2009R0152 — IT — 01.01.2014 — 003.001

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►B REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE del 27 gennaio 2009 che fissa i metodi di campionamento e d'analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (Testo rilevante ai fini del SEE) (GU L 054, 26.2.2009, p.1)

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REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE

del 27 gennaio 2009

che fissa i metodi di campionamento e d'analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

(Testo rilevante ai fini del SEE)







LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, visto il regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali ( 1 ), in particolare l’articolo 11, paragrafo 4, lettere a), b) e c), considerando quanto segue: (1) Ai fini dell'applicazione della direttiva 70/373/CEE sono stati adottati e rimangono in vigore, conformemente all'articolo 61, paragrafo 2, del regolamento (CE) n. 882/2004, i seguenti atti normativi: — prima direttiva 71/250/CEE della Commissione, del 15 giugno 1971, che fissa i metodi d'analisi comunitari per controlli ufficiali degli alimenti per gli animali ( 2 ), — seconda direttiva 71/393/CEE della Commissione, del 18 novembre 1971, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali ( 3 ), — terza direttiva 72/199/CEE della Commissione, del 27 aprile 1972, che fissa i metodi di analisi comunitari per i controlli degli alimenti per gli animali ( 4 ), — quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali ( 5 ), — prima direttiva 76/371/CEE della Commissione, del 1o marzo 1976, che fissa i modi comunitari di prelevamento dei campioni per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 6 ), — settima direttiva 76/372/CEE della Commissione, del 1o marzo 1976, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali ( 7 ), — ottava direttiva 78/633/CEE della Commissione, del 15 giugno 1978, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 8 ), — nona direttiva 81/715/CEE della Commissione, del 31 luglio 1981, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 9 ), — decima direttiva 84/425/CEE della Commissione, del 25 luglio 1984, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 10 ), — direttiva 86/174/CEE della Commissione, del 9 aprile 1986, che fissa il metodo di calcolo del valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame ( 11 ), — undicesima direttiva 93/70/CEE della Commissione, del 28 luglio 1993, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo degli alimenti per animali ( 12 ), — dodicesima direttiva 93/117/CE della Commissione, del 17 dicembre 1993, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 13 ), — direttiva 98/64/CE della Commissione, del 3 settembre 1998, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione degli amminoacidi, delle materie grasse grezze e dell'olaquindox negli alimenti per animali e che modifica la direttiva 71/393/CEE ( 14 ), — direttiva 1999/27/CE della Commissione, del 20 aprile 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell'amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE ( 15 ), — direttiva 1999/76/CE della Commissione, del 23 luglio 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione del lasalocid sodico negli alimenti per animali ( 16 ), — direttiva 2000/45/CE della Commissione, del 6 luglio 2000, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione della vitamina A, della vitamina E e del triptofano negli alimenti per animali ( 17 ), — direttiva 2002/70/CE della Commissione, del 26 luglio 2002, che stabilisce i requisiti per la determinazione dei livelli di diossine e PCB diossina-simili nei mangimi ( 18 ), — direttiva 2003/126/CE della Commissione, del 23 dicembre 2003, che stabilisce il metodo analitico per la determinazione dei costituenti di origine animale nell'ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 19 ). (2) Dal momento che la direttiva 70/373/CEE è stata sostituita dal regolamento (CE) n. 882/2004 è opportuno sostituire i provvedimenti attuativi di tale direttiva con un regolamento unico. Al contempo vanno adeguate le metodiche tenendo conto degli sviluppi delle conoscenze in campo scientifico e tecnologico. I metodi non più validi per i fini previsti vanno soppressi. È previsto l'aggiornamento a tempo debito delle disposizioni relative al campionamento al fine di tener conto degli ultimi sviluppi nel campo della produzione, dell'immagazzinamento, del trasporto e della commercializzazione degli alimenti per animali, ma è opportuno, per il momento, mantenere le disposizioni vigenti in materia. (3) Occorre di conseguenza abrogare le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE. (4) Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali, considerando quanto segue: HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:







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Articolo 1

Il campionamento per il controllo ufficiale degli alimenti per animali, in particolare per quanto concerne la determinazione dei costituenti, compresi i materiali che contengono, o sono costituiti da o sono prodotti a partire da, organismi geneticamente modificati (OGM), gli additivi per mangimi come definiti dal regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio ( 20 ), le sostanze indesiderabili quali definite dalla direttiva 2002/32/CE del Parlamento europeo e del Consiglio ( 21 ), è effettuato conformemente ai metodi di cui all’allegato I.

Il metodo di campionamento di cui all’allegato I è applicabile per il controllo dei mangimi per quanto concerne la determinazione dei residui di antiparassitari quali definiti dal regolamento (CE) n. 396/2005 del Parlamento europeo e del Consiglio ( 22 ), e il controllo della conformità al regolamento (UE) n. 619/2011.

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Articolo 2

La preparazione dei campioni per l'analisi e l'espressione dei risultati sono conformi ai metodi indicati nell'allegato II.

Articolo 3

Le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali sono effettuate secondo i metodi indicati nell'allegato III (Metodi di analisi per il controllo della composizione delle materie prime per alimenti per animali e degli alimenti composti), nell'allegato IV (Metodi di analisi per il controllo del contenuto di additivi autorizzati negli alimenti per animali), nell'allegato V (Metodi di analisi per il controllo della presenza di sostanze indesiderabili negli alimenti per animali) e nell'allegato VI (Metodi di analisi per la determinazione dei costituenti di origine animale nell'ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali).

Articolo 4

Il valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame è calcolato conformemente al metodo descritto nell'allegato VII.

Articolo 5

I metodi di analisi per il controllo della presenza illecita di additivi il cui uso non è più autorizzato negli alimenti per animali di cui all'allegato VIII sono applicati a fini di conferma.

Articolo 6

Le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE sono abrogate.

I riferimenti alle direttive abrogate s'intendono fatti al presente regolamento e vanno letti secondo le tavole di concordanza che figurano nell'allegato IX.

Articolo 7

Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Esso si applica a decorrere dal 26 agosto 2009.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

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ALLEGATO I

METODI DI CAMPIONAMENTO

1. FINALITÀ E CAMPO DI APPLICAZIONE

I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo le modalità sottoindicate. Tali campioni sono da considerarsi rappresentativi delle partite campionate.

Lo scopo del campionamento rappresentativo è di prelevare una piccola frazione di un lotto in modo che la determinazione di una caratteristica specifica di tale frazione rappresenti il valore medio della caratteristica del lotto. Il campionamento avviene mediante prelievo ripetuto di campioni elementari in diversi punti del lotto. Tali campioni elementari sono mescolati per formare un campione globale, dal quale sono ricavati a loro volta dei campioni finali rappresentativi per divisione rappresentativa.

Se, ad un controllo visivo, partite del mangime da sottoporre a campionamento mostrano una differenza di qualità dal resto del mangime dello stesso lotto, tali partite vengono separate dal resto del mangime e trattate come un sottolotto distinto. Qualora non fosse possibile suddividerlo in sottolotti, il mangime viene sottoposto a campionamento come lotto unico. In tali casi, ne è fatta menzione nel verbale di campionamento.

Se un mangime facente parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione viene sottoposto a campionamento conformemente alle disposizioni del presente regolamento e risulta non soddisfare i requisiti UE, si presume che tutto il mangime di tale lotto non soddisfi i requisiti UE, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti alcuna prova che confermi che anche il resto del lotto non soddisfa i requisiti UE.

2. DEFINIZIONI

— Lotto : quantità determinata di mangime che possiede caratteristiche comuni come l’origine, la varietà, il tipo di imballaggio, l’identità dell’imballatore, lo speditore o l’etichettatura e, nel caso di un processo produttivo, un’unità di produzione prodotta in un singolo impianto applicando parametri di produzione uniformi o più unità di produzione di questo tipo, se prodotte in ordine continuo e immagazzinate insieme.

— Partita campionata : lotto o parte identificata del lotto o del sottolotto.

— Campione sigillato : campione sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l’asportazione del sigillo.

— Campione elementare : quantità prelevata da un punto della partita campionata.

— Campione globale : insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata.

— Campione ridotto : parte del campione globale ottenuta mediante riduzione rappresentativa di quest’ultimo.

— Campione finale : parte del campione ridotto o del campione globale omogeneizzato.

— Campione di laboratorio : campione destinato al laboratorio (come ricevuto dal laboratorio) che può essere il campione finale, il campione ridotto o il campione globale.

3. DISPOSIZIONI GENERALI

— Personale addetto al campionamento: i campioni sono prelevati da personale appositamente autorizzato dall’autorità competente.

— Il campione è sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l’asportazione del sigillo. Il marchio del sigillo è chiaramente identificabile e ben visibile. In alternativa, il campione può essere messo in un recipiente che, una volta chiuso, non possa essere aperto senza danneggiarsi irreparabilmente e non possa quindi essere riutilizzato.

— Identificazione del campione: il campione è contrassegnato in modo indelebile e deve essere identificato in maniera tale da essere collegato inequivocabilmente al verbale di campionamento.

— Da ciascun campione globale sono prelevati almeno due campioni finali: almeno uno come controllo (verifica dell’applicazione della normativa) e uno per l’operatore del settore dei mangimi (difesa in caso di controversia). Infine, può essere prelevato un campione finale come riferimento. Nel caso che l’intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali sono prelevati dal campione globale omogeneizzato, a meno che tale procedura non sia in contrasto con le norme vigenti nello Stato membro in materia di diritti degli operatori del settore dei mangimi.

4. STRUMENTI

4.1. Gli strumenti utilizzati per il campionamento sono realizzati con materiali che non possono contaminare i prodotti da campionare. Se destinati ad essere riutilizzati varie volte, gli strumenti sono di agevole pulizia, per evitare una contaminazione crociata.

