1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 1
Trattandosidiunsemplice strumentodidocumentazione,essononimpegnalaresponsabilitàdelleistituzioni
►B REGOLAMENTO(CEE)n.2568/91DELLACOMMISSIONE
dell'11luglio1991
relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi
attinenti
(GU L 248 del 5.9.1991, pag. 1)
Modificato da:
Gazzetta ufficiale
n. pag. data
►M1Regolamento (CEE) n. 3682/91 della Commissione del 17 dicembre
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Regolamento (CEE) n. 1429/92 della Commissione del 26 maggio 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Regolamento (CEE) n. 1683/92 della Commissione del 29 giugno 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Regolamento (CEE) n. 1996/92 della Commissione del 15 luglio 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Regolamento (CEE) n. 3288/92 della Commissione del 12 novembre
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Regolamento (CEE) n. 183/93 della Commissione del 29 gennaio 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7Regolamento (CEE) n. 620/93 della Commissione del 17 marzo 1993 L 66 29 18.3.1993
Rettificato da:
►C1Rettifica, GU L 289 del 19.10.1991, pag. 38 (2568/91)
►C2Rettifica, GU L 347 del 28.11.1992, pag. 69 (2568/91)
►C3Rettifica, GU L 176 del 20.7.1993, pag. 26 (183/93)
▼B
REGOLAMENTO(CEE)n.2568/91DELLACOMMISSIONE
dell'11luglio1991
relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa
d'olivanonchéaimetodiadessiattinenti
LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,
visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre
1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati
nel settore dei grassi(1), modificato da ultimo dal regolamento (CEE)
n. 3577/90(2), in particolare l'articolo 35 bis,
considerando che l'allegato del regolamento n. 136/66/CEE prevede le
denominazioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansad'oliva commercializzati nei singoli Stati membri, nonché negli scambiintracomunitari e con i paesi terzi;
considerando che per poter distinguere i vari tipi di olio è opportuno
definire le caratteristiche fisico-chimiche di ciascuno di essi, nonchéle caratteristiche organolettiche degli oli vergini, per garantire lapurezza e la qualità dei prodotti in parola, salve le altre disposizionivigenti in materia;
considerando che è opportuno stabilire in modo uniforme in tutta la
Comunità la presenza delle caratteristiche dei vari tipi di olio; che a
tal fine occorre stabilire i metodi comunitari di analisi chimica e divalutazione organolettica; che occorre tuttavia autorizzare, durante unperiodo transitorio, il ricorso ad altri metodi di analisi applicati negliStati membri pur prevedendo che, in caso di divergenza dei risultati,saranno determinanti quelli ottenuti in base al metodo comune;
considerando che la definizione delle caratteristiche fisico-chimiche
degli oli d'oliva e dei metodi di analisi comporta l'adattamento dellenote complementari del capitolo 15 della nomenclatura combinata;
considerando che il metodo di valutazione delle caratteristiche organo-
lettiche degli oli vergini implica la costituzione di comitati diassaggiatori selezionati ed esperti e che è pertanto opportuno prevedere
il termine necessario per la realizzazione di siffatta struttura; che,
tenuto conto delle difficoltà che taluni Stati membri dovranno affron-tare per la costituzione dei comitati di assaggio, è opportunoautorizzare il ricorso ai comitati esistenti negli altri Stati membri;
considerando che per garantire il corretto funzionamento del sistema
dei prelievi applicabili all'importazione di sanse di oliva, è opportuno
prescrivere un metodo unico per determinare il tenore in olio di questi
prodotti;
considerando che per non recare pregiudizio agli scambi è opportuno
prevedere un periodo limitato per lo smaltimento dell'olio condizionatoprima dell'entrata in vigore del presente regolamento;
considerando che è opportuno abrogare il regolamento (CEE) n. 1058/
77 della Commissione(
3), modificato da ultimo dal regolamento (CEE)
n. 1858/88(4);
considerando che il comitato di gestione per i grani non ha emesso
alcun parere nel termine fissato dal suo presidente,1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 2
(1) GU n. 172 del 30. 9. 1966, pag. 3025/66.
(2) GU n. L 353 del 17. 12. 1990, pag. 23.
(3) GU n. L 128 del 24. 5. 1977, pag. 6.
(4) GU n. L 166 dell'1. 7. 1988, pag. 10.
▼B
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1
1. Sono considerati oli d'oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a),
b) e c) dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui carat-teristiche sono conformi a quelle indicate rispettivamente nei punti 1, 2
e 3 dell'allegato I del presente regolamento.
2. È considerato olio d'oliva vergine lampante ai sensi del punto 1,
lettera d) dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui
caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 4,
del presente regolamento.
3. È considerato olio d'oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'alle-
gato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono
conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del presente regola-
mento.
4. È considerato olio d'oliva ai sensi del punto 3 dell'allegato del
regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi
a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente regolamento.
5. È considerato olio di sansa d'oliva greggio ai sensi del punto 4
dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche
sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del presente
regolamento.
6. È considerato olio di sansa d'oliva raffinato ai sensi del punto 5
dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche
sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del presente
regolamento.
7. E considerato olio di sansa d'oliva ai sensi del punto 6 dell'alle-
gato del regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono
conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 9, del presente regola-mento.
Articolo 2
1. Le caratteristiche degli oli contemplati nell'allegato I sono deter-
minate in base ai seguenti metodi di analisi:
— per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percen-
tuale di acido oleico, il metodo di cui all'allegato II,
— per la determinazione dell'indice di perossido, il metodo di cui
all'allegato III,
— per la determinazione degli alcoli alifatici, il metodo di cui all'alle-
gato IV,
— per la determinazione del contenuto di steroli, il metodo di cui
all'allegato V,
— per la determinazione dell'eritrodiolo + uvaolo, il metodo di cui
all'allegato VI,
— per la determinazione degli acidi grassi saturi in posizione 2 del
trigliceride, il metodo di cui all'allegato VII,
— per la determinazione del tenore di trigliceridi, il metodo di cui
all'allegato VIII,
— per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui all'allegato IX,
— per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo
di cui all'allegato X «A» e X «B»,
— per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di
cui all'allegato XI,
— per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli
d'oliva vergini, il metodo di cui all'allegato XII, applicato confor-memente al paragrafo 2,
— per la prova di raffinazione, il metodo di cui all'allegato XIII.
2.►
M3L'analista competente in analisi sensoria o assistito da
periti◄, procede alla valutazione delle caratteristiche organolettiche
secondo la procedura descritta nella scheda di assaggio di cui all'alle-gato XII. Qualora l'analista constati caratteristiche organolettiche1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 3
▼B
diverse da quelle risultanti dalla denominazione del prodotto, è tenuto a
fare esaminare il campione da un comitato di assaggio, conformementealle disposizioni dell'allegato XII.
Ogni analisi di revisione è effettuata dal comitato di assaggio confor-
memente alle dette disposizioni.
Per la valutazione delle caratteristiche organolettiche nel corso delle
operazioni legate al regime d'intervento il comitato di assaggio procedea tale valutazione conformemente all'allegato XII.
Articolo 3
Fino al►
M628 febbraio 1993 ◄, l'introduzione dei metodi di analisi
contemplati all'articolo 2 non osta a che gli Stati membri adottino altrimetodi provati e scientificamente affidabili, a condizione di non osta-colare la libera circolazione dei prodotti riconosciuti conformi alla
normativa di applicazione dei metodi comunitari. Gli Stati membri
interessati notificano tali altri metodi alla Commissione prima di appli-carli.
Qualora uno di questi altri metodi dovesse dare un risultato diverso da
quello ottenuto con l'applicazione del metodo comune, si tiene contosolo del risultato ottenuto con l'applicazione del metodo comune.
Articolo 3bis
In caso di divergenza sulle caratteristiche organolettiche di un olio
oggetto di scambi commerciali, le parti interessate possono rivolgersi
a un comitato di assaggio riconosciuto di loro scelta.
Articolo 3ter
Qualora si constati che le caratteristiche organolettiche di un olio sono
diverse da quelle proprie alla sua denominazione, lo Stato membrointeressato applica sanzioni pecuniarie amministrative, la cui entità èstabilita in base alla gravità dell'irregolarità accertata, ferme restandoaltre sanzioni eventuali.
Ai fini della valutazione dell'irregolarità si tiene conto, in particolare,
dell'evoluzione naturale delle caratteristiche di un olio che sia stato
conservato in condizioni normali.
All'inizio di ogni semestre gli Stati membri informano la Commissione
in merito al numero e alla natura delle irregolarità constatate, nonché inmerito alle sanzioni irrogate nel semestre precedente.
Articolo 4
1. Ai fini della valutazione delle caratteristiche organolettiche, gli
Stati membri costituiscono comitati di assaggio incaricati del controlloufficiale di dette caratteristiche, i quali rispondano ai seguenti requisiti:
— essere costituiti da assaggiatori selezionati e formati secondo le
norme previste dal metodo di cui all'allegato XII;
— possedere le attrezzature e il materiale necessari per procedere alla
valutazione organolettica secondo le norme previste dal metodo
succitato;
— utilizzare il vocabolario proprio dell'analisi sensoria dell'olio d'oliva,
il foglio del profilo e la tabella di punteggio previsti dal medesimometodo;
— impegnarsi ad eseguire le valutazioni organolettiche previste a
livello comunitario o internazionale all'atto di controlli periodici odi sessioni di armonizzazione dei criteri di percezione;
— impegnarsi a comunicare annualmente alla Commissione tutte le
informazioni concernenti i cambiamenti intervenuti nella composi-zione del comitato e il numero di valutazioni effettuate in veste dicomitato riconosciuto.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 4
▼M5
▼M5
Ciascuno Stato membro procede al riconoscimento dei comitati costi-
tuiti sul suo territorio in possesso dei requisiti di cui sopra e traquesti, ne designa uno o più d'uno, incaricati delle analisi di revisione.
I comitati istituiti dagli Stati membri anteriormente al 1
onovembre
1992 secondo le norme previste dal metodo di cui all'allegato XII siconsiderano riconosciuti ai sensi del presente articolo.
Ogni Stato membro comunica alla Commissione e agli altri Stati
membri l'elenco dei comitati riconosciuti.
2. Lo Stato membro che incontri difficoltà per la costituzione di un
comitato di assaggio sul proprio territorio può ricorrere ad un comitato
di assaggio riconosciuto da un altro Stato membro.
3. Ogni Stato membro compila l'elenco dei comitati di assaggio isti-
tuiti da associazioni professionali o interprofessionali in conformità del
paragrafo 1 e controlla il rispetto di dette norme.
Articolo 5
Le note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della nomenclatura
combinata di cui all'allegato I del regolamento (CEE) n. 2658/87 delConsiglio(
1), sono sostituite da quelle che figurano nell'allegato XIV
del presente regolamento.
Articolo 6
1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione
dell'olio (codice NC 2306 90 11 e 2306 9019) è determinato conforme-mente al metodo che figura nell'allegato XV.
2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del
suo peso rispetto a quello della sostanza secca.
Articolo 7
Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di
sostanze indesiderabili diverse da quelle di cui all'allegato XI.
Articolo 8
1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misure adot-
tate per l'applicazione del presente regolamento.
2. Ogni Stato membro comunica alla Commissione, alla fine di ogni
semestre, un riassunto dei dati analitici delle determinazioni effettuati
nel corso del semestre precedente.
Detti risultati sono esaminati dal comitato di gestione dei grassi
secondo la procedura prevista all'articolo 39 del regolamento n. 136/
66/CEE.
Articolo 9
Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.
Articolo 10
1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo
a quello della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità
europee.
Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decor-
rere dal ►
M11onovembre 1992 ◄, salvo per quanto riguarda le
operazioni legate all'intervento.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 5
(1) GU n. L 256 del 7. 9. 1987, pag. 1.▼M6
▼B
▼M5
Questo metodo non si applica all'olio d'oliva vergine condizionato ante-
riormente al 1onovembre 1992.
2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di
sansa d'oliva condizionati anteriormente all'entrata in vigore delpresente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre 1992.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e diretta-
mente applicabile in ciascuno degli Stati membri.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 6
▼B
▼B
ALLEGATI
Sommario
Allegato I: Caratteristiche degli oli di oliva …
Allegato II: Determinazione dell'acidità …
Allegato III: Determinazione del numero di perossidi …Allegato IV: ►
M6Determinazione del contenuto di cere mediante
gascromatografia con colonna capillare ◄…
Allegato V: Determinazione della composizione e del contenuto di
steroli mediante gascromatografia con colonna capillare …
Allegato VI: Determinazione dell'eritrodiolo e dell'uvaolo …Allegato VII: Determinazione degli acidi grassi in posizione 2 nel trigli-
ceride …
Allegato VIII: Determinazione del contenuto di trilinoleina …Allegato IX: Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto …
Allegato X «A»: Analisi gascromatografica degli esteri metilici degli acidi
grassi …
Allegato X «B»: Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi in
conformità all'allegato VI — punti I e II del regolamento
(CEE) n. 72/77 della Commissione oppure in alternativa il
metodo seguente …
Allegato XI: Determinazione del tenore dei solventi alogenati …
Allegato XII: Valutazione organolettica dell'olio di oliva vergine …
Allegato XIII: ►
M6Neutralizzazione e decolorazione dell'olio d'oliva in
laboratorio ◄…
Allegato XIV: Note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della Nomen-
clatura combinata …
Allegato XV: Metodo di determinazione del tenore in olio d'oliva delle
sanse …
Allegato XVI: Determinazione del numero di iodio …1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 7
ALLEGATOI
CARATTERISTICHEDEGLIOLID'OLIVA
Categoria Acidità %Numero
dei peros-
sidi mcq
O2/kgSolventi
alogenati
mg/kg (1)Cere mg/
kgAcidi
saturi in
posizione 2
del trigli-
ceride %Eritrodiolo
+ uvualo
%Tritino-
leino %Colesterolo
%Brassico-
sterolo %Campeste-
rolo %Stigmeste-
rolo %Beta sito-
sterolo
%(2)Delta 7
stimeste-
rolo %Steroidi
totali mg/
kg
1. Olio di oliva vergine
extra M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
2. Olio di oliva vergine M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0003. Olio di oliva vergine
corrente M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
4. Olio di oliva vergine
lampante > 3,3 > 20 > 0,20 ►
C3
M 350
◄M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1 000
5. Olio di oliva raffi-
nato M 0,5 M 10 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
6. Olio di oliva M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0007. Olio di sansa di
olivo greggio m 2,0 — — — M 1,8 m 12 ►
M7
M 0,7
◄M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2 500
8. Olio di sansa di
oliva raffinato M 0,5 M 10 M 0,20 — M 2,0 m 12 ►M7
M 0,6
◄M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
9. Olio di sansa di
oliva M 1,5 M 15 M 0,20 > 350 M 2,0 > 4,5 ►M7
M 0,6
◄M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
M = massimo, m = minimo.
(1) Limite massimo complessivo per i composti rivelati dal rivelatore a cattura di elettroni. Per i componenti accertati singolarmente il limite massi mo è 0,10 mg/kg.
(2) (Delta-5-23-Stigmastodienolo + Cierosterolo + Betasitosterolo + Sitostanolo + Delta-5-24 Stigmastodienolo).▼B1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 8▼M6
ALLEGATOI(seguito)
CategoriaComposizione acidica
Somma
isomeri
transoleici
%Somma
isomeri
translinolei-
ci +translin-
olenici
%K232K270K270con
allumina +Delta K Panel testNiriatico
%Linolenico
%Arachido
%Eicoeenico
%Beenico
%Lignocerico
%
1. Olio di oliva vergine
extra M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 ≥6,5
2. Olio di oliva vergine M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥5,5
3. Olio di oliva vergine
corrente M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥3,5
4. Olio di oliva vergine
lampante M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,10 < 0,10 M 3,70 > 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Olio di oliva raffi-
nato M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —
6. Olio di oliva M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Olio di sansa di oliva
greggio M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,10 —————
8. Olio di sansa di oliva
raffinato M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Olio di sansa d'oliva M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
Ai fini della constatazione della purezza, qualora il K270superi il limite della categoria corrispondente, si deve procedere alla determinazione del K270dopo il passaggio su allumina.▼B1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 9▼M2
▼M6
▼B
ALLEGATOII
DETERMINAZIONEDELL'ACIDITÀ
1. OGGETTO
Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi
grassi liberi viene espresso mediante l'acidità calcolata in modo conven-
zionale.
1.1.Principio
Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela
di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una
soluzione etanolica di idrossido di potassio.
1.2.Reattivi
Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua
impiegata dev'essere acqua distillata o di purezza equivalente.
1.2.1. Etere dietilico — etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 - 1 in volume.
Nota:l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplo-
sivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari.
Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di
idrossido di potassio (1.2.2) in presenza di 0,3 ml della soluzione di
fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela.
Nota:se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una
miscela di solventi costituita da etanolo e da toluene. Se neces-
sario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.
1.2.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata c(KOH) all'incirca
0,1 mol oppure, se necessario, c( ►C2KOH◄) 0,5 mol circa.
La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio
deve essere nota e verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare
una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un
flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve
essere incolore o giallo pallida.
Nota:una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere
preparata come segue. Portare e mantenere per un'ora all'ebolli-
zione a ricadere 1 000 ml di etanolo con 8 g di idrossido di
potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente.
Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di
potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido
chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio.
La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come
segue. A 1 000 ml di etanolo aggiungere 4 ml di butilato di allu-
minio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il
liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idro-
ssido di potassio. Questa soluzione è pronta per l'uso.
1.2.3. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alca-
lino (nel caso di sostanze grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l
nell'etanolo al 95-96 % (V/V).
1.3.Apparecchiatura
Materiale corrente da laboratorio, in particolare:
1.3.1. Bilancia analitica.1.3.2. Beuta, avente una capacità di 250 ml.
1.3.3. Buretta, avente una capacità di 10 ml, graduata in 0,05 ml.
1.4.Mododioperare
1.4.1. Preparazione del campione da analizzare.
La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità
+ impurezze è inferiore all'1 %, sul campione tal quale.
1.4.2. Sostanza da analizzare1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 10
▼B
Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero
di acidità presunto, secondo le indicazioni della seguente tabella.
Numero di acidità
presuntoMassa della sostanza da
analizzare
(in g)Precisione della pesata
della sostanza da analiz-
zare
(in g)
< 1 20 0,05
1 a 4 10 0,024 a 15 2,5 0,01
15 a 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).
1.4.3. Determinazione
Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50—150 ml della
miscela etere etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata.
Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l
(1.2.2) ( ►
C2vedi nota 2 ◄) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione
rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s).
Nota1:La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può
essere sostituita con una soluzione acquosa di idrossido di
potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non comporta
una separazione di fasi.
Nota2:Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio
di 0,1 mol/l supera i 10 ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l.
Nota3:Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere
un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (1.2.1) per
ottenere una soluzione chiara.
1.5.Espressionedell'acidità come%diacidooleico.
L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
dove:
V = è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di
potassio usata;
c = è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata
di idrossido di potassio usata;
M = è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per
l'espressione del risultato (acido oleico = 282);
m = è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare.
Prendere come risultato la media aritmetica ►M6di due determina-
zioni◄.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 11
▼B
ALLEGATOIII
DETERMINAZIONEDELNUMERODIPEROSSIDI
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli
e grassi.
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Oli e grassi animali e vegetali.
3. DEFINIZIONE
Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel
campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossi-
dano lo ioduro di potassio nelle condizioni che vengono descritte.
4. PRINCIPIO
Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio,
con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con
soluzione di tiosolfato di sodio standardizzata.
5. APPARECCHIATURA
Tutta l'apparecchiatura usata dev'essere esente da sostanze riducenti od
ossidanti.
Nota:Non ungere le superfici smerigliate.
5.1. Ditale di vetro da 3 ml.5.2.►
C2Palloni a collo e tappo smerigliato ◄, aventi una capacità di circa
250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto
o, di preferenza, anidride carbonica).
5.3. Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml.
6. REAGENTI
6.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facen-
dovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco.
6.2. Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facen-
dovi gorgogliare una corrente di gas puro e secco.
6.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione,
esente da iodio e da iodati.
6.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente stan-
dardizzata immediatamente prima dell'uso.
6.5. Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione
da amido naturale solubile.
7. CAMPIONE
Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco
e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati erme-
ticamente con tappi a smeriglio o di sughero.
8. PROCEDIMENTO
La prova dev'essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce
artificiale. Pesare in un ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un
pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione
conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 12
▼B
Numero di perossidi previsto
(meq)Peso della sostanza da analizzare
(in g)
0 — 12 5,0 — 2,0
12 — 20 2,0 — 1,220 — 30 1,2 — 0,830 — 50 0,8 — 0,5
50 — 90 0,5 — 0,3
Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la
sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere
la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido
acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3). Ritappare
rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al
riparo dalla luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25 ºC.
Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con
una soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) (soluzione 0,002 N per valori
previsti inferiori a 12 e soluzione 0,01 N per valori previsti superiori a
12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come indi-
catore.
Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.
Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del
bianco supera 0,05 ml di soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (6.4), sosti-
tuire i reagenti impuri.
9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il numero di perossidi (P.V.), espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo
per kg, viene dato dalla formula:
P:V:¼
V/C2T
m/C21000
dove:
V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di
sodio (6.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della
prova in bianco.
T = è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4)
usata.
m = è il peso in g della sostanza da analizzare.
Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni
eseguite.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 13
▼B
ALLEGATOIV
DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI ALCOLI ALIFATICI
MEDIANTEGASCROMATOGRAFIACONCOLONNACAPILLARE
1. OGGETTO
Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del conte-
nuto di alcoli alifatici, singoli e totali, delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di 1-eicosanolo quale standard interno,
è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi
l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.
Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione degli alcoli mediante
cromatografia su placca di gel di silice basica; gli alcoli recuperati dal
gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati
mediante gascromatografia in colonna capillare.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a
smeriglio.
3.2. Imbuti separatori da 500 ml.3.3. Matracci da 250 ml.3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per
lastre di vetro 20 × 20 cm.
3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.3.6. Microsiringhe da 100 µl e 500 µl.3.7. Imbuto filtrante cilindrico con setto poroso G 3 (porosità 15-40 µl) di
diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtra-
zione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.
3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adatta-
bile all'imbuto filtrante (3.7).
3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.
3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare,
dotato di sistema di splittaggio, costituito da:
3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura
desiderata con la precisione di ± 1 ºC.
3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporiz-
zante in vetro persilanizzato.
3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-
amplificatore (3.10.3), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo
e con velocità della carta variabile.
3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro
interno 0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o
SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e
0,30 µm.
3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 µl con ago cementato.
4. REAGENTI
4.1. Potassio idrossido, soluzione metanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto
raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in
200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La
soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.
4.2. Etere etilico, puro per analisi.4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.
4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluore-
scenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per
l'uso).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 14
▼B
4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 0,2 N: si sciolgono 13 g di
idrossido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con
etanolo.
4.6. Benzene, per cromatografia. (vedi 5.2.2)4.7. Acetone, per cromatografia. (vedi 5.2.2)4.8. Esano, per cromatografia. (vedi 5.2.2)4.9. Etere etilico, per cromatografia.4.10. Cloroformio, puro per analisi.4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: miscela di
alcoli da C
20aC28soluzione al 5 % in cloroformio.
4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende legger-
mente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di
idrossido di potassio.
4.13. Piridina anidra, per cromatografia.4.14. Esametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli alcoli alifatici da C
20aC28.
Si preparano al momento dell'impiego da miscele di alcoli puri.
4.17. 1-eicosanolo, soluzione allo 0,1 (m/V) in cloroformio (standard
interno).
4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.
4.19. Gas ausiliari:
— idrogeno, puro per gascromatografia
— aria, pura per gascromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione dell'insaponificabile.5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegando la microsiringa da
500 µl, un volume di soluzione di 1-eicosanolo(
1) allo 0,1 % in cloro-
formio (4.17) che contenga una quantità di 1-eicosanolo corrispondente
a circa il 10 % del contenuto di alcoli alifatici nell'aliquota di campione
da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di campione si
aggiungano 250 µl della soluzione di 1-eicosanolo allo 0,1 % se trattasi
di oli di oliva ►M6 ◄e 1 500 µl se trattasi di olio di
sansa di oliva.
Si evapora il cloroformio in corrente di azoto fino a secchezza, quindi
nello stesso matraccio si pesano esattamente circa 5 g di campione
secco e filtrato.
5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N,
si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su
bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione
avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento
ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata
facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e
si raffredda il matraccio a circa 30 ºC.
5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto
separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese,
impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa
80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si
lascia stratificare (nota 1).
Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo
imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estra-
zioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70 ml di etere
etilico.
Nota1— Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo,
mediante spruzzetta, piccole quantità di alcool etilico o meti-
lico.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 15
(1) Può essere usato in alternativa 1-eneicosanolo.
▼B
5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano
con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque
di lavaggio.
Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si
filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente
pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico.
5.1.5. Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero
vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100 ºC
per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa.
5.2. Separazione della frazione degli alcoli.
5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice
(4.4.), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di
potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa
per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100 ºC per 1 ora.
Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio
fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere
impiegate entro 15 giorni).
Nota2— Impiegando per la separazione della frazione alcolica delle
lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del tratta-
mento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono
trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura
acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così le bande degli
alcoli alifatici e terpenici nettamente separate dalla banda degli
steroli.
5.2.2. ►M6Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela
esano-etere etilico 65:35 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm(1).◄Si
chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno
mezz'ora in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle
superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di
carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette
di ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più
uniforme e regolare eluizione dei componenti.
Nota3— Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente
riproducibili la miscela di sviluppo deve essere sostituita ad
ogni prova.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in
cloroformio e, con la microsiringa da 100 µl si depositano su una placca
cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml di detta
soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento
con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-
3 µl della soluzione di riferimento degli alcoli (4.11), allo scopo di
identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli alcoli alifatici.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in
5.2.2. La temperatura dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 ºC. Si chiude
subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del
solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si
rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il
solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca per un pò
di tempo sotto cappa.
5.2.5. Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di
2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si
individua la banda degli alcoli alifatici per allineamento con la macchia
ottenuta con la soluzione di riferimento e si delimita con una matita
nera l'insieme della banda degli alcoli alifatici e della banda immedia-
tamente superiore corrispondente agli alcoli triterpenici.
Nota4— La prescrizione di raccogliere insieme alla banda degli alcoli
alifatici anche la banda degli alcoli triterpenici è dettata dal
fatto che in questa, nelle condizioni del metodo, vengono inglo-
bate significative quantità di alcoli alifatici.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area
delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene intro-
dotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di cloroformio
caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 16
(1) In questi casi particolari, per ottenere una buona separazione delle bande è necessario
utilizzare la miscela eluente benzene-acetone 95:5 (V/V).
▼B
aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) colle-
gata all'imbuto filtrante.
Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml
per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata
all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si
trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previa-
mente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera
corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta
ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 ºC, indi si lascia
raffreddare in essiccatore e si pesa.
Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione alcolica.
5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.5.3.1. Nella provetta contenente la frazione alcolica si aggiunge il reattivo per
la sililazione, costituito da una miscela di ►
C2piridina-esametildisila-
zanotrimetilchlorsilano ◄9:3:1 (V/V/V) (nota 5) in ragione di 50 µl
per ogni milligrammo di alcoli, evitando ogni assorbimento di umidità
(nota 6).
Nota5— Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono
inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali as esempio il
bis- trimetiltrifluoroacetammide + 1 % trimetilclorosilano da
diluire con uno stesso volume di piridina anidra.
5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a
completa solubilizzazione degli alcoli. Si lascia a sé per almeno 15
minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti:
la soluzione limpida è pronta per l'analisi gàscromatografica.
Nota6— L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è
normale e non è causa di alcun disturbo. La formazione di un
flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono
indizio della presenza di umidità o di alterazione del reattivo.
In questo caso la prova dovrà essere ripetuta.
5.4. Analisi gascromatografica.5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.
5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di
ingresso all'evaporatore connesso col sistema di splittaggio, e il termi-
nale di uscita al rivelatore.
Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico
(tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del
sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.).
5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile proce-
dere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas
attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromato-
grafico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una
temperatura di almeno 20 ºC superiore a quella di esercizio (nota 7).
Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il
complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei
gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il
registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per
la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad
una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecu-
zione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare,
esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.
Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni
della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condiziona-
mento della colonna.
Nota7— La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere
inferiore di almeno 20 ºC alla temperatura massima prevista per
il liquido di ripartizione impiegato.
5.4.2. Scelta delle condizioni operative.5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
— temperatura della colonna: inizio isoterma 8 ′a 180 ºC, quindi
programma 5 ºC/minuto fino a 260 ºC e ancora 15 ′a 260 ºC
— temperatura dell'evaporatore: 280 ºC— temperatura del rivelatore: 290 ºC— velocità lineare del gas di trasporto: ►
C2elio 20-35 cm/s, idro-
geno 30-50 cm/s ◄1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 17
▼B
— rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100
— sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima
—►C2sensibilità di registrazione: 1 - 2 ◄mV fondo scala
— velocità della carta: 30 + 60 cm/ora— quantità di sostanza iniettata: ►
C20,5 − 1 ◄µl di soluzione di
TMSE.
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere
cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:
— il tempo di ritenzione dell'alcool C26deve essere 18 ± 5 minuti
— il picco dell'alcool C22deve essere per l'olio di oliva 80 ± 20 % del
fondo scala e per gli oli di semi 40 ± 20 % del fondo scala.
5.4.2.2. Per verificare i suddetti requisiti si effettuano ripetute iniezioni con le
miscele campione di TMSE degli alcoli e si ritoccano le condizioni
operative fino a raggiungere i migliori risultati.
5.4.2.3. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in
modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che
vengono presi in considerazione.
5.4.3. Esecuzione dell'analisi.5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 µl di esano, si aspirano 0,5 µl
di aria e successivamente ►
C20,5 − 1 ◄µl della soluzione del
campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago
sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di
iniezione e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi
lentamente l'ago dopo circa 5 secondi.
5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli
alcoli presenti.
La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti
(5.4.1.2.).
5.4.4. Identificazione dei picchi.
L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di
ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli alcoli, analizzate
nelle medesime condizioni.
Nella figura 1 è riportato un cromatogramma della frazione alcolica di
un olio di oliva vergine.
5.4.5. Valutazione quantitativa5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'1-eico-
sanolo e degli alcoli alifatici da C
22aC28.
5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo alcool, in ►C2mg/1 000 g di
sostanza grassa ◄come segue:
alcool x =Ax·ms·►M61 000◄
As·m
in cui:
Ax= area del picco dell'alcool x ►M6 ◄;
As= area del picco dell'1-eicosanolo ►M6 ◄;
ms= peso di 1-eicosanolo aggiunto, in milligrammi;
m = peso del campione prelevato per la determinazione, in grammi.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Si riportano i contenuti dei singoli alcoli alifatici, in ►C2mg/
1 000◄g di sostanza grassa e, come «alcoli alifatici totali», la loro
somma.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 18
▼B
APPENDICE
Determinazionedellavelocità linearedelgas
Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1
— 3 µl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a
percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del
picco (tM).
La velocità lineare in cm/s è data da L/tMin cui L è la lunghezza della colonna
in centimetri e tMè il tempo cronometrato in secondi.
1 = Eicosanolo
2 = Docosanolo3 = Tricosanolo
4 = Tetracosanolo
5 = Pentacosanolo6 = Esacosanolo
7 = Eptacosanolo
8 = Octacosanolo1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 19
▼M6
▼C3
▼B
ALLEGATOV
DETERMINAZIONEDELLACOMPOSIZIONEEDELCONTENUTODI
STEROLI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA
CAPILLARE
1. OGGETTO
Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del conte-
nuto di steroli, singoli e totali, delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di α-colestanolo quale standard interno,
è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi
l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.
Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione sterolica mediante
cromatografia su placca di gel di silice basica; gli steroli recuperati dal
gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati
mediante gascromatografia in colonna capillare.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a
smeriglio.
3.2. Imbuti separatori da 500 ml.
3.3. Matracci da 250 ml.3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per
lastre di vetro 20 × 20 cm.
3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.3.6. Microsiringhe da 100 µl e 500 µl.
3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 µm) di
diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtra-
zione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.
3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adatta-
bile all'imbuto filtrante (3.7.).
3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.
3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare,
dotato di sistema di splittaggio, costituito da:
3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura
desiderata con la precisione di ± 1 ºC.
3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporiz-
zante in vetro persilanizzato.
3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-
amplificatore (3.10.3.), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo
e con velocità della carta variabile.
3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro
interno 0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o
SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e
0,30 µm.
3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 µl con ago cementato.
4. REAGENTI
4.1. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto
raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in
200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La
soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.
4.2. Etere etilico, puro per analisi.
4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 20
▼B
4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluore-
scenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per
l'uso).
4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idro-
ssido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con
etanolo.
4.6. Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2).4.7. Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.8. Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.9. Etere etilico, per cromatografia.4.10. Cloroformio, puro per analisi.4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o
fitosteroli, soluzione al ►
M62%◄in cloroformio.
4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende legger-
mente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di
idrossido di potassio.
4.13. Piridina anidra, per cromatografia.
4.14. Esametildisilazano.
4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al
momento dell'impiego partendo da steroli puri o da miscele di steroli
ottenute da oli che li contengano.
4.17. α-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard
interno).
4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.4.19. Gas ausiliari:
— idrogeno, puro per gascromatografia
— aria, pura per gascromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione dell'insaponificabile.
5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da
500 µl, un volume di soluzione di α-colestanolo allo 0,2 % in cloro-
formio (4.17.) che contenga una quantità di α-colestanolo
corrispondente a circa il 10 % del contenuto di steroli nell'aliquota di
campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di
campione si aggiungano 500 µl della soluzione di α-colestanolo allo
0,2 % se trattasi di un olio di oliva e 1500 µl se trattasi di
►
M6 ◄olio di sansa di oliva.
Si evapora in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso
matraccio si pesano esattamente 5 g di campione secco e filtrato.
In caso di oli ►M6 ◄contenenti quantità notevoli di
colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione
identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione stero-
lica in doppio con e senza standard interno ►M6oppure utilizzare
betulinolo al posto del colesterolo ◄.
5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N,
si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su
bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione
avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento
ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata
facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e
si raffredda il matraccio a circa 30 ºC.
5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto
separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese,
impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa
80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si
lascia stratificare (nota 1).
Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo
imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estra-
zioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70 ml di etere
etilico.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 21
▼B
Nota1— Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo,
mediante spruzzetta, piccole quantità di alcool etilico o meti-
lico.
5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano
con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque
di lavaggio.
Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si
filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente
pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico.
5.1.5. Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero
vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100 ºC
per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa.
5.2. Separazione della frazione sterolica.5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice
(4.4.), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di
potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa
per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100 ºC per 1 ora.
Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio
fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere
impiegate entro 15 giorni).
Nota2Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle
lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del tratta-
mento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono
trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura
acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così la banda degli
steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e
triterpenici.
5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-
acetone 95:5 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può
essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35 (V/V). Si chiude la
camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora
in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici
interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro
che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di
circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare
eluizione dei componenti.
Nota3:Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente ripro-
ducibili la miscela di sviluppo deve essere sostituita ad ogni
prova.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in
cloroformio e, con la microsiringa da 100 µl si depositano su una placca
cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml di detta
soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento
con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-
3 µl della soluzione di riferimento degli steroli (4.11.), allo scopo di
identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in
5.2.2. La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 ºC.
Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il
fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della
placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si
evapora il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca
per un pò di tempo sotto cappa.
5.2.5. Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di
2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si
individua la banda degli steroli per allineamento con la macchia otte-
nuta con la soluzione di riferimento; si delimitano con una matita nera
i limiti della banda lungo i margini di fluorescenza.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area
delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene intro-
dotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di cloroformio
caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra
aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) colle-
gata all'imbuto filtrante.
Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml
per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata
all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si
trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previa-1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 22
▼B
mente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera
corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta
ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 ºC indi si lascia
raffreddare in essiccatore e si pesa.
Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione sterolica.
5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per
la sililazione, costituito da una miscela di piridina-esametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 4) in ragione di 50 µl per ogni
milligrammo di steroli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 5).
Nota4— Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono
inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il
bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da
diluire son uno stesso volume di piridina anidra.
5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a
completa solubilizzazione degli steroli. Si lascia a sé per almeno 15
minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti:
la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.
Nota5— L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è
normale e non è causa di alcun disturbo. La formazione di un
flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono
indizio della presenza di umidità o di alterazione del reattivo.
In questo caso la prova dovrà essere ripetuta.
5.4. Analisi gascromatografica.5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di
ingresso all'evaporatore connesso col sistema di splittaggio e il termi-
nale di uscita al rivelatore.
Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico
(tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del
sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.).
5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile proce-
dere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas
attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromato-
grafico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una
temperatura di almeno 20 ºC superiore a quella di esercizio (nota 6).
Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il
complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei
gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il
registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per
la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad
una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecu-
zione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare,
esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva.
Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni
della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condiziona-
mento della colonna.
Nota6— La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere
inferiore di almeno 20 ºC alla temperatura massima prevista per
il liquido di ripartizione impiegato.
5.4.2. Scelta delle condizioni operative.5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
— temperatura della colonna: 260 ºC ± 5 ºC
— temperatura dell'evaporatore: 280 ºC— temperatura del rivelatore: 290 ºC— velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno
30 + 50 cm/s
— rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100— sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima— sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV f.s.— velocità della carta: 30 + 60 cm/ora— quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 µl di soluzione di TMSE.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 23
▼B
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteri-
stiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere
cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:
— il tempo di ritenzione del β-sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti
— il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto
medio 3 %) 15 ± 5 % del fondo scala, per l'olio di soia (contenutomedio 20 %) 80 ± 10 % del fondo scala
— si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario
che i picchi oltre che separati siano anche completamente risolti
cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima
dell'uscita del picco successivo. È tuttavia tollerata anche una riso-
luzione incompleta a condizione però che sia quantificabile secondo
la perpendicolare il picco a TRR 1,02.
5.4.3. Esecuzione dell'analisi.
5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 µl di esano, si aspirano 0,5 µl
di aria e successivamente 0,5 + 1 µl della soluzione del campione; si
alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si
introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e
dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente
l'ago dopo circa 5 secondi.
5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli
steroli presenti.
La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti
(5.4.1.2.).
5.4.4. Identificazione dei picchi.
L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di
ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli steroli, analizzate
nelle medesime condizioni.
Gli steroli vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, bras-
sicasterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo,
stigmasterolo, ∆
7-campesterolo, ∆5,23-stigmastadienolo, clerosterolo, β-
sitosterolo, sitostanolo, ∆5— -avenasterolo, ∆5,24-stigmastadienolo, ∆7-
stigmastenolo, ∆7-avenasterolo.
Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al sitosterolo
per le colonne SE 52 e SE 54.
Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli.
5.4.5. Valutazione quantitativa.
5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell' α-cole-
stanolo e degli steroli. Non vengono considerati i picchi di eventuali
componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella I. Il coeffi-
ciente di risposta dell' α-colestanolo si deve intendere unitario.
5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza
grassa, come segue:
sterolo x =Ax·ms· 100
As·m
in cui:
Ax= area del picco dello sterolo x ►M6 ◄;
As= area del picco dell' α-colestanolo ►M6 ◄;
ms= massa di α-colestanolo aggiunta, in milligrammi;
m = massa del campione prelevato per la determinazione, in
grammi.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
6.1 Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza
grassa e, come steroli totali, la loro somma.
6.2 Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto
fra l'area del picco corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi
degli steroli.
% dello sterolo x =Ax
ΣA· 1001991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 24
▼B
in cui:
Ax= Area del picco x,
ΣA = Sommatoria delle aree di tutti i picchi.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 25
▼B
APPENDICE
Determinazionedellavelocità linearedeigas
Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano
1 + 3 µl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a
percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del
picco (tM).
La velocità lineare in cm/s è data da L/tMin cui L è la lunghezza della colonna
in centimetri e tMè il tempo cronometato in secondi.
TabellaI
Tempi di ritenzione relativi degli steroli
Pi-
cc-
oIdentificazioneTempo di ritenzione
relativo
Colonna
SE 54Colonna
SE 52
1 colesterolo ∆-5-colesten-3 β-olo 0,67 0,63
2 colestanolo 5 α-colestan-3 β-olo 0,68 0,64
3 brassicasterolo [24S]-24-metil- ∆-5,22-colestadien-3 β-olo 0,73 0,71
4 24-metilencolesterolo 24-metilen- ∆-5,24-colestadien-3 β-olo 0,82 0,80
5 campesterolo [24R]-24-metil- ∆-5-colesten-3 β-olo 0,83 0,81
6 campestanolo [24R]-24-metil-colestan-3 β-olo 0,85 0,82
7 stigmasterolo [24S]-24-etil- ∆-5,22-colestadien-3 β-olo 0,88 0,87
8 ∆-7-campesterolo [24R]-24-metil- ∆-7-colesten-3 β-olo 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil- ∆-5,23-colestadien-3 β-olo 0,95 0,95
10 clerosterolo [24S]-24-etil- ∆-5,25-colestadien-3 β-olo 0,96 0,96
11 β-sitosterolo [24R]-24-etil- ∆-5-colesten-3 β-olo 1,00 1,00
12 sitostanolo 24-etil-colestan-3 β-olo 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-5-colesten-3 β-olo 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil- ∆-5,24-colestadien-3 β-olo 1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenolo [24R,S]-24-etil- ∆-7-colesten-3 β-olo 1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterolo [24Z]-24-etiliden- ∆-7-colesten-3 β-olo 1,16 1,161991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 26
▼B
Figura1
Gascromatogrammadellafrazionesterolicadiunoliodiolivagrezzo
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 27
▼B
Figura2
Gascromatogrammadellafrazionesterolica diunoliodiolivaraffinato
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 28
▼B
ALLEGATOVI
DETERMINAZIONEDELL'ERITRODIOLOEDELL'UVAOLO
PREMESSA
L'eritrodiolo (convenzionalmente inteso come l'insieme dei dioli eritro-
diolo ed uvaolo) è un costituente dell'insaponificabile, caratteristico di
alcune specie di sostanze grasse. La sua concentrazione risulta notevol-
mente più elevata negli oli di oliva di estrazione rispetto ad altri oli che
lo contengono (oli di oliva di pressione, oli di vinaccioli) e pertanto la
sua determinazione può servire per accertare la presenza di olio di oliva
di estrazione.
1. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per la determinazione dell'eritrodiolo
nelle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa viene saponificata con idrossido di potassio in solu-
zione etanolica, quindi si estrae l'insaponificabile con etere etilico e lo si
purifica per passaggio su colonna di allumina.
Si procede al frazionamento dell'insaponificabile mediante cromatografia
su strato sottile su placca di gel di silice e si isolano la bandadella
frazione sterolica e quella dell'eritrodiolo.
Gli steroli e l'eritrodiolo, recuperati dalla placca vengono trasformati in
trimetilsilileteri, la miscela è quindi analizzata mediante gascromato-
grafia.
Il risultato è espresso in percento di eritrodiolo rispetto all'insieme eritro-
diolo + steroli.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Apparecchiature prescritte nel metodo all'allegato V (Determinazione del
contenuto degli steroli).
4. REAGENTI
4.1. Reagenti prescritti nel metodo all'allegato V (determinazione del conte-
nuto degli steroli).
4.2. Soluzione di riferimento di eritrodiolo, allo 0,5 % in cloroformio.
5. PROCEDIMENTO5.1.Preparazione dell'insaponificabile.
Si procede come descritto al paragrafo 5.1.2. del metodo all'allegato V.
5.2.Separazionedell'eritrodiolo edeglisteroli.
5.2.1. Vedi paragrafo 5.2.1. del metodo all'allegato V.5.2.2. Vedi paragrafo 5.2.2. del metodo all'allegato V.
5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % in cloroformio dell'insaponificabile.
Con la microsiringa da 0,1 ml, si depositano su una placca cromatogra-
fica, a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, 0,3 ml di detta soluzione, in
striscia il più possibile sottile ed uniforme. Ad una estremità della placca
si depositano, come riferimento, alcuni microlitri delle soluzioni di cole-
sterolo e di eritrodiolo.
5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto al para-
grafo 5.2.1. La temperatura ambiente deve essere di circa 20 ºC. Si
chiude subito col coperchio e si eluisce fino a che il fronte del solvente
sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove la
placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria
calda.
5.2.5. Si spruzza la placca uniformemente con la soluzione alcolica di 2 ′,7′-
diclorofluoresceina. Esaminando la placca alla luce ultravioletta si indivi-
duano le bande degli steroli e dell'eritrodiolo in base all'allineamento con1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 29
▼B
i riferimenti, e si delimitano con una punta leggermente al di fuori dei
margini di fluorescenza.
5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nelle aree
delimitate. Il materiale asportato dalla placca viene riunito in bevuta da
50 ml; si aggiungono 15 ml di cloroformio caldo, si agita bene e si filtra
sull'imbuto a setto poroso trasferendo il gel di silice sul filtro stesso. Si
lava per tre volte con porzioni di 10 ml di cloroformio caldo per volta,
raccogliendo il filtrato in palloncino da 100 ml. Si evapora fino ad un
volume di 4-5 ml, si trasferisce in provetta da centrifuga a fondo conico
da 10 ml previamente tarata, si porta a secco con blando riscaldamento in
corrente di azoto e si pesa.
5.3.Preparazione deitrimetilsilileteri.
Si procede come descritto al paragrafo 5.3 del metodo all'allegato V.
5.4. Analisi gascromatografica.
Si procede come descritto al paragrafo 5.4 del suddetto metodo. Le
condizioni operative dell'analisi gascromatografica devono essere tali
che, oltre a soddisfare i requisiti richiesti per l'analisi degli steroli, portino
anche alla separazione dei TMSE dell'eritrodiolo e dell'uvaolo.
Iniettato il campione si lascia svolgere la carta fino a che siano stati eluiti
gli steroli presenti, l'eritrodiolo e l'uvaolo; si identificano quindi i picchi
(l'eritrodiolo e l'uvaolo hanno tempi di ritenzione relativi, rispetto al β-
sitosterolo, di circa 1,45 e 1,55 rispettivamente) e se ne calcolano le
aree come detto per gli steroli.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Eritrodiolo, % =A1+A2
A1+A2+ΣAsteroli· 100
in cui:
A1= area del picco dell'eritrodiolo ►M6 ◄,
A2= area del picco dell'uvaolo ►M6 ◄,
ΣAsteroli= somma delle aree degli steroli presenti
►M6 ◄.
Il risultato si esprime con una cifra decimale.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 30
▼B
ALLEGATOVII
DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI IN POSIZIONE 2 NEL
TRIGLICERIDE
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo per la determinazione della composizione di quella
frazione degli acidi grassi di un olio o di un grasso che viene esterificata
nella posizione 2 (oppure posizione interna) del glicerolo.
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo è applicabile agli oli e ai grassi aventi un punto di
fusione inferiore ai 45 ºC, a causa delle caratteristiche dell'azione della
lipasi pancreatica.
Esso non si può applicare indiscriminatamente agli oli e ai grassi conte-
nenti quantitativi sostanziali di: acidi grassi con 12 atomi di carbonio o
meno (oli di noci di cocco e di semi di palma, grasso butirrico), o acidi
grassi insaturi (con oltre quattro doppi legami) contenenti 20 o più atomi
di carbonio (oli di pesce e di animali marini), oppure acidi grassi conte-
nenti gruppi ossigenati diversi dal gruppo acido.
3. PRINCIPIO
Eventuale neutralizzazione di oli e grassi acidi in un solvente. Purifica-
zione filtrando attraverso una colonna di allumina. Idrolisi parziale dei
trigliceridi a opera della lipasi pancreatica in un periodo determinato.
Separazione dei monogliceridi formatisi mediante cromatografia su strato
sottile e metanolisi degli stessi. Analisi di questi esteri metilici mediante
cromatografia gas-liquido.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Pallone a fondo arrotondato, da 100 ml.
4.2. Pallone a fondo arrotondato, da 25 ml, con giunto smerigliato.4.3. Condensatore ad aria, di 1 m di lunghezza, idoneo ad essere montato sul
pallone a 4.2.
4.4. Beuta da 250 ml.
4.5. Bicchiere da 50 ml.4.6. Imbuto separatore da 500 ml.4.7. Colonna di vetro per cromatografia, avente un diametro interno di 13 mm,
una lunghezza di 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di
rubinetto.
