimo, vanno esaminati i seguenti tessuti:
 
— tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo,  
— tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel 
corso dello studio,  
— tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, tumori compresi,  
— se si osservano dei cambiamenti istopatologici in relazione al trattamento 
nel gruppo ad alta dose, tali tessuti vanno esaminati in ogni animale di 
tutti gli altri gruppi-dose,  
— in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
esaminati entrambi gli organi.  
DATI E RELAZIONE  
Dati 
39. Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati 
vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo speri ­
mentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante la prova o sottoposti ad eutanasia e il momento di tutti i decessi/eutanasie, il numero di animali che presentano segni di 
tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento 
dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali rappor ­
tata al tipo di lesione. Tabelle riassuntive dei dati devono fornire le medie e 
le deviazioni standard (per dati raccolti in via continuativa) relative agli 
animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’en ­
tità delle lesioni.
 
40. I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello 
studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli 
sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di 
controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati 
nei cinque anni che precedono lo studio in questione.
 
41. I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e 
generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno 
scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale. Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di soprav ­
vivenza, se necessario.
 
Relazione sulla prova  
42. La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 478
 
— origine della sostanza chimica,  
— numero del lotto,  
— certificazione dell’analisi chimica.  
Veicolo (se del caso):  
— motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall’acqua.  
Animali sperimentali:  
— specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata,  
— numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova,  
— origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc.,  
— peso di ciascun animale all’inizio della prova.  
Condizioni sperimentali:  
— criteri di scelta della via di somministrazione e della dose,  
— laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati,  
— dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la prepara ­
zione della dieta,  
— dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della 
preparazione,  
— via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in 
esame,  
— per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta 
tra esposizione «a naso solo» o «a corpo intero»,  
— dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di 
conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella 
dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva,  
— dettagli relativi alla qualità del cibo e dell’acqua.  
Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati 
individuali sugli animali)  
Dati generali:  
— dati sulla sopravvivenza degli animali,  
— peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo,  
— assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, non ­
ché consumo di acqua, se del caso,  
— dati tossicocinetici (se disponibili),  
— dati oftalmoscopici (se disponibili),  
— esami ematologici (se disponibili),  
— esami di chimica clinica (se disponibili).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 479
 
Risultati clinici:  
— segni di tossicità,  
— incidenza (e, se classificata, la gravità) di eventuali anomalie,  
— natura, gravità e durata dei segni clinici (transitori o permanenti).  
Dati necroscopici:  
— peso corporeo finale,  
— peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso),  
— reperti necroscopici; incidenza e gravità delle anomalie.  
Esame istopatologico.  
— reperti istopatologici non neoplastici,  
— reperti istopatologici neoplastici,  
— correlazione tra reperti macroscopici e microscopici,  
— descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al 
trattamento, inclusi i livelli di gravità,  
— relazioni su eventuali esami inter pares dei vetrini.  
Elaborazione statistica dei risultati, se del caso  
Discussione dei risultati, compreso:  
— discussione su tutti gli approcci di modellizzazione,  
— rapporti dose-risposta,  
— dati storici di controllo,  
— esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione,  
— determinazione BMD, NOAEL o LOAEL,  
— rilevanza per gli esseri umani.  
Conclusioni  
BIBLIOGRAFIA  
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(6) Capitolo B.27 del presente allegato, Test di tossicità orale subcronica Stu ­
dio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni 
sui non roditori.  
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(8) OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
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OECD, Paris.  
(9) Capitolo B.8 del presente allegato, Tossicità subacuta a dose ripetuta (28 
giorni) per inalazione.  
(10) Capitolo B.29 del presente allegato, Studio di tossicità subcronica a dose 
ripetuta (90 giorni) per inalazione.  
(11) Capitolo B.9 del presente allegato, Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per 
via cutanea.  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
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131. ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 482
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 483
 
B.33.  STUDI COMBINATI DI TOSSICITÀ CRONICA/CANCEROGE ­
NESI  
INTRODUZIONE  
1. Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 453 (2009) La prima linea guida 453 è 
stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione aggiornata del metodo di prova B.33 alla luce dei recenti progressi nell’am ­
bito del benessere animale e degli obblighi normativi (1) (2) (3) (4) (5). 
L’aggiornamento del presente metodo di prova B.33 si è svolto in parallelo 
alle revisioni del capitolo B.32 del presente allegato, studi di cancerogenesi, e del capitolo B.30 del presente allegato, studi di tossicità cronica, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello 
studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente 
metodo di prova è concepito per testare un’ampia serie di sostanze chimi ­
che, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali. Va tuttavia specificato che alcuni dettagli e requisiti possono essere diversi per i prodotti farma ­
ceutici (cfr. Conferenza internazionale sull’armonizzazione,  Guidance S1B 
on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals ).
 
2. La maggior parte degli studi di tossicità cronica e cancerogenesi è svolta su 
specie di roditori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad ap ­
plicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le 
procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli 
specificati al capitolo B.27 del presente allegato (studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (6), come indicato nel documento di orientamento dell’OCSE —  Design and 
Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies  (7).
 
3. Le tre vie principali di somministrazione usate in relazione alla tossicità 
cronica/cancerogenesi sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della 
via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposi ­
zione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 
(7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta della via di esposi ­
zione.
 
4. Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la 
via più usata negli studi di tossicità cronica e di cancerogenesi. Gli studi a 
lungo termine che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inala ­
zione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o possono essere richiesti da determinati regimi normativi, 
ma entrambe le vie di esposizione evidenziano una complessità considere ­
vole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere concepito caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della tossicità cronica e della cancerogenesi con somministrazione orale potrebbe 
costituire la base di un protocollo per studi per inalazione e/o cutanei, per 
quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamenti, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione delle sostanze chimiche in esame per via cutanea (7) 
e per inalazione (7) (8). Il capitolo B.8 del presente allegato (9) e il capitolo 
B.29 del presente allegato (10), insieme al documento di orientamento dell’OCSE —  Acute inhalation testing  (8) vanno consultati in particolare 
nell’impostazione di studi a lungo termine che prevedono l’esposizione per 
inalazione. Il capitolo B.9 del presente allegato (11) va consultato nel caso 
di prove svolte per via cutanea.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 484
 
5. Lo studio combinato di tossicità cronica/cancerogenesi fornisce informazioni 
sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall’esposizione 
ripetuta nell’arco di un periodo che può estendersi fino all’intero ciclo di vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informa ­
zioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, tra cui la poten ­
ziale cancerogenesi, e dare indicazioni su organi bersaglio e sulla possibilità 
di accumulo. Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto  no-obser ­
ved-adverse-effect level  (livello fino al quale non si osservano effetti dan ­
nosi) per gli effetti tossici e, nel caso di cancerogeni non genotossici, per le 
risposte tumorali, consentendo la determinazione di criteri di sicurezza per 
l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli ani ­
mali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni.
 
6. Tra gli obiettivi degli studi di tossicità cronica/cancerogenesi condotti con 
questo metodo di prova figurano:  
— l’individuazione delle proprietà cancerogene di una sostanza chimica in 
esame, che risultano in una maggiore incidenza di neoplasmi, una più 
grande proporzione di neoplasmi maligni o una riduzione nei tempi di latenza di neoplasmi, il tutto in confronto a gruppi di controllo,
 
— l’individuazione dei tempi di latenza di neoplasmi,  
— l’individuazione della tossicità cronica della sostanza chimica in esame,  
— l’individuazione di uno o più organi bersaglio di tossicità cronica e 
cancerogenesi,  
— la caratterizzazione del rapporto dose-risposta,  
— l’individuazione di un  no-observed-adverse-effect level  (NOAEL), ossia 
il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi o di un punto di 
partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD),  
— l’estrapolazione di effetti cancerogeni relativi a un’esposizione umana a 
basse dosi,  
— la previsione degli effetti di tossicità cronica ai livelli di esposizione 
umana,  
— la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di 
azione (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
7. Nella valutazione e nell’esame della potenziale cancerogenesi e tossicità 
cronica di una sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio, i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni 
disponibili sulla sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno 
sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossi ­
cità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Le informa ­
zioni e considerazioni relative alle modalità di azione di una presunta so ­
stanza cancerogena (2) (7) (12) (13) (14) (15) sono particolarmente impor ­
tanti, poiché il disegno ottimale potrebbe variare a seconda del fatto che una sostanza chimica sia una sostanza cancerogena genotossica nota o presunta. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indi ­
cazioni, tra cui considerazioni in merito alle modalità di azione.
 
8. Tre le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate 
l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza 
chimica in esame, le informazioni sulle modalità di azione, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, incluse delle prove di genotossicità; l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, 
dati (Q)SAR, di mutagenesi/genotossicità, cancerogenesi e altri dati tossico ­
logici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine; i dati
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 485
 
tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, laddove disponibile) e 
i risultati di altri studi a dose ripetuta. La determinazione della tossicità 
cronica/cancerogenesi si effettua solamente una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. Anche prove di iniziazione-promozione di tumori a breve termine possono fornire 
informazioni utili. È opportuno prendere in considerazione un approccio a 
tappe nello svolgimento delle prove di cancerogenesi svolte nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chimica in esame (16) (17) (18) (19).
 
9. I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del 
disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere 
conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza, dell’analisi dei 
rischi cumulati di tumore legati al tempo di sopravvivenza, dell’analisi dei tempi di latenza del tumore e dell’analisi effettuata in caso di morte prema ­
tura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento 
dell’OCSE n. 116 (7) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 —  
Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies  (20) 
forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale.
 
10. Nella realizzazione di uno studio di cancerogenesi è opportuno seguire 
sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 —  Recognition, assessment, and use of cli ­
nical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation  (21), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che 
negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un ani ­
male manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore 
peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione 
di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va anche soppesato il valore delle informazioni che possono essere ottenute conti ­
nuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se 
si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare 
la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la sommini ­
strazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto 
l’animale, oppure ancora ridurre le dosi.
 
11. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e due pubblicazioni 
dell’International Life Sciences Institute (22) (23) forniscono ragguagli det ­
tagliati in merito ai dibattiti sulla selezione delle dosi per gli studi di tos ­
sicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dal o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equi ­
librio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratteriz ­
zazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare rilevanza nel caso del presente studio combinato di tossicità cronica e can ­
cerogenesi.
 
12. È opportuno valutare l’opportunità di svolgere il presente studio combinato 
di tossicità cronica e cancerogenesi piuttosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (capitolo B.30 del presente allegato) e uno 
studio di cancerogenesi (capitolo B.32 del presente allegato). La prova 
combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi nonché di un numero minore di animali utilizzati rispetto alla condu ­
zione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella 
fase che verifica la cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello 
svolgimento di uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 11 e 22-26). È inoltre riconosciuto che de ­
terminati quadri normativi richiedono la conduzione di studi ben distinti. Il 
documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori orienta ­
menti sul disegno dello studio combinato di tossicità cronica e canceroge ­
nesi al fine di ottenere la massima efficacia negli studi in termini di possi ­
bilità di riduzione dell’uso di animali e di armonizzazione delle varie pro ­
cedure sperimentali.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 486
 
13. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono speci ­
ficate alla fine del presente capitolo e nel documento di orientamento 
dell’OCSE n. 116 (7).  
PRINCIPIO DELLA PROVA  
14. Il disegno sperimentale prevede due fasi parallele, una relativa alla cronicità, 
l’altra relativa alla cancerogenesi (per la durata delle fasi si rimanda rispet ­
tivamente ai paragrafi 34 e 35). La sostanza chimica in esame di norma è 
somministrata per via orale, ma può essere opportuno anche ricorrere alla 
via inalatoria o cutanea. Per la fase relativa alla cronicità, la sostanza chi ­
mica in esame è somministrata giornalmente in dosi graduali a diversi gruppi di animali, con un livello di dose per gruppo, di norma per un 
periodo di 12 mesi, ma a seconda degli obblighi normativi possono essere 
scelti anche periodi più lunghi o più corti (cfr. paragrafo 34). La durata scelta deve essere sufficientemente lunga da garantire la manifestazione de ­
gli effetti della tossicità cumulata senza che insorgano gli effetti distorsivi 
dei cambiamenti geriatrici. Il disegno sperimentale può anche prevedere uno 
o più sacrifici intermedi, ad esempio dopo 3 e 6 mesi, e a tale fine possono essere introdotti nello studio ulteriori animali (cfr. paragrafo 20). Per la fase relativa alla cancerogenesi, la sostanza chimica in esame è somministrata 
giornalmente a vari gruppi di animali per la maggior parte della loro vita. In 
entrambe le fasi gli animali sono sottoposti ad attenta osservazione per accertare eventuali sintomi di tossicità e lo sviluppo di lesioni neoplastiche. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a 
necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi 
e sottoposti a necroscopia.
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
15. Il presente metodo di prova è dedicato innanzitutto alla valutazione e 
all’esame della tossicità cronica e della cancerogenesi nei roditori (paragrafo 2). L’uso di specie di non roditori può essere considerato se i dati disponi ­
bili indicano che ciò sia più appropriato per prevedere gli effetti sulla salute 
umana. La scelta del veicolo deve essere motivata. La specie di elezione è il 
ratto, sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. Nonostante l’uso di topi possa avere un’utilità limitata nelle prove di 
cancerogenesi (24), (25) (26), nel quadro di alcuni programmi di natura 
normativa le prove di cancerogenesi sui tipi sono tuttora previste, salvo nei casi in cui è stato appurato che una tale prova non è necessaria dal punto di vista scientifico. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali 
preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del 
loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente carat ­
terizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di 
informazioni di carattere fisiologico e patologico. Il disegno e lo svolgi ­
mento di studi di tossicità cronica/cancerogenesi su specie di non roditori, se richieste, vanno basate sui principi indicati nel presente metodo di prova e in quelli specificati nel capitolo B.27 del presente allegato (Studio della 
tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non 
roditori) (6). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo.
 
16. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi co ­
munemente usati in laboratorio. Lo studio combinato di tossicità cronica/ 
cancerogenesi andrebbe condotto su animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza rispetto a quelli utilizzati per studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Ciononostante, se è appurato che animali dello stesso ceppo 
e della medesima provenienza presentano problemi nel soddisfare i criteri di 
sopravvivenza normalmente riconosciuti per studi a lungo termine [cfr. il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7)] si dovrebbe considerare l’utilizzo di un ceppo di animali che evidenzia un tasso di sopravvivenza 
accettabile per uno studio a lungo termine. Le femmine devono essere 
nullipare e non gravide.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 487
 
Condizioni di stabulazione e alimentazione  
17. Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli 
gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (27) (28) (29). Le gabbie devono essere si ­
stemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro 
collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). L’umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, 
tranne durante la pulizia del laboratorio. L’illuminazione deve essere artifi ­
ciale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto con ­
cerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio 
con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispon ­
dere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di con ­
taminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potrebbero in ­
fluenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le informa ­
zioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione finale. 
Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’ac ­
qua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti 
nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è sommini ­
strata con il cibo.
 
Preparazione degli animali  
18. Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di 
laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti 
ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione 
delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali del test vanno caratterizzati 
per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso e/o età. All’ini ­
zio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso uti ­
lizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del 
sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento 
avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizza ­
ta, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio cor ­
poreo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statistica ­
mente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possi ­
bile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, im ­
pianto di un microchip o un altro metodo analogo.
 
PROCEDURA  
Numero e sesso degli animali  
19. È opportuno usare animali di entrambi i sessi. È opportuno utilizzare un 
numero sufficiente di animali, in modo tale da poter valutare in maniera 
approfondita l’evoluzione dei dati dal punto di vista biologico e statistico. Per i roditori, ogni gruppo-dose (come illustrato al paragrafo 22) e ogni gruppo di controllo parallelo previsti per la fase dello studio relativa alla 
cancerogenesi devono pertanto essere composti da almeno 50 animali per 
sesso. A seconda della finalità dello studio, si può aumentare la potenza statistica delle stime principali ripartendo gli animali in maniera in maniera disomogenea tra i vari gruppi-dose, assegnando oltre 50 animali ai gruppi a 
bassa dose, ad esempio per valutare il potenziale cancerogeno a basse dosi. 
Tuttavia va riconosciuto che un aumento moderato della dimensione dei
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gruppi comporterà un aumento relativamente esiguo della potenza statistica 
dello studio. Per i roditori, ogni gruppo-dose (come illustrato al 
paragrafo 22) e ogni gruppo di controllo parallelo previsti per la fase dello studio relativa alla tossicità cronica devono essere composti da almeno 10 animali per sesso. Si fa presente che questo numero è inferiore a quello 
degli studi relativi alla tossicità cronica (capitolo B.30 del presente allegato). 
L’interpretazione dei dati rilevati con un numero ridotto di animali per gruppo nella fase relativa alla tossicità cronica di questo studio combinato sarà tuttavia avallata dai dati rilevati con un numero maggiore di animali 
nella fase dedicata alla cancerogenesi. Negli studi che prevedono la presenza 
di topi, nella fase relativa alla tossicità cronica potrebbero essere necessari ulteriori animali in ciascun gruppo-dose al fine di poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 
(7) fornisce ulteriori informazioni in merito al disegno statistico dello studio 
e alla scelta dei livelli di dose per sfruttare al massimo la potenza statistica.
 
Disposizioni relative ai sacrifici intermedi, a gruppi satellite e ad ani ­
mali sentinella  
20. Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi, ad esem ­
pio dopo 6 mesi nella fase relativa alla tossicità cronica, al fine di reperire 
informazioni sull’evoluzione di alterazioni non neoplastiche e dati meccani ­
cistici, se scientificamente giustificato. Se tali informazioni sono già dispo ­
nibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica 
in esame, tali sacrifici intermedi possono non essere scientificamente giu ­
stificati. Gli animali usati nella fase relativa alla tossicità cronica dello studio, di norma dalla durata di 12 mesi (paragrafo 34) forniscono dati sui sacrifici intermedi per la fase dello studio relativa alla cancerogenesi, 
riducendo pertanto il numero totale di animali usati nello studio. Nella fase 
relativa alla tossicità cronica dello studio, ai fini del monitoraggio della reversibilità dei cambiamenti tossicologici indotti dalla sostanza chimica in esame possono essere previsti anche gruppi satellite. Tali gruppi possono 
essere limitati al livello di dose più elevato dello studio e ai gruppi di 
controllo. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario du ­
rante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (30). Il documento di orientamento 
dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni sul disegno sperimentale 
al fine di includere i sacrifici intermedi, gli animali satellite e sentinella, riducendo al contempo il numero di animali usati complessivamente.
 
21. Se il disegno sperimentale prevede animali satellite e/o sacrifici intermedi, il 
numero di animali in ciascun gruppo-dose previsto a tale scopo sarà, di norma, pari a 10 animali per sesso e il numero complessivo di animali previsti dal disegno sperimentale dovrà aumentare del numero di animali 
che si prevede di sopprimere prima della conclusione dello studio. Gli 
animali oggetto di sacrifici intermedi e gli animali satellite di norma sono sottoposti alle medesime osservazioni, tra cui il controllo del peso corporeo, il consumo di cibo/acqua, analisi ematologiche e biochimico-cliniche ed 
esami patologici degli animali coinvolti nella fase di esame della tossicità 
cronica dello studio principale, sebbene sia possibile disporre anche che (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio) le osservazioni siano limitate a parametri chiave specifici come la neurotossicità o l’immunotos ­
sicità.
 
Gruppi-dose e dosaggi  
22. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce indicazioni in 
merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Si somministrano almeno tre diversi livelli di dose e un controllo 
parallelo, sia per la fase relativa alla cronicità, sia a quella relativa alla 
cancerogenesi. I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossi ­
cocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a 
sostanze chimiche analoghe.
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23. Per la fase relativa dello studio relativa alla tossicità cronica, si può non 
considerare necessario eseguire uno studio completo utilizzando tre livelli di 
dose qualora si possa prevedere che una prova svolta con un livello di dose, equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno, probabilmente non produrrà effetti avversi. Tale decisione si deve basare sui risultati di 
studi preliminari e su una probabile assenza di tossicità in base a dati relativi 
a sostanze chimiche di struttura affine. Si può applicare un limite di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno eccetto nei casi in cui l’esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato.
 
24. A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza 
chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli 
effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. 
Il livello di dose più elevato di norma è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %). Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può 
optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la 
tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccu ­
pante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso cor ­
poreo.
 
25. I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per 
stabilire un rapporto dose-risposta e, a seconda delle modalità di azione della sostanza chimica in esame, un NOAEL o altri risultati attesi dello 
studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD,  benchmark dose , cfr. 
paragrafo 27). Tra i fattori da tenere in considerazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella 
modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello 
che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi. L’obiettivo principale di uno studio combinato di cancerogenesi/ tossicità cronica è di ottenere informazioni ai fini della valutazione del 
rischio di cancerogenesi, mentre ottenere informazioni sulla cronicità tossica 
di norma è un obiettivo secondario. Questo aspetto va tenuto in considera ­
zione nella scelta dei livelli di dose e dell’intervallo tra i livelli di dose per lo studio.
 
26. L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dagli obiettivi dello studio e 
dalle caratteristiche della sostanza chimica in esame e non può essere impo ­
sto in ogni suo dettaglio dal presente metodo di prova, ma di frequente 
fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati delle prove se applicati 
per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile ag ­
giungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea 
generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è oppor ­
tuno giustificare tale scelta.
 
27. Come precisato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 
116 (7), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i 
seguenti aspetti:  
— non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva 
dose-risposta,  
— aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione 
metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne,  
— lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biolo ­
gici fondamentali sottostanti in corso,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 490
 
— aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi 
alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono pertur ­
bati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc.,  
— regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima partico ­
larmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento pre ­
vista o di una soglia ipotizzata,  
— considerazione dei livelli previsti di esposizione umana, soprattutto nella 
scelta delle dosi intermedie e basse.  
28. Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo 
nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in 
esame. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali del gruppo 
di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimen ­
tali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è sommini ­
strata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo signi ­
ficativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà di più a tale scopo.
 
Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in 
esame  
29. La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, 
l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orienta ­
mento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alle 
vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende 
dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo pre ­
dominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la 
scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute 
animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma è scelta solo per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione 
corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad 
esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o pre ­
senti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solita ­
mente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, 
ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la 
somministrazione per altre vie.
 
30. Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo 
adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti 
caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che 
possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di 
cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di pren ­
dere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una so ­
luzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/ 
emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile 
soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle solu ­
zioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di sommi ­
nistrazione (ad esempio dieta).
 
31. Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è 
importante impedire che le quantità della sostanza in esame interferiscano 
con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concen ­
trazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare 
la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri 
alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg 
di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali 
alternative va specificata.
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32. In caso di somministrazione per via orale è prevista una dose giornaliera 
della sostanza chimica in esame (sette giorni la settimana) per un periodo di 
12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase relativa alla cancero ­
genesi), cfr. anche paragrafi 33 e 34. Occorre giustificare la scelta di even ­
tuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso 
di somministrazione per via cutanea, di norma gli animali sono trattati con 
la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (11), per un periodo di 12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase 
relativa alla cancerogenesi). L’esposizione per via inalatoria si protrae per 
6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di sommini ­
strazione di norma è di 12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase 
relativa alla cancerogenesi). Se per l’esposizione «a naso solo» s’impiegano 
specie di roditori diverse dai ratti, è si possono adeguare le durate massime di esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere 
debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (9).
 
33. Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via 
intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda gastrica o una cannula per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene 
somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esem ­
pio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in 
un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve 
essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di peso corporeo (31). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando le concentrazioni in modo da assicurare un 
volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente 
corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto ga ­
strointestinale.
 
Durata dello studio  
34. Il periodo di esposizione e la durata della fase relativa alla cronicità del 
presente studio di norma sono pari a 12 mesi, ma il disegno sperimentale rende possibile e può essere applicato anche a studi dalla durata più breve (ad esempio 6 o 9 mesi) o più lunga (ad esempio 18 o 24 mesi), a seconda 
delle disposizioni di regimi normativi specifici o dagli specifici fini mecca ­
nicistici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. Tutti i gruppi-dose previsti per questa fase saranno conclusi nel momento 
previsto ai fini della valutazione della tossicità cronica e della patologia non 
neoplastica. Una volta terminata l’esposizione, ai gruppi satellite previsti per controllare la reversibilità di eventuali alterazioni tossicologiche indotte dalla sostanza chimica in esame non sarà somministrata alcuna dose per un pe ­
riodo non inferiore di 4 settimane e non superiore a un terzo della durata 
totale dello studio.
 
35. La durata della fase del presente studio relativa alla cancerogenesi per i 
roditori di norma sarà pari a 24 mesi, un periodo che si estende per la 
maggior parte della durata di vita normale degli animali utilizzati. La durata 
degli studi può essere più lunga o più breve a seconda della durata di vita del ceppo delle specie animali previste per lo studio, ma deve essere giu ­
stificata. Per determinati ceppi di topi, ad esempio AKR/J, C3H/J o 
C57BL/6J, può essere più appropriata una durata di 18 mesi. Qui di seguito 
saranno forniti alcuni orientamenti relativi alla durata e al termine dello studio e alla sopravvivenza. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori orientamenti in materia, tra cui le considerazioni 
sull’accettabilità di uno studio di cancerogenesi negativo in relazione alla 
sopravvivenza degli animali.
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— Va considerata la decisione di concludere lo studio se il numero di 
animali sopravvissuti nei gruppi a dose più bassa è inferiore al 25 %  
— Lo studio non va concluso in caso di morti premature dovute alla tos ­
sicità limitate al gruppo ad alta dose  
— Le valutazioni relative alla sopravvivenza vanno effettuate distinguendo 
tra i due sessi  
— Lo studio non si deve prolungare oltre il momento in cui i dati resi 
disponibili in questo contesto non sono più sufficienti per giungere a una 
valutazione valida dal punto di vista statistico.  
OSSERVAZIONI (FASE RELATIVA ALLA CRONICITÀ TOSSICA)  
36. Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mor ­
talità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi 
inclusi. Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al gior ­
no, preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa av ­
venga per via intragastrica.
 
37. Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche almeno 
una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all’in ­
terno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, al termine della prima settimana dello studio e successivamente a cadenza mensile. Le osservazioni 
devono rispettare un protocollo che limiti al minimo indispensabile le dif ­
ferenze tra i singoli e non devono dipendere dai risultati del gruppo esami ­
nato. Le osservazioni del caso vanno eseguite fuori dalla gabbia di stabu ­
lazione, preferibilmente in un ambiente standard e sempre all’incirca allo 
stesso orario. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente 
usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio che esegue la prova. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte 
le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della 
comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività del sistema nervoso autonomo (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate 
nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come 
pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per esempio automutilazione, marcia a ritroso) (32).
 
38. Tutti gli animali vanno sottoposti a un esame oftalmologico con un oftalmo ­
scopio o un altro dispositivo idoneo, prima della prima somministrazione 
della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, questo esame va 
condotto preferibilmente su tutti gli animali, ma almeno sui gruppi ad alta dose e di controllo. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali. Se da un’analisi strut ­
turale o da altre informazioni si riscontra una tossicità oculare, la frequenza 
degli esami oculari va intensificata.
 
39. Per le sostanze chimiche per cui prove precedenti di tossicità a dose ripetuta 
a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti neurotossici, possono essere svolte valutazioni facoltative della reattività sensoriale a stimoli di vario tipo (32) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) 
(33) (34) (35), della forza di presa (36) e dell’attività motoria (37) prima 
dell’inizio dello studio e a cadenza trimestrale dopo l’inizio dello studio fino al 12° mese incluso, così come alla fine dello studio (se più lungo di 12 mesi). Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle 
voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure 
alternative non indicate nella bibliografia.
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40. Le sostanze chimiche per cui prove di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni 
e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti immunotossici, alla fine 
dello studio possono essere sottoposte ad ulteriori analisi facoltative di tale parametro.
 
Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare  
41. Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una 
volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimen ­
tare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 
settimane e successivamente almeno una volta al mese Se la sostanza chi ­
mica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 
settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto 
della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ul ­
timo è alterato.
 
Esami ematologici e biochimici clinici  
42. Negli studi che prevedono la presenza di roditori, vanno svolti esami ema ­
tologici su tutti gli animali sperimentali (10 animali di sesso maschile e 10 
animali di sesso femminile per gruppo), a 3, 6 e 12 mesi, così come alla fine 
dello studio (se di durata superiore a 12 mesi). Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso (cfr. paragrafo 19). Negli studi con non roditori, sa ­
ranno presi dei campioni da quantità minore di animali (ad esempio 4 
animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono necessariamente essere 
condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri ema ­
tologici in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, 
sotto anestesia.
 
43. Vanno esaminati i seguenti parametri (38): conteggio totale e differenziato 
dei leucociti, conteggio degli eritrociti, conteggio delle piastrine, ematocrito (volume sanguigno occupato dalla componente eritrocitaria), volume corpu ­
scolare medio, emoglobina corpuscolare media, concentrazione di emoglo ­
bina corpuscolare media, tempo di prototrombina e tempo di tromboplastina 
parziale attivata. Possono essere misurati anche altri parametri ematologici come i corpi di Heinz o un’altra morfologia eritrocitaria atipica o metaemo ­
globina, se del caso, a seconda della tossicità della sostanza chimica in 
esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in fun ­
zione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chi ­
mica in esame. Se la sostanza chimica in esame ha un effetto sul sistema 
ematopoietico, possono essere indicati anche il conteggio dei reticolociti e la 
citologia del midollo osseo, sebbene questi non siano necessariamente esami di routine.
 
44. Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici 
gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, vanno condotte 
su campioni di sangue prelevati da almeno 10 animali di sesso maschile e 
10 animali di sesso femminile per gruppo, ai medesimi intervalli di tempo specificati per gli esami ematologici e sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter 
eseguire tutte le determinazioni biochimiche cliniche del caso. Negli studi 
con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minore di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misu ­
razioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere 
necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai
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parametri di biochimica clinica in uno studio precedente della durata di 90 
giorni condotto con livelli di dose comparabili. Si raccomanda di lasciare gli 
animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (ad eccezione dei topi) (
 1 ). Vanno esaminati i seguenti parametri (38): glucosio, urea 
(azoto ureico), creatinina, proteine totali, albumina, calcio, sodio, potassio, 
colesterolo totale, almeno due esami idonei alla valutazione epatocellulare 
(alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, glutammato deidroge ­
nasi, acidi biliari totali (39) e almeno due esami idonei alla valutazione epatobiliare (fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, 5’-nucleotidasi, 
bilirubina totale, acidi biliari totali) (39). Se opportuno possono essere mi ­
surati anche altri parametri di chimica clinica, come i trigliceridi a digiuno, ormoni specifici e colinesterasi, a seconda della tossicità della sostanza chi ­
mica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, 
in funzione delle specie e dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una 
data sostanza.
 
45. L’esame delle urine va effettuato su tutti gli animali sperimentali (10 animali 
di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo) sui campioni 
raccolti seguendo gli stessi intervalli applicati in ambito ematologico e di 
chimica clinica. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscon ­
trato nessun effetto sull’esame delle urine in uno studio precedente della 
durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. I seguenti 
parametri sono stati inclusi in una raccomandazione di esperti su studi di patologia clinica (38): aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine totali e glucosio. Altre determinazioni riguardano il chetone, l’uro ­
bilinogeno, la bilirubina e il sangue occulto. Se necessario, per ampliare lo 
studio dell’effetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori parametri.
 
46. Generalmente si considera necessario determinare le variabili di riferimento 
di natura ematologica e di biochimica clinica prima di iniziare un tratta ­
mento in studi che coinvolgono dei cani, ma ciò non è ritenuto necessario negli studi che prevedono l’uso di roditori (38). Se tuttavia non si dispone di dati storici di riferimento adeguati (cfr. paragrafo 58), si dovrebbe conside ­
rare di produrre tali dati.
 
PATOLOGIA  
Necroscopia macroscopica  
47. Tutti gli animali dello studio di norma vanno sottoposti a completa e detta ­
gliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della su ­
perficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Tuttavia si può anche disporre (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio o per i gruppi satellite) 
che le osservazioni siano limitate a parametri specifici e fondamentali, come 
la neurotossicità o l’immunotossicità (cfr. paragrafo 21). Gli animali in oggetto non devono necessariamente essere sottoposti ad autopsia e alle procedure successive descritte nei seguenti paragrafi. Per gli animali senti ­
nella, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discre ­
zione del responsabile scientifico dello studio.
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( 1 ) Per svariate misurazioni del siero e del plasma, e soprattutto per il glucosio, è preferibile 
mantenere il digiuno per tutta la notte. Il motivo principale è che l’aumento della 
variabilità dovuto inevitabilmente al mancato digiuno tenderebbe a mascherare effetti 
meno evidenti rendendo più difficile l’interpretazione. D’altro lato, però, il digiuno 
notturno può interferire con il metabolismo generale degli animali e, soprattutto negli 
studi sull’alimentazione, può incidere sull’esposizione quotidiana alla sostanza in esame. 
Tutti gli animali valutati dovrebbero essere nella stessa situazione fisiologica e pertanto 
esami approfonditi di tipo neurologico dovrebbero essere svolti in un giorno diverso dai 
campionamenti biochimico-clinici.
 48. Si deve misurare il peso degli organi di ciascun animale, tranne di quelli 
esclusi dall’ultima parte del paragrafo 47. Fegato, reni, ghiandole surrenali, 
testicoli, epididimi, utero, ovaie, timo, milza, cervello e cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi imme ­
diatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento.
 
49. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato 
sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (40) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): 
tutte le lesioni macroscopi ­
che cuore pancreas stomaco (prestomaco, sto ­
maco ghiandolare) 
ghiandole surrenali ileo ghiandola paratiroidea [denti] 
aorta digiuno nervo periferico testicoli cervello (incluse le sezioni 
di cervello, cervelletto, bul ­
bo/ponte) reni pituitaria Timo 
intestino cieco ghiandola lacrimale 
(esorbitale) prostata, tiroide 
cervice fegato retto [lingua] 
ghiandola della coagula ­
zione polmone ghiandola salivare trachea 
colon linfonodi (superficiali e 
profondi) vescicola seminale vescica 
duodeno ghiandola mammaria 
(obbligatoria per esem ­
plari di sesso femminile 
e, se visibile ai fini della 
la dissezione, anche per quelli di sesso maschile muscolo scheletrico utero (cervice inclusa) 
epididimo [tratto respiratorio supe ­
riore, incluso il naso, i turbinati e i seni parana ­
sali] pelle [uretere] 
occhi (retina inclusa) esofago midollo spinale (a tre li ­
velli: Cervicale, medio ­
toracico e lombare) [uretra] 
[femore con articolazione] [bulbo olfattivo] milza vagina 
cistifellea (eccetto per i to ­
pi) ovaia [sterno] sezione di midollo osseo e/o 
un aspirato di midollo osseo 
fresco 
ghiandola di Harder
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 496
 
In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evi ­
denziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per 
via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla 
via orale. In particolare, è necessario procedere al campionamento e alla conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco 
dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratorio deve 
corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/ tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va 
esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale.
 
Esame istopatologico  
50. Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi 
di patologia tossicologica (40). Come minimo, gli esami istopatologici pre ­
vedono quanto segue:  
— tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo,  
— tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel 
corso dello studio,  
— tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche,  
— tessuti bersaglio o tessuti che hanno evidenziato cambiamenti legati al 
trattamento nel gruppo ad alta dose, di tutti gli animali in tutti gli altri gruppi-dose,
 
— in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
esaminati entrambi gli organi.  
OSSERVAZIONI (FASE RELATIVA ALLA CANCEROGENESI)  
51. Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mor ­
talità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Inoltre gli animali devono essere sottoposti a un controllo quotidiano 
dei segni di rilevanza tossicologica. Negli studi che prevedono una sommi ­
nistrazione per via intragastrica, gli animali devono essere controllati nel periodo immediatamente successivo alla somministrazione della dose. Va prestata particolare attenzione allo sviluppo di tumori e si registrerà la 
data di inizio, la posizione, le dimensioni, l’aspetto e la progressione di 
ogni tumore grossolanamente visibile o palpabile.
 
52. Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una 
volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimen ­
tare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 
settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza 
chimica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto 
della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ul ­
timo è alterato.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 497
 
Ematologia, biochimica clinica e altre misurazioni  
53. Al fine di sfruttare al massimo le informazioni ottenute dallo studio, soprat ­
tutto per quando riguarda le considerazioni legate alle modalità di azione è possibile effettuare dei prelievi di sangue ai fini di analisi ematologiche e di 
biochimica clinica, ma la scelta è a discrezione del responsabile scientifico 
dello studio. Potrebbe essere utile anche effettuare l’esame delle urine. I dati sugli animali usati nella fase relativa alla tossicità cronica dello studio, di norma dalla durata di 12 mesi (paragrafo 34) forniscono informazioni su 
questi parametri. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) forni ­
sce ulteriori indicazioni sul valore di tali campionamenti nel quadro di uno studio di cancerogenesi. Se alla fine del test si raccolgono campioni di 
sangue, ciò deve avvenire alla fine del periodo di prova, subito prima o 
nel corso della procedura di soppressione degli animali. Occorre che i cam ­
pioni siano prelevati da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. Per l’esame possono essere prepa ­
rati anche degli strisci di sangue, in particolare se si presume che il midollo 
osseo rientri tra gli organi bersaglio, sebbene il valore di tale esame degli strisci di sangue nella fase relativa alla cancerogenesi ai fini della valuta ­
zione del potenziale cancerogeno/oncogeno non sia indiscusso (38).
 
PATOLOGIA  
Necroscopia macroscopica  
54. Tutti gli animali dello studio, ad eccezione degli animali sentinella e di altri 
animali satellite (cfr. paragrafo 20), dovranno essere sottoposti ad una ne ­
croscopia completa, comprendente un accurato esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi, della cavità cranica, toracica e addo ­
minale e del loro contenuto. Per gli animali sentinella e altri animali satel ­
lite, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione 
del responsabile scientifico dello studio. Il peso degli organi di norma non rientra nello studio di cancerogenesi, poiché i cambiamenti geriatrici prima, e in fasi successive lo sviluppo di tumori hanno un effetto distorsivo 
sull’utilità dei relativi dati. Il peso degli organi potrebbe essere tuttavia 
importante ai fini della valutazione della forza probante dei dati e in parti ­
colare per considerazioni sulle modalità di azione. Se tali dati sono rilevati nel quadro di uno studio satellite, vanno raccolti a distanza di non oltre un 
anno dall’inizio dello studio.
 
55. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato 
sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo 
(40) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): 
tutte le lesioni macroscopi ­
che cuore pancreas stomaco (prestomaco, sto ­
maco ghiandolare) 
ghiandole surrenali ileo ghiandola paratiroidea [denti] aorta digiuno nervo periferico testicoli cervello (incluse le sezioni 
di cervello, cervelletto, bul ­
bo/ponte) reni pituitaria timo 
intestino cieco ghiandola lacrimale 
(esorbitale) prostata, tiroide 
cervice fegato retto [lingua] 
ghiandola della coagula ­
zione polmone ghiandola salivare trachea 
colon linfonodi (superficiali e 
profondi) vescicola seminale vescica
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 498
 
duodeno ghiandola mammaria 
(obbligatoria per esem ­
plari di sesso femminile e, se visibile ai fini della 
la dissezione, anche per 
quelli di sesso maschile) muscolo scheletrico utero (cervice inclusa) 
epididimo [tratto respiratorio supe ­
riore, incluso il naso, i turbinati e i seni parana ­
sali] pelle [uretere] 
occhi (retina inclusa) esofago midollo spinale (a tre li ­
velli: cervicale, medio ­
toracico e lombare) [uretra] 
[femore con articolazione] [bulbo olfattivo] milza vagina 
cistifellea (eccetto per i to ­
pi) ovaia [sterno] sezione di midollo osseo e/o 
un aspirato di midollo osseo 
fresco 
ghiandola di Harder
 
In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evi ­
denziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della 
sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per 
via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, è necessario procedere al campionamento e alla conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi 
che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco 
dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratori deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/ 
tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va 
esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale.
 
Esame istopatologico  
56. Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi 
di patologia tossicologica (40). Come minimo, vanno esaminati i seguenti tessuti:
 
— tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo;  
— tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel 
corso dello studio;  
— tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, tumori compresi;  
— se si osservano dei cambiamenti istopatologici in relazione al trattamento 
nel gruppo ad alta dose, tali tessuti vanno esaminati in ogni animale di tutti gli altri gruppi-dose;
 
— in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno 
esaminati entrambi gli organi.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 499
 
DATI E RELAZIONE (CANCEROGENESI E TOSSICITÀ CRONICA)  
Dati 
57. Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati 
vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo speri ­
mentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il 
momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che presentano 
segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di 
animali rapportata al tipo di lesione. Tabelle riassuntive dei dati devono 
fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continua ­
tiva) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni.
 
58. I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello 
studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli 
sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di 
controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati 
nei cinque anni che precedono lo studio in questione.
 
59. I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e 
generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno 
scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale. Questa scelta 
deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di soprav ­
vivenza, se necessario.  
60. La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti:  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  
— origine della sostanza chimica,  
— numero del lotto,  
— certificazione dell’analisi chimica.  
Veicolo (se del caso):  
— giustificazione per la scelta del veicolo, se diverso dall’acqua.  
Animali sperimentali.  
— specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata,  
— numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova,  
— origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc.,  
— peso di ciascun animale all’inizio del saggio.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 500
 
Condizioni sperimentali:  
— criteri di scelta della via di somministrazione e della dose,  
— laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati,  
— dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la prepara ­
zione della dieta,  
— dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della 
preparazione,  
— via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in 
esame,  
— per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta 
tra esposizione «a naso solo» o «a corpo intero»,  
— dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di 
conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella 
dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva,  
— informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell’acqua.  
Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati 
individuali sugli animali)  
Dati generali:  
— dati sulla sopravvivenza degli animali,  
— peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo,  
— assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, non ­
ché consumo di acqua, se del caso,  
— dati tossicocinetici, se disponibili,  
— dati oftalmoscopici (se disponibili),  
— esami ematologici (se disponibili),  
— esami di chimica clinica (se disponibili).  
Risultati clinici:  
— segni di tossicità,  
— incidenza (e, se classificata, la gravità) di eventuali anomalie,  
— natura, gravità e durata dei segni clinici (reversibili o meno).  
Dati necroscopici:  
— peso corporeo finale,  
— peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso),  
— reperti necroscopici; incidenza e gravità delle anomalie.  
Esame istopatologico:  
— reperti istopatologici non neoplastici,  
— qualsiasi altro reperto istopatologico,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 501
 
— correlazione tra reperti macroscopici e microscopici,  
— descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al 
trattamento, inclusi i livelli di gravità,  
— relazioni su eventuali esami inter pares dei vetrini.  
Elaborazione statistica dei risultati, se del caso  
Discussione dei risultati:  
— discussione su tutti gli approcci di modellizzazione,  
— rapporti dose-risposta,  
— dati umani storici,  
— esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione,  
— determinazione BMD, NOAEL o LOAEL,  
— rilevanza per gli esseri umani.  
Conclusioni  
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(9) Capitolo B.8 del presente allegato, Tossicità subacuta a dose ripetuta (28 
giorni) per inalazione.  
(10) Capitolo B.29 del presente allegato, Studio di tossicità subcronica a dose 
ripetuta (90 giorni) per inalazione.  
(11) Capitolo B.9 del presente allegato, Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per 
via cutanea.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 502
 
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Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 504
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 505
 
B.34.  SAGGIO DI TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE: UNA 
GENERAZIONE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.3. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4. PRINCIPI DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza sperimentale è somministrata in dosi graduate a diversi 
gruppi di animali maschi e femmine. I maschi dovrebbero essere 
sottoposti a dosaggio durante la crescita e per almeno un ciclo sper ­
matogenico completo (approssimativamente 56 giorni per il topo e 70 giorni per il ratto) per provocare qualsiasi tipo di effetto avverso da parte della sostanza di saggio sulla spermatogenesi.
 
Le femmine della generazione P dovrebbero essere sottoposte a do ­
saggio per almeno due cicli estrali completi per suscitare qualsiasi tipo di effetto contrario della sostanza in esame sull'estro. Gli animali 
sono poi accoppiati. La sostanza in esame viene somministrata ad 
entrambi i sessi durante il periodo di accoppiamento ed in seguito soltanto alle femmine durante la gravidanza e per la durata del periodo di allattamento. Per la somministrazione della sostanza in 
esame per via inalatoria, il metodo richiederà modifiche.
 
1.5. CRITERI QUALITATIVI  
Nessuno.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Preparazioni  
Prima del saggio gli animali giovani e sani sono mescolati con 
metodo casuale ed assegnati ai gruppi trattati e di controllo. Gli 
animali sono tenuti nelle condizioni sperimentali di alloggiamento e nutrizione per almeno 5 giorni prima dell'inizio della prova. Si raccomanda di somministrare la sostanza in esame nella dieta o 
nell'acqua da bere. Sono accettabili anche altre vie di somministra ­
zione. Il dosaggio per tutti gli animali dovrebbe essere fatto con lo stesso metodo durante l'appropriato periodo dell'esperimento. Se un veicolo od altri additivi sono utilizzati per facilitare il dosaggio, essi 
non dovranno notoriamente produrre effetti tossici. Il dosaggio dovrà 
essere fatto su una base di sette giorni per settimana.
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A n i m a l i d a e s p e r i m e n t o  
Scelta della specie  
Il ratto o il topo sono le specie preferite. Si dovrebbero utilizzare 
animali sani, non sottoposti in precedenza a esperimenti. Non si dovrebbero utilizzare ceppi a bassa fecondità. Gli animali di saggio 
dovrebbero essere caratterizzati quanto alle specie, al ceppo, al sesso, 
al peso e all'età.
 
Per una valutazione adeguata della fertilità, si dovrebbero studiare sia 
i maschi sia le femmine. Tutti gli animali per il saggio e i controlli dovrebbero essere svezzati prima dell'inizio del dosaggio.
 
Numero e sesso  
Ogni gruppo trattato e di controllo dovrebbe contenere un numero 
sufficiente di animali per avere circa 20 femmine incinte prossime a partorire o quasi al termine della gravidanza.
 
L'obiettivo è di avere sufficienti gravidanze e figliate per assicurare 
una valutazione significativa del potenziale della sostanza di influire 
negativamente sulla fertilità, sulla gravidanza e sul comportamento 
materno negli animali della generazione P, e sul lattante, sulla cre ­
scita e sullo sviluppo della figliata F, dal concepimento allo svezza ­
mento.  
C o n d i z i o n i d i s a g g i o  
Il cibo e l'acqua dovrebbero essere forniti ad libitum. Nell'imminenza 
del parto, le femmine incinte dovrebbero essere messe in gabbie separate o in gabbie apposite per il parto e possono essere rifornite 
di materiale per la costruzione della tana.
 
L i v e l l i d i d o s e  
Si dovrebbero usare almeno tre gruppi di trattamento e un gruppo di 
controllo. Se si usa un veicolo per la somministrazione della sostanza in esame, il gruppo di controllo dovrebbe ricevere il veicolo al 
livello di dose più alto usato. Se una sostanza in esame provoca 
una riduzione dell'ingestione o dell'utilizzazione della dieta, si po ­
trebbe considerare necessario l'uso di un gruppo di controllo paral ­
lelo. Idealmente, a meno che non sia limitato dalla natura fisico/ ­
chimica o dagli effetti biologici della sostanza in esame, il livello di dose più elevato dovrebbe indurre effetti tossici, ma non mortalità nei genitori P. La(e) dose(i) intermedia(e) dovrebbe indurre effetti 
tossici minimi attribuibili alla sostanza in esame e la dose più bassa 
non dovrebbe indurre alcun effetto osservabile sui genitori o sulla prole. Quando somministrato con sonda o in capsula, il dosaggio di ogni animale dovrebbe essere basato sul peso corporeo del singolo 
animale e regolato settimanalmente per tener conto dei cambiamenti 
del peso corporeo. Per le femmine gravide, i dosaggi possono essere basati sul peso corporeo nel giorno 0 o al 6° giorno di gravidanza.
 
S a g g i o l i m i t e  
Nel caso di sostanze a bassa tossicità, se un livello di dose di almeno 
1 000 mg/kg non produce evidenza di interferenza con la funzione 
riproduttiva, studi con altri livelli di dose possono essere considerati non necessari. Se uno studio preliminare con un livello di dose elevato, con evidenza precisa di tossicità materna, non evidenzia 
effetti avversi sulla fertilità, studi con altri livelli di dose possono 
essere considerati non necessari.
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Svolgimento del saggio  
P r o g r a m m i s p e r i m e n t a l i  
Il dosaggio giornaliero dei genitori maschi P dovrebbe cominciare a 
circa cinque-nove settimane di età, dopo svezzamento e acclimata ­
zione per almeno 5 giorni, Nei ratti, il dosaggio viene continuato per 
dieci settimane prima del periodo di accoppiamento (per i topi, otto 
settimane). I maschi dovrebbero essere sacrificati ed esaminati sia alla fine del periodo di accoppiamento oppure, alternativamente, essi possono essere mantenuti con la dieta sperimentale per la possibile 
produzione di una seconda figliata e dovrebbero essere sacrificati un 
po' prima della fine dello studio. Per le femmine genitrici P il do ­
saggio dovrebbe cominciare dopo almeno 5 giorni di acclimatazione e continuare per almeno due settimane prima dell'accoppiamento. Il 
dosaggio giornaliero delle femmine P dovrebbe continuare durante il 
periodo di accoppiamento di tre settimane, la gravidanza e fino allo svezzamento della prole F
 1 . Si dovrebbe dare attenzione a modifiche 
del programma di dosaggio sulla base di altre informazioni disponi ­
bili sulla sostanza in esame, quali l'induzione del suo metabolismo o 
bioaccumulazione.  
P r o c e d u r a d i a c c o p p i a m e n t o  
Negli studi degli effetti tossici sulla riproduzione si possono usare i 
seguenti sistemi di accoppiamento: 1:1 (un maschio e una femmina), oppure 1:2 (un maschio e due femmine).
 
Usando il sistema di accoppiamento 1:1 si dovrebbe mettere una 
femmina con lo stesso maschio finché la femmina non rimanga 
gravida o finché non siano trascorse tre settimane. Ogni mattina le femmine dovrebbero essere esaminate per la presenza di sperma o di tappi vaginali. Il giorno 0 di gravidanza è definito come il giorno in 
cui si trova un tappo vaginale oppure lo sperma.
 
Le coppie che non riescono ad accoppiarsi dovrebbero essere stu ­
diate per determinare la causa della sterilità apparente.  
Questo può comportare procedure quali, ad esempio, quella di for ­
nire opportunità supplementari di accoppiamento con altri maschi o 
femmine provati, esame microscopico degli organi riproduttori, e esame del ciclo estrale o della spermatogenesi.
 
D i m e n s i o n i d e l l a f i g l i a t a  
Gli animali sottoposti a dosaggio durante lo studio di fertilità ven ­
gono lasciati partorire normalmente ed allevare liberamente la prole fino alla fase di svezzamento.
 
Se si effettua una standardizzazione si suggerisce la seguente proce ­
dura. Tra il 1° ed il 4° giorno dopo la nascita, la dimensione di ogni figliata può essere regolata eliminando i piccoli in più, in modo da avere, nella misura del possibile, quattro maschi e quattro femmine 
per figliata.
 
Ogni volta che il numero di maschi o di femmine non permette di 
avere quattro animali di ogni sesso per figliata, è accettabile una regolazione parziale (ad esempio, cinque maschi e tre femmine). 
La standardizzazione non è applicabile alle figliate di meno di otto 
piccoli.
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O s s e r v a z i o n i  
Durante tutto il periodo di saggio, ogni animale dovrebbe essere 
sottoposto ad osservazione almeno una volta al giorno. Si dovreb ­
bero registrare tutte le variazioni comportamentali pertinenti, i segni di parto difficile o prolungato, e tutti i sintomi di tossicità, compresa 
la mortalità. Nei periodi precedenti e durante l'accoppiamento, il 
consumo alimentare può essere misurato quotidianamente. Dopo il parto e durante l'allattamento, le misurazioni del consumo di ali ­
mento (e del consumo dell'acqua quando la sostanza sperimentale 
è somministrata in acqua potabile) dovrebbero essere effettuate nello 
stesso giorno della pesatura delle figliate. I maschi e le femmine P dovrebbero essere pesati nel primo giorno del dosaggio e in seguito settimanalmente. Queste osservazioni dovrebbero essere registrate 
individualmente per ogni animale adulto.
 
La durata della gestazione dovrebbe essere calcolata dal giorno 0 di 
gravidanza. Ogni figliata dovrebbe essere esaminata non appena 
possibile dopo il parto per stabilire il numero ed il sesso dei piccoli, 
dei nati morti, dei nati vivi e la presenza di grosse anomalie.  
I piccoli morti e quelli sacrificati al 4° giorno dovrebbero essere 
conservati e studiati per la constatazione di possibili difetti. I piccoli 
vivi dovrebbero essere contati e le figliate pesate al mattino dopo la 
nascita, al 4° giorno e al 7° e settimanalmente fino alla conclusione dello studio, quando gli animali dovrebbero essere pesati individual ­
mente.
 
Le anomalie fisiche o comportamentali osservate nei ceppi o nella 
prole dovrebbero essere registrate.  
P a t o l o g i a  
N e c r o s c o p i a  
Al momento del sacrificio o della morte durante lo studio, gli ani ­
mali della generazione P dovrebbero essere esaminati macroscopica ­
mente per l'individuazione di tutte le anomalie strutturali o muta ­
menti patologici, prestando particolare attenzione agli organi del sistema riproduttivo. I piccoli morti o moribondi dovrebbero essere 
esaminati per individuare eventuali difetti.
 
I s t o p a t o l o g i a  
Le ovaie, l'utero, il collo dell'utero, la vagina, i testicoli, l'epididimo, 
le vescichette seminali, la prostata, la ghiandola della coagulazione, 
la ghiandola pituitaria e l'organo(i)-bersaglio di tutti gli animali P dovrebbero essere conservati per l'esame microscopico. Nel caso in 
cui questi organi non siano stati esaminati in altri studi con dosi 
multiple, essi dovrebbero essere esaminati microscopicamente in tutti gli animali dei gruppi trattati con dose elevata e di controllo e negli animali che muoiono durante l'esperimento, quando fattibile.
 
Gli organi di questi animali che mostrano anomalie dovrebbero 
quindi essere esaminati in tutti gli altri animali P. In questi casi, si dovrebbe eseguire l'esame microscopico di tutti i tessuti che mo ­
strano alterazioni patologiche macroscopiche. Come suggerito per 
le procedure di accoppiamento, gli organi riproduttivi degli animali 
sospetti di sterilità possono essere sottoposti all'esame microscopico.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 509
 
2. DATI  
I dati possono essere riassunti sotto forma di tabella, indicando per 
ogni gruppo sperimentale il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di maschi fertili, il numero di femmine incinte, i tipi di 
cambiamenti e la percentuale degli animali che mostrano ciascun 
tipo di cambiamento.
 
Quando possibile, i risultati numerici dovrebbero essere valutati con 
un metodo statistico idoneo. Qualsiasi metodo statistico generalmente 
riconosciuto può essere utilizzato.  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— specie/ceppo usato,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e per dose, compresa la 
fertilità, la gestazione normale e la vitalità,  
— tempo di morte durante lo studio o, se gli animali sono soprav ­
vissuti fino al tempo previsto per il sacrificio, alla conclusione 
dello studio,  
— tabella indicante i pesi di ogni figliata, il peso medio dei piccoli 
ed i pesi individuali dei piccoli a termine,  
— effetti tossici o altri effetti sulla riproduzione, sulla prole, sulla 
crescita postnatale,  
— data di osservazione di ogni segno anomalo e decorso successi ­
vo, 
— dati sul peso corporeo degli animali P,  
— risultati della microscopia,  
— descrizione particolareggiata di tutti i risultati degli esami micro ­
scopici,  
— elaborazione statistica dei risultati, quando appropriata,  
— discussione dei risultati,  
— interpretazione dei risultati.  
3.2. VALUTAZIONE ED INTERPRETAZIONE  
Vedi introduzione generale, parte B.  
4. RIFERIMENTI  
Vedi introduzione generale, parte B.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 510
 
B.35.  STUDIO DI TOSSICITÀ RIPRODUTTIVA A DUE 
GENERAZIONI  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde al TG 416 (2001) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo metodo di test della capacità riproduttiva a due generazioni è 
in grado di fornire dati generici riguardanti gli effetti di una sostanza 
sull'integrità e le prestazioni degli apparati riproduttori maschile e femminile, compresi funzione delle gonadi, ciclo estrale, comporta ­
mento nell'accoppiamento, concepimento, gestazione, parto, allatta ­
mento e svezzamento, nonché crescita e sviluppo della prole. Lo 
studio può inoltre fornire informazioni sugli effetti della sostanza circa la morbilità e la mortalità neonatale, nonché dati preliminari sulla tossicità a carico dello sviluppo prenatale e postnatale, e servire 
da guida per test successivi. Oltre a studiare la crescita e lo sviluppo 
della generazione F
 1 , questo metodo di test è inteso a valutare l'inte ­
grità e le prestazioni degli apparati riproduttori maschile e femminile, 
nonché la crescita e lo sviluppo della generazione F  2 . Per ottenere 
ulteriori dati inerenti alla tossicità sullo sviluppo e ai deficit funzio ­
nali è possibile incorporare nel presente protocollo parti di altri studi attingendo eventualmente ai metodi per la tossicità e/o la neurotos ­
sicità in fase evolutiva; alternativamente gli stessi endpoint possono 
essere esaminati in studi separati, mediante adeguati metodi di test.
 
1.2. PRINCIPIO DEL TEST  
La sostanza di saggio viene somministrata in dosi graduate a diversi 
gruppi di maschi e femmine. Ai maschi della generazione P la so ­
stanza va somministrata durante la crescita e per almeno un ciclo 
completo di spermatogenesi (all'incirca 56 giorni nel topo e 70 giorni 
nel ratto) con l'obiettivo di provocare eventuali effetti avversi sulla spermatogenesi. Gli effetti sugli spermatozoi si rilevano in base a svariati parametri (tra cui la morfologia e la motilità degli sperma ­
tozoi) nonché mediante preparazione tissutale e dettagliato esame 
istopatologico. Nel caso siano disponibili dati sulla spermatogenesi provenienti da un precedente studio a dosi ripetute di durata suffi ­
ciente, come ad esempio uno studio di 90 giorni, non occorre inclu ­
dere nella valutazione i maschi della generazione P. Si raccomanda 
tuttavia di conservare campioni o registrazioni digitali degli sperma ­
tozoi della generazione P, per consentirne la valutazione in un mo ­
mento successivo. Alle femmine della generazione P la sostanza va 
somministrata durante la crescita e per diversi cicli estrali completi 
con l'obiettivo di provocare eventuali effetti avversi sulla normalità del ciclo estrale. La sostanza di saggio viene somministrata agli animali della generazione parentale (P) durante l'accoppiamento, du ­
rante la gravidanza e per tutto lo svezzamento della loro prole della 
generazione F
 1 . Allo svezzamento, si prosegue la somministrazione 
della sostanza da saggiare alla prole della generazione F  1 durante la 
crescita e successivamente l'età adulta, l'accoppiamento e la produ ­
zione di una generazione F  2 , continuando fino allo svezzamento 
della generazione F  2 . 
Tutti gli animali vanno sottoposti a osservazioni cliniche e valuta ­
zione anatomopatologica per individuare eventuali segni di tossicità, in particolare gli effetti sull'integrità e le prestazioni degli apparati 
riproduttori maschile e femminile e sulla crescita e sullo sviluppo 
della prole.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 511
 
1.3. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.3.1.  Selezione delle specie animali  
La specie d'elezione per l'esecuzione del test è il ratto. In caso di 
utilizzo di altre specie, occorre giustificare tale scelta e apportare 
adeguate modifiche al protocollo. Non vanno usati ceppi a bassa 
fecondità o con nota elevata incidenza di difetti dello sviluppo. Al ­
l'inizio dello studio la variazione ponderale degli animali utilizzati deve essere minima e non superare il 20 % del peso medio di 
ciascun sesso.
 
1.3.2.  Condizioni di stabulazione e alimentazione  
La temperatura nella stanza degli animali sperimentali deve essere di 
22 o C (± 3  o ). Sebbene l'umidità relativa debba raggiungere almeno il 
30 % e preferibilmente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie della stanza, è bene puntare a un valore del 50-60 %. 
L'illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di 
luce e 12 di buio. Per quanto concerne l'alimentazione si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla 
necessità di assicurare un'adeguata miscelazione della sostanza di 
saggio, quando somministrata con il presente metodo.
 
Gli animali possono essere alloggiati individualmente o in piccoli 
gruppi dello stesso sesso. Le procedure di accoppiamento vanno effettuate in gabbie adeguate per tale scopo. Dopo comprovata co ­
pulazione, le femmine accoppiate vanno isolate in gabbie da parto o 
maternità. Anche i ratti accoppiati possono essere tenuti in piccoli gruppi, ma vanno separati uno o due giorni prima del parto. Quando si avvicina il momento del parto occorre fornire agli animali mate ­
riali specifici adeguati per la costruzione del nido.
 
1.3.3.  Preparazione degli animali  
Devono essere utilizzati animali giovani sani, che siano stati accli ­
matati alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti ad altre procedure sperimentali. Gli animali del test vanno caratterizzati per quanto concerne specie, 
ceppo, provenienza, sesso, peso e/o età. È necessario conoscere 
eventuali relazioni di consanguineità in modo da evitare l'accoppia ­
mento tra individui fratelli. Gli animali vanno assegnati a random ai gruppi di controllo e di trattamento (si raccomanda la stratificazione 
per peso corporeo). Le gabbie vanno sistemate in modo da ridurre al 
minimo i possibili effetti dovuti alla loro posizione. A ciascun ani ­
male va assegnato un numero identificativo unico. Per la generazione P l'assegnazione del numero identificativo deve avvenire prima del ­
l'inizio della somministrazione delle dosi. Per la generazione F
 1 l'as­
segnazione va fatta allo svezzamento degli animali selezionati per l'accoppiamento. È necessario conservare la registrazione indicante la nidiata di origine per tutti gli animali F
 1 selezionati. Inoltre, si rac ­
comanda l'identificazione individuale dei piccoli non appena possi ­
bile dopo la nascita nel caso si preveda la pesatura individuale degli stessi o l'esecuzione di eventuali test funzionali.
 
All'inizio della somministrazione delle dosi gli animali della genera ­
zione parentale P devono avere 5-9 settimane di età. Gli animali di 
tutti i gruppi sperimentali devono essere, per quanto praticamente 
possibile, di età e peso uniformi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 512
 
1.4. PROCEDURA  
1.4.1.  Numero e sesso degli animali  
Ciascun gruppo di trattamento e di controllo deve comprendere un 
numero sufficiente di animali da fornire idealmente non meno di 20 
femmine gravide al parto o prossime al termine. Ciò può risultare 
impossibile in caso di somministrazione di sostanze che causano effetti indesiderati correlati al trattamento (ad esempio sterilità o eccessiva tossicità a dose elevata). L'obiettivo è di produrre un nu ­
mero di gravidanze tale da assicurare un'analisi significativa del 
potenziale della sostanza in termini di effetti sulla fertilità, la gravi ­
danza e il comportamento materno, oltre che la suzione, la crescita e 
lo sviluppo della prole F
 1 , dal concepimento e fino alla maturità, per 
proseguire poi con gli effetti sullo sviluppo della prole della succes ­
siva generazione F  2 fino allo svezzamento. Comunque, il mancato 
ottenimento del numero desiderato di femmine gravide (± 20) non 
invalida necessariamente lo studio e va valutato caso per caso.  
1.4.2.  Preparazione delle dosi  
Si raccomanda di somministrare la sostanza di prova per via orale 
(assieme alla dieta o all'acqua potabile o mediante sonda gastrica), a meno che non si consideri più adeguata un'altra via di sommini ­
strazione (ad esempio cutanea o per inalazione).
 
Se necessario la sostanza di prova va disciolta o sospesa in un 
veicolo adeguato. Si raccomanda di prendere anzitutto in considera ­
zione, ogni qualvolta possibile, l'uso di una soluzione/sospensione 
acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in 
olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall'acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. È necessario determinare la stabilità della 
sostanza di prova nel veicolo.
 
1.4.3.  Dosaggio  
Si utilizzano almeno tre livelli di dose e un controllo corrispondente. 
A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza di prova non impongano limiti in tal senso, il livello della 
dose più elevata va scelto con l'obiettivo di indurre tossicità ma non 
provocare il decesso o gravi sofferenze. Di norma gli studi con un tasso di mortalità imprevista inferiore a circa il 10 % degli animali parentali P sono comunque accettabili. Per dimostrare eventuali ef ­
fetti correlati al dosaggio e individuare il livello al quale non si 
osservano effetti avversi (NOAEL) occorre selezionare una sequenza decrescente di livelli di dose. In genere, per determinare i livelli decrescenti delle dosi risultano ottimali fattori compresi tra due e 
quattro e spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova 
piuttosto che utilizzare intervalli molto ampi (ad esempio un fattore superiore a 10) fra i dosaggi. Per gli studi con somministrazione nella dieta, l'intervallo fra le dosi non deve superare un fattore di 
3. I livelli delle dosi vanno selezionati tenendo conto di eventuali 
dati sulla tossicità già disponibili, e in particolar modo dei risultati di studi con dosi ripetute. Occorre inoltre tenere conto di eventuali informazioni già disponibili sul metabolismo e la cinetica della so ­
stanza di prova o di sostanze correlate. Questi dati contribuiranno 
altresì a dimostrare l'adeguatezza del regime di dosaggio.
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Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il 
veicolo nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza 
di saggio. Tranne per la somministrazione della sostanza di saggio, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in maniera identica ai soggetti del gruppo di trattamento. Se si utilizza un vei ­
colo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato 
in uso nel test. Se una sostanza di prova viene somministrata me ­
diante la dieta e causa una riduzione dell'apporto o dell'utilizzo degli alimenti, può diventare necessario l'impiego di un gruppo di con ­
trollo pair-fed. In alternativa è possibile usare i dati da studi con ­
trollati disegnati per valutare gli effetti della diminuzione del con ­
sumo di cibo sui parametri della riproduzione al posto di un gruppo di controllo pair-fed concomitante.
 
Occorre tenere conto delle seguenti caratteristiche del veicolo e di 
altri additivi: effetti sull'assorbimento, sulla distribuzione, sul meta ­
bolismo o sulla ritenzione della sostanza di prova; effetti sulle pro ­
prietà chimiche della sostanza di prova che potrebbero alterarne le 
caratteristiche tossiche; infine, effetti sul consumo di cibo o di acqua 
o sulle condizioni nutrizionali degli animali.  
1.4.4.  Test limite  
Se uno studio orale a un livello di dose di almeno 1 000 mg/kg per 
peso corporeo/die o, per somministrazione tramite l'alimentazione o 
l'acqua potabile, a una percentuale equivalente nella dieta o nell'ac ­
qua potabile secondo le procedure descritte per questo studio non produce effetti tossici osservabili, sia negli animali parentali sia nella prole e se, sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente e/o 
metabolicamente correlate, non ci si attende tossicità, allora può non 
essere considerato necessario uno studio completo con livelli di dosi differenti. Si applica il test limite, tranne quando l'esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dose orale più elevato. 
Per altri tipi di somministrazione, quali l'inalazione o l'applicazione 
cutanea, sono spesso le proprietà fisico-chimiche della sostanza di saggio, come la solubilità, a indicare e limitare il livello massimo di esposizione raggiungibile.
 
1.4.5.  Somministrazione delle dosi  
Occorre somministrare la sostanza di prova agli animali per 7 giorni 
alla settimana, di preferenza per via orale (dieta, acqua potabile o sonda gastrica). In caso di utilizzo di un'altra via di somministrazio ­
ne, occorre giustificare tale scelta ed eventualmente apportare modi ­
fiche adeguate al test. Tutti gli animali saranno trattati per la stessa 
via di somministrazione nel corso di un periodo sperimentale ade ­
guato. Se la sostanza di saggio viene somministrata mediante sonda, deve trattarsi di una sonda gastrica. Il volume di liquidi sommini ­
strati in una volta non deve superare 1 ml/l00 g di peso corporeo 
(0,4 ml/100 g di peso corporeo è il massimo per l'olio di semi di mais), tranne che nel caso di soluzioni acquose in cui è consentito usare 2 ml/100 g. Ad eccezione delle sostanze irritanti o corrosive, 
che generalmente manifestano effetti esacerbati a concentrazioni più 
elevate, occorre ridurre al minimo la variabilità del volume di prova, regolando la concentrazione, in modo da assicurare un volume co ­
stante a tutti i livelli di dose. Negli studi con sonda gastrica normal ­
mente i piccoli ricevono la sostanza solo indirettamente, attraverso il 
latte, finché non comincia il dosaggio diretto al momento dello svezzamento. Negli studi che prevedono la somministrazione nella dieta o nell'acqua potabile in genere i piccoli ricevono la sostanza di 
saggio anche direttamente quando cominciano ad alimentarsi da soli 
durante l'ultima settimana del periodo di allattamento.
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Per quanto concerne le sostanze somministrate tramite il cibo o 
l'acqua potabile, è importante fare in modo che le quantità di so ­
stanza di saggio impiegate non interferiscano con la normale alimen ­
tazione o il normale bilancio idrico. Se la sostanza di saggio viene somministrata con la dieta, è possibile usare una concentrazione 
alimentare costante (ppm) o un livello costante di dosi rispetto al 
peso corporeo degli animali; occorre specificare l'opzione utilizzata. Nel caso di sostanze somministrate mediante sonda gastrica, la dose va somministrata ogni giorno all'incirca negli stessi orari e regolata 
almeno settimanalmente per mantenere un livello costante delle dosi 
rispetto al peso corporeo degli animali. Nel regolare le dosi per la sonda gastrica in base al peso occorre tenere conto dei dati sulla distribuzione nella placenta.
 
1.4.6.  Programma sperimentale  
La somministrazione giornaliera delle dosi ai maschi e alle femmine 
della generazione parentale P deve iniziare a 5-9 settimane di età. La 
somministrazione giornaliera ai maschi e alle femmine F  1 deve ini­
ziare allo svezzamento; occorre ricordare che, in caso di sommini ­
strazione della sostanza di saggio tramite la dieta o l'acqua potabile, l'esposizione diretta dei piccoli F
 1 alla sostanza di saggio può avve ­
nire già durante il periodo dell'allattamento. Per entrambi i sessi di 
entrambe le generazioni (P e F1) la somministrazione proseguirà per almeno 10 settimane prima del periodo di accoppiamento e andrà continuata, in entrambi i sessi, durante le 2 settimane del periodo di 
accoppiamento. I maschi vanno sacrificati con metodi non cruenti ed 
esaminati quando non sono più necessari per la valutazione degli effetti sulla riproduzione. Per quanto riguarda le femmine parentali P, il dosaggio va continuato per tutta la gravidanza e fino allo 
svezzamento della prole F
 1 . Occorre eventualmente modificare il 
programma di somministrazione sulla base delle informazioni dispo ­
nibili circa la sostanza di saggio, compresi dati già esistenti di tos ­
sicità, induzione del metabolismo o bioaccumulo. Di norma la dose 
somministrata a ciascun animale deve essere basata sulla più recente 
determinazione individuale del peso corporeo. Occorre tuttavia usare cautela nel regolare la dose durante l'ultimo periodo della gravidanza.
 
Il trattamento di maschi e femmine delle generazioni P e F  1 va 
proseguito fino alla soppressione. Tutti i maschi e le femmine adulti P e F
 1 vanno sacrificati con metodi non cruenti quando non sono più 
necessari per la valutazione degli effetti sulla riproduzione. La prole 
F 1 non selezionata per l'accoppiamento e tutta la prole F  2 vanno 
sacrificate con metodi non cruenti dopo lo svezzamento.  
1.4.7.  Procedura di accoppiamento  
1.4.7.1.  Accoppiamento parentale (P)  
Per ogni accoppiamento, ciascuna femmina viene posta insieme a un 
unico maschio dello stesso livello di dose (accoppiamento 1:1) fin ­
ché non avviene la copulazione o finché non sono trascorse 2 setti ­
mane. Occorre esaminare ogni giorno le femmine alla ricerca di spermatozoi o tappi vaginali. Il giorno 0 della gravidanza è definito come il giorno in cui si rileva la presenza di un tappo vaginale o di 
spermatozoi. Nel caso l'accoppiamento non abbia successo, si può 
valutare la possibilità di far accoppiare le femmine con maschi di comprovata capacità riproduttiva dello stesso gruppo. Le coppie in cui è avvenuta la copulazione vanno identificate chiaramente in sede 
di registrazione dei dati. Occorre evitare l'accoppiamento fra consan ­
guinei.
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1.4.7.2.  Accoppiamento della generazione F  1 
Per l'accoppiamento della prole F  1 occorre selezionare, allo svezza ­
mento, almeno un maschio e una femmina da ciascuna nidiata per farli accoppiare con altri piccoli dello stesso livello di dose, ma di 
una nidiata diversa, allo scopo di produrre la generazione F
 2 . Se non 
si osservano differenze significative nel peso corporeo o nell'aspetto dei potenziali partner, la selezione dei piccoli da ciascuna nidiata va effettuata a random. Nel caso in cui si osservino differenze, vanno 
selezionati i migliori rappresentanti di ciascuna nidiata. Di prassi, il 
modo migliore per farlo è basarsi sul peso corporeo, sebbene l'aspetto possa risultare un parametro più adeguato. La prole F
 1 
non va fatta accoppiare prima del raggiungimento della piena matu ­
rità sessuale.  
Le coppie senza progenie vanno analizzate per determinare la causa 
apparente dell'infertilità. In tal caso può rendersi necessario ricorrere 
a determinate procedure, tra cui la ripetizione dell'accoppiamento con 
altri maschi o femmine di comprovata capacità riproduttiva, l'esame microscopico degli organi riproduttori e l'esame dei cicli estrali o della spermatogenesi.
 
1.4.7.3.  Secondo accoppiamento  
Qualora si riscontri una deviazione dalla norma nel numero di esem ­
plari di una nidiata correlabile al trattamento o qualora si osservino effetti inusitati nel corso del primo accoppiamento, si raccomanda di far accoppiare una seconda volta gli adulti delle generazioni P o F
 1 
per produrre una seconda nidiata. Per le femmine o i maschi che non 
hanno prodotto piccoli è consigliabile il riaccoppiamento con ripro ­
duttori comprovati del sesso opposto. Se si ritiene necessaria la produzione di una seconda nidiata da parte di una delle generazioni, 
gli animali vanno fatti riaccoppiare all'incirca una settimana dopo lo 
svezzamento della nidiata precedente.
 
1.4.7.4  Dimensioni della nidiata  
Occorre permettere agli animali di figliare normalmente e di allevare 
la prole fino allo svezzamento. La standardizzazione del numero di 
individui delle nidiate è facoltativa. Nel caso venga eseguita, occorre 
descrivere in modo particolareggiato il metodo utilizzato.  
1.5. OSSERVAZIONI  
1.5.1.  Osservazioni cliniche  
Occorre eseguire ogni giorno osservazioni cliniche generali e, nel 
caso di somministrazione mediante sonda gastrica, tale esame va 
programmato tenendo conto del previsto periodo di picco degli ef ­
fetti dopo la somministrazione. Sono da registrare i cambiamenti del comportamento, i segni di parto difficoltoso o prolungato e tutti i 
segni di tossicità. È necessario eseguire un ulteriore esame più detta ­
gliato su ciascun animale a intervalli almeno settimanali, ad esempio da svolgersi in occasione di una pesatura dell'animale. Due volte al giorno, o eventualmente una volta al giorno durante il fine settimana, 
occorre valutare tutti gli animali in relazione alla morbilità e alla 
mortalità.
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1.5.2.  Peso corporeo e consumo di cibo/acqua degli animali parentali  
Gli animali delle generazioni parentali (P e F  1 ) vanno pesati il primo 
giorno della somministrazione e, successivamente, a cadenza almeno settimanale. Le femmine parentali (P e F
 1 ) vanno pesate almeno nei 
giorni 0, 7, 14 e 20 o 21 di gestazione, nonché durante l'allattamento 
negli stessi giorni di pesatura dei cuccioli e nel giorno della soppressione degli animali. Queste osservazioni vanno riportate sin ­
golarmente per ciascun animale adulto. Durante il periodo precedente 
all'accoppiamento e quello di gestazione il consumo di cibo va regi ­
strato con cadenza almeno settimanale. Se la sostanza di saggio viene somministrata nell'acqua, il consumo di acqua va registrato 
con cadenza almeno settimanale.
 
1.5.3.  Ciclo estrale  
La lunghezza e la normalità del ciclo estrale vanno valutate nelle 
femmine P e F  1 mediante striscio vaginale prima dell'accoppiamento, 
nonché facoltativamente durante l'accoppiamento, finché l'accoppia ­
mento non risulti avvenuto. Durante il prelievo delle cellule vaginali/ ­
cervicali occorre prestare attenzione a non arrecare disturbo alla mu ­
cosa per evitare un'eventuale induzione di pseudogravidanza (1).  
1.5.4.  Parametri relativi agli spermatozoi  
Al momento della soppressione occorre registrare il peso di testicoli 
ed epididimi di tutti i maschi P e F  1 , riservando un esemplare di 
ciascun organo per l'esame istopatologico (vedi sezioni 1.5.7 e 
1.5.8.1). In una subserie di almeno dieci maschi di ciascun gruppo di maschi delle generazioni P e F
 1 , i testicoli e gli epididimi restanti 
sono da utilizzare rispettivamente per la conta degli spermatidi resi ­
stenti all'omogeneizzazione e delle riserve di spermatozoi nella coda dell'epididimo. Per la stessa subserie di maschi occorre raccogliere gli spermatozoi dalla coda dell'epididimo o dal vaso deferente allo 
scopo di valutarne la motilità e la morfologia. Se si osservano effetti 
correlati al trattamento o se da altri studi emergono prove di possibili effetti sulla spermatogenesi, la valutazione degli spermatozoi va ese ­
guita su tutti i maschi di ciascun gruppo; diversamente, è possibile 
limitare la conta ai maschi P e F
 1 di controllo e del gruppo di 
trattamento alla dose più elevata.  
È necessario contare il numero totale degli spermatidi testicolari 
resistenti all'omogeneizzazione e degli spermatozoi della coda del ­
l'epididimo (2)(3). Le riserve caudali di spermatozoi possono essere calcolate in base alla concentrazione e al volume degli spermatozoi 
nella sospensione usata per eseguire le valutazioni qualitative e in 
base al numero di spermatozoi rinvenuti mediante successiva tritu ­
razione e/o omogeneizzazione del restante tessuto caudale. La conta va eseguita sulla subserie selezionata di maschi di tutti i gruppi di 
dosaggio immediatamente dopo la soppressione degli animali, a 
meno che non si eseguano registrazioni video o digitali o salvo in caso di congelamento degli esemplari per esame successivo. In questi casi è possibile analizzare anzitutto i controlli e il gruppo alla dose 
più elevata. Se non si rilevano effetti correlati al trattamento (ad 
esempio effetti sulla conta, sulla motilità o sulla morfologia degli spermatozoi) non occorre procedere all'analisi degli altri gruppi. Se nel gruppo che ha ricevuto la dose più elevata si osservano effetti 
correlati al trattamento, è necessario analizzare anche i gruppi delle 
dosi inferiori.
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La motilità degli spermatozoi dell'epididimo (o del vaso deferente) 
va valutata o videoregistrata immediatamente dopo aver sacrificato 
gli animali. Occorre recuperare gli spermatozoi riducendo al minimo il danno e diluirli, per l'analisi della motilità, usando metodi accet ­
tabili (4). La percentuale di spermatozoi progressivamente mobili va 
determinata soggettivamente od oggettivamente. Se si esegue l'analisi 
computerizzata del movimento (5)(6)(7)(8)(9)(10) il calcolo della mobilità progressiva si basa su soglie definite dall'utente per la ve ­
locità media sul percorso e l'avanzamento in linea retta o indice 
lineare. Se si esegue una videoregistrazione dei campioni (11) o le 
immagini vengono registrate in altro modo al momento dell'autopsia, è sufficiente procedere solo all'analisi dei maschi P e F
 1 di controllo 
e della dose più elevata, a meno che non si osservino effetti correlati 
al trattamento; in tal caso vanno esaminati anche i gruppi delle dosi 
inferiori. In assenza di immagini video o digitali, vanno analizzati mediante autopsia tutti i campioni di tutti i gruppi di trattamento.
 
È necessario eseguire una valutazione morfologica di un campione di 
spermatozoi dell'epididimo (o del vaso deferente). Gli spermatozoi (ad esempio 200) vanno esaminati come preparazioni fisse e umide 
(12) e classificati come normali o anomali. Esempi di anomalie 
morfologiche degli spermatozoi sono fusione, teste isolate e malfor ­
mazioni di testa e/o coda. La valutazione va eseguita sulla subserie selezionata dei maschi di ciascun gruppo di dose subito dopo la 
soppressione degli animali o, in caso di registrazioni video o digitali, 
in un secondo momento. Gli strisci, una volta fissati, possono an ­
ch'essi essere letti in un momento successivo. In questi casi è pos ­
sibile analizzare anzitutto i controlli e il gruppo della dose più ele ­
vata. Se non si rilevano effetti correlati al trattamento (ad esempio 
effetti sulla morfologia degli spermatozoi) non occorre procedere all'analisi degli altri gruppi. Se nel gruppo della dose più elevata si osservano effetti correlati al trattamento, è necessario analizzare an ­
che i gruppi delle dosi inferiori.
 
Qualora uno o più parametri di valutazione degli spermatozoi di cui 
sopra siano già stati esaminati nell'ambito di uno studio sulla tossi ­
cità sistemica della durata di almeno 90 giorni, non occorre ripeterli nello studio su due generazioni. Si raccomanda, tuttavia, di conser ­
vare campioni o registrazioni digitali degli spermatozoi della gene ­
razione P per consentire un'eventuale valutazione successiva.
 
1.5.5.  Prole  
Ciascuna nidiata va esaminata non appena possibile dopo il parto 
(giorno di allattamento 0) per stabilire il numero e il sesso dei 
piccoli, distinguere gli individui nati morti da quelli nati vivi e 
individuare eventuali anomalie macroscopiche. I piccoli trovati morti il giorno 0 dovrebbero, se non sono in stato di decomposizione, essere esaminati alla ricerca di possibili difetti e della causa del 
decesso e preparati per la conservazione. I piccoli vivi dovrebbero 
essere contati e pesati individualmente alla nascita (giorno di allat ­
tamento 0) o il giorno 1, e successivamente ad intervalli regolari, ad esempio nei giorni 4, 7, 14 e 21 dell'allattamento. È importante 
registrare eventuali anomalie fisiche o comportamentali osservate 
nelle madri o nella prole.
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Lo sviluppo fisico della prole va registrato soprattutto in termini di 
aumento del peso corporeo. Altri parametri fisici (ad esempio l'aper ­
tura di orecchie e occhi, l'eruzione dei denti, la crescita del pelo) possono fornire informazioni supplementari, ma è preferibile valutare questo tipo di dati alla luce di quelli sulla maturazione sessuale (ad 
esempio età e peso corporeo all'apertura vaginale o alla separazione 
balano-prepuziale) (13). Si raccomanda di eseguire indagini sulla funzionalità in generale (ad esempio attività motoria, funzioni sen ­
soriali, ontogenesi dei riflessi) della prole F
 1 prima e/o dopo lo 
svezzamento, in particolare per le funzioni correlate alla maturazione 
sessuale, se tali indagini non sono comprese in studi separati. Degli animali F
 1 svezzati e selezionati per l'accoppiamento occorre deter ­
minare l'età al momento dell'apertura vaginale e della separazione 
prepuziale. La distanza anogenitale va misurata al giorno 0 dalla 
nascita nei piccoli F  2 , se ciò risulta indicato per la presenza di 
alterazioni nel rapporto tra i due sessi o nei tempi di maturazione sessuale della generazione F
 1 . 
Le osservazioni sulla funzionalità possono essere omesse nei gruppi 
che rivelano altri chiari segni di effetti negativi (ad esempio un 
rallentamento significativo dell'aumento ponderale, ecc.). Se effettua ­
te, le indagini sulla funzionalità non devono riguardare i piccoli selezionati per l'accoppiamento.
 
1.5.6.  Esame autoptico macroscopico  
Al momento della soppressione o dell'eventuale decesso di esemplari 
nel corso dello studio è necessario eseguire un esame autoptico macroscopico per determinare eventuali anomalie strutturali o altera ­
zioni patologiche su tutti gli animali parentali (P e F
 1 ), tutti i piccoli 
con anomalie visibili o segni clinici, oltre che su un piccolo di 
ciascun sesso di ogni nidiata selezionato a random, sia della gene ­
razione F  1 che della F  2 . Occorre prestare particolare attenzione agli 
organi dell'apparato riproduttore. I piccoli moribondi che vengono 
sacrificati con modalità non cruente e i piccoli deceduti, quando 
non in stato di decomposizione, vanno esaminati alla ricerca di pos ­
sibili difetti e/o della causa del decesso e successivamente conservati.  
Occorre esaminare l'utero di tutte le femmine primipare, evitando di 
compromettere l'esame istopatologico, per determinare la presenza e il numero dei siti di impianto.
 
1.5.7.  Peso degli organi  
Al momento della soppressione occorre determinare il peso corporeo 
e il peso dei seguenti organi di tutti gli animali delle generazioni parentali P e F
 1 (gli organi pari vanno pesati individualmente):  
— utero, ovaie,  
— testicoli, epididimi (totali e coda),  
— prostata,  
— vescicole seminali con ghiandole della coagulazione e i relativi 
liquidi oltre che la prostata (come un'unica unità),  
— cervello, fegato, reni, milza, ghiandole pituitaria, tiroide e surre ­
nali e organi bersaglio noti.  
Al momento della soppressione dei piccoli F  1 e F  2 selezionati per 
l'esame autoptico si procede alla determinazione del peso corporeo raggiunto alla fine dell'esperimento (vedi sezione 1.5.6). Di ciascun 
piccolo, di entrambi i sessi da ciascuna nidiata selezionato a random, 
alla pesatura dei seguenti organi: cervello, milza e timo.
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I risultati dell'autopsia macroscopica e della pesatura degli organi 
vanno valutati, quando possibile, in rapporto alle osservazioni fatte 
in altri studi con dose ripetuta.  
1.5.8.  Istopatologia  
1.5.8.1.  Animali parentali  
I seguenti organi e tessuti degli animali delle generazioni parentali 
(P e F  1 ), o loro campioni rappresentativi, devono essere fissati e 
conservati in un mezzo adeguato per l'esame istopatologico:  
— vagina, utero con cervice e ovaie (conservati in un fissativo 
appropriato),  
— un testicolo (conservato in soluzione di Bouin o in un fissativo 
analogo), un epididimo, vescicole seminali, prostata e ghiandola 
della coagulazione,  
— organi bersaglio precedentemente identificati di tutti gli animali P 
e F 1 selezionati per l'accoppiamento.  
L'esame istopatologico completo degli organi e dei tessuti conservati 
sopra elencati va eseguito su tutti gli animali P e F  1 della dose 
elevata e di controllo selezionati per l'accoppiamento. L'esame delle 
ovaie degli animali P è facoltativo. Gli organi che evidenziano alte ­
razioni correlate al trattamento vanno esaminati anche nei gruppi alla dose bassa ed intermedia, allo scopo di contribuire alla determina ­
zione del NOAEL. Inoltre, vanno sottoposti ad esame istopatologico 
gli organi della riproduzione degli animali dei gruppi di trattamento 
alla dose bassa ed intermedia nei quali si sospetta una riduzione della fertilità (ad esempio gli esemplari che non si sono accoppiati, che non hanno concepito, che non hanno generato o che non hanno 
partorito prole sana, o nei quali si sono osservati effetti sul ciclo 
estrale o sul numero, sulla motilità o sulla morfologia degli sperma ­
tozoi). Devono essere esaminate tutte le lesioni macroscopiche, quali atrofie e tumori.
 
L'esame istopatologico dettagliato dei testicoli (trattati ad esempio 
mediante fissativo di Bouin, inclusi in paraffina e preparati in sezioni trasversali di 4-5 μm di spessore) va effettuato allo scopo di identi ­
ficare eventuali effetti correlati al trattamento, quali ritenzione di 
spermatidi, mancanza di strati o tipi di cellule germinali, formazione di cellule giganti polinucleate o spostamento delle cellule spermato ­
geniche nel lume (14). L'esame degli epididimi intatti deve compren ­
dere testa, corpo e coda e può essere eseguito mediante valutazione 
di una sezione longitudinale. Occorre valutare la presenza di infil ­
trazioni leucocitarie, alterazioni della prevalenza dei tipi cellulari, tipi cellulari aberranti e fagocitosi degli spermatozoi nell'epididimo. Per 
l'esame degli organi della riproduzione maschili può essere impiegata 
la colorazione con PAS ed ematossilina.
 
Dopo l'allattamento l'ovaio deve contenere follicoli primordiali e in 
crescita, oltre ai grandi corpi lutei della lattazione. L'esame isto ­
patologico deve individuare un deterioramento qualitativo della popolazione di follicoli primordiali. Nelle femmine F
 1 occorre ef ­
fettuare un'analisi quantitativa dei follicoli primordiali; il numero di 
animali, la selezione delle sezioni ovariche e le dimensioni dei 
campioni devono essere statisticamente adeguati alla procedura di analisi applicata. L'esame deve comprendere la conta del numero dei follicoli primordiali che può essere combinata con i follicoli 
piccoli in crescita per il confronto delle ovaie tra soggetti trattati e 
i controlli (15)(16)(17)(18)(19).
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1.5.8.2.  Animali svezzati  
I tessuti e gli organi bersaglio che presentano evidenti irregolarità nei 
piccoli con anomalie esterne o segni clinici, oltre a quelli di un individuo di ciascun sesso di ogni nidiata scelto a random, sia della 
generazione F
 1 che della F  2 , che non sono stati selezionati per l'ac ­
coppiamento, devono essere fissati e conservati in mezzo adeguato per l'esame istopatologico. Occorre effettuare una caratterizzazione istopatologica completa del tessuto conservato con particolare atten ­
zione per gli organi dell'apparato riproduttore.
 
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
I dati vanno riportati individualmente e riassunti sotto forma di 
tabella, evidenziando per ciascun gruppo sperimentale e ciascuna 
generazione il numero di animali presenti all'inizio del test, il numero 
di animali trovati morti durante il test o soppressi per motivi uma ­
nitari, il momento di eventuali decessi o soppressioni con metodi non cruenti, il numero di animali fertili, il numero di femmine gravide, il 
numero di animali che mostrano segni di tossicità, una descrizione 
dei segni di tossicità osservati, ivi compresi il momento dell'insor ­
genza, la durata e la gravità degli effetti tossici, i tipi di osservazione sugli animali parentali e sulla prole, i tipi di alterazioni istopatologi ­
che, nonché tutti i dati di rilievo riguardanti le nidiate.
 
È necessario valutare i risultati numerici mediante un metodo stati ­
stico adeguato e generalmente accettato; i metodi statistici vanno selezionati come parte del disegno sperimentale e devono essere 
giustificati. Per l'analisi dei dati possono risultare utili i modelli 
statistici dose-risposta. La relazione deve comprendere sufficienti informazioni sul metodo di analisi e sul programma software utiliz ­
zati, di modo che un revisore o un esperto di statistica indipendente 
possa rivalutare e ricostruire l'analisi.
 
2.2. VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati del presente studio di tossicità riproduttiva a due genera ­
zioni vanno valutati in base agli effetti osservati, ai reperti delle autopsie e all'esame microscopico. La valutazione deve includere il 
rapporto, o la sua assenza, fra la dose della sostanza di saggio e la 
presenza o assenza, incidenza e gravità delle anomalie, comprese eventuali lesioni macroscopiche, gli organi bersaglio identificati, le conseguenze sulla fertilità, le anomalie cliniche, la capacità riprodut ­
tiva, gli effetti sulla generazione successiva, le alterazioni del peso 
corporeo, gli effetti sulla mortalità ed eventuali altri effetti tossici. Nella valutazione dei risultati del test occorre tenere conto delle proprietà fisico-chimiche della sostanza di saggio e, quando dispo ­
nibili, dei dati sulla sua tossicocinetica.
 
Un test di tossicità riproduttiva adeguatamente condotto deve fornire 
una stima soddisfacente del livello di dose al quale non si osservano effetti e consentire di capire gli effetti negativi sulla riproduzione, sul 
parto, sull'allattamento, sullo sviluppo postnatale, sulla crescita e 
sullo sviluppo sessuale.
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2.3. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Uno studio di tossicità riproduttiva a due generazioni deve fornire 
informazioni sugli effetti dovuti all'esposizione ripetuta ad una sostanza durante tutte le fasi del ciclo riproduttivo. In particolare, 
un simile studio fornisce informazioni sui parametri relativi alla 
riproduzione e sullo sviluppo, la crescita, la maturazione e la sopravvivenza della prole. I risultati dello studio vanno interpretati insieme ai dati ottenuti con studi subcronici, sullo sviluppo prena ­
tale, di tossicocinetica e altri studi disponibili. I risultati di questo 
studio possono essere impiegati per valutare la necessità di sotto ­
porre a ulteriori test una determinata sostanza chimica. L'estrapo ­
lazione all'uomo dei risultati dello studio è valida solo limitata ­
mente. Tali risultati si prestano piuttosto per trarre informazioni sui livelli di dose ai quali non si rilevano effetti e sui livelli di esposizione accettabile per l'uomo (20)(21)(22)(23).
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
sostanza di saggio:  
— natura fisica e, se pertinenti, proprietà fisico-chimiche,  
— dati identificativi,  
— purezza.  
Veicolo (se pertinente):  
— giustificazione per la scelta del veicolo, se diverso dall'acqua.  
Animali sperimentali:  
— specie/ceppo,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— origine, condizioni di alloggio, dieta, materiali per la lettiera, 
ecc., 
— peso individuale degli animali all'inizio del test.  
Condizioni del test:  
— motivazione per la selezione del livello delle dosi,  
— dettagli sulla formulazione/preparazione della sostanza di saggio 
somministrata nella dieta, concentrazioni ottenute,  
— stabilità e omogeneità della preparazione,  
— dettagli sulla somministrazione della sostanza di saggio,  
— conversione dalla concentrazione della sostanza di saggio in 
dieta/acqua potabile (ppm) alla dose ottenuta (mg/kg peso corporeo/die), se pertinente,
 
— dettagli circa la qualità di cibo e acqua.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 522
 
Risultati:  
— consumo di cibo e di acqua (se disponibile), efficienza di tra ­
sformazione alimentare (incremento ponderale per grammo di 
cibo assunto), consumo della sostanza di saggio per gli animali P e F
 1 , tranne che per il periodo di coabitazione e per almeno 
l'ultimo terzo dell'allattamento,  
— dati sull'assorbimento (se disponibili),  
— dati sul peso corporeo per gli animali P e F  1 selezionati per 
l'accoppiamento,  
— dati sul peso corporeo degli individui singoli e delle intere ni ­
diate,  
— peso corporeo al momento della soppressione degli animali e dati 
sul peso assoluto e relativo degli organi negli animali parentali,  
— natura, gravità e durata dei segni clinici (reversibili o meno),  
— momento del decesso durante lo studio o indicazione degli ani ­
mali sopravvissuti fino alla conclusione del test,  
— dati sulla risposta tossica per sesso e dose, ivi compresi gli indici 
di accoppiamento, fertilità, gestazione, nascita, vitalità e allatta ­
mento; la relazione deve indicare i numeri utilizzati per calcolare questi indici,
 
— effetti tossici o di altro tipo sulla riproduzione, sulla prole, sulla 
crescita postnatale, ecc.,  
— reperti delle autopsie,  
— descrizione dettagliata di tutti i reperti istopatologici,  
— numero di femmine P e F  1 con cicli normali e lunghezza dei 
cicli,  
— numero totale degli spermatozoi nella coda dell'epididimo, per ­
centuale di spermatozoi progressivamente mobili, percentuale di 
spermatozoi morfologicamente normali e percentuale di sperma ­
tozoi con ciascuna delle anomalie identificate,  
— tempo di maturazione per l'accoppiamento, compreso il numero 
di giorni fino all'accoppiamento,  
— durata della gestazione,  
— numero di impianti, corpi lutei, numero di esemplari per nidiata,  
— numero di nati vivi e di perdite post-impianto,  
— numero di piccoli con anomalie evidenti; numero di esemplari 
più piccoli del normale (se determinato),  
— dati sui punti di repere fisici nei piccoli e altri dati sullo sviluppo 
postnatale; i punti di repere fisici valutati vanno giustificati,  
— dati sulla funzionalità in piccoli e adulti, per quanto pertinenti,  
— trattamento statistico dei risultati, se pertinente.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 523
 
Discussione dei risultati.  
Conclusioni, compresi i valori NOAEL per gli effetti sulle madri e 
sulla prole.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduc ­
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B.36.  TOSSICOCINETICA  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 417 (2010). Gli studi incentrati sulla tos ­
sicocinetica di una sostanza chimica si prefiggono di ottenere informazioni 
adeguate sull’assorbimento, la distribuzione, la biotrasformazione (ovvero il 
metabolismo) e l’escrezione della sostanza, di facilitare la comprensione della relazione tra la concentrazione, o la dose, e la tossicità osservata e di contribuire a comprendere il meccanismo attraverso il quale la sostanza 
chimica in esame esercita la propria tossicità. La tossicocinetica può aiutare 
a comprendere gli studi tossicologici dimostrando che l’esposizione degli animali da laboratorio alla sostanza in esame è di natura sistemica e rive ­
lando quali siano i gruppi funzionali circolanti (composto progenitore/meta ­
boliti). I principali parametri tossicocinetici ricavati dagli studi forniscono 
anche informazioni sul potenziale di accumulo della sostanza in esame nei tessuti e/o negli organi, come pure sul rischio di induzione di biotrasforma ­
zioni derivanti dall’esposizione alla sostanza.
 
2. I dati tossicocinetici possono essere utili per valutare se i dati di tossicità 
negli animali sono pertinenti ed adeguati ad essere estrapolati per valutare i pericoli e/o i rischi per gli esseri umani. Inoltre, gli studi tossicocinetici possono fornire informazioni utili a determinare i livelli di dose per gli studi 
di tossicità (cinetica lineare o non-lineare), gli effetti derivanti dalla via di 
somministrazione, la biodisponibilità e i problemi connessi all’impostazione dello studio. Alcuni tipi di dati tossicocinetici possono servire a elaborare dei modelli tossicocinetici su base fisiologica.
 
3. I dati tossicocinetici e metabolici sono importanti sotto diversi aspetti. Pos ­
sono ad esempio fornire indicazioni su eventuali tossicità e modalità d’azione e su come queste interagiscono con i livelli di dose e la via di 
esposizione. Inoltre, i dati sul metabolismo possono fornire informazioni 
utili per valutare l’importanza, sul piano tossicologico, dell’esposizione a metaboliti esogeni della sostanza in esame.
 
4. La presenza di dati tossicocinetici adeguati aiuterà a confermare l’accettabi ­
lità e l’applicabilità dei metodi fondati sulle relazioni quantitative 
struttura-attività e le interpolazioni fondate sul metodo read-across o sul metodo del raggruppamento per valutare la sicurezza delle sostanze chimi ­
che. I dati cinetici possono anche servire a valutare la rilevanza tossicologica 
di altri studi (ad esempio quelli in vivo/in vitro).
 
5. Salvo menzione contraria (cfr. in particolare i paragrafi da 74 a 78), il 
presente metodo di prova presuppone la somministrazione della sostanza in esame per via orale.
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
6. Gli endpoint e i parametri tossicocinetici da misurare per le diverse classi di 
sostanze chimiche (ad esempio pesticidi, biocidi, sostanze chimiche indu ­
striali) sono diversi a seconda delle necessità e degli obblighi imposti dai diversi regimi normativi. Contrariamente alla maggior parte degli altri me ­
todi di prova, il presente metodo descrive delle prove tossicocinetiche che 
comprendono misurazioni ed endpoint multipli. In futuro potranno essere 
sviluppati nuovi metodi di prova, e/o documenti di orientamento, per de ­
scrivere ciascun endpoint separatamente e più in dettaglio. Per quanto ri ­
guarda il presente metodo, la definizione di quali prove o quali valutazioni 
condurre è subordinata alle esigenze e/o ai bisogni dei singoli regimi nor ­
mativi.
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7. Si possono allestire molti tipi di studi per valutare il comportamento tossi ­
cocinetico della sostanza in esame in riposta alle disposizioni normative. 
Tuttavia, a seconda delle particolari situazioni o esigenze normative, per valutare la sostanza in questione non sempre è necessario ricorrere a tutti i diversi studi a disposizione. L’impostazione di uno studio tossicocinetico 
deve essere sufficientemente flessibile, in modo da poter prendere in consi ­
derazione le caratteristiche della sostanza analizzata. In alcuni casi, sarà sufficiente esplorare solo una particolare serie di aspetti per prevenire i pericoli e i rischi associati alla sostanza. In alcune situazioni, è possibile 
estrarre dati tossicocinetici dalle valutazioni svolte per altri studi tossicolo ­
gici, in altre, possono essere necessari studi tossicocinetici più approfonditi, a seconda dei regimi normativi e/o nel caso sia necessario rispondere a nuove questioni sorte nel corso della valutazione della sostanza.
 
8. Per migliorare la qualità delle analisi ed evitare un inutile ricorso ad animali, 
prima di svolgere le prove il laboratorio deve prendere in considerazione tutte le informazioni disponibili sulla sostanza e sui rilevanti metaboliti e analoghi. Le informazioni possono comprendere dati provenienti da altri 
metodi di prova pertinenti (studi in vivo, in vitro e/o valutazioni in silico). 
Per programmare lo studio e interpretare i risultati potrebbero risultare utili le proprietà fisico-chimiche, ad esempio: il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua (espresso in valore log P
 OW ), la costante di dissociazione 
(pKa), l’idrosolubilità, la pressione di vapore e il peso molecolare di una 
sostanza. Li si può determinare utilizzando metodi idonei, descritti nei me ­
todi di prova pertinenti.  
LIMITI  
9. Il presente metodo di prova non è stato concepito per casi particolari, quali 
femmine gravide o che allattano e relativa prole, né per valutare gli even ­
tuali residui in animali da produzione alimentare esposti alla sostanza. Tut ­
tavia, i dati ottenuti da uno studio allestito secondo il presente metodo possono fornire informazioni generali utili a impostare studi specifici per questo tipo di indagini. Il presente metodo di prova non è destinato a essere 
utilizzato per test sui nanomateriali. Una relazione sull’analisi preliminare 
delle linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche in merito alla loro applicabilità ai nanomateriali suggerisce che non sia possibile applicare a tali materiali la linea guida dell’OCSE n. 417 (equivalente al 
presente metodo B.36) (1).
 
DEFINIZIONI  
10. Le definizioni utilizzate ai fini del presente metodo di prova sono fornite in 
appendice.  
CONSIDERAZIONI SUL BENESSERE DEGLI ANIMALI  
11. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 19 contiene delle indicazioni sul 
trattamento umano degli animali (2). Se ne raccomanda la consultazione per tutti gli studi in vivo e in vitro descritti nel presente metodo.
 
DESCRIZIONE DEI METODI  
Studi pilota  
12. Si raccomanda e incoraggia il ricorso a studi pilota per la scelta dei para ­
metri sperimentali per gli studi tossicocinetici (es.: metabolismo, bilancio di massa, procedure analitiche, definizione delle dosi, esalazioni di CO
 2 ecc.). 
Potrebbe non essere necessario ricorrere all’uso di sostanze chimiche radio ­
marcate per caratterizzare alcuni dei parametri elencati sopra.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 527
 
Scelta degli animali  
Specie  
13. Le specie (e i ceppi) animali utilizzati per le prove tossicocinetiche devono 
di preferenza essere identiche a quelle utilizzate in altri studi tossicologici svolti con la sostanza in esame. Normalmente viene utilizzato il ratto, in quanto specie ampiamente usata negli studi tossicologici. Il ricorso o l’ag ­
giunta di altre specie possono essere giustificati se uno studio tossicologico 
importante ha dimostrato la presenza di tossicità rilevante nelle specie in questione o se è dimostrato che la loro tossicità/tossicocinetica è più perti ­
nente per l’uomo. In caso di utilizzo di un’altra specie e ceppo è necessario 
motivare la scelta.
 
14. Salvo indicazioni contrarie, la specie scelta per il presente metodo di prova è 
il ratto. Se si fa ricorso ad altre specie, alcuni aspetti del metodo potrebbero 
necessitare di modifiche.  
Età e ceppo  
15. Gli animali utilizzati devono essere adulti giovani (normalmente, 6-12 set ­
timane al momento della somministrazione) e sani (cfr. anche paragrafi 13 e 
14). In caso non si utilizzino giovani adulti, è necessario motivare la scelta. All’inizio della prova gli animali devono essere nella stessa fascia di età. La variazione ponderale degli animali utilizzati deve essere minima e non su ­
perare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio. 
Idealmente, il ceppo usato sarà lo stesso di quello utilizzato per stabilire la banca dati tossicologica della sostanza in esame.
 
Numero e sesso degli animali  
16. Ciascuna dose sperimentale va somministrata a un minimo di quattro ani ­
mali dello stesso sesso. È necessario giustificare la scelta del sesso dell’ani ­
male. Occorre prendere in considerazione l’opportunità di ricorrere ad ani ­
mali di entrambi i sessi (quattro maschi e quattro femmine) in presenza di 
dati che suffragano differenze tossicologiche significative legate al sesso.  
Condizioni di stabulazione e alimentazione  
17. Nel corso della prova gli animali vanno stabulati individualmente. La sta ­
bulazione in gruppo può essere giustificata in determinate circostanze. L’il ­
luminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 
d’oscurità. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C) con un’umidità relativa del 30-70 %. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimi ­
tata d’acqua potabile.
 
Sostanza chimica in esame  
18. Occorre usare una sostanza radiomarcata al  14 C per tutti gli aspetti dello 
studio che riguardano il bilancio di massa e l’identificazione dei metaboliti; 
tuttavia, nel caso sia dimostrato che:  
— è possibile valutare adeguatamente il bilancio di massa e l’identifica ­
zione dei metaboliti utilizzando una sostanza chimica non marcata,  
— la specificità analitica e la sensibilità del metodo che fa ricorso a una 
sostanza non radioattiva sono uguali o maggiori di quelle che si sareb ­
bero ottenute con una sostanza radiomarcata,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 528
 
non è necessario utilizzare una sostanza radiomarcata. Inoltre, si può ricor ­
rere ad altri isotopi radioattivi e stabili, in particolare se tali elementi sono 
responsabili della porzione tossica della sostanza in esame o ne fanno parte. Se possibile, il marcatore radioattivo deve collocarsi in quella porzione centrale della molecola che è metabolicamente stabile (vale a dire, non è 
scambiabile, non è rimossa metabolicamente come CO
 2 e non è incorporata 
nell’insieme dei radicali monocarbonici dell’organismo). Per seguire il de ­
stino metabolico della sostanza in esame potrebbe essere necessario marcare vari punti o determinate regioni della sua molecola.
 
19. Le sostanze radiomarcate e non radiomarcate sono analizzate utilizzando 
metodi idonei a stabilirne purezza e identità. La radiopurezza della sostanza 
radioattiva in esame deve essere la massima raggiungibile per tale sostanza (idealmente, superiore al 95 %) ed è necessario fare un ragionevole sforzo per identificare eventuali impurità presenti in percentuale pari o superiore al 
2 %. Nella relazione sulla prova vengono riportate la purezza, l’identità e 
l’eventuale percentuale di presenza di impurità. Alcuni regimi normativi possono fornire sia ulteriori orientamenti per la definizione e la caratteriz ­
zazione delle sostanze chimiche composte da miscele sia metodi per deter ­
minarne la purezza.
 
Scelta delle dosi  
Studio pilota  
20. Una dose unica somministrata per via orale è generalmente sufficiente per lo 
studio pilota. Va utilizzata una dose non tossica ma sufficientemente elevata 
da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se 
del caso) e da soddisfare lo scopo dichiarato dello studio pilota, come stabilito al paragrafo 12 del presente metodo.
 
Studio principale  
21. Per gli studi principali, è preferibile ricorrere a un minimo di due dosi dato 
che le informazioni raccolte da almeno due gruppi-dose possono essere d’aiuto a stabilire le dosi da somministrare in altri studi di tossicità e per 
la valutazione dose-risposta nelle prove di tossicità già disponibili.
 
22. Se vengono somministrate due dosi, devono entrambe essere in dosaggio 
sufficientemente alto da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se del caso). Le informazioni provenienti dai dati sulla 
tossicità già disponibili vanno prese in considerazione al momento di sce ­
gliere la dose. Se non si dispone di informazioni (provenienti, ad esempio, da studi di tossicità acuta orale che indichino i segni clinici di tossicità, oppure da studi sulla tossicità da dosi ripetute), per la dose più elevata è 
possibile prendere in considerazione un valore inferiore alla stima della 
DL
 50 (per via orale e per via cutanea) o della CL  50 (per inalazione) o 
inferiore al valore più basso nella gamma di valori sperimentali stimati di tossicità acuta. La dose più bassa corrisponderà a una frazione della dose più 
elevata.
 
23. Se viene utilizzato un solo livello di dose, sarà idealmente una dose suffi ­
cientemente elevata da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se del caso) anche senza produrre tossicità apparente. Occorre giustificare la decisione di non includere un secondo livello di dose.
 
24. Se è necessario stabilire gli effetti della dose sui processi cinetici, due dosi 
potrebbero non essere sufficienti e almeno una dose dovrebbe essere suffi ­
cientemente elevata da saturare tali processi. Se l’area sotto la curva «con ­
centrazione plasmatica/tempo» (AUC) non è lineare nell’intervallo tra la somministrazione di due livelli di dose nello studio principale, si può chia ­
ramente dedurre che la saturazione di uno (o più) dei processi cinetici 
avviene in un punto compreso tra questi due livelli di dose.
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25. Nel caso di sostanze di prova con bassa tossicità, va utilizzata una dose 
massima di 1 000 mg/kg di peso corporeo (per via orale e per via cutanea; 
se la somministrazione avviene per inalazione, cfr. capitolo B.2 del presente allegato; in quest’ultimo caso, generalmente, la dose non supera i 2 mg/l). Considerazioni specifiche relative a una determinata sostanza possono ren ­
dere necessaria una dose superiore, in funzione dei regimi normativi. Oc ­
corre sempre giustificare la scelta di una particolare dose.
 
26. I dati relativi alla tossicocinetica e alla distribuzione tissutale ottenuti a 
partire da una dose singola possono essere sufficienti per determinare il potenziale di accumulo e/o di persistenza. In alcune circostanze può essere 
tuttavia necessario somministrare dosi ripetute: i) per valutare più accurata ­
mente il potenziale di accumulo e/o di persistenza o l’evoluzione dei para ­
metri tossicocinetici (per esempio induzione e inibizione enzimatica); oppu ­
re, ii) per rispondere alle esigenze della normativa applicabile. Negli studi a 
dosi ripetute è generalmente sufficiente la somministrazione ripetuta di dosi 
basse, ma, in determinate circostanze, può essere necessario somministrare a più riprese dosi elevate (cfr. anche paragrafo 57).
 
Somministrazione della sostanza chimica in esame  
27. È necessario sciogliere la sostanza in esame o prepararne una sospensione 
omogenea nello stesso veicolo utilizzato per gli altri studi di tossicità orale realizzati sulla sostanza con somministrazione mediante sonda, se il veicolo 
è conosciuto. La scelta del veicolo deve essere motivata. Quando si imposta 
lo studio è necessario prendere in considerazione la scelta del veicolo e il volume delle dosi. Il metodo consueto di somministrazione è tramite sonda gastrica; ciononostante, in casi specifici può essere più opportuno ricorrere a 
capsule di gelatina o a una somministrazione con la dieta (in entrambi i casi 
è necessario giustificare la scelta). È altrettanto necessario avvalersi di mezzi di verifica delle dosi effettivamente somministrate a ogni animale.
 
28. Il volume massimo dei liquidi da somministrare tramite sonda gastrica in 
una sola volta dipende dalla taglia degli animali, dal tipo di veicolo scelto 
per la dose e dalla soppressione o meno dell’alimentazione prima della somministrazione della sostanza in esame. Occorre giustificare la scelta di sospendere o continuare l’alimentazione prima della somministrazione della 
dose. Solitamente, va utilizzato il minor volume possibile sia per veicoli 
acquosi sia per veicoli non acquosi. Di norma, per i roditori il livello di dose non deve superare i 10 ml/kg di peso corporeo. Nel caso di sostanze più lipofile, il volume del veicolo utilizzato può essere di 4 ml/kg di peso 
corporeo o superiore. Nel caso di somministrazione ripetuta, quando il 
digiuno quotidiano è controindicato, occorre considerare l’uso di livelli di dose più bassi (per esempio, da 2 a 4 ml/kg di peso corporeo). Se possibile, prendere in considerazione la possibilità di utilizzare livelli di dose coerenti 
con quello somministrato in altri studi su sostanze chimiche in esame som ­
ministrate per via orale tramite sonda gastrica.
 
29. La somministrazione della sostanza in esame per via endovenosa e la mi ­
surazione del tenore della sostanza nel sangue e/o negli escreti può servire a determinare la biodisponibilità o l’assorbimento orale relativo. Per lo studio 
per via endovenosa, viene somministrata una dose singola della sostanza in 
esame (generalmente equivalente, ma non superiore, alla dose orale più bassa — cfr. «Scelta delle dosi») utilizzando un veicolo idoneo. La dose va somministrata in un volume adeguato (es. 1 ml/kg di peso corporeo) e 
nel sito prescelto ad almeno quattro animali di sesso adatto (si possono 
utilizzare animali di entrambi i sessi, giustificando la scelta, cfr. paragrafo 16). Per la somministrazione della sostanza in esame per via endovenosa, è necessario sciogliere completamente o preparare una solu ­
zione in sospensione della dose. Fare in modo che il veicolo per la sommini ­
strazione per via endovenosa non interferisca col flusso sanguigno o con
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l’integrità delle cellule sanguigne. Se la sostanza viene infusa tramite un’ap ­
posita pompa, la velocità di somministrazione deve essere registrata e va 
standardizzata per tutti gli animali. È necessario ricorrere ad anestesia se si procede all’incanulamento della vena giugulare (per somministrare la so ­
stanza in esame e/o per prelievo di sangue) o se per la somministrazione 
si fa ricorso all’arteria femorale. Considerare con attenzione il tipo di ane ­
stesia, in quanto può incidere sulla tossicocinetica. Gli animali devono potersi riprendere adeguatamente prima della somministrazione della so ­
stanza chimica in esame incorporata nel veicolo.
 
30. Per determinate sostanze chimiche è possibile ricorrere ad altre vie di som ­
ministrazione (come le vie cutanee e l’inalazione, per esempio, cfr. paragrafi da 74 a 78), in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche e l’utilizzo o la via di esposizione umana previsti.
 
Misurazioni  
Bilancio di massa  
31. Il bilancio di massa viene determinato in base alla somma della percentuale 
di dose (radioattiva) somministrata escreta nelle urine, nelle feci e nell’aria espirata, e della percentuale presente nei tessuti, nel resto della carcassa e 
nell’acqua di risciacquo delle gabbie (cfr. paragrafo 46). In generale, sono 
considerati adeguati i recuperi totali della sostanza chimica (radioattività) somministrata superiori al 90 %.
 
Assorbimento  
32. È possibile calcolare una stima iniziale dell’assorbimento escludendo dal 
bilancio di massa la percentuale della dose nel tratto gastrointestinale e/o 
nelle feci. Per il calcolo della percentuale di assorbimento, cfr. paragrafo 33. 
Per l’analisi degli escreti, cfr. paragrafi da 44 a 49. Se non è possibile stabilire con esattezza, per mezzo di un bilancio di massa, l’assorbimento conseguente a una somministrazione per via orale (per esempio se più del 
20 % della dose somministrata è presente nelle feci), può essere necessario 
procedere a studi più approfonditi che possono includere: 1) la sommini ­
strazione per via orale della sostanza in esame e la misurazione della so ­
stanza nella bile; oppure 2) la somministrazione per via orale e per endovena 
della sostanza in esame e la misurazione della quantità netta di sostanza 
presente nelle urine, più quella nell’aria espirata e più quella nella carcassa, per ciascuna delle due vie citate. In entrambi gli studi, la misurazione della radioattività è utilizzata come metodo sostitutivo all’analisi specifica della 
sostanza chimica in esame e dei suoi metaboliti.
 
33. Per lo studio dell’escrezione biliare, la sostanza in esame viene sommini ­
strata generalmente per via orale. In questo tipo di studio, è necessario incanulare le vie biliari di almeno quattro animali di sesso adatto (o di 
entrambi i sessi, giustificando la scelta) e somministrare una dose singola 
della sostanza in esame. Dopo la somministrazione della sostanza, occorre monitorare l’escrezione di radioattività/sostanza in esame nella bile per il tempo necessario a stimare la percentuale della dose somministrata che 
viene escreta per questa via, in modo da calcolare direttamente a partire 
da questo dato la percentuale dell’assorbimento per via orale, nel modo seguente:
 
Percentuale di assorbimento  ¼ ðquantità presentenella bile  þ nell’urina 
þ nell’aria espirata þ nella carcassa ; esclusa la 
quantità presente nel tratto gastrointestinale Þ= 
quantità somministrata  Ü 100 
34. Per alcune classi di sostanze la dose assorbita può essere secreta diretta ­
mente attraverso le membrane intestinali. In questi casi, la misurazione della 
percentuale della dose presente nelle feci dopo la somministrazione orale in 
ratti con dotto biliare incanulato non è considerata rappresentativa della dose non assorbita. Nei casi in cui si presume avvenga una secrezione intestinale, si raccomanda di basare il calcolo della percentuale della dose assorbita a 
partire dall’assorbimento calcolato, confrontando l’escrezione a seguito di 
somministrazione per via orale e l’escrezione tramite somministrazione per via endovenosa (in ratti intatti o con dotto biliare incanulato) (cfr. paragrafo 35). Inoltre, quando la quantificazione della secrezione intestinale 
è considerata necessaria, si consiglia di misurare l’escrezione presso ratti con 
dotto biliare incanulato dopo aver somministrato la dose per via endovenosa.
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Biodisponibilità  
35. La biodisponibilità può essere determinata a partire dalla cinetica plasmatica/ 
sanguigna dei gruppi esposti per via orale e per via endovenosa, come descritto ai paragrafi 50-52, attraverso analisi chimiche specifiche della 
sostanza in esame e/o del o dei metaboliti corrispondenti, evitando, pertanto, 
di ricorrere alla radiomarcatura della sostanza in causa. Per calcolare la biodisponibilità (F) della sostanza chimica in esame oppure del metabolita o dei metaboliti corrispondenti, ricorrere a questa formula:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
dove «AUC» è l’area sotto la curva «concentrazione plasmatica/tempo», 
mentre «exp» è la via di somministrazione sperimentale (orale, cutanea, 
inalatoria).  
36. Nella valutazione del rischio legato ad effetti sistemici, è generalmente 
preferibile ricorrere alla biodisponibilità del componente tossico, invece 
che alla percentuale di assorbimento, per confrontare le concentrazioni si ­
stemiche ricavate da studi sugli animali con dati analoghi di biomonitorag ­
gio provenienti da studi sull’esposizione professionale. La situazione può 
diventare più complessa se le dosi si situano nell’intervallo di risposta non 
lineare; è quindi importante che un precedente studio tossicocinetico con ­
senta di scegliere una gamma di dosi con risposta nell’intervallo lineare.  
Distribuzione tissutale  
37. È importante conoscere la distribuzione tissutale della sostanza in esame e/o 
dei suoi metaboliti per poter identificare i tessuti bersaglio, comprendere i meccanismi soggiacenti alla tossicità e per poter ottenere informazioni sul potenziale di accumulo e di persistenza della sostanza e dei metaboliti. La 
percentuale della dose (radioattiva) totale nei tessuti e nel resto della car ­
cassa va misurata per lo meno al termine dello studio di escrezione (vale a dire, di solito, fino a 7 giorni dopo la somministrazione della dose, oppure prima in funzione del comportamento specifico della sostanza in esame). Se 
alla fine dello studio non si rileva la presenza della sostanza nei tessuti (ad 
esempio nel caso in cui la sostanza sia stata eliminata prima della fine dello studio a causa di un’emivita breve) occorre prestare particolare attenzione per evitare una scorretta interpretazione dei dati. In situazioni simili, la 
distribuzione tissutale deve essere analizzata quando si raggiunge la concen ­
trazione massima nel plasma/nel sangue (T
 max ) oppure il picco dell’escre ­
zione urinaria della sostanza chimica in esame (e/o dei metaboliti), a se ­
conda del caso (cfr. paragrafo 38). Inoltre, può essere necessario raccogliere 
tessuti anche in altri momenti in modo da poter determinare la distribuzione 
della sostanza in esame e/o dei metaboliti nei tessuti, valutare la dipendenza temporale (se del caso), aiutare a stabilire il bilancio di massa e/o se ciò è richiesto da un’autorità competente. I tessuti da prelevare comprendono 
fegato, grasso, tratto gastrointestinale, reni, milza, sangue intero, residuo 
della carcassa, tessuti dell’organo bersaglio ed altri eventuali tessuti (es. tiroide, eritrociti, organi riproduttivi, pelle e — in particolare negli animali pigmentati — occhi) potenzialmente importanti per la valutazione tossico ­
logica della sostanza in esame. Occorre analizzare la più ampia gamma 
possibile di tessuti negli stessi momenti, per sfruttare al massimo l’uso degli animali e nell’eventualità che, negli studi di tossicità cronica e subcronica, si osservino effetti tossici nell’organo bersaglio. Vanno inoltre registrate la 
concentrazione del residuo (radioattivo) e le relazioni percentuali tra concen ­
trazione nei tessuti e nel plasma (nel sangue).
 
38. È inoltre possibile che la valutazione della distribuzione tissutale in ulteriori 
momenti — ad esempio nel momento della concentrazione di picco nel plasma/nel sangue (es. T
 max ) o al massimo dell’escrezione urinaria — otte ­
nuta, rispettivamente, a partire da studi di cinetica plasmatica/sanguigna o da 
studi sull’escrezione, possa essere necessaria a un’autorità competente o 
venga richiesta da quest’ultima. Si tratta di un’informazione che può aiutare a comprendere la tossicità e il potenziale di accumulo e di persistenza della sostanza in esame e dei metaboliti. Occorre giustificare la scelta dei cam ­
pioni; i campioni da sottoporre ad analisi devono solitamente essere uguali a 
quelli indicati sopra (cfr. paragrafo 37).
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39. Negli studi sulla distribuzione tissutale è possibile quantificare la radioatti ­
vità ricorrendo a dissezione, omogeneizzazione, combustione e/o solubiliz ­
zazione degli organi, seguite da conteggio in scintillazione liquida dei resi ­
dui intrappolati. Altre tecniche (es. autoradiografia quantitativa a corpo in ­
tero e microautoradiografia dei recettori), attualmente a diversi livelli di 
sviluppo, potrebbero dimostrarsi utili per determinare la distribuzione di 
una sostanza chimica negli organi e/o nei tessuti (3) (4).  
40. Per le vie d’esposizione che non siano quella orale, occorre prelevare e 
analizzare tessuti specifici, ad esempio i polmoni negli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria e la pelle in quelli con somministra ­
zione per via cutanea. Cfr. paragrafi da 74 a 78.
 
Metabolismo  
41. È necessario raccogliere escreti (e plasma, se del caso) per procedere 
all’identificazione e alla quantificazione di una sostanza chimica e dei suoi metaboliti, non modificati, come descritto ai paragrafi da 44 a 49. È 
accettabile raggruppare gli escreti per facilitare l’identificazione dei metabo ­
liti in seno a un determinato gruppo-dose. Si raccomanda di stabilire il profilo dei metaboliti per ogni fase dello studio. Tuttavia, se l’assenza di campioni o di radioattività impedisce di farlo, è accettabile raggruppare 
l’urina e le feci raccolte in diversi momenti, ma provenienti solo da animali 
dello stesso sesso che abbiano ricevuto la stessa dose. Utilizzare metodi qualitativi e quantitativi appropriati per le analisi delle urine, delle feci e della radioattività espirata nonché, se del caso, della bile degli animali 
esposti.
 
42. Occorre fare un ragionevole sforzo per identificare tutti i metaboliti presenti 
in una percentuale uguale o superiore al 5 % della dose somministrata e 
tracciare uno schema metabolico per la sostanza in esame. Se la quantità della sostanza chimica in esame presente negli escreti è pari o superiore al 5 % della dose somministrata, la sostanza chimica va identificata. Con 
«identificata» si intende che venga determinata la struttura esatta dei suoi 
componenti. Normalmente, l’identificazione avviene effettuando simultanea ­
mente una co-cromatografia del metabolita e dei modelli conosciuti, usando due sistemi diversi, oppure utilizzando tecniche in grado di determinare con 
sicurezza la struttura come la spettrometria di massa, la risonanza magnetica 
nucleare ecc. Nel caso della co-cromatografia, i metodi cromatografici che utilizzano la stessa fase stazionaria con due sistemi di solventi diversi non sono considerati adeguati per verificare l’identità dei metaboliti in quanto i 
due sistemi non sono indipendenti. L’identificazione tramite 
co-cromatografia va ottenuta utilizzando due sistemi diversi e indipendenti sul piano analitico, come ad esempio la cromatografia su strato sottile (TLC) in fase normale o inversa, oppure la cromatografia in fase liquida ad elevate 
prestazioni (HPLC). Se la qualità della separazione cromatografica è ade ­
guata, non è necessario ottenere un’ulteriore conferma tramite mezzi spet ­
troscopici. Per un’identificazione inequivocabile è possibile ricorrere anche a metodi che forniscono informazioni strutturali: cromatografia in fase liquida/ 
spettrometria di massa (LC-MS), oppure cromatografia in fase liquida/spet ­
trometria di massa tandem (LC-MS/MS), gascromatografia/spettrometria di massa (GC-MS) e spettrometria di risonanza magnetica nucleare.
 
43. Se non è possibile procedere all’identificazione dei metaboliti che rappre ­
sentano, individualmente, il 5 % od oltre della dose somministrata è neces ­
sario fornire una giustificazione/spiegazione di questo fatto nella relazione 
finale. Potrebbe essere utile identificare i metaboliti che rappresentano meno 
del 5 % della dose somministrata per migliorare la comprensione della via metabolica per la valutazione dei rischi e/o dei pericoli della sostanza in esame. Ogniqualvolta possibile, è necessario fornire la conferma della strut ­
tura dei metaboliti, che potrebbe rendere necessario stabilire il profilo me ­
tabolico nel plasma, nel sangue o in altri tessuti.
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Escrezione  
44. Il tasso e il grado di escrezione della sostanza somministrata devono essere 
determinati attraverso la misurazione della percentuale di dose (radioattiva) recuperata dalle urine, dalle feci e dall’aria espirata. Si tratta di dati utili 
anche per stabilire il bilancio di massa. Le quantità della sostanza (radio ­
attività) in esame eliminate nelle urine, nelle feci e nell’aria espirata devono essere determinate ad intervalli appropriati (cfr. paragrafi da 47 a 49). Gli esperimenti a dosi ripetute devono essere appositamente impostati, in modo 
da consentire la raccolta di dati sugli escreti sufficienti a raggiungere gli 
obiettivi stabiliti al paragrafo 26. Ciò consentirà di poterli confrontare con quelli degli esperimenti con dose unica.
 
45. Se lo studio pilota dimostra che la quantità di sostanza in esame (radio ­
attività) escreta nell’aria espirata non è significativa (secondo il paragrafo 49), per lo studio definitivo non sarà necessario raccogliere l’aria espirata.
 
46. Ciascun animale viene collocato in un’unità metabolica separata per la 
raccolta degli escreti (urina, feci, aria espirata). Alla fine di ciascun periodo di raccolta (cfr. paragrafi da 47 a 49), le unità metaboliche vanno risciac ­
quate con un solvente adeguato («acqua di risciacquo») per assicurare il 
massimo recupero della sostanza in esame (radioattività). La raccolta degli 
escreti termina in capo a sette giorni o dopo aver recuperato almeno il 90 % della dose, a seconda di quale eventualità si verifica per prima.
 
47. La quantità totale della sostanza in esame (radioattività) nelle urine dev’es ­
sere determinata almeno due volte nel corso della prima giornata di raccolta 
(una delle quali 24 ore dopo la somministrazione della dose) per poi con ­
tinuare una volta al giorno fino alla fine dello studio. Per la prima giornata, si raccomanda di optare per più di due momenti di campionamento (ad 
esempio dopo 6, 12 e 24 ore). I risultati degli studi pilota vanno analizzati 
per trarre informazioni sull’opportunità di introdurre momenti di raccolta diversi o supplementari. È necessario giustificare la scelta del calendario adottato.
 
48. La quantità totale della sostanza in esame (radioattività) nelle feci dev’essere 
determinata una volta al giorno, a partire da 24 ore dopo la somministra ­
zione della dose e fino alla fine dello studio, salvo indicazioni contrarie provenienti dagli studi pilota che suggeriscano di svolgere raccolte più 
frequenti o in altri momenti. È necessario giustificare la scelta di un calen ­
dario alternativo.
 
49. Se in un determinato studio meno dell’1 % della dose somministrata viene 
rilevata nell’aria espirata raccolta in un periodo di 24 ore, la raccolta di CO  2 
espirata e di altri materiali volatili può essere sospesa.  
Studi in funzione del tempo  
Cinetica plasmatica/sanguigna  
50. Lo scopo di questi studi è di ottenere delle stime relative ai principali 
parametri tossicocinetici della sostanza in esame [es.: C  max , T max , emivita 
(t 1/2 ), AUC]. È possibile svolgere gli studi somministrando una dose unica, 
ma generalmente se ne somministrano due o più. Le dosi vengono stabilite a seconda della natura e/o dell’oggetto dello studio. I dati cinetici possono 
essere necessari per risolvere questioni quali la biodisponibilità della so ­
stanza in esame e/o per chiarire gli effetti della dose sull’eliminazione (vale a dire, per chiarire se la saturazione dell’eliminazione dipende o meno dalla dose).
 
51. Per questo tipo di studi, devono essere usati almeno quattro animali dello 
stesso sesso per ogni gruppo-dose. È necessario giustificare la scelta del sesso degli animali. Occorre prendere in considerazione l’opportunità di ricorrere ad animali di entrambi i sessi (quattro maschi e quattro femmine) 
in presenza di dati che suffragano differenze tossicologiche significative 
legate al sesso.
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52. Dopo la somministrazione della sostanza (radiomarcata), utilizzare un me ­
todo di campionamento adeguato per prelevare campioni di sangue da ogni 
animale in momenti idonei. Eventuali potenziali effetti del campionamento ripetuto sulla salute/fisiologia degli animali e/o la sensibilità del metodo analitico potrebbero limitare il volume e il numero di campioni di sangue 
da prelevare da ciascun animale. Devono essere sottoposti ad analisi cam ­
pioni provenienti da ogni singolo animale. In determinate circostanze (ad esempio per la caratterizzazione dei metaboliti), può essere necessario rag ­
gruppare i campioni provenienti da diversi animali. I campioni raggruppati 
devono essere chiaramente identificati e occorre fornire una spiegazione per 
la scelta del raggruppamento. Se si utilizza una sostanza chimica radiomar ­
cata, può essere opportuno determinare la radioattività totale presente. In tal caso, la radioattività totale deve essere analizzata nel sangue intero e nel 
plasma o nel plasma e negli eritrociti, per poter calcolare il rapporto sangue/ 
plasma. In altre circostanze, potrebbero essere necessari studi più approfon ­
diti che includano l’identificazione del composto progenitore e/o dei meta ­
boliti o la valutazione della fissazione alle proteine.
 
Altri studi di cinetica tissutale  
53. Questi studi si propongono di ottenere informazioni sull’evoluzione nel 
tempo, per chiarire questioni legate ad aspetti quali il meccanismo dell’azione tossica, il bioaccumulo e la biopersistenza, determinando i livelli della sostanza chimica in esame nei vari tessuti. I tipi di tessuti selezionati e 
il numero di momenti da sottoporre a valutazione dipenderanno dagli aspetti 
oggetto dello studio e dalla base dei dati tossicologici disponibili per la sostanza chimica in esame. Il disegno di questi ulteriori studi di cinetica tissutale deve tenere conto delle informazioni raccolte seguendo le indica ­
zioni dei paragrafi da 37 a 40. Gli studi possono essere condotti sommini ­
strando una dose unica o dosi ripetute. Occorre fornire una giustificazione dettagliata dell’approccio scelto.
 
54. Le ragioni che possono giustificare il ricorso a ulteriori studi cinetici com ­
prendono:  
— indicazioni di una emivita prolungata nel sangue, che suggeriscono la 
possibilità di un accumulo della sostanza nei diversi tessuti, oppure  
— l’interesse a verificare se è stato raggiunto uno stadio stazionario in 
determinati tessuti (ad esempio, negli studi a somministrazione ripetuta, 
sebbene possa sembrare che la concentrazione della sostanza in esame 
nel sangue abbia raggiunto uno stato apparentemente stazionario, può essere utile confermare se sia stata raggiunta la stessa concentrazione stazionaria anche nei tessuti bersaglio).
 
55. Per questo tipo di studi in funzione del tempo, occorre somministrare per via 
orale una dose adeguata della sostanza chimica in esame ad almeno quattro animali, per ciascuna dose e per punto temporale, e sorvegliare l’evoluzione 
nel tempo della distribuzione nei tessuti selezionati. Si utilizzano animali 
dello stesso sesso, salvo se si è osservata una tossicità specifica legata al sesso. A seconda dell’oggetto dello studio, si procederà o meno all’analisi della radioattività totale o della sostanza madre e/o dei metaboliti. Utilizzare 
tecniche idonee per valutare la distribuzione tissutale.
 
Induzione/Inibizione enzimatica  
56. In uno o più dei casi elencati di seguito può essere necessario svolgere studi 
sui possibili effetti dell’induzione/inibizione enzimatica o della biotrasfor ­
mazione della sostanza in esame:  
1) se alcuni elementi indicano una possibile relazione tra biotrasformazione 
della sostanza in esame e aumento della tossicità;  
2) se i dati sulla tossicità disponibili segnalano una relazione non lineare tra 
dose e metabolismo;  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 535
 
3) se gli studi sull’identificazione dei metaboliti identificano un metabolita 
potenzialmente tossico che può essere stato prodotto da una via enzima ­
tica indotta dalla sostanza chimica in esame;  
4) per spiegare effetti che si presume siano legati a fenomeni di induzione 
enzimatica;  
5) in caso di esperimenti in vitro o in vivo con specie e in condizioni 
diverse, se vengono osservate alterazioni tossicologiche rilevanti nel pro ­
filo metabolico della sostanza in esame, può essere necessario caratteriz ­
zare l’enzima o gli enzimi coinvolti (per esempio, enzimi di fase I come 
gli isoenzimi del sistema della monoossigenasi dipendente dal citocroma 
P450, enzimi di fase II come gli isoenzimi della uridina difosfato glucoronil-transferasi, o ogni altro enzima pertinente). Queste informa ­
zioni possono essere utilizzate per valutare la pertinenza delle specie in 
causa per le estrapolazioni inter-specie.
 
57. Per valutare le variazioni tossicocinetiche legate alla sostanza in esame, è 
necessario utilizzare protocolli di studio adeguati, debitamente convalidati e giustificati. Il disegno dello studio può ad esempio prevedere la sommini ­
strazione di dosi ripetute di una sostanza non marcata, seguite da una dose 
unica radiomarcata somministrata il 14° giorno, oppure la somministrazione 
di dosi ripetute con una sostanza radiomarcata con campionamenti il 1
 o , 7° e 
14° giorno in modo da determinare il profilo dei metaboliti. La sommini ­
strazione di dosi ripetute della sostanza chimica radiomarcata, inoltre, può 
fornire informazioni sul bioaccumulo (cfr. paragrafo 26).  
METODI COMPLEMENTARI  
58. Altri metodi, al di là degli esperimenti in vivo descritti in questo metodo di 
prova, possono fornire informazioni utili su assorbimento, distribuzione, 
metabolismo o eliminazione delle sostanze chimiche in determinate specie.  
Uso dei dati ottenuti in vitro  
59. Utilizzando sistemi di prova adeguati è possibile studiare in vitro molti 
aspetti del metabolismo della sostanza in esame. Si può ricorrere a epatociti 
isolati di fresco o coltivati, oppure a frazioni subcellulari (es.: microsomi e 
citosol o frazione S9) epatiche per studiare i possibili metaboliti. Il meta ­
bolismo locale nell’organo bersaglio, ad esempio il polmone, può fornire indicazioni interessanti per la valutazione dei rischi. A tal fine, possono 
essere utili frazioni microsomiali dei tessuti bersaglio. Gli studi che ricor ­
rono ai microsomi possono servire a indagare potenziali differenze dovute al genere o alle fasi di vita e a caratterizzare i parametri enzimatici (K
 m e 
V max ) che possono essere d’aiuto nella valutazione della dose-dipendenza 
del metabolismo rispetto ai livelli di esposizione. Inoltre, i microsomi pos ­
sono essere utili nell’identificazione degli enzimi microsomiali specifici coinvolti nel metabolismo della sostanza in esame, un aspetto che può rivelarsi importante per le estrapolazioni inter-specie (cfr. anche 
paragrafo 56). È inoltre possibile esaminare il potenziale di induzione della 
biotrasformazione utilizzando frazioni subcellulari epatiche (es. microsomi e citosol) di animali pretrattati con la sostanza in questione, attraverso studi di induzione sugli epatociti in vitro o a partire da determinate linee cellulari 
che esprimono degli enzimi pertinenti. In determinate circostanze e in con ­
dizioni adeguate, le frazioni subcellulari provenienti da tessuti umani pos ­
sono essere prese in considerazione ed essere utilizzate per determinare eventuali differenze tra specie a livello di biotrasformazione. I risultati degli 
studi in vitro possono essere utili anche per sviluppare modelli tossicocine ­
tici su base fisiologica (5).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 536
 
60. A partire da studi in vitro sull’assorbimento cutaneo, si possono ottenere 
informazioni supplementari per caratterizzare l’assorbimento (6).  
61. È possibile utilizzare colture cellulari primarie da cellule epatiche e cam ­
pioni tissutali freschi per chiarire questioni simili a quelle studiate ricorrendo 
a microsomi epatici. In alcuni casi, si potrebbero trovare risposte a deter ­
minate questioni utilizzando linee cellulari che esprimano specificamente 
l’enzima in causa, o linee cellulari geneticamente modificate. In altri casi, 
può essere utile studiare in vitro l’inibizione e l’induzione di isoenzimi specifici del citocroma P450 (es. CYP1A1, 2E1, 1A2, e altri) e/o di enzimi di fase II, attraverso il composto progenitore. Le informazioni ottenute 
possono dimostrarsi utili per composti di struttura simile.
 
Uso di dati tossicocinetici provenienti da studi di tossicità quali infor ­
mazioni complementari  
62. Le analisi di campioni di sangue, tessuti e/o escreti svolte all’interno di altri 
studi di tossicità possono fornire dati su biodisponibilità, cambiamenti nella 
concentrazione plasmatica in funzione del tempo (AUC, C  max ), potenziale di 
bioaccumulo, tassi di eliminazione e cambiamenti nel metabolismo e nella 
cinetica legati al genere o alle fasi di vita.  
63. Si possono effettuare modifiche a livello di impostazione dello studio per 
rispondere a domande concernenti: la saturazione delle vie di assorbimento, 
di biotrasformazione o di escrezione a dosi più elevate; il funzionamento di nuove vie metaboliche a dosi più elevate; la limitazione dei metaboliti 
tossici, sempre a dosi più elevate.
 
64. Si possono affrontare anche altre considerazioni legate alla valutazione dei 
rischi:  
— la sensibilità in funzione dell’età, dovuta alle differenze nello stato della 
barriera emato-encefalica, a livello dei reni e/o delle capacità di detos ­
sificazione,  
— la sensibilità di determinate sottopopolazioni dovuta a differenze nella 
capacità di biotrasformazione o ad altre differenze tossicocinetiche,  
— il grado di esposizione fetale per trasferimento transplacentare delle 
sostanze chimiche o l’esposizione neonatale attraverso l’allattamento.  
Uso dei modelli tossicocinetici  
65. I modelli tossicocinetici possono essere utili per diversi aspetti della valu ­
tazione dei rischi e dei pericoli, ad esempio nella previsione dell’esposizione 
sistemica e della dose trasmessa ai tessuti interni. Inoltre, possono servire per chiarire determinate questioni relative alle modalità d’azione, potendo fungere da base per estrapolazioni interspecie, tra vie di esposizione, tra 
dosaggi, e per la valutazione dei rischi per l’uomo. Tra i dati utili per 
l’elaborazione di modelli tossicocinetici su base fisiologica per una sostanza chimica in esame in una determinata specie si trovano: 1) i coefficienti di ripartizione; 2) le costanti biochimiche e i parametri fisiologici; 3) i parame ­
tri di assorbimento specifico per via di esposizione; e 4) i dati cinetici in 
vivo per la valutazione dei modelli [ad esempio i parametri di eliminazione per le vie di escrezione pertinenti (> 10 %) nonché K
 m e V  max per il 
metabolismo]. I dati sperimentali usati per elaborare il modello devono 
essere generati ricorrendo a metodi scientificamente solidi e i risultati otte ­
nuti dall’applicazione del modello devono essere convalidati. Per facilitare l’elaborazione di modelli non compartimentali o a base fisiologica (7) ven ­
gono spesso determinati parametri specifici a una sostanza chimica o a una 
specie in esame, quali i tassi di assorbimento, il coefficiente di ripartizione 
sangue-tessuto e le costanti di velocità metabolica.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 537
 
DATI E RELAZIONE  
66. Si raccomanda di inserire un indice nella relazione.  
Corpo della relazione  
67. Il corpo della relazione deve includere le informazioni previste dal presente 
metodo di prova, organizzate nelle sezioni e nei paragrafi descritti di segui ­
to. 
Sintesi  
68. Occorre esporre sinteticamente l’impostazione dello studio e il metodo usa ­
to. È altrettanto necessario evidenziare i risultati principali concernenti il 
bilancio di massa, la natura e l’importanza dei metaboliti, i residui nei tessuti, il tasso di eliminazione, il potenziale di bioaccumulo, le differenze legate al sesso ecc. La sintesi dev’essere dettagliata a sufficienza da con ­
sentire una valutazione dei risultati.
 
Introduzione  
69. In questa sezione si presentano gli obiettivi dello studio, le ragioni alla sua 
base e l’impostazione sperimentale, come pure i riferimenti pertinenti ed 
eventuali cenni storici.  
Materiali e metodi  
70. Vanno descritte in dettaglio tutte le informazioni pertinenti, in particolare:  
a) sostanza chimica in esame  
È necessario includere l’identificazione del prodotto chimico, che deve 
comprendere: denominazione chimica, struttura molecolare, composi ­
zione chimica qualitativa e quantitativa, grado di purezza chimica e, se possibile, tipo e quantità delle eventuali impurità. Occorre inoltre inclu ­
dere informazioni sulle proprietà fisico-chimiche, incluso stato fisico, 
colore, grado lordo di solubilità e/o coefficiente di ripartizione, stabilità e, se del caso, corrosività. Se del caso, fornire informazioni sugli isomeri. Se la sostanza chimica è radiomarcata, vanno indicati: il tipo di radionu ­
clide, la posizione della marcatura, l’attività specifica e il grado di pu ­
rezza radiochimica.
 
Si deve indicare il tipo o la descrizione dei veicoli, dei diluenti, degli 
agenti di sospensione e degli emulsionanti o di altri materiali utilizzati per somministrare la sostanza in esame;
 
b) animali da laboratorio  
È necessario fornire informazioni sugli animali utilizzati per la prova, 
incluse quelle sulla selezione, giustificandola, della specie, del ceppo, 
dell’età all’inizio dello studio, del sesso, insieme a informazioni su peso corporeo, stato di salute e condizioni di allevamento;
 
c) metodi  
Occorre fornire dettagli sull’impostazione dello studio e sulla metodolo ­
gia utilizzata, includendo:  
1) una giustificazione delle eventuali modifiche alla via e, se del caso, 
alle condizioni di esposizione;  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 538
 
2) una giustificazione della scelta dei livelli della dose;  
3) la descrizione degli studi pilota sottesi al disegno sperimentale degli 
studi di follow-up, se del caso, allegando i dati di supporto prove ­
nienti dagli studi pilota;  
4) la modalità di preparazione della soluzione somministrata, il tipo di 
solvente o veicolo, se utilizzato;  
5) il numero dei gruppi esposti e il numero degli animali per ciascun 
gruppo;  
6) il livello e il volume delle dosi (e attività specifica in caso di utilizzo 
di marcatori radioattivi);  
7) la o le vie e i metodi di somministrazione;  
8) la frequenza di somministrazione;  
9) il periodo di digiuno (se del caso);  
10) la radioattività totale per animale;  
11) la manipolazione degli animali;  
12) la raccolta e il trattamento dei campioni;  
13) i metodi d’analisi utilizzati per la separazione, quantificazione e 
identificazione dei metaboliti;  
14) i limiti di rivelabilità per i metodi utilizzati;  
15) le altre misure e procedure sperimentali utilizzate (inclusa la valida ­
zione dei metodi per l’analisi dei metaboliti);  
d) analisi statistica  
Se per analizzare i risultati degli studi si ricorre all’analisi statistica, la 
relazione deve includere sufficienti informazioni sul metodo di analisi e sul programma informatico utilizzati, in maniera tale che un revisore o 
un esperto di statistica indipendente possa rivalutare e ricostruire l’ana ­
lisi.
 
Nel caso si ricorra a una modellizzazione sistemica, utilizzando ad esem ­
pio modelli tossicocinetici su base fisiologica, la presentazione dei mo ­
delli deve includerne una descrizione completa in modo da poterli rico ­
struire e convalidare in modo indipendente (cfr. paragrafo 65 e l’appen ­
dice «Definizioni»).  
Risultati  
71. I dati vanno riportati sinteticamente in una tabella, con una valutazione 
statistica idonea e una descrizione. Quelli relativi al conteggio della radio ­
attività devono essere sintetizzati e presentati nel modo più consono allo studio, in genere in microgrammi o milligrammi equivalenti per massa del campione, sebbene sia possibile utilizzare altre unità. In questa sezione della 
relazione vanno inserite le illustrazioni grafiche dei risultati, la riproduzione 
dei dati cromatografici e spettrometrici, l’identificazione/quantificazione dei metaboliti e le vie metaboliche proposte, ivi compresa la struttura moleco ­
lare dei metaboliti. Inoltre, ove pertinenti, vanno incluse le informazioni 
elencate di seguito:
 
1) quantità e recupero percentuale della radioattività nelle urine, nelle feci, 
nell’aria espirata e nell’acqua di risciacquo delle urine e delle feci dalle gabbie.
 
— Per gli studi per via cutanea, è inoltre necessario includere i dati sul 
recupero della sostanza dalla cute trattata e dai lavaggi della cute, i dati relativi alla radioattività residua nella copertura protettiva della 
pelle e nell’unità metabolica, nonché i risultati dello studio sul la ­
vaggio cutaneo; per ulteriori informazioni, cfr. paragrafi da 74 a 77,
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— per gli studi per via inalatoria, includere anche i dati sul recupero 
della sostanza in esame nei polmoni e nei tessuti nasali (8); per 
ulteriori informazioni, cfr. paragrafo 78;  
2) distribuzione nei tessuti, espressa in percentuale della dose somministrata 
e come concentrazione (microgrammi equivalenti per grammo di tessuto) e rapporti tessuto/sangue o tessuto/plasma;
 
3) bilancio di materia elaborato per ciascuno studio, che implica l’analisi dei 
tessuti e degli escreti;  
4) concentrazione del plasma e parametri tossicocinetici (biodisponibilità, 
AUC, C  max , T max , eliminazione, emivita) della sostanza dopo la sommi ­
nistrazione attraverso la o le vie di esposizione pertinenti;  
5) tasso e grado di assorbimento della sostanza chimica in esame dopo la 
somministrazione attraverso la o le vie di esposizione pertinenti;  
6) quantità della sostanza chimica e dei metaboliti (espressa in percentuale 
della dose somministrata) raccolta negli escreti;  
7) riferimento ai dati sugli animali presentati in allegato per tutti i parametri 
e gli endpoint misurati (ad esempio, dose somministrata, percentuale di 
recupero, concentrazioni, parametri tossicocinetici ecc.).  
8) grafico sul quale figurano le vie metaboliche proposte e la struttura 
metabolica dei metaboliti.  
Discussione dei risultati e conclusioni  
72. In questa sezione della relazione l’autore, o gli autori, devono:  
1) proporre la via metabolica, basata sui risultati del metabolismo e sull’eli ­
minazione della sostanza chimica in esame;  
2) esaminare le eventuali differenze legate alla specie e al sesso, rispetto 
all’eliminazione e/o alla biotrasformazione della sostanza chimica in 
esame;  
3) presentare sotto forma di tabella ed esaminare l’identità e l’importanza 
dei metaboliti, i tassi di eliminazione, il potenziale di bioaccumulo e il 
livello dei residui tissutali del composto progenitore e/o del o dei meta ­
boliti, oltre a eventuali alterazioni dei parametri tossicocinetici in fun ­
zione della dose;  
4) integrare in questa sezione eventuali dati tossicocinetici pertinenti, otte ­
nuti nel corso dello svolgimento degli studi di tossicità;  
5) fornire una conclusione concisa, giustificata dai risultati dello studio;  
6) aggiungere altre sezioni, se necessario.  
73. Le eventuali ulteriori sezioni possono servire ad includere informazioni 
bibliografiche a sostegno degli studi, tabelle, grafici, appendici ecc.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 540
 
VIE DI ESPOSIZIONE ALTERNATIVE  
Via cutanea  
Esposizione per via cutanea  
74. Questa sezione contiene indicazioni specifiche per studi di tossicocinetica 
sulla sostanza in esame somministrata per via cutanea. Per quanto riguarda 
l’assorbimento cutaneo, consultare il capitolo B.44 del presente allegato: Assorbimento cutaneo: metodo in vivo (9). Per altri endpoint, quali la di ­
stribuzione e il metabolismo, è possibile utilizzare il presente metodo di 
prova (B.36). Nell’esposizione per via cutanea, è possibile utilizzare uno 
o più livelli di dose della sostanza chimica in esame. La sostanza chimica in esame (sostanza chimica pura, diluita o formulazione che la contenga, da applicare sulla pelle) deve essere identica (o essere un suo surrogato plau ­
sibile) a quella a cui possono essere esposti gli esseri umani o le altre specie 
bersaglio potenziali. Il livello o i livelli di dose devono essere scelti con ­
formemente a quanto indicato ai paragrafi da 20 a 26 del presente metodo di prova. I fattori di cui tenere conto nella scelta della o delle dosi da sommini ­
strare per via cutanea sono la prevista esposizione umana e/o le dosi alle 
quali è stata osservata tossicità in altri studi di tossicità cutanea. La o le dosi da somministrare per via cutanea devono essere disciolte in un veicolo idoneo e applicate in congrua quantità. Poco prima della prova si effettua 
il taglio del pelo nella parte dorsale del corpo degli animali. Si può usare la 
rasatura, ma questa dovrebbe essere effettuata circa 24 ore prima dell’inizio della prova. Durante le operazioni di taglio o rasatura, si deve badare a non ledere la cute dell’animale per evitarne l’abrasione che potrebbe alterarne la 
permeabilità. Si dovrà preparare circa il 10 % della superficie corporea per 
l’applicazione della sostanza in esame. In caso di sostanze altamente tossi ­
che, la superficie può essere inferiore al 10 %, ma deve però essere coperta quanto più possibile da uno strato uniforme e sottile della sostanza. La 
superficie esposta deve essere la stessa per tutti i gruppi di animali che 
partecipano alla prova cutanea. Le superfici esposte devono essere protette con una protezione idonea adeguatamente fissata in posizione. Gli animali 
vanno alloggiati separatamente.
 
75. È necessario svolgere uno studio sul lavaggio cutaneo per determinare la 
quantità di dose somministrata che può essere rimossa dalla pelle mediante 
un lavaggio della superficie esposta con sapone delicato e acqua. Tale studio 
può essere utilizzato anche per stabilire il bilancio di massa quando la sostanza in esame viene somministrata per via cutanea. Per realizzare questo studio, applicare un dose unica della sostanza su due animali. La scelta del 
livello della dose va effettuata conformemente a quanto indicato al 
paragrafo 23 del presente metodo di prova (cfr. anche paragrafo 76 per indicazioni sul tempo di contatto con la pelle). Per valutare l’efficacia della rimozione della sostanza in esame attraverso questo metodo di lavaggio, 
occorre determinare la quantità di sostanza recuperata nell’acqua di lavag ­
gio.
 
76. Salvo che la corrosività lo impedisca, una volta applicata, la sostanza chi ­
mica in esame va lasciata a contatto della pelle per un minimo di 6 ore. Una volta rimossa la protezione, l’area esposta deve essere lavata seguendo la procedura descritta per lo studio sul lavaggio cutaneo (cfr. paragrafo 75). 
Analizzare sia la protezione sia l’acqua di lavaggio per determinare la 
quantità residua della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, gli animali vengono sottoposti a eutanasia, conformemente al riferimento bibliografico (2), e la pelle esposta viene rimossa. Occorre analizzare una 
sezione idonea della pelle esposta per determinare i residui della sostanza 
chimica in esame (radioattività).
 
77. Per la valutazione tossicocinetica dei prodotti farmaceutici può essere ne ­
cessario ricorrere ad altri protocolli, conformemente agli obblighi normativi 
applicabili.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 541
 
Via inalatoria  
78. Per questo tipo di studi va utilizzata una concentrazione unica (o più con ­
centrazioni, se necessario) della sostanza in esame. La o le concentrazioni devono essere scelte conformemente a quanto indicato ai paragrafi da 20 a 
26 del presente metodo di prova. La somministrazione per via inalatoria 
deve effettuarsi tramite apparecchi che consentono di esporre solo il naso o la testa, in modo da evitare l’assorbimento tramite altre vie d’esposizione (8). Se vengono utilizzate altre condizioni di esposizione per via inalatoria, è 
necessario giustificare e documentare la scelta. Il periodo di esposizione va 
indicato (generalmente, si situa tra le 4 e le 6 ore).
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OCSE (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Ma ­
nufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
(2) OCSE (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
 
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
(6) Capitolo B.45 del presente allegato, Assorbimento cutaneo: metodo in 
vitro.  
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety.
 
(8) OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Capitolo B.44 del presente allegato, Assorbimento cutaneo: metodo in vivo.  
(10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 542
 
Appendice  
DEFINIZIONI  
Assorbimento:  processo o processi tramite i quali una sostanza chimica attra ­
versa i tessuti o vi penetra. L’assorbimento si riferisce a un composto progenitore 
e a tutti i suoi metaboliti. Non va confuso con «biodisponibilità».  
Accumulo (bioaccumulo):  aumento, nel corso del tempo, della quantità della 
sostanza chimica in esame nei tessuti (solitamente tessuti grassi, dopo ripetute esposizioni); se la quantità somministrata della sostanza in esame è maggiore 
della quantità eliminata, essa si accumula nell’organismo fino anche a raggiun ­
gere concentrazioni tossiche.
 
ADME:  sigla che sta per «Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo ed Escre ­
zione».  
AUC ( Area Under the Curve , area sotto la curva):  area sotto la curva «concen ­
trazione plasmatica/tempo» della sostanza in esame. Rappresenta il volume totale 
della sostanza in esame assorbita dal corpo in un intervallo di tempo predeter ­
minato. In condizioni lineari, l’AUC (da zero a infinito) è proporzionale al volume totale della sostanza in esame assorbita dal corpo, a prescindere dal tasso di assorbimento.
 
Autoradiografia:  (autoradiografia a corpo intero) tecnica utilizzata per determi ­
nare qualitativamente e/o quantitativamente la localizzazione tissutale della so ­
stanza radioattiva in esame; utilizza pellicola a raggi X o, più recentemente, immagini digitali su schermi al fosforo per visualizzare molecole o frammenti di molecole radiomarcate, registrando l’irraggiamento emesso all’interno dell’og ­
getto studiato. Rispetto alla dissezione degli organi, l’autoradiografia quantitativa 
a corpo intero può comportare dei vantaggi per determinare la distribuzione della sostanza in esame e valutare il recupero globale e la risoluzione del materiale radioattivo nei tessuti. Un vantaggio significativo, per esempio, è rappresentato 
dal fatto che questa tecnica può essere utilizzata su un modello animale pigmen ­
tato per valutare l’eventuale associazione della sostanza in esame con la mela ­
nina, che può legarsi ad alcune molecole. Tuttavia, sebbene possa rappresentare un mezzo utile per visualizzare globalmente i siti di fissazione di grande capacità 
e bassa affinità, questa tecnica può rivelarsi meno efficace per quanto riguarda il 
riconoscimento di siti bersaglio specifici quali i siti di fissaggio dei recettori per rilevare i quali è necessario ricorrere a risoluzioni e sensibilità relativamente elevate. Quando si ricorre all’autoradiografia, gli esperimenti intesi a determinare 
il bilancio di massa dei composti somministrati vanno svolti su un gruppo di ­
stinto o tramite uno studio distinto rispetto a quello che si concentra sulla di ­
stribuzione tissutale, nel quale tutti gli escreti (che possono includere l’aria espirata) e le carcasse intere vengono omogeneizzati e testati tramite conteggio 
in scintillazione liquida.
 
Escrezione biliare:  escrezione attraverso i dotti biliari.  
Bioaccumulo:  cfr. «accumulo».  
Biodisponibilità:  frazione di una dose somministrata che raggiunge la circolazione 
sistemica o viene resa disponibile nel sito dell’attività fisiologica. Generalmente, la biodisponibilità della sostanza in esame si riferisce al composto progenitore, ma potrebbe riferirsi ai suoi metaboliti. Tiene conto di una sola forma chimica.  NB 
biodisponibilità e assorbimento non sono sinonimi. La differenza, ad esempio, tra 
assorbimento orale (cioè presenza nella parete intestinale e circolazione portale) e biodisponibilità (cioè presenza nel sangue sistemico e nei tessuti) potrebbe deriva ­
re, tra le varie possibilità, dalla degradazione chimica dovuta al metabolismo delle 
pareti intestinali, dall’efflusso verso il lume intestinale o dal metabolismo presi ­
stemico nel fegato (10). La biodisponibilità del componente tossico (il composto progenitore o un metabolita) rappresenta un parametro fondamentale per la valu ­
tazione del rischio per gli esseri umani (estrapolazione da dosi basse a dosi alte, 
estrapolazione da una via all’altra) per poter derivare un valore interno dal NOAEL 
o dalla BMD esterni (dose applicata). Per studiare gli effetti sul fegato in caso di somministrazione orale, è sufficiente l’assorbimento orale. Tuttavia, per valutare tutti gli altri effetti, escluso quello alla porta d’entrata, il parametro generalmente 
più affidabile da utilizzare per un’ulteriore valutazione del rischio è rappresentato 
dalla biodisponibilità e non dall’assorbimento.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 543
 
Biopersistenza:  cfr. «Persistenza».  
Biotrasformazione:  conversione chimica (solitamente enzimatica), all’interno del 
corpo, della sostanza in esame in una sostanza chimica diversa. Sinonimo di «metabolismo».
 
C max : concentrazione massima (picco di concentrazione) nel sangue (plasma/sie ­
ro) dopo la somministrazione, oppure escrezione massima (picco di escrezione) 
nelle urine o nelle feci dopo la somministrazione.  
Velocità di eliminazione ( clearance rate ): misura quantitativa della velocità alla 
quale una sostanza viene eliminata dal sangue, dal plasma o da un dato tessuto, 
per unità di tempo.  
Compartimento:  porzione (o unità) strutturale o biochimica di un corpo, tessuto 
o cellula, separata dal resto di tale corpo, tessuto o cellula.  
Vie di detossificazione:  serie di tappe che conducono all’eliminazione delle 
sostanze tossiche dal corpo, per trasformazione metabolica o per escrezione.  
Distribuzione:  dispersione di un prodotto chimico e dei suoi derivati attraverso 
l’organismo.  
Enzimi/Isoenzimi:  Proteine che catalizzano le reazioni chimiche. Gli isoenzimi 
sono enzimi che catalizzano reazioni chimiche simili ma si differenziamo nella sequenza degli aminoacidi.
 
Parametri enzimatici:  K m (costante di Michaelis) e V  max (velocità massima).  
Escrezione:  processo o processi attraverso i quali una sostanza somministrata e/o 
i suoi metaboliti vengono rimossi dal corpo.  
Esogeno:  introdotto dall’esterno o prodotto all’esterno dell’organismo o del si ­
stema.  
Estrapolazione:  inferenza di uno o più valori sconosciuti sulla base di ciò che è 
conosciuto o è stato osservato.  
Emivita (t  1/2 ): tempo necessario a ridurre della metà la concentrazione della 
sostanza in esame in un comparto. Si riferisce generalmente alla concentrazione del plasma o alla quantità della sostanza presente nell’intero corpo.
 
Induzione/Induzione enzimatica:  sintesi degli enzimi in risposta a uno stimolo 
ambientale o a una molecola induttrice.  
Linearità/cinetica lineare:  in cinetica si definisce un processo come lineare 
quando tutte le velocità di trasferimento tra compartimenti sono proporzionali 
alle quantità o concentrazioni presenti, cioè di primo ordine. Di conseguenza i 
volumi di eliminazione e di distribuzione sono costanti, allo stesso modo delle emivite. Le concentrazioni ottenute sono proporzionali ai tassi di somministra ­
zione (esposizione) e l’accumulo è più facilmente prevedibile. È possibile valu ­
tare la linearità/non linearità attraverso il confronto dei parametri pertinenti, ad 
esempio l’AUC, dopo la somministrazione di dosi diverse o dopo un’esposizione singola e un’esposizione ripetuta. L’assenza di dose-dipendenza può essere indi ­
cativa della saturazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo del composto, un 
aumento dell’AUC dopo esposizione ripetuta rispetto all’esposizione singola può 
indicare invece l’inibizione del metabolismo e, infine, una riduzione dell’AUC può indicare l’induzione del metabolismo [cfr. anche (11)].
 
Bilancio di massa:  contabilità delle entrate e delle uscite dal sistema della 
sostanza chimica in esame.  
Bilancio di materia:  cfr. «bilancio di massa».  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 544
 
Meccanismo (Modalità) di tossicità/d’azione:  il meccanismo d’azione si riferi ­
sce alle interazioni biochimiche specifiche attraverso le quali una sostanza pro ­
duce il suo effetto. La modalità d’azione si riferisce ai fenomeni più generali attraverso i quali si manifesta la tossicità di una sostanza.
 
Metabolismo:  sinonimo di «biotrasformazione».  
Metaboliti:  prodotti del metabolismo o dei processi metabolici.  
Assorbimento orale:  percentuale della dose di sostanza in esame assorbita a 
partire dal sito di somministrazione (per esempio: tratto gastrointestinale). Si 
tratta di un parametro fondamentale che può aiutare a comprendere quale frazione della sostanza somministrata raggiunge la vena porta e in seguito il fegato.
 
Coefficiente di ripartizione:  chiamato anche «coefficiente di distribuzione», 
misura la solubilità differenziale di una sostanza chimica in due solventi.  
Concentrazione sanguinea (plasmatica/sierica) massima:  concentrazione mas ­
sima (picco di concentrazione) nel sangue (plasma/siero) dopo la somministra ­
zione (cfr. anche «C  max »). 
Persistenza (biopersistenza):  presenza a lungo termine di una sostanza chimica 
(in un sistema biologico) dovuta alla sua resistenza alla degradazione/eliminazione.  
Metodo read-across:  metodo con il quale le informazioni sull’endpoint di una o 
più sostanze chimiche vengono utilizzate per prevedere l’endpoint della sostanza 
in esame.  
Autoradiografia microscopica dei recettori (microautoradiografia dei recet ­
tori):  tecnica che può essere utilizzata per studiare l’interazione xenobiotica con 
popolazioni di cellule o siti tissutali specifici, per esempio nel quadro degli studi 
sulla fissazione al recettore o sulla modalità d’azione specifica che possono 
richiedere una qualità di risoluzione e sensibilità impossibile da ottenere con altre tecniche come l’autoradiografia a corpo intero.
 
Via di somministrazione (per via orale, endovenosa, cutanea, per inalazione 
ecc.):  come le sostanze chimiche vengono somministrate al corpo (es.: per via 
orale mediante sonda gastrica o mediante dieta, per via cutanea, per inalazione, per endovena ecc.).
 
Saturazione:  stato nel quale uno o più processi cinetici (es.: assorbimento, 
metabolismo o eliminazione) raggiungono il picco massimo (sono cioè «saturi»).  
Sensibilità:  capacità di un metodo o di uno strumento di discriminare tra misu ­
razioni corrispondenti a diversi livelli di risposta alla variabile in causa.  
Concentrazione sanguinea (plasmatica) allo stato stazionario:  stato di non 
equilibrio di un sistema aperto nel quale tutte le forze che agiscono sul sistema sono perfettamente controbilanciate da forze opposte in modo tale che tutti i 
componenti del sistema abbiano una concentrazione stazionaria, nonostante al 
suo interno circoli della materia.
 
Modellizzazione dei sistemi (modello tossicocinetico su base fisiologica, mo ­
dello su base farmacocinetica, modello farmacocinetico su base fisiologica, modello su base biologica ecc.):  modello astratto che utilizza il linguaggio 
matematico per descrivere il comportamento di un sistema.
 
Tessuto bersaglio:  tessuto nel quale si manifesta il principale effetto avverso del 
tossico.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 545
 
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  
Distribuzione tissutale:  movimento reversibile di una sostanza chimica da un 
punto a un altro del corpo. La distribuzione tissutale può essere studiata ricor ­
rendo a dissezione, omogeneizzazione, combustione e conteggio in scintillazione liquida di un organo oppure a autoradiografia qualitativa o quantitativa a corpo 
intero. Il primo metodo è utile per ottenere la concentrazione e la percentuale di 
recupero nei tessuti e nella carcassa degli stessi animali, ma può fornire una risoluzione insufficiente per tutti i tessuti e raggiungere un recupero globale che è lungi dall’essere ideale (< 90 %). Cfr. «autoradiografia».
 
T max : tempo necessario a raggiungere C  max . 
Tossicocinetica (farmacocinetica):  studio dell’assorbimento, della distribuzione, 
del metabolismo e dell’escrezione delle sostanze chimiche, nel tempo.  
Convalida dei modelli:  processo destinato a valutare se un modello descriva 
convenientemente i dati tossicocinetici disponibili. I modelli possono essere va ­
lutati attraverso la comparazione statistica o visiva delle loro predizioni con i 
valori sperimentali, in funzione di una variabile indipendente comune (ad esem ­
pio il tempo). La portata della valutazione dev’essere giustificata in funzione dell’uso che si intende fare del modello.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 546
 
B.37.  NEUROTOSSICITÀ RITARDATA DI SOSTANZE 
ORGANOFOSFORICHE DOPO ESPOSIZIONE ACUTA  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Per la valutazione degli effetti tossici delle sostanze è importante 
tener conto della facoltà di talune classi di sostanze di indurre effetti neurotossici specifici che potrebbero non essere messi in luce da altri studi di tossicità. Alcune sostanze organofosforiche, che hanno evi ­
denziato una neurotossicità ritardata, dovrebbero essere oggetto di 
una valutazione in questo senso.
 
Saggi preliminari in vitro consentono di identificare le sostanze su ­
scettibili di indurre una polineuropatia ritardata; tuttavia risultati di studi in vitro non garantiscono l'assenza di neurotossicità della so ­
stanza saggiata.
 
Vedi introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Le sostanze organofosforiche comprendono esteri, tioesteri o anidridi 
organofosforici neutri degli acidi organofosforico, organofosfonico o organofosforamidico o dei corrispondenti acidi fosforotioico, fosfo ­
notioico o fosforotioamidico, o altre sostanze suscettibili di indurre 
gli effetti neurotossici ritardati talvolta osservati in questa classe di sostanze.
 
La neurotossicità ritardata è una sindrome associata ad atassia pro ­
lungata a comparsa tardiva, ad assonopatie distali del midollo spinale e dei nervi periferici e ad un'inibizione e un invecchiamento dell'este ­
rasi suggestiva di neuropatia (NTE, neuropathy target esterase) nei 
tessuti nervosi.
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Una sostanza di riferimento può essere sagggiata in un gruppo di 
controllo positivo al fine di dimostrare che, nelle condizioni speri ­
mentali utilizzate, la reazione delle specie esaminate non ha subito variazioni significative.
 
Una sostanza neurotossica di comune utilizzo è il tri-o-tolil fosfato 
[CAS 78-30-8, E1NECS 201-103-5, nomenclatura CAS: acido fo ­
sforico, tris (2-metilfenil)estere], noto anche come tris-o-cresilfosfato.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame viene somministrata per via orale in un'unica 
dose a galline eventualmente protette contro effetti colinergici acuti. Gli animali vengono tenuti in osservazione per 21 giorni al fine di 
individuare eventuali anomalie del comportamento, atassia e paralisi. 
A 24 e 48 ore di distanza dalla somministrazione vengono effettuate analisi biochimiche, e in particolare l'inibizione della NTE, su galline selezionate da ciascun gruppo secondo un criterio di casualità. Ven ­
tun giorni dopo l'esposizione si sopprimono gli animali superstiti e si 
procede all'esame istopatologico di determinati tessuti nervosi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 547
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.5.1.  Preparazioni  
Galline adulte, giovani e sane, che non presentino affezioni virali e 
non siano trattate con farmaci suscettibili di alterare i risultati del 
saggio, nonché esenti da turbe della deambulazione, vengono asse ­
gnate in modo casuale a gruppi da trattare e di controllo e acclima ­
tate alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'ini ­
zio del saggio.  
Le gabbie o i recinti saranno sufficientemente ampi affinché gli 
animali possano muoversi liberamente ed essere facilmente osservati 
durante la deambulazione.  
Di norma la sostanza in esame viene somministrata per via orale 
tramite sonda gastrica, capsule di gelatina o un metodo analogo. 
Le sostanze liquide possono essere somministrate non diluite o di ­
sciolte in un veicolo appropriato, quale l'olio di mais. Se possibile, si avrà cura di sciogliere le sostanze solide, in quanto dosi elevate di 
tali sostanze in capsule di gelatina possono non essere completa ­
mente assorbite. Per i veicoli non acquosi, le caratteristiche di tos ­
sicità del veicolo dovranno essere note o, in caso contrario, determi ­
nate prima del saggio.
 
1.5.2.  Condizioni sperimentali  
1.5.2.1.  Animali da esperimento  
Si utilizzeranno di preferenza galline domestiche ovaiole ( Gallus 
gallus domesticus ), giovani e adulte, di età compresa tra 8 e 
12 mesi, appartenenti a razze e a ceppi di taglia standard. Gli animali 
saranno allevati in condizioni che ne garantiscano la libertà di mo ­
vimento.  
1.5.2.2.  Numero e sesso  
Oltre al gruppo da trattare, si utilizzeranno un gruppo di controllo 
positivo ed uno con somministrazione del solo veicolo. Quest'ultimo sarà trattato in modo identico al primo, tranne per il fatto che agli 
animali non verrà somministrata la sostanza in esame.
 
Ogni gruppo dovrà comprendere un numero sufficiente di animali, in 
modo che almeno sei esemplari possano essere soppressi per effet ­
tuare le analisi biochimiche (tre a 24 ore e tre a 48 ore di distanza dalla somministrazione) ed altri sei possano sopravvivere per i 21 giorni del periodo di osservazione.
 
Il gruppo di controllo positivo può essere attuale o appartenere a 
studi recentemente effettuati. Esso comprenderà almeno sei animali trattati con una sostanza neurotossica nota ad effetto ritardato, tre dei 
quali saranno destinati alle analisi biochimiche e tre all'osservazione. 
È opportuno procedere ad un aggiornamento periodico dei dati sto ­
rici. Nuovi dati di controllo positivo dovranno essere elaborati ogni ­
qualvolta venga modificato un elemento essenziale del saggio (quale 
il ceppo, il tipo di alimentazione o le condizioni di 
alloggiamento degli animali).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 548
 
1.5.2.3.  Livelli di dosaggio  
Per la determinazione del livello di dosaggio da utilizzare nello 
studio principale si procederà ad uno studio preliminare su un nu ­
mero adeguato di animali suddivisi in gruppi trattati con diversi 
livelli di dosaggio. Per una corretta definizione di detto parametro 
sono generalmente necessari in questa fase preliminare, un certo numero di decessi. Tuttavia, al fine di evitare decessi cagionati da effetti colinergici acuti, si potrà fare ricorso ad atropina o ad un altro 
agente protettivo che non sia suscettibile di interferire con eventuali 
reazioni neurotossiche ritardate. Esistono diversi metodi per la deter ­
minazione della dose massima non letale di una sostanza (vedi me ­
todo B.l  bis). Anche i dati di precedenti studi su galline o altre 
informazioni tossicologiche possono essere utili a questo scopo.
 
Il livello di dosaggio da utilizzare nello studio principale deve essere 
il più elevato possibile tenendo conto dei risultati ottenuti nello studio preliminare per la determinazione del dosaggio e del limite 
massimo di 2 000 mg/kg peso corporeo. Indipendentemente dal tasso 
di mortalità, è indispensabile che un numero sufficiente di animali sopravviva per l'esecuzione delle analisi biochimiche (sei) e del ­
l'esame istologico del ventunesimo giorno (sei). Per evitare decessi 
cagionati da effetti colinergici acuti, si potranno somministrare atro ­
pina o un analogo agente protettivo che non sia suscettibile di inter ­
ferire con eventuali reazioni neurotossiche ritardate.
 
1.5.2.4.  Saggio limite  
Qualora un saggio, effettuato in conformità con il metodo descritto, 
con un livello di dosaggio di almeno 2 000 mg/kg di peso corporeo/ ­
giorno, non produca effetti tossici evidenti e se i dati relativi a 
sostanze di struttura affine non sono suggestivi di tossicità, può 
non essere necessario somministrare un dosaggio superiore. Il saggio limite è giustificato, salvo nel caso in cui l'esposizione umana com ­
porti la necessità di utilizzare un più elevato livello di dosaggio.
 
1.5.2.5.  Periodo di osservazione  
Il periodo di osservazione avrà una durata di 21 giorni.  
1.5.3.  Procedimento  
Dopo aver trattato gli animali con un agente protettivo atto a preve ­
nire effetti colinergici acuti potenzialmente letali, si somministra la 
sostanza in esame in una singola dose.  
1.5.3.1. Osservazioni generali  
II periodo di osservazione inizia subito dopo l'esposizione alla so ­
stanza. Tutte le galline saranno accuratamente esaminate diverse 
volte per i primi 2 giorni e almeno quotidianamente a partire dal terzo fino alla soppressione degli animali, prevista per il ventunesimo giorno. Si registreranno tutti i segni di tossicità, nonché il momento 
della comparsa, la natura, la gravità e la durata di qualsiasi anomalia 
del comportamento. Per l'atassia si utilizzerà un sistema di classifi ­
cazione comprendente un minimo di quatro livelli; si registreranno altresì i casi di paralisi. Almeno due volte alla settimana le galline 
selezionate per l'osservazione dovranno essere tolte dalle gabbie o 
sottoposte ad attività motoria forzata (ad esempio salire le scale) al fine di agevolare l'osservazione degli effetti tossici minimi. Gli ani ­
mali moribondi o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza do ­
vranno essere immediatamente sottoposti ad eutanasia e ad esame 
necroscopico.
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1.5.3.2. Peso corporeo  
Tutte le galline saranno pesate poco prima della somministrazione 
della sostanza e almeno una volta alla settimana successivamente.  
1.5.3.3. Biochimica  
Pochi giorni dopo l'esposizione si sopprimeranno sei galline scelte in 
modo casuale da ciascuno dei gruppi trattati e di controllo negativo e tre appartenenti al gruppo di controllo positivo (se realizzato). Il cervello e il midollo spinale lombare saranno quindi preparati e 
analizzati per identificare un'eventuale attività di inibizione della 
NTE. Inoltre può essere utile effettuare la stessa analisi su tessuti del nervo sciatico. Generalmente si sopprimono tre animali per il gruppo di controllo e per ciascuno dei gruppi trattati a distanza di 
24 ore ed altri tre a distanza di 48 ore, mentre le tre galline del 
gruppo di controllo positivo vengono soppresse dopo 24 ore. Qua ­
lora l'osservazione dei segni clinici di intossicazione (spesso valuta ­
bili in funzione della comparsa di effetti colinergici) suggerisca che 
l’eliminazione della sostanza tossica avviene molto lentamente, può 
essere preferibile effettuare altri due prelievi tissutali da tre animali nel periodo compreso tra 24 e non oltre 72 ore dopo la sommini ­
strazione.
 
Se del caso, è possibile effettuare su tali tessuti analisi dell'acetilco ­
linesterasi (AChE). Tuttavia si può avere una riattivazione spontanea dell'AChE  in vivo , il che potrebbe indurre a sottovalutare il poten ­
ziale di inibizione dell'AChE di una sostanza.
 
1.5.3.4. Necroscopia macroscopica  
L'esame necroscopico di tutti gli animali (sia di quelli soppressi 
come da programma che di quelli sottoposti ad eutanasia) dovrà comprendere l'osservazione dell'aspetto del cervello e del midollo 
spinale.
 
1.5.3.5. Esame istopatologico  
I tessuti nervosi degli animali sopravvissuti al periodo di osserva ­
zione e non utilizzati per gli studi biochimici saranno sottoposti ad 
esame microscopico. Essi saranno fissati in situ con tecniche di 
perfusione. I prelievi tissutali saranno effettuati su cervelietto (piano longitudinale medio), midollo allungato, midollo spinale e nervi pe ­
riferici. Il midollo spinale sarà prelevato dal tratto cervicale superio ­
re, dal terzo toracico centrale e dal tratto lombosacrale. Si preleve ­
ranno inoltre tessuti dal segmento distale del nervo tibiale e delle sue ramificazioni verso il muscolo gastrocnemio e dal nervo sciatico. I tessuti saranno colorati con appositi coloranti specifici per la mielina 
e gli assoni.
 
2. DATI  
Di norma, se i risultati ottenuti per i parametri di valutazione adottati 
nel presente metodo (biochimica, istopatologia e osservazione del comportamento) sono negativi, non è necessario eseguire ulteriori 
saggi di neurotossicità ritardata. Risultati equivoci o non conclusivi 
possono invece richiedere un approfondimento.
 
Dovranno essere forniti i dati individuali di ciascun animale. Inoltre, 
tutti i dati dovranno essere riassunti in una tabella indicante, per ogni 
gruppo, il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di animali recanti lesioni, alterazioni del comportamento o effetti bio ­
chimici, la natura e la gravità di detti effetti o lesioni e la percentuale 
di animali per ogni tipo di effetto o lesione e per ogni livello di 
gravità.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 550
 
I risultati del presente studio dovranno essere valutati in termini di 
incidenza, gravità e correlazione tra effetti comportamentali, biochi ­
mici e istopatologici e qualsiasi altro effetto osservato nei gruppi trattati e di controllo.
 
I risultati numerici dovranno essere elaborati sulla base di metodi 
statistici appropriati e generalmente riconosciuti. I metodi statistici 
saranno selezionati durante la fase di progettazione dello studio.  
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni.  
Animali da esperimento:  
— ceppo utilizzato,  
— numero e età degli animali,  
— origine, condizioni di allogiamento, ecc.,  
— peso di ciascun animale all'inizio del saggio.  
Condizioni sperimentali:  
— modalità precise di preparazione della sostanza in esame, stabilità 
e omogeneità, ove del caso,  
— motivazione della scelta del veicolo,  
— modalità precise di somministrazione della sostanza in esame,  
— caratteristiche della qualità del cibo e dell'acqua,  
— motivazione della scelta del dosaggio,  
— dosi somministrate, caratteristiche del veicolo, volume e forma 
fisica della sostanza somministrata,  
— tipo di agente protettivo e caratteristiche di somministrazione, 
ove del caso.  
Risultati:  
— dati relativi al peso corporeo,  
— dati relativi alla reazione tossica per ciascun gruppo, compresa la 
mortalità,  
— natura, gravità e durata degli effetti clinici osservati (ed eventuale 
reversibilità),  
— descrizione particolareggiata delle analisi biochimiche e relativi 
risultati,  
— risultati dell'esame necroscopico,  
— descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici,  
— elaborazione statistica dei risultati, ove del caso.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. RIFERIMENTI  
Il presente metodo corrisponde al metodo OCSE TG 418.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 551
 
B.38.  NEUROTOSSICITÀ RITARDATA DI SOSTANZE 
ORGANOFOSFORICHE STUDIO CON SOMMINISTRAZIONE 
RIPETUTA PER 28 GIORNI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Per la valutazione degli effetti tossici delle sostanze è importante 
tener conto della facoltà di talune classi di sostanze di indurre effetti neurotossici specifici che potrebbero non essere messi in luce da altri 
studi di tossicità. Alcune sostanze organofosforiche, che hanno evi ­
denziato una neurotossicità ritardata, dovrebbero essere oggetto di una valutazione in questo senso.
 
Saggi preliminari in vitro consentono di identificare le sostanze su ­
scettibili di indurre una polineuropatia ritardata; tuttavia risultati ne ­
gativi di studi in vitro non garantiscono l'assenza di neurotossicità 
della sostanza saggiata.  
Il presente saggio di neurotossicità ritardata su 28 giorni fornisce 
informazioni sui rischi che l'esposizione ripetuta per un periodo li ­
mitato di tempo può comportare per la salute. Esso consente di trarre 
indicazioni sulla correlazione dose-risposta e di valutare il NOAEL 
applicabile per la determinazione di criteri di sicurezza per l'esposi ­
zione.  
Vedi anche introduzione generale, parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Le sostanze organofosforiche comprendono esteri, tioesteri o anidridi 
organofosforici neutri degli acidi organofosforico, organofosfonico o organofosforamidico o dei corrispondenti acidi fosforotioico, fosfo ­
notioico o fosforotioamidico, o altre sostanze suscettibili di indurre 
gli effetti neurotossici ritardati talvolta osservati in questa classe di sostanze.
 
La neurolossicità ritardata è una sindrome associata ad atassia pro ­
lungata a comparsa tardiva, ad assonopatie distali del midollo spinale e dei nervi periferici e ad un'inibizione e un invecchiamento dell'este ­
rasi suggestiva di neuropatia (NTE, neuropathy target esterase) nei 
tessuti nervosi.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza in esame viene quotidianamente somministrata per via 
orale a galline domestiche per un periodo di 28 giorni. Gli animali vengono esaminati almeno una volta al giorno al fine di individuare eventuali anomalie del comportamento, atassia e paralisi fino a 14 
giorni dopo l'ultima somministrazione. Analisi biochimiche, e in 
particolare l'inibizione della NTE, vengono di norma eseguite 24 e 48 ore dopo l'ultima esposizione su galline selezionate da ciascun gruppo secondo un criterio di casualità. Due settimane dopo l'ultima 
somministrazione si sopprimono gli animali superstiti e si procede 
all'esame istopatologico di determinati tessuti nervosi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 552
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.4.1.  Preparazioni  
Galline adulte, giovani e sane, che non presentino affezioni virali e 
non siano trattate con farmaci suscettibili di alterare i risultati del 
saggio, nonché esenti da turbe della deambulazione, vengono asse ­
gnate in modo casuale a gruppi da trattare e di controllo e acclima ­
tate alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni prima dell'ini ­
zio del saggio.  
La gabbie o i recinti saranno sufficientemente ampi affinché gli 
animali possano muoversi liberamente ed essere facilmente osservati 
durante la deambulazione.  
La sostanza viene somministrata giornalmente, sette giorni su sette, 
preferibilmente tramite sonda gastrica o capsule di gelatina. Le so ­
stanze liquide possono essere somministrate non diluite o disciolte in 
un veicolo appropriato, quale l'olio di mais. Se possibile, si avrà cura di sciogliere le sostanze solide, in quanto dosi elevate di tali sostanze in capsule di gelatina possono non essere completamente assorbite. 
Per i veicoli non acquosi, le caratteristiche di tossicità del veicolo 
dovranno essere note o, in caso contrario, determinate prima del saggio.
 
1.4.2.  Condizioni sperimentali  
1.4.2.1.  Animali da esperimento  
Si utilizzeranno di preferenza galline domestiche ovaiole ( Gallus 
gallus domesticus ), giovani e adulte, di età compresa tra 8 e 
12 mesi, appartenenti a razze e a ceppi di taglia standard. Gli animali 
saranno allevati in condizioni che ne garantiscano la libertà di mo ­
vimento.  
1.4.2.2.  Numero e sesso  
Si utilizzano di norma almeno tre gruppi da trattare ed uno di con ­
trollo con somministrazione del solo veicolo. Quest'ultimo sarà trat ­
tato in modo identico ai primi, tranne per il fatto che agli animali 
non verrà somministrata la sostanza in esame.  
Ogni gruppo dovrà comprendere un numero sufficiente di animali, in 
modo che almeno sei esemplari possano essere soppressi per effet ­
tuare le analisi biochimiche (tre a 24 e tre a 48 ore di distanza dall'ultima somministrazione) ed altri sei possano sopravvivere per 
i 14 giorni del periodo di osservazione.
 
1.4.2.3.  Livelli di dosaggio  
I livelli di dosaggio dovranno essere selezionati tenendo conto dei 
risultati del saggio di neurotossicità ritardata dopo esposizione acuta e di tutti i dati di tossicità o di tossicocinetica esistenti per la so ­
stanza in esame. Il livello massimo di dosaggio dovrà essere tale da 
indurre effetti tossici, preferibilmente effetti neurotossici ritardati, senza tuttavia cagionare la morte o sofferenze gravi. Sarà inoltre definita una serie descrescente di dosaggi al fine di individuare 
eventuali risposte a dosi determinate e dimostrare l'assenza di effetti 
avversi al dosaggio minimo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 553
 
1.4.2.4.  Saggio limite  
Qualora un saggio, effettuato in conformità con il metodo descritto, 
con un livello di dosaggio di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/ ­
giorno, non produca effetti tossici evidenti e se i dati relativi a 
sostanze di struttura affine non sono suggestivi di tossicità, può 
non essere necessario somministrare un dosaggio superiore. Il saggio limite giustificato, salvo nel caso in cui l'esposizione umana comporti la necessità di utilizzare un più elevato livello di dosaggio.
 
1.4.2.5.  Periodo di osservazione  
Tutti gli animali saranno esaminati almeno quotidianamente durante 
il periodo di esposizione e nei 14 giorni successivi, salvo nel caso in 
cui sia previsto un esame necroscopico.  
1.4.3.  Procedimento  
La sostanza in esame viene somministrata sette giorni su sette per un 
periodo di 28 giorni.  
1.4.3.1.  Osservazioni generali  
Il periodo di osservazione inizia subito dopo l'esposizione alla so ­
stanza. Tutte le galline saranno accuratamente esaminate almeno una volta al giorno per i 28 giorni del trattamento e i 14 giorni succes ­
sivi, fino al momento della loro soppressione. Si registreranno futi i 
segni di tossicità, specificandone il momento della comparsa, la 
natura, la gravità e la durata. Le osservazioni riguarderanno, tra l'altro, eventuali anomalie comportamentali. Per l'atassia si utilizzerà 
un sistema di classificazione comprendente un minimo di quattro 
livelli; si registreranno altresì i casi di paralisi. Almeno due volte alla settimana le galline selezionate per l'osservazione dovranno es ­
sere tolte dalle gabbie e sottoposte ad attività motoria forzata (ad 
esempio salire le scale) al fine di agevolare l'osservazione degli ef ­
fetti tossici minimi. Gli animali moribondi o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza dovranno essere immediatamente sottoposti ad eutanasia e ad esame necroscopico.
 
1.4.3.2.  Peso corporeo  
Tutte le galline saranno pesate poco prima della somministrazione 
della sostanza e almeno una volta alla settimana successivamente.  
1.4.3.3.  Biochimica  
Pochi giorni dopo l'ultima esposizione si sopprimeranno sei galline 
scelte in modo casuale da ciascuno dei gruppi trattati e dal gruppo di 
controllo con somministrazione del solo veicolo. Il cervello e il 
midollo spinale lombare saranno quindi preparati e analizzati per identificare un'eventuale attività di inibizione della NTE. Inoltre può essere utile effettuare la stessa analisi su tessuti del nervo scia ­
tico. Generalmente si sopprimono tre animali per il gruppo di con ­
trollo e per ciascuno dei gruppi trattati dopo 24 ore ed altri tre dopo 48 ore dall'ultima somministrazione. Qualora ciò risulti preferibile in 
base ai risultati dello studio con esposizione acuta o di altri studi (ad 
esempio di tossicocinetica), si potranno modificare i tempi previsti per la soppresisone degli animali. Tale scelta dovrà essere tuttavia scientificamente motivata.
 
Se del caso, è possibile effettuare su tali tessuti analisi dell'acetilco ­
linesterasi (AChE). Tuttavia si può avere una riattivazione spontanea 
dell'AChE  in vivo , il che potrebbe indurre a sottovalutare il poten ­
ziale di inibizione dell'AChE di una sostanza.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 554
 
1.4.3.4.  Necroscopia macroscopica  
L'esame necroscopico di tutti gli animali (sia di quelli soppressi 
come da programma che di quelli sottoposti ad eutanasia) dovrà comprendere l'osservazione dell'aspetto del cervello e del midollo 
spinale.
 
1.4.3.5.  Esame istopatologico  
I tessuti nervosi degli animali sopravvissuti al periodo di osserva ­
zione e non utilizzati per gli studi biochimici saranno sottoposti ad 
esame microscopico. Essi saranno fissati in situ con tecniche di 
perfusione. I prelievi tissutali saranno effettuati su cervelletto (piano longitudinale medio), midollo allungato, midollo spinale e nervi pe ­
riferici. Il midollo spinale sarà prelevato dal tratto cervicale superio ­
re, dal terzo toracico centrale e dal tratto lombosacrale. Si preleve ­
ranno inoltre tessuti dal segmento distale del nervo tibiale e delle sue ramificazioni verso il muscolo gastrocnemio e dal nervo sciatico. I tessuti saranno colorati con apposti coloranti specifici per la mielina 
e gli assoni. L'esame microscopico sarà dapprima effettuato su tessuti 
conservati di tutti gli animali del gruppo di controllo e di quello trattato con il livello massimo di dosaggio. Qualora in questo gruppo si riscontrino effetti, si procederà all'esame microscopico di tessuti 
prelevati da animali appartenenti agli altri due gruppi (rispettiva ­
mente con somministrazione del dosaggio intermedio e del dosaggio minimo).
 
2. DATI  
Di norma, se i risultati ottenuti per i parametri di valutazione adottati 
nel presente metodo (biochimica, istopatologia e osservazione del 
comportamento) sono negativi, non è necessario eseguire ulteriori saggi di neurotossicità ritardata. Risultati equivoci o non conclusivi possono invece richiedere un approfondimento.
 
Dovranno essere forniti i dati individuali di ciascun animale. Inoltre, 
tutti i dati dovranno essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo, il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di 
animali recanti lesioni, alterazioni del comportamento o effetti bio ­
chimici, la natura e la gravita di detti effetti o lesioni e la percentuale di animali per ogni tipo di effetto o lesione e per ogni livello di gravità.
 
I risultati del presente studio dovranno essere valutati in termini di 
incidenza, gravità e correlazione tra effetti comportamentali, biochi ­
mici e istopatologici e qualsiasi altro effetto osservato nei gruppi 
trattati e di controllo.  
I risultati numerici dovranno essere elaborati sulla base di metodi 
statistici appropriati e generalmente riconosciuti. I metodi statistici saranno selezionati durante la fase di progettazione dello studio.
 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni.  
Animali da esperimento:  
— ceppo utilizzato,  
— numero e età degli animali,  
— origine, condizioni di alloggiamento, ecc.,  
— peso di ciascun animale all'inizio del saggio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 555
 
Condizioni sperimentali:  
— modalità precise di preparazione della sostanza in esame, stabilità 
e omogeneità, ove del caso,  
— motivazione della scelta del veicolo,  
— modalità precise di somministrazione della sostanza in esame,  
— caratteristiche della qualità del cibo e dell'acqua,  
— motivazione della scelta del dosaggio,  
— dosi somministrate, caratteristiche del veicolo, volume e forma 
fisica della sostanza somministrata,  
— qualora le analisi biochimiche vengano effettuate in tempi diversi 
da quelli previsti (24 e 48 h), motivazione di tale scelta.  
Risultati:  
— dati relativi al peso corporeo,  
— dati relativi alla reazione tossica per ciascun livello di dosaggio, 
compresa la mortalità,  
— livello di esposizione massimo per il quale non siano stati osser ­
vati effetti avversi (NOAEL),  
— natura, gravità e durata degli effetti clinici osservati (ed eventuale 
reversibilità),  
— descrizione particolareggiata delle analisi biochimiche e relativi 
risultati,  
— risultati dell'esame necroscopico,  
— descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici,  
— elaborazione statistica dei risultati, ove del caso.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. RIFERIMENTI  
Il presente metodo corrisponde al metodo OCSE TG 419.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 556
 
B.39.  TEST  IN VIVO  DI SINTESI NON PROGRAMMATA DI DNA 
(UDS) SU CELLULE EPATICHE DI MAMMIFERO  
1. METODO  
Il metodo è ripreso dal metodo OECD TG 486, (UDS) Test with 
Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il saggio  in vivo  della sintesi non programmata di DNA (Unschedu ­
led DNA Synthesis — UDS) su cellule epatiche di mammifero è destinato ad identificare le sostanze che inducono la riparazione del DNA nelle cellule epatiche degli animali trattati [cfr. (1) (2) (3) (4)].
 
Questo test  in vivo  fornisce un metodo per studiare gli effetti geno ­
tossici di sostanze chimiche sul fegato. L'effetto misurato è indice di 
danno al DNA e successiva riparazione nelle cellule epatiche. Il fegato è di norma la sede principale del metabolismo delle sostanze assorbite. Rappresenta pertanto il sito idoneo per misurare  in vivo  il 
danno al DNA.
 
Questo saggio non è idoneo se è evidente che la sostanza in esame 
non raggiunge il tessuto bersaglio.  
La sintesi non programmata dì DNA (UDS) è misurata determinando 
l'assorbimento di nucleosidi marcati nelle cellule in cui non è in corso una sintesi programmata (fase S) del DNA. La tecnica più comunemente usata è la determinazione mediante autoradiografia 
dell'assorbimento di timidina marcata con tritio (
 3 H-TdR). Per il 
test UDS  in vivo  si usa di preferenza il fegato di ratto. Si possono 
usare anche altri tessuti, ma non sono oggetto del presente metodo.  
L'individuazione di una risposta UDS dipende dal numero di basi del 
DNA escisse e sostituite nel sito danneggiato. Il saggio di UDS 
pertanto è particolarmente valido per individuare la riparazione di 
sequenze lunghe (da 20 a 30 basi) indotta dalla sostanza. È molto meno sensibile invece trattandosi di rilevare la riparazione di se ­
quenze corte (1-3 basi). Fenomeni di mutagenesi possono inoltre 
risultare da mancata riparazione o riparazione difettosa di lesioni 
del DNA o da errata replicazione. Il grado di risposta di UDS non fornisce alcuna indicazione sulla fedeltà del meccanismo di ripara ­
zione. Inoltre un agente mutageno può reagire con il DNA senza che 
il danno prodotto al DNA sia riparato con un processo di riparazione 
per escissione. L'impossibilità di ottenere con il saggio UDS infor ­
mazioni specifiche sull'attività mutagena è compensata dalla sua po ­
tenziale sensibilità, in quanto viene misurato nell'intero genoma.
 
Cfr. anche introduzione generale parte B.  
1.2. DEFINIZIONI  
Cellule in riparazione:  cellule in cui il numero di grani nucleari 
netti (NNG) è superiore ad un valore prestabilito, che il laboratorio 
che effettua il saggio deve motivare.  
Grani nucleari netti (NNG):  misura quantitativa in autoradiografìa 
dell'attività di UDS delle cellule, calcolata sottraendo il numero me ­
dio di grani citoplasmici in aree citoplasmiche equivalenti al nucleo (CG) dal numero di grani nucleari (NG): NNG = NG-CG. I NNG 
sono conteggiati per le singole cellule, poi sommati per le cellule di 
una coltura, di colture in parallelo, ecc.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 557
 
Sintesi non programmata di DNA (UDS):  sintesi di riparazione del 
DNA dopo escissione e rimozione di un tratto di DNA che contiene 
una regione danneggiata per effetto di sostanze chimiche o agenti fisici.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Il saggio UDS  in vivo  su cellule epatiche di mammifero permette di 
individuare la sintesi di riparazione del DNA dopo escissione e rimozione di un tratto di DNA contenente una regione che presenta 
un danno indotto da sostanze chimiche o agenti fisici. Il test è di 
solito basato sull'incorporazione di
 3 H-TdR nel DNA di cellule epa ­
tiche che presentano una bassa frequenza di cellule nella fase S del ciclo cellulare. La captazione di
 3 H-TdR è solitamente determinata 
mediante autoradiografia, non essendo tale tecnica soggetta ad inter ­
ferenze da parte delle cellule nella fase S, a differenza, ad esempio, del conteggio per scintillazione in fase liquida.
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1.  Preparazioni  
1.4.1.1.  Scelta delle specie ammali  
Il ratto è la specie più comunemente usata, ma si può usare qualsiasi 
specie di mammifero adatta. Si scelgano individui adulti, giovani e in 
buona salute, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. All'ini ­
zio dello studio la variazione di peso tra gli animali deve essere minima e non superare ± 20 % del peso medio per sesso.
 
1.4.1.2.  Condizioni dì stabulazione e alimentazione  
Valgono le condizioni generali citate nell'Introduzione generale alla 
parte B; l'umidità ideale è pari al 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preparazione degli animali  
Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi 
di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere disposte in 
modo da minimizzare eventuali effetti dovuti alla posizione. Gli animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle con ­
dizioni di laboratorio per almeno cinque giorni.
 
1.4.1.4.  Sostanze in esame/preparazione  
Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione 
in adeguati solventi o mezzi disperdenti e, se necessario, diluite 
prima di essere somministrate agli animali. Le sostanze liquide pos ­
sono essere somministrate direttamente o diluite prima del trattamen ­
to. Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conserva ­
zione è ammissibile.
 
1.4.2.  Condizioni di esperimento  
1.4.2.1.  Solvente/mezzo disperdente  
Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle 
dosi usate e non deve reagire chimicamente con la sostanza in esa ­
me. L'uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilita. Si raccomanda di 
prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l'uso di un 
solvente/mezzo disperdente acquoso.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 558
 
1.4.2.2.  Controlli  
Ogni parte dell'esperimento condotta separatamente dovrà compren ­
dere controlli positivi e negativi (solvente/mezzo disperdente). Gli animali dei vari gruppi dovranno essere trattati in modo identico, 
salvo per la somministrazione della sostanza in esame.
 
I controlli positivi devono essere effettuati con sostanze che produ ­
cono UDS  in vivo  a livelli di esposizione ai quali è previsto un 
aumento rilevabile rispetto alla media. I controlli positivi che richie ­
dono un'attivazione metabolica devono essere usati a dosi che pro ­
vochino una risposta moderata (4). Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore d'identità dei vetrini codificati. 
Fra gli esempi di sostanze per i controlli positivi si citano:
 
Fasi di campionamento Sostanza N. CAS N. Einecs  
Fasi di campionamento precoci 
(2-4 ore) N-Nitrosodimetilammina 62-75-9 200-249-8 
Fasi di campionamento tardive 
(12-16 ore) N-2-Fluorenilacetammide 
(2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Sono ammesse altre sostanze adeguate per i controlli positivi. Il 
controllo positivo può essere somministrato per una via diversa ri ­
spetto alla sostanza in esame.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Numero e sesso degli animali  
Si usi un numero di animali adeguato, per tener conto delle normali 
variazioni biologiche di risposta al saggio. Ogni gruppo dovrebbe comprendere almeno 3 animali analizzabili. Qualora esista una base di dati precedenti significativa, sono sufficienti 1 o 2 animali per i 
gruppi di controllo negativo e positivo.
 
Se al momento dello studio sono disponibili dati relativi a studi sulla 
stessa specie, nei quali è stata usata la stessa via di esposizione, che dimostrano che non vi sono sostanziali differenze di tossicità tra i 
sessi, sarà sufficiente effettuare il test su un singolo sesso, preferi ­
bilmente sui maschi. Se l'esposizione umana a sostanze chimiche è specifica per un sesso, ad esempio nel caso di alcuni prodotti far ­
maceutici, il test deve essere eseguito su animali di tale sesso.
 
1.5.2.  Protocollo di trattamento  
Le sostanze in esame vengono in generale somministrate in un'unica 
volta.  
1.5.3.  Dosi  
Di norma si usano almeno due dosi. La dose massima è definita 
come dose che produce segni di tossicità tali che livelli più elevati, con la stessa posologia, sarebbero presumibilmente letali. In linea di 
principio la dose inferiore dovrebbe andare dal 50 % al 25 % della 
dose massima.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 559
 
Sostanze con azione biologica specifica, a dosi basse non tossiche 
(come ormoni e mitogeni) possono costituire eccezione rispetto ai 
criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso. Se si procede a uno studio per individuare l'intervallo di dosi, non essendo disponibili dati utili in materia, questo va eseguito nello stesso labo ­
ratorio, sulla stessa specie e ceppo, con il medesimo protocollo usato 
nel test principale.
 
La dose massima può anche essere definita come dose che produce 
qualche segno di epatotossicità (ad esempio nuclei picnotici).  
1.5.4.  Saggio con dose limite  
Se la somministrazione di una dose di almeno 2 000 mg/kg di peso 
corporeo in una singola presa o in due prese lo stesso giorno non produce effetti tossici rilevabili, e se non c'è ragione di sospettare genotossicità sulla base di dati relativi a sostanze strutturalmente 
correlate, può essere superfluo uno studio completo. Sulla base 
dell’esposizione umana prevista per la sostanza in esame, può essere necessario usare una dose più elevata nel test con dose limite.
 
1.5.5.  Somministrazione delle dosi  
La sostanza in esame viene di solito somministrata con sonda ga ­
strica o cannula di intubazione, oppure mediante iniezione intraperi ­
toneale. Possono essere accettate altre vie se esiste una valida ragio ­
ne. La via intraperitoneale non è però raccomandata, in quanto po ­
trebbe esporre il fegato alla sostanza in esame direttamente, e non 
attraverso il sistema circolatorio. Il volume massimo di liquido som ­
ministrabile in una volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell'animale da laboratorio; non deve superare i 2 ml/100 g di peso corporeo. L'uso di volumi più elevati deve essere 
motivato. Salvo per sostanze irritanti o corrosive, che di norma 
riveleranno effetti esacerbati a concentrazioni più elevate, le varia ­
zioni di volume devono essere minimizzate, regolando la concentra ­
zione in modo da garantire un volume costante a tutte le dosi.
 
1.5.6.  Preparazione delle cellule epatiche  
Di norma le cellule epatiche sono prelevate da animali trattati e 
preparate 12-16 ore dopo la somministrazione. In genere è necessario un altro prelievo dopo un periodo più breve (di norma da 2 a 4 ore dopo il trattamento), salvo che a 12-16 ore si abbia una risposta 
positiva chiara. Si possono comunque usare fasi di campionamento 
diverse se motivate sulla base di dati tossicocinetici.
 
Le colture a breve termine di cellule epatiche di mammifero sono di 
solito costituite mediante perfusione del fegato in situ con collage ­
nasi, lasciando poi le cellule epatiche appena dissociate aderire ad 
una superficie idonea. Le cellule epatiche dei controlli negativi do ­
vrebbero avere una vitalità (5) almeno del 50 %.  
1.5.7.  Determinazione dell’UDS  
Le cellule epatiche di mammifero appena isolate sono poste in in ­
cubazione, di norma su terreno contenente  3 H-TdR, per un periodo 
adeguato, ad esempio da 3 a 8 ore. Al termine dell'incubazione, si rimuova il terreno dalle cellule, che possono poi essere incubate con terreno contenente un eccesso di timidina non marcata, per ridurre la 
radioattività non incorporata («cold chase»). Le cellule vengono poi 
risciacquate, fissate ed essiccate. Per tempi di incubazione più pro ­
lungati, la «cold chase» può essere superflua. I vetrini sono immersi in emulsione autoradiografica, esposti al buio (ad esempio refrigerati 
per 7-14 giorni), sviluppati, colorati; si contano quindi i grani d'ar ­
gento. Per ogni animale si preparano due o tre vetrini.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 560
 
1.5.8.  Analisi  
I preparati su vetrino devono contenere cellule di morfologia nor ­
male in numero sufficiente per permettere una valutazione probante dell'UDS. I preparati sono esaminati al microscopio alla ricerca di 
segni evidenti di citotossicìtà (ad esempio picnosi, livelli ridotti di 
radiomarcatura).
 
Si codifichino i vetrini prima del conteggio dei grani. Di norma si 
analizzano 100 cellule per animale, su almeno due vetrini. L'analisi di un numero inferiore a 100 cellule per animale deve essere moti ­
vato. Nel conteggio dei grani non si tiene conto dei nuclei in fase S, 
ma si può registrare la percentuale delle cellule in fase S.
 
Il grado di incorporazione della  3 H-TdR nel nucleo e nel citoplasma 
di cellule morfologicamente normali, messo in evidenza dal deposito 
di granuli di argento, deve essere determinato mediante metodi ade ­
guati.  
Il numero dei grani è determinato sui nuclei (grani nucleari, NG) e 
su aree del citoplasma equivalenti al nucleo (grani citoplasmici, CG). Il numero dei CG è determinato prendendo in considerazione l'area 
più densamente marcata del citoplasma, oppure in base alla media di 
due o più regioni citoplasmiche adiacenti al nucleo, scelte casual ­
mente. Si possono usare altri metodi di conteggio (ad esempio il conteggio delle cellule complete) se motivabili (6).
 
2. RISULTATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Si forniscano i dati relativi ai singoli vetrini e ai singoli animali. 
Inoltre tutti i dati devono essere riassunti in tabelle. Il numero dei 
grani nucleari netti (NNG) va determinato per ciascuna cellula, per ciascun animale e per ciascuna dose e fase di prelievo sottraendo il numero dei CG dal numero dei NG. Se si contano le «cellule in 
riparazione», i criteri di definizione delle «cellule in riparazione» 
devono essere motivati e basati sui dati di controlli negativi prece ­
denti o paralleli. I risultati numerici possono essere valutati mediante metodi statistici. Gli eventuali test statistici devono essere scelti e 
motivati prima di condurre lo studio.
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Esempi di criteri che permettono di concludere che la risposta è 
positiva o negativa: 
risposta posi ­
tiva i) valori di NNG superiori ad una soglia presta ­
bilita, motivata sulla base di dati di laboratorio 
precedenti; o 
ii) valori di NNG significativamente maggiori ri ­
spetto al controllo parallelo; 
risposta nega ­
tiva i) valori di NNG uguali o inferiori alla soglia dei 
controlli precedenti; o 
ii) valori di NNG non significativamente mag ­
giori rispetto al controllo parallelo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 561
 
Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista 
biologico; si tenga conto di parametri quali le variazioni intraspecifì ­
che, la relazione dose-risposta e la citotossicità. Si possono usare metodi statistici come ausilio nella valutazione dei risultati sperimen ­
tali, ma la significatività statistica non dovrebbe essere l'unico attore 
determinante di una risposta positiva.
 
La maggior parte degli esperimenti fornirà indubbiamente risultati 
chiaramente positivi o negativi ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull'azione 
della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui nono ­
stante l'esperimento venga ripetuto più volte.
 
Risultati positivi del saggio  in vivo  su cellule epatiche di mammifero 
indicano che la sostanza in esame induce nel DNA di cellule epati ­
che di mammifero  in vivo  un danno che può essere riparato in vitro 
mediante sintesi non programmata del DNA. Risultati negativi indi ­
cano che, nelle condizioni di esperimento, la sostanza in esame non induce nel DNA danni rilevabili mediante questo saggio.
 
Si vagli la probabilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti 
entrino in circolo o raggiungano specificamente il tessuto bersaglio (tossicità sistemica).
 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio dovrà contenere le seguenti informazioni.  
Solvente/mezzo disperdente:  
— motivazione della scelta del mezzo disperdente,  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo 
disperdente, se nota.  
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo usato,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.,  
— peso dei singoli animali all'inizio del test, con range, media e 
deviazione standard per ciascun gruppo.  
Condizioni di esperimento:  
— controlli positivi e negativi mezzo disperdente/solvente,  
— risultati dello studio per individuare l'intervallo di dosi, se effet ­
tuato,  
— criteri di selezione delle dosi,  
— illustrazione paiticolareggiata della preparazione della sostanza in 
esame,  
— illustrazione particolareggiata della somministrazione della so ­
stanza in esame,  
— criteri di selezione della via di somministrazione,  
— metodi usati per verificare che la sostanza in esame sia entrata in 
circolo o abbia raggiunto il tessuto bersaglio, se del caso,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 562
 
— conversione della concentrazione (ppm) della sostanza in esame 
nel cibo o nell'acqua potabile nella dose effettiva (mg/kg di peso 
corporeo/giorno), se del caso,  
— dettagli relativi alla qualità del cibo e dell'acqua,  
— descrizione dettagliata dei protocolli di trattamento e campiona ­
mento,  
— metodi di misura della tossicità,  
— metodo di preparazione e di coltura delle cellule epatiche,  
— tecnica autoradiografica usata,  
— numero di vetrini preparati e numero di cellule analizzate,  
— criteri di valutazione,  
— criteri in base ai quali i risultati sono giudicati positivi, negativi o 
ambigui.  
Risultati:  
— valori medi dei grani nucleari, dei grani citoplasmici, e dei grani 
nucleari netti per vetrino, per animale e per gruppo,  
— relazione dose-risposta, se possibile,  
— eventuali analisi statistiche,  
— segni di tossicità,  
— dati sui controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) e positivi 
paralleli,  
— dati sui precedenti controlli negativi (solvente/mezzo disperdente) 
con intervalli, medie e deviazioni standard,  
— numero di «cellule in riparazione», se determinato,  
— numero di cellule in fase S, se determinato,  
— vitalità delle cellule.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985), An Assessment of the in Vivo Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.  
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay, 
Mutation Res., 189, pp. 123-133.  
(3) Kennelly, J.C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson 
B., Benford, D. J., Dean, S.W. and Mitchell I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M, 
(eds.), Supplementary Mutagenicily Tests: UKEM Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidlines for Mu ­
lagenicity Testing Report. Part II revised, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 52-77.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 563
 
(4) Madie, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C.A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutations Res., 312, pp. 263- 285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger- 
Freudl, C. (1993), Assessment of the Relation Between the 
Initital Viability and the Attachment of Freshly Isolateci Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
 
(6) Mirsalis, J.C, Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982), De ­
tection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro He ­
patocyte DNA Repair Assay, Environ Mutagen, 4, pp. 553- 562.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 564
 
B.40.  CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: TEST DI RESISTENZA 
ELETTRICA TRANSCUTANEA (TER)  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde alle linee guida OCSE TG 430 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Per corrosione cutanea si intende il manifestarsi di lesioni irreversi ­
bili sulla pelle dopo l'applicazione della sostanza che si intende 
testare (come definita dal Globally Harmonised System for the Clas ­
sification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures (GHS)(1). Il presente metodo prevede una procedura per la valuta ­
zione della corrosività che non è condotta su animali vivi.
 
Tipicamente, la valutazione della corrosività cutanea è effettuata su 
cavie (2). Gli aspetti connessi al dolore ed alla sofferenza inflitti agli 
animali ai fini del test di corrosività sono stati affrontati in occasione della revisione del metodo di prova B.4, che consente di determinare la corrosione cutanea tramite metodi alternativi in vitro, evitando la 
sofferenza degli animali.
 
Il primo passo verso la definizione di test alternativi atti a studiare la 
corrosività cutanea a fini regolamentari è stato la realizzazione di studi di prevalidazione (3). Successivamente è stato realizzato (6) ­
(7)(8) uno studio di validazione formale dei metodi in vitro di va ­
lutazione della corrosione cutanea (4)(5). I risultati di questi studi e 
di altri documenti pubblicati hanno permesso di stabilire che i se ­
guenti test potevano essere utilizzati per valutare la corrosività cuta ­
nea in vivo  (9)(10)(11): il test eseguito su modelli di pelle umana 
(cfr. il metodo di prova B.40  bis) e il test di resistenza elettrica 
transcutanea (TER, il presente metodo).
 
I risultati di uno studio di validazione e di altri studi pubblicati 
indicano che il test di resistenza elettrica (TER) condotto sui ratti (12)(13) è in grado di discriminare in modo affidabile, tra le sostanze conosciute, quelle che sono corrosive e non corrosive 
per la pelle (5)(9).
 
Il test descritto nel presente metodo permette di identificare le so ­
stanze e i composti chimici corrosivi. Permette inoltre l'identifica ­
zione delle sostanze e dei composti non corrosivi se sostenuto da molte prove basate su altre informazioni esistenti (ad esempio, pH, 
relazioni struttura/attività, dati relativi agli esseri umani e/o agli ani ­
mali) (1)(2)(11)(14). Non fornisce informazioni pertinenti sull'irrita ­
zione cutanea, né permette la sottocategorizzazione delle sostanze corrosive conformemente al sistema armonizzato universale di clas ­
sificazione (GHS) (1).
 
Per una valutazione completa degli effetti cutanei locali dopo una 
singola esposizione della cute, si raccomanda di applicare la strategia 
di test sequenziale allegata al metodo di prova B.4 (2) e descritta nel sistema armonizzato universale (1). Detta strategia sperimentale com ­
porta la realizzazione di test in vitro volti a determinare la corrosione 
cutanea (come descritta nel presente metodo) e l'irritazione cutanea 
prima di prevedere la conduzione di test su animali vivi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 565
 
1.2. DEFINIZIONI  
Corrosione cutanea  in vivo : è il manifestarsi di lesioni irreversibili 
della pelle, vale a dire, necrosi visibile dell'epidermide e del derma, a seguito dell'applicazione della sostanza di prova per non più di quat ­
tro ore. Le reazioni corrosive sono caratterizzate da ulcere, emorra ­
gie, escare sanguinanti e, alla fine dell'osservazione, il giorno 14, da alterazione del colore dovuta a pallore della cute, zone di completa alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie effettuare eventual ­
mente un esame istopatologico.
 
Resistenza elettrica transcutanea (TER):  misurazione dell'impe ­
denza elettrica della pelle, come valore di resistenza espressa in kΩ (kilo-ohm). Si tratta di un metodo al contempo semplice ed 
affidabile per valutare la funzione di barriera tramite la registrazione 
del passaggio di ioni attraverso la pelle per mezzo di un ponte di 
Wheatstone.
 
1.3. SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
Tabella 1  
Sostanze chimiche di riferimento  
Denominazione N. Einecs N. CAS  
1,2-diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Fortemente corrosivo 
Acido acrilico 201-177-9 79-10-7 Fortemente corrosivo 2-tert-butilfenolo 201-807-2 88-18-6 Corrosivo Idrossido di potassio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo Acido solforico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo Acido ottanoico (caprilico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo 
4-amino-1,2,4-triazolo 209-533-5 584-13-4 Non corrosivo 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Non corrosivo Fenetil bromuro 203-130-8 103-63-9 Non corrosivo Tetracloroetilene 204-825-9 27-18-4 Non corrosivo Acido isostearico 250-178-0 30399-84-9 Non corrosivo 4-(metiltio)-benzaldeide 222-365-7 3446-89-7 Non corrosivo
 
La maggior parte delle sostanze chimiche sopra elencate proviene 
dall'elenco delle sostanze chimiche selezionate per lo studio di vali ­
dazione internazionale di ECVAM (4). Detta selezione si basa sui criteri seguenti:
 
i) ugual numero di sostanze corrosive e non corrosive;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 566
 
ii) sostanze disponibili in commercio, rappresentanti la maggior 
parte delle classi chimiche pertinenti;  
iii) l'inclusione di sostanze fortemente corrosive e meno corrosive ai 
fini della discriminazione in base al potere corrosivo;  
iv) selezione di sostanze chimiche che possono essere trattate in 
laboratorio senza presentare altri rischi gravi oltre alla corrosività.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza di prova è applicata per non più di 24 ore sulla super ­
ficie epidermica di dischi di tessuto cutaneo in un sistema di test a due compartimenti nel quale i dischi di tessuto cutaneo fungono da 
separatori tra i compartimenti. I dischi di tessuto cutaneo sono pre ­
levati da ratti di 28-30 giorni, soppressi con metodi non cruenti. Le materie corrosive sono individuate in base alla loro capacità di com ­
portare una perdita dell'integrità dello strato corneo normale e della 
funzione di barriera, che si misura come riduzione della TER al di 
sotto di un livello soglia (12). Per la TER dei ratti, un valore limite di 5 kΩ è stato scelto sulla base di molti dati relativi ad un elevato 
numero di sostanze chimiche per le quali la maggior parte dei valori 
era nettamente superiore (spesso > 10 k Ω), o nettamente inferiore 
(spesso < 3 k Ω) a tale valore (12). In generale, le sostanze che non 
sono corrosive per gli animali ma che sono irritanti o non irritanti non comportano una riduzione della TER al di sotto di tale valore 
limite. Inoltre, l'utilizzo di altre preparazioni cutanee o di altre at ­
trezzature può alterare il valore limite, rendendo necessaria in tal caso una validazione supplementare.
 
La procedura sperimentale include una sequenza relativa alla fissa ­
zione del colorante al fine di confermare i risultati positivi del TER con valori attorno a 5 k Ω. Tale sequenza determina se l'aumento 
della permeabilità ionica è dovuto alla distruzione fisica dello strato 
corneo. È stato dimostrato che il metodo TER su pelle di ratto 
permetteva di predire la corrosività  in vivo  nel coniglio valutato 
con il metodo di prova B.4 (2). Giova osservare che il test  in vivo  
sul coniglio è estremamente conservativo per quanto riguarda la 
corrosività cutanea e l'irritazione cutanea rispetto al test sul tessuto 
cutaneo umano (15).
 
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.5.1.  Animali  
I ratti sono la specie di elezione, giacché la sensibilità della loro 
pelle alle sostanze chimiche utilizzate nel test è stata già dimostrata (10). L'età (al momento in cui la cute è prelevata) ed il ceppo del ratto sono particolarmente importanti perché si deve essere sicuri che 
i follicoli piliferi siano in fase d'inattività, prima dell'inizio della 
crescita dei peli adulti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 567
 
I peli della zona dorsale e laterale di giovani ratti maschi o femmine 
di circa 22 giorni (Wistar o ceppo comparabile) sono rimossi con 
cura per mezzo di piccole forbici. Gli animali sono successivamente lavati con cura mediante pezze bagnate e la zona rimossa è immersa in una soluzione antibiotica (contenente, ad esempio, streptomicina, 
penicillina, cloramfenicolo e amfotericina a concentrazioni efficaci 
per inibire la crescita batterica). Gli animali sono nuovamente lavati con antibiotici il terzo o il quarto giorno dopo il primo lavaggio e sottoposti al test entro 3 giorni dal secondo lavaggio, quando lo 
strato corneo si è rimesso dalla rimozione dei peli.
 
1.5.2.  Preparazione dei dischi di tessuto cutaneo  
Gli animali sono uccisi in modo non cruento quando hanno 28-30 
giorni. La pelle dorso-laterale di ciascun animale è successivamente 
rimossa ed accuratamente liberata da qualsiasi eccesso di grasso sottocutaneo. Vengono rimossi dischi di tessuto cutaneo del diametro di circa 20 mm. Il tessuto cutaneo potrà essere conservato prima 
dell'utilizzo dei dischi se i dati dei controlli positivi e negativi risul ­
tano equivalenti a quelli ottenuti sul tessuto cutaneo fresco.
 
Ciascun disco di tessuto cutaneo è posto su una delle estremità di un 
tubo di politetrafluoroetilene (PTFE), con la superficie epidermica a contatto con il tubo. Dopo aver fissato il disco all'estremità del tubo 
con un anello di tenuta toroidale in gomma, si elimina la parte 
eccedentaria del tessuto. Le dimensioni del tubo e del giunto toroi ­
dale sono indicate nella figura 2. L'anello toroidale di gomma viene quindi fissato con cura all'estremità del tubo per mezzo di vaselina. Il 
tubo è posizionato con una pinza a molla all'interno in un cilindro 
contenente una soluzione di 154 mM di MgSO
 4 (figura 1). Il disco 
cutaneo deve essere interamente sommerso nella soluzione di MgSO
 4 . È possibile ottenere fino a 10-15 dischi di tessuto cutaneo 
dalla pelle di un solo ratto.  
Prima di cominciare le prove, misurare la resistenza elettrica di due 
dischi cutanei per controllare la qualità della pelle di ciascun anima ­
le. I due dischi devono dare valori di resistenza superiori a 10 k Ω 
affinché gli altri dischi possano essere utilizzati per il test. Se il 
valore di resistenza è inferiore a 10 k Ω, gli altri dischi della stessa 
cute devono essere eliminati.  
1.5.3.  Applicazione delle sostanze di prova e delle sostanze di controllo  
Controlli positivi e negativi concorrenti devono essere utilizzati per 
ciascuno studio in modo da garantire un'adeguata prestazione del metodo di prova. Devono essere utilizzati dischi di tessuto cutaneo provenienti da un unico animale. Le sostanze proposte per i controlli 
positivi e negativi sono, rispettivamente, l'acido cloridrico 10 M e 
l'acqua distillata.
 
La sostanza di prova liquida (150 μL) è applicata uniformemente 
sulla superficie epidermica all'interno del tubo. Per il test di sostanze solide, si applica in modo uniforme sul disco di tessuto cutaneo una 
quantità sufficiente di sostanza in modo da coprire la totalità della 
superficie dell'epidermide. Dopo avere aggiunto l'acqua deionizzata (150 μL) sulla sostanza solida, agitare delicatamente il tubo. Per 
ottenere il massimo contatto con la pelle, può risultare necessario 
riscaldare i solidi a 30
 o C per sciogliere o rammollire la sostanza di 
prova o macinarli per ottenere grani o polveri.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 568
 
Tre dischi di pelle sono utilizzati per ciascuna sostanza di prova e di 
controllo. La sostanza di prova è applicata per 24 ore a 20-23  o C, 
quindi rimossa con un getto d'acqua corrente a 30  o C fino alla sua 
completa rimozione.  
1.5.4.  Misurazione della TER  
L'impedenza cutanea è determinata misurando la TER per mezzo di 
un ponte Wheatstone a basso voltaggio e corrente alternata (13). Le 
specificazioni generali del ponte sono una tensione operativa di 1- 3 V, una corrente alternata sinusoidale o rettangolare di 50-1 000 Hz ed un intervallo di misurazione di almeno 0,1-30 k Ω. Il ponte uti ­
lizzato nello studio di validazione misura l'induttanza, la capacitanza 
e la resistenza fino a valori di 2 000 H, 2 000 μF e 2 MΩ, rispet­
tivamente, a frequenze di 100 Hz o 1 kHz, utilizzando valori in serie o paralleli. Ai fini della TER, le misurazioni dei test di corrosività 
sono registrate in resistenza ad una frequenza di 100 Hz utilizzando 
valori in serie. Prima di misurare la resistenza elettrica, la tensione di superficie della pelle è ridotta aggiungendo un volume di etanolo al 70 % sufficiente a coprire l'epidermide. Dopo alcuni secondi, l'eta ­
nolo è rimosso dal tubo ed il tessuto è idratato con l'aggiunta di 
3 mL di soluzione di MgSO
 4 (154 mM). Gli elettrodi del ponte di 
misurazione sono posizionati su entrambi i lati del disco cutaneo per misurare la resistenza in k Ω/disco di tessuto cutaneo (figura 1). Le 
dimensioni degli elettrodi e la lunghezza dell'elettrodo esposto al di 
sotto dei morsetti a coccodrillo sono indicate nella figura 2. Il mor ­
setto attaccato all'elettrodo interno è posto sulla parte superiore del tubo durante la misurazione della resistenza, affinché la lunghezza 
dell'elettrodo immerso nella soluzione di MgSO
 4 resti costante. 
L'elettrodo esterno è posizionato all'interno del cilindro in modo tale da posarsi sul fondo dello stesso. La distanza tra la pinza a molla e la parte inferiore del tubo deve rimanere costante (figura 
2), poiché tale distanza influenza il valore di resistenza che si ottiene. 
Di conseguenza, la distanza tra l'elettrodo interno ed il disco di tessuto cutaneo deve essere costante e minima (1-2 mm).
 
Se la misurazione della resistenza dà un valore superiore a 20 k Ω, 
ciò può essere dovuto ad un residuo della sostanza di prova che copre la superficie epidermica del disco di tessuto cutaneo. Un ten ­
tativo di rimozione della sostanza può essere effettuato, ad esempio, 
turando ermeticamente il tubo con il pollice inguantato ed agitandolo 
per 10 secondi circa; la soluzione di MgSO
 4 viene così completa ­
mente rimossa e la misurazione della resistenza è ripetuta con una nuova soluzione di MgSO
 4 . 
Le proprietà e le dimensioni dell'apparecchiatura e la procedura spe ­
rimentale utilizzate possono influenzare i valori della TER che si ottengono. La soglia di corrosività è stata fissata a 5 k Ω sulla base 
di dati ottenuti con l'apparecchiatura e la procedura sperimentale 
specifiche descritte nel presente metodo. Possono essere applicati diversi valori limite e di controllo nel caso in cui le condizioni sperimentali siano alterate o sia utilizzata una diversa attrezzatura. 
Pertanto, si raccomanda di calibrare la metodologia ed i valori limite 
di resistenza provando una serie di sostanze standard di riferimento scelte fra le sostanze chimiche utilizzate nello studio di validazione (4)(5) o fra classi di sostanze chimiche simili a quelle studiate. Un 
elenco di idonee sostanze chimiche di riferimento è proposto nella 
tabella 1.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 569
 
1.5.5.  Metodi di fissazione del colorante  
L'esposizione ad alcune sostanze non corrosive può comportare una 
diminuzione della resistenza al di sotto del valore soglia di 5 k Ω e 
permettere il passaggio di ioni attraverso lo strato corneo riducendo 
in tal modo la resistenza elettrica (5). Ad esempio, le sostanze or ­
ganiche neutre e le sostanze tensioattive (compresi detergenti, emul ­
sionanti ed altri agenti di superficie) può eliminare i lipidi della cute rendendo in tal modo la barriera più permeabile agli ioni. Di conse ­
guenza, se i valori della TER delle sostanze di prova sono inferiori o 
all'incirca di 5 k Ω in mancanza di lesioni visive, si deve effettuare 
una valutazione della penetrazione del colorante sui tessuti di con ­
trollo ed i tessuti trattati per determinare se i valori della TER otte ­
nuti sono il risultato della maggiore permeabilità della cute o della corrosione cutanea (3)(5). In caso di corrosione cutanea con danno dello strato corneo, il colorante sulforodamina B, quando applicato 
sulla pelle, penetra rapidamente e colora il tessuto sottostante. Questo 
colorante è stabile con un'ampia gamma di sostanze chimiche e non è influenzato dal procedimento di estrazione descritto di seguito.
 
1.5.5.1.  Applicazione ed eliminazione del colorante sulforodamina B  
Al termine della valutazione della TER, il solfato di magnesio è 
rimosso dal tubo ed il tessuto cutaneo è esaminato con cura in cerca di lesioni manifeste. Se non ci sono importanti lesioni manifeste, 150 μL di una diluizione al 10 % (p/v) di colorante sulforodamina B 
(rosso acido 52; n. Einecs 222-529-8; n. CAS 3520-42-1) in acqua 
distillata sono applicati sulla superficie epidermica di ogni disco di tessuto cutaneo per 2 ore. Questi dischi di tessuto vengono succes ­
sivamente lavati con un getto d'acqua corrente a temperatura am ­
biente per circa 10 secondi in modo da eliminare il colorante 
eccedentario/non fissato. Ciascun disco di tessuto cutaneo è rimosso attentamente dal tubo e messo in una fiala (ad esempio, una fiala a scintillazione in vetro di 20 mL) contenente acqua deionizzata 
(8 mL). Agitare delicatamente le fiale per 5 minuti fino ad eliminare 
qualsiasi eccesso di colorante non fissato. Dopo aver ripetuto la procedura di risciacquo, i dischi di tessuto cutaneo sono rimossi e inseriti in fiale contenenti 5 ml di sodio dodecil solfato (SDS) al 
30 % (p/v) in acqua distillata, quindi incubati per una notte a 60
 o C. 
In seguito all'incubazione, ciascun disco di tessuto cutaneo è rimosso 
e scartato e la soluzione restante è centrifugata per 8 minuti a 21  o C 
(forza centrifuga relativa ~175 × g). Un campione di 1 mL di su ­
pernatante è in seguito diluito in rapporto 1:5 (v/v) (cioè 1 mL + 4 mL) con SDS al 30 % (p/v) in acqua distillata. La densità 
ottica (OD) della soluzione è misurata a 565 nm.
 
1.5.5.2.  Calcolo del tasso di colorante  
Il tasso di sulforodamina B in ciascun disco è calcolato sulla base dei 
valori di OD (5) (coefficiente di estinzione molare della sulforoda ­
mina B a 565 nm = 8,7 × 10  4 ; peso molecolare = 580). Il tenore di 
colorante è determinato per ciascun disco di tessuto cutaneo per mezzo di un’idonea curva di taratura. Un tenore medio è quindi calcolato per le prove ripetute.
 
2. DATI  
I valori di resistenza (k Ω) e, eventualmente, i valori di tasso medio 
del colorante ( μg/disco), per la sostanza di prova ed i controlli po ­
sitivi e negativi sono presentati sotto forma di tabella (dati relativi ai 
singoli test e medie ± D.S.), compresi i dati dei test ripetuti/replicati 
ed i valori medi ed individuali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 570
 
2.1. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
I valori medi della TER sono accettati se i valori dei controlli posi ­
tivi e negativi effettuati in parallelo si situano entro gli intervalli accettabili di valori per il metodo utilizzato nel laboratorio di prova. 
Gli intervalli accettabili di resistenza per la metodologia e l'apparec ­
chiatura descritte sono indicati nella tabella seguente:
 
Controllo Sostanza Intervallo di re ­
sistenza (k Ω) 
Positivo 10 M acido cloridrico 0,5-1,0 
Negativo Acqua distillata 10-25  
I valori medi della fissazione del colorante sono accettati a condi ­
zione che i valori dei controlli effettuati in parallelo si situino entro gli intervalli accettabili per il metodo. Gli intervalli accettabili di 
tasso colorante per le sostanze di controllo proposte per la metodo ­
logia e l'apparecchiatura descritte sono i seguenti:
 
Controllo Sostanza Intervallo di 
tasso di colo ­
rante (μg/disco)  
Positivo 10 M acido cloridrico 40-100 
Negativo Acqua distillata 15-35  
La sostanza di prova è considerata non corrosiva per la pelle:  
i) se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza di prova è 
superiore a 5 k; o  
ii) se il valore medio della TER è inferiore o uguale a 5 k Ω; e se  
— il disco di tessuto cutaneo non presenta alcuna lesione mani ­
festa, e  
— il tasso medio di colorante del disco è nettamente inferiore a 
quello del controllo positivo di 10 M HCl realizzato in pa ­
rallelo.  
La sostanza di prova è considerata corrosiva per la pelle:  
i) se il valore medio della TER è inferiore o uguale a 5 k Ω e se il 
disco di tessuto cutaneo presenta lesioni manifeste; o  
ii) se il valore medio della TER è inferiore o uguale a 5 k Ω, e se  
— il disco di tessuto cutaneo non presenta alcuna lesione mani ­
festa, ma soltanto  
— il tasso medio di colorante del disco è maggiore o uguale a 
quello del controllo positivo di 10 M HCl realizzato in pa ­
rallelo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 571
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL SAGGIO  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere le informazioni seguenti.  
Sostanze di prova e sostanze di controllo:  
— denominazioni chimiche, quali i nomi IUPAC o CAS ed il nu ­
mero CAS, se conosciuti,  
— purezza e composizione della sostanza o della preparazione (in 
percentuale ponderale), natura fisica,  
— proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello stu ­
dio, quali la natura fisica, il pH, la stabilità e la solubilità nel ­
l'acqua,  
— trattamento delle sostanze di prova/di controllo prima del test, se 
necessario (ad esempio, riscaldamento, frantumazione);  
— stabilità, se conosciuta.  
Cavie:  
— ceppo e sesso utilizzati,  
— età degli animali in caso d'utilizzo come animali donatori,  
— origine, condizione d'alloggio, alimentazione, ecc.,  
— dettagli sulla preparazione della pelle.  
Condizioni di prova:  
— curve di taratura dell'apparecchiatura di test,  
— curve di taratura delle prestazioni del test di fissazione del colo ­
rante,  
— dettagli sulla procedura sperimentale utilizzata per le misurazioni 
della TER,  
— dettagli sulla procedura sperimentale utilizzata per la valutazione 
della fissazione del colorante, se del caso,  
— descrizione di qualsiasi modifica delle procedure sperimentali;  
— descrizione dei criteri di valutazione utilizzati.  
Risultati:  
— presentazione sotto forma di tabella dei dati derivati dal test della 
TER e dal test di fissazione del colorante (se del caso) per i singoli animali e singoli campioni di pelle,
 
— descrizione di tutti gli effetti osservati.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275- 
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(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
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micals. NIH Publication No. NIH Publication No. 02- 
4502. National Toxicology Program Interagency Center for 
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(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
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March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
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(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
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(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
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(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
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 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 574
 
Figura 1  
Attrezzatura per il test di resistenza elettrica transcutanea (TER) su tessuti cutanei 
di ratto
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 575
 
Figura 2  
Dimensioni del tubo in polietrafluoroetilene (PTFE), del cilindro contenitore 
e degli elettrodi utilizzati
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 576
 
Fattori critici dell'attrezzatura sopra descritta:  
— diametro interno del tubo PTFE,  
— lunghezza degli elettrodi relativi al tubo PTFE e al cilindro con ­
tenitore, di modo che il disco di tessuto cutaneo non è in contatto 
con gli elettrodi e che una lunghezza standard dell'elettrodo sia in contatto con la soluzione MgSO4,
 
— la quantità della soluzione MgSO4 nel cilindro contenitore do ­
vrebbe essere tale che la profondità del liquido, relativo al livello 
nel tubo PFTE, appaia come indicato nella figura 1,  
— il disco di tessuto cutaneo deve essere fissato accuratamente al 
tubo PFTE, di modo che la resistenza elettrica sia una misura reale delle proprietà del tessuto cutaneo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 577
 
B.40  BIS. CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: TEST SU MODELLI DI 
PELLE UMANA  
1. METODO  
Il presente metodo corrisponde alle linee guida OCSE TG 431 
(2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Per corrosione cutanea si intende il manifestarsi di lesioni irreversi ­
bili sulla pelle dopo l'applicazione della sostanza che si intende testare (come definita dal Globally Harmonised System for the Clas ­
sification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures 
(GHS)(1). Il presente metodo non prevede l'utilizzo di animali vivi o di tessuti animali ai fini della valutazione della corrosività cutanea.
 
Tipicamente, la valutazione della corrosività cutanea è effettuata su 
cavie (2). Gli aspetti connessi al dolore ed alla sofferenza inflitti agli 
animali ai fini del test di corrosività sono stati affrontati in occasione della revisione del metodo di prova B.4, che consente di determinare la corrosione cutanea tramite metodi alternativi in vitro, evitando la 
sofferenza degli animali.
 
Il primo passo verso la definizione di test alternativi atti a studiare la 
corrosività cutanea a fini regolamentari è stato la realizzazione di studi di prevalidazione (3). Successivamente è stato realizzato (6) ­
(7)(8) uno studio di validazione formale dei metodi in vitro di va ­
lutazione della corrosione cutanea (4)(5). I risultati di questi studi e di altri documenti pubblicati (9) hanno permesso di stabilire che i seguenti test potevano essere utilizzati per valutare la corrosività 
cutanea  in vivo  (10)(1 1)(12)(13): il test eseguito su modelli di pelle 
umana (cfr. il presente metodo) e il test di resistenza elettrica tran ­
scutanea (TER, il metodo di prova B.40).
 
I risultati degli studi di validazione indicano che i test basati sui 
modelli di pelle umana (3)(4)(5)(9) sono in grado di discriminare 
in modo affidabile, tra le sostanze conosciute, quelle che sono cor ­
rosive e non corrosive per la pelle. Il presente metodo di prova è altresì in grado di fornire un'indicazione sulla distinzione fra le so ­
stanze che presentano un diverso grado di corrosività.
 
Il test descritto nel presente metodo permette di identificare le so ­
stanze e i composti chimici corrosivi. Permette inoltre l'identifica ­
zione delle sostanze e dei composti non corrosivi se sostenuto da 
molte prove basate su altre informazioni esistenti (ad esempio, pH, 
relazioni struttura/attività, dati relativi agli esseri umani e/o agli ani ­
mali) (1)(2)(13)(14). In generale, non fornisce adeguate informazioni sull'irritazione cutanea, né permette la sottocategorizzazione delle 
sostanze corrosive conformemente al sistema armonizzato universale 
di classificazione (GHS) (1).
 
Ai fini di una completa valutazione degli effetti cutanei locali dopo 
una singola esposizione della cute, si raccomanda di applicare la 
strategia di test sequenziale indicata nell'allegato al metodo di prova 
B.4 (2) e descritta nel sistema armonizzato universale (GHS)(1). Detta strategia sperimentale comporta la realizzazione di test in vitro volti a determinare la corrosione cutanea (come descritta nel presente 
metodo) e l'irritazione cutanea prima di prevedere la conduzione di 
test su animali vivi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 578
 
1.2. DEFINIZIONI  
Corrosione cutanea  in vivo : è il manifestarsi di lesioni irreversibili 
della pelle, vale a dire, necrosi visibile dell'epidermide e del derma, a seguito dell'applicazione della sostanza di prova per non più di quat ­
tro ore. Le reazioni corrosive sono caratterizzate da ulcere, emorra ­
gie, escare sanguinanti e, alla fine dell'osservazione, il giorno 14, da alterazione del colore dovuta a pallore della cute, zone di completa alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie effettuare eventual ­
mente un esame istopatologico.
 
Vitalità cellulare:  parametro che misura l'attività totale di una po ­
polazione di cellule (ad esempio, capacità delle deidrogenasi mito ­
condriali cellulari di ridurre il colorante vitale MTT), che, in fun ­
zione del parametro misurato e del tipo di test utilizzato, corrisponde 
al numero totale e/o alla vitalità delle cellule.  
1.3. SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
Tabella 1  
Sostanze chimiche di riferimento  
Denominazione N. Einecs N. CAS  
1,2-diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Fortemente corrosivo 
Acido acrilico 201-177-9 79-10-7 Fortemente corrosivo 
2-tert-butilfenolo 201-807-2 88-18-6 Corrosivo Idrossido di potassio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo Acido solforico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo Acido ottanoico (caprilico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo 4-amino-1,2,4-triazolo 209-533-5 584-13-4 Non corrosivo 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Non corrosivo 
Fenetil bromuro 203-130-8 103-63-9 Non corrosivo Tetracloroetilene 204-825-9 27-18-4 Non corrosivo Acido isostearico 250-178-0 30399-84-9 Non corrosivo 4-(metiltio)-benzaldeide 222-365-7 3446-89-7 Non corrosivo
 
La maggior parte delle sostanze chimiche sopra elencate proviene 
dall'elenco delle sostanze chimiche selezionate per lo studio di vali ­
dazione internazionale di ECVAM (4). Detta selezione si basa sui criteri seguenti:
 
i) ugual numero di sostanze corrosive e non corrosive;  
ii) sostanze disponibili in commercio, rappresentanti la maggior 
parte delle classi chimiche pertinenti;  
iii) l'inclusione di sostanze fortemente corrosive e meno corrosive ai 
fini della discriminazione in base al potere corrosivo;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 579
 
iv) selezione di sostanze chimiche che possono essere trattate in la ­
boratorio senza presentare altri rischi gravi oltre alla corrosività.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza di prova è applicata localmente su un modello tridimen ­
sionale di pelle umana che comprende almeno un'epidermide rico ­
stituita con uno strato corneo funzionale. Le sostanze corrosive sono 
individuate in base alla loro attitudine a ridurre la vitalità cellulare [determinata, ad esempio, tramite test di riduzione del MTT (15)] al di sotto di valori limite definiti per periodi di esposizione determi ­
nati. Il principio del test si basa sull'ipotesi secondo la quale le 
sostanze chimiche corrosive sono capaci di penetrare nello strato corneo per diffusione o erosione e sono citotossiche per gli strati cellulari sottostanti.
 
1.4.1.  Procedura  
1.4.1.1.  Modelli di pelle umana  
I modelli di pelle umana possono essere costruiti, acquistati in com ­
mercio (ad esempio, i modelli EpiDerm  TM ed EPISKIN  TM ) (16)(17) ­
(18)(19) oppure sviluppati o costruiti nel laboratorio di prova (20) ­
(21). Com'è generalmente riconosciuto, l'utilizzo di pelle umana forma l'oggetto di considerazioni etiche ed è subordinato a condi ­
zioni nazionali ed internazionali. Qualsiasi nuovo modello deve es ­
sere validato (almeno nella misura descritta al punto 1.4.1.1.2). I 
modelli di pelle umana utilizzati nel presente test devono soddisfare i criteri seguenti.
 
1.4.1.1.1 C o n d i z i o n i g e n e r a l i d e i m o d e l l i :  
Per costruire l'epitelio devono essere utilizzati cheratinociti d'origine 
umana. Devono essere presenti molteplici strati di cellule epiteliali 
vitali sotto lo strato corneo funzionale. Il modello di pelle umana può 
anche avere uno strato stromale. Lo strato corneo deve presentare una molteplicità di strati con il necessario profilo lipidico per pro ­
durre una barriera funzionale solida capace di resistere alla penetra ­
zione rapida dei marcatori citotossici. Le proprietà di contenimento 
del modello devono impedire il passaggio delle sostanze dallo strato corneo verso i tessuti vitali. Il passaggio delle sostanze chimiche da testare dallo strato corneo potrebbe infatti dare origine a modelli di 
esposizione cutanea non validi. Il modello di pelle umana non deve 
essere stato contaminato da batteri (tra cui micoplasmi) né da funghi.
 
1.4.1.1.2 C o n d i z i o n i f u n z i o n a l i d e i m o d e l l i :  
La vitalità è generalmente quantificata tramite MTT o altri coloranti 
vitali che hanno subito una conversione metabolica. In questo caso, la densità ottica (DO) del colorante estratto (solubilizzato) dal tessuto 
di controllo negativo deve essere almeno 20 volte superiore alla DO 
del solo solvente di estrazione [per maggiori dettagli, si rimanda al riferimento (22)]. Il tessuto di controllo negativo deve essere stabile in cultura (cioè fornire misure di vitalità simili) nel corso del periodo 
di esposizione. Lo strato corneo deve essere sufficientemente solido 
per resistere alla penetrazione rapida di alcuni marcatori citotossici (ad esempio, Triton X-100 all'1 %). Tale proprietà può essere valu ­
tata calcolando il tempo di esposizione necessaria per ridurre la 
vitalità cellulare del 50 % (ET
 50 ) (ad esempio, per i modelli Epi ­
Derm  TM ed EPISKIN  TM , tale tempo è inferiore a 2 ore). Il tessuto 
deve dimostrare una riproducibilità dei risultati nel tempo e preferi ­
bilmente tra laboratori. Deve inoltre permettere di prevedere il po ­
tenziale corrosivo delle sostanze chimiche di riferimento (cfr. tabella 
1) quando utilizzate nel metodo di prova selezionato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 580
 
1.4.1.2.  Applicazione delle sostanze di prova e delle sostanze di controllo  
Due tessuti replicati sono utilizzati per ciascun trattamento (tempo di 
esposizione), compresi i controlli. Per le sostanze liquide, deve es ­
sere applicata una quantità della sostanza di prova sufficiente a co ­
prire la superficie cutanea in modo uniforme (almeno 25 μL/cm  2 ). 
Per le sostanze solide, occorre applicare in modo uniforme una quantità della sostanza di prova sufficiente a coprire la pelle; essa deve successivamente essere inumidita con acqua deionizzata o di ­
stillata al fine di garantire un buon contatto con la pelle. Se neces ­
sario, le sostanze solide devono essere ridotte in polvere prima della loro applicazione. Il metodo d'applicazione deve essere adatto alla 
sostanza di prova (cfr., ad esempio, il riferimento 5). Al termine del 
periodo di esposizione, la sostanza di prova deve essere tolta con cura dalla superficie cutanea con idoneo tampone o NaCl allo 0,9 %.
 
Controlli positivi e negativi concorrenti devono essere utilizzati per 
ciascuno studio in modo da garantire un'adeguata prestazione del metodo di prova. Le sostanze proposte ai fini dei controlli positivi 
sono l'acido acetico ghiacciato o 8N KOH. Le sostanze proposte per 
i controlli negativi sono NaCl allo 0,9 % o l'acqua.
 
1.4.1.3.  Misurazioni della vitalità cellulare  
Solo metodi quantitativi validati possono essere utilizzati per misu ­
rare la vitalità cellulare. La misurazione della vitalità deve inoltre essere compatibile con l'utilizzo in un modello tridimensionale di tessuto. Il legame non specifico dei coloranti non deve interferire 
con la misurazione della vitalità. L'utilizzo di coloranti che si legano 
alle proteine o che non subiscono conversioni metaboliche (ad esem ­
pio, il rosso neutro) non risulta pertanto adeguato. Il metodo più spesso utilizzato è la riduzione del MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2- 
yl)-2,5-difeniltetrazolio bromide; Tiazolil blue: numero Einecs 206- 
069-5, numero CAS 298-93-1), di cui si è constatata l'esattezza e la riproducibilità dei risultati (5), ma è anche possibile utilizzare altri metodi. Il campione di pelle è inserito in una soluzione MTT alla 
concentrazione adeguata (ad esempio, 0,3-1/ml) e ad una temperatura 
di incubazione adeguata per 3 ore. Il precipitato blu formazan è successivamente estratto con solvente (isopropanolo) e la concentra ­
zione di formazan è misurata determinando la DO ad una lunghezza 
d'onda compresa tra 540 e 595 nm.
 
L'azione chimica prodotta dalla sostanza di prova sul colorante 
vitale può imitare quella del metabolismo cellulare, il che può 
condurre ad una stima sbagliata della vitalità. È stato dimostrato che ciò avviene in particolare quando la sostanza di prova non è 
stata rimossa completamente dalla pelle con risciacquo (9). Se la 
sostanza di prova agisce direttamente sul colorante vitale, devono essere utilizzati controlli supplementari per individuare e correggere qualsiasi interferenza delle sostanze di prova con la misurazione 
della vitalità (9)(23).
 
2. DATI  
Per ciascun tessuto, i valori della DO, le percentuali calcolate della 
vitalità cellulare per la sostanza di prova ed i controlli positivi e 
negativi sono presentati sotto forma di tabella, compresi i dati delle 
prove ripetute ed i valori medi ed individuali.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 581
 
2.1. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
I valori della DO ottenuti per ciascun campione di prova possono 
essere utilizzati per calcolare una percentuale di vitalità rispetto al controllo negativo, il cui valore è fissato arbitrariamente al 100 %. Il 
valore limite della percentuale di vitalità cellulare in base al quale si 
stabilisce la distinzione tra sostanze corrosive e sostanze non corro ­
sive (o tra diverse classi di sostanze corrosive) o le procedure stati ­
stiche utilizzate per analizzare i risultati e individuare le sostanze 
corrosive devono essere chiaramente definite e documentate, nonché 
dimostrarsi idonee. In generale, questi valori limite sono stabiliti nel corso dell'ottimizzazione del test, testati in una fase di prevalidazione 
e confermati da uno studio di validazione. Ad esempio, la previsione 
di corrosività associata al modello EpiDerm
 TM è la seguente (9):  
La sostanza di prova è considerata corrosiva per la pelle:  
i) se la vitalità dopo 3 minuti d'esposizione è inferiore al 50 %; o  
ii) se la vitalità dopo 3 minuti d'esposizione è superiore o uguale al 
50 %, ma è inferiore al 15 % dopo 1 ora di esposizione.  
La sostanza di prova è considerata non corrosiva per la pelle:  
i) se la vitalità dopo 3 minuti di esposizione è superiore o uguale al 
50 %, e la vitalità dopo un'ora di esposizione è superiore o uguale al 15 %.
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DELLA PROVA  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto sul test deve contenere le informazioni seguenti:  
Sostanze di prova e sostanze di controllo:  
— denominazioni chimiche, quali le denominazioni IUPAC o CAS 
ed il numero CAS, se conosciuti;  
— purezza e composizione della sostanza o della preparazione (in 
percentuale ponderale);  
— proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello stu ­
dio, quali la natura fisica, il pH, la stabilità e la solubilità in 
acqua;  
— trattamento delle sostanze di prova/di controllo prima del test, se 
del caso (ad esempio, riscaldamento, frantumazione);  
— stabilità, se conosciuta.  
Giustificazione del modello di pelle umana e del metodo utilizzato.  
Condizioni di prova:  
— sistema cellulare utilizzato;  
— informazioni sulla taratura dell'attrezzatura di misurazione utiliz ­
zata per misurare la vitalità cellulare (spettrofotometro, ad esem ­
pio); ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 582
 
— informazioni complete sul modello di pelle utilizzato e sulla sua 
vitalità  
— dettagli sulla procedura sperimentale utilizzata;  
— dosi utilizzate per il test;  
— descrizione di qualsiasi modifica delle procedure sperimentali;  
— riferimenti a dati storici del modello;  
— descrizione dei criteri di valutazione utilizzati.  
Risultati:  
— presentazione sotto forma di tabella dei dati tratti dai campioni di 
prova individuali;  
— descrizione di altri effetti osservati.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 585
 
B.41.  SAGGIO DI FOTOTOSSICITÀ IN VITRO 3T3 NRU  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde alle linee guida OCSE TG 432 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Per fototossicità si intende la risposta tossica che si manifesta dopo 
esposizione del corpo ad una sostanza chimica e che è indotta o 
accentuata (ma presente a dosaggi inferiori) dopo successiva esposi ­
zione alla luce, o che è indotta da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica.
 
Il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU consente di identificare il 
potenziale fototossico di una sostanza di prova indotto dalla sostanza 
chimica eccitata dopo esposizione alla luce. Il saggio determina la fotocitotossicità in base alla relativa riduzione della vitalità delle cellule esposte alla sostanza chimica in presenza di luce rispetto 
alla mancata esposizione alla luce. Le sostanze individuate da questo 
saggio sono verosimilmente fototossiche  in vivo , dopo applicazione 
sistemica e distribuzione sulla cute o altra applicazione topica.
 
È noto che molti tipi di sostanze chimiche inducono effetti fototos ­
sici (1)(2)(3)(4). La caratteristica che le accomuna è la capacità di 
assorbire l'energia luminosa nello spettro della luce solare. In base 
alla prima legge della fotochimica (legge di Grotthaus-Draper), la reazione fotochimica richiede un assorbimento sufficiente di quanti di luce. Pertanto, prima di prendere in esame l'eventualità di un 
saggio biologico, occorre determinare lo spettro di assorbimento 
UV/visibile della sostanza di prova secondo le linee guida dell'OCSE dal titolo  OECD Test Guideline 101.  Secondo alcuni, se il coeffi ­
ciente di estinzione/assorbimento molare è inferiore a 10 litri × mol-1 
× cm-1 è improbabile che la sostanza chimica sia fotoreattiva. In 
quel caso non è necessario sottoporre la sostanza al saggio di foto ­
tossicità in vitro 3T3 NRU o ad altri saggi biologici per determinarne gli effetti fotochimici indesiderati (1)(5). Cfr. anche l'allegato I.
 
Recentemente sono state valutate l'affidabilità e la pertinenza del 
saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU (6)(7)(8)(9). È stato dimo ­
strato che il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU consente di prevedere gli effetti fototossici acuti negli animali e nelle persone  in 
vivo. Il saggio non è concepito per prevedere altri effetti indesiderati 
che potrebbero derivare dall'azione combinata di una sostanza chi ­
mica e della luce, come ad esempio la fotogenotossicità, la fotoal ­
lergia e la fotocancerogenicità né permette di valutare la potenza 
fototossica. Il saggio non è nemmeno studiato per determinare i 
meccanismi indiretti della fototossicità, gli effetti dei metaboliti della sostanza di prova o gli effetti delle miscele di sostanze.
 
Mentre in genere è richiesto l'utilizzo di sistemi metabolizzanti per 
tutti i saggi in vitro utilizzati per determinare il potenziale genotos ­
sico e cancerogeno, finora nel caso della fototossicologia si contano 
solo rari esempi dove è richiesta la trasformazione metabolica affin ­
ché la sostanza chimica agisca come fototossina  in vivo  o in vitro. 
Non si ritiene pertanto necessario né giustificato dal punto di vista 
scientifico che il presente saggio sia eseguito con un sistema di 
attivazione metabolica.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 586
 
1.2. DEFINIZIONI  
Irradianza:  l'intensità della luce ultravioletta (UV) o visibile inci ­
dente su una superficie, misurata in W/m  2 o in mW/cm  2 . 
Dose di luce:  la quantità (= intensità × tempo) di radiazione ultra ­
violetta (UV) o visibile incidente su una superficie, espressa in joule 
(= W × s) per area di superficie, ad esempio J/m  2 o J/cm  2 . 
Bande di lunghezza d'onda della luce  UV: i valori raccomandati 
dalla CIE  (Commission Internationale de l'Éclairage)  sono: UVA 
(315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). Sono in 
uso, inoltre, altri valori: spesso la distinzione fra UVB e UVA viene posta a 320 nm e gli UVA possono essere suddivisi in UV-A1 e UV-A2, con una distinzione posta a circa 340 nm.
 
Vitalità cellulare:  parametro che misura l'attività totale di una po ­
polazione di cellule (ad esempio l'assunzione del colorante vitale 
rosso neutro nei lisosomi cellulari) che, in funzione dell  ’ «endpoint» 
misurato e del tipo di saggio impiegato, è correlato al numero totale 
e/o alla vitalità delle cellule.  
Vitalità cellulare relativa:  vitalità cellulare espressa in relazione a 
controlli negativi (solvente) effettuati nel corso del saggio (+ Irr o - Irr) senza trattamento con la sostanza chimica di prova.
 
PIF (Photo Irritation Factor —  Fattore di fotoirritazione):  fattore 
ottenuto comparando due concentrazioni di pari citotossicità (IC  50 ) 
della sostanza chimica di prova in assenza (- Irr) e in presenza (+ Irr) di una irradiazione non citotossica con raggi UVA/luce visibile.
 
IC 50 : concentrazione della sostanza di prova alla quale la vitalità 
cellulare è ridotta del 50 %.  
MPE  (Mean Photo Effect —  Foto-effetto medio):  misura derivata 
dall'analisi matematica delle curve di concentrazione-risposta ottenute in assenza (- Irr) e in presenza (+ Irr) di una irradiazione non cito ­
tossica con UVA/luce visibile.
 
Fototossicità:  risposta tossica acuta che si manifesta dopo esposi ­
zione primaria della cute ad alcune sostanze chimiche e successiva esposizione alla luce, o che è indotta analogamente da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica.
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO  
Il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU è basato sul confronto 
della citotossicità di una sostanza chimica sottoposta al saggio con e 
senza esposizione a una dose non citotossica di luce solare simulata. In questo saggio la citotossicità viene espressa come riduzione, di ­
pendente dalla concentrazione, dell'assunzione del colorante vitale 
rosso neutro 24 ore dopo il trattamento con la sostanza chimica di 
prova e l'irradiazione (10). Il rosso neutro  (Neutral Red,  NR) è un 
colorante cationico debole che penetra rapidamente nelle membrane cellulari per non-diffusione e si accumula a livello intracellulare nei 
lisosomi. Le alterazioni della superficie della membrana sensibile del 
lisosoma causano una fragilità del lisosoma e altri cambiamenti che diventano progressivamente irreversibili. Tali cambiamenti dovuti all'azione degli xenobiotici riducono l'assunzione e il legame del ­
l'NR. È dunque possibile fare la distinzione tra cellule vitali, cellule 
danneggiate e cellule morte, che è alla base di questo saggio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 587
 
Le cellule Balb/c 3T3 vengono mantenute in coltura per 24 ore per 
permettere la formazione di monostrati. Quindi, per ogni sostanza 
chimica di prova, vengono preincubate due piastre a 96 pozzetti con otto diverse concentrazioni della sostanza chimica per 1 ora. Una delle due piastre viene successivamente esposta alla massima dose 
non citotossica di luce, mentre l'altra piastra viene mantenuta al buio. 
In entrambe le piastre, il mezzo di trattamento viene successivamente sostituito con il mezzo di coltura e, dopo altre 24 ore di incubazione, si determina la vitalità cellulare tramite assunzione del rosso neutro  
(Neutral Red Uptake,  NRU). Per ognuna delle otto concentrazioni di 
prova viene dunque calcolata la vitalità cellulare, espressa come percentuale dei controlli non trattati (solvente). Per prevedere il po ­
tenziale fototossico vengono confrontate le risposte alla concentra ­
zione ottenute in presenza e in assenza di irradiazione, generalmente 
al livello IC
 50 , cioè alla concentrazione che inibisce la vitalità cellu ­
lare del 50 % rispetto ai controlli non trattati.  
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1  Preparazioni  
1.4.1.1  Cellule  
Nello studio di validazione è stata usata una linea cellulare perma ­
nente di fibroblasti di topo — Balb/c 3T3, clone 31 — proveniente 
dall'American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, 
USA, o dalla European Collection of Cell Cultures (ECACC) di Salisbury, Wiltshire, Regno Unito. Si raccomanda di acquisire le cellule da una banca di cellule qualificata. È possibile utilizzare 
anche altre cellule o linee cellulari applicando lo stesso protocollo 
se le condizioni della coltura vengono adattate alle esigenze specifi ­
che delle cellule; in quel caso è tuttavia necessario dimostrare l'equi ­
valenza.
 
È necessario verificare con regolarità che le cellule non siano 
contaminate da micoplasmi e utilizzarle solo se non vi è contami ­
nazione (11).  
È importante verificare periodicamente la sensibilità delle cellule 
Balb/c 3T3 agli UV secondo la procedura di controllo della qualità 
descritta in questo metodo. Poiché la sensibilità delle cellule agli UVA può aumentare con il numero di passaggi, vanno impiegate cellule Balb/c 3T3 del numero più basso ottenibile di passaggi, 
preferibilmente inferiore a 100 (cfr. punto 1.4.2.2.2 e allegato II).
 
1.4.1.2.  Condizioni dei mezzi e della coltura  
Per il passaggio di routine delle cellule e durante il saggio è neces ­
sario utilizzare mezzi di coltura e condizioni di incubazione adeguati: 
ad esempio, nel caso delle cellule Balb/c 3T3, il DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) integrato con 10 % di siero di vitello neonato, 4 mM di glutammina, penicillina (100 IU) e streptomicina 
(100 μg/mL), nonché incubazione umidificata a 37
 o C, al 5-7,5 % di 
CO 2 in funzione del tampone (cfr. punto 1.4.1.4, secondo paragrafo). 
È particolarmente importante che le condizioni della coltura cellulare assicurino un tempo di ciclo cellulare compreso nel normale range 
storico delle cellule o della linea cellulare utilizzate.
 
1.4.1.3  Preparazione delle colture  
Le cellule ottenute da colture madre congelate vengono seminate nel 
terreno di coltura alla densità adeguata e poste in sottocoltura almeno 
una volta prima di essere utilizzate per il saggio di fototossicità in 
vitro 3T3 NRU.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 588
 
Per il saggio di fototossicità occorre seminare le cellule nel terreno di 
coltura ad una densità tale che impedisca alle colture di raggiungere 
la confluenza prima della fine del saggio, cioè quando viene deter ­
minata la vitalità cellulare 48 ore dopo la semina. Per le cellule Balb/c 3T3 coltivate in piastre a 96 pozzetti la densità raccomandata 
è di 1 × 10
 4 cellule per pozzetto.  
Per ogni sostanza chimica di prova si seminano cellule in maniera 
identica in due diverse piastre a 96 pozzetti, che vengono poi sotto ­
poste simultaneamente all'intero protocollo in condizioni colturali identiche, salvo il periodo di tempo in cui una delle piastre viene 
irradiata (+ Irr) mentre l'altra viene tenuta al buio (- Irr).
 
1.4.1.4  Preparazione della sostanza chimica di prova  
Le sostanze chimiche di prova devono essere preparate di fresco 
immediatamente prima dell'uso, a meno che non siano disponibili 
dati che ne dimostrino la stabilità di conservazione. Si raccomanda che tutte le manipolazioni chimiche e il trattamento iniziale delle 
cellule avvengano in condizioni di luce tali da evitare la fotoattiva ­
zione o la degradazione della sostanza di prova prima dell'irradiazione.
 
Le sostanze chimiche di prova vanno dissolte in soluzioni saline 
tampone, come la soluzione isotonica di Earl (EBSS) o altre solu ­
zioni tampone in equilibrio fisiologico che, per evitare interferenze 
durante l'irradiazione, devono essere prive di componenti proteiche e 
fotoassorbenti (ad esempio colori indicatori di pH e vitamine). Poi ­
ché durante l'irradiazione le cellule sono mantenute per circa 50 minuti al di fuori dell'incubatore al CO
 2 , è necessario fare in 
modo di evitare l'alcalizzazione. Se vengono impiegati tamponi de ­
boli come l'EBSS, è necessario incubare le cellule al 7,5 % di CO  2 ; 
se invece le cellule sono incubate al 5 % di CO  2 è necessario 
selezionare un tampone più forte.  
Le sostanze chimiche di prova che presentano una scarsa solubilità in 
acqua devono essere disciolte in solventi adeguati. Gli eventuali 
solventi utilizzati devono essere presenti a un volume costante in tutte le colture, e cioè sia nei controlli negativi che in tutte le con ­
centrazioni della sostanza chimica di prova; a tali concentrazioni non 
devono essere citotossici. Le concentrazioni della sostanza chimica di 
prova devono essere tali da evitare precipitati o soluzioni torbide.
 
I solventi raccomandati sono il dimetilsolfossido (DMSO) e l'etanolo 
(ETOH). Possono essere adatti anche altri solventi a bassa citotossi ­
cità. Prima dell'uso è necessario valutare attentamente le proprietà 
specifiche di tutti i solventi utilizzati, quali la reazione con la so ­
stanza chimica di prova, l'estinzione dell'effetto fototossico, le pro ­
prietà di cattura dei radicali e/o la stabilità chimica nel solvente.  
Se necessario, si può procedere a miscelazione tramite vortex e/o 
sonicazione e/o riscaldamento alle temperature opportune per favo ­
rire la solubilizzazione, a condizione che non ci siano conseguenze 
sulla stabilità della sostanza di prova.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 589
 
1.4.1.5  Condizioni di irradiazione  
1.4.1.5.1 F o n t e d i l u c e  
La scelta di una fonte di luce e di filtri adeguati è il fattore più 
importante ai fini di un corretto saggio della fototossicità. Le radia ­
zioni UVA e la luce visibile si associano generalmente a fotosensi ­
bilizzazione  in vivo  (3) (12), mentre i raggi UVB sono in genere 
meno rilevanti ma fortemente citotossici; la citotossicità aumenta di 
1 000 volte quando la lunghezza d'onda passa da 313 a 280 nm (13). Per scegliere una fonte luminosa adeguata valgono, tra l'altro, i seguenti criteri essenziali: la fonte di luce deve emettere lunghezze 
d'onda assorbite dalla sostanza chimica di prova (spettro di assorbi ­
mento) e la dose di luce (ottenibile in tempi di esposizione ragione ­
voli) deve essere sufficiente per individuare le sostanze con caratteri ­
stiche fotocitotossiche note. Inoltre, le lunghezze d'onda e le dosi 
utilizzate non devono essere eccessivamente nocive per il sistema 
sottoposto a prova, ad esempio per quanto riguarda l'emissione di calore (spettro dell'infrarosso).
 
La fonte di luce artificiale ottimale si ottiene simulando la luce solare 
con simulatori solari. La distribuzione della potenza di irradiazione 
dei simulatori solari con filtri deve essere la più vicina possibile a quella della luce solare esterna indicata in (14). Nei simulatori solari si usano sia gli archi allo xeno che gli archi al mercurio e ad 
alogenuri metallici (drogati) (15). Questi ultimi presentano il vantag ­
gio di emettere meno calore e di essere meno costosi, ma la simu ­
lazione della luce solare che offrono è inferiore a quella garantita dagli archi allo xeno. Poiché tutti i simulatori solari emettono quan ­
tità significative di UVB, vanno muniti di filtri adeguati per attenuare 
le lunghezze d'onda UVB altamente citotossiche. Poiché i materiali plastici delle colture cellulari contengono stabilizzatori UV, lo spettro deve essere misurato utilizzando lo stesso tipo di coperchio della 
piastra a 96 pozzetti impiegato per il saggio. Indipendentemente dalle 
misure adottate per attenuare parti dello spettro con filtri o con gli effetti filtranti inevitabili dell'apparecchiatura, lo spettro registrato al di sotto dei filtri non deve discostarsi dalla luce solare esterna stan ­
dardizzata (14). Un esempio della distribuzione spettrale dell'irra ­
dianza del simulatore solare con filtro impiegato nello studio di validazione del saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU 1 figura in (8)(16). Cfr. anche allegato II, figura 1.
 
1.4.1.5.2 D o s i m e t r i a  
Prima di effettuare il saggio di fototossicità occorre controllare re ­
golarmente l'intensità della luce (irradianza) mediante opportuno mi ­
suratore UV a banda larga. L'intensità deve essere misurata utiliz ­
zando lo stesso tipo di coperchio della piastra a 96 pozzetti impie ­
gato per il saggio. Il misuratore UV deve essere calibrato in funzione della fonte. È necessario controllare la funzionalità del misuratore UV e, a tale scopo, si raccomanda di impiegare un secondo misu ­
ratore UV di riferimento, dello stesso tipo e con identica calibrazio ­
ne. L'ideale sarebbe che, a intervalli di tempo più lunghi, con uno spettroradiometro si misurasse l'irradianza spettrale della fonte di luce filtrata e si controllasse la calibrazione del misuratore UV a 
banda larga.
 
È stato dimostrato che una dose di 5 J/cm  2 (nelle lunghezze d'onda 
UVA) non è citotossica per le cellule Balb/c 3T3 ed è sufficiente ­
mente potente per eccitare le sostanze chimiche e indurre reazioni di fototossicità (6) (17): a titolo di esempio, per ottenere una dose di 5 
J/cm
 2 entro 50 minuti, l'irradianza deve essere regolata a 1,7 mW/ ­
cm 2 (cfr. allegato II, figura 2). Se si utilizza un'altra linea cellulare o 
una diversa fonte luminosa, potrebbe essere necessario adattare la dose irradiata in modo tale che non sia nociva per le cellule e che 
sia comunque sufficiente per eccitare le fototossine standard. Il 
tempo di esposizione alla luce si calcola come segue:
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 590
 
tðminÞ ¼ dose irradiazione ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
irradianza ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2  Condizioni di prova  
1.4.2.1  Concentrazioni della sostanza di prova  
I range (o intervalli) di concentrazione di una sostanza chimica sot ­
toposta al saggio in presenza (+ Irr) e in assenza (- Irr) di luce vanno determinati in modo adeguato con esperimenti espressamente effet ­
tuati a tale scopo. Può essere utile valutare la solubilità nel momento 
iniziale e dopo 60 minuti (o dopo qualsiasi altro periodo di tratta ­
mento utilizzato), perché la solubilità può variare nel tempo o nel corso dell'esposizione. Per evitare di indurre tossicità a causa di condizioni inadeguate delle colture o in presenza di sostanze chimi ­
che altamente acide o alcaline, il pH delle colture cellulari alle quali 
è aggiunta la sostanza chimica di prova deve essere compreso tra 6,5 e 7,8.
 
La concentrazione massima della sostanza chimica di prova deve 
rientrare nelle condizioni fisiologiche di prova (occorre ad esempio evitare stress osmotico e del pH). In funzione della sostanza di prova 
prescelta può essere necessario prendere in considerazione altre pro ­
prietà fisico-chimiche tra i fattori che limitano la concentrazione massima di prova. Per le sostanze relativamente insolubili che non sono tossiche a concentrazioni massime fino al punto di saturazione 
è necessario testare la concentrazione massima raggiungibile. In ge ­
nerale è preferibile evitare la precipitazione della sostanza di prova a qualsiasi concentrazione. La concentrazione massima di una sostanza di prova non deve superare i 1 000 μg/mL e l'osmolalità non deve 
superare 10 mmolari. È necessario utilizzare diluizioni in serie geo ­
metrica con 8 concentrazioni della sostanza di prova (con un fattore di diluizione costante) (cfr. punto 2.1, secondo paragrafo).
 
Se sono disponibili dati (ricavati da esperimenti preliminari per de ­
terminare il range di concentrazione o  range finding)  che dimostrano 
che la sostanza chimica non è citotossica fino al limite di concen ­
trazione nell'esperimento in assenza di luce (- Irr), ma è altamente 
citotossica se irradiata (+ Irr), per garantire un'adeguata qualità dei dati gli intervalli di concentrazione da scegliere per l'esperimento (+ Irr) possono essere diversi da quelli utilizzati nel saggio (- Irr).
 
1.4.2.2  Controlli  
1.4.2.2.1 S e n s i b i l i t à d e l l e c e l l u l e a l l e r a d i a z i o n i , d e t e r ­
m i n a z i o n e d e i d a t i s t o r i c i  
Le cellule devono essere controllate con regolarità (ogni cinque pas ­
saggi) per accertarne la sensibilità alla fonte luminosa valutando la loro vitalità dopo l'esposizione a dosi crescenti di radiazioni. Nella valutazione devono essere applicate varie dosi di radiazioni lumino ­
se, fino a livelli molto superiori a quelli applicati nel saggio di 
fototossicità 3T3 NRU. Le dosi in questione sono quantificate più facilmente misurando lo spettro UV della fonte luminosa. Le cellule sono seminate alla stessa densità utilizzata nel saggio di fototossicità 
in vitro 3T3 NRU e irradiate il giorno successivo; il giorno ancora 
successivo si determina la vitalità cellulare misurando l'assunzione del rosso neutro (NRU). Si deve poter dimostrare che la dose non- citotossica massima che ne risulta [ad esempio, nello studio di vali ­
dazione: 5 J/cm
 2 (UVA)] è sufficiente per classificare correttamente 
le sostanze chimiche di riferimento (tabella 1).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 591
 
1.4.2.2.2 S e n s i b i l i t à a l l e r a d i a z i o n i , v e r i f i c a d e l s a g g i o i n 
c o r s o  
Il saggio risponde ai criteri di qualità se i controlli negativi/solvente 
con irradiazione dimostrano una vitalità superiore all'80 % rispetto ai controlli negativi/solvente senza irradiazione.
 
1.4.2.2.3 V i t a l i t à a s s o c i a t a a i c o n t r o l l i a b a s e d i s o l v e n t e  
La densità ottica assoluta (OD  540 NRU  ) del rosso neutro derivata dai 
controlli in solvente indica se le 1 × 10  4 cellule seminate in ogni 
pozzetto sono cresciute con un tempo di raddoppiamento normale 
durante i due giorni della prova. Il saggio soddisfa i criteri di accet ­
tazione se la OD  540 NRU  media dei controlli non trattati è ≥ 0,4 (cioè 
circa 20 volte l'assorbanza di fondo del solvente).  
1.4.2.2.4 C o n t r o l l o p o s i t i v o  
Contemporaneamente al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU, si 
saggia una sostanza chimica notoriamente fototossica. Si raccomanda 
l'uso di clorpromazina (CPZ). Per la CPZ saggiata con il protocollo 
standard nel saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU sono stati definiti i seguenti criteri di accettazione: CPZ irradiata (+ Irr): IC
 50 
= da 0,1 a 2,0 μg/ml; CPZ non irradiata (- Irr): IC  50 = da 7,0 a 90,0 
μg/ml. Il PIF deve essere superiore a 6. È necessario monitorare le 
prestazioni dei controlli positivi nel tempo.  
Come controlli positivi concomitanti, al posto della CPZ possono 
essere impiegate altre sostanze chimiche notoriamente fototossiche, 
corrispondenti alla classe chimica o alle caratteristiche di solubilità della sostanza chimica di prova.
 
1.4.3  Procedura di prova (6)(7)(8)(16)(17)  
1.4.3.1  Primo giorno  
Versare 100 μL di terreno di coltura nei pozzetti periferici di una 
piastra per microtitolazione di coltura tissutale da 96 pozzetti (= bianchi). Nei restanti pozzetti versare 100 μL di una sospensione 
cellulare di 1 × 10
 5 cellule/mL (= 1 × 10  4 cellule/pozzetto). Per 
ciascuna serie di concentrazioni delle singole sostanze di prova e per i controlli in solvente e i controlli positivi preparare due piastre.
 
Incubare le cellule per 24 ore (cfr. punto 1.4.1.2) finché formano un 
monostrato semiconfluente. Questo periodo di incubazione tiene conto del recupero e dell'aderenza delle cellule, nonché della crescita esponenziale.
 
1.4.3.2  Secondo giorno  
Dopo l'incubazione, far decantare il terreno di coltura separandolo 
dalle cellule e lavare con cura con 150 μL della soluzione tamponata 
usata per l'incubazione chimica. Aggiungere 100 μL del tampone 
contenente la concentrazione corretta della sostanza chimica di prova 
o del solvente (controllo in solvente). Utilizzare 8 diverse concen ­
trazioni della sostanza chimica di prova. Incubare le cellule con la sostanza chimica di prova al buio per 60 minuti (cfr. punti 1.4.1.2 e 
1.4.1.4, secondo paragrafo).
 
Delle due piastre preparate per ogni serie di concentrazioni della 
sostanza di prova e dei controlli, una è scelta, in genere a caso, 
per determinare la citotossicità (- Irr) (la piastra di controllo) e una 
(la piastra di trattamento) per determinare la fotocitotossicità (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 592
 
Per eseguire la parte + Irr del saggio, irradiare le cellule a tempera ­
tura ambiente per 50 minuti attraverso il coperchio della piastra a 96 
pozzetti con la dose massima di radiazione non citotossica (cfr. anche allegato II). Mantenere le piastre non irradiate (- Irr) a tem ­
peratura ambiente in una scatola al buio per 50 minuti (= tempo di 
esposizione alla luce).
 
Far decantare la soluzione di prova e lavare con cura due volte con 
150 μL della soluzione tamponata usata per l'incubazione e non 
contenente materiale di prova. Sostituire il tampone con terreno di 
coltura e incubare (cfr. punto 1.4.1.2) per una notte (18-22 ore).  
1.4.3.3  Terzo giorno  
1.4.3.3.1 E s a m e a l m i c r o s c o p i o  
Esaminare le cellule con un microscopio a contrasto di fase per 
verificare la crescita, la morfologia e l'integrità del monostrato. Regi ­
strare gli eventuali cambiamenti morfologici delle cellule e gli effetti sulla crescita cellulare.
 
1.4.3.3.2 S a g g i o d i a s s u n z i o n e d e l r o s s o n e u t r o ( N R U )  
Lavare le cellule con 150 μL di tampone preriscaldato. Eliminare la 
soluzione di lavaggio con lievi colpetti. Aggiungere 100 μl di rosso 
neutro (3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazina cloridrato, numero Einecs 209-035-8; numero CAS 553-24-2; C.I. 50040) a 50 μg/ml 
nel terreno di coltura senza siero (16) e incubare per 3 ore secondo la 
procedura descritta al punto 1.4.1.2. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno al rosso neutro e lavare le cellule con 150 μL di tampone. Far 
decantare ed eliminare il tampone con materiale assorbente o per 
centrifugazione.
 
Aggiungere esattamente 150 μL di soluzione di estinzione del rosso 
neutro (49 parti di acqua + 50 parti di etanolo + 1 parte di acido acetico preparati di fresco).
 
Scuotere con attenzione la piastra di microtitolazione con un agita ­
tore per 10 minuti fino ad estrazione del rosso neutro dalle cellule e formazione di una soluzione omogenea.
 
Misurare la densità ottica dell'estratto di rosso neutro a 540 nm con 
uno spettrofotometro, utilizzando i bianchi come riferimento. Salvare i dati nel formato elettronico più opportuno per le analisi successive.
 
2. DATI  
2.1. QUALITÀ E QUANTITÀ DEI DATI  
I dati devono permettere un'analisi significativa della concentrazione- 
risposta ottenuta in presenza e in assenza di irradiazione e, se pos ­
sibile, la concentrazione della sostanza di prova alla quale la vitalità cellulare è ridotta al 50 % (IC
 50 ). Se si rileva citotossicità, è neces ­
sario fissare sia il range di concentrazione che l'intervallo tra le 
singole concentrazioni in modo da adattare una curva ai dati speri ­
mentali.  
Per i casi evidentemente positivi e negativi (cfr. punto 2.3, primo 
paragrafo) è sufficiente procedere all'esperimento principale, soste ­
nuto da uno o più esperimenti preliminari di definizione dei range 
delle dosi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 593
 
I risultati dubbi, borderline o non chiari devono essere definiti con 
altre prove (cfr. anche punto 2.4, secondo paragrafo). In tal caso si 
deve prendere in considerazione l'eventualità di modificare le condi ­
zioni dell'esperimento; tra le condizioni che possono essere modifi ­
cate vi sono il range o l'intervallo tra le concentrazioni, il tempo di 
pre-incubazione e il tempo di esposizione all'irradiazione. Per le 
sostanze chimiche instabili in acqua può essere indicato un tempo di esposizione più breve.
 
2.2. TRATTAMENTO DEI DATI  
Per poter valutare i dati è possibile calcolare il PIF (fattore di fo ­
toirritazione) o l'MPE (foto-effetto medio).  
Per il calcolo delle misure di fototossicità (cfr. sotto) la serie di 
valori dose-risposta discreti deve essere approssimata con un'ade ­
guata curva continua dose-risposta (modello). L'adattamento della 
curva ai dati è in genere effettuato con il metodo di regressione non lineare (18). Per valutare come la variabilità dei dati incida sulla curva adattata si raccomando l'uso di un metodo  bootstrap.
 
Il PIF è calcolato con la seguente formula:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Se non è possibile calcolare l'IC  50 in presenza o in assenza di luce, 
non si può determinare il PIF per il materiale di prova. L'MPE si basa sulla comparazione delle curve complete di concentrazione-ri ­
sposta (19) ed è definito come la media ponderata di una serie 
rappresentativa di valori di foto-effetto.
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Il valore PE  C alla concentrazione C è definito come il prodotto 
dell'effetto di risposta RE  C per l'effetto alla dose DE  C , cioè PE  C = 
RE C × DE  C . L'effetto di risposta RE  C è uguale alla differenza tra le 
risposte osservate in assenza e in presenza di luce, cioè RE  C = R  C 
(- Irr) - R  C (+ Irr). L'effetto rispetto alla dose è dato da:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ 
dove C* è la concentrazione di equivalenza, cioè la concentrazione 
alla quale la risposta + Irr è uguale alla risposta - Irr alla concen ­
trazione C. Se non è possibile determinare C* perché i valori di 
risposta della curva + Irr sono sistematicamente superiori o inferiori 
a R  C (- Irr) l'effetto rispetto alla dose è fissato a 1. I fattori di pon ­
derazione w  i sono dati dal valore di risposta più alto, cioè w  i = MAX 
{R i (+ Irr), R  i (- Irr)}. La griglia di concentrazione C  i è scelta in 
modo tale che lo stesso numero di punti rientri in ciascuno degli 
intervalli di concentrazione definiti dai valori di concentrazione uti ­
lizzati nell'esperimento. Il calcolo dell'MPE è limitato al valore mas ­
simo di concentrazione al quale almeno una delle due curve mostra 
ancora un valore di risposta pari ad almeno il 10 %. Se questa 
concentrazione massima è superiore alla concentrazione più elevata utilizzata nell'esperimento + Irr, la parte residua della curva + Irr è fissata al valore di risposta «0». Se il valore MPE è superiore ad un 
valore discriminante adeguatamente scelto (MPE
 C = 0,15) la so ­
stanza è classificata come fototossica.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 594
 
Un pacchetto software per il calcolo del PIF e dell'MPE è disponibile 
al sito indicato in bibliografia (20).  
2.3. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
In base allo studio di validazione (8), una sostanza di prova con un 
PIF < 2 o un MPE < 0,1 è indice di assenza di fototossicità. Un PIF 
> 2 e < 5 o un MPE > 0,1 e < 0,15 è indice di una probabile 
fototossicità e un PIF > 5 o un MPE > 0,15 predice fototossicità.  
Per i laboratori che svolgono questo saggio per la prima volta i 
materiali di riferimento indicati nella tabella 1 devono essere testati prima delle sostanze di prova per verificarne le caratteristiche foto ­
tossiche. I valori del PIF o dell'MPE devono essere prossimi a quelli 
indicati nella tabella 1.
 
Tabella 1  
Denominazione 
chimica N. Einecs N. CAS PIF MPE Picco di assor ­
bimento Solvente (  1 ) 
Amiodarone 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(spalla) etanolo 
Cloropromazina 
HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33-0,63 309 nm etanolo 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitrile 
Antracene 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitrile 
Protoporfirina 
IX, Disodio 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54-0,74 402 nm etanolo 
L-Istidina [7006-35-1] nessun 
PIF 0,05-0,10 211 nm acqua 
Esaclorofene 200-733-8 [70-30-4] 1,1- 1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(spalla) etanolo 
Laurilsolfato di 
sodio 205-788-1 [151-21-3] 1,0- 1,9 0,00-0,05 Nessun as ­
sorbimento acqua  
( 1 ) Solvente impiegato per misurare l'assorbimento.  
2.4. INTERPRETAZIONE DEI DATI  
Se vengono rilevati effetti fototossici solo al valore massimo di 
concentrazione utilizzato nel saggio (in particolare per le sostanze 
di prova solubili in acqua) può essere necessario tener conto di altri elementi per la valutazione del rischio. Tali fattori possono includere dati sull'assorbimento cutaneo e l'accumulo della sostanza nella cute 
oppure dati ricavati da altre prove, ad esempio saggi in vitro della 
sostanza sulla cute umana o animale o modelli di cute.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 595
 
Se non si rileva fototossicità (+ Irr e - Irr) e se la scarsa solubilità ha 
limitato le concentrazioni da testare, si può mettere in questione la 
compatibilità della sostanza di prova con il saggio e si deve consi ­
derare la possibilità di effettuare un saggio di conferma, ad esempio utilizzando un modello diverso.
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL SAGGIO  
RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere almeno le seguenti informazioni:  
Sostanza chimica di prova:  
— dati di identificazione, denominazione generica e numeri IUPAC 
e CAS, se noti;  
— caratteristiche fisiche e purezza;  
— proprietà fisico-chimiche rilevanti per l'esecuzione dello studio;  
— spettro di assorbimento UV/visibile;  
— stabilità e fotostabilità, se note.  
Solvente:  
— motivazione della scelta del solvente;  
— solubilità della sostanza chimica di prova nel solvente;  
— percentuale di solvente presente nel terreno di trattamento.  
Cellule:  
— tipo e origine;  
— assenza di micoplasmi;  
— numero di passaggi delle cellule, se noto;  
— sensibilità delle cellule alle radiazioni, determinata con gli stru ­
menti di irradiazione usati nel saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU.
 
Condizioni di prova (1);  incubazione prima e dopo il trattamento:  
— tipo e composizione del terreno di coltura;  
— condizioni di incubazione (concentrazione di CO  2 , temperatura, 
umidità);  
— durata dell'incubazione (pre-trattamento, post-trattamento).  
Condizioni di prova (2);  trattamento con la sostanza chimica:  
— criteri di scelta delle concentrazioni della sostanza chimica di 
prova usata sia in presenza che in assenza di irradiazione;  
— in caso di solubilità limitata della sostanza chimica di prova e 
assenza di citotossicità, motivi della scelta della concentrazione più elevata;
 
— tipo e composizione del terreno di trattamento (soluzione tam ­
pone salina);  
— durata del trattamento chimico.  
Condizioni di prova (3);  irradiazione:  
— motivo della scelta della fonte di luce utilizzata nel saggio;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 596
 
— fabbricante e tipo di fonte luminosa e radiometro;  
— caratteristiche di irradianza spettrale della fonte di luce;  
— caratteristiche di trasmissione/assorbimento del/i filtro/i usato/i;  
— caratteristiche del radiometro e particolari sulla sua calibrazione;  
— distanza della fonte di luce dal sistema di prova;  
— irradianza UVA a tale distanza, espressa in mW/cm  2 ; 
— durata dell'esposizione alla luce UV/visibile;  
— dose UVA (irradianza × tempo), espressa in J/cm  2 ; 
— temperatura delle colture cellulari durante l'irradiazione e delle 
colture cellulari mantenute al buio.  
Condizioni di prova (4);  prova vitalità in rosso neutro:  
— composizione del terreno per il trattamento al rosso neutro;  
— durata dell'incubazione nel rosso neutro;  
— condizioni di incubazione (concentrazione di CO  2 , temperatura, 
umidità);  
— condizioni di estrazione del rosso neutro (agente di estrazione, 
durata);  
— lunghezza d'onda usata per la lettura spettrofotometrica della 
densità ottica del rosso neutro;  
— seconda lunghezza d'onda (riferimento), se utilizzata;  
— contenuto del bianco spettrofotometrico, se utilizzato.  
Risultati:  
— vitalità cellulare ottenuta a ciascuna concentrazione della sostanza 
chimica di prova, espressa in vitalità percentuale media dei con ­
comitanti controlli in solvente;  
— curve concentrazione-risposta (concentrazione della sostanza chi ­
mica di prova rispetto a vitalità cellulare relativa), ottenute negli esperimenti simultanei + Irr e - Irr;
 
— analisi dei dati delle curve concentrazione-risposta: se possibile, 
computo/calcolo dell'IC  50 (+ Irr) e dell'IC  50 (- Irr);  
— confronto delle due curve concentrazione-risposta ottenute in pre ­
senza e in assenza di irradiazione, tramite calcolo del PIF o 
dell'MPE;  
— criteri di accettazione del saggio; controllo simultaneo in solvente:  
— vitalità assoluta (densità ottica dell'estratto di rosso neutro) delle 
cellule irradiate e non irradiate;  
— dati storici del controllo negativo e con solvente; deviazione 
media e standard;  
— criteri di accettazione del saggio; controllo positivo simultaneo:  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 597
 
— IC  50 (+ Irr) e IC  50 (- Irr) e PIF/PME della sostanza chimica del 
controllo positivo:  
— dati storici riguardanti la sostanza chimica del controllo positivo: 
IC 50 (+ Irr) e IC  50 (- Irr) e PIF/PME; deviazione media e stan ­
dard.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
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colour films and paper prints — Methodsfor measuring image stability.
 
15. CIE (1993),  Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICAL REPORT,  
n. 90, Vienna, ISBN 3 900 734 275.  
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA —  Standard Operating Procedure: 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test,  versione finale, 
7 settembre 1998, 18 pagg.  
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W. e Pfannenbecker, U. (1998), «A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test»,  ATLA  26, pagg. 
679-708.
 
18. Holzhütter, H.G. e Quedenau, J. (1995), «Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals», J.  Biol. Systems  
3, pagg. 127-138.  
19. Holzhütter, H.G. (1997), «A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals»,  ATLA,  
25, pagg. 445-462.  
20. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349 
687_1_1_1_1,00.html  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 599
 
Allegato 1  
Ruolo del saggio 3T3 NRU PT in un approccio sequenziale ai saggi di fototossicità delle 
sostanze chimiche
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 600
 
Allegato 2  
Figura 1  
Distribuzione spettrale della potenza di un simulatore solare con filtro
  
(cfr. punto 1.4.1.5, secondo paragrafo)  
La figura 1 presenta un esempio di una distribuzione spettrale di potenza accettabile di un simu ­
latore solare con filtro. È derivato dal simulatore ad alogenuri metallici (drogati) utilizzato nel trial di validazione del saggio 3T3 NRU PT (6)(8)(17). La figura mostra l'effetto di due diversi filtri e l'effetto filtrante aggiuntivo dato dal coperchio della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Il filtro 
H2 è stato utilizzato solo con sistemi di saggio in grado di tollerare un quantitativo superiore di 
UVB (saggio su un modello di cute e test di fotoemolisi degli eritrociti). Nel saggio 3T3 NRU-PT è stato usato il filtro H1. La figura mostra che l'effetto filtrante aggiuntivo dato dal coperchio della piastra si osserva principalmente nello spettro UVB, ma lascia ancora radiazioni UVB sufficienti 
nello spettro di irradiazione da eccitare le sostanze chimiche che in genere assorbono i raggi UVB, 
come l'amiodarone (cfr. tabella 1).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 601
 
Figura 2  
Sensibilità all'irradiazione delle cellule Balb/c 3T3 (nelle lunghezze d'onda UVA)  
Vitalità cellulare (% assunzione del rosso neutro dei controlli al buio)
  
(cfr. punti 1.4.1.5.2, secondo paragrafo, 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Sensibilità delle cellule Balb/c 3T3 all'irradiazione con il simulatore solare utilizzato nel trial di 
validazione del saggio di fototossicità 3T3 NRU, misurata nelle lunghezze d'onda UVA. La figura 
illustra i risultati ottenuti nello studio di pre-validazione in 7 laboratori diversi (1). Le due curve con 
i simboli in chiaro sono state ottenute con cellule vecchie (numero elevato di passaggi), che sono state sostituite da nuove popolazioni di cellule; le curve con i simboli scuri mostrano che le cellule presentano una tolleranza accettabile all'irradiazione.
 
Da questi dati è stata ricavata la più elevata dose di irradiazione non-citotossica pari a 5 J/cm  2 (linea 
tratteggiata verticale. La linea tratteggiata orizzontale indica anche l'effetto di irradiazione massimo 
accettabile fornito al punto 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 602
 
B.42.  SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY  
INTRODUZIONE  
1. Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche (OCSE 
Guidelines for the Testing of Chemicals) e i metodi di prova dell’UE 
fondati su tali linee guida vengono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli esigenze in materia di regolamentazione, e di considerazioni relative al benessere degli animali. Il metodo di 
prova (TM) originale per la determinazione dell’irritazione cutanea nel topo, 
denominato Local Lymph Node Assay (LLNA; OCSE Test Guideline 429; capitolo B.42 del presente allegato) era stato precedentemente adottato (1) e sono state pubblicate informazioni dettagliate sulla validazione dell’LLNA 
nonché una revisione delle attività a questa associate (2) (3) (4) (5) (6) (7) 
(8) (9) (10) (11). L’LLNA aggiornato poggia sulla valutazione dell’espe ­
rienza acquisita e dei dati scientifici (12). Questo metodo di prova è il se ­
condo metodo concepito per valutare il potenziale di irritazione cutanea 
delle sostanze chimiche (sostanze e miscele) negli animali. L’altro metodo 
di prova (OCSE Test Guideline 406; capitolo B.6 del presente allegato) fa ricorso a saggi con porcellini d’India, segnatamente il saggio di massimiz ­
zazione sui porcellini d’India e il saggio di Buehler (13). L’LLNA offre 
vantaggi rispetto al metodo B.6 e alla linea guida OCSE Test Guideline 406 
(13) dal punto di vista del benessere degli animali. Questo metodo di prova aggiornato sull’LLNA comprende un insieme di standard di prestazione (appendice 1) che può essere usato per valutare lo stato di convalida di 
metodi di prova nuovi e/o modificati che sono simili, da un punto di vista 
funzionale e meccanico, all’LLNA, conformemente ai principi del docu ­
mento orientativo dell’OCSE «OECD Guidance Document n. 34» (14).
 
2. L’LLNA studia la fase di induzione dell’irritazione cutanea e fornisce dati 
quantitativi adeguati per la valutazione dose-risposta. Si deve osservare che i sensibilizzanti di tipo leggero/medio che sono raccomandati come sostanze 
di controllo positivo (PC) per i saggi sui porcellini d’India (ossia metodo 
B.6; OCSE Test Guideline 406) (13) sono adatti anche per l’LLNA (6) (8) (15). In questo metodo di prova è anche descritta l’opzione di un approccio ridotto all’LLNA (rLLNA), che potrebbe prevedere il ricorso fino al 40 % 
di animali in meno (16) (17) (18). L’rLLNA potrebbe essere impiegato 
quando vi sia l’esigenza regolamentare di confermare una previsione nega ­
tiva di irritabilità cutanea potenziale, purché tutte le altre specifiche del protocollo LLNA siano rispettate, così come descritto nel presente metodo 
di prova. La previsione di un risultato negativo dovrebbe essere fatta sulla 
base di tutte le informazioni disponibili elencate al punto 4. Prima di applicare l’approccio rLLNA, devono essere fornite giustificazioni chiare e precise motivazioni scientifiche. Se con l’rLLNA si ottiene, contraria ­
mente alle aspettative, un risultato positivo o equivoco, potrebbe essere 
necessario effettuare ulteriori saggi per interpretare o chiarire tale risultato. L’rLLNA non è adatto a essere impiegato per l’identificazione dei pericoli delle sostanze irritanti per la cute quando sono necessarie informazioni sulla 
dose-risposta come la classificazione in una sottocategoria per il 
regolamento (CE) n. 1272/2008 relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele e per il Sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche (Glo ­
bally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) 
delle Nazioni Unite.
 
DEFINIZIONI  
3. Le definizioni utilizzate sono fornite nell’appendice 2.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI  
4. L’LLNA costituisce un metodo alternativo da usarsi per identificare le 
sostanze chimiche che provocano sensibilizzazione cutanea. Ciò non signi ­
fica necessariamente che l’LLNA vada usato in sostituzione del test sui 
porcellini d’India (ossia B.6; OCSE Test Guideline 406) (13), ma piuttosto che il saggio ha gli stessi meriti e può essere utilizzato in alternativa, poiché i risultati positivi e negativi ottenuti con questo metodo non richiedono 
generalmente un’ulteriore conferma. Prima di effettuare lo studio, il labo ­
ratorio che esegue il test deve consultare tutte le informazioni disponibili
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 603
 
sulla sostanza di prova, tra cui l’identità e la struttura chimica, le proprietà 
chimiche-fisiche, i risultati di eventuali altri test di tossicità in vitro o in 
vivo eseguiti sulla sostanza e i dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini. Queste informazioni devono essere considerate per stabilire l’adegua ­
tezza dell’LLNA per la sostanza (data l’incompatibilità di talune limitate 
tipologie di sostanze chimiche con l’LLNA — cfr. il punto 5) e servono a 
scegliere la dose iniziale.
 
5. L’LLNA è un metodo in vivo e, di conseguenza, non elimina l’impiego di 
animali nella valutazione dell’attività sensibilizzante da contatto. Esso ha 
però il potenziale di ridurre il numero di animali necessari a tale scopo. 
Inoltre, l’LLNA rappresenta un significativo miglioramento (minor soffe ­
renza e dolore fisico) del modo in cui vengono usati gli animali per gli studi 
sulla sensibilizzazione da contatto. L’LLNA è basato sull’attenta valuta ­
zione delle manifestazioni immunologiche stimolate dalle sostanze chimiche durante la fase di induzione della sensibilizzazione. Diversamente dai saggi sui porcellini d’India (ossia B.6; OCSE Test Guideline 406) (13), l’LLNA 
non richiede la stimolazione di reazioni di ipersensibilità cutanea indotte da 
provocazione. Inoltre, l’LLNA non richiede l’uso di un adiuvante, come invece è il caso del saggio di massimizzazione sui porcellini d’India (13). Per questo motivo, l’LLNA riduce la sofferenza e il dolore fisico degli 
animali. Nonostante i vantaggi dell’LLNA rispetto al metodo B.6 e alla 
linea guida OCSE Test Guideline 406, occorre riconoscere che esistono alcune limitazioni che possono rendere necessario l’impiego del metodo B.6 o della linea guida OCSE Test Guideline 406 (13) (ad esempio, risposte 
falsi negativi nell’LLNA con alcuni metalli, risposte falsi positivi con alcuni 
irritanti cutanei [tra cui alcune sostanze della categoria dei tensioattivi] (19) (20), o solubilità della sostanza usata per il saggio). Inoltre, le classi di sostanze chimiche o le sostanze contenenti gruppi funzionali che hanno 
dimostrato di agire da potenziali fattori di confondimento (21) possono 
richiedere l’uso dei saggi sui porcellini d’India (ossia B.6; OCSE Test Guideline 406) (13). Infine, in considerazione della limitata banca dati di validazione, che consisteva prevalentemente in formulati pesticidi, l’LLNA 
ha maggiori possibilità del saggio sui porcellini d’India di fornire un risul ­
tato positivo per questi tipi di sostanze (22). Tuttavia, nel sottoporre a prova le formulazioni, si potrebbe valutare l’opportunità di inserire come sostanze di riferimento sostanze simili con risultati noti, per dimostrare che l’LLNA 
funziona correttamente (cfr. il punto 16). Fatte salve le restrizioni indicate, 
si dovrebbe ricorrere all’LLNA per testare qualsiasi sostanza, a meno che una sostanza non possieda proprietà che possono interferire con l’accura ­
tezza dello stesso.
 
PRINCIPIO DEL METODO  
6. Il principio fondamentale alla base dell’LLNS è che i sensibilizzanti indu ­
cono una proliferazione dei linfociti nei linfonodi responsabili del drenaggio della zona di applicazione della sostanza sperimentale. Tale proliferazione è 
proporzionale alla dose e alla potenza dell’allergene applicato e costituisce 
un semplice mezzo per ottenere una misurazione quantitativa oggettiva della sensibilizzazione. La proliferazione è misurata confrontando la prolifera ­
zione media osservata in ciascun gruppo sperimentale con quella del con ­
trollo trattato con il veicolo (gruppo VC). Occorre determinare il rapporto 
tra la proliferazione media in ciascun gruppo trattato e quella del gruppo parallelo trattato con veicolo, definito «Indice di stimolazione» (SI), che deve essere ≥ 3 prima che una sostanza sperimentale possa essere ulterior ­
mente classificata come potenziale. Le procedure qui descritte si basano 
sull’uso della marcatura radioattiva in vivo per misurare un aumento del numero di cellule in fase di proliferazione nei linfonodi auricolari respon ­
sabili del drenaggio. È possibile però impiegare anche altri criteri per la 
valutazione del numero di cellule in fase di proliferazione, a condizione che 
lo standard di prestazione sia pienamente soddisfatto (appendice 1).
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 604
 
DESCRIZIONE DEL SAGGIO  
Selezione delle specie animali  
7. La specie di elezione per questo saggio è il topo. Vanno usate femmine di 
topo, giovani adulte, del ceppo CBA/Ca o CBA/J, nullipare e non gravide. 
All’inizio dello studio, gli animali devono avere un’età compresa fra 8 e 12 settimane e la variazione ponderale degli animali deve essere minima e non superare il 20 % del peso medio. In alternativa, è possibile utilizzare altri 
ceppi ed esemplari di sesso maschile quando vengano prodotti dati suffi ­
cienti a dimostrare che nella risposta all’LLNA non esistono differenze significative specifiche per il ceppo e/o il genere.
 
Condizioni di alloggio e alimentazione  
8. I topi devono essere sistemati in gruppi (23), a meno che non venga fornita 
una giustificazione scientifica adeguata per la sistemazione dei topi in gab ­
bie singole. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). Sebbene l’umidità relativa debba raggiungere almeno il 30 % e preferibil ­
mente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli am ­
bienti. Idealmente il valore dovrebbe essere pari al 50-60 %. L’illumina ­
zione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile.
 
Preparazione degli animali  
9. Gli animali vanno selezionati in maniera randomizzata, marcati per consen ­
tire l’identificazione individuale (ma non mediante marchi per orecchio) e tenuti nelle loro gabbie per almeno cinque giorni prima dell’inizio del dosaggio, per permetterne l’acclimatazione alle condizioni di laboratorio. 
Prima dell’inizio del trattamento, tutti gli animali vanno esaminati per ac ­
certare che non presentino lesioni cutanee visibili.
 
Preparazione delle soluzioni  
10. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in 
solventi/veicolo e, se necessario, diluite prima dell’applicazione su un orec ­
chio del topo. Le sostanze liquide possono essere applicate direttamente o 
diluite prima del dosaggio. Le sostanze chimiche insolubili, come quelle solitamente presenti nei dispositivi medici, dovrebbero essere sottoposte a una procedura di estrazione forzata in un solvente adeguato per individuare 
tutti i componenti estraibili per la sperimentazione prima dell’applicazione a 
un orecchio del topo. Le sostanze di prova devono essere preparate quoti ­
dianamente, salvo quando siano disponibili dati sulla stabilità che dimo ­
strino che la conservazione è accettabile.
 
Controllo dell’affidabilità  
11. Si utilizzano sostanze chimiche per i controlli positivi (PC) per dimostrare 
che il saggio è stato eseguito in modo adeguato, rispondendo con una sensibilità appropriata e riproducibile, come una sostanza sperimentale sen ­
sibilizzante per la quale l’entità della risposta sia ben caratterizzata. Si 
raccomanda l’inclusione di una sostanza di controllo parallela, che dimostri 
la competenza del laboratorio nel condurre il saggio con successo e che consenta di valutare la riproducibilità e la comparabilità all’interno del laboratorio e tra laboratori diversi. Alcune autorità di regolamentazione 
richiedono inoltre l’uso di un controllo positivo per ciascuno studio; si 
invitano pertanto gli utilizzatori a consultare le autorità competenti prima di eseguire l’LLNA. Di conseguenza, è auspicabile l’uso routinario di una sostanza di controllo parallela onde evitare la necessità di condurre ulteriori 
esperimenti su animali per soddisfare obblighi che potrebbero emergere 
dall’impiego periodico di un controllo positivo (cfr. il punto 12). Il controllo positivo dovrebbe produrre una risposta positiva all’LLNA a un livello di esposizione che si ritiene provochi un aumento dell’indice di stimolazione > 
3 rispetto al gruppo di controllo negativo (NC). La dose per il controllo 
positivo va scelta in modo che non provochi eccessiva irritazione cutanea
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 605
 
o tossicità sistemica e che l’induzione sia riproducibile ma non eccessiva 
(ad esempio, un indice > 20 sarebbe eccessivo). Le sostanze di elezione 
sono un 25 % di esilcinnamaldeide [Chemical Abstracts Service (CAS) 101-86-0] in acetone: olio d’oliva (4:1, v/v) e un 5 % di mercaptobenzo ­
tiazolo (CAS 149-30-4) in  N,N -dimetilformammide (cfr. l’appendice 1, ta ­
bella 1). In determinate circostanze, con adeguata giustificazione, è possibile 
usare altre sostanze di controllo che rispondano ai criteri di cui sopra.
 
12. Se da un lato si raccomanda l’inclusione di un gruppo di controllo positivo, 
possono esservi situazioni in cui l’esame periodico (ossia a intervalli ≤ 6 
mesi) della sostanza di controllo può essere appropriato nel caso di labo ­
ratori che effettuano l’LLNA regolarmente (ossia con una frequenza non inferiore a una volta al mese) e che hanno a disposizione una banca dati con informazioni storiche consolidate sui controlli positivi, che dimostra la ca ­
pacità del laboratorio di ottenere risultati accurati e riproducibili con le 
sostanze di controllo. Un’adeguata competenza nella conduzione dell’LLNA può essere dimostrata senza difficoltà producendo risultati positivi coerenti con i controlli positivi in almeno 10 saggi indipendenti effettuati in un 
periodo di tempo ragionevole (ossia meno di un anno).
 
13. Un gruppo di controllo positivo parallelo deve essere incluso ogni volta che 
viene introdotta una modifica procedurale nell’LLNA (ad esempio, una 
modifica del personale qualificato, dei materiali e/o dei reagenti usati per 
il metodo di prova, delle attrezzature impiegate per il metodo di prova, dell’origine degli animali sperimentali), e tali modifiche dovrebbero essere documentate nelle relazioni del laboratorio. Nel valutare la necessità di 
creare una nuova banca dati storica per documentare la coerenza dei risultati 
sui controlli positivi occorre prendere in considerazione le conseguenze che tali modifiche producono sull’adeguatezza della banca dati storica pregressa.
 
14. Gli esaminatori devono essere consapevoli del fatto che la decisione di 
condurre uno studio sui controlli positivi con cadenza periodica anziché 
in parallelo ha ripercussioni sull’adeguatezza e sull’accettabilità dei risultati negativi ottenuti senza un controllo positivo parallelo nell’intervallo com ­
preso tra ciascuno studio periodico sul controllo positivo. Per esempio, se in 
uno studio periodico sui controlli positivi si ottiene un risultato falso nega ­
tivo, possono essere messi in dubbio i risultati negativi ottenuti sulle so ­
stanze sperimentali nell’intervallo tra l’ultimo studio periodico sul controllo positivo accettabile e lo studio periodico sul controllo positivo ritenuto 
inaccettabile. Le implicazioni di questi risultati devono essere considerate 
con estrema attenzione al momento di stabilire se includere i controlli positivi paralleli o se condurre soltanto studi periodici sui controlli positivi. 
Si deve inoltre valutare la possibilità di utilizzare un numero di animali 
inferiore nel gruppo dei controlli positivi paralleli, qualora ciò sia scienti ­
ficamente giustificato e se il laboratorio dimostra, sulla scorta di dati storici specifici per il laboratorio, che è possibile ricorrere a un numero di topi 
inferiore (12).
 
15. Sebbene la sostanza di controllo positivo vada sottoposta a saggi nel veicolo 
che è noto per la sua capacità di provocare una risposta coerente (ad esempio, acetone: olio d’oliva; 4:1, v/v), è possibile che si verifichino 
alcune situazioni normative nelle quali sarà necessario eseguire il saggio 
anche in un veicolo non standard (formulazione clinicamente/chimicamente pertinente) (24). Se il controllo positivo parallelo è testato in un veicolo diverso rispetto alla sostanza in esame, si deve inserire per il controllo 
positivo parallelo un VC distinto.
 
16. Nei casi in cui si valutano sostanze sperimentali di una specifica classe 
chimica o nell’ambito di una specifica gamma di risposte, la presenza di 
sostanze di riferimento può essere utile anche per dimostrare che il metodo 
di prova funziona correttamente per rilevare il potenziale di irritazione cutanea di queste tipologie di sostanze sperimentali. Le sostanze di riferi ­
mento appropriate devono avere le seguenti proprietà:
 
— somiglianza strutturale e funzionale con la classe della sostanza in 
esame,  
— caratteristiche fisiche/chimiche note,  
— dati di supporto provenienti dall’LLNA,  
— dati di supporto provenienti da altri modelli animali e/o dall’uomo.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 606
 
PROCEDURA DI PROVA  
Numero di animali e livelli di dose  
17. Ogni gruppo di saggi comprende almeno quattro animali, sui quali si sag ­
giano almeno tre concentrazioni della sostanza sperimentale, più un gruppo 
di controllo negativo parallelo trattato solo con il veicolo della sostanza sperimentale e un controllo positivo (parallelo o recente, secondo la politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-14). Si deve valutare 
l’opportunità di testare dosi multiple del controllo positivo, soprattutto se 
quest’ultimo è sottoposto ad esame con modalità intermittente. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali dei gruppi di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali.
 
18. La selezione della dose e del veicolo è basata sulle raccomandazioni con ­
tenute nelle voci bibliografiche (3) e (5). Le dosi consecutive si selezionano normalmente da una concentrazione appropriata tra le seguenti: 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ecc. La selezione della concen ­
trazione usata va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche. Ove 
disponibili, occorre tener conto dei dati tossicologici esistenti (ad esempio, tossicità acuta e irritazione cutanea) e delle informazioni strutturali e fisico-chimiche sulla sostanza sperimentale d’interesse (e/o sulle sostanze 
strutturalmente affini), nel selezionare le tre concentrazioni consecutive in 
modo che la concentrazione più elevata massimizzi l’esposizione, evitando al contempo la tossicità sistemica e/o l’eccessiva irritazione cutanea locale (3) (25). In assenza di tali informazioni può essere necessario effettuare un 
saggio iniziale preliminare (cfr. i punti 21-24).
 
19. Il veicolo non deve interferire o condizionare il risultato del saggio e va 
selezionato con l’obiettivo di massimizzare la solubilità per ottenere la concentrazione più elevata possibile, producendo al contempo una soluzio ­
ne/sospensione adatta all’applicazione della sostanza di prova. I veicoli 
raccomandati sono acetone, olio di oliva (4:1, v/v),  N,N -dimetilformammi ­
de, metiletilchetone, glicole propilenico e dimetilsulfossido (19), ma è pos ­
sibile utilizzarne anche altri, fornendo una sufficiente motivazione scienti ­
fica. In alcune situazioni può rendersi necessario l’uso di un solvente cli ­
nicamente pertinente o la formulazione nella quale la sostanza sperimentale è posta in commercio, come controllo ulteriore. Occorre prestare particolare cura per assicurare che i materiali idrofili vengano incorporati in un sistema 
veicolare che inumidisce la pelle e non scorre via immediatamente, inclu ­
dendo solventi adeguati (ad esempio, 1 % Pluronic® L92). Vanno pertanto evitati i veicoli completamente acquosi.
 
20. L’elaborazione dei linfonodi da singoli topi consente di valutare la variabi ­
lità interanimale e permette di effettuare un confronto statistico della diffe ­
renza tra le misurazioni raccolte con la sostanza sperimentale e quelle con il 
gruppo VC (cfr. il punto 35). Inoltre, quando si raccolgono risultati indivi ­
duali per ciascun animale è possibile valutare l’opportunità di ridurre il numero di topi nel gruppo del controllo positivo (12). Tra l’altro, alcune 
autorità di regolamentazione impongono l’obbligo di raccogliere risultati 
individuali per ciascun animale. Tuttavia, alcune autorità di regolamenta ­
zione potrebbero accettare dati aggregati; in questi casi gli utilizzatori pos ­
sono scegliere se raccogliere dati individuali o aggregati.
 
Saggio preliminare  
21. In assenza di informazioni per determinare la dose più elevata da testare 
(cfr. il punto 18), è necessario eseguire un saggio preliminare, che consenta di definire il livello di dose appropriato per l’LLNA. Scopo del saggio preliminare è fornire informazioni orientative per la selezione della dose 
massima di utilizzo nello studio LLNA principale, nel caso in cui non siano 
disponibili informazioni sulla concentrazione che induce tossicità sistemica (cfr. il punto 24) e/o eccessiva irritazione cutanea locale (cfr. il punto 0). La dose massima utilizzata nel saggio deve corrispondere al 100 % della so ­
stanza sperimentale per i liquidi o alla concentrazione massima possibile per 
i solidi o le sospensioni.
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22. Il saggio preliminare è condotto in condizioni identiche allo studio LLNA 
principale, con la differenza che la proliferazione dei linfonodi non è valu ­
tata e che può essere utilizzato un numero inferiore di animali per gruppo di saggi. Si suggerisce di ricorrere a uno o due animali per gruppo di saggi. Tutti i topi sono sottoposti quotidianamente a osservazione per la ricerca di 
eventuali segni clinici di tossicità sistemica o irritazione locale nel sito di 
applicazione. Il peso è registrato prima del saggio e prima della sua con ­
clusione (giorno 6). Entrambe le orecchie dei topi sono esaminate per individuare segni di eritema e l’esito dell’ispezione è registrato sulla scorta 
della tabella 1 (25). Lo spessore dell’orecchio si misura con un apposito 
misuratore (ad esempio, un micrometro digitale o un micrometro Peacock Dial) il giorno 1 (prima della somministrazione della dose), il giorno 3 (circa 48 ore dopo la prima somministrazione) e il giorno 6. Inoltre, il 
giorno 6, lo spessore dell’orecchio potrebbe essere calcolato misurando il 
peso di parti di orecchio prelevate con biopsia dopo la morte dell’animale per eutanasia. Un’irritazione cutanea eccessiva a livello locale è indicata da un punteggio ≥ 3 e/o da un aumento dello spessore dell’orecchio ≥ 25 % in 
un giorno di misurazione qualsiasi (26) (27). La dose più elevata selezionata 
per lo studio LLNA principale sarà la dose immediatamente inferiore nella serie di concentrazioni utilizzate per il saggio preliminare (cfr. il punto 18) che non induce tossicità sistemica e/o irritazione cutanea eccessiva a livello 
locale.
 
Tabella 1  
Scala di valutazione dell’eritema  
Osservazione Punteggio  
Nessun segno di eritema 0 
Eritema di lieve entità (appena visibile) 1 Eritema ben visibile 2 Eritema da moderato a grave 3 
Eritema grave (rosso barbabietola) con formazione di escare 
che impedisce di valutare l’entità della lesione 4
 
23. Oltre all’aumento del 25 % dello spessore dell’orecchio (26) (27), per in ­
dividuare le sostanze irritanti nell’LLNA è stato anche utilizzato un au ­
mento statisticamente significativo dello spessore dell’orecchio nei topi 
trattati rispetto ai controlli (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tuttavia, se 
è vero che possono verificarsi aumenti statisticamente significativi dello spessore dell’orecchio, altrettanto certo è che quando sono inferiori al 25 % non sono associati, nello specifico, a un’eccessiva irritazione (30) 
(31) (33) (34).
 
24. Le seguenti osservazioni cliniche possono indicare tossicità sistemica (35) 
(36) se usate nell’ambito di una valutazione integrata e, pertanto, possono suggerire la dose massima da utilizzare nell’LLNA principale: alterazioni della funzione del sistema nervoso (ad esempio, piloerezione, atassia, tre ­
mori e convulsioni); variazioni del comportamento (ad esempio, aggressi ­
vità, cambiamenti delle attività di toelettatura, marcato cambiamento nel livello di attività); variazioni dei pattern respiratori (ossia variazioni della frequenza e dell’intensità della respirazione come dispnea, boccheggiamento 
e rantoli) e variazioni nel consumo di cibo e acqua. Inoltre, nella valuta ­
zione vanno presi in considerazione segni di letargia e/o assenza di reattività e qualsiasi altro segno di sofferenza e dolore fisico non lieve o momenta ­
neo, o una riduzione ponderale > 5 % dal giorno 1 al giorno 6, oltre che la 
mortalità. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni 
gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia (37).
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Protocollo sperimentale dello studio principale  
25. Il protocollo sperimentale del saggio è il seguente:  
— Giorno 1:  Identificare e registrare il peso di ciascun animale singolar ­
mente e riportare eventuali elementi emersi all’osservazione clinica. 
Applicare 25 μL della diluizione appropriata della sostanza sperimenta ­
le, del solo veicolo o del controllo positivo (parallelo o recente, a se ­
conda della politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15), sulla parte posteriore di entrambe le orecchie.
 
— Giorni 2 e 3:  Ripetere la procedura di applicazione eseguita il giorno 1.  
— Giorni 4 e 5:  Nessun trattamento.  
— Giorno 6:  Registrare il peso di ciascun animale. Iniettare 250 μL di 
soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS) contenente 20 μCi (7,4 × 
10 5 Bq) di (  3 H)-metil timidina triziata a tutti i topi trattati e di controllo, 
attraverso la vena caudale. In alternativa, iniettare 250 μL di PBS sterile 
contenente 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq) di  125 I-iododeossiuridina e 10  –5 M 
fluorodeossiuridina a tutti i topi, attraverso la vena caudale. Cinque ore (5 h) dopo, gli animali vanno sottoposti ad eutanasia. Asportare i 
linfonodi auricolari drenanti di entrambe le orecchie e porli in soluzione 
salina tampone fosfato per ciascun animale separatamente (sistema del singolo animale), oppure per gruppo sperimentale (sistema del gruppo di trattamento). I particolari e i diagrammi relativi all’identificazione e 
alla dissezione dei linfonodi si trovano alla voce bibliografica (12). Per 
un ulteriore controllo della risposta cutanea locale nello studio princi ­
pale possono essere inclusi nel protocollo altri parametri come il pun ­
teggio relativo all’eritema o le misurazioni dello spessore dell’orecchio 
(ottenute utilizzando un micrometro o mediante biopsie effettuate all’au ­
topsia).
 
Preparazione delle sospensioni cellulari  
26. Mediante attenta disaggregazione meccanica attraverso una rete di acciaio 
inossidabile con maglie da 200 μm o un’altra tecnica accettabile si prepara 
una singola sospensione cellulare di cellule linfonodali asportate bilateral ­
mente con il sistema del singolo animale o, in alternativa, con il sistema del 
gruppo di trattamento. Le cellule linfonodali vanno lavate due volte con abbondante PBS e il DNA è precipitato con acido tricloroacetico al 5 % (TCA) a 4 °C per 18 ore (3). I granuli vanno poi rimessi in sospen ­
sione in 1 mL di TCA e quindi trasferiti in fiale di scintillazione contenenti 
10 mL di liquido di scintillazione per il conteggio del
 3 H, oppure trasferiti 
direttamente in tubi per conteggio gamma per il conteggio dello  125 I. 
Determinazione della proliferazione delle cellule (radioattività incorporata)  
27. L’incorporazione di  3 H-metil timidina viene misurata mediante conteggio a 
β-scintillazione, in disintegrazione per minuto (DPM). L’incorporazione di  
125 I-iododeossiuridina viene misurata mediante conteggio dello  125 I ed 
espressa ugualmente in DPM. A seconda dell’approccio usato, l’incorpora ­
zione viene espressa in DPM/topo (sistema del singolo animale) o DPM/ gruppo di trattamento (sistema del gruppo di trattamento).
 
LLNA ridotto  
28. In alcune situazioni, quando c’è l’esigenza regolamentare di confermare una 
previsione negativa di potenziale irritazione cutanea, si può ricorrere a un 
protocollo rLLNA opzionale (16) (17) (18) che prevede l’utilizzo di un 
numero inferiore di animali, purché siano rispettate tutte le altre specifiche del protocollo LLNA riportate in questo metodo di prova. Prima di ricorrere all’approccio rLLNA, devono essere fornite giustificazioni chiare e precise 
motivazioni scientifiche. Se si ottiene un risultato positivo o equivoco, può 
essere necessario effettuare altri saggi per interpretare o chiarire il risultato.
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29. La riduzione del numero di gruppi di trattamento è l’unica differenza tra il 
protocollo del metodo LLNA e quello del metodo rLLNA; per tale ragione 
l’rLLNA non fornisce informazioni sul rapporto dose-risposta. Di conse ­
guenza, l’rLLNA non deve essere usato allorché si devono raccogliere tali informazioni. Come l’LLNA effettuato con più dosi, la concentrazione della 
sostanza sperimentale valutata nell’rLLNA deve essere la concentrazione 
massima che non induce palese tossicità sistemica e/o eccessiva irritazione cutanea a livello locale nel topo (cfr. il punto 18).
 
OSSERVAZIONI  
Osservazioni cliniche  
30. Ogni topo va osservato attentamente almeno una volta al giorno per indi ­
viduare eventuali segni clinici di irritazione locale nel punto di applicazione o di tossicità sistemica. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematica ­
mente e riportate singolarmente per ciascun topo. I piani di controllo de ­
vono includere criteri per individuare prontamente gli esemplari che esibi ­
scono tossicità sistemica, eccessiva irritazione cutanea a livello locale o corrosione cutanea per eutanasia (37).
 
Peso corporeo  
31. Come illustrato al punto 25, all’inizio del saggio e al momento della sop ­
pressione programmata degli animali per eutanasia occorre determinare il 
peso dei singoli esemplari.  
CALCOLO DEI RISULTATI  
32. I risultati vengono espressi, per ciascun gruppo di trattamento, mediante 
l’indice di stimolazione (SI) medio. Se si utilizza l’approccio a singolo 
animale, l’indice di stimolazione si ottiene dividendo i valori medi delle DPM per topo calcolate per ogni gruppo di trattamento, compreso il gruppo di controllo positivo, per le medie delle DPM per topo calcolate per il 
gruppo di controllo trattato con veicolo/solvente. Quindi l’SI medio per i 
controlli trattati con veicolo è uno. Se si applica il sistema del gruppo di trattamento, l’indice di stimolazione si ottiene dividendo l’incorporazione radioattiva per ciascun gruppo di trattamento per l’incorporazione del 
gruppo di controllo trattato con veicolo; si ottiene così un SI medio.
 
33. Il processo decisionale rispetto a una risposta positiva prevede un indice di 
stimolazione SI ≥ 3. Tuttavia, per determinare se un risultato borderline 
vada considerato positivo possono anche essere utilizzati la potenza della dose-risposta, la significatività statistica e la coerenza del solvente/veicolo oltre che le risposte dei controlli positivi (4)(5)(6).
 
34. Qualora sia necessario chiarire i risultati ottenuti, occorre prendere in con ­
siderazione diverse proprietà della sostanza sperimentale, in particolare se 
ha un rapporto strutturale con noti sensibilizzanti cutanei, se causa eccessiva 
irritazione cutanea, nonché la natura della risposta alla dose rilevata. Queste e altre considerazioni sono illustrate in dettaglio in altra sede (7).
 
35. La raccolta di dati sulla radioattività a livello di singolo animale consentirà 
di eseguire un’analisi statistica della presenza e del grado di rapporto dose-risposta nei dati. Una qualsiasi analisi statistica potrebbe comprendere una valutazione del rapporto dose-risposta oltre che confronti debitamente 
aggiustati di gruppi sperimentali (ad esempio, confronti parallelizzati tra 
gruppo dosato e gruppo VC parallelo). Le analisi statistiche possono inclu ­
dere, ad esempio, la regressione lineare o il test di William per valutare l’andamento della dose-risposta, e il test di Dunnett per confronti paralle ­
lizzati. Nella scelta di un metodo adeguato di analisi statistica, lo sperimen ­
tatore deve essere consapevole di possibili ineguaglianze delle varianze e di altri problemi correlati che possono richiedere una trasformazione dei dati o un’analisi statistica non parametrica. In ogni caso lo sperimentatore po ­
trebbe dover calcolare l’SI e svolgere analisi statistiche con e senza deter ­
minati punti (talvolta denominati «aberranti»).
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DATI E RELAZIONE  
Dati 
36. I dati vanno riassunti sotto forma di tabella. Se si utilizza il sistema del 
singolo animale, si evidenziano i valori delle disintegrazioni per 
minuto (DPM) per ciascun animale, i valori DPM medi per gruppo e individuali, il termine di errore associato (ad esempio, SD, SEM) e l’indice di stimolazione medio per ciascun gruppo di dose rispetto al gruppo del 
controllo con veicolo parallelo. Se si utilizza il sistema del gruppo di 
trattamento, si evidenziano i valori medio/mediano delle DPM e il valore medio degli indici di stimolazione per ciascun gruppo di dose rispetto al gruppo del controllo con veicolo parallelo.
 
Relazione sull’esecuzione del saggio  
37. La relazione sull’esecuzione del saggio deve contenere le seguenti informa ­
zioni:  
Sostanze di prova e di controllo  
— dati di identificazione (ad esempio, numero CAS e numero CE, se 
disponibili; origine; purezza; impurità note; numero di lotto);  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad esempio, volatilità, stabilità, 
solubilità);  
— se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei 
componenti;  
Solvente/veicolo  
— dati di identificazione (purezza; concentrazione, ove pertinente; volume 
usato);  
— giustificazione per la scelta del veicolo;  
Animali sperimentali  
— origine dei topi del ceppo CBA;  
— condizioni microbiologice degli animali, se note;  
— numero, età e sesso degli animali;  
— origine degli animali, condizioni di alloggio, dieta ecc.;  
Condizioni del saggio  
— dettagli relativi alla preparazione e all’applicazione della sostanza di 
prova;  
— giustificazione per la scelta delle dosi, compresi i risultati del saggio 
preliminare, se eseguito);  
— concentrazioni del veicolo e della sostanza e quantità totale di sostanza 
applicata;  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta, origine dell’acqua);  
— dettagli dei programmi di trattamento e di campionamento;  
— metodi di misurazione della tossicità;  
— criteri per considerare gli studi positivi o negativi;  
— dettagli di eventuali deviazioni dal protocollo e spiegazione su come la 
deviazione influenzi il progetto e i risultati dello studio;  
Controllo dell’affidabilità  
— riassunto dei risultati del più recente controllo dell’affidabilità, comprese 
informazioni sulla sostanza, la concentrazione e il veicolo usati;  
— dati sui controlli positivi e negativi, paralleli e/o storici, per il labora ­
torio di prova;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 611
 
— se non è stato incluso un controllo positivo parallelo, la data e la 
relazione del laboratorio per il controllo positivo periodico più recente 
e una relazione che riporta nel dettaglio i dati storici sui controlli po ­
sitivi per il laboratorio, che giustifichi la scelta di base di non effettuare un controllo positivo parallelo;
 
Risultati  
— peso dei singoli topi all’inizio dell’applicazione delle dosi e alla sop ­
pressione programmata, oltre che il termine di errore medio e associato (ad esempio SD, SEM) per ciascun gruppo di trattamento;
 
— momento dell’insorgenza e decorso degli eventuali segni di tossicità, 
compresa l’irritazione cutanea nel punto di applicazione, per ciascun 
animale;  
— tabella dei valori di DPM individuali (sistema del singolo animale) o 
valori medi/mediani (sistema del gruppo di trattamento) e dei valori de ­
gli indici di stimolazione per ciascun gruppo di trattamento;  
— termine di errore medio e associato (ad esempio, SD, SEM) per DPM/ 
animale per ciascun gruppo di trattamento e i risultati dell’osservazione aberrante per ciascun gruppo di trattamento se si ricorre al sistema del 
singolo animale;
 
— indice di stimolazione calcolato e un’adeguata misura della variabilità 
che tenga conto della variabilità interanimale sia nella sostanza speri ­
mentale che nei gruppi di controllo, se si ricorre al sistema del singolo animale;
 
— rapporto dose-risposta;  
— analisi statistiche, ove pertinenti;  
Discussione dei risultati  
— breve commento sui risultati, sull’analisi dose-risposta e sulle analisi 
statistiche, ove pertinenti, con una conclusione sulla necessità o meno 
di considerare la sostanza di prova un sensibilizzante cutaneo.  
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Appendice 1  
Standard di prestazione per la valutazione di metodi di prova LLNA simili o 
modificati proposti per l’irritazione cutanea  
INTRODUZIONE  
1. Scopo degli standard di prestazione (PS) è comunicare il fondamento in 
base al quale è possibile determinare nuovi metodi di prova, considerati o 
meno proprietari (ossia tutelati dal diritto d’autore, contrassegnati da mar ­
chio, registrati), per avere un’accuratezza e un’affidabilità sufficienti per specifici scopi sperimentali. Tali standard di prestazione, basati su metodi 
di prova convalidati e accettati, possono essere impiegati per valutare l’af ­
fidabilità e l’accuratezza di altri metodi simili (definiti metodi «struttural ­
mente analoghi»), basati su principi scientifici analoghi, e per misurare o prevedere lo stesso effetto biologico o tossico (14).
 
2. Prima dell’adozione di un metodo modificato (ossia di potenziali miglio ­
ramenti proposti rispetto a un metodo di prova approvato), si dovrebbe effettuare una valutazione per stabilire l’effetto delle modifiche proposte 
sulla prestazione del saggio e la portata di tali modifiche sulle informazioni 
disponibili per le altri componenti del processo di convalida. A seconda del numero e della natura delle modifiche proposte, dei dati generati e della documentazione giustificativa di tali modifiche, queste ultime devono es ­
sere sottoposte al medesimo processo di convalida descritto per un nuovo 
saggio o, se del caso, a una valutazione ristretta dell’affidabilità e della pertinenza, sulla scorta di un PS consolidato (14).
 
3. I metodi simili o le varianti di tali metodi, proposti nel quadro del presente 
metodo di prova, devono essere valutati per stabilirne l’affidabilità e l’ac ­
curatezza, con l’impiego di sostanze chimiche che rappresentano l’inter ­
vallo completo dei punteggi di irritazione dell’LLNA. Per evitare un uso 
ingiustificato degli animali si raccomanda vivamente agli sviluppatori del 
modello di consultare le autorità competenti prima di iniziare gli studi di convalida, in conformità con il PS e gli orientamenti forniti nell’ambito del presente metodo di prova.
 
4. Gli standard di prestazione qui specificati fanno riferimento ai seguenti 
standard armonizzati, usati per valutare la validità di versioni simili o modificate dell’LLNA: US-ICCVAM, EC-ECVAM e Japanese-JaCVAM 
(12). Il PS consiste di componenti essenziali del metodo di prova, sostanze 
chimiche di riferimento raccomandate e standard per l’accuratezza e l’affi ­
dabilità che il metodo proposto dovrebbe soddisfare o superare.
 
I. Componenti essenziali del metodo di prova  
5. Per garantire che un metodo LLNA simile o modificato sia funzionalmente 
e meccanicamente analogo all’LLNA e misuri il medesimo effetto biolo ­
gico, nel protocollo del metodo di prova devono essere inserite le seguenti 
componenti:  
— la sostanza sperimentale deve essere applicata a livello locale su en ­
trambe le orecchie del topo;  
— la proliferazione dei linfociti deve essere misurata nei linfonodi drenanti 
dal sito di applicazione della sostanza sperimentale;  
— la proliferazione dei linfociti deve essere misurata durante la fase di 
induzione dell’irritazione cutanea;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 616
 
— per le sostanze sperimentali, la dose più elevata selezionata dovrebbe 
essere la concentrazione massima che non induce tossicità sistemica e/o 
eccessiva irritazione cutanea locale nel topo. Per le sostanze chimiche di riferimento positive, la dose massima dovrebbe essere almeno la stessa dei valori EC3 LLNA delle corrispondenti sostanze di riferi ­
mento (cfr. la tabella 1) senza produrre tossicità sistemica e/o eccessiva 
irritazione cutanea locale nel topo;
 
— in ogni studio deve essere inserito un controllo trattato con 
veicolo (VC) parallelo e, se del caso, dovrebbe essere usato anche un controllo positivo parallelo;
 
— devono essere usati almeno quattro animali per gruppo di trattamento;  
— possono essere raccolti dati individuali o aggregati.  
Se uno qualsiasi di tali criteri non è soddisfatto, gli standard di riferimento 
non possono essere usati per convalidare il metodo simile o modificato.  
II. Elenco minimo di sostanze chimiche di riferimento  
6. Gli standard armonizzati US-ICCVAM, EC-ECVAM e Japanese-JaCVAM 
(12) identificano un minimo di 18 sostanze chimiche di riferimento obbli ­
gatorie e 4 sostanze di riferimento facoltative (ossia sostanze che hanno prodotto risultati falsi positivi o falsi negativi nell’LLNA rispetto ai risultati 
ottenuti sull’uomo o sui porcellini d’India (B.6 o OCSE Test Guideline 
406) (13), e pertanto offrono l’opportunità di dimostrare un rendimento uguale o migliore rispetto all’LLNA), che sono incluse nello standard di prestazione dell’LLNA. I criteri di selezione per individuare tali sostanze 
chimiche sono:
 
— l’elenco delle sostanze chimiche di riferimento conteneva i tipi di so ­
stanze che solitamente vengono testate per il loro potenziale di irrita ­
zione cutanea e la gamma di risposte che l’LLNA è in grado di misu ­
rare o prevedere;  
— le sostanze possedevano strutture chimiche ben definite;  
— per ogni sostanza erano disponibili dati dell’LLNA ottenuti da saggi sui 
porcellini d’India (ossia B.6; OCSE Test Guideline 406) (13) e (se del caso) dati ottenuti dall’uomo;
 
— le sostanze potevano essere facilmente reperite sul mercato.  
Le sostanze chimiche di riferimento raccomandate sono elencate nella ta ­
bella 1. Gli studi che utilizzano le sostanze chimiche di riferimento propo ­
ste devono essere valutati nel veicolo con cui sono elencate nella tabella 1. Nell’eventualità in cui una sostanza elencata non sia disponibile, con un’adeguata giustificazione possono essere usate altre sostanze che soddi ­
sfano i criteri di selezione menzionati.
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Tabella 1  
Sostanze chimiche di riferimento raccomandate per lo standard di Prestazione dell’LLNA  
Numero Sostanze chimiche (  1 ) CAS Forma Veic. (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Gamma EC3 
effettiva LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
uomo  
1 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-one (CMI)/2-metil- 
4-isotiazolin-3-one (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Liq. DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sol. AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-fenilediammina 106-50-3 Sol AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Cloruro di cobalto 7646-79-9 Sol DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Isoeugenolo 97-54-1 Liq AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 6 2-mercaptobenzotiazolo 149-30-4 Sol DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 7 Citrale 5392-40-5 Liq AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Liq AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 
9 Eugenolo 97-53-0 Liq AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Fenil benzoato 93-99-2 Sol AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Alcol cinnamico 104-54-1 Sol AOO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 12 Imidazolidinil urea 39236-46-9 Sol DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 13 Metilmetacrilato 80-62-6 Liq AOO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 Clorobenzene 108-90-7 Liq AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Isopropanolo 67-63-0 Liq AOO 50 1 NA NA –/– –/+
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 ▼M3 
Numero Sostanze chimiche (  1 ) CAS Forma Veic. (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Gamma EC3 
effettiva LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
uomo  
16 Acido lattico 50-21-5 Liq DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Salicilato di metile 119-36-8 Liq AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Acido salicilico 69-72-7 Sol AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Sostanze opzionali per dimostrare un migliorato rendimento relativo all’LLNA 
19 Laurilsolfato di sodio 151-21-3 Sol. DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Etilene glicol dimetacrilato 97-90-5 Liq. MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 21 Xilene 1330-20-7 Liq. AOO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 22 Cloruro di nichel 7718-54-9 Sol. DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Abbreviazioni: AOO = acetone: olio di oliva (4:1, v/v); CAS = Chemical Abstracts Service Number; DMF =  N,N -dimetilformammide; DMSO = dimetilsolfossido; DNCB = 2,4-dinitroclorobenzene; EC3 = concentrazione stimata 
necessaria a produrre un indice di stimolazione pari a 3; GP = risultato del saggio sul porcellino d’India (ossia B. 6 o OCSE T est Guideline 406) (13); HCA = aldeide esil cinnamica; Liq = liquido; LLNA = risultato del saggio 
local lymph node assay eseguito sui topi (ossia. B. 42 o OCSE Test Guideline 429) (1); MEK = metiletilchetone; NA = non applica bile perché l’indice di stimolazione < 3; NC = non calcolato perché i dati sono stati ottenuti da 
un unico studio; Sol = solido; Veic. = veicolo del saggio. 
(*) Si presume che sia un non irritante nell’uomo, per il fatto che non sono stati raccolti risultati da saggi epicutanei clini ci, la sostanza non è stata inclusa come allergene in kit di saggi epicutanei e non sono stati segnalati casi 
di irritazione nell’uomo. 
(**) non sono disponibili dati raccolti da saggi condotti su porcellini d’India. 
( 1 ) Le sostanze chimiche devono essere preparate quotidianamente, salvo qualora siano disponibili dati sulla stabilità che dimost rino che la conservazione è accettabile. 
( 2 ) A causa del potenziale impatto di veicoli diversi sul rendimento dell’LLNA, per ogni sostanza di riferimento deve essere util izzato il veicolo raccomandato (24)(32). 
( 3 ) Valori medi nel caso in cui fossero disponibili più valori EC3. Per le sostanze negative (ossia con indice di stimolazione < 3) è fornita la concentrazione più elevata testata). 
( 4 ) Numero di studi LLNA da cui sono stati ottenuti dati. 
( 5 ) Disponibile in commercio con la denominazione Kathon CG (CAS 55965-84-9), che è una miscela 3:1 di CMI e MI. Le concentrazion i relative di ciascuna componente vanno dall’1,1 % all’1,25 % (CMI) e dallo 0,3 % allo 
0,45 % (MI). Le componenti inattive sono sali di magnesio (dal 21,5 % al 24 %) e nitrato rameico (dallo 0,15 % allo 0,17 %), co n la rimanente formulazione dal 74 % al 77 % d’acqua. Kathon CG è messa a disposizione 
da Sigma-Aldrich e da Rohm and Haas (ora Dow Chemical Corporation).
 III. Standard di affidabilità e accuratezza definiti  
7. L’accuratezza di un metodo simile o modificato rispetto all’LLNA deve 
soddisfare o superare gli standard di prestazione dell’LLNA allorché è 
valutata sulla base delle 18 sostanze di riferimento minime che è ob ­
bligatorio utilizzare. Il metodo nuovo o modificato deve poter essere classificato correttamente sulla base di una decisione «sì/no». Tuttavia, 
il metodo nuovo o modificato potrebbe non classificare correttamente 
tutte le sostanze chimiche di riferimento minime che devono essere utilizzate. Se, per esempio, uno degli irritanti deboli fosse erroneamente classificato, per dimostrare un rendimento equivalente si potrebbe consi ­
derare l’opportunità di spiegarne l’errata classificazione e di fornire dati 
supplementari adeguati (ad esempio, risultati di saggi che forniscono classificazioni corrette per altre sostanze con proprietà fisiche, chimiche e irritanti simili a quelle della sostanza chimica di riferimento in que ­
stione). In questi casi, lo stato di convalida del metodo di prova LLNA 
nuovo o modificato sarebbe valutato caso per caso.
 
Riproducibilità all’interno del laboratorio di prova  
8. Per stabilire la riproducibilità all’interno del laboratorio che ha eseguito il 
saggio, un metodo LLNA nuovo o modificato dovrebbe essere valutato 
utilizzando una sostanza irritante ben caratterizzata nell’LLNA. Pertanto, 
gli standard di riferimento dell’LLNA sono basati sulla variabilità dei risultati da saggi ripetuti dell’aldeide esil cinnamica (HCA). Al fine di valutare l’affidabilità all’interno del laboratorio che ha eseguito il saggio, 
i valori soglia della concentrazione stimata (ECt) per l’HCA devono essere 
ottenuti in quattro distinte occasioni, lasciando trascorrere almeno una set ­
timana tra ciascun test. Una riproducibilità accettabile all’interno del labo ­
ratorio è indicata dalla capacità del laboratorio di ottenere, per ciascun 
saggio con l’HCA, valori ECt compresi tra il 5 % e il 20 %, che rappre ­
sentano un intervallo di 0,5-2,0 volte il valore EC3 medio specificato per l’HCA (10 %) nell’LLNA (cfr. la tabella 1).
 
Riproducibilità tra laboratori  
9. Per stabilire la riproducibilità tra laboratori di un metodo LLNA nuovo o 
modificato si dovrebbero utilizzare due sostanze irritanti ben caratterizzate 
nell’LLNA. Gli standard di prestazione dell’LLNA dipendono dalla varia ­
bilità dei risultati dei saggi condotti con l’HCA e il 2,4- dinitroclorobenzene (DNCB) in laboratori diversi. I valori ECt devono 
essere ottenuti in maniera indipendente da un unico studio condotto in 
almeno tre laboratori distinti. Per dimostrare una riproducibilità accettabile tra laboratori, ogni laboratorio dovrebbe ottenere valori ECt del 5 % fino al 20 % per l’HCA e dello 0,025 % fino allo 0,1 % per il DNCB, che rap ­
presentano l’intervallo di 0,5-2,0 volte le concentrazioni EC3 medie speci ­
ficate per l’HCA (10 %) e il DNCB (0,05 %), rispettivamente, nell’LLNA (cfr. la tabella 1).
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 620
 
Appendice 2  
Definizioni  
Accuratezza:  grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo di prova e 
i valori di riferimento accettati. Misura l’efficienza del metodo di prova e rap ­
presenta un aspetto della pertinenza. Il termine è usato spesso in modo intercam ­
biabile con «concordanza», per indicare la proporzione di risultati corretti di un 
metodo di prova (14).  
Sostanza di riferimento:  sostanza irritante o non irritante usata come standard di 
confronto rispetto a una sostanza di prova. Una sostanza di riferimento dovrebbe presentare le seguenti proprietà: i) fonte o fonti coerenti e affidabili; ii) analogia 
strutturale e funzionale alla classe delle sostanze in esame; iii) caratteristiche 
fisiche/chimiche conosciute; iv) dati di supporto relativi agli effetti noti; v) effi ­
cacia nota nell’ambito della reazione auspicata.
 
Soglia di concentrazione stimata (ECt):  concentrazione stimata di una sostanza di 
prova necessaria a produrre un indice di stimolazione indicativo di una risposta 
positiva.  
Concentrazione stimata tre (EC3):  concentrazione stimata di una sostanza di 
prova necessaria a produrre un indice di stimolazione pari a tre.  
Falso negativo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come negativa o non attiva, mentre in realtà si tratta di una sostanza positiva o attiva.
 
Falso positivo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come positiva o attiva, mentre di fatto si tratta di una sostanza negativa o 
non attiva.  
Pericolo:  un potenziale effetto avverso per la salute o l’ambiente. L’effetto 
avverso si manifesta soltanto se c’è un’esposizione di livello sufficiente.  
Riproducibilità fra laboratori:  una misura della possibilità che laboratori quali ­
ficati diversi, seguendo lo stesso protocollo e testando la stessa sostanza di prova, riproducano risultati qualitativamente e quantitativamente simili. La riproducibi ­
lità fra laboratori è determinata nel corso dei processi di pre-validazione e vali ­
dazione e indica la misura in cui un saggio può essere trasferito efficacemente tra 
laboratori; è detta anche riproducibilità inter-laboratorio (14).
 
Riproducibilità all’interno del laboratorio:  la misura della possibilità che persone 
qualificate all’interno del medesimo laboratorio, seguendo un protocollo specifi ­
co, replichino efficacemente i risultati di un saggio. È detta anche riproducibilità 
intra-laboratorio (14).  
Test strutturalmente analoghi:  espressione che indica un metodo di prova strut ­
turalmente e funzionalmente analogo a un metodo di prova di riferimento con ­
validato e accettato. Tale metodo di prova potrebbe essere candidato a convalide accelerate (catch-up validation). Usato in maniera intercambiabile con un metodo 
di prova simile (14).
 
Osservazione aberrante:  un’osservazione aberrante è un’osservazione marcata ­
mente diversa dagli altri valori in un campione casuale di popolazione.  
Standard di prestazione (PS):  standard basati su un metodo di riferimento con ­
validato, che consentono di valutare la comparabilità di un metodo proposto simile sotto il profilo strutturale e funzionale. Detti standard comprendono: i) i 
componenti essenziali del metodo; ii) un elenco minimo di sostanze di riferi ­
mento scelte tra le sostanze utilizzate per dimostrare l’accettabilità delle presta ­
zioni del metodo di riferimento convalidato; e iii) in funzione dei risultati ottenuti con il metodo di riferimento convalidato, i livelli comparabili di accuratezza e 
affidabilità che il metodo proposto dovrebbe ottenere quando viene valutato 
utilizzando l’elenco minimo di sostanze di riferimento (14).
 
Metodo di prova proprietario:  un metodo di prova la cui fabbricazione e di ­
stribuzione è limitata da brevetti, diritti d’autore, marchi ecc.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 621
 
Assicurazione della qualità:  un processo di gestione in base al quale l’aderenza a 
standard e requisiti di prova e procedure di registrazione propri di un laboratorio 
e l’accuratezza del trasferimento dei dati sono valutate da individui indipendenti da coloro che eseguono le prove.
 
Sostanze chimiche di riferimento:  sostanze chimiche selezionate per essere uti ­
lizzate nella procedura di convalida, di cui sono già note le risposte nel sistema di 
prova di riferimento in vitro o in vivo o le specie di interesse. Tali sostanze 
chimiche dovrebbero essere rappresentative delle classi di sostanze chimiche per le quali si prevede di utilizzare il metodo di prova, e dovrebbero rappresentare l’intera gamma di risposte prevedibili delle sostanze chimiche per le quali il 
metodo di prova può essere usato, ossia da forte a debole a negativa. Gruppi 
diversi di sostanze di riferimento possono essere richiesti per le diverse fasi del processo di convalida e per i diversi metodi di prova e utilizzi della prova (14).
 
Pertinenza:  descrizione del rapporto del saggio con l’effetto di interesse e se esso 
è significativo e utile per uno scopo specifico. È il grado con cui il saggio misura 
o prevede correttamente l’effetto biologico di interesse. La pertinenza comprende 
una valutazione dell’accuratezza (concordanza) di un metodo di prova (14).  
Affidabilità:  misura in cui un metodo può essere riprodotto nel tempo all’interno 
dello stesso laboratorio o da laboratori diversi utilizzando il medesimo protocollo. 
È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratorio (14).  
Irritazione cutanea:  un processo immunologico che si verifica quando un indi ­
viduo suscettibile è esposto a livello topico a un allergene chimico, che provoca una risposta immunitaria cutanea che può portare allo sviluppo di sensibilizza ­
zione da contatto.
 
Indice di stimolazione (SI):  un valore calcolato per valutare il potenziale di 
irritazione cutanea di una sostanza di prova, corrispondente al rapporto della proliferazione nei gruppi trattati rispetto a quella del gruppo di controllo trattato contemporaneamente con veicolo.
 
Sostanza di prova (o sostanza sperimentale):  qualsiasi sostanza o miscela testata 
seguendo il presente metodo di prova.  
Metodo di prova convalidato:  metodo di prova in base al quale sono stati com ­
pletati studi di convalida per determinare la rilevanza (compresa l’accuratezza) e l’affidabilità per un fine specifico. Va sottolineato che un metodo di prova 
convalidato potrebbe non avere un rendimento sufficiente in termini di valori 
di accuratezza e affidabilità ritenuti accettabili per il raggiungimento dell’obiet ­
tivo prefissato (14).
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 622
 
B.43.  STUDI DI NEUROTOSSICITÀ NEI RODITORI  
1. METODO  
Questo metodo di saggio è equivalente al metodo OCSE TG 424 
(1997).  
Il suo scopo è permettere di ricavare le informazioni necessarie per 
confermare o caratterizzare in modo più accurato la potenziale neu ­
rotossicità di sostanze chimiche in animali adulti. Può essere abbi ­
nato a metodi esistenti utilizzati per studi di tossicità per dose ripe ­
tuta, oppure essere utilizzato in uno studio a sé stante. Per la con ­
cezione di studi basati sul suo utilizzo, si raccomanda di consultare il 
documento orientativo OCSE sulle strategie e sui metodi di speri ­
mentazione riguardanti la neurotossicità (1), in particolare nel caso in cui siano previste modifiche delle osservazioni e dei procedimenti raccomandati per l'uso routinario di questo metodo. Tale documento, 
infatti, è stato elaborato allo scopo di facilitare la scelta di altri 
procedimenti da utilizzare in casi specifici.
 
La valutazione della neurotossicità sullo sviluppo non rientra nell'og ­
getto di questo metodo.  
1.1 INTRODUZIONE  
Per la valutazione delle caratteristiche tossiche delle sostanze chimi ­
che, è importante prendere in considerazione la loro capacità poten ­
ziale di causare effetti neurotossici. Il metodo utilizzato per i saggi di 
tossicità sistemica per dose ripetuta prevede già osservazioni intese a individuare una potenziale neurotossicità. Il metodo oggetto del pre ­
sente documento può essere utilizzato per disegnare uno studio che 
consenta di ricavare maggiori informazioni o di confermare gli effetti 
neurotossici osservati negli studi di tossicità sistemica per dose ripe ­
tuta. Tuttavia, per talune classi di sostanze chimiche, di cui è nota la 
potenziale neurotossicità, può essere opportuno utilizzare questo me ­
todo anche in assenza di indicazioni di una potenziale neurotossicità emerse da studi di tossicità sistemica per dose ripetuta. Depongono a favore di questo approccio, ad esempio:
 
— l'osservazione di segni neurologici o lesioni neuropatologiche in 
studi di tossicità diversi dagli studi di tossicità per dose ripetuta, oppure
 
— l'affinità strutturale o altre informazioni che indicano una corre ­
lazione tra tali sostanze e neurotossici noti.  
L'uso di questo metodo può essere opportuno anche in altri casi; per 
maggiori indicazioni a questo riguardo, si rimanda alla voce biblio ­
grafica (1).  
Nell'elaborazione di questo metodo, si è posta particolare attenzione 
alla possibilità di un suo adattamento a necessità specifiche di con ­
ferma della specifica neurotossicità istopatologica e comportamentale 
di una sostanza chimica, nonché di caratterizzazione e quantifica ­
zione delle risposte neurotossiche.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 623
 
In passato, si faceva coincidere la neurotossicità con la neuropatia, 
che comporta lesioni neuropatologiche o disfunzioni neurologiche 
quali convulsioni, paralisi o tremore. La neuropatia è indubbiamente una manifestazione importante di neurotossicità, ma oggi appare evidente che vi sono molti altri segni di tossicità per il sistema 
nervoso centrale (p. es. la perdita della coordinazione motoria, i 
deficit sensoriali, le disfunzioni dell'apprendimento e della memoria) che possono non emergere negli studi sulla neuropatia o in altri tipi di studi.
 
Questo metodo per la conduzione di studi di neurotossicità ha lo 
scopo di consentire l'individuazione di effetti neurocomportamentali 
e neuropatologici di rilievo nei roditori adulti. Gli effetti comporta ­
mentali, anche in assenza di modificazioni morfologiche, possono essere indicativi di un effetto avverso sull'organismo; viceversa, non tutte le modificazioni comportamentali sono riconducibili in 
modo specifico al sistema nervoso centrale. Per questo motivo, tutte 
le modificazioni osservate devono essere valutate insieme a dati correlati di tipo istopatologico, ematologico o biochimico, nonché a dati riguardanti altri tipi di tossicità sistemica. Ai fini della carat ­
terizzazione e quantificazione delle risposte neurotossiche, questo 
metodo prevede tra l'altro specifici esami istopatologici e comporta ­
mentali che possono essere ulteriormente supportati da indagini elet ­
trofisiologiche e/o biochimiche (1)(2)(3)(4).
 
I neurotossici possono agire su diversi target del sistema nervoso e 
con svariati meccanismi. Dato che non esiste un unico insieme di test 
che permetta di valutare in modo approfondito e completo il poten ­
ziale neurotossico di ogni sostanza, può essere necessario ricorrere ad altri test  in vivo  o in vitro specifici per il tipo di neurotossicità 
osservata o attesa.
 
Questo metodo di saggio può essere anche usato, insieme alle indi ­
cazioni riportate nel documento orientativo OCSE sulle strategie e 
sui metodi di sperimentazione riguardanti la neurotossicità (1), per 
disegnare studi che permettano di caratterizzare in modo più accurato la quantificazione dose-risposta o migliorarne la sensibilità in modo da poter stimare meglio il NOAEL (livello in corrispondenza del 
quale non si osservano effetti avversi) o documentare rischi noti o 
sospetti associati alla sostanza chimica. Ad esempio, può essere utilizzato per disegnati studi intesi a identificare e valutare il mec ­
canismo o i meccanismi di neurotossicità, oppure a integrare i dati 
già disponibili ricavati da procedure di base per l'osservazione degli 
effetti neurocomportamentali o neuropatologici. Non è necessario che tali studi producano gli stessi dati che si ricaverebbero applicando i procedimenti standard raccomandati in questo metodo, se tali dati 
sono già disponibili e non sono ritenuti necessari per l'interpretazione 
dei risultati dello studio.
 
Questo studio di neurotossicità, usato da solo o in abbinamento ad 
altri studi, permette di ricavare informazioni utili per:  
— stabilire se la sostanza chimica esaminata provoca effetti perma ­
nenti o reversibili sul sistema nervoso;  
— caratterizzare con maggior precisione le alterazioni del sistema 
nervoso associate all'esposizione alla sostanza chimica, e com ­
prendere il meccanismo alla base di tali alterazioni;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 624
 
— determinare le relazioni dose-risposta e tempo-risposta al fine di 
stimare un livello in corrispondenza del quale non si osservano 
effetti avversi (a sua volta utilizzabile per stabilire criteri di si ­
curezza per la sostanza chimica in questione).  
Questo metodo di saggio prevede la somministrazione orale della 
sostanza da esaminare. In talune circostanze può essere preferibile 
usare altre vie di somministrazione (ad esempio cutanea o per ina ­
lazione); in tal caso può essere necessaria una modifica dei procedi ­
menti raccomandati. La via di somministrazione deve essere scelta in funzione del profilo di esposizione negli esseri umani e delle infor ­
mazioni disponibili sulle caratteristiche tossicologiche o cinetiche.
 
1.2 DEFINIZIONI  
Effetto avverso:  alterazione rispetto alle condizioni di base, riferibile 
al trattamento somministrato, che riduce la capacità di un organismo di sopravvivere, riprodursi o adattarsi all'ambiente.
 
Dose:  quantità di sostanza somministrata. Viene espressa in peso (g, 
mg), oppure in peso per unità di peso dell'animale usato per il saggio 
(p. es. mg/kg), oppure concentrazione costante nella dieta (ppm).  
Dosaggio:  termine generale che indica la dose, la frequenza e la 
durata della somministrazione.  
Neurotossicità:  modificazione avversa che si produce nella struttura 
o nella funzione del sistema nervoso centrale in seguito all'esposi ­
zione a un agente chimico, biologico o fisico.  
Neurotossico:  agente chimico, biologico o fisico potenzialmente in 
grado di causare neurotossicità.  
NOAEL:  abbreviazione dell'inglese no observed adverse effect level; 
designa il livello di dose massimo in corrispondenza del quale non si 
osservano effetti avversi correlati al trattamento.  
1.3 PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
La sostanza chimica in esame viene somministrata per via orale in un 
range di dosi a diversi gruppi di roditori da laboratorio. Normal ­
mente sono necessarie dosi ripetute, e il regime di somministrazione può essere di 28 giorni, subcronico (90 giorni) o cronico (1 anno o 
più). I procedimenti indicati in questo metodo sono utilizzabili anche 
per studi di neurotossicità acuta. Il saggio eseguito sugli animali ha lo scopo di consentire l'individuazione o la caratterizzazione di ano ­
malie del comportamento e/o neurologiche. In ciascun periodo di 
osservazione viene valutata una serie di comportamenti che potreb ­
bero essere influenzati dai neurotossici. Al termine del saggio, all'in ­
terno di ciascun gruppo un sottogruppo di animali di ciascun sesso viene sottoposto a perfusione in situ e prelievo di tessuti del cervello, 
del midollo spinale e dei nervi periferici, destinati a un successivo 
esame.
 
Nel caso di studi a sé stanti condotti per determinare la neurotossicità 
di una sostanza o per caratterizzarne gli effetti neurotossici, gli ani ­
mali di ciascun gruppo non utilizzati per la perfusione e il successivo 
esame istopatologico (vedi tabella 1) possono essere utilizzati per 
specifici esami neurocomportamentali, neuropatologici, neurochimici o elettrofisiologici allo scopo di completare i dati ricavati dagli esami standard previsti da questo metodo (1). Questi esami supplementari 
possono essere particolarmente utili qualora osservazioni empiriche o 
gli effetti attesi indichino che l'azione neurotossica della sostanza in esame si esercita su un tipo specifico di bersaglio. Altrimenti, gli animali rimanenti possono essere utilizzati per valutazioni analoghe a 
quelle previste da questo metodo nell'ambito di studi di tossicità per 
dose ripetuta nei roditori.
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Quando gli esami previsti da questo metodo sono abbinati a esami 
previsti da altri metodi, è necessario disporre di un numero suffi ­
ciente di animali per poter eseguire le osservazioni richieste da en ­
trambi gli studi.  
1.4 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1  Scelta della specie di animali  
La specie di roditori da preferirsi è rappresentata dal ratto, ma è 
possibile utilizzare anche altre specie di roditori, fornendone ade ­
guata motivazione. Gli animali utilizzati devono essere adulti giovani 
e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Di norma, la som ­
ministrazione deve iniziare quanto prima possibile dopo il divezza ­
mento, preferibilmente prima che gli animali abbiano raggiunto le sei 
settimane di età e in ogni caso prima che abbiano raggiunto le nove settimane di età. Tuttavia, quando questo studio viene eseguito in abbinamento ad altri studi, può essere necessario un aggiustamento 
del criterio relativo all'età degli animali. All'inizio dello studio, il 
peso degli animali deve essere del ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Quando uno studio per dose ripetuta di breve durata serve da studio preliminare per uno studio a lungo termine, nei due 
studi devono essere utilizzati animali dello stesso ceppo e della 
stessa provenienza.
 
1.4.2  Condizioni di stabulazione e di alimentazione  
La temperatura dello stabulario deve essere di 22  o C (± 3  o C). 
L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L'illuminazione deve 
essere artificiale e alternare 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. I 
rumori forti intermittenti devono essere ridotti al minimo. Per l'ali ­
mentazione, si possono utilizzare diete convenzionali da laboratorio con acqua ad libitum. La scelta della dieta può essere influenzata 
dalla necessità di garantire un'adeguata miscelazione della sostanza 
in esame, allorché essa viene somministrata con questo metodo. Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso.
 
1.4.3  Preparazione degli animali  
L'assegnazione al gruppo di trattamento e al gruppo di controllo 
viene effettuata in modo casuale scegliendo animali giovani e sani. 
Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo 
eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali devono essere identificati in modo univoco e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell'inizio dello studio, in modo da consentirne l'ac ­
climatazione alle condizioni di laboratorio.
 
1.4.4  Via di somministrazione e preparazione delle dosi  
Questo metodo prevede espressamente la somministrazione orale 
della sostanza da esaminare. La somministrazione può essere effet ­
tuata per via intragastrica, con gli alimenti, nell'acqua di bevanda o mediante capsule. Si possono utilizzare anche altre vie di sommini ­
strazione (ad es. cutanea o per inalazione), ma in questo caso può 
essere necessario modificare i procedimenti raccomandati. La via di 
somministrazione deve essere scelta in funzione del profilo di esposizione degli esseri umani e delle informazioni disponibili sulle caratteristiche tossicologiche o cinetiche. Si devono comunque indi ­
care i motivi della scelta della via di somministrazione e le conse ­
guenti modifiche dei procedimenti previsti da questo metodo.
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Se necessario, la sostanza da esaminare può essere disciolta o so ­
spesa in un veicolo adatto. Ove possibile, si raccomanda di utilizzare 
una soluzione/sospensione acquosa, oppure, come seconda alternati ­
va, una soluzione/sospensione in olio (per esempio olio di mais), o infine una soluzione/sospensione in altri veicoli. Le caratteristiche di 
tossicità del veicolo devono essere note. È opportuno inoltre verifi ­
care le seguenti caratteristiche del veicolo: effetti del veicolo sull'as ­
sorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza in esame che potrebbero alterare le caratteristiche 
tossiche di tale sostanza; ed effetti sul consumo di cibo o di acqua 
o sullo stato nutrizionale degli animali.
 
1.5 PROCEDIMENTI  
1.5.1  Numero e sesso degli animali  
Quando lo studio viene condotto come studio a sé stante, ciascun 
gruppo di trattamento e di controllo deve essere composto almeno da 20 animali (10 femmine e 10 maschi) ai fini della valutazione delle 
osservazioni cliniche e funzionali dettagliate. Al termine dello studio, 
almeno cinque maschi e cinque femmine, scelti tra questi 10 maschi e 10 femmine, devono essere sottoposti a perfusione in situ e a esame neuroistopatologico dettagliato. Nei casi in cui solo un nu ­
mero limitato di animali all'interno di un determinato gruppo di 
trattamento venga sottoposto a osservazione per rilevare segni di effetti neurotossici, è opportuno includere tali animali tra quelli scelti 
per la perfusione. Quando lo studio viene condotto in abbinamento a 
uno studio di tossicità per dose ripetuta, si deve prevedere l'utilizzo di un numero di animali sufficiente per gli obiettivi di entrambi gli studi. Nella tabella 1 è riportato, per varie combinazioni di studi, il 
numero minimo di animali da utilizzare per ciascun gruppo. Se sono 
previsti sacrifici intermedi nel corso dello studio, o gruppi di recu ­
pero per l'osservazione della reversibilità, della persistenza o della comparsa tardiva di effetti tossici dopo il trattamento, oppure se sono 
previste osservazioni supplementari, il numero di animali deve essere 
opportunamente aumentato affinché sia disponibile il numero di ani ­
mali necessario per l'osservazione e l'esame istopatologico.
 
1.5.2  Gruppi di trattamento e gruppo di controllo  
In genere si devono utilizzare almeno tre gruppi di trattamento a dosi 
diverse e un gruppo di controllo; tuttavia, se la valutazione di altri dati porta a prevedere l'assenza di effetti a una dose ripetuta di 1 000 
mg/kg di peso corporeo/giorno, può essere eseguito un saggio limite. 
Per stabilire le dosi da utilizzare, in mancanza di dati adeguati si può effettuare uno studio preliminare di tipo range finding. Fatta ecce ­
zione per la somministrazione della sostanza da esaminare, gli ani ­
mali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo identico agli esemplari del gruppo di controllo. Qualora la sostanza da sag ­
giare venga incorporata in un veicolo, al gruppo di controllo verrà 
somministrato il medesimo veicolo nel volume massimo utilizzato.
 
1.5.3  Controllo di attendibilità  
Il laboratorio che esegue lo studio deve presentare dati che dimo ­
strino la capacità dello stesso di eseguire lo studio, nonché la sensi ­
bilità dei procedimenti utilizzati. Tali dati devono provare la capacità di individuare e quantificare, nel modo più opportuno, modificazioni dei diversi endpoint di cui è raccomandata l'osservazione, quali segni 
autonomici, reattività sensoriale, forza di prensione e attività motoria. 
Per informazioni su sostanze chimiche che causano vari tipi di ri ­
sposte neurotossiche e che possono essere utilizzate come sostanze di controllo positivo si rimanda alle voci bibliografiche da (2) a (9). È 
ammesso l'uso di dati storici, che si raccomanda di aggiornare pe ­
riodicamente, a condizione che siano identici gli aspetti essenziali dei procedimenti sperimentali. Nuovi dati che dimostrino che i procedi ­
menti continuano a essere sensibili devono essere elaborati ogniqual ­
volta venga modificato un elemento essenziale del saggio o dei 
procedimenti.
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1.5.4  Scelta della dose  
I livelli di dose devono essere scelti tenendo conto di tutti i dati 
esistenti sulla tossicità e sulle caratteristiche cinetiche della sostanza da esaminare o di sostanze affini. Il livello di dose più elevato deve 
essere tale da indurre effetti neurotossici o chiari effetti tossici siste ­
mici. Deve essere inoltre definita una serie decrescente di livelli di dose al fine di individuare un'eventuale risposta dose-correlata e l'assenza di effetti avversi osservati al livello di dose più basso 
(NOAEL). In linea di massima, i livelli di dose devono essere tali 
da consentire di distinguere gli effetti tossici primari sul sistema nervoso dagli effetti legati alla tossicità sistemica. Per la determina ­
zione dei livelli di dose decrescenti risulta spesso ottimale applicare 
un fattore di divisione compreso tra due e tre; è comunque preferibile aggiungere un quarto gruppo di studio piuttosto che avere uno scarto eccessivo (ad esempio superiore a un fattore 10) tra un dosaggio e 
l'altro. Se esistono stime attendibili sull'esposizione umana prevista, 
se ne deve tenere conto.
 
1.5.5  Saggio limite  
Se uno studio effettuato conformemente al metodo descritto con un 
livello di dose di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno non 
produce effetti neurotossici osservabili e se i dati relativi a composti 
di struttura affine non sono suggestivi di tossicità, può non essere necessario eseguire uno studio completo con tre livelli di dose. In funzione dell'esposizione umana prevista può essere opportuno uti ­
lizzare un livello di dose orale più elevato nel saggio limite. Per altri 
tipi di somministrazione, ad esempio per inalazione o applicazione cutanea, il livello massimo di esposizione realizzabile dipende in molti casi dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza da esamina ­
re. La dose da utilizzare in un saggio limite per uno studio di 
neurotossicità acuta per via orale deve essere di almeno 2 000 mg/kg.
 
1.5.6  Somministrazione delle dosi  
La sostanza viene somministrata agli animali giornalmente, sette 
giorni su sette, per un periodo di almeno 28 giorni. La scelta di 
somministrare la sostanza cinque giorni alla settimana o per un pe ­
riodo più breve deve essere opportunamente motivata. Se viene ef ­
fettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in 
dose singola mediante sonda gastrica o idonea cannula per intuba ­
zione. Il volume massimo di liquido somministrabile in una volta sola dipende dalla taglia dell'animale, ma non deve superare 1 ml/ ­
100 g di peso corporeo tranne nel caso delle soluzioni acquose, per 
le quali si possono prevedere fino a 2 ml/100 g di peso corporeo. 
Salvo nel caso di sostanze irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l'aumentare della concentrazione, la varia ­
bilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo va ­
riando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante 
per tutti i livelli di dose.
 
Se la sostanza in esame è somministrata con la dieta o con l'acqua, è 
importante verificare che le quantità da utilizzare non alterino il 
normale bilancio idrico o nutrizionale. Se la sostanza è somministrata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dose costante in funzione del peso degli ani ­
mali, avendo cura di specificare quale sia l'alternativa prescelta. Se la 
sostanza è somministrata per via intragastrica, la dose deve essere somministrata ogni giorno alla stessa ora e all'occorrenza modificata per mantenere costante il livello di dose rispetto al peso dell'animale. 
Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio 
preliminare per dose ripetuta, la dieta degli animali deve essere identica nei due studi. Per gli studi acuti, nel caso in cui non sia possibile effettuare la somministrazione in un'unica dose, si può 
procedere al frazionamento della stessa e alla somministrazione delle 
varie frazioni nell'arco di un periodo non superiore a 24 ore.
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1.6 OSSERVAZIONE  
1.6.1  Frequenza delle osservazioni e degli esami  
Negli studi per dose ripetuta, il periodo di osservazione deve coprire 
il periodo della somministrazione. Negli studi acuti, l'osservazione 
deve estendersi ai 14 giorni successivi al trattamento. Nel caso degli 
animali dei gruppi satellite, per i quali è previsto un periodo post- trattamento senza esposizione, l'osservazione deve comprendere an ­
che questo periodo.
 
Le osservazioni devono essere effettuate con frequenza tale da assi ­
curare la massima probabilità che vengano individuate le anomalie comportamentali e/o neurologiche. Le osservazioni devono essere effettuate preferibilmente ogni giorno alla stessa ora, tenendo conto 
del periodo probabile di massima intensità degli effetti dopo la som ­
ministrazione. La frequenza delle osservazioni cliniche e degli esami funzionali è riassunta nella tabella 2. Se in base ai dati cinetici o di altro tipo ricavati in precedenza appare necessario effettuare le os ­
servazioni o gli esami funzionali in momenti diversi rispetto a quelli 
previsti o variare i periodi post-osservazione, deve essere elaborato un programma alternativo che consenta di ricavare quante più infor ­
mazioni possibile. Queste variazioni devono essere adeguatamente 
motivate.
 
1.6.1.1  Osservazione delle condizioni generali di salute e della mortalità/ ­
morbilità  
Tutti gli animali devono essere esaminati attentamente almeno una 
volta al giorno per verificare le condizioni di salute e almeno due volte al giorno per determinare la morbilità e la mortalità.
 
1.6.1.2  Osservazioni cliniche dettagliate  
Osservazioni cliniche dettagliate devono essere eseguite su tutti gli 
animali scelti a questo scopo (vedi tabella 1) una volta prima del ­
l'esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo stesso sog ­
getto) e successivamente a diversi intervalli, in funzione della durata dello studio (vedi tabella 2). Nel caso degli animali dei gruppi sa ­
tellite di recupero, le osservazioni cliniche dettagliate devono essere 
eseguite al termine del periodo di recupero. Le osservazioni cliniche dettagliate devono essere eseguite fuori dalle gabbie, collocando gli animali in un recinto standard. Le osservazioni devono essere accu ­
ratamente registrate, possibilmente utilizzando sistemi di punteggio 
che comprendano criteri o scale di punteggi esplicitamente definiti dal laboratorio che esegue il saggio per ciascuna delle misurazioni effettuate. Le variazioni delle condizioni sperimentali devono essere 
minime (non legate sistematicamente al trattamento) e le osservazioni 
devono essere condotte da osservatori preparati non a conoscenza del trattamento somministrato.
 
Si raccomanda di eseguire le osservazioni in modo strutturato, così 
da applicare sistematicamente criteri ben definiti (compresa la defi ­
nizione del range normale) a ciascun animale in ciascuna osserva ­
zione. Il range normale deve essere adeguatamente documentato. Tutti i segni osservati devono essere registrati. Ogniqualvolta ciò sia possibile, deve essere registrata anche l'entità dei segni osservati. 
Le osservazioni cliniche devono riguardare, tra l'altro, tutte le alte ­
razioni della cute, del pelo, degli occhi e delle mucose, la comparsa di secrezioni ed escrezioni e l'attività autonomica (ad es. lacrimazio ­
ne, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito e/o 
respirazione attraverso la bocca, anomalie nella minzione o nella 
defecazione, e variazione di colore dell'urina).
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Deve essere registrata anche ogni risposta inusuale riguardante la 
posizione del corpo, il livello di attività (ad es. maggiore o minore 
esplorazione del recinto standard) e la coordinazione dei movimenti. Devono essere inoltre registrate le modificazioni dell'andatura (ad es. andatura anserina, atassia), della postura (ad es. gobba) e della reat ­
tività alla manipolazione, al posizionamento o ad altri stimoli am ­
bientali, come pure la presenza di movimenti clonici o tonici, con ­
vulsioni o tremori, stereotipi (ad es. tolettatura eccessiva, movimenti inusuali della testa, continuo girare in tondo) o comportamenti inso ­
liti (ad es. tendenza a mordere o tendenza eccessiva a leccarsi, au ­
tomutilazione, marcia a ritroso, vocalizzazione) o aggressivi.
 
1.6.1.3  Esami funzionali  
Analogamente alle osservazioni cliniche dettagliate, anche gli esami 
funzionali devono essere eseguiti una volta prima dell'esposizione e 
successivamente a intervalli frequenti in tutti gli animali scelti a questo scopo (vedi tabella 1). La frequenza degli esami funzionali dipende anche dalla durata dello studio (vedi tabella 2). Oltre che 
agli intervalli indicati nella tabella 2, nei gruppi satellite di recupero 
devono essere effettuate osservazioni funzionali anche quanto più vicino possibile al sacrificio finale. Tra gli esami funzionali dev'es ­
sere compresa la valutazione della reattività sensoriale a stimoli di 
diverso tipo [ad es. stimoli uditivi, visivi e propriocettivi (5)(6)(7)], 
della forza di prensione (8) e dell'attività motoria (9). L'attività mo ­
toria deve essere misurata con un dispositivo automatizzato in grado di rilevare sia un aumento che una diminuzione della stessa. Se si 
utilizza un altro sistema, questo deve essere quantitativo e presentare 
sensibilità e affidabilità dimostrate. Ciascun dispositivo deve essere collaudato per garantire l'affidabilità nel tempo e l'omogeneità delle sue caratteristiche rispetto a quelle degli altri dispositivi. Ulteriori 
indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle voci 
bibliografiche citate. Se non esistono dati (ad es. struttura-attività, dati epidemiologici, altri studi tossicologici) che indicano i potenziali effetti neurotossici, è opportuno prevedere l'esecuzione di esami più 
specifici sulla funzione sensoriale e motoria o sull'apprendimento e 
sulla memoria per valutare in maggior dettaglio questi possibili ef ­
fetti. Per ulteriori informazioni sugli esami più specifici e sul loro impiego, si rimanda alla voce bibliografica (1).
 
In via eccezionale, gli animali che presentano segni di tossicità tali 
da interferire in modo significativo con gli esami funzionali possono essere esclusi da tali esami, fornendone opportuna motivazione.
 
1.6.2  Peso corporeo e consumo di cibo/acqua  
Negli studi di durata fino a 90 giorni, tutti gli animali devono essere 
pesati almeno una volta alla settimana e almeno settimanalmente deve essere determinato il loro consumo di cibo (o di acqua, nel 
caso in cui la sostanza in esame venga somministrata con l'acqua). 
Negli studi a lungo termine, tutti gli animali devono essere pesati almeno una volta alla settimana nelle prime 13 settimane e succes ­
sivamente almeno una volta ogni quattro settimane. Il consumo di 
cibo (o di acqua, nel caso in cui la sostanza in esame venga som ­
ministrata con l'acqua) deve essere misurato almeno una volta alla settimana nelle prime 13 settimane e successivamente a intervalli di circa tre mesi, sempreché non appaia opportuno modificare tale fre ­
quenza alla luce dello stato di salute degli animali o di variazioni del 
loro peso corporeo.
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1.6.3  Esame oftalmologico  
Per studi di durata superiore a 28 giorni deve essere effettuato un 
esame oftalmologico, utilizzando un oftalmoscopio o uno strumento equivalente adatto, prima della somministrazione della sostanza in 
esame e al termine dello studio, preferibilmente su tutti gli animali 
e in ogni caso almeno sugli animali del gruppo di trattamento a dose elevata e del gruppo di controllo. In presenza di modificazioni degli occhi o di segni clinici che ne indichino l'opportunità, l'esame deve 
essere effettuato su tutti gli animali. Negli studi a lungo termine, 
l'esame oftalmologico deve essere effettuato anche alla tredicesima settimana. Gli esami oftalmologici non sono necessari se i relativi 
dati possono essere ricavati da altri studi di durata e con livelli di 
dose simili.
 
1.6.4  Esami ematologici e biochimici clinici  
Quando lo studio di neurotossicità viene effettuato in abbinamento a 
uno studio di tossicità sistemica per dose ripetuta, devono essere eseguiti gli esami ematologici e biochimici-clinici previsti dal me ­
todo dello studio di tossicità sistemica. Il prelievo dei campioni deve 
avvenire in modo da ridurre al minimo i potenziali effetti neurocom ­
portamentali.
 
1.6.5  Esame istopatologico  
L'esame neuropatologico deve integrare e ampliare le osservazioni 
effettuate nella fase  in vivo  dello studio. A tal fine, si deve procedere 
alla fissazione in situ dei tessuti di almeno 5 animali/sesso/gruppo 
(vedi tabella 1 e il seguente paragrafo), utilizzando tecniche di per ­
fusione e fissazione generalmente accettate [vedi voce bibliografica (3), capitolo 5 e voce bibliografica (4), capitolo 50]. Tutte le modi ­
ficazioni macroscopiche osservabili devono essere registrate. Se lo 
studio è eseguito come studio a sé stante per la valutazione della neurotossicità o la caratterizzazione degli effetti neurotossici, gli ani ­
mali rimanenti possono essere utilizzati per specifici esami neuro ­
comportamentali (10)(11), neuropatologici (10)(11)(12)(13), neuro ­
chimici (10)(11)(14)(15) o elettrofisiologici (10)(11)(16)(17) a inte ­
grazione dei test e degli esami qui descritti, o sottoposti anch'essi a esame istopatologico. Questi esami supplementari sono particolar ­
mente utili quando, in base a osservazioni empiriche o agli effetti 
attesi, si prevede un tipo specifico di neurotossicità o un target specifico (2)(3). In alternativa, gli animali rimanenti possono essere anch'essi utilizzati per le valutazioni patologiche di routine descritte 
nel metodo relativo agli studi per dose ripetuta.
 
Tutti i campioni di tessuti, inclusi in paraffina, devono essere colorati 
con un procedimento di colorazione generale, ad esempio con ema ­
tossilina-eosina, quindi sottoposti a esame microscopico. Se si osser ­
vano o si sospettano segni di neuropatia periferica, si deve procedere 
all'esame di campioni di tessuti di nervi periferici inclusi in plastica. 
In base ai segni clinici, può essere opportuno estendere l'esame ad altri siti o utilizzare procedure di colorazione speciali. Per indicazioni sugli ulteriori siti da esaminare si rimanda alle voci bibliografiche 
(3)(4). Può essere utile anche utilizzare opportuni coloranti speciali 
per provare tipi specifici di modificazioni patologiche (18).
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Sezioni rappresentative del sistema nervoso centrale e del sistema 
nervoso periferico devono essere sottoposte a esame istologico [vedi 
voce bibliografica (3), capitolo 5 e voce bibliografica (4), capitolo 50]. Di norma, i prelievi tissutali devono essere effettuati almeno su: prosencefalo, area centrale del cervello, compresa una sezione che 
attraversi l'ippocampo, mesencefalo, cervelletto, ponte, midollo allun ­
gato, occhio con nervo ottico e retina, midollo spinale a livello dei rigonfiamenti cervicale e lombare, gangli della radice dorsale, fibre della radice dorsale e ventrale, nervo sciatico prossimale, nervo ti ­
biale prossimale (a livello del ginocchio) e ramificazioni del nervo 
tibiale a livello dei muscoli del polpaccio. Per il midollo spinale e i nervi periferici, le sezioni devono essere sia trasversali che longitu ­
dinali. Deve essere osservata la vascolarizzazione del sistema nervo ­
so. Deve essere esaminato anche un campione di muscolo scheletri ­
co, in particolare dei muscoli del polpaccio. Particolare attenzione deve essere rivolta a punti del SNC e SNP con strutture e modelli cellulari e delle fibre notoriamente molto sensibili all'azione dei neu ­
rotossici.
 
Indicazioni sulle alterazioni neuropatologiche tipiche indotte dal ­
l'esposizione a tossici sono contenute nelle voci bibliografiche (3)(4). 
Si raccomanda di sottoporre i campioni tissutali a un esame artico ­
lato in più fasi. Innanzitutto, si devono confrontare sezioni di tessuti prelevati da esemplari del gruppo trattato con dose elevata a sezioni 
di tessuti prelevati da esemplari del gruppo di controllo. Se non 
vengono osservate alterazioni neuropatologiche, non sono necessarie ulteriori analisi. Se invece vengono osservate alterazioni neuropato ­
logiche nel gruppo trattato con dose elevata, si procede assegnando 
un numero di codice ed esaminando sequenzialmente campioni di 
ciascuno dei tessuti potenzialmente interessati prelevati da esemplari dei gruppi trattati con dose intermedia e con dose bassa.
 
Se all'esame qualitativo vengono riscontrate alterazioni neuropatolo ­
giche, deve essere effettuato un secondo esame su tutte le regioni del sistema nervoso che manifestano tali alterazioni. Dopo aver asse ­
gnato un codice a tutte le sezioni prelevate da ciascuna delle regioni 
potenzialmente interessate in tutti i gruppi trattati, si fanno esaminare 
le sezioni in modo casuale da persone all'oscuro del significato dei codici e si registrano la frequenza e la gravità di ciascuna lesione. Terminata la classificazione di tutte le regioni di tutti i gruppi trattati, 
si apre il codice e si procede all'analisi statistica per valutare le 
relazioni dose-risposta, avendo cura inoltre di descrivere esempi dei diversi livelli di gravità di ciascuna lesione.
 
I reperti neuropatologici devono essere valutati nel contesto delle 
osservazioni e misurazioni comportamentali, come pure di altri dati ricavati da studi precedenti o contemporanei sulla tossicità sistemica 
della sostanza in esame.
 
2. DATI  
2.1 ELABORAZIONE DEI RISULTATI  
Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, 
tutti i dati devono essere riassunti in una tabella indicante, per 
ogni gruppo di trattamento o di controllo, il numero di animali all'inizio del saggio, il numero di animali rinvenuti morti durante il saggio o sottoposti a eutanasia, nonché il momento del decesso di 
ciascun animale morto spontaneamente o sottoposto a eutanasia, il 
numero di animali che hanno manifestato segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati con indicazione del mo ­
mento di insorgenza, della durata, del tipo e della gravità degli effetti 
tossici, il numero di animali che hanno manifestato lesioni, con 
indicazione del tipo e della gravità delle lesioni.
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2.2 VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati dello studio devono essere valutati in termini di incidenza, 
gravità e correlazione tra effetti neurocomportamentali e neuropato ­
logici (compresi gli effetti neurochimici o elettrofisiologici, nonché 
gli effetti riscontrati con gli eventuali esami supplementari effettuati) 
e qualsiasi altro effetto avverso osservato. Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un metodo statistico appropriato e comunemente accettato. I metodi statistici devono es ­
sere selezionati durante la fase di progettazione dello studio.
 
3. PRESENTAZIONE DEI DATI  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
La relazione sul saggio deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza in esame:  
— natura fisica (compresi isomerismo, purezza e proprietà fisico- 
chimiche);  
— dati identificativi.  
Veicolo (se del caso):  
— motivazione della scelta del veicolo.  
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo impiegati;  
— numero, età e sesso degli animali;  
— provenienza, condizioni di stabulazione, acclimatazione, dieta, 
ecc.; 
— peso di ciascun animale all'inizio del saggio.  
Condizioni sperimentali:  
— informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza in 
esame/preparazione della dieta, sulla concentrazione utilizzata, sulla stabilità e sull'omogeneità del preparato;
 
— dosi somministrate, caratteristiche del veicolo, volume e forma 
fisica del preparato somministrato;  
— modalità precise di somministrazione della sostanza in esame;  
— motivazione della scelta dei livelli di dose;  
— motivazione della scelta della via e della durata di esposizione;  
— se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella 
dieta o nell'acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso 
corporeo/giorno);  
— informazioni dettagliate sulla qualità degli alimenti e dell'acqua.  
Osservazione e procedimenti del saggio:  
— informazioni dettagliate sull'assegnazione degli animali di cia ­
scun gruppo ai sottogruppi destinati alla perfusione;  
— informazioni dettagliate sui sistemi di punteggio utilizzati, com ­
presi criteri e scale di punteggio impiegati per ciascuna misura ­
zione effettuata nel corso delle osservazioni cliniche dettagliate;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 633
 
— informazioni dettagliate sugli esami funzionali per la valutazione 
della reattività sensoriale a stimoli di diverso tipo (p. es. uditivi, 
visivi e propriocettivi), della forza di prensione, dell'attività mo ­
toria (comprese indicazioni particolareggiate sui dispositivi auto ­
matizzati impiegati per rilevare l'attività); altri esami eseguiti;  
— informazioni dettagliate sugli esami oftalmologici e, se del caso, 
sugli esami ematologici e sugli esami di biochimica clinica con i rispettivi valori di riferimento;
 
— informazioni dettagliate su specifici esami neurocomportamentali, 
neuropatologici, neurochimici o elettrofisiologici.  
Risultati:  
— peso corporeo e relative modificazioni, compreso il peso corpo ­
reo al momento del sacrificio;  
— consumo di cibo e consumo d'acqua, se del caso;  
— dati sulla risposta tossica per sesso e per livello di dose, compresi 
i segni di tossicità o mortalità;  
— natura, gravità e durata (momento di insorgenza e successivo 
decorso) degli effetti clinici osservati (sia reversibili che non reversibili);
 
— descrizione dettagliata di tutti i risultati degli esami funzionali;  
— reperti necroscopici;  
— descrizione dettagliata dei risultati di tutti gli eventuali esami 
neurocomportamentali, neuropatologici e neurochimici o elettro ­
fisiologici;  
— eventuali dati sull'assorbimento e sul metabolismo;  
— elaborazione statistica dei risultati, se del caso.  
Discussione dei risultati:  
— informazioni sulla relazione dose-risposta;  
— relazione tra eventuali altri effetti tossici e la conclusione sul 
potenziale neurotossico della sostanza chimica in esame;  
— NOAEL.  
Conclusioni:  
— viene incoraggiata l'inclusione di una indicazione specifica della 
neurotossicità complessiva della sostanza chimica esaminata.  
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
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gstone.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 635
 
Tabella 1  
Numero minimo di animali necessari per ciascun gruppo per uno studio di neurotossicità a sé stante o abbinato 
ad altri studi  
STUDIO DI NEUROTOSSICITÀ ESEGUITO COME: 
Studio a sé stante Studio abbinato a uno 
studio su 28 giorni Studio abbinato a uno 
studio su 90 giorni Studio abbinato a uno 
studio di tossicità cro ­
nica 
Numero totale di animali 
per gruppo 10 maschi e 10 
femmine 10 maschi e 10 
femmine 15 maschi e 15 
femmine 25 maschi e 25 
femmine 
Numero di animali scelti 
per gli esami funzionali, comprese le osservazioni cliniche dettagliate 10 maschi e 10 
femmine 10 maschi e 10 
femmine 10 maschi e 10 
femmine 10 maschi e 10 
femmine 
Numero di animali scelti 
per la perfusione in situ e 
l'esame neuroistopatologico 5 maschi e 5 fem ­
mine 5 maschi e 5 fem ­
mine 5 maschi e 5 fem ­
mine 5 maschi e 5 fem ­
mine 
Numero di animali scelti 
per le osservazioni sulla tossicità per dose ripetuta/ subcronica/cronica, gli 
esami ematologici, di bio ­
chimica clinica, istopatolo ­
gici, ecc. conformemente alle indicazioni delle rispet ­
tive linee guida 5 maschi e 5 fem ­
mine 10 maschi † e 10 
femmine † 20 maschi † e 20 
femmine † 
Eventuali osservazioni sup ­
plementari 5 maschi e 5 fem ­
mine
 
† Compresi cinque animali scelti per gli esami funzionali e le osservazioni cliniche dettagliate nello studio di neurotossicità . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 636
 
Tabella 2  
Frequenza dell'osservazione clinica e degli esami funzionali  
Tipo di ossservazioni Durata dello studio 
Acuto 28 giorni 90 giorni Cronico  
In tutti gli animali Condizioni di 
salute generali una volta al 
giorno una volta al 
giorno una volta al 
giorno una volta al 
giorno 
Mortalità/morbi ­
lità due volte al 
giorno due volte al 
giorno due volte al 
giorno due volte al 
giorno 
Negli animali scelti 
per le osservazioni funzionali Osservazioni cli ­
niche dettagliate — prima del ­
l'esposizione iniziale 
— entro 8 ore 
dalla som ­
ministra­
zione nel momento di 
massimo ef ­
fetto previ ­
sto 
— il 7 e 14 
giorno dopo 
la sommini ­
strazione — prima del ­
l'esposizione iniziale 
— successiva ­
mente una 
volta alla settimana — prima del ­
l'esposizione iniziale 
— una volta 
durante la 
prima o seconda settimana di 
esposizione 
— successiva ­
mente una volta al 
mese — prima del ­
l'esposizione iniziale 
— una volta alla 
fine del primo 
mese di espo ­
sizione 
— successiva ­
mente ogni 
tre mesi 
Esami funzionali — prima del ­
l'esposizione 
iniziale 
— entro 8 ore 
dalla som ­
ministra­
zione nel 
momento di massimo ef ­
fetto previ ­
sto 
— il 7
 o e 
14 o giorno 
dopo la 
somministra ­
zione — prima del ­
l'esposizione 
iniziale 
— durante la 
quarta setti ­
mana di 
trattamento 
il più vicino possibile alla fine del pe ­
riodo di 
esposizione — prima del ­
l'esposizione 
iniziale 
— una volta 
durante la prima 
o seconda 
settimana di esposizione 
— successiva ­
mente una 
volta al mese — prima del ­
l'esposizione 
iniziale 
— una volta alla 
fine del primo mese di espo ­
sizione 
— successiva ­
mente ogni tre mesi
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 637
 
B.44.  ASSORBIMENTO CUTANEO: METODO  IN VIVO  
1. METODO  
Il presente metodo corrisponde alle linee guida OCSE TG 427 
(2004).  
1.1 INTRODUZIONE  
L'esposizione a molte sostanze chimiche avviene principalmente at ­
traverso la pelle, ma la maggior parte degli studi tossicologici ese ­
guiti su animali da laboratorio ricorre alla somministrazione orale. Lo studio dell'assorbimento percutaneo  in vivo  presentato in queste linee 
guida fornisce il collegamento necessario per estrapolare, da studi 
basati sulla somministrazione orale, dati utili per la valutazione del ­
l'innocuità in caso di esposizione cutanea.
 
Prima di entrare in circolazione, una sostanza deve attraversare molti 
strati cellulari cutanei. Lo strato cineticamente determinante per la maggior parte delle sostanze è lo strato corneo, costituito da cellule morte. La permeabilità percutanea dipende sia dalla lipofilia della 
sostanza chimica che dallo spessore dello strato esterno dell'epider ­
mide, nonché da fattori quali il peso molecolare e la concentrazione della sostanza. Generalmente, la pelle dei ratti e dei conigli è più permeabile di quella dell'uomo, mentre la permeabilità cutanea delle 
cavie e delle scimmie è più simile a quella umana. I metodi di 
misurazione dell'assorbimento percutaneo possono essere suddivisi in due categorie: metodi  in vivo  e metodi in vitro. Il metodo  in 
vivo permette di ottenere buone informazioni sull'assorbimento cuta ­
neo in varie specie animali di laboratorio. Più recentemente sono 
stati sviluppati i metodi in vitro, basati sul trasporto attraverso un campione di pelle umana o animale, di spessore totale o parziale, verso un serbatoio di fluidi.
 
Il metodo in vitro è descritto in un altro metodo di prova (1). Ai fini 
della scelta del metodo più idoneo per una determinata situazione, si raccomanda di consultare il documento dell'OCSE Guidance Docu ­
ment for the Conduct of Skin Absorption Studies (2), che contiene 
maggiori informazioni sull'idoneità dei metodi  in vivo  e in vitro.
 
Il metodo  in vivo  descritto nel presente documento permette di de ­
terminare la penetrazione della sostanza di prova attraverso la pelle 
fino al compartimento sistemico. Questa tecnica è ampiamente uti ­
lizzata da molti anni (3) (4) (5) (6) (7). Benché in molti casi sia possibile ricorrere a studi sull'assorbimento percutaneo in vitro, po ­
trebbero esservi situazioni in cui soltanto uno studio  in vivo  permette 
di ottenere i dati necessari.
 
Il metodo  in vivo  presenta diversi vantaggi: utilizza un sistema in ­
tatto dal punto di vista fisiologico e metabolico, fa ricorso ad una 
specie comunemente utilizzata negli studi sulla tossicità e può essere 
adattato in modo da poter essere impiegato su altre specie. Gli svan ­
taggi sono il ricorso ad animali vivi, la necessità di utilizzare so ­
stanze radiomarcate per poter ottenere risultati affidabili, le difficoltà 
connesse alla determinazione della fase iniziale di assorbimento e le 
differenze di permeabilità tra la pelle della specie generalmente uti ­
lizzata (il ratto) e la pelle umana. La pelle degli animali è general ­
mente più permeabile, cosicché si rischia di sovrastimare l'assorbi ­
mento percutaneo umano (6)(8)(9). Le sostanze caustiche/corrosive 
non devono essere testate su animali vivi.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 638
 
1.2 DEFINIZIONI  
Dose non assorbita:  la dose presente nell'acqua di risciacquo del ­
l'epidermide dopo esposizione e sul bendaggio non occlusivo, ivi comprese le dosi che evaporano dalla pelle durante l'esposizione.
 
Dose assorbita ( in vivo ): comprende i residui presenti nell'urina, 
nell'acqua di risciacquo delle gabbie, negli escrementi, nell'aria espi ­
rata (se misurata), nel sangue, nei tessuti (se raccolti) e nella carcassa restante dopo il prelievo della pelle nel punto di applicazione della sostanza.
 
Dose assorbibile:  dose presente sulla o nella pelle dopo il lavaggio.  
1.3 PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza di prova, preferibilmente radiomarcata, è applicata sulla 
pelle rasata degli animali in una o più concentrazioni idonee, sotto 
forma di preparazione rappresentativa delle preparazioni in uso. La 
preparazione di prova è lasciata a contatto con la pelle per un de ­
terminato periodo di tempo, ed è coperta con idoneo bendaggio (non 
occlusivo, semi-occlusivo o occlusivo) per evitarne l'ingestione. Al 
termine del periodo di esposizione, il bendaggio è rimosso e la pelle è pulita con un apposito prodotto detergente. Il bendaggio e il ma ­
teriale utilizzato per la pulizia sono conservati per essere poi analiz ­
zati ed è applicato un nuovo bendaggio. Prima, durante e dopo il 
periodo di esposizione, gli animali sono collocati in gabbie metabo ­
liche individuali e gli escrementi e l'aria espirata nelle diverse fasi sono raccolti ai fini della successiva analisi. Si può evitare di racco ­
gliere l'aria espirata se i dati disponibili sono sufficienti a concludere 
che la formazione di metaboliti radioattivi è scarsa o assente. Cia ­
scuno studio prevede generalmente l'esposizione di più gruppi di animali alla preparazione di prova. Gli animali di uno dei gruppi 
sono soppressi alla fine del periodo di esposizione. Gli animali degli 
altri gruppi sono soppressi successivamente, a intervalli prestabiliti. Al termine del periodo di campionamento, gli animali restanti ven ­
gono soppressi, il loro sangue viene raccolto per essere poi analiz ­
zato, la zona di pelle su cui era stata applicata la sostanza viene 
prelevata ai fini della successiva analisi e la carcassa viene esaminata per individuare l'eventuale presenza di materia non escreta. Si pro ­
cede quindi all'analisi dei campioni con metodi adeguati e alla stima 
del grado di assorbimento percutaneo (6) (8) (9).
 
1.4 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1  Scelta della specie animale  
Il ratto è la specie più frequentemente utilizzata, ma possono essere 
utilizzati anche ceppi glabri e specie che presentano tassi di assor ­
bimento cutaneo più vicini a quelli umani (3) (6) (7) (8) (9). Di preferenza sono impiegati giovani animali adulti sani dello stesso 
sesso (maschi, ove non espressamente indicato), appartenenti ai ceppi 
di laboratorio generalmente utilizzati. All'inizio dello studio, la va ­
riazione di peso degli animali utilizzati non può superare ± 20 % del peso medio. A titolo di esempio, sono adatti i ratti maschi di peso 
compreso tra 200 e 250 g, specialmente quelli il cui peso è situato 
nella metà superiore di tale intervallo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 639
 
1.4.2  Numero e sesso degli animali  
Per ciascuna preparazione di prova e ciascuna fase di soppressione 
programmata deve essere utilizzato un gruppo di almeno quattro animali dello stesso sesso. Ciascun gruppo di animali è soppresso 
a intervalli di tempo differenti, ad esempio alla fine del periodo di 
esposizione (in genere, 6 o 24 ore) e in momenti successivi (ad esempio, dopo 48 e 72 ore). Se i dati disponibili indicano differenze sostanziali a livello della tossicità cutanea tra maschi e femmine, sarà 
selezionato il sesso più sensibile. In assenza di dati di questo tipo, si 
potrà utilizzare indifferentemente l'uno o l'altro sesso.
 
1.4.3  Condizioni di stabulazione e di alimentazione  
La temperatura dello stabulario deve essere di 22  o C (± 3  o C). 
L'umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio. L'illuminazione 
deve essere artificiale, con un'alternanza di 12 ore di luce e 12 ore di 
buio. Per l'alimentazione, si possono utilizzare diete convenzionali da laboratorio, con cibo liberamente disponibile e acqua potabile in quantità illimitata. Durante lo studio e preferibilmente anche durante 
il periodo di acclimatazione, gli animali sono alloggiati in gabbie 
metaboliche individuali. Poiché la fuoriuscita accidentale di cibo e di acqua rischia di compromettere i risultati, sarà necessario ridurre al minimo la probabilità che tale evento si verifichi.
 
1.4.4  Preparazione degli animali  
Gli animali sono contrassegnati in modo da poter essere identificati e 
lasciati nella loro gabbia per almeno cinque giorni prima dell'inizio dello studio, onde permetterne l'acclimatazione alle condizioni del 
laboratorio.
 
Al termine del periodo di acclimatazione e circa 24 ore prima della 
somministrazione della sostanza di prova, si rasa una zona di pelle 
nella regione delle spalle e del dorso di ciascun animale. Poiché la capacità di penetrazione della pelle danneggiata è diversa da quella della pelle intatta, si deve aver cura di non procurare abrasioni 
cutanee. Dopo la rasatura e circa 24 ore prima dell'applicazione della 
sostanza di prova sulla pelle (cfr. sezione 1.4.7), la superficie cutanea è lavata con acetone per rimuovere il sebo. Non è opportuno lavare ulteriormente la pelle con acqua saponata, poiché i residui di sapone 
rischiano di favorire l'assorbimento della sostanza di prova. La zona 
di applicazione deve essere abbastanza grande (preferibilmente al ­
meno 10 cm
 2 ) da consentire un calcolo affidabile della quantità di 
sostanza chimica di prova assorbita per cm  2 di pelle. Una zona di tali 
dimensioni può essere facilmente individuata in ratti di peso com ­
preso fra 200 e 250 g. Dopo la preparazione, gli animali sono collocati nuovamente nelle gabbie metaboliche.
 
1.4.5  Sostanza di prova  
La sostanza di prova è la sostanza di cui si intendono studiare le 
caratteristiche di penetrazione. Preferibilmente tale sostanza deve essere radiomarcata.
 
1.4.6  Preparazione della sostanza di prova  
La preparazione della sostanza di prova (ad esempio, materiale puro, 
diluito o formulato contenente la sostanza di prova e applicato sulla pelle) deve essere la stessa a cui possono essere esposti gli esseri 
umani o le altre specie potenzialmente interessate, o un adeguato 
sostituto. Qualsiasi variazione dalla preparazione d'uso deve essere giustificata. Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o so ­
spesa in un veicolo adeguato. Per veicoli diversi dall'acqua, devono 
essere note le caratteristiche di assorbimento e l'interazione poten ­
ziale con la sostanza di prova.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 640
 
1.4.7  Applicazione sulla pelle  
Si delimita sulla superficie cutanea una zona di applicazione di 
dimensioni prestabilite. Successivamente si applica su questa zona, in maniera uniforme, una quantità nota della preparazione di prova. 
Normalmente la quantità applicata deve simulare l'esposizione umana 
potenziale (generalmente 1-5 mg/cm
 2 per i solidi e fino a 10 μl/cm  2 
per i liquidi). L'utilizzo di altre quantità deve essere giustificato in 
base alle condizioni di uso previste, agli obiettivi dello studio o alle 
caratteristiche fisiche della preparazione di prova. Dopo l'applicazio ­
ne, la zona di pelle trattata deve essere protetta in modo che l'ani ­
male non possa effettuare la tolettatura. La figura 1 mostra un esem ­
pio di dispositivo tipicamente utilizzato a tal fine. Normalmente la 
zona di pelle su cui è effettuata l'applicazione è protetta con un bendaggio non occlusivo (ad es. garza di nylon permeabile). Tutta ­
via, in caso di applicazioni illimitate occorre un bendaggio occlusivo. 
Qualora il saggio riguardi sostanze semivolatili, se l'evaporazione 
provoca una riduzione inaccettabile del tasso di recupero della so ­
stanza di prova (cfr. anche la prima parte del punto 1.4.10) è neces ­
sario raccogliere la sostanza evaporata in un filtro a carbone che 
copra il dispositivo di applicazione (cfr. figura 1). È importante 
che il dispositivo utilizzato non danneggi la pelle e non assorba il preparato di prova né reagisca con esso. Gli animali sono poi nuo ­
vamente collocati nelle gabbie metaboliche individuali per la 
raccolta degli escrementi.
 
1.4.8  Durata dell'esposizione e campionamento  
La durata dell'esposizione è l'intervallo di tempo tra l'applicazione e 
la rimozione del preparato di prova mediante lavaggio della pelle. Il 
periodo di esposizione utilizzato (normalmente 6 o 24 ore) deve essere scelto in funzione della probabile durata dell'esposizione uma ­
na. Dopo il periodo di esposizione, gli animali sono tenuti nelle 
gabbie metaboliche fino alla loro soppressione programmata e sono 
sottoposti ad osservazione periodica per l'intera durata del saggio, onde rilevare eventuali segni di tossicità o reazioni anomale. Al termine del periodo di esposizione la pelle trattata deve essere esa ­
minata al fine di rilevare segni visibili di irritazione.
 
Le gabbie metaboliche devono consentire la raccolta separata del ­
l'urina e delle feci durante tutto lo studio, nonché la raccolta del biossido di carbonio 14C e dei composti volatili del carbonio 14C, che devono essere analizzati qualora siano prodotti in quantità signi ­
ficativa (> 5 %). L'urina, le feci e i fluidi trattenuti (ad es. il biossido 
di carbonio 14C e i composti volatili del carbonio 14C) devono essere raccolti individualmente per ciascun gruppo in ciascun inter ­
vallo di campionamento. Se i dati disponibili sono sufficienti a con ­
cludere che la formazione di metaboliti radioattivi volatili è scarsa o 
assente, è possibile utilizzare gabbie aperte.
 
Gli escrementi sono raccolti durante il periodo di esposizione e fino 
a 24 ore dopo il contatto iniziale con la pelle, e in seguito con cadenza giornaliera fino alla fine dell'esperimento. Se normalmente 
sono sufficienti tre intervalli di raccolta degli escrementi, potrebbe 
essere opportuno prevedere intervalli di tempo supplementari o più pertinenti per lo studio, a seconda della finalità alla quale è destinata la preparazione di prova o dei dati cinetici esistenti.
 
Al termine del periodo di esposizione il dispositivo di protezione è 
rimosso da ogni animale e conservato ai fini della successiva analisi. 
La pelle trattata deve essere lavata almeno 3 volte con un prodotto detergente, utilizzando appositi tamponi. Occorre fare attenzione per evitare di contaminare altre parti del corpo. Il prodotto detergente 
deve essere rappresentativo delle normali pratiche igieniche (ad es. 
una soluzione acquosa di sapone). Infine, la pelle deve essere asciu ­
gata. Tutti i tamponi e i residui del lavaggio devono essere conser ­
vati per essere poi analizzati. Agli animali appartenenti ai gruppi da 
sottoporre ad ulteriori osservazioni viene applicato un nuovo bendag ­
gio prima del ritorno nelle gabbie individuali.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 641
 
1.4.9  Procedure finali  
I singoli animali di ciascun gruppo sono soppressi al momento pre ­
visto e il loro sangue è raccolto e analizzato. Il bendaggio o dispo ­
sitivo di protezione è rimosso e analizzato. La pelle del punto di 
applicazione e una zona simile di pelle rasata non trattata sono 
prelevate da ciascun animale e analizzate separatamente. La pelle del punto di applicazione può essere frazionata per separare lo strato corneo dall'epidermide sottostante e ottenere in tal modo maggiori 
informazioni sulla distribuzione della sostanza di prova. La determi ­
nazione di tale distribuzione in un periodo di tempo predefinito dopo il periodo di esposizione dovrebbe fornire alcune indicazioni sul 
destino della sostanza di prova eventualmente presente nello strato 
corneo. Per facilitare il frazionamento della pelle (dopo il lavaggio finale e la soppressione dell'animale) viene rimosso il bendaggio protettivo. La pelle del punto di applicazione, insieme ad un'areola 
di pelle circostante, è asportata dal ratto e fissata su una tavola. Con 
una leggera pressione, viene applicata sulla pelle una striscia di nastro adesivo, che viene poi rimossa insieme a parte dello strato corneo. Successivamente sono applicate altre strisce di nastro adesivo 
fino al momento in cui, essendo stato rimosso tutto lo strato corneo, 
il nastro cessa di aderire alla superficie della pelle. Tutte le strisce di adesivo utilizzate per lo stesso animale possono essere messe insieme in un unico recipiente, nel quale viene aggiunta una sostanza per la 
digestione dei tessuti, al fine di solubilizzare lo strato corneo. Tutti i 
tessuti potenzialmente interessati possono essere asportati e sottoposti a misurazione separata prima di analizzare il resto della carcassa per stabilire la dose assorbita da quest'ultima. Le carcasse dei singoli 
animali devono essere conservate ai fini della successiva analisi. 
Normalmente è sufficiente l'analisi del contenuto totale. Gli organi potenzialmente interessati possono essere asportati per essere analiz ­
zati individualmente (se indicato da altri studi). L'urina presente nella 
vescica al momento della soppressione è aggiunta all'urina raccolta 
in precedenza. Dopo la raccolta degli escrementi presenti nelle gab ­
bie metaboliche al momento della soppressione programmata, le gabbie e i sistemi di raccolta devono essere lavati con un solvente 
adeguato. Occorre inoltre analizzare gli altri materiali potenzialmente 
contaminati.
 
1.4.10  Analisi  
In tutti gli studi si deve ottenere un tasso di recupero adeguato 
(l'obiettivo deve essere una media di 100 ± 10 % della radioattività). L'eventuale scostamento da questi valori deve essere giustificato. La quantità di dose somministrata presente in ciascun campione deve 
essere analizzata mediante procedure opportunamente convalidate.
 
Le analisi statistiche devono prevedere la misurazione della varianza 
tra le diverse repliche di ciascuna applicazione.  
2. DATI  
Per determinare la presenza della sostanza di prova e/o di metaboliti 
per ciascun animale e a ciascun tempo di campionamento occorre effettuare le misurazioni di seguito indicate. Oltre ad essere presen ­
tati individualmente, i dati devono essere raggruppati in funzione dei 
tempi di campionamento e devono essere riportati sotto forma di 
medie.
 
— quantità associata ai dispositivi di protezione;  
— quantità che può essere rimossa dalla pelle;  
— quantità presente sulla o nella pelle e non eliminabile con il 
lavaggio;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 642
 
— quantità presente nel campione di sangue;  
— quantità presente negli escrementi e nell'aria espirata (eventual ­
mente);  
— quantità esistente nella carcassa e negli organi eventualmente 
asportati in vista di un'analisi individuale.  
La quantità della sostanza di prova e/o dei metaboliti presenti negli 
escrementi, nell'aria espirata, nel sangue e nella carcassa permetterà 
di determinare la quantità totale assorbita in ogni intervallo di tempo. 
Potrà inoltre essere calcolata la quantità di sostanza chimica di prova assorbita per cm
 2 di pelle esposta nel corso del periodo di esposi ­
zione.  
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DELLA PROVA  
3.1 RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere i dati richiesti dal protocollo, in 
particolare la giustificazione del sistema utilizzato, nonché le se ­
guenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— dati identificativi [ad es. numero CAS, se disponibile; purezza 
(purezza radiochimica); impurità note; numero di lotto];  
— natura fisica, proprietà fisicochimiche (ad es. pH, volatilità, so ­
lubilità, stabilità, peso molecolare e coefficiente di ripartizione — 
log P  OW ). 
Preparazione della sostanza di prova:  
— formulazione e giustificazione dell'utilizzo;  
— informazioni dettagliate riguardanti la preparazione della sostanza 
di prova, la quantità applicata, la concentrazione raggiunta, il veicolo impiegato, la stabilità e l'omogeneità.
 
Animali da laboratorio:  
— specie/ceppo utilizzato;  
— numero, età e sesso degli animali;  
— provenienza, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.;  
— peso dei singoli animali all'inizio dell'esperimento.  
Condizioni di prova:  
— modalità di somministrazione della preparazione di prova (punto 
di applicazione, metodi di determinazione, bendaggio occlusivo/ ­
non occlusivo, volume, estrazione, rilevazione);  
— informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell'acqua.  
Risultati:  
— eventuali segni di tossicità;  
— tabella dei valori di assorbimento (espressi sotto forma di tasso, 
quantità o percentuale);  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 643
 
— recuperi totali del saggio;  
— interpretazione dei risultati, comparazione con i dati eventualmente 
esistenti sull'assorbimento percutaneo del composto di prova.  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. Metodo di prova B.45. Assorbimento cutaneo:  In vitro  Method.  
2. OCSE (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OCSE, Parigi.  
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.  
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for En ­
vironmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. Toxi ­
col. 8(5), 829-835.  
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin ab ­
sorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment.  
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
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Substances.  
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
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9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  54, 399- 
404. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 644
 
Figura 1  
Esempio di dispositivo generalmente utilizzato per delimitare e proteggere il punto 
di applicazione cutanea durante gli studi di assorbimento percutaneo  in vivo
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 645
 
B.45.  ASSORBIMENTO CUTANEO: METODO IN VITRO  
1. METODO  
Il metodo di seguito descritto corrisponde alle linee guida dell'OCSE 
TG 428 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo metodo è stato elaborato per ottenere informazioni sull'assor ­
bimento di una sostanza di prova applicata su un campione di pelle 
asportata. Può essere associato al metodo di assorbimento cutaneo  in 
vivo (1), o essere eseguito da solo. Si raccomanda di consultare il 
documento orientativo dell'OCSE sullo svolgimento di studi concer ­
nenti l'assorbimento cutaneo [ OECD Guidance Document for the 
Conduct of Skin Absorption Studies  (2)] per l'elaborazione di studi 
che si basano su questo metodo. Tale documento è stato elaborato per agevolare la selezione di procedure in vitro adeguate, da utiliz ­
zare in circostanze specifiche al fine di garantire l'affidabilità dei 
risultati ottenuti con tale metodo.
 
I metodi per la misurazione dell'assorbimento cutaneo e della diffu ­
sione cutanea possono essere divisi in due categorie:  in vivo  e in 
vitro. I metodi  in vivo  per la valutazione dell'assorbimento cutaneo 
sono di uso comune e forniscono informazioni di carattere farmaco ­
cinetico per una serie di specie animali. In un altro metodo di prova (1) viene descritto un metodo  in vivo . I metodi in vitro sono anche 
utilizzati da molti anni per misurare l'assorbimento cutaneo. Sebbene 
non siano stati eseguiti studi di validazione ufficiale dei metodi in vitro di cui al presente metodo, gli esperti dell'OCSE hanno conve ­
nuto nel 1999 che esistevano dati sufficienti a sostegno del metodo 
in vitro (3). Ulteriori informazioni in questo senso, in particolare un 
numero importante di confronti diretti tra i metodi in vitro e  in vivo , 
sono contenuti nel documento orientativo (2). Varie monografie trat ­
tano questo tema e forniscono informazioni dettagliate sull'uso del 
metodo in vitro (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). I metodi in vitro mi ­
surano la diffusione di sostanze chimiche nella pelle e attraverso la pelle verso un serbatoio di fluidi e possono servirsi di campioni di pelle non vitale per misurare unicamente la diffusione, o campioni di 
pelle appena asportati e che evidenziano un'attività metabolica, per 
misurare contemporaneamente la diffusione e il metabolismo cuta ­
neo. Questi metodi sono utilizzati, in particolare, per confrontare la somministrazione cutanea e transcutanea di varie formulazioni di 
sostanze chimiche e possono fornire modelli utili per la valutazione 
dell'assorbimento transcutaneo nell'essere umano.
 
Tale metodo in vitro potrebbe non essere applicabile in tutte le 
situazioni e a tutte le classi di sostanze chimiche. Può essere utiliz ­
zato per una valutazione qualitativa iniziale della penetrazione cuta ­
nea. In alcuni casi potrebbe essere necessario completare detta valu ­
tazione con dati  in vivo . È opportuno consultare il documento orien ­
tativo (2) per l'individuazione di altre situazioni in cui l'uso del 
metodo in vitro può rivelarsi opportuno. I riferimenti bibliografici 
(3) contengono informazioni dettagliate complementari che risulte ­
ranno utili ai fini della scelta del metodo.  
Questo documento presenta i principi generali per la misura dell'as ­
sorbimento e della diffusione cutanee della sostanza di prova utiliz ­
zando pelle asportata. Si possono utilizzare campioni di pelle di 
molte specie di mammiferi diversi, esseri umani compresi. Le pro ­
prietà di permeabilità della pelle sono mantenute dopo l'asportazione dal corpo in quanto la principale barriera di diffusione è lo strato 
corneo non vitale; non è stato rilevato alcun trasporto transcutaneo 
attivo di sostanze chimiche. La pelle ha evidenziato la capacità di metabolizzare alcune sostanze chimiche durante l'assorbimento tran ­
scutaneo (6), ma questo processo non è limitativo della velocità in 
termini di dosi effettivamente assorbite, sebbene possa condizionare 
la natura del materiale che entra nella circolazione sanguigna.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 646
 
1.2. DEFINIZIONI  
Dose non assorbita:  la dose presente nell'acqua di risciacquo del ­
l'epidermide dopo l'esposizione e sulla copertura non occlusiva, ivi comprese le dosi che evaporano dalla pelle durante l'esposizione.
 
Dosa assorbita (in vitro):  massa della sostanza di prova che rag ­
giunge il fluido recettore o la circolazione sistemica entro un deter ­
minato periodo.  
Dose assorbibile (in vitro):  dose presente sulla o nella pelle dopo il 
lavaggio.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO  
La sostanza di prova, che può essere radiomarcata, viene applicata 
sulla superficie di un campione di pelle che separa le due camere di una cella di diffusione. La sostanza chimica viene lasciata sulla pelle 
per un periodo determinato in condizioni specifiche prima di essere 
eliminata con un'adeguata procedura di pulitura. Il fluido recettore è campionato in vari momenti durante l'esperimento e analizzato per stabilire la presenza della sostanza di prova e/o di metaboliti.
 
Qualora vengano utilizzati sistemi metabolicamente attivi, i metabo ­
liti della sostanza di prova possono essere analizzati ricorrendo a metodi adeguati. Alla fine dell'esperimento, la distribuzione della 
sostanza di prova e i suoi metaboliti sono quantificati, se opportuno.
 
Nelle condizioni adeguate, descritte nel presente metodo e nel docu ­
mento orientativo (2), l'assorbimento di una sostanza di prova in un 
periodo determinato viene misurata analizzando il fluido recettore e 
il campione di pelle trattato. La sostanza di prova che rimane nella pelle deve essere considerata assorbita, a meno che non si riesca a dimostrare che l'assorbimento può essere determinato anche solo dai 
valori del fluido recettore. L'analisi degli altri componenti (materiale 
eliminato dalla pelle mediante risciacquo che rimane negli strati cutanei) consente di procedere a ulteriori valutazioni dei dati, quali l'eliminazione totale della sostanza di prova e la percentuale di re ­
cupero.
 
Al fine di dimostrare le prestazioni e l'affidabilità del sistema nel 
laboratorio che esegue la prova, sarebbe opportuno disporre dei ri ­
sultati ottenuti con dei prodotti chimici di riferimento pertinenti, 
conformemente alla letteratura pubblicata sul metodo in questione. Questo requisito potrebbe essere soddisfatto testando una sostanza di riferimento adeguata (di preferenza una sostanza con affinità per 
ambienti lipidici simili alla sostanza di prova) contemporaneamente 
alla sostanza di prova o fornendo dati storici pertinenti per una serie di sostanze di riferimento con affinità per ambienti lipidici diversi 
(ad esempio, caffeina, acido benzoico e testosterone).
 
1.4. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.4.1  Cella di diffusione  
Una cella di diffusione è costituita da una camera «donatrice» e una 
camera «recettrice» in mezzo alle quali viene posto il campione di 
pelle (alla fig. 1 è riportato un modello standard). La cella di diffu ­
sione deve avere una buona tenuta intorno alla pelle, consentire un agevole campionamento e un'adeguata miscela della soluzione recet ­
trice in contatto con la faccia inferiore della pelle, permettere un 
controllo adeguato della temperatura della cella e del suo contenuto. 
Si possono utilizzare celle di diffusione statiche e a flusso  (flow- 
through).  Di norma le camere donatrici sono lasciate aperte al mo ­
mento dell'esposizione ad una dose finita di un preparato di prova. 
Tuttavia, per applicazioni infinite e in alcuni casi di dosaggi finiti, le 
camere donatrici possono essere chiuse.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 647
 
1.4.2.  Fluido recettore  
Si utilizzerà di preferenza un fluido recettore fisiologicamente ade ­
guato, anche se è consentito l'uso di altri fluidi qualora il loro uso sia giustificato. Occorrerà fornire la composizione esatta del fluido re ­
cettore. Occorrerà dimostrare l'adeguata solubilità della sostanza di 
prova nel fluido recettore in modo che quest'ultimo non ostacoli l'assorbimento. Inoltre, il fluido recettore non deve intaccare l'inte ­
grità del campione di pelle. In un sistema a flusso la velocità di 
flusso non deve ostacolare la diffusione della sostanza di prova nel 
fluido recettore. In un sistema a cella statica, il fluido dovrebbe essere continuamente agitato e regolarmente campionato. Per lo stu ­
dio del metabolismo il fluido recettore deve consentire la vitalità del 
campione di pelle per l'intera durata dell'esperimento.
 
1.4.3  Preparati di pelle  
Potranno essere utilizzati campioni di pelle di origine umana e ani ­
male. È noto che l'utilizzo di pelle umana è oggetto di considerazioni 
etiche e soggetto a condizioni nazionali ed internazionali. Di prefe ­
renza si utilizzeranno campioni di pelle vitale, ma l'uso di campioni non vitali è consentito a condizione di poter dimostrare l'integrità della pelle. Possono essere utilizzate membrane epidermiche (sepa ­
rate mediante processi enzimatici, termici o chimici) o campioni di 
pelle di spessore parziale (di solito tra 200 e 400 μm) preparati con 
un dermatomo. I campioni di pelle a spessore totale sono consentiti, ma dovrebbero essere evitati spessori eccessivi (superiori a circa 
1 mm), a meno che non siano specificatamente richiesti per deter ­
minare la sostanza chimica di prova negli strati epidermici. Occorre giustificare la scelta della specie, del sito anatomico e della tecnica di preparazione. Sono richiesti dati accettabili risultanti da almeno quat ­
tro repliche per preparato di prova.
 
1.4.4  Integrità del preparato  
Il campione di pelle deve essere adeguatamente preparato. Eventuali 
manipolazioni inadeguate possono danneggiare lo strato corneo, per ­
tanto è opportuno verificare l'integrità della pelle preparata. Per lo 
studio del metabolismo la pelle appena asportata dovrebbe essere 
utilizzata il più rapidamente possibile e in condizioni che consentano di mantenere l'attività metabolica. A titolo orientativo, la pelle ap ­
pena asportata dovrebbe essere utilizzata nell'arco di 24 ore, ma il 
periodo di conservazione consentito potrebbe variare in funzione del 
sistema enzimatico che interviene nella metabolizzazione e delle temperature di stoccaggio (13). Qualora i campioni di pelle siano stati conservati prima dell'utilizzazione, occorrerebbe dimostrare che 
la funzione di barriera è stata mantenuta.
 
1.4.5  Sostanza di prova  
La sostanza di prova è il prodotto di cui si intende studiare le 
caratteristiche di penetrazione. Preferibilmente detta sostanza sarà radiomarcata.
 
1.4.6  Preparazione della sostanza di prova  
La preparazione della sostanza di prova (ad esempio, materiale puro, 
diluito o formulato contenente la sostanza di prova applicata sulla pelle) dovrebbe essere identica (o un sostituto adeguato) a quella cui gli esseri umani o le altre specie potenzialmente interessate possono 
essere esposti. Qualsiasi variazione dalla preparazione d'uso deve 
essere giustificata.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 648
 
1.4.7  Concentrazioni e formulazioni delle sostanze di prova  
In linea di massima si utilizzano più concentrazioni della sostanza di 
prova in modo da coprire i valori più elevati della potenziale espo ­
sizione umana. Analogamente, si potrebbero  analizzare  una serie di 
formulazioni tipo.  
1.4.8  Applicazione sulla pelle  
Nelle condizioni normali di esposizione umana alle sostanze chimi ­
che, in linea di massima si riscontrano dosi finite. Sarà pertanto opportuno utilizzare un'applicazione che imiti le condizioni dell'espo ­
sizione umana, di solito pari a 1-5 mg/cm
 2 di pelle per un solido e 
10 μl/cm  2 per i liquidi. La quantità dovrebbe dipendere dalle condi ­
zioni di utilizzo previste, dagli obiettivi del saggio e dalle caratteri ­
stiche fisiche del preparato di prova. Ad esempio, le applicazioni 
sull'epidermide possono essere infinite dove si applicano importanti 
volumi per unità di superficie.  
1.4.9  Temperatura  
La temperatura condiziona la diffusione passiva delle sostanze chi ­
miche (e pertanto il loro assorbimento cutaneo). La cella di diffu ­
sione e la pelle devono essere mantenute ad una temperatura costante 
vicina alla temperatura normale della pelle (32 ± 1  o C). I vari mo ­
delli di cella richiederanno temperature diverse per il bagnomaria e il blocco riscaldante in modo da garantire il rispetto della norma fisio ­
logica del recettore/della pelle. L'umidità sarà preferibilmente com ­
presa tra 30 e 70 %.
 
1.4.10  Durata dell'esposizione e del campionamento  
Il campione di pelle può essere esposto al preparato di prova per 
l'intera durata del saggio o per periodi più brevi (ad esempio per simulare un tipo specifico di esposizione). Il lavaggio della pelle per eliminare l'eccesso di sostanza di prova dove essere eseguito con un 
agente di pulizia adeguato e l'acqua di risciacquo deve essere rac ­
colta per essere analizzata. La procedura di eliminazione del prepa ­
rato di prova dipenderà delle condizioni di uso previste e deve essere 
giustificata. Di norma è necessario un periodo di campionamento di 
24 ore per ottenere l'adeguata caratterizzazione del profilo di assor ­
bimento. Dal momento che l'integrità della pelle può cominciare a deteriorarsi dopo 24 ore, i periodi di campionamento non dovrebbero 
mai superare le 24 ore. Per le sostanze di prova che penetrano 
rapidamente nella pelle, il problema non si pone, ma per quelle che penetrano più lentamente possono essere necessari tempi più lunghi. La frequenza di campionamento del fluido recettore dovrebbe 
consentire di procedere alla rappresentazione grafica del profilo di 
assorbimento della sostanza di prova.
 
1.4.11  Procedure finali  
Tutti i componenti del sistema di prova devono essere analizzati ed 
occorre determinare il tasso di recupero. Ciò riguarda la camera donatrice, l'acqua di risciacquo dell'epidermide, il preparato di pelle, 
il fluido recettore o la camera recettrice. In alcuni casi la pelle può 
essere frazionata nell'area esposta della pelle e nell'area della pelle sotto il bordo della cella e in frazioni di strato corneo, epidermide e derma per eseguire analisi separate.
 
1.4.12  Analisi  
In tutti gli studi si dovrebbe ottenere un tasso di recupero sufficiente 
(l'obiettivo deve essere una media di 100 ± 10 % della radioattività, 
gli eventuali scartamenti da questi valori devono essere giustificati). La quantità di sostanza di prova nel fluido recettore, nel preparato di pelle, nelle acque di lavaggio dell'epidermide e nell'acqua di risciac ­
quo dell'apparecchio devono essere analizzate con una tecnica ade ­
guata.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 649
 
2. DATI  
Occorre fornire l'analisi del fluido recettore, la distribuzione della 
sostanza di prova nel sistema e il profilo d'assorbimento nel corso del tempo. In condizioni di esposizione a dosi finite, è necessario 
calcolare la quantità eliminata dalla pelle con il risciacquo, la quan ­
tità assimilata dalla pelle (e dai vari strati cutanei, se sono analizzati) e la quantità presente nel fluido recettore (tasso, quantità o percen ­
tuale della dose applicata). L'assorbimento cutaneo può a volte essere 
espresso unicamente utilizzando i dati relativi al fluido recettore. 
Tuttavia, quando la sostanza di prova rimane nella pelle alla fine dello studio, può essere necessario includerla nella quantità totale 
assorbita [cfr. paragrafo 66 nel riferimento bibliografico (3)]. In 
condizioni di esposizione a dosi infinite, i dati possono consentire di calcolare una costante di permeabilità (Kp). In tal caso, la per ­
centuale assorbita è irrilevante.
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL SAGGIO  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere i requisiti stabiliti nel protocollo, 
in particolare la giustificazione del sistema utilizzato, nonché le se ­
guenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— natura fisica, proprietà fisicochimiche (almeno il peso molecolare 
e il coefficiente di ripartizione - log P  OW ), purezza (purezza 
radiochimica);  
— dati di identificazione (ad es. numero del lotto);  
— solubilità nel fluido recettore.  
Preparazione della sostanza di prova:  
— formulazione e giustificazione dell'utilizzo;  
— omogeneità.  
Condizioni di prova:  
— origini e sito della pelle, metodo di preparazione, condizioni di 
stoccaggio prima dell'uso, eventuali pretrattamenti (pulizia, trat ­
tamenti antibiotici ecc.), misure dell'integrità della pelle, stato 
metabolico, giustificazione dell'uso;  
— modello di cella, composizione del fluido recettore, velocità di 
flusso del fluido recettore o intervalli e procedure di campiona ­
mento;  
— informazioni sull'applicazione del preparato di prova e quantifi ­
cazione della dose applicata;  
— durata dell'esposizione;  
— informazioni sull'eliminazione del preparato di prova dalla pelle 
(ad es. risciacquo della pelle);  
— informazioni sull'analisi della pelle e le tecniche di frazionamento 
eventualmente utilizzate per dimostrare la distribuzione cutanea;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 650
 
— procedure di lavaggio della cella e dell'apparecchiatura;  
— metodi di saggio, tecniche di estrazione, limiti di rilevazione e 
validazione del metodo analitico.  
Risultati:  
— recuperi totali del saggio (dose applicata  = liquido di lavaggio 
della pelle + pelle + fluido recettore + liquido di lavaggio della cella);
 
— tabella dei tassi di recupero in ciascun compartimento della cella;  
— profilo di assorbimento;  
— tabella dei valori di assorbimento (espressi sotto forma di tasso, 
quantità o percentuale).  
Discussione dei risultati.  
Conclusioni.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. Metodo B.44. Assorbimento cutaneo: metodo  in vivo . 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
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6. Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
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8. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Du ­
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10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al.  (1996). Me ­
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11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
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12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
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13. Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
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Figura 1  
Esempio di un modello tipo di cella di diffusione statica concepita per studiare 
l'assorbimento transcutaneo  in vitro
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 652
 
B.46.  IRRITAZIONE CUTANEA IN VITRO: TEST SU UN MODELLO 
DI EPIDERMIDE UMANA RICOSTITUITA  
INTRODUZIONE  
1. Per irritazione cutanea si intende la comparsa di lesioni reversibili della 
pelle in seguito all’applicazione della sostanza di prova per un massimo 
di 4 ore [secondo la definizione del  Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals  – Sistema generale armonizzato di 
classificazione ed etichettatura dei prodotti chimici (GHS) delle Nazioni 
Unite e del regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del 
Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichetta ­
tura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele (regolamento CLP) (1)(3)]. Il presente metodo di prova (TM) propone una procedura in vitro 
che può essere utilizzata per individuare il rischio di sostanze irritanti (so ­
stanze e miscele) corrispondenti alla categoria 2 del GHS delle Nazioni Unite e del regolamento CLP dell’UE (1) (2) (3). Nell’UE e in altre regioni, 
che non hanno adottato la categoria opzionale 3 del sistema GHS delle 
Nazioni Unite (lievi irritanti), questo metodo può anche essere impiegato per individuare sostanze chimiche non classificate (sostanze «senza catego ­
ria» del GHS delle Nazioni Unite e del CLP dell’UE) (1)(3). Infine, il 
presente metodo può essere usato per determinare il potere di irritazione 
cutanea delle sostanze e costituire un test sostitutivo a se stante per un test di irritazione cutanea in vivo nel quadro di una strategia di prova sequen ­
ziale (4 e capitolo B.4 del presente allegato).
 
2. Tradizionalmente, la valutazione dell’irritazione cutanea implicava il ricorso 
ad animali di laboratorio [linea guida OCSE Test Guideline 404; capitolo B.4 del presente allegato](4). Per via delle preoccupazioni legate al benes ­
sere degli animali, nel 2004 il metodo B.4 è stato rivisto per consentire di 
determinare la corrosione/irritazione cutanea tramite una strategia di prova sequenziale, ricorrendo a metodi in vitro o ex vivo convalidati, onde evitare di causare sofferenze agli animali. Sono stati adottati tre metodi per i test in 
vitro convalidati come linee guida OCSE Test Guidelines 430, 431 e 435 
(5) (6) (7); di questi, due sono stati inseriti come capitoli B.40 e B.40  bis 
del presente allegato, da utilizzare per determinare la corrosività della stra ­
tegia di prova sequenziale proposta dal metodo B.4 o dalla linea guida 
OCSE Test Guideline 404 (4).
 
3. Il presente metodo di prova riguarda l’endpoint per la salute umana dell’ir ­
ritazione cutanea. Il metodo si basa su epidermide umana ricostruita (RhE), 
che riproduce fedelmente le proprietà biochimiche e fisiologiche degli strati superiori della pelle umana (l’epidermide) nella struttura generale (uso di cheratinociti prelevati da epidermide umana non trasformati come origine 
per le cellule, tessuto e citoarchitettura rappresentativi). Il presente metodo è 
costituito inoltre da un insieme di standard di prestazione (PS) (appendice 2) per la valutazione di metodi simili basati su epidermide umana ricosti ­
tuita o di varianti di tali metodi sviluppati dall’EC-ECVAM (8), in confor ­
mità ai principi del documento orientativo dell’OCSE n. 34 (OCSE Gui ­
dance Document No. 34) (9).
 
4. Esistono tre metodi convalidati conformi al presente metodo di prova. Sono 
stati svolti studi di prevalidazione, ottimizzazione e validazione per un 
metodo di prova in vitro (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), disponibile sul mercato con la denominazione EpiSkin
 TM (denominato 
metodo di riferimento convalidato o VRM), utilizzando modelli di epider ­
mide umana ricostituita (RhE). Due ulteriori metodi di prova in vitro per 
l’irritazione cutanea basati sull’epidermide umana ricostituita, disponibili in commercio, sono stati convalidati conformemente agli standard di presta ­
zione e danno risultati simili al metodo di riferimento convalidato (21). Si 
tratta del metodo EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) e del metodo SkinEthic  TM 
RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 653
 
5. Prima di poter utilizzare a fini normativi un test basato su un modello di 
epidermide umana in vitro simile al metodo di riferimento convalidato, a 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) o a SkinEthic  TM , oppure una variante di tali 
metodi, occorre determinarne l’affidabilità, la pertinenza (accuratezza) e i limiti per l’uso proposto, al fine di assicurare che il test sia comparabile con 
il metodo di riferimento convalidato, come previsto dai requisiti degli stan ­
dard di prestazione definiti nel presente metodo (appendice 2). Inoltre, prima di sviluppare e convalidare un metodo basato su un modello di epidermide umana in vitro e di presentarlo ai fini dell’adozione da parte 
delle autorità normative, si raccomanda di consultare il documento esplica ­
tivo generale dell’OCSE sulle prove di irritazione cutanea in vitro (23).
 
DEFINIZIONI  
6. Le definizioni utilizzate figurano nell’appendice 1.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI  
7. Uno dei limiti del metodo di prova, evidenziato anche dallo studio di 
convalida (16), è che esso non consente di classificare le sostanze nella 
categoria opzionale 3 del sistema GHS delle Nazioni Unite (lievi irritanti) 
(1). Se il metodo è impiegato come test sostitutivo parziale, può essere necessario effettuare test in vivo di follow-up per caratterizzare pienamente il potenziale di irritazione cutanea (4 e capitolo B.4 del presente allegato). È 
riconosciuto che l’uso di pelle umana è soggetto a considerazioni e condi ­
zioni di carattere etico a livello nazionale e internazionale.
 
8. Il presente metodo riguarda la componente in vitro dell’irritazione cutanea 
della strategia di prova sequenziale del metodo B.4 (OCSE Test Guideline 404) sulla corrosione/irritazione cutanea (4). Se da un lato il metodo non fornisce informazioni adeguate in merito alla corrosione cutanea, dall’altro 
lato va detto che il metodo B.40  bis (OCSE Test Guideline 431) sulla 
corrosione cutanea ricorre al medesimo sistema di prova con modelli di epidermide umana ricostituita, sia pur sulla base di un diverso protocollo (capitolo B.40  bis). Il metodo in esame si basa su modelli di epidermide 
umana ricostituita utilizzando cheratinociti umani, che pertanto rappresen ­
tano in vitro l’organo bersaglio della specie di interesse. Oltretutto, esso riguarda direttamente la fase iniziale dell’attivazione della cascata infiam ­
matoria/meccanismo d’azione (danno cellulare e tissutale dovuti a traumi 
localizzati) che si verifica durante l’irritazione in vivo. Nella procedura di 
convalida sottesa al presente metodo di prova è stata testata un’ampia gamma di sostanze chimiche e la banca dati empirica dello studio di con ­
valida conteneva complessivamente 58 sostanze (16)(18)(23). Si trattava di 
solidi, liquidi, semisolidi e cere. I liquidi possono essere acquosi o non 
acquosi, i solidi possono essere solubili o insolubili in acqua. Quando possibile, prima dell’applicazione i solidi dovrebbero essere frantumati in polvere fine; non sono necessarie altre forme di pretrattamento del campio ­
ne. I gas e gli aerosol non sono ancora stati valutati nell’ambito di uno 
studio di convalida (24). Se non si può escludere che tali sostanze possano essere testate utilizzando la tecnologia RhE, l’attuale metodo di prova non prevede l’esecuzione di prove per gas e aerosol. Occorre precisare inoltre 
che sostanze chimiche molto colorate potrebbero interferire con le misura ­
zioni della vitalità cellulare e rendono necessario l’utilizzo di controllo adattati per le correzioni (cfr. i punti 24-26).
 
9. Un singolo ciclo di prove costituito da tre tessuti replicati dovrebbe essere 
sufficiente per una sostanza sperimentale, se la classificazione è univoca. Tuttavia, in caso di risultati borderline, tra cui misurazioni replicate discor ­
danti e/o una vitalità percentuale media pari a 50 ± 5 %, si dovrebbe 
considerare l’opportunità di eseguire un secondo ciclo di prove, oltre che 
un terzo nell’eventualità di risultati discordanti tra i primi due cicli.
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 654
 
PRINCIPIO DELLA PROVA  
10. La sostanza in esame viene applicata localmente ad un modello tridimen ­
sionale di epidermide umana ricostituita, composta da cheratinociti non 
trasformati prelevati da epidermide umana, messi in coltura per formare un modello multistrato, altamente differenziato, di epidermide umana. Il modello è costituito da uno strato basale, uno strato spinoso e uno strato 
granuloso organizzati e da uno strato corneo multiplo contenente strati di 
strutture lamellari lipidiche intercellulari disposte in modo analogo a quelle presenti in vivo.
 
11. L’irritazione cutanea indotta dalle sostanze chimiche, manifestata da eritema 
ed edema, scaturisce da una cascata di eventi che iniziano con la penetra ­
zione nello strato corneo e con lesioni ai sottostanti strati di cheratinociti. Morendo, i cheratinociti rilasciano mediatori che scatenano la cascata in ­
fiammatoria, la quale agisce sulle cellule del derma, in particolare sulle 
cellule stromali ed endoteliali. Sono la dilatazione e l’accresciuta permea ­
bilità delle cellule endoteliali a produrre l’eritema e l’edema (24). I metodi basati sull’epidermide umana ricostituita rilevano gli eventi iniziali della cascata.
 
12. La vitalità cellulare nei modelli di epidermide umana ricostituita è misurata 
tramite conversione enzimatica del colorante vitale MTT [3-(4,5-dimetiltia ­
zol-2-ile)-2,5-difeniltetrazolio bromide, tiazolil blu; numero CAS 298-93-1 in un sale, il blu di formazan, misurato quantitativamente dopo l’estrazione 
dai tessuti (25). Le sostanze irritanti sono identificate per la loro capacità di 
diminuire la vitalità cellulare al di sotto di determinati livelli soglia (ossia ≤ 
50 %, per gli irritanti appartenenti alla categoria 2 del sistema GHS delle Nazioni Unite/CLP dell’UE). A seconda del quadro regolamentare in cui 
sono usati i risultati del presente metodo di prova, le sostanze che danno 
vitalità cellulare superiore al livello soglia definito possono essere conside ­
rate non irritanti (> 50 %, senza categoria).
 
DIMOSTRAZIONE DEL RENDIMENTO  
13. Prima di utilizzare sistematicamente uno dei tre metodi convalidati conformi 
al presente metodo di prova, è consigliabile che i laboratori ne verifichino il rendimento tecnico, utilizzando le dieci sostanze di riferimento elencate nella tabella 1. Per metodi analoghi messi a punto conformemente a questo 
metodo o per modifiche dei metodi convalidati occorre applicare gli stan ­
dard di prestazione descritti nell’appendice 2 del presente metodo, prima di utilizzarli a fini regolamentari.
 
14. Nell’ambito della verifica del rendimento, si raccomanda che l’utente si 
accerti delle proprietà di barriera dei tessuti dopo averli ricevuti, in confor ­
mità delle specifiche del produttore del modello di epidermide umana rico ­
stituita. Tale verifica è particolarmente importante se i tessuti vengono trasportati per lunghe distanze/per viaggi lunghi. Quando un metodo è 
consolidato e la sua correttezza d’impiego è stata dimostrata, non è più 
necessario effettuare la verifica in maniera routinaria. Tuttavia, se un me ­
todo viene utilizzato di routine, si raccomanda di continuare a verificare le proprietà di barriera a intervalli regolari.
 
Tabella 1  
Sostanze di riferimento  ( 1 ) 
Sostanza CAS Punteggio 
in vivo (  2 ) Stato fisico Categoria 
GHS ONU/CLP UE  
acido 1-naftalenacetico 86-87-3 0 Solido Senza cat. 
isopropanolo 67-63-0 0,3 Liquido Senza cat.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 655
 
Sostanza CAS Punteggio 
in vivo (  2 ) Stato fisico Categoria 
GHS ONU/CLP UE  
stearato di metile 112-61-8 1 Solido Senza cat. 
butirrato di eptile 5870-93-9 1,7 Liquido Senza cat. 
(Cat. 
opzionale 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
salicilato di esile 6259-76-3 2 Liquido Senza cat. 
(Cat. 
opzionale 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
aldeide ciclamenica 103-95-7 2,3 Liquido Cat. 2 1-bromoesano 111-25-1 2,7 Liquido Cat. 2 idrossido di potassio (5 % acq.) 1310-58-3 3 Liquido Cat. 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 3,3 Solido Cat. 2 
eptanale 111-71-7 3,4 Liquido Cat. 2
 
( 1 ) Queste sostanze di riferimento sono un sottoinsieme delle sostanze di riferimento usate nello studio di convalida. 
( 2 ) Punteggio in vivo ai sensi del metodo B.4 e di OCSE Test Guideline 404 (4). 
( 3 ) Nell’ambito del presente metodo di prova, la categoria opzionale 3 del sistema GHS delle Nazioni Unite (lievi irritanti) (1) è 
considerata una sostanza «senza categoria». 
( 4 ) La categoria opzionale 3 del sistema GHS delle Nazioni Unite non si applica nell’ambito del regolamento CLP dell’UE.  
PROCEDURA  
15. Di seguito sono descritte le componenti e le procedure di un metodo su 
modello di epidermide umana ricostituita per la valutazione del potere di irritazione cutanea. Il modello dovrebbe essere ricostruito e può essere preparato internamente o acquistato sul mercato. Le procedure operative 
standard (SOP) per i modelli EpiSkin
 TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) e 
SkinEthic  TM RHE sono disponibili (26)(27)(28). I test devono essere svolti 
come descritto di seguito.  
Componenti del modello di epidermide umana ricostituita  
Condizioni generali del modello  
16. Per ricostruire l’epitelio devono essere utilizzati cheratinociti non trasformati 
di origine umana. Devono essere presenti molteplici strati di cellule epite ­
liali vitali (strato basale, strato spinoso, strato granuloso) sotto uno strato 
corneo funzionale. Lo strato corneo deve presentare molteplici strati con il 
profilo lipidico necessario per costituire una barriera funzionale solida ca ­
pace di resistere alla penetrazione rapida dei marcatori tossici, ad esempio, sodio dodecil solfato (SDS) o Triton X-100. La funzione di barriera deve 
essere dimostrata e può essere valutata la concentrazione alla quale un 
marcatore riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC
 50 ) dopo un tempo di 
esposizione fisso oppure determinando il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità cellulare del 50 % (ET
 50 ) dopo l’applicazione del 
marcatore ad una concentrazione fissa predeterminata. Le proprietà di con ­
tenimento del modello devono essere tali da impedire il passaggio delle sostanze presenti attorno allo strato corneo verso i tessuti vitali, che inci ­
derebbe negativamente sulla qualità della modellizzazione dell’esposizione 
cutanea. Il modello di pelle umana non deve essere contaminato da batteri, 
virus, micoplasmi o funghi.
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Condizioni funzionali del modello  
Vitalità  
17. Il saggio usato per la determinazione della vitalità è il test basato sull’MTT 
(25). Gli utilizzatori del modello devono accertarsi che ciascun lotto del 
modello impiegato soddisfi i criteri definiti per il controllo negativo (NC). La densità ottica (OD) del solo solvente di estrazione dovrebbe essere sufficientemente bassa, ossia OD< 0,1. Lo sviluppatore/il fornitore del mo ­
dello stabilisce un intervallo di accettabilità (limite superiore e inferiore) per 
i valori OD del controllo negativo (nelle condizioni del metodo di prova dell’irritazione cutanea); gli intervalli di accettabilità per i tre metodi con ­
validati figurano nella tabella 2. Occorre documentare che i tessuti trattati 
con il controllo negativo sono stabili in coltura (ossia presentano misure di 
vitalità simili) nel corso del periodo di esposizione.
 
Tabella 2  
Intervalli di accettabilità dei valori OD del controllo negativo  
Limite di accettazione inferiore Limite di accettazione superiore  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Funzione barriera  
18. Lo strato corneo e la relativa composizione lipidica devono essere suffi ­
cienti per resistere alla penetrazione rapida dei marcatori citotossici, come SDS o Triton X-100, valutata tramite i fattori IC
 50 o ET  50 (tabella 3).  
Morfologia  
19. L’esame istologico del modello di epidermide umana ricostituita deve essere 
svolto in modo da dimostrare che la struttura è analoga all’epidermide umana (compreso lo strato corneo multiplo).
 
Riproducibilità  
20. I risultati del controllo positivo (PC) e dei controlli negativi (NC) del 
metodo devono mostrare la riproducibilità nel tempo.  
Controllo di qualità (QC)  
21. Lo sviluppatore/fornitore del modello di epidermide deve garantire e dimo ­
strare che ogni lotto del modello utilizzato rispetta determinati criteri di 
fabbricazione, i più rilevanti dei quali sono quelli relativi alla  vitalità  (punto 
17), alla  funzione di barriera  (punto 18) e alla  morfologia  (punto 19). Tali 
informazioni devono essere fornite agli utilizzatori del metodo, perché pos ­
sano inserirle nella relazione di prova. È opportuno che lo sviluppatore/il 
fornitore del modello di cute (o il ricercatore qualora si usi un modello 
prodotto internamente) stabilisca un intervallo di accettabilità (limite supe ­
riore e inferiore) per i valori di IC  50 o di ET  50 . Per una previsione affidabile 
degli effetti irritanti possono essere considerati accettabili solo i risultati 
ottenuti con tessuti idonei. A titolo di esempio, nella tabella 3 sono riportati 
gli intervalli di accettabilità per i tre metodi convalidati.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 657
 
Tabella 3  
Esempi di criteri di QC dei lotti  
Limite di accettabilità inferiore Limite di accettabilità superiore  
EpiSkin  TM (SM) 
(trattamento di 18 ore con 
SDS)(26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100)(27) ET 50 = 4,8 ore ET  50 = 8,7 ore 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100)(28) ET 50 = 4,0 ore ET  50 = 9,0 ore  
Applicazione delle sostanze di prova e delle sostanze di controllo  
22. Per ogni sostanza sperimentale e per i controlli devono essere utilizzate 
almeno tre repliche di tessuto per prova. Per le sostanze sia liquide che solide occorre applicare una quantità sufficiente della sostanza in esame fino 
a coprire uniformemente la superficie dell’epidermide evitando nel con ­
tempo una dose infinita, ossia un minimo di 25 μL/cm
 2 o 25 mg/cm  2 . 
Per le sostanze solide, la superficie dell’epidermide deve essere inumidita con acqua deionizzata o distillata prima dell’applicazione, al fine di miglio ­
rare il contatto tra la sostanza sperimentale e la superficie dell’epidermide. 
Quando possibile, i solidi dovrebbero essere testati sotto forma di polvere fine. Al termine del periodo di esposizione, la sostanza di prova deve essere tolta con cura dalla superficie dell’epidermide utilizzando un tampone ac ­
quoso o NaCl allo 0,9 %. In funzione del metodo RhE convalidato, il 
periodo di esposizione può variare da 15 a 60 minuti e la temperatura di incubazione da 20 a 37 °C. Questi periodi di esposizione e queste tempe ­
rature sono ottimizzati per ciascun metodo basato su modelli di epidermide 
umana ricostituita e rappresentano le diverse proprietà intrinseche dei me ­
todi; per maggiori dettagli consultare le procedure operative standard (SOP) per i tre metodi (26)(27)(28).
 
23. Occorre utilizzare simultaneamente controlli negativi (NC) e controlli 
positivi (PC) per ogni studio al fine di dimostrare che la vitalità (nell’NC), 
la funzione di barriera e la conseguente sensibilità (con il PC) dei tessuti rientrano in un intervallo di accettabilità storico determinato. La sostanza PC consigliata è una soluzione acquosa di SDS al 5 %. Le sostanze NC 
consigliate sono acqua o un tampone fosfato salino (PBS).
 
Misurazione della vitalità cellulare  
24. L’elemento più importante del protocollo di prova è che le misure della 
vitalità non siano svolte immediatamente dopo l’esposizione alle sostanze in esame bensì dopo un periodo di incubazione post-trattamento sufficiente ­
mente lungo dei tessuti risciacquati in un mezzo fresco. Questo periodo 
consente sia il recupero da effetti citotossici blandi sia la comparsa di effetti citotossici evidenti. La fase di ottimizzazione del test (11) (12) (13) (14) 
(15) ha dimostrato che un periodo di incubazione post-trattamento di 42 ore 
è ottimale.
 
25. Il saggio MTT è un metodo quantitativo convalidato che dovrebbe essere 
utilizzato per misurare la vitalità cellulare nell’ambito del presente metodo di prova. È compatibile con l’utilizzo di un modello tridimensionale di 
tessuto. Il campione di tessuto è inserito in una soluzione MTT alla concen ­
trazione adeguata (ad esempio, 0,3-1 mg/mL) per 3 ore. Il precipitato di formazan blu che si forma è successivamente estratto dal tessuto con un solvente (ad esempio, isopropanolo o con una soluzione isopropanolo/HCl 
95:5), e ne viene misurata la concentrazione determinando la densità ottica a 
570 nm con una banda passante massima di ± 30 nm.
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26. Le proprietà ottiche della sostanza in esame o la sua azione chimica 
sull’MTT potrebbero interferire con la prova, causando una stima errata 
della vitalità (perché la sostanza in esame potrebbe impedire o annullare la generazione di colore, oltre a causarla). Questo può verificarsi quando una specifica sostanza non viene completamente rimossa dal tessuto con il 
risciacquo o quando penetra nell’epidermide. Se la sostanza in esame agisce 
direttamente sull’MTT (riduttore dell’MTT), è naturalmente colorata o si colora durante il trattamento del tessuto, devono essere utilizzati controlli supplementari per individuare e correggere qualsiasi interferenza della so ­
stanza di prova con la tecnica di misurazione della vitalità. Per una descri ­
zione dettagliata di come correggere la riduzione diretta dell’MTT e le interferenze da parte degli agenti coloranti consultare le SOP dei metodi di riferimento convalidati (26)(27)(28).
 
Criteri di accettabilità  
27. Per ogni metodo svolto utilizzando lotti di modelli di epidermide validi (cfr. 
il punto 21), i tessuti trattati con controllo negativo devono mostrare una 
densità ottica che rifletta la qualità dei tessuti sia dopo le fasi di spedizione e ricezione, sia durante l’applicazione di tutti i protocolli. I valori di OD dei controlli non devono essere inferiori ai limiti storici stabiliti. Allo stesso 
modo, i tessuti trattati con il controllo positivo, ossia soluzione acquosa di 
SDS al 5 %, devono riflettere la capacità dei tessuti di rispondere ad una sostanza irritante nelle condizioni del metodo di prova (26) (27) (28). È necessario definire misure correlate e adeguate di variabilità tra le repliche 
di tessuto (ad esempio, se vengono usate deviazioni standard, devono rien ­
trare nell’intervallo di confidenza unilaterale al 95 %, calcolato da dati storici; per il metodo di riferimento convalidato le deviazioni standard devono essere < 18 %).
 
Interpretazione dei risultati e modello predittivo  
28. I valori di OD ottenuti per ciascun campione di prova possono essere 
utilizzati per calcolare la percentuale di vitalità normalizzata rispetto al controllo negativo, il cui valore è fissato al 100 %. Il valore limite della percentuale di vitalità cellulare in base al quale si stabilisce la distinzione tra 
sostanze irritanti e sostanze non classificate e le procedure statistiche usate 
per analizzare i risultati e individuare le sostanze irritanti devono essere chiaramente definiti e documentati e deve esserne dimostrata l’idoneità. I valori limite per la previsione di irritazione sono riportati di seguito:
 
— La sostanza in esame è considerata irritante per la pelle conformemente 
alla categoria 2 del sistema GHS/CLP se la vitalità del tessuto dopo 
l’esposizione e l’incubazione post-trattamento è inferiore o uguale ( ≤) al 
50 %.  
— A seconda del quadro regolamentare in cui sono usati i risultati del 
presente metodo di prova, la sostanza di prova è considerata come 
non irritante per la cute (corrispondente alla voce «senza categoria» 
del sistema GHS/CLP) se la vitalità del tessuto dopo l’esposizione e l’incubazione post-trattamento è superiore (>) al 50 %.
 
DATI E RELAZIONI  
Dati 
29. Per ciascuna prova, i dati ottenuti da singole repliche dei tessuti (ad esem ­
pio, i valori OD e le percentuali di vitalità cellulare calcolate per ogni 
sostanza in esame, compresa la relativa classificazione) sono presentati sotto forma di tabella, compresi i dati delle prove ripetute, secondo le necessità. Sono inoltre registrati, per ogni prova, i valori medi ± la deviazione stan ­
dard. Per ogni sostanza testata devono essere segnalate le interazioni osser ­
vate tra il reagente MTT e le sostanze in esame colorate.
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Relazione sull’esecuzione della prova  
30. La relazione deve comprendere i seguenti dati:  
Sostanze di prova e sostanze di controllo  
— denominazioni chimiche, quali il nome e il numero CAS, il nome e il 
numero CE, se noti;  
— purezza e composizione della sostanza (in percentuale ponderale);  
— proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello studio (ad 
esempio, natura fisica, stabilità e volatilità, pH e solubilità in acqua, se 
nota);  
— trattamento delle sostanze di prova/controllo prima del test, se del caso 
(ad esempio, riscaldamento, frantumazione);  
— condizioni di conservazione;  
Giustificazione per la scelta del modello di epidermide umana ricostituita e 
del metodo utilizzati  
Condizioni di prova  
— sistema cellulare utilizzato;  
— informazioni complete sul modello di epidermide specifico utilizzato e 
sulla sua efficienza. Esse dovrebbero includere (elenco non esauriente):  
i) vitalità;  
ii) funzione di barriera;  
iii) morfologia;  
iv) riproducibilità e predittività;  
v) controlli di qualità (QC) del modello;  
— dettagli del protocollo utilizzato;  
— dosaggi usati per il test, durata dell’esposizione e del periodo di incu ­
bazione post-trattamento;  
— descrizione di qualsiasi modifica del protocollo sperimentale;  
— riferimenti a dati storici del modello. Essi dovrebbero includere (elenco 
non esauriente):  
i) accettabilità dei dati di QC rispetto ai dati storici del lotto;  
ii) accettabilità dei valori di controllo positivi e negativi rispetto alle 
medie e agli intervalli di controllo positivi e negativi;  
— descrizione dei criteri di valutazione utilizzati, compresa la giustifica ­
zione per la scelta del valore o dei valori limite per il modello predit ­
tivo; 
— riferimenti a dati storici del modello;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 660
 
Risultati  
— presentazione sotto forma di tabella dei dati ottenuti da singole sostanze 
sperimentali per ciascuna prova e per ciascuna misurazione della replica;  
— indicazione dei controlli usati per riduttori dell’MTT diretti e/o sostanze 
sperimentali coloranti;  
— descrizione di altri effetti osservati;  
Discussione dei risultati  
Conclusioni  
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Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
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(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. 
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(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
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(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
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(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
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(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
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(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
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Graw-Hill, New York.  
(30) Direttiva 2001/59/CE della Commissione, del 6 agosto 2001, recante ven ­
tottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del 
Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, re ­
golamentari ed amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e all’etichettatura delle sostanze pericolose, GU L 225, del 21.8.2001, pag. 1.
 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
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(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, 
H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.
 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Der ­
matitis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 663
 
Appendice 1  
Definizioni  
Accuratezza:  grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo di prova e 
i valori di riferimento accettati. Misura l’efficienza del metodo di prova e rap ­
presenta un aspetto della pertinenza. Il termine è usato spesso in modo intercam ­
biabile con «concordanza» per indicare la proporzione di risultati corretti di un 
metodo di prova (9).  
Vitalità cellulare:  parametro che misura l’attività totale in una popolazione di 
cellule, per esempio la capacità delle deidrogenasi mitocondriali cellulari di ri ­
durre il colorante vitale MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ile)-2,5-difeniltetrazolio bro ­
mide, tiazolil blu) che, in funzione del parametro misurato e del tipo di test 
utilizzato, corrisponde al numero totale e/o alla vitalità delle cellule viventi.  
Concordanza:  misura l’efficacia del metodo di prova per metodi che forniscono 
un risultato categorico e rappresenta un aspetto della pertinenza. Il termine è 
usato in modo intercambiabile con «accuratezza» ed è definito come la propor ­
zione di tutte le sostanze di prova che sono correttamente classificate come positive o negative. (9).
 
ET 50 : può essere calcolato determinando il tempo di esposizione necessario per 
ridurre la vitalità cellulare del 50 % in seguito all’applicazione del marcatore ad una concentrazione specifica e fissa; cfr. anche IC
 50 . 
EU CLP [Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consi ­
glio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele]:  attua nell’Unione europea (UE) 
il sistema GHS delle Nazioni Unite per la classificazione e l’etichettatura delle 
sostanze chimiche (sostanze e miscele) (3).
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) 
delle Nazioni Unite (ONU):  un sistema di classificazione delle sostanze e miscele 
secondo tipi standardizzati e livelli di rischio fisico, sanitario e ambientale, che elabora i relativi elementi di comunicazione, quali pittogrammi, avvertenze, in ­
dicazioni di pericolo, consigli di precauzioni e schede informative di sicurezza, 
per trasmettere informazioni sugli effetti avversi di dette sostanze a tutela delle persone (compresi datori di lavoro, lavoratori, trasportatori, consumatori e perso ­
nale di pronto intervento) e dell’ambiente (1).
 
IC 50 : può essere calcolato per determinazione della concentrazione alla quale un 
marcatore riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC  50 ) dopo un tempo di espo ­
sizione fisso, cfr. anche ET  50 . 
Dose infinita:  quantità di sostanza in esame applicata all’epidermide che supera 
la quantità necessaria per coprire in maniera completa e uniforme la superficie 
dell’epidermide.  
Test strutturalmente analoghi:  espressione che indica un metodo di prova strut ­
turalmente e funzionalmente analogo a un metodo di prova di riferimento con ­
validato e accettato. Tale metodo di prova potrebbe essere candidato a convalide accelerate (catch-up validation). Usato in maniera intercambiabile con un metodo di prova simile (9).
 
Standard di prestazione (PS):  standard basati su un metodo di riferimento con ­
validato, che consentono di valutare la comparabilità di un metodo proposto simile sotto il profilo strutturale e funzionale. Detti standard comprendono: i) i 
componenti essenziali del metodo; ii) un elenco minimo di sostanze di riferi ­
mento scelte tra le sostanze utilizzate per dimostrare l’accettabilità delle presta ­
zioni del metodo di riferimento convalidato; e iii) in funzione dei risultati ottenuti con il metodo di riferimento convalidato, i livelli comparabili di accuratezza e 
affidabilità che il metodo proposto dovrebbe ottenere quando viene valutato 
utilizzando l’elenco minimo di sostanze di riferimento (9).
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 664
 
Sostanze chimiche di riferimento:  sostanze chimiche selezionate per essere uti ­
lizzate nella procedura di convalida, di cui sono già note le risposte nel sistema di 
prova di riferimento in vitro o in vivo o le specie di interesse. Tali sostanze chimiche dovrebbero essere rappresentative delle classi di sostanze chimiche per le quali si prevede di utilizzare il metodo di prova, e dovrebbero rappresentare 
l’intera gamma di risposte prevedibili delle sostanze chimiche per le quali il 
metodo di prova può essere usato, ossia da forte a debole a negativa. Gruppi diversi di sostanze di riferimento possono essere richiesti per le diverse fasi del processo di convalida e per i diversi metodi di prova e utilizzi della prova (9).
 
Pertinenza:  descrizione del rapporto del saggio con l’effetto di interesse e se esso 
è significativo e utile per uno scopo specifico. È il grado con cui il saggio misura 
o prevede correttamente l’effetto biologico di interesse. La pertinenza comprende una valutazione dell’accuratezza (concordanza) di un metodo di prova (9).
 
Affidabilità:  misura in cui un metodo può essere riprodotto nel tempo all’interno 
dello stesso laboratorio o da laboratori diversi utilizzando il medesimo protocollo. 
È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratorio (9).  
Prova di sostituzione:  una prova progettata per sostituire un saggio usato routi ­
nariamente e accettato per l’individuazione dei pericoli e/o la valutazione dei rischi, e che è stata determinata per fornire una protezione equivalente o mag ­
giore della salute dell’uomo o degli animali oppure dell’ambiente, se del caso, 
rispetto alla prova accettata, per tutte le possibili situazioni sperimentali e le sostanze di prova (9).
 
Sensibilità:  proporzione di tutte le sostanze positive/attive correttamente classifi ­
cate dal test. Misura l’accuratezza di un metodo di prova che produce risultati 
ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di 
un metodo (9).  
Irritazione cutanea:  comparsa di danni reversibili sulla pelle a seguito dell’ap ­
plicazione della sostanza di prova per una durata massima di 4 ore. L’irritazione 
cutanea è una reazione locale, non immunogenica, che si manifesta poco dopo la 
stimolazione (29). Si caratterizza essenzialmente per la reversibilità del processo, che comprende reazioni infiammatorie e la maggior parte dei segni clinici carat ­
teristici dell’irritazione (eritema, edema, prurito e dolore) associati al processo 
infiammatorio.
 
Specificità:  proporzione di tutte le sostanze negative/inattive correttamente clas ­
sificate dal test. Misura l’accuratezza di un metodo di prova che produce risultati ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di un metodo (9).
 
Strategia di prova sequenziale:  prove che ricorrono a metodi sperimentali in 
maniera sequenziale; i metodi di prova selezionati in ciascun livello consequen ­
ziale sono decisi in base ai risultati del precedente livello di prova (9).  
Sostanza di prova (o sostanza sperimentale):  qualsiasi sostanza o miscela testata 
seguendo il presente metodo di prova.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 665
 
Appendice 2  
Standard di prestazione per la valutazione di metodi in vitro simili basati su 
epidermide umana ricostituita (RHE), o di varianti di tali metodi, proposti 
per le prove di irritazione cutanea  
INTRODUZIONE  
1. Scopo degli standard di prestazione (PS) è comunicare il fondamento in 
base al quale è possibile determinare nuovi metodi, soggetti o meno al 
diritto di proprietà (ossia tutelati dal diritto d’autore, contrassegnati da mar ­
chio, registrati), per avere un’accuratezza e un’affidabilità sufficienti per specifici scopi sperimentali. Tali standard di prestazione, basati su metodi 
di prova convalidati e accettati, possono essere impiegati per valutare l’af ­
fidabilità e l’accuratezza di altri metodi analoghi (definiti metodi «struttu ­
ralmente analoghi»), basati su principi scientifici simili, e per misurare o prevedere lo stesso effetto biologico o tossico (9).
 
2. Prima dell’adozione di un metodo modificato (ossia di potenziali migliora ­
menti proposti rispetto a un metodo approvato), si dovrebbe effettuare una valutazione per stabilire l’effetto delle modifiche proposte sulla prestazione del saggio e la portata di tali modifiche sulle informazioni disponibili per le 
altri componenti del processo di convalida. A seconda del numero e della 
natura delle modifiche proposte, dei dati generati e della documentazione giustificativa di tali modifiche, queste ultime devono essere sottoposte al medesimo processo di convalida descritto per un nuovo saggio o, se del 
caso, a una valutazione ristretta dell’affidabilità e della pertinenza, sulla 
scorta di un PS consolidato (9).
 
3. I metodi simili («strutturalmente analoghi») rispetto ai tre metodi convali ­
dati [EpiSkin™ (metodo di riferimento convalidato, VRM), EpiDerm™ SIT 
(EPI-200) e SkinEthic™ RHE] o le varianti di tali metodi, proposti nel 
quadro del presente metodo di prova, devono essere valutati al fine di determinarne l’affidabilità e l’accuratezza utilizzando sostanze che rappre ­
sentano l’intervallo completo dei punteggi di irritazione di Draize. Se va ­
lutati utilizzando le 20 sostanze di riferimento consigliate dello standard di 
prestazione (tabella 1), i metodi simili proposti, o le varianti di tali metodi, devono avere valori di affidabilità e di accuratezza confrontabili o migliori rispetto a quelli ottenuti tramite il metodo di riferimento convalidato (tabella 
2) (2) (16). I valori di affidabilità e accuratezza che dovrebbero essere 
raggiunti sono riportati nei punti da 8 a 12 della presente appendice. Le sostanze non classificate (ossia «senza categoria» nel sistema GHS/CLP) e classificate (nella categoria 2 del sistema GHS/CLP) (1) che rappresentano 
classi chimiche diverse sono incluse affinché i valori relativi all’affidabilità 
e all’accuratezza (sensibilità, specificità e accuratezza generale) del metodo proposto possano essere confrontati con quelli del metodo di riferimento convalidato. Prima di utilizzarlo per esaminare nuove sostanze determinare 
l’affidabilità del metodo e la sua capacità di individuare correttamente le 
sostanze irritanti di categoria 2 secondo il sistema GHS/CLP.
 
4. I presenti standard di prestazione sono basati sullo standard EC-ECVAM 
(8), aggiornato in conformità dei sistemi GHS dell’ONU e CLP dell’UE 
sulla classificazione e l’etichettatura (1) (3). Gli standard di prestazione originari erano stati definiti dopo il completamento dello studio di convalida (21) ed erano basati sul sistema di classificazione dell’UE previsto dalla 
direttiva 2001/59/CE della Commissione, del 6 agosto 2001, recante ven ­
tottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, rego ­
lamentari ed amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e 
all’etichettatura delle sostanze pericolose (
 1 ). In seguito all’adozione del  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 666  
( 1 ) GU L 225 del 21.8.2001, pag. 1.
 sistema GHS delle Nazioni Unite per la classificazione e l’etichettatura 
nell’UE (regolamento CLP dell’UE) (3), avvenuta tra l’ultimazione dello 
studio di valutazione e il completamento del presente metodo di prova, gli standard di prestazione sono stati aggiornati (8). Tale aggiornamento consta prevalentemente di modifiche apportate: i) all’insieme delle sostanze di riferi ­
mento del PS; e ii) ai valori definiti per l’affidabilità e l’accuratezza (2) (23).
 
STANDARD DI PRESTAZIONE PER METODI DI PROVA RhE IN VITRO 
PER L’IRRITAZIONE CUTANEA  
5. Gli standard di prestazione sono costituiti dai seguenti tre elementi (9):  
I) componenti essenziali del metodo  
II) elenco minimo di sostanze di riferimento  
III) valori definiti di accuratezza e affidabilità  
I) Componenti essenziali del metodo  
6. Si tratta di elementi strutturali, funzionali e procedurali essenziali di un 
metodo convalidato che dovrebbero essere inclusi nel protocollo di un 
metodo proposto simile sotto il profilo meccanico e funzionale o di una 
sua variante. Tali componenti comprendono caratteristiche uniche del me ­
todo, dettagli procedurali critici e misure di controllo della qualità. La conformità alle componenti essenziali del metodo di prova contribuirà a 
garantire che un metodo proposto simile o una sua variante poggi sui 
medesimi concetti del metodo di riferimento convalidato corrispondente (9). Le componenti essenziali del metodo di prova sono descritte nei punti da 16 a 21 del metodo di prova e le prove devono essere eseguite confor ­
memente a:
 
— le condizioni generali (punto 16)  
— le condizioni funzionali, che comprendono:  
— la vitalità (punto 17);  
— la funzione di barriera (punto 18);  
— la morfologia (punto 19);  
— la riproducibilità (punto 20);  
— il controllo della qualità (punto 21).  
II) Elenco minimo di sostanze di riferimento  
7. Le sostanze di riferimento sono impiegate per determinare se l’affidabilità e 
l’accuratezza di un metodo di prova simile proposto, o di una sua variante, 
di cui è stata dimostrata una somiglianza sufficiente, sotto il profilo strut ­
turale e funzionale, al metodo di riferimento convalidato, o che rappresenta una modifica di minore entità di uno dei tre metodi convalidati, sono comparabili o migliori rispetto all’affidabilità e all’accuratezza del metodo 
di riferimento convalidato (2) (8) (16) (23). Le 20 sostanze di riferimento 
raccomandate elencate nella tabella 1 comprendono le sostanze che rappre ­
sentano diverse classi chimiche di interesse (ossia categorie chimiche basate su gruppi funzionali) e l’intervallo completo dei punteggi di irritazione di 
Draize (da non irritante a fortemente irritante). Le sostanze incluse 
nell’elenco comprendono 10 sostanze appartenenti alla categoria 2 del si ­
stema GHS/CLP e 10 sostanze non classificate, di cui 3 appartengono alla categoria opzionale 3 del sistema GHS delle Nazioni Unite. Per questo 
metodo, la categoria opzionale 3 non corrisponde a nessuna categoria. Le 
sostanze elencate nella tabella 1 sono selezionate tra le sostanze chimiche
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 667
 
usate nella fase di ottimizzazione che è seguita alla pre-convalida e nello 
studio di convalida del metodo di riferimento convalidato, per quanto con ­
cerne la funzionalità chimica e lo stato fisico (14) (18). Tali sostanze di riferimento rappresentano il numero minimo di sostanze da utilizzare per valutare l’accuratezza e l’affidabilità di un metodo di prova simile proposto 
o di una sua variante, ma non devono essere usate per sviluppare nuovi 
metodi. Nelle situazioni in cui una delle sostanze elencate non sia disponi ­
bile possono essere utilizzate altre sostanze per le quali esistano adeguati dati di riferimento in vivo, prevalentemente selezionate dalle sostanze usate 
nella fase di ottimizzazione successiva alla pre-convalida o allo studio di 
convalida del metodo di riferimento convalidato. Facoltativamente, è possi ­
bile aggiungere all’elenco minimo di sostanze di riferimento altre sostanze che rappresentano classi chimiche diverse e per le quali sono disponibili 
adeguati dati di riferimento in vivo al fine di valutare più approfonditamente 
l’accuratezza del metodo proposto.
 
Tabella 1  
Elenco minimo di sostanze di riferimento per la determinazione dei valori di accuratezza e affidabilità per metodi 
RhE simili o varianti di tali metodi per le prove di irritazione cutanea  ( 1 ) 
Sostanza Numero CAS Stato fisico Punteggio in vivo Cat. VRM in 
vitro Categoria GHS/CLP 
in vivo  
1-bromo-4-clorobutano 6940-78-9 Liquido 0 Cat. 2 Nessuna cat. 
dietil ftalato 84-66-2 Liquido 0 Nessuna cat. Nessuna cat. acido 1-naftalenacetico 86-87-3 Solido 0 Nessuna cat. Nessuna cat. fenossiacetato di allile 7493-74-5 Liquido 0,3 Nessuna cat. Nessuna cat. isopropanolo 67-63-0 Liquido 0,3 Nessuna cat. Nessuna cat. 
4-metil-tio-benzaldeide 3446-89-7 Liquido 1 Cat. 2 Nessuna cat. 
stearato di metile 112-61-8 Solido 1 Nessuna cat. Nessuna cat. butirrato di eptile 5870-93-9 Liquido 1,7 Nessuna cat. Nessuna cat. salicilato di esile 6259-76-3 Liquido 2 Nessuna cat. Nessuna cat. cinnamaldeide 104-55-2 Liquido 2 Cat. 2 Nessuna cat. 
(Cat. 
opzionale 3 ) (
 3 ) 
1-decanolo  ( 2 ) 112-30-1 Liquido 2,3 Cat. 2 Cat. 2  
aldeide ciclamenica 103-95-7 Liquido 2,3 Cat. 2 Cat. 2 1-bromoesano 111-25-1 Liquido 2,7 Cat. 2 Cat. 2 idrocloruro di 2-clorometil- 
3,5-dimetil-4-metossipiridina 86604-75-3 Solido 2,7 Cat. 2 Cat. 2  
disolfuro di di-n-propile  (
 2 ) 629-19-6 Liquido 3 Nessuna cat. Cat. 2  
idrossido di potassio (5 % 
acq.) 1310-58-3 Liquido 3 Cat. 2 Cat. 2 
benzenethiolo, 5-(1,1-dimeti ­
letil)-2-metile 7340-90-1 Liquido 3,3 Cat. 2 Cat. 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 Solido 3,3 Cat. 2 Cat. 2  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 668
 
Sostanza Numero CAS Stato fisico Punteggio in vivo Cat. VRM in 
vitro Categoria GHS/CLP 
in vivo  
eptanale 111-71-7 Liquido 3,4 Cat. 2 Cat. 2 
tetracloroetilene 127-18-4 Liquido 4 Cat. 2 Cat. 2  
( 1 ) La selezione delle sostanze si basa sui seguenti criteri: i) le sostanze sono disponibili sul mercato; ii) sono rappresentati ve dell’intera 
gamma di punteggi di irritabilità di Draize (da non irritante a fortemente irritante); iii) hanno una struttura chimica ben def inita; iv) 
sono rappresentative della funzionalità chimica usata nel processo di convalida; v) non sono associate ad un profilo estremamen te 
tossico (ad esempio, cancerogeno o tossico per la riproduzione) e non comportano costi di smaltimento eccessivi. 
( 2 ) Sostanze che sono irritanti nel coniglio ma per le quali esistono prove affidabili che non sono irritanti nell’uomo (31) (32)  (33). 
( 3 ) Nell’ambito del GHS, non menzionata nel CLP dell’UE  
III) Valori definiti di accuratezza e affidabilità  
8. Al fine di stabilire l’affidabilità e la pertinenza dei metodi simili proposti o 
di loro varianti da trasferire tra laboratori, tutte le 20 sostanze di riferimento della tabella 1 devono essere testate in almeno tre laboratori. Tuttavia, se il metodo proposto deve essere usato soltanto in un laboratorio, per la con ­
valida non sono richieste prove effettuate in più laboratori. È comunque 
fondamentale che tali studi di convalida siano valutati in maniera indipen ­
dente da organismi di validazione riconosciuti a livello internazionale, in conformità delle linee guida internazionali (9). In ogni laboratorio, tutte le 
20 sostanze di riferimento devono essere testate in tre prove indipendenti 
eseguite con diversi lotti di tessuto e in momenti sufficientemente distanziati tra loro. Ogni prova deve consistere in un minimo di tre repliche di tessuto testate simultaneamente per ogni sostanza sperimentale, per ogni campione 
negativo e per ogni campione positivo.
 
9. Il calcolo dei valori di affidabilità e accuratezza del metodo proposto 
dev’essere effettuato considerando tutti i quattro criteri riportati di seguito, garantendo che i valori di affidabilità e pertinenza siano calcolati in maniera 
predefinita e coerente:
 
1. soltanto i dati di prove ottenuti da sequenze complete possono essere 
usati per calcolare la variabilità inter- e intralaboratoriale e la capacità predittiva (accuratezza) del metodo.
 
2. La classificazione finale di ogni sostanza di riferimento in ogni labora ­
torio partecipante dev’essere ottenuta utilizzando il valore medio relativo alla vitalità nelle diverse prove di una sequenza completa.
 
3. Soltanto i dati ottenuti per sostanze per le quali sono state condotte 
sequenze di prova complete in tutti i laboratori partecipanti possono essere utilizzati per calcolare la variabilità interlaboratorio del metodo.
 
4. Il calcolo dei valori di accuratezza dev’essere fatto sulla base delle 
previsioni individuali di laboratorio ottenute per le 20 sostanze di rife ­
rimento dai vari laboratori partecipanti.  
In questo contesto, una  sequenza di prova  consiste in tre prove indipen ­
denti condotte in un laboratorio per una sostanza sperimentale. Una  se­
quenza di prova completa  è una sequenza di prova condotta in un labo ­
ratorio per una sostanza sperimentale in cui tutte le prove siano valide. Ciò significa che un’eventuale prova non valida annulla la validità dell’intera 
sequenza di tre prove.
 
Riproducibilità intra-laborataorio  
10. La valutazione della riproducibilità intra-laboratorio dovrebbe mostrare una 
concordanza delle classificazioni (categoria 2 e nessuna categoria del si ­
stema GHS/CLP), ottenuta in prove diverse e indipendenti svolte sulle 20 
sostanze di riferimento da uno stesso laboratorio, che deve essere pari o 
superiore ( ≥) al 90 %.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 669
 
Riproducibilità inter-laboratorio  
11. La valutazione della riproducibilità inter-laboratorio non è essenziale se il 
metodo proposto deve essere utilizzato in un solo laboratorio. Per i metodi 
che devono essere trasferiti da un laboratorio all’altro, la concordanza delle classificazioni (categoria 2 e nessuna categoria del sistema GHS/CLP), ottenuta in prove diverse e indipendenti svolte sulle 20 sostanze di riferi ­
mento fra almeno tre laboratori, deve essere pari o superiore ( ≥) all’80 %.
 
Capacità predittiva (accuratezza)  
12. L’accuratezza (sensibilità, specificità e accuratezza generale) del metodo 
simile proposto o di una sua variante dovrebbe essere comparabile o mi ­
gliore a quella del metodo di riferimento convalidato, tenendo conto delle informazioni aggiuntive relative alla pertinenza nella specie di interesse 
(tabella 2). La sensibilità dovrebbe essere pari o superiore ( ≥) all’80 % 
(2) (8) (23). Tuttavia, un’ulteriore limitazione specifica si applica alla sen ­
sibilità del metodo in vitro proposto, nel senso che soltanto due sostanze in vivo della categoria 2,  1-decanolo e disolfuro di di-n-propile,  possono 
essere erroneamente considerate come non classificabili (senza categoria) 
da più di un laboratorio partecipante. La specificità dovrebbe essere pari o superiore ( ≥) al 70 % (2) (8) (23). Non esistono ulteriori limitazioni per 
quanto riguarda la specificità del metodo in vitro proposto, ossia qualsiasi 
laboratorio partecipante può erroneamente classificare qualsiasi sostanza in 
vivo senza categoria purché la specificità finale del metodo di prova rientri nell’intervallo accettabile. L’accuratezza generale dovrebbe essere pari o superiore ( ≥) al 75 % (2) (8) (23). Sebbene la sensibilità del metodo di 
riferimento convalidato calcolata per le 20 sostanze di riferimento elencate 
nella tabella 1 sia pari al 90 %, il valore minimo per la sensibilità richiesto per ogni metodo simile o una sua variante da considerare valido è fissato all’80 %, poiché sia  1-decanolo  (una sostanza borderline) sia e  disolfuro di 
di-n-propile  (un falso negativo del metodo di riferimento convalidato) sono 
note per essere prive di potenziale irritante nell’uomo (31) (32) (33), pur essendo state identificate come irritanti nel test sul coniglio. Poiché i mo ­
delli RhE si basano su cellule di origine umana, essi possono considerare 
tali sostanze come non irritanti («nessuna categoria» del sistema GHS/CLP).
 
Tabella 2  
Valori predittivi richiesti per la sensibilità, la specificità e l’accuratezza generale per un 
qualsiasi metodo simile o sua variante da considerare validi  
Sensibilità Specificità Accuratezza generale  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Criteri di accettazione dello studio  
13. È possibile che una o più prove riguardanti una o più sostanze sperimentali 
non soddisfino i criteri di accettazione dello studio per le sostanze speri ­
mentali e i controlli o non siano accettabili per altri motivi. Per integrare i 
dati mancanti, per ogni sostanza sperimentale è ammissibile un numero 
massimo di due prove aggiuntive («prove ulteriori»). Più precisamente, poiché in caso di prove ulteriori anche i controlli positivi e i controlli negativi devono essere testati simultaneamente, per ogni sostanza sperimen ­
tale può essere effettuato un numero massimo di due prove aggiuntive.
 
14. È possibile che, anche dopo le ulteriori prove, non si riesca a ottenere per 
ogni sostanza di riferimento il numero minimo di tre prove valide richiesto per ogni sostanza sperimentale in ogni laboratorio partecipante, il che com ­
porterebbe la presenza di una matrice di dati incompleta. In questi casi, per 
poter considerare gli insiemi di dati accettabili, devono essere soddisfatti 
tutti i seguenti tre criteri:
 
1. tutte le 20 sostanze di riferimento devono almeno avere una sequenza di 
prove completa.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 670
 
2. In ognuno di almeno tre laboratori partecipanti, almeno l’85 % delle 
sequenze di prova dev’essere completo (per 20 sostanze, ossia sono 
ammesse in un laboratorio 3 sequenze di prova non valide).  
3. Almeno il 90 % di tutte le sequenze di prova possibili di almeno tre 
laboratori dev’essere completo (per 20 sostanze testate in 3 laboratori, ossia sono ammesse in totale 6 sequenze di prova non valide).
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 671
 
B. 47  SAGGIO DI OPACITÀ E PERMEABILITÀ DELLA CORNEA 
NEI BOVINI ( BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABI ­
LITY  – BCOP) PER L’IDENTIFICAZIONE DI SOSTANZE COR ­
ROSIVE E GRAVEMENTE IRRITANTI PER GLI OCCHI  
INTRODUZIONE  
01. Il saggio di opacità e permeabilità della cornea nei bovini ( Bovine Corneal 
Opacity and Permeability  - BCOP) è un metodo di saggio  in vitro  che può 
essere utilizzato, in determinate circostanze e con specifiche limitazioni, per 
la classificazione di sostanze e miscele come «agenti corrosivi e gravemente 
irritanti per gli occhi» (1) (2) (3). Ai fini del presente metodo di prova, sono definite sostanze gravemente irritanti le sostanze che inducono lesioni ocu ­
lari che persistono nel coniglio per almeno 21 giorni dopo la somministra ­
zione. Sebbene non sia considerato un metodo valido per sostituire com ­
pletamente il saggio  in vivo  sugli occhi del coniglio, il metodo BCOP è 
consigliato quale parte integrante di una strategia di prove in sequenza per la classificazione e l’etichettatura, applicabile in uno specifico ambito norma ­
tivo (4) (5). Le sostanze di prova e le miscele (6) possono essere classificate 
come sostanze corrosive o gravemente irritanti per gli occhi senza la neces ­
sità di condurre ulteriori prove sui conigli. Una sostanza che risulta negativa al saggio deve essere sottoposta a ulteriori saggi su coniglio facendo ricorso 
a una strategia di prove in sequenza, come descritto dalla linea guida OCSE 
405, 7 (capitolo B. 5 del presente allegato).
 
02. Scopo di questo metodo di prova è descrivere le procedure impiegate per 
valutare il potenziale di corrosione o di grave irritazione oculare di una 
sostanza di prova sulla base della capacità di tale sostanza di indurre opacità 
o aumentare la permeabilità di una cornea isolata di bovino. Gli effetti in termini di tossicità sulla cornea vengono misurati attraverso i) la diminu ­
zione della luce trasmessa (opacità) e ii) l’aumento della quantità di colo ­
rante a base di fluoresceina sodica che attraversa la cornea (permeabilità). Le 
valutazioni di opacità e permeabilità della cornea successivamente all’espo ­
sizione a una sostanza di prova vengono combinate per ottenere un punteg ­
gio di irritazione  in vitro  (In Vitro Irritancy Score  – IVIS), utilizzato per 
classificare il livello di irritazione provocato dalla sostanza di prova.
 
03. Il metodo di prova BCOP è stato impiegato anche per analizzare sostanze 
irritanti per gli occhi in grado di causare lesioni che guariscono in meno di 21 giorni e sostanze non irritanti. Tuttavia, l'accuratezza e l’affidabilità del 
metodo di prova BCOP per le sostanze che rientrano nelle suddette categorie 
non sono state oggetto di valutazione formale.
 
04. L’appendice 1 riporta un elenco delle definizioni in uso.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITAZIONI  
05. Il presente metodo di prova BCOP (8) si basa sul protocollo del Comitato di 
coordinamento interagenzia per la convalida dei metodi alternativi ( Intera­
gency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods , 
ICCVAM), che è stato sviluppato in seguito ad uno studio internazionale in materia di convalida di metodi alternativi (4) (5) (9) con il contributo del 
Centro europeo per la convalida di metodi alternativi ( European Centre for 
the Validation of Alternative Methods , ECVAM) e del corrispondente orga ­
nismo del Giappone ( Japanese Centre for the Validation of Alternative 
Methods , JaCVAM). Il protocollo si basa su informazioni ottenute dall’Isti ­
tuto per le scienze in vitro ( Institute for In Vitro Sciences , IIVS) e dal 
protocollo 124 della Banca dati tossicologici in vitro ( In-Vitro Toxicology 
data bank , INVITTOX) (10), che costituisce il protocollo alla base dello 
studio sulla preconvalida del metodo di prova BCOP finanziato dalla Co ­
munità europea nel 1997-1998. Entrambi i protocolli si basano sulla meto ­
dologia BCOP illustrata per la prima volta da Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 672
 
06. Le limitazioni identificate per questo metodo di prova consistono nelle 
elevate percentuali di falsi positivi per alcoli e chetoni e nelle elevate per ­
centuali di falsi negativi per i solidi, rilevate nella banca dati sulla convalida (cfr. paragrafo 44) (5). Quando si escludono dalla banca dati sostanze ap ­
partenenti a queste classi chimiche e fisiche si registra un marcato miglio ­
ramento dell’accuratezza del metodo di prova BCOP in tutti i sistemi di 
classificazione dell’Unione europea, dell’Agenzia di protezione ambientale statunitense ( Environmental Protection Agency  – EPA) e del Sistema mon ­
diale armonizzato di classificazione e di etichettatura dei prodotti chimici 
delle Nazioni Unite ( Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals  — GHS) (5). Considerando l’obiettivo del presente 
saggio, che mira a identificare solamente sostanze corrosive/gravemente irritanti per gli occhi, le percentuali di falsi negativi non rappresentano un 
problema primario, poiché tali sostanze sarebbero oggetto di analisi succes ­
sive nel coniglio o per mezzo di altri saggi  in vitro  debitamente convalidati, 
a seconda delle prescrizioni normative, applicando una strategia di saggio in sequenza, basata sulla forza probante dei dati disponibili. Inoltre, l’attuale 
banca dati di convalida non ha consentito di effettuare un’adeguata valuta ­
zione di alcune classi chimiche o di prodotto (ad esempio, delle miscele). I ricercatori potrebbero comunque considerare di utilizzare questo saggio per tutti i materiali di prova (comprese le miscele), accettando un risultato 
positivo come indicativo di una reazione a una sostanza corrosiva o grave ­
mente irritante per gli occhi. I risultati positivi ottenuti con alcoli o chetoni andrebbero tuttavia interpretati con cautela, considerato il rischio di effet ­
tuare una sovrastima.
 
07. Tutte le procedure che prevedono l’impiego di occhi o cornee di bovini 
dovrebbero osservare le regolamentazioni e le procedure in vigore nella struttura che effettua l’analisi relativamente alla gestione dei materiali di derivazione animale che comprendono, tra l’altro, i tessuti e i liquidi tessu ­
tali. È raccomandata l’adozione delle comuni norme di cautela osservate nei 
laboratori (12).
 
08. Un limite del saggio è dato dal fatto che, sebbene esso prenda in esame 
alcuni degli effetti oculari valutati con il saggio di irritazione oculare nel 
coniglio e in certa misura anche la relativa gravità, non considera le lesioni 
della congiuntiva e dell’iride. Inoltre, nonostante il saggio BCOP non con ­
senta di per sé di valutare la reversibilità delle lesioni corneali, studi condotti sugli occhi del coniglio suggeriscono di esaminare la profondità iniziale di 
una lesione corneale per distinguere se si è in presenza di effetti reversibili o 
irreversibili (13). Infine, il saggio BCOP non consente di valutare il poten ­
ziale di tossicità sistemica associato all’esposizione attraverso l’occhio.
 
09. Sono in atto studi per caratterizzare ulteriormente l’utilità e i limiti del 
metodo di prova BCOP per l’identificazione di sostanze irritanti non gravi 
e di sostanze non irritanti (cfr. anche paragrafo 45). Gli utilizzatori sono altresì invitati a fornire campioni e/o dati di organismi di convalida per una valutazione formale della possibilità di impieghi futuri del saggio BCOP, 
anche per l’identificazione di sostanze irritanti non gravi e di sostanze non 
irritanti.
 
10. Per i laboratori che ricorrono a questo tipo di saggio per la prima volta è 
consigliabile utilizzare le sostanze chimiche di riferimento indicate nell’ap ­
pendice 2 per la verifica delle prestazioni del saggio. Un laboratorio può 
utilizzare tali sostanze chimiche per dimostrare le proprie competenze tecni ­
che nell’esecuzione del saggio BCOP prima di presentare i dati del saggio BCOP a scopi normativi per la classificazione dei rischi.
 
PRINCIPIO DEL SAGGIO  
11. Il metodo di prova BCOP è un modello organotipico che mantiene a breve 
termine  in vitro  la normale funzionalità fisiologica e biochimica della cornea 
dei bovini. Questo metodo è utilizzato per la valutazione dei danni prodotti dalla sostanza di prova sulla base di misurazioni quantitative dei cambia ­
menti di opacità e permeabilità, effettuate rispettivamente con un opacimetro 
e uno spettrofotometro. Entrambe le misurazioni vengono impiegate per il calcolo del punteggio IVIS ( In Vitro Irritancy Score ), utilizzato per asse ­
gnare una categoria di classificazione di pericolo di irritazione  in vitro  per la 
previsione del potenziale di irritazione oculare  in vivo  di una sostanza di 
prova (cfr. criteri decisionali).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 673
 
12. Il metodo di prova BCOP impiega cornee isolate da occhi di bovini appena 
macellati. L’opacità corneale si misura con la quantità di luce trasmessa 
attraverso la cornea. La permeabilità si misura con la quantità di colorante a base di fluoresceina sodica che attraversa l’intero spessore della cornea ed é rilevata nel mezzo della camera posteriore. Le sostanze di prova vengono 
applicate alla superficie epiteliale della cornea e aggiunte alla camera ante ­
riore del supporto corneale. L’appendice 3 riporta una descrizione e un diagramma del supporto corneale utilizzato per il saggio BCOP. I supporti corneali possono essere acquistati sul mercato da diversi fornitori o possono 
essere costruiti.
 
Origine ed età degli occhi dei bovini e selezione delle specie animali  
13. I bovini inviati ai macelli vengono di norma abbattuti per il consumo umano 
o altri usi commerciali. Le cornee utilizzate per i saggi BCOP provengono esclusivamente da animali sani ritenuti idonei a essere immessi nella catena alimentare umana. Poiché i capi di bestiame sono di peso diverso a seconda 
della razza, dell’età e del sesso, non vi sono raccomandazioni relative al 
peso dell’animale al momento della macellazione.
 
14. L’impiego di animali di età diversa può comportare variazioni nelle dimen ­
sioni della cornea. Le cornee di diametro orizzontale > 30,5 mm e spessore corneale centrale ( central corneal thickness  – CCT) ≥ 1 100 μm si otten ­
gono di norma da bovini di età superiore a otto anni, mentre le cornee che 
presentano un diametro orizzontale < 28,5 mm e un valore di CCT 
< 900 μm derivano solitamente da capi di bestiame di età inferiore a cinque 
anni (14). Per questo motivo non si utilizzano di norma occhi di bovini di età superiore a 60 mesi. Gli occhi dei bovini di età inferiore a 12 mesi non 
sono normalmente impiegati, in quanto sono ancora in fase di sviluppo e i 
valori relativi allo spessore e al diametro della cornea sono notevolmente inferiori rispetto ai corrispondenti parametri rilevati nei bovini adulti. L’im ­
piego di cornee di animali giovani (ovvero di età compresa fra 6 e 12 mesi) 
è tuttavia ammesso in quanto comporta alcuni vantaggi, quali la maggiore disponibilità, la limitata fascia di età e la riduzione dei rischi legati alla potenziale esposizione del lavoratore all’encefalopatia spongiforme bovina 
(15). Sarebbe utile valutare ulteriormente gli effetti delle dimensioni o dello 
spessore corneali sulla capacità di reazione a sostanze corrosive e irritanti, pertanto si raccomanda agli utilizzatori di indicare la stima dell’età e/o del peso degli animali da cui provengono le cornee utilizzate in uno studio.
 
Prelievo e trasporto degli occhi in laboratorio  
15. Gli occhi sono prelevati dai dipendenti del mattatoio. Per ridurre al minimo i 
danni meccanici o di altro tipo agli occhi, è consigliabile procedere all’enu ­
cleazione oculare appena possibile dopo l’abbattimento dell’animale. Du ­
rante il risciacquo della testa dell’animale è opportuno che i dipendenti del mattatoio non facciano uso di detergenti al fine di evitare 
l’esposizione degli occhi a sostanze potenzialmente irritanti.
 
16. Gli occhi vanno immersi completamente nella soluzione salina bilanciata di 
Hank ( Hank’s Balanced Salt Solution , HBBS) in un contenitore di dimen ­
sioni adeguate e trasportati in laboratorio in modo da ridurre al minimo il relativo deterioramento e/o la contaminazione batterica. Gli occhi sono pre ­
levati durante il processo di macellazione e potrebbero pertanto essere espo ­
sti al sangue o ad altre sostanze biologiche, compresi batteri e microorgani ­
smi di altra natura. Per questo motivo è importante assicurare che il rischio di contaminazione sia ridotto al minimo (ad esempio, tenendo il contenitore degli occhi in ghiaccio o aggiungendo antibiotici alla soluzione 
HBSS utilizzata per conservare gli occhi durante il trasporto [ad esempio, 
penicillina a 100 IU/mL e streptomicina a 100 μg/mL]).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 674
 
17. È consigliabile ridurre al minimo l’intervallo temporale che intercorre fra il 
prelievo degli occhi e l’utilizzo delle cornee per il saggio BCOP (idealmen ­
te, gli occhi andrebbero raccolti e utilizzati nell’arco della stessa giornata) e accertare che tale intervallo non pregiudichi i risultati del saggio. I risultati in questione si basano sui criteri di selezione degli occhi e sulle reazioni dei 
controlli positivi e negativi. Per il saggio si suggerisce di utilizzare occhi 
prelevati nella medesima giornata e appartenenti ad uno stesso gruppo di prelievo.
 
Criteri di selezione degli occhi impiegati nel saggio BCOP  
18. Giunti in laboratorio, gli occhi sono sottoposti a un attento esame volto a 
evidenziare la presenza di eventuali difetti, quali ad esempio aumento 
dell’opacità, graffi e neovascolarizzazione. Possono essere utilizzate sola ­
mente cornee provenienti da occhi privi di tali difetti.  
19. La qualità di ciascuna cornea é valutata anche durante le fasi successive del 
saggio. Vanno scartate le cornee che presentano un valore di opacità supe ­
riore a sette unità (NOTA: l’opacimetro va tarato a valori di opacità standard 
impiegati per definire le unità di opacità, cfr. appendice 3) dopo un periodo di equilibratura iniziale di un’ora.
 