4.2. Strumenti raccomandati per il prelievo di campioni di alimenti solidi per animali 4.2.1. Campionamento manuale 4.2.1.1. Pala a fondo piatto e a bordi laterali verticali 4.2.1.2. Sonda a lungo setto o a partizioni. Le dimensioni della sonda sono adeguate alle caratteristiche della partita campionata (profondità del recipiente, misure del sacco ecc.) e alla dimensione delle particelle costituenti l’alimento. Se la sonda presenta diverse aperture per fare sì che il campione sia prelevato in diversi punti lungo la sonda, le aperture sono separate da compartimenti o scalate in sequenza. 4.2.2. Campionamento meccanico Per il prelievo di campioni di alimenti in flusso possono essere utilizzati strumenti meccanici appropriati, vale a dire che consentano di sottoporre a campionamento almeno l’intera sezione del flusso. Il campionamento dei mangimi in movimento (a elevata velocità di flusso) può essere effettuato facendo uso di campionatori automatici. 4.2.3. Divisori Se possibile e opportuno, per preparare campioni ridotti rappresentativi possono essere utilizzati strumenti che servono a dividere i campioni in parti approssimativamente uguali.

5. REQUISITI QUANTITATIVI PER QUANTO RIGUARDA IL NUMERO DI CAMPIONI ELEMENTARI

— I requisiti quantitativi di cui ai punti 5.1 e 5.2 riguardanti il numero di campioni elementari sono applicabili a partite di dimensioni massime di 500 tonnellate l’una e campionabili in modo rappresentativo. La procedura di campionamento descritta è ugualmente valida per i quantitativi superiori alla dimensione massima della partita campionata se non si tiene conto del numero massimo di campioni elementari indicato nelle tabelle che seguono; in tal caso il numero di campioni elementari è determinato dalla formula contenente la radice quadrata che figura nella parte corrispondente della procedura (cfr. punto 5.3) e la dimensione minima del campione globale aumentata in proporzione. Ciò non impedisce di suddividere un lotto grande in sottolotti più piccoli e di sottoporre a campionamento ciascun sottolotto seguendo la procedura descritta ai punti 5.1 e 5.2.

— La grandezza della partita da campionare deve essere tale da consentire il prelievo di campioni in ogni sua parte.

— Nel caso dei lotti o sottolotti molto grandi (> 500 tonnellate) e dei lotti trasportati o immagazzinati in un modo che non rende possibile effettuare campionamenti seguendo la procedura di cui ai punti 5.1 e 5.2 del presente capitolo, si adotta la procedura di campionamento indicata al punto 5.3.

— Qualora sia tenuto per legge a rispettare il presente regolamento nell’ambito di un sistema di monitoraggio obbligatorio, l’operatore del settore dei mangimi può discostarsi dai requisiti quantitativi di cui al presente capitolo al fine di tenere conto delle caratteristiche operative, purché dimostri in modo convincente all’autorità competente l’equivalenza della procedura di campionamento per quanto concerne la rappresentatività e previa autorizzazione dell’autorità competente.

— In casi eccezionali, quando non è possibile applicare i requisiti quantitativi del metodo di campionamento prescritto senza danneggiare il lotto in misura inaccettabile per il commercio (ad esempio a causa delle tipologie d’imballaggio, dei mezzi di trasporto, delle modalità di immagazzinamento ecc.), si può ricorrere a un metodo alternativo, a condizione che il campionamento sia il più rappresentativo possibile e che il metodo applicato sia chiaramente descritto e debitamente documentato.

5.1. Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo delle sostanze o dei prodotti distribuiti in modo uniforme negli alimenti per animali

5.1.1. Alimenti solidi alla rinfusa







Dimensioni della partita campionata Numero minimo di campioni elementari ≤ 2,5 tonnellate 7 > 2,5 tonnellate √ di 20 volte il numero di tonnellate che costituiscono la partita campionata (1), fino a un massimo di 40 campioni elementari (1) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

5.1.2. Alimenti liquidi alla rinfusa







Dimensioni della partita campionata Numero minimo di campioni elementari ≤ 2,5 tonnellate o ≤ 2 500 litri 4 (1) > 2,5 tonnellate o > 2 500 litri 7 (1) (1) Nel caso in cui non sia possibile rendere omogeneo il liquido, il numero di campioni elementari deve essere aumentato.

5.1.3. Alimenti in confezioni

Gli alimenti (solidi e liquidi) possono essere confezionati in sacchetti, sacchi, barattoli, fusti ecc., ai quali si fa riferimento nella tabella come «unità». Le unità grandi (≥ 500 kg o litri) si campionano in base alle disposizioni prescritte per gli alimenti alla rinfusa (cfr. punti 5.1.1 e 5.1.2)







Dimensioni della partita campionata Numero minimo di unità da cui deve essere prelevato (almeno) un campione elementare (1) Da 1 a 20 unità 1 unità (2) Da 21 a 150 unità 3 unità (2) Da 151 a 400 unità 5 unità (2) > 400 unità ¼ della √ del numero di unità che costituiscono la partita campionata (3), fino a un massimo di 40 unità (1) Qualora l’apertura di un’unità possa alterare i risultati dell’analisi (per esempio nel caso degli alimenti umidi deperibili), il campione elementare è costituito dall’unità non aperta. (2) Per le unità di contenuto non superiore a 1 kg o a un litro, il campione elementare è costituto dal contenuto di un unità originaria. (3) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

5.1.4. Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali

Almeno un formellato o una mattonella da campionare per partita di 25 unità, per un massimo di quattro formellati o mattonelle.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

5.1.5. Foraggi grossolani/foraggio







Dimensioni della partita campionata Numero minimo di campioni elementari (1) ≤ 5 tonnellate 5 > 5 tonnellate √ di 5 volte il numero di tonnellate che costituiscono la partita campionata (2), fino a un massimo di 40 campioni elementari (1) Si riconosce che in determinate situazioni (ad esempio nel caso degli insilati) non è possibile prelevare i necessari campioni elementari senza provocare danni inaccettabili al lotto. In tali situazioni può essere applicato un metodo di campionamento alternativo. Prima dell’entrata in vigore del presente regolamento sarà approntata una guida per il campionamento di questo tipo di lotti. (2) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

5.2. Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti negli alimenti per animali in maniera non uniforme

Questi requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari si applicano nei casi seguenti:

— controllo delle aflatossine, della segale cornuta, di altre micotossine e impurità botaniche nocive nelle materie prime per alimenti per animali,

— controllo della contaminazione crociata da un costituente, incluso il materiale geneticamente modificato, o da una sostanza presumibilmente non distribuita in modo uniforme nelle materie prime per alimenti per animali.

Nel caso che l’autorità di controllo sospetti fortemente che una tale distribuzione non uniforme si presenti anche in caso di contaminazione crociata da un componente o da una sostanza in un alimento per animali composto, si possono applicare i requisiti quantitativi indicati nella tabella che segue.







Dimensioni della partita campionata Numero minimo di campioni elementari < 80 tonnellate Cfr. i requisiti quantitativi al punto 5.1. Il numero di campioni elementari da prelevare si moltiplica per 2,5. ≥ 80 tonnellate 100

5.3. Requisiti quantitativi relativi ai campioni elementari nel caso di lotti molto grandi

Nel caso di grandi partite campionate (> 500 tonnellate): numero di campioni elementari da prelevare = 40 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di sostanze o prodotti ripartiti in modo uniforme nell’alimento, oppure 100 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme nelle materie prime per alimenti per animali.

6. REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI IL CAMPIONE GLOBALE







È richiesto un solo campione globale per partita. Natura degli alimenti Dimensione minima del campione globale (1) (2) 6.1. Alimenti alla rinfusa: 4 kg 6.2. Alimenti in confezioni: 4 kg (3) 6.3. Alimenti liquidi o semiliquidi: 4 litri 6.4. Alimenti minerali in formellati o mattonelle di sali minerali: 6.4.1. di peso unitario superiore a 1 kg 4 kg 6.4.2. di peso unitario pari o inferiore a 1 kg peso di quattro originari formellati o mattonelle 6.5. Foraggi grossolani/foraggio 4 kg (4) (1) Se l’alimento da sottoporre a campionamento ha un valore elevato, si può prelevare una quantità inferiore di campione globale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento. (2) Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011 della Commissione, del 24 giugno 2011, che fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali riguardo alla presenza di materiale geneticamente modificato per il quale sia in corso una procedura di autorizzazione o la cui autorizzazione sia scaduta (GU L 166 del 25.6.2011, pag. 9), il campione globale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 35 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione globale deve essere pari ad almeno 10,5 kg e per la soia a 7 kg. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione globale di 4 kg corrisponde a più di 35 000 semi. (3) Nel caso degli alimenti confezionati, è possibile che le dimensioni delle singole unità non consentano di prelevare 4 kg per il campione globale. (4) Qualora si tratti di foraggio grossolano o foraggio a basso peso specifico (ad esempio fieno o paglia), il campione globale deve essere di almeno 1 kg.

7. REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI I CAMPIONI FINALI

Campioni finali

È richiesta l’analisi di almeno un campione finale. L’entità del campione finale destinato all’analisi deve essere non inferiore ai seguenti quantitativi:







Alimenti solidi 500 g (1) (2) (3) Alimenti liquidi o semiliquidi 500 ml (1) (1) Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione finale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 10 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione finale deve essere pari ad almeno 3 000 g e per la soia a 2 000 g. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione finale di 500 g corrisponde a più di 10 000. (2) Se le dimensioni del campione globale sono considerevolmente inferiori a 4 kg o litri (cfr. note al punto 6), si può prelevare anche una quantità inferiore di campione finale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento. (3) Nel caso del campionamento di legumi, cereali in grani e frutta a guscio per determinare i residui di antiparassitari, il campione finale deve essere di almeno 1 kg, conformemente alle disposizioni della direttiva 2002/63/CE della Commissione (GU L 187 del 16.7.2002, pag. 30).

8. METODO DI CAMPIONAMENTO PER LOTTI MOLTO GRANDI IMMAGAZZINATI O TRASPORTATI CON MODALITÀ CHE NON PERMETTONO IL PRELIEVO DI CAMPIONI DA TUTTO IL LOTTO.

8.1. Principi generali

Se le modalità di trasporto o di immagazzinamento di un lotto non consentono il prelievo di campioni elementari dall’intero lotto, è preferibile effettuare il campionamento quando il lotto è in movimento.

Nel caso dei grandi depositi per immagazzinare alimenti per animali, gli operatori vanno incoraggiati ad installare nel deposito attrezzature che consentano di effettuare il campionamento (automatico) su tutto il lotto immagazzinato.

In caso di applicazione delle procedure di campionamento previste dal presente capitolo 8, l’operatore del settore dei mangimi o un suo rappresentante viene informato sulla procedura di campionamento. Se contesta la procedura, l’operatore o il suo rappresentante deve consentire all’autorità competente di effettuare prelievi per il campionamento in tutto il lotto a proprie spese.

8.2. Lotti grandi trasportati per nave

8.2.1. Campionamento dinamico di lotti grandi trasportati per nave

È preferibile effettuare il campionamento di lotti grandi nelle navi quando il prodotto è in movimento (campionamento dinamico).

Il campionamento si effettua stiva per stiva (intendendo come stiva uno spazio separabile fisicamente). Le stive vengono comunque parzialmente svuotate l’una dopo l’altra, così che l’iniziale separazione fisica non sussiste più dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio. Il campionamento può pertanto essere effettuato in funzione della separazione fisica iniziale o della separazione dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio.

Le operazioni di scarico di una nave possono durare diversi giorni. Di norma, il campionamento deve essere effettuato ad intervalli regolari durante l’intera fase di scarico. La presenza di un ispettore ufficiale per il campionamento durante l’intera operazione di scarico non è tuttavia sempre possibile o opportuna. Pertanto, il campionamento può riguardare soltanto una parte (partita campionata) del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata.

In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

La presenza di un ispettore è necessaria anche quando il campione ufficiale è prelevato automaticamente. Tuttavia, nel caso in cui il campionamento sia effettuato in modo automatico con parametri prefissati non modificabili nel corso dello stesso e i campioni elementari siano posti in un recipiente sigillato, così da prevenire possibili frodi, la presenza di un ispettore è richiesta solo all’inizio del campionamento, ogni volta che il recipiente dei campioni deve essere cambiato e alla fine del campionamento.

8.2.2. Campionamento statico di lotti trasportati per nave

Se il campionamento è eseguito in modo statico, si applica la stessa procedura prevista per le strutture di stoccaggio (sili) accessibili dall’alto (cfr. punto 8.4.1).

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile (dall’alto) del lotto/della stiva. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.3. Campionamento di lotti grandi immagazzinati in depositi

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.4. Campionamento di strutture di stoccaggio (sili)

8.4.1. Campionamento di sili (facilmente) accessibili dall’alto

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.4.2. Campionamento di sili non accessibili dall’alto (chiusi)

8.4.2.1. Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni > 100 tonnellate

Il mangime immagazzinato in siffatti sili non è campionabile in modo statico. Pertanto, qualora si debba campionare il mangime che si trova all’interno del silo e non vi sia possibilità di spostare la partita, occorre accordarsi con l’operatore affinché questi informi l’ispettore su quando sarà svuotato il silo, di modo che il campionamento possa essere eseguito con il mangime in movimento.

8.4.2.2. Sili non accessibili dall’alto (chiusi) di dimensioni < 100 tonnellate

La procedura di campionamento prevede che si inserisca in un recipiente un quantitativo compreso fra 50 e 100 kg e che si prelevi da esso il campione. Le dimensioni del campione globale corrispondono alla totalità del lotto e il numero dei campioni elementari alla quantità tratta dal silo e immessa nel recipiente per il campionamento. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutto il mangime di tale lotto, a meno che, a seguito di un esame dettagliato, non risulti prova alcuna della non conformità del resto del lotto ai requisiti UE.

8.5. Campionamento di alimenti alla rinfusa in grandi contenitori chiusi

Spesso tali lotti sono campionabili solo dopo essere stati scaricati. In certi casi non è possibile scaricare presso il punto di importazione o di controllo, per cui il campionamento va eseguito al momento dello scarico dei contenitori.

9. ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI, ALLA FORMAZIONE E ALL’IMBALLAGGIO DEI CAMPIONI

9.1. Aspetti generali

Prelevare e formare i campioni senza inutili ritardi, prendendo le precauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto. Le superfici, i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti.

9.2. Campioni elementari

I campioni elementari vanno prelevati a caso dall’insieme della partita da campionare e devono risultare d’entità approssimativamente uguale.

Il campione elementare è pari ad almeno 100 grammi o a 25 grammi in caso di foraggio grossolano o foraggio a basso peso specifico.

Qualora siano da prelevare meno di 40 campioni elementari, conformemente alle norme procedurali per il campionamento fissate al punto 8, le dimensioni di tali campioni sono determinate in funzione delle dimensioni prescritte per il campione globale da ottenere (cfr. punto 6).

In caso di campionamento di piccoli lotti di mangime confezionato da cui, in base ai requisiti quantitativi, sia da prelevare un numero limitato di campioni elementari, il campione elementare è dato dal contenuto di un’unità originaria di peso non superiore a 1 kg o di volume non superiore a un litro.

Per i campionamenti di mangime confezionato composto da piccole unità (ad esempio < 250 g), le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell’unità.

9.2.1. Alimenti alla rinfusa

Eventualmente si può procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita da campionare (carico o scarico).

9.2.2. Alimenti in confezioni

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare con una sonda o con una pala una parte del contenuto di ciascuna di tali unità. All’occorrenza svuotare separatamente le unità.

9.2.3. Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare una parte del contenuto di ciascuna unità, se necessario dopo omogeneizzazione.

I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al momento del travaso del prodotto.

9.2.4. Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare i campioni a diversi livelli.

I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto, dopo eliminazione delle prime frazioni.

In entrambi i casi, il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri.

9.2.5. Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali

Dopo aver selezionato il numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare secondo quanto indicato nel capitolo 5, prelevare una parte da ciascun formellato o da ciascuna mattonella. Se si ha il sospetto che un formellato o una mattonella non sia omogeneo/a, può essere prelevato come campione l’intero formellato o l’intera mattonella.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

9.3. Formazione dei campioni globali

Riunire i campioni elementari per costituire un unico campione globale.

9.4. Formazione dei campioni finali

Il materiale del campione globale va mescolato con cura ( 23 )

— Introdurre ciascun campione in un contenitore/recipiente idoneo. Prendere tutte le precauzioni del caso per evitare qualsiasi modifica alla composizione del campione o qualsiasi contaminazione o alterazione fortuita durante il trasporto o lo stoccaggio.

— In caso di controllo di costituenti o sostanze distribuiti in modo uniforme nell’alimento, il campione globale può essere ridotto in modo rappresentativo a non meno di 2,0 kg o 2,0 litri (campione ridotto) ( 24 ), possibilmente facendo uso di un divisore meccanico o automatico. Per la verifica della presenza di residui di antiparassitari nei legumi, nei cereali in grani e nella frutta a guscio, il campione ridotto deve essere di almeno 3 kg. Se la natura dell’alimento non consente di utilizzare un divisore o se non si dispone di un divisore, si può ridurre il campione con il metodo della suddivisione in quarti. Formare quindi dai campioni ridotti campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia e riferimento) di entità approssimativamente uguale e rispondenti alle prescrizioni quantitative di cui al capitolo 7. Se si controllano costituenti, incluso il materiale geneticamente modificato, o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme nelle materie prime per alimenti per animali, il campione globale sarà: — — interamente omogeneizzato e successivamente diviso in campioni finali, oppure — ridotto a non meno di 2 kg o 2 litri ( 25 ) servendosi di un divisore meccanico o automatico. Solo se la natura dell’alimento non consente di utilizzare un divisore si può ridurre il campione, qualora necessario, con il metodo della suddivisione in quarti. Per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato nel quadro del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione ridotto deve contenere almeno 35 000 semi/grani per permettere di ottenere campioni finali di almeno 10 000 semi grani ai fini di verifica dell’applicazione della normativa, per la difesa in caso di controversia e come riferimento [cfr. nota (**) al capitolo 6 e nota (*) al capitolo 7].

9.5. Imballaggio dei campioni

Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo. L’etichetta completa deve essere incorporata nel sigillo.

9.6. Invio dei campioni al laboratorio

Il campione deve essere inviato senza indugio al laboratorio di analisi designato. Con esso vanno inviate anche le informazioni necessarie all’analista.

10. VERBALI DEL CAMPIONAMENTO

Per ogni campione va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata e le sue dimensioni.

Il verbale deve anche recare nota di ogni eventuale scostamento rispetto alla procedura di campionamento prevista dal presente regolamento.

Oltre che al laboratorio di controllo ufficiale, il verbale va messo a disposizione dell’operatore del settore dei mangimi e/o del laboratorio designato dall’operatore del settore dei mangimi.









ALLEGATO II

DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

A. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI

1. Finalità

Le modalità qui di seguito descritte riguardano la preparazione per l’analisi dei campioni, trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati prelevati conformemente alle diposizioni di cui all’allegato I.

La preparazione dei campioni di laboratorio deve assicurare che le quantità pesate previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresentative dei campioni finali.

2. Precauzioni necessarie

Le modalità di preparazione dei campioni sono scelte in funzione dei metodi di analisi impiegati e dei costituenti o delle sostanze da controllare. È pertanto di fondamentale importanza assicurare che le modalità prescelte siano adeguate al metodo di analisi applicato e ai costituenti o alle sostanze da controllare.

Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare, nei limiti del possibile, di contaminare il campione o di modificarne le composizione.

Effettuare le macinazioni, le miscelazioni e le setacciature senza ritardi, esponendo il meno possibile il campione all’aria e alla luce. Evitare l’impiego di mulini o attrezzature per la macinazione suscettibili di riscaldare eccessivamente il campione.

Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la macinazione manuale. Assicurarsi altresì che l’apparecchiatura in se stessa non costituisca una fonte di contaminazione.

Se il campione non può essere preparato senza causare una variazione sensibile del contenuto di umidità, quest’ultimo va determinato prima e dopo la preparazione, secondo il metodo previsto nell’allegato III, parte A.

3. Procedura

3.1. Procedura generale

Il quantitativo da saggiare è prelevato dal campione finale. Il metodo del cono e della quartatura è sconsigliato, in quanto può dar luogo a quantitativi da saggiare con un elevato errore di ripartizione.

3.1.1. Alimenti che possono essere macinati direttamente

— Mescolare il campione finale setacciato e raccoglierlo in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare di nuovo, al fine di garantire che l’omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (quantitativo da saggiare).

3.1.2. Alimenti che possono essere macinati dopo essiccazione

— Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi, essiccare il campione finale, in modo da portarne il contenuto di umidità ad un livello compreso tra l’8 e il 12 %, applicando il procedimento di pre essiccazione indicato al punto 4.3 del metodo di dosaggio dell’umidità menzionato nell’allegato III, parte A. Procedere quindi come indicato al punto 3.1.1.

3.1.3. Alimenti liquidi o semiliquidi

— Raccogliere il campione finale in un recipiente appropriato pulito ed asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare bene, al fine di garantire che l’omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (quantitativo da saggiare).

3.1.4. Altri alimenti

— Se il campione finale non può essere preparato secondo uno dei procedimenti di cui sopra, applicare qualsiasi altro procedimento di preparazione che consenta di ottenere quantitativi da saggiare omogenei e rappresentativi dei campioni finali.

3.2. Procedura specifica in caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio o nei casi in cui sia omogeneizzato l’intero campione globale

— In caso di esame mediante ispezione visiva (senza uso del microscopio), si adopera l’intero campione di laboratorio.

— In caso di esame al microscopio, il laboratorio può ridurre il campione globale o ridurre ulteriormente il campione ridotto. I campioni finali per la difesa in caso di controversia e di riferimento si prelevano seguendo una procedura equivalente a quella seguita per il campione finale ai fini di verifica dell’applicazione della normativa.

— Qualora l’intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali si prelevano dal campione globale omogeneizzato.

4. Conservazione e immagazzinamento dei campioni

Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione. Nel caso dei campioni destinati all’analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce, conservarli in modo tale che non vengano alterati dalla luce.

B. DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L’APPARECCHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI

1. Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni, specificate nel metodo di analisi, devono essere puri per analisi (p.a.). Per l’analisi degli elementi in traccia, la purezza dei reattivi deve essere controllata con una prova in bianco. A seconda del risultato ottenuto, può rendersi necessaria una purificazione supplementare dei reattivi.

2. Per le operazioni di dissoluzione, diluizione, risciacquo o lavaggio, menzionate nei metodi di analisi senza indicazioni riguardo alla natura del solvente o del diluente, deve essere utilizzata acqua. Di norma, l’acqua deve essere demineralizzata o distillata. In casi particolari, indicati nei metodi di analisi, deve essere sottoposta a procedimenti specifici di purificazione.

3. Tenuto conto dell’abituale equipaggiamento dei laboratori di controllo, l’apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si limita agli strumenti e agli apparecchi speciali o rispondenti a prescrizioni d’uso specifiche. Detto materiale deve essere pulito, soprattutto per le determinazioni di quantità minime di sostanze.

C. APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI

1. Procedura di estrazione

Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato un’efficienza di estrazione, per la matrice analizzata, equivalente a quella della procedura indicata nel metodo.

2. Procedura di purificazione

Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati, per la matrice analizzata, equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo.

3. Numero di determinazioni

Qualora si analizzino sostanze indesiderabili, se il risultato della prima determinazione risulta significativamente inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una seconda analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni, che tiene conto dell’incertezza di misura, è utilizzata per verificare la conformità.

Se, nel controllare il contenuto dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente, il risultato della prima determinazione conferma il contenuto dichiarato (ossia, lo scarto tra il risultato dell’analisi e il contenuto dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile), non è necessario ripetere la determinazione, purché siano rispettate le opportune procedure di qualità. In altri casi, è necessaria una seconda analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni, che tiene conto dell’incertezza di misura, è utilizzata per verificare la conformità.

In alcuni casi il margine di variazione accettabile è definito da norme quali il regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 13 luglio 2009, sull’immissione sul mercato e sull’uso dei mangimi, che modifica il regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio e che abroga le direttive 79/373/CEE del Consiglio, 80/511/CEE della Commissione, 82/471/CEE del Consiglio, 83/228/CEE del Consiglio, 93/74/CEE del Consiglio, 93/113/CE del Consiglio e 96/25/CE del Consiglio e la decisione 2004/217/CE della Commissione ( 26 ).

4. Comunicazione del metodo di analisi applicato

Il rapporto di prova deve indicare il metodo di analisi applicato.

5. Comunicazione dei risultati dell’analisi

Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel metodo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e, ove necessario, corretto in funzione del contenuto di umidità del campione finale prima della sua preparazione.

6. Incertezza di misura e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili

Per quanto riguarda le sostanze indesiderabili ai sensi della direttiva 2002/32/CE, un prodotto destinato all’alimentazione animale è considerato non conforme al livello massimo fissato quando il risultato d’analisi, relativo a un alimento con tenore di umidità del 12 %, è giudicato superiore al livello massimo, tenuto conto dell’incertezza di misura estesa e della correzione per il recupero. Al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall’analisi, corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l’incertezza di misura estesa. Tale procedura è applicabile unicamente nei casi in cui il metodo d’analisi consenta la stima dell’incertezza di misura e la correzione per il fattore di recupero (non è possibile, ad esempio, in caso di analisi microscopica).

Il risultato dell’analisi è riportato come segue (quando il metodo d’analisi consente di valutare l’incertezza di misura e il tasso di recupero):

a) corretto per il recupero, indicando il tasso di recupero. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %;

b) nella forma «x +/– U», dove x è il risultato dell’analisi e U l’incertezza di misura estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che dà un livello di affidabilità del 95 % circa.

Tuttavia, qualora il risultato dell’analisi risulti molto inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, e a condizione che si rispettino le procedure appropriate in materia di qualità e l’analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, il risultato dell’analisi può essere presentato senza correzioni per il recupero e, in questo caso, il tasso di recupero e l’incertezza della misura possono essere omessi.

▼B









ALLEGATO III

METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA COMPOSIZIONE DELLE MATERIE PRIME PER ALIMENTI PER ANIMALI E DEGLI ALIMENTI COMPOSTI

A. DETERMINAZIONE DELL'UMIDITÀ

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità degli alimenti per animali. Nel caso degli alimenti contenenti sostanze volatili, ad esempio acidi organici, va osservato che oltre al contenuto di umidità si rileva anche un'importante presenza di materie volatili.

Il metodo non riguarda l'analisi dei prodotti lattieri in quanto materie prime per alimenti per animali, delle sostanze minerali e miscele essenzialmente composte di sostanze minerali, l'analisi dei grassi e oli vegetali, né quella dei semi e frutti oleaginosi.

2. Principio

Il campione è sottoposto a essiccazione in condizioni ben definite, varianti in funzione della natura dell'alimento. La perdita di peso è determinata per pesata. È necessario procedere a una preessiccazione quando si tratta di alimenti solidi aventi un elevato contenuto di umidità.

3. Apparecchiatura

3.1. Mulino da laboratorio costruito in materiale non assorbente l'umidità, facile a pulirsi, che permetta una macinazione rapida e uniforme senza provocare un sensibile riscaldamento, eviti al massimo il contatto con l'aria in ambiente esterno e risponda ai requisiti di cui ai punti 4.1.1 e 4.1.2 (ad esempio micromacinatori a martelli o a raffreddamento ad acqua, mulini a coni smontabili, macinatori a movimento lento o a dischi dentati).

3.2. Bilancia analitica (precisione 1 mg).

3.3. Recipienti asciutti, di vetro o di metallo inossidabile, provvisti di coperchi a chiusura ermetica; superficie utile che permetta di ottenere una ripartizione della quantità di prodotto su cui si opera dell'ordine di 0,3 g/cm2.

3.4. Stufa isotermica (± 2 °C) a riscaldamento elettrico, adeguatamente ventilata, capace di assicurare una regolazione rapida della temperatura ( 27 ).

3.5. Stufa a vuoto a riscaldamento elettrico regolabile munita di pompa a olio e di un dispositivo per l'introduzione di aria calda disidratata o di un agente disidratante (ad esempio ossido di calcio).

3.6. Essiccatore a piastra in metallo o in porcellana, spessa, perforata, contenente un efficace disidratante.

4. Procedimento

Nota: Le operazioni descritte in questo capitolo debbono essere effettuate immediatamente dopo l'apertura degli imballaggi contenenti i campioni. Le analisi vanno eseguite almeno due volte.

4.1. Preparazione

4.1.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.1.2 e 4.1.3

Prelevare almeno 50 g di campione. Se necessario macinare o dividere in particelle di grandezza appropriata in modo da evitare ogni variazione del contenuto di umidità (cfr. punto 6).

4.1.2. Cereali e semole

Prelevare almeno 50 g di campione. Macinare in particelle di cui almeno la metà passi per un setaccio a maglie di 0,5 mm e non lasci più del 10 % di residuo su un setaccio a maglie rotonde di 1 mm di diametro.

4.1.3. Alimenti liquidi o pastosi, alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse

Prelevare almeno 25 g di campione, pesati con l'approssimazione di 10 mg, e aggiungere una quantità appropriata di sabbia anidra, pesare con l'approssimazione di 10 mg e mescolare sino a ottenere un prodotto omogeneo.

4.2. Essiccazione

4.2.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.2.2 e 4.2.3

Tarare, con la precisione di 1 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 103 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per quattro ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 103 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg.

Nel caso di alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse, lasciare essiccare per altri 30 minuti nella stufa a 130 oC. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.2.2. Cereali, farine, semole e semolini

Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g circa di prodotto macinato e ripartirlo uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 130 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per due ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 130 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg.

4.2.3. Alimenti composti contenenti più del 4 % di saccarosio o lattosio: materie prime per mangimi quali carrube, prodotti a base di cereali idrolizzati, germi di malto, fettucce di barbabietola, «solubili» di pesce e zuccheri; alimenti composti contenenti più del 25 % di sali minerali con acqua di cristallizzazione. Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, privo del coperchio, nella stufa a vuoto (3.5) preriscaldata a una temperatura di 80-85 oC. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Portare la pressione a 100 Torr e lasciare essiccare a questa pressione per quattro ore in corrente d'aria secca e calda, o mediante un disidratante (300 g circa per 20 campioni). In quest'ultimo caso interrompere la connessione con la pompa a vuoto quando è raggiunta la pressione prescritta. Misurare la durata dell'essiccazione a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 80-85 oC. Riportare poi con precauzione la stufa alla pressione atmosferica. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg. Essiccare per altri 30 minuti nella stufa a vuoto, alla temperatura di 80-85 oC, e pesare di nuovo. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.