4.8. Provetta da centrifuga di 10 ml, provvista di tappo di vetro smerigliato.4.9. Buretta da 5 ml, graduata in 0,05 ml.
4.10. Siringa ipodermica da 1 ml, provvista di ago sottile.
4.11. Microsiringa, idonea a rilasciare gocce di 3-4 µl.4.12. Diffusore per cromatografia su strato sottile.4.13. Piastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 20 × 20 cm.4.14. Vaschetta di sviluppo in vetro per cromatografia su strato sottile, con
coperchio a smeriglio, idoneo per le piastre 20 × 20.
4.15. Spray per cromatografia su strato sottile.4.16. Stufa regolata a 103 ± 2 ºC.4.17. Termostato regolabile tra 30 e 45 ºC con un'approssimazione di 0,5 ºC.
4.18. Evaporatore rotante.
4.19. Vibratore elettrico, che consenta un'agitazione vigorosa delle provette da
centrifuga.
4.20. Lampada a ultravioletto per l'esame delle piastre di strato sottile.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 31
▼B
Inoltre,perilcontrollo dell'attività dellalipasi:
4.21. pH metro.
4.22. Agitatore a spirale.
4.23. Buretta da 5 ml.
4.24. Cronometro.
Inoltre,perl'eventuale preparazionedellalipasi:
4.25. Agitatore da laboratorio, idoneo per la dispersione e la miscela di mate-
riali eterogenei.
5. REAGENTI
5.1. n-esano oppure, in mancanza di quest'ultimo, etere di petrolio (p. eb. 30-
50 ºC), di qualità per cromatografia.
5.2. 2-propanolo, oppure etanolo, al 95 % (V/V), di qualità per reagente anali-
tico.
5.3. 2-propanolo, oppure etanolo, soluzione acquosa 1/1.
5.4. Etere etilico, esente da perossidi.5.5. Acetone.
5.6. Acido formico, almeno al 98 % (m/m).
5.7. Solvente di sviluppo: miscela di n-esano (5.1), etere etilico (5.4) ed acido
formico (5.6) in proporzioni 70/30/1 (V/V/V).
5.8. Allumina attivata per cromatografia, neutra, grado Brockmann I.
5.9. Polvere di silice, con legante, di qualità idonea alla cromatografia su
strato sottile.
5.10. Lipasi pancreatica di qualità adeguata (nota 1, nota 2).
5.11. Idrossido di sodio, soluzione acquosa di 120 g/l.5.13. Cloruro di calcio (CaCl
2), soluzione acquosa di 220 g/l.
5.14. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 1 g/l.
5.15. Soluzione tampone: soluzione acquosa 1 M di tris-idrossimetilamminome-
tano, portata a pH 8 mediante aggiunta di acido cloridrico (5.12)
(controllare col potenziometro).
5.16. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95 % (V/V).
5.17. 2′,7′-diclorofluoresceina, soluzione di 2 g/l in etanolo al 95 % (V/V), resa
leggermente alcalina mediante aggiunta di 1 goccia di soluzione di idro-
ssido di sodio 1 N per 100 ml.
Inoltre,perilcontrollo dell'attività lipasica:
5.18. Olio neutralizzato.
5.19. Idrossido di sodio, soluzione acquosa 0,1 N.
5.20. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 200 g/l.
5.21. Gomma arabica, soluzione acquosa di 100 g/l.
6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Se il campione ha un'acidità inferiore al 3 %, determinata conformemente
all'allegato II, purificare direttamente su allumina conformemente al punto
6.2. Se il campione ha un'acidità superiore al 3 %, determinata conforme-
mente all'allegato II, neutralizzare con alcali in presenza di un solvente
conformemente al punto 6.1, quindi passare su allumina conformemente
al punto 6.2.
6.1. Neutralizzazione con alcali in presenza di solvente.
In un imbuto separatore (4.6) introdurre circa 10 g dell'olio grezzo e
aggiungere 100 ml di esano (5.1), 50 ml di 2-propanolo (5.2), poche gocce
di soluzione di fenolftaleina (5.16) e un quantitativo di soluzione di idro-
ssido di sodio (5.11) corrispondente all'acidità libera dell'olio, oltre a uno
0,3 % in eccesso. Agitare vigorosamente per 1 minuto, aggiungere 50 ml
di acqua distillata, agitare di nuovo e lasciar riposare.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 32
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Dopo la separazione, rimuovere lo strato di sapone che si trova sul fondo.
Rimuovere altresì eventuali strati intermedi (mucillagine, sostanza insolu-
bile). Lavare la soluzione di esano dell'olio neutralizzato
con successive porzioni da 25-30 ml della soluzione di 2-propanolo (5.3)
finché il colore rosa della fenolftaleina scompare. Eliminare la maggior
parte dell'esano mediante distillazione sotto vuoto nell'evaporatore rotante
(4.18), essiccare l'olio a 30-40 ºC sotto vuoto con l'ausilio di una corrente
di azoto puro finché l'esano è stato completamente rimosso.
6.2. Purificazione mediante allumina.
Preparare una sospensione di 15 g di allumina attivata (5.8) in 50 ml di
esano (5.1) e versarla, agitando, sulla colonna cromatografica (4.7).
Lasciare che l'allumina si depositi uniformemente e che il solvente scenda
ad 1-2 mm sopra l'assorbente. Versare cautamente sulla colonna una solu-zione di 5 g di olio in 25 ml di esano (5.1); raccogliere la totalità
dell'effluente dalla colonna in un pallone a fondo arrotondato (4.1).
7. PREPARAZIONE DELLE PIASTRE CROMATOGRAFICHE
Pulire accuratamente le piastre di vetro (4.13) con etanolo, etere di
petrolio ed acetone per eliminare qualsiasi traccia di sostanza grassa. In
una beuta (4.4) versare 30 g di polvere di silice (5.9). Aggiungere 60 ml
di acqua distillata. Tappare ed agitare fortemente per 1 minuto. Trasferire
immediatamente l'impasto nel diffusore (4.12) e coprire le piastre pulite
con uno strato di 0,25 mm.
Essiccare le piastre all'aria per 15 minuti e successivamente per un'ora
nella stufa (4.16) a 103 ± 2 ºC. Raffreddare le piastre in un essiccatore a
temperatura ambiente prima dell'uso.
Sono disponibili in commercio piastre preparate.
8. PROCEDIMENTO
8.1. Idrolisi con lipasi pancreatica.
In una provetta da centrifuga (4.8) pesare circa 0,1 g del campione prepa-
rato: se si tratta di grasso solido, si scioglie con 0,2 ml di esano (5.1),
scaldando leggermente se necessario. Aggiungere 20 mg di lipasi (5.10)
e 2 ml della soluzione tampone (5.15). Agitare energicamente, ma con
cautela e aggiungere successivamente 0,5 ml della soluzione di colato di
sodio (5.14) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio (5.13). Chiudere
la provetta con il tappo smerigliato, agitare con cautela (evitare di bagnare
il tappo), inserire la provetta immediatamente nel termostato (4.17) mante-
nuto a 40 ± 0,5 ºC ed agitare manualmente ►
C2esattamente 1
minuto ◄.
Togliere la provetta dal termostato ed agitare vigorosamente mediante
agitatore elettrico (4.19) ►C2esattamente per 2 minuti ◄.
Raffreddare immediatamente in acqua corrente; aggiungere 1 ml di acido
cloridrico (5.12) ed 1 ml di etere etilico (5.4). Tappare e agitare vigorosa-
mente mediante l'agitatore elettrico. Lasciar riposare e rimuovere lo strato
organico per mezzo della siringa (4.10), se necessario dopo aver centrifu-
gato.
8.2. Separazione dei monogliceridi mediante cromatografia su strato sottile.
Applicare l'estratto sulla piastra cromatografica con la microsiringa (4.11),
a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, in una linea sottile, uniforme, il più
stretta possibile. Sistemare la piastra nella vaschetta di sviluppo ben satu-
rata (4.14) e sviluppare col solvente di sviluppo (5.7) a circa 20 ºC, fino a
circa 1 cm dal bordo superiore della piastra.
Essiccare la piastra all'aria alla temperatura della vaschetta e spruzzare
con la soluzione di 2 ′,7′-diclorofluoresceina (5.17). Identificare la banda
del monogliceride (Rfcirca 0,035) sotto luce ultravioletta (4.20).
8.3. Analisi dei monogliceridi mediante cromatografia gas-liquido.
Rimuovere la banda ottenuta al punto 8.2 mediante una spatola (evitare di
rimuovere i componenti che restano sulla linea di base) e trasferire nel
pallone di metilazione (4.2).
Trattare la silice raccolta direttamente come descritto all'allegato X-B
alternativo in modo da trasformare i monogliceridi in esteri metilici ed
esaminare quindi gli esteri mediante gascromatografia come descritto
all'allegato X-A.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 33
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9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Calcolare la composizione dell'acido grasso nella posizione 2 con una
decimale (nota 3).
10. NOTE
Nota1:Controllo dell'attività della lipasi
Preparare una emulsione oleosa agitando una miscela di 165 ml
della soluzione di gomma arabica (5.21), 15 g di ghiaccio tritato
e 20 ml di un olio neutralizzato (5.18) in un agitatore adeguato.
In un bicchiere (4.5) versare 10 ml di questa emulsione, seguiti
da 0,3 ml della soluzione di colato di sodio (5.20) e 20 ml di
acqua distillata.
Sistemare il bicchiere in un termostato mantenuto a 37 ± 0,5 ºC
(nota 4); inserire gli elettrodi di un pHmetro (4.21) e un agitatore
a spirale (4.22). Mediante una buretta (4.23) aggiungere goccia a
goccia la soluzione di idrossido di sodio (5.19) fino a pH 8,5.
Aggiungere un quantitativo sufficiente di una sospensione
acquosa della lipasi (vedasi sotto). Non appena il pHmetro indica
un pH di 8,3, avviare il cronometro (4.24) e farvi gocciolare la
soluzione di idrossido di sodio (5.19) in modo da mantenere il
pH a 8,3. Leggere il volume di soluzione alcalina consumata
ogni minuto.
Registrare le osservazioni sotto forma di grafico, indicando le
letture di tempo nelle ascisse e i ml di soluzione alcalina neces-
sari per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere
un grafico lineare.
La sospensione di lipasi di cui sopra è una sospensione in acqua
all'1 per mille (m/m). Per ciascuna prova dev'essere usato un
quantitativo sufficiente di questa sospensione in modo che venga
consumato in 4 o 5 minuti circa 1 ml della soluzione alcalina. Di
solito sono necessari da 1 a 5 mg della polvere. L'unità di lipasi
viene definita come il quantitativo di enzima che libera 10 µ-
equivalenti di acido per minuto. Pertanto l'attività A della polvere
usata, misurata in unità di lipasi per mg, è indicata dalla formula
seguente:
A¼V/C210
m
dove V è il numero della soluzione di idrossido di sodio (5.19)
consumato per minuto, desunto dal grafico; m è la massa, in
mg, dell'aliquota della polvere da analizzare.
Nota2:Preparazione della lipasi
Sono disponibili in commercio lipasi aventi un'attività lipasica
soddisfacente. Tuttavia è possibile prepararle in laboratorio come
segue: Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 ºC; rimuo-
vere il grasso solido circostante e il tessuto connettivo e triturare
in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Mesco-
lare questa pasta con l'agitatore (4.25) per 4-6 ore con 2,5 l di
acetone anidro e centrifugare. Esterarre il residuo altre tre volte
con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela
1 / 1 (V/V) di acetone e di etere etilico e due volte con etere
etilico. Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da
ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero.
Nota3:In ogni caso è consigliabile determinare la composizione degli
acidi grassi totali dello stesso campione, dato che il confronto
con quelli degli acidi nella posizione 2 contribuirà all'interpreta-
zione dei dati ottenuti.
Nota4:La temperatura di idrolisi è fissata a 37 ºC, dato che si usa un
olio liquido. Tuttavia essa viene fissata a 40 ºC per il campione
da analizzare, in modo da consentire l'esame di grassi aventi
punti di fusione superiori a 45 ºC.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 34
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ALLEGATOVIII
DETERMINAZIONEDELCONVENUTODITRILINOLEINA
1. OGGETTO
Si tratta di un metodo di separazione e determinazione quantitativa della
composizione di trigliceridi degli oli vegetali a seconda del loro peso mole-
colare e grado di insaturazione, in funzione del rispettivo numero di
carbonio equivalente (vedi nota 1).
2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo si applica a tutti gli oli vegetali contenenti trigliceridi di
acidi grassi a catena lunga. Il metodo si applica soprattutto per individuare
la presenza di piccoli quantitativi di oli semisiccativi (ricchi di acido lino-
leico) in oli vegetali contenenti acido oleico come acido grasso insaturo
predominante, quale l'olio d'oliva.
3. PRINCIPIO
Separazione di trigliceridi, a seconda del loro numero di carbonio equiva-
lente, mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni (polarità di fase
inversa) ed interpretazione dei cromatogrammi.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Cromatografo liquido ad alte prestazioni, che consente un controllo termo-
statico della temperatura della colonna.
4.2. Unità di iniezione da 10 µl.
4.3. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilità su tutta la scala non
deve essere inferiore a 10−4unità di indice di rifrazione.
4.4. Colonna: tubo in acciaio inossidabile da 250 mm di lunghezza e 4,5 mm di
diametro interno, riempito di particelle di silice aventi un diametro di 5 µm,
con il 22-23 % di carbonio sotto forma di octadecilsilano (nota 2).
4.5. Registratore e/o integratore.
5. REAGENTI
I reagenti devono essere di purezza per analisi. I solventi di eluizione
devono essere degassati e possono essere riciclati parecchie volte senza
ripercussioni sulle separazioni.
5.1. Cloroformio.5.2. Acetone.
5.3. Acetonitrile.
5.4. Solvente di eluizione: Acetonitrile + acetone (proporzioni da modificare in
modo da ottenere la separazione desiderata; cominciare con miscela 50:
50).
5.5. Solvente di solubilizzazione: acetone oppure miscela acetone-cloroformio
1: 1.
5.6. Trigliceridi di riferimento: è possibile usare o trigliceridi commerciali
(tripalmitina, trioleina ecc.) e, in questo caso, i tempi di ritenzione vengono
portati in grafico in conformità con il numero di carbonio equivalente
oppure, alternativamente, è possibile ottenere un cromatogramma di riferi-
mento dall'olio di soia (vedi note 3, 4 e figure 1 e 2).
6. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Una soluzione al 5 % dei campioni da analizzare viene preparata pesando
0,5 ± 0,001 g del campione in un pallone graduato da 10 ml e portando a
10 ml con il solvente di solubilizzazione (5.5).
7. PROCEDIMENTO
7.1. Allestire il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (5.4)
alla velocità di 1,5 ml/mm in modo da pulire l'intero sistema. Aspettare
finché la linea di base rimane stabile.
Iniettare 10 µl del campione preparato come al punto (6).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 35
▼B
8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Usare il metodo di standardizzazione interno, cioè assumere che la somma
delle aree dei picchi corrispondente ai vari trigliceridi sia eguale al 100 %.
Calcolare la percentuale relativa di ciascun trigliceride usando la seguente
formula:
% di trigliceride =area del picco
somma delle aree dei picchi× 100,
esprimendo il risultato con una decimale.
Nota1:L'ordine di eluzione può essere determinato calcolando i numeri di
carbonio equivalente, spesso definiti dalla relazione ECN = CN −
2n, dove CN è il numero di carbonio ed n è il numero di doppi
legami; esso può essere calcolato più precisamente tenendo conto
dell'origine del legame doppio.
Se no,n1en1nsono i numeri di legami doppi attribuibili rispettiva-
mente all'acido oleico, linoleico e linolenico, il numero di carbonio
equivalente può essere calcolato mediante una relazione del tipo:
ENC = CN − dono−d1n1−d1nn1n
dove i coefficienti do,d1ed1npossono essere calcolati mediante i
trigliceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente
metodo la relazione ottenuta sarà strettamente simile a:
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 n1] − [2,17 n1n]
Nota2:Esempi: Lichrosorb(Merck) RP18 Art 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, o similari.
Nota3:Con parecchi trigliceridi di riferimento è possibile altresì calcolare
la risoluzione rispetto alla trioleina,
α=R T′/R T′di oleinausando il tempo di ritenzione corretto RT ′=
RT − RTsolvente
Il grafico del log αin funzione di f (numero di doppi legami)
consente di determinare i valori di ritenzione di tutti i trigliceridi
di acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento — vedi
figura 2.
Nota4:L'efficienza della colonna deve permettere la netta separazione del
picco della LLL (trilinoleina) da quelli dei trigliceridi con Tr adia-cente.
Nota5:Per gli oli di sansa d'oliva greggi, al fine di ottenere una buona
separazione del picco della trilinoleina da quelli adiacenti, è neces-
sario purificare preventivamente gli oli conformemente al punto
6.2 dell'allegato VII, in alternativa:
si fanno assorbire 200 µl di olio, senza diluirli, su una colonna di
silice per estrazione liquido-solido (tipo SEP PAK silica cartriage-
waters port. n. 51900).
I trigliceridi vengono eluiti con 20 ml di esano anidro per HPLC.
Il prodotto eluito viene essiccato in corrente d'azoto e ripreso in
isopropanolo o acetone (5 ml). Si iniettano 10-20 µl in HPLC.
Per i due metodi di purificazione, è necessario controllare che la
composizione di acidi grassi dell'olio sia la stessa prima e dopo la
purificazione. Se la composizione non è la stessa, à necessario
ridurre gradualmente la quantità di assorbente usato.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 36
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▼B
Figura 1
Cromatogrammadiuncampionedioliodisoia
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Figura 2
Graficodellog αinfunzionedif(numerodidoppilegami)
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ALLEGATOIX
ANALISISPETTROFOTOMETRICANELL'ULTRAVIOLETTO
PREMESSA
L'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto può fornire indicazioni sulla
qualità di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modi-
ficazioni indotte da processi tecnologici.
Gli assorbimenti alle lunghezze d'onda previste nel metodo sono dovuti alla
presenza di sistemi dienici e trienici coniugati. I valori di tali assorbimenti
sono espressi come estinzione specifica E 1 % 1 cm (estinzione di una
soluzione della sostanza grassa all'1 % nel solvente prescritto, in spessore
di 1 cm) convenzionalmente indicata con K, (detto anche coefficiente di
estinzione).
1. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per l'esecuzione dell'esame spettrofoto-
metrico nell'ultravioletto delle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene disciolta nel solvente richiesto, quindi si
determina l'estinzione della soluzione alle lunghezze d'onda prescritte, in
riferimento al solvente puro. Dalle letture spettrofotometriche si calcolano
le estinzioni specifiche.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Spettrofotometro per misure di estinzione nell'ultravioletto fra 220 e
360 nm, con possibilità di lettura per ogni unità nanometrica.
3.2. Vaschette di quarzo prismatiche, con coperchio, di percorso ottico da 1 cm.
Le vaschette, riempite di acqua o altro solvente idoneo, non devono presen-
tare fra di loro differenze superiori a 0,01 unità di estinzione.
3.3. Matracci tarati da 25 ml.
3.4. Colonna per cromatografia con una parte superiore avente lunghezza di 270
mm e diametro di 35 mm e una parte inferiore avente lunghezza di 270
mm e diametro di 10 mm.
4. REAGENTI
4.1. Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) spettrofotometricamente puro: deve avere,
in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 60 % a
220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm;
oppure
— Cicloesano spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento
all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 40 % a 220 nm e non
inferiore al 95 % a 250 nm.
4.2. Allumina basica per cromatografia su colonna, preparata e controllata come
descritto in Appendice I.
4.3. n-Esano, per cromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Il campione in esame deve essere perfettamente omogeneo ed esente da
impurezze sospese. Gli oli liquidi a temperatura ambiente si filtrano su
carta alla temperatura di circa 30 ºC, i grassi concreti vengono omogeneiz-
zati e filtrati a temperatura superiore di non oltre 10 ºC alla temperatura di
fusione.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 39
▼M6
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▼M6
▼B
▼B
5.2. Del campione così preparato si pesano esattamente circa 0,25 g in
matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si
omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida.
Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente su carta.
5.3. Con la soluzione ottenuta si riempie una vaschetta e si misurano le estin-
zioni, usando come riferimento il solvente impiegato, alle lunghezze
d'onda significative comprese fra 232 e 276 nm.
I valori di estinzione letti devono essere compresi nell'intervallo 0,1 ± 0,8;
in caso contrario è necessario ripetere le misure operando con soluzioni
opportunamente più concentrate o più diluite.
5.4. Qualora sia richiesta la determinazione dell'estinzione specifica dopo
passaggio su allumina si procede nel seguente modo: nella colonna croma-
tografica si introducono 30 g di allumina basica in sospensione in esano;
dopo assestamento dell'adsorbente si elimina l'eccesso di esano, sino ad
1 cm circa al disopra del livello superiore dell'allumina.
Si sciolgono 10 g di sostanza grassa, omogeneizzata e filtrata come
descritto in 5.1., in 100 ml di esano e si versa tale soluzione in colonna.
Si raccoglie l'eluato e si evapora totalmente il solvente sotto vuoto ad una
temperatura inferiore ai 25 ºC.
Sulla sostanza grassa così ottenuta si procede immediatamente come detto
in 5.2.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
6.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie
lunghezze d'onda calcolate come segue:
Kλ¼Eλ
c/C1s
in cui:
Kλ= estinzione specifica alla lunghezza d'ondaλ,
Eλ= estinzione misurata alla lunghezza d'onda λ,
c = concentrazione della soluzione in g/100 ml,s = spessore della vaschetta in cm.
I risultati si esprimono con due cifre decimali.
6.2. L'esame spettrofotometrico dell'olio di oliva secondo il metodo ufficiale dei
Regolamenti della CEE prevede la determinazione dell'estinzione specifica,
in soluzione in isoottano, alle lunghezze d'onda di 232 e 270 nm e la deter-
minazione del ∆K inteso come:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
in cui Kmè l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda m, lunghezza d'onda
di massimo assorbimento intorno a 270 nm.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 40
▼B
APPENDICEI
Preparazionedell'allumina econtrollo dell'attività
A1.1. Preparazione dell'allumina
In un recipiente a chiusura ermetica si pone l'allumina preventivamente
essiccata in forno a 380-400 ºC per 3 ore, si aggiunge acqua distillata in
ragione di 5 ml per 100 g di allumina, si chiude subito il recipiente, si
agita ripetutamente, quindi si lascia a riposo per almeno 12 ore prima
dell'uso.
A1.2. Controllo dell'attività dell'allumina
Si prepara una colonna cromatografica con 30 g di allumina. Operando
come descritto al paragrafo 5.4. si fa passare attraverso la colonna una
miscela costituita da:
— 95 % olio di oliva vergine, avente estinzione specifica a 268 nm infe-
riore a 0,18;
— 5 % olio di arachide trattato con terre nel processo di raffinazione,
avente estinzione specifica a 268 nm uguale o superiore a 4.
Se la miscela dopo passaggio in colonna presenta estinzione specifica a
268 nm superiore a 0,11 l'allumina è accettabile, altrimenti deve essere
aumentato il tasso di idratazione.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 41
▼B
APPENDICEII
Taraturadellospettrofotometro
A2. L'apparecchio deve essere controllato periodicamente (almeno ogni 6
mesi) sia per la rispondenza della lunghezza d'onda che per l'esattezza
della risposta.
A2.1. Il controllo della lunghezza d'onda può essere fatto mediante la lampada a
vapori di mercurio o mediante gli appositi filtri.
A2.2. Per il controllo della risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore si
procede come segue: si pesano 0,2000 g di potassio cromato puro per
spettrofotometria e si sciolgono, in matraccio tarato da 1 000 ml, in solu-
zione di idrossido di potassio 0,05 N diluendo poi a volume. Della
soluzione ottenuta si prelevano 25 ml esatti, si trasferiscono in matraccio
tarato da 500 ml e si diluisce ulteriormente a volume con la stessa solu-
zione di idrossido di potassio.
Della soluzione così ottenuta si misura l'estinzione a 275 nm, impiegando
la soluzione di idrossido di potassio come riferimento. L'estinzione misu-
rata con vaschetta da 1 cm dovrà essere 0,200 ± 0,005.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 42
▼B
ALLEGATOXA
ANALISIGASCROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI
ACIDIGRASSI
1. OGGETTO
Il presente metodo dà un orientamento generale per l'applicazione della
gascromatografia, con l'uso di colonne a riempimento o capillari, per
determinare la composizione qualitativa e quantitativa di una miscela
di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta in conformità con il metodo
specificato nell'allegato X B.
