6.

Dodaje se sljedeći Prilog XIX. „PRILOG XIX. ODREĐIVANJE SADRŽAJA ALIFATSKIH ALKOHOLA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM 1. PREDMET Ovim se postupkom opisuje metoda za određivanje sadržaja alifatskih alkohola u uljima i mastima. 2. PRINCIP METODE Masna tvar s dodatkom 1-eikosanola koji služi kao interni standard saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira dietilnim eterom. Alkoholna se frakcija odjeljuje od neosapunjive tvari tankoslojnom kromatografijom na bazičnoj podlozi od silikagela; alkoholi koji se dobiju sa silikagela transformiraju se u trimetilsilil etere i analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom. 3. OPREMA 3.1. Tikvica okruglog dna volumena 250 ml s povratnim hladilom i nastavcima od brušenog stakla. 3.2. Lijevak za odjeljivanje volumena 500 ml. 3.3. Tikvice okruglog dna volumena 250 ml. 3.4. Kromatografska komora za tankoslojnu kromatografiju, za staklene ploče veličine 20 × 20 cm. 3.5. Ultraljubičasta svjetiljka valne duljine 366 ili 254 nm. 3.6. Mikroštrcaljke od 100 μl i 500 μl. 3.7. Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G3 (poroznost 15-40 μm), promjera približno 2 cm i dubine približno 5 cm, s nastavkom prikladnim za filtriranje pod vakuumom i 12/21 s muškim spojem od brušenog stakla. 3.8. Vakuumska tikvica volumena 50 ml, s 12/21 ženskim spojem od brušenog stakla za korištenje s lijevkom za filtriranje (3.7.). 3.9. Epruveta volumena 10 ml s konusnim dnom i nepropusnim čepom. 3.10. Plinski kromatograf za korištenje s kapilarnom kolonom i opremljen sustavom za razdvajanje koji se sastoji od: 3.10.1. termostatske komore za kolone (peć), koja može održavati željene temperature uz točnost ± 1 °C; 3.10.2. jedinica za injektiranje s mogućnošću podešavanja temperature, s elementom za uparavanje od persilaniziranog stakla; 3.10.3. plameno-ionizacijski detektor i mjerni pretvarač s pojačalom; 3.10.4. snimač-integrator koji se može povezati s pretvaračem s pojačalom (3.10.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira. 3.11. staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine 20 do 30 m, unutarnjeg promjera 0,25 do 0,32 mm, s SE-52, SE-54 ili drugom odgovarajućom tekućom fazom, ravnomjerne debljine filma između 0,10 i 0,30 μm. 3.12. Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju volumena 10 μl, s tvrdom iglom. 3.13. Analitička vaga osjetljivosti 1 mg (s podjelom od 0,1 mg). 4. REAGENSI 4.1. Kalijev hidroksid, približno 2 mol/l otopina u etanolu: 130 g kalijevog hidroksida (minimalne koncentracije 85 %) otopi se uz hlađenje u 200 ml destilirane vode i zatim nadopuni etanolom do jedne litre. Otopina se treba čuvati u dobro začepljenoj boci od tamnog stakla. 4.2. Dietilni eter, analitičke čistoće. 4.3. Bezvodni natrijev sulfat, analitičke čistoće. 4.4. Staklene ploče sa slojem silikagela, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 ml (na tržištu su dostupne ploče spremne za uporabu). 4.5. Kalijev hidroksid, približno 0,2 mol/l otopina u etanolu: 13 g kalijevog hidroksida otopi se u 20 ml destilirane vode i zatim nadopuni etanolom do jedne litre. 4.6. Benzen, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.). 4.7. Aceton, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.). 4.8. Heksan, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.). 4.9. Dietilni eter, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.). 4.10. Kloroform, za kromatografiju. 4.11. Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: kolesterol ili fitosteroli, 5 %-tna otopina u kloroformu. 4.12. 0,2 %-tna otopina 2’,7’-diklorfluoresceina u etanolu. Može se učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 mol/l kalijevog hidroksida. 4.13. Bezvodni piridin, za kromatografiju. 4.14. Heksametildisilazan. 4.15. Trimetilklorosilan. 4.16. Standardne otopine trimetilsilil etera alifatskih alkohola od C20 do C28. Mogu se pripremiti iz mješavina čistih alkohola, neposredno prije upotrebe. 4.17. 