4.3. Preessiccazione

4.3.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati al punto 4.3.2

Gli alimenti solidi, il cui contenuto di umidità è elevato e rende difficile la macinazione, devono essere preessiccati nel modo indicato di seguito.

Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di prodotto non macinato (un grossolano spezzettamento può essere effettuato, se necessario, nel caso di alimenti compressi o agglomerati) in un recipiente appropriato (ad esempio, una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciar essiccare in una stufa alla temperatura di 60-70 oC, sino a che il contenuto di umidità sia portato a un valore compreso tra l'8 e il 12 %. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per un'ora e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Macinare subito dopo come indicato al punto 4.1.1 ed effettuare l'essiccazione come indicato ai punti 4.2.1 o 4.2.3 secondo la natura dell'alimento.

4.3.2. Cereali

I cereali in granella aventi una percentuale di umidità superiore al 17 % debbono essere preessiccati nel modo indicato di seguito.

Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di cereali in granella non moliti in un recipiente appropriato (ad esempio una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciare essiccare in una stufa per 5-7 minuti alla temperatura di 130 oC. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per due ore e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Molire subito dopo come indicato al punto 4.1.2 ed effettuare l'essiccazione come indicato al punto 4.2.2.

5. Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità (X), espresso in percentuale del campione, è dato dalle seguenti formule:

5.1. Essiccazione senza preessiccazione

dove

m = peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi,

m0 = peso, in grammi, del campione essiccato.

5.2. Essiccazione con preessiccazione

dove

m = peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi,

m1 = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, dopo la preessiccazione,

m2 = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, dopo la macinazione o frantumazione,

m0 = peso, in grammi, del campione essiccato.

5.3. Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera lo 0,2 % di umidità (valore assoluto).

6. Osservazione

Qualora sia necessario procedere alla macinazione e questa comporti una variazione nel contenuto di umidità del prodotto, i risultati dell'analisi dei componenti dell'alimento devono essere corretti in funzione del contenuto di umidità del campione iniziale.

B. DETERMINAZIONE DELL'UMIDITA NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità (acqua ed altre materie volatili) dei grassi e degli oli animali e vegetali.

2. Principio

Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103 oC fino a cessazione della diminuzione di massa (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere inferiore o pari a 1 mg). La perdita di peso è determinata per pesata.

3. Apparecchiatura

3.1. Recipiente a fondo piano, di materiale resistente alla corrosione, diametro da 8 a 9 cm, altezza di 3 cm circa.

3.2. Termometro con bulbo rinforzato e camera di espansione all'estremità superiore, tarato da circa 80 oC ad almeno 110 oC , lunghezza di 10 cm circa.

3.3. Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante.

3.4. Essiccatore, contenente un efficace disidratante.

3.5. Bilancia per analisi.

4. Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 20 g circa del campione omogeneizzato nel recipiente (3.1), essiccato e tarato, contenente il termometro (3.2). Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante (3.3), agitando continuamente con il termometro, in modo da far salire la temperatura a 90 oC in circa 7 minuti.

Ridurre l'intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente. La temperatura non deve superare i 105 oC. Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano più bolle.

Per assicurare l'eliminazione completa dell'umidità, riscaldare più volte a 103 ± 2 oC, raffreddando a 93 oC tra i riscaldamenti successivi. Lasciare quindi raffreddare nell'essiccatore (3.4) sino a temperatura ambiente e pesare. Ripetere l'operazione fino a quando la perdita di peso tra due pesate consecutive non supera i 2 mg.

Nota Un aumento del peso del campione dopo i ripetuti riscaldamenti indica un'ossidazione del grasso. In questo caso, calcolare il risultato basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che il peso abbia incominciato ad aumentare.

5. Calcolo dei risultati

Il contenuto di umidità, espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula:

dove

m = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi,

m1 = peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto prima del riscaldamento,

m2 = peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto dopo il riscaldamento.

I risultati inferiori allo 0,05 % debbono recare la dicitura «meno di 0,05 %».

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele, effettuate sullo stesso campione, non deve oltrepassare lo 0,05 % in valore assoluto.

C. DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI PROTEINE GREGGE

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto in proteine gregge degli alimenti per animali a partire dal contenuto di azoto, dosato secondo il metodo di Kjeldahl.

2. Principio

Il campione viene mineralizzato in acido solforico in presenza di un catalizzatore. La soluzione acida è alcalinizzata con una soluzione d'idrossido di sodio. L'ammoniaca viene isolata per distillazione e raccolta in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con una soluzione standard d'idrossido di sodio.

In alternativa, l'ammoniaca liberatasi viene distillata in un eccesso di soluzione di acido borico e successivamente titolata con una soluzione di acido cloridrico o acido solforico.

3. Reattivi

3.1. Solfato di potassio.

3.2. Catalizzatore: ossido rameico (II) CuO o solfato di rame (II) pentaidrato CuSO4 5H2 O.

3.3. Zinco in granuli.

3.4. Acido solforico, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Acido solforico, soluzione volumetrica, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Indicatore rosso di metile: sciogliere 300 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Soluzione d'idrossido di sodio (è possibile usare quello di purezza tecnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Idrossido di sodio, soluzione standard volumetrica, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Idrossido di sodio, soluzione volumetrica standard, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Pietra pomice in granulati, lavata con acido cloridrico e calcinata.

3.13. Acetanilide (p.f. = 114 oC, contenuto N = 10,36 %).

3.14. Saccarosio (esente da azoto).

3.15. Acido borico (H3BO3).

3.16. Soluzione d'indicatore rosso di metile: sciogliere 100 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo o metanolo.

3.17. Soluzione di verde di bromocresolo: sciogliere 100 mg di verde di bromocresolo in 100 ml di etanolo o metanolo.

3.18. Soluzione di acido borico (da 10 g/l a 40 g/l a seconda dell'apparecchiatura utilizzata) Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale vanno aggiunti alle soluzioni di acido borico gli indicatori rosso di metile e bromocresolo. Nella preparazione di 1 litro di soluzione di acido borico, prima di portare a volume, aggiungere 7 ml di soluzione d'indicatore rosso metile (3.16) e 10 ml di soluzione di verde di bromocresolo (3.17). A seconda dell'acqua utilizzata, il pH della soluzione di acido borico può variare da una partita all'altra. Per ottenere una prova in bianco positiva è spesso necessario un trattamento con una piccola quantità di alcali. Nota.: L'aggiunta di circa 3-4 ml di NaOH (3.11) a 1 litro di soluzione di acido borico a 10 g/l dà in genere buoni risultati. Conservare la soluzione a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce e da sorgenti di fumi di ammoniaca.

3.19. Acido cloridrico, soluzione volumetrica standard, c(HCl) = 0,10 mol/l. Nota.: Si possono utilizzare altre concentrazioni di soluzioni volumetriche (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 e 3.19) a condizione di apportare le necessarie correzioni nei calcoli. Le concentrazioni sono espresse sempre in cifre a quattro decimali.

4. Apparecchiatura

Apparecchi per mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo di Kjeldahl.

5. Procedimento

5.1. Mineralizzazione

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel pallone dell'apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere 15 g di solfato di potassio (3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (3.2) [da 0,3 g a 0,4 g di ossido rameico, oppure da 0,9 g a 1,2 g di solfato di rame (II) pentaidrato], 25 ml di acido solforico (3.4) e, se necessario, frammenti di pietra pomice (3.12). Mescolare.

Riscaldare il pallone prima moderatamente, agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione della massa e a scomparsa della schiuma; quindi scaldare più intensamente sino a ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l'acido bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano.

Quando la soluzione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l'ebollizione ancora per due ore. Lasciare quindi raffreddare.

5.2. Distillazione

Aggiungere con precauzione un quantitativo d'acqua sufficiente a sciogliere completamente i solfati. Lasciar raffreddare. Aggiungere quindi, se necessario, qualche granulo di zinco (3.3). Procedere secondo il punto 5.2.1 o 5.2.2.

5.2.1. Distillazione in acido solforico

Introdurre nel matraccio collettore dell'apparecchio di distillazione 25 ml misurati esattamente di acido solforico (3.5 o 3.7, a seconda del presunto contenuto di azoto) e qualche goccia di indicatore al rosso di metile (3.8).

Collegare il pallone di mineralizzazione al refrigerante dell'apparecchio di distillazione e immergere l'estremità di quest'ultimo per almeno 1 cm nel liquido del matraccio collettore (cfr. osservazione al punto 8.3). Versare lentamente nel pallone 100 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9) senza provocare una perdita di ammoniaca (cfr. osservazione al punto 8.1). Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell'ammoniaca.

5.2.2. Distillazione in acido borico

Quando la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato è realizzata manualmente, si applica il metodo indicato di seguito. Quando l'unità di distillazione è interamente automatizzata, anche per quanto riguarda la titolazione del tenore di ammoniaca del distillato, seguire le istruzioni d'uso di tale unità fornite dal fabbricante.

Collocare un matraccio collettore contenente 25-30 ml della soluzione di acido borico (3.18) alla bocca d'uscita del refrigerante in modo che il tubo di evacuazione si trovi al di sotto della superficie dell'eccesso di soluzione di acido borico. Regolare l'unità di distillazione per ottenere 50 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9). Far funzionare l'unità di distillazione conformemente alle istruzioni fornite dal fabbricante ed eliminare l'ammoniaca liberatasi per distillazione aggiungendo la soluzione di idrossido di sodio. Raccogliere il distillato nella soluzione di acido borico. La quantità di distillato (tempo di distillazione in corrente di vapore) dipende dal tenore di azoto nel campione. Seguire le indicazioni fornite dal fabbricante.

Nota: In un'unità di distillazione semiautomatica l'aggiunta di eccesso di idrossido di sodio e la distillazione in corrente di vapore avvengono automaticamente.