20. Ciascun gruppo di trattamento (sostanza di prova, controlli negativi e posi ­
tivi paralleli) consiste di un minimo di tre occhi. Tre cornee dovrebbero 
essere utilizzate per le cornee di controllo negativo nel saggio BCOP. Poi ­
ché tutte le cornee sono tagliate dal bulbo intero e montate nelle camere corneali, vi è il rischio che maneggiando tali dispositivi vengano alterati i 
valori di opacità e permeabilità (compresi i valori relativi ai controlli nega ­
tivi). Inoltre, i valori di opacità e permeabilità delle cornee di controllo negativo sono utilizzati per correggere i valori di opacità e permeabilità corneali relativi alla sostanza da saggiare e al controllo positivo nei 
calcoli IVIS.
 
PROCEDURA  
Preparazione degli occhi  
21. Le cornee prive di difetti sono dissezionate lasciando un bordo di 2-3 mm di 
sclera per permettere di maneggiarle più agevolmente in seguito e facendo 
attenzione a non danneggiare l’epitelio e l’endotelio corneale. Le cornee così 
separate sono montate in appositi supporti corneali composti da una sezione anteriore e una posteriore, che si interfacciano rispettivamente ai lati epite ­
liale ed endoteliale della cornea. Entrambe le camere sono riempite fino 
all’orlo con mezzo minimo essenziale di Eagle (EMEM) preriscaldato, riem ­
piendo per prima la camera posteriore e facendo attenzione a evitare la formazione di bolle. L’apparecchio é poi equilibrato a 32 ± 1 °C per almeno un’ora per consentire alle cornee di equilibrarsi con il mezzo e raggiungere 
per quanto possibile la normale attività metabolica (la temperatura appros ­
simativa della superficie corneale  in vivo  è di 32 °C).
 
22. Dopo il periodo di equilibratura si aggiunge il mezzo EMEM fresco preri ­
scaldato in entrambe le camere e si rilevano i valori base di opacità per ciascuna cornea. Si scartano tutte le cornee che presentano danni macro ­
scopici ai tessuti (ad esempio, graffi, pigmentazione, neovascolarizzazione) 
o un valore di opacità > 7 unità di opacità. Si calcola poi il valore medio dell’opacità di tutte le cornee equilibrate. Almeno tre cornee con valori di opacità prossimi al valore medio di tutte le cornee sono selezionate come 
controllo negativo (non trattate o trattate con il veicolo). Le cornee restanti 
sono poi allocate al gruppo di trattamento e al gruppo dei controlli positivi.
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 675
 
23. La capacità termica dell’acqua è più elevata di quella dell’aria, di conse ­
guenza l’acqua offre condizioni di temperatura più stabili per l’incubazione. 
Si suggerisce pertanto di utilizzare un bagno ad acqua per mantenere il supporto corneale e il relativo contenuto a una temperatura pari a 32 ± 1 °C. Si possono comunque utilizzare anche incubatori ad aria, a 
condizione che si adottino le necessarie cautele per il mantenimento di 
condizioni di temperatura stabili (ad esempio, preriscaldando i supporti e il mezzo in essi contenuto).
 
Applicazione della sostanza di prova  
24. Si seguono due diversi protocolli di trattamento, uno per i liquidi e i tensio ­
attivi (solidi o liquidi) e uno per i solidi non tensioattivi.  
25. I liquidi sono analizzati non diluiti, mentre il saggio sui tensioattivi è ese ­
guito a una concentrazione del 10 % w/v in una soluzione composta da cloruro di sodio 0,9 %, acqua distillata o altro solvente che abbia dimostrato di non avere ripercussioni negative sul sistema di saggio. Le sostanze se ­
misolide, le creme e le cere sono di norma analizzate come liquidi. L’im ­
piego di diluizioni diverse deve essere opportunamente motivato. Le cornee sono esposte ai liquidi e ai tensioattivi per 10 minuti. La scelta di altri tempi di esposizione va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche.
 
26. I solidi non surfattanti sono di norma analizzati sotto forma di soluzioni o 
sospensioni a una concentrazione del 20 % w/v, in una soluzione composta da cloruro di sodio 0,9 %, acqua distillata o altro solvente, che abbia dimo ­
strato di non avere ripercussioni negative sul sistema di prova. In determi ­
nate circostanze e con opportune giustificazioni scientifiche i solidi possono anche essere analizzati non diluiti e applicati direttamente sulla superficie 
della cornea utilizzando il metodo della camera aperta (cfr. paragrafo 29). Le 
cornee sono esposte ai solidi per quattro ore, mentre in caso di applicazione di liquidi e tensioattivi è possibile scegliere tempi di esposizione alternativi a condizione che vengano fornite opportune motivazioni scientifiche.
 
27. A seconda della natura fisica e delle caratteristiche chimiche della sostanza 
di prova (ad esempio solidi, liquidi, liquidi viscosi vs. liquidi non viscosi) possono essere adottati diversi metodi di trattamento. La criticità sta nel 
garantire che la sostanza di prova copra adeguatamente la superficie epite ­
liale e che venga correttamente rimossa durante il risciacquo. Il metodo della camera chiusa é di norma impiegato per sostanze liquide da non viscose a leggermente viscose, mentre il metodo della camera aperta si utilizza di 
regola per sostanze di prova liquide da semiviscose a viscose e per solidi 
non diluiti.
 
28. Il metodo della camera chiusa prevede l’introduzione nella camera anteriore 
di una sostanza di prova in quantità sufficiente (750 μL) a coprire il lato 
epiteliale della cornea attraverso i fori di dosaggio posti sulla superficie superiore della camera. I fori sono successivamente sigillati con dei tappi 
durante l’esposizione. È importante assicurare che ciascuna cornea sia espo ­
sta alla sostanza di prova per l’intervallo di tempo necessario per il saggio.
 
29. Nel metodo della camera aperta, prima di eseguire il trattamento, occorre 
rimuovere dalla camera anteriore l’anello di chiusura della finestra e la 
finestra in vetro. La sostanza di controllo o di prova (750 μL o una quantità 
della sostanza di prova sufficiente a coprire interamente la cornea) é appli ­
cata direttamente alla superficie epiteliale della cornea con una micropipetta. 
Se una sostanza di prova è difficile da prelevare, può essere caricata a 
pressione in una pipetta a spostamento positivo per facilitare il dosaggio. Il puntale di una pipetta a spostamento positivo é inserito nel puntale di erogazione della siringa al fine di caricare sotto pressione il materiale nel 
puntale di spostamento. Contemporaneamente, lo stantuffo della siringa é 
premuto man mano che il pistone della pipetta è tirato verso l’alto. Se si formano delle bolle d’aria nel puntale della pipetta, occorre rimuovere (espellere) la sostanza di prova e ripetere il processo finché il puntale non 
sarà riempito senza che si creino bolle d’aria. È possibile all’occorrenza 
utilizzare una normale siringa (senza ago), poiché tale metodo consente la misurazione di un volume preciso di sostanza di prova e facilita l’applica ­
zione della sostanza alla superficie epiteliale della cornea. Dopo il dosaggio, 
la finestra é riposizionata sulla camera anteriore per ricreare un sistema 
chiuso.
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 676
 
Incubazione post-esposizione  
30. Dopo il periodo di esposizione la sostanza di prova, la sostanza usata per il 
controllo negativo o la sostanza per il controllo positivo sono rimosse dalla 
camera anteriore e si lava l’epitelio é almeno tre volte (o comunque fino a che non restino ulteriori tracce visibili della sostanza di prova) con EMEM (contenente rosso fenolo). Si utilizza per il risciacquo il mezzo contenente 
rosso fenolo, in quanto è possibile monitorare l’eventuale cambiamento di 
colore del rosso fenolo per determinare l’efficacia del risciacquo di sostanze di prova acide o alcaline. Le cornee sono lavate più di tre volte nel caso in cui il rosso fenolo continui a scolorirsi, divenendo giallo o porpora, o se vi 
siano ancora tracce visibili della sostanza di prova. Non appena la sostanza 
di prova è stata completamente eliminata, le cornee sono sottoposte a un ultimo risciacquo con EMEM (senza rosso fenolo). Si impiega l’EMEM (senza rosso fenolo) per il risciacquo finale per assicurare che il rosso fenolo 
sia stato completamente rimosso dalla camera anteriore prima della misura ­
zione dell’opacità. Si riempie la camera anteriore nuovamente con EMEM fresco senza rosso fenolo.
 
31. In caso di saggio su liquidi o tensioattivi, dopo il risciacquo le cornee 
restano in incubazione per ulteriori due ore a una temperatura di 32 ± 1°C. Un periodo più lungo di post-esposizione può rivelarsi utile in deter ­
minate circostanze e va valutato caso per caso. Le cornee trattate con i solidi 
sono risciacquate accuratamente al termine delle quattro ore di esposizione, 
ma non richiedono un ulteriore periodo di incubazione.
 
32. Al termine del periodo di post-incubazione per liquidi e tensioattivi e delle 
quattro ore di esposizione per i solidi non tensioattivi sono registrati i valori 
di opacità e permeabilità di ciascuna cornea. Inoltre, ogni cornea é sottopo ­
sta a esame visivo e sono registrate altre osservazioni utili (ad esempio, desquamazione dei tessuti, presenza di residui della sostanza di prova, opa ­
cità non uniforme). Queste osservazioni potrebbero essere importanti in 
quanto possono determinare eventuali variazioni dei dati registrati con l’opa ­
cimetro.
 
Sostanze di controllo  
33. Ogni prova deve includere controlli positivi o negativi (solvente o mezzo 
disperdente) paralleli.  
34. Nelle prove con sostanze liquide al 100 % il saggio BCOP comprende un 
controllo negativo parallelo (ad esempio, soluzione di cloruro di sodio allo 0,9 % o acqua distillata) al fine di rilevare eventuali cambiamenti non 
specifici nel sistema di prova e offrire una base di riferimento per i risultati 
del saggio. La presenza del controllo garantisce inoltre che non si verifi ­
chino reazioni irritanti a causa delle condizioni del saggio.
 
35. Nelle prove con liquidi diluiti, tensioattivi o solidi, il saggio BCOP com ­
prende un gruppo di controlli (solventi o mezzi disperdenti) paralleli al fine di rilevare eventuali cambiamenti non specifici nel sistema di prova e offrire una base di riferimento per i risultati del saggio. Può essere utilizzato solo 
un solvente/mezzo disperdente che abbia dimostrato di non influire negati ­
vamente sul sistema di prova.
 
36. Ciascuna prova comprende un controllo positivo parallelo (noto irritante per 
occhi) per verificare la possibilità di indurre una reazione adeguata. Poiché il 
presente saggio utilizza il metodo di prova BCOP per l’identificazione di 
sostanze corrosive o gravemente irritanti, il controllo positivo ideale do ­
vrebbe essere una sostanza di riferimento che induca una reazione grave con questo metodo di prova. Tuttavia il grado dell’irritazione non dovrebbe 
essere eccessivo, per garantire la possibilità di valutare la variabilità della 
reazione dei controlli positivi nel tempo.
 
37. Gli esempi di controlli positivi per le sostanze di prova liquide comprendono 
la dimetilformammide o una soluzione di idrossido di sodio all’1 %. Un 
esempio di controllo positivo per le sostanze di prova solide è il 20 % di 
imidazolo (peso per volume) in soluzione di cloruro di sodio allo 0,9 %.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 677
 
38. L’impiego di sostanze di riferimento è un modo utile per valutare il poten ­
ziale di irritazione oculare di sostanze chimiche sconosciute appartenenti a 
determinate classi di sostanze chimiche o prodotti o per la valutazione del potenziale di irritazione relativo di una sostanza irritante per occhi nell’am ­
bito di una gamma specifica di reazioni irritanti.
 
Risultati misurati  
39. L’opacità è determinata dalla quantità di luce trasmessa attraverso la cornea. 
L’opacità corneale é misurata quantitativamente per mezzo di un opacime ­
tro, che consente di ottenere valori di opacità misurati su una scala continua.  
40. La permeabilità è determinata dalla quantità di colorante a base di fluore ­
sceina sodica che penetra negli strati cellulari della cornea (ovvero, l’epitelio sulla superficie esterna della cornea attraverso l’endotelio sulla superficie 
corneale interna). Si aggiunge 1 mL di soluzione di fluoresceina sodica 
(rispettivamente 4 o 5 mg/mL nella prova con sostanze tensioattivi o solidi non tensioattivi) alla camera anteriore del supporto corneale. Tale soluzione é a contatto con l’epitelio della cornea, mentre la camera posteriore, che è a 
contatto con il lato endoteliale della cornea, é riempita con EMEM fresco. Il 
supporto é poi messo in incubazione in posizione orizzontale per 90 ± 5 min a 32 ± 1 °C. La quantità di fluoresceina sodica che giunge alla camera posteriore é misurata attraverso la spettrofotometria UV/VIS. I dati spettro ­
fotometrici rilevati a 490 nm sono registrati come valori di densità ottica 
(OD
 490 ) o assorbanza e misurati su una scala continua. I valori di permea ­
bilità della fluoresceina sono determinati utilizzando valori OD  490 a partire 
da uno spettrofotometro a luce visibile impostato su una lunghezza di per ­
corso standard di 1 cm.  
41. In alternativa, è possibile utilizzare un lettore per piastra per microtitolazione 
a 96 pozzetti a condizione che: i) sia possibile stabilire la sequenza lineare 
sul lettore di piastra per la determinazione dei valori di fluoresceina OD  490 ; 
e ii) venga utilizzato il giusto volume di campione di fluoresceina nella piastra a 96 pozzetti al fine di ottenere valori di OD
 490 equivalenti alla 
lunghezza di percorso standard di 1 cm (a tal fine potrebbe essere necessario 
riempire i pozzetti interamente [di norma 360L]).  
DATI E RENDICONTAZIONE  
Valutazione dei dati  
42. Appena saranno stati corretti i valori di opacità e permeabilità media 
(OD  490 ) con i valori dell’opacità di fondo e i valori di permeabilità OD  490 
dei controlli negativi, i valori medi di opacità e permeabilità OD  490 relativi a 
ciascun gruppo di trattamento saranno utilizzati nella seguente formula em ­
pirica per il calcolo del punteggio di irritazione in vitro ( In Vitro Irritancy 
Score  – IVIS) per ciascun gruppo di trattamento:  
IVIS = valore medio di opacità + (15 × valore medio di permeabilità OD  490 ) 
Secondo Sina  et al . (16) suddetta formula è stata ottenuta grazie a studi 
interni e inter-laboratorio. I dati generati per una serie di 36 composti 
nell’ambito di uno studio che ha coinvolto più laboratori sono stati oggetto di un’analisi multivariata per la determinazione dell’equazione più appro ­
priata per la correlazione fra dati  in vivo  e in vitro . L’analisi è stata eseguita 
dai ricercatori di due diverse aziende, che sono giunti a equazioni pressoché 
identiche.
 
43. I valori di opacità e permeabilità dovrebbero essere valutati separatamente 
per determinare se la sostanza di prova ha indotto corrosività o irritazione 
grave solo per uno dei due risultati (cfr. criteri decisionali).  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 678
 
Criteri decisionali  
44. Una sostanza che fa registrare un punteggio IVIS ≥ 55,1 é definita come 
corrosiva o gravemente irritante. Come indicato al paragrafo 1, se la so ­
stanza di prova non è identificata come corrosiva o gravemente irritante per gli occhi è comunque consigliabile condurre altri saggi per la classificazione e l’etichettatura della sostanza stessa. Il metodo di prova BCOP ha un’ac ­
curatezza complessiva compresa fra il 79 % (113/143) e l’81 % (119/147), 
una percentuale di falsi positivi fra il 19 % (20/103) e il 21 % (22/103) e una percentuale di falsi negativi compresa fra il 16 % (7/43) e il 25 % (10/40), se si paragonano i risultati con i dati del saggio  in vivo  sugli occhi 
del coniglio secondo i sistemi di classificazione EPA (1), UE (2) o GHS (3). 
Se si escludono dalla banca dati sostanze che rientrano in determinate classi chimiche (ad esempio, alcoli, chetoni) o fisiche (ad esempio, solidi), l’ac ­
curatezza del saggio BCOP nei sistemi di classificazione UE, EPA e GHS 
varia fra l’87 % (72/83) e il 92 % (78/85), le percentuali di falsi positivi 
sono comprese fra il 12 % (7/58) e il 16 % (9/56) e le percentuali di falsi negativi sono fra lo 0 % (0/27) e il 12 % (3/26).
 
45. Anche nei casi in cui la sostanza di prova non possa essere classificata come 
corrosiva o gravemente irritante, i dati del saggio BCOP possono essere utili se associati ai dati del saggio  in vivo  sugli occhi del coniglio o di un saggio  
in vitro  opportunamente convalidato, al fine di valutare ulteriormente l’uti ­
lità e i limiti del metodo di prova BCOP quale strumento per l’identifica ­
zione di sostanze irritanti non gravi o sostanze non irritanti (è attualmente in corso la preparazione di linee guida sull’uso di metodi di prova  in vitro  per 
la tossicità oculare).
 
Criteri di accettazione dello studio  
46. Un saggio è considerato accettabile se il punteggio IVIS risultante dal con ­
trollo positivo rientra fra due deviazioni standard dalla media storica, che va 
aggiornata con cadenza almeno trimestrale o comunque ogni volta in cui si effettui un saggio accettabile in laboratori nei quali le prove sono svolte con scarsa frequenza (ovvero, meno di una volta al mese). Le reazioni dei 
controlli negativi o dei veicoli dovrebbero corrispondere a valori di opacità 
e permeabilità inferiori ai limiti superiori stabiliti per i valori storici di opacità e permeabilità di cornee di bovini trattati con i relativi controlli negativi.
 
Rapporto di prova  
47. Il rapporto di prova dovrebbe comprendere le seguenti informazioni, se 
pertinenti alla conduzione dello studio:  
Sostanze di prova e di controllo  
Denominazioni chimiche, quali le denominazioni strutturali utilizzate dal 
CAS ( Chemical Abstracts Service ) seguite da altri nomi, se conosciuti;  
numero di registro CAS (RN), se conosciuto;  
purezza e composizione della sostanza o della miscela (in percentuale pon ­
derale), nella misura in cui l’informazione è disponibile;  
proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello studio, quali lo 
stato fisico, la volatilità, il pH, la stabilità, la classe chimica e la solubilità in acqua;
 
trattamento delle sostanze di prova/di controllo prima del saggio, se del caso 
(ad esempio, riscaldamento, frantumazione);  
stabilità, se conosciuta.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 679
 
Informazioni relative allo sponsor e ai centri di prova  
Nome e indirizzo dello sponsor, del centro di prova e del responsabile dello 
studio;  
identificazione dell’origine degli occhi (ovvero, la struttura presso la quale 
sono stati prelevati);  
condizioni di conservazione e trasporto degli occhi (ad esempio, data e ora 
del prelievo, intervallo di tempo prima dell’inizio della prova, mezzi di 
trasporto e condizioni di temperatura, eventuali antibiotici usati);  
se disponibili, informazioni relative a caratteristiche specifiche degli animali 
dai quali sono stati prelevati gli occhi (ad esempio, età, sesso, peso dell’ani ­
male donatore).  
Giustificazione del metodo di prova e del protocollo utilizzato  
Integrità del metodo di prova  
Procedura utilizzata per assicurare l’integrità (ovvero, l’accuratezza e l’affi ­
dabilità) del metodo di prova nel tempo (ad esempio, attraverso saggi pe ­
riodici delle sostanze di riferimento per la verifica delle prestazioni, utilizzo 
di dati storici sui controlli negativi e positivi).  
Criteri di accettabilità del saggio  
Serie di controlli positivi e negativi paralleli accettabili, basati su dati storici;  
se applicabili, serie di controlli di riferimento paralleli, basati su dati storici.  
Condizioni di prova  
Descrizione del sistema di prova utilizzato;  
tipo di supporto corneale impiegato;  
informazioni di taratura per gli apparecchi utilizzati per le misurazioni di 
opacità e permeabilità (ad esempio, opacimetro e spettrofotometro);  
informazioni sulle cornee bovine utilizzate, comprese dichiarazioni relative 
alla loro qualità;  
dettagli delle procedure di prova adottate;  
concentrati della sostanza di prova utilizzati;  
descrizione di ogni eventuale modifica alla procedura;  
riferimento ai dati storici del modello (ad esempio, controlli negativi e 
positivi, sostanze per la verifica delle prestazioni del modello, sostanze di riferimento);
 
descrizione dei criteri di valutazione impiegati.  
Risultati  
Presentazione in forma tabulare dei dati relativi ai singoli campioni di prova 
(ad esempio, valori di opacità e OD  490 e punteggio IVIS calcolato per la 
sostanza di prova, i controlli positivi, negativi e di riferimento [se compresi], 
compresi i dati delle prove ripetute e i valori medi ± la deviazione standard 
per ciascuna prova);  
descrizione degli altri effetti osservati.  
Discussione dei risultati  
Conclusioni  
BIBLIOGRAFIA  
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del consiglio del 18 dicembre 2006 concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze 
chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il 
regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Con ­
siglio e le direttive 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE 
della Commissione. GU L 396, 30.12.2006, pag. 1.
 
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ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 682
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Accuratezza:  prossimità fra i risultati del metodo di prova e i valori di riferi ­
mento accettati. Misura il rendimento del metodo di prova e rappresenta un 
aspetto della «rilevanza». Il termine è spesso sostituibile con «concordanza», a indicare la percentuale di risultati corretti di un metodo di prova.
 
Affidabilità:  misura la possibilità di eseguire un metodo di prova in maniera 
riproducibile nel tempo all’interno dei laboratori e fra di essi seguendo lo stesso protocollo. Si valuta calcolando la riproducibilità interna ai laboratori e la ripe ­
tibilità fra i laboratori.
 
Categoria EPA 1:  sostanza corrosiva (distruzione irreversibile del tessuto ocu ­
lare) o interessamento o irritazione della cornea persistenti per oltre 21 giorni (1).  
Categoria GHS 1:  produzione di danni ai tessuti oculari o indebolimento 
grave della vista in seguito all’applicazione di una sostanza di prova sulla 
parte anteriore dell’occhio, non completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione (3).
 
Categoria UE R41:  produzione di danni ai tessuti oculari o indebolimento 
grave della vista in seguito all’applicazione di una sostanza di prova sulla 
parte anteriore dell’occhio, non completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione (2).
 
Controllo negativo:  un duplicato non trattato che contiene tutti i componenti di 
un sistema di prova. Il campione é saggiato con campioni trattati con la sostanza e altri campioni di controllo per determinare se il veicolo interagisce con il sistema di prova.
 
Controllo positivo:  un duplicato che contiene tutti i componenti di un sistema di 
prova e che si tratta con una sostanza che notoriamente induce una reazione positiva. Il grado dell’irritazione non dovrebbe essere eccessivo per garantire la 
possibilità di valutare la variabilità della reazione dei controlli positivi nel tempo.
 
Controllo solvente/mezzo disperdente:  campione non trattato che contiene tutti 
i componenti di un sistema di prova, compreso il solvente e il mezzo disperdente (veicolo) usato con la sostanza di prova saggiato con gli altri campioni di con ­
trollo al fine di stabilire la reazione di base nei campioni trattati con la sostanza 
di prova disciolta nello stesso solvente o mezzo disperdente. Nelle prove con controlli negativi paralleli, questo campione dimostra anche se il veicolo è in grado di interagire con il sistema di prova.
 
Cornea:  parte trasparente frontale del bulbo oculare che copre l’iride e la pupilla 
e consente il passaggio della luce verso l’interno.  
Corrosivo oculare:  a) sostanza che causa danni irreversibili ai tessuti oculari; b) 
sostanza classificata come irritante per gli occhi GHS categoria1, EPA categoria I 
o UE categoria R41 (1) (2) (3).  
Forza probante:  il processo che consiste nel tener conto dei punti di forza e di 
debolezza di informazioni diverse per conseguire e supportare una data conclu ­
sione relativa al potenziale di pericolo di una sostanza.  
GHS ( Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemi ­
cals): un sistema che propone la classificazione delle sostanze e miscele chimiche 
in base a tipi e livelli standardizzati di rischi fisici, per la salute e ambientali, e 
applica elementi di comunicazione corrispondenti, quali pittogrammi, avvertenze, indicazioni di pericolo, consigli di prudenza e schede tecniche di sicurezza, al fine di trasmettere informazioni sui loro effetti nocivi e garantire la protezione di 
persone (compresi datori di lavoro, lavoratori, trasportatori, consumatori e ope ­
ratori dei servizi di soccorso) e ambiente (3).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 683
 
Grave irritante oculare:  a) sostanza che causa danni ai tessuti oculari in seguito 
all’applicazione sulla superficie anteriore dell’occhio non risolvibili entro 21 
giorni dall’applicazione o indebolimento fisico grave della vista; b) sostanze classificate come irritanti per gli occhi GHS categoria 1, EPA categoria I o UE categoria R41 (1) (2) (3).
 
Irritante oculare:  a) sostanza che produce cambiamenti reversibili negli occhi in 
seguito all’applicazione sulla superficie anteriore dell’occhio; b) sostanza classi ­
ficata come irritante per gli occhi EPA categorie II e III, UE categorie R36 e GHS categorie 2A e 2B (1) (2) (3).
 
Metodo di prova convalidato:  metodo di prova in base al quale sono stati 
completati studi di convalida per determinare la rilevanza (compresa l’accuratez ­
za) e l’affidabilità per un fine specifico. Va sottolineato che un metodo di prova convalidato potrebbe non avere un rendimento sufficiente in termini di valori di accuratezza e affidabilità ritenuti accettabili per il raggiungimento dell’obiettivo 
prefissato.
 
Non-irritante:  sostanza non classificata come irritante per gli occhi EPA cate ­
gorie I, II e III; UE categorie R41 e R36; o GHS categorie 1, 2A e 2B (1)(2)(3).  
Opacimetro:  strumento impiegato per la misurazione dell’«opacità corneale» 
attraverso la determinazione della quantità di luce trasmessa attraverso la cornea. 
Lo strumento tipico ha due comparti, ciascuno provvisto della sua fonte di luce e 
di una fotocellula. Un comparto é utilizzato per la cornea trattata, mentre l’altro per la taratura e l’azzeramento dello strumento. La luce emessa da una lampada alogena é irradiata attraverso un comparto di controllo (rappresentato da una 
camera vuota senza finestre o liquidi) a una fotocellula e confrontata con la 
luce trasmessa a una fotocellula attraverso il comparto di prova in cui si trova la camera contenente la cornea. Si confronta la differenza di luce trasmessa dalle fotocellule e un valore numerico di opacità è visualizzato su un display digitale.
 
Opacità corneale:  misurazione del grado di opacità della cornea in seguito 
all’esposizione a una sostanza di prova. Un aumento dell’opacità corneale è indice di danni alla cornea. L’opacità può essere valutata in modo soggettivo, come nel test sugli occhi dei conigli di Draize, o oggettivo utilizzando uno 
strumento come un «opacimetro».
 
Percentuale di falsi negativi:  percentuale di tutte le sostanze positive erronea ­
mente identificate come negative da un metodo di prova. È un indicatore della prestazione del metodo di prova.
 
Percentuale di falsi positivi:  percentuale di tutte le sostanze negative erronea ­
mente identificate come positive da un metodo di prova. È un indicatore della 
prestazione del metodo di prova.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 684
 
Pericolo:  proprietà intrinseca di un agente o di una situazione di causare poten ­
zialmente effetti nocivi se un organismo, un sistema o una (sotto-)popolazione vi 
sono esposti.  
Permeabilità corneale:  misurazione quantitativa dei danni all’epitelio corneale, 
effettuata attraverso la determinazione della quantità di colorante a base di fluore ­
sceina sodica che attraversa tutti gli strati cellulari della cornea.  
Prove in sequenza:  strategia di prove graduali in cui sono riesaminate tutte le 
informazioni disponibili su una sostanza di prova, secondo un ordine ben speci ­
ficato, seguendo un approccio basato sulla forza probante dei dati disponibili per ciascuna prova, al fine di stabilire se vi sono informazioni sufficienti per una decisione sulla classificazione del pericolo prima di procedere alla fase succes ­
siva. Se è possibile assegnare il potenziale di irritazione di una sostanza di prova 
in base alle informazioni disponibili, non è necessario svolgere prove aggiuntive. Se non è possibile assegnare il potenziale di irritazione di una sostanza di prova in base alle informazioni disponibili, si svolge una procedura di prova graduale in 
sequenza su animali fino a che non é possibile effettuare una classificazione 
inequivocabile.
 
Punteggio di irritazione in vitro ( In Vitro Irritancy Score , IVIS):  formula 
empirica utilizzata nel saggio BCOP con la quale i valori medi di opacità e 
permeabilità relativi a ciascun gruppo di trattamento sono combinati per ottenere 
un unico punteggio in vitro per ogni gruppo di trattamento.  IVIS  = valore di 
opacità medio + (15 x valore di permeabilità medio)  
Sostanza di riferimento:  sostanza usata come standard di confronto rispetto a 
una sostanza di prova. Una sostanza di riferimento dovrebbe presentare le se ­
guenti proprietà: i) fonti coerenti e affidabili; ii) analogia strutturale e funzionale 
alla classe delle sostanze in esame; iii) caratteristiche fisiche/chimiche conosciute; iv) dati di supporto relativi agli effetti noti, e) efficacia nota nell’ambito della reazione auspicata.
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 685
 
Appendice 2  
Sostanze chimiche per la verifica della prestazione nel metodo di 
prova BCOP  
Prima di utilizzare regolarmente un metodo di prova che soddisfi i requisiti del 
presente metodo, i laboratori possono decidere di dimostrare le prestazioni tecni ­
che identificando correttamente la classificazione di corrosività oculare delle 10 sostanze raccomandate nella tabella 1. Tali sostanze sono state selezionate quali 
rappresentative di una serie di reazioni locali di irritazione/corrosione degli occhi, 
sulla base di risultati del saggio sugli occhi del coniglio  in vivo  (TG 405) 
(ovvero, categorie 1, 2A, 2B, o non classificato ed etichettato in base alla clas ­
sificazione UN GHS (3) (7). Tuttavia, in considerazione dell’utilità comprovata 
di tali saggi (che consiste nell’identificare esclusivamente corrosivi/gravi irritanti 
oculari) esistono solo due risultati di prova utili ai fini di una classificazione (corrosivo/gravemente irritante o non corrosivo/non gravemente irritante) per dimostrare la prestazione. Gli altri criteri di selezione comprendevano la dispo ­
nibilità delle sostanze sul mercato, la presenza di dati di elevata qualità che 
fungono da riferimento per gli studi  in vivo , nonché di dati di qualità di riferi ­
mento concernenti i due metodi  in vitro  per i quali le linee guida dei saggi sono 
attualmente in fase di elaborazione. Per questa ragione, sono state selezionate 
sostanze irritanti dall’elenco raccomandato ICCVAM di 122 sostanze di riferi ­
mento per la convalida di saggi  in vitro  di tossicità oculare (cfr. appendice H: 
sostanze di riferimento raccomandate ICCVAM) (5). I dati di riferimento relativi 
sono disponibili nella documentazione ICCVAM relativa ai saggi BCOP e ICE 
(ICCVAM Background Review Documents for BCOP and Isolated Chicken 
Eye (ICE) test method ) (17) (18).
 
Tabella 1  
Sostanze raccomandate per la verifica del rendimento tecnico con il metodo BCOP  
Sostanza CASRN Classe chimica (  1 ) Forma fisica Classificazione (  2 ) 
in Vivo  Classificazione (  3 ) in Vitro  
Cloruro di benzal ­
conio (5 %) 8001-54-5 Composto ionico Liquido Categoria 1 Corrosivo/Gravemente irri ­
tante 
Clorexidina 55-56-1 Ammina, ammi ­
dina Solido Categoria 1 Corrosivo/Gravemente irri ­
tante 
Acido 
dibenzoil-L-tarta ­
rico 2743-38-6 Acido carbossili ­
co, estere Solido Categoria 1 Corrosivo/Gravemente irri ­
tante 
Imidazolo 288-32-4 Composto etero ­
ciclico Solido Categoria 1 Corrosivo/Gravemente irri ­
tante 
Acido tricloroace ­
tico (30 %) 76-03-9 Acido carbossi ­
lico Liquido Categoria 1 Corrosivo/Gravemente irri ­
tante 
2,6-Dicloroben ­
zoilcloruro 4659-45-4 Acil-alogenuro Liquido Categoria 2A Non corrosivo/Non grave ­
mente irritante 
Etil 2-metilacetoa ­
cetato 609-14-3 Chetone, estere Liquido Categoria 2B Non corrosivo/Non grave ­
mente irritante 
Nitrato di ammo ­
nio 6484-52-2 Sale inorganico Solido Categoria 2A Non corrosivo/Non grave ­
mente irritante  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 686
 
Sostanza CASRN Classe chimica (  1 ) Forma fisica Classificazione (  2 ) 
in Vivo  Classificazione (  3 ) in Vitro  
Glicerolo 56-81-5 alcol Liquido Non etichettato Non corrosivo/Non grave ­
mente irritante 
n-esano 110-54-3 Idrocarburo 
(aciclico) Liquido Non etichettato Non corrosivo/Non grave ­
mente irritante  
Abbreviazioni: CASRN = numero CAS ( Chemical Abstracts Service Registry Number ). 
( 1 ) Ciascuna sostanza di prova è stata assegnata a classi chimiche definite in base a un sistema di classificazione standard, bas ato sul 
sistema di classificazione della  National Library of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) (disponibile online al sito http// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Basata sui risultati del saggio sugli occhi dei conigli  in vivo  (OECD TG 405) e sul sistema di classificazione UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Basata sui risultati dei test BCOP e ICE.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 687
 
Appendice 3  
IL SUPPORTO CORNEALE PER IL SAGGIO BCOP  
1. I supporti corneali impiegati per il test BCOP sono fatti di materiale inerte 
(ad esempio, polipropilene). I supporti constano di due metà (una camera 
anteriore e una posteriore) e presentano due camere cilindriche interne simili. Ciascuna camera ha una capacità di 5 mL e termina in una finestra di vetro attraverso la quale sono registrate le misurazioni relative all’opacità. Ciascuna 
camera interna ha un diametro di 1,7 cm ed è profonda 2,2 cm (
 1 ). Un anello 
ad O posto sulla camera posteriore serve a prevenire fuoriuscite. Le cornee sono posizionate dal lato dell’endotelio in basso sull’anello a O delle camere posteriori, mentre le camere anteriori sono poste dal lato dell’epitelio delle 
cornee. Le camere sono mantenute in posizione da tre viti in acciaio inossi ­
dabile poste sui bordi esterni della camera. L’estremità di ciascuna camera presenta una finestra in vetro che può essere rimossa per facilitare l’accesso alla cornea. Un anello a O è posizionato anche fra la finestra in vetro e la 
camera per prevenire fuoriuscite. Due aperture nella parte superiore di cia ­
scuna camera consentono di introdurre ed estrarre il mezzo e i composti usati per la prova. Le aperture sono chiuse con tappi di gomma durante le fasi di 
trattamento e incubazione.
 
Legenda  
Glass disc:  disco di vetro  
PTFE-O-ring:  anello ad O di PFTE  
Refill:  camera di riempimento  
Hanger:  sospensore  
Cap:  tappo  
Nut: dado  
O-ring:  anello ad O  
Posterior compartment:  camera posteriore  
Anterior compartment:  camera anteriore  
Fixing screws:  viti di fissazione  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 688  
( 1 ) Le dimensioni fornite si riferiscono a un supporto corneale utilizzato per capi di bestiame 
di età compresa fra 12 e 60 mesi. Se l’esame è svolto su animali fra i 6 e i 12 mesi di 
età, il supporto deve essere realizzato in modo tale che ciascuna camera abbia una 
capacità di 4 mL e che ciascuna camera interna presenti un diametro di 1,5 cm e una 
profondità di 2,2 cm. Per ogni nuovo supporto corneale è necessario che fra l’area della 
cornea esposta e il volume della camera posteriore sia mantenuto lo stesso rapporto del 
supporto corneale tradizionale. Ciò è necessario per garantire la corretta determinazione 
dei valori di permeabilità per il calcolo dell’IVIS con la formula proposta.
 L’OPACIMETRO  
2. L’opacimetro è un dispositivo di misurazione della luce trasmessa. La luce 
emessa da una lampada alogena é irradiata attraverso un comparto di con ­
trollo (una camera vuota senza finestre o liquidi) a una fotocellula e con ­
frontata con la luce trasmessa a una fotocellula attraverso il comparto di prova in cui si trova la camera contenente la cornea. E’confrontata la diffe ­
renza di trasmissione luminosa tra le fotocellule e un display digitale visua ­
lizza un valore numerico di opacità. Le unità di opacità sono predefinite.
 
3. L’opacimetro dovrebbe fornire una risposta lineare a partire da una serie di 
valori di opacità registrati, che coprono tutte le soglie critiche utilizzate per le diverse classificazioni descritte dal modello predittivo (ovvero, fino alla so ­
glia critica che determina la presenza di corrosività/irritazione grave). Per 
garantire letture lineari e accurate fino a 75-80 unità di opacità occorre tarare l’opacimetro attraverso una serie di calibratori. I calibratori (fogli opachi di poliestere), sono disposti all’interno della camera di taratura (una camera 
corneale realizzata per sostenere i calibratori) e leggono i valori sull’opaci ­
metro. La camera di taratura è concepita per alloggiare i calibratori all’incirca alla stessa distanza fra la luce e la fotocellula, alla quale sarebbero poste le 
cornee durante le misurazioni di opacità. L’opacimetro é inizialmente tarato a 
0 unità di opacità utilizzando la camera di taratura senza calibratore. Tre diversi calibratori sono poi disposti all’interno della camera di taratura uno dopo l’altro e i valori di opacità sono successivamente registrati. I calibratori 
1, 2 e 3 dovrebbero corrispondere a valori registrati di opacità pari alla 
rispettiva serie di valori rispettivamente di 75, 150 e 225 unità di opacità, con una tolleranza di ± 5 %.
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B 48  METODO DI PROVA SULL’OCCHIO ISOLATO DEI POLLI 
(ISOLATED CHICKEN EYE - ICE) PER L’IDENTIFICAZIONE 
DI SOSTANZE CORROSIVE E GRAVEMENTE IRRITANTI 
PER GLI OCCHI  
INTRODUZIONE  
01. Il saggio sull’occhio isolato dei polli ( Isolated Chicken Eye  – ICE) è un 
metodo di test  in vitro  che può essere utilizzato in determinate circostanze ed 
entro certi limiti per la classificazione di sostanze e miscele come «agenti 
corrosivi e gravemente irritanti per gli occhi» (1) (2) (3). Ai fini delle presenti linee guida per il saggio, sono definite sostanze gravemente irritanti le sostanze che inducono lesioni oculari nel coniglio che permangono per 
almeno 21 giorni dopo la somministrazione. Sebbene non sia considerato un 
saggio atto a sostituire completamente il saggio  in vivo  sugli occhi del 
coniglio, l’utilizzo del metodo ICE è consigliato quale parte integrante di una strategia di prove in sequenza per la classificazione normativa e l’eti ­
chettatura nell’ambito di una specifica sfera di applicabilità (4) (5). Le so ­
stanze e le miscele di prova (6) che risultano positive a questo tipo di saggio possono essere classificate come corrosive o gravi irritanti oculari senza la 
necessità di condurre ulteriori prove nel coniglio. Una sostanza che risulta 
negativa al saggio deve essere sottoposta a ulteriori saggi nel coniglio fa ­
cendo ricorso a una strategia di prove in sequenza, come descritto dalla linee guida OCSE 405, 7 (capitolo B. 5 del presente allegato).
 
02. Scopo di questo metodo di prova è descrivere le procedure impiegate per 
valutare il potenziale di corrosione o di grave irritazione oculare di una sostanza di prova sulla base della capacità di tale sostanza di indurre la 
tossicità in un occhio enucleato di pollo. Gli effetti tossici sulla cornea 
sono misurati attraverso i) una valutazione qualitativa dell’opacità, ii) una valutazione qualitativa dei danni all’epitelio in base all’applicazione di fluo ­
resceina all’occhio (ritenzione della fluoresceina), iii) una misurazione quan ­
titativa dell’aumento dello spessore (rigonfiamento), e iv) una stima qualita ­
tiva di eventuali danni morfologici macroscopici in superficie. L’opacità, il rigonfiamento e le stime dei danni della cornea in seguito all’esposizione a 
una sostanza di prova sono valutati individualmente e poi cumulativamente 
per formulare un sistema di classificazione di irritazione oculare ( Eye Irri­
tancy Classification ).
 
03. Il metodo di prova ICE è stato impiegato anche per analizzare sostanze 
irritanti per gli occhi in grado di causare lesioni che guariscono in meno di 21 giorni e sostanze non irritanti. Tuttavia, l’accuratezza e l’affidabilità del metodo di saggio ICE per le sostanze che rientrano nelle suddette categorie 
non sono state oggetto di valutazione formale.
 
04. L’appendice 1 riporta un elenco delle definizioni in uso.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITAZIONI  
05. Il presente metodo di prova ICE (8) si basa sul protocollo del Comitato di 
coordinamento interagenzia per la convalida dei metodi alternativi ( Intera­
gency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods , 
ICCVAM), che è stato sviluppato in seguito ad uno studio internazionale di convalida di metodi alternativi (4) (5) (9) con il contributo del Centro europeo per la convalida di metodi alternativi ( European Centre for the 
Validation of Alternative Methods , ECVAM) e del corrispondente organismo 
del Giappone ( Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods , 
JaCVAM) ) e del dipartimento di tossicologia e farmacologia applicata per la qualità della vita (TNO). Il protocollo si basa su informazioni ottenute da 
protocolli già pubblicati, nonché dal protocollo impiegato dalla TNO (10) 
(11) (12) (13) (14).
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06. Le limitazioni identificate per questo metodo sono relative alla percentuale di 
falsi positivi per gli alcoli e alle percentuali di falsi negativi per i solidi e i 
tensioattivi (cfr. paragrafo 47) (4). Quando si escludono dalla banca dati sostanze appartenenti a queste classi chimiche e fisiche si registra un marcato miglioramento dell’accuratezza del metodo di prova ICE in tutti i sistemi di 
classificazione dell’Unione europea, dell’Agenzia di protezione ambientale 
statunitense ( Environmental Protection Agency  – EPA) e del Sistema gene ­
rale armonizzato di classificazione e di etichettatura dei prodotti chimici delle Nazioni Unite ( Globally Harmonized System of Classification and Labelling 
of Chemicals  — GHS) (4). Considerando l’obiettivo del presente saggio, che 
mira a identificare solamente corrosivi e gravi irritanti oculari, le percentuali di falsi negativi non rappresentano un problema primario poiché tali sostanze sarebbero oggetto di analisi successive nel coniglio o per mezzo di altri saggi  
in vitro  debitamente convalidati, a seconda delle prescrizioni normative, 
applicando una strategia di saggio in sequenza basata sulla forza probante dei dati disponibili. Inoltre, la banca dati di convalida attuale non ha con ­
sentito di effettuare un’adeguata valutazione di alcune classi chimiche o di 
prodotto (ad esempio, delle miscele). I ricercatori potrebbero comunque 
considerare di utilizzare questo saggio per tutti i materiali di prova (comprese le miscele), accettando un risultato positivo come indicativo di una reazione oculare a una sostanza corrosiva o gravemente irritante. I risultati positivi 
ottenuti con gli alcoli andrebbero tuttavia interpretati con cautela, considerato 
il rischio di effettuare previsioni non corrette.
 
07. Tutte le procedure che prevedono l’impiego di occhi di polli dovrebbero 
osservare le regole e le procedure in vigore nella struttura che effettua l’analisi relativamente alla gestione di materiali di derivazione umana o 
animale che comprendono, tra l’altro, i tessuti e i liquidi tessutali. È consi ­
gliabile adottare le comuni norme di cautela osservate nei laboratori (15).
 
08. Un limite del metodo di prova è che, sebbene il saggio prenda in esame 
alcuni degli effetti oculari valutati con il saggio di irritazione oculare nel 
coniglio e in certa misura anche la relativa gravità, non considerale lesioni 
della congiuntiva e dell’iride. Inoltre, nonostante il saggio ICE non consenta di per sé di valutare la reversibilità delle lesioni corneali, studi condotti sugli occhi del coniglio suggeriscono di esaminare la profondità iniziale di una 
lesione corneale per distinguere se si è in presenza di effetti reversibili o 
irreversibili (16). Infine, il saggio ICE non consente di valutare il potenziale di tossicità sistemica associato all’esposizione attraverso l’occhio.
 
09. Sono in atto studi per caratterizzare ulteriormente l’utilità e i limiti del 
metodo di prova ICE per l’identificazione di sostanze irritanti non gravi e 
di sostanze non irritanti (cfr. anche paragrafo 48). Gli utilizzatori sono altresì 
invitati a mettere campioni e/o dati a disposizione di organismi di convalida in grado di valutare formalmente la possibilità di impieghi futuri del saggio ICE, anche per l’identificazione di sostanze irritanti non gravi e di sostanze 
non irritanti per gli occhi.
 
10. Per i laboratori che ricorrono a questo tipo di saggio per la prima volta è 
consigliabile utilizzare le sostanze chimiche di riferimento indicate nell’ap ­
pendice 2 per la verifica delle prestazioni del saggio. Un laboratorio può 
utilizzare tali sostanze chimiche per dimostrare le proprie competenze tecni ­
che nell’esecuzione del saggio ICE prima di presentare i dati relativi al saggio ICE a fini normativi di classificazione dei rischi.
 
PRINCIPIO DEL SAGGIO  
11. Il metodo di prova ICE è un modello organotipico per il mantenimento di 
occhi di pollo a breve termine  in vitro . Questo saggio consente di valutare i 
danni prodotti dalla sostanza di prova in base al rigonfiamento, all’opacità e 
alla ritenzione di fluoresceina della cornea. Mentre gli ultimi due parametri richiedono una valutazione qualitativa, l’analisi del rigonfiamento della cor ­
nea è di tipo quantitativo. Ciascuna misurazione é convertita in un punteggio 
quantitativo usato per calcolare un indice di irritazione complessivo, o in 
alternativa fatta rientrare in categorie qualitative volte ad attribuire una clas ­
sificazione di corrosività e grave irritazione oculare  in vitro . Ciascuno di 
questi due valori può poi essere usato per prevedere il potenziale di corro ­
sività e irritazione oculare grave  in vivo  di una sostanza di prova (cfr. criteri 
decisionali).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 691
 
Origine ed età degli occhi dei polli  
12. Storicamente, per questo tipo di saggio sono utilizzati occhi prelevati da polli 
abbattuti nei mattatoi per il consumo alimentare umano, ovviando in questo 
modo alla necessità di animali da laboratorio. Sono impiegati solamente occhi di animali sani ritenuti idonei a essere immessi nella catena alimentare umana.
 
13. Sebbene non sia stato condotto alcuno studio con controlli per identificare 
l’età ottimale del pollo, l’età e il peso degli animali storicamente impiegati 
per questo metodo di prova corrispondono a quelli dei pollastri tradizional ­
mente abbattuti nei macelli per pollame (ovvero, pollastri di circa 7 settimane e 1,5 – 2,5 kg di peso).
 
Prelievo e trasporto degli occhi in laboratorio  
14. Si suggerisce di rimuovere le teste subito dopo aver sedato i polli, di norma 
con scossa elettrica, e aver praticato loro un’incisione sul collo per consentire 
il sanguinamento. È preferibile che l’allevamento da cui provengono i polli sia situato nelle vicinanze del laboratorio, per consentire di trasferire le loro teste dal macello in tempi sufficientemente rapidi e ridurre così al minimo il 
deterioramento e/o la contaminazione batterica. È consigliabile ridurre al 
minimo l’intervallo temporale che intercorre fra il prelievo delle teste dei polli e l’utilizzo degli occhi per il saggio ICE (di norma massimo due ore) e verificare che tale intervallo non pregiudichi i risultati del saggio. I risultati 
in questione si basano sui criteri di selezione degli occhi e sulle reazioni dei 
controlli positivi e negativi. Si suggerisce di utilizzare per il saggio occhi dello stesso gruppo di prelievo, ottenuti nella medesima giornata.
 
15. Gli occhi sono dissezionati in laboratorio, pertanto il trasporto delle teste 
intatte dal macello è a temperatura ambiente in scatole di plastica umidificate 
con panni inumiditi di soluzione salina isotonica.  
Criteri di selezione degli occhi impiegati nel saggio ICE  
16. Sono scartati gli occhi che presentano consistenti macchie di fluoresceina 
(> 0,5) o un punteggio di opacità corneale elevato (> 0,5) dopo l’enuclea ­
zione.  
17. Ciascun gruppo di trattamento e di controllo positivo parallelo comprende 
almeno tre occhi. Il gruppo di controllo negativo o del veicolo (se si utilizza un veicolo diverso dalla soluzione salina) comprende almeno un occhio.
 
PROCEDURA  
Preparazione degli occhi  
18. Le palpebre sono asportate con cautela, facendo attenzione a non danneg ­
giare la cornea. L’integrità della cornea é subito valutata con una goccia di fluoresceina sodica al 2 % (w/v) applicata alla superficie della cornea per alcuni secondi e poi risciacquata con soluzione salina isotonica. Gli occhi 
trattati con la fluoresceina sono poi esaminati al microscopio con lampada a 
fessura per assicurare che la cornea non presenti danni (ad esempio, riten ­
zione di fluoresceina e valori di opacità corneale ≤ 0,5).
 
19. Se non è danneggiato, l’occhio é ulteriormente dissezionato dal cranio fa ­
cendo attenzione a non danneggiare la cornea. Il bulbo oculare é tirato via 
dall’orbita servendosi di pinze chirurgiche per tenere saldamente ferma la 
membrana nittitante e i muscoli oculari sono tagliati con forbici chirurgiche curve smusse. È importante non applicare una pressione eccessiva (ad esem ­
pio, artefatti da compressione) per evitare di danneggiare la cornea
 
20. Nel rimuovere l’occhio dall’orbita, dovrebbe restare attaccata una porzione 
visibile di nervo ottico. Rimosso dall’orbita, l’occhio é posto su un tappetino 
assorbente e sono recisi la membrana nittitante e il restante tessuto connet ­
tivo. ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 692
 
21. L’occhio enucleato é montato in un morsetto in acciaio inossidabile con la 
cornea in posizione verticale. Il morsetto é poi trasferito all’interno di una 
camera dell’apparecchio di superfusione (16). I morsetti devono essere po ­
sizionati nell’apparecchio di superfusione in posizione tale che l’intera cor ­
nea sia irradiata dalle gocce di soluzione salita isotonica. Le camere dell’ap ­
parecchio di superfusione devono essere a temperatura controllata di 32 ± 
1,5 °C. L’appendice 3 presenta un diagramma esemplificativo di apparecchio di superfusione e morsetti oculari, che sono disponibili sul mercato o pos ­
sono essere costruiti. L’apparecchio può essere modificato a seconda delle 
esigenze dei singoli laboratori (ad esempio, per alloggiare un numero diverso 
di occhi).
 
22. Dopo l’inserimento nell’apparecchio di superfusione, gli occhi sono nuova ­
mente esaminati con un microscopio con lampada a fessura per accertarsi che 
non siano stati danneggiati durante la procedura di dissezione. È opportuno misurare anche lo spessore corneale, questa volta all’apice della cornea, utilizzando lo strumento di misurazione della profondità del microscopio 
con lampada a fessura. È consigliabile sostituire gli occhi che presentano 
i) un valore di ritenzione di fluoresceina > 0,5; ii) opacità corneale > 0,5; o iii) ogni altro segno di danni. Fra gli occhi che non sono stati scartati per nessuno dei criteri suddetti, devono essere scartati gli occhi con una devia ­
zione dello spessore corneale di oltre il 10 % dal valore medio di tutti gli 
occhi. È opportuno che gli utilizzatori siano consapevoli del fatto che i microscopi con lampade a fessura possono produrre misurazioni dello spes ­
sore corneale diverse a seconda delle diverse larghezze su cui è impostata la 
fessura. La larghezza della fessura dovrebbe essere impostata a 0,095 mm.
 
23. Dopo essere stati esaminati e selezionati, gli occhi sono incubati per un 
periodo di tempo compreso fra 45 e 60 minuti circa per l’equilibratura 
con il sistema prima del dosaggio. Successivamente al periodo di equilibra ­
tura é registrato il valore di riferimento per lo spessore e l’opacità della cornea, che funge da base per le altre misurazioni (ad esempio, tempo = 
0). Il valore di fluoresceina determinato al momento della dissezione é usato 
come misurazione di base per questo risultato.
 
Applicazione della sostanza di prova  
24. Subito dopo le misurazioni del valore di riferimento (zero) si estrae l’occhio 
(nel suo supporto) dall’apparecchio di superfusione, lo si dispone in posi ­
zione orizzontale e si applica alla cornea la sostanza di prova.  
25. Le sostanze di prova liquide sono di norma analizzate non diluite, ma pos ­
sono essere diluite se lo si ritiene necessario (ad esempio, se previsto dallo studio). Il solvente più frequentemente utilizzato per le sostanze diluite è la soluzione salina fisiologica. In determinate condizioni controllate possono 
tuttavia essere utilizzati anche solventi alternativi diversi dalla soluzione 
salina fisiologica, ma la loro idoneità deve essere comunque dimostrata.
 
26. Le sostanze di prova liquide sono applicate alla cornea in modo da coprire 
uniformemente l’intera superficie della cornea; il volume standard utilizzato è 0,03 mL.
 
27. Se possibile, è opportuno triturare le sostanze solide il più finemente possi ­
bile in un mortaio con un pestello o un strumento di macinatura simile. La polvere é applicata alla cornea in modo da coprirne uniformemente la su ­
perficie con la sostanza di prova; la quantità standard applicata è 0,03 g.
 
28. La sostanza di prova (liquida o solida) é applicata per 10 secondi e succes ­
sivamente risciacquata dall’occhio con circa 20 mL di soluzione salina iso ­
tonica a temperatura ambiente. L’occhio (nel suo supporto) é in seguito 
posizionato nuovamente nell’apparecchio di superfusione nella posizione verticale originaria.
 
Sostanze di controllo  
29. Ogni saggio dovrà comprendere controlli negativi o con solventi/mezzi di ­
sperdenti (veicolo) e controlli positivi paralleli.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 693
 
30. Le prove con i liquidi al 100 % o i solidi prevedono l’impiego di una 
soluzione salina fisiologica come controllo negativo parallelo nel saggio 
ICE per rilevare cambiamenti non specifici del sistema di prova e assicurare che le condizioni del saggio non causino una reazione irritante non deside ­
rata.
 
31. Le prove con i liquidi diluiti comprendono un gruppo di controllo con 
solventi/mezzi disperdenti per rilevare cambiamenti non specifici del sistema di prova e assicurare che condizioni del saggio non causino una reazione irritante non desiderata. Come indicato al paragrafo 25, può essere utilizzato 
solo un solvente/mezzo disperdente per il quale si sia dimostrato che non ha 
ripercussioni negative sul sistema di prova.
 
32. Ciascuna prova comprende un controllo positivo parallelo (noto irritante per 
occhi) per verificare la possibilità di indurre una reazione adeguata. Poiché il 
presente metodo di prova utilizza il saggio ICE per l’identificazione di 
sostanze corrosive o gravemente irritanti, il controllo positivo ideale do ­
vrebbe essere una sostanza di riferimento che consenta di indurre una rea ­
zione grave durante questo metodo di saggio. Tuttavia la portata dell’irrita ­
zione non dovrebbe essere eccessiva per garantire la possibilità di valutare la 
variabilità della reazione dei controlli positivi nel tempo. Dovrebbero essere generati dati  in vitro  sufficienti per il controllo positivo in modo da poter 
calcolare una serie statisticamente accettabile di dati per il controllo positivo. 
Se non sono disponibili dati storici idonei relativi al saggio ICE per un determinato controllo positivo, è opportuno condurre degli studi per ottenere questo tipo di informazioni.
 
33. L’acido acetico al 10 % o il cloruro di benzalconio al 5 % sono esempi di 
controlli positivi di sostanze di prova liquide, mentre esempi di controlli positivi per le sostanze di prova solide comprendono l’idrossido di sodio o l’imidazolo.
 
34. Le sostanze di riferimento sono utili per valutare il potenziale di irritazione 
oculare di sostanze chimiche sconosciute appartenenti a determinate classi di sostanze chimiche o prodotti o per la valutazione del potenziale di irritazione relativo di una sostanza irritante per occhi nell’ambito di una serie specifica 
di reazioni irritanti.
 
Risultati misurati  
35. La valutazione delle cornee trattate avviene prima del trattamento e dopo 30, 
75, 120, 180 e 240 minuti (con una tolleranza di ± 5 minuti) dal risciacquo 
successivo al trattamento. Queste scadenze temporali consentono di svolgere 
un numero idoneo di misurazioni nel corso del periodo complessivo di quattro ore previsto dal trattamento e lasciano al tempo stesso un periodo sufficiente fra una misurazione e l’altra per le necessarie osservazioni da 
effettuarsi su tutti gli occhi.
 
36. I risultati valutati sulla cornea comprendono fenomeni quali opacità, rigon ­
fiamento, ritenzione di fluoresceina ed effetti morfologici (ad esempio,  pit­
ting o allentamento dell’epitelio). Tutti i risultati sono rilevati a ciascuna 
delle scadenze temporali sopra menzionate, ad eccezione della ritenzione della fluoresceina che é determinata prima del trattamento e 30 minuti dopo l’esposizione alla sostanza di prova.
 
37. È consigliabile servirsi di fotografie per documentare l’opacità corneale, la 
ritenzione della fluoresceina, gli effetti morfologici e l’istopatologia, se ef ­
fettuata.  
38. Dopo l’esame al termine delle quattro ore si suggerisce agli utilizzatori di 
conservare gli occhi in un apposito fissativo (ad esempio, formalina tampo ­
nata neutra) per un possibile esame istopatologico.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 694
 
39. Il rigonfiamento corneale si determina grazie a misurazioni dello spessore 
della cornea, condotte con un pachimetro ottico montato su un microscopio 
con lampada a fessura. Il valore relativo è espresso in percentuale e é calcolato sulla base delle misurazioni dello spessore della cornea secondo la seguente formula:
 
" 
corneal thickness at time t  Ä corneal thickness at time  ¼ 0 
corneal thickness at time  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. La percentuale media di rigonfiamento corneale per tutti gli occhi sottoposti 
al saggio é calcolata a tutte le scadenze temporali di osservazione. In base al 
valore medio più elevato di rigonfiamento corneale, osservato a ciascuna scadenza, é poi assegnato un punteggio complessivo di categoria per cia ­
scuna sostanza di prova.
 
41. L’opacità corneale é calcolata ai fini del punteggio utilizzando l’area della 
cornea più opacizzata. La percentuale media di opacità corneale per tutti gli occhi sottoposti al saggio é calcolata a tutte le scadenze temporali di osser ­
vazione. In base al punteggio medio più elevato di opacità corneale, osser ­
vato a ciascuna scadenza, é poi assegnato un punteggio complessivo di categoria per ciascuna sostanza di prova (tabella 1).
 
Tabella 1  
Punteggi di opacità corneale  
Punteggio Osservazione  
0 Assenza di opacità 
0,5 Opacità molto lieve 1 Opacità distribuita o diffusa in varie zone; dettagli dell’iride chiaramente visibili 2 Area traslucida facilmente visibile; dettagli dell’iride leggermente oscurati 3 Grave opacità corneale; nessun dettaglio specifico dell’iride visibile; dimensioni 
della pupilla appena discernibili 
4 Opacità corneale completa; iride invisibile
 
42. Il valore di ritenzione della fluoresceina medio per tutti gli occhi esaminato é 
calcolato solamente a 30 minuti dal trattamento e vale come punteggio di categoria assegnato a ciascuna sostanza di prova (tabella 2).
 
Tabella 2  
Punteggi di ritenzione della fluoresceina  
Punteggio Osservazione  
0 Assenza di ritenzione della fluoresceina 
0,5 Lievi macchie nelle singole cellule 
1 Macchie nelle singole cellule diffuse in tutta l’area trattata della cornea 2 Macchie focalizzate o addensate e confluenti delle singole cellule 3 Vaste aree confluenti della cornea con ritenzione di fluoresceina
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43. Gli effetti morfologici comprendono il « pitting » delle cellule epiteliali cor ­
neali, l’«allentamento» dell’epitelio, l’«irruvidimento» della superficie cor ­
neale e l’«incollamento» della sostanza di prova alla cornea. Questi risultati possono variare in termini di gravità e presentarsi contemporaneamente. La classificazione dei risultati suddetti è soggettiva e dipende dall’interpreta ­
zione del ricercatore.
 
DATI E RENDICONTAZIONE  
Valutazione dei dati  
44. I risultati delle misurazioni relative a opacità, rigonfiamento e ritenzione di 
fluoresceina della cornea dovrebbero essere valutati separatamente per creare una classe ICE per ciascun risultato. Le classi ICE relative a ciascun risultato sono poi associate per generare una classificazione di irritazione per ciascuna 
sostanza di prova.
 
Criteri decisionali  
45. Dopo aver valutato ciascun risultato, è possibile assegnare le classi ICE sulla 
base di una serie predefinita. L’interpretazione dello spessore della cornea (tabella 3), dell’opacità (tabella 4) e della ritenzione della fluoresceina (ta ­
bella 5),utilizzando quattro classi ICE, avviene in base alle seguenti scale di 
classificazione:
 
Tabella 3  
Criteri di classificazione ICE di spessore corneale  
Rigonfiamento corneale medio (%) (*) Classe ICE  
da 0 a 5 I 
> 5 a 12 II > 12 a 18 (> 75 minuti dopo il trattamento) II > 12 a 18 ( ≤ 75 minuti dopo il trattamento) III 
> 18 a 26 III > 26 a 32 (> 75 minuti dopo il trattamento) III 
> 26 a 32 ( ≤ 75 minuti dopo il trattamento) IV 
> 32 IV
 
(*) Punteggi di rigonfiamento corneale applicabili solo se lo spessore è misurato con microscopio con 
lampada a fessura Haag-Streit BP900 con dispositivo di misurazione della profondità n. I e larghezza 
della fessura impostata a 9½, pari a 0,095 mm. È opportuno richiamare l’attenzione degli utilizzatori sul fatto che i microscopi con lampade a fessura possono produrre misurazioni dello spessore della cornea 
diverse a seconda delle diverse larghezze su cui è impostata la fessura.
 
Tabella 4  
Criteri di classificazione ICE di opacità  
Punteggio medio di opacità massima (*) Classe ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Cfr. tabella 1.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 696
 
Tabella 5  
Criteri di classificazione ICE di ritenzione media di fluoresceina  
Punteggio medio di ritenzione della fluoresceina a 
30 minuti dopo il trattamento (*) Classe ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Cfr. tabella 2.  
46. La classificazione di irritazione  in vitro  complessiva per una sostanza di 
prova é valutata rilevando la classificazione di irritazione che corrisponde 
ai dati combinati di rigonfiamento corneale, opacità corneale e ritenzione della fluoresceina e applicando lo schema riportato nella tabella 6.
 
Tabella 6  
Classificazioni di irritazione complessiva  in vitro  
Classificazione Combinazione dei 3 risultati  
Corrosivo/Grave irritante 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Opacità corneale ≥ 3 a 30 min (in almeno 2 
occhi) Opacità corneale = 4 a ogni scadenza di rileva ­
zione (in almeno 2 occhi) 
Grave allentamento dell’epitelio (in almeno 1 
occhio)
 
(*) Combinazioni meno probabili.  
47. Come indicato al paragrafo 1, se la sostanza di prova non è identificata come 
corrosiva o gravemente irritante per gli occhi è comunque consigliabile 
condurre altri saggi per la classificazione e l’etichettatura della sostanza 
stessa. Il metodo di saggio ICE ha un’accuratezza complessiva compresa fra l’83 % (120/144) e l’87 % (134/154), una percentuale di falsi positivi fra il 6 % (7/122) e l’8 % (9/116) e una percentuale di falsi negativi com ­
presa fra il 41 % (13/32) e il 50 % (15/30), se si paragonano tali risultati con 
i dati del saggio  in vivo  sugli occhi del coniglio secondo i sistemi di clas ­
sificazione EPA (1), UE (2) o GHS (3). Se si escludono dalla banca dati sostanze che rientrano in determinate classi chimiche (ad esempio, alcoli e 
tensioattivi) e fisiche (ad esempio, solidi), l’accuratezza del saggio ICE nei 
sistemi di classificazione UE, EPA e GHS varia fra il 91 % (75/82) e il 92 % (69/75), le percentuali di falsi positivi sono comprese fra il 5 % (4/73) e il 
6 % (4/70) e le percentuali di falsi negativi sono fra il 29 % (2/7) e il 33 % 
(3/9) (4).
 
48. Anche nei casi in cui la sostanza di prova non possa essere classificata come 
corrosiva oculare o gravemente irritante, i dati del saggio ICE possono essere 
utili se associati ai dati del saggio  in vivo  sugli occhi dei conigli o di un 
saggio  in vitro  opportunamente convalidato per valutare ulteriormente l’uti ­
lità e i limiti del saggio ICE quale strumento per l’identificazione di sostanze 
irritanti non gravi o sostanze non irritanti (è in corso la preparazione di linee 
guida sull’uso di metodi di prova  in vitro  per la tossicità oculare).  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 697
Criteri di accettazione dello studio  
49. Un saggio si ritiene accettabile se i controlli negativi o su mezzi disperdenti/ ­
solventi (veicolo) e i controlli positivi condotti parallelamente generano una 
classificazione di irritazione che rientra rispettivamente nelle classi delle sostanze non irritanti e gravemente irritanti/corrosive.
 
Rapporto di prova  
50. Il rapporto di prova dovrebbe includere le seguenti informazioni, se perti ­
nenti alla conduzione dello studio:  
Sostanze di prova e di controllo  
Denominazioni chimiche, quali le denominazioni strutturali CAS ( Chemical 
Abstracts Service ) seguite da altri nomi, se conosciuti;  
numero di registro CAS (RN), se conosciuto;  
purezza e composizione della sostanza o della miscela (in percentuale pon ­
derale), nella misura in cui l’informazione è disponibile;  
proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello studio, quali la 
natura fisica, la volatilità, il pH, la stabilità, la classe chimica e la solubilità in acqua;
 
trattamento delle sostanze di prova/di controllo prima del saggio, se appli ­
cabile (ad esempio, riscaldamento, frantumazione);  
stabilità, se conosciuta;  
Informazioni relative allo sponsor e ai centri di prova  
Nome e indirizzo dello sponsor, del centro di prova e del responsabile dello 
studio;  
identificazione dell’origine degli occhi (ovvero, la struttura presso la quale 
sono stati prelevati);  
condizioni di conservazione e trasporto degli occhi (ad esempio, data e ora 
del prelievo degli occhi, intervallo di tempo antecedente al saggio);  
se disponibili, informazioni relative a caratteristiche specifiche degli animali 
dai quali sono stati prelevati gli occhi (ad esempio, età, sesso, peso dell’ani ­
male donatore).  
Giustificazione del metodo di prova e del protocollo utilizzato  
Integrità del metodo di prova  
La procedura utilizzata per assicurare l’integrità (ovvero, l’accuratezza e 
l’affidabilità) del metodo di prova nel tempo (ad esempio, saggi periodici delle sostanze per la verifica delle prestazioni, utilizzo di dati storici sui 
controlli negativi e positivi).
 
Criteri di accettabilità del saggio  
Se applicabili, serie di controlli di riferimento paralleli, basati su dati storici.  
Condizioni di prova  
Descrizione del sistema di prova utilizzato;  
microscopio con lampada a fessura usato (indicare, ad esempio, il modello);  
impostazioni relative al microscopio con lampada a fessura utilizzata;  
informazioni relative agli occhi di pollo utilizzati, comprese dichiarazioni 
relative alla loro qualità;  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 698
 
dettagli delle procedure di prova adottate;  
concentrazione/i della sostanza di prova utilizzati;  
descrizione di ogni eventuale modifica alla procedura di prova;  
riferimento ai dati storici del modello (ad esempio, controlli negativi e po ­
sitivi, sostanze per la verifica del rendimento, sostanze di riferimento);  
descrizione dei criteri di valutazione impiegati.  
Risultati  
Descrizione di eventuali altri effetti osservati;  
se del caso, fotografie dell’occhio.  
Discussione dei risultati  
Conclusioni  
BIBLIOGRAFIA  
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16 dicembre 2008 relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’im ­
ballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le 
direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e reca modifica del 
regolamento (CE) n. 1907/2006. GU L 353, 31.12.2008, pag. 1.  
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del consiglio del 18 dicembre 2006 concernente la registrazione, la 
valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze 
chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 
1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Con ­
siglio e le direttive 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE della Commissione. GU L 396, 30.12.2006, pag. 1.
 
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native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
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Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
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ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 701
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Accuratezza:  prossimità fra i risultati del metodo di prova e i valori di riferi ­
mento accettati. Misura il rendimento del metodo di prova e rappresenta un 
aspetto della «rilevanza.». Il termine è spesso sostituibile con «concordanza», a indicare la percentuale di risultati corretti di un metodo di prova.
 
Affidabilità:  misura la possibilità di eseguire un metodo di prova in maniera 
riproducibile all’interno dei laboratori e fra di essi nel tempo seguendo lo stesso protocollo. É valutata calcolando la riproducibilità interna ai laboratori e la ripetibilità fra i laboratori.
 
Categoria EPA 1:  sostanza corrosiva (distruzione irreversibile del tessuto ocu ­
lare) o interessamento o irritazione della cornea persistenti per oltre 21 giorni (1).  
Categoria GHS 1:  produzione di danni ai tessuti oculari o indebolimento 
grave della vista in seguito all’applicazione di una sostanza di prova sulla 
parte anteriore dell’occhio, non completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione (3).
 
Categoria UE R41:  produzione di danni ai tessuti oculari o indebolimento 
grave della vista in seguito all’applicazione di una sostanza di prova sulla 
parte anteriore dell’occhio, non completamente reversibile entro 21 giorni dall’applicazione (2).
 
Controllo negativo:  un duplicato non trattato che contiene tutti i componenti di 
un sistema di prova. Il campione é saggiato con campioni trattati con la sostanza e altri campioni di controllo per determinare se il veicolo interagisce con il sistema di prova.
 
Controllo positivo:  un duplicato che contiene tutti i componenti di un sistema di 
prova e che é trattato con una sostanza che notoriamente induce una reazione positiva. Il grado dell’irritazione non dovrebbe essere eccessivo per garantire la 
possibilità di valutare la variabilità della reazione dei controlli positivi nel tempo.
 
Controllo solvente/mezzo disperdente:  campione non trattato che contiene tutti 
i componenti di un sistema di prova, compreso il solvente e il mezzo disperdente (veicolo) usato con la sostanza di prova saggiato con gli altri campioni di con ­
trollo al fine di stabilire la reazione di base nei campioni trattati con la sostanza 
di prova disciolta nello stesso solvente o mezzo disperdente. Nelle prove con controlli negativi paralleli, questo campione dimostra anche se il veicolo è in grado di interagire con il sistema di prova.
 
Cornea:  parte trasparente frontale del bulbo oculare che copre l’iride e la pupilla 
e consente il passaggio della luce verso l’interno.  
Corrosivo oculare:  a) sostanza che causa danni irreversibili ai tessuti oculari; 
b) sostanza classificata come irritante oculare di categoria GHS 1, EPA I o 
UE R41 (1) (2) (3).  
Forza probante:  il processo che consiste nel tener conto dei punti di forza e di 
debolezza di informazioni diverse per conseguire e supportare una data conclu ­
sione relativa al potenziale di pericolo di una sostanza.  
GHS ( Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemi ­
cals): un sistema che propone la classificazione delle sostanze e miscele chimiche 
in base a tipi e livelli standardizzati di rischi fisici, per la salute e ambientali, e 
applica elementi di comunicazione corrispondenti, quali pittogrammi, avvertenze, indicazioni di pericolo, consigli di prudenza e schede tecniche di sicurezza, al fine di trasmettere informazioni sui loro effetti nocivi e garantire la protezione di 
persone (compresi datori di lavoro, lavoratori, trasportatori, consumatori e ope ­
ratori dei servizi di soccorso) e ambiente (3).
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 702
 
Grave irritante oculare:  a) sostanza che causa danni ai tessuti oculari in seguito 
all’applicazione sulla superficie anteriore dell’occhio non risolvibili entro 21 
giorni dall’applicazione o indebolimento grave della vista; b) sostanze classificate come irritanti oculari di categoria GHS 1, EPA I o UE R41 (1) (2) (3).
 
Irritante oculare:  a) sostanza che produce cambiamenti reversibili negli occhi 
in seguito all’applicazione sulla superficie anteriore dell’occhio; b) sostanza classificata come irritante oculare di categoria EPA II o III, UE R36 o 
GHS 2A o2B (1) (2) (3).
 
Metodo di prova convalidato:  metodo di prova in base al quale sono stati 
completati studi di convalida per determinare la rilevanza (compresa l’accuratez ­
za) e l’affidabilità per un fine specifico. Va sottolineato che un metodo di prova convalidato potrebbe non avere un rendimento sufficiente in termini di valori di 
accuratezza e affidabilità ritenuti accettabili per il raggiungimento dell’obiettivo 
prefissato.
 
Microscopio con lampada a fessura:  strumento utilizzato per esaminare diret ­
tamente l’occhio sotto l’ingrandimento di un microscopio binoculare e creando un’immagine stereoscopica e diritta. Nel metodo di prova ICE, questo strumento é usato per visualizzare le strutture anteriori dell’occhio del pollo e per misurare 
in modo oggettivo lo spessore corneale con uno strumento accessorio di misu ­
razione in profondità.
 
Non-irritante:  sostanza non classificata come irritante oculare di categoria EPA 
I, II o III; UE R41 o R36; o GHS 1, 2  o o 2B (1) (2) (3).  
Opacità corneale:  misurazione del grado di opacità della cornea in seguito 
all’esposizione a una sostanza di prova. Un aumento dell’opacità corneale è indice di danni alla cornea.
 
Percentuale di falsi negativi:  percentuale di tutte le sostanze positive erronea ­
mente identificate come negative da un metodo di prova. È un indicatore della 
prestazione del metodo di prova.  
Percentuale di falsi positivi:  percentuale di tutte le sostanze negative erronea ­
mente identificate come positive da un metodo di prova. È un indicatore della prestazione del metodo di prova.
 
Pericolo:  proprietà intrinseca di un agente o di una situazione di causare poten ­
zialmente effetti nocivi se un organismo, un sistema o una (sotto-)popolazione vi 
sono esposti.  
Prove in sequenza:  strategia di prove graduali in cui vengono riesaminate tutte 
le informazioni disponibili su una sostanza di prova, secondo un ordine ben 
specificato, seguendo un approccio basato sulla forza probante dei dati disponibili per ciascuna prova al fine di stabilire se vi sono informazioni sufficienti per una decisione sulla classificazione del pericolo prima di procedere alla fase succes ­
siva. Se è possibile assegnare il potenziale di irritazione di una sostanza di prova 
in base alle informazioni disponibili, non è necessario svolgere prove aggiuntive. Se non è possibile assegnare il potenziale di irritazione di una sostanza di prova in base alle informazioni disponibili, é svolta una procedura di prova graduale su 
animali in sequenza fino a che non sarà possibile effettuare una classificazione 
inequivocabile.
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 703
 
Rigonfiamento corneale:  misurazione obiettiva del saggio ICE dell’ingrossa ­
mento della cornea in seguito all’esposizione a una sostanza di prova. È espresso 
in percentuale e si ottiene dalle misurazioni dello spessore corneale di partenza (prima del dosaggio) e dallo spessore registrato a intervalli regolari dopo l’espo ­
sizione al materiale di prova nel saggio ICE. Il grado di rigonfiamento corneale è 
indice di danni alla cornea.
 
Ritenzione di fluoresceina:  misurazione soggettiva nell’ambito del saggio ICE 
del grado di fluoresceina trattenuto dalle cellule epiteliali della cornea in seguito all’esposizione a una sostanza di prova. Il grado di ritenzione di fluoresceina è indice di danni all’epitelio della cornea.
 
Sostanza di riferimento:  sostanza usata come standard di confronto rispetto a 
una sostanza di prova. Una sostanza di riferimento dovrebbe presentare le se ­
guenti proprietà: i) fonti coerenti e affidabili; ii) analogia strutturale e funzionale alla classe delle sostanze in esame; iii) caratteristiche fisiche/chimiche conosciute; iv) dati di supporto relativi agli effetti noti, e v) efficacia nota nell’ambito della 
reazione auspicata.
 ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 704
 
Appendice 2  
SOSTANZE CHIMICHE PER LA VERIFICA DELLA PRESTAZIONE NEL 
METODO DI PROVA ICE  
Prima di utilizzare regolarmente un metodo di prova che soddisfi i requisiti delle 
presenti linee guida, i laboratori possono decidere di dimostrare le prestazioni tecniche identificando correttamente la classificazione di corrosività oculare delle 10 sostanze raccomandate nella tabella 1. Tali sostanze sono state selezionate 
quali rappresentative di una serie di reazioni di irritazione/corrosione topica 
dell’occhio, basata sui risultati del saggio sugli occhi del coniglio  in vivo  (TG 
405) (ovvero, categorie 1, 2A, 2B, o Non classificato o etichettato in base alla classificazione UN GHS (3) (7). Tuttavia, in considerazione dell’utilità compro ­
vata di tali saggi (che consiste nell’identificare esclusivamente corrosivi/gravi 
irritanti oculari) esistono solo due risultati di prova ai fini di una classificazione (corrosivo/gravemente irritante o non corrosivo/non gravemente irritante) per dimostrare la prestazione. Gli altri criteri di selezione comprendevano la dispo ­
nibilità delle sostanze sul mercato, la presenza di dati di qualità che fungono da 
riferimento per gli studi in vivo, nonché di dati di qualità di riferimento concer ­
nenti i due metodi  in vitro  per i quali le linee guida dei saggi sono attualmente in 
fase di elaborazione. Per questa ragione, sono state selezionate sostanze irritanti 
dall’elenco raccomandato ICCVAM di 122 sostanze di riferimento per la conva ­
lida del saggio  in vitro  di tossicità oculare (cfr. appendice H: sostanze di riferi ­
mento raccomandate  ICCVAM ) (4). I dati di riferimento relativi sono disponibili 
nella documentazione ICCVAM relativa ai saggi di opacità e permeabilità della 
cornea nei bovini (Bovine Corneal Opacity and Permeability - BCOP) e ICE (ICCVAM Background Review Documents for BCOP and Isolated Chicken 
Eye (ICE) test method ) (18) (19).
 
Tabella 1  
Sostanze raccomandate per la verifica del rendimento tecnico con il metodo ICE  
Sostanza chimica CASRN Classe chimica (  1 ) Forma fisica Classificazione (  2 ) 
in Vivo  Classificazione (  3 ) in 
Vitro 
Cloruro di benzalco ­
nio (5 %) 8001-54-5 Composto io ­
nico Liquido Categoria 1 Corrosivo/Grave ­
mente irritante 
Clorexidina 55-56-1 Ammina, am ­
midina Solido Categoria 1 Corrosivo/Grave ­
mente irritante 
Acido dibenzoil-L- 
tartarico 2743-38-6 Acido carbossi ­
lico, estere Solido Categoria 1 Corrosivo/Grave ­
mente irritante 
Imidazolo 288-32-4 Composto ete ­
rociclico Solido Categoria 1 Corrosivo/Grave ­
mente irritante 
Acido tricloroacetico 
(30 %) 76-03-9 Acido carbossi ­
lico Liquido Categoria 1 Corrosivo/Grave ­
mente irritante 
2,6-Diclorobenzoil ­
cloruro 4659-45-4 Acil-alogenuro Liquido Categoria 2A Non corrosivo/Non 
gravemente irritante 
Etil 2-metilacetoace ­
tato 609-14-3 Chetone, estere Liquido Categoria 2B Non corrosivo/Non 
gravemente irritante 
Nitrato di ammonio 6484-52-2 Sale inorganico Solido Categoria 2A Non corrosivo/Non 
gravemente irritante  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 705
 
Sostanza chimica CASRN Classe chimica (  1 ) Forma fisica Classificazione (  2 ) 
in Vivo  Classificazione (  3 ) in 
Vitro 
Glicerolo 56-81-5 alcol Liquido Non etichettato Non corrosivo/Non 
gravemente irritante 
n-esano 110-54-3 Idrocarburo 
(aciclico) Liquido Non etichettato Non corrosivo/Non 
gravemente irritante  
Abbreviazioni: CASRN = numero di registrazione CAS ( Chemical Abstracts Service Registry Number ). 
( 1 ) Ciascuna sostanza di prova è stata assegnata a classi chimiche definite in base a un sistema di classificazione standard, bas ato sul 
sistema di classificazione della  National Library of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) (disponibile online al sito 
http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Basata sui risultati del test sugli occhi dei conigli  in vivo  (OECD TG 405) e sul sistema di classificazione UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Basata sui risultati dei saggi BCOP e ICE.  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 706
 
Appendice 3  
Diagrammi relativi all’apparecchio di superfusione e ai morsetti oculari  
(cfr Burton et al. (17) per ulteriori descrizioni generiche dell’apparecchio di 
superfusione e del morsetto oculare)
  ▼M2 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 707
 
B.49.  TEST DEL MICRONUCLEO IN VITRO CON CELLULE DI 
MAMMIFERO  
INTRODUZIONE  
1. Il test del micronucleo in vitro (MNvit) è un test di genotossicità effettuato 
per rilevare la presenza di micronuclei (MN) nel citoplasma delle cellule 
durante l’interfase. I micronuclei possono formarsi a partire da frammenti cromosomici acentrici (ossia privi di centromero) o da cromosomi interi che non sono in grado di migrare ai poli durante l’anafase (una fase della 
divisione cellulare). Il saggio rileva l’attività delle sostanze con proprietà 
clastogeniche e aneugeniche (sostanze e miscele) (1) (2) nelle cellule che hanno iniziato la divisione cellulare durante o dopo l’esposizione alla so ­
stanza sperimentale. Il presente metodo di prova (TM) permette il ricorso a 
protocolli sperimentali con e senza citocalasina B (citoB), un inibitore della 
polimerizzazione dell’actina. L’aggiunta di citoB prima della mitosi oggetto dello studio consente l’individuazione e l’analisi selettiva della frequenza 
dei micronuclei nelle cellule che hanno completato una mitosi, perché tali 
cellule sono binucleate (3) (4). Il presente metodo di prova permette altresì di ricorrere a protocolli senza blocco della citocinesi, purché si possa dimo ­
strare che la popolazione cellulare analizzata si sia già avviata alla mitosi.
 
2. Oltre al saggio MNvit per individuare le sostanze (sostanze e miscele) che 
inducono la formazione di micronuclei, anche il ricorso a un blocco della 
citocinesi, alla marcatura immunochimica dei cinetocori o all’ibridazione con sonde centromero- o telomero-specifiche [ibridazione fluorescente in situ (FISH)] può fornire informazioni sui meccanismi di danno cromoso ­
mico e formazione di micronuclei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 
(15) (16). Le procedure di marcatura e ibridazione possono essere impiegate quando si osserva un incremento della formazione di micronuclei e lo sperimentatore desidera stabilire se tale aumento è la conseguenza di eventi 
clastogenici e/o aneugenici.
 
3. I micronuclei rappresentano danni che sono trasmessi alle cellule figlie, 
mentre le aberrazioni cromosomiche verificatesi nelle cellule in metafase potrebbero non essere trasmesse. Poiché nelle cellule in interfase è possibile 
valutare i micronuclei in maniera relativamente obiettiva, il personale del 
laboratorio deve soltanto stabilire se le cellule hanno avviato o meno la divisione cellulare e quante di esse contengono un micronucleo. Di conse ­
guenza, i preparati possono essere valutati con relativa rapidità e l’analisi 
può essere automatizzata, il che permetterebbe di valutare migliaia anziché 
centinaia di cellule per trattamento, e quindi di accrescere la potenza del saggio. Infine, poiché i micronuclei possono formarsi anche da cromosomi ritardatari, c’è la possibilità di individuare agenti che inducono aneuploidia, 
che solitamente è difficile esaminare tramite i tradizionali test sulle aberra ­
zioni cromosomiche (cfr. la linea guida OCSE Test Guideline 473, capitolo B.10 del presente allegato) (17). Tuttavia, il saggio MNvit non permette di distinguere le sostanze che inducono polipoidia da quelle che causano cla ­
stogenicità senza il ricorso a tecniche speciali come la FISH, descritta al 
punto 2.
 
4. Il saggio MNvit è un metodo in vitro che in genere utilizza cellule umane o 
animali (di roditori). Il saggio offre una base completa per studiare il 
potenziale di danno cromosomico in vitro, poiché permette di rilevare agenti 
sia aneugeni sia clastogeni.  
5. Il saggio MNvit è robusto ed efficace per vari tipi cellulari, con o senza 
ricorso a citoB. Sono numerosi i dati a sostegno della validità del saggio MNvit con diverse linee cellulari di roditori (CHO, V79, CHL/IU e 
L5178Y) e di linfociti umani (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) 
(27) (28) (29) (30) (31). Tra questi si annoverano, in particolare, gli studi internazionali di convalida coordinati dalla Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) e le relazioni dell’International 
Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Le informazioni disponibili 
sono anche state riesaminate nell’ambito di uno studio di convalida
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retrospettivo basato sul peso dell’evidenza condotto dal Centro europeo per 
la convalida di metodi alternativi (ECVAM) della Commissione europea, 
mentre la validità scientifica del metodo di prova è stata riconosciuta dal comitato scientifico consultivo dell’ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). È stato descritto l’uso di cellule umane della linea linfoblastoide TK6 (35), di 
cellule HepG2 (36) (37) e di cellule embrionali primarie di criceto siriano 
(38), sebbene tali cellule non siano state utilizzate in studi di convalida.
 
DEFINIZIONI  
6. Le definizioni usate figurano nell’allegato 1.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
7. I saggi in vitro richiedono in generale l’uso di una fonte esogena di atti ­
vazione metabolica, a meno che le cellule non siano metabolicamente com ­
petenti per quanto riguarda le sostanze in esame. Il sistema esogeno di attivazione metabolica non simula perfettamente le condizioni in vivo. Si deve prestare inoltre attenzione al fine di evitare condizioni che portereb ­
bero a risultati positivi artefatti, che non riflettono una mutagenicità intrin ­
seca, e che possono avere origine da cambiamenti marcati di pH o di osmolalità, o da elevati livelli di citotossicità (39) (40) (41). Se, aggiun ­
gendo la sostanza sperimentale, si verifica un cambiamento di pH del 
mezzo, il pH deve essere aggiustato, preferibilmente tamponando la solu ­
zione pronta per l’uso affinché tutti i volumi rimangano gli stessi per tutte le concentrazioni testate e per tutti i controlli.
 
8. Per esaminare l’induzione di micronuclei è fondamentale che sia avvenuta 
la mitosi sia nelle colture trattate che in quelle non trattate. Lo stadio più 
informativo per il conteggio dei micronuclei è quello che si riscontra nelle cellule che hanno completato una mitosi durante o dopo il trattamento con la sostanza sperimentale.
 
PRINCIPIO DEL METODO  
9. Le colture di cellule umane o di mammifero sono esposte alla sostanza 
sperimentale con e senza una fonte esogena di attivazione metabolica, a meno che non si utilizzino cellule con un’adeguata capacità metabolizzante. Ogni test dovrà comprendere controlli con solventi/veicoli e controlli posi ­
tivi trattati in parallelo.
 
10. Durante o dopo l’esposizione alla sostanza sperimentale, le cellule sono 
coltivate per un periodo sufficiente a consentire che il danno cromosomico o del fuso porti alla formazione di micronuclei nelle cellule in interfase. Per 
l’induzione di aneuploidia, la sostanza sperimentale dovrebbe solitamente 
essere presente durante la mitosi. Le cellule in interfase coltivate e colorate sono analizzate per rilevare la presenza di micronuclei. Idealmente, si do ­
vrebbero contare micronuclei soltanto nelle cellule che hanno completato la 
mitosi durante l’esposizione alla sostanza sperimentale o nell’eventuale pe ­
riodo successivo all’esposizione. Nelle colture trattate con un inibitore della citocinesi questo risultato si ottiene prendendo in considerazione soltanto le cellule binucleate. In assenza di un inibitore della citocinesi è importante 
dimostrare che le cellule analizzate hanno avviato la divisione cellulare 
durante o dopo l’esposizione alla sostanza sperimentale. Per tutti i protocolli è essenziale dimostrare che la proliferazione cellulare è avvenuta sia nelle colture trattate che nei controlli; inoltre, nelle colture in cui si è riscontrata 
la presenza di micronuclei (o in colture parallele) dev’essere valutata l’entità 
della citotossicità o della citostasi indotta dalla sostanza sperimentale.
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DESCRIZIONE DEL METODO  
Preparazioni  
11. Possono essere usati linfociti del sangue periferico umano primario coltivato 
(5) (19) (42) (43) e una serie di linee cellulari di roditori quali CHO, V79, 
CHL/IU e L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). L’uso di altre linee cellulari e di altri tipi di cellule deve essere giustificato in base alla loro dimostrata prestazione nel saggio, così come descritta nella 
sezione sui criteri di accettabilità. Poiché la frequenza generale dei micro ­
nuclei influenzerà la sensibilità del saggio, si raccomanda di utilizzare tipi cellulari con una frequenza bassa e stabile di formazione di micronuclei.
 
12. I linfociti del sangue periferico umano devono essere prelevati da individui 
giovani (circa 18-35 anni di età), sani, non fumatori, che non siano stati esposti di recente a sostanze chimiche genotossiche o a radiazioni. Se si 
raccolgono cellule da più donatori, il numero dei donatori dev’essere indi ­
cato. La frequenza dei micronuclei aumenta con l’età e questa tendenza è più marcata nelle donne rispetto agli uomini (44); occorre tener conto di tali elementi nella selezione delle cellule dei donatori.
 
Terreni e condizioni di coltura  
13. Per mantenere le colture devono essere garantiti terreni e condizioni di 
incubazione adeguati (recipienti per coltura, concentrazione di CO  2 , tempe­
ratura e umidità). Si controlli periodicamente la stabilità del numero modale 
dei cromosomi e l’assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari stabilizzate e nei ceppi; non si usino ceppi contaminati o che presentano modifiche del numero modale dei cromosomi. Dovrebbero es ­
sere note la durata normale del ciclo cellulare e le condizioni di coltura 
utilizzate nel laboratorio di prova. Se si ricorre al metodo dell’inibizione della citocinesi, la concentrazione dell’agente inibitore dev’essere ottimiz ­
zata per lo specifico tipo cellulare e deve essere dimostrata la sua capacità 
di produrre un buon numero di cellule binucleate per l’analisi.
 
Preparazione delle colture  
14. Linee cellulari stabilizzate e ceppi: le cellule provenienti da colture primarie 
vengono inoculate in un terreno di coltura ad una densità tale da impedire 
che le colture raggiungano la confluenza in monostrati, e che le colture in sospensione non raggiungano una densità eccessiva prima della raccolta, e incubate a 37 °C.
 
15. Linfociti: sangue intero trattato con un anticoagulante (ad esempio, eparina) 
o linfociti isolati sono posti in un terreno di coltura contenente un mitogeno (ad esempio, fitoemoagglutinina, PHA) prima dell’esposizione alla sostanza 
sperimentale e a citoB.
 
Attivazione metabolica  
16. Se si utilizzano cellule prive di un’adeguata capacità di attivazione meta ­
bolica endogena si deve ricorrere a sistemi di attivazione metabolica eso ­
geni. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattori (S9) ricavata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici, come Aroclor 1254 (45) (46) o una combinazione di fenobar ­
bitone e β-naftoflavone (46) (47) (48) (49). Quest’ultima combinazione è 
conforme alla Convenzione di Stoccolma sugli inquinanti organici persi ­
stenti (50) e al regolamento (CE) n. 850/2004 relativo agli inquinanti or ­
ganici persistenti (66), e ha dimostrato di essere tanto efficace quanto Aro ­
clor 1254 nell’indurre ossidasi a funzione mista (46) (47) (48) (49). La 
frazione S9 viene di solito usata a concentrazioni comprese tra 1 e 10 % (v/v) nel terreno di coltura. Le condizioni del sistema di attivazione meta ­
bolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi 
può essere opportuno utilizzare varie concentrazioni della frazione 
post-mitocondriale.
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17. Linee cellulari modificate mediante ingegneria genetica che esprimono en ­
zimi attivatori specifici nell’uomo o nel roditore possono eliminare la ne ­
cessità di ricorrere a un sistema di attivazione metabolica esogeno e pos ­
sono essere usate nel saggio. In questi casi la scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (ad esempio, in base all’importanza 
delle ossidasi a funzione mista nel metabolismo della sostanza in esame 
(51) e della loro capacità di reagire ai clastogeni e agli aneugeni noti (cfr. la sezione sui criteri di accettabilità). Si deve riconoscere che la sostanza sperimentale non può essere metabolizzata dall’ossidasi o dalle ossidasi a 
funzione mista espresse; in tal caso, i risultati negativi non indicherebbero 
che la sostanza sperimentale non causa la formazione di micronuclei.
 
Sostanza in esame/Preparazione  
18. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione in adeguati solventi o 
veicoli e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le so ­
stanze liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura e/o diluite prima del trattamento. Le sostanze gassose o volatili devono essere testate modificando adeguatamente i protocolli standard (trattamento in contenitori 
sigillati) (52) (53). Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora 
siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile.
 
Condizioni di esperimento  
Solventi/veicoli  
19. Il solvente/veicolo non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame 
e deve essere compatibile con la sopravvivenza delle cellule e con l’azione di S9 alla concentrazione usata. L’uso di solventi/veicoli poco noti (ad esempio, acqua, terreno di coltura cellulare, dimetilsolfossido) è ammesso 
purché suffragato da dati che ne provino la compatibilità con la sostanza 
sperimentale e l’assenza di tossicità genetica. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l’uso di un solvente/veicolo acquoso.
 
Uso di citoB come inibitore della citocinesi  
20. Una delle considerazioni più importanti riguardo alla prestazione del saggio 
MNvit è garantire che le cellule contate abbiano completato la micosi durante il trattamento o nell’eventuale periodo di incubazione successiva 
al trattamento. La citocalasina B è l’agente più diffusamente usato per 
bloccare la citocinesi, poiché inibisce l’aggregazione dell’actina e, di con ­
seguenza, impedisce la separazione delle cellule figlie dopo la mitosi, por ­
tando alla formazione di cellule binucleate (5) (54) (55). Il conteggio dei 
micronuclei, pertanto, può essere limitato alle cellule che si sono avviate alla mitosi durante o dopo il trattamento. L’effetto della sostanza sperimen ­
tale sulla proliferazione cellulare può essere misurato simultaneamente. La 
citocalasina B deve essere usata come inibitore della citocinesi quando si 
impiegano linfociti umani, perché la durata del ciclo cellulare può variare tra le colture e tra donatori e perché non tutti i linfociti rispondono alla PHA. Nei test su linee cellulari sono stati utilizzati altri metodi per stabilire 
se le cellule sottoposte a conteggio si sono divise; tali metodi sono descritti 
di seguito (cfr. il punto 26).
 
21. Per ciascun tipo cellulare il laboratorio deve determinare la concentrazione 
adeguata di citocalasina B per ottenere la frequenza ottimale di cellule 
binucleate nelle colture di controllo con solvente/veicolo. La concentrazione 
adeguata di citocalasina B è solitamente compresa tra 3 e 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 711
 
Misurazione della proliferazione cellulare e della citotossicità e scelta delle 
concentrazioni di esposizione  
22. Nel determinare la concentrazione massima di sostanza da testare si devono 
evitare concentrazioni che hanno la capacità di produrre risposte positive artefatte tra cui le concentrazioni che causano eccessiva citotossicità, preci ­
pitazione nel terreno di coltura e variazioni marcate di pH o osmolalità (39) 
(40) (41).
 
23. La proliferazione cellulare deve essere misurata per garantire che le cellule 
trattate si sono avviate alla mitosi durante il saggio e che i trattamenti sono 
condotti ad adeguati livelli di citotossicità (cfr. il punto 29). La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione metabolica nelle cellule che 
richiedono attivazione metabolica sulla base dell’aumento relativo delle 
conte cellulari (RICC) o del raddoppiamento relativo della popolazione (RPD) (cfr. l’appendice 2 per le formule), a meno che non si ricorra alla citocalasina B. In tal caso, la citotossicità può essere determinata 
sulla base dell’indice di replicazione (RI) (cfr. l’appendice 2 per la formula).
 
24. Il trattamento di colture con citoB e la misurazione delle frequenze relative 
di cellule mononucleate, binucleate e multinucleate nella coltura rappresen ­
tano un metodo accurato per la quantificazione dell’effetto sulla prolifera ­
zione cellulare e dell’attività citotossica o citostatica di un trattamento (5), e garantiscono che siano conteggiate soltanto le cellule che hanno iniziato la 
divisione durante o dopo il trattamento.
 
25. Negli studi con citoB, la citostasi/citotossicità può essere quantificata sulla 
scorta dell’indice che misura la cinetica della proliferazione cellulare (CBPI) (5) (26) (56) o può essere ottenuto dall’indice di replicazione di almeno 500 cellule per coltura (cfr. l’appendice 2 per le formule). Se per valutare la 
proliferazione è usata la citocalasina B, si deve determinare un CBPI o un 
indice di replicazione a partire da almeno 500 cellule per coltura. Queste misurazioni, tra le altre, possono essere utilizzate per stimare la citotossicità confrontando valori nelle colture trattate e nei controlli. La valutazione di 
altri marcatori di citotossicità (ad esempio, confluenza, numero di cellule, 
apoptosi, necrosi, conteggio in metafase) può fornire informazioni utili.
 
26. Negli studi condotti senza citoB occorre dimostrare che le cellule contate 
nella coltura hanno avviato il processo di divisione durante o in seguito al trattamento con la sostanza sperimentale, per evitare che si producano falsi negativi. Tra i metodi usati per assicurare che siano contate le cellule in fase 
di divisione vi sono l’incorporazione e il successivo rilevamento di bromo ­
deossiuridina (BrdU) per individuare le cellule che si sono replicate (57), la formazione di cloni quando cellule da linee cellulari permanenti sono trat ­
tate e contate in situ su un vetrino per microscopio (indice di proliferazione, 
PI) (25) (26) (27) (28) o la misurazione del raddoppiamento relativo della 
popolazione (RPD) o dell’aumento relativo della conta cellulare (RICC) o altri metodi dimostrati (16) (56) (58) (59) (cfr. l’appendice 2 per le formu ­
le). La valutazione di altri marcatori di citotossicità o citostasi (ad esempio, 
confluenza, numero di cellule, apoptosi, necrosi, conteggio in metafase) può 
fornire informazioni utili.
 
27. Si usino almeno tre concentrazioni analizzabili. A tal fine può essere ne ­
cessario eseguire l’esperimento utilizzando un maggior numero di concen ­
trazioni strettamente intervallate e analizzando la formazione di micronuclei 
nelle concentrazioni che forniscono un intervallo di citotossicità adeguato. 
Una strategia alternativa consiste nell’eseguire un test di citotossicità preli ­
minare per ridurre l’intervallo di tossicità del test definitivo.  
28. La concentrazione più elevata deve puntare a produrre una tossicità pari a 
55 ± 5 %. Livelli più elevati possono indurre danni cromosomici come effetto secondario di citotossicità (60). In caso di sostanze citotossiche, le 
concentrazioni selezionate per il saggio devono andare dalla citotossicità 55 
± 5 % ad una tossicità assente o modica.
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29. Se non si osserva citotossicità o non si rileva la presenza di un precipitato, 
la concentrazione massima di prova dovrebbe essere pari a 0,01 M, 5 
mg/mL o 5 μl/mL (si scelga il valore più basso). Le concentrazioni scelte 
per l’analisi cioè devono essere di norma separate al massimo da un fattore compreso tra 0 e più di 10. Per sostanze che esibiscono una curva 
concentrazione-risposta a forte inclinazione potrebbe essere necessario in ­
tervallare più frequentemente le concentrazioni della sostanza, affinché si possano contare anche le colture che ricadono nell’intervallo di tossicità moderata o bassa.
 
30. Per sostanze difficilmente solubili, la dose massima, se non limitata dalla 
citotossicità, dovrebbe essere la concentrazione più bassa in cui sia visibile 
la precipitazione minima nelle colture, purché questa non interferisca con la 
valutazione. La valutazione della precipitazione dev’essere fatta sulla base di tecniche quali la microscopia ottica, rilevando il precipitato che persiste o appare durante la coltura (al termine del trattamento).
 
Controlli  
31. Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e con solvente o veicolo 
trattati in parallelo, con e senza attivazione metabolica.  
32. I controlli positivi sono necessari per dimostrare la capacità delle cellule 
usate, e del protocollo sperimentale, di individuare clastogeni e aneugeni, e di affermare la capacità metabolica del preparato S9. Come controlli positivi si utilizzino induttori noti della formazione di micronuclei, a livelli ai quali 
ci si attende un aumento modesto ma riproducibile rispetto ai valori nor ­
mali, che dimostri la sensibilità del test. La concentrazione del controllo positivo deve essere tale che gli effetti siano chiari ma non rivelino imme ­
diatamente al lettore l’identità dei vetrini codificati.
 
33. Per dimostrare sia la competenza metabolica sia la capacità del test di 
rilevare i clastogeni dev’essere usato un clastogeno che esige attivazione 
metabolica (ad esempio, ciclofosfamide; benzo[a]pirene). Si possono usare altre sostanze per i controlli positivi, se giustificate. Poiché in alcune con ­
dizioni sperimentali o in determinate linee cellulari taluni controlli positivi 
che richiedono l’attivazione metabolica possono essere attivi senza attiva ­
zione metabolica esogena, la necessità dell’attivazione metabolica, e dell’at ­
tività del preparato S9, dev’essere testata nella linea cellulare selezionata e alle concentrazioni selezionate.
 
34. Attualmente, non sono noti aneugeni che richiedono l’attivazione metabo ­
lica per la loro attività genotossica (16). I controlli positivi attualmente 
accettati per l’attività aneugenica sono, per esempio, colchicina e vinbla ­
stina. Possono essere usate altre sostanze chimiche, se inducono la forma ­
zione di micronuclei esclusivamente o prevalentemente mediante attività 
aneugenica. Per evitare la necessità di due controlli positivi (per clastoge ­
nicità e aneugenicità) senza attivazione metabolica, il controllo per l’aneu ­
genicità può essere utilizzato come controllo positivo senza S9, e il con ­
trollo per la clastogenicità può essere impiegato per valutare l’adeguatezza 
del sistema di attivazione metabolica usato. Nelle cellule che non necessi ­
tano di S9 possono essere usati controlli positivi sia per la clastogenicità che per l’aneugenicità. I controlli positivi raccomandati figurano nell’appendice 3.
 
35. Si può prendere in considerazione l’uso di sostanze di una classe chimica 
correlata, se sono disponibili sostanze adeguate. Tutti i controlli positivi 
utilizzati devono essere adeguati per il tipo cellulare e per le condizioni 
di attivazione.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 713
 
36. Per ogni fase di raccolta si effettuino anche controlli con solvente o veicolo. 
Si proceda inoltre a controlli negativi non trattati (senza solvente/veicolo), 
salvo che dati precedenti pubblicati o di laboratorio provino che il solvente scelto non induce effetti genotossici o altri effetti nocivi alle concentrazioni utilizzate.
 
PROCEDURA  
Calendario del trattamento  
37. Per massimizzare la probabilità di individuare un aneugeno o un clastogeno 
in azione in un determinato stadio del ciclo cellulare è importante che quantitativi sufficienti di cellule siano trattati con la sostanza sperimentale 
in tutte le fasi dei cicli cellulari. Il calendario di trattamento per le linee 
cellulari e per le colture cellulari primarie, pertanto, può differire in parte da quello previsto per i linfociti, che per avviare il ciclo cellulare necessitano 
di una stimolazione mitogenica (cfr. i punti 41-43) (16).
 
38. Considerazioni teoriche, unitamente ai dati pubblicati, (18) indicano che la 
maggior parte degli aneugeni e dei clastogeni sarà rilevata entro un periodo di trattamento breve di 3 fino a 6 ore, con o senza S9, cui seguirà la 
rimozione della sostanza sperimentale e un periodo di crescita di 1,5–2,0 
cicli cellulari (6). Le cellule sono campionate in un lasso di tempo pari a circa 1,5–2,0 volte la durata normale (ossia senza trattamento) del ciclo cellulare, dopo l’inizio o alla fine del trattamento stesso (cfr. la tabella 1). 
I tempi di campionamento o di recupero possono essere estesi se è noto o si 
sospetta che la sostanza sperimentale incide sulla durata del ciclo cellulare (ad esempio, se si sperimentano analoghi nucleosidici).
 
39. In considerazione della potenziale tossicità dei preparati S9 per le cellule di 
mammifero coltivate, l’esposizione al trattamento è estesa di 1,5–2,0 cicli cellulari normali soltanto in assenza di S9. In caso di estensione il tratta ­
mento con la sostanza sperimentale può essere effettuato con o senza citoB. 
Queste alternative permettono di gestire situazioni in cui vi siano timori per 
le potenziali interazioni tra la sostanza sperimentale e citoB.
 
40. I calendari di trattamento suggeriti figurano nella tabella 1. Si tratta di 
calendari generici che possono essere modificati in base alla stabilità o 
alla reattività della sostanza sperimentale ovvero alle particolari caratteristi ­
che di crescita delle cellule utilizzate. Tutti i trattamenti devono iniziare e terminare nel momento di crescita esponenziale delle cellule. I calendari 
sono illustrati in maniera più dettagliata ai punti 41-47.
 
Tabella 1  
Trattamento delle cellule e fasi di raccolta per il saggio MNvit  
Linfociti, cellule primarie e linee cellulari 
trattate con citoB + S9 Trattare per 3-6 ore con S9; 
rimuovere S9 e terreno di coltura; aggiungere nuovo terreno e citoB; 
procedere alla raccolta a distanza di 1,5–2,0 
cicli cellulari normali. 
– S9 
Breve esposizione Trattare per 3-6 ore; 
rimuovere il terreno di coltura; 
aggiungere nuovo terreno e citoB; 
procedere alla raccolta a distanza di 1,5–2,0 
cicli cellulari normali.
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– S9 
Esposizione 
Prolungata  Opzione A:  trattare per 1,5–2 cicli cellulari nor ­
mali con citoB; 
procedere alla raccolta al termine del periodo 
di esposizione.  
Opzione B:  trattare per 1,5–2,0 cicli cellulari 
normali; 
asportare la sostanza sperimentale; aggiungere nuovo terreno e citoB; procedere alla raccolta dopo 1,5–2,0 cicli cel ­
lulari normali. 
Linee cellulari trattate senza citoB 
(medesimo calendario di trattamento descritto sopra, a eccezione dell’aggiunta di citoB)
 
Linfociti, cellule primarie e linee cellulari con citoB  
41. Per i linfociti, l’approccio più efficiente è iniziare l’esposizione alla sostanza 
sperimentale a distanza di 44-48 ore dopo la stimolazione con PHA, quando 
la sincronizzazione del ciclo sarà scomparsa (5). Nel saggio iniziale, le cellule sono trattate per 3 fino a 6 ore con la sostanza sperimentale, con o senza S9. Il terreno di coltura viene rimosso e sostituito con nuovo 
terreno contenente citoB; si procede alla raccolta quando è trascorso un 
periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale.
 
42. Se entrambi i test iniziali del trattamento breve (3-6 ore) sono negativi o 
ambigui, si ricorre a un’ulteriore esposizione successiva con S9. In tal caso sono possibili due opzioni, entrambe accettabili. Tuttavia, potrebbe essere più appropriato seguire l’opzione A per i linfociti stimolati se la crescita 
esponenziale risulta in calo a distanza di 96 ore dalla stimolazione. Inoltre, 
nell’opzione B le colture cellulari non devono aver raggiunto la confluenza prima dell’ultimo campionamento.
 
— Opzione A: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 
1,5–2,0 cicli cellulari normali; si procede alla raccolta al termine del 
periodo di trattamento.  
— Opzione B: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 
1,5–2,0 cicli cellulari normali. Il terreno di coltura è rimosso e sostituito 
con nuovo terreno; si procede alla raccolta quando è trascorso un ulte ­
riore periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale.
 
43. Le cellule primarie e le linee cellulari devono essere trattate in maniera 
analoga ai linfociti, salvo che non è necessario ricorrere alla stimolazione 
con PHA per 44-48 ore. Le cellule diverse dai linfociti devono essere 
esposte in maniera tale che, al momento della conclusione dello studio, le cellule si trovino ancora in una fase di crescita esponenziale.
 
Linee cellulari senza citoB  
44. Le cellule sono trattate per 3-6 ore, in presenza o in assenza di S9. Il terreno 
di coltura è rimosso e sostituito con nuovo terreno; si procede alla raccolta 
quando è trascorso un periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo 
cellulare normale.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 715
 
45. Se entrambi i test iniziali del trattamento breve (3-6 ore) sono negativi o 
ambigui, si ricorre a un’ulteriore esposizione successiva con (senza S9). In 
tal caso sono possibili due opzioni, entrambe accettabili:  
— Opzione A: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 
1,5–2,0 cicli cellulari normali; si procede alla raccolta al termine del 
periodo di trattamento.  
— Opzione B: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 
1,5–2,0 cicli cellulari normali. Il terreno di coltura è rimosso e sostituito con nuovo terreno; si procede alla raccolta quando è trascorso un ulte ­
riore periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare 
normale.
 
46. Nei monostrati possono essere presenti cellule mitotiche (identificabili per ­
ché di forma tonda e in fase di distacco dalla superficie) al termine del 
trattamento di 3-6 ore. Poiché tali cellule mitotiche si staccano facilmente, potrebbero andare perdute al momento della rimozione del terreno di col ­
tura. Tali cellule vanno raccolte con una certa attenzione quando le colture 
vengono lavate e vanno riposte nuovamente nelle colture per evitare di 
perdere cellule in mitosi, e quindi a rischio di formazione di micronuclei, al momento della raccolta.
 
Numero di colture  
47. Per ogni concentrazione di sostanza sperimentale e per le colture dei con ­
trolli negativi e con solvente/veicolo si utilizzino colture doppie. Se è 
possibile dimostrare, a partire da dati di laboratorio pregressi, una varia ­
zione minima tra colture doppie, si potrebbe ricorrere a colture singole. In tal caso, si raccomanda di analizzare un maggior numero di concentrazioni.
 
Raccolta delle colture e preparazione dei vetrini  
48. Per ogni coltura si procede a una raccolta e a un’elaborazione separate. Per 
la preparazione delle cellule può essere necessario un trattamento ipotonico, che tuttavia si può evitare se, con altri mezzi, è possibile ottenere un’ade ­
guata diffusione delle cellule. Possono essere usate tecniche diverse per la 
preparazione dei vetrini, purché siano garantiti preparati cellulari di elevata qualità per il conteggio. Il citoplasma cellulare può essere conservato per consentire il rilevamento dei micronuclei e (con il metodo di inibizione 
della citocinesi) l’individuazione affidabile di cellule binucleate.
 
49. I vetrini possono essere colorati con tecniche diverse, per esempio con il 
metodo Giemsa o tinture fluorescenti che si legano al DNA (59). L’uso di 
un colorante specifico per il DNA [ad esempio, arancio di acridina (61) o Hoechst 33258 più pironina-Y (62)] può eliminare alcuni degli artefatti dovuti all’uso di un colorante non specifico per il DNA. Per individuare i 
contenuti (cromosoma/frammento cromosomico) dei micronuclei possono 
essere usati anche anticorpi anticinetocore, FISH con sonde di DNA pan ­
centromerico o marcatura in situ mediante primer specifici per DNA pan ­
centromerico, unitamente a un’adeguata colorazione del DNA, se interessa 
acquisire informazioni sui meccanismi di formazione dei micronuclei 
(15)(16). Possono infine essere usati altri metodi per distinguere i clastogeni dagli aneugeni, purché sia stata dimostrata la loro efficacia.
 
Analisi  
50. Tutti i vetrini, compresi quelli del solvente/veicolo e dei controlli, devono 
essere codificati indipendentemente prima dell’esame al microscopio. In alternativa, i campioni codificati possono essere esaminati mediante un 
sistema convalidato e automatizzato di analisi citometrica o di analisi per 
immagini.
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51. Nelle colture trattate con citoB, le frequenze dei micronuclei devono essere 
analizzate in almeno 2 000 cellule binucleate per concentrazione (almeno 
1 000 cellule binucleate per coltura; due colture per concentrazione). Se si utilizza un’unica coltura, dalla stessa devono essere contate almeno 2 000 cellule binucleate per concentrazione. Se per il conteggio è disponibile un 
numero sostanzialmente inferiore a 1 000 cellule binucleate per coltura, o a 
2 000 cellule se si usa un’unica coltura, per ogni concentrazione, e se non si rileva un aumento significativo dei micronuclei, il saggio dev’essere ripetuto con più cellule o con una concentrazione meno tossica, a seconda di quale 
opzione sia più appropriata. Si deve prestare attenzione a non conteggiare 
cellule binucleate con forme irregolari o che evidenzino due nuclei di dimensioni marcatamente diverse; le cellule binucleate non possono inoltre essere confuse con cellule multinucleate a scarsa diffusione. Le cellule 
contenenti più di due nuclei principali non devono essere considerate per 
la ricerca di micronuclei, poiché la frequenza di riferimento dei micronuclei può essere superiore in queste cellule (63) (64). Il calcolo delle cellule mononucleate è accettabile se è dimostrato che la sostanza sperimentale 
interferisce con l’attività della citoB.
 
52. Nelle linee cellulari testate senza trattamento con citoB, i micronuclei de ­
vono essere contati in almeno 2 000 cellule per concentrazione (almeno 
1 000 cellule per coltura; due colture per concentrazione). Se si utilizza 
soltanto una coltura per concentrazione, da tale coltura devono essere con ­
tate almeno 2 000 cellule.  
53. Nei trattamenti con citoB dev’essere determinato un CBPI o un RI per 
valutare la proliferazione cellulare (cfr. l’appendice 2) a partire da almeno 500 cellule per coltura. Al contrario, nei trattamenti effettuati senza citoB, è 
fondamentale dimostrare che le cellule inserite nel conteggio sono in fase di 
proliferazione, come si è detto ai punti 24-27.
 
Criteri di accettabilità  
54. Un laboratorio che propone di utilizzare il saggio MNvit descritto nel 
presente metodo di prova deve dimostrare la propria capacità di indivi ­
duare con affidabilità e accuratezza le sostanze chimiche con un’attività aneugenica e clastogenica nota, con e senza attivazione metabolica, oltre che le sostanze chimiche negative note, con l’impiego delle sostanze di 
riferimento riportate nell’appendice 3. Come prova della sua capacità di 
eseguire il presente metodo di prova correttamente, il laboratorio deve dimostrare che le cellule conteggiate per la formazione di micronuclei 
hanno portato a termine una divisione nucleare se il test è condotto senza 
l’impiego di citoB.
 
55. Si raccomanda di utilizzare le sostanze elencate nell’appendice 3 come 
sostanze di riferimento. Possono essere incluse sostanze alternative o ag ­
giuntive, purché la loro attività sia nota e inducano la formazione di mi ­
cronuclei mediante gli stessi meccanismi d’azione, e qualora si dimostri che tali sostanze sono rilevanti per le sostanze chimiche che saranno testate con 
la procedura MNvit. Tra le motivazioni addotte può figurare uno studio di 
convalida che utilizza un’ampia varietà di sostanze o incentrato su uno spettro più ridotto in base alla classe chimica della sostanza sperimentale o al meccanismo che produce il danno.
 
56. Dal controllo con solvente/veicolo e dalle colture non trattate devono emer ­
gere frequenze di formazione di micronuclei basse e coerenti in maniera riproducibile (normalmente 5-25 micronuclei/1 000 cellule per i tipi cellulari 
individuati al punto 11). Altri tipi cellulari possono avere gamme di risposta 
diverse, che devono essere determinate al momento della convalida ai fini di un loro impiego nel saggio MNvit. I dati provenienti dai controlli negativi, positivi e con solvente devono essere utilizzati per fissare range di controllo 
storici. Tali valori vanno considerati per decidere in merito all’adeguatezza 
dei controlli positivi e negativi paralleli per un esperimento.
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57. Se si propongono per il saggio modifiche di modesta entità al protocollo (ad 
esempio, uso di tecniche di conteggio automatizzate anziché manuali, uso di 
un nuovo tipo cellulare), l’efficacia di tali modifiche dev’essere dimostrata prima di considerare adatto all’uso il protocollo modificato. Per dimostrare l’efficacia è necessario dimostrare che i principali meccanismi di rottura 
cromosomica e di perdita o acquisizione di materiale cromosomico possono 
essere rilevati e che è possibile ottenere risultati positivi e negativi appro ­
priati per la classe della sostanza in esame, o per la più ampia gamma di sostanze in esame.
 
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
58. Se si ricorre alla tecnica dell’inibizione della citocinesi, per valutare l’indu ­
zione di micronuclei si usano soltanto le frequenze di cellule binucleate con 
micronuclei (indipendentemente dal numero di micronuclei per cellula). Il conteggio del numero di cellule con uno, duo o più micronuclei non è 
obbligatorio, anche se potrebbe fornire informazioni utili.
 
59. Per tutte le colture di controllo trattate e per quelle con solvente/veicolo si 
determini in parallelo la citotossicità e/o la citostasi (58). Nell’eventualità in 
cui si ricorra al metodo dell’inibizione della citocinesi, per tutte le colture trattate e per i controlli dev’essere calcolato il CBPI o l’RI quale misura ­
zione del ritardo del ciclo cellulare. Nei trattamenti senza citoB si utilizza 
l’RPD o il RICC o il PI (cfr. l’appendice 2).
 
60. Devono essere forniti dati sulle singole colture. Tutti i dati devono essere 
riportati sinteticamente in una tabella.  
61. Le sostanze chimiche che inducono formazione di micronuclei nel saggio 
MNvit possono avere questo effetto come conseguenza dell’induzione della rottura cromosomica, della perdita di cromosomi o di entrambi tali eventi. 
Si può ricorrere a un’ulteriore analisi con anticorpi anticinetocore, sonde 
centromero-specifiche in situ o altri metodi per stabilire se il meccanismo di induzione di micronuclei è dovuto a un’attività clastogenica e/o aneugenica.
 
Valutazione e interpretazione dei risultati  
62. Non è richiesta la verifica di una risposta chiaramente positiva o negativa 
mediante test ulteriori. I risultati ambigui possono essere chiariti attraverso 
l’analisi di altre 1 000 cellule prelevate da tutte le colture per evitare la 
perdita di cecità. Se questo approccio non risolve l’ambiguità, occorre ri ­
correre a test ulteriori. Negli esperimenti di follow-up è bene considerare l’opportunità di variare i parametri dello studio in base a una serie ampliata 
o limitata di condizioni, a seconda dei casi. Tra i parametri che potrebbero 
essere modificati si annoverano l’intervallazione delle concentrazioni speri ­
mentali, la durata del trattamento e la raccolta delle cellule, e/o le condizioni di attivazione metabolica.
 
63. Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, ad esempio 
un aumento correlato alla concentrazione o un aumento statisticamente 
significativo del numero di cellule che presentano micronuclei. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Il fatto di stabilire se i valori osservati rientrano o trascendono l’intervallo storico 
dei controlli può fornire informazioni importanti per la valutazione della 
significatività biologica della risposta. Si possono usare metodi statistici adeguati come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (65), ma i risultati delle prove statistiche dovrebbero essere analizzati alla luce del 
rapporto dose-risposta. Si deve infine tener conto della riproducibilità e dei 
dati storici.
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64. La maggior parte degli esperimenti fornirà risultati chiaramente positivi o 
negativi, ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formu ­
lare un giudizio definitivo sull’azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui o dubbi nonostante l’esperimento venga ripe ­
tuto più volte.
 
65. Risultati positivi del saggio MNvit indicano che una sostanza induce rottura 
cromosomica o perdita di materiale cromosomico nelle cellule germinali della specie sottoposta a test. Risultati negativi indicano che, nelle condi ­
zioni del test, la sostanza in esame non induce rotture cromosomiche e/o 
acquisizione o perdita di materiale cromosomico nelle cellule germinali della specie sottoposta a test.
 
Relazione sul saggio  
66. La relazione sul saggio deve contenere perlomeno le seguenti informazioni, 
se pertinenti per l’esecuzione dello studio:  
Sostanza chimica di prova  
— dati di identificazione e numeri CAS e CE;  
— caratteristiche fisiche e purezza;  
— proprietà fisico-chimiche rilevanti per l’esecuzione dello studio;  
— reattività della sostanza sperimentale al solvente/veicolo o al terreno di 
coltura cellulare;  
Solvente/veicolo  
— motivazione della scelta del solvente/veicolo;  
— solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/veicolo;  
Cellule  
— tipo e origine delle cellule usate;  
— adeguatezza del tipo cellulare usato;  
— assenza di micoplasmi, se del caso;  
— informazioni sulla durata del ciclo cellulare, sui tempi di raddoppia ­
mento o sull’indice di proliferazione;  
— se si utilizzano linfociti, sesso, età e numero dei donatori di sangue, se 
del caso;  
— se si utilizzano linfociti, precisazione in merito all’esposizione di sangue 
intero o di singoli linfociti;  
— numero di passaggi in coltura, se del caso;  
— metodi usati per la conservazione delle colture cellulari, se del caso;  
— numero modale di cromosomi;  
— durata del normale ciclo cellulare (controlli negativi);  
Condizioni di prova  
— identità dell’inibitore della citocinesi (ad esempio, citoB), se impiegato, 
e la sua concentrazione oltre che la durata di esposizione delle cellule;  
— criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, com ­
presi i dati sulla citotossicità e sui limiti di solubilità, se disponibili;  
— composizione del terreno di coltura, concentrazione di CO  2 , se del caso;  
— concentrazioni della sostanza in esame;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 719
 
— concentrazione (e/o volume) del veicolo e della sostanza di prova ag ­
giunti;  
— temperatura e tempo di incubazione;  
— durata del trattamento;  
— momento della raccolta dopo il trattamento;  
— densità delle cellule al momento dell’inoculazione, se del caso;  
— tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, compresi i 
criteri di accettabilità;  
— controlli positivi e negativi;  
— metodi di preparazione dei vetrini e tecniche di colorazione utilizzati;  
— criteri di identificazione dei micronuclei;  
— numeri di cellule analizzate;  
— metodi di misura della citotossicità;  
— eventuali informazioni supplementari pertinenti per la citotossicità;  
— criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi o 
ambigui;  
— metodo o metodi di analisi statistica usati;  
— metodi, come l’uso di anticorpi anticinetocore, per stabilire se i micro ­
nuclei contengono cromosomi interi o frammenti, se del caso;  
Risultati  
— metodo di misurazione della citotossicità impiegato, ad esempio CBPI o 
RI, se si ricorre al metodo dell’inibizione della citocinesi; RICC, RPD o 
PI, se non si ricorre a metodi di inibizione della citocinesi; altre osser ­
vazioni, se del caso, ad esempio confluenza cellulare, apoptosi, necrosi, conta in metafase, frequenza di cellule binucleate;
 
— segni di precipitazione;  
— dati sul pH e sull’osmolalità del terreno di trattamento, se determinati;  
— definizione delle cellule accettabili per l’analisi;  
— distribuzione delle cellule mononucleate, binucleate e multinucleate, se 
si utilizza un metodo di inibizione della citocinesi;  
— numero di cellule con micronuclei, indicato separatamente per ciascuna 
coltura trattata e di controllo, e indicazione relativa alla loro origine (se 
da cellule binucleate o mononucleate), se del caso;  
— relazione concentrazione-risposta, se possibile;  
— dati sui controlli negativi (solvente/veicolo) e positivi (concentrazioni e 
solventi) paralleli;  
— precedenti dati sui controlli negativi (solvente/veicolo) e positivi, con 
variazioni, medie e deviazioni standard e con l’indicazione dell’inter ­
vallo di confidenza (ad esempio, 95 %);  
— analisi statistica; valori p, se noti;  
Discussione dei risultati  
Conclusioni  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 720
 
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29 aprile 2004, relativo agli inquinanti organici persistenti e che modifica la direttiva 79/117/CEE, GU L 229 del 30.4.2004, pag. 5.
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 725
 
Appendice 1  
Definizioni  
Aneugeno:  qualsiasi sostanza o processo che, interagendo con le componenti del 
ciclo mitotico e meiotico di divisione cellulare, determina aneuploidia nelle cel ­
lule o negli organismi.  
Aneuploidia:  qualsiasi deviazione dal normale numero diploide (o aploide) di 
cromosomi da parte di uno o più cromosomi, ma non dell’intero corredo di 
cromosomi (poliploidia).  
Apoptosi:  morte cellulare programmata caratterizzata da una serie di fasi che 
portano alla disintegrazione delle cellule in particelle legate alla membrana, le 
quali vengono poi eliminate mediante fagocitosi o «shedding» (clivaggio dei ricettori di membrana).
 
Proliferazione cellulare:  aumento del numero di cellule dovuto alla divisione 
mitotica delle cellule.  
Centromero:  regione del DNA di un cromosoma in cui la coppia dei cromatidi è 
mantenuta unita e sulla quale sono localizzati fianco a fianco i due cinetocori.  
Clastogeno:  qualsiasi sostanza o processo in grado di provocare aberrazioni nella 
struttura di un cromosoma in popolazioni di cellule o organismi.  
Citocinesi o citodieresi:  il processo di divisione cellulare immediatamente suc ­
cessivo alla mitosi e che porta alla formazione di due cellule figlie, ciascuna contenente un nucleo.
 
Indice di proliferazione cellulare (CBPI):  la proporzione di cellule in fase di 
seconda divisione nella popolazione trattata rispetto al controllo (cfr. l’appendice 2 per la formula).
 
Citostasi:  inibizione della crescita cellulare (cfr. l’appendice 2 per la formula).  
Citotossicità:  effetti dannosi a carico della struttura o della funzione cellulare che 
in ultima istanza provocano la morte della cellula.  
Genotossico:  termine generico che comprende tutti i tipi di danno a carico del 
DNA o dei cromosomi, tra cui rotture, riarrangiamenti degli addotti, alterazioni, aberrazioni cromosomiche e aneuploidia. Non tutti i tipi di effetti genotossici 
determinano alterazioni cromosomiche o danni permanenti ai cromosomi.
 
Cellule in interfase:  cellule non ancora approdate alla fase mitotica.  
Cinetocore:  una struttura proteica che si forma nel centromero di un cromosoma 
e alla quale si agganciano i microtubuli del fuso durante la divisione cellulare, consentendo un movimento ordinato dei cromosomi delle cellule figlie verso i poli di queste ultime.
 
Micronuclei:  piccoli nuclei, distinti e soprannumerari rispetto al principale nucleo 
delle cellule, prodotti durante la telofase della mitosi o della meiosi da frammenti residui di cromosomi o da cromosomi interi.
 
Mitosi:  divisione del nucleo cellulare, solitamente suddivisa in profase, prome ­
tafase, metafase, anafase e telofase.  
Indice mitotico:  il rapporto tra cellule in metafase e il numero totale di cellule 
osservate in una popolazione cellulare; un’indicazione del grado di proliferazione cellulare di una popolazione.
 
Mutageno:  un fattore in grado di provocare mutazioni ereditarie delle sequenze di 
coppie di basi del DNA nei geni o della struttura dei cromosomi (aberrazioni 
cromosomica).  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 726
 
Non disgiunzione:  incapacità della coppia di cromatidi di separarsi e di migrare 
in due cellule figlie distinte in fase di divisione, con la conseguenza che una 
cellula figlia presenterà un numero anomalo di cromosomi.  
Poliploidia:  aberrazioni numeriche dei cromosomi che interessa l’intero corredo 
cromosomico di cellule o organismi, a differenza dall’aneuploidia, che invece interessa un solo cromosoma o più cromosomi, ma non l’intero corredo cromo ­
somico.
 
Indice di proliferazione (PI):  metodo per la misurazione della citotossicità nel 
caso in cui non si utilizzi citoB (cfr. l’appendice 2 per la formula).  
Aumento relativo della conta cellulare (Relative Increase in Cell Count, RICC):  
metodo per la misurazione della citotossicità nel caso in cui non si utilizzi citoB 
(cfr. l’appendice 2 per la formula).  
Raddoppiamento relativo della popolazione (Relative Population Doubling, 
RPD):  metodo per la misurazione della citotossicità nel caso in cui non si utilizzi 
citoB (cfr. l’appendice 2 per la formula).  
Indice di replicazione (RI):  la proporzione dei cicli di divisione cellulare com ­
pletati in una coltura trattata rispetto al controllo, durante il periodo di esposi ­
zione e il recupero (cfr. l’appendice 2 per la formula).  
Sostanza di prova (o sostanza sperimentale):  qualsiasi sostanza o miscela testata 
seguendo il presente metodo di prova.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 727
 
Appendice 2  
Formule per la valutazione della citotossicità  
1. Nei trattamenti con citoB , la valutazione della tossicità deve basarsi sull’in ­
dice di proliferazione cellulare (CBPI) o sull’indice di replicazione (RI) (16) (58). 
Il CBPI indica la media dei cicli cellulari per singola cellula durante il periodo di 
esposizione alla citoB e può essere usato per calcolare la proliferazione cellulare. L’RI indica il numero relativo di nuclei nelle colture trattate rispetto ai controlli e può essere usato per calcolare la % di citostasi:
 
% citostasi = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
e: 
T = coltura di trattamento con la sostanza chimica  
C = coltura di controllo con veicolo  
dove:  
CBPI ¼ ððn: cellule mononucleate Þ þ ð2 Ü n: cellule binucleateÞ þ ð3 Ü n: cellule multinucleate ÞÞ 
ðNumero totale di cellule Þ 
Quindi, un CBPI pari a 1 (tutte le cellule sono mononucleate) equivale a una 
percentuale di citostasi del 100 %.  
Citostasi = 100 – RI  
RI ¼ ððn: cellule binucleateÞ þ ð2 Ü n: cellule multinucleate ÞÞ ö ðNumero totale di cellule Þ T 
ððn: cellule binucleateÞ þ ð2 Ü n: cellule multinucleate ÞÞ ö ðNumero totale di cellule Þ C Ü 100  
T = colture trattate  
C = colture di controllo  
2. Quindi, un RI del 53 % significa che, rispetto al numero di cellule che si 
sono divise per formare cellule binucleate e multinucleate nella coltura di con ­
trollo, nella coltura trattata soltanto il 53 % si è avviato alla divisione, ossia si ha 
una percentuali di citostasi pari al 47 %.  
3. Nei trattamenti senza citoB , si raccomanda di valutare la citotossicità in 
base all’aumento relativo delle conte cellulari (RICC) o al raddoppiamento rela ­
tivo della popolazione (RPD) (58), poiché entrambi i metodi tengono conto della 
proporzione di popolazione cellulare che è andata incontro a divisione.  
RICC ¼ ðAumento del numero di cellule nelle colture trattate  ðdefinitivo – iniziale ÞÞ 
ðAumento del numero di cellule nelle colture di controllo  ðdefinitivo – iniziale ÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðn: di raddoppiamenti della popolazione nelle colture trattate Þ 
ðn: di raddoppiamenti della popolazione nelle colture di controllo Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 728
 
dove:  
Raddoppiamento della popolazione = [logaritmo (numero di cellule dopo il trat ­
tamento ÷ numero di cellule iniziale)] ÷ logaritmo 2  
4. Quindi, un RICC o un RPD del 53 % indica una citotossicità/citostasi del 
47 %.  
5. Con un indice di proliferazione (PI) è possibile valutare la citotossicità 
contando il numero di cloni consistenti in 1 cellula (cl1), 2 cellule (cl2), da 3 
a 4 cellule (cl4) e da 5 a 8 cellule (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Il PI è stato usato come parametro di citotossicità valido e affidabile anche 
per le linee cellulari coltivate in situ in assenza di citoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 729
 
Appendice 3  
Sostanze di riferimento raccomandate per la valutazione della prestazione  ( 1 ) 
Categoria Sostanza CAS CE  
1. Clastogeni attivi senza attivazione metabolica 
Citosina arabinoside 147-94-4 205-705-9 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastogeni che richiedono attivazione metabolica 
Benzo(a)pirene 50-32-8 200-028-5 
Ciclofosfamide 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeni 
Colchicina 64-86-8 200-598-5 Vinblastina 143-67-9 205-606-0 
4. Sostanze negative 
Di-2-etilesilftalato 117-81-7 204-211-0 
Acido nalidixico 389-08-2 206-864-7 Pirene 129-00-0 204-927-3 Cloruro di sodio 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Le sostanze di riferimento sono le sostanze di cui si raccomanda l’uso. Nell’elenco possono essere incluse sostanze alternati ve o 
aggiuntive, purché la loro attività sia nota e inducano la formazione di micronuclei mediante gli stessi meccanismi d’azione, e  
qualora si dimostri che tali sostanze sono rilevanti per le sostanze chimiche che saranno testate con la procedura MNvit. A sec onda 
dello scopo, tra le motivazioni addotte può figurare anche uno studio di convalida che utilizza un’ampia varietà di sostanze o 
incentrato su uno spettro più ridotto in base alla classe chimica della sostanza sperimentale o al meccanismo che produce il da nno. ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 730
 
B.50.  SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY: DA  
INTRODUZIONE  
1. Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche (OCSE 
Guidelines for the Testing of Chemicals) e i metodi di prova dell’UE ven ­
gono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli 
esigenze in materia di regolamentazione, e di considerazioni relative al be ­
nessere degli animali. Il primo metodo di prova (TM) (B.42) per la deter ­
minazione dell’irritazione cutanea nel topo, denominato Local Lymph Node Assay (LLNA; OCSE Test Guideline 429), è stato rivisto (1). Sono state 
pubblicate informazioni dettagliate sulla validazione dell’LLNA nonché una 
revisione delle attività a queste associate (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Nell’LLNA si utilizzano timidina o iodina marcate con traccianti radioisotopici per mi ­
surare la proliferazione dei linfociti; di conseguenza, quando l’acquisizione, 
l’impiego o lo smaltimento della radioattività risultano problematici, il ri ­
corso al saggio è limitato. L’LLNA: DA (sviluppato da Daicel Chemical Industries, Ltd.) è una variante non radioattiva del metodo LLNA, che quantifica il contenuto di adenosina trifosfato (ATP) tramite 
bio-luminescenza utilizzandolo come indicatore della proliferazione linfoci ­
taria. Il saggio LLNA: DA è stato convalidato, rivisto e raccomandato da un gruppo internazionale di esperti scientifici indipendenti, che lo considerano utile per l’individuazione di sostanze chimiche che provocano o non provo ­
cano sensibilizzazione cutanea, con alcuni limiti (10) (11) (12) (13). Il pre ­
sente metodo di prova è stato concepito per valutare il potenziale di sensi ­
bilizzazione cutanea delle sostanze chimiche (sostanze e miscele) negli ani ­
mali. Il capitolo B.6 del presente allegato e la linea guida dell’OCSE «Test 
Guideline 406» utilizzano saggi sui porcellini d’India, segnatamente il saggio 
di massimizzazione sui porcellini d’India e il saggio di Buehler (14). L’LLNA (capitolo B.42 del presente allegato; OCSE Test Guideline 429) e le sue due varianti non radioattive, LLNA: DA (capitolo B.50 del presente 
allegato; OCSE Test Guideline 442 A) e LLNA: BrdU-ELISA (capitolo B.51 
del presente allegato; OCSE Test Guideline 442 B), offrono tutti un vantag ­
gio rispetto ai saggi sui porcellini d’India in B.6 e OCSE Test Guideline 406 (14) in termini di riduzione e perfezionamento dell’utilizzo di animali.
 
2. Simile all’LLNA, l’LLNA: DA studia la fase di induzione della sensibiliz ­
zazione cutanea e fornisce dati quantitativi adeguati per una valutazione 
dose-risposta. Inoltre, la capacità del saggio di individuare sensibilizzanti cutanei senza la necessità di ricorrere a marcatori radioattivi per il DNA elimina il potenziale di esposizione professionale alla radioattività e le pro ­
blematiche correlate allo smaltimento dei rifiuti. Ciò a sua volta può giu ­
stificare un accresciuto impiego dei topi per l’individuazione dei sensibiliz ­
zanti cutanei, che potrebbe ridurre ulteriormente l’uso dei porcellini d’India per testare il potenziale di sensibilizzazione cutanea (B.6; OCSE Test Gui ­
deline 406) (14).
 
DEFINIZIONI  
3. Le definizioni usate figurano nell’appendice 1.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI  
4. Il saggio LLNA: DA è una variante del metodo LLNA da usarsi per iden ­
tificare le potenziali sostanze chimiche che provocano sensibilizzazione cu ­
tanea, con alcuni limiti specifici. Ciò non significa necessariamente che 
l’LLNA: DA vada usato in tutti i casi in sostituzione del metodo LLNA o 
dei test sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14), ma piuttosto che il saggio ha gli stessi meriti e può essere utilizzato in alterna ­
tiva, poiché i risultati positivi e negativi ottenuti con questo metodo non 
richiedono generalmente un’ulteriore conferma (10) (11). Prima di effettuare 
lo studio, il laboratorio che esegue il test deve consultare tutte
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 731
 
le informazioni disponibili sulla sostanza di prova, tra cui l’identità e la 
struttura chimica, le proprietà chimiche-fisiche, i risultati di eventuali altri 
test di tossicità in vitro o in vivo eseguiti sulla sostanza e i dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini. Queste informazioni devono essere consi ­
derate per stabilire l’adeguatezza del saggio LLNA: DA per la sostanza in 
questione [data l’incompatibilità di talune limitate tipologie di sostanze chi ­
miche LLNA: DA (cfr. il punto 5)] e servono a scegliere la dose.
 
5. L’LLNA: DA è un metodo in vivo e, di conseguenza, non elimina l’impiego 
di animali nella valutazione dell’attività allergizzante da contatto. Essa ha però il potenziale di ridurre il numero di animali necessari a tale scopo 
rispetto ai saggi sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14). 
Inoltre, l’LLNA: DA rappresenta un significativo miglioramento (minor sof ­
ferenza e dolore fisico) del modo in cui vengono usati gli animali per gli studi sull’allergia da contatto perché, diversamente dal metodo B.6 e dalla 
linea guida OCSE Test Guideline 406, l’LLNA: DA non richiede la stimo ­
lazione di reazioni di ipersensibilità cutanea indotte da provocazione. Nono ­
stante i vantaggi dell’LLNA: DA rispetto al metodo B.6 e alla linea guida OCSE Test Guideline 406 (14), occorre riconoscere che esistono alcune 
limitazioni che possono rendere necessario l’impiego del metodo B.6 o della 
linea guida OCSE Test Guideline 406 [ad esempio, i test con alcuni metalli, risposte falsi positivi con alcuni irritanti cutanei (tra cui alcune sostanze della categoria dei tensioattivi) (6) (1 e capitolo B.42 del presente allegato), la 
solubilità della sostanza di prova]. Inoltre, le classi di sostanze chimiche o le 
sostanze contenenti gruppi funzionali che hanno dimostrato di agire da po ­
tenziali fattori di confondimento (16) possono richiedere l’uso dei saggi sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14). Si raccomanda di 
applicare anche all’LLNA: DA (10) i limiti che sono stati individuati per 
l’LLNA (1, e capitolo B.42 del presente allegato). Inoltre, l’uso del metodo LLNA: DA potrebbe non essere appropriato per la sperimentazione di so ­
stanze che interferiscono con i livelli di ATP (ad esempio, sostanze che 
funzionano come inibitori degli ATP) o che non permettono un’accurata 
misurazione degli ATP intracellulari (ad esempio, presenza di enzimi che degradano gli ATP, presenza di ATP extracellulari nel linfonodo). A parte tali limiti già rilevati, l’LLNA: DA dovrebbe essere adatto per la sperimen ­
tazione di qualsiasi sostanza chimica, a meno che tale sostanza non possieda 
delle proprietà che possono interferire con l’accuratezza del saggio. Inoltre, non andrebbe esclusa la possibilità di produrre risultati positivi borderline nel caso in cui si ottengano valori per l’indice di stimolazione (SI) compresi tra 
1,8 e 2,5 (cfr. i punti 31-32). Tale considerazione è basata sulla banca dati di 
validazione di 44 sostanze e l’uso di un SI ≥ 1,8 (cfr. il punto 6) nelle quali 
l’LLNA: DA ha correttamente individuato tutti i 32 sensibilizzanti dell’LLNA, ma ha erroneamente identificato tre delle 12 sostanze non sen ­
sibilizzanti dell’LLNA con valori SI compresi tra 1,8 e 2,5 (risultato border ­
line positivo) (10). Tuttavia, poiché lo stesso insieme di dati è stato usato per definire i valori SI e per calcolare le proprietà predittive del test, i risultati 
menzionati potrebbero essere una stima in eccesso delle reali proprietà pre ­
dittive.
 
PRINCIPIO DEL METODO  
6. Il principio fondamentale che sta alla base dell’LLNA: DA è che i sensibi ­
lizzanti inducono una proliferazione di linfociti nel linfonodo responsabile del drenaggio della zona di applicazione della sostanza chimica. Tale proli ­
ferazione è proporzionale alla dose e alla potenza dell’allergene applicato e 
costituisce un semplice mezzo per ottenere una misurazione quantitativa della sensibilizzazione. Tale proliferazione è misurata confrontando la prolifera ­
zione media in ogni gruppo sperimentale con la proliferazione media nei 
controlli trattati con veicolo (VC). Occorre determinare il rapporto fra la 
proliferazione media nel gruppo trattato e quella del gruppo parallelo
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trattato con veicolo, definito «Indice di Stimolazione» (SI), che deve essere ≥ 
1,8 prima che una sostanza sperimentale possa ulteriormente valutata come 
potenziale sensibilizzante cutaneo. Le procedure qui descritte si basano sulla misurazione del contenuto di ATP tramite bioluminescenza (tecnica nota per il conteggio delle cellule vive) (17) per rilevare un aumento del numero di 
cellule in fase di proliferazione nei linfonodi auricolari responsabili del dre ­
naggio (18) (19). Il metodo della bioluminescenza utilizza l’enzima luciferasi per catalizzare la formazione di luce da ATP e luciferina in base alla se ­
guente reazione:
 
ATP + Luciferina  + O 2
 Ossiluciferina  + AMP  + PP  i + CO  2 + Luce  
L’intensità della luce emessa è linearmente correlata alla concentrazione di 
ATP ed è misurata mediante un luminometro. Il saggio luciferina-luciferasi è 
un metodo sensibile per la quantificazione degli ATP usato in un’ampia 
varietà di applicazioni (20).  
DESCRIZIONE DEL SAGGIO  
Selezione delle specie animali  
7. La specie di elezione per questo saggio è il topo. Gli studi di validazione per 
l’LLNA: DA sono stati condotti esclusivamente con il ceppo CBA/J, che 
pertanto è considerato il ceppo da preferire (12) (13). Vanno usate femmine 
di topo, giovani adulte, nullipare e non gravide. All’inizio dello studio, gli animali devono avere un’età compresa fra 8 e 12 settimane e la variazione ponderale degli animali deve essere minima e non superare il 20 % del peso 
medio. In alternativa, è possibile usare altri ceppi ed esemplari di sesso 
maschile quando vengano prodotti dati sufficienti a dimostrare che nella risposta LLNA: DA non esistono differenze significative per il ceppo e/o il genere.
 
Condizioni di alloggio e alimentazione  
8. I topi devono essere sistemati in gruppi (21), a meno che non venga fornita 
una giustificazione scientifica adeguata per la sistemazione dei topi in gabbie 
singole. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). Sebbene l’umidità relativa debba raggiungere almeno il 30 % e preferibil ­
mente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambien ­
ti, occorre puntare a un valore del 50-60 %. L’illuminazione deve essere 
artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 ore d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da labora ­
torio con una quantità illimitata di acqua potabile.
 
Preparazione degli animali  
9. Gli animali vanno selezionati in maniera randomizzata, marcati per consen ­
tire l’identificazione individuale (ma non mediante marchi per orecchio) e 
tenuti nelle loro gabbie per almeno cinque giorni prima del’inizio del dosag ­
gio, per permetterne l’acclimatazione alle condizioni di laboratorio. Prima dell’inizio del trattamento, tutti gli animali vanno esaminati per accertarsi che 
non presentino lesioni cutanee visibili.
 
Preparazione delle soluzioni  
10. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in 
solventi/veicolo e, se necessario, diluite prima dell’applicazione su un orec ­
chio del topo. Le sostanze liquide possono essere applicate direttamente o diluite prima del dosaggio. Le sostanze chimiche insolubili, come quelle 
solitamente presenti nei dispositivi medici, dovrebbero essere sottoposte a 
un’esagerata procedura di estrazione in un solvente adeguato per individuare tutti i componenti estraibili per la sperimentazione prima dell’applicazione a un orecchio del topo. Le sostanze di prova devono essere preparate quoti ­
dianamente, salvo qualora siano disponibili dati sulla stabilità che dimostrino 
che la conservazione è accettabile.
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Controllo dell’affidabilità  
11. Si utilizzano sostanze chimiche per i controlli positivi (PC) per dimostrare 
che il saggio è stato eseguito in modo adeguato, rispondendo con una sen ­
sibilità appropriata e riproducibile a una sostanza sperimentale sensibilizzante per la quale l’entità della risposta SIA ben caratterizzata. Si raccomanda l’inclusione di una sostanza di controllo parallela, che dimostri la compe ­
tenza del laboratorio nel condurre il saggio con successo e che consenta di 
valutare la riproducibilità e la compatibilità all’interno del laboratorio e tra laboratori diversi. Alcune autorità di regolamentazione richiedono inoltre l’uso di un controllo positivo per ciascuno studio; si invitano pertanto gli 
utilizzatori a consultare le autorità competenti prima di eseguire l’LLNA: 
DA. Di conseguenza, è auspicabile l’uso routinario di una sostanza di con ­
trollo parallela onde evitare la necessità di condurre ulteriori esperimenti su animali per soddisfare obblighi che potrebbero emergere dall’impiego perio ­
dico di un controllo positivo (cfr. il punto 12). Il controllo positivo dovrebbe 
produrre una risposta positiva all’LLNA: DA a un livello di esposizione che si ritiene provochi un aumento dell’indice di stimolazione SI ≥ 1,8 rispetto al 
gruppo di controllo negativo (NC). La dose per il controllo positivo va scelta 
in modo che non provochi eccessiva irritazione cutanea o tossicità sistemica 
e che l’induzione sia riproducibile m non eccessiva (ad esempio, un SI > 10 sarebbe eccessivo). Le sostanze di elezione sono un 25 % di esilcinnamal ­
deide (CAS 101-86-0) e un 25 % di eugenolo (CAS 97-53-0,) in acetone: 
olio d’oliva (4:1, v/v). Possono verificarsi occasioni in cui, con adeguata 
giustificazione, è possibile usare altre sostanze di controllo che rispondono ai criteri di cui sopra.
 
12. Se da un lato si raccomanda l’inclusione di un gruppo di controllo positivo, 
possono esservi situazioni in cui l’esame periodico (ossia a intervalli ≤ 6 
mesi) della sostanza di controllo può essere appropriato nel caso di laboratori 
che effettuano l’LLNA: DA regolarmente (ossia con una frequenza non inferiore a una volta al mese) e che hanno a disposizione una banca dati con informazioni storiche consolidate sui controlli positivi, che dimostra la 
capacità del laboratorio di ottenere risultati accurati e riproducibili con le 
sostanze di controllo. Un’adeguata competenza nella conduzione dell’LLNA: DA può essere dimostrata senza difficoltà producendo risultati positivi coe ­
renti con i controlli positivi in almeno 10 saggi indipendenti effettuati in un 
periodo di tempo ragionevole (ossia meno di un anno).
 
13. Un gruppo di controllo positivo parallelo deve essere incluso ogni volta che 
viene introdotta una modifica procedurale nell’LLNA: DA (ad esempio, una 
modifica del personale qualificato, dei materiali e/o dei reagenti usati per il metodo di prova, delle attrezzature impiegate per il metodo di prova, dell’ori ­
gine degli animali sperimentali), e tali modifiche devono essere documentate 
nelle relazioni del laboratorio. Nel valutare la necessità di creare una nuova 
banca dati storica per documentare la coerenza dei risultati sui controlli positivi occorre prendere in considerazione le conseguenze che tali modifiche producono sull’adeguatezza della banca dati pregressa.
 
14. Gli esaminatori devono essere consapevoli del fatto che la decisione di 
condurre uno studio sui controlli positivi con cadenza periodica anziché in 
parallelo ha ripercussioni sull’adeguatezza e sull’accettabilità dei risultati 
negativi ottenuti senza un controllo positivo parallelo nell’intervallo com ­
preso tra ciascuno studio periodico sul controllo positivo. Per esempio, se in uno studio periodico sui controlli positivi si ottiene un risultato falso 
negativo, i risultati negativi ottenuti sulle sostanze sperimentali nell’intervallo 
tra l’ultimo studio periodico accettabile e lo studio periodico sul controllo positivo ritenuto inaccettabile possono essere messi in dubbio. Le implica ­
zioni di questi risultati devono essere considerate con estrema attenzione al 
momento di stabilire se includere controlli positivi paralleli o se condurre 
soltanto studi periodici sui controlli positivi. Si deve inoltre valutare la possibilità di utilizzare un numero di animali inferiore nel gruppo di controlli positivi paralleli, qualora ciò sia scientificamente giustificato e se il labora ­
torio dimostra, sulla scorta di dati storici specifici per il laboratorio, che è 
possibile ricorrere a un numero di topi inferiore (22).
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15. Sebbene la sostanza di controllo positivo vada sottoposta a saggi nel veicolo 
che è noto per la sua capacità di provocare una risposta coerente (ad esem ­
pio, acetone: olio d’oliva; 4:1, v/v), è possibile che si verifichino alcune situazioni normative nelle quali sarà necessario eseguire il saggio anche in un veicolo non standard (formulazione clinicamente/chimicamente pertinen ­
te) (23). Se il controllo positivo parallelo è testato in un veicolo diverso 
rispetto alla sostanza in esame, si deve inserire per il controllo positivo parallelo un VC distinto.
 
16. Nei casi in cui si valutano sostanze sperimentali di una specifica classe 
chimica o nell’ambito di una specifica gamma di risposte, la presenza di 
sostanze di riferimento può essere utile anche per dimostrare che il metodo di prova funziona correttamente per rilevare il potenziale di irritazione cutanea di queste tipologie di sostanze. Le sostanze di riferimento appropriate devono 
avere le seguenti proprietà:
 
— somiglianza strutturale e funzionale con la classe della sostanza in esame;  
— caratteristiche fisiche/chimiche note;  
— dati di supporto provenienti dall’LLNA: DA;  
— dati di supporto provenienti da altri modelli animali e/o dall’uomo.  
PROCEDURA DI PROVA  
Numero di animali e livelli di dose  
17. Ogni gruppo di saggi comprende almeno quattro animali, sui quali si sag ­
giano almeno tre concentrazioni della sostanza sperimentale, più un gruppo 
di controllo negativo parallelo trattato solo con il veicolo della sostanza 
sperimentale e un controllo positivo (parallelo o recente, secondo la politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15). Si deve valutare l’opportunità di testare dosi multiple del controllo positivo, soprattutto se 
quest’ultimo è sottoposto ad esame con modalità intermittente. Salvo il trat ­
tamento con la sostanza in esame, gli animali dei gruppi di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali.
 
18. La selezione della dose e del veicolo è basata sulle raccomandazioni conte ­
nute nelle voci bibliografiche (2) e (24). Le dosi consecutive si selezionano 
normalmente da una concentrazione appropriata tra le seguenti: 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0,5 % ecc. La selezione della concentrazione usata va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche. Ove disponibili, 
occorre tener conto dei dati tossicologici esistenti (ad esempio, tossicità acuta 
e irritazione cutanea) e delle informazioni strutturali e fisico-chimiche sulla sostanza sperimentale d’interesse (e/o sulle sostanze strutturalmente affini), 
nel selezionare le tre concentrazioni consecutive in modo che la concentra ­
zione più elevata massimizzi l’esposizione, evitando al contempo la tossicità sistemica e/o l’eccessiva irritazione cutanea locale (24) (25). In assenza di tali informazioni può essere necessario effettuare un saggio iniziale preliminare 
(cfr. i punti 21-24).
 
19. Il veicolo non deve interferire o condizionare il risultato del saggio e va 
selezionato con l’obiettivo di massimizzare la solubilità per ottenere la con ­
centrazione più elevata possibile, producendo al contempo una soluzione/so ­
spensione adatta all’applicazione della sostanza di prova. I veicoli raccoman ­
dati sono acetone: olio d’oliva (4:1 v/v), N,N-dimetilformammide, metiletil ­
cheton, glicole propilenico e dimetilsulfossido (6), ma è possibile utilizzarne anche altri, fornendo una sufficiente motivazione scientifica. In alcune situa ­
zioni può rendersi necessario l’uso di un solvente clinicamente pertinente o 
la formulazione nella quale la sostanza è posta in commercio, come controllo ulteriore. Occorre prestare particolare cura per assicurare che i materiali idrofili vengano incorporati in un sistema veicolare che inumidisce la pelle 
e non scorre via immediatamente, includendo solventi adeguati (ad esempio, 
1 % Pluronic® L92). Vanno pertanto evitati i veicoli completamente acquosi.
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20. L’elaborazione dei linfonodi da singoli topi consente di valutare la variabilità 
interanimale e permette di effettuare un confronto statistico della differenza 
tra le misurazioni raccolte con la sostanza sperimentale e quelle con il gruppo VC (cfr. il punto 33). Inoltre, è possibile valutare la possibilità di ridurre il numero di topi nel gruppo di controllo positivo soltanto quando si 
raccolgono risultati individuali per ciascun animale (22). Tra l’altro, alcune 
autorità di regolamentazione impongono l’obbligo di raccogliere risultati individuali per ciascun animale. La regolare raccolta di dati individuali per singolo animale offre il vantaggio, dal punto di vista del benessere degli 
animali, di evitare di replicare i test, il che sarebbe invece indispensabile 
se i risultati sulla sostanza sperimentale raccolti originariamente con una modalità (ad esempio, raccogliendo dati aggregati) fossero successivamente considerati dalle autorità di regolamentazione assieme ad altri requisiti (ad 
esempio, dati individuali).
 
Saggio preliminare  
21. In assenza di informazioni per determinare la dose più elevata da testare (cfr. 
il punto 18), è necessario eseguire un saggio preliminare, che consenta di 
definire il livello di doser appropriato per l’LLNA: DA. Scopo del saggio 
preliminare è fornire informazioni orientative per la selezione della dose massima di utilizzo nel principale studio LLNA: DA, nel caso in cui non 
siano disponibili informazioni sulla concentrazione che induce tossicità si ­
stemica (cfr. il punto 24)/o eccessiva irritazione cutanea locale (cfr. il punto 23) La dose massima utilizzata nel saggio deve corrispondere al 100 % della sostanza sperimentale per i liquidi o la concentrazione massima 
possibile per i solidi o le sospensioni.
 
22. Il saggio preliminare è condotto in condizioni identiche allo studio LLNA: DA, 
con la differenza che la proliferazione dei linfonodi non è valutata e che può 
essere utilizzato un numero inferiore di animali per gruppi di saggi. Si suggerisce 
di ricorrere a uno o due animali per gruppo di saggi. Tutti i topi sono sottoposti quotidianamente a osservazioni per la ricerca di eventuali segni clinici di tossicità sistemica o irritazione locale nel sito di applicazione. Il peso è registrato prima del 
saggio e prima della sua conclusione (giorno 8). Entrambe le orecchie dei topi 
sono esaminate per individuare segni di eritema e l’esito dell’ispezione è regi ­
strato sulla scorta della tabella 1 (25). Lo spessore dell’orecchio si misura con un apposito misuratore (ad esempio, un micrometro digitale o un micrometro Pea ­
cock Dial) il giorno 1 (prima della somministrazione della dose), il giorno 3 (circa 
48 ore dopo la prima somministrazione), il giorno 7 (24 ore prima della con ­
clusione dello studio) e il giorno 8. Inoltre, il giorno 8 lo spessore dell’orecchio potrebbe essere calcolato misurando il peso di parti di orecchio prelevate con 
biopsia eseguita dopo la morte dell’animale per eutanasia. Un’irritazione cutanea 
eccessiva a livello locale è indicata da un punteggio ≥ 3 e/o da un aumento dello 
spessore dell’orecchio ≥ 25 % in un qualsiasi giorno di misurazione (26) (27). La 
dose più elevata selezionata per lo studio LLNA: DA principale sarà la dose 
immediatamente inferiore nella serie di concentrazioni utilizzate per il saggio 
preliminare (cfr. il punto 18) che non induce tossicità sistemica e/o irritazione cutanea eccessiva a livello locale.
 
Tabella 1  
Scala di valutazione dell’eritema  
Osservazioni Punteggio  
Nessun eritema 0 
Eritema di lieve entità (appena visibile) 1 Eritema ben visibile 2
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Osservazioni Punteggio  
Eritema da moderato a grave 3 
Eritema grave (rosso barbabietola) con formazione di escare che impedisce 
di valutare l’entità della lesione 4 
23. Oltre all’aumento del 25 % dello spessore dell’orecchio (26) (27), per indi ­
viduare le sostanze irritanti nell’LLNA è stato anche utilizzato un aumento statisticamente significativo dello spessore dell’orecchio nei topi trattati ri ­
spetto ai controlli (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tuttavia, se è vero che 
possono verificarsi aumenti statisticamente significativi dello spessore 
dell’orecchio, altrettanto certo è che quando sono inferiori al 25 % non sono stati associati, nello specifico, a un’eccessiva irritazione (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Le seguenti osservazioni cliniche possono indicare tossicità sistemica (35) se 
usate nell’ambito di una valutazione integrata e, pertanto, possono suggerire 
la dose massima da utilizzare nell’LLNA: DA principale: alterazioni della funzione del sistema nervoso (ad esempio, piloerezione, atassia, tremori e convulsioni); variazioni del comportamento (ad esempio, aggressività, cam ­
biamenti delle attività di toelettatura, marcato cambiamento nel livello di 
attività); variazioni dei pattern respiratori (ossia variazioni della frequenza e dell’intensità della respirazione come dispnea, boccheggiamento e rantoli) e variazioni nel consumo di cibo e acqua. Inoltre, nella valutazione vanno presi 
in considerazione segni di letargia e/o assenza di reattività e qualsiasi altro 
segno di sofferenza e dolore fisico non lieve o momentaneo, o una riduzione ponderale > 5 % dal giorno 1 al giorno 8, oltre che la mortalità. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di 
sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia (36).
 
Protocollo sperimentale dello studio principale  
25. Il protocollo sperimentale del saggio è il seguente:  
— Giorno 1:  Identificare e registrare il peso di ciascun animale singolar ­
mente e riportare eventuali elementi emersi dall’osservazione clinica. Applicare una soluzione acquosa all’1 % di laurilsolfato di 
sodio (SLS) sulla parte posteriore di entrambe le orecchie utilizzando 
un pennello intinto nella soluzione SLS per coprire la parte di orecchio interessata con quattro-cinque pennellate. Un’ora dopo il trattamento con SLS, applicare 25 μL della diluizione appropriata della sostanza speri ­
mentale, del solo veicolo o del controllo positivo (parallelo o recente, 
a seconda della politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15), sulla parte posteriore di entrambe le orecchie.
 
— Giorni 2, 3 e 7:  Ripetere il trattamento con soluzione acquosa all’1 % di 
SLS e la procedura di applicazione eseguita il giorno 1.  
— Giorni 4, 5 e 6:  Nessun trattamento.  
— Giorno 8:  Registrare il peso di ciascun animale ed eventuali elementi 
emersi dall’osservazione clinica. Circa 24-30 ore dopo l’inizio dell’ap ­
plicazione il giorno 7, sottoporre gli animali a eutanasia. Asportare i linfonodi auricolari drenanti di entrambe le orecchie e porli in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per ciascun animale separatamente. I par ­
ticolari e i diagrammi relativi all’identificazione e alla dissezione dei 
linfonodi si trovano nella bibliografia (22). Per un ulteriore controllo della risposta cutanea locale nello studio principale possono essere in ­
clusi nel protocollo altri parametri come il punteggio relativo all’eritema 
o le misurazioni dello spessore dell’orecchio (ottenute utilizzando un 
micrometro o mediante ear punch weight determinations all’autopsia.
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Preparazione delle sospensioni cellulari  
26. Da ciascun topo si prepara una singola sospensione di cellule linfonodali 
asportate bilateralmente inserendo i linfonodi tra due vetrini ed esercitando 
una leggera pressione per schiacciare i linfonodi. Dopo essersi accertati di aver ottenuto un sottile strato di tessuto, aprire i vetrini. Porre il tessuto rimasto sui due vetrini in sospensione in una soluzione salina tampone 
fosfato (PBS): reggere un angolo di ciascun vetrino sopra la piastra di Petri 
e sciacquare con la soluzione, raschiando il tessuto dal vetrino con apposito raschietto. Poiché i linfonodi dei controlli negativi sono piccoli, è importante effettuare queste operazioni con attenzione per evitare di provocare effetti 
artificiali sui valori dell’indice di stimolazione. Per sciacquare i due vetrini è 
necessario un volume complessivo di soluzione PBS pari a 1 mL. La so ­
spensione di linfonodi nella piastra di Petri dev’essere delicatamente omo ­
geneizzata con il raschietto. Raccogliere 20 μL della sospensione con una 
micropipetta, facendo attenzione a non prelevare la membrana visibile a 
occhio nudo, e successivamente miscelare il tessuto prelevato con 1,98 mL di soluzione PBS fino a ottenere un campione di 2 mL. Preparare un secondo campione di 2 mL seguendo la medesima procedura, in modo da predisporre 
due campioni per ciascun animale.
 
Determinazione della proliferazione delle cellule (misurazione del contenuto 
di ATP nei linfociti)  
27. Gli aumenti del contenuto di ATP nei linfonodi si misurano con il metodo 
luciferina/luciferasi avvalendosi di un kit ATP, che misura la biolumine ­
scenza nelle unità di luminescenza relative (RLU). La durata del saggio, 
dal momento della soppressione dell’animale alla misurazione del contenuto 
di ATP per ciascun animale, dev’essere mantenuta uniforme, entro un arco temporale di circa 30 minuti, poiché si ritiene che il contenuto di ATP diminuisca gradualmente nel tempo dopo la morte dell’animale (12). Pertan ­
to, la serie di procedure compresa tra l’escissione dei linfonodi auricolari e la 
misurazione degli ATP dev’essere ultimata entro 20 minuti, secondo il ca ­
lendario prefissato che è lo stesso per ciascun animale. La luminescenza ATP si misura in ciascun campione di 2 mL in modo da raccogliere per ogni 
animale un totale di due misure ATP. In questo modo si determina la 
luminescenza ATP media, che verrà usata per i successivi calcoli (cfr. il punto 30).
 
OSSERVAZIONI  
Osservazioni cliniche  
28. Ogni topo va osservato attentamente almeno una volta al giorno per indivi ­
duare eventuali segni clinici di irritazione locale nel punto di applicazione o 
di tossicità sistemica. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematicamente 
e riportate singolarmente per ciascun topo. I piani di controllo devono in ­
cludere criteri per individuare prontamente gli esemplari che esibiscono tos ­
sicità sistemica, eccessiva irritazione cutanea a livello locale o corrosione 
cutanea per eutanasia (36).  
Peso corporeo  
29. Come illustrato al punto 25, all’inizio del saggio e al momento della sop ­
pressione programmata degli animali per eutanasia occorre individuare il 
peso dei singoli esemplari.  
CALCOLO DEI RISULTATI  
30. I risultati vengono espressi, per ciascun gruppo di trattamento, mediante 
l’indice di stimolazione (SI) medio. L’indice di stimolazione si ottiene divi ­
dendo i valori medi dell’RLU per topo calcolati per ogni gruppo di tratta ­
mento, compreso il controllo positivo, per la media dell’RLU per topo per il 
gruppo di controllo trattato con veicolo/solvente. Quindi l’SI medio per i 
controlli trattati con veicolo è uno.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 738
 
31. Il processo decisionale rispetto a una risposta positiva prevede un indice di 
stimolazione SI ≥ 1,8 (10). Tuttavia, per determinare se un risultato border ­
line (ossia un valore SI compreso tra 1,8 e 2,5) è dichiarato positivo (2) (3) (37), possono anche essere utilizzati la potenza del rapporto dose-risposta, la significatività statistica e la coerenza del solvente/veicolo oltre che le risposte 
dei controlli positivi.
 
32. Nel caso di una risposta positiva borderline con un valore SI compreso tra 
1,8 e 2,5, per confermare che tali risultati sono positivi gli utilizzatori po ­
trebbero voler prendere in considerazione informazioni aggiuntive come il 
rapporto dose-risposta, le prove di tossicità sistemica o irritazione eccessiva 
e, se del caso, la significatività statistica oltre che i valori SI (10). Inoltre, è necessario tener conto di diverse proprietà della sostanza sperimentale, in particolare se ha un rapporto strutturale con noti sensibilizzanti cutanei, se 
causa eccessiva irritazione cutanea nel topo, nonché la natura del rapporto 
dose-risposta rilevato. Queste e altre considerazioni sono illustrate in detta ­
glio in altra sede (4).
 
33. La raccolta di dati a livello di singolo animale consentirà di eseguire un’ana ­
lisi statistica della presenza e del grado di rapporto dose-risposta nei dati. Una qualsiasi analisi statistica potrebbe comprendere una valutazione del rapporto dose-risposta oltre che confronti debitamente aggiustati di gruppi 
sperimentali (ad esempio, confronti parallelizzati tra gruppo dosato e gruppo 
trattato con veicolo/solvente parallelo). Le analisi statistiche possono inclu ­
dere, ad esempio, la regressione lineare o il test di William per valutare l’andamento della dose-risposta, e il test di Dunnett per confronti paralleliz ­
zati. Nella scelta di un metodo adeguato di analisi statistica, lo sperimenta ­
tore deve essere consapevole di possibili ineguaglianze delle varianze e di altri problemi correlati che possono richiedere una trasformazione dei dati o un’analisi statistica non parametrica. In ogni caso lo sperimentatore potrebbe 
dover calcolare l’SI e svolgere analisi statistiche con e senza determinati 
punti (talvolta denominati «aberranti»).
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
34. I dati vanno riassunti sotto forma di tabella, evidenziando i valori RLU medi 
individuali, il valore RLU medio per ciascun animale, il termine di errore associato (ad esempio, SD, SEM) e l’indice di stimolazione medio per cia ­
scun gruppo di dose rispetto al gruppo del controllo parallelo con veicolo/ 
solvente.
 
Relazione sull’esecuzione del saggio  
35. La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
Sostanze di prova e di controllo  
— dati di identificazione (ad esempio, numero CAS e numero CE, se di ­
sponibili; origine; purezza; impurità note; numero di lotto);  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad esempio, volatilità, stabilità, 
solubilità);  
— se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei com ­
ponenti;  
Solvente/veicolo  
— dati di identificazione (purezza; concentrazione, ove pertinente; volume 
usato);  
— giustificazione per la scelta del veicolo;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 739
 
Animali sperimentali  
— origine dei topi del ceppo CBA;  
— condizioni microbiologiche degli animali, se note;  
— numero ed età degli animali;  
— origine degli animali, condizioni di alloggio, dieta ecc.;  
Condizioni del saggio  
— origine, numero di lotto, assicurazione della qualità/dati sul controllo 
della qualità del fabbricante per il kit ATP;  
— dettagli relativi alla preparazione e all’applicazione della sostanza di 
prova;  
— giustificazione per la scelta delle dosi, compresi i risultati del saggio 
preliminare, se eseguito;  
— concentrazioni del veicolo e della sostanza e quantità totale di sostanza 
applicata;  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta, origine dell’acqua);  
— dettagli dei programmi di trattamento e di campionamento;  
— metodi di misurazione della tossicità;  
— criteri per considerare gli studi positivi o negativi;  
— dettagli di eventuali deviazioni dal protocollo e spiegazione su come la 
deviazione influenzi il progetto e i risultati dello studio;  
Controllo dell’affidabilità  
— riassunto dei risultati del più recente controllo dell’affidabilità, comprese 
informazioni sulla sostanza, la concentrazione e il veicolo usato;  
— dati sui controlli positivi e/o negativi (solvente/veicolo), paralleli e/o 
storici, per il laboratorio di prova;  
— se non è stato incluso un controllo positivo parallelo, la data e la rela ­
zione del laboratorio per il controllo positivo periodico più recente e una relazione che riporta nel dettaglio i dati storici sui controlli positivi per il laboratorio, che giustifichi la scelta di base di non effettuare un controllo 
positivo parallelo;
 
Risultati  
— peso dei singoli animali all’inizio dell’applicazione delle dosi e della 
soppressione programmata, oltre che il termine di errore medio e asso ­
ciato (ad esempio, SD, SEM) per ciascun gruppo di trattamento;  
— momento dell’insorgenza e decorso degli eventuali segni di tossicità, 
compresa l’eventuale irritazione cutanea nel punto di applicazione della 
somministrazione, per ciascun animale;  
— momento dell’eliminazione dell’animale e momento della misurazione 
ATP per ciascun animale;  
— tabella dei valori RLU individuali e dei valori SI per ciascun gruppo di 
trattamento;  
— termine di errore medio e associato (ad esempio, SD, SEM) per valore 
RLU per topo per ciascun gruppo di trattamento e i risultati dell’osser ­
vazione aberrante per ciascun gruppo di trattamento;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 740
 
— indice di stimolazione calcolato e un’adeguata misura della variabilità che 
tenga conto della variabilità interanimale sia nella sostanza sperimentale 
che nei gruppi di controllo;  
— rapporto dose-risposta;  
— analisi statistiche, ove pertinenti;  
Discussione dei risultati  
— breve commento sui risultati, sull’analisi dose-risposta e sulle analisi 
statistiche, ove pertinenti, con una conclusione sulla necessità o meno di considerare la sostanza di prova un sensibilizzante cutaneo.
 
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 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 743
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Accuratezza:  grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo di prova e 
i valori di riferimento accettati. Misura l’efficienza del metodo di prova e rap ­
presenta un aspetto della pertinenza. Il termine è usato spesso in modo intercam ­
biabile con «concordanza» per indicare la proporzione di risultati corretti di un metodo di prova (38).
 
Sostanza di riferimento:  sostanza irritante o non irritante usata come standard di 
confronto rispetto a una sostanza di prova. Una sostanza di riferimento dovrebbe 
avere le seguenti proprietà: i) origine o origini coerenti e affidabili; ii) analogia 
strutturale e funzionale alla classe delle sostanze in esame; iii) caratteristiche fisiche/chimiche conosciute; iv) dati di supporto relativi agli effetti noti; v) effi ­
cacia nota nell’ambito della reazione auspicata.
 
Falso negativo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come negativa o non attiva, mentre in realtà si tratta di una sostanza positiva o attiva.
 
Falso positivo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come positiva o attiva, mentre di fatto si tratta di una sostanza negativa o 
non attiva.  
Pericolo:  un potenziale effetto avverso per la salute o l’ambiente. L’effetto 
avverso si manifesta soltanto se c’è un’esposizione di livello sufficiente.  
Riproducibilità fra laboratori:  una misura della possibilità che laboratori quali ­
ficati diversi, seguendo lo stesso protocollo e testando le stesse sostanze di prova, 
riproducano risultati qualitativamente e quantitativamente simili. La riproducibi ­
lità fra laboratori è determinata nel corso dei processi di pre-validazione e vali ­
dazione e indica la misura in cui un saggio può essere trasferito efficacemente tra laboratori; è detta anche riproducibilità inter-laboratorio (38).
 
Riproducibilità all’interno del laboratorio:  La misura della possibilità che per ­
sone qualificate all’interno del medesimo laboratorio, seguendo un protocollo 
specifico, replichino efficacemente i risultati di un saggio. È detta anche ripro ­
ducibilità intra-laboratorio (38).  
Aberrante:  un’osservazione aberrante è un’osservazione marcatamente diversa 
dagli altri valori in un campione casuale di popolazione.  
Assicurazione della qualità:  un processo di gestione in base al quale l’aderenza a 
standard e requisiti di prova e a procedure di registrazione propri di un labora ­
torio e l’accuratezza del trasferimento dei dati sono valutate da individui indi ­
pendenti rispetto a coloro che eseguono le prove.  
Affidabilità:  misura in cui un metodo può essere riprodotto nel tempo all’interno 
dello stesso laboratorio o da laboratori diversi utilizzando il medesimo protocollo. È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratorio (38).
 
Irritazione cutanea:  Un processo immunologico che si verifica quanto un indi ­
viduo suscettibile è esposto a livello topico a un allergene chimico, che provoca 
una risposta immunitaria cutanea che può portare allo sviluppo di sensibilizza ­
zione da contatto.  
Indice di stimolazione (SI):  Un valore calcolato per valutare il potenziale di 
irritazione cutanea di una sostanza di prova, corrispondente al rapporto della 
proliferazione nei gruppi trattati rispetto a quella del gruppo di controllo trattato 
contemporaneamente con veicolo.  
Sostanza di prova (o sostanza sperimentale):  qualsiasi sostanza o miscela testata 
seguendo il presente metodo di prova.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 744
 
B.51. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE 
ASSAY: BrdU-ELISA  
INTRODUZIONE  
1. Le linee guida OCSE «Guidelines for the Testing of Chemicals» e i metodi 
di prova dell’UE sono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scien ­
tifici, delle mutevoli esigenze a livello regolamentare e di considerazioni 
legate al benessere degli animali. Il primo metodo di prova (TM) (B.42) per 
la determinazione dell’irritazione cutanea nel topo, il cosiddetto Local Lymph Node Assay (LLNA; OCSE Test Guideline 429) è stato rivisto (1, e capitolo B.42 del presente allegato). Sono state pubblicate informa ­
zioni dettagliate sulla convalida dell’LLNA oltre che una revisione delle 
attività ad esso associate (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Nell’LLNA si utilizzano timidina o iodina marcate con traccianti radioisotopici per misu ­
rare la proliferazione dei linfociti; di conseguenza, quando l’acquisizione, 
l’impiego o lo smaltimento della radioattività risultano problematici, il ri ­
corso al saggio è limitato. L’LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immu ­
nosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato a un enzima] è una variante non radioattiva del metodo LLNA, che utilizza 5-bromo-2-deossiu ­
ridina (BrdU) non marcata [Chemical Abstracts Service (CAS) n. 59-14-3] 
in un sistema di prova basato su ELISA per misurare la proliferazione dei linfociti. Il saggio LLNA: BrdU-ELISA è stato convalidato e rivisto da un gruppo internazionale di esperti scientifici indipendenti, che ne raccoman ­
dano l’utilizzo perché considerato utile per l’individuazione di sostanze 
chimiche che provocano o non provocano sensibilizzazione cutanea, con alcuni limiti (10) (11) (12). Il presente metodo di prova è stato concepito per valutare il potenziale di sensibilizzazione cutanea delle sostanze chimi ­
che (sostanze e miscele) negli animali. Il capitolo B.6 del presente allegato 
e la linea guida dell’OCSE «Test Guideline 406» utilizzano saggi sui por ­
cellini d’India, segnatamente il saggio di massimizzazione sui porcellini d’India e il saggio di Buehler (13). L’LLNA (capitolo B.42 del presente 
allegato; OCSE Test Guideline 429) e le sue due varianti non radioattive, 
LLNA: BrdU-ELISA (capitolo B.51 del presente allegato; OCSE Test Gui ­
deline 442 B) e LLNA: DA (capitolo B.50 del presente allegato; OCSE Test Guideline 442 A), offrono tutti un vantaggio rispetto ai saggi sui 
porcellini d’India in B.6 e OCSE Test Guideline 406 (13) in termini di 
riduzione e perfezionamento dell’utilizzo di animali.
 
2. Simile all’LLNA, l’LLNA: BrdU-ELISA studia la fase di induzione della 
sensibilizzazione cutanea e fornisce dati quantitativi adeguati per una valu ­
tazione dose-risposta. Inoltre, la capacità del saggio di individuare sensibi ­
lizzanti cutanei senza la necessità di ricorrere a marcatori radioattivi per il 
DNA elimina il potenziale di esposizione professionale alla radioattività e le 
problematiche correlate allo smaltimento dei rifiuti. Ciò a sua volta può giustificare un accresciuto impiego dei topi per l’individuazione dei sensi ­
bilizzanti cutanei, che potrebbe ridurre ulteriormente l’uso dei porcellini 
d’India per testare il potenziale di sensibilizzazione cutanea (B.6; OCSE 
Test Guideline 406) (13).
 
DEFINIZIONI  
3. Le definizioni usate figurano nell’appendice 1.  
CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI  
4. Il saggio LLNA: BrdU-ELISA è una variante del metodo LLNA da usarsi 
per identificare le potenziali sostanze chimiche che provocano sensibilizza ­
zione cutanea, con alcuni limiti specifici. Ciò non significa necessariamente che l’LLNA: BrdU-ELISA vada usato in tutti i casi in sostituzione del 
metodo LLNA o dei test sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 
406) (13), ma piuttosto che il saggio ha gli stessi meriti e può essere utilizzato in alternativa, poiché i risultati positivi e negativi ottenuti con questo metodo non richiedono generalmente un’ulteriore conferma (10) 
(11). Prima di effettuare lo studio, il laboratorio che esegue il test deve 
consultare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza di prova, tra
 ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 745
 
cui l’identità e la struttura chimica, le proprietà chimiche-fisiche, i risultati 
di eventuali altri test di tossicità in vitro o in vivo eseguiti sulla sostanza e i 
dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini. Queste informazioni devono essere considerate per stabilire l’adeguatezza del saggio LLNA: BrdU-ELISA per la sostanza in questione [data l’incompatibilità di talune 
limitate tipologie di sostanze chimiche con il LLNA: BrdU-ELISA (cfr. il 
punto 5)] e servono a scegliere la dose.
 
5. L’LLNA: BrdU-ELISA è un metodo in vivo e, di conseguenza, non elimina 
l’impiego di animali nella valutazione dell’attività sensibilizzante da contat ­
to. Esso ha però il potenziale di ridurre il numero di animali necessari a tale 
scopo rispetto ai saggi sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 
406) (13). Inoltre, l’LLNA: BrdU-ELISA rappresenta un significativo mi ­
glioramento del modo in cui vengono usati gli animali per gli studi sulla sensibilizzazione da contatto perché, diversamente dal metodo B.6 e dalla 
linea guida OCSE Test Guideline 406, l’LLNA: BrdU-ELISA non richiede 
la stimolazione di reazioni di ipersensibilità cutanea indotte da provocazio ­
ne. Inoltre, l’LLNA: BrdU-ELISA non richiede l’uso di un adiuvante, come invece è il caso del saggio di massimizzazione sui porcellini d’India (capi ­
tolo B.6 del presente allegato, 13). Per questo motivo, l’LLNA: 
BrdU-ELISA riduce la sofferenza degli animali. Nonostante i vantaggi dell’LLNA: BrdU-ELISA rispetto al metodo B.6 e alla linea guida OCSE 
Test Guideline 406 (13), occorre riconoscere che esistono alcune limitazioni 
che possono rendere necessario l’impiego del metodo B.6 o della linea guida OCSE Test Guideline 406 [ad esempio, i test con alcuni metalli, risposte falsi positivi con alcuni irritanti cutanei (tra cui alcune sostanze 
della categoria dei tensioattivi) (6) (1, e capitolo B.42 del presente allegato), 
la solubilità della sostanza di prova]. Inoltre, le classi di sostanze chimiche o le sostanze contenenti gruppi funzionali che hanno dimostrato di agire da potenziali fattori di confondimento (15) possono richiedere l’uso dei saggi 
sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (13). Si raccomanda 
di applicare anche all’LLNA: BrdU-ELISA (10) i limiti che sono stati individuati per l’LLNA (1, e capitolo B.42 del presente allegato). A parte tali limiti già rilevati, l’LLNA: BrdU-ELISA dovrebbe essere adatto per la 
sperimentazione di qualsiasi sostanza chimica, a meno che tale sostanza non 
possieda delle proprietà che possono interferire con l’accuratezza del saggio. Inoltre, non andrebbe esclusa la possibilità di produrre risultati positivi borderline nel caso in cui si ottengano valori per l’indice di 
stimolazione (SI) compresi tra 1,6 e 1,9 (cfr. i punti 31-32). Tale conside ­
razione è basata su prove effettuate con la banca dati di validazione di 43 sostanze e l’uso di un SI ≥ 1,6 (cfr. il punto 6), nelle quali l’LLNA: 
BrdU-ELISA ha correttamente individuato tutti i 32 sensibilizzanti 
dell’LLNA, ma ha erroneamente identificato due delle 11 sostanze non 
sensibilizzanti dell’LLNA con valori SI compresi tra 1,6 e 1,9 (risultato borderline positivo) (10). Tuttavia, poiché lo stesso insieme di dati è stato usato per definire i valori SI e per calcolare le proprietà predittive del test, i 
risultati menzionati potrebbero essere una stima in eccesso delle reali pro ­
prietà predittive.
 
PRINCIPIO DEL METODO  
6. Il principio fondamentale che sta alla base dell’LLNA: BrdU-ELISA è che i 
sensibilizzanti inducono una proliferazione di linfociti nel linfonodo respon ­
sabile del drenaggio della zona di applicazione della sostanza chimica. Tale 
proliferazione è proporzionale alla dose e alla potenza dell’allergene appli ­
cato e costituisce un semplice mezzo per ottenere una misurazione quanti ­
tativa della sensibilizzazione. Tale proliferazione è misurata confrontando la 
proliferazione media in ogni gruppo sperimentale con la proliferazione me ­
dia nei controlli trattati con veicolo (VC). Occorre determinare il rapporto fra la proliferazione media nel gruppo trattato e quella del gruppo parallelo trattato con veicolo, definito «Indice di Stimolazione» (SI), che deve essere 
≥ 1,6 prima che una sostanza sperimentale possa essere ulteriormente va ­
lutata come potenziale sensibilizzante cutaneo. Le procedure qui descritte
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si basano sulla misurazione del contenuto di BrdU per rilevare un aumento 
del numero di cellule in fase di proliferazione nei linfonodi auricolari re ­
sponsabili del drenaggio. BrdU è un analogo della timidina, anch’esso similmente incorporato nel DNA delle cellule in fase di proliferazione. Il metodo ELISA misura l’incorporazione di BrdU, utilizzando un anticorpo 
specifico per BrdU che è marcato anche con perossidasi. Quando il sub ­
strato viene aggiunto, la perossidasi reagisce con il substrato per generare un prodotto colorato che è quantificato in una specifica assorbanza con un lettore di micropiastra.
 
DESCRIZIONE DEL SAGGIO  
Selezione delle specie animali  
7. La specie di elezione per questo saggio è il topo. Gli studi di validazione 
per l’LLNA: BrdU-ELISA sono stati condotti esclusivamente con il ceppo CBA/JN, che pertanto è considerato il ceppo da preferire (10) (12). Vanno usate femmine di topo, giovani adulte, nullipare e non gravide. All’inizio 
dello studio, gli animali devono avere un’età compresa fra 8 e 12 settimane 
e la variazione ponderale degli animali deve essere minima e non superare il 20 % del peso medio. In alternativa, è possibile usare altri ceppi ed 
esemplari di sesso maschile quando vengano prodotti dati sufficienti a 
dimostrare che nella risposta LLNA: BrdU-ELISA non esistono differenze significative per il ceppo e/o il genere.
 
Condizioni di alloggio e alimentazione  
8. I topi devono essere sistemati in gruppi (16), a meno che non venga fornita 
una giustificazione scientifica adeguata per la sistemazione dei topi in gab ­
bie singole. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C ± 3 °C. Sebbene l’umidità relativa debba raggiungere almeno il 30 % e preferibil ­
mente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli am ­
bienti, occorre puntare a un valore del 50-60 %. L’illuminazione deve 
essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile.
 
Preparazione degli animali  
9. Gli animali vanno selezionati in maniera randomizzata, marcati per consen ­
tire l’identificazione individuale (ma non mediante marchi per orecchio) e tenuti nelle loro gabbie per almeno cinque giorni prima dell’inizio del dosaggio, per permetterne l’acclimatazione alle condizioni di laboratorio. 
Prima dell’inizio del trattamento, tutti gli animali vanno esaminati per ac ­
certarsi che non presentino lesioni cutanee visibili.
 
Preparazione delle soluzioni  
10. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in 
solventi/veicolo e, se necessario, diluite prima dell’applicazione su un orec ­
chio del topo. Le sostanze liquide possono essere applicate direttamente o 
diluite prima del dosaggio. Le sostanze chimiche insolubili, come quelle solitamente presenti nei dispositivi medici, dovrebbero essere sottoposte a un’esagerata procedura di estrazione in un solvente adeguato per individuare 
tutti i componenti estraibili per la sperimentazione prima dell’applicazione a 
un orecchio del topo. Le sostanze di prova devono essere preparate quoti ­
dianamente, salvo qualora siano disponibili dati sulla stabilità che dimo ­
strino che la conservazione è accettabile.
 
Controllo dell’affidabilità  
11. Si utilizzano sostanze chimiche per i controlli positivi (PC) per dimostrare 
che il saggio è stato eseguito in modo adeguato, rispondendo con una sensibilità appropriata e riproducibile, come una sostanza sperimentale sen ­
sibilizzante per la quale l’entità della risposta sia ben caratterizzata. Si 
raccomanda l’inclusione di una sostanza di controllo parallela, che dimostri 
la competenza del laboratorio nel condurre il saggio con successo e che consenta di valutare la riproducibilità e la comparabilità all’interno del laboratorio e tra laboratori diversi. Alcune autorità di regolamentazione 
richiedono inoltre l’uso di un controllo positivo per ciascuno studio; si 
invitano pertanto gli utilizzatori a consultare le autorità competenti prima
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di eseguire l’LLNA: BrdU-ELISA. Di conseguenza, è auspicabile l’uso 
routinario di una sostanza di controllo parallela onde evitare la necessità 
di condurre ulteriori esperimenti su animali per soddisfare obblighi che potrebbero emergere dall’impiego periodico di un controllo positivo (cfr. il punto 12). Il controllo positivo dovrebbe produrre una risposta positiva 
all’LLNA: BrdU-ELISA a un livello di esposizione che si ritiene provochi 
un aumento dell’indice di stimolazione SI ≥ 1,6 rispetto al gruppo di con ­
trollo negativo (NC). La dose per il controllo positivo va scelta in modo che non provochi eccessiva irritazione cutanea o una tossicità sistemica e che 
l’induzione sia riproducibile ma non eccessiva (ad esempio, un SI > 14 
sarebbe eccessivo). Le sostanze di elezione sono un 25 % di esilcinnamal ­
deide (CAS 101-86-0) e un 25 % di eugenolo (CAS 97-53-0) in acetone: olio d’oliva (4:1, v/v). Possono verificarsi occasioni in cui, con adeguata 
giustificazione, è possibile usare altre sostanze di controllo che rispondano 
ai criteri di cui sopra.
 
12. Se da un lato si raccomanda l’inclusione di un gruppo di controllo positivo, 
possono esservi situazioni in cui l’esame periodico (ossia a intervalli ≤ 6 
mesi) della sostanza di controllo può essere appropriato nel caso di labo ­
ratori che effettuano l’LLNA: BrdU-ELISA regolarmente (ossia con una 
frequenza non inferiore a una volta al mese) e che hanno a disposizione una banca dati con informazioni storiche consolidate sui controlli positivi, che dimostra la capacità del laboratorio di ottenere risultati accurati e ri ­
producibili con le sostanze di controllo. Un’adeguata competenza nella 
conduzione dell’LLNA: BrdU-ELISA può essere dimostrata senza difficoltà producendo risultati positivi coerenti con i controlli positivi in almeno 10 saggi indipendenti effettuati in un periodo di tempo ragionevole (ossia meno 
di un anno).
 
13. Un gruppo di controllo positivo parallelo deve essere incluso ogni volta che 
viene introdotta una modifica procedurale nell’LLNA: BrdU-ELISA (ad esempio, una modifica del personale qualificato, dei materiali e/o dei rea ­
genti usati per il metodo di prova, delle attrezzature impiegate per il metodo 
di prova, dell’origine degli animali sperimentali), e tali modifiche devono essere documentate nelle relazioni del laboratorio. Nel valutare la necessità di creare una nuova banca dati storica per documentare la coerenza dei 
risultati sui controlli positivi occorre prendere in considerazione le conse ­
guenze che tali modifiche producono sull’adeguatezza della banca dati pre ­
gressa.
 
14. Gli esaminatori devono essere consapevoli del fatto che la decisione di 
condurre uno studio sui controlli positivi con cadenza periodica anziché 
in parallelo ha ripercussioni sull’adeguatezza e sull’accettabilità dei risultati negativi ottenuti senza un controllo positivo parallelo nell’intervallo com ­
preso tra ciascuno studio periodico sul controllo positivo. Per esempio, se in 
uno studio periodico sui controlli positivi si ottiene un risultato falso nega ­
tivo, i risultati negativi ottenuti sulle sostanze sperimentali nell’intervallo tra l’ultimo studio periodico accettabile e lo studio periodico sul controllo positivo ritenuto inaccettabile possono essere messi in dubbio. Le implica ­
zioni di questi risultati devono essere considerate con estrema attenzione al 
momento di stabilire se includere controlli positivi paralleli o se condurre soltanto studi periodici sui controlli positivi. Si deve inoltre valutare la possibilità di utilizzare un numero di animali inferiore nel gruppo dei con ­
trolli positivi paralleli, qualora ciò sia scientificamente giustificato e se il 
laboratorio dimostra, sulla scorta di dati storici specifici per il laboratorio, che è possibile ricorrere a un numero di topi inferiore (17).
 
15. Sebbene la sostanza di controllo positivo vada sottoposta a saggi nel veicolo 
che è noto per la sua capacità di provocare una risposta coerente (ad 
esempio, acetone: olio d’oliva; 4:1, v/v), è possibile che si verifichino 
alcune situazioni normative nelle quali sarà necessario eseguire il saggio anche in un veicolo non standard (formulazione clinicamente/chimicamente pertinente) (18). Se il controllo positivo parallelo è testato in un veicolo 
diverso rispetto alla sostanza in esame, si deve inserire per il controllo 
positivo parallelo un VC distinto.
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16. Nei casi in cui si valutano sostanze sperimentali di una specifica classe 
chimica o nell’ambito di una specifica gamma di risposte, la presenza di 
sostanze di riferimento può essere utile anche per dimostrare che il metodo di prova funziona correttamente per rilevare il potenziale di irritazione cutanea di queste tipologie di sostanze sperimentali. Le sostanze di riferi ­
mento appropriate devono avere le seguenti proprietà:
 
— somiglianza strutturale e funzionale con la classe della sostanza in esame;  
— caratteristiche fisiche/chimiche note;  
— dati di supporto provenienti dall’LLNA: BrdU-ELISA;  
— dati di supporto provenienti da altri modelli animali e/o dall’uomo.  
PROCEDURA DI PROVA  
Numero di animali e livelli di dose  
17. Ogni gruppo di saggi comprende almeno quattro animali, sui quali si sag ­
giano almeno tre concentrazioni della sostanza sperimentale, più un gruppo 
di controllo negativo parallelo trattato solo con il veicolo della sostanza 
sperimentale e un controllo positivo (parallelo o recente, secondo la politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11- 15). Si deve valutare l’opportunità di testare dosi multiple del controllo positivo, soprattutto se 
quest’ultimo è sottoposto ad esame con modalità intermittente. Salvo il 
trattamento con la sostanza in esame, gli animali dei gruppi di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali.
 
18. La selezione della dose e del veicolo è basata sulle raccomandazioni con ­
tenute nelle voci bibliografiche 2 e 19. Le dosi consecutive si selezionano 
normalmente da una concentrazione appropriata tra le seguenti: 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ecc. La selezione della concen ­
trazione usata va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche. Ove 
disponibili, occorre tener conto dei dati tossicologici esistenti (ad esempio, 
tossicità acuta e irritazione cutanea) e delle informazioni strutturali e fisico-chimiche sulla sostanza sperimentale d’interesse (e/o sulle sostanze strutturalmente affini), nel selezionare le tre concentrazioni consecutive in 
modo che la concentrazione più elevata massimizzi l’esposizione, evitando 
al contempo la tossicità sistemica e/o l’eccessiva irritazione cutanea a livello locale (19)(20 e capitolo B.4 del presente allegato). In assenza di tali informazioni può essere necessario effettuare un saggio iniziale preliminare 
(cfr. i punti 21-24).
 
19. Il veicolo non deve interferire o condizionare il risultato del saggio e va 
selezionato con l’obiettivo di massimizzare la solubilità per ottenere la concentrazione più elevata possibile, producendo al contempo una soluzio ­
ne/sospensione adatta all’applicazione della sostanza di prova. I veicoli 
raccomandati sono acetone: olio di oliva (4:1 v/v),  N,N -dimetilformammide, 
metiletilcheton, glicole propilenico e dimetilsulfossido (6), ma è possibile utilizzarne anche altri, fornendo una sufficiente motivazione scientifica. In alcune situazioni può rendersi necessario l’uso di un solvente clinicamente 
pertinente o la formulazione nella quale la sostanza sperimentale è posta in 
commercio, come controllo ulteriore. Occorre prestare particolare cura per assicurare che i materiali idrofili vengano incorporati in un sistema veicolare che inumidisce la pelle e non scorre via immediatamente, includendo sol ­
venti adeguati (ad esempio, 1 % Pluronic® L92). Vanno pertanto evitati i 
veicoli completamente acquosi.
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20. L’elaborazione dei linfonodi da singoli topi consente di valutare la variabi ­
lità interanimale e permette di effettuare un confronto statistico della diffe ­
renza tra le misurazioni raccolte con la sostanza sperimentale e quelle con il gruppo VC (cfr. il punto 33). Inoltre, è possibile valutare la possibilità di ridurre il numero di topi nel gruppo del controllo positivo soltanto quando 
si raccolgono risultati individuali per ciascun animale (17). Tra l’altro, 
alcune autorità di regolamentazione impongono l’obbligo di raccogliere risultati individuali per ciascun animale. La regolare raccolta di dati indivi ­
duali per singolo animale offre il vantaggio, dal punto di vista del benessere 
degli animali, di evitare di replicare i test, il che sarebbe invece indispen ­
sabile se i risultati sulla sostanza sperimentale raccolti originariamente con una modalità (ad esempio, raccogliendo dati aggregati) fossero successiva ­
mente considerati dalle autorità di regolamentazione assieme ad altri requi ­
siti (ad esempio, dati individuali).
 
Saggio preliminare  
21. In assenza di informazioni per determinare la dose più elevata da testare 
(cfr. il punto 18) è necessario eseguire un saggio preliminare, che consenta di definire il livello di dose appropriato per l’LLNA: BrdU-ELISA. Scopo 
del saggio preliminare è fornire informazioni orientative per la selezione 
della dose massima di utilizzo nel principale studio LLNA: BrdU-ELISA, nel caso in cui non siano disponibili informazioni sulla concentrazione che induce tossicità sistemica (cfr. il punto 24) e/o eccessiva irritazione cutanea 
locale (cfr. il punto 23). La dose massima utilizzata nel saggio deve corri ­
spondere al 100 % della sostanza sperimentale per i liquidi o la concen ­
trazione massima possibile per i solidi o le sospensioni.
 
22. Il saggio preliminare è condotto in condizioni identiche allo studio LLNA: 
BrdU-ELISA principale, con la differenza che la proliferazione dei linfonodi 
non è valutata e che può essere utilizzato un numero inferiore di animali per gruppi di saggi. Si suggerisce di ricorrere a uno o due animali per gruppo di saggi. Tutti i topi sono sottoposti quotidianamente a osservazioni per la 
ricerca di eventuali segni clinici di tossicità sistemica o irritazione locale 
nel sito di applicazione. Il peso è registrato prima del saggio e prima della sua conclusione (giorno 6). Entrambe le orecchie dei topi sono esaminate per individuare segni di eritema e l’esito dell’ispezione è registrato sulla 
scorta della tabella 1 (20, e capitolo B.4 del presente allegato). Lo spessore 
dell’orecchio si misura con un apposito misuratore (ad esempio, un micro ­
metro digitale o un micrometro Peacock Dial) il giorno 1 (prima della somministrazione della dose), il giorno 3 (circa 48 ore dopo la prima 
somministrazione) e il giorno 6. Inoltre, il giorno 6 lo spessore dell’orecchio 
potrebbe essere calcolato misurando il peso di parti di orecchio prelevate con biopsia eseguita dopo la morte dell’animale per eutanasia. Un’irrita ­
zione cutanea eccessiva a livello locale è indicata da un punteggio ≥ 3 e/o 
da un aumento dello spessore dell’orecchio ≥ 25 % in un qualsiasi giorno di 
misurazione (21) (22). La dose più elevata selezionata per lo studio LLNA: BrdU-ELISA principale sarà la dose immediatamente inferiore nella serie di concentrazioni utilizzate per il saggio preliminare (cfr. il punto 18) che non 
induce tossicità sistemica e/o irritazione cutanea eccessiva a livello locale.
 
Tabella 1  
Scala di valutazione dell’eritema  
Osservazione Punteggio  
Nessun segno di eritema 0 
Eritema di lieve entità (appena visibile) 1 Eritema ben visibile 2
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Osservazione Punteggio  
Eritema da moderato a grave 3 
Eritema grave (rosso barbabietola) con formazione di escare 
che impedisce di valutare l’entità della lesione 4 
23. Oltre all’aumento del 25 % dello spessore dell’orecchio (21) (22), per in ­
dividuare le sostanze irritanti nell’LLNA è stato anche utilizzato un au ­
mento statisticamente significativo dello spessore dell’orecchio nei topi trattati rispetto ai controlli (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Tuttavia, se 
è vero che possono verificarsi aumenti statisticamente significativi dello 
spessore dell’orecchio, altrettanto certo è che quando sono inferiori al 25 % non sono associati, nello specifico, a un’eccessiva irritazione (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Le seguenti osservazioni cliniche possono indicare tossicità sistemica (30) 
se usate nell’ambito di una valutazione integrata e, pertanto, possono sug ­
gerire la dose massima da utilizzare nell’LLNA: BrdU-ELISA principale: alterazioni della funzione del sistema nervoso (ad esempio, piloerezione, 
atassia, tremori e convulsioni); variazioni del comportamento (ad esempio, 
aggressività, cambiamenti delle attività di toelettatura, marcato cambiamento nel livello di attività); variazioni dei pattern respiratori (ossia variazioni 
della frequenza e dell’intensità della respirazione come dispnea, boccheg ­
giamento e rantoli) e variazioni nel consumo di cibo e acqua. Inoltre, nella valutazione vanno presi in considerazione segni di letargia e/o assenza di reattività e qualsiasi altro segno di sofferenza e dolore fisico non lieve o 
momentaneo, o una riduzione ponderale > 5 % dal giorno 1 al giorno 6, 
oltre che la mortalità. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia (31).
 
Protocollo sperimentale dello studio principale  
25. Il protocollo sperimentale del saggio è il seguente:  
— Giorno 1:  Identificare e registrare il peso di ciascun animale singolar ­
mente e riportare eventuali elementi emersi dall’osservazione clinica. 
Applicare 25 μL della diluizione appropriata della sostanza sperimen ­
tale, del solo veicolo o del controllo positivo (parallelo o recente, a seconda della politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15), sulla parte posteriore di entrambe le orecchie.
 
— Giorni 2 e 3:  Ripetere la procedura di applicazione eseguita il giorno 1.  
— Giorno 4:  Nessun trattamento.  
— Giorno 5:  Somministrare 0,5 mL (5 mg/topo) di soluzione BrdU (10 
mg/mL) mediante iniezione intraperitoneale.  
— Giorno 6:  Registrare il peso di ciascun animale. Circa 24 ore (24 h) 
dopo la somministrazione di BrdU, gli animali vanno sottoposti ad 
eutanasia. Asportare i linfonodi auricolari drenanti di entrambe le orec ­
chie e porli in soluzione salina tampone fosfato per ciascun animale separatamente. I particolari e i diagrammi relativi all’identificazione e 
alla dissezione dei linfonodi si trovano alla voce bibliografica (17). Per 
un ulteriore controllo della risposta cutanea locale nello studio princi ­
pale possono essere inclusi nel protocollo altri parametri come il pun ­
teggio relativo all’eritema o le misurazioni dello spessore dell’orecchio 
(ottenute utilizzando un micrometro o mediante biopsie effettuate all’au ­
topsia).
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Preparazione delle sospensioni cellulari  
26. Mediante delicata disaggregazione meccanica attraverso una rete di acciaio 
inossidabile con maglie da 200 μm o un’altra tecnica accettabile (ad esem ­
pio, uso di un pestello in plastica usa e getta per schiacciare i linfonodi, seguito dal passaggio su un filtro di nylon #70) si prepara una singola sospensione cellulare di cellule linfonodali asportate bilateralmente. La pro ­
cedura per la preparazione della sospensione cellulare è fondamentale in 
questo saggio e, pertanto, ogni operatore deve aver già acquisito la neces ­
saria perizia. Oltretutto, negli animali per i controlli negativi i linfonodi sono piccoli, cosicché è necessario intervenire con attenzione per evitare 
effetti artificiali sui valori SI. In ogni caso, il volume bersaglio della so ­
spensione cellulare deve essere aggiustato fino a ottenere un determinato volume ottimizzato (circa 15 mL). Il volume ottimizzato si basa sul rag ­
giungimento di un’assorbanza media del gruppo del controllo negativo 
compresa tra 0,1 e 0,2.
 
Determinazione della proliferazione delle cellule (misurazione del contenuto 
di BrdU nel DNA dei linfociti)  
27. Il metodo ELISA misura il BrdU utilizzando un kit commerciale (ad esem ­
pio, Roche Applied Science, Mannheim, Germania, numero di catalogo 11 
647 229 001). In breve, si aggiungono 100 μL della sospensione cellulare ai 
pozzi di una micropiastra a fondo piatto in triplice copia. Dopo la fissazione e la denaturazione della sospensione, a ogni pozzo si aggiunge un anticorpo anti-BrdU che viene lasciato reagire. Successivamente l’anticorpo anti-BrdU 
viene asportato tramite lavaggio e viene aggiunta la soluzione di substrato, 
lasciando il tempo sufficiente a produrre il cromogeno. Si misura quindi l’assorbanza a 370 nm con una lunghezza d’onda di riferimento di 492 nm. In tutti i casi, le condizioni di prova devono essere ottimizzate (cfr. il 
punto 26).
 
OSSERVAZIONI  
Osservazioni cliniche  
28. Ogni topo va osservato attentamente almeno una volta al giorno per indi ­
viduare eventuali segni clinici di irritazione locale nel punto di applicazione o di tossicità sistemica. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematica ­
mente e riportate singolarmente per ciascun topo. I piani di controllo de ­
vono includere criteri per individuare prontamente gli esemplari che esibi ­
scono tossicità sistemica, eccessiva irritazione cutanea a livello locale o corrosione cutanea per eutanasia (31).
 
Peso corporeo  
29. Come illustrato al punto 25, all’inizio del saggio e al momento della sop ­
pressione programmata degli animali per eutanasia occorre individuare il 
peso dei singoli esemplari.  
CALCOLO DEI RISULTATI  
30. I risultati vengono espressi, per ciascun gruppo di trattamento, mediante 
l’indice di stimolazione (SI) medio. L’indice di stimolazione si ottiene 
dividendo i valori medi dell’indice di marcatura con BrdU per topo calcolati 
per ogni gruppo di trattamento, compreso il gruppo di controllo positivo, per la media dell’indice di marcatura con BrdU per il gruppo di controllo trattato con veicolo/solvente. Quindi l’SI medio per i controlli trattati con 
veicolo è uno.
 
L’indice di marcatura con BrdU è così definito:  
Indice di marcatura con BrdU = (ABS  em – ABS vuoto  em ) – (ABS  ref – ABS vuoto  ref ) 
dove em = lunghezza d’onda delle emissioni e ref = lunghezza d’onda di 
riferimento.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 752
 
31. Il processo decisionale rispetto a una risposta positiva prevede un indice di 
stimolazione SI ≥ 1,6 (10). Tuttavia, per determinare se un risultato bor ­
derline (ossia un valore SI compreso tra 1,6 e 1,9) è dichiarato positivo (3) (6) (32), possono anche essere utilizzati la potenza del rapporto dose-risposta, la significatività statistica e la coerenza del solvente/veicolo 
oltre che le risposte dei controlli positivi.
 
32. Nel caso di una risposta positiva borderline con un valore SI compreso tra 
1,6 e 1,9, per confermare che tali risultati sono positivi gli utenti potrebbero voler prendere in considerazione informazioni aggiuntive come il rapporto dose-risposta, le prove di tossicità sistemica o irritazione eccessiva e, se del 
caso, la significatività statistica oltre che i valori SI (10). Inoltre, è neces ­
sario tener conto di diverse proprietà della sostanza sperimentale, in parti ­
colare se ha un rapporto strutturale con noti sensibilizzanti cutanei, se causa eccessiva irritazione cutanea nel topo, nonché la natura della risposta alla 
dose rilevata. Queste e altre considerazioni sono illustrate in dettaglio in 
altra sede (4).
 
33. La raccolta di dati a livello di singolo animale consentirà di eseguire 
un’analisi statistica della presenza e del grado di rapporto dose-risposta nei dati. Una qualsiasi analisi statistica potrebbe comprendere una valuta ­
zione del rapporto dose-risposta oltre che confronti debitamente aggiustati 
di gruppi sperimentali (ad esempio, confronti parallelizzati tra gruppo do ­
sato e gruppo trattato con veicolo/solvente parallelo). Le analisi statistiche possono includere, ad esempio, la regressione lineare o il test di William per 
valutare l’andamento della dose-risposta, e il test di Dunnett per confronti 
parallelizzati. Nella scelta di un metodo adeguato di analisi statistica, lo sperimentatore deve essere consapevole di possibili ineguaglianze delle va ­
rianze e di altri problemi correlati che possono richiedere una trasforma ­
zione dei dati o un’analisi statistica non parametrica. In ogni caso lo spe ­
rimentatore potrebbe dover calcolare l’SI e svolgere analisi statistiche con e senza determinati punti (talvolta denominati «aberranti»).
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
34. I dati vanno riassunti sotto forma di tabella, evidenziando i valori medi 
individuali dell’indice di marcatura con BrdU, il valore medio dell’indice di 
marcatura con BrdU per ciascun animale per gruppo, il termine di errore associato (ad esempio, SD, SEM) e l’indice di stimolazione medio per ciascun gruppo di dose rispetto al gruppo del controllo parallelo con vei ­
colo/solvente.
 
Relazione sull’esecuzione del saggio  
35. La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
Sostanze di prova e di controllo  
— dati di identificazione (ad esempio, numero CAS e numero CE, se 
disponibili; origine; purezza; impurità note; numero di lotto);  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad esempio, volatilità, stabilità, 
solubilità);  
— se si tratta di una miscela, composizione e percentuali relative dei 
componenti;  
Solvente/veicolo  
— dati di identificazione (purezza; concentrazione, ove pertinente; volume 
usato);  
— giustificazione per la scelta del veicolo;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 753
 
Animali sperimentali  
— origine dei topi del ceppo CBA;  
— condizioni microbiologiche degli animali, se note;  
— numero ed età degli animali;  
— origine degli animali, condizioni di alloggio, dieta ecc.;  
Condizioni del saggio  
— origine, numero di lotto, assicurazione della qualità/dati sul controllo 
della qualità del fabbricante (sensibilità e specificità anticorpale e limite di rilevazione) per il kit ELISA;
 
— dettagli relativi alla preparazione e all’applicazione della sostanza di 
prova;  
— giustificazione per la scelta delle dosi, compresi i risultati del saggio 
preliminare, se eseguito;  
— concentrazioni del veicolo e della sostanza e quantità totale di sostanza 
applicata;  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta, origine dell’acqua);  
— dettagli dei programmi di trattamento e di campionamento;  
— metodi di misurazione della tossicità;  
— criteri per considerare gli studi positivi o negativi;  
— dettagli di eventuali deviazioni dal protocollo e spiegazione su come la 
deviazione influenzi il progetto e i risultati dello studio;  
Controllo dell’affidabilità  
— riassunto dei risultati del più recente controllo dell’affidabilità, comprese 
informazioni sulla sostanza, la concentrazione e il veicolo usato;  
— dati sui controlli positivi e negativi (solvente/veicolo), paralleli e/o sto ­
rici, per il laboratorio di prova;  
— se non è stato incluso un controllo positivo parallelo, la data e la 
relazione del laboratorio per il controllo positivo periodico più recente 
e una relazione che riporta nel dettaglio i dati storici sui controlli po ­
sitivi per il laboratorio, che giustifichi la scelta di base di non effettuare un controllo positivo parallelo;
 
Risultati  
— peso dei singoli animali all’inizio dell’applicazione delle dosi e della 
soppressione programmata, oltre che il termine di errore medio e asso ­
ciato (ad esempio, SD, SEM) per ciascun gruppo di trattamento;  
— momento dell’insorgenza e decorso degli eventuali segni di tossicità, 
compresa l’eventuale irritazione cutanea nel punto di applicazione della somministrazione, per ciascun animale;
 
— tabella degli indici di marcatura con BrdU individuali e dei valori SI per 
ciascun gruppo di trattamento;  
— termine di errore medio e associato (ad esempio, SD, SEM) per indice 
di marcatura con BrdU per topo per ciascun gruppo di trattamento e i 
risultati dell’osservazione aberrante per ciascun gruppo di trattamento;  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 754
 
— indice di stimolazione calcolato e un’adeguata misura della variabilità 
che tenga conto della variabilità interanimale sia nella sostanza speri ­
mentale che nei gruppi di controllo;  
— rapporto dose-risposta;  
— analisi statistiche, ove pertinenti;  
Discussione dei risultati  
— breve commento sui risultati, sull’analisi dose-risposta e sulle analisi 
statistiche, ove pertinenti, con una conclusione sulla necessità o meno di considerare la sostanza di prova un sensibilizzante cutaneo.
 
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Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Accuratezza:  grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo di prova e 
i valori di riferimento accettati. Misura l’efficienza del metodo di prova e rap ­
presenta un aspetto della pertinenza. Il termine è usato spesso in modo intercam ­
biabile con «concordanza» per indicare la proporzione di risultati corretti di un metodo di prova (33).
 
Sostanza di riferimento:  sostanza irritante o non irritante usata come standard di 
confronto rispetto a una sostanza di prova. Una sostanza di riferimento deve 
avere le seguenti proprietà: i) origine o origini coerenti e affidabili; ii) analogia 
strutturale e funzionale alla classe delle sostanze in esame; iii) caratteristiche fisiche/chimiche conosciute; iv) dati di supporto relativi agli effetti noti; v) effi ­
cacia nota nell’ambito della reazione auspicata.
 
Falso negativo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come negativa o non attiva, mentre in realtà si tratta di una sostanza positiva o attiva (33).
 
Falso positivo:  una sostanza di prova erroneamente identificata da un metodo di 
prova come positiva o attiva, mentre di fatto si tratta di una sostanza negativa o 
non attiva (33).  
Pericolo:  un potenziale effetto avverso per la salute o l’ambiente. L’effetto 
avverso si manifesta soltanto se c’è un’esposizione di livello sufficiente.  
Riproducibilità fra laboratori:  una misura della possibilità che laboratori quali ­
ficati diversi, seguendo lo stesso protocollo e testando la stessa sostanza di prova, 
riproducano risultati qualitativamente e quantitativamente simili. La riproducibi ­
lità fra laboratori è determinata nel corso dei processi di pre-validazione e vali ­
dazione e indica la misura in cui un saggio può essere trasferito efficacemente tra laboratori; è detta anche riproducibilità inter-laboratorio (33).
 
Riproducibilità all’interno del laboratorio:  la misura della possibilità che persone 
qualificate all’interno del medesimo laboratorio, seguendo un protocollo specifi ­
co, replichino efficacemente i risultati di un saggio. È detta anche riproducibilità intra-laboratorio (33).
 
Aberrante:  Un’osservazione aberrante è un’osservazione marcatamente diversa 
dagli altri valori in un campione casuale di popolazione.  
Assicurazione della qualità:  un processo di gestione in base al quale l’aderenza a 
standard e requisiti di prova e a procedure di registrazione propri di un labora ­
torio e l’accuratezza del trasferimento dei dati sono valutate da individui indi ­
pendenti rispetto a coloro che eseguono le prove.  
Affidabilità:  misura in cui un metodo può essere riprodotto nel tempo all’interno 
dello stesso laboratorio o da laboratori diversi utilizzando il medesimo protocollo. È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratorio (33).
 
Irritazione cutanea:  un processo immunologico che si verifica quando un indi ­
viduo suscettibile è esposto a livello topico a un allergene chimico, che provoca 
una risposta immunitaria cutanea che può portare allo sviluppo di sensibilizza ­
zione da contatto.  
Indice di stimolazione (SI):  un valore calcolato per valutare il potenziale di 
irritazione cutanea di una sostanza di prova, corrispondente al rapporto della 
proliferazione nei gruppi trattati rispetto a quella del gruppo di controllo trattato 
contemporaneamente con veicolo.  
Sostanza di prova (o sostanza sperimentale):  qualsiasi sostanza o miscela testata 
seguendo il presente metodo di prova.  ▼M3 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 758
 
B.52.  TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE — METODO DELLA 
CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 436 (2009). La prima linea guida sulla 
tossicità acuta per inalazione (TG n. 403) è stata adottata nel 1981 e suc ­
cessivamente riveduta (cfr. capitolo B.2 del presente allegato) (1). Dopo l’adozione della revisione del metodo della classe di tossicità acuta per via orale (capitolo B.1  ter del presente allegato) (5), si è ritenuto opportuno 
mettere a punto un metodo della classe di tossicità acuta per inalazione (2) 
(3) (4). Una valutazione retrospettiva di questo metodo ne ha dimostrato l’idoneità ai fini della classificazione e dell’etichettatura (6). Il metodo di prova della classe di tossicità acuta per inalazione consente di classificare la 
tossicità della sostanza chimica in esame mediante una serie di fasi in cui si 
saggiano concentrazioni fisse predeterminate. Sebbene la letalità sia l’en ­
dpoint fondamentale, gli animali che presentano segni di dolore e sofferenza gravi o morte imminente devono essere sottoposti a eutanasia per ridurne al 
minimo la sofferenza. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 19 (7) 
contiene indicazioni utili per riconoscere tali segni.
 
2. Nel documento d’orientamento sulle prove di tossicità acuta per inalazione 
(documento d’orientamento n. 39) (8) figurano indicazioni sull’esecuzione e 
sull’interpretazione del presente metodo di prova.  
3. Le definizioni usate nell’ambito del presente metodo di prova figurano 
nell’appendice 1 e nel documento di orientamento n. 39 (8).  
4. Questo metodo fornisce informazioni sulla pericolosità della sostanza esa ­
minata, permettendone la classificazione secondo il regolamento (CE) n. 1272/2008 per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità acuta (9). Qualora sia necessario effettuare stime puntuali di valori 
di CL
 50 o analisi della curva concentrazione-risposta, il metodo più adatto è 
quello descritto nel capitolo B.2 del presente allegato (1). Per ulteriori indicazioni sulla scelta del metodo di prova, consultare il documento di orientamento n. 39 (8). Questo metodo di prova non è specificamente de ­
stinato a testare materiali speciali come le materie isometriche o fibrose poco 
solubili o i nanomateriali di sintesi.
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
5. Prima di eseguire una prova in base a questo metodo, il laboratorio deve 
considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, ivi compresi gli studi esistenti i cui risultati concorrano ad escludere la 
necessità di ulteriori prove, al fine di ricorrere il meno possibile all’impiego 
di animali. Tra le informazioni utili per la scelta della specie, del ceppo, del sesso, della modalità di esposizione e delle concentrazioni più adeguati, rientrano l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della 
sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in 
vivo, l’impiego o gli impieghi previsti e potenziali per l’esposizione umana, dati (Q)SAR e dati tossicologici disponibili in merito alle sostanze chimiche di struttura affine. Non si deve utilizzare il presente metodo per saggiare 
concentrazioni che si prevede provochino dolore e sofferenza gravi a causa 
di proprietà corrosive (
 1 ) o fortemente irritanti (cfr. documento di orienta ­
mento n. 39) (8).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 759  
( 1 ) La valutazione della corrosività può fondarsi sul parere di esperti che tenga conto di dati 
sperimentali sull’uomo e su animali, dati (in vitro) esistenti (ad esempio capitolo B.40 
(10) e B.40  bis (11) del presente allegato, oppure linea guida OCSE n. 435 (12), valori 
del pH, informazioni concernenti sostanze simili od ogni altro dato pertinente.
 PRINCIPIO DELLA PROVA  
6. Mediante un procedimento articolato in fasi successive che prevede un 
periodo di esposizione di 4 ore alla sostanza in esame, si ricavano informa ­
zioni sulla sua tossicità acuta per inalazione sufficienti a consentirne la 
classificazione. La durata dell’esposizione può essere diversa se necessario 
a fini di legge. In ciascuna fase di prova di una concentrazione prestabilita sono utilizzati 3 animali dello stesso sesso. In unzione del numero di animali morti e/o moribondi, possono bastare 2 fasi per valutare la tossicità acuta 
della sostanza in esame. Se uno dei due sessi è più sensibile dell’altro, si 
può proseguire la prova solo con gli animali del sesso più sensibile. L’esito di una fase determina come proseguire nella fase successiva, nei seguenti 
termini:
 
a) non occorrono altre prove;  
b) si sottopongono alla prova 3 animali di ciascun sesso; oppure  
c) si sottopongono alla prova 6 animali solo del sesso più sensibile, ossia il 
limite inferiore della classe di tossicità deve essere determinato in base a prove con 6 animali per gruppo di concentrazione in esame, indipenden ­
temente dal sesso.
 
7. Gli animali moribondi o che manifestano segni evidenti di dolore o di 
sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e, ai 
fini dell’interpretazione dei risultati della prova, sono considerati alla stregua di animali morti spontaneamente nel corso dell’esperimento. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in 
stato di grave sofferenza sono oggetto del documento di orientamento n. 19 
(7), che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente.
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Selezione delle specie animali  
8. Si devono utilizzare animali adulti, giovani e sani appartenenti a ceppi 
comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. Occorre 
motivare l’eventuale scelta di un’altra specie.  
Preparazione degli animali  
9. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno dell’esposizio ­
ne, gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane, il cui peso corporeo non eccede ± 20 % del peso medio, per ciascun sesso, degli animali della stessa età precedentemente esposti. Gli 
animali sono scelti a caso e marcati individualmente per poterli identificare. 
Affinché si acclimatino alle condizioni di laboratorio, devono essere lasciati nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova e, poco prima della prova, vanno anche acclimatati alle apparecchiature utilizzate per le 
prove, per attenuare la tensione causata dal nuovo ambiente.
 
Allevamento degli animali  
10. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa 
va idealmente mantenuta tra 30 % e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere 
possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposi ­
zione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con 
un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le 
perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene unicamente per via nasale, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non dovrebbero provocare agli animali eccessivi stress 
fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sui parametri fisio ­
logici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 760
 
al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di 
queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di acclima ­
tamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti «a corpo intero» ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che l’aerosol filtri attraverso il pelo degli 
altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli 
animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità.
 
Camere di inalazione  
11. La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza 
chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposi ­
zione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente 
della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione del corpo intero può essere 
più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve 
essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmo ­
sferica di una camera di esposizione del corpo intero, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume 
della camera. Il documento orientativo 39 (8) descrive i principi delle tecni ­
che di esposizione del corpo intero e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi.
 
CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Somministrazione delle concentrazioni  
12. Si raccomanda un’esposizione della durata fissa di quattro ore, escludendo il 
tempo di equilibrazione. Per esigenze specifiche può essere necessario ri ­
correre ad altri tempi di esposizione, nel qual caso occorre fornire una 
giustificazione nella relazione sullo studio (cfr. documento di orientamento 
n. 39) (8). Gli animali esposti in camere «a corpo intero» devono essere stabulati individualmente per evitare che gli animali coabitanti ingeriscano la sostanza in esame pulendosi reciprocamente il mantello. Durante il periodo 
di esposizione l’alimentazione va sospesa. Nel corso dell’esposizione «a 
corpo intero» si può continuare a somministrare acqua.
 
13. Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, 
aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da saggiare dipende dalle pro ­
prietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta 
e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che essa si presenti nel corso della sua manipolazione e del suo utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere saggiate in atmosfera 
secca. Prestare attenzione ad evitare concentrazioni esplosive.
 
Distribuzione granulometrica  
14. La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che 
potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di 
tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 4 μm con una deviazione standard geometrica ( σ
 g ) compresa tra 1,5 e 3,0 
(8) (13) (14). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, 
ma qualora non ci si riuscisse è necessario presentare il parere di un esperto. Ad esempio, le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole del limite inferiore sopraindicato, e le particelle caricate, le fibre e il materiale 
igroscopico (le cui dimensioni aumentano nell’ambiente umido delle vie 
respiratorie) possono oltrepassare il limite superiore.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 761
 
Preparazione della sostanza in esame in un veicolo  
15. Per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in 
esame nell’atmosfera si può utilizzare un veicolo. Di norma è preferibile utilizzare l’acqua. Per ottenere la distribuzione granulometrica desiderata il 
materiale particellato può essere sottoposto a processi meccanici, avendo 
però cura di non decomporre o alterare la sostanza in esame. Se si ritiene che i processi meccanici abbiano provocato alterazioni (ad esempio, a causa delle alte temperature generate dalla frizione durante una macinazione ec ­
cessiva), si deve analizzare la composizione chimica della sostanza in esa ­
me. Prestare particolare attenzione a non contaminare la sostanza in esame. Non è necessario saggiare le sostanze granulari non friabili, appositamente 
concepite per non poter essere inalate. Per dimostrare che la manipolazione 
del materiale granulare non produce particelle respirabili, effettuare una prova di logorio per attrito. Se questa produce particelle respirabili, effet ­
tuare una prova di tossicità per inalazione.
 
Animali di controllo  
16. Non è necessario un gruppo di controllo negativo (aria) in parallelo. Se per 
produrre l’atmosfera di prova si utilizza un veicolo diverso dall’acqua, è necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo solo se non si dispone di dati storici sulla tossicità. Se lo studio di tossicità di una sostanza in 
esame incorporata in un veicolo non rivela alcuna tossicità, significa che il 
veicolo non è tossico alla concentrazione saggiata e pertanto non è neces ­
sario allestire un gruppo di controllo del veicolo.
 
MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE  
Flusso d’aria nella camera di esposizione  
17. Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in 
continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il 
monitoraggio della concentrazione (o stabilità) dell’atmosfera di prova co ­
stituisce una misura permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare tutti quelli che regolano la produzione dell’atmosfera 
di prova. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione unicamente per via 
nasale, per evitare la reinalazione qualora il flusso d’aria attraverso il si ­
stema di esposizione non sia in grado di produrre una circolazione dinamica dell’atmosfera che contiene la sostanza in esame. Esistono metodologie 
specifiche a cui si può ricorrere per dimostrare l’assenza di reinalazione 
nelle condizioni sperimentali prescelte (8) (15). La concentrazione di ossi ­
geno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non rispettare 
queste concentrazioni, è necessario misurarle.
 
Temperatura e umidità relativa della camera  
18. La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 ± 3 °C. Sia nel 
caso delle esposizioni unicamente per via nasale che per le esposizioni del corpo intero, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è moni ­
torata e registrata almeno tre volte per le prove che durano fino a 4 ore, 
oppure una volta l’ora per le prove più brevi. L’umidità relativa dovrebbe idealmente essere mantenuta tra 30 % e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si studiano miscele 
acquose) o che non possa essere misurata per via delle interferenze della 
sostanza con il metodo di prova.
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Concentrazione nominale della sostanza chimica in esame  
19. Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale 
nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divi ­
sione della massa della sostanza in esame generata per il volume totale di 
aria circolata nella camera. La concentrazione nominale non serve a carat ­
terizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficacia del si ­
stema di prova quanto alla sua capacità di generazione e può essere utile per 
individuare eventuali problemi a questo livello.
 
Concentrazione reale della sostanza chimica in esame  
20. La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame nella 
zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentra ­
zioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio 
campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come 
l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica 
è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate 
prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica 
anche per determinare la concentrazione di un aerosol di polveri con vari componenti, ma in tal caso sono necessari dati analitici che dimostrino che la composizione del prodotto in sospensione nell’aria è analoga a quella del 
prodotto di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario riana ­
lizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evapo ­
rare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con 
il metodo prescelto. Le concentrazioni bersaglio, nominali e reali devono 
essere riportate nella relazione, ma nell’analisi statistica per calcolare i valori delle concentrazioni letali sono utilizzate solo le concentrazioni reali.
 
21. Si utilizza, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione 
allo studio va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare 
la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente 
fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di riten ­
zione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia 
di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che 
effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia, per precauzione, è consigliabile che confermi almeno una parte delle caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.).
 
22. L’atmosfera di esposizione è mantenuta il più costante possibile e monitorata 
in continuo e/o in modo intermittente secondo il metodo di analisi. Quando si 
procede ad un campionamento intermittente, in uno studio di quattro ore si 
devono raccogliere campioni dell’atmosfera della camera almeno due volte. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un solo campione nell’intero pe ­
riodo di esposizione. Se si osservano evidenti fluttuazioni da un campione 
all’altro, per le concentrazioni successive si devono prelevare quattro cam ­
pioni per esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del 
± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o 
solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t
 95 ). La durata di un’esposizione 
corrisponde al tempo in cui la sostanza in esame viene generata, ivi compreso 
il tempo necessario per raggiungere t  95 . Il documento di orientamento n. 39 
(8) contiene indicazioni per la stima di t  95 . ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 763
 
23. Per miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (ad 
esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per pro ­
pulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), 
normalmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza 
chimica in esame è una miscela, nella relazione dovrà essere indicata la concentrazione analitica corrispondente alla miscela e non solo quella del principio attivo o del componente in esame (analita). Informazioni aggiun ­
tive sulle concentrazioni effettive sono reperibili nel documento di orienta ­
mento n. 39 (8).
 
Granulometria della sostanza chimica in esame  
24. La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata al ­
meno due volte nel corso di ciascuna esposizione di 4 ore, utilizzando un 
impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro per la 
misura delle dimensioni aerodinamiche delle particelle. Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. Per confer ­
mare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare 
parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi gra ­
nulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con 
l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (8)]. Se questa 
equivalenza viene stabilita nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misure di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati non conclusivi che potrebbero comportare la 
necessità di ripetere un’esposizione. È necessario effettuare un’analisi gra ­
nulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare ae ­
rosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste (cfr. paragrafo 14).
 
PROCEDURA  
Prova principale  
25. In ogni fase si utilizzano tre animali di ciascun sesso, oppure sei animali del 
sesso più sensibile. Se per l’esposizione solo per via nasale s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. 
Come dose iniziale si sceglie quella tra le quattro concentrazioni fisse che ha 
la maggior probabilità di produrre effetti tossici in alcuni degli animali esposti. Gli schemi di prova per i gas, i vapori e gli aerosol (che figurano nelle appendici da 2 a 4) rappresentano il procedimento da seguire in fun ­
zione dei valori limite delle categorie CLP da 1a 4 (9) stabilite per i gas 
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (appendice 2), per i vapori (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (appendice 3) e per gli aerosol (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (appen ­
dice 4). La categoria 5, che non è prevista dal regolamento (CE) 
n. 1272/2008 (regolamento CLP) (9) si riferisce alle concentrazioni al di 
sopra del relativo limite. Ad ogni concentrazione iniziale si applica lo schema di prova corrispondente. Il modus operandi consiste nel seguire le frecce indicate negli schemi in funzione del numero di animali sottoposti a 
eutanasia o morti spontaneamente, fino a poter stabilire una categoria.
 
26. L’intervallo di tempo tra l’esposizione dei vari gruppi è determinato dalla 
comparsa, dalla durata e dalla gravità dei segni di tossicità rilevati. Si 
espongono animali al livello di concentrazione superiore solo quando si 
ha la ragionevole certezza che i precedenti animali esposti sono sopravvis ­
suti. Si consiglia di far trascorrere tre o quattro giorni tra le esposizioni per consentire l’osservazione di eventuali segni di tossicità tardiva. L’intervallo 
di tempo può essere modificato secondo necessità, ad esempio in caso di 
risposte non conclusive.
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Prova limite  
27. Un prova limite viene effettuata quando si sa per certo o si prevede che la 
sostanza in esame è praticamente non tossica, ossia che determinerà una reazione di tossicità solo al di sopra della concentrazione limite autorizzata. 
Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere rica ­
vate da prove già realizzate con sostanze o miscele simili, tenendo conto dell’identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Se le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame sono 
scarse o nulle, o se ci si attende che sia tossica, è necessario eseguire la 
prova principale (per ulteriori indicazioni, cfr. documento di orientamento n. 39) (8).
 
28. Seguendo il procedimento normale, la prova limite del presente metodo di 
prova consiste nell’esporre tre animali di ciascun sesso, o sei animali del sesso più sensibile, alle concentrazioni di 20 000 ppm per i gas, 20 mg/l per 
i vapori e 5 mg/l per le polveri/nebbie, se raggiungibili. Per le prove con 
aerosol, l’obiettivo principale è ottenere particelle di dimensioni respirabili (ossia DAMM da 1 a 4 μm), il che è possibile con la maggior parte delle 
sostanze testate a una concentrazione di 2 mg/l. Le prove con aerosol a 
concentrazioni superiori a 2 mg/l sono eseguite solo se si è riusciti a gene ­
rare particelle di dimensioni respirabili (cfr. documento di orientamento n. 39) (8). Per ragioni legate al benessere degli animali, il sistema GHS (16) sconsiglia di testare concentrazioni superiori alla concentrazione limite. Per 
quanto concerne la sperimentazione in relazione alla categoria 5 del sistema 
GHS (16), non prevista dal regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), va consi ­
derata solo se è altamente probabile che i risultati abbiano una pertinenza diretta con la protezione della salute umana e occorre darne giustificazione 
nella relazione. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono 
adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare il ricorso inutile ad animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova limite, per accertarsi che sia possibile ottenere le 
condizioni per quest’ultima nella camera.
 
OSSERVAZIONI  
29. Durante il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami 
clinici degli animali. Dopo l’esposizione, l’esame clinico va effettuato al ­
meno due volte il giorno stesso dell’esposizione, o più spesso a seconda 
della risposta degli animali al trattamento, e almeno una volta al giorno nei 
successivi 14 giorni. Il periodo di osservazione non ha durata fissa, in quanto dipende dalla natura dei segni clinici, dal momento della loro com ­
parsa e dalla durata del periodo di recupero. Un elemento importante è 
rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di 
tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare segni di tossicità tardiva. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematica ­
mente e riportate singolarmente per ciascun animale. Gli animali moribondi 
o che manifestano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente 
devono essere sottoposti a eutanasia, per ragioni legate al loro benessere. Occorre fare attenzione, quando si effettua l’esame clinico alla ricerca di segni di tossicità, a non confondere un cattivo aspetto iniziale e alterazioni 
respiratorie passeggere, imputabili al procedimento di esposizione, con gli 
effetti dell’esposizione vera e propria. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento di orientamento OCSE citato in bibliografia al punto (7). Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rin ­
venuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima 
precisione possibile.
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30. Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e 
delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso 
autonomo e centrale, dell’attività e del comportamento somatomotori. Si annoterà, laddove possibile, l’eventuale differenziazione tra gli effetti locali e sistemici. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di 
tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura 
della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione.
 
Peso corporeo  
31. Il peso di ciascun animale è rilevato e annotato una volta durante il periodo 
di acclimatazione, il giorno dell’esposizione, prima che questa abbia inizio (giorno 0), e almeno nei giorni 1, 3 e 7 (e successivamente una volta la 
settimana), così come al momento del decesso o dell’eutanasia, se posteriore 
al giorno 1. Il peso corporeo è manifestamente uno dei primi indici di tossicità e gli animali che mostrano un calo ponderale ≥ 20 % rispetto al 
peso anteriore allo studio devono essere osservati attentamente. Alla fine del 
periodo post esposizione si pesano e si sottopongono a eutanasia gli animali 
sopravvissuti.
 
Patologia  
32. Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della 
prova o che sono sottoposti a eutanasia e ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a necroscopia macrosco ­
pica. Se non è possibile eseguire la necroscopia subito dopo il rilevamento 
del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una tem ­
peratura sufficientemente bassa da rallentare l’autolisi. La necroscopia va effettuata il più rapidamente possibile, di norma entro uno o due giorni dal decesso, annotando per ogni animale tutte le alterazioni patologiche macro ­
scopiche, con particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie.
 
33. È possibile effettuare altri esami previamente inclusi nel disegno sperimen ­
tale, per ampliare il valore interpretativo dello studio, quali, ad esempio, la determinazione del peso polmonare nei ratti sopravvissuti e/o la ricerca, per esame microscopico, di irritazioni delle vie respiratorie. Si possono anche 
esaminare gli organi che mostrano macropatologie negli animali che soprav ­
vivono più di 24 ore, così come gli organi di cui si ha la certezza o il sospetto che siano stati colpiti. L’esame microscopico dell’intero apparato respiratorio può fornire informazioni utili sulle sostanze in esame che reagi ­
scono con l’acqua, come gli acidi e le sostanze chimiche igroscopiche.
 
DATI E RELAZIONE  
Dati 
34. Si devono indicare il peso corporeo e i risultati della necroscopia per ciascun 
animale. I dati degli esami clinici devono essere riassunti in una tabella 
indicante, per ogni gruppo sottoposto alla prova, il numero di animali uti ­
lizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossi ­
cità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli 
effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e l’esito della 
necroscopia.
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Relazione sulla prova  
35. La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi:  
Animali sperimentali e condizioni di allevamento:  
— descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica 
del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta,
 
— specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse 
dal ratto,  
— numero, età e sesso degli animali,  
— metodo di randomizzazione,  
— dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della 
dieta e origine dell’acqua),  
— descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in parti ­
colare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie.  
Sostanza chimica in esame:  
— natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche pertinenti 
(compresa l’isomerizzazione),  
— dati di identificazione e numero CAS, se noto.  
Veicolo:  
— motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione della scelta del 
veicolo utilizzato (se diverso dall’acqua),  
— dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con 
i risultati dello studio.  
Camera di inalazione:  
— descrizione della camera di inalazione, che includa le dimensioni e il 
volume,  
— provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposi ­
zione degli animali e per la generazione dell’atmosfera,  
— apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granu ­
lometria e della concentrazione reale,  
— fonte dell’aria, trattamento dell’aria immessa/estratta e sistema di clima ­
tizzazione utilizzato,  
— metodi utilizzati per tarare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omo ­
geneità dell’atmosfera di prova,  
— differenza di pressione (positiva o negativa),  
— bocchette di esposizione per camera (unicamente via nasale); ubicazione 
degli animali nel sistema (camera di esposizione «a corpo intero»),  
— omogeneità/stabilità nel tempo dell’atmosfera di prova,  
— ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campio ­
namento dell’atmosfera di prova nella camera,  
— velocità del flusso d’aria, velocità del flusso d’aria in ogni bocchetta di 
esposizione («a naso solo») o rapporto tra il volume occupato dagli 
animali e il volume della camera («a corpo intero»),  
— informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per misurare l’ossigeno e il 
diossido di carbonio, se applicabile,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 767
 
— tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t  95 ), 
— numero di cambi di volume per ora,  
— dosatori (se applicabile).  
Dati sull’esposizione:  
— giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio 
principale,  
— concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in 
esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta 
circolare nella camera),  
— concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per 
le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, va ­
pori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse,  
— esprimere le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, 
mg/l, mg/m  3 ecc.), indicando facoltativamente tra parentesi le unità di 
volume (ad esempio, ppm, ppb),  
— distribuzione granulometrica, diametro aerodinamico mediano di 
massa (DAMM) e deviazione standard geometrica ( σ g ), con relativi 
metodi di calcolo. Devono essere indicate anche le singole analisi gra ­
nulometriche.  
Condizioni sperimentali:  
— ragguagli sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando 
le eventuali procedure impiegate per ridurre la granulometria delle so ­
stanze solide o per preparare soluzioni della sostanza in esame. Qualora i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza, in ­
cludere i risultati delle analisi eseguite per verificare la composizione,
 
— descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura 
utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali,  
— ragguagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla validazione di 
tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in 
esame dal mezzo campionato),  
— giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali.  
Risultati:  
— tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera,  
— tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera,  
— tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul cam ­
pionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σ
 g, 
— tabella con risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale 
a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità e durata degli effetti),
 
— peso corporeo di ciascun animale registrato nei giorni in cui si è svolto 
lo studio, precisando la data e l’ora del decesso, se anteriore all’eutana ­
sia programmata; momento della comparsa dei segni di tossicità, loro 
decorso ed eventuale reversibilità, per ciascun animale,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 768
 
— reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun ani ­
male,  
— categoria nel sistema CLP e valore limite della CL  50 . 
Discussione e interpretazione dei risultati:  
— dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per 
soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto 
concerne la concentrazione limite o la granulometria,  
— esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati comples ­
sivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti,  
— tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei 
metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e 
considerare il rapporto tra di esse,  
— considerare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione 
prevalente (sistemico o locale),  
— spiegare perché è stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che 
manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, 
in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (7).
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Capitolo B.2 del presente allegato, Tossicità acuta per inalazione.  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biome ­
tric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. 
Toxicol.  77: 243-254.  
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
(5) Capitolo B.1  ter del presente allegato, Tossicità acuta orale — Metodo 
della classe di tossicità acuta.  
(6) OCSE (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Disponibile all’indirizzo: http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines
 
(7) OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19. Disponibile all’indirizzo: http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines
 
(8) OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Paris. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines  
(9) Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, 
del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’im ­
ballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 
67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) 
n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 769
 
(10) Capitolo B.40 del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: test di 
resistenza elettrica transcutanea (TER).  
(11) Capitolo B.40  bis del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: test su 
modelli di pelle umana.  
(12) OCSE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Dispo ­
nibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Appl. Toxicol. Toxicol.  18: 321-327.
 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167  
(16) ONU (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classifica ­
tion and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York 
and Geneva. Disponibile all’indirizzo: http://www.unece.org/trans/danger/ 
publi/ ghs/ghs_welcome_e.html  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 770
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 771
 
Appendice 2  
Procedimento da seguire per i gas in funzione della concentrazione iniziale 
(ppm/4 h)  
Osservazioni generali (  1 ) 
Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna 
concentrazione iniziale.  
Appendice 2a: concentrazione iniziale di 100 ppm  
Appendice 2b: concentrazione iniziale di 500 ppm  
Appendice 2c: concentrazione iniziale di 2 500 ppm  
Appendice 2d: concentrazione iniziale di 20 000 ppm  
Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali 
sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 772  
( 1 ) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di 
classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione eu ­
ropea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la 
tossicità acuta per inalazione.
 Appendice 2a  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 100 ppm/4 h per i 
gas
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 773
 
Appendice 2b  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 500 ppm/4h per i 
gas
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 774
 
Appendice 2c  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 2 500 ppm/4h per i 
gas
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 775
 
Appendice 2d  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 20 000 ppm/4h per i gas
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 776
 
Appendice 3  
Procedimento da seguire per i vapori in funzione della concentrazione 
iniziale (mg/l/4 h)  
Osservazioni generali (  1 ) 
Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna 
concentrazione iniziale.  
Appendice 3a: concentrazione iniziale 0,5 mg/l  
Appendice 3b: concentrazione iniziale 2,0 mg/l  
Appendice 3c: concentrazione iniziale 10 mg/l  
Appendice 3d: concentrazione iniziale 20 mg/l  
Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali 
sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 777  
( 1 ) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di 
classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione eu ­
ropea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la 
tossicità acuta per inalazione.
 Appendice 3a  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0,5 mg/L/4h per i vapori
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 778
 
Appendice 3b  
Tossicità Acuta per Inalazione:  
Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 2 mg/L/4h per i vapori
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 779
 
Appendice 3c  
Tossicità Acuta per Inalazione:  
Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 10 mg/L/4h per i vapori
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 780
 
Appendice 3d  
Tossicità Acuta per Inalazione:  
Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 20 mg/L/4h per i vapori
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 781
 
Appendice 4  
Procedimento da seguire per gli aerosol in funzione della concentrazione 
iniziale (mg/l/4 h)  
Osservazioni generali (  1 ) 
Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna 
concentrazione iniziale.  
Appendice 4a: concentrazione iniziale 0,05 mg/l  
Appendice 4b: concentrazione iniziale 0,5 mg/l  
Appendice 4c: concentrazione iniziale 1 mg/l  
Appendice 4d: concentrazione iniziale 5 mg/l  
Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali 
sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 782  
( 1 ) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di 
classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione eu ­
ropea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la 
tossicità acuta per inalazione.
 Appendice 4a  
Tossicità Acuta per Inalazione:  
Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0.05 mg/L/4h per i 
vapori
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 783
 
Appendice 4b  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0,5 mg/L/4h per 
gli aerosol
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 784
 
Appendice 4c  
Tossicità acuta per inalazione:  
procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 1 mg/L/4h per gli 
aerosol
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 785
 
Appendice 4d  
Tossicità Acuta per Inalazione:  
Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 5 mg/L/4h per gli 
aerosol
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 786
 
PARTE C: METODI PER LA DETERMINAZIONE 
DELL'ECOTOSSICITÀ  
INDICE 
C.1. TOSSICITÀ ACUTA PER I PESCI 
C.2. SAGGIO DI IMMOBILIZZAZIONE ACUTA IN  DAPHNIA SP  
C.3. ALGHE DI ACQUA DOLCE E CIANOBATTERI, SAGGIO DI 
INIBIZIONE DELLA CRESCITA 
C.4. BIODEGRADAZIONE Determinazione della «pronta» (ready) 
biodegradabilità 
PARTE I. CONSIDERAZIONI GENERALI 
PARTE II. SAGGIO DI RIMOZIONE LENTA DEL DOC (Metodo C.4-A) 
PARTE III. SAGGIO DI SCREENING OCSE MODIFICATO (Metodo 
C.4-B) 
PARTE IV. SAGGIO DI SVILUPPO DEL CO  2 (Metodo C.4-C) 
PARTE V. SAGGIO RESPIROMETRICO MANOMETRICO (Metodo 
C.4-D) 
Parte VI. SAGGIO DELLA BOTTIGLIA CHIUSA (Metodo C.4-E) 
PARTE 
VII. SAGGIO M.I.T.I. (Metodo C.4-F) 
C.5. DEGRADAZIONE — DOMANDA BIOCHIMICA DI OSSI ­
GENO (BOD) 
C.6. DEGRADAZIONE — DOMANDA CHIMICA DI OSSIGENO 
(COD) 
C.7. DEGRADAZIONE — DEGRADAZIONE ABIOTICA: IDRO ­
LISI IN FUNZIONE DEL PH 
C.8. TOSSICITÀ PER I LOMBRICHI 
C.9. BIODEGRADAZIONE — ZAHN — WELLENS TEST C.10. PROVA DI SIMULAZIONE SUI SISTEMI DI TRATTAMENTO 
AEROBICO DEI LIQUAMI: C.10-A: UNITÀ CON FANGHI ATTIVI — C.10-B: BIOFILM 
C.11. BIODEGRADAZIONE — FANGHI ATTIVI: SAGGIO DI INI ­
BIZIONE DELLA RESPIRAZIONE 
C.12. BIODEGRADAZIONE — SAGGIO SCAS MODIFICATO C.13. BIOCONCENTRAZIONE: SAGGIO SUI PESCI, METODO A 
FLUSSO CONTINUO 
C.14. TEST SULLA CRESCITA DEI PESCI GIOVANI 
C.15. PESCI, PROVA DI TOSSICITÀ A BREVE TERMINE SUGLI 
STADI DI EMBRIONI E DI LARVA CON SACCO VITELLINO 
C.16. API MELLIFERE — TEST DI TOSSICITÀ ORALE ACUTA C.17. API MELLIFERE — TEST DI TOSSICITÀ ACUTA PER CON ­
TATTO 
C.18. ADSORBIMENTO/DESORBIMENTO: METODO DISCONTI ­
NUO ALL'EQUILIBRIO
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 787
 
C.19. STIMA DEL COEFFICIENTE DI ADSORBIMENTO  (K OC ) SUL 
TERRENO E SUI FANGHI DI ACQUE DA SCARICO ME ­
DIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTA ­
ZIONE (HPLC) 
C.20. PROVA DI RIPRODUZIONE CON  DAPHNIA MAGNA  
C.21. MICRORGANISMI DEL SUOLO: TEST DI TRASFORMA ­
ZIONE DELL'AZOTO 
C.22. MICRORGANISMI DEL SUOLO: TEST DI TRASFORMA ­
ZIONE DEL CARBONIO 
C.23. TRASFORMAZIONE AEROBICA E ANAEROBICA NEL 
SUOLO 
C.24. TRASFORMAZIONE AEROBICA E ANAEROBICA NEI SI ­
STEMI SEDIMENTOSI ACQUATICI 
C.25. MINERALIZZAZIONE AEROBICA DELLE ACQUE DI SU ­
PERFICIE — SAGGIO DI SIMULAZIONE DELLA BIODE ­
GRADAZIONE 
C.26. SAGGIO DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA DI  LEMNA  SP. 
▼M4 
C.27. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDE IN 
ACQUA-SEDIMENTO CON SEDIMENTO ADDIZIONATO 
C.28. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDI IN 
SEDIMENTO-ACQUA CON ACQUA ADDIZIONATA 
C.29. PRONTA BIODEGRADABILITÀ — CO  2 IN RECIPIENTI ER ­
METICI (prova del CO  2 nello spazio di testa) 
C.30. BIOACCUMULO NEGLI OLIGOCHETI TERRESTRI  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 788
 
C.1. TOSSICITÀ ACUTA PER I PESCI  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Lo scopo di questo saggio è di determinare la tossicità letale acuta di 
una sostanza nei confronti di pesci in acqua dolce. Per poter sce ­
gliere il metodo di saggio (statico, semistatico o a flusso continuo) più idoneo a garantire che le concentrazioni della sostanza in esame si mantengano soddisfacentemente costanti per tutta la durata del 
saggio, è desiderabile disporre, per quanto possibile, di dati concer ­
nenti la solubilità in acqua, la tensione di vapore, la stabilità chimica, le costanti di dissociazione e la biodegradabilità della sostanza in 
esame.
 
