HR Službeni list Europske unije 57

31991R2568



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 11.07.1991.

UREDBA KOMISIJE (EEZ) br. 2568/91

od 11. srpnja 1991.

o karakteristikama maslinovog ulja i ulja komine maslina te o odgovarajućim metodama analize

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske ekonomske zajednice,

uzimajući u obzir Uredbu Vijeća br. 136/66/EEZ od 22. rujna 1966. o osnivanju zajedničke organizacije tržišta ulja i masti (1), kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EEZ) br. 3577/90 (2), a posebno njezin članak 35.a,

budući da Prilog Uredbi br. 136/66/EEZ sadrži opise i definicije maslinovog ulja i ulja komine maslina koje se stavlja na tržište unutar svake države članice, kojima se trguje unutar Zajednice i kojima se trguje s trećim zemljama;

budući da, u smislu međusobnog razlikovanja različitih vrsta ulja, fizikalna i kemijska svojstva svakog od njih kao i organoleptičke karakteristike djevičanskih ulja trebaju biti definirane kako bi se osigurala čistoća i kvaliteta određenog proizvoda, ne dovodeći u pitanje ostale postojeće odredbe;

budući da prisutnost karakteristika različitih vrsta ulja treba odrediti ujednačeno u cijeloj Zajednici; budući da, u tu svrhu, treba ustanoviti metode kemijske analize i organoleptičkog ocjenjivanja Zajednice; budući da, u tranzicijskom razdoblju, trebaju biti dopuštene druge metode analiza koje se primjenjuju u državama članicama, pod uvjetom da u slučaju kad postoji razlika u rezultatima, odlučujućima će se smatrati oni dobiveni korištenjem zajedničke metode;

budući da definiranje fizikalnih i kemijskih karakteristika maslinovog ulja i metoda analize imaju za nužnu posljedicu izradu izmjena dodatnih bilješki uz Poglavlje 15. kombinirane nomenklature;

budući da metode ocjenjivanja organoleptičkih karakteristika djevičanskog ulja uključuju osnivanje komisije odabranih i obučenih organoleptičkih ocjenjivača; budući da razdoblje potrebno za ustanovljavanje takve strukture treba stoga biti fiksno; budući da, s obzirom na poteškoće na koje će neke od država članica naići prilikom uvođenja komisije organoleptičkih ocjenjivača, korištenje tih komisija u drugim državama članicama treba dopustiti;

budući da, radi osiguranja ispravnog funkcioniranja sustava oporezivanja koji se primjenjuje pri uvozu komine maslina, treba postaviti jedinstvenu metodu za određivanje sadržaja ulja u tim proizvodima;

budući da, s ciljem da se ne naškodi trgovini, treba sastaviti odredbe za uklanjanje onih ulja koja su bila zapakirana prije stupanja ove Uredbe na snagu, unutar ograničenog vremenskog razdoblja;

budući da je potrebno staviti izvan snage Uredbu Komisije (EEZ) br. 1058/77 (3), kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EEZ) br. 1858/88 (4);

budući da Upravljački odbor za ulja i masti nije dao svoje mišljenje unutar postavljenog vremenskog roka kojeg je odredio njihov predsjedavajući,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

1. Ulja, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točkama 1., 2. i 3. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati djevičanskim maslinovim uljem u smislu točke 1. podtočaka (a), (b) i (c) Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

2. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 4. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati djevičanskim maslinovim uljem lampante u smislu točke 1. podtočke (d) Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

3. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 5. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati rafiniranim maslinovim uljem u smislu točke 2. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

4. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 6. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati čistim maslinovim uljem u smislu točke 3. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

5. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 7. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati uljem komine maslina u smislu točke 4. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

6. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 8. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati rafiniranim uljem komine maslina u smislu točke 5. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

7. Ulje, čije su karakteristike u skladu s onima postavljenima u točki 9. Priloga I. ovoj Uredbi, treba smatrati uljem komine maslina u smislu točke 6. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

Članak 2.

1. Karakteristike ulja postavljene u Prilogu I. treba odrediti u skladu sa sljedećim metodama analize:

— za određivanje slobodnih masnih kiselina, iskazanih kao postotak oleinske kiseline, metoda postavljena u Prilogu II.,

— za određivanje peroksidnog broja, metoda postavljena u Prilogu III.,

— za određivanje alifatskih alkohola, metoda postavljena u Prilogu IV.,

— za određivanje sadržaja sterola, metoda postavljena u Prilogu V.,

— za određivanje eritrodiola i uvaola, metoda postavljena u Prilogu VI.,

— za određivanje zasićenih masnih kiselina u položaju 2. na trigliceridima, metoda postavljena u Prilogu VII.,

— za određivanje sadržaja trilinoleina, metoda postavljena u Prilogu VIII.,

— za spektrofotometrijsko ispitivanje, metoda postavljena u Prilogu IX.,

— za određivanje sastava masnih kiselina, metoda postavljena u prilozima X.A i X.B,

— za određivanje hlapivih halogeniranih otapala, metoda postavljena u Prilogu XI.,

— za ocjenjivanje organoleptičkih karakteristika djevičanskog maslinovog ulja, metoda postavljena u Prilogu XII.,

— za dokazivanje da je proveden postupak rafiniranja, metoda postavljena u Prilogu XIII.

2. Ocjenjivanje organoleptičkih karakteristika provodi analitičar i, kad je to prikladno, uz pomoć specijalista, u skladu s postupkom opisanim u bilješkama o organoleptičkom ocjenjivanju koje se navode u Prilogu XII. U slučaju kad analiza ukaže na karakteristike koje se razlikuju od onih koje proizlaze iz opisa proizvoda, uzorak treba ispitati komisija organoleptičkih ocjenjivača u skladu s odredbama Priloga XII.

Svaku drugu analizu treba provesti komisija u skladu s navedenim odredbama.

S ciljem potvrđivanja organoleptičkih karakteristika u vezi s djelatnostima koje se odnose na sustav intervencija, komisija organoleptičkih ocjenjivača provest će ovo ocjenjivanje u skladu s odredbama Priloga XII.

Članak 3.

Do 31. listopada 1992. uvođenje analitičkih metoda koje su predviđene u članku 2. neće spriječiti države članice da primjenjuju ostale iskušane i znanstveno valjane metode pod uvjetom da onim proizvodima za koje se utvrdi da su sukladni s pravilima na snazi koja uređuju metode Zajednice bude dopuštena slobodna trgovina. Prije korištenja ostalih metoda države članice koje su posrijedi obavijestit će o njima Komisiju.

U slučaju kad se jednom od ostalih metoda dobije rezultat koji se razlikuje od onih dobivenih metodom Zajednice, odlučujućima će se smatrati rezultati dobiveni metodom Zajednice.

Članak 4.

1. Za potrebe procjene organoleptičkih karakteristika, države članice osnivaju komisije koje se sastoje od obučenih i odabranih organoleptičkih ocjenjivača u skladu s pravilima utvrđenima metodom navedenom u Prilogu XII.

2. U slučaju kad neka država članica naiđe na poteškoće vezane uz osnivanje komisije na svojem državnom području, može se koristiti uslugama komisije koja djeluje u nekoj drugoj državi članici.

Članak 5.

Dodatne bilješke 2., 3. i 4. uz poglavlje 15. kombinirane nomenklature zamjenjuju se onima sadržanima u Prilogu XIV.

Članak 6.

1. Sadržaj ulja u uljnoj pogači i drugim ostacima maslina koje nastaju ekstrakcijom maslinovog ulja (oznake KN 2306 90 11 i 2306 90 19) utvrđuju se primjenom metoda navedenih u Prilogu XV.

2. Sadržaj ulja na koje se odnosi stavak 1. iskazuje se kao postotak težine ulja u odnosu na težinu suhe tvari.

Članak 7.

Primjenjuju se odredbe Zajednice koje se odnose na prisutnost neželjenih tvari, osim onih na koje upućuje Prilog XI.

Članak 8.

1. Države članice obavještavaju Komisiju o mjerama poduzetima s ciljem provedbe ove Uredbe.

2. Države članice trebaju na početku svakog polugodišta poslati Komisiji izjavu o analitičkim podacima koji se odnose na ispitivanja provedena tijekom prethodnog polugodišnjeg razdoblja.

Rezultate razmatra Upravni odbor za ulja i masti u skladu s postupkom utvrđenim u članku 39. Uredbe br. 136/66/EEZ.

Članak 9.

Uredba (EEZ) br. 1058/77 stavlja se izvan snage.

Članak 10.

1. Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europskih zajednica.

Bez obzira na to, metoda navedena u Prilogu XII. Primjenjuje se od 1. siječnja 1992., osim kad su u pitanju djelatnosti vezane uz sustav intervencija.

2. Ova Uredba ne primjenjuje se na maslinova ulja i ulja komine maslina zapakirana prije stupanja ove Uredbe na snagu i stavljena na tržište do 31. listopada 1992.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama. Sastavljeno u Bruxellesu 11. srpnja 1991. Za Komisiju Ray MAC SHARRY Član Komisije

(1) SL L 172, 30.9.1966., str. 3025/66.

(2) SL L 353, 17.12.1990., str. 23.

(3) SL L 128, 24.5.1977., str. 6.

(4) SL L 166, 1.7.1988., str. 10.

PRILOZI

Sadržaj

Prilog I.: Karakteristike maslinovog ulja

Prilog II.: Određivanje slobodnih masnih kiselina

Prilog III.: Određivanje peroksidnog broja

Prilog IV.: Određivanje sadržaja alifatskih alkohola kapilarnom plinskom kromatografijom

Prilog V.: Određivanje sastava i sadržaja sterola kapilarnom plinskom kromatografijom

Prilog VI.: Određivanje eritrodiola i uvaola

Prilog VII.: Određivanje zasićenih masnih kiselina u položaju 2. na trigliceridima

Prilog VIII.: Određivanje sastava trilinoleina

Prilog IX.: Spektrofotometrijsko ispitivanje u ultraljubičastom području

Prilog X.A: Analiza metilnih estera masnih kiselina plinskom kromatografijom

Prilog X.B: Pripremanje metilnih estera masnih kiselina

Prilog XI.: Određivanje hlapivih halogeniranih otapala u maslinovom ulju

Prilog XII.: Organoleptička procjena djevičanskog maslinovog ulja

Prilog XIII.: Dokazivanje da je proveden postupak rafiniranja

Prilog XIV.: Dodatne bilješke 2., 3. i 4. uz poglavlje 15. kombinirane nomenklature

Prilog XV.: Sadržaj ulja u komini maslina

Prilog XVI.: Određivanje jodnog broja

PRILOG I.

KARAKTERISTIKE MASLINOVOG ULJA

Vrsta Kiselost % Peroksidni broj meq/O2/kg Halogenirana otapala mg/kg (1) Alifatski alkoholi mg/kg Zasićene masne kiseline u položaju 2. na trigliceridima % Eritrodiol + uvaol % Trilinolein % Kolesterol % Brasikasterol % Kampesterol % Stigmasterol % Beta-sitosterol % (2) Delta-7-stigmasterol % Ukupno sterola mg/kg 1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje M 1,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000 2. Djevičansko maslinovo ulje M 2,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000 3. Obično djevičansko maslinovo ulje M 3,3 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000 4. Djevičansko maslinovo ulje lampante > 3,3 > 20 > 0,20 M 400 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1000 5. Rafinirano maslinovo ulje M 0,5 M 10 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000 6. Maslinovo ulje M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000 7. Sirovo ulje komine maslina m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500 8. Rafinirano ulje komine maslina M 0,5 M 10 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1800 9. Ulje komine maslina M 1,5 M 15 M 0,20 — M 2,0 > 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1800 M = maksimum, m = minimum Ako je ijedna karakteristika nekog ulja izvan određenih granica, to se ulje ne smije prihvatiti.





Vrsta Sastav kiselina K232 K270 K270 s aluminijevim oksidom(1) Delta K Senzorska ocjena Miristinska % Linolenska % Arahinska % Eikozenska % Behenska % Lignocerinska % 1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 ≥ 6,5 2. Djevičansko maslinovo ulje M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥ 5,5 3. Obično djevičansko maslinovo ulje M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥ 3,5 4. Djevičansko maslinovo ulje lampante M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,70 > 0,25 M 0,11 — < 3,5 5. Rafinirano maslinovo ulje M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 — 6. Maslinovo ulje M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 — 7. Sirovo ulje komine maslina M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 — — — — — 8. Rafinirano ulje komine maslina M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 — 9. Ulje komine maslina M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 — ( 1) U slučaju ulja čija je kiselost (sadržaj slobodnih masnih kiselina) veća od 3,3 %, ako je K270 više od 0,11 nakon prelaska preko aluminijevog oksida, potrebno je provesti ispitivanje rafiniranja na koje upućuje Prilog XIII. Za potrebe utvrđivanja čistoće, u slučaju kad K270 prelazi granicu za kategoriju koja je u pitanju, treba ga ponovno odrediti nakon prelaska preko aluminijevog oksida.

(1) Ukupna gornja granica za sastojke otkrivene detektorom zahvata elektrona. Gornja granica za pojedinačno otkrivene sastojke iznosi 0,10 mg/kg.

(2) Delta-5,23-stigmastadiernol + klerosterol + sitosterol + sitostanol + delta-5-avenosterol + delta-5,24-stigmastadienol.

Bilješka:

Ako je ijedna karakteristika nekog ulja izvan određenih granica, to se ulje ne smije prihvatiti.

PRILOG II.

ODREĐIVANJE SLOBODNIH MASNIH KISELINA

1. ODREĐIVANJE KISELOSTI

Određivanje slobodnih masnih kiselina u maslinovim uljima. Sadržaj slobodnih masnih kiselina iskazuje se kao kiselost izračunata na uobičajeni način.

1.1. Princip

Uzorak se otopi u mješavini otapala i postojeće se slobodne masne kiseline odrede titracijom s otopinom kalijevog hidroksida u etanolu.

1.2. Reagensi

Svi reagensi trebaju biti priznate analitičke kvalitete, a voda koja se koristi treba biti bilo destilirana ili odgovarajuće čistoće.

1.2.1. Dietil eter; 95 % etanol (V/V), mješavina dijelova jednakih po volumenu.

Bilješka: Dietil eter je visoko zapaljiv i može stvoriti eksplozivne perokside. Prilikom njegova korištenja treba biti posebno pažljiv.

Neutralizirati točno u trenutku korištenja otopinom kalijevog hidroksida (1.2.2.) uz dodatak 0,3 ml otopine fenolftaleina (1.2.3.) na 100 ml mješavine.

Bilješka: Ako nije moguće koristiti dietil eter, može se koristiti mješavina otapala koja sadrži etanol i toluen. Ako je potrebno, etanol se može zamijeniti 2-propanolom.

1.2.2. Kalijev hidroksid, titrirana etanolna otopina, c(KOH) približno 0,1 mol/l ili, ako je potrebno, c(KOH) približno 0,5 mol/l.

Neposredno prije korištenja treba biti poznata i provjerena točna koncentracija otopine kalijevog hidroksida u etanolu. Treba koristiti otopinu koja je pripremljena najmanje pet dana prije korištenja i dekantirana u smeđe staklene boce s gumenim čepom. Otopina treba biti bezbojna ili boje slame.

Bilješka: Stabilna bezbojna otopina kalijevog hidroksida može se pripremiti na sljedeći način: zavrite 1 000 ml etanola s 8 g kalijevog hidroksida i 0,5 g aluminijskih strugotina i pustite da vrije pod povratnim hladilom sat vremena. Odmah destilirajte. Otopite potrebnu količinu kalijevog hidroksida u destilatu. Pustite da odstoji nekoliko dana i zatim dekantirajte kako biste odvojili bistru, supernatantnu tekućinu od nataloženog kalijevog karbonata. Otopina se, također, može pripremiti bez destiliranja, na sljedeći način: na 1 000 ml etanola dodajte 4 ml aluminijevog butilata i pustite mješavinu da odstoji nekoliko dana. Dekantiranjem odvojite supernatantnu tekućinu i u njoj otopite potrebnu količinu kalijevog hidroksida. Otopina je spremna za korištenje.

1.2.3. Otopina 10 g/l fenolftaleina u 95 do 96 % etanolu (v/v) ili otopina 20 g/l alkalnog modrila (u slučaju snažno obojenih masnoća) u 95 do 96 % etanolu (volumenski).

1.3. Oprema

Uobičajena laboratorijska oprema, koja uključuje:

1.3.1. analitičku vagu;

1.3.2. Erlenmeyerovu tikvicu volumena 250 ml;

1.3.3. graduiranu biretu volumena 10 ml, s podjelom po 0,05 ml.

1.4. Postupak

1.4.1. Pripremanje uzoraka za ispitivanje

(Ispitivanje treba provoditi na filtriranom uzorku. U slučaju kad vlaga i nečistoća zajedno ne prelaze 1 %, treba koristiti uzorak bez dodatnog obrađivanja; u slučaju kad su veći od 1 %, treba ga filtrirati.)

1.4.2. Uzimanje uzorka

Uzorak treba odabrati ovisno o pretpostavljenom kiselinskom broju u skladu sa sljedećom tablicom:

Očekivani kiselinski broj Masa uzorka (g) Preciznost vaganja (g) < 1 20 0,05 1 do 4 10 0,02 4 do 15 2,5 0,01 15 do 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002

Uzorak treba odvagnuti u Erlenmeyerovoj tikvici (1.3.2.).

1.4.3. Određivanje

Uzorak (1.4.2.) treba otopiti u 50 do 150 ml prethodno neutralizirane mješavine dietil etera i etanola (1.2.1.).

Titrirati uz miješanje 0,1 mol/l otopinom kalijevog hidroksida (1.2.2.) (vidjeti bilješku 2.) dok se ne promijeni boja indikatora (ružičasta boja fenolftaleina treba biti postojana najmanje 10 sekundi).

Bilješka 1. Titrirana otopina kalijevog hidroksida u etanolu (1.2.2.) može se zamijeniti vodenom otopinom kalijevog ili natrijevog hidroksida pod uvjetom da volumen dodane vode ne prouzroči fazno razdvajanje.

Bilješka 2. Ako potrebna količina otopine kalijevog hidroksida od 0,1 mol/l bude veća od 10 ml, treba koristiti otopinu od 0,5 mol/l.

Bilješka 3. Ako otopina tijekom titriranja postane mutna, treba dodati dovoljno otapala (1.2.1.) da bi se dobila bistra otopina.

1.5. Kiselost: iskazana kao postotak oleinske kiseline

Kiselost izražena u težinskim postocima jednaka je:

pri čemu je:

V= volumen otopine kalijevog hidroksida utrošen za titriranje, u mililitrima;

c= točna koncentracija u mol po litri korištene otopine kalijevog hidroksida za titriranje;

M= molarna masa u gramima po molu kiseline korištene za iskazivanje rezultata (= 282);

m= masa uzorka u gramima.

Kao rezultat treba uzeti aritmetički prosjek dvaju provedenih izračuna.

PRILOG III.

ODREĐIVANJE PEROKSIDNOG BROJA

1. OPSEG

Ova norma opisuje metodu za određivanje peroksidnog broja ulja i masti.

2. PODRUČJE PRIMJENE

Ova norma primjenjuje se na ulja i masti životinjskog i biljnog podrijetla.

3. DEFINICIJA

Peroksidni broj je količina onih tvari u uzorku, iskazanih u obliku miliekvivalenata aktivnog kisika na kilogram, koji pod opisanim radnim uvjetima oksidiraju kalijev jodid.

4. PRINCIP

Reakcija ispitivanog dijela uzorka u otopini octene kiseline i kloroforma s otopinom kalijevog jodida. Titriranje oslobođenog joda standardiziranom otopinom natrijevog tiosulfata.

5. OPREMA

Sva oprema koja se koristi ne smije sadržavati tvari koje uzrokuju redukciju ili oksidaciju.

Bilješka: Površinu podloge ne zamastiti.

5.1. Staklena odmjerna posudica volumena 3 ml.

5.2. Tikvice s užim grlom i čepom, volumena približno 250 ml, prethodno osušene i ispunjene čistim, suhim, inertnim plinom (dušikom ili, još bolje, ugljičnim dioksidom).

5.3. Graduirana bireta volumena 25 ili 50 ml, s podjelom po 0,1 ml.

6. REAGENSI

6.1. Kloroform, kvalitete analitičkog reagensa, očišćen od kisika propuhivanjem strujom čistog, suhog inertnog plina.

6.2. Ledena octena kiselina, kvalitete analitičkog reagensa, očišćena od kisika propuhivanjem strujom čistog, suhog inertnog plina.

6.3. Kalijev jodid, zasićena vodena otopina, svježe pripremljena, bez joda i jodata.

6.4. Precizno standardizirana vodena otopina natrijevog tiosulfata 0,01 ili 0,002 mol/l, standardizirana neposredno prije korištenja.

6.5. Škrobna otopina, vodena otopina 10 g/l, svježe pripremljena korištenjem prirodnog topivog škroba.

7. UZORAK

Treba paziti da uzeti uzorak bude pohranjen na tamnom i hladnom mjestu u potpuno ispunjenim staklenim posudama, hermetički zatvorenima staklenim ili plutenim čepovima.

8. POSTUPAK

Ispitivanje treba provesti pri difuznom dnevnom svjetlu ili pod umjetnim svjetlom. U staklenoj odmjernoj posudici (5.1.), ili, ako to ne uspije, u tikvici (5.2.), treba izvagati masu uzorka s preciznošću od 0,001 g, u skladu sa sljedećom tablicom, u skladu s očekivanim peroksidnim brojem:

Očekivani peroksidni broj (meq) Težina ispitivanog dijela uzorka (g) 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

Tikvicu (5.2.) treba odčepiti i u nju staviti staklenu odmjernu posudicu koja sadrži ispitivani dio uzorka. Dodati 10 ml kloroforma (6.1.). Miješanjem brzo otopiti uzorak. Dodati 15 ml octene kiseline (6.2.), zatim 1 ml otopine kalijevog jodida (6.3.). Brzo začepiti, protresti jednu minutu i odložiti da odleži točno pet minuta na tamnom mjestu i na temperaturi između 15 i 25 °C.

Dodati približno 75 ml destilirane vode. Titrirati oslobođeni jod otopinom natrijevog tiosulfata (6.4.) (otopina 0,002 mol/l za očekivane vrijednosti niže od 12 i otopina 0,01 mol/l za očekivane vrijednosti više od 12), snažnim protresanjem uz korištenje škrobne otopine (6.5.) kao indikatora.

Treba provesti dva određivanja na istom uzorku.

Istodobno treba provesti slijepu probu. Ako rezultat slijepe probe prelazi 0,05 ml 0,01 mol/l otopine natrijevog tiosulfata (6.4.), treba zamijeniti onečišćeni reagens.

9. ISKAZIVANJE REZULTATA

Peroksidni broj (PB) iskazan u miliekvivalentima aktivnog kisika na kilogram dan je sljedećom formulom:

pri čemu je:

V= volumen standardizirane otopine natrijevog tiosulfata (6.4.) utrošen za ispitivanje, iskazan u mililitrima, ispravljen rezultatom za slijepu probu;

T= točna molarnost korištene otopine natrijevog tiosulfata (6.4.);

m= masa ispitivanog dijela uzorka u gramima.

Kao rezultat treba uzeti aritmetički prosjek dvaju provedenih određivanja.

PRILOG IV.

ODREĐIVANJE SADRŽAJA ALIFATSKIH ALKOHOLA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. PREDMET

Ovaj postupak opisuje metodu za određivanje sadržaja alifatskih alkohola u uljima i mastima.

2. PRINCIP METODE

Masna tvar s dodatkom 1-eikozanola koji služi kao interni standard, saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira dietilnim eterom.

Alkoholna frakcija odjeljuje se od neosapunjive tvari kromatografijom na podlozi od silikagela impregniranog kalijevim hidroksidom; alkoholi koji se dobiju sa silikagela transformiraju se u trimetilsilil etere i analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom.

3. OPREMA

3.1. Tikvica okruglog dna volumena 250 ml s povratnim hladilom i brušenim staklenim nastavcima.

3.2. Lijevci za odjeljivanje volumena 500 ml.

3.3. Tikvice volumena 250 ml.

3.4. Kromatografska komora za tankoslojnu kromatografsku analizu, za staklene ploče veličine 20 x 20 cm.

3.5. Ultraljubičasta svjetlost valne duljine 366 ili 254 nm, za ispitivanje TLC ploča.

3.6. Mikroštrcaljka za unos 100 μl i 500 μl.

3.7. Stakleni lijevci za filtriranje od sinter-stakla s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i približne visine 5 cm, primjereni za filtriranje pod vakuumom i 12/21 brušeni muški spoj.

3.8. Vakuumska tikvica volumena 50 ml s 12/21 ženskim spojem od brušenog stakla za korištenje s lijevkom za filtriranje (3.7.).

3.9. Epruveta volumena 10 ml s konusnim dnom i ručicom.

3.10. Plinski kromatograf za korištenje s kapilarnom kolonom i opremljen sustavom za razdvajanje koji se sastoji od:

3.10.1. termostatske komore za kolone (peć) koja može održavati željene temperature uz točnost od ± 1 °C;

3.10.2. termostatski sklop za uparavanje (injektor) od silaniziranog stakla;

3.10.3. plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom;

3.10.4. snimač-integrator za aktivnosti s pretvaračem s pojačalom (3.10.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira.

3.11. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, s SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom tekućom fazom, s debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm.

3.12. Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju, volumena 10 μl s tvrdom iglom (od kaljenog stakla).

4. REAGENSI

4.1. Kalijev hidroksid, približno 2 mol/l otopina u etanolu: 130 g kalijevog hidroksida (minimalne koncentracije 85 %) otopi se, uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim se nadopuni etanolom do jedne litre. Otopinu treba čuvati u dobro začepljenoj boci od tamnog stakla.

4.2. Dietilni eter, analitičke čistoće.

4.3. Bezvodni natrijev sulfat, analitičke čistoće.

4.4. Silikagel TLC staklene ploče, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 mm (mogu se nabaviti u slobodnoj trgovini).

4.5. Kalijev hidroksid, približno 0,2 mol/l otopina u etanolu; 13 g kalijevog hidroksida otopi se u 20 ml destilirane vode i nadopuni se etanolom do jedne litre.

4.6. Benzen, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.7. Aceton, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.8. Heksan, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.9. Dietilni eter, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.10. Kloroform, za kromatografiju.

4.11. Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: mješavina 5 % C20 do C28 alkohola u kloroformu.

4.12. 0,2 %-tna otopina 2,7-diklorofluoresceina u etanolu. Ovo se može učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 mol/l kalijevog hidroksida.

4.13. Bezvodni piridin, za kromatografiju.

4.14. Heksametildisilazan.

4.15. Trimetilklorosilan.

4.16. Standardne otopine trimetilsilil etera alifatskih alkohola od C20 do C28. Može ih se pripremiti od mješavina čistih alkohola u trenutku kad su potrebni za korištenje.

4.17. 0,1 %-tna (m/v) otopina 1-eikozanola u CHCl3 (interni standard).

4.18. Plinovi nosači: vodik i helij, kromatografske čistoće.

4.19. Pomoćni plinovi:

— vodik, kromatografske čistoće,

— zrak, kromatografske čistoće.

5. POSTUPAK

Pripremanje neosapunjive tvari.

5.1.1. Pomoću mikroštrcaljke od 500 μl treba u tikvicu s okruglim dnom volumena 250 ml ubrizgati volumen 0,1 %-tne otopine 1-heneikozanola (4.17.) (može se također koristiti 1-eneikozanol) koja sadrži količinu 1-eikozanola koja je približno jednaka 10 % sadržaja alifatskih alkohola u onom dijelu uzorka koji će se uzeti za analizu. Primjerice, na 5 g uzorka dodati 250 μl 0,1 %-tne otopine 1-eikozanola ako se radi o maslinovom ulju ili sjemenskom ulju i 1 500 μl ako se radi o ulju komine maslina. Interni standard treba osušiti isparivanjem u atmosferi dušika.

U tikvicu treba odmjeriti približno 5 g suhog, filtriranog uzorka.

5.1.2. Dodaje se 50 ml 2 mol/l otopine kalijevog hidroksida u etanolu, namješta se povratno hladilo i uređaj zagrijava do točke slabog vrenja na parnoj kupelji uz neprekidno miješanje tijekom cijelog zagrijavanja, dok se ne završi saponificiranje (otopina postane bistra). Zagrijavanje se nastavlja još 20 minuta, a zatim se kroz hladilo dodaje 50 ml destilirane vode, nakon čega se hladilo odvaja, a tikvica se ohladi na približno 30 °C.

5.1.3. Sadržaj tikvice se kvantitativno prenese u lijevak za odjeljivanje volumena 500 ml i opere s 2 x 25 ml destilirane vode. Dodaje se približno 80 ml dietilnog etera, sve se žestoko protrese 30 sekundi i zatim odloži da se rasloji u dvije faze (bilješka 1.).

Donja vodena faza prenosi se u drugi lijevak za odjeljivanje. U vodenoj fazi obavljaju se još dvije ekstrakcije, na jednak način, uz korištenje između 60 i 70 ml dietilnog etera za svaku.

Bilješka 1. Emulzije se mogu odstraniti dodavanjem (postupkom prskanja) malih količina etilnog alkohola ili metilnog alkohola.

5.1.4. Ekstrakti dietilnog etera miješaju se u lijevku za odjeljivanje i ispiru destiliranom vodom (u obrocima od 50 ml) dok voda kojom se ispiralo ne pokaže neutralnu reakciju.

Odbacite vodenu fazu a eter-fazu osušite bezvodnim natrijevim sulfatom i profiltrirajte u tikvicu volumena 250 ml koja je prethodno izvagana, a lijevak i filtre operite malim količinama dietilnog etera koje se dodaju na ukupnu količinu.

5.1.5. Eter se isparuje nježnim zagrijavanjem na nekoliko ml, a zatim se suši pod blagim vakuumom ili pod strujom dušika; sušenje se završava u sušioniku na 100 °C na približno 15 minuta, a nakon hlađenja u eksikatoru mjeri se ostatak.

Odjeljivanje alkoholnih frakcija

5.2.1. Pripremanje osnovnih ploča: TLC ploče (4.4.) potpuno se urone u otopinu 0,2 mol/l kalijevog hidroksida (4.5.) na 10 sekundi, zatim ih se ostavi da se dva sata suše u digestoru, a na kraju ih se stavlja u sušionik na 100 °C na sat vremena.

Ploče se zatim vade iz sušionika i pohranjuju u eksikator napunjen kalcijevim kloridom dok ne budu potrebne za uporabu. Ploče obrađene na ovaj način moraju se iskoristiti unutar dva tjedna.

Bilješka 2. Kad se za odjeljivanje alkoholnih frakcija koriste osnovne silikagel ploče, nema potrebe da se neosapunjive tvari obrađuju s Al203. Slijedi da se svi kiseli sastojci (masne kiseline i drugi) zadržavaju na početku čime se dobiva i vrpca alifatskog alkohola i vrpca terpenskog alkohola, a oba se značajno razlikuju od vrpce sterola.

5.2.2. Otopina benzena i acetona u volumnom omjeru 95:5 % unosi se u komoru za razvijanje do visine od približno 1 cm. Umjesto toga, može se koristiti mješavina heksana i dietilnog etera u volumnom omjeru 65:35 %. Komora se zatvara i ostavlja na najmanje pola sata da bi se uspostavila ravnoteža pare i tekućine. Trake filtar-papira namočene u eluens (tekućinu za razvijanje) mogu se pričvrstiti na unutarnju površinu komore kako bi se skratilo vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobila jednoličnija, pravilna eluacija komponenata.

Bilješka 3. Otopina za razvijanje mora se zamijeniti prilikom svake analize da bi se postigli reproducibilni uvjeti razvijanja.

5.2.3. Pripremi se otprilike 5 %-tna otopina neosapunjive tvari (5.1.5.) u kloroformu, a 300 μl otopine nanese se u jednoličnom sloju minimalne debljine pomoću mikroštrcaljke zapremnine100 μl na TLC ploču približno 2 cm od donjeg ruba TLC ploče. Poravnano sa slojem, nasumce se nanese između 2 i 3 μl referentne otopine alifatskog alkohola (4.11.) radi identificiranja vrpce alifatskog alkohola nakon završetka razvijanja.

5.2.4. Ploča se smješta unutar komore za razvijanje kako je navedeno u 5.2.2. Temperaturu treba održavati između 15 i 20 °C. Komora se odmah zatvara, a uzorak se ostavlja da eluira dok prednji dio otapala ne dođe do udaljenosti od 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja još neko vrijeme u digestoru.

5.2.5. Ploča se blago i jednoliko pošprica otopinom 2,7-diklorofluoresceina; kad se ploča promatra pod ultraljubičastom svjetlošću, vrpca alifatskog alkohola identificira se uspoređivanjem s alifatskim alkoholima u vrpci koja se nalazi neposredno iznad, vrpce triterpenskog alkohola i zajedno se zaokruže.

Bilješka 4. Razlog zahtjeva za uklanjanje vrpci alifatskog alkohola i triterpenskog alkohola jest moguća migracija nekih alifatskih alkohola u vrpcu triterpenskih alkohola.

5.2.6. Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se pomoću metalne spatule. Sastrugani materijal razbija se na fine čestice i unosi u lijevak za filtriranje (3.7.), dodaje se 10 ml vrućeg kloroforma. Sadržaj se temeljito miješa pomoću metalne spatule i filtrira pod vakuumom; filtrat se skuplja u tikvici (3.8.) koja je spojena s lijevkom za filtriranje.

Ostatak unutar lijevka ispire se tri puta s po 10 ml etilnog etera, a filtrat se skuplja u istu tikvicu spojenu na lijevak. Filtrat se isparuje na volumen od približno 4 do 5 ml, a preostala otopina se ulijeva u testnu epruvetu volumena 10 ml (3.9.) koja je prije tog izvagana; epruveta se suši laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika. Ostatak se ponovno otapa s nekoliko kapi acetona, ponovno se suši, a zatim smješta u sušionik na 105 °C na 10 minuta, vadi se i hladi u eksikatoru i važe.

Ostatak unutar epruvete sastoji se od alkoholne frakcije.

Pripremanje trimetilsilil etera.

5.3.1. Reagens za sililaciju, koji se sastoji od mješavine piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana u volumnom omjeru 9:3:1 (v/v/v) (bilješka 5.), u omjeru od po 50 μl na svaki miligram alkohola, dodaje se u epruvetu koja sadrži alkoholnu frakciju, tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (bilješka 6.).

Bilješka 5. Otopine spremne za uporabu dostupne su u slobodnoj trgovini; reagens za silaniziranje kao što su N, 0-bis (trimetilsilil)trifluoracetamid + 1 % trimetilklorosilan za miješanje s jednakim volumenom bezvodnog piridina.

5.3.2. Epruvetu treba začepiti i pažljivo protresti bez preokretanja, sve dok se alkoholi ne rastope. Zatim ju treba odložiti na sobnoj temperaturi na vrijeme ne kraće od 15 minuta, nakon čega ju se na nekoliko minuta stavlja na centrifugiranje; bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom.

Bilješka 6. Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće utjecati na rezultat. Stvaranje bijelog flokulata i pojava ružičastog obojenja znakovi su prisutnosti vlage ili propadanja reagensa. U tom slučaju treba ponoviti ispitivanje.

Analiza plinskim kromatografom.

Pripremne djelatnosti i kondicioniranje kapilarne kolone.

5.4.1.1. Kapilarna kolona namješta se unutar plinskog kromatografa tako da se početak kolone spoji s isparivačem koji je spojen na sustav za razdvajanje, a kraj kolone na detektor.

Treba provesti opću provjeru stanja sklopa plinskog kromatografa (čvrstoću spoja (brtvljenja) plinskih priključaka, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava za razdvajanje i sustava za bilježenje, i tako dalje).

5.4.1.2. Kapilarna kolona koja se koristi prvi put treba proći postupak kondicioniranja. Kroz kapilarnu kolonu pusti se da proteče malo plina nositelja, a zatim se sklop plinskog kromatografa uključi i postupno ga se zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (vidjeti Bilješku 7.). Ta se temperatura treba održavati ne kraće od dva sata, zatim se sklop dovede na radne uvjete (reguliranje protoka plina, paljenje plamena dijeljenja, spoj na elektronički uređaj za bilježenje, prilagođavanje temperature komore (peći) kapilarne kolone, detektor i injektor, i tako dalje), a signal se prilagođava na osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od najviše razine predviđene za provođenje analize. Bazna linija za praćenje treba biti linearna, bez ikakvih pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona.

Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da spojevi kolone nisu savršeno čvrsti (zabrtvljeni), dok pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije dostatno kondicionirana.

Bilješka 7. Temperatura kondicioniranja mora biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature predviđene za primijenjenu tekuću fazu.

Odabir radnih uvjeta

5.4.2.1. Opći radni uvjeti su kako slijedi:

— temperatura kolone: inicijalni izoterma postavlja se na 180 °C na osam minuta, a zatim se programira na 5 °C po minuti dok ne dosegne 260 °C i daljnjih 15 minuta na 260 °C,

— temperatura isparivača: 280 °C,

— temperatura detektora: 290 °C,

— linearna brzina plina nosača: helij između 20 i 35 cm/s, vodik između 30 i 50 cm/s,

— omjer razdvajanja: 1:50 do 1:100,

— osjetljivost instrumenta: između 4 i 16 puta viša od minimalne atenuacije,

— osjetljivost bilježenja: između 1 i 2 mV pune skale,

— brzina papira: između 30 i 60 cm/h,

— količina injektirane tvari: između 0,5 i 1 μl TMSE otopine.

Gore navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu s karakteristikama kolone i karakteristikama plinskog kromatografa ne bi li se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim uvjetima:

— retenciono vrijeme alkohola C26 treba biti 18 ± 5 minuta,

— pik alkohola C22 treba biti 80 ± 20 % vrijednosti pune skale za maslinovo ulje i 40 ± 20 % vrijednosti pune skale za sjemensko ulje.

5.4.2.2. Prethodno navedeni zahtjevi provjeravaju se opetovanim injektiranjem standardne TMSE mješavine alkohola i radni uvjeti se prilagođavaju tako da bi se postigli najbolji mogući rezultati.

5.4.2.3. Parametri za integriranje pikova postavljaju se na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira.

Provođenje analize

5.4.3.1. Korištenjem mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl heksana, za kojim slijedi 0,5 μl zraka, a nakon tog i između 0,5 i 1 μl otopine uzorka; klip mikroštrcaljke treba dignuti da bi se igla ispraznila.

Igla se uvodi kroz septum sklopa za injektiranje; nakon jedne do dvije sekunde otopina se brzo injektira, a nakon približno pet sekundi igla se polako izvlači.

5.4.3.2. Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE prisutnih alkohola u potpunosti ne eluira. Bazna linija treba u svakom trenutku odgovarati zahtjevima točke 5.4.1.2.

5.4.4. Identificiranje pikova

Identificiranje pojedinačnih pikova provodi se u skladu s retencijskim vremenima i uspoređivanjem sa standardnom TMSE mješavinom koja se analizira pri jednakim uvjetima.

Kromatogram alkoholne frakcije djevičanskog maslinovog ulja prikazan je na Slici 1.

Kvantitativna procjena

5.4.5.1. Površine pikova 1-eikozanola i alifatskih alkohola C22 i C28 izračunavaju se elektroničkom integracijom.

5.4.5.2. Sadržaj svakog alkohola, iskazan u mg/100 g masne tvari izračunava se kako slijedi:

pri čemu je:

Ax= površina pika alkohola x, u kvadratnim milimetrima;

As= površina 1-eikozanola u kvadratnim milimetrima;

ms= masa 1-eikozanola u miligramima;

m= masa uzorka uzetog za određivanje, u gramima.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

Iskazuje se sadržaj pojedinačnih alifatskih alkohola u mg/100 g masne tvari i zbroj „ukupnih alifatskih alkohola”.

DODATAK Određivanje linearne brzine plina U plinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se između 1 i 3 μl metana ili propana i zatim se zapornom urom mjeri vrijeme koje je metanu ili propanu potrebno da proteče kroz kolonu od trenutka injektiranja do trenutka eluacije (razvijanja) pika (tM). Linearna brzina u cm/s zadana je s L/tM, pri čemu je L duljina kolone u centrima, a tM vrijeme, u sekundama, koje je izmjereno zapornom urom. 1= Eikozanol (SI), 2= Dokozanol, 3= Trikozanol, 4= Tetrakozanol, 5= Pentakozanol, 6= Heksakozanol, 7= Heptakozanol, 8= Oktakozanol.

PRILOG V.

ODREĐIVANJE SASTAVA I SADRŽAJA STEROLA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. OPSEG

Ova metoda opisuje postupak određivanja sadržaja pojedinačnih i ukupnih sterola u masnim tvarima.

2. PRINCIP METODE

Masna tvar s dodatkom β-kolestanola koji služi kao interni standard, saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira dietilnim eterom.

Sterolna frakcija odjeljuje se od neosapunjivog ekstrakta kromatografijom na osnovnoj silikagel ploči. Steroli koji se dobiju sa silikagela transformiraju se u trimetil-silil etere i analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom.

3. OPREMA

3.1. Tikvica volumena 250 ml s povratnim hladilom i nastavcima od brušenog stakla.

3.2. Lijevci za odjeljivanje volumena 500 ml.

3.3. Tikvice volumena 250 ml.

3.4. Cjeloviti instrument za analizu tankoslojnom kromatografijom, korištenjem staklenih ploča veličine 20 x 20 cm.

3.5. Ultraljubičasta svjetiljka valne duljine 366 ili 254 nm.

3.6. Mikroštrcaljke od 100 μl i 500 μl.

3.7. Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i visine od oko 5 cm, s dodatkom primjerenim za filtriranje pod vakuumom i 12/21 brušeni muški spoj.

3.8. Erlenmeyerova vakuumska tikvica volumena 50 ml s 12/21 ženskim spojem od brušenog stakla koja se može pričvrstiti na lijevak za filtriranje (3.7.).

3.9. Epruveta volumena 10 ml s konusnim dnom i brtvenim čepom.

3.10. Plinski kromatograf prikladan za korištenje s kapilarnom kolonom i opremljen sustavom za razdvajanje koji se sastoji od:

3.10.1. termostatske komore za kolone koje mogu održavati željene temperature uz točnost od ± 1 °C;

3.10.2. jedinice za uparavanje s mogućnošću prilagođavanja temperature, s elementom za uparavanje od persilaniziranog stakla;

3.10.3. plameno-ionizacijskog detektora i pretvarača s pojačalom;

3.10.4. snimač-integratorora prikladnog za korištenje s pretvaračem s pojačalom (3.10.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira.

3.11. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, potpuno prekrivena sa SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom tekućinom jednolikom debljinom između 0,10 i 0,30 μm.

3.12. Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju volumena 10 μl s tvrdom iglom (od kaljenog stakla).

4. REAGENSI

4.1. Kalijev hidroksid, približno 2 mol/l otopina u etanolu. Treba otopiti 130 g kalijevog hidroksida (minimalne koncentracije 85 %), uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim nadopuniti etanolom do jedne litre. Otopinu treba čuvati u dobro začepljenim bocama od tamnog stakla.

4.2. Dietilni eter, analitičke čistoće.

4.3. Bezvodni natrijev sulfat, analitičke čistoće.

4.4. Staklene ploče presvučene silikagelom, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 mm (mogu se nabaviti u slobodnoj trgovini).

4.5. Kalijev hidroksid, 0,2 mol/l otopina u etanolu. Treba otopiti 13 g kalijevog hidroksida u 20 ml destilirane vode i nadopuniti etanolom do jedne litre.

4.6. Benzen, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.7. Aceton, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.8. Heksan, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.9. Dietilni eter, za kromatografiju (vidjeti 5.2.2.).

4.10. Kloroform, analitičke čistoće (Vidjeti 5.2.2.).

4.11. Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: 5 %-tna otopina kolesterola ili fitosterola u kloroformu.

4.12. 2,7-diklorofluorescein, 0,2 %-tna otopina u etanolu. Ovo se može učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 mol/l kalijevog hidroksida.

4.13. Bezvodni piridin, za kromatografiju.

4.14. Heksametil disilazan.

4.15. Trimetilklorosilan.

4.16. Standardne otopine sterolnih trimetilsilil etera. Treba ih se pripremiti neposredno prije korištenja od čistih sterola ili mješavine sterola dobivenih iz ulja koja ih sadrže.

4.17. β-kolestanol, 0,2 %-tna otopina (m/V) u kloroformu (interni standard).

4.18. Plinovi nosači: vodik ili helij, čistoće za plinsku kromatografiju.

4.19. Pomoćni plinovi:

— vodik, čistoće za plinsku kromatografiju,

— zrak, čistoće za plinsku kromatografiju.

5. POSTUPAK

Pripremanje neosapunjive tvari

5.1.1. Pomoću mikroštrcaljke od 500 μl treba u tikvicu volumena 250 ml ubrizgati onu količinu 0,2 %-tne otopine β-kolestanola u kloroformu (4.17.) koja sadrži količinu kolestanola koja je približno jednaka 10 % sadržaja sterola alikvota uzorka koji će se uzeti za određivanje. Primjerice, na 5 g uzorka treba dodati 500 μl 0,2 %-tne otopine β-kolestanola u slučaju kad se radi o maslinovom ulju i 1 500 μl ako se radi o sjemenskom ulju ili ulju komine maslina.

Osušiti isparivanjem u atmosferi dušika i zatim izvagati točno 5 g suhog filtriranog uzorka u istu tikvici.

Ulja i masti životinjskog ili biljnog podrijetla koja sadrže znatne količine kolesterola mogu dati pik s retencijskim vremenom koje je identično onome kolestanola. U tom slučaju frakcija sterola treba se analizirati dvostruko - s i bez internog standarda.

5.1.2. Dodaje se 50 ml 2 mol/l otopine kalijevog hidroksida u etanolu, namješta se povratno hladilo i zagrijava do točke slabog vrenja na parnoj kupelji uz neprekidno energično miješanje, dok se ne završi saponificiranje (otopina postane bistra). Zagrijavanje se nastavlja još 20 minuta, a zatim se dodaje 50 ml destilirane vode u vrh hladila, nakon čega se hladilo odvaja, a tikvica se ohladi na približno 30 °C.

5.1.3. Sadržaj tikvice se kvantitativno prenese u lijevak za odjeljivanje volumena 500 ml uz nekoliko ispiranja destiliranom vodom u ukupnoj količini od približno 50 ml. Dodaje se približno 80 ml dietilnog etera, sve se žestoko protrese približno 30 sekundi i zatim odloži da se slegne (bilješka 1.).

Donja vodena faza treba se odvojiti sakupljanjem u drugi lijevak za odjeljivanje. Treba provesti još dvije ekstrakcije na vodenoj fazi na jednak način, uz korištenje između 60 i 70 ml etilnog etera za svaku.

Bilješka 1. Svaka se emulzija može uništiti prskanjem malih količina etilnog ili metilnog alkohola.

5.1.4. Ekstrakte etera treba pomiješati u lijevku za odjeljivanje i ispirati destiliranom vodom (u obrocima od 50 ml) dok voda kojom se ispiralo ne pokaže neutralnu reakciju.

Nakon uklanjanja vode kojom se ispiralo, osušite bezvodnim natrijevim sulfatom i profiltrirajte kroz bezvodni natrijev sulfat u tikvici volumena 250 ml koja je prethodno izvagana, perući lijevak i filtar malim količinama dietilnog etera.

5.1.5. Eter se destilira na nekoliko ml, a zatim se suši pod blagim vakuumom ili pod strujom dušika; sušenje se završava u sušioniku na 100 °C na približno četvrtinu sata, a nakon hlađenja u eksikatoru se važe.

Odjeljivanje frakcije sterola.

5.2.1. Pripremanje osnovnih ploča. Silikagel ploče (4.4.) se potpuno urone u otopinu 0,2 mol/l kalijevog hidroksida u etanolu (4.5.) na 10 sekundi, zatim ih se ostavi da se dva sata suše u digestoru i na kraju ih se stavlja u sušionik na 100 °C na sat vremena.

Ploče se zatim vade iz sušionika i pohranjuju u eksikator napunjen kalcijevim kloridom dok ne budu potrebne za uporabu (ploče obrađene na ovaj način mogu se koristiti unutar razdoblja od 15 dana).

Bilješka 2.

Kad se za odjeljivanje frakcije sterola koriste osnovne silikagel ploče, nema potrebe da se neosapunjive tvari obrađuju aluminijevim oksidom. Na taj način, svi sastojci koji su po prirodi kiseli (masne kiseline i drugi) zadržavaju se na liniji raspršivanja, a vrpca sterola jasno se odvaja od vrpce alifatskih i triterpenskih alkohola.

5.2.2. Mješavina benzena i acetona u volumnom omjeru 95:5 % i unosi se u komoru za razvijanje do visine od približno 1 cm. Umjesto toga, može se koristiti mješavina heksana i etilnog etera u volumnom omjeru 65:35 %. Komora se zatvara odgovarajućim poklopcem i ostavlja tako na približno pola sata kako bi se uspostavila ravnoteža tekućine-para. Trake filtar-papira namočene u eluens mogu se postaviti na unutarnje površine komore. Time se skraćuje vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobiva jednoličnija, pravilna eluacija komponenata.

Bilješka 3. Mješavina za razvijanje mora se zamijeniti za svako ispitivanje da bi se postigli reproducibilni uvjeti eluacije.

5.2.3. Pripremi se otprilike 5 %-tna otopina neosapunjive tvari (5.1.5.) u kloroformu, a 300 μl otopine se nanese u što tanjem i jednoličnijem sloju pomoću mikroštrcaljke od 100 μl na kromatografsku ploču približno (5.2.1.) 2 cm od jednog ruba. Poravnano s nanosom, nanosi se između 2 i 3 μl referentne otopine sterola (4.11.) na jednom kraju ploče, tako da se vrpca sterola nakon razvijanja može identificirati.

5.2.4. Ploča se smješta unutar komore za razvijanje pripremljene kako je navedeno u 5.2.2. Temperaturu treba održavati između 15 i 20 °C. Komoru treba odmah zatvoriti i ostaviti da eluira dok prednji dio otapala ne dođe do udaljenosti od približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja još neko kraće vrijeme u digestoru.

5.2.5. Ploča se blago i jednoliko pošprica otopinom 2,7-diklorofluoresceina. Kad se ploča promatra pod ultraljubičastom svjetlošću, vrpca sterola identificira tako što je poravnata s mrljom dobivenom od referentne otopine. Granice vrpce označavaju se uz rub fluorescencije crnom pisaljkom.

5.2.6. Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se pomoću metalne spatule. Sastrugani materijal razbija se u fini prah i unosi u lijevak za filtriranje (3.7.). Treba dodati 10 ml vrućeg kloroforma i pažljivo miješati pomoću metalne spatule i filtrirati pod vakuumom; filtrat treba skupiti u Erlenmeyerovu tikvicu (3.8.) koja je spojena na lijevak za filtriranje.

Ostatak unutar lijevka ispire se tri puta dietilnim eterom (približno 10 ml za svako ispiranje) uz skupljanje filtrata u istu tikvicu spojenu na lijevak. Filtrat se isparuje na volumen između 4 i 5 ml, a preostala otopina se prenosi u epruvetu volumena 10 ml (3.9.) koja je prije tog izvagana, isparuje se sušenjem laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika, ponovno se otapa u nekoliko kapljica acetona, ponovno se isparuje sušenjem, a zatim smješta u sušionik na 105 °C na približno 10 minuta, ostavlja se da se ohladi u eksikatoru i važe.

Ostatak unutar epruvete sastoji se od frakcije sterola.

Pripremanje trimetilsilil etera.

5.3.1. Reagens za sililaciju, koji se sastoji od mješavine piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana u volumnom omjeru 9:3:1 (bilješka 4.), dodaje se u omjeru od po 50 μl na svaki miligram sterola, u epruvetu koja sadrži frakciju sterola, tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (bilješka 5.).

Bilješka 4. Otopine spremne za uporabu dostupne su u slobodnoj trgovini. Ostali reagensi za silaniziranje kao što su, primjerice, bis-trimetilsilil, trifluoroacetamid + 1 % trimetil klorosilan, koji se treba razrijediti jednakom zapreminom bezvodnog piridina, također su dostupni.

5.3.2. Epruvetu treba začepiti i pažljivo protresti (bez preokretanja), sve dok se steroli u potpunosti ne rastope. Zatim ju treba odložiti na sobnoj temperaturi na vrijeme ne kraće od 15 minuta, nakon čega ju se na nekoliko minuta stavlja na centrifugiranje. Bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom.

Bilješka 5. Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće utjecati na rezultat. Stvaranje bijelog flokulata i pojava ružičastog obojenja znakovi su prisutnosti vlage ili propadanja reagensa. U tom slučaju treba ponoviti ispitivanje.

Analiza plinskim kromatografom

Pripremne djelatnosti, punjenje kolone

5.4.1.1. Kolonu treba namjestiti u plinski kromatograf tako da se početak kolone spoji na isparivač koji je spojen sa sustavom za razdvajanje, a izlazni kraj kolone na detektor.

Treba provesti opću provjeru stanja jedinice plinskog kromatografa (curenje iz plinskih tokova, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava za razdvajanje i sustava za bilježenje, i tako dalje).

5.4.1.2. U slučaju kad se kolona koristi prvi put, preporuča se da ju se podvrgne postupku kondicioniranja. Kroz kolonu se pusti da proteče malo plina, a zatim se jedinica plinskog kromatografa uključi i postupno zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (bilješka 6.). Ta se temperatura treba održavati ne kraće od dva sata, zatim se cijela jedinica stavlja u radne uvjete (prilagođavanje protoka plina i razdvajanja, paljenja plamena, provjera spoja s elektroničkim uređajem za bilježenje, prilagođavanje komore za kolonu, temperature detektora i injektora, i tako dalje), a zatim se bilježi signal uz osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od razine predviđene za analizu. Tijek bazne linije treba biti linearan, bez pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona.

Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da je došlo do curenja iz spojeva kolone, a pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije kondicionirana na odgovarajući način.

Bilješka 6. Temperatura kondicioniranja mora uvijek biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature utvrđene za primijenjenu stacionarnu fazu.

Odabir radnih uvjeta.

5.4.2.1. Opći radni uvjeti su kako slijedi:

— temperatura kolone: 260 ± 5 °C,

— temperatura isparivača: 280 °C,

— temperatura detektora: 290 °C,

— linearna brzina plina nosača: helij između 20 i 35 cm/s, vodik između 30 i 50 cm/s,

— omjer razdvajanja: između 1:50 i 1:100,

— osjetljivost instrumenta: između 4 i 16 puta viša od minimalne atenuacije,

— osjetljivost bilježenja: između 1 i 2 mV pune skale,

— brzina papira: između 30 i 60 cm/sat,

— količina injektirane tvari: između 0,5 i 1 μl TMSE otopine.

Gore navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu s karakteristikama kolone i karakteristikama plinskog kromatografa ne bi li se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim zahtjevima:

— retencijsko vrijeme β-sitosterola treba biti 20 ± 5 minuta,

— pik kampesterola treba biti: za maslinovo ulje (prosječni sadržaj 3 %) 15 ± 5 % vrijednosti pune skale; a za sojino ulje (prosječni sadržaj 20 %) 80 ± 10 % vrijednosti pune skale,

— svi prisutni steroli moraju biti odijeljeni. Osim odjeljivanja, pikovi također moraju biti u potpunosti razdvojeni, drugim riječima, trag pika mora se vratiti na baznu liniju prije no što krene stvarati novi pik. Međutim, nepotpuno razdvajanje tolerira se u slučaju da se pik pri TRR 1,02 može kvantificirati korištenjem okomice.

Analitički postupak.

5.4.3.1. Korištenjem mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl heksana, za kojim slijedi 0,5 μl zraka, a nakon tog i između 0,5 i 1 μl otopine uzorka. Klip štrcaljke treba dignuti toliko da se igla isprazni. Iglu treba gurnuti kroz membranu jedinice za injektiranje i, nakon jedne do dvije sekunde, treba brzo injektirati, a nakon otprilike pet sekundi iglu treba polako izvući.

5.4.3.2. Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE prisutnih sterola u potpunosti ne eluiraju

Bazna linija treba u svakom trenutku odgovarati zahtjevima (5.4.1.2.).

5.4.4. Identificiranje pikova.

Identificiranje pojedinačnih pikova provodi se na temelju retencijskog vremena i uspoređivanjem sa mješavinama sterolnih TMSE koje se analiziraju pri jednakim uvjetima.

Steroli se eluiraju sljedećim redoslijedom: kolesterol, brasikasterol, 24-metilen kolesterol, kampesterol, kampastanol, stigmasterol, Δ 7-kampesterol, Δ 5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24-stigmastadienol, Δ 7-stigmasterol, Δ 7-avenasterol.

Retencijska vremena sitosterola za kolone SE-52 i SE-54 prikazana su u Tablici 1.

Slike 1. i 2. prikazuju tipične kromatograme za neka ulja.

Kvantitativna procjena

5.4.5.1. Površine pikova β-kolestanola i sterola izračunavaju se korištenjem integratora. Pikove bilo kojega od spojeva koji nisu uključeni među one koji su popisani u Tablici 1. ne treba uzimati u obzir. Koeficijent odziva za α-kolestanol treba biti jednak 1.

5.4.5.2. Treba izračunati koncentraciju svakog pojedinačnog sterola u mg/100 g masnog materijala kako slijedi:

pri čemu je:

Ax= površina pika sterola x, u kvadratnim milimetrima;

As= površina pika β-kolestanola, u kvadratnim milimetrima;

ms= masadodanog β-kolestanola, u miligramima;

m= masa uzorka korištenog za određivanje, u gramima.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

6.1. Koncentracije pojedinačnih sterola bilježe se kao mg/100 g masnog materijala, a njihov zbroj kao „ukupni steroli”.

6.2. Postotak svakog pojedinačnog sterola izračunava se iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova za sterole.

pri čemu je:

Ax= površina pika za x;

ΣΑ= ukupna površina pikova za sterole.

DODATAK Određivanje linearne brzine plina U plinski kromatograf postavljen na normalne radne uvjete injektira se između 1 i 3 μl metana (ili propana) i zatim se mjeri vrijeme koje je plinu potrebno da proteče kroz kolonu od trenutka injektiranja do trenutka pojavljivanja pika (tM). Linearna brzina u cm/s zadana je s L/tM, pri čemu je L duljina kolone u centimetrima, a tM izmjereno vrijeme u sekundama.

Tablica I.

Relativna retencijska vremena za sterole

Pik Identifikacija Relativno retencijskovrijeme kolona SE 54 kolona SE 52 1. kolesterol Δ-5-kolesten-3β-ol 0,67 0,63 2. kolestanol 5α-kolestan-3β-ol 0,68 0,64 3. brasikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol 0,73 0,71 4. 24-metilen-kolesterol 24-metilen-Δ-5,24-kolesten-3β-ol 0,82 0,80 5. kampesterol [24R]-24-metil-Δ-5-kolesten-3β-ol 0,83 0,81 6. kampestanol [24R]-24-metil-kolestan-3β-ol 0,85 0,82 7. stigmasterol [24R]-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterol [24R]-24-metil-Δ-7-kolesten-3β-ol 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3β-ol 0,95 0,95 10. klerosterol [24S]-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3β-ol 0,96 0,96 11. β-sitosterol [24R]-24-etil-Δ-5-kolestan-3β-ol 1,00 1,00 12. sitostanol 24-etil-kolestan-3β-ol 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etiliden-5-kolesten-3β-ol 1,03 1,03 14. Δ-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3β-ol 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-etil-Δ-7,24-kolestadien-3β-ol 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterol [24Z]-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3β-ol 1,16 1,16

Slika 1.

Plinski kromatogram frakcije sterola jednog nerafiniranog maslinovog ulja

Slika 2.

Plinski kromatogram frakcije sterola jednog rafiniranog maslinovog ulja

PRILOG VI.

ODREĐIVANJE ERITRODIOLA I UVAOLA

UVOD

Eritrodiol (uobičajeni zajednički naziv za glikole eritrodiola i uvaola) sastojak je neosapunjive frakcije koja je karakteristična za neke vrste masnih tvari. U maslinovom ulju koje je dobiveno ekstrakcijom otapalom nalazi se u značajno višim koncentracijama nego u drugim uljima, kao što su prešano maslinovo ulje i ulje koštica grožđa koja ga također sadrže, pa stoga njegova prisutnost može ukazati na prisutnost maslinovog ulja dobivenog ekstrakcijom otapalom.

1. OPSEG

Ova metoda opisuje postupak otkrivanja eritrodiola u masnim tvarima.

2. PRINCIP METODE

Masna tvar saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu. Neosapunjiva frakcija se zatim ekstrahira dietilnim eterom i pročišćava prelaskom preko kolone s aluminijevim oksidom.

Neosapunjive tvari podvrgavaju se tankoslojnoj kromatografiji na silikagel ploči dok se ne odijele vrpce koje odgovaraju frakcijama sterola i eritrodiola. Steroli i eritrodioli koji se dobiju s ploče transformiraju se u trimetilsilil etere i smjesa se analizira plinskom kromatografijom.

Rezultat se iskazuje kao postotak eritrodiola u smjesi eritrodiola i sterola.

3. OPREMA

3.1. Oprema opisana u Prilogu V. (određivanje sadržaja sterola).

4. REAGENSI

4.1. Reagensi opisani u Prilogu V. (određivanje sadržaja sterola).

4.2. Referentna otopina eritrodiola, 0,5 %-tna otopina u kloroformu.

5. POSTUPAK

5.1. Pripremanje neosapunjive tvari.

Kao što je opisano u stavku 5.1.2. Priloga V.

5.2. Odjeljivanje eritrodiola i sterola.

5.2.1. Vidjeti stavak 5.2.1. Priloga V.

5.2.2. Vidjeti stavak 5.2.2. Priloga V.

5.2.3. Pripremi se 5 %-tna otopina neosapunjive tvari u kloroformu.

0,3 ml otopine nanese se u što tanjem i jednoličnijem sloju pomoću mikroštrcaljke od 0,1 ml na kromatografsku ploču, približno 1,5 cm od donjeg ruba.

Na jedan kraj ploče treba nanijeti nekoliko mikrolitara otopine kolesterola i eritrodiola koji će poslužiti kao reference.

5.2.4. Ploča se smješta unutar komore za razvijanje pripremljene kako je navedeno u 5.2.1. Temperatura treba biti oko 20 °C. Komoru treba odmah zatvoriti poklopcem i ostaviti da eluira dok prednji dio otapala ne dođe do udaljenosti od približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka.

5.2.5. Ploča se blago i jednoliko pošprica otopinom 2,7-diklorofluoresceina u alkoholu. Kad se ploču promatra pod ultraljubičastom svjetlošću, vrpce sterola i eritrodiola identificiraju se tako što su poravnate s referentnima. Treba ih označiti točkom neposredno izvan rubova fluorescencije.

5.2.6. Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se pomoću metalne spatule. Materijal sastrugan s ploče treba staviti u tikvicu volumena 50 ml. Treba dodati 15 ml vrućeg kloroforma, dobro protresti i filtrirati kroz lijevak s diskom od sinter-stakla tako da se silikagel prenese na filtar. Isprati tri puta vrućim kloroformom (po 10 ml za svako ispiranje), a filtrat skupiti u tikvicu volumena 100 ml. Filtrat se isparuje na volumen između 4 i 5 ml, prenosi u kalibriranu epruvetu za centrifugiranje s konusnim dnom volumena 10 ml, suši laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika i važe.

5.3. Pripremanje trimetilsilil estera.

Kao što je opisano u stavku 5.3. Priloga V.

5.4. Analiza plinskim kromatografom.

Kao što je opisano u stavku 5.4. gornje metode. Radni uvjeti plinskog kromatografa tijekom provođenja analize moraju biti takvi da se može provesti analiza sterola i odijeliti TMSE od eritrodiola i uvaola.

Nakon što je uzorak injektiran, treba nastaviti provoditi bilježenje sve dok se prisutni steroli, eritrodiol i uvaol, u potpunosti ne eluiraju Zatim treba identificirati pikove (retencijska vremena za eritrodiol i uvaol u odnosu na β-sitosterol iznose 1,45, odnosno, 1,55) i izračunati površine kao za sterole.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

pri čemu je:

A1= površina pika eritrodiola, u kvadratnim milimetrima;

A2= površina pika uvaola, u kvadratnim milimetrima;

ΣΑsterola= ukupna površina pikova za sterole, u kvadratnim milimetrima.

Rezultat se iskazuje jednim decimalnim mjestom.

PRILOG VII.

ODREĐIVANJE ZASIĆENIH MASNIH KISELINA U POLOŽAJU 2. NA TRIGLICERIDIMA ULJA I MASTI

1. OPSEG

Ova norma opisuje metodu određivanja sastava one frakcije masnih kiselina nekog ulja ili masti koja se esterificira na položaju 2. (ili unutarnjem položaju) glicerola.

2. PODRUČJE PRIMJENE

Ova norma primjenjuje se na ulja i masti čije je talište niže od 45 °C, zahvaljujući posebnim karakteristikama djelovanja lipaze iz gušterače.

Ne primjenjuje se bezrezervno na ulja i masti koje sadrže znatne količine: masnih kiselina s 12 ili manje atoma ugljika (kokosovo ulje, ulje od palmine jezgre (koštica) i mliječna mast) ili visoko nezasićenih masnih kiselina (s više od četiri dvostruke veze) koje sadrže 20 ili više atoma ugljika (riblje ulje i ulje od morskih organizama), ili pak masnih kiselina koje sadrže oksigenirane grupe, osim karboksilne grupe.

3. PRINCIP

Moguća neutralizacija kiselih ulja i masti u otapalu. Pročišćavanje prelaskom preko kolone s aluminijevim oksidom. Djelomična hidroliza triglicerida lipazom iz gušterače tijekom određenog vremena. Odijeljivanje stvorenih monoglicerida tankoslojnom kromatografijom i metanoliza tih monoglicerida. Analiza tih metilnih estera plinsko-tekućinskom kromatografijom.

4. OPREMA

4.1. Tikvica s okruglim dnom volumena 100 ml.

4.2. Tikvica s okruglim dnom volumena 25 ml sa spojevima od brušenog stakla.

4.3. Zračno hladilo duljine 1 m, koje se može pričvrstiti na tikvicu navedenu u stavku 4.2.

4.4. Erlenmeyerova tikvica volumena 250 ml.

4.5. Čaša volumena 50 ml.

4.6. Lijevak za odjeljivanje volumena 500 ml.

4.7. Staklena kromatografska kolona unutarnjeg promjera 13 mm i duljine 400 mm, sa zataljenim staklenim diskom i ventilom.

4.8. Epruveta za centrifugiranje volumena 10 ml, sa čepom od brušenog stakla.

4.9. Graduirana bireta volumena 5 ml, s podjelom po 0,05 ml.

4.10. Štrcaljka volumena 1 ml, s tankom iglom.

4.11. Mikroštrcaljka kojim se mogu dobiti kapljice veličine između 3 i 4 μl.

4.12. Pribor za nanošenje tankog sloja za tankoslojnu kromatografiju.

4.13. Staklene ploče za tankoslojnu kromatografiju, veličine 20 × 20 cm.

4.14. Staklena komora za razvijanje za tankoslojnu kromatografiju, s poklopcem od brušenog stakla, koja odgovara pločama veličine 20 × 20 cm.

4.15. Sprej za tankoslojnu kromatografiju.

4.16. Sušionik podešen na 103 ± 2 °C.

4.17. Termostat kojega se može regulirati između 30 i 45 °C s točnošću od 0,5 °C.

4.18. Rotirajući isparivač.

4.19. Vibrirajuća električna tresilica koja omogućava snažno protresanje epruvete za centrifugiranje.

4.20. Ultraljubičasta svjetiljka za ispitivanje tankoslojnih ploča.

Za kontroliranje aktivnosti lipaze:

4.21. pH-metar.

4.22. Spiralna miješalica.

4.23. Bireta volumena 5 ml.

4.24. Zaporna ura.

Za moguće pripremanje lipaze:

4.25. Laboratorijska miješalica, odgovarajuća za dispergiranje i miješanje heterogenih materijala.

5. REAGENSI

5.1. n-heksan ili, ako nije dostupan, lagani petrolej (čija je točka vrelišta između 30 i 50 °C), kromatografske kvalitete.

5.2. 2-propanol, ili etanol, 95 % (v/v), kvalitete analitičkog reagensa.

5.3. 2-propanol, ili etanol, 1/1 otopina u vodi.

5.4. Dietil eter, bez peroksida.

5.5. Aceton.

5.6. Mravlja kiselina, ne manje od 98 % (m/m).

5.7. Otopina za razvijanje: mješavina n-heksana (5.1.), dietil etera (5.4.) i mravlje kiseline 5.6.) u volumnom omjeru 70:30:1 (v/v/v).

5.8. Aktivirani aluminijev oksid za kromatografiju, neutralan, stupnja kvalitete I. po Brockmannu.

5.9. Kvarcni prah s vezivom, kvalitete odgovarajuće za tankoslojnu kromatografiju.

5.10. Lipaza iz gušterače, odgovarajuće kvalitete (Bilješke 1. i 2.).

5.11. Natrijev hidroksid, 120 g/l otopina u vodi.

5.12. Solna kiselina, otopina u vodi 6 mol/l.

5.13. Kalcijev klorid (CaCl2), 220 g/l otopina u vodi.

5.14. Natrijev kolat (enzimatske kvalitete), 1 g/l otopina u vodi.

5.15. Pufer otopina: 1 M otopinu u vodi tris-hidroksimetilaminometana podesiti na pH 8 dodavanjem solne kiseline (5.12.) (provjerite pomoću pH-metra).

5.16. Fenolftalein, 10 g/l otopina u 95 %-tnom (v/v) etanolu.

5.17. 2’,7’ -diklorofluorescein, 2 g/l otopina u 95 %-tnom (v/v) etanolu, učinjena blago lužnatim dodavanjem jedne kapljice 1 mol/l otopine natrijevog hidroksida na 100 ml.

Za kontroliranje aktivnosti lipaze:

5.18. Neutralizirano ulje.

5.19. Natrijev hidroksid, 0,1 mol/l otopina u vodi.

5.20. Natrijev kolat (enzimatske kvalitete), 200 g/l otopina u vodi.

5.21. Guma arabika, 100 g/l otopina u vodi.

6. PRIPREMANJE UZORKA

Ako je kiselost uzorka (sadržaj slobodnih masnih kiselina) niža od 3 %, određena u skladu s Prilogom II., pročistite ga direktno preko aluminijevog oksida u skladu s uputama u stavku 6.2.

Ako je kiselost uzorka viša od 3 %, određena u skladu s Prilogom II., neutralizirajte ga lužinom uz prisutnost otapala u skladu sa stavkom 6.1., a zatim pročistite aluminijevim oksidom u skladu s uputama u stavku 6.2.

6.1. Neutralizacija lužinom uz prisutnost otapala

U lijevak za odjeljivanje (4.6.) stavite oko 10 g sirovog ulja i dodajte 100 ml heksana (5.1.), 50 ml 2-propanola (5.2.), nekoliko kapljica otopine fenolftaleina (5.16.) i otopinu natrijevog hidroksida (5.11) u količini koja odgovara slobodnoj kiselosti ulja (sadržaju slobodnih masnih kiselina) plus 0,3 % viška. Snažno protresajte jednu minutu, dodajte 50 ml destilirane vode, ponovno protresite i odložite da se slegne.

Nakon odjeljivanja odstranite sapunasti sloj s dna. Također odstranite sve međuslojeve (sluz, netopljiva tvar). Operite otopinu neutraliziranog ulja u heksanu uzastopnim obrocima (25 do 30 ml) otopine 2-propanola (5.3.), sve dok ne nestane ružičasta boja fenolftaleina.

Većinu heksana odstranite destiliranjem pod vakuumom u rotirajućem isparivaču (4.18.), osušite ulje na temperaturi između 30 i 40 °C pod vakuumom strujom čistog dušika, dok se heksan u cijelosti ne odstrani.

6.2. Pročišćavanje kroz aluminijev oksid

Pripremite suspenziju od 15 g aktiviranog aluminijevog oksida (5.8.) i 50 ml heksana (5.1.) i ulijte ju, uz miješanje, u kromatografsku kolonu (4.7.). Pustite da se aluminijev oksid jednoliko slegne i pustite da razina otapala padne na između 1 i 2 mm iznad apsorbenta. Pažljivo u kolonu ulijte otopinu 5 g ulja i 25 ml heksana (5.1.), a svu tekućinu prikupljenu iz kolone prebacite u tikvicu s okruglim dnom (4.1.).

7. Pripremanje kromatografskih ploča

Temeljito očistite staklene ploče (4.13.) etanolom, laganim petrolejem i acetonom da biste odstranili i najmanji trag masne tvari.

U Erlenmeyerovu tikvicu (4.4.) stavite 30 g kvarcnog praha (5.9.) Dodajte 60 ml destilirane vode. Začepite i snažno tresite jednu minutu. Premjestite emulziju direktno u pribor za nanošenje tankog sloja (4.12.) i premažite čiste ploče slojem debljine 0,25 mm.

Pustite da se ploče suše 15 minuta na zraku, a zatim sat vremena u sušioniku (4.16.) na 103 ± 2 °C. Prije korištenja ploča ohladite ih na sobnu temperaturu u eksikatoru.

Pripremljene ploče dostupne su u slobodnoj trgovini.

8. POSTUPAK

8.1. Hidroliza lipazom iz gušterače.

U epruveti za centrifugiranje (4.8.) izvažite približno 0,1 g pripremljenog uzorka, a ako je uzorak tekuće ulje, direktno nastavite kako je opisano dolje.

Dodajte 20 mg lipaze (5.10.) i 2 ml pufer otopine (5.15.). Protresite dobro ali pažljivo, a zatim dodajte 0,5 ml otopine natrijevog kolata (5.14.) i 0,2 ml otopine kalcijevog klorida (5.13.). Epruvetu začepite čepom od brušenog stakla, pažljivo protresite (tako da se čep ne smoči) i epruvetu odmah stavite u termostat (4.17.) koji održava temperaturu od 40 ± 0,5 °C i tresite rukom točno jednu minutu.

Izvadite epruvetu iz termostata i snažno protresajte pomoću električne tresilice (4.19.) točno dvije minute.

Odmah ohladite u tekućoj vodi; dodajte 1 ml solne kiseline (5.12.) i 1 ml dietil etera (5.4.). Začepite i snažno miješajte pomoću električne tresilice. Pustite da se slegne i odstranite organski sloj pomoću štrcaljke (4.10.) ako je potrebno nakon centrifugiranja.

8.2. Odjeljivanje monoglicerida tankoslojnom kromatografijom

Nanesite ekstrakt na kromatografsku ploču pomoću mikroštrcaljke (4.11.), približno 1,5 cm od donjeg ruba, u tankoj, jednolikoj liniji koja treba biti čim je moguće uža. Postavite ploču u dobro zasićenu komoru za razvijanje (4.14.) i razvijajte otapalom za razvijanje (5.7.) na približno 20 °C do približno 1 cm od gornjeg ruba ploče.

Ploču osušite na zraku, na temperaturi komore, i pošpricajte ju otopinom 2’ ,7’ -diklorofluoresceina (5.17.). Identificirajte vrpcu monoglicerida (Rf oko 0,035) pod ultraljubičastom svjetlošću (4.20.).

8.3. Analiza monoglicerida plinsko-tekućinskom kromatografijom.

Sastružite vrpcu dobivenu u stavku 8.2. pomoću spatule (nemojte sastrugati komponente koje su preostale na baznoj liniji) i premjestite u tikvicu za metiliranje (4.2.).

Sastruganu masu kvarcnog praha tretirajte direktno, metodom opisanom u Prilogu X.B tako da monogliceride pretvorite u metilne estere, a zatim ispitajte estere plinskom kromatografijom kao što je opisano u Prilogu X.A.

9. ISKAZIVANJE REZULTATA

Izračunajte sastav masnih kiselina u položaju 2., s jednim decimalnim mjestom (bilješka 3.).

10. BILJEŠKE

Bilješka 1.: Provjeravanje aktivnosti lipaze

Pripremite uljnu emulziju protresanjem mješavine 165 ml otopine gumi arabike (5.12.), 15 g mrvljenog leda i 20 ml neutraliziranog ulja (5.18.) u odgovarajućoj tresilici.

U čašu (4.5.) stavite 10 ml ove emulzije, zatim dodajte 0,3 ml otopine natrijevog kolata (5.20.) i na kraju 20 ml destilirane vode.

Čašu stavite u termostat koji održava temperaturu od 37 ± 0,5 °C (bilješka 4.); umetnite elektrode pH-metra (4.21.) i spiralnu miješalicu (4.22.).

Pomoću birete (4.23.) dodavajte kap po kap otopine natrijevog hidroksida (5.19.) dok pH vrijednost ne dosegne 8,5.

Dodajte dovoljnu količinu vodene suspenzije lipaze (vidjeti dolje). Čim pH-metar pokaže pH vrijednost 8,3, uključite zapornu uru (4.24.) i ukapajte otopinu natrijevog hidroksida (5.19.) brzinom koja će osigurati održavanje pH vrijednosti 8,3. Svaku minutu očitajte volumen utrošene otopine lužine.

Zabilježite očitanja u obliku grafa, tako da očitanje vremena bude na apscisi, a ml otopine lužine potrebni za održavanje konstantnog pH bude na ordinati. Trebali biste dobiti linearni graf.

Suspenzija lipaze spomenuta gore je 1:1 000 (m/m) suspenzija u vodi. Za svako ispitivanje treba koristiti toliko suspenzije da bi se utrošio približno 1 ml otopine lužine tijekom četiri do pet minuta. Obično je potrebno između 1 i 5 mg praha.

Jedinica lipaze definirana je kao količina enzima koji će osloboditi 10 μ-ekvivalenata kiseline u minuti. U tom je slučaju aktivnost A utrošenog praha, mjerenog u jedinici lipaze na mg, zadan formulom:

pri čemu je V volumen otopine natrijevog hidroksida (5.19.) utrošene u minuti, izračunan iz grafa, a m je masa u mg ispitivanog dijela praha.

Bilješka 2.: Pripremanje lipaze

Lipaze koje imaju zadovoljavajuću aktivnost lipaze dostupne su u slobodnoj trgovini. No, moguće je također pripremiti ih u laboratoriju na sljedeći način:

Ohladite 5 kg svježe svinjske gušterače na 0 °C; odstranite okolnu krutu mast i vezivno tkivo i sameljite u mikseru da biste dobili gustu tekućinu. Ovu pastu miješajte miješalicom (4.25.) između četiri i šest sati s 2,5 l bezvodnog acetona i centrifugirajte ju. Ekstrahirajte ostatak još tri puta s jednakim volumenom acetona, a zatim dva puta s 1/1 (V/V) mješavinom acetona i dietil etera i dva puta dietil eterom.

Ostatak sušite u vakuumu 48 sati da biste dobili stabilan prah, kojeg treba pohraniti u hladnjaku.

Bilješka 3.: U svakom se slučaju preporučuje odrediti sastav ukupnih masnih kiselina istog uzorka, budući da će njegovo uspoređivanje s onima kiselina na položaju 2. pomoći u tumačenju dobivenih vrijednosti.

Bilješka 4.: Temperatura hidrolize zadana je na 37 °C, budući da se koristi tekuće ulje. Međutim, za ispitivani uzorak zadana je na 40 °C kako bi se omogućilo ispitivanje masti čija je točka vrelišta do 45 °C.

PRILOG VIII.

ODREĐIVANJE SASTAVA TRILINOLEINA

1. OPSEG

Određivanje sastava triglicerida u maslinovim uljima u smislu njihovog ekvivalentnog ugljikovog broja visoko djelotvornom tekućinskom kromatografijom.

Ova norma opisuje metodu odjeljivanja i kvantitativnog određivanja sastava triglicerida biljnih ulja u smislu njihove molekularne mase i stupnja nezasićenosti kao funkcije njihovog ekvivalentnog ugljikovog broja (vidjeti bilješku 1.).

2. PODRUČJE PRIMJENE

Ova se norma primjenjuje na sva biljna ulja koja sadrže trigliceride masnih kiselina dugog lanca. Ta se metoda posebno može primjenjivati na otkrivanje prisutnosti malih količina polusušivih ulja (bogatih linolnom kiselinom) u biljnim uljima koja sadrže oleinsku kiselinu kao najdominantniju nezasićenu masnu kiselinu, kao što je maslinovo ulje.

3. PRINCIP

Odjeljivanje triglicerida u skladu s njihovim ekvivalentnim ugljikovim brojem visoko djelotvornom tekućinskom kromatografijom (reverzno-fazna) i interpretacija kromatograma.

4. OPREMA

4.1. Visoko djelotvorni tekućinski kromatograf, koji omogućava termostatsku kontrolu temperature kolone.

4.2. Jedinica za injektiranje 10 μl.

4.3. Detektor: diferencijalni refraktometar. Osjetljivost pune skale treba biti najmanje 10-4 jedinica indeksa refrakcije.

4.4. Kolona: cijev od nehrđajućeg čelika duljine 250 mm i unutarnjeg promjera 4,5 mm, napunjena česticama kvarca promjera 5 μm s između 22 i 23 % ugljika u obliku oktadecilsilana (bilješka 2.).

4.5. Pisač i/ili integrator.

5. REAGENSI

Reagensi moraju biti analitičke čistoće. Otapala za eluaciju moraju biti takva da se mogu nekoliko puta reciklirati bez da to utječe na odjeljivanja, a iz njih moraju biti odstranjeni svi plinovi.

5.1. Kloroform.

5.2. Aceton.

5.3. Acetonitril.

5.4. Otapalo za eluaciju: acetonitril + aceton (omjer treba prilagoditi postizanju željenog odjeljivanja; započnite s mješavinom 50:50).

5.5. Otapalo za rastapanje: aceton ili mješavina acetona i kloroforma u omjeru 1:1.

5.6. Referentni trigliceridi: možete koristiti trigliceride dostupne u slobodnoj trgovini (tripalmitin, triolein i tako dalje), u kojem se slučaju retencijska vremena bilježe u skladu s ekvivalentnim ugljikovim brojem, ili pak možete koristiti referentni kromatogram dobiven od sojinog ulja (vidjeti bilješke 3. i 4. i slike 1. i 2.).

6. PRIPREMANJE UZORAKA

5 %-tnu otopinu uzoraka koje ćete analizirati pripremite tako da odvagnete 0,5 ± 0,001 g uzorka u graduiranoj tikvici volumena 10 ml i nadopunite do 10 ml otapalom za rastapanje (5.5.).

7. POSTUPAK

7.1. Postavite sustav za kromatografiju. Upumpajte otapalo za eluaciju (5.4.) brzinom od 1,5 ml/mm da biste pročistili cijeli sustav. Pričekajte dok ne dobijete stabilnu baznu liniju.

Injektirajte 10 μl uzorka pripremljenog kao u točki 6.

8. IZRAČUNAVANJE I ISKAZIVANJE REZULTATA

Koristite metodu interne standardizacije, odnosno, pretpostavite da zbroj površina pikova koji odgovaraju različitim trigliceridima iznosi 100 %. Izračunajte relativni postotak svakog triglicerida koristeći sljedeću formulu:

Rezultat treba iskazati jednim decimalnim mjestom.

Bilješka 1. Redoslijed eluacije može se odrediti izračunavanjem ekvivalentnih ugljikovih brojeva, što se najčešće definira odnosom ECN = CN - 2n, pri čemu je CN ugljikov broj, a n broj dvostrukih veza; preciznije se može izračunati tako da se u obzir uzme izvor dvostruke veze. Ako su n0, n1 i n1n brojevi dvostrukih veza koje se pripisuju oleinskoj, linolnoj i linolenskoj kiselini, ekvivalentni ugljikov broj može se izračunati pomoću odnosa u formuli:

NCE = NC – dono – d1n1 – d1nn1n

pri čemu se koeficijenti d0, d1 i d1n mogu izračunati pomoću referentnih triglicerida. Pod uvjetima utvrđenima ovom metodom, dobiveni odnos bit će blizak sljedećemu:

NCE = NC – (2,60no) – (2,35n1) – (2,17n1n).

Bilješka 2. Primjeri: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333;

Licrosphere ili ekvivalent (Merck) 100 CH18 Art 50377.

Bilješka 3. S nekoliko je referentnih triglicerida također moguće izračunati rezoluciju u odnosu na triolein,

α = TR′/TR′oleină

korištenjem reduciranog retencijskog vremena RT’ = RT – RTotapalo.

Graf „log α” u odnosu na „f” (broj dvostrukih veza) omogućava određivanje retencijskih vrijednosti za sve trigliceride masnih kiselina sadržanih u referentnim trigliceridima - vidjeti sliku 2.

Bilješka 4. Učinkovitost kolone mora omogućiti jasno odjeljivanje pika trilinoleina od pikova triglicerida sa susjednim RT.

Slika 1.

Kromatogram uzorka sojinog ulja

P= palmitinska kiselina

St= stearinska kiselina

O= oleinska kiselina

L= linolna kiselina

Ln= linolenska kiselina

Slika 2.

Graf od „log α” u odnosu na „f” (broj dvostrukih veza)

La= laurinska kiselina

My= miristinska kiselina

P= palmitinska kiselina

St= stearinska kiselina

O= oleinska kiselina

L= linolna kiselina

Ln= linolenska kiselina

PRILOG IX.

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ISPITIVANJE U ULTRALJUBIČASTOM PODRUČJU

UVOD

Spektrofotometrijsko ispitivanje u ultraljubičastom području može dati informacije o kvaliteti masti, njezinoj očuvanosti i promjenama koje su u njoj uzrokovane tehnološkim procesima.

Do apsorpcija na valnim duljinama utvrđenima u ovoj metodi dolazi zbog prisustva konjugiranih diena i triena. Te se apsorpcije iskazuju kao specifične ekstinkcije E1 % 1cm (ekstinkcija 1 %-tne otopine masti u određenom otapalu, na debljini od 1 cm), što se uobičajeno označava s K (i također se naziva „koeficijentom ekstinkcije”).

1. OPSEG

Ova metoda opisuje postupak provođenja spektrofotometrijskog ispitivanja maslinovog ulja u ultra-ljubičastom području.

2. PRINCIP METODE

Predmetna mast otapa se u propisanom otapalu, a zatim se određuje ekstinkcija otopine na utvrđenim valnim duljinama u odnosu na čisto otapalo. Specifične ekstinkcije izračunavaju se iz spektrofotometrijskih očitanja.

3. OPREMA

3.1. Spektrofotometar za mjerenje ekstinkcije u ultraljubičastom području između 220 i 360 nm, s mogućnošću očitavanja pojedinačnih nanometrijskih jedinica.

3.2. Pravokutne kvarcne kivete, s poklopcima, optičke duljine 1 cm. Kad su napunjene vodom ili nekim drugim odgovarajućim otapalom, kivete se međusobno ne smiju razlikovati za više od 0,01 ekstinkcijskih jedinica.

3.3. Graduirana tikvica volumena 25 ml.

3.4. Kromatografska kolona duljine 450 mm i promjera 35 mm s ispusnom cijevi čiji je promjer približno 10 mm.

4. REAGENSI

4.1. Spektrofotometrijski čist izo-oktan (2,2,4-trimetilpentan). U odnosu na destiliranu vodu, treba imati transmisiju koja nije manja od 60 % kod 220 nm niti je manja od 95 % kod 250 nm, ili

— spektrofotometrijski čist cikloheksan: u odnosu na destiliranu vodu, treba imati transmisiju koja nije manja od 40 % kod 220 nm niti je manja od 95 % kod 250 nm, ili

— neko drugo odgovarajuće otapalo sposobno u potpunosti otopiti mast (primjerice, etilni alkohol za ricinusovo ulje).

4.2. Bazični aluminijev oksid za kromatografiju na koloni pripremljen i provjeren kako je opisano u Dodatku I.

4.3. n-heksan, za kromatografiju.

5. POSTUPAK

5.1. Predmetni uzorak mora biti savršeno homogen i bez sumnjivih onečišćenja. Ulja koja su tekuća na temperaturi okoline treba profiltrirati kroz papir na temperaturi od približno 30 °C, tvrde masti treba homogenizirati i profiltrirati na temperaturi koja nije više od 10 °C viša od točke tališta.

5.2. Odvagnite precizno približno 0,25 g tako pripremljenog uzorka u graduiranoj tikvici volumena 25 ml, nadopunite propisanim otapalom do oznake i homogenizirajte. Dobivena otopina mora biti savršeno bistra. Ako je došlo do opalescencije ili zamućenosti, brzo ju profiltrirajte kroz papir.

5.3. Napunite kivetu dobivenom otopinom i izmjerite ekstinkcije na odgovarajućoj valnoj duljini između 232 i 276 nm, koristeći upotrijebljeno otapalo kao referentno.

Zabilježene vrijednosti ekstinkcije moraju se nalaziti unutar raspona od 0,1 do 0,8. Ako nije tako, mjerenja se moraju ponoviti, s time da se upotrijebe otopine veće ili manje koncentracije, ovisno o slučaju.

5.4. Kad se zahtijeva određivanje specifične ekstinkcije nakon prelaska preko aluminijevog oksida, postupite kako slijedi. U kolonu za kromatografiju stavite 30 g bazičnog aluminijevog oksida u otopini u heksanu. Nakon što se adsorbent slegao, uklonite suvišak heksana do približno 1 cm iznad vrha aluminijevog oksida.

Otopite 10 g masti, homogenizirane i filtrirane kako je opisano u točki 5.1., u 100 ml heksana i ulijte otopinu u kolonu. Sakupite eluat (tekućinu iz kolone) i isparite svo otapalo pod vakuumom na temperaturi nižoj od 25 °C.

Odmah nastavite kako je opisano u točki 5.2., koristeći ovako dobivenu mast.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

6.1. Zabilježite specifične ekstinkcije (koeficijente ekstinkcije) na različitim valnim duljinama, izračunate kako slijedi:

pri čemu je:

Κλ= specifična ekstinkcija na valnoj duljini λ;

Ελ= ekstinkcija mjerena na valnoj duljini λ;

c= koncentracija otopine u g/100 ml;

s= debljina kivete u cm.

Rezultate treba iskazati s dva decimalna mjesta.

6.2. Spektrofotometrijska analiza maslinovog ulja u skladu sa službenom metodom u propisima EEZ-a utvrđuje određivanje specifične ekstinkcije u otopini izo-oktana na valnim duljinama između 232 i 270 nm i određivanje K, što je zadano kao:

pri čemu je Km specifična ekstinkcija na valnoj duljini m, valnoj duljini za maksimalnu apsorpciju oko 270 nm.

DODATAK I.

Pripremanjealuminijevog oksida i ispitivanje njegove aktivnosti

A.1.1. Pripremanje aluminijevog oksida

Aluminijevoksid koji ste prethodno osušili držeći ga u peći tri sata na temperaturiizmeđu 380 i 400 °C, stavite u posudu koja se može hermetički zatvoriti,dodajte destiliranu vodu u omjeru od 5 ml na 100 g aluminijevog oksida, odmahzatvorite posudu, opetovano protresajte i zatim pustite da se sliježe najmanje12 sati prije uporabe.

A.1.2. Provjeravanje aktivnosti aluminijskogoksida

Pripremite kromatografsku kolonu s30 g aluminijevog oksida. Postupajući kako je opisano u stavku 5.4., krozkolonu treba propustiti mješavinu koja se sastoji od:

— 95 % djevičanskog maslinovog ulja čija je specifičnaekstinkcija manja od 0,18 kod 268 nm,

— 5 % ulja odkikirikija, koje je u procesu rafiniranja tretirano zemljom, čija specifičnaekstinkcija nije niža od 4 kod 268 nm.

Ako mješavina, nakonprolaska kroz kolonu, ima specifičnu ekstinkciju višu od 0,11 kod 248 nm,aluminijev oksid je prihvatljiv, a u suprotnom se slučaju mora povećati razinadehidracije.

DODATAK II.

Umjeravanje spektrofotometra

A.2. Oprema se mora periodički provjeravati (najmanje jedanput svakih šest mjeseci) obzirom na odziv valne duljine i preciznost odziva.

A.2.1. Valna duljina može se provjeriti korištenjem svjetiljke sa živinom parom ili pomoću odgovarajućih filtara.

A.2.2. S ciljem provjeravanja odziva fotoćelije i fotomultiplikatora postupite kako slijedi: odvagnite 0,2000 g čistog kalijevog kromata za spektrofotometriju i otopite ga u 0,05 mol/l otopini kalijevog hidroksida u graduiranoj tikvici volumena 1 000 ml i nadopunite do oznake. Uzmite točno 25 ml dobivene otopine, stavite ju u graduiranu tikvicu volumena 500 ml i razrijedite do oznake koristeći istu otopinu kalijevog hidroksida.

Izmjerite ekstinkciju tako dobivene otopine kod 275 nm, koristeći otopinu kalijevog hidroksida kao referentnu. Ekstinkcija izmjerena korištenjem kivete od 1 cm treba biti 0,200 ± 0,005.

PRILOG X.A

ANALIZA METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. OPSEG

Ova metoda daje opće upute za primjenu plinske kromatografije, korištenjem punjenih ili kapilarnih kolona, radi utvrđivanja kvalitativnog i kvantitativnog sastava mješavine metilnih estera masnih kiselina dobivenih u skladu s metodom utvrđenom u Prilogu X.B.

Ova metoda ne primjenjuje se na polimerizirane masne kiseline.

2. REAGENSI

2.1. Plin nosač

Inertni plin (dušik, helij, argon, vodik, i tako dalje), temeljito osušen, sa sadržajem kisika manjim od 10 mg/kg.

Bilješka 1. Vodik, koji se kao plin nosač koristi samo u kapilarnim kolonama, može udvostručiti brzinu analize, ali je opasan. Dostupni su sigurnosni uređaji.

2.2. Pomoćni plinovi

2.2.1. Vodik (čistoće ≥ 99,9 %), bez organskih nečistoća.

2.2.2. Zrak ili kisik, bez organskih nečistoća.

2.3. Referentni standard

Mješavina metilnih estera čistih masnih kiselina, ili metilnih estera masti poznatog sastava, po mogućnosti nalik onoj masne tvari koja se analizira.

Posebnu pažnju treba posvetiti sprečavanju oksidacije višestruko nezasićenih masnih kiselina.

3. OPREMA

Navedene upute odnose se na uobičajenu opremu koja se koristi za plinsku kromatografiju, uključujući punjene i/ili kapilarne kolone i plameno-ionizacijski detektor. Sva oprema koja osigurava učinkovitost i rezoluciju utvrđenu u stavku 4.1.2. smatra se odgovarajućom.

3.1. Plinski kromatograf

Plinski kromatograf treba sadržavati sljedeće elemente.

3.1.1. Sustav za injektiranje

Koristite sustav za injektiranje bilo s:

(a) punjenim kolonama, s najmanjim mogućim slobodnim (neiskorištenim) volumenom (u ovom slučaju sustav za injektiranje treba biti u stanju zagrijati se na temperaturu koja je između 20 i 50 °C viša od temperature kolone); ili s

(b) kapilarnim kolonama, u kojem slučaju sustav za injektiranje treba biti izrađen posebno za korištenje s takvim kolonama. Po vrsti, injektor može biti s dijeljenjem uzorka ili bez dijeljenja uzorka u koloni.

Bilješka 2. Ako nema masnih kiselina s manje od 16 atoma ugljika, može se koristiti injektor s pomičnom iglom.

3.1.2. Peć

Peć za termostatiranje kolone mora biti u stanju zagrijati kolonu na temperaturu od najmanje 260 °C i održavati željenu temperaturu unutar 1 °C u slučaju punjene kolone i unutar 0,1 °C u slučaju kapilarne kolone. Ovaj posljednji zahtjev posebno je važan kad se koristi kvarcna cijev.

U svim se slučajevima preporučuje korištenje zagrijavanja programiranom temperaturom, a posebno za masne kiseline koje imaju manje od 16 atoma ugljika.

3.1.3. Punjena kolona

3.1.3.1. Kolona izrađena od materijala koji je inertan u odnosu prema tvari koja će se analizirati (primjerice, staklo ili nehrđajući čelik) čije su dimenzije kako slijedi:

(a) duljina: 1 do 3 m. Relativno kratka kolona treba se koristiti kad su prisutne masne kiseline dugog lanca (iznad C20). Prilikom analiziranja kiselina s 4 ili 6 atoma ugljika, preporuča se korištenje kolone duljine 2 m;

(b) unutarnji promjer: 2 do 4 mm.

Bilješka 3. Ako su prisutne višestruko nezasićene komponente s više od tri dvostruke veze, mogu se razgraditi u koloni od nehrđajućeg čelika.

Bilješka 4. Može se koristiti sustav s dvije jednake punjene kolone.

3.1.3.2. Punjenje, koje uključuje sljedeće elemente:

(a) nositelj: diatomejska zemlja oprana kiselinom i silanizirana, ili neki drugi odgovarajući inertni nositelj s malim rasponom veličine zrna (raspon od 25 μm unutar granica između 125 i 200 μm), s time da je prosječna veličina zrna u određenom odnosu na unutarnji promjer i duljinu kolone;

(b) stacionarna faza: polarna tekućina poliesterskog tipa(primjerice, dietilenglikol polisukcinat, butandiol polisukcinat, etileneglikol poliadipat, i tako dalje) cijanosilikoni ili druge tekućine koje omogućuju zahtijevano kromatografsko odjeljivanje (vidjeti klauzulu 4.). Punjenje treba sadržavati između 5 i 20 % (m/m) stacionarne faze. Za određena odjeljivanja može se koristiti nepolarna stacionarna faza.

3.1.3.3. Kondicioniranje kolone

Kad je kolona odspojena, ako je to moguće, od detektora, postupno zagrijte peć na 185 °C i kroz svježe pripremljenu kolonu puštajte struju inertnog plina brzinom od između 20 i 60 ml/min, ne kraće od 16 sati na toj temperaturi te još sljedeća 2 sata na 195 °C.

3.1.4. Kapilarna kolona

3.1.4.1. Cijev, izrađena od materijala koji je inertan u odnosu prema tvari koja će se analizirati (uobičajeno, staklo ili kvarc). Unutarnji promjer treba biti između 0,2 i 0,8 mm. Unutarnja površina treba se obraditi na odgovarajući način (primjerice, pripremanje površine, deaktiviranje) prije nanošenja premaza stacionarne faze. U većini je slučajeva dovoljna duljina od 25 mm.

3.1.4.2. Stacionarna faza, obično po vrsti poliglikol (poli(etilen glikol) 20 000), poliester (butandiol polisukcinat) ili polarni polisiloksan (cijanosilikon). Odgovarajuće su i kolone gdje je stacionarna faza kemijski vezana (umrežena) na materijal nosač (tzv. bonded/crosslinked columns).

Bilješka 5. Postoji opasnost da polarni polisiloksani prouzroče poteškoće prilikom identificiranja i odjeljivanja linolenske kiseline i C20 kiselina.

Premazi trebaju biti tanki, odnosno, od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3. Sastavljanje i kondicioniranje kolone

Uvažavajte normalne mjere predostrožnosti prilikom sastavljanja kapilarnih kolona, odnosno, namještanje kolone u peći (nositelj), odabir i sastavljanje priključaka (čvrsto spojeni (zabrtvljeni) da ne bi došlo do curenja), pozicioniranje krajeva kolone u injektoru i na detektoru (smanjivanje slobodnog (neiskorištenog) volumena). Kolonu stavite pod struju plina nosača (primjerice, 0,3 bar (30 kPa) za kolonu duljine 25 mm i unutarnjeg promjera 0,3 mm).

Kolonu kondicionirajte temperaturnim programiranjem peći po 3 °C/min od temperature okoline na temperaturu koja je 10 °C niža od granice razgrađivanja stacionarne faze. Održavajte ovu temperaturu peći jedan sat, dok se bazna linija ne stabilizira. Vratite ju na 180 °C da biste radili u izotermnim uvjetima.

Bilješka 6. Odgovarajuće unaprijed kondicionirane kolone dostupne su u slobodnoj trgovini.

3.1.5. Detektor, po mogućnosti takav da ga se može zagrijati na temperaturu višu od one kolone.

3.2. Štrcaljka

Štrcaljka treba imati maksimalni volumen 10 μl i biti graduirana s podjelom po 0,1 μl.

3.3. Pisač

Ako će se krivulja koristiti za izračunavanje sastava analizirane mješavine, zahtijeva se elektronički pisač visoke preciznosti, kompatibilan s korištenom opremom. Pisač treba imati sljedeće karakteristike:

(a) brzina odziva ispod 1,5 s, po mogućnosti 1 s (brzina odziva je vrijeme potrebno za pisaljku da, nakon iznenadnog dobivanja 100 %-tnog signala, prijeđe od 0 do 90 %);

(b) širina papira minimalno 20 cm;

(c) brzina papira, takva da se može prilagoditi vrijednostima između 0,4 i 2,5 cm/min.

3.4. Integrator

Brz i precizan izračun može se postići pomoću elektroničkog integratora. Time se dobiva linearni odziv odgovarajuće osjetljivosti, a ispravak za devijaciju bazne linije bit će zadovoljavajući.

4. POSTUPAK

Aktivnosti opisane u stavcima od 4.1. do 4.3. odnose se na korištenje plameno-ionizacijskog detektora.

Umjesto toga, može se koristiti plinski kromatograf s katarometarskim detektorom (koji radi na principu promjena toplinske vodljivosti). Radni uvjeti se u tom slučaju prilagođavaju kako je opisano u klauzuli 6.

4.1. Uvjeti ispitivanja

Odabir optimalnih radnih uvjeta

4.1.1.1. Punjena kolona

Prilikom odabira uvjeta ispitivanja u obzir treba uzeti sljedeće varijable:

(a) duljina i promjer kolone;

(b) priroda i količina stacionarne faze;

(c) temperatura kolone;

(d) protok plina nosača;

(e) zahtijevana rezolucija;

(f) veličina ispitivanog dijela, odabrana na takav način da sklop detektora i elektrometra daje linearni odziv;

(g) trajanje analize.

Općenito, vrijednosti dane u tablici 1. i tablici 2. dovest će do željenih rezultata, odnosno najmanje 2 000 teoretskih odsječaka po metru duljine kolone za metilni stearat i njegovo eluiranje unutar otprilike 15 minuta.

U slučaju kad to oprema dopušta, injektor treba biti na temperaturi od otprilike 200 °C, a detektor na temperaturi jednakoj ili višoj od temperature kolone.

U pravilu, odnos brzine protoka vodika unesenog u plameno-ionizacijski detektor i brzine plina nosača varira od 1:2 do 1:1, ovisno o promjeru kolone. Protok kisika je otprilike između 5 i 10 puta veći od protoka vodika.

Tablica 1.

Unutarnji promjer kolone mm Protok plina nosača ml/min 2 15 do 25 3 20 do 40 4 40 do 60





Tablica 2.

Koncentracija stacionarne faze % (m/m) Temperatura kolone °C 5 175 10 180 15 185 20 185

4.1.1.2. Kapilarna kolona

Svojstva učinkovitosti i propusnosti kapilarne kolone pokazuju da odjeljivanje između sastojaka i trajanje analize uvelike ovise o brzini protoka plina nosača kroz kolonu. Stoga je potrebno optimirati radne uvjete djelovanjem na ovaj parametar (ili, jednostavnije, na glavni gubitak kolone), ovisno o tome želite li poboljšati odjeljivanje ili ubrzati analizu.

4.1.2. Određivanje broja teoretskih odsječaka/tavana (učinkovitost) i rezolucije (vidjeti sliku 1.)

Analizu mješavine metilnog stearata i metilnog oleata provedite u približno jednakim omjerima (primjerice, metilni esteri iz kakao maslaca).

Odaberite temperaturu kolone i protok plina nosača tako da se maksimum pika metilnog stearata zabilježi približno 15 minuta nakon pika otapala. Upotrijebite onoliku količinu mješavine metilnih estera koja je dovoljna da pik metilnog stearata zauzme oko tri četvrtine pune skale.

Broj teoretskih odsječaka, n (učinkovitost), izračunajte koristeći formulu:

a rezoluciju, R, koristeći formulu:

pri čemu je:

dr1 retencijska udaljenost, u milimetrima, od početka kromatograma do maksimuma pika metilnog stearata;

ω1 i ω2 širine, u milimetrima, pikova metilnog stearata odnosno metilnog oleata, mjerene između sjecišta tangenti na točkama infleksije krivulje s baznom linijom;

Δ udaljenost, u milimetrima, između maksimalnog pika metilnog stearata i metilnog oleata.

Slika 1.

Kromatogram za određivanje broja teoretskih odsječaka (učinkovitost) i rezolucije

Radni uvjeti koje treba odabrati jesu oni koji će omogućiti najmanje 2 000 teoretskih odsječaka po metru duljine kolone za metilni stearat i rezoluciju od najmanje 1,25.

4.2. Ispitivani dio uzorka

Pomoću štrcaljke (3.2.) uzmite između 0,1 i 2 μl otopine metilnog estera pripremljene u skladu s Prilogom X.B i injektirajte u kolonu.

U slučaju da esteri nisu u otopini, pripremite otopinu od približno 100 mg/ml u heptanu kromatografske čistoće i injektirajte između 0,1 i 1 μl ove otopine.

Ako analizirate sastojke prisutne samo u tragovima, veličina ispitivanog dijela uzorka može se povećati (i do deseterostruko).

4.3. Analiza

Općenito, radni uvjeti trebaju biti kao oni utvrđeni u točki 4.1.1.

Međutim, moguće je raditi s nižom temperaturom kolone kad se zahtijeva određivanje masnih kiselina koje imaju manje od 12 atoma ugljika, ili s višom temperaturom kad se zahtijeva određivanje masnih kiselina koje imaju više od 20 atoma ugljika. Povremeno je moguće u oba slučaja koristiti temperaturno programiranje. Primjerice, ako uzorak sadrži metilne estere masnih kiselina s manje od 12 atoma ugljika, injektirajte uzorak na 100 °C (ili na između 50 i 60 °C ako je prisutna maslačna kiselina) i odmah povisite temperaturu brzinom od 4 do 8 °C/min do optimalne. U nekim slučajevima mogu se kombinirati ova dva postupka.

Nakon programiranog zagrijavanja nastavite eluaciju na stalnoj temperaturi sve dok sve komponente ne eluiraju. Ako instrument nema programirano zagrijavanje, koristite ga na dvije fiksne temperature između 100 i 195 °C.

Ako je potrebno, preporučuje se provođenje analize na dvije nepromjenjive faze s različitim polarnostima da bi se potvrdilo da nema maskiranih pikova, primjerice u slučaju istovremene prisutnosti konjugiranih C18:3 i C20:0, ili C18:3 i C18:2.

4.4. Pripremanje referentnog kromatograma i referentnih grafova

Analizirajte referentnu standardnu mješavinu (2.3.) koristeći iste radne uvjete kao što su oni primijenjeni za uzorak, pa izmjerite retencijska vremena ili retencijske udaljenosti za prisutne masne kiseline. Na semi-logaritamskom papiru, za svaki stupanj nezasićenosti, kreirajte grafove koji pokazuju logaritamsku vrijednost retencijskog vremena ili udaljenosti kao funkciju broja atoma ugljika. U izotermnim uvjetima, grafovi za kiseline ravnog lanca jednakog stupnja nezasićenosti trebali bi biti ravne linije. Te linije trebale bi biti približno paralelne.

Potrebno je izbjegavati uvjete u kojima postoje „maskirani pikovi”, odnosno u kojima rezolucija nije dovoljna da bi se odijelila dva sastojka.

5. ISKAZIVANJE REZULTATA

5.1. Kvalitativna analiza

Identificirajte pikove metilnog estera za uzorak iz grafa pripremljenog prema točki 4.4., ako je potrebno interpolacijom.

5.2. Kvantitativna analiza

5.2.1. Određivanje sastava

Osim u iznimnim slučajevima, koristite metodu interne normalizacije, odnosno, pretpostavite da su svi sastojci uzorka predstavljeni na kromatogramu, tako da ukupna površina pod pikovima predstavlja 100 % sastojaka (ukupna eluacija).

Ako oprema uključuje integrator, koristite brojke dobivene od njega. Ako ga ne uključuje, odredite površinu pod svakim pikom tako da pomnožite visinu pika s njegovom širinom na polovici visine, a, kad je potrebno, uzmite u obzir različite atenuacije koje su se koristile tijekom bilježenja.

5.2.2. Metoda izračunavanja

5.2.2.1. Općeniti slučaj

Izračunajte sadržaj danog sastojka i, iskazan kao postotak mase metilnih estera, određivanjem postotka kojega predstavlja površina odgovarajućeg pika u odnosu na zbroj površina svih pikova, koristeći sljedeću formulu:

pri čemu je:

Ai površina pod pikom koji odgovara sastojku i;

ΣΑ zbroj površina pod svim pikovima.

Rezultat iskažite jednim decimalnim mjestom.

Bilješka 7.: U ovom općenitom slučaju, smatra se da rezultat izračuna na temelju relativnih površina predstavlja postotak mase. U slučajevima u kojima ova pretpostavka nije dopuštena, vidjeti točku 5.2.2.2.

5.2.2.2. Korištenje korekcijskih faktora

U nekim slučajevima, primjerice kad su prisutne masne kiseline s manje od osam atoma ugljika ili kiselina sa sekundarnim grupama, kad se koriste detektori toplinske vodljivosti ili kad se posebno zahtijeva najviši stupanj preciznosti, treba koristiti korekcijske faktore da bi se postotke površine pikova pretvorilo u postotke mase sastojaka.

Korekcijske faktore odredite pomoću kromatograma dobivenog analizom referentne mješavine metilnih estera poznatog sastava, provedene pod radnim uvjetima jednakima onima koji su korišteni za uzorak.

Za ovu referentnu mješavinu postotak mase sastojaka i zadan je sljedećom formulom:

pri čemu je:

mi masa sastojka i u referentnoj mješavini;

Σm zbroj masa svih sastojaka referentne mješavine.

Za kromatogram referentne mješavine (4.4.) izračunajte postotak (površina/površina) za sastojak i kako slijedi:

pri čemu je:

Ai površina pod pikom koji odgovara sastojku i;

ΣΑ zbroj površina pod svim pikovima.

Korekcijski faktor se zatim izračunava kao:

Uobičajeno se korekcijski faktori iskazuju u odnosu na KC16, tako da relativni faktori postaju:

Za uzorak, sadržaj svakog sastojka i, iskazan kao postotak mase metilnih estera, jest:

Rezultat iskažite jednim decimalnim mjestom.

5.2.2.3. Korištenje internog standarda

U nekim analizama (primjerice, gdje nisu sve masne kiseline kvantificirane, kao kad su prisutne kiseline sa četiri i šest ugljika zajedno s kiselinama sa 16 i 18 ugljika, ili kad je potrebno odrediti apsolutnu količinu masnih kiselina u nekom uzorku), potrebno je koristiti interni standard. Često se koriste masne kiseline s pet, 15 ili 17 ugljika. Treba odrediti korekcijski faktor (ako postoji) za interni standard.

Postotak mase sastojka i, iskazan kao metilni esteri, zadan je formulom:

pri čemu je:

Ai površina pod pikom koji odgovara sastojku i;

As površina pod pikom koji odgovara Internom standardu;

K’ i korekcijski faktor za sastojak i (u odnosu na K C1 );

K’ s korekcijski faktor za interni standard (u odnosu na K C16 );

m je masa, u miligramima, ispitivanog dijela uzorka;

ms je masa, u miligramima, internog standarda.

Rezultate iskažite jednim decimalnim mjestom.

6. POSEBAN SLUČAJ - KORIŠTENJE KATAROMETARSKOG DETEKTORA (KOJI RADI NA