5.3. Titolazione

Procedere conformemente al punto 5.3.1 o 5.3.2.

5.3.1. Acido solforico

Titolare l'eccesso di acido solforico nel matraccio collettore per mezzo di una soluzione d'idrossido di sodio (3.10 o 3.11) secondo la concentrazione dell'acido solforico usato, sino a raggiungere il punto finale.

5.3.2. Acido borico

Titolare il contenuto del matraccio collettore con la soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (3.19) o con la soluzione volumetrica standard di acido solforico (3.6) per mezzo di una buretta e leggere la quantità di soluzione titolata utilizzata.

Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale, si raggiunge il punto finale all'apparire della prima traccia di colore rosa nel contenuto. Valutare il contenuto della buretta con l'approssimazione di 0,05 ml. La visualizzazione del punto finale può essere facilitata per mezzo di un rivelatore fotometrico.

È possibile farlo automaticamente per mezzo di un'unità di distillazione in corrente di vapore a titolazione automatica.

Seguire le istruzioni del fabbricante relative al funzionamento dell'unità di distillazione o del distillatore titolatore, a seconda dei casi.

Nota: Quando è utilizzato un sistema di titolazione automatica, con soluzione di acido borico all'1 % (3.18), la titolazione inizia non appena avviene la distillazione. In caso di utilizzo di un'unità di distillazione interamente automatica, anche la titolazione automatica dell'ammoniaca può essere eseguita applicando il metodo di determinazione del punto finale per mezzo di un sistema di titolazione potenziometrica del pH. In questo caso si ricorre ad un titolatore automatico con pH-metro, tarato in maniera appropriata entro una gamma di valori compresa tra pH 4 e pH 7 conformemente ai normali metodi di taratura del pH in laboratorio. Il punto finale in pH della titolazione è raggiunto a pH 4,6, che corrisponde al punto di inflessione (o di flesso) della curva di titolazione.

5.4. Prova in bianco

Per confermare che i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) sostituendo il campione con 1 g di saccarosio (3.14).

6. Calcolo dei risultati

I calcoli sono effettuati conformemente ai punti 6.1 o 6.2.

6.1. Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.1

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

V0 = volume (ml) di NaOH (3.10 o 3.11) usato nella prova in bianco;

V1 = volume (ml) di NaOH (3.10 o 3.11) usato nella titolazione del campione;

c = concentrazione (mol/l) dell'idrossido di sodio (3.10 o 3.11);

m = peso (g) del campione.

6.2. Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.2

6.2.1. Titolazione con acido cloridrico

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

m = peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all'analisi;

c = concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (3.19);

V0 = volume (ml) di acido cloridrico usato nella prova in bianco;

V1 = volume (ml) di acido cloridrico usato per la quantità di sostanza sottoposta all'analisi.

6.2.2. Titolazione con acido solforico

Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente:

dove

m = peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all'analisi;

c = concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido solforico (3.6);

V0 = volume (ml) di acido solforico usato per la prova in bianco;

V1 = volume (ml) di acido solforico (3.6) usato per la quantità di sostanza sottoposta all'analisi.

7. Verifica del metodo

7.1. Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

— lo 0,2 % in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge inferiori al 20 %;

— l'1,0 % rispetto al valore più elevato, per i contenuti di proteine gregge compresi fra il 20 e il 40 %;

— lo 0,4 % in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge superiori al 40 %.

7.2. Precisione

Eseguire l'analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su 1,5-2,0 g di acetanilide (3.13) in presenza di 1 g di saccarosio (3.14); 1 g di acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico (3.5). Il recupero deve essere almeno del 99 %.

8. Osservazioni

8.1. L'apparecchiatura può essere di tipo manuale, semiautomatico o automatico. Se l'apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione e distillazione, il travasamento deve essere effettuato senza perdite. Se il pallone dell'apparecchio di distillazione non è provvisto di un imbuto separatore, aggiungere la soluzione d'idrossido di sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante, lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti.

8.2. Se il prodotto mineralizzato si solidifica, ricominciare la determinazione usando un quantitativo di acido solforico (3.4) superiore a quello indicato sopra.

8.3. Per i prodotti poveri di sostanze azotate, il volume di acido solforico (3.7) da introdurre nel matraccio collettore può essere ridotto, se necessario, a 10 o 15 ml e portato a 25 ml con acqua.

8.4. Per analisi ordinarie possono essere applicati metodi alternativi per determinare le proteine gregge, ma il metodo di Kjeldahl descritto in questa parte C costituisce il metodo di riferimento. L'equivalenza tra i risultati ottenuti con il metodo alternativo (ad esempio, il metodo Dumas) e quelli del metodo di riferimento va dimostrata per ciascuna matrice singolarmente. Dato che i risultati ottenuti con un metodo diverso, anche dopo verifica dell'equivalenza, possono deviare leggermente da quelli ottenuti con il metodo di riferimento, è necessario indicare nella relazione di analisi il metodo utilizzato per la determinazione delle proteine gregge.

D. DETERMINAZIONE DELL'UREA

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di urea negli alimenti per animali.

2. Principio

Il campione è messo in sospensione nell'acqua in presenza di un chiarificante. La sospensione è filtrata. Il contenuto di urea del filtrato è determinato, dopo aggiunta di 4-dimetilamminobenzaldeide (4-DMAB), misurando la densità ottica alla lunghezza d'onda di 420 nm.

3. Reattivi

3.1. Soluzione di 4-dimetilamminobenzaldeide: sciogliere 1,6 g di 4-DMAB in 100 ml di etanolo al 96 % e aggiungere 10 ml di acido cloridrico (ρ20 1,19 g/ml). Questo reattivo si conserva soltanto per due settimane.

3.2. Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco, Zn(CH3COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua.

3.3. Soluzione di Carrez II: sciogliere nell'acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio, K4 Fe (CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua.

3.4. Carbone attivo non assorbente urea (eseguire un controllo).

3.5. Urea, soluzione allo 0,1 % (p/v).

4. Apparecchiatura

4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri per minuto.

4.2. Provette: 160 × 16 mm, a tappo smerigliato.

4.3. Spettrofotometro.

5. Procedimento

5.1. Analisi del campione

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2 g del campione ed introdurli con 1 g di carbone attivo (3.4) in un matraccio tarato da 500 ml. Aggiungere 400 ml di acqua e 5 ml di soluzione di Carrez I (3.2), agitare per circa 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II (3.3). Mescolare per mezz'ora mediante l'agitatore rotativo a capovolgimento. Portare a volume con acqua, agitare e filtrare.

Prelevare 5 ml di filtrati limpidi ed incolori, introdurli nei tubi da prova con tappo smerigliato, aggiungere 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1) e mescolare. Porre i tubi in bagnomaria a 20 oC (+/- 4 oC). Dopo 15 minuti, misurare la densità ottica della soluzione del campione con lo spettrofotometro a 420 nm rispetto alla soluzione della prova in bianco dei reattivi.

5.2. Curva di taratura

Prelevare volumi di 1, 2, 4, 5 e 10 ml della soluzione di urea (3.5), introdurli in matracci tarati da 100 ml e portare a volume con acqua. Prelevare 5 ml di ciascuna soluzione aggiungendo ogni volta 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1), mescolare e misurare la densità ottica, come indicato dianzi, rispetto ad una soluzione testimone contenente 5 ml di 4-DMAB e 5 ml d'acqua, esente da urea. Tracciare la curva di taratura.

6. Calcolo dei risultati

Determinare la quantità d'urea, nella parte di campione sottoposta all'analisi, servendosi della curva di taratura.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

7. Osservazioni

7.1. Per contenuti di urea superiori al 3 %, ridurre la quantità di campione da sottoporre all'analisi a 1 g o diluire la soluzione originale, per non avere più di 50 mg d'urea in 500 ml.

7.2. Per bassi tenori di urea, aumentare la quantità di campione da sottoporre all'analisi fino a quando il filtrato resta limpido ed incolore.

7.3. Quando il prodotto contiene composti azotati semplici, ad esempio amminoacidi, si effettua la misurazione della densità ottica a 435 nm.

E. DETERMINAZIONE DELLE BASI AZOTATE VOLATILI

I. PER MICRODIFFUSIONE

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, degli alimenti per gli animali.

2. Principio

Il campione viene estratto con acqua, la soluzione viene chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono spostate per mezzo di una soluzione di carbonato di potassio per microdiffusione, raccolte in una soluzione di acido borico e titolate con acido solforico.

3. Reattivi

3.1. Soluzione al 20 % (p/v) di acido tricloroacetico.

3.2. Indicatore: sciogliere 33 mg di verde di bromocresolo e 65 mg di rosso di metile in 100 ml d'etanolo al 95-96 % (v/v).

3.3. Soluzione di acido borico: in un pallone tarato da 1 litro, sciogliere 10 g d'acido borico in 200 ml d'etanolo al 95-96 % (v/v) e 700 ml d'acqua. Aggiungere 10 ml di indicatore (3.2). Mescolare e aggiustare, se necessario, il colore della soluzione al rosso chiaro mediante aggiunta di una soluzione d'idrossido di sodio. 1 ml di questa soluzione consente di fissare al massimo 300 μg di ammoniaca.

3.4. Soluzione satura di carbonato di potassio: sciogliere 100 g di carbonato di potassio in 100 ml d'acqua portata all'ebollizione. Lasciar raffreddare e filtrare.

3.5. Acido solforico 0,01 mol/l.

4. Apparecchiatura

4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto

4.2. Celle di Conway (cfr. figura), in vetro o in materia plastica.

4.3. Microburette, graduate a 1/100 ml.

5. Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e porli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe.

Prelevare con una pipetta 1 ml della soluzione di acido borico (3.3) nell'incavo centrale della cella Conway e, nella corona della cella, 1 ml del filtrato ottenuto dal campione. Coprire parzialmente con il coperchio ingrassato. Lasciar scolare rapidamente nella corona periferica 1 ml della soluzione satura di carbonato di potassio (3.4) e chiudere ermeticamente il coperchio. Agitare con precauzione la cella facendola rotare su un piano orizzontale in modo da assicurare la miscelazione dei due reattivi. Mantenere l'apparecchio per almeno quattro ore alla temperatura ambiente o per un'ora a 40 oC.