Sia per la programmazione della prova che per l'interpretazione dei 
risultati si dovrebbero tenere in considerazione anche altre informa ­
zioni (per esempio formula di struttura, grado di purezza, natura e percentuale delle impurezze significative, presenza e quantità di ad ­
ditivi e coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua).
 
1.2. DEFINIZIONE E UNITÀ  
La tossicità acuta è l'effetto avverso osservabile indotto in un orga ­
nismo entro un breve tempo (giorni) di esposizione ad una data 
sostanza. Nel presente saggio, la tossicità acuta viene espressa 
come concentrazione letale media (CL  50 ), che è la concentrazione 
di una sostanza nell'acqua capace di uccidere il 50 % di un gruppo di pesci entro un periodo continuo di esposizione, la cui durata deve 
essere precisata.
 
Tutte le concentrazioni delle sostanze in esame sono espressi in 
peso/volume (mg/l). Esse possono anche venire espresse in peso/peso 
(mg.kg  -1 ). 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Per dimostrare che, nelle condizioni sperimentali di laboratorio, la 
risposta della specie usata per il saggio non è variata in modo si ­
gnificativo, può essere saggiata una sostanza di riferimento.  
Per il presente saggio non vengono specificate sostanze di riferimento.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Si può eseguire un saggio limite a 100 mg per litro allo scopo di 
dimostrare che la CL  50 è maggiore di questa concentrazione.  
I pesci sono esposti alla sostanza (alle sostanze) in esame, aggiunta 
all'acqua in varie concentrazioni, per un periodo di 96 ore. Le mor ­
talità vengono registrate almeno ad intervalli di 24 ore, quando pos ­
sibile, per ciascun tempo di osservazione si calcola la concentrazione 
(CL  50 ) alla quale muore il 50 % dei pesci.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
I criteri di qualità dovranno essere applicati sia per il saggio limite 
che per il metodo di saggio completo.  
La mortalità negli animali di controllo usati non deve essere supe ­
riore al 10 % (o un pesce se se ne usano meno di 10) ai termine 
della prova.  
La concentrazione dell'ossigeno deve rimanere per tutta la prova al di 
sopra del 60 % del valore di saturazione dell'aria.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 789
 
La concentrazione della sostanza in esame deve essere mantenuta 
entro l'80 % della concentrazione iniziale per tutta la durata della 
prova.  
Per sostanze che si sciolgono facilmente nel mezzo di saggio pro ­
ducendo soluzioni stabili, cioè quelle che non presentano un grado 
significativo di volatilizzazione, degradazione, idrolisi o assorbimen ­
to, la concentrazione iniziale può essere presa equivalente alla con ­
centrazione nominale. Deve essere fornita la documentazione che la 
concentrazione si è mantenuta costante per tutta la durata del saggio 
e che sono stati soddisfatti i criteri di qualità.  
Per sostanze che sono:  
i) scarsamente solubili nel mezzo di saggio; o  
ii) in grado di formare emulsioni o dispersioni stabili; o  
iii) non stabili in soluzione acquosa;  
come concentrazione iniziale si dovrà prendere la concentrazione 
misurata in soluzione (o, se non è possibile tecnicamente, misurata nella colonna d'acqua) all'inizio della prova. La concentrazione sarà 
determinata dopo un periodo di equilibrazione, ma prima dell'intro ­
duzione dei pesci di prova.
 
In ciascuno di questi casi, ulteriori misure devono essere effettuate 
durante il saggio per confermare che la concentrazione di esposizione 
effettiva o i criteri di qualità sono stati rispettati.  
Il pH non dovrebbe variare più di una unità.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
Tre diversi procedimenti possono essere usati.  
Prova statica:  
Prova di tossicità su pesci nel corso della quale non ha luogo alcun 
flusso della soluzione di saggio (le soluzioni non vengono cambiate 
per tutta la durata della prova).  
Prova semistatica:  
Prova senza alcun flusso della soluzione ma nella quale le soluzioni 
di saggio vengono rinnovate ad intervalli regolari e prolungati (ad 
esempio 24 ore).  
Prova a flusso continuo:  
Prova di tossicità nella quale l'acqua è rinnovata costantemente nelle 
vasche di saggio e la sostanza in esame viene trasportata insieme 
all'acqua usata per rinnovare l'ambiente del saggio.  
1.6.1.  Reattivi  
1.6.1.1.  Soluzioni delle sostanze da esaminare  
Si preparano soluzioni di riserva alla concentrazione richiesta, scio ­
gliendo la sostanza in acqua deionizzata o comunque rispondente alle 
caratteristiche descritte al punto 1.6.1.2.  
Le concentrazioni di prova scelte vengono preparate per diluizione 
della soluzione di riserva. Se si saggiano concentrazioni elevate, la 
sostanza può essere disciolta direttamente nell'acqua di diluizione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 790
 
Le sostanze devono normalmente essere saggiate solo fino al limite 
di solubilità. Per alcune sostanze (per esempio sostanze che hanno 
una scarsa solubilità in acqua o un elevato P  ow , o quelle che formano 
dispersioni stabili piuttosto che soluzioni vere in acqua), è accettabile preparare un livello di concentrazione al di sopra del limite di solu ­
bilità della sostanza per garantire di raggiungere la massima concen ­
trazione solubile/stabile. È importante tuttavia che questa concentra ­
zione non disturbi altrimenti il sistema di saggio (per esempio una pellicola della sostanza sulla superficie dell'acqua che impedisca 
l'ossigenazione dell'acqua, ecc.).
 
Si può ricorrere a dispersione ultrasonica, solventi organici, emulsio ­
nanti o disperdenti come aiuto per preparare le soluzioni concentrate 
di riserva delle sostanze di scarsa solubilità in acqua o per disperdere queste sostanze nell'ambiente di prova. Quando si utilizzano tali sostanze ausiliarie, tutte le concentrazioni da saggiare dovrebbero 
contenere la stessa quantità di sostanza ausiliaria, e pesci di controllo 
addizionali dovrebbero essere esposti alla stessa concentrazione della sostanza ausiliaria usata nella serie di concentrazioni da saggiare. La concentrazione di tali sostanze ausiliarie deve essere minimizzata, e 
in nessun caso deve superare i 100 mg per litro nell'ambiente di 
prova.
 
La prova dovrebbe essere effettuata senza aggiustamento del pH. Se 
esiste evidenza di variazioni pronunciate del pH, si consiglia di 
ripetere la prova procedendo all'opportuna regolazione del pH e riportando i risultati. In questo caso, il valore del pH della soluzione 
di riserva dovrebbe essere aggiustato a quello dell'acqua di diluizio ­
ne, a meno che non esistano specifiche ragioni per agire diversamen ­
te. A tal fine sono da preferirsi HCl ed NaOH. Questa regolazione del pH dovrebbe essere effettuata in modo che la concentrazione 
della sostanza in esame nella soluzione di riserva non cambi in 
modo significativo. Qualora la regolazione dovesse provocare rea ­
zioni chimiche o la precipitazione fisica del composto in esame, ciò dovrebbe essere riportato.
 
1.6.1.2.  Acqua di stabulazione e di diluizione  
Si possono impiegare acqua potabile (non contaminata da concen ­
trazioni potenzialmente pericolose di cloro, metalli pesanti od altre sostanze), acqua naturale di buona qualità od acqua ricostituita (cfr. 
Appendice 1). Sono da preferirsi acque con una durezza totale com ­
presa tra 10 e 250 mg/l (come CaCO
 3 ) e con pH fra 6,0 e 8,5.  
1.6.2.  Attrezzatura  
Tutte le attrezzature devono essere costruite in materiale chimica ­
mente inerte.  
— sistema di diluizione automatico (per le prove a flusso continuo),  
— misuratore di ossigeno,  
— apparecchiatura per la determinazione della durezza dell'acqua,  
— apparecchiatura adeguata per il controllo della temperatura,  
— pH-metro.  
1.6.3.  Pesci per il saggio  
I pesci devono essere in buona salute e non presentare evidenti 
malformazioni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 791
 
Le specie usate devono essere scelte sulla base di criteri pratici, 
come la loro facile disponibilità per tutto l'anno, la facilità di man ­
tenimento, la idoneità per il saggio, sensibilità relativa e qualsiasi fattore economico, biologico o ecologico avente qualche rilevanza. Nella scelta della specie di pesce si deve tenere presente anche la 
necessità di poter confrontare i dati ottenuti e l'armonizzazione in ­
ternazionale esistente (riferimento 1).
 
Un elenco di specie ittiche che sono raccomandate per l'esecuzione 
di questo saggio è presentato in Appendice 2. Le specie preferite sono il danio zebrato e la trota.
 
1.6.3.1.  Stabulazione  
I pesci dovrebbero provenire di preferenza da un singolo gruppo con 
lunghezza ed età simili. Essi devono essere mantenuti per almeno 12 giorni nelle seguenti condizioni:
 
densità degli animali:  
appropriata al sistema (riciclo o flusso continuo) e alla specie di 
pesce;  
acqua:  
vedi punto 1.6.1.2;  
illuminazione:  
fotoperiodo da 12 a 16 ore al giorno;  
concentrazione dell'ossigeno disciolto:  
almeno 1'80 % del valore di saturazione dell'aria;  
alimentazione:  
tre volte alla settimana o quotidianamente con sospensione 24 ore 
prima dell'inizio della prova.  
1.6.3.2.  Mortalità  
Dopo un periodo di adattamento di 48 ore, si procede a registrare la 
mortalità e si applicano i seguenti criteri:  
— mortalità superiore al 10 % della popolazione in sette giorni:  
l'intera partita viene respinta,  
— mortalità tra il 5 e il 10 % della popolazione:  
il periodo di adattamento prosegue per altri sette giorni.  
Se non si verificano ulteriori mortalità, la partita è accettabile, in 
caso contrario essa deve essere respinta,  
— mortalità inferiore al 5 % della popolazione:  
la partita è accettabile.  
1.6.4.  Adattamento  
Prima dell'impiego, tutti i pesci debbono essere posti per almeno 
sette giorni in acqua della qualità e temperatura da impiegare per 
il saggio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 792
 
1.6.5.  Procedimento del saggio  
Al saggio definitivo si può far precedere una prova orientativa allo 
scopo di ottenere informazioni per definire l'intervallo di concentra ­
zioni da impiegare.  
In aggiunta alla serie di concentrazioni da saggiare, si esegue anche 
una esposizione di controllo senza la sostanza in esame e, se perti ­
nente, una esposizione di controllo contenente la sostanza ausiliaria.  
A seconda delle proprietà fisiche e chimiche del composto in esame, 
si deve scegliere una prova statica, semistatica o a flusso continuo, secondo quanto più appropriato per soddisfare i criteri di 
qualità.
 
I pesci vengono esposti alla sostanza nel modo indicato di seguito:  
— durata: 96 ore,  
— numero di animali: almeno 7 per concentrazione,  
— vasche: di capacità opportuna secondo il carico raccomandato,  
— densità dei pesci: per i saggi statici e semistatici si raccomanda 
un carico di biomassa massimo di 1,0 g/l; per i sistemi a flusso continuo può essere accettabile un carico più elevato,
 
— concentrazioni di saggio: almeno cinque concentrazioni, diffe ­
renti per un fattore costante non superiore a 2,2, e che, nel limite 
del possibile, coprano l'intervallo di mortalità dallo 0 al 100 %,  
— acqua: vedi punto 1.6.1.2,  
— illuminazione: fotoperiodo quotidiano: da 12 a 16 ore al giorno,  
— temperatura: appropriata alla specie (vedi appendice 2) ma con 
variazioni entro ± 1  o C per ciascuna prova,  
— concentrazione dell'ossigeno disciolto: non meno del 60 % del 
valore di saturazione dell'aria alla temperatura prescelta,  
— alimentazione: nessuna.  
I pesci sono esaminati dopo le prime 2-4 ore ed almeno a intervalli 
di 24 ore. Essi sono considerati morti se toccando il peduncolo caudale non si ha alcuna reazione e non sono visibili movimenti 
respiratori. I pesci morti sono allontanati al momento in cui vengono 
osservati e le mortalità devono essere registrate. Va presa nota delle anormalità visibili (come la perdita di equilibrio, cambiamento di comportamento alla natazione, funzione respiratoria, pigmentazione, 
ecc.).
 
Il pH, l'ossigeno disciolto e la temperatura devono essere misurati 
quotidianamente.  
Saggio limite  
Usando le procedure descritte in questo metodo di saggio, si può 
eseguire un saggio limite a 100 mg per litro allo scopo di dimostrare 
che la CL  50 è più elevata di questa concentrazione.  
Se la natura della sostanza è tale che non si possa raggiungere una 
concentrazione di 100 mg per litro nel mezzo di saggio, il saggio limite deve essere eseguito ad una concentrazione uguale alla solu ­
bilità della sostanza (o alla concentrazione massima formante una 
dispersione stabile) nell'ambiente usato (vedi anche 1.6.1.1.).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 793
 
Il saggio limite deve essere eseguito usando da 7 a 10 pesci, con lo 
stesso numero nel saggio (nei saggi) di controllo. (La teoria bino ­
miale stabilisce che quando si utilizzano 10 pesci con mortalità 0, c'è il 99,9 % di confidenza che la CL
 50 sia maggiore della concentra ­
zione usata nel saggio limite. Con 7, 8 0 9 pesci l'assenza di mor ­
talità assicura una confidenza di almeno il 99 % che la CL  50 sia 
maggiore della concentrazione usata).  
Se si verifica mortalità, occorre eseguire uno studio completo. Se si 
osservano effetti sub-letali, questi devono essere registrati.  
2. DATI E VALUTAZIONE  
Per ciascun periodo in cui sono registrate osservazioni (24, 48, 72 e 
96 ore) riportare su carta logaritmico-pro-babilistica la mortalità per ­
centuale per ciascun periodo di esposizione raccomandato in fun ­
zione della concentrazione.  
Dove è possibile, e per ciascun tempo di osservazione, si dovrebbero 
stimare la CL  50 e i limiti di confidenza statistica (p = 0,05) con l'uso 
di procedure standard; questi valori devono essere arrotondati ad una (o al massimo due) cifre significative (esempi di arrotondamento a 
due cifre: 170 per 173,5; 0,13 per 0,127; 1,2 per 1,21).
 
Nei casi in cui il coefficiente angolare della curva di concentrazione/ ­
risposta percentuale è troppo alto per permettere il calcolo della 
CL 50 , è sufficiente una stima grafica di questo valore.  
Quando due concentrazioni consecutive in un rapporto di 2,2 danno 
solo 0 e 100 % di mortalità, questi due valori sono sufficienti per indicare l'intervallo in cui cade la CL
 50 . 
Qualora si osservasse che la stabilità o l'omogeneità della sostanza in 
esame non può essere mantenuta, tale fatto dovrebbe essere indicato nella relazione e l'interpretazione dei risultati dovrebbe essere fatta 
con prudenza.
 
3. RELAZIONE  
La relazione sulla prova deve, se possibile, includere le seguenti 
informazioni:  
— informazioni sul pesce impiegato per la prova (nome scientifico, 
ceppo, fornitore, eventuali pretrattamenti, grandezza e numero 
impiegato a ciascuna concentrazione di saggio),  
— fonte dell'acqua di diluizione e principali caratteristiche chimiche 
(pH, durezza, temperatura),  
— nel caso di una sostanza di scarsa solubilità in acqua, il metodo 
di preparazione della soluzione concentrata di riserva e della soluzione di saggio,
 
— concentrazione di eventuali sostanze ausiliarie,  
— elenco delle concentrazioni usate e qualsiasi informazione dispo ­
nibile relativa alla stabilità, alle concentrazioni della sostanza chimica provata nella soluzione di saggio,
 
— se si eseguono analisi chimiche, metodi usati e risultati ottenuti,  
— risultati dell'eventuale saggio limite,  
— ragioni della scelta e dettagli del procedimento usato nel saggio (per 
esempio statico, semistatico, tasso di dosaggio, portata nel caso di 
flusso continuo, eventuale aereazione, densità dei pesci, ecc.),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 794
 
— descrizione dell'apparecchiatura sperimentale,  
— regime di illuminazione,  
— concentrazione dell'ossigeno disciolto, pH e temperatura delle 
soluzioni di saggio ogni 24 ore,  
— evidenze del fatto che sono stati soddisfatti i criteri di qualità,  
— una tabella che presenti la mortalità cumulativa a ciascuna con ­
centrazione e nel controllo (e controllo con la sostanza ausiliaria, 
se richiesto) a ciascuno dei tempi di osservazione raccomandati,  
— grafico della curva di concentrazione/risposta percentuale al ter ­
mine del saggio,  
— se possibile, i valori di CL  50 a ciascuno dei tempi di osservazione 
raccomandati (con limiti di confidenza statistica al 95 %),  
— procedure statistiche usate per determinare i valori della CL  50 , 
— se si usa una sostanza di riferimento, risultati ottenuti,  
— concentrazione di saggio massima che non ha causato mortalità 
nel periodo di saggio,  
— concentrazione di saggio minima che ha provocato il 100 % di 
mortalità nel periodo del saggio.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Brachydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fìsh  (Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan —  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
through method.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
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(6) DIN Tesrverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L 
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(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
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(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes rum akuten 
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(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
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(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
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Appendice 1  
Acqua ricostituita  
Esempio di acqua di diluizione appropriata  
Tutti i prodotti chimici devono avere purezza analitica.  
Dovrebbe essere impiegata acqua distillata di buona qualità oppure acqua deio ­
nizzata, di conduttività, inferiore a 5 μScm  -1 
L'apparecchio per la distillazione dell'acqua non deve contenere parti in rame.  
Soluzioni di riserva  
CaCl  2 . 2H  2 O (calcio cloruro diidrato): 
Sciogliere e portare ad un litro con acqua. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (magnesio solfato eptaidrato): 
Sciogliere e portare ad un litro con acqua. 4,93 g 
NaHCO  3 (sodio bicarbonato): 
Sciogliere e portare ad un litro con acqua. 2,59 g 
KCl (potassio cloruro): 
Sciogliere e portare ad un litro con acqua. 0,23 g  
Acqua di diluizione ricostituita  
Mescolare 25 ml di ciascuna delle quattro soluzioni di riserva e portare ad un 
litro con acqua.  
Aerare finchè la concentrazione dell'ossigeno disciolto uguagli il valore di satu ­
razione per l'aria.  
Il pH dovrebbe essere di 7,8 ± 0,2.  
Se necessario regolare il pH mediante aggiunte di NaOH (sodio idrossido) o HCl 
(acido cloridrico).  
L'acqua di diluizione così preparata viene lasciata da parte per circa 12 ore e non 
richiede alcuna ulteriore aerazione.  
La somma degli ioni Ca e Mg in questa soluzione è di 2,5 mmol/l. II 
rapporto degli ioni Ca e Mg è di 4:1 e quello degli ioni Na e K è di 
10:1. L'alcalinità totale di questa soluzione è 0,8 mmol/1.  
Eventuali deviazioni nel modo di preparare l'acqua di diluizione non devono 
modificarne la composizione e le proprietà.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 797
 
Appendice 2  
Specie di pesci raccomandate per il saggio  
Specie raccomandate Intervallo di tem ­
peratura racco ­
mandato per il 
saggio (  o C) Lunghezza totale 
racommandata per 
gli animali da 
saggio (cm)  
Brachydanio reno (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Danio Zebrato 20 a 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Fathead minnow 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) Carpe commune 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae Cypri ­
nodonti-dae)  (Tomminck et Schlegel 1850) 
Red Killifish 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque Linnaeus 1758) Bluegill 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Trota iridea 12 a 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) Golden orfe 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Raccolta  
I pesci suelencati sono allevabili facilmente e/o sono largamente disponibili per 
tutto l'anno. Possono riprodursi e essere mantenuti sia in stabilimenti di acqui ­
coltura sia in laboratorio, sotto condizioni di controllo delle malattie e dei pa ­
rassiti, in modo che gli animali di saggio saranno sani e geneticamente control ­
lati. Questi pesci sono disponibili in molte parti del mondo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 798
 
Appendice 3  
Esempio di curva concentrazione/percento di mortalità  
Esempio di determinazione della CL  50 usando carta log-probit.
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 799
 
C.2. SAGGIO DI IMMOBILIZZAZIONE ACUTA IN  DAPHNIA SP.  
1. METODO  
Il presente metodo di prova di immobilizzazione acuta corrisponde a 
quello descritto nelle linee guida dell'OCSE TG 202 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo descrive un saggio di tossicità acuta 
finalizzato a determinare gli effetti di una sostanza chimica sulle dafnie. Per quanto possibile sono stati utilizzati i me ­
todi di prova esistenti (1)(2)(3).
 
1.2. DEFINIZIONI  
Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni:  
EC 50 : concentrazione stimata che immobilizza il 50 % delle dafnie 
entro un periodo di esposizione prestabilito. Se si applica una defi ­
nizione diversa, è necessario indicarlo con i relativi riferimenti bi ­
bliografici.  
Immobilizzazione:  sono considerati immobili gli animali che, dopo 
lieve agitazione del contenitore usato per il saggio, non sono in grado di nuotare entro 15 secondi (anche se possono ancora muovere le antenne).
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO  
Le giovani dafnie, di età inferiore a 24 ore all'inizio del saggio, sono 
esposte alla sostanza di prova ad un certo range di concentrazione 
per 48 ore. L'immobilizzazione viene registrata dopo 24 ore e dopo 48 ore e comparata ai valori di controllo. I risultati sono successi ­
vamente analizzati per calcolare la EC
 50 a 48 ore (cfr. definizioni al 
punto 1.2.). La determinazione della EC  50 a 24 ore è facoltativa.  
1.4. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
È necessario conoscere la solubilità in acqua e la pressione di vapore 
della sostanza di prova e deve essere disponibile un metodo analitico affidabile per quantificare la sostanza nelle soluzioni di prova con 
una efficienza di recupero e un limite di rilevamento noti. Tra le 
informazioni utili di cui disporre figurano la formula di struttura, la purezza della sostanza, la stabilità in acqua o alla luce, P
 ow e i 
risultati di un saggio di biodegradabilità con metodo  ready  (cfr. 
metodo C.4).  
Nota: orientamenti per testare sostanze con caratteristiche fisico-chi ­
miche che rendono difficoltosa l'esecuzione del saggio sono conte ­
nuti in (4).  
1.5. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Una sostanza di riferimento può essere sottoposta a prova per deter ­
minarne l'EC50 al fine di garantire che le condizioni di prova sono 
affidabili. A tal fine si raccomanda l'utilizzo di tossicanti utilizzati in prove interlaboratorio  (ring test)  (1)(5) (
 1 ). La o le prove con una 
sostanza di riferimento devono essere condotte preferibilmente una 
volta al mese e almeno due volte l'anno.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 800  
( 1 ) I risultati di queste prove interlaboratorio e una rettifica tecnica alla norma tecnica ISO 
6341 danno una EC50 — 24 h del dicromato di potassio (K  2 Cr 2 O 7 ) nell'intervallo 0,6 
mg/l-1,7mg/l.
 1.6. CRITERI DI QUALITÀ  
Ai fini della validità del saggio devono applicarsi i seguenti criteri:  
— nei controlli, compreso il controllo contenente l'agente di solubi ­
lizzazione, l'immobilizzazione nelle dafnie non deve superare il 
10 %,  
— la concentrazione dell'ossigeno disciolto nei contenitori usati nel 
saggio e nei controlli deve essere ≥ 3 mg/l alla fine del saggio.  
Nota: per il primo criterio, non più del 10 % delle dafnie di controllo 
deve presentare immobilizzazione o altri segni di disturbo o stress quali scolorazione o comportamento anomalo come il fatto di rima ­
nere bloccate alla superficie dell'acqua.
 
1.7. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.7.1.  Apparecchiature  
I contenitori e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con 
le soluzioni di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. I contenitori saranno in genere pro ­
vette o bicchieri di vetro; prima di ogni uso devono essere 
puliti secondo le normali procedure di laboratorio. I contenitori uti ­
lizzati nelle prove devono essere coperti in maniera non ermetica per ridurre la perdita d'acqua per evaporazione ed evitare che penetri 
polvere nelle soluzioni. Le sostanze volatili devono essere testate 
in contenitori chiusi e completamente riempiti, abbastanza grandi da evitare che l'ossigeno raggiunga un livello troppo scarso o tale da avere un effetto limitante (cfr. punto 1.6 e punto 1.8.3, primo 
paragrafo).
 
Oltre ai contenitori saranno utilizzate alcune o tutte le apparecchia ­
ture indicate di seguito: misuratore di ossigeno (con microelettrodo o altro apparecchio adatto per la misurazione dell'ossigeno disciolto in 
campioni di piccolo volume); pH-metro; apparecchiatura adeguata 
per il controllo della temperatura; apparecchiatura per determinare la concentrazione di carbonio organico totale (TOC); apparecchiatura per determinare la domanda chimica di ossigeno (COD); apparec ­
chiatura per la determinazione della durezza dell'acqua, ecc.
 
1.7.2.  Organismo sottoposto al saggio  
Daphnia magna Straus  è la specie sperimentale preferita, anche se è 
possibile ricorrere ad altre specie (ad esempio  Daphnia pulex).  Al­
l'inizio del saggio gli animali devono avere meno di 24 ore di vita; 
per ridurre la variabilità è fortemente consigliabile non utilizzare 
progenie provenienti dalla prima nidiata. Devono provenire da una popolazione sana (senza segni di stress quali un alto tasso di mor ­
talità, presenza di maschi e formazione di efippi, ritardo nella pro ­
duzione della prima nidiata, scolorazione ecc.). Tutti gli organismi 
utilizzati per una prova particolare devono provenire da colture de ­
rivanti dalla stessa popolazione di dafnie. Gli animali della popola ­
zione vanno mantenuti in condizioni colturali (luce, temperatura, 
mezzo) simili a quelle che verranno utilizzate nel saggio. Se il mezzo 
di coltura delle dafnie da usare nel saggio è diverso da quello uti ­
lizzato di routine per la coltura delle dafnie, è buona prassi prevedere un periodo di acclimatazione prima del saggio. A tal fine le dafnie 
parentali devono essere mantenute in acqua di diluizione alla tem ­
peratura di prova per almeno 48 ore prima dell'inizio del saggio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 801
 
1.7.3.  Acqua di allevamento e di diluizione  
È possibile utilizzare come acqua di allevamento e acqua di dilui ­
zione acqua naturale (di superficie o freatica), acqua ricostituita o acqua di rubinetto non clorata se le dafnie sopravvivono per la durata 
della coltura, dell'acclimatazione e della prova senza manifestare se ­
gni di stress. Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate all'allegato I riferite ad un'acqua di diluizione accettabile sono considerate adatte come acque da utilizzare per il saggio. Per 
tutta la durata del saggio l'acqua deve mantenere una qualità costante. 
L'acqua ricostituita può essere ottenuta aggiungendo ad acqua deio ­
nizzata o distillata specifiche quantità di reagenti di grado analitico 
riconosciuto. Esempi di acqua ricostituita sono indicati in (1)(6) e 
all'allegato II. Per saggiare sostanze contenenti metalli non utilizzare mezzi contenenti agenti chelanti noti, come l'M4 e l'M7 indicati all'allegato II. Il pH deve essere compreso tra 6 e 9. Per la  Daphnia 
magna  si raccomanda una durezza compresa tra 140 e 250 mg/l 
(come CaCO
 3 ), mentre per altre specie di  Daphnia  può essere più 
opportuna una durezza inferiore. L'acqua di diluizione deve essere aerata prima di utilizzarla nel saggio per consentire alla concentra ­
zione di ossigeno disciolto di raggiungere la saturazione.
 
Se si utilizza acqua naturale, i parametri relativi alla qualità devono 
essere misurati almeno due volte all'anno oppure ogni volta si so ­
spetti che tali caratteristiche possano essersi modificate sensibilmente (cfr. paragrafo precedente e allegato I). È inoltre necessario misurare 
i metalli pesanti (ad esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Se si utilizza 
acqua di rubinetto non clorata, è preferibile procedere ad un'analisi giornaliera del cloro. Se l'acqua di diluizione proviene da una sor ­
gente di acqua di superficie o da una sorgente freatica, è necessario 
misurare la conduttività e il carbonio organico totale (TOC) oppure 
la domanda chimica di ossigeno (COD).
 
1.7.4.  Soluzioni di prova  
Le soluzioni di prova delle concentrazioni scelte sono in genere 
preparate diluendo una soluzione madre. Le soluzioni madre devono essere preferibilmente preparate mediante dissoluzione della sostanza di prova nell'acqua di diluizione. Per quanto possibile evitare l'im ­
piego di solventi, emulsionanti o agenti di dispersione; in alcuni casi, 
tuttavia, può essere necessario usare questi composti per ottenere una soluzione madre della concentrazione corretta. Per ottenere indica ­
zioni sull'impiego dei solventi, emulsionanti e agenti di dispersione 
adeguati, consultare il testo (4). In ogni caso, la sostanza di prova 
contenuta nelle soluzioni di prova non deve superare il limite di solubilità nell'acqua di diluizione.
 
Il saggio deve essere effettuato senza regolazione del pH. Se que ­
st'ultimo non rimane nell'intervallo 6-9 si consiglia di ripetere il 
saggio regolando il pH della soluzione madre in base a quello del ­
l'acqua di diluizione prima di aggiungere la sostanza di prova. La regolazione del pH deve essere effettuata in modo tale che la con ­
centrazione della soluzione madre non vari in modo significativo e 
che non si producano reazioni chimiche o precipitazione della so ­
stanza di prova. A tal fine sono da preferirsi l'HCl e l'NaOH.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 802
 
1.8. PROCEDURA  
1.8.1.  Condizioni di esposizione  
1.8.1.1.  Gruppi di prova e controlli  
Riempire i contenitori usati nel saggio con la quantità corretta di 
acqua di diluizione e soluzioni della sostanza di prova. Il rapporto 
tra volume di aria/volume di acqua all'interno del contenitore deve essere uguale per il gruppo di prova e il gruppo di controllo. Le dafnie sono successivamente collocate nei contenitori di prova. Per 
ciascuna concentrazione di prova e per i controlli devono essere 
utilizzati almeno 20 animali, preferibilmente suddivisi in quattro gruppi di cinque. Per ciascun animale sono necessari almeno 2 ml 
di soluzione di prova (cioè un volume di 10 ml per cinque dafnie per 
contenitore di prova). Il saggio può essere effettuato con un sistema di rinnovo semi-statico o con un sistema dinamico quando la concen ­
trazione della sostanza di prova non è stabile.
 
Oltre alla serie di trattamento è necessario procedere a una serie di 
controlli con acqua di diluizione e, se opportuno, a una serie di controlli con agente solubilizzante.
 
1.8.1.2.  Concentrazioni di prova  
Si può procedere a una prova per determinare il range di concen ­
trazione per il saggio definitivo, a meno di non disporre già di 
informazioni sulla tossicità della sostanza di prova. A tal fine le dafnie sono esposte a una serie di concentrazioni della sostanza di prova molto intervallate tra loro. Cinque dafnie devono essere sot ­
toposte a ciascuna concentrazione di prova per 48 ore al massimo e 
non sono necessarie ripetizioni. Il periodo di esposizione può essere ridotto (ad esempio a 24 ore o meno) se è possibile ottenere i dati necessari per determinare il range di concentrazione in meno tempo.
 
Devono essere utilizzate almeno cinque concentrazioni di prova in 
una serie geometrica con un rapporto geometrico preferibilmente non superiore a 2,2. Se vengono utilizzate meno di cinque concentrazioni 
è necessario motivare la scelta. La concentrazione più elevata testata 
deve preferibilmente produrre l'immobilizzazione totale (100 %), mentre la concentrazione più bassa non deve, di preferenza, causare alcun effetto osservabile.
 
1.8.1.3.  Condizioni di incubazione  
La temperatura deve essere compresa tra 18  o C e 22  o C e per ogni 
singolo saggio deve mantenersi costante con uno scarto di ± 1  o C. È 
consigliabile effettuare un ciclo di 16 ore di luce e un ciclo di 8 ore di buio. Si può anche procedere all'incubazione nell'oscurità totale, in 
particolare se le sostanze di prova sono instabili alla luce.
 
Durante il saggio i contenitori non devono essere aerati. Il saggio 
non richiede la regolazione del pH. Durante il saggio le dafnie non devono essere alimentate.
 
1.8.1.4.  Durata  
Il saggio dura 48 ore.  
1.8.2.  Osservazioni  
Ciascun contenitore utilizzato per il saggio deve essere controllato 
per verificare l'immobilizzazione delle dafnie dopo 24 e dopo 48 ore dall'inizio del saggio (cfr. definizioni al punto 1.2). Oltre all'immo ­
bilità è necessario riferire su qualsiasi comportamento o aspetto ano ­
mali.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 803
 
1.8.3.  Misurazioni analitiche  
L'ossigeno disciolto e il pH sono misurati all'inizio e alla fine del 
saggio nel/nei controllo/i e alla concentrazione più elevata della so ­
stanza di prova. La concentrazione dell'ossigeno disciolto nei con ­
trolli deve rispettare il criterio di validità (cfr. punto 1.6). Il pH non 
deve in genere variare di oltre 1,5 unità in ciascun saggio effettuato. La temperatura viene in genere rilevata nei contenitori di controllo o nell'aria ambiente e dev'essere preferibilmente registrata in maniera 
continua durante il saggio o comunque almeno all'inizio e alla fine 
del saggio.
 
La concentrazione della sostanza di prova deve essere misurata al ­
meno alla concentrazione di prova massima e minima, all'inizio e alla fine del saggio (4). I risultati devono basarsi sulle concentrazioni misurate. Tuttavia, se vi sono dati in grado di dimostrare che per 
tutta la durata del saggio la concentrazione della sostanza di prova si 
è mantenuta in maniera soddisfacente entro ± 20 % della concen ­
trazione nominale o della concentrazione iniziale rilevata, i risultati possono anche basarsi sui valori nominali o sui valori iniziali misu ­
rati.
 
1.9. SAGGIO LIMITE  
Usando le procedure descritte in questo metodo di prova, si può 
eseguire un saggio limite a 100 mg/l della sostanza di prova oppure fino al limite di solubilità di quest'ultima nel terreno utilizzato per il 
saggio (se è inferiore) allo scopo di dimostrare che la EC
 50 si colloca 
al di sopra di questa concentrazione. Il saggio limite deve essere eseguito usando 20 dafnie (preferibilmente suddivise in 4 gruppi di 
cinque), con un ugual numero nel gruppo (nei gruppi) di controllo. 
Se si verifica immobilizzazione, si deve eseguire uno studio com ­
pleto. Ogni comportamento anomalo rilevato deve essere registrato.
 
2. DATI  
I dati devono essere riassunti sotto forma di tabelle; per ogni gruppo 
di trattamento e gruppo di controllo devono essere indicati il numero 
di dafnie utilizzate e il grado di immobilizzazione rilevato ad ogni osservazione. Le percentuali di dafnie immobilizzate dopo 24 ore e dopo 48 ore devono essere rappresentate graficamente rispetto alle 
concentrazioni di prova. I dati devono essere analizzati con gli op ­
portuni metodi statistici (come analisi  probit  ecc.) per calcolare l'an ­
damento delle curve e la EC
 50 con limiti di affidabilità del 95 % (p = 
0,05) (7) (8).  
Se non è possibile applicare ai dati ottenuti i metodi standard di 
calcolo della EC  50 , come valore approssimativo per la EC  50 devono 
essere utilizzate la concentrazione massima che non causa immobi ­
lizzazione e la concentrazione minima che causa l'immobilità totale 
(100 %) (il valore è dato dalla media geometrica di queste due concentrazioni).
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL SAGGIO  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— natura fisica e caratteristiche fisico-chimiche,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 804
 
— dati che ne consentano l'identificazione chimica, compresa la 
purezza.  
Specie sottoposte al saggio:  
— origine e specie di  Daphnia,  fornitore (se noto) e condizioni di 
coltura utilizzate (inclusa la fonte, il tipo e la quantità di alimento e la frequenza di alimentazione).
 
Condizioni di prova:  
— descrizione dei contenitori utilizzati per il saggio: tipo di conte ­
nitori, volume della soluzione, numero di dafnie per contenitore, numero di contenitori di prova (ripetizioni) per concentrazione,
 
— metodi di preparazione della soluzione madre e della soluzione di 
prova, compreso l'eventuale impiego di solventi o agenti di di ­
spersione, concentrazioni utilizzate,  
— informazioni sull'acqua di diluizione: provenienza e caratteristi ­
che di qualità dell'acqua (pH, durezza, rapporto Ca/Mg, rapporto 
Na/K, alcalinità, conduttività ecc.); composizione dell'acqua rico ­
stituita, se utilizzata,  
— condizioni di incubazione: temperatura, intensità luminosa e pe ­
riodicità dell'esposizione alla luce, ossigeno disciolto, pH, ecc.  
Risultati:  
— numero e percentuale di dafnie immobilizzate o che hanno mo ­
strato effetti negativi (compreso un comportamento anomalo) nei gruppi di controllo e in ciascun gruppo di trattamento, per ogni tempo di osservazione e descrizione del tipo di effetti osservati,
 
— risultati e data del saggio eseguito con la sostanza di riferimento, 
se disponibili,  
— concentrazioni nominali di prova e risultato di tutte le analisi 
effettuate per determinare la concentrazione della sostanza di 
prova nei contenitori utilizzati nel saggio; devono essere indicati 
anche l'efficienza di recupero del metodo e il limite di determi ­
nazione,  
— tutte le misurazioni fisico-chimiche di temperatura, pH e ossi ­
geno disciolto svolte durante il saggio,  
— EC  50 a 48 ore per l'immobilizzazione con intervalli di affidabilità 
e grafici del modello adattato utilizzato per il calcolo, andamento delle curve dose-risposta ed errore standard; procedimenti stati ­
stici utilizzati per determinare la EC
 50 (questi stessi dati devono 
essere riportati anche per l'immobilizzazione a 24 ore, se misu ­
rati),  
— spiegazione delle eventuali deviazioni rispetto al metodo di pro ­
va, con indicazione dell'eventuale incidenza della deviazione sui 
risultati ottenuti nel saggio.  
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ALLEGATO 1  
ALCUNE CARATTERISTICHE CHIMICHE RIFERITE AD UN'ACQUA 
DI DILUIZIONE DI QUALITÀ ACCETTABILE  
Sostanza Concentrazione  
Particolato < 20 mg/l 
Carbonio organico totale < 2 mg/l 
Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l 
Cloro residuo < 10 μg/l 
Pesticidi organofosforici totali < 50 ng/l Pesticidi organoclorati totali più difenili policlorurati < 50 ng/l Cloro organico totale < 25 ng/l
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ALLEGATO 2  
ESEMPI DI ACQUA RICOSTITUITA RITENUTA ADEGUATA PER IL 
SAGGIO  
Acqua per il saggio ISO (1)  
Soluzione madre (singola sostanza) Per preparare l'acqua ricosti ­
tuita, aggiungere i seguenti 
volumi di soluzione madre in 1 
litro d'acqua (*) Sostanza Quantità aggiunta in 1 li ­
tro d'acqua (*)  
Cloruro di calcio 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Solfato di magnesio 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Bicarbonato di sodio 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Cloruro di potassio 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Acqua di purezza adeguata, ad esempio acqua non ionizzata, acqua distillata o sottopo ­
sta a trattamento di osmosi inversa con una conduttività preferibilmente inferiore o 
uguale a 10 μS.cm  -1 . 
Mezzo Elendt M7 ed M4  
Acclimatazione al mezzo Elendt M4 ed M7  
Alcuni laboratori hanno riscontrato difficoltà a trasferire direttamente la  Daphnia  
ai mezzi di coltura M4 ed M7. Qualche risultato è stato invece ottenuto con 
un'acclimatazione graduale, cioè trasferendo la  Daphnia  dal proprio mezzo ad un 
mezzo Elendt al 30 %, poi al 60 % e infine ad un mezzo Elendt al 100 %. I periodi di acclimatazione possono avere anche una durata di un mese.
 
Preparazione  
Elementi in tracce  
Preparare innanzitutto distinte soluzioni madre (I) dei singoli elementi in tracce in 
acqua di purezza adeguata, ad esempio acqua non ionizzata, acqua distillata o 
sottoposta a trattamento di osmosi inversa. Da queste soluzioni (I) preparare una seconda soluzione madre unica (II) contenente tutti gli elementi in tracce (soluzione combinata), cioè:
 
Soluzione(i) madre I (unica 
sostanza) Quantità aggiunta al ­
l'acqua (mg/l) Concentrazione (riferita 
al mezzo M4) Per preparare la soluzione madre combinata II 
aggiungere i seguenti quantitativi di soluzione I 
all'acqua (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 volte 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000 volte 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 volte 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 808
 
Soluzione(i) madre I (unica 
sostanza) Quantità aggiunta al ­
l'acqua (mg/l) Concentrazione (riferita 
al mezzo M4) Per preparare la soluzione madre combinata II 
aggiungere i seguenti quantitativi di soluzione I 
all'acqua (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 volte 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000 volte 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 volte 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000 volte 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000 volte 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 volte 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000 volte 1,0 1,0 
KI 65 20 000 volte 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 volte 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 volte 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000 volte — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000 volte — — 
Le soluzioni Na 2 EDTA ed FeSO  4 sono preparate individualmente, mescolate e messe immediatamente in autoclave. 
Il risultato è: 
2 l Fe-EDTA solutione 1 000 volte 20,0 5,0  
Mezzi di coltura M4 edM7  
I mezzi di coltura M4 ed M7 sono preparati con la soluzione madre II, macro ­
nutrienti e vitamine come indicato nella tabella:  
Quantità aggiunta al ­
l'acqua (mg/l) Concentrazione (riferita 
al mezzo M4) Quantitativo di soluzione II aggiunto per preparare 
il mezzo di coltura (ml/l) 
M4 M7  
Soluzione madre II (ele ­
menti in tracce combinati) 20 volte 50 50 
Soluzioni madre con ma ­
cronutrienti (unica sostan ­
za) 
CaCl  2 — 2H  2 O 293 800 1 000 volte 1,0 1,0 
MgSO  4 — 7H  2 O 246 600 2 000 volte 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 volte 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 volte 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 — 9H  2 O 50 000 5 000 volte 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 volte 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 volte 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 volte 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 809
 
Quantità aggiunta al ­
l'acqua (mg/l) Concentrazione (riferita 
al mezzo M4) Quantitativo di soluzione II aggiunto per preparare 
il mezzo di coltura (ml/l) 
M4 M7  
Soluzione madre di vita ­
mine combinate — 10 000 volte 0,1 0,1 
La soluzione madre di vitamine combinate viene preparata aggiungendo le 3 vitamine indicate di seguitoin un litro 
d'acqua: 
Tiamina cloridrato 750 10 000 volte 
Cianocobalamina (B  12 ) 10 10 000 volte 
Biotina 7,5 10 000 volte  
La soluzione di vitamine combinate è conservata in congelatore in piccole ali ­
quote. Le vitamine vengono aggiunte al mezzo di coltura poco prima dell'utiliz ­
zo. 
N.B.: Per evitare la precipitazione di sali durante la preparazione del mezzo di 
coltura completo, aggiungere le aliquote di soluzioni madre a circa 500- 800 ml di acqua non ionizzata e poi riempire fino a raggiungere il litro.
 
N.B.: La prima pubblicazione riguardante il mezzo M4 si trova in 
Elendt, B. P. (1990), Selenium deficiency in crustacea; an ultra ­
structual approach to antennal damage in  Daphnia magna Straus.  
Protoplasma, 154, pagg. 25-33.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 810
 
C.3. ALGHE DI ACQUA DOLCE E CIANOBATTERI, SAGGIO DI 
INIBIZIONE DELLA CRESCITA  
1. METODO  
Il metodo corrisponde alla linea guida 201 dell’OCSE (2006)(1).  
1.1. INTRODUZIONE  
I metodi di prova sono periodicamente riveduti e aggiornati alla luce 
del progresso scientifico. Il metodo di prova C.3 doveva essere 
riveduto per includere nuove specie e soddisfare i requisiti per la 
valutazione del rischio e la classificazione delle sostanze chimiche. La revisione è stata effettuata sulla base di un’ampia esperienza pratica, del progresso scientifico nel settore degli studi di tossicità 
sulle alghe e di una lunga pratica normativa messa in atto fin 
dall’adozione iniziale.
 
1.2. DEFINIZIONI  
Ai fini del presente metodo di prova sono usate le definizioni e 
abbreviazioni seguenti:  
Biomassa : il peso secco della sostanza vivente presente in una po ­
polazione espresso in termini di un determinato volume, per esempio mg alghe/litro di soluzione di prova. Di solito la «biomassa» è 
definita come una massa, ma ai fini della presente prova il termine 
è utilizzato per riferirsi alla massa per volume. Anche nella presente prova i surrogati della biomassa, come i conteggi delle cellule, la fluorescenza, ecc. sono normalmente misurati e l’uso del termine 
«biomassa» si riferisce quindi anche a queste misure surrogate.
 
Coefficiente di variazione : una misura adimensionale della variabi ­
lità di un parametro, definita come il rapporto della deviazione stan ­
dard rispetto alla media. Può essere espresso anche con una percen ­
tuale. Il coefficiente medio di variazione del tasso medio di crescita specifico nelle colture di controllo deve essere calcolato come segue:
 
1. Calcolare il CV in percentuale del tasso medio di crescita speci ­
fico a partire dai tassi di crescita quotidiani/sezione per sezione per la rispettiva replica.
 
2. Calcolare il valore medio di tutti i valori calcolati al punto 1 per 
ottenere il coefficiente medio di variazione del tasso di crescita specifico quotidiano/sezione per sezione nelle rispettive colture replicate.
 
ECx : la concentrazione della sostanza dissolta nel mezzo di prova 
che genera una riduzione dell’x % (per esempio del 50 %) della crescita dell’organismo di prova entro un periodo di esposizione 
specificato (da citare esplicitamente se diverso dalla durata completa 
o normale della prova). Per indicare chiaramente se un valore EC risultante si riferisce al tasso di crescita o al rendimento, sono uti ­
lizzati rispettivamente i simboli «E
 r C» e «E  y C». 
Mezzo di crescita : il mezzo completo di coltura sintetica in cui le 
alghe crescono quando sono esposte alla sostanza di prova. Di norma la sostanza di prova è dissolta nel mezzo di prova.
 
Tasso di crescita (tasso di crescita specifico medio) : l’aumento 
logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 811
 
Concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente 
significativo (Lowest Observed Effect Concentration — LOEC) : 
la concentrazione più bassa che produce un effetto statisticamente significativo (p < 0,05) sulla crescita rispetto al controllo in un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni superiori a 
quella della LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale 
o più elevato di quello osservato per la LOEC (e di conseguenza per la NOEC). Quando queste due condizioni non sono soddisfatte oc ­
corre fornire una spiegazione dettagliata sulle modalità di selezione 
della LOEC (e pertanto della NOEC).
 
NOEC (No Observed Effect Concentration — concentrazione 
senza effetti osservabili) : concentrazione di prova immediatamente 
inferiore alla LOEC.  
Variabile di risposta : la variabile per la stima della tossicità derivata 
da qualsiasi parametro misurato che descrive la biomassa mediante metodi diversi di calcolo. Per questo metodo i tassi di crescita e rendimento sono variabili di risposta derivanti dalla misurazione 
diretta della biomassa o di qualsiasi dei surrogati citati.
 
Tasso specifico di crescita : una variabile di risposta definita come il 
quoziente della differenza dei logaritmi naturali di un parametro di osservazione (in questo metodo di prova, la biomassa) e il tempo 
rispettivo.
 
Rendimento : il valore di una variabile di misurazione usato al ter ­
mine del periodo di esposizione meno la variabile di misurazione 
all’inizio del periodo di esposizione per esprimere l’aumento della 
biomassa durante la prova.  
1.3. APPLICABILITÀ DELLA PROVA  
Il presente metodo di prova si applica più facilmente alle sostanze 
idrosolubili che, nelle condizioni della prova, sono suscettibili di restare nell’acqua. Per effettuare prove su sostanze volatili, forte ­
mente adsorbenti, colorate, a bassa solubilità nell’acqua o sostanze 
che possono influire sulla disponibilità di sostanze nutrienti o mine ­
rali nel mezzo di prova, possono essere necessarie determinate mo ­
difiche della procedura descritta (per esempio sistema chiuso, condi ­
zionamento dei recipienti di prova). Ai punti 2, 3 e 4 sono fornite 
indicazioni su alcune modifiche appropriate.
 
1.4. PRINCIPIO DELLA PROVA  
La presente prova intende determinare gli effetti di una sostanza 
sulla crescita di microalghe di acqua dolce e/o cianobatteri. Organi ­
smi di prova in fase di crescita esponenziale sono esposti alla so ­
stanza di prova in colture in lotti per un periodo che dura normal ­
mente 72 ore. Nonostante la durata relativamente breve della prova è possibile valutare gli effetti su diverse generazioni.
 
La risposta del sistema è la riduzione della crescita in una serie di 
colture di alghe (unità di prova) esposte a varie concentrazioni di una sostanza di prova. La risposta è valutata come una funzione della concentrazione di esposizione in relazione alla crescita media di 
colture di controllo identiche non esposte. Per ottenere l’espressione 
completa della risposta del sistema agli effetti tossici (sensibilità ottimale), è autorizzata la crescita esponenziale delle colture senza limitazioni, con una quantità sufficiente di nutrienti e in condizioni di 
illuminazione continua per un periodo sufficiente a misurare la ridu ­
zione del tasso di crescita specifico.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 812
 
La crescita e l’inibizione della crescita sono quantificate attraverso 
misure della biomassa delle alghe in funzione del tempo. La bio ­
massa delle alghe è definita come il peso secco per volume, per esempio mg di alghe/litro di soluzione di prova. Tuttavia, è difficile misurare il peso secco, quindi sono utilizzati parametri alternativi. 
Quello usato con maggiore frequenza è il conteggio delle cellule. 
Altri parametri alternativi comprendono il volume delle cellule, la fluorescenza, la densità ottica, ecc. Deve essere noto un fattore di conversione fra il parametro alternativo misurato e la biomassa.
 
Il punto finale della prova è l’inibizione della crescita, espressa come 
l’aumento del logaritmo della biomassa (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. Dai tassi di crescita medi specifici registrati in una serie di soluzioni di prova, la concentra ­
zione che genera un’inibizione specificata del tasso di crescita pari a 
x % (per esempio 50 %) è determinata ed espressa come E
 r C x (per 
esempio E  r C 50 ). 
Per l’applicazione del presente metodo nel quadro normativo comu ­
nitario, il calcolo dei risultati deve essere basato su un tasso di crescita medio specifico per le ragioni di cui al punto 2.2. Una variabile di risposta supplementare utilizzata in questo metodo di 
prova è il rendimento, che può essere necessario per rispondere a 
specifici requisiti normativi in alcuni paesi. Il rendimento è definito come la biomassa al termine del periodo di esposizione meno la biomassa all’inizio del periodo di esposizione. A partire dal rendi ­
mento registrato in una serie di soluzioni di prova, la concentrazione 
che genera un’inibizione specificata del rendimento pari a x % (per esempio 50 %) è calcolata ed espressa come E
 y C x (per esempio 
EyC  50 ). 
Inoltre, la concentrazione minima a cui si osserva un effetto stati ­
sticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC) possono essere determinate statisticamente.
 
1.5. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Le informazioni sulla sostanza di prova che possono essere utili per 
stabilire le condizioni di prova comprendono la formula strutturale, la purezza, la stabilità alla luce, la stabilità nelle condizioni della prova, le proprietà di assorbimento della luce, pKa e i risultati di 
studi di trasformazione, inclusa la biodegradabilità nell’acqua.
 
L’idrosolubilità, il coefficiente di partizione ottanolo/acqua (P  ow ) e la 
pressione di vapore della sostanza di prova devono essere noti e un metodo convalidato per la quantificazione della sostanza nelle solu ­
zioni di prova con efficienza di recupero e limite di rilevamento noti 
deve essere disponibile.
 
1.6. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Le sostanze di riferimento, come per esempio il 3,5-diclorofenolo 
utilizzato nella prova interlaboratorio (ring-test) internazionale (4), 
possono essere testate per verificare la procedura di prova. Anche 
il dicromato di potassio può essere utilizzato come sostanza di rife ­
rimento per le alghe verdi. È preferibile effettuare una prova con una sostanza di riferimento almeno due volte all’anno.
 
1.7. VALIDITÀ DELLA PROVA  
Per garantire la validità della prova i criteri di esecuzione seguenti 
devono essere soddisfatti:  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 813
 
— la biomassa nelle colture di controllo deve essere aumentata 
esponenzialmente con un fattore di almeno 16 entro il periodo 
di prova di 72 ore. Questo valore corrisponde a un tasso di crescita specifico di 0,92 giorni
 –1 . Per le specie utilizzate più 
spesso il tasso di crescita è di solito sensibilmente superiore (cfr. 
l’appendice 1). Questo criterio può non essere rispettato quando 
sono utilizzate specie che crescono più lentamente di quelle elencate all’appendice 1. In questo caso, il periodo di prova deve essere prolungato per ottenere almeno una crescita di 16 
volte nelle colture di controllo, mentre la crescita deve essere 
esponenziale per tutto il periodo di prova. Il periodo di prova può essere abbreviato ad almeno 48 ore per mantenere una cre ­
scita esponenziale illimitata durante la prova, a condizione che il 
fattore minimo di moltiplicazione 16 sia raggiunto,
 
— il coefficiente medio di variazione per i tassi di crescita specifici 
«sezione per sezione» (giorni 0-1, 1-2 e 2-3, per le prove da 72 
ore) nelle colture di controllo (cfr. la voce «coefficiente di va ­
riazione» al punto 1.2) non deve superare il 35 %. Per il calcolo del tasso di crescita specifico «sezione per sezione» consultare 
il secondo paragrafo del punto 2.2.1. Questo criterio si applica al 
valore medio dei coefficienti di variazione calcolato per le repli ­
che delle colture di controllo,
 
— il coefficiente di variazione dei tassi medi specifici di crescita 
durante l’intero periodo di prova nelle repliche delle colture di controllo non deve superare il 7 % nelle prove con  Pseudokir ­
chneriella subcapitata  e Desmodesmus subspicatus . Per altre spe ­
cie utilizzate con minore frequenza per le prove, il valore non 
deve superare il 10 %.
 
1.8. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.8.1.  Apparecchiature  
I contenitori di prova e le altre apparecchiature che entrano in con ­
tatto con le soluzioni di prova devono essere completamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Gli strumenti devono essere 
lavati accuratamente per assicurare che contaminanti organici o inor ­
ganici non possano interferire con la crescita delle alghe o la com ­
posizione delle soluzioni di prova.
 
I contenitori di prova sono normalmente palloni di vetro di dimen ­
sioni tali da consentire un volume sufficiente di colture per le misure durante la prova e un trasferimento sufficiente di massa di CO
 2 
dall’atmosfera (cfr. il secondo paragrafo del punto 1.8.9). Il volume 
liquido deve essere sufficiente per le determinazioni analitiche (cfr. il 
quinto paragrafo del punto 1.8.11).  
Inoltre sono necessarie alcune o tutte le seguenti apparecchiature:  
— apparecchiature per le colture: si consiglia un armadio o una 
camera in cui la temperatura di incubazione prescelta possa es ­
sere mantenuta a ± 2 °C.  
— strumenti per la misurazione della luce: è importante notare che il 
metodo di misurazione dell’intensità della luce, e in particolare il 
tipo di recettore (collettore), influenzerà il valore misurato. È preferibile effettuare le misure utilizzando un recettore sferico (4 π) (che risponde alla luce diretta e riflessa da tutti gli angoli 
e sotto il piano di misurazione) o un recettore 2 π (che risponde 
alla luce da tutti gli angoli sopra il piano di misurazione).
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— apparecchiatura per determinare la biomassa delle alghe. Il con ­
teggio delle cellule, il parametro alternativo più comunemente 
utilizzato per la biomassa delle alghe, può essere effettuato usando un contatore elettronico di particelle, un microscopio con camera di conteggio o un citometro a flusso. Altri parametri 
alternativi per la biomassa possono essere misurati usando un 
citometro a flusso, un fluorimetro, uno spettrofotometro o un colorimetro. Per effettuare il calcolo è utile un fattore di conver ­
sione che mette in relazione il conteggio delle cellule e il peso 
secco. Per fornire misure utili con basse concentrazioni di bio ­
massa quando è utilizzato uno spettrofotometro può essere ne ­
cessario usare cuvette con un percorso ottico minimo di almeno 4 cm.
 
1.8.2.  Organismi di prova  
Possono essere utilizzate diverse specie di microalghe e di cianobat ­
teri che non formano aggregati. I ceppi di cui all’appendice 1 sono 
risultati idonei per l’uso del procedimento di prova specificato nel 
presente metodo di saggio.  
Se sono usate altre specie, devono essere indicati il ceppo e/o l’ori ­
gine. È necessario confermare che la crescita esponenziale dell’alga selezionata per la prova può essere mantenuta per tutto il periodo della prova nelle condizioni applicate.
 
1.8.3.  Mezzo di crescita  
Si consigliano due mezzi di crescita alternativi: quello dell’OCSE e 
quello dell’AAP. Le composizioni di questi mezzi sono illustrati 
all’appendice 2. Occorre notare che il valore iniziale del pH e la 
capacità tampone (regolazione dell’aumento del pH) di questi due mezzi sono diversi. I risultati delle prove possono pertanto variare in 
funzione del mezzo utilizzato, soprattutto nelle prove con sostanze 
ionizzanti.
 
Può risultare necessario modificare i mezzi di crescita per determi ­
nate finalità, per esempio per le prove su metalli o agenti chelanti o per le prove con valori di pH diversi. L’uso di un mezzo modificato deve essere descritto con precisione e giustificato (3)(4).
 
1.8.4.  Concentrazione iniziale della biomassa  
La biomassa iniziale deve essere la stessa in tutte le colture e suffi ­
cientemente bassa da permettere una crescita esponenziale per tutto il 
periodo di incubazione senza il rischio di esaurimento degli elementi 
nutritivi. La biomassa iniziale non deve superare 0,5 mg/l come peso secco. Si raccomandano le concentrazioni iniziali di cellule riportate di seguito:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 x 10
 3 -10 4 cellule/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 x 10  3 cellule/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 cellule/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 cellule/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 x 10  4 -10 5 cellule/ml  
1.8.5.  Concentrazioni della sostanza di prova  
L’intervallo di concentrazione nel quale possono verificarsi degli 
effetti può essere determinato sulla base dei risultati di prove ese ­
guite per determinare l’intervallo di concentrazioni. Per la prova 
finale e definitiva devono essere selezionate almeno cinque concen ­
trazioni disposte in una serie geometrica con un fattore non superiore a 3,2. Un fattore più elevato può essere giustificato per le sostanze di prova che mostrano una curva concentrazione-risposta piatta. È pre ­
feribile che la serie di concentrazione copra i valori che generano 
un’inibizione del 5-75 % del tasso di crescita delle alghe.
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1.8.6.  Repliche e controlli  
La prova deve comprendere tre repliche con ogni concentrazione 
prevista. Se non è necessario determinare il NOEC, la prova può essere modificata per aumentare il numero di concentrazioni e ridurre 
il numero di repliche per concentrazione. Le repliche di controllo 
devono essere almeno tre e idealmente dovrebbero essere il doppio delle repliche utilizzate per ogni concentrazione prevista dalla prova.
 
Può essere preparata una serie separata di soluzioni di prova per 
determinare analiticamente le concentrazioni delle sostanze di prova 
(cfr. i paragrafi 4 e 6 del punto 1.8.11).  
Quando si utilizza un solvente per solubilizzare la sostanza di prova 
la prova deve comprendere controlli integrativi con la stessa concen ­
trazione di solvente utilizzata nelle colture di prova.  
1.8.7.  Preparazione della coltura dell’inoculo  
Per adattare le alghe alle condizioni di prova e assicurare che siano 
nella fase di crescita esponenziale quando sono utilizzate per inocu ­
lare le soluzioni di prova, 2-4 giorni prima dell’inizio della prova è preparata una coltura di inoculo nel mezzo di prova. La biomassa 
delle alghe deve essere adattata affinché la coltura dell’inoculo pre ­
senti una crescita esponenziale fino all’inizio della prova. La coltura dell’inoculo deve essere incubata nelle stesse condizioni delle colture 
di prova. È necessario misurare l’aumento della biomassa nella col ­
tura dell’inoculo per garantire che la crescita rientri nella gamma normale del ceppo di prova nelle condizioni di coltura. L’appendice 3 presenta una descrizione della procedura per la coltura delle alghe. 
Per evitare le divisioni sincrone delle cellule durante la prova può 
essere necessaria una seconda fase di propagazione della coltura dell’inoculo.
 
1.8.8.  Preparazione delle soluzioni di prova  
Tutte le soluzioni di prova devono contenere le stesse concentrazioni 
del mezzo di crescita e la stessa biomassa iniziale delle alghe di 
prova. Le soluzioni di prova delle concentrazioni prescelte sono di 
solito preparate mescolando una soluzione madre della sostanza di prova con il mezzo di crescita e la coltura dell’inoculo. Di solito le soluzioni madri sono preparate dissolvendo la sostanza nel mezzo di 
prova.
 
Solventi quali l’acetone, l’alcol t-butilico e la dimetilformamide pos ­
sono essere utilizzati come vettori per aggiungere sostanze a bassa idrosolubilità al mezzo di prova (2)(3). La concentrazione di solvente 
non deve superare il valore di 100 μl/l e la stessa concentrazione di 
solvente deve essere aggiunta a tutte le colture (comprese quelle di controllo) nella serie di prova.
 
1.8.9.  Incubazione  
I contenitori di prova sono provvisti di coperchi permeabili all’aria. I 
contenitori sono agitati e posti nell’apparecchiatura per le colture. 
Durante la prova è necessario mantenere le alghe in sospensione e 
agevolare il trasferimento di CO  2 . A tal fine i contenitori sono agitati 
o il loro contenuto è rimescolato costantemente. Le colture devono essere mantenute a una temperatura compresa fra 21 e 24 °C, con 
uno scarto controllato di ± 2 °C. Per le specie diverse da quelle di 
cui all’appendice 1, come per esempio le specie tropicali, può essere opportuno utilizzare temperature più elevate, a condizione che i cri ­
teri di validità siano rispettati. Si raccomanda di posizionare i con ­
tenitori casualmente e di cambiarne ogni giorno la posizione all’in ­
terno dell’incubatore.
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Il pH del mezzo di controllo non deve aumentare di oltre 1,5 unità 
durante la prova. Per i metalli e i composti che ionizzano in parte a 
un pH attorno a quello della prova può essere necessario limitare l’evoluzione del pH per ottenere risultati riproducibili e chiaramente definiti. Un’evoluzione del pH inferiore a 0,5 unità è tecnicamente 
fattibile e può essere ottenuta assicurando un tasso di trasferimento 
adeguato di massa di CO
 2 dall’aria circostante alla soluzione di 
prova, per esempio aumentando la frequenza dell’agitazione. Un’al ­
tra possibilità consiste nel ridurre la richiesta di CO  2 diminuendo la 
biomassa iniziale o la durata della prova.  
La superficie su cui le colture sono incubate deve ricevere illumina ­
zione fluorescente continua ed uniforme, per esempio del tipo «luce 
bianca fredda» o «luce naturale». I requisiti di illuminazione variano in funzione dei ceppi di alghe e dei cianobatteri utilizzati. L’intensità della luce deve essere adeguata all’organismo di prova utilizzato. Per 
le specie di alghe verdi raccomandate l’intensità della luce al livello 
delle soluzioni di prova deve essere selezionata nell’intervallo 60- 120 μE·m
 –2 ·s –1 quando è misurata in un intervallo di lunghezza 
d’onda che autorizza la fotosintesi di 400-700 nm utilizzando un 
recettore adeguato. Alcune specie, in particolare l’ Anabaena flos- 
aquae , crescono bene con intensità di luce inferiore e possono essere 
danneggiate da intensità elevate. Per queste specie è opportuno sce ­
gliere un’intensità media della luce compresa nell’intervallo 40-60 
μE·m  –2 ·s –1 (per gli strumenti di misurazione della luce calibrati in un 
intervallo equivalente di 4 440-8 880 lux per la luce bianca fredda corrisponde approssimativamente all’intensità raccomandata della luce di 60-120 μE·m
 –2 ·s –1 ). L’intensità della luce non deve variare 
di oltre il ± 15 % rispetto all’intensità media sull’area di incubazione.  
1.8.10.  Durata della prova  
La prova dura normalmente 72 ore. Tuttavia, le prove possono avere 
durata inferiore o superiore, a condizione che tutti i criteri di validità 
di cui al punto 1.7 siano rispettati.  
1.8.11.  Misure e determinazioni analitiche  
La biomassa delle alghe in ogni contenitore è determinata almeno 
quotidianamente durante il periodo di prova. Se le misure sono effettuate su piccoli volumi prelevati dalla soluzione di prova tramite una pipetta, i volumi in questione non devono essere rimessi nella 
soluzione.
 
La misura della biomassa è effettuata mediante conteggio manuale 
delle cellule al microscopio o con un contatore elettronico di parti ­
celle (conteggio delle cellule e/o biovolume). È possibile utilizzare tecniche alternative, come per esempio la citometria a flusso, la 
fluorescenza clorofilliana in vitro o in vivo (6)(7) o la densità ottica 
a condizione di poter dimostrare che esiste una correlazione soddi ­
sfacente con la biomassa per l’intervallo di biomassa utilizzato nella prova.
 
Il pH delle soluzioni è misurato all’inizio e al termine della prova.  
Se è disponibile una procedura di analisi per determinare la sostanza 
di prova nella gamma di concentrazione utilizzata, le soluzioni di prova devono essere analizzate per verificare le concentrazioni ini ­
ziali e il mantenimento delle concentrazioni di esposizione durante la 
prova.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 817
 
L’analisi della concentrazione della sostanza di prova all’inizio e al 
termine della prova di una concentrazione bassa, di una concentra ­
zione elevata e di una concentrazione attorno al valore EC  50 previsto, 
può essere sufficiente se è probabile che le concentrazioni di espo ­
sizione varino meno del 20 % rispetto ai valori nominali durante la 
prova. Si raccomanda l’analisi di tutte le concentrazioni di prova 
all’inizio e al termine della prova quando è improbabile che le con ­
centrazioni restino entro l’80-120 % del valore nominale. Per le sostanze di prova volatili, instabili o fortemente adsorbenti si racco ­
manda una campionatura integrativa per analisi a intervalli di 24 ore 
durante il periodo di esposizione per definire con maggiore efficacia la perdita della sostanza di prova. Per queste sostanze sono neces ­
sarie ulteriori repliche. In tutti i casi, la determinazione delle concen ­
trazioni della sostanza di prova deve essere eseguita su un solo 
contenitore di replica per ogni concentrazione di prova (o sulla mi ­
scela dei contenuti dei recipienti delle repliche).
 
I mezzi di prova specificamente preparati per l’analisi delle concen ­
trazioni di esposizione durante la prova devono essere trattati come 
quelli utilizzati per le prove, devono cioè essere inoculati con alghe e incubati alle stesse condizioni. Se occorre effettuare l’analisi della 
concentrazione della sostanza di prova dissolta, può essere necessario 
separare le alghe dal mezzo. È preferibile effettuare la separazione tramite centrifuga con debole forza di accelerazione, sufficiente per far sedimentare le alghe.
 
Se è dimostrato che per tutta la durata della prova la concentrazione 
della sostanza oggetto di prova è stata conservata in modo soddi ­
sfacente entro un margine del ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione misurata inizialmente, l’analisi dei risultati 
può essere basata sui valori nominali o su quelli misurati inizialmen ­
te. Se lo scarto rispetto alla concentrazione nominale o a quella misurata inizialmente è superiore a ± 20 %, l’analisi dei risultati deve basarsi sulla concentrazione ottenuta con la media geometrica 
durante l’esposizione o su modelli che descrivono il declino della 
concentrazione della sostanza di prova (3)(8).
 
La prova di inibizione della crescita delle alghe è un sistema più 
dinamico di altre prove di tossicità acquatica a breve termine. Di 
conseguenza, può essere difficile definire le concentrazioni reali di esposizione, soprattutto per le sostanze adsorbenti sottoposte a prova a basse concentrazioni. In questi casi, la scomparsa della sostanza 
dalla soluzione per assorbimento sulla biomassa crescente delle alghe 
non significa che la sostanza di prova sia scomparsa dal sistema di prova. Quando il risultato della prova è analizzato, è opportuno verificare se una diminuzione della concentrazione della sostanza 
di prova nel corso della prova è accompagnato da una diminuzione 
dell’inibizione della crescita. In caso affermativo può essere presa in considerazione la possibilità di applicare un modello adeguato per descrivere la diminuzione della concentrazione della sostanza di 
prova (8). In caso contrario, può essere opportuno basare l’analisi 
dei risultati sulle concentrazioni iniziali (nominali o misurate).
 
1.8.12.  Altre osservazioni  
Deve essere eseguita un’osservazione microscopica per verificare 
l’aspetto normale e sano della coltura dell’inoculo e osservare even ­
tuali aspetti anormali delle alghe (causati per esempio dall’esposi ­
zione alla sostanza di prova) al termine della prova.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 818
 
1.8.13.  Prova limite  
In determinate circostanze, per esempio quando una prova prelimi ­
nare indica che la sostanza di prova non ha effetti tossici in concen ­
trazioni fino a 100 mg·l  –1 o fino al limite di solubilità nel mezzo di 
prova (a seconda del valore più basso), può essere svolta una prova 
limite che consiste nel confrontare le risposte in un gruppo di con ­
trollo e in un gruppo trattato (100 mg·l  –1 o una concentrazione 
uguale al limite di solubilità). È fortemente raccomandato di confer ­
mare il risultato mediante un’analisi della concentrazione di esposi ­
zione. Tutte le condizioni di prova precedentemente descritte e i criteri di validità si applicano a una prova limite, ad eccezione del 
fatto che le repliche del trattamento devono essere almeno sei. Le 
variabili di risposta nel gruppo di controllo e di trattamento possono essere analizzate con una prova statistica per confrontare le medie, per esempio con un test t di Student. Se le varianze dei due gruppi 
sono ineguali, è eseguito un test t adattato per varianze ineguali.
 
1.8.14.  Modifica per sostanze fortemente colorate  
L’irraggiamento (intensità della luce) deve avere i valori massimi 
della scala prescritta nel presente metodo di prova: 120 μE m-2 s-1 
o superiore.  
Il percorso ottico deve essere abbreviato con riduzione del volume 
delle soluzioni di prova (nella gamma di 5-25 ml).  
Occorre effettuare un’agitazione sufficiente (per esempio rimesco ­
lando moderatamente) per ottenere una frequenza elevata di esposi ­
zione delle alghe all’irraggiamento elevato sulla superficie della col ­
tura. 
2. DATI  
2.1. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DELLE CURVE DI CRE ­
SCITA  
La biomassa dei contenitori di prova può essere espressa nell’unità 
del parametro di sostituzione utilizzato per misurarla (per esempio, 
numero di cellule, fluorescenza).  
Si riportino in una tabella la concentrazione stimata della biomassa 
nelle colture di prova e di controllo, le concentrazioni della sostanza di prova e i tempi delle misure registrati con una precisione minima 
di un’ora, al fine di rappresentare graficamente le curve di crescita. 
Entrambe le scale logaritmica e lineare possono essere utili in questa prima fase, ma le scale logaritmiche sono indispensabili e general ­
mente danno una migliore rappresentazione delle variazioni del ritmo 
di crescita nel corso della prova. Si osservi che nella rappresenta ­
zione grafica la crescita esponenziale è espressa con una linea retta su scala logaritmica e che l’inclinazione (pendenza) di questa retta indica il tasso di crescita specifico.
 
Utilizzando i grafici risultanti, verificare se le colture di controllo si 
sviluppano nel corso dell’intera prova al ritmo esponenziale previsto. 
Esaminare attentamente tutti i punti e i grafici risultanti e verificare 
che i dati grezzi e i metodi utilizzati non siano falsati da errore. Verificare in particolare tutti i punti che sembrano scostarsi per un errore sistematico. Se appare evidente che il procedimento utilizzato 
comporta errori individuabili e/o molto probabili, lo specifico punto 
deve essere evidenziato come valore aberrante e non deve essere incluso nella successiva analisi statistica. (Una concentrazione algale nulla in uno dei due o tre contenitori trattati in modo identico può 
indicare che l’inoculazione non è avvenuta correttamente o che il 
contenitore non è stato pulito sufficientemente bene.) Le ragioni che giustificano l’esclusione di un punto perché considerato «valore aber ­
rante» devono essere esposte chiaramente nella relazione di prova. 
Sono accettate soltanto le ragioni dovute a (rari) errori metodologici 
e non a mancanza di precisione. I metodi statistici di identificazione dei valori aberranti offrono una soluzione limitata a questo tipo di problema e non possono sostituire il giudizio dell’esperto. Preferibil ­
mente, i valori aberranti (segnalati come tali) devono essere mante ­
nuti nelle successive rappresentazioni grafiche o tabulari dei dati.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 819
 
2.2. VARIABILI DI RISPOSTA  
Questa prova mira a determinare gli effetti della sostanza di prova 
sulla crescita delle alghe. Il metodo di prova descrive due variabili di risposta, giacché negli Stati membri esistono preferenze e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano accettabili in 
tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione 
delle due variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito.
 
a) Tasso di crescita specifico medio: questa variabile di risposta è 
calcolata in base all’incremento logaritmico della biomassa du ­
rante il periodo sperimentale, espresso in giorni.  
b) Rendimento: questa variabile di risposta corrisponde al valore 
della biomassa alla fine della prova dopo aver sottratto il valore della biomassa all’inizio della prova.
 
Per l’applicazione del presente metodo nel quadro normativo comu ­
nitario, il calcolo dei risultati deve essere basato su un tasso di crescita medio specifico per le ragioni di seguito illustrate. Giova osservare che i valori di tossicità calcolati utilizzando queste due 
variabili di risposta non sono comparabili e che occorre tenere conto 
di questa differenza quando si utilizzano i risultati della prova. I valori EC
 x basati sul tasso di crescita specifico medio (E  r C x ) saranno 
generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (E  y C x ) se le 
condizioni sperimentali di questo metodo di prova sono rispettate, a 
causa del fondamento matematico dei due approcci. Questa diffe ­
renza è dovuta soltanto al calcolo matematico, non si tratta di una differenza di sensibilità tra le due variabili in esame. Il concetto del 
tasso di crescita specifico medio si basa sullo schema generale di 
crescita esponenziale delle alghe in colture non limitate, in cui la tossicità è valutata sulla base degli effetti sul tasso di crescita, senza tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico di 
controllo, della curva discendente di concentrazione-risposta o della 
durata della prova. I risultati basati sulla variabile di rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. La E
 y C x dipende 
dal tasso di crescita specifico della specie di alga utilizzata in cia ­
scuna prova e dal tasso di crescita specifico massimo, che può va ­
riare da una specie di alga all’altra, o da un ceppo all’altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la sensibilità alle sostanze tossiche delle specie o ceppi di alga. Seppure sia preferibile, 
dal punto di vista scientifico, valutare la tossicità in base al tasso di 
crescita specifico medio, il presente metodo propone anche stime basate sul rendimento per soddisfare i requisiti normativi vigenti in alcuni paesi.
 
2.2.1.  Tasso di crescita specifico medio  
Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è 
calcolato in funzione dell’incremento logaritmico della biomassa, per ciascun contenitore dei gruppi trattati e di controllo, utilizzando la formula riportata di seguito:
 
μ iÄj ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i ðgiorno  – 1 Þ 
in cui:  
μ i-j : è il tasso di crescita specifico medio dal momento  i al mo­
mento  j; 
X i : è la biomassa al momento  i; 
X j : è la biomassa al momento  j. ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 820
 
Per ciascuno gruppo trattato e di controllo, calcolare un tasso di 
crescita a medio termine e le stime della varianza.  
Calcolare il tasso di crescita specifico medio per l’intero periodo 
della prova (generalmente dal giorno 0 al giorno 3), prendendo 
come valore di partenza, il valore nominale della biomassa inoculata 
anziché il suo valore misurato, poiché ciò permette generalmente di ottenere una maggiore precisione. Se lo strumento utilizzato per misurare la biomassa consente di determinare con sufficiente preci ­
sione una piccola biomassa di inoculo (per esempio un citometro a 
flusso), può essere utilizzata la concentrazione della biomassa misu ­
rata inizialmente. Valutare anche il tasso di crescita «sezione per sezione», calcolato come i tassi di crescita specifici di ciascun giorno 
di prova (giorni 0-1, 1-2 e 2-3) e verificare se il tasso di crescita di 
controllo rimane costante (cfr. i criteri di validità, punto 1.7). Il fatto che il tasso di crescita specifico del primo giorno sia sensibilmente inferiore al tasso di crescita specifico medio può indicare una fase di 
latenza. Se è possibile ridurre al minimo e praticamente eliminare la 
fase di latenza nelle colture di controllo mediante un’adeguata pro ­
pagazione della precoltura, la presenza di una fase di latenza nelle colture esposte può stare ad indicare una fase di recupero successiva 
ad uno choc tossico iniziale o un’esposizione ridotta causata da una 
perdita di sostanza di prova (compreso l’assorbimento sulla biomassa delle alghe) dopo l’esposizione iniziale. Il tasso di crescita «sezione per sezione» permette quindi di studiare i vari effetti della sostanza 
di prova durante il periodo di esposizione. Una differenza significa ­
tiva tra il tasso di crescita «sezione per sezione» e il tasso di crescita medio sta a indicare l’esistenza di uno scarto rispetto alla crescita 
esponenziale costante, scarto che richiede un esame attento delle 
curve di crescita.
 
Si calcoli la percentuale di inibizione del tasso di crescita per ciascun 
replicato del gruppo trattato secondo la formula seguente:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100 
in cui:  
%I r : è la percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico 
medio;  
μ C : è il valore medio del tasso di crescita specifico ( μ) medio nel 
gruppo di controllo;  
μ T : è il tasso di crescita specifico medio di uno dei replicati del 
gruppo trattato.  
Se le soluzioni di prova sono preparate utilizzando un solvente, per 
calcolare la percentuale di inibizione si devono utilizzare i controlli 
con solvente anziché i controlli senza solvente.  
2.2.2.  Rendimento  
Il rendimento è calcolato in funzione della differenza tra il valore 
della biomassa alla fine della prova e il suo valore all’inizio della 
prova per ciascun contenitore dei gruppi trattati e di controllo. Per ciascuna concentrazione di prova e di controllo, calcolare un rendi ­
mento medio e le stime della varianza. La percentuale di inibizione 
del rendimento (%I
 r ) può essere calcolata per ciascuna replica di 
ciascun gruppo trattato, secondo la formula seguente:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 821
 
in cui:  
% I  y : è la percentuale di riduzione del rendimento;  
Y C : è il valore medio del rendimento nel gruppo di controllo;  
Y T : è il valore del rendimento di uno dei replicati del gruppo 
trattato.  
2.3. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DELLE CURVE CONCEN ­
TRAZIONE-RISPOSTA  
Tracciare su un grafico la percentuale di inibizione in funzione del 
logaritmo della concentrazione della sostanza di prova e esaminare 
con attenzione i punti ottenuti, senza tenere conto dei punti eliminati 
perché considerati valori aberranti nel corso della prima fase. Inter ­
polare, manualmente o con programma informatico, una curva rego ­
lare tra i punti per ottenere una prima impressione della relazione 
concentrazione-risposta e successivamente procedere con un metodo 
più dettagliato, preferibilmente un metodo statistico computerizzato. In funzione dell’impiego al quale i dati sono destinati, della qualità (precisione) e della quantità dei dati e della disponibilità di strumenti 
di analisi dei dati, si potrà decidere (in modo fondato in alcuni casi) 
di interrompere l’analisi dei dati in questa fase e prendere in consi ­
derazione soltanto le cifre chiave, vale a dire i valori EC
 50 e EC  10 
(e/o EC  20 ), della curva interpolata manualmente (cfr. anche il se ­
guente punto sugli effetti di stimolazione). Valide ragioni per non ricorrere ad un metodo statistico possono includere:
 
— ai fini dell’affidabilità, i dati trattati con strumenti informatizzati 
non danno risultati più affidabili di quelli ottenuti in base all’ana ­
lisi di un esperto — in queste circostanze, alcuni programmi 
informatici potrebbero persino non riuscire a fornire alcuna so ­
luzione affidabile (le ripetizioni possono non convergere, ecc.),  
— gli effetti che stimolano la crescita possono non essere trattati 
correttamente dai programmi informatici disponibili (cfr. infra).  
2.4. METODI STATISTICI  
L’obiettivo consiste nell’ottenere una relazione quantitativa della 
concentrazione-risposta mediante un’analisi della regressione. È pos ­
sibile utilizzare una regressione lineare ponderata dopo avere effet ­
tuato una trasformazione di linearizzazione dei dati di reazione — 
per esempio in unità probit, logit o Weibull (9), ma è preferibile 
applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle irregolarità inevitabili dei valori e degli scarti rispetto alle distribuzioni regolari. Vicine allo zero o all’inibizione totale, 
queste irregolarità possono essere amplificate dalla trasformazione 
e interferire con l’analisi (9). Occorre rilevare che i metodi analitici usuali che ricorrono alle trasformazioni probit, logit o Weibull sono destinati ad essere utilizzati con dati quantali (per esempio, mortalità 
o sopravvivenza) e devono essere modificati per poter essere utiliz ­
zati con i dati concernenti la crescita o la biomassa. Alcune proce ­
dure specifiche che consentono di determinare i valori EC
 x a partire 
da dati continui sono reperibili nei riferimenti 10, 11 e 12. L’utilizzo 
di un’analisi della regressione non lineare è precisato 
nell’appendice 4.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 822
 
Per ciascuna variabile di risposta, utilizzare il rapporto concentrazio ­
ne-risposta per calcolare stime puntuali dei valori EC  x . Laddove 
possibile, determinare gli intervalli di confidenza a 95 % per ogni stima. La validità dell’adeguatezza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione dovrebbe essere valutata grafica ­
mente o statisticamente. L’analisi della regressione deve essere ef ­
fettuata basandosi sulle reazioni rilevate in ogni contenitore replicato e non sulle medie dei gruppi trattati. Tuttavia, se risulta difficile o impossibile interpolare una curva perché i dati sono troppo dispersi, 
si può in quel caso ricorrere ad una regressione sulle medie dei 
gruppi, il che consente di ridurre l’influenza dei valori che potreb ­
bero essere aberranti. Il ricorso a questa opzione deve essere indicato nella relazione di prova come uno scostamento dalla procedura nor ­
male, dovuto al risultato insoddisfacente prodotto dall’interpolazione 
della curva con i valori dei singoli replicati.
 
Le stime della EC  50 e gli intervalli di confidenza possono essere 
ottenuti anche mediante interpolazione lineare con  bootstrapping  
(13), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.
 
Per stimare la LOEC, e dunque la NOEC, per gli effetti della so ­
stanza di prova sul tasso di crescita, è necessario paragonare le medie dei gruppi trattati mediante un’analisi della varianza (ANO ­
VA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata 
con la media dei controlli mediante un metodo adeguato di compa ­
razione multipla o un metodo di tendenza. Possono risultare utili i test di Dunnett o di William (14, 15, 16, 17, 18). È necessario controllare se l’ipotesi di omogeneità della varianza dell’ANOVA è 
fondata. Questo controllo può essere effettuato graficamente o con 
un test formale (18), come il test di Levene o di Bartlett. Se l’ipotesi dell’omogeneità della varianza non si conferma, a volte si possono correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. Se l’ete ­
rogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta mediante 
una trasformazione, si prenderanno in considerazione metodi analitici come i test di tendenza regressivi di Jonkheere. Il riferimento 12 fornisce ulteriori informazioni sulla determinazione della NOEC.
 
Alcuni progressi recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare 
l’abbandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali 
della EC  x basate sulla regressione. Per questa prova sulle alghe non 
sono stati fissati valori adeguati di x. Tuttavia, un intervallo tra il 10 e il 20 % sembra adeguato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile menzionare entrambi i valori 
EC
 10 e EC  20 . 
2.5. STIMOLAZIONE DELLA CRESCITA  
Si osserva a volte una stimolazione della crescita (inibizione negati ­
va) a basse concentrazioni. Questo fenomeno può derivare da ormesi («stimolazione tossica») o dall’introduzione di fattori di stimolazione 
della crescita, trasportati dalla sostanza di prova, nel mezzo minimo 
utilizzato. Si noti che l’aggiunta di sostanze nutritive minerali non dovrebbe esercitare alcun effetto diretto dato che il mezzo di prova deve contenere un eccesso di sostanze nutritive nel corso della prova. 
La stimolazione a basse dosi può essere generalmente ignorata nei 
calcoli della EC
 50 , a meno che sia molto pronunciata. Tuttavia, se 
tale stimolazione è estrema o se si deve calcolare un valore EC  x per 
un valore basso di x, potrebbero essere necessarie procedure parti ­
colari. Si eviti, per quanto possibile, di eliminare dall’analisi dei dati 
le risposte minime della stimolazione e, se il software di interpola ­
zione della curva non accetta una stimolazione di piccola entità, può essere usata un’interpolazione lineare mediante bootstrapping. Se la 
stimolazione è estrema, è possibile ricorrere a un modello di ormesi 
(19).
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 823
 
2.6. INIBIZIONE NON TOSSICA DELLA CRESCITA  
Le sostanze di prova che assorbono la luce possono dar luogo a una 
riduzione del tasso di crescita, poiché l’ombreggiatura diminuisce la quantità di luce disponibile. Occorre distinguere questi tipi di effetti 
fisici dagli effetti tossici modificando le condizioni sperimentali; 
menzionare i primi separatamente nella relazione. I riferimenti 2 e 3 danno indicazioni al riguardo.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SULLA PROVA  
La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— stato fisico e proprietà fisico-chimiche pertinenti, compreso il 
limite di solubilità in acqua,  
— dati di identificazione chimica, compresa la purezza.  
Specie oggetto della prova:  
— ceppo, fornitore o origine e condizioni di coltura utilizzate.  
Condizioni sperimentali:  
— data dell’inizio della prova e durata della prova,  
— descrizione della prova: contenitori di prova, volumi delle solu ­
zioni, densità della biomassa all’inizio della prova,  
— composizione del mezzo,  
— concentrazioni di prova e replicati (per esempio, numero di re ­
plicati, numero di concentrazioni di prova e progressione geome ­
trica applicata),  
— descrizione dei metodi di preparazione delle soluzioni di prova, 
ivi compreso l’uso di solventi, ecc.,  
— apparecchiatura per le colture,  
— intensità e qualità dell’illuminazione (fonte, omogeneità),  
— temperatura,  
— concentrazioni testate: concentrazioni di prova nominali e tutti i 
risultati delle analisi volti a determinare la concentrazione della 
sostanza di prova nei contenitori di prova; devono essere indicati 
anche l’efficienza di recupero del metodo e il limite di determi ­
nazione,  
— tutte le deviazioni rispetto al metodo di prova,  
— metodo di determinazione della biomassa e dimostrazione della 
correlazione tra il parametro misurato e il peso secco.  
Risultati:  
— valori del pH all’inizio e alla fine della prova in tutti i contenitori 
trattati,  
— biomassa in ciascun contenitore in ciascun punto di prelievo e 
metodo di misurazione della biomassa,  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 824
 
— curve di crescita (biomassa in funzione del tempo),  
— calcolo delle variabili di risposta per ciascun replicato, con valore 
medio e coefficiente di variazione dei replicati,  
— rappresentazione grafica del rapporto concentrazione-risposta,  
— stima della tossicità per le variabili di risposta, per esempio EC  50 , 
EC 10 e EC  20 e relativi intervalli di confidenza. Qualora siano 
calcolate, la LOEC e la NOEC e i metodi statistici utilizzati 
per determinarle,  
— se è stata effettuata un’analisi della varianza (ANOVA), la por ­
tata dell’effetto individuabile (ovvero la differenza meno signifi ­
cativa),  
— stimoli alla crescita eventualmente osservati in un gruppo trattato,  
— altri effetti osservati, per esempio modifiche morfologiche delle 
alghe,  
— analisi dei risultati, compresa l’influenza sul risultato del test 
risultante dagli scostamenti dal presente metodo di prova.  
4. BIBLIOGRAFIA  
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Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
11. Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
12. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
13. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
14. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096-1121  
15. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics 20: 482-491.  
16. Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103-117.  
17. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
18. Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
19. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
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Appendice 1  
Specie dimostratesi idonee alla prova  
Alghe verdi  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (già nota come  Selenastrum capricornutum ), 
ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (già nota come  Scenedesmus subspicatus ) 86.81 
SAG  
Diatomee  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobatteri  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Fonti delle specie  
Le specie raccomandate sono disponibili in colture unialgali dalle seguenti col ­
lezioni (in ordine alfabetico):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
STATI UNITI  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
REGNO UNITO  
SAG: Collection of Algal Cultures  
Inst. Plant Physiology  
University of Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
3400 Göttingen  
GERMANIA  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
STATI UNITI  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 827
 
Aspetto e caratteristiche delle specie raccomandate  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aspetto singole cellu ­
le, curve e ri ­
torte per lo più 
singole cellu ­
le, ovali bastoncelli catene for ­
mate da cel ­
lule ovali bastoncelli 
Dimensioni (L × W) μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volume cellulare ( μm 3 /cell) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Peso secco cellulare (mg/cell) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Tasso di crescita (  3 ) (giorno  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Misurato con un contatore elettronico di particelle. 
( 2 ) Calcolato sulla base delle dimensioni. 
( 3 ) Tasso di crescita generalmente osservato in mezzo OCSE esposto a un’intensità luminosa approssimativamente di 70 μE m  –2 ·s –1 e 
a 21 °C.  
Raccomandazioni particolari per la coltura e la manipolazione delle specie di 
prova raccomandate  
Pseudokirchneriella subcapitata  e Desmodesmus subspicatus  
Queste alghe verdi sono generalmente facili da coltivare in vari terreni di coltura. 
Le collezioni di colture forniscono agli utenti informazioni sui terreni adeguati. Le cellule sono generalmente separate e la densità cellulare si misura facilmente con un contatore elettronico di particelle o microscopio.
 
Anabaena flos-aquae  
La coltura madre si conserva in diversi terreni di coltura. In particolar modo si 
deve evitare che i batch di coltura abbiano superato la fase esponenziale di 
crescita al momento del rinnovo, poiché il recupero è difficile a questo punto.  
L’Anabaena flos-aquae  forma catene di cellule raccolte in spirali (aggregati). La 
dimensione di tali aggregati varia in funzione delle condizioni di coltura. Può essere necessario spezzare tali aggregati per contare le cellule al microscopio o con contatore elettronico di particelle, per determinare la biomassa.
 
Le catene di sottocampioni possono essere spezzate in vari punti mediante soni ­
cazione, per ridurre la variabilità di calcolo. Processi di sonicazione più lunghi 
del necessario per spezzare le catene in piccoli segmenti potrebbero distruggere le 
cellule. L’intensità e la durata della sonicazione devono essere identiche per ciascuno gruppo trattato.
 
Per contribuire a compensare la variabilità si contino sufficienti campi nella 
griglia dell’emocitometro (almeno 400). Ciò aumenterà l’affidabilità delle deter ­
minazioni della densità al microscopio.  
Dopo aver diviso le catene di cellule mediante attenta sonicazione, il volume 
cellulare totale di Anabaena può essere determinato utilizzando un contatore 
elettronico di particelle. La potenza della sonicazione deve essere regolata in 
modo da evitare di rompere le cellule.  
Utilizzare un agitatore a vortice o strumento analogo per assicurare che la so ­
spensione di alghe utilizzata per inoculare i contenitori di prova sia sufficiente ­
mente mescolata e omogenea.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 828
 
I contenitori di prova devono essere posti su tavoli scuotitori reciproci con moto 
rettilineo alternato o con moto rotatorio a circa 150 giri al minuto. In alternativa, 
l’Anabaena  può anche essere agitata ad intermittenza al fine di evitare la forma ­
zione di aggregati. Qualora invece ciò avvenga, si provvederà a prelevare cam ­
pioni rappresentativi ai fini della misurazione della biomassa. Un’agitazione vi ­
gorosa prima del prelievo può essere necessaria per disgregare gli ammassi di 
alghe.  
Synechococcus leopoliensis  
La coltura madre si conserva in diversi terreni di coltura. Le collezioni di colture 
forniscono informazioni agli utenti sui terreni adeguati.  
La Synechococcus leopoliensis  cresce formando bastoncelli isolati. La minuscola 
dimensione delle cellule ne rende difficile la conta al microscopio ai fini della misurazione della biomassa. In questo caso, è utile disporre di un contatore elettronico capace di contare particelle di dimensione fino a 1 μm. È applicabile 
anche la misurazione fluorimetrica in vitro.
 
Navicula pelliculosa  
La coltura madre si conserva in diversi terreni di coltura. Le collezioni di colture 
forniscono informazioni agli utenti sui terreni adeguati. Si noti che in questo caso 
deve essere aggiunto silicato.  
La Navicula pelliculosa  può formare aggregati in alcune condizioni colturali. A 
causa della produzione lipidica, le cellule algali tendono a volte ad accumularsi nella pellicola che si forma in superficie. Se ciò avviene, si devono prendere 
misure apposite durante il prelievo di sottocampioni ai fini della determinazione 
della biomassa per garantire la rappresentatività dei campioni. Può risultare ne ­
cessaria un’agitazione vigorosa, per esempio tramite un agitatore a vortice.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 829
 
Appendice 2  
Mezzi di crescita  
Può essere utilizzato uno dei due mezzi di crescita seguenti:  
Mezzo OCSE: Mezzo originale della linea guida 201 dell’OCSE, conforme alla 
norma ISO 8692  
Mezzo AAP dell’EPA (USA), conforme all’ASTM.  
Nella preparazione di questi mezzi devono essere utilizzati reagenti o sostanze di 
grado «analitico» e acqua deionizzata.  
Composizione del mezzo AAP (EPA USA) e di quello indicato nella linea guida 201 dell’OCSE  
Componente EPA OCSE 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) La relazione molare dell’EDTA sul ferro è leggermente superiore all’unità. Ciò impedisce al ferro di 
precipitare e minimizza allo stesso tempo la chelazione degli ioni di metalli pesanti.  
Nella prova condotta sulla diatomea  Navicula pelliculosa , ai due mezzi deve 
essere aggiunto Na  2 SiO  3 ·9H  2 O, per raggiungere una concentrazione di 1,4 Mg 
di Si/l.  
Il pH del mezzo è ottenuto al punto di equilibrio tra il sistema carbonato del 
mezzo e la pressione parziale di CO  2 nell’aria atmosferica. Una relazione ap ­
prossimativa tra il pH a 25 °C e la concentrazione molare di bicarbonato è 
espressa dalla seguente formula:  
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 830
 
Con 15 mg/l NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (mezzo USA-EPA) e con 50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8,1 (mezzo OCSE).  
Composizione degli elementi del mezzo di prova  
Elemento EPA OCSE 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Preparazione del mezzo di crescita OCSE  
Sostanza nutritiva Concentrazione nella soluzione madre 
Soluzione madre 1: macroelementi  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Soluzione madre 2: ferro  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Soluzione madre 3: oligoelementi  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Soluzione madre 4: bicarbonato  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Le soluzioni madre sono sterilizzate mediante filtrazione su membrana (diametro 
medio dei pori: 0,2 μm) o con autoclavaggio (15 minuti a 120 °C). Conservare le 
soluzioni al buio e alla temperatura di 4 °C.  
Le soluzioni madre 2 e 4 sono sterilizzate solo mediante filtrazione su membrana, 
non devono essere sottoposte ad autoclavaggio.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 831
 
Preparare il mezzo di crescita aggiungendo un volume adeguato delle soluzioni 
madre da 1 a 4 all’acqua:  
Aggiungere a 500 ml di acqua deionizzata:  
— 10 ml di soluzione madre 1  
— 1 ml di soluzione madre 2  
— 1 ml di soluzione madre 3  
— 1 ml di soluzione madre 4  
Portare a 1 000 ml con acqua deionizzata.  
Attendere che il preparato raggiunga l’equilibrio con il CO  2 atmosferico, se 
necessario facendo gorgogliare aria sterile e filtrata per alcune ore.  
Preparazione del mezzo di crescita AAP  
A1.1. Aggiungere 1 ml di ciascuna soluzione madre di cui ai punti A1.2.1- 
A1.2.7 a circa 900 ml di acqua deionizzata o distillata, e diluire fino al volume di 1 litro.
 
A1.2. Preparare le soluzioni madre macronutrienti sciogliendo i seguenti com ­
posti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata. I reagenti A1.2.1, 
A1.2.2, A1.2.3 e A1.2.4 possono essere combinati in un’unica solu ­
zione madre.  
A1.2.1.  NaNO  3 -12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O-6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O-2,205 g.  
A1.2.4.  Soluzioni madre macronutrienti -(cfr. A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O-7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 -0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 -7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O-Cfr. Nota A1.1.  
Nota A1.1. Da utilizzare soltanto per le diatomee. Può essere aggiunto 
direttamente (202,4 mg) o tramite soluzione madre per raggiungere una concentrazione finale di 20 mg/l di Si nel mezzo di crescita.
 
A1.3. La soluzione madre macronutriente è preparata sciogliendo i seguenti 
composti in 500 ml di acqua deionizzata o distillata:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 -92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O-207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 -1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O-79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O-0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O-3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O-0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O-150,000 mg.  
[Disodio (etilendiamina-)tetracetato].  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 832
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O-0,005 mg Cfr. Nota A1.2.  
Nota A1.2. Da utilizzare soltanto nel mezzo di crescita per le soluzioni 
madre di diatomee.  
A1.4. Regolare il pH a 7,5 ± 0,1 con 0,1  N o 1,0  N NaOH o HCl.  
A1.5. Filtrare il mezzo in un contenitore sterile attraverso un filtro a mem ­
brana con pori di 0,22 μm se si utilizza un contatore di particelle, o 
attraverso un filtro con pori di 0,45 μm se non si utilizza il contatore di 
particelle.  
A1.6. Conservare il mezzo di crescita al buio, alla temperatura di circa 4 °C 
fino all’utilizzo.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 833
 
Appendice 3  
Esempio di metodo di coltura delle alghe  
Osservazioni generali  
La preparazione di colture sulla base del seguente procedimento mira a ottenere 
colture algali destinate ai test di tossicità.  
Si devono usare metodi adatti per assicurare che le colture algali non siano infette 
da batteri. Sono auspicabili colture axeniche, ma devono essere utilizzate colture 
unialgali.  
Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili per evitare ogni 
contaminazione con batteri o altre alghe.  
Attrezzature e materiale  
Cfr. Metodo di prova: attrezzature.  
Metodo per ottenere colture algali  
Preparazione di soluzioni nutritive (mezzo)  
Tutti i sali minerali del mezzo sono preparati sotto forma di soluzioni madre 
concentrate e depositate al freddo e al riparo dalla luce. Queste soluzioni sono 
sterilizzate tramite filtrazione o con autoclavaggio.  
Preparare il mezzo aggiungendo una quantità adeguata di soluzione madre all’ac ­
qua distillata sterile, facendo attenzione ad evitare ogni rischio di infezione. Per i 
mezzi solidi, aggiungere 0,8 % di agar.  
Coltura madre  
Le colture madri che fungono da materiale di prova iniziale sono piccole colture 
algali trasferite con regolarità su mezzo di crescita fresco. Nel caso in cui le 
colture non vengano utilizzate con regolarità, esse vanno strisciate su pezzi di 
agar in provette inclinate. Le colture sono trasferite su mezzo fresco almeno una volta ogni due mesi.
 
Le colture madri sono coltivate in matracci conici contenenti il mezzo adeguato 
(volume di circa 100 ml). Quando le alghe sono incubate a 20 °C con illumi ­
nazione continua è necessario un trasferimento settimanale.  
Durante il trasferimento, una certa quantità di coltura «vecchia» viene trasferita 
con pipette sterili in una beuta contenente mezzo fresco; la quantità deve essere tale che, nel caso delle specie a crescita rapida, la concentrazione iniziale sia 
circa 100 volte inferiore di quella della coltura vecchia.
 
Il tasso di crescita di una specie può essere determinato dalla curva di crescita. Se 
questa è nota, è possibile stimare la densità alla quale la coltura deve essere trasferita ad un mezzo nuovo. Ciò deve essere fatto prima che la coltura rag ­
giunga la fase di mortalità.
 
Precoltura  
La precoltura serve a fornire un quantitativo di alghe sufficiente per l’inoculo 
delle colture di prova. La precoltura è incubata in condizioni sperimentali e utilizzata quando è ancora in crescita esponenziale, solitamente dopo un periodo 
di incubazione da 2 a 4 giorni. Qualora contengano cellule deformate o anomale, 
le colture algali devono essere scartate.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 834
 
Appendice 4  
Analisi dei dati tramite regressione non lineare  
Osservazioni generali  
L’effetto osservato nelle prove sulle alghe e nelle altre prove di crescita di 
microrganismi (aumento della biomassa) è espresso, per sua natura, da una 
variabile continua o discreta; tale variabile è data dalla velocità del processo se 
si utilizza il tasso di crescita o dalla sua integrale in funzione del tempo se si sceglie la biomassa. Queste due variabili sono raffrontate con il corrispondente risultato medio osservato su repliche di non esposti che presentano l’effetto 
massimo alle condizioni imposte, in cui la luce e la temperatura sono i principali 
fattori determinanti nei test sulle alghe. Il sistema è distribuito o omogeneo e la biomassa può essere considerata un continuum, senza considerare le singole cellule. La distribuzione della varianza del tipo di risposta di tale sistema dipende 
soltanto dai fattori sperimentali (descritti generalmente dalle distribuzioni log- 
normale o normale dell’errore), contrariamente a quanto avviene negli esperi ­
menti biologici classici i cui effetti sono espressi con dati quantali e per i quali spesso si presume che la tolleranza (generalmente con distribuzione binomiale) di 
ciascun organismo costituisca la componente dominante della varianza. In questo 
caso, le risposte di controllo hanno valore zero o quello del livello di fondo.
 
Nella situazione semplice, l’effetto normalizzato o relativo (r) diminuisce da 1 
(inibizione nulla) a 0 (inibizione al 100 %). Si noti che tutti gli effetti hanno un 
errore associato e che le inibizioni negative evidenti possono essere calcolate 
come risultato del solo errore casuale.  
Analisi della regressione  
Modelli  
Un’analisi della regressione mira a descrivere quantitativamente la curva concen ­
trazione-risposta sotto forma di funzione matematica della regressione Y = f (C) o, più frequentemente, F (Z) dove Z = log C. La funzione inversa, C = f
 –1 (Y) 
permette di calcolare i valori EC  x , compresi i valori EC  50 , EC  10 e EC  20 , e i 
corrispondenti intervalli di confidenza a 95 %. Molte funzioni matematiche sem ­
plici hanno dimostrato di descrivere correttamente la relazione concentrazione- risposta ottenuta nelle prove di inibizione della crescita delle alghe. Fra dette 
funzioni rientrano, per esempio, l’equazione logistica, l’equazione asimmetrica di 
Weibull e la distribuzione log-normale, che sono tutte curve sigmoidee che tendono asintoticamente a 1 per C → 0 e a 0 per C → infinito.
 
L’utilizzo di modelli di funzioni soglia continue (per esempio il modello di 
Kooijman per «l’inibizione della crescita della popolazione», Kooijman et al, 
1996) costituisce una soluzione proposta recentemente in alternativa ai modelli asintotici. Questo modello suppone che non si producano effetti a concentrazioni inferiori ad una certa soglia, EC0+, stimata tramite estrapolazione della relazione 
concentrazione-risposta che consiste nell’intercettare l’asse delle concentrazioni 
per mezzo di una funzione continua semplice non differenziabile al punto di partenza.
 
Giova notare che l’analisi può essere una semplice minimizzazione delle somme 
dei quadrati dei residui (supponendo che la varianza sia costante) o dei quadrati 
ponderati se l’eterogeneità della varianza è compensata.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 835
 
Procedimento  
Scegliere un’equazione funzionale adeguata, Y = f (C), e interpolare i dati con 
una regressione non lineare. Utilizzare preferibilmente le misure rilevate in cia ­
scuna beuta anziché i valori medi delle repliche, per trarre quante più informa ­
zioni possibile dai dati. D’altra parte, se la varianza è elevata, l’esperienza pratica 
induce a supporre che le medie delle repliche possono fornire una stima mate ­
matica più solida, meno influenzata dagli errori casuali dei dati rispetto a ciascun punto preso singolarmente.
 
Rappresentare su un grafico i valori misurati e la curva interpolata e verificare se 
l’interpolazione è adeguata. L’analisi dei valori residui può essere uno strumento 
particolarmente utile a questo proposito. Se la funzione scelta per interpolare la curva concentrazione-risposta non descrive l’intera curva o un segmento fonda ­
mentale di questa, per esempio l’effetto alle basse concentrazioni, si scelga un 
altro modello di interpolazione, per esempio una curva asimmetrica, quale la 
funzione di Weibull, anziché la funzione simmetrica. Le inibizioni negative possono porre problemi con, per esempio, la funzione di distribuzione log-nor ­
male, che richiede parimenti una funzione alternativa di regressione. È sconsi ­
gliato assegnare un valore nullo o un valore positivo di piccola entità a questi valori negativi perché ciò distorce la distribuzione degli errori. Per stimare i valori di EC
 xlow può essere utile procedere a interpolazioni separate su parti della 
curva, per esempio il segmento in cui l’inibizione relativa è bassa. Sulla base 
dell’equazione interpolata (con «stima inversa», C = f  –1 (Y)), calcolare stime 
specifiche caratteristiche della EC  x e riportare almeno la EC  50 e una o due 
EC xlow . L’esperienza maturata nelle prove pratiche ha dimostrato che la preci ­
sione della prova sulle alghe permette generalmente di ottenere una stima ragio ­
nevolmente precisa con soglia di inibizione del 10 % se i punti disponibili sono sufficientemente numerosi — a meno che non si produca una stimolazione alle basse concentrazioni, che renderebbe confusi i risultati della prova. La precisione 
della stima dei valori EC
 20 è spesso migliore di quelli EC  10 , perché la EC  20 si 
situa generalmente sulla parte quasi lineare della curva centrale concentrazione- risposta. A volte, la EC
 10 può essere difficile da interpretare a causa della 
stimolazione di crescita, di modo che, sebbene la EC  10 si ottenga generalmente 
con una precisione sufficiente, si raccomanda di citare sempre anche la EC  20 . 
Fattori di ponderazione  
In generale, la varianza sperimentale non è costante e include una componente 
proporzionale; per questo motivo risulta opportuno procedere regolarmente ad 
una regressione ponderata. I fattori di ponderazione per tale analisi sono gene ­
ralmente considerati inversamente proporzionali alla varianza:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Molti programmi di regressione permettono di effettuare un’analisi della regres ­
sione ponderata con fattori di ponderazione riportati in una tabella. Per maggiore 
semplicità, conviene normalizzare i fattori di ponderazione moltiplicandoli per 
n/∑ w i (n è il numero dei punti) di modo che la loro somma risulti 1.  
Normalizzare le risposte  
La normalizzazione con il valore medio delle risposte pone alcuni problemi di 
principio e dà luogo ad una struttura della varianza piuttosto complicata. Divi ­
dendo i valori ottenuti dalle prove per il loro valore medio al fine di ottenere la percentuale di inibizione, si introduce un errore supplementare dovuto all’errore 
sulla media di controllo. A meno che l’errore non sia trascurabile, si devono 
correggere i fattori di ponderazione applicati alla regressione e gli intervalli di confidenza in funzione della covarianza con il controllo (17). Si sottolinea l’im ­
portanza di ottenere un’elevata precisione nella stima della media dei valori di 
controllo, per ridurre al minimo la varianza complessiva delle risposte relative. 
Tale varianza si calcola con la seguente formula:
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 836
 
(il deponente  i è riferito al livello di concentrazione i e il deponente  0 ai controlli)  
Y i = Risposta relativa = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
con una varianza:  
Var(Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
e, giacché  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 and (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
con una distribuzione normale dei dati e delle repliche m  i e m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
la varianza totale della risposta relativa, Y  i diventa quindi:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
L’errore sulla media dei controlli è inversamente proporzionale alla radice qua ­
drata del numero di repliche di controlli utilizzati per il calcolo della media, e a 
volte è giustificato includere dati storici, riducendo così l’errore in modo sensi ­
bile. Un metodo alternativo consiste nel non normalizzare i dati né interpolare i valori relativi alle risposte assolute, ivi comprese le risposte dei controlli, bensì introdurre il valore della risposta dei controlli come parametro aggiuntivo da 
interpolare mediante regressione non lineare. Con una consueta equazione di 
regressione a due parametri, questo metodo richiede l’interpolazione di 3 para ­
metri e richiede pertanto più punti rispetto alla regressione non lineare su dati normalizzati utilizzando un valore predeterminato della risposta di controllo.
 
Intervalli di confidenza inversi  
Il calcolo degli intervalli di confidenza di una regressione non lineare mediante 
una stima inversa è abbastanza complesso e generalmente non rientra fra le opzioni standard dei normali programmi di calcolo statistico. Intervalli di confi ­
denza approssimativi possono essere ottenuti con programmi classici di regres ­
sione non lineare, tramite una riparametrizzazione (Bruce e Versteeg, 1992) consistente nel riformulare l’equazione matematica con le stime desiderate, per esempio la EC
 10 e la EC  50 , come parametri da stimare. (Sia la funzione I = f ( α, 
β, concentrazione), si utilizzino le relazioni di definizione f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 e f 
(α, β, EC  50 ) = 0,5 per sostituire f ( α, β, concentrazione) con una funzione 
equivalente g (EC  10 , EC  50 , concentrazione).  
Un calcolo più diretto (Andersen et al, 1998) consiste nel mantenere l’equazione 
di origine e applicare un’espansione di Taylor attorno alle medie di r  i e r 0 . 
Negli ultimi anni si sono diffusi i metodi «bootstrapping». Questi metodi utiliz ­
zano i dati misurati e un ri-campionamento frequente diretto da un generatore di numeri casuali, per stimare la distribuzione empirica della varianza.
 
Bibliografia  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricoltural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 837
 
C.4. BIODEGRADAZIONE DETERMINAZIONE DELLA «PRONTA» 
(READY) BIODEGRADABILITÀ  
PARTE I.  CONSIDERAZIONI GENERALI  
1.1. INTRODUZIONE  
Vengono descritti sei metodi d'analisi che permettono di valutare la 
pronta biodegradabilità di composti chimici in un mezzo acquoso in condizioni aerobiche:
 
a) Carbonio organico disciolto (DOC) — rimozione lenta (Metodo 
C.4-A)  
b) «Screening» OCSE modificato — rimozione lenta del DOC (Me ­
todo C.4-B)  
c) Sviluppo di biossido di carbonio (CO  2 ) — Saggio di Sturm mo ­
dificato) (Metodo C.4-C)  
d) Respirometria manometrica (Metodo C.4-E)  
e) Bottiglia chiusa (Metodo C.4-E)  
f) MITI (Ministero del Commercio Internazionale e dell'Industria — 
Giappone) (Metodo C.4-F)  
Nella Parte I del metodo sono date indicazioni di carattere generale 
nonchè considerazioni comuni per tutti sei i saggi. Gli aspetti spe ­
cifici dei metodi sono presentati nelle parti da II a VII. Gli allegati contengono definizioni, formule e materiale operativo.
 
Un saggio di confronto interlaboratori OCSE, effettuato nel 1988, ha 
mostrato che i metodi forniscono dei risultati coerenti. 
Tuttavia, secondo le caratteristiche fisiche della sostanza da saggiare, 
si può preferire l'uno o l'altro metodo.  
1.2. SCELTA DEL METODO PIÙ APPROPRIATO  
Allo scopo di scegliere il metodo più appropriato, è essenziale di ­
sporre di informazioni sulla solubilità, sulla tensione di vapore e sulle caratteristiche di adsorbimento del composto chimico. Do ­
vrebbe essere nota la struttura chimica o la formula bruta per calco ­
lare i valori teorici e/o per controllare i valori dei parametri signifi ­
cativi, per esempio ThOD, ThCO
 2 , DOC, TOD, COD, misurati (si 
vedano gli allegati I e II).  
I composti chimici da esaminare che sono solubili in acqua, ad una 
concentrazione di almeno 100 mg/l, possono essere valutati con tutti i metodi, a condizione che non siano volatili e non diano luogo a 
fenomeni di adsorbimento. Nella tabella n. 1 vengono riportati me ­
todi idonei per quei composti chimici, volatili o adsorbibili, scarsa ­
mente solubili in acqua. Nell'allegato IH è descritto come si possono trattare i composti chimici scarsamente solubili in acqua e quelli 
volatili. Composti chimici moderatamente volatili possono essere 
controllati mediante il metodo di rimozione lenta del DOC se nei contenitori di prova si dispone di uno spazio gassoso sufficiente (che dovrebbe opportunamente tappato). In questo caso, è necessario ese ­
guire anche un controllo abiotico per tener conto di eventuali perdite 
per fenomeni fisici.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 838
 
Tabella 1  
Applicabilità dei metodi di saggio  
Saggio Metodo analitico Idoneità del metodo per sostanze: 
scars. solub. volatili adsorbibili  
Rimozione lenta DOC Carbonio organico disciolto — — +/– 
Rimozione lenta OCSE mo ­
dificato Carbonio organico disciolto — — +/– 
Sviluppo CO  2 Respìrometria: sviluppo 
CO 2 + — + 
Respirometria manometrica Respirometria manometrica: 
consumo d'ossigeno + +/– + 
Bottiglia chiusa Respirometria: ossigeno di ­
sciolto +/– + + 
MITI Respirometria: consumo 
d'ossigeno + +/– +  
Per interpretare i risultati ottenuti, in particolare quando i valori di 
biodegradabilità sono bassi o marginali, è necessario acquisire ulte ­
riori informazioni riguardo alla purezza e alle proporzioni relative dei componenti principali del materiale da saggiare.
 
Informazioni sulla tossicità del composto chimico da saggiare, nei 
confronti dei batteri (vedi allegato IV), possono essere molto utili per 
una scelta mirata della concentrazione da sottoporre a saggio e per una corretta interpretazione dei bassi valori di biodegradazione.
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Allo scopo di verificare la procedura, si controllano prodotti chimici 
di riferimento che rispettano i criteri di pronta biodegradabilità in ­
stallando un pallone apportuno in parallelo come parte delle normali 
prove sperimentali.  
Composti chimici adatti sono anilina (distillata di fresco), acetato di 
sodio e benzoato di sodio. Questi prodotti chimici di riferimento si degradano tutti in questi metodi anche quando non si aggiunga 
deliberatamente inoculo.
 
È stato suggerito che si dovrebbe cercare un prodotto chimico di 
riferimento che sia facilmente biodegradabile, ma che richieda l'ag ­
giunta di un inoculo, anche nel saggio della bottiglia chiusa. È stato 
proposto l'idrogenoftalato di potassio, ma mancano le prove per 
accettare questa sostanza come sostanza di riferimento.  
Nei saggi respirometrici, i composti contenenti azoto possono in ­
fluire sull'assorbimento di ossigeno a causa della nitrificazione (si vedano gli allegati II e V).
 
1.4. PRINCIPIO DEI METODI DI SAGGIO  
Una soluzione, o sospensione, della sostanza in esame in un mezzo 
minerale viene inoculata e incubata in condizioni aerobiche al buio o 
a luce diffusa. La quantità di DOC introdotta nella soluzione con l'inoculo dovrebbe essere quanto più bassa possibile in paragone alla quantità di DOC dovuta alla sostanza in esame. Per valutare l'attività 
endogena dell'inoculo, si eseguono, in parallelo, dei saggi in bianco 
con l'inoculo ma senza sostanze in esame, in quanto l'attività endo ­
gena delle cellule, in presenza della sostanza, non si concilia esatta ­
mente con quella del controllo. Un saggio con una sostanza di rife ­
rimento viene eseguito in parallelo per valutare l'efficacia della pro ­
cedura.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 839
 
In generale, la degradazione viene seguita mediante la determina ­
zione di parametri significativi, come DOC, produzione di CO  2 e 
consumo dell'ossigeno. Le misure vengono effettuate ad intervalli sufficientemente frequenti per permettere l'identificazione della bio ­
degradazione dall'inizio alla fine. Con respirometri automatici, la 
misurazione è continua. Il DOC viene misurato in aggiunta ad un 
altro parametro, di solito all'inìzio e al termine della prova. Si può anche utilizzare un'analisi chimica specifica per valutare la degradazione primaria della sostanza in esame e per determinare 
la concentrazione delle eventuali sostanze intermedie formate (questa 
analisi è obbligatoria nel saggio MITI).
 
Normalmente la prova dura 28 giorni. Tuttavia è possibile terminare 
il saggio prima dei 28 giorni, per esempio appena la curva 
della degradazione biologica ha raggiunto un livello stazionario per almeno tre determinazioni. Le prove possono anche essere prolun ­
gate oltre i 28 giorni quando la curva mostra che la biodegradazione 
è iniziata ma che non si è ancora raggiunto lo stato stazionario al 28° 
giorno.
 
1.5. CRITERIO DI QUALITÀ  
1.5.1.  Riproducibilità  
A causa della natura della biodegradazione e delle popolazioni bat ­
teriche miste usate come inoculi, le determinazioni devono essere eseguite almeno in doppio.
 
È esperienza comune che quanto più grande è la concentrazione di 
microorganismi aggiunti inizialmente al mezzo colturale, tanto mi ­
nori saranno le variazioni tra le repliche. Prove di intercalibrazione 
tra laboratori hanno mostrato che vi possono essere grandi variazioni 
tra i risultati ottenuti da differenti laboratori, ma normalmente si ottiene un buon accordo con composti chimici di riferimento facil ­
mente biodegradabili.
 
1.5.2.  Validità del saggio  
Il saggio viene considerato valido se la differenza tra i valori estremi 
delle prove in multiplo di rimozione del composto chimico in esame al «plateau», alla fine del saggio o alla fine della fase di crescita 
(rime window) di 10 giorni, è minore del 20 % e se la degradazione 
percentuale della sostanza di riferimento ha raggiunto il livello corri ­
spondente alla «pronta» biodegradabilità in 14 giorni. Se non si verifica una di queste condizioni, la prova deve venire ripetuta. 
Data la rigorosità dei metodi, bassi valori non significano necessa ­
riamente che la sostanza in esame non sia biodegradabile nell'am ­
biente, ma che sarà necessario ulteriore lavoro per definire la biode ­
gradabilità.
 
Se in un saggio di tossicità, contenente sia la sostanza in esame che un 
composto chimico di riferimento, in 14 giorni si verifica una degradazione inferiore al 35 % (in base al DOC) o minore del 
25 % (in base a ThOD o ThCO
 2 ), si deve supporre che i composti 
chimici in esame siano inibitorì (si veda anche l'allegato IV). Le prove dovrebbero essere ripetute, possibilmente con l'uso di una concentra ­
zione minore di sostanza chimica in esame e/o una concentrazione più 
elevata di inoculo, ma non superiore a 30 mg per litro di solido.
 
1.6. PROCEDURE GENERALI E PREPARAZIONI  
Le condizioni generali che valgono per le prove sono riassunte in 
Tabella 2. Le apparecchiature e le altre condizioni sperimentali va ­
lide per un particolare tipo di saggio sono descritte più avanti al 
paragrafo «saggio specifico».  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 840
 
Tabella 2  
Condizioni sperimentali  
Saggio Rimozione 
lenta DOC Sviluppo CO  2 Respirometria 
manometrica Screenig OCSE 
tnodif. Bottiglia 
chiuasa MITI (I)  
Concentra ­
zione della sostanza in esame 
in mg/L 100 2-10 100 
mg DOC/L 10-40 10-20 10-40 mg ThOD/L 50-100 5-10 
Concentra ­
zione del ­
l'inoculo (in 
cellule/L, ap ­
prossimata) ≤ 30 mg/l SS 
o ≤ 100 ml effluente/L 
(10
 7 -10 8 ) 0,5 ml 
effluente sec ­
ondario/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml di 
effluente/L 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 -10 8 ) 
Concentra ­
zione di ele ­
menti nel mezzo mine ­
rale (in mg/l): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05-0,1 0,05-0,1 0,15 
pH 7,4± 0,2 preferibil ­
mente 7,0 
Temperatura 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = carbonio organico disciolto ThoD = domanda teorica 
ossigeno SS = solidi sospesi  
1.6.1.  Acqua di diluizione  
L'acqua deionizzata o distillata, esente da concentrazioni inibitrici di 
sostanze tossiche (per esempio ioni Cu  ++ ), è usata come solvente. 
Essa deve contenere non oltre il 10 % del carbonio organico intro ­
dotto mediante il materiale in esame. L'elevata purezza dell'acqua per il saggio è necessaria per eliminare valori di bianco elevati. La 
contaminazione può essere dovuta a impurezze intrinseche, all'im ­
piego di resine a scambio ionico o a materiale lisato proveniente da batteri e alghe. Per ciascuna serie di saggi usare una sola partita d'acqua, controllata preventivamente mediante analisi DOC. Detto 
controllo non è necessario per il saggio della bottiglia chiusa, perchè 
il consumo dì ossigeno da parte dei microorganismi dell'acqua sia basso.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 841
 
1.6.2.  Soluzioni «stock» dei sali minerali  
Per preparare le soluzioni per il saggio, devono essere preventiva ­
mente preparate delle soluzioni «stock» di appropriata concentra ­
zione dei sali minerali. Possono essere usate le seguenti soluzioni 
«stock» (con differenti fattori di diluizione) per i metodi: rimozione 
lenta DOC, screening OCSE modificato, sviluppo di CO  2 , respiro­
metria manometrica, saggio della bottiglia chiusa.  
I fattori di diluizione e, per il saggio MITI, la preparazione specifica 
del mezzo minerale sono indicati nei saggi specifici.  
Soluzioni «stock»:  
Preparare le seguenti soluzioni «stock» utilizzando reagenti puri per 
analisi. 
(a) Diidrogenoortofosfato monopotassico, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monoidrogenoortofosfato dipotassico, K  2 HPO  4 21,75 g 
Monoidrogenoortofosfato disodico diidrato 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g 
Cloruro d'ammonio, NH  4 Cl 0,50 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litroll pH della 
soluzione deve essere 7,4 
(b) Cloruro di calcio anidro, CaCl  2 27,50 g 
O cloruro di calcio diidrato, CaCl  2 - 2 H  2 O 36,40 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro 
(c) Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro 
(d) Cloruro di ferro (III) esaidrato, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro.  
Nota: allo scopo dì evitare di dover preparare questa soluzione im ­
mediatamente prima dell'uso, aggiungere una goccia di HCl concen ­
trato o 0,4 g di acido etilendiamminotetra-acetico sale disodico (ED ­
TA) per litro.  
1.6.3.  Soluzioni «stock» di composti chimici  
Per esempio, sciogliere da 1 a 10 g, a seconda della sostanza chimica da 
saggiare o di riferimento in acqua deionizzata e portare a 1 litro quando la 
solubilità sia superiore a 1 g/l. Altrimenti, preparare soluzioni «stock» del mezzo minerale, oppure aggiungere la sostanza chimica direttamente al mezzo minerale. Per la solubilizza-zione dì composti chimici poco 
solubili, si veda l'allegato III, ma nel saggio MITI (Metodo C.4-F), non si 
devono usare nè solventi nè emulsionanti.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 842
 
1.6.4.  Inoculi  
L'inoculo può essere ottenuto da varie fonti: fango attivo, acque di 
scarico (non clorate), acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi. Per i saggi di rimozione lenta del DOC, sviluppo di CO
 2 e 
respirometria manometrica, se si usa fango attivo esso dovrebbe essere 
prelevato da un impianto di trattamento 0 da una unità su scala di laboratorio che riceva principalmente scarichi domestici. Si è visto che gli inoculi provenienti da altre fonti danno luogo ad una dispersione 
maggiore dei risultati. Per lo screening OCSE modificato e per il saggio 
della bottiglia chiusa occorre un inoculo più diluito senza fiocchi di fango; la fonte preferita è un effluente secondario di un impianto di 
trattamento delle acque di rifiuto domestiche o una rispettiva unità su 
scala di laboratorio. Per il saggio MITI l'inoculo viene ricavato da una miscela di fanghi di diversa provenienza ed è descritto nel paragrafo di questo saggio specifico.
 
1.6.4.1.  Inoculo da fanghi attivi  
Raccogliere un campione di fango attivo fresco dal serbatoio di 
aereazione di un impianto di trattamento o da una unità pilota di laboratorio per il trattamento delle acque di scarico che tratti preva ­
lentemente acque di origine domestica. Rimuovere, se necessario, le 
particelle grossolane mediante filtrazione attraverso un setaccio fine, 
e quindi mantenere il fango in condizioni aerobiche.
 
In alternativa, decantare o centrifugare (per esempio a 1 100 g per 
10 minuti) dopo la rimozione di eventuali particelle grossolane. Scartare il surnatante. Il fango può essere lavato nel mezzo minerale. Sospendere il fango concentrato in mezzo minerale per ottenere una 
concentrazione di 3-5 g di solidi sospesi/l e aereare fino a quando è 
necessario.
 
Il fango dovrebbe essere prelevato da un impianto convenzionale ben 
funzionante. Se il fango è stato preso da un impianto ad alta poten ­
zialità o si ritiene contenga inibitori dovrebbe essere lavato. Decan ­
tare o centrifugare il fango risospeso dopo accurata miscelazione, scartare il surnatante e risospendere il fango lavato in un volume 
ulteriore di terreno minerale. Ripetere questa procedura fino a 
quando il fango può essere considerato esente da eccesso di substrato e da inibitori.
 
Dopo avere ottenuto la completa risospensione, con fango non trat ­
tato, prelevare un'aliquota prima dell'uso per la determinazione del peso secco dei solidi sospensi.
 
Un'ulteriore alternativa è quella di omogeneizzare il fango attivo (3-5 g 
di solidi sospesi/l). Trattare il fango in un miscelatore meccanico per due minuti a velocità media. Decantare il fango miscelato per 30 minuti, o 
più a lungo se necessario, e utilizzare il liquido sovrastante per l'uso 
come inoculo nel rapporto di 10 ml/l nel mezzo minerale.
 
1.6.4.2.  Altre fonti di inoculo  
Esso può essere ottenuto da un effluente secondario di un impianto 
di trattamento o da una unità pilota di laboratorio che riceve preva ­
lentemente scarichi domestici. Raccogliere un campione fresco e 
mantenerlo in condizioni aerobiche durante il trasporto. Lasciare decantare per 1 ora o filtrare con carta da filtro grossolana e man ­
tenere l'effluente decantato o il filtrato in condizioni aerobiche fino a 
quando è necessario. Si possono usare fino a 100 ml di questo tipo 
di inoculo per litro di mezzo minerale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 843
 
Una fonte alternativa per l'inoculo è l'acqua superficiale. In questo 
caso, raccogliere un'idonea quantità di campione acqua superficiale, 
per esempio acqua di fiume, di lago, e mantenerla in condizioni aerobiche fino a quando è necessario. Se è il caso, concentrare l'inoculo mediante filtrazione o centrifugazione.
 
1.6.5.  Precondizionamento degli inoculi  
Gli inoculi possono essere precondizionati alle condizioni sperimen ­
tali, ma non preadattati al composto chimico in esame. Il precondi ­
zionamento consiste nell'aereare fango attivo nel mezzo minerale o effluente secondario per 5-7 giorni alla temperatura di prova. Il precondizionamento migliora tavolta la precisione dei metodi speri ­
mentali riducendo i valori del bianco. Sì ritiene non necessario pre ­
condizionare l'inoculo nel metodo MITI.
 
1.6.6.  Controlli abiotici  
Quando è necessario, controllare la possibile degradazione abiotica della 
sostanza in esame determinando la rimozione di DOC, l'assorbimento di ossigeno o lo sviluppo di biossido di carbonio in controlli sterili che non 
contengono inoculo. La sterilizzazione può essere fatta mediante filtra ­
zione attraverso una membrana (0,2- 0,45 micrometri), mediante l'ag ­
giunta di una sostanza tossica di idonea concentrazione. Se viene usata una membrana filtrante, prelevare i campioni in modo asettico per man ­
tenerli sterili. A meno che l'adsorbimento della sostanza chimica saggiata 
non sia risultato precedentemente assente, i saggi che misurano la biode ­
gradazione come rimozione del DOC (carbonio organico disciolto), spe ­
cialmente con inoculi a fanghi attivi, dovrebbero includere un controllo 
abiotico con inoculo tossico.
 
1.6.7.  Numero di contenitori usati in un saggio tipo  
Il numero di contenitori usati in una prova tipo è descritto nei 
rispettivi metodi di ciascun saggio.  
Possono essere usati i seguenti tipi di contenitori:  
— sospensione: contenente la sostanza per il saggio e l'inoculo  
— bianco: contenente solo l'inoculo  
— controllo: contenente la sostanza di riferimento e l'inoculo  
— controllo abiotico sterile: contenente la sostanza per il saggio 
sterile (vedi 1.6.6.)  
— controllo dell'adsorbimento: contenente la sostanza per il saggio, 
l'inoculo e l'agente sterilizzante  
— controllo della tossicità: contenente la sostanza per il saggio, la 
sostanza di riferimento e l'inoculo  
Le determinazioni nella sospensione in esame e nel bianco dovreb ­
bero essere fatti in parallelo. È consigliabile effettuare le determina ­
zioni in parallelo negli altri contenitori al meglio.  
Tuttavia ciò non sempre è possibile. Assicurarsi che vengano prele ­
vati un numero sufficiente di campioni o vengano effettuate un 
numero sufficiente di letture per permettere di valutare la rimozione 
percentuale nell'arco di 10 giorni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 844
 
1.7. DATI E VALUTAZIONE  
Nel calcolo della degradazione percentuale (D  t ), si utilizzano i valori 
medi delle misure in doppio del parametro significativo nei recipienti di prova e nel bianco dell'inoculo. Le formule sono rappresentate nei 
paragrafi relativi ai saggi specifici. L'andamento della degradazione 
viene illustrato graficamente e con l'indicazione della fase di crescita (time window) di 10 giorni. Calcolare e riportare la rimozione per ­
centuale ottenuta al termine della fase di crescita (time window) di 
10 giorni e il valore raggiunto nella fase di stabilizzazione o al 
termine della prova, a seconda dei casi.
 
Nelle prove respirometriche, i composti che contengono azoto pos ­
sono influire sul consumo di ossigeno a causa della nitrificazione (si 
vedano gli allegati II e V).  
1.7.1.  Misura della degradazione mediante determinazione del DOC  
La percentuale di degradazione nel tempo (D  t ) dovrebbe essere cal ­
colata separatamente nei recipienti contenenti la sostanza da esami ­
nare usando i valori medi della misura in doppio del DOC perché il saggio possa avere significato. Ciò può essere calcolato usando la seguente equazione:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
dove:  
D t = degradazione % al tempo t,  
C o = concentrazione iniziale media di DOC nel mezzo di coltura 
inoculato contenente la sostanza in esame (mg DOC/1),  
C t = concentrazione media di DOC nel mezzo di coltura inocu ­
lato contenente la sostanza in esame al tempo t (mg DOC/ ­
1), 
C bo = concentrazione media iniziale di DOC ne! bianco del 
mezzo minerale inoculato (mg DOC/l),  
C bt = concentrazione media di DOC nel bianco del mezzo mine ­
rale inoculato al tempo t (mg DOC/l).  
Tutte le concentrazioni sono misurate sperimentalmente.  
1.7.2.  Misura della degradazione mediante analisi specifica  
Quando sono disponibili dati analitici specifici, calcolare 
la degradazione biologica primaria dalla relazione:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
dove:  
D t = degradazione % al tempo t, normalmente 28 giorni,  
S a = quantità residua di sostanza in esame nel terreno inoculato al 
termine della prova (mg),  
S b = quantità residua di sostanza in esame nella prova in bianco 
con acqua/mezzo minerale a cui è stata aggiunta solo la 
sostanza in esame (mg).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 845
 
1.7.3.  Degradazione abiotica  
Se è usato un controllo abiotico sterile, calcolare la percentuale 
di degradazione abiotica usando:  
% di degradazione abiotica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
dove  
C s(0) = concentrazione del DOC nel controllo sterile al giorno 0,  
C s(t) = concentrazione del DOC nel controllo sterile al giorno t.  
1.8. RELAZIONE  
La relazione del saggio deve, se possibile, contenere le seguenti 
informazioni:  
— sostanze chimiche sperimentali di riferimento, e loro purezza,  
— condizioni del saggio,  
— inoculo: natura e località del campionamento, concentrazione ed 
eventuale trattamento di precondizionamento,  
— proporzione e natura degli effluenti industriali presenti nelle ac ­
que di scarico, se note,  
— tempi di conduzione del saggio e temperatura,  
— nel caso di sostanze chimiche scarsamente solubili, il tipo di 
trattamento adottato,  
— metodo di saggio applicato; dovrebbero essere fornite ragioni 
scientifiche e una spiegazione per eventuali modifiche alla pro ­
cedura,  
— registrazione dei dati,  
— dovrebbero essere indicati eventuali fenomeni di inibizione os ­
servati,  
— eventuale degradazione abiotica osservata,  
— dati analitici chimici specifici, se disponibili,  
— dati analitici sugli intermedi, se disponibili,  
— grafico della degradazione percentuale in funzione del tempo per le 
sostanze in esame e per quelle di riferimento; la fase di latenza, la fase di degradazione, la fase di crescita (rime window) di 10 giorni e la pendenza devono essere indicate chiaramente (allegato I). Se il 
saggio ha rispettato il criterio di validità, per il grafico può essere 
usata la media della percentuale di degradazione dei recipienti con ­
tenenti la sostanza da esaminare,
 
— la rimozione percentuale dopo la fase di crescita (time window) 
di 10 giorni, nonché. La stabilizzazione o il termine della prova.  
PARTE II.  SAGGIO DI RIMOZIONE LENTA DEL DOC  
(Metodo C.4-A)  
II.1. PRINCIPIO DEL METODO  
Un volume misurato del mezzo minerale inoculato, contenente una 
concentrazione nota della sostanza in esame (10-40 mg DOC/l) come 
unica fonte nominale di carbonio organico, viene aereato al buio o in 
luce diffusa a 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 846
 
La degradazione viene seguita mediante analisi del DOC a intervalli 
regolari in un arco di tempo di oltre 28 giorni. Il grado di biode ­
gradazione viene calcolato esprimendo la concentrazione di DOC rimossa (corretta del bianco di controllo dell'inoculo) in percento di concentrazione presente inizialmente. Il grado di degradazione 
biologica primaria può anche essere calcolato da una analisi chimica 
supplementare effettuata all'inizio e al termine dell'incubazione.
 
II.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
II.2.1.  Apparecchiatura  
a) Beute, per esempio, da 250 ml a 2 litri, secondo il volume 
necessario per l'analisi DOC;  
b) tavola di agitazione — in grado di accogliere le beute, con con ­
trollo automatico della temperatura oppure disposta in un am ­
biente a temperatura costante — e di potenza tale da mantenere le condizioni aerobiche in tutte le beute;
 
c) apparecchio di filtrazione con membrane adatte;  
d) analizzatore di DOC;  
e) apparecchio per determinare l'ossigeno disciolto;  
f) centrifuga.  
II.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Per la preparazione delle soluzioni concentrate vedi 1.6.2.  
Miscelare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua di diluizione, 
aggiungere 1 ml di soluzioni da (b) a (d) e portare a 1 litro con 
acqua di diluizione.  
II.2.3.  Preparazione e precondizionamemo dell'inoculo  
L'inoculo può essere ottenuto da varie fonti: fango attivo, acque di 
scarico, acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi.  
Vedi I.6.4., 1.6.4.1., 1.6.4.2. e 1.6.5.  
II.2.4.  Preparazione delle beute  
Introdurre, per esempio, porzioni da 800 ml di mezzo minerale in 
beute da 2 litri e aggiungere volumi sufficienti di soluzioni concen ­
trate delle sostanze in esame e di riferimento a beute separate in 
modo da ottenere una concentrazione di sostanza chimica equivalente a 10-40 mg DOC/1. Controllare il valore del pH e correggerlo, se necessario, a pH = 7,4. Inoculare i palloni con fango attivo o altra 
fonte di inoculo (vedi I.6.4.), in modo da ottenere una concentra ­
zione finale non superiore a 30 mg di solidi sospesi/l. Preparare inoltre controlli di inoculo in mezzo minerale senza il composto chimico in esame nè quello di riferimento.
 
Se necessario, usare un recipiente per controllare il possibile effetto 
inibitore della sostanza chimica in esame inoculando una soluzione contenente, nel mezzo minerale, concentrazioni confrontabili della sostanza chimica in esame e di quella di riferimento.
 
Inoltre, se richiesto, preparare un'ulteriore beuta sterile per controllare se 
la sostanza chimica in esame venga degradata abioticamente utilizzando 
una soluzione non inoculata della sostanza chimica (vedi 1.6,6.).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 847
 
In aggiunta, se si sospetta che la sostanza chimica in esame sia 
adsorbita in modo significativo sul vetro, sul fango etc., effettuare 
una valutazione preliminare per determinare il grado probabile di adsorbimento e quindi l'idoneità del saggio per il composto chimico (vedi Tabella 1). Preparazione di un recipiente contenente la sostanza 
da esaminare, l'inoculo e l'agente sterilizzante.
 
Portare i volumi in tutte le beute a 11 con mezzo minerale, e, dopo 
miscelazione, prelevare un campione da ciascuna beuta per determi ­
nare la concentrazione iniziale di DOC (vedi allegato II.4). Coprire le 
aperture delle beute, per esempio, con un foglio di alluminio, in 
modo da permettere uno scambio libero di aria tra la beuta e l'atmo ­
sfera circostante. Inserire poi i contenitori nella tavola di agitazione e avviare il saggio.
 
II.2.5.  Numero di contenitori usati in un saggio tipo  
Recipiente 1 e 2: sospensione  
Recipiente 3 e 4: bianco con inoculo  
Recipiente 5: controllo  
preferibilmente se è necessario:  
Recipiente 6: controllo abiotico sterile  
Recipiente 7: controllo per l'adsorbimento  
Recipiente 8: controllo per la tossicità  
Vedi I.6.7.  
II.2.6.  Esecuzione del saggio  
Durante l'esecuzione del saggio, determinare la concentrazione di 
DOC in ciascuna beuta, in doppio, a intervalli di tempo noti, in modo sufficientemente regolare per poter determinare il momento di inizio della fase di crescita (time window) di 10 giorni e la 
rimozione percentuale al termine della fase dì crescita (time window) 
di 10 giorni. Prelevare solo il volume minimo necessario di sospen ­
sione di prova per ciascuna determinazione.
 
Prima del campionamento, compensare le perdite per evaporazione 
dalle beute mediante l'aggiunta di acqua di diluizione (I.6.1) nella 
quantità richiesta, se necessario. Miscelare il mezzo di coltura accu ­
ratamente prima di prelevare un campione e assicurarsi che il mate ­
riale eventualmente aderente alle pareti dei recipienti sia disciolto o 
sospeso prima del campionamento. Filtrare su membrana o centrifu ­
gare (vedi allegato II.4) immediatamente dopo aver prelevato il cam ­
pione. Analizzare i campioni filtrati e centrifugati lo stesso giorno, 
altrimenti conservarli a 2-4  o C per un massimo di 48 ore o al di sotto 
di - 18  o C per un periodo più lungo.  
II.3. DATI E RELAZIONE  
II.3.1.  Modalità di esposizione dei risultati  
Calcolare la degradazione percentuale al tempo t come indicato al 
punto I.7.1. (determinazione del DOC) e (analisi specifica) punto 
I.7.2. facoltativa.  
Trascrivere tutti i risultati su moduli predisposti.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 848
 
II.3.2.  Validità dei risultati  
Vedi I.5.2.  
II.3.3.  RELAZIONE  
Vedi 1.8.  
II.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo predisposto.  
SAGGIO DI RIMOZIONE LENTA DEL DOC  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  
3. SOSTANZA CHIMICA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l come sostanza  
Concentrazione iniziale nel mezzo, t  0 : ... mg/l come sostanza  
4. INOCULO  
Fonte: ...  
Trattamento applicato: ...  
Eventuale precondizionamento: ...  
Concentrazione dei solidi sospesi nella miscela di reazione: ... 
mg/l 
5. DETERMINAZIONI DEL CARBONIO  
Analizzatore di carbonio: ...  
Beuta N. DOC dopo n giorni (mg/L) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Sostanza chemica 
in esame più ino ­
culo 
1 a 1 
a 2 
a, media 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, media 
C b(t) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 849
 
Beuta N. DOC dopo n giorni (mg/L) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Bianco dell'ino ­
culo senza so ­
stanza chemica in 
esame 3 C 1 
C 2 
C, media C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, media 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VALUTAZIONE DEI DATI GREZZI  
Beuta Nr % degradazione dopo in giorni 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Media (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 e D  2 non dovrebbero essere mediati se c'è notevole differenza tra loro.  
Nota:  formule simili possono essere usate per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e di tossicità.  
7. CONTROLLO ABIOTICO  (facoltativo)  
Tempo (in giorni) 
0 t  
DOC conc. in (mg/L) nel controllo sterile C s(o) C s(t) 
% di degradazione abiotica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANALISI SPECIFICA DEL COMPOSTO CHIMICO  (fa­
coltativa)  
quantità residua della sostanza 
chimica alla fine del saggio % di degradazione primaria  
Controllo sterile S  b ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 850
 
quantità residua della sostanza 
chimica alla fine del saggio % di degradazione primaria  
Saggio del mezzo inoculato S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
PARTE III.  SAGGIO DI SCREENING OCSE MODIFICATO  
(Metodo C.4-B)  
III.l. PRINCIPIO DEL METODO  
Un volume noto di mezzo minerale contenente una concentrazione 
nota della sostanza in esame (10-40 mg DOC/1) come unica fonte nominale di carbonio organico viene inoculato con 0,5 ml di ef ­
fluente per litro di mezzo minerale. La miscela viene aerata al 
buio o in luce diffusa a 22 ± 2
 o C. 
La degradazione viene seguita mediante analisi del DOC a intervalli 
regolari in un arco di tempo di 28 giorni. Il grado di biodegradazione viene calcolato esprimendo la concentrazione dì DOC rimossa (cor ­
retta del bianco di controllo dell'inoculo) in percento della concen ­
trazione presente inizialmente. Il grado di degradazione biologica 
primaria può anche essere calcolato mediante analisi chimica sup ­
plementare effettuata all'inizio e al termine dell'incubazione.
 
III.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
III.2.1. Apparecchiatura  
a) Beute, per esempio da 250 ml a 2 litri, secondo il volume neces ­
sario per l'analisi del DOC;  
b) tavola di agitazione — in grado di accogliere le beute, con con ­
trollo automatico della temperatura oppure disposta in un am ­
biente a temperatura costante — e di potenza sufficiente a man ­
tenere le condizioni aerobiche in tutte le beute;  
c) apparecchio di filtrazione con membrane adatte;  
d) analizzatore di DOC;  
e) apparecchio per determinare l'ossigeno disciolto;  
f) centrifuga.  
III.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Per la preparazione delle soluzioni concentrate vedi I.6.2.  
Miscelare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua di diluizione, 
aggiungere 1 ml di soluzioni da (b) a (d) e portare a 1 litro con 
acqua di diluizione.  
In questo metodo si utilizzano solo 0,5 ml di effluente/litro 
come inoculo e pertanto può essere necessario integrare il terreno con oligoelementi e fattori di crescita aggiungendo 
1 ml per ciascuna delle seguenti soluzioni per litro di terreno 
finale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 851
 
Soluzione di oligoelementi: 
Solfato di manganese tetraidrato, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Acido borico, H  3 BO 3 57,2 mg 
Solfato di zinco eptaidrato, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Eptamolibdato d'ammonio, (NH  4 ) 6 MO  7 O 24 34,7 mg 
Chelato di Fe (FeCl  3 acido etilendiammino-tetraa ­
cetico) 100,0 mg 
Sciogliere in un matraccio e portare a 1 000 ml con 
acqua di diluizione. 
Soluzione di vitamine: Estratto di lievito 15,0 mg
 
Sciogliere l'estratto di lievito in 100 ml di acqua e sterilizzare attra ­
verso una membrana da 0,2 micron, preparare la soluzione al mo ­
mento dell'uso.  
III.2.3.  Preparazione e precondizionamento dell'inoculo  
L'inoculo è ottenuto da un effluente secondario di un impianto di 
trattamento o da un'unità pilota di laboratorio alimentata prevalente ­
mente da scarichi domestici.  
È usato in ragione di 0,5 ml/l di mezzo minerale. Vedi 
I.6.4.2. e I.6.5.  
III.2.4.  Preparazione dei contenitori  
Introdurre, per esempio, porzioni da 800 ml di mezzo minerale in 
beute da 2 litri e aggiungere volumi sufficienti di soluzioni stock delle sostanze in esame e di riferimento a beute separate in modo da 
ottenere una concentrazione di sostanza chimica equivalente a 10- 
40 mg DOC/l. Controllare il valore del pH e correggerlo, se neces ­
sario, a pH = 7,4. Inoculare le beute con effluente di acque di scarico (0,5 ml/litro) (vedi I.6.4.2.). Preparare inoltre controlli dell'inoculo 
nel mezzo minerale senza le sostanze chimiche in esame e di riferi ­
mento.
 
Se necessario, usare un recipiente per controllare il possibile 
effetto inibitore della sostanza chimica in esame inoculando 
una soluzione contenente, nel mezzo minerale, concentrazioni confrontabili della sostanza chimica in esame e di quella di riferimento.
 
Inoltre, se richiesto, preparare un'ulteriore beuta sterile per control ­
lare se la sostanza chimica in esame venga degradata abiotica ­
mente utilizzando una soluzione non inoculata della sostanza chi ­
mica (vedi I.6.6.).  
In aggiunta, se si sospetta che la sostanza chimica in esame sia 
adsorbita in modo significativo sul vetro, sul fango ecc, effettuare una valutazione preliminare per determinare il grado probabile di 
adsorbimento e quindi l'idoneità del saggio per il composto chimico 
(vedi Tabella 1). Preparazione di un recipiente contenente la sostanza da esaminare, l'inoculo e l'agente sterilizzante.
 
Portare i volumi in tutte le beute a 1 l con mezzo minerale, e, dopo 
miscelazione, prelevare un campione da ciascuna beuta per determi ­
nare la concentrazione iniziale di DOC (vedi allegato II.4). Coprire le aperture delle beute, per esempio con un foglio di alluminio, in modo da permettere uno scambio libero di aria tra la beuta e l'atmo ­
sfera circostante. Inserire poi i recipienti nella tavola di agitazione e 
avviare il saggio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 852
 
III.2.5.  Numero di contenitori usati in una prova tipo  
Recipiente 1 e 2: sospensione  
Recipiente 3 e 4: bianco con inoculo  
Recipiente 5: controllo  
preferibilmente se è necessario:  
Recipiente 6: controllo abiotico sterile  
Recipiente 7: controllo per l'adsorbimento  
Recipiente 8: controllo per la tossicità  
Vedi 1.6.7.  
III.2.6.  Esecuzione del saggio  
Durante l'esecuzione del saggio, determinare la concentrazione di 
DOC in ciascuna beuta, in doppio, a intervalli di tempo noti, in modo sufficientemente regolare per poter determinare il momento di inizio della fase di crescita (time window) di 10 giorni e la 
rimozione percentuale al termine della fase di crescita (time window) 
di 10 giorni. Prelevare solo il volume mìnimo necessario dì sospen ­
sione di prova per ciascuna determinazione.
 
Prima del campionamento, compensare le perdite per evaporazione 
dalle beute mediante l'aggiunta di acqua di diluizione (I.6.1), se 
necessario, nella quantità richiesta. Miscelare il mezzo di coltura accuratamente prima di prelevare un campione e assicurarsi che il materiale eventualmente aderente alle pareti dei recipienti sia di ­
sciolto o sospeso prima del campionamento. Filtrare su membrana 
o centrifugare (vedi allegato II.4) immediatamente dopo aver prele ­
vato il campione. Analizzare i campioni filtrati e centrifugati lo stesso giorno, altrimenti conservarli a 2-4
 o C per un massimo di 
48 ore o al di sotto di - 18  o C per un periodo più lungo.  
III.3. DATI E RELAZIONE  
III.3.1.  Trattamento dei risultati  
Calcolare la degradazione percentuale al tempo t come indicato al 
punto I.7.1. (determinazione del DOC) e, facoltativamente, al punto I.7.2. (analisi specifica).
 
Trascrivere tutti i risultati su moduli predisposti.  
III.3.2. Validità dei risultati  
Vedi I.5.2.  
III.3.3. RELAZIONE  
Vedi I.8.  
III.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo.  
SAGGIO DI RIMOZIONE LENTA DEL DOC SCREENING OCSE 
MODIFICATO  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 853
 
3. SOSTANZA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l come sostanza  
Concentrazione iniziale nel mezzo, t  o : ... mg/l come sostanza  
4. INOCULO  
Fonte: ...  
Trattamento applicato: ... mg/l  
Eventuale precondizionamento: ...  
Concentrazione dei solidi sospesi nella miscela di reazione: ... 
mg/l 
5. DETERMINAZIONI DEL CARBONIO  
Analizzatore di carbonio: ...  
Beuta N. DOC dopo n giorni (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Sostanza chimica 
in esame più ino ­
culo 
1 a 1 
a 2 
a, media 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, media 
C b(t) 
Bianco dell'ino ­
culo senza so ­
stanza chimica in 
esame 3 c 1 
c 2 
c, media C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, media 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VALUTAZIONE DEI DATI GREZZI  
Beuta n. % degradazione dopo n giorni 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 854
 
Beuta n. % degradazione dopo n giorni 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Media (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 e D  2 non dovrebbero essere mediati se c'è notevole differenza tra loro.  
Nota:  formule simili possono essere usate per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e di tossicità.  
7. CONTROLLO ABIOTICO  (facoltativo)  
Tempo (in giorni) 
0 t  
DOC conc. in mg/L nel controllo sterile C s(o) C s(t) 
% di degradazione abiotica  ¼ C sðoÞ ÄC sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANALISI SPECIFICA DEL COMPOSTO CHIMICO  (fa­
coltativa)  
quantità residua della sostanza 
chimica alla fine del saggio % di degradazione primaria  
Controllo sterile S  b 
Saggio del mezzo inoculato S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTE IV. SAGGIO DI SVILUPPO DEL CO  2 (Metodo C.4-C)  
IV.1. PRINCIPIO DEL METODO  
Un volume misurato di mezzo minerale inoculato contenente una 
concentrazione nota della sostanza chimica in esame (10-20 mg DOC o TOC/l) come unica fonte nominale di carbonio organico, viene aerato mediante il passaggio di aria esente da biossido di 
carbonio ad una portata controllata, al buio o a luce diffusa. 
La degradazione viene seguita per 28 giorni determinando il biossido di carbonio prodotto, che viene assorbito su idrossido di bario o di sodio e che viene misurato per titolazione dell'idrossido di bario 
residuo o come carbonio inorganico. La quantità di biossido di car ­
bonio prodotta dalla sostanza chimica in esame (corretta, per tener conto di quella derivante dal bianco dell'inoculo) viene espressa come percentuale di ThCO
 2 . Il grado di degradazione biologica 
può anche essere calcolato da un'analisi DOC supplementare effet ­
tuata all'inizio e al termine dell'incubazione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 855
 
IV.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
IV.2.1.  Apparecchiatura  
a) Palloni, 2-5 litri, dotati ciascuno di un tubo di aerazione che 
giunge quasi al fondo del recipiente e di una uscita;  
b) agitatori magnetici quando la valutazione viene effettuata su so ­
stanze chimiche scarsamente solubili;  
c) bottiglie per l'assorbimento di gas;  
d) dispositivo per controllare e misurare il flusso d'aria;  
e) apparecchio per la rimozione del biossido di carbonio per la 
preparazione d'aria esente da biossido di carbonio; in alternativa, 
una miscela di ossigeno esente da CO  2 e azoto esente da CO  2 
prelevata da bombole di gas nelle proporzioni corrette (20 % 
O 2 :80 % N  2 ); 
f) dispositivo per la determinazione del biossido di carbonio, o per 
titolazione o mediante qualche tipo di analizzatore del carbonio 
inorganico;  
g) dispositivo di filtrazione su membrana (facoltativo);  
h) analizzatore del DOC (facoltativo).  
IV.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Per la preparazione delle soluzioni concentrate vedi I.6.2.  
Miscelare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua di diluizione, 
aggiungere 1 ml di soluzioni da (b) a (d) e portare a 1 litro con 
acqua di diluizione.  
IV.2.3.  Preparazione e precondizionamento dell'inoculo  
L'inoculo può essere ottenuto da varie fonti: fango attivo, acque di 
scarico, acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi.  
Vedi I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. e I.6.5.  
IV.2.4.  Preparazione dei contenitori  
Per esempio, i seguenti volumi e pesi indicano i valori per palloni da 
5 litri contenenti 3 litri di sospensione. Se si utilizzano volumi più piccoli, modificare proporzionatamente i valori, ma assicurarsi che il 
biossido di carbonio formato possa venire misurato con accuratezza.
 
In ciascun pallone da 5 litri introdurre 2 400 ml di mezzo mine ­
rale. Aggiungere un volume appropriato del fango attivo preparato 
(vedi I.6.4.1. e I.6.5.) in modo da ottenere una concentrazione di solidi sospesi non maggiore di 30 mg/l nei 3 litri finali di miscela 
inoculata. In alternativa, diluire per prima cosa il fango preparato 
in modo da ottenere una sospensione a 500-1 000 mg/l nel mezzo minerale prima di aggiungerne un'aliquota al contenuto del pallone da 5 litri per realizzare una concentrazione di 30 mg/l; questo 
assicura una maggior precisione. È possibile usare altre fonti di 
inoculo (vedi I.6.4.2.).
 
Aerare queste miscele inoculate con aria esente da CO  2 per una notte 
in modo da bonificare il sistema dal biossido di carbonio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 856
 
Aggiungere il materiale in esame e la sostanza di riferimento, sepa ­
ratamente, come volumi noti delle soluzioni concentrate ai palloni in 
multiplo, in modo da ottenere concentrazioni, fornite dalle sostanze chimiche aggiunte, da 10 a 20 mg di DOC o TOC/l; lasciare alcuni palloni senza aggiunta di sostanze chimiche come controlli dell'ino ­
culo. Aggiungere le sostanze chimiche in esame, scarsamente solu ­
bili, direttamente nei palloni in una percentuale in peso o in volume, oppure trattarle come descritto nell'allegato III.
 
Se richiesto, usare un pallone per controllare il possibile effetto 
inibitore della soluzione chimica in esame aggiungendo le sostanze 
chimiche in esame e di riferimento alle stesse concentrazioni alle quali sono presenti negli altri palloni.
 
Inoltre, se richiesto, utilizzare un pallone sterile per controllare se la 
sostanza chimica in esame venga degradata abioticamente, utiliz ­
zando una soluzione non inoculata della sostanza chimica (vedi I.6.6.). Sterilizzare mediante l'aggiunta di una sostanza tossica ad 
una idonea concentrazione.
 
Portare i volumi delle sospensioni in tutti i palloni a 3 l mediante 
l'aggiunta del mezzo minerale preventivamente aerato con aria esente 
da CO  2 . In alternativa, si possono prelevare dei campioni per l'analisi 
del DOC (vedi allegato II.4.) e/o per l'analisi specifica. Collegare le bottiglie di assorbimento alle uscite dell'aria dei palloni.
 
Se si utilizza idrossido di bario, collegare tre bottiglie di assorbimen ­
to, contenenti ciascuna 100 ml di soluzione 0,0125 M di idrossido di bario, in serie con ciascun pallone da 5 l. La soluzione deve essere esente da solfati e carbonati precipitati e la sua concentrazione deve 
essere determinata immediatamente prima dell'uso. Se si utilizza 
idrossido di sodio, collegare due recipienti di cattura, dove il secondo agisce da controllo per verificare che tutto il biossido di carbonio è stato assorbito nel primo. Sono adatte bottiglie di assor ­
bimento con chiusure per bottiglie da siero. Aggiungere 200 ml di 
idrossido di sodio 0,05 M a ciascuna bottiglia, quantità sufficiente per assorbire la quantità totale di biossido di carbonio sviluppata quando la sostanza chimica in esame è completamente degradata. 
La soluzione di idrossido di sodio, anche quando è stata preparata 
di fresco, conterrà tracce di carbonati; questo valore viene corretto sottraendo il carbonato contenuto nel bianco.
 
IV.2.5.  Numero di palloni usati in un saggio tipo  
Recipiente 1 e 2: sospensione  
Recipiente 3 e 4: bianco con inoculo  
Recipiente 5: controllo  
preferibilmente se è necessario:  
Recipiente 6: controllo abiotico sterile  
Recipiente 7: controllo per la tossicità  
Vedi I.6.7.  
IV.2.6.  Esecuzione del saggio  
Iniziare la prova facendo gorgogliare aria esente da CO  2 attraverso le 
sospensioni ad una portata di 30-100 ml/min. Prelevare periodica ­
mente dei campioni dal contenitore che assorbe il biossido di carbo ­
nio per l'analisi del contenuto di CO  2 . Durante i primi 10 giorni si 
raccomanda di effettuare l'analisi ogni due o tre giorni, poi ogni 
cinque giorni fino al ventottesimo giorno in modo da poter identifi ­
care la fase di crescita (time window) di 10 giorni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 857
 
Al ventottesimo giorno, prelevare dei campioni (facoltativamente) 
per l'analisi del DOC e/o l'analisi specifica, misurare il pH delle 
sospensioni e aggiungere 1 ml di acido cloridrico concentrato a ciascun contenitore; aerare i contenitori per una notte per scacciare il biossido di carbonio presente nelle, sospensioni in esame. Al 
giorno ventinovesimo eseguire l'ultima analisi del biossido di carbo ­
nio sviluppato.
 
Nei giorni di misura del CO  2 , scollegare l'assorbitore dell'idrossido di 
bario più vicino al pallone e titolare la soluzione di idrossido con 
HCl 0,05 M utilizzando fenolftaleina come indicatore. Spostare gli 
assorbitori rimanenti di un posto verso il pallone e porre un nuovo assorbitore contenente 100 ml di idrossido di bario 0,0125 M fresco all'estremità più lontana della serie. Effettuare le titolazioni quando 
necessario, per esempio quando si vede una sostanziale precipita ­
zione nella prima trappola e prima che sia evidente una precipita ­
zione nella seconda, oppure almeno ogni settimana. In alternativa, con NaOH come assorbente, prelevare con una siringa una piccola 
aliquota di campione (secondo le caratteristiche dell'analizzatore di 
carbonio usato) della soluzione di idrossido di sodio nell'assorbitore più vicino al pallone. Iniettare il campione nella parte per il carbonio 
inorganico dell'analizzatore di carbonio ed effettuare direttamente 
l'analisi del biossido di carbonio sviluppato.
 
Analizzare il contenuto della seconda trappola solo al termine del 
saggio per correggere eventuali trascinamenti di biossido di carbonio.  
IV.3. DATI E RELAZIONE  
IV.3.1.  Modalità di esposizione dei risultati  
La quantità di CO  2 catturata nell'assorbitore al momento della tito ­
lazione è data da:  
mg CO  2 = (100 × C  B - 0,5 × V × C  A ) ×l44  
in cui:  
V = volume di HCl utilizzato per la titolazione dei 100 ml nel ­
l'assorbitore (ml),  
C B = concentrazione della soluzione di idrossido di bario (M),  
C A = concentrazione della soluzione di acido cloridrico (M),  
se C  B è 0,0125 MeCA è 0,05 M, la titolazione per 100 ml di 
idrossido di bario è 50 ml e il peso di CO  2 è dato da:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCl titolato ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
Così, in questo caso, il fattore di conversione del volume di HCl 
titolato in mg di CO  2 prodotta è 1,1.  
Calcolare i pesi di CO  2 prodotto dall'inoculo da solo e dall'inoculo 
più la sostanza chimica in esame utilizzando i rispettivi valori di 
titolazione; la differenza è il peso di CO  2 prodotto dalla sostanza 
chimica in esame da sola.  
Per esempio, se l'inoculo da solo fornisce una titolazione di 48 ml e 
l'inoculo più sostanza chimica in esame fornisce 45 ml.  
CO 2 dall'inoculo = 1,1 × (50 - 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 858
 
CO 2 dall'inoculo più sostanza chimicain esame= 1,1 × (50 - 45) = 
5,5 mg  
e così il peso di CO  2 prodotto dalla sostanza chimica in esame 
è 3,3 mg.  
La degradazione biologica percentuale si calcola da:  
% degradazione ¼ mg CO  2 prodotti Ü 100 
ThCO  2 prodotti mgdi sostanza chimica in esame aggiunta  
o, 
% degradazione ¼ mg CO  2 prodotti Ü 100 
mg TOC aggiunti nella prova  Ü 3; 67 
dove 3,67 è il fattore di conversione (44/12) da carbonio a biossido 
di carbonio.  
Ricavare la degradazione percentuale dopo ogni intervallo di tempo 
aggiungendo la percentuale dei valori di ThCO  2 calcolati per cia ­
scuno dei giorni in cui è stata misurata fino a quel momento.  
Per gli assorbitori all'idrossido di sodio, calcolare la quantità di 
biossido di carbonio prodotto, espressa come 1C (mg), moltiplicando la concentrazione di IC nell'assorbente per il volume dell'assorbente.
 
Calcolare la degradazione percentuale dalla:  
% ThCO  2 ¼ mg IC del pallone di prova − mg IC del bianco 
mg TOC aggiunti come sostanza chimica in esame  Ü 100 
Calcolare il grado di rimozione del DOC (facoltativo) come descritto 
al punto 1.7. Registrare questi risultati, e tutti gli altri, sui registri 
forniti.  
IV.3.2.  Validità dei risultati  
Il contenuto di carbonio inorganico nella sospensione della sostanza 
chimica in esame nel mezzo minerale all'inizio della prova deve 
essere minore del 5 % del carbonio totale e lo sviluppo totale di CO
 2 nel bianco dell'inoculo al termine della prova non dovrebbe 
normalmente superare i 40 mg/l di terreno. Se si ottengono valori 
maggiori di 70 mg CO  2 /l, si dovrebbero esaminare criticamente i dati 
e la tecnica sperimentale.  
Vedi anche I.5.2.  
IV.3.3.  Relazione  
Vedi I.8.  
IV.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo predisposto.  
SAGGIO DI SVILUPPO DEL BIOSSIDO DI CARBONIO  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  
3. SOSTANZA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l come sostanza  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 859
 
Concentrazione iniziale nel mezzo: ... mg/l come sostanza  
C totale aggiunto al contenitore: ... mg C  
ThCO  2 : ... mg CO  2 
4. INOCULO  
Fonte: ...  
Trattamento effettuato: ...  
Eventuale precondizionamento: ...  
Concentrazione dei solidi sospesi nella miscela di reazione: ... 
mg/l 
5. PRODUZIONE DI BIOSSIDO DI CARBONIO E DEGRA ­
DABILITÀ  
Metodo: Ba(OH)  2 /NaOH/altro: ...  
Tempo 
(giorno) CO 2 formato 
prova (mg) CO 2 formato 
bianca (mg) CO 2 formato 
kumulativo (mg) % ThCO  2 
cumulativo  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 media 3 
4 media 1 2 1 2 media  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Nota: formati simili possono essere usati per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e di tossicità.  
6. ANALISI DEL CARBONIO  (facoltativa)  
Analizzatore di carbonio:  
Tempo (giorno) Bianco mg/l Sostanza chimica in esame mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) 0 al termine dell'incubazione  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 860
 
% DOC rimosso ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. DEGRADAZIONE ABIOTICA  (facoltativa) 
% degradazione abiotica  ¼ Formazione di CO  2 contenitore sterile dopo 28 giorni  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
PARTE V.  SAGGIO RESPIROMETRICO MANOMETRICO  
(Metodo C.4-D)  
V. 1. PRINCIPIO DEL METODO  
Un volume misurato di mezzo minerale inoculato, contenente una 
concentrazione nota della sostanza chimica in esame (100 mg/l della sostanza chimica in esame in modo da fornire almeno 50-100 mg ThOD/1) come unica fonte nominale di carbonio organico, viene 
tenuto sotto agitazione in un contenitore chiuso a temperatura co ­
stante (± 1
 o C o meno) per un tempo fino a 28 giorni. Il consumo di 
ossigeno viene determinato o misurando la quantità di ossigeno (prodotto elettroliticamente) necessario per mantenere costante il vo ­
lume di gas nel contenitore del respirometro, oppure dalla variazione 
di volume o di pressione (o da una combinazione delle due varia ­
zioni) nell'apparecchiatura. Il biossido di carbonio sviluppato viene assorbito in una soluzione di idrossido di potassio o un altro assor ­
bente adatto. La quantità di ossigeno consumata dalla sostanza chi ­
mica in esame (corretta del consumo del bianco dell'inoculo, con ­
trollato in parallelo) viene espressa in percentuale di ThOD o COD. In alternativa, la degradazione primaria può anche essere calcolata 
mediante analisi specifica supplementare fatta all'inizio e alla fine 
dell'incubazione e la degradazione ultima mediante analisi del DOC.
 
V.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
V.2.1.  Apparecchiatura  
a) Adatto respirometro;  
b) sistema di regolazione della temperatura che mantenga ± 1  o C, o 
miglio;  
c) dispositivo di filtrazione su membrana (facoltativo);  
d) analizzatore di carbonio (facoltativo).  
V.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Per la preparazione delle soluzioni concentrate vedi I.6.2.  
Miscelare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua di diluizione, 
aggiungere 1 ml di soluzioni da (b) a (d) e portare a 1 litro con acqua di diluizione.
 
V.2.3.  Preparazione e precondizionamento dell'inoculo  
L'inoculo può essere ottenuto da varie fonti: fango attivo, acque di 
scarico, acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi.  
Vedi I.6.4., 1.6.4.1., I.6.4.2. e I.6.5.  
V.2.4.  Preparazione dei contenitori  
Preparare separatamente le soluzioni delle sostanze chimiche in 
esame e di riferimento nel mezzo minerale, normalmente equivalenti ad una concentrazione di 100 mg di sostanza chimica/1 (che forni ­
scono almeno 50-100 mg ThOD/1) utilizzando le soluzioni concen ­
trate (stock).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 861
 
Calcolare la ThOD sulla base della formazione di sali di 
ammonio, salvo che si preveda una nitrificazione, nel qual 
caso il calcolo dovrebbe essere basato sulla formazione di nitrati (vedi allegato H.2.).
 
Determinare i valori di pH e, se necessario, regolare a pH = 7,4± 0,2.  
Sostanze scarsamente solubili dovrebbero essere aggiunte in una fase 
più avanzata (vedi nel seguito).  
Se si deve determinare la tossicità della sostanza chimica in esame, 
preparare una ulteriore soluzione nel mezzo minerale contenente sia 
la sostanza chimica in esame che quella di riferimento alle stesse concentrazioni delle singole soluzioni.
 
Se è richiesta una misura dell'assorbimento chimico-fisico dell'ossi ­
geno, preparare una soluzione sterile della sostanza chimica in esame 
ad una concentrazione, normalmente, di 100 mg ThOD/1 mediante aggiunta di una idonea sostanza tossica (vedi I.6,6.).
 
Introdurre il volume richiesto di soluzione delle sostanze chimiche 
rispettivamente in esame e di riferimento, in contenitori almeno in doppio. Aggiungere ad ulteriori contenitori il mezzo minerale da solo (per i controlli dell'inoculo) e, se richiesto, la soluzione mista della 
sostanza chimica di prova/riferimento e la soluzione sterile.
 
Se la sostanza chimica in esame è scarsamente solubile, aggiungerla 
direttamente a questo stadio, in ragione del peso o del volume, oppure trattarla come descrino nell'allegato III. Nel comparto di 
assorbimento della CO
 2 , aggiungere idrossido di potassio, pastiglie 
di calce sodata o altro assorbente.  
V.2.5.  Numero di contenitori usati in un saggio tipo  
Recipiente 1 e 2: sospensione  
Recipiente 3 e 4: bianco con inoculo  
Recipiente 5: controllo  
preferibilmente se è necessario:  
Recipiente 6: controllo sterile  
Recipiente 7: controllo per la tossicità  
Vedi I.6.7.  
V.2.6.  Esecuzione del saggio  
Aspettare che i contenitori abbiano raggiunto la temperatura deside ­
rata, inoculare i recipienti appropriati con fango attivo preparato o 
altra fonte di inoculo in modo da ottenere una concentrazione di solidi sospesi non superiore a 30 mg/l. Montare l'apparecchiatura, avviare l'agitatore e controllare la tenuta nei confronti dell'aria, e 
iniziare la misura del consumo di ossigeno. Di solito non sono 
richieste ulteriori attenzioni a parte quella di effettuare le necessarie letture e i controlli giornalieri per verificare che vengano mantenute la temperatura corretta ed una adeguata agitazione.
 
Calcolare il consumo di ossigeno con letture effettuate ad intervalli 
regolari e frequenti, utilizzando i metodi forniti dal fabbricante del ­
l'apparecchiatura. Al termine dell'incubazione, normalmente 28 gior ­
ni, misurare il pH del contenuto dei contenitori, sopratutto se il 
consumo di ossigeno è basso o maggiore della ThOD  NH4 (vedi 
composti contenenti azoto).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 862
 
Se necessario, prelevare campioni dai contenitori del respirometro, 
all'inizio e alla fine, per l'analisi del DOC o per l'analisi chimica 
specifica (vedi allegato II.4.). Al momento del prelievo iniziale, as ­
sicurarsi che il volume della sospensione in esame che rimane nel contenitore sia noto. Quando l'ossigeno viene consumato da una 
sostanza in esame contenente azoto, determinare l'aumento della 
concentrazione dei nitriti e dei nitrati durante i 28 giorni e calcolare la correzione per l'ossigeno consumato mediante nitrificazione (alle ­
gato V).
 
V.3. DATI E RELAZIONE  
V.3.1.  Modalità di esposizione dei risultati  
Dividere il consumo di ossigeno (mg) da parte della sostanza chi ­
mica in esame dopo un tempo stabilito (corretto del controllo del 
bianco di inoculo dopo lo stesso tempo) per il peso della sostanza chimica in esame usata. Questo fornisce il BOD espresso come mg 
di ossigeno/mg di sostanza chimica in esame, cioè
 
BOD ¼ ðmg O  2 consumato dalla sostanza chimica in esame − mg O  2 consumato dal bianco Þ 
ðmg sostanza chimica in esame nel contenitore Þ 
= mg O  2 per mg di sostanza chimica in esame.  
Calcolare la percentuale di degradazione biologica con una delle 
seguenti relazioni:  
% degrad : biologica ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg sostanza chimica Þ 
ThOD ðmg O  2=mg sostanza chimica Þ Ü 100 
o 
% COD ¼ BOD ðmg O  2=mg sostanza chimica Þ 
COD ðmg O  2=mg sostanza chimica Þ Ü 100 
Si dovrebbe notare che questi due metodi non forniscono necessa ­
riamente lo stesso valore; dei due è preferibile usare il primo.  
Per le sostanze in esame che contengono azoto, utilizzare il valore 
appropriato di ThOD (NH  4 o NO  3 ) secondo quanto è noto o ci si 
aspetta per quanto riguarda il verificarsi della nitrificazione (allegato II.2). Se viceversa si verifica una nitrificazione non completa, effet ­
tuare una correzione che tenga conto dell'ossigeno consumato dalla 
nitrificazione in base alle variazioni di concentrazione dei nitriti e dei 
nitrati (allegato V).
 
Quando si effettuano determinazioni facoltative del carbonio orga ­
nico e/o di una sostanza chimica specifica, calcolare la degradazione percentuale come descritto al punto I.7.
 
V.3.2.  Validità dei risultati  
Il consumo di ossigeno da parte del bianco dell'inoculo è normal ­
mente di 20-30 mg O  2 /l e non dovrebbe essere maggiore di 60 mg/l 
in 28 giorni. Valori più elevati di 60 mg/l richiedono un esame critico dei dati e delle tecniche sperimentali. Se il valore del pH è al di fuori del campo 6-8,5 ed il consumo di ossigeno da parte della sostanza 
chimica in esame è minore del 60 %, si dovrebbe ripetere la prova 
con una minore concentrazione della sostanza chimica in esame.
 
Vedi anche I.5.2.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 863
 
V.3.3.  Relazione  
Vedi I.8.  
V.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo predisposto.  
SAGGIO RESPIROMETRICO MANOMETRICO  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  
3. SOSTANZA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l  
Concentrazione iniziale nel mezzo, C  o : ... mg/l  
Volume nel recipiente di saggio (V): ... ml  
ThOD o COD: ... mg O  2 /mg sostanza saggiata (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOCULO  
Fonte: ...  
Trattamento effettuato: ...  
Eventuale precondizionamento: ...  
Concentrazione dei solidi sospesi nella miscela di reazione: ... 
mg/l 
5. CONSUMO DI OSSIGENO: BIODEGRADABILITÀ  
Tempo (giorni) 
0 7 14 21 28  
O 2 cons. (mg) 
sostanza chi ­
mica in esame 1 
2 
a, media 
O 2 cons. (mg) 
bianco 3 
4 
b, media 
BOD (mg) cor ­
retto (a 1 — b  m ) 
(a 2 — b  m ) 
BOD per mg di 
sostanza chi ­
mica in esame ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 864
 
Tempo (giorni) 
0 7 14 21 28  
% degrada ­
zione  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Media (*)  
V = Volume del mezzo nel contenitore d'esame 
(*) D  1: e D  2 non dovrebbero essere mediati se c'è notevole differenza tra loro.  
Nota: formule simili possono essere usate per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e per i controlli di tossicità.  
6. CORREZIONE PER LA NITRIFICAZIONE  (vedi alle ­
gato V)  
Giorno 0 28 Differenza  
(i) Concentrazione nitrati (mg N/l) (N) 
(ii) Ossigeno equivalente (4,57 × N × V) (mg) — — (iii) Concentrazione nitriti (mg N/l) (N) 
(iv) Ossigeno equivalente (3,43 × N × V) (mg) — — 
(ii + iv) Ossigeno equivalente totale — —
 
7. ANALISI DEL CARBONIO  (facoltativa)  
Analizzatore di carbonio: ...  
Tempo (giorno) Bianco mg/l Sostanza chimica in esame mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) o al termine dell'incubazione  
% DOC rimosso ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SOSTANZA CHIMICA SPECIFICA  (facoltativa)  
S b = concentrazione nel controllo chimico-fisico (sterile) al 
ventottesimo giorno.  
S a = concentrazione nel pallone inoculato al ventottesimo 
giorno.  
% biodegradazione  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. DEGRADAZIONE ABIOTICA  (facoltativa)  
a = consumo di ossigeno nei contenitori sterili dopo 28 
giorni, (mg). 
consumo di ossigeno per mg di sostanza chimica in esame  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 865
 
(vedi sezioni 1 e 3)  
% degradazione abiotica  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
PARTE VI.  SAGGIO DELLA BOTTIGLIA CHIUSA  (Metodo 
C.4-E)  
VI.l. PRINCIPIO DEL METODO SPERIMENTALE  
La soluzione della sostanza chimica in esame nel mezzo minerale, di 
solito a 2-5 mg/l, viene inoculata con un numero relativamente pic ­
colo di microorganismi provenienti da una popolazione mista e man ­
tenuti in bottiglie chiuse, completamente piene, al buio a temperatura 
costante. La degradazione viene seguita mediante l'analisi dell'ossi ­
geno disciolto su un arco di tempo di 28 giorni. La quantità di ossigeno consumata dalla sostanza chimica in esame, corretta per tener conto del bianco dell'inoculo controllato in parallelo, è espressa 
in percentuale di ThOD o COD.
 
VI.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
VI.2.1.  Apparecchiatura  
a) Bottiglie per BOD, con tappi di vetro, per esempio da 250- 
300 ml;  
b) bagno d'acqua o incubatore per mantenere le bottiglie a tempe ­
ratura costante (± 1  o C o meglio) con l'esclusione di luce;  
c) bottiglie di vetro grandi (2-5 l) per la preparazione dei terreni e 
per il riempimento delle bottiglie per BOD:  
d) elettrodo a ossigeno e misuratore, o apparecchiatura e reagenti 
per la titolazione di Winkler.  
VI.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Per la preparazione della soluzione concentrata, vedi I.6.2.  
Miscelare 1 ml di soluzioni da (a) a (d) e portare a 1 l con acqua di 
diluizione.  
VI.2.3.  Preparazione dell'inoculo  
L'inoculo è normalmente proveniente da un effluente secondario di 
un impianto di trattamento o da una unità pilota di laboratorio ali ­
mentata prevalentemente da scarichi domestici. In alternativa una 
sorgente d'inoculo è un'acqua superficiale. Normalmente si usa da 
una goccia (0,05 ml) a 5 ml di filtrato per litro di mezzo minerale; è utile eseguire delle prove sperimentali per valutare il volume ottimale per un dato effluente (vedi I.6.4.2 e I.6.5.).
 
VI.2.4.  Preparazione dei contenitori  
Aerare fortemente il mezzo minerale per almeno 20 minuti. Eseguire 
ogni serie di esperimenti con mezzo minerale ottenuto dalla stessa 
partita. In generale, il mezzo è pronto per l'uso dopo essere stato a 
riposo per 20 ore alla temperatura di prova. Determinare la concen ­
trazione dell'ossigeno disciolto a scopo di controllo; il valore do ­
vrebbe essere di circa 9 mg/l a 20  o C. Eseguire tutte le operazioni 
di trasferimento e di riempimento del terreno saturato con aria evi ­
tando la formazione di bolle, per esempio mediante l'uso di sifoni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 866
 
Preparare gruppi paralleli di bottiglie per BOD per la determinazione 
delle sostanze chimiche di prova e di riferimento in serie sperimen ­
tali simultanee. Preparare un numero sufficiente di bottiglie per BOD, includendo i bianchi dell'inoculo, per permettere di fare delle misure almeno in doppio del consumo di ossigeno agli intervalli di 
prova desiderati, per esempio dopo 0, 7, 14, 21 e 28 giorni. Per 
assicurarsi di poter identificare la fase di crescita di 10 giorni (time window), possono essere necessarie un maggior numero di bottiglie.
 
Aggiungere mezzo minerale completamente aerato a bottiglie grandi 
in modo che esse siano riempite per circa un terzo. Aggiungere poi 
una quantità sufficiente delle soluzioni concentrate della sostanza 
chimica in esame e della sostanza chimica di riferimento a bottiglie grandi separate in quantità tale che la concentrazione finale delle sostanze chimiche sia normalmente non superiore a 10 mg/l. Non 
aggiungere sostanze chimiche al terreno di controllo del bianco con ­
tenuto in una ulteriore bottiglia grande.
 
Allo scopo di garantire che l'attività dell'inoculo non sia contenuta, la 
concentrazione dell'ossigeno disciolto non deve scendere al di sotto di 0,5 mg/l nelle bottiglie per BOD. Questo limita la concentrazione 
della sostanza chimica in esame a circa 2 mg/l. Tuttavia, per compo ­
sti scarsamente degradabili e per quelli con un basso ThOD, si possono usare 5-10 mg/l. In alcuni casi, è consigliabile eseguire 
prove su serie in parallelo della sostanza chimica a due differenti 
concentrazioni, per esempio 2 e 5 mg/l. Normalmente, si calcola il ThOD sulla base della formazione di sali d'ammonio ma, se è previ ­
sta la nitrificazione, si calcola sulla base della formazione di nitrato 
(ThOD
 NO3 : vedi allegato II.2). Tuttavia, se si verifica una nitrifica ­
zione non completa, si effettua una correzione tenendo conto delle variazioni di concentrazione di nitrito e nitrato determinate mediante analisi (vedi allegato V).
 
Se si deve studiare la tossicità della sostanza chimica in esame (nel 
caso per esempio sia stato trovato preventivamente un basso valore 
di biodegradabilità), è necessaria un'altra serie di bottiglie.  
Preparare un'altra bottiglia grande, che deve contenere mezzo mine ­
rale aerato (fino a circa un terzo del suo volume) più la sostanza chimica in esame e la sostanza chimica di riferimento alle concen ­
trazioni finali normalmente uguali a quelle usate nelle altre bottiglie 
grandi.
 
Inoculare le soluzioni contenute nelle bottiglie grandi con 
effluente secondario (da una goccia, o circa 0,05 ml, a 5 ml/l) o 
con un'altra fonte, come acqua di fiume (vedi I.6.4.2.). Infine, portare 
a volume le soluzioni con mezzo minerale aerato utilizzando un tubo flessibile che arrivi fino al fondo della bottiglia per realizzare una adeguata miscelazione.
 
VI.2.5.  Numero di contenitori usati in un saggio tipo  
In una prova tipica si usano le seguenti bottiglie:  
— almeno 10 contenenti la sostanza chimica in esame e l'inoculo 
(sospensione in esame),  
— almeno 10 contenenti solo l'inoculo (bianco dell'inoculo),  
— almeno 10 contenenti la sostanza chimica di riferimento e l'ino ­
culo (controllo),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 867
 
— e, quando sia necessario, 6 bottiglie contenenti la sostanza chi ­
mica in esame, la sostanza chimica di riferimento e l'inoculo 
(controllo di tossicità). Tuttavia, per poter essere sicuri di riuscire a identificare la fase di crescita (time window) di 10 giorni, sarà necessario un numero di bottiglie circa doppio.
 
VI.2.6. Esecuzione dei saggio  
Dosare immediatamente ciascuna soluzione preparata nel rispettivo 
gruppo di bottiglie per BOD mediante un tubo flessibile prelevandola 
dal quarto inferiore (non dal fondo) dell'opportuna bottiglia grande in modo che tutte le bottiglie per BOD siano completamente riempite. Battere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria. Analizzare 
immediatamente le bottiglie al tempo zero per determinare l'ossigeno 
disciolto mediante il metodo di Winkler o il metodo all'elettrodo. Il contenuto delle bottiglie può venire conservato per un'analisi succes ­
siva mediante il metodo di Winkler aggiungendo solfato di manga ­
nese (II) e idrossido di sodio (il primo reagente di Winkler). Con ­
servare le bottiglie, accuratamente tappate, contenenti l'ossigeno fis ­
sato in forma di ossido di manganese (III) idrato marrone, al buio a 10-20
 o C per non oltre 24 ore prima di procedere con le fasi rima ­
nenti del metodo di Winkler. Tappare le bottiglie in multiplo rima ­
nenti assicurandosi che non siano intrappolate bolle d'aria, e incubare a 20
 o C al buio. Ciascuna serie deve essere accompagnata da una 
serie parallela completa per la determinazione del bianco del mezzo 
inoculato. Prelevare bottiglie almeno in doppio di tutte le serie per 
l'analisi dell'ossigeno disciolto ad intervalli di tempo (almeno setti ­
manali) durante i 28 giorni di incubazione.  
I campioni settimanali dovrebbero permettere la valutazione della 
rimozione percentuale in una fase di crescita di 14 giorni, mentre 
un campionamento ogni 3-4 giorni dovrebbe permettere di identifi ­
care la fase di crescita di 10 giorni, il che richiederà un numero di bottiglie circa doppio.
 
Per sostanze in esame contenenti azoto, si devono apportare delle 
correzioni per il consumo dell'ossigeno che si verifica nell'eventuale nitrificazione. A questo scopo, usare il metodo dell'elettrodo a O
 2 per 
la determinazione della concentrazione di ossigeno disciolto e prele ­
vare poi un campione dalla bottiglia per BOD per analizzare nitriti e 
nitrati. Dall'aumento di concentrazione dei nitriti e dei nitrati, calco ­
lare l'ossigeno consumato (vedi allegato V).  
VI.3. DATI E RELAZIONE  
VI.3.1.  Modalità di esposizione dei risultati  
Calcolare per prima cosa il BOD dopo ciascun periodo di tempo 
sottraendo il consumo di ossigeno (mg O  2 /l) del bianco dell'inoculo 
da quello presentato dalla sostanza chimica in esame. Dividere que ­
sto consumo corretto per la concentrazione (mg/l) della sostanza chimica in esame per ottenere il BOD specifico come mg di ossigeno 
per mg di sostanza chimica in esame. Calcolare la biodegradabilità 
percentuale dividendo il BOD specifico per il ThOD specifico (calcolato secondo l'allegato II.2) o per il COD (determinato me ­
diante analisi, vedi allegato II.3), come segue:
 
BOD ¼ ðmg O  2 consumato dalla sostanza chimica in esame − mg O  2 consumato dal bianco Þ 
ðmg sostanza chimica in esame nel contenitore Þ ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 868
 
= mg O  2 per mg di sostanza chimica in esame  
% degradazione ¼ BOD ðmg O  2=mg sostenza chimica Þ 
ThOD ðmg O  2=mg sostenza chimica Þ Ü 100 
o 
% degradazione ¼ BOD ðmg O  2=mg sostenza chimica Þ 
COD ðmg O  2=mg sostenza chimica Þ Ü 100 
Si noti che questi due metodi non forniscono necessariamente lo 
stesso valore; è preferibile usare il primo dei due.  
Per le sostanze in esame che contengono azoto, utilizzare il valore 
appropriato di ThOD (NH  4 o NO  3 ) secondo quanto è noto o ci si 
aspetta per quanto riguarda il verificarsi della nitrificazione (allegato 
II.2). Se si verifica la nitrificazione ma non è completa, calcolare una 
correzione per tener conto dell'ossigeno consumato dalla nitrifica ­
zione in base alle variazioni di concentrazione dei nitriti e dei nitrati (allegato V).
 
VI.3.2.  Validità dei risultati  
Il consumo di ossigeno nel bianco dell'inoculo non dovrebbe supe ­
rare 1,5 mg di ossigeno disciolto/1 dopo 28 giorni. Valori più elevati 
di questo richiedono un esame delle tecniche sperimentali. La con ­
centrazione residua di ossigeno nelle bottiglie di prova non dovrebbe scendere al di sotto di 0,5 mg/l dopo questo tempo. Livelli di ossi ­
geno cosi bassi sono validi solo se il metodo usato per la determi ­
nazione dell'ossigeno disciolto è in grado di misurare accuratamente 
livelli cosi bassi.
 
Vedi anche I.5.2.  
VI.3.3.  Relazione  
Vedi I.8.  
VI.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo predisposto.  
SAGGIO DELLA BOTTIGLIA CHIUSA  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  
3. SOSTANZA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l  
Concentrazione iniziale nella bottiglia: ... mg/l  
ThOD o COD: .. mg O  2 /mg sostanza saggiata  
4. INOCULO  
Fonte: ...  
Trattamento effettuato: ...  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 869
 
Eventuale precondizionamento: ...  
Concentrazione nella miscela di reazione: ... mg/l  
5. DETERMINAZIONE DEL DO  
Metodo: Winkler/elettrodo  
Analisi dei contenitori  
Tempo di incubazione (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Bianco (senza so ­
stanza chimica) 1 C  1 
2 C  2 
Media 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Sostanza chimica in 
esame 1 a  1 
2 a  2 
Media 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Nota: formule simili possono essere usate per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e per i controlli di tossicità.  
6. CORREZIONE PER LA NITRIFICAZIONE  (vedi 
allegato V)  
Tempo di incubazione (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Concentrazione nitrati (mg N/l) 
(ii) Variazione della concentrazione dei nitrati (mg N/l) — (iii) Ossigeno equivalente (mg/l) — (iv) Concentrazione nitriti (mg N/l) (v) Variazione della concentrazione dei nitriti (mg N/l) — (vi) Ossigeno equivalente (mg/l) — (iii + vi) Ossigeno equivalente totale (mg/l) —
 
7. CONSUMO DI DO: % DEGRADAZIONE  
Abbattimento dopo n giorni (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Recipiente 1: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) 
Recipiente 2: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 870
 
Abbattimento dopo n giorni (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Recipiente 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : of test Ü ThOD chemical 
Recipiente 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : of test Ü ThOD chemical 
% D mean (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Non prendere il valore medio se c'è una notevole differenza tra due dati replicati.  
m to = valore nel recipiente di saggio al tempo 0  
m tx = valore nel recipiente di saggio al tempo x  
m bo = valore medio del bianco al tempo 0  
m bx = valore medio del bianco al tempo x  
Applicare anche la correzione per la nitrificazione da iii + vi della 
sezione 6.  
8. CONSUMI DI DO DEL BIANCO  
Consumo di ossigeno da parte del bianco: (m  bo - m  b28 ) mg/l. 
Questo consumo è importante per la validità del saggio. Non deve essere inferiore a 1,5 mg/l.
 
PARTE VII.  SAGGIO MITI  (Metodo C.4-F)  
VII.1. PRINCIPIO DEL METODO  
Il consumo di ossigeno da parte di una soluzione o sospensione 
agitata della sostanza chimica in esame in un mezzo minerale ino ­
culato con microorganismi non adattati, coltivati in modo speciale, 
viene misurato in modo automatico in un arco di tempo di 28 giorni in un respirometro tenuto in ambiente chiuso al buio a 25 ± 1
 o C. Il 
biossido di carbonio sviluppato viene assorbito mediante calce soda ­
ta. La biodegradabilità è espressa come percentuale di ossigeno con ­
sumato (corretta del consumo del bianco) rispetto all'assorbimento teorico (ThOD). La percentuale di biodegradanbilità primaria viene inoltre calcolata mediante una analisi chimica specifica supplemen ­
tare effettuata all'inizio e al termine dell'incubazione e, possibilmente, 
mediante analisi del DOC.
 
VII.2. DESCRIZIONE DEL METODO  
VII.2.1.  Apparecchiatura  
a) Misuratore elettrolitico automatico di BOD o respirometro equi ­
paggiato normalmente con 6 bottiglie da 300 ml ciascuna munite 
di contenitori per l'assorbimento del CO  2 ; ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 871
 
b) camera e/o bagno d'acqua a temperatura costante a 25  o C ± 1  o C 
o meglio;  
c) dispositivo di filtrazione su membrana (facoltativo);  
d) analizzatore di carbonio (facoltativo).  
VII.2.2.  Preparazione del mezzo minerale  
Preparare le seguenti soluzioni concentrate (stock) utilizzando reattivi 
puri per analisi e acqua (I.6.1.)- 
(a) Diidrogenoortofosfato monopotassico, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monoidrogenoortofosfato dipotassico, K  2 HPO  4 21,75 g 
Monoidrogenoortofosfato disodico dodecaidrato 
Na 2 HP0  4 .12 H  2 O 44,60 g 
Cloruro d'ammonio, NH  4 Cl 1,70 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro Il pH della soluzione deve essere 7,2 
(b) Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO
 4 .7 H  2 O 22,50 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro 
(c) Cloruro di calcio anidro, CaCl  2 27,50 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro 
(d) Cloruro di ferro (III) esaidrato, FeCl  3 .6 H  2 O 0,25 g 
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro.  
Prelevare 3 ml di ciascuna soluzione (a), (b), (c) e (d) e portare a 1 
litro.  
VII.2.3.  Preparazione dell'inoculo  
Raccogliere campioni freschi provenienti da almeno 10 località, prin ­
cipalmente da aree nelle quali vengono usati e scaricati vari prodotti chimici. Raccogliere da località come impianti di trattamento degli scarichi di fognatura, trattamento delle acque di scarico industriali, 
fiumi, laghi, mari, campioni da 1 litro di fango, terreno superficiale, 
acqua e così via e miscelare accuratamente insieme. Dopo avere rimosso la sostanza galleggiante e aver lasciato il resto a riposo, regolare il surnatante a pH 7 ± 1 con idrossido di sodio o acido 
fosforico.
 
Utilizzare un volume appropriato del surnatante filtrato per riempire 
un recipiente a fango attivo del tipo riempi e preleva e aerare il liquido per circa 23 ore e mezzo. Trenta minuti dopo avere arrestato l'aerazione, scartare circa un terzo del volume totale di surnatante e 
aggiungere un volume uguale di una soluzione (pH = 7) contenente 
lo 0,1 % rispettivamente di glucosio, peptone e ortofosfato monopo ­
tassico al materiale decantato e ricominciare l'aereazione. Ripetere questa procedura una volta al giorno. L'unità del fango deve essere 
fatta funzionare secondo la buona pratica di laboratorio: gli effluenti 
dovrebbero essere limpidi, la temperatura dovrebbe mantenersi a 25 ± 2
 o C, il pH dovrebbe essere 7 ± 1, il fango ben decantato, una 
sufficiente aereazione per mantenere la miscela aerobica per tutto il 
tempo, devono essere presenti protozoi e l'attività del fango deve 
essere verificata contro una sostanza di riferimento almeno ogni tre mesi. Non usare il fango come inoculo prima di almeno un mese di funzionamento, ma nemmeno dopo più di quattro mesi. Prelevare, 
quindi, campioni da almeno 10 località ad intervalli regolari, una 
volta ogni tre mesi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 872
 
Allo scopo di mantenere il fango fresco e quello vecchio alla stessa 
attività, miscelare il surnatante filtrato di un fango attivo in uso con 
un volume uguale del surnatante filtrato di una miscela raccolta di fresco da 10 fonti e coltivare il liquido combinato come visto sopra. Prelevare il fango da usarsi come inoculo 18-24 ore dopo che l'unità 
è stata alimentata.
 
VII.2.4.  Preparazione dei contenitori  
Preparare i seguenti sei palloni:  
n. 1: sostanza chimica in esame in acqua di diluizione a 100 mg/l  
n. 2, 3 e 4: sostanza chimica in esame nel mezzo minerale a 100 mg/l  
n. 5: sostanza chimica di riferimento (per esempio anilina) nel mezzo 
minerale a 100 mg/l  
n. 6: mezzo minerale da solo  
Aggiungere le sostanze chimiche scarsamente solubili direttamente, 
in ragione del peso o del volume, o trattarle come descritto nell'al ­
legato III, salvo il fatto che non si devono usare né solventi né agenti 
emulsionanti. Aggiungere l'assorbente del CO  2 in tutti i contenitori in 
speciali recipienti appositamente previsti. Regolare il pH nei conte ­
nitori n. 2, 3 e 4 a 7,0.  
VII.2.5.  Esecuzione del saggio  
Inoculare i palloni n. 2, 3 e 4 (sospensioni in esame), n. 5 (controllo 
dell'attività) e n. 6 (bianco dell'inoculo) con un piccolo volume del ­
l'inoculo fino ad una concentrazione di 30 mg/l di solidi sospesi. Non si aggiunge inoculo nel contenitore n. 1, che serve da controllo abiotico. Montare l'apparecchiatura, controllare che sia a tenuta 
d'aria, avviare gli agitatori e iniziare la misura dell'assorbimento di 
ossigeno in condizioni di buio. Controllare giornalmente la tempera ­
tura, l'agitatore e il registratore del consumo di ossigeno coulome ­
trico e annotare tutte le eventuali variazioni di colore del contenuto 
dei contenitori. Leggere il consumo di ossigeno per i sei palloni 
mediante un idoneo metodo, per esempio direttamente dal registra ­
tore scrivente a sei punti, che produce una curva di BOD. Al termine dell'incubazione, normalmente 28 giorni, misurare il pH del conte ­
nuto nei contenitori e determinare la concentrazione della sostanza 
chimica in esame residua e di tutti gli eventuali intermedi e, nel caso di sostanze solubili in acqua, la concentrazione di DOC (allegato II.4). Porre una cura particolare nel caso di sostanze chimiche vola ­
tili. Se si prevede la nitrificazione, determinare, se possibile, la con ­
centrazione di nitrati e nitriti.
 
VII.3. DATI E RELAZIONE  
VII.3.1.  Modalità di esposizione dei risultati  
Dividere il consumo di ossigeno (mg) da parte della sostanza chi ­
mica in esame dopo un tempo stabilito (corretto del controllo del 
bianco di inoculo dopo lo stesso tempo) per il peso della sostanza chimica in esame usata. Questo fornisce il BOD espresso come mg di ossigeno/mg di sostanza chimica in esame, cioè
 
BOD ¼ ðmg O  2 consumato dalla sostanza chimica in esame − mg O  2 consumato dal bianco Þ 
ðmg sostanza chimica in esame nel contenitore Þ 
= mg O  2 per mg di sostanza chimica in esame  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 873
 
La biodegradazione percentuale si ottiene poi da:  
% degrad : biologica ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg sostanza chimica Þ 
ThOD ðmg O  2= mg sostanza chimica Þ Ü 100 
Per le miscele, calcolare il ThOD dall'analisi elementare, come per i 
composti semplici. Utilizzare il valore appropriato di ThOD (ThOD
 NH4 o ThOD  NO3 ) a secondo che la nitrificazione sia assente 
o completa (allegato II.2). Se, tuttavia, si verifica la nitrificazione ma 
non è completa, calcolare la correzione, che tenga conto dell'ossi ­
geno consumato per nitrificazione, dalle variazioni di concentrazione di nitriti e nitrati (allegato V).
 
Calcolare la biodegradazione primaria percentuale dalla perdita del 
composto chimico (progenitore) specifico (vedi I.7,2.).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Se c'è stata una perdita di sostanza chimica in esame nel contenitore 
n. 1 che misura la rimozione chimico-fisica, riportare questa nella relazione e usare la concentrazione della sostanza chimica in esame 
(S
 b ) dopo 28 giorni in questo pallone per calcolare la biodegrada ­
zione percentuale.  
Quando si effettuano misure (facoltative) di DOC, calcolare la bio ­
degradazione finale percentuale da:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
come descritto al punto I.7.1. Se c'è stata una perdita di DOC nel 
pallone n. 1, che misura la rimozione chimico-fisica, utilizzare la 
concentrazione di DOC in questo pallone per calcolare la biodegra ­
dazione percentuale.  
Registrare tutti i risultati sui moduli allegati.  
VII.3.2.  Validità dei risultati  
Il consumo di ossigeno da parte del bianco dell'inoculo è normal ­
mente di 20-30 mg O  2 /l e non dovrebbe essere maggiore di 60 mg/l 
in 28 giorni. Valori più elevati di 60 mg/l richiedono un esame critico dei dati e delle tecniche sperimentali. Se il valore del pH è al di fuori del campo 6-8,5 e il consumo di ossigeno da parte della sostanza 
chimica in esame è minore del 60 %, si dovrebbe ripetere la prova 
con una minore concentrazione della sostanza chimica in esame.
 
Vedi anche I.5.2.  
Se la degradazione percentuale dell'anilina, calcolata dal consumo di 
ossigeno, non supera il 40 % dopo 7 giorni e il 65 % dopo 14 giorni, 
la prova viene considerata non valida.  
VII.3.3.  Relazione  
Vedi I.8.  
VII.4. MODULARIO  
Nel seguito è presentato un esempio di modulo predisposto.  
SAGGIO MITI (I)  
1. LABORATORIO  
2. DATA DI INIZIO DEL SAGGIO  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 874
 
3. SOSTANZA IN ESAME  
Nome: ...  
Concentrazione della soluzione stock: ... mg/l come sostanza  
Concentrazione iniziale nel mezzo, C  o : ... mg/l come sostanza  
Volume della miscela di reazione, V: ... ml  
ThOD: ... mg O  2 /l 
4. INOCULO  
Località di campionamento del fango: 
1) ... 6) ... 
2) ... 7) ... 3) ... 8) ... 
4) ... 9) ... 
5) ... 10) ...
 
Concentrazione dei solidi sospesi nel fango attivo dopo accli ­
matazione con liquido fognario sintetico = ... mg/l  
Volume di fango attivo per litro di mezzo finale = ... ml  
Concentrazione del fango nel mezzo finale = ... mg/l  
5. CONSUMO DI OSSIGENO: BIODEGRADABILITÀ  
Tipo di respirometro usato: ...  
Tempo (giorni) 
0 7 14 21 28  
O 2 cons. (mg) so ­
stanza chimica in 
esame a 1 
a 2 
a 3 
O 2 cons. (mg) 
bianco b 
O 2 cons. (mg) 
corretto (a 1 - b 1 ) 
(a 1 - b 1 ) 
(a 1 - b 1 ) 
BOD per mg di 
sostanza chimica in esame
 ða Ä bÞ 
C o V Conten. 1 
Conten. 2 Conten. 3 
% degradazione
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 
3 
media (*)  
(*) Non prendere il valore medio se c'è una notevole differenza tra due dati replicati.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 875
 
Nota: formule simili possono essere usate per i controlli della so ­
stanza chimica di riferimento e per i controlli di tossicità.  
6. ANALISI DEL CARBONIO  (facoltativa)  
Analizzatore di carbonio: ...  
Contenitore DOC 
% DOC rimosso Media 
Misurato Corretto  
Acqua + sost. in esame a — — 
Fango + sost. in esame b  1 b 1 - c 
Fango + sost. in esame b  2 b 2 - C 
Fango + sost. in esame b  3 b 3 - c 
Controllo del bianco c — — —  
% DOC rimosso ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DATI ANALITICI DELLA SOSTANZA CHIMICA SPE ­
CIFICA  
Quantità residua della sostanza chimica 
in esame al termine della prova % degradazione  
prova in bianco con acqua S  b 
mezzo inoculato S a1 
S a2 
S a3 
% degradazione ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Calcolare la degradazione % per i contenitori a  1 , a 2 e a 3 ri­
spettivamente.  
8. NOTE  
Se disponibile, allegare la curva del BOD in funzione del 
tempo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 876
 
ALLEGATO I  
ABBREVIAZIONI E DEFINIZIONI  
DO: Ossigeno disciolto (mg/1); è la concentrazione di ossigeno disciolto in 
un campione acquoso.  
BOD: Domanda biochimica di ossigeno (g); è la quantità di ossigeno consu ­
mato dai microorganismi nella metabolizzazione di un composto in esame; espressa anche come grammi di ossigeno consumato per 
grammo di composto in esame (vedi metodo C.5).
 
COD: Domanda chimica di ossigeno (g); è la quantità di ossigeno consumata 
durante l'ossidazione di un composto in esame con dicromato acido 
caldo: fornisce una misura della quantità di materia ossidabile presente; 
espressa anche come grammi di ossigeno consumati per grammo di sostanza in esame (vedi metodo C.6).
 
DOC: Carbonio organico disciolto; è il carbonio organico presente in solu ­
zione o che passa attraverso un filtro da 0,45 micrometri o che rimane nel surnatante dopo centrifugazione a 40 000 m/s
 2 (± 4 000 g) per 
15 minuti.  
ThOD: Domanda teorica di ossigeno (mg); è la quantità totale di ossigeno 
richiesta per ossidare completamente una sostanza chimica; viene 
calcolata dalla formula molecolare (vedi allegato II.2) ed è espressa 
anche come mg di ossigeno richiesti per mg di sostanza in esame.  
ThCO  2 : Biossido di carbonio teorico (mg); è la quantità di biossido di carbonio 
prodotto calcolato dal contenuto di carbonio noto o misurato della sostanza in esame quando sia stata completamente mineralizzata; espresso anche come mg di biossido di carbonio sviluppati per mg di 
sostanza in esame.
 
TOC: Carbonio organico totale di un campione; è la somma del carbonio 
organico in soluzione e in sospensione.  
IC: Carbonio inorganico.  
TC: Carbonio totale; è la somma del carbonio organico e di quello inorga ­
nico presenti in un campione.  
Biodegradazione primaria:  
è l'alterazione della struttura chimica di una sostanza provocata da un'azione 
biologica, che dà come risultato la perdita delle proprietà specifiche di quella sostanza.
 
Biodegradazione ultima (aerobica):  
è il livello di degradazione realizzato quando la sostanza in esame è completa ­
mente utilizzata da microorganismi, con il risultato della produzione di biossido di 
carbonio, acqua, sali minerali e nuovi costituenti cellulari microbici (biomassa).  
Prontamente biodegradabile:  
una classificazione arbitraria di sostanze chimiche che hanno superato certe 
prove specifiche di selezione riguardo alla biodegradabilità ultima; queste prove sono cosi rigorose che si suppone che tali composti si degraderanno 
biologicamente in modo rapido e completo in ambienti acquosi in condizioni 
aerobiche.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 877
 
Intrinsecamente biodegradabile:  
una classificazione di sostanze chimiche per le quali vi è una dimostrazione 
inequivocabile di biodegradazione (primaria o ultima) in qualsiasi riconosciuto saggio di biodegradabilità.
 
Trattabilità:  
è la capacità di composti di essere rimossi durante il trattamento biologico di 
acque di scarico senza influire in modo dannoso sul funzionamento normale dei processi di trattamento. In generale, i composti prontamente biodegradabili pos ­
sono essere trattaci, ma non tutti i composti intrinsecamente biodegradabili lo 
sono. Possono funzionare anche processi abiotici.
 
Tempo di latenza:  
è il tempo che passa dall'inoculazione in un saggio di rimozione lenta a quando 
la degradazione percentuale è aumentata fino ad almeno il 10 %. Il tempo di 
latenza è spesso notevolmente variabile e scarsamente riproducibile.  
Tempo di degradazione:  
è il tempo che passa dal termine del tempo di latenza al momento in cui si 
raggiunge il 90 % o il massimo livello di degradazione.  
Finestra di 10 giorni:  
sono i 10 giorni che seguono immediatamente il raggiungimento del 10 % 
di degradazione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 878
 
ALLEGATO II  
CALCOLO E DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI SIGNIFICATIVI  
Secondo il metodo scelto, saranno richiesti certi parametri somma. La sezione 
che segue descrive come ricavare questi valori. L'uso di questi parametri è de ­
scritto nei metodi specifici.  
1. Contenuto di carbonio  
Il contenuto di carbonio viene calcolato dalla composizione elementare nota 
oppure viene determinato mediante analisi elementare della sostanza in esame.
 
2. Domanda teorica di ossigeno (ThOD)  
La domanda teorica di ossigeno (ThOD) può essere calcolata se è nota la 
composizione elementare, oppure se questa viene determinata mediante analisi elementare. Per il composto:
 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
senza nitrificazione, si ha  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
PM mg=mg 
oppure, con nitrificazione,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
PM mg=mg 
3. Domanda chimica di ossigeno (COD)  
La domanda chimica di ossigeno (COD) viene determinata secondo il 
metodo C.6.  
4. Carbonio organico disciolto (DOC)  
Il carbonio organico disciolto (DOC) è per definizione il carbonio organico 
di qualsiasi sostanza chimica o miscela in acqua che passa attraverso un 
filtro da 0,45 micrometri.  
Campioni estratti dal recipiente di prova vengono prelevati e filtrati imme ­
diatamente nell'apparecchiatura di filtrazione utilizzando un appropriato 
filtro a membrana. I primi 20 ml (quantità che può essere ridotta quando si usino filtri piccoli) del filtrato vengono scartati. Per l'analisi del carbonio si trattengono volumi di 10-20 ml, o minori, nel caso vengano iniettati (il 
volume dipende dalla quantità richiesta dall'analizzatore del carbonio). La 
concentrazione di DOC viene determinata mediante un analizzatore di car ­
bonio organico che è in grado di misurare accuratamente una concentra ­
zione di carbonio equivalente o minore del 10 % della concentrazione 
iniziale di DOC usata nella prova.
 
Campioni filtrati che non possono essere analizzati lo stesso giorno di 
lavoro possono essere conservati in frigorifero a 2-4 °C per 48 ore o al 
di sotto di - 18 °C per periodi più lunghi.  
Note:  
I filtri a membrana  sono spesso impregnati di tensioattivi per la idrofiliz ­
zazione. Così i filtri possono contenere fino a parecchi mg di carbonio 
organico solubile che interferirebbe nelle determinazioni di biodegradabili ­
tà. I tensioattivi e altri composti organici solubili vengono rimossi dai filtri bollendoli in acqua deionizzata per tre periodi di 1 ora ciascuno. I filtri 
possono poi venire conservati in acqua per una settimana. Se si utilizzano 
cartucce filtranti a perdere, ciascuna partita deve essere controllata per confermare che non liberi carbonio organico solubile.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 879
 
Secondo il tipo di filtro a membrana, la sostanza chimica in esame può 
essere trattenuta per adsorbimento. Pertanto può essere consigliabile assi ­
curarsi che la sostanza chimica in esame non venga trattenuta dal filtro.  
Una centrifugazione  a 40 000 m/s  2 (4 000 g) per 15 minuti può venire 
usata al posto della filtrazione per differenziare tra TOC e DOC. Il metodo 
non è affidabile a una concentrazione iniziale < 10 mg DOC/l perché o non 
vengono rimossi tutti i batteri, oppure viene ridisciolto carbonio come parte del plasma batterico.
 
BIBLIOGRAFIA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th, 
ed. Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen De ­
mand, 1965, P 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 — Deutsche Einheitsverfahren zur Was ­
ser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- 
und Stoffkenngrö βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauer ­
stoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu β Wasserwesen (NAW) in 
DIN Deutsches Institut für Normung e.V.  
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 880
 
ALLEGATO III  
VALUTAZIONE DELLA BIODEGRADABILITÀ DI SOSTANZE 
SCARSAMENTE SOLUBILI  
Nei saggi di biodegradabilità con sostanze scarsamente solubili, si dovrebbe 
prestare una particolare attenzione agli aspetti seguenti:  
Mentre i liquidi omogenei raramente creano problemi di campionamento, si 
raccomanda di omogenizzare i materiali solidi mediante mezzi appropriati per 
evitare errori dovuti alla disomogenità. Un'attenzione particolare deve essere adoperata quando occorrono campioni rappresentativi di pochi mg prelevati da miscele di prodotti chimici o sostanze con grandi quantità di impurezze.
 
Durante le prove si possono usare varie forme di agitazione. Bisogna porre 
attenzione ad applicare semplicemente una agitazione sufficiente per mantenere 
in dispersione la sostanza chimica e ad evitare un surriscaldamento, eccessiva formazione di schiuma e eccessive forze di taglio.
 
Si può usare un emulsionante che fornisca una dispersione stabile della sostanza 
chimica. Esso non dovrebbe essere tossico per i batteri e non dovrebbe essere 
biodegradato né provocare schiuma nelle condizioni sperimentali.  
Gli stessi criteri valgono per i solventi e gli emulsionanti.  
Non è raccomandabile usare carriers solidi per le sostanze in esame solide, ma 
essi possono essere adatti per le sostanze oleose.  
Quando si utilizzano sostanze ausiliarie, come emulsionanti, solventi e veicoli, si 
dovrebbe eseguire una prova in bianco contenente la sostanza ausiliaria.  
Per studiare la biodegradabilità di composti scarsamente solubili si può usare uno 
qualunque dei tre saggi respirometrici CO  2 , BOD, MITI.  
BIBLIOGRAFIA  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The Biodegradabily testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 881
 
ALLEGATO IV  
VALUTAZIONE DELLA BIODEGRADABILITÀ DI SOSTANZE 
CHIMICHE DI SOSPETTA TOSSICITÀ PER L'INOCULO  
Quando una sostanza chimica viene sottoposta ad un saggio di pronta biodegra ­
dabilità e risulta non biodegradabile, si raccomanda di eseguire la procedura 
seguente se si vuole distinguere tra inibizione e inerzia (Reynolds et al., 1987).  
Si devono usare inoculi simili o identici per i saggi di tossicità e degradazione 
biologica.  
Per valutare la tossicità di sostanze chimiche studiate in saggi di pronta biode ­
gradabilità, sembra appropriata l'applicazione di uno dei metodi, o una loro combinazione, di inibizione del tasso di respirazione del fango (saggio di inibi ­
zione della respirazione del fango attivo — direttiva 88/302/CEE), BOD e/o 
inibizione della crescita.
 
Se si deve evitare l'inibizione dovuta a tossicità, si suggerisce di usare nelle prove 
di pronta biodegradabilità una concentrazione della sostanza in esame minore di 
1/10 dei valori di EC  50 (o minore dei valori di EC  20 ) ottenuti nelle prove di 
tossicità. I composti con un valore di Ec  50 maggiore di 300 mg/l è improbabile 
che abbiano effetti tossici nelle prove di pronta biodegradabilità.  
I valori di EC  50 minori di 20 mg/l è probabile che pongano seri problemi per la 
successiva esecuzione delle prove. Si devono impiegare concentrazioni di prova 
basse, che richiedono l'uso del saggio rigoroso e sensibile della bottiglia chiusa 
oppure l'uso di materiale marcato  14 C. In alternativa, un inoculo acclimatato può 
permettere di usare concentrazioni più elevate della sostanza in esame. In questo ultimo caso, tuttavia, si perde lo specifico criterio di pronta biodegradabilità.
 
BIBLIOGRAFIA  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 882
 
ALLEGATO V  
CORREZIONE DELL'ASSORBIMENTO DI OSSIGENO PER 
INTERFERENZA DOVUTA A NITRIFICAZIONE  
Errori dovuti al fatto di non considerare la nitrificazione, nella valutazione del 
consumo di ossigeno nella biodegradabilità di sostanze in esame che non con ­
tengono azoto, sono marginali (minori del 5 %), anche se si verifica, in modo 
irregolare, l'ossidazione dell'azoto ammoniacale nel mezzo, tra i recipienti di prova e i recipienti del bianco. Invece, per le sostanze di prova, che contengono azoto, possono verificarsi gravi errori.
 
Se si è avuta nitrificazione ma questa non è completa, il consumo di ossigeno 
osservato, nella miscela di reazione, può essere corretto tenendo conto della 
quantità di ossigeno utilizzata nell'ossidazione dell'ammonio a nitrito e nitrato, se si determinano le variazioni di concentrazione dei nitriti e dei nitrati durante l'incubazione, tenendo conto delle equazioni seguenti: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Complessivamente: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Dall'equazione (1) risulta che l'ossigeno consumato da 28 g d'azoto, contenuti nel 
cloruro d'ammonio (NH  4 Cl) ossidato a nitrito è pari a 96 g, il che corrisponde ad 
un fattore di 3,43 (96/28). Nello stesso modo dall'equazione (3) l'assorbimento di 
ossigeno da parte di 28 g di azoto, ossidati a nitrato, è di 128 g, il che corri ­
sponde ad un fattore di 4,57 (128/28).  
Poichè le reazioni avvengono  in sequenza,  in quanto sono eseguite da specie 
batteriche distinte e differenti, è possibile che la concentrazione di nitrito aumenti 
o diminuisca; in quest'ultimo caso si formerà una concentrazione equivalente di 
nitrato. Così, l'ossigeno consumato nella formazione di nitrato è 4,57 moltiplicato per l'aumento di concentrazione del nitrato, mentre l'ossigeno associato alla for ­
mazione di nitrito è 3,43 moltiplicato per l'aumento di concentrazione del nitrito 
o per la diminuzione della sua concentrazione; la perdita di ossigeno è - 3,43 
moltiplicato per la diminuzione di concentrazione.
 
Cioè: 
O 2 consumato nella formazione di nitrato = 4,57 × aumento di 
concentrazione dei N-nitrati (4) 
e 
O 2 consumato nella formazione di nitrito = 3,43 × aumento della 
concentrazione di N-nitrito (5) 
e 
O 2 perso nella sparizione dei nitriti = - 3,43 × diminuzione della 
concentrazione di N-nitriti (6) 
Di modo chel'assorbimento di O  2 dovuto alla nitrificazione = 
± 3,43 × variazione della concentrazione di N-nitrito + 4,57 × 
aumento della concentrazione di N-nitrato (7) 
e così l'assorbimento di O  2 dovuto all'ossidazione del C = as ­
sorbimento osservato totale - assorbimento dovuto alla nitrifica ­
zione (8) 
In alternativa, se si determina solo l'N totale ossidato, l'assorbimento di ossigeno 
dovuto alla nitrificazione può essere assunto, in prima approssimazione, pari a 
4,57 × aumento di N ossidato.  
Il valore corretto per il consumo di ossigeno dovuto all'ossidazione di C viene 
poi confrontato con il ThOD NH  4 , come calcolato nell'allegato II.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 883
 
C.5. DEGRADAZIONE — DOMANDA BIOCHIMICA DI OSSIGENO 
(BOD)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo serve a misurare la domanda biochimica di ossi ­
geno (BOD) delle sostanze organiche solide e liquide.  
I dati ottenuti con questa prova riguardano i composti idrosolubili; è 
tuttavia possibile, almeno in linea di principio, esaminare anche i composti volatili e quelli poco solubili in acqua.
 
Il metodo può essere applicato soltanto a sostanze organiche che non 
esercitano azione inibitoria sui batteri alla concentrazione impiegata 
per le prove. Se la sostanza non è solubile, per ottenere una buona dispersione potrà essere necessario ricorrere a speciali accorgimenti, come l'impiego di ultrasuoni.
 
Informazioni preliminari in merito alla tossicità del composto chi ­
mico possono risultare utili per interpretare i valori più bassi e per 
scegliere adeguate concentrazioni per la prova.  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
Si definisce BOD la quantità di ossigeno che un determinato quan ­
titativo della sostanza in esame richiede, in determinate condizioni, per consentire il verificarsi del processo di ossidazione biochimica.
 
I risultati vengono espressi in g di BOD per g di sostanza esaminata.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
È consigliabile impiegare una sostanza di riferimento adatta per ve ­
rificare l'attività dell'inoculo.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Una quantità predeterminata della sostanza in esame, disciolta o 
dispersa in un mezzo idoneo ben aerato, viene inoculata con oppor ­
tuni microorganismi e posta in incubazione al buio, a temperatura 
ambiente determinata e costante.  
Il BOD viene determinato dalla differenza del contenuto di ossigeno 
disciolto all'inizio e alla fine del saggio. La durata del saggio deve essere almeno di 5 giorni e non più di 28 giorni.
 
Deve essere effettuata in parallelo una prova in bianco, su un sistema 
analogo, ma non contenente la sostanza in esame.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La determinazione del BOD non può essere ritenuta una valida 
determinazione della biodegradabilità di una sostanza. Il presente 
metodo può essere considerato unicamente come un saggio orienta ­
tivo. 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
Si prepara preliminarmente una soluzione od una dispersione della 
sostanza da esaminare, per ottenere una concentrazione di BOD compatibile con il metodo impiegato. Si determina successivamente 
il BOD seguendo un qualunque metodo nazionale o internazionale 
normalizzato.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 884
 
2. DATI E VALUTAZIONE  
Il BOD ottenuto nella soluzione preliminare viene calcolato confor ­
memente al metodo normalizzato prescelto e convertito in grammi di BOD per grammo di sostanza esaminata.
 
3. RELAZIONE  
Va precisato il metodo impiegato.  
La domanda biochimica di ossigeno deve risultare dalla media di 
almeno tre misurazioni valide.  
Va indicata ogni informazione ed ogni osservazione utile per l'inter ­
pretazione del saggio, soprattutto per quanto riguarda le impurezze, lo stato fisico, gli effetti tossici, la composizione intrinseca della 
sostanza ed ogni altro elemento tale da influenzarne i risultati.
 
Nella relazione va indicato l'eventuale impiego di un additivo mi ­
rante a impedire la nitrificazione biologica.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Elenco di metodi normalizzati, quali ad esempio:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand  
NBN 407: Biochemical oxygen demand  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik 
(BZV)  
The determination of biochemical oxygen demand, 1981, Methods 
for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 885
 
C.6. DEGRADAZIONE — DOMANDA CHIMICA DI OSSIGENO 
(COD)  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo è destinato alla determinazione della domanda 
chimica di ossigeno (COD) delle sostanze organiche solide o liquide, secondo una tecnica normalizzata ed arbitraria, in condizioni di laboratorio prefissate.
 
Per effettuare la prova ed interpretarne i risultati sarà utile disporre di 
dati sulla formula chimica della sostanza (ad esempio: sali alogenati, 
sali ferrosi di composti organici, composti organoclorurati).  
1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
La richiesta chimica di ossigeno è una misura dell'ossidabilità di una 
sostanza, espressa come equivalente in ossigeno di un reattivo ossi ­
dante consumato dalla sostanza in condizioni di laboratorio presta ­
bilite.  
Il risultato si esprime in g COD/g sostanza in esame.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nell'esame di nuovi prodotti non è necessario impiegare costante ­
mente sostanze di riferimento. Queste dovrebbero servire essenzial ­
mente a calibrare saltuariamente il metodo e fornire la possibilità di 
confrontare i risultati con quelli ottenuti applicando un altro metodo.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Una quantità prestabilita della sostanza da esaminare, disciolta o 
dispersa in acqua, viene ossidata con potassio dicromato in ambiente 
fortemente acido per H  2 SO 4 , impiegando solfato d'argento come 
catalizzatore e facendo bollire a ricadere per due ore. La quantità residua di dicromato viene determinata titolando con solfato di ferro (II) e ammonio standardizzato.
 
Nel caso delle sostanze contenenti cloro, si aggiunge solfato di 
mercurio (*) per ridurre l'interferenza dei cloruri.  
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Data l'arbitrarietà di determinazione del metodo, il COD è un «indi ­
catore di ossidabilità» e come tale viene usato come un metodo pratico per determinare la sostanza organica.
 
Nella prova possono interferire i cloruri; anche riducenti o ossidanti 
inorganici possono interferire con la determinazione del COD.  
Alcuni composti ciclici e molte sostanze volatili (per esempio acidi 
grassi inferiori) non vengono ossidati completamente da questo sag ­
gio. 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
Si prepara una soluzione o una dispersione della sostanza da saggia ­
re, in modo da ottenere una domanda chimica di ossigeno compresa tra 250 e 600 mg/l di COD.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 886  
(*) Dopo l'uso, le soluzioni contenenti sali di mercurio devono essere tranate in modo da 
evitare la diffusione di mercurio nell'ambiente.
 Osservazioni  
Nel caso di sostanze scarsamente solubili o non disperdibili, si può 
pesare una quantità di sostanza, finemente polverizzata od allo stato 
liquido, corrispondente a 5 mg di COD, e si colloca nell'apparecchio sperimentale con acqua.
 
La domanda chimica di ossigeno (COD) viene spesso determinata, 
specialmente nel caso di sostanze scarsamente solubili, secondo una 
variante al metodo, cioè in un sistema chiuso con un equalizzatore di 
pressione (H. Kelkenberg, 1975). Con questa variante, è spesso pos ­
sibile riuscire a quantificare composti che si determinano solo con difficoltà con il metodo convenzionale, per esempio acido acetico. 
Anche questo metodo fallisce tuttavia nel caso della piridina. Se si 
aumenta la concentrazione del dicromato di potassio descritta nel riferimento (1), fino a 0,25 N (0,0416 M), la pesata diretta di 5- 10 mg di sostanza viene facilitata, e ciò è essenziale per la determi ­
nazione del COD di sostanze scarsamente solubili in acqua (rif. 2).
 
Altrimenti, il COD viene poi determinato seguendo un qualunque 
metodo nazionale o internazionale normalizzato.  
2. DATI E VALUTAZIONI  
Il COD del recipiente sperimentale viene calcolato secondo il me ­
todo normalizzato prescelto e trasformato in grammi di COD per 
grammi della sostanza in esame.  
3. RELAZIONE  
Nella relazione deve essere indicato il metodo di riferimento.  
Il COD deve risultare dalla media di almeno tre misure. Devono 
essere riferiti tutti i dati e le osservazioni significative per l'interpre ­
tazione dei valori ottenuti: ciò vale particolarmente per le impurezze, lo stato fisico e le proprietà della sostanza (se note), qualora possano 
influire sui risultati.
 
Va altresì riferito l'eventuale impiego di solfato mercurico per mini ­
mizzare l'interferenza dei cloruri.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Kelkenberg, H.Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compound;. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Elenco dei metodi standardizzati, ad esempio:  
NBN T 91-201 Determinaition of the chemical oxygen de ­
mand.  
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen de ­
mand.  
DS 217 = water analyis Determination of the chemical oxy ­
gen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 887
 
C.7. DEGRADAZIONE — DEGRADAZIONE ABIOTICA: IDROLISI 
IN FUNZIONE DEL PH  
1. METODO  
Il metodo di seguito descritto è equivalente alle linee guida OCSE 
TG 111 (2004).  
1.1. INTRODUZIONE  
Le sostanze chimiche possono penetrare nelle acque superficiali per 
immissione diretta, dispersione di sostanze nebulizzate, scorrimento, 
drenaggio, smaltimento dei rifiuti, tramite gli effluenti industriali, 
domestici o agricoli o per deposizione atmosferica, e in acqua pos ­
sono subire trasformazioni mediante processi chimici (ad es. idrolisi, ossidazione), fotochimici e/o microbici. Le presenti linee guida de ­
scrivono un metodo di prova di laboratorio per valutare la trasfor ­
mazione idrolitica abiotica delle sostanze chimiche nei sistemi ac ­
quatici ai valori di pH normalmente riscontrabili nell'ambiente (pH 4- 9) e sono basate su linee guida già esistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
Scopo degli esperimenti è determinare: i) la velocità di idrolisi della 
sostanza di prova in funzione del pH, e ii) l'identità o la natura e la velocità di formazione e degradazione dei prodotti dell'idrolisi ai 
quali gli organismi possono essere esposti. Tali esperimenti possono 
risultare necessari per le sostanze chimiche immesse direttamente in acqua o in grado di penetrare nell'ambiente attraverso le altre vie sopra indicate.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ DI MISURA  
Cfr. allegato 2.  
1.3. APPLICABILITÀ DEL METODO  
Il metodo è applicabile a tutte le sostanze chimiche (marcate o non 
marcate) per le quali sia disponibile un metodo analitico di suffi ­
ciente accuratezza e sensibilità; è applicabile a composti leggermente 
volatili o non volatili sufficientemente solubili in acqua, ma non a sostanze chimiche che presentano elevata volatilità in acqua (ad es. fumiganti o solventi organici) e che non possono pertanto essere 
mantenute in soluzione nelle condizioni sperimentali del presente 
saggio. L'esecuzione del saggio potrebbe risultare difficile con so ­
stanze scarsamente solubili in acqua (8).
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Soluzioni tampone acquose sterili con differenti valori di pH (4, 7 e 
9) sono trattate con la sostanza di prova e incubate al buio in con ­
dizioni controllate di laboratorio (a temperature costanti). Ad oppor ­
tuni intervalli di tempo, le soluzioni tampone sono analizzate per identificare e quantificare la sostanza di prova e i prodotti dell'idro ­
lisi. L'uso di sostanze di prova marcate (ad es.
 14 C) facilita la deter ­
minazione del bilancio di massa.  
Questo metodo di prova è concepito secondo uno schema articolato 
in più fasi (o livelli), illustrato e descritto nell'allegato 1. Ogni fase è 
avviata sulla base dei risultati della fase precedente.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 888
 
1.5. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Per misurare la velocità di idrolisi è possibile utilizzare sostanze di 
prova marcate o non marcate. Generalmente per studiare il meccani ­
smo di idrolisi e per determinare il bilancio di massa si preferisce 
utilizzare materiale marcato; tuttavia, in casi particolari, la marcatura 
può non essere affatto necessaria. Si raccomanda la marcatura con  
14 C, ma possono risultare utili anche altri isotopi, quali  13 C, 15 N, 3 H. 
Nei limiti del possibile, la marcatura va posizionata nella parte o 
nelle parti più stabili della molecola. Se per esempio la sostanza di 
prova contiene un anello, la marcatura va effettuata su questo anello; se la sostanza di prova contiene due o più anelli potrebbero essere 
necessari studi separati per valutare il destino di ciascun anello mar ­
cato e ottenere informazioni adeguate sulla formazione dei prodotti dell'idrolisi. La sostanza di prova deve avere una purezza minima del 95 %.
 
Prima di eseguire il saggio di idrolisi è necessario disporre delle 
seguenti informazioni sulla sostanza di prova:  
a) solubilità in acqua [metodo di prova A.6];  
b) solubilità in solventi organici;  
c) pressione di vapore [metodo di prova A.4] e/o costante della 
legge di Henry;  
d) coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua [metodo di 
prova A. 8];  
e) costante di dissociazione (pK  a ) [linee guida OCSE 112] (9);  
f) tasso di fototrasformazione diretta o indiretta in acqua, a seconda 
dei casi.  
Occorre disporre di metodi analitici per la quantificazione della so ­
stanza di prova e, se necessario, per l'identificazione e la quantifica ­
zione dei prodotti dell'idrolisi in soluzioni acquose (cfr. anche punto 1.7.2).
 
1.6. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Ove possibile, occorre utilizzare sostanze di riferimento per l'identi ­
ficazione e la quantificazione dei prodotti dell'idrolisi mediante me ­
todi spettroscopici e cromatografici o altri metodi di sensibilità ade ­
guata.  
1.7. CRITERI DI QUALITÀ  
1.7.1.  Recuperi  
L'analisi delle soluzioni tampone (almeno in duplicato) o dei loro 
estratti subito dopo l'aggiunta della sostanza di prova fornisce una 
prima indicazione della ripetibilità del metodo analitico e dell'unifor ­
mità della procedura di applicazione della sostanza. Nelle ultime fasi degli esperimenti i recuperi sono dati dai rispettivi bilanci di 
massa (in caso di utilizzo di sostanze marcate). Sia per le sostanze 
marcate che per le sostanze non marcate i recuperi devono essere compresi tra il 90 % e il 110 % (7). Qualora sia tecnicamente difficile raggiungere questo intervallo, si considera accettabile un 
recupero del 70 % per le sostanze non marcate, ma in tal caso 
occorre fornire una giustificazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 889
 
1.7.2.  Ripetibilità e sensibilità del metodo analitico  
La ripetibilità del(i) metodo(i) analitico(i) utilizzato(i) per quantifi ­
care la sostanza di prova e i prodotti dell'idrolisi può essere verificata mediante analisi in duplicato delle stesse soluzioni tampone (o dei 
loro estratti) dopo la formazione di una quantità di prodotti dell'idro ­
lisi sufficiente a permetterne la quantificazione.
 
Il metodo analitico deve essere sufficientemente sensibile da consen ­
tire di quantificare concentrazioni della sostanza di prova uguali o 
inferiori al 10 % della concentrazione iniziale. All'occorrenza i me ­
todi analitici devono essere anche sufficientemente sensibili da con ­
sentire di quantificare qualsiasi prodotto dell'idrolisi che rappresenti almeno il 10 % della dose applicata (in qualsiasi fase del saggio) 
fino al 25 % o meno della sua concentrazione massima.
 
1.7.3.  Intervalli di confidenza dei dati cinetici dell'idrolisi  
Occorre calcolare e indicare gli intervalli di confidenza di tutti i 
coefficienti di regressione, delle costanti di velocità, dei tempi di dimezzamento e di tutti gli altri parametri cinetici (ad es. DT
 50 ). 
1.8. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.8.1.  Attrezzature e apparecchiature  
Il saggio deve essere realizzato in recipienti di vetro (ad es. provette, 
piccoli matracci), al buio e in condizioni sterili, se necessario, a 
meno che dalle informazioni preliminari (quali ad esempio il coeffi ­
ciente di ripartizione n-ottanolo/acqua) non risulti che la sostanza di prova può aderire al vetro. In tal caso, può essere necessario pren ­
dere in considerazione l'uso di materiali alternativi come il teflon. 
Per ovviare al problema dell'aderenza al vetro è possibile ricorrere ad 
uno o più dei seguenti metodi:
 
— determinazione della massa della sostanza di prova e dei prodotti 
dell'idrolisi assorbiti dal recipiente di prova;  
— uso di un bagno ad ultrasuoni;  
— lavaggio con solvente di tutti i recipienti in vetro in ciascun 
intervallo di campionamento;  
— uso di prodotti formulati;  
— uso di una maggiore quantità di cosolvente per aggiungere la 
sostanza di prova al sistema. In caso di utilizzo di un cosolvente, quest'ultimo non deve idrolizzare la sostanza di prova.
 
Sono normalmente necessari bagnomaria agitanti a temperatura con ­
trollata o incubatori termostatici per l'incubazione delle varie solu ­
zioni di prova.  
È necessaria la normale attrezzatura da laboratorio e in particolare:  
— pH-metro;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 890
 
— strumenti analitici e in particolare apparecchi per gascromatogra ­
fia (GC), cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC), cro ­
matografia su strato sottile (TLC), compresi gli opportuni sistemi di rilevazione per l'analisi delle sostanze radiomarcate e non marcate, o per il metodo della diluizione isotopica inversa;
 
— strumenti di identificazione, quali ad esempio spettrometria di 
massa (MS), gascromatografia con spettrometria di massa (GC- 
MS), cromatografia liquida ad alta risoluzione con spettrometria 
di massa (HPLC-MS), risonanza magnetica nucleare (NMR), ecc.;
 
— contatore a scintillazione liquida;  
— imbuti separatori per estrazione liquido-liquido;  
— strumenti per la concentrazione delle soluzioni e degli estratti (ad 
es. evaporatore rotante);  
— dispositivi per il controllo della temperatura (ad es. bagnomaria).  
I reagenti chimici utilizzati comprendono ad esempio:  
— solventi organici di grado analitico quali l'esano, il diclorometa ­
no, ecc.;  
— liquido di scintillazione;  
— soluzioni tampone (per una descrizione più dettagliata cfr. punto 
1.8.3).  
Tutti i recipienti di vetro, l'acqua di grado reagente e le soluzioni 
tampone da utilizzare nei saggi di idrolisi devono essere sterilizzati.  
1.8.2.  Applicazione della sostanza di prova  
La sostanza di prova deve essere applicata in soluzione acquosa nelle 
varie soluzioni tampone (cfr. allegato 3). Per permettere un'adeguata 
dissoluzione è consentito, se necessario, l'uso di piccole quantità di solventi miscibili in acqua (ad es. acetonitrile, acetone, etanolo) per 
l'applicazione e la distribuzione della sostanza di prova, che tuttavia 
non devono di norma superare l'1 % v/v. L'uso di una concentra ­
zione più elevata di solventi (ad es. in caso di sostanze poco solubili) è ammesso solo se è possibile dimostrare che il solvente non ha 
alcun effetto sull'idrolisi delle sostanze di prova.
 
Si sconsiglia di utilizzare regolarmente prodotti formulati, in quanto 
non si può escludere che gli ingredienti della formulazione interferi ­
scano con il processo di idrolisi. L'impiego di materiale formulato può tuttavia rappresentare un'alternativa adeguata nel caso di so ­
stanze di prova scarsamente idrosolubili o caratterizzate da aderenza 
al vetro (cfr. punto 1.8.1).
 
Occorre utilizzare un'unica concentrazione della sostanza di prova, 
che non deve essere superiore a 0,01 M o alla metà della concen ­
trazione di saturazione (cfr. allegato 1).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 891
 
1.8.3.  Soluzioni tampone  
Il saggio di idrolisi deve essere eseguito a valori di pH 4, 7 e 9. A tal 
fine occorre preparare soluzioni tampone utilizzando acqua e so ­
stanze chimiche di grado reagente. Nell'allegato 3 sono indicati al ­
cuni utili esempi di sistemi tampone. Occorre notare che il sistema 
tampone utilizzato può influenzare il grado di idrolisi; in tal caso occorre utilizzare un altro sistema tampone (
 1 ). 
Il pH di ciascuna soluzione tampone va verificato con un pH-metro 
tarato ad una precisione di almeno 0,1 alla temperatura richiesta.  
1.8.4.  Condizioni di prova  
1.8.4.1.  Temperatura  
Gli esperimenti di idrolisi devono essere effettuati a temperature 
costanti. A fini di estrapolazione è importante mantenere la varia ­
zione della temperatura entro ± 0,5  o C. 
Se il comportamento idrolitico della sostanza di prova è sconosciuto, 
occorre eseguire un saggio preliminare (fase 1) ad una temperatura di 
50 o C. I saggi cinetici di livello superiore devono essere eseguiti ad 
almeno tre temperature (compreso il saggio a 50  o C) a meno che il 
saggio di primo livello non abbia dimostrato la stabilità idrolitica della sostanza di prova. Si suggerisce un intervallo di temperature 
compreso tra 10
 o C e 70  o C (preferibilmente con almeno una tem ­
peratura inferiore a 25  o C), che deve includere la temperatura di 
riferimento di 25  o C e la maggior parte delle temperature registrate 
sul campo.  
1.8.4.2.  Illuminazione e ossigeno  
Tutti i saggi di idrolisi devono essere realizzati utilizzando metodi 
atti ad evitare effetti fotolitici. Occorre prendere tutte le misure op ­
portune per evitare la formazione di ossigeno (ad esempio facendo 
gorgogliare elio, azoto o argon per 5 minuti prima di preparare la soluzione).
 
1.8.4.3.  Durata del saggio  
Il saggio preliminare deve essere eseguito per 5 giorni mentre i saggi 
di livello superiore devono essere eseguiti fino a quando non è idrolizzato il 90 % della sostanza di prova o per 30 giorni, a seconda dell'ipotesi che si verifica per prima.
 
1.8.5.  Esecuzione del saggio  
1.8.5.1.  Saggio preliminare (fase 1)  
Il saggio preliminare è eseguito a 50 ± 0,5  o C e a valori di pH 4,0, 
7,0 e 9,0. Se dopo 5 giorni l'idrolisi è inferiore al 10 % (t0,5  25 oC > 
1 anno), la sostanza di prova è considerata idroliticamente stabile e 
non è necessario eseguire altri saggi. Se la sostanza di prova è notoriamente instabile a temperature rappresentative di quelle 
ambientali (
 2 ), non è necessario eseguire il saggio preliminare. Il 
metodo analitico deve essere sufficientemente preciso e sensibile da consentire di rilevare una riduzione del 10 % della concentrazione iniziale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 892  
( 1 ) Mabey e Mill raccomandano l'utilizzo di tamponi borati o acetati anziché di tamponi 
fosfati (11). 
( 2 ) Tali informazioni possono provenire da altre fonti: può trattarsi ad esempio di dati 
sull'idrolisi di composti strutturalmente affini ricavati dalla letteratura scientifica o di 
dati ottenuti da altri saggi preliminari semiquantitativi di idrolisi eseguiti sulla sostanza 
di prova ad uno stadio precedente di sviluppo.
 1.8.5.2.  Idrolisi di sostanze instabili (fase 2)  
Il saggio di livello superiore (avanzato) deve essere eseguito ai valori 
di pH ai quali la sostanza di prova è risultata instabile nel saggio preliminare. Le soluzioni tampone della sostanza di prova devono 
essere termostatizzate alle temperature selezionate. Per verificare se il 
comportamento cinetico è di primo ordine, ogni soluzione deve es ­
sere analizzata ad intervalli di tempo che permettano di ottenere almeno sei valori adeguatamente distanziati compresi in linea di 
principio tra il 10 % e il 90 % di idrolisi della sostanza di prova. 
Occorre prelevare singole repliche dei campioni (almeno due repli ­
che contenute in recipienti di reazione separati) e analizzare il loro 
contenuto in ciascuno dei sei tempi di campionamento (per un mi ­
nimo di dodici valori). Il ricorso ad un unico campione globale da cui prelevare singole aliquote della soluzione di prova in ciascun intervallo di campionamento si considera inadeguato, in quanto 
non consente l'analisi della variabilità dei dati e può comportare 
problemi di contaminazione della soluzione di prova. Al termine del saggio di livello superiore (ossia al raggiungimento del 90 % di idrolisi o trascorsi 30 giorni) occorre eseguire saggi di conferma 
della sterilità. Tuttavia, nel caso in cui non si osservi 
alcuna degradazione (ossia trasformazione), tali saggi non sono con ­
siderati necessari.
 
1.8.5.3.  Identificazione dei prodotti dell'idrolisi (fase 3)  
Occorre identificare con appositi metodi analitici tutti i principali 
prodotti dell'idrolisi, ossia almeno quelli che rappresentano una per ­
centuale uguale o superiore al 10 % della dose applicata.  
1.8.5.4.  Saggi facoltativi  
Per sostanze di prova idroliticamente instabili può essere necessario 
eseguire ulteriori saggi a valori di pH diversi da 4, 7 e 9. Ad esem ­
pio, a fini fisiologici può essere necessario effettuare un saggio in condizioni di maggiore acidità (ad es. pH 1,2) ad un'unica tempera ­
tura rilevante dal punto di vista fisiologico (37
 o C). 
2. DATI  
La quantità di sostanza di prova e, se necessario, dei prodotti del ­
l'idrolisi, deve essere espressa in percentuale della concentrazione iniziale applicata ed eventualmente in mg/L per ciascun intervallo 
di campionamento e per ogni pH e temperatura di prova. Nel caso in 
cui sia stata utilizzata una sostanza marcata occorre inoltre indicare il bilancio di massa, espresso in percentuale della concentrazione ini ­
ziale applicata.
 
Occorre fornire una rappresentazione grafica dei logaritmi delle con ­
centrazioni della sostanza di prova in funzione del tempo e identifi ­
care i principali prodotti dell'idrolisi, ossia almeno quelli che rap ­
presentano una percentuale uguale o superiore al 10 % della dose applicata. I logaritmi delle concentrazioni di tali prodotti devono 
essere rappresentati graficamente nella stessa maniera della sostanza 
madre per evidenziare i tassi di formazione e distruzione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 893
 
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
È possibile calcolare in modo più preciso il tempo di dimezzamento 
o i valori del DT  50 utilizzando adeguati modelli cinetici. Occorre 
indicare il tempo di dimezzamento e/o i valori del DT  50 (compresi 
i limiti di confidenza) per ciascun pH e ciascuna temperatura, in ­
sieme ad una descrizione del modello utilizzato, dell'ordine cinetico e del coefficiente di determinazione (r
 2 ). Se necessario, i calcoli de ­
vono essere applicati anche ai prodotti dell'idrolisi.  
Nel caso di studi sulla velocità di reazione effettuati a diverse tem ­
perature, le costanti di velocità di pseudo-primo ordine (k  obs ) del­
l'idrolisi devono essere descritte in funzione della temperatura. Il calcolo deve basarsi sulla scomposizione di k
 obs in costanti di velo ­
cità dell'idrolisi in catalisi acida, neutra e in catalisi basica (rispetti ­
vamente k  H , k neutral  , e k  OH ) e sull'equazione di Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i¼H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
dove A  i e B  i sono le costanti di regressione, rispettivamente dall'in ­
tercetta e dalla pendenza, delle rette di  best fit  ottenute dalla regres ­
sione lineare di ln k  i rispetto all'inverso della temperatura assoluta 
espressa in Kelvin (T). Applicando le relazioni di Arrhenius all'idro ­
lisi catalizzata da acidi, neutra e catalizzata da basi, è possibile calcolare le costanti di velocità di pseudo-primo ordine, e di conse ­
guenza i tempi di dimezzamento relativi ad altre temperature per le 
quali non è possibile una determinazione sperimentale diretta della 
costante di velocità (10).
 
2.2. VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
La maggior parte delle reazioni di idrolisi segue un'apparente cinetica 
di primo ordine e quindi i tempi di dimezzamento sono indipendenti 
dalla concentrazione (cfr. equazione 4 nell'allegato 2). Ciò consente 
generalmente di applicare alle condizioni ambientali (concentrazioni ≤ 10
 -6 M) i risultati di laboratorio determinati a concentrazioni tra 
10 -2 e 10  -3 M (10). Mabey e Mill (11) hanno indicato diversi esempi 
di buona corrispondenza tra la velocità di idrolisi di varie sostanze 
chimiche misurata in acque pure e in acque naturali, a condizione che siano stati misurati sia il pH che la temperatura.
 
3. RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL SAGGIO  
3.1. RAPPORTO DI PROVA  
Il rapporto di prova deve contenere almeno le seguenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— denominazione comune, nome chimico, numero CAS, formula di 
struttura (se si utilizza materiale radiomercato occorre indicare la posizione della marcatura) e relative proprietà fisico-chimiche (cfr. punto 1.5);
 
— purezza (impurità) della sostanza di prova;  
— purezza radiochimica della sostanza marcata e attività molare (nei 
casi opportuni).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 894
 
Soluzioni tampone:  
— date e dettagli della preparazione;  
— tamponi e acqua utilizzati;  
— molarità e pH delle soluzioni tampone.  
Condizioni di prova:  
— date di esecuzione degli esperimenti;  
— quantità di sostanza di prova applicata;  
— metodo e solventi (tipo e quantità) utilizzati per l'applicazione 
della sostanza di prova;  
— volume delle soluzioni tampone trattate con la sostanza di prova 
incubate;  
— descrizione del sistema di incubazione utilizzato;  
— pH e temperatura durante l'esperimento;  
— tempi di campionamento;  
— metodo(i) di estrazione;  
— metodi utilizzati per la quantificazione e l'identificazione della 
sostanza di prova e dei prodotti della relativa idrolisi nelle solu ­
zioni tampone;  
— numero di repliche dei campioni.  
Risultati:  
— ripetibilità e sensibilità dei metodi di analisi utilizzati;  
— recuperi (al punto 1.7.1 sono indicati i valori percentuali neces ­
sari per la validità dello studio);  
— dati e medie delle repliche dei campioni, sotto forma di tabelle;  
— bilancio di massa nel corso e al termine degli studi (in caso di 
utilizzo di sostanze di prova marcate);  
— risultati del saggio preliminare;  
— discussione e interpretazione dei risultati;  
— tutti i dati e i valori originari.  
Le seguenti informazioni sono necessarie soltanto quando si deter ­
mina la velocità di idrolisi:  
— rappresentazione grafica delle concentrazioni delle sostanze di 
prova (ed eventualmente dei prodotti dell'idrolisi) in funzione 
del tempo per ciascun pH e ciascuna temperatura;  
— tabelle dei risultati dell'equazione di Arrhenius per una tempera ­
tura di 20  o C/25  o C, specificando il pH, la costante di velocità 
[h -1 o g  -1 ], il tempo di dimezzamento o il DT  50 , le temperature 
[espresse in  o C], compresi i limiti di confidenza e i coefficienti di 
correlazione (r  2 ) o altre informazioni analoghe;  
— meccanismo di idrolisi proposto.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 895
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OCSE (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adottata il 12 maggio 1981.
 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Direttiva 95/36/CE della Commissione, del 14 luglio 1995, che 
modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio relativa all’im ­
missione in commercio dei prodotti fitosanitari. Allegato V: 
destino e comportamento nell'ambiente.  
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (otto ­
bre 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides (a cura di Mark R. Lynch).  
(8) OCSE (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment Nr. 23.  
(9) OCSE (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Parigi. 
OCSE (1994 — 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(10) Nelson, H., Laskowski D., Thermes S. e Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models (versione scritta della relazione presentata alla 14
 a riunione annuale della Society 
of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas, novem ­
bre 1993).  
(11) Mabey, W., Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of 
organic compounds in water under environmental conditions, J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 896
 
ALLEGATO 1  
Schema delle fasi del saggio di idrolisi
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 897
 
ALLEGATO 2  
Definizioni e unità di misura  
Le unità di misura del sistema internazionale (SI)  dovrebbero essere utilizzate 
in ogni caso.  
Sostanza di prova:  qualsiasi sostanza (sia il composto originale che i relativi 
prodotti di trasformazione).  
Prodotti di trasformazione:  tutte le sostanze derivanti da reazioni di trasforma ­
zione biotica o abiotica della sostanza di prova.  
Prodotti dell'idrolisi:  tutte le sostanze derivanti da reazioni di trasformazione 
idrolitica della sostanza di prova.  
Idrolisi:  reazione di una sostanza RX con l'acqua, con scambio netto del gruppo 
X con OH al centro della reazione: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
La velocità di riduzione della concentrazione di RX in questo processo sempli ­
ficato è data da: 
velocità = k [H  2 O] [RX] reazione di secondo ordine 
o 
velocità = k [RX] reazione di primo ordine  
a seconda dello stadio cineticamente determinante. Poiché l'acqua è presente in 
forte eccesso rispetto alla sostanza di prova, questo tipo di reazione è normal ­
mente descritto come «reazione di pseudo-primo ordine», e la costante di velocità osservata è data dalla relazione 
k
 obs = k [H  2 O] [2]  
e può essere ricavata dall'espressione  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
dove  
t = tempo  
e C  o , C t = concentrazioni di RX al tempo 0 e al tempo t.  
Le unità di questa costante hanno dimensioni di (tempo)  -1 e il tempo di dimez ­
zamento (tempo necessario per ottenere una reazione del 50 % di RX) è dato da  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Tempo di dimezzamento:  (t 0,5 ) è il tempo necessario per l'idrolisi del 50 % della 
sostanza di prova quando la reazione può essere descritta mediante una cinetica 
di primo ordine; è indipendente dalla concentrazione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 898
 
DT 50 (Disappearance Time 50):  tempo entro cui la concentrazione della so ­
stanza di prova si riduce del 50 %; è diverso dal tempo di dimezzamento t  0,5 
quando la reazione non segue una cinetica di primo ordine.  
Stima di k a diverse temperature  
Se sono note le costanti di velocità per due temperature, è possibile calcolare le 
costanti di velocità ad altre temperature utilizzando l'equazione di Arrhenius:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T o ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
La rappresentazione grafica di ln k rispetto ad 1/T è una linea retta con 
pendenza -E/R  
in cui:  
k = costante di velocità misurata a diverse temperature  
E = energia di attivazione [kJ/mol]  
T = temperatura assoluta [K]  
R = costante universale dei gas [8,314 J/mol.K]  
L'energia di attivazione è stata calcolata mediante analisi di regressione o tramite 
la seguente equazione:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 Í 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Î 
in cui: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 899
 
ALLEGATO 3  
Sistemi tampone  
A. CLARK E LUBS:  
Miscele tampone di CLARK e LUBS  (*) 
Composizione pH  
0,2 N HCl e 0,2 N KCl a 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 1,4 13,15 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 1,8 5,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl dil. a 100 ml 2,2  
0,1 M ftalato acido di potassio + 0,1 N HCl a 20
 o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 3,4 5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalato acido a 100 ml 3,8  
0,1 M ftalato acido di potassio + 0,1 N NaOH a 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 900  
(*) I valori del pH riportati in queste tabelle sono stati calcolati a partire da misure del potenziale, utilizzando le 
equazioni standard di Sörensen (1909). I valori effettivi del pH sono superiori di 0,04 unità rispetto ai valori 
indicati nelle tabelle.
 Composizione pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato acido a 100 ml 6,0
 
Miscele tampone di CLARK e LUBS (segue) 
0,1 M fosfato monopotassico + 0,1 N NaOH a 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato a 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 B0 3 in 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH a 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 901
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml acido borico a 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF E VLEESCHHOUWER:  
Tamponi citrato di KOLTHOFF e VLEESCHHOUWER  ( 1 ) 
Composizione pH  
0,1 M citrato monopotassico e 0,1 N HCl a 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 2,6 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrato a 100 ml 3,6  
0,1 M citrato monopotassico e 0,1 N NaOH a 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 4,4 
31,5 ml 0,1 NNaOH + 50 ml citrato a 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 5,4 68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato a 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 902  
( 1 ) Aggiungere qualche piccolo cristallo di timolo o altra sostanza simile per prevenire la 
formazione di muffe.
 C. SÖRENSEN:  
Miscele di borati di SÖRENSEN  
Composizione 
Sörensen 
18 o C Walbum, pH a 
ml di borace ml di HCl/ 
NaOH 10 o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borace + 0,1 NHCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 
7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 
7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borace + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Miscele di fosfati di SÖRENSEN  
Composizione pH  
0,0667 M fosfato monopotassico + 0,0667 M fosfato disodico a 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 903
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 904
 
C.8 TOSSICITÀ PER I LOMBRICHI  
SAGGIO SU TERRENO ARTIFICIALE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
In questo saggio di laboratorio la sostanza in esame viene aggiunta 
ad un terreno artificiale dove si pongono i lombrichi per quattordici giorni. Dopo tale periodo (facoltativamente dopo sette giorni) si esamina l'effetto letale della sostanza sui lombrichi. Il saggio fornisce 
un metodo di valutazione, a termine relativamente breve, dell'effetto 
sui lombrichi di sostanze chimiche assunte per via cutanea e alimen ­
tare.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
LC 50 : concentrazione di una sostanza capace di uccidere il 
50 % degli animali in esame entro il periodo del saggio.  
1.3. Sostanza di riferimento  
Una sostanza di riferimento viene usata periodicamente per dimo ­
strare che la sensibilità del sistema (di saggio) non è cambiata in 
modo significativo.  
Come sostanza di riferimento si raccomanda cloroacetammide di 
grado analitico.  
1.4. Principio del saggio  
Il terreno è un elemento variabile; si usa pertanto, per questo saggio, 
un terreno fertile artificiale definito accuratamente. Lombrichi adulti della specie  Eisenia foetida  (vedi nota in appendice) vengono tenuti 
in un determinato terreno artificiale, trattato con diverse concentra ­
zioni della sostanza in esame. Quattordici giorni (facoltativamente 
sette giorni) dopo l'inizio della prova, si sparge il contenuto dei recipienti su un vassoio e per ciascuna concentrazione si contano i lombrichi sopravvissuti.
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Il saggio è programmato in modo da essere il più possibile riprodu ­
cibile per quanto concerne il substrato e gli organismi in esame. Alla 
fine del saggio, la mortalità fra gli animali di controllo non deve 
superare il 10 %, altrimenti la prova non è valida.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Materiali  
1.6.1.1. S u b s t r a t o p e r i l s a g g i o  
Come substrato di base per il saggio si usa un ben determinato 
terreno artificiale.  
a) Substrato di base (percentuali espresse in peso secco)  
— ►C1 10 % di torba di sfagno (con pH più vicino possibile a 
5,5-6,0, priva di residui visibili di piante e finemente maci ­
nata) ◄; ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 905
 
— 20 % di argilla caolinica preferibilmente con più del 50 % di 
caolinite;  
— circa 69 % di sabbia quarzosa industriale (sabbia a grana 
prevalentemente fine con oltre il 50 % dei granuli di dimen ­
sioni comprese fra 0,05 e 0,2 mm). Qualora la sostanza in esame non possa essere sufficientemente dispersa in acqua, 
per ogni recipiente (di saggio) andrebbero messi da parte 10 g 
di tale sabbia da mescolare successivamente con la sostanza stessa;
 
— circa 1 % di carbonato di calcio (CaCO  3 ) in polvere, chimi ­
camente puro, aggiunto per portare il pH a 6,0 ± 0,5,  
b) Substrato per il saggio  
Il substrato per il saggio contiene i! substrato di base, la sostanza 
in esame e acqua deionizzata.  
Il contenuto in acqua è circa dal 25 al 42 % del peso secco del 
substrato di base. Il contenuto in acqua del substrato si determina per essiccamento di un campione fino a peso costante, a 105
 o C. 
II criterio base è che il terreno artificiale deve essere addizionato 
con acqua fino al punto in cui non vi sia acqua stagnante. Nel 
mescolare si dovrebbe fare attenzione ad ottenere una distribu ­
zione uniforme della sostanza in esame e del substrato. Il proce ­
dimento seguito per addizionare la sostanza in esame al substrato 
deve essere riportato.  
c) Substrato di controllo  
Il substrato di controllo contiene il substrato di base e l'acqua. Se 
si usa un additivo, un ulteriore controllo dovrebbe contenere la stessa quantità di additivo.
 
1.6.1.2. R e c i p i e n t i p e r i l s a g g i o  
Recipienti di vetro della capacità di circa un litro (adeguatamente 
coperti con coperchi di plastica, piatti o con una pellicola di plastica muniti di fori di ventilazione) vengono riempiti, sia per il saggio che 
per il controllo, con una quantità di substrato umido equivalente a 
500 g di peso secco di substrato.
 
1.6.2.  Condizioni della prova  
I recipienti dovrebbero essere tenuti in camere climatizzate a 20  o C 
(± 2  o C) ed illuminate in continuazione. L'intensità luminosa do ­
vrebbe essere compressa fra 400 e 800 lux.  
La durata della prova è di quattordici giorni, ma è facoltativo fare 
una prima determinazione della mortalità a sette giorni dall'inizio del 
saggio.  
1.6.3.  Procedimento del saggio  
C o n c e n t r a z i o n i d e l s a g g i o  
Le concentrazioni della sostanza in esame sono espresse in peso 
della sostanza per peso secco del substrato di base (mg/kg):  
S a g g i o o r i e n t a t i v o  
L'intervallo delle concentrazioni che causano una mortalità variabile 
fra lo 0 ed il 100 % può essere determinato con un saggio orientativo 
che fornisca informazioni sull'intervallo di concentrazioni da impie ­
gare nel saggio definitivo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 906
 
Si dovrebbe esaminare la sostanza alle seguenti concentrazioni: 
1 000, 100, 10, 1, 0,1 mg di sostanza/kg di substrato in esame (peso 
secco).  
Se si deve effettuare un saggio definitivo completo, per ogni prova 
orientativa e per il controllo non trattato, potrebbe essere sufficiente 
un gruppo di dieci lombrichi per ciascuna concentrazione.  
S a g g i o d e f i n i t i v o  
I risultati del saggio orientativo vengono impiegati per scegliere 
almeno 5 concentrazioni in serie geometrica, che causino una mor ­
talità variabile fra lo 0 ed il 100 % e che differiscano fra loro per un fattore costante non superiore a 1,8.
 
Con questa serie di concentrazioni, il saggio dovrebbe consentire una 
stima la più precisa possibile del valore della LC  50 e dei suoi limiti 
di confidenza.  
Nella prova definitiva si usano almeno quattro gruppi di saggio per 
concentrazione e quattro per controlli non trattati, ciascuno con dieci lombrichi. I risultati ottenuti con questi gruppi saggiati in replicato 
vengono espressi con il valore medio e con la deviazione standard 
relativa.
 
Quando due concentrazioni consecutive, nel rapporto 1,8, danno una 
mortalità pari allo 0 ed al 100 %, questi due valori sono sufficienti 
ad indicare l'intervallo entro il quale è compresa la LC  50 . 
M i s c e l a d e l s u b s t r a t o d i b a s e p e r i l s a g g i o e 
d e l l a s o s t a n z a i n e s a m e  
Se possibile, il substrato per il saggio dovrebbe essere preparato 
senza alcun additivo che non sia acqua. Subito prima dell'inizio 
del saggio, si mescola con il substrato di base, oppure vi si sparge 
sopra uniformemente, con uno spruzzatore da cromatografia o dispo ­
sitivo similare, un'emulsione o dispersione in acqua deionizzata o in altro solvente della sostanza da esaminare.
 
Se insolubile in acqua, la sostanza in esame può essere disciolta nel 
minor volume possibile di un idoneo solvente organico (per esempio esano, acetone, cloroformio).
 
Per solubilizzare, disperdere o emulsionare la sostanza in esame, si 
possono impiegare soltanto agenti che volatilizzano rapidamente. Prima dell'uso occorre ventilare il substrato per il saggio. Si deve aggiungere una quantità di acqua pari a quella evaporata. Il controllo 
dovrebbe contenere la stessa quantità di tutti gli additivi.
 
Se la sostanza in esame non è solubile, disperdibile o emulsionabile 
in solventi organici, 10 g di una miscela costituita da sabbia fine 
quarzosa e dalla quantità di sostanza in esame necessaria per trattare 
500 g di peso secco di terreno artificiale, vengono mescolate con 490 g di peso secco del substrato per il saggio.
 
Per ciascun gruppo di saggio, si riempie ogni recipiente di vetro con 
una quantità di substrato umido equivalente a 500 g di peso secco, e sulla superficie del substrato si collocano 10 lombrichi precedente ­
mente condizionati per 24 ore in un simile substrato umido e quindi 
lavati rapidamente ed asciugati dell'acqua in eccesso per assorbi ­
mento su carta da filtro.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 907
 
I recipienti vengono coperti con coperchi, piatti o pellicole di plastica 
perforati per impedire l'essiccamento del substrato e sono mantenuti 
nelle condizioni sperimentali per quattordici giorni.  
Le valutazioni andrebbero effettuate quattordici giorni (facoltativa ­
mente sette giorni) dopo l'inizio del saggio. Si sparge il substrato su un piatto di vetro o di acciaio inossidabile. Si esaminano i lombrichi 
e si determina il numero di quelli sopravvissuti. I lombrichi sono 
considerati morti se non reagiscono ad un leggero stimolo meccanico sull'estremità anteriore.
 
Se l'esame è effettuato dopo sette giorni, il recipiente è riempito di 
nuovo con lo stesso substrato ed i lombrichi sopravvissuti vengono 
collocati sulla sua superficie.  
1.6.4.  Organismi per il saggio  
Gli organismi per il saggio dovrebbero essere individui adulti di  
Eisenia foetida  (vedi la nota dell'allegato) (di almeno due mesi con 
clitella) del peso umido di 300-600 mg. (Per il metodo di alleva ­
mento vedi allegato).  
2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO E VALUTAZIONE DEI RISULTATI  
Si riportano le concentrazioni della sostanza esaminata con le rispet ­
tive percentuali di lombrichi morti.  
Quando i dati sono affidabili si dovrebbero determinare il valore 
della LC  50 e i limiti di confidenza (P = 0,05) utilizzando metodi 
standard (Litchfield e Wilcoxon, 1949 o un metodo equivalente). Il 
valore della LC  50 dovrebbe essere espresso in mg di sostanza in 
esame per kg di substrato per il saggio (peso secco).  
Nei casi in cui la pendenza della curva di concentrazione sia troppo 
elevata per consentire il calcolo della LC  50 , è sufficiente una stima 
grafica di tale valore.  
Quando due concentrazioni consecutive, nel rapporto di 1,8, danno 
mortalità pari allo 0 % ed al 100 %, questi due valori sono sufficienti 
per indicare l'intervallo entro il quale è situata la LC  50 . 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— la dichiarazione che la prova è stata eseguita conformemente ai 
criteri di qualità sopra riportati,  
— il saggio effettuato (saggio orientativo e/o saggio definitivo),  
— l'esatta descrizione delle condizioni in cui è stato effettuato il 
saggio o la dichiarazione che il saggio è stato condotto confor ­
memente al metodo; qualsiasi modifica del procedimento deve essere riportata,
 
— l'esatta descrizione del procedimento seguito per mescolare la 
sostanza in esame con il substrato di base,  
— informazioni sugli organismi impiegati per il saggio (specie, età, 
media ed intervallo di variazione del peso, condizioni di mante ­
nimento e di allevamento fornitore),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 908
 
— il metodo seguito per la determinazione della LC  50 , 
— i risultati del saggio comprensivi di tutti i dati utilizzati,  
— la descrizione dei sintomi e dei cambiamenti osservati nel 
comportamento degli organismi per il saggio,  
— la mortalità nei controlli,  
— la LC  50 oppure la più elevata concentrazione saggiata che non 
provoca mortalità e la più bassa concentrazione saggiata che provoca il 100 % di mortalità, a quattordici giorni (facoltativa ­
mente a sette giorni) dopo l'inizio della prova,
 
— il grafico della curva concentrazione/risposta,  
— i risultati ottenuti con la sostanza di riferimento, specificando se 
siano stati ottenuti in associazione con il saggio in questione o da precedenti saggi di controllo di qualità.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OCSE, Parigi 1981,  Linea Guida 207,  decisione C(81) 30 def. 
del Consiglio.  
(2) Edwards, C. A. e Lofty, 1977,  Biology of Earthworms,  Londra: 
Chapman and Hall, 331 pagine.  
(3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de Frante, Ecologie et 
Systématique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 
671 pagine.  
(4) Litchfield, J. T. e Wilcoxon, F., A simplified method of eva ­
luating dose-effect experiments.  ]. Pharm. Exp. Therap.,  vol.  
96, pagine  99. 
(5) Commissione delle Comunità europee 1983,  Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms.  Report EUR 8714 EN.  
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlino 1984, Verfahrensvorschlag «Toxizität ­
stest am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden», 
in: Rudolph/Boje: Ö kotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 909
 
Appendice  
Allevamento e mantenimento dei lombrichi prima del saggio  
Per l'allevamento si pongono gli animali, da 30 a 50 lombrichi adulti, in una 
scatola di allevamento con substrato fresco e si rimuovono dopo 14 giorni. Questi animali possono essere utilizzati per ulteriori gruppi di allevamento. I 
lombrichi nati dalle zooteche vengono impiegati per i saggi quando sono maturi 
(nelle condizioni prescritte, dopo 2-3 mesi).
 
Condizioni di allevamento e mantenimento  
Camera climatizzata: temperatura di 20  o C (± 2  o C), di preferenza illuminata 
ininterrottamente (intensità da 400 a 800 lux).  
Scatole di allevamento: idonei contenitori poco profondi del volume da 10 a 20 
litri. 
Substrato:  Eisenia foetida  può essere allevata in diversi escrementi 
animali. Come terreno per l'allevamento si raccomanda 
l'uso di una miscela costituita dal 50 % in volume di 
torba e dal 50 % di sterco di mucca o di cavallo. Il terreno dovrebbe avere un pH di circa 6-7 (corretto 
con carbonato di calcio) ed una bassa conduttività ionica 
(meno di 6 mmhos o 0,5 % di concentrazione salina).
 
Il substrato dovrebbe essere umido ma non troppo ba ­
gnato.  
Oltre al metodo sopra esposto si possono impiegare con 
buoni risultati anche altri procedimenti.  
Nota:  Esistono due varietà di  Eisenia foetida  che alcuni tassonomi hanno sepa ­
rato in specie (Bouché, 1972). Queste sono morfologicamente simili ma una, la  
Eisenia foetida foetida , ha delle tipiche strisce o fasce trasversali sui segmenti 
mentre l'altra, la  Eisenia foetida andrei , ne è priva ed ha un colore rossiccio 
screziato. Ove possibile si dovrebbe usare la  Eisenia foetida andrei . Se è dispo ­
nibile la metodologia necessaria, si possono usare altre specie.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 910
 
C.9 BIODEGRADAZIONE  
ZAHN-WELLENS TEST  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Il metodo è destinato a valutare la potenziale biodegradabilità 
ultima (  1 ) delle sostanze organiche idrosolubili e non volatili: esposte 
a concentrazioni relativamente elevate di microorganismi nel corso di un saggio statico.
 
Può verificarsi un assorbimento chimico-fisico della sostanza in 
esame sui solidi sospesi; di ciò si dovrà tener conto nell'interpretare 
i risultati (vedi punto 3.2),  
Le sostanze da studiare vengono impiegate a concentrazioni corri ­
spondenti a valori del DOC compresi fra 50 e 400 mg/l o a valori del 
COD compresi fra 100 e 1 000 mg/l (DOC = carbonio organico disciolto; COD = domanda chimica di ossigeno). Dette concentra ­
zioni, relativamente elevate, hanno il vantaggio dell'attendibilità ana ­
litica. I composti dotati di proprietà tossiche possono ritardare o 
inibire il processo di degradazione.
 
In questo metodo, la misura della concentrazione del carbonio orga ­
nico disciolto o la richiesta chimica di ossigeno vengono impiegate 
per valutare la biodegradazione ultima della sostanza in esame.  
L'impiego simultaneo di un metodo di analisi specifico può permet ­
tere di valutare la biodegradazione primaria della sostanza (modifica della struttura chimica della sostanza in esame).
 
Il metodo può essere applicato soltanto all'esame di quelle sostanze 
organiche le quali, alle concentrazioni impiegate per la prova:  
— sono solubili in acqua nelle condizioni sperimentali;  
— hanno una tensione di vapore trascurabile nelle condizioni speri ­
mentali;  
— non esercitano effetti inibitori sui batteri;  
— sono assorbite soltanto in misura limitata nel sistema sperimen ­
tale; 
— non vanno perdute per effetto della formazione di schiume nella 
soluzione in esame.  
La disponibilità di dati sulle proporzioni relative dei principali com ­
ponenti del materiale da esaminare sarà utile per interpretare i risul ­
tati, particolarmente nei casi in cui i risultati sono bassi o trascurabili.  
Per poter interpretare i risultati più bassi e per poter scegliere le 
opportune concentrazioni sperimentali sarà altresì utile disporre di dati sulla tossicità della sostanza nei confronti dei microorganismi.
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( 1 ) I termini «ultima» e «primaria», riferiti alla biodegradazione, sono traduzioni dei termini 
inglesi «ultimate» e «primary», rispettivamente.
 1.2. DEFINIZIONI ED UNITÀ  
Il livello di degradazione raggiunto alla fine dell'esperimento, deno ­
minato «biodegradabilità nel Zahn-Wellens Test», è dato dall'espres ­
sione:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
D T = biodegradazione (%) al tempo T  
C A = valori del DOC (o del COD) della miscela in esame, 
espressi in mg/l e misurati tre ore dopo l'inizio della 
prova (DOC = carbonio organico disciolto, COD = domanda chimica di ossigeno)
 
C T = valori del DOC o del COD nella miscela in esame al 
momento del prelievo (mg/l)  
C B = valori del DOC o del COD relativi al «bianco» al 
momento del prelievo (mg/l)  
C BA = valori del DOC o del COD del «bianco», misurati tre 
ore dopo l'inizio della prova (mg/l)  
L'entità della degradazione dev'essere arrotondata all'unità percentuale.  
La degradazione percentuale si esprime come eliminazione percen ­
tuale del DOC (o del COD) della sostanza sperimentata.  
La differenza tra il valore misurato dopo tre ore e il valore calcolato, 
o preferibilmente misurato inizialmente, può fornire informazioni 
utili in merito all'eliminazione della sostanza (vedi punto 3.2: «Inter ­
pretazione dei risultati»).  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
In taluni casi, quando vengono studiate sostanze nuove, può essere 
utile l'impiego di sostanze di riferimento. Tuttavia, non possono 
ancora essere raccomandate specifiche sostanze di riferimento.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
In un recipiente di vetro da 1 a 4 litri, provvisto di agitatore e 
aereatore, vengono introdotti contemporaneamente il fango attivo, 
le sostanze nutritive minerali e il materiale da esaminare, quale unica fonte di carbonio, in soluzione acquosa. La miscela viene agitata ed 
aereata alla temperatura di 20-25
 o C, sotto illuminazione diffusa o in 
camera oscura, per la durata massima di 28 giorni. Il processo di degradazione viene seguito mediante determinazione dei valori del COD o del DOC nella soluzione filtrata, eseguita giornalmente 
o comunque ad intervalli appropriati e regolari. Il rapporto fra il 
DOC (o il COD) eliminato dopo ciascun intervallo ed il valore a tre ore dall'inizio viene espresso come biodegradazione percentuale e serve per misurare l'entità della degradazione in quel momento. Dia ­
grammando tale valore in funzione del tempo si costruisce la curva 
di biodegradazione.
 
Impiegando un metodo analitico specifico è possibile misurare le 
variazioni di concentrazione della sostanza in esame dovute alla 
biodegradazione (biodegradabilità primaria).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 912
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
Prove d'intercalibrazione tra laboratori hanno dimostrato che la ri ­
producibilità di questo metodo è soddisfacente.  
La sensibilità del metodo è determinata principalmente dalla varia ­
bilità del «bianco» e, in misura minore, dalla precisione con cui è possibile determinare il carbonio organico disciolto e la quantità del 
composto da esaminare contenuto nel mezzo.
 
1.6 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Preparazioni  
1.6.1.1. R e a t t i v i  
Acqua per il saggio: acqua potabile a contenuto di carbonio organico 
inferiore a 5 mg/l. La concentrazione globale degli ioni calcio e magnesio non deve superare 2,7 mmol/l; in caso contrario sarà ne ­
cessaria un'opportuna diluizione con acqua deionizzata o distillata 
Acido solforico, p.a., 50 g/l 
Soluzione di idrossido di sodio, p.a., 40 g/l Soluzione nutritiva minerale: sciogliere in 1 litro d'acqua 
deionizzata: 
cloruroammonico, NH
 4 Cl, p.a. 38,5 g 
ortofosfato monosodico diidrato NaH  3 PO4.2H  2 O, p.a. 33,4 g, 
ortofosfato monopotassico, KH  2 PO 4 , p.a. 8,5 g, 
ortofosfato dipotassico, K  2 HPO  4 . p.a. 21,75 g.  
La miscela serve contemporaneamente da sostanza nutritiva e da 
tampone.  
1.6.1.2. A p p a r e c c h i a t u r a  
Recipienti cilindrici di vetro, del volume da 1 a 4 litri  
Dispositivo di agitazione. L'agitatore vero e proprio, di vetro o me ­
tallo, dev'essere sostenuto da un albero adatto e deve girare a 5- 
10 cm circa dal fondo del recipiente. Si può anche impiegare un 
agitatore magnetico, con barretta da 7 a 10 cm di lunghezza  
Tubo di vetro, del diametro interno di 2-4 mm, per l'introduzione 
dell'aria. L'apertura del tubo deve trovarsi a 1 cm circa sopra il fondo del recipiente
 
Centrifuga (3 550 giri circa)  
pH-metro  
Misuratore dell'ossigeno disciolto  
Filtri di carta  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 913
 
Apparecchiatura per filtrazione su membrana  
Filtri a membrana, porosità 0,45 μm. I filtri a membrana sono adatti 
solo a condizione che non cedano carbonio organico e non assorbano 
la sostanza durante la filtrazione  
Apparecchiatura analitica per la determinazione del contenuto in 
carbonio organico e della domanda chimica di ossigeno  
1.6.1.3. P r e p a r a z i o n e d e l l ' i n o c u l o  
Lavare il fango attivo proveniente da un impianto di trattamento 
biologico centrifugando o lasciando sedimentare ripetutamente con l'acqua per il saggio (vedi sopra).
 
I! fango attivo deve trovarsi in idonee condizioni. Esso può essere 
prelevato da un impianto di trattamento di acque di scarico in buone 
condizioni di funzionamento. Per ottenere il maggior numero possi ­
bile di specie o ceppi differenti di batteri è preferibile mescolare gli inoculi provenienti da varie fonti (per esempio: vari impianti di 
trattamento, estratti di suoli, acque di fiume, ecc). La miscela deve 
essere trattata come descritto sopra.
 
Per controllare l'attività del fango attivo vedi oltre il paragrafo «Con ­
trollo funzionale».  
1.6.1.4. P r e p a r a z i o n e d e l l e s o l u z i o n i d a e s a m i n a r e  
Nel recipiente per il saggio, introdurre 500 ml dell'acqua per il 
saggio, insieme alla soluzione nutritiva minerale in quantità pari a 
2,5 ml/l e al fango attivo in quantità corrisponderne a 0,2-1,0 g/l di 
materiale secco nella miscela finale. Aggiungere la soluzione madre della sostanza da esaminare in quantità tale da ottenere un DOC da 50 a 400 mg/l nella miscela finale. I corrispondenti valori del COD 
saranno da 100 a 1 000 mg/l. Portare con l'acqua di cui sopra al 
volume totale da 1 a 4 litri. Il volume totale da scegliere dipende dal numero dei campioni da prelevare per le determinazioni del DOC o del COD, nonché dai volumi necessari per il procedimento analitico.
 
Normalmente, un volume di 2 litri può essere considerato soddisfa ­
cente. Per ciascuna serie di saggi va preparato almeno un recipiente 
di controllo (bianco): esso deve contenere soltanto il fango attivo e la soluzione nutritiva minerale portata allo stesso volume totale dei recipienti per il saggio.
 
1.6.2.  Esecuzione del saggio  
Si agita il contenuto dei recipienti per il saggio con agitatori ma ­
gnetici od a spirale, sotto illuminazione diffusa o in camera oscura e 
alla temperatura di 20-25  o C. L'aerazione dev'essere ottenuta insuf ­
flando aria compressa purificata facendola passare attraverso un tam ­
pone di cotone e, se necessario, una bottiglia di lavaggio. Si farà in modo che il fango non si depositi e che la concentrazione dell'ossi ­
geno non scenda al di sotto di 2 mg/l.
 
Il valore del pH deve essere controllato ad intervalli regolari (ad 
esempio quotidianamente) e regolato se necessario sul valore di 7-8.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 914
 
Le perdite dovute all'evaporazione andranno compensate immediata ­
mente prima di ogni prelievo aggiungendo acqua deionizzata o di ­
stillata nelle quantità richieste. Sarà particolarmente utile segnare il livello del liquido sul recipiente prima di avviare la prova. Dopo ogni campionamento (in assenza di aerazione e agitazione} si appor ­
ranno nuovi contrassegni. I primi campioni dovranno sempre essere 
prelevati tre ore dopo l'inizio della prova per verificare se ha luogo un assorbimento del materiale in esame da parte del fango attivo.
 
L'eliminazione della sostanza in esame dev'essere seguita mediante 
determinazioni del DOC e del COD, effettuate quotidianamente o ad intervalli comunque regolari. I campioni prelevati dal recipiente di 
saggio e dal «bianco» devono essere filtrati su carta accuratamente 
lavata. I primi 5 ml del filtrato della soluzione devono essere scartati. I fanghi difficilmente filtrabili possono essere eliminati in precedenza centrifugando per 10 minuti. Le determinazioni del COD e del DOC 
devono essere effettuate almeno in doppio. L'esperimento deve pro ­
seguire per la durata di 28 giorni.
 
Nota:  I campioni che rimangono torbidi devono essere filtrati attra ­
verso filtri a membrana, Questi ultimi non devono cedere od assor ­
bire materiale organico.  
C o n t r o l l o f u n z i o n a l e d e l f a n g o a t t i v o  
In parallelo a ciascuna serie di esperimenti, deve essere saggiata una 
sostanza nota, destinata a controllare la capacità funzionale del fango 
attivo. A questo scopo si è mostrato utile il glicoldietilenico.  
A d a t t a m e n t o  
Qualora si eseguano analisi ad intervalli relativamente brevi (ad 
esempio quotidianamente}, l'adattamento può essere chiaramente controllato dalla curva di degradazione (vedi figura 2). Il saggio, 
pertanto, non deve essere avviato immediatamente prima dell'inter ­
ruzione di fine settimana.
 
Qualora l'adattamento si verifichi verso la fine del periodo di saggio, 
il saggio stesso può essere prolungato fino al momento in cui la degradazione è terminata.
 
Nota:  Se è necessaria una conoscenza più vasta del comportamento 
dei fanghi adattati, lo stesso fango attivo deve essere posto nuova ­
mente a contatto con lo stesso materiale di prova, procedendo come 
segue:  
arrestare l'agitatore e l'aeratore e lasciar sedimentare il fango attivo; 
eliminare il surnatante, riempire fino a 2 litri con acqua per il saggio, agitare per 15 minuti e lasciare nuovamente sedimentare; eliminare nuovamente il surnatante e impiegare il fango rimanente per ripetere 
il saggio con gli stessi materiali conformemente a quanto indicato ai 
precedenti punti 1.6.1.4 e 1.6.2. Il fango attivo può essere isolato anche per centrifugazione anziché per sedimentazione.
 
Il fango adattato può essere mescolato con fango fresco, fino ad una 
quantità totale di 0,2-1 g di sostanza secca per litro.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 915
 
M e z z i a n a l i t i c i  
Normalmente i campioni vengono filtrati attraverso un filtro di carta 
accuratamente lavato (per il lavaggio, impiegare acqua deionizzata).  
I campioni che restano torbidi devono essere filtrati con filtri a 
membrana (0,45 μm). 
La concentrazione del DOC dev'essere determinata in doppio sul 
campione filtrato (scartando i primi 5 ml) con apparecchiatura per 
la determinazione del TOC. Se il filtrato non può essere analizzato lo stesso giorno, esso va conservato in frigorifero fino al giorno suc ­
cessivo. Una conservazione più lunga non è da raccomandarsi:
 
La concentrazione del COD va determinata sul campione filtrato con 
il procedimento analitico descritto nel riferimento bibliografico (2).  
2. DATI E VALUTAZIONE  
Le concentrazioni del DOC e del COD devono essere determinate 
almeno in doppio in ogni campione secondo quanto indicato al punto 1.6.2. La degradazione al momento T viene calcolata mediante la formula riportata (insieme alle definizioni) al punto 1.2.
 
La misura della degradazione dev'essere arrotondata all'unità percen ­
tuale. L'entità della degradazione raggiunta alla fine dell'esperimento viene definita come «biodegradabilità secondo Zahn-Wellens»
 
Nota:  Qualora la degradazione completa venga raggiunta prima che 
il tempo necessario per il saggio sia terminato e questo risultato sia 
confermato da una seconda analisi effettuata il giorno successivo, il saggio può essere considerato concluso.
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— la concentrazione iniziale della sostanza,  
— tutte le altre informazioni e risultati sperimentali concernenti la 
sostanza esaminata, la sostanza di riferimento (se impiegata) e il «bianco»,
 
— la concentrazione dopo tre ore,  
— la curva di biodegradazione con la relativa descrizione,  
— la data e la località di prelievo dei microorganismi usati per 
l’esperimento, lo stato di adattamento, la concentrazione impie ­
gata, ecc.  
— le giustificazioni scientifiche per qualsiasi modifica apportata al 
procedimento sperimentale.  
3.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
La rimozione del DOC (o del COD) che si verifica gradualmente 
entro giorni o settimane indica che la sostanza in esame sta subendo 
biodegradazione.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 916
 
In taluni casi può comunque entrare in gioco l'assorbimento chimico- 
fisico, denotato dal fatto che la scomparsa si verifica in modo com ­
pleto o parziale fin dall'inizio, entro le prime tre ore e che la diffe ­
renza di risposta tra i surnatanti del controllo e del saggio rimane a livelli inaspettatamente bassi.
 
Se si vuole distinguere fra la biodegradazione (o biodegradazione 
parziale) e l'assorbimento, sono necessari ulteriori saggi.  
Ciò può essere fatto in numerosi modi, ma il metodo più convincente 
consiste nell'impiegare il surnatante quale inoculo in una prova del dossier di base (preferibilmente un saggio respirometrico).
 
Le sostanze che, nel corso di questo saggio, mostrano un'elevata 
eliminazione del DOC (o del COD) non dovuta ad assorbimento 
devono essere considerate potenzialmente biodegradabili. Una rimo ­
zione parziale, non dovuta ad assorbimento indica che il prodotto chimico è soggetto almeno in parte alla biodegradazione. Una rimo ­
zione bassa o nulla del DOC (o del COD) può essere dovuta all'ini ­
bizione dei microorganismi da parte delle sostanze in esame: ciò può anche essere rivelato dalla lisi e dalla perdita di fango, accompagnata dalla formazione di surnatanti torbidi. In questo caso il saggio deve 
essere ripetuto impiegando la sostanza in esame a concentrazione 
minore.
 
L'impiego di un metodo di analisi specifico per la sostanza in esame 
o della sostanza marcata con  14 C può consentire una maggiore sen ­
sibilità. Nel caso di composto marcato al  14 C, il recupero di  14 CO 2 
confermerà che la biodegradazione è avvenuta.  
Quando i risultati sono espressi in termini di biodegradazione pri ­
maria, dovrà essere fornita, possibilmente, una spiegazione della modifica di struttura chimica che conduce alla diminuzione di rispo ­
sta della sostanza in esame.
 
Si deve dimostrare la validità del metodo analitico e fornire la ri ­
sposta ottenuta sul «bianco».  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OCSE, Parigi 1981,  Linea Guida 302 B,  decisione C(81) 30 
def. del Consiglio.  
(2) Allegato V C.9 Degradazione: Domanda chimica di ossigeno; 
direttiva 84/449/CEE della Commissione, Gazzetta ufficiale 
delle Comunità europee L 251 del 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 917
 
Appendice  
ESEMPIO DI VALUTAZ1ONE 
Composto organico: acido 4-etossibenzoico 
Conccntrazione teorica della sostanza: 600 mg/l DOC teorico: 390 mg/l 
Inoculo Impianto di trattamento delle acque fognarie di 
Concentrazione 1 g di sostanza secca Stato di adattamento non adattato Analisi: determinazione DOC 
Quantità del campione 3 ml 
Sostanza di controllo glicoldietilenico Tossicità del composto nessun effetto tossico al di sotto di 1 000 mg/l 
(metodo utilizzato: saggio in tubi di fermenta ­
zione)
 
Tempi di ana ­
lisi Sostanza di riferimento Sostanza in esame 
Bianco 
DOC (  1 ) 
mg/1 DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/1 Degrada­
zione 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/l Degrada­
zione 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 ore 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 giorno 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 giorni 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 giorni 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 giorni 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 giorni 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 giorni 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 giorni 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 giorni 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Valore medio di tre determinazioni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 918
 
Figura 1  
Esempio di curve di biodegradazione
  
Figura2  
Esempio di adattamento dei fanghi
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 919
 
C.10.  PROVA DI SIMULAZIONE SUI SISTEMI DI TRATTAMENTO 
AEROBICO DEI LIQUAMI: C.10-A: UNITÀ CON FANGHI ATTIVI — 
C.10-B: BIOFILM  
C.10-A: unità con fanghi attivi  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le 
prove sulle sostanze chimiche n. 303 (2001). Negli anni Cinquanta si è capito che i tensioattivi, da poco introdotti, provocavano una formazione 
di schiuma eccessiva negli impianti di trattamento delle acque reflue e nei 
fiumi. Si trattava di sostanze che non venivano completamente eliminate nel trattamento aerobico e in alcuni casi limitavano l’eliminazione di altra ma ­
teria organica. Queste constatazioni hanno stimolato molte ricerche scienti ­
fiche incentrate sull’eliminazione dei tensioattivi dalle acque reflue e sulla 
possibilità di utilizzare nuove sostanze chimiche prodotte industrialmente per il trattamento di questo tipo di acque. Sono state utilizzate unità modello 
rappresentative dei due principali tipi di trattamento biologico aerobico delle 
acque reflue: fanghi attivi e filtri percolatori (detti anche filtri biologici). Sarebbe stato poco pratico, ed estremamente costoso, distribuire le singole nuove sostanze chimiche e monitorare i grandi impianti per il trattamento 
delle acque, anche solo su base locale.
 
CONSIDERAZIONI INIZIALI  
Unità con fanghi attivi  
2. Sono state descritte unità modello con fanghi attivi di dimensioni variabili: 
da 300 ml fino a circa 2 000 ml. Alcune riproducevano da vicino il funzio ­
namento degli impianti di scala normale, con vasche di sedimentazione dalle quali i fanghi sedimentati venivano ripompati verso il serbatoio di aerazione, 
mentre altre unità non prevedevano vasche di sedimentazione, cfr. Swisher 
(1). La dimensione dell’apparecchio rappresenta un compromesso; da un lato dev’essere sufficientemente grande da consentire un buon funziona ­
mento meccanico e da fornire un volume adeguato di campioni senza che 
ciò incida sull’operatività, mentre dall’altro deve essere di dimensione suf ­
ficientemente contenuta da evitare sprechi di materiali e spazio.
 
3. Due tipi di apparecchiature sono stati utilizzati su larga scala e in modo 
soddisfacente: le unità Husmann (2) e le unità a vaso poroso (3) e (4), 
impiegate inizialmente per lo studio dei tensioattivi; entrambe queste appa ­
recchiature vengono descritte nel presente metodo di prova. Anche altri apparecchi hanno dato esito soddisfacente, cfr. ad esempio Eckenfelder 
(5). Dato il costo e gli sforzi relativamente onerosi legati all’applicazione 
di questa prova di simulazione, sono state analizzate in parallelo anche altre prove di screening, più semplici e meno costose, che sono ora incluse nel capitolo C.4, lettere da A a F, del presente allegato (6). L’esperienza acqui ­
sita in merito a molti tensioattivi e ad altre sostanze chimiche ha dimostrato 
che quelli che superano le prove di screening (sono cioè prontamente bio ­
degradabili) si degradano anche nella prova di simulazione. Alcuni tra quelli che non superano le prove di screening superano però le prove di biode ­
gradabilità intrinseca [capitoli C.12 (7) e C.19 (8) del presente allegato], ma 
solo alcuni di questi ultimi si degradano nella prova di simulazione, mentre le sostanze chimiche che non superano le prove di biodegradabilità intrin ­
seca non si degradano nelle prove di simulazione (9), (10), (11).
 
4. In alcuni casi, sono sufficienti le prove di simulazione svolte in un singolo 
insieme di condizioni di funzionamento specifiche. I risultati sono espressi sotto forma di eliminazione percentuale della sostanza chimica in esame o 
del carbonio organico disciolto (DOC). La descrizione della prova in que ­
stione è fornita nel presente metodo. Tuttavia, a differenza della precedente
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 920
 
versione del presente capitolo che descriveva solo un tipo di apparecchio per 
il trattamento dei liquami artificiali a unità abbinate, utilizzando un metodo 
relativamente approssimativo per i fanghi esausti, il presente testo offre una serie di alternative, riguardo il tipo di apparecchio, la modalità di funziona ­
mento, la rimozione dei liquami e dei fanghi esausti. Il testo segue da vicino 
quello della norma ISO 11733 (12), che è stato passato attentamente al 
setaccio in fase di preparazione, sebbene il metodo non sia stato sottoposto a prove interlaboratorio ( ring-test ).
 
5. In altri casi, sono necessari dati più precisi riguardo alla concentrazione 
della sostanza chimica in esame negli effluenti ed è quindi inevitabile ricor ­
rere a un metodo più completo. Ad esempio, il tasso di eliminazione dei 
fanghi esausti va controllato con più precisione nel corso di ogni singola giornata e per tutto il periodo di prova, per cui le unità devono funzionare secondo diversi tassi di eliminazione. Un metodo veramente completo do ­
vrebbe inoltre includere prove eseguite a due o tre temperature diverse: un 
metodo simile è descritto da Birch (13) (14) e riassunto nell’appendice 6. Tuttavia, le conoscenze attualmente a disposizione sono insufficienti per poter decidere quale dei modelli cinetici siano applicabili alla biodegrada ­
zione delle sostanze chimiche negli impianti per il trattamento delle acque 
reflue e, in generale, negli ambienti acquatici. L’applicazione della cinetica di Monod, cfr. appendice 6 a titolo d’esempio, si limita alle sostanze chimi ­
che presenti in quantità pari a 1 mg/l e oltre, ma alcuni ritengono che anche 
questo sia da dimostrare. Le prove condotte su concentrazioni che meglio riflettono quelle riscontrabili nelle acque reflue sono riportate nell’appendice 7; queste prove sono state inserite in appendice, analogamente a quelle 
nell’appendice 6, e non pubblicate come metodi di prova a sé stanti.
 
Filtri  
6. Si è prestata meno attenzione ai modelli pilota a filtri percolatori (detti anche 
letti percolatori), forse perché sono più complessi e meno compatti rispetto 
agli impianti pilota a fanghi attivi. Gerike  et al.  hanno sviluppato unità a 
filtri percolatori, facendole funzionare in modalità abbinata (15). Si tratta di filtri relativamente grandi (altezza: 2 m; volume: 60 l) che richiedono cia ­
scuno fino a 2 l/h di liquami. Bauman  et al.  (16) hanno simulato dei filtri 
percolatori inserendo delle strisce di «fibra pile» di poliestere in tubi lunghi 1 m (diametro interno: 14 mm) dopo averle immerse in fanghi attivi con ­
centrati per 30 min. La sostanza chimica in esame, quale unica fonte di 
carbonio in una soluzione minerale salina, è stata introdotta nel tubo verti ­
cale, valutando in seguito la biodegradazione attraverso la misurazione del DOC negli effluenti e del CO
 2 nel gas emesso.  
7. I biofiltri sono stati simulati seguendo una procedura diversa (15); le super ­
fici interne di alcuni tubi rotanti, leggermente inclinati rispetto all’asse oriz ­
zontale, sono state irrorate con acque reflue (circa 250 ml/h) con e senza la sostanza chimica in esame, e gli effluenti risultanti sono stati analizzati per determinare la presenza di DOC e/o della sostanza.
 
PRINCIPIO DELLA PROVA  
8. Il metodo intende determinare l’eliminazione e la biodegradazione primaria 
e/o completa di sostanze chimiche organiche idrosolubili attraverso micror ­
ganismi aerobici, in un sistema di prova a funzionamento continuo che simula il processo a fanghi attivi. Le fonti di carbonio e di energia per i microrganismi sono costituite da un mezzo organico facilmente biodegrada ­
bile e dalla sostanza chimica organica in esame.
 
9. Due unità di prova a funzionamento continuo (impianti a fanghi attivi o vasi 
porosi) vengono fatte operare in parallelo in condizioni identiche, scelte in quanto adatte ai fini della prova. Normalmente, il tempo medio di ritenzione idraulica è di 6 h e l’età media dei fanghi (tempo di ritenzione dei fanghi) 
varia da 6 a 10 giorni. I fanghi sono eliminati mediante uno dei metodi; la 
sostanza chimica in esame viene aggiunta agli affluenti (mezzo organico) di una sola delle due unità, con una concentrazione di carbonio organico disciolto (DOC) tra 10 mg/l e 20 mg/l. La seconda unità viene utilizzata 
come unità di controllo per determinare la biodegradazione del mezzo or ­
ganico.
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10. A intervalli frequenti vengono saggiati campioni degli effluenti, nei quali 
vengono determinati il DOC, preferibilmente, oppure la COD (domanda 
chimica di ossigeno), insieme alla concentrazione della sostanza chimica in esame (se richiesto) attraverso analisi specifiche sugli effluenti prove ­
nienti dall’unità che riceve la sostanza. Quando si effettuano le misurazioni 
del DOC o della COD, si assume che la differenza fra le concentrazioni 
medie degli effluenti nelle due unità (di prova e di controllo) sia dovuta alla sostanza in esame o ai suoi metaboliti organici. Tale differenza viene con ­
frontata con la concentrazione di DOC o COD negli affluenti dovuta all’im ­
missione della sostanza chimica in esame, al fine di determinare l’elimina ­
zione di quest’ultima.
 
11. È generalmente possibile distinguere tra biodegradazione e bioassorbimento 
attraverso un attento esame della curva eliminazione-tempo e la biodegra ­
dazione può normalmente essere confermata attraverso una prova di biode ­
gradazione rapida utilizzando un inoculo acclimatato proveniente dall’unità che ha ricevuto la sostanza in esame.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME  
12. È necessario disporre delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, volatilità 
e adsorbimento della sostanza in esame, in modo da permettere la corretta 
interpretazione dei risultati. Le sostanze chimiche volatili e insolubili non possono normalmente essere sottoposte a prova, se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. appendice 5). Per calcolare i valori teorici e/o 
per controllare i valori dei parametri significativi, per esempio ThOD (do ­
manda teorica di ossigeno), DOC e COD, è necessario conoscere la struttura chimica o la formula bruta.
 
13. Per una scelta mirata delle concentrazioni da sottoporre a prova e per inter ­
pretare correttamente dei valori di biodegradazione bassi, possono essere utili informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i mi ­
crorganismi (cfr. appendice 4).
 
SOGLIE MINIME  
14. La biodegradabilità primaria dei tensioattivi è l’applicazione originaria della 
presente prova di simulazione (di conferma), e l’immissione sul mercato di 
un tensioattivo è subordinata all’eliminazione di più dell’80 % della so ­
stanza specifica. Se il tasso dell’80 % non è raggiunto, si può applicare la prova di simulazione (di conferma) e il tensioattivo è immesso sul mercato 
solo se viene eliminato più del 90 % della sostanza chimica specifica. Per le 
sostanze chimiche in generale, il problema di ottenere un risultato positivo o negativo ( pass/fail ) non si pone e la percentuale di eliminazione ottenuta 
può servire per un calcolo approssimativo della probabile concentrazione 
nell’ambiente, da utilizzare nella valutazione dei rischi dovuti alle sostanze 
chimiche. I risultati tendono ad essere del tipo «tutto o niente». La percen ­
tuale di eliminazione del DOC ottenuta in diversi studi su sostanze chimiche 
pure era superiore al 90 % in oltre tre quarti dei prodotti chimici che 
presentavano un grado di biodegradabilità significativo e superiore all’80 % nel novanta per cento degli stessi.
 
15. Un numero relativamente contenuto di sostanze chimiche (ad esempio ten ­
sioattivi) è presente nei liquami alle stesse concentrazioni utilizzate nel 
presente metodo di prova (circa 10 mg C/l). A simili concentrazioni alcune sostanze chimiche possono essere inibitrici, mentre la cinetica di elimina ­
zione di altre sostanze può differire a basse concentrazioni. È possibile 
valutare la degradazione con più precisione ricorrendo a metodi modificati 
e scegliendo delle concentrazioni realisticamente basse della sostanza chi ­
mica in esame; i risultati ottenuti potrebbero servire a calcolare le costanti cinetiche. Tuttavia, le tecniche sperimentali necessarie non sono state ancora 
completamente convalidate, né sono stati definiti i modelli cinetici che de ­
scrivono le reazioni di biodegradazione (cfr. appendice 7).
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SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
16. A volte, per assicurare il corretto svolgimento della procedura sperimentale, 
è utile sottoporre a prova, parallelamente alle sostanze chimiche in esame, anche delle sostanze chimiche il cui comportamento è conosciuto, ad esem ­
pio: acido adipico, 2-fenilfenolo, 1-naftolo, acido difenico, 1-acido naftoico 
ecc. (9) (10) (11).
 
RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE  
17. Il numero di relazioni sulle prove di simulazione è molto inferiore rispetto a 
quello delle relazioni sulle prove di biodegradabilità immediata. Per le so ­
stanze chimiche in esame degradate all’80 % od oltre la riproducibilità tra le 
prove condotte simultaneamente è buona (dal 10 al 15 %), ma la variabilità aumenta per le sostanze meno efficacemente degradate. Inoltre, alcune so ­
stanze limite hanno fornito risultati molto eterogenei (ad esempio 10 %, 
90 %) a diverse riprese nel corso delle nove settimane della prova.
 
18. I risultati ottenuti con i due tipi di apparecchi non si differenziano di molto, 
ma alcune sostanze chimiche hanno subito una degradazione più estesa e 
costante con liquami domestici invece che con liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE.
 
DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
Apparecchiatura  
Sistema di prova  
19. Il sistema di prova per una singola sostanza chimica comprende un’unità di 
prova e un’unità di controllo; se vengono svolte solo analisi specifiche (biodegradazione primaria) è sufficiente la sola unità di prova. Una sola 
unità di controllo può essere utilizzata per diverse unità di prova che rice ­
vono le stesse o diverse sostanze chimiche sperimentali. In caso di abbina ­
mento (appendice 3), a ciascuna unità di prova deve corrispondere un’unità di controllo. Il sistema di prova può consistere in un modello di impianto a 
fanghi attivi — unità di Husmann (appendice 1, figura 1) — o in un vaso 
poroso (appendice 1, figura 2). In entrambi i casi è necessario utilizzare serbatoi di capacità sufficiente a ricevere affluenti ed effluenti, insieme a pompe per il dosaggio degli affluenti, mischiati o non mischiati alla solu ­
zione contenente la sostanza chimica in esame.
 
20. Ciascuna unità a fanghi attivi consiste in un recipiente di aerazione con una 
capacità nota di circa 3 litri di fanghi attivi e di un sedimentatore (chiari ­
ficatore secondario) contenente circa 1,5 litri; è possibile modificare parzial ­
mente i volumi regolando l’altezza del sedimentatore. È consentito l’utilizzo di recipienti di dimensioni diverse, se sottoposti a carichi idraulici parago ­
nabili. In caso non sia possibile mantenere la temperatura della sala prova 
nell’intervallo desiderato, si raccomanda l’uso di recipienti a camicia termo ­
statica ad acqua. I fanghi attivi sono riciclati dal sedimentatore al recipiente di aerazione attraverso una pompa ad aria compressa o una pompa dosatrice, in continuo o a intervalli regolari.
 
21. Il sistema a vaso poroso consiste in un cilindro poroso a fondo conico, 
contenuto all’interno di un recipiente leggermente più grande, di forma identica ma in materia plastica impermeabile. Per il vaso poroso, un mate ­
riale adatto è il polietilene, spesso 2 mm e con pori di dimensione non 
superiore a 90 μm. La separazione dei fanghi e del mezzo organico trattato 
avviene mediante passaggio differenziale attraverso la parete porosa. Gli effluenti fluiscono nello spazio anulare dal quale traboccano nel recipiente 
di raccolta. Non avviene alcuna decantazione e di conseguenza non vi è 
ricircolo di fanghi. L’intero sistema può essere montato in un bagnomaria
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controllato termostaticamente. I vasi porosi si ostruiscono e rischiano di 
traboccare nelle fasi iniziali. Se ciò avviene, occorre sostituire il rivestimento 
poroso con un rivestimento pulito, cominciando per prima cosa a sifonare i fanghi dal vaso a un secchio pulito per poi rimuovere il rivestimento ostrui ­
to. Dopo aver asciugato il cilindro impermeabile esterno, occorre collocare 
un rivestimento pulito e rimettere i fanghi nel vaso. È anche necessario 
raschiare e trasferire con cura eventuali fanghi aderenti ai lati del rivesti ­
mento ostruito. La pulizia dei vasi ostruiti si effettua ricorrendo inizialmente a un leggero getto d’acqua per rimuovere i fanghi residui, in seguito met ­
tendo a bagno i vasi prima in una soluzione diluita di ipoclorito di sodio poi 
in acqua, infine sciacquando accuratamente con acqua.
 
22. Occorre applicare tecniche appropriate all’aerazione dei fanghi nei recipienti 
di aerazione di entrambi i sistemi, utilizzando, ad esempio, aeratori oppure 
aria compressa. Se occorre, l’aria viene purificata (passando attraverso un filtro idoneo) e lavata. È necessario insufflare nel sistema una quantità d’aria sufficiente per mantenere le condizioni aerobiche e tenere perennemente in 
sospensione i fiocchi di fango nel corso della prova.
 
Apparecchio di filtrazione o centrifuga  
23. I campioni vengono filtrati attraverso filtri a membrana di porosità idonea 
(diametro d’apertura nominale di 0,45 μm) che adsorbono le sostanze chi ­
miche organiche solubili e rilasciano la minima quantità possibile di carbo ­
nio organico. Se i filtri utilizzati rilasciano carbonio organico, occorre lavarli accuratamente con acqua calda per rimuovere il carbonio organico lisciviato. In alternativa si può usare una centrifuga in grado di girare a 40 000 m/s
 2 . 
Apparecchiatura di analisi  
24. Apparecchiatura richiesta per determinare:  
— DOC (carbonio organico disciolto) e TOC (carbonio organico totale) o 
COD (domanda chimica di ossigeno),  
— sostanze chimiche specifiche, se richiesto,  
— solidi sospesi, pH, concentrazione di ossigeno nell’acqua,  
— temperatura, acidità e alcalinità,  
— ammonio, nitriti e nitrati, se la prova è svolta in condizioni nitrificanti.  
Acqua  
25. Acqua di rubinetto, contenente meno di 3 mg/l di DOC. Determinare l’al ­
calinità se non già nota.  
26. Acqua deionizzata, contenente meno di 2 mg/l di DOC.  
Mezzo organico  
27. Sono accettati, quali mezzo organico, i liquami artificiali, quelli domestici o 
una miscela di entrambi. È stato dimostrato (11) (14) che, spesso, l’uso di soli liquami domestici genera un maggior tasso di eliminazione del DOC e consente addirittura l’eliminazione e la biodegradazione di alcune sostanze 
chimiche che non sono invece biodegradate se si usano liquami artificiali 
ricostituiti secondo la formula OCSE. Inoltre, l’aggiunta costante o intermit ­
tente di liquami domestici spesso stabilizza i fanghi attivi e li rende capaci, crucialmente, di decantare in modo ottimale. Si raccomanda, quindi, l’uso di 
liquami domestici. Occorre misurare la concentrazione di DOC o COD in 
ciascun nuovo lotto di mezzo organico e determinarne l’acidità o alcalinità. Se il mezzo organico presenta una bassa acidità o alcalinità potrebbe essere necessario aggiungere un tampone idoneo (idrogenocarbonato di sodio o 
diidrogenofosfato di potassio), per mantenere un pH di circa 7,5 ± 0,5 nel 
recipiente di aerazione nel corso della prova. La quantità del tampone da aggiungere, e quando aggiungerla, vanno decise caso per caso. Quando le miscele vengono utilizzate in continuo o a intermittenza, occorre mantenere 
il DOC (o la COD) della miscela stessa a un valore pressoché costante, ad 
esempio diluendola con acqua.
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Liquami artificiali  
28. Sciogliere per ogni litro di acqua di rubinetto i seguenti composti: 160 mg di 
peptone; 110 mg di estratto di carne; 30 mg di urea; 28 mg di idrogenofo ­
sfato di potassio (K  2 HPO  4 ); 7 mg di cloruro di sodio (NaCl); 4 mg di 
cloruro di calcio diidrato (CaCl  2 .2H  2 O); 2 mg di solfato di magnesio eptai ­
drato (MgSO  4 .7H  2 0); questi liquami artificiali ricostituiti secondo la formula 
OCSE rappresentano un esempio dove la concentrazione media di DOC negli affluenti è di circa 100 mg/l. In alternativa, utilizzare altre composi ­
zioni, con la stessa concentrazione di DOC, più prossime ai liquami reali. Se 
occorrono affluenti meno concentrati, diluire i liquami artificiali con acqua di rubinetto, ad esempio 1:1, per ottenere una concentrazione di circa 50 
mg/l. Gli affluenti meno concentrati consentono una migliore crescita di 
organismi nitrificanti: occorrerà ricorrere a una concentrazione inferiore se è necessario svolgere uno studio sulla simulazione di impianti di depura ­
zione delle acque reflue dove sia presente nitrificazione. Questi liquami 
artificiali, a base di acqua distillata, possono essere preparati in forma con ­
centrata e conservati a circa 1 °C per una settimana al massimo. Se occorre, diluire con acqua di rubinetto. (Questo mezzo non è del tutto soddisfacente perché, in particolare, la concentrazione di azoto è molto elevata e il tenore 
di carbonio è relativamente basso, ma non è stata suggerita un’alternativa 
migliore, se non attraverso l’aggiunta di un tampone fosfato e di peptone).
 
Liquami domestici  
29. Utilizzare liquami freschi decantati raccolti giornalmente in un impianto di 
trattamento delle acque reflue che riceve principalmente liquami domestici. Occorre prelevare i liquami prima che avvenga la sedimentazione primaria, 
dallo stramazzo della vasca di sedimentazione primaria oppure dall’alimen ­
tazione dell’impianto a fanghi attivi; i liquami devono essere il più possibile privi delle particelle più grosse. È possibile utilizzarli dopo averli stoccati anche per diversi giorni (in generale, però, non più di sette) a 4 °C, se è 
provato che il DOC (o la COD) non sono diminuiti in modo significativo 
(vale a dire di più del 20 %) in fase di stoccaggio. Al fine di limitare eventuali perturbazioni al sistema, occorre correggere il DOC (o la COD) di ogni nuovo lotto per ottenere un valore adeguato costante prima dell’uso, 
ad esempio diluendolo con acqua.
 
Fanghi attivi  
30. Raccogliere un campione di fanghi attivi per l’inoculazione dal serbatoio di 
aerazione di un impianto di trattamento o da una unità pilota di laboratorio per il trattamento delle acque di scarico che tratti prevalentemente acque di origine domestica.
 
Soluzioni madre della sostanza in esame  
31. Per le sostanze che presentano una solubilità adeguata, preparare delle so ­
luzioni madre a concentrazioni idonee (es.: da 1 a 5 g/l) in acqua deionizzata 
o nella frazione minerale dei liquami artificiali (per le sostanze insolubili o volatili, cfr. appendice 5). Determinare il DOC e il carbonio organico totale (TOC) della soluzione madre e ripetere le misure per ciascun nuovo 
lotto. Se la differenza tra il DOC e il TOC supera il 20 %, verificare 
l’idrosolubilità della sostanza chimica in esame. Confrontare il DOC o la concentrazione della sostanza in esame, misurata attraverso un’analisi spe ­
cifica della soluzione madre, con il valore nominale, per assicurarsi che il 
tasso di recupero sia sufficiente (solitamente deve superare il 90 %). Veri ­
ficare, in particolare per le dispersioni, se il DOC può essere utilizzato come parametro analitico o se invece si possa applicare solo una tecnica d’analisi specifica per la sostanza in esame. Le dispersioni impongono il ricorso alla 
centrifuga dei campioni. Per ciascun nuovo lotto, misurare DOC, COD o la 
sostanza in esame attraverso un’analisi specifica.
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32. Determinare il pH della soluzione madre. I valori estremi indicano che 
l’aggiunta della sostanza chimica può influenzare il pH dei fanghi attivi 
nel sistema di prova. In tal caso, neutralizzare la soluzione madre per ottenere un pH di 7 ± 0,5 ricorrendo a piccole quantità di acido o di base inorganici, evitando però la precipitazione della sostanza in esame.
 
PROCEDURA  
33. La procedura descritta si applica alle unità a fanghi attivi; è necessario 
modificarla leggermente per il sistema a vaso poroso.  
Preparazione dell’inoculo  
34. Per cominciare, inoculare il sistema sottoposto a prova con fanghi attivi o 
con un inoculo contenente una bassa concentrazione di microrganismi. Con ­
servare l’inoculo in luogo aerato a temperatura ambiente ed utilizzarlo entro 
le 24 ore. Nel primo caso, raccogliere un campione di fanghi attivi dalla 
vasca di aerazione di un impianto di trattamento biologico delle acque reflue che funzioni efficientemente o da un’unità pilota sperimentale che riceva prevalentemente liquami domestici. Se è necessario simulare condizioni ni ­
trificanti, raccogliere i fanghi attivi da un impianto di trattamento delle 
acque reflue in presenza di nitrificazione. Determinare la concentrazione di solidi in sospensione e, se necessario, concentrare i fanghi per sedimen ­
tazione in modo che il volume aggiunto al sistema sia minimo. Verificare 
che la concentrazione di partenza di materia secca sia intorno a 2,5 g/l.
 
35. Nel secondo caso, utilizzare come inoculo da 2 ml/l a 10 ml/l di effluenti 
provenienti da un impianto di trattamento biologico dei liquami domestici. 
Per ottenere il maggior numero possibile di specie o ceppi differenti di 
batteri può essere utile mescolare degli inoculi provenienti da varie fonti, ad esempio acque di superficie. In tal caso, i fanghi attivi si formeranno e svilupperanno nel sistema di prova.
 
Dosaggio del mezzo organico  
36. Pulire accuratamente, all’inizio e durante la prova, tutti i recipienti destinati 
ad affluenti ed effluenti e i tubi che li collegano, per eliminare la prolife ­
razione microbica. Riunire i sistemi di prova in un ambiente a temperatura controllata (normalmente tra i 20 e i 25 °C) oppure utilizzare unità di prova 
a camicia termostatica ad acqua. Preparare un volume sufficiente del mezzo 
organico richiesto (cfr. paragrafi da 27 a 29). Cominciare a riempire il recipiente di aerazione e il sedimentatore con il mezzo organico e aggiun ­
gere l’inoculo (paragrafi 34, 35). Mettere in azione il dispositivo di aera ­
zione in modo che i fanghi siano mantenuti in sospensione e in condizioni 
aerobiche, cominciando a dosare gli affluenti e a riciclare i fanghi sedimen ­
tati. Dosare il mezzo organico dai recipienti di stoccaggio trasferendolo nei recipienti di aerazione (paragrafi 20, 21) delle unità di prova e di controllo e 
raccogliere i rispettivi effluenti in recipienti di stoccaggio simili. Per ottenere 
il normale tempo di ritenzione idraulica di 6 h, occorre pompare il mezzo organico a 0,5 l/h. Per confermare questa velocità di flusso, misurare la quantità quotidiana di mezzo organico dosato registrando la riduzione dei 
volumi del mezzo nei recipienti di stoccaggio. È necessario ricorrere ad altre 
modalità di dosaggio per determinare gli effetti dello scarico intermittente di una sostanza chimica oppure dell’aggiunta di «dosi shock».
 
37. Se il mezzo organico viene preparato in vista di un’utilizzazione la cui 
durata supera le 24 ore, è possibile refrigerarlo a circa 4 °C o conservarlo utilizzando un metodo adeguato, in modo da prevenire la crescita microbica e la biodegradazione al di fuori delle unità di prova (paragrafo 29). Se si 
utilizzano i liquami artificiali, è possibile preparare e stoccare a circa 4 °C 
una soluzione madre concentrata (es.: dieci volte superiore a quella normale, cfr. paragrafo 28). La soluzione madre può essere mischiata con il volume adeguato di acqua di rubinetto prima dell’uso; oppure, può essere pompata 
direttamente, mentre il volume adeguato di acqua di rubinetto viene pom ­
pato separatamente.
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Dosaggio della sostanza chimica in esame  
38. Aggiungere un volume adeguato della soluzione madre della sostanza chi ­
mica (paragrafo 31) al recipiente di stoccaggio degli affluenti, oppure do ­
sarla direttamente nel recipiente di aerazione, ricorrendo a un’altra pompa. 
La concentrazione di prova media normale negli affluenti dovrebbe situarsi 
tra 10 mg/l e 20 mg/l di DOC, e la concentrazione massima è di 50 mg/l. Se l’idrosolubilità della sostanza in esame è bassa, o se è possibile che si producano effetti tossici, occorre ridurre la concentrazione a 5 mg/l di 
DOC o addirittura meno, ma solo se è possibile applicare un metodo di 
analisi specifico (le sostanze di prova disperse e scarsamente solubili in acqua possono essere aggiunte attraverso tecniche di dosaggio speciali, 
cfr. appendice 5).
 
39. Quando il sistema è stabilizzato ed elimina il DOC dal mezzo organico in 
modo efficiente (all’80 % circa), cominciare ad aggiungere la sostanza. È importante verificare che tutte le unità operino allo stesso grado di efficienza 
prima di aggiungere la sostanza in esame; se così non fosse, spesso è utile 
mischiare i singoli fanghi e ridistribuirli in quantità uguali alle diverse unità. Se si utilizza un inoculo di circa 2,5 g/l (peso secco) di fanghi attivi, la sostanza chimica in esame può essere aggiunta sin dall’inizio della prova, in 
quando aggiungere direttamente e fin dall’inizio dei quantitativi crescenti 
presenta il vantaggio di rendere i fanghi attivi più adattabili alla sostanza in esame. A prescindere dal modo in cui viene aggiunta la sostanza in esame, si raccomanda di misurare ad intervalli regolari la velocità di flusso e/o i 
volumi nel o nei recipienti di stoccaggio.
 
Manipolazione dei fanghi attivi  
40. Indipendentemente dall’inoculo utilizzato, di norma la concentrazione dei 
solidi nei fanghi attivi si stabilizza nel corso della prova tra 1 e 3 g/l (peso secco), a seconda della qualità e della concentrazione del mezzo organico, delle condizioni di funzionamento, della natura dei microrganismi presenti e 
dell’influenza della sostanza in esame.
 
41. Determinare i solidi in sospensione nel recipiente di aerazione almeno una 
volta la settimana, eliminando il surplus di fanghi per mantenere la concen ­
trazione da 1 g/l a 3 g/l (peso secco), oppure controllare che l’età media dei 
fanghi si mantenga a un valore costante tra i 6 e i 10 giorni. Ad esempio, se 
viene scelto un tempo di ritenzione medio dei fanghi di 8 giorni, occorre rimuovere giornalmente 1/8 del volume di fanghi attivi dal recipiente di aerazione ed eliminarlo. Questa operazione va effettuata quotidianamente 
o, preferibilmente, attraverso una pompa automatica intermittente. Il mante ­
nimento della concentrazione dei solidi in sospensione a un valore costante, o entro limiti ristretti, non rende però costante il tempo di ritenzione dei 
fanghi, e cioè la variabile che permette di determinare la concentrazione 
della sostanza in esame negli effluenti.
 
42. Per tutta la durata della prova, rimuovere, almeno una volta al giorno, 
eventuali fanghi che aderiscono alle pareti del recipiente di aerazione e al 
sedimentatore e rimetterli in sospensione. Controllare e pulire regolarmente 
tutti i tubi e le tubature per evitare la crescita di biofilm. Riciclare i fanghi sedimentati, rinviandoli dal sedimentatore al recipiente di aerazione, prefe ­
ribilmente attraverso una pompa a intermittenza. Il sistema a vasi porosi non 
comporta alcun riciclo, ma occorre fare attenzione e inserire vasi interni 
puliti prima che il volume all’interno del recipiente raggiunga un livello troppo alto (paragrafo 21).
 
43. Nelle unità di Husmann si possono verificare cattiva sedimentazione e per ­
dita di fanghi. È possibile rimediarvi effettuando in parallelo, nelle unità di 
prova e di controllo, una o più delle operazioni elencate di seguito:  
— aggiungendo a intervalli regolari, ad esempio settimanalmente, dei fan ­
ghi freschi o un flocculante (es.: 2 ml per recipiente di una soluzione di 
FeCl  3 a 50 g/l), facendo attenzione a che il FeCl  3 non reagisca con la 
sostanza chimica in esame e non la faccia precipitare,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 927
 
— sostituendo la pompa ad aria compressa con una pompa peristaltica, al 
fine di creare un flusso di ricircolo dei fanghi pressappoco uguale al 
flusso degli affluenti in entrata da utilizzare e consentire lo sviluppo di una zona anaerobica nei fanghi sedimentati (la geometria della pompa ad aria compressa limita il flusso minimo di ritorno dei fanghi a circa 
dodici volte quello degli affluenti da trattare),
 
— pompando i fanghi in modo intermittente dal sedimentatore verso il 
recipiente di aerazione (es.: per 5 minuti ogni 2,5 h per riciclare da 1 l/h a 1,5 l/h),
 
— utilizzando un agente antischiuma atossico a concentrazione minima, 
che prevenga perdite dovute alla formazione di schiuma (es.: olio di silicone),
 
— insufflando aria nei fanghi del sedimentatore, in soffi brevi e intensi 
(es.: 10 secondi ogni ora),  
— dosando il mezzo organico a intervalli regolari nel recipiente di 
aerazione (es.: dai 3 ai 10 minuti l’ora).  
Campionamento e analisi  
44. A intervalli regolari, misurare la concentrazione dell’ossigeno disciolto, la 
temperatura e il pH dei fanghi attivi nei recipienti di aerazione. Assicurarsi 
che sia sempre disponibile sufficiente ossigeno (> 2 mg/l) e che la tempe ­
ratura si situi nell’intervallo richiesto (normalmente tra i 20 e i 25 °C). Mantenere il pH a 7,5 ± 0,5 dosando piccole quantità di una base o di un acido inorganici nel recipiente d’aerazione o negli affluenti, oppure 
aumentando la capacità tampone del mezzo organico (cfr. paragrafo 27). 
Se si verifica nitrificazione viene prodotto acido: l’ossidazione di 1 mg di azoto produce l’equivalente di circa 7 mg di CO
 3 – . La frequenza delle 
misurazioni dipende dal parametro da misurare e dalla stabilità del sistema 
e può variare in funzione della cadenza giornaliera o settimanale.  
45. Occorre misurare il DOC o la COD negli affluenti dei recipienti di controllo 
e di prova. La concentrazione della sostanza in esame negli affluenti di prova va determinata attraverso analisi specifiche od occorre stimarla a 
partire dalla concentrazione nella soluzione madre (paragrafo 31), dal vo ­
lume utilizzato e dalla quantità di liquami dosati nell’unità di prova. Si raccomanda di calcolare la concentrazione della sostanza in esame in modo da ridurre la variabilità dei dati sulla concentrazione.
 
46. Prelevare dei campioni adatti dagli effluenti raccolti (es. campioni compositi 
sulle 24 h) e filtrarli attraverso una membrana con pori di 0,45 μm oppure 
centrifugarli a circa 40 000 m/s  2 per circa 15 min. Ricorrere alla centrifu ­
gazione se il filtraggio risulta difficile. Determinare il DOC o la COD 
almeno due volte, in modo da misurare la biodegradazione completa e, se 
richiesto, quella primaria, attraverso un’analisi specifica per la sostanza in esame.
 
47. L’utilizzo della COD può far sorgere problemi analitici a basse concentra ­
zioni ed è raccomandato solo se la concentrazione di prova è sufficiente ­
mente alta (circa 30 mg/l). Inoltre, in caso di sostanze chimiche fortemente adsorbenti, si raccomanda di misurare la quantità di sostanza chimica ad ­
sorbita nei fanghi attraverso una tecnica di analisi specifica per la sostanza 
in esame.
 
48. La frequenza di campionamento dipende dalla durata prevista della prova. Si 
raccomandano tre campionamenti la settimana. Quando le unità iniziano a funzionare efficacemente, occorre lasciar trascorrere un periodo di adatta ­
mento da una a sei settimane a partire dall’introduzione della sostanza in 
esame, in modo da consentire il raggiungimento di uno stato stazionario. Per valutare i risultati della prova è necessario ottenere, preferibilmente, un minimo di 15 valori validi nel corso della fase di plateau (paragrafo 59), 
che dura normalmente tre settimane. È possibile interrompere la prova una 
volta raggiunto un grado di eliminazione sufficiente (es. > 90 %) e se si hanno a disposizione i 15 valori sopracitati a seguito di analisi svolte quo ­
tidianamente (giorni feriali) per tre settimane. La prova non deve general ­
mente estendersi al di là delle 12 settimane a partire dalla prima aggiunta 
della sostanza in esame.
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49. Se i fanghi subiscono un processo di nitrificazione ed occorre studiare gli 
effetti della sostanza in esame su tale processo, è opportuno analizzare 
campioni degli effluenti delle unità di prova e di controllo almeno una volta la settimana per rilevare ammonio e/o nitriti e nitrati.
 
50. Le analisi vanno svolte il più rapidamente possibile, in particolare quelle che 
riguardano l’azoto. In caso fosse necessario rimandare le analisi, conservare 
i campioni a circa 4 °C al buio, in bottiglie piene ed ermeticamente chiuse. Se è necessario stoccare i campioni per più di 48 h, la conservazione può avvenire tramite congelazione, acidificazione (es. 10 ml/l di un soluzione di 
acido solforico a 400 g/l) o aggiunta di una sostanza tossica idonea [es. 20 
ml/l di una soluzione di cloruro di mercurio (II) a 10 g/l]. Assicurarsi che la tecnica di conservazione non incida sui risultati dell’analisi.
 
Abbinamento delle unità di prova  
51. Se è necessario abbinare le unità (appendice 3), occorre scambiare quotidia ­
namente la stessa quantità di fanghi attivi (da 150 ml a 1 500 ml per i 
recipienti di aerazione contenenti tre litri di liquido) tra i recipienti di aera ­
zione dell’unità di prova e dell’unità di controllo. Se la sostanza in esame si adsorbe fortemente sui fanghi, cambiare solo il surnatante dei sedimentatori. 
In entrambi i casi, introdurre un fattore di correzione per calcolare i risultati 
della prova (paragrafo 55).
 
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
52. Per ogni valutazione programmata, calcolare la percentuale di eliminazione 
della sostanza in esame in termini di DOC o di COD ricorrendo alla se ­
guente equazione:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
dove:  
D t = percentuale di eliminazione del DOC o della COD al tempo t  
C s = valori del DOC o della COD negli affluenti, dovuti alla sostanza 
chimica in esame, preferibilmente stimati a partire dalla soluzione 
madre (mg/l)  
E = valori del DOC o della COD misurati negli effluenti di prova al 
tempo t (mg/l)  
E o = valori del DOC o della COD misurati negli effluenti di controllo al 
tempo t (mg/l)  
53. Il grado di eliminazione del DOC o della COD dal mezzo organico 
dell’unità di controllo è utile per valutare l’attività di biodegradazione dei fanghi attivi nel corso della prova. Calcolare la percentuale di eliminazione 
ricorrendo alla seguente equazione:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
dove:  
D B = percentuale di eliminazione del DOC o della COD dal mezzo orga ­
nico dell’unità di controllo al tempo t  
C M = DOC o COD del mezzo organico negli affluenti di controllo (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 929
 
Calcolare, in via facoltativa, la percentuale di eliminazione del DOC o della 
COD generati dal mezzo organico e dalla sostanza in esame nell’unità di 
prova, ricorrendo alla seguente equazione:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
dove:  
D T = percentuale di eliminazione del DOC o della COD nella totalità de ­
gli affluenti di prova  
C T = DOC o COD della totalità degli affluenti di prova o calcolati a 
partire dalle soluzioni madri (mg/l)  
54. Per ogni rilevazione calcolare l’eliminazione della sostanza in esame, se è 
stata misurata con un metodo di analisi specifico, ricorrendo alla seguente equazione:
 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
dove:  
D ST = percentuale di eliminazione primaria della sostanza chimica in esame 
al tempo t  
S i = concentrazione misurata o stimata della sostanza chimica in esame 
negli affluenti di prova (mg/l)  
S e = concentrazione misurata della sostanza chimica in esame negli ef ­
fluenti di prova al tempo t (mg/l)  
55. In modalità abbinata, compensare la diluizione della sostanza in esame nel 
recipiente di aerazione dovuta allo scambio di fanghi utilizzando un fattore 
di correzione (cfr. appendice 3). Se è stato applicato un tempo medio di 
ritenzione idraulica pari a 6 h ed è stata scambiata la metà del volume dei fanghi attivi contenuti nel recipiente di aerazione, occorre correggere i valori determinati dell’eliminazione quotidiana (D
 t , paragrafo 52) in modo da ot ­
tenere il grado reale di eliminazione, D  tc , della sostanza in esame, a partire 
dalla seguente equazione:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Espressione dei risultati della prova  
56. Tracciare su un grafico le curve dell’eliminazione D  t (o D  tc ) e D  st , se 
disponibile, in funzione del tempo (cfr. appendice 2). È possibile trarre 
alcune conclusioni sul processo di eliminazione della sostanza in esame 
(per se  o attraverso il DOC) a partire dall’andamento della curva.  
Adsorbimento  
57. Se già dall’inizio della prova si osserva una forte eliminazione della sostanza 
in esame in termini di DOC, la sostanza è stata probabilmente eliminata per 
adsorbimento sui solidi dei fanghi attivi. È possibile provare il fenomeno misurando l’adsorbimento della sostanza in esame mediante un’analisi spe ­
cifica. È raro che l’eliminazione del DOC delle sostanze adsorbibili si 
mantenga elevata nel corso di tutta la prova; normalmente, il grado di 
eliminazione è elevato all’inizio per poi declinare progressivamente fino a raggiungere un valore di equilibrio. Tuttavia, se la sostanza chimica adsor ­
bibile in esame fosse tale da causare, in un modo o nell’altro, un’acclima ­
tazione della popolazione microbica, l’eliminazione del DOC della sostanza 
chimica aumenterebbe fino a raggiungere un elevato valore di plateau.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 930
 
Fase di latenza  
58. Molte delle sostanze chimiche in esame, analogamente a quanto avviene 
nelle prove di screening statiche, attraversano una fase di latenza prima che avvenga una biodegradazione a pieno regime. Nel corso della fase di 
latenza, l’acclimatazione o l’adattamento dei batteri degradanti avviene 
senza che si produca, o quasi, l’eliminazione della sostanza in esame; in seguito, inizia la proliferazione dei batteri. Al termine di questa fase, quando circa il 10 per cento della quantità iniziale della sostanza in esame viene 
eliminata (compreso anche per adsorbimento, se del caso) si suppone che 
inizi la fase di degradazione. Il tempo di latenza è spesso notevolmente variabile e scarsamente riproducibile.
 
Fase di plateau  
59. La fase di plateau di una curva di eliminazione in un test in continuo è 
definita come la fase nella quale si raggiunge il massimo livello di degra ­
dazione. La fase di plateau dovrebbe protrarsi per almeno 3 settimane ed 
essere determinata attraverso la misurazione di 15 valori validi.  
Grado medio di eliminazione della sostanza chimica in esame  
60. Calcolare il valore medio a partire dai valori di eliminazione (D  t ) della 
sostanza in esame durante la fase di plateau. Arrotondata all’unità più vicina (1 %), tale media rappresenta il grado di eliminazione della sostanza in esame. Si raccomanda inoltre di calcolare l’intervallo di confidenza (95 %) 
del valore medio.
 
Eliminazione del mezzo organico  
61. Tracciare su un grafico la percentuale di eliminazione del DOC o della COD 
dal mezzo organico dell’unità di controllo (D  B ) in funzione del tempo. 
Indicare il grado medio di eliminazione come per la sostanza in esame (paragrafo 60).
 
Indicazione della biodegradazione  
62. Se la sostanza in esame non viene adsorbita in modo significativo sui fanghi 
attivi e se la curva di eliminazione presenta il profilo tipico di una curva di biodegradazione con fasi di latenza, degradazione e plateau (cfr. paragrafi 
58 e 59), l’eliminazione misurata può essere attribuita con certezza alla 
biodegradazione. Se il livello di eliminazione è alto in fase iniziale, la prova di simulazione non consente di distinguere tra i processi di eliminazione biologici e non biologici. In questi casi, come nei casi in cui la biodegra ­
dazione suscita dubbi (ad esempio, quando si osserva un fenomeno di 
stripping), occorre analizzare le sostanze in esame adsorbite oppure effet ­
tuare prove di biodegradazione statiche supplementari basate su parametri che indicano chiaramente i processi biologici. Si tratta di prove che si 
basano sul consumo di ossigeno [capitolo C.4, lettere D, E e F del presente 
allegato (6)] o sulla misurazione della produzione di diossido di carbonio [capitolo C.4-C del presente allegato (6)] oppure sul metodo ISO per la prova del CO
 2 nello spazio di testa (18) che utilizza un inoculo 
pre-esposto proveniente dal test di simulazione. Se sono state misurate sia 
l’eliminazione del DOC sia l’eliminazione della sostanza chimica specifica, la presenza di differenze significative (essendo la prima inferiore alla secon ­
da) tra le percentuali indica che gli effluenti contengono dei prodotti orga ­
nici intermedi probabilmente più difficili da degradare rispetto al composto 
progenitore.
 
Validità dei risultati della prova  
63. L’ottenimento di informazioni sulla normale attività di biodegradazione 
dell’inoculo è subordinata alla determinazione del grado di eliminazione del mezzo organico (paragrafo 53) nell’unità di controllo. Il test è da con ­
siderare valido se il grado di eliminazione del DOC e della COD nella o 
nelle unità di controllo è superiore all’80 % dopo due settimane e se non si 
osserva alcun fenomeno insolito.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 931
 
64. Se è stata utilizzata una sostanza chimica di riferimento prontamente biode ­
gradabile, il grado di biodegradazione (Dt, paragrafo 52) deve essere supe ­
riore al 90 %.  
65. Se la prova viene svolta in condizioni nitrificanti, la concentrazione media 
negli effluenti deve essere < 1 mg/l di azoto ammoniacale e < 2 mg/l di azoto sotto forma di nitriti.
 
66. Se non vengono soddisfatti questi criteri, ripetere la prova utilizzando un 
inoculo proveniente da una fonte diversa, sottoporre a prova una sostanza di riferimento e riesaminare tutte le procedure sperimentali.
 
Relazione sulla prova  
67. La relazione deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza chimica in esame:  
— dati identificativi,  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche.  
Condizioni sperimentali:  
— descrizione del sistema di prova utilizzato; qualsiasi modifica introdotta 
nella prova per testare le sostanze chimiche insolubili o volatili,  
— tipo di mezzo organico,  
— proporzione e natura degli effluenti industriali presenti nelle acque di 
scarico, se note,  
— inoculo: natura e località del campionamento, concentrazione ed even ­
tuale pretrattamento,  
— soluzioni madre della sostanza chimica in esame: tenore di DOC e di 
TOC; modalità di preparazione, se si tratta di una sospensione; concen ­
trazione utilizzata per la prova; giustificare, eventualmente, valori che si 
discostano dall’intervallo 10-20 mg/l di DOC; modalità di aggiunta; data della prima aggiunta; eventuali modifiche,
 
— età media dei fanghi attivi e tempo medio di ritenzione idraulica; metodo 
di rimozione dei fanghi attivi esausti; metodi per affrontare il rigonfia ­
mento (bulking), la perdita di fanghi attivi ecc.,  
— tecniche di analisi utilizzate,  
— temperatura di prova,  
— qualità del rigonfiamento dei fanghi; indice di volume dei fanghi (SVI,  
sludge volume index ); solidi sospesi nella miscela liquida (MLSS,  mixed 
liquor suspended solids ), 
— ogni eventuale scarto dalla normale modalità operativa e ogni eventuale 
circostanza suscettibile di aver inciso sui risultati.  
Risultati della prova:  
— tutti i dati derivanti dalle misurazioni (DOC, COD, analisi specifiche, 
pH, temperatura, concentrazione di ossigeno, solidi sospesi, sostanze 
azotate, se del caso),  
— tutti i valori calcolati per D  t (o D  tc ) D  B e D  St , presentati sotto forma di 
tabella e di curve di eliminazione,  
— informazioni sulle fasi di latenza e di plateau, la durata della prova, il 
grado di eliminazione della sostanza in esame e del mezzo organico 
nell’unità di controllo, insieme alle informazioni statistiche e conclusioni sulla biodegradabilità e sulla validità della prova,
 
— discussione dei risultati.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 932
 
BIBLIOGRAFIA  
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Res. 12: 909-915.  
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della «pronta» ( ready ) 
biodegradabilità.  
(7) Capitolo C.12 del presente allegato, Biodegradazione — saggio SCAS 
modificato.  
(8) Capitolo C.19 del presente allegato, Stima del coefficiente di adsorbimento 
(K OC ) sul terreno e sui fanghi di acque da scarico mediante cromatografia 
liquida ad alta prestazione (HPLC).  
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Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
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(18) ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analy ­
sis of inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 933
 
Appendice 1  
Figura 1  
Attrezzatura per valutare la biodegradabilità  
Unità di Husmann
  
A. recipiente di stoccaggio  
B. pompa dosatrice  
C. recipiente di aerazione (capacità 3 litri)  
D. decantatore  E. pompa ad aria compressa  
F. recipiente di raccolta  
G. aeratore  
H. flussimetro  
Figura 2  
Attrezzatura per valutare la biodegradabilità  
Vaso poroso
  
A. recipiente di stoccaggio  
B. pompa dosatrice  
C. recipiente poroso di aerazione  
D. recipiente esterno impermeabile  E. recipiente di raccolta  
F. diffusore  
G. flussimetro  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 934
 
Figura 3  
Dettagli del recipiente di aerazione a vaso poroso da 3 litri
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 935
 
Appendice 2  
Esempio di curva di eliminazione
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 936
 
Appendice 3  
[INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI]  
ABBINAMENTO DELLE UNITÀ DI PROVA  
Nel tentativo di livellare le popolazioni microbiche nei fanghi attivi dell’unità di 
prova (dove confluiscono i liquami più la sostanza in esame) e dell’unità di 
controllo (dove confluiscono solo i liquami) è stato introdotto uno scambio giornaliero di fanghi tra le due unità (1). La procedura, detta «abbinamento», ha dato origine al «processo ad unità abbinate». L’abbinamento, inizialmente 
realizzato su unità di Husmann a fanghi attivi, è stato applicato anche a unità 
a vasi porosi (2) (3). I risultati ottenuti con unità abbinate e con unità non abbinate, sia nel caso di unità di Husmann sia in quello di unità a vasi porosi, non presentano differenze significative e non c’è quindi alcun vantaggio ad 
investire tempo ed energia nell’abbinamento.
 
Lo scambio dei fanghi può far credere che avvenga un’eliminazione piuttosto 
importante, dato che una parte della sostanza chimica in esame viene trasferita e che lo scarto tra la concentrazione di tale sostanza negli effluenti di prova e negli 
effluenti di controllo diviene pressoché nullo. È quindi necessario applicare dei 
fattori di correzione che dipendono dalla frazione oggetto dello scambio e dal tempo medio di ritenzione idraulica. È stato pubblicato un metodo di calcolo più dettagliato (1).
 
Calcolare il grado d’eliminazione corretto del DOC o della COD utilizzando la 
formula generale:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
dove:  
D tc = percentuale di eliminazione, corretta, del DOC o della COD  
D t = percentuale di eliminazione, determinata, del DOC o della COD  
a = frazione volumetrica scambiata tra le unità a fanghi attivi  
r = tempo medio di ritenzione idraulica (h)  
Se, per esempio, viene scambiata la metà del volume del recipiente di aerazione 
(a = 0,5) e il tempo medio di ritenzione idraulica è di 6 h, la formula di 
correzione diventa:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
 
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(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, 
Stevenage, UK.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 937
 
Appendice 4  
VALUTAZIONE DELL’INIBIZIONE DEI FANGHI ATTIVI  
Processo a mezzo delle sostanze chimiche in esame  
1. Può succedere che una sostanza chimica (o dei liquami) non vengano né 
degradati né eliminati nella prova di simulazione e che possano addirittura 
avere un effetto inibitorio sui microrganismi dei fanghi. Alcune sostanze chimiche vengono biodegradate a basse concentrazioni ma svolgono un’azione inibitoria a concentrazioni superiori (ormesi). Gli effetti inibitori 
possono essere rivelati a uno stadio precedente oppure essere determinati 
attraverso una prova di tossicità, utilizzando un inoculo simile o identico a quello usato nella prova di simulazione (1). Si tratta di metodi di prova inibitori del consumo di ossigeno [capitolo C.11 del presente allegato (2) e 
norma ISO 8192 (3)] oppure inibitori della crescita degli organismi dei fan ­
ghi attivi [norma ISO 15522 (4)]
 
2. L’inibizione che avviene nel corso della prova di simulazione si manifesta 
attraverso la differenza del DOC e della COD degli effluenti del recipiente di 
prova e di quelli del recipiente di controllo, che è superiore al DOC aggiunto 
attraverso la sostanza chimica in esame. Altrimenti espresso, la presenza della sostanza chimica in esame riduce la percentuale di eliminazione della COD (nonché del BOD e della COD, e/o di NH
 + 4 ) del mezzo organico trattato. Se 
ciò avviene, occorrerà ricominciare la prova riportando la concentrazione 
della sostanza in esame a un livello al quale non abbia effetti inibitori ed eventualmente anche diminuendone ulteriormente la concentrazione fino a un valore che la renda biodegradata. Tuttavia, se la sostanza in esame (o i 
liquami) alterano il processo a tutte le concentrazioni testate, si tratta vero ­
similmente di una sostanza difficile, se non impossibile, da trattare biologi ­
camente, ma potrebbe valere la pena di ripetere la prova con fanghi attivi provenienti da una fonte diversa e/o sottoporli a un’acclimatazione più pro ­
gressiva.
 
3. Al contrario, se nella simulazione di prova la sostanza in esame viene eli ­
minata biologicamente al primo tentativo, la sua concentrazione va aumentata nel caso in cui si cerchi di stabilire se tale sostanza possa svolgere azione 
inibitoria.
 
4. Quando si tenta di determinare il grado di inibizione, occorre ricordare che la 
popolazione dei fanghi attivi può evolvere e questo fa sì che, nel tempo, i microrganismi possano sviluppare una tolleranza nei confronti della sostanza chimica inibitrice.
 
5. Calcolo del grado di inibizione:  
È possibile calcolare le percentuali globali di eliminazione, R  o , di BOD, 
DOC, COD ecc. nelle unità di prova e di controllo utilizzando la seguente formula:
 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
dove:  
I = concentrazione di BOD, DOC, COD ecc. negli affluenti dei recipienti 
di prova o di controllo (mg/l)  
E = concentrazioni rispettive negli effluenti (mg/l)  
I ed E devono essere corrette per tenere conto del DOC proveniente dalla 
sostanza in esame nelle unità di prova, altrimenti la percentuale di inibizione 
risulterà imprecisa.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 938
 
Il grado di inibizione prodotto dalla presenza della sostanza in esame può 
essere calcolato secondo la formula seguente:  
%diinibizione ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
dove:  
R c = percentuale di eliminazione nei recipienti di controllo  
R t = percentuale di eliminazione dei recipienit di prova  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Capitolo C.11 del presente allegato, Biodegradazione — Fanghi attivi: saggio 
di inibizione della respirazione.  
(3) ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 939
 
Appendice 5  
Sostanze chimiche in esame scarsamente solubili in acqua — sostanze 
volatili  
Sostanze chimiche scarsamente solubili in acqua  
Sono stati pubblicati apparentemente pochi studi incentrati su prove di simula ­
zione del trattamento delle acque reflue condotte su sostanze chimiche scarsa ­
mente solubili in acqua e insolubili (1) (2) (3).  
Non esiste un metodo universale di dispersione di una sostanza chimica appli ­
cabile a tutte le sostanze chimiche insolubili. Dei quattro tipi di metodi descritti nella norma ISO 10634 (4), i due che sembrerebbero essere adatti alla disper ­
sione delle sostanze destinate a una prova di simulazione fanno ricorso ad agenti 
emulsionanti e/o energia ultrasonica. È opportuno determinare la stabilità della 
dispersione ottenuta su un periodo di almeno 24 ore. Le dispersioni convenien ­
temente stabilizzate, contenute in recipienti costantemente sottoposti ad agita ­
zione (paragrafo 38), sono in seguito introdotte nei recipienti di aerazione, sepa ­
ratamente dai liquami domestici (o artificiali).
 
Se le dispersioni sono stabili, è necessario esaminare in che modo è possibile 
determinare la sostanza in esame nella sua forma dispersa. È improbabile che il DOC sia stato determinato in maniera adeguata, e va quindi messo a punto un 
metodo analitico specifico per la sostanza in esame da applicare agli effluenti, ai 
solidi degli effluenti e ai fanghi attivi. Il destino della sostanza chimica in esame nella simulazione del trattamento a fanghi attivi sarà in tal caso determinato nelle fasi solide e liquide. È quindi necessario calcolare un «bilancio di massa» per 
stabilire se la sostanza in esame è stata biodegradata. Tale bilancio, tuttavia, 
segnala solo la biodegradazione primaria. Sarà necessario dimostrare la biode ­
gradazione completa attraverso un test respirometrico di pronta biodegradabilità [capitolo C.4 del presente allegato (5), lettere C, F o D] utilizzando come inoculo 
dei fanghi esposti alla sostanza in esame nella prova di simulazione.
 
Sostanze chimiche volatili  
La simulazione del trattamento delle acque reflue con le sostanze chimiche 
volatili è discutibile e problematica. Come già rilevato per le sostanze poco solubili in acqua, sono apparentemente rari gli studi che descrivono le prove 
di simulazione con sostanze volatili. Occorre adattare uno strumento classico 
per la miscelatura integrale turando ermeticamente i recipienti di aerazione e decantazione, misurando e controllando il flusso d’aria con flussimetri, e facendo passare il gas in uscita attraverso trappole che consentono di raccogliere materia 
organica volatile. In alcuni casi, il gas in uscita viene convogliato verso una 
trappola fredda tramite una pompa a vuoto, oppure viene estratto mediante la tecnica « purge and trap » in una trappola contenente Tenax e gel di silice per 
analisi gascromatografiche. La sostanza in esame presente nella trappola può 
essere determinata analiticamente.
 
La prova viene svolta in due fasi. Le unità vengono messe in funzione inizial ­
mente senza fanghi, pompando i liquami artificiali addizionati della sostanza in 
esame nel recipiente di aerazione. Per alcuni giorni i campioni di affluenti, 
effluenti e gas in uscita vengono raccolti e analizzati per determinare la presenza della sostanza in esame. A partire dai dati raccolti, è possibile calcolare la percentuale (R
 vs ) della sostanza in esame estratta dal sistema tramite stripping.  
Si conduce in seguito la normale prova biologica (con fanghi attivi), in condi ­
zioni sperimentali identiche a quelle utilizzate per lo studio basato sullo stripping, misurando anche il DOC e la COD, per verificare che le unità operino efficace ­
mente. È inoltre opportuno eseguire analisi occasionali per misurare la presenza 
della sostanza in esame negli affluenti, negli effluenti e nei gas in uscita nel corso 
della prima parte della prova; dopo l’acclimatazione, le analisi vanno condotte con più frequenza. I dati raccolti allo stato stazionario permettono, di nuovo, di calcolare la percentuale di eliminazione della sostanza in esame nella fase liquida 
attraverso i processi fisici e biologici (R
 T ), nonché la proporzione estratta dal 
sistema (R  V ) tramite stripping.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 940
 
Calcolo:  
a) nella prova non biologica, la percentuale (R  VP ) della sostanza in esame 
estratta dal sistema (tramite stripping) può essere calcolata a partire dalla formula:
 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
dove:  
R VP = eliminazione della sostanza in esame per volatilizzazione (%),  
S VP = sostanza in esame raccolta nella trappola espressa come concentra ­
zione equivalente nella fase liquida (mg/l),  
S IP = concentrazione della sostanza in esame negli effluenti (mg/l);  
b) nella prova biologica, la percentuale (R  V ) della sostanza in esame estratta dal 
sistema (tramite stripping) può essere calcolata a partire dalla formula:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
dove:  
R V = eliminazione della sostanza in esame per volatilizzazione nella prova 
biologica (%),  
S V = sostanza in esame raccolta nella trappola, nella prova biologica, 
espressa come concentrazione equivalente negli affluenti liquidi (mg/l),
 
S I = concentrazione della sostanza in esame negli affluenti (mg/l);  
c) nella prova biologica, la percentuale (R  T ) della sostanza in esame eliminata 
attraverso tutti i diversi processi può essere calcolata a partire dalla formula:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
dove:  
S E = concentrazione della sostanza chimica in esame negli effluenti (liqui ­
di) (mg/l);  
d) quindi, la percentuale (R  BA ) rimossa per biodegradazione e per adsorbimento 
può essere calcolata a partire dalla formula:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
È consigliabile svolgere altre prove per determinare se la sostanza in esame è 
adsorbita; in tal caso, si potrebbe procedere ad un’ulteriore correzione;  
e) un confronto tra la proporzione di sostanza in esame estratta durante la prova 
biologica (R  v ) e durante quella non-biologica (R  vp ) mostra l’effetto comples ­
sivo del trattamento biologico sull’emissione della sostanza in esame nell’at ­
mosfera.  
Esempio:  Benzene  
Tempo di ritenzione dei fanghi = 4 giorni  
Tempo di ritenzione del liquame artificiale = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 941
 
Pertanto,  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % e R  BA = 85 %.  
Si è ipotizzato che il benzene non venga adsorbito sui fanghi attivi.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  
(5) Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della «pronta» ( ready ) 
biodegradabilità.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 942
 
Appendice 6  
Effetti del tempo di ritenzione dei fanghi sulla trattabilità delle sostanze 
chimiche  
INTRODUZIONE  
1. Il metodo qui descritto è stato concepito per verificare se le sostanze chimi ­
che in esame (in generale quelle riconosciute come biodegradabili intrinse ­
camente ma non prontamente) possono venire biodegradate nei limiti impo ­
sti dagli impianti di trattamento delle acque reflue. I risultati sono espressi in 
termini di percentuali di eliminazione e di biodegradazione. Le condizioni di 
funzionamento delle unità a fanghi attivi e la scelta degli affluenti da trattare portano a oscillazioni piuttosto marcate della concentrazione della sostanza in esame negli effluenti. Le prove vengono svolte su una sola concentra ­
zione nominale di solidi dei fanghi attivi o su un solo tempo di ritenzione 
nominale dei fanghi e i regimi di eliminazione dei fanghi esausti descritti possono far variare notevolmente il tempo di ritenzione nel corso della prova, sia da un giorno all’altro che all’interno di una sola giornata.
 
2. In questa variante (1) (2), il tempo di ritenzione dei fanghi è mantenuto 
all’interno di limiti molto più stretti nel corso di ciascun periodo di 24 ore 
(come avviene su vasta scala) e quindi la concentrazione negli effluenti 
risulta più costante. Si raccomanda l’uso di liquami domestici in quanto generano un tasso più elevato e consistente di eliminazione. Occorre inoltre esaminare gli effetti di un certo numero di valori attinenti ai tempi di 
ritenzione dei fanghi ed è necessario uno studio più dettagliato per deter ­
minare l’incidenza di una gamma di temperature diverse sulla concentra ­
zione degli effluenti.
 
3. Non esiste ancora un consenso generale sui modelli cinetici che riproducono 
la biodegradazione delle sostanze chimiche nelle condizioni riscontrabili in 
un impianto per il trattamento delle acque reflue. Si è scelto di applicare ai 
dati raccolti il modello di Monod per la crescita batterica e per l’utilizzo del substrato (1) (2), in quanto trattasi di metodo destinato ad essere applicato solo a sostanze chimiche prodotte in grandi quantità e quindi presenti nelle 
acque reflue in concentrazioni superiori a 1 mg/l. La validità del modello 
semplificato e delle ipotesi formulate è stata stabilita utilizzando una serie di alcoli etossilati con vari gradi di biodegradabilità primaria (2) (3).
 
Nota:  Questa variante segue da vicino il metodo di prova qui descritto 
(C.10-A), discostandosene solo nei dettagli illustrati di seguito.  
PRINCIPIO DELLA PROVA  
4. Si utilizzano delle unità a vaso poroso con fanghi attivi — concepite per 
facilitare l’eliminazione (quasi) continua di liquami misti grazie a una rego ­
lazione molto precisa dei tempi di ritenzione dei fanghi (SRT, o θ s ) — in 
modo non abbinato, con diversi tempi di ritenzione e, facoltativamente, diverse temperature. Il tempo di ritenzione si situa generalmente tra 2 e 
10 giorni e la temperatura tra 5 e 20 °C. Si dosano, separatamente, nelle 
unità i liquami di preferenza domestici e una soluzione della sostanza in esame, agli intervalli più idonei ad ottenere il tempo di ritenzione richiesto per i liquami (da 3 a 6 ore) e la concentrazione desiderata della sostanza in 
esame nei liquami da trattare. Le unità di controllo che non ricevono la 
sostanza in esame funzionano in parallelo, a fini di comparazione.
 
5. È possibile utilizzare altri tipi di apparecchiature, ma occorre prestare 
estrema attenzione per assicurare un controllo ottimale dei tempi di riten ­
zione. Ad esempio, se si utilizzano impianti che comprendono un decanta ­
tore, potrebbe essere necessario tener conto della perdita di solidi attraverso 
gli effluenti. Inoltre, è necessario prendere precauzioni particolari per evitare 
errori dovuti a variazioni della quantità dei fanghi nei decantatori.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 943
 
6. Le unità sono fatte funzionare nelle varie combinazioni di condizioni scelte 
e, dopo aver raggiunto l’equilibrio, si misurano le concentrazioni medie 
della sostanza in esame negli effluenti nello stato stazionario e, facoltativa ­
mente, la COD, su un periodo di circa tre settimane. La valutazione della percentuale di eliminazione della sostanza in esame e, facoltativamente, 
della COD, è espressa da una rappresentazione grafica della relazione tra 
le condizioni di funzionamento dell’impianto e la concentrazione negli ef ­
fluenti. A partire da qui è possibile calcolare le costanti cinetiche sperimen ­
tali e prevedere le condizioni nelle quali la sostanza in esame può essere 
trattata.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
7. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 12 e 13.  
SOGLIE MINIME  
8. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 14 e 15.  
SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO  
9. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 16.  
RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE  
10. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 17 e 18.  
DESCRIZIONE DEL METODO  
Apparecchiatura  
11. Per questo metodo, l’unità adatta è una versione modificata del sistema a 
vaso poroso (appendice 6.1). Si tratta di un recipiente interno (o rivestimen ­
to) in polipropilene poroso di 3,2 mm di spessore, con pori da circa 90 μm e 
con giunti saldati di testa, che rendono questa unità più robusta rispetto a quella descritta al paragrafo 21 del presente capitolo, C.10-A. Il rivestimento 
è inserito in un recipiente esterno in polietilene impermeabile composto da 
due elementi: una base circolare forata (per permettere il passaggio di due tubi di aerazione e di un tubo per lo scarico dei fanghi) e un cilindro superiore avvitato sulla base e provvisto di un’uscita posizionata in modo 
tale da versare un volume noto (3 l) nel vaso poroso. Uno dei tubi di 
aerazione è dotato di un diffusore e l’altro è aperto alle estremità e disposto ad angolo retto rispetto al diffusore posto nel recipiente. Questo sistema crea turbolenze sufficienti ad assicurare che i contenuti del recipiente siano me ­
scolati integralmente e a generare concentrazioni dell’ossigeno disciolto 
superiori a 2 mg/l.
 
12. Sistemare le unità, in numero adeguato, in un bagnomaria o in ambienti a 
temperatura costante e termostatizzata tra 5 e 20 °C (± 1 °C). Sono neces ­
sarie due pompe per dosare la soluzione della sostanza in esame e dei 
liquami decantati nei recipienti di aerazione alla portata richiesta (rispettiva ­
mente 0-1,0 ml/min e 0-25 ml/min) e una terza pompa per l’eliminazione dei fanghi esausti dai recipienti di aerazione. Il flusso dei fanghi esausti deve 
essere molto lento ed è ottenuto attraverso una pompa regolata a velocità 
superiore che funziona a intermittenza grazie a un timer settato, ad esempio, su 10 secondi al minuto, che risulta in un flusso di 3 ml/min e in una portata di fanghi eliminati pari a 0,5 ml/min.
 
Apparecchio di filtrazione o centrifuga  
13. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 23.  
Apparecchiatura di analisi  
14. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 24.  
Acqua  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 944
 
15. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 25 e 26.  
Mezzo organico  
16. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 27.  
Liquami artificiali  
17. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 28.  
Liquami domestici  
18. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 29.  
Fanghi attivi  
19. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 30.  
Soluzioni madre della sostanza in esame  
20. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 31 e 32.  
PROCEDURA  
Preparazione dell’inoculo  
21. Si applica il capitolo C.10-A solo il paragrafo 34 — utilizzare fanghi attivi 
(circa 2,5 g/l).  
Numero di unità di prova  
22. Nel caso di una prova semplice, ad esempio per misurare unicamente la 
percentuale di eliminazione, è sufficiente un solo valore di tempo di riten ­
zione dei fanghi, ma se si vuole ricavare dati necessari a calcolare le costanti cinetiche sperimentali, occorreranno 4 o 5 valori del tempo di ritenzione. I 
valori scelti si situano generalmente tra 2 e 10 giorni. Risulta più pratico 
effettuare una prova applicando 4 o 5 diversi valori del tempo di ritenzione dei fanghi simultaneamente alla stessa temperatura; per studi più approfon ­
diti, si utilizzano gli stessi tempi di ritenzione o eventualmente una serie di 
valori diversi, a temperature diverse situate nell’intervallo tra 5 e 20 °C. La 
biodegradazione primaria (utilizzo principale) richiede normalmente una sola unità per ciascuna combinazione di condizioni. Tuttavia, per la biodegrada ­
zione completa occorre aggiungere un’unità di controllo per ciascuna com ­
binazione di condizioni, destinata ad accogliere i liquami ma non la sostanza 
in esame. Se si presume che nei liquami utilizzati sia presente la sostanza in esame, è possibile incorporare delle unità di controllo al momento di valu ­
tare la biodegradazione primaria e apportare le correzioni necessarie ai 
calcoli.
 
Dosaggio del mezzo organico e della sostanza chimica in esame  
23. Si applicano i paragrafi da 36 a 39 del capitolo C.10-A, facendo però 
attenzione a dosare separatamente la soluzione della sostanza in esame e a utilizzare diversi tassi di eliminazione dei fanghi. Occorre inoltre monito ­
rare frequentemente, ad esempio due volte al giorno, e se necessario aggiu ­
stare entro ± 10 %, la portata degli affluenti, degli effluenti e dei fanghi esausti. Se i metodi di analisi comportano delle difficoltà per i liquami domestici, si possono utilizzare al loro posto dei liquami artificiali, assicu ­
randosi che i diversi mezzi forniscano dati cinetici paragonabili.
 
Manipolazione delle unità a fanghi attivi  
24. Si applicano i paragrafi da 40 a 43 del capitolo C.10-A, facendo però 
attenzione a controllare il tempo di ritenzione dei fanghi solo attraverso un’eliminazione a flusso «costante» dei fanghi esausti.
 
Campionamento e analisi  
25. Si applicano i paragrafi da 44 a 50 del capitolo C.10-A, determinando, 
inoltre, la concentrazione della sostanza in esame ed eventualmente il 
DOC; la COD non va utilizzata.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 945
 
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
26. Si applica il capitolo C.10 lettera A, paragrafi da 52 a 54.  
Espressione dei risultati della prova  
27. Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi da 56 a 62.  
Calcolo delle costanti cinetiche  
28. È più realistico esprimere la concentrazione media della sostanza in analisi 
allo stato stazionario negli effluenti e descrivere come essa vari in funzione delle condizioni di funzionamento dell’impianto, invece che citare la per ­
centuale di biodegradazione primaria. A tal fine è possibile utilizzare l’equa ­
zione [6] dell’appendice 6.2, che può fornire i valori dei parametri K
 S , μ m e 
θ SC , tempo critico di ritenzione dei fanghi.  
[Alternativamente, è possibile ottenere i valori di K  S e μm utilizzando un 
programma informatico semplice che adatta la curva teorica calcolata a partire dall’equazione [2] (appendice 6.2) ai valori sperimentali ottenuti. Anche se la soluzione ottenuta non rappresenterà una risposta assoluta, si 
può ottenere una ragionevole approssimazione dei valori K
 S e μ m ]. 
Variabilità dei risultati  
29. Capita frequentemente di ottenere parametri cinetici variabili per una mede ­
sima sostanza. Si ritiene che le condizioni di crescita dei fanghi e le con ­
dizioni nella quali si svolge la prova (come al paragrafo 5 e in altre prove) 
incidano fortemente sui risultati. Un aspetto di tale variabilità è stato esa ­
minato da Grady  et al  (4), che hanno suggerito di applicare i termini 
«effettiva» e «intrinseca» a due condizioni estreme che rappresentano i limiti 
dello stato fisiologico raggiungibile da una coltura nel corso di una prova 
cinetica. Se lo stato si mantiene inalterato nel corso della prova, i valori dei parametri cinetici riflettono le condizioni dell’ambiente dal quale proven ­
gono i microrganismi; tali valori vengono detti «effettivi» ovvero attual ­
mente esistenti. All’estremo opposto, se le condizioni della prova sono 
tali da permettere il pieno sviluppo del sistema di sintesi proteica e quindi il massimo tasso di crescita, i parametri cinetici risultanti vengono detti «intrinseci» e dipendono unicamente dalla natura del substrato e dal tipo 
di batteri che compongono la coltura. A titolo orientativo, si otterranno 
valori effettivi mantenendo il rapporto tra concentrazione del substrato e microrganismi degradanti (S
 o /X o ) a livelli bassi (ad esempio 0,025), mentre 
si otterranno valori intrinseci mantenendolo a livelli alti (ad esempio, 20 o 
oltre). In entrambi i casi, S  o deve essere pari o superiore al valore applica ­
bile di Ks, la costante di semisaturazione.  
30. La variabilità e altri aspetti della cinetica di biodegradazione sono stati 
discussi nel corso di una recente riunione del SETAC (5). Gli studi discussi, sia quelli già pubblicati sia quelli in fase progettuale, dovrebbero presto consentirci di avere un’immagine più chiara della cinetica alla base del 
trattamento delle acque reflue negli impianti e permetterci quindi una mi ­
gliore interpretazione dei dati esistenti e di impostare in futuro delle linee guida più pertinenti per i metodi di prova.
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
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(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 946
 
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 947
 
Appendice 6.1  
Vaso poroso con regolazione del tempo di ritenzione dei fanghi
  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 948
 
Appendice 6.2  
Calcolo delle costanti cinetiche  
1. Supponendo che si applichi la cinetica di Monod e tenendo conto di un 
bilancio di massa dei solidi attivi e del substrato nel sistema a fanghi attivi (1), le seguenti espressioni descrivono lo stato stazionario:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
ovvero  
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
dove:  
S 1 = concentrazione del substrato negli effluenti (mg/l)  
K S = costante di semisaturazione, concentrazione alla quale μ = μ m /2 
(mg/l)  
μ = tasso di crescita specifico (d  –1 ) 
μ m = valore massimo di μ m (d –1 ) 
K d = velocità di degradazione specifica dei solidi attivi (d  –1 ) 
θ S = tempo medio di ritenzione dei fanghi (d)  
Lo studio dell’equazione conduce alle seguenti conclusioni:  
i) la concentrazione negli effluenti è indipendente da quella negli affluenti 
(S 0 ); di conseguenza, la percentuale di biodegradazione varia in fun ­
zione della concentrazione negli affluenti, S  0 ; 
ii) l’unico parametro di controllo dell’impianto che incide su S  1 è il tempo 
di ritenzione dei fanghi θ S ; 
iii) a una data concentrazione negli affluenti, S  0 , corrisponderà un tempo 
critico di ritenzione dei fanghi, secondo la seguente formula:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
dove:  
θ SC = tempo critico di ritenzione dei fanghi al di sotto del quale i 
microrganismi competenti vengono eliminati dall’impianto;  
iv) dato che gli altri parametri dell’equazione [2] sono associati alla cinetica 
di crescita, è probabile che la temperatura incida sul livello del substrato 
degli effluenti e sull’età critica dei fanghi, ovvero, il tempo di ritenzione dei fanghi necessario ad ottenere un certo grado di trattamento aumenta in funzione della diminuzione della temperatura.
 
2. A partire da un bilancio di massa dei solidi nel sistema a vaso poroso, e 
supponendo che la concentrazione dei solidi negli effluenti dell’impianto, X
 2 , sia bassa rispetto a quella nel recipiente di aerazione, X  1 , il tempo di 
ritenzione dei fanghi è dato da:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 949
 
e 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
dove:  
V = volume del recipiente di aerazione (l)  
X 1 = concentrazione dei solidi nel recipiente di aerazione (mg/l)  
X 2 = concentrazione dei solidi negli effluenti (mg/l)  
Q 0 = velocità di flusso degli affluenti (l/d)  
Q 1 = velocità di flusso dei fanghi esausti (l/d)  
Regolando la velocità di flusso dei fanghi esausti, Q  1 , è quindi possibile 
regolare il tempo di ritenzione dei fanghi al determinato valore prescelto.  
Conclusioni:  
3. Scopo principale della prova è consentire di prevedere la concentrazione 
della sostanza in esame negli effluenti e, di conseguenza, i livelli di tale 
sostanza nelle acque che li ricevono.  
4. Tracciando S  1 in funzione di θ S è a volte possibile valutare con facilità il 
tempo critico di ritenzione dei fanghi, come ad esempio nella curva 3 della 
figura 1. Se non è possibile farlo, il valore θ SC può essere calcolato, insieme 
ai valori approssimativi di μ m e K  S , tracciando S  1 , in funzione di S  1 •θ S . 
Riarrangiando l’equazione, si ottiene:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
se il valore di K  d è basso, si ottiene 1 + θ s • K  d ~ 1 e [5] diventa:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Di conseguenza la curva dovrebbe diventare una retta (cfr. la figura 2) con 
inclinazione 1/ μ m che interseca K  S /μ m ; inoltre: θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 950
 
Figura 1  
Tre temperature; cinque tempi di ritenzione dei fanghi
  
Figura 2  
Retta di regressione SRT · S 1 in funzione di S  1 a T = 5 °C
  
Legenda  
Concentrazione negli effluenti  
Curva  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 951
 
Appendice 7  
PROVE SVOLTE A BASSE CONCENTRAZIONI ( μg/l) 
1. Negli ambienti acquatici, che includono le acque reflue, diverse sostanze 
chimiche sono spesso presenti a concentrazioni molto basse ( μg/l). In tal 
caso, le sostanze non servono da substrati primari per la crescita ed è invece più verosimile che subiscano una degradazione in quanto substrati secondari 
che non intervengono nella crescita, parallelamente a una serie di composti a 
base di carbonio presenti in natura. Di conseguenza, la degradazione di questo tipo di composti non risponde al modello descritto all’appendice 6. Si possono però applicare diversi altri modelli e, date le condizioni preva ­
lentemente presenti nei sistemi di trattamento delle acque reflue, è possibile 
utilizzare contemporaneamente molti modelli. Occorre svolgere studi molto più approfonditi per chiarire questo punto.
 
2. Nel frattempo, è possibile applicare la procedura descritta nel presente testo 
(capitolo C.10-A), ma solo per la biodegradabilità primaria, utilizzando basse concentrazioni idonee (< 100 μg/l) e una procedura di analisi conva ­
lidata. È possibile calcolare la percentuale di biodegradazione (cfr. 
paragrafo 54 del metodo di prova) a condizione che venga tenuto conto 
dei processi abiotici (adsorbimento, volatilità ecc.). Si può prendere ad esempio lo studio condotto da Nyholm e dai suoi collaboratori (1) (2), con un ciclo di 4 ore in un sistema a riempimento e scarico ( fill and draw ). 
Lo studio riporta costanti di pseudo primo ordine per le cinque sostanze 
chimiche addizionate a liquami artificiali, da 5 a 100 μg/l (per la biodegra ­
dabilità finale è possibile utilizzare sostanze di prova marcate con
 14 C). La 
descrizione di questo processo si situa al di fuori dell’ambito del presente 
metodo di prova in quanto non si tratta di procedure sulle quali vi è con ­
senso, sebbene un metodo proposto per la norma ISO 14592 (3) contenga delle indicazioni sull’uso delle sostanze chimiche marcate con
 14 C. 
Prova a mezzo di unità semicontinue per fanghi attivi (SCAS)  
3. È stata in seguito proposta una prova più semplice, in due fasi (4) (5) (6); il 
metodo, che prevede il ricorso a unità semicontinue (SCAS), è seguito da 
prove cinetiche brevi condotte su campioni prelevati dalle unità SCAS. Il 
sistema SCAS funziona con flussi di fanghi esausti conosciuti (a differenza del metodo originale C.12) e viene alimentato con liquami artificiali rico ­
stituiti secondo la formula OCSE modificata o con liquami domestici. La 
formula dei liquami artificiali è stata modificata (a causa di un diverso 
valore di pH e scarsa capacità di sedimentazione dei fanghi) con l’aggiunta di un tampone fosfato, di estratto di lievito, cloruro di ferro (III) e tracce di oligoelementi, inoltre la COD è stata aumentata a circa 750 mg/l incremen ­
tando la concentrazione di peptone ed estratti di carne. Le unità hanno 
funzionato in cicli continui di 24 ore: 23 ore di aerazione, eliminazione dei fanghi esausti, sedimentazione, estrazione del liquido sopranatante (ef ­
fluenti) seguite dall’aggiunta di liquami artificiali e sostanza in esame, fino a 
100 μg/l (vale a dire circa la stessa concentrazione applicata nella prova 
breve). Una volta la settimana il 10 % della totalità dei fanghi è stata sostituita con fanghi freschi in modo da mantenere l’equilibrio della popo ­
lazione microbica.
 
4. Le concentrazioni della sostanza in esame vengono misurate inizialmente e 
alla fine della fase di aerazione e la prova viene condotta finché si raggiunge un’eliminazione costante della sostanza: possono essere necessari da una settimana a diversi mesi.
 
Prova breve  
5. Viene svolta una prova breve (es. 8 ore) per determinare la costante di 
velocità cinetica di pseudo primo ordine per la degradazione della sostanza 
chimica in esame nei fanghi attivi le cui origini e modalità di sviluppo sono conosciute ma diverse. In particolare, vengono presi campioni di fanghi dai reattori SCAS — alla fine di un periodo di aerazione, quando la concen ­
trazione del substrato è bassa — durante un test di acclimatazione (paragrafi 
3 e 4). A scopo di confronto, i fanghi possono essere presi anche da
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 952
 
un’unità SCAS operante in parallelo ma non esposta alla sostanza in esame. 
Aerare le miscele di fanghi e della sostanza in esame aggiunta a due o più 
concentrazioni nell’intervallo da 1 a 50 μg/l, senza aggiungere liquami 
artificiali o altro substrato organico. La sostanza in esame rimasta in solu ­
zione viene misurata a intervalli regolari, ad esempio ogni ora, a seconda 
della sua degradabilità, per non più di 24 ore. Centrifugare i campioni prima 
di sottoporli ad adeguata analisi.  
Calcoli  
6. I dati provenienti dalle unità SCAS vengono utilizzati per calcolare la per ­
centuale di eliminazione della sostanza in esame (paragrafo 54). È inoltre possibile calcolare la costante di velocità media, K
 1 (corretta, per tenere 
conto della concentrazione dei solidi in sospensione), ricorrendo alla for ­
mula seguente:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
dove:  
t = tempo di aerazione (23 ore)  
C e = concentrazione alla fine del periodo di aerazione ( μg/l) 
C i = concentrazione all’inizio del periodo di aerazione ( μg/l) 
SS = concentrazione dei solidi dei fanghi attivi (g/l)  
7. Nella prova breve, tracciare il logaritmo della concentrazione percentuale 
restante in funzione del tempo; la curva della parte iniziale (degradazione 10-50 %) del grafico è equivalente a K
 1 , la costante di (pseudo) primo 
ordine. Correggere la costante in funzione della concentrazione dei solidi 
nei fanghi, dividendo la curva per la concentrazione di tali solidi. Il risultato 
deve precisare anche le concentrazioni iniziali della sostanza in esame e dei solidi in sospensione, il tempo di ritenzione dei fanghi, il carico e la fonte dei fanghi e indicare, se del caso, un’eventuale pre-esposizione alla sostanza 
in esame.
 
Variabilità dei risultati  
8. La variabilità e altri aspetti della cinetica di biodegradazione sono stati 
discussi nel corso di una recente riunione del SETAC (7). Gli studi discussi, sia quelli già pubblicati sia quelli in fase progettuale, dovrebbero presto 
consentirci di avere un’immagine più chiara della cinetica alla base del 
trattamento delle acque reflue negli impianti e permetterci quindi una mi ­
gliore interpretazione dei dati esistenti e di impostare in futuro delle linee guida più pertinenti per i metodi di prova.
 
BIBLIOGRAFIA  
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semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
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C.10-B: Biofilm  
INTRODUZIONE  
1. Generalmente le prove di simulazione vengono svolte sulle sostanze che non 
superano la prova di screening per la pronta biodegradabilità [capitolo C.4, lettere da A a F, del presente allegato (9)] ma superano invece quella per la biodegradabilità intrinseca. In casi eccezionali, le prove di simulazione ven ­
gono applicate anche a sostanze chimiche sulle quali è necessario ottenere 
maggiori informazioni, specialmente le sostanze prodotte in grandi quantità; normalmente, viene applicata la prova a fanghi attivi (C.10-A). In alcuni casi, tuttavia, sono necessarie informazioni specifiche relative al comporta ­
mento di una determinata sostanza quando viene sottoposta a metodi di 
trattamento delle acque reflue che comportano il ricorso a biofilm, in par ­
ticolare attraverso l’uso di filtri percolatori, biodischi ( rotating biological 
contactors ) o letti fluidi; per venire incontro a tale necessità, sono state 
sviluppate diverse soluzioni.
 
2. Gerike  et al.  (1) hanno sviluppato delle unità pilota costituite da filtri per ­
colatori di grandi dimensioni, facendole funzionare in modalità abbinata. I filtri occupavano però troppo spazio e richiedevano quantità relativamente elevate di liquami o liquami artificiali. Truesdale  et al.  (2) hanno utilizzato 
filtri percolatori più piccoli (1,83 m × 0,15 m di diametro) alimentati con 
liquami naturali privi di tensioattivi, ma che richiedevano comunque quan ­
tità significative di liquami. Erano necessarie fino a 14 settimane per svi ­
luppare un biofilm «maturo» e bisognava attendere altre 4-8 settimane, dopo 
la prima introduzione del tensioattivo in esame, perché avvenisse l’acclima ­
tazione.
 
3. Baumann  et al.  (3) sono ricorsi a un filtro molto più piccolo che usava 
«fibra pile» di poliestere precedentemente immersa in fanghi attivi come mezzo inerte di supporto per il biofilm. La sostanza in esame costituiva 
l’unica fonte di carbonio e la biodegradabilità veniva valutata a partire dalle 
misure del DOC nell’affluente e nell’effluente e dalla quantità di CO
 2 nel 
gas emesso.  
4. Gloyna  et al.  (4) hanno adottato un approccio completamente diverso e a 
loro si deve l’invenzione del reattore tubolare rotante. Sulla superficie in ­
terna del tubo rotante (sull’area della superficie conosciuta) è stato coltivato 
un biofilm introducendo gli affluenti dall’estremità superiore del tubo (leg ­
germente inclinato rispetto all’asse orizzontale). Il reattore è stato utilizzato per studiare la biodegradabilità dei tensioattivi (5), lo spessore ottimale del biofilm e la diffusione attraverso il film (6). Gloyna  et al.  hanno poi per ­
fezionato e modificato il reattore in modo da poter determinare il CO
 2 nel 
gas emesso.  
5. Il reattore tubolare rotante è stato adottato dallo Standing Committee of 
Analysts del Regno Unito come metodo standard per valutare la biodegra ­
dabilità delle sostanze chimiche (7) nonché la trattabilità e tossicità delle 
acque reflue (8). Il metodo qui descritto presenta il vantaggio di essere 
semplice, compatto e riproducibile e di richiedere quantità relativamente contenute di mezzo organico.
 
PRINCIPIO DELLA PROVA  
6. Si applicano sulla superficie interna del tubo inclinato, facendolo ruotare 
lentamente, i liquami (artificiali o domestici) e la sostanza in esame, intro ­
dotta separatamente o miscelata. Sulla superficie interna si sviluppa uno strato di microrganismi, simili a quelli presenti sui biofiltri. Il funzionamento 
del reattore è calibrato in modo da ottenere un’eliminazione adeguata della 
materia organica e, se necessario, l’ossidazione dell’ammonio.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 955
 
7. Si raccolgono gli effluenti dal tubo e li si fa decantare e/o filtrare prima di 
analizzarli per verificare la presenza del DOC e/o della sostanza chimica in 
esame, scegliendo un metodo specifico. Si fanno funzionare in parallelo le unità di controllo che non ricevono la sostanza in esame, a fini di compa ­
razione. Quando si effettuano le misurazioni del DOC negli effluenti, si 
presume che la differenza fra le concentrazioni medie delle due unità (di 
prova e di controllo) sia dovuta alla sostanza in esame o ai suoi metaboliti organici. Tale differenza è confrontata con la concentrazione della sostanza chimica in esame (in termini di DOC) negli affluenti, al fine di determinarne 
l’eliminazione.
 
8. È generalmente possibile distinguere tra biodegradazione e bioassorbimento 
osservando con attenzione la curva eliminazione-tempo; normalmente, la 
biodegradazione può essere confermata da una prova di pronta biodegrada ­
zione (consumo di ossigeno e produzione di diossido di carbonio) utiliz ­
zando un inoculo acclimatato estratto alla fine della prova dai reattori che hanno ricevuto la sostanza in esame.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
9. È necessario disporre delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, volatilità 
e adsorbimento della sostanza in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati.
 
10. Le sostanze chimiche volatili e scarsamente solubili non possono normal ­
mente essere testate se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. capitolo C.10-A, appendice 5). È necessario conoscerne la struttura chimica o la formula bruta per calcolare i valori teorici e/o per controllare i valori dei 
parametri significativi, per esempio ThOD (domanda teorica di ossigeno) e 
DOC.
 
11. Le informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i mi ­
crorganismi (cfr. capitolo C.10-A, appendice 4) possono essere utili per una 
scelta mirata delle concentrazioni da sottoporre a prova e per interpretare correttamente valori di biodegradazione bassi.
 
SOGLIE MINIME  
12. Originariamente, l’immissione sul mercato dei tensioattivi era subordinata al 
raggiungimento di un tasso minimo di biodegradazione primaria pari almeno 
all’80 %. Se il tasso dell’80 % non viene raggiunto, si può applicare la presente prova di simulazione (di conferma) e il tensioattivo è immesso sul mercato solo se viene eliminato più del 90 % della sostanza chimica 
specifica. In generale, per le sostanze chimiche, il problema di ottenere un 
risultato positivo o negativo ( pass/fail ) non si pone e la percentuale di 
eliminazione ottenuta può servire per un calcolo approssimativo della pro ­
babile concentrazione nell’ambiente, da utilizzare nella valutazione dei rischi 
dovuti alle sostanze chimiche. La percentuale di eliminazione del DOC 
ottenuta in diversi studi su sostanze chimiche pure era superiore al 90 % in oltre tre quarti dei prodotti chimici che presentavano un grado di biode ­
gradabilità significativo ed era superiore all’80 % nel novanta per cento de ­
gli stessi.
 
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
13. Per assicurare il corretto svolgimento della procedura sperimentale è utile, a 
volte, testare in parallelo delle sostanze chimiche il cui comportamento è conosciuto. Si può, ad esempio, ricorrere ad acido adipico, 2-fenilfenolo, 1- 
naftolo, acido difenico e 1-acido naftoico.
 
RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE  
14. Un laboratorio situato nel Regno Unito ha calcolato una deviazione standard 
relativa del 3,5 % all’interno delle prove e del 5 % tra le prove (7).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 956
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Apparecchiatura  
Reattori tubolari rotanti  
15. L’apparecchiatura (cfr. appendice 8, figure 1 e 2) consiste in una serie di 
tubi acrilici, lunghi 30,5 cm con diametro interno di 5 cm, applicati su ruote 
con corone in gomma all’interno di una struttura di supporto in metallo. I tubi, la cui superficie interna viene resa ruvida con lana abrasiva, hanno un bordo esterno alto circa 0,5 cm che ne permette il fissaggio sulle ruote; 
all’estremità superiore (estremità di carico) si trova un bordo interno di 
0,5 cm, per la ritenzione dei liquidi. Occorre inclinare i tubi a un angolo di circa un grado rispetto al piano orizzontale, per consentire che il mezzo di prova applicato ai tubi puliti resti in contatto con la loro superficie per il 
tempo richiesto. Fare girare lentamente le ruote gommate attraverso un 
motore a velocità variabile. Controllare la temperatura dei tubi collocandoli in una camera a temperatura costante.
 
16. Porre ciascun reattore tubolare in un tubo leggermente più grande e chiuso 
da un tappo, assicurandosi che le giunzioni siano a tenuta stagna, in modo da raccogliere in una soluzione alcalina il CO
 2 del gas emesso, per poi 
misurarlo (6).  
17. Alimentare ogni tubo con mezzo organico contenente, se del caso, la so ­
stanza in esame; prevedere per ciascun tubo un recipiente della capacità di 20 l per lo stoccaggio di sufficiente mezzo organico per 24 ore (A) (cfr. 
figura 2). Se richiesto, la sostanza chimica in esame può essere dosata 
separatamente. Sul fondo di ciascun recipiente di stoccaggio c’è un foro d’uscita collegato attraverso un tubicino idoneo, ad esempio in gomma siliconata, via una pompa peristaltica (B) a un tubicino di alimentazione 
acrilico o in vetro che entra per 2-4 cm nell’estremità superiore (di carico) 
del tubo inclinato (C). L’effluente sgocciola quindi dalla parte inferiore del tubo inclinato verso un altro recipiente di stoccaggio (D). Far decantare l’effluente, o filtrarlo, prima di analizzarlo.
 
Apparecchio di filtrazione — centrifuga  
18. I campioni vengono filtrati attraverso filtri a membrana di porosità idonea 
(diametro d’apertura nominale di 0,45 μm) che adsorbono le sostanze chi ­
miche organiche solubili o rilasciano la minima quantità possibile di carbo ­
nio organico. Se i filtri utilizzati rilasciano carbonio organico, occorre lavarli 
accuratamente con acqua calda per rimuovere il carbonio organico lisciviato. 
In alternativa si può usare una centrifuga in grado di girare a 40 000 m/s  2 . 
19. Apparecchiatura di analisi che permette di determinare:  
— DOC/carbonio organico totale (TOC) o domanda chimica di 
ossigeno (COD),  
— sostanze chimiche specifiche (HPLC, GC ecc.) se richiesto,  
— pH, temperatura, acidità, alcalinità,  
— ammonio, nitrito e nitrato, se la prova è svolta in condizioni nitrificanti.  
Acqua  
20. Acqua di rubinetto, contenente meno di 3 mg/l di DOC.  
21. Acqua distillata o deionizzata, contenente meno di 2 mg/l di DOC.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 957
 
Mezzo organico  
22. Sono accettati quali mezzo organico i liquami artificiali, quelli domestici o 
una miscela di entrambi. È stato dimostrato che l’uso di soli liquami dome ­
stici genera spesso un maggior tasso di eliminazione del DOC (nelle unità a 
fanghi attivi) e consente addirittura la biodegradazione di alcune sostanze 
chimiche che non sono invece biodegradate se si usano liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE. Si raccomanda quindi l’uso di liquami domestici. Occorre misurare la concentrazione di DOC (o COD) in ciascun 
nuovo lotto di mezzo organico e occorre conoscerne l’acidità o l’alcalinità. 
Se il mezzo organico presenta una bassa acidità o alcalinità potrebbe essere necessario aggiungere un tampone idoneo (idrogenocarbonato di sodio o 
idrogenofosfato di potassio) per mantenere un pH di circa 7,5 ± 0,5 nel 
reattore nel corso della prova. La quantità del tampone da aggiungere, e quando aggiungerla, vanno decise caso per caso.
 
Liquami artificiali  
23. Sciogliere per ogni litro di acqua di rubinetto i seguenti composti: 160 mg di 
peptone; 110 mg di estratto di carne; 30 mg di urea; 28 mg di idrogenofo ­
sfato di potassio (K  2 HPO  4 ); 7 mg di cloruro di sodio (NaCl); 4 mg di 
cloruro di calcio diidrato (C  a Cl 2 .2H  2 O); 2 mg di solfato di magnesio eptai ­
drato (MgSO  4 .7H  2 0). Questi liquami artificiali ricostituiti secondo la for ­
mula OCSE costituiscono un esempio dove la concentrazione media di DOC negli affluenti è di circa 100 mg/l. In alternativa, utilizzare altre composizioni con la stessa concentrazione di DOC, più prossime ai liquami 
reali. I liquami artificiali, a base di acqua distillata, possono essere preparati 
in forma concentrata e conservati a circa 1 °C per una settimana al massimo. Se occorre, diluire con acqua di rubinetto (si tratta, peraltro, di un mezzo organico insoddisfacente in particolare perché la concentrazione di azoto è 
molto elevata e il tenore di carbonio è relativamente basso, ma non è stata 
suggerita un’alternativa migliore, se non attraverso l’aggiunta di un tampone fosfato e di peptone).
 
Liquami domestici  
24. Utilizzare liquami freschi decantati raccolti giornalmente in un impianto di 
trattamento delle acque reflue che riceve principalmente liquami domestici. Occorre prelevare i liquami dallo stramazzo della vasca di sedimentazione 
primaria oppure dall’alimentazione dell’impianto a fanghi attivi; i liquami 
devono essere il più possibile privi delle particelle più grosse. I liquami possono essere utilizzati dopo averli stoccati anche per diversi giorni a 4 °C, se è provato che il DOC (o la COD) non sono diminuiti in modo signifi ­
cativo (vale a dire di più del 20 %) in fase di stoccaggio. Al fine di limitare 
eventuali perturbazioni al sistema, occorre correggere il DOC (o la COD) di ogni nuovo lotto a un valore adeguato costante prima dell’uso, ad esempio diluendolo con acqua.
 
Lubrificante  
25. Per lubrificare i rulli della pompa peristaltica, utilizzare glicerolo od olio 
d’oliva: entrambi sono adatti per i tubi in gomma siliconata.  
Soluzioni madre della sostanza in esame  
26. Per le sostanze che presentano una solubilità adeguata, preparare delle so ­
luzioni madre a concentrazioni idonee (es.: da 1 a 5 g/l) in acqua deionizzata o nella frazione minerale dei liquami artificiali. Per le sostanze insolubili, 
cfr. capitolo C.10-A, appendice 5; non applicare il metodo alle sostanze 
chimiche volatili senza prima modificare i reattori tubolari (paragrafo 16). Determinare il DOC e il TOC della soluzione madre e ripetere le misure per ciascun nuovo lotto. Se la differenza tra il DOC e il TOC supera il 20 %, 
verificare l’idrosolubilità della sostanza chimica in esame. Confrontare il 
DOC o la concentrazione della sostanza in esame misurata attraverso
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un’analisi specifica della soluzione madre a valore nominale, per assicurarsi 
che il tasso di recupero sia sufficiente (solitamente deve superare il 90 %). 
Verificare, in particolare per le dispersioni, se il DOC può essere utilizzato come parametro analitico, o se invece si possa applicare solo una tecnica d’analisi specifica per la sostanza in esame. Le dispersioni impongono il 
ricorso alla centrifuga dei campioni. Per ciascun nuovo lotto, misurare DOC, 
COD o la sostanza in esame attraverso un’analisi specifica.
 
27. Determinare il pH della soluzione madre. I valori estremi indicano che 
l’aggiunta della sostanza chimica può influenzare il pH dei fanghi attivi 
nel sistema di prova. In tal caso, neutralizzare la soluzione madre per 
ottenere un pH di 7 ± 0,5 ricorrendo a piccole quantità di acido o di base inorganica, evitando però la precipitazione della sostanza in esame.
 
PROCEDURA  
Preparazione del mezzo organico da dosare  
28. Pulire accuratamente, all’inizio e durante la prova, tutti i recipienti destinati 
ad affluenti ed effluenti e i tubi che li collegano, per eliminare la prolife ­
razione microbica.  
29. Preparare giornalmente liquami artificiali freschi (paragrafo 23) a partire dai 
solidi o dalla soluzione madre concentrata, diluendo con acqua di rubinetto. Misurare la quantità richiesta in un cilindro e aggiungerla in un recipiente per gli affluenti, pulito. Inoltre, se necessario, aggiungere la quantità richie ­
sta della soluzione madre della sostanza in esame o della sostanza di rife ­
rimento ai liquami artificiali prima della diluzione. Per praticità o per evitare eventuali perdite della sostanza, prepararne a parte una soluzione diluita, in 
un recipiente separato, e caricarla nei tubi inclinati attraverso una diversa 
pompa dosatrice.
 
30. In alternativa (e preferibilmente), usare liquami domestici decantati freschi 
(paragrafo 24), se possibile raccolti giornalmente.  
Funzionamento dei reattori tubolari rotanti  
31. Per valutare una singola sostanza chimica sono necessari due identici reattori 
tubolari, installati in un ambiente a temperatura costante, normalmente a 22 
± 2 °C.  
32. Regolare la pompa peristaltica in modo da caricare 250 ± 25 ml/h del mezzo 
organico (senza sostanza chimica) nei tubi inclinati, che dovranno ruotare a 
18 ± 2 rpm. Applicare il lubrificante (paragrafo 25) ai tubicini della pompa, all’inizio e a intervalli regolari durante la prova, per assicurare un funzio ­
namento corretto e prolungare la durata dei tubicini.
 
33. Regolare l’angolo di inclinazione dei tubi rispetto al piano orizzontale, in 
modo da produrre un tempo di residenza di 125 ± 12,5 sec per il carico nel tubo pulito. Fare una stima del tempo di ritenzione aggiungendo al liquido erogato un marcatore non biologico (es.: NaCl, colorante inerte): il tempo 
necessario a raggiungere la massima concentrazione negli effluenti viene 
considerato tempo medio di ritenzione (nel momento di massimo sviluppo del film, il tempo di ritenzione può aumentare fino a 30 minuti circa).
 
34. È stato confermato che i tassi, le velocità e i tempi indicati producono 
percentuali di eliminazione adeguate (> 80 %) del DOC (o COD) ed ef ­
fluenti nitrificati. La portata del flusso va modificata se l’eliminazione è insufficiente o se va simulato il funzionamento di un particolare impianto di depurazione. In quest’ultimo caso, occorre continuare a regolare il do ­
saggio del mezzo organico fino a ottenere una prestazione del reattore 
identica a quella dell’impianto di depurazione.
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Inoculazione  
35. In caso si faccia uso di liquami artificiali, l’inoculazione per via aerea può 
essere sufficiente ad avviare la proliferazione dei microrganismi; altrimenti aggiungere al liquido erogato 1 ml/l di liquami decantati, per 3 giorni.
 
Misurazioni  
36. Verificare, ad intervalli regolari, che i dosaggi e le velocità di rotazione 
rientrino nei limiti richiesti. Inoltre, misurare il pH degli effluenti, special ­
mente se si prevede che si verifichi nitrificazione.  
Campionamento e analisi  
37. Il metodo, la modalità e la frequenza del campionamento vengono scelti in 
funzione dello scopo prefisso della prova. Ad esempio, è possibile prelevare campioni di affluenti o effluenti con un campionamento istantaneo oppure 
su un periodo più lungo (es.: 3-6 ore). Nel corso del primo periodo, e quindi 
senza sostanza chimica in esame, prelevare dei campioni due volte la setti ­
mana. Filtrare i campioni tramite membrane o centrifugarli a circa 40 000 m/sec
 2 per più o meno 15 minuti (paragrafo 18). Potrebbe essere necessario 
far decantare e/o passare i campioni da un filtro grossolano prima di filtrarli 
tramite membrane. Determinare il DOC o la COD almeno due volte e, se richiesto, il BOD, l’ammonio e i nitriti/nitrati.
 
38. Dopo la raccolta e la preparazione dei campioni, occorre svolgere le analisi 
il più rapidamente possibile. In caso fosse necessario rimandare le analisi, conservare i campioni a circa 4 °C al buio, in bottiglie piene ed ermetica ­
mente chiuse. Se è necessario stoccare i campioni per più di 48 h, la 
conservazione può avvenire tramite congelazione, acidificazione o aggiunta 
di una sostanza tossica idonea [es. 20 ml/l di una soluzione di cloruro di mercurio (II) a 10 g/l]. Assicurarsi che la tecnica di conservazione non 
incida sui risultati dell’analisi.
 
Periodo di attivazione  
39. Si tratta del periodo nel quale il biofilm cresce fino ad ottenere lo spessore 
ottimale: generalmente due settimane e comunque non più di sei. L’elimi ­
nazione (paragrafo 44) del DOC (o della COD) aumenta e raggiunge un 
valore di plateau: una volta raggiunto un valore di plateau simile in entrambi 
i tubi, sceglierne uno che diventerà l’unità di controllo per il resto della prova, durante la quale le loro prestazioni devono rimanere coerenti.
 
Addizione della sostanza chimica in esame  
40. A questo punto, aggiungere all’altro tubo reattore la sostanza chimica in 
esame nella concentrazione richiesta, di solito 10-20 mg C/l, mentre nel reattore di controllo viene aggiunto solo il mezzo organico.
 
Periodo di acclimatazione  
41. Continuare a svolgere analisi con cadenza bisettimanale per il DOC (o la 
COD) e, se è necessario valutare la biodegradabilità, misurare anche la 
concentrazione della sostanza in esame attraverso analisi specifiche. Lasciare acclimatare per un periodo da una a sei settimane (o più a lungo se sussi ­
stono condizioni particolari) dopo la prima addizione della sostanza in esa ­
me. Quando la percentuale di eliminazione (paragrafi 43-45) raggiunge il 
valore massimo, ottenere 12-15 valori validi nella fase di plateau nel corso di 3 settimane per calcolare la percentuale media di eliminazione. La prova è considerata conclusa se si è raggiunta una percentuale di eliminazione suf ­
ficientemente alta. La prova non deve generalmente estendersi al di là delle 
12 settimane a partire dalla prima addizione della sostanza in esame.
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Distacco del biofilm  
42. Dalle pareti dei tubi si distaccano, ad intervalli piuttosto regolari, delle 
grandi quantità di biofilm. Per assicurare che ciò non incida sulla confron ­
tabilità dei risultati, fare in modo che le prove coprano un periodo equiva ­
lente ad almeno due cicli completi di crescita e distacco.  
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
43. Per ogni valutazione programmata, calcolare la percentuale di eliminazione 
della sostanza in esame in termini di DOC (o di COD) ricorrendo alla seguente equazione:
 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
dove:  
D t = percentuale di eliminazione del DOC o della COD al tempo t;  
C s = concentrazione del DOC (o della COD) negli affluenti dovuta alla 
sostanza chimica in esame, preferibilmente stimata a partire dalla concentrazione della soluzione madre immessa (mg/l) e dal suo vo ­
lume;
 
E = valore del DOC (o della COD) misurato negli effluenti di prova al 
tempo t (mg/l);  
E o = valore del DOC (o della COD) misurato negli effluenti di controllo al 
tempo t (mg/l).  
Ripetere il calcolo per la sostanza chimica di riferimento, se sottoposta a 
prova.  
Prestazioni del reattore di controllo  
44. Il grado di eliminazione del DOC o della COD (D  B ) dal mezzo organico 
dell’unità di controllo è utile per valutare l’attività di biodegradazione del 
biofilm nel corso della prova. Calcolare la percentuale di eliminazione ri ­
correndo alla seguente equazione:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
dove:  
C m = DOC (o COD) del mezzo organico negli affluenti di controllo 
(mg/l).  
45. Calcolare l’eliminazione (D  ST ) della sostanza in esame, se misurata, ricor ­
rendo a un metodo di analisi specifico ad ogni misurazione, con la seguente equazione:
 
DST ¼ 100ð1 Ä Se=Si %  
dove:  
Si = concentrazione misurata o, preferibilmente, stimata della sostanza 
chimica in esame negli affluenti di prova (mg/l)  
Se = concentrazione misurata della sostanza chimica in esame negli ef ­
fluenti di prova al tempo t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 961
 
Se il metodo di analisi produce un valore positivo nei liquami non arricchiti 
equivalente a Sc mg/l, calcolare la percentuale di eliminazione (D  SC ) ricor­
rendo alla seguente equazione:  
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Espressione dei risultati della prova  
46. Tracciare su un grafico le curve dell’eliminazione D  t e D  ST (o D  SC ), se del 
caso, in funzione del tempo (cfr. capitolo C.10-A, appendice 2). Utilizzare la media (arrotondata all’unità più vicina) e la deviazione standard dei 12-15 valori ottenuti per D
 T (e per D  ST , se disponibile) durante la fase di plateau, 
come percentuale di eliminazione della sostanza in esame. A partire dall’an ­
damento della curva di eliminazione si possono trarre alcune conclusioni sui processi di eliminazione.
 
Adsorbimento  
47. Se già dall’inizio della prova si osserva una forte eliminazione della sostanza 
in esame in termini di DOC, la sostanza è stata probabilmente eliminata 
tramite adsorbimento sul biofilm. Dovrebbe essere possibile confermare tale ipotesi determinando la quantità della sostanza in esame adsorbita sui solidi distaccati dal film. È raro che l’eliminazione del DOC delle sostanze adsor ­
bibili si mantenga elevata nel corso di tutta la prova; normalmente, il grado 
di eliminazione è elevato all’inizio per poi declinare progressivamente fino a raggiungere un valore di equilibrio. Tuttavia, se la sostanza chimica adsor ­
bibile in esame fosse tale da causare, in un modo o nell’altro, un’acclima ­
tazione della popolazione microbica, l’eliminazione del DOC della sostanza 
chimica aumenterebbe fino a raggiungere un elevato valore di plateau.
 
Fase di latenza  
48. Molte delle sostanze chimiche in esame, analogamente a quanto avviene 
nelle prove di screening statiche, attraversano una fase di latenza prima 
che avvenga una biodegradazione a pieno regime. Nel corso della fase di 
latenza, l’acclimatazione o l’adattamento dei batteri degradanti avviene senza che si produca, o quasi, l’eliminazione della sostanza in esame; in seguito i batteri cominciano a proliferare. Al termine di questa fase, quando 
circa il 10 per cento della quantità iniziale della sostanza in esame viene 
eliminata (compreso anche per adsorbimento, se del caso) si suppone, arbi ­
trariamente, che inizi la fase di degradazione. Il tempo di latenza è spesso notevolmente variabile e scarsamente riproducibile.
 
Fase di plateau  
49. La fase di plateau di una curva di eliminazione in un test in continuo è 
definita come la fase nella quale si raggiunge il massimo livello di degra ­
dazione. La fase dovrebbe protrarsi per almeno 3 settimane ed essere deter ­
minata attraverso la misurazione di 12-15 valori validi.  
Grado medio di eliminazione della sostanza chimica in esame  
50. Calcolare il valore medio a partire dai valori di eliminazione D  t (e D  st , se 
disponibile) della sostanza in esame durante la fase di plateau. Arrotondata 
all’unità più vicina (1 %), tale media rappresenta il grado di eliminazione della sostanza in esame. Si raccomanda inoltre di calcolare l’intervallo di confidenza (95 %) del valore medio. Utilizzare lo stesso metodo per calco ­
lare il valore medio (D
 B ) di eliminazione del mezzo organico nel recipiente 
di controllo.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 962
 
Indicazione della biodegradazione  
51. Se la sostanza in esame non viene adsorbita in modo significativo sul 
biofilm e se la curva di eliminazione presenta il profilo tipico di una curva di biodegradazione con fasi di latenza, di degradazione e di plateau (cfr. 
paragrafi 48 e 49), l’eliminazione misurata può essere attribuita con certezza 
alla biodegradazione. Se il livello di eliminazione è alto in fase iniziale, la prova di simulazione non consente di distinguere tra i processi di elimina ­
zione biologici e abiotici. In questi casi, come nei casi in cui la biodegra ­
dazione suscita dubbi (ad esempio, quando si osserva un fenomeno di 
stripping), occorre analizzare le sostanze in esame adsorbite su campioni del biofilm oppure effettuare prove di biodegradazione statiche supplemen ­
tari basate su parametri che indicano chiaramente i processi biologici. Si 
tratta di prove che si basano sul consumo di ossigeno (capitolo C.4 del presente allegato, lettere D, E e F) o sulla produzione di CO
 2 (capitolo 
C.4-C, del presente allegato, ovvero prova del CO  2 nello spazio di testa) 
(10); occorre usare come inoculo del biofilm pre-esposto proveniente dal 
reattore idoneo.  
52. Se sono state misurate sia l’eliminazione del DOC sia l’eliminazione della 
sostanza chimica specifica, la presenza di differenze significative (essendo la 
prima inferiore alla seconda) tra le percentuali indica che gli effluenti con ­
tengono dei prodotti organici intermedi probabilmente più difficili da degra ­
dare rispetto al composto progenitore, che vanno sottoposti ad analisi.  
Validità dei risultati della prova  
53. Il test è da considerare valido se il grado di eliminazione del DOC (o della 
COD), D  B , nelle unità di controllo è superiore all’80 % dopo due settimane 
e se non si osserva alcun fenomeno insolito.  
54. Se è stata testata una sostanza (di riferimento) prontamente biodegradabile, il 
grado di biodegradazione deve essere superiore al 90 % e la differenza tra i valori determinati nelle repliche non deve eccedere il 5 %. Se i due criteri 
non vengono soddisfatti, è necessario rivedere le procedure sperimentali e/o 
prelevare i liquami domestici da un’altra fonte.
 
55. Analogamente, i valori di biodegradazione ottenuti nelle unità replica dove è 
stata trattata la sostanza in esame (se ne sono state utilizzate), non devono presentare differenze superiori al 5 %. Se questo criterio non viene rispettato ma i tassi di eliminazione sono alti, occorre continuare le analisi per altre tre 
settimane. Se il tasso di eliminazione è basso, si devono studiare gli effetti 
inibitori della sostanza chimica, se non sono già conosciuti, e ripetere la prova con una concentrazione più bassa della sostanza, se possibile.
 
Relazione  
56. La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza chimica in esame:  
— dati identificativi,  
— natura fisica e, se del caso, proprietà chimico-fisiche.  
Condizioni sperimentali:  
— qualsiasi modifica al sistema di prova, specialmente se vengono utiliz ­
zate sostanze insolubili o volatili,  
— tipo di mezzo organico,  
— proporzione e natura degli effluenti industriali presenti nei liquami, se 
l’informazione è pertinente e conosciuta,  
— modalità di inoculazione,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 963
 
— soluzione madre della sostanza in esame: tenore in DOC (carbonio 
organico disciolto) e TOC (carbonio organico totale); modalità di pre ­
parazione, se si tratta di una sospensione; concentrazione o concentra ­
zioni usate per la prova; giustificare, eventualmente, i valori che si discostano dall’intervallo 10-20 mg/l di DOC; modalità di addizione; 
data della prima addizione; eventuali cambiamenti nella concentrazione,
 
— tempo medio di ritenzione idraulica (senza crescita); velocità di rota ­
zione del tubo; angolo di inclinazione approssimativo, se possibile,  
— dettagli sul distacco del biofilm; tempo e intensità,  
— temperatura della prova e gamma di temperature,  
— tecniche di analisi utilizzate.  
Risultati della prova:  
— tutti i dati derivanti dalle misurazioni: DOC, COD, analisi specifiche, 
pH, temperatura, sostanze azotate, se rilevante,  
— tutti i valori calcolati per D  t (o D  tc ) D  B e D  S , presentati sotto forma di 
tabella e di curve di eliminazione,  
— informazioni sulle fasi di latenza e di plateau, la durata della prova, il 
grado di eliminazione della sostanza in esame, della sostanza di riferi ­
mento (se testata) e del mezzo organico (nell’unità di controllo), insieme 
ad informazioni statistiche e conclusioni sulla biodegradabilità e sulla 
validità della prova,  
— discussione dei risultati.  
BIBLIOGRAFIA  
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waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London.
 
(9) Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della «pronta» ( ready ) 
biodegradabilità, lettere da A a F.  
(10) ISO 14593 (1998) Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 964
 
Appendice 8  
Figura 1  
Tubi rotanti
  
Legenda:  
Vista in pianta  
Vista A/B  
Ruote motrici  
Ruote non motrici  
Motore con alimentazione  
Riduttore  
Flangia interna  
Meccanismo d’inclinazione  
Trasmissione a coppia conica  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 965
 
Figura 2  
Schema di flusso
  
A: Recipiente di alimentazione  
B: Pompa peristaltica  
C: Tubo rotante  
D: Recipiente di raccolta degli effluenti  
DEFINIZIONI  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  
Sostanza chimica (in inglese chemical):  occorre notare che il termine « chemical » 
viene ampiamente utilizzato negli accordi UNCED e nei documenti posteriori e include sostanze, prodotti, miscele, preparazioni o qualsiasi altro termine utiliz ­
zato nei sistemi esistenti per descrivere i prodotti chimici in questione.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 966
 
C.11.  BIODEGRADAZIONE  
FANGHI ATTIVI: SAGGIO DI INIBIZIONE DELLA RESPIRAZIONE  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Con il metodo qui descritto si valuta l'effetto della sostanza in esame 
sui microorganismi misurando la velocità di respirazione in determi ­
nate condizioni alla presenza di diverse concentrazioni della sostanza stessa.
 
Il metodo ha lo scopo di fornire un procedimento rapido di «scree ­
ning» per l'identificazione delle sostanze che possono avere effetti 
nocivi sugli impianti di trattamento batterico aerobio e per indicare le concentrazioni della sostanza in esame, che non provocano effetti inibitori, da usare nei saggi di biodegradabilità.
 
Si può fare precedere la prova definitiva da una prova orientativa che 
consenta di avere delle informazioni sull'intervallo di concentrazioni 
da usare nel saggio.  
Nel programma del saggio vengono inclusi due controlli senza la 
sostanza da esaminare, da utilizzare uno all'inizio e l'altro alla fine 
della serie di saggi. Ciascun gruppo di fanghi attivi dovrebbe essere anche controllato con una sostanza di riferimento.
 
Il presente metodo si applica più facilmente a quelle sostanze che 
grazie alla loro idrosolubilità ed alla loro bassa volatilità, perman ­
gano prevalentemente in acqua.  
Per le sostanze che hanno invece una limitata solubilità nei mezzi di 
trattamento, può non essere possibile determinare la EC  50. 
Quando la sostanza in esame ha tendenza a disaccoppiare la fosfo ­
rilazione ossidativa, i risultati basati sull'assunzione di ossigeno pos ­
sono condurre ad errate conclusioni.  
Per eseguire il saggio è utile disporre delle seguenti informazioni:  
— idrosolubilità,  
— tensione di vapore,  
— formula di struttura,  
— grado di purezza della sostanza in esame.  
Raccomandazione  
I fanghi attivi possono contenere organismi potenzialmente patogeni 
e dovrebbero perciò essere maneggiati con cautela.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
La velocità di respirazione è il consumo di ossigeno da parte di 
microrganismi del fango aerobio di acque reflue ed è espresso ge ­
neralmente in mg di O  2 per mg di fango per ora.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 967
 
Per calcolare l'effetto inibitorio della sostanza in esame ad una data 
concentrazione, la velocità di respirazione si esprime come percen ­
tuale della media delle velocità di respirazione dei due controlli:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ percentuale di inhibizione  
dove:  
R s = velocità di consumo di ossigeno alla concentrazione sag ­
giata della sostanza in esame  
R c1 = velocità di consumo di ossigeno nel controllo 1,  
Rc 2 = velocità di consumo di ossigeno nel controllo 2.  
Ec 50 è, in questo metodo, la concentrazione della sostanza in esame 
alla quale la velocità di respirazione risulta pari al 50 % di quella 
rilevata nel controllo nelle condizioni qui descritte.  
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Per controllare che la sensibilità del fango sia normale si raccomanda 
di usare come sostanza di riferimento il 3,5-diclorofenolo, noto come 
inibitore della respirazione, e di sottoporlo a determinazione della 
EC 50 in ciascun gruppo di fanghi attivi.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
La velocità di respirazione di un fango attivo, alimentato con una 
quantità standard di liquame sintetico, è misurato dopo un tempo di contatto di 30 minuti o/e di 3 ore. Si misura anche la velocità di respirazione dello stesso fango attivo in presenza di diverse concen ­
trazioni della sostanza in esame in condizioni per il resto identiche. 
L'effetto inibitorio della sostanza in esame ad una data concentra ­
zione è espresso come percentuale delle velocità medie di respira ­
zione dei due controlli. Dalle determinazioni a diverse concentrazioni 
si calcola un valore della Ec
 50 . 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
I risultati del saggio sono validi se:  
— le velocità di respirazione dei controlli differiscono entro il 15 %,  
— la EC  50 (30 minuti e/o 3 ore) del 3,5-diclorofenolo cade nell'in ­
tervallo accettato compreso fra 5 e 30 mg/l.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Reagenti  
1.6.1.1. S o l u z i o n i d e l l a s o s t a n z a i n e s a m e  
Le soluzioni della sostanza in esame vengono preparate all'inizio 
dello studio impiegando una soluzione madre. Se si segue il proce ­
dimento di cui sotto, è opportuno che la concentrazione della solu ­
zione madre sia di 0,5 g/l.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 968
 
1.6.1.2. S o l u z i o n e d e l l a s o s t a n z a d i r i f e r i m e n t o  
Si può preparare ad esempio una soluzione di 5,5-diclorofenolo scio ­
gliendo 0,5 g di 3,5 diclorofenolo in 10 ml di NaOH lM, diluendo quindi con acqua distillata sino a circa 30 ml, addizionando (mentre 
si agita) H
 2 SO 4 0,5M sino al punto di precipitazione incipiente — 
occorreranno circa 8 ml di H  2 SO 4 0,5M — e diluendo infine la 
miscela con acqua distillata sino al volume di 1 litro. Il pH dovrebbe allora avere un valore compreso fra 7 e 8.
 
1.6.1.3. L i q u a m e s i n t e t i c o  
Una alimentazione di liquame sintetico si ottiene sciogliendo in un 
litro di acqua le seguenti sostanze nelle quantità precisate:  
— 16 g di peptone,  
— 11 g di estratto di carne,  
— 3 g di urea,  
— 0,7 g di NaCl,  
— 0,4 g di CaCl  2 2H 2 O, 
— 0,2 g di MgSO  4 7H 2 O, 
— 2,8 g di K  2 HPO  4 . 
Nota 1:  Questo liquame sintetico è 100 volte più concentrato di 
quello descritto in OECD Technical Report, «Metodo proposto per 
la determinazione della biodegradabilità dei tensioattivi impiegati nei detersivi sintetici» (11 giugno 1976), con l'aggiunta di fosfato acido di potassio.
 
Nota 2:  La soluzione preparata, se non viene utilizzata subito, dovrà 
essere conservata ai buio a temperature comprese tra 0  o C e 4  o C per 
non oltre una settimana, in condizioni tali da non subire alterazioni 
nella composizione. Inoltre, prima della conservazione la soluzione 
potrà essere sterilizzata oppure si potranno aggiungere il peptone e l'estratto di carne solo poco prima di effettuare l'analisi. Prima del ­
l'uso la soluzione dovrà essere agitata ed il suo pH dovrà essere 
corretto.
 
1.6.2.  Apparecchiatura  
Apparecchiatura di misurazione: non è importante che l'apparecchio 
abbia una forma precisa. Comunque, la bottiglia di misurazione do ­
vrebbe essere completamente piena e la sonda dovrebbe aderire er ­
meticamente al collo.  
È necessaria la normale dotazione di laboratorio ed in particolare:  
— apparecchio di misurazione,  
— sistema di aerazione,  
— elettrodo per pH e relativa apparecchiatura di misurazione,  
— elettrodo ad ossigeno.  
1.6.3.  Preparazione dell'inoculo  
Come inoculo batterico per il saggio si impiega fango attivo prove ­
niente da un impianto di trattamento di liquami prevalentemente 
domestici.  
Se necessario, al ritorno in laboratorio, si possono rimuovere le 
particelle grossolane mediante sedimentazione per un breve periodo ad esempio per 15 minuti, e, quindi, decantare, per l'uso, lo strato 
superficiale contenente le particelle solide più piccole, In alternativa 
il fango può essere miscelato per pochi secondi con un agitatore.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 969
 
Inoltre, ove si presume la presenza di materiali inibenti, il fango 
dovrebbe essere lavato con acqua di rubinetto o con soluzione iso ­
tonica. Dopo centrifugazione si decanta il surnatante (questo proce ­
dimento si ripete per tre volte).  
Una piccola quantità di fango umido viene pesata, essiccata e ripe ­
sata. In questo modo si può calcolare la quantità di fango umido da sospendere in acqua per ottenere un fango attivo con una quantità di 
solidi sospesi nel liquido chiarificato compresa tra 2 e 4 g/l. Questa 
quantità dà una concentrazione compresa tra 0,8 e 1,6 g/l nel mezzo utilizzato per il saggio, se si segue la procedura raccomandata più 
sotto.
 
Se il fango non può essere utilizzato il giorno stesso del prelievo, ad 
ogni litro del fango attivo preparato come sopra si aggiungono 50 ml 
di liquame sintetico; il fango viene quindi aerato per tutta la notte a 20
 o C ± 2  o C). L'aerazione viene mantenuta anche durante la gior ­
nata in attesa dell'uso prima del quale si controlla e, se necessario, si 
tampona il pH fra 6 e 8. I solidi sospesi nel liquido chiarificato si dovrebbero determinare come descritto nel precedente paragrafo.
 
Se si deve impiegare lo stesso gruppo di fanghi nei giorni successivi 
(quattro giorni al massimo), alla fine di ogni giornata di lavoro occorrerà aggiungere altri 50 ml di liquame sintetico, per litro di 
fango.
 
1.6.4.  Esecuzione del saggio  
Durata/tempo di contatto: 30 minuti e/o 3 ore, sotto aerazione 
Acqua: acqua potabile (se necessario declorata) Alimentazione di aria: aria pulita, esente da oli; flusso da 0,5 a 
1 l/min 
Apparecchiatura di misu ­
razione: bottiglia a fondo piatto del tipo della 
bottiglia per la determinazione del BOD 
Ossimetro: idoneo elettrodo ad ossigeno con regi ­
stratore 
Soluzione nutritiva: liquame sintetico (vedi sopra) Sostanza in esame: la soluzione in esame è preparata in 
concomitanza all'inizio del saggio 
Sostanza di riferimento: ad esempio 3,5-diclorofenolo (almeno 
tre concentrazioni) 
Controlli: campioni inoculati esenti dalla sostanza 
in esame 
Temperatura: 20
 o C ± 2  o C. 
Si descrive in seguito un procedimento sperimentale che può essere 
seguito sia per la sostanza in esame che per quella di riferimento durante il periodo di contatto di tre ore.
 
Occorrono diversi recipienti (ad esempio becher da 1 litro).  
Si dovrebbe impiegare una serie di almeno cinque concentrazioni che 
differiscano tra di loro di un fattore costante di preferenza non su ­
periore a 3,2.  
Al tempo «0», si portano 16 ml di liquame sintetico a 300 ml con 
acqua. Si aggiungono 200 ml di inoculo batterico e si versa la 
miscela totale (500 ml) in un primo recipiente (primo controllo C  1 ). ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 970
 
I recipienti in esame dovrebbero essere aerati continuativamente in 
modo da impedire che il livello di O  2 disciolto scenda al di sotto di 
2,5 ml/l ed in modo che, subito prima di misurare la velocità di respirazione, la concentrazione di O
 2 sia almeno uguale a 6,5 mg/l.  
Al tempo «15 minuti» (15 minuti è un intervallo arbitrario ma ade ­
guato) si ripete la stessa operazione salvo che 100 ml della soluzione madre della sostanza in esame vengono aggiunti ai 16 ml di liquame 
sintetico prima di addizionare l'acqua sino a 300 ml e l'inoculo 
batterico sino al volume di 500 ml. Questa miscela viene quindi versata in un secondo recipiente ed aerata come sopra. Si ripete questo procedimento ad intervalli di 15 minuti con differenti volumi 
della soluzione madre della sostanza in esame, in modo da disporre 
di una serie di recipienti contenenti diverse concentrazioni della sostanza in esame. Infine si prepara un secondo controllo (C
 2 ). 
Dopo tre ore si determina il pH e si versa un'aliquota ben miscelata 
del contenuto del primo recipiente nell'apparecchio di misurazione e 
si misura la velocità di respirazione per un tempo fino a 10 minuti.  
Questa determinazione viene ripetuta sul contenuto di ciascun reci ­
piente ad intervalli di 15 minuti, in modo che il tempo di contatto 
per ogni recipiente sia di tre ore.  
La sostanza di riferimento viene saggiata nello stesso modo su cia ­
scun gruppo di inoculi batterici.  
Quando si devono effettuare misurazioni dopo 30 minuti di contatto, 
occorre un procedimento diverso (ad esempio con più di un ossimetro).  
Se si richiede la misura del consumo di ossigeno, si preparano altre 
bottiglie contenenti la sostanza in esame, il liquame sintetico ed acqua ma non fango attivo. Il consumo di ossigeno si misura e 
registra dopo un periodo di aerazione di 30 minuti e/o 3 ore (tempo 
di contatto).
 
2. DATI E VALUTAZIONE  
La velocità di respirazione si calcola dal tracciato del registratore 
nell'intervallo che va da circa 2,5 a 6,5 mg O  2 /l, oppure, se la 
velocità di respirazione è bassa, per un periodo di 10 minuti. Il tratto di curva di respirazione in cui si misura la velocità di respirazione 
dovrebbe essere lineare.
 
Se le velocità di respirazione dei due controlli differiscono tra loro di 
più del 15 % o se la EC  50 (30 minuti e/o 3 ore) della sostanza di 
riferimento non cade nell'intervallo ammesso (da 5 a 30 mg/l per il 3,5-diclorofenolo), la prova non è valida e deve essere ripetuta.
 
Per ogni concentrazione in esame si calcola la percentuale di inibi ­
zione (vedi paragrafo 1.2). Quest'ultima viene riportata in grafico, su 
carta log-normale (o log-probability), in funzione della concentra ­
zione e si ricava un valore di EC  50 . 
Usando procedimenti standard si possono determinare i limiti di 
confidenza al 95 % per i valori della EC  50 . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 971
 
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— sostanza in esame: dati di identificazione chimica,  
— sistema di saggio: origine, concentrazione ed eventuali tratta ­
menti preliminari del fango attivo,  
— condizioni del saggio:  
— pH della miscela in esame prima di determinare la respira ­
zione,  
— temperatura,  
— durata,  
— sostanza di riferimento e relativa EC  50 misurata,  
— eventuale assunzione abiotica di ossigeno,  
— risultati:  
— tutti i dati misurati,  
— curva di inibizione e metodo per il calcolo della EC  50 , 
— EC  50 e, se possibile, limiti di confidenza al 95 %, EC  20 ed 
EC 10, 
— tutte le osservazioni e le eventuali deviazioni dal presente 
metodo che potrebbero aver condizionato il risultato.  
3.2. INTERPRETAZIONE DEI DATI  
Dal momento che le complesse interazioni che si hanno nell'am ­
biente non possono essere fedelmente riprodotte in un saggio di 
laboratorio, il valore della EC  50 dovrebbe essere considerato sem ­
plicemente come una indicazione della probabile tossicità della so ­
stanza in esame per il fango attivo usato nel trattamento dei liquami 
o per i microorganismi delle acque reflue. Inoltre, le sostanze in 
esame aventi effetto inibitorio sull'ossidazione dell'ammoniaca pos ­
sono anche causare curve di inibizione atipiche. Di conseguenza cali curve dovranno essere interpretate con cautela.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
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del Consiglio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 972
 
C.12.  BIODEGRADAZIONE  
SAGGIO SCAS MODIFICATO  
1. METODO  
1.1. INTRODUZIONE  
Scopo del metodo è quello di valutare la potenziale biodegradabilità 
ultima di sostanze organiche solubili in acqua e non volatili, esposte per un lungo periodo a concentrazioni relativamente elevate di mi ­
croorganismi. La vitalità dei microorganismi viene mantenuta per 
tutto il periodo aggiungendo giornalmente liquami decantati. (Per 
l'intervallo di fine settimana, i liquami possono essere conservati a 4
 o C. In alternativa si può usare il liquame sintetico del saggio di 
conferma OCSE.)  
Nell'interpretazione dei risultati occorre tenere conto dell'eventuale 
assorbimento fisico-chimico della sostanza in esame sui solidi in sospensione (cfr. paragrafo 3.2).
 
A causa del lungo periodo di ritenzione della fase liquida (36 ore) e 
dell'aggiunta intermittente di nutrienti, la prova non riproduce le 
stesse condizioni che si hanno in un impianto per il trattamento dei liquami. I risultati ottenuti con diverse sostanze indicano che il sistema ha un elevato potenziale di biodegradazione.
 
Le condizioni sperimentali sono estremamente favorevoli alla sele ­
zione e/o all'adattamento di microorganismi capaci di degradare il 
composto in esame (si può seguire questo procedimento anche per produrre inoculi acclimatati da utilizzare in altri saggi).
 
Nel presente metodo la biodegradabilità ultima delle sostanze in 
esame viene determinata attraverso la misura della concentrazione 
del carbonio organico disciolto (DOC) (è preferibile determinare il DOC dopo acidificazione e depurazione anziché dalla differenza C
 totale — C  inorganico  ). 
L'impiego simultaneo di un metodo analitico specifico consente di 
determinare la degradazione primaria della sostanza (modifica della 
struttura chimica della sostanza in esame).  
Il metodo può essere applicato soltanto alle sostanze organiche che 
alle concentrazioni impiegate per il saggio:  
— sono solubili in acqua (almeno 20 mg/l di carbonio organico 
disciolto),  
— hanno una tensione di vapore trascurabile,  
— non esercitano effetti inibitori sui batteri,  
— non vengono assorbite in modo significativo dal sistema speri ­
mentale,  
— non vengono sottratte alla soluzione in esame mediante forma ­
zione di schiume.  
Occorre determinare il contenuto di carbonio organico della sostanza 
in esame.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 973
 
Per l'interpretazione dei risultati ottenuti, in particolare nei casi in cui 
i valori siano bassi o trascurabili, sarà utile disporre di informazioni 
sulle proporzioni relative dei principali componenti della sostanza in esame.
 
Per l'interpretazione di eventuali valori bassi e per la scelta di una 
concentrazione adeguata al saggio, può essere utile disporre di in ­
formazioni sulla tossicità della sostanza per i microorganismi.  
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
C T = concentrazione della sostanza in esame espressa come carbo ­
nio organico presente o addizionato al liquame sedimentato all'inizio dei periodo di aerazione (mg/l)
 
C t = concentrazione del carbonio organico disciolto rinvenuto nel 
surnatante del saggio alla fine del periodo di aerazione (mg/l)  
C c = concentrazione del carbonio organico disciolto rinvenuto nel 
surnatante del controllo alla fine del periodo di aerazione (mg/l)
 
Nel presente metodo la biodegradazione è definita come elimina ­
zione del carbonio organico. La biodegradazione può essere espressa come:
 
1) la rimozione percentuale D  Da della sostanza aggiunta giornalmente:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100 [1]  
dove:  
D da = degradazione/aggiunta giornaliera.  
2) la rimozione percentuale D  ssd di sostanza rispetto a quella pre ­
sente all'inizio di ogni giorno:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2 (b)]  
dove:  
D ssd = degradazione/sostanza iniziale giornaliera.  
Gli indici i e (i + 1) si riferiscono al giorno in cui si effettua la 
misurazione.  
L'equazione 2(a) è consigliata se il DOC dell'effluente varia gior ­
nalmente mentre l'equazione 2(b) può essere usata quando il DOC 
dell'effluente rimane relativamente costante da un giorno all'altro.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 974
 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
In alcuni casi quando si esamina una nuova sostanza, possono essere 
utili delle sostanze di riferimento; ciò nonostante non si propogono qui sostanze di riferimento specifiche.
 
Nell'appendice I vengono forniti dati relativi a numerosi composti 
analizzati in un saggio interlaboratorio soprattutto per consentire di 
tanto in tanto la calibrazione del metodo e per rendere possibile il 
confronto dei risultati quando se ne adotta un altro.  
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
I fanghi arrivi provenienti da un impianto di trattamento dei liquami 
vengono posti in una unità semicontinua per fanghi attivi (SCAS). Si 
aggiungono il composto in esame e liquame domestico sedimentato; si effettua l'aerazione della miscela per 23 ore. Quindi si interrompe 
l'aerazione, si lasciano decantare i fanghi e si rimouve il surnatante.
 
I fanghi che rimangono nella camera di aerazione vengono quindi 
mescolati con un'altra aliquota del composto in esame e del liquame, 
e si ripete il ciclo.  
La biodegradazione si ricava determinando la quantità di carbonio 
organico disciolto nel surnatante. Tale valore viene confrontato con 
quello trovato nel surnatante del controllo contenente soltanto li ­
quame decantato.  
Se si utilizza un metodo analitico specifico si possono determinare le 
variazioni di concentrazione della sostanza in esame dovute alla biodegradazione (biodegradabilità primaria).
 
1.5. CRITERI DI QUALITÀ  
La riproducibilità di questo metodo basato sulla rimozione di carbo ­
nio organico disciolto non è stata ancora dimostrata. (Se si prende in considerazione la biodegradazione primaria si ottengono dati molto 
precisi per sostanze che siano estesamente degradate.)
 
La sensibilità del metodo dipende soprattutto dalla variabilità del 
bianco ed in minor misura dalla precisione della determinazione 
del carbonio organico disciolto e dalla quantità del composto in esame presente nel liquido all'inizio di ogni ciclo.
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Preparazioni  
Per ciascuna sostanza in esame e per i controlli si collega un numero 
sufficiente di unità di aerazione pulite (in alternativa si può usare 
l'unità originale per il saggio SCAS da 1,5 litri) con i tubi di presa 
dell'aria (figura 1). L'aria compressa inviata nelle unità di saggio, purificata con un filtro di cotone grezzo, deve essere esente da carbonio organico e satura di acqua per ridurre le perdite per eva ­
porazione.
 
Da un impianto di trattamento a fanghi attivi adibito prevalentemente 
a liquami domestici si preleva un campione di liquido chiarificato, 
contenente da 1 a 4 g/l di solidi sospesi. Per ciascuna unità di 
aerazione occorrono circa 150 ml di liquido chiarificato.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 975
 
Si preparano con acqua distillata le soluzioni madri della sostanza in 
esame; di solito è richiesta una concentrazione di 400 mg/l di car ­
bonio organico che, se non ha luogo biodegradazione, corrisponde ad una concentrazione di sostanza in esame pari a 20 mg/l di carbonio all'inizio di ogni ciclo di aerazione.
 
Se la tossicità per i microorganismi lo consente si possono avere 
concentrazioni più elevate.  
Si misura la concentrazione di carbonio organico nelle soluzioni 
madri.  
1.6.2.  Condizioni del saggio  
Il saggio va effettuato da 20 a 25  o C. 
Si utilizza un'elevata concentrazione di microorganismi aerobici (da 
1 a 4 g/l di solidi sospesi) ed il periodo di ritenzione effettivo è di 36 
ore. In genere, otto ore dopo l'avvio di ciascun ciclo di aerazione, il 
carbonio organico contenuto nei liquami immessi è ampiamente os ­
sidato. Dopo ha inizio la respirazione endogena del fango che si manterrà per tutto il rimanente periodo di aerazione, durante il quale 
il solo substrato disponibile è la sostanza in esame a meno che non 
venga anch'essa metabolizzata rapidamente. Questi fattori, unita ­
mente alla reinoculazione giornaliera del sistema (cfr. paragrafo 1.4), nel caso in cui si usino come mezzo liquami domestici, crea condi ­
zioni estremamente favorevoli sia per l'acclimatazione, sia per otte ­
nere elevati valori di biodegradazione.
 
1.6.3.  Esecuzione del saggio  
Si preleva un campione del liquido chiarificato da un idoneo im ­
pianto a fanghi attivi per il trattamento di liquami in prevalenza 
domestici oppure da un impianto di laboratorio e si mantiene in 
condizioni aerobiche sino all'impiego in laboratorio. Si riemie cia ­
scuna unità di aerazione e l'unità di controllo con 150 ml (se si 
utilizza l'unità originale per il saggio SCAS, moltiplicare i volumi 
per 10) di liquido chiarificato e si avvia l'aerazione. Dopo 23 ore si interrompe l'aerazione e si lasciano decantare i fanghi per 45 minuti. Si apre, a turno, il rubinetto di ogni recipiente e si prelevano aliquote 
da 100 ml di surnatante. Si prepara, immediatamente prima dell'im ­
piego, un campione di liquami domestici decantati e se ne aggiun ­
gono 100 ml al fango che rimane in ciascuna unità di aerazione. Si avvia nuovamente l'aerazione. A questo punto non si aggiunge la 
sostanza da esaminare e si alimentano giornalmente le unità con 
liquami domestici fino a quando si forma per decantazione un sur ­
natante chiaro. In genere questa fase richiede al massimo due setti ­
mane e nel frattempo il carbonio organico disciolto nel surnatante 
raggiunge alla fine di ogni ciclo di aerazione un valore costante.
 
Terminata questa fase, i singoli fanghi sedimentati vengono mesco ­
lati tra loro e 50 ml di tale miscela vengono introdotti in ciascuna unità.
 
95 ml di liquame sedimentato e 5 ml di acqua vengono aggiunti 
all'unità di controllo, e 95 ml di liquame sedimentato più 5 ml della soluzione madre della sostanza in esame (400 mg/l) vengono ag ­
giunti alle unità di saggio. Si riavvia l'aerazione e si protrae per 
23 ore. Si lasciano quindi sedimentare i fanghi per 45 minuti, si preleva il surnatante e se ne analizza il contenuto di carbonio orga ­
nico disciolto.
 
Le suddette operazioni di riempimento e di prelievo, vengono ripe ­
tute ogni giorno per tutta la durata del saggio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 976
 
Prima della sedimentazione può essere necessario pulire le pareti 
delle unità per evitare che si accumulino solidi al di sopra del livello 
del liquido. Per evitare contaminazioni incrociate si utilizza un ra ­
schiatore o una spazzola diversa per ciascuna unità.  
Idealmente, il carbonio organico disciolto nei surnatanti dovrebbe 
essere determinato ogni giorno anche se si può consentire una mi ­
nore frequenza delle analisi. Prima delle analisi i liquidi vengono 
filtrati mediante filtri a membrana con pori da 0,45 μm lavati oppure 
vengono centrifugati. Il filtri a membrana sono idonei se durante la filtrazione non liberano carbonio organico né assorbono la sostanza 
in esame. Nella centrifuga la temperatura del campione non deve 
superare i 40 gradi centrigradi.
 
La durata del saggio per i composti che mostrano una biodegrada ­
zione limitata o nulla non è fissata, ma l'esperienza suggerisce che la 
durata dovrebbe essere, in generale, di almeno 12 settimane, ma non 
più lunga di 26 settimane.  
2. DATI E VALUTAZIONE  
I valori del carbonio organico disciolto rilevati nei surnatanti delle 
unità di saggio e delle unità di controllo vengono riportati in grafico in funzione del tempo.
 
Con il procedere della biodegradazione i valori determinati nel sag ­
gio si avvicinano a quelli del controllo, Quando la differenza tra i 
due livelli si mantiene costante per oltre tre misurazioni consecutive, si esegue un numero di ulteriori misurazioni, tale da effettuare una elaborazione statistica dei dati e da calcolare la biodegradazione 
percentuale subita dalla sostanza in esame (D
 da oppure D  ssd , cfr. 
paragrafo 1.2).  
3. RELAZIONE  
3.1. RELAZIONE SUL SAGGIO  
Nella relazione sul saggio devono figurare, se possibile:  
— tutte le informazioni sul tipo di liquame, sul tipo di unità usata e 
sui risultati sperimentali concernenti le sostanze esaminate, la 
sostanza di riferimento, se usata, ed il bianco,  
— la temperatura,  
— la curva di rimozione, nonché descrizione e metodo di calcolo 
relativi (cfr. paragrafo 1.2),  
— date e luogo di prelievo dei fanghi attivi e del liquame, stato di 
adattamento, concentrazione, ecc.,  
— motivazioni scientifiche di eventuali modifiche del procedimento,  
— firma e data.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 977
 
3.2. INTERPRETAZIONI DEI RISULTATI  
Dato che le sostanze esaminate con il presente metodo non sono 
facilmente biodegradabili, qualsiasi rimozione del DOC imputabile esclusivamente alla biodegradazione avviene in genere gradualmente 
nel corso di giorni o settimane, ad eccezione di quei casi in cui 
avviene una improvvisa acclimatazione indicata da una brusca scom ­
parsa che si verifica dopo alcune settimane.
 
In ogni caso l'assorbimento chimico-fisico può a volte giocare un 
ruolo importante; ciò si verifica quando all'inizio della prova si 
riscontra una parziale o completa rimozione del DOC aggiunto. Ciò che accade successivamente, dipende da fattori quali il grado di assorbimento e la concentrazione di solidi sospesi nell'effluente di 
scarico. Di solito la differenza tra concentrazione del DOC nel con ­
trollo e nei surnatanti del saggio aumenta gradualmente rispetto al basso valore iniziale e tale differenza si mantiene quindi al nuovo valore per il resto della prova a meno che non si verifichi l'acclima ­
tazione.
 
Se si vuole distinguere nel grafico la biodegradazione (o la parziale 
biodegradazione) dall'assorbimento, sono necessari ulteriori saggi. Questi possono essere effettuati in diversi modi: il più convincente è quello di usare il surnatante o i fanghi come inoculo in un saggio 
del dossier di base (preferibilmente il saggio respirometrico).
 
Le sostanze che in questo saggio mostrano un'elevata rimozione del 
DOC, non dovuta ad assorbimento, devono essere considerate poten ­
zialmente biodegradabili. Un'eliminazione parziale non dovuta ad as ­
sorbimento indica che la sostanza è almeno in parte biodegradabile.  
Valori bassi o nulli di rimozione del DOC possono essere dovuti ad 
un effetto inibente della sostanza in esame sui microorganismi, il che può anche essere evidenziato da lisi o da riduzione dei fanghi con formazione di surnatanti torbidi. Il saggio deve essere ripetuto a 
concentrazione più bassa della sostanza in esame.
 
Il ricorso a un metodo analitico specifico o alla marcatura della 
sostanza in esame con il  14 C può permettere una maggiore sensibi ­
lità. Nel caso di composti marcati con  14 C lo sviluppo di  14 CO 2 
confermerà che la biodegradazione ha avuto luogo.  
Quando i risultati vengono presentati anche come biodegradazione 
primaria occorre dare, se possibile, una spiegazione del cambiamento di struttura chimica che causa la diminuzione di risposta della so ­
stanza in esame.
 
Si deve dimostrare la validità del metodo analitico e riportare la 
risposta fornita dal bianco.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OCSE, Parigi 1981,  Linea Guida 302 A,  decisione C(81) 30 
def. del Consiglio.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 978
 
Appendice 1  
Saggio SCAS: Esempio di risultati  
Sostanza (mg/l) C t — C  c 
(mg/l) Biodegradazion* 
percentuale 
D da Durata del saggio 
(giorni)  
4-acetil aminobenzen sulfonato 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropilene benzen sulfonato 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenolo 16,9 0,8 95,3 40 
Glicol dietilenico 16,5 0,2 98,8 40 
Anilina 16,9 1,7 95,9 40 Ciclopentano tetra carbossilato 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 979
 
Appendice 2  
Esempio di apparecchiatura per il saggio  
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 980
 
C.13.  BIOCONCENTRAZIONE: SAGGIO SUI PESCI, METODO A 
FLUSSO CONTINUO  
1. METODO  
Questo metodo di bioconcentrazione corrisponde al metodo OCSE 
TG 305 (1996).  
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo descrive una procedura per caratterizzare il po ­
tenziale di bioconcentrazione di una sostanza nei pesci in condizioni 
di flusso continuo. Benché i regimi di saggio a flusso continuo siano ampiamente preferibili, sono ammissibili regimi semistatici, purché 
soddisfatti i criteri di validità.
 
Il metodo fornisce dettagli sufficienti per eseguire il saggio conce ­
dendo una libertà adeguata per adattare l'impianto sperimentale alle 
particolari condizioni di laboratorio e alla variabilità delle caratteri ­
stiche delle sostanze analizzate. La sua validità è massima per com ­
posti chimici organici stabili con log P  oa compreso tra 1,5 e 6,0 (1), 
ma è applicabile anche a sostanze superlipofile (log P  oa > 6,0). La 
stima preliminare del fattore di bioconcentrazione (BCF), indicato talvolta con K
 B , per tali sostanze superlipofile sarà presumibilmente 
più elevata del fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario 
(BCF  SS ) prevedibilmente ottenuto da esperimenti di laboratorio. 
Stime preliminari del fattore di bioconcentrazione per composti chi ­
mici organici con valori di log P  oa fino a circa 9,0 si possono 
ricavare dall'equazione di Bintein at al (2). I parametri che caratte ­
rizzano il potenziale di bioconcentrazione includono la costante di 
velocità di assorbimento (k  l ), la costante di velocità di depurazione 
(k 2 ) e il BCF  SS . 
L'analisi dei campioni di acqua e di pesce può risultare più facile se 
le sostanze in esame sono radiomarcate; e queste possono venire 
utilizzate per determinare se sia il caso di procedere all'identifica ­
zione e alla qualificazione dei prodotti di degradazione. Se si misu ­
rano i residui radioattivi totali (per esempio per combustione o so ­
lubilizzazione dei tessuti), il BCF risulta basato sul composto proge ­
nitore, eventuali metaboliti trattenuti e anche sul carbonio assimilato. 
I BCF basati sui residui radioattivi totali non sono pertanto confron ­
tabili direttamente con un BCF ottenuto mediante analisi chimica specifica del solo composto progenitore.
 
Negli studi con radiomarcante si possono impiegare procedure di 
bonifica per determinare il BCF sulla base del composto progenitore, 
e se ritenuto necessario si possono caratterizzare i principali meta ­
boliti. È anche possibile combinare uno studio di metabolismo nei pesci con uno studio di bioconcentrazione mediante l'analisi e l'iden ­
tificazione dei residui nei tessuti.
 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Bioconcentrazione/Bioaccumulo  è l'aumento di concentrazione della 
sostanza in esame in o su un organismo (suoi tessuti specificati) 
rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell'ambiente circostante.
 
Il fattore di bioconcentrazione  (BCF o K  B ) in qualsiasi momento 
durante la fase di assorbimento di questo saggio di accumulo è la concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce o suoi tessuti 
specificati [C
 f in μg/g (ppm)] divisa per la concentrazione del com ­
posto chimico nell'ambiente circostante [C  a in μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 981
 
Il fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario  (BCF  SS o K  B ) 
non cambia in modo significativo su un periodo di tempo prolunga ­
to, la concentrazione della sostanza in esame nell'ambiente circo ­
stante essendo costante durante tale periodo di tempo.  
Un livello costante  o stato stazionario  nel tracciato della sostanza in 
esame nei pesci (C  f ) contro il tempo viene raggiunto quando la curva 
diventa parallela all' asse del tempo e tre analisi successive di C  f su 
campioni prelevati ad intervalli di almeno due giorni differiscono di non oltre il ± 20 % una dall'altra, e non vi sono differenze signifi ­
cative tra i tre periodi di campionamento. Quando si analizzano 
campioni raggruppati, sono necessarie almeno quattro analisi succes ­
sive. Per il controllo di sostanze che vengono assorbite lentamente saranno più opportuni intervalli di sette giorni.
 
Fattori di bioconcentrazione  calcolati direttamente dalle costanti di 
velocità cinetiche (k  1 /k 2 ) sono definiti fattore di concentrazione ci ­
netico, BCF  k . 
Il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua  (P oa ) è il rapporto della 
solubilità di un composto chimico in n-ottanolo su quella in acqua 
all'equilibrio (metodo A.8), espresso anche come K  oa . Il logaritmo di 
P oa viene usato come indicazione del potenziale di bioconcentrazione 
di un composto chimico da parte di organismi acquatici.  
La fase di esposizione o assorbimento  è il tempo durante il quale i 
pesci sono esposti al composto chimico in esame.  
La costante di velocità di assorbimento  (k 1 ) è il valore numerico che 
definisce la velocità di aumento della concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce di prova (o suoi tessuti specificati) quando il pesce viene esposto a tale composto chimico (k
 1 è espresso in 
giorni  -1 ). 
La fase post-esposizione o di depurazione (perdita)  è il tempo, dopo 
il trasferimento del pesce di prova da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza, durante 
il quale viene studiata la depurazione (o perdita netta) della sostanza 
dal pesce di prova (o suo tessuto specificato).
 
La costante di velocità di depurazione (perdita) ( k 2 ) è il valore 
numerico che definisce la velocità di riduzione della concentrazione della sostanza in esame nel pesce di prova (o suoi tessuti specificati) 
dopo il trasferimento del pesce da un ambiente contenente la so ­
stanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza (k
 2 è 
espresso in giorni  -1 ). 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI SAGGIO  
Il saggio è costituito da due fasi: la fase di esposizione (assorbimen ­
to) e di post-esposizione (depurazione). Durante la fase di assorbi ­
mento, gruppi separati di pesci di una stessa specie vengono esposti 
ad almeno due concentrazioni della sostanza in esame. Essi vengono poi trasferiti in un ambiente esente dalla sostanza in esame per la fase di depurazione. È sempre necessaria una fase di depurazione, 
salvo che l'assorbimento della sostanza durante la fase di assorbi ­
mento sia risultato insignificante (per esempio BCF minore di 10). La concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce (o suo tessuto specificato) viene seguita in tutte e due le fasi della prova. In 
aggiunta alle due concentrazioni di prova, un gruppo di pesci di 
controllo viene mantenuto in condizioni identiche, salvo per l'assenza della sostanza in esame, per confrontare possibili effetti dannosi osservati nel saggio di bioconcentrazione con un gruppo di controllo 
corrispondente e per ottenere concentrazioni di fondo della sostanza 
in esame.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 982
 
La fase di assorbimento viene eseguita per 28 giorni salvo dimo ­
strazione che l'equilibrio è stato raggiunto prima. Per una previsione 
della durata della fase di assorbimento e del tempo necessario per arrivare allo stato stazionario ci si può basare sull'equazione fornita nell'allegato 3. Viene poi iniziato il periodo di depurazione trasfe ­
rendo il pesce in un altro contenitore pulito con lo stesso ambiente 
ma senza la sostanza in esame. Se possibile, il fattore di bioconcen ­
trazione viene calcolato preferibilmente sia come rapporto (BCF
 SS ) 
delle concentrazioni nel pesce (C  f ) e nell'acqua (C  a ) nello stato sta ­
zionario apparente che come fattore di bioconcentrazione cinetico, 
BCF  k , che è il rapporto fra le costanti di velocità di assorbimento 
(k 1 ) e di depurazione (k  2 ) assumendo una cinetica di primo ordine. 
Se appare ovvio che la cinetica seguita non è di primo ordine, 
impiegare modelli più complessi (allegato 5).  
Se lo stato stazionario non viene raggiunto entro 28 giorni, la fase di 
assorbimento deve essere prolungata fino al raggiungimento dello 
stato stazionario, con un limite massimo di 60 giorni, dopo di che si incomincia la fase di depurazione.
 
La costante di velocità di assorbimento, la costante di velocità di 
depurazione (perdita) (o le costanti nel caso di modelli più comples ­
si), il fattore di bioconcentrazione e, se possibile, i limiti di confi ­
denza di ciascuno di questi parametri vengono calcolati sulla base 
del modello che meglio descrive le concentrazioni misurate di so ­
stanza in esame nel pesce e nell'acqua.  
Il BCF è espresso in funzione del peso umido totale del pesce. 
Tuttavia, per scopi speciali, se il pesce è sufficientemente grande o può venire diviso in parti commestibili (filetto) e non commestibili (viscere), si possono usare tessuti od organi specificati (per esempio 
muscolo, fegato).  ►
C1 Poiché per molte sostanze organiche esiste 
una chiara relazione tra il potenziale di bioconcentrazione e la lipo ­
filia, esiste anche una relazione corrispondente tra il contenuto di lipidi nel pesce di prova e la bioconcentrazione osservata di tali 
sostanze ◄. Pertanto, allo scopo di ridurre questa fonte di variabilità 
nei risultati sperimentali per le sostanze di elevata lipofilia (cioè con log P
 oa > 3), la bioconcentrazione dovrebbe essere espressa in rela ­
zione al contenuto di lipidi oltre che al peso corporeo totale.  
Il contenuto di lipidi deve essere determinato possibilmente sullo 
stesso materiale biologico usato per determinare la concentrazione 
della sostanza in esame.  
1.4. INFORMAZIONE SULLA SOSTANZA IN ESAME  
Prima di eseguire la prova di bioconcentrazione si dovrebbero cono ­
scere le seguenti informazioni sulla sostanza in esame:  
— solubilità in acqua;  
— coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua P  oa (indicato anche con 
K oa , determinato mediante HPLC in A.8)  
— idrolisi  
— fototrasformazione in acqua, determinata sotto irraggiamento so ­
lare o solare simulato e nelle condizioni di irraggiamento della 
prova di bioconcentrazione (3);  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 983
 
— tensione superficiale (per sostanze per le quali non è possibile 
determinare il log P  oa ); 
— tensione di vapore;  
— pronta biodegradabilità (se del caso).  
Un'altra informazione richiesta è la tossicità nei confronti delle spe ­
cie ittiche usate nel saggio, preferibilmente la CL  50 asintotica (cioè 
indipendente dal tempo). Per la quantificazione della sostanza in esame nelle soluzioni di saggio e nel materiale biologico, oltre ai 
dettagli relativi alla preparazione e conservazione del campione è 
necessario disporre di un metodo analitico appropriato, di accuratez ­
za, precisione e sensibilità note. Dovrebbe essere noto anche il limite di rivelazione analitica in acqua e nei tessuti del pesce della sostanza 
in esame. Quando per l'esame si utilizza una sostanza marcata con
 
14 C è necessario conoscere la percentuale di radioattività associata ad 
impurezze.  
1.5. VALIDITÀ DEL SAGGIO  
Perché il saggio sia valido occorre rispettare le seguenti condizioni:  
— le variazioni di temperatura devono essere minori di ± 2  o C, 
— la concentrazione dell'ossigeno disciolto non deve scendere al di 
sotto del 60 % della saturazione,  
— la concentrazione della sostanza in esame nelle camere deve 
venire mantenuta entro ±20 % della media dei valori misurati durante la fase di assorbimento,
 
— la mortalità o altri effetti dannosi o malattie sia nei pesci di 
controllo che in quelli trattati devono essere minori del 10 % al termine della prova. Quando la prova viene prolungata a varie 
settimane o mesi, il tasso di mortalità o altri effetti dannosi in 
tutte e due le serie di pesci deve essere minore del 5 % al mese e non superare il 30 % in totale.
 
1.6. COMPOSTI DI RIFERIMENTO  
Per verificare la procedura sperimentale, laddove richiesto, può ser ­
vire l'uso di composti di riferimento di potenziale di bioconcentra ­
zione noto. Tuttavia per ora non è possibile raccomandare sostanze specifiche.
 
1.7. DESCRIZIONE DEL METODO DI SAGGIO  
1.7.1.  Apparecchiatura  
Per tutte le parti dell'apparecchiatura, evitare accuratamente l'uso di 
materiali soggetti a dissoluzione, assorbimento o lisciviatura e che possano avere un effetto dannoso sul pesce. Si possono usare vasche rettangolari o cilindriche normali di materiale chimicamente inerte e 
di capacità adeguata al tasso di carico. Minimizzare l'uso di tubature 
in materia plastica flessibile. Usare di preferenza tubature di Teflon (R), acciaio inossidabile e/o vetro. L'esperienza ha dimostrato che per sostanze con elevati coefficienti di assorbimento come i piretroidi 
sintetici può essere necessario il vetro silanizzato. In queste situa ­
zioni le apparecchiature non possono venire riutilizzate.
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1.7.2.  Acqua  
Nel saggio si usa in genere acqua naturale che dovrebbe essere 
prelevata da una fonte non contaminata e di qualità uniforme. L'ac ­
qua di diluizione deve essere di una qualità che permetta la soprav ­
vivenza delle specie ittiche scelte per la durata del periodo di accli ­
matazione e del periodo di prova senza che mostrino alcun aspetto o comportamento anomalo. L'ideale sarebbe dimostrare che la specie in esame è in grado di sopravvivere, crescere e riprodursi nell'acqua di 
diluizione (per esempio in una coltura di laboratorio o in un saggio 
di tossicità su tutto il ciclo di vita). L'acqua deve essere caratterizzata almeno con il pH, la durezza, i solidi totali, il carbonio organico 
totale e di preferenza anche ammonio, nitriti e alcalinità nonché, per 
le specie marine, la salinità. I parametri importanti per il benessere ottimale dei pesci sono perfettamente noti, ma l'allegato 1 fornisce concentrazioni massima raccomandate per un certo numero di para ­
metri per le acque dolci e marine usate nel saggio.
 
L'acqua dovrebbe essere di qualità costante per tutta la durata di un 
saggio. Il pH dovrebbe essere compreso tra 6,0 e 8,5, ma durante un dato saggio deve restare entro ± 0,5 unità di pH. Per assicurarsi che 
l'acqua di diluizione non abbia influenze indesiderate sul risultato 
sperimentale (per esempio per complessazione della sostanza in esa ­
me) o influisca dannosamente sul pesce, prelevare di quando in quando dei campioni per l'analisi. La determinazione dei metalli 
pesanti (per esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), dei principali anioni 
e cationi (per esempio Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), dei pesticidi (per 
esempio pesticidi organofosforati totali e organoclorurati totali), del carbonio organico totale e dei solidi in sospensione deve essere 
effettuata per esempio ogni 3 mesi, ove si sappia che l'acqua di 
diluizione è di qualità relativamente costante. Se la qualità dell'acqua si è dimostrata costante per almeno un anno, le determinazioni pos ­
sono essere effettuate con minore frequenza, a intervalli più lunghi 
(per esempio ogni sei mesi).
 
Il contenuto naturale di particelle in sospensione nonché il carbonio 
organico totale (TOC) nell'acqua di diluizione devono essere i più 
bassi possibili per evitare un assorbimento della sostanza in esame su 
materia organica che ne può ridurre la biodisponibilità (4). Il valore massimo accettabile è di 5 mg/l per i solidi sospesi (materia secca che non passa attraverso un filtro da 0,45 μm) e di 2 mg/l per il 
carbonio organico totale (vedi allegato 1). Se necessario, filtrare 
l'acqua prima dell'uso. Il contributo del pesce di prova al contenuto di carbonio organico nell'acqua (escrezioni) e quello dei residui ali ­
mentari deve essere il più basso possibile. Durante tutto il saggio, la 
concentrazione del carbonio organico nel recipiente di esecuzione del 
saggio non deve superare la concentrazione di carbonio organico derivata dalla sostanza in esame e dall'eventuale agente solubiliz ­
zante più di 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3.  Soluzioni di saggio  
Preparare una soluzione madre («stock») della sostanza in esame a 
una concentrazione adatta. La soluzione madre deve essere preparata preferibilmente per semplice miscelazione o agitazione della sostanza in esame nell'acqua di diluizione. È preferibile non usare solventi o 
disperdenti (agenti solubilizzanti); può tuttavia essere opportuno in 
alcuni casi per produrre una soluzione madre di concentrazione adat ­
ta. Solventi che si possono usare sono etanolo, metanolo, etere mo ­
nometilico del glicol etilenico, etere dimetilico del glicol etilenico, 
dimetilformammide e glicol trietilenico. Disperdenti utilizzabili sono 
Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e HCO- 40. Prestare attenzione quando si usano agenti prontamente biode ­
gradabili perché possono causare problemi di crescita batterica nelle 
prove a flusso continuo. La sostanza in esame può essere radiomar ­
cata e dovrebbe avere la massima purezza (preferibilmente > 98 %).
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Per le prove a flusso continuo occorre un sistema che eroghi e 
diluisca in continuo una soluzione madre della sostanza in esame 
(per esempio pompa dosatrice, diluitore proporzionale, sistema di saturazione) per fornire le concentrazioni di prova nelle camere di saggio. Il volume di ciascuna camera di saggio deve essere sostituito 
preferibilmente almeno cinque volte al giorno. La modalità a flusso 
continuo va preferita, ma laddove non sia possibile (per esempio quando ciò ha un'influenza dannosa sugli organismi in esame) si può utilizzare una tecnica semistatica, purché siano rispettati i criteri 
di validità. Le portate di soluzione madre e acqua di diluizione 
devono essere controllate 48 ore prima del saggio e poi almeno una volta al giorno durante il saggio. In questo controllo deve essere inclusa la determinazione della portata attraverso ciascuna camera di 
saggio e si deve garantire che questa vari non più del 20 % all'in ­
terno di ciascuna camera e tra una camera e l'altra.
 
1.7.4.  Scelta delle specie  
Criteri importanti nella scelta delle specie sono la disponibilità, la 
possibilità di ottenerle di dimensioni convenienti e di mantenerle in 
modo soddisfacente in laboratorio. Altri criteri per la scelta delle specie ittiche includono l'importanza ricreativa, commerciale ed eco ­
logica nonché una sensibilità paragonabile, il fatto che essa sia stata 
già utilizzata con successo in passato, ecc.
 
Specie sperimentali raccomandate sono indicate nell'allegato 2. Si 
possono usare anche altre specie, ma può darsi che la procedura di saggio debba venire adattata per ottenere condizioni sperimentali idonee. In questo caso, la relazione deve indicare la ragione della 
scelta della specie e il metodo di saggio.
 
1.7.5.  Stabulazione del pesce  
Acclimatare la popolazione ittica di scorta per almeno due settimane 
in acqua alla temperatura di saggio e alimentarla con mangime dello 
stesso tipo usato durante il saggio in quantità sufficiente.  
Dopo un periodo di ambientazione di 48 ore, si registra la mortalità e 
si applicano i seguenti criteri:  
— mortalità superiore al 10 % della popolazione in sette giorni: 
l'intera partita viene respinta,  
— mortalità tra il 5 % e il 10 % della popolazione in sette giorni: 
l'acclimatazione prosegue per altri sette giorni,  
— mortalità minore del 5 % della popolazione in sette giorni: la 
partita è accettabile — in caso di mortalità superiore al 5 % durante il secondo periodo di sette giorni l'intera partita viene respinta.
 
Assicurarsi che i pesci usati nelle prove non presentino malattie o 
anomalie osservabili. Scartare qualsiasi pesce ammalato. Nelle due 
settimane che precedono il saggio e durante il saggio i pesci non 
devono ricevere alcun trattamento per la cura di malattia.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 986
 
1.8. ESECUZIONE DEL SAGGIO  
1.8.1.  Saggio preliminare  
Può essere utile condurre un esperimento preliminare allo scopo di 
ottimizzare le condizioni sperimentali del test definitivo, per esempio 
la scelta delle concentrazioni della sostanza in esame e la durata 
delle fasi di assorbimento e di depurazione.  
1.8.2.  Condizioni di esposizione  
1.8.2.1. D u r a t a d e l l a f a s e d i a s s o r b i m e n t o  
La durata prevedibile della fase di assorbimento si può ricavare 
dall'esperienza pratica (per esempio da uno studio precedente o da un composto chimico con accumulo simile) o da certe relazioni empiriche, conoscendo la solubilità in acqua o il coefficiente di 
ripartizione ottanolo/acqua della sostanza in esame (vedi allegato 3).
 
La fase di assorbimento deve durare 28 giorni, salvo dimostrazione 
che l'equilibrio è stato raggiunto prima. Se in 28 giorni non si 
raggiunge lo stato stazionario, prolungare la fase di assorbimento effettuando ulteriori misure, fino al raggiungimento dello stato sta ­
zionano, con un massimo di 60 giorni.
 
1.8.2.2. D u r a t a d e l l a f a s e d i d e p u r a z i o n e  
Un periodo pari a metà della durata della fase di assorbimento è 
solitamente sufficiente per una riduzione appropriata (per esempio del 95 %) del carico della sostanza nel corpo (vedi allegato 3 per una 
spiegazione della stima). Se il tempo necessario per raggiungere una 
perdita del 95 % è troppo lungo nella pratica, per esempio se supera il doppio della normale durata della fase di assorbimento (cioè oltre 56 giorni), si può utilizzare un periodo più breve (fino ad una ridu ­
zione della concentrazione della sostanza in esame al di sotto del 
10 % della concentrazione nello stato stazionario). Tuttavia, per sostanze con caratteristiche di assorbimento e depurazione più com ­
plesse di quelle rappresentate da un modello ittico a compartimento 
singolo, che fornisce una cinetica di primo ordine, prevedere fasi di 
depurazione più lunghe per la determinazione delle costanti di velo ­
cità di perdita. Il periodo può tuttavia dipendere dal tempo durante il quale la concentrazione della sostanza in esame nel pesce rimane al 
di sopra del limite analitico di rivelazione.
 
1.8.2.3. N u m e r o d i p e s c i d i p r o v a  
Scegliere il numero di pesci per ogni concentrazione di prova in 
modo tale che ad ogni campionamento siano disponibili almeno 
quattro pesci per campione. Se si richiede una potenza statistica 
più elevata, sarà necessario un maggior numero di pesci per cam ­
pione.  
Se si usano pesci adulti, indicare nella relazione se l'esperimento 
viene effettuato con maschi o femmine o ambedue. Se si utilizzano tutti e due i sessi, prima di incominciare l'esposizione documentare che le differenze di contenuto di lipidi tra i sessi non siano signifi ­
cative; può essere necessario raggruppare tutti i maschi e tutte le 
femmine.
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In ogni saggio scegliere pesci di peso simile, tale che il più piccolo 
abbia un peso non inferiore a due terzi del più grande. I pesci 
dovrebbero essere tutti della stessa classe di età e provenire dalla stessa fonte. Poiché il peso e l'età di un pesce sembrano talvolta avere un effetto significativo sui valori di BCF (1), riportare accu ­
ratamente questi dettagli nella relazione. Si raccomanda di pesare un 
sottocampione dello stock di pesci prima del saggio per stimare il peso medio.
 
1.8.2.4. C a r i c o  
Usare rapporti acqua su pesce elevati per minimizzare la riduzione di 
C a causata dall'aggiunta del pesce all'inizio del saggio e per evitare 
riduzioni della concentrazione di ossigeno disciolto. È importante 
che il carico sia appropriato per la specie usata nel saggio. In ogni caso si raccomanda normalmente un carico di 0,1-1,0 g di pesce (peso umido) per litro d'acqua per giorno. Si possono utilizzare 
carichi elevati se si dimostra che la concentrazione della sostanza 
in esame può venire mantenuta entro i limiti di ± 20 % del valore richiesto, e che la concentrazione dell'ossigeno disciolto non scende al di sotto del 60 % della saturazione.
 
Nella scelta di appropriati regimi di carico si deve tener conto del ­
l'habitat normale della specie ittica. Per esempio, pesci che vivono sul fondo, a pari volume d'acqua, possono richiedere un acquario con area di fondo più grande rispetto alle specie ittiche pelagiche.
 
1.8.2.5. A l i m e n t a z i o n e  
Durante i periodi di acclimatazione e di saggio, mantenere i pesci ad 
un regime alimentare appropriato, avente un contenuto di lipidi e di 
proteine totali noto, in quantità sufficiente per tenerli in condizioni di buona salute e per mantenere il peso corporeo. Per tutto il periodo di acclimatazione e di prova somministrare ai pesci il cibo in una 
quantità approssimativamente dall'1 % al 2 % del peso corporeo al 
giorno; nella maggior parte delle specie ittiche questo regime man ­
tiene la concentrazione dei lipidi ad un livello relativamente costante 
durante il saggio. La quantità di mangime deve venire ricalcolata, per 
esempio una volta alla settimana, per mantenere costanti il peso corporeo e il contenuto di lipidi. Per questo calcolo, si può stimare il peso dei pesci in ciascuna camera di saggio in base al peso del 
pesce campionato più recentemente nella stessa camera. Non pesare i 
pesci rimasti nella camera.
 
Cibo non consumato e feci vengono sifonati giornalmente dalle ca ­
mere di saggio poco dopo la fornitura del cibo (da 30 minuti a 1 
ora). Mantenere le camere più pulite possibile per tutto il saggio in 
modo che la concentrazione di materia organica rimanga più scarsa possibile perché la presenza di carbonio organico può limitare la biodisponibilità della sostanza in esame (1).
 
Poiché molti mangimi derivano da farina di pesce, analizzare il 
contenuto della sostanza in esame nel mangime. È desiderabile ana ­
lizzare nel mangime anche il contenuto di pesticidi e metalli pesanti.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 988
 
1.8.2.6. L u c e e t e m p e r a t u r a  
Il fotoperiodo è normalmente da 12 a 16 ore e la temperatura (± 2  
o C) dovrebbe essere appropriata per la specie di prova (cfr. allegato 
2). Il tipo e le caratteristiche dell'illuminazione devono essere noti. 
Fare attenzione ad una possibile fototrasformazione della sostanza in 
esame nelle condizioni di irraggiamento dello studio. Usare un'illu ­
minazione appropriata evitando l'esposizione del pesce a fotoprodotti non naturali. In alcuni casi può essere appropriato utilizzare un filtro 
per bloccare la radiazione UV al di sotto di 290 nm.
 
1.8.2.7. C o n c e n t r a z i o n i d i p r o v a  
I pesci vengono esposti in condizioni di flusso continuo ad almeno 
due concentrazioni della sostanza in esame in acqua. Normalmente la concentrazione più elevata (o massima) della sostanza in esame viene 
scelta intorno all'1 % della sua CL
 50 asintotica acuta e almeno dieci 
volte più elevata del suo limite di rivelazione in acqua mediante il metodo analitico usato.
 
La concentrazione di prova massima può venire determinata anche 
dividendo la CL  50 acuta a 96 ore per un appropriato rapporto acuta/ ­
cronica (rapporti appropriati per alcuni composti chimici possono essere da circa 3 fino a 100). Se possibile, scegliere l'altra o le altre 
concentrazioni in modo che differiscano dalla suddetta di un fattore 
10. Se ciò non è possibile perché il limite analitico urta con il criterio dell'1 % della CL
 50 , si può usare un fattore minore di 10, altrimenti 
prendere in considerazione la marcatura con  14 C della sostanza in 
esame. Non usare mai una concentrazione superiore alla solubilità 
della sostanza in esame.  
Se si usa un agente solubilizzante, la sua concentrazione non do ­
vrebbe essere superiore a 0,1 ml/l, e deve essere uguale in tutte le 
vasche di saggio. Il suo contributo, insieme con la sostanza in esame, 
al contenuto complessivo di carbonio organico nell'acqua usata per il saggio deve essere noto. Fare comunque il possibile per evitare l'uso di tali materiali.
 
1.8.2.8. P r o v e d i c o n t r o l l o  
Oltre alla serie dei saggi, eseguire una prova di controllo con l'acqua 
di diluizione o, se del caso, una prova con acqua contenente l'agente solubilizzante, posto che sia stato stabilito che l'agente non ha effetti sul pesce; altrimenti eseguire tutte e due le prove di controllo.
 
1.8.3.  Frequenza delle misure della qualità dell'acqua  
Durante il saggio, misurare in tutte le vasche ossigeno disciolto, 
TOC, pH e temperatura. La durezza totale e la salinità, se del caso, devono essere misurate nelle prove di controllo e in una vasca alla concentrazione massima. Come minimo, l'ossigeno disciolto e, se del 
caso, la salinità devono essere misurati tre volte — all'inizio, verso la 
metà e alla fine del periodo di assorbimento — e una volta alla settimana durante il periodo di depurazione. Il TOC deve essere misurato all'inizio del saggio (24 h e 48 h prima dell'inizio della 
fase di assorbimento) prima dell'aggiunta del pesce e almeno una 
volta la settimana durante le fasi di assorbimento e depurazione. La temperatura va misurata giornalmente, il pH all'inizio e al termine di ciascun periodo e la durezza una volta per ogni saggio. La tempe ­
ratura dovrebbe preferibilmente essere controllata in continuo in al ­
meno una vasca.
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1.8.4.  Campionamento e analisi dei pesci e dell'acqua  
1.8.4.1. P r o g r a m m a d i c a m p i o n a m e n t o d e l p e s c e e d e l ­
l ' a c q u a  
Per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame, 
l'acqua delle camere di saggio viene campionata prima dell'aggiunta 
del pesce e durante le fasi di assorbimento e depurazione. Campio ­
nare l'acqua come minimo tutte le volte che viene campionato il pesce e prima della fornitura del mangime. Durante la fase di assor ­
bimento, determinare le concentrazioni della sostanza in esame per 
verificare il rispetto dei criteri di validità.
 
I pesci vengono campionati almeno cinque volte durante la fase di 
assorbimento e almeno quattro volte durante la fase di depurazione. Poiché in qualche caso risulterà difficile calcolare una stima ragio ­
nevolmente precisa del BCF sulla base di questo numero di campio ­
ni, in particolare quando la cinetica di depurazione non è una sem ­
plice cinetica di primo ordine, è consigliabile prelevare campioni a frequenza più elevata in tutti e due i periodi (cfr. allegato 4). I campioni in più vengono conservati e analizzati solo se i risultati 
della prima serie di analisi si dimostrano inadeguati per il calcolo del 
BCF con la precisione desiderata.
 
L'allegato 4 presenta un esempio di un programma di campiona ­
mento accettabile. Se si usano altri valori di P  oa per calcolare il 
tempo di esposizione necessario per un assorbimento del 95 %, si possono facilmente calcolare altri programmi.
 
Il campionamento viene continuato durante la fase di assorbimento 
fino a quando si stabilisce lo stato stazionario, con un limite mas ­
simo di 28 giorni. Se non si raggiunge lo stato stazionario in 28 giorni, il campionamento continua fino al raggiungimento dello stato 
stazionario, con un massimo di 60 giorni. Prima dell'inizio della fase 
di depurazione, i pesci vengono trasferiti in vasche pulite.
 
1.8.4.2. C a m p i o n a m e n t o e p r e p a r a z i o n e d e l c a m p i o n e  
I campioni d'acqua per l'analisi vengono ottenuti per esempio me ­
diante sifonatura attraverso tubature inerti da un punto centrale della 
camera di saggio. Poiché sembra che né la filtrazione né la centri ­
fugazione separino sempre la frazione non-biodisponibile della so ­
stanza in esame da quella biodisponibile (in particolare per composti 
chimici super-lipofili, cioè quelli con un log P  oa > 5) (1) (5), i 
campioni non devono essere sottoposti a questi trattamenti.  
Curare, invece, di mantenere le vasche più pulite possibile e con ­
trollare il contenuto di carbonio organico totale durante le fasi di 
assorbimento e depurazione.  
Ad ogni campionamento rimuovere dalle camere di saggio un nu ­
mero appropriato di pesci (normalmente almeno quattro). I pesci 
campionati vengono rapidamente risciacquati con acqua, «asciugati» per tamponamento, uccisi immediatamente con l'uso del metodo più appropriato e umano e poi pesati.
 
È preferibile analizzare il pesce e l'acqua immediatamente dopo il 
campionamento allo scopo di evitare degradazione o altre perdite e calcolare tassi approssimativi di assorbimento e depurazione nel 
corso del saggio. L'analisi immediata evita inoltre ritardi nella deter ­
minazione del raggiungimento di un livello costante.
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In mancanza di analisi immediata, conservare i campioni mediante 
un metodo appropriato. Prima di iniziare lo studio procurarsi le 
informazioni sul metodo appropriato di conservazione per la partico ­
lare sostanza in esame — per esempio surgelazione, mantenimento a 4
 o C, durata della conservazione, estrazione, ecc.  
1.8.4.3. Q u a l i t à d e l m e t o d o a n a l i t i c o  
Poiché tutta la procedura è basata sostanzialmente sull'accuratezza, la 
precisione e la sensibilità del metodo analitico utilizzato per la so ­
stanza in esame, controllare sperimentalmente che la precisione e la 
riproducibilità dell'analisi chimica, e che il recupero della sostanza in 
esame dall'acqua e dal pesce, siano soddisfacenti per quel particolare metodo. Inoltre, controllare che la sostanza in esame non sia rileva ­
bile nell'acqua di diluizione usata.
 
Se necessario, correggere i valori di C  a e C  f ottenuti nel saggio per 
tener conto del livello di recupero e dei valori di fondo delle prove di 
controllo. Manipolare sempre i campioni di pesce e acqua in modo 
da minimizzare la contaminazione e le perdite (per esempio per assorbimento sul dispositivo di campionamento).
 
1.8.4.4. A n a l i s i d e l c a m p i o n e d i p e s c e  
Se nel saggio vengono usati materiali radiomarcati, è possibile ana ­
lizzare il radiomarcante totale (cioè progenitore e metaboliti), oppure i campioni possono venire depurati, così da poter analizzare il com ­
posto progenitore separatamente. Inoltre si possono caratterizzare i 
principali metaboliti allo stato stazionario, oppure al termine della 
fase di assorbimento se viene conclusa prima del raggiungimento dello stato stazionario. Se il BCF, in termini di residui radiomarcati totali, è ≥ 1 000 %, può essere consigliabile, e per alcune categorie 
di composti chimici come i pesticidi è fortemente raccomandato, 
identificare e quantificare i composti di degradazione che rappresen ­
tano ≥ 10 % dei residui totali nei tessuti del pesce allo stato stazio ­
nario. Se si identificano e quantificano i prodotti di degradazione che 
rappresentano ≥ 10 % dei residui radiomarcati totali nei tessuti del 
pesce, si raccomanda di identificarli e quantificarli anche nell'acqua di prova.
 
La concentrazione della sostanza in esame viene di solito determinata 
su ciascun singolo pesce pesato. Se ciò non è possibile, si possono raggruppare i campioni in occasione di ciascun campionamento, ma 
questo limita le procedure statistiche applicabili ai dati. Se si da 
importanza ad una specifica procedura statistica e alla sua potenza, nel saggio va incluso un numero di pesci adeguato per tener conto della procedura di raggruppamento e della potenza desiderate (6) (7).
 
Il BCF va espresso sia in funzione del peso umido totale che, per le 
sostanze fortemente lipofile, in funzione del contenuto di lipidi. De ­
terminare se possibile il contenuto di lipidi nel pesce ad ogni cam ­
pionamento. Per la determinazione del contenuto lipidico utilizzare metodi adatti (rif. 8 e 2 dell'allegato 3). Come metodo standard si può raccomandare la tecnica di estrazione con cloroformio/metanolo 
(9). I vari metodi non forniscono valori identici (10), per cui è 
importante indicare in dettaglio il metodo usato. Se possibile l'analisi dei lipidi deve essere effettuata sullo stesso estratto prodotto per l'analisi della sostanza in esame, perché i lipidi devono spesso venire 
rimossi dall'estratto prima di poterlo analizzare per via cromatogra ­
fica. La differenza del contenuto di lipidi del pesce (in mg/kg di peso umido) tra l'inizio e il termine dell'esperimento non deve essere superiore a ± 25 %. Registrare anche i solidi percentuali del tessuto 
per poter convertire la concentrazione lipidica da base umida a base 
secca.
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2. DATI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
La curva di assorbimento della sostanza in esame viene ottenuta 
riportando la sua concentrazione nel/sul pesce (o tessuti specificati) 
durante la fase di assorbimento contro il tempo su scale aritmetiche. 
Se la curva ha raggiunto un andamento costante, cioè è diventata approssimativamente asintotica all'asse del tempo, il BCF
 SS allo stato 
stazionario si calcola da:  
C i stato stazionario ðmediaÞ 
C w stato stazionario ðmediaÞ 
Quando non si raggiunge lo stato stazionario si può calcolare un 
BCF  SS di sufficiente precisione per una valutazione di rischio da 
uno «stato stazionario» all'80 % (1,6/k  2 o al 95 % (3,0/k  2 dell'equili ­
brio. 
Determinare inoltre il fattore di concentrazione (BCF  k ) come rapporto 
k 1 /k 2 , cioè delle due costanti cinetiche di primo ordine. La costante di 
velocità di depurazione (k  2 ) viene di solito determinata dalla curva di 
depurazione (cioè da una curva di riduzione della concentrazione 
della sostanza in esame nel pesce contro il tempo). La costante di velocità di assorbimento (K
 1 ) viene poi calcolata sulla base di k  2 e di 
un valore di C  f che si ottiene dalla curva di assorbimento (vedi anche 
allegato 5). Il metodo preferito per l'ottenimento del BCF  k e delle 
costanti di velocità k  1 e k 2 consiste nell'uso di metodi di stima para ­
metrica non lineare su computer (11). Altrimenti, per calcolare k  1 e k 2 
si possono usare metodi grafici. Se è evidente che la curva di depu ­
razione non è di primo ordine, bisogna allora impiegare modelli più 
complessi (vedi bibliografia dell'allegato 3) con l'assistenza di un biostatistico.
 
2.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Se le concentrazioni misurate delle soluzioni di prova sono prossime 
al limite di rivelazione del metodo analitico, i risultati devono essere 
interpretati con cautela.  
Curve di assorbimento e di perdita chiaramente definite sono un'in ­
dicazione di buona qualità dei dati di bioconcentrazione. La varia ­
zione delle costanti di assorbimento/depurazione tra le due concen ­
trazioni di prova deve essere minore del 20 %. Se si osservano 
differenze significative nelle velocità di assorbimento/depurazione 
tra le due concentrazioni di prova applicate, registrarle e fornire una possibile spiegazione. In genere, il limite di confidenza di BCF ottenuti da studi ben impostati è vicino al ± 20 %.
 
3. RELAZIONE  
La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni:  
3.1. SOSTANZA DI PROVA  
— natura fisica e, se del caso, proprietà chimico fisiche,  
— dati di identificazione chimica (incluso, se opportuno, il conte ­
nuto di carbonio organico),  
— se radiomarcata, la posizione precisa dell'atomo o degli atomi 
marcati e la percentuale di radioattività associata ad impurezze.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 992
 
3.2. SPECIE USATA NEL SAGGIO  
— nome scientifico, ceppo, provenienza, eventuali pretrattamenti, 
acclimatazione, età, intervallo di dimensioni, ecc.  
3.3. CONDIZIONI SPERIMENTALI  
— procedura di saggio usata (per esempio a flusso continuo o semi ­
statica),  
— tipo e caratteristiche dell'illuminazione usata e fotoperiodo(i),  
— impostazione della prova (per esempio numero e dimensioni 
delle camere di saggio, tasso di sostituzione del volume d'acqua, molteplicità dei campioni, numero di pesci per campione, numero delle concentrazioni di prova, durata delle fasi di assorbimento e 
depurazione, frequenza di campionamento per i campioni di pe ­
sce e di acqua,
 
— metodo di preparazione delle soluzioni madre e frequenza di 
rinnovo (se usato, indicare l'agente solubilizzante, la sua concen ­
trazione e il suo contributo al contenuto di carbonio organico 
dell'acqua),  
— concentrazioni nominali nel saggio, medie dei valori misurati e 
loro deviazioni standard nelle vasche di saggio, e metodo me ­
diante cui sono stati ottenuti questi valori,  
— fonte dell'acqua di diluizione, descrizione degli eventuali pretrat ­
tamenti, risultati di eventuali dimostrazioni della capacità del 
pesce di saggio di vivere nell'acqua, e caratteristiche dell'acqua: pH, durezza, temperatura, concentrazione di ossigeno disciolto, livelli residui di cloro (se misurati), carbonio organico totale, 
solidi sospesi, salinità dell'ambiente di prova (se del caso) ed 
eventuali altre misure effettuate,
 
— qualità dell'acqua all'interno delle vasche di saggio, pH, durezza, 
TOC, temperatura e concentrazione dell'ossigeno disciolto,  
— informazioni dettagliate sull'alimentazione (per esempio tipo di 
mangime, fonte, composizione — se possibile almeno il tenore 
lipidico e proteico, quantità somministrata e frequenza),  
— informazioni sul trattamento dei campioni di pesce e d'acqua, 
inclusi dettagli di preparazione, conservazione, estrazione e pro ­
cedure analitiche (e loro precisione) per la sostanza in esame e il 
contenuto di lipidi (se misurato).  
3.4. RISULTATI  
— risultati di eventuali studi preliminari eseguiti,  
— mortalità dei pesci di controllo e dei pesci in ciascuna camera di 
esposizione ed eventuale, comportamento anomalo osservato,  
— contenuto di lipidi del pesce (se determinato durante l'esecuzione 
delle prove),  
— curve (con tutti i dati di misura) di assorbimento e di depurazione 
del composto chimico in esame nel pesce, tempo di raggiungi ­
mento dello stato stazionano,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 993
 
— C  f e C  a (con deviazione standard e intervallo, se del caso) per 
tutti i momenti di campionamento [C  f espresso in μg/g di peso 
umido (ppm) del corpo intero o dei suoi tessuti specificati, per esempio lipidi, e C
 a in μg/ml (ppm)]. Valori di C  a per la serie di 
controllo (riportare anche il valore di fondo),  
— fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario (BCF  SS ) e/o 
fattore di concentrazione cinetico (BCF  k ) e, se del caso, limiti 
di confidenza al 95 % per le costanti di velocità di assorbimento 
e depurazione (perdita) (tutte espresse in relazione al corpo intero 
e al contenuto totale di lipidi, se misurato, dell'animale o di suoi tessuti specificati), limiti di confidenza e deviazione standard (se disponibili) e metodi di calcolo o analisi dei dati per ciascuna 
concentrazione della sostanza in esame usata,
 
— se vengono usate sostanze radio-marcate, e se richiesto, si può 
presentare l'accumulo di tutti i metaboliti rilevati,  
— qualsiasi cosa insolita riguardo al saggio, eventuali deviazioni da 
queste procedure e qualsiasi altra informazione pertinente.  
Minimizzare i risultati come «non rilevato a questo limite di rivela ­
zione» mediante lo sviluppo pre-test del metodo e l'imposizione 
sperimentale, perché tali risultati non possono venire utilizzati per i 
calcoli delle costanti di velocità.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. To ­
xicol. 102, pp 1 17-1.56.  
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dependence of fish bioconcentration on n-octanol/'water parti ­
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(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
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(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM te ­
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bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.  
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Ini ­
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(8) Compaan H. (1980) in «The determination of the possible 
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Netherlands.
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(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
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(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984- 
1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 995
 
ALLEGATO 1  
Caratteristiche chimiche di un'acqua di diluizione accettabile  
Sostanza Concentrazione limite  
1 Solidi sospesi 5 mg/l 
2 Carbonio organico totale 2 mg/l 3 Ammoniaca non ionizzata 1 μg/l 
4 Cloro residuo 10 μg/l 
5 Pesticidi organofosforati totali 50 μg/l 
6 Pesticidi organoclorurati totali più bifenili policlorurati 50 μg/l 
7 Cloro organico totale 25 μg/l 
8 Alluminio 1 μg/l 
9 Arsenico 1 μg/l 
10 Cromo 1 μg/l 
11 Cobalto 1 μg/l 
12 Rame 1 μg/l 
13 Ferro 1 μg/l 
14 Piombo 1 μg/l 
15 Nichel 1 μg/l 
16 Zinco 1 μg/l 
17 Cadmio 100 μg/l 
18 Mercurio 100 μg/l 
19 Argento 100 μg/l
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 996
 
ALLEGATO 2  
Specie ittiche raccomandate per l'esecuzione del saggio  
Specie raccomandata Intervallo di tem ­
peratura racco ­
mandato per la 
prova (  o C) Lunghezza totale 
raccomandata 
dell' animale di 
prova (cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) Danio zebrato 20-25 3,0± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) Fathead minnow 20-25 5,0± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Carpa comune 20-25 5,0± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck e 
Schlegel) Ricefish 20-25 4,0± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
Guppy 20-25 3,0± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Bluegill 20-25 5,0± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) Trota iridea 13-17 8,0± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Spinarello 18-20 3,0± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Rovai Society of London, Series B., Vol.252, p. 231.  
Varie specie di estuario e marine sono in uso in differenti paesi, per esempio: 
Corvina striata Leiostomus xanthurus 
Sheepshead minnow Cyprinodon variegatus Latterino Menidia beryllina 
Shiner perch Cymatogaster aggregata 
English sole Parophrys vetulus Staghorn sculpin Leptocottus armatus 
Spinarello Gasterosteus aculeatus 
Spigola Dicentracus labrax Alborella Alburnus alburnus
 
Raccolta  
I pesci d'acqua dolce suelencati sono facilmente allevabili e/o sono largamente disponibili per tutto 
l’anno, mentre la disponibilità delle specie marine e di estuario è parzialmente confinata ai rispettivi paesi. Possono riprodursi e venire allevati sia in stabilimenti di acquacoltura che in laboratorio, in 
condizioni di controllo delle malattie e dei parassiti, in modo che gli animali di saggio siano sani e 
geneticamente controllati. Questi pesci sono disponibili in molte parti del mondo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 997
 
ALLEGATO 3  
Previsione della durata delle fasi di assorbimento e depurazione  
1. Previsione della durata della fase di assorbimento  
Prima di eseguire il saggio, si può ricavare una stima di k  2 e quindi di una 
data percentuale del tempo occorrente per arrivare allo stato stazionario da 
relazioni empiriche tra k  2 e il coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua 
(P oa ) o tra k  2 e la solubilità in acqua (s).  
Una stima di k  2 (giorni  -1 ) si può ottenere per esempio dalla seguente 
relazione empirica (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P oa ) + 1,47 (r  2 = 0,95) [equazione 1]  
Per altre relazioni cfr. rif. (2).  
Se il coefficiente di ripartizione (P  oa ) non è noto, si può ricavare una stima 
(3) conoscendo la solubilità in acqua della sostanza da utilizzare: 
log 10 (P oa ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) [equazione 2]  
in cui  
s = solubilità (moli/1): (n = 36)  
Queste relazioni valgono solo per composti chimici con valori di P  oa com­
presi tra 2 e 6,5 (4).  
Il tempo necessario per raggiungere una certa percentuale dello stato sta ­
zionario si può ricavare, applicando il valore stimato di k  2 , dall'equazione 
cinetica generale che descrive l'assorbimento e la depurazione (cinetica di primo ordine):
 
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
o, se C è costante:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ [equazione 3]  
Approssimandosi allo stato stazionario, (t — ∞), l'equazione 3 può venire 
ridotta (5) (6) a:  
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
C w è allora k  1 /k 2 . un'approssimazione della concentrazione nel pesce allo 
«stato stazionario» (C  fs ). 
L'equazione 3 può venire riscritta come:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ o C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t [equazione 4]  
Applicando l'equazione 4, si può prevedere il tempo necessario per rag ­
giungere una certa percentuale dello stato stazionario quando k  2 sia stato 
pre-stimato con l'equazione 1 o 2.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 998
 
Indicativamente, la durata statisticamente ottimale della fase di assorbi ­
mento per ottenere dati statisticamente accettabili (BCF  K ) è il periodo 
necessario perché la cura del logaritmo della concentrazione della sostanza in esame nel pesce contro il tempo, su scala lineare raggiunga il suo punto medio, o 1,6/k
 2 , o 80 % dello stato stazionario, ma non più di 3,0/k  2 o 
95 % dello stato stazionario (7).  
Il tempo necessario per raggiungere 1'80 % dello stato stazionario si ottiene 
da (equazione 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 o t 80 ¼ 1; 6 
k 2 [equazione 5]  
Similmente, il 95 % dello stato stazionario si ottiene da:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 [equazione 6]  
Per esempio, la durata dalla fase di assorbimento (as) per una sostanza in 
esame con log P  oa = 4 sarà (utilizzando le equazioni 1, 5, 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 giorni  -1 
t op = t 80 = 1,6/0,652, cioè 2,45 giorni (59 ore)  
o t op = t 95 = 3,0/0,652, cioè 4,60 giorni (110 ore)  
Similmente, per una sostanza con s = 10  -5 mol/l (log(s) = - 5,0), la durata 
dell'assorbimento sarà (utilizzando le equazioni 1, 2, 5, 6):  
log 10 (P oa ) = - 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = - 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 giorni  -1 
t op = t 80 = 1,6/0,246, cioè 6,5 giorni (156 ore)  
o t op = t 95 = 3,0/0,246, cioè 12,2 giorni (293 ore)  
In alternativa, si può utilizzare l'espressione:  
t eq = 6,54 x 10  -3 P oa + 55,31 (ore)  
per calcolare il tempo necessario per raggiungere uno stato stazionario 
efficace (4).  
2. Previsione della durata della fase di depurazione  
Una previsione del tempo necessario per ridurre il carico sul corpo ad una 
certa percentuale della concentrazione iniziale si può ricavare anch'essa 
dall'equazione generale che descrive l'assorbimento e la depurazione (cine ­
tica di primo ordine) (1) (8).  
Per la fase di depurazione, si assume che C  a sia zero. L'equazione si può 
ridurre a:  
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f o C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 999
 
dove C  f, o è la concentrazione all'inizio del periodo di depurazione. Una 
depurazione del 50 % verrà allora raggiunta al tempo (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 o t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Similmente, una depurazione del  95 % verrà raggiunta a:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Se per il primo periodo si usa un assorbimento dell'80 % (1,6/k,) e nella 
fase di depurazione si usa una perdita del 95 % (3,0/k  2 ), la fase di depu ­
razione dura allora circa il doppio della fase di assorbimento.  
È importante notare, tuttavia, che le stime sono basate sull'ipotesi che 
l'assorbimento e la depurazione seguano una cinetica di primo ordine. Se è ovvio che non viene seguita una cinetica di primo ordine, si devono impiegare modelli più complessi [per esempio rif (1)].
 
Bibliografia ( dell'allegato 3 ) 
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for descri ­
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culate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Qua ­
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Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pagine 785- 
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Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, pagine 
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(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. 
Eng, 55, pagine 614-622.
 
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pagine 3-19.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1000
 
ALLEGATO 4  
Esempio teorico di un programma di campionamento per saggi di bioconcentrazione di sostanze con log P  oa = 4 
Campionamento del pe ­
sce Programma di campionamento 
Numero di campioni 
d'acqua Numero di pesci per 
campione Frequenza minima richie ­
sta (giorni) Campionamento addizio ­
nale 
Fase di assorbimento -1 
0 2 (*) 
2 immettere 45-80 pesci 
1 a 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2 a 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3 a 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4 a 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5 a 4,7 2 6 
Fase di depurazione Trasferire il pesce in 
acqua esente dal com ­
posto chimico in 
esame 
6 a 5,0 5,3 4 
(4) 
7 a 5,9 7,0 4 
(4) 
8 a 9,3 11,2 4 
(4) 
9 a 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Campionare l'acqua dopo l’erogazione di almeno tre «volumi di camera». 
I valori tra parentesi sono il numero di campioni (acqua, pesce) da prelevare se si esegue un campionamento addizionale.  
Nota : La stima preliminare di k  2 per log P  ow = 4,0 è di 0,652 giorni  -1 . La durata totale dell’esperimento viene impostata su 3 × as = 3 × 
4,6 giorni, cioè 14 giorni. Per la stima di «as» vedi allegato 3.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1001
 
ALLEGATO 5  
Differenziazione dei modelli  
Si è supposto che la maggior parte dei dati di bioconcentrazione sia «ragione ­
volmente» ben descritta mediante un semplice modello a due compartimenti e due parametri, come indicato dalla curva rettilinea che approssima i punti delle 
concentrazioni nel pesce durante la fase di depurazione quando vengono tracciati 
su carta semilogaritmica (nel caso questi punti non possano essere descritti mediante una linea retta, impiegare modelli più complessi, cfr. per esempio Spacie and Hamelink, rif. 1 nell'allegato 3).
 
Metodo grafico per la determinazione della costante di velocità di 
depurazione (perdita) k  2 
Tracciare la concentrazione della sostanza in esame trovata in ciascun campione 
di pesce contro il tempo su carta semilogaritmica. Il coefficiente angolare della linea è k
 2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Si noti che le deviazioni dalla linea retta possono indicare uno schema di depu ­
razione più complesso di una cinetica di primo ordine. Per risolvere i tipi di depurazione che deviano dalla cinetica di primo ordine si può applicare un metodo grafico.
 
Metodo grafico per la determinazione della costante di velocità di 
assorbimento k  t 
Dato k  2 calcolare k  1 come segue:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [equazione 1]  
Il valore di C  f viene letto dal punto centrale del tratto piatto della curva di 
assorbimento ottenuta dai dati tracciando log concentrazione contro il tempo 
(su scala aritmetica).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1002
 
Metodo per il calcolo su computer delle costanti di velocità di assorbimento e 
depurazione (perdita)  
Il mezzo preferito per ottenere il fattore di bioconcentrazione e le costanti di 
velocità k  1 e k  2 prevede l'uso di metodi di stima parametrica non lineare su 
computer. Questi programmi trovano i valori di k  1 e k 2 data una serie di dati 
sequenziali di concentrazione contro il tempo e il modello:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c [equazione 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c [equazione 3]  
in cui si ha t  e = tempo al termine della fase di assorbimento.  
Questo approccio e stime della deviazione fornisce standard di k  1 e k 2 . 
Poiché k  2 nella maggior parte dei casi può venire stimato con una precisione 
relativamente elevata dalla curva di depurazione, e poiché vi è una forte corre ­
lazione tra i due parametri, k  1 e k 2 se vengono stimati simultaneamente, e può 
essere conveniente calcolare per primo k  2 dai soli dati di depurazione e succes ­
sivamente k  1 dai dati di assorbimento utilizzando una regressione non lineare.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1003
 
C.14.  TEST SULLA CRESCITA DEI PESCI GIOVANI  
1. METODO  
Questo metodo di test di tossicità sulla crescita corrisponde al TG 
215 (2000) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
L'obiettivo di questo test è valutare gli effetti dell'esposizione pro ­
lungata alle sostanze chimiche sulla crescita dei pesci giovani. Il test si basa su un metodo, sviluppato e sottoposto ad esercizi di interca ­
librazione (ring test) (1) (3) all'interno dell'Unione europea, per va ­
lutare gli effetti delle sostanze chimiche sulla crescita di giovani di 
trota iridea ( Oncorynchus mykiss ) in condizioni di flusso continuo. È 
possibile utilizzare anche altre specie ben documentate. Per esempio, 
esistono esperienze di test sulla crescita con il danio zebrato (Danio 
rerio) (
 1 ) (2) (4) (5) e  Oryzias latipes  (6) (7) (8).  
Cfr. anche Introduzione generale, parte C.  
1.2. DEFINIZIONI  
Minima concentrazione con effetto (Lowest Observed Effect 
Concentration, LOEC):  è la più bassa concentrazione testata di 
una sostanza in esame alla quale si osserva un effetto significativo (p < 0,05) rispetto alla sostanza di controllo. Tuttavia, tutte le con ­
centrazioni al di sopra della LOEC devono avere un effetto dannoso 
uguale o superiore a quelli osservati alla LOEC.
 
Massima concentrazione senza effetto (No Observed Effect Con ­
centration, NOEC):  concentrazione di prova immediatamente infe ­
riore alla LOEC.  
EC x : in questo metodo di test è la concentrazione della sostanza in 
esame che provoca una variazione x % nel tasso di crescita dei pesci rispetto ai controlli.
 
Regime di carico:  peso fresco dei pesci per volume di acqua.  
Densità della popolazione:  numero di pesci per volume di acqua.  
Tasso di crescita specifico del singolo pesce:  esprime il tasso di 
crescita di un individuo in base al suo peso iniziale.  
Tasso di crescita specifico medio della vasca:  esprime il tasso di 
crescita medio della popolazione di una vasca a una specifica con ­
centrazione.  
Tasso di crescita pseudo-specifico:  esprime il tasso di crescita di un 
individuo rispetto al peso iniziale medio della popolazione della 
vasca.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1004  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI TEST  
I pesci giovani in fase di crescita esponenziale vengono pesati e 
collocati in contenitori di prova e quindi esposti a un intervallo di concentrazioni subletali della sostanza in esame disciolta in acqua, 
preferibilmente in condizioni di flusso continuo o, ove non sia pos ­
sibile, in adeguate condizioni semistatiche (statiche con rinnovo del medium). La durata del test è di 28 giorni. I pesci sono alimentati quotidianamente. La razione di cibo è basata sul peso iniziale dei 
pesci e può essere ricalcolata dopo 14 giorni. Al termine del test, i 
pesci vengono nuovamente pesati. Gli effetti sui tassi di crescita vengono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la 
concentrazione che causerebbe una variazione x % del tasso di cre ­
scita, cioè EC
 X (ad esempio EC  10 , EC  20 o EC  30 ). In alternativa, è 
possibile paragonare i dati con valori di controllo per determinare la minima concentrazione con effetto (LOEC) e di conseguenza la 
concentrazione senza effetto (NOEC).
 
1.4. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
Dovrebbero essere disponibili i risultati di un test di tossicità acuta 
(cfr. metodo C.1) eseguito preferibilmente sulle stesse specie scelte per il presente test. Occorre pertanto che siano note la solubilità in 
acqua e la tensione di vapore della sostanza in esame e che sia 
disponibile un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza nelle soluzioni di prova, di cui devono essere noti e riportati i dati relativi all'accuratezza e al limite di rivelabilità.
 
Le informazioni utili comprendono: formula di struttura, purezza 
della sostanza, stabilità in acqua e alla luce, pK  a , P ow - e risultati 
di un test di biodegradabilità immediata (cfr. metodo C.4).  
1.5. VALIDITÀ DEL TEST  
Perché il test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— la mortalità del/i controllo/i non deve superare il 10 % alla fine 
del test,  
— il peso medio dei pesci di controllo deve essere aumentato a 
sufficienza da consentire di individuare la variazione minima del tasso di crescita considerata significativa. Un ring-test (3) 
ha dimostrato che, per la trota iridea, il peso medio dei pesci 
controlli deve essere aumentato, nei 28 giorni, di almeno la metà (50 %) del loro peso medio iniziale: ad esempio, peso iniziale:1 g/pesce (= 100 %), peso finale dopo 28 giorni:  > 1,5 g/pesce ( ≥ 
150 %),
 
— la concentrazione dell'ossigeno disciolto deve essere rimasta al ­
meno al 60 % del valore di saturazione in aria per tutta la durata 
del test,  
— la temperatura dell'acqua non deve mai differire di oltre ± 1  o C 
fra i diversi contenitori, né fra i vari giorni e dovrebbe essere 
mantenuta in un intervallo di 2  o C entro gli intervalli di tempe ­
ratura specificati per la specie utilizzata (allegato 1).  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.6.1.  Apparecchiatura  
Normale attrezzatura da laboratorio e in particolare:  
— misuratori dell'ossigeno e del pH;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1005
 
— attrezzatura per la determinazione della durezza e dell'alcalinità 
dell'acqua;  
— apparecchiatura adeguata per il controllo della temperatura e pre ­
feribilmente per il monitoraggio continuo;  
— vasche in materiale chimicamente inerte e di capacità adeguata in 
relazione al carico e alla densità di popolazione raccomandati 
(cfr. sezione 1.8.5 e appendice 1);  
— bilancia sufficientemente precisa (precisione a ± 0,5 %).  
1.6.2.  Acqua  
Per il test si può utilizzare qualunque tipo di acqua in cui la specie in 
esame dimostra di sopravvivere a lungo termine e di crescere in modo adeguato. La qualità dell'acqua deve essere costante per tutta 
la durata del test. Il pH deve essere compreso entro 6,5 e 8,5, ma nel 
corso di un dato test deve essere compreso entro un intervallo di ± 0,5 unità di pH. Si raccomanda una durezza superiore a 140 mg/l (come CaCO
 3 ). Per evitare effetti indesiderati dell'acqua di diluizione 
sui risultati del test (ad esempio per complessazione della sostanza in 
esame), ad intervalli si dovrebbero prelevare campioni e analizzarli. La misura dei metalli pesanti (ad esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), dei principali anioni e cationi (ad esempio Ca, Mg, Na, K, Cl e SO
 4 ), 
dei pesticidi (ad esempio pesticidi organofosforati totali e organoclo ­
rurati totali), del carbonio organico totale e dei solidi in sospensione va effettuata ad esempio ogni tre mesi, se l'acqua di diluizione è di qualità relativamente costante. Se la qualità dell'acqua è risultata 
costante per almeno un anno, le determinazioni possono essere ef ­
fettuate con minore frequenza (ad esempio ogni sei mesi). Alcune caratteristiche chimiche di un'acqua di diluizione accettabile sono elencate nell'allegato 2.
 
