„PRILOG XVII.:

METODA ZA ODREĐIVANJE STIGMASTADIENA U BILJNIM ULJIMA

1. CILJ

Određivanje stigmastadiena u biljnim uljima koja sadrže niske koncentracije tih ugljikovodika, posebno u djevičanskom maslinovom ulju i sirovom ulju komine maslina.

2. OPSEG

Taj se standard može primijeniti na sva biljna ulja, iako su mjerenja pouzdana samo u slučaju kada sadržaj tih ugljikovodika iznosi od 0,01 do 4,0 mg/kg. Ta je metoda posebno primjerena za otkrivanje prisutnosti rafiniranih biljnih ulja (maslinovog, ulja komine maslina, suncokretovog, palminog itd.) u djevičanskom maslinovom ulju budući da rafinirana ulja sadrže stigmastadiene, za razliku od djevičanskih ulja.

3. PRINCIP

Izdvajanje neosapunjive tvari. Odvajanje frakcije steroidalnih ugljikovodika kromatografijom na koloni sa silika-gelom i analiza kapilarnom plinskom kromatografijom.

4. OPREMA

4.1. Tikvica volumena 250 ml za uporabu s povratnim hladilom.

4.2. Lijevci za odjeljivanje volumena 500 ml.

4.3. Tikvica okruglog dna volumena 100 ml.

4.4. Rotirajući isparivač

4.5. Staklena kromatografska kolona (unutarnjega promjera 1,5 do 2,0 cm i dužine 50 cm) s teflonskim ventilom i zatvaračem od staklene vune ili pločicom od sinter-stakla na dnu. Za pripremu kolone sa silika-gelom u kromatografsku kolonu treba uliti heksan do razine od 5 cm od dna te napuniti emulzijom silika-gela u heksanu (15 g u 40 ml) uz pomoć dodatka heksana. Pričekati da se staloži te primjenom laganih vibracija dovršiti taloženje. Dodati bezvodni natrijev sulfat do razine od približno 0,5 cm i konačno eluirati višak heksana.

4.6. Plinski kromatograf s plameno-ionizacijskim detektorom, injektor s dijeljenjem uzorka ili injektorom koji omogućava izravno ubrizgavanje na početak (hladne) kolone (cold on-column) i peći s mogućnošću podešavanja temperature na ± 1 °C.

4.7. Kvarcna kapilarna kolona za plinsku kromatografiju (unutarnjega promjera 0,25 ili 0,35 mm i dužine 25 m) obložena s 5 %-tnom fenilmetilsilikonskom fazom debljine sloja od 0,25 mm.

Napomena 1.:

Mogu se upotrijebiti i druge kolone slične ili niže polarnosti.

4.8. Snimač-integrator s mogućnošću uporabe integracijskoga načina dolina-dolina (valley-valley).

4.9. Mirkoštrcaljka od 5 do 10 ml za plinsku kromatografiju s neodvojivom iglom.

4.10. Električni pokrivač ili grijaća ploča.

5. REAGENSI

Svi reagensi trebaju biti analitičke kvalitete, osim ako je drukčije određeno. Voda koja se koristi treba biti destilirana ili barem jednake čistoće.

5.1. Heksan ili smjesa alkana intervala vrelišta od 65 do 70 °C, destilirani s kolonom za ispravljanje.

Napomena 2.:

Otapalo se mora destilirati kako bi se odstranile nečistoće.

5.2. 96 %-tni v/v etanol.

5.3. Bezvodni natrijev sulfat

5.4. 10 %-tna alkoholna otopina kalijevoga hidroksida. Dodati 10 ml vode u 50 g kalijevoga hidroksida, promiješati, a zatim tu smjesu otopiti u etanolu tako da ukupni volumen bude 500 ml.

Napomena 3.:

Alkoholna otopina kalijevog hidroksida stajanjem posmeđi. Treba se svakodnevno pripremati iznova te je treba čuvati u dobro zatvorenim bocama od tamnoga stakla.

5.5. Silika-gel 60 za kromatografiju na koloni, 70 do 230 mesh, (Merck, referenca 7734 ili slično).

Napomena 4.:

Silika-gel se obično može izravno upotrebljavati bez ikakve obrade. Međutim, određene serije silika-gela mogu imati nisku aktivnost te time uzrokovati slabije kromatografsko odvajanje. U tim okolnostima silika-gel treba obraditi na sljedeći način: aktivirati silika-gel zagrijavanjem na 550 °C najmanje četiri sata. Nakon zagrijavanja staviti silika-gel u eksikator dok se hladi, a zatim ga premjestiti u začepljenu tikvicu. Dodati 2 % vode i protresti smjesu sve dok u njoj više nema vidljivih grudica i ona postane sipka.

U slučaju da serije silika-gela uzrokuju kromatograme s pikovima koji se preklapaju, silika-gel treba obraditi na gore navedeni način. Alternativa bi mogla biti uporaba ekstra čistog silika-gela 60 (Merck, referenca 7754).

5.6. Ishodišna otopina (200 ppm) kolesta-3,5-diena (Sigma, 99 %-tne čistoće) u heksanu (10 mg u 50 ml).

5.7. Standardna otopina kolesta-3,5-diena u heksanu koncentracije 20 ppm, dobivena razrjeđivanjem gore navedene otopine.

Napomena 5.:

Otopine pod 5.6 i 5.7. stabilne su najmanje četiri mjeseca ako se čuvaju na temperaturi nižoj od 4 °C.

5.8. Otopina n-nonakozana u heksanu približne koncentracije 100 ppm.

5.9. Plin nosač za kromatografiju: helij ili vodik 99,9990 %-tne čistoće.

5.10. Pomoćni plinovi za plameno-ionizacijski detektor: vodik 99,9990 %-tne čistoće i pročišćeni zrak.

6. POSTUPAK

6.1. Priprema neosapunjive tvari

6.1.1. Izvagati 20 ± 0,1 g ulja u tikvicu od 250 ml (4.1.), dodati 1 ml standardne otopine kolesta-3,5-diena (20 μg) i 75 ml alkoholne otopine kalijevog hidroksida koncentracije 10 %, postaviti na povratno hladilo i zagrijati na lagano vrenje 30 minuta. Odvojiti tikvicu s uzorkom od izvora topline i pustiti otopinu da se lagano ohladi (ne smije se potpuno ohladiti jer će se uzorak staložiti). Dodati 100 ml vode i otopinu uz pomoć 100 ml heksana preliti u lijevak za odjeljivanje (4.2.). Smjesu snažno tresti 30 sekundi i ostaviti da se odvoji.

Napomena 6.:

Ako se pojavi emulzija koja brzo ne nestane, dodati malu količinu etanola.

6.1.2. Premjestiti donju vodenu fazu u drugi lijevak za odjeljivanje i opet je ekstrahirati s 100 ml heksana. Vodenu fazu još jednom odliti i tri puta isprati heksanske ekstrakte (pomiješane u još jednom lijevku za odjeljivanje), svaki put sa 100 ml smjese vode i etanola (1:1), dok se ne postigne neutralni pH faktor.

6.1.3. Heksansku otopinu preliti preko bezvodnog natrijevog sulfata (50 g), isprati s 20 ml heksana i heksan ispariti u rotirajućem isparivaču na 30 °C pod sniženim tlakom dok se ne osuši.

6.2. Odvajanje frakcije steroidalnih ugljikovodika

6.2.1. Taj talog prenijeti na kolonu za frakcije dodavanjem dva puta po 1 ml heksana, pustiti da se razina otopine spusti na vrh natrijevog sulfata kako bi se dobio uzorak na koloni te započeti kromatografsku eluciju s heksanom protoka od približno 1 ml/min. Zanemariti prvih 25 do 30 ml eluata i zatim skupiti sljedećih 40 ml frakcije. Nakon prikupljanja frakciju premjestiti u tikvicu okruglog dna volumena 100 ml (4.3.).