Titolare le basi volatili nella soluzione d'acido borico con la soluzione di acido solforico (3.5) per mezzo di una microburetta (4.3).

Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare.

6. Calcolo dei risultati

1 ml di H2SO40,01 mol/l corrisponde a 0,34 mg di ammoniaca.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera:

— il 10 %, in valore relativo, per i contenuti di ammoniaca inferiori a 1,0 %,

— lo 0,1 %, in valore assoluto, per i contenuti di ammoniaca uguali o superiori all'1,0 %.

7. Osservazione

Se il contenuto di ammoniaca del campione è superiore allo 0,6 %, diluire il filtrato iniziale.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. PER DISTILLAZIONE

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, delle farine di pesce non contenenti, praticamente, urea. Il metodo è applicabile unicamente a contenuti di ammoniaca inferiori a 0,25 %.

2. Principio

Il campione viene estratto con acqua, la soluzione è chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono portate/spostate all'ebollizione per aggiunta di ossido di magnesio e raccolte in una quantità determinata d'acido solforico il cui eccesso viene titolato di ritorno con una soluzione d'idrossido di sodio.

3. Reattivi

3.1. Soluzione al 20 % (p/v) di acido tricloroacetico.

3.2. Ossido di magnesio.

3.3. Emulsione antischiuma (ad esempio, silicone).

3.4. Acido solforico 0,05 mol/l.

3.5. Soluzione di idrossido di sodio (0,1 mol/l).

3.6. Soluzione allo 0,3 % (v/v) di rosso di metile in etanolo al 95-96 % (v/v).

4. Apparecchiatura

4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto.

4.2. Apparecchio per distillazione del tipo Kjeldahl.

5. Procedimento

Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e introdurli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe.

Prelevare una quantità di filtrato limpido in funzione del presunto contenuto di basi azotate volatili (100 ml sono generalmente sufficienti). Diluire a 200 ml e aggiungere 2 g di ossido di magnesio (3.2) e qualche goccia di emulsione antischiuma (3.3). La soluzione deve risultare alcalina alla cartina tornasole, altrimenti aumentare la quantità di ossido di magnesio (3.2). Procedere conformemente ai punti 5.2 e 5.3 del metodo di analisi per la determinazione del contenuto di proteine gregge (parte C del presente allegato).

Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare.

6. Calcolo dei risultati

1 ml di H2SO4 0,05 mol/l corrisponde a 1,7 mg di ammoniaca.

Esprimere il risultato in percentuale del campione.

Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera, in valore relativo, il 10 % di ammoniaca.

F. DETERMINAZIONE DEGLI AMMINOACIDI (TRIPTOFANO ESCLUSO)

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo serve per determinare gli amminoacidi liberi (sia di sintesi che naturali) e totali (legati a peptidi e liberi) negli alimenti per animali mediante un analizzatore di amminoacidi. Il metodo è applicabile ai seguenti amminoacidi: cist(e)ina, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, acido aspartico, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

Il metodo non distingue gli amminoacidi dai loro sali e non può distinguere la forma D degli amminoacidi dalla forma L; esso non è adatto per la determinazione del triptofano né degli analoghi idrossilati degli amminoacidi.

2. Principio

2.1. Amminoacidi liberi

Gli amminoacidi liberi sono estratti con acido cloridrico diluito. Le macromolecole azotate coestratte vengono fatte precipitare con acido solfosalicilico e vengono rimosse per filtrazione. La soluzione filtrata viene portata a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm.

2.2. Amminoacidi totali

La scelta della procedura dipende dagli amminoacidi oggetto dell'analisi. Cist(e)ina e metionina devono essere ossidate ad acido cisteico e al metionina sulfone prima dell'idrolisi. La tirosina deve essere determinata in idrolizzati di campioni non ossidati. Tutti gli altri amminoacidi elencati al punto 1 possono essere determinati sia nel campione ossidato sia in quello non ossidato.

L'ossidazione viene eseguita a 0 oC con una miscela di acido performico e di fenolo. L'eccesso del reagente di ossidazione viene decomposto con metabisolfito di sodio. Il campione ossidato o non ossidato è idrolizzato con acido cloridrico (3.20) per 23 ore. L'idrolizzato è regolato a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm (440 nm per la prolina).

3. Reattivi

Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS).

3.1. Perossido d'idrogeno, p (p/p) = 30 %.

3.2. Acido formico, p (p/p) = 98-100 %.

3.3. Fenolo.

3.4. Metabisolfito di sodio.

3.5. Idrossido di sodio.

3.6. Acido 5-solfosalicilico diidrato.

3.7. Acido cloridrico, densità circa 1,18 g/ml.

3.8. Citrato trisodico diidrato.

3.9. 2,2'-Tiodietanolo (tiodiglicole).

3.10. Cloruro di sodio.

3.11. Ninidrina.

3.12. Etere di petrolio, intervallo di ebollizione: 40-60 oC.

3.13. Norleucina o altro composto adatto ad essere utilizzato come standard interno.

3.14. Azoto gassoso (< 10 ppm di ossigeno).

3.15. 1-Ottanolo.

3.16. Amminoacidi.

3.16.1. Sostanze di riferimento elencate al punto 1. Composti puri non contenenti acqua di cristallizzazione. Essiccare sotto vuoto su P2O5 o H2SO4 per una settimana prima dell'uso.

3.16.2. Acido cisteico.

3.16.3. Metionina sulfone.

3.17. Soluzione di idrossido di sodio, c = 7,5 mol/l: sciogliere 300 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro.

3.18. Soluzione di idrossido di sodio, c = 1 mol/l: sciogliere 40 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro.

3.19. Soluzione di acido formico-fenolo: miscelare 889 g di acido formico (3.2) con 111 g d'acqua e aggiungere 4,73 g di fenolo (3.3).

3.20. Miscela di idrolisi, c = HCl 6 mol/l contenente 1 g di fenolo: aggiungere 1 g di fenolo (3.3) a 492 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua.

3.21. Miscela di estrazione, c = HCl 0,1 mol/l contenente 2 % di tiodiglicole: introdurre 8,2 ml di HCl (3.7) in circa 900 ml d'acqua e miscelare, aggiungere 20 ml di tiodiglicolo (3.9) e portare a 1 litro con acqua (non miscelare direttamente le sostanze di cui ai punti 3.7 e 3.9).

3.22. Acido 5-solfosalicilico: β = 6 %: sciogliere 60 g di acido 5-solfosalicilico (3.6) in acqua e portare a 1 litro con acqua.

3.23. Miscela di ossidazione (acido performico-fenolo): miscelare 0,5 ml di perossido di idrogeno (3.1) con 4,5 ml di soluzione di acido formico e fenolo (3.19) in un piccolo becher. Tenere in incubazione a 20-30 oC per un'ora per ottenere acido performico; lasciare raffreddare su un bagno di acqua gelata (15 min) prima di aggiungere il campione. Attenzione: evitare il contatto con la pelle e indossare indumenti di protezione.

3.24. Tampone citrato, c = Na+ 0,2 mol/l, pH 2,20: sciogliere 19,61 g di citrato di sodio (3.8), 5 ml di tiodiglicole (3.9), 1 g di fenolo (3.3) e 16,50 ml di HCl (3.7) in cira 800 ml d'acqua. Portare il pH a 2,20. Portare a 1 litro con acqua.

3.25. Tamponi di eluizione preparati conformemente alle prescrizioni relative all'analizzatore (4.9).

3.26. Reattivo alla ninidrina preparato conformemente alle prescrizioni relative all'analizzatore (4.9).

3.27. Soluzioni standard di amminoacidi. Conservare queste soluzioni a temperatura inferiore a 5 oC.

3.27.1. Soluzione madre standard di amminoacidi (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml di ciascuno in acido cloridrico. Reperibile in commercio.

3.27.2. Soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone, c = 1,25 μmol/ml. Sciogliere 0,2115 g di acido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g di metionina sulfone (3.16.3) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 1 litro e portare a volume con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 12 mesi. Questa soluzione non viene utilizzata se la soluzione madre standard (3.27.1) contiene acido cisteico e metionina sulfone.

3.27.3. Soluzione madre standard, ad esempio norleucina, c = 20 μmol/ml. Sciogliere 0,6560 g di norleucina (3.13) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato e portare a 250 ml con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 6 mesi.

3.27.4. Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati, c = 5 nmol/50 μl di acido cisteico e metionina sulfone e c = 10 nmol/50 μl di altri amminoacidi. Sciogliere 2,2 g di cloruro di sodio (3.10) in un becher da 100 ml con 30 ml di tampone citrato (3.24). Aggiungere 4,00 ml di soluzione madre standard di amminoacidi (3.27.1), 4,00 ml di soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone (3.27.2) e, se del caso, 0,50 ml di soluzione madre standard dello standard interno (3.27.3). Portare il pH a 2,20 con idrossido di sodio (3.18). Trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con tampone citrato (3.24) e miscelare. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi. Cfr. anche le osservazioni al punto 9.1.

3.27.5. Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati preparati secondo quanto prescritto al punto 5.3.3.1 e destinati all'uso con estratti (5.2). Preparare la soluzione di taratura secondo quanto indicato al punto 3.27.4, ma senza cloruro di sodio. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi.

4. Apparecchiatura

4.1. Pallone a fondo arrotondato da 100 o 250 ml provvisto di refrigerante a ricadere.

4.2. Flacone di vetro borosilicatico da 100 ml con tappo a vite e guarnizione di gomma/teflon (ad esempio Duran, Schott) utilizzabile in stufa.

4.3. Stufa a ventilazione forzata con regolazione della temperatura avente una precisione superiore a ± 2 oC.

4.4. pH-metro (a tre cifre decimali).