1.6.3.  Soluzioni di prova  
Le soluzioni di prova alle concentrazioni scelte vanno preparate per 
diluizione di una soluzione madre.  
La soluzione madre deve essere di preferenza preparata semplice ­
mente miscelando o agitando la sostanza di prova nell'acqua di di ­
luizione con mezzi meccanici (cioè agitazione o ultrasuoni). Per 
ottenere una concentrazione adeguata della soluzione madre si pos ­
sono utilizzare colonne di saturazione (colonne di solubilità).  
In alcuni casi può rendersi necessario l'utilizzo di solventi o disper ­
denti (agenti solubilizzanti) per ottenere una soluzione madre di 
adeguata concentrazione. A tale scopo si prestano, ad esempio, sol ­
venti quali acetone, eta-nolo, metanolo, dimetilsolfossido, dimetilfor ­
mammide e glicole trietilenico o disperdenti quali Cremophor RH40. Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e HCO-40. Quando si im ­
piegano agenti a rapida biodegradabilità, come l'acetone, e/o alta ­
mente volatili è necessario procedere con cautela, poiché potrebbero causare problemi nelle prove a flusso continuo dovuti a sviluppo batterico Eventuali agenti solubilizzanti non devono avere effetti 
significativi sulla crescita dei pesci, né effetti negativi visibili sui 
giovani; come deve risultare da un controllo con solo solvente.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1006
 
Per le prove a flusso continuo occorre un sistema che eroghi e 
diluisca in continuo una soluzione madre della sostanza in esame 
(ad esempio una pompa dosatrice, un diluitore proporzionale, un sistema di saturazione) per fornire alle camere di prova una serie di concentrazioni. Le portate di soluzione madre e acqua di dilui ­
zione dovrebbero essere controllate a intervalli, preferibilmente ogni 
giorno, e non devono variare di oltre il 10 % per tutta la durata del test. Un ring-test (3) ha dimostrato che, per la trota iridea, è accet ­
tabile una rimozione dell'acqua, durante il test, di 6 litri/g di pesce/ ­
die (cfr. sezione 1.8.2.2).
 
Per i test semistatici (con rinnovo), la frequenza di rinnovo del 
mezzo dipende dalla stabilità della sostanza in esame, ma si racco ­
manda di sostituire l'acqua quotidianamente. Se da test preliminari di 
stabilità (cfr. sezione 1.4) la concentrazione della sostanza in esame 
non risulta stabile (cioè è al di fuori dell' intervallo dell'80-120 % della concentrazione nominale o al di sotto dell'80 % della concen ­
trazione iniziale misurata) durante l'intervallo di tempo tra due rin ­
novi dell'acqua, occorre prendere in considerazione l'uso di un test a 
flusso continuo.
 
1.6.4.  Selezione della specie  
La trota iridea ( Oncorhynchus mykiss ) è la specie raccomandata per 
questo test, in quanto la maggior parte dell'esperienza deriva da ring- 
test effettuati su questa specie (1) (3). È però possibile utilizzare altre 
specie ben documentate, ma in questo caso potrebbe essere necessa ­
rio adattare la procedura sperimentale per fornire condizioni speri ­
mentali adeguate. Ad esempio, sono state fatte esperienze anche con 
il danio zebrato ( Danio rerio ) (4) (5) e l' Oryzias latipes  (6) (7) (8). 
In questo caso occorre motivare la scelta della specie e descrivere dettagliatamente il metodo sperimentale.
 
1.6.5.  Mantenimento dei pesci  
I pesci vanno selezionati da una popolazione di un solo stock, pre ­
feribilmente dalla stessa nidiata che sia stata mantenuta in condizioni 
di qualità dell'acqua e di illuminazione simili a quelle usate nel test per almeno due settimane prima della sperimentazione. Essi vanno alimentati con una razione minima quotidiana pari al 2 % del peso 
corporeo (razione quotidiana ideale = 4 % del peso corporeo) per 
tutto il periodo di mantenimento e durante il test.
 
Dopo un periodo di acclimatazione di 48 h si registra la mortalità e 
si applicano i seguenti criteri:  
— mortalità di oltre il 10 % della popolazione in sette giorni: re ­
spingere l'intero lotto,  
— mortalità fra il 5 % e il 10 % della popolazione: acclimatazione 
per altri sette giorni; se nel corso della seconda settimana la 
mortalità supera il 5 %, respingere l'intero lotto,  
— mortalità inferiore al 5 % della popolazione in sette giorni: ac ­
cettare il lotto.  
Durante le due settimane precedenti il test e durante il test ai pesci 
non vanno somministrate sostanze terapeutiche.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1007
 
1.7. DISEGNO SPERIMENTALE  
Il «disegno sperimentale» comprende la selezione del numero delle 
concentrazioni di prova, e dell'intervallo fra esse, il numero di vasche per ciascun livello di concentrazione e il numero di pesci per vasca. 
Idealmente, il disegno sperimentale dovrebbe essere scelto tenendo 
conto dei seguenti aspetti:
 
— obiettivo dello studio;  
— metodo di analisi statistica che verrà impiegato;  
— disponibilità e costo delle risorse sperimentali.  
Nel dichiarare l'obiettivo occorre possibilmente specificare il potere 
statistico a cui occorre rilevare una data differenza (ad esempio nel 
tasso di crescita) o, alternativamente, la precisione con cui occorre 
stimare la EC  X (ad esempio con x = 10, 20 o 30, comunque di 
preferenza non meno di 10). In assenza di questi dati è impossibile dare indicazioni precise sulle dimensioni dello studio.
 
È importante riconoscere che un disegno che risulta ottimale (ovvero 
utilizza al meglio le risorse) per un dato metodo di analisi statistica 
non è necessariamente ottimale per un altro metodo. Il disegno rac ­
comandato per la stima della LOEC/NOEC non sarebbe pertanto lo stesso raccomandato per l'analisi con la regressione.
 
Nella maggior parte dei casi l'analisi di regressione è preferibile 
all'analisi della varianza per i motivi discussi da Stephan e Rogers 
(9). Comunque, qualora non si trovi un modello di regressione ade ­
guato (r  2 < 0,9), si dovrebbe utilizzare la NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Disegno per l'analisi con la regressione  
Nel definire il disegno sperimentale di un test cui applicare l'analisi 
di regressione occorre considerare quanto segue:  
— la concentrazione con effetto (ad esempio EC  10,20,30  ) e l'inter ­
vallo di concentrazioni a cui interessa l'effetto della sostanza in esame dovrebbero necessariamente essere compresi dalle concen ­
trazioni incluse nel test. La precisione con cui si possono stimare 
le concentrazioni con effetto sarà maggiore quando la concen ­
trazione con effetto è al centro dell'intervallo di concentrazioni da testare. Un test preliminare di ricerca dell'intervallo può risultare utile per selezionare le concentrazioni di prova più adeguate;
 
— per consentire l'intervallo di un modello statistico soddisfacente il 
test dovrebbe comprendere almeno una vasca di controllo e cin ­
que vasche ulteriori a concentrazioni diverse fra loro. Se del 
caso, quando si utilizza un agente solubilizzante, occorre predi ­
sporre un controllo contenente l'agente solubilizzante alla più alta concentrazione utilizzata, oltre alla serie prevista dal test (cfr. 
sezioni 1.8.3 e 1.8.4);
 
— è possibile usare una serie geometrica adeguata allo scopo o una 
serie logaritmica (10) (cfr. allegato 3). E preferibile un intervallo 
logaritmico fra le concentrazioni sperimentali;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1008
 
— se sono disponibili più di sei vasche, le vasche in eccedenza 
dovrebbero essere utilizzate come repliche o distribuite per tutto 
il intervallo di concentrazioni per ridurre gli intervalli tra le concentrazioni. Entrambi i metodi sono ugualmente accettabili.
 
1.7.2.  Disegno per la stima di una NOEC/LOEC mediante analisi della 
varianza (ANOVA)  
È preferibile che vi siano vasche di replica per ciascuna concentra ­
zione e l'analisi statistica dovrebbe essere fatta a livello di vasca (11). 
La mancanza di vasche di replica non consente di tener conto della variabilità fra le vasche al di là di quella dovuta ai singoli pesci. Tuttavia, l'esperienza (12) ha dimostrato che, nel caso esaminato, la 
variabilità fra le vasche era molto bassa rispetto alla variabilità al ­
l'interno della vasca (ovvero fra i pesci). Pertanto un'alternativa re ­
lativamente accettabile è quella di effettuare l'analisi statistica a li ­
vello dei singoli pesci.
 
Di norma si utilizzano almeno cinque concentrazioni sperimentali 
in una serie geometrica con un fattore preferibilmente non supe ­
riore a 3,2.  
Generalmente, quando si eseguono test con repliche, il numero di 
vasche di replica nel controllo e pertanto il numero di pesci dovrebbe 
corrispondere al doppio del numero in ciascuna delle concentrazioni sperimentali, che dovrebbero essere di dimensioni uguali (13) (14) (15). Per contro, in mancanza di repliche il numero di pesci nel 
gruppo di controllo dovrebbe essere uguale a quello in ciascuna 
concentrazione sperimentale.
 
Se l'ANOVA deve essere basata sulle vasche invece che sui singoli 
pesci [cosa che comporterebbe la marcatura individuale dei pesci o 
l'uso dei tassi di crescita «pseudo» specifici (cfr. sezione 2.1.2)], il 
numero di vasche di replica deve essere sufficiente per consentire la determinazione della deviazione standard delle «vasche all'interno delle concentrazioni». Ciò significa che i gradi di libertà dell'errore 
nell'analisi della varianza sono almeno 5 (11). Replicando solo i 
controlli si rischia di influenzare la variabilità dell'errore poiché essa può aumentare con il valore medio del tasso di crescita in questione. Poiché è probabile che il tasso di crescita diminuisca 
con l'aumentare della concentrazione, ciò tenderà a portare a una 
sovrastima della variabilità.
 
1.8. PROCEDURA  
1.8.1.  Selezione e pesatura dei pesci da sottoporre al test  
È importante ridurre a! minimo la differenza di peso tra i pesci 
all'inizio del test. L'appendice 1 fornisce gli intervalli adeguati di 
misura per le diverse specie raccomandate per questo test. Per l'intero 
lotto di pesci utilizzato nel test, la differenza di peso tra i singoli individui all'inizio del test dovrebbe essere idealmente mantenuta entro ± 10 % del peso medio aritmetico e, in ogni caso, non deve 
superare il 25 %. Si raccomanda di pesare un sottocampione di pesci 
prima del test per stimare il peso medio.
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La popolazione dello stock non va nutrita per 24 ore prima dell'inizio 
del test. Successivamente, i pesci vanno scelti in maniera casuale. 
Utilizzando un anestetico generale [ad esempio con una soluzione acquosa di 100 mg/l di metilsolfonato di tricaina (MS 222) neutra ­
lizzato con l'aggiunta di due parti di bicarbonato di sodio per parte di 
MS 222], occorre pesare individualmente i pesci asciugati per tam ­
ponamento come peso fresco alla precisione indicata nell'allegato 1. I pesci con pesi entro il intervallo desiderato vanno tenuti e quindi distribuiti a caso tra le vasche sperimentali. È necessario registrare il 
peso fresco totale dei pesci in ciascuna vasca sperimentale. L'im ­
piego di anestetici e la manipolazione dei pesci (compresi l'asciuga ­
tura e la pesatura) possono provocare stress e lesioni nei pesci gio ­
vani, in particolare nelle specie di piccola taglia. I pesci giovani 
vanno pertanto maneggiati con la massima cura per evitare di stres ­
sare e danneggiare gli animali sperimentali.
 
I pesci vanno nuovamente pesati il giorno 28 del test (cfr. sezione 
1.8.6). Se tuttavia si ritiene necessario ricalcolare la razione di cibo, i pesci possono essere pesati anche il giorno 14 del test (cfr. sezione 
1.8.2.3). Per determinare i cambiamenti di dimensione dei pesci, su 
cui basarsi per adeguare le razioni di cibo, si possono utilizzare metodi diversi come quello fotografico.
 
1.8.2.  Condizioni di esposizione  
1.8.2.1.  Durata  
La durata del test è di ≥ 28 giorni.  
1.8.2.2.  Regimi di carico e densità della popolazione  
È importante che il regime di carico e la densità della popolazione 
siano adeguate per la specie usata nel test (cfr. allegato 1). Se la 
densità della popolazione è eccessivamente alta, si verificherà uno 
stress da sovraffollamento, con conseguente diminuzione dei tassi di crescita e, verosimilmente, sviluppo di malattie. Se è eccessivamente bassa, è possibile che si induca un comportamento territoriale passi ­
bile di influenzare anche la crescita degli individui. In ogni caso il 
regime di carico dovrebbe essere sufficientemente basso da consen ­
tire di mantenere, senza areazione, una concentrazione di ossigeno 
disciolto pari ad almeno il 60 % del valore di saturazione in aria. Un 
ring test (3) ha dimostrato che, per la trota iridea, è accettabile un regime di carico di 16 trote di 3-5 g in un volume di 40 litri. La frequenza raccomandata di rimozione dell'acqua durante il test è di 6 
litri/g di pesce/die.
 
1.8.2.3.  Alimentazione  
I pesci vanno nutriti con cibo adatto (allegato 1) in quantità suffi ­
ciente da indurre un tasso di crescita accettabile. Occorre evitare la 
crescita microbica e l'intorbidimento dell'acqua. Per la trota iridea una quantità quotidiana pari al 4 % del peso corporeo dovrebbe soddisfare queste condizioni (3) (16) (17) (18). La razione quotidiana 
può essere suddivisa in due porzioni uguali e offerta ai pesci in due 
pasti al giorno, a distanza di almeno 5 ore l'uno dall'altro. La razione si basa sul peso totale iniziale dei pesci per ciascuna vasca speri ­
mentale. Se i pesci vengono pesati anche il giorno 14. la razione 
viene ricalcolata. Nelle 24 ore precedenti alla pesatura i pesci non 
dovrebbero essere nutriti.
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II cibo avanzato e il materiale fecale vanno rimossi dalle vasche 
sperimentali ogni giorno, pulendo con cura il fondo di ciascuna 
vasca con un aspiratore.  
1.8.2.4.  Luce e temperatura  
Il fotoperiodo e la temperatura dell'acqua devono essere adatti alla 
specie utilizzata (allegato 1).  
1.8.3.  Concentrazioni sperimentali  
Normalmente occorrono cinque concentrazioni della sostanza in esa ­
me, a prescindere dal disegno sperimentale scelto (cfr. sezione l.7.2). 
La conoscenza preliminare della tossicità della sostanza in esame (ad 
esempio mediante un test di tossicità acuta e/o uno studio di ricerca dell'intervallo di tossicità) dovrebbe essere d'aiuto nella selezione delle opportune concentrazioni sperimentali Se si utilizzano meno 
di cinque concentrazioni occorre spiegarne il motivo. La più alta 
concentrazione utilizzata nel test non deve superare il limite di so ­
lubilità in acqua della sostanza.
 
Se nella preparazione delle soluzioni madre si utilizza un agente 
solubilizzante, la sua concentrazione finale non deve superare 0,1 ml/l e, di preferenza, essere uguale in tutte le vasche (cfr. sezione 
1.6.3). L'uso di tali materiali dovrebbe comunque essere evitato il più 
possibile.
 
1.8.4.  Controlli  
Il numero di controlli dell'acqua di diluizione dipende dal disegno 
sperimentale (cfr. sezioni 1.7-1.7.2). Se si utilizza un agente solubi ­
lizzante, il numero di controlli dell'agente solubilizzante deve corri ­
spondere a quello dei controlli dell'acqua di diluizione.  
1.8.5.  Frequenza delle determinazioni analitiche e delle misure  
Durante il test vanno determinate a intervalli regolari le concentra ­
zioni della sostanza in esame (cfr. sotto).  
Nei test a flusso continuo le portate del diluente e della soluzione 
madre della sostanza tossica dovrebbero essere controllati a interval ­
li, preferibilmente ogni giorno, e non dovrebbero variare di oltre il 10 % per tutta la durata del test. Quando si suppone che le concen ­
trazioni della sostanza in esame siano entro ± 20 % dei valori no ­
minali (cioè entro l'intervallo 80-120 %; cfr. sezioni 1.6.2 e 1.6.3), si raccomanda di analizzare, come minimo, la concentrazione minima e massima all'inizio del test e, successivamente, a intervalli settimanali. 
Per i test in cui non si ritiene che la concentrazione della sostanza in 
esame resti entro ± 20 % dei valori nominali (sulla base dei dati di stabilità relativi alla sostanza in esame), è necessario analizzare tutte le concentrazioni sperimentali, ma seguendo lo stesso regime.
 
Nei test semistatici (con rinnovo) in cui si suppone che la concen ­
trazione della sostanza in esame resti entro ± 20 % dei valori nomi ­
nali, si raccomanda di analizzare, come minimo, la concentrazione 
minima e massima appena preparate e subito prima del rinnovo, 
all'inizio dello studio e, successivamente, ogni settimana. Per i test in cui non si ritiene che la concentrazione della sostanza in esame resti entro ± 20 % dei valori nominali, si devono analizzare tutte le 
concentrazioni sperimentali seguendo lo stesso regime adottato per le 
sostanze più stabili.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1011
 
Si raccomanda che i risultati siano basati sulle concentrazioni misu ­
rate. Se tuttavia vi sono prove che dimostrino che la concentrazione 
della sostanza in esame in soluzione è stata mantenuta in modo soddisfacente entro ± 20 % della concentrazione iniziale nominale o misurata per tutta la durata del test, allora i risultati possono essere 
basati sui valori nominali o misurati.
 
Qualora si rendesse necessario filtrare (ad esempio con pori di 
0,45 μm) o centrifugare i campioni, la centrifugazione è la procedura 
raccomandata. Comunque, se il materiale da testare non assorbe ai filtri, può essere accettabile anche la filtrazione.
 
Durante il test l'ossigeno disciolto, il pH e la temperatura dovrebbero 
essere misurati in tutte le vasche sperimentali. La durezza totale, l'alcalinità e la salinità (se del caso) vanno misurate nei controlli e in una vasca alla concentrazione massima. L'ossigeno disciolto e, 
eventualmente la salinità, vanno misurati almeno tre volte (all'inizio, 
verso la metà e alla fine del test). Nei testi semistatici si raccomanda di misurare l'ossigeno disciolto con maggiore frequenza, preferibil ­
mente prima e dopo ogni rinnovo dell'acqua o almeno una volta alla 
settimana. Il pH dovrebbe essere misurato all'inizio e alla fine di 
ogni rinnovo dell'acqua nei test semistatici e almeno una volta alla settimana nei test a flusso continuo. La durezza e l'alcalinità vanno misurate una sola volta per ciascun test. È auspicabile che la tem ­
peratura sia controllata continuamente in almeno in una vasca spe ­
rimentale.
 
1.8.6.  Osservazioni  
Peso: alla fine del test tutti i pesci sopravvissuti devono essere pesati 
come peso fresco dopo essere stati asciugati per tamponamento o in gruppo per ogni vasca sperimentale o singolarmente. La 
pesatura degli animali per vasca è preferibile a quella dei singoli 
individui, poiché evita di marcare i pesci uno per uno. Nel caso della misura individuale per la determinazione del tasso di crescita specifico di ogni singolo pesce, la tecnica di marcatura selezionata 
non deve causare stress agli animali (possono risultare adatte delle 
alternative alla marcatura per congelamento come ad esempio l'uso di una sottile lenza da pesca colorata).
 
I pesci dovrebbero essere esaminati ogni giorno durante il periodo di 
test ed eventuali anomalie esterne (quali emorragie, scoloramento) o 
comportamenti anomali dovrebbero essere registrati. Eventuali casi 
di mortalità vanno registrati e i pesci morti devono essere rimossi appena possibile. Questi non vanno sostituiti, in quanto il regime di carico e la densità della popolazione sono sufficienti per evitare 
effetti sulla crescita dovuti al cambiamento del numero di pesci 
per vasca. Sarà invece necessario adeguare la quantità di cibo som ­
ministrata.
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Si raccomanda di ricorrere ad uno statistico sia per la concezione del 
disegno sperimentale che per l'analisi statistica dei risultati del test, 
in quanto il metodo consente considerevoli variazioni, ad esempio nel numero di vasche e di concentrazioni di prova, nel numero dei pesci e così via. Viste le diverse opzioni di disegno sperimentale, in 
questa sede non si forniscono indicazioni specifiche sulle procedure 
statistiche.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1012
 
Non vanno calcolati i tassi di crescita per le vasche in cui la mor ­
talità supera il 10 %. Il tasso di mortalità dovrebbe però essere 
indicato per tutte le concentrazioni di prova.  
Qualsiasi metodo venga utilizzato per l'analisi dei dati, il concetto 
centrale è il tasso di crescita specifico r fra il tempo t  1 e il tempo t  2 . 
Esso può essere definito in vari modi, a seconda che i pesci siano 
marcati individualmente o meno, o che sia richiesta una media della 
vasca.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
dove,  
r 1 = tasso di crescita specifico del singolo pesce  
r 2 = tasso di crescita specifico medio della vasca  
r 3 = tasso di crescita «pseudo» specifico  
w 1 , w 2 = pesi di un particolare pesce rispettivamente ai tempi t  1 
e t 2 
log e w 1 = logaritmo del peso di un singolo pesce all'inizio del 
periodo di studio  
log e w 2 = logaritmo del peso di un singolo pesce alla fine del 
periodo di studio  
log e W 1 = media dei logaritmi dei valori w  1 per i pesci nella 
vasca all'inizio del periodo di studio  
log e W 2 = media dei logaritmi dei valori w  2 per i pesci nella 
vasca alla fine del periodo di studio  
t 1 , t 2 = tempo (giorni) all'inizio e alla fine del periodo di stu ­
dio 
r 1 , r 2 , r 3 possono essere calcolati per il periodo compreso fra i giorni 
0 e 28 ed eventualmente (cioè quando è stata effettuata la misura ­
zione al giorno 14) per i periodi fra i giorni 0 e 14 e 14 e 28.  
2.1.1.  Analisi dei risultati con la regressione (modello concentrazione- 
risposta)  
Questo metodo di analisi trova una relazione matematica adeguata 
fra il tasso di crescita specifico e la concentrazione. e dunque con ­
sente la stima della «EC  X », ovvero qualsiasi valore di EC richiesto. 
Con questo metodo non è necessario calcolare r per ogni singolo 
pesce (r  1 ): l'analisi può invece essere basata sul valore di r medio per 
la vasca (r  2 ). Quest'ultimo metodo è preferibile, nonché più adatto 
nel caso si utilizzino le specie più piccole.  
I tassi di crescita specifici medi per la vasca (r  2 ) dovrebbero essere 
riportati in grafico contro la concentrazione, allo scopo di esaminare 
la relazione concentrazione-risposta.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1013
 
Per esprimere la relazione fra r  2 e la concentrazione occorre scegliere 
un modello adatto e la sua scelta deve essere sostenuta da opportune 
considerazioni.  
Se il numero dei pesci sopravvissuti varia di vasca in vasca, il 
processo di adattamento del modello ai punti sperimentali (fitting) che sia semplice o non lineare, dovrebbe essere pesato per tenere conto delle diverse dimensioni dei gruppi.
 
Il metodo di adattamento del modello deve permettere di ricavare 
una stima, ad esempio, della EC  20 e della sua dispersione (errore 
standard o intervallo di confidenza). Il grafico del modello trovato va presentato in relazione ai dati in modo tale da mostrare l'adeguatezza dell'adattamento (fit) del modello (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2.  Analisi dei risultati per la stima della LOEC  
Se il test prevedeva repliche a tutti i livelli di concentrazione, la 
stima della LOEC può essere basata su un'analisi della varianza 
(ANOVA) del tasso di crescita specifico medio della vasca (cfr. 
sezione 2.1), seguita da un metodo adeguato [ad esempio il test di Dunnett o di Williams (13) (14) (15) (22)] di confronto tra l'r media per ciascuna concentrazione con l'r media per i controlli, allo scopo 
di identificare la concentrazione più bassa alla quale tale differenza 
risulti significativa a un livello di probabilità dello 0,05. Se non vengono soddisfatte le assunzioni richieste per i metodi parametrici — distribuzione non normale (ad esempio al test di Shapiro-Wilk) o 
varianza eterogenea (al test di Bartlett) —, potrebbe essere necessario 
trasformare i dati per rendere omogenee le varianze prima di eseguire l'ANOVA oppure effettuare un'ANOVA ponderata.
 
Se il test non comprendeva repliche a ciascuna concentrazione, 
un'ANOVA basata sulle vasche non sarà sensibile o risulterà impos ­
sibile. In tal caso un compromesso accettabile è quello di basare 
l'ANOVA sul tasso di crescita «pseudo» specifico r  3 dei singoli 
pesci.  
L'r 3 medio di ciascuna concentrazione sperimentale può quindi essere 
paragonato con l'r  3 medio dei controlli. La LOEC può quindi essere 
identificata come in precedenza. Va detto che questo metodo non 
consente di tenere conto della variabilità fra le vasche, (né di salva ­
guardarsi da essa) ma solo di quella dovuta alla variabilità esistente fra i singoli pesci. Tuttavia, l'esperienza ha dimostrato (9) che la 
variabilità fra le vasche era molto piccola rispetto alla variabilità 
all'interno della vasca (cioè fra i pesci). Se nell'analisi non sono compresi i singoli pesci, occorre indicare il metodo di identificazione dei valori anomali e giustificarne l'utilizzo.
 
2.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati vanno interpretati con cautela nel caso in cui nelle solu ­
zioni di prova si misurino concentrazioni di sostanze tossiche a 
livelli vicini al limite di rivelabilità del metodo analitico o, nei test 
semistatici, quando la concentrazione della sostanza in esame prima del rinnovo risulta diminuita rispetto alla soluzione appena preparata.
 
2.3. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere le seguenti informazioni:  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1014
 
2.3.1.  Sostanza in esame:  
— natura fisica e proprietà chimico-fisiche rilevanti,  
— dati chimici di identificazione, compresi purezza e metodo ana ­
litico per la quantificazione della sostanza in esame, se del caso.  
2.3.2.  Specie utilizzata:  
— nome scientifico, se possibile,  
— ceppo, dimensioni, fornitore, eventuali pretrattamenti, ecc.  
2.3.3.  Condizioni di esecuzione del test:  
— procedura sperimentale utilizzata (ad esempio semistatica con 
rinnovo, a flusso continuo, carico, densità della popolazione, ecc.),
 
— disegno sperimentale (ad esempio numero di vasche, concentra ­
zioni e repliche, numero di pesci per vasca),  
— metodo di preparazione delle soluzioni madre e frequenza di 
rinnovo (l'agente solubilizzante, se usato, va indicato insieme alla sua concentrazione),
 
— concentrazioni sperimentali nominali, medie dei valori misurati e 
loro deviazioni standard nelle vasche sperimentali nonché metodo 
con cui sono state calcolate e dimostrazione che le misure si 
riferiscono alle concentrazioni della sostanza in esame in solu ­
zione vera,  
— caratteristiche dell'acqua di diluizione: pH, durezza, alcalinità, 
temperatura, concentrazione di ossigeno disciolto, livelli di cloro residuo (se misurati), carbonio organico totale, solidi in sospen ­
sione, salinità del mezzo di prova (se misurata) ed eventuali altre 
misurazioni effettuate,
 
— qualità dell'acqua nelle vasche sperimentali: pH, durezza, tempe ­
ratura e concentrazione dell'ossigeno disciolto,  
— informazioni dettagliate sull'alimentazione (ad esempio tipo/i di 
cibo, origine, quantità somministrata e frequenza).  
2.3.4.  Risultati:  
— dimostrazione che i controlli soddisfino i criteri di validità per la 
sopravvivenza, nonché dati sulla eventuale mortalità in tutte le 
concentrazioni sperimentali,  
— tecniche di analisi statistica utilizzate, statistica basata sulle re ­
pliche o sui pesci, trattamento dei dati e giustificazione delle tecniche usate,
 
— dati tabulati sui pesi individuali e medi dei pesci nei giorni 0,14 
(se misurati) e 28, valori dei tassi di crescita medi per vasca o pseudo specifici (a seconda del caso) per i periodi da 0 a 28 
giorni o eventualmente da 0 a 14 e da 14 a 28,
 
— risultati dell'analisi statistica (analisi di regressione o ANOVA) 
preferibilmente mostrati in tabelle e grafici, nonché la LOEC (p = 
0,05) e la NOEC o EC  x con gli errori standard, se possibile, 
a seconda dei casi,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1015
 
— incidenza delle eventuali reazioni anomale da parte dei pesci e di 
eventuali effetti visibili indotti dalla sostanza in esame.  
3. BIBLIOGRAFIA  
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 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1018
 ▼B 
ALLEGATO 1  
SPECIE DI PESCI RACCOMANDATE PER IL TEST E CONDIZIONI SPERIMENTALI ADEGUATE  
Specie Intervallo di tem ­
peratura raccoman ­
dalo 
( o C) Fotoperiodo 
(ore) Intervallo racco ­
mandato per il 
peso iniziale dei 
pesci 
(g) Precisione della mi ­
sura richiesta Regime di carico 
(g/l) Densità della po ­
polazione 
(per litro) Cibo Durata de! test 
(giorni)  
Specie raccomandate:  
Oncorhynchus mykiss  
Trota iridea 12,5-16,0 12-16 1-5 Ai 100 mg più 
vicini 1,2-2,0 4 Cibo secco commerciale per 
avan-notti di salmonidi ≥ 28 
Altre specie ben documentate:  
Danio rerio 
Danio zebrato 21-25 12-16 0,050-0,100 All'1 mg più vi ­
cino 0,2-1,0 5-10 Cibo vivo (Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28 
Oryzias latipes 21-25 12-16 0,050-0,100 All'1 mg più vi ­
cino 0,2-1,0 5-20 Cibo vivo (Brachionus Anemia) ≥ 28
ALLEGATO 2  
ALCUNE CARATTERISTICHE CHIMICHE DI UN'ACQUA DI 
DILUIZIONE ACCETTABILE  
Sostanza Concentrazioni  
Particolato < 20 mg/l 
Carbonio organico totale < 2 mg/l 
Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l 
Cloro residuo < 10 μg/l 
Pesticidi organofosforati totali < 50 μg/l 
Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati < 50 μg/l 
Cloro organico totale < 25 μg/l ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1019
 
APPENDICE 3  
Serie logaritmiche di concentrazioni adatte per i test di tossicità (9)  
Colonna (numero di concentrazioni fra 100 e 10 o fra 10 e 1(  1 ) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 
1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 
1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 
1,0
 
( 1 ) Da ciascuna colonna è possibile scegliere una serie di cinque (o più) concentrazioni .successive. I punti intermedi fra le co ncen­
trazioni nella colonna (x) si trovano nella colonna (2x + 1). I valori elencati possono rappresentare le concentrazioni espress e come 
percentuale per volume o peso (mg/1 o ug/1). I valori possono essere moltiplicati o divisi per qualsiasi potenza di 10 a second a del 
caso. È possibile usare la colonna 1 in caso di notevoli incertezze sul livello di tossicità.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1020
 
C.15.  PESCI, PROVA DI TOSSICITÀ A BREVE TERMINE SUGLI 
STADI DI EMBRIONI E DI LARVA CON SACCO VITELLINO  
1. METODO  
Questo metodo di prova della tossicità a breve termine corrisponde al 
TG 212 (1998) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Questa prova di tossicità a breve termine sugli stadi di embrione e di 
larve con sacco vitellino di pesci è una prova a breve termine in cui vengono esposti i pesci negli stadi che vanno dall'uovo appena fer ­
tilizzato alla fine dello stadio di larve con sacco vitellino. La prova 
sugli embrioni e sulle larve con sacco vitellino non prevede alcun 
tipo di alimentazione e va pertanto conclusa mentre le larve con sacco vitellino sono ancora nutrite dal sacco vitellino.
 
L'obiettivo della prova è definire gli effetti letali e, limitatamente, 
subletali di sostanze chimiche sugli specifici stadi vitali e specie 
sottoposti alla prova. Questa prova è in grado di fornire informazioni utili in quanto: a) può fare da nesso fra le prove letali e subletali; b) può essere utilizzata come prova di screening in una «prova com ­
pleta su stadi di vita precoci» per una prova di tossicità cronica e c) 
può essere usata per saggiare specie per le quali le tecniche di allevamento non sono sufficientemente avanzate per coprire il pe ­
riodo di transizione dall'alimentazione endogena a quella esogena.
 
È necessario ricordare che, in generale, solo le prove che compren ­
dono tutti gli stadi del ciclo vitale dei pesci sono in grado di fornire 
una stima accurata della tossicità cronica delle sostanze chimiche nei confronti dei pesci e che eventuali riduzioni dell'esposizione in fun ­
zione dei diversi stadi di vita possono diminuire la sensibilità della 
prova e quindi sottovalutare la tossicità cronica. Si ritiene pertanto 
che la prova sugli embrioni e su larve con sacco vitellino sia meno sensibile di una «prova completa su stadi di vita precoci», soprattutto rispetto a sostanze chimiche altamente lipofile (log P
 OW > 4) e a 
sostanze chimiche con un meccanismo di azione tossica specifico. 
Comunque, si prevede che per sostanze chimiche con un modo di azione narcotico non specifico le differenze di sensibilità fra le due 
prove siano minori (1).
 
Prima della sua pubblicazione la presente prova sugli embrioni e su 
larve con sacco vitellino è stata per la maggior parte condotta sul pesce d'acqua dolce  Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cy ­
prinidae — nome comune: danio zebrato). Per questo motivo l'ap ­
pendice 1 contiene indicazioni più dettagliate sull'esecuzione della 
prova su questa specie, ma ciò non impedisce di utilizzare altre specie con le quali sono già state fatte esperienze (tabelle 1A e 1B).
 
1.2. DEFINIZIONI  
Minima concentrazione con effetti significativi (Lowest observed 
effect concentration, LOEC):  è la più bassa concentrazione saggiata 
di una sostanza di prova alla quale si osserva un effetto significativo 
(p < 0,05) rispetto al controllo. Tuttavia, tutte le concentrazioni al di sopra della LOEC devono avere un effetto dannoso uguale o supe ­
riore a quello osservato alla LOEC.
 
Massima concentrazione senza effetti significativi (No observed 
effect concentration, NOEC):  è la concentrazione di prova imme ­
diatamente inferiore alle LOEC.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1021
 
1.3. PRINCIPIO DELLA PROVA  
Gli stadi di embrione e di larva con sacco vitellino vengono esposti a 
un intervallo di concentrazioni della sostanza di prova disciolta in acqua. Il protocollo consente di optare per una procedura semistatica 
o per una a flusso continuo in funzione della natura della sostanza in 
esame. La prova inizia con la collocazione delle uova fecondate in contenitori di prova e termina subito prima che il sacco vitellino di una qualsiasi delle larve in una delle camere di prova sia completa ­
mente assorbito, o prima che i controlli inizino a morire per man ­
canza di cibo. Gli effetti letali e subletali vengono valutati e con ­
frontati con i valori relativi ai controlli allo scopo di determinare la 
minima concentrazione alla quale si osservano effetti significativi 
(LOEC) e di conseguenza la concentrazione senza effetti significativi (NOEC). In alternativa, è possibile valutare gli effetti tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione capace di cau ­
sare una determinata percentuale di effetto (cioè LC/ECx, dove x è 
una % di effetto definita).
 
1.4. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Dovrebbero essere disponibili i risultati di una prova di tossicità 
acuta (cfr. metodo C.1) eseguita preferibilmente sulla stessa specie scelta per la presente prova. I risultati possono essere utili per sce ­
gliere un intervallo adeguato di concentrazioni di prova nella prova 
sugli stadi di vita precoci. Occorre conoscere i valori relativi alla solubilità in acqua (compresa la solubilità nell'acqua utilizzata per la prova) e alla tensione di vapore della sostanza di prova. Occorre 
inoltre disporre di un metodo analitico affidabile per la quantifica ­
zione della sostanza nelle soluzioni di prova, di cui devono essere noti e riportati i dati relativi all'accuratezza e al limite di rivelabilità.
 
Le informazioni sulla sostanza in esame utili per definire le condi ­
zioni di esecuzione della prova sono: formula di struttura, purezza 
della sostanza, fotostabilità, stabilità nelle condizioni di esecuzione della prova, pKa, P
 OW . e risultati di una prova di biodegradabilità 
immediata (cfr. metodo C.4).  
1.5. VALIDITÀ DELLA PROVA  
Perché una prova sia valida devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— la sopravvivenza complessiva delle uova fecondate nei controlli 
e, se del caso, nei contenitori con solo solvente, deve essere superiore o uguale ai valori definiti nelle appendici 2 e 3,
 
— la concentrazione dell'ossigeno disciolto deve essere compresa fra 
il 60 e il 100 % del valore di saturazione nell'aria per tutta la 
durata della prova,  
— la temperatura dell'acqua non deve mai differire di oltre ± 1,5  o C 
fra le diverse camere di prova, né fra i vari giorni, e dovrebbe 
restare negli intervalli di temperatura indicata per le specie uti ­
lizzate nella prova (appendici 2 e 3).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1022
 
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.6.1.  Contenitori di prova  
Si può utilizzare qualsiasi tipo di recipiente in vetro o in altro ma ­
teriale chimicamente inerte. Le dimensioni dei recipienti devono 
essere proporzionate al regime di carico (cfr. sezione 1.7.1.2). Si 
raccomanda di randomizzare la collocazione delle camere di prova nella zona della prova. Se nel laboratorio sussistono effetti sistema ­
tici controllabili tramite separazione per blocchi, è preferibile utiliz ­
zare un disegno sperimentale a blocchi randomizzati in cui ciascun 
trattamento è presente in ciascun blocco, piuttosto che un disegno completamente randomizzato. Se si opta per il disegno sperimentale 
a blocchi, occorre tenerne conto anche in sede di analisi dei dati. Le 
camere di prova devono essere protette da eventuali disturbi.
 
1.6.2.  Selezione della specie ittica  
Le specie ittiche raccomandate sono elencate nella tabella 1A. Ciò 
non preclude l'uso di altre specie (cfr. esempi nella tabella 1B), ma in questo caso potrebbe essere necessario adattare la procedura spe ­
rimentale per ottenere adeguate condizioni di esecuzione della prova. 
In tal caso occorre spiegare i criteri di scelta delle specie e del 
metodo sperimentale.
 
1.6.3.  Mantenimento dei pesci riproduttori  
Per informazioni dettagliate su come mantenere i pesci riproduttori in 
condizioni soddisfacenti, si rimanda al TG 210 dell'OCSE (  1 ) e ai 
riferimenti bibliografici (2) (3) (4) (5) (6).  
1.6.4.  Manipolazione di embrioni e larve  
All'interno del contenitore principale gli embrioni e le larve possono 
essere esposti in recipienti più piccoli forniti di rete ai lati o alle 
estremità per consentire il flusso della soluzione di prova attraverso il 
recipiente. Si può indurre un flusso non turbolento in questi reci ­
pienti più piccoli sospendendoli a un braccio sistemato in modo che muova il recipiente verticalmente, mantenendo però sempre som ­
mersi gli organismi: è possibile usare anche un sistema di flusso a 
sifone. Le uova fecondate dei pesci salmonidi possono essere siste ­
mate su rastrelliere o reti con aperture sufficientemente grandi da permettere alle larve di cadere fuori dopo la schiusa delle uova. 
Per rimuovere gli embrioni e le larve nella prova semistatica con 
rinnovo quotidiano completo dell'acqua sono adatte pipette Pasteur (cfr. 1.6.6).
 
I contenitori, le griglie o le reti eventualmente utilizzati per tenere le 
uova all'interno della vasca principale vanno rimossi, in quanto osta ­
coli, dopo la schiusa delle larve (  81 ): le reti vanno invece lasciate per 
evitare la fuga dei pesci. Dovendo trasferire le larve, queste non dovrebbero essere esposte all'aria e per rilasciare i pesci dai conte ­
nitori per le uova non si devono usare retini (questa precauzione può 
essere superflua per alcune specie meno delicate, come la carpa). Il 
trasferimento, i cui tempi dipendono dalla specie, non è sempre necessario. Per la tecnica semistatica si possono usare beaker o 
contenitori poco profondi e, se necessario, forniti di un divisorio a 
rete lievemente sopraelevato rispetto al fondo. Se il volume dei contenitori è sufficiente a soddisfare le richieste di carico (cfr. l.7.1.2) il trasferimento degli embrioni o delle larve può essere evi ­
tato.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1023  
( 1 ) OECD, Paris. 1992. Test Guideline 210, Fish. Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5.  Acqua  
Per la prova si può utilizzare qualunque tipo di acqua conforme alle 
caratteristiche chimiche di un'acqua di diluizione accettabile, come descritta nell'appendice 4, e in cui la specie utilizzata nella prova 
dimostra una capacità di sopravvivenza dei controlli almeno pari a 
quella descritta nelle appendici 2 e 3. La qualità dell'acqua dovrebbe essere costante per tutta la durata della prova. Il pH dovrebbe rima ­
nere entro un intervallo di ± 0,5 unità di pH. Per escludere la 
possibilità di effetti indesiderati dell'acqua di diluizione sui risultati 
della prova (ad esempio per complessazione della sostanza in esame) o influenze negative sulla performance dei pesci riproduttori è utile 
prelevare di quando in quando alcuni campioni e analizzarli. La 
misura dei metalli pesanti (ad esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), dei principali anioni e cationi (ad esempio Ca, Mg, Na, K, Cl e SO
 4 ), 
dei pesticidi (ad esempio pesticidi organofosforati totali e organoclo ­
rurati totali), del carbonio organico totale e dei solidi sospesi va 
effettuata ad esempio ogni tre mesi, se l'acqua di diluizione è di qualità relativamente costante. Se la qualità dell'acqua si è dimostrata costante per almeno un anno, le titolazioni possono essere effettuate 
con minore frequenza (ad esempio ogni sei mesi),
 
1.6.6.  Soluzioni di prova  
Le soluzioni di prova alle concentrazioni scelte vanno preparate per 
diluizione di una soluzione madre.  
La soluzione madre deve essere di preferenza preparata semplice ­
mente miscelando o agitando la sostanza di prova nell'acqua di di ­
luizione con mezzi meccanici (cioè agitazione e ultrasuoni). Per 
ottenere una concentrazione adeguata della soluzione madre si pos ­
sono utilizzare colonne di saturazione (colonne di solubilità). Per quanto possibile va evitato l'utilizzo di solventi o disperdenti (agenti 
solubilizzanti); tuttavia, in alcuni casi tali composti possono essere 
necessari per ottenere una soluzione madre di concentrazione ade ­
guata. A tale scopo si prestano ad esempio solventi quali acetone, etanolo, metanolo, dimetilformammide e glicole trietilenico o disper ­
denti quali Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e 
HCO-40. Quando si impiegano agenti a rapida biodegradabilità, come l'acetone, e/o altamente volatili è necessario procedere con cautela, poiché potrebbero causare problemi nelle prove a flusso 
continuo dovuti a sviluppo batterico. Qualora si utilizzi un agente 
solubilizzante questo non deve avere effetti significativi sulla soprav ­
vivenza né effetti negativi visibili sui primi stadi di vita degli orga ­
nismi come è dimostrato da un controllo con solo solvente. L'uso di 
questi materiali dovrebbe essere evitato il più possibile.
 
Per la tecnica semistatica è possibile seguire due diverse procedure 
di rinnovo dell'acqua: i) si preparano nuove soluzioni di prova in recipienti puliti e si trasferiscono delicatamente le uova e le larve 
sopravvissute nei nuovi recipienti utilizzando un piccolo volume di 
soluzione vecchia ed evitando l'esposizione all'aria, oppure ii) gli organismi della prova sono mantenuti nei recipienti mentre viene cambiata una parte (almeno tre quarti) dell'acqua. La frequenza di 
rinnovo del mezzo dipende dalla stabilità della sostanza di prova, ma 
si raccomanda di sostituire l'acqua quotidianamente. Se da prove preliminari di stabilità (cfr. sezione 1.4) la concentrazione della so ­
stanza di prova non risulta stabile (cioè è al di fuori dell' intervallo 
dell'80-120 % della concentrazione nominale o al di sotto dell'80 % 
della concentrazione iniziale misurata) durante l'intervallo di tempo tra le operazioni di rinnovo dell'acqua, occorre prendere in conside ­
razione l'opportunità di utilizzare una prova a flusso continuo, in 
ogni caso occorre evitare di sottoporre le larve a stress durante 
l'operazione di rinnovo dell'acqua.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1024
 
Le prove a flusso continuo comportano l'uso di un sistema che 
eroghi e diluisca di continuo la soluzione madre della sostanza in 
esame (ad esempio pompa dosatrice, diluitore proporzionale, sistema di saturazione) per fornire alle camere di prova una serie di concen ­
trazioni. Le portate di soluzione madre e acqua di diluizione dovreb ­
bero essere controllate a intervalli, preferibilmente ogni giorno, e non 
presentare variazioni superiori al 10 % per tutta la durata della prova. Si considera adeguata una portata equivalente ad almeno cinque volte il volume della camera di prova ogni 24 ore (2).
 
1.7. PROCEDURA  
In letteratura si trovano informazioni utili sull'esecuzione della prova 
di tossicità sugli stadi di embrione e di larve con sacco vitellino di 
pesci; alcuni riferimenti sono elencati nella bibliografia della presente prova (7) (8) (9).
 
1.7.1  Condizioni di esposizione  
1.7.1.1.  Durata  
La prova dovrebbe avere inizio preferibilmente entro 30 minuti dalla 
fecondazione delle uova. Gli embrioni vanno immersi nella soluzione 
di prova prima o immediatamente dopo l'inizio dello stadio di seg ­
mentazione del blastodisco e, comunque, prima che inizi lo stadio di gastrula. Se le uova provengono da fornitori esterni può risultare impossibile iniziare la prova subito dopo la fecondazione. Poiché 
un ritardo nell'avvio della prova può influire fortemente sulla sua 
sensibilità, la prova dovrebbe iniziare entro 8 ore dalla fecondazione. Dato che le larve non vengono nutrite durante il periodo di esposi ­
zione, la prova dovrebbe terminare subito prima che il sacco vitellino 
di una qualsiasi delle larve in una delle camere di prova sia stato completamente assorbito, o prima che i controlli inizino a morire per mancanza di cibo. La durata della prova dipende dalla specie utiliz ­
zata. Le appendici 2 e 3 contengono alcune raccomandazioni al 
riguardo.
 
1.7.1.2.  Carico  
All'inizio della prova il numero di uova fecondate deve essere suf ­
ficiente a soddisfare le richieste dell'analisi statistica. Le uova do ­
vrebbero essere distribuite a caso fra i trattamenti e per ogni concen ­
trazione si dovrebbero usare almeno 30 uova fecondate, divise equa ­
mente (o il più equamente possibile, visto che con alcune specie può essere difficile ottenere lotti uguali) tra almeno tre repliche. Il regime di carico (biomassa per volume di soluzione di prova) deve essere 
abbastanza basso da consentire di mantenere senza aerazione una 
concentrazione di ossigeno disciolto pari ad almeno il 60 % del valore di saturazione nell'aria. Per la prova a flusso continuo è stato raccomandato un regime di carico non superiore a 0,5 g/l per 24 ore 
e non superiore a 5 g/l di soluzione in qualsiasi momento (2).
 
1.7.1.3.  Luce e temperatura  
Il fotoperiodo e la temperatura dell'acqua di prova devono essere 
adatti alla specie utilizzata (appendici 2 e 3). Per controllare la 
temperatura si può utilizzare un recipiente di prova aggiuntivo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1025
 
1.7.2.  Concentrazioni della sostanza di prova  
Di norma occorrono cinque concentrazioni della sostanza in esame 
che differiscano di un fattore costante non superiore a 3,2. Nella scelta dell'intervallo delle concentrazioni bisogna tenere conto della 
curva che pone in relazione la CL
 50 al periodo di esposizione nello 
studio della tossicità acuta. In alcune circostanze, ad esempio nelle prove limite, può essere appropriato impiegare meno di cinque con ­
centrazioni a un intervallo di concentrazione più ristretto. Se si uti ­
lizzano meno di cinque concentrazioni occorre spiegarne il motivo. 
Non è necessario provare concentrazioni della sostanza superiori alla CL
 50 nelle 96 ore o a 100 mg/l, qualsiasi sia la più bassa. Le 
sostanze non dovrebbero essere provate a concentrazioni al di sopra 
del loro limite di solubilità nell'acqua di prova.  
Se nella preparazione delle soluzioni di prova si utilizza un agente 
solubilizzante (cfr. sezione 1.6.6), la sua concentrazione finale nei recipienti di prova non dovrebbe superare 0,1 ml/l e dovrebbe essere uguale in tutti i recipienti.
 
1.7.3.  Controlli  
In aggiunta alle concentrazioni della sostanza in esame, dovrebbe 
essere allestito un controllo con l'acqua di diluizione (ripetendola 
in modo adeguato) ed eventualmente controllo con acqua contenente l'agente solubilizzante (ripetendola in modo adeguato), ambedue con un adeguato numero di repliche.
 
1.7.4.  Frequenza delle determinazioni e delle misurazioni analitiche  
Durante la prova vanno determinate a intervalli regolari le concen ­
trazioni della sostanza di prova.  
Nella prova semistatica in cui si prevede che la concentrazione della 
sostanza in esame si mantenga intorno a ± 20 % del valore nominale 
(ovvero entro un intervallo di 80-120 %; cfr. sezioni 1.4 e 1.6.6), si raccomanda, come minimo, di analizzare le concentrazioni minima e massima subito dopo la preparazione e immediatamente prima del 
rinnovo dell'acqua almeno tre volte a intervalli regolari nel corso 
della prova (le analisi vanno effettuate su un campione della stessa soluzione preparata di fresco e poi al momento di rinnovarla).
 
Quando si prevede che la concentrazione della sostanza in esame 
non si mantenga intorno a ± 20 % del valore nominale (in base ai dati sulla stabilità della sostanza), è necessario analizzare tutte le 
concentrazioni di prova, preparate di fresco e al momento di rinno ­
varle, ma seguendo lo stesso schema (cioè almeno tre volte a inter ­
valli regolari nel corso della prova), è sufficiente determinare le concentrazioni della sostanza in esame prima di rinnovare la solu ­
zione solo su una replica per ogni concentrazione. L'intervallo fra le 
determinazioni analitiche non deve superare i sette giorni. Si racco ­
manda che i risultati siano basati sulle concentrazioni misurate. Tut ­
tavia se è possibile provare che durante tutta la prova la concentra ­
zione della sostanza di prova nella soluzione è stata mantenuta in modo soddisfacente entro ± 20 % della concentrazione nominale o della concentrazione iniziale misurata, i risultati possono essere ba ­
sati sui valori nominali o sui valori iniziali misurati.
 
Per le prove a flusso continuo è appropriato l'uso di un regime di 
campionamento simile a quello descritto per i le prove semistatiche 
(sebbene in questo caso non si effettui la misurazione delle soluzioni «vecchie»). Se però la durata della prova supera i sette giorni, può essere consigliabile aumentare il numero di campionamenti durante 
la prima settimana (ad esempio, tre serie di misurazioni) per assicu ­
rare che le concentrazioni di prova restino stabili.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1026
 
Può essere necessario centrifugare o filtrare i campioni (ad esempio 
con filtro con pori di 0,45 μm). Poiché tuttavia né la centrifugazione 
né la filtrazione sembrano essere sempre in grado di separare la frazione non biodisponibile della sostanza in esame da quella biodi ­
sponibile, i campioni non devono necessariamente essere sottoposti a 
questi trattamenti.
 
Durante la prova in tutti i recipienti di prova dovrebbero essere 
misurati l'ossigeno disciolto, il pH e la temperatura. La durezza totale e la salinità (se del caso) vanno misurate nei controlli e in un reci ­
piente alla concentrazione massima. L'ossigeno disciolto ed eventual ­
mente la salinità vanno misurati almeno tre volte (all'inizio, verso la 
metà e alla fine della prova). Nella prova semistatica si raccomanda di misurare l'ossigeno disciolto con maggiore frequenza, preferibil ­
mente prima e dopo ogni rinnovo dell'acqua o almeno una volta alla 
settimana. Il pH dovrebbe essere misurato all'inizio e alla fine di 
ogni rinnovo dell'acqua nella prova semistatica e almeno una volta alla settimana nella prova a flusso continuo. La durezza va misurata 
una sola volta per ciascuna prova. La temperatura dovrebbe essere 
misurata una volta al giorno e preferibilmente essere costantemente controllata almeno in un recipiente di prova.
 
1.7.5.  Osservazioni  
1.7.5.1.  Stadio dello sviluppo embrionale  
Lo stadio embrionale (stadio di gastrula) all'inizio dell'esposizione 
alla sostanza di prova va verificato nel modo più accurato possibile. 
Per far ciò si può utilizzare un campione rappresentativo di uova adeguatamente conservate e separate. Per la descrizione e l'illustrazione degli stadi embrionali si rimanda alla letteratura in 
materia (2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2.  Schiusa e sopravvivenza  
Almeno una volta al giorno occorre effettuare osservazioni sulla 
schiusa e la sopravvivenza e registrarne i dati. All'inizio della prova può essere consigliabile effettuare osservazioni più frequenti (ad esempio ogni 30 minuti durante le prime tre ore), poiché in alcuni 
casi i tempi di sopravvivenza possono avere maggiore importanza 
del solo numero di decessi (ad esempio in presenza di effetti tossici acuti). Gli embrioni e le larve morti vanno rimossi appena individuati in quanto possono decomporsi rapidamente. Nel rimuovere gli indi ­
vidui morti è necessario procedere con estrema cautela per non urtare 
o danneggiare le uova/larve vicine, che sono estremamente delicate e sensibili. I criteri per stabilire la morte variano a seconda dello stadio di vita:
 
— per le uova:  soprattutto nei primi stadi, marcata perdita di tra ­
slucidità e cambiamento di colorazione dovute a coagulazione e/o precipitazione delle proteine, con conseguente aspetto bianco opaco,
 
— per gli embrioni:  assenza di movimenti del corpo e/o assenza di 
battito cardiaco e/o di colorazione opaca nelle specie in cui gli embrioni sono normalmente traslucidi,
 
— per le larve:  immobilità e/o assenza di movimenti respiratori e/o 
assenza di battito cardiaco e/o colorazione bianca opaca del si ­
stema nervoso centrale e/o mancanza di reazione agli stimoli 
meccanici.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1027
 
1.7.5.3.  Anomalie dell'aspetto  
A intervalli adeguati, a seconda della durata della prova e della 
natura dell'anomalia descritta, vanno registrati il numero di larve che presentano anomalie morfologiche e/o della pigmentazione, e 
lo stadio di assorbimento del sacco vitellino. Va rilevato che la 
presenza di embrioni e larve anomali è un fenomeno naturale e nel/i controllo/i di alcune specie può raggiungere molti punti percentuali. Gli individui che presentano anomalie vanno rimossi dai recipienti 
solo dopo la loro morte.
 
1.7.5.4.  Anomalie del comportamento  
Le anomalie, quali iperventilazione. movimenti natatori scoordinati e 
inattività atipica, dovrebbero essere registrate a intervalli adeguati in 
funzione della durata della prova. Il rilevamento di tali effetti, per quanto difficili da quantificare, può facilitare l'interpretazione dei dati sulla mortalità, cioè fornire informazioni sul modo d'azione tossica 
della sostanza.
 
1.7.5.5.  Lunghezza  
Alla fine della prova si raccomanda di misurare la lunghezza degli 
individui, che può essere quella standard alla biforcazione della 
pinna caudale o quella totale. In caso di marcescenza della pinna 
caudale o erosione della pinna, si dovrebbe misurare la lunghezza standard. Generalmente, in una prova ben eseguita, il coefficiente di variazione della lunghezza tra le repliche dei controlli dovrebbe es ­
sere < 20 %.
 
1.7.5.6.  Peso  
Alla fine della prova si può procedere alla pesatura degli individui; i 
pesi a secco (24 ore a 60  o C sono preferibili ai pesi umidi (dopo 
asciugatura). Generalmente, in una prova ben eseguita, il coefficiente 
di variazione del peso tra le repliche dei controlli dovrebbe essere ≤ 
20 %.  
Al termine delle osservazioni alcuni o tutti i seguenti dati saranno 
disponibili per l'analisi statistica:  
— mortalità cumulativa,  
— numero di larve sane alla fine della prova,  
— tempo all'inizio della schiusa e alla fine della schiusa (90 % di 
schiusa in ogni replica),  
— numero di larve che si schiudono ogni giorno,  
— lunghezza (e peso) degli animali sopravvissuti alla fine della 
prova,  
— numero delle larve deformi o di aspetto anomalo,  
— numero delle larve che presentano un comportamento anomalo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1028
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Si raccomanda di ricorrere a personale esperto di statistica sia per la 
concezione del disegno sperimentale che per l'analisi statistica dei 
risultati della prova, in quanto il metodo consente considerevoli va ­
riazioni nel disegno sperimentale, ad esempio nel numero di camere di prova e numero di concentrazioni di prova, nel numero iniziale di uova fecondate e nei parametri da misurare. Viste le diverse possibili 
opzioni di disegno sperimentale, in questa sede non si forniscono 
indicazioni specifiche sulle procedure statistiche.
 
Dovendo stimare i valori LOEC/NOEC sarà necessario analizzare le 
variazioni all'interno di ogni serie di repliche mediante l'analisi della 
varianza (ANOVA) o tabelle di contingenza. Per effettuare un con ­
fronto multiplo fra i risultati delle singole concentrazioni e quelli dei controlli, può essere utile il metodo di Dunnett (12) (13). Allo scopo sono disponibili anche altri metodi (14) (15). Occorre calcolare e 
riportare l'entità dell'effetto individuabile mediante ANOVA o altre 
procedure (vale a dire la potenza della prova). Va rilevato che non tutti i dati elencati nella sezione 1.7.5.6 sono adatti all'analisi stati ­
stica mediante ANOVA. Per esempio, la mortalità cumulativa e il 
numero delle larve sane alla fine della prova potrebbero essere ana ­
lizzati con metodi dei probit.
 
Dovendo stimare i valori CL/CE  X occorre adottare una curva/e 
adeguata/e (ad esempio la curva logistica) ai dati da analizzare me ­
diante un metodo statistico come quello dei minimi quadrati o dei 
minimi quadrati non lineare. La/e curva/e dovrebbe/ro essere 
parametrizzata/e in modo da consentire di stimare direttamente la CL/CE
 X di interesse e il suo errore standard. Ciò faciliterà notevol ­
mente il calcolo dei limiti di confidenza della CL/CE  X . A meno che 
vi siano buoni motivi per preferire livelli fiduciali diversi dovrebbero 
essere riportati limiti di confidenza a due code ad un livello fiduciale del 95 %. La procedura di adattamento della curva dovrebbe prefe ­
ribilmente consentire di valutare il significato della mancanza di 
adattamento (lack of fit). È possibile usare metodi grafici per l'adat ­
tamento delle curve. L'analisi di regressione è adatta a tutti i dati elencati nella sezione 1.7.5.6,
 
2.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
I risultati vanno interpretati con cautela nel caso in cui nelle solu ­
zioni di prova si misurino concentrazioni di sostanze tossiche a livelli vicini al limite di rivelabilità del metodo analitico. Occorre 
usare cautela anche nell'interpretazione dei risultati riferiti a concen ­
trazioni al di sopra della solubilità in acqua della sostanza.
 
2.3. RELAZIONE SULLA PROVA  
La relazione sulla prova deve contenere le seguenti informazioni:  
2.3.1.  Sostanza di prova:  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche rilevanti,  
— dati chimici di identificazione, compresi purezza e metodo ana ­
litico per la quantificazione della sostanza di prova, se del caso.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1029
 
2.3.2.  Specie utilizzata:  
— nome scientifico, ceppo, numero di pesci riproduttori (cioè 
quante femmine sono state usate per produrre il numero di uova necessarie per la prova), origine e metodo di raccolta delle 
uova fecondate e successiva manipolazione.
 
2.3.3.  Condizioni di esecuzione della prova:  
— procedura di prova utilizzata (ad esempio semistatica o a flusso 
continuo, periodo di tempo dalla fecondazione all'inizio della prova, carico, ecc),
 
— fotoperiodo/i,  
— disegno sperimentale (ad esempio, numero di camere di prova e 
repliche, numero di embrioni per replica),  
— metodo di preparazione delle soluzioni madre e frequenza di 
rinnovo (l'agente solubilizzante, se usato, deve essere indicato 
insieme alla sua concentrazione),  
— concentrazioni nominali di prova, valori misurati, loro medie e 
deviazioni standard nei recipienti di prova e metodo con cui sono state ottenute e, se la sostanza è solubile in acqua a concentra ­
zioni inferiori a quelle provate, va dimostrato che le misurazioni 
si riferiscono alle concentrazioni della sostanza di prova in solu ­
zione,
 
— caratteristiche dell'acqua di diluizione: pH, durezza, temperatura, 
concentrazione di ossigeno disciolto, livelli di cloro residuo (se misurati), carbonio organico totale, solidi sospesi, salinità del 
mezzo di prova (se misurato) ed eventuali altre misurazioni ef ­
fettuate,
 
— qualità dell'acqua nei recipienti di prova: pH, durezza, tempera ­
tura e concentrazione di ossigeno disciolto.  
2.3.4.  Risultati:  
— risultati di eventuali studi preliminari sulla stabilità della sostanza 
di prova,  
— dimostrazione che i controlli rispondono allo standard di accet ­
tabilità di sopravvivenza complessiva della specie in esame (ap ­
pendici 2 e 3),  
— dati sulla mortalità/sopravvivenza agli stadi embrionale e larvale 
e mortalità/sopravvivenza complessiva,  
— giorni alla schiusa e numero di uova schiuse,  
— dati relativi alla lunghezza (e al peso),  
— incidenza e descrizione delle eventuali anomalie morfologiche,  
— incidenza e descrizione degli eventuali effetti sul comportamento,  
— analisi statistica e trattamento dei dati,  
— per le prove analizzate mediante ANOVA, minima concentra ­
zione con effetti significativi (LOEC) con p = 0,05 e massima concentrazione senza effetti significativi (NOEC) per ogni rispo ­
sta analizzata, compresa una descrizione delle procedure statisti ­
che utilizzate e un'indicazione dell'entità dell'effetto che poteva 
essere individuato.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1030
 
— per le prove analizzate mediante tecniche di regressione. CL/CE  X 
e intervalli di confidenza, nonché un grafico del modello adattato 
usato per i relativi calcoli,  
— spiegazione di eventuali deviazioni da questo metodo.  
3. BIBLIOGRAFIA  
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TABELLA 1A  
Specie di pesci raccomandate per la prova  
ACQUA DOLCE  
Oncorhynchus mykiss  
Trota iridea (9) (16)  
Danio rerio  
Danio zebrato (7) (17) (18)  
Cyprinus capilo  
Carpa (8) (19)  
Orvzias latipes  
(20) (21)  
Pimephales promelas  
(8) (22)  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1032
 
TABELLA 1B  
Esempi di altre specie ben documentate  
Acqua dolce Acqua salata  
Carassius auratus  
Carassio dorato (8)  Menidia peninsulare  
Latterino menidia (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  (8) Clupea harengu  
Aringa (24) (25)  
Gadus morhua  
Merluzzo comune (24) (25)  
Cyprinodon variegates  
(23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1033
 
APPENDICE 1  
GUIDA ALL'ESECUZIONE DI UNA PROVA DI TOSSICITÀ SUGLI 
EMBRIONI E SULLE LARVE CON SACCO VITELLINO DEL DANIO 
ZEBRATO ( BRACHYDANIO RERIO ) 
INTRODUZIONE  
Il danio zebrato proviene dalla costa di Coromandel, in India, dove vive in corsi 
d'acqua a corso rapido. Si tratta di un comune pesce da acquario della famiglia delle carpe e le informazioni sulla sua cura e sul suo allevamento si trovano nella normale bibliografia sui pesci tropicali. La sua biologia e il suo impiego nella 
ricerca ittica sono stati riesaminati da Laale (1).
 
Questo pesce, che supera raramente i 45 mm di lunghezza, ha il corpo di forma 
cilindrica, con 7-9 strisce orizzontali blu scuro argentate che arrivano alla pinna 
caudale e anale. Il dorso è verde oliva. I maschi sono più sottili delle femmine, le 
quali sono più argentate e presentano l'addome disteso, soprattutto prima della deposizione delle uova.
 
Gli esemplari adulti sono in grado di tollerare ampie fluttuazioni di temperatura, 
pH e durezza dell'acqua, ma per ottenere pesci sani che producano uova di buona qualità è necessario creare le condizioni ottimali.
 
Durante la deposizione delle uova, il maschio insegue e colpisce la femmina con 
la testa e feconda le uova appena espulse. Le uova, trasparenti e non adesive, cadono sul fondo, dove possono essere mangiate dai genitori. La deposizione delle uova viene influenzata dalla luce. Se la luce del mattino è adeguata, in 
genere il pesce depone le uova nelle prime ore dopo l'alba.
 
Ogni femmina può produrre lotti di parecchie centinaia di uova a intervalli 
settimanali.  
CONDIZIONI DEI PESCI RIPRODUTTORI, RIPRODUZIONE E STADI DI 
VITA PRECOCI  
Scegliere un numero adeguato di pesci sani e tenerli in un'acqua adatta (cfr. ad 
esempio l'appendice 4) per almeno 2 settimane prima della deposizione delle uova progettata. È necessario consentire al gruppo di pesci di riprodursi almeno una volta prima di produrre il lotto di uova da utilizzare nella prova. La densità 
dei pesci durante questo periodo non dovrebbe superare 1 grammo di pesce per 
litro. La sostituzione regolare dell'acqua o l'uso di sistemi di purificazione con ­
sente di mantenere una maggiore densità. La temperatura nelle di mantenimento dovrebbe essere mantenuta a 25 ± 2
 o C. Il pesce deve avere una dieta varia che 
può essere costituita, per esempio, da mangime secco commerciale adatto, indi ­
vidui vivi appena schiusi di Artemia, chironomidi, Daphnia ed oligocheti (En ­
chytrraeidae).  
Di seguito vengono descritte due procedure che, nella pratica, hanno consentito 
di ottenere un lotto sufficiente di uova sane e fecondate per effettuare la prova:  
i) In una vasca contenente 50 litri di acqua di diluizione vengono posti 8 
femmine e 16 maschi, schermati dalla luce diretta e lasciati il più possibile 
indisturbati per almeno 48 ore. Nel pomeriggio precedente l'inizio della prova sul fondo dell'acquario viene posto un vassoio per la deposizione delle uova, costituita da un telaio di plexiglas o di altro materiale adatto alto 5-7 mm con 
una rete a maglia grossa di 2-5 mm fissata sul lato superiore e una rete a 
maglia fine di 10-30 μm sul fondo. Alla rete a maglia grossa sono attaccati 
numerosi «alberi di deposizione» formati da corde di nylon non ritorte. I pesci vengono lasciati nell'oscurità per 12 ore, dopo di che viene accesa una luce 
debole che darà inizio alla deposizione delle uova. Circa 2-4 ore dopo la 
deposizione delle uova si rimuove l'apposito vassoio e si raccolgono le uova. Il vassoio impedisce ai pesci di cibarsi delle uova e, allo stesso tempo, consente di raccoglierle facilmente. Il gruppo di pesci dovrebbe aver già 
deposto uova almeno una volta prima della deposizione di quelle destinate 
alla prova.
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ii) 5-10 pesci maschi e femmine vengono mantenuti singolarmente per almeno 2 
settimane prima della deposizione delle uova progettata. Dopo 5-10 giorni 
l'addome delle femmine apparirà disteso e saranno visibili le loro papille genitali. I maschi non hanno papille. Le uova vengono deposte in apposite vasche fornite di un falso fondo di rete (come descritto sopra). La vasca è 
riempita di acqua di diluizione, con una profondità di 5-10 cm al di sopra 
della rete. Il giorno prima della prevista deposizione si introducono nella vasca una femmina e due maschi. La temperatura dell'acqua viene progressi ­
vamente aumentata di un grado oltre la temperatura di acclimatazione. Si 
spegne la luce e si lascia la vasca il più possibile indisturbata. Il mattino 
seguente si accende una luce debole che darà inizio alla deposizione delle uova. Dopo 2-4 ore si rimuovono i pesci e si raccolgono le uova. Se sono necessarie più uova rispetto a quelle ottenibili da una sola femmina si possono 
allestire contemporaneamente più vasche di deposizione. Registrando il suc ­
cesso riproduttivo delle singole femmine prima della prova (numero e qualità delle uova deposte), è possibile selezionare per l'allevamento le femmine che presentano maggiore successo riproduttivo.
 
Le uova vanno trasferite nei recipienti di prova mediante tubi di vetro (diametro 
interno non inferiore a 4 mm), dotate di bulbo contagocce flessibile. La quantità di acqua raccolta con le uova nel trasferimento dovrebbe essere la minima 
possibile. Le uova sono più pesanti dell'acqua e colano fuori dal tubo. Occorre 
evitare che le uova (e le larve) vengano a contatto con l'aria. Alcuni campioni del/i lotto/i vanno esaminati al microscopio per verificare che i primi stadi dello sviluppo non presentino irregolarità. Non è consentito disinfettare le uova.
 
Il tasso di mortalità delle uova è massimo entro le prime 24 ore dalla feconda ­
zione. Spesso, in questo periodo, si registra una mortalità che varia tra il 5 e il 
40 %. Le uova degenerano se non sono fecondate o per difetti dello sviluppo. 
Sembra che la qualità delle uova dipenda dalla femmina; infatti, alcune femmine producono costantemente uova di buona qualità, altre non vi riescono mai. Anche la velocità di sviluppo e la percentuale di schiusa variano da un lotto all'altro. Le 
uova fecondate e le larve con sacco vitellino sopravvivono bene, generalmente 
per oltre il 90 %. A 25
 o C le uova si schiudono 3-5 giorni dopo la fecondazione 
e il sacco vitellino viene assorbito all'incirca 13 giorni dopo la fecondazione.  
Lo sviluppo embrionale è stato accuratamente descritto da Hisaoka e Battle (2). 
Grazie alla trasparenza delle uova e delle larve dopo la schiusa è possibile seguire lo sviluppo del pesce e osservare la presenza di eventuali malformazioni. Circa 4 ore dopo la deposizione è possibile distinguere le uova non fecondate da 
quelle fecondate (3). Per effettuare questo esame si pongono uova e larve in 
recipienti di prova di dimensioni ridotte e le si studiano al microscopio.
 
Le condizioni di esecuzione della prova che si applicano ai primi stadi di vita 
sono specificate nell'appendice 2. I valori ottimali del pH e della durezza del ­
l'acqua di diluizione sono rispettivamente 7,8 e 250 mg CaCO  3 /l. 
CALCOLI E STATISTICA  
Si propone un approccio a due fasi. Anzitutto si analizzano statisticamente i dati 
sulla mortalità, sulle anomalie dello sviluppo e sul tempo di schiusa. Poi si valuta statisticamente la lunghezza del corpo, per le concentrazioni alle quali non sono 
stati rilevati effetti negativi per nessuno dei precedenti parametri. Si consiglia 
questo approccio in quanto la sostanza tossica può uccidere selettivamente i pesci più piccoli, ritardare il tempo di schiusa e indurre gravi malformazioni, influen ­
zando così i valori relativi alla lunghezza. Inoltre il numero di pesci da misurare 
per ogni trattamento sarà all'incirca uguale, garantendo così la validità dei dati 
statistici.
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DETERMINAZIONE DELLA CL  50 E DELLA CE  50 
Si calcola la percentuale di uova e larve sopravvissute e la si corregge in base 
alla mortalità riscontrata nei controlli, mediante la formula di Abbot (4):  
P ¼ 100 Ä Í 
C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
dove  
P = % sopravvivenza corretta  
P' = % sopravvivenza osservata nella concentrazione di prova  
C = % sopravvivenza nel controllo  
Se possibile, la CL  50 viene determinata alla fine della prova mediante un metodo 
adeguato.  
Per includere nel calcolo statistico della CE  50 anche le anomalie morfologiche. si 
rimanda a Stephan (5).  
STIMA DEI VALORI DI LOEC E NOEC  
Uno degli obiettivi della prova sulle uova e sulle larve con sacco vitellino è parago ­
nare le concentrazioni diverse da zero con il controllo, cioè determinare la LOEC. Occorre dunque utilizzare procedure di comparazione multipla (6) (7) (8) (9) (10).
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review.). Fish Biol. 10. pp. 121- 
173. 
(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Riproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173-181.  
(4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, pp. 69-81.  
(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096- 1121.
 
(7) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, pp. 103-117.  
(9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1036
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APPENDICE 2  
CONDIZIONI DI ESECUZIONE DELLA PROVA, DURATA E CRITERI DI SOPRAVVIVENZA PER LE SPECIE RACCOMANDATE  
Specie Temperatura 
( o C) Salinità 
(0/0") Fotoperiodo 
(ore) Durata degli stadi 
(giorni) 
Durata tipica della prova Sopravvivenza del controllo 
(% minima) 
Embrioni Larve con sacco 
vitellino Successo alla 
schiusa Post-schiusa  
ACQUA DOLCE  
Brachydanio rerio  
Danio zebrato 25 ±1 — 12-16 3-5 8-10 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio di gastrula) fino a 5 giorni dopo la schiusa (8-10 giorni) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Trota iridea 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30-35 25-30 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 20 giorni 
dopo la schiusa (50-55 giorni) 66 70  
Carpa carpio  
Carpa 21-25 — 12-16 5 > 4 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 4 giorni dopo la schiusa (8-9 giorni) 80 75  
Oryzias lalipes  24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 5 giorni 
dopo la schiusa (13-16 giorni) 80 80  
Pimephales promelas  25 ± 2 — 16 4-5 5 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 4 giorni 
dopo la schiusa (8-9 giorni) 60 70  
( 1 ) Per gli embrioni. 
( 2 ) Per le larve. 
( a ) Buio per embrioni e larve fino a una settimana dopo la schiusa, tranne per le ispezioni. Poi luce debole per tutta la prova.
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APPENDICE 3  
Condizioni di esecuzione della prova, durata e criter1 di sopravvivenza per altre specie ben documentate  
Specie Temperatura 
( o C) Salinità (0/00) Fotoperiodo 
(ore) Durata degli sudi (giorni) 
Durata tipica della prova su embrioni e larve con 
sacco vitellino Sopravvivenza dei controlli (% 
minima) 
Embrioni Larve con sacco 
vitellino Successo alla 
schiusa Post-schiusa  
ACQUA DOLCE  
Carassius auratus  
Carassio dorato 24 ± 1 — — 3-4 > 4 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 4 giorni 
dopo la schiusa (7 giorni) — 80  
Leopomis macrochirus  21 ± 1 — 16 3 > 4 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 4 giorni dopo la schiusa (7 giorni) — 75 
ACQUA SALATA  
Menida peninsulare  
Latterino menidia 22-25 15-22 12 1,5 10 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 5 giorni 
dopo la schiusa (6-7 giorni) 80 60  
Clupea harengus  
Aringa 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 3 giorni 
dopo la schiusa (23-27 giorni) 60 80  
Gadus morhua  
Merluzzo comune 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 3 giorni dopo la schiusa (18 giorni) 60 80  
Cyprinodon variegatus  25 ± 1 15-30 12 — — Appena possibile dopo la fecondazione 
(inizio stadio gastrula) fino a 4-7 giorni 
dopo la schiusa (28 giorni) > 75 80
APPENDICE 4  
ALCUNE CARATTERISTICHE CHIMICHE DI UN'ACQUA DI 
DILUIZIONE ACCETTABILE  
Sostanza Concentrazioni  
Particolato < 20 mg/1 
Carbonio organico totale < 2 mg/1 
Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l 
Cloro residuo < 10 μg/1 
Pesticidi organofosforati totali < 50 ng/1 Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati < 50 ng/1 Cloro organico totale < 25 ng/1
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C.16.  API MELLIFERE — TEST DI TOSSICITÀ ORALE ACUTA  
1. METODO  
Questo metodo di test della tossicità acuta corrisponde al TG 213 
(1998) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo test di tossicità è un metodo di laboratorio progettato per 
valutare la tossicità orale acuta dei fitofarmaci e di altre sostanze 
chimiche sulle api operaie adulte.  
Per determinare e valutare le proprietà tossiche delle sostanze può 
rendersi necessario determinare la tossicità orale acuta sulle api, ad 
esempio in caso di probabile esposizione di api a una data sostanza. 
Il test di tossicità orale acuta viene eseguito per determinare la tossicità intrinseca dei pesticidi e di altre sostanze chimiche sulle api. In base ai risultati di tale test si valuta la necessità di effettuare 
analisi più approfondite. In particolare questo metodo può essere 
applicato per valutare i rischi che i pesticidi presentano per le api nell'ambito di un programma di test a più fasi che prevede in se ­
quenza l'esecuzione di test in laboratorio, di esperimenti condotti 
parzialmente di semi-campo ed altri di campo (1). I pesticidi possono essere testati come principi attivi (p.a.) oppure come prodotti formu ­
lati.
 
Per verificare la sensibilità delle api e la precisione della procedura 
del test si utilizza una sostanza tossica standard.  
1.2. DEFINIZIONI  
Tossicità orale acuta:  effetti avversi che si verificano entro un 
massimo di 96 ore dalla somministrazione orale di una dose singola della sostanza in esame.
 
Dose:  quantità della sostanza di prova consumata, espressa in termini 
di massa ( μg) della sostanza per animale sperimentale ( μg/ape). Non 
è possibile calcolare la dose reale per ogni ape, in quanto le api 
vengono alimentate tutte insieme, ma si può fare una stima della 
dose media (sostanza consumata in totale/numero di api in una gab ­
bia). 
DL 50 (Dose Letale Mediana) orale:  dose singola, calcolata statisti ­
camente, di una sostanza in grado di provocare la morte del 50 % degli animali se somministrata per via orale. Il valore della 
DL
 50 si esprime in μg di sostanza di prova per ape. Nel caso dei 
pesticidi la sostanza di prova può essere un principio attivo (p.a.) o un prodotto formulato contenente uno o più principi attivi.
 
Mortalità:  si registra la morte di un animale quando l'esemplare 
resta completamente immobile.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
Si espongono api operaie adulte ( Apis mellifera ) a un range di dosi 
della sostanza in esame dispersa in soluzioni di saccarosio. Succes ­
sivamente si alimentano le api con la stessa dieta, senza la sostanza in esame. Per almeno 48 ore si registra quotidianamente la mortalità 
e la si confronta con i valori di controllo. Se il tasso di mortalità 
aumenta fra le 24 ore e le 48 ore mentre la mortalità dei controlli resta a livelli accettabili, ovvero ≤ 10 %,. il test deve essere protratto 
fino a un massimo di 96 ore. Si analizzano i risultati per calcolare la 
DL
 50 a 24 ore e 48 ore e. nel caso lo studio venga prolungato, a 72 
ore e 96 ore.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1040
 
1.4. VALIDITÀ DEL TEST  
Perché un test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— la mortalità media del numero totale dei controlli non deve su ­
perare il 10 % alla fine del test,  
— la DL  50 della sostanza tossica standard corrisponde al range spe ­
cificato.  
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.5.1.  Raccolta delle api  
Si utilizzano giovani api operaie adulte della stessa razza, della stessa 
età, alimentate allo stesso modo ecc. Le api vanno prelevate da 
colonie con regina, devono essere adeguatamente nutrite e sane e, 
per quanto possibile, esenti da malattie con storia e condizioni fisio ­
loeiche note. Possono essere raccolte la mattina del test o la sera prima e vanno tenute in condizioni sperimentali fino al giorno suc ­
cessivo. Si prestano a tale fine le api raccolte da telaini senza covata. 
È meglio evitare di raccogliere gli insetti all'inizio della primavera o alla fine dell'autunno, poiché in tali periodi il loro stato fisiologico è alterato. Dovendo eseguire i test all'inizio della primavera o alla fine 
dell'autunno, si possono tenere le api in un'incubatrice e allevarle per 
una settimana con polline raccolto dal favo e soluzione di saccarosio. Le api trattate con sostanze chimiche quali antibiotici, prodotti anti- Varroa ed altri non possono essere utilizzate nei test di tossicità 
prima di quattro settimane dalla fine dell'ultimo trattamento.
 
1.5.2.  Condizioni di mantenimento e alimentazione  
Si usano gabbie facili da pulire e ben ventilate di qualsiasi materiale 
adatto: acciaio inossidabile, reti di ferro, plastica o legno monouso. Il 
numero ideale è di dieci api per gabbia. Le dimensioni delle gabbie devono essere adeguate al numero di api per garantire uno spazio sufficiente.
 
Le api devono essere mantenute nell'oscurità in una stanza sperimen ­
tale a una temperatura di 25 ± 2  o C. L'umidità relativa (normalmente 
tra 50-70 %) va registrata durante tutto il test. Le procedure di 
manipolazione, compresi il trattamento e le osservazioni, possono essere condotte in presenza di luce (naturale). L'alimentazione è 
costituita da una soluzione di saccarosio in acqua ad una concen ­
trazione finale di 500 g/l (50 % p/v). Dopo aver somministrato le dosi sperimentali, le api vanno alimentate per tutta la durata del test. Il sistema di alimentazione deve consentire di registrare l'assunzione 
di cibo per ogni gabbia (cfr. sezione 1.6.3.1). Come tale si può usare 
una pipetta di vetro (lunga 50 mm e larga 10 mm circa con l'estre ­
mità aperta ristretta a circa 2 mm di diametro).
 
1.5.3.  Preparazione delle api  
Le api raccolte vengono collocate per randomizzazione nelle gabbie, 
a loro volta poste in maniera randomizzata nella stanza sperimentale.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1041
 
Prima di iniziare il test si possono lasciare le api a digiuno per un 
massimo di 2 ore. Si raccomanda di privare le api del cibo prima del 
trattamento in modo che all'inizio del test risultino tutte uguali per contenuto intestinale. Prima di cominciare il test occorre scartare le eventuali api moribonde e sostituirle con api sane.
 
1.5.4.  Preparazione delle dosi  
Se la sostanza di prova è un composto idromiscibile, la si può 
disperdere direttamente in una soluzione di saccarosio al 50 %. Per i prodotti tecnici e le sostanze a bassa idrosolubilità è possibile 
usare veicoli come i solventi organici, gli emulsionanti e i disper ­
denti scarsamente tossici per le api (quali acetone, dimetilformam ­
mide, dimetilsolfossido). La concentrazione del veicolo dipende dalla solubilità della sostanza di prova e deve essere uguale per tutte le 
concentrazioni testate. Generalmente, però, non si dovrebbe superare 
una concentrazione dell'1 %, che risulta essere la più appropriata.
 
Occorre preparare adeguate soluzioni di controllo; quando si utilizza 
un solvente o un disperdente per solubilizzare la sostanza vanno usati due gruppi di controllo separati: una soluzione in acqua e una soluzione di saccarosio con il solvente/veicolo alla concentra ­
zione usata nelle soluzioni di dosaggio.
 
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Gruppi sperimentali e gruppi di controllo  
Il numero di dosi e di repliche testati deve soddisfare i requisiti 
statistici per la determinazione della DL  50 con limiti di affidabilità 
del 95 %. Per il test sono di solito necessarie cinque dosi in serie geometriche, con un fattore non superiore a 2,2 e che coprano il range della DL
 50 . È tuttavia necessario determinare il fattore di 
diluizione e il numero di concentrazioni per dosaggio, in relazione 
alla pendenza della curva di tossicità (dose/mortalità) e tenendo conto del metodo statistico scelto per l'analisi dei risultati. Un test di ricerca del range permette di scegliere le concentrazioni adeguate 
per dosaggio.
 
Con ogni concentrazione utilizzata vanno effettuate almeno 3 repli ­
che, ognuna di dieci api. Oltre alle serie sperimentali è necessario 
analizzare almeno tre lotti di controllo, ognuno di dieci api. Occor ­
rono 3 gruppi di controllo anche per i solventi/veicoli usati (cfr. sezione 1.5.4).
 
1.6.2.  Sostanza tossica standard  
Nelle serie sperimentali deve essere inclusa una sostanza tossica 
standard. Occorre selezionare almeno tre dosi che coprano il valore atteso di DL
 50 . Per ciascuna dose si utilizzano almeno tre gabbie, 
ognuna contenente dieci api. La sostanza tossica di elezione è il 
dimetoato, per il quale la DL  50 sulle 24 ore per somministrazione 
orale si colloca tra 0,10 e 0,35 μg p.a./ape (2). Tuttavia sono accet ­
tabili anche altre sostanze tossiche standard di cui occorre avere dati 
sufficienti per verificare la risposta attesa rispetto alla dose (ad esem ­
pio il parathion).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1042
 
1.6.3.  Esposizione  
1.6.3.1.  Somministrazione delle dosi  
Ogni gruppo sperimentale di api deve ricevere 100-200 μl di solu­
zione di saccarosio/acqua al 50 % contenente la sostanza in esame 
alla concentrazione adeguata. Per i prodotti a bassa solubilità, bassa 
tossicità o bassa concentrazione nella formulazione è necessario au ­
mentare il volume, in quanto vanno usate proporzioni maggiori nella soluzione di saccarosio. È necessario monitorare la quantità di cibo 
trattato consumato da ciascun gruppo. Una volta vuoto (in genere 
entro 3-4 ore), l'alimentatore va tolto dalla gabbia e sostituito con un altro contenente solo la soluzione di saccarosio. Le soluzioni di 
saccarosio vengono quindi somministrate ad libitum. Per alcune so ­
stanze a concentrazioni elevate è possibile che le api rifiutino l'ali ­
mentazione trattata. Anche se le quantità consumate sono ridotte, dopo un massimo di 6 ore il cibo trattato non consumato va comun ­
que sostituito con la soluzione di solo saccarosio. È necessario va ­
lutare la quantità di cibo trattato consumato (ad esempio con misu ­
razione del peso/volume del cibo trattato rimanente).
 
1.6.3.2.  Durata  
Il test dovrebbe durare 48 ore dal momento della sostituzione della 
soluzione di prova con la soluzione di solo saccarosio. Se la morta ­
lità continua ad aumentare di oltre il 10 % dopo le prime 24 ore, la 
durata del test va prolungata fino ad un massimo di 96 ore, sempre che la mortalità fra i controlli non superi il 10 %.
 
1.6.4.  Osservazioni  
La mortalità viene registrata 4 ore dopo l'inizio del test e in seguito 
dopo 24 ore e 48 ore dalla somministrazione della dose. In caso di 
prolungamento del periodo di osservazione occorre effettuare altre valutazioni a intervalli di 24 ore, fino a un massimo di 96 ore, sempre che la mortalità nei controlli non superi il 10 %.
 
E necessario stimare la quantità di cibo trattato consumato da ciascun 
gruppo. Il confronto fra la quantità consumata di cibo trattato e non trattato entro le 6 ore può fornire informazioni sulla gustosità della dieta trattata.
 
Vanno registrate tutte le anomalie del comportamento osservate du ­
rante il periodo di svolgimento del test.  
1.6.5.  Test limite  
In alcuni casi (ad esempio quando si presume che la sostanza di 
prova sia poco tossica) si può eseguire un test limite utilizzando 
100 μg p.a./ape per dimostrare che la DL  50 è maggiore di tale valore. 
La procedura da seguire è la stessa, comprese le tre repliche per dose di prova, i controlli, la valutazione della quantità di cibo trattato consumato e l'uso della sostanza tossica standard. Se si verificano 
casi di mortalità occorre effettuare uno studio completo. Se si veri ­
ficano effetti subletali, è necessario registrarli (cfr. sezione 1.6.4).
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2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
I dati vanno riassunti in una tabella che evidenzi il numero di api 
usate, la mortalità a ogni osservazione e il numero di api con com ­
portamento anomalo per ogni gruppo di trattamento, di controllo e 
relativo alla sostanza tossica standard. Per analizzare i dati della mortalità occorrono metodi statistici adeguati (ad esempio analisi probit, media mobile, probabilità binomiale) (3) (4). Occorre trac ­
ciare curve dose-risposta per ogni tempo di osservazione raccoman ­
dato e calcolare le pendenze delle curve e le dosi letali mediane (DL
 50 ) con limiti di affidabilità al 95 %. Le correzioni per la mor ­
talità fra i controlli possono essere effettuate con il metodo di Abbott 
(4) (5). Quando il cibo trattato non viene consumato completamente è necessario determinare la dose della sostanza in esame consumata da ciascun gruppo. La DL
 50 va espressa in μg di sostanza di prova 
per ape.  
2.2. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere le seguenti informazioni:  
2.2.1.  Sostanza di prova:  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche rilevanti (ad esempio 
stabilità nell'acqua, tensione di vapore),  
— dati chimici di identificazione, compresi formula di struttura, 
purezza (per i pesticidi: identità e concentrazione del/i principio/i 
attivo/i).  
2.2.2.  Animali sperimentali:  
— nome scientifico della specie, razza, età approssimativa (in setti ­
mane), metodo e data di raccolta,  
— informazioni sulle colonie usate per la raccolta, compresi stato di 
salute, eventuali malattie degli esemplari adulti, eventuali pre- 
trattamenti, ecc.  
2.2.3.  Condizioni di esecuzione del test:  
— temperatura e umidità relativa della stanza sperimentale,  
— condizioni di alloggiamento, compresi tipo, dimensioni e mate ­
riale delle gabbie,  
— metodi di preparazione delle soluzioni madri e sperimentali (in ­
dicare eventuale solvente e relativa concentrazione),  
— disegno sperimentale, ad esempio numero delle concentrazioni 
della sostanza in esame utilizzata, numero dei controlli; per cia ­
scuna concentrazione e ciascun controllo, numero di gabbie e 
numero di api per gabbia,  
— data del test.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1044
 
2.2.4.  Risultati:  
— risultati dello studio preliminare di ricerca del range, se effettuato,  
— dati primari: mortalità per ciascuna dose testata in funzione dei 
diversi tempi di osservazione,  
— grafico delle curve dose-risposta alla fine del test,  
— valori della DL  50 con limiti di affidabilità al 95 %, per i singoli 
tempi di osservazione raccomandati per la sostanza di prova e la 
sostanza tossica standard,  
— procedure statistiche usate per determinare la DL  50 , 
— mortalità fra i controlli,  
— altri effetti biologici osservati o misurati, quali comportamento 
anomalo delle api (compreso il rifiuto della dose sperimentale), 
quantità di cibo consumato nei gruppi trattati e non trattati,  
— eventuali deviazioni dalle procedure sperimentali qui descritte ed 
eventuali altre informazioni pertinenti.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Pro ­
ducts — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.l, pp. 151- 
165. March 1993.  
(2) Gough, H.J., Mclndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxi ­
city tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal 
of Apicultural Research, 22, pp. U9-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
 
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effective ­
ness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1045
 
C.17.  API MELLIFERE — TEST DI TOSSICITÀ ACUTA PER 
CONTATTO  
1. METODO  
Questo metodo di test della tossicità acuta corrisponde al TG 214 
(1998) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo test di tossicità è un metodo di laboratorio progettato per 
valutare la tossicità acuta per contatto dei fitofarmaci e di altre sostanze chimiche sulle api operaie adulte.
 
Per determinare e valutare le proprietà tossiche delle sostanze può 
rendersi necessario determinare la tossicità acuta per contatto nelle 
api, ad esempio in caso di probabile esposizione di api a una data sostanza. Il test di tossicità acuta per contatto viene eseguito per determinare la tossicità intrinseca dei pesticidi e di altre sostanze 
chimiche sulle api. In base ai risultati di tale test si valuta la neces ­
sità di effettuare analisi più approfondite. In particolare questo me ­
todo può essere applicato per valutare i rischi che i pesticidi presen ­
tano per le api nell'ambito di un programma di test a più fasi che 
prevede in sequenza l'esecuzione di test in laboratorio, di esperimenti 
condotti di semi-campo ed altri di campo (1). I pesticidi possono essere testati come principi attivi (p.a.) oppure come prodotti formu ­
lati.
 
Per verificare la sensibilità delle api e la precisione della procedura 
del test si utilizza una sostanza tossica standard.  
1.2. DEFINIZIONI  
Tossicità acuta per contatto:  effetti avversi che si verificano entro 
un massimo di 96 ore dall'applicazione topica di una dose singola di una sostanza.
 
Dose:  quantità della sostanza di prova applicata. La dose si esprime 
in termini di massa ( μg) della sostanza per animale sperimentale 
(μg/ape).  
DL 50 (Dose Letale Mediana) per contatto:  dose singola, calcolata 
statisticamente, di una sostanza in grado di provocare la morte del 
50 % degli animali se somministrata per contatto. Il valore della 
DL 50 si esprime in μg di sostanza di prova per ape. Nel caso dei 
pesticidi la sostanza di prova può essere un principio attivo (p.a.) o 
un prodotto formulato contenente uno o più principi attivi.  
Mortalità:  si registra la morte di un animale quando l'esemplare 
resta completamente immobile.  
1.3. PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
Si espongono api operaie adulte ( Apis mellifera ) a un range di dosi 
della sostanza in esame disciolta in un veicolo adeguato, per appli ­
cazione diretta sul torace (goccioline). La durata del test è di 48 ore. 
Se il tasso di mortalità aumenta fra le 24 ore e le 48 ore mentre la 
mortalità dei controlli resta a livelli accettabili, ovvero ≤ 10 %, il test 
deve essere protratto fino a un massimo di 96 ore. La mortalità va registrata quotidianamente e confrontata con i valori di controllo. I 
risultati vengono analizzati per calcolare la DL
 50 a 24 ore e 48 ore e, 
nel caso lo studio sia prolungato, a 72 ore e 96 ore.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1046
 
1.4. VALIDITÀ DEL TEST  
Perché un test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— la mortalità media del numero totale dei controlli non deve su ­
perare il 10 % alla fine del test,  
— la DL  50 della sostanza tossica standard corrisponde al range spe ­
cificato.  
1.5. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.5.1.  Raccolta delle api  
Si utilizzano giovani api operaie adulte della stessa razza, della stessa 
età, alimentate allo stesso modo ecc. Le api vanno prelevate da colonie con regina, devono essere adeguatamente nutrite e sane e, per quanto possibile. esenti da malattie con storia e condizioni fisio ­
logiche note. Possono essere raccolte la mattina del test o la sera 
prima e vanno tenute in condizioni sperimentali fino al giorno suc ­
cessivo. Si prestano a tale fine le api raccolte da telaini senza covata. È meglio evitare di raccogliere gli insetti all'inizio della primavera o 
alla fine dell'autunno, poiché in tali periodi il loro stato fisiologico è 
alterato. Dovendo eseguire i test all'inizio della primavera o alla fine dell'autunno, si possono tenere le api in un'incubatrice e allevarle per 
una settimana con polline raccolto dal favo e soluzione di saccarosio. 
Le api trattate con sostanze chimiche quali antibiotici, prodotti anti- Varroa ed altri non possono essere utilizzate nei test di tossicità prima di quattro settimane dalla fine dell'ultimo trattamento.
 
1.5.2.  Condizioni di mantenimento e alimentazione  
Si usano gabbie facili da pulire e ben ventilate di qualsiasi materiale 
adatto: acciaio inossidabile, reti di ferro, plastica, legno monouso, e così via. Le dimensioni delle gabbie devono essere adeguate al nu ­
mero delle api per garantire uno spazio sufficiente. Si consiglia di 
mettere gruppi di dieci api per ogni gabbia.
 
Le api devono essere mantenute nell'oscurità in una stanza sperimen ­
tale a una temperatura di 25 ± 2  o C. L'umidità relativa (normalmente 
tra 50-70 %) va registrata durante tutto il test. Le procedure di 
manipolazione, compresi il trattamento e le osservazioni, possono 
essere condotte in presenza di luce (naturale). L'alimentazione, for ­
nita per tutta la durata del test, è costituita da una soluzione di saccarosio in acqua ad una concentrazione finale di 500 g/l (50 % 
p/v) ed è somministrata tramite un alimentatore per api. Come tale si 
può usare una pipetta di vetro (lunga 50 mm e larga 10 mm circa con l'estremità aperta ristretta a circa 2 mm di diametro).
 
1.5.3.  Preparazione delle api  
Le api raccolte possono essere anestetizzate con anidride carbonica o 
azoto per l'applicazione della sostanza di prova. La quantità di ane ­
stetico e i tempi di esposizione devono essere minimi. Prima di cominciare il test occorre scartare le eventuali api moribonde e so ­
stituirle con api sane.
 
1.5.4.  Preparazione delle dosi  
La sostanza di prova va applicata come soluzione in un veicolo, ad 
esempio un solvente organico o una soluzione acquosa con un agente umettante. Come solvente organico è preferibile l'acetone, ma si possono utilizzare, anche altri solventi organici {come la di ­
metilformammide e il dimetilsolfossido). Per i prodotti formulati 
dispersi in acqua e le sostanze organiche altamente polari non solu ­
bili in solventi organici può risultare più semplice applicare le solu ­
zioni preparandole in una soluzione debole di un agente umettante 
comunemente in commercio (ad esempio Agral, Cittowett, Lubrol, 
Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1047
 
Occorre preparare adeguate soluzioni di controllo: quando si utilizza 
un solvente o un disperdente per solubilizzare la sostanza, vanno 
usati due gruppi di controllo separati: uno trattato con acqua e l'altro con il solvente/disperdente.
 
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Gruppi sperimentali e gruppi di controllo  
Il numero di dosi e di repliche testati deve soddisfare i requisiti 
statistici per la determinazione della DL  50 con limiti di affidabilità 
del 95 %. Per il test sono di solito necessarie cinque dosi in serie 
geometriche, con un fattore non superiore a 2,2 e che coprano il range della DL
 5O . È tuttavia necessario determinare il numero di 
dosi, in relazione alla pendenza della curva di tossicità (dose/ ­
mortalità) e tenendo conto del metodo statistico scelto per l'analisi 
dei risultati. Un test di ricerca del range permette di scegliere le dosi adeguate.
 
Con ogni concentrazione utilizzata vanno effettuate almeno tre repli ­
che, ognuna di dieci api.  
Oltre alle serie sperimentali è necessario analizzare almeno tre lotti di 
controllo, ognuno di dieci api. Dovendo utilizzare un solvente orga ­
nico o un agente umettante occorre aggiungere altri tre lotti di con ­
trollo, di dieci api ciascuno, per il solvente o l'agente umettante.  
1.6.2.  Sostanza tossica standard  
Nelle serie sperimentali deve essere inclusa una sostanza tossica 
standard. Occorre selezionare almeno tre dosi che coprano il valore atteso di DL
 50 . Per ciascuna dose si utilizzano almeno tre gabbie, 
ognuna contenente dieci api. La sostanza tossica di elezione è il 
dimetoato, per il quale la DL  50 sulle 24 ore per contatto si colloca 
tra 0,10 e 0,30 μg p.a./ape (2). Tuttavia sono accettabili anche altre 
sostanze tossiche standard di cui occorre avere dati sufficienti per verificare la risposta attesa rispetto alla dose (ad esempio il para ­
thion).
 
1.6.3.  Esposizione  
1.6.3.1.  Somministrazione delle dosi  
Le api vengono anestetizzate e trattate una per una con applicazione 
topica. L'assegnazione delle diverse dosi sperimentali e dei controlli è fatta per randomizzazione. Con un microapplicatore si applica 1 μl 
di soluzione contenente la sostanza di prova alla corretta concentra ­
zione nella porzione dorsale del torace di ciascuna ape. Se si utilizza 
una quantità diversa, occorre precisarne le ragioni. Dopo l'applica ­
zione le api vengono assegnate alle gabbie e alimentate con soluzioni di saccarosio.
 
1.6.3.2.  Durata  
Di preferenza, il test deve durare 48 ore. Se la mortalità aumenta di 
oltre il 10 % fra le 24 ore e le 48 ore, la durata del test va prolungata 
fino ad un massimo di 96 ore, sempre che la mortalità fra i controlli 
non superi il 10 %.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1048
 
1.6.4.  Osservazioni  
La mortalità va registrata 4 ore dopo l'applicazione e, successiva ­
mente, alla ventiquattresima e quarantottesima ora. In caso di pro ­
lungamento del periodo di osservazione occorre effettuare altre va ­
lutazioni a intervalli di 24 ore, fino a un massimo di 96 ore, sempre 
che la mortalità fra i controlli non superi il 10 %.  
E necessario registrare tutte le anomalie del comportamento osservate 
durante il test.  
1.6.5.  Test limite  
In alcuni casi (ad esempio quando si presume che la sostanza di 
prova sia poco tossica) si può eseguire un test limite utilizzando 100 μg p.a./ape per dimostrare che la DL
 50 è maggiore di tale valore. 
La procedura da seguire è la stessa, comprese le tre repliche per dose 
di prova, i controlli e l'uso della sostanza tossica standard. Se si verificano casi di mortalità occorre effettuare uno studio completo. Se si verificano effetti subletali, è necessario registrarli (cfr. sezione 
1.6.4).
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. DATI  
I dati vanno riassunti in una tabella che evidenzi il numero di api 
usate, la mortalità a ogni osservazione e il numero di api con com ­
portamento anomalo per ogni gruppo di trattamento, di controllo e relativo alla sostanza tossica standard. Per analizzare i dati della 
mortalità occorrono metodi statistici adeguati (ad esempio analisi 
probit, media mobile, probabilità binomiale) (3) (4). Occorre trac ­
ciare curve dose-risposta per ogni tempo di osservazione raccoman ­
dato {cioè 24 ore. 48 ore ed eventualmente 72 ore e 96 ore) e 
calcolare le pendenze delle curve e le dosi letali mediane (DL
 5O ) 
con limiti di affidabilità al 95 %. Le correzioni per la mortalità fra i controlli possono essere effettuate con il metodo di Abbott (4) (5). La DL
 50 va espressa in μg di sostanza di prova per ape.  
2.2. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere le seguenti informazioni:  
2.2.1.  Sostanza di prova:  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche (ad esempio stabilità 
nell'acqua, tensione di vapore).  
— dati chimici di identificazione, compresi formula di struttura, 
purezza (per i pesticidi: identità e concentrazione del/i principio/i 
attivo.i).  
2.2.2.  Animali sperimentali:  
— nome scientifico della specie, razza, età approssimativa (in setti ­
mane), metodo e data di raccolta,  
— informazioni sulle colonie usate per la raccolta, compresi stato di 
salute, eventuali malattie degli esemplari adulti, eventuali pre- 
trattamenti. ecc.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1049
 
2.2.3.  Condizioni di esecuzione del test:  
— temperatura e umidità relativa della stanza sperimentale,  
— condizioni di alloggiamento, compresi tipo, dimensioni e mate ­
riale delle gabbie,  
— metodi di somministrazione della sostanza di prova, ad esempio 
solvente veicolo usato, volume della soluzione di prova applicata, 
anestetici usati,  
— disegno sperimentale, ad esempio numero delle dosi sperimentali 
usate, numero dei controlli; per ciascuna dose e ciascun control ­
lo, numero di gabbie e numero di api per gabbia,  
— data del test.  
2.2.4.  Risultati:  
— risultati dello studio preliminare di ricerca del range, se effettua ­
to, 
— dati primari: mortalità per ciascuna concentrazione testata in fun ­
zione dei diversi tempi di osservazione,  
— grafico delle curve dose-risposta alla fine del test,  
— valori della DL  50 con limiti di affidabilità al 95 %, per i singoli 
tempi di osservazione raccomandati per la sostanza di prova e la 
sostanza tossica standard,  
— procedure statistiche usate per determinare la DL  50 , 
— mortalità fra i controlli,  
— altri effetti biologici osservati o misurati ed eventuali risposte 
anomale delle api,  
— eventuali deviazioni dalle procedure del metodo sperimentale qui 
descritte ed eventuali altre informazioni pertinenti.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Pro ­
ducts — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.l, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H.J., Mclndoe, E.C, Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxi ­
city tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal 
of Apicultural Research 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield,). T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effective ­
ness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1050
 
C.18.  ADSORBIMENTO/DESORBIMENTO: METODO DISCONTI ­
NUO ALL'EQUILIBRIO  
1. METODO  
Il metodo discontinuo all'equilibrio qui descritto è una replica di: 
OECD TG 106 for the Determination of Soil Adsorption/Desorption, 
Using a Batch Equilibrium Method (2000).  
1.1. INTRODUZIONE  
Nell'elaborazione del presente metodo sono stati presi in conto i 
risultati di una sperimentazione circolare e di un workshop per la selezione dei terreni in vista della messa a punto di una prova di 
adsorbimento (1) (2) (3) (4), nonché le linee direttrici già esistenti sul 
piano nazionale (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
 
Gli studi sull'adsorbimento/desorbimento sono utili per ottenere co ­
noscenze essenziali in merito alla mobilità dei composti chimici e alla loro distribuzione nei comparti terreno, acqua ed aria della bio ­
sfera (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Queste cono ­
scenze possono servire, per esempio, a prevedere o valutare la di ­
sponibilità di un prodotto chimico sotto vari aspetti: degradazione 
(22) (23); trasformazione ed assimilazione da parte degli organismi 
viventi (24); dilavamento attraverso il profilo del terreno (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); volatilità a partire dal terreno (21) (29) (30); passaggio dalla superficie del terreno alle acque naturali (18) 
(31) (32). I dati sull'adsorbimento possono essere impiegati a fini di 
comparazione e di modellizzazione (19) (33) (34) (35).
 
La distribuzione di un prodotto chimico fra il terreno e le fasi ac ­
quose è un processo complicato, che dipende da svariati fattori: la natura chimica della sostanza (12) (36) (37) (38) (39) (40), le carat ­
teristiche dei terreni (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) 
(47) (48) (49) e i fattori climatici (precipitazioni, temperatura, luce solare, vento). I numerosi fenomeni e meccanismi coinvolti nel pro ­
cesso di adsorbimento di una sostanza chimica non possono essere 
definiti completamente attraverso un modello semplificato di labora ­
torio, sul tipo di quello qui proposto. Nondimeno, pur non permet ­
tendo di coprire tutti i casi che possono manifestarsi nella realtà, il presente tentativo fornisce informazioni utili sulla rilevanza ambien ­
tale dell'adsorbimento di una sostanza chimica.
 
Cfr. anche l'Introduzione generale.  
1.2. CAMPO DI APPLICAZIONE  
Il metodo è destinato a valutare il comportamento di una data so ­
stanza sotto l'aspetto del suo adsorbimento/desorbimento nei vari tipi di terreno. Esso ha lo scopo di ricavare un valore del sorbimento che possa essere impiegato per prevedere la ripartizione della sostanza 
entro un'intera gamma di condizioni ambientali; a tale fine, per cia ­
scun prodotto chimico considerato, si procede a determinare i coef ­
ficienti di adsorbimento all'equilibrio su vari tipi di terreno, in fun ­
zione delle caratteristiche del terreno stesso (ad esempio contenuto in 
carbonio organico, contenuto in argilla, struttura, pH). Per coprire nel 
modo più ampio possibile le interazioni di una data sostanza con i suoli, nelle condizioni in cui essi si presentano effettivamente in natura, è necessario impiegare vari tipi di terreno.
 
Ai fini del presente metodo, per adsorbimento s'intende il processo 
col quale un prodotto chimico si lega alla superficie dei terreni; non 
viene fatta differenza fra i vari processi di adsorbimento (adsorbi ­
mento chimico e fisico) ed altri processi, come la degradazione ca ­
talitica in superficie, l'adsorbimento in massa o le reazioni chi-miche. 
Non si è tenuto conto dell'adsorbimento che si verifica sulle parti ­
celle colloidali (diametro < 0,2 μm) generate dai terreni.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1051
 
Per i vari tipi di terreno, si è ritenuto che i parametri di maggiore 
importanza dal punto di vista dell'adsorbimento siano il contenuto in 
carbonio organico (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), il contenuto in argilla e la struttura del terreno (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48), e, per i composti ionizzabili, il pH (3) 
(4) (42). Si è tenuto altresì conto: della capacità effettiva di scambio 
cationico (CESC), del contenuto in ossidi amorfi di ferro e di allu ­
minio, particolarmente per i terreni vulcanici e tropicali (4), e della superficie specifica (49).
 
Il metodo è destinato a valutare l'adsorbimento di un prodotto chi ­
mico su vari tipi di terreno, entro una gamma variabile di contenuti di carbonio organico e di argilla, di struttura e di pH del terreno. 
Esso consiste in tre momenti:
 
Primo momento : studi preliminari destinati a determinare:  
— il rapporto terreno/soluzione,  
— il tempo di equilibrio per l'adsorbimento e la 
quantità della sostanza sotto esame che risulta adsorbita all'equilibrio,
 
— l'adsorbimento della sostanza sotto esame alla 
superficie dei recipienti e la stabilità della so ­
stanza sotto esame lungo tutta la durata del ­
l'esperimento.  
Secondo momento : prova di selezione: l'adsorbimento viene stu ­
diato su cinque diversi tipi di terreno, attra ­
verso la cinetica di adsorbimento a concentra ­
zione singola e la successiva determinazione dei coefficienti di distribuzione K
 d e K  oc . 
Terzo momento : determinazione delle isoterme di adsorbimento 
di Freundlich, per determinare l'influenza della concentrazione sull'entità dell'adsorbimento nei terreni.
 
Studio di desorbimento attraverso la cinetica di 
desorbimento/isoterme di desorbimento di Freundlich (appendice 1).
 
1.3. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Simbolo Definizione Unità  
A t i percentuale di adsorbimento al tempo t  i % 
A eq percentuale di adsorbimento all'equilibrio di adsorbimento %  
m s ads ðt i Þ massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno al 
tempo t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno 
durante l'intervallo di tempo At  i μg 
m s ads ðeqÞ massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno 
all'equilibrio di adsorbimento μg 
m 0 massa della sostanza sotto esame contenuta nella provetta, 
all'inizio della prova di adsorbimento μg 
m m ads ðt i Þ massa della sostanza sotto esame misurata in un'aliquota 
(v a A ) al tempo t  i μg 
m aq ads ðeqÞ massa della sostanza nella soluzione all'equilibrio di ad ­
sorbimento μg 
m soil quantità in massa della fase terreno, riferita al secco g  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1052
 
Simbolo Definizione Unità  
c st concentrazione di massa della soluzione di riserva della 
sostanza μg cm  -3 
C 0 concentrazione iniziale di massa della soluzione in esame a 
contatto col terreno μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ concentrazione di massa della sostanza nella fase acquosa 
al tempo t  i in cui l'analisi viene effettuata μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ contenuto della sostanza adsorbita sul terreno all'equilibrio 
di adsorbimento μg cm  -1 
C aq ads ðeqÞ concentrazione di massa della sostanza nella fase acquosa 
all'equilibrio di adsorbimento μg cm  -3 
V 0 volume iniziale della fase acquosa a contatto col terreno 
durante la prova di adsorbimento cm 3 
v a A volume dell'aliquota in cui viene misurata la sostanza sotto 
esame cm 3 
K d coefficiente di distribuzione per l'adsorbimento cm  3 g -1 
K oc coefficiente di adsorbimento normalizzato per il carbonio 
organico cm 3 g -1 
K om coefficiente di distribuzione normalizzato per la sostanza 
organica cm 3 g -1 
K F ads coefficiente di adsorbimento secondo Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
l/n esponente di Freundlich  
D t i percentuale di desorbimento al tempo t  i % 
D Δt i percentuale di desorbimento durante l'intervallo di tempo 
Δt i % 
K des coefficiente apparente di desorbimento cm  3 g -1 
K F des coefficiente di desorbimento secondo Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ massa della sostanza sotto esame desorbita dal terreno al 
tempo t  i μg 
m m des ðΔt i Þ massa della sostanza sotto esame desorbita dal terreno 
durante l'intervallo di tempo Δt i μg 
m m des ðeqÞ massa della sostanza determinata analiticamente nella fase 
acquosa all'equilibrio di desorbimento μg 
m aq des ðeqÞ massa totale della sostanza sotto esame desorbita all'equi ­
librio di desorbimento μg 
m s des ðΔt i Þ massa della sostanza che resta adsorbita nel terreno dopo 
l'intervallo di tempo Δt i μg 
m aq A massa della sostanza residua dall'equilibrio di adsorbi ­
mento per effetto di una sostituzione incompleta del vo ­
lume μg 
C s des ðeqÞ contenuto della sostanza sotto esame che rimane adsorbito 
sul terreno all'equilibrio di desorbimento μg g -1 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1053
 
Simbolo Definizione Unità  
C aq des ðeqÞ concentrazione di massa della sostanza sotto esame pre ­
sente nella fase acquosa all'equilibrio di desorbimento μg cm  -3 
V T volume totale della fase acquosa a contatto col terreno 
durante l'esperimento sulla cinetica di desorbimento effet ­
tuato col metodo in serie cm 3 
V R volume del surnatante eliminato dalla provetta dopo il 
raggiungimento di un equilibrio di adsorbimento e sosti ­
tuito dallo stesso volume in una soluzione 0,01 M CaCl  2 cm 3 
v a D volume dell'aliquota prelevata a fini analitici dal tempo (i), 
durante l'esperimento sulla cinetica di desorbimento effet ­
tuato col metodo in serie cm 3 
V r r volume della soluzione prelevata dalla provetta (i) per la 
misurazione della sostanza sotto esame, durante l'esperi ­
mento di cinetica di desorbimento (metodo in parallelo) cm 3 
V r F volume della soluzione prelevata dal tubo per la misura 
della sostanza sotto esame all'equilibrio di desorbimento cm 3 
MB bilancio di massa % 
m E massa totale della sostanza sotto esame estratta in due stadi 
dal terreno e dalle pareti del recipiente μg 
V rec volume del surnatante recuperato dopo che è stato rag ­
giunto l'equilibrio di adsorbimento cm 3 
p ow coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua 
pKa costante di dissociazione 
S w solubilità in acqua g l  -1 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO  
Volumi noti di soluzioni della sostanza sotto esame, non marcata o 
radiomarcata, a concentrazioni note in CaCl  2 0,01 M, vengono ag ­
giunti a campioni di terreno di peso secco noto, previamente equili ­
brati in CaCl  2 0,01 M. La miscela viene agitata per un tempo ade ­
guato. Le sospensioni di terreno vengono quindi separate per cen ­
trifugazione e facoltativa filtrazione, e si procede all'analisi della fase 
acquosa. La quantità di sostanza sotto esame adsorbita sul campione 
di terreno viene calcolata per differenza fra la quantità di sostanza sotto esame contenuta inizialmente nella soluzione e la quantità che rimane alla fine dell'esperimento (metodo indiretto).
 
Un altro metodo per determinare la quantità adsorbita della sostanza 
sotto esame è quello di analizzare direttamente il terreno (metodo 
diretto). Questo procedimento, che comporta un'estrazione per stadi successivi dei terreni mediante un appropriato solvente, è raccoman ­
dabile quando le differenze di concentrazione della soluzione della 
sostanza non possono essere determinate con precisione (casi possi ­
bili: adsorbimento della sostanza sotto esame sulla superficie dei recipienti nei quali ha luogo l'esperimento; instabilità della sostanza entro la durata dell'esperimento; adsorbimento debole, che dà luogo 
soltanto a piccole variazioni di concentrazione nella soluzione; ad ­
sorbimento energico, che conduce a basse concentrazioni non deter ­
minabili con esattezza). Se si impiega una sostanza radiomarcata, l'estrazione del terreno può essere evitata analizzando la fase terreno 
con la tecnica della combustione e successiva conta delle scintilla ­
zioni in fase liquida. Quest'ultima tecnica, peraltro, manca di speci ­
ficità e non permette di distinguere i prodotti progenitori da quelli della trasformazione, e perciò dovrebbe essere riservata ai casi in cui 
il prodotto chimico sotto esame rimane stabile per tutta la durata 
dello studio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1054
 
1.5. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA SOTTO ESAME  
I reattivi chimici debbono essere di purezza analitica. Si raccomanda 
l'impiego di sostanze non marcate, a composizione nota e preferibil ­
mente di purezza non inferiore al 95 %, oppure di sostanze radio ­
marcate a composizione e radiopurezza note. Nel caso dei radiomar ­
catori a semivita breve si terrà conto della degradazione apportando adeguate correzioni.
 
Prima di eseguire una prova per l'adsorbimcnto-desorbimento, è ne ­
cessario disporre dei seguenti dati relativi alla sostanza sotto esame:  
a) solubilità in acqua (A.6);  
b) tensione di vapore (A.4) e/o costante della legge di Henry;  
c) degradazione abiotica: idrolisi in funzione del pH (C.7);  
d) coefficiente di ripartizione (A.8);  
e) biodegrabilità rapida (C.4) o trasformazione aerobica ed anaero ­
bica nel terreno;  
f) pKa delle sostanze ionizzabili;  
g) fotolisi diretta nell'acqua (cioè spettro di assorbimento UV-Vis 
nell'acqua, rendimento quantico) e fotodegradazione nel terreno.  
1.6. APPLICABILITÀ  
La prova può essere eseguita sulle sostanze chimiche per le quali si 
dispone di un metodo analitico sufficientemente preciso. La stabilità della sostanza sotto esame durante il tempo necessario per l'esecu ­
zione della prova è un parametro importante, capace di influenzare 
l'attendibilità dei risultati, specialmente quando si applica il metodo indiretto. Pertanto, è necessario verificare detta stabilità attraverso uno studio preliminare; se nell'ordine di durata della prova si osserva 
una trasformazione, si raccomanda di eseguire lo studio principale 
analizzando tanto la fase terreno quanto la fase acquosa.
 
L'esecuzione di questa prova su sostanze a bassa solubilità in acqua 
(S W < 10  -4 g l -1 ) e su sostanze a carica elevata può dar luogo a 
difficoltà, dovute al fatto che la concentrazione nella fase acquosa 
non può essere misurata analiticamente con sufficiente precisione. In questi casi debbono essere introdotti passaggi intermedi. Il modo di affrontare questi problemi è descritto dove di rilevanza nel presente 
documento.
 
Sperimentando su sostanze volatili, si avrà cura di evitare le perdite 
durante lo studio.  
1.7. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.7.1.  Apparecchiature e reattivi chimici  
Normale apparecchiatura di laboratorio, e in particolare:  
a) provette o recipienti per eseguire l'esperimento. È importante che 
essi: 
— siano adattabili direttamente alla centrifuga, in modo da mi ­
nimizzare le perdite per manipolazione o travaso,  
— siano costituiti da materiale inerte, tale cioè che l'adsorbi ­
mento della sostanza sotto esame sulla loro superficie sia 
minimo;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1055
 
b) agitatore od apparecchio equivalente, capace di mantenere il ter ­
reno in sospensione durante l'agitazione;  
c) centrifuga, di preferenza ad alta velocità (capace per esempio di 
produrre più di 3 000 g), a temperatura controllabile e che per ­
metta di eliminare dalla soluzione acquosa le particelle di diame ­
tro superiore a 0,2 μm. Durante l'agitazione e la centrifugazione i 
contenitori dovranno essere mantenuti coperti, per evitare le per ­
dite di liquido e quelle dovute alla volatilità; per rendere minimo 
l'adsorbimento sui coperchi, questi dovranno essere disattivati (ad 
esempio: coperchi a vite rivestiti di teflon);  
d) facoltativi: apparecchio da filtrazione; filtri con porosità da 
0,2 μm, sterili, per uso unico. Si avrà particolare cura di scegliere 
il materiale filtrante in modo da evitare che esso possa provocare perdite della sostanza sotto esame; per le sostanze scarsamente solubili non è opportuno impiegare materiale filtrante organico;
 
e) strumentazione analitica, adatta a misurare la concentrazione della 
sostanza sotto esame;  
f) stufa da laboratorio, capace di mantenere una temperatura com ­
presa fra 103  o C e 110  o C. 
1.7.2.  Caratterizzazione e selezione dei terreni  
I terreni debbono essere caratterizzati attraverso tre parametri, dai 
quali si ritiene dipendere principalmente la loro capacità di adsorbi ­
mento: carbonio organico, contenuto in argilla e struttura del terreno, 
pH. Come già indicato (cfr. «Campo di applicazione»), va peraltro presa in considerazione ogni altra caratteristica chimico-fisica dei terreni che possa avere effetti sull'adsorbimento/desorbimento di 
una particolare sostanza.
 
I metodi impiegati per la caratterizzazione sono molto importanti e 
possono avere un influsso significativo sui risultati. Si raccomanda 
pertanto di misurare il pH del terreno in una soluzione in CaCl  2 0,01 
M (cioè nella soluzione usata per la prova di adsorbimento/ ­
desorbimento), secondo il corrispondente metodo ISO (ISO-10390- 1). Si raccomanda inoltre di determinare le altre proprietà rilevanti 
del terreno attraverso metodi standard (esempio manuale ISO di 
analisi dei terreni «Hanbook of Soil Analysis»); in questo modo, l'analisi dei dati sul sorbimento potrà basarsi su parametri dei terreni standardizzati globalmente. I riferimenti bibliografici (50-52) forni ­
scono alcune indicazioni sui metodi standard disponibili per l'analisi 
e la caratterizzazione dei terreni. Per la taratura dei metodi di prova dei terreni, si raccomanda l'impiego di terreni di riferimento.
 
La tabella 1 fornisce indicazioni per la scelta dei terreni in vista degli 
esperimenti di adsorbimento/desorbimento. I sette terreni prescelti coprono i tipi di terreni che si incontrano nelle zone geografiche temperate. Quando le sostanze sotto prova sono ionizzabili, i terreni 
scelti debbono coprire una vasta gamma di pH, in modo da potersi 
valutare l'adsorbimento della sostanza nelle sue forme ionizzata e non ionizzata. Indicazioni sul numero di terreni diversi da impiegare nelle varie fasi della prova sono fornite al punto 1.9 («Esecuzione 
dell'esperimento»).
 
Se si preferiscono altri tipi di terreno, questi debbono essere carat ­
terizzati dagli stessi parametri, e le loro proprietà debbono variare 
analogamente a quelle indicate nella tabella 1, anche se non corri ­
spondono esattamente ai criteri.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1056
 
Tabella 1  
Guida per la selezione dei campioni di terreno per l'adsorbimento-desorbimento  
Tipo di terreno Campo di pH (in 
CaCl  2 0,01 M) Contenuto in carbonio 
organico Contenuto in argilla 
(%) Composizione del 
terreno (  1 ) 
1 4,5-5,5 1,0-2,0 65-80 argilla 
2 > 7,5 3,5-5,0 20-40 limo argilloso 
3 5,5-7,0 1,5-3,0 15-25 limo sedimentario 4 4,0-5,5 3,0-4,0 15-30 limo 5 < 4,0-6,0 (
 2 ) < 0,5-1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) sabbia limacciosa 
6 > 7,0 < 0,5-1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 limo argilloso/ar ­
gilla 
7 < 4,5 > 10 < 10 sabbia/sabbia li ­
macciosa  
( 1 ) Secondo il sistema FAO e quello US (85). 
( 2 ) Le rispettive variabili debbono mostrare di preferenza valori rientranti nel campo indicato. Se tuttavia risultasse 
difficile trovare materiali appropriati, sono accettabili valori inferiori al minimo indicato. 
( 3 ) I terreni contenenti meno dello 0,3 % di carbonio organico possono perturbare la correlazione fra il contenuto 
organico e l'adsorbimento. Si raccomanda perciò l'impiego di terreni a contenuto di carbonio organico non infe ­
riore allo 0,3 %.  
1.7.3.  Raccolta e conservazione dei campioni di terreno  
1.7.3.1.  Raccolta  
Per il campionamento non si raccomandano tecniche o strumenti 
specifici; la tecnica di campionamento dipende dalle finalità dello 
studio (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Va tenuto presente quanto segue:  
a) è necessario disporre di informazioni particolareggiate sui prece ­
denti della località dove ha luogo il prelievo, riguardanti il manto vegetale, i trattamenti con antiparassitari e/o fertilizzanti, gli am ­
mendamenti biologici o la contaminazione accidentale, e le loro 
localizzazioni. Quanto alla descrizione del luogo di prelievo vanno seguite le raccomandazioni della norma ISO sul campio ­
namento dei terreni (ISO 10381-6);
 
b) il luogo di campionamento deve essere definito secondo il me ­
todo UTM (Proiezione universale traversa di Mercatore/dato oriz ­
zontale europeo) od attraverso le sue coordinate geografiche; ciò permetterà di eseguire futuri prelievi dello stesso terreno e con ­
tribuirà a definire il terreno a norma dei vari sistemi di classifica 
impiegati nei vari paesi. Si raccoglierà esclusivamente l'orizzonte 
A fino a una profondità massima di 20 cm. Con particolare riguardo al terreno n. 7, se del terreno fa parte un orizzonte O
 h , questo deve essere incluso nel campionamento.  
I campioni di terreno debbono essere trasportati entro contenitori, ed 
in condizioni di temperatura, tali da impedire che le proprietà iniziali 
del terreno risultino significativamente alterate.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1057
 
1.7.3.2.  Conservazione  
È da preferirsi l'impiego di terreni prelevati di recente. Soltanto 
quando ciò non fosse possibile si potranno utilizzare terreni conser ­
vati a temperatura ambiente, al secco e all'asciutto. Per la conserva ­
zione non si raccomandano particolari limiti di tempo, ma i terreni 
conservati per più di tre anni saranno rianalizzati prima dell'impiego, per verificarne il contenuto in carbonio organico, il pH e il CESC.
 
1.7.3.3.  Manipolazione e preparazione dei campioni di terreno per la prova  
I terreni debbono essere essiccati all'aria a temperatura ambiente (di 
preferenza fra 20 e 25  o C). La disgregazione deve essere effettuata 
applicando la minima forza possibile, in modo da non alterare sen ­
sibilmente la struttura originale del terreno. I terreni saranno setac ­
ciati fino a granulometria < 2 mm; seguendo le raccomandazioni della norma ISO sul campionamento dei terreni (ISO 10381-6). Si raccomanda un'accurata omogeneizzazione, in quanto essa giova alla 
riproducibilità dei risultati. Il contenuto di umidità di ciascun terreno 
viene determinato su tre aliquote, per riscaldamento a 105
 o C fino a 
peso sensibilmente costante (12 ore circa). Per tutti i calcoli, la massa del terreno va riferita alla massa essiccata in stufa, cioè al 
peso del terreno corretto per il suo contenuto di umidità.
 
1.7.4.  Preparazione della sostanza sotto esame per l'applicazione al 
terreno  
La sostanza sotto esame viene sciolta in una soluzione 0,01 M di 
CaCl  2 in acqua distillata o deionizzata; la soluzione di CaCl  2 .im­
piegata come fase acquosa solvente serve a migliorare la centrifuga ­
bilità ed a rendere minimo lo scambio di cationi. La concentrazione 
della soluzione di riserva deve di preferenza superare di tre ordini di 
grandezza il limite di rivelazione del metodo analitico applicato: ciò salvaguarda l'esattezza delle misure effettuate secondo la metodolo ­
gia qui descritta. La concentrazione della soluzione di riserva deve 
inoltre essere inferiore alla solubilità in acqua della sostanza sotto 
esame.
 
Di preferenza, la soluzione di riserva deve essere preparata estem ­
poraneamente al momento dell'applicazione ai campioni di terreno ed essere mantenuta ben chiusa e al buio, alla temperatura di 4
 o C. Il 
tempo di conservazione dipende dalla stabilità della sostanza sotto 
esame e dalla sua concentrazione nella soluzione.  
Soltanto nel caso delle sostanze scarsamente solubili (S  w < 10  -4 g l -1 ) 
può essere necessario ricorrere a un agente di solubilizzazione. Que ­
st'ultimo: a) deve essere miscibile con l'acqua (ad esempio metanolo, acetonitrile); b) la sua concentrazione non deve superare l'1 % del volume totale della soluzione di riserva ed essere inferiore a quella 
della soluzione della sostanza sotto esame che verrà a contatto col 
terreno (di preferenza meno dello 0,1 %); c) non deve avere carattere di tensioattivo o dar luogo a reazioni solvolitiche con la sostanza chimica sotto esame. L'impiego di un agente di solubilizzazione deve 
essere menzionato e giustificato nella relazione.
 
Un'altra possibilità per le sostanze scarsamente solubili consiste nel ­
l'aggiunta intenzionale della sostanza sotto esame al sistema di pro ­
va: la sostanza sotto esame viene disciolta in un solvente organico, un'aliquota del quale viene aggiunta al sistema terreno (soluzione 0,01 M di CaCl
 2 in acqua distillata o deionizzata). Il contenuto del 
solvente organico nella fase acquosa deve essere mantenuto al più 
basso livello possibile, in modo da non superare lo 0,1 %. L'addi ­
zione intenzionale di una soluzione organica può compromettere la riproducibilità sotto l'aspetto del volume: essa introdurrebbe un ulte ­
riore fattore di errore, in quanto le concentrazioni della sostanza sotto 
esame e del cosolvente non sarebbero le stesse in tutte le prove.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1058
 
1.8. PREREQUISITI PER L'ESECUZIONE DELLA PROVA DI 
ADSORBIMENTO/DESORBIMENTO  
1.8.1.  Il metodo analitico  
Fra i parametri chiave capaci di influenzare la precisione delle mi ­
sure di sorbimento sono compresi la precisione dei metodi impiegati 
per analizzare la soluzione e la fase adsorbita, la stabilità e la purezza della sostanza da esaminare, il raggiungimento di un equilibrio di sorbimento, l'ordine di grandezza delle variazioni di concentrazione 
della soluzione, il rapporto terreno/soluzione e le variazioni di strut ­
tura del terreno durante i processi di equilibrazione (35) (59-62). Alcuni esempi, focalizzati sulla precisione, sono riportati 
nell'appendice 2.
 
L'attendibilità del metodo analitico nell'intervallo di concentrazioni 
che è verosimile incontrare durante la prova deve essere controllata. Lo sperimentatore deve essere libero di mettere a punto un metodo appropriato sotto gli aspetti dell'esattezza, della precisione, della ri ­
producibilità, dei limiti di rivelazione e del recupero. La tecnica 
sperimentale appresso descritta costituisce una guida per l'esecuzione della prova.
 
Un adeguato volume (ad esempio 100 cm  3 ) di CaCl  2 0,01 M viene 
agitato per 4 ore insieme a un'adeguata massa (ad esempio 20 g) di 
terreno ad elevata capacità di adsorbimento, vale a dire ad elevato contenuto di carbonio organico e di argilla. Le masse e i volumi possono variare secondo le esigenze analitiche, ma un rapporto 
terreno/soluzione di 1 a 5 può rappresentare un punto di partenza 
adeguato. La miscela viene centrifugata, e la fase acquosa viene filtrata. A quest'ultima viene aggiunto un determinato volume della 
soluzione di riserva della sostanza sotto esame, in modo da ottenere 
una concentrazione nominale rientrante nel campo di concentrazioni che è verosimile incontrare durante la prova. Il volume non deve superare il 10 % del volume finale della fase acquosa, allo scopo di 
modificare il meno possibile la natura della soluzione di pre-equili ­
brazione. Si procede quindi all'analisi della soluzione.
 
Per tener conto delle sostanze artificiali impiegate nel metodo anali ­
tico e degli effetti matrice causati dal terreno va previsto un «bian ­
co», consistente nel solo sistema terreno + soluzione di CaCl  2 , senza 
aggiunta della sostanza sotto esame.  
Per le misure di sorbimento si possono impiegare la cromatografia 
gas-liquido (GLC), la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC), la spettrometria (ad esempio GC/spettrometria di massa, 
HPLC/spettrometria di massa) e la conta delle scintillazioni in fase 
liquida (per le sostanze radiomarcate). Indipendentemente dalla sua natura, un metodo analitico può ritenersi adeguato se il recupero è compreso fra il 90 % e il 110 % del valore nominale. Per consentire 
l'identificazione e la quantificazione dopo la ripartizione, i limiti di 
rivelazione del metodo analitico dovrebbero essere almeno due ordini di grandezza al di sotto della concentrazione nominale.
 
Le caratteristiche e i limiti di rivelazione del metodo analitico utiliz ­
zato per eseguire gli studi sull'adsorbimento sono importanti per 
definire le condizioni sperimentali e l'intera esecuzione dell'esame. Il presente metodo segue uno schema sperimentale generale e forni ­
sce raccomandazioni e linee direttrici in vista di soluzioni alternative 
laddove la metodica analitica e le disponibilità di laboratorio impo ­
nessero limitazioni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1059
 
1.8.2.  Selezione dei rapporti ottimali terreno/soluzione  
Negli studi sui fenomeni di sorbimento, la scelta dei rapporti 
terreno/soluzione dipende dal coefficiente di distribuzione K  d e dal 
grado relativo di adsorbimento desiderato. La variazione di concen ­
trazione della sostanza in soluzione determina la precisione statistica 
della misura, la quale dipende dalla forma dell'equazione di adsor ­
bimento e, per quanto riguarda la rivelazione della concentrazione della sostanza chimica in soluzione, dalle limitazioni della metodo ­
logia analitica applicata. Pertanto, nella pratica generale, è utile adot ­
tare un numero limitato di rapporti fissi, nei quali la percentuale adsorbita sia superiore al 20 % e, meglio ancora, al 50 % (62); al 
tempo stesso si avrà cura che la concentrazione della sostanza sotto 
esame nella fase acquosa rimanga sempre abbastanza alta da poter essere misurata con precisione. Ciò ha particolare importanza quando le percentuali di adsorbimento sono elevate.
 
Un modo conveniente per scegliere i rapporti terreno/acqua più ap ­
propriati comincia da una valutazione di K  d attraverso studi prelimi ­
nari o secondo tecniche di valutazione che abbiano dato buona prova 
(appendice 3). Il rapporto appropriato può quindi essere scelto in 
base a un grafico del rapporto terreno/soluzione in funzione di K  d 
per determinate percentuali fisse di adsorbimento (fig. 1). Tale gra ­
fico è basato sul presupposto che l'equazione di adsorbimento sia 
lineare (  1 ). La relazione applicabile si ottiene rielaborando l'equa ­
zione 4 del K  d nella forma dell’equazione 1:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
ovvero, in forma logaritmica ed ammettendo che R = m  soil /V 0 e 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
log R ¼ Älog K  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # 
(2)
 
Fig. 1.  Relazioni fra i valori di K  d e i vari rapporti terreno/soluzione, alle varie 
percentuali della sostanza sotto esame adsorbita  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1060  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d ·C aq ads ðeqÞ:
 La figura 1 mostra i rapporti terreno/soluzione, espressi in funzione 
di K  d , per i vari livelli di adsorbimento. Ad esempio: per un rapporto 
terreno/soluzione di 1 a 5 e K  d = 20, l'adsorbimento dovrebbe essere 
dell'80 % circa. A parità di K  d , per ottenere un adsorbimento del 
50 % andrebbe impiegato un rapporto di 1 a 25. Questa maniera di 
scegliere gli adeguati rapporti terreno/soluzione offre al ricercatore la 
flessibilità necessaria per rispondere alle esigenze sperimentali.  
Le maggiori difficoltà s'incontrano quando la sostanza chimica viene 
adsorbita in misura molto elevata o molto bassa. Quando l'adsorbi ­
mento è basso, è raccomandabile adottare un rapporto terreno/ ­
soluzione di 1 a 1, anche se, per alcuni tipi di terreno ad elevato contenuto organico, può essere necessario ricorrere a rapporti più 
bassi, in modo da ottenere un impasto liquido. La metodologia ana ­
litica dovrà permettere di misurare piccole modifiche della concen ­
trazione della soluzione; in caso contrario, le misure di adsorbimento saranno imprecise. D'altra parte, per valori molto elevati di K
 d si può 
arrivare a rapporti terreno/soluzione di 1 a 100, per lasciare in solu ­
zione una quantità significativa della sostanza chimica. Si avrà co ­
munque cura di assicurare una buona miscelazione, e si lascerà al sistema un tempo adeguato per raggiungere l'equilibrio. Un'altra pos ­
sibilità è quella di prevedere il valore di Kd applicando tecniche di 
valutazione fondate, ad esempio, sui valori di P
 ow (appendice 3). Ciò 
potrebbe rivelarsi utile, specialmente nel caso delle sostanze chimi ­
che scarsamente adsorbite/polari, con P  ow < 20, e di quelle lipofile/ ­
altamente sorbitive, con P  ow > 10  4 . 
1.9. ESECUZIONE DELL'ESPERIMENTO  
1.9.1.  Condizioni sperimentali  
Tutta la sperimentazione deve essere effettuata a temperatura am ­
biente, possibilmente costante, compresa fra 20  o C e 25  o C. 
Le condizioni di centrifugazione debbono permettere di eliminare 
dalla soluzione le particelle oltre 0,2 μm. Questo valore rappresenta 
le dimensioni limite fra le particelle solide e quelle colloidali. L'ap ­
pendice 4 offre una guida per determinare le condizioni di centrifu ­
gazione.  
Se l'apparecchiatura di centrifugazione disponibile non garantisce 
l'eliminazione delle particelle sopra gli 0,2 μm, la centrifugazione 
può essere associata alla filtrazione attraverso filtri da 0,2 μm. Per 
evitare perdite della sostanza sotto esame, questi debbono essere composti di un appropriato materiale inerte. Va in ogni caso assicu ­
rato che durante la filtrazione non si verifichino perdite della so ­
stanza sotto esame.
 
1.9.2.  Primo momento: studio preliminare  
Le ragioni di uno studio preliminare sono già state indicate al capi ­
tolo «Campo di applicazione». Lo schema sperimentale suggerito qui 
appresso costituisce una guida per la sua esecuzione.  
1.9.2.1.  Scelta dei rapporti ottimali terreno/soluzione  
Si ricorre a due tipi di terreno e a tre rapporti terreno/soluzione (sei 
esperimenti). Un tipo di terreno ha un elevato contenuto in carbonio 
organico e un basso contenuto in argilla, e l'altro ha un basso con ­
tenuto in carbonio organico e un elevato contenuto in argilla. Si suggeriscono i seguenti rapporti:
 
— 50 g di terreno e 50 cm  3 di soluzione acquosa della sostanza 
sotto esame (rapporto 1/1),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1061
 
— 10 g di terreno e 50 cm  3 di soluzione acquosa della sostanza 
sotto esame (rapporto 1/5),  
— 2 g di terreno e 50 cm  3 di soluzione acquosa della sostanza sotto 
esame (rapporto 1/25).  
La quantità minima di terreno da impiegare dipende dalle disponi ­
bilità del laboratorio e dall'efficacia del metodo analitico applicato. Per ottenere risultati attendibili si raccomanda comunque di impie ­
gare non meno di 1 g, e preferibilmente 2 g.
 
Per verificare se la sostanza sotto esame è stabile nella soluzione di 
CaCl  2 e se eventualmente rimane adsorbita sulle pareti dei recipienti, 
si preparerà un campione di riferimento non contenente terreno, ma soltanto la sostanza in questione e la soluzione di CaCl
 2 0,01 M: esso 
verrà sottoposto esattamente alle stesse operazioni dei sistemi esami ­
nati. 
Per ogni terreno si preparerà un «bianco» contenente la stessa quan ­
tità di terreno e un volume totale di 50 cm  3 di soluzione di 
CaCl  2 0,01 M (senza la sostanza sotto esame), che verrà sottoposto 
alla stessa procedura sperimentale. Esso servirà da riferimento di base durante l'analisi, per rivelare se sono presenti sostanze capaci 
di interferire o se il terreno è contaminato.
 
Tutti gli esperimenti, compresi quelli sul campione di riferimento e 
sui «bianchi», verranno effettuati almeno in doppio. Il numero totale 
di campioni da preparare per lo studio va stabilito in funzione della 
metodologia da seguire.  
I metodi per lo studio preliminare e per quello principale sono ge ­
nericamente gli stessi: se del caso, gli eventuali discostamenti vanno 
menzionati.  
I campioni di terreno essiccati all'aria vengono equilibrati mantenen ­
doli sotto agitazione per 12 h (tutta la notte precedente l'esperimento) 
insieme a un volume minimo di 45 cm  3 di CaCl  2 0,01 M. Si ag ­
giunge poi un certo volume della soluzione di riserva della sostanza sotto esame, fino a un totale di 50 cm
 3 . Il volume di soluzione di 
riserva aggiunto: a) non deve eccedere il 10 % dei 50 cm  3 di volume 
della fase acquosa, per alterare il meno possibile la natura della 
soluzione di pre-equilibrazione; b) deve condurre di preferenza a una concentrazione iniziale della sostanza sotto esame a contatto col terreno (Co) superiore di almeno due ordini di grandezza al 
limite di rivelazione del metodo analitico, per salvaguardare la capa ­
cità di eseguire misure esatte anche quando l'adsorbimento è forte (> 90 %) e determinare più tardi le isoterme di adsorbimento. Si rac ­
comanda inoltre, se possibile, che la concentrazione iniziale (Co) 
della sostanza sotto esame non superi la metà del suo limite di 
solubilità.
 
Il seguente esempio indica il modo di calcolare la concentrazione 
della soluzione di riserva (Cst). Si parte dall'idea che il limite di 
rivelazione sia di 0,01 μg cm  -3 e l'adsorbimento sia del 90 %: la 
concentrazione iniziale della sostanza sotto esame a contatto col suolo dovrebbe quindi essere preferibilmente uguale ad 1 μg cm
 -3 
(due ordini di grandezza sopra il limite di rivelazione). Ammettendo 
che si sia aggiunto il massimo volume raccomandato della soluzione di riserva, cioè da 5 a 45 cm
 3 della soluzione di equilibrazione di 
CaCl  2 0,01 M (= 10 % della soluzione di riserva rispetto a 50 cm  3 di 
volume totale della fase acquosa), la concentrazione della soluzione 
di riserva dovrebbe essere di 10 μg cm  -3 , cioè superiore di tre ordini 
di grandezza al limite di rivelazione del metodo analitico.  
Il pH della fase acquosa deve essere misurato prima e dopo il con ­
tatto col terreno, poiché esso ha una funzione importante nell'intero 
processo di adsorbimento, specialmente per le sostanze ionizzabili.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1062
 
La miscela deve essere agitata finché sia raggiunto l'equilibrio di 
adsorbimento. Il tempo di equilibrio nei terreni è assai 
variabile, secondo la natura del prodotto chimico e del terreno: in generale è sufficiente un periodo di 24 h (77). Nello studio prelimi ­
nare, i campioni possono essere prelevati sequenzialmente su un 
periodo di 48 h di miscelazione (ad esempio 4. 8, 24, 48 h). Co ­
munque, i tempi di analisi debbono essere considerati con flessibilità, tenendo conto dei programmi di lavoro del laboratorio.
 
Per l'analisi della sostanza sotto esame nella soluzione acquosa è 
possibile scegliere fra: a) il metodo in parallelo: b) il metodo in serie. Si noti che, sebbene il metodo in parallelo sia più tedioso sul piano sperimentale, il trattamento matematico dei risultati ne 
risulta semplificato (appendice 5). La scelta della metodologia da 
seguire spetta comunque allo sperimentatore, il quale terrà conto delle disponibilità materiali e delle risorse del laboratorio.
 
a) Metodo in parallelo: si preparano dei campioni con lo stesso 
rapporto terreno/soluzione, nel numero necessario per coprire gli intervalli di tempo ai quali si desidera studiare la cinetica di 
adsorbimento. Dopo centrifugazione e facoltativa filtrazione, la 
fase acquosa della prima provetta viene recuperata nel modo più completo possibile; si procede quindi alle misure dopo tempi adeguati (ad esempio dopo 4 h per la prima provetta, dopo 8 h 
per la seconda, dopo 24 h per la terza, ecc.).
 
b) Metodo in serie: per ciascun rapporto terreno/soluzione si prepara 
soltanto un campione in doppio. A determinati intervalli di tem ­
po, la miscela viene centrifugata per separare le fasi. In una 
piccola aliquota della fase acquosa si ricerca immediatamente la sostanza sotto esame; dopo di che, l'esperimento prosegue sulla miscela originale. Se la centrifugazione è stata seguita dalla fil ­
trazione, il laboratorio deve avere la possibilità di eseguire la 
filtrazione di piccole aliquote acquose. Per non modificare in modo significativo il rapporto terreno/soluzione e far diminuire la massa del soluto disponibile per l'adsorbimento durante la 
prova, si raccomanda che il volume totale delle aliquote prelevate 
non superi l'1 % del volume totale della soluzione.
 
Per ciascun tempo t  i si calcola la percentuale di adsorbimento  A t i , 
sulla base della concentrazione nominale iniziale e della concentra ­
zione misurata ai momenti t  i del prelievo, previa correzione per il 
bianco. Per valutare se la piattaforma di equilibrio è stata raggiunta, 
si riportano graficamente i valori di  A t i in funzione del tempo (cfr. 
appendice 5, fig. 1) (  1 ). Si calcola inoltre il valore di K  d all'equili­
brio. Sulla base del valore di K  d ed utilizzando la fig.l si scelgono gli 
appropriati rapporti terreno/soluzione, in modo che l'adsorbimento 
percentuale risulti superiore al 20 % e, di preferenza, al 50 % (61). 
Tutte le equazioni applicabili e i principi per il tracciamento del grafico sono indicati al capitolo sulla presentazione dei dati e la relazione, nonché nell'appendice 5.
 
1.9.2.2.  Determinazione del tempo di equilibrazione all'adsorbimento e della 
quantità di sostanza sotto esame adsorbita all'equilibrio  
Come già detto, i grafici di  A t i o di C aq ads in funzione del tempo 
permettono di stabilire se l'equilibrio all'adsorbimento è stato rag ­
giunto e di valutare la quantità di sostanza sotto esame adsorbita 
all'equilibrio. Le figure 1 e 2 nell'appendice 5 mostrano alcuni esempi di tali grafici. Il tempo di equilibrio è quello necessario perché il sistema raggiunga una piattaforma.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1063  
( 1 ) Per valutare se la piattaforma di equilibro è stala raggiunta si potrebbero impiegare arche  
i grafici della concentrazione della sostanza sotto esame nella fase acquosa  
C ad saq ð Þ  in funzione del tempo (cfr. appendice 5, fig. 2).
 Se con un dato terreno non si raggiunge una piattaforma ma si ha un 
incremento continuo, la causa andrebbe cercata in certi fattori di 
complicanza, quali la biodegradazione o la diffusione lenta. La bio ­
degradazione può essere evidenziata ripetendo l'esperimento su un campione di terreno sterilizzato. Se nemmeno in questo modo si 
raggiunge una piattaforma, lo sperimentatore dovrebbe esaminare 
l'eventualità che nei suoi specifici studi possano essere coinvolti altri fenomeni, e modificare adeguatamente le condizioni sperimentali (temperatura, tempi di agitazione, rapporti terreno/soluzione). Inoltre, 
spetta a lui decidere se proseguire il lavoro malgrado l'eventuale 
impossibilità di raggiungere un equilibrio.
 
1.9.2.3.  Adsorbimento alla superficie dei recipienti e stabilità della sostanza 
sotto esame  
Alcuni dati sulla stabilità della sostanza sotto esame e sul suo ad ­
sorbimento alla superficie dei recipienti possono essere ricavati ana ­
lizzando i campioni di riferimento. Se si osserva una deplezione superiore all'errore standard implicito nel metodo analitico, si po ­
trebbe pensare a una degradazione abiotica e/o ad un adsorbimento 
alla superficie del recipiente. Una distinzione fra questi due fenomeni può essere fatta lavando a fondo le pareti del recipiente con un volume noto di un opportuno solvente ed analizzando il liquido di 
lavaggio per ricercarvi la sostanza sotto esame. Se non si osserva 
alcun adsorbimento alla superficie dei recipienti, la deplezione evi ­
denzia l'instabilità abiotica della sostanza sotto esame. Se si constata un adsorbimento, è necessario utilizzare recipienti in altro materiale. 
In ogni modo, i dati sull'adsorbimento così ottenuti non possono 
essere estrapolati direttamente all'esperimento terreno/soluzione, poi ­
ché la presenza del terreno influisce sull'adsorbimento.
 
Ulteriori informazioni sulla stabilità della sostanza sotto esame pos ­
sono essere ricavate da un bilancio della massa progenitrice nel tempo. In altre parole, bisogna analizzare la fase acquosa, gli estratti 
del terreno e le pareti dei recipienti per ricercarvi la sostanza sotto 
esame. La differenza fra la massa della sostanza sotto esame ag ­
giunta e la somma delle masse della sostanza sotto esame nella fase acquosa, negli estratti di terreno e nelle pareti dei recipienti 
corrisponde alla massa degradata c/o volatilizzata e/o non estratta. 
Per un corretto bilancio di massa, l'equilibrio di adsorbimento do ­
vrebbe essere stato raggiunto durante l'esperimento.
 
Il bilancio di massa dev'essere eseguito tanto sui terreni quanto per 
un rapporto terreno/soluzione per ogni terreno che all'equilibrio dia luogo a una deplezione superiore al 20 % e preferibilmente al 50 %. Quando l'esperimento per la ricerca dei rapporti viene completato 
con l'analisi dell'ultimo campione della fase acquosa dopo 48 h, le 
fasi debbono essere separate per centrifugazione e facoltativa filtra ­
zione. La fase acquosa dev'esere recuperata nella maggior quantità possibile, aggiungendo poi al terreno un solvente di estrazione adatto 
(coefficiente di estrazione non inferiore al 95 %) per estrarne la 
sostanza sotto esame. Si raccomanda di eseguire non meno di due estrazioni successive. Si determina poi la quantità di sostanza sotto esame negli estratti del terreno e dei recipienti e si calcola il bilancio 
di massa (equazione 10, «Dati e relazione»). Se essa è inferiore al 
9 %, la sostanza sotto esame viene considerata instabile nella scala di tempo dell'esperimento. Gli studi vanno comunque proseguiti, te ­
nendo conto dell'instabilità della sostanza sotto esame: in questo 
caso si raccomanda di esaminare ambedue le fasi nello studio prin ­
cipale.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1064
 
1.9.2.4.  Secondo momento — Cinetica di adsorbimento per una data concen ­
trazione della sostanza sotto esame  
Si impiegano cinque terreni, scelti dalla tabella 1. Può convenire 
includere fra di essi qualcuno di quelli impiegati nello studio preli ­
minare (al limite, tutti}. In questo caso, le operazioni del secondo 
momento non vanno ripetute sui terreni impiegati nello studio preli ­
minare.  
Il tempo di equilibrio, il rapporto terreno/soluzione, il peso di cam ­
pione di terreno, il volume della fase acquosa a contatto col terreno e 
la concentrazione della sostanza sotto esame nella soluzione debbono 
essere scelti sulla base dei risultati degli studi preliminari. Di prefe ­
renza, l'analisi deve essere eseguita dopo circa 2, 4, 6, 8 e possibil ­
mente anche 10 e 24 ore di contatto; il tempo di agitazione può 
essere portato fino a un massimo di 48 h nel caso che una sostanza 
chimica richieda tempi di equilibrio più lunghi rispetto ai risultati della ricerca del campo di rapporti. In ogni modo, i tempi di analisi debbono essere considerati con flessibilità.
 
Ogni esperimento (un terreno ed una soluzione) deve essere fatto 
almeno in doppio, per poter valutare la varianza dei risultati. Per 
ogni esperimento va previsto un bianco, consistente nel terreno e nella soluzione di CaCl
 2 0,01 M, senza aggiunta della sostanza sotto 
esame, di peso e volume rispettivamente identici a quelli dell'espe ­
rimento. A titolo di salvaguardia contro gli imprevisti, si sottoporrà 
alla stessa procedura sperimentale un campione di controllo conte ­
nente soltanto la sostanza sotto esame nella soluzione di CaCl  2 0,01 
M (senza aggiunta di terreno).  
L'adsorbimento percentuale va calcolato per ogni attimo  A t i e/o in­
tervallo di tempo  A Δt i (secondo necessità), e riportato in funzione del 
tempo. Vanno altresì calcolati il coefficiente di distribuzione K  d 
all'equilibrio e il coefficiente di adsorbimento normalizzato per il 
carbonio organico K  oc (per i composti chimici organici non polari).  
Risultati degli esperimenti sulla cinetica di adsorbimento  
Il valore lineare K  d è generalmente abbastanza preciso da poter 
descrivere il comportamento relativo al sorbimento nei terreni (35) 
(78) e rappresenta un'espressione della mobilità intrinseca dei pro ­
dotti chimici nel terreno. Ad esempio: sul piano generale, i prodotti chimici con K
 d < 1 cm  3 g -1 sono considerati qualitativamente mobili. 
McCall et al. hanno inoltre messo a punto uno schema di classifica 
della mobilità basato sul valore di K  oc (16). Esistono infine schemi 
di classifica in funzione del dilavamento, basati su una relazione fra K
 oc e DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Da studi sull'analisi degli errori (61) risulta altresì che, partendo da una 
diminuzione della concentrazione della fase acquosa, non è possibile 
valutare con precisione i valori di K  d inferiori a 0,3 cm  3 g -1 , neppure 
quando si applica il rapporto terreno/soluzione più favorevole dal punto di vista della precisione, cioè quello di 1:1. In questo caso si racco ­
manda di analizzare ambedue le fasi (terreno e soluzione).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1065  
( 1 ) DT-50: tempo di degradazione per il 50 % della sostanza sotto esame.
 Quanto alle osservazioni di cui sopra, si raccomanda di proseguire 
gli studi del comportamento all'adsorbimento di un prodotto chimico 
nel terreno e della sua mobilità potenziale, determinando le isoterme di adsorbimento secondo Freundlich, per tutti i sistemi per i quali il valore di K
 d può essere determinato con esattezza, applicando il 
protocollo sperimentale descritto nel presente metodo. Una determi ­
nazione accurata è possibile se il valore ottenuto moltiplicando K  d 
per il rapporto terreno/soluzione è superiore a 0,3, quando le misure 
si basano sulla diminuzione di concentrazione nella fase acquosa 
(metodo indiretto), oppure a 0,1, quando vengono analizzate ambe ­
due le fasi (metodo diretto) (61).  
1.9.2.5  Terzo momento — Isoterme di adsorbimento e cinetica di 
desorbimento/isoterme di desorbimento  
1.9.2.5.1. I s o t e r m e d i a d s o r b i m e n t o  
Si impiegano cinque concentrazioni della sostanza sotto esame, tali 
da coprire preferibilmente due ordini di grandezza: per la scelta di queste concentrazioni vanno prese in conto la solubilità in acqua e le concentrazioni all'equilibrio acquoso che ne risultano. Lo stesso rap ­
porto terreno/soluzione per ogni terreno deve essere mantenuto per 
tutta la durata dello studio. La prova di adsorbimento viene eseguita come sopra descritto, con la sola differenza che la fase acquosa viene analizzata una sola volta, al momento necessario per raggiungere 
l'equilibrio. come determinato al secondo momento. Si determinano 
le concentrazioni all'equilibrio nella soluzione e si calcola la quantità adsorbita partendo dalla deplezione della sostanza sotto esame nella soluzione, oppure col metodo diretto. La massa adsorbita, riferita 
all'unità di massa di terreno, viene poi riportata graficamente, in 
funzione della concentrazione all'equilibrio della sostanza sotto esame (cfr. «Dati e relazione»).
 
Risultati della sperimentazione per le isoterme di adsorbimento  
Fra i modelli matematici per l'adsorbimento proposti fino ad oggi, le 
isoterme di Freundlich sono quelle più frequentemente utilizzate per 
descrivere i procedimenti di adsorbimento. Dati più particolareggiati sull'interpretazione e l'importanza dei modelli di adsorbimento sono reperibili in letteratura (41) (45) (80) (81) (82).
 
NB: va tenuto presente che, per varie sostanze, un confronto fra i 
valori di K  F (coefficienti di adsorbimento secondo Freundlich) è 
possibile soltanto se tali valori sono espressi nelle stesse unità (83).  
1.9.2.5.2. C i n e t i c a d i d e s o r b i m e n t o  
Questo esperimento ha lo scopo di stabilire se una sostanza chimica 
viene adsorbita reversibilmente o irreversibilmente dal terreno. Que ­
sto dato è importante, poiché i processi di desorbimento hanno an ­
ch'essi una funzione rilevante nel comportamento di un composto chimico nelle condizioni effettive sul terreno. Inoltre, i dati di desor ­
bimento contribuiscono utilmente alla modellizzazione computeriz ­
zata del dilavamento ed alla simulazione della scomparsa della so ­
stanza dilavata. Se si vuole studiare il desorbimento, si raccomanda di eseguire lo studio appresso descritto su ciascun sistema per il 
quale è stato possibile determinare con accuratezza il valore di K
 d 
nel precedente studio sulla cinetica di adsorbimento.  
Analogamente alla cinetica di adsorbimento, per studiare la cinetica 
di desorbimento esistono due possibilità: a) il metodo in parallelo; b) il metodo in serie. La scelta della metodologia da seguire è lasciata 
allo sperimentatore, che dovrà considerare le disponibilità strumentali 
e le risorse del laboratorio.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1066
 
a) Metodo in parallelo: per ciascun terreno scelto per lo studio sul 
desorbimento si preparano dei campioni con lo stesso rapporto 
terreno/soluzione, nel numero necessario per coprire gli intervalli di tempo ai quali si desidera studiare la cinetica di desorbimento. Di preferenza, vanno impiegati gli stessi intervalli di tempo uti ­
lizzati per la cinetica di adsorbimento; tuttavia, il tempo totale 
può essere esteso secondo necessità, in modo che il sistema possa raggiungere l'equilibrio di desorbimento. Per ogni esperimento (un terreno, una soluzione) si esegue un bianco. Esso consiste 
nel terreno e nella soluzione 0,01 M di CaCl
 2 , senza la sostanza 
sotto esame, nonché di un peso e un volume rispettivamente identici a quelli dell'esperimento. Quale termine di riferimento s'impiega la sostanza sotto esame nella soluzione 0,01 M di CaCl, 
(senza terreno), che viene sottoposta alla stessa procedura speri ­
mentale. Tutte le miscele del terreno con la soluzione vengono agitate fino a raggiungimento dell'equilibrio di adsorbimento (come in precedenza al secondo momento). Le due fasi vengono 
quindi separate per centrifugazione, e la fase acquosa viene al ­
lontanata nella maggior misura possibile. Il volume della solu ­
zione allontanata viene sostituito da un volume uguale di 0,01 M CaCl
 2 , senza la sostanza sotto esame, e le nuove miscele vengono 
nuovamente agitate. La fase acquosa della prima provetta viene 
recuperata nel modo più completo possibile e viene misurata, ad esempio, dopo 2 h, quella della seconda provetta dopo 4 h, quella della terza dopo 6 h, ecc. finché sia raggiunto l'equilibrio di 
desorbimento.
 
b) Metodo in serie: dopo l'esperimento sulla cinetica di adsorbimen ­
to, la miscela viene centrifugata e la fase acquosa viene eliminata nella maggior misura possibile. Il volume di soluzione eliminato 
viene sostituito da un uguale volume di CaCl
 2 0,01 M, senza la 
sostanza sotto esame. La nuova miscela viene agitata fino a rag ­
giungere l'equilibrio di desorbimento. Durante questo periodo di tempo, ad intervalli di tempo definiti, la miscela viene centrifu ­
gata per separare le fasi. La sostanza sotto esame viene ricercata 
immediatamente in una piccola aliquota della fase acquosa; l'esperimento prosegue quindi con la miscela originale. Il volume delle singole aliquote deve essere inferiore all'1 % del volume 
totale. Si aggiunge alla miscela la stessa quantità di soluzione 
fresca di CaCl
 2 0,01 M, in modo da mantenere il rapporto 
terreno/soluzione e si prosegue l'agitazione fino al successivo intervallo di tempo.
 
Il desorbimento percentuale viene calcolato ad ogni momento  
ðD t i Þe/o intervallo tempo  ðD Δt i Þ, secondo le esigenze dello studio, 
e riportato graficamente in funzione del tempo. Si calcola anche il coefficiente di desorbimento Kd
 es all'equilibrio. Tutte le equazioni 
applicabili sono riportate al capitolo «Presentazione dei dati e rela ­
zione», nonché nell'appendice 5.  
Risultati dell'esperimento sulla cinetica di desorbimento  
I grafici comuni del desorbimento percentuale  D t i e dell'adsorbi ­
mento percentuale  A t i in funzione del tempo permettono di valutare 
la reversibilità dei processi di adsorbimento. Se l'equilibrio di desor ­
bimento viene raggiunto entro un tempo che può essere anche dop ­
pio del tempo ottenuto per l'equilibrio di adsorbimento, e il desorbi ­
mento totale risulta superiore al 75 % della quantità adsorbita, l'ad ­
sorbimento è considerato reversibile.  
1.9.2.5.3. I s o t e r m e d i d e s o r b i m e n t o  
Le isoterme di desorbimento secondo Freundlich sono determinate 
sui terreni impiegati nell'esperimento sulle isoterme di adsorbimento. 
La prova di desorbimento viene eseguita come descritto al capitolo «Cinetica di desorbimento» con la sola differenza che la fase ac ­
quosa viene analizzata soltanto una volta, all'equilibrio di desorbi ­
mento. Si procede poi al calcolo della quantità di sostanza sotto 
esame desorbita. La quantità di sostanza sotto esame che resta ad ­
sorbita sul terreno all'equilibrio di desorbimento viene riportata gra ­
ficamente in funzione delle concentrazioni di equilibrio della so ­
stanza sotto esame in soluzione (cfr. «Presentazione dei dati e rela ­
zione» ed appendice 5).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1067
 
2. PRESENTAZIONE DEI DATI E RELAZIONE  
I dati analitici vanno presentati in forma tabulare (cfr. appendice 6). 
Vanno indicate le misure singole e le medie calcolate. Debbono essere fornite le rappresentazioni grafiche delle isoterme di adsorbi ­
mento. I calcoli vanno eseguiti come appresso indicato.
 
Ai fini della prova, il peso di 1 cm  3 di soluzione acquosa è consi ­
derato uguale a 1 g. Il rapporto terreno/soluzione può essere espresso 
in unità peso/peso o peso/volume con la stessa cifra.  
2.1. ADSORBIMENTO  
L'adsorbimento ( A t i ) si definisce come percentuale della sostanza 
sotto esame adsorbita dal terreno, riferita alla quantità presente al ­
l'inizio della prova, nelle condizioni sperimentali. Se la sostanza sotto prova è stabile e non viene adsorbita significativamente sulle 
pareti del recipiente,
 A t i può essere calcolato a ciascun momento t  i , 
con l'equazione:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
dove:  
A t i = percentuale di adsorbimento al momento t  i (%); 
m s ads ðt i Þ = massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno 
al momento t  i (μg); 
m 0 = massa della sostanza sotto esame nella provetta, all'ini ­
zio della prova ( μg). 
Informazioni particolareggiate sul modo di calcolare la percentuale di 
adsorbimento  A t i per i metodi in serie e in parallelo sono fornite 
nell'appendice 5.  
Il coefficiente di distribuzione K  d è il rapporto fra il contenuto della 
sostanza nella fase terreno e la concentrazione di massa della so ­
stanza della soluzione acquosa, nelle condizioni sperimentali, al mo ­
mento in cui viene raggiunto l'equilibrio di adsorbimento.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
dove:  
C s ads ðeqÞ = contenuto della sostanza adsorbita sul terreno al ­
l'equilibrio di adsorbimento (ug g  -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = concentrazione di massa della sostanza nella fase ac ­
quosa all'equilibrio di adsorbimento ( μg cm  -3 ). Que­
sta concentrazione viene determinata analiticamente 
tenendo conto dei valori indicati dai bianchi;  
m s ads ðeqÞ = massa della sostanza adsorbita sul terreno all'equili ­
brio di adsorbimento ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = massa della sostanza in soluzione all'equilibrio di ad ­
sorbimento ( μg); 
m soil = quantità della fase terreno, espressa come massa 
secca di terreno (g);  
V 0 = volume iniziale della fase acquosa a contatto col ter ­
reno (cm  3 ). 
La relazione fra A  eq e K  d è data dall'espressione:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1068
 
dove:  
A eq = percentuale di adsorbimento all'equilibrio di 
adsorbimento, %.  
Il coefficiente normalizzato di adsorbimento del carbonio organico 
K oc collega il coefficiente di distribuzione K  d al contenuto di carbo ­
nio organico del campione di terreno:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
dove:  
% OC = percentuale di carbonio organico nel campione di terreno 
(g g  -1 ). 
Il coefficiente K  oc rappresenta un valore singolo che caratterizza la 
ripartizione, principalmente delle sostanze chimiche organiche non polari, fra il carbonio organico contenuto nel terreno o nel sedimento e l'acqua. L'adsorbimento di queste sostanze chimiche è in relazione 
col contenuto organico del solido sorbente (7); quindi, i valori di K
 oc 
dipendono dalle specifiche caratteristiche delle frazioni umiche che 
differiscono considerevolmente per la loro capacità di sorbimento a causa delle differenze di genesi, di provenienza ecc.
 
2.1.1.  Isoterme di adsorbimento  
L'equazione delle isoterme di adsorbimento secondo Freundlich col ­
lega la quantità della sostanza sotto esame adsorbita con la concen ­
trazione della sostanza sotto esame in soluzione all'equilibrio (equa ­
zione 8).  
I dati sono trattati come descritto alla voce «Adsorbimento», e per 
ciascuna provetta si calcola il contenuto della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno dopo la prova di adsorbimento [
C s ads ðeqÞ (eq), 
altrove indicato come x/m]. Si parte dall'idea che l'equilibrio sia stato 
raggiunto e che  C s ads ðeqÞ (eq) rappresenti il valore all'equilibrio:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i
: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
L'equazione di adsorbimento secondo Freundlich è data dall'espres ­
sione:  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
oppure, in forma lineare, da:  
log C  s ads ðeqÞ ¼ log K  F ads þ 1=n·log C  aq ads ðeqÞ (9) 
dove:  
K F ads = coefficiente di adsorbimento secondo Freundlich. Le sue 
dimensioni sono cm  3 g -1 soltanto se 1/n = 1: in tutti gli 
altri casi, nelle dimensioni di  K F ads [μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ) è 
introdotto il coefficiente angolare 1/n;  
n = costante di regressione; 1/n è generalmente compreso fra 
0,7 e 1,0. Ciò sta a indicare che spesso i dati relativi al 
sorbimento si discostano leggermente dalla linearità.  
Si tracciano i grafici delle equazioni (8) e (9), e si calcolano i valori 
di K F ads e di 1/n attraverso l'analisi di regressione applicando la (9). 
Si calcola inoltre il coefficiente di correlazione r  2 dell'equazione 
logaritmica. Un esempio dei due grafici è presentato nella figura 2.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1069
 
Fig. 2.  Grafici di adsorbimento secondo Freundlich, normali e linea ­
rizzati  
2.1.2.  Bilancio di massa  
Come bilancio di massa (MB) si definisce la percentuale di sostanza 
che può essere recuperata analiticamente dopo una prova di adsor ­
bimento, espressa in funzione della quantità nominale di sostanza all'inizio della prova.
 
Il trattamento dei dati sarà diverso se il solvente è completamente 
miscibile con l'acqua. Nel caso del solvente miscibile con l'acqua, 
per determinare la quantità di sostanza recuperata per estrazione del 
solvente si potranno trattare i dati al modo descritto sotto la voce «Desorbimento». Se il solvente è meno miscibile con acqua, si dovrà procedere alla determinazione della quantità recuperata.
 
Il bilancio di massa MB per l'adsorbimento viene calcolato come 
appresso indicato: si ammette che il termine (m  E ) corrisponda alla 
somma delle masse dei prodotti chimici sotto prova estratte dal 
terreno o dalla superficie del recipiente con un solvente organico:  
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m  E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
dove:  
MB = bilancio di massa (%)  
m E = massa totale della sostanza sotto prova, estratta dal terreno 
e dalle pareti del recipiente in due stadi ( μg) 
C 0 = concentrazione iniziale di massa della soluzione sotto 
prova a contatto col terreno ( μg/cm  3 ) 
V rec = volume del surnatante recuperato dopo l'equilibrio di ad ­
sorbimento (cm  -3 ). 
2.2. DESORBIMENTO  
Il desorbimento (D) si definisce come percentuale della sostanza 
sotto esame che viene desorbita, riferita alla quantità di sostanza precedentemente adsorbita, nelle condizioni sperimentali:
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
dove:  
D t i = percentuale di desorbimento al momento t  i (%) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1070
 
m aq des ðt i Þ = massa della sostanza sotto esame desorbita dal terreno 
al momento t  i (μg) 
m s ads ðeqÞ = massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno 
all'equilibrio di adsorbimento ( μg). 
Informazioni particolareggiate sul modo di calcolare la percentuale di 
desorbimento  D  t i per i metodi in parallelo e in serie figurano 
nell'appendice 5.  
Il coefficiente apparente di desorbimento (K  des ), nelle condizioni 
sperimentali, è il rapporto fra il contenuto della sostanza che rimane nella fase terreno e la concentrazione di massa della sostanza desor ­
bita nella soluzione acquosa, al momento in cui l'equilibrio di desor ­
bimento è raggiunto:
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12)  
dove:  
K des = coefficiente di desorbimento cm  3 g -1 ) 
m aq des ðeqÞ = massa totale della sostanza sotto esame desorbita dal 
terreno all'equilibrio di desorbimento ( μg) 
V T = volume totale della fase acquosa a contatto col ter ­
reno durante la prova di cinetica del desorbimento (cm
 3 ). 
Una guida per calcolare il  m aq des ðeqÞ (eq) figura nell'appendice 5 sotto 
l'intestazione «Desorbimento».  
Osservazioni:  
Se la precedente prova di adsorbimento era stata eseguita col metodo 
in parallelo, il volume V  T nell'equazione 12 viene considerato uguale 
a V  0 . 
2.2.1.  Isoterme di desorbimento  
L'equazione delle isoterme di desorbimento secondo Freundlich col ­
lega il contenuto della sostanza sotto esame che rimane adsorbita al 
terreno alla concentrazione della sostanza sotto esame nella soluzio ­
ne, all'equilibrio di desorbimento (equazione 16).  
Per ogni provetta, il contenuto della sostanza che rimane adsorbita al 
terreno all'equilibrio di desorbimento viene calcolata come segue:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞsi definisce come:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
dove:  
C s des ðeqÞ = contenuto della sostanza sotto esame che rimane ad ­
sorbito sul terreno all'equilibrio di desorbimento (μg g
 -1 ) 
m m des ðeqÞ = massa di sostanza determinata analiticamente nella 
fase acquosa all'equilibrio di desorbimento ( μg) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1071
 
m aq A = massa della sostanza sotto esame residuata dall'equi ­
librio di adsorbimento a causa dell'incompleta sosti ­
tuzione del volume ( μg) 
m aq des ðeqÞ = massa della sostanza della soluzione all'equilibrio di 
adsorbimento ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· Í 
V 0 Ä V R 
V 0 Î 
(15) 
V r F = volume della soluzione prelevata dalla provetta per la mi ­
sura della sostanza sotto esame, all'equilibrio di desorbi ­
mento (cm  3 ) 
V R = volume del surnatante allontanato dalla provetta dopo il 
raggiungimento dell'equilibrio all'adsorbimento e sostituito 
dallo stesso volume di soluzione 0,01 M CaCl  2 (cm  3 ). 
L'equazione di desorbimento secondo Freundlich è data dalla (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
oppure, in forma lineare:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n·log C  aq des ðeqÞ (17) 
dove:  
K F des = coefficiente di desorbimento secondo Freundlich  
n = costante di regressione  
C aq des ðeqÞ = concentrazione di massa della sostanza nella fase ac ­
quosa all'equilibrio di desorbimento ( μg cm  -3 ). 
Le equazioni (16) e (17) possono essere rappresentate graficamente, 
e i valori di  K F des e 1/n vengono calcolati per analisi di regressione 
con l'equazione 17.  
Osservazioni:  
Se l'esponente l/n di adsorbimento o desorbimento secondo Freun ­
dlich è uguale a 1, le costanti di legame di adsorbimento o 
desorbimento secondo Freundlich ( K F ads e K F des ) saranno rispettiva ­
mente uguali alle costanti di equilibrio all'adsorbimento o al desor ­
bimento (K  d e K  des ), e il grafico di C  s in funzione di C  aq sarà lineare. 
Se gli esponenti sono diversi da 1, i grafici di Q in funzione di C  aq 
non saranno lineari, e le costanti di adsorbimento e desorbimento 
varieranno con le isoterme.  
2.2.2.  Relazione  
La relazione deve comprendere i seguenti dati:  
— Identificazione completa dei campioni di terreno utilizzati, com ­
prendenti:  
— coordinate geografiche della località (latitudine, longitudine),  
— data di prelievo del campione,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1072
 
— schema d'impiego (esempio: terreno agrario, foresta, ecc),  
— profondità del prelievo,  
— contenuto in sabbia/torba/argilla,  
— valore del pH (come CaCl  2 0,01 M),  
— contenuto in carbonio organico,  
— contenuto in sostanza organica,  
— contenuto in azoto,  
— rapporto C/N,  
— capacità di scambio canonico (mmol/kg),  
— tutte le informazioni relative alla raccolta e alla conservazione dei 
campioni di suolo,  
— dove del caso, tutte le informazioni rilevanti ai fini dell'interpre ­
tazione dell'adsorbimento/desorbimento della sostanza sotto esa ­
me, 
— riferimento ai metodi impiegati per la determinazione di ciascun 
parametro,  
— informazioni sulla sostanza sotto esame, come del caso,  
— temperatura della sperimentazione,  
— condizioni di centrifugazione,  
— procedimento analitico impiegato per analizzare la sostanza sotto 
esame,  
— giustificazione per l'impiego di qualsiasi agente solubilizzante per 
la preparazione della soluzione di riserva della sostanza sotto esame,
 
— spiegazione delle correzioni apportate ai calcoli, se del caso,  
— dati secondo il formulario dell'appendice 6 e presentazioni grafi ­
che, 
— tutte le informazioni e osservazioni che possono essere utili per 
interpretare i risultati delle prove.  
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therms» in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C.H.; McEwan J.H.: Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), «Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
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face areas of soils». J. Chem. Soc, pp. 3973-93.  
(82) Calvet R., Terce M., and Arvien J.C, (1980), «Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption». Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996), «Anomalies in the Freundlich equation», 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
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(84) Guth, J. A., (1985), «Adsorption/desorption», in Joint Internatio ­
nal Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.  
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1078
 
APPENDICE 1  
Schema di sperimentazione
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1079
 
APPENDICE 2  
INFLUENZA DELLA PRECISIONE DEL METODO ANALITICO E DEL 
CAMBIAMENTO DI CONCENTRAZIONE SULLA PRECISIONE DEI 
RISULTATI RELATIVI ALL'ADSORBIMENTO  
La seguente tabella (84) mostra chiaramente che, quando la differenza fra la 
massa iniziale (m  0 = 110 μg) e la massa all'equilibrio ( m aq ads ðeqÞ = 100 μg) della 
sostanza sotto esame nella soluzione è assai piccola, un errore del 5 % nella misura della concentrazione all'equilibrio conduce a un errore del 50 % nel calcolo della sostanza adsorbita nel terreno (
m s ads ðeqÞ) e del 52,4 % nel calcolo 
del K  d . 
Quantità di terreno m  soil = 10 g 
Volume di soluzione V  o = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
PER A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 valore 
vero 10 1,00 valore 
vero 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
PER A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 valore 
vero 60,0 6,00 valore 
vero 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
PER A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 valore 
vero 108,9 10,89 valore 
vero 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
Dove: 
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ ½C 0 Ä C aq ads ðeqÞâ V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = massa della sostanza sotto esame nella fase terreno all'equilibrio, μg 
m aq ads ðeqÞ = massa della sostanza sotto esame nella fase acquosa all'equilibrio, μg 
C s ads ðeqÞ = contenuto della sostanza sotto esame nella fase terreno all'equilibrio, μg g  -1 
C aq ads ðeqÞ = concentrazione in massa della sostanza sotto esame nella fase acquosa all'equilibrio, μg cm  -3 
R = errore analitico nella determinazione di  m aq ads ðeqÞ 
R‡ = errore calcolato dovuto all'errore analitico R.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1080
 
APPENDICE 3  
TECNICHE DI VALUTAZIONE PER K  d 
1. Le tecniche di valutazione consentono di prevedere i valori di K  d basan­
dosi, ad esempio, sulle correlazioni con i valori di P  OW (12) (39) (63-68), 
sui dati relativi alla solubilità in acqua (12) (19) (21) (39) (68-73), o su 
quelli relativi alla polarità ricavati applicando la HPLC in fase invertita (74- 
76). Come mostrato nelle tabelle 1 e 2, queste equazioni permettono di calcolare i valori di K
 oc o di K  om , dai quali si ricava indirettamente il valore 
di K  d attraverso le equazioni:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Queste correlazioni si fondano essenzialmente su due supposizioni: 1) la 
principale influenza sull'adsorbimento di una sostanza viene esercitata dalla 
sostanza organica contenuta nel terreno; 2) le interazioni che si manifestano hanno principalmente un carattere non polare. Di conseguenza, tali corre ­
lazioni: 1) non possono essere applicate alle sostanze polari, o possono 
esserlo soltanto in misura limitata; 2) non possono essere applicate nei 
casi in cui il contenuto in sostanza organica del terreno è molto basso (12). Inoltre, sebbene si siano trovate correlazioni soddisfacenti fra i valori di P
 OW e l'adsorbimento (19), lo stesso non può dirsi per le relazioni fra la 
solubilità in acqua e la misura dell'adsorbimento (19) (21); gli studi effet ­
tuati fino ad oggi hanno dato esiti assai contraddittori.  
3. Nelle tabelle 1 e 2 sono indicati rispettivamente alcuni esempi di correla ­
zione fra il coefficiente di adsorbimento e il coefficiente di ripartizione 
ottanolo-acqua, nonché alcuni dati relativi alla solubilità in acqua.  
Tabella 1  
Esempi di correlazione fra il coefficiente di distribuzione all'adsorbimento e il coefficiente di ripartizione 
ottanolo-acqua [per ulteriori esempi cfr. (12) (68)]  
Sostanza Correlazioni Autori  
Uree sostituite log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Chloroganici aromatici log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou et al. (1983) (65) 
Antiparassitari diversi log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl e Mingelgrin (1984) (66) 
Idrocarburi aromatici log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles e Mantoura (1987) (67)  
Tabella 2  
Esempi di correlazione fra il coefficiente di distribuzione all'adsorbimento e la solubilità in acqua [per 
ulteriori esempi cfr. (68) (69)].  
Sostanza Correlazioni Autori  
Antiparassitari diversi log Kom = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl e Mingelgrin (1984) (66) 
Sostanze alifatiche e aroma ­
tiche clorurate log K0m = (4,040 +/- 0,038) -(0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou et al. (1979) (70) 
a-naftolo log Koc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Sostanze cicliche, alifatiche e 
aromatiche log Koc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Composti vari log Kom = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1081
 
APPENDICE 4  
CALCOLI PER LA DEFINIZIONE DELLE CONDIZIONI DI 
CENTRIFUGAZIONE  
1. Il tempo di centrifugazione è dato dalla formula seguente, basata sul pre ­
supposto che le particelle siano sferiche e nella quale, 
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
lnðR b=R t Þ (1) 
per semplificare, tutti i parametri sono espressi in unità non appartenenti al 
SI (g, cm).  
dove:  
ω = velocità angolare (=2 π rpm/60), rad s  -1 
rpm = giri al minuto  
η = viscosità della soluzione (g s  -1 cm -1 ) 
r p = raggio delle particelle (cm)  
ρ s = densità del terreno (g cm  -3 ) 
ρ aq = densità della soluzione (g cm  -3 ) 
R t = distanza dal centro del rotore della centrifuga alla sommità della 
soluzione nella provetta da centrifuga (cm)  
R b = distanza dal centro del rotore della centrifuga al fondo della 
provetta da centrifuga, cm  
R b -R t = lunghezza della miscela terreno/soluzione della provetta da 
centrifuga, cm.  
In pratica, per assicurare la separazione completa si usa generalmente rad ­
doppiare i tempi calcolati.  
2. L'equazione 1 può essere ulteriormente semplificata ammettendo che la 
viscosità ( η) e la densità ( ρ aq ) della soluzione siano uguali alla viscosità 
e alla densità dell'acqua a 25  o C; ne deriva che η = 8,95 × 10  -3 g s-1 cm  -1 e 
ρ aq = 1,0 g cm  -3 . 
Il tempo di centrifugazione si ricava quindi dall'equazione (2): 
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Dall'equazione 2 risulta chiaro che, per stabilire le condizioni di centrifu ­
gazione (tempo e velocità) da applicare per ottenere la separazione delle 
particelle di una data grandezza (nel nostro caso, quelle da 0,1 μm di 
raggio), i parametri importanti sono due: a) la densità del terreno; b) l'«al ­
tezza» (R  b -R t ) della miscela contenuta nella provetta da centrifuga, cioè la 
distanza che una particella di terreno deve percorrere dalla sommità della 
soluzione al fondo della provetta. Ovviamente, a parità del volume di 
contenuto, tale altezza dipenderà dal quadrato del raggio della provetta.  
4. Nella figura 1 è rappresentato il modo di variare del tempo di centrifuga ­
zione (t) in funzione della velocità di centrifugazione (rpm), secondo le diverse densità del terreno ( ρ
 s ) (Fig. 1a) e secondo la diversa altezza della 
miscela nelle provette (Fig. 1b). Dalla Fig. 1a risulta ovvia l'influenza della 
densità del terreno: ad esempio, per una centrifugazione classica a 3000, il 
tempo di centrifugazione è di 240 min per una densità di 1,2 g cm  3 ma 
scende a 50 min per una densità di 2,0 g cm  3 . Analogamente, dalla Figura 
1b si vede che, per una centrifugazione classica a 3000 rpm il tempo di 
centrifugazione è dell'ordine di 50 min. quando l'altezza della miscela è di 
10 cm, ma scende a soli 7 min. per un'altezza di 1 cm. È comunque importante trovare un compromesso ottimale fra le condizioni di centrifu ­
gazione, che richiedono la minor altezza possibile, e la facilità di manipo ­
lazione da parte dello sperimentatore al momento di separare le fasi dopo la 
centrifugazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1082
 
5. Nello stabilire le condizioni sperimentali per la separazione delle fasi 
terreno/soluzione non va altresì trascurata la possibile esistenza di una terza 
«pseudofase», costituita dai colloidi. Le particelle colloidali, di diametro inferiore a 0,2 μm, possono avere un effetto importante sull'intero mecca ­
nismo di adsorbimento di una data sostanza in una sospensione di terreno. 
Quando la centrifugazione viene eseguita al modo sopra descritto, i colloidi 
restano nella fase acquosa e vengono analizzati insieme a quest'ultima, e i dati relativi ai loro effetti vanno perduti.
 
Se il laboratorio che esegue l'analisi è dotato di strumenti per l'ultracen ­
trifugazione o l'ultrafiltrazione, l'adsorbimento/desorbimento di una sostanza 
nel terreno può essere studiato più a fondo, per approfondire la maniera in 
cui la sostanza sotto esame viene adsorbita dai colloidi. In questo caso, per separare le tre fasi (terreno, colloidi, soluzione) si dovrebbe procedere a un'ultracentrifugazione a 60 000 rpm o un'ultrafiltrazione su filtri con pori 
da 100 000 dalton. La sostanza sotto esame va ricercata in tutte e tre le fasi, 
perciò il protocollo di sperimentazione dovrebbe essere modificato di con ­
seguenza.
 
Fig. 1a
  
Variazione dei tempi di centrifugazione (t) in funzione della velocità di 
centrifugazione (rpm) per differenti densità ( ρ s ). dei terreni R  t = 10 cm, R  b - 
R t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 e ρ aq = 1,0 g cm  -3 a 25  o C. 
Fig. 1b
  
Variazione dei tempi di centrifugazione (t) in funzione della velocità di 
centrifugazione {rpm) per differenti altezze della miscela nella provetta (R  b - 
R t ) = L, R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -3 , ρ aq = 1,0 g cm  -3 a 25  o C e 
ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1083
 
APPENDICE 5  
CALCOLO DELL'ADSORBIMENTO A (%) E DEL DESORBIMENTO 
D (%)  
Lo schema cronologico del procedimento è il seguente:
  
Per tutti i calcoli si parte dal presupposto che la sostanza sotto esame sia stabile e 
non rimanga significativamente adsorbita sulle pareti del recipiente.  
ADSORBIMENTO A (A %)  
a) Metodo in parallelo  
La percentuale di adsorbimento è calcolata per ciascuna provetta (i) a 
ciascun attimo (t  i ), secondo l'equazione:  ( 1 ) 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) (  1 ) 
Equazione applicabile tanto al metodo diretto quanto al 
metodo indiretto. Tutte le altre equazioni sono applicabili 
esclusivamente al metodo indiretto.  
I termini di quest'equazione possono essere calcolati come segue: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
dove:  
A t i = percentuale di adsorbimento (%) all'attimo t  i 
m s ads ðt i Þ = massa della sostanza sotto esame sul terreno all'attimo t  i in 
cui viene eseguita l'analisi ( μg) 
m 0 = massa della sostanza sotto esame nella provetta, all'inizio 
della prova ( μg) 
C 0 = concentrazione di massa iniziale della soluzione sotto esame 
a contatto col terreno ( μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1084  
( 1 ) Equazione applicabile tanto al metodo diretto quanto al metodo indiretto. Tutte le altre 
equazioni sono applicabili esclusivamente al metodo indiretto.
 C aq ads ðt i Þ = concentrazione di massa della sostanza nella fase acquosa 
all'attimo t  i in cui l'analisi viene effettuata ( μg cm  -3 ); questa 
concentrazione viene determinata analiticamente tenendo conto dei valori forniti dai «bianchi»
 
V 0 = volume iniziale della soluzione di prova a contatto col ter ­
reno (cm  3 ). 
I valori della percentuale di adsorbimento  A t i o C aq ads ðt i Þ vengono riportati 
graficamente in funzione del tempo, e si determina il tempo dopo il quale 
viene raggiunto l'equilibrio di sorbimento. Esempi di questi grafici sono riportati rispettivamente nella fig. 1 e fig. 2.
 
Fig. 1.  
Grafico di equilibrio all'adsorbimento
  
Fig. 2.  
Concentrazione di massa della sostanza sotto esame nella fase acquosa (C  aq ) in 
funzione del tempo  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1085
 
b) Metodo in serie  
Nelle equazioni che seguono si è tenuto conto del fatto che la procedura di 
adsorbimento viene eseguito attraverso misure della sostanza sotto esame su piccole aliquote della fase acquosa, eseguite a specifici intervalli di tempo.
 
— Durante ciascun intervallo di tempo, la quantità di sostanza adsorbita 
dal terreno si calcola come segue:  
— per il primo intervallo di tempo Δt 1 = t 1 - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
(4) 
— per il secondo intervallo di tempo Δt 2 = t 2 - t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— per il terzo intervallo di tempo Δt 3 = t 3 - t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2· v a A 
v a A Î 
(6) 
— per l'ennesimo intervallo di tempo Δt n = t n - t n - 1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m m ads ðt nÄ1 Þ · V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A   !  
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A Î 0 
@ (7) 
— La percentuale di adsorbimento ad ogni intervallo di tempo  A Δt i , si 
calcola con l'equazione seguente:  ( 1 ) 
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) (  1 ) 
Equazione applicabili tanto al m
sono applicabili esclusivament e
mentre la percentuale di adsorbimento  ðA t i Þ a un dato attimo t  i si ricava 
con l'equazione:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) (  1 ) 
Si riportano graficamente i valori dell'adsorbimento  A t i o A Δt i (secondo 
le necessità dello studio) in funzione del tempo, e si determina il tempo dopo il quale si raggiunge l'equilibrio di sorbimento.
 
— Al tempo di equilibrio t  eq : 
— la massa della sostanza sotto esame adsorbita sul terreno è:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) (  1 ) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1086  
( 1 ) Equazione applicabili tanto al metodo diretto quanto al metodo indiretto. Tutte le altre 
equazioni sono applicabili esclusivamente al metodo indiretto.
 — la massa della sostanza sotto esame nella soluzione è:  ( 1 ) 
m aq ads ðeqÞ ¼ m 0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) (  1 ) 
— la percentuale di adsorbimento all'equilibrio è:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) (  1 ) 
I parametri sopra impiegati sono definiti come segue:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = massa di sostanza adsorbita sul 
terreno, rispettivamente durante gli intervalli di tempo Δ
 t1 , Δ t2 ,..., 
Δ tn (μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = massa della sostanza misurata in 
un'aliquota  m  s ads ðeqÞ rispettiva ­
mente agli attimi t  1 , t 2 , ..., t  n 
(μg); 
m s ads ðeqÞ = massa della sostanza adsorbita 
sul terreno all'equilibrio di adsor ­
bimento ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = massa della sostanza nella solu ­
zione all'equilibrio di adsorbi ­
mento (μg); 
v a A = volume dell'aliquota nella quale 
viene misurata la sostanza in 
esame (cm  3 ); 
A Δt i = percentuale di adsorbimento cor ­
rispondente all'intervallo di 
tempo Δt 1 (%); 
A eq = percentuale di adsorbimento al ­
l'equilibrio (%).  
DESORBIMENTO D(%)  
Quale tempo iniziale t  0 dell'esperimento di cinetica del desorbimento si considera 
il momento in cui il massimo volume recuperato della soluzione della sostanza 
sotto esame (dopo che è stato raggiunto l'equilibrio di adsorbimento) è sostituito 
da un uguale volume di soluzione di CaCl  2 M. 
a) Metodo in parallelo  
All'attimo t  i , si misura la massa della sostanza sotto esame nella fase 
acquosa prelevata dalla provetta i  V i 
r e si calcola la massa desorbita con 
l'equazione:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
All'equilibrio di desorbimento è t  i = t eq , e pertanto è  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
La massa della sostanza sotto esame desorbita durante l'intervallo di tempo 
(Δt i ) è data dall'equazione:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
La percentuale di desorbimento si calcola:  
all'attimo t  i , con l'equazione:  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1087  
( 1 ) Equazione applicabili tanto al metodo diretto quanto al metodo indiretto. Tutte le altre 
equazioni sono applicabili esclusivamente al metodo indiretto.
 D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
durante l'intervallo di tempo ( Δt 1 ) con l'equazione:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
dove:  
D t i = percentuale di desorbimento all'attimo t  i (%) 
D Δt i = percentuale di desorbimento corrispondente all'intervallo di 
tempo Δt 1 (%) 
m aq des ðt 1 Þ = massa della sostanza sotto esame desorbita all'attimo t  1 , 
(μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = massa della sostanza sotto esame desorbita durante l'inter ­
vallo di tempo Δt i (μg) 
m m des ðt i Þ = massa della sostanza sotto esame misurata analiticamente 
all'attimo t  1 nel volume  V r i ,di soluzione prelevata per l'ana ­
lisi (μg) 
m aq A = massa della sostanza sotto esame rimasta all'equilibrio di 
adsorbimento per effetto dell'incompleta sostituzione del volume (μg)
 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · Í 
V 0 Ä V R 
V 0 Î (17) 
m aq ads ðeqÞ = massa della sostanza sotto esame nella soluzione all'equili ­
brio ed adsorbimento ( μg) 
V R = volume del surnatante eliminato dal tubo dopo che è stato 
raggiunto l'equilibrio di adsorbimento in sostituzione dello stesso volume di soluzione 0,01 M CaCl
 2 soluzione (cm  3 ) 
V r i = volume della soluzione prelevata dalla provetta (i) per la 
misura della sostanza sotto esame, nell'esperimento di ci ­
netica di desorbimento (cm  3 ). 
Si riportano graficamente i valori del desorbimento  D t i o D Δt i (secondo le 
necessità dello studio) in funzione del tempo, e si determina il tempo dopo il quale si raggiunge l'equilibrio di desorbimento.
 
b) Metodo in serie  
Le seguenti equazioni tengono conto del fatto che il precedente processo di 
adsorbimento era stato effettuato misurando la sostanza sotto esame in 
piccole aliquote ðv a A Þ della fase acquosa (cfr. punto 14.9., 
«1.9. Esecuzione dell'esperimento», metodo in serie). Si ammette quanto 
segue: a) il volume del surnatante allontanato dal tubo dopo l'esperimento 
sulla cinetica di adsorbimento è sostituito dallo stesso volume (V  R ) di 
soluzione 0,01 M di CaCl  2 ; b) il volume totale di fase acquosa a contatto 
col terreno (V  T ) durante l'esperimento di cinetica di desorbimento rimane 
costante ed è espresso dall'equazione:  
V T ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1088
 
All'attimo t  i : 
— si misura la massa della sostanza sotto esame in una piccola aliquota  
v a D Ê Ì  
e si calcola la massa desorbita con l'equazione:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— all'equilibrio di desorbimento è t  i = t eq e pertanto è  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— si calcola la percentuale di desorbimento  D t i con la seguente equazione:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Per l'intervallo di tempo ( Δt i ): 
la quantità di sostanza desorbita durante ciascun intervallo di tempo si 
calcola come segue:  
— per il primo intervallo di tempo, Δt 1 = t 1 - t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— per il secondo intervallo di tempo Δt 2 = t 2 - t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— per l'ennesimo intervallo di tempo, Δt n = t n - t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
and 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
In conclusione, la percentuale  D Δt i , di desorbimento per ciascun intervallo 
di tempo si calcola con l'equazione  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
dove la percentuale di desorbimento  D t i all'attimo t  i è data dall'equazione:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1089
 
dove i parametri sopra impiegati sono definiti come segue:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = massa della sostanza che ri ­
mane rispettivamente adsor ­
bita sul terreno dopo gli in ­
tervalli di tempo Δt 1 , Δt 2 ,..., 
Δt n (μg) 
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = massa della sostanza di prova 
rispettivamente desorbita du ­
rante gli intervalli di tempo Δt
 1 , Δt 2 ,..., Δt n (μg) 
m s des ðt 1 Þ, m s des ðt 2 Þ,... , m s des ðt n Þ = massa della sostanza rispetti ­
vamente misurata in un'ali ­
quota ai momenti  ðv D 
a Þ 
t 1 ,t 2 ,..., t  n (μg) 
V T = volume totale della fase ac ­
quosa a contatto col terreno 
durante l'esperimento di cine ­
tica di desorbimento effet ­
tuato col metodo in serie 
(cm  3 ); 
m A 
aq = massa della sostanza sotto 
esame rimasta dopo l'equili ­
brio di adsorbimento per ef ­
fetto della sostituzione in ­
completa del volume, ( μg) 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volume del surnatante allon ­
tanato dalla provetta dopo il 
raggiungimento dell'equili ­
brio di adsorbimento e sosti ­
tuita dallo stesso volume di 
soluzione 0,01 M di CaCl  2 
(cm  3 ); 
v D 
a = volume dell'aliquota prelevata 
a fini analitici dalla provetta 
i), durante l'esperimento di 
cinetica di desorbimento ef ­
fettuato col metodo in serie (cm
 3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1090
 
APPENDICE 6  
ADSORBIMENTO-DESORBIMENTO NEI SUOLI: FORMULARI DI PRESENTAZIONE DEI RISULTATI  
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Idoneità del metodo analitico  
Suolo pesato g 
Suolo: massa secca g 
Volume di soluzione CaC1  2 cm 3 
Concentrazione nominale soluzione finale μg cm  -3 
Concentrazione analitica soluzione finale μg cm  -3 
Principio del metodo analitico impiegato:  
Taratura del metodo analitico:  
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analitica seguita: Indiretta  □ In parallelo  □ In serie  □ 
Diretta  □ 
Prova di adsorbimento: campioni esaminati  
Simbolo Unità Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione  
N. della provetta 
Suolo pesato — g Suolo: massa secca m
 soil g 
Volume d'acqua nel suolo pe ­
sato (calcolato) V WS cm 3 
Volume di soluzione 0,01 M 
CaCl  2 per equilibrare il suolo cm 3 
Volume della soluzione di ri ­
serva cm 3 
Volume totale della fase ac ­
quosa a contatto col suolo V 0 cm 3 
Concentrazione iniziale della 
soluzione di prova C 0 μg cm  -3 
Massa della sostanza in esame 
all'inizio della prova m 0 μg ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1091
 
Simbolo Unità Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione Tempo di equi ­
librazione  
Dopo agitazione e centrifugazione  
METODO INDIRETTO 
Metodo parallelo 
Concentrazione sostanza in 
esame fase acquosa (compresa 
correzione del bianco)  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Metodo in serie 
Massa di sostanza in esame mi ­
surata nell'aliquota V  a A m m ads ðt i Þ μg 
METODO DIRETTO 
Massa della sostanza in esame 
adsorbita nel suolo  m s ads ðt i Þ μg 
Concentrazione dell'adsorbimento 
Adsorbimento  A  t i % 
A Δt i % 
Media 
Coefficiente di adsorbimento K  d cm 3 g -1 
Media 
Adsorbimento K  oc cm 3 g -1 
Media  
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Prova di adsorbimento: bianchi e controllo  
Simbolo Unità Bianco Bianco Controllo  
Provetta N. 
Suoli pesati g 0 0 Quantità d'acqua nel suolo pe ­
sato (calcolata) cm
 3 — — 
Volume di soluzione 0,01 M 
CaCl  2 aggiunta cm 3 
Volume della soluzione di ri ­
serva della sostanza in esame aggiunta cm
 3 0 0 
Volume totale della fase ac ­
quosa (calcolata) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1092
 
Simbolo Unità Bianco Bianco Controllo  
Concentrazione iniziale della 
sostanza in esame della fase ac ­
quosa μg cm  -3 
Dopo agitazione e centrifugazione  
Concentrazione nella fase ac ­
quosa μg cm  -3 
Osservazione: aggiungere colonne se necessario.  
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura:  o C 
Bilancio di massa  
Simbolo Unità  
Provetta n. 
Suolo pesato — g 
Suolo: massa secca m  soil g 
Volume d'acqua nel suolo pesato (cal ­
colato) V WS ml 
Volume di soluzione 0,01 M CaCl  2 per 
equilibrare il suolo ml 
Volume della soluzione di riserva cm  3 
Volume totale della fase acquosa a con ­
tatto col suolo V 0 cm 3 
Concentrazione iniziale della soluzione 
in esame C 0 μg cm  -3 
Tempo di equilibrazione — h  
Dopo agitazione e centrifugazione  
Concentrazione della sostanza in esame. 
Fase acquosa all'equilibrio di adsorbi ­
mento, compresa la correzione per il bianco
 C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Tempo di equilibrazione t  eq h 
l a diluizione con solvente 
Volume eliminato di fase acquosa V  rec cm 3 
Volume aggiunto di solvente ΔV cm  3 
l a estrazione col solvente 
Segnale analizzato nel solvente S  E1 var. 
Concentrazione della sostanza in esame 
nel solvente C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1093
 
Simbolo Unità  
Massa della sostanza estratta dal suolo e 
dalle pareti del recipiente m E1 μg 
2 a diluizione col solvente 
Volume di solvente eliminato ΔV s cm 3 
Volume di solvente aggiunto ΔV’ cm  3 
2 a estrazione col solvente 
Segnale analizzato nella fase solvente S  E2 var. 
Concentrazione della sostanza in esame 
nel solvente C E2 μg cm  -3 
Massa della sostanza estratta dal suolo e 
dalle pareti del recipiente m E2 μg 
Massa totale della sostanza in esame 
estratta in due fasi m E μg 
Bilancio di massa MB %  
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Isoterme di adsorbimento  
Simbolo Unità  
Provetta n. 
Suolo pesato — g 
Suolo: massa secca E g Volume dell'acqua nel suolo 
pesato (calcolato) V
 WS cm 3 
Volume di soluzione di 0,01 
CaCl  2 M necessaria per equili ­
brare il suolo cm 3 
Volume di soluzione di riserva 
aggiunto cm 3 
Volume totale di fase acquosa a 
contatto col suolo (calcolato) V 0 cm 3 
Soluzione della concentrazione C  0 μg cm-  3 
Tempo di equilibrio — h  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1094
 
Simbolo Unità  
Dopo agitazione e centrifugazione  
Concentrazione della sostanza 
nella fase acquosa, compresa la 
correzione per il bianco C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatura  o C 
Massa adsorbita per unità di 
suolo  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Analisi di regressione:  
valore di K  F ads : 
valore di 1/n:  
coefficiente di regressione r  2 : 
Sostanza esaminata:  
Suolo esaminato:  
Contenuto in sostanza secca del suolo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analitica seguita: Indiretta  □ Parallel  □ In serie  □ 
Prova di desorbimento  
Simbolo Unità Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo  
N. della provetta proveniente dallo stadio 
di adsorbimento 
Massa della sostanza adsorbita sul suolo 
all'equilibrio di adsorbimento  m s ads ðeqÞ μg 
Volume di fase acquosa eliminato e so ­
stituito da 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Volume totale di fase ac ­
quosa a contatto col suolo PM V  0 cm 3 
SM v  T cm 3 
Massa della sostanza in esame rimasta 
dopo l'equilibrio di adsorbimento per ef ­
fetto della sostituzione incompleta del volume
 m aq A μg 
Cinetica di desorbimento  
Massa misurata di sostanza desorbita dal 
suolo al momento t  i m m des ðt i Þ μg 
Volume della soluzione 
prelevata dalla provetta (i) per la misura della so ­
stanza in esame PM V
 f i cm 3 
SM V  a D cm 3 
Massa della sostanza desorbita dal suolo 
al momento t  i (calcolata)  m aq des ðt i Þ μg 
Massa della sostanza desorbita dal suolo 
durante l'intervallo di tempo Δt i (calcola­
ta) m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1095
 
Simbolo Unità Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo Intervallo 
di tempo  
Percentuale di desorbimento  
Desorbimento al tempo t  i D ti % 
Desorbimento nell'intervallo di tempo di 
Δt i D Δt i % 
Coefficiente di desorbimento apparente K  des 
PM: Metodo in parallelo.  
SM: Metodo in serie.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1096
 
C.19.  STIMA DEL COEFFICIENTE DI ADSORBIMENTO (k  OC ) SUL 
TERRENO E SUI FANGHI DI ACQUE DA SCARICO 
MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA 
PRESTAZIONE (HPLC)  
1. METODO  
Il metodo qui descritto corrisponde al TG121 (2001) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Le caratteristiche di adsorbimento delle sostanze presenti nei terreni 
o nei fanghi di acque da scarico possono essere descritte con para ­
metri determinati per via sperimentale tramite il metodo di prova 
C.18. Un parametro importante è il coefficiente di adsorbimento, definito come il rapporto tra la concentrazione di una sostanza nel suolo/fango e la concentrazione della sostanza stessa nella fase ac ­
quosa all'equilibrio di adsorbimento. Il coefficiente di adsorbimento 
K
 oc normalizzato al contenuto di carbonio organico del terreno è un 
buon indicatore della capacità a formare legami di una sostanza 
chimica alla componente organica del suolo e dei fanghi di acque 
da scarico e permette di fare confronti tra diverse sostanze chimiche. Questo parametro può essere stimato mediante correlazioni con la solubilità in acqua e con il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Il metodo sperimentale descritto in questo test consente di stimare il 
coefficiente di adsorbimento K  oc nel suolo e nei fanghi di acque da 
scarico mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) 
(8). L'affidabilità dei valori stimati con questo metodo è superiore a 
quella ottenuta tramite QSAR. (relazione quantitativa struttura-attivi ­
tà) (9). Trattandosi di un metodo di stima, non può sostituire com ­
pletamente gli esperimenti di equilihrio in batch usati nel metodo di 
prova 18. Tuttavia, stimare il valore K  oc può essere utile nella scelta 
dei parametri più appropriati per gli studi di adsorbimento- desorbimento secondo il metodo di prova C.18 e a tal fine si calcola il valore K
 d (coefficiente di distribuzione) o K  f (coefficiente di ad ­
sorbimento di Freundlich) in base all'equazione 3 (cfr. punto 1.2).  
1.2. DEFINIZIONI  
K d : si definisce coefficiente di distribuzione il rapporto tra le concen ­
trazioni all'equilibrio C di una sostanza in esame disciolta in un sistema a due fasi composto da un mezzo adsorbente (terreno o 
fanghi di acque da scarico) e una fase acquosa; è un valore adimen ­
sionale quando le concentrazioni in entrambe le fasi sono espresse in termini di peso/peso. Se la concentrazione nella fase acquosa è in ­
dicata in termini di peso/volume, il valore sarà espresso in unità 
ml g
 -1 . Il valore di K  d può variare in base alle proprietà di adsorbi ­
mento e col variare della concentrazione.  
K d ¼ C suolo 
C aq or C fango 
C aq (1) 
dove:  
C suolo = concentrazione della sostanza in esame nel terreno al ­
l'equilibrio ( μg· g -1 ) 
C fango = concentrazione della sostanza in esame nel fango al ­
l'equilibrio ( μg· g -1 ) 
C aq = concentrazione della sostanza in esame nella fase ac ­
quosa all'equilibrio ( μg· g -1 , μg· ml  -1 ), ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1097
 
K f : il coefficiente di adsorbimento di Freundlich è definito come la 
concentrazione della sostanza in esame nel suolo o nei fanghi di 
acque da scarico (x/m) quando la concentrazione all'equilibrio nella fase acquosa C
 aq è uguale a uno; le unità si riferiscono a μg· g -1 di 
sostanza adsorbente. Il valore può variare in base alle proprietà 
adsorbenti.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n·logC  aq (2) 
dove:  
x/m = quantità (in μg) di sostanza in esame x adsorbita a contatto 
con una quantità (in g) di sostanza adsorbente m all'equili ­
brio 
l/n = pendenza dell'isoterma di adsorbimento di Freundlich  
C aq = concentrazione della sostanza in esame nella fase acquosa 
all'equilibrio ( μg · ml  -1 ) 
At C  aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : il coefficiente di distribuzione (K  d ) o il coefficiente di adsorbi ­
mento di Freundlich (K  f ) normalizzati al contenuto di carbonio or ­
ganico (f  oc ) della sostanza adsorbente; specialmente per le sostanze 
chimiche non ionizzate fornisce un'indicazione approssimativa del ­
l'entità di adsorbimento tra una sostanza e il mezzo adsorbente e consente di effettuare confronti tra diverse sostanze chimiche. 
A seconda delle dimensioni di K
 d e K  f , K  oc può essere un valore 
adimensionale o essere espresso in μg· g -1 di sostanza organica.  
Koc ¼ Kd 
foc ðvalore adimensionale or ml ·g Ä1 Þ or Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
La relazione tra K  oc e K  d non è sempre lineare, pertanto i valori di 
K oc possono variare da terreno a terreno, anche se la loro variabilità 
è notevolmente minore rispetto i valori di K  d o di K  f . 
Il coefficiente di adsorbimento (K  oc ) viene ricavato dal fattore di 
capacità (k') usando un diagramma di taratura log k'/log K  oc dei 
composti di riferimento selezionati.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
dove:  
t R = tempo di ritenzione in HPLC del test e della sostanza di 
riferimento (minuti)  
t 0 = tempo morto in HPLC (minuti) (cfr. punto 1.8.2).  
P ow : il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua è definito come il 
rapporto tra le concentrazioni di una sostanza disciolta in n-ottanolo 
e quella disciolta in acqua; si tratta di una valore adimensionale  
Pow ¼ C octanol  
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Prima di applicare il metodo è opportuno conoscere la formula di 
struttura, la purezza e la costante di dissociazione (se la sostanza è ionizzabile). Sono utili anche informazioni sulla solubilità in acqua e 
in solventi organici, sul coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua e 
sulle caratteristiche di idrolisi.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1098
 
Per stabilire una correlazione tra i tempi di ritenzione in HPLC che 
riguardano la sostanza in esame con il suo coefficiente di adsorbi ­
mento K  oc occorre costruire un grafico di taratura log K  oc /log k' che 
comprenda almeno sei punti di riferimento, di cui almeno uno al di sopra e uno al di sotto del valore previsto per la sostanza in esame. 
L'accuratezza del metodo può essere migliorata in modo significativo 
utilizzando sostanze di riferimento che presentino affinità strutturali con la sostanza in esame. Se tali dati non sono disponibili, la sele ­
zione delle sostanze di taratura è affidata al giudizio dell'operatore. 
In tal caso è consigliabile scegliere una serie più generale di sostanze 
strutturalmente eterogenee. Le sostanze e i valori di K
 oc che possono 
essere utilizzati per i fanghi di acque da scarico e per il terreno sono elencati, rispettivamente, nella tabella 1 e nella tabella 3 dell'appen ­
dice. La scelta di altre sostanze di riferimento va motivata.
 
1.4. PRINCIPIO DEL METODO UTILIZZATO  
L'HPLC viene eseguita con colonne analitiche impaccate con una 
fase solida commerciale di cianopropile contenente gruppi lipofili e polari. Si utilizza inoltre una fase stazionaria moderatamente polare su una matrice di silice: 
— O— Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
silice spaziatore non polare gruppo polare  
Il principio del metodo è analogo al metodo di prova A.8 (coeffi ­
ciente di ripartizione, metodo per HPLC). Durante il passaggio nella colonna insieme alla fase mobile la sostanza in esame interagisce con 
la fase stazionaria. La ripartizione tra la fase mobile e la fase stazio ­
naria provoca un rallentamento della sostanza in esame. La doppia composizione della fase stazionaria, che ha gruppi polari e non po ­
lari, consente l'interazione tra i gruppi polari e non polari di una 
molecola in maniera analoga a quanto avviene per le sostanze orga ­
niche nelle matrici di terreno o di fango. Ciò permette di stabilire una relazione tra il tempo di ritenzione in colonna ed il coefficiente 
di adsorbimento sulla sostanza organica.
 
Il pH influenza in maniera significativa le caratteristiche di adsorbi ­
mento, specie per le sostanze polari. Nei terreni agricoli o nei collettori degli impianti di trattamento dei fanghi di acque da scarico il pH varia normalmente tra 5,5 e 7,5. Per le sostanze ionizzabili, nei 
casi in cui almeno il 10 % del composto in esame verrà dissociato 
nel range di pH compreso tra 5,5 e 7,5, occorre eseguire due test, uno sulla forma ionizzata e l'altro sulla forma non ionizzata, utiliz ­
zando soluzioni tampone adeguate.
 
Poiché la relazione tra il tempo di ritenzione nella colonna per HPLC 
e il coefficiente di adsorbimento è il solo criterio impiegato per la 
stima, non è necessario ricorrere a metodi analitici quantitativi, ma basta solo la determinazione del tempo di ritenzione. Avendo a disposizione un gruppo adeguato di sostanze di riferimento e po ­
tendo applicare condizioni sperimentali standard, il metodo offre 
una tecnica rapida ed efficiente per stimare il coefficiente di adsor ­
bimento K
 oc . 
1.5. APPLICABILITÀ DEL TEST  
Il metodo per HPLC è applicabile a sostanze chimiche (marcate o 
non marcate) per cui è disponibile un sistema di rilevazione adeguato 
(ad esempio spettrofotometro o rilevatore di radioattività) e che siano 
sufficientemente stabili per tutta la durata dell'esperimento. Può ri ­
velarsi particolarmente utile per sostanze chimiche difficili da stu ­
diare con altri sistemi sperimentali (ad esempio sostanze volatili, 
sostanze non solubili in acqua ad una concentrazione analiticamente 
misurabile, sostanze con elevata affinità verso la superficie dei si ­
stemi di incubazione). Il metodo è applicabile a miscele che danno bande di eluizione non risolte. In tal caso è opportuno determinare il 
limite superiore e inferiore del valore log K
 oc dei composti della 
miscela di prova.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1099
 
Le impurezze possono talvolta interferire con l'interpretazione dei 
risultati HPLC, ma ciò non ha rilievo particolare purché la sostanza 
in esame possa essere chiaramente identificata e separata dalle im ­
purezze.  
Il metodo è convalidato per le sostanze elencate nella tabella 1 
dell'appendice ed è stato anche applicato ad una serie di sostanze delle seguenti classi chimiche:
 
— ammine aromatiche (ad esempio trifluralin, 4-cloroanilina, 3,5- 
dinitroanilina, 4-metilanilina, N-metilanilina, 1-naftilammina),  
— esteri degli acidi carbossilici aromatici (ad esempio estere meti ­
lico dell'acido benzoico, estere etilico dell'acido 3,5-dinitroben ­
zoico),  
— idrocarburi aromatici (ad esempio toluene, xilene, etilbenzene, 
nitrobenzene),  
— esteri dell'acido arilossifenossipropionico (ad esempi diclofop- 
metile, fenoxaprop-etile, fenoxaprop-P-etile),  
— fungicidi a base di benzimidazolo e imidazolo (ad esempio car ­
bendazim, fuberidazole, triazoxide),  
— ammidi degli acidi carbossilici (ad esempio 2-clorobenzammide, 
N,N-dimetilbenzammide, 3,5-dinitrobenzammide, N-metilben ­
zammide, 2-nitrobenzammide, 3-nitrobenzammide),  
— idrocarburi clorurati (ad esempio endosulfan, DDT, esacloroben ­
zene, quintozene, 1,2,3-triclorobenzene),  
— insetticidi organofosforati (ad esempio azinfos-metile, 
disulfoton. fenamifos. isofenfos. pirazofos, sulprofos, triazofos).  
— fenoli (ad esempio fenolo. 2-nitrofenolo, 4-nitrofenolo, pentaclo ­
rofenolo. 2,4,6-triclorofenolo, I-naftolo),  
— derivati della fenilurea (ad esempio isoproturon, monolinuron, 
pencicuron).  
— coloranti di pigmentazione (ad esempio Giallo Acido 219, Blu 
Basico 41. Rosso Diretto 81),  
— idrocarburi poliaromatici (ad esempio acenaftene, naftalene),  
— erbicidi a base di 1,3,5-triazina (ad esempio prometryn, propazi ­
na, simazina, terbutrin),  
— derivati del triazolo (ad esempio tebuconazolo, triadimefon, tra ­
dimenol, triapenthenol).  
Il metodo non è applicabile a sostanze che reagiscono con l'eluente o 
con la fase stazionaria, né a sostanze che interagiscono in maniera specifica con i componenti inorganici (ad esempio formazione di cluster complessi con i minerali delle argille). Il metodo potrebbe 
non funzionare per le sostanze tensioattive, i composti inorganici e le 
basi e gli acidi organici moderati e forti. Sono determinabili i valori di log K
 oc compresi tra 1,5 e5,0. Le sostanze ionizzabili devono 
essere testate usando una fase mobile tamponata, ma occorre proce ­
dere con la massima cura per evitare la precipitazione di componenti 
del tampone o della sostanza in esame.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1100
 
1.6. CRITERI QUALITATIVI  
1.6.1.  Accuratezza  
Normalmente la stima del coefficiente di adsorbimento può raggiun ­
gere una precisione di ± 0,5 unità logaritmiche del valore determi ­
nato con il metodo di equilibrio in batch (cfr. la tabella 1 nell'ap ­
pendice). Si può ottenere una maggior accuratezza utilizzando come riferimento sostanze strutturalmente analoghe alla sostanza in esame.
 
1.6.2.  Ripetibilità  
Le determinazioni devono essere eseguite almeno due volte. I valori 
di log K  oc ricavati dalle singole misurazioni dovrebbero essere com ­
presi entro un range di 0,25 unità logaritmiche.  
1.6.3.  Riproducibilità  
L'esperienza finora acquisita nell'applicazione del metodo ne con ­
ferma la validità. Da uno studio di validazione del metodo per 
HPLC usando 48 sostanze (in prevalenza pesticidi), per le quali 
erano disponibili dati affidabili relativi al K  oc sul terreno, è risultato 
un coefficiente di correlazione di R = 0,95 (10) (11).  
Per migliorare e validare il metodo è stato effettuato un test a cui 
hanno partecipato 11 laboratori (12). I risultati sono riportati nella 
tabella 2 dell'appendice.  
1.7. DESCRIZIONE DEL METODO UTILIZZATO  
1.7.1.  Stima preliminare del coefficiente di adsorbimento  
Il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua P  ow (= K  ow ) e, entro 
certi limiti, la solubilità in acqua, possono servire da indicatori del ­
l'entità dell'adsorbimento, soprattutto per le sostanze non ionizzate, e quindi essere utilizzati per l'identificazione preliminare del range. Sono state pubblicate una serie di utili correlazioni per diversi gruppi 
di sostanze chimiche (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Apparecchiatura  
E richiesto un apparecchio per cromatografia liquida dotato di pompa 
pulse-free e di un sistema di rilevazione adeguato. Si raccomanda l'utilizzo di una valvola di iniezione con loop. Occorre utilizzare 
resine legate a cianopropile, comunemente disponibili in commercio, 
su una base di silice (ad esempio Hypersil e Zorbax CN). Tra il sistema di iniezione e la colonna analitica è possibile inserire una precolonna dello stesso materiale. L'efficienza di separazione della 
colonna può variare in modo significativo a seconda della casa pro ­
duttrice. Si tenga presente che, indicativamente, la colonna deve raggiungere i seguenti fattori di capacità k': log k' > 0,0 per log K
 oc = 3,0 e log k' > 0,4 per log K  oc = 2,0 con una fase mobile 
metanolo/acqua 55/45 %.  
1.7.3.  Fasi mobili  
A seguito di test effettuati su diverse fasi mobili. si raccomandano le 
due seguenti:  
— metanolo/acqua (55/45 % v/v),  
— metanolo/soluzione tampone citrato 0,01 M a pH 6,0 
(55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1101
 
Il solvente di eluizione viene preparato con metanolo per HPLC e 
acqua distillata o tampone citrato. Prima dell'uso la miscela viene 
sottoposta a degasaggio. Si consiglia di optare per l'eluizione isocra ­
tica. Nel caso le miscele metanolo/acqua non siano adeguate, è pos ­
sibile provare altre miscele di solvente organico/acqua, come miscele 
di etanolo/acqua o acetonitrile/acqua. Per i composti ionizzabili si 
raccomanda l'uso di soluzioni tampone allo scopo di stabilizzare il pH. È importante osservare tutte le precauzioni necessarie per evitare la precipitazione di sali e il deterioramento della colonna, che si 
possono verificare con alcune miscele di fase organica/soluzione 
tampone.
 
Non è consentito l'uso di additivi quali ad esempio i reagenti ione 
pair che possono modificare le proprietà di adsorbimento della fase 
stazionaria. Tali modifiche possono essere irreversibili. Per questo motivo è necessario che gli esperimenti che prevedono l'uso di ad ­
ditivi vengano condotti su colonne separate.
 
1.7.4.  Soluti  
Le sostanze in esame e di riferimento devono essere sciolte nella fase 
mobile.  
1.8. ESECUZIONE DEL TEST  
1.8.1.  Condizioni  
È bene registrare la temperatura durante le misurazioni. Si racco ­
manda in modo particolare l'uso di un comparto colonne a tempera ­
tura controllata per garantire condizioni costanti durante i cicli di 
esecuzione della taratura, delle corse e delle misurazioni sulla so ­
stanza in esame.  
1.8.2.  Determinazione del tempo morto t  o 
Il tempo morto t  o può essere determinato con due metodi diversi (cfr. 
anche il punto 1.2).  
1.8.2.1.  Determinazione del tempo morto t  o mediante serie omologa  
È comprovato che con questa procedura i valori di t  o sono affidabili 
e standardizzati. Per maggiori dettagli, consultare il metodo di prova 
A.8: coefficiente di ripartizione (n-ottanolo/acqua), metodo per 
HPLC.  
1.8.2.2.  Determinazione del tempo morto t  o mediante sostanze inerti non 
trattenute dalla colonna  
Questa tecnica si basa sull'iniezione di formammide, urea o nitrato di 
sodio. Le misurazioni devono essere eseguite almeno due volte.  
1.8.3.  Determinazione dei tempi di ritenzione t  R 
Selezionare le sostanze di riferimento secondo le modalità descritte 
nel punto 1.3. Queste sostanze sono iniettabili sotto forma di miscela 
standard, purché esista una conferma che il tempo di ritenzione di 
ciascuno standard di riferimento non sia influenzato dalla presenza degli altri. Effettuare la taratura a intervalli regolari almeno due volte al giorno, in modo da considerare eventuali variazioni 
impreviste nelle prestazioni della colonna. È buona prassi eseguire 
le iniezioni di taratura prima e dopo le iniezioni della sostanza in esame per escludere eventuali derive dei tempi di ritenzione. Iniettare le singole sostanze in esame nella minor quantità possibile (per 
evitare un sovraccarico della colonna) e determinare i relativi tempi 
di ritenzione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1102
 
Per aumentare l'affidabilità delle misurazioni, ripetere le determina ­
zioni almeno due volte. I valori di log K  oc ricavati dalle singole 
misurazioni dovrebbero essere compresi entro un range di 0,25 unità logaritmiche.
 
1.8.4.  Valutazione  
I fattori di capacità k' vengono ricavati dal tempo morto t  o e dai 
tempi di ritenzione t  R delle sostanze di riferimento 
selezionate secondo l'equazione 4 (cfr. il punto 1.2). Successiva ­
mente si costruisce un grafico log k'/log K  oc ottenuti dagli esperi ­
menti di equilibrio in batch riportati nelle tabelle 1 e 3 dell'appen ­
dice. Servendosi di questo grafico, si utilizza il valore di log k' della sostanza in esame per determinare il rispettivo valore di log K
 oc 
(interpolazione). Se i risultati mostrano che log K  uc della sostanza 
in esame esce dal range di taratura, occorre ripetere il test usando altre sostanze di riferimento più appropriate.
 
2. DATI E RELAZIONE  
La relazione deve contenere le seguenti informazioni:  
— identità della sostanza in esame e delle sostanze di riferimento, 
relativa purezza e valori pK  a . per composti ionizzabili,  
— descrizione della strumentazione e delle condizioni operative, ad 
esempio tipo e dimensioni della colonna (e precolonna) analitica, mezzi di rivelazione, fase mobile (rapporto dei componenti e 
pH), intervallo di temperatura durante le misurazioni,
 
— tempo morto e relativo metodo di determinazione,  
— quantità delle sostanze in esame e di riferimento introdotte nella 
colonna,  
— tempi di ritenzione dei composti di riferimento usati per la tara ­
tura, 
— dettagli sulla retta di regressione approssimata (log k' in rapporto 
a log K  oc ) e rappresentazione grafica della retta di regressione,  
— dati sui tempi medi di ritenzione e valore stimato di d log K  oc 
riferito al composto in esame,  
— cromatogrammi.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl. D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Han ­
dbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the ad ­
sorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67.  
(3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relation ­
ships between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
 
(4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil orga ­
nic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.  
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substan ­
ces by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 
297-312.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1103
 
(6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V.H. Freed (1979). A physical con ­
cept of soil water equilibria for non-ionic organic compounds, 
Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sor ­
ption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening me ­
thods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphe ­
re, 27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1104
 
APPENDICE  
Tabella 1  
Confronto tra i valori di K  oc per i terreni e i fanghi di acque da scarico e i valori calcolati con il metodo di 
screening per HPLC  ( 1 ) ( 2 ) 
Sostanza N.CAS Log K  oc 
fanghi di 
acque da 
scarico Log K  o 
HPLC Δ Log K  oc 
terreni Log K  oc 
HPLC Δ 
Atrazina 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantrene 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Acido benzoico fenilestere 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzammide 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-nitrobenzammide 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilide 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilina 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-dicloroanilina 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s 
Chemosphere, 3 5 (1/2), pp. 107-119.  
Tabella 2  
Risultati di un test comparativo fra laboratori (11 laboratori partecipanti) eseguito per migliorare e validare il 
metodo per HPLC  ( 1 ) 
Sostanza N.CAS Log K  Oc : K  oc Log K  oc 
[OCSE 106] [Metodo HPLC]  
Atrazina 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 
Triapenthenol 776O8-8S-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fention 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G, Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1105
 
Tabella 3  
Sostanze di riferimento raccomandate per il metodo di screening per HPLC in base ai dati sull'adsorbimento del 
suolo  
Sostanza di riferimento N.CAS Valori medi di 
log K  oc ottenuti 
dall'equilibrio in 
batch Numero di dati 
relativi a K  oc Log S.D. Fonte  
Acetanilide 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenolo 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-nitrobenzammide 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetilbenzammide 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metilbenzammide 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Benzoato di metile 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazina 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-nitrobenzammide 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilina 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-dinitrobenzammide 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalene 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diolo 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Giallo Acido 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-triclorobenzene 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Rosso Diretto 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pirazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-metile 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantrene 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Blu Basico 41 (miscela) 26S50-47-5 
12270-l 3-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten, organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No. 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oeper, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 21 pp. 285-304. 
( c ) Dati fomiti dalle industrie.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1106
 
C.20.  PROVA DI RIPRODUZIONE CON  DAPHNIA MAGNA  
1. METODO  
Questo metodo di test della tossicità per la riproduzione corrisponde 
al TG 211 (1998) dell'OCSE.  
1.1. INTRODUZIONE  
Il principale obiettivo del test è valutare l'effetto delle sostanze chi ­
miche sulla capacità riproduttiva di  Daphnia magna . 
1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ  
Animali riproduttori:  femmine di  Daphnia  presenti all'inizio del 
test la cui capacità riproduttiva è oggetto dello studio.  
Prole:  piccoli di  Daphnia  prodotti dagli animali riproduttori nel 
corso del test.  
Minima concentrazione con effetti significativi (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC):  concentrazione più bassa testata 
della sostanza alla quale si osserva un effetto statisticamente signi ­
ficativo (p < 0,05) sulla riproduzione e sulla mortalità parentale rispetto ai controlli, entro un periodo di esposizione definito. Tutta ­
via, tutte le concentrazioni al di sopra della LOEC devono avere un 
effetto dannoso uguale o superiore a quelli osservati alla LOEC. Se non è possibile soddisfare queste due condizioni, è necessario fornire una spiegazione esauriente sulle modalità di scelta della LOEC {e di 
conseguenza della NOEC).
 
Massima concentrazione senza effetti significativi (No Observed 
Effect Concentration, NOEC):  concentrazione di prova immediata ­
mente inferiore alla LOEC che, se confrontata con i controlli, non ha 
un effetto statisticamente significativo (p < 0,05), entro un periodo di 
esposizione definito.  
EC x : concentrazione della sostanza di prova disciolta in acqua che 
provoca una percentuale x di riduzione della capacità riproduttiva di  
Daphnia magna  entro un determinato periodo di esposizione.  
Tasso intrinseco di accrescimento:  misura della crescita della po ­
polazione che integra la capacità riproduttiva e la mortalità specifica in base all'età (20) (21) (22). Nelle popolazioni in equilibrio dina ­
mico è uguale a zero. Per le popolazioni in crescita è positivo, 
mentre per quelle in diminuzione è negativo. Ovviamente, quest'ul ­
timo tasso non è sostenibile e, alla fine, porta all'estinzione.
 
Limite di rivelabilità:  concentrazione minima che può essere indi ­
viduata ma non quantificata.  
Limite di determinazione:  concentrazione minima misurabile quan ­
titativamente.  
Mortalità:  si considerano morti gli animali che, entro 15 secondi 
dopo lieve agitazione del contenitore usato per il test, restano im ­
mobili, cioè non sono in grado di nuotare, o nei quali non si osserva alcun movimento delle appendici o della parte posteriore dell'addo ­
me. (Nel caso si usi un'altra definizione, essa deve essere indicata 
insieme al relativo riferimento bibliografico).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1107
 
1.3. PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
Giovani femmine di  Daphnia  (animali riproduttori), di età inferiore 
alle 24 ore al momento dell'inizio del test, vengono esposte alla sostanza di prova aggiunta ad acqua a un intervallo di concentrazioni 
diverse. La durata del test è di 21 giorni. Alla fine del test si valuta il 
numero totale di piccoli vivi prodotti da ciascun animale riproduttore vivo alla fine del test. Ciò significa che la prole nata da adulti che muoiono durante il test viene esclusa dai calcoli. La capacità 
riproduttiva degli animali parentali può essere espressa in altri 
modi (ad esempio, con il numero dei piccoli vivi prodotti giornal ­
mente da ciascun animale a partire dal primo giorno di comparsa 
della prole) ma questi dati dovrebbero essere riportati solo ad inte ­
grazione del numero totale di piccoli prodotti da ciascun genitore vivo alla fine del test. La capacità riproduttiva degli animali esposti alla sostanza di prova viene confrontata con quella del/i controllo/i 
allo scopo di determinare la concentrazione più bassa alla quale si 
osservano effetti (LOEC) e quindi la concentrazione a cui non si osservano effetti (NOEC). Inoltre, e per quanto possibile, si analiz ­
zano i dati mediante un modello di regressione allo scopo di calco ­
lare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x 
della capacità riproduttiva (cioè CE
 50 , CE  20 o CE  10 ). 
Deve essere inoltre riportata la sopravvivenza degli animali riprodut ­
tori e il tempo intercorso fino alla produzione della prima schiusa, è possibile esaminare anche altri effetti correlati alla sostanza su para ­
metri quali la crescita (ad esempio la lunghezza) e il tasso intrinseco 
di accrescimento.
 
1.4. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Dovrebbero essere disponibili i risultati di un test di tossicità acuta 
(cfr. metodo C.2, parte I) effettuato sulla  Daphnia magna . Tali ri­
sultati possono essere utili per selezionare un intervallo di concen ­
trazione adeguato da utilizzare nei test sulla riproduzione. Dovreb ­
bero essere noti la solubilità in acqua e la tensione di vapore della 
sostanza di prova e dovrebbe essere disponibile un metodo analitico 
affidabile per quantificare la sostanza nelle soluzioni di prova con la relativa efficienza di recupero e limite di determinazione.
 
Le informazioni sulla sostanza in esame utili per definire le condi ­
zioni di esecuzione del test sono: formula di struttura, purezza della sostanza, fotostabilità, stabilità nelle condizioni di esecuzione del 
test, pKa, P
 ow e risultati del test di biodegradabilità immediata (cfr. 
metodo C.4).  
1.5. VALIDITÀ DEL TEST  
Perché il test sia valido, il/i controllo/i dovrebbe/ro soddisfare i 
seguenti criteri di prestazione:  
— la mortalità degli animali riproduttori (femmine di  Daphnia ) non 
deve superare il 20 % alla fine del test,  
— il numero medio dei piccoli vivi prodotti da ciascun animale 
riproduttore sopravvissuto alla fine del test deve essere > 60.  
1.6. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.6.1.  Apparecchiatura  
I recipienti di prova e le altre apparecchiature destinate a entrare in 
contatto con le soluzioni della prova devono essere interamente di 
vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Di norma si utilizzano 
beaker di vetro come recipienti di prova.  
Occorrono inoltre alcuni (o tutti) dei seguenti strumenti:  
— misuratore di ossigeno (con microelettrodo o altro apparecchio 
adatto per la misurazione dell'ossigeno disciolto in campioni di 
volume ridotto),  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1108
 
— adeguata apparecchiatura per il controllo della temperatura,  
— pH-metro,  
— apparecchiatura per la determinazione della durezza dell'acqua,  
— apparecchiatura per la determinazione della concentrazione dei 
carbonio organico totale (TOC) nell'acqua o per la determina ­
zione della domanda chimica di ossigeno (COD),  
— adeguata apparecchiatura per il controllo del regime di illumina ­
zione e la misurazione dell'intensità della luce.  
1.6.2.  Organismi da utilizzare nella prova  
La specie da utilizzare nel test è la  Daphnia magna  Straus. È pos ­
sibile usare altre specie di dafnie, purché soddisfino adeguatamente i 
criteri di validità (il criterio di validità relativo alla capacità ripro ­
duttiva nei controlli deve essere calibrato sulla specie di dafnia). Nel caso si utilizzino altre specie di dafnie, occorre identificarle con 
precisione e motivare la scelta.
 
Di preferenza il clone dovrebbe essere stato identificato tramite de ­
terminazione del genotipo. La ricerca (1) ha dimostrato che le pre ­
stazioni riproduttive del Clone A (proveniente dall'IRCHA, in Fran ­
cia) (3), allevato nelle condizioni descritte nel presente metodo, sod ­
disfa costantemente il criterio di validità di una media di ≥ 60 di 
piccoli per animale riproduttore sopravvissuto. Sono comunque ac ­
cettabili altri cloni, purché si dimostri che la coltura di  Daphnia  
soddisfa i criteri di validità del test.  
All'inizio del test gli animali devono avere meno di 24 ore di vita e 
non devono provenire dalla prima nidiata. Devono provenire da un allevamento sano (senza segni di stress quali un alto tasso di mor ­
talità, presenza di maschi e formazione di efippi. ritardo nella pro ­
duzione della prima nidiata, scolorazione ecc). Gli animali riprodut ­
tori vanno mantenuti in condizioni di allevamento (luce, temperatura, mezzo, alimentazione e numero di animali per unità di volume) 
simili a quelle che verranno utilizzate nella prova. Se il mezzo di 
coltura delle dafnie da usare nel test è diverso da quello utilizzato di routine per la coltura delle dafnie, è buona prassi prevedere un periodo di acclimatazione prima del test, normalmente di tre setti ­
mane (cioè una generazione) per evitare di sottoporre a stress gli 
animali destinati alla riproduzione.
 
1.6.3.  Mezzo di prova  
Si raccomanda di usare per questa prova un mezzo completamente 
definito per evitare l'uso di additivi (ad esempio alghe, estratto di 
terra, e così via), che sono difficili da caratterizzare, e dunque au ­
mentare la possibilità di standardizzazione fra vari laboratori. I mezzi M4 (4) e M7 di Elendt (cfr. appendice 1) si sono rivelati adatti a 
questo scopo. Sono comunque accettabili altri mezzi [ad esempio (5) 
(6)], purché si dimostri che le prestazioni della coltura di  Daphnia  
soddisfano i criteri di validità del test.
 
Se si impiegano mezzi contenenti additivi non ben definiti, occorre 
descriverli in dettaglio aggiungendo nella relazione informazioni sulla loro composizione, con particolare riferimento al contenuto di 
carbonio, che potrebbe influire sulla dieta. Si raccomanda di deter ­
minare il carbonio organico totale (TOC) e/o la domanda chimica di ossigeno (COD) della preparazione madre dell'additivo organico e di effettuare una stima del contributo dato al TOC/COD del mezzo di 
prova. Si raccomanda che i livelli di TOC nel mezzo (cioè prima 
dell'aggiunta delle alghe) siano inferiori a 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1109
 
Quando si provano sostanze contenenti metalli è importante tener 
conto del fatto che le proprietà del mezzo di prova (ad esempio la 
durezza e la capacità di chelazione) possono influire sulla tossicità della sostanza in esame. Per questo motivo è consigliabile avere un mezzo completamente definito. Attualmente però gli unici mezzi di 
questo tipo noti per essere adatti all' allevamento a lungo termine di  
Daphnia magna  sono l'M4 e l'M7 di Elendt. Entrambi i mezzi con ­
tengono l'agente chelante EDTA. La ricerca ha dimostrato (2) che la «tossicità apparente» del cadmio è generalmente inferiore quando il 
test sulla riproduzione viene eseguito nei mezzi M4 e M7 invece che 
in mezzi non contenenti EDTA. I mezzi M4 e M7 non sono pertanto raccomandati per il test di sostanze contenenti metalli; occorre inoltre evitare anche altri mezzi che contengono agenti chelanti. Per le 
sostanze contenenti metalli può essere consigliabile utilizzare un 
mezzo alternativo come, ad esempio, l'acqua dolce dura ricostituita secondo le indicazioni dell'ASTM (7), che non contiene EDTA, con l'aggiunta di estratto di alghe marine (8). Questa com ­
binazione di acqua dolce dura ricostituita ed estratto di alghe marine 
è adatta anche per l'allevamento a lungo termine e la sperimentazione con Daphnia magna  (2), sebbene anch'essa eserciti un'azione lieve ­
mente chelante a causa del componente organico presente nel ­
l'estratto di alghe marine aggiunto.
 
All'inizio e nel corso del test la concentrazione dell'ossigeno disciolto 
deve essere superiore a 3 mg/l. Il pH dovrebbe restare nel range 6-9 
senza di norma variare di oltre 1,5 unità nell'ambito di un test. Si 
raccomanda una durezza superiore a 140 mg/l (come CaCO  3 ). I test 
eseguiti con un valore pari o superiore a questo livello hanno dimo ­
strato che le prestazioni riproduttive sono conformi ai criteri di va ­
lidità (9) (10).  
1.6.4.  Soluzioni di prova  
Le soluzioni di prova alle concentrazioni scelte vanno in genere 
preparate per diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre dovrebbero preferibilmente essere preparate solubilizzando la so ­
stanza nel mezzo di prova.
 
Per produrre una soluzione madre alla concentrazione adeguata, tal ­
volta è necessario aggiungere solventi organici o disperdenti, ma 
l'uso di queste sostanze dovrebbe essere evitato per quanto possibile. 
Alcuni solventi adatti sono ad esempio l'acetone, l'etanolo, il meta ­
nolo, la dimetilformammide e il glicole trietilenico. Alcuni disper ­
denti adatti sono ad esempio il Cremophor RH40, la metilcellulosa 
0,01 % e l'HCO-40. In ogni caso nelle soluzioni di prova la sostanza 
da saggiare non deve eccedere il limite di solubilità nel mezzo di prova.
 
Solventi: servono per produrre una soluzione madre che possa essere 
dosata con precisione nell'acqua. Alla concentrazione di solvente raccomandata nel mezzo di prova finale (< 0,1 ml/l) i solventi sopra 
elencati non sono tossici e non aumentano la solubilità in acqua delle 
sostanze.
 
Disperdenti: possono facilitare il dosaggio preciso e la dispersione. 
Alla concentrazione raccomandata nel mezzo di prova finale ( ≤ 0,1 
ml/l) i disperdenti sopra elencati non sono tossici e non aumentano la 
solubilità in acqua delle sostanze.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1110
 
1.7. DISEGNO SPERIMENTALE  
Occorre randomizzare l'assegnazione dei trattamenti ai recipienti di 
prova e tutte le successive manipolazioni. In caso contrario si po ­
trebbero venficare «bias» che potrebbero essere interpretate come un 
effetto della concentrazione. In particolare, se le unità sperimentali 
vengono manipolate in ordine di trattamento o di concentrazione, non si può escludere che alcuni effetti collegati al tempo (ad esempio la stanchezza dell'operatore o un altro errore) possono produrre ef ­
fetti maggiori alle concentrazioni più alte. Inoltre, se si ritiene pos ­
sibile una alterazione dei risultati del test a causa delle condizioni sperimentali iniziali o ambientali (ad esempio la posizione delle va ­
sche nel laboratorio), si può ricorrere al frazionamento del test in 
blocchi.
 
1.8. PROCEDURA  
1.8.1  Condizioni di esposizione  
1.8.1.1.  Durata  
La durata del test è di 21 giorni.  
1.8.1.2.  Carico  
Gli esemplari riproduttori vengono mantenuti individualmente, uno 
per ciascun recipiente di prova, con 50-100 ml di mezzo in ogni recipiente.
 
Talvolta, per soddisfare i requisiti della procedura analitica usata per 
determinare la concentrazione della sostanza in esame, occorre uti ­
lizzare un volume maggiore, sebbene sia consentito il raggruppa ­
mento delle repliche per l'analisi chimica. Nel caso si utilizzino volumi superiori a 100 ml, potrebbe essere necessario aumentare la 
razione fornita alle dafnie per assicurare un'adeguata disponibilità del 
cibo e il rispetto dei criteri di validità. Per i test a flusso continuo è possibile prendere in considerazione, per motivi tecnici, disegni spe ­
rimentali alternativi (ad esempio quattro gruppi di 10 animali in una 
soluzione di prova più abbondante); qualunque modifica del disegno 
sperimentale deve essere descritta nella relazione.
 
1.8.1.3.  Numero di animali  
Per i test semistatici occorrono almeno 10 animali, mantenuti singo ­
larmente, per ogni concentrazione di prova e almeno 10 animali, mantenuti singolarmente nella serie di controllo.
 
E stato dimostrato che per i test a flusso continuo è adeguato utiliz ­
zare 40 animali suddivisi in quattro gruppi di 10 per ciascuna con ­
centrazione di prova (1). È possibile utilizzare un numero inferiore di 
organismi sperimentali, ma si raccomanda comunque di utilizzare un minimo di 20 animali per concentrazione, divisi in due o più repliche con un numero uguale di animali (ad esempio quattro repliche con 
cinque dafnidi ciascuna). Si noti che per i test nei quali gli animali 
sono tenuti in gruppi, se gli animali riproduttori muoiono, non è possibile esprimere la capacità riproduttiva in termini di numero totale di piccoli vivi prodotti da ciascun animale riproduttore vivo 
alla fine del test. In questi casi la capacità riproduttiva dovrebbe 
essere espressa come «numero totale di piccoli vivi prodotti per (pro)genitore presente all'inizio del test».
 
1.8.1.4.  Alimentazione  
Nei test semistatici è preferibile nutrire gli animali ogni giorno, e 
comunque almeno tre volte alla settimana (in concomitanza con la sostituzione del mezzo). Se non si osserva questo modello di alimen ­
tazione, (per esempio nei saggi a flusso continuo) occorre segnalarlo 
nella relazione.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1111
 
Durante la prova la dieta degli animali riproduttori dovrebbe consi ­
stere preferibilmente in alghe unicellulari vive di una o più delle 
seguenti specie:  Chlorella sp ., Selenastrum capricornutum  [ora  Pseu­
dokirchneriella subcapitata  (11)] e  Scenedesmus subspicatus . La 
dieta deve essere basata sulla quantità di carbonio organico (C) 
fornita a ciascun animale riproduttore. Ricerche (12) hanno dimo ­
strato che per ottenere il numero di piccoli di  Daphnia magna  ne­
cessari per soddisfare i criteri di validità sono sufficienti razioni comprese fra 0,1 e 0,2 mg C/ Daphnia /die. È possibile somministrare 
la razione in maniera costante per tutto il periodo del test oppure una 
razione inferiore all'inizio della prova del test ed una razione più alta durante la prova, tenendo conto della crescita degli animali riprodut ­
tori. In questo caso la razione deve comunque restare sempre nel 
range raccomandato di 0,1- 0,2 mg C/ Daphnia /die.
 
Se per comodità (visto che la misurazione del tenore di carbonio 
richiede molto tempo) si utilizzano altri parametri di misurazione, quali la conta delle cellule algali o l'assorbanza della luce, per som ­
ministrare la razione necessaria, ogni laboratorio deve elaborare un 
proprio nomogramma che correli il parametro di misurazione scelto 
al contenuto di carbonio della coltura di alghe (cfr. appendice 2 per l'elaborazione del nomogramma). I nomogrammi vanno controllati almeno una volta all'anno e con maggiore frequenza in caso di 
modifica delle condizioni di coltura delle alghe. È stato dimostrato 
che l'assorbanza della luce è un parametro alternativo al contenuto di carbonio migliore rispetto al numero di cellule (13).
 
