PRILOG I.

Metode testiranja za otkrivanje i identifikaciju navedenog štetnog organizma iz članka 3. stavka 2.

1. Testiranje s pomoću spora

Za otkrivanje i identifikaciju upotrebljavaju se ljetni sporangiji i mirujuće spore, koji se dobivaju iz tla nakon prosijavanja ili izravno iz biljnog materijala.

2. Metode otkrivanja

Za ekstrakciju spora navedenog štetnog organizma iz tla primjenjuje se jedna od sljedećih metoda:

(a) metoda prosijavanja tla, kako je opisana u Pratt (1976.) (1);

(b) metoda prosijavanja tla, kako je opisana u van Leeuwen et al. (2005.) (2);

(c) tehnika zonalne centrifuge za obradu velike količine uzoraka, kako je opisana u Wander et al. (2007.) (3).

3. Metode identifikacije

Nakon ekstrakcije spore navedenog štetnog organizma identificiraju se jednom od sljedećih metoda:

(a) morfološka identifikacija pod svjetlosnim mikroskopom pri povećanju od 100x do 400x;

(b) konvencionalni PCR test u kojem se upotrebljavaju početnice prema Lévesque et al. (2001.) (4) i van den Boogert et al. (2005.) (5);

(c) PCR testovi u stvarnom vremenu s pomoću početnica i proba prema Gent-Pelzer et al. (2010.) (6);

(d) PCR testovi u stvarnom vremenu s pomoću početnica i proba prema Smith et al. (2014.) (7).

4. Vijabilnost mirujućih spora

Vijabilnost mirujućih spora može se odrediti mikroskopskim pregledom ili biotestom. Vijabilnost sporangija može se odrediti mikroskopskim pregledom sporangija stavljenog u laktofenol ili u vodu (Przetakiewicz 2015.) (8). Sporangiji s granuliranim sadržajem ili blago zaokruženom protoplazmom mogu se smatrati vijabilnima. Oni koji su trajno plazmolizirani ili bez vidljivog sadržaja smatraju se mrtvima.

Kao alternativa ili u slučaju sumnje može se provesti biotest, kako je opisano u točki 3. Priloga IV.

5. Određivanje patotipova

Za određivanje patotipova potrebni su svježi tumori.

Inokulum za testiranje proizvodi se jednom od sljedećih metoda:

(a) metoda SASA-e (Science and Advice for Scottish Agriculture) koja se sastoji od sljedeća dva koraka: i. proizvodnja inokuluma Staro (smeđe) tumorsko tkivo usitnjava se i suši na zraku na sobnoj temperaturi dok ne postane tvrdo. Tvrdo tkivo se melje, ručno ili mehanički. Mljeveni materijal prosijava se suhom metodom, prikuplja se frakcija između 25 i 75 μm, a zatim se ekstrahira kloroformnom Prattovom metodom (1976.)1; ii. proizvodnja svježih tumora Približno 10 mg ekstrahiranih mirujućih spora raspršuje se na površinu 10 ml sterilne destilirane vode u maloj plastičnoj petrijevoj zdjelici i inkubira na mračnom mjestu na 20 °C do klijanja. Gomolji krumpira s malim klicama duljine oko 1–2 mm stavljaju se u prozirne plastične kutije obložene vlažnim upijajućim papirom s označenim klicama okrenutima prema gore. Oko klica se injekcijom s otopljenim vazelinom oblikuje prsten. Prsten mora biti neprekinut i dovoljno visok da drži suspenziju spora bez propuštanja. Sterilnom vodom 10 ml klijajućih mirujućih spora razrijedi se dok se ne dobije 20 ml, što se potom stavlja u prstene s pomoću pipete ili boce štrcaljke dok klica ne bude potpuno potopljena u suspenziju spora. Plastične kutije prekrivaju se poklopcem i inkubiraju četiri dana na temperaturi od 10 °C, nakon čega se kutije otvaraju, uklanjaju se inokulum i prsteni od vazelina, a kutije se premještaju u staklenik sa sustavom orošavanja na temperaturi od 15 do 18 °C (16 sati svjetlosti);

(b) metoda prema Spiekermann i Kothoff (1924.) (9);

(c) metoda prema Potoček et al. (1991.) (10);

(d) metoda prema Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925. (11); Lemmerzahl 1930. (12); Noble and Glynne 1970. (13)).

Za određivanje svih patotipova za koje je poznato da su relevantni za Uniju (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) i 38(Nevşehir)) primjenjuje se diferencijalni test na zarazu s raznim sortama navedenog bilja kako je navedeno u tablici. Test na zarazu provodi se u skladu s protokolom iz točke (d) (metoda Glynne-Lemmerzahl).

Selektivna osjetljivost kultivara krumpira za određivanje patotipova štetnog organizma S. endobioticum

Kultivar Patotipovi štetnog organizma S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S”: osjetljivo „R”: otporno *: upućuje na slabu osjetljivost sorte na S. endobioticum („prisutnost nenekrotičnih nakupina sorusa bez formacije tumora”).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of. Annals of Applied Biology 82: str. 21.–29.

(2) Van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: str. 25.–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: str. 165.–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001.). Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: str. 200.–201.

(5) Van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: str. 47.–57.

(6) Van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: str. 129.–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil). Phytopathology 104: str. 422.–432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. Vijabilnost zimskih sporangija štetnog organizma Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92: str. 704.–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: str. 114.–115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: str. 191.–205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: str. 34.–60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: str. 288.–297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: str. 125.–135.