4.5. Filtro a membrana, da 0,22 μm.

4.6. Centrifuga.

4.7. Evaporatore rotante sotto vuoto.

4.8. Agitatore meccanico o mescolatore magnetico.

4.9. Analizzatore di amminoacidi o apparecchiatura HPLC provvista di colonna a scambio ionico, dispositivo per ninidrina, derivatizzatore post-colonna e rivelatore fotometrico. La colonna deve essere riempita di resine polistireniche sulfonate in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e da altri prodotti reattivi alla ninidrina. Il flusso del tampone e del reattivo di ninidrina è garantito da pompe il cui grado di stabilità di portata è ±0,5 % nell'intervallo tra l'analisi della soluzione di taratura e l'analisi del campione. Con alcuni analizzatori di amminoacidi si possono utilizzare metodi di idrolisi in cui l'idrolizzato presenta una concentrazione di sodio di c = 0,8 mol/l e contiene tutto l'acido formico residuo dalla fase di ossidazione. Altri apparecchi non consentono una separazione soddisfacente di certi amminoacidi se l'idrolizzato contiene troppo acido formico e/o presenta elevate concentrazioni di ioni sodio. In questo caso il volume dell'acido è ridotto a circa 5 ml mediante evaporazione dopo l'idrolisi e prima della regolazione del pH. L'evaporazione è eseguita sotto vuoto a temperatura non superiore a 40 oC.

5. Procedimento

5.1. Preparazione del campione

Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all'aria ad una temperatura non superiore a 50 oC o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (3.12) prima di essere triturati.

5.2. Determinazione degli amminoacidi liberi negli alimenti per animali e nelle premiscele

Pesare con l'approssimazione di 0,2 mg una quantità appropriata (1-5 g) del campione preparato (5.1) in una beuta e aggiungere 100,0 ml di miscela di estrazione (3.2.1). Agitare la miscela per 60 minuti con un agitatore o meccanico o miscelatore magnetico (4.8). Lasciar depositare il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher da 100 ml.

Aggiungere 5,0 ml di soluzione di acido solfosalicilico (3.22) sempre agitando e continuare ad agitare con agitatore magnetico per 5 minuti. Filtrare o centrifugare il surnatante per rimuovere eventuali precipitati. Introdurre 10,0 ml della soluzione risultante in un becher da 100 ml e portare il pH a 2,20 con una soluzione di idrossido di sodio (3.18), trasferire in un matraccio tarato di volume appropriato utilizzando tampone citrato (3.24) e portare a volume con la soluzione tampone (3.24).

Se si usa uno standard interno, aggiungere 1,00 ml di standard interno (3.27.3) ogni 100 ml di soluzione finale e portare a volume con la soluzione tampone (3.24).

Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4.

Se gli estratti non vengono cromatografati lo stesso giorno, conservarli a temperatura inferiore a 5 oC.

5.3. Determinazione degli amminoacidi totali

5.3.1. Ossidazione

Pesare, con l'approssimazione di 0,2 mg, da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1) in:

— un pallone a fondo arrotondato da 100 ml (4.1) per l'idrolisi in sistema aperto (5.3.2.3), o

— un pallone a fondo arrotondato da 250 ml (4.1) se è richiesta una bassa concentrazione di sodio, o

— un flacone da 100 ml dotato di tappo a vite (4.2) per l'idrolisi in sistema chiuso (5.3.2.4).

La porzione di campione pesata deve avere un contenuto d'azoto di circa 10 mg e un contenuto di umidità non superiore a 100 mg.

Introdurre il pallone o il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio e raffreddare a 0 oC; aggiungere 5 ml di miscela di ossidazione (3.23) e miscelare con una spatola di vetro con un estremità ricurva. Sigillare il pallone o flacone contenente la spatola con una pellicola impermeabile all'aria, introdurre il bagno di acqua e ghiaccio contenente il contenitore sigillato in un frigorifero a 0 oC e lasciarvelo per 16 ore. Dopo 16 ore togliere dal frigorifero e decomporre l'eccesso di reagente di ossidazione mediante l'aggiunta di 0,84 g di bisolfito di sodio (3.4).

Procedere come indicato al punto 5.3.2.1.

5.3.2. Idrolisi

5.3.2.1. Idrolisi dei campioni ossidati

Aggiungere al campione ossidato, preparato conformemente al punto 5.3.1, 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) avendo cura di risciacquare eventuali residui di campione che aderiscono alle pareti del recipiente e alla spatola.

Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, a seconda del metodo di idrolisi utilizzato.

5.3.2.2. Idrolisi dei campioni non ossidati

Pesare in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml o 250 ml (4.1) o in un flacone da 100 ml con tappo a vite (4.2) (con l'approssimazione di 0,2 mg) una quantità da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1). La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere con cautela 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) e miscelare con il campione. Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

5.3.2.3. Idrolisi, sistema aperto

Aggiungere 3 biglie di vetro alla miscela (preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2) contenuta nel pallone e far bollire a ricadere per 23 ore a ebollizione continua. Al completamento dell'idrolisi, risciacquare il refrigerante con 5 ml di tampone citrato (3.24). Togliere il pallone e farlo raffreddare in un bagno di ghiaccio.

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.2.4. Idrolisi, sistema chiuso

Introdurre il flacone contenente la miscela, preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2, in un forno (4.3) a 110 oC. Durante la prima ora, allo scopo di evitare un accumulo di pressione in conseguenza dello sviluppo di sostanze gassose e di evitare un'esplosione, porre il tappo a vite sopra al recipiente senza chiuderlo. Dopo un'ora, chiudere il recipiente con il tappo e lasciarlo nel forno (4.3) per 23 ore. Al completamento dell'idrolisi, togliere il flacone dal forno, aprire con cautela il tappo del flacone e introdurre il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio. Lasciar raffreddare.

Secondo la procedura usata per la regolazione del pH (5.3.3), trasferire quantitativamente il contenuto del flacone in un becher da 250 ml o in un pallone a fondo tondo da 250 ml utilizzando tampone citrato (3.24).

Procedere come indicato al punto 5.3.3.

5.3.3. Regolazione del pH

Procedere, conformemente al punto 5.3.3.1 o 5.3.3.2, alla regolazione del pH, in funzione della tolleranza al sodio dell'analizzatore di amminoacidi (4.9).

5.3.3.1. Per sistemi cromatografici (4.9) che richiedono una bassa concentrazione di sodio.

Quando si impiegano analizzatori di amminoacidi che richiedono una bassa concentrazione di sodio (quando il volume dell'acido deve essere ridotto), è consigliabile utilizzare una soluzione madre standard interna (3.27.3).

In questo caso aggiungere 2,00 ml della soluzione standard interna (3.27.3) all'idrolizzato prima dell'evaporazione.

Aggiungere 2 gocce di 1-ottanolo (3.15) all'idrolizzato ottenuto conformemente alla procedura di cui al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

Utilizzando un evaporatore rotante (4.7), ridurre il volume a 5-10 ml sotto vuoto a 40 oC. Se il volume viene ridotto accidentalmente a meno di 5 ml, scartare l'idrolizzato e ricominciare l'analisi.

Portare il pH a 2,20 con soluzione di idrossido di sodio (3.18) e procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.3.2. Per tutti gli altri analizzatori di amminoacidi (4.9)

Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati ottenuti conformemente al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, aggiungendovi con cautela, sempre agitando, 17 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.17), facendo attenzione che la temperatura rimanga al di sotto di 40 oC.

Portare il pH a 2,20 a temperatura ambiente utilizzando la soluzione di idrossido di sodio di cui al punto 3.17 e, infine, una soluzione di idrossido di sodio conforme al punto 3.18. Procedere conformemente al punto 5.3.4.

5.3.4. Soluzione del campione per cromatografia

Trasferire quantitativamente l'idrolizzato portato a pH 2,20 (5.3.3.1 o 5.3.3.2) con tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con tampone (3.24).

Se non è stato ancora utilizzato uno standard interno, aggiungerne 2,00 ml (3.27.3) e portare a volume con tampone citrato (3.24). Miscelare accuratamente.

Procedere alla fase della cromatografia (5.4).

Se le soluzioni del campione non vengono cromatografate nello stesso giorno, conservarle a temperatura inferiore a 5 oC.

5.4. Cromatografia

Prima della cromatografia, portare l'estratto (5.2) o l'idrolizzato (5.3.4) a temperature ambiente. Agitare la miscela e filtrarne una quantità appropriata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm (4.5). La soluzione limpida risultante viene sottoposta a cromatografia a scambio ionico utilizzando un analizzatore di amminoacidi (4.9).

L'iniezione può venire eseguita manualmente o automaticamente. È importante iniettare sempre la stessa quantità (± 0,5 %) di soluzione nella colonna per l'analisi degli standard e dei campioni, salvo quando si usa uno standard interno; inoltre i rapporti sodio/amminoacidi nello standard e nelle soluzioni del campione devono essere il più possibile simili.

La frequenza delle iniezioni della soluzione di taratura dipende dalla stabilità del reattivo ninidrina e del sistema analitico. La soluzione standard o del campione è diluita con tampone citrato (3.24) in misura tale che l'area del picco della soluzione standard sia compresa Fra il 30 % e il 200 % dell'area del picco dell'amminoacido nel campione.

La cromatografia degli amminoacidi varierà leggermente secondo il tipo di analizzatore impiegato e la resina usata. Il sistema scelto deve essere in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e dalle sostanze reattive alla ninidrina. Nel corso dell'operazione, il sistema cromatografico deve dare una risposta lineare alle variazioni delle quantità di amminoacidi introdotti in colonna.

Durante la fase di cromatografia, quando si analizza una soluzione equimolare (degli amminoacidi sottoposti a determinazione), si applicano i rapporti di altezza valle/picco citati più avanti. La soluzione equimolare deve contenere almeno il 30 % del carico massimo di ciascun amminoacido che può essere determinato con precisione tramite il sistema di analisi degli amminoacidi (4.9).

Per la separazione treonina-serina, il rapporto di altezza valle/picco del più basso dei due amminoacidi che si sovrappongono sul cromatogramma non deve superare 2/10 [se la determinazione viene effettuata solo su cist(e)ina, metionina, treonina e lisina, una insufficiente separazione di picchi adiacenti influirà sfavorevolmente sulla determinazione]. Per tutti gli altri amminoacidi la separazione deve essere maggiore di 1/10.

Il sistema deve poter separare la lisina da «artefatti di lisina» e dall'ornitina.

6. Calcolo dei risultati

Determinare le aree del picco del campione e della soluzione standard per ogni singolo amminoacido e calcolare la quantità (X) in g di amminoaci