Occorre alimentare le dafnie con una sospensione concentrata di 
alghe per ridurre al minimo il volume del mezzo di coltura algale 
trasferito nei recipienti di prova. La concentrazione delle alghe av ­
viene per centrifugazione con successiva risospensione in acqua di ­
stillata, acqua deionizzata o mezzo di allevamento delle dafnie.  
1.8.1.5.  Luce  
16 ore di luce a un'intensità non superiore a 15-20 μE.m  -2 s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
La temperatura dei mezzi di prova dovrebbe rimanere tra i 18 e i 22  o C e 
possibilmente non variare di oltre 2  o C in ogni test, restando comunque 
entro i suddetti limiti (ad esempio 18-20, 19-21 o 20-22  o C). Per con ­
trollare la temperatura si può utilizzare un recipiente di prova aggiuntivo.  
1.8.1.7.  Aerazione  
I recipienti di prova non devono essere aerati durante il test.  
1.8.2.  Concentrazioni di prova  
In genere si dovrebbero provare almeno cinque concentrazioni di 
prova, disposte in serie geometriche e separate da un fattore prefe ­
ribilmente non superiore a 3,2; per ogni concentrazione si dovrebbe allestire un numero adeguato di repliche (cfr. punto 1.8.1.3). Se si utilizzano meno di cinque concentrazioni occorre indicare il motivo. 
Le sostanze non vanno provate al di sopra del loro limite di solubi ­
lità nel mezzo di prova.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1112
 
Nel definire l'intervallo delle concentrazioni è necessario tenere 
conto dei seguenti elementi:  
i) se l'obiettivo è ottenere la LOEC/NOEC, la concentrazione mi ­
nima deve essere sufficientemente bassa affinché la fecondità, a tale concentrazione, non sia significativamente inferiore rispetto a 
quella del controllo. In caso contrario il test andrà ripetuto con 
una concentrazione minima più bassa;
 
ii) se l'obiettivo è ottenere la LOEC/NOEC, la concentrazione mas ­
sima deve essere sufficientemente alta affinché la fecondità, a 
tale concentrazione, sia significativamente inferiore rispetto a quella del controllo. In caso contrario il test andrà ripetuto con 
una concentrazione massima più elevata;
 
iii) se si stima la CE  X per gli effetti sulla riproduzione, è consiglia ­
bile usare un numero sufficiente di concentrazioni tale da con ­
sentire di definire la CE  X con un livello di confidenza adeguato. 
Se si stima la CE  50 per gli effetti sulla riproduzione, è consi ­
gliabile che la massima concentrazione di prova sia maggiore della CE
 50 calcolata. Diversamente, sebbene sia comunque pos ­
sibile calcolare la CE  50 , l'intervallo fiduciale per la CE  50 sarà 
molto ampio e potrebbe non essere possibile valutare in modo soddisfacente l'adeguatezza del modello adattato;
 
iv) è preferibile che l'intervallo delle concentrazioni di prova non 
comprenda concentrazioni con un effetto statisticamente signifi ­
cativo sulla sopravvivenza degli adulti, in quanto ciò trasforme ­
rebbe la natura della prova da una semplice prova sulla riprodu ­
zione a una prova combinata su riproduzione e mortalità, che 
richiederebbe un'analisi statistica molto più complessa.  
Le informazioni disponibili sulla tossicità della sostanza di prova (ad 
esempio risultati di prove di tossicità acuta e/o di studi di definizione 
dell'intervallo di concentrazione) dovrebbero essere di aiuto nella 
scelta delle concentrazioni di prova appropriate.  
Se per facilitare la preparazione delle soluzioni di prova si utilizza un 
solvente o un disperdente (cfr. punto 1.6.4), la sua concentrazione 
finale nei recipienti di prova non dovrebbe superare 0,1 ml/l e do ­
vrebbe essere uguale in tutti i recipienti.  
1.8.3.  Controlli  
In aggiunta alle concentrazioni con la sostanza di prova, dovrebbe 
essere allestita una serie di controllo con il mezzo di prova ed eventualmente una serie di controllo contenente il solvente o il di ­
sperdente. La concentrazione dell'eventuale solvente o disperdente 
deve essere identica a quella usata nei recipienti contenenti la so ­
stanza di prova. Anche per i controlli dovrebbe essere usato un numero adeguato di repliche (cfr. punto 1.8.1.3),
 
Generalmente, in un test ben condotto, il coefficiente di variazione 
del numero medio di piccoli vivi prodotti da ciascun animale ripro ­
duttore nel/i controllo/i dovrebbe essere ≤ 25 %; il coefficiente di 
variazione dovrebbe essere riportato per le prove dove gli animali 
riproduttori sono mantenuti individualmente.  
1.8.4.  Rinnovo del mezzo di prova  
La frequenza con cui il mezzo viene rinnovato dipende dalla stabilità 
della sostanza di prova, ma dovrebbe essere almeno tre volte alla settimana. Se da prove preliminari sulla stabilità (cfr. punto 1.4) la 
concentrazione della sostanza di prova non risulta stabile (cioè è al di 
fuori del range dell'80-120 % della concentrazione nominale o al di sotto dell'80 %, della concentrazione iniziale misurata) durante il periodo massimo di rinnovo (tre giorni), si consiglia di rinnovare 
il mezzo con maggiore frequenza oppure di eseguire una prova a 
flusso continuo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1113
 
Quando si rinnova il mezzo nelle prove semistatiche si prepara 
una seconda serie di recipienti dove vengono trasferiti gli animali 
riproduttori mediante, ad esempio, una pipetta di vetro di diametro adeguato. Il volume del mezzo trasferito con le dafnie dovrebbe essere il più piccolo possibile.
 
1.8.5.  Osservazioni  
I risultati delle osservazioni fatte durante il test vanno registrati su 
apposite schede di raccolta dei dati (cfr. appendici 3 e 4). Dovendo fornire i dati di altre misurazioni (cfr. punti 1.3 e 1.8.8) possono essere richieste ulteriori osservazioni.
 
1.8.6.  Prole  
La prole prodotta da ciascun animale riproduttore dovrebbe essere di 
preferenza tolta dal recipiente e contata ogni giorno a partire dalla comparsa della prima schiusa, per impedire che consumi cibo desti ­
nato all'adulto. Ai fini del metodo qui descritto è necessario contare 
solo il numero di piccoli vivi, ma è consigliabile registrare anche la presenza di uova abortite o piccoli morti.
 
1.8.7.  Mortalità  
La mortalità fra gli animali riproduttori va rilevata di preferenza 
quotidianamente, almeno ad ogni conta dei piccoli.  
1.8.8.  Altri parametri  
Sebbene questo metodo sia fondamentalmente inteso a valutare gli 
effetti sulla riproduzione, è possibile che altri effetti siano sufficien ­
temente quantificati da permettere un'analisi statistica. La misura della crescita è molto auspicabile in quanto fornisce informazioni su possibili effetti subletali, che potrebbero essere più utili della 
sola misura della riproduzione; si raccomanda di misurare la 
lunghezza degli animali riproduttori (lunghezza del corpo esclusa la spina posteriore del carapace) alla fine del test. Altri parametri che possono essere misurati o calcolati sono: il periodo intercorso 
fino alla produzione della prima schiusa (e delle schiuse successive), 
il numero e le dimensioni delle schiuse per animale, il numero delle schiuse abortite, la presenza di maschi o efippi e il tasso intrinseco di aumento della popolazione.
 
1.8.9.  Frequenza delle determinazioni e delle misurazioni analitiche  
Concentrazione dell'ossigeno, temperatura, durezza e pH dovrebbero 
essere misurati almeno una volta alla settimana, nei mezzi freschi e vecchi, nel/i controllo/i e nella concentrazione massima della so ­
stanza in esame.
 
Durante la prova le concentrazioni della sostanza di prova vanno 
determinate a intervalli regolari.  
Nei test semistatici in cui si prevede che la concentrazione della 
sostanza in esame resti intorno a ± 20 % del valore nominale (e cioè entro l'intervallo dell'80-120 %; cfr. punti 1.4. e 1.8.4), si rac ­
comanda di analizzare almeno le concentrazioni minima e massima 
di prova subito dopo la loro preparazione e in occasione di un rinnovo del mezzo nel corso della prima settimana del test (le analisi vanno effettuate su un campione della stessa soluzione, preparata di 
fresco e al momento di rinnovarla). Queste determinazioni vanno poi 
ripetute a intervalli almeno settimanali.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1114
 
Per i test in cui non si prevede che la concentrazione della sostanza 
in esame resti entro ± 20 % del valore nominale, è necessario ana ­
lizzare tutte le concentrazioni di prova, appena preparate e al mo ­
mento di rinnovarle. Tuttavia, per i test in cui la concentrazione iniziale misurata della sostanza di prova non è entro ± 20 % del 
valore nominale, ma si può fornire prova che le concentrazioni ini ­
ziali sono ripetibili e stabili (cioè entro un range dell'80-120 % delle concentrazioni iniziali), nella seconda e terza settimana del test le determinazioni chimiche possono limitarsi alle concentrazioni mas ­
sima e minima. In tutti i casi la determinazione delle concentrazioni 
della sostanza in esame prima del rinnovo può limitarsi ad un unico recipiente per ciascuna concentrazione.
 
Per i test a flusso continuo è appropriato l'uso di un regime di 
campionamento simile a quello descritto per i test semistatici (seb ­
bene in questo caso non ci sia la misurazione delle soluzioni «vec ­
chie»). Può essere però consigliabile aumentare il numero di cam ­
pionamenti durante la prima settimana (ad esempio, tre serie di 
misurazioni;) per accertare la stabilità delle concentrazioni di prova. In questi tipi di prova dovrebbe essere controllato quotidianamente il tasso di flusso del diluente e della sostanza di prova.
 
Potendo dimostrare che durante tutto il test la concentrazione della 
sostanza di prova in soluzione è stata mantenuta in modo soddisfa ­
cente entro ± 20 % della concentrazione nominale o della concen ­
trazione iniziale misurata, i risultati possono essere basati sui valori nominali o sui valori iniziali misurati. Se la deviazione dalla concen ­
trazione iniziale nominale o misurata è maggiore di ± 20 %, i risul ­
tati vanno espressi come media ponderata nel tempo (cfr. 
appendice 5).
 
2. DATI E RELAZIONE  
2.1. ELABORAZIONE DEI RISULTATI  
Scopo di questo test è determinare l'effetto della sostanza di prova 
sul numero complessivo di piccoli vivi prodotti da ciascun animale riproduttore vivo alla fine del test. Occorre calcolare il numero com ­
plessivo di piccoli per animale riproduttore per ciascun recipiente di 
prova (replica). Se in una replica qualsiasi l'animale riproduttore 
muore durante il test o si rivela essere un maschio, questa replica viene esclusa dall'analisi. L'analisi si baserà quindi su un numero ridotto di repliche.
 
Per stimare la LOEC e quindi la NOEC per gli effetti della sostanza 
chimica sulla capacità riproduttiva è necessario calcolare la capacità riproduttiva media nelle varie repliche di ciascuna concentrazione, 
nonché la deviazione standard residua di dati comuni («pooled»), 
utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA). La media di ogni con ­
centrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli mediante un metodo adeguato di comparazione multipla. Possono 
essere utilizzati i test di Dunnett o di Williams (14) (15) (16) (17). 
E necessario controllare se la assunzione di omogeneità della va ­
rianza dell'ANOVA è fondata. Si raccomanda di fare questo con ­
trollo graficamente piuttosto che con un test formale della significa ­
tività (18); una possibile alternativa è il test di Bartlett. Se la assun ­
zione non è fondata, bisogna valutare se trasformare i dati per omo ­
geneizzare le varianze prima di eseguire l'ANOVA, o se eseguire una ANOVA ponderata. Occorre calcolare e riferire nella relazione l'en ­
tità dell'effetto misurabile tramite ANOVA (ovvero la più piccola 
differenza significativa).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1115
 
Per la stima della concentrazione che causerebbe una riduzione del 
50 % della capacità riproduttiva (CE  50 ) è necessario approssimare ai 
dati una curva adeguata, come la curva logistica, utilizzando un metodo statistico come quello dei minimi quadrati. È possibile pa ­
rametrizzare la curva in modo da poter stimare direttamente la CE
 50 
e il suo errore standard. Ciò faciliterebbe notevolmente il calcolo dei 
limiti fiduciali della CE  50 . A meno che vi siano buoni motivi per 
preferire limiti fiduciali diversi, vanno utilizzati i limiti di confidenza inferiore e superiore (probabilità del 95 %). La procedura di appros ­
simazione deve fornire, di preferenza, uno strumento per valutare il 
significato della mancanza di approssimazione. Lo si può fare grafi ­
camente o dividendo la somma residua dei quadrati in componenti di mancanza di adattamento e «componenti d'errore puro» ed ese ­
guendo un test della significatività per la mancanza di adattamento. 
Poiché generalmente i trattamenti che danno alta fecondità tendono ad avere una varianza maggiore nel numero dei piccoli prodotti rispetto ai trattamenti che danno bassa fecondità, si potrebbe even ­
tualmente ponderare i valori osservati per rispecchiare le diverse 
varianze nei diversi gruppi di trattamento [cfr. riferimento (18) per ulteriori dettagli].
 
Nell'analisi dei dati ottenuti nel «ring test» finale (2) è stata appros ­
simata una curva logistica mediante il seguente modello, sebbene si possano usare altri modelli adeguati:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
dove:  
Y = numero totale dei piccoli per animale riproduttore vivo alla 
fine del test (calcolato per ciascun recipiente)  
x = concentrazione della sostanza  
c = numero previsto di piccoli se x = 0  
x 0 = CE  50 della popolazione  
b = parametro della pendenza.  
Questo modello dovrebbe essere adeguato in molte situazioni diver ­
se, ma esistono senz'altro test per i quali non è adatto. È dunque 
necessario controllarne la validità come suggerito sopra. In alcuni 
casi può prestarsi meglio un modello di ormesi in cui concentrazioni basse danno effetti più severi (19).
 
È possibile calcolare anche altre concentrazioni efficaci, come la 
CE 10 o la CE  20 , anche se può essere preferibile utilizzare una para ­
metrizzazione diversa del modello rispetto a quella usata per la stima 
della CE  50 . 
2.2. RELAZIONE SUL TEST  
La relazione sul test deve contenere:  
2.2.1  Sostanza di prova:  
— natura fisica e proprietà fisico-chimiche pertinenti,  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1116
 
— dati di identificazione chimica, compresa la purezza.  
2.2.2.  Specie di prova:  
— clone (se è stato tipizzato geneticamente), fornitore o fonte (se 
nota) e condizioni di utilizzate. Se si usa una specie diversa dalla  
Daphnia magna,  è necessario precisarlo nella relazione e giusti ­
ficare i motivi di questa scelta.  
2.2.3.  Condizioni di esecuzione della prova:  
— procedura usata (ad esempio semistatica o a flusso continuo, 
volume, carico espresso in numero di  Daphnia  per litro),  
— fotoperiodo e intensità della luce,  
— disegno sperimentale (ad esempio, numero di repliche, numero di 
animali riproduttori per replica),  
— particolari sul mezzo di allevamento utilizzato,  
— eventuali aggiunte di materiale organico, inclusa composizione, 
fonte, metodo di preparazione, TOC/COD delle preparazioni ma ­
dri, stima del TOC/COD risultante nel mezzo di prova,  
— informazioni dettagliate sull'alimentazione, comprese la quantità 
(in mg C/ Daphnia /die) e il programma (ad esempio tipo di 
alimento/i, compresi il nome della specie di alghe e, se noti, il 
ceppo e le condizioni di coltura),  
— metodo di preparazione delle soluzioni madri e frequenza di 
rinnovo (deve essere specificato il tipo e la concentrazione del solvente o disperdente, se usati).
 
2.2.4.  Risultati:  
— risultati di eventuali studi preliminari sulla stabilità della sostanza 
di prova,  
— concentrazioni di prova nominali e risultati di tutte le analisi per 
determinare la concentrazione della sostanza nei recipienti di 
prova (cfr. esempi di schede di raccolta dati nell'appendice 4): vanno riportati nella relazione anche l'efficienza di recupero del metodo e il limite di determinazione,
 
— qualità dell'acqua nei recipienti di prova (pH, temperatura e con ­
centrazione dell'ossigeno disciolto, e, dove possibile, anche TOC 
e/o COD e durezza) (cfr. esempio di scheda di raccolta dati nell'appendice 3),
 
— numero totale di piccoli vivi per ciascun animale riproduttore 
(cfr. esempio di scheda di raccolta dati nell'appendice 3),  
— numero di decessi fra gli animali riproduttori e giorno in cui 
sono avvenuti (cfr. esempio di scheda di raccolta dati nell'ap ­
pendice 3),  
— coefficiente di variazione per la fecondità dei controlli (basato sul 
numero totale di piccoli vivi per animale riproduttore vivo alla fine del test),
 
— diagramma del numero totale di piccoli vivi per animale ripro ­
duttore vivo (per ogni replica) alla fine del test sulla concentra ­
zione della sostanza in esame,  
— concentrazione più bassa alla quale si osservano effetti (LOEC) 
sulla riproduzione, comprese una descrizione delle procedure 
statistiche usate e un'indicazione dell'entità dell'effetto che poteva essere rilevato e concentrazione più alta alla quale non si osser ­
vano effetti (NOEC) sulla riproduzione: se del caso, va indicata 
anche la LOEC/NOEC relativa alla mortalità degli animali ripro ­
duttori,
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— se del caso, CE  X per la riproduzione e intervalli di confidenza, 
nonché un grafico del modello approssimato usato per il suo 
calcolo, la pendenza della curva dose-risposta e il suo errore standard.
 
— altri effetti biologici osservati o misure effettuate: riferire qual ­
siasi altro effetto biologico osservato o misurato (ad esempio, 
crescita degli animai: riproduttori) comprese le motivazioni ade ­
guate.  
— spiegazione di eventuali deviazioni dal metodo di prova.  
3. BIBLIOGRAFIA  
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the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
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Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
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88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 pp.  
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long terra maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; pro ­
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(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
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comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
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(15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
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(16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
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(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 
532. 
(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1119
 
APPENDICE 1  
PREPARAZIONE DEI MEZZI M7 E M4 DI ELENDT TOTALMENTE 
DEFINITI  
Acclimatazione ai mezzi M7 e M4 di Elendt  
Alcuni laboratori hanno avuto difficoltà nel trasferire direttamente le daphnie nei 
mezzi M4 (1) e M7. Per contro, con l'acclimatazione graduale, cioè lo sposta ­
mento dal mezzo originario a un mezzo Elendt al 30 %, poi al 60 % e infine al 100 % si sono avuti risultati soddisfacenti. Potrebbe essere necessario prevedere periodi di acclimatazione persino di un mese.
 
PREPARAZIONE  
Oligoelementi  
Inizialmente si preparano soluzioni madri distinte (I) dei singoli oligoelementi in 
acqua di adeguata purezza, ad esempio deionizzata, distillata o sottoposta a 
osmosi inversa. Da queste diverse soluzioni madre (I) si prepara una seconda 
soluzione madre singola (II) che contiene tutti gli oligoelementi (soluzione com ­
binata), e cioè:  
Soluzioni madre I 
(sostanza singola) Quantità aggiunta 
(mg/l) Concentrazione (in 
relazione al mezzo 
M4) 
(volte) Per preparare la soluzione madre com ­
binata II aggiungere la seguente quantità 
di soluzione madre I ad acqua 
(ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Sia la soluzione Na  2 EDTA che la FeSO  4 vengono preparate singolarmente, versate insieme e inserite immediatamente 
nell'autoclave. Con ciò si ottiene: 
21 soluzione Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1120
 
Mezzi M4 e M7  
I mezzi M4 e M7 si preparano usando la soluzione madre II, i macronutrienti e le 
vitamine, nel modo seguente:  
Quantità aggiunta 
ad acqua 
(mg/l) Concentrazione (ri ­
spetto al mezzo 
M4) 
(volte) Quantità di soluzione madre aggiunta 
per preparare il mezzo 
ml/l 
M 4 M 7  
Soluzione madre II oligoelementi combinati 20 50 50 
Soluzioni madri con macrocostituenti (singola sostanza) CaCl
 2 * 2 H  2 0 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 0 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 0 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Soluzione madre combinata di vitamine — 10 000 0,1 0,1 
La soluzione madre combinata di vitamine si prepara aggiungendo le 3 vitamine a 1 litro di acqua, come segue: Cloridrato di tiammina 750 10 000 — — Cianocobalamina (B
 l2 ) 10 10 000 — — 
Biotina 7,5 10 000 — —  
La soluzione madre combinata di vitamine si conserva congelata in piccole aliquote Le vitamine si aggiungono ai mezzi poco prim a 
dell'uso.  
Note:  Per evitare la precipitazione dei sali durante la preparazione dei mezzi completi, aggiungere le aliquote delle soluzioni madr e a 
circa 500-800 ml di acqua deionizzata e poi portare a 1 litro. 
Il primo studio pubblicato sul mezzo M4 si trova in Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1121
 
APPENDICE 2  
ANALISI DEL CARBONIO ORGANICO TOTALE (TOC) E 
PRODUZIONE DI UN NOMOGRAMMA PER IL CONTENUTO DI 
TOC DELL'ALIMENTO ALGALE  
È riconosciuto che il contenuto di carbonio dell'alimento algale non viene di 
norma misurato direttamente, bensì mediante correlazioni (cioè nomogrammi) 
con misure sostitutive quali il numero di cellule algali o l'assorbanza della luce.  
Il TOC dovrebbe essere misurato per ossidazione ad alta temperatura piuttosto 
che mediante UV o metodi con persolfati. (Cfr.: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 
1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Per la produzione del nomogramma, le alghe vanno separate dal mezzo di crescita 
mediante centrifugazione, seguita da risospensione in acqua distillata. Occorre misu ­
rare il parametro surrogato e la concentrazione del TOC in ciascun campione in triplicato. Vanno analizzati i bianchi di acqua distillata e la loro concentrazione di 
TOC viene dedotta dalla concentrazione del TOC nel campione di alghe.
 
Il nomogramma deve essere lineare nell'intervallo richiesto di concentrazioni del 
carbonio. Di seguito sono riportati alcuni esempi.  
NB: Non usare questi nomogrammi per effettuare conversioni; è essenziale che 
ogni laboratorio prepari il suo nomogramma.
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1122
 
▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1123
 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1124
 ▼B 
APPENDICE 3  
ESEMPIO DI SCHEDA PER LA RACCOLTA DI DATI SUL RINNOVO DEL MEZZO, IL MONITORAGGIO FISICO/CHIMICO, L'ALIMENTAZIONE, LA RIPRODUZIO NE 
DELLE DAPHNIA E LA MORTALITÀ DEGLI ADULTI  
Esperimento n.: Inizio raccolta dati: Clone: Mezzo: Tipo di cibo: Sostanza di prova; Concentrazione nominale: 
Giorno 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Rinnovo del mezzo 
(spuntare) 
PH (  1 ) nuovo 
vecchio 
O 2 mg/l (  1 ) nuovo 
vecchio 
Temperatura (  o C) (  1 ) nuovo 
vecchio 
Somministrazione 
del cibo (spuntare) 
N. di piccoli vivi (  2 ) Totale 
Recipiente 1 
2 
3 4 5
 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1125
 ▼B 
Esperimento n.: Inizio raccolta dati: Clone: Mezzo: Tipo di cibo: Sostanza di prova; Concentrazione nominale: 
Giorno 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Totale 
Mortalità cumulativa 
adulti (
 3 ) 
( 1 ) Indicare quale recipiente è stato usato per l’esperimento. 
( 2 ) Registrare la mortalità di qualsiasi animale adulto inserendo la lettera «M» nella casella corrispondente. 
( 3 ) Registrare le schiuse abortite inserendo la sigla «AB» nella casella corrispondente.
 APPENDICE 4  
ESEMPIO DI SCHEDA PER LA REGISTRAZIONE DEI RISULTATI DELLE ANALISI CHIMICHE  
a) Concentrazioni misurate  
Concentrazioni 
nominali Campione settimana 1 Campione settimana 2 Campione settimana 3 
Fresco Vecchio Fresco Vecchio Fresco Vecchio  
b) Concentrazioni misurate come percentuale del valore nominale  
Concentrazioni 
nominali Campione settimana 1 Campione settimana 2 Campione settimana 3 
Fresco Vecchio Fresco Vecchio Fresco Vecchio  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1126
 
APPENDICE 5  
CALCOLO DI UNA MEDIA PONDERATA NEL TEMPO  
Media ponderata nel tempo  
Dato che la concentrazione della sostanza di prova può diminuire nel periodo fra 
i rinnovi del mezzo è necessario considerare quale concentrazione vada scelta 
come rappresentativa dell' intervallo di concentrazioni a cui sono state esposte le 
dafnie riproduttrici. La selezione deve basarsi su considerazioni biologiche oltre che statistiche. Per esempio, se si ritiene che la riproduzione venga influenzata soprattutto dalla concentrazione picco, si deve utilizzare la concentrazione mas ­
sima. Se invece si ritiene più importante l'effetto accumulato o a più lungo 
termine della sostanza tossica, allora risulta più pertinente una concentrazione media. In questo caso una media adeguata è la concentrazione media ponderata nel tempo, in quanto tiene conto della variazione della concentrazione istantanea 
nel corso del tempo.
 
Figura 1:  
Esempio di media ponderata nel tempo
  
La Figura 1 mostra un esempio di test (semplificato) della durata di sette giorni 
con rinnovo del mezzo nei giorni 0, 2 e 4.  
— La linea sottile a zig-zag rappresenta la concentrazione in qualsiasi momento 
nel tempo. Si suppone che la caduta di concentrazione segua un processo di 
decadimento esponenziale.  
— I sei quadratini rappresentano le concentrazioni osservate misurate all'inizio e 
alla fine di ciascun periodo di rinnovo.  
— La linea retta spessa indica la posizione della media ponderata nel tempo.  
La media ponderata nel tempo viene calcolata in modo che l'area ad essa sotto ­
stante sia uguale all'area sotto la curva della concentrazione. Il calcolo per 
l'esempio in figura è illustrato nella tabella 1.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1127
 
Tabella 1:  
Calcolo della media ponderata nel tempo  
Rinnovo n. Giorni Conc0 Conc1 Ln(Conc0) Ln(Conc1) Area  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Giorni totali: 7 Area totale 50,091 
Media pon ­
derata/t 7,156
 
«Giorni» è il numero di giorni nel periodo di rinnovo.  
«Conc0» è la concentrazione misurata all'inizio di ciascun periodo di rinnovo.  
«Conc1» è la concentrazione misurata alla fine di ciascun periodo di rinnovo.  
«Ln(Conc0)» è il logaritmo naturale di Conc0.  
«Ln(Conc1)» è il logaritmo naturale di Conc1.  
«Area» è l'area sotto la curva esponenziale per ciascun periodo di rinnovamento. Viene 
calcolata nel modo seguente: 
Area ¼ Conc0 Ä Conc 1 
LnðConc0Þ Ä LnðConc1Þ Ü Giorni  
La media ponderata nel tempo («media ponderata/t») è l'«Area totale» divisa per 
i «Giorni totali».  
Ovviamente per il test di riproduzione con  Daphnia  la tabella andrebbe prolun ­
gata fino a coprire 21 giorni.  
È chiaro che quando le osservazioni vengono effettuate solo all'inizio e alla fine 
di ciascun periodo di rinnovamento non è possibile confermare che il processo di decadimento è effettivamente esponenziale. Una curva diversa produrrebbe un 
calcolo diverso per l'A rca. È tuttavia plausibile che il processo di decadimento 
sia esponenziale e questa è probabilmente la curva migliore da usare in assenza di altre informazioni.
 
E però necessario procedere con cautela se l'analisi chimica non rileva alcuna 
sostanza alla fine del periodo di rinnovo. A meno che non sia possibile stimare la 
rapidità con cui la sostanza è scomparsa dalla soluzione, è impossibile ottenere 
un'area sotto la curva che sia realistica, e pertanto è impossibile ottenere una ragionevole media ponderata nel tempo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1128
 
C.21.  MICRORGANISMI DEL SUOLO: TEST DI TRASFORMA ­
ZIONE DELL'AZOTO  
1. METODO  
Questo metodo di prova corrisponde al TG 216 (2000) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Qui di seguito è descritto un metodo di laboratorio messo a punto 
per studiare gli effetti a lungo termine delle sostanze chimiche, dopo un'unica esposizione, sull'attività di trasformazione dell'azoto ad opera dei microrganismi del suolo. Il test si basa principalmente sulle 
raccomandazioni dell'Organizzazione europea e mediterranea per la 
protezione delle piante (1), ma tiene conto anche delle linee guida formulate dal Centro federale tedesco di ricerca biologica per l'agri ­
coltura e la silvicoltura  (Biologische Bundesanstalt für Land und 
Forstwirtschaft)  (2), dall'Agenzia per la protezione 
dell'ambiente degli Stati Uniti  (Environmental Protection Agency)  
(3), dal SETAC (4) e dall'Organizzazione internazionale di norma ­
lizzazione (ISO) (5). Il numero ed il tipo di suoli da utilizzare nel 
test sono stati concordati in occasione di un  workshop  dell'OCSE 
sulla selezione dei suoli e dei sedimenti, svoltosi a Belgirate nel 1995 (6). Le raccomandazioni riguardanti il prelievo, la manipola ­
zione e lo stoccaggio dei campioni di suolo si basano su linee guida 
ISO (7) e sulle raccomandazioni formulate dal  workshop  di Belgira ­
te. Per accertare e valutare le caratteristiche tossiche delle sostanze di prova può essere necessario determinarne gli effetti sull'attività mi ­
crobica del suolo, ad esempio quando occorre disporre di dati sui 
potenziali effetti collaterali dei prodotti fitosanitari sulla microflora del suolo o quando si prevede un'esposizione dei microrganismi del suolo ad altri tipi di sostanze chimiche. Il test di trasformazione 
dell'azoto viene effettuato per determinare gli effetti di queste so ­
stanze chimiche sulla microflora del suolo. Qualora siano testati prodotti agrochimici (ad es. fitosanitari, fertilizzanti, prodotti chimici per la silvicoltura), oltre al test di trasformazione dell'azoto si effettua 
anche il test di trasformazione del carbonio. Per le altre sostanze 
chimiche è invece sufficiente il test di trasformazione dell'azoto. Tuttavia se i valori CE
 50 riscontrati per queste sostanze nel test di 
trasformazione dell'azoto corrispondono a quelli degli inibitori della 
nitrificazione disponibili in commercio (ad es. nitrapirina), per otte ­
nere maggiori informazioni può essere effettuato anche il test di trasformazione del carbonio.
 
I suoli sono costituiti da miscele eterogenee e complesse di compo ­
nenti viventi e non viventi. I microrganismi svolgono un ruolo im ­
portante nella decomposizione e nella trasformazione della materia organica in suolo fertile, contribuendo in maniera differente 
a seconda delle specie ai vari aspetti della fertilizzazione. Eventuali 
interferenze con questi processi biochimici rischiano a lungo termine di influenzare il ciclo delle sostanze nutritive e di alterare la fertilità del suolo. La trasformazione del carbonio e dell'azoto avviene in tutti 
i suoli fertili; anche se le comunità microbiche responsabili di questi 
processi variano a seconda del tipo di suolo, le vie di trasformazione sono sostanzialmente le stesse.
 
Il metodo di prova di seguito descritto è stato concepito per indivi ­
duare gli effetti nocivi a lungo termine di una sostanza sul processo 
di trasformazione dell’azoto nei suoli aerobici superficiali, ma con ­
sente anche di stimarne gli effetti sulla trasformazione del carbonio ad opera della microflora del suolo. La formazione di nitrati avviene 
in seguito alla degradazione del legame carbonio-azoto; di conse ­
guenza, qualora nei campioni di suolo trattato ed in quelli di con ­
trollo si riscontrino gli stessi tassi di produzione di nitrati, è molto probabile che le principali vie di degradazione del carbonio siano 
intatte e funzionali. Il substrato scelto per il test (farina di erba 
medica in polvere) presenta un buon rapporto carbonio/azoto (com ­
preso normalmente tra 12:1 e 16:1). Per questo motivo durante il test la carenza di carbonio è ridotta e le comunità microbiche eventual ­
mente danneggiate da una sostanza chimica possono ristabilirsi entro 
100 giorni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1129
 
I test su cui si basa questo metodo di prova sono stati originaria ­
mente concepiti per sostanze di cui è possibile stimare la quantità 
che penetra nel suolo. È il caso, ad esempio, dei prodotti fitosanitari, la cui dose di applicazione nel terreno è conosciuta. Per i prodotti agrochimici è sufficiente utilizzare due concentrazioni di prova, cor ­
rispondenti alla dose di applicazione prevista o stimata; tali prodotti 
possono essere testati come ingredienti attivi (i.a.) o come prodotti formulati. Tuttavia, cambiando sia la quantità della sostanza di prova applicata al suolo sia le modalità di valutazione dei dati il test può 
essere utilizzato non soltanto per i prodotti agrochimici ma anche per 
altre sostanze chimiche di cui non si conosca la quantità che penetra nel suolo; in questo caso è possibile determinare gli effetti sulla trasformazione dell'azoto di una serie di concentrazioni. I dati otte ­
nuti sono utilizzati per costruire una curva dose-risposta e calcolare i 
valori CE
 x , dove x è la percentuale di effetto.  
1.2 DEFINIZIONI  
Trasformazione dell'azoto:  degradazione ad opera dei microrgani ­
smi di materia organica contenente azoto attraverso il processo di 
ammonificazione e nitrificazione, con formazione del relativo pro ­
dotto finale inorganico, il nitrato.  
CE x (concentrazione efficace):  concentrazione della sostanza di 
prova nel suolo che determina un'inibizione dell'x per cento nella trasformazione dell'azoto in nitrato.
 
CE 50 (concentrazione efficace media):  concentrazione della so ­
stanza di prova nel suolo che determina un'inibizione del 50 % nella 
trasformazione dell'azoto in nitrato.  
1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  
1.4 PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
Dopo essere stato setacciato il suolo viene ammendato con farine 
vegetali in polvere ed una parte viene trattata con la sostanza di prova mentre un'altra parte non viene sottoposta ad alcun trattamento 
(controllo). Se il test è effettuato su prodotti agrochimici, si racco ­
manda di utilizzare almeno due concentrazioni di prova, scelte in relazione alla massima concentrazione prevista nel terreno. Dopo 0, 7, 14 e 28 giorni di incubazione si utilizza un solvente adeguato per 
estrarre i campioni trattati e i campioni controllo e si determinano le 
quantità di nitrati presenti negli estratti. La velocità di formazione dei nitrati nei campioni trattati viene comparata con quella dei campioni di controllo, calcolando la percentuale di scarto tra campione trattato 
e campione controllo. Tutti i test durano almeno 28 giorni. Se al 
ventottesimo giorno le differenze tra i campioni di suolo trattati e non trattati sono uguali o superiori al 25 % le misurazioni conti ­
nuano fino ad un massimo di 100 giorni. Se il test è effettuato su 
prodotti non agrochimici ai campioni di suolo viene aggiunta la 
sostanza di prova in diverse concentrazioni e dopo 28 giorni di incubazione vengono misurate le quantità di nitrati formate nei cam ­
pioni trattati ed in quelli di controllo. I risultati dei test effettuati con 
concentrazioni multiple sono analizzati mediante un modello di re ­
gressione ed infine vengono calcolati i valori CE
 x (CE  50 , CE  25 e/o 
CE 10 . Cfr. in proposito le definizioni).  
1.5 VALIDITÀ DEL TEST  
Le analisi dei risultati del test sui prodotti agrochimici si basano su 
differenze relativamente modeste (valore medio ± 25 %) tra le con ­
centrazioni di nitrati presenti nei campioni controllo e in quelli trat ­
tati, e dunque la presenza di forti variazioni tra i campioni controllo 
può portare a falsi risultati. Pertanto la variazione tra le diverse 
repliche dei campioni controllo deve essere inferiore a ± 15 %.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1130
 
1.6 DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.6.1  Apparecchiatura  
Per il test sono utilizzati contenitori di materiale chimicamente inerte, 
di capacità adeguata al metodo di incubazione del suolo utilizzato 
(ad es. in un campione globale o in una serie di sottocampioni: cfr. 
paragrafo 1.7.1.2). Occorre adottare le precauzioni necessarie per ridurre al minimo l'evaporazione di acqua e consentire lo scambio di gas durante il test (ad es. i contenitori utilizzati per il test possono 
essere coperti con un foglio di polietilene perforato). Per i test su 
sostanze volatili devono essere utilizzati contenitori a chiusura erme ­
tica e a tenuta di gas, di dimensioni tali che il campione di suolo 
occupi all'incirca un quarto del volume.
 
Si utilizza attrezzatura da laboratorio di uso comune tra cui:  
— agitatore: agitatore meccanico o dispositivo equivalente;  
— centrifuga (3 000 g) o sistema filtrante (con carta da filtro priva 
di nitrati);  
— strumento di sensibilità e riproducibilità adeguata per l'analisi dei 
nitrati.  
1.6.2  Selezione e numero di suoli  
Si utilizza un unico suolo, per il quale si raccomandano le seguenti 
caratteristiche:  
— contenuto in sabbia: non inferiore al 50 % e non superiore al 
75 %;  
— pH: 5,5-7,5;  
— contenuto di carbonio organico: 0,5-1,5 %;  
— deve essere misurata la biomassa microbica (8)(9): il contenuto di 
carbonio di quest'ultima deve corrispondere almeno all'1 % del 
carbonio organico totale del suolo.  
Nella maggior parte dei casi un suolo con queste caratteristiche 
rappresenta l'ipotesi più sfavorevole, in quanto l'adsorbimento della sostanza chimica di prova è minimo, mentre la disponibilità per la 
microflora è massima e dunque in genere non è necessario effettuare 
il test con altri suoli. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio quando si prevede un uso prevalente della sostanza di prova su particolari tipi di suolo, (ad es. suoli forestali acidi) o per sostanze 
chimiche con carica elettrostatica, può essere necessario utilizzare un 
suolo aggiuntivo.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1131
 
1.6.3  Prelievo e stoccaggio dei campioni di suolo  
1.6.3.1  Prelievo  
Devono essere disponibili informazioni dettagliate sulla storia del 
sito di campionamento, tra cui l'esatta ubicazione, il tipo di copertura 
vegetale, le date dei trattamenti con prodotti fitosanitari e con ferti ­
lizzanti organici o inorganici, l'eventuale applicazione di materiali biologici ed i casi di contaminazione accidentale. Il sito scelto per il prelievo del suolo deve consentire cicli molto lunghi; sono perciò 
adatti i pascoli permanenti, i terreni destinati a colture cerealicole 
annuali (ad eccezione del granturco) o da sovescio a semina fitta. Il sito di campionamento scelto non deve essere stato sottoposto a 
trattamenti con prodotti fitosanitari da almeno un anno e da almeno 
sei mesi non devono essere stati applicati fertilizzanti organici. L'uso di fertilizzanti minerali è ammesso solo se richiesto dal tipo di col ­
tura in atto ed in questo caso il prelievo di campioni di suolo deve 
essere effettuato almeno tre mesi dopo l'applicazione del fertilizzante. 
Bisogna evitare di utilizzare suoli trattati con fertilizzanti di cui siano noti gli effetti biocidi (ad es. calciocianammide).
 
Il prelievo di campioni non deve avvenire durante o subito dopo 
lunghi periodi (> 30 giorni) di siccità o di saturazione idrica del 
terreno. Nei suoli arati i campioni devono essere prelevati ad una 
profondità compresa tra 0 e 20 cm. Nei suoli a prato o a pascolo o in altri suoli che non vengono arati per lunghi periodi (almeno un ciclo vegetativo) la profondità massima di campionamento può essere leg ­
germente superiore a 20 cm (ad es. fino a 25 cm).
 
I campioni devono essere trasportati in contenitori adeguati e in 
condizioni di temperatura tali da garantire che le proprietà iniziali del suolo non vengano alterate in maniera significativa.
 
1.6.3.2  Stoccaggio  
È preferibile utilizzare suoli appena prelevati dal terreno. Qualora 
non si possa evitare lo stoccaggio in laboratorio, i suoli possono 
essere conservati al buio ad una temperatura di 4 ± 2  o C per un 
massimo di tre mesi. Durante lo stoccaggio deve essere assicurato il mantenimento in condizioni aerobiche. Se i suoli vengono prelevati da zone in cui gelano per almeno tre mesi l'anno, si può prendere in 
considerazione lo stoccaggio per sei mesi ad una temperatura com ­
presa tra - 18
 o C e - 22  o C. Prima di ogni esperimento viene misurata 
la biomassa microbica dei suoli: il carbonio presente nella biomassa 
deve essere pari almeno all'1 % del contenuto di carbonio organico 
totale nel suolo (cfr. paragrafo 1.6.2).  
1.6.4  Manipolazione e preparazione del suolo  
1.6.4.1  Pre-incubazione  
Se il suolo è stato stoccato (cfr. paragrafo 1.6.3.2), si raccomanda la 
pre-incubazione per un periodo compreso tra 2 e 28 giorni. Durante la pre-incubazione la temperatura e il contenuto di umidità del suolo 
devono essere analoghi a quelli del test (cfr. paragrafi 1.6.4.2 e 
1.7.1.3).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1132
 
1.6.4.2  Caratteristiche fisico-chimiche  
Dopo la rimozione manuale di particelle di grandi dimensioni (ad es. 
sassi, parti di piante, ecc.) il suolo viene setacciato ad umido, evi ­
tando l'eccessiva essiccazione, in modo tale che la dimensione dei 
granuli sia inferiore o uguale a 2 mm. Il contenuto di umidità del 
campione di suolo deve essere regolato con acqua distillata o deio ­
nizzata ad un valore compreso tra il 40 % ed il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica.
 
1.6.4.3  Ammendamento con substrato organico  
Il suolo deve essere ammendato con idoneo substrato organico, ad 
es. farina di erba medica verde in polvere (componente principale:  
Medicago sativa)  con un rapporto carbonio-azoto (C/N) compreso tra 
12:1 e 16:1. Si raccomanda una proporzione di 5 g di erba medica per ogni chilogrammo di terreno (peso secco).
 
1.6.5  Preparazione della sostanza di prova per l'applicazione al suolo  
Normalmente la sostanza di prova è applicata utilizzando un vettore, 
che può essere l'acqua (per le sostanze idrosolubili) o un solido 
inerte come la sabbia di quarzo fine (diametro: 0,1-0,5 mm). Si 
deve evitare l'uso di vettori liquidi diversi dall'acqua (ad es. solventi organici come l'acetone o il cloroformio) in quanto possono danneg ­
giare la microflora. Se il vettore utilizzato è la sabbia, quest'ultima 
può essere rivestita con la sostanza di prova, disciolta o posta in 
sospensione in un solvente adeguato. In questi casi il solvente deve essere eliminato per evaporazione prima della miscelazione con il 
suolo. Per consentire una distribuzione ottimale della sostanza di 
prova nel suolo, si raccomanda una proporzione di 10 g di sabbia per ogni chilogrammo di suolo (peso secco). I campioni controllo sono trattati esclusivamente con una quantità equivalente di acqua 
e/o di sabbia di quarzo.
 
Se il test viene effettuato su sostanze chimiche volatili, occorre per 
quanto possibile evitare dispersioni durante il trattamento e cercare di assicurare una distribuzione omogenea nel suolo (ad es. la sostanza di prova deve essere iniettata in diversi punti del suolo).
 
1.6.6  Concentrazioni di prova  
Se il test è effettuato su prodotti agrochimici, devono essere utiliz ­
zate almeno due concentrazioni. La concentrazione più bassa deve 
corrispondere almeno alla quantità massima che si prevede possa 
effettivamente penetrare nel suolo, mentre la concentrazione più ele ­
vata deve essere un multiplo della concentrazione più bassa. Le concentrazioni della sostanza di prova aggiunte al suolo sono calco ­
late supponendo un'incorporazione uniforme ad una profondità di 
5 cm ed una densità apparente del suolo di 1,5 g/cm
 3 . Per i prodotti 
agrochimici applicati direttamente al suolo o per le sostanze chimi ­
che di cui si può prevedere la quantità che penetra nel suolo, le 
concentrazioni di prova raccomandate sono la massima concentra ­
zione ambientale prevista (PEC) ed il suo quintuplo. Le sostanze per le quali si prevedono più applicazioni al suolo nel corso di una stagione devono essere testate a concentrazioni calcolate moltipli ­
cando la PEC per il numero massimo di applicazioni previste. Tut ­
tavia la più alta concentrazione testata non deve superare il decuplo della dose massima di applicazione. Se invece il test è effettuato su altri tipi di sostanze chimiche, si utilizza una serie geometrica di 
almeno cinque concentrazioni. Il range delle concentrazioni testate 
deve essere tale da consentire di determinare i valori CE
 x . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1133
 
1.7 ESECUZIONE DEL TEST  
1.7.1  Condizioni di esposizione  
1.7.1.1  Trattamento e controllo  
Qualora il test sia condotto su prodotti agrochimici, il suolo viene 
suddiviso in tre porzioni di uguale peso. Due di esse sono miscelate 
con il vettore contenente la sostanza chimica, mentre la terza è miscelata soltanto con il vettore, senza aggiunta di alcuna sostanza (campione controllo). Si raccomanda di utilizzare almeno tre repliche 
sia per i campioni di suolo trattato, sia per quelli di controllo. Nei 
test su altri tipi di sostanze chimiche il suolo viene suddiviso in sei porzioni di uguale peso. Cinque campioni vengono miscelati con il 
vettore contenente la sostanza di prova, mentre il sesto è miscelato 
unicamente con il vettore, senza aggiungere la sostanza chimica. Si raccomanda di utilizzare almeno tre repliche sia per i campioni di suolo trattato sia per quelli di controllo. Bisogna cercare di assicurare 
una distribuzione omogenea della sostanza di prova nei campioni di 
suolo trattati. Durante la miscelazione occorre evitare di compattare o agglomerare il suolo.
 
1.7.1.2  Incubazione dei campioni  
L'incubazione dei campioni di suolo può essere effettuata in due 
modi: utilizzando un campione globale di suolo trattato ed uno di suolo non trattato o invece una serie di sottocampioni elementari e di 
uguali dimensioni di suolo trattato e di suolo non trattato. Tuttavia 
per le sostanze volatili il test deve necessariamente essere effettuato utilizzando una serie di sottocampioni. Se si opta per l'incubazione in un campione globale occorre preparare grandi quantità sia di suolo 
trattato sia di suolo non trattato e, durante il test, procedere secondo 
necessità al prelievo dei vari sottocampioni da analizzare. La quantità inizialmente preparata per il trattamento e per i controlli dipende dalla dimensione dei sottocampioni, dal numero di repliche utilizzate 
per l'analisi e dal numero massimo di tempi di campionamento pre ­
visti. I suoli incubati in un campione globale devono essere accura ­
tamente mescolati prima di procedere al prelievo di sottocampioni. Se invece i suoli sono incubati in una serie di sottocampioni, il suolo 
trattato e quello non trattato vengono suddivisi nel numero di sotto ­
campioni necessario, e questi ultimi vengono utilizzati a seconda del bisogno. Negli esperimenti in cui si possono prevedere più di due tempi di campionamento deve essere preparato un numero sufficiente 
di sottocampioni per tener conto di tutte le repliche e di tutti i tempi 
di campionamento. Per il test devono essere incubate in condizioni aerobiche almeno tre repliche di campioni di suolo (cfr. paragrafo 1.7.1.1.) Durante tutti i test devono essere utilizzati appositi conte ­
nitori con uno spazio di testa sufficiente ad evitare che si sviluppino 
condizioni anaerobiche. Se il test è effettuato su sostanze volatili, il metodo da impiegare è necessariamente quello dei sottocampioni.
 
1.7.1.3  Condizioni e durata del test  
Il test viene eseguito al buio ad una temperatura ambiente di 
20 ± 2  o C. Durante il test il contenuto di umidità dei campioni 
deve essere mantenuto tra il 40 % ed il 60 % della capacità massima 
di ritenzione idrica del suolo (cfr. paragrafo 1.6.4.2), con un margine 
di variazione di ± 5 %. Se necessario può essere aggiunta acqua distillata e deionizzata.
 
La durata minima dei test è di 28 giorni. Se il test è effettuato su 
prodotti agrochimici, i tassi di formazione di nitrati nei campioni trattati vengono comparati con quelli riscontrati nei campioni con ­
trollo. Se al ventottesimo giorno la differenza è superiore al 25 %, il 
test prosegue fino al raggiungimento di una differenza uguale o inferiore al 25 % o per un massimo di 100 giorni. Per le sostanze diverse dai prodotti agrochimici il test termina dopo 28 giorni. Al 
ventottesimo giorno vengono determinate le quantità di nitrati nei 
campioni trattati e nei campioni controllo e calcolati i valori CE
 x . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1134
 
1.7.2  Campionamento e analisi dei suoli  
1.7.2.1  Programma di campionamento  
Se il test è condotto su prodotti agrochimici occorre analizzare i 
campioni di suolo per misurare la quantità di nitrati nei giorni 0, 
7, 14 e 28. Qualora la durata del test debba essere prolungata, le 
successive misurazioni vengono effettuate ad intervalli di 14 giorni a partire dal ventottesimo giorno.
 
Se il test è condotto su sostanze diverse dai prodotti agrochimici, si 
utilizzano almeno cinque concentrazioni di prova e l'analisi dei nitrati 
sui campioni di suolo viene effettuata all'inizio (giorno 0) e alla fine del periodo di esposizione (giorno 28). Se necessario si può ricorrere ad una misurazione intermedia, ad esempio il giorno 7. I dati ottenuti 
il ventottesimo giorno sono utilizzati per determinare il valore CE
 x 
per la sostanza chimica. Eventualmente i dati ottenuti dai campioni 
controllo il giorno 0 possono essere utilizzati come misura della quantità iniziale di nitrati nel suolo.
 
1.7.2.2  Analisi dei campioni di suolo  
Ad ogni campionamento viene determinata la quantità di nitrati for ­
mata in ciascuna replica dei campioni trattati e dei campioni con ­
trollo. I nitrati vengono estratti dal suolo agitando i campioni con idoneo solvente di estrazione, ad es. una soluzione 0,1 M di cloruro di potassio. Si raccomanda di utilizzare 5 ml di soluzione KCl per 
grammo di suolo (peso secco equivalente). Per ottimizzare l'estra ­
zione il campione di suolo e la soluzione di estrazione non devono occupare più della metà del volume del contenitore. La miscela viene agitata a 150 giri al minuto per 60 minuti e poi centrifugata o filtrata; 
vengono quindi analizzate le fasi liquide per misurare i nitrati. Gli 
estratti liquidi privi di particelle possono essere stoccati prima del ­
l'analisi ad una temperatura di - 20 ± 5
 o C per un massimo di sei 
mesi.  
2. DATI  
2.1 TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Se il test è effettuato su prodotti agrochimici si registra la quantità di 
nitrati formata in ciascun campione replicato di suolo, e i valori medi 
di tutti i campioni replicati devono essere riportati in una tabella. I tassi di trasformazione dell'azoto devono essere analizzati con metodi 
statistici adeguati e comunemente accettati (ad es. F-test, soglia di 
significatività del 5 %). La quantità di nitrati è espressa in mg/kg di suolo (peso secco)/die. Il tasso di formazione di nitrati riscontrato in ciascun campione trattato viene comparato con quello del campione 
controllo e viene calcolato lo scarto percentuale tra i due campioni.
 
Se il test è effettuato su altre sostanze chimiche, viene determinata la 
quantità di nitrati formata in ciascun campione replicato e viene costruita una curva dose-risposta per stimare i valori CE
 x . La quan ­
tità di nitrati ottenuta dopo 28 giorni nei campioni trattati, espressa in 
mg di nitrati/kg di suolo (peso secco), viene comparata con quella 
riscontrata nei campioni controllo. I risultati vengono utilizzati per calcolare i valori percentuali di inibizione per ogni concentrazione di prova. Su un grafico si riportano le percentuali ottenute in funzione 
delle concentrazioni e con metodi statistici vengono calcolati i valori 
CE
 x . Con procedure standard vengono determinati anche gli inter ­
valli di confidenza (p = 0,95) dei valori CE  x (10)(11)(12).  
Le sostanze di prova che contengono elevate quantità di azoto pos ­
sono contribuire alla quantità di nitrati che si forma nel corso del 
test. Se queste sostanze sono testate a concentrazioni elevate (come 
avviene ad es. per le sostanze chimiche per cui si prevedono appli ­
cazioni ripetute) il test deve prevedere adeguati controlli, ad esempio aggiungendo al suolo la sostanza di prova ma non la farina vegetale. 
I risultati dei controlli devono essere presi in considerazione nel 
calcolo dei valori CE
 x . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1135
 
2.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Nella valutazione dei risultati dei test sui prodotti agrochimici, se in 
un qualsiasi campionamento effettuato dopo il ventottesimo giorno la differenza tra i tassi di formazione dei nitrati nel campione di suolo 
trattato con la concentrazione più bassa (cioè la massima concentra ­
zione prevista) e nel campione controllo è uguale o inferiore al 25 %, si può ritenere che la sostanza testata non produce effetti a lungo termine sulla trasformazione dell'azoto nel suolo. Per la valutazione 
dei risultati dei test su sostanze diverse dai prodotti agrochimici si 
utilizzano i valori CE
 50 , CE  25 e/o CE  10 . 
3. RELAZIONE  
La relazione sull'esecuzione del test deve contenere le seguenti in ­
formazioni:  
Completa identificazione del suolo utilizzato comprendente:  
— coordinate geografiche del sito (latitudine, longitudine);  
— informazioni sulla storia del sito (tipo di copertura vegetale, trat ­
tamenti con prodotti fitosanitari, trattamenti con fertilizzanti, casi 
di contaminazione accidentale, ecc.);  
— destinazione (ad es. suolo agricolo, forestale, ecc.);  
— profondità del campionamento (cm);  
— contenuto in sabbia/limo/argilla (% peso secco);  
— pH (in acqua);  
— contenuto di carbonio organico (% peso secco);  
— contenuto di azoto (% peso secco);  
— concentrazione iniziale di nitrati (mg di nitrati/kg peso secco);  
— capacità di scambio cationico (mmol/kg);  
— biomassa microbica (in termini di percentuale del carbonio orga ­
nico totale);  
— indicazione dei metodi utilizzati per la determinazione di ciascun 
parametro;  
— tutte le informazioni relative al prelievo e allo stoccaggio dei 
campioni di suolo;  
— informazioni dettagliate sulla eventuale pre-incubazione del suolo.  
Sostanza di prova:  
— natura fisica e (se pertinenti) proprietà fisico-chimiche;  
— dati di identificazione chimica (se pertinenti), compresa la for ­
mula strutturale, la purezza (per i prodotti fitosanitari, la percen ­
tuale di ingrediente attivo), il contenuto di azoto.  
Substrato:  
— origine del substrato;  
— composizione (farina di erba medica, farina di erba medica 
verde);  
— contenuto di carbonio e di azoto (% peso secco);  
— dimensione delle maglie del setaccio (mm).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1136
 
Condizioni del test:  
— informazioni dettagliate sull'ammendamento del suolo con sub ­
strato organico;  
— numero di concentrazioni della sostanza chimica di prova utiliz ­
zata e, ove opportuno, giustificazione delle concentrazioni scelte;  
— informazioni dettagliate sulle modalità di applicazione al suolo 
della sostanza di prova;  
— temperatura di incubazione;  
— contenuto di umidità del suolo all'inizio e nel corso del test;  
— metodo di incubazione del suolo (campione globale o serie di 
sottocampioni);  
— numero di repliche dei campioni;  
— tempi di campionamento;  
— metodi utilizzati per l'estrazione dei nitrati dal suolo.  
Risultati:  
— procedure analitiche e strumenti utilizzati per l'analisi dei nitrati;  
— tabelle dei risultati, con i valori singoli ed i valori medi della 
misurazione dei nitrati;  
— variazioni tra le differenti repliche dei campioni trattati e dei 
campioni controllo;  
— giustificazioni delle eventuali correzioni apportate ai calcoli;  
— scarto percentuale tra i tassi di formazione dei nitrati per ciascun 
campionamento o, se opportuno, valore CE  50 con un intervallo di 
confidenza del 95 %, altri valori CE  x (CE  25 o CE  10 ) con i ri ­
spettivi intervalli di confidenza e grafico della curva dose-rispo ­
sta; 
— trattamento statistico dei risultati;  
— altre informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei 
risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
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mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Ni ­
trogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the In ­
fluence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
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1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration me ­
thod.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigationextraction method.  
(10) Litchfield, J.T. e Wilcoxon F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
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(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New-York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1138
 
C.22.  MICRORGANISMI DEL SUOLO: TEST DI TRASFORMA ­
ZIONE DEL CARBONIO  
1. METODO  
Questo metodo di prova corrisponde al TG 217 (2000) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Qui di seguito è descritto un metodo di laboratorio messo a punto per 
studiare i potenziali effetti a lungo termine di un'unica esposizione a 
prodotti fitosanitari e possibilmente ad altre sostanze chimiche sull'at ­
tività di trasformazione del carbonio ad opera dei microrganismi del suolo. Il test si basa principalmente sulle raccomandazioni dell'Orga ­
nizzazione europea e mediterranea per la protezione delle piante (1), 
ma tiene conto anche delle linee guida formulate dal Centro federale 
tedesco di ricerca biologica per l'agricoltura e la silvicoltura  (Biologi­
sche Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft)  (2), dall'Agenzia 
per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti  (Environmental Pro ­
tection Agency)  (3), e dal SETAC (4). Il numero ed il tipo di suoli da 
utilizzare nel test sono stati concordati in occasione di un  workshop  
dell'OCSE sulla selezione dei suoli e dei sedimenti, svoltosi a Belgi ­
rate nel 1995 (5). Le raccomandazioni riguardanti il prelievo, la ma ­
nipolazione e lo stoccaggio dei campioni di suolo si basano su linee 
guida ISO (6) e sulle raccomandazioni formulate dal  workshop  di 
Belgirate.
 
Per accertare e valutare le caratteristiche tossiche delle sostanze di 
prova può essere necessario determinarne gli effetti sull'attività mi ­
crobica del suolo, ad esempio quando occorre disporre di dati sui potenziali effetti collaterali dei prodotti fitosanitari sulla microflora 
del suolo o quando si prevede un'esposizione dei microrganismi del 
suolo ad altri tipi di sostanze chimiche. Il test di trasformazione del carbonio viene effettuato per determinare gli effetti di tali sostanze 
chimiche sulla microflora del suolo. Qualora siano testati prodotti 
agrochimici (ad es. fitosanitari, fertilizzanti, prodotti chimici per la silvicoltura), oltre al test di trasformazione dell'azoto si effettua an ­
che il test di trasformazione del carbonio. Per le altre sostanze chi ­
miche è invece sufficiente il test di trasformazione dell'azoto. Tutta ­
via se i valori CE
 50 riscontrati per queste sostanze nel test di tra ­
sformazione dell'azoto corrispondono a quelli degli inibitori della nitrificazione disponibili in commercio (ad es. nitrapirina), per otte ­
nere maggiori informazioni può essere effettuato anche il test di 
trasformazione del carbonio.
 
I suoli sono costituiti da miscele eterogenee e complesse di compo ­
nenti viventi e non viventi. I microrganismi svolgono un ruolo im ­
portante nella decomposizione e nella trasformazione della materia organica in suolo fertile, contribuendo in maniera differente a seconda delle specie ai vari aspetti della fertilizzazione. Eventuali 
interferenze con questi processi biochimici rischiano a lungo termine 
di influenzare il ciclo delle sostanze nutritive e di alterare la fertilità del suolo. La trasformazione del carbonio e dell'azoto avviene in tutti i suoli fertili; anche se le comunità microbiche responsabili di questi 
processi variano a seconda del tipo di suolo, le vie di trasformazione 
sono sostanzialmente le stesse.
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Il metodo di prova di seguito descritto è stato concepito per indivi ­
duare gli effetti nocivi a lungo termine di una data sostanza sul 
processo di trasformazione del carbonio nei suoli aerobici superficia ­
li. Il test è sensibile alle variazioni di dimensione e di attività delle comunità microbiche responsabili della trasformazione del carbonio 
in quanto sottopone tali comunità sia ad uno stress chimico che ad 
una carenza di carbonio. Viene utilizzato un suolo sabbioso con un basso contenuto di materia organica, che viene trattato con la so ­
stanza di prova ed incubato in condizioni che consentono un rapido 
metabolismo microbico. In tali condizioni, le fonti di carbonio pron ­
tamente disponibile nel suolo si esauriscono rapidamente. Ciò pro ­
voca una carenza di carbonio, che da un lato provoca la morte delle cellule microbiche e dall'altro induce dormienza e/o sporulazione. Se 
il test prosegue per più di 28 giorni, la somma di queste reazioni può 
essere misurata nei campioni controllo (costituiti da suolo non trat ­
tato) come perdita progressiva di biomassa microbica metabolica ­
mente attiva (7). Se nelle condizioni di esecuzione del test la bio ­
massa del suolo sottoposto a stress da carenza di carbonio subisce la 
presenza di una sostanza chimica, è possibile che essa non riesca a tornare allo stesso livello del campione controllo, per cui si può dedurre che le perturbazioni provocate dalla sostanza di prova in 
un qualsiasi momento del test spesso dureranno fino alla fine del 
test.
 
I test su cui si basa questo metodo di prova sono stati originaria ­
mente concepiti per sostanze di cui è possibile stimare la quantità che penetra nel suolo. È il caso, ad esempio, dei prodotti fitosanitari, la cui dose di applicazione nel terreno è conosciuta. Per i prodotti 
agrochimici è sufficiente utilizzare due concentrazioni di prova, cor ­
rispondenti alla dose di applicazione prevista o stimata; tali prodotti possono essere testati come ingredienti attivi (i.a.) o come prodotti formulati. Tuttavia il test non si limita alle sostanze chimiche le cui 
concentrazioni ambientali siano prevedibili; cambiando sia la quan ­
tità della sostanza di prova applicata al suolo sia le modalità di valutazione dei dati il test può infatti essere utilizzato anche per altre sostanze chimiche, di cui non si conosca la quantità che penetra nel 
suolo; in questo caso è possibile determinare gli effetti sulla trasfor ­
mazione del carbonio di una serie di concentrazioni. I dati ottenuti sono utilizzati per costruire una curva dose-risposta e calcolare i valori CE
 x , dove x è la percentuale di effetto.  
1.2 DEFINIZIONI  
Trasformazione del carbonio:  degradazione ad opera dei microrga ­
nismi di materia organica, con formazione di un prodotto finale 
inorganico, l'anidride carbonica.  
CE x (concentrazione efficace):  concentrazione della sostanza di 
prova nel suolo che determina un'inibizione dell'x per cento nella 
trasformazione del carbonio in anidride carbonica.  
CE 50 (concentrazione efficace media):  concentrazione della so ­
stanza di prova nel suolo che determina un'inibizione del 50 % nella trasformazione del carbonio in anidride carbonica.
 
1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Nessuna.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1140
 
1.4 PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
Dopo la setacciatura, una parte del suolo viene trattata con la so ­
stanza di prova mentre un'altra parte non è sottoposta ad alcun trattamento (controllo). Se il test è effettuato su prodotti agrochimici 
si raccomanda di utilizzare almeno due concentrazioni di prova, 
scelte in relazione alla massima concentrazione prevista nel terreno. Dopo 0, 7, 14 e 28 giorni di incubazione, i campioni di suolo trattati con la sostanza di prova e i campioni controllo sono miscelati con 
glucosio e per 12 ore consecutive vengono misurati i tassi di respi ­
razione indotta dal glucosio, espressi in termini di anidride carbonica emessa (mg di anidride carbonica/kg di suolo peso secco/ora) o di 
ossigeno consumato (mg di ossigeno/kg di suolo/ora). Il tasso di 
respirazione medio dei campioni di suolo trattato viene comparato con quello dei campioni controllo e viene calcolata la percentuale di scarto del campione trattato rispetto al campione controllo. Tutti i 
test durano almeno 28 giorni. Se al ventottesimo giorno le differenze 
tra i campioni trattati e non trattati sono uguali o superiori al 25 %, le misurazioni continuano ad intervalli di 14 giorni fino ad un mas ­
simo di 100 giorni. Se il test è effettuato su prodotti non agrochimici, 
ai campioni di suolo viene aggiunta la sostanza di prova in diverse 
concentrazioni e dopo 28 giorni vengono misurati i tassi di respira ­
zione indotta dal glucosio (cioè la media delle quantità di anidride carbonica prodotta o di ossigeno consumato). I risultati dei test ef ­
fettuati con una serie di concentrazioni sono analizzati mediante un 
modello di regressione; infine vengono calcolati i valori CE
 x (CE  50 , 
CE 25 e/o CE  10 . Cfr. in proposito le definizioni).  
1.5 VALIDITÀ DEL TEST  
Le analisi dei risultati del test sui prodotti agrochimici si basano su 
differenze relativamente modeste (valore medio ± 25 %) tra l'ani ­
dride carbonica emessa o l'ossigeno consumato nei (o dai) campioni 
di suolo trattato e nei controlli, e dunque la presenza di forti varia ­
zioni tra i campioni controllo può portare a falsi risultati. Pertanto la variazione tra le diverse repliche dei campioni controllo deve essere inferiore a ± 15 %.
 
1.6 DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.6.1  Apparecchiatura  
Per il test sono utilizzati contenitori di materiale chimicamente inerte, 
di capacità adeguata al metodo di incubazione del suolo utilizzato 
(ad es. in un campione globale o in una serie di campioni singoli: cfr. paragrafo 1.7.1.2). Occorre adottare le precauzioni necessarie per 
ridurre al minimo l'evaporazione di acqua e consentire lo scambio di 
gas durante il test (ad es. i contenitori utilizzati per il test possono essere coperti con un foglio di polietilene perforato). Per i test su sostanze volatili, devono essere utilizzati contenitori a chiusura er ­
metica e a tenuta di gas, di dimensioni tali che il campione di suolo 
occupi all'incirca un quarto del volume.
 
Per determinare i tassi di respirazione indotta dal glucosio sono 
necessari sistemi di incubazione e strumenti per la misurazione della produzione di anidride carbonica o del consumo di ossigeno. La letteratura scientifica citata in bibliografia riporta alcuni esempi di 
sistemi e strumenti utilizzabili [cfr. (8) (9) (10) (11)].
 
1.6.2  Selezione e numero di suoli  
Si utilizza un unico suolo, per il quale si raccomandano le seguenti 
caratteristiche:  
— contenuto in sabbia: non inferiore al 50 % e non superiore al 
75 %;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1141
 
— pH: 5,5- 7,5;  
— contenuto di carbonio organico: 0,5- 1,5 %;  
— deve essere misurata la biomassa microbica (12)(13), il cui con ­
tenuto di carbonio deve corrispondere almeno all'1 % del carbo ­
nio organico totale del suolo.  
Nella maggior parte dei casi un suolo con queste caratteristiche 
rappresenta l'ipotesi più sfavorevole, in quanto l'adsorbimento della 
sostanza chimica di prova è minimo, mentre la disponibilità per la 
microflora è massima e dunque in genere non è necessario effettuare il test con altri suoli. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio quando si prevede un uso prevalente della sostanza di prova su 
particolari tipi di suolo (ad es. i suoli forestali acidi) o per sostanze 
chimiche con carica elettrostatica, può essere necessario utilizzare un suolo aggiuntivo.
 
1.6.3  Prelievo e stoccaggio dei campioni di suolo  
1.6.3.1  Prelievo  
Devono essere disponibili informazioni dettagliate sulla storia del 
sito di campionamento, tra cui l'esatta ubicazione, il tipo di copertura vegetale, le date dei trattamenti con prodotti fitosanitari e con ferti ­
lizzanti organici o inorganici, l'eventuale applicazione di materiali 
biologici ed i casi di contaminazione accidentale. Il sito scelto per il prelievo del suolo deve consentire cicli molto lunghi; sono perciò adatti i pascoli permanenti, i terreni destinati a colture cerealicole 
annuali (ad eccezione del granturco) o da sovescio a semina fitta. Il 
sito di campionamento scelto non deve essere stato sottoposto a trattamenti con prodotti fitosanitari da almeno un anno e da almeno 
sei mesi non devono essere stati applicati fertilizzanti organici. L'uso 
di fertilizzanti minerali è ammesso solo se richiesto dal tipo di col ­
tura in atto ed in questo caso il prelievo di campioni di suolo deve essere effettuato almeno tre mesi dopo l'applicazione del fertilizzante. 
Bisogna evitare di utilizzare suoli trattati con fertilizzanti di cui siano 
noti gli effetti biocidi (ad es. calciocianammide).
 
Il prelievo di campioni non deve avvenire durante o subito dopo 
lunghi periodi (> 30 giorni) di siccità o di saturazione idrica del terreno. Nei suoli arati i campioni devono essere prelevati ad una profondità compresa tra 0 e 20 cm. Nei suoli a prato o a pascolo o in 
altri suoli che non vengono arati per lunghi periodi (almeno un ciclo 
vegetativo) la profondità massima di campionamento può essere leg ­
germente superiore a 20 cm (ad es. fino a 25 cm). I campioni devono essere trasportati in contenitori adeguati e in condizioni di tempera ­
tura tali da garantire che le proprietà iniziali del suolo non vengano 
alterate in maniera significativa.
 
1.6.3.2  Stoccaggio  
È preferibile l'uso di suoli appena prelevati dal terreno. Qualora non 
si possa evitare lo stoccaggio in laboratorio, i suoli possono essere 
conservati al buio ad una temperatura di 4 ± 2  o C per un massimo di 
tre mesi. Durante lo stoccaggio deve essere assicurato il manteni ­
mento in condizioni aerobiche. Se i suoli vengono prelevati da zone 
in cui gelano per almeno tre mesi l'anno, si può prendere in consi ­
derazione lo stoccaggio per sei mesi ad una temperatura compresa tra - 18
 o C e - 22  o C. Prima di ogni esperimento viene misurata la 
biomassa microbica dei suoli: il carbonio presente nella biomassa 
deve essere pari almeno all'1 % del contenuto di carbonio organico 
totale nel suolo (cfr. paragrafo 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1142
 
1.6.4  Manipolazione e preparazione del suolo  
1.6.4.1  Pre-incubazione  
Se il suolo è stato stoccato (cfr. paragrafi 1.6.4.2 e 1.7.1.3), si 
raccomanda la pre-incubazione per un periodo compreso tra 2 e 28 
giorni. Durante la pre-incubazione la temperatura e il contenuto di 
umidità del suolo devono essere analoghi a quelli del test (cfr. para ­
grafi 1.6.4.2 e 1.7.1.3).  
1.6.4.2  Caratteristiche fisico-chimiche  
Dopo la rimozione manuale di particelle di grandi dimensioni (ad es. 
sassi, parti di piante, ecc.) il suolo viene setacciato ad umido, evi ­
tando l'eccessiva essiccazione, in modo tale che la dimensione dei 
granuli sia inferiore o uguale a 2 mm. Il contenuto di umidità del campione di suolo deve essere regolato con acqua distillata o deio ­
nizzata ad un valore compreso tra il 40 % ed il 60 % della capacità 
massima di ritenzione idrica.
 
1.6.5  Preparazione della sostanza di prova per l'applicazione al suolo  
Normalmente la sostanza di prova è applicata utilizzando un vettore, 
che può essere l'acqua (per le sostanze idrosolubili) o un solido inerte come la sabbia di quarzo fine (diametro: 0,1- 0,5 mm). Si deve evitare l'uso di vettori liquidi diversi dall'acqua (ad es. solventi 
organici come l'acetone o il cloroformio) in quanto possono danneg ­
giare la microflora. Se il vettore utilizzato è la sabbia, quest'ultima può essere rivestita con la sostanza di prova, disciolta o posta in sospensione in un solvente adeguato. In questi casi il solvente deve 
essere eliminato per evaporazione prima della miscelazione con il 
suolo. Per consentire una distribuzione ottimale della sostanza di prova nel suolo, si raccomanda una proporzione di 10 g di sabbia per ogni chilogrammo di suolo (peso secco). I campioni controllo 
sono trattati esclusivamente con la quantità equivalente di acqua e/o 
di sabbia di quarzo.
 
Se il test viene effettuato su sostanze chimiche volatili, occorre per 
quanto possibile evitare dispersioni durante il trattamento e cercare di 
assicurare una distribuzione omogenea nel suolo (ad es. la sostanza 
di prova deve essere iniettata in diversi punti del suolo).  
1.6.6  Concentrazioni di prova  
Se il test è effettuato su prodotti agrochimici o su altre sostanze 
chimiche le cui concentrazioni ambientali siano prevedibili, devono essere utilizzate almeno due concentrazioni di prova. La concentra ­
zione più bassa deve corrispondere almeno alla quantità massima che 
si prevede possa effettivamente penetrare nel suolo, mentre la con ­
centrazione più elevata deve essere un multiplo della concentrazione più bassa. Le concentrazioni della sostanza di prova aggiunte al 
suolo sono calcolate supponendo un'incorporazione uniforme ad 
una profondità di 5 cm ed una densità apparente del suolo di 1,5 g/cm
 3 . Per i prodotti agrochimici applicati direttamente al suolo o per 
le sostanze chimiche di cui si può prevedere la quantità che penetra 
nel suolo, le concentrazioni di prova raccomandate sono la massima 
concentrazione ambientale prevista (PEC) ed il suo quintuplo. Le sostanze per le quali si prevedono più applicazioni al suolo nel corso di una stagione devono essere testate a concentrazioni calcolate mol ­
tiplicando la PEC per il numero massimo di applicazioni previste. 
Tuttavia la più alta concentrazione testata non deve superare il decu ­
plo della dose massima di applicazione.
 
Se invece il test è effettuato su altri tipi di sostanze chimiche, si 
utilizza una serie geometrica di almeno cinque concentrazioni. Il 
range delle concentrazioni testate deve essere tale da consentire di 
determinare i valori CE  x . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1143
 
1.7 ESECUZIONE DEL TEST  
1.7.1  Condizioni di esposizione  
1.7.1.1  Trattamento e controllo  
Qualora il test sia condotto su prodotti agrochimici, il suolo viene 
suddiviso in tre porzioni di uguale peso. Due di esse sono miscelate 
con il vettore contenente la sostanza chimica, mentre la terza è miscelata soltanto con il vettore, senza aggiunta della sostanza (cam ­
pione controllo). Si raccomanda di utilizzare almeno tre repliche sia 
per i campioni di suolo trattato sia per quelli di controllo. Nei test su 
altri tipi di sostanze chimiche il suolo viene suddiviso in sei porzioni di uguale peso. Cinque campioni vengono miscelati con il vettore 
contenente la sostanza di prova, mentre il sesto è miscelato unica ­
mente con il vettore, senza aggiungere la sostanza chimica. Si rac ­
comanda di utilizzare almeno tre repliche sia per i campioni di suolo trattato sia per quelli di controllo. Bisogna cercare di assicurare una 
distribuzione omogenea della sostanza di prova nei campioni di 
suolo trattati. Durante la miscelazione, bisogna evitare di compattare o di agglomerare il suolo.
 
1.7.1.2  Incubazione dei campioni  
L'incubazione dei campioni di suolo può essere effettuata in due 
modi: utilizzando un campione globale di suolo trattato ed uno di suolo non trattato o invece una serie di sottocampioni elementari e di 
uguali dimensioni di suolo trattato e di suolo non trattato. Tuttavia 
per le sostanze volatili il test deve necessariamente essere effettuato utilizzando una serie di sottocampioni. Se si opta per l'incubazione in un campione globale, occorre preparare grandi quantità sia di suolo 
trattato sia di suolo non trattato e, durante il test, procedere secondo 
necessità al prelievo dei vari sottocampioni da analizzare. La quantità inizialmente preparata per il trattamento e i controlli dipende dalla dimensione dei sottocampioni, dal numero di repliche utilizzate per 
l'analisi e dal numero massimo di tempi di campionamento previsti. I 
suoli incubati in un campione globale devono essere accuratamente mescolati prima di procedere al prelievo di sottocampioni. Se invece i suoli sono incubati in una serie di sottocampioni, il suolo trattato e 
quello non trattato vengono suddivisi nel numero di sottocampioni 
necessario, e questi ultimi vengono utilizzati a seconda del bisogno. Negli esperimenti in cui si possono prevedere più di due tempi di campionamento deve essere preparato un numero sufficiente di sot ­
tocampioni per tener conto di tutte le repliche e di tutti i tempi di 
campionamento. Per il test devono essere incubate in condizioni aerobiche almeno tre repliche di campioni di suolo (cfr. paragrafo 1.7.1.1.) Durante tutti i test devono essere utilizzati appositi conte ­
nitori con uno spazio di testa sufficiente ad evitare che si sviluppino 
condizioni anaerobiche. Se il test è effettuato su sostanze volatili, il metodo da impiegare è necessariamente quello dei sottocampioni.
 
1.7.1.  Condizioni e durata del test  
Il test viene eseguito al buio ad una temperatura ambiente di 20 ± 2  o C. 
Durante il test il contenuto di umidità dei campioni deve essere mante ­
nuto tra il 40 % ed il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica del 
suolo (cfr. paragrafo 1.6.4.2), con un margine di variazione di ± 5 %. Se 
necessario può essere aggiunta acqua distillata e deionizzata.  
La durata minima dei test è di 28 giorni. Se il test è effettuato su 
prodotti agrochimici, viene comparata la quantità di anidride carbo ­
nica emessa o di ossigeno consumato nei campioni trattati e nei controlli. Se al ventottesimo giorno la differenza è superiore al 
25 %, il test prosegue fino al raggiungimento di una differenza 
uguale o inferiore al 25 % o per un massimo di 100 giorni. Per le sostanze diverse dai prodotti agrochimici il test termina dopo 28 giorni. Al ventottesimo giorno viene determinata la quantità di ani ­
dride carbonica emessa o di ossigeno consumato nei campioni trattati 
e in quelli di controllo e vengono calcolati i valori CE
 x . ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1144
 
1.7.2  Campionamento e analisi dei suoli  
1.7.2.1  Programma di campionamento  
Se il test è condotto su prodotti agrochimici occorre analizzare i 
campioni di suolo per misurare i tassi di respirazione indotta dal 
glucosio nei giorni 0, 7, 14 e 28. Qualora la durata del test debba 
essere prolungata, le successive misurazioni vengono effettuate ad intervalli di 14 giorni a partire dal ventottesimo giorno.
 
Se il test è condotto su sostanze diverse dai prodotti agrochimici, si 
utilizzano almeno cinque concentrazioni di prova e l'analisi dei tassi di respirazione indotta dal glucosio viene effettuata all'inizio (giorno 
0) e alla fine del periodo di esposizione (giorno 28). Se necessario si 
può ricorrere ad una misurazione intermedia, ad esempio il giorno 7. I dati ottenuti il ventottesimo giorno sono utilizzati per determi ­
nare il valore CE
 x per la sostanza chimica. Eventualmente i dati 
ottenuti dai campioni controllo il giorno 0 possono essere utilizzati 
come misura della quantità iniziale di biomassa microbica metaboli ­
camente attiva nel suolo (12).  
1.7.2.2  Misura dei tassi di respirazione indotta dal glucosio  
Ad ogni campionamento viene determinato il tasso di respirazione 
indotta dal glucosio in ciascuna replica dei campioni trattati e dei campioni controllo. I campioni di suolo vengono miscelati con una quantità di glucosio sufficiente a provocare una reazione respiratoria 
massima immediata. La quantità di glucosio necessaria per provocare 
una reazione respiratoria massima in un dato suolo può essere de ­
terminata in un test preliminare con una serie di concentrazioni della sostanza (14). Tuttavia, nel caso di suoli sabbiosi con un contenuto 
di carbonio organico compreso tra lo 0,5 e l'1,5 %, in genere è 
sufficiente una quantità di glucosio compresa tra 2 000 e 4 000 mg per chilogrammo di suolo (peso secco). Il glucosio può essere ridotto in polvere con sabbia di quarzo fine [10 g di sabbia/kg di suolo 
(peso secco)] e miscelato con il suolo in modo tale da assicurarne 
una distribuzione omogenea.
 
I campioni di suolo arricchiti con glucosio vengono incubati a 
20 ± 2  o C in un apparecchio che consenta di misurare i tassi di 
respirazione in modo continuo, ogni ora, oppure ogni due ore (cfr. paragrafo 1.6.1). Per 12 ore consecutive vengono misurati l'anidride carbonica emessa o l'ossigeno consumato. Le misurazioni devono 
iniziare quanto prima, cioè entro 1-2 ore dall'aggiunta del glucosio. 
Dopo aver misurato la quantità totale di anidride carbonica emessa o di ossigeno consumato nel corso delle 12 ore, vengono determinati i tassi medi di respirazione.
 
2. DATI  
2.1 TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Se il test è effettuato su prodotti agrochimici si registra la quantità di 
anidride carbonica emessa o di ossigeno consumato da ciascun cam ­
pione replicato di suolo e si riportano in una tabella i valori medi di 
tutti i campioni replicati. I risultati devono essere analizzati con metodi statistici adeguati e comunemente accettati (ad es. F-test, soglia di significatività del 5 %). I tassi di respirazione indotta dal 
glucosio sono espressi in mg di anidride carbonica/kg di suolo (peso 
secco)/ora o in mg di ossigeno/suolo (peso secco)/ora. Il tasso medio di produzione di anidride carbonica o il tasso medio di consumo di ossigeno riscontrato in ciascun campione trattato viene comparato 
con quello del campione controllo e viene calcolato lo scarto per ­
centuale fra i due campioni.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1145
 
Se il test è effettuato su altre sostanze chimiche, viene determinata la 
quantità di anidride carbonica emessa o di ossigeno consumato da 
ciascun campione replicato e viene costruita una curva dose-risposta per stimare i valori CE
 x . I tassi di respirazione indotta dal glucosio 
riscontrati dopo 28 giorni nei campioni trattati [espressi in mg di 
anidride carbonica/kg di suolo (peso secco)/ora o in mg di ossigeno/ ­
suolo (peso secco)/ora] sono comparati con quelli dei campioni con ­
trollo. I risultati vengono utilizzati per calcolare i valori percentuali di inibizione per ogni concentrazione di prova. Su un grafico si 
riportano le percentuali ottenute in funzione delle concentrazioni e 
con metodi statistici vengono calcolati i valori CE
 x . Con procedure 
standard vengono determinati anche gli intervalli di confidenza (p = 0,95) dei valori CE
 x (15)(16)(17).  
2.2 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Nella valutazione dei risultati dei test sui prodotti agrochimici, se in 
un qualsiasi campionamento effettuato dopo il ventottesimo giorno la differenza tra i tassi di respirazione nel campione di suolo trattato 
con la concentrazione più bassa (cioè la massima concentrazione 
prevista) e nel campione controllo è uguale o inferiore al 25 %, si può ritenere che la sostanza testata non produce effetti a lungo 
termine sulla trasformazione del carbonio nel suolo. Per la valuta ­
zione dei risultati dei test su sostanze diverse dai prodotti agrochi ­
mici si utilizzano i valori CE
 50 , CE  25 e/o CE  10 . 
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione sull'esecuzione del test deve contenere le seguenti in ­
formazioni:  
Completa identificazione del suolo utilizzato comprendente:  
— coordinate geografiche del sito (latitudine, longitudine);  
— informazioni sulla storia del sito (tipo di copertura vegetale, trat ­
tamenti con prodotti fitosanitari, trattamenti con fertilizzanti, casi 
di contaminazione accidentale, ecc.);  
— destinazione (ad es. suolo agricolo, forestale, ecc.);  
— profondità del campionamento (cm);  
— contenuto in sabbia/limo/argilla (% peso secco);  
— pH (in acqua);  
— contenuto di carbonio organico (% peso secco);  
— contenuto di azoto (% peso secco);  
— capacità di scambio cationico (mmol/kg);  
— biomassa microbica iniziale (in termini di percentuale del carbo ­
nio organico totale);  
— indicazione dei metodi utilizzati per la determinazione di ciascun 
parametro;  
— tutte le informazioni relative al prelievo e allo stoccaggio dei 
campioni di suolo;  
— informazioni dettagliate sulla eventuale pre-incubazione del suolo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1146
 
Sostanza di prova:  
— natura fisica e (se pertinenti) proprietà fisico-chimiche;  
— dati di identificazione chimica (se pertinenti), compresa la for ­
mula strutturale, la purezza (per i prodotti fitosanitari, la percen ­
tuale di ingrediente attivo), il contenuto di azoto.  
Condizioni del test:  
— informazioni dettagliate sull'ammendamento del suolo con sub ­
strato organico;  
— numero di concentrazioni della sostanza chimica di prova utiliz ­
zata e, ove opportuno, giustificazione delle concentrazioni scelte;  
— informazioni dettagliate sulle modalità di applicazione al suolo 
della sostanza di prova;  
— temperatura di incubazione;  
— contenuto di umidità del suolo all'inizio e nel corso del test;  
— metodo di incubazione del suolo utilizzato (campione globale o 
serie di sottocampioni);  
— numero di repliche dei campioni;  
— tempi di campionamento.  
Risultati:  
— metodo e strumenti utilizzati per misurare i tassi di respirazione;  
— tabelle dei risultati, con i valori singoli e i valori medi delle 
quantità di anidride carbonica o di ossigeno;  
— variazioni tra le differenti repliche dei campioni trattati e dei 
campioni controllo;  
— giustificazioni delle eventuali correzioni apportate ai calcoli;  
— scarto percentuale tra i tassi di respirazione indotta dal glucosio 
registrati in ciascun campionamento o, se del caso, valore CE  50 
con un intervallo di confidenza del 95 %, altri valori CE  x (CE  25 
o CE  10 ) con i rispettivi intervalli di confidenza e grafico della 
curva dose-risposta;  
— trattamento statistico dei risultati, ove opportuno;  
— altre informazioni e osservazioni utili per l'interpretazione dei 
risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
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(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
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(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
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(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in «Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties». Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41:831-871.
 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeyer O., Insam, H., Kaiser, E.A, Walenzik, G. (1989). 
Soil microbial biomass and respiration measurements; an auto ­
mated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration me ­
thod.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigationextraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. Nachri ­
chtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38:113-120.  
(15) Litchfield, J.T. — Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1148
 
C.23.  TRASFORMAZIONE AEROBICA E ANAEROBICA NEL 
SUOLO  
1. METODO  
Questo metodo corrisponde al TG 307 (2002) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Il presente metodo di test è basato sulle linee guida esistenti (1)(2) ­
(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Il metodo descritto è progettato per determinare la trasformazione aerobica ed anaerobica delle sostanze chimiche nel suolo. Gli esperimenti eseguiti hanno l'obiettivo di determinare: i) la 
velocità di trasformazione della sostanza di prova e ii) la natura e la 
velocità di formazione e di diminuzione dei prodotti di trasforma ­
zione ai quali possono essere esposti piante ed organismi del suolo. Tali studi sono necessari per le sostanze chimiche che vengono 
applicate direttamente sul suolo o che abbiano probabilità di raggiun ­
gere l'ambiente del suolo. I risultati di questi studi di laboratorio possono essere utilizzati anche per sviluppare protocolli di campio ­
namento e di analisi per studi correlati sul campo.
 
Per la valutazione delle vie di trasformazione sono in genere suffi ­
cienti gli studi aerobici ed anaerobici con un solo tipo di suolo (8)(10)(11). I tassi di trasformazione vanno determinati in almeno altri tre suoli (8)(10).
 
Un workshop dell'OCSE sulla selezione dei suoli e dei sedimenti, 
tenutosi a Belgirate nel 1995 (10), ha definito, in particolare, il numero e i tipi di suoli da usarsi in questo test. I tipi di suoli esaminati devono essere rappresentativi delle condizioni ambientali 
in cui la sostanza verrà usata o rilasciata. Per esempio, le sostanze 
chimiche che potrebbero essere rilasciate in climi subtropicali e tro ­
picali vanno testate utilizzando Ferrasols o Nitosols (sistema FAO). Il workshop ha inoltre espresso raccomandazioni circa la raccolta, la 
manipolazione e la conservazione dei campioni, sulla base delle linee 
guida ISO (15). Questo metodo prevede anche l'uso di suoli per risaia.
 
1.2 DEFINIZIONI  
Sostanza di prova:  qualsiasi sostanza, sia un composto progenitore 
che i relativi prodotti di trasformazione.  
Prodotti di trasformazione:  tutte le sostanze derivanti da reazioni di 
trasformazione biotica o abiotica della sostanza di prova, compresi CO
 2 e i prodotti che si trovano in residui non estraibili.  
Residui non estraibili:  i «residui non estraibili» sono sostanze nel 
suolo, nelle piante o negli animali, che dopo estrazione persistono nella matrice sotto forma di sostanza progenitrice o dei suoi meta ­
boliti o prodotti di trasformazione. Il metodo di estrazione non deve 
alterare in modo considerevole le sostanze stesse o la struttura della 
matrice. La natura del legame può essere in parte chiarita mediante metodi di estrazione che alterano la matrice e sofisticate tecniche analitiche. Fino ad oggi, ad esempio, in questo modo sono stati 
identificati i legami ionici covalenti e di assorbimento/adsorbimento, 
oltre alle catture. In generale, la formazione di residui non estraibili riduce significativamente la bioaccessibilità e la biodisponibilità (12) [modificato da IUPAC 1984 (13)].
 
Trasformazione aerobica:  reazioni che hanno luogo in presenza di 
ossigeno molecolare (14).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1149
 
Trasformazione anaerobica:  reazioni che hanno luogo in assenza di 
ossigeno molecolare (14).  
Suolo:  miscela di costituenti chimici organici e inorganici (questi 
ultimi contengono sostanze ad elevato contenuto di carbonio e azoto e di elevato peso molecolare), contenente organismi vitali di piccole dimensioni (soprattutto microrganismi). Il suolo può essere manipo ­
lato in due stati:
 
a) indisturbato, come si è sviluppato nel tempo, in strati caratteristici 
di diversi tipi di suolo;  
b) disturbato, come si trova generalmente nei campi arabili o come 
si riscontra quando ne vengono prelevati campioni mediante sca ­
vo, che vengono utilizzati in questo metodo di test (14).  
Mineralizzazione:  completa degradazione di un composto organico 
in CO  2 e H  2 O in condizioni aerobiche, e in CH  4 , CO  2 e H  2 O in 
condizioni anaerobiche. Nel contesto del presente metodo di test, quando si utilizza una sostanza marcata al
 14 C, per mineralizzazione 
si intende una prolungata degradazione durante la quale un atomo di 
carbonio marcato viene ossidato con rilascio della corretta quantità di  
14 CO 2 (14).  
Tempo di dimezzamento: t  0,5 , è il tempo necessario per una tra ­
sformazione del 50 % di una sostanza di prova, quando la trasfor ­
mazione può essere descritta mediante cinetica di primo ordine; è 
indipendente dalla concentrazione.  
DT 50 (Tempo di scomparsa 50):  tempo entro cui la concentrazione 
della sostanza di prova si riduce del 50 %; è diverso dal tempo di dimezzamento t
 0,5 quando la trasformazione non segue la cinetica di 
primo ordine.  
DT 75 (Tempo di scomparsa 75):  tempo entro cui la concentrazione 
della sostanza di prova si riduce del 75 %.  
DT 90 (Tempo di scomparsa 90):  tempo entro cui la concentrazione 
della sostanza di prova si riduce del 90 %.  
1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Per la caratterizzazione e/o l'identificazione dei prodotti di trasfor ­
mazione mediante metodi spettroscopici e cromatografici si utiliz ­
zano sostanze di riferimento.  
1.4 APPLICABILITÀ DEL TEST  
Il metodo è applicabile a tutte le sostanze chimiche (non marcate o 
radiomarcate) per le quali è disponibile un metodo analitico suffi ­
cientemente accurato e sensibile. È applicabile a sostanze lievemente 
volatili, non volatili, idrosolubili e non idrosolubili. Il test non va applicato a sostanze chimiche altamente volatili dal suolo (ad es. fumiganti, solventi organici) che non possono essere tenute all'in ­
terno del suolo nelle condizioni sperimentali necessarie per questo 
test.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1150
 
1.5 INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Per misurare la velocità di trasformazione è possibile usare una 
sostanza di prova non marcata o marcata. Il materiale marcato è necessario per lo studio della via di trasformazione e per definire 
un bilancio di massa. Si raccomanda la marcatura con
 14 C, sebbene 
possa essere utile anche l'uso di altri isotopi, quali  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. 
Per quanto possibile, la marcatura va applicata alla parte o alle parti più stabili della molecola (
 1 ). La purezza della sostanza di prova 
deve essere almeno del 95 %.  
Prima di eseguire un test sulla trasformazione aerobica ed anaerobica 
nel suolo, devono essere disponibili le seguenti informazioni sulla 
sostanza di prova:  
a) solubilità in acqua (Metodo A.6)  
b) solubilità in solventi organici;  
c) tensione di vapore (Metodo A.4) e costante della legge di Henry;  
d) coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua (Metodo A. 8);  
e) stabilità chimica al buio (idrolisi) (Metodo C.7);  
f) pK  a se una molecola è soggetta a protonazione o deprotonazione 
(Linee guida OCSE 112) (16).  
Altre informazioni utili possono essere costituite da dati sulla tossi ­
cità della sostanza di prova per i microrganismi del suolo (Metodi di test C.21 e C.22) (16).
 
Dovrebbero essere disponibili metodi analitici (compresi metodi per 
l'estrazione e di depurazione) per la quantificazione e l'identifica ­
zione della sostanza di prova e dei suoi prodotti di trasformazione.  
1.6 PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
I campioni di suolo vengono trattati con la sostanza di prova e 
incubati al buio in contenitori per biometria o in sistemi a flusso 
continuo in condizioni controllate di laboratorio (a temperatura e umidità costante del suolo). Dopo adeguati intervalli di tempo, i campioni di suolo vanno estratti e analizzati alla ricerca della so ­
stanza progenitrice e dei prodotti di trasformazione. Mediante ade ­
guati dispositivi di assorbimento vengono raccolti anche i prodotti volatili e sottoposti ad analisi. Impiegando materiale
 14 C-marcato è 
possibile misurare i tassi di mineralizzazione della sostanza di prova 
intercettando il  14 CO 2 evoluto e determinare un bilancio di massa, 
compresa la formazione di residui non estraibili.  
1.7 CRITERI DI QUALITÀ  
1.7.1  Recupero  
L'estrazione e l'analisi di campioni di suolo almeno duplicati, imme ­
diatamente dopo l'aggiunta della sostanza di prova, forniscono una 
prima indicazione della ripetibilità del metodo analitico e dell'unifor ­
mità della procedura di applicazione per la sostanza di prova. Le percentuali di recupero per le fasi successive degli esperimenti sono 
determinate dai rispettivi bilanci di massa e dovrebbero essere com ­
prese tra 90 % e 110 % per le sostanze chimiche marcate (8) e tra 70 % e 110 % per le sostanze chimiche non marcate (3).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1151  
( 1 ) Per esempio, se la sostanza di prova contiene un solo anello, è necessario marcare tale 
anello; se la sostanza contiene due anelli o più, possono risultare necessari studi separati 
per valutare il destino di ciascun anello marcato e per ottenere informazioni adeguate 
sulla formazione dei prodotti di trasformazione.
 1.7.2  Ripetibilità e sensibilità del metodo di analisi  
La ripetibilità del metodo di analisi (esclusa l'efficienza di estrazione 
iniziale) per quantificare la sostanza di prova e i prodotti di trasfor ­
mazione può essere controllata duplicando l'analisi dello stesso 
estratto di suolo, incubato sufficientemente a lungo perché si formino 
prodotti di trasformazione.  
Il limite di rivelabilità del metodo di analisi per la sostanza di prova 
e per i prodotti di trasformazione deve essere di almeno 0,01 mg kg  -1 
di suolo (come sostanza di prova) o dell'1 % della dose applicata 
(scegliere il dato inferiore). Il limite di quantificazione va anch'esso 
specificato.  
1.7.3  Accuratezza dei dati sulla trasformazione  
L'analisi di regressione delle concentrazioni della sostanza di prova 
in funzione del tempo fornisce dati adeguati circa l'affidabilità della curva di trasformazione e consente di calcolare gli intervalli di con ­
fidenza per i tempi di dimezzamento (in caso di cinetica di pseudo 
primo ordine) o i valori DT
 50 e, se del caso, DT  75 e DT  90 . 
1.8 DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.8.1  Apparecchiature e reagenti chimici  
I sistemi di incubazione sono costituiti da sistemi statici chiusi o 
adeguati sistemi a flusso continuo (7)(17). Le figure 1 e 2 mostrano rispettivamente esempi di apparecchi di flusso adatti all'incubazione del suolo e contenitori per biometria. Entrambi i 
tipi di sistemi di incubazione presentano vantaggi e limiti (7)(17).
 
È necessario disporre di un'attrezzatura standard da laboratorio, e in 
particolare:  
— strumentazione analitica quale apparecchi per GLC, HPLC, TLC, 
compresi adeguati sistemi di rilevazione per l'analisi di sostanze radiomarcate e non radiomarcate, o il metodo di diluizione iso ­
topica inversa;
 
— strumenti di identificazione (ad esempio: MS, GC-MS, HPLC- 
MS, RMN, ecc.);  
— rivelatore a scintillazione a liquido;  
— ossidatore per la combustione del materiale radioattivo;  
— centrifuga;  
— apparecchio per l'estrazione (per esempio tubi da centrifuga per 
l'estrazione a freddo ed estrattore di Soxhlet per l'estrazione con ­
tinua sotto riflusso);  
— strumentazione per la concentrazione di soluzioni ed estratti (ad 
es. evaporatore a rotazione);  
— bagnomaria;  
— apparecchio per miscelatura meccanica (ad es. impastatrice, mi ­
scelatore a rotazione).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1152
 
I reagenti chimici usati sono, ad esempio:  
— NaOH, grado analitico, 2 mol · dm  -3 , o un'altra base adeguata (ad 
es. KOH, etanolammina);  
— H  2 SO 4 , grado analitico, 0,05 mol · dm  -3 ; 
— glicole etilenico, grado analitico;  
— materiali assorbenti solidi, quali calce sodata e tappi in poliure ­
tano;  
— solventi organici, grado analitico, quali acetone, metanolo, ecc.;  
— liquido per scintillazione.  
1.8.2  Applicazione della sostanza di prova  
Per introdurre e distribuire la sostanza di prova nel suolo la si può 
sciogliere in acqua (distillata o deionizzata) o, se necessario, in mi ­
nime quantità di acetone o di altri solventi organici (6) nei quali la 
sostanza di prova sia sufficientemente solubile e stabile. La quantità di solvente scelto non deve però esercitare un'influenza significativa sull'attività microbica del suolo (vedi sezioni 1.5 e 1.9.2-1.9.3). Va 
evitato l'impiego di solventi che inibiscono l'attività microbica, quali 
il cloroformio, il diclorometano e altri solventi alogenati.
 
La sostanza di prova può essere aggiunta anche in forma solida, ad 
es. mista a sabbia quarzosa (6) o in un piccolo sottocampione del suolo sperimentale che sia stato asciugato all'aria e sterilizzato. Se la sostanza di prova viene aggiunta con l'ausilio di un solvente, occorre 
permettere al solvente di evaporare prima di aggiungere il sottocam ­
pione arricchito al campione di suolo originale non sterile.
 
Per le sostanze chimiche generiche, che entrano nel suolo soprattutto 
attraverso i fanghi delle acque di scarico e le pratiche agricole, la sostanza di prova va prima aggiunta al fango, che viene poi intro ­
dotto nel campione di suolo (vedi sezioni 1.9.2 e 1.9.3).
 
Di norma non si consiglia l'impiego di prodotti formulati, che pos ­
sono però costituire una valida alternativa, ad esempio, per le so ­
stanze di prova scarsamente solubili.  
1.8.3  Suoli  
1.8.3.1  Selezione del suolo  
Per determinare la via di trasformazione è possibile usare un suolo 
rappresentativo; è consigliabile impiegare un limo sabbioso, un limo 
fangoso, un limo glaciale o una sabbia limosa [secondo la classifi ­
cazione FAO e USDA (18)] con un pH di 5,5-8,0, un contenuto di carbonio organico dello 0,5-2,5 % e una biomassa microbica pari ad 
almeno l'1 % del carbonio organico totale (10).
 
Per gli studi dei tassi di trasformazione occorre usare almeno tre 
suoli aggiuntivi che rappresentino una gamma di suoli attinenti. I 
suoli devono differire tra loro in quanto a contenuto di carbonio 
organico, pH, contenuto di argilla e biomassa microbica (10).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1153
 
Tutti i suoli devono essere caratterizzati per lo meno per quanto 
concerne struttura (% di sabbia, % di limo, % di argilla) [secondo 
la classificazione FAO e USDA (18)], pH, capacità di scambio dei cationi, carbonio organico, peso specifico apparente, caratteristiche di ritenzione idrica (
 1 ) e biomassa microbica (solo per gli studi aerobi ­
ci). Per l'interpretazione dei risultati possono essere utili ulteriori 
informazioni sulle proprietà del suolo. Per determinare le caratteri ­
stiche del suolo è possibile usare i metodi raccomandati nelle voci bibliografiche (19)(20)(21)(22)(23). La biomassa microbica va deter ­
minata utilizzando il metodo della respirazione indotta dal substrato 
(25)(26) o metodi alternativi (20).
 
1.8.3.2  Raccolta, manipolazione e conservazione dei suoli  
Occorre fornire possibilmente informazioni dettagliate circa la storia 
del sito da cui è stato raccolto il suolo per il test. Tali dettagli 
comprendono il luogo esatto, la copertura vegetale, i trattamenti con sostanze chimiche, i trattamenti con fertilizzanti organici e inor ­
ganici, l'aggiunta di materiali biologici e altri tipi di contaminazione. 
I suoli trattati con la sostanza di prova o con i suoi analoghi strut ­
turali nei precedenti quattro anni non vanno usati per gli studi sulla trasformazione (10)(15).
 
Il suolo deve essere raccolto di fresco sul campo (dall'orizzonte A o 
dallo strato superficiale di 20 cm) ad un tasso di umidità tale da facilitarne la setacciatura. Per suoli diversi da quelli provenienti dalle risaie, occorre evitare la raccolta di campioni durante o immediata ­
mente dopo lunghi periodi (> 30 giorni) di siccità, gelo o inonda ­
zione (14). I campioni vanno trasportati in modo da ridurre al mi ­
nimo l'alterazione del tasso di umidità del suolo e vanno tenuti al buio ma, per quanto possibile, con libero passaggio dell'aria. A tale 
scopo risulta generalmente adeguata una busta di polietilene con 
l'apertura allentata.
 
Il suolo deve essere trattato appena possibile dopo il campionamento. 
Occorre asportare la vegetazione, la fauna di maggiori dimensioni e 
le pietre, prima di passare il suolo attraverso un setaccio di 2 mm che rimuova le pietre, la fauna e i detriti delle piante di piccole dimen ­
sioni. Occorre evitare di essiccare e rompere eccessivamente il suolo 
prima della setacciatura (15).
 
Quando in inverno il campionamento sul campo risulta dif ­
ficoltoso (suolo gelato o coperto da strati di neve), il cam ­
pione può essere prelevato da un lotto di suolo conservato in serra sotto copertura vegetale (ad es. erba o miscugli erba-trifoglio). Sono di gran lunga preferibili gli studi con 
suoli appena raccolti dal campo, ma dovendo conservare il 
suolo raccolto e trattato prima di poter avviare lo studio, le condizioni di conservazione devono essere adeguate e limitate nel tempo (4 ± 2
 o C per un massimo di tre mesi) per 
mantenere l'attività microbica (  2 ). Istruzioni dettagliate circa la 
raccolta, la manipolazione e la conservazione dei suoli da usarsi per gli esperimenti di biotrasformazione sono reperibili in (8)(10)(15)(26)(27).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1154  
( 1 ) La caratteristica della ritenzione idrica di un suolo può essere misurata come capacità di 
campo, come capacità idrica di ritenuta o come tensione di aspirazione dell'acqua (pF). 
Per le spiegazioni, cfr. l'allegato 1. Nella relazione è necessario riferire se le caratteri ­
stiche di ritenzione idrica e il peso specifico apparente dei suoli sono stati determinati in 
campioni di campi indisturbati o in campioni disturbati (lavorati) 
( 2 ) I risultati di recenti ricerche indicano che i suoli delle zone temperate possono essere 
conservati anche a - 20  o C per oltre tre mesi (28)(29) senza perdita significativa dell'at ­
tività microbica.
 Prima che il suolo trattato venga usato per questo test, deve essere 
pre-incubato per consentire la germinazione e la rimozione dei semi, 
e per ristabilire l'equilibrio del metabolismo microbico successiva ­
mente al passaggio dalle condizioni di campionamento o conserva ­
zione alle condizioni di incubazione. Generalmente è ritenuto ade ­
guato un periodo di pre-incubazione di 2-28 giorni in cui ci si 
avvicina alle condizioni di temperatura e umidità del test vero e proprio (15). Il tempo di conservazione e di pre-incubazione non deve superare complessivamente i tre mesi.
 
1.9 ESECUZIONE DEL TEST  
1.9.1  Condizioni  
1.9.1.1  Temperatura  
Durante tutto il periodo del test, i suoli vanno incubati al buio a una 
temperatura costante rappresentativa delle condizioni climatiche del luogo in cui verranno usati o rilasciati. Una temperatura di 20 ± 2
 o C 
è consigliata per tutte le sostanze sperimentali che possono raggiun ­
gere il suolo in climi temperati. La temperatura va monitorata.  
Per le sostanze chimiche applicate o rilasciate in climi più freddi (ad 
es. nei paesi settentrionali, durante il periodo autunnale o invernale), 
occorre incubare anche altri campioni di suolo a una temperatura 
inferiore (ad es. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2  Tenore di umidità  
Per i test di trasformazione in condizioni aerobiche, il tenore di 
umidità del suolo (  1 ) deve essere regolato e mantenuto a un pF 
compreso fra 2,0 e 2,5 (3). Il tenore di umidità del suolo si esprime 
come massa di acqua per massa di suolo secco e va controllato regolarmente (ad es. a intervalli di 2 settimane) mediante pesatura dei contenitori di incubazione; eventuali perdite di acqua vanno 
compensate con un'aggiunta di acqua (preferibilmente acqua corrente 
filtrata in condizioni sterili). Nel fare questo occorre prestare atten ­
zione in modo da prevenire o ridurre al minimo le perdite di sostanza di prova e/o dei prodotti di trasformazione per volatilizzazione e/o 
fotodegradazione.
 
Per i test di trasformazione in condizioni anaerobiche e in risaia, il 
suolo va saturato di acqua mediante inondazione.  
1.9.1.3  Condizioni aerobiche di incubazione  
Nei sistemi a flusso continuo le condizioni aerobiche sono mantenute 
mediante afflusso intermittente o ventilazione continua con aria umi ­
dificata. Nei contenitori per studi biometrici, lo scambio dell'aria 
viene mantenuto per diffusione.  
1.9.1.4  Condizioni aerobiche sterili  
Per ottenere informazioni sulla rilevanza della trasformazione abio ­
tica di una sostanza di prova, i campioni di suolo possono essere sterilizzati (per i metodi di sterilizzazione, cfr. i riferimenti biblio ­
grafici 16 e 29), trattati con sostanza di prova sterile (ad es. aggiunta 
di soluzione attraverso un filtro sterile) e aerati con aria sterile umi ­
dificata come descritto nella sezione 1.9.1.3. Per i terreni da risaia, suolo e acqua vanno sterilizzati e l'incubazione va effettuata come 
descritto nella sezione 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1155  
( 1 ) Per areare e nutrire adeguatamente la microflora del suolo, il suolo non deve essere né 
troppo umido né troppo secco. I tenori di umidità raccomandati per una crescita micro ­
bica ottimale sono compresi fra il 40 e il 60 % della capacità idrica di ritenuta e fra 0,1 e 
0,33 bar (6). Quest'ultima gamma di valori equivale a una gamma pF di 2,0-2,5. Nel ­
l'allegato 2 sono indicati i tenori di umidità tipici di vari tipi di suoli.
 1.9.1.5  Condizioni anaerobiche di incubazione  
Per ottenere e mantenere condizioni anaerobiche, il suolo trattato con 
la sostanza di prova e incubato in condizioni aerobiche per 30 giorni o un tempo di dimezzamento o DT
 50 (il tempo più breve) viene 
successivamente impregnato d'acqua (strato di acqua di 1-3 cm) e 
il sistema di incubazione viene sommerso con un gas inerte (ad es. azoto o argon) (
 1 ). Il sistema di prova deve consentire di effettuare 
anche misurazioni ad es. del pH, della concentrazione di ossigeno e 
del potenziale di ossidoriduzione e comprendere dispositivi di cattura 
dei prodotti volatili. Il sistema a biometro deve essere chiuso in modo da evitare l'ingresso di aria per diffusione.
 
1.9.1.6  Condizioni di incubazione in risaia  
Per studiare la trasformazione nei suoli allagati da risaia, il suolo viene 
allagato con uno strato di acqua di circa 1-5 cm e la sostanza di prova 
viene applicata alla fase acquosa (9). Si raccomanda che il suolo sia profondo almeno 5 cm. Il sistema è ventilato con aria in condizioni aerobiche. pH, concentrazione di ossigeno e potenziale di ossidoridu ­
zione dello strato acquoso vanno monitorati e indicati nella relazione. 
Prima di iniziare gli studi sulla trasformazione il suolo va tenuto in pre- incubazione per almeno due settimane (cfr. sezione 1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Durata del test  
Gli studi sulla velocità e la via di trasmissione non dovrebbero di 
norma superare i 120 giorni (  2 ) (3)(6)(8), poiché, superato questo 
lasso di tempo, è molto probabile che in un sistema artificiale di 
laboratorio, isolato dalla naturale ricostituzione, si verifichi una ridu ­
zione dell'attività microbica. Se necessario, per caratterizzare la di ­
minuzione della sostanza di prova e la formazione e la diminuzione 
dei principali prodotti di trasformazione, è possibile continuare gli 
studi per periodi più lunghi (ad es. 6 o 12 mesi) (8). In caso di prolungamento dei tempi di incubazione occorre dare motivazione nella relazione, aggiungendo i dati delle misurazioni della biomassa 
durante e alla fine dei periodi di incubazione.
 
1.9.2  Esecuzione del test  
In ciascun contenitore per incubazione si sistemano circa 50-200 g di 
suolo (peso a secco) (cfr. figure 1 e 2 nell'allegato 3), che viene trattato con la sostanza di prova utilizzando uno dei metodi descritti 
nella sezione 1.8.2. Se si impiegano solventi organici per l'applica ­
zione della sostanza di prova, è necessario eliminarli dal suolo per evaporazione. Il suolo va poi miscelato accuratamente con una spa ­
tola e/o scuotendo il contenitore. Se si conduce lo studio in condi ­
zioni di risaia, occorre miscelare accuratamente acqua e suolo dopo 
l'applicazione della sostanza di prova. Allo scopo di controllare la distribuzione uniforme della sostanza di prova, questa va ricercata analizzando piccole quantità (ad es. 1 g) dei suoli trattati. Per un 
metodo alternativo, cfr. sotto.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1156  
( 1 ) Le condizioni aerobiche sono dominanti nei suoli superficiali e anche negli strati sotto la 
superficie, come dimostrato dal progetto di ricerca sponsorizzato dall'UE [K. Takagi et 
al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. 
Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Condi ­
zioni anaerobiche possono verificarsi solo occasionalmente durante l'inondazione dei 
suoli dopo forti piogge o quando le risaie vengono sommerse. 
(
 2 ) Gli studi aerobici possono essere conclusi molto prima di 120 giorni, a condizione che al 
momento della conclusione siano state raggiunte con certezza la via definitiva di tra ­
sformazione e la massima mineralizzazione. È possibile concludere il test dopo 120 
giorni o quando almeno il 90 % della sostanza di prova è trasformata, ma solo se si è 
formato almeno il 5 % di CO  2 .
 Il tasso di concentrazione delle sostanze per il trattamento deve 
corrispondere al tasso più elevato di applicazione di un prodotto 
fitosanitario indicato nelle istruzioni per l'uso e con incorporazione uniforme a una profondità adeguata nel terreno del campo (ad es. strato superficiale di 10 cm (
 1 ) di suolo). Per esempio, per le sostanze 
chimiche da applicare sul fogliame o sul suolo senza incorporazione, 
la profondità corretta per calcolare quanta sostanza chimica occorre aggiungere a ciascun contenitore è 2,5 cm. Per le sostanze chimiche da incorporare nel suolo, la profondità corretta è la profondità di 
incorporazione specificata nelle istruzioni per l'uso. Per le sostanze 
chimiche generiche, il tasso di applicazione va calcolato sulla base della via di somministrazione più rilevante; per esempio, quando la principale via di somministrazione nel suolo sono i fanghi di acque 
reflue, la sostanza chimica va dosata nel fango ad una concentra ­
zione che rispecchi il normale carico di fanghi nei suoli agricoli. Se tale concentrazione non è sufficientemente elevata per identificare i principali prodotti di trasformazione, può essere utile l'incubazione di 
campioni di suolo separati con tenore più elevato, ma è importante 
evitare di eccedere nelle quantità per non avere reazioni che influi ­
scono sulle funzioni microbiche (cfr. sezioni 1.5 e 1.8.2).
 
In alternativa è possibile trattare con la sostanza di prova un lotto più 
esteso (ad es. di 1-2 kg), accuratamente mescolato in un miscelatore adeguato e poi diviso in porzioni più piccole di 50-200 g nei con ­
tenitori per l'incubazione (per esempio usando inquartatori di cam ­
pioni). Allo scopo di controllare la distribuzione uniforme della so ­
stanza di prova, questa va ricercata analizzando piccole quantità (ad es. 1 g) del lotto di suolo trattato. Una procedura di questo tipo è preferibile, in quanto consente una distribuzione più uniforme della 
sostanza di prova nel suolo.
 
Anche i campioni di suolo non trattati vengono incubati nelle stesse 
condizioni (aerobiche) dei campioni trattati con la sostanza di prova. 
Tali campioni sono usati per le misurazioni della biomassa durante e 
alla fine degli studi.  
Quando la sostanza di prova viene applicata al suolo disciolta in uno 
o più solventi organici, occorre incubare anche campioni di suolo 
trattati con la stessa quantità di solvente/i mantenendo le stesse con ­
dizioni (aerobiche) utilizzate per i campioni trattati con la sostanza di prova. I campioni trattati vengono usati per le misurazioni della 
biomassa all'inizio, durante e alla fine degli studi per controllare 
gli eventuali effetti del/i solvente/i sulla biomassa microbica.
 
I contenitori con il suolo trattato vengono collegati al sistema a 
flusso continuo descritto nella figura 1 o chiusi con la colonna di 
assorbimento di cui alla figura 2 (cfr. allegato 3).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1157  
( 1 ) Calcolo della concentrazione iniziale su una base d'area usando la seguente equazione:  
C soil ½mg=kg soil â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg=kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d½kg soil=m 3 â 
C soil = concentrazione iniziale nel suolo [mg · kg] 
A = tasso di applicazione [kg · ha -1 ]; l = spessore dello strato di suolo nel campo [m]; 
d = peso specifico apparente secco del suolo [kg · m -3 ]. 
Di massima, con un tasso di applicazione di 1 kg · ha -1 si ottiene una concentrazione nel suolo 
di circa 1 mg · kg -1 in uno strato di 10 cm (presupponendo un peso specifico apparente di 
1 g· cm  -3 ).
 1.9.3  Campionamento e misurazione  
I contenitori doppi per l'incubazione vengono rimossi ad opportuni 
intervalli di tempo per estrarre i campioni di suolo con solventi appropriati di diversa polarità che vengono poi analizzati alla ricerca 
della sostanza di prova e/o di prodotti di trasformazione. Uno studio 
ben disegnato prevede un numero sufficiente di contenitori per con ­
sentire di sacrificare due contenitori durante ciascun campionamento. Inoltre, le soluzioni di assorbimento o i materiali solidi di assorbi ­
mento vengono rimossi a vari intervalli di tempo (intervalli di 7 
giorni durante il primo mese e, successivamente, a intervalli di 17 giorni) durante e alla fine dell'incubazione di ciascun campione e 
analizzati alla ricerca di prodotti volatili. Oltre a un campione di 
suolo prelevato subito dopo l'applicazione (campione del giorno 0) occorre prevedere almeno altri 5 momenti di campionamento. Gli intervalli di tempo vanno scelti in modo da poter stabilire una co ­
stante di diminuzione della sostanza di prova e costanti di forma ­
zione e diminuzione dei prodotti di trasformazione (ad es. giorni 0, 1, 3, 7; settimane 2, 3; mesi 1, 2, 3, ecc.).
 
Quando si utilizza una sostanza di prova  14 C-marcata, la radioattività 
non estraibile verrà quantificata per combustione e per ogni inter ­
vallo di campionamento verrà calcolato un bilancio di massa.  
Nel caso di incubazione anaerobica e in risaia, le fasi di suolo e 
d'acqua vengono analizzate insieme per ricercare la sostanza di prova 
e i prodotti di trasformazione, oppure separate per filtrazione o cen ­
trifugazione prima dell'estrazione e dell'analisi.  
1.9.4  Test opzionali  
Studi aerobici, non sterili, ad altre temperature e diverse concentra ­
zioni di umidità del suolo possono risultare utili per stimare gli effetti della temperatura e dell'umidità del suolo sulla velocità di 
trasformazione di una sostanza di prova e/o dei suoi prodotti di 
trasformazione nel suolo.
 
È possibile tentare un'ulteriore caratterizzazione della radioattività 
non estraibile usando, ad esempio, l'estrazione fluida supercritica.  
2. DATI  
2.1 TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Le quantità delle sostanza di prova, dei prodotti di trasformazione e 
delle sostanze volatili (solo in %) e non estraibili vanno indicate 
come % della concentrazione iniziale applicata e, ove pertinente, in 
mg· kg  -1 di suolo (in base al peso secco del suolo) per ciascun 
intervallo di campionamento. È necessario indicare in percentuale l'equilibrio di massa della concentrazione iniziale applicata per cia ­
scun intervallo di campionamento. La presentazione grafica delle 
concentrazioni della sostanza di prova in funzione del tempo con ­
sentirà una stima del suo tempo di dimezzamento o DT
 50 di trasfor ­
mazione. È inoltre necessario identificare i principali prodotti di 
trasformazione, rappresentandone graficamente le concentrazioni in 
funzione del tempo per evidenziarne la velocità di formazione e di diminuzione. Per principale prodotto di trasformazione si intende qualsiasi prodotto che rappresenti ≥ 10 % della dose applicata in 
qualsiasi momento nel corso dello studio.
 
I prodotti volatili intrappolati forniscono una certa indicazione del 
potenziale di volatilità di una sostanza di prova e dei suoi prodotti di 
trasformazione dal suolo.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1158
 
È possibile calcolare in modo più accurato i tempi di dimezzamento 
o i valori DT  50 e, se pertinente, i valori DT  75 e DT  90 utilizzando 
adeguati modelli cinetici. Il tempo di dimezzamento e i valori DT  50 
vanno riportati nella relazione insieme alla descrizione del modello 
usato, dell'ordine della cinetica e del coefficiente di determinazione 
(r 2 ). Si preferisce la cinetica di primo ordine, a meno che r  2 < 0,7. Se 
del caso, i calcoli vanno applicati anche ai principali prodotti di trasformazione. Nei riferimenti bibliografici da 31 a 35 sono descritti esempi di modelli adeguati.
 
Nel caso di studi sulla velocità eseguiti a diverse temperature, le 
velocità di trasformazione vanno descritte come funzione della tem ­
peratura all'interno della gamma di temperature sperimentali, usando il rapporto di Arrhenius della formula:
 
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
dove ln A e B sono costanti di regressione, rispettivamente, dall'in ­
tercetta e dalla pendenza di una retta best fit generata dalla regres ­
sione lineare di ln k rispetto a 1/T, k è la velocità costante alla 
temperatura T e T è la temperatura in Kelvin. Occorre prestare attenzione alla gamma limitata di temperature in cui il rapporto di Arrhenius sarà valido nel caso la trasformazione sia governata dal ­
l'azione microbica.
 
2.2 VALUTAZIONE E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Sebbene gli studi vengano eseguiti in un sistema artificiale di labo ­
ratorio, i risultati consentiranno di stimare la velocità di trasforma ­
zione della sostanza di prova, oltre che il tasso di formazione e diminuzione dei prodotti di trasformazione in condizioni paragonabili 
a quelle di campo (36)(37).
 
Lo studio della via di trasformazione di una sostanza di prova forni ­
sce informazioni sul modo in cui la sostanza applicata viene modi ­
ficata strutturalmente nel suolo da reazioni chimiche e microbiche.  
3. RELAZIONE  
RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione sull'esecuzione del test deve contenere le seguenti in ­
formazioni specifiche:  
Sostanza di prova:  
— denominazione comune, nome chimico, numero CAS, formula di 
struttura [indicante la(e) posizione(i) della(e) marcatura(e) quando 
si utilizza materiale radiomercato] e proprietà fisico-chimiche 
pertinenti (cfr. sezione 1.5);  
— purezza (impurità) della sostanza di prova;  
— purezza radiochimica della sostanza chimica marcata e attività 
specifica (ove pertinente).  
Sostanze di riferimento:  
— nome chimico e struttura delle sostanze di riferimento usate per 
la caratterizzazione e/o l'identificazione dei prodotti di trasforma ­
zione.  
Suoli sperimentali:  
— particolari riguardanti il sito di raccolta;  
— data e procedura di campionamento dei suoli;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1159
 
— proprietà dei suoli, quali pH, contenuto di carbonio organico, 
tessitura (% sabbia, % limo, % argilla), capacità di scambio dei 
cationi, peso specifico apparente, caratteristiche di ritenzione idrica e biomassa microbica;
 
— durata della conservazione del suolo e condizioni di conserva ­
zione (se pertinente).  
Condizioni del test:  
— date di esecuzione degli studi;  
— quantità di sostanza di prova applicata;  
— solventi usati e metodo di applicazione per la sostanza di prova;  
— peso del suolo trattato inizialmente e campionato a ciascun in ­
tervallo per essere analizzato;  
— descrizione del sistema di incubazione;  
— tassi di flusso dell'aria (solo per i sistemi a flusso continuo);  
— temperatura dell'ambiente sperimentale;  
— tasso di umidità del suolo durante l'incubazione;  
— biomassa microbica all'inizio, durante e alla fine degli studi ae ­
robici;  
— pH, concentrazione di ossigeno e potenziale di ossidoriduzione 
all'inizio, durante e alla fine degli studi anaerobici e in risaia;  
— metodo/i di estrazione;  
— metodi per la quantificazione e l'identificazione della sostanza di 
prova e dei principali prodotti di trasformazione nel suolo e nei materiali di assorbimento;
 
— numero di replicati e numero di controlli.  
Risultati:  
— risultato della determinazione dell'attività microbica;  
— ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici usati;  
— tassi di recupero (i valori % per uno studio valido sono indicati 
nella sezione 1.7.1);  
— tabelle dei risultati espressi in % della dose iniziale applicata e, 
ove pertinente, in mg · kg -1 di suolo (base di peso secco);  
— bilancio di massa durante e alla fine degli studi;  
— caratterizzazione della radioattività o dei residui non estraibili nel 
suolo;  
— quantificazione del CO  2 e di altre sostanze volatili rilasciate;  
— grafici delle concentrazioni nel suolo in funzione del tempo rife ­
riti alla sostanza di prova e, ove pertinente, ai principali prodotti 
di trasformazione;  
— tempo di dimezzamento o DT  50 , DT  75 e DT  90 della sostanza di 
prova e, ove pertinente, dei principali prodotti di trasformazione, 
compresi gli intervalli di confidenza;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1160
 
— stima della velocità di degradazione abiotica in condizioni sterili;  
— una valutazione della cinetica di trasformazione per la sostanza di 
prova e, ove pertinente, per i principali prodotti di trasformazione;  
— vie di trasformazione proposte, ove pertinente;  
— discussione e interpretazione dei risultati;  
— dati originali (cioè cromatogrammi campione, calcoli campione 
dei tassi di trasformazione e metodi usati per identificare i pro ­
dotti di trasformazione).  
4. BIBLIOGRAFIA  
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ALLEGATO 1  
TENSIONE DELL'ACQUA, CAPACITÀ DI CAMPO (FC) E CAPACITÀ 
DI RITENUTA IDRICA (WHC)  ( 1 ) 
Altezza della colonna d'acqua 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Note  
10 7 7 10  4 Suolo secco 
1,6 · 10 4 4,2 16 Punto di appassimento 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Gamma della capacità di 
campo (  d ) imazione) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (approssimazione) 
1 0 0,001 Suolo saturato d'acqua
 
( a ) pF = log di cm di colonna d'acqua. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Corrisponde a un contenuto idrico approssimativo del 10 % in sabbia, 35 % in limo e 45 % in argilla. 
( d ) La capacità di campo non è costante ma varia con il tipo di suolo fra pF 1,5 e 2,5.  
La tensione dell'acqua  si misura in cm di colonna d'acqua o in bar. A motivo dell'ampia gamma di 
tensione di aspirazione viene espressa semplicemente come valore pF, che è equivalente al loga ­
ritmo di cm di colonna d'acqua.  
La capacità di campo  si definisce come la quantità d'acqua che può essere conservata contro la 
gravità da parte di un suolo naturale 2 giorni dopo un periodo di pioggia prolungato o dopo irrigazione sufficiente. Viene determinata in suolo indisturbato in situ nel campo. La misurazione, pertanto, non è applicabile ai campioni di suolo disturbati di laboratorio. I valori FC determinati in 
suoli disturbati possono presentare notevoli varianze sistematiche.
 
La capacità di ritenuta idrica  (WHC) si definisce in laboratorio con suolo indisturbato e disturbato 
saturando una colonna di suolo con acqua per trasporto capillare. È particolarmente utile per i suoli disturbati e può essere fino al 30 % superiore alla capacità di campo (1). Inoltre, sperimentalmente è 
più semplice da determinare rispetto ai valori affidabili diFC.
 
Note  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1164
 
ALLEGATO 2  
CONTENUTO DI UMIDITÀ DEL SUOLO (g di acqua per 100 g di suolo secco) DI VARI 
TIPI DI SUOLO DA DIVERSI PAESI  
Contenuto di umidità del suolo a 
Tipo di suolo Paese 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Sabbia Germania 28,7 8,8 3,9 
Sabbia limosa Germania 50,4 17,9 12,1 Sabbia limosa Svizzera 44,0 35,3 9,2 
Limo fangoso Svizzera 72,8 56,6 28,4 
Limo argilloso Brasile 69,7 38,4 27,3 Limo argilloso Giappone 74,4 57,8 31,4 Limo sabbioso Giappone 82,4 59,2 36,0 Limo fangoso USA 47,2 33,2 18,8 Limo sabbioso USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Capacità di ritenuta idrica.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1165
 
ALLEGATO 3  
Figura 1  
Esempio di apparecchio a flusso continuo per studiare la trasformazione delle sostanze 
chimiche nel suolo  ( 1 ) ( 2 )
 
Figura 2  
Esempio di contenitori per sistemi a biometro per studiare la trasformazione delle sostanze 
chimiche nel suolo  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1166  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  TRASFORMAZIONE AEROBICA E ANAEROBICA NEI 
SISTEMI SEDIMENTOSI ACQUATICI  
1. METODO  
Questo metodo di prova corrisponde al TG 308 (2002) dell'OCSE.  
1.1 INTRODUZIONE  
Le sostanze chimiche possono penetrare nelle acque superficiali, 
basse o profonde, per applicazione diretta, deriva di sostanze nebu ­
lizzate, deflusso, drenaggio, smaltimento di rifiuti, effluenti industria ­
li, domestici o agricoli e deposizione atmosferica. Questo metodo di prova descrive un metodo di laboratorio per determinare la trasfor ­
mazione aerobica e anaerobica di sostanze chimiche organiche nei 
sistemi sedimentosi acquatici. Esso si basa su linee guida esistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6). Un gruppo di lavoro OCSE sulla selezione dei suoli e dei sedimenti, tenuto a Belgirate nel 1995 (7), ha definito, 
in particolare, il numero e il tipo di sedimenti da usare per questo 
test e ha formulato alcune raccomandazioni sulla raccolta, la mani ­
polazione e la conservazione di campioni di sedimento, sulla base di norme ISO (8). Questi studi sono necessari per esaminare le sostanze 
chimiche che sono direttamente introdotte nell'acqua o che hanno la 
possibilità di raggiungere l'ambiente acquatico tramite le vie sopra menzionate.
 
I sistemi sedimentosi acquatici naturali hanno speso condizioni ae ­
robiche nella fase acquosa superiore. Lo strato superficiale del sedi ­
mento può essere aerobico o anaerobico, mentre il sedimento più 
profondo è solitamente anaerobico. Per tenere conto di tutte queste 
possibilità, il presente documento descrive prove sia aerobiche, sia anaerobiche. La prova aerobica simula una colonna d'acqua aerobica sopra uno strato di sedimento aerobico sotto il quale si trova un 
gradiente anaerobico. La prova anaerobica simula un sistema ac ­
qua-sedimento completamente anaerobico. Vi sono altri metodi uti ­
lizzabili in circostanze nelle quali occorre scostarsi significativamente da queste raccomandazioni, per esempio impiegando nuclei di sedi ­
mento intatti o sedimenti che potrebbero essere stati esposti alla 
sostanza di prova (9).
 
1.2 DEFINIZIONI  
In tutti i casi vanno applicate le unità del sistema internazionale (SI).  
Sostanza di prova:  qualsiasi sostanza, sia un composto progenitore 
che i relativi prodotti di trasformazione.  
Prodotti di trasformazione:  tutte le sostanze derivate da reazioni di 
trasformazione biotica o abiotica della sostanza di prova, compresi CO
 2 e i residui non estraibili.  
Residui non estraibili:  composti presenti nel suolo, nelle piante o 
negli animali, che dopo estrazione persistono nella matrice sotto 
forma di sostanza progenitrice o di uno o più dei suoi metaboliti. 
Il metodo di estrazione non deve alterare in modo considerevole i composti stessi o la struttura della matrice. La natura del legame può essere chiarita, in parte, mediante metodi di estrazione che alterano la 
matrice e sofisticate tecniche analitiche. Finora, ad esempio, sono 
stati individuati in questo modo legami ionici covalenti e di assorbimento/adsorbimento, come pure le catture. In generale, la formazione di residui non estraibili riduce la bioaccessibilità e la 
biodisponibilità in maniera significativa (10) [modificato da IUPAC 
1984 (11)].
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Trasformazione aerobica:  (ossidante): reazioni che si verificano in 
presenza di ossigeno molecolare (12).  
Trasformazione anaerobica:  (riducente): reazioni che si verificano 
in assenza di ossigeno molecolare (12).  
Acque naturali:  acque superficiali ottenute da laghi, fiumi, ruscelli, 
ecc. 
Sedimento:  miscela di costituenti chimici inorganici e organici, que ­
sti ultimi contenenti composti ad elevato contenuto di carbonio e azoto e di elevata massa molecolare. Viene depositato dall'acqua 
naturale con cui forma un'interfaccia.
 
Mineralizzazione:  degradazione completa di un composto organico 
in CO  2 e H  2 O in condizioni aerobiche, e in CH  4 , CO  2 e H  2 O in 
condizioni anaerobiche. Nel contesto del presente metodo di prova, quando viene impiegato un composto radiomarcato, la mineralizza ­
zione rappresenta la degradazione di una molecola, durante la quale 
un atomo di carbonio marcato viene ossidato o ridotto in maniera quantitativa, con rilascio della quantità appropriata di
 14 CO 2 o 
14 CH 4 , a seconda dei casi.  
Tempo di dimezzamento:  t 0,5 : il tempo occorrente per la trasforma ­
zione del 50 % di una sostanza di prova, quando la trasformazione 
può essere descritta mediante cinetica di primo ordine; essa è indi ­
pendente dalla concentrazione iniziale.  
DT 50 (Tempo di scomparsa 50):  tempo entro cui la concentrazione 
iniziale della sostanza di prova viene ridotta del 50 %.  
DT 75 (Tempo di scomparsa 75):  tempo entro cui la concentrazione 
iniziale della sostanza di prova viene ridotta del 75 %.  
DT 90 (Tempo di scomparsa 90):  tempo entro cui la concentrazione 
iniziale della sostanza di prova viene ridotta del 90 %.  
1.3 SOSTANZE DI RIFERIMENTO  
Per identificare e determinare quantitativamente i prodotti di trasfor ­
mazione mediante metodi spettroscopici e cromatografici vengono utilizzate sostanze di riferimento.
 
1.4 INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Per misurare la velocità di trasformazione è possibile utilizzare una 
sostanza di prova non marcata o marcata con isotopo, ma si preferi ­
sce il materiale marcato. Il materiale marcato è essenziale per lo 
studio delle vie di trasformazione e per determinare il bilancio di massa. È consigliata la marcatura con
 14 C, ma possono anche rive ­
larsi utili altri isotopi, quali  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. La marcatura va 
posizionata nei limiti del possibile nella parte o nelle parti più stabili 
della molecola (  1 ). La purezza chimica e/o radiochimica della so ­
stanza di prova deve essere almeno pari al 95 %.  
Prima di eseguire la prova devono essere disponibili le seguenti 
informazioni sulla sostanza di prova:  
a) solubilità in acqua (Metodo A.6);  
b) solubilità in solventi organici;  
c) pressione di vapore (Metodo A.4) e costante della legge di Henry;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1168  
( 1 ) Se, per esempio, la sostanza contiene un anello, la marcatura va effettuata su questo 
anello; se la sostanza di prova contiene due o più anelli, potrebbero rilevarsi necessari 
più studi per determinare il destino di ciascun anello marcato e per ottenere informazioni 
adeguate sulla formazione dei prodotti di trasformazione.
 d) coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua (Metodo A.8);  
e) coefficiente di adsorbimento (K  d , K  f o K  oc , a seconda dei casi) 
(Metodo C.18);  
f) idrolisi (Metodo C.7);  
g) costante di dissociazione (pK  a ) [linee guida OCSE 112] (13);  
h) struttura chimica della sostanza di prova ed eventuale posizione 
della marcatura isotopica.  
Nota.  Va indicata la temperatura alla quale vengono effettuate queste 
misurazioni.  
Altre informazioni utili possono comprendere i dati sulla tossicità 
della sostanza di prova nei confronti di microrganismi, i dati sulla 
biodegradabilità rapida e/o intrinseca, e i dati sulla trasformazione aerobica e anaerobica nel suolo.
 
Dovrebbero essere disponibili metodi analitici (compresi i metodi di 
estrazione e depurazione) per l'identificazione e la determinazione quantitativa della sostanza di prova e dei suoi prodotti di trasforma ­
zione nell'acqua e nel sedimento (vedi sezione 1.7.2).
 
1.5 PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA  
Il metodo descritto in questo test utilizza un sistema sedimentoso 
acquatico aerobico e uno anaerobico (vedi allegato 1) che consente:  
i) la misurazione della velocità di trasformazione della sostanza di 
prova in un sistema acqua-sedimento;  
ii) la misurazione della velocità di trasformazione della sostanza di 
prova nel sedimento,  
iii) la misurazione della velocità di mineralizzazione della sostanza 
di prova e/o dei suoi prodotti di trasformazione (quando viene 
usata una sostanza di prova marcata con  14 C), 
iv) l'identificazione e la determinazione quantitativa dei prodotti di 
trasformazione della fase acquosa e di quella sedimentosa, com ­
preso il bilancio di massa (quando viene usata una sostanza di 
prova marcata),  
v) la misurazione della distribuzione della sostanza di prova e dei 
suoi prodotti di trasformazione tra le due fasi durante il periodo di incubazione al buio (per evitare ad esempio la fioritura delle alghe) a temperatura costante. I tempi di dimezzamento e i valori 
di DT
 50 , DT  75 e DT  90 vengono determinati quando i dati lo 
dovessero consigliare, ma non vanno estrapolati di molto oltre l'intervallo sperimentale (vedi sezione 1.2).
 
Per ciascuno degli studi aerobico e anaerobico occorrono almeno due 
sedimenti con le rispettive acque (7). In determinati casi occorre però utilizzare più di due sedimenti acquatici, ad esempio nel caso di una 
sostanza chimica che può essere presente in ambienti di acqua dolce 
e/o in ambienti marini.
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1.6 APPLICABILITÀ DEL TEST  
Il metodo è generalmente applicabile alle sostanze chimiche (marcate 
o non marcate) per le quali è noto un metodo analitico sufficiente ­
mente accurato e sensibile. Esso è applicabile a composti legger ­
mente volatili, non volatili, idrosolubili o scarsamente idrosolubili. 
Il test non va applicato a sostanze chimiche che presentano elevata volatilità in acqua (ad esempio fumiganti, solventi organici), che non possono pertanto essere tenute in acqua e/o nel sedimento nelle 
condizioni sperimentali del presente test.
 
Il metodo è stato applicato finora per studiare la trasformazione di 
sostanze chimiche in acque dolci e sedimenti, ma in linea di princi ­
pio può anche essere applicato a sistemi estuariali o marini. Esso non 
è invece idoneo alla simulazione delle condizioni di acqua corrente (ad esempio nei fiumi) o di mare aperto.
 
1.7 CRITERI DI QUALITÀ  
1.7.1  Recupero  
L'estrazione e l'analisi di campioni di acqua e sedimento, perlomeno 
in duplicato, subito dopo l'aggiunta della sostanza di prova, forni ­
scono una prima indicazione della ripetibilità del metodo analitico e dell'uniformità della procedura di applicazione per la sostanza di 
prova. Le percentuali di recupero per gli stadi successivi degli espe ­
rimenti sono basate sui rispettivi bilanci di massa (quando viene usato materiale marcato) e dovrebbero essere comprese tra 90 % e 110 % per le sostanze chimiche marcate (6) e tra 70 % e 110 % per 
le sostanze chimiche non marcate.
 
1.7.2  Ripetibilità e sensibilità del metodo analitico  
La ripetibilità del metodo analitico (esclusa l'efficienza dell'estrazione 
iniziale) utilizzato per quantificare la sostanza di prova e i prodotti di trasformazione può essere controllata mediante un'analisi in duplicato 
dello stesso estratto dei campioni di acqua o sedimento, incubati 
sufficientemente a lungo per consentire la formazione di prodotti di trasformazione.
 
Il limite di rivelabilità del metodo analitico per la sostanza di prova e 
i prodotti di trasformazione deve essere pari ad almeno 0,01 mg · kg -1 
in acqua o sedimento (come sostanza di prova) o all'1 % della 
quantità iniziale applicata a un sistema di prova, se minore del precedente. Va anche specificato il limite di quantificazione.
 
1.7.3  Accuratezza dei dati sulla trasformazione  
L'analisi di regressione delle concentrazioni della sostanza di prova 
in funzione del tempo fornisce dati adeguati sull'accuratezza della curva di trasformazione e consente di calcolare gli intervalli di con ­
fidenza per i tempi di dimezzamento (in caso di cinetica del pseudo 
primo ordine) o i valori di DT
 50 e, se del caso, DT  75 e DT  90 . 
1.8 DESCRIZIONE DEL METODO  
1.8.1  Sistema di prova e attrezzatura  
Lo studio va eseguito in contenitori di vetro (ad esempio bottiglie, 
provette da centrifuga) salvo quando dati preliminari (quali il coef ­
ficiente di ripartizione n-ottanolo-acqua, i dati di assorbimento/ ­
adsorbimento, ecc.) indicano che la sostanza di prova può aderire al vetro, nel qual caso potrebbe essere necessario prendere in consi ­
derazione un materiale alternativo (ad esempio teflon). Se è noto che 
la sostanza di prova aderisce al vetro, può essere possibile ovviare al 
problema mediante uno o più dei metodi seguenti:
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1170
 
— determinazione della massa della sostanza di prova e dei prodotti 
di trasformazione assorbiti sul vetro;  
— lavaggio con solvente di tutta la vetreria al termine della prova;  
— impiego di prodotti formulati (vedi anche sezione 1.9.2);  
— uso di una quantità maggiore di cosolvente per l'aggiunta della 
sostanza di prova al sistema; l'eventuale cosolvente impiegato deve essere tale da non sottoporre a solvolisi la sostanza di 
prova.
 
Gli allegati 2 e 3 riportano esempi di attrezzature di prova tipiche, 
ossia, rispettivamente, a flusso continuo e con sistema a biometro 
(14). Altri sistemi ad incubazione utili sono descritti nel riferimento bibliografico 15. L'attrezzatura sperimentale deve essere progettata in modo tale da consentire lo scambio di aria o azoto e la cattura dei 
prodotti volatili. Le sue dimensioni devono essere tali da soddisfare i 
requisiti del test (vedi sezione 1.9.1). La ventilazione può essere garantita mediante un leggero gorgogliamento o mediante il passag ­
gio di aria o azoto sopra la superficie dell'acqua. In quest'ultimo caso 
può essere consigliabile agitare leggermente l'acqua dall'alto, per 
migliorare la distribuzione dell'ossigeno o dell'azoto nell'acqua. Non va impiegata aria priva di CO
 2 che potrebbe portare all'aumento 
del pH dell'acqua. In entrambi i casi è bene evitare se possibile di 
disturbare il sedimento. Le prove su sostanze chimiche leggermente 
volatili vanno effettuate in un sistema a biometro con leggera agita ­
zione della superficie dell'acqua. Si possono anche usare recipienti chiusi con uno spazio di testa di aria atmosferica o azoto e fiale 
interne per la cattura dei prodotti volatili (16). Nella prova aerobica il 
gas contenuto nello spazio di testa va scambiato ad intervalli regolari per compensare il consumo di ossigeno ad opera della biomassa.
 
Come trappole idonee per la cattura di prodotti di trasformazione volatili 
si possono impiegare, senza però alcuna limitazione, soluzioni da 1 mol · 
dm -3 di idrossido di potassio o idrossido di sodio per l'anidride 
carbonica (  1 ), e glicole etilenico, etanolammina o paraffina al 2 % in 
xilene per i composti organici. Le sostanze volatili formate in condizioni anaerobiche, quali metano, possono essere raccolte per esempio me ­
diante setacci molecolari. Tali sostanze possono ad esempio essere bru ­
ciate per produrre CO
 2 facendo passare il gas attraverso un tubo in 
quarzo riempito con CuO alla temperatura di 900  o C e catturando la 
CO 2 formata in un assorbitore contenente un alcale (17).  
È necessaria una strumentazione da laboratorio per l'analisi chimica 
della sostanza di prova e dei prodotti di trasformazione [ad esempio 
cromatografia gas liquido (GLC), cromatografia liquida ad alta riso ­
luzione (HPLC), cromatografia su strato sottile (TLC), spettroscopia di massa (MS), gas cromatografia-spettroscopia di massa (GC-MS), cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), risonanza 
magnetica nucleare (NMR), ecc.], ivi compresi i sistemi di rileva ­
mento per le sostanze chimiche radiomarcate o non marcate, a seconda dei casi. Quando si usa materiale radiomarcato occorrono inoltre un contatore a scintillazione a liquido e un ossidatore a com ­
bustione (per la combustione dei campioni di sedimento prima del ­
l'analisi della radioattività).
 
Servono inoltre altre normali attrezzature da laboratorio per misura ­
zioni fisico-chimiche e biologiche (vedi la tabella 1, sezione 1.8.2.2), vetreria, sostanze chimiche e reagenti, secondo necessità.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1171  
( 1 ) Poiché queste soluzioni di assorbimento alcaline assorbono anche l'anidride carbonica 
proveniente dall'aria di ventilazione e quella prodotta per respirazione negli esperimenti 
aerobici, esse vanno cambiate ad intervalli regolari per evitarne la saturazione con con ­
seguente perdita di capacità assorbente.
 1.8.2  Selezione e numero dei sedimenti acquatici  
I siti di campionamento vanno selezionati in funzione delle finalità 
del test in ogni situazione sperimentale. Ai fini della selezione dei siti di campionamento occorre prendere in considerazione tutti gli 
eventuali apporti agricoli, industriali e domestici verificatisi nella 
zona interessata e nelle acque a monte. Non vanno impiegati sedi ­
menti che sono stati contaminati con la sostanza di prova o con i suoi analoghi strutturali nel corso dei precedenti 4 anni.
 
1.8.2.1  Selezione del sedimento  
Per gli studi aerobici vengono normalmente usati due sedimenti (7). I 
due sedimenti selezionati dovrebbero essere diversi in quanto a con ­
tenuto di carbonio organico e tessitura. Uno dei sedimenti dovrebbe 
avere contenuto elevato di carbonio organico (2,5-7,5 %) e tessitura 
fine, mentre l'altro sedimento dovrebbe avere basso contenuto di carbonio organico (0,5-2,5 %) e tessitura grossa. La differenza tra i contenuti di carbonio organico deve essere normalmente pari al ­
meno al 2 %. Per «tessitura fine» si intende un contenuto di 
[argilla + limo] (
 1 ) > 50 %, e per «tessitura grossa» un contenuto 
di [argilla + limo] < 50 %. Di norma la differenza di contenuto di [argilla + limo] dei due sedimenti deve essere almeno pari al 20 %. 
Nei casi in cui la sostanza chimica potrebbe anche raggiungere le 
acque marine è necessario che almeno uno dei sistemi acqua-sedi ­
mento abbia origine marina.
 
Per lo studio strettamente anaerobico vanno prelevati due campioni 
di sedimento (comprese le rispettive acque) da zone anaerobiche dei 
corpi d'acqua superficiali (7). Entrambe le fasi sedimentose e ac ­
quose vanno maneggiate e trasportate con cura in ambiente privo di ossigeno.
 
Potrebbero esserci altri fattori importanti nella scelta dei sedimenti, 
che vanno presi in considerazione caso per caso. L'intervallo di pH dei sedimenti, ad esempio, assumerebbe notevole importanza qualora 
la trasformazione e/o l'assorbimento della sostanza chimica oggetto 
della prova dipendessero dal pH. La dipendenza dal pH dell'assor ­
bimento potrebbe riflettersi nel pK
 a della sostanza di prova.  
1.8.2.2  Caratterizzazione dei campioni acqua-sedimento  
Nella tabella seguente sono riassunti i parametri principali da misu ­
rare e documentare (con riferimento al metodo utilizzato) sia per 
l'acqua, sia per il sedimento, con indicazione delle fasi del test in cui tali parametri vanno determinati. Per ulteriori informazioni sui metodi per la determinazione di questi parametri si rimanda ai rife ­
rimenti bibliografici (18)(19)(20)(21).
 
Potrebbe inoltre essere necessario misurare e documentare altri pa ­
rametri, a seconda dei casi [ad esempio, per acqua dolce: particelle, 
alcalinità, durezza, conduttività, NO  3 /PO  4 (rapporto e valori singoli); 
per i sedimenti: capacità di scambio cationico, capacità di tratteni ­
mento dell'acqua, carbonato, azoto e fosforo totali; per sistemi ma ­
rini: salinità]. Per valutare le condizioni di ossido-riduzione potrebbe 
inoltre rivelarsi utile l'analisi di nitrato, solfato, ferro biodisponibile 
ed eventualmente altri accettori elettronici nell'acqua e nei sedimenti, soprattutto in relazione alla trasformazione anaerobica.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1172  
( 1 ) [Argilla + limo] è la frazione inorganica del sedimento con particelle di dimensione < 
50 μm.
 Rilevamento dei parametri per la caratterizzazione dei campioni acqua-sedimento (7)(22)(23)  
Parametro Fase del test 
campiona ­
tura sul 
campo post-mani ­
polazione inizio del ­
l'acclimata ­
zione inizio della 
prova durante la 
prova termine 
della prova  
Acqua  
Origine/fonte x 
Temperatura x 
pH x x x x x TOC x x x Concentrazione di O
 2 (*) x x x x x 
Potenziale Redox (*) x x x x  
Sedimento  
Origine/fonte x Profondità dello strato x pH x x x x x 
Distribuzione della dimensione 
delle particelle x 
TOC x x x x 
Biomassa microbica (**) x x x Potenziale Redox (*) Osserva ­
zione (colore/ 
odore) x x x x
 
(*) Studi recenti hanno mostrato che le misurazioni delle concentrazioni dell'ossigeno in acqua e dei potenziali redox non 
hanno valore meccanicistico né predittivo sulla crescita e lo sviluppo di popolazioni microbiche in acque superficiali 
(24)(25). La determinazione della domanda biochimica d'ossigeno (BOD, in corrispondenza della campionatura sul 
campo, dell'inizio e del termine della prova) e delle concentrazioni dei micro/macro nutrienti Ca, Mg e Mn (all'inizio 
e alla fine della prova) in acqua, nonché la misurazione dell'N totale e del P totale nei sedimenti (in corrispondenza 
della campionatura sul campo e al termine della prova) possono rivelarsi più adatte per l'interpretazione e la 
valutazione delle velocità e delle vie di biotrasformazione aerobica. 
(**) Metodo della velocità di respirazione microbica (26), metodo di fumigazione (27) o conteggi in piastra (ad esempio 
batteri, attinomiceti, funghi e colonie totali) per gli studi aerobici; velocità di metanogenesi per gli studi anaerobici.  
1.8.3  Raccolta, manipolazione e conservazione  
1.8.3.1  Raccolta  
Per la campionatura del sedimento va utilizzata la bozza di linea 
guida ISO sulla campionatura dei sedimenti depositati sul fondo (8). I campioni di sedimento vanno prelevati dall'intero strato 
superiore del sedimento, avente spessore di 5-10 cm. Le relative 
acque vanno raccolte nello stesso sito o ubicazione da cui viene prelevato il sedimento e nello stesso istante. Per gli studi anaerobici il prelievo e il trasporto del sedimento e dell'acqua relativa vanno 
effettuati in assenza di ossigeno (28) (vedi sezione 1.8.2.1). Alcuni 
dispositivi di campionatura sono descritti in bibliografia (8)(23).
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1173
 
1.8.3.2  Manipolazione  
Il sedimento viene dapprima separato dall'acqua per filtrazione 
e poi setacciato a umido con un setaccio da 2 mm impie ­
gando un eccesso di acqua locale, che viene poi gettata. 
Successivamente si mescolano quantità note di sedimenti e 
acqua nei rapporti desiderati (vedi sezione 1.9.1) utilizzando palloni di incubazione, le quali vengono poi preparate per il periodo di acclimatazione (vedi sezione 1.8.4). Per lo studio 
anaerobico tutte le operazioni di manipolazione vanno effettuate 
in assenza di ossigeno (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3  Conservazione  
Si raccomanda vivamente di utilizzare sedimento e acqua campio ­
nati di fresco, ma se vi fossero necessità di conservazione occorre 
setacciare il sedimento e l'acqua come sopra descritto e conservarli 
insieme, coperti da uno strato d'acqua di 6-10 cm, al buio, a 4 ± 2
 o C 4 per un massimo di 4 settimane (7)(8)(23). I campioni da 
utilizzare per gli studi aerobici vanno conservati all'aria (ad esem ­
pio in contenitori aperti), mentre per gli studi anaerobici occorre 
eliminare la presenza di ossigeno. I campioni non vanno congelati e il sedimento non va lasciato asciugare durante il trasporto e la 
conservazione.
 
1.8.4  Preparazione dei campioni di sedimento/acqua per il test  
Prima dell'aggiunta della sostanza di prova occorre prevedere un 
periodo di acclimatazione, ponendo ciascun campione di sedimento/ ­
acqua nel recipiente di incubazione che verrà poi utilizzato per il test principale; l'acclimatazione va eseguita esattamente nelle stesse con ­
dizioni dell'incubazione di prova (vedi sezione 1.9.1). Il periodo di 
acclimatazione serve per raggiungere sufficiente stabilità nel sistema, valutata in base al pH, alla concentrazione di ossigeno nell'acqua, al 
potenziale redox di sedimento e acqua e alla separazione macrosco ­
pica delle fasi. Il periodo di acclimatazione è di norma compreso tra una e due settimane e comunque non supera le quattro settimane. I risultati delle determinazioni effettuate durante questo periodo vanno 
documentati.
 
1.9 ESECUZIONE DEL TEST  
1.9.1  Condizioni  
Il test va effettuato nell'attrezzatura di incubazione (vedi sezione 
1.8.1) con rapporto volumetrico acqua/sedimento compreso tra 3:1 
e 4:1 e strato del sedimento di 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). Per ogni 
recipiente di incubazione si raccomanda una quantità minima di sedimento pari a 50 g (peso secco).
 
Il test va condotto al buio, a temperatura costante compresa tra 10 e 
30 o C. La temperatura ideale è 20 ± 2  o C. In casi particolari può 
essere necessario eseguire un test anche a temperatura inferiore (ad esempio 10
 o C), in funzione dei dati che si vogliono raccogliere. La 
temperatura d'incubazione va sottoposta a monitoraggio e documen ­
tata. ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1174  
( 1 ) Alcuni studi recenti hanno dimostrato che la conservazione a 4  o C può comportare una 
diminuzione del contenuto in carbonio organico del sedimento, che potrebbe forse por ­
tare alla diminuzione dell'attività microbica (34).
 1.9.2  Trattamento e applicazione della sostanza di prova  
Viene utilizzata una sola concentrazione di prova della sostanza 
chimica (  1 ). Per le sostanze fitosanitarie applicate direttamente ai 
corpi d'acqua, la dose massima riportata sull'etichetta rappresenta il 
tasso di applicazione massimo calcolato sulla base dell'area superfi ­
ciale dell'acqua nel recipiente di prova. In tutti gli altri casi la con ­
centrazione da utilizzare va basata su previsioni derivate dalle emis ­
sioni ambientali. La concentrazione delle sostanze di prova applicate 
va studiata con cura al fine di caratterizzare la via di trasformazione, 
nonché la formazione e la diminuzione dei prodotti di trasformazio ­
ne. Può essere necessario applicare dosi più elevate (ad esempio 10 
volte maggiori) in situazioni in cui le concentrazioni delle sostanze 
di prova sono vicine ai limiti di rilevamento all'inizio della prova, e/o nei casi in cui alcuni importanti prodotti di trasformazione non po ­
trebbero venire facilmente determinati se presenti in quantità pari al 
10 % del tasso di applicazione della sostanza di prova. Se però 
vengono impiegate concentrazioni di prova più elevate, queste non devono avere significativi effetti avversi sull'attività microbica del sistema acqua-sedimento. Al fine di ottenere una concentrazione 
costante della sostanza di prova in recipienti di dimensione diversa, 
va presa in considerazione l'opportunità di modificare la quantità del materiale applicato sulla base della profondità della colonna d'acqua nel recipiente rispetto alla profondità dell'acqua sul campo (presunta 
pari a 100 cm, ma possono essere usate altre profondità). Un esem ­
pio di calcolo è riportato nell'allegato 4.
 
Nel caso ideale la sostanza di prova va applicata alla fase acquosa 
del sistema di prova sotto forma di soluzione acquosa. È ammesso, 
nei casi in cui ciò sia inevitabile, l'uso di piccole quantità di solventi miscibili in acqua (ad es. acetone, etanolo) per l'applicazione e la distribuzione della sostanza di prova, senza tuttavia superare l'1 % 
v/v ed evitando in ogni caso il rischio di produrre effetti avversi 
sull'attività microbica del sistema di prova. La soluzione acquosa della sostanza di prova va preparata con cautela; per garantire un'omogeneità completa può rivelarsi utile l'impiego di colonne di 
generazione e di premiscelazione. Dopo l'aggiunta della soluzione 
acquosa al sistema di prova si raccomanda di miscelare leggermente la fase acquosa, disturbando il meno possibile il sedimento.
 
L'uso di prodotti formulati non è consigliato in condizioni normali, 
perché gli ingredienti della formulazione possono influire sulla di ­
stribuzione della sostanza di prova e/o dei prodotti di trasformazione 
tra le fasi acquosa e sedimentosa. Nel caso di sostanze di prova 
scarsamente idrosolubili l'impiego di materiale formulato può rap ­
presentare però un'alternativa appropriata.  
Il numero di recipienti di incubazione dipende dal numero dei tempi 
di campionatura (vedi sezione 1.9.3). Il numero dei sistemi di prova deve essere sufficiente a consentire il sacrificio di due sistemi per ciascun tempo di campionatura. Se si impiegano unità di controllo 
per ciascun sistema sedimentoso acquatico, esse non vanno trattate 
con la sostanza di prova. Le unità di controllo possono essere usate per determinare la biomassa microbica del sedimento e il carbonio organico totale di acqua e sedimento al termine dello studio. Due 
unità di controllo (cioè un'unità di controllo per ciascun sedimento 
acquatico) possono essere utilizzate per monitorare i parametri richie ­
sti nel sedimento e nell'acqua durante il periodo di acclimatazione (vedi tabella in sezione 1.8.2.2). Vanno incluse due unità di controllo 
aggiuntive nel caso in cui la sostanza di prova venga applicata 
mediante un solvente in modo da poter misurare gli effetti avversi sull'attività microbica del sistema di prova.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1175  
( 1 ) Per sostanze chimiche che raggiungono le acque superficiali per vie d'ingresso diverse, 
comportanti concentrazioni significativamente diverse, potrebbero rivelarsi utili prove 
con una seconda concentrazione, a condizione che la concentrazione inferiore possa 
essere analizzata con accuratezza sufficiente.
 1.9.3  Durata del test e campionatura  
La durata dell'esperimento non deve normalmente eccedere 100 
giorni (6) e dovrebbe continuare fino alla determinazione delle vie di degradazione e delle caratteristiche di distribuzione acqua/ ­
sedimento, oppure fino alla dissipazione del 90 % della sostanza 
di prova a seguito di trasformazione e/o volatilizzazione. I tempi di campionatura devono essere almeno sei (tempo zero compreso), ricorrendo opzionalmente ad uno studio preliminare (vedi sezione 
1.9.4) per determinare un regime di campionatura appropriato e la 
durata del test, salvo quando esistano dati sufficienti sulla sostanza di prova ottenuti da studi precedenti. Per sostanze di prova idrofobiche 
potrebbero rivelarsi necessari punti di campionatura aggiuntivi du ­
rante il periodo iniziale dello studio, allo scopo di determinare la velocità di distribuzione tra le fasi acquosa e sedimentosa.
 
In corrispondenza dei tempi di campionatura accuratamente selezio ­
nati si rimuovono i recipienti di incubazione interi (in duplicato) da sottoporre all'analisi. Il sedimento e l'acqua soprastante vengono 
analizzati separatamente (
 1 ). L'acqua superficiale va rimossa con at ­
tenzione, disturbando il meno possibile il sedimento. L'estrazione e la caratterizzazione della sostanza di prova e dei prodotti di trasfor ­
mazione devono rispettare le procedure analitiche del caso. Va ri ­
mosso con attenzione l'eventuale materiale adsorbito nei recipienti di 
incubazione o nei tubi di interconnessione utilizzati per catturare le sostanze volatili.
 
1.9.4  Prova preliminare opzionale  
Se la durata e il regime di campionatura non possono essere stimati 
sulla base di altri studi effettuati sulla sostanza di prova, può essere utile svolgere una prova preliminare opzionale, che va in tal caso 
effettuata alle stesse condizioni di prova proposte per lo studio de ­
finitivo. Le condizioni sperimentali e i risultati dell'eventuale prova preliminare vanno documentati brevemente.
 
1.9.5  Misurazioni e analisi  
È necessario misurare e riportare la concentrazione della sostanza di 
prova e dei prodotti di trasformazione nell'acqua e nel sedimento in corrispondenza di ciascun tempo di campionatura (espressa come 
concentrazione e come percentuale della sostanza applicata). In via 
generale, per ciascun tempo di campionatura vanno identificati i prodotti di trasformazione rilevati a ≥ 10 % della radioattività ap ­
plicata al sistema totale acqua-sedimento, a meno che vi siano motivi 
ragionevoli che consiglino altrimenti. Va inoltre presa in considera ­
zione l'opportunità di identificare i prodotti di trasformazione le cui concentrazioni aumentano in modo continuativo durante lo studio, pur non eccedendo i limiti sopra riportati, poiché tale aumento può 
essere indicativo di persistenza. Questi aspetti vanno affrontati caso 
per caso, motivando nella relazione le soluzioni adottate.
 
I risultati ottenuti dai sistemi per la cattura di gas e sostanze volatili 
(CO  2 e altri, cioè sostanze organiche volatili) vanno riportati per 
ciascun tempo di campionatura. Le velocità di mineralizzazione vanno anch'esse riportate. I residui non estraibili (legati) nel sedi ­
mento vanno riportati per ciascun punto di campionatura.
 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1176  
( 1 ) In casi in cui può verificarsi facilmente una rapida riossidazione dei prodotti di trasfor ­
mazione anaerobici occorre mantenere le condizioni anaerobiche durante tutta la cam ­
pionatura e l'analisi.
 2. DATI  
2.1 TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
Per ciascun tempo di campionatura si calcolano il bilancio di massa 
totale o il recupero (vedi sezione 1.7.1) della radioattività aggiunta. I 
risultati vanno espressi come percentuale della radioattività aggiunta. 
La distribuzione della radioattività tra acqua e sedimento va espressa come concentrazione e in percentuale, per ciascun tempo di campio ­
natura.
 
Il tempo di dimezzamento, il DT  50 ed eventualmente il DT  75 e il 
DT 90 della sostanza di prova vanno calcolati con i rispettivi intervalli 
di confidenza (vedi sezione 1.7.3). I dati sulla velocità di dissipa ­
zione della sostanza di prova nell'acqua e nel sedimento possono 
essere ricavati mediante opportuni strumenti di valutazione. Essi possono comprendere l'applicazione di cinetiche dello pseudo primo ordine, tecniche empiriche di interpolazione con curve che applicano 
soluzioni grafiche o numeriche, e valutazioni più complesse, tra cui 
modelli a compartimento singolo o multiplo. Per maggiori dettagli si rimanda alle rispettive pubblicazioni (35)(36)(37).
 
Tutte le tecniche hanno punti forti e punti deboli e possono variare 
notevolmente in quanto a complessità. L'ipotesi di una cinetica del 
primo ordine può semplificare eccessivamente i processi di degradazione e distribuzione, ma in determinati casi essa consente 
di disporre di un valore (la costante di velocità o il tempo di dimez ­
zamento) che può essere compreso facilmente ed è utile nei modelli di simulazione e nei calcoli di previsione delle concentrazioni am ­
bientali. Le soluzioni empiriche o le trasformazioni lineari possono 
fornire interpolazioni più aderenti e consentire pertanto una stima 
migliore dei tempi di dimezzamento, del DT
 50 ed eventualmente 
dei DT  75 e DT  90 . L'uso delle costanti così derivate è però limitato. 
I modelli a compartimento possono dare luogo a diverse costanti utili 
ai fini della valutazione dei rischi, per descrivere la velocità 
di degradazione in compartimenti diversi e la distribuzione delle sostanze chimiche. Essi vanno inoltre utilizzati per stimare le costanti di velocità per la formazione e la degradazione dei prodotti di tra ­
sformazione principali. In tutti i casi il metodo prescelto va motivato 
e lo sperimentatore deve dimostrare graficamente e/o statisticamente la bontà dell'interpolazione.
 
3. RELAZIONE  
3.1 RELAZIONE SULL'ESECUZIONE DEL TEST  
La relazione deve comprendere le seguenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— denominazione comune, nome chimico, numero CAS, formula di 
struttura (indicante la posizione della marcatura o delle marcature 
quando si utilizzano materiali radiomarcati) e proprietà fisicochi ­
miche rilevanti;  
— purezza (impurità) della sostanza di prova;  
— purezza radiochimica della sostanza chimica marcata e attività 
molare (nei casi opportuni).  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1177
 
Sostanze di riferimento:  
— nome chimico e struttura delle sostanze di riferimento utilizzate 
per la caratterizzazione e/o l'identificazione dei prodotti di tra ­
sformazione.  
Sedimenti e acque di prova:  
— ubicazione e descrizione dei siti di campionatura dei sedimenti 
acquatici, precisando se possibile i casi di contaminazione che si 
sono verificati;  
— tutte le informazioni riguardanti il prelievo, l'eventuale conserva ­
zione e l'acclimatazione dei sistemi acqua-sedimento;  
— caratteristiche dei campioni acqua-sedimento come riportato nella 
tabella in sezione 1.8.2.2.  
Condizioni del test:  
— sistema di prova utilizzato (ad esempio flusso, biometro, modalità 
di ventilazione, metodo di agitazione, volume d'acqua, massa del sedimento, spessore degli strati acquoso e sedimentoso, dimen ­
sione dei recipienti di prova, ecc.);
 
— applicazione della sostanza di prova al sistema di prova: concen ­
trazione di prova utilizzata, numero dei replicati e dei controlli, 
modalità di applicazione della sostanza di prova (ad esempio eventuale uso di solvente), ecc.;
 
— temperatura di incubazione;  
— tempi di campionatura;  
— metodi di estrazione e relative efficienze, oltre ai metodi analitici 
e ai limiti di rivelabilità;  
— metodi di caratterizzazione/identificazione dei prodotti di trasfor ­
mazione;  
— deviazioni dai protocolli di prova o dalle condizioni di prova 
durante lo studio.  
Risultati:  
— dati grezzi delle analisi rappresentative (tutti i dati grezzi vanno 
conservati nell'archivio GLP);  
— ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici utilizzati;  
— tassi di recupero (i valori percentuali per la validità dello studio 
sono riportati nella sezione 1.7.1);  
— tabelle dei risultati, espressi come percentuale della dose appli ­
cata e in mg · kg -1 in acqua, sedimento e sistema totale (percen ­
tuale soltanto) per la sostanza di prova e, se appropriato, per i 
prodotti di trasformazione e la radioattività non estraibile;  
— bilancio di massa durante gli studi e al termine degli studi;  
— rappresentazione grafica della trasformazione nelle frazioni ac ­
quosa e sedimentosa e nel sistema totale (mineralizzazione com ­
presa);  
— velocità di mineralizzazione;  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1178
 
— tempo di dimezzamento, DT  50 ed eventualmente DT  75 e DT  90 
della sostanza di prova e, se del caso, per i principali prodotti 
di trasformazione, compresi gli intervalli di confidenza in acqua, nel sedimento e nel sistema totale;
 
— valutazione delle cinetiche di trasformazione della sostanza di 
prova e, se del caso, dei principali prodotti di trasformazione;  
— via di trasformazione proposta, se del caso;  
— discussione dei risultati.  
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 ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1181
 
ALLEGATO 1  
LINEE GUIDA SUI SISTEMI DI PROVA AEROBICI E ANAEROBICI  
Sistema di prova aerobico  
Il sistema di prova aerobico descritto in questo metodo di prova consiste di uno 
strato di acqua aerobico (concentrazioni di ossigeno tipiche comprese tra 7 e 
10 mg· l -1 ) e uno strato sedimentoso aerobico in superficie e anaerobico sotto la 
superficie [potenziali redox (E  h ) medi tipici nella zona anaerobica del sedimento 
compresi tra - 80 e - 190 mV]. Dell'aria inumidita viene fatta passare sopra la superficie dell'acqua in ciascuna unità di incubazione per mantenere una quantità 
sufficiente di ossigeno nello spazio di testa.
 
Sistema di prova anaerobico  
Per il sistema di prova anaerobico la procedura di prova è sostanzialmente uguale 
a quella delineata per il sistema aerobico, con la differenza che viene fatto 
passare dell'azoto inumidito sopra la superficie dell'acqua in ciascuna unità di 
incubazione per mantenere uno spazio di testa di azoto. Il sedimento e l'acqua vengono considerati anaerobici se il potenziale redox (E
 h ) è minore di - 100 mV.  
Nella prova anaerobica la valutazione della mineralizzazione comprende la mi ­
surazione dell'anidride carbonica e del metano prodotti.  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1182
 
ALLEGATO 2  
ESEMPIO DI UN ATTREZZATURA A FLUSSO CONTINUO
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1183
 
ALLEGATO 3  
ESEMPIO DI UN'ATTREZZATURA A BIOMETRO
  ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1184
 
ALLEGATO 4  
ESEMPIO DI CALCOLO PER LA DOSE DI APPLICAZIONE NEI 
RECIPIENTI DI PROVA  
Diametro interno del cilindro: = 8 cm 
Profondità della colonna d'acqua, sedimento 
escluso: = 12 cm 
Area di superficie: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Tasso di applicazione: 500 g di sostanza di 
prova/ha corrispondente a 5 μg/cm  2 
Totale μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Regolazione della quantità in relazione ad una 
profondità di 100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volume della colonna d'acqua: 50,3 × 12 = 603 ml 
Concentrazione in acqua: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml oppure 50 μg/l ▼B 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1185
 
C.25.  MINERALIZZAZIONE AEROBICA DELLE ACQUE DI 
SUPERFICIE — SAGGIO DI SIMULAZIONE DELLA 
BIODEGRADAZIONE  
1. METODO  
Questo metodo è equivalente al metodo dell’OCSE TG 309 
(2004) (1).  
1.1. INTRODUZIONE  
Questo saggio serve a misurare i tempi di biodegradazione di una 
sostanza di prova a bassa concentrazione in acque naturali aerobiche e a quantificare i risultati sotto forma di espressioni delle velocità cinetiche. Questo saggio di simulazione è realizzato in discontinuo 
(batch) in flaconi collocati in un agitatore per determinare la biode ­
gradazione aerobica di sostanze organiche in campioni di acque di superficie naturali (dolci, salmastre o marine). È basato sulla norma ISO/DIS 14592-1 (2) e comprende anche elementi dei metodi di 
prova C.23 e C.24 (3)(4). In via facoltativa, con tempi di prova 
prolungati, un procedimento semi-continuo può sostituire il procedi ­
mento in discontinuo per evitare di deteriorare il microcosmo di prova. L’obiettivo principale del saggio di simulazione è la possibi ­
lità di determinare la mineralizzazione della sostanza di prova nelle 
acque di superficie, che rappresenta la base per esprimere la cinetica della degradazione. Un obiettivo secondario e facoltativo del saggio è quello di ottenere informazioni sulla degradazione primaria e sulla 
formazione dei principali prodotti di trasformazione (metaboliti). 
L’identificazione dei prodotti di trasformazione e l’eventuale quanti ­
ficazione delle rispettive concentrazioni sono dati particolarmente importanti per le sostanze che vengono mineralizzate molto lenta ­
mente (per esempio che presentano tempi di dimezzamento per il
 14 C 
totale residuo superiori a 60 giorni). Per l’individuazione e la quan ­
tificazione dei principali metaboliti in genere si dovrebbero utilizzare concentrazioni più elevate della sostanza di prova (per esempio, > 
100 μg/l) a causa dei limiti analitici.
 
Nell’ambito di questo saggio per «bassa concentrazione» s’intende 
una concentrazione abbastanza bassa (per esempio inferiore a 1 μg/l 
e fino a 100 μg/l) da garantire che la cinetica di biodegradazione 
ottenuta durante il saggio rispecchi quelle che si possono attendere nell’ambiente naturale. Rispetto alla massa totale dei substrati di carbonio biodegradabili presenti nelle acque naturali utilizzate per 
il saggio, la sostanza di prova a bassa concentrazione fungerà da 
substrato secondario. Ciò implica che la cinetica di biodegradazione prevista è del 1
 o ordine (cinetica di «non crescita») e che la sostanza 
di prova può essere degradata per «co-metabolismo». Nella cinetica 
del 1  o ordine la velocità di degradazione (mg/L/giorno) è proporzio ­
nale alla concentrazione di substrato che diminuisce nel tempo. Nel caso di una vera cinetica del 1
 o ordine la costante di velocità 
di degradazione specifica, k, è indipendente dal tempo e dalla con ­
centrazione. In altri termini, la costante k non varia molto nel corso 
di un esperimento e non varia con le concentrazioni aggiunte tra un esperimento e l’altro. Per definizione la costante di velocità di degradazione specifica è uguale al cambiamento relativo di con ­
centrazione per il tempo: k = (1/C)·(dC/dt). Anche se in genere, nelle 
condizioni descritte, è verosimile attendersi una cinetica del 1
 o ordine, in alcuni casi altre cinetiche possono rivelarsi più adatte. 
Deviazioni rispetto alla cinetica del 1  o ordine possono, per esempio, 
essere osservate se fenomeni di trasferimento di massa come la 
velocità di diffusione piuttosto che la velocità di reazione biologica sono un fattore limitante della velocità di biotrasformazione. Tutta ­
via, è quasi sempre possibile descrivere i dati con una cinetica di 
psuedo-1
 o ordine, accettando una costante di velocità dipendente 
dalla concentrazione.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1186
 
Le informazioni sulla biodegradabilità della sostanza di prova a con ­
centrazioni più elevate (desunte, per esempio, da saggi di screening 
standard) e le informazioni sulla degradabilità abiotica, sui metaboliti e sulle rispettive proprietà fisico-chimiche devono essere disponibili prima dell’inizio del saggio per poterlo pianificare e interpretarne i 
risultati. L’uso di sostanze di prova marcate con
 14 C e la determi ­
nazione della distribuzione di fase del  14 C al termine del saggio 
permettono di determinare la biodegradabilità completa. Se si utiliz ­
zano sostanze non marcate, la biodegradazione completa si può sti ­
mare solo se il saggio è eseguito a concentrazione più elevata e se 
sono noti tutti i principali metaboliti.  
1.2. DEFINIZIONI  
Biodegradazione primaria : modifica strutturale (trasformazione) di 
una sostanza chimica da parte di microrganismi risultante nella per ­
dita dell’identità chimica.  
Biodegradazione funzionale : modifica strutturale (trasformazione) 
di una sostanza chimica da parte di microrganismi risultante nella perdita di una proprietà specifica.
 
Biodegradazione aerobica completa : scomposizione di una so ­
stanza chimica da parte di microrganismi in presenza di ossigeno e 
formazione di biossido di carbonio, acqua e sali minerali di qualsiasi altro elemento presente (mineralizzazione) e produzione di nuova biomassa e prodotti organici per biosintesi microbica.
 
Mineralizzazione : scomposizione di una sostanza chimica o di ma ­
teria organica da parte di microrganismi in presenza di ossigeno e 
formazione di biossido di carbonio, acqua e sali minerali di qualsiasi 
altro elemento presente.  
Fase di latenza : tempo intercorso dall’inizio del saggio fino all’adat ­
tamento dei microrganismi di degradazione e all’aumento del livello di degradazione di una sostanza chimica o materia organica fino al 
limite rilevabile (per esempio 10 % o meno della biodegradazione 
teorica massima, in funzione dell’accuratezza della tecnica di misura).
 
Livello massimo di biodegradazione : livello di biodegradazione di 
una sostanza chimica o di materia organica nel corso del saggio, espresso in percentuale, al di sopra del quale non c’è ulteriore bio ­
degradazione durante il saggio.
 
Substrato primario : collezione di fonti naturali di carbonio e di 
energia che garantiscono la crescita e il mantenimento della biomassa 
microbica.  
Substrato secondario : componente del substrato presente in una 
concentrazione talmente bassa che, con la biodegradazione, fornisce solo quantitativi insignificanti di carbonio ed energia ai microrgani ­
smi competenti, rispetto al carbonio e all’energia forniti 
dalla degradazione dei componenti del substrato principale (substrati primari).
 
Costante di velocità di degradazione : costante di velocità cinetica 
del 1  o ordine o pseudo-1  o ordine, k (giorni  –1 ), che indica la velocità 
dei processi di degradazione. Per un esperimento in discontinuo la 
costante k è stimata a partire dalla parte iniziale della curva 
di degradazione ottenuta dopo la fase di latenza.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1187
 
Tempo di emivita, t  1/2 (giorni) : termine usato per indicare la velo ­
cità di una reazione di 1  o ordine. Corrisponde all’intervallo di tempo 
necessario perché la concentrazione diminuisca del 50 %. La rela ­
zione tra il tempo di emivita e la costante di velocità di degradazione è rappresentata dalla seguente equazione t
 1/2 = ln2/k.  
Tempo di dimezzamento di degradazione, DT  50 (giorni) : espres­
sione utilizzata per quantificare l’esito dei saggi di biodegradazione. Corrisponde all’intervallo di tempo, compresa la fase di latenza, necessario per raggiungere il 50 % della biodegradazione.
 
Limite di rilevabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ) : il 
limite di rilevabilità (LOD) è la concentrazione di una sostanza al di sotto della quale non è possibile distinguerla dagli artefatti della tecnica di analisi utilizzata. Il limite di quantificazione (LOQ) è la 
concentrazione di una sostanza al di sotto della quale non è possibile 
determinare la concentrazione con un’accuratezza accettabile.
 
Carbonio organico disciolto (DOC) : frazione del carbonio organico 
contenuto in un campione d’acqua che non può essere eliminato con 
una separazione di fase, per esempio per centrifugazione a 40 000 ms
 –2 per 15 minuti o con membrana filtrante con pori di 0,2 μm- 
0,45 μm di diametro.  
Attività totale del  14 C organico (TOA) : l’attività complessiva del  
14 C associata al carbonio organico.  
Attività del  14 C organico disciolto (DOA) : l’attività complessiva 
del 14 C associata al carbonio organico disciolto.  
Attività del  14 C organico particellato (POA) : l’attività complessiva 
del 14 C associata al carbonio organico particellato.  
1.3. APPLICABILITÀ DEL SAGGIO  
Il saggio di simulazione è applicabile a sostanze organiche non 
volatili o leggermente volatili testate a basse concentrazioni. Se si 
utilizzano flaconi non ermetici (per esempio chiusi con tappi in cotone idrofilo), le sostanze che presentano costanti di Henry infe ­
riori a circa 1 Pa·m
 3 /mol (circa 10  –5 atm·m  3 /mol) nella pratica pos ­
sono essere considerate non volatili. Se si utilizzano flaconi chiusi 
con uno spazio libero nella parte superiore, è possibile sottoporre al saggio sostanze leggermente volatili (con costanti di Henry < 100 Pa·m
 3 /mol o < 10  –3 atm·m  3 /mol) senza perdite dal sistema di saggio. 
Vi può essere perdita di sostanze marcate con  14 C in assenza di 
precauzioni adeguate, quando avviene lo strippaggio del CO  2 . In 
tal caso può essere necessario intrappolare il CO  2 in un assorbente 
alcalino interno oppure utilizzare un sistema esterno di assorbimento 
del CO  2 (per la determinazione diretta del  14 CO 2 cfr. appendice 3). 
Per determinare la cinetica di biodegradazione, le concentrazioni della sostanza di prova devono essere inferiori alla solubilità della sostanza in acqua. Occorre tuttavia rilevare che i valori della solu ­
bilità in acqua indicati in letteratura possono essere molto più elevati 
della solubilità della sostanza di prova nelle acque naturali. In via facoltativa, è possibile stabilire la solubilità di sostanze di prova scarsamente solubili in acqua utilizzando le acque naturali oggetto 
del saggio.
 
Questo metodo può essere utilizzato per simulare la biodegradazione 
in acque di superficie che non presentano grosse particelle (saggio pelagico) oppure in acque di superficie torbide che si possono, per 
esempio, trovare nei pressi di un’interfaccia acque/sedimenti (saggio 
con sedimento in sospensione).
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1.4. PRINCIPIO DEL SAGGIO  
Il saggio viene eseguito in discontinuo (batch) incubando la sostanza 
di prova unicamente con acqua superficiale (saggio pelagico) oppure con acqua superficiale addizionata con solidi/sedimento in sospen ­
sione di peso a secco compreso tra 0,01 e 1 g/l (saggio con sedi ­
mento in sospensione) per simulare un corpo idrico con solidi in sospensione o sedimenti in risospensione. In genere, nella maggior parte delle acque superficiali la concentrazione dei solidi/sedimenti 
sospesi si colloca nella fascia bassa di questo intervallo. I flaconi 
utilizzati per il saggio sono incubati al buio a temperatura ambiente in condizioni aerobiche e agitati. Per determinare la cinetica 
di degradazione è necessario utilizzare almeno due concentrazioni 
diverse della sostanza di prova. Le concentrazioni devono differen ­
ziarsi tra loro di un fattore compreso tra 5 e 10 e devono rappresen ­
tare l’intervallo di concentrazioni che si possono attendere nell’am ­
biente naturale. La concentrazione massima della sostanza di prova 
non deve superare 100 μg/l, ma è preferibile utilizzare concentrazioni 
massime inferiori a 10 μg/l per garantire che la biodegradazione 
presenti una cinetica del 1
 o ordine. La concentrazione più bassa 
non deve superare 10 μg/l, ma è preferibile utilizzare concentrazioni 
pari a 1-2 μg/l o inferiori a 1 μg/l. In genere è possibile procedere ad 
un’analisi adeguata di tali basse concentrazioni con l’utilizzo della sostanze marcate con
 14 C reperibili in commercio. A causa dei limiti 
analitici, spesso risulta impossibile misurare la concentrazione della 
sostanza di prova con la dovuta accuratezza se la sostanza presenta una concentrazione ≤ 100 μg/l (cfr. punto 1.7.2, secondo paragrafo). 
È possibile utilizzare concentrazioni più elevate della sostanza di 
prova (> 100 μg/l e a volte > 1 mg/l) per identificare e quantificare 
i principali metaboliti o se non è disponibile un metodo di analisi specifico con un limite di rilevabilità basso. Se vengono testate concentrazioni elevate della sostanza, può non essere possibile uti ­
lizzare i risultati per stimare la costante di degradazione del 1
 o ordine 
e l'emivita, perché è probabile che la degradazione non segua una cinetica del 1
 o ordine.  
Il processo di degradazione deve essere verificato a intervalli di 
tempo adeguati, misurando il  14 C residuo o la concentrazione residua 
della sostanza di prova se si utilizza un'analisi chimica specifica. La 
marcatura della parte più stabile della molecola con  14 C consente di 
determinare la mineralizzazione totale, mentre la marcatura con  14 C 
della parte meno stabile della molecola e l’impiego di analisi speci ­
fiche permettono di valutare solo la biodegradazione primaria. La 
parte più stabile non include, però, necessariamente la frazione rile ­
vante sotto il profilo funzionale della molecola (che può essere cor ­
relata ad una proprietà specifica come la tossicità, il bioaccumulo 
ecc.). In tal caso può essere opportuno utilizzare una sostanza di 
prova, marcata con  14 C, nella parte funzionale per verificare l’elimi ­
nazione della proprietà specifica.  
1.5. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Per questo saggio è possibile utilizzare sostanze radiomarcate e non. 
La tecnica di marcatura che utilizza il  14 C è quella raccomandata e in 
genere la marcatura deve avvenire nella o nelle parti più stabili della 
molecola (cfr. anche il punto 1.4). Per le sostanze che contengono 
più di un anello aromatico, è preferibile marcare con il  14 C uno o più 
atomi di carbonio in ciascun anello. È inoltre preferibile marcare con  
14 C uno o più atomi di carbonio situati su entrambi i lati dei legami 
facilmente degradabili. La sostanza deve presentare una purezza chi ­
mica e/o radiochimica > 95 %. Per le sostanze radiomarcate è pre ­
feribile un’attività specifica di circa 50 μCi/mg (1,85 MBq) o supe ­
riore per facilitare la misurazione del  14 C durante i saggi effettuati a 
basse concentrazioni iniziali. È necessario disporre delle seguenti 
informazioni sulla sostanza di prova:  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1189
 
— solubilità in acqua (Metodo A.6),  
— solubilità in solventi organici (sostanze applicate con solvente o a 
bassa solubilità in acqua),  
— costante di dissociazione (pKa) se la sostanza è soggetta a pro ­
tonazione o deprotonazione (OCSE TG 112) (5),  
— pressione di vapore (Metodo A.4) e costante di Henry,  
— stabilità chimica nell’acqua e al buio (idrolisi) (Metodo C.7).  
Quando sostanze scarsamente solubili in acqua vengono testate in 
acqua di mare, può essere utile conoscere la costante di Setschenow 
(o «costante di salting-out») K  s , definita dalla seguente espressione: 
log (S/S’) = K  s C m , dove S e S’ sono la solubilità della sostanza in 
acque dolci e in acque marine, rispettivamente, e C  m è la concen ­
trazione molare di sale.  
Se viene eseguito il «saggio con sedimento in sospensione» è neces ­
sario disporre anche dei seguenti dati:  
— coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua (Metodo A.8),  
— coefficiente di adsorbimento (Metodo C.18).  
Altri dati utili possibili:  
— concentrazione ambientale (conosciuta o stimata),  
— tossicità della sostanza di prova per i microrganismi (Metodo 
C.11),  
— biodegradabilità pronta e/o intrinseca [Metodi C.4 A-F, C.12, 
C.9, OCSE TG 302 (5)],  
— biodegradabilità aerobica o anaerobica negli studi di trasforma ­
zione nel suolo e in sedimenti/acqua (Metodi C.23, C.24).  
1.6. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Come sostanza di riferimento deve essere utilizzata una sostanza che 
in genere si degrada facilmente in condizioni aerobiche (per esempio 
l’anilina o il benzoato di sodio). L’intervallo di tempo atteso per 
la degradazione dell’anilina e del benzoato di sodio è in genere inferiore a due settimane. Le sostanze di riferimento servono a ga ­
rantire che l’attività microbica delle acque di prova rientri entro 
determinati limiti (cioè che l’acqua contenga una popolazione micro ­
bica attiva).
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1190
 
1.7. CRITERI DI QUALITÀ  
1.7.1.  Recupero  
Subito dopo aver aggiunto la sostanza di prova è necessario verifi ­
care ogni concentrazione iniziale di prova misurando l’attività del  
14 C, oppure procedendo ad analisi chimiche se non vengono utiliz ­
zate sostanze marcate, almeno su due campioni uguali. In questo modo si ottengono informazioni sull’applicabilità e sulla ripetibilità del metodo di analisi e sull’omogeneità della distribuzione della 
sostanza di prova. In genere nelle analisi successive dei dati si uti ­
lizza l’attività iniziale del
 14 C misurata o la concentrazione della 
sostanza di prova piuttosto che la concentrazione nominale perché 
in questo modo vengono compensati le perdite dovute all’assorbi ­
mento-adsorbimento e gli errori di dosaggio. Per una sostanza di prova marcata con
 14 C, il livello di recupero al termine dell’esperi ­
mento è dato dal bilancio di massa (cfr. ultimo paragrafo del punto 
1.8.9.4). Idealmente il bilancio di massa di una sostanza radiomar ­
cata dovrebbe oscillare tra il 90 % e il 110 %, mentre l’accuratezza dell’analisi dovrebbe dare un recupero iniziale compreso tra il 70 % e il 110 % per le sostanze di prova non marcate. Questi intervalli 
devono intendersi come obiettivi e non devono essere utilizzati come 
criteri di accettazione del saggio. In via facoltativa, l’accuratezza dell’analisi può essere determinata per una sostanza di prova a una concentrazione più bassa rispetto alla concentrazione iniziale e per i 
principali metaboliti.
 
1.7.2.  Ripetibilità e sensibilità del metodo analitico  
La ripetibilità del metodo analitico (compresa l’efficienza dell’estra ­
zione iniziale) per quantificare la sostanza di prova ed eventualmente i metaboliti deve essere verificata con cinque analisi replicate dei singoli estratti delle acque superficiali.
 
Il limite di rilevabilità (LOD) del metodo analitico per la sostanza di 
prova e i metaboliti deve essere, se possibile, pari ad almeno l’1 % del quantitativo iniziale applicato al sistema di saggio. Il limite di 
quantificazione (LOQ) deve essere uguale o inferiore al 10 % della 
concentrazione applicata. Le analisi chimiche di molte sostanze or ­
ganiche e dei loro metaboliti spesso impongono che la sostanza di prova sia applicata ad una concentrazione relativamente elevata, cioè 
> 100 μg/l.
 
1.8. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA  
1.8.1.  Apparecchiature  
Il saggio può essere eseguito in flaconi conici o cilindrici di capacità 
adeguata (per esempio 0,5 o 1 litro) chiusi con tappi di silicone o di gomma, oppure in flaconi di siero con coperchi ermetici al CO
 2 (per 
esempio dotati di tappi in gomma di butile). In alternativa è possibile 
eseguire il saggio utilizzando flaconi multipli e prelevare flaconi interi (almeno due), per ogni intervallo di campionamento (cfr. ul ­
timo paragrafo del punto 1.8.9.1). Per le sostanze di prova non 
volatili che non sono state radiomarcate, non sono necessari coperchi 
o tappi ermetici; bastano invece tappi in cotone che impediscano la contaminazione con aria (cfr. punto 1.8.9.1, secondo paragrafo). Le sostanze leggermente volatili devono essere testate in un sistema tipo 
biometro con leggera agitazione dell’acqua superficiale. Per evitare 
qualsiasi tipo di contaminazione batterica, prima dell’uso è possibile sterilizzare i recipienti riscaldandoli o in autoclave. Vengono inoltre impiegate le seguenti apparecchiature di laboratorio standard:
 
— tavola vibrante o agitatori magnetici per l’agitazione continua dei 
flaconi di prova,  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1191
 
— centrifuga,  
— misuratore di pH,  
— turbidimetro per misure nefelometriche della torbidità,  
— forno o forno a microonde per determinare il peso a secco,  
— apparecchio di filtrazione a membrana,  
— autoclave o forno per sterilizzare i recipienti in vetro,  
— strutture per la manipolazione delle sostanze marcate con  14 C, 
— apparecchiature per quantificare l’attività del  14 C in campioni 
ricavati da soluzioni che intrappolano il CO  2 e, se necessario, 
da campioni di sedimento,  
— apparecchiatura di analisi per determinare la sostanza di prova (e 
di riferimento) se viene utilizzata un’analisi chimica specifica (come il gascromatografo o il cromatografo liquido ad alta pres ­
sione).
 
1.8.2.  Soluzioni madre della sostanza di prova  
Per preparare le soluzioni madre delle sostanze di prova e di riferi ­
mento si utilizza acqua deionizzata (cfr. punto 1.8.7, primo paragra ­
fo). Nell’acqua deionizzata non devono essere presenti sostanze che 
possono risultare tossiche per i microrganismi; il carbonio organico disciolto (DOC) non deve essere superiore a 1 mg/l (6).
 
1.8.3.  Prelievo e trasporto dell’acqua superficiale  
Il sito di campionamento dove prelevare l’acqua superficiale deve 
essere scelto in funzione dell’obiettivo del saggio in una determinata situazione. Nella scelta dei siti occorre considerare la storia dei pos ­
sibili apporti di origine agricola, industriale o domestica. Se è risa ­
puto che un ambiente acquatico è stato contaminato dalla sostanza di prova o da analoghi strutturali nei quattro anni precedenti, non deve essere utilizzato per il prelievo dell’acqua di prova, a meno che la 
finalità esplicita del ricercatore non sia proprio l'esame della velocità 
di degradazione in siti già esposti. Il pH e la temperatura dell'acqua vanno misurati sul sito di prelievo. Occorre inoltre rilevare la pro ­
fondità del campionamento e l’aspetto del campione di acqua (per 
esempio, colore e torbidità) (cfr. punto 3). È necessario misurare la 
concentrazione di ossigeno e il potenziale di ossido-riduzione nell’acqua e nello strato superficiale del sedimento per verificare le condizioni aerobiche, a meno che non risultino evidenti dall’aspetto e 
dall’esperienza acquisita con il sito. L’acqua superficiale deve essere 
trasportata in un contenitore perfettamente pulito. La temperatura durante il trasporto non deve superare di molto la temperatura uti ­
lizzata per il saggio; se il trasporto supera le 2-3 ore si consiglia di 
portare la temperatura a 4 °C. Il campione di acqua non deve tuttavia 
essere congelato.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1192
 
1.8.4.  Stoccaggio e preparazione dell’acqua di superficie  
Il saggio deve preferibilmente iniziare entro un giorno dal prelievo 
del campione. Se è necessario stoccare l’acqua, il periodo di stoc ­
caggio deve essere ridotto al minimo e in ogni caso non può supe ­
rare 4 settimane. Il campione di acqua va mantenuto ad una tempe ­
ratura di 4 °C con aerazione fino al momento dell’utilizzo. Prima dell’impiego, occorre eliminare le particelle più grosse, per esempio per sedimentazione o per filtrazione con filtro in nylon con maglie di 
circa 100 μm o con un filtro grossolano in carta.
 
1.8.5.  Preparazione di acqua addizionata con sedimento (facoltativo)  
Per il saggio con sedimento in sospensione, il sedimento superficiale 
viene aggiunto nei flaconi contenenti acqua naturale (prefiltrata per eliminare le particelle più grossolane secondo quanto descritto al 
punto 1.8.4) per ottenere una sospensione. La concentrazione dei 
solidi sospesi deve essere compresa tra 0,01 e 1 g/l. Il sedimento superficiale deve provenire dallo stesso sito da cui è stato prelevato il campione di acqua. In funzione dell’ambiente acquatico specifico, il 
sedimento superficiale può essere caratterizzato da un elevato tenore 
di carbonio organico (2,5-7,5 %) e da una consistenza fine oppure da un basso tenore di carbonio organico (0,5-2,5 %) e da una consi ­
stenza più grossa (3). Preparazione del sedimento superficiale: 
estrarre varie carote di sedimento con un tubo di plastica trasparente, 
tagliare gli strati aerobici superiori (a partire dalla superficie fino ad una profondità massima di 5 mm) subito dopo il campionamento e riunirli. Il campione di sedimento che ne risulterà deve essere tra ­
sportato in un contenitore con un grande spazio libero superiore per 
mantenerlo in condizioni aerobiche (conservarlo a 4 °C se il tra ­
sporto dura più di 2-3 ore). Il campione di sedimento deve essere sospeso nell’acqua di prova con un rapporto di 1:10 e deve essere 
mantenuto a 4 °C con aerazione fino al momento dell’utilizzo. Se è 
necessario stoccare il sedimento, il periodo di stoccaggio deve essere ridotto al minimo e in ogni caso non può superare 4 settimane.
 
1.8.6.  Procedimento semi-continuo (facoltativo)  
Può essere necessario procedere ad un’incubazione prolungata (di 
vari mesi) se si verifica una fase di latenza lunga prima che si possa 
misurare una degradazione significativa della sostanza di prova. Se 
questa condizione è già nota da precedenti saggi eseguiti sulla so ­
stanza, è possibile iniziare il saggio con un procedimento semi-con ­
tinuo, che permette di rinnovare periodicamente una parte dell’acqua 
o della sospensione utilizzata nel saggio (cfr. appendice 2). In alter ­
nativa, il normale saggio in discontinuo può diventare una prova semi-continua se non viene rilevata alcuna degradazione della so ­
stanza di prova per circa 60 giorni con il procedimento in disconti ­
nuo (cfr. punto 1.8.8.3, secondo paragrafo).
 
1.8.7.  Aggiunta della sostanza di prova (o di riferimento)  
Per le sostanze ad elevata solubilità in acqua (> 1 mg/l) e a bassa 
volatilità (costanti di Henry < 1 Pa·m  3 /mol o < 10  –5 atm·m  3 /mol), si 
può preparare una soluzione madre (stock solution) in acqua deio ­
nizzata (cfr. punto 1.8.2) e aggiungerne il volume adeguato ai reci ­
pienti di prova fino ad ottenere la concentrazione desiderata. Il vo ­
lume dell'eventuale soluzione madre addizionata deve essere mante ­
nuto al livello minimo raggiungibile (< 10 % del volume liquido finale, se possibile). Un’altra possibilità consiste nel dissolvere la 
sostanza di prova in una quantità maggiore di acqua di prova: questa 
alternativa permette di non utilizzare solventi organici.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1193
 
Se non è possibile evitarlo, si devono preparare soluzioni madre di 
sostanze non volatili e scarsamente solubili in acqua utilizzando un 
solvente organico volatile; il solvente aggiunto non deve, tuttavia, superare l'1 % v/v e non deve presentare effetti negativi sull’attività microbica. Il solvente non deve incidere sulla stabilità della sostanza 
di prova nell’acqua. Deve inoltre essere strippato in una quantità 
estremamente limitata in modo da non incrementare in maniera si ­
gnificativa la concentrazione del DOC dell’acqua o della sospensione utilizzata per il saggio. Questa situazione viene verificata con un’ana ­
lisi specifica della sostanza o, se possibile, ad un’analisi del DOC 
(6). È necessario limitare la quantità di solvente trasferita allo stretto necessario e garantire che la quantità di sostanza di prova possa dissolversi nel volume finale di acqua di prova. È possibile utilizzare 
altre tecniche per introdurre la sostanza di prova nei recipienti di 
prova, come descritto nei riferimenti 7 e 8. Se viene utilizzato un solvente organico per applicare la sostanza di prova i controlli con solvente contenenti l’acqua di prova (senza aggiunte) e l’acqua di 
prova con la sostanza di riferimento addizionata devono essere trat ­
tati come recipienti di prova attivi addizionati con la sostanza di prova in un vettore solvente. I controlli con solvente servono a verificare eventuali effetti negativi causati dal solvente alla popola ­
zione microbica evidenziati dalla degradazione della sostanza di ri ­
ferimento.
 
1.8.8.  Condizioni di prova  
1.8.8.1.  Temperatura di prova  
L’incubazione deve avvenire (preferibilmente) al buio o in presenza 
di luce diffusa a una temperatura controllata (± 2 °C), che può essere la temperatura sul campo o una temperatura standard di 20-25 °C. 
Per temperatura sul campo si può intendere o la temperatura effettiva 
del campione al momento del campionamento o la temperatura me ­
dia sul campo nel sito di campionamento.
 
1.8.8.2.  Agitazione  
Per mantenere le particelle e i microrganismi in sospensione è ne ­
cessario agitarli o mescolarli continuamente. L’agitazione agevola 
anche il trasferimento dell’ossigeno dallo spazio libero superiore al 
liquido per mantenere adeguatamente le condizioni aerobiche. Col ­
locare i flaconi su una tavola vibrante (agitazione pari a circa 100 gpm) o utilizzare un agitatore magnetico. L’agitazione deve essere 
continua ma il più delicata possibile e deve riuscire a mantenere la 
sospensione omogenea.
 
1.8.8.3.  Durata del saggio  
In genere il saggio non dovrebbe durare più di 60 giorni, a meno di 
non utilizzare la procedura semi-continua rinnovando periodicamente la sospensione di prova (cfr. punto 1.8.6 e appendice 2). La durata del saggio in discontinuo può tuttavia essere prolungata fino ad un 
massimo di 90 giorni se la degradazione della sostanza ha avuto 
inizio entro i primi 60 giorni. La degradazione è monitorata a inter ­
valli di tempo adeguati, determinando l’attività residua del
 14 C o il  
14 CO 2 formatosi (cfr. punto 1.8.9.4) e/o procedendo ad analisi chi ­
mica (punto 1.8.9.5). Il tempo di incubazione deve essere sufficien ­
temente lungo da permettere di valutare il processo di degradazione. La degradazione dovrebbe preferibilmente essere superiore al 50 %; per le sostanze a degradazione lenta l’entità della degradazione deve 
essere sufficiente (in genere superiore al 20 %) a stimare la costante 
cinetica di velocità di degradazione.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1194
 
È necessario effettuare misure periodiche del pH e della concentra ­
zione di ossigeno nel sistema di saggio, a meno che esperienze 
precedenti derivate da saggi analoghi con campioni di acqua e di sedimento prelevati dallo stesso sito non le rendano superflue. In presenza di determinate condizioni, il metabolismo dei substrati pri ­
mari a concentrazioni molto più elevate nell’acqua o nel sedimento 
può portare ad una formazione di CO
 2 e ad una riduzione di ossi ­
geno tali da modificare sensibilmente le condizioni sperimentali del saggio.
 
1.8.9.  Procedimento  
1.8.9.1.  Preparazione dei flaconi per il saggio pelagico  
Trasferire un volume adeguato di acqua di prova nei flaconi (mas ­
simo un terzo del volume del flacone, ma non meno di 100 ml circa). Se si utilizzano flaconi multipli (per raccogliere flaconi interi 
ad ogni campionamento) il volume giusto di acqua di prova è ancora 
pari a circa 100 ml, perché volumi ridotti possono influenzare la durata della fase di latenza. La sostanza di prova addizionata pro ­
viene da una soluzione madre (cfr. punti 1.8.2 e 1.8.7.). Per deter ­
minare la cinetica di degradazione e calcolare la costante cinetica di 
velocità di degradazione è necessario utilizzare la sostanza di prova ad almeno due diverse concentrazioni che si differenziano di un fattore compreso tra 5 e 10. Le due concentrazioni prescelte devono 
essere inferiori a 100 μg/l e comprese, preferibilmente, nell’intervallo 
< 1-10 μg/l.
 
Chiudere i flaconi con tappi o coperchi ermetici all’aria e al CO  2 . 
Per le sostanze chimiche di prova non volatili e non marcate con  14 C 
si consiglia di utilizzare tappi di cotone idrofilo per impedire la 
contaminazione con aria (cfr. punto 1.8.1) purché si sappia con certezza che gli eventuali prodotti di degradazione principali non siano volatili e si proceda alla determinazione indiretta del CO
 2 (cfr. 
appendice 3).  
Incubare i flaconi alla temperatura prescelta (cfr. punto 1.8.8.1). 
Ritirare i campioni per procedere all’analisi chimica o alla misura 
del 14 C all’inizio del saggio (cioè prima che inizi la biodegradazione; 
cfr. punto 1.7.1) e successivamente ad intervalli di tempo adeguati per tutta la durata del saggio. Il campionamento può avvenire per rimozione di sotto-campioni (per esempio aliquote di 5 ml) da cia ­
scun campione replicato o prelevando i flaconi interi ad ogni cam ­
pionamento. La mineralizzazione della sostanza di prova può essere determinata direttamente o indirettamente (cfr. appendice 3). Di so ­
lito sono necessari almeno cinque punti di campionamento durante la 
fase di degradazione (cioè al termine della fase di latenza) per sti ­
mare una costante di velocità affidabile, a meno che non si riesca a dimostrare che tre punti di campionamento sono sufficienti per le sostanze a degradazione rapida. Per le sostanze a degradazione lenta 
è facile effettuare più misure durante la fase di degradazione e per ­
tanto si devono utilizzare più punti di dati per stimare la costante k. Non è possibile stabilire tempi fissi per il campionamento vista la variabilità della velocità di biodegradazione; se la degradazione è 
lenta, si raccomanda tuttavia un campionamento a settimana. Se 
invece la sostanza di prova è a degradazione rapida, si deve effet ­
tuare un campionamento al giorno per i primi tre giorni e successi ­
vamente a giorni alterni o ogni due giorni. In alcuni casi, per esem ­
pio per le sostanze che idrolizzano molto rapidamente, può essere 
necessario effettuare campionamenti a intervalli orari. Prima del sag ­
gio si raccomanda di procedere a uno studio preliminare per deter ­
minare gli intervalli di campionamento adatti. Se servono campioni 
per effettuare altre analisi specifiche, si consiglia di prelevarne di più 
e di scegliere quali sottoporre ad analisi al termine dell’esperimento secondo una strategia a ritroso: in altri termini, gli ultimi campioni sono analizzati per primi (per indicazioni sulla sta ­
bilità dei campioni in fase di stoccaggio cfr. il punto 1.8.9.5, secondo 
paragrafo).
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1195
 
1.8.9.2.  Numero di flaconi e di campioni  
Preparare un numero sufficiente di flaconi in modo da avere a di ­
sposizione:  
— flaconi per la prova; almeno flaconi replicati per ciascuna con ­
centrazione della sostanza di prova (preferibilmente almeno 3) o 
flaconi multipli per ogni concentrazione se vengono raccolti fla ­
coni interi a ciascun campionamento (contrassegnati dal simbolo F
 T ), 
— flaconi per il calcolo del bilancio di massa; almeno flaconi re ­
plicati per ciascuna concentrazione di prova (contrassegnati dal simbolo F
 M ), 
— controllo in bianco, nessuna sostanza di prova: almeno un fla ­
cone in bianco contenente solo l’acqua di prova (contrassegnato 
dal simbolo F  B ), 
— controllo di riferimento; flaconi replicati con la sostanza di rife ­
rimento (per esempio anilina o benzoato di sodio a 10 μg/l) 
(contrassegnati dal simbolo F  C ). Il controllo di riferimento serve 
a confermare una minima attività microbica. Se conveniente è 
possibile utilizzare una sostanza di riferimento radiomarcata, an ­
che nel caso in cui la degradazione della sostanza di prova sia monitorata con analisi chimica,
 
— controllo sterile; uno o due flaconi contenenti acqua di prova 
sterilizzata per esaminare l’eventuale degradazione abiotica o 
un altro tipo di eliminazione non biologica della sostanza di 
prova (contrassegnati dal simbolo F  S ). L’attività biologica può 
essere interrotta ponendo l’acqua di prova in autoclave (a 121 °C per 20 min) oppure aggiungendo un tossico [per esempio sodio 
azide (NaN
 3 ) a 10-20 g/l, cloruro di mercurio (HgCl  2 ) a 100 mg/l 
o formalina a 100 mg/l] o ancora con radiazioni gamma. Se si utilizza HgCl
 2 deve essere smaltito come rifiuto tossico. Se 
all’acqua viene aggiunto un ingente quantitativo di sedimento 
non è semplice ottenere condizioni di sterilità; in tal caso si 
raccomanda di ripetere l’operazione di sterilizzazione in auto ­
clave (per esempio tre volte). Si consideri che le caratteristiche di assorbimento-adsorbimento del sedimento possono risultare 
alterate da questa operazione,
 
— controlli con solvente, contenenti acqua di prova e acqua di 
prova con sostanza di riferimento; flaconi replicati trattati con la stessa quantità di solvente e seguendo lo stesso procedimento utilizzato per l’applicazione della sostanza di prova. In questo 
modo s’intende verificare gli eventuali effetti negativi del sol ­
vente determinando la degradazione della sostanza di riferimento.
 
Nel concepire il saggio il ricercatore deve considerare l’importanza 
relativa di una maggiore replicazione sperimentale rispetto all’au ­
mento del numero dei momenti di campionamento. Il numero esatto di flaconi necessari dipenderà dal metodo utilizzato per misurare 
la degradazione (cfr. punto 1.8.9.1, terzo paragrafo, punto 1.8.9.4 e 
appendice 3).
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Per ciascun momento di campionamento da ciascun flacone devono 
essere prelevati due sottocampioni (per esempio aliquote di 5 ml). Se 
vengono impiegati flaconi multipli per prelevare i flaconi interi, almeno due flaconi devono essere sacrificati per ciascun momento di campionamento (cfr. punto 1.8.9.1, primo paragrafo).
 
1.8.9.3.  Preparazione dei flaconi per il saggio con sedimento in sospensione 
[facoltativo]  
Aggiungere, se richiesto, i volumi necessari di acqua di prova e 
sedimento ai recipienti utilizzati nel saggio (cfr. punto 1.8.5). Prepa ­
rare i flaconi per il saggio con sedimento in sospensione seguendo lo 
stesso procedimento del saggio pelagico (cfr. punti 1.8.9.1 e 1.8.9.2). 
Utilizzare preferibilmente bottiglie di siero o flaconi di forma analo ­
ga. Collocare i flaconi chiusi su un agitatore in posizione orizzontale. I flaconi aperti per le sostanze non marcate con
 14 C e non volatili 
devono essere naturalmente collocati in posizione verticale; in questo 
caso si consiglia di procedere all'agitazione magnetica utilizzando barre magnetiche rivestite di vetro. Se necessario, aerare le bottiglie per conservare le condizioni aerobiche necessarie.
 
1.8.9.4.  Determinazione radiochimica  
Il 14 CO 2 che si forma può essere misurato direttamente o indiretta ­
mente (cfr. appendice 3). Per via indiretta viene misurato determi ­
nando la differenza tra l’attività iniziale del  14 CO 2 nell’acqua di 
prova o nella sospensione e l’attività residua totale al momento del 
campionamento misurata dopo l’acidificazione del campione (fino a 
ottenere un pH 2-3) e lo strippaggio del CO  2 . Il carbonio inorganico 
viene così eliminato e l’attività residua misurata è data dal materiale organico. Non si procede alla determinazione indiretta del
 14 CO 2 se 
durante la trasformazione della sostanza di prova si formano notevoli 
metaboliti volatili (cfr. appendice 3). Se possibile la formazione di  
14 CO 2 deve essere misurata direttamente (appendice 3) al momento 
di ciascun campionamento in almeno un flacone di prova; con questo 
procedimento è possibile verificare il bilancio di massa e il processo 
di biodegradazione, ma solo nei saggi che utilizzano flaconi chiusi.  
In caso di misurazione diretta del  14 CO 2 nel corso del saggio, è 
necessario preparare un maggior numero di flaconi a tal fine all’ini ­
zio del saggio stesso. È consigliabile misurare il  14 CO 2 per via 
diretta se durante la trasformazione della sostanza di prova si for ­
mano notevoli metaboliti volatili. In ciascun punto di misurazione i flaconi supplementari vengono acidificati (pH 2-3) e il
 14 CO 2 viene 
raccolto in un assorbitore interno o esterno (cfr. appendice 3).  
In via facoltativa è possibile determinare la concentrazione della 
sostanza di prova marcata con  14 C e i principali metaboliti con la 
tecnica della radiocromatografia (per esempio cromatografia su strato 
sottile o TLC, la cromatografia RAD-TLC) o della cromatografia HPLC con rivelatore radiochimico.
 
È inoltre facoltativo determinare la distribuzione di fase della radio ­
attività rimanente (cfr. appendice 1) e la sostanza di prova e i me ­
taboliti residui.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1197
 
Al termine del saggio il bilancio di massa deve essere determinato 
con la misurazione diretta del  14 CO 2 utilizzando flaconi separati dai 
quali nel corso del saggio non è stato prelevato alcun campione (cfr. appendice 3).
 
1.8.9.5.  Analisi chimica specifica  
Se è disponibile un metodo analitico specifico sensibile, è possibile 
determinare la biodegradazione primaria misurando la concentrazione 
residua totale della sostanza di prova, senza ricorrere alle tecniche di 
radiomarcatura. Se viene utilizzata una sostanza di prova radiomar ­
cata (per misurare la mineralizzazione totale), parallelamente è pos ­
sibile effettuare analisi chimiche specifiche che offrono utili infor ­
mazioni supplementari e permettono di verificare il procedimento. Le 
analisi chimiche specifiche possono essere utili anche per misurare i metaboliti che si formano durante la degradazione della sostanza di prova: questo procedimento è consigliabile per le sostanze minera ­
lizzate con tempi di emivita superiori a 60 giorni. È necessario 
misurare la concentrazione della sostanza di prova e i metaboliti al momento di ciascun campionamento e riferire i dati ottenuti (sotto 
forma di concentrazione e di percentuale della sostanza applicata). In 
generale, i metaboliti rilevati in percentuale ≥ 10 % della concen ­
trazione applicata al momento del campionamento devono essere identificati, a meno di fondate ragioni per non farlo. Occorre valutare 
la possibilità di identificare anche i metaboliti le cui concentrazioni 
aumentano continuamente nel corso dello studio, anche se tali con ­
centrazioni non superano il limite indicato precedentemente, perché questo elemento potrebbe essere indice di persistenza. Occorre valu ­
tare la possibilità di procedere all’analisi dei metaboliti in controlli 
sterili se si ritiene possibile una trasformazione abiotica rapida della sostanza di prova (per esempio nel caso dell’idrolisi). È necessario valutare caso per caso se sia necessario quantificare e identificare i 
metaboliti, motivando le scelte nella relazione. Le tecniche di estra ­
zione con solvente organico devono essere applicate secondo le in ­
dicazioni fornite nel rispettivo procedimento analitico.
 
Tutti i campioni devono essere stoccati a 2-4 °C e in condizioni 
ermetiche se l’analisi viene effettuata nel giro di 24 ore (ipotesi da 
privilegiare). Se lo stoccaggio si prolunga, i campioni devono essere congelati a temperature inferiori a – 18 °C o devono essere conser ­
vati chimicamente. Non è consigliabile procedere all’acidificazione 
per conservare i campioni, perché in quel caso i campioni possono 
risultare instabili. Se i campioni non sono analizzati entro 24 ore e devono essere stoccati più a lungo, è necessario svolgere uno studio sulla stabilità allo stoccaggio per dimostrare la stabilità delle sostanze 
chimiche interessate ad una temperatura di stoccaggio inferiore a – 
18 °C o in condizioni di conservazione. Se il metodo di analisi prevede l’estrazione con solvente o l’estrazione in fase solida (SPE), l’estrazione deve avvenire immediatamente dopo il campionamento o 
lo stoccaggio del campione refrigerato per un massimo di 24 ore.
 
In base alla sensibilità del metodo di analisi potrebbe essere neces ­
sario utilizzare campioni di volume superiore a quello indicato al paragrafo 1.8.1. Il saggio può essere svolto facilmente con volumi 
di prova di un litro in flaconi da 2-3 litri, che permettono di prele ­
vare campioni di circa 100 ml.
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2. DATI E RELAZIONI  
2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI  
2.1.1.  Rappresentazione dei dati  
Arrotondare i tempi di campionamento ad un numero intero di ore (a 
meno che la sostanza non si degradi in maniera consistente in un 
periodo variabile tra minuti e ore), ma non ad un numero intero di giorni. Indicare le stime dell'attività residua della sostanza di prova (per le sostanze marcate con
 14 C) o la concentrazione residua (per le 
sostanze non marcate), rispetto al tempo in un grafico lineare e in un 
grafico semi-logaritmico (cfr. figure 1a e 1b). Se è avvenuta la degradazione, comparare i risultati dei flaconi F
 T con quelli dei 
flaconi F  S . Se le medie dei risultati ricavati dai flaconi con la so ­
stanza di prova (F  T ) e dai flaconi sterili (F  S ) divergono di meno del 
10 %, si può ritenere che la degradazione osservata è prevalente ­
mente abiotica. Se la degradazione nei flaconi F  S è inferiore, i risul ­
tati possono essere utilizzati per correggere quelli ottenuti con i 
flaconi F  T (per sottrazione) per stimare l’entità della degradazione. 
Nel caso in cui vengano effettuate analisi facoltative per i principali metaboliti, oltre al grafico relativo alla scomparsa della sostanza di 
prova, è necessario fornire i grafici relativi alla formazione e alla 
scomparsa dei metaboliti.
 
Stimare la durata della fase di latenza t  L dalla curva di degradazione 
(grafico semi-logaritmico) estrapolando la parte lineare fino alla degradazione zero o, in alternativa, determinando il tempo ne ­
cessario per ottenere circa il 10 % della degradazione (cfr. figure 1a 
e 1b). In base al grafico semi-logaritmico, stimare la costante di velocità del 1
 o ordine, k, e l’errore standard con la regressione li ­
neare di ln (attività residua del  14 C o concentrazione della sostanza 
di prova) rispetto al tempo. In particolare con le misure del  14 C 
utilizzare solo i dati che appartengono alla parte lineare iniziale della curva dopo la fase di latenza e, di preferenza, selezionare pochi dati rappresentativi piuttosto che una grande quantità di dati più incerti. 
In questo caso l’incertezza comprende errori inerenti all’uso diretto 
raccomandato delle attività residue del
 14 C rilevate (cfr. sotto). A 
volte può essere utile calcolare due diverse costanti di velocità se la degradazione segue un modello bifasico. A tal fine vengono de ­
finite due diverse fasi della curva di degradazione. Effettuare il cal ­
colo della costante k e dell’emivita t
 ½ = ln2/k per ciascuno dei 
singoli flaconi replicati quando dallo stesso flacone vengono prele ­
vati sottocampioni, oppure applicando i valori medi quando sono 
raccolti interi flaconi per ciascun momento di campionamento (cfr. 
l’ultimo paragrafo del punto 1.8.9.2). Se si utilizza la prima proce ­
dura è necessario riportare la costante di velocità e l’emivita per ciascuno dei singoli flaconi replicati e un valore medio con un errore 
standard. Se sono state utilizzate concentrazioni elevate della so ­
stanza di prova, la curva di degradazione può discostarsi notevol ­
mente da una retta (grafico semi-logaritmico) e la cinetica del 1
 o ordine può non risultare valida. In tal caso non ha senso definire 
un’emivita. Tuttavia, per un intervallo di dati limitato, è possibile 
applicare una cinetica di pseudo-1  o ordine e stimare il tempo di 
dimezzamento DT  50 (cioè il tempo necessario a raggiungere 
una degradazione del 50 %). Occorre tuttavia ricordare che, utiliz ­
zando il DT  50 , non è possibile prevedere la durata della degradazione 
oltre l’intervallo di dati selezionato, perché il DT  50 non è altro che 
un descrittore di una determinata serie di dati. Gli strumenti analitici che agevolano il calcolo statistico e l’aggiustamento della curva sono 
facilmente disponibili e si raccomanda pertanto di utilizzare questo 
tipo di software.
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Se si effettuano analisi chimiche specifiche, stimare le costanti di 
velocità e i tempi di emivita per la degradazione primaria come 
indicato in precedenza nel caso della mineralizzazione totale. Se la degradazione primaria è il processo limitante, talvolta è possibile utilizzare i punti di dati dell’intera degradazione, perché le misure 
sono dirette, al contrario di quanto avviene con le misure dell’attività 
del
 14 C. 
Se si utilizzano sostanze marcate con  14 C il bilancio di massa deve 
essere espresso in percentuale della concentrazione iniziale applicata, 
almeno alla fine del saggio.  
2.1.2.  Attività residua  
Quando la parte marcata con  14 C di una sostanza organica è biode ­
gradata, la parte più consistente del  14 C è convertita in  14 CO 2 , men­
tre un’altra parte è utilizzata per la crescita di biomassa e/o per la 
sintesi di metaboliti extra-cellulari. La biodegradazione «completa» 
di una sostanza non produce pertanto una conversione al 100 % del carbonio in
 14 CO 2 . Il 14 C integrato nei prodotti formatisi per biosin ­
tesi è successivamente rilasciato lentamente sotto forma di  14 CO 2 a 
causa della «mineralizzazione secondaria». Per questi motivi la rap ­
presentazione grafica dell’attività residua del  14 C organico (misurata 
dopo strippaggio del CO  2 ) o del  14 CO 2 prodotto rispetto al tempo 
indicherà un fenomeno di «coda» (tailing) dopo che la biodegrada ­
zione sarà ultimata. Questa situazione rende più complessa l’inter ­
pretazione cinetica dei dati e, a tal fine, in genere per stimare la costante di velocità di degradazione si deve utilizzare solo la parte iniziale della curva (dopo la conclusione della fase di latenza e prima 
che sia raggiunto il 50 % circa della degradazione). Se la sostanza di 
prova è degradata, l’attività totale residua del
 14 C organico è sempre 
più elevata dell’attività del  14 C associata alla sostanza di prova che 
rimane intatta. Se la sostanza di prova è degradata con una reazione 
del 1  o ordine e una frazione costante α è mineralizzata in CO  2 , la 
pendenza iniziale della curva di scomparsa del  14 C (  14 C organico 
totale rispetto al tempo) sarà α volte la pendenza della corrispondente 
curva della concentrazione della sostanza di prova (o, più precisa ­
mente, della parte della sostanza di prova marcata con  14 C). Se si 
utilizzano le misure dell’attività totale del  14 C organico senza corre ­
zioni, la costante di velocità di degradazione calcolata risulterà espressa per difetto. Le procedure per stimare le concentrazioni della 
sostanza di prova dalle attività radiochimiche misurate sulla base di 
varie ipotesi semplificatrici sono state descritte nei riferimenti 2, 9, 10, 11. Tali procedure sono applicabili più facilmente nel caso di sostanze a degradazione rapida.
 
2.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI  
Se risulta che k non è funzione della concentrazione addizionata 
(cioè se la costante k calcolata è indicativamente uguale a concen ­
trazioni diverse della sostanza di prova) si può ipotizzare che la costante di velocità del 1
 o ordine è rappresentativa delle condizioni 
di prova impiegate, cioè la sostanza di prova, il campione di acqua e 
la temperatura di prova. Un giudizio esperto deve valutare se i risultati possono essere generalizzati o estrapolati ad altri sistemi. Se si utilizza una concentrazione elevata della sostanza di prova e 
dunque la degradazione non segue una cinetica del 1
 o ordine, non è 
possibile utilizzare i dati per la stima diretta di una costante di velocità del 1
 o ordine o un’emivita corrispondente. Tuttavia, i dati 
ricavati da una prova a concentrazioni elevate della sostanza di prova 
possono comunque essere utilizzati per stimare la mineralizzazione 
totale e/o per rilevare e quantificare i metaboliti.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1200
 
Se si conoscono le velocità di altri processi di perdita diversi dalla 
biodegradazione (per esempio l’idrolisi o la volatilizzazione), questi 
valori possono essere sottratti dalla velocità netta della perdita osser ­
vata durante il saggio e ottenere una stima approssimativa della velocità di biodegradazione. I dati relativi all’idrolisi possono essere 
ottenuti, per esempio, da un controllo sterile o da una prova parallela 
applicando una concentrazione più elevata della sostanza di prova.
 
La determinazione diretta e indiretta del  14 CO 2 (punto 1.8.9.4 e 
appendice 3) può essere utilizzata solo per misurare l’entità della mineralizzazione della sostanza di prova in CO
 2 . La radiocromato ­
grafia (RAD-TLC) o l’HPLC possono essere utilizzate per analizzare 
le concentrazioni della sostanza di prova marcata con  14 C e la for ­
mazione dei principali metaboliti (punto 1.8.9.4, terzo paragrafo). Per una stima diretta dell’emivita è necessario che non siano presenti 
importanti metaboliti (definiti come quelli che rappresentano una 
percentuale ≥ 10 % della quantità applicata di sostanza di prova). 
Se sono presenti metaboliti nella quantità indicata nella definizione, occorre una valutazione dettagliata dei dati, che può comprendere la 
ripetizione del saggio e/o l’individuazione dei metaboliti (cfr. punto 
1.8.9.5, primo paragrafo), a meno che non si possa ragionevolmente determinare il destino dei metaboliti in base all'esperienza (per esem ­
pio con informazioni sulla via di degradazione). Poiché la propor ­
zione di carbonio presente nella sostanza di prova che viene conver ­
tita in CO
 2 è variabile (soprattutto in funzione della concentrazione 
della sostanza di prova e di altri substrati disponibili, delle condizioni della prova e della comunità microbica), questo saggio non consente 
di stimare direttamente la biodegradazione completa come avviene 
nel saggio con esaurimento del carbonio organico disciolto (DOC die-away test), ma il risultato è analogo a quello ottenuto mediante test respirometrico. Il grado di mineralizzazione sarà pertanto uguale 
o simile al livello minimo di biodegradazione completa. Per avere un 
quadro più completo della biodegradazione completa (mineralizza ­
zione e incorporazione nella biomassa) l’analisi della distribuzione di fase del
 14 C deve avvenire al termine del saggio (cfr. appendice 1). Il  
14 C nel pool del particolato sarà dato dal  14 C incorporato nella 
biomassa batterica e dal  14 C adsorbito o assorbito nelle particelle 
organiche.  
2.3. VALIDITÀ DEL SAGGIO  
Se la sostanza di prova non viene degradata nell’intervallo di tempo 
previsto (per l’anilina e il benzoato di sodio si tratta, in genere, di meno di due settimane) la validità del saggio deve ritenersi dubbia e 
deve essere ulteriormente verificata; in alternativa, è necessario ripe ­
tere il saggio con un nuovo campione d’acqua. In una prova inter ­
laboratorio (ring-test) ISO del metodo al quale hanno partecipato sette laboratori di tutta Europa, le costanti di velocità 
di degradazione adattate per l’anilina variavano da 0,3 a 1,7 giorni
 –1 
con una media di 0,8 g  -1 a 20 o  C e un errore standard di ± 0,4 g  –1 (t ½ 
= 0,9 giorni). I tempi di latenza tipici variavano tra 1 e 7 giorni. Le 
acque esaminate presentavano una biomassa batterica di 10  3 -10 4 
unità formanti colonie (CFU) per ml. Le velocità di degradazione 
nelle acque dell’Europa centrale, ricche in nutrienti, erano superiori a quelle delle acque oligotrofiche dell’Europa settentrionale: questo 
dato può essere dovuto al diverso stato trofico delle acque o a una 
precedente esposizione a sostanze chimiche.
 
Il recupero totale (bilancio di massa) al termine dell’esperimento 
dovrebbe oscillare tra il 90 % e il 110 % per le sostanze radiomar ­
cate, mentre il recupero iniziale all’inizio dell’esperimento dovrebbe essere compreso tra il 70 % e il 110 % per le sostanze non marcate. 
Questi intervalli devono tuttavia essere interpretati come obiettivi e 
non essere considerati dei criteri per l’accettazione del saggio.
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3. RELAZIONE DI PROVA  
Nella relazione di prova deve essere indicato chiaramente il tipo di 
studio condotto, cioè saggio pelagico o con sedimento in sospensio ­
ne, oltre che le informazioni minime riportate di seguito.  
Sostanza di prova e sostanza(e) di riferimento:  
— denominazioni comuni, nomi chimici (si raccomanda di indicare 
le denominazioni IUPAC e/o CAS), numeri CAS, formule di struttura (indicando la posizione del
 14 C se si utilizzano sostanze 
radiomarcate) e le pertinenti proprietà fisico-chimiche della so ­
stanza di prova e della sostanza di riferimento (cfr. punti 1.5 e 1.6),
 
— nomi chimici, numeri CAS, formule di struttura (indicando la 
posizione del  14 C se si utilizzano sostanze radiomarcate) e le 
pertinenti proprietà fisico-chimiche delle sostanze utilizzate come standard per l’identificazione e la quantificazione dei me ­
taboliti,
 
— purezza (impurità) delle sostanze di prova e di riferimento,  
— purezza radiochimica della sostanza marcata e attività specifica 
(se pertinente).  
Acqua superficiale:  
Per il campione di acqua prelevato è necessario fornire le seguenti 
informazioni minime:  
— ubicazione e descrizione del sito di campionamento e, se possi ­
bile, cronistoria della contaminazione,  
— data e ora in cui è stato prelevato il campione,  
— nutrienti (N totale, ammonio, nitriti, nitrati, P totale, ortofosfato 
disciolto),  
— profondità alla quale è stato prelevato il campione,  
— aspetto del campione (per esempio, colore e torbidità),  
— DOC e TOC,  
— BOD,  
— temperatura e pH nel luogo e al momento del prelievo,  
— ossigeno o potenziale di ossido-riduzione (obbligatorio solo se le 
condizioni aerobiche non sono evidenti),  
— salinità o conduttività (in caso di acque di mare o salmastre),  
— solidi in sospensione (se il campione è torbido),  
— eventualmente, altre informazioni attinenti sul punto di campio ­
namento al momento del prelievo (per esempio dati effettivi o 
storici sulla portata dei fiumi o sulle correnti marine, sulle prin ­
cipali fonti di emissioni/scarichi eventualmente presenti nelle vi ­
cinanze e sui tipi di scarichi, sulle condizioni meteorologiche verificatesi prima del campionamento).
 
In via facoltativa è possibile indicare le seguenti informazioni:  
— biomassa microbica (per esempio conteggio diretto con arancio- 
acridina o unità formanti colonie),  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1202
 
— carbonio inorganico,  
— concentrazione di clorofilla  a utilizzata per la stima specifica 
della biomassa algale.  
Se viene eseguito il saggio con sedimento in sospensione devono 
essere fornite le seguenti informazioni sul sedimento:  
— profondità a cui è stato prelevato il sedimento,  
— aspetto del sedimento (colorato, fangoso, limoso o sabbioso),  
— consistenza (per esempio % di sabbia grossa, sabbia fine, limo e 
argilla),  
— peso secco in g/l di solidi in sospensione, concentrazione di TOC 
o perdita di peso alla combustione come indicazione del conte ­
nuto di materia organica,  
— pH,  
— ossigeno o potenziale di ossido-riduzione (obbligatorio solo se le 
condizioni aerobiche non risultano evidenti).  
Condizioni della prova:  
— tempo intercorso tra il prelievo del campione e l’utilizzo nel 
saggio in laboratorio, stoccaggio e pretrattamento del campione, date di esecuzione degli studi,
 
— quantità di sostanza applicata, concentrazione di prova e sostanza 
di riferimento,  
— metodo di applicazione della sostanza di prova, compreso l’even ­
tuale uso di solventi,  
— volume di acqua superficiale utilizzata e di sedimento (eventuale) 
e volume campionato ad ogni intervallo ai fini dell’analisi,  
— descrizione del sistema di saggio applicato,  
se il saggio non avviene al buio, fornire informazioni sulle condi ­
zioni di «luce diffusa»,  
— informazioni sul o sui metodi utilizzati per procedere a controlli 
sterili (per esempio temperatura, tempo e numero di sterilizza ­
zioni in autoclave),  
— temperatura di incubazione,  
— informazioni sulle tecniche di analisi e sui metodi utilizzati per le 
misure radiochimiche e per il controllo del bilancio di massa e la misura della distribuzione di fase (se effettuata),
 
— numero di misure replicate.  
Risultati:  
— percentuali di recupero (cfr. punto 1.7.1),  
— ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici applicati, compreso il 
limite di rilevabilità (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) 
(cfr. punto 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1203
 
— tutti i dati misurati (comprese le ore dei campionamenti) e i 
valori calcolati in formato tabulare e le curve di degradazione; 
per ogni concentrazione di prova e flacone replicato riportare il coefficiente di correlazione lineare per la pendenza del grafico logaritmico, la fase di latenza stimata e una costante di velocità 
del 1
 o ordine o di pseudo-1  o ordine (se possibile), nonché il 
corrispondente tempo di dimezzamento di degradazione (o emi ­
vita, t  50 ), 
— riportare i valori pertinenti sotto forma di medie dei risultati 
osservati nei singoli campioni replicati, per esempio la lunghezza della fase di latenza, la costante di velocità di degradazione e il 
tempo di dimezzamento di degradazione (o il t
 50 ), 
— classificare il sistema come non adattato o adattato in base all’an ­
damento della curva di degradazione e della possibile influenza 
della concentrazione di prova,  
— i risultati del controllo finale del bilancio di massa e i risultati 
delle eventuali misure della distribuzione di fase,  
— la frazione di  14 C mineralizzata e, in caso di analisi specifiche, il 
livello finale di degradazione primaria,  
— l’identificazione, la concentrazione molare e la percentuale di 
prodotti applicati e dei principali metaboliti (cfr. punto 1.8.9.5, primo paragrafo), se del caso,
 
— eventualmente, una possibile via di trasformazione,  
— un commento sui risultati.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
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2. ISO/DIS 14592-1 (1999),  Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions .
 
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4. Metodo di prova C.24. Trasformazione aerobica e anaerobica nei 
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Parigi.  
6. ISO 8245 (1999),  Water quality — Guidelines on the determi ­
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carbon (DOC) . 
7. ISO 10634 (1995),  Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium .
 
8. OCSE progetto (2000),  Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental He ­
alth and Safety Publications. Series on Testing and Assessment , 
n. 22.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1204
 
9. Simkins, S. e Alexander, M. (1984), «Models for mineralization 
kinetics with the variables of substrate concentration and popu ­
lation density»,  Appl. Environ. Microbiol . n. 47, pagg. 394-401.  
10. Ingerslev, F. e N. Nyholm, (2000), «Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems»,  Ecotoxicol. Environ. 
Saf. n. 45, pagg. 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999),  Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic com ­
pounds at low concentrations part 1  — report of 1998/1999 
ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions . ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1205
 
Appendice 1  
Distribuzione di fase del  14 C 
Per verificare il procedimento, le misure di routine dell’attività totale residua del  
14 C organico (TOA) devono essere integrate da misure del bilancio di massa con 
la determinazione diretta del  14 CO 2 formatosi dopo intrappolamento in un assor ­
bitore (cfr. appendice 3). Di per sé, una formazione di  14 CO 2 costituisce una 
prova diretta della biodegradazione rispetto alla degradazione abiotica o ad altri meccanismi di perdita, come la volatilizzazione e l’assorbimento/adsorbimento. Altre informazioni utili che caratterizzano il comportamento di biodegradabilità si 
ottengono misurando la distribuzione della TOA tra stato disciolto (attività del
 
14 C organico disciolto, DOA) e stato particolato (attività del  14 C organico parti ­
colato, POA) dopo separazione del particolato per filtrazione a membrana o centrifugazione. La POA è data dalla sostanza di prova sorbita dalla biomassa 
microbica e da altre particelle oltre al carbonio della sostanza di prova utilizzato 
per la sintesi di nuovo materiale cellulare e dunque incorporato nella frazione particellare della biomassa. La formazione di materiale con
 14 C organico disciolto 
può essere stimata come DOA al termine della biodegradazione (linea orizzontale 
sulla curva degradazione-tempo).  
Stimare la distribuzione di fase del  14 C residuo in determinati campioni filtran ­
doli con un filtro a membrana con porosità di 0,22 μm o 0,45 μm realizzato con 
un materiale che non adsorba quantitativi ingenti di sostanza di prova (i filtri di policarbonato possono essere i più adatti). Se l’assorbimento/adsorbimento della 
sostanza di prova nel filtro è troppo consistente per essere ignorato (fattore da 
verificare prima del saggio), al posto della filtrazione è possibile utilizzare la centrifugazione ad alta velocità (2 000 g, 10 min).
 
Procedere con il filtrato o centrifugato secondo quanto descritto all’appendice 3 
per i campioni non filtrati. Dissolvere i filtri a membrana in un fluido di scin ­
tillazione adeguato e procedere al conteggio secondo le modalità consuete, usando in genere solo il metodo del rapporto standard esterno per compensare il fenomeno del quenching (attenuazione) oppure usare un ossidante del campio ­
ne. Se è stata utilizzata la centrifugazione, rimettere in sospensione il pellet 
formato dalla frazione di particolato in 1-2 ml di acqua distillata e trasferirlo in una fiala da scintillazione. Successivamente, procedere a un doppio lavaggio con 1 ml di acqua distillata e trasferire l’acqua di lavaggio nella fiala. Se neces ­
sario, la sospensione può essere incorporata in un gel per il conteggio in scin ­
tillazione liquida.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1206
 
Appendice 2  
Procedimento semi-continuo  
Per raggiungere una degradazione sufficiente di sostanze recalcitranti può essere 
necessaria un'incubazione prolungata che può durare fino a vari mesi. In genere il saggio non dovrebbe durare più di 60 giorni, a meno che non si riesca a man ­
tenere le caratteristiche del campione di acqua originario rinnovando la sospen ­
sione di prova. La durata del saggio può tuttavia essere prolungata fino ad un massimo di 90 giorni senza rinnovo della sospensione di prova se la degradazione della sostanza di prova è iniziata entro i primi 60 giorni.
 
Se l’incubazione si prolunga per lungo tempo, la diversità della comunità mi ­
crobica può diminuire a causa di vari meccanismi di perdita e alla possibile 
riduzione di nutrienti essenziali e dei substrati di carbonio primari presenti nel campione di acqua. Per determinare la velocità di degradazione di sostanze a degradazione lenta si raccomanda pertanto di procedere ad un saggio semi- 
continuo. Il saggio deve iniziare con un procedimento semi-continuo se, in base 
ad esperienze precedenti, si ritiene che sarà necessario un periodo di incubazione di tre mesi per raggiungere una degradazione della sostanza pari al 20 %. In alternativa, il normale saggio in discontinuo potrà essere trasformato in un saggio 
semi-continuo se nel giro di circa 60 giorni di saggio con la procedura in 
discontinuo non c’è stata degradazione. La procedura semi-continua può essere arrestata e il saggio può continuare in discontinuo quando si registra una degradazione notevole (per esempio > 20 %).
 
Nel saggio semi-continuo ogni due settimane circa un terzo del volume della 
sospensione di prova viene sostituito da acqua appena prelevata alla quale è addizionata la sostanza di prova alla concentrazione iniziale. Analogamente, se viene eseguito il saggio facoltativo con sedimento in sospensione, viene aggiunto 
anche sedimento all’acqua di sostituzione alla concentrazione iniziale (compresa 
tra 0,01 e 1 g/l). Nell’esecuzione del saggio con sedimenti solidi in sospensione, è importante mantenere un sistema completamente in sospensione anche quando l'acqua viene rinnovata; inoltre, il tempo di residenza deve essere lo stesso per i 
solidi e per l'acqua, altrimenti si può perdere la similarità con il sistema acquatico 
omogeneo, senza fasi fisse, che si intende riprodurre. Per questo motivo, nel caso della procedura semi-continua, è preferibile che la concentrazione iniziale dei sedimenti in sospensione si attesti nell’intervallo più basso indicato.
 
L’aggiunta di sostanza di prova che viene richiesta implica che la concentrazione 
iniziale della sostanza di prova non deve essere superata dal rinnovo parziale 
della sospensione di prova e, dunque, che si deve evitare l'adattamento, che si riscontra di frequente in presenza di concentrazioni elevate della sostanza di prova. Poiché la procedura comprende sia la re-inoculazione che la compensa ­
zione per la riduzione dei nutrienti e dei substrati primari, la diversità microbica 
originaria viene ripristinata e la durata del saggio può essere prolungata, in teoria, all’infinito. In caso di procedura semi-continua è importante ricordare che la concentrazione residua della sostanza di prova deve essere corretta in funzione 
dei quantitativi di sostanza di prova addizionati o eliminati nel corso di ciascuna 
procedura di rinnovo. La concentrazione totale e la concentrazione della sostanza di prova disciolta possono essere utilizzate in maniera intercambiabile per i composti con basso grado di assorbimento/adsorbimento. L’assorbimento/ ­
adsorbimento è insignificante (< 5 %) alle condizioni indicate (0,1-1 g solidi/l) 
per le sostanze con log Kow < 3 (valido per composti neutri, lipofilici), come si può notare dal seguente esempio. 0,1 g/l di solidi corrispondono a circa 10 mg di 
carbonio per litro (frazione di carbonio, f
 C = 0,01). Se:  
Log K  ow (della sostanza di prova) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Coefficiente di partizione, K  d = f C × K  oc 
la frazione disciolta della concentrazione totale [C-acqua (C  w )/C-totale (C  t )] pari 
a: 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 x 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1207
 
Appendice 3  
Determinazione del  14 CO  2 
Determinazione indiretta del  14 CO  2 
Per le misure di routine, il metodo indiretto è in genere quello che richiede meno 
tempo e il più preciso se la sostanza di prova non è volatile e non si trasforma in 
metaboliti volatili. È sufficiente trasferire campioni non filtrati (per esempio di 
5 ml) in fiale da scintillazione. All’inizio un’attività adeguata nei campioni è compresa tra 5 000 dpm e 10 000 dpm (80-170 Bq) e l’attività iniziale minima è pari a circa 1 000 dpm. Il CO
 2 deve essere strippato dopo acidificazione (pH 2-3) 
con 1 o 2 gocce di H  3 PO 4 o di HCl concentrato. Lo strippaggio del CO  2 può 
essere eseguito insufflando aria per circa ½-1 ora. In alternativa, è possibile agitare vigorosamente le fiale per 1-2 ore (per esempio su un agitatore a micro ­
piastre) oppure procedere ad un’agitazione più delicata per tutta una notte. È 
necessario verificare l’efficienza dello strippaggio del CO
 2 (prolungando l’aera ­
zione o l'agitazione). Successivamente aggiungere un liquido di scintillazione adatto a conteggiare i campioni acquosi; omogeneizzare il campione in miscela ­
tore rotante e determinare la radioattività tramite conteggio in scintillazione li ­
quida e sottraendo l’attività di fondo riscontrata nei bianchi di prova (F
 B ). A 
meno che l’acqua di prova non sia molto colorata o contenga concentrazioni elevate di particelle, in genere i campioni presenteranno un quenching (attenua ­
zione) uniforme e sarà sufficiente apportare correzioni all’attenuazione utiliz ­
zando uno standard esterno. Se l’acqua di prova è molto colorata, può essere 
necessario procedere alla correzione con uno standard interno. Se la concentra ­
zione delle particelle è elevata, potrebbe non essere possibile ottenere una solu ­
zione o un gel omogenei, oppure la variazione di attenuazione tra un campione e 
l’altro potrebbe essere notevole. In tal caso si può utilizzare il metodo di con ­
teggio descritto per i fanghi. Se il saggio viene effettuato sotto forma di saggio con sedimento in sospensione, si può misurare indirettamente il
 14 CO 2 prendendo 
un campione omogeneo di 10 ml dell’acqua/sospensione di prova e separarne le 
fasi per centrifugazione a velocità adeguata (per esempio 40 000 m/s  2 per 
15 min). La fase acquosa deve successivamente essere trattata come descritto in precedenza. L’attività del
 14 C organico particolato — POA — deve essere 
determinata mediante ri-sospensione del sedimento in poca acqua distillata, che 
deve essere successivamente trasferita nelle fiale da scintillazione con l'aggiunta 
di liquido di scintillazione per formare un gel (a tal fine esistono in commercio liquidi speciali). In base al tipo di particelle (per esempio al loro contenuto di materiale organico) può essere fattibile digerire il campione in una notte con un 
solubilizzatore in tessuto e successivamente procedere all’omogeneizzazione in 
un miscelatore rotante prima di aggiungere il liquido di scintillazione. In alter ­
nativa, la POA può essere determinata tramite combustione in eccesso di ossi ­
geno utilizzando un ossidante del campione. Al momento del conteggio è sempre 
necessario includere standard interni e può essere necessario effettuare correzioni 
dell’attenuazione aggiungendo standard interni per ogni singolo campione.
 
Determinazione diretta del  14 CO  2 
Se il  14 CO 2 formatosi viene misurato direttamente, occorre preparare vari flaconi 
all’inizio del saggio, prelevarli in ciascun punto di misura acidificandoli (pH 2-3) 
e raccogliendo il  14 CO 2 in un assorbitore interno (collocato in ogni flacone di 
prova all’inizio del saggio) o esterno. Come mezzo di assorbimento è possibile utilizzare un mezzo alcalino (per esempio una soluzione di 1N di NaOH o un 
pellet di NaOH), etanolammina, un assorbitore a base di etanolammina oppure 
assorbitori reperibili sul mercato. Per la misurazione diretta del
 14 CO 2 , i flaconi 
devono essere chiusi, per esempio con tappi in gomma di butile.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1208
 
Figura 1a  
Esempio di rappresentazione aritmetica dei dati (attività residua rispetto al 
tempo)
  
Figura 1b  
Esempio di grafico semi-logaritmico (ln attività residua rispetto al tempo)
  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1209
 
C.26.  SAGGIO DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA DI  LEMNA  SP. 
1. METODO  
Il presente metodo corrisponde alla linea guida TG 221 (2006) del ­
l'OCSE. Esiste un ampio consenso da parte delle autorità UE sul 
fatto che il saggio con Lemna costituisce un'alternativa adeguata al saggio algale per le sostanze fortemente colorate (2, 3).
 
1.1. INTRODUZIONE  
Il presente metodo di prova è destinato a valutare la tossicità di 
sostanze nei confronti di piante acquatiche di acqua dolce del genere  
Lemna  (lenticchia d'acqua). Si basa su linee direttici esistenti (4, 5, 6, 
7, 8, 9) ma comprende modifiche apportate a questi metodi in modo da tenere conto degli ultimi progressi della ricerca e delle consulenze 
di esperti su una serie di aspetti fondamentali. Il metodo qui proposto 
è stato convalidato da una prova interlaboratorio (ring test) interna ­
zionale (10).
 
Il presente metodo di prova descrive delle prove di tossicità su  
Lemna gibba  e Lemna minor , che sono state entrambe ampiamente 
studiate e oggetto delle norme summenzionate. La tassonomia di  
Lemna  spp. è complessa ed è complicata dall'esistenza di numerosi 
fenotipi. Sebbene con  Lemna  possa verificarsi una variabilità gene ­
tica nella reazione alle sostanze tossiche, attualmente disponiamo di 
dati insufficienti su questa fonte di variabilità per raccomandare l'utilizzo di un clone specifico per questo metodo di prova. Occorre rilevare che la prova non viene effettuata in condizioni asettiche, ma 
che nel corso della procedura sono adottate misure per mantenere al 
minimo la contaminazione da parte di altri organismi.
 
Sono descritte dettagliatamente le procedure con rinnovo (semistatico 
e continuo) e senza rinnovo (statico) della soluzione di prova. In 
funzione degli obiettivi della prova e dei requisiti normativi si rac ­
comanda di valutare l'uso di metodi semistatici e continui, per esem ­
pio per le sostanze che spariscono rapidamente dalla soluzione per volatilizzazione, fotodegradazione, precipitazione o biodegradazione. 
Ulteriori elementi sono contenuti nel riferimento 11.
 
1.2. DEFINIZIONI  
Ai fini del presente metodo di prova sono usate le definizioni e le 
abbreviazioni seguenti:  
Biomassa : il peso secco della sostanza vivente presente in una po ­
polazione. Nel presente saggio, i surrogati della biomassa, come i 
conteggi delle fronde e l'area fogliare sono misurati come di norma e 
l'uso del termine «biomassa» si riferisce quindi anche a queste mi ­
sure.  
Clorosi : è l'ingiallimento del tessuto fogliare.  
Clone : è un organismo o una cellula derivante da un singolo indi ­
viduo per riproduzione asessuata. Gli individui dello stesso clone sono pertanto geneticamente identici.
 
Colonia : un aggregato di fronde madre e figlia (di norma da due a 
quattro) attaccate le une alle altre. A volte si utilizza il termine 
«pianta».  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1210
 
CE x : la concentrazione della sostanza di prova dissolta nel mezzo di 
prova che determina una riduzione dell'x % (per esempio, 50 %) 
della crescita di  Lemna  entro un periodo di esposizione definito 
(da citare esplicitamente se diverso dalla durata totale o normale della prova). Per indicare chiaramente se un valore CE si riferisce 
al tasso di crescita o al rendimento, si utilizzano le abbreviazioni 
«CE
 r » per il tasso di crescita e «CE  y » per il rendimento; seguita 
dalla variabile di misura utilizzata «CE  r » (numero di fronde).  
Continuo (flow-through) : si riferisce ad una prova in cui le solu ­
zioni sono rinnovate costantemente.  
Fronda : struttura individuale/singola del tipo «a foglia» di una 
pianta di lenticchia d'acqua. Si tratta dell'unità più piccola (individuo) in grado di riprodursi.
 
Gibbosità : fronde che hanno un aspetto curvo o rigonfio.  
Crescita : un aumento della variabile di misura, per esempio il nu ­
mero di fronde, il peso secco, il peso umido o l'area fogliare nel corso del periodo di prova.
 
Tasso di crescita  (tasso di crescita specifico medio ): l'aumento 
logaritmico della biomassa durante il periodo di esposizione.  
Concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente 
significativo  (Lowest Observed Effect Concentration  — LOEC ): la 
concentrazione più bassa che produce un effetto di riduzione stati ­
sticamente significativo (p < 0,05) sulla crescita rispetto al campione 
di controllo, nel corso di un periodo di esposizione definito. Tutte le concentrazioni superiori alla LOEC, tuttavia, devono avere un effetto dannoso uguale o superiore a quello osservato per la LOEC. Quando 
queste due condizioni non possono essere soddisfatte occorre fornire 
una spiegazione dettagliata per spiegare come è stata scelta la LOEC (e pertanto la NOEC).
 
Variabili di misura : qualsiasi tipo di variabile che viene misurata 
per esprimere  l'endpoint  della prova utilizzando una o più variabili di 
risposta. Nella prova in questione il numero di fronde, l'area fogliare, 
il peso fresco e il peso secco sono variabili di misura.  
Monocultura : coltura con una sola specie di pianta  
Necrosi : tessuto fogliare morto (ossia bianco o rigonfio d'acqua).  
Concentrazione senza effetti osservabili (NOEC) : concentrazione 
di prova immediatamente inferiore alla LOEC.  
Fenotipo : caratteristiche osservabili di un organismo, determinate 
dall'interazione dei suoi geni con l'ambiente.  
Variabili di risposta : sono le variabili per la stima della tossicità 
dedotte da qualsiasi variabile di misura che descrive la biomassa mediante vari metodi di calcolo. In questo metodo, i tassi di crescita e il rendimento sono variabili di risposta dedotte da variabili di 
misura come il numero di fronde, l'area fogliare, il peso fresco e il 
peso secco.
 
Prova semistatica (di rinnovo) : prova in cui la soluzione di prova è 
periodicamente sostituita a determinati intervalli nel corso della prova.  
Prova statica : metodo di prova senza rinnovo della soluzione nel 
corso della prova.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1211
 
Endpoint della prova : indica il fattore generale che sarà modificato, 
rispetto al controllo, dalla sostanza chimica di prova. In questo me ­
todo l'endpoint è l'inibizione della crescita che può essere espressa da più variabili di risposta dedotte da una o più variabili di misura.
 
Mezzo di prova : è il mezzo di crescita sintetico completo sui cui le 
piante di prova crescono mentre sono esposte alla sostanza di prova. 
La sostanza di prova è di norma disciolta nel mezzo di prova.  
Rendimento : il valore di una variabile di misura per esprimere la 
biomassa al termine del periodo di esposizione meno il valore di tale variabile all'inizio del periodo di esposizione.
 
1.3. PRINCIPIO DELLA PROVA  
Le colture a crescita esponenziale del genere  Lemna  possono cre ­
scere come monoculture esposte a varie concentrazioni della sostanza 
di prova per un periodo di sette giorni. L'obiettivo della prova è quantificare gli effetti della sostanza sulla crescita vegetativa nel corso di questo periodo, sulla base di valutazioni di determinate 
variabili di misura. Il numero di fronde è la principale variabile di 
misura. Viene misurata almeno un'altra variabile (area fogliare totale, peso secco o peso fresco), in quanto alcune sostanze possono avere 
un effetto più pronunciato su variabili di misura diverse dal numero 
di fronde. Per quantificare gli effetti della sostanza, la crescita nelle soluzioni di prova viene paragonata con quella che avviene nei campioni di controllo; la concentrazione che determina una percen ­
tuale specifica x di inibizione della crescita (per esempio 50 %) è 
determinata ed espressa come CE
 x (per esempio CE  50 ). 
L'endpoint della prova in questione è l'inibizione della crescita, 
espressa come l'aumento logaritmico della variabile di misura (tasso di crescita specifico medio) durante il periodo di esposizione. A 
partire dai tassi di crescita specifica medi registrati in una serie di 
soluzioni di prova, la concentrazione che determina un'inibizione x % specifica del tasso di crescita (per esempio 50 %) è determinata ed espressa come C
 x E r (per esempio C  50 E r ). 
Un'altra variabile di risposta utilizzata nel presente metodo di prova è 
il rendimento che può essere necessario per soddisfare requisiti nor ­
mativi specifici in alcuni paesi. È definito come la differenza tra il valore delle variabili di misura al termine del periodo di esposizione 
e il valore delle variabili di esposizione all'inizio del periodo di 
esposizione. Dal rendimento registrato in una serie di soluzioni di prova, la concentrazione che determina un'inibizione specifica pari a x % del rendimento (per esempio 50 %) è calcolata ed espressa come 
C
 x E y (per esempio C  50 E y ). 
Inoltre la concentrazione minima a cui si osserva un effetto stati ­
sticamente significativo (LOEC) e la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC) possono essere determinate mediante un calcolo 
statistico.
 
1.4. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA DI PROVA  
Occorre disporre di un metodo analitico con un'adeguata sensibilità 
per la quantificazione della sostanza nel mezzo di prova.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1212
 
Le informazioni sulla sostanza di prova, che possono essere utili per 
stabilire le condizioni di prova, comprendono la formula strutturale, 
la purezza, l'idrosolubilità, la stabilità in acqua e alla luce, il pK  a , il 
K ow , la pressione di vapore e la biodegradabilità. L'idrosolubilità e la 
pressione di vapore possono essere utilizzate per calcolare la costante 
della legge di Henry che indica se possono verificarsi perdite signi ­
ficative della sostanza di prova nel corso della prova. Tale calcolo consente di sapere se occorre adottare misure specifiche per tenere sotto controllo tali perdite. Quando le informazioni sulla solubilità e 
la stabilità della sostanza di prova sono incerte, si consiglia di veri ­
ficarle nelle condizioni di prova, ossia nel mezzo di crescita, alla temperatura e con l'illuminazione che si utilizzeranno nella prova.
 
Quando il controllo del pH del mezzo di prova è particolarmente 
importante, ossia quando si saggiano metalli o sostanze idrolitica ­
mente instabili, si raccomanda di aggiungere un tampone al mezzo di 
crescita (cfr. primo paragrafo del punto 1.7.4). Al riferimento 11 sono forniti ulteriori orientamenti per le prove su sostanze le cui proprietà fisiochimiche rendono difficili le prove in questione.
 
1.5. SOSTANZA DI RIFERIMENTO  
Le sostanze di riferimento, come il 3,5-diclorofenolo utilizzato nelle 
prove interlaboratorio (ring test) internazionali (10), possono essere sottoposte a prova per verificare la procedura di prova. Si consiglia di effettuare una prova con una sostanza di riferimento almeno due 
volte l'anno o, qualora la prova sia realizzata con una frequenza 
inferiore, parallelamente alla determinazione della tossicità della so ­
stanza di prova.
 
1.6. VALIDITÀ DELLA PROVA  
Affinché la prova sia valida, il tempo di raddoppio del numero di 
fronde nel campione di controllo deve essere inferiore a 2,5 giorni 
(60 ore), che corrisponde approssimativamente ad una moltiplica ­
zione per sette in sette giorni e a un tasso di crescita specifica media di 0,275 giorni
 –1 . Utilizzando il mezzo e le condizioni di prova 
descritti nel metodo di prova, questo criterio può essere soddisfatto 
utilizzando un metodo di prova statico (8). Si parte dal principio che 
questo criterio può essere soddisfatto anche in condizioni di prova semistatiche o continue. Il calcolo del tempo di raddoppio è illustrato al punto 2.1.
 
1.7. DESCRIZIONE DEL METODO  
1.7.1.  Apparecchiature  
Tutte le apparecchiature che entrano in contatto con i mezzi di prova 
devono essere di vetro o di un altro materiale chimicamente inerte. Le apparecchiature di vetro utilizzate per le colture e le prove de ­
vono essere esenti da contaminanti chimici che potrebbero penetrare 
nel mezzo di prova e devono essere sterili. I recipienti di prova 
devono essere sufficientemente ampi da consentire alle fronde delle diverse colonie nei recipienti di controllo di crescere senza sovrap ­
porsi alla fine della prova. Le radici possono toccare il fondo dei 
recipienti, ma si consiglia di prevedere una profondità minima di 
20 mm e un volume minimo di 100 ml in ciascun contenitore. La scelta dei recipienti di prova non riveste particolare importanza a condizione che si rispettino i suddetti requisiti. I beaker di vetro, i 
cristallizzatori o i piatti Petri di vetro di dimensioni adeguate si sono 
dimostrati adatti. I recipienti di prova devono essere coperti per minimizzare l'evaporazione e la contaminazione accidentale, pur con ­
sentendo il ricambio d'aria necessario. I recipienti di prova, e in 
particolari i loro coperchi, non devono creare zone d'ombra o alterare 
le caratteristiche spettrali della luce.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1213
 
Le colture e i recipienti di prova non devono essere conservati 
insieme; è opportuno utilizzare camere di crescita ambientali, incu ­
batori o stanze separati. L'illuminazione e la temperatura devono essere regolabili e mantenute ad un livello costante (cfr. punto 1.7.8).
 
1.7.2.  Organismo di prova  
L'organismo utilizzato per questa prova è la  Lemna gibba  o la  
Lemna minor . L'appendice 1 contiene una breve descrizione delle 
specie di lenticchie d'acqua che sono state utilizzate per le prove di tossicità. Il materiale vegetale può essere ottenuto da una collezione di colture, da un altro laboratorio o essere raccolto sul terreno. In tal 
caso, le piante dovrebbero essere tenute nel mezzo che sarà utilizzato 
per le prove per almeno otto settimane prima di essere utilizzate. Le colture di partenza saranno prelevate solo su siti chiaramente esenti da fonti evidenti di inquinamento. Se le colture provengono da un 
altro laboratorio o da una collezione di colture, devono essere man ­
tenute nelle stesse condizioni per almeno tre settimane. La fonte del materiale vegetale e la specie e il clone (se conosciuto) utilizzati per la prova devono sempre essere indicati.
 
Occorre utilizzare delle monoculture, chiaramente esenti da contami ­
nazioni da parte di altri organismi come alghe e protozoi. Le piante sane di  L. minor  formano colonie comprendenti da due a cinque 
fronde, mentre le colonie sane di  L. gibba  possono comprendere 
fino a sette fronde.
 
La qualità e l'uniformità delle piante utilizzate per la prova avranno 
un impatto significativo sui risultati della stessa e dovrebbero per ­
tanto essere selezionate con cura. Occorre utilizzare piante giovani, in rapida crescita, sprovviste di lesioni visibili e di parti scolorite (clorosi). Le colture di buona qualità presentano un elevato numero 
di colonie con almeno due fronde. Un elevato numero di fronde 
singole indica la presenza di uno stress ambientale, per esempio scarsità di nutrienti, e tale materiale non dovrebbe essere utilizzato per le prove in questione.
 
1.7.3.  Colture  
Per ridurre la frequenza delle operazioni di manutenzione (per esem ­
pio, se per un certo periodo, non si prevedono prove sulle  Lemna ), le 
colture possono essere conservate ad un'illuminazione e una tempe ­
ratura ridotte (4-10 °C). Informazioni dettagliate sulla coltura sono 
riportate nell'appendice 2. In caso di segni evidenti di contamina ­
zione da parte di alghe o altri organismi occorrerà effettuare una sterilizzazione superficiale di un sottocampione di fronde di  Lemna , 
e in seguito trasferirlo in un mezzo nuovo (cfr. appendice 2). In tal 
caso la coltura contaminata rimanente dovrebbe essere eliminata.
 
Almeno sette giorni prima della prova, un numero sufficiente di 
colonie è trasferito in modo asettico in un mezzo sterile nuovo e 
coltivato per 7-10 giorni nelle condizioni previste per la prova.  
1.7.4.  Mezzo di prova  
I vari mezzi raccomandati per  Lemna minor  e Lemna gibba  sono 
descritti qui di seguito. Occorre prestare particolare attenzione all'ag ­
giunta di un tampone pH nel mezzo di prova [MOPS (acido 4- 
morfolinopropanosulfonico, CAS n. 1132-61-2; EINECS n. 214- 478-5) nel mezzo di  L. minor  e NaHCO
 3 nel mezzo di  L. gibba ] 
qualora si pensi che questi possa reagire con la sostanza di prova e 
condizionare l'espressione della sua tossicità. Il mezzo di Steinberg 
(12) è accettabile a condizione che siano rispettati i criteri di validità.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1214
 
Per le colture e le prove con  L. minor  si raccomanda l'uso del mezzo 
di crescita standard svedese (SIS) modificato. La composizione di 
questo mezzo è riportata all'appendice 3.  
Il mezzo di crescita 20X — AAP, descritto all'appendice 3, è consi ­
gliato per la coltura e le prove con  L. gibba . 
Il mezzo di Steinberg descritto all'appendice 3, è adatto a  L. minor , 
ma può essere utilizzato anche per  L. gibba  a condizione che siano 
rispettati i criteri di validità.  
1.7.5.  Soluzioni di prova  
Le soluzioni di prova sono generalmente preparate mediante dilui ­
zione di una soluzione madre. Le soluzioni madri sono solitamente 
preparate dissolvendo la sostanza nel mezzo di crescita.  
La concentrazione più elevata della sostanza di prova non deve di 
norma superare l'idrosolubilità della sostanza nelle condizioni di prova. Va rilevato, tuttavia, che le specie  Lemna  galleggiano in 
superficie e rischiano di essere esposte a sostanze che si accumulano 
all'interfaccia acqua-aria (per esempio sostanze scarsamente solubili in acqua, sostanze idrofobe o tensioattivi). In tali circostanze, l'espo ­
sizione risulterà da sostanze diverse da quelle presenti nella soluzio ­
ne, pertanto le concentrazioni di prova potrebbero, in funzione delle 
caratteristiche della sostanza di prova, eccedere la solubilità dell'ac ­
qua. Per le sostanze di prova a bassa idrosolubilità, potrà essere necessario preparare una soluzione madre concentrata o una disper ­
sione della sostanza utilizzando un solvente organico o un additivo 
di dispersione al fine di agevolare l'aggiunta di quantità precise di sostanze di prova nel mezzo di prova e favorire la sua dispersione e 
dissoluzione. Occorre fare il possibile per evitare di utilizzare tali 
materiali. Non si deve verificare una fitotossicità dovuta a solventi o disperdenti. Tra i solventi di uso comune che non provocano fito ­
tossicità a concentrazioni fino a 100 μl·l
 –1 ricordiamo l'acetone e il 
dimetilformammide. Se si utilizza un solvente o un disperdente, la 
sua concentrazione finale (ridotta al minimo, ossia ≤ 100 μl·l –1 ), 
deve essere comunicata e identica in tutti i recipienti trattati e di controllo. Ulteriori informazioni sull'uso dei disperdenti sono ripor ­
tate al riferimento 11.
 
1.7.6.  Gruppi sperimentali e gruppi di controllo  
Informazioni sulla tossicità della sostanza di prova nei confronti di  
Lemna , per esempio sulla base di una prova per la determinazione 
dell’intervallo di concentrazioni da usare, aiuterà a determinare le concentrazioni di prova adeguate. Nella prova di tossicità vera e 
propria di norma si dovrebbero prevedere almeno cinque concentra ­
zioni che formano una serie geometrica. Il fattore di separazione tra le concentrazioni di prova non dovrebbe superare 3,2 ma si può utilizzare un fattore più elevato se la curva concentrazione-risposta 
è piatta. Qualora si utilizzino meno di cinque concentrazioni occorre 
fornire una giustificazione. Occorre realizzare almeno tre repliche per ogni concentrazione.
 
Nel fissare l’intervallo delle concentrazioni di prova (per determinare 
l’intervallo e/o la prova di tossicità finale), occorre tenere presente 
quanto segue:  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1215
 
— per determinare la CE  x , le concentrazioni di prova dovrebbero 
essere intorno al valore CE  x per garantire un intervallo di confi ­
denza adeguato. Per esempio, quando si valuta la CE  50 , la con­
centrazione di prova più elevata deve essere superiore al valore CE
 50 . Se il valore CE  50 si trova al di fuori dell’intervallo delle 
concentrazioni di prova, i relativi intervalli di confidenza saranno 
ampi e si rischia di non poter valutare correttamente la validità dell'adeguamento statistico del modello.
 
— Quando la finalità è valutare la LOEC/NOEC, la concentrazione 
di prova più bassa deve essere sufficientemente ridotta affinché la 
sua crescita non sia notevolmente inferiore a quella dei controlli. 
Inoltre la concentrazione di prova più elevata deve essere suffi ­
cientemente alta affinché la sua crescita sia significativamente inferiore a quella del controllo. In caso contrario, occorrerà ripe ­
tere la prova utilizzando un intervallo di concentrazione diverso 
(a meno che la concentrazione più elevata raggiunga il limite di solubilità o la concentrazione limite superiore richiesta, per esem ­
pio 100 mg·l
 –1 ). 
Ogni prova deve prevedere controlli con mezzo nutriente, numero di 
fronde e colonie, condizioni ambientali e procedure (come i reci ­
pienti di prova) identici, ma senza la sostanza di prova. Qualora si utilizzi un solvente o un additivo di dispersione, occorre effettuare 
un ulteriore trattamento di controllo col solvente/disperdente nelle 
stesse concentrazioni utilizzate nei recipienti contenenti la sostanza di prova. Il numero di recipienti di controllo replicati (e di recipienti di solvente, se del caso) dovrebbero idealmente corrispondere al 
doppio dei recipienti di prova utilizzati per ciascuna concentrazione 
di prova.
 
Se la determinazione della NOEC non è necessaria, la prova può 
essere modificata in modo da aumentare il numero di concentrazioni 
e ridurre il numero di repliche per concentrazione. Tuttavia occorre 
prevedere almeno tre repliche di controllo.  
1.7.7.  Esposizione  
Alcune colonie, composte da 2 a 4 fronde visibili, sono prelevate 
dalle colture dell'inoculo e ripartite a caso nei recipienti di prova in condizioni asettiche. Ciascun recipiente di prova contiene comples ­
sivamente da 9 a 12 fronde. Il numero di fronde e di colonie deve 
essere uguale in ciascun recipiente di prova. L'esperienza acquisita con questo metodo e i dati ottenuti con la prova interlaboratorio 
(ring-test) indicano che bastano tre repliche per trattamento (ciascuna 
replica contiene da 9 a 12 fronde inizialmente) per individuare dif ­
ferenze di crescita tra i trattamenti pari a circa da 4 a 7 % dell'ini ­
bizione, calcolate in base al tasso di crescita (e da 10 a 15 % se 
calcolata in base al rendimento) (10).
 
La disposizione casuale dei recipienti di prova nell'incubatore è ne ­
cessaria per ridurre al minimo l'impatto delle differenze spaziali di intensità di luce o di temperatura. La disposizione dei recipienti quando si effettuano le osservazioni (o più spesso quando si rimet ­
tono a posto i recipienti) deve avvenire secondo un piano in blocchi 
o una procedura casuale.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1216
 
Se una prova di stabilità preliminare indica che la concentrazione 
della sostanza di prova non può essere mantenuta (ossia, la concen ­
trazione misurata scende al di sotto dell'80 % della concentrazione misurata inizialmente) nel corso della prova (7 giorni), si raccoman ­
dano delle prove semistatiche. In tal caso, occorre esporre le colonie 
a soluzioni di prova e a soluzioni di controllo nuove almeno due 
volte nel corso della prova (per esempio, il 3° e il 5° giorno). La frequenza dell'esposizione al mezzo fresco dipenderà dalla stabilità della sostanza di prova; una frequenza più elevata può essere neces ­
saria per mantenere concentrazioni pressoché costanti nel caso di 
sostanze ad elevata volatilità o instabilità. In alcuni casi può rivelarsi necessaria una procedura continua (11, 13).
 
L'esposizione mediante un'applicazione fogliare (polverizzazione) 
non è esaminata nel presente metodo di prova, il riferimento 14 
contiene informazioni in proposito.  
1.7.8.  Condizioni di incubazione  
Occorre applicare un'illuminazione continua a fluorescenza bianca, 
calda o fredda, al fine di ottenere un'intensità luminosa compresa tra 85 e 135 μE·m
 –2 ·s –1 quando è misurata in una radiazione fotosinte ­
ticamente attiva (da 400 a 700 nm) in punti situati alla stessa di ­
stanza dalla fonte luminosa delle fronde di  Lemna  (pari a 6 500- 
10 000 lux). Eventuali scarti rispetto all'intensità luminosa scelta non devono superare ± 15 % nell'area di prova. Il metodo di indi ­
viduazione e misurazione della luce, in particolare il tipo di sensore, 
inciderà sul valore misurato. I sensori sferici (che rilevano la luce 
proveniente da tutti gli angoli situati sopra e sotto il piano di misura) e i sensori «cosinusoidali» (che rilevano la luce da tutti gli angoli situati al di sopra del piano di misura) sono preferibili ai sensori 
unidirezionali e indicheranno valori più elevati per una fonte lumi ­
nosa multipla come quella qui descritta.
 
La temperatura nei recipienti di prova è mantenuta a 24 ± 2 °C. Il 
pH del mezzo di controllo non deve aumentare di oltre 1,5 unità nel 
corso della prova. Uno scarto superiore a 1,5 unità non invalida la 
prova se il rispetto dei criteri di validità può essere dimostrato. Occorre prestare particolare attenzione alle variazioni del pH in al ­
cuni casi specifici, in particolare quando si effettuano prove con 
sostanze instabili e metalli. Cfr. (11) per indicazioni supplementari 
in materia.
 
1.7.9.  Durata  
La prova termina sette giorni dopo il trasferimento delle piante nei 
recipienti di prova.  
1.7.10.  Misure e determinazioni analitiche  
All'inizio della prova, si contano le fronde contenute nei recipienti di 
prova e si registrano questi valori, stando attenti a contare le fronde emergenti chiaramente visibili. Il numero di fronde che sembrano normali o anormali deve essere determinato all'inizio della prova, 
almeno una volta ogni tre giorni nel periodo di esposizione (ossia 
almeno due volte nel corso del periodo di sette giorni) e infine al termine della prova. Occorre prender nota anche delle modifiche nello sviluppo delle piante per quanto riguarda, per esempio, la 
dimensione e l'aspetto delle fronde, i segni di necrosi, clorosi e le 
gibbosità, la frammentazione delle colonie o la diminuzione della loro galleggiabilità, nonché la lunghezza e l'aspetto delle radici. Oc ­
corre prender nota anche delle caratteristiche salienti del mezzo di 
prova (per esempio la presenza di materie non disciolte, lo sviluppo 
di alghe nei recipienti di prova).
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1217
 
Durante le prova, oltre a determinare il numero di fronde, si misu ­
rano gli effetti della sostanza di prova su una o più delle seguenti 
variabili:  
i) area fogliare totale;  
ii) peso secco;  
iii) peso fresco.  
L'area totale delle fronde presenta il vantaggio di potere essere sta ­
bilita per ciascun recipiente di prova e di controllo all'inizio e al 
termine della prova. Il peso secco o fresco è stabilito all'inizio della prova da un campione della coltura dell'inoculo rappresentativo del materiale utilizzato per avviare la prova e alla fine della prova col 
materiale vegetale di ciascun recipiente di prova e di controllo. Se la 
superficie fogliare non è misurata, il peso secco va preferito al peso fresco.
 
L'area fogliare totale, il peso secco e il peso fresco posso essere 
determinati nel modo seguente:  
i) area fogliare totale: l'area fogliare totale di tutte le colonie può 
essere determinata mediante l'analisi dell'immagine. Si può rile ­
vare la sagoma del recipiente di prova e delle piante con una 
videocamera (ponendo il recipiente su un illuminatore) e si di ­
gitalizza l'immagine ottenuta. Una calibratura realizzata con forme piane di superficie conosciuta consente in seguito di de ­
terminare l'area fogliare totale in un recipiente di prova. Occorre 
fare in modo di evitare le interferenze con il bordo del recipiente di prova. Un metodo più elaborato consiste nel fotocopiare i recipienti di prova che contengono le piante, ritagliare la sagoma 
risultante dalle colonie e determinarne la superficie mediante un 
analizzatore della superficie fogliare o della carta millimetrata. Si possono utilizzare anche altre tecniche (per esempio il quoziente del peso della sagoma ritagliata nella carta per il peso di un 
pezzo di carta di superficie nota);
 
ii) peso secco: tutte le colonie sono prelevate in ciascun recipiente 
di prova e sciacquate con acqua distillata e deionizzata. Sono poi poste su della carta assorbente che ne assorbe l'eccesso di acqua ed asciugate a 60 °C fino a quando non raggiungono un peso 
costante. Eventuali frammenti di radici devono essere inclusi. Il 
peso secco deve essere espresso con una precisione di almeno 0,1 mg.
 
iii) peso fresco: tutte le colonie sono trasferite in tubi di polistirolo 
(o altro materiale inerte) tarati e bucati con piccoli fori (1 mm) nel fondo arrotondato. I tubi sono in seguito centrifugati a 3 000 
gpm per 10 minuti a temperatura ambiente. I tubi contenenti le 
colonie asciugate sono nuovamente pesati e il preso fresco è calcolato per sottrazione dalla tara del tubo.
 
1.7.10.1.  Frequenza delle misurazioni e determinazioni analitiche  
Se si utilizza un procedimento statico, il pH di ciascun recipiente 
trattato deve essere misurato all'inizio e alla fine della prova. Se il procedimento è semistatico, il pH deve essere misurato in ciascun 
lotto di soluzione di prova «nuova», prima di ogni rinnovo e nelle 
soluzioni «utilizzate» corrispondenti.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1218
 
L'intensità luminosa è misurata nella camera di crescita, nell'incuba ­
tore o nella stanza in dei punti situati alla stessa distanza della fonte 
luminosa delle fronde di  Lemna . Tali misurazioni devono essere 
effettuate almeno una volta nel corso della prova. La temperatura del mezzo è misurata almeno una volta al giorno in un recipiente di 
prova supplementare conservato nelle stesse condizioni degli altri 
nella stanza di crescita, l'incubatore o la stanza.
 
Durante la prova, le concentrazioni della sostanza di prova sono 
determinate ad intervalli adeguati. Nelle prove statiche, occorre de ­
terminare le concentrazioni all'inizio e al termine della prova.  
Nelle prove semistatiche, laddove si presume che la concentrazione 
della sostanza di prova non rimanga in un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale; è necessario analizzare tutte le soluzioni di 
prova appena preparate e le stesse soluzioni ad ogni rinnovo (cfr. 
terzo paragrafo del punto 1.7.7). Tuttavia, per le prove in cui la concentrazione della sostanza di prova misurata inizialmente non si situa in un intervallo di ± 20 % della concentrazione nominale, ma in 
cui un numero sufficiente di indizi indica che le concentrazioni 
iniziali sono ripetibili e stabili (ossia nell'intervallo tra 80 e 120 % della concentrazione iniziale), si possono effettuare le analisi chimi ­
che anche solo alle concentrazioni di prova più elevate e più basse. 
In ogni caso, la determinazione delle concentrazioni della sostanza di 
prova prima del rinnovo deve essere effettuata su un solo recipiente identico per ciascuna concentrazione di prova (o in un recipiente in cui si sarà mescolato il contenuto di tutti i recipienti trattati in modo 
identico).
 
Nel caso delle prove continue si può applicare un sistema di prelievo 
identico a quello descritto per le prove semistatiche, con un'analisi all'inizio, a metà e al termine della prova, ma senza l'analisi delle 
soluzioni «utilizzate» che in questo caso non è necessaria. In questo 
tipo di prova, il flusso del diluente e della sostanza di prova e della soluzione madre della sostanza di prova deve essere controllato gior ­
nalmente.
 
Se risulta che la concentrazione della sostanza di prova si è mante ­
nuta nel corso dell'intera prova in un intervallo ± 20 % della concen ­
trazione nominale o misurata all'inizio, l'analisi dei risultati può ba ­
sarsi sui valori nominali o quelli misurati all'inizio. Se lo scarto 
rispetto alla concentrazione nominale o quella misurata inizialmente 
è superiore a ± 20 %, l'analisi dei risultati dovrà basarsi sulla media geometrica della concentrazione rilevata nel corso dell'esposizione o su due modelli che descrivono il calo della concentrazione della 
sostanza di prova (11).
 
1.7.11.  Prova limite  
In determinate circostanze, per esempio quando una prova prelimi ­
nare indica che la sostanza di prova non esercita nessun effetto tossico a concentrazioni fino a 100 mg·l
 –1 o al suo limite di solubi ­
lità nel mezzo di prova (a seconda del valore più basso), si potrà 
effettuare una prova limite che comporta il confronto tra le reazioni 
di un gruppo di controllo e un gruppo trattato (100 mg·l  –1 o una 
concentrazione uguale al limite di solubilità). A supporto di questa prova, si raccomanda di effettuare un'analisi della concentrazione di 
esposizione. Tutti i criteri di validità e le condizioni sperimentali 
descritti precedentemente si applicano alla prova limite, eccezion fatta per il numero di recipienti trattati in modo identico, che deve essere raddoppiato. La crescita nel gruppo di controllo e nel gruppo 
trattato può essere analizzata mediante una prova statistica che con ­
senta di paragonare le medie, per esempio un t-test di Student.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1219
 
2. DATI E RELAZIONI  
2.1. TEMPIO DI RADDOPPIO  
Per determinare i tempi di raddoppio (T  d ) del numero di fronde e 
verificare se lo studio rispetta questo criterio di validità (punto 1.6), 
si utilizza la formula seguente applicata con i dati risultanti dai 
recipienti di prova:  
T d = ln 2/μ 
in cui μ è il tasso di crescita specifica medio determinato conforme ­
mente al primo e al secondo paragrafo del punto 2.2.1.  
2.2. VARIABILI DI RISPOSTA  
Questa prova mira a determinare gli effetti della sostanza di prova 
sulla crescita vegetativa di  Lemna . Il metodo di prova descrive due 
variabili di risposta, in quanto negli Stati membri esistono preferenze 
e requisiti normativi diversi. Affinché i risultati della prova siano 
accettabili in tutti gli Stati membri, gli effetti devono essere valutati in funzione delle due variabili di risposta (a) e (b) definite di seguito.
 
a) tasso di crescita specifico medio: questa variabile è calcolata in 
base alle modifiche dei logaritmi del numero di fronde e, d'altra parte, ai logaritmi di un altro parametro di misura (area fogliare totale, peso secco o peso fresco) nel corso del tempo (espresso in 
giorni) nei gruppi di controllo e nei gruppi trattati. A volte viene 
definito «tasso di crescita relativo» (15).
 
b) Rendimento: questa variabile di risposta è calcolata in funzione 
dei cambiamenti del numero di fronde e di un altro parametro di 
misura (area fogliare totale, peso secco o peso fresco) nei gruppi di controllo e nei gruppi trattati.
 
Occorre rilevare che i valori di tossicità calcolati utilizzando queste 
due variabili di risposta non sono comparabili e che occorre tenere conto di questa differenza quando si utilizzato i risultati della prova. I valori della CE
 x basati sul tasso di crescita specifico medio (C  x E r ) 
saranno generalmente superiori a quelli basati sul rendimento (C  x E y ), 
se le condizioni del presente metodo di prova sono rispettate, per via del fondamento matematico dei due approcci. Questa differenza è dovuta solo al calcolo matematico e non si tratta di una differenza di 
sensibilità tra le due variabili in esame. Il concetto di tasso di crescita 
specifico medio si basa sullo schema generale di crescita esponen ­
ziale delle lenticchie d'acqua in colture non limitate, in cui la tossi ­
cità è valutata sulla base degli effetti sul tasso di crescita, senza 
tenere conto del livello assoluto del tasso di crescita specifico di 
controllo, della curva discendente concentrazione-risposta o della durata della prova. I risultati basati sulla variabile di rendimento dipendono invece da tutte queste altre variabili. Il C
 x E y dipende 
dal tasso di crescita specifico della specie di lenticchia d'acqua uti ­
lizzata in ogni prova e dal tasso di crescita specifico massimo che può variare da una specie all'altra, se non addirittura da un clone all'altro. Questa variabile non deve essere utilizzata per confrontare la 
sensibilità alle sostanze tossiche di specie diverse o addirittura di 
cloni diversi di lenticchie d'acqua. Pur essendo preferibile, da un punto di vista scientifico, valutare la tossicità in base al tasso di crescita specifico medio, il presente metodo di prova propone anche 
delle stime basate sul rendimento al fine di soddisfare i requisiti 
normativi vigenti in alcuni paesi.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1220
 
Le stime di tossicità devono basarsi sul numero di fronde nonché su 
un'altra variabile di misura (area fogliare totale, peso secco o peso 
fresco) perché alcune sostanze possono avere un effetto più marcato su una variabile diversa dal numero di fronde, che potrebbe non essere individuato calcolando unicamente il numero di fronde.
 
Si inseriscono in una tabella il numero di fronde e qualsiasi altra 
variabile di misura (area fogliare totale, peso secco o peso fresco) 
insieme alle concentrazioni della sostanza di prova risultanti da ogni misurazione. Le analisi seguenti, per esempio per stimare la LOEC, la NOEC o la CE
 x devono basarsi sui valori di ogni replicato e non 
sulle medie calcolate per ciascun gruppo trattato.  
2.2.1.  Tasso di crescita specifico medio  
Il tasso di crescita specifico medio per un determinato periodo è 
calcolato in funzione dell'incremento logaritmico delle variabili di crescita — il numero di fronde e un'altra variabile di misura (area fogliare totale, peso secco o peso fresco) — utilizzando la formula 
riportata qui di seguito per ciascun replicato dei gruppi di controllo e 
dei gruppi trattati:
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
in cui:  
— μ i-j : tasso di crescita specifico medio dal momento i al mo ­
mento j  
— N  i : variabile di misura nel recipiente di prova o di controllo 
nel momento i  
— N  j : variabile di misura nel recipiente di prova o di controllo 
nel momento j  
— t: periodo di tempo tra i e j  
Per ciascun gruppo trattato e di controllo, calcolare un valore medio 
del tasso di crescita e le stime della varianza.  
Occorre calcolare il tasso di crescita specifico medio per l'intero 
periodo di prova (il momento «i» citato nella formula corrisponde 
all'inizio della prova e il momento «j» corrisponde alla fine della prova). Per ciascuna concentrazione dei gruppi trattati e di controllo, calcolare il valore medio del tasso di crescita specifico e le stime 
della varianza. Occorre inoltre valutare il tasso di crescita sezione per 
sezione, al fine di determinare gli effetti della sostanza di prova nel corso del periodo di esposizione (per esempio analizzando le curve di crescita «log-trasformate»). Una differenza significativa tra il tasso 
di crescita «sezione per sezione» e il tasso di crescita medio sta ad 
indicare l'esistenza di uno scarto rispetto alla crescita esponenziale costante, scarto che richiede un attento esame delle curve di crescita. In tal caso, un approccio prudente consisterebbe nel confrontare i 
tassi di crescita specifici delle colture trattate durante il periodo di 
inibizione massima con quelli dei controlli nello stesso periodo.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1221
 
La percentuale di inibizione del tasso di crescita (I  r ) può esser cal ­
colata per ciascuna concentrazione di prova (gruppo trattato) secondo 
la formula seguente:  
%I r ¼ ðμ C –μ T Þ 
μ C Ü 100 
in cui:  
— % I  r : percentuale di inibizione del tasso di crescita specifico 
medio  
— μ C : valore medio di μ nel gruppo di controllo  
— μ T : valore medio di μ nel gruppo trattato  
2.2.2.  Rendimento  
Gli effetti sul rendimento sono determinati in funzione di due varia ­
bili di misura: il numero di fronde e un'altra variabile di misura (area fogliare totale, peso secco o peso fresco) misurati in ciascun reci ­
piente di prova all'inizio e al termine della prova. Per quanto ri ­
guarda il peso secco o il peso fresco, la biomassa di partenza è 
determinata a partire da un campione di fronde prelevato dallo stesso lotto utilizzato per l'inoculazione dei recipienti di prova (cfr. secondo paragrafo del punto 1.7.3). Per ciascuna concentrazione di prova e di 
controllo, occorre calcolare un valore medio di rendimento nonché le 
stime della varianza. La percentuale media di inibizione del rendi ­
mento (% I
 r ) può esser calcolata per ogni gruppo trattato secondo la 
formula seguente:  
%I y ¼ ðb C –b T Þ 
b C Ü 100 
in cui:  
— % I  y : percentuale di riduzione del rendimento  
— b  C : biomassa finale meno la biomassa di partenza nel 
gruppo di controllo  
— b  T : biomassa finale meno la biomassa di partenza nel 
gruppo trattato  
2.2.3.  Tracciato delle curve concentrazione-risposta  
Occorre tracciare curve concentrazione-risposta che raffigurano la 
percentuale d'inibizione media della variabile di risposta (I  r , o I  y 
calcolate come indicato nell'ultimo paragrafo del punto 2.2.1 o 2.2.2) 
e la log concentrazione della sostanza di prova.  
2.2.4.  Stima della CE  x 
Le stime della CE  x (per esempio la CE  50 ) si devono basare sia sul 
tasso di crescita specifico medio (C  x E r ) sia sul rendimento (C  x E y ), 
che devono, a loro volta, basarsi sul numero di fronde e su un'ulte ­
riore variabile di misura (area fogliare totale, peso secco o peso 
fresco), in quanto alcune sostanze esercitano un impatto diverso 
sul numero di fronde e sulle altre variabili di misura. I parametri di tossicità auspicati corrispondono pertanto a quattro valori di CE
 x 
per ciascun livello di inibizione x calcolato: C  x E r (numero di fronde); 
C x E r (area fogliare totale, peso secco o pesco fresco); C  x E y (numero 
di fronde); e C  x E y (area fogliare totale, peso secco o peso fresco).  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1222
 
2.3. PROCEDURE STATISTICHE  
L'obiettivo è ottenere una relazione quantitativa concentrazione-ri ­
sposta mediante un'analisi della regressione. È possibile utilizzare una regressione lineare ponderata dopo aver effettuato una trasfor ­
mazione di linearizzazione dei dati di reazione — per esempio in 
unità probit, logit o Weibull (16), ma è preferibile applicare metodi di regressione non lineare in quanto tengono conto meglio delle irregolarità inevitabili dei valori e degli scarti rispetto alle distribu ­
zioni regolari. Vicine allo zero o all'inibizione totale, queste irrego ­
larità possono essere amplificate dalla trasformazione e interferire con l'analisi (16). Occorre rilevare che i metodi analitici usuali che 
ricorrono alle trasformazioni probit, logit, o Weibull sono destinati 
ad essere utilizzati con dati quantali (per esempio, mortalità o so ­
pravvivenza) e devono essere modificati per poter essere utilizzati con i dati concernenti la crescita o il rendimento. Alcune procedure 
specifiche che consentono di determinare i valori della CE
 x a partire 
da dati continui sono reperibili nei riferimenti 17, 18 e 19.  
Per ciascuna variabile di risposta da analizzare, occorre utilizzare il 
rapporto concentrazione-risposta per calcolare stime puntuali dei va ­
lori CE  x . Laddove possibile, occorre determinare gli intervalli di 
confidenza a 95 % per ogni stima. La corrispondenza dei dati che descrivono gli effetti rispetto al modello di regressione dovrebbe 
essere valutata graficamente o statisticamente. L'analisi della regres ­
sione deve essere effettuata basandosi sulle reazioni rilevate in ogni recipiente replicato e non sulle medie dei gruppi trattati.
 
Le stime della CE  50 e gli intervalli di confidenza possono essere 
ottenuti anche mediante interpolazione lineare con bootstrapping 
(20), se i modelli o i metodi di regressione disponibili non sono adatti ai dati.
 
Per stimare la LOEC, e dunque la NOEC, è necessario paragonare le 
medie dei gruppi trattati mediante un'analisi della varianza (ANO ­
VA). La media di ogni concentrazione deve poi essere confrontata con la media dei controlli mediante un metodo adeguato di compa ­
razione multipla o un metodo di tendenza. Possono essere utili i test 
di Dunnett o di Williams (21, 22, 23, 24). È necessario controllare se l'ipotesi di omogeneità della varianza dell'ANOVA è fondata. Si raccomanda di effettuare questo controllo graficamente o con un 
test formale (25), come il test di Levene o quello di Bartlett. Se 
l'ipotesi dell'omogeneità della varianza non si conferma, a volte si possono correggere i dati mediante una trasformazione logaritmica. 
Se l'eterogeneità della varianza è estrema e non può essere corretta 
mediante una trasformazione, si prenderanno in considerazione me ­
todi analitici come i test di tendenza regressivi di Jonkheere. Ulte ­
riori riferimenti sulla determinazione della NOEC sono reperibili al 
riferimento 19.
 
Alcuni progressi recenti hanno portato i ricercatori ad auspicare l'ab ­
bandono della nozione di NOEC a vantaggio di stime puntuali della CE
 x basate sulla regressione. Per questa prova su  Lemna  non sono 
stati fissati valori adeguati di x. Tuttavia un intervallo da 10 a 20 % 
sembra adeguato (in funzione della variabile di risposta scelta) e nella relazione è preferibile menzionare sia la CE
 10 che la CE  20 . 
3. RELAZIONI  
3.1. RELAZIONE SULLA PROVA  
La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni:  
Sostanza di prova:  
— stato fisico e proprietà fisico-chimiche pertinenti, compreso il 
limite di solubilità in acqua,  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1223
 
— dati di identificazione chimica (per esempio il numero CAS), 
compresa la purezza.  
Specie oggetto della prova:  
— nome scientifico, clone (se noto) e origine.  
Condizioni sperimentali:  
— procedimento di prova utilizzato (statico, semi-statico o conti ­
nuo),  
— data dell'inizio della prova e durata della prova,  
— mezzo della prova,  
— descrizione della prova: contenitori e coperchi, volumi delle so ­
luzioni, numero di colonie e di fronde per contenitore all'inizio della prova,
 
— concentrazioni di prova (nominali e misurate in funzione delle 
esigenze), numero di replicati per concentrazione,  
— metodi di preparazione delle soluzioni madri e delle soluzioni di 
prova, ivi compreso l'uso di eventuali solventi o disperdenti,  
— temperatura nel corso della prova,  
— fonte luminosa, intensità luminosa e omogeneità,  
— valori del pH dei mezzi di prova e di controllo,  
— concentrazioni della sostanza di prova e metodo di analisi e dati 
adeguati per la valutazione della qualità (studi di convalida, scarti tipo o intervalli di confidenza delle analisi),
 
— metodo di determinazione del numero di fronde o di altre varia ­
bili di misura, per esempio peso secco, peso fresco o area fo ­
gliare,  
— tutte le deviazioni rispetto al metodo di prova.  
Risultati:  
— dati grezzi: numero di fronde e altre variabili di misura in ciascun 
recipiente di prova e di controllo a ciascuna osservazione e ana ­
lisi, 
— medie e scarti tipo per ciascuna variabile di misura,  
— curve di crescita per ciascuna concentrazione (si raccomanda la 
log-trasformazione della variabile di misura, cfr. secondo para ­
grafo del punto 2.2.1),  
— tempio di raddoppio/tasso di crescita nel controllo sulla base del 
numero di fronde,  
— calcolo delle variabili studiate per ciascun replicato, con valore 
medio e coefficiente di variazione dei replicati,  
— rappresentazione grafica della relazione concentrazione/effetto,  
— stime degli endpoint tossici per le variabili di risposta: per esem ­
pio CE  50 , CE  10 , CE  20 , e relativi intervalli di confidenza. Qualora 
siano state calcolate, la LOEC e/o la NOEC e i metodi statistici 
utilizzati per determinarle,  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1224
 
— se è stata praticato un test ANOVA, la portata dell'effetto indi ­
viduato (per esempio, la differenza meno significativa),  
— stimoli alla crescita eventualmente osservati in un gruppo trattato,  
— eventuali segni di fitotossicità e osservazioni delle soluzione di 
prova,  
— analisi dei risultati, compresa l'influenza sul risultato del test 
risultante dagli scostamenti dal presente metodo di prova.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. Linea guida TG 221 (2006) dell'OCSE. Saggio di inibizione 
della crescita di  Lemna  sp. 
2. L'utilizzo di studi su Lemna per le sostanze colorate è illustrato 
dettagliatamente al punto 13.5.3 del manuale delle decisioni 
dell'UE di luglio 2006, all'indirizzo: http://ecb.jrc.ec.europa.eu/ ­
new-chemicals.  
3. Guidance on information requirements and chemical safety as ­
sessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 
7.8.3 Summary of difficult substance testing issues all'indirizzo:  
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
4. ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
5. USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
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6. AFNOR —  Association Française de Normalisation . (1996). XP 
T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 pagg.  
7. SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckwe­
ed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
8. Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Ma ­
crophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37-120 pagg.  
9. Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
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luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 
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plc — Environment Agency.
 
11. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
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12. ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
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(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1225
 
13. Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
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14. Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bio ­
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and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.  
15. Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.
 
16. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  
17. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.
 
18. Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
19. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
20. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
21. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121.  
22. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics, 20, 482-491.  
23. Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117.  
24. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
25. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1226
 
Appendice 1  
Descrizione di  Lemna  spp.  
La pianta acquatica comunemente denominata «lenticchia d'acqua» Lemna  spp., 
appartiene alla famiglia delle  Lemnaceae  costituita da quattro generi presenti in 
tutto il mondo. La loro tassonomia e il loro aspetto sono stati descritti in maniera 
esaustiva, (1, 2).  Lemna gibba  e L. minor  sono specie rappresentative delle zone 
temperate e sono regolarmente utilizzate nelle prove di tossicità. Entrambe le specie possiedono un fusto discoide (fronda) galleggiante o sommerso e una radice estremamente sottile che parte dalla superficie inferiore di ogni fronda.  
Lemna  spp. fiorisce raramente e la pianta si riproduce per via vegetativa dando 
luogo a nuove fronde (3). Rispetto alle piante più vecchie, le giovani tendono ad essere più pallide, avere radici più corte ed essere costituite da 2-3 fronde di misure diverse. Le dimensioni ridotte di  Lemna , la sua struttura semplice, la sua 
riproduzione asessuata e il «tempo di generazione» breve rendono le piante di 
questo genere particolarmente adatte alle prove di laboratorio (4, 5).
 
Data la possibile variazione di sensibilità da una specie all'altra, solo i confronti 
di sensibilità all'interno della stessa specie sono validi.  
Esempi di specie di  Lemna  utilizzati per le prove: riferimenti bibliografici 
delle specie  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». 
EPA 712-C-96-156. 8 pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (in Swe ­
dish).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733- 
742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». EPA 
712-C-96-156. 8 pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1227
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Fonti di specie di  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, CANADA, M5S 3 B2  
Tel. +1 416978-3641  
Fax +1 416978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
STATI UNITI  
Tel. +1 919515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 Stoccolma  
SVEZIA  
Tel. +46 86747240  
Fax +46 86747636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlino  
GERMANIA  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Bibliografia  
1. Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the de ­
scriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
2. Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
3. Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricul ­
tural Research Council of Norway, University of Oslo.  
4. Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
5. Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1228
 
Appendice 2  
Conservazione di una coltura madre  
Le colture madri possono essere conservate a basse temperature (4-10 °C) per 
lunghi periodi senza che occorra ristabilirle. Il mezzo di crescita delle  Lemna  può 
esser identico a quello utilizzato per le prove, ma anche altri mezzi ricchi di 
nutrienti sono adatti alla colture madri.  
Periodicamente alcune giovani piante di color verde-chiaro sono prelevate e 
trasferite, con una tecnica asettica, in nuovi recipienti di coltura contenenti un mezzo fresco. Alle temperature proposte, le sottocolture possono essere avviate anche ad intervalli di tre mesi.
 
Occorre utilizzare recipienti di coltura in vetro sterili e chimicamente puliti (lavati 
con acido) e ricorrere a tecniche di manipolazione asettiche. Se la coltura madre 
viene contaminata, per esempio da alghe o funghi, si adotteranno le misure necessarie per eliminare gli organismi contaminanti. Per le alghe e la maggior parte degli altri organismi contaminanti basta una sterilizzazione di superficie. A 
tal fine si preleva un campione delle piante contaminate e si tagliano le radici; in 
seguito si agita vigorosamente tale materiale in acqua pulita prima di immergerlo in una soluzione di ipoclorito di sodio a 0,5 % (v/v) per un periodo compreso tra 
30 secondi e 5 minuti. In seguito si sciacquano le piante con acqua sterile e le si 
trasferisce, suddivise per lotti, in recipienti di coltura contenenti del mezzo fresco. Molte fronde moriranno dopo questo trattamento, soprattutto se il periodo di esposizione è stato lungo, ma alcune di quelle sopravvissute non saranno più 
contaminate e potranno essere inoculate in nuove colture.
 ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1229
 
Appendice 3  
Mezzi  
Si raccomandano mezzi di crescita diversi per  L. minor  e L. gibba . Per  L. minor , 
una versione modificata del mezzo stabilito dalla norma svedese (SIS) mentre per  
L. gibba , il mezzo 20X — AAP. Le composizioni di questi due mezzi sono 
riportate qui di seguito. Nella preparazione di questi mezzi occorre utilizzare 
reattivi e sostanze di grado analitico e acqua deionizzata.  
Mezzo di crescita per Lemna istituito in base ad una norma dell'istituto 
svedese di standardizzazione  
— Le soluzioni madre I-V sono sterilizzate in autoclave (120 °C, 15 minuti) o 
mediante filtrazione su membrana (dimensione dei pori di circa 0,2 μm). 
— La soluzione madre VI (ed eventualmente VII) sono sterilizzate solo mediante 
filtrazione su membrana, non devono essere sottoposte a sterilizzazione in 
autoclave.  
— Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e nell'oscurità. 
Le soluzioni madre I-V devono essere eliminate dopo sei mesi, mentre la 
soluzione madre VI (ed eventualmente VII) può essere conservata per un mese.
 
Soluzione ma ­
dre n. Sostanza Concentrazione 
nella soluzione 
madre (g·l  –1 ) Concentrazione 
nel mezzo prepa ­
rato (mg·l  –1 ) Mezzo preparato 
Elemento Concentrazione 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 1,00 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 B 
Mn Mo 
Zn 
Cu Co 0,17 
0,056 0,0040 
0,011 
0,013 0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (tampone) 490 490 — —  
— Per ottenere un litro del mezzo SIS, aggiungere gli ingredienti seguenti a 
900 ml di acqua deionizzata:  
— 10 ml di soluzione madre I  
— 5 ml di soluzione madre II  
— 5 ml di soluzione madre III  
— 5 ml di soluzione madre IV  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1230
 
— 1 ml di soluzione madre V  
— 5 ml di soluzione madre VI  
— 1 ml di soluzione madre VII (facoltativo)  
NB: Per alcune sostanze di prova può essere necessaria la soluzione madre VII (tampone 
MOPS) (cfr. l'ultimo paragrafo del punto 1.4).  
— Il pH è portato a 6,5 ± 0,2 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è 
portato ad un litro con acqua deionizzata.  
Mezzo di crescita 20X — AAP  
Le soluzioni madre sono preparate in acqua sterile distillata o deionizzata.  
Le soluzioni madre sterili devono essere conservate al fresco e nell'oscurità. In 
queste condizioni le soluzioni madre si possono conservare da 6 a 8 settimane.  
Per il mezzo 20X — AAP si preparano cinque soluzioni madri nutrienti (A1, A2, 
A3, B e C) utilizzando sostanze chimiche di grado reagente. Il mezzo di crescita 
è composto da 20 ml di ciascuna soluzione madre nutriente aggiunte a circa 850 ml di acqua deionizzata. Il pH è portato a 7,5 ± 0,1 con 0,1 o 1 mol di HCl o NaOH, e il volume è portato ad un litro con acqua deionizzata. Il mezzo è 
successivamente filtrato con una membrana di 0,2 μm (circa) in un recipiente 
sterile.
 
Il mezzo di crescita destinato alle prove deve essere preparato 1 o 2 giorni prima 
dell'utilizzazione in modo che il suo pH abbia il tempo di stabilizzarsi. Il pH del mezzo di crescita dovrebbe essere controllato prima dell'utilizzo e riequilibrato, se necessario, aggiungendovi, una soluzione di 0,1 o 1 mol di NaOH o HCl 
come già illustrato.
 
Soluzione ma ­
dre n. Sostanza Concentrazione 
nella soluzione 
madre (g·l  –1 ) ( 1 ) Concentrazione nel 
mezzo preparato 
(mg·l  –1 ) (*) Mezzo preparato 
Elemento Concentrazione 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Salvo indicazione contraria  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1231
 
Nota:  La concentrazione finale di bicarbonato teoricamente adeguata (che consente di evitare 
l'adeguamento del pH) è 15 mg/l, non 300 mg/l. Tuttavia il mezzo 20X — AAP è 
stato sempre utilizzato con una concentrazione di 300 mg/l, anche per il ring-test [I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition 
Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical 
Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency].
 
Mezzo di Steinberg (secondo la norma ISO 20079)  
Concentrazioni e soluzioni madre  
— Nell'ISO 20079 il mezzo modificato di Steinberg è utilizzato solo per  Lemna 
minor  (in quanto è la sola ad essere autorizzata nelle prove previste da questa 
norma) ma alcune prove hanno dimostrato che si possono ottenere buoni risultati anche con  Lemna gibba .
 
— Per preparare questo mezzo occorre utilizzare sostanze chimiche di grado 
reagente e acqua deionizzata.  
— Occorre preparare il mezzo nutriente a partire da soluzioni madri (o mezzi 
con una concentrazione dieci volte superiore) che consentono di raggiungere 
la massima concentrazione senza precipitazione.  
Tabella 1  
Mezzo di Steinberg a pH stabilizzato (modificato da Altenburger)  
Sostanza Mezzo nutriente  
Macroelementi  peso molare mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Microelementi  peso molare μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,2 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA diidrato di sodio 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1232
 
Tabella 2  
Soluzioni madre (macroelementi)  
1. Macroelementi (concentrato 50 volte)  g/l  
Soluzione madre 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Soluzione madre 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Soluzione madre 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabella 3  
Soluzioni madre (microelementi)  
2. Microelementi (concentrato 1 000 volte)  mg/l  
Soluzione madre 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Soluzione madre 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Soluzione madre 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Soluzione madre 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Soluzione madre 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA diidrato di sodio 1 500,00  
— Le soluzioni madre 2 e 3 possono essere mischiate, così come le soluzioni 4 
e 7 (tenendo conto delle concentrazioni necessarie).  
— Per aumentarne la durata di conservazione, occorre sterilizzare le soluzioni 
madre in autoclave per 20 minuti a 121 °C o filtrandole in modo sterile su 
una membrana porosa (0,2 μm). Si consiglia vivamente la sterilizzazione 
mediante filtrazione (0,2 μm). 
Preparazione della concentrazione finale del mezzo di Steinberg (modificato)  
— Aggiungere 20 ml delle soluzioni madre 1, 2 e 3 (cfr. tabella 2) a circa 
900 ml di acqua deionizzata per impedire la precipitazione.  
— Aggiungere 1,0 ml delle soluzioni madre 4, 5, 6, 7 e 8 (cfr. tabella 3).  
— Il pH deve essere 5,5 ± 0,2 (adeguare aggiungendo un volume minimo di 
soluzione di NaOH o di HCl)  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1233
 
— Portare a 1 000 ml con acqua  
— Se le soluzioni madre sono sterilizzate e si utilizza un'acqua adeguata non è 
necessaria un'ulteriore sterilizzazione. Se il mezzo finale è sterilizzato, ag ­
giungere la soluzione madre 8 dopo la sterilizzazione in autoclave (a 121 °C per 20 minuti).
 
Preparazione del mezzo di Steinberg (modificato) concentrato dieci volte per 
la conservazione intermedia  
— Aggiungere 20 ml delle soluzioni madre 1, 2 e 3 (cfr. tabella 2) a circa 30 ml 
di acqua per impedire la precipitazione.  
— Aggiungere 1,0 ml delle soluzioni madre 4, 5, 6, 7 e 8 (cfr. tabella 3). Portare 
a 100 ml con acqua.  
— Se le soluzioni madre sono sterilizzate e si utilizza un'acqua adeguata non è 
necessaria un'ulteriore sterilizzazione. Se il mezzo finale è sterilizzato, ag ­
giungere la soluzione madre 8 dopo la sterilizzazione in autoclave (a 121 °C per 20 minuti)
 
— Il pH del mezzo (concentrazione finale) dovrebbe essere 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1234
 
C.27.  PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDE IN ACQUA- 
SEDIMENTO CON SEDIMENTO ADDIZIONATO  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 218 (2004) 
ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze 
chimiche su larve di  Chironomus  sp., un dittero che vive nei sedimenti di 
acqua dolce. Tiene conto anche dei protocolli per le prove di tossicità su  
Chironomus riparius  e Chironomus tentans  messi a punto in Europa (1) (2) 
(3) e in Nord America (4) (5) (6) (7) (8) e sottoposti a prove interlaboratorio 
(1) (6) (9). È possibile utilizzare anche altre specie ben documentate, ad 
esempio  Chironomus yoshimatsui  (10) (11).  
2. Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a 
mezzo di sedimenti addizionati. La scelta dello scenario d’esposizione di ­
pende dalla finalità della prova. Lo scenario che consiste nell’addizionare i sedimenti con la sostanza in esame è inteso a simulare il persistere di livelli 
cumulativi della sostanza. In questo sistema sperimentale sedimento-acqua è 
il sedimento ad essere addizionato.
 
3. In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti 
persistono a lungo in questo comparto. Questi organismi possono essere esposti per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e 
il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico 
globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log K
 ow > 5) oppure 
per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di 
alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per 
non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può consi ­
derare l’opportunità di aggiungere alimenti al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le pos ­
sibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova 
dura da 20 a 28 giorni per  C. riparius  e C. yoshimatsui , e da 28 a 65 giorni 
per C. tentans . Se occorrono dati a breve termine per un fine specifico, ad 
esempio studiare gli effetti di una sostanza chimica instabile, è possibile 
ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’am ­
bito dello stesso impianto sperimentale.
 
4. Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti comparsi e il tempo 
intercorso fino alla loro comparsa. Se occorrono dati a breve termine, si consiglia di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla soprav ­
vivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche supple ­
mentari.
 
5. Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi 
vantaggi rispetto a quello naturale:  
— riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una «matrice 
standardizzata» riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle 
fonti di sedimenti pulite e incontaminate,  
— consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che 
occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indi ­
gena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità 
sufficienti di sedimento per le prove di routine,
 
— è possibile mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla loro 
tossicità.  
6. L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente 
metodo.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1235
 
PRINCIPIO DELLA PROVA  
7. Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di 
concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La sostanza in esame è aggiunta al sedimento e le larve al primo stadio vengo 
in seguito introdotte nei becher dove le concentrazioni sedimento-acqua 
sono state stabilizzate. Le percentuali di emergenza e crescita dei chirono ­
midi sono misurate alla fine della prova. La sopravvivenza e il peso delle larve possono essere misurati anche dopo 10 giorni, se necessario (utiliz ­
zando le eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tra ­
mite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della 
crescita delle larve (ad esempio CE
 15 , CE  50 ecc.), oppure mediante verifica 
di un’ipotesi statistica per determinare un valore NOEC/LOEC. Nel secondo caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
8. È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza 
in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e 
la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre disporre di un 
metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui de ­
vono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rive ­
labilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della 
sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipa ­
zione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per sag ­
giare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa 
l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12).
 
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
9. Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si 
possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di 
riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di vali ­
dazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13).
 
VALIDITÀ DELLA PROVA  
10. Perché il test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— l’emergenza nei controlli deve arrivare almeno al 70 % alla fine del test 
(1) (6),  
— per quanto riguarda  C. riparius  e C. yoshimatsui , l’emergenza allo stadio 
adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni 
successivi alla loro introduzione nei recipienti; per  C. tentans  il periodo 
va da 20 a 65 giorni,  
— alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione 
dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossi ­
geno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in 
aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova,
 
— la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1.0 °C e può essere 
regolata per mezzo di un camera isotermica, nel qual caso la temperatura 
ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui intervalli di 
tempo.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1236
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Recipienti di prova  
11. Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. 
Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profon ­
dità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La super ­
ficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm  2 per 
larva. La profondità dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua 
sovrastante devono essere in un rapporto di 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con il sistema di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad 
esempio Teflon).
 
Selezione delle specie  
12. La specie che conviene utilizzare per la prova è  Chironomus riparius . Si 
può utilizzare anche C hironomus tentans , anche se è più difficile da mani ­
polare e richiede un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche  
Chironomus yoshimatsui . Metodi di coltura di  Chironomus riparius  figurano 
nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni anche sulle condizioni di 
coltura delle altre specie:  Chironomus tentans  (4) e  Chironomus yoshimatsui  
(11). Occorre identificare la specie prima dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue la sperimentazione.
 
Sedimento  
13. Utilizzare di preferenza sedimento artificiale (detto anche sedimento formu ­
lato). Se si sceglie di utilizzare un sedimento naturale, occorre caratterizzar ­
lo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di 
altri parametri, come il rapporto C/N e la granulometria è altrettanto racco ­
mandata), e assicurarsi che sia esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o con ­
sumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità 
su chironomidi, si consiglia inoltre di farlo riposare per sette giorni alle 
stesse condizioni in cui verrà realizzata la prova. Per questo test si consiglia di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di 
prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È 
importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata 
(granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria;  
b) 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza 
superiore al 30 %);  
c) 75-76 % (peso secco) di sabbia quarzosa (composta in prevalenza da 
sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm);
 
d) aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale 
della miscela compreso tra 30 e 50 %;  
e) aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO  3 ) per 
aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5. Il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato in a) e c).
 
14. La provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere nota. Occorre 
verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da sostanze 
chimiche (es.: metalli pesanti, composti organoclorurati o organo fosforati 
ecc.). L’appendice 3 contiene un esempio per la preparazione del sedimento artificiale. È possibile mescolare componenti secchi, se si può dimostrare che con l’aggiunta di acqua sovrastante non si verifica alcuna separazione 
dei componenti del sedimento (es. particelle di torba che galleggiano) e che 
la torba o il sedimento sono sufficientemente condizionati.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1237
 
Acqua  
15. Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate alle appendici 2 
e 4 sono considerate adatte per le prove. È possibile utilizzare come acqua di allevamento e acqua di prova ogni tipo di acqua idonea, quali acqua 
naturale (di superficie o freatica), ricostituita (cfr. appendice 2) o di rubi ­
netto non clorata, se i chironomidi riescono a sopravvivervi per la durata della coltura e della prova senza manifestare segni di stress. All’inizio della prova, il pH dell’acqua di prova dev’essere compreso tra 6 e 9 e la durezza 
totale non dev’essere superiore a 400 mg/l (come CaCO
 3 ). Utilizzare, però, 
un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt 
M4 non può essere usato). Utilizzare lo stesso tipo di acqua nel corso di 
tutta la prova. Misurare le caratteristiche della qualità dell’acqua elencate nell’appendice 4 almeno due volte l’anno o quando si sospetta che possano essere cambiate significativamente.
 
Soluzioni madre — sedimenti addizionati  
16. I sedimenti addizionati — alla concentrazione desiderata — vengono gene ­
ralmente preparati aggiungendo una soluzione della sostanza in esame di ­
rettamente al sedimento. La soluzione madre della sostanza in esame dis ­
solta in acqua deionizzata viene mescolata con il sedimento artificiale ricor ­
rendo a un laminatoio, a un miscelatore per mangimi oppure a mano. Se scarsamente solubile in acqua, la sostanza in esame può essere disciolta nel 
minor volume possibile di un solvente organico idoneo (per esempio esano, 
acetone, cloroformio). La soluzione ottenuta va poi mischiata con 10 g di sabbia quarzosa fine per ciascun recipiente di prova. Il solvente va lasciato evaporare e deve essere completamente eliminato dalla sabbia; la sabbia va 
poi mescolata alla quantità di sedimento necessaria per un becher. Per 
solubilizzare, disperdere o emulsionare la sostanza in esame, si possono impiegare soltanto agenti che volatilizzano rapidamente. Occorre tener con ­
to, al momento di preparare il sedimento, della sabbia contenuta nella so ­
stanza in esame e nella miscela di sabbia (il sedimento, quindi, va preparato 
utilizzando meno sabbia). Fare attenzione a che la sostanza in esame ag ­
giunta al sedimento sia perfettamente e omogeneamente distribuita al suo interno. Se necessario, analizzare dei sottocampioni per verificare il grado di 
omogeneità.
 
DISEGNO SPERIMENTALE  
17. Il disegno comprende la selezione del numero delle concentrazioni di prova, 
e dell’intervallo fra esse, del numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e del numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della 
NOEC e per l’esecuzione di una prova limite.
 
Disegno per l’analisi di regressione  
18. La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE  15 , CE  50 ) e 
l’intervallo di concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un 
effetto interessante devono essere contemplati dalle concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concentrazioni con effetto (CE
 X ) saranno maggiori quando la concen ­
trazione con effetto rientra nell’intervallo di concentrazioni da testare. Biso ­
gna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione efficace più debole o al di sopra della concentrazione massima. È utile condurre una prova preliminare di determinazione dell’intervallo di concen ­
trazioni per delimitare le concentrazioni su cui imperniare la prova (cfr. 
paragrafo 27).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1238
 
19. Se si deve stimare la CE  X occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, 
allestendo tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per otte ­
nere una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia 
poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito 
se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’au ­
mento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli tra le concen ­
trazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero 
delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvi ­
venza e la crescita delle larve dopo 10 giorni.
 
Disegno per la stima di una NOEC/LOEC  
20. Se occorre stimare la LOEC o la NOEC si saggeranno cinque concentrazioni 
con almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 
20 % con l’unità di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % 
(p = 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appro ­
priata un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dun ­
nett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può 
utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione 
secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel.
 
Prova limite  
21. Se la prova preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentra ­
zioni non ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concentrazione di prova e un controllo). Lo scopo della prova limite è quello di condurre un test con una concentrazione sufficientemente alta da consen ­
tire ai responsabili delle decisioni di escludere eventuali effetti tossici della 
sostanza in esame; il limite va fissato a una concentrazione la cui comparsa è improbabile in tutte le situazioni. Si raccomanda un rapporto di 1 000 mg/kg (peso secco). Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli 
organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la 
potenza statistica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo 
e peso, il test t costituisce un metodo statistico adatto se i dati rispettano le 
condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di 
emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato.
 
PROCEDURA  
Condizioni di esposizione  
Preparazione del sistema sedimento addizionato-acqua  
22. Per l’applicazione della sostanza in esame (14), si raccomanda l’uso del 
processo di addizione descritto nel metodo di prova C.8: Tossicità per i lombrichi. I sedimenti addizionati vengono posti nei recipienti e viene ag ­
giunta acqua sovrastante per produrre un rapporto volumetrico 
sedimento-acqua di 1:4 (cfr. paragrafi 11 e 15). La profondità dello strato 
sedimentario dev’essere tra 1,5 e 3 cm. Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica 
durante l’operazione di riempimento della colonna d’acqua, per poi ritirarlo 
a operazione completata. Possono essere utilizzati anche altri dispositivi.
 
23. I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di 
vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’eva ­
porazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare 
l’accumulo di sali.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1239
 
Stabilizzazione  
24. Una volta che il sedimento addizionato sovrastato da uno strato d’acqua è 
stato preparato, è preferibile lasciare che la sostanza in esame si ripartisca tra la fase acquosa e il sedimento (3) (4) (6) (13); di preferenza, ciò dovrebbe 
avvenire nelle stesse condizioni di temperatura e aerazione utilizzate nella 
prova. Il tempo di equilibratura può durare alcune ore, dei giorni o, in rari casi, fino a 4 o 5 settimane, a seconda del sedimento e della sostanza chimica. Non occorre attendere il raggiungimento dell’equilibrio, perché 
molte sostanze rischiano di degradarsi nel corso di questo periodo, ma è 
raccomandato un tempo di attesa di 48 ore. Al termine di questo periodo di equilibratura, occorre misurare la concentrazione della sostanza in esame 
nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, almeno alla 
concentrazione massima e a una più bassa (cfr. paragrafo 38). Tali misura ­
zioni analitiche della sostanza in esame consentono di calcolare il bilancio di massa e di esprimere i risultati in funzione delle concentrazioni misurate.
 
Introduzione degli organismi di prova  
25. Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si 
prelevano dalle colture ammassi di uova e le si depositano in recipienti 
piccoli con il mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato 
dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. 
appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. 
Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 2 a 3 giorni per  Chironomus riparius  a 20
 o C e da 1 a 4 giorni per  
Chironomus tentans  a 23  o C e Chironomus yoshimatsui  a 25  o C) e la loro 
crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 
giorni. Questa prova si applica al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in base alle dimensioni della capsula cefalica (6).
 
26. In ciascun recipiente contenente il sedimento addizionato e l’acqua si depo ­
sitano, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio scelte 
a caso. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero di larve 
utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 
80 per la determinazione della NOEC.
 
Concentrazioni di prova  
27. Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma 
delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova 
vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della 
sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica.
 
28. Le concentrazioni di prova per la prova vera e propria sono decise in 
funzione dell’esito del saggio di determinazione dell’intervallo di concen ­
trazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a 
quanto indicato nei paragrafi 18-20.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1240
 
Controlli  
29. La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza 
in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un 
solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo 
che contenga sedimento e solvente.
 
Sistema di prova  
30. Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rin ­
novo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utiliz ­
zati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua 
diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti ecces ­
sivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il 
pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’areazione.
 
Cibo  
31. Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte 
la settimana. Durante i primi 10 giorni la dieta giornaliera ritenuta adeguata per le larve in questo stadio consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per  C. 
yoshimatsui ) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o fine ­
mente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può 
essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della prova. Si diminuirà la razione di mangime di tutti gli organismi trattati e dei 
controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di 
controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log K
 ow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, 
la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli 
organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di 
ortica ( Urtica dioica ), gelso ( Morus alba ), trifoglio bianco ( Trifolium re ­
pens), spinacio ( Spinacia oleracea ) o di altro materiale vegetale ( Cerophyl  o 
alfa cellulosa).
 
Condizioni di incubazione  
32. L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di 
preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine 
della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda sotto il 60 % del valore di saturazione dell’aria). L’aria è insufflata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento 
(nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è 
volatile, va eventualmente considerato di sopprimere l’aerazione.
 
33. La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per  C. 
tentans  e C. yoshimatsui  la temperatura consigliata è, rispettivamente, di 
23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa 
compresa tra 500 e 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1241
 
Durata dell’esposizione  
34. L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e 
di controllo. La prova dura 28 giorni per  C. riparius  e C. yoshimatsui , e 65 
giorni per  C. tentans . Se i moscerini emergono prima, la prova può con ­
cludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di 
controllo.  
Osservazioni  
Emergenza  
35. Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini 
maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate.
 
36. I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che 
non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti na ­
tatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e 
registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta 
identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il 
numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 
contiene indicazioni su come misurare l’emergenza.
 
Crescita e sopravvivenza  
37. Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 
10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è 
setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è 
determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi (è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da 
microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve 
sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvis ­
sute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni indi ­
viduo.
 
Misurazioni analitiche  
Concentrazione della sostanza in esame  
38. Prima di iniziare la prova (cioè prima di introdurre le larve), occorre prele ­
vare campioni di sedimento da almeno uno dei recipienti per ciascun trat ­
tamento, per determinare analiticamente la concentrazione nel sedimento della sostanza in esame. Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sopranatante, dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio 
della prova (cfr. paragrafo 24) e alla fine, e ciò per la concentrazione 
massima e per una più bassa. La concentrazione della sostanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento.
 
39. Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) 
e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni analitiche sono praticate su campioni prelevati da recipienti supplementari 
trattati allo stesso modo (anche contenenti organismi di prova) ma non 
utilizzati per le osservazioni biologiche.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1242
 
40. Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad 
esempio, a 10 000 g e a 4  o C per 30 minuti. Se però è dimostrato che la 
sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale.
 
Parametri fisici e chimici  
41. Il pH e la temperatura dei recipienti devono essere debitamente misurati (cfr. 
paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la 
durezza dell’acqua e il tenore di ammoniaca nei controlli e in un recipiente 
trattato alla concentrazione massima.  
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
42. Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla 
velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini moscerini maschi e 
femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 
giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini 
dell’analisi statistica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono 
essere raggruppati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisticamente tramite, ad esempio, il test χ
 2 -r x 2. La sopravvi ­
venza delle larve e il peso secco individuale medio per recipiente devono 
essere determinati dopo 10 giorni, se del caso.  
43. Le concentrazioni con effetto espresse (basate sul peso secco), sono calco ­
late di preferenza sulla base delle concentrazioni dei sedimenti misurate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38).
 
44. Per effettuare una stima puntuale della CE  50 o di qualsiasi altra CE  X , le 
statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. 
Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CE  X occorre 
tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale va ­
riabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per reci ­
piente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CE
 X 
devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel 
suo valore originario.  
45. Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante verifica 
di un’ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considerazio ­
ne, ad esempio mediante un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove 
non sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece utilizzare test più robusti (21).
 
Tasso di emergenza  
46. I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati 
con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano 
questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o 
un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indiche ­
rebbe (variazione spesso denominata «extrabinomiale»), si applicherà un test 
più robusto (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto alla nota (21).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1243
 
Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (n  e ) e la si divide 
per il numero di larve introdotte (n  a ): 
ER ¼ n e 
n a 
dove:  
ER = tasso di emergenza  
n e = numero di moscerini emersi per recipiente  
n a = numero di larve introdotte per recipiente  
47. Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di 
varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza 
che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emer ­
genza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il 
numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica.
 
48. Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre dapprima trasformare i valori 
del tasso di emergenza (ER) per la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper ottenere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il test di Cochran-Armitage, il test esatto 
di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel 
possono essere impiegati quando si utilizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno
 -1 ) della radice quadrata del tasso di 
emergenza (ER).  
49. Per i tassi di emergenza, i valori della CE  X sono calcolati con un’analisi di 
regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commer ­
ciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non parametrici quali la media mobile o una semplice interpolazione.
 
Velocità di sviluppo  
50. Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione 
delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto 
dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo 
è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consi ­
ste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di svi ­
luppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e 
valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è 
trattata come risposta continua, i valori della CE
 X possono essere stimati 
avvalendosi dell’analisi di regressione [ad esempio (23) (24)].  
51. Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è 
considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La 
velocità media di sviluppo per recipiente ( x) è calcolata come segue:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1244
 
dove:  
x: velocità media di sviluppo per recipiente  
i: indice dell’intervallo di osservazione  
m: numero massimo di intervalli di osservazione  
ƒ i : numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i  
n e : numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (=  P ƒ i ) 
x i : velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
dove:  
day  i : giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione)  
l i : lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di solito 
1 giorno)  
Relazione sulla prova  
52. La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni:  
Sostanza in esame:  
— natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, 
tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel suolo (o nel sedimen ­
to, se disponibile), stabilità nell’acqua ecc.),  
— dati di identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula 
strutturale, numero CAS ecc.) compresi purezza e metodo di analisi per 
la quantificazione della sostanza in esame.  
Specie in esame:  
— animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi 
e condizioni di allevamento,  
— informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve,  
— età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di 
prova.  
Condizioni sperimentali:  
— sedimento utilizzato (specificare se naturale o artificiale),  
— se il sedimento è naturale: ubicazione e descrizione del sito di campio ­
namento del sedimento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; 
caratteristiche: pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granu ­
lometria (se del caso).  
— preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (te ­
nore di carbonio organico, pH, tenore di umidità ecc., all’inizio della prova),
 
— preparazione dell’acqua per la prova (se l’acqua è ricostituita) e carat ­
teristiche (concentrazione dell’ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc., 
all’inizio della prova),  
— spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante,  
— volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedi ­
mento umido, con acqua interstiziale e senza,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1245
 
— recipienti di prova (materiale e dimensioni),  
— metodo per l’addizione della sostanza al sedimento: concentrazioni uti ­
lizzate nella prova, numero di repliche e, se del caso, solventi utilizzati,  
— fase di stabilizzazione del sistema sedimento addizionato-acqua: durata e 
condizioni,  
— condizioni di incubazione: temperatura, fotoperiodo e intensità luminosa, 
aerazione (frequenza e intensità),  
— informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendono il tipo di 
mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione.  
Risultati:  
— concentrazioni di prova, nominali e concentrate, e risultati di tutte le 
analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza in esame nel recipiente di prova,
 
— qualità dell’acqua nei recipienti di prova, ossia pH, temperatura, ossi ­
geno disciolto, durezza e ammoniaca,  
— aggiunta di acqua per sostituire quella eventualmente evaporata,  
— numero di moscerini maschi e femmine emersi, per ciascun recipiente e 
ciascun giorno,  
— numero di larve non emerse come moscerini, per recipiente,  
— peso secco individuale medio delle larve, per recipiente e, se del caso, 
per stadio larvale,  
— percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati rag ­
gruppati per moscerini maschi e femmine),  
— velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi, per 
replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per mo ­
scerini maschi e femmine),  
— stime degli endpoint di tossicità, ad esempio per CE  X (e relativi inter ­
valli di confidenza), NOEC e/o LOEC, nonché metodi statistici utilizzati 
per determinarli,  
— discussione dei risultati comprese le eventuali ripercussioni sui risultati 
dovute allo scostamento dal presente metodo di prova.  
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Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni:  
Sedimento artificiale:  sintetico o formulato, miscela di materiali utilizzati per 
simulare le componenti fisiche di un sedimento naturale.  
Acqua sovrastante:  acqua posta sopra il sedimento nel recipiente di prova.  
Acqua interstiziale:  acqua che occupa lo spazio tra il sedimento e le particelle di 
terreno.  
Sedimento addizionato:  sedimento al quale è stata aggiunta la sostanza in 
esame.  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1248
 
Appendice 2  
Indicazioni per l’allevamento di  Chironomus riparius  
1. Le larve di  Chironomus  possono essere allevate in cristallizzatori o in 
grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato 
idoneo (nel qual caso ne basta uno strato ancora più sottile, di pochi 
millimetri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può 
essere rinnovata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione mode ­
rata. I recipienti di allevamento devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti emergenti. La gabbia dev’essere sufficiente ­
mente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione 
imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una 
temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce 
(a un’intensità luminosa di circa 1 000 lux) e 8 ore di buio. Secondo le informazioni disponibili, un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può 
impedire la riproduzione.
 
Acqua di diluizione  
3. Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. 
Normalmente viene utilizzata acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clo ­
rata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua 
deve essere aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua 
di allevamento versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti, facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve.
 
Alimentazione delle larve  
4. Le larve di  Chironomus  sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi 
(Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere sommini ­
strato sotto forma di polvere macinata secca o sospensione acquosa: si 
aggiunge 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e si agita la 
miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato consiste in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie.
 
5. L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo 
di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quan ­
tità di mangime somministrate vanno controllate scrupolosamente: se scarse 
faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se in eccesso intensifi ­
cheranno l’attività microbica e abbasseranno la concentrazione di ossigeno. 
La conseguenza, in entrambi i casi, potrebbe essere l’inibizione della cre ­
scita degli organismi.  
6. Nell’allestire i nuovi recipienti di allevamento è possibile aggiungere anche 
alcune cellule di alghe verdi (come  Scenedesmus subspicatus , Chlorella 
vulgaris ). 
Alimentazione degli adulti emersi  
7. Alcuni ricercatori suggeriscono, come mezzo di alimentazione per gli adulti 
emersi, un tampone di ovatta imbevuto di una soluzione satura di sacca ­
rosio.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1249
 
Emergenza  
8. Alla temperatura di 20 ± 2 °C gli adulti iniziano ad emergere dai recipienti 
di allevamento delle larve dopo circa 13-15 giorni. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate.
 
Ammassi di uova  
9. Dal momento in cui si osserva la presenza di adulti nelle gabbie di alle ­
vamento, occorre controllare tre volte la settimana, in tutti i recipienti, se 
sono stati depositati ammassi gelatinosi di uova. Se presenti, gli ammassi di uova devono essere rimossi con cura e trasferiti in un recipiente piccolo contenente un campione dell’acqua di allevamento. Essi sono utilizzati per 
allestire un nuovo recipiente di allevamento (ad esempio, 2-4 ammassi per 
recipiente) oppure per eseguire prove di tossicità.
 
10. Le larve al primo stadio compaiono di norma dopo 2-3 giorni.  
Allestimento di nuovi recipienti di coltura  
11. Una volta avviate le colture, dovrebbe essere possibile allestire un nuovo 
recipiente per la coltura di larve a cadenza settimanale o meno spesso, secondo quanto richiesto dalla prova, ritirando i recipienti vecchi dopo 
che i moscerini adulti sono emersi. Questo sistema permette di ottenere 
regolarmente una quota di adulti con un’organizzazione minima.
 
Preparazione delle soluzioni di prova M4 e M7  
12. Il mezzo M4 è stato descritto da Elendt (1990). Il mezzo M7 è preparato 
come l’M4 tranne per le sostanze indicate nella tabella 1, le cui concen ­
trazioni nel mezzo M7 sono quattro volte inferiori rispetto al mezzo M4. Una pubblicazione sul mezzo M7 è in preparazione (Elendt, comunicazione 
personale). La soluzione di prova non deve essere preparata secondo le 
istruzioni di Elendt e Bias (1990), perché le concentrazioni di NaSiO
 3 5 
H 2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 e K  2 HPO  4 indicate per la preparazione delle solu ­
zioni madre non sono adatte.  
Preparazione del mezzo M7  
13. Ciascuna soluzione madre (I) è preparata separatamente e a partire da 
queste soluzioni madri (I) si prepara la soluzione madre combinata (II) 
(cfr. tabella 1). Per preparare il mezzo M7 mescolare 50 ml di soluzione madre combinata (II) con i quantitativi di ogni soluzione madre con ma ­
cronutrienti indicati nella tabella 2 e portare a 1 litro aggiungendo acqua 
deionizzata. Per preparare una soluzione madre vitaminica, aggiungere tre 
vitamine all’acqua deionizzata, come indicato nella tabella 3, e versare 0,1 ml della soluzione madre combinata di vitamine al mezzo M7 finale poco prima dell’uso La soluzione di vitamine combinate è conservata in conge ­
latore in piccole aliquote. Aerare e stabilizzare il mezzo.
 
BIBLIOGRAFIA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1250
 
Tabella 1  
Soluzioni madre di oligoelementi per i mezzi M4 e M7  
Soluzioni madre (I) Quantità (mg) per 
formare una so ­
luzione di 1 litro 
con acqua deio ­
nizzata Preparazione della soluzione madre 
combinata (II): mescolare le quantità 
seguenti (ml) di soluzioni madre (I) 
e portare a 1 litro aggiungendo ac ­
qua deionizzata Concentrazioni finali nelle soluzioni 
di prova (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Queste sostanze sono presenti in dosi diverse in M4 e M7, come indicato sopra. 
( 2 ) Queste soluzioni sono preparate separatamente, mescolate e messe immediatamente in autoclave.  
Tabella 2  
Soluzioni madre di macronutrienti per i mezzi M4 e M7  
Quantità per formare 
una soluzione di 1 litro 
con acqua deionizzata 
(mg) Quantità di soluzione madre 
di macronutrienti aggiunta 
per preparare i mezzi M4 e 
M7 
(ml/l) Concentrazioni finali 
delle soluzioni di 
prova M4 e M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1251
 
Tabella 3  
Soluzione madre vitaminica per i mezzi M4 e M7. Le tre soluzioni di vitamine sono mescolate 
in modo da formare un’unica soluzione madre vitaminica.  
Quantità per formare 
una soluzione di 1 litro 
con acqua deionizzata 
(mg) Quantità di soluzione madre 
vitaminica aggiunta per pre ­
parare i mezzi M4 e M7 
(ml/l) Concentrazioni finali 
delle soluzioni di prova 
M4 e M7 
(mg/l)  
Tiamina cloridrato 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075
 
BIBLIOGRAFIA  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25- 
33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on LIFE History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1252
 
Appendice 3  
PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO ARTIFICIALE  
Composizione del sedimento  
Il sedimento è preparato come illustrato nella tabella sottostante:  
Componente Caratteristiche % di sedimento 
peso secco  
Torba Torba di sfagno, con pH più 
vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di 
piante, finemente macinata 
(granulometria ≤ 1 mm) ed 
essiccata all’aria 4-5 
Sabbia di quarzo Granulometria: > 50 % delle 
particelle ha dimensioni com ­
prese tra 50 e 200 μm 75-76 
Argilla caolinica Tenore di caolinite ≥ 30 % 20 
Carbonio organico Regolato aggiungendo torba 
e sabbia 2 (± 0,5) 
Carbonato di calcio CaCO
 3 , in polvere, chimica ­
mente puro 0,05-0,1 
Acqua Conduttività ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparazione  
Far essiccare all’aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione 
della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Aggiustare il pH della sospensione a 5,5 
± 0,5 con CaCO
 3. Conservare per almeno due giorni la sospensione a tempera ­
tura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve 
essere pari a 6,0 ± 0,5. Successivamente mescolare la sospensione di torba con 
gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30-50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e 
aggiustare a 6,5-7,5 con CaCO
 3 se necessario. Prelevare campioni del sedimento 
per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Prima di impiegare il sedimento artificiale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia di conservarlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova.
 
Conservazione  
I componenti secchi destinati alla preparazione del sedimento artificiale possono 
essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento artificiale (umido) non può essere conservato prima del suo impiego per la prova, 
ma deve essere utilizzato subito dopo il periodo di riposo di 7 giorni che ne 
conclude la preparazione.
 
BIBLIOGRAFIA  
Capitolo C.8 del presente allegato. Tossicità per i lombrichi.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1253
 
Appendice 4  
Caratteristiche chimiche di un’acqua di diluizione accettabile  
Sostanza Concentrazioni  
Particolato < 20 mg/l 
Carbonio organico totale < 2 mg/l Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l 
Durezza espressa come CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residuo < 10 μg/l 
Pesticidi organofosforati totali < 50 ng/l Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati < 50 ng/l Cloro organico totale < 25 ng/l
 
(*) Utilizzare un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che 
provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può 
essere usato).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1254
 
Appendice 5  
Indicazioni per monitorare l’emergenza delle larve di chironomidi  
A partire dal 20  o giorno fino alla fine della prova, in cima ai becher si collocano 
contenitori «trappola». Un esempio di trappola è raffigurato nell’immagine sotto ­
stante.
  
A: reticella di nylon  
B: contenitore di plastica capovolto  
C: becher senza beccuccio  D: aperture ricoperte di reticella attraverso cui si 
effettua il ricambio dell’acqua  
E: acqua  
F: sedimento  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1255
 
C. 28.  PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDI IN SEDIMENTO- 
ACQUA CON ACQUA ADDIZIONATA  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 219 (2004) 
ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze 
chimiche su larve di  Chironomus  sp., un dittero che vive nei sedimenti di 
acqua dolce. Si basa principalmente sulla linea guida della BBA che utilizza un sistema sperimentale sedimento-acqua con terreno artificiale, in cui 
l’esposizione avviene nella colonna d’acqua (1) e tiene conto anche dei 
protocolli per le prove di tossicità su  Chironomus riparius  e Chironomus 
tentans  messi a punto in Europa e in Nord America (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 
e sottoposti a prove interlaboratorio (1) (6) (9). È possibile utilizzare anche 
altre specie ben documentate, ad esempio  Chironomus yoshimatsui  (10 (11).
 
2. Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a 
mezzo d’acqua addizionata. La scelta dello scenario d’esposizione dipende 
dalla finalità della prova. Lo scenario d’esposizione, che consiste nell’addi ­
zionare alla colonna d’acqua la sostanza in esame, è inteso a simulare la dispersione di pesticidi nebulizzati e copre il picco iniziale di concentrazioni nell’acqua interstiziale. È utile anche per altri tipi di esposizione (fuoriuscite 
di sostanze chimiche, ad esempio), tranne quando i processi di accumulo 
hanno durata superiore a quella della prova.
 
3. In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti 
persistono a lungo in questo comparto. L’esposizione di questi organismi può avvenire per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico 
globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. 
Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log K
 ow > 5) oppure 
per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per 
non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può consi ­
derare l’opportunità di aggiungere cibo al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le possibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova dura da 
20 a 28 giorni per  C. riparius  e C. yoshimatsui , e da 28 a 65 giorni per  C. 
tentans . Se si ha bisogno di dati a breve termine per un fine specifico, ad 
esempio studiare gli effetti di sostanze chimiche instabili, è possibile ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’ambito 
dello stesso impianto sperimentale.
 
4. Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti emersi e il tempo 
intercorso fino alla loro emergenza. Se occorrono dati a breve termine, si 
raccomanda di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla so ­
pravvivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche sup ­
plementari.  
5. Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi 
vantaggi rispetto a quello naturale:  
— riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una «matrice 
standardizzata» riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle fonti di sedimenti pulite e incontaminate,
 
— consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che 
occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indi ­
gena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità 
sufficienti di sedimento per le prove di routine,
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1256
 
— consente di mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla 
loro tossicità: i dati sulla tossicità ricavati da prove con sedimenti natu ­
rali e artificiali sono comparabili per varie sostanze chimiche (2).  
6. L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente 
metodo.  
PRINCIPIO DEL METODO  
7. Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di 
concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La prova inizia introducendo le larve al primo stadio nei becher contenenti il 
sistema sedimento-acqua e aggiungendo successivamente all’acqua la so ­
stanza in esame. La percentuale di emergenza e la velocità di sviluppo dei chironomidi sono misurate alla fine della prova. Dopo 10 giorni, se necessario, si misurano anche la sopravvivenza e il peso delle larve (utiliz ­
zando eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tramite 
un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della crescita delle larve (ad esempio CE
 15 , CE  50 ecc.), oppure mediante verifica di 
un’ipotesi statistica per determinare un valore LOEC/NOEC. Nel secondo 
caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche.
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
8. È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza 
in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e 
la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre avvalersi di un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui de ­
vono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rive ­
labilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipa ­
zione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per sag ­
giare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa 
l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12).
 
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
9. Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si 
possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di 
riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di vali ­
dazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13).
 
VALIDITÀ DELLA PROVA  
10. Perché la prova sia valida devono realizzarsi le seguenti condizioni:  
— alla fine della prova l’emergenza nei controlli deve essere almeno pari al 
70 % (1) (6),  
— per quanto riguarda  C. riparius  e C. yoshimatsui , l’emergenza allo stadio 
adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni successivi alla loro introduzione nei recipienti; per  C. tentans  il periodo 
va da 20 a 65 giorni,
 
— alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione 
dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossi ­
geno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in 
aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante 
deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1257
 
— la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1,0 °C e può essere 
regolata per mezzo di una camera isotermica, nel qual caso la tempera ­
tura ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui inter ­
valli di tempo.  
DESCRIZIONE DEL METODO  
Recipienti di prova  
11. Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. 
Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profon ­
dità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La super ­
ficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm  2 per 
larva. Lo spessore dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua sovra ­
stante devono essere in rapporto 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi 
destinati ad entrare in contatto con il sistema sperimentale devono essere 
interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad esempio Teflon).
 
Selezione delle specie  
12. La specie che meglio si presta a questa prova è  Chironomus riparius . 
Chironomus tentans  è altrettanto adatto, sebbene sia più difficile da mani ­
polare e richieda un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche  
Chironomus yoshimatsui.  Le istruzioni sul metodo di allevamento di  Chiro­
nomus riparius  figurano nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni an ­
che sulle condizioni di allevamento delle altre specie:  Chironomus tentans  
(4) e  Chironomus yoshimatsui  (11). Occorre identificare la specie prima 
dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue 
la sperimentazione.
 
Sedimento  
13. Si utilizza di preferenza sedimento artificiale. Se si sceglie di utilizzare un 
sedimento naturale, occorre caratterizzarlo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di altri parametri, come il rapporto 
C/N e la granulometria è altrettanto raccomandata), e assicurarsi che sia 
esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o consumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità su chironomidi, si raccomanda 
inoltre di mantenerlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui verrà 
realizzata la prova. Per questo test si raccomanda di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È 
importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria;
 
b) 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza 
superiore al 30 %);  
c) 75-76 % (peso secco) di sabbia di quarzo (composta in prevalenza da 
sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm);
 
d) aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale 
della miscela compreso tra 30 % e 50 %;  
e) aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO  3 ) 
per aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5.  
f) il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % 
(± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, 
come indicato in a) e c).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1258
 
14. Il luogo di provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere noto. 
Occorre verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da 
sostanze chimiche (ad esempio, metalli pesanti, composti organoclorurati, composti organofosforici ecc.). Un esempio di preparazione del sedimento artificiale figura nell’appendice 3. I componenti possono anche essere me ­
scolati allo stato secco, purché si dimostri che dopo l’aggiunta dell’acqua 
sovrastante non si separino (ad esempio, particelle di torba in sospensione) e che la torba o il sedimento sono condizionati a sufficienza.
 
Acqua  
15. Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate nelle appendici 
2 e 4 per un’acqua di diluizione accettabile sono considerate adatte per la prova. È possibile utilizzare come acqua di coltura e acqua di diluizione 
qualsiasi acqua naturale (di superficie o freatica), acqua ricostituita (cfr. 
appendice 2) o acqua di rubinetto non clorata se i chironomidi sopravvivono durante l’allevamento e la prova senza manifestare segni di stress. All’inizio 
della prova il pH dell’acqua di prova deve situarsi tra 6 e 9 e la sua durezza 
complessiva non superare 400 mg/l di CaCO
 3. Se però si sospetta che vi sia 
un’interazione tra gli ioni che determinano la durezza e la sostanza in esame, occorre utilizzare un’acqua meno dura (in tal caso il mezzo Elendt M4 non è 
idoneo). Lo stesso tipo di acqua deve essere impiegato per tutta la prova. Le 
caratteristiche della qualità dell’acqua indicate nell’appendice 4 vanno mi ­
surate almeno due volte l’anno oppure quando si sospetta che abbiano subito un’alterazione significativa.
 
Soluzioni madre — Acqua addizionata  
16. Le concentrazioni sperimentali sono calcolate in base alle concentrazioni 
della colonna d’acqua, ossia l’acqua sovrastante il sedimento. Le soluzioni 
di prova alle concentrazioni prescelte vanno in genere preparate per dilui ­
zione di una soluzione madre. Le soluzioni madre devono preferibilmente essere preparate solubilizzando la sostanza nel mezzo di prova. In alcuni 
casi può rendersi necessario l’uso di solventi o disperdenti per ottenere una 
soluzione madre di adeguata concentrazione. Tra i solventi che si possono usare vi sono: acetone, etanolo, metanolo, etere monometilico del glicol etilenico, etere dimetilico del glicol etilenico, dimetilformammide e glicol 
trietilenico. Disperdenti utilizzabili sono Cremophor RH40, Tween 80, me ­
tilcellulosa 0,01 % e HCO-40. La concentrazione dell’agente solubilizzante nel mezzo di prova finale deve essere minima (ossia ≤ 0,1 ml/l) e identica in 
tutti i trattamenti. Qualora si utilizzi un agente solubilizzante, questo non 
deve avere effetti significativi sulla sopravvivenza né effetti negativi visibili 
sulle larve di chironomide, effetti che si ricavano dall’osservazione del recipiente di controllo trattato con solo solvente. L’uso di questi materiali dovrebbe tuttavia essere evitato il più possibile.
 
DISEGNO SPERIMENTALE  
17. Il disegno sperimentale comprende la selezione del numero delle concen ­
trazioni della sostanza in esame e dell’intervallo fra esse, il numero di 
recipienti per ciascun livello di concentrazione e il numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della NOEC e per l’esecuzione di una prova limite. Come 
impostazione sperimentale, l’analisi di regressione è da preferirsi alla veri ­
fica di un’ipotesi.
 
Disegno per l’analisi di regressione  
18. La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE  15 , CE  50 ) e 
l’intervallo delle concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto d’interesse devono rientrare tra le concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concen ­
trazioni che determinano un effetto (CE
 X ) saranno maggiori quando la con ­
centrazione con effetto rientra nell’intervallo delle concentrazioni da testare.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1259
 
Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione 
efficace minima o al di sopra di quella massima. È utile condurre una prova 
preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentrazioni per deli ­
mitare quelle su cui impostare la prova (cfr. paragrafo 27).  
19. Se si deve stimare la CE  X occorre saggiare almeno cinque concentrazioni e 
allestire tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per ottenere 
una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero suffi ­
ciente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si 
aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’aumento 
del numero di repliche o la riduzione degli intervalli delle concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvivenza e 
crescita delle larve dopo 10 giorni.
 
Disegno per la stima di una NOEC/LOEC  
20. Se occorre stimare la LOEC/NOEC si saggeranno cinque concentrazioni con 
almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve 
essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, applicando una significatività statistica del 5 % (p  
= 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appropriata 
un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dunnett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione 
secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel.
 
Prova limite  
21. Se la prova preliminare per determinare l’intervallo delle concentrazioni non 
ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concen ­
trazione di prova e un controllo). Scopo della prova limite è di indicare che la concentrazione tossica della sostanza in esame è superiore alla concen ­
trazione limite saggiata. Per questo metodo di prova non è possibile racco ­
mandare una concentrazione precisa, che è lasciata alla discrezione dei 
regolatori. Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la potenza stati ­
stica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con il controllo, 
applicando una significatività statistica del 5 % (p  = 0,05). Per quanto 
concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo e peso, il test t costituisce un metodo statistico idoneo se i dati rispettano le condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, 
si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, 
come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato.
 
PROCEDURA  
Condizioni di esposizione  
Preparazione del sistema addizionato acqua-sedimento  
22. Si deposita nei recipienti una congrua quantità di sedimento artificiale (cfr. 
paragrafi 13-14 e appendice 3), in modo da formare uno strato di almeno 
1,5 cm. Si aggiunge acqua fino ad un’altezza di 6 cm (cfr. paragrafo 15). Il 
rapporto tra spessore del sedimento e profondità dell’acqua non deve essere superiore a 1:4 e lo strato di sedimento non deve oltrepassare i 3 cm. Il sistema sedimento-acqua è posto in moderata aerazione per sette giorni 
prima di introdurvi gli organismi di prova (cfr. paragrafo 14 e 
appendice 3). Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica durante l’operazione di riem ­
pimento della colonna d’acqua per poi ritirarlo a operazione completata. 
Possono essere utilizzati anche altri dispositivi.
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23. I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di 
vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere 
l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’eva ­
porazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare l’accumulo di sali.
 
Introduzione degli organismi di prova  
24. Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si 
prelevano dagli allevamenti ammassi di uova e li si depositano in recipienti piccoli contenenti mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si 
aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche 
goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 
2 a 3 giorni per  Chironomus riparius  a 20
 o C e da 1 a 4 giorni per  
Chironomus tentans  a 23 C e  Chironomus yoshimatsui  a 25  o C) e la loro 
crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 giorni. Questa prova si esegue al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni 
dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in 
base alle dimensioni della capsula cefalica (6).
 
25. In ciascun recipiente contenente il sistema addizionato sedimento-acqua si 
distribuiscono casualmente, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). 
In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero 
di larve utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 80 per la determinazione della NOEC.
 
26. Ventiquattr’ore dopo avere introdotto le larve, la sostanza da saggiare è 
aggiunta nella colonna d’acqua sovrastante e i recipienti vengono di nuovo sottoposti a moderata aerazione. Piccoli volumi della soluzione contenente la 
sostanza in esame sono iniettati con un pipetta sotto la superficie dell’acqua. 
In seguito si mescola delicatamente l’acqua sovrastante, con la dovuta cau ­
tela per evitare la risospensione del sedimento.
 
Concentrazioni di prova  
27. Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma 
delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza a una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova 
vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della 
sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica.
 
28. Le concentrazioni sperimentali per la prova vera e propria sono decise in 
funzione dell’esito della prova di determinazione dell’intervallo di concen ­
trazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a 
quanto indicato nei paragrafi 18-20.  
Controlli  
29. La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza 
in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un 
solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo 
che contenga sedimento e solvente.
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Sistema di prova  
30. Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rin ­
novo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utiliz ­
zati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua 
diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono 
sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti ecces ­
sivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il 
pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad 
altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’aerazione.
 
Alimentazione  
31. Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte 
la settimana. Durante i primi 10 giorni l’alimentazione giornaliera ritenuta adeguata per le larve giovani consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per  C. 
yoshimatsui ) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o fine ­
mente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può 
essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della 
prova. Si diminuirà la razione di cibo di tutti gli organismi trattati e dei 
controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, 
con log K
 ow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, 
la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti 
vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di 
ortica ( Urtica dioica ), gelso ( Morus alba ), trifoglio bianco ( Trifolium re ­
pens), spinacio ( Spinacia oleracea ) o di altro materiale vegetale ( Cerophyl  o 
alfa cellulosa).
 
Condizioni di incubazione  
32. L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di 
preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non 
scenda sotto il 60 % del suo valore di saturazione dell’aria). L’aria è insuf ­
flata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento (nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è volatile, va eventualmente considerato di non aerare il sistema.
 
33. La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per  C. 
tentans  e C. yoshimatsui  la temperatura raccomandata è, rispettivamente, di 
23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa 
compresa tra 500 e 1 000 lux.  
Durata dell’esposizione  
34. L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e 
di controllo. La prova dura 28 giorni per  C. riparius  e C. yoshimatsui , e 65 
giorni per  C. tentans . Se i moscerini emergono prima, la prova può con ­
cludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di controllo.
 
OSSERVAZIONI  
Emergenza  
35. Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini 
maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono 
facilmente perché dotati di antenne piumate.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1262
 
36. I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che 
non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti na ­
tatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta 
identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova 
deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 
contiene indicazioni su come misurare l’emergenza.
 
Crescita e sopravvivenza  
37. Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 
10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è 
setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è 
determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi 
(è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da 
microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvis ­
sute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni indi ­
viduo.
 
Misurazioni analitiche  
Concentrazione della sostanza in esame  
38. Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sovrastante, 
dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio della prova (di preferenza un’ora dopo l’applicazione della sostanza in esame) e alla fine, e ciò per la 
concentrazione massima e per una più bassa. La concentrazione della so ­
stanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento. Dato che il prelievo di campioni di sedimento all’inizio della prova può perturbare l’impianto sperimentale (rimozione di 
larve, ad esempio), è opportuno usare dei recipienti supplementari per ef ­
fettuare i rilievi analitici all’inizio ed eventualmente durante la prova (cfr. paragrafo 39). Non è necessario analizzare il sedimento se la ripartizione della sostanza in esame tra l’acqua e il sedimento è stata chiaramente de ­
terminata con uno studio acqua/sedimento condotto in condizioni analoghe 
(ad esempio, rapporto sedimento/acqua, tipo di applicazione, tenore di car ­
bonio organico nel sedimento).
 
39. Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) 
e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni 
analitiche sono praticate su campioni prelevati dai recipienti supplementari 
trattati allo stesso modo (anche contenenti gli organismi di prova) ma non utilizzati per le osservazioni biologiche.
 
40. Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad 
esempio, a 10 000 g e a 4  o C per 30 minuti. Se però è dimostrato che la 
sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In 
alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile 
analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1263
 
Parametri fisici e chimici  
41. Il pH, l’ossigeno disciolto nell’acqua di prova e la temperatura dei recipienti 
devono essere debitamente misurati (cfr. paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la durezza dell’acqua e il tenore di am ­
moniaca nei controlli e in un recipiente trattato alla concentrazione massima.
 
DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
42. Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla 
velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due 
sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini dell’analisi stati ­
stica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono essere raggrup ­
pati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisti ­
camente tramite, ad esempio, il test χ
 2 -r x 2. La sopravvivenza delle larve e 
il peso secco individuale medio per recipiente devono essere determinati 
dopo 10 giorni, se del caso.  
43. Le concentrazioni con effetto, espresse come concentrazioni nell’acqua so ­
vrastante, sono calcolate di preferenza sulla base delle concentrazioni misu ­
rate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38).  
44. Per effettuare una stima puntuale della CE  50 o di qualsiasi altra CE  X , le 
statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. 
Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CE  X occorre 
tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale va ­
riabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il 
metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per reci ­
piente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CE  X 
devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel 
suo valore originario.  
45. Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante la veri ­
fica di ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considera ­
zione, ad esempio con un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove non 
sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece 
utilizzare test più robusti (21).  
Tasso di emergenza  
46. I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati 
con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano 
questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o 
un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indiche ­
rebbe (variazione spesso denominata «extrabinomiale»), si applicherà un test 
più potente (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto in (21).
 
47. Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (n  e ) e la si divide 
per il numero di larve introdotte (n  a ): 
TE ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1264
 
dove:  
TE = tasso di emergenza  
n e = numero di moscerini emersi per recipiente  
n a = numero di larve introdotte per recipiente  
48. Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di 
varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una 
risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emer ­
genza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando 
l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è 
considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica.
 
49. Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre trasformare i valori del TE per 
la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper otte ­
nere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il 
test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel possono essere impiegati quando si uti ­
lizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata 
dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno
 -1 ) 
della radice quadrata del TE.  
50. Per i tassi di emergenza, i valori della CE  X sono calcolati con un’analisi di 
regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commer ­
ciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando 
vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non 
parametrici quali media mobile o interpolazione lineare.  
Velocità di sviluppo  
51. Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione 
delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo 
è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consi ­
ste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di svi ­
luppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e 
valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per 
questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è trattata come risposta continua, i valori della CE
 X possono essere stimati 
avvalendosi dell’analisi di regressione (ad esempio (23) (24)].  
52. Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è 
considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La velocità media di sviluppo per recipiente ( x) è calcolata come segue:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
dove:  
x: velocità media di sviluppo per recipiente  
i: indice dell’intervallo di osservazione  
m: numero massimo di intervalli di osservazione  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1265
 
ƒ i : numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i  
n e : numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (=  P ƒ i ) 
x i : velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
dove:  
giorno  i : giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione)  
l i : lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di 
solito 1 giorno)  
Relazione sulla prova  
53. La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni:  
Sostanza in esame:  
— natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, 
tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel terreno — o nel 
sedimento, se noto —, stabilità nell’acqua ecc.),  
— identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula struttu ­
rale, numero CAS ecc.), purezza e metodo di analisi per la quantifica ­
zione della sostanza in esame.  
Specie in esame:  
— animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi 
e condizioni di allevamento,  
— informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve,  
— età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di 
prova.  
Condizioni sperimentali:  
— sedimento utilizzato, ossia se naturale o artificiale,  
— per il sedimento naturale, ubicazione e descrizione del sito di campio ­
namento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; caratteristiche: 
pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granulometria (se del 
caso),  
— preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (te ­
nore di carbonio organico, pH, umidità ecc. all’inizio della prova),  
— preparazione dell’acqua (se si utilizza acqua artificiale) e caratteristiche 
(concentrazione di ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc. all’inizio della prova),
 
— spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante,  
— volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedi ­
mento umido con e senza acqua interstiziale,  
— recipienti di prova (materiale e dimensioni),  
— metodo di preparazione delle soluzioni madre e delle concentrazioni in 
esame,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1266
 
— applicazione della sostanza in esame: concentrazioni utilizzate, numero 
di repliche e impiego di eventuali solventi,  
— condizioni d’incubazione: temperatura, fotoperiodo, intensità luminosa, 
aerazione (frequenza e intensità),  
— informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendano il tipo di 
mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione.  
Risultati:  
— concentrazioni nominali sperimentali, concentrazioni sperimentali misu ­
rate e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentra ­
zione della sostanza in esame nel recipiente di prova,  
— qualità dell’acqua nei recipienti, ossia pH, temperatura, ossigeno disciol ­
to, durezza e tenore di ammoniaca,  
— sostituzione dell’eventuale acqua evaporata nel corso della prova,  
— numero di moscerini maschi e femmine emersi, al giorno, per recipiente,  
— numero di larve non emerse come moscerini per recipiente,  
— peso secco individuale medio delle larve per recipiente, e per stadio 
larvale, se del caso,  
— percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati rag ­
gruppati per moscerini maschi e femmine),  
— velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi per 
replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per mo ­
scerini maschi e femmine),  
— stime degli endpoint di tossicità, ad esempio CE  X (e relativi intervalli di 
confidenza), NOEC e/o LOEC, e metodi statistici impiegati per deter ­
minarle,  
— discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati 
dovute allo scostamento dal presente metodo di prova.  
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nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485- 1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1268
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni:  
Sedimento artificiale , sintetico o formulato: una miscela di materiali usati per 
simulare i componenti fisici di un sedimento naturale.  
Acqua sovrastante : l’acqua al di sopra del sedimento nel recipiente di prova.  
Acqua interstiziale  o soluzione circolante: l’acqua che occupa lo spazio tra il 
sedimento e le particelle di terreno.  
Acqua addizionata : l’acqua utilizzata per la prova alla quale è stata aggiunta la 
sostanza in esame.  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata utilizzando il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1269
 
Appendice 2  
Indicazioni per l’allevamento di  Chironomus riparius  
1. Le larve di  Chironomus  possono essere allevate in cristallizzatori o in 
grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato 
idoneo (nel qual caso basta uno strato ancora più sottile di pochi millime ­
tri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può essere rinno ­
vata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione moderata. I reci ­
pienti di coltura devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti via via che emergono. La gabbia deve essere sufficiente ­
mente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione 
imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una 
temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce 
(a un’intensità luminosa di circa.1 000 lux) e 8 ore di buio. Da alcuni studi si è appreso che un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può impedire 
la riproduzione.
 
Acqua di diluizione  
3. Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. 
Di solito si impiega acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clorata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua deve essere 
aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua di coltura 
versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve.
 
Alimentazione delle larve  
4. Le larve di  Chironomus  sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi 
(Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere sommini ­
strato sotto forma di polvere macinata secca o in sospensione acquosa: 
aggiungere 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e agitare la 
miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato può consistere in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie.
 
5. L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo 
di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quan ­
tità di mangime introdotte nei recipienti vanno controllate scrupolosamente: 
se scarse faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se in eccesso intensificheranno l’attività microbica e abbasseranno la concentrazione di 
ossigeno. La conseguenza, in entrambi i casi, potrebbe essere l’inibizione 
della crescita degli organismi.
 
6. Nell’allestire nuovi recipienti di allevamento è possibile aggiungere anche 
alcune cellule di alghe verdi (come  Scenedesmus subspicatus , Chlorella 
vulgaris ). 
Alimentazione degli adulti emersi  
7. Alcuni ricercatori suggeriscono, come mezzo di alimentazione per gli adulti 
emersi, un tampone di ovatta imbevuto di una soluzione satura di sacca ­
rosio.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1270
 
Emergenza  
8. Alla temperatura di 20 ± 2 °C gli adulti iniziano ad emergere dai recipienti 
di allevamento delle larve dopo circa 13-15 giorni. I maschi si distinguono facilmente in quanto provvisti di antenne piumate.
 
Ammassi di uova  
9. Dal momento in cui si osserva la presenza di adulti nelle gabbie di alle ­
vamento, occorre controllare tutti i recipienti tre volte la settimana per 
vedere se sono state deposte le uova, sotto forma di ammassi gelatinosi. Gli ammassi di uova devono essere rimossi con cura e trasferiti in un recipiente piccolo contenente un campione dell’acqua di coltura. Essi 
sono utilizzati per preparare un nuovo recipiente di coltura (ad esempio, 
2-4 ammassi per recipiente) oppure per eseguire prove di tossicità.
 
10. Le larve al primo stadio nascono di norma dopo 2-3 giorni.  
Allestimento di nuovi recipienti di coltura  
11. Una volta avviate le colture, dovrebbe essere possibile allestire un nuovo 
recipiente per la coltura di larve a cadenza settimanale o meno spesso, 
secondo quanto richiesto dalla prova, ritirando i recipienti vecchi dopo 
che i moscerini adulti sono emersi. Questo sistema permette di ottenere regolarmente una quota di adulti con un’organizzazione minima.
 
Preparazione delle soluzioni di prova M4 e M7  
12. Il mezzo M4 è stato descritto da Elendt (1990). Il mezzo M7 è preparato 
come l’M4 tranne per le sostanze indicate nella tabella 1, le cui concen ­
trazioni nel mezzo M7 sono quattro volte inferiori rispetto al mezzo M4. 
Una pubblicazione sul mezzo M7 è in preparazione (Elendt, comunicazione personale). La soluzione di prova non deve essere preparata secondo le istruzioni di Elendt e Bias (1990), perché le concentrazioni di NaSiO
 3 5 
H 2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 e K  2 HPO  4 indicate per la preparazione delle solu ­
zioni madre non sono adatte.  
Preparazione del mezzo M7  
13. Ogni soluzione madre (I) è preparata separatamente e a partire da ciascuna 
di esse (I) si prepara la soluzione madre combinata (II) (cfr. tabella 1). Per preparare il mezzo M7 prelevare 50 ml di soluzione madre combinata (II), 
mescolarla ai quantitativi di ogni soluzione madre con macronutrienti in ­
dicati nella tabella 2 e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata. Per preparare una soluzione madre vitaminica, aggiungere tre vitamine a acqua deionizzata, come indicato nella tabella 3, e versare 0,1 ml della soluzione 
madre combinata di vitamine al mezzo M7 finale poco prima dell’uso 
(conservare la soluzione madre vitaminica in congelatore in piccole aliquo ­
te). Aerare e stabilizzare il mezzo.
 
Tabella 1  
Soluzioni madre di oligoelementi per i mezzi M4 e M7  
Soluzioni madre (I) Quantità (mg) per 
formare una so ­
luzione di 1 litro 
con acqua deio ­
nizzata Preparazione della soluzione madre 
combinata (II): mescolare le quantità 
seguenti (ml) di soluzioni madre (I) 
e portare a 1 litro aggiungendo ac ­
qua deionizzata Concentrazioni finali nelle soluzioni 
di prova (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 • 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1271
 
Soluzioni madre (I) Quantità (mg) per 
formare una so ­
luzione di 1 litro 
con acqua deio ­
nizzata Preparazione della soluzione madre 
combinata (II): mescolare le quantità 
seguenti (ml) di soluzioni madre (I) 
e portare a 1 litro aggiungendo ac ­
qua deionizzata Concentrazioni finali nelle soluzioni 
di prova (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 • 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 • 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 • 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 • 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA • 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 • 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Queste sostanze sono presenti in dosi diverse in M4 e M7, come indicato sopra. 
( 2 ) Queste soluzioni sono preparate separatamente, mescolate e messe immediatamente in autoclave.  
Tabella 2  
Soluzioni madre di macronutrienti per i mezzi M4 e M7  
Quantità per formare 
una soluzione di 1 litro 
con acqua deionizzata 
(mg) Quantità di soluzione madre 
di macronutrienti aggiunta 
per preparare i mezzi M4 e 
M7 
(ml/l) Concentrazioni finali 
nelle soluzioni di 
prova M4 e M7 
(mg/l)  
CaCl  2 • 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 • 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 • 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1272
 
Tabella 3  
Soluzione madre vitaminica per i mezzi M4 e M7  
Le tre soluzioni di vitamine sono mescolate in modo da formare un’unica soluzione madre vita ­
minica  
Quantità per formare 
una soluzione di 1 litro 
con acqua deionizzata 
(mg) Quantità di soluzione madre 
vitaminica aggiunta per pre ­
parare i mezzi M4 e M7 
(ml/l) Final concentrations in 
test solutions M4 and 
M7 
(mg/l)  
Tiamina cloridrato 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075
 
BIBLIOGRAFIA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on LIFE History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1273
 
Appendice 3  
PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO ARTIFICIALE  
Composizione del sedimento  
Il sedimento è preparato come illustrato nella tabella sottostante:  
Componente Caratteristiche % di sedimento 
peso secco  
Torba Torba di sfagno, con pH più 
vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di 
piante, finemente macinata 
(granulometria ≤ 1 mm) ed 
essiccata all’aria 4-5 
Sabbia di quarzo Granulometria: > 50 % delle 
particelle ha dimensioni com ­
prese tra 50 e 200 μm 75-76 
Argilla caolinica Tenore di caolinite ≥ 30 % 20 
Carbonio organico Regolato aggiungendo torba 
e sabbia 2 (± 0,5) 
Carbonato di calcio CaCO
 3 , in polvere, chimica ­
mente puro 0,05-0,1 
Acqua Conduttività ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparazione  
Far essiccare all’aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione 
della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Aggiustare il pH della sospensione a 5,5 
± 0,5 con CaCO
 3. Conservare per almeno due giorni la sospensione a tempera ­
tura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve 
essere pari a 6,0 ± 0,5. Successivamente mescolare la sospensione di torba con 
gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30-50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e 
aggiustare a 6,5-7,5 con CaCO
 3 se necessario. Prelevare campioni del sedimento 
per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Prima di impiegare il sedimento artificiale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia di conservarlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova.
 
Conservazione  
I componenti secchi destinati alla preparazione del sedimento artificiale possono 
essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento artificiale (umido) non può essere conservato prima del suo impiego per la prova, 
ma deve essere utilizzato subito dopo il periodo di riposo di 7 giorni che ne 
conclude la preparazione.
 
BIBLIOGRAFIA  
Capitolo C.8 del presente allegato. Tossicità per i lombrichi.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1274
 
Appendice 4  
Caratteristiche chimiche di un’acqua di diluizione accettabile  
Sostanza Concentrazioni  
Particolato < 20 mg/l 
Carbonio organico totale < 2 mg/l Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l 
Durezza espressa come CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residuo < 10 μg/l 
Pesticidi organofosforati totali < 50 ng/l Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati < 50 ng/l Cloro organico totale < 25 ng/l
 
(*) Utilizzare un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che 
provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può 
essere usato).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1275
 
Appendice 5  
Indicazioni per monitorare l’emergenza delle larve di chironomidi  
A partire dal 20  o giorno fino alla fine della prova è necessario collocare dei 
contenitori «trappola» in cima ai becher utilizzati per la prova. Un esempio di trappola è raffigurato nell’immagine sottostante.
 
A: reticella di nylon (del tipo zanzariera)  
B: contenitore di plastica capovolto  
C: becher senza beccuccio  D: aperture protette da reticella attraverso cui si 
effettua il ricambio d’acqua  
E: acqua  
F: sedimento  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1276
 
C.29.  PRONTA BIODEGRADABILITÀ — CO  2 IN RECIPIENTI 
ERMETICI (prova del CO  2 nello spazio di testa)  
INTRODUZIONE  
1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 310 (2006). 
Si tratta di un metodo di screening che consente di valutare la pronta 
biodegradabilità delle sostanze chimiche e che fornisce informazioni analo ­
ghe ai sei metodi di prova descritti nel capitolo C.4 del presente allegato (da A a F). Pertanto, una sostanza chimica che risulta positiva a questo metodo 
di prova può essere considerata prontamente biodegradabile e quindi rapi ­
damente biodegradabile nell’ambiente.
 
2. L’ormai consolidato metodo del biossido di carbonio (CO  2 ) (1), basato sul 
test originale di Sturm (2) che permette di valutare la biodegradabilità delle 
sostanze chimiche organiche misurando il biossido di carbonio prodotto dall’attività microbica, è in genere quello che meglio si presta a saggiare le sostanze chimiche poco solubili e quelle fortemente adsorbenti. È utiliz ­
zato anche per le sostanze solubili (ma non volatili), poiché molti ritengono 
che lo sviluppo di biossido di carbonio sia l’unica prova inequivocabile dell’attività microbica. L’eliminazione del carbonio organico disciolto può avvenire mediante processi fisico-chimici (adsorbimento, volatilizzazione, 
precipitazione, idrolisi), nonché ad opera dell’azione microbica e di molte 
reazioni non biologiche che consumano ossigeno; è raro che il CO
 2 sia 
prodotto a partire da prodotti chimici organici per via abiotica. Nel test di Sturm originale e in quello modificato (1) (2), il CO
 2 è estratto dalla fase 
liquida ed inviato negli assorbitori per gorgogliamento (ossia insufflando nel 
mezzo liquido l’aria trattata per eliminare il CO  2 ), mentre nella versione di 
Larson (3) (4) è trasferito dal reattore agli assorbitori facendo passare nello spazio di testa un flusso d’aria priva di CO
 2 e, in più, agitando il reattore in 
continuo. Solo nella versione modificata di Larson il reattore viene agitato; 
l’agitazione è prescritta solo per le sostanze insolubili nella norma ISO 9439 (5) e nella versione originale degli Stati Uniti (6), entrambe le quali pre ­
scrivono il gorgogliamento invece della sostituzione dell’aria nello spazio di 
testa. In un altro metodo ufficiale dell’agenzia statunitense per la protezione dell’ambiente (US EPA) (7), che si basa sul metodo di Gledhill (8), il reattore agitato è chiuso ermeticamente e il CO
 2 prodotto è raccolto diret ­
tamente dalla fase gassosa in una trappola alcalina interna, come nel respi ­
rometro classico di Warburg/Barcroft.  
3. È stato tuttavia dimostrato, nell’applicazione della prova standard modificata 
di Sturm a varie sostanze chimiche (9), che il carbone inorganico si accu ­
mula nel mezzo. Nella degradazione di 20 mg C/l di anilina, ad esempio, si è osservata una concentrazione di carbonio inorganico dell’ordine di 8 mg/l, da cui si è desunto che la raccolta di CO
 2 nelle trappole alcaline non 
rispecchia la quantità reale di CO  2 prodotta dall’azione microbica nelle 
fasi intermedie della degradazione. Pertanto, la prescrizione secondo la qua ­
le, per poter classificare la sostanza in esame come prontamente biodegra ­
dabile, è necessario raggiungere una produzione di CO  2 superiore al 60 % 
della produzione massima teorica (ThCO  2 ) nella fase di crescita di 10 giorni 
(«time window», ossia i 10 giorni immediatamente successivi al raggiungi ­
mento della soglia del 10 % di biodegradazione) non è rispettata nel caso di alcune sostanze chimiche che rientrerebbero in questa categoria utilizzando 
come criterio l’eliminazione del carbonio organico disciolto (DOC).
 
4. Quando la degradazione percentuale è inferiore al valore previsto, è proba ­
bile che una quantità di carbonio inorganico si sia accumulata nella solu ­
zione di prova. La degradabilità può allora essere valutata tramite le altre 
prove di pronta biodegradabilità.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1277
 
5. Altri inconvenienti del metodo di Sturm (laboriosità, tempi lunghi, propen ­
sione a errori sperimentali e non applicabilità alle sostanze chimiche volatili) 
avevano già indotto i ricercatori ad orientarsi verso una tecnica con reci ­
pienti ermetici, diversa da quella di Gledhill, prescindendo dall’uso di un flusso di gas continuo (10) (11). Boatman  et al.  (12) hanno riveduto i primi 
metodi e hanno adottato un sistema con spazio di testa chiuso, in cui il CO
 2 
è liberato nello spazio di testa alla fine dell’incubazione mediante acidifica ­
zione del mezzo. Il CO  2 era misurato per gascromatografia/analisi del car ­
bonio inorganico in campioni prelevati automaticamente dallo spazio di 
testa, senza però tenere conto del carbonio inorganico disciolto (DIC) nella 
fase liquida. Inoltre, i recipienti utilizzati erano molto piccoli (20 ml) e contenevano soltanto 10 ml di mezzo, il che era fonte di problemi, ad esempio quando si aggiungevano quantità necessariamente molto piccole 
di sostanze chimiche insolubili, e/o per il fatto che il mezzo inoculato 
rischiava di non contenere affatto i microrganismi in grado di degradare le sostanze in esame o di contenerli in un numero insufficiente.
 
6. Tali problemi sono stati risolti dagli studi indipendenti di Struijs e Stolten ­
kamp (13) e di Birch e Fletcher (14), questi ultimi ispirati dalla loro espe ­
rienza con le apparecchiature utilizzate nella prova di biodegradazione anae ­
robica (15). Nel primo metodo (13) il CO  2 era misurato nello spazio di testa 
dopo l’acidificazione e l’equilibrazione, mentre nel secondo (14) il DIC era misurato nelle fasi gassosa e liquida, senza trattamento; più del 90 % del 
carbonio inorganico formatosi era presente nella fase liquida. Entrambi i 
metodi presentavano vantaggi rispetto al test di Sturm: poggiavano su un sistema sperimentale più compatto e maneggevole, si applicavano anche alle 
sostanze chimiche volatili ed evitavano che la misurazione del CO
 2 prodotto 
fosse ritardata.  
7. I due approcci sono stati combinati nella norma ISO sul CO  2 nello spazio di 
testa (16), che è stata sottoposta a prove interlaboratorio (17) e costituisce la base del presente metodo di prova. Essi sono stati anche utilizzati nel 
metodo dell’EPA (18). Sono stati raccomandati due metodi di misurazione 
del CO
 2 : il CO  2 nello spazio di testa dopo acidificazione (13) e il carbonio 
inorganico nella fase liquida dopo l’aggiunta di un agente alcalino in ecces ­
so. Quest’ultimo è stato introdotto da Peterson nel corso della prova inter ­
laboratorio, condotta da CONCAWE (19), del presente metodo dello spazio 
di testa modificato, per misurare la biodegradabilità intrinseca. Nel 1992 è stata effettuata una revisione dei metodi di cui al capitolo C.4 del presente allegato per la pronta biodegradabilità (20) e le modifiche apportate in quella 
sede sono state integrate nel metodo di prova qui descritto, cosicché le 
condizioni (mezzo, durata ecc.) sono per il resto identiche a quelle del test di Sturm riveduto (20). Birch e Fletcher (14) hanno dimostrato che, sulle stesse sostanze, la prova dello spazio di testa dava risultati molto simili 
a quelli della prova interlaboratorio condotta dall’OCSE (21) dei metodi di 
prova riveduti.
 
PRINCIPIO DEL METODO  
8. La sostanza chimica in esame, normalmente a una concentrazione di 20 mg 
C/l e unica fonte di carbonio ed energia, è incubata in un tampone a base di sali minerali in cui è stata inoculata una popolazione mista di microrganismi. 
La prova è eseguita in bottiglie ermeticamente chiuse contenenti aria nello 
spazio di testa, che costituisce una riserva di ossigeno per la biodegrada ­
zione aerobica. Si determina il CO
 2 sviluppatosi dalla biodegradazione ae ­
robica completa della sostanza in esame misurando la quantità eccedente di 
carbonio inorganico prodotta nelle bottiglie rispetto a quella prodotta nelle 
bottiglie di controllo, che contengono solo il mezzo inoculato. Il grado di biodegradazione è espresso come percentuale della produzione massima teorica di carbonio inorganico (ThIC), in base alla quantità di sostanza 
chimica in esame (in carbonio organico) aggiunta all’inizio.
 
9. È anche possibile misurare l’eliminazione del DOC e/o il grado di biode ­
gradazione primaria della sostanza chimica in esame (20).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1278
 
INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME  
10. Per poter calcolare la percentuale di degradazione occorre conoscere il te ­
nore (% del peso) di carbonio organico della sostanza chimica in esame, desumendolo dalla sua struttura chimica oppure misurandolo. Per le sostanze 
volatili, è utile misurare o calcolare la costante di Henry per determinare un 
rapporto adeguato tra il volume dello spazio di testa e quello di liquido. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame per i microrganismi aiutano a scegliere la concentrazione sperimentale adatta e a interpretare i 
risultati quando indicano scarsa biodegradabilità: si raccomanda di includere 
un controllo per l’inibizione, tranne nel caso in cui si sappia che la sostanza in esame non inibisce l’attività microbica (cfr. paragrafo 24).
 
APPLICABILITÀ DEL METODO  
11. La prova si applica alle sostanze chimiche idrosolubili e insolubili, purché la 
sostanza in esame sia ben dispersa. Se per il rapporto volumico spazio di 
testa/liquido si applica il rapporto raccomandato di 1:2, le sostanze volatili la cui costante di Henry non supera 50 Pa.m
 3 .mol  -1 possono essere saggiate, 
poiché la porzione di sostanza in esame nello spazio libero non sarà supe ­
riore all’1 % (13). Si può utilizzare uno spazio di testa di volume inferiore 
per saggiare sostanze chimiche più volatili, la cui biodisponibilità rischia tuttavia di essere limitante soprattutto se sono poco idrosolubili. L’operatore deve però assicurarsi che il rapporto volumico spazio di testa/liquido e la 
concentrazione della sostanza in esame lascino ossigeno in quantità suffi ­
ciente da permettere il compiersi di una biodegradazione aerobica completa (evitando, ad esempio, di usare un substrato molto concentrato e uno spazio di testa ridotto). Ulteriori orientamenti a questo proposito si trovano nei 
riferimenti bibliografici (13) e (23).
 
SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO  
12. Occorre verificare il procedimento sperimentale saggiando in parallelo una 
sostanza di riferimento la cui biodegradabilità sia nota. A tal fine si può ricorrere all’anilina, al benzoato di sodio o al glicol etilenico quando si 
saggiano sostanze chimiche idrosolubili, e all’1-ottanolo quando si saggiano 
sostanze chimiche poco solubili (13). La biodegradazione di queste sostanze deve essere superiore al 60 % della ThIC dopo 14 giorni.
 
RIPRODUCIBILITÀ  
13. Dalla prova interlaboratorio del metodo realizzata dall’ISO (17) sono emersi 
i seguenti risultati, ottenuti applicando le condizioni raccomandate, ivi com ­
presa la concentrazione della sostanza in esame pari a 20 mg C/l.  
Sostanza chimica 
in esame Percentuale media di 
biodegradazione 
(28 giorni) Coefficiente di va ­
riazione 
(%) Numero di labora ­
tori 
Anilina 90 16 17 
1-ottanolo 85 12 14  
Con l’anilina, la variabilità interna della prova (riproducibilità) è risultata 
bassa, con coefficienti di variabilità non superiori a 5 % in quasi tutte le 
prove. Nei due casi con peggiore riproducibilità, la causa è probabilmente 
una produzione elevata di carbonio inorganico nei controlli. La riproducibi ­
lità con l’1-ottanolo ha dato risultati meno soddisfacenti, risultando comun ­
que inferiore al 10 % nel 79 % delle prove. Questa maggiore variabilità 
interna della prova potrebbe derivare da errori di dosaggio, dato che il 
volume di 1-ottanolo da iniettare nelle bottiglie era assai piccolo (3 to 4 μl). Si osservano coefficienti di variazione più alti quando si utilizzano 
concentrazioni più deboli della sostanza in esame, in particolare al di sotto 
di 10 mg C/l. Si può in parte ovviare a questo inconveniente riducendo la 
concentrazione del carbonio inorganico totale (TIC) nell’inoculo.
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14. Una prova interlaboratorio, organizzata dall’UE (24), di cinque tensioattivi a 
una concentrazione di 10 mg C/l ha dato i seguenti risultati:  
Sostanza chimica in esame Percentuale media di 
biodegradazione 
(28 giorni) Coefficiente di 
variazione 
(%) Numero di 
laboratori  
Tetrapropilenbenzene 
solfonato 17 45 10 
Di-isoottilsulfosucci ­
nato 
(anionico) 72 22 9 
Cloruro di esadecil-tri ­
metilammonio (*) 
(cationico) 75 13 10 
Isononilfenolo(etossil ­
lato)  9 
(non ionico) 41 32 10 
Cocoamidopropil 
dimetilidrossi 
sulfobetaina (anfotero) 60 23 11
 
(*) Il SiO  2 è stato aggiunto per neutralizzare la tossicità.  
Dai risultati si ricava che in generale la variabilità è maggiore per i tensio ­
attivi meno degradabili. La variabilità interna della prova è stata inferiore al 
15 % in più del 90 % dei casi, senza mai superare il 30-40 %.  
NB: La maggior parte dei tensioattivi non sono specie molecolari semplici 
bensì miscele di isomeri, omologhi ecc. che degradano dopo periodi di latenza diversi e a diverse velocità cinetiche, dando luogo a curve poco nette, attenuate, cosicché la soglia del 60 % rischia di non essere 
raggiunta nell’arco dei 10 giorni, anche se ogni singola specie mole ­
colare, se saggiata isolatamente, la raggiungerebbe. Questo fenomeno può essere osservato anche con altre miscele complesse.
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Apparecchiatura  
15. Normale attrezzatura da laboratorio e:  
a) bottiglie da siero, chiuse ermeticamente con tappi di butile e ghiere di 
alluminio. La capacità raccomandata è di 125 ml, ossia un volume totale 
di circa 160 ml (nel qual caso il volume noto di ciascuna bottiglia deve essere di 160 ± 1 ml). Si possono utilizzare bottiglie più piccole se i risultati soddisfano le condizioni di cui ai paragrafi 66 e 67;
 
b) analizzatore di carbonio o altro strumento (ad esempio, gascromatografo) 
per misurare il carbonio inorganico;  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1280
 
c) siringhe ad alta precisione per i campioni gassosi e liquidi;  
d) agitatore orbitale in ambiente termostatato;  
e) flusso d’aria priva di CO  2 — può esser preparata facendo passare un 
flusso d’aria attraverso granuli di calce sodata o impiegando una miscela gassosa costituita da 80 % di N
 2 e 20 % di 0  2 (facoltativo) (cfr. 
paragrafo 28);  
f) dispositivo di filtrazione su membrana con porosità da 0,20 a 0,45 μm 
(facoltativo);  
g) analizzatore di carbonio organico (facoltativo).  
Reagenti  
16. Impiegare sempre reagenti di grado analitico.  
Acqua  
17. Utilizzare acqua distillata o deionizzata con contenuto totale di carbonio 
organico ≤ 1 mg/l. Questo valore rappresenta una quantità ≤ 5 % del tenore 
iniziale di carbonio organico introdotto dalla dose raccomandata della so ­
stanza chimica in esame.  
Soluzioni madre per il mezzo a base di sali minerali  
18. Le soluzioni madre e il mezzo a base di sali minerali sono simili a quelli 
della norma ISO 14593 (16) e delle prove di «pronta biodegradabilità» 
descritte nel capitolo C.4 (20). Una concentrazione più alta di cloruro di 
ammonio (2,0 g/l invece di 0,5 g/l) è da usarsi solo in casi molto eccezio ­
nali, ad esempio quando la concentrazione della sostanza in esame eccede i 40 mg C/l. Le soluzioni madre devono essere conservate al freddo e per non 
più di sei mesi, o per meno tempo se si osserva una precipitazione o una 
proliferazione microbica. Preparare le soluzioni madre seguenti:
 
a) diidrogenofosfato di potassio (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
idrogenofosfato di potassio (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
sodio idrogenofosfato diidrato (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
cloruro d’ammonio (NH  4 Cl) 0,50 g  
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro. Questa soluzione deve avere un 
pH pari a 7,4 (± 0,2). Se così non fosse, preparare una nuova soluzione;  
b) cloruro di calcio diidrato (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro;  
c) solfato di magnesio eptaidrato (Mg  2 SO 4 .7H  2 0) 22,50 g  
Sciogliere in acqua e portare a 1 litro;  
d) cloruro di ferro (III) esaidrato (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Sciogliere in acqua portando a 1 litro e aggiungere una goccia di HCl 
concentrato.  
Preparazione del mezzo minerale  
19. Mescolare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua (paragrafo 17), 
aggiungere 1 ml delle soluzioni (b), (c) e (d) e portare a 1 litro con acqua 
(paragrafo 17).  
Altri reagenti  
20. Acido fosforico concentrato (H  3 PO 4 ) (> 85 % massa per volume).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1281
 
Soluzione di idrossido di sodio 7M  
21. Sciogliere 280 g di idrossido di sodio (NaOH) in 1 litro di acqua (paragrafo 
17). Determinare la concentrazione di DIC di questa soluzione e tenere conto di questo valore nel calcolo del risultato della prova (cfr. paragrafi 
55 e 61), in particolare alla luce del criterio di validità di cui al 
paragrafo 66, lettera b). Preparare una nuova soluzione se la concentrazione di DIC è troppo alta.
 
Sostanza chimica in esame  
22. Preparare una soluzione madre di una sostanza chimica sufficientemente 
solubile in acqua (paragrafo 17) oppure nel mezzo di prova (paragrafo 19), a una concentrazione di preferenza 100 volte superiore alla concentra ­
zione finale da utilizzarsi nella prova; può essere necessario aggiustare il pH 
della soluzione madre. La soluzione madre deve essere aggiunta al mezzo 
minerale in modo da ottenere una concentrazione finale di carbonio organico tra 2 e 40 mg C/l. di preferenza 20 mg C/l. Concentrazioni più basse rischiano di diminuire la precisione. Le sostanze liquide solubili e insolubili 
possono essere introdotte direttamente nei recipienti con siringhe ad alta 
precisione. Le sostanze chimiche poco solubili e insolubili possono richie ­
dere un trattamento speciale (25), da scegliere tra i seguenti:
 
a) aggiunta diretta delle aliquote pesate note;  
b) dispersione ultrasonica prima dell’aggiunta;  
c) dispersione con l’ausilio di agenti emulsionanti di cui occorre stabilire, 
prima dell’aggiunta, se esercitano un effetto inibitorio o stimolante 
sull’attività microbica;  
d) adsorbimento della sostanza in esame liquida, o di una soluzione della 
sostanza in esame in un solvente volatile adeguato, su un mezzo o un supporto inerte (ad esempio un filtro in fibra di vetro), seguito dall’eva ­
porazione del solvente, se utilizzato, e dall’aggiunta diretta delle aliquote 
note;
 
e) introduzione in un recipiente vuoto di un’aliquota nota di una soluzione 
della sostanza chimica in esame in un solvente facilmente volatile, se ­
guita da evaporazione del solvente.  
Occorre saggiare gli agenti o i solventi di cui alle lettere c), d) ed e) per 
verificare se hanno un effetto stimolante o inibitorio sull’attività microbica [cfr. paragrafo 42, lettera b)].
 
Sostanze chimiche di riferimento  
23. Preparare una soluzione madre della sostanza chimica di riferimento (solu ­
bile) in acqua (paragrafo 17), a una concentrazione di preferenza 100 volte superiore alla concentrazione finale (20 mg C/l) da utilizzarsi nella prova.
 
Verifica dell’inibizione  
24. Si osserva spesso che le sostanze chimiche in esame non si degradano in 
modo significativo nelle condizioni sperimentali stabilite nelle prove per valutare la pronta biodegradazione. Ciò potrebbe essere causato dal fatto che la sostanza in esame esercita un effetto inibitore sull’inoculo alla con ­
centrazione alla quale è saggiata. Il disegno sperimentale può prevedere una 
verifica dell’effetto inibitore, per facilitare l’individuazione (in retrospettiva) dell’inibizione come causa possibile o fattore concomitante, oppure, al con ­
trario, per dissipare questa ipotesi e mostrare che la degradazione debole o 
nulla è imputabile unicamente al fatto che i microrganismi non attaccano la 
sostanza nelle condizioni in cui è condotta la prova. Per ottenere informa ­
zioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i microrganismi (aerobici), preparare una soluzione nel mezzo di prova contenente la so ­
stanza in esame e la sostanza di riferimento (paragrafo 19), ciascuna alle 
stesse concentrazioni utilizzate nel mezzo di prova (cfr. paragrafi 22 e 23).
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1282
 
Inoculo  
25. L’inoculo può essere di varia origine: fanghi attivi, acqua di scarico (non 
clorata), acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi ele ­
menti (20). Occorre verificare l’attività di biodegradazione dell’origine uti ­
lizzando una sostanza chimica di riferimento. Indipendentemente dall’origi ­
ne, non utilizzare microrganismi che sono già stati esposti alla sostanza in esame se il procedimento è destinato a una prova per determinare la pronta biodegradabilità.
 
Attenzione: il fango attivo e l’acqua di scarico contengono organismi pa ­
togeni e devono essere manipolati con cautela.  
26. In base all’esperienza acquisita, il volume ottimale dell’inoculo è quello che 
soddisfa le seguenti condizioni:  
— è sufficiente a fornire un’adeguata attività di biodegradazione,  
— degrada la sostanza chimica di riferimento alla percentuale prestabilita 
(cfr. paragrafo 66),  
— fornisce da 10  2 a 10  5 unità formanti colonie per millilitro nella miscela 
finale,  
— dà luogo normalmente a una concentrazione di 4 mg/l di solidi sospesi 
nella miscela finale quando si usa fango attivo; possono essere impiegate concentrazioni fino a 30 mg/l, tenendo presente che rischiano di aumen ­
tare notevolmente la produzione di CO
 2 nei bianchi (26),  
— costituisce meno del 10 % della concentrazione iniziale di carbonio 
organico introdotto dalla sostanza chimica in esame,  
— equivale generalmente a un quantitativo compreso tra 1 ml e 10 ml di 
inoculo per litro di soluzione di prova.  
Fango attivo  
27. Raccogliere un campione di fango attivo fresco dal serbatoio di aerazione di 
un impianto di trattamento o da un’unità pilota di laboratorio per il tratta ­
mento delle acque di scarico che tratti prevalentemente liquami domestici. 
Se necessario, setacciarlo per rimuovere le particelle grossolane (con un setaccio a maglia da 1 mm
 2 ) e mantenerlo in condizioni aerobiche sino al 
momento dell’uso.  
28. In alternativa, far decantare o centrifugare (per esempio a 1 100 g per 10 
minuti) dopo la rimozione delle eventuali particelle grossolane. Scartare il 
surnatante. Il fango può essere lavato nella soluzione minerale. Sospendere il fango concentrato nel mezzo minerale per ottenere una concentrazione di 3- 5 g di solidi sospesi/l e aerare finché sia necessario.
 
29. Il fango deve essere prelevato da un impianto di trattamento convenzionale 
ben funzionante. Se il fango è stato prelevato da un impianto ad alta po ­
tenzialità o si ritiene contenga inibitori deve essere lavato. Decantare o 
centrifugare il fango risospeso dopo accurata miscelazione, scartare il sur ­
natante e risospendere il fango lavato in un volume ulteriore di mezzo minerale. Ripetere questa procedura fino a quando il fango può essere 
considerato esente da substrato e inibitori in eccesso.
 
30. Prelevare un campione di fango risospeso (a risospensione ultimata) oppure 
di fango non trattato appena prima di utilizzarlo per determinare il peso secco dei solidi sospesi.
 
31. Un’ulteriore alternativa è quella di omogeneizzare il fango attivo (3-5 g di 
solidi sospesi/l). Trattare il fango in un miscelatore Waring per due minuti a velocità media. Decantare il fango miscelato per 30 minuti, o più a lungo se 
necessario, e utilizzare il liquido sovrastante come inoculo nel rapporto di 10 
ml per litro di mezzo minerale.
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32. È possibile ottenere una riduzione ulteriore dello sviluppo di CO  2 nel bianco 
aerando il fango tutta una notte con aria priva di CO  2 . In questa prova la 
concentrazione dell’inoculo deve essere pari a 4 mg/l di solidi di fanghi attivi (13).
 
Effluenti secondari  
33. L’inoculo può provenire anche da un effluente secondario di un impianto di 
trattamento o da una unità pilota di laboratorio che riceve prevalentemente liquami domestici. Conservato in condizioni aerobiche, il campione può essere utilizzato il giorno del prelievo oppure può essere precondizionato, 
se necessario. Filtrare l’effluente con un filtro grossolano per rimuovere le 
parti solide più evidenti e misurarne il pH.
 
34. Per ridurre il tenore di carbonio inorganico del filtrato, lo si fa gorgogliare 
insufflandogli aria priva di CO  2 [paragrafo 15, lettera e)] per 1 ora, mante ­
nendo il pH a 6,5 con acido fosforico (paragrafo 20). Riportare il pH al 
valore di partenza con dell’idrossido di sodio (paragrafo 21) e, dopo decan ­
tazione di circa 1 ora, prelevare un volume appropriato di surnatante per l’inoculo. Questa procedura riduce il tenore di carbonio inorganico nell’ino ­
culo. Ad esempio, se si utilizza il volume massimo raccomandato di ef ­
fluente filtrato e gorgogliato (100 ml) per litro come inoculo, la quantità di 
carbonio inorganico nei bianchi è compresa tra 0,4 e 1,3 mg/l (14), il che rappresenta da 2 % a 6,5 % del carbonio della sostanza in esame, per una concentrazione di 20 mg C/l, e da 4 % a 13 %, per una concentrazione di 
10 mg C/l.
 
Acque superficiali  
35. Da un’acqua superficiale adeguata si preleva un campione che sarà conser ­
vato in condizioni aerobiche e impiegato il giorno stesso del prelievo. Se 
necessario, concentrare il campione filtrandolo o centrifugandolo. Il volume dell’inoculo da utilizzare in ogni recipiente di prova deve soddisfare i criteri di cui al paragrafo 26.
 
Terreno  
36. Prelevare un campione di terreno appropriato, a una profondità massima di 
20 cm sotto la superficie del terreno. Occorre asportare le pietre, i residui di 
piante e gli invertebrati prima di passare il campione attraverso un setaccio 
con maglia di 2 mm (se il campione è troppo umido da non poter essere setacciato immediatamente, farlo asciugare parzialmente all’aria). Va con ­
servato in condizioni aerobiche e impiegato il giorno stesso del prelievo (se 
il campione è trasportato in una busta di polietilene con la chiusura non 
ermetica può essere conservato a una temperatura compresa tra 2 °C e 4 °C nella busta stessa fino a un mese).
 
Precondizionamento dell’inoculo  
37. L’inoculo può essere precondizionato in base alle condizioni in cui si svol ­
gerà la prova, ma non può essere preadattato alla sostanza in esame. Il precondizionamento può diminuire lo sviluppo di CO
 2 nel bianco. Il pre ­
condizionamento consiste nell’aerare il fango attivo, dopo averlo diluito nel 
mezzo di prova a 30 mg/l, con aria umida priva di CO  2 per un periodo fino 
a 5-7 giorni alla temperatura in cui si svolgerà la prova.  
PROCEDURA SPERIMENTALE  
Numero di bottiglie  
38. Il numero delle bottiglie [paragrafo 15, lettera a)] necessarie per una prova 
dipenderà dalla frequenza delle analisi e dalla durata della prova.  
39. Si raccomanda di effettuare l’analisi in triplicato dopo un numero di inter ­
valli di tempo sufficiente per poter individuare la fase di crescita di 10 giorni. Alla fine della prova analizzare almeno altre cinque bottiglie speri ­
mentali [paragrafo 15, lettera a)] delle serie a), b) e c) (cfr. paragrafo 42), 
per poter calcolare gli intervalli di confidenza al 95 % per la percentuale 
media di biodegradazione.
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Mezzo inoculato  
40. L’inoculo è utilizzato a una concentrazione di 4 mg/l di solidi secchi di 
fango attivo. Preparare subito prima dell’uso una quantità sufficiente di mezzo inoculato aggiungendo, ad esempio, 2 ml di fango attivo opportuna ­
mente trattato (paragrafi da 27 a 32) con concentrazione di 2 000 mg/l a 1 
litro di mezzo salino (paragrafo 19). Se si impiega effluenti secondari, ag ­
giungere fino a 100 ml di effluenti (paragrafo 33) a 900 ml di mezzo salino (paragrafo 19) e portare a 1 litro con il mezzo.
 
Preparazione delle bottiglie  
41. Versare aliquote di mezzo inoculato nelle bottiglie di ciascuna replica in 
modo che il rapporto spazio di testa/liquido sia di 1:2 (ad esempio, intro ­
ducendo 107 ml in bottiglie dalla capacità di 160 ml). Si possono utilizzare altri rapporti, tenendo però conto dell’avvertenza di cui al paragrafo 11. Indipendentemente dal tipo di inoculo impiegato, occorre aver cura di me ­
scolare correttamente il mezzo inoculato affinché sia distribuito uniforme ­
mente nelle bottiglie.
 
42. Preparare delle serie di bottiglie [paragrafo 15, lettera a)] da destinare ai 
seguenti usi:  
f) recipienti per la prova (denominati F  T ) contenenti la sostanza chimica in 
esame;  
g) recipienti per la prova in bianco (denominati F  B ) contenenti solo il 
mezzo di prova e l’inoculo; vanno aggiunte anche tutte le sostanze chimiche, i solventi, gli agenti o i filtri di fibra di vetro usati per in ­
trodurre la sostanza in esame nei recipienti di prova;
 
h) recipienti (denominati F  C ) contenenti la sostanza chimica di riferimento 
per verificare la procedura;  
se necessario, recipienti (denominati F  I ) per verificare l’eventuale effetto 
inibitorio della sostanza chimica in esame, contenenti sia la sostanza in 
esame sia la sostanza di riferimento alle stesse concentrazioni (paragrafo 
24) delle bottiglie F  T e F C . 
j) recipienti (denominati F  S ) per verificare l’eventuale degradazione abioti ­
ca: si tratta di recipienti come in a) a cui si sono aggiunti 50 mg/l di 
HgCl  2 o che sono stati sterilizzati in altro modo (ad esempio, autoclave).  
43. Introdurre nelle bottiglie, sotto forma di soluzioni madre acquose (paragrafi 
22, 23 e 24), le sostanze chimiche solubili in esame e quelle di riferimento in modo da ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 20 mg C/l.
 
44. Le sostanze chimiche insolubili in esame e di riferimento possono essere 
introdotte nelle bottiglie in svariati modi [cfr. paragrafo 22, lettere da a) a 
e)], in funzione della natura della sostanza in esame, prima o dopo l’ag ­
giunta del mezzo inoculato, secondo il metodo di trattamento della sostanza in esame. Se si ricorre a uno dei procedimenti indicati nel paragrafo 22, 
lettere da a) a e), le bottiglie per il bianco F
 B [paragrafo 42, lettera b)] 
devono essere trattate allo stesso modo, salvo non contenere la sostanza in esame o quella di riferimento.
 
45. Iniettare con una microsiringa le sostanze chimiche in esame volatili nelle 
bottiglie ermeticamente chiuse (paragrafo 47). La dose è calcolata in base al 
volume iniettato e alla densità della sostanza in esame.  
46. Se necessario, aggiungere acqua nei recipienti affinché il volume di liquido 
sia identico in tutti i recipienti. Assicurarsi che il rapporto spazio di testa/ liquido (normalmente di 1:2) e la concentrazione della sostanza in esame 
siano tali da garantire la presenza di ossigeno nello spazio di testa in 
quantità sufficiente a permettere la biodegradazione completa.
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47. Chiudere ermeticamente tutte le bottiglie, ad esempio con tappi di butile e 
ghiere di alluminio. È in questa fase che vanno aggiunte le sostanze in 
esame volatili (paragrafo 45). Se si deve monitorare la diminuzione della concentrazione di DOC della soluzione sperimentale e analizzare al tempo zero la concentrazione iniziale di carbonio inorganico [controlli sterili, 
paragrafo 42, lettera e)] o altri parametri, prelevare un campione adeguato 
dal recipiente di prova. Eliminare successivamente il recipiente di prova e il suo contenuto.
 
48. Collocare le bottiglie ermeticamente chiuse in un agitatore orbitale [para ­
grafo 15, lettera d)], regolato a una velocità di rotazione sufficiente a man ­
tenere il contenuto delle bottiglie ben mescolato e in sospensione (ad esem ­
pio da 150 a 200 rpm), e incubarle al buio a temperatura costante di 20 °C 
(± 1 °C).  
Campionamento  
49. La strategia di campionamento dipende dal periodo di latenza e dalla velo ­
cità cinetica di biodegradazione della sostanza chimica in esame. Le bottiglie sono analizzate ed eliminate il giorno stesso del campionamento, che deve avvenire almeno a cadenza settimanale o più di frequente (ad esempio, due 
volte la settimana) se si deve definire una curva completa di degradazione. 
Ritirare dall’agitatore il numero necessario di repliche di ogni categoria: F
 T , 
F B e F C e, se del caso, F  I e F S (cfr. paragrafo 42). La prova dura normal ­
mente 28 giorni. Se la curva di biodegradazione indica il raggiungimento di 
un plateau prima di questo termine, la prova può essere conclusa prima di 
28 giorni. Prelevare dei campioni dalle cinque bottiglie destinate ad essere analizzate il 28° giorno della prova e utilizzare i risultati per calcolare gli intervalli di confidenza o il coefficiente di variazione della percentuale di 
biodegradazione. Le bottiglie destinate a verificare l’inibizione e la degra ­
dazione abiotica non devono essere campionate con la stessa frequenza delle altre: basteranno due prelievi, effettuati il 1
 o e il 28° giorno della prova.  
Analisi del carbonio inorganico (IC)  
50. La produzione di CO  2 nelle bottiglie è determinata misurando l’aumento 
della concentrazione di carbonio inorganico durante l’incubazione. Si racco ­
mandano due metodi, descritti di seguito, per misurare la quantità di carbo ­
nio inorganico prodotta durante la prova. Poiché possono dare risultati leg ­
germente diversi, nella stessa serie di prove si deve impiegare o l’uno o l’altro metodo.
 
51. Il metodo (a) è consigliato se si ritiene che il mezzo contenga residui, ad 
esempio di filtri in fibra di vetro e/o della sostanza in esame insolubile. Se 
non si dispone di un analizzatore di carbonio, l’analisi può essere eseguita 
con un gascromatografo. Durante l’analisi del gas nello spazio di testa è importante mantenere le bottiglie alla temperatura in cui è stata condotta la prova, o quantomeno prossime alla stessa. Il metodo (b) può essere di più 
facile applicazione per i laboratori che impiegano analizzatori di carbonio 
per misurare il carbonio inorganico. È importante che la soluzione di idros ­
sido di sodio (paragrafo 21) utilizzata per convertire il CO
 2 in carbonato sia 
preparata ex novo oppure che sia noto il suo tenore di carbonio inorganico, 
in modo da poter tenere conto di questo valore al momento di calcolare i 
risultati della prova [cfr. paragrafo 66, lettera b)].  
Metodo (a): acidificazione a pH < 3  
52. Prima di ogni lotto di analisi, l’analizzatore di carbonio inorganico è tarato 
con una sostanza dal tenore standard di carbonio inorganico (ad esempio 
una diluizione 1 % p/p di CO  2 in N  2 ). Iniettare l’acido fosforico concentrato 
(paragrafo 20) nel tappo di ogni bottiglia campionata per abbassare il pH del mezzo a un valore < 3 (ad esempio, aggiungendo 1 ml a 107 ml di mezzo di 
prova). Rimettere le bottiglie nell’agitatore. Dopo averle agitate per un’ora 
alla temperatura in cui è stata condotta la prova, togliere le bottiglie dall’agi ­
tatore, prelevare dallo spazio di testa di ciascuna bottiglia delle aliquote di gas (ad esempio, 1 ml) e iniettarle nell’analizzatore di carbonio inorganico. 
Annotare le concentrazioni di carbonio inorganico misurate esprimendole in 
mg C/l.
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53. Questo metodo verte sul principio secondo il quale dopo l’acidificazione a 
pH < 3 e l’equilibrazione a 20 °C, la costante di equilibrio per la riparti ­
zione del CO  2 tra la fase liquida e la fase gassosa nelle bottiglie è pari a 1,0 
se misurata sotto forma di concentrazione (13). Tale rapporto deve essere dimostrato almeno una volta per il sistema sperimentale, nel seguente modo:
 
allestire delle bottiglie contenenti 5 e 10 mg/l di carbonio inorganico utiliz ­
zando una soluzione di carbonato di sodio (Na  2 CO 3 ) in acqua priva di CO  2 
preparata acidificando l’acqua a pH 6,5 con acido fosforico (paragrafo 20), 
facendola gorgorgliare per una notte immettendo aria priva di CO  2 e por­
tando il pH alla neutralità con alcali. Assicurarsi che il rapporto volumico tra lo spazio di testa e il liquido sia lo stesso delle prove (ad esempio 1:2). Acidificare ed equilibrare come indicato nel paragrafo 52 e misurare le 
concentrazioni di carbonio inorganico nello spazio di testa e nella fase 
liquida. Verificare che le due concentrazioni siano le stesse, nei limiti dell’errore sperimentale. Se non lo sono, riesaminare il procedimento. Non è necessario verificare la ripartizione del carbonio inorganico tra la fase 
liquida e quella gassosa ad ogni prova, limitandosi a farlo, ad esempio, 
durante la taratura.
 
54. Se occorre misurare l’eliminazione del DOC (unicamente per sostanze idro ­
solubili), prelevare campioni della fase liquida da bottiglie separate (non acidificate), filtrarli su membrana e iniettarli nell’analizzatore di carbonio organico disciolto. Queste bottiglie possono servire eventualmente per altre 
analisi, al fine di misurare la biodegradazione primaria.
 
Metodo (b): conversione del CO  2 in carbonato  
55. Prima di ogni lotto di analisi, tarare l’analizzatore di carbonio inorganico 
mediante uno standard adeguato, ad esempio una soluzione di bicarbonato di 
sodio (NaHCO  3 ) in acqua priva di CO  2 (cfr. paragrafo 53) a una concen ­
trazione di carbonio inorganico compresa tra 0 e 20 mg per litro. Iniettare una soluzione di idrossido di sodio (7M, paragrafo 21) (ad esempio, aggiun ­
gendo 1 ml a 107 ml di mezzo di prova) nel tappo di ogni bottiglia cam ­
pionata e agitare le bottiglie per un’ora alla temperatura stabilita per la 
prova. Utilizzare la stessa soluzione di NaOH in tutte le bottiglie analizzate lo stesso giorno, ma non necessariamente in tutte le sessioni di campiona ­
mento effettuate nel corso della prova. Se occorre rilevare i valori assoluti 
del tenore di carbonio inorganico nei bianchi in tutte le sessioni di campio ­
namento, si dovrà determinare il tenore di carbonio inorganico della solu ­
zione di NaOH ogniqualvolta la si utilizza. Togliere le bottiglie dall’agita ­
tore e farle decantare. Prelevare con un siringa da ogni bottiglia un idoneo 
volume della fase liquida (ad esempio, da 50 a 1 000 μl), iniettare i cam ­
pioni nell’analizzatore di carbonio inorganico e prendere nota delle concen ­
trazioni di carbonio inorganico. Assicurarsi che l’analizzatore utilizzato sia predisposto a trattare i campioni alcalini ottenuti con questo metodo.
 
56. Questo metodo verte sul principio secondo il quale dopo l’aggiunta di alcali 
e l’agitazione, la concentrazione di carbonio inorganico nello spazio di testa 
è trascurabile. Ciò deve essere verificato almeno una volta nel sistema 
sperimentale: a tal fine utilizzare gli standard di carbonio inorganico, ag ­
giungere alcali e equilibrare, per poi misurare la concentrazione di carbonio inorganico sia nello spazio di testa che nella fase liquida (cfr. paragrafo 53). 
La concentrazione nello spazio di testa deve essere praticamente nulla. Non 
è necessario verificare l’assorbimento pressoché completo di CO
 2 ad ogni 
prova.  
57. Se occorre misurare l’eliminazione del DOC (unicamente per sostanze in 
esame idrosolubili), prelevare campioni della fase liquida da bottiglie sepa ­
rate (non contenenti alcali aggiunti), filtrarli su membrana e iniettarli nell’analizzatore di carbonio organico disciolto. Queste bottiglie possono 
servire eventualmente per altre analisi, al fine di misurare la biodegradazione 
primaria.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1287
 
DATI E RELAZIONE  
Calcolo dei risultati  
58. Supponendo che la sostanza in esame sia stata mineralizzata al 100 % in 
CO 2 , la produzione massima teorica di carbonio inorganico (ThIC) delle 
bottiglie di prova in eccesso rispetto ai bianchi è uguale al carbonio orga ­
nico totale (TOC) aggiunto ad ogni bottiglia all’inizio del saggio, ossia:  
ThIC ¼ TOC  
La massa totale (mg) di carbonio inorganico (TIC) in ogni bottiglia è: 
TIC ¼ ðmg di C nel liquido  þ mg di C nello spazio di testa Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ equazione [1]  
dove:  
V L = volume di liquido nella bottiglia (litro);  
CL = concentrazione di carbonio inorganico nel liquido (mg/l, espressa in 
carbonio);  
VT = volume dello spazio di testa (litro);  
CT = concentrazione di carbonio inorganico nello spazio di testa (mg/l, 
espressa in carbonio).  
I calcoli del TIC per i due metodi d’analisi utilizzati per misurare il carbonio 
inorganico nella presente prova sono descritti di seguito nei paragrafi 60 e 61. La percentuale di biodegradazione ( % D ) in entrambi i casi è data dalla 
seguente equazione: 
%D ¼
 ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 equazione [2]  
dove:  
TIC  t = mg di TIC nella bottiglia di prova al tempo t;  
TIC  b = media dei mg di TIC nelle bottiglie dei bianchi al tempo t;  
TOC = mg di TOC aggiunti inizialmente alla bottiglia di prova.  
La percentuale di biodegradazione (% D) è calcolata per le bottiglie di prova 
(F T ), quelle di riferimento (F  C ) e, se del caso, quelle destinate alla verifica di 
un’eventuale effetto inibitore (F  I ), in base alle quantità rispettive di TIC 
prodotte fino al momento di ogni campionamento.  
59. Se si osserva un aumento significativo del tenore di TIC nei controlli sterili 
(F S ) durante il periodo di esecuzione della prova, si può giungere alla 
conclusione che si è verificata una degradazione abiotica della sostanza in 
esame di cui occorre tener conto nel calcolo di D nell’equazione [2].  
Acidificazione a pH < 3  
60. Una volta che l’acidificazione a pH < 3 e il successivo equilibrio hanno dato 
luogo a un’uniformazione della concentrazione di TIC nella fase liquida e in quella gassosa, basta misurare solo la concentrazione di carbonio inorganico della fase gassosa. Pertanto, in base all’equazione [1]
 
TIC ¼ ðV L þ V T Þ Ü C T ¼ V B Ü C T , dove V  B = volume della bottiglia da 
siero.  
Conversione del CO  2 in carbonato  
61. In questo metodo i calcoli sono effettuati in base all’equazione [1], ma senza 
tenere conto della quantità trascurabile di carbonio inorganico nella fase 
gassosa, in modo che  V T Ü C T ¼ 0 e TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1288
 
Espressione dei risultati  
62. Tracciare la curva della biodegradazione in un grafico in cui è rappresentata 
la percentuale di biodegradazione (D) in funzione del tempo di incubazione, indicando, se possibile, le fasi di latenza, biodegradazione, crescita di 10 
giorni e plateau, ossia la fase in cui è stata raggiunta la degradazione mas ­
sima e la curva presenta un andamento orizzontale. Se per le bottiglie di prova F
 T saggiate in parallelo si sono ottenuti risultati paragonabili (diffe ­
renza < 20 %), tracciare la curva media (cfr. appendice 2, fig. 1), altrimenti 
tracciare una curva per ciascuna bottiglia. Determinare il valore medio della 
percentuale di biodegradazione nella fase di plateau oppure valutarne il valore massimo (ad esempio, quando la curva scende nella fase di plateau), 
ma, in quest’ultimo caso, è importante verificare che non sia un valore 
anomalo ( outlier ). Questo livello massimo di biodegradazione va indicato 
nella relazione sulla prova come «grado di biodegradazione della sostanza in esame». Se il numero delle bottiglie di prova si è rivelato insufficiente ad 
indicare una fase di plateau, calcolare un valore medio utilizzando i dati 
misurati dell’ultimo giorno della prova. Quest’ultimo valore, la media di cinque repliche, serve a indicare la precisione con cui è stata determinata la percentuale di biodegradazione. Nella relazione deve anche figurare il 
valore ottenuto alla fine della fase di crescita di 10 giorni.
 
63. Tracciare, allo stesso modo, una curva per la sostanza chimica di riferimento 
F C e, eventualmente, per la verifica della degradazione abiotica F  S e per il 
controllo dell’inibizione F  I . 
64. Registrare la quantità di TIC sia dei controlli in bianco (F  B ) sia delle 
bottiglie F  S (verifica abiotica), se queste ultime sono incluse nella prova.  
65. Calcolare D per le bottiglie F  I in base al rendimento teorico di carbonio 
inorganico previsto unicamente in base al componente di riferimento della 
miscela. Se al 28° giorno [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, si può 
presumere che la sostanza in esame abbia inibito l’attività dell’inoculo, il che può spiegare i bassi valori di D
 FT ottenuti alle condizioni della prova. In 
tal caso, la prova può essere ripetuta con una concentrazione sperimentale 
inferiore e riducendo di preferenza il DIC nell’inoculo e il TIC formato nei controlli in bianco, dal momento che una diminuzione della concentrazione della sostanza in esame comporta anche una minore precisione del metodo. 
In alternativa si può utilizzare un altro inoculo. Se nella bottiglia F
 S (de­
gradazione abiotica) si osserva un aumento significativo (> 10 %) della quantità di TIC, è possibile che siano avvenuti processi di degradazione abiotica.
 
Validità dei risultati  
66. La prova è considerata valida se:  
a) la percentuale media di degradazione nelle bottiglie F  C contenenti la 
sostanza di riferimento è > 60 % al 14° giorno di incubazione; e  
b) la quantità media di TIC nei controlli in bianco F  B alla fine della prova è 
> 3 mg C/l.  
Se questi valori limite non sono raggiunti, occorre ripetere la prova con un 
inoculo di provenienza diversa e/o rivedere i procedimenti seguiti. Ad esem ­
pio, se nel bianco si registra una produzione elevata di carbonio inorganico, è opportuno seguire il procedimento di cui ai paragrafi da 27 a 32.
 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1289  
( 1 ) La percentuale di degradazione nelle bottiglie F  C contenenti la sostanza di riferimento. 
( 2 ) La percentuale di degradazione nelle bottiglie F  I
 67. Se la sostanza chimica in esame non produce il 60 % di ThIC e ha dimo ­
strato di non esercitare alcun effetto inibitore (paragrafo 65), la prova può 
essere ripetuta aumentando la concentrazione di inoculo (fino a 30 mg/l di fango attivo e 100 ml di effluente/l), oppure con inoculi di altra provenien ­
za, in particolare se la degradazione è stata di un valore compreso tra 20 % 
e 60 %.
 
Interpretazione dei risultati  
68. Se la sostanza chimica in esame subisce una biodegradazione > 60 % della 
ThIC nella fase di crescita di 10 giorni nella presente prova significa che è prontamente biodegradabile in condizioni aerobiche.
 
69. Se il valore-soglia di 60 % della ThIC non è raggiunto, misurare il pH del 
mezzo contenuto nelle bottiglie che non sono state acidificate o alcalinizza ­
te; un valore inferiore a 6,5 potrebbe indicare un’avvenuta nitrificazione. In 
tal caso, ripetere la prova con una soluzione tampone più concentrata.  
Relazione sulla prova  
70. Disegnare un grafico della percentuale di degradazione (% D) rilevata in 
ogni bottiglia di prova (F  T ), di riferimento (F  C ) e, se prevista, di verifica 
dell’inibizione (F  I ) per ciascun giorno di campionamento. Se le repliche 
danno risultati paragonabili, tracciare la curva della percentuale di degrada ­
zione media in funzione del tempo. Annotare la quantità di TIC nei bianchi (F
 B ) e nei controlli sterili (F  S ), come pure il DOC e/o altri parametri, 
insieme alla loro percentuale di eliminazione.  
71. Determinare il valore medio della percentuale di biodegradazione nella fase 
di plateau, oppure utilizzare il valore massimo se la curva di biodegrada ­
zione scende nella fase di plateau, e indicare questo valore come «grado di 
biodegradazione della sostanza in esame». È importante garantire che, 
nell’ultimo caso, non si tratti di un valore anomalo ( outlier ). 
72. La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti.  
Sostanza chimica in esame:  
— nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale e pro ­
prietà fisico-chimiche pertinenti,  
— purezza (presenza di impurità).  
Condizioni sperimentali:  
— riferimento al presente metodo di prova,  
— descrizione del sistema sperimentale utilizzato (ad esempio, volume della 
bottiglia, rapporto spazio di testa/liquido, metodo di agitazione ecc.),  
— applicazione della sostanza in esame e della sostanza di riferimento nel 
sistema sperimentale; concentrazione applicata e quantità di carbonio introdotta in ciascuna bottiglia di prova, nonché l’eventuale uso di sol ­
venti,
 
— ragguagli sull’inoculo utilizzato, sull’eventuale pretrattamento e precon ­
dizionamento,  
— temperatura di incubazione,  
— validazione del principio dell’analisi del carbonio inorganico,  
— caratteristiche principali dell’analizzatore di carbonio inorganico (e di 
ogni altro metodo d’analisi eventualmente impiegato),  
— numero di repliche.  
Risultati:  
— dati grezzi e valori calcolati della biodegradabilità presentati su tabella,  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1290
 
— grafico della percentuale di degradazione in funzione del tempo per la 
sostanza in esame e quella di riferimento, fase di latenza, fase di degra ­
dazione, fase di crescita di 10 giorni e inclinazione,  
— percentuale di eliminazione nella fase di plateau, all’inizio e alla fine 
della prova e dopo la fase di crescita di 10 giorni,  
— giustificazione in caso dell’eventuale rigetto dei risultati della prova,  
— qualsiasi altro elemento inerente alla procedura seguita,  
— discussione dei risultati.  
BIBLIOGRAFIA  
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biodegradabilità — Saggio di sviluppo del CO  2 (Metodo C.4-C).  
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3235.
 
(20) Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della «pronta» ( ready ) 
biodegradabilità.  
(21) OCSE (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. 
Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
(22) Capitolo C.11 del presente allegato, Fanghi attivi: saggio di inibizione della 
respirazione.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Cen ­
tre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and tre ­
atment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent eva ­
luation of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1292
 
Appendice 1  
ABBREVIAZIONI E DEFINIZIONI  
IC: carbonio inorganico.  
ThCO  2 : produzione teorica di biossido di carbonio (mg), ossia la quantità di 
biossido di carbonio prodotto calcolato in base al tenore di carbonio noto o misurato della sostanza in esame quando sia stata completamente mineralizzata; 
espressa anche come mg di biossido di carbonio sviluppati per mg di sostanza in 
esame.
 
DOC:  carbonio organico disciolto, ossia il carbonio organico presente in solu ­
zione, che passa attraverso un filtro da 0,45 micrometri o che rimane nel surna ­
tante dopo centrifugazione a ± 4 000 g (40 000 m/s  -2 ) per 15 minuti.  
DIC:  carbonio organico disciolto.  
ThIC:  produzione teorica di carbonio inorganico.  
TIC:  carbonio inorganico totale.  
Prontamente biodegradabile:  classificazione arbitraria delle sostanze chimiche 
che hanno superato certe prove specifiche di selezione riguardo alla biodegrada ­
bilità ultima; data la rigorosità di queste prove, si suppone che tali composti 
si degradino biologicamente in modo rapido e completo in ambienti acquosi in 
condizioni aerobiche.  
Fase di crescita di 10 giorni:  i 10 giorni che seguono immediatamente il 
momento in cui la percentuale di degradazione raggiunge il 10 %.  
Biodegradabilità intrinseca:  classificazione delle sostanze chimiche per le quali 
vi è una dimostrazione inequivocabile di biodegradazione (primaria o completa) 
in qualsiasi prova di biodegradabilità.  
Biodegradazione aerobica completa:  livello di degradazione raggiunto quando 
la sostanza in esame è completamente utilizzata da microorganismi, con la con ­
seguente produzione di biossido di carbonio, acqua, sali minerali e nuovi costi ­
tuenti cellulari microbici (biomassa).  
Mineralizzazione:  completa degradazione di un composto organico in CO  2 e 
H 2 O in condizioni aerobiche, e in CH  4 , CO  2 e H  2 O in condizioni anaerobiche.  
Fase di latenza:  periodo che intercorre tra l’inizio della prova e il momento in 
cui i microrganismi responsabili della degradazione si sono acclimatati e/o adat ­
tati e il livello di degradazione della sostanza chimica o della materia organica ha 
raggiunto un limite rilevabile (per esempio 10 % della biodegradazione teorica massima, o meno, in funzione dell’accuratezza della tecnica di misura).
 
Fase di degradazione:  periodo che intercorre tra la fine della fase di latenza e il 
momento in cui è raggiunto il 90 % del livello massimo di degradazione.  
Fase di plateau:  fase in cui è stata raggiunta la degradazione massima e la curva 
di biodegradazione presenta un andamento orizzontale.  
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1293
 
Appendice 2  
Esempio di curva di biodegradazione  
Figura 1  
Biodegradazione di 1-ottanolo nella prova del CO  2 nello spazio di testa
  
Legenda  
Biodegradazione  
Fase di degradazione  
Livello massimo di biodegradazione  
Fase di plateau  
Fase di crescita di 10 giorni  
Tempo di prova (giorni)  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1294
 
C.30.  BIOACCUMULO NEGLI OLIGOCHETI TERRESTRI  
INTRODUZIONE  
1. Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 317 
(2010). Tra i metodi di prova relativi al destino ambientale, quelli intitolati  
Bioconcentrazione: saggio sui pesci, metodo a flusso continuo  (capitolo 
C.13 del presente allegato) (49) e  Bioaccumulation in Sediment-dwelling 
Benthic Oligochates  (53) sono stati pubblicati, rispettivamente, nel 1996 e 
nel 2008. È difficile, se non impossibile, estrapolare i dati sul bioaccumulo 
in ambiente acquatico e applicarli a organismi terrestri come i lombrichi. Per 
valutare il bioaccumulo delle sostanze chimiche nel suolo attualmente si utilizzano modelli calcolati basandosi sulla lipofilia della sostanza in esame (14) e (37), come nel documento tecnico di orientamento dell’UE (19). 
L’esigenza di un metodo di prova specifico per questo compartimento è 
già stata sollevata (55), in particolare data l’importanza di poter valutare l’avvelenamento secondario nelle catene alimentari terrestri (4). Esistono vari metodi di prova nazionali che vertono sul bioaccumulo in organismi 
diversi dai pesci, ad esempio (2) e (72). Un metodo di misurazione del 
bioaccumulo da suoli contaminati nei lombrichi ( Eisenia fetida , Savigny) 
e negli enchitreidi è stato messo a punto dall’American Society for Testing and Materials (3). Un metodo di prova riconosciuto a livello internazionale 
per la determinazione del bioaccumulo in un suolo addizionato consentirà di 
valutare meglio i rischi posti dalle sostanze chimiche per gli ecosistemi terrestri, ad esempio (25) e (29).
 
2. Gli invertebrati detritivori sono esposti alle sostanze chimiche presenti nel 
suolo. Tra questi animali, gli oligocheti terrestri svolgono un ruolo impor ­
tante nella struttura e nella funzione del suolo (15) (20). Gli oligocheti 
terrestri vivono nel suolo e in parte sulla sua superficie (in special modo nella lettiera) e costituiscono spesso la specie più abbondante in termini di biomassa (54). Per la loro azione di bioturbazione e a causa della loro 
funzione di prede, questi animali possono avere un’influenza determinante 
sulla biodisponibilità delle sostanze chimiche per altri organismi, come i predatori invertebrati [tra cui acari e coleotteri (64)] e invertebrati (quali volpi e gabbiani) (18) e (62). Alcune specie di oligocheti terrestri attual ­
mente impiegate nelle prove ecotossicologiche sono descritte 
nell’appendice 5.
 
3. Una fonte di informazioni essenziali che sono servite per l’elaborazione del 
presente metodo di prova sul bioaccumulo è il manuale dell’ASTM per le prove di laboratorio dedicate alla tossicità del suolo e al bioaccumulo con ­
dotte su lombrichi  Eisenia fetida  ed enchitreidi  Enchytraeus albidus  (3). Tra 
gli altri riferimenti utilizzati figurano il capitolo C.13 Bioconcentrazione: 
saggio sui pesci, metodo a flusso continuo (49) e la linea guida dell’OCSE n. 315  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochate  (53). Fonti 
di ispirazione altrettanto importanti sono state le esperienze pratiche tratte 
dagli studi e da diverse pubblicazioni sul bioaccumulo nel suolo, tra cui (1) 
(5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79).
 
4. Il presente metodo di prova è per lo più applicabile a sostanze chimiche 
organiche neutre stabili, che hanno tendenza ad essere adsorbite sul suolo. Esso consente anche di valutare il bioaccumulo di composti organometallici 
stabili, associati al suolo. Si applica inoltre ai metalli e ad altri oligoelementi.
 
PREREQUISITI  
5. Le prove volte a misurare il bioaccumulo di una sostanza chimica negli 
oligocheti terrestri sono state eseguite con metalli pesanti [cfr. in particolare 
(63)] e sostanze organiche persistenti il cui log K  ow si situa tra 3,0 e 6,0 
(40). Queste prove si applicano anche a:  
— sostanze chimiche con un log K  ow superiore a 6,0 (sostanze superidro ­
fobe),  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1295
 
— sostanze appartenenti alla classe di sostanze organiche note per il loro 
potenziale di bioaccumulo negli organismi viventi, ad esempio le so ­
stanze fortemente adsorbenti o tensioattive,  
— sostanze che, per le loro caratteristiche strutturali, presentano un poten ­
ziale di bioaccumulo, ad esempio analoghi di sostanze chimiche con 
potenziale di bioaccumulo noto, e  
— metalli.  
6. Prima di iniziare lo studio occorre disporre di talune informazioni sulla 
sostanza chimica in esame, quali nome comune, nome chimico (di prefe ­
renza il nome IUPAC), formula strutturale, numero CAS, purezza, precau ­
zioni, condizioni di conservazione adeguate e metodi di analisi. È inoltre opportuno conoscerne le seguenti proprietà:
 
a) idrosolubilità;  
b) coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua K  ow ; 
c) coefficiente di ripartizione terreno-acqua, K  oc ; 
d) tensione di vapore;  
e) degradabilità (nel suolo o nell’acqua);  
f) metaboliti noti.  
7. È possibile utilizzare sostanze radiomarcate e no, sebbene, per facilitare 
l’analisi, si raccomanda di utilizzare una sostanza radiomarcata. Questa de ­
cisione dipenderà dai limiti di rivelazione o dalla necessità di misurare il 
composto progenitore e i suoi metaboliti. Se si impiega una sostanza radio ­
marcata e si misurano i residui radioattivi totali, è importante che i residui radiomarcati sia nel suolo sia negli organismi sperimentali siano caratteriz ­
zati in percentuali del composto progenitore e di quello marcato non pro ­
genitore, ad esempio in campioni prelevati allo stato stazionario o alla fine della fase di assorbimento, per poter calcolare il fattore di bioaccumulo (BAF) per il composto progenitore e i metaboliti del suolo 
pertinenti (cfr. paragrafo 50). Può essere necessario modificare il metodo 
qui descritto, ad esempio per disporre di una biomassa sufficiente a misurare le sostanze in esame organiche non radiomarcate o i metalli. Se si misurano i residui radioattivi totali (per esempio per conteggio in scintillazione liquida 
dopo estrazione, per combustione o per solubilizzazione dei tessuti), il fat ­
tore di bioaccumulo risulta basato sul composto progenitore e sui metaboliti. È preferibile calcolare il BAF in base alla concentrazione del composto progenitore negli organismi e nei residui radioattivi totali. In seguito il 
fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF), normalizzato per il tenore 
lipidico dei lombrichi e il tenore di carbonio organico (OC), è calcolato a partire dal BAF per garantire la comparabilità dei risultati di diverse prove di bioaccumulo.
 
8. Occorre conoscere la tossicità della sostanza in esame per le specie utilizzate 
nella prova, in particolare la concentrazione con effetto (EC  X ) o la concen ­
trazione letale (CL  X ) per la durata della fase di assorbimento [ad esempio 
(19)]. La concentrazione scelta per la sostanza in esame deve essere prefe ­
ribilmente circa l’1 % della sua CL  50 acuta asintotica e almeno dieci volte 
superiore del suo limite di rivelabilità nel suolo con il metodo d’analisi utilizzato. Si devono privilegiare, se disponibili, i valori di tossicità ricavati da studi a lungo termine sugli endpoint subletali (51) (52). Se questi dati 
non sono disponibili, una prova di tossicità acuta apporterà informazioni 
utili [cfr. ad esempio, (23)].
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9. Per la quantificazione della sostanza in esame nelle soluzioni di prova, nel 
suolo e nel materiale biologico, oltre ai dettagli relativi alla preparazione e 
alla conservazione del campione e alle schede dati sulla sicurezza, è neces ­
sario disporre di un metodo analitico appropriato, di accuratezza, precisione e sensibilità note. Devono essere noti anche i limiti di rivelazione analitica 
nel suolo e nei tessuti del lombrico della sostanza in esame. Quando per la 
prova si utilizza una sostanza marcata con
 14 C è necessario conoscere la 
percentuale di radioattività associata alle impurità. La radioattività specifica della sostanza in esame deve essere abbastanza elevata da facilitare l’analisi, 
e le concentrazioni sperimentali utilizzate non devono provocare effetti tos ­
sici.
 
10. La prova può essere realizzata con un terreno artificiale o naturale. Prima 
dell’inizio della prova è opportuno conoscere le caratteristiche del terreno 
naturale utilizzato, ad esempio l’origine o i componenti, il pH, il tenore di carbonio organico, la distribuzione granulometrica (percentuale di sabbia, limo e argilla), e la capacità idrica (WHC) (3) (48).
 
PRINCIPIO DEL METODO  
11. I parametri che caratterizzano il bioaccumulo di una sostanza chimica in 
esame consistono nel fattore di bioaccumulo (BAF), la costante di velocità di assorbimento (k
 s ) e la costante di velocità di eliminazione (k  e ). Le defi ­
nizioni di questi parametri figurano nell’appendice 1.  
12. La prova consta di due fasi: la fase di assorbimento (esposizione) e la fase 
di eliminazione (post-esposizione). Durante la fase di assorbimento varie 
repliche di gruppi di lombrichi vengono esposte al terreno a cui è stata addizionata la sostanza in esame. Oltre agli animali sperimentali, gruppi di lombrichi di controllo sono mantenuti in condizioni identiche senza la 
sostanza in esame. Si misura il peso secco e il contenuto di lipidi degli 
organismi sperimentali, utilizzando eventualmente i lombrichi del gruppo di controllo. I valori di fondo (bianco) possono essere ottenuti analizzando campioni di lombrichi e del terreno di controllo. Per la fase di eliminazione i 
lombrichi sono trasferiti in un terreno privo della sostanza in esame. A meno 
che l’assorbimento della sostanza in esame durante la fase di esposizione sia stato insignificante, la fase di eliminazione è sempre necessaria, perché è in questa fase che si raccolgono le informazioni sulla velocità alla quale la 
sostanza in esame è escreta dagli organismi sperimentali [ad esempio (27)]. 
Se uno stato stazionario non è stato raggiunto nella fase di assorbimento, è preferibile determinare i parametri cinetici — fattore di bioaccumulo cine ­
tico (BAF
 K ), costanti di velocità di assorbimento ed eliminazione — basan ­
dosi sull’adattamento simultaneo dei risultati delle fasi di assorbimento ed 
eliminazione. La concentrazione della sostanza in esame nei/sui lombrichi è monitorata per l’intera durata delle due fasi della prova.
 
13. Durante la fase di assorbimento, le misurazioni sono effettuate in periodi di 
campionamento la cui durata massima è di 14 giorni per gli enchitreidi e 21 giorni per i lombrichi, fino a quando non venga raggiunto lo stato stazio ­
nario (11) (12) (67). Lo stato stazionario è raggiunto quando, nel tracciato 
della concentrazione negli organismi sperimentali in funzione del tempo, la curva diviene parallela all’asse del tempo e da tre analisi successive della concentrazione su campioni prelevati a intervalli di almeno due giorni si 
ottengono valori che non divergono tra loro più del ± 20 % sulla base di 
raffronti statistici (ad esempio, analisi della varianza, analisi di regressione).
 
14. La fase di eliminazione consiste nel trasferire gli organismi sperimentali in 
recipienti che contengono lo stesso substrato ma senza la sostanza in esame. 
In questa fase le misurazioni sono effettuate in periodi di campionamento la cui durata massima è di 14 giorni per gli enchitreidi e 21 giorni per i lombrichi, a meno che un’analisi effettuata prima di questi termini non 
mostri una diminuzione del 90 % dei residui della sostanza in esame negli 
organismi sperimentali. La concentrazione della sostanza in esame negli
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organismi alla fine della fase di eliminazione è riportata nella relazione 
come residui non eliminati. Il fattore di bioaccumulo allo stato stazionario 
(BAF  SS ) è calcolato di preferenza sia come il rapporto tra la concentrazione 
negli organismi (Ca) e nel suolo (Cs) ad uno stato stazionario apparente, sia come fattore di bioaccumulo cinetico (BAF
 K ), ossia come il rapporto tra la 
costante di velocità d’assorbimento dal suolo (ks) e la costante di velocità di 
eliminazione (ke) (cfr. definizioni nell’appendice 1) presupponendo una cinetica di primo ordine (cfr. calcoli nell’appendice 2). Se la cinetica di primo ordine non è manifestamente applicabile è opportuno ricorrere ad 
altri modelli.
 
15. La costante di velocità di assorbimento, la costante di velocità di elimina ­
zione (o le costanti, se si utilizzano altri modelli), il fattore di bioaccumulo 
cinetico (BAF  K ) e, se possibile, gli intervalli di confidenza di ciascuno di 
questi parametri sono calcolati a partire dalle equazioni dei modelli con l’ausilio di programmi informatici (cfr. appendice 2). La bontà di adatta ­
mento di un modello può essere desunta dal coefficiente di correlazione, dal 
coefficiente di determinazione (coefficienti vicini a 1 indicano un buon adattamento), oppure mediante il test chi quadrato. Anche l’entità dell’errore standard o dell’intervallo di confidenza intorno ai parametri stimati può 
essere indice della bontà di adattamento del modello.
 
16. Per ridurre la variabilità dei risultati della prova per le sostanze ad elevata 
lipofilia, i fattori di bioaccumulo devono essere espressi in relazione al 
contenuto lipidico e al contenuto di carbonio organico [contenuto in kg di 
carbonio organico (OC) del suolo per contenuto in kg-1 di lipidi degli or ­
ganismi sperimentali]. Questo approccio si basa sul fatto che per alcune 
classi di sostanze chimiche esiste una netta relazione tra il potenziale di 
bioaccumulo e la lipofilia, relazione che è stata stabilita in modo chiaro per i pesci (47), nei quali il contenuto di grassi e il bioaccumulo di queste sostanze sono correlati. Correlazioni analoghe sono state riscontrate negli 
organismi bentonici, ad esempio (30) (44), e negli oligocheti terrestri, ad 
esempio (5) (6) (7) (14). Se si dispone di tessuto di lombrico sufficiente, il contenuto lipidico degli animali sperimentali può essere determinato sullo stesso materiale biologico utilizzato per determinare la concentrazione della 
sostanza in esame, altrimenti questa misurazione può essere fatta sugli ani ­
mali di controllo.
 
VALIDITÀ DELLA PROVA  
17. Affinché una prova sia valida occorre che siano soddisfatti i seguenti criteri, 
sia per gli animali sperimentali sia per i controlli:  
— alla fine della prova, la mortalità totale durante le fasi di assorbimento e 
di eliminazione non deve superare il 10 % (lombrichi) o il 20 % (en ­
chitreidi) del numero complessivo degli organismi introdotti nei reci ­
pienti,  
— per  Eisenia fetida  e Eisenia andrei , la perdita di massa media misurata 
alla fine delle fasi di assorbimento e di eliminazione non deve superare il 20 % del peso iniziale fresco (f.w.) misurato all’inizio di ogni fase.
 
DESCRIZIONE DEL METODO  
Specie sperimentali  
18. Per le prove di bioaccumulo sono raccomandate varie specie di oligocheti 
terrestri. Le specie più utilizzate sono  Eisenia fetida  o Eisenia andrei  (Lum­
bricidi),  Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus  o Enchytraeus luxurio ­
sus (Enchitreidi), descritte nell’appendice 5.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1298
 
Apparecchiatura  
19. Per tutte le parti dell’apparecchiatura, evitare accuratamente l’uso di mate ­
riali soggetti a dissoluzione, assorbimento o lisciviatura e che possano avere un effetto dannoso sugli animali sperimentali. Si possono usare normali 
recipienti rettangolari o cilindrici di materiale chimicamente inerte e di 
capacità adeguata al tasso di carico, ossia al numero degli animali sperimen ­
tali. Per le apparecchiature destinate ad entrare in contatto con il mezzo di prova si può usare acciaio inossidabile, plastica o vetro. I recipienti devono 
essere debitamente coperti per evitare la fuga degli animali, assicurando nel 
contempo un sufficiente apporto d’aria. Per sostanze con elevati coefficienti di adsorbimento come i piretroidi sintetici, può essere necessario il vetro 
silanizzato. In tal caso le apparecchiature non possono venire riutilizzate. 
Occorre evitare la fuoriuscita delle sostanze radiomarcate e l’evaporazione delle sostanze volatili. Utilizzare delle trappole (ad esempio bottiglie di lavaggio per gas in vetro) contenenti un assorbente per catturare eventuali 
residui che possano evaporare dai recipienti di prova.
 
Terreno  
20. Il terreno sperimentale deve essere di una qualità tale da permettere la 
sopravvivenza e di preferenza la riproduzione degli organismi sperimentali durante i periodi di acclimatazione e di prova senza che essi presentino un aspetto o un comportamento anomali. I lombrichi devono poter infossarsi 
nel terreno.
 
21. Per questa prova si raccomanda di utilizzare il terreno artificiale descritto nel 
metodo di prova C.8 del presente allegato (48). La preparazione del terreno 
artificiale da utilizzare nelle prove di bioaccumulo e le indicazioni per la sua 
conservazione figurano nell’appendice 4. Il terreno artificiale asciugato all’aria può essere conservato a temperatura ambiente fino all’utilizzo.
 
22. È tuttavia possibile impiegare come terreno di prova e/o di coltura anche 
terreno naturale proveniente da siti non inquinati. I terreni naturali sono caratterizzati almeno per i seguenti parametri: origine (sito di prelievo), pH, tenore di carbonio organico, distribuzione granulometrica (percentuale 
di sabbia, limo e argilla), capacità massima di ritenzione idrica (WHCmax) e 
tenore di umidità (3). La ricerca di microinquinanti nel terreno o nei suoi componenti, prima del suo utilizzo, fornisce informazioni utili. Se si impiega terreno naturale prelevato da suoli agricoli, è opportuno che non sia stato 
trattato con fitofarmaci né con letame di animali trattati per almeno un anno 
prima del prelievo, né con fertilizzanti organici per almeno sei mesi prima del prelievo (50). Le procedure per la manipolazione dei terreni naturali prima del loro utilizzo nelle prove ecotossicologiche di laboratorio con 
oligocheti sono descritte nel manuale dell’ASTM (3). Il tempo di conserva ­
zione dei terreni naturali in laboratorio deve essere il più breve possibile.
 
Applicazione della sostanza in esame  
23. La sostanza chimica in esame è incorporata nel terreno, tenendo conto delle 
proprietà fisico-chimiche di detta sostanza. Una sostanza idrosolubile va disciolta completamente in acqua prima di mescolarla al terreno. Per l’ag ­
giunta delle sostanze poco solubili in acqua, la procedura raccomandata 
consiste nel rivestire con la sostanza in esame uno o più componenti del terreno (artificiale). Ad esempio, si può impregnare la sabbia di quarzo, o una sua porzione, con una soluzione della sostanza in esame in un solvente 
organico adatto, che si lascia poi lentamente evaporare a secco. La frazione 
rivestita può così essere mescolata al terreno umido. Questa procedura ha il
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grande vantaggio di non introdurre alcun solvente nel terreno. Quando si 
utilizza un terreno naturale, la sostanza in esame può essere aggiunta arric ­
chendo una porzione di terreno asciugato all’aria come descritto in prece ­
denza per il terreno artificiale, oppure mescolandola al terreno umido, con successiva fase di evaporazione se si utilizza un agente solubilizzante. In 
linea di principio, il contatto del terreno umido con solventi è da evitarsi per 
quanto possibile. Va tenuto presente quanto segue:
 
— se si utilizza un solvente diverso dall’acqua, è opportuno che sia misci ­
bile con l’acqua e/o che possa essere eliminato (ad esempio, per evapo ­
razione), lasciando sul terreno solo la sostanza in esame,  
— se si utilizza un solvente di controllo, non è necessario alcun controllo 
negativo. Il solvente di controllo deve contenere la concentrazione mas ­
sima del solvente aggiunto al terreno e deve provenire dallo stesso lotto utilizzato per preparare la soluzione madre. La tossicità e la volatilità del solvente, nonché la solubilità della sostanza in esame nel solvente pre ­
scelto devono costituire i criteri principali per la scelta dell’agente solu ­
bilizzante.
 
24. Per le sostanze poco solubili in acqua e nei solventi organici, è possibile 
mescolare alla quantità di sostanza in esame, ad esempio utilizzando un mortaio e pestello, da 2,0 a 2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata 
per ottenere la concentrazione sperimentale voluta. Questa miscela di sabbia 
di quarzo e sostanza in esame è incorporata al terreno preumidificato, me ­
scolando a fondo dopo l’aggiunta della quantità necessaria di acqua deio ­
nizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è 
distribuita nei recipienti di prova. La procedura è ripetuta per ogni concen ­
trazione sperimentale preparando anche un congruo controllo di 2,0-2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per recipiente di prova.
 
25. La concentrazione della sostanza in esame nel terreno va determinata dopo 
la sua addizione al terreno. La distribuzione omogenea della sostanza nel 
terreno deve essere verificata prima di introdurre gli organismi sperimentali. 
Il metodo di addizione prescelto e le ragioni di tale scelta devono essere riportati nella relazione (24).
 
26. Idealmente l’equilibrio tra il terreno e l’acqua interstiziale deve essere sta ­
bilito prima dell’introduzione degli organismi; si raccomanda un periodo di 
quattro giorni a 20 °C. Per molte sostanze chimiche organiche poco idro ­
solubili, il tempo necessario per raggiungere un vero equilibrio tra le parti adsorbite e dissolte può essere dell’ordine di vari giorni o mesi. Secondo la finalità dello studio, ad esempio se si tratta di simulare delle condizioni 
ambientali, può essere necessario «invecchiare» più a lungo il terreno addi ­
zionato [per i metalli, tre settimane a 20 °C (22)].
 
Allevamento degli organismi sperimentali  
27. È preferibile tenere i lombrichi e gli enchitreidi in allevamento di laboratorio 
permanente. Indicazioni sui metodi di allevamento in laboratorio di  Eisenia 
fetida  e Eisenia andrei , e delle specie di enchitreidi figurano nell’appendice 
5 [cfr. anche (48) (51) (52)].  
28. Gli animali usati nelle prove devono essere esenti da malattie, anomalie e 
parassiti osservabili.  
ESECUZIONE DELLA PROVA  
29. Gli organismi sperimentali sono esposti alla sostanza in esame durante la 
fase di assorbimento. La fase di assorbimento dura 14 giorni (enchitreidi) o 
21 giorni (lombrichi) salvo dimostrazione che lo stato stazionario è stato 
raggiunto prima.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1300
 
30. Per la fase di eliminazione, gli animali sono trasferiti in un terreno privo 
della sostanza in esame. Il primo campione deve essere prelevato da 4 a 24 
ore dopo l’inizio della fase di eliminazione. L’appendice 3 contiene qualche esempio di programma di campionamento con fase di assorbimento e fase di eliminazione di 21 giorni ciascuna.
 
Organismi sperimentali  
31. In molte specie di enchitreidi terrestri il peso individuale è molto basso (ad 
esempio, 5-10 mg di peso umido per individuo per  Enchytraeus albidus  e 
peso inferiore per  Enchytraeus crypticus  o Enchytraeus luxuriosus ); per 
misurare il peso ed eseguire l’analisi chimica può essere necessario riunire gli animali dei recipienti delle repliche (si utilizzeranno tutti gli animali di 
una replica per ottenere un risultato unico per i tessuti analizzati). Si utiliz ­
zano almeno tre repliche, ciascuna contenente venti enchitreidi. Se il limite di rivelabilità della sostanza in esame è alto, può essere necessario aggiun ­
gere più animali. Per le specie sperimentali con peso individuale più elevato 
(Eisenia fetida  e Eisenia andrei ) è possibile allestire repliche costituite cia ­
scuna di un solo individuo.
 
32. I lombrichi impiegati in una prova devono essere di peso simile ( Eisenia 
fetida  e Eisenia andrei  hanno peso individuale compreso tra 250 e 600 mg). 
Gli enchitreidi (ad esempio,  Enchytraeus albidus ) devono misurare circa 
1 cm di lunghezza. Tutti gli animali impiegati nella stessa prova devono avere la stessa origine ed essere adulti con clitello (cfr. appendice 5). Poiché 
il peso e l’età dell’animale possono influire sui valori del BAF (a causa, per 
esempio, del variare del contenuto lipidico e/o della presenza di uova), questi parametri vanno accuratamente riportati nella relazione e tenuti in considerazione al momento di interpretare i risultati. È inoltre possibile 
che nel periodo di esposizione compaiano dei bozzoli, anch’essi con un 
effetto sui valori del BAF. Si raccomanda di pesare un sotto-campione di organismi sperimentali prima della prova per stimare il peso medio secco e umido.
 
33. Per contenere al minimo la riduzione della concentrazione della sostanza in 
esame durante la fase di assorbimento, occorre utilizzare un rapporto elevato terreno/animali: si raccomanda per  Eisenia fetida  e Eisenia andrei  una 
quantità minima di 50 g in peso secco di terreno per lombrico, mentre 
per gli enchitreidi un minimo di 10-20 g in peso secco di terreno per 
recipiente. Lo strato di terreno nei recipienti ha uno spessore di 2-3 cm (enchitreidi) o 4-5 cm (lombrichi).
 
34. Gli animali utilizzati nella prova sono prelevati dal terreno di allevamento 
(gli enchitreidi con l’ausilio di pinzette da orafo). Gli animali adulti sono trasferiti in terreno sperimentale non trattato affinché si acclimatino, e qui alimentati (cfr. paragrafo 36). Se le condizioni sperimentali sono diverse 
dalle condizioni di allevamento, una fase di acclimatazione compresa tra 
24 e 72 ore dovrebbe essere sufficiente perché gli animali si adattino alle condizioni sperimentali. Una volta acclimatati, i lombrichi sono trasferiti in piastre di vetro (ad esempio, capsula Petri) contenenti acqua pulita per 
esservi risciacquati, sono poi pesati e infine deposti sul terreno sperimentale. 
Prima della pesatura, occorre togliere dagli animali l’acqua in eccesso, pas ­
sandoli delicatamente sul bordo della piastra o tamponandoli con cura con un fazzoletto di carta leggermente inumidito.
 
35. Occorre osservare e riportare nella relazione il comportamento fossorio. 
Nelle prove con i lombrichi, gli animali (di controllo e trattati) in genere s’infossano nel terreno nel giro di qualche ora; questo dato va verificato entro 24 ore dall’introduzione degli animali nei recipienti di prova. Se così 
non fosse (ad esempio più del 10 % di lombrichi non si è infossato per oltre 
la metà della fase di assorbimento) la causa va ricercata nelle condizioni
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sperimentali, che potrebbero essere inadeguate, oppure nello stato di salute 
degli organismi sperimentali, non buono. In tal caso la prova deve essere 
arrestata e ripetuta. Gli enchitreidi vivono soprattutto nei pori interstiziali del suolo e accade spesso che il loro tegumento sia solo in parte in contatto con il substrato circostante; si presume che l’esposizione degli enchitreidi fossori 
e non fossori sia equivalente e l’osservazione di enchitreidi non infossati 
non richiede necessariamente la ripetizione della prova.
 
Alimentazione  
36. L’alimentazione degli animali va prevista quando si utilizza un terreno po ­
vero in carbonio organico totale. Se il terreno utilizzato è artificiale si raccomanda il seguente regime settimanale (una somministrazione la setti ­
mana): per i lombrichi, 7 mg di sterco secco per g di terreno in peso secco; 
per gli enchitreidi 2-2,5 mg di fiocchi d’avena macinati per g di terreno in peso secco (11). La prima razione è mescolata al terreno subito prima di 
introdurvi gli organismi sperimentali. Utilizzare di preferenza lo stesso tipo 
di cibo impiegato durante l’allevamento (cfr. appendice 5).
 
Illuminazione e temperatura  
37. Le prove sono condotte in base a un fotoperiodo controllato di 16 ore/8 ore 
(luce/buio), con un’intensità luminosa di preferenza compresa tra 400 e 800 lx nella zona dei recipienti di prova (3), a una temperatura di 20 ± 2 °C.
 
Concentrazioni della sostanza in esame  
38. Si utilizza un’unica concentrazione. I casi in cui è necessario utilizzarne 
un’altra, o altre, devono essere motivati. Se la tossicità (CE  X ) della sostanza 
in esame è prossima al limite di rivelabilità analitica, si raccomanda di utilizzare sostanze di prova radiomarcate con radioattività specifica elevata. 
Per i metalli, la concentrazione deve essere superiore alla concentrazione di 
fondo nei tessuti e nel terreno.
 
Repliche  
39. Per le misurazioni cinetiche (fasi di assorbimento e di eliminazione), il 
numero minimo di repliche (recipienti) trattate è tre per punto di campio ­
namento. Il numero complessivo di repliche preparate dovrà essere suffi ­
ciente a coprire i campionamenti previsti per le fasi di assorbimento e di eliminazione.
 
40. Per le osservazioni e le misurazioni biologiche (rapporto peso secco/peso 
umido, tenore lipidico) e per l’analisi delle concentrazioni di fondo negli animali e nel terreno, occorre allestire almeno 12 repliche di controllo negativo (quattro campioni prelevati all’inizio, quattro alla fine della fase 
di assorbimento e quattro alla fine della fase di eliminazione), se come 
solvente non è stata utilizzata che acqua. Se per l’applicazione della sostanza in esame si utilizza un agente di solubilizzazione, occorre allestire, oltre alle repliche trattate, delle repliche di controllo con solvente (quattro recipienti 
campionati all’inizio, quattro alla fine della fase di assorbimento e quattro 
alla fine della fase di eliminazione) contenenti tutti i componenti tranne la sostanza in esame. In tal caso è possibile allestire anche altre quattro repli ­
che di controllo negativo (senza solvente) per un campionamento facoltativo 
alla fine della fase di assorbimento. Queste repliche possono essere con ­
frontate biologicamente con quelle di controllo con solvente per ottenere informazioni sull’eventuale influenza del solvente sugli organismi sottoposti alla prova. Si raccomanda di prevedere un numero sufficiente di repliche di 
riserva (otto recipienti, ad esempio), per gli organismi trattati e per i con ­
trolli.
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Frequenza delle misure della qualità del terreno  
41. Il pH e il tasso di umidità del terreno sono misurati all’inizio e alla fine 
delle fasi di assorbimento e di eliminazione. La temperatura del locale di prova è misurata in continuo. L’umidità del terreno va controllata una volta 
la settimana pesando i recipienti di prova e confrontandone il peso con il 
peso rilevato all’inizio della prova. Le perdite di umidità devono essere compensate aggiungendo acqua deionizzata.
 
Campionamento e analisi degli organismi sperimentali e del terreno  
42. Nell’appendice 3 figura un esempio di programma di campionamento per le 
fasi di assorbimento e di eliminazione delle prove di bioaccumulo su lom ­
brichi e enchitreidi.  
43. Un campione di terreno è prelevato dai recipienti di prova per determinare la 
concentrazione della sostanza in esame prima dell’introduzione degli animali e durante le fasi di assorbimento e di eliminazione. Durante la prova le concentrazioni della sostanza in esame sono determinate negli animali e 
nel terreno. In linea di principio, si misurano le concentrazioni totali nel 
terreno, ma si possono misurare anche le concentrazioni nell’acqua inter ­
stiziale, nel qual caso, prima dell’inizio della prova, occorre spiegarne la ragione e descrivere i metodi appropriati previsti, riportando poi tali infor ­
mazioni nella relazione.
 
44. Gli animali e il terreno sono campionati almeno a sei riprese durante le fasi 
di assorbimento e di eliminazione. Se la stabilità di una sostanza di prova è dimostrata, il numero di analisi del terreno può essere ridotto. Si racco ­
manda di analizzare almeno tre repliche all’inizio e alla fine della fase di 
assorbimento. Se la differenza tra la concentrazione misurata nel terreno alla fine della fase di assorbimento e la concentrazione iniziale è superiore al 30 %, occorre analizzare i campioni di terreno prelevati in altre date.
 
45. Ad ogni campionamento, togliere dal terreno gli animali della replica (ad 
esempio, dopo aver sparso il terreno della replica su un contenitore poco 
profondo e prelevato gli animali con pinzette da orafo), sciacquarli rapida ­
mente con acqua in un piatto di vetro o di acciaio e asciugarli dell’acqua in eccesso (cfr. paragrafo 34). Trasferirli delicatamente in un recipiente tarato e 
pesarli immediatamente, contenuto intestinale compreso.
 
46. Lasciare i lombrichi ( Eisenia  sp.) evacuare l’intestino per una notte, ad 
esempio su carta da filtro inumidita su una capsula Petri incoperchiata (cfr. paragrafo 34), poi pesarli per valutare l’eventuale perdita di biomassa du ­
rante la prova (si vedano i criteri di validità al paragrafo 17). La pesatura e 
l’analisi dei tessuti degli enchitreidi sono effettuate senza evacuazione inte ­
stinale, operazione tecnicamente difficile a causa delle piccole dimensioni di questi animali. Una volta determinato il peso finale, sopprimere immediata ­
mente gli animali con il metodo più appropriato (ad esempio, con azoto 
liquido o congelandoli a una temperatura inferiore a - 18 °C).
 
47. Durante la fase di eliminazione, questi animali sostituiscono il contenuto 
intestinale contaminato con terreno pulito. Ciò significa che le misure rela ­
tive a un campione di animali a intestino pieno (nella fattispecie gli enchi ­
treidi) eseguite subito prima della fase di eliminazione includono il terreno 
contaminato ivi presente. Per quanto concerne gli oligocheti acquatici, si presume che dopo le prime 4-24 ore della fase di eliminazione, la maggior parte del contenuto intestinale contaminato sia stato sostituito da sedimento 
pulito [cfr. ad esempio (46)]. Osservazioni analoghe sono state riferite per i 
lombrichi in studi sull’accumulo di cadmio e zinco radiomarcati (78). Per quanto riguarda gli enchitreidi con contenuto intestinale intatto, la concen ­
trazione di questo primo campione della fase di eliminazione può essere 
considerata come la concentrazione dei tessuti dopo evacuazione intestinale. 
Per tenere conto del fatto che la concentrazione della sostanza in esame viene diluita da terreno non contaminato durante la fase di eliminazione, è possibile stimare il peso del contenuto intestinale in base ai rapporti peso 
umido degli organismi/peso delle ceneri degli organismi oppure peso secco 
degli organismi/peso delle ceneri degli organismi.
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48. È preferibile analizzare i campioni di terreno e di animali subito dopo averli 
prelevati (ossia entro 1-2 giorni), per evitare il degrado o altre perdite, e si 
raccomanda di calcolare la velocità approssimativa di assorbimento ed eli ­
minazione durante lo svolgimento della prova. Se l’analisi è posticipata, conservare i campioni in modo idoneo, ad esempio surgelandoli ≤ - 18 °C).
 
49. Controllare che la precisione e la riproducibilità dell’analisi chimica e che il 
recupero della sostanza in esame dai campioni di terreno e di animali siano 
soddisfacenti per il metodo in oggetto; riportare nella relazione l’efficacia di 
estrazione, il limite di rivelabilità (LOD) e il limite di quantificazione. Verificare inoltre che la sostanza in esame non sia rilevabile nei recipienti di controllo in concentrazioni superiori a quella di fondo. Se la concentra ­
zione della sostanza in esame nell’organismo sperimentale, Ca, è > 0 per i 
controlli, includere questo dato nel calcolo dei parametri cinetici (cfr. appendice 2). Per tutta la durata della prova tutti i campioni devono essere manipolati in modo da ridurre al minimo la contaminazione e le perdite 
(derivanti, ad esempio, dall’adsorbimento della sostanza in esame sul dispo ­
sitivo di campionamento).
 
50. Qualora si operi con sostanze radiomarcate, è possibile analizzare il proge ­
nitore e i metaboliti. Informazioni importanti si ricavano dalla quantifica ­
zione del composto progenitore e dei metaboliti allo stato stazionario o alla 
fine della fase di assorbimento. I campioni vanno in tal caso «puliti» in 
modo da poter quantificare separatamente il composto progenitore. Si rac ­
comanda di identificare gli eventuali metaboliti che rappresentano più del 10 % della radioattività totale del/i campione/i analizzato/i.
 
51. Annotare e riferire nella relazione il recupero complessivo e il recupero della 
sostanza in esame negli animali, nel terreno e, se utilizzate, nelle trappole 
assorbenti che trattengono la sostanza in esame evaporata.  
52. È ammesso per gli enchitreidi, perché di dimensioni più piccole dei lom ­
brichi, il raggruppamento di individui prelevati dal recipiente di prova. Se il raggruppamento implica la riduzione del numero di repliche, ciò limita le procedure statistiche che si possono applicare ai dati ricavati dal campiona ­
mento. Se sono richieste una potenza ed una procedura statistiche specifiche, 
includere nella prova un numero adeguato di repliche per tener conto del raggruppamento, della procedura e della potenza desiderati.
 
53. Si raccomanda che il BAF sia espresso sia come funzione del peso secco 
totale e, se necessario (ad esempio per sostanze chimiche fortemente idro ­
fobe), come funzione del tenore lipidico. Per determinare il tenore lipidico 
avvalersi di metodi idonei [alcuni dei metodi esistenti, ad esempio (31) e 
(58), vanno adeguati a tal fine]. Questi metodi si basano su una tecnica di estrazione con cloroformio/metanolo, ma se si vuole evitare l’uso di solventi clorati, utilizzare una versione modificata del metodo di Bligh e Dyer (9) 
descritta in (17). Poiché i vari metodi possono non fornire valori identici, è 
importante precisare il metodo usato. Quando possibile, ossia se si dispone di sufficiente tessuto animale, il tenore lipidico è idealmente analizzato sullo stesso campione o estratto che è servito per l’analisi della sostanza in esame, 
in quanto i lipidi devono spesso venire rimossi dall’estratto prima di poterlo 
analizzare per via cromatografica (49). In alternativa è possibile misurare il tenore lipidico sugli animali di controllo e il valore ottenuto può essere utilizzato per normalizzare i valori del BAF. Con quest’ultimo approccio 
la contaminazione dell’apparecchiatura con la sostanza in esame è più con ­
tenuta.
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DATI E RELAZIONE  
Trattamento dei risultati  
54. La curva di assorbimento della sostanza in esame si ottiene rappresentando 
graficamente la sua concentrazione nel/sugli animali durante la fase di as ­
sorbimento in funzione del tempo su scale aritmetiche. Quando la curva ha raggiunto un plateau, o stato stazionario (cfr. definizioni nell’appendice 1), 
calcolare il fattore di bioaccumulo allo stato stazionario (BAF
 SS ) secondo la 
seguente formula:  
C a allo stato stazionario o alla fine della fase di assorbimento  ðmediaÞ 
C s allo stato stazionario o alla fine della fase di assorbimento  ðmediaÞ 
C a = concentrazione della sostanza in esame nell’organismo sperimentale  
C s = concentrazione della sostanza in esame nel terreno  
55. Se la curva non raggiunge lo stato stazionario, invece del BAF  SS determi­
nare il BAF  K , in base alle costanti di velocità, come indicato di seguito:  
— determinare il fattore di accumulo (BAF  K ) come rapporto ks/ke,  
— calcolare di preferenza simultaneamente le velocità di assorbimento e di 
eliminazione (cfr. equazione [11] nell’appendice 2),  
— la costante di velocità di eliminazione (k  e ) è in genere ricavata dalla 
curva di eliminazione (ossia dal tracciato della concentrazione della sostanza in esame negli animali durante la fase di eliminazione). Calco ­
lare la costante di velocità di assorbimento k
 s in funzione di k  e e di un 
valore di C  a che è derivato dalla curva di assorbimento — per la de ­
scrizione di questi metodi cfr. appendice 2. Il metodo preferito per ottenere il BAF
 K e le costanti di velocità k  s e k  e consiste nell’uso di 
metodi di stima parametrica non lineare su computer. Se la curva di 
eliminazione non obbedisce manifestamente a una cinetica di primo ordine si dovrà ricorrere a modelli più complessi.
 
Relazione sulla prova  
56. La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti.  
Sostanza chimica in esame:  
— ogni informazione disponibile sulla tossicità acuta o a lungo termine (ad 
esempio CE  X , CL  X , NOEC) della sostanza in esame per gli oligocheti 
terrestri,  
— purezza, natura fisica e proprietà fisico-chimiche, ad esempio log K  ow , 
idrosolubilità,  
— dati di identificazione chimica; provenienza della sostanza in esame, 
identità e concentrazione di eventuali solventi utilizzati,  
— in caso di utilizzo di una sostanza radiomarcata, posizione esatta degli 
atomi marcati, radioattività specifica e purezza radiochimica.  
Specie sperimentali:  
— nome scientifico, ceppo, provenienza, eventuali pretrattamenti, acclima ­
tazione, età, dimensioni ecc.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1305
 
Condizioni sperimentali:  
— procedura di prova utilizzata,  
— tipo e caratteristiche dell’illuminazione usata e fotoperiodo,  
— disegno sperimentale (ad esempio numero e dimensioni dei recipienti, 
massa del terreno e spessore dello strato di terreno, numero di repliche, numero di animali per replica, numero di concentrazioni di prova, durata delle fasi di assorbimento e di eliminazione, frequenza di campionamento),
 
— motivazione del materiale scelto per i recipienti di prova,  
— metodo di preparazione e applicazione della sostanza di prova, nonché 
ragioni della scelta di tale metodo,  
— concentrazioni nominali nella prova, medie dei valori misurati e loro 
deviazioni standard nei recipienti di prova, e metodo mediante cui sono stati ottenuti questi valori,
 
— provenienza dei componenti del terreno artificiale oppure, se si utilizza 
terreno naturale, provenienza del terreno, descrizione degli eventuali pre ­
trattamenti, risultati dei controlli (sopravvivenza, aumento della biomas ­
sa, riproduzione), caratteristiche del terreno (pH, tenore di carbonio 
organico totale, distribuzione granulometrica, percentuale di sabbia, limo e argilla), WHC
 max , tenore di umidità all’inizio e alla fine della 
prova e eventuali altre misurazioni effettuate,  
— informazioni particolareggiate sul trattamento dei campioni di terreno e 
animali, ivi compresi i dettagli su preparazione, conservazione, proce ­
dure di addizione, estrazione e procedure analitiche (e loro precisione) per la sostanza in esame negli animali e nel terreno, il tenore lipidico (se 
misurato) e i metodi di recupero della sostanza in esame.
 
Risultati:  
— mortalità dei controlli e degli organismi trattati in ogni recipiente e 
eventuali comportamenti anomali osservati (ad esempio, comportamento non fossorio, assenza di riproduzione in una prova di bioaccumulo con enchitreidi),
 
— rapporto peso secco/peso umido del terreno e degli organismi sperimen ­
tali (utile per la normalizzazione),  
— peso umido degli animali ad ogni campionamento; per i lombrichi, peso 
umido all’inizio della prova e ad ogni campionamento prima e dopo 
l’evacuazione intestinale,  
— tenore lipidico degli organismi sperimentali (se determinato),  
— curve che mostrano le costanti cinetiche di assorbimento e di elimina ­
zione della sostanza in esame negli animali e il tempo occorso per raggiungere lo stato stazionario,
 
— C  a e C  s (con deviazione standard e intervallo, se necessario) per ogni 
campionamento (C  a espressa in g kg  -1 di peso umido e secco del corpo 
intero, C  s espressa in g kg  -1 di peso umido e secco del terreno). Se è 
necessario ricavare un fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF), (ad 
esempio per confrontare i risultati di due o più prove realizzate su animali con tenore lipidico diverso), C
 a può essere espressa anche come 
g kg  -1 di tenore lipidico dell’organismo e Cs come g kg  -1 di carbonio 
organico (OC) del terreno,  
— BAF (espresso in kg terreno kg  -1 di animale), costante di velocità di 
assorbimento dal terreno k  s (espressa in g di terreno kg  -1 di animale 
giorno  -1 ), e costante di velocità di eliminazione k  e (espressa in 
giorno  -1 ); eventualmente anche BSAF (espresso in kg di OC del 
terreno kg  -1 di tenore lipidico dell’animale),  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1306
 
— se misurate: percentuali del composto progenitore, dei metaboliti e dei 
residui combinati (ossia la percentuale della sostanza in esame che non 
può essere estratta con i normali metodi di estrazione) rilevate nel ter ­
reno e negli animali sperimentali,  
— metodi usati per le analisi statistiche dei dati.  
Valutazione dei risultati:  
— conformità dei risultati con i criteri di validità di cui al paragrafo 17,  
— risultati imprevisti o insoliti, ad esempio, eliminazione incompleta della 
sostanza in esame dagli animali sperimentali.  
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(48) Capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi.  
(49) Capitolo C.13 del presente allegato, Bioconcentrazione: saggio sui pesci, 
metodo a flusso continuo.  
(50) Capitolo C.21 del presente allegato, Microrganismi del suolo: test di tra ­
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 ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1311
 
Appendice 1  
DEFINIZIONI  
Bioaccumulo : aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su un 
organismo rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell’ambiente circostante. Il bioaccumulo è il risultato sia dei processi di bioconcentrazione che di quelli di biomagnificazione (cfr. di seguito).
 
Bioconcentrazione : aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su 
un organismo, derivante dall’assorbimento della sostanza esclusivamente dall’am ­
biente circostante (ossia attraverso la superficie corporea e in terreno ingerito), rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell’ambiente circostante.
 
Biomagnificazione : aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su 
un organismo, derivante principalmente dall’assorbimento di alimenti o prede 
contaminate, rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell’alimento o nella preda. La biomagnificazione può comportare un trasferimento o un ac ­
cumulo della sostanza in esame nelle reti trofiche.
 
Eliminazione  della sostanza in esame: perdita della sostanza dai tessuti dell’or ­
ganismo sperimentale mediante processi attivi o passivi che si verificano indi ­
pendentemente dalla presenza o dall’assenza della sostanza nell’ambiente circo ­
stante.  
Fattore di bioaccumulo  (BAF) in qualsiasi momento della fase di assorbimento 
della prova: concentrazione della sostanza in esame in o sull’organismo speri ­
mentale (C  a in g·kg -1 di peso secco dell’animale) diviso per la concentrazione 
della sostanza chimica nell’ambiente circostante (C  s espressa in g ·kg -1 di peso 
secco del terreno); il BAF è espresso in kg di terreno ·kg -1 di animale.  
Fattore di bioaccumulo allo stato stazionario  (BAF  SS ): BAF allo stato stazio ­
nario, che non varia in modo significativo per un lungo periodo, periodo durante il quale la concentrazione della sostanza in esame nell’ambiente circostante (C
 s in 
g·kg -1 di peso secco del terreno) rimane costante.  
Fattori di bioaccumulo cinetico  (BAF  K ): fattori di bioaccumulo calcolati diret ­
tamente dal rapporto tra la costante di velocità di assorbimento dal terreno e la 
costante di velocità di eliminazione (k  s and k  e , cfr. di seguito).  
Fattore di accumulo biota-sedimento  (BSAF): concentrazione normalizzata per 
il tenore lipidico della sostanza in esame nel o sull’organismo sperimentale divisa 
per la concentrazione normalizzata per il tenore di carbonio organico della so ­
stanza in esame nel terreno allo stato stazionario. C  a è pertanto espressa in g ·kg -1 
di tenore in lipidi dell’organismo, e C  s in g·kg -1 di tenore in carbonio organico 
del terreno; il BSAF è espresso in kg di carbonio organico kg  -1 di lipidi.  
Plateau  o stato stazionario : equilibrio tra il processo di assorbimento e di 
eliminazione che si verificano simultaneamente nella fase di esposizione. Lo stato 
stazionario, nel tracciato del BAF in funzione del tempo, viene raggiunto quando la curva diventa parallela all’asse del tempo e tre analisi successive del BAF su campioni prelevati ad intervalli di almeno due giorni differiscono di non oltre il 
± 20 % una dall’altra, e non vi sono differenze statisticamente significative tra i 
tre periodi di campionamento. Per il controllo di sostanze che vengono assorbite lentamente, intervalli di sette giorni saranno più idonei (49).
 
Coefficiente di ripartizione carbone organico-acqua  (K  oc ): rapporto tra la 
concentrazione di una sostanza chimica nella o sulla frazione di carbonio orga ­
nico di un terreno e la concentrazione della sostanza all’equilibrio.  
Coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua  (K  ow ): rapporto tra la solubilità di 
una sostanza chimica in n-ottanolo e quella in acqua all’equilibrio, espresso anche come P
 ow . Il logaritmo di K  ow (log K  ow ) viene usato come indicazione 
del potenziale di bioaccumulo di una sostanza chimica da parte di organismi 
acquatici.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1312
 
Fase di assorbimento o esposizione : tempo durante il quale gli organismi spe ­
rimentali sono esposti alla sostanza chimica in esame.  
Costante di velocità di assorbimento dal terreno  (k s ): valore numerico che 
definisce la velocità di aumento della concentrazione della sostanza in esame nel o sull’organismo sperimentale derivante dall’assorbimento dalla fase del terreno. k
 s è espressa in g di terreno kg  -1 di animale giorno  -1 . 
Fase di eliminazione : tempo, dopo il trasferimento dell’organismo sperimentale 
da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale 
sostanza, durante il quale viene studiata l’eliminazione (o perdita netta) della sostanza dall’organismo sperimentale.
 
Costante di velocità di eliminazione  (k e ): valore numerico che definisce la 
velocità di riduzione della concentrazione della sostanza in esame nel o sull’or ­
ganismo sperimentale dopo il trasferimento di quest’ultimo da un ambiente con ­
tenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza; k  e è espressa 
in giorno  -1 . 
Sostanza chimica in esame:  qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il 
presente metodo di prova.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1313
 
Appendice 2  
Calcolo dei parametri di assorbimento ed eliminazione  
Il principale endpoint di una prova di bioaccumulo è il fattore di bioaccumulo 
BAF. Per calcolare il BAF si divide la concentrazione nell’organismo sperimen ­
tale, C  a , per la concentrazione del terreno C  s , allo stato stazionario. Se lo stato 
stazionario non è raggiunto durante la fase di assorbimento, il BAF  K è calcolato a 
partire dalle costanti di velocità invece che dal BAF  SS . Va tuttavia annotato se il 
BAF si basa o meno sulle concentrazioni allo stato stazionario.  
La procedura abituale per ottenere il fattore di bioaccumulo cinetico (BAF  K ), la 
costante di velocità di assorbimento dal terreno (k  s ) e la costante di velocità di 
eliminazione (k  e ) consiste nel ricorrere a metodi informatici non lineari di stima 
dei parametri, ad esempio sulla base dei modelli descritti in (68). Data una serie 
di valori sequenziali della concentrazione in funzione del tempo e le equazioni 
dei modelli 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c equazione [1]  
oppure 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c equazione [2]  
dove:  
C a = concentrazione della sostanza negli animali [g ·kg -1 di peso umido o secco]  
k s = costante di velocità di assorbimento nei tessuti [g di terreno kg  -1 di ani­
male giorno  -1 ] 
C a = concentrazione della sostanza nel terreno [g ·kg -1 di peso umido o secco]  
k e = costante di velocità di eliminazione [giorno  -1 ] 
t c = tempo al termine della fase di assorbimento,  
questi programmi informatici calcolano i valori di BAF  K , k s e k e . 
Quando la concentrazione di fondo negli animali non esposti, ad esempio il 
giorno 0, è significativamente diversa da zero (come può essere il caso dei metalli), tale concentrazione (C
 a,0 ) deve essere inclusa in queste equazioni, 
come segue: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c equazione [3]  
e 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c equazione [4]  
Se si osserva un forte calo della concentrazione della sostanza di prova nel 
terreno durante la fase di assorbimento, è possibile utilizzare i seguenti modelli, 
ad esempio (67) e (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ equazione [5]  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1314
 
dove:  
C s = concentrazione della sostanza nel terreno [g ·kg -1 di peso umido o secco]  
k 0 = costante di velocità di degradazione nel terreno [d-1]  
C 0 = concentrazione iniziale della sostanza nel terreno [g ·kg -1 di peso umido o 
secco] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c equazione [6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c equazione [7]  
dove:  
C a = concentrazione della sostanza negli animali [g ·kg -1 di peso umido o secco]  
k s = costante di velocità di assorbimento nei tessuti [g di terreno ·kg -1 di animale 
giorno  -1 ] 
k 0 = costante di velocità di degradazione nel terreno [giorno  -1 ] 
k e = costante di velocità di eliminazione [giorno  -1 ] 
t c = tempo al termine della fase di assorbimento.  
Quando si è raggiunto uno stato stazionario durante la fase di assorbimento (ossia 
t = ∞), è possibile ridurre l’equazione 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c equazione [1]  
all’equazione:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
oppure 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K equazione [8]  
In seguito k  s /k e × C  s dà un’approssimazione della concentrazione della sostanza 
in esame nel tessuto dell’animale allo stato stazionario (C  a,ss ). 
Il fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF) può essere calcolato come segue: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip equazione [9]  
dove f  oc è la frazione di carbonio organico nel terreno e f  lip è la frazione di lipidi 
negli animali, entrambe determinate di preferenza su campioni prelevati dalla prova, e basate rispettivamente sul peso secco o sul peso umido.
 
Per modellizzare le costanti cinetiche di eliminazione si possono utilizzare i dati 
ricavati dalla fase di eliminazione e applicare la seguente equazione del modello e un metodo informatico non lineare di stima dei parametri. Se il tracciato dei 
dati in funzione del tempo indica una diminuzione esponenziale costante della 
concentrazione della sostanza in esame negli animali, il decorso dell’eliminazione può essere descritto da un modello a compartimento singolo (equazione [9]). 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t equazione [10]  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1315
 
I processi di eliminazione paiono talvolta avvenire in due fasi: dapprima una 
rapida diminuzione di C  a , che nelle fasi successive dell’eliminazione evolve in 
una perdita più lenta delle sostanze in esame, ad esempio (27) e (68). Le due fasi possono essere interpretate ipotizzando l’esistenza di due compartimenti nell’or ­
ganismo, a partire dai quali la sostanza in esame è eliminata a velocità diverse. In 
questi casi è opportuno studiare la letteratura pertinente, ad esempio (38) (39) 
(40) e (78).
 
Le equazioni del modello illustrate sopra possono servire a calcolare simultanea ­
mente i parametri cinetici (k  s and k  e ), applicando un modello di cinetica di primo 
ordine a tutti i dati delle fasi di assorbimento e di eliminazione simultaneamente. 
Per una descrizione di un metodo che permetta un tale calcolo combinato delle 
costanti di velocità di assorbimento ed eliminazione, consultare ad esempio (41), (73) e (70). 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
equazione [11]  
NB: quando i parametri di assorbimento e di eliminazione sono stimati simulta ­
neamente sulla base dei dati combinati di assorbimento ed eliminazione, «m» di cui all’equazione [11] è un descrittore che consente al programma 
informatico di attribuire i sottotermini dell’equazione alle serie di dati della 
fase corrispondente e eseguire una valutazione corretta (m = 1 per la fase di assorbimento; m = 2 per la fase di eliminazione).
 
Ciononostante, queste equazioni di modelli vanno utilizzate con cautela, in par ­
ticolare se nella prova si verificano cambiamenti della biodisponibilità o della 
(bio)degradazione della sostanza in esame [cfr. ad esempio (79)].  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1316
 
Appendice 3  
ESEMPI DI PROGRAMMI PER LE PROVE DI BIOACCUMULO NEL TER ­
RENO  
Prova sui lombrichi  
a) Fase di assorbimento con 8 date di campionamento per il calcolo dei para ­
metri cinetici  
Giorno Attività  
- 6 Condizionamento del terreno preparato per 48 ore. 
- 4 Addizione della soluzione della sostanza in esame alla frazione di 
terreno; evaporazione degli eventuali solventi; miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del terreno nei recipienti 
di prova; equilibrazione alle condizioni sperimentali per 4 giorni 
(3 settimane per i terreni addizionati di metalli). 
da - 3 a - 1 Rimozione degli organismi sperimentali dal terreno di alleva ­
mento per acclimatazione; preparazione e umidificazione dei componenti del terreno. 
0 Misurazione della temperatura e del pH del terreno; prelievo di 
campioni di terreno dai recipienti trattati e dai controlli con sol ­
vente per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame; introduzione di una razione di cibo; pesatura e distribu ­
zione casuale degli animali nei recipienti di prova; accantona ­
mento di un numero sufficiente di sottocampioni di animali per determinare i valori analitici di fondo, del peso umido e secco e del tenore lipidico; pesatura di tutti i recipienti di prova per il 
controllo dell’umidità del terreno; controllo del flusso d’aria, se si 
utilizza un sistema sperimentale chiuso. 
1 Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli 
animali e della temperatura; prelievo di campioni di terreno e di animali per determinare la concentrazione della sostanza in esa ­
me. 
2 Idem come il 1
 o giorno. 
3 Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e 
della temperatura. 
4 Idem come il 1  o giorno. 
5 - 6 Idem come il 3  o giorno. 
7 Idem come il 1  o giorno; introduzione di una razione di cibo; 
controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e com ­
pensando l’acqua evaporata. 
8 - 9 Idem come il 3  o giorno. 
10 Idem come il 1  o giorno. 
11 - 13 Idem come il 3  o giorno. 
14 Idem come il 1  o giorno; introduzione di una razione di cibo; 
controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e com ­
pensando l’acqua evaporata. 
15 - 16 Idem come il 3  o giorno. 
17 Idem come il 1  o giorno. 
18 - 20 Idem come il 3  o giorno.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1317
 
Giorno Attività  
21 Idem come il 1  o giorno; misurazione della temperatura e del pH 
del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i reci ­
pienti; fine della fase di assorbimento; trasferimento degli animali dalle restanti repliche esposte ai recipienti contenenti terreno pu ­
lito per la fase di eliminazione (senza evacuazione dell’intestino); 
prelievo di campioni di terreno e animali dai controlli con sol ­
vente. 
Le attività che precedono l’esposizione (fase di equilibrazione) 
sono programmate tenendo conto delle proprietà della sostanza chimica in esame. 
Le attività descritte per il 3
 o giorno sono effettuate quotidiana ­
mente (almeno nei giorni lavorativi).  
b) Fase di eliminazione  
Giorno Attività  
- 6 Preparazione e umidificazione dei componenti del terreno; con ­
dizionamento del terreno preparato per 48 ore. 
- 4 Miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del ter ­
reno nei recipienti di prova; incubazione alle condizioni speri ­
mentali per 4 giorni. 
0 (fine della fase di 
assorbimento) Misurazione della temperatura e del pH del terreno; pesatura e 
distribuzione casuale degli animali nei recipienti di prova; intro ­
duzione di una razione di cibo; trasferimento degli animali dalle 
restanti repliche esposte ai recipienti contenenti terreno pulito; 
prelievo di campioni di terreno e di animali dopo 4-6 ore per determinare la concentrazione della sostanza in esame. 
1 Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli 
animali e della temperatura. prelievo di campioni di terreno e di animali per determinare la concentrazione della sostanza in esa ­
me. 
2 Idem come il 1
 o giorno. 
3 Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e 
della temperatura. 
4 Idem come il 1  o giorno. 
5 - 6 Idem come il 3  o giorno. 
7 Idem come il 1  o giorno. introduzione di una razione di cibo; 
controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e com ­
pensando l’acqua evaporata. 
8 - 9 Idem come il 3  o giorno. 
10 Idem come il 1  o giorno. 
11 - 13 Idem come il 3  o giorno. 
14 Idem come il 1  o giorno. introduzione di una razione di cibo; 
controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e com ­
pensando l’acqua evaporata. 
15 - 16 Idem come il 3  o giorno. 
17 Idem come il 1  o giorno.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1318
 
Giorno Attività  
18 - 20 Idem come il 3  o giorno. 
21 Idem come il 1  o giorno. misurazione della temperatura e del pH 
del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i reci ­
pienti; prelievo di campioni di terreno e animali dai controlli con solvente. 
La preparazione del terreno per la fase di eliminazione è eseguita 
come per la fase di assorbimento. 
Le attività descritte per il 3
 o giorno sono effettuate quotidiana ­
mente (almeno nei giorni lavorativi).  
Prova sugli enchitreidi  
a) Fase di assorbimento con 8 date di campionamento per il calcolo dei para ­
metri cinetici  
Giorno Attività  
- 6 Condizionamento del terreno preparato per 48 ore. 
- 4 Addizione della soluzione della sostanza in esame alla frazione di 
terreno; evaporazione degli eventuali solventi; miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del terreno nei recipienti di prova; equilibrazione alle condizioni sperimentali per 4 giorni 
(3 settimane per i terreni addizionati di metalli). 
da - 3 a - 1 Rimozione degli organismi sperimentali dal terreno di alleva ­
mento per acclimatazione; preparazione e umidificazione dei 
componenti del terreno. 
0 Misurazione della temperatura e del pH del terreno; prelievo di 
campioni di terreno dai recipienti trattati e dai controlli con sol ­
vente per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame; introduzione di una razione di cibo; pesatura e distribu ­
zione casuale degli animali nei recipienti di prova; accantona ­
mento di un numero sufficiente di sottocampioni di animali per 
la determinazione dei valori analitici di fondo, del peso umido e secco e del tenore lipidico; pesatura di tutti i recipienti di prova il controllo dell’umidità del terreno; controllo del flusso d’aria, se si 
utilizza un sistema sperimentale chiuso. 
1 Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli 
animali e della temperatura; prelievo di campioni di terreno e di 
animali per determinare la concentrazione della sostanza in esa ­
me. 
2 Idem come il 1
 o giorno. 
3 Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e 
della temperatura. 
4 Idem come il 1  o giorno. 
5 - 6 Idem come il 3  o giorno. 
7 Idem come il 1  o giorno; introduzione di una razione di cibo; 
controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e com ­
pensando l’acqua evaporata. 
9 Idem come il 1  o giorno. 
10 Idem come il 3  o giorno.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1319
 
Giorno Attività  
11 Idem come il 1  o giorno. 
12 - 13 Idem come il 3  o giorno. 
14 Idem come il 1  o giorno; introduzione di una razione di cibo; 
misurazione della temperatura e del pH del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti; fine della fase di 
assorbimento; trasferimento degli animali dalle restanti repliche 
esposte ai recipienti contenenti terreno pulito per la fase di eli ­
minazione (senza evacuazione dell’intestino); prelievo di cam ­
pioni di terreno e animali dai controlli con solvente. 
Le attività che precedono l’esposizione (fase di equilibrazione) 
sono programmate tenendo conto delle proprietà della sostanza chimica in esame. 
Le attività descritte per il 3
 o giorno sono effettuate quotidiana ­
mente (almeno nei giorni lavorativi).  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1320
 
Appendice 4  
Terreno artificiale — indicazioni per la preparazione e la conservazione  
Poiché, nel corso dell’anno, non sempre si può disporre di terreno naturale di una 
determinata origine e dato che gli organismi indigeni e i microinquinanti in esso 
presenti possono influire sull’esito della prova, si raccomanda di utilizzare in questa prova il terreno artificiale di cui al capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi (48). Si tratta di un terreno in cui possono sopravvivere, 
crescere e riprodursi varie specie sperimentali e che offre sia una standardizza ­
zione massima sia la comparabilità intra e interlaboratorio delle condizioni di prova e di allevamento.
 
Componenti 
Torba 10 % Torba di sfagno in conformità con la linea 
guida OCSE n. 207 (48) 
Sabbia di quarzo 70 % Sabbia di quarzo industriale (asciugata 
all’aria); granulometria: > 50 % delle parti ­
celle comprese tra 50 e 200 μm, ma tutte ≤ 
2 mm 
Argilla caolinica 20 % Tenore di caolinite ≥ 30 % 
Carbonato di calcio ≤ 1 % CaCO  3 , in polvere, chimicamente puro  
Il tenore di carbonio organico del terreno artificiale può anche essere ridotto, 
diminuendo, ad esempio, la percentuale di torba al 4-5 % di terreno secco e 
aumentando proporzionalmente il contenuto di sabbia. Con un tenore inferiore di carbonio organico, può risultare inferiore l’adsorbimento della sostanza in esame nel terreno (carbonio organico) e aumentare la disponibilità della sostanza 
in esame per gli animali (74). È stato dimostrato che  Enchytraeus albidus  e 
Eisenia fetida  possono soddisfare i criteri di validità relativi alla riproduzione 
quando saggiati in terreni naturali con un tenore più basso di carbonio organico, ad esempio 2,7 % (33) e (61), ed è stato sperimentalmente constatato che ciò 
vale anche con un terreno artificiale contenente 5 % di torba.
 
Preparazione  
Mescolare accuratamente i componenti secchi del terreno (ad esempio in un 
grande miscelatore da laboratorio), operazione che può essere eseguita circa 
una settimana prima dell’inizio della prova. Inumidire la miscela con acqua deionizzata almeno 48 ore prima di applicarvi la sostanza in esame per equili ­
brare/stabilizzare l’acidità. Per determinare il pH, utilizzare una miscela di terreno 
con una soluzione di 1 M KCl in rapporto 1:5. Se il pH non rientra nell’inter ­
vallo richiesto (6,0 ± 0,5), aggiungere al terreno CaCO
 3 in quantità sufficiente 
oppure preparare un nuovo lotto di terreno.  
Determinare la capacità massima di ritenzione idrica (WHC  max ) del terreno arti ­
ficiale in base alla norma ISO 11268-2 (35). Almeno due giorni prima dell’inizio della prova, inumidire il terreno aggiungendo acqua deionizzata o acqua artifi ­
ciale in quantità sufficiente a ottenere circa la metà del tenore d’umidità finale. Il 
tenore di umidità finale deve rappresentare dal 40 % al 60 % della WHC
 max . 
Suddividere, all’inizio della prova, il terreno preinumidito in un numero di lotti pari al numero delle concentrazioni sperimentali e dei controlli da utilizzarsi nella 
prova, e aggiustare il tenore di umidità al 40 – 60 % della WHC
 max aggiungendo 
la soluzione della sostanza in esame e/o acqua deionizzata o artificiale. Misurare il tenore di umidità all’inizio e alla fine della prova (a 105 °C) per accertarsi che soddisfi in modo ottimale le esigenze delle specie sperimentali (ad esempio, se 
stringendo leggermente in mano un pugno di terreno, tra le dita compaiono delle 
goccioline d’acqua).
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Conservazione  
Conservare i componenti secchi del terreno artificiale a temperatura ambiente 
fino al momento dell’uso. Conservare il terreno preparato e preinumidito in luogo 
fresco per tre giorni al massimo prima di addizionarvi la sostanza in esame, avendo cura di ridurre al minimo l’evaporazione d’acqua. Una volta addizionata la sostanza in esame, utilizzare il terreno immediatamente, salvo vi siano infor ­
mazioni che indicano la possibilità di conservarlo senza alterare la tossicità e la 
biodisponibilità della sostanza di prova. Conservare fino all’analisi i campioni di terreno addizionato alle condizioni raccomandate per la sostanza in esame.
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Appendice 5  
Specie di oligocheti terrestri raccomandate per le prove di bioaccumulo nel 
suolo  
Lombrichi  
La specie raccomandata per questa prova è  Eisenia fetida  (Savigny 1826) della 
famiglia dei Lumbricidi. Dal 1972, la si suddivide in due sottospecie [ Eisenia 
fetida  e Eisenia andrei  (10)]. Secondo Jaenike (36), si tratta di due specie a sé 
stanti.  Eisenia fetida  è facilmente riconoscibile per le strisce giallo acceso inter ­
segmentarie, mentre  Eisenia andrei  ha una livrea uniforme color rosso scuro. 
Probabilmente originarie della regione del Mar Nero, sono oggi diffuse in tutto il mondo, soprattutto in habitat modificati dalle attività antropiche, come i mucchi 
di compost. Entrambe si prestano ad essere utilizzate nelle prove ecotossicologi ­
che e di bioaccumulo.
 
Eisenia fetida  e Eisenia andrei  sono disponibili in commercio, ad esempio come 
esche per la pesca. Rispetto ad altri lumbricidi, hanno un ciclo di vita breve e raggiungono la maturità in 2-3 mesi (a temperatura ambiente). Prosperano a temperature oscillanti tra i 20 e i 24 °C e prediligono substrati relativamente 
umidi, con pH pressoché neutro e a forte tenore di materia organica. Dato che 
si tratta di specie ampiamente utilizzate da 25 anni in prove ecotossicologiche standardizzate, il loro allevamento è ormai diffuso (48) (77).
 
Entrambe le specie possono essere allevate in deiezioni animali di vario tipo. Il 
mezzo di allevamento raccomandato dall’ISO (35) è una miscela di letame di 
equini o bovini e torba in parti uguali. Il mezzo deve avere un pH di circa 6-7 
(aggiustato con carbonato di calcio), una conduttività ionica bassa (minore di 6 mS/cm o concentrazione di sali inferiore a 0,5 %) e non essere troppo contami ­
nato da ammoniaca o urina animale. Si può utilizzare anche la terra da giardino 
che si trova in commercio, priva di additivi, oppure terreno artificiale quale 
definito dall’OCSE (48), o ancora una miscela di entrambi in parti uguali. Il substrato dovrebbe essere umido ma non troppo bagnato. Le cassette d’alleva ­
mento più idonee hanno capacità compresa tra 10 e 50 litri.
 
Per ottenere una popolazione di lombrichi omogenea per età e massa, è consi ­
gliabile iniziare l’allevamento con i bozzoli. A tal fine introdurre una quantità di 
animali adulti in una cassetta d’allevamento contenente substrato fresco. L’espe ­
rienza dimostra che si ottengono buoni tassi di riproduzione con una densità demografica di circa 100 lombrichi adulti per kg di substrato (peso umido). Dopo 28 giorni togliere i lombrichi adulti. I lombrichi nati dai bozzoli sono 
utilizzati per le prove una volta adulti, ossia dopo almeno 2 mesi dalla schiusa 
ma non oltre 12 mesi.
 
Si può ritenere che i lombrichi delle specie qui descritte godano di buona salute 
se si muovono nel substrato, non tentano di fuggire e si riproducono continua ­
mente. Una certa inazione o una colorazione gialla dell’estremità posteriore (nel 
caso di  Eisenia fetida ) sono indici di impoverimento del substrato. In tal caso si 
raccomanda di utilizzare substrato fresco e/o ridurre il numero di animali per cassetta.
 
Bibliografia scelta di approfondimento  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Lan ­
dwirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1323
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
 
Enchitreidi  
La specie consigliata per questa prova è  Enchytraeus albidus  (Henle 1837 — 
verme bianco).  Enchytraeus albidus  è una delle specie di maggiori dimensioni 
(fino a 15 mm) della famiglia di anellidi oligocheti degli Enchitreidi ed è diffusa in tutto il mondo (8). La si ritrova in ambiente marino, dulciacquicolo e terrestre, 
principalmente nella materia organica in putrefazione (alghe, compost), talvolta 
nei terreni prativi (42). L’ampia valenza ecologica che caratterizza questa specie e alcune sue variazioni morfologiche indicano che potrebbero esistere varie razze.
 
Enchytraeus albidus  è reperibile in commercio, sotto forma di mangime per 
pesci. Occorre verificare se l’allevamento è contaminato da altre specie, general ­
mente più piccole (60), nel qual caso gli animali vanno lavati con acqua in una capsula Petri. Per avviare un nuovo allevamento, scegliere gli esemplari adulti di grandi dimensioni (prelevandoli con un microscopio stereoscopico) e scartare 
tutti gli altri. Il ciclo di vita di questo animale è breve, dato che raggiunge la 
maturità in un tempo oscillante tra 33 (a 18 °C) e 74 giorni (a 12 °C). Utilizzare per questa prova solo gli animali che siano stati tenuti in laboratorio almeno 5 settimane (una generazione) e che non abbiano mostrato complicazioni.
 
Anche altre specie del genere  Enchytraeus  sono adatte per questa prova, in 
particolare  Enchytraeus luxuriosus.  Questa specie è prevalentemente terricola, 
come è stato recentemente descritto in (65). Se si impiegano altre specie di  
Enchytraeus  occorre identificarle in modo chiaro e giustificare tale scelta nella 
relazione.  
La specie  Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) appartiene allo 
stesso gruppo di  Enchytraeus luxuriosus . Poiché questa specie è stata descritta 
solo negli allevamenti di lombrichi e nei mucchi di compost (Römbke 2003), la 
sua esistenza in natura non è certa e quindi non se ne conoscono le esigenze 
ecologiche. Pur tuttavia, alcuni studi recenti di laboratorio condotti su vari tipi di terreno hanno confermato la grande tolleranza di questa specie verso caratteri ­
stiche del suolo quali ph e struttura (Jänsch  et al.  2005). Negli ultimi anni essa è 
stata spesso utilizzata negli studi ecotossicologici proprio perché semplice da 
allevare e da saggiare (Kuperman  et al.  2003). Presenta tuttavia l’inconveniente 
delle piccole dimensioni, che, essendo in media da 3 a 12 mm (Westheide & Müller 1996), ne rendono difficoltosa la manipolazione rispetto a  Enchytraeus 
albidus . Quando si utilizza questa specie invece di  Enchytraeus albidus , i reci­
pienti di prova possono essere più piccoli, ma non necessariamente. Va inoltre tenuto in considerazione che questa specie si riproduce molto rapidamente, con un tempo di moltiplicazione inferiore a 20 giorni a 20 ± 2 °C (Achazi  et al.  
1999) se non ancor più basso a temperature più elevate.
 
Gli enchitreidi della specie  Enchytraeus albidus  (così come di altre specie di 
enchitreidi) possono essere allevati in grandi cassette di plastica (di dimensioni, ad esempio, 30 × 60 × 10 cm oppure, per vermi piccoli, 20 × 12 × 8 cm) 
riempite di una miscela di terreno artificiale e terra da giardino reperibile in 
commercio, non contaminata e priva di additivi. Il compost è da evitare poiché può contenere sostanze tossiche, come i metalli pesanti. Prima dell’utilizzo, eliminare la fauna indigena dal terreno di allevamento surgelandolo tre volte. 
È possibile utilizzare un terreno completamente artificiale, tenendo presente che il 
tasso di riproduzione potrebbe essere più lento rispetto a quello che si osserva con i substrati misti. Il substrato deve avere un pH di 6,0 ± 0,5. Tenere gli animali al buio, in un’incubatrice con temperatura di 15 ± 2 °C, evitando in 
ogni caso temperature superiori a 23 °C. Il terreno artificiale o naturale deve 
essere umido, ma non bagnato, tale che, se premuto leggermente con la mano, lasci filtrare in superficie solo qualche gocciolina d’acqua. Evitare di creare condizioni anossiche (se si utilizza un coperchio, accertarsi che abbia un numero 
di fori sufficienti a garantire un congruo ricambio d’aria). Il terreno va aerato 
rimescolandolo delicatamente una volta la settimana.
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Alimentare gli animali almeno a cadenza settimanale, a volontà, con fiocchi 
d’avena posti in una cavità sulla superficie del terreno e ricoperti di terra. Se 
rimane cibo dalla volta precedente, adeguare la nuova razione in funzione della quantità rimasta. Se il cibo restante presenta muffa, sostituirlo con una nuova razione di fiocchi d’avena. Per stimolare la riproduzione, i fiocchi d’avena pos ­
sono essere sostituiti, ogni due settimane, da una polvere proteica, reperibile in 
commercio, arricchita di vitamine. Dopo tre mesi trasferire gli animali in un substrato di allevamento fresco. Conservare i fiocchi d’avena in recipienti erme ­
ticamente chiusi e sterilizzarli in autoclave o riscaldarli prima di somministrarli, 
onde prevenire eventuali infestazioni da acari della farina (ad esempio  Glycy­
phagus sp. , Astigmata, Acarina) o da acari predatori [ad esempio  Hypoaspis 
(Cosmolaelaps) miles , Gamasida, Acarina]. Una volta disinfettato, macinare l’ali ­
mento in modo da poterlo distribuire con facilità sulla superficie del terreno. In 
alternativa ai fiocchi d’avena si può utilizzare lievito per panificazione o man ­
gime per pesci TetraMin
 ® . 
In linea di principio, le condizioni di allevamento sono soddisfacenti se gli 
animali non cercano di scappare dal substrato, si spostano rapidamente su di esso, presentano una livrea brillante, di colore bianco più o meno intenso, sulla 
quale le particelle di terreno non aderiscono e sono rappresentati da varie fasce 
d’età. Di fatto, si può ritenere che gli animali godano di buona salute se si riproducono continuamente.
 
Bibliografia scelta di approfondimento  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). New ­
sletter on Enchytraeidae 6: 117-126.  
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological re ­
quirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Re ­
views 13: 51-83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — IT — 22.03.2014 — 004.001 — 1325