Il metodo non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.
2. REAGENTI
2.1. Gas vettore
Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.) completamente essiccato
ed avente un tenore di ossigeno inferiore a 10 mg/kg.
Nota1:L'idrogeno, che viene usato come gas vettore soltanto con
colonne capillari, può raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è
pericoloso; sono disponibili dispositivi di sicurezza.
2.2.Gasausiliari
2.2.1. Idrogeno (purezza ≥99,9 %), esente da impurezze organiche.
2.2.2. Aria od ossigeno, esente da impurezze organiche.
2.3.Standarddiriferimento
Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un
grasso a composizione nota, di preferenza analogo a quello della
sostanza grassa da analizzare.
Sarà necessario l'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi.
3. APPARECCHIATURA
Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchia-
tura per gascromatografia, facendo uso di colonne a riempimento e/o
capillari nonché di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. È consiglia-
bile usare apparecchiatura in grado di garantire l'efficienza e la
risoluzione specificate al punto 4.1.2.
3.1.Gascromatografo
Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.
3.1.1. Sistema ad iniezione
Usare un sistema ad iniezione:
a) con colonne a riempimento, aventi lo spazio morto minore possibile
(in questo caso il sistema di iniezione deve poter essere riscaldato a
una temperatura di 20-50 ºC superiore a quella della colonna)
oppure
b) con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve
essere appositamente progettato. Esso può essere del tipo a separa-
zione oppure del tipo non a separazione sull'iniettore della colonna.
Nota2:In assenza di acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio,
può essere usato un iniettore ad ago mobile.
3.1.2. Stufa
La stufa deve essere atta a scaldare la colonna ad almeno 260 ºC e a
mantenere la temperatura desiderata con l'approssimazione di 1 ºC per
la colonna a riempimento e con l'approssimazione di 0,1 ºC per la
colonna capillare.
Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una
provetta di silice fusa.
Il ricorso al riscaldamento programmato è raccomandato in tutti i casi e
in particolare per gli acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 43
▼B
3.1.3. Col onna e riempimento
3.1.3.1. Colonna costruita in materiale inerte alle sostanze da analizzare (cioè
vetro o acciaio inossidabile) e avente le seguenti dimensioni:
a) lunghezza: 1-3 m. Se sono presenti acidi grassi a catena lunga (oltre
C20) dovrà essere usata una colonna relativamente corta. Se invece si
analizzano acidi a 4-6 atomi di carbonio, si raccomanda di usare una
colonna avente una lugnhezza di 2 m.
b) diametro interno: da 2 a 4 mm.
Nota3:Se sono presenti componenti poliinsaturi aventi più di tre
legami doppi, essi potranno essere decomposti in una colonna
di acciaio inossidabile.
Nota4:Può essere usato un sistema di colonne a riempimento gemelle.
3.1.3.2. Riempimento, comprendente i seguenti elementi:
a)supporto: terra di diatomee lavata con acido e silanizzata, oppure
altro idoneo supporto inerte con una gamma ristretta di granulome-
tria (compresa tra 125 e 200 µm, con variazioni di ± 25 µm); la
granulometria media è correlata al diametro interno e alla lunghezza
della colonna;
b)fase stazionaria: tipo di poliestere di liquido polare (ad es. polisuc-
cinato di dietilenglicole, polisuccinato di butandiolo, poliadipato di
etilenglicole ecc.), cianosiliconi o qualsiasi altro liquido che
consenta la separazione cromatografica richiesta (vedi clausola 5).
La fase stazionaria deve essere compresa tra il 5 % (m/m) e il 20 %
(m/m) del riempimento. Per alcune separazioni può essere usata una
fase stazionaria non polare.
3.1.3.3. Condizionamento della colonna
Con la colonna staccata, dalla parte del rivelatore, scaldare gradual-
mente la stufa a 185 ºC e far passare una corrente di gas inerte
attraverso la colonna di recente preparata ad un flusso compreso tra
20 ml/min e 60 ml/min per almeno 16 h a questa temperatura e per
ulteriori 2 h a 195 ºC.
3.1.4. Col onna capillare
3.1.4.1. Tubo costituito di materiale inerte alle sostanze da analizzare (di solito
vetro o silice fusa). Il diametro interno deve essere compreso tra 0,2 mm
e 0,8 mm. La superficie interna deve esser sottoposta a un opportuno
trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima
di essere ricoperto con la fase stazionaria. Nella maggior parte dei casi
è sufficiente una lunghezza di 25 mm.
3.1.4.2. Fase stazionaria, di solito del tipo poliglicole [poli(etilenglicole)
20000], poliestere (polisuccinato di butandiolo) oppure polisilossano
polare (cianosiliconi). Sono adatte le colonne legate (cross-linked).
Nota5:Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'i-
dentificazione e separazione dell'acido linolenico e degli acidi
aC20.
Le coperture devono essere sottili, ad esempio 0,1 µm-0,2 µm.
3.1.4.3. Montaggio e condizionamento della colonna
Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle
colonne capillari, ovvero sistemazione della colonna nella stufa
(supporto), scelta e collegamento di giunti (a tenuta stagna), sistema-
zione delle estremità della colonna nell'iniettore e nel rivelatore
(riduzione degli spazi morti). Sottoporre la colonna ad un flusso di gas
vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna avente una lunghezza
di 25 mm e un diametro interno di 0,3 mm].
Condizionare la colonna programmando la temperatura della stufa a
3 ºC/min dalla temperatura ambiente a una temperatura di 10 ºC infe-
riore al limite di decomposizione della fase stazionaria. Mantenere la
stufa a questa temperatura per 1 h fino a stabilizzazione della linea di
base. Riportarla a 180 ºC in modo da lavorare in condizioni di isoter-
micità.
Nota6:Sono disponibili in commercio opportune colonne precondizio-
nate.
3.1.5. Rivelatore, di preferenza idoneo ad essere riscaldato a una temperatura
superiore a quella della colonna.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 44
▼B
3.2.Siringa
La siringa deve avere una capacità massima di 10 µl ed essere graduata
in divisioni di 0,1 µl.
3.3.Registratore
Se la curva di registrazione deve essere usata per calcolare la composi-
zione della miscela analizzata, è necessario un registratore elettronico di
alta precisione compatibile con l'apparecchiatura usata. Detto registra-
tore deve avere le seguenti caratteristiche:
a) tasso di risposta, al di sotto di 1,5 s, di preferenza 1 s (il tasso di
risposta è il periodo necessario affinché la punta di registrazione
passi dallo 0 % al 90 % a seguito dell'introduzione improvvisa di
un segnale del 100 %);
b) ampiezza della carta, minimo 20 cm;
c) velocità della carta, adattabile a valori compresi tra 0,4 cm/min e
2,5 cm/min.
3.4.Integratoreocalcolatore (facoltativo)
Un calcolo rapido ed accurato può essere effettuato con l'ausilio di un
integratore o calcolatore elettronico. Quest'ultimo deve dare una
risposta lineare con una sensibilità adeguata e la correzione della devia-
zione della linea di base deve essere soddisfacente.
4. PROCEDIMENTO
Nelle operazioni descritte dal paragrafo 4.1 al paragrafo 4.3 si fa
accenno all'uso di un rivelatore a ionizzazione di fiamma.
Come alternativa può essere usato un gascromatografo munito di cata-
rometro (che funziona in base al principio della variazione di
conducibilità termica). Le condizioni di funzionamento vengono
pertanto modificate come descritto nella clausola 6.
4.1. Condizioni dell'analisi4.1.1. Selezione delle condizioni operative ottimali4.1.1.1. Colonna a riempimento
Nella scelta delle condizioni per effettuare la prova, devono essere
prese in considerazione le seguenti varianti:
a) la lunghezza ed il diametro della colonna;
b) la natura e la quantità della fase stazionaria;
c) la temperatura della colonna;
d) il flusso di gas vettore;
e) la risoluzione necessaria;
f) le dimensioni del campione da analizzare, scelto in modo che il
collegamento tra il rivelatore e l'elettrometro diano una risposta
lineare;
g) la durata dell'analisi.
In linea di massima i valori riportati nella tabella 1 e nella tabella 2
danno i risultati auspicati, cioè almeno 2 000 piatti teorici per metro di
lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato di metile, e
l'eluizione dello stesso entro 15 minuti circa.
Se l'apparecchiatura lo consente, l'iniettore deve trovarsi a una tempera-
tura di circa 200 ºC ed il rivelatore a una temperatura pari o superiore a
quella della colonna.
Di norma, il rapporto tra il flusso dell'idrogeno fornito al rilevatore a
ionizzatore di fiamma e quello del gas vettore varia tra 1:2 e 1:1 in
funzione del diametro della colonna. Il flusso dell'ossigeno è di circa
5-10 volte quello dell'idrogeno.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 45
▼B
Tabella1
Diametro interno della colonna
mmFlusso del gas vettore
ml/min
2d a 1 5 a 2 5
3d a 2 0 a 4 0
4d a 4 0 a 6 0
Tabella2
Concentrazione della fase stazionaria
% (m/m)Temperatura della colonna
ºC
5 175
10 180
15 18520 185
4.1.1.2. Colonna capillare
Le caratteristiche di efficienza e di permeabilità delle colonne capillari
indicano che la separazione tra i costituenti e la durata dell'analisi sono
ampiamente dipendenti dal flusso del gas vettore nella colonna. È
pertanto necessario ottimizzare le condizioni operative influenzando
questo parametro (o più semplicemente la pressione di testa della
colonna), a seconda che si desideri migliorare le separazioni o effet-
tuare un'analisi rapida.
4.1.2. Determinazione del numero di piatti teorici (efficacia) e risoluzione
(vedi figura 1)
Effettuare l'analisi di una miscela di stearato di metile e di oleato di
metile in proporzioni più o meno equivalenti (ad es. esteri metilici del
burro di cacao).
Scegliere la temperatura della colonna e il flusso di gas vettore in modo
che il massimo del picco dello stearato di metile venga registrato circa
15 minuti dopo il picco del solvente. Usare un quantitativo sufficiente
della miscela di esteri metilici in modo che il picco dello stearato di
metile occupi circa tre quarti della scala intera.
Calcolare il numero dei piatti teorici, n (efficienza), con la formula:
n¼16drIðÞ
WIðÞ/C20/C21
2
e la risoluzione R usando la formula:
R¼2∆
WIðÞþWIIðÞ
dove:
dr (I)= è la distanza di ritenzione, in millimetri, dall'inizio del
cromatogramma fino al massimo del picco dello stea-
rato di metile;
W(I)eW(II)= sono le ampiezze, in millimetri, del picchi rispettiva-
mente dello stearato di metile e dell'oleato di metile,
misurati tra i punti d'intersezione delle tangenti ai
punti di inflessione della curva con la linea di base;
∆ = è la distanza, in millimetri, tra i picchi massimi dello
stearato di metile e dell'oleato di metile;
e l'indice di risoluzione lr usando la formula:
a
b1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 46
▼M2
▼M2
dove:
a = l'altezza del picco più basso, misurata rispetto alla linea di base;
b= l'altezza del punto più b asso dell'avvallamento compreso tra i due
picchi adiacenti, misurata rispetto alla linea di base.
Figura1
Cromatogramma per la determinazione del numero di piatti teorici (efficienza) e
risoluzione
Le condizioni operative da scegliere sono quelle idonee ad almeno2 000 piatti teorici per metro di lunghezza della colonna per quanto si
riferisce allo stearato di metile e una risoluzione di almeno 1,25.
4.2.Sostanzadaanalizzare
Usando la siringa (3.2) prendere 0,1 µl-2 µl della soluzione di esteri
metilici preparata conformemente all'allegato X B e iniettarli nella
colonna.
Nel caso di esteri non in soluzione, preparare una soluzione di circa
100 mg/ml in eptano di qualità cromatografica ed iniettare da 0,1 µl a
1 µl di questa soluzione.
Se l'analisi riguarda costituenti presenti soltanto in tracce, la quantità di
sostanza da analizzare può essere aumentata (fino a 10 volte).
4.3.Analisi
Di norma le condizioni operative sono quelle di cui al paragrafo 4.1.1.
È possibile tuttavia operare a una temperatura inferiore della colonna
quando si tratta di determinare acidi grassi aventi meno di 12 atomi di
carbonio oppure a una temperatura più elevata quando si tratta di deter-
minare acidi grassi con oltre 20 atomi di carbonio. All'occasione, è
possibile programmare la temperatura in entrambi questi casi. Ad
esempio, se il campione contiene gli esteri metilici degli acidi grassi
con meno di 12 atomi di carbonio, iniettare il campione a 100 ºC
(oppure da 50 ºC a 60 ºC se è presente acido butirrico) e raggiungere
immediatamente la temperatura a un tasso compreso tra 4 ºC/min e1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 47
▼B
▼B
8 ºC/min in condizioni ottimali. In taluni casi possono essere associati i
due procedimenti.
Dopo il riscaldamento programmato, continuare l'eluizione a tempera-
tura costante finché tutti i componenti sono stati eluiti. Se lo
strumento non prevede il riscaldamento programmato, usarlo a due
temperature fisse comprese tra 100 ºC e 195 ºC.
Se necessario, si raccomanda di effettuare un'analisi su due fasi fisse a
polarità differente per verificare l'assenza di picchi mascherati, ad
esempio nel caso della presenza contemporanea di C18:3eC20:0oppure
C18:3eC18:2associati.
4.4. Preparazione del cromatogramma di riferimento e dei grafici di riferi-
mento
Analizzare la miscela standard di riferimento (2.3) nelle stesse condi-
zioni operative di quelle usate per il campione e misurare i tempi di
ritenzione o le distanze di ritenzione per gli acidi grassi costituenti. Su
carta semilogaritmica, per qualsiasi grado di insaturazione, costruire i
grafici che mostrano il logaritmo del tempo o della distanza di riten-
zione in funzione del numero di atomi di carbonio. In condizioni
isotermiche, i grafici relativi ad acidi a catena lineare aventi lo stesso
grado di insaturazione devono essere linee rette. Queste linee devono
essere all'incirca parallele.
È necessario evitare condizioni in cui si possano verificare i «picchi
mascherati», ovvero nei quali la risoluzione è insufficiente a separare
due costituenti.
5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI5.1.Analisiqualitativa
Identificare i picchi dell'estere metilico del campione dai grafici prepa-
rati al paragrafo 4.4, se necessario per interpolazione.
5.2.Analisiquantitativa
5.2.1. Determinazione della composizione
A parte casi eccezionali, usare il metodo di normalizzazione interno,
cioè presumere che la totalità dei componenti del campione siano
rappresentati sul cromatogramma, in modo che il totale delle aree sotto
i picchi costituisca il 100 % dei costituenti (eluizione totale).
Se nell'apparecchiatura è previsto un integratore, usare i dati da esso
ottenuti. In caso negativo, determinare l'area sotto ciascun picco molti-
plicando l'altezza del picco per l'ampiezza a metà altezza e, se
necessario, prendere in considerazione le varie attenuazioni usate
durante la registrazione.
5.2.2. Metodo di calcolo
5.2.2.1. Caso generale
Calcolare il contenuto di un dato componente I, espresso come percen-
tuale in massa degli esteri metilici, determinando la percentuale
rappresentata dall'area del picco corrispondente relativa alla somma
delle aree di tutti i picchi, usando la formula seguente:
Ai
ΣA/C2100
dove
Ai= è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
ΣA = è la somma delle aree sotto tutti i picchi.
Esprimere il risultato con l'approssimazione di una decimale.
Nota7:In questo caso generale, si ritiene che il risultato del calcolo
basato sulle aree relative rappresenti una percentuale in massa.
Per i casi nei quali questa asserzione non è giustificata, vedi
5.2.2.2.
5.2.2.2. Uso dei fattori di correzione
In taluni casi, ad esempio in presenza di acidi grassi aventi meno di 8
atomi di carbonio oppure di acidi aventi gruppi secondari, quando si
usano rivelatori di conduttività termica oppure quando è necessario il1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 48
▼B
grado più elevato di accuratezza, devono essere usati fattori di corre-
zione che convertano le percentuali delle aree e dei picchi in
percentuali in peso dei componenti.
Determinare i fattori di correzione con l'ausilio di un cromatogramma
derivato dall'analisi di una miscela di riferimento di esteri metilici di
composizione nota, effettuata in condizioni operative identiche a quelle
usate per il campione.
Per questa miscela di riferimento, la percentuale in peso del compo-
nente i è data dalla formula:
mi
Σm/C2100
dove
mi= è il peso del componente i nella miscela di riferimento;
Σm = è il totale delle masse dei vari componenti della miscela di
riferimento.
Dal cromatogramma della miscela di riferimento (4.4) calcolare la
percentuale (area/area) del componente i come segue:
Ai
ΣA/C2100
dove
Aiè l'area sotto il picco corrispondente al componente i,
ΣA è la somma delle aree sotto tutti i picchi.
Il fattore di correzione viene quindi calcolato come segue:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Di norma i fattori di correzione vengono espressi facendo riferimento a
KC16sicché i fattori relativi diventano:
K0
i¼Ki
KC16
Per il campione il contenuto di ciascun componente espresso come
percentuale in degli esteri metilici è:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.
5.2.2.3. Uso di uno standard interno
In alcune analisi (ad es. quando non tutti gli acidi grassi sono quantifi-
cati, ad esempio quando sono presenti acidi con 4 e 6 atomi di carbonio
accanto ad acidi con 16 e 18 atomi di carbonio, oppure quando è neces-
sario determinare il quantitativo assoluto di un acido grasso in un
campione) è necessario ricorrere ad uno standard interno. Vengono
spesso usati acidi grassi con 5,15 o 17 atomi di carbonio. Deve essere
determinato l'eventuale fattore di correzione per lo standard interno.
La percentuale in peso del componente i, espressa come esteri metilici,
è data dalla formula:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
dove
Aiè l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
Asè l'area sotto il picco corrispondente allo standard interno;
K′iè il fattore di correzione per il componente i (relativo a KC16);
K′sè il fattore di correzione dello standard interno (relativo a KC16);
m è il peso, in milligrammi, della sostanza da analizzare;
msè il peso, in milligrammi, dello standard interno.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 49
▼B
Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.
6. CASO PARTICOLARE DELLA DETERMINAZIONE DEGLI
ISOMERI TRANS
Il contenuto degli isomeri trans degli acidi grassi, con il numero di
atomi di carbonio compreso tra 10 e 24, può essere determinato
mediante separazione degli esteri metilici, usando colonne cromatogra-
fiche capillari che presentino una particolare polarità.
6.1. Colonna capillare in silice, avente un diametro interno da 0,25 mm a
0,32 mm e una lunghezza di 50 mm, ricoperta di cianopropilsilicone,
la cui pellicola ha uno spessore compreso tra 0,1 e 0,3 µm (tipo SP
2340, tipo SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 e tipi simili).
6.2. Gli esteri metilici vengono separati con il procedimento B presentato
nell'altro allegato (X/B). Le sostanze grasse con acidità libera superiore
al 3 % devono essere prima neutralizzate conformemente al punto 6.1
dell'allegato VII.
6.3. Le condizioni operative per la cromatografia in fase gassosa sono
complessivamente le seguenti:
— temperatura della colonna programmata da 150 ºC a 230 ºC (ad
esempio 165 ºC per 15 minuti, aumentata poi di 5 ºC/minuto sino
a 200 ºC);
— temperatura dell'iniettore: 250 ºC, con il sistema dell'iniettare divi-
sore, oppure temperatura iniziale della colonna, con il sistema «on
column»;
— temperatura del rivelatore: 260 ºC;— flusso del gas vettore (elio e idrogeno): 1,2 ml/minuto.
La quantità iniettata deve essere tale che nelle condizioni di sensibilità
utilizzate l'altezza del picco corrispondente all'estere metilico dell'acido
arachico sia pari o superiore al 20 % della parte inferiore della scala.
6.4. I diversi esteri metilici vengono identificati in base ai tempi di riten-
zione che vengono confrontati con quelli di miscele di riferimento
(come indicato al punto 2.3).
Gli esteri degli acidi grassi trans vengono eluiti prima degli isomeri
corrispondenti cis. Un esempio di cromatogramma è riportato nella
figura 2.
Fig.2
Gascromatogramma tipo relativo alla determinazione degli isomeri trans degli
acidi con colonna capillare
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 50
▼M2
▼M2
6.5. L'efficienza della colonna determinata conformemente al punto 4.1.2
deve consentire la separazione di talune coppie critiche, ad esempio la
coppia formata dall'insieme degli acidi transisooleici e il picco dell'a-
cido oleico, trans C18: 1/cis C18: 1, con un indice di risoluzione
superiore a 2.
6.6. La percentuale dei diversi acidi grassi trans è calcolata in base al
rapporto tra la superficie del picco attinente e la somma delle superfici
di tutti i picchi presenti.
Si considerano le percentuali degli acidi:
— trans ottadecenoici (T 18: 1), indicati nell'allegato I del presente
regolamento come somma degli isomeri transoleici;
— cis-trans e trans-cis ottadecadienoici [(CT/TC) 8: 2]: indicati nell'al-
legato I del presente regolamento come somma degli isomeri
translinoleici;
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, ottadecatrie-
noici [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3], indicati nell'allegato I
del presente regolamento come somma degli isomeri translinolenici.
Nota8:viste le caratteristiche particolari di questo metodo, dare i risul-
tati con due decimali.
►M27.◄CASO SPECIALE — USO DI UN CATAROMETRO (FUNZIO-
NANTE IN BASE AL PRINCIPIO DEI MUTAMENTI DI
CONDUTTIVITÀ TERMICA)
Per la determinazione della composizione qualitativa e quantitativa di
una miscela di esteri metilici degli acidi grassi può essere usato altresì
un gascromatografo associato a un rivelatore funzionante in base al
principio dei mutamenti di conduttività termica (catarometro). Se
quest'ultimo viene usato, le condizioni specificate alle clausole 3 e 4
devono essere modificate come indicato nella tabella 3.
Per l'analisi quantitativa, usare i fattori di correzione definiti al para-
grafo 5.2.2.2.
Tabella3
Variabile Valore/condizioni
Colonna Lunghezza: da 2 m a 4 m
Diametro interno: 4 mm
Supporto Granulometria compresa tra
160 µm e 200 µm
Concentrazione della fase stazio-
nariaDal 15 % (m/m) al 25 % (m/m)
Gas vettore Elio oppure, in mancanza di
quest'ultimo, idrogeno, col tenore
più basso possibile di ossigeno
Gas ausiliari Nessuno
Temperatura dell'iniettore Da 40 ºC a 60 ºC al di sopra di
quella della colonna
Temperatura della colonna Da 180 ºC a 200 ºC
Flusso del gas vettore Di norma tra 60 ed 80 ml/min
Entità del campione di sostanza
iniettatoDi norma tra 0,5 µl e 2 µl
►M28.◄RELAZIONE SULLA PROVA
La relazione sulla prova deve specificare i metodi usati per la prepara-
zione degli esteri metilici e per l'analisi gascromatografica nonché i
risultati tenuti. Essa deve citare altresì tutti i dettagli operativi non
specificati nella presente norma internazionale oppure considerati come
facoltativi, nonché i particolari di qualsiasi evento che possa avere
influenzato i risultati.
La relazione sulla prova deve comprendere tutti i dati necessari per la
completa identificazione del campione.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 51
▼B
▼B
ALLEGATOXB
PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI IN
CONFORMITÀALL'ALLEGATOVI—PUNTIIEII—DELREGOLA-
MENTO (CEE) N. 72/77 DELLA COMMISSIONE OPPURE IN
ALTERNATIVAILMETODOSEGUENTE
PREMESSA
La scelta del procedimento da seguire deve essere fatta in funzione della
composizione acidica e dell'acidità della sostanza grassa da esaminare e
della analisi gascromatografica da effettuare.
In particolare:
— per sostanze grasse contenenti acidi grassi inferiori a C12, possono
essere impiegati solo i procedimenti in fiala chiusa o al solfato dimeti-
lico;
— per sostanze grasse aventi acidità superiore al 3 % possono essere
impiegati solo i procedimenti al metanolo-acido cloridrico o al solfato
di metilico;
— per determinazioni gascromatografiche di isomeri trans possono essere
impiegati solo i procedimenti al metilato sodico o al solfato dimetilico;
— il procedimento al metanolo-esano-acido solforico deve essere impie-
gato per la preparazione degli esteri metilici di piccole quantità di
sostanze grasse da separazioni per cromatografia su strato sottile.
La presenza di insaponificabile può essere trascurata purché non superi il
3 %, altrimenti gli esteri metilici dovranno essere preparati dagli acidi
grassi.
1. OGGETTO
Sono descritti cinque procedimenti per la preparazione degli esteri metilici
da sostanze grasse:
a) con metilato sodico
b) con metilato sodico in fiala chiusa
c) con metanolo-acido cloridrico in fiala chiusa
d) con solfato dimetilico
e) con metanolo-esano-acido solforico.
Procedimento A
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con alcool metilico
e metilato sodico. Gli esteri metilici ottenuti sono estratti con etere etilico.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Pallone da 100 ml con refrigerante a ricadere, munito all'estremità supe-
riore di tubo a calce sodata, con giunti a smeriglio.
3.2. Cilindri graduati da 50 ml.
3.3. Pipetta graduata da 5 ml, con divisioni in 0,1 ml.
3.4. Imbuti separatori da 250 ml.
3.5. Pallone da 200 ml.
4. REAGENTI
4.1. Metanolo anidro.
4.2. Metilato sodico, soluzione all'1 % circa in metanolo; si prepara sciogliendo
0,34 g di sodio metallico in 100 ml di metanolo anidro.
4.3. Etere etilico.
4.4. Sodio cloruro, soluzione 10 %.4.5. Etere di petrolio 40-60 ºC.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 52
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5. PROCEDIMENTO
5.1. Nel pallone da 100 ml si introducono 2 g di sostanza grassa previamente
disidratata su solfato sodico e filtrata. Si aggiungono 35 ml di metanolo,
si congiunge il refrigerante e si fa bollire a ricadere per alcuni minuti.
5.2. Si interrompe il riscaldamento, si stacca il refrigerante e si aggiungono
rapidamente 3,5 ml di soluzione di metilato sodico; si collega nuovamente
il refrigerante e si fa bollire a riflusso per almeno 3 ore. La metilazione
deve ritenersi completa quando tutta la sostanza grassa è passata in solu-
zione e la miscela di reazione è perfettamente limpida a temperatura
ambiente.
5.3. Si raffredda e si versa la miscela di reazione in un imbuto separatore da
250 ml, si aggiungono 35-40 ml di etere etilico, 100 ml di acqua e 5-6 ml
di soluzione di cloruro sodico al 10 %. Si agita e si lasciano separare gli
strati; la fase acquosa viene trasferita in un secondo imbuto separatore ed
estratta nuovamente con 25 ml di etere etilico.
Agli estratti eterei, riuniti, si aggiungono 50 ml di etere di petrolio 40-
60 ºC; ciò provoca la separazione di acqua che viene eliminata.
Si lava la fase eterea per 3 volta con porzioni di 10-15 ml di acqua, si
essicca su solfato sodico e si filtra su carta raccogliendo il filtrato nel
pallone da 200 ml.
Si distilla il solvente, completandone l'allontanamento su bagnomaria in
corrente di azoto puro.
Procedimento B
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene trattata con metilato sodico in soluzione
metanolica, in fiala chiusa, a 85-90 ºC.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Fiala di vetro a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro
14-16 mm).
3.2. Pipetta graduata da 1 ml con divisioni in 0,1 ml.
4. REAGENTI
4.1. Metilato sodico, soluzione all'1,5 % circa in metanolo. Si prepara scio-
gliendo 0,50 g di sodio metallico in 100 ml di metanolo anidro.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Nella fiala di vetro si introducono 2 g di sostanza grassa, previamente disi-
dratata su solfato sodico e filtrata. Si aggiungono 0,3 g (circa 0,4 ml) di
soluzione di metilato sodico e si chiude la fiala alla fiamma.
5.2. Si mantiene la fiala per 2 ore in bagno a 85-90 ºC agitando di tanto in
tanto; l'avvenuta esterificazione si rileva dalla limpidezza del contenuto
della fiala dopo sedimentazione della glicerina e del residuo dei reagenti.
5.3. Si raffredda a temperatura ambiente. Si apre la fiala al momento dell'im-
piego degli esteri metilici. Questi non richiedono altre manipolazioni
prima dell'introduzione nel gascromatografo.
Procedimento C
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene trattata con metanolo-acido cloridrico, in
fiala chiusa, a 100 ºC.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Fiala di vetro, a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro
14-16 mm).
3.2. Pipette tarate da 1 e 2 ml.
4. REAGENTI
4.1. Soluzione di acido cloridrico in metanolo al 2 %. Si prepara con acido
cloridrico gassoso e metanolo anidro (Nota 1).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 53
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4.2. Esano per gascromatografia.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Si introducono nella fiala di vetro 0,2 g di sostanza grassa, preventivamente
disidratata su solfato sodico e filtrata, e 2 ml di soluzione di acido clori-
drico-metanolo. Si chiude la fiala alla fiamma.
5.2. Si mantiene la fiala in bagno a 100 ºC per 40 minuti.5.3. Si raffredda la fiala sotto acqua corrente, si apre, si aggiungono 2 ml di
acqua distillata e 1 ml di esano. Si centrifuga e si preleva la fase esanica
che è pronta per l'impiego.
Procedimento D
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene saponificata con soluzione metilalcolica
di potassio idrossido, quindi trattata con solfato dimetilico. Dopo aggiunta
di acido cloridrico, si ha separazione spontanea degli esteri metilici forma-
tisi. Mediante successivo trattamento con allumina, si ottengono esteri
metilici ad elevata purezza.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Provetta di vetro, a pareti robuste, capacità circa 20 ml, con tappo smeri-
gliato 10/19, con ganci di sicurezza.
3.2. Refrigeranti a ricadere a 5 bolle, attacco a smeriglio 10/19.3.3. Filtri di vetro a setto poroso gradazione G 2, diametro 20 mm.3.4. Provette di vetro, capacità circa 10 ml, fondo conico.3.5. Siringhe da 1 ml e 5 ml.
4. REAGENTI
4.1. Potassio idrossido, soluzione al 10 % in alcool metilico per gascromato-
grafia.
4.2. Indicatore verde di bromocresolo: soluzione allo 0,05 % in alcool metilico.4.3. Solfato dimetilico (d = 1,335 a 15 ºC).4.4. Acido cloridrico concentrato, d 1,19, diluito 1 + 1 con alcool metilico per
gascromatografia.
4.5. Ossido di alluminio standardizzato secondo Brockmann per cromatografia
di adsorbimento.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Si introducono nella provetta da 20 ml. (circa 2,2 ml) di sostanza grassa
preventivamente disidratata su solfato sodico e filtrata, si aggiungono 5 ml
della soluzione di potassio idrossido e alcuni granuli di quarzo per regolare
l'ebollizione. Si applica il refrigerante a ricadere e si riscalda su piccolafiamma per 5 minuti agitando: la saponificazione risulta comunque
completa quando la soluzione è limpida. Al termine, si raffredda con acqua
corrente e si stacca il refrigerante.
5.2. Si aggiungono 2 gocce di indicatore e, mediante siringa, 1 ml di solfato
dimetilico, lentamente. Si chiude ermeticamente la provetta e si agita 2-3
minuti, immergendo frequentemente il fondo della provetta in b.m.
bollente: la reazione è completa quando l'indicatore vira dal blu al giallo.
Al termine, si raffredda la provetta sotto acqua corrente, quindi si apre e
si aggiungono 5 ml della soluzione metanolica di acido cloridrico.
5.3. Dopo agitazione per alcuni secondi, si pone la provetta in posizione incli-
nata quindi si imprimono ad essa delle leggere scosse che facilitano
l'affioramento degli esteri metilici sotto forma di massa oleosa (Nota A).
Si prelevano gli esteri metilici mediante siringa, si introducono in una
provetta a fondo conico, si aggiunge un volume di allumina pari a circa 1/
4 del volume degli esteri metilici, si agita e si filtra su carta.
NotaA:Nel caso non si abbia separazione spontanea degli esteri metilici,
aggiungere nella provetta 5 ml di acqua ed agitare.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 54
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Procedimento E
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con metanolo-
esano-acido solforico. Gli esteri metilici ottenuti sono estratti con etere di
petrolio.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Provetta da 20 ml circa, munita di refrigerante a ricadere ad aria, della
lunghezza di 1 m circa, con giunti a smeriglio.
3.2. Pipetta tarata da 5 ml.3.3. Imbuto separatore da 50 ml.
3.4. Cilindri graduati da 10 e 25 ml.
3.5. Provetta da 15 ml, a fondo conico.
4. REAGENTI
4.1. Reagente di metilazione: metanolo anidro-esano-acido solforico concentrato
(d 1,84) in raporto 75:25:1 (V/V/V).
4.2. Etere di petrolio 40-60 ºC.
4.3. Sodio solfato anidro.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Nella provetta da 20 ml si introduce il materiale recuperato dalla placca e
si aggiungono 5 ml di reagente di metilazione.
5.2. Si collega il refrigerante a ricadere e si riscalda per 30 minuti in bagno-
maria bollente (Nota 2).
5.3. Si trasferisce quantitativamente la miscela in un imbuto separatore da 50 ml,
aiutandosi con 10 ml di acqua distillata e 10 ml di etere di petrolio. Si agita
vigorosamente, si lasciano separare le fasi, si allontana lo strato acquoso e
si lava lo strato etereo per due volte con 20 ml di acqua distillata. Si
aggiunge nell'imbuto separatore una piccola quantità di solfato sodico
anidro, si agita, si lascia a riposo per qualche minuto e si filtra, racco-
gliendo il filtrato in una provetta a fondo conica da 15 ml.
Si evapora il solvente su bagnomaria, in corrente di azoto.
Nota1:È possibile preparare facilmente in laboratorio piccole quantità
d'acido cloridrico gassoso, modificando la soluzione disponibile in
commercio ( ρ= 1,18) aggiungendo qualche goccia d'acido solfo-
rico concentrato ( ρ= 1,84). Il gas liberato può facilmente essere
seccato se viene fatto gorglogliare nell'acido solforico concentrato.
Poiché l'acido cloridrico è rapidamente assorbito dal metanolo, si
raccomanda di prender le precauzioni abituali al momento della
dissoluzione, ad esempio introducendo il gas con una piccola fiala
rovesciata il cui bordo sfiora la superficie del liquido. La soluzione
metanolica d'acido cloridrico può essere preparata in anticipo in
grandi quantità, poiché si conserva perfettamente in bottiglie con
tappo di vetro conservate nell'oscurità.
Nota2:Per controllare l'ebollizione introdurre una bacchetta di vetro nella
provetta e limitare la temperatura del bagnomaria a 90 ºC.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 55
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ALLEGATOXI
DETERMINAZIONE DEL TENORE DI SOLVENTI ALOGENATI
VOLATILINELL'OLIODIOLIVA
1. PRINCIPIO
Analisi mediante cromatografia in fase gassosa secondo la tecnica dello
spazio di testa (head space).
2. APPARECCHIATURA
2.1. Apparecchio di cromatografia in fase gassosa, munito di rivelatore a cattura
di elettroni.
2.2. Apparecchiatura per spazio di testa.2.3. Colonna per cromatografia in fase gassosa, in vetro, di 2 m di lunghezza e
2 mm di diametro, fase stazionaria.
OV101 al 10 % o equivalente, impregnato su una terra di diatomee calci-
nata, lavata con acidi e silanizzata, di granulometria 80-100 Mesh.
2.4. Gas vettore e gas ausiliario; azoto per cromatografia in fase gassosa, idoneo
alla rivelazione per cattura di elettroni.
2.5. Bottiglie in vetro da 10 a 15 ml, munite di una guarnizione in teflon e di un
tappo d'alluminio provvisto di un orifizio per prelievo a mezzo siringa.
2.6. Pinze a chiusura ermetica.
2.7. Siringa per gas da 0,5 a 2 ml.
3. REATTIVI
Solventi alogenati volatili di purezza idonea all'impiego per cromatografia
in fase gassosa.
4. PROCEDIMENTO
4.1. Pesare con precisione 3 g d'olio circa in una bottiglia di vetro (da non riuti-
lizzare) e chiudere la bottiglia ermeticamente. Riporre la bottiglia in un
termostato a 70 ºC per un'ora. Prelevare con precisione con la siringa un
volume da 0,2 a 0,5 ml dallo spazio di testa ed iniettarlo nella colonna
del cromatografo in fase gassosa regolato come segue:
— temperatura dell'iniettore: 150 ºC
— temperatura della colonna: 70-80 ºC— temperatura del rivelatore: 200-250 ºC
Si possono usare temperature diverse purché i risultati siano equivalenti.
4.2. Soluzioni di riferimento: preparare soluzioni standard, usando olio d'oliva,
raffinato senza traccia di solventi, a concentrazioni variabili tra 0,05 e 1 mg/
kg ed in relazione con il tenore presunto del campione. L'eventuale dilui-
zione deve essere fatta con pentano.
4.3. Valutazione quantitativa: fare il rapporto tra le superfici o le altezze dei
picchi del campione e della soluzione standard corrispondente alla concen-
trazione presunta più vicina. Se lo scarto relativo supera il 10 % occorre
ripetere l'analisi comparato con una nuova soluzione standard, fino a che
la sua concentrazione rientri nel suddetto scarto relativo. Il tenore è deter-
minato in base ad una media di iniezioni elementari.
4.4. Espressione dei risultati: i risultati sono espressi in mg/kg (ppm). Il limite
di rivelazione del metodo è di 0,01 mg/kg.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 56
▼B
ALLEGATOXII
VALUTAZIONEORGANOLETTICADELL'OLIODIOLIVAVERGINE
1. PREMESSA
Il presente metodo si propone di stabilire i criteri necessari alla valuta-
zione delle caratteristiche del flavor dell'olio di oliva vergine e di
sviluppare l'opportuna metodologia.
2. CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo descritto è applicabile soltanto alla valutazione e alla classifica-
zione organolettica dell'olio di oliva vergine utilizzabile per il consumo
diretto. Si limita a classificare l'olio vergine in una scala numerica stabi-
lita in rapporto alla percezione degli stimoli del suo flavor secondo il
giudizio di un gruppo di assaggiatori scelti costituiti in «panel».
3. VOCABOLARIO GENERALE DI ANALISI SENSORIA
Vedi norma prevista nel capitolo «Analisi sensoria: vocabolario gene-
rale».
4. VOCABOLARIO SPECIFICO PER L'OLIO D'OLIVA
4.1. Sensazioni gradevoli suscitate dalle caratteristiche di qualità degli oli
d'oliva vergini:
Fruttato: flavor che ricorda l'odore e il gusto del frutto sano, fresco e
colto al punto ottimale di maturazione.
Fruttatomaturo: flavor dell'olio d'oliva ottenuto da frutti maturi, general-
mente di odore smorzato e sapore dolciastro.
Fruttatoverde: flavor dell'olio ottenuto da frutti ancora verdi.
4.2. Sensazioni più o meno gradevoli in funzione dell'intensità con cui cono
percepite, da non considerare come difetti, ma aventi un'influenza sull'ar-
monia del fruttato:
Mela:flavor dell'olio di oliva che ricorda questo frutto.
Dolce:sapore gradevole dell'olio nel quale, senza essere esattamente
zuccherino, non primeggiano gli attributi amaro, astringente e piccante.
Erba:flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda l'erba appena tagliata.
Foglie verdi (amaro): flavor dell'olio ottenuto da olive eccessivamente
verdi o che siano state macinate con foglie e rametti.
Amaro:sapore caratteristico dell'olio ottenuto da olive verdi o invaiate.
Può essere più o meno gradevole, secondo l'intensità.
Aspro:sensazione caratteristica di alcuni oli che, all'assaggio, producono
una reazione orale-tattile di astringenza.
Piccante: sensazione di gusto pungente, caratteristico degli oli ottenuti
all'inizio della campagna, essenzialmente da olive ancora verdi. È dovuto
all'azione delle sostanze fenoliche sulle terminazioni del nervo trigemino
che si estendono a tutta la cavità orale.
Mandorlato: questo flavor può manifestarsi in due modi: quello tipico
della mandorla fresca o quello proprio della mandorla secca e sana, che
si può confondere con un rancido incipiente. Si apprezza come un retro-
gusto quando l'olio resta in contatto con la lingua e il palato. Si associa
ad oli dolci e di odore smorzato.
Smorzato o piano: flavor dell'olio d'oliva dalle caratteristiche organolet-
tiche molto tenui, a causa della perdita dei compenenti aromatici.
Fieno:flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda l'erba più o meno
secca.
4.3. Sensazioni sempre sgradevoli, sebbene la loro intensità sia appena percet-
tibile, da considerare come difetti organolettici:
Sparto:flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli
nuovi di sparto. Il flavor può essere differente se il fiscolo è fatto con
sparto verde o con sparte secco.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 57
▼M3
▼M3
Terra:flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive raccolte con terra o
infangate e non lavate. In qualche caso questo flavor può manifestarsi
insieme con quello della muffa-umidità.
Vecchio: flavor caratteristico dell'olio quando resta troppo tempo nei reci-
pienti di ammasso. Può darsi anche in oli imbottigliati per un periodo
eccessivamente lungo.
Verme:flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive fortemente colpite
da larve di mosca dell'oliva (Dacus oleae).
Metallico: flavor che ricorda il metallo. È caratteristico dell'olio mante-
nuto a lungo in contatto con alimenti o superficie metalliche, in
condizioni inadatte, durante i procedimenti di macinatura, impastatura,
pressione o ammasso.
Muffa-umidità: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da frutti nei quali si
sono sviluppati abbondanti funghi e lieviti per essere rimasti ammassati
molti giorni, in ambienti umidi.
Rancido: flavor caratteristico e comune a tutti gli oli e grassi che hanno
sofferto un processo autossidativo, a causa del loro prolungato contatto
con l'aria. Questo flavor è sgradevole e irreversibile.
Riscaldo: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive ammassate in
uno stato di avanzata fermentazione.
Salamoia: flavor dell'olio estratto da olive conservate in soluzioni saline.
Sansa:flavor caratteristico che ricorda quello della sansa di oliva.
Saponoso: flavor con una sensazione olfatto-gustativa che ricorda quella
del sapone verde.
Acqua di vegetazione: flavor caratteristico acquisito dall'olio a causa di
cattiva decantazione e prolungato contatto con le acque di vegetazione.
Avvinato-inacetito: flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda quello
del vino e dell'aceto. È dovuto essenzialmente alla formazione di acido
acetico, acetato di etile e etanolo, in quantità superiori alle normali nell'a-
roma dell'olio d'oliva.
Cetriolo: flavor che si produce nell'olio durante un imbottigliamento
ermetico eccessivamente prolungato, particolarmente in lattine, attribuito
alla formazione di 2-6 nonadienale.
Cottoostracotto: flavor caratteristico dell'olio dovuto a un eccessivo e/o
prolungato riscaldamento durante l'ottenimento, specialmente durante la
termo-impastatura, se avviene in condizioni inadatte.
Fecce:flavor caratteristico dell'olio recuperato dai fanghi decantati in
depositi e torchi.
Fiscolo: flavor dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli sporchi di
residui fermentati.
Grasso di macchina: odore dell'olio d'oliva ottenuto in frantoio dal cui
macchinario non sono stati adeguatamente eliminati resti di petrolio, di
grasso o di olio minerale.
Grossolano: percezione caratteristica di alcuni oli che, all'assaggio,
producono una sensazione orale-tattile densa e pastosa.
5. BICCHIERE PER L'ASSAGGIO DI OLI
Vedi capitolo «Bicchiere per l'assaggio di oli».
6. SALA DI ASSAGGIO
Vedi capitolo «Guida per l'allestimento di una sala di assaggio».
7. UTENSILI
In ogni cabina e a disposizione dell'assaggiatore devono esserci gli uten-
sili necessari perché questi possa esercitare adeguatamente il suo lavoro.
Sono:
— bicchieri (normalizzati), contenenti i campioni contrassegnati in
chiave con numeri a due cifre presi a caso, o con un paio di numeri
e lettere. Le indicazioni devono farsi con una matita indelebile e
inodora,
— vetri di orologio recanti le stesse indicazioni, per coprire i bicchieri,1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 58
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▼B
— foglio di punteggio, vedi fig. 2, con le istruzioni per l'uso,
— matita o penna a sfera,
— piattini con fettine di mela,
— bicchiere d'acqua a temperatura ambiente.
8. METODOLOGIA
In questo comma si stabiliscono le cognizioni previe necessarie per la
realizzazione dell'analisi sensoria degli oli di oliva vergini e si cerca di
normalizzare il comportamento e il modo di procedere degli assaggiatori
che devono intervenire nella prova, i quali devono prendere coscienza
tanto delle raccomandazioni di tipo generale, quanto di quelle specifiche
per l'assaggio degli oli di oliva.
8.1.Ruolodell'organizzatore ocapodelpanel (o gruppo di assaggiatori)
L'organizzatore del panel dovrà essere una persona sufficientemente
formata, intenditrice ed esperta nei tipi di olio che troverà nel suo lavoro.
È la figura chiave del panel e il responsabile della sua organizzazione e
del suo funzionamento. Convocherà gli assaggiatori con tempo sufficiente
e chiarirà loro qualsiasi dubbio sulla realizzazione delle prove, pur aste-
nendosi di suggerire qualsiasi opinione sul campione.
Sarà responsabile dell'inventario degli utensili, della loro pulizia, della
preparazione e codificazione dei campioni, nonché della loro presenta-
zione agli assaggiatori secondo il disegno sperimentale adottato, del
compendio dei dati e del loro trattamento statistico, per ottenere i migliori
risultati col minore sforzo.
Il lavoro del capo del panel richiede abilità sensoria, meticolosità nella
preparazione delle prove, ordine rigoroso di esecuzione, nonché abilità e
pazienza per pianificare ed eseguire le prove. Missione del capo del panel
è lo stimolare il morale dei componenti del gruppo, suscitando tra loro
l'interesse, la curiosità e lo spirito di emulazione. Deve evitare che si
conosca la sua opinione e impedire che i criteri di possibili leader si
impongano sugli altri assaggiatori. Spetta anche a lui allenarli, sceglierli
e controllarli, per sapere se si mantengono con il livello di attitudine
adeguato.
8.2.Condizionidell'assaggio
8.2.1. Dimensioni del campione
La quantità di olio contenuto in ciascun bicchiere deve essere di 15 ml.
8.2.2. Temperatura della prova
I campioni di olio da assaggiare si manterranno nei bicchieri a 28 ºC
± 2 ºC. È stata scelta questa temperatura per essere quella alla quale si
osservano più facilmente differenze organolettiche, in temperatura
normale, quando gli oli si usano come condimento. Un'altra ragione che
spinge a prendere questo valore è che temperature più basse o più alte
producono una scarsa volatilizzazione dei componenti aromatici o, al
contrario, la produzione dei volatili propri degli oli riscaldati.
8.2.3. Orario della prova
Per l'assaggio di oli, le ore di lavoro ottimali sono quelle di mattina. È
dimostrato che durante la giornata vi sono periodi di percezione ottimale
per il gusto e l'olfatto.
I pasti sono preceduti da un periodo d'incremento della sensibilità olfatto-
gustativa, e seguiti da una diminuzione.
Tuttavia questo criterio non deve esagerarsi fino al punto che la fame
possa distrarre gli assaggiatori, riducendo la loro capacità di discrimina-
zione e, particolarmente, i loro criteri di preferenza e accettazione.
9. ASSAGGIATORI
Le persone che intervengono come assaggiatori nelle prove organolettiche
di oli di oliva commestibili dovranno essere preparati e scelti secondo la
loro abilità a distinguere tra campioni similari; tengasi conto che la preci-
sione migliorerà con l'allenamento (vedi comma corrispondente).
Per la prova occorrono da 8 a 12 assaggiatori. Conviene disporre di qual-
cuno di piú, di riserva, per sopperire a possibili assenze.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 59
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9.1.Normegenerali dicomportamentopercandidatieassaggiatori
Le presenti raccomandazioni si riferiscono al comportamento dei candi-
dati e degli assaggiatori durante il loro lavoro.
Al ricevere la comunicazione del capo del panel, per intervenire in una
prova organolettica, l'assaggiatore dovrà essere in condizioni di realiz-
zarla all'ora previamente indicata, attenendosi a quanto segue:
9.1.1. Si asterrà dal fumare almeno 30 minuti prima dell'ora fissata.9.1.2. Non userà nessun profuma, cosmetico o sapone il cui odore persista al
momento della prova. Per lavarsi le mani si servirà di un sapone non
profumato o poco profumato e se le sciacquerà e asciugherà tutte le volte
che sia necessario per eliminare qualsiasi odore.
9.1.3. Non dovrà aver preso nessun alimento almeno un'ora prima dell'assaggio.9.1.4. Se si trovasse in condizioni di inferiorità fisiologica, particolarmente se
ha il senso dell'olfatto o del gusto alterato, o se è sotto qualche effetto
psicologico che gli impedisca di concentrarsi nel suo lavoro, dovrà comu-
nicarlo al capo del panel, o perché lo esenti dal lavoro, o perché prenda le
decisioni opportune, tenendo conto del possibile scostamento dai valori
medi del resto del panel.
9.1.5. L'assaggiatore, verificate le norme precedenti, occuperà il suo posto nella
cabina assegnatagli, nella maniera più ordinata e silenziosa possibile.
9.1.6. Una volta seduto, controllerà se il materiale che gli occorre è in ordine e
quello giusto e se la chiave del bicchiere corrisponde con quella del vetro
di orologio che la copre.
9.1.7. Leggerà con attenzione le istruzioni contenute nel foglio di punteggio, e
non inizierà l'esame del campione finché non sia totalmente compenetrato
con il lavoro che deve realizzare. In caso di dubbio, si consulterà in
privato con il capo del panel.
9.1.8. L'assaggiatore prenderà il bicchiere tenendolo coperto col vetro di
orologio e l'inclinerà leggermente e in questa posizione lo girerà comple-
tamente per bagnare il più possibile la superficie interna. Fatto ciò,
separerà il vetro d'orologio e odorerà il campione, facendo inspirazioni
soavi, lente e intense, fino a formarsi un criterio sull'olio che deve giudi-
care. Il periodo di odorazione non deve eccedere i 30 secondi. Se in
questo periodo non si è giunti a nessuna conclusione, si riposi prima di
un nuovo tentativo. Fatta la prova olfattiva, si giudicherà il flavour
(sensazione congiunta olfatto-gustativa-tattile). Si prenderà un sorsetto
d'olio, di piú o meno tre ml. Importa molto ripartire l'olio per tutta la
cavità orale, dalla parte anteriore e dalla lingua, per i laterali e la parte
posteriore, fino ai pilastri del palato, giacché, come si sa, la percezione
dei quattro sapori fondamentali (dolce, salato, acido e amaro) varia
d'intensità secondo le zone della lingua e del palato.
Si deve insistere sulla necessità che l'olio si stenda in quantità sufficiente
e molto lentamente dalla parte posteriore della lingua verso i pilastri del
palato e la gola, concentrando l'attenzione nell'ordine di apparizione degli
stimoli amaro e piccante; se non si facesse così, in alcuni oli di due
stimoli potrebbero passare inavvertiti o l'amaro essere occultato dal
piccante.
Aspirazioni corte e successive, introducendo aria per la bocca, permet-
tono, oltre ad estendere il campione ampiamente per la cavità orale, di
percepire per via retronasale i componenti volatili aromatici.
Deve tenersi conto anche della sensazione tattile: devesi, perciò, prendere
nota, se si notano fluidità, pastosità, prurigine o bruciore, e se la prova lo
richiede, quantificarne l'intensità.
9.1.9. La valutazione organolettica di un olio vergine deve farsi per un solo
campione per seduta, per evitare l'effetto di contrasto che potrebbe
produrre l'assaggio immediato di altri.
Dato che i successivi assaggi sono alterati dalla fatica, o perdita di sensi-
bilità dovute ai precedenti, sarà necessario servirsi di un prodotto capace
di eliminare dalla bocca i resti d'olio dell'assaggio anteriore.
Si raccomanda l'uso di un pezzettino di mela, di circa 15 gr, che, una
volta masticato, può essere sputato; sciacquarsi poi con un poco d'acqua
a temperatura ambiente. Tra un assaggio e l'altro devono passare almeno
15 minuti.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 60
▼B
9.2.Sceltadicandidati
L'organizzatore del panel dovrà realizzare questa fase mediante interviste
personali per conoscere la personalità del candidato e le sue caratteri-
stiche. I requisiti previ quanto alle condizioni fisiologiche e psicologiche
sono molto rigorosi, giacché, in principio, qualsiasi persona normale può
svolgere questa attività. L'importanza dell'età, del sesso, di certe abitudini
(fumare), ecc. si considerano secondarie dinanzi ad altri aspetti come: la
salute, l'interesse personale e il tempo disponibile.
Durante l'intervista, l'organizzatore della prova deve spiegare al candidato
le caratteristiche dell'attività che realizzerà e informarlo sul tempo
approssimativo che dovrà dedicarle. Deve poi raccogliere dati che gli
permettano di valutare il grado di interesse e la motivazione del candi-
dato, nonché della sua disponibilità reale di tempo. Dovrà servirgli di
riferimento il seguente questionario.
(1)
Con questa informazione l'organizzatore realizzerà la scelta preliminare,
rifiutando i candidati con poco interesse per questo tipo di lavoro, con
poco tempo disponibile o incapaci di concretare le loro idee.
9.3.Determinazione della«sogliamedia»delgruppoper«attributicarat-
teristici»
Si scelgono con cura quattro oli, in maniera che ciascuno sia considerato
come rappresentante tipico degli attributi: Riscaldo, Avvinato, Rancido e
Amaro, con la maggiore e più chiara intensità possibile.
Prendendo un'aliquota di ciascuno si preparano campioni, a differenti
concentrazioni per successive diluzioni (ragione 2) con il supporto oleoso
adeguato finché nelle due o tre ultime diluzioni non sia possibile scoprire
differenza con il bicchiere che contiene soltanto il supporto. Un'ultima
coppia la formeranno due bicchieri di supporto oleoso.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 61
(1) Descriva l'interesse che può avere la valutazione organolettica di qualsiasi alimento o,
se vuole, dell'olio di oliva.
▼B
La serie si completerà con bicchieri di concentrazioni superiori, fino a un
totale di otto.
Preparare una quantità sufficiente di campioni delle differenti concentra-
zioni per dare serie complete di ciascun attributo a ciascuno dei candidati.
Per stabilire la «soglia media» dei candidati per ciascun attributo si
presenterà loro un bicchiere con 15 ml di una qualsiasi delle concentra-
zioni preparate, insieme con un altro bicchiere con 15 ml del solo
supporto. Il candidato, fatta la prova, deve indicare se sono uguali odiverse.
La stessa prova si ripete per le altre concentrazioni dell'attributo studiato.
Si annota il numero di risposte corrette ottenute per ciascuna concentra-
zione dal complesso di candidati e si riferisce come percento del numero
di prove eseguite.
Si rappresenta in ordine crescente, nelle ascisse le concentrazioni provate
e nelle ordinate il percento di identificazioni corrette fatte per ciascuna
concentrazione.
La figura 1 rappresenta un esempio pratico di quanto anteriormente
esposto. La soglia di rivelazione si definisce sulle ascisse extrapolando
dalla curva il punto dell'ordinata che corrisponde a un 75 % di prove
riuscite.
Questa concentrazione «soglia» può essere distinta per ciascun olio di un
lotto, e dipende dall'intensità dell'attributo in detto olio; deve essere simi-
lare per i distinti gruppi di candidati di distinti «panels»; non è vincolata
a nessuna abitudine, consuetudine o preferenza tendenziale; è, perciò, un
punto di riferimento comune a qualsiasi gruppo umano normale e può
servire per rendere omogenei i distinti «panels» soltanto per la loro sensi-
bilità olfatto-gustativa.
Partendo dalla concentrazione soglia del gruppo ottenuta:
Si prepara una serie di concentrazioni crescenti e decrescenti in maniera
che questa «concentrazione soglia» corrisponda al posto 10 di questa
scala. Logicamente le concentrazioni 11 e 12 saranno più diluite e
pertanto sarà molto difficile scoprirvi l'esistenza dell'olio con l'attributo
scelto.
Dalla concentrazione C
10, gli altri campioni possono prepararsi mediante
la formula:
C10×an, ove «a» è una costante corrispondente al fattore di diluzione
uguale a 1,5 e «n» l'esponente che varierà da 9 a −2.
Per esempio: posta la soglia ottenuta per l'olio rancido = 0,32, sarà C10= 0,32 e dato che a = 1,5 la serie di campioni avrà le seguenti concentra-
zioni:
Campioni 1 2 3 4 567891 0 1 1 1 2
Concentrazione 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Se si ripete quanto detto per gli altri tre attributi, partendo dalle soglie
rispettive calcolate anche come è stato indicato, si otteranno scale che
per tutti i laboratori avranno intensità aromatiche similari per ciascuno
stimolo, sebbene si sia partiti da oli di oliva i cui difetti sono percettibili
con distinta intensità.
9.4.Sceltadiassaggiatoricolmetododi«classificazione diintensità»
La scelta deve farsi partendo da un numero di candidati due o tre volte
superiore a quello necessario per formare il gruppo, per poter scegliere i
più sensibili e quelli con maggior capacità discriminatrice. È sempre
consigliabile fare le prove con lo stesso prodotto che si analizzerà poi.
(Pertanto, noi impiegheremo olio di oliva).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 62
▼B
Figura1
Nella scelta del metodo, insieme con la sua efficacia non si deve dimen-
ticare che interessa che la procedura da seguire sia la più economica
possibile quanto a quantità di olio, numero di campioni da impiegare e
tempo dedicato alla scelta. L'efficacia di una procedura di scelta è carat-
terizzata dalla scelta dei livelli ottimali delle tre seguenti variabili
dipendenti: a) «costo» determinato dal numero di prove, b) «proporzione»
di candidati potenzialmente adatti, che per caso possono essere sfortuna-
tamente rifiutati nella cernita e c) «proporzione» di candidati non adatti
che per un caso favorevole sono accettati nella scelta pur non dovendo.
La procedura di selezione, scelta e proposta, è quella della «prova di clas-
sificazione d'intensità» (The intensity rating test) descritta nelle norme
ASTM(*), STP(*) n. 440, pag. 53, modificata in quattro punti:
1) riduzione del numero di campioni nella serie,
2) ampliamento di stimoli, per aumentare il numero di note olfatto-gusta-
tive sulle quali è fondata la selezione, per adattarle ai difetti piùcomuni percettibili nell'olio di oliva,
3) variazione della relazione di concentrazione nella serie, e4) trattamento statistico dei risultati.
Materialenecessario
— bottiglie o matracci di 1 500 ml,
— bicchieri di vetro scuro,— provette di 10 ml, 15 ml, 1 000 ml e 1 500 ml.
Prodottinecessari
— paraffina Merck (riferimento 7.160, DAB 8, USP XX) o supporto
oleoso inodoro e insipido (olio di oliva o un altro similare) raffi-
nato di recente),
— oli: riscaldo, avvinato, rancido e amaro.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 63
(*) American Society for Testing and Materials (ASTM), Special Technical Publication
(STP).
▼B
9.4.1. Modo di operare
Preparate le concentrazioni, si comincerà la selezione partendo da 25
candidati, secondo la seguente metodologia per ciascuno stimolo:
1) Si preparano serie di dodici bicchieri, marcati con chiave di identifica-
zione (una serie per candidato). In ciascun bicchiere si versano 15 ml
di ciascuna delle distinte concentrazioni, preparate secondo la formula
C10×an.
2) Conviene che i bicchieri, pieni, rimangano nella sala di assaggio, a 20-
22 ºC, coperti con un vetro di orologio almeno un'ora prima delle
prove perché raggiungano la temperatura ambiente.
3) L'organizzatore della prova ordinerà i dodici bicchieri di una serie in
fila da maggiore a minore concentrazione.
Si invita, quindi, ciascun candidato a fare la prova, separatamente,
dandogli le seguenti istruzioni:
9.4.2. Istruzioni per il candidato
I dodici bicchieri allineati dinanzi al candidato contengono diluzioni di
ciascuno degli stimoli riscaldo, avvinato, rancido o amaro, secondo il
caso. I bicchieri differiscono gli uni dagli altri nell'intensità dell'odore;
quello di odore più intenso trovasi nell'estrema sinistra, l'intensità di
odore dei restanti diminuisce gradualmente verso destra. L'ultimo
bicchiere a destra può avere così poco odore che potrebbe essere impos-
sibile rivelarlo.
Procedere così: si abitui agli odori dei bicchieri della serie. Cominci,
perciò, con quello a destra (n. 12) e cerchi di ricordare l'intensità degli
odori. Non si stanchi.
Quando consideri che ha preso familiarità con la scala di concentrazione
di odore presentata, esca dalla sala.
Frattanto, l'organizzatore sceglierà un bicchiere dalla serie che accoppierà
con l'ultimo della destra e coprirà il vuoto avvicinando tra loro i restanti.
Ritorni quindi in sala e continui la prova.
La prova è la seguente.
Riponga il bicchiere separato al posto giusto della serie. Per far ciò, può
odorarlo e confrontarlo con gli altri tante volte quante vuole; se lo rimette
al posto giusto, deve odorare più forte del più vicino di destra e meno di
quello della sinistra. Questa prova dovrà ripeterla con altri tre bicchieri.
Per agevolare l'operazione e la raccolta della risposta data, a ciascun
candidato si consegnerà, insieme con le istruzioni già descritte, il
seguente specchietto:
9.4.3. Ottenimento dei risultati
Per facilitare l'ordinamento dei dati di ciascun candidato, l'organizzatore
del «panel», li annoterà nella seguente forma:
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 64
▼B
9.4.4. Procedimento statistico di punteggio
Nel caso concreto della selezione richiesta, i bicchieri da reintegrare al
loro posto dovranno essere gli stessi per tutti e per ciascun candidato e
secondo i calcoli statistici realizzati per questo caso, saranno quelli il
cui ordine di serie è qui indicato per ciascun attributo.
Riscaldo (Ri) Avvinato (Av) Rancido (Ra) Amaro (Am)
Bicchiere n. Bicchiere n. Bicchiere n. Bicchiere n.
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Il numero occupato dai bicchieri nella serie non può essere variato,
giacché i calcoli statistici per questa prova sono stati fatti conformemente
alla probabilità che i bicchieri siano rimessi al loro posto per caso.
Orbene, per impedire qualsiasi passaggio d'informazione da un candidato
all'altro, l'organizzatore del «panel» terrà presente i seguenti punti:
1) I candidati non possono comunicare tra loro. Le chiavi saranno diffe-
renti per ciascun candidato.
2) I candidati non devono conoscere la posizione dei bicchieri loro tolti.
3) Sebbene tutti i candidati debbano ricevere i bicchieri prima indicati,
l'organizzatore deve variarne l'ordine di consegna.
A ciascun candidato si assegna un punteggio, in funzione dei risultati
ottenuti, nella seguente maniera:
Siano e1i,e2i,…e12ii dodici bicchieri con le dodici concentrazioni corri-
spondenti di un attributo i (i = uno qualsiasi dei quattro attributi riscaldo,
avvinato, rancido e amaro) ordinate da maggiore a minore.
Sia ekiuno dei bicchieri scelti e sia K ′la posizione assegnatagli dal candi-
dato nella serie. I valori di K e K ′sono, perciò, numeri interi compresi tra
l'1 e il 12, che corrispondono alla posizione reale e a quella assegnata dal
candidato, rispettivamente.
Sia T (massimo scostamento ammesso) un valore, prefissato, nel nostro
caso uguale a 3 in maniera che se (K ′−K) > T il candidato è scartato
automaticamente(1).
Se invece (K ′−K)≤T, il candidato in principio, non è scartato e può
continuare la prova, dato che è capace di situare lo stimolo problema
nel posto giusto o almeno nei posti più prossimi.
In tal caso, il punteggio assegnato a un candidato, quando valuta uno
stimolo (concentrazione) di un tipo determinato, per es. della serie
riscaldo (Ri), sarà pari al quadrato della differenza tra il numero di ordine
che spetta alla posizione corretta che occuperebbe nella serie il bicchiere
contenente lo stimolo e la posizione nella quale il candidato lo ha
rimesso. Ossia:
Ph(Ri) = (K ′−K)2
Dato che questa operazione sarà realizzata da uno stesso candidato su
quattro stimoli (concentrazioni) di ciascun attributo, il punteggio parziale
per dotto tipo (per es.: Ri) sarebbe:
ZRi=PRi
h+PRi
j+PRi
l+PRi
m
Per maggior chiarezza si espongono gli esempi seguenti:
Esempio 1:
Supponiamo che le risposte del candidato A per i quattro stimoli ritirati
dalla serie dell'attributo (i) siano:
Posizione corretta
del bicchiere nella
serie
(K)Posizione nella quale
fu messo
(K′)Scostamento dalla posizione
corretta
(K′−K)
7 7 7−7=01991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 65
(1) L'organizzatore del «panel» deve insistere al candidato perché la prova si faccia in
maniera ragionevole, ossia che non vi sia perdita di sensibilità per fatica olfattiva.
▼B
Posizione corretta
del bicchiere nella
serie
(K)Posizione nella quale
fu messo
(K′)Scostamento dalla posizione
corretta
(K′−K)
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Questo candidato è eliminato, giacché ha ottenuto nella prova un valore di T
>3 .
Esempio 2:
Supponiamo che un candidato riordini così i bicchieri di un attributo:
Posizione corretta
del bicchiere nella
serie
(K)Posizione nella quale
fu messo
(K′)Scostamento dalla posizione
corretta
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Zi=02+02+32+ (−1)2=1 0
Il punteggio finale del candidato che ci permetterà di sceglierlo o no
come assaggiatore in funzione delle sue risposte dinanzi ai quattro tipi
che abbiamo preso per la scelta sarebbe:
PhRi+PjRi+PlRi+PmRi=ZRi
PhAv+PjAv+PlAv+PmAv=ZAv
PhRa+PjRa+PlRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PlAm+PmAm=ZAm
Z finale = Zri+…+ZAm
dove:
Ri = Riscaldo
Av = AvvinatoRa = RancidoAm = Amaro
Si tratta adesso di determinare fino a quale valore di Z si può considerare
che il candidato possiede buoni livelli di percezione, memoria olfattiva e
organizzazione mentale per dare l'adeguata risposta per i quattro stimoli
dati. Naturalmente Z è sempre un valore non negativo, e Z = 0 significa
che il candidato ha riconosciuto e quantificato correttamente tutte le
sedici intensità presentategli (quattro di ciascun attributo). Valori di Z di-
versi da zero indicano che il candidato ha riconosciuto le zone delle scale
dove si situano le intensità scelte, ma all'interno d'esse, non ha potuto
assegnare correttamente una posizione per non possedere una buona
capacità discriminatrice associata alla scala d'intensità presentatagli per
uno o vari stimoli.
Cosicché, si dovrà determinare un valore critico Z, tale che, nell'ipotesi in
cui il candidato assegni tutte le posizioni nella scala a caso, all'interno
delle zone che previamente ha riconosciuto, la probabilità di un punteggio
definitivo Z, inferiore a Z
c, sia una quantità sufficientemente piccola α
che si può fissare previamente. In altre parole: che la probabilità che
con questa procedura si scelga un assaggiatore per il «panel», che non
possegga sufficiente capacità discriminatrice per le intensità degli stimoli
impiegati per la scelta, sia inferiore a α.
Fissato α,nel nostro caso uguale a 0,05, l'ottenimento di Zcdipende dalla
distribuzione di probabilità della variabile Z, che, a sua volta, dipende
dalle distribuzioni di probabilità delle variabili p(K ′).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 66
▼B
Fatti gli appositi calcoli statistici il valore ottenuto per Zcè uguale a 34.
Ottenuto il punteggio Z di tutti i candidati, saranno eliminati quelli dal
punteggio superiore a 34.
Per esempio, i candidati A e B ottengono i seguenti punteggi:
Tipo Candidato A Candidato B
Riscaldo ZRi=1 0 ZRi=1 2
Avvinato ZAv=1 0 ZAv=1 1
Rancido ZRa=1 0 ZRa=1 5
Amaro ZAm=4 ZAm=0
Σ=3 4 Σ=3 8
I valori di Z per i due candidati sono: 34 per l'A e 38 per il B; quindi sarà
eletto il candidato A e scartato il B. Eliminati i candidati con punteggio
superiore a 34, i restanti si ordineranno per i loro valori di Z, scegliendosi
per ordine fino a completare i dodici che desideriamo riunire.
9.5.Allenamento
L'allenamento ha come scopo principale:
a) Familiarizzare l'assaggiatore con le numerose varianti olfatto-gusta-
tive-tattili che offrono gli oli di oliva vergini;
b) Familiarizzare gli assaggiatori con la metodologia sensoria specifica;
c) Incrementare l'abilità individuale per riconoscere, identificare e quan-
tificare gli attributi sensori;
d) Migliorare la sensibilità e la memoria dinanzi ai distinti attributi per
ottenere giudizi consistenti.
Il periodo di allenamento suole consistere in una serie di sedute, secondo
le possibilità del gruppo e dello studio, nelle quali, analizzati individual-
mente gli oli, gli assaggiatori discutono insieme con il direttore le
difficoltà trovate e commentano le qualificazioni per unificare criteri e
opinioni.
Il grado di allenamento raggiunto dopo un determinato numero di sedute
si valuta osservando l'incremento nel percento di giudizi corretti, se si
impiegano prove discriminatrici, o analizzando le varianze delle qualifi-
cazioni individuali medie del gruppo, se si tratta di prove scalari.
L'utilità pratica di questo periodo di allenamento è stata ampiamente
discussa, però oggi si considera molto efficace e perfino imprescindibile
quando occorrono dati sensori esatti e precisi.
9.6.Controllo
I gruppi di assaggiatori molto allenati sono soliti fare assaggi periodici e
continui con prove sensorie che richiedono grande sforzo. Sulla loro
opinione si fondano, spesso, decisioni di grande importanza tecnologica
e commerciale e, pertanto, dopo essere stati scelti e allenati, devono
essere soggetti a controlli che garantiscano che i risultati siano degni di
fede.
È evidente che sarebbe necessario che, una volta costituiti i «panels» e
soggetti a prove d'uso, si procedesse periodicamente a verificare la loro
«forma» a intervalli adeguati.
10. MODO DI OPERARE PER LA VALUTAZIONE ORGANOLETTICA
DELL'OLIO D'OLIVA VERGINE
Soddisfatti le condizioni e i mezzi necessari indicati nelle succitate norme
e scelto il gruppo di assaggiatori, ciascuno di loro odorerà e assaggerà(1)
l'olio da esaminare, contenuto in apposito bicchiere, per analizzarne le
percezioni olfattive, gustative, tattili e chinestetiche e si servirà del foglio1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 67
(1) Si potrà astenere quando all'odorarlo trovi qualche attributo estremamente sgradevole.
Annoterà questa eccezionale circostanza nel foglio di punteggio.
▼B
della figura 2 per annotare la loro presenza e il valore della loro intensità.
Passerà, poi, al punteggio della qualità dell'olio.
10.1.Uso del foglio della fig. 2 (descrizione del «flavour» e punteggio di
qualità)
Sulla parte sinistra di questo foglio sono indicate alcune delle percezioni
sensorie più caratteristiche che si trovano con più frequenza negli oli di
oliva e che ne descrivono il «flavor». Nel caso in cui si percepissero altri
stimoli che non corrispondano ai qualificativi enumerati, l'assaggiatore
deve annotarli nella voce «altri» impiegando il o i qualificativo(i) che
meglio li descriva.
Gli stimoli percettibili devono essere valutati proporzionalmente alla loro
intensità con un segno (+) nella casella corrispondente, secondo il
seguente criterio:
1 quasi impercettibile
2 leggera
3 media4 grande
5 estrema
Sulla parte destra di questo foglio si stabilisce una scala da uno a nove
punti (9 per qualità eccezionale, 1 per la pessima), che l'assaggiatore
impiegherà per dare un punteggio unico, d'insieme, delle caratteristiche
dell'olio. Questo punteggio deve essere coerente con i pregi e i difetti
trovati nell'olio e già annotati nella parte sinistra del foglio.
La prima colonna (difetti) della tabella di punteggio comprende cinque
settori; pertanto, la classificazione degli oli deve fondarsi essenzialmente
sull'assenza totale o sulla presenza di «flavours» difettosi, nonché sulla
loro maggiore o minore gravità o intensità; tuttavia, essendo la scala di
valutazione di nove punti, bisogna cogliere quelle sfumature e quegli
aspetti, descritti nella seconda colonna «caratteristiche», che contribui-
scono in maniera definitiva a decidere sul punteggio totale di qualità.
10.2.Punteggiofinale
Il capo del panel deve raccogliere le schede riempite da ogni assaggia-
tore, verificare che gli attributi sensoriali e le intensità con le quali li ha
percepiti ed annotati nel foglio del profilo concordano con la valutazione
assegnata nel foglio di punteggio. In caso di differenza notevole chiederà
all'assaggiatore di rivedere il foglio di punteggio.
Se fosse necessario l'assaggiatore dovrà ripetere la prova.
Infine, il capo del panel deve fare una tabella con i punteggi di tutto il
gruppo, calcolarne la media aritmetica e l'errore tipico (della media).
Se l'erore tipico è superiore all'errore del metodo dovrà far ripetere la
prova a tutto il gruppo.
Solo nel caso di analisi di revisione il gruppo ripeterà comunque le prove
fino ad ottenere una valutazione per triplicato del campione; il punteggio
finale saro la media dei tre punteggi dati, con una cifra decimale.
Se il valore di intensità media dell'amaro e/o piccante è superiore a 2,5 si
darà all'olio la corrispondente classificazione aggiungendo la nota che è
particolarmente amaro e/o piccante.
Espressione dei risultati: il capo del panel, sulla base del punteggio
medio, determina la categoria di appartenenza del campione, conforme-
mente ai limiti previsti nell'allegato I. A tal fine, il capo del panel
applica:
— durante la campagna 1992/1993, una tolleranza di + 1,5,
— durante la campagna 1993/1994, una tolleranza di + 1,— durante la campagna 1994/1995, una tolleranza di + 0,5,
se il punteggio medio è pari o superiore a 5 punti.
Tuttavia, per gli oli oggetto di operazioni collegate all'intervento, la tolle-
ranza per le campagne citate è limitata a + 0,5.
La differenza statistica, con riferimento ai valori di ripetibilità e di ripro-
ducibilità del metodo, tra il risultato dell'analisi e il limite regolamentare
è compresa nella tolleranza di cui ai precedenti commi.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 68
▼M5
▼M5
Qualora nelle campagne sopra citate l'interessato classifichi l'olio senza
applicare la tolleranza stabilita, può indicare sull'imballaggio immediato
il punteggio organolettico minimo del prodotto, verificabile durante il
periodo di commercializzazione.
Il capo del panel indica nella relazione d'analisi soltanto la categoria in
cui è classificato il campione. In caso di esame effettuato dall'analista
conformemente all'articolo 2, paragrafo 2, primo comma, egli applica lo
stesso procedimento di determinazione della categoria.
Nota:I campioni devono essere conservati chiusi e in frigorifero fino al
momento dell'analisi e devono eservi nuovamente riposti fino a
completare il triplicato.
Figura2
Oliodiolivavergine
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 69
▼B
▼M3
▼B
ANALISISENSORIA:VOCABOLARIOGENERALE
1. PREMESSA
La presente norma si propone di riunire i concetti generali utilizzati per
l'analisi sensoria dell'olio d'oliva e di darne la definizione.
2. VOCABOLARIO2.1.Terminologiagenerale
Analisisensoria (sostantivo):
Esame dei caratteri organolettici di un prodotto mediante i sensi.
Percezione (sostantivo):
Presa di coscienza sensoria di oggetti o avvenimenti esterni.Organolettico (aggettivo) (carattere o proprietà):
Qualifica ogni proprietà di un prodotto suscettibile di essere percepita
dagli organi dei sensi.
Esperto(sostantivo):
(Per ciò che concerne l'esame dei caratteri organolettici)Assaggiatore specializzato nell'analisi sensoria di un determinato prodotto
e che possiede cognizioni fondamentali sulla sua elaborazione e sulle
preferenze del mercato.
Assaggiatore (sostantivo):
Persona perspicace, sensibile, scelta e allenata, che stima con gli organi
dei suoi sensi i caratteri organolettici di un alimento.
Gruppodiassaggiatori:Insieme di assaggiatori che si riuniscono per eseguire, in condizioni
controllate, l'analisi sensoria del prodotto.
Sensazione (sostantivo):
fenomeno soggettivo risultante dallo stimolo di un sistema sensorio.
Questo fenomeno è soggettivamente discriminabile e oggettivamente
definibile attraverso l'organo sensorio interessato, secondo la natura o la
qualità dello stimolo, nonché la sua intensità.
Sensibilità (sostantivo):
capacità degli organi sensori di percepire qualitativamente e quantitativa-
mente uno stimolo di poca intensità o piccole differenze tra stimoli.
Assaggio (sostantivo):
operazione consistente in percepire, analizzare e giudicare i caratteri
organolettici e più particolarmente gli olfatto-gustativi, tattili e chineste-
tici di un prodotto alimentare.
Accettazione (sostantivo):
atto consistente in accogliere favorevolmente un prodotto da parte di un
individuo o una popolazione.
Armonia (sostantivo):
qualità di un prodotto che dà origine a una sensazione d'insieme grade-
vole. Detta sensazione è dovuta alla percezione dei suoi componenti,
che agiscono come stimoli olfatto-gustativi, tattili e chinestetici per
trovarsi in rapporti di concentrazione adeguati.
Accettabilità (sostantivo):
stato di un prodotto accolto favorevolmente da un individuo o da una
popolazione, in funzione delle sue proprietà organolettiche.
Discriminazione (sostantivo):
differenziazione qualitativa e/o quantitativa tra due o parecchi stimoli.
Compensazione (sostantivo):
risultato dell'interazione dovuta a un complesso di stimoli in modo che
ciascuno si percepisca con minore intensità che se agisse da solo.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 70
▼B
Aspetto(sostantivo):
complesso di caratteri organolettici percepiti dall'organo della vista:
dimensioni, forma, colore, conformazione, torbidità, pulizia, fluidità,
spuma e effervescenza. Questo termine è preferibile a quello di appa-
renza.
Attributo (sostantivo):
proprietà caratteristica percettibile.
2.2.Terminologiarelativa allafisiologia
Stimolo(sostantivo):
agente fisico o chimico che produce specificamente la risposta dei ricet-
tori sensori esterni o interni.
Gusto(sostantivo):
uno dei sensi i cui ricettori sono localizzati nella bocca, particolarmente
sulla lingua, e che sono attivati da differenti composti in soluzione.
Gustativo (aggettivo):
qualifica la proprietà di un prodotto capace di stimolare l'apparato gusta-
tivo destando le sensazioni corrispondenti a uno o più dei quattro sapori
elementari: dolce, salato, acido e amaro.
Ricettore (sostantivo):
struttura specializzata di un organo sensorio eccitabile, capace di ricevere
uno stimolo e convertirlo in flusso nervoso.
Nota:i ricettori si classificano secondo il tipo di energia associata allo
stimolo (luce, calore, suono, ecc.).
Odorazione (sostantivo):
funzione dell'organo olfattivo tendente a percepire e distinguere le mole-
cole che vi accedono, in fase gassosa da un mezzo esterno, per via nasale
diretta o indiretta.
Intensità (sostantivo):
grado di energia di una qualità misurabile secondo una scala quantitativa
di valori superiori alla soglia.
Adattamento (sostantivo):
modificazione temporale della sensibilità a percepire stimoli sensori come
risultato di una continua e ripetuta esposizione a questo o similare
stimolo.
Inibizione (sostantivo):
mancanza di risposta da parte di un organo sensorio o di una sua parte,
nonostante sia sottoposto all'azione di uno stimolo adeguato di intensità
superiore alla soglia.
Risposta (sostantivo):
azione con la quale le cellule sensorie rispondono a quella di uno o vari
stimoli relativi a una modalità sensoria definita.
Corpo(sostantivo):
sensazione tattile percepita nella bocca e che dà un grado di densità,
viscosità, consistenza o compattezza a un prodotto.
Fragranza (sostantivo):
odore fresco, soave e delizioso.Odorare (verbo):
senso attivo applicato all'odorato.Designa l'azione di percepire un odore.Oggettivo (aggettivo):
a) qualifica ciò che dà una rappresentazione reale e comprovabile
dell'oggetto, riducendo al minimo i fattori umani (per es.: preferenza,
abitudine, affettività);
b) qualifica quella tecnica che, impiegando o metodi sensori o metodi
strumentali, permette di ridurre al minimo gli errori peculiari.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 71
▼B
Nota:Si consiglia di non impiegare come sinonimo il termine «strumen-
tale».
Soggettivo (aggettivo):
Qualifica ciò che dà una percezione condizionata dal nostro modo di
pensare o sentire e non soltanto dallo stimolo.
Chinestesia:complesso di sensazioni risultanti dall'applicazione di una pressione
applicata al campione da un movimento nella cavità orale o nelle dita
(per es.: pressione delle dita nel caso di un formaggio).
Soglia(sostantivo):
Sogliaassoluta:quantità minima di uno stimolo sensorio, che origina:
— l'apparizione di una sensazione (soglia di apparizione o di rivela-
zione);
— o il riconoscimento di detta sensazione (soglia di identificazione).
Sogliadifferenziale:quantità minima di stimolo sensorio che genera una differenza percettibile
nell'intensità della sensazione.
Sogliafinale:
quantità massima di uno stimolo a decorrere dalla quale un aumento di
intensità non si percepisce.
Sogliapreferenziale:valore quantitativo minimo di uno stimolo o valore critico soprallimitare
di questo stimolo al quale corrisponde l'apparizione di una risposta di
attrazione o ripulsa rispetto a uno stimolo neutro, per esempio, nella
scelta tra una soluzione zuccherina e l'acqua.
Nota:Devesi dinstinguere tra soglia assoluta di preferenza e soglia diffe-
renziale di preferenza.
Sublimitare (aggettivo):
di sotto della soglia appropriata.Soprallimitare (aggettivo):
di sopra della soglia appropriata.
Faticasensoria:caso di adattamento sensoriale che produce una diminuzione della sensi-
bilità.
Compensazione (sostantivo):
risultato dell'interazione dovuta a un complesso di stimoli in modo che
ciascuno si percepisca con minore intensità che se agisse da solo.
Sinergico (aggettivo):
effetto o azione concertata di determinate sostanze, in modo che
l'intensità dei caratteri organolettici risultanti dalla mescolanza è supe-
riore alla somma delle intensità che ciascuno di essi mostrava
separatamente.
Effetto dicontrasto:aumento della risposta alle differenze tra due stimoli simultanei o conse-
cutivi. Contrario dell'effetto di convergenza.
Effetto diconvergenza:diminuzione della risposta alle differenze tra due stimoli simultanei o
consecutivi. Contrario dell'effetto di contrasto.
2.3.Terminologiarelativa alle proprietàorganolettiche
Acido(aggettivo):
a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose diluite
della maggioranza degli acidi (per es.: acidi citrico, lattico e tartarico);
b) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che, all'as-
saggio, producono questo sapore.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 72
▼B
Il sostantivo corrispondente è acidità.
Agro(aggettivo):
qualifica la sensazione olfatto-gustativa con predominio di acidi general-
mente di origine fermentativa e gli alimenti che producono questa
sensazione. Alcuni fattori che contribuiscono a detta sensazione sono in
rapporto con il processo di fermentazione (per esempio acetica o lattica)
di un prodotto alimentare.
Amaro(aggettivo):
a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose diluite di
diverse sostanze come la chinina, la caffeina e determinati eterossidi;
b) qualifica la proprietà di quei corpi puri o loro mescolanze che, all'as-
saggio, producono questo sapore.
Il sostantivo corrispondente è amarezza o amaro.
Salato(aggettivo):
a) sensazione caratteristica che si percepisce attraverso il senso del gusto,
e il cui esempio più tipico è quello prodotto da una soluzione di
cloruro sodico;
b) qualifica la proprietà dei corpi o delle mescolanze che producono
questo sapore durante l'assaggio.
Il sostantivo corrispondente è salinità.Dolce(aggettivo):
a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose di diverse
sostanze, per esempio il saccarosio;
b) qualifica la proprietà delle sostanze pure o mescolanze che, all'as-
saggio, producono questo sapore.
Il sostantivo corrispondente è dolcezza.
Astringente:
a) qualifica la complessa sensazione prodotta nella bocca da una solu-
zione acquosa diluita di prodotti come certi tannini (per es.: i tannini
del cachi e della prugna);
b) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che producono
questa sensazione.
Il sostantivo corrispondente è astringenza.Flavor(sostantivo):
complesso delle percezioni degli stimoli olfatto-gustativi, tattili e chine-
stetici che permette di identificare un alimento e stabilire un criterio, a
distinti livelli, favorevole o sfavorevole.
Sapore(sostantivo):
a) sensazioni percepite come conseguenza dello stimolo delle papille
gustative da alcune sostanze solubili;
b) qualità della peculiare sensazione prodotta da tali sostanze.
Saporeelementare (sostantivo):
Ciascuno dei quattro sapori noti: dolce, salato, acido, amaro.
Odore(sostantivo):
a) complesso di sensazioni percepite dall'organo olfattivo quando si
inspirano determinate sostanze volatili;
b) qualità della peculiare sensazione prodotta da ciascuna delle sostanze
anteriori.
Aroma(sostantivo):
a) sensazioni gradevoli percepite dall'organo olfattivo per via indiretta
all'assaggio di un alimento.
b) in profumeria e nel linguaggio non specializzato si applica anche alle
stesse sensazioni percepite per via nasale diretta.
Retrogusto (sostantivo):
Complesso di sensazioni percepite una volta scomparso lo stimolo dalla
bocca, distinte da quelle previamente percepite.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 73
▼B
Aromatico (aggettivo):
a) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che, all'as-
saggio, producono le sensazioni qualificate come aroma;
b) qualifica quei prodotti che, esaminati per via nasale diretta, producono
sensazioni di fragranza e di fresco.
Struttura (sostantivo):
caratteristiche dello stato solido o reologico di un prodotto, il cui
complesso è capace di stimolare i ricettori meccanici, durante l'assaggio,
particolarmente di quelli situati nella cavità orale.
Nota:Questo termine si riferisce soltanto alle proprietà oggettive e non
alle sensazioni prodotte e che si designano con termini generali,
come consistenza, fibrosità, untuosità, ecc.
Assaporare:
far che un alimento situato nella bocca entri in contatto con tutte le sue
zone sensibili per percepire le sensazioni orali che produce.
Nota:Questo vocabolario si può ampliare consultando le Norme ISO
5492/I, II, III, IV, V ed altre esistenti, nonché quello elaborato da
J.L. Magnen «Les cahiers techniques du Centre national de coordi-
nation des études et recherches sur la nutrition et l'alimentation»,
ecc.
BICCHIEREPERL'ASSAGGIODIOLI
1. PREMESSA
La presente norma si propone di descrivere le caratteristiche del bicchiere
da usare per l'analisi organolettica degli oli commestibili (odore, sapore,
flavor).
Descrive, inoltre, il dispositivo di riscaldamento adattato, necessario per
ottenere e mantenere la temperatura adeguata per quest'analisi.
2. DESCRIZIONE
Lo schema disegnato della figura 1 vuol migliorare le caratteristiche desi-
derabili in un utensile di questa natura, e che possono essere:
a) Massima stabilità, che ostacoli l'inclinazione e il versamento dell'olio
contenuto;
b) Fondo facilmente adattabile alla forma della piastra riscaldante che
permetta il riscaldamento omogeneo della base del bicchiere.
c) Restringimento della bocca per favorire la concentrazione degli odori
e agevolarne l'identificazione.
d) Vetro oscuro che non permetta all'assaggiatore di percepire il colore
dell'olio, per impedirgli così qualsiasi pregiudizio e la possibile crea-
zione di inclinazioni o tendenze che possano alterare l'obiettività della
determinazione.
2.1.Dimensioni
Lo schema del bicchiere è rappresentato nella figura 1 ed ha le seguenti
dimensioni:
— capacità totale …............................... 130 ml ± 10 ml,
— altezza totale …................................ 60 mm ± 1 mm,— diametro della bocca …........................ 50 mm ± 1 mm,— diametro della parte più larga …............... 70 mm ± 1 mm,
— diametro della base … .......................... 35mm±1mm,
— spessore del vetro nelle pareti laterali …........ 1,5 mm ± 0,2 mm,— spessore del vetro nel fondo …................. 5 mm ± 1 mm.
Ogni bicchiere sarà accompagnato di un vetro di orologio dal diametro di
circa 10 mm maggiore di quello della bocca. Questo vetro servirà di
coperchio per evitare la perdita di aroma e l'entrata di polvere.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 74
▼B
2.2.Caratteristiche difabbricazione
Il bicchiere dovrà essere fabbricato con vetro resistente, di colore scuro
per impedire l'apprezzamento della colorazione del suo contenuto, ed
esente da strisce o da bolle di fusione.
L'orlo dovrà essere regolare, liscio e rivolto.Il bicchiere dovrà essere ricotto per resistere alle variazioni di tempera-
tura che dovrà sopportare durante le prove.
2.3.Normeperl'uso
La pulizia dei bicchieri dovrà farsi servendosi di sapone o detersivo non
profumati, sciacquando più volte fino ad eliminare il prodotto impiegato.
Si sciacqua, infine, con acqua distillata, si lascia scorrere e si asciuga in
una stufa di essiccamento.
Non devono usarsi acidi concentrati né miscela cromica.I bicchieri devono mantenersi nella stufa fino al momento di usarli, o
conservarsi in un armadio al riparo da qualsiasi contaminazione di odori
estranei.
Prima dell'uso bisognerà odorare ogni bicchiere per comprovare l'assenza
di qualsiasi odore estraneo. Al preparare la prova bisognerà avere la
precauzione di prendere nota della chiave di identificazione di ogni
bicchiere e dell'olio corrispondente. Questa corrispondenza chiave/olio
sarà nota soltanto all'organizzatore della prova.
3. Dispositivo di riscaldamento dei campioni
L'esame organolettico dei campioni dovrà farsi a una temperatura deter-
minata che, per gli oli commestibili, è di 28 ºC ± 2 ºC. All'interno di ogni
cabina dovrà porsi, alla portata dell'assaggiatore, un dispositivo di riscal-
damento come quello della figura 2. Trattasi di un blocco di alluminio
sommerso in un bagno d'acqua regolato termostaticamente, per ottenere
una temperatura uniforme. Questo blocco ha dei vuoti per adattarvi i
fondi dei bicchieri. La differenza di temperatura tra il dispositivo di
riscaldamento e l'olio dei bicchieri nei vuoti dei distinti blocchi deve
essere di ± 2 ºC.
Figura1—Bicchiere diassaggio
Dimensioni (in mm)1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 75
▼B
Figura 2 — Dispositivo di riscaldamento dei campioni (Dimensioni in
millimetri)
GUIDAPERL'ALLESTIMENTODIUNASALADIASSAGGIO
1. INTRODUZIONE
La sala di assaggio serve ad offrire al gruppo di assaggiatori che interven-
gono nelle prove sensorie un ambiente adeguato, comodo e normalizzato
che agevoli il lavoro e tenda a favorire la ripetibilità e la riproducibilità
dei risultati.
2. PREMESSA
La presente norma si propone di determinare le condizioni essenziali di
cui bisogna tener conto per allestire una sala di assaggio.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 76
▼B
3. CARATTERISTICHE GENERALI
La sala, qualunque sia la sua superficie, dovrà rispondere alle seguenti
specificazioni:
Dovrà essere gradevole e convenientemente illuminata, mantenendo,
però, un carattere neutro. A tal fine, si raccomanda un colore rilassante,
chiaro e a tinta unita nelle pareti per creare un'atmosfera di disten-
sione(1).
Dovrà potersi pulire facilmente ed essere isolata da qualsiasi fonte di
rumore e, se possibile, insonorizzata. Sarà anche protetta da odori estranei
e provvista di un efficace dispositivo di ventilazione. Se le oscillazioni
della temperatura ambientale lo consigliano, la sala di assaggio dovrà
essere dotata di aria condizionata per mantenere l'ambiente intorno ai
20-22 ºC.
3.1.Dimensioni
Le dimensioni della sala dipendono spesso dalle disponibilità del labora-
torio o delle imprese. In generale, dovrà essere sufficientemente ampia
per permettere l'impianto di circa dieci cabine ed anche di una zona per
la preparazione dei campioni.
Tuttavia, più grande è lo spazio dedicato all'impianto, meglio è, perché si
potranno prevedere dipendenze per, ad esempio, pulizia del materiale,
collocazione di preparazioni gastronomiche e riunioni di «panels aperti».
3.2.Illuminazione
L'illuminazione generale, sia solare, sia elettrica (per esempio, lampade di
tubo tipo «luce solare») dovrà essere uniforme, regolabile e di luce
diffusa.
3.3.Temperaturaeigrometria
La sala sarà sempre in condizioni termiche e igrometriche gradevoli.
Tranne in speciali circostanze, si raccomanda una temperatura di 20-
22 ºC e un'igrometria del 60/70 % di umidità relativa.
4. DESCRIZIONE DELLE CABINE
4.1.Caratteristiche generali
Le cabine di analisi sensoria staranno nella sala una accanto all'altra;
saranno tutte uguali e separate da paraventi abbastanza alti e larghi da
isolare gli assaggiatori una volta seduti. Possono costruirsi con qualsiasi
materiale adeguato e di facile pulizia e conservazione (legno, lastre vetri-
ficate, laminati, ecc.). Se si utilizzano pitture, queste, una volta asciutte,
dovranno essere del tutto inodore.
I sedili in ciascuna cabina dovranno essere comodi e di altezza regolabile.
Bisogna anche prevedere in ciascuna cabina illuminazione individuale
regolabile in direzione e intensità.
Si raccomanda che le cabine siano provviste di un pulsante collegato a un
dispositivo luminoso esterno che permetta all'assaggiatore di comunicare
alla persona che si occupa di lui all'esterno, senza distrarre gli altri, che
ha terminato la prova, che desidera altri campioni, che ha bisogno di
qualcosa, che ha osservato qualche irregolarità o desidera qualche infor-
mazione, ecc.
4.2.Dimensioni
Le cabine devono essere abbastanza ampie e comode.
In generale, bisogna attenersi alle seguenti dimensioni:
— Larghezza:
0,75 m (senza lavandino),
0,85 m (con lavandino);
— Profondità:
0,50 m (la tavola),1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 77
(1) Il colore della stanza e la sua illuminazione possono influire sui risultati dell'analisi
sensoria.
▼B
0,20 m (eccesso del paravento);
— Altezza dei paraventi:
0,60 m, come minimo, (a contare dalla tavola);
— Altezza della tavola:
0,75 m.
4.3.Disposizione
La superficie della tavola deve essere facile da pulire.
Una parte di detta superficie deve essere riservata per un lavandino con
acqua corrente potabile. Se ciò non fosse possibile, questo spazio servirà
per mettere una bacinella, una sputacchiera, o qualcosa del genere.
Se si devono mantenere i campioni, mentre si realizza la prova, a tempe-
ratura costante superiore o inferiore a quella ambiente, conviene disporre
di un'attrezzatura adeguata a tal fine (bagnomaria, riscaldatore, ecc.).
Si può mettere anche una mensola a più o meno 110 cm dal suolo, per
porvi diversi accessori (bicchieri, piccoli oggetti, ecc.).
Se la disposizione delle cabine nella sala lo consente, conviene aggiun-
gere un dispositivo per agevolare la presentazione dei campioni, che può
essere una porticina scorrevole, (figura 17), una ruota verticale (figura 2)
adatta per bicchieri o coppe (recipienti alti), o a ribalta se i recipienti nei
quali si servono i campioni non sono molto alti (figura 3). Semplice-
mente, che vi sia un passaggio sufficiente per i vassoi e i bicchieri che
contengono i campioni da esaminare.
5. DIPENDENZE
Se si dispone di spazio sufficiente, conviene prevedere stanze separate
per preparare i campioni (cucina sperimentale se si prevedono prove
gastronomiche o altre), scansie per collocare bicchieri o utensili e sale
di riunioni per le discussioni previe o posteriori alle prove. In tal caso,
queste si manterranno pulite e non dovranno mai molestare con odori,
rumori e conversazioni di coloro che vi fossero riuniti, il lavoro deigiudici nella sala di assaggio.
La figura 4 mostra un esempio di sala di assaggio e di impianti comple-
mentari.
Nota:Le condizioni descritte sono le ideali, però se non fosse possibile
disporre di una sala del genere riservata soltanto per analisi
sensoria, le prove potrebbero farsi in una stanza che offra le condi-
zioni minime descritte (luce, temperatura, rumore, odori),
allestendo cabine mobili di elementi pieghevoli tali da permettere
di isolare gli assaggiatori.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 78
▼B
DISPOSIZIONE DELLA CABINA
Figura1
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 79
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RUOTA DI PRESENTAZIONE DEI CAMPIONI
Figura2
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 80
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SPORTELLO DI PRESENTAZIONE DEI CAMPIONI
Figura3
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 81
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LABORATORIO DI ANALISI SENSORIA
Figura 4— Esempio di sala di assaggio
1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 82
▼B
ALLEGATOXIII
NEUTRALIZZAZIONEE DECOLORAZIONEDELL'OLIO D'OLIVA IN
LABORATORIO
1. NEUTRALIZZAZIONE E DECOLORAZIONE DELL'OLIO D'OLIVA
IN LABORATORIO
1.1.Neutralizzazione dell'olio
1.1.1. Apparecchiatura
— bicchiere da 300 ml a forma alta,
— centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml,— bicchiere da 250 ml,
— palloncini da 100 ml,
— imbuto separatore da 1 litro.
1.1.2. Reattivi
— soluzione acquosa di idrossido di sodio al 12 %,
— soluzione etilalcolica all'1 % di fenolftaleina,— esano puro per analisi,
— alcool isopropilico per analisi.
1.1.3. Modo di operare
a)Olioconacidità, espressainacidooleico, inferioreal30%
In un bicchiere da 300 ml a forma alta si pongono 50 g di olio greggio
e si riscalda a 65º su bagnomaria. Sotto lenta agitazione si aggiunge
una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % corrispondente
all'acidità libera dell'olio, con un eccesso del 5 %. Si prosegue l'agita-
zione per 5 minuti, mantenendo la temperatura a 65º.
Si trasferisce il tutto in provette da centrifuga aventi capacità di 100 ml
e si separano le paste saponose per centrifugazione. Si versa l'olio
decantato in un bicchiere da 250 ml e si lava con 50-60 ml di acqua
distillata bollente eliminando per sifonamento lo strato acquoso. Si
ripetono i lavaggi sino alla completa rimozione delle tracce di saponi
residui (scomparsa della colorazione rosea alla fenolftaleina).
Si centrifuga l'olio per eliminare le piccole quantità di acqua residua.
b)Oliconacidità, espressainacidooleico, superioreal30%
In un imbuto separatore da 1 litro si pongono 50 g di olio greggio,
200 ml di esano, 100 ml di alcool isopropilico e una quantità della
soluzione di idrossido di sodio al 12 %, corrispondente all'acidità
libera dell'olio, con un eccesso dello 0,3 %.
Si agita energicamente per 1 minuto. Si aggiungono 100 ml di acqua
distillata, si agita nuovamente e si lascia a riposo. Dopo stratifica-
zione, si allontana lo strato inferiore contenente i saponi. In molti
casi fra i due strati (oleoso superiore, acquoso inferiore), si forma
uno strato intermedio, costituito da mucillagini è di sostanze insolubili
che devono parimenti essere allontanate.
Si procede quindi al lavaggio della soluzione esanica dell'olio neutro
con porzioni di 50-60 ml di una soluzione di alcool isopropilico/acqua
distillata 1/1 (v/v) fino a scomparsa della colorazione rosea alla
fenolftaleina.
Si allontana quindi completamente l'esano per distillazione sotto vuoto
(ad esempio in evaporatore rotavivo).
1.2.Decolorazione dell'olio neutralizzato
1.2.1. Apparecchiatura
— pallone da 250 ml a 3 colli, con attacchi a smeriglio per l'inserimento
di:
a) un termometro con divisioni in gradi, permettente misure fino a
90º;1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 83
▼M6
▼B
▼B
b) un agitatore meccanico con velocità di rotazione di 250-300 giri/
minuto equipaggiato per funzionare sotto vuoto;
c) un raccordo per la pompa a vuoto;
— pompa a vuoto, in grado di dare pressioni residue di 15-30 millibar e
relativo manometro.
1.2.2. Modo di operare
Nel pallone a 3 colli si pesano circa 100 g dell'olio neutralizzato. Si inse-
riscono il termometro e l'agitatore; si opera il collegamento con la pompa
per vuoto e si riscalda fino a 90º agitando, si mantiene tale temperatura,
sempre agitando, sino a quando l'olio in esame non risulti completamente
deacquificato (30 minuti circa).
Si interrompe quindi il vuoto e si aggiungono 2-3 g di terra attivata. Si
stabilisce il collegamento con il vuoto fino a raggiungere una pressione
residua di 15-30 millibar, sempre mantenendo la temperatura a 90º, si
agita per 30 minuti intorno ai 250 giri/minuto.
Si filtra poi a caldo in stufa termostatica (50-60º).1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 84
▼M6
ALLEGATOXIV
NOTE COMPLEMENTARI 2, 3 E 4 DEL CAPITOLO 15 DELLA
NOMENCLATURACOMBINATA
2. A. Rientrano nei codici NC 1509 e 1510soltanto gli oli provenienti esclusi-
vamente dal trattamento delle olive e le cui caratteristiche analitiche
relative ai tenori in steroli e in acidi grassi sono quelle di seguito ripor-
tate:
Tabella I: Tenore in acidi grassi in % degli acidi
grassi totaliTabella II: Tenore in steroli in % degli steroli totali
ac. miristico M 0,1 colesterolo M 0,5
ac. linoleico M 0,9 brassicasterolo M 0,2
ac. arachico M 0,7 campesterolo M 4,0
ac. eicosenoico M 0,5 stigmasterolo (1) < campesterolo
ac. beenico M 0,3 betasitosterolo (2) m 93,0
ac. lignocerico M 0,5 delta-7-stigmastenolo M 0,5
m = minimo
M = massimo
(1) Condizione non applicabile per gli oli d'oliva vergini lampanti (codice NC 150910 10) e per gli oli di
sansa d'oliva greggi (codice NC 1510 00 10).
(2) Delta-5,23-stigmastadienolo + clerosterolo + betasistosterolo + sitostanolo + delta-5-avenasterolo + delta-
5,24-stigmastadienolo.
Non rientrano nei codici NC 1509 e 1510 gli oli d'oliva chimicamente
modificati (segnatamente gli oli riesterificati) e le miscele di oli d'oliva
e di oli di diversa natura. La presenza di olio d'oliva riesterificato o di
oli di diversa natura è determinata mediante i metodi descritti negli alle-
gati V, VII, X A e X B del regolamento (CEE) n. 2568/91.
B. Rientrano nel codice NC 150910 soltanto gli oli d'oliva definiti di
seguito ai punti I e II, che sono stati ottenuti esclusivamente mediante
processi meccanici o altri processi fisici, in condizioni, segnatamente
termiche, tali da non causare alterazioni dell'olio, e che non hanno subito
trattamenti diversi dal lavaggio, dalla decantazione, dalla centrifugazione
e dalla filtrazione. Gli oli ottenuti dalle olive mediante solventi rientrano
nel codice NC 1510.
I. È considerato «olio di oliva vergine lampante» ai sensi del codice NC
15091010 l'olio che, indipendentemente dalla sua acidità, presenti:
a) tenore in alcoli alifatici non superiore a 400 mg/kg;
b) tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore a 4,5 %;
c) contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non
superiore a 1,3 %;
d) somma degli isomeri transoleici inferiore a 0,10 % e somma degli
isomeri translinoleici + translinolenici inferiore a 0,10 %;
e) e una o più delle seguenti caratteristiche:
1) numero di perossidi superiore a 20 mEq di ossigeno attivo /kg;
2) tenore in solventi alogenati volatili totali superiore a 0,2 mg/kg
o superiore a 0,1 mg/kg per almeno uno di essi;
3) coefficiente di estinzione K270superiore a 0,25 e, dopo tratta-
mento dell'olio su allumina attivata, non superiore a 0,11; in
realtà, certi oli aventi tenore in acidi grassi liberi, espresso in
acido oleico, superiore a 3,3 g/100 g possono avere, dopo
passaggio su allumina attivata conformemente al metodo
descritto nell'allegato IX del regolamento (CEE) n. 2568/91,
un coefficiente di estinzione K270superiore a 0,10; in tal caso,
dopo neutralizzazione e decolorazione effettuate in laboratorio
conformemente al metodo descritto nell'allegato XIII del rego-
lamento citato, essi debbono presentare le caratteristiche
seguenti:
— coefficiente di estinzione K270non superiore a 1,20,
— variazione (K) del coefficiente di estinzione in prossimità di
270 nm superiore a 0,01 e non superiore a 0,16, e cioè:1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 85
▼M6
K=Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
dove
Km= indica il coefficiente di estinzione alla
lunghezza d'onda del massimo della
curva di assorbimento in prossimità
di 270 nm, e
Km−4eKm+4= indicano i coefficienti di estinzione
alle lunghezza d'onda inferiore e
superiore di 4 nm a quella di Km;
4) caratteristiche organolettiche che evidenzino difetti percepibili
con un'intensità superiore al limite di accettabilità, con
punteggio inferiore a 3,5 nell'analisi sensoriale di cui all'alle-
gato XII del regolamento (CEE) n. 2568/91.
II. È considerato «altro olio d'oliva vergine» ai sensi del codice NC
15091090 l'olio d'oliva che presenti le seguenti caratteristiche:
a) acidità, espressa in acido oleico, non superiore a 3,3 g/100 g;
b) numero di perossidi non superiore a 20mEq di ossigeno attivo /kg;
c) tenore in alcoli alifatici non superiore a 300 mg/kg;
d) tenore in solventi alogenati volatili totali non superiore a 0,2 mg/
kg e, per ciascuno di essi, non superiore a 0,1 mg/kg;
e) coefficiente di estinzione K270non superiore a 0,25 e, dopo
passaggio dell'olio su allumina attivata, non superiore a 0,10;
f) variazione (K) del coefficiente di estinzione in prossimità di 270
nm non superiore a 0,01;
g) caratteristiche organolettiche che evidenzino anche difetti percepi-
bili con un'intensità inferiore al limite di accettabilità, con
punteggio pari o superiore a 3,5 nell'analisi sensoriale di cui all'al-
legato XII del regolamento (CEE) n. 2568/91;
h) tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore a 4,5 %;
i) contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non
superiore a 1,3 %;
j) somma degli isomeri transoleici inferiore a 0,03 % e somma degli
isomeri translinoleici + translinolenici inferiore a 0,03 %.
C. Rientra nel codice NC 1509 9000 l'olio d'oliva ottenuto dal trattamento
degli oli dei codici NC 15091010 e/o 1509 1090, anche tagliato con
olio d'oliva vergine, che presenti le seguenti caratteristiche:
a) acidità, espressa in acido oleico, non superiore a 3,3 g/100 g;
b) tenore in alcoli alifatici non superiore a 350 mg/kg;
c) coefficiente di estinzione K270superiore a 0,25 e non superiore a 1,20
e, dopo passaggio dell'olio su allumina attivata, superiore a 0,10;
d) variazione (K) del coefficiente di estinzione in prossimità di 270 nm
superiore a 0,01 e non superiore a 0,16;
e) tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore a 4,5 %;
f) contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non supe-
riore a 1,5 %;
g) somma degli isomeri transoleici inferiore a 0,20 % e somma degli
isomeri translinoleici + translinolenici inferiore a 0,30 %.
D. Sono considerati «oli greggi» ai sensi del codice NC 15100010 gli oli, e
particolarmente gli oli di sansa d'oliva, che presentino le seguenti caratte-
ristiche:
a) acidità, espressa in acido oleico, pari o superiore a 2 g/100 g;
b) tenore in eritrodiolo + uvaolo pari o superiore a 12 %;
c) contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non supe-
riore a 1,8 %;
d) somma degli isomeri transoleici inferiore a 0,20 % e somma degli
isomeri translinoleici + translinolenici inferiore a 0,10 %.
E. Rientrano nel codice NC 15100090 gli oli ottenuti dal trattamento degli
oli di cui al codice NC 1510 0010, anche tagliati con olio d'oliva vergine,
nonché gli oli che non presentano le caratteristiche degli oli di cui alle
note complementari 2.B, 2.C e 2.D. Gli oli di questo codice devono
presentare un contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 86
▼M6
non superiore a 2 %, una somma degli isomeri transoleici inferiore a
0,40 % e una somma degli isomeri translinoleici + translinolenici infe-
riore a 0,35 %.
3. Non rientrano nei codici NC 15220031 e 1522 0039:
a) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti
olio con indice di iodio, determinato secondo il metodo descritto nell'alle-
gato XVI del regolamento (CEE) n. 2568/91, inferiore a 70 o superiore a
100;
b) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti
olio con indice di iodio compresa tra 70 e 100, ma per il quale la super-
ficie del picco corrispondente al tempo di ritenzione del betasitosterolo(1),
determinata conformemente all'allegato V del regolamento (CEE) n. 2568/
91, rappresenta meno del 93 % della superficie totale dei picchi degli
steroli.
4. I metodi di analisi per la determinazione delle caratteristiche dei prodotti di
cui sopra sono quelli descritti negli allegati del regolamento (CEE) n. 2568/
91.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 87
(1) Delta-5,23-stigmastadienolo + clerosterolo ►C3+ betasistosterolo ◄+ sitostanolo +
delta-5-avenasterolo + delta-5,24-stigmastadienolo.
▼B
ALLEGATOXV
1. METODO DI DETERMINAZIONE DEL TENORE IN OLIO D'OLIVA
DELLE SANSE
1.1.Materiale
— apparecchio da estrazione appropriato, munito di un pallone da 200-
250 ml,
— bagno a riscaldamento elettrico (bagno a sabbia, bagno ad acqua, ecc.)
o piastra riscaldante,
— bilancia analitica,— stufa regolata su un massimo di 80 ºC,— stufa a riscaldamento elettrico, provvista di un dispositivo di termorego-
lazione regolato su 103 ± 2 ºC e tale da consentire una insufflazione
d'aria o una depressione,
— frantoio meccanico facile da pulire, che permette la frantumazione dei
noccioli senza riscaldamento e senza modificazione sensibile del loro
tenore in acqua e in olio,
— ditale da estrazione e cotone idrofilo o carta da filtro, esenti da sostanze
estraibili con esano,
— essiccatore,— setaccio a maglie da 1 mm di diametro,— pietra pomice in granuli, previamente essiccata.
1.2.Reattivo
n-esano tecnico, il cui residuo all'evaporazione completa dev'essere infe-
riore a 0,002 g/100 ml.
2. MODO DI OPERARE2.1.Preparazione delcampioneperl'analisi
Frantumare il campione contrattuale, se necessario, nel frantoio meccanico
ben pulito in precedenza, allo scopo di ridurlo in particelle che attraversino
completamente il setaccio.
Utilizzare
1/20circa del campione per completare la pulizia del frantoio,
scartare il prodotto di questa macinazione, frantumare il resto, raccoglierlo,
mescolarlo con cura e analizzarlo immediatamente.
2.2.Quantitàdisostanzadaanalizzare
Immediatamente dopo la fine della frantumazione, pesare con l'approssima-
zione di 0,01 g circa 10 g del campione.
2.3.Preparazione delditaledaestrazione
Porre la sostanza destinata all'analisi nella cartuccia, che va tappata con il
tampone di cotone idrofilo. Nel caso che si utilizzi una carta da filtro,
impacchettare le sanse frantumate in tale carta.
2.4.Preessiccazione
Se la sansa è molto umida (tenore in acqua ed in sostanze volatili superiore
al 10 %), effettuare un'essiccazione preliminare ponendo per un tempo
conveniente il ditale riempito (o la carta da filtro) nella stufa riscaldata ad
un massimo di 80 ºC, per ricondurre il tenore in acqua ed in materie vola-
tili al di sotto del 10 %.
2.5.Preparazione delpallone
Pesare con l'approssimazione di 1 mg il pallone contenente 1-2 granuli di
pomice, previamente essiccato in stufa a 103 ± 2 ºC e poi raffreddato per
almeno un'ora in essiccatore.
2.6.Primaestrazione
Porre nell'apparecchio da estrazione il ditale (o la carta da filtro) contenente
la sostanza da analizzare. Versare nel pallone la quantità necessaria di
esano. Adattare il pallone all'apparecchio da estrazione e porre il tutto sul
bagno a riscaldamento elettrico. Effettuare il riscaldamento in condizioni1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 88
▼B
tali che la portata del riflusso sia di almeno tre gocce al secondo (ebolli-
zione moderata, non tumultuosa).
Dopo quattro ore di estrazione, lasciar raffreddare. Togliere il ditale dall'ap-
parecchio di estrazione e porlo in una corrente d'aria, al fine di eliminare la
maggior parte del solvente che lo impregna.
2.7.Secondaestrazione
Vuotare il ditale nel microfrantoio e macinare il più finemente possibile.
Reintrodurre quantitativamente la miscela nel ditale e rimettere questo
nell'apparecchio da estrazione.
Ricominciare l'estrazione per altre due ore, utilizzando lo stesso pallone che
contiene la prima sostanza estratta.
La soluzione ottenuta nel pallone da estrazione dev'essere limpida. Se così
non fosse, filtrarla su carta, lavando più volte il primo pallone e la carta da
filtro con esano. Raccogliere filtrato e solvente di lavaggio in un secondo
pallone, previamente essiccato e tarato con l'approssimazione di 1 mg.
2.8.Eliminazione delsolventeepesatadell'estratto
Eliminare la maggior parte del solvente distillato su bagno a riscaldamento
elettrico. Eliminare le ultime tracce di solvente riscaldando il pallone instufa a 103 ± 2 ºC per 20 minuti. Facilitare questa eliminazione sia insuf-
flando ogni tanto dell'aria o, preferibilmente, del gas inerte, sia operando
sotto pressione ridotta.
Lasciar raffreddare il pallone in essiccatore per almeno un'ora, poi pesarlo
con l'approssimazione di 1 mg.
Riscaldare di nuovo per 10 minuti nelle stesse condizioni, poi raffreddare
in essiccatore e pesare.
La differenza fra i risultati di queste due pesate dev'essere inferiore od
uguale a 10 mg. In caso contrario, riscaldare di nuovo per periodi di 10
minuti, seguiti da raffreddamento e pesata, finché la differenza di massa
sia uguale tutt'al più a 10 mg. Adottare per il calcolo il valore dato dall'ul-
tima pesata.
Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.
3. ESPRESSIONE DEI RISULTATI3.1.Mododicalcoloeformula
a) L'estratto, espresso come massa percentuale sul prodotto tal quale, è
dato dalla formula:
S=m
1×100
m0
nella quale:
S = percentuale in massa sul prodotto tal quale,
m0= massa in grammi della quantità di sostanza prelevata per l'ana-
lisi,
m1= massa in grammi dell'estratto dopo essiccazione.
Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni, se
le condizioni di ripetibilità sono adempiute.
Esprimere il risultato con una sola cifra decimale.
b) L'estratto viene riferito alla sostanza secca utilizzando la formula
seguente:
S×100
100 − U= estratto in % grasso/secco
dove:
S = percentuale in massa di estratto sul prodotto tal quale (vedi
lettera a),
U = suo tenore in acqua e in sostanze volatili.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 89
▼B
3.2.Ripetibilità
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultanea-
mente o in rapida successione dallo stesso analista non deve eccedere i
0,2 g di estratto ottenuto con l'esano per ogni 100 g di campione.
In caso contrario, ripetere l'analisi su due altri quantitativi di sostanza. Se
ancora questa volta la differenza eccede gli 0,2 g, assumere come risultato
la media aritmetica delle quattro determinazioni effettuate.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 90
▼B
ALLEGATOXVI
DETERMINAZIONEDELNUMERODIIODIO
1. OGGETTO
La presente norma internazionale definisce un metodo per la determina-
zione del numero di iodio nei grassi e negli oli di origine animale e
vegetale, qui di seguito denominati «grassi».
2. DEFINIZIONE
Ai fini della presente norma internazionale, si applica la seguente defini-
zione.
2.1.Numerodiiodio: la massa di iodio assorbita dal campione nelle condizioni
specificate nella presente norma internazionale.
Il numero di iodio viene espresso in grammi di iodio per 100 g di
campione.
3. PRINCIPIO
Scioglimento della sostanza da analizzare nel solvente ed aggiunta di
reagente di Wijs. Trascorso un certo lasso di tempo, aggiunta di soluzione
di ioduro di potassio e di acqua e titolazione dello iodio liberato con solu-
zione di tiosolfato di sodio.
4. REAGENTI
Tutti i reagenti devono essere di grado analitico riconosciuto.
4.1. Ioduro di potassio, soluzione di 100 g/l, non contenente iodato o iodio
libero.
4.2. Amido, soluzione.
Versare 5 g di amido solubile in 30 ml d'acqua, aggiungere questa miscela
a 1 000 ml di acqua bollente, fare bollire per 3 minuti e lasciar raffreddare.
4.3. Tiosolfato di sodio, soluzione volumetrica standard c (Na2S2O3.5H2O)
= 0,1 mol/l, standardizzato non oltre 7 giorni prima dell'uso.
4.4. Solvente, preparato miscelando volumi eguali di cicloesano e di acido
acetico.
4.5. Reagente di Wijs, contenente monocloruro di iodio in acido acetico. È
opportuno usare il reagente di Wijs disponibile in commercio.
Nota:Il reagente contiene 9 g di ICl3+ 9 g di I in acido acetico.
5. APPARECCHIATURA
La consueta apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.
5.1. Ditali da pesata, in vetro, idonei per la sostanza da analizzare e per l'inse-
rimento nelle beute (5.2).
5.2. Beute, aventi una capacità di 500 ml, provviste di tappi in vetro smerigliato
e completamente asciutte.
6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI SOSTANZA DA ANALIZZARE
Il campione omogeneizzato è seccato su solfato sodico e filtrato.
7. PROCEDIMENTO
7.1. Sostanza da analizzare
Il peso della sostanza da analizzare varia a seconda del numero di iodio che
si prevede, come indicato nella tabella 1.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 91
▼B
Tabella1
Numero di iodio previstomassa della sostanza da analizzare
g
inferiore a 5 3,00
da 5 a 20 1,00
da 21 a 50 0,40
da 51 a 100 0,20
da 101 a 150 0,13
da 151 a 200 0,10
Pesare la sostanza da analizzare con l'approssimazione di 0,1 mg in un
ditale da pesata in vetro (5.1).
7.2. Determinazione
Versare la sostanza da analizzare in una beuta da 500 ml (5.2). Aggiungere
20 ml del solvente (4.4) in modo da sciogliere li grasso. Aggiungere esatta-
mente 25 ml del reagente di Wijs (4.5), inserire il tappo, agitare il
contenuto e riporre la beuta al buio. Per il reagente di Wijs non usare una
pipetta a bocca.
Analogamente preparare un bianco col solvente ed il reagente, ma trala-
sciando la sostanza da analizzare.
Per le sostanze aventi un numero di iodio inferiore a 150, mantenere le
beute al buio per un'ora; per quelle aventi un numero di iodio superiore a
150 nonché per i prodotti polimerizzati oppure per i prodotti notevolmente
ossidati, lasciar riposare per due ore.
Trascorso il periodo necessario, aggiungere 20 ml della soluzione di ioduro
di potassio (4.1) e 150 ml di acqua a ciascuna delle beute.
Titolare con la soluzione volumetrica standard di tiosolfato di sodio (4.3)
finché la colorazione gialla dovuta allo iodio non sia quasi scomparsa.
Aggiungere alcune gocce della soluzione di amido (4.2) e continuare latitolazione finché la colorazione blu sia appena scomparsa a seguito di
agitazione molto vigorosa.
Nota—È consentita la determinazione potenziometrica del punto finale.
7.3. Numero di determinazioni
Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.
8. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il numero di iodio viene dato dalla seguente espressione:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
Dove:
c = è il numerico della concentrazione esatta, in moli per litro, della
soluzione di Tiosolfato di sodio Titolata (5.4) utilizzata;
V1= è il valore numerico del volume, in ml, della soluzione di Tiosol-
fato di sodio Titolata (5.4) utilizzata;
V2= è il valore numerico del volume, in ml, delle soluzioni di Tiosol-
fato di sodio (5.4) utilizzato per la determinazione;
m = è il valore numerico del peso, in g, della sostanza da analizzare
(7.1).
Prendere come risultato la media aritmetica di due determinazioni.1991R2568 — IT — 21.03.1993 — 007.001 — 92