Napomena 7.:

Prva frakcija sadrži zasićene ugljikovodike (slika 1 a), a druga frakcija steroidne ugljikovodike. Daljnjom se elucijom dobivaju skvalen i skvalenu srodni spojevi. Kako bi se postiglo dobro odvajanje zasićenih od steroidnih ugljikovodika potrebna je optimizacija frakcijskih volumena. Radi toga, volumen prve frakcije treba biti tako podešen da pri analizi druge frakcije pikovi koji predstavljaju zasićene ugljikovodike budu niski (pogledati sliku 1 c); ako se ne pojave, ali intenzitet standardnog pika bude nizak, volumen treba smanjiti. Uostalom, potpuno odvajanje sastojaka prve i druge frakcije nije potrebno; budući da se pikovi u analizi plinskom kromatografijom ne preklapaju ako se uvjeti plinske kromatografije prilagode kako je navedeno pod 6.3.1. Optimiranje volumena druge frakcije općenito nije potrebno budući da postoji dobro odvajanje kod daljnjih sastojaka. Ipak, prisutnost velikog pika s otprilike 1,5 minuta kraćim retencijskim vremenom od standardnog nastaje zbog skvalena i ukazuje na loše odvajanje.

6.2.2. Ispariti drugu frakciju u rotirajućem isparivaču na 30 °C pod sniženim tlakom dok se ne osuši te nastali talog odmah rastopiti u 0,2 ml heksana. Otopinu do analize čuvati u hladnjaku.

Napomena 8.:

Talozi pod 6.1.3. i 6.2.2. ne smiju se čuvati u suhom stanju niti na sobnoj temperaturi. Čim se dobiju treba im dodati otapalo, a ta se otopina treba čuvati u hladnjaku.

6.3. Plinska kromatografija

6.3.1. Radni uvjeti za injektiranje s razdvajanjem:

— temperatura injektora: 300 °C,

— temperatura detektora: 320 °C,

— snimač-integrator: parametri integracije trebaju biti namješteni tako da omogućuju točnu procjenu područja. Preporučuje se integracijski način dolina-dolina (valley-valley),

— osjetljivost: otprilike 16 puta veća od najmanje atenuacije,

— količina ubrizgane otopine: 1 μl,

— podešavanje temperature peći: početno šest minuta na 235 °C, a zatim temperatura raste za 2 °C/min do 285 °C,

— injektor s razdvojnikom protoka 1: 15,

— plin nosač: helij ili vodik pri tlaku od 120 kPa.

Ti se uvjeti mogu prilagoditi u skladu s karakteristikama kromatografa i kolone da bi se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim zahtjevima: pik unutarnjeg standarda mora se pojaviti u roku od 5 minuta od vremena koje je navedeno pod 6.3.2.; pik unutarnjeg standarda treba dosezati barem 80 % punog raspona.

Sustav plinske kromatografije mora se provjeriti ubrizgavanjem smjese ishodišne otopine kolestadiena i (5.6.) i n-nonakozana (5.8.). Pik kolesta-3,5-diena treba se pojaviti prije pika n-nonakozana (slika 1 c); u slučaju da se to ne dogodi, mogu se poduzeti dvije mjere: sniziti temperaturu peći i/ili upotrijebiti kolonu niže polarnosti.

6.3.2. Identificiranje pikova

Pik unutarnjeg standarda pojavljuje se nakon približno 19 minuta, dok je relativno retencijsko vrijeme 3,5-stigmastadiena 1,29 (vidjeti sliku 1 b). 3,5-stigmastadien pojavljuje se s malim količinama svog izomera te obično zajedno eluiraju kao jedan kromatografski pik. Međutim, ako je kolona previše polarna ili ima visoku razlučivost, izomer se može pojaviti kao mali pik ispred i blizu pika 3,5-stigmastadiena (slika 2). Da bi se osigurala eluacija stigmastadiena kao jednog pika, preporučuje se zamijeniti kolonu onom manje polarnom ili kolonom s većim unutarnjim promjerom.

Napomena 9.:

Stigmastadieni za referencu mogu se dobiti analizom rafiniranog biljnog ulja uz uporabu manje količine uzorka (1 do 2 g). Stigmastadieni tvore istaknut i lako uočljiv pik.

6.3.3. Kvantitativna analiza

Sadržaj se stigmastadiena određuje na temelju formule:

mg/kg stigmastadiena =

gdje je: As = područje stigmastadienskoga pika (ako se pik razdvoji na dva izomera, zbroj područja oba vrha), Ac = područje unutarnjeg standarda (kolestadien), Mc = masa dodanog standarda u mikrogramima, Mo = masa korištenog ulja u gramima.

Granica detekcije: približno 0,01 mg/kg.”