0,1 %-tna (m/v) otopina 1-eikosanola u kloroformu (interni standard). 4.18. Plin nosač: vodik ili helij, kromatografske čistoće. 4.19. Pomoćni plin: dušik, kromatografske čistoće. 5. POSTUPAK 5.1. Priprava neosapunjive tvari 5.1.1. Pomoću mikroštrcaljke od 500 μl u tikvicu okruglog dna volumena 250 ml ubrizgati volumen 0,1 %-tne otopine 1-eikosanola u kloroformu (4.17.), koji sadrži udio 1-eikosanola približno jednak 10 % sadržaja alifatskih alkohola u dijelu uzorka koji se uzima za analizu. Na primjer, za 5 g uzorka dodaje se 250 μl 0,1 %-tne otopine 1-eikosanola u slučaju maslinovog ulja i 1 500 μl u slučaju ulja komine maslina. Upariti do suha u struji dušika i zatim izvagati točno 5 g suhog filtriranog uzorka u istu tikvicu. 5.1.2. Dodati 50 ml 2 mol/l otopine kalij hidroksida u etanolu, pričvrstiti povratno hladilo i zagrijavati na parnoj kupelji do točke slabog vrenja, uz neprekidno miješanje tijekom zagrijavanja, dok se ne završi saponifikacija (otopina postaje bistra). Zagrijavanje nastaviti još sljedećih 20 minuta i zatim kroz hladilo dodati 50 ml destilirane vode. Hladilo se zatim odvoji i tikvica ohladi na približno 30 °C. 5.1.3. Sadržaj tikvice kvantitativno prenijeti u lijevak za odjeljivanje volumena 500 ml dodajući destiliranu vodu nekoliko puta, tako da se ukupno doda približno 50 ml destilirane vode. Dodati približno 80 ml dietilnog etera, snažno tresti približno 30 sekundi i odložiti da se slegne (bilješka 1). Odvojiti donju vodenu fazu sakupljajući je u drugom lijevku za odjeljivanje. Na vodenoj fazi na isti se način provode daljnje dvije ekstrakcije, uz korištenje 60 do 70 ml dietilnog etera za svaku. Bilješka 1: Ako se stvori emulzija, može se ukloniti prskanjem malim količinama etanola ili metanola. 5.1.4. Ekstrakte dietilnog etera miješati u lijevku za odjeljivanje i isprati destiliranom vodom (po 50 ml) dok voda kojom se ispiralo ne pokaže neutralnu reakciju. Vodu od ispiranja odbaciti, a eter-fazu osušiti bezvodnim natrijevim sulfatom i profiltrirati u prethodno izvaganu tikvicu volumena 250 ml, uz ispiranje lijevka i filtra malim količinama dietilnog etera koje se dodaju na ukupnu količinu. 5.1.5. Eter destilirati do volumena od nekoliko ml te zatim sušiti pod blagim vakuumom ili pod strujom dušika, sušenje se završava u peći na 100 °C približno četvrt sata te zatim važe nakon hlađenja u eksikatoru. 5.2. Odjeljivanje alkoholnih frakcija 5.2.1. Priprema osnovnih ploča za tankoslojnu kromatografiju: silikagel ploče (4.4) potpuno se uranjaju u otopinu kalijevog hidroksida, koncentracije 0,2 mol/l (4.5.), na 10 sekundi te zatim ostave da se suše dva sata u digestoru i konačno stave u peć na 100 °C sat vremena. Ploče se izvade iz peći i pohranjuju u eksikator s kalcijevim kloridom do upotrebe (ploče obrađene na ovaj način moraju se upotrijebiti u roku od 15 dana). Bilješka 2: Kada se koriste osnovne silikagel ploče za odvajanje alkoholnih frakcija, nije potrebno tretirati neosapunjive tvari aluminijevim oksidom. Na taj se način svi kiseli sastojci (masne kiseline i drugi) zadržavaju na početku, čime se dobiva vrpca alifatskog alkohola i vrpca terpenskog alkohola, a obje se značajno razlikuju od vrpce sterola. 5.2.2. U komoru za razvijanje ploča unijeti mješavinu heksana i dietilnog etera u volumenom omjeru 65/35 (v/v), do razine od približno 1 cm (*). Komora se zatvara odgovarajućim poklopcem i ostavlja pola sata kako bi se uspostavila ravnoteža između pare i tekućine. Trake filtar-papira namočene u eluens mogu se pričvrstiti na unutarnju površinu komore kako bi se skratilo vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobila jednoličnija, pravilna eluacija komponenata. Bilješka 3: Otopina za razvijanje mora se zamijeniti za svaku analizu kako bi se postigli ponovljivi uvjeti razvijanja. 5.2.3. Pripremi se približno 5 %-tna otopina neosapunjivih tvari (5.1.5) u kloroformu i, pomoću mikroštrcaljke od 100 μl, nanese 0,3 ml te otopine u što tanjoj i jednoličnijoj liniji na TLC ploču približno 2 cm od donjeg ruba TLC ploče. U ravnini originalnog sloja, nanosi se 2 do 3 μl referentne otopine alifatskih alkohola (4.11.) radi identificiranja vrpce alifatskog alkohola nakon završetka razvijanja. 5.2.4. Ploča se smjesti u komoru za razvijanje pripremljenu kako je opisano u 5.2.2. Temperaturu okoliša treba održavati između 15 i 20 °C. Komora se odmah zatvara poklopcem i ostavi da eluira dok prednji dio otapala ne dosegne približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim izvadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja neko vrijeme u digestoru. 5.2.5. Ploča se blago i jednoliko pošprica otopinom 2’,7’-diklorfluoresceina kad se promatra pod ultraljubičastim svjetlom. Vrpca alifatskih alkohola može se identificirati usporedbom sa slojem dobivenim od referentne otopine: rubovi trake označe se crnom olovkom; označavajući zajedno vrpcu alifatskih alkohola i vrpcu terpenskih alkohola neposredno iznad nje. Bilješka 4: Vrpce alifatskih alkohola i terpenskih alkohola uzimaju se zajedno zbog mogućih migracija nekih alifatskih alkohola u vrpcu triterpenskih alkohola. 5.2.6. Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se pomoću metalne spatule. Tako dobiveni fino usitnjeni materijal unosi se u lijevak za filtriranje (3.7.). Dodaje se 10 ml vrućeg kloroforma, pažljivo izmiješa metalnom spatulom i filtrira pod vakuumom, skupljajući filtrat u vakuumsku tikvicu (3.8.) spojenu na lijevak za filtriranje. Ostatak u tikvici ispere se tri puta dietilnim eterom (približno 10 ml svaki put), skupljajući filtrat u istu tikvicu spojenu na lijevak. Filtrat se isparuje do volumena od 4 do 5 ml, preostala se otopina prenosi u prethodno izvaganu epruvetu volumena 10 ml (3.9.), suši se laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika, otapa se s nekoliko kapi acetona, ponovo suši, stavlja se u peć na 105 °C približno 10 minuta, ostavlja se da se ohladi u eksikatoru i važe. Ostatak u epruveti sastoji se od alkoholne frakcije. 5.3. Pripremanje trimetilsilil etera 5.3.1. Reagens za silaniziranje, koji se sastoji od mješavine piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana u volumnom omjeru 9:3:1 (v/v/v) (bilješka 5.), u omjeru od po 50 μl na svaki miligram alifatskih alkohola, dodaje se u epruvetu koja sadrži alkoholnu frakciju, tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (bilješka 6). Bilješka 5: Otopine spremne za uporabu dostupne su u slobodnoj trgovini. Također su dostupni drugi reagensi za silaniziranje kao što su npr. bis-trimetilsililtrifluoracetamid + 1 % trimetil klorosila, za miješanje s jednakim volumenom bezvodnog piridina. Bilješka 6: Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće utjecati na rezultat. Stvaranje bijelog flokulata ili pojava ružičastog obojenja upućuju na prisutnost vlage ili propadanje reagensa. U tom slučaju ispitivanje treba ponoviti. 5.3.2. Epruvetu treba začepiti i pažljivo protresti (bez preokretanja) dok se alifatski alkoholi potpuno ne otope. Ostavi se da stoji najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi i zatim centrifugira nekoliko minuta. Bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom. 5.4. Analiza plinskim kromatografom 5.4.1. Preliminarni postupci, punjenje kolone 5.4.1.1. Kolona se učvrsti u plinski kromatograf, priključujući početak kolone na injektor spojen sa sustavom razdvajanja, a kraj kolone na detektor. Provesti opću provjeru sklopa plinskog kromatografa (čvrstoću spoja (brtvljenja) plinskih priključaka, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava razdvajanja i sustava za bilježenje itd.). 5.4.1.2. Ako se kapilarna kolona koristi prvi put, preporučuje se da ju se podvrgne kondicioniranju. Kroz kapilarnu kolonu pusti se da proteče malo plina nosača, a zatim se sklop plinskog kromatografa uključi i postupno ga se zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (vidjeti bilješku 7.). Ta se temperatura treba održavati ne kraće od dva sata, zatim se sklop dovede na radne uvjete (reguliranje protoka plina, paljenje plamena dijeljenja, spoj na elektronički uređaj za bilježenje, prilagođavanje temperature komore (peći) kapilarne kolone, detektor i injektor, i tako dalje), a signal se prilagođava na osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od najviše razine predviđene za provođenje analize. Bazna linija za praćenje treba biti linearna, bez pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da spojevi kolone nisu savršeno čvrsti (zabrtvljeni), dok pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije dostatno kondicionirana. Napomena 7: Temperatura kondicioniranja mora biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature predviđene za primijenjenu tekuću fazu. 5.4.2. Odabir radnih uvjeta 5.4.2.1. Opći radni uvjeti su sljedeći: — temperatura kolone: inicijalna izoterma postavlja se na 180 °C osam minuta, a zatim se programira na povećanje od 5 °C/min dok ne dosegne 260 °C i daljnjih 15 minuta pri 260 °C, — temperatura isparivača: 280 °C — temperatura detektora: 290 °C — linearna brzina plina nosača: helij 20 do 35 cm/s, vodik 30 do 50 cm/s, — omjer razdvajanja: 1:50 do 1:100, — osjetljivost instrumenta: 4 do 16 puta veća od minimalne atenuacije, — osjetljivost bilježenja: 1 do 2 mV pune skale, — brzina papira: 30 do 60 cm/h, — količina injektirane tvari: 0,5 do 1 μl TMSE otopine, Gore navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu s karakteristikama kolone i plinskog kromatografa kako bi se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim uvjetima: — retencijsko vrijeme alkohola C26 treba biti 18 ± 5 minuta, — pik alkohola C22 treba biti 80 ± 20 % vrijednosti pune skale za maslinovo ulje, odnosno 40 ± 20 % vrijednosti pune skale za sjemensko ulje. 5.4.2.2. Gore navedeni zahtjevi provjeravaju se ponovljenim injektiranjem standardne TMSE mješavine alkohola i radni uvjeti se prilagođavaju kako bi se postigli najbolji mogući rezultati. 5.4.2.3. Parametri za integriranje pikova određuju se na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira. 5.4.3. Postupak analize 5.4.3.1. Korištenjem mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl heksana, za kojim slijedi 0,5 μl zraka, a nakon toga 0,5 do 1 μl otopine uzorka. Pritom klip mikroštrcaljke treba podignuti da bi se igla ispraznila. Igla se uvodi kroz membranu sklopa za injektiranje; nakon jedne do dvije sekunde otopina se brzo injektira, a nakon približno pet sekundi igla se polako izvlači. 5.4.3.2. Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE prisutnih alifatskih alkohola u potpunosti ne eluira. Bazna linija treba u svakom trenutku odgovarati zahtjevima točke 5.4.1.2. 5.4.4. Identificiranje pikova Identificiranje pojedinačnih pikova provodi se u skladu s retencijskim vremenima i uspoređivanjem sa standardnom TMSE mješavinom koja se analizira pri jednakim uvjetima. Kromatogram alkoholne frakcije djevičanskog maslinovog ulja prikazan je na slici 1. 5.4.5. Kvantitativna ocjena 5.4.5.1. Površine pikova 1-eikosanola i alifatskih alkohola C22, C24, C26 i C28 izračunavaju se elektroničkom integracijom. 5.4.5.2. Sadržaj svakog alifatskog alkohola, iskazan u mg/1 000 g masne tvari, izračunava se kako slijedi: pri čemu je: Ax= površina pika alkohola x As= površina 1-eikosanola ms= masa 1-eikosanola u miligramima m= masa uzorka u gramima 6. IZRAŽAVANJE REZULTATA Iskazuje se sadržaj pojedinih alifatskih alkohola u mg/1 000 g masne tvari i zbroj „ukupnih alifatskih alkohola”. DODATAK Određivanje linearne brzine plina U plinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se 1 do 3 μl metana ili propana i zatim se zapornom urom mjeri vrijeme koje je metanu ili propanu potrebno da proteče kroz kolonu od trenutka injektiranja do trenutka eluacije (razvijanja) pika (tM). Linearna brzina u cm/s zadana je s L/tM, gdje je L duljina kolone u cm, a tM izmjereno vrijeme u sekundama. 1= eikozanol 2= dekozanol 3= trikozanol 4= tetrakozanol 5= pentakozanol 6= heksakozanol 7= heptakozanol 8= oktakozanol ”