PRILOG I.

Postupak za provođenje testova u skladu s člancima 3., 4., 5., 7. i 8.

1. OPĆA NAČELA O PRISUTNOSTI NAVEDENOG ŠTETNOG ORGANIZMA

1.1. Na prisutnost navedenog štetnog organizma sumnja se ako se dobije pozitivan rezultat prvim testom za otkrivanje provedenim na navedenom bilju. Za simptomatski biljni materijal prvi test za otkrivanje može biti selektivno izdvajanje.

1.2. Prisutnost navedenog štetnog organizma na simptomatskim uzorcima navedenog bilja potvrđuje se u sljedećim slučajevima: (a) ako je prvi test za otkrivanje selektivno izdvajanje koje rezultira kolonijama tipične morfologije: pozitivni rezultati dobiveni su dvama identifikacijskim testovima; (b) ako prvi test za otkrivanje nije selektivno izdvajanje: i. pozitivni rezultati dobiveni su dvama identifikacijskim testovima nakon podvrgavanja uzorka selektivnom izdvajanju; ii. pozitivni rezultati dobiveni su drugim testom za otkrivanje koji nije selektivno izdvajanje.

1.3. Prisutnost navedenog štetnog organizma na asimptomatskim uzorcima navedenog bilja potvrđuje se u sljedećim slučajevima: (a) ako se drugim testom za otkrivanje dobije pozitivan rezultat, pod uvjetom da je prvi ili drugi test za otkrivanje molekularni test (temelji se na DNA analizi) (PCR test TaqMan® u stvarnom vremenu ili konvencionalni PCR test); (b) za uzorke uzete u državi članici ili na području države članice za koje nije poznato da se u njima pojavljuje navedeni štetni organizam te za uzorke koji potječu iz druge države članice: ako se drugim testom za otkrivanje dobije pozitivan rezultat u skladu s točkom (a) i ako se dvama identifikacijskim testovima provedenima nakon podvrgavanja uzorka selektivnom izdvajanju dobiju pozitivni rezultati.

2. TESTOVI

2.1. Testovi za otkrivanje

Testovi za otkrivanje moraju biti takvi da se njima dosljedno otkriva najmanje 104 stanica/ml resuspendiranog taloga.

Drugi test za otkrivanje temelji se na drukčijim biološkim načelima ili drukčijim nukleotidnim regijama od prvog testa za otkrivanje.

Testovi za otkrivanje su sljedeći:

(a) testovi imunofluorescencije opisani u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(b) test FISH (van Beuningen et al. (1995.) (1), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(c) izdvajanje, kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama. Upotrebljava se jedna od dviju mogućnosti: i. izravno izdvajanje na poluselektivnoj (ili neselektivnoj) hranjivoj podlozi, kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama; ii. izdvajanje, nakon obogaćivanja biotestom, kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(d) konvencionalni PCR test uz upotrebu početnica (Pastrik, 2000.) (2), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(e) PCR testovi TaqMan® u stvarnom vremenu uz upotrebu početnica i proba koje su opisali: i. Schaad et al. (1999.) (3), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; ii. Vreeburg et al. (2018.) (4) (takozvani test NYtor), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iii. Gudmestad et al. (2009.), kako su ga prilagodili Vreeburg et al. (2018.)4, kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iv. Massart et al. (2014.) (5), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

2.2. Identifikacijski testovi

Identifikacijski testovi su sljedeći:

(a) test imunofluorescencije kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(b) konvencionalni PCR test (Pastrik (2000.)), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(c) PCR testovi TaqMan® u stvarnom vremenu uz upotrebu početnica i proba koje su opisali: i. Schaad et al. (1999.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; ii. Vreeburg et al. (2018.) (takozvani test NYtor), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iii. Gudmestad et al. (2009.), kako su ga prilagodili Vreeburg et al. (2018.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iv. Massart et al. (2014.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(d) DNA barkodiranje, kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011.) (6), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama.

3. DIJAGRAMI POSTUPAKA

Dijagram br. 1: Dijagnostički postupak za utvrđivanje prisutnosti navedenog štetnog organizma u simptomatskim uzorcima navedenog bilja.

a Izdvajanje se može primijeniti kao prvi ili drugi test za otkrivanje. Ako se sumnja na prisutnost navedenog štetnog organizma na hranjivoj podlozi, kolonije se pročišćavaju kako bi se dobile čiste kulture na kojima se provode dva identifikacijska testa. Za potvrdu prisutnosti štetnog organizma rezultati obaju identifikacijskih testova moraju biti pozitivni.

b Treći test za otkrivanje temelji se na drukčijim biološkim načelima ili drukčijim nukleotidnim regijama.

Dijagram br. 2: Dijagnostički postupak za utvrđivanje prisutnosti navedenog štetnog organizma u asimptomatskim uzorcima navedenog bilja.

a Ne provodi se izdvajanje.

b Treći test za otkrivanje temelji se na drukčijim biološkim načelima ili drukčijim nukleotidnim regijama. Ne provodi se izdvajanje.

c Kad je riječ o uzorcima iz točke 1.3. podtočke (b), za potvrđivanje prisutnosti navedenog štetnog organizma nakon drugog pozitivnog testa za otkrivanje potrebno je provesti izdvajanje navedenog štetnog organizma iz uzorka, nakon čega su potrebna dva pozitivna identifikacijska testa.

4. PRIPREMA UZORKA

4.1. Uzorci asimptomatskih gomolja

Standardni uzorak sadržava 200 gomolja po testu. Odgovarajući laboratorijski postupak za obradu jezgara stolona radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma opisan je u međunarodnim dijagnostičkim normama.

4.2. Uzorci asimptomatskog biljnog materijala osim gomolja

Otkrivanje latentnih zaraza provodi se na kompozitnim uzorcima dijelova stabljike. Postupak se može primijeniti na najviše 200 dijelova stabljike različitih biljaka u jednom uzorku. Odgovarajući laboratorijski postupak za dezinficiranje i obradu dijelova stabljike radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma opisan je u međunarodnim dijagnostičkim normama.

4.3. Uzorci simptomatskog navedenog bilja

Dijelovi tkiva aseptično se uklanjaju iz žilnog prstena u gomolju ili iz žilnih snopića stabljike navedenog bilja koje pokazuje simptome venuća. Odgovarajući laboratorijski postupak za obradu tih tkiva radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma detaljno je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995.). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, str. 266.–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000.). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology 106, str. 155.–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D. (1999.). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, str. 1095.–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018.). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, str. 86.–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M. H. (2014.). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, str. 29.–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011.). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, str. 400.–407. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.