31998L0057



DIREKTIVA VIJEĆA 98/57/EZ

od 20. srpnja 1998.

o suzbijanju bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

VIJEĆE EUROPSKE UNIJE,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice, a posebno njegov članak 43.,

uzimajući u obzir prijedlog Komisije (1),

uzimajući u obzir mišljenje Europskog parlamenta (2),

uzimajući u obzir mišljenje Gospodarskog i socijalnog odbora (3),

budući da je štetni organizam Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. ranije bio poznat pod nazivom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; budući da će naziv Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. vjerojatno postati opće prihvaćenim nazivom za taj organizam; budući da bi ovom Direktivom trebalo uzeti u obzir navedeni razvoj u području znanosti;

budući da proizvodnja krumpira i rajčica zauzima značajno mjesto u poljoprivredi Zajednice; budući da štetni organizmi neprestano ugrožavaju prinos krumpira i rajčice;

budući da bi se zaštitom proizvodnje krumpira i rajčica od takvih štetnih organizama ne samo održavali proizvodni kapaciteti, već bi se i povećala poljoprivredna proizvodnost;

budući da bi zaštitne mjere za sprečavanje unošenja štetnih organizama u državno područje jedne države članice imale samo ograničeni učinak ako se takve organizme ne bi istodobno i metodički suzbijalo u čitavoj Zajednici te sprečavalo njihovo širenje;

budući da je jedan od organizama štetnih za krumpir i rajčicu, Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogeni uzročnik smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća krumpira i rajčice; budući da je u nekim dijelovima Zajednice izbila bolest koju uzrokuje taj patogeni organizam i još uvijek postoje određeni ograničeni izvori zaraze;

budući da za uzgoj krumpira i rajčica postoji znatan rizik u čitavoj Zajednici ako se za ove kulture ne poduzmu učinkovite mjere za otkrivanje tog organizma i utvrđivanje njegove rasprostranjenosti s ciljem sprečavanja njegove pojave i širenja te, ako se otkrije, za sprečavanje njegova širenja i suzbijanje s ciljem iskorjenjivanja;

budući da je zbog osiguranja tog cilja potrebno u Zajednici poduzeti određene mjere; budući da je pored toga državama članicama potrebno omogućiti da prema potrebi poduzmu dodatne ili strože mjere, pod uvjetom da to ne ometa kretanje krumpira i rajčica u Zajednici, osim u mjeri u kojoj je to utvrđeno Direktivom Vijeća 77/93/EEZ od 21. prosinca 1976. o mjerama zaštite za sprečavanje unošenja u Zajednicu organizama štetnih za bilje ili biljne proizvode i njihovog širenja unutar Zajednice (4); budući da je o takvim mjerama potrebno obavijestiti druge države članice i Komisiju;

budući da je tim mjerama potrebno uzeti u obzir da su za otkrivanje toga patogenog organizma potrebna sustavna službena istraživanja; budući da bi takva istraživanja trebala uključivati inspekcijske postupke i, prema potrebi, postupke za uzorkovanje i testiranje s obzirom da u određenim okolišnim uvjetima bolest može može ostati latentna i nezapažena kako u nasadima krumpira, tako i u uskladištenim gomoljima krumpira; budući da širenje toga patogenog organizma u nasadima krumpira nije najvažniji čimbenik s obzirom da se taj patogeni organizam može širiti putem površinskih voda i određenih s njima povezanih samoniklih biljaka iz porodice Solanaceae, zbog čega navodnjavanje nasada krumpira i rajčica zaraženom vodom predstavlja rizik zaraze tih kultura; budući da taj patogeni organizam može također preživjeti zimu u samoniklom krumpiru i rajčicama, koji mogu predstavljati izvor prijenosa zaraze iz jedne sezone u drugu; budući da se taj patogeni organizam širi i putem doticaja sa zaraženim krumpirom i opremom za sadnju, vađenje i obradu krumpira ili spremnicima za prijevoz i skladištenje koji su kontaminirani tim organizmom pri prethodnom doticaju sa zaraženim krumpirom;

budući da se širenje toga patogenog organizma može smanjiti ili spriječiti raskuživanjem takvih predmeta; budući da svaka zaraza sjemenskog krumpira predstavlja značajan rizik od širenja tog patogenog organizma; na sličan način veliki rizik od širenja tog patogenog organizma predstavlja i latentna zaraza sjemenskog krumpira, što se može spriječiti uporabom sjemenskog krumpira proizvedenog u okviru službeno odobrenih programa, u okviru kojih je izvršeno testiranje sjemenskog krumpira i utvrđeno da nije zaražen;

budući da su postojeće spoznaje o biologiji i epidemiologiji bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. u europskim uvjetima nepotpune te da se može pretpostaviti da će za nekoliko sezona trebati ponovno pregledati predložene mjere; na sličan se način s obzirom na daljnja istraživanja može očekivati unapređenje postupka testiranja, a posebno u pogledu osjetljivosti i specifičnosti testnih metoda, s ciljem odabira i normizacije najboljih raspoloživih testnih metoda;

budući da je za utvrđivanje pojedinosti takvih općih mjera, kao i strožih ili dodatnih mjera koje mogu poduzeti države članice radi sprečavanja unosa tog patogenog organizma u njihovo državno područje, poželjna bliska suradnja država članica s Komisijom u okviru Stalnog odbora za biljno zdravstvo (dalje u tekstu: „Odbor”),

DONIJELO JE OVU DIREKTIVU:

Članak 1.

Ova se Direktiva odnosi na mjere koje treba poduzeti u svakoj državi članici protiv bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., prethodno poznate pod nazivom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (dalje u tekstu: „organizam”), kako bi se s obzirom na biljke domaćine organizma iz Priloga 1. odjeljka I. (dalje u tekstu: „popisani biljni materijal”):

Članak 2.

1. Države su članice dužne provoditi sustavna godišnja službena istraživanja za otkrivanje organizma na popisanom biljnom materijalu podrijetlom s njihova državnog područja. Za otkrivanje drugih mogućih izvora zaraze koji ugrožavaju proizvodnju popisanog biljnog materijala države su članice dužne vršiti procjenu rizika i, osim ako tom procjenom nije utvrđen nikakav rizik od širenja organizma, a u područjima za proizvodnju popisanog biljnog materijala, provoditi ciljana službena ispitivanja za otkrivanje organizma na biljkama koje ne spadaju u popisani biljni materijal, uključujući samonikle biljke domaćine iz porodice Solanaceae te u površinskim vodama koje se koriste za navodnjavanje ili prskanje popisanog biljnog materijala i otpadnim vodama koje se ispuštaju iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje u kojima se obrađuje popisani biljni materijal, a koje se potom koriste za navodnjavanje ili prskanje popisanog biljnog materijala. Opseg tih ciljanih istraživanja utvrđuje se sukladno utvrđenom riziku. Države članice smiju također provoditi sustavna službena istraživanja za otkrivanje organizma na materijalu poput supstrata za uzgoj, zemlji i krutom otpadu iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje.

2. Službena istraživanja koja su predviđena stavkom 1. provode se:

Dodatne pojedinosti o postupcima inspekcijskih pregleda te o broju, podrijetlu, razvrstavanju i vremenu uzorkovanja za ta istraživanja utvrđuju nadležna službena tijela u skladu s Direktivom 77/93/EEZ, i to na temelju pouzdanih znanstvenih i statističkih načela i biologije organizma te uzimajući u obzir posebnosti sustava proizvodnje popisanog biljnog materijala i, prema potrebi, drugih biljaka domaćina organizma u odnosnoj državi članici.

3. O pojedinostima i rezultatima službenih istraživanja koja su predviđena stavkom 1. svake je godine potrebno obavijestiti ostale države članice i Komisiju u skladu s odredbama Priloga I. odjeljka II. točke 2. Te se obavijesti dostavljaju do 1. lipnja, osim za krumpir upotrijebljen za sjeme na vlastitim poljoprivrednim gospodarstvima, za koji se obavijesti dostavljaju do 1. rujna. Pojedinosti i rezultati za usjeve odnose se na proizvodnju iz prethodne godine. Pojedinosti tih obavijesti smiju se podnijeti Odboru.

4. Sljedeća se odredba donosi u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

5. Sljedeće je odredbe moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

Članak 3.

Države su članice dužne osigurati da se slučajevi sumnje na pojavu ili potvrđene pojave organizma u njezinom državnom području prijave vlastitim nadležnim službenim tijelima.

Članak 4.

1. U svakom slučaju sumnje na zarazu nadležna službena tijela odnosne ili odnosnih država članica moraju osigurati izvršenje službenog laboratorijskog ispitivanja ili laboratorijskog ispitivanja pod službenim nadzorom za popisani biljni materijal uporabom odgovarajuće metode iz Priloga II. i u skladu s uvjetima iz Priloga III. točke 1. ili, u svim ostalim slučajevima, bilo koje druge službeno odobrene metode, a s ciljem potvrđivanja ili pobijanja sumnje na pojavu organizma. U slučaju potvrde sumnje primjenjuju se zahtjevi iz Priloga III. točke 2.

2. Do potvrde ili pobijanja sumnje na pojavu organizma iz stavka 1. u svim slučajevima sumnje na pojavu organizma u kojima:

nadležna službena tijela država članica dužna su za vlastitu proizvodnju:

3. U slučajevima sumnje na zarazu u kojima postoji rizik od kontaminacije popisanog biljnog materijala ili površinskih voda iz drugih država članica ili u druge države članice, država članica u kojoj je prijavljena sumnja na zarazu dužna je u skladu s utvrđenim rizikom i bez odlaganja obavijestiti ostale uključene države članice o pojedinostima te sumnje na zarazu, a odnosne su države članice dužne uspostaviti primjerenu međusobnu suradnju. Države članice obaviještene na taj način dužne su poduzeti sigurnosne mjere u skladu sa stavkom 2. točkom (c) i, prema potrebi, dodatne mjere u skladu sa stavcima 1. i 2.

4. Sljedeću je odredbu moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

Članak 5.

1. Ako službeno laboratorijsko ispitivanje ili laboratorijsko ispitivanje pod službenim nadzorom, koristeći odgovarajaću metodu za popisani biljni materijal u Prilogu II. ili, u svim ostalim slučajevima, bilo koju drugu službeno odobrenu metodu, potvrdi prisutnost organizma u uzorku uzetom u skladu s ovom Direktivom, nadležna službena tijela države članice, uzimajući u obzir pouzdana znanstvena načela, biologiju organizma i posebnosti sustava proizvodnje, trgovine i prerade bilja domaćina tog organizma u odnosnoj državi članici, dužna su:

2. U skladu s odredbama Priloga V. točke 3. države su članice dužne odmah obavijestiti ostale države članice i Komisiju o svakoj zarazi utvrđenoj sukladno stavku 1. točki (a) podtočki ii. i stavku 1. točki (c) podtočki ii. te o pojedinostima ograničavanja sigurnosnog područja sukladno stavku 1. točki (a) podtočki iv. i, prema potrebi, stavku 1. točki (c) podtočki iii. Pojedinosti obavijesti iz ovog stavka mogu se dostaviti Odboru.

Države su članice dužne istodobno dostaviti Komisiji dodatnu obavijest iz Priloga V. točke 4. Pojedinosti obavijesti iz ovog stavka odmah se dostavljaju članovima Odbora.

3. Na temelju obavijesti iz stavka 2. i u njoj navedenih elemenata, ostale države članice koje su navedene u obavijesti provode istraživanje u skladu sa stavkom 1. točkom (a) podtočkom i. i, ovisno o slučaju, stavkom 1. točkom (c) podtočkom i. te, prema potrebi, poduzimaju daljnje radnje u skladu sa stavcima 1. i 2.

Članak 6.

1. Države su članice dužne propisati da se popisani biljni materijal označen kao zaražen u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. ne smije saditi i da se pod nadzorom i uz odobrenje njihovih nadležnih službenih tijela na njega primijeni jedna od odredaba iz Priloga VI. točke 1. kako bi se utvrdilo da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma.

2. Države su članice dužne propisati da se popisani biljni materijal označen kao vjerojatno zaražen u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii. i točkom (c) podtočkom iii., uključujući popisani biljni materijal za koji je utvrđen rizik i koji je proizveden na mjestima proizvodnje za koja je utvrđena vjerojatna zaraza u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii., ne smije saditi i da se pod nadzorom njihovih nadležnih službenih tijela na primjeren način iskoristi ili zbrine, kako je utvrđeno u Prilogu VI. točki 2., kako bi se utvrdilo da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma.

3. Države su članice dužne propisati da se svi strojevi, vozila, posude, skladišta ili njihovi dijelovi te svi ostali predmeti, uključujući materijal za pakiranje, koji su označeni kao zaraženi u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. ili kao vjerojatno zaraženi u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii. i točkom (c) podtočkom iii., unište ili raskuže primjenom odgovarajućih metoda iz Priloga VI. točke 3. Nakon raskuživanja ni jedan se od tih predmeta više ne smatra zaraženim.

4. Ne dovodeći u pitanje mjere koje se provode u skladu sa stavcima 1., 2. i 3., države su članice dužne propisati da se u sigurnosnom području ograničenom sukladno članku 5. stavku 1. točki (a) podtočki iv. i točki (c) podtočki iii. provodi niz mjera iz Priloga VI. stavaka 4.1. i 4.2. Pojedinosti tih mjera svake se godine službeno priopćavaju drugim državama članicama i Komisiji. Pojedinosti tih obavijesti mogu se dostaviti Odboru.

Članak 7.

1. Države su članice dužne propisati da sjemenski krumpir mora ispuniti zahtjeve Direktive 77/93/EEZ i potjecati izravno od krumpira koji je proizveden u okviru službeno odobrenog programa te za koji je službenim testiranjem ili testiranjem pod službenim nadzorom utvrđeno da nije zaražen organizmom uporabom odgovarajuće metode iz Priloga II.

Država članica provodi gore navedeno testiranje:

2. Sljedeće je odredbe moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

Članak 8.

Države su članice dužne zabraniti čuvanje i raspolaganje organizmom.

Članak 9.

Ne dovodeći u pitanje odredbe Direktive 77/93/EEZ, države članice smiju odobriti odstupanja od mjera iz članaka 6. i 8. ove Direktive u skladu s odredbama navedenim u Direktivi 95/44/EZ (5) u eksperimentalne ili znanstvene svrhe te za rad u području selekcije sorti.

Članak 10.

U odnosu na vlastitu proizvodnju države članice smiju donijeti dodatne ili strože mjere potrebne za suzbijanje organizma ili za sprečavanje njegova širenja ako je to u skladu s odredbama Direktive 77/93/EEZ.

Pojedinosti takvih mjera službeno se priopćavaju drugim državama članicama i Komisiji. Pojedinosti tih obavijesti mogu se dostaviti Odboru.

Članak 11.

Izmjene Priloga ovoj Direktivi, koje je potrebno izvršiti imajući u vidu razvoj znanstvenih ili tehničkih spoznaja, donose se u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ. U pogledu metoda iz Priloga II. i mjera iz stavaka 4.1. i 4.2. Priloga VI. ove Direktive, Komisija je dužna pripremiti izvješće kojim se te metode i mjere pregledavaju s obzirom na stečeno iskustvo i dostaviti ga Odboru do 1. siječnja 2002.

Članak 12.

1. Države članice donose zakone i druge propise potrebne za usklađivanje s ovom Direktivom s učinkom od 21. kolovoza 1999. One o tome odmah obavješćuju Komisiju.

Kada države članice donesu ove mjere, te mjere prilikom njihove službene objave sadržavaju uputu na ovu Direktivu ili se uz njih navodi takva uputa. Načine tog upućivanja određuju države članice.

2. Države članice Komisiji odmah dostavljaju tekst glavnih odredaba nacionalnog prava koji donesu u području na koje se odnosi ova Direktiva. Komisija o tome obavješćuje druge države članice.

Članak 13.

Ova Direktiva stupa na snagu na dan objave u Službenom listu Europskih zajednica.

Članak 14.

Ova je Direktiva upućena državama članicama.

(1) SL C 124, 21.4.1997., str. 12. i

SL C 108, 7.4.1998., str. 85.

(2) SL C 14, 19.1.1998., str. 34.

(3) SL C 206, 7.7.1997., str. 57.

(4) SL L 26, 31.1.1977., str. 20. Direktiva kako je zadnje izmijenjena Direktivom Komisije 98/2/EZ (SL L 15, 21.1.1998., str. 34.).

(5) SL L 184, 3.8.1995., str. 34. Direktiva kako je zadnje izmijenjena Direktivom Komisije 97/46/EZ (SL L 204, 31.7.1997., str. 43.).

PRILOG I.

ODJELJAK I.

Popis biljaka domaćina bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. iz članka 1.

ODJELJAK II.

Istraživanja

1. Službena istraživanja iz članka 2. stavka 2. točke (a) temelje se na biologiji organizma i posebnostima proizvodnih sustava u odnosnoj državi članici, a obuhvaćaju:

2. Obavijest o službenim istraživanjima iz članka 2. stavka 3. obuhvaća:

PRILOG II.

PLAN TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, OTKRIVANJE I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

PODRUČJE PRIMJENE PLANA TESTIRANJA

Ovim se planom testiranja opisuju različiti postupci koji se koriste za:

U dodacima su navedene pojedinosti za pripremanje materijala za testiranje, odnosno hranjivih podloga, pufera, otopina, reagensa.

SADRŽAJ:

ODJELJAK I.

PRIMJENA PLANA TESTIRANJA

1. Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice

Postupak testiranja namijenjen je za gomolje krumpira sa simptomima koji su tipični ili koji upućuju na smeđu trulež te za biljke krumpira i rajčice sa simptomima koji su tipični ili koji upućuju na bakterijsko venuće. Postupak uključuje brzi test probira, izolaciju patogenog organizma iz zaraženog žilnog tkiva na diagnostičkoj podlozi i, u slučaju pozitivnog rezultata, identifikaciju kulture kao bakterije Ralstonia solanacearum.

Dijagram toka

Napomene uz dijagram toka:

2. Otkrivanje i identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira

Postupak se koristi za otkrivanje latentne zaraze u gomoljima krumpira uporabom jednog ili, po mogućnosti, više testova probira, koji se u slučaju pozitivnog rezultata dopunjuju izolacijom patogena; nakon toga, u slučaju izolacije tipičnih kolonija, slijedi identifikacija čiste kulture kao bakterije Ralstonia solanacearum.

Dijagram toka

Napomene uz dijagram toka:

Test PCR potencijalno je vrlo osjetljiv iako ga vrlo lako inhibiraju sastojci ekstrakta biljke ili gomolja, što dovodi do lažno negativnih rezultata. Neki kultivari krumpira sadrže više inhibitora od drugih. Zbog toga je te inhibitore potrebno ukloniti. Inhibicija se može smanjiti razrjeđivanjem, no time se razrjeđuju i populacije bakterije Ralstonia solanacearum. Potrebno je vrlo pažljivo provoditi sve faze pripreme uzorka i testa kako bi se spriječila kontaminacija koja može dovesti do lažno pozitivnih rezultata. Lažno pozitivni rezultati mogu nastati i uslijed homologije sekvence drugih organizama. Zbog toga se izravni test PCR ne može koristiti kao jedini test probira.

ODJELJAK II.

Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice

1. Simptomi

1.1 Simptomi kod krumpira

Biljka krumpira. Rana faza zaraze je venuće listova prema vrhu biljke pri visokim dnevnim temperaturama, uz oporavak biljke tijekom noći. Venuće brzo postaje nepovratno i završava odumiranjem biljke. Žilno tkivo poprečno prerezanih stabljika uvenulih biljaka može dobiti smeđu boju, a na površini prereza vidljiv je mliječni iscjedak ili se isti lako može istisnuti. Kada se prerezanu stabljiku postavi okomito u vodu, iz žilnih snopova počinju teći sluzave niti.

Gomolj krumpira. Gomolje krumpira treba poprečno prerezati u blizini hiluma. Rana faza zaraze je promjena boje žilnog prstena od staklasto žute do svijetlo smeđe, odakle nakon nekoliko minuta spontano počinje izlaziti blijedi kremasti iscjedak ili nakon laganog pritiska palcima na koru u blizini prereza. S vremenom žilno tkivo postaje izrazito smeđe, a nekroza se može proširiti i na parenhimsko tkivo. U uznapredovalim fazama zaraza izbija prema van od hiluma i okaca, pri čemu mogu nastati crvenkasto-smeđa uleknuća na kori, iz kojih može poteći bakterijski iscjedak na koji se lijepe čestice zemlje.

1.2 Simptomi kod rajčica

Biljka rajčice. Prvi vidljivi simptom je uvenuli izgled najmlađih listova. U okolišnim uvjetima povoljnima za patogen (temperatura tla od oko 25 °C uz zasićenost vlagom) u roku od nekoliko dana dolazi do epinastije i venuća jedne strane ili čitave biljke, što vodi do njezina potpunog uvenuća. U manje povoljnim uvjetima (temperatura tla niža od 21 °C) na stabljici se može razviti veći broj adventivnih korjena. Duž stabljike je moguće zamijetiti nabrekle pruge, što je dokaz nekroze žilnog sustava. Ako se stabljika poprečno prereže, iz žilnog tkiva stabljike, čija je boja promijenjena u smeđu, počinju izlaziti kapljice bijelog ili žućkastog bakterijskog iscjetka.

2. Brzi testovi probira

Brzi testovi probira olakšavaju vjerojatnu dijagnozu. Koristiti jedan ili više sljedećih testova:

Test eksudacije na stabljici

Prisutnost bakterije Ralstonia solanacearum u uvelim stabljikama krumpira ili rajčice moguće je procijeniti putem sljedećeg jednostavnog testa vjerojatnosti:

Prerezati stabljiku tik iznad površine tla. Staviti prerezanu površinu presjeka u čašu s vodom. Nakon kraćeg vremena iz žilnih snopova spontano će izlaziti sluzave niti bakterijskog iscjetka. Nijedna druga bakterija koja uzrokuje zarazu žilnog tkiva biljaka krumpira ili rajčice ne dovodi do te pojave.

Otkrivanje zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB)

Zrnca PHB u stanicama bakterije Ralstonia solanacearum postaju vidljiva nakon bojanja bojilom Nile Blue A ili Sudan black B.

Pripremiti razmaz iscjetka ili suspendiranog tkiva na mikroskopskom staklu ili razmaz 48-satne kulture na YPGA ili SPA (Dodatak 1.). Pripremiti razmaze soja biovar 2/biotip 3 za pozitivnu kontrolu i, prema potrebi, razmaz heterolognog soja za negativnu kontrolu. Ostaviti razmaze da se osuše. Brzo provući donju površinu stakla nekoliko puta iznad plamena kako bi se razmaz fiksirao.

Test s bojilom Nile blue

Test s bojilom Sudan black

Ostali testovi

Ostali prikladni testovi probira su test imunofluorescencije (odjeljak III.2), test ELISA (odjeljak III.3) i test PCR (odjeljak III.4).

3. Postupak izolacije

3.1. Ukloniti iscjedak ili dijelove tkiva promijenjene boje iz žilnog prstena u gomolju krumpira ili iz žilnog snopa u stabljici biljke krumpira ili rajčice. Suspendirati u manjoj količini sterilne destilirane vode ili u 50 mM fosfatnog pufera. Ostaviti 5 – 10 minuta.

3.2. Pripremiti niz decimalnih razrjeđenja suspenzije, npr. 1/10 i 1/100 ili više, ovisno o potrebi.

3.3. Prenijeti standardnu količinu suspenzije i razrjeđenja na univerzalnu hranjivu podlogu (NA, YPGA i SPA, Dodatak 1.) i/ili na Kelmanovu tetrazolij-podlogu (Dodatak 1.) i/ili selektivnu hranjivu podlogu SMSA (Dodatak 7.). Razmazati ili iscrtati odgovarajućom tehnikom nanošenja razrjeđenja na podlogu. Ovisno o potrebi, pripremiti posebne pločice za svaku upotrijebljenu hranjivu podlogu s razrijeđenom staničnom suspenzijom kulture virulentnog soja bakterije Ralstonia solanacearum biovar 2/biotip 3 za pozitivnu kontrolu.

3.4. Inkubirati podloge tri dana na temperaturi od 28 °C. Ako je rast usporen, inkubacija može trajati i do šest dana, no kolonije na pločicama SMSA često postaju atipične i odumiru.

Na univerzalnoj hranjivoj podlozi virulentni izolati bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju plosnate i nepravilne tekuće kolonije biserno bijele boje, često s karakterističnim spiralama u sredini.

Na Kelmanovoj tetrazolij-podlozi tipične kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum kremaste su boje te plosnate, nepravilne i tekuće s krvavo crvenim spiralama u sredini. Nevirulentni oblici bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju maslaste tamnocrvene kolonije.

Na podlozi SMSA tipične kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum mliječno su bijele boje, plosnate, nepravilne i tekuće, a s krvavo crvenim obojenjem u sredini.

Nevirulentni oblici bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju manje tekuće kolonije, koje na podlozi SMSA poprimaju boju u rasponu od potpuno ružičaste do crvene.

3.5. Pročistiti kolonije s tipičnom morfologijom precjepljivanjem na univerzalnoj hranjivoj podlozi. Potrebno je izbjegavati redovito precjepljivanje budući da može dovesti do gubitka virulentnosti.

4. Potvrdni test(ovi)

4.1. Identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum

Čiste kulture bakterije Ralstonia solanacearum identificiraju se putem barem jednog od sljedećih postupaka:

Hranidbeni i enzimatski testovi

Napomena: U svaki je korišteni test potrebno uključiti odgovarajuće kontrolne sojeve.

Sustavno su prisutne ili odsutne sljedeće fenotipske osobine bakterije Ralstonia solanacearum:

Podloge i metode navedene su u Lelliott & Stead (1987.).

Test imunofluorescencije

Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Pripremiti niz dvostrukih razrjeđenja antiseruma. Provesti test imunofluorescencije (odjeljak III.2.). IF titar kulture mora biti jednak titru pozitivne kontrole.

Test ELISA

Pripremiti suspenziju od > 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test ELISA (odjeljak III.3.). Vrijednost kulture ELISA mora biti jednaka vrijednosti pozitivne kontrole.

Test PCR

Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test PCR (odjeljak III.4.). Produkt kulture PCR mora biti jednake veličine i imati isti uzorak analize restrikcijskog enzima (REA) kao produkt pozitivne kontrole.

Fluorescentna hibridizacija in-situ (FISH)

Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test FISH (van Beuningen et al, 1995) s početnicom OLI-1 PCR (Seal et al, 1993.). Kultura mora reagirati jednako kao pozitivna kontrola.

Profiliranje bjelančevina

Denaturirane bjelančevine cijelih stanica razdvajaju se postupkom elektroforeze u poliakrilamidnom gelu – PAGE (Stead, 1992a.).

Profiliranje masnih kiselina (FAP)

Uzgajati kulturu i soj za pozitivnu kontrolu 48 sati na temperaturi od 28 °C u triptikaza-soja-agaru i provesti postupak FAP (Janse, 1991.; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Profil kulture mora biti jednak profilu pozitivne kontrole. U navedenim uvjetima karakteristične masne kiseline su 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH.

4.2. Karakterizacija soja

Karakterizacija soja nije obvezna, ali se preporuča za svaki novi slučaj primjenom barem jednog od sljedećih postupaka:

Određivanje biovara

Ralstonia solanacearum dijeli se na biovare na temelju sposobnosti stvaranja kiseline iz tri heksozna alkohola i tri šećera (Hayward, 1964 & 1994):

Dodatnim se testovima biovar 2 dijeli na podfenotipove (Hayward, 1994.):

Određivanje biotipa

Biotip (Buddenhagen et al., 1962.) se može utvrditi na temelju testa patogenosti kod biljaka rajčice ili patlidžana i kod biljaka duhana te pomoću testa hipersenzitivne reakcije (HR) na listovima duhana (Lozano i Sequeira, 1970.):

Određivanje biotipa testom patogenosti ili testom hipersenzitivnosti na duhanu nije nužno visokopouzdano te se umjesto toga biotip može odrediti na temelju biovara i prirodnog domaćina izvora.

Kultura se može dodatno karakterizirati sljedećim postupcima:

Molekularna diferencijacija sojeva u kompleksu bakterije Ralstonia solanacearum može se postići:

Ponavljajućim slijedom PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995.)]

4.3 Test patogenosti

Ovim se testom potvrđuje dijagnoza bakterije Ralstonia solanacearum i ocjenjuje virulentnost kultura identificiranih kao Ralstonia solanacearum.

Pripremiti inokulum 106 stanica po ml iz kulture i pozitivnog kontrolnog soja. Inokulirati 5 – 10 biljaka rajčice ili patlidžana, poželjno u fazi trećeg pravog lista ili u kasnijoj fazi (odjeljak III.6.). Inkubirati najviše dva tjedna na temperaturi 22 – 28 °C i visokoj relativnoj vlažnosti uz svakodnevno zalijevanje. Promatrati pojavu venuća i/ili epinastije, kloroze, zaostajanja u rastu.

Postupak izolacije iz biljaka sa simptomima vrši se na sljedeći način:

ODJELJAK III.

OTKRIVANJE I IDENTIFIKACIJA BAKTERIJE RALSTONIA SOLANACEARUM U UZORCIMA GOMOLJA KRUMPIRA

Napomena: Standardna veličina uzorka jest 200 gomolja. Međutim, postupak se može primijeniti na odgovarajući način i na uzorcima manjima od 200 gomolja.

1. Pripremanje uzorka za testiranje

Napomena: Pelet ekstrakta krumpira dobiven ovim postupkom može se koristiti i za otkrivanje bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Mogući postupci obrade prije testiranja ako se smatraju korisnima:

1.1. Čistim i sterilnim skalpelom ili nožem za povrće odstraniti koru gomolja na području hiluma tako da žilna tkiva postanu vidljiva. Pomno izrezati malu stožastu jezgru (promjera 3 – 5 mm) žilnog tkiva na području hiluma. Količina nežilnog tkiva treba biti što je manja moguća. Obraditi sve gomolje u uzorku.

Napomena: U ovoj je fazi moguće izvršiti vizualni pregled gomolja (odjeljak II.1.). Odvojiti sve gomolje sa simptomima ili vrlo trule gomolje i testirati zasebno (odjeljak II.).

1.2. Staviti hilume gomolja u zatvorenu posudu. Poželjno ih je odmah obraditi. Ako to nije moguće, čuvati ih najviše 24 sata, odnosno najviše 72 sata na 4 °C.

1.3. Obraditi hilume gomolja jednim od sljedećih postupaka:

1.4. Ekstrahirati bakterije iz obrađenih hiluma jednim od sljedećih postupaka:

1.5 Resuspendirati pelet u 1 ml peletnog pufera (Dodatak 2.).

Podijeliti na dva jednaka dijela i staviti svaki dio u mikroepruvetu.

Za testiranje se koristi jedna mikroepruveta. Ostatak ekstrakta čuvati na 4 °C tijekom testiranja.

U drugu mikroepruvetu dodati 10 – 25 % (v/v) sterilnog glicerola. Snažno promiješati. Pohraniti na temperaturi od – 18 °C (tjednima) ili – 70 °C (mjesecima).

2. Test imunofluorescencije

Koristiti antiserum za bakteriju Ralstonia solanacearum, po mogućnosti protiv biotipa 3/biovara 2. Odrediti titar suspenzije od 106 stanica po ml homolognog soja bakterije Ralstonia solanacearum pomoću odgovarajućeg razrjeđenja fluorescein izotiocijanat (FITC) konjugata sukladno uputama proizvođača. IF titar sirovog antiseruma mora iznositi barem 1:2 000.

Koristiti predmetna stakalca s više jažica, po mogućnosti s 10 jažica promjera barem 6 mm.

Na svakom predmetnom stakalcu koristiti kontrolu FITC konjugata. Test je potrebno ponoviti s uključenom kontrolom PBS ako se u kontroli FITC opaze bilo koje pozitivne stanice.

Pripremiti posebna stakalca za pozitivnu kontrolu sa suspenzijom od 106 stanica po ml soja odgovarajućeg biotipa/biovara bakterije Ralstonia solanacearum. Za svaki niz testova koristiti po jedno stakalce.

2.1. Pripremiti testna stakalca jednim od sljedećih postupaka:

2.2. Ostaviti da se kapljice osuše. Fiksirati stanice bakterija na staklo zagrijavanjem, plamenom ili 95-postotnim etanolom.

Postupak za test imunofluorescencije

2.3.1. Posložiti stakalca na navlaženi upijajući papir.

Testne jažice prekriti razrjeđenjem(-ima) antiseruma. Nanijeti PBS na jamice s FITC-om. Obujam antiseruma koji se stavlja u jažice mora biti jednak obujmu stavljenog ekstrakta.

2.3.2. Inkubirati pokriveno 30 minuta na sobnoj temperaturi.

2.3.3. Otresti sa stakalaca kapljice antiseruma i pažljivo ih isprati IF puferom. Ispirati pet minuta u IF puferu-Tween i potom još pet minuta u IF puferu (Dodatak 3.). Pažljivo ukloniti višak vlage.

2.3.4. Posložiti stakalca na navlaženi upijajući papir. Prekriti testne jažice i jažicu s FITC-om razrjeđenjem konjugata FITC korištenog za određivanje titra. Obujam konjugata koji se stavlja u jažice mora biti jednak obujmu stavljenog antiseruma.

2.3.5. Inkubirati pokriveno 30 minuta na sobnoj temperaturi.

2.3.6. Otