6.

Dodaju se sljedeća poglavlja od C.31. do C.46.: „ C.31. TEST NA KOPNENOM BILJU: ISPITIVANJE NICANJA I RASTA KLIJANACA UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 208 (2006.). Ispitne se metode periodički preispituju u svjetlu znanstvenoga napretka i primjenjivosti za regulatorne svrhe. Ova ažurirana ispitna metoda namijenjena je ocjenjivanju mogućih učinaka kemikalija na nicanje i rast klijanaca. Kao takva ne obuhvaća kronične učinke ili učinke na razmnožavanje (tj. zametanje sjemena, formiranje cvjetova i sazrijevanje plodova). Kako bi se osigurao odabir primjerenih ispitnih metoda, mora se voditi računa o uvjetima izloženosti i svojstvima kemikalije koja će se ispitivati (npr. kada se ispituju metali/spojevi metala, treba voditi računa o učincima pH-vrijednosti i pripadajućim protuionima) (1). Ovom se ispitnom metodom ne ispituje bilje izloženo parama kemikalija. Ispitna se metoda može primijeniti za ispitivanje kemikalija u općoj uporabi, biocida i proizvoda za zaštitu usjeva (poznatih i kao sredstva za zaštitu bilja ili pesticidi). Razvijena je na temelju postojećih metoda (2) (3) (4) (5) (6) (7). Razmotrena je i ostala literatura koja se odnosi na ispitivanje bilja (8) (9) (10). Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1. NAČELO ISPITIVANJA 2. Ispitivanjem se ocjenjuju učinci na nicanje klijanaca i rani rast viših biljaka nakon izloženosti ispitivanoj kemikaliji u tlu (ili drugoj prikladnoj matrici tla). Sjeme se stavi u dodir sa zemljom koja je tretirana ispitivanom kemikalijom čiji se učinci ocjenjuju obično nakon 14 do 21 dana nakon što nikne 50 % klijanaca u kontrolnoj skupini. Krajnje točke koje se mjere jesu vizualna procjena nicanja klijanaca, masa suhe tvari izdanka (alternativno masa svježe tvari izdanka) i u određenim slučajevima visina izdanka, kao i procjena vidljivih štetnih učinaka na različite dijelove biljke. Ta se mjerenja i zapažanja uspoređuju s onima kod netretiranih kontrolnih biljaka. 3. Ovisno o očekivanom putu izlaganja, ispitivana se kemikalija unosi u zemlju (ili eventualno u matricu umjetne zemlje) ili se primjenjuje na površinu zemlje, što pravilno predstavlja mogući put izlaganja kemikaliji. Kemikalija se unosi u zemlju tretiranjem zemlje u rasulu. Nakon primjene kemikalije zemlja se premješta u uzgojne posude, u koje se potom sije sjeme određene biljne vrste. Kod površinske primjene kemikalija se primjenjuje na zemlju u posudama u koju je već posijano sjeme. Ispitne jedinice (kontrole i tretirana zemlja plus sjeme) potom se stavljaju u odgovarajuće uvjete kako bi se potaknulo klijanje/rast biljaka. 4. Ispitivanje se može provesti kako bi se odredila krivulja doza-odgovor ili kao granični test sa samo jednom koncentracijom / dozom primjene u skladu s ciljem studije. Ako rezultati dobiveni ispitivanjem sa samo jednom koncentracijom / dozom primjene premašuju određenu razinu toksičnosti (npr. uoče li se učinci veći od x %), provodi se ispitivanje za određivanje raspona kako bi se odredile gornja i donja granica toksičnosti, nakon čega se provodi ispitivanje s više koncentracija / doza primjene kako bi se dobila krivulja doza-odgovor. Odgovarajućom statističkom analizom izračunava se učinkovita koncentracija ECx ili učinkovita doza primjene ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) za najosjetljiviji parametar ili najosjetljivije parametre koji se ispituju. Osim toga, ovim se ispitivanjem može izračunati najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC) i najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC). INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI 5. Sljedeće su informacije korisne za utvrđivanje očekivanog puta izloženosti kemikaliji i za planiranje ispitivanja: strukturna formula, čistoća, topljivost u vodi, topljivost u organskim otapalima, koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/voda, sorpcijsko ponašanje u tlu, tlak para, kemijska stabilnost u vodi i na svjetlosti te biorazgradivost. VALJANOST ISPITIVANJA 6. Da bi ispitivanje bilo valjano, kontrole moraju zadovoljavati sljedeće kriterije uspješnosti: — nicanje klijanaca iznosi najmanje 70 %, — klijanci ne pokazuju vidljive fitotoksične učinke (npr. klorozu, nekrozu, uvenuće, deformacije lista i stabljike) i biljke pokazuju uobičajene varijacije u rastu i morfologiji za predmetnu vrstu, — srednja stopa preživljavanja izniklih kontrolnih klijanaca iznosi najmanje 90 % tijekom trajanja istraživanja, — okolišni su uvjeti za određenu vrstu identični, a uzgojni mediji sadržavaju istu količinu matrice tla, pomoćnih medija ili supstrata iz istog izvora. REFERENTNA KEMIKALIJA 7. Ispitivanjem referentne kemikalije u redovitim vremenskim razmacima može se provjeriti jesu li se provođenje ispitivanja i odgovor određenih ispitnih biljaka te uvjeti ispitivanja značajno promijenili tijekom vremena. Alternativno se mogu upotrijebiti prijašnja mjerenja biomase ili rasta kontrola kako bi se ocijenila uspješnost ispitnih sustava u pojedinim laboratorijima, a mogu poslužiti i za kontrolu kvalitete unutar laboratorija. OPIS METODE Prirodno tlo – umjetni supstrat 8. Biljke se mogu uzgajati u posudama s pjeskovitom ilovačom, ilovastim pijeskom ili pjeskovito glinastom ilovačom koja sadržava do 1,5 % organskog ugljika (oko 3 % organske tvari). Može se upotrijebiti i komercijalna zemlja za lončanice ili sintetička mješavina zemlje koja sadržava do 1,5 % organskog ugljika. Ne smije se upotrijebiti glinovita zemlja ako je poznato da ispitivana kemikalija ima visoki afinitet za gline. Zemlju s polja treba prosijati na veličinu čestica 2 mm kako bi se homogenizirala i kako bi se uklonile grube čestice. Treba dokumentirati vrstu i teksturu, postotak organskog ugljika, pH te udio soli koji se mjeri kao električna vodljivost konačne pripremljene zemlje. Zemlju treba klasificirati prema standardnoj klasifikacijskoj shemi (11). Zemlja se može pasterizirati ili toplinski obraditi kako bi se smanjio učinak patogena iz tla. 9. Uporaba prirodne zemlje može otežati tumačenje rezultata i povećati varijabilnost zbog varirajućih fizikalno-kemijskih svojstava i mikrobnih populacija. Te varijable mogu pak izmijeniti sposobnost zadržavanja vlažnosti, sposobnost vezanja kemikalija, dotok zraka te udio hranjivih sastojaka i elemenata u tragovima. Osim varijacija u navedenim fizikalnim faktorima, postojat će i varijacije u kemijskim svojstvima, kao što su pH-vrijednost i redoks-potencijal, koja mogu utjecati na bioraspoloživost ispitivane kemikalije (12) (13) (14). 10. Umjetni se supstrati u pravilu ne upotrebljavaju za ispitivanje sredstava za zaštitu bilja, ali se mogu upotrijebiti za ispitivanje kemikalija u općoj uporabi ili kad se želi smanjiti varijabilnost prirodnih tala i povećati usporedivost rezultata ispitivanja. Upotrijebljeni se supstrati moraju sastojati od inertnih materijala koji u najvećoj mogućoj mjeri smanjuju interakciju s ispitivanom kemikalijom, nosačem otapala ili jednim i drugim. Pokazalo se da su kremeni pijesak ispran kiselinom, mineralna vuna i staklena zrnca (npr. promjera od 0,35 do 0,85 mm) prikladni inertni materijali koji minimalno apsorbiraju ispitivanu kemikaliju (15), čime se osigurava maksimalna dostupnost kemikalije klijancu putem korijena. Vermikulit, perlit i ostali jaki apsorbenti nisu prikladni supstrati. Potrebno je osigurati nutrijente za rast bilja kako bi se spriječio stres biljaka zbog nutritivnog deficita, koji gdje je moguće treba procijeniti kemijskom analizom ili vizualnim pregledom kontrolnih biljaka. Kriteriji za odabir ispitnih vrsta 11. Kako bi se dobio niz odgovora, raspon odabranih vrsta mora biti prilično širok, npr. u smislu njihove taksonomske raznolikosti u carstvu biljaka, njihove rasprostranjenosti, brojnosti, značajki životnog ciklusa koje su specifične za vrstu te područja prirodnog rasta (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Pri odabiru potrebno je uzeti u obzir sljedeća svojstva mogućih ispitnih vrsta: — vrsta ima ujednačeno sjeme koje se može nabaviti iz pouzdanih izvora standardnog sjemena i koje klija redovito, pouzdano i ujednačeno te daje klijance ujednačenog rasta, — biljka se može ispitivati u laboratoriju i može dati pouzdane i obnovljive rezultate, kako unutar istog, tako i u različitim objektima u kojima se provodi ispitivanje, — osjetljivost ispitivane vrste mora biti u skladu s reakcijama biljaka koje se mogu pronaći u okolišu izloženom kemikaliji, — vrsta je u određenoj mjeri već bila upotrebljavana u prethodnim ispitivanjima toksičnosti i njezino ponašanje u primjerice biološkim ispitivanjima (biotestovima) herbicida, testovima probira na teške metale, testovima na salinitetni ili mineralni stres ili u istraživanjima alelopatije ukazuje na postojanje velikog broja stresora, — spojiva je s uvjetima rasta koji su predviđeni ispitnom metodom, — ispunjuje kriterije valjanosti ispitivanja. Neke od vrsta koje su se najviše upotrebljavale u dosadašnjim ispitivanjima navedene su u Dodatku 2., a moguće nepoljoprivredne vrste navedene su u Dodatku 3. 12. Broj vrsta koje će se ispitivati ovisi o odgovarajućim regulatornim zahtjevima pa taj broj nije određen u ovoj ispitnoj metodi. Primjena ispitivane kemikalije 13. Kemikaliju treba primijeniti u odgovarajućem nosaču (npr. vodi, acetonu, etanolu, polietilen glikolu, gumi arabici ili pijesku). Mogu se ispitivati i mješavine (formulirani proizvodi ili formulacije) koje sadržavaju aktivne sastojke i različita pomoćna sredstva. Unošenje u tlo / umjetni supstrat 14. Kemikalije koje su topljive ili suspendirane u vodi mogu se dodati u vodu, a otopina se potom pomiješa sa zemljom odgovarajućim uređajem za miješanje. Ova vrsta testa može biti primjerena ako do izlaganja kemikaliji dolazi kroz tlo ili pornu vodu i postoji rizik od njezina unošenja putem korijena. Dodavanjem ispitivane kemikalije ne smije se premašiti kapacitet tla za vodu. Količina dodane vode mora biti ista za svaku ispitnu koncentraciju, ali mora biti ograničena kako bi se spriječilo stvaranje grudastih nakupina zemlje. 15. Kemikalije niske topljivosti u vodi treba otopiti u odgovarajućem hlapljivom otapalu (npr. acetonu, etanolu) te pomiješati s pijeskom. Otapalo se potom može ukloniti iz pijeska mlazom zraka uz stalno miješanje pijeska. Tretirani se pijesak pomiješa s pokusnom zemljom. Priprema se druga kontrola koja se sastoji samo od pijeska i otapala. Svim razinama tretmana i drugoj kontroli dodaju se jednake količine pijeska u koji je otapalo bilo umiješano i potom uklonjeno. U slučaju krutih, netopljivih ispitnih kemikalija u odgovarajućem se uređaju za miješanje pomiješaju suha zemlja i kemikalija. Potom se zemlja dodaje u uzgojne posude i odmah se sije sjeme. 16. Kada se umjesto zemlje upotrebljava umjetni supstrat, kemikalije topljive u vodi mogu se otopiti u hranjivoj otopini netom prije početka ispitivanja. Kemikalije koje nisu topljive u vodi, ali se mogu suspendirati u vodi uporabom nosača otapala, treba u hranjivu otopinu dodati s nosačem. Kemikalije netopljive u vodi za koje ne postoji netoksični nosač topljiv u vodi potrebno je otopiti u odgovarajućem hlapljivom otapalu. Otopina se pomiješa s pijeskom ili staklenim kuglicama, stavi u okretni vakuumski isparivač gdje isprava, nakon čega na pijesku ili kuglicama ostaje ujednačen sloj kemikalije. Odmjereni dio kuglica ekstrahira se istim organskim otapalom te se odredi količina kemikalije prije punjenja uzgojnih posuda. Površinska primjena 17. U slučaju sredstava za zaštitu bilja ispitivana se kemikalija često primjenjuje raspršivanjem ispitne otopine po površini tla. Sva oprema koja se upotrebljava za provođenje ispitivanja, uključujući opremu za pripremanje i primjenu ispitivane kemikalije, mora biti takve izrade i kapaciteta da omogući ispravno provođenje ispitivanja uz obnovljivu pokrivenost. Pokrivenost mora biti ujednačena na svim površinama tla. Potrebno je voditi brigu o tome da se izbjegne mogućnost adsorpcije kemikalija na opremu ili njihove reakcije s opremom (npr. plastične cijevi i lipofilne kemikalije ili čelični dijelovi i elementi). Ispitivana se kemikalija raspršuje po površini tla simuliranjem tipične primjene s pomoću prskalice. Količine koje se raspršuju općenito moraju biti u rasponu količina koje se upotrebljavaju u uobičajenoj poljoprivrednoj praksi i treba ih zabilježiti (količina vode itd.). Treba odabrati takvu vrstu mlaznice koja će osigurati ujednačenu pokrivenost površine tla. Ako se primjenjuju otapala i nosači, treba uspostaviti još jednu skupinu kontrolnih biljaka koje će primati samo otapalo/nosač. To nije potrebno za sredstva za zaštitu bilja koja se ispituju kao formulacije. Verifikacija koncentracije / doze primjene ispitivane kemikalije 18. Odgovarajućom analitičkom verifikacijom moraju se potvrditi koncentracije / doze primjene. Za topljive se kemikalije verifikacija svih ispitnih koncentracija / doza primjene može potvrditi analizom ispitne otopine najveće koncentracije, s dokumentacijom o naknadnom razrjeđenju i uporabi kalibrirane opreme za primjenu (npr. kalibrirane analitičke staklene posude i kalibriranje opreme za primjenu škropiva). Za netopljive se kemikalije verifikacija mora poduprijeti masama ispitne kemikalije dodane tlu. Ako je potrebno dokazati homogenost, može biti potrebna analiza tla. POSTUPAK Plan ispitivanja 19. Sjeme iste vrste posije se u uzgojne posude. Broj sjemenki posijanih u pojedinoj posudi ovisit će o vrsti, veličini posude i trajanju ispitivanja. Broj biljaka po posudi mora biti takav da omogući primjerene uvjete rasta i spriječi preveliku gustoću za vrijeme trajanja ispitivanja. Maksimalna gustoća sjemena iznosi oko tri do deset sjemenki na 100 cm2, ovisno o veličini sjemena. Na primjer, preporučuju se jedna do dvije biljke kukuruza, soje, rajčice, krastavca ili šećerne repe po posudi od 15 cm, tri biljke repe ili graška po posudi od 15 cm te pet do deset sjemenki luka, pšenice ili drugog sitnog sjemena po posudi od 15 cm. Broj sjemenki i ponavljanja (ponavljanje se definira kao jedna uzgojna posuda pa biljke u istoj posudi nisu ponavljanje) mora biti takav da osigura optimalnu statističku analizu (21). Valja napomenuti da će varijabilnost biti veća kod ispitnih vrsta za koje se upotrebljava manji broj velikih sjemenki po posudi (ponavljanju) u usporedbi s ispitnim vrstama kod kojih je moguće upotrijebiti veći broj manjih sjemenki po posudi. Sijanjem jednakog broja sjemenki u svaku posudu ta se varijabilnost može smanjiti. 20. Kontrolne se skupine upotrebljavaju kako bi se osiguralo da se uočeni učinci povezuju isključivo s izloženošću ispitivanoj kemikaliji ili da se pripisuju isključivo toj izloženosti. Odgovarajuća kontrolna skupina mora u svakom pogledu biti identična ispitnoj skupini, osim izloženosti ispitivanoj kemikaliji. Unutar određenog ispitivanja sve ispitne biljke, uključujući kontrole, moraju biti iz istog izvora. Kako bi se izbjegla pristranost, ispitne i kontrolne uzgojne posude potrebno je odrediti slučajnim odabirom. 21. Treba izbjegavati sjeme tretirano insekticidom ili fungicidom (tj. ‚obloženo’ sjeme). Međutim, neka regulatorna tijela dopuštaju primjenu određenih nesistemičnih kontaktnih fungicida (npr. kaptana i tirama) (22). Ako postoji zabrinutost zbog patogena koji se prenose sjemenjem, sjeme se može kratko namakati u slaboj petpostotnoj otopini hipoklorita i potom temeljito isprati tekućom vodom te osušiti. Nije dopušteno nikakvo kurativno tretiranje drugim sredstvom za zaštitu bilja. Uvjeti ispitivanja 22. Uvjeti ispitivanja moraju biti približni uvjetima koji su potrebni za normalan rast ispitivanih vrsta i sorti (u Dodatku 4. navedeni su primjeri uvjeta ispitivanja). Iznikle biljke potrebno je održavati u skladu s dobrom hortikulturnom praksom u kontroliranim uvjetima u komorama, fitotronima ili staklenicima. Ako se upotrebljavaju objekti za rast, ta praksa obično uključuje kontrolu i primjereno često (npr. dnevno) bilježenje temperature, vlažnosti, koncentracije ugljičnog dioksida, svjetlosti (intenzitet, valna duljina, fotosintetički aktivno zračenje) te razdoblja svjetlosti, načina zalijevanja itd. kako bi se osigurao dobar rast biljaka koji se ocjenjuje promatranjem kontrolnih biljaka odabranih vrsta. Temperature u stakleniku potrebno je kontrolirati sustavima ventilacije, grijanja i/ili hlađenja. Za ispitivanja u staklenicima općenito se preporučuju sljedeći uvjeti: — temperatura: 22 °C ± 10 °C; — vlaga: 70 % ± 25 %; — fotoperiod: najmanje 16 sati svjetlosti; — intenzitet svjetlosti: 350 ± 50 μE/m2/s. Ako intenzitet padne ispod 200 μE/m2/s, valne duljine 400 – 700 nm, možda će biti potrebno dodatno osvjetljenje, osim za određene vrste čije su potrebe za svjetlošću manje. Tijekom trajanja ispitivanja treba pratiti i bilježiti okolišne uvjete. Biljke je potrebno uzgajati u neporoznim plastičnim ili glaziranim posudama postavljenima na podložak ili tanjurić. Posude se mogu periodično premještati kako bi se smanjila varijabilnost rasta biljaka (zbog razlika u uvjetima ispitivanja unutar objekta za uzgoj). Posude moraju biti dovoljno velike da omoguće normalan rast. 23. Hranjive tvari tla mogu se prema potrebi dopuniti kako bi se održao dobar vigor biljaka. Potreba za dodatnim hranjivim tvarima i vrijeme njihova dodavanja mogu se procijeniti promatranjem kontrolnih biljaka. Preporučuje se zalijevati ispitne posude odozdo (npr. uporabom vrpci od staklenih vlakana). Međutim, prvo zalijevanje može biti površinsko kako bi se potaknulo klijanje sjemena i, kad je riječ o sredstvu koje se primjenjuje po površini tla, kako bi se olakšalo prodiranje kemikalije u tlo. 24. Specifični uvjeti rasta moraju biti primjereni za ispitnu vrstu i ispitivanu kemikaliju. Kontrolne i tretirane biljke moraju se držati u istim okolišnim uvjetima, ali treba poduzeti odgovarajuće mjere za sprječavanje unakrsne izloženosti (npr. zbog hlapljivih kemikalija) među različitim tretmanima, kao i izloženosti kontrola ispitivanoj kemikaliji. Ispitivanje s jednom koncentracijom / dozom primjene 25. Pri određivanju odgovarajuće koncentracije / doze primjene kemikalije koja će se upotrijebiti u testu s jednom koncentracijom ili dozom primjene (test izazova / granični test) mora se uzeti u obzir više faktora. Kad je riječ o kemikalijama u općoj uporabi, ti faktori uključuju njihova fizikalno-kemijska svojstva. Kad je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, potrebno je uzeti u obzir fizikalno-kemijska svojstva i obrazac uporabe ispitivane kemikalije, njezinu maksimalnu koncentraciju ili dozu primjene, broj primjena po sezoni i/ili njezinu postojanost. Da bi se odredilo ima li kemikalija u općoj uporabi fitotoksična svojstva, može biti primjereno ispitati maksimalnu količinu od 1 000 mg/kg suhog tla. Ispitivanje za određivanje raspona 26. Prema potrebi može se provesti ispitivanje za određivanje raspona kako bi se dobile smjernice o tome koje bi koncentracije / doze primjene trebalo ispitati u glavnom istraživanju odnosa između doze i odgovora. Kod ispitivanja za određivanje raspona potrebno je odabrati ispitne koncentracije / doze primjene sa širokim intervalima (npr. 0,1, 1,0, 10, 100 i 1 000 mg/kg suhog tla). Ako je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, koncentracije / doze primjene mogu se temeljiti na preporučenoj ili maksimalnoj koncentraciji odnosno dozi primjene, npr. 1/100, 1/10, 1/1 preporučene/maksimalne koncentracije ili doze primjene. Ispitivanje s više koncentracija / doza primjene 27. Svrha je ispitivanja s više koncentracija / doza primjene utvrditi odnos između doze i odgovora te odrediti vrijednost ECx ili ERx za nicanje, biomasu i/ili vizualne učinke u usporedbi s neizloženim kontrolama, kako to zahtijevaju regulatorna tijela. 28. Broj i interval između koncentracija ili doza primjene moraju biti dovoljni da se može pouzdano utvrditi odnos između doze i odgovora i regresijska jednadžba te procijeniti vrijednost ECx. ili ERx.. Odabrane koncentracije / doze primjene moraju obuhvaćati vrijednosti ECx ili ERx koje je potrebno odrediti. Na primjer, ako se traži vrijednost EC50, poželjno je provesti ispitivanje s dozama primjene koje proizvode 20-postotni do 80-postotni učinak. Da bi se to postiglo, preporučuje se najmanje pet ispitnih koncentracija / doza primjene u geometrijskom nizu, plus netretirana kontrola, s faktorom ne većim od tri. Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu potrebna su najmanje četiri ponavljanja, a ukupan broj sjemenki mora iznositi najmanje 20. Za određene biljke koje imaju nizak stupanj klijavosti ili promjenjive značajke rasta ponekad je potrebno više ponavljanja kako bi se povećala statistička snaga ispitivanja. Ako se upotrebljava veći broj ispitnih koncentracija / doza primjene, broj ponavljanja može se smanjiti. Ako treba odrediti NOEC, možda će biti potrebno više ponavljanja kako bi se postigla željena statistička snaga (23). Promatranja 29. Razdoblje promatranja, tj. 14 do 21 dan nakon što nikne 50 % kontrolnih biljaka (i kontrola s otapalom, ako je primjenjivo), biljke se učestalo promatraju (najmanje jednom tjedno, a po mogućnosti svakodnevno) kako bi se provjerilo njihovo nicanje te ima li vidljivih znakova fitotoksičnosti i slučajeva uginuća. Na kraju ispitivanja treba zabilježiti izmjereni postotak nicanja te biomasu preživjelih biljaka, kao i štetne učinke vidljive na različitim dijelovima biljke. Štetni učinci uključuju anomalije u izgledu izniklih klijanaca, zakržljali rast, promjenu boje, uginuće te učinke na razvoj biljke. Konačna se biomasa može izmjeriti primjenom konačne prosječne mase suhe tvari izdanka preživjelih biljaka, i to tako da se izdanci uberu pri površini tla te suše do stalne mase na temperaturi od 60 °C. Alternativno, konačna se biomasa može izmjeriti na temelju mase svježe tvari. Druga krajnja točka može biti visina izdanka, ako to zahtijevaju regulatorna tijela. Za ocjenjivanje uočenih toksičnih odgovora potrebno je primjenjivati ujednačeni sustav ocjenjivanja. Praktični primjeri kvalitativnih i kvantitativnih vizualnih ocjenjivanja navedeni su u literaturi (23) (24). PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Statistička analiza Ispitivanje s jednom koncentracijom / dozom primjene 30. Primjerenom statističkom metodom potrebno je analizirati podatke za svaku biljnu vrstu (21). Potrebno je izvijestiti o razini učinka pri ispitnoj koncentraciji / dozi primjene ili o nepostizanju određenog učinka pri ispitnoj koncentraciji / dozi primjene (npr. < x % učinka uočenog pri koncentraciji / dozi primjene y) Ispitivanje s više koncentracija / doza primjene 31. Odnos između doze i odgovora utvrđuje se regresijskom jednadžbom. Mogu se upotrijebiti različiti modeli: na primjer, za procjenu vrijednosti ECx ili ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) i njihovih granica pouzdanosti za nicanje, u obliku kvantalnih podataka, mogu biti prikladni modeli logit, probit i Weibull te Spearman-Karberova metoda i modificirana Spearman-Karberova metoda. Za rast klijanaca (masa i visina) kao stalnih krajnjih točaka, ECx ili ERx i njihove granice pouzdanosti mogu se procijeniti primjenom odgovarajuće regresijske analize (npr. Bruce-Versteegove nelinearne regresijske analize (25)). Kad je god moguće, vrijednost R2 trebala bi iznositi 0,7 ili više za najosjetljivije vrste, a upotrijebljene ispitne koncentracije / doze primjene moraju obuhvaćati 20 % do 80 % učinaka. Ako je potrebno procijeniti NOEC, poželjno je primijeniti snažne statističke testove koje treba odabrati na temelju distribucije podataka (21) (26). Izvješće o ispitivanju 32. U izvješću o ispitivanju potrebno je navesti rezultate ispitivanja te detaljan opis uvjeta ispitivanja, iscrpnu raspravu o rezultatima, analizu podataka i zaključke izvučene iz analize. Potrebno je navesti sažetak u obliku tablice i sintezu rezultata. Izvješće mora sadržavati sljedeće: Ispitivana kemikalija: — podaci za identifikaciju kemikalije, relevantna svojstva ispitivane kemikalije (npr. log Pow, topljivost u vodi, tlak para te podaci o sudbini i ponašanju u okolišu, ako su dostupni), — pojedinosti o pripremi ispitne otopine i verifikaciji ispitnih koncentracija, kako je navedeno u stavku 18. Ispitne vrste: — pojedinosti o ispitnom organizmu: vrsta/sorta, biljne porodice, znanstveni i uobičajeni nazivi, izvor i povijest sjemena što je moguće detaljnije (tj. ime dobavljača, postotak klijavosti, kategorija veličine sjemena, broj serije ili partije, sjemena godina ili vegetacijsko razdoblje u kojemu je prikupljeno, datum ocjenjivanja klijavosti), vitalnost itd., — broj ispitanih vrsta jednosupnica i dvosupnica, — razlozi za odabir vrsta, — opis skladištenja, tretiranja i održavanja sjemena. Uvjeti ispitivanja: — objekt u kojemu se provelo ispitivanje (npr. uzgojna komora, fitotron i staklenik), — opis ispitnog sustava (npr. dimenzije uzgojnih posuda, materijal od kojeg su napravljene uzgojne posude te količine zemlje), — svojstva zemlje (tekstura ili vrsta zemlje: distribucija i klasifikacija čestica zemlje, fizikalna i kemijska svojstva, uključujući postotak organske tvari, postotak organskog ugljika i pH); — priprema zemlje/supstrata (npr. tlo, umjetno tlo, pijesak i ostalo) prije ispitivanja, — opis hranjivog medija, ako je upotrijebljen, — primjena ispitivane kemikalije: opis metode primjene, opis opreme, doza izloženosti i količina, uključujući kemijski provjeru, opis metode umjeravanja i opis okolišnih uvjeta tijekom primjene, — uvjeti rasta: intenzitet svjetlosti (npr. PAR, fotosintetički aktivno zračenje), fotoperiod, najviše/najniže temperature, raspored i metoda zalijevanja, gnojenje, — broj sjemenki po uzgojnoj posudi, broj biljaka po dozi, broj ponavljanja (uzgojnih posuda) po dozi izloženosti, — vrsta i broj kontrola (negativne i/ili pozitivne kontrole te kontrola s otapalom, ako je upotrijebljena), — trajanje ispitivanja. Rezultati: — tablica svih krajnjih točaka za svako ponavljanje, ispitnu koncentraciju / stupanj i vrstu, — broj i postotak izniklih klijanaca u usporedbi s kontrolama, — mjerenja biomase biljaka (suha ili svježa masa izdanaka) izražena kao postotak kontrola, — visine izdanaka biljaka izražene kao postotak kontrola, ako su izmjerene, — postotak vidljivih oštećenja te kvalitativan i kvantitativan opis vidljivih oštećenja (kloroza, nekroza, uvenuće, deformacije lista i stabljike, kao i svako nepostojanje učinaka) koje je uzrokovala ispitna kemikalija, u usporedbi s kontrolnim biljkama, — opis ljestvice ocjenjivanja primijenjene za procjenu vidljivih oštećenja, ako se izvješćuje o vizualnom ocjenjivanju, — za ispitivanja s jednom dozom primjene treba navesti postotak oštećenja, — vrijednosti ECx ili ERx (npr. EC50, ER50, EC25, ER25) i pripadajuće granice pouzdanosti. Ako se provodi regresijska analiza, navodi se standardna pogreška za regresijsku jednadžbu te standardna pogreška za procjenu pojedinačnih parametara (npr. nagiba, sjecišta), — vrijednosti NOEC (i LOEC) ako su izračunane, — opis primijenjenih statističkih postupaka i pretpostavki, — grafički prikaz navedenih podataka i odnosa između doze i odgovora ispitnih vrsta. Odstupanja od postupaka opisanih u ovoj ispitnoj metodi i sve neuobičajene pojave tijekom ispitivanja. LITERATURA (1) Schrader G., Metge K. i Bahadir M. (1998.) Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189 – 193. (2) International Organisation of Standards. (1993.) ISO 11269-1. Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995.) ISO 11269-2. Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002.) E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) US EPA. (1982.) FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996.) OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982.) Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993.) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K. E. i Keddy, C. J. (1993.) Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C. i Zwerger, P. (1997.) Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No. 48. (10) Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K. i Stephenson, G. (1994.) A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985.) i Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962.) (12) Audus, L. J. (1964.) Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L. J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, poglavlje 5., str. 163. – 206. (13) Beall, M. L., Jr. i Nash, R. G. (1969.) Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G. D., Kenney, D. R. i Chesters, G. (1969.) Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U. S. Food and Drug Administration (FDA). (1987.) Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, str. 14, FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L. i Warren, L. W. (2002.) A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. i Kjær, C. (2004.) Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349 – 369. (18) Boutin, C. i Rogers, C. A. (2000.) Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255-271. (19) Boutin, C. i Harper, J. L. (1991.) A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H. B., Peart, T. E., Batchelor, S. P. i Maguire, R. J.. (2000.) Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532 – 2541. (21) OECD (2006.) Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K. K. i Penner, D. (1985.) Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P. B., Marriage, P. B. i Friesen, G. (1977.) A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R. E. i Talbert, R. E. (1992.) Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2. izdanje, Southern weed Science Society, Auburn, 15 – 23. (25) Bruce, R. D. i Versteeg, D. J. (1992.) A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485 – 1492. (26) Poglavlje C.33. ovog Priloga: Test reproduktivne toksičnosti na gujavicama (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Dodatak 1. Definicije Aktivni sastojak (a. s.) (ili aktivna tvar (a. t.)): materijal namijenjen postizanju posebnog biološkog učinka (npr. suzbijanje kukaca, suzbijanje bolesti bilja, suzbijanje korova na području tretiranja), poznat i kao tehnički aktivni sastojak ili tehnička aktivna tvar. Kemikalija znači tvar ili smjesa. Proizvodi za zaštitu usjeva (PZU) ili sredstva za zaštitu bilja (SZB) ili pesticidi: materijali koji imaju specifično biološko djelovanje i namjerno se primjenjuju radi zaštite usjeva od nametnika (npr. gljivičnih bolesti, kukaca i kompetitivnih biljaka). ECx. koncentracija s x-postotnim učinkom ili ERx. doza s x-postotnim učinkom: koncentracija ili doza koja dovodi do x-postotne neželjene promjene u ispitnoj krajnjoj točki koja se mjeri u odnosu na kontrolu (npr. 25-postotno ili 50-postotno smanjenje broja izniklih klijanaca, mase izdanaka, konačnog broja prisutnih biljaka ili 25-postotno ili 50-postotno povećanje vidljivih oštećenja daje EC25/ER25 odnosno EC50/ER50). Nicanje: pojava koleoptila ili kotiledona iznad površine tla. Formulacija: komercijalno formulirano sredstvo koje sadržava aktivnu tvar (aktivni sastojak), poznato i kao konačni pripravak (8) ili tipični proizvod za krajnju uporabu (eng. typical end-use product (TEP)). LOEC (najniža koncentracija s vidljivim učinkom): najniža koncentracija ispitivane kemikalije pri kojoj je uočen učinak. U ovom ispitivanju koncentracija koja odgovara LOEC-u ima statistički značajan učinak (p < 0,05) unutar zadanog razdoblja izloženosti u usporedbi s kontrolom i veća je od vrijednosti NOEC-a. Biljke koje ne pripadaju ciljanoj skupini: biljke izvan područja na kojemu se nalaze ciljane biljke. Kad je riječ o sredstvima za zaštitu bilja, to se obično odnosi na biljke izvan područja na kojemu se provodi tretiranje. NOEC (najviša koncentracija bez vidljivog učinka): najviša koncentracija ispitivane kemikalije pri kojoj nije uočen nikakav učinak. U ovom ispitivanju koncentracija koja odgovara NOEC-u nema statistički značajan učinak (p < 0,05) unutar zadanog razdoblja izloženosti u usporedbi s kontrolom. Fitotoksičnost: štetna odstupanja (prema izmjerenim vrijednostima ili vizualnoj procjeni) od normalnog izgleda i načina rasta biljaka koja se javljaju kao reakcija na određenu kemikaliju. Ponavljanje: pokusna jedinica koja predstavlja kontrolnu skupinu i/ili skupinu koja se tretira. U ovom se ispitivanju uzgojna posuda definira kao ponavljanje. Vizualna procjena: ocjenjivanje vidljivih oštećenja na temelju promatranja sklopa i vigora biljaka, deformacija, kloroze, nekroze i cjelokupnog izgleda u usporedbi s kontrolom. Ispitivana kemikalija: bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode. Dodatak 2. Popis vrsta koje se obično upotrebljavaju u ispitivanjima na biljkama Porodica Vrsta Uobičajeni nazivi DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Mrkva Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Suncokret Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Zelena salata Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Gorušica bijela Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Kineski kupus Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Uljana repica Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Kupus Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Postrna repa Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Vrtni borovnjak Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Rotkvica Chenopodiaceae Beta vulgaris Šećerna repa Cucurbitaceae Cucumis sativus Krastavac Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soja za zrno Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungo grah Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Grah Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Grašak Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Piskavica (grčka djetelina) Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Smiljkita roškasta Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Djetelina crvena Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Grahorica jara Linaceae Linum usitatissimum Lan Polygonaceae Fagopyrum esculentum Heljda Solanaceae Solanum lycopersicon Rajčica MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Luk Poaceae (Gramineae) Avena sativa Zob Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Ječam Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Ljulj engleski Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Riža Poaceae (Gramineae) Secale cereale Raž Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Stočni sirak Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Pšenica Poaceae (Gramineae) Zea mays Kukuruz Dodatak 3. Popis mogućih nepoljoprivrednih vrsta Vrste koje je prema OECD-u moguće upotrebljavati za ispitivanje toksičnosti za bilje Napomena: U sljedećoj su tablici navedeni podaci za 52 nepoljoprivredne vrste (kod svakog je unosa u zagradama navedeno upućivanje na literaturu). Navedene stope nicanja uzete su iz objavljene literature i služe samo za opću orijentaciju. Pojedinačno iskustvo može varirati ovisno o izvoru sjemena i drugim faktorima. PORODICA Botanički naziv vrste (Uobičajeni hrvatski naziv) Životni vijek (9) i stanište Težina sjemena (mg) Fotoperiod za klijanje ili rast (10) Dubina sadnje (mm) (11) Vrijeme potrebno za klijanje (u danima) (12) Posebna obrada (13) Test toksičnosti (14) Dobavljači sjemena (15) Ostala upućivanja (16) APIACEAE Torilis japónica (kimljen divlji) J, D poremećena područja, živice, pašnjaci (16, 19) 1,7 – 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) hladna stratifikacija (7, 14, 18, 19), može biti potrebno dozrijevanje (19), klijanje inhibirano tamom (1, 19), nikakva posebna obrada (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (tratinčica) V travnjaci, oranice, ledine (16, 19) 0,09 – 0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) zračenje ne utječe na klijanje (18, 19), nikakva posebna obrada (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (različak) J polja, uz ceste, otvorena staništa (16) 4,1 – 4,9 (4, 14) L = D (14) 0 – 3 (2, 4, 14) 14 – 21 (100 %) (14) nikakva posebna obrada (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (crna zečina) V polja, uz ceste, otvorena staništa (16, 19) 2,4 – 2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) može biti potrebno dozrijevanje (18, 19), klijanje inhibirano tamom (19), nikakva posebna obrada (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (pravi oman) V vlažna, poremećena mjesta (16) 1 – 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) nikakva posebna obrada (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (lavlji zub) V polja, uz ceste, poremećena područja (16, 19) 0,85 – 1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) klijanje inhibirano tamom (17, 18, 19), nikakva posebna obrada (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (crnooka pupavica) D, V poremećena područja (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) nikakva posebna obrada (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (gustocvjetna zlatnica) V pašnjaci, otvorena područja (16) 0,06 – 0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14 – 21 (11) pomiješati s jednakom količinom pijeska i namakati u 500 ppm GA 24 sata (11), nikakva posebna obrada (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (dikica) J polja, otvorena staništa (16) 25 – 61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) klijanje može biti inhibirano tamom (1), namakati u toploj vodi 12 sati (29) PRE i POST (31) A Xanthium spinosum (trnovita dikica) J otvorena staništa (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) skarifikacija (14), nikakva posebna obrada (6) PRE i POST (6) A Xanthium strumarium (obična dikica) J polja, otvorena staništa (16) 67,4 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 21) nikakva posebna obrada (6, 14, 21) PRE i POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (livadna režuha) V polja, uz ceste, livade (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) klijanje inhibirano tamom (18, 19), nikakva posebna obrada (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (drijemnina) V (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) može biti potrebno dozrijevanje (18), nikakva posebna obrada (5, 14, 15, 22 – 26) POST (5, 15, 22 – 26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (bijela loboda) J rubovi polja, poremećena područja (16, 19) 0,7 – 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) obrada se razlikuje ovisno o boji sjemena (19), dormantnost pri suhom skladištenju (19), klijanje inhibirano tamom (1, 18, 19), hladna stratifikacija (18), nikakva posebna obrada (14, 34) PRE i POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (rupičasta pljuskavica) V polja, oranice, otvorena staništa (16, 19) 0,1 – 0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) klijanje inhibirano tamom (1, 18, 19), nikakva posebna obrada (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (vrtni slak) J uz ceste, otvorena staništa, kukuruzna polja (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10 – 20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) zračenje ne utječe na klijanje (1), nikakva posebna obrada (6, 21) PRE i POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (okruglasti oštrik) V oranice, pašnjaci, uz ceste (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10 – 20 (6, 10) 12 (91 %) (10) klijanje inhibirano tamom (1), nikakva posebna obrada (6, 10, 14) PRE i POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (smiljkita roškasta) V travnata područja, uz ceste, otvorena staništa (16, 19) 1 – 1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikacija (14, 19), zračenje ne utječe na klijanje (18, 19), nikakva posebna obrada (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (sena) J vlažne šume (16) 23 – 28 (9) L = D (14) L > D (9) 10 – 20 (6, 9) namakati sjeme u vodi 24 sata (9), skarifikacija (14), vijabilnost sjemena razlikuje se ovisno o boji (1), nikakva posebna obrada (6) POST (6, 9) A Sesbania exaltata (konoplja) J aluvijalno tlo (16) 11 – 13 (9, 14) L > D (9) 10 – 20 (9, 21) namakati sjeme u vodi 24 sata (9), zračenje ne utječe na klijanje (1), nikakva posebna obrada (21) PRE i POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (djetelina crvena) V polja, uz ceste, oranice (16, 19) 1,4 – 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikacija (14, 18), može biti potrebno dozrijevanje (19), zračenje ne utječe na klijanje (1, 19), nikakva posebna obrada (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (prava srčenica) V otvorena područja (16) 0,75 – 1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) nikakva posebna obrada (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (klasasta metvica) V vlažna područja (16) 2,21 (4) 0 (4) nikakva posebna obrada (4) POST (4) F Nepeta cataria (prava mačja metvica) V poremećena područja (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) nikakva posebna obrada (2, 4, 14) POST (2, 4) F Prunella vulgaris (obična celinščica) V oranice, travnata područja, poremećena mjesta (16, 19) 0,58 – 1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) klijanje inhibirano tamom (18, 19), veća klijavost kod većih sjemenki (1 ), nikakva posebna obrada (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (ljekoviti čistac) V travnjaci, rubovi polja (19) 14 – 18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) nikakva posebna obrada (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (Teofrastov mračnjak) J polja, otvorena staništa (16) 8,8 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) skarifikacija (14), nikakva posebna obrada (5, 10, 21) PRE i POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (/) J polja, uz ceste (16) 3,8 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 21) skarifikacija (14), zračenje ne utječe na klijanje (1), nikakva posebna obrada (6, 21) PRE i POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (mak turčinak) J polja, oranice, poremećena mjesta (16, 19) 0,1 – 0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) hladna stratifikacija i skarifikacija (1, 19, 32), nikakva posebna obrada (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (obična rosulja) tratine, pašnjaci (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) klijanje inhibirano tamom (1, 17 – 19), nikakva posebna obrada (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (poljski repak) J polja, otvorena staništa (16) 0,9 – 1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) skarifikacija (14), tretirati sa 101 mg/l KNO3 (14), topla stratifikacija (1) klijanje inhibirano tamom (1) nikakva posebna obrada (34) PRE i POST (28, 34) A 32 Avena fatua (štura zob) J obrađena područja, otvorena staništa (16) 7 – 37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10 – 20 (6, 10) 3 (70 %) (18) skarifikacija (7, 32), tama inhibira klijanje (1), hladna stratifikacija (1, 18), nikakva posebna obrada (6, 10, 14) PRE i POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (krovni ovsik) J polja, uz ceste, oranice (16) 0,45 – 2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) razdoblje dozrijevanja (1, 7, 32), klijanje inhibirano svjetlošću (1), nikakva posebna obrada (14) PRE i POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (livadni krestac) V polja, uz ceste, otvorena staništa (16, 19) 0,5 – 0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) zračenje ne utječe na klijanje (19), nikakva posebna obrada (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (ljubičasta svračica) J polja, ledine, otvorena staništa (16) 0,52 – 0,6 (14, 30) L = D (14) 10 – 20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) skarifikacija, hladna stratifikacija i dozrijevanje (1, 7, 14, 32), tretirati sa 101 mg/L KNO3 (14), klijanje inhibirano tamom (1), nikakva posebna obrada (21) PRE i POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (kokošje proso) J (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10 – 20 (7, 21) skarifikacija (7, 32), zračenje ne utječe na klijanje (1), nikakva posebna obrada (3, 14, 21) PRE i POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (kanadska pirika) V riječne obale, poremećena područja (16) 4 – 5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14 – 28 (11) nikakva posebna obrada (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (livadna vlasulja) V polja, vlažna područja (16, 19) 1,53 – 2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) nikakva posebna obrada (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusilium (mali ječam) J pašnjaci, uz ceste, otvorena staništa (16) 3,28 (14) topla stratifikacija (1), zračenje ne utječe na klijanje (1) PRE (31) 7 Phieum pratense (mačji repak) V pašnjaci, oranice, poremećena mjesta (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0 – 10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) klijanje inhibirano tamom (19), zračenje ne utječe na klijanje (17), nikakva posebna obrada (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (povijajuća heljda) J otvorena staništa, uz ceste (16) 5 – 8 (4, 14, 29) L = D (20) 0 – 2 (4, 29) hladna stratifikacija 4 – 8 tjedana (1, 2, 4, 20, 29), zračenje ne utječe na klijanje (1) PRE i POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (kiseličasti dvornik) J vlažno tlo (16) 1,8 – 2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) zračenje ne utječe na klijanje (1), klijanje inhibirano tamom (18), hladna stratifikacija (1), nikakva posebna obrada (5) PRE i POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (/) J polja, otvorena staništa (16) 3,6 – 7 (14, 29) 2 (29) hladna stratifikacija 4 tjedana na 0 – 5 °C (1, 29), klijanje inhibirano tamom (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (pjegasti dvornik) J poremećena područja, oranice (16, 19) 2,1 – 2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) skarifikacija, hladna stratifikacija, tretiranje s GA (14), hladna stratifikacija, dozrijevanje (17 – 19) klijanje inhibirano tamom (19) nikakva posebna obrada (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (kovrčava kiselica) V oranice, uz ceste, otvorena područja (16, 19) 1,3 – 1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) klijanje inhibirano tamom (18, 19), može biti potrebno dozrijevanje (18), nikakva posebna obrada (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (modra krivičica) J oranice, otvorena područja, poremećena mjesta (16, 19) 0,4 – 0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) hladna stratifikacija, tretiranje s GA (1,14, 18, 19, 32), za klijanje je potrebna svjetlost (1), nikakva posebna obrada (2, 4) POST (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (žabnjak ljutić) V oranice, uz ceste, otvorena područja (16, 19) 1,5 – 2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 – 56 (19, 29) nikakva posebna obrada (5, 14, 22, 24 – 26) POST (5, 22, 24 – 26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (pravi blaženak) V živice, vlažna područja (16, 19) 0,8 – 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) klijanje inhibirano tamom (18, 19), topla stratifikacija (1), nikakva posebna obrada (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (čekinjasta broćika) J oranice, vlažna područja, poremećena mjesta (16, 19) 7 – 9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) hladna stratifikacija (1, 18, 19), zračenje ne utječe na klijanje (18, 19), svjetlost inhibira klijanje (1), nikakva posebna obrada (6, 14) PRE i POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (livadna broćika) V živice, otvorena područja (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) nikakva posebna obrada (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (grimizni naprstak) J, V, živice, otvorena područja (16, 19) 0,1 – 0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) klijanje inhibirano tamom (1, 17 – 19), nikakva posebna obrada (4, 22 – 26) POST (4, 22 – 26) D, G, F Veronica persica (perzijska čestoslavica) J oranice, otvorena područja, poremećena mjesta (16, 19) 0,5 – 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) klijanje inhibirano tamom (18, 19), hladna stratifikacija (18), nikakva posebna obrada (14) PRE i POST (28) A 32 Navedeni dobavljači sjemena Oznaka dobavljača Podaci o dobavljaču A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLESKA +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 SAD (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 SAD (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 SAD (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLESKA +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com CITIRANA LITERATURA (1) Baskin, C. C. i Baskin, J. M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L. G. i Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H. B., Peart, T., Batchelor, P. S., i Maguire, R. J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N. i Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G. i Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R. A. i Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. U: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang i M.A. Lewis, ur. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. str. 197. – 208. (7) Buhler, D. D. i Hoffman, M. L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A. R., Tutin, T. G. i Warburg, E. F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3. izdanje. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P. A. i Griffin, J. L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J. F. H. i Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. str. 151. – 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Osobna komunikacija. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J. S., Johnson, F. L. i McFarlane, J. C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H.C. i Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R. M. i Dickie, J. B. 2004. Seed Information Database (izdanje 6.0, listopad 2004.) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H. A. i Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2. izdanje, New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J. P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M. i Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J. P., Hodgson, J. G. i Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T. E., King, C. A. i Oliver, L. R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J. i Plant, R. A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R. H., Frost, A. J. & Plant, R. A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R. H., Frost, A. J. i Plant, R. A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A. i Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R. H. i Frost, A. J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E. J. P. i Bernie, J. E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. str. 1021. – 1028. (28) McKelvey, R. A., Wright, J. P. i Honegger, J. L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Osobna komunikacija. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, verzija3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) US EPA. 1999. One-Liner Database. [US EPA/Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R. H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. i Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Osobna komunikacija. (34) Zwerger, P. i Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Dodatak 4. Primjeri odgovarajućih uvjeta rasta za određene poljoprivredne vrste Pokazalo se da su sljedeći uvjeti prikladni za deset poljoprivrednih vrsta i mogu služiti i kao smjernica za ispitivanja u uzgojnim komorama na nekim drugim vrstama: Koncentracija ugljičnog dioksida: 350 ± 50 ppm; Relativna vlažnost: 70 ± 5 % u razdobljima svjetla i 90 ± 5 % u razdobljima mraka; Temperatura: 25 ± 3 °C tijekom dana, 20 ± 3 °C tijekom noći; Fotoperiod: 16 sati svjetla / osam sati mraka, uz pretpostavku prosječne valne duljine od 400 do 700 nm; Svjetlo: osvjetljenje od 350 ± 50 μE/m2/s, mjereno na vrhu nadzemnog dijela biljke. Predmetne su poljoprivredne vrste: — rajčica (Solanum lycopersicon), — krastavac (Cucumis sativus), — zelena salata (Lactuca sativa), — soja (Glycine max), — kupus (Brassica oleracea var. capitata), — mrkva (Daucus carota), — zob (Avena sativa), — višegodišnji ljulj (Lolium perenne), — kukuruz (Zea mays), — luk (Allium cepa). C.32. TEST REPRODUKTIVNE TOKSIČNOSTI NA ENHITREJAMA UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 220 (2004.). Namijenjena je procjeni učinaka kemikalija na reprodukcijsku uspješnost crva iz porodice enhitreja, Enchytraeus albidus Henle 1873., u tlu. Uglavnom se temelji na metodi koju je razvio Umweltbundesamt (Njemačka) (1) koja bila ispitana u prstenastom testu (2). Razmotrene su i druge metode ispitivanja toksičnosti kemikalija za enhitreje i gujavice (3) (4) (5) (6) (7) (8). POČETNA RAZMATRANJA 2. Kolutićavci koji žive u tlu i pripadaju rodu Enchytraeus ekološki su relevantne vrste za ekotoksikološka ispitivanja. Iako enhitreji često nastanjuju tla koja sadržavaju gujavice, njima isto tako obiluju i mnoga tla u kojima nema gujavica. Enhitreji se mogu upotrebljavati u laboratorijskim ispitivanjima, kao i u poluterenskim i terenskim istraživanjima. S praktične točke gledišta, enhitrejima je lako rukovati i lako ih je uzgajati te im je generacijsko vrijeme kraće nego kod gujavica. Stoga ispitivanje reproduktivne toksičnosti na erhitrejama traje samo četiri do šest tjedana, dok kod gujavica (Eisenia fetida) traje osam tjedana. 3. Osnovne informacije o ekologiji i ekotoksikologiji enhitreja u kopnenom okolišu mogu se pronaći u literaturi (9) (10) (11) (12). NAČELO ISPITIVANJA 4. Odrasli crvi enhitreja izlažu se nizu koncentracija ispitivane kemikalije umiješane u umjetno tlo. Ispitivanje se može podijeliti u dvije faze: (a) ispitivanje za određivanje raspona, koje se provodi u slučaju kad nema dovoljno informacija i u kojem je smrtnost glavna krajnja točka koja se procjenjuje nakon dvotjedne izloženosti te (b) glavno ispitivanje reproduktivne toksičnosti u kojem se procjenjuje ukupan broj mladih po roditeljskoj životinji i preživljavanje roditeljskih životinja. Glavno ispitivanje traje šest tjedana. Nakon prva tri tjedna odrasli se crvi vade i bilježe se morfološke promjene. Nakon dodatna tri tjedna utvrđuje se broj potomaka koji su se izvalili iz kokona što su ih proizvele odrasle jedinke. Reprodukcijska uspješnost životinja izloženih ispitivanoj kemikaliji uspoređuje se s kontrolom odnosno kontrolama kako bi se odredila (i) najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC) i/ili (ii) ECx (npr. EC10, EC50) primjenom regresijskog modela kako bi se procijenila koncentracija koja bi izazvala x-postotno smanjenje reprodukcijske uspješnosti. Ispitne koncentracije moraju obuhvaćati ECx (npr. EC10, EC50) tako da se ECx potom može dobiti interpolacijom, a ne ekstrapolacijom. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI 5. Po mogućnosti moraju biti poznati topljivost u vodi, log Kow, koeficijent razdjeljenja između tla i vode (npr. poglavlje C.18. ili C.19. ovog Priloga) te tlak para ispitivane kemikalije. Poželjno je imati i dodatne informacije o sudbini ispitivane kemikalije u tlu, kao što su brzina fotolize i hidrolize. 6. Ova se ispitna metoda može upotrebljavati za kemikalije koje su topljive, kao i za one koje nisu topljive u vodi. Ovisno o tome, razlikovat će se i način primjene ispitivane kemikalije. Ova ispitna metoda nije primjenljiva na hlapljive kemikalije, tj. kemikalije za koje su Henryjeva konstanta ili koeficijent razdjeljenja između zraka i vode veći od jedan ili kemikalije čiji je tlak para veći od 0,0133 Pa pri 25 °C. VALJANOST ISPITIVANJA 7. Da bi ispitivanje bilo valjano, kontrole moraju zadovoljavati sljedeće provedbene kriterije: — smrtnost odraslih jedinki ne smije biti veća od 20 % na kraju ispitivanja za određivanje raspona te nakon prva tri tjedna ispitivanja reproduktivne toksičnosti, — pod pretpostavkom da je ispitivanje započeto s 10 odraslih jedinki po posudi, na kraju ispitivanja mora biti prosječno najmanje 25 mladih jedinki po posudi. — koeficijent varijacije oko srednje vrijednosti broja mladih jedinki ne smije biti veći od 50 % na kraju ispitivanja reproduktivne toksičnosti. Ako ispitivanje ne ispuni navedene kriterije valjanosti, potrebno ga je prekinuti, osim ako postoji opravdanje za njegov nastavak. To je opravdanje potrebno navesti u izvješću o ispitivanju. REFERENTNA KEMIKALIJA 8. Referentnu kemikaliju potrebno je ispitivati u redovitim vremenskim razmacima ili je se može uključiti u svaki test kako bi se provjerilo da se odgovor ispitnih organizama nije značajno promijenio tijekom vremena. Prikladna je referentna kemikalija karbendazim, za koji je dokazano da utječe na preživljavanje i razmnožavanje enhitreja (13) (14), a mogu se upotrebljavati i druge kemikalije za koje su podaci o toksičnosti dobro poznati. Formulacija karbendazima, poznata pod trgovačkim nazivom Derosal ™ koju isporučuje AgrEvo Company (Frankfurt, Njemačka) i koja sadržava 360 g/l (32,18 %) aktivnog sastojka, upotrijebljena je u prstenastom ispitivanju (2). Vrijednost EC50 za razmnožavanje koja je utvrđena prstenastim ispitivanjem bila je u rasponu od 1,2 ± 0,8 mg aktivnog sastojka (a. s.) / kg suhe mase (2). Ako se u ispitni niz uključi pozitivan toksični standard, upotrebljava se jedna koncentracija i jednak broj ponavljanja kao i kod kontrola. Za karbendazim se preporučuje ispitivanje 1,2 mg a. s. / kg suhe mase (ispitano u obliku tekuće formulacije). OPIS ISPITIVANJA Oprema 9. Ispitne posude moraju biti od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Prikladne su staklenke (npr. zapremina: 0,20 – 0,25 l; promjer: ≈ 6 cm). Posude moraju imati proziran poklopac (npr. od stakla ili polietilena) koji je tako napravljen da smanjuje isparavanje vode i istodobno omogućuje izmjenu plinova između tla i atmosfere. Poklopci moraju biti prozirni da omoguće prolaz svjetla. 10. Potrebna je uobičajena laboratorijska oprema, a posebno: — ormar za sušenje, — stereomikroskop, — pH-metar i fotometar, — prikladne precizne vage, — odgovarajuća oprema za kontrolu temperature, — odgovarajuća oprema za kontrolu vlage (nije nužna ako ispitne posude imaju poklopce), — inkubator ili manja prostorija opremljena klimatizacijskim uređajem, — pincete, kuke ili petlje, — kada za razvijanje fotografija. Pripremanje umjetnog tla 11. U ovom se ispitivanju upotrebljava umjetno tlo (5) (7) sljedećeg sastava (na bazi suhe mase, osušene do stalne mase pri 105 °C): — 10 % sphagnum treseta, osušenog na zraku i fino usitnjenog (prihvatljive su čestice veličine 2 ± 1 mm); prije uporabe preporučljivo je provjeriti je li tlo koje je pripremljeno od svježe serije treseta prikladno za uzgoj crva, — 20 % kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogućnosti iznad 30 %), — približno 0,3 do 1,0 % kalcijeva karbonata (CaCO3, u prahu, analitičkog stupnja čistoće) da bi se dobio pH od 6,0 ± 0,5; količina kalcijeva karbonata koju je potrebno dodati može u prvom redu ovisiti o kvaliteti/prirodi treseta, — oko 70 % kremenog pijeska sušenog na zraku (ovisno o potrebnoj količini CaCO3), pretežno finog pijeska s više od 50 % čestica veličine između 50 i 200 mikrona. Prije nego što se umjetno tlo upotrijebi u glavnom ispitivanju, preporučljivo je dokazati da je takvo tlo prikladno za uzgoj crva i da omogućuje ispunjenje kriterija valjanosti ispitivanja. Posebno se preporučuje izvršiti takvu provjeru kako bi se osiguralo da uspješnost ispitivanja neće biti ugrožena ako se smanji sadržaj organskog ugljika u umjetnom tlu, npr. smanjenjem sadržaja treseta na 4 do 5 % i odgovarajućim povećanjem sadržaja pijeska. Takvim smanjenjem sadržaja organskog ugljika može se smanjiti mogućnost adsorpcije ispitivane kemikalije u tlo (organski ugljik) te se može povećati dostupnost ispitivane kemikalije crvima. Pokazalo se da Enchytraeus albidus može ispuniti kriterije valjanosti koji se odnose na razmnožavanje kada se ispituje u tlima u kojima je sadržaj organskog ugljika manji od navedenog (npr. 2,7 %) (15), a iskustvo, iako ograničeno, pokazuje da se to može postići i s umjetnim tlom s 5 % treseta. Napomena: Ako se u dodatnim ispitivanjima (npr. ispitivanjima višeg stupnja) upotrebljava prirodno tlo, isto je tako potrebno dokazati prikladnost tla i ispunjenje kriterija valjanosti ispitivanja. 12. Suhi sastojci tla temeljito se izmiješaju (npr. u velikoj laboratorijskoj miješalici). To treba učiniti najmanje tjedan dana prije početka ispitivanja. Izmiješano tlo potrebno je držati pohranjeno dva dana kako bi se uravnotežila/stabilizirala kiselost. Za određivanje pH-vrijednosti upotrebljava se smjesa tla s otopinom 1 M kalijeva klorida (KCl) ili 0,01 M kalcijeva klorida (CaCl2) u omjeru 1: 5 (vidjeti (16) i Dodatak 3.). Ako kiselost tla nije unutar zahtijevanog raspona (vidjeti stavak 11.), može se prilagoditi dodavanjem odgovarajuće količine CaCO3. Ako je tlo previše lužnato, može se prilagoditi dodavanjem smjese iz stavka 11., ali bez CaCO3. 13. Maksimalni vodni kapacitet (WHC) umjetnog tla određuje se u skladu s postupcima opisanima u Dodatku 2. Jedan ili dva dana prije početka ispitivanja suho se umjetno tlo vlaži dodavanjem dovoljno deionizirane vode da bi se dobilo otprilike pola konačnog sadržaja vode, tj. 40 do 60 % maksimalnog vodnog kapaciteta. Na početku ispitivanja prethodno navlaženo tlo dijeli se na onoliko dijelova koliko ima ispitnih koncentracija (prema potrebi uključujući i referentnu kemikaliju) i kontrola koje se upotrebljavaju za ispitivanje. Sadržaj vlage prilagođava se na 40 do 60 % maksimalnog WHC-a dodavanjem otopine ispitivane kemikalije i/ili dodavanjem destilirane ili deionizirane vode (vidjeti stavke od 19. do 21.). Sadržaj vlage određuje se na početku i na kraju ispitivanja (sušenjem do stalne mase na 105 °C) i trebao bi biti unutar optimalnog raspona za preživljavanje crva. Vlažnost tla može se ugrubo procijeniti laganim gnječenjem rukom: ako je sadržaj vlage ispravan, među prstima bi se trebale pojaviti kapljice vode. Odabir i priprema ispitnih životinja 14. Preporučena je ispitna vrsta Enchytraeus albidus Henle 1837 (bijeli crv), koja pripada porodici Enchytraeidae (red Oligochaeta, koljeno Annelida). E. albidus jedna je od najvećih enhitreja, kod koje su zabilježeni primjerci i do 35 mm duljine (17) (18). E. albidus rasprostranjena je diljem svijeta i može se naći u morskim, slatkovodnim i kopnenim staništima, uglavnom u organskoj tvari u raspadu (morska trava, kompost), a rijetko na livadama (9). Njezina velika ekološka tolerancija i neke morfološke varijacije mogući su znak postojanja više podvrsta. 15. E. albidus dostupna je u trgovinama kao hrana za ribe. Treba provjeriti je li kultura onečišćena drugom, obično manjom vrstom (1) (19). Ako dođe do onečišćenja, sve crve treba oprati vodom u Petrijevoj zdjelici. Potom se veliki primjerci vrste E. albidus biraju (stereomikroskopom) za početak nove kulture, a svi se ostali crvi bacaju. E. albidus može se lako uzgajati u vrlo različitim organskim materijalima (vidjeti Dodatak 4.). E. albidus ima kratak životni ciklus jer zrelost postiže u dobi između 33 dana (na 18 °C) i 74 dana (na 12 °C). Za ispitivanje se upotrebljavaju samo kulture koje su najmanje pet tjedana (jedan naraštaj) držane u laboratoriju bez problema. 16. Prikladne su i druge vrste iz roda Enchytraeus, npr. E. buchholzi Vejdovsky 1879 ili E. crypticus Westheide i Graefe 1992. (vidjeti Dodatak 5.). Ako se upotrebljavaju druge vrste Enchytraeus, treba ih jasno identificirati i u izvješću je potrebno navesti obrazloženje za odabir te vrste. 17. Životinje koje se upotrebljavaju u ispitivanjima odrasli su crvi. Moraju imati jajašca (bijele točkice) u području kliteluma i biti otprilike iste veličine (dugi oko 1 cm). Sinkronizacija uzgojne kulture nije potrebna. 18. Ako se enhitreje ne uzgajaju u istom tipu tla i u istim uvjetima (uključujući hranjenje) koji se primjenjuju za glavno ispitivanje, moraju proći razdoblje aklimatizacije od najmanje 24 sata do tri dana. Za početak je potrebno aklimatizirati veći broj odraslih životinja nego što ih je potrebno za provođenje ispitivanja, kako bi se mogli odbaciti primjerci koji su oštećeni ili nisu prikladni zbog drugih razloga. Na kraju razdoblja aklimatizacije za ispitivanje se odabiru samo crvi koji imaju jajašca i ne pokazuju anomalije u ponašanju (npr. pokušaj bijega iz tla). Crvi se pažljivo vade s pomoću draguljarske pincete, kukice ili petlje te se stavljaju u Petrijevu zdjelicu koja sadržava malu količinu svježe vode. U tu je svrhu poželjno upotrijebiti obrađenu vodu, kako se predlaže u poglavlju C.20. ovog Priloga (Test reproduktivne toksičnosti na vrsti Daphnia magna) jer bi deionizirana, demineralizirana ili vodovodna voda mogla biti štetna za crve. Crvi se pregledavaju stereomikroskopom te se odbacuju svi koji nemaju jajašca. Treba se pobrinuti da budu uklonjene sve grinje i skokuni kojima su možda zaražene kulture. Zdravi crvi koji se neće upotrijebiti za ispitivanje vraćaju se u matičnu kulturu. Priprema ispitnih koncentracija Ispitivana kemikalija topljiva u vodi 19. Otopina ispitivane kemikalije priprema se u deioniziranoj vodi u količini dovoljnoj za sva ponavljanja jedne ispitne koncentracije. Preporučuje se upotrijebiti odgovarajuću količinu vode da se postigne potreban sadržaj vlage, tj. 40 do 60 % maksimalnog WHC-a (vidjeti stavak 13.). Svaka se otopina ispitivane kemikalije temeljito izmiješa s jednom šaržom prethodno navlaženog tla prije nego što se uvede u ispitnu posudu. Ispitivana kemikalija netopljiva u vodi 20. Ispitivana kemikalija koja nije topljiva u vodi, ali je topljiva u organskim otapalima, može se otopiti u najmanjoj mogućoj količini prikladnog nosača (npr. acetona). Treba upotrijebiti samo hlapljiva otapala. Nosač se poprska po maloj količini, npr. 2,5 g, finog kremenog pijeska ili se pomiješa s njom. Nosač se uklanja isparavanjem u digestoru najmanje jedan sat. Ta se smjesa kremenog pijeska i ispitivane kemikalije dodaje prethodno navlaženom tlu i temeljito se izmiješa nakon dodavanja odgovarajuće količine deionizirane vode da bi se dobio potreban sadržaj vlage. Konačna se smjesa unosi u ispitne posude. 21. Za kemikalije koje su slabo topljive u vodi i u organskim otapalima, 2,5 g fino usitnjenog kremenog pijeska po ispitnoj posudi pomiješa se s količinom ispitivane kemikalije za dobivanje željene ispitne koncentracije. Ta se smjesa kremenog pijeska i ispitivane kemikalije doda prethodno navlaženom tlu i temeljito se izmiješa nakon dodavanja odgovarajuće količine deionizirane vode da bi se dobio potreban sadržaj vlage. Konačna se smjesa podijeli na ispitne posude. Navedeni se postupak ponavlja za svaku ispitnu koncentraciju, a pripremi se i odgovarajuća kontrola. 22. Kemikalije se obično ne bi smjele ispitivati u koncentracijama većim od 1 000 mg/kg suhe mase tla. Međutim, određeni posebni ispitni ciljevi mogu zahtijevati primjenu viših koncentracija. PROVEDBA ISPITIVANJA Ispitne skupine i kontrole 23. Za svaku se ispitnu koncentraciju u ispitnu posudu stavlja količina ispitnog tla koja odgovara količini od 20 g suhe mase (vidjeti stavke od 19. do 21.). Pripremaju se i kontrole bez ispitne kemikalije. U svaku se posudu dodaje hrana u skladu s postupcima opisanima u stavku 29. Deset crva nasumce se rasporedi u svaku ispitnu posudu. Crvi se pažljivo prenesu u svaku posudu i stavljaju na površinu tla s pomoću npr. draguljarske pincete, kukice ili petlje. Broj ponavljanja za ispitne koncentracije i kontrole ovisi o primijenjenom planu ispitivanja (vidjeti stavak 34.). Ispitne se posude nasumce rasporede po inkubatoru i svakog se tjedna nasumce premještaju. 24. Ako se za primjenu ispitivane kemikalije upotrebljava nosač, uz ispitni je niz potrebno uključiti i jedan kontrolni niz koji sadržava kremeni pijesak poprskan otapalom ili pomiješan s njim. Koncentracija otapala ili dispergenta mora biti ista kao u ispitnim posudama koje sadržavaju ispitivanu kemikaliju. Kontrolni niz koji sadržava dodatni kremeni pijesak (2,5 g po posudi) potrebno je uključiti za kemikalije koje je potrebno primijeniti u skladu s postupcima opisanima u stavku 21. Uvjeti ispitivanja 25. Ispitna temperatura iznosi 20 ± 2 °C. Kako bi se spriječilo bježanje crva iz tla, ispitivanje se provodi u kontroliranim ciklusima izmjene svjetlosti i tame (po mogućnosti 16 sati svjetla i osam sati tame), uz osvjetljenje od 400 do 800 luksa u području ispitnih posuda. 26. Radi provjere vlažnosti tla, posude se važu na početku ispitivanja i potom jednom tjedno. Gubitak težine nadoknađuje se dodavanjem odgovarajuće količine deionizirane vode. Valja napomenuti da se gubitak vode može smanjiti održavanjem visoke vlažnosti zraka (> 80 %) u inkubatoru. 27. Sadržaj vlage i pH potrebno je izmjeriti na početku i na kraju ispitivanja za određivanje raspona i glavnog ispitivanja. Mjerenja je potrebno izvršiti u tretiranim (sve koncentracije) i kontrolnim uzorcima tla koji su pripremljeni i održavani na isti način kao ispitne kulture, ali ne sadržavaju crve. Tim uzrocima tla hranu je potrebno dodati samo na početku ispitivanja kako bi se omogućila mikrobna aktivnost. Količina dodane hrane mora biti jednaka količini dodanoj ispitnim kulturama. Tijekom ispitivanja u te posude više nije potrebno dodavati hranu. Hranjenje 28. Može se upotrebljavati hrana koja omogućuje održavanje populacije enhitreja. Pokazalo se da su prikladna hrana zobene pahuljice, po mogućnosti obrađene u autoklavu prije uporabe kako bi se spriječila kontaminacija mikroorganizmima (može se primijeniti i zagrijavanje). 29. Hrana se prvo daje tako da se 50 mg mljevenih zobenih pahuljica pomiješa s tlom u svakoj posudi prije unošenja crva. Potom se hrana daje jednom tjedno do 21. dana. Hrana se ne daje 28. dana, jer su u toj fazi odrasli crvi već uklonjeni, a mladim je jedinkama otada potrebno relativno malo dodatne hrane. Tijekom ispitivanja hranjenje se provodi tako da se u svaku posudu doda 25 mg mljevenih zobenih pahuljica, koje se pažljivo stavljaju na površinu tla kako se crvi ne bi oštetili. Kako bi se smanjio rast gljivica, zobene pahuljice treba zatrpati prekrivajući ih malom količinom tla. Ako hrana ostane nepojedena, porcije hrane treba smanjiti. Plan ispitivanja za određivanje raspona 30. Ako je potrebno, provodi se ispitivanje za određivanje raspona s na primjer pet koncentracija ispitivane kemikalije: 0,1, 1,0, 10, 100 i 1 000 mg/kg (suhe mase tla). Dovoljno je jedno ponavljanje za svaki tretman i kontrolu. 31. Ispitivanje za određivanje raspona traje dva tjedna. Na kraju ispitivanja procjenjuje se smrtnost crva. Crv se evidentira kao mrtav ako ne reagira na mehanički podražaj na prednjem kraju. Osim podataka o smrtnosti, korisno je raspolagati i drugim podacima kako bi se mogla donijeti odluka o rasponu koncentracija koje će se upotrebljavati u glavnom ispitivanju. Stoga je osim bilježenja prisutnosti mladih jedinki potrebno zabilježiti i promjene u ponašanju odraslih jedinki (npr. nesposobnost ukopavanja u tlo; nepomično pripijanje uz staklenu stijenku ispitne posude) i u njihovoj morfologiji (npr. prisutnost otvorenih rana). Prisutnost mladih jedinki može se odrediti metodom bojenja koja je opisana u Dodatku 6. 32. Vrijednost LC50 može se približno odrediti izračunavanjem geometrijske sredine podataka o smrtnosti. Kod utvrđivanju raspona koncentracija za glavno ispitivanje polazi se od pretpostavke da su učinci na razmnožavanje manji od LC50 za faktor koji može iznositi do 10. Međutim, to je empirijski odnos koji u konkretnim slučajevima može biti drukčiji. Dodatna opažanja iz ispitivanja za određivanje raspona, kao što je prisutnost mladih jedinki, mogu omogućiti bolju prilagodbu raspona koncentracija ispitivane kemikalije koje će se upotrebljavati u glavnom ispitivanju. 33. Za precizno određivanje vrijednosti LC50 preporučuje se provođenje ispitivanja s najmanje četiri ponavljanja po svakoj koncentraciji ispitne kemikalije i odgovarajućim brojem koncentracija koje će izazvati najmanje četiri različita statistički značajna srednja odgovora pri tim koncentracijama. Ako je primjenljivo, i za kontrole se upotrebljava isti broj koncentracija i ponavljanja. Plan glavnog testa reproduktivne toksičnosti 34. Predlažu se tri plana na temelju preporuka proizišlih iz prstenastog ispitivanja (2). — Za određivanje NOEC-a potrebno je ispitati najmanje pet koncentracija u geometrijskom nizu. Preporučuju se četiri ponavljanja za svaku ispitnu koncentraciju plus osam kontrola. Koncentracije se moraju razlikovati za faktor koji nije veći od 1,8. — Za određivanje vrijednosti ECx (npr. EC10, EC50) potrebno je ispitati najmanje pet koncentracija koje obuhvaćaju vrijednost ECx kako bi se vrijednost ECx mogla dobiti interpolacijom umjesto ekstrapolacijom. Preporučuju se najmanje četiri ponavljanja za svaku ispitnu koncentraciju i četiri kontrolna ponavljanja. Interval između koncentracija može se razlikovati, tj. može iznositi 1,8 ili manje za raspon koncentracija za koji se očekuje da će izazvati učinak te više od 1,8 kod viših i nižih koncentracija. — Kombinirani pristup omogućuje određivanje i NOEC-a i ECx. Potrebno je upotrijebiti osam ispitnih koncentracija u geometrijskom nizu. Preporučuju se četiri ponavljanja za svaki tretman plus osam kontrola. Koncentracije se moraju razlikovati za faktor koji nije veći od 1,8. 35. Potrebno je upotrijebiti deset odraslih crva po ispitnoj posudi (vidjeti stavak 23.). Hrana se dodaje u ispitne posude na početku ispitivanja i potom jednom tjedno (vidjeti stavak 29.) do uključivo 21. dana. Na 21. dan uzorci tla pažljivo se ručno pretražuju te se živi odrasli crvi promatraju i prebrojavaju i bilježe se promjene u njihovu ponašanju (npr. nesposobnost ukopavanja u tlo, nepomično pripijanje uz staklenu stijenku ispitne posude) i u njihovoj morfologiji (npr. otvorene rane). Svi se odrasli crvi potom uklanjaju iz ispitnih posuda i ispitnog tla. Ispitno tlo koje sadržava kokone inkubira se tri dodatna tjedna u istim ispitnim uvjetima, osim što se hranjenje provodi samo 35. dana (25 mg mljevenih zobenih pahuljica po posudi). 36. Nakon šest tjedana prebrojavaju se crvi izleženi iz kokona. Preporučuje se metoda bojenja bengalskim crvenilom (vidjeti Dodatak 6.), iako su se prikladnima pokazale i druge tehnike ekstrakcije i flotacije mokrim (ali ne toplinskim) postupkom (vidjeti Dodatak 6.) (4) (10) (11) (20). Preporučuje se bojenje bengalskim crvenilom jer ekstrakcija mokrim postupkom iz supstrata tla može biti onemogućena zbog zamućenja uzrokovanog suspendiranim česticama gline. Granično ispitivanje 37. Ako se u ispitivanju za određivanje raspona ne uoče učinci pri najvećoj koncentraciji (tj. 1 000 mg/kg), test reproduktivne toksičnosti može se provesti kao granični test s 1 000 mg/kg kako bi se dokazalo da je NOEC za razmnožavanje veći od te vrijednosti. Sažetak i vremenski raspored ispitivanja 38. Faze ispitivanja mogu se sažeto prikazati kako slijedi: Vrijeme Ispitivanje za određivanje raspona Glavno ispitivanje Dan –7. ili ranije — Pripremiti umjetno tlo (miješanje suhih sastojaka) — Pripremiti umjetno tlo (miješanje suhih sastojaka) Dan –5. — Provjeriti pH-vrijednost umjetnog tla — Izmjeriti maksimalni WHC tla — Provjeriti pH-vrijednost umjetnog tla — Izmjeriti maksimalni WHC tla Dan –5. do –3. — Razvrstati crve za aklimatizaciju — Razvrstati crve za aklimatizaciju Dan – 3. do 0. — Aklimatizirati crve najmanje 24 sata — Aklimatizirati crve najmanje 24 sata Dan –1. — Prethodno ovlažiti umjetno tlo i rasporediti ga u šarže — Prethodno ovlažiti umjetno tlo i rasporediti ga u šarže Dan 0. — Pripremiti radne otopine — Primijeniti ispitivane kemikalije — Odmjeriti ispitni supstrat u ispitne posude — Umiješati hranu — Unijeti crve — Izmjeriti pH-vrijednost i sadržaj vlage u tlu — Pripremiti radne otopine — Primijeniti ispitivane kemikalije — Odmjeriti ispitni supstrat u ispitne posude — Umiješati hranu — Unijeti crve — Izmjeriti pH-vrijednost i sadržaj vlage u tlu Dan 7. — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Hranjenje Dan 14. — Odrediti smrtnost odraslih jedinki — Procijeniti broj mladih jedinki — Izmjeriti pH-vrijednost i sadržaj vlage u tlu — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Hranjenje Dan 21. — Promatrati ponašanje odraslih jedinki — Ukloniti odrasle jedinke — Odrediti smrtnost odraslih jedinki — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Hranjenje Dan 28. — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Ne dodavati hranu Dan 35. — Provjeriti sadržaj vlage u tlu — Hranjenje Dan 42. — Prebrojavanje mladih crva — Izmjeriti pH-vrijednost i sadržaj vlage u tlu PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Obrada rezultata 39. Iako je u Dodatku 7. naveden opći pregled, u ovoj se ispitnoj metodi ne daje stroga statistička smjernica za analizu rezultata ispitivanja. 40. U ispitivanju za određivanje raspona smrtnost je glavna krajnja točka. Međutim potrebno je zabilježiti i promjene u ponašanju odraslih jedinki (npr. nesposobnost ukopavanja u tlo, nepomično pripijanje uz staklenu stijenku ispitne posude) i u njihovoj morfologiji (npr. otvorene rane), kao i prisutnost mladih jedinki. Za određivanje vrijednosti LC50 u pravilu je potrebno primijeniti probit-analizu (21) ili logističku regresiju. Međutim, u slučajevima u kojima je ta metoda analize neprikladna (npr. ako imamo manje od tri koncentracije koje uzrokuju djelomičnu smrtnost), mogu se primijeniti alternativne metode. To mogu biti metoda pomičnih prosjeka (22), modificirana Spearman-Karberova metoda (23) ili jednostavna interpolacija (npr. geometrijska sredina vrijednosti LC0 i LC100, izračunana množenjem drugog korijena vrijednosti LC0 s vrijednošću LC100). 41. U glavnom je ispitivanju krajnja točka plodnost (tj. broj nastalih mladih jedinki). Međutim i tu, kao i kod ispitivanja za određivanje raspona, u završnom izvješću potrebno je navesti sve ostale znakove koji ukazuju na štetno djelovanje. Da bi se izračunali rezultati koji se odnose na razmnožavanje, za statističku je analizu potrebno znati aritmetičku sredinu i standardnu devijaciju po tretmanu i po kontroli. 42. Ako je provedena analiza varijance, standardna devijacija (s) i stupnjevi slobode (df) mogu se zamijeniti procjenom zajedničke (engl. pooled) varijance dobivenom ANOVA-om i njezinim stupnjevima slobode – pod uvjetom da varijanca ne ovisi o koncentraciji. U tom se slučaju upotrebljavaju pojedinačne varijance kontrole i tretmana. Te se vrijednosti obično izračunavaju s pomoću komercijalno dostupnog statističkog računalnog programa, pri čemu se rezultati dobiveni po posudi upotrebljavaju kao ponavljanja. Ako se čini da je razumnije združiti podatke za negativnu kontrolu i kontrolu s otapalom nego izračunati rezultate uspoređujući ih s jednom od tih dviju kontrola, te je podatke potrebno testirati kako bi se provjerilo da među njima nema značajnih razlika (za odgovarajuće testove vidjeti stavak 45. i Dodatak 7.). 43. Daljnje statističko testiranje i zaključivanje ovisi o tome jesu li vrijednosti dobivene u ponavljanjima normalno distribuirane i jesu li im varijance homogene. Procjena NOEC-a 44. Poželjno je primijeniti snažne testove. Potrebno je koristiti se informacijama o tome jesu li podaci približno normalno distribuirani, npr. informacijama iz prijašnjeg iskustva s prstenastim ispitivanjem ili drugim podacima iz prethodno obavljenih ispitivanja. Od veće je važnosti homogenost varijance (homoskedastičnost). Iskustvo pokazuje da se varijanca često povećava kako se povećava srednja vrijednost. U tim bi se slučajevima homoskedastičnost mogla postići pretvorbom podataka. Međutim, ta se pretvorba mora temeljiti na podacima iz prethodno obavljenih ispitivanja, a ne na podacima koji se istražuju. S homogenim podacima potrebno je provesti t-testove višestruke usporedbe, kao što su Williamsov test (α = 0,05, jednosmjerni) (24) (25) ili u nekim slučajevima Dunnettov test (26) (27). Potrebno je napomenuti da se u slučaju nejednake replikacije tablične t-vrijednosti moraju ispraviti, kako to sugeriraju Dunnett i Williams. Ponekad zbog velike varijacije ne dolazi do redovitog povećanja/smanjenja odgovora. U slučaju takvog velikog odstupanja od monotoničnosti primjereniji je Dunnettov test. Ako postoje odstupanja od homoskedastičnosti, možda bi bilo uputno temeljitije istražiti moguće učinke na varijance kako bi se moglo utvrditi mogu li se t-testovi primijeniti a da ne izgube mnogo na svojoj snazi (28). Alternativno se mogu primijeniti višestruki U-test, npr. Bonferronijev U-test prema Holmu (29) ili, kada podaci pokazuju heteroskedastičnost, ali su inače u skladu s temeljnim monotoničnim odnosom između doze i odgovora, neki drugi neparametarski test [npr. Jonckheere-Terpstra (30) (31) ili Shirley (32) (33)], kojima bi općenito trebalo davati prednost u odnosu na t-testove nejednake varijance. (Vidi i shemu u Dodatku 7.) 45. Ako je proveden granični test te su ispunjeni uvjeti koje zahtijevaju parametarski testovi (normalnost, homogenost), može se primijeniti Studentov t-test parova, a u drugim slučajevima Mann-Whitneyjev U-test (29). Procjena vrijednosti ECx 46. Za izračunavanje bilo koje vrijednosti ECx za regresijsku se analizu (linearnu ili nelinearnu) upotrebljavaju srednje vrijednosti po tretmanu, nakon što se dobije odgovarajuća funkcija doza-odgovor. Za rast crva kao kontinuirani odgovor vrijednosti ECx mogu se procijeniti odgovarajućom regresijskom analizom (35). Među prikladne funkcije za kvantalne podatke (smrtnost/preživljavanje i broj mladih jedinki) spadaju normalna sigmoidna funkcija, logistička funkcija ili Weibullova funkcija, koje sadržavaju dva do četiri parametra, od kojih neki mogu modelirati hermetičke odgovore. Ako je funkcija doza-odgovor prilagođena linearnom regresijskom analizom, značajni r2 (koeficijent određivanja) i/ili nagib potrebno je odrediti regresijskom analizom prije procjene vrijednosti ECx uvrštavanjem vrijednosti koja odgovara x-postotnoj kontrolnoj srednjoj vrijednosti u jednadžbu dobivenu regresijskom analizom. Granice pouzdanosti od 95 % izračunavaju se prema Fielleru (citirano u Finney (21)) ili u skladu s drugim odgovarajućim suvremenim metodama. 47. Druga je mogućnost da se odgovor modelira kao postotak ili dio parametra modela koji se tumači kao kontrolni srednji odgovor. U tim se slučajevima normalna (logistička, Weibullova) sigmoidna krivulja često može lako prilagoditi rezultatima primjenom probit-regresije (21). U tim se slučajevima ponderacijska funkcija mora prilagoditi metričkim odgovorima prema Christensenu (36). Međutim, ako je uočena hormeza, probit-analizu potrebno je zamijeniti logističkom ili Weibullovom funkcijom s četiri parametra prilagođenom nelinearnom regresijom (36). Ako se prikladna funkcija doza-odgovor ne može prilagoditi podacima, mogu se primijeniti alternativne metode za procjenu vrijednosti ECx i njezinih granica pouzdanosti, kao što su metoda pomičnih prosjeka prema Thompsonu (22) i modificirana Spearman-Karberova metoda (23). IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU 48. Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijedeće informacije: Ispitivana kemikalija: — fizikalno stanje i, tamo gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (npr. topljivost u vodi, tlak para), — kemijska identifikacija ispitivane kemikalije prema nomenklaturi IUPAC-a, CAS broj, proizvodna serija, šarža, strukturna formula i čistoća, — rok valjanosti uzorka. Ispitne vrste: — upotrijebljene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i uvjeti uzgoja. Uvjeti ispitivanja: — sastojci i priprema umjetnog tla, — metoda primjene ispitivane kemikalije, — opis uvjeta ispitivanja, uključujući temperaturu, sadržaj vlage, pH itd., — potpun opis plana i postupaka pokusa. Rezultati ispitivanja: — smrtnost odraslih crva nakon dva tjedna te broj mladih na kraju ispitivanja za određivanje raspona, — smrtnost odraslih crva nakon tri tjedna izloženosti i potpuna evidencija mladih na kraju glavnog ispitivanja, — svi uočeni fizički ili patološki simptomi i promjene ponašanja kod ispitnih organizama, — vrijednosti LC50, NOEC i/ili ECx (npr. EC50, EC10) za razmnožavanje, ako su neke od njih primjenjive, te njihovi intervali pouzdanosti, kao i graf prilagođenog modela upotrijebljenog za njihov izračun te sve informacije i opažanja korisna za tumačenje rezultata. Odstupanja od postupaka opisanih u ovoj ispitnoj metodi i sve neuobičajene pojave tijekom ispitivanja. LITERATURA (1) Römbke, J. (1989.) Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. i Moser, T. (1999.) Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, str. 150. + 223. (3) Westheide, W. i Bethge-Beilfuss, D. (1991.) The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, U: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Uredili Esser, G. i Overdieck, D. str. 497. – 508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. i Notenboom, J. (1994.) Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. str. 46. (5) Poglavlje C.8. ovog Priloga, Toksičnost za gujavice. (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993.) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996.) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. i Augustsson, A. K. (1998.) Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). U: Løkke, H. i Van Gestel, C. A. M., Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73 – 94. (9) Kasprzak, K. (1982.) Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217 – 232. (10) Römbke, J. (1995.) Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246 – 249. (11) Dunger, W. i Fiedler, H. J. (1997.) Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W. A. M. (1993.) Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2 – 29. (13) Becker, H. (1991.) Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19 – 24. (14) Römbke, J. i Federschmidt, A. (1995.) Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79 – 96. (15) Römbke, J., Riepert, F. i Achazi R. (2000.) Enchytraeen als Testorganismen. U: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. i Eisentraeger, A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59 – 81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994.) Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A. W. (1958.) The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1 – 13. (18) Nielsen, C. O. i Christensen, B. (1959.) The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8 – 9, 1 – 160. (19) Bouguenec, V. i Giani, N. (1987.) Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9 – 22. (20) Korinkova, J. i Sigmund, J. (1968.) The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300 – 305. (21) Finney, D. J. (1971.) Probit Analysis (3. izdanje), str. 19. – 76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D. J. (1978.) Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M. A., Russo, R. C. i Thurston, R. V. (1977.) Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714 – 719; Correction Environ. Sci. Technol. 12 (1998.), 417. (24) Williams, D. A. (1971.) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D. A. (1972.) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C. W. (1955.) A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett, C. W. (1964.) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der, (1998.) Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 (29) Holm, S. (1979.): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954.); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133 – 145. (31) Terpstra, T. J. (1952.); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327 – 333. (32) Shirley, E. A., (1979.); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144 – 151. (33) Williams, D. A. (1986.); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183 – 186. (34) Sokal, R. R. i Rohlf, F. J. (1981.) Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2. izdanje. W. H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E. R. (1984.) Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213 – 221. (36) Van Ewijk, P. H. i Hoekstra, J. A. (1993.) Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25 – 32. Dodatak 1. Definicije Za potrebe ove ispitne metode primjenjuju se sljedeće definicije: Kemikalija znači tvar ili smjesa. ECx (koncentracija s učinkom od x %): koncentracija koja u određenom razdoblju izloženosti izaziva x-postotni učinak na ispitne organizme u usporedbi s kontrolom. U ovom se ispitivanju koncentracije s učinkom iskazuju kao masa ispitivane kemikalije po suhoj masi ispitnog tla. LC0 (nesmrtonosna koncentracija): koncentracija ispitivane kemikalije koja u određenom razdoblju ne izaziva smrt nijednog izloženog ispitnog organizma. U ovom se ispitivanju LC0 iskazuje kao masa ispitivane kemikalije po suhoj masi ispitnog tla. LC50 (srednja smrtonosna koncentracija): koncentracija ispitivane kemikalije koja u određenom razdoblju izaziva smrt 50 % izloženih ispitnih organizama. U ovom se ispitivanju LC50 iskazuje kao masa ispitivane kemikalije po suhoj masi ispitnog tla. LC100 (potpuno smrtonosna koncentracija): koncentracija ispitivane kemikalije koja u određenom razdoblju izaziva smrt 100 % izloženih ispitnih organizama. U ovom se ispitivanju LC100 iskazuje kao masa ispitivane kemikalije po suhoj masi ispitnog tla. LOEC (najniža koncentracija s vidljivim učinkom): najniža koncentracija ispitivane kemikalije koja ima statistički značajan učinak (p < 0,05). U ovom se ispitivanju LOEC iskazuju kao masa ispitivane kemikalije po suhoj masi ispitnog tla. Sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a u pravilu moraju imati učinak koji se statistički razlikuje od kontrole. Svako odstupanje od navedenoga pri određivanju LOEC-a mora biti obrazloženo u izvješću o ispitivanju. NOEC (najviša koncentracija bez vidljivog učinka): najviša koncentracija ispitivane kemikalije neposredno ispod LOEC-a kod koje nije uočen nikakav učinak. U ovom ispitivanju koncentracija koja odgovara NOEC-u nema statistički značajan učinak (p < 0,05) u određenom razdoblju izloženosti u usporedbi s kontrolom. Stopa razmnožavanja: srednji broj mladih crva dobivenih od određenog broja odraslih crva u razdoblju ispitivanja. Ispitivana kemikalija: svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom. Dodatak 2. Određivanje maksimalnog vodnog kapaciteta Određivanje vodnog kapaciteta umjetnog tla Prikladnom se pokazala sljedeća metoda. Opisana je u Prilogu C normi ISO DIS 11268-2. Odgovarajućom napravom (npr. svrdlom s epruvetom) uzme se određena količina (npr. 5 g) tla koje služi kao ispitni supstrat. Dno epruvete prekrije se komadom filtarskog papira te se nakon punjenja vodom epruveta postavi na stalak u vodenoj kupelji. Epruvetu je potrebno postupno uranjati sve dok razina vode ne bude iznad gornjeg dijela tla. Potom je treba ostaviti u vodi tri sata. Budući da tlo ne može zadržati svu vodu koju apsorbira kapilarama, uzorak tla potrebno je ostaviti dva sata da se ocijedi tako što se epruveta postavi na podlogu od vrlo mokrog fino usitnjenog kremenog pijeska u zatvorenoj posudi (da se spriječi sušenje). Uzorak je potom potrebno izvagati i osušiti do stalne mase na 105 °C. Vodni kapacitet (WHC) potom se može izračunati kako slijedi: , gdje je: S = supstrat zasićen vodom + masa epruvete + masa filtarskog papira, T = tara (masa epruvete + masa filtarskog papira), D = suha masa supstrata. UPUĆIVANJA: ISO (International Organization for Standardization) (1996.) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Ženeva. Dodatak 3. Određivanje ph-vrijednosti tla Sljedeća se metoda određivanja pH-vrijednosti uzorka tla temelji na opisu navedenom u normi ISO 10390 (Kakvoća tla – određivanje pH-vrijednosti). Definirana količina tla suši se na sobnoj temperaturi najmanje 12 sati. Potom se tlo (najmanje 5 grama) suspendira u pet puta većoj količini 1 M kalijeva klorida (KCl) analitičkog stupnja čistoće ili 0,01 M otopine kalcijeva klorida (CaCl2) analitičkog stupnja čistoće. Suspenzija se nakon toga protresa pet minuta. Nakon protresanja suspenzija se ostavlja da se taloži najmanje dva sata, ali ne dulje od 24 sata. Potom se pH-vrijednost tekuće faze izmjeri pH-metrom koji se prije svakog mjerenja kalibrira s pomoću odgovarajućeg niza puferskih otopina (npr. pH 4,0 i 7,0). UPUĆIVANJA: ISO (International Organization for Standardization) (1994.) Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Ženeva. Dodatak 4. Uvjeti uzgoja Enchytraeus sp. Enhitreji vrste Enchytraeus albidus (kao i ostale vrste Enchytraeus) mogu se uzgajati u velikim plastičnim kutijama (npr. 30 × 60 × 10 cm) napunjenima mješavinom umjetnog tla i prirodnog, neonečišćenog vrtnog tla u omjeru 1:1. Mora se izbjegavati kompost jer može sadržavati toksične kemikalije poput teških metala. Prije uporabe iz tla potrebno je ukloniti faunu (npr. dubokim zamrzavanjem). Može se upotrebljavati i supstrat koji se sastoji isključivo od umjetnog tla, ali je moguće da će stopa razmnožavanja biti manja od one koja se postiže kod supstrata s miješanim tlom. pH supstrata mora iznositi 6,0 ± 0,5. Kultura se drži u mraku na temperaturi od 15 do 20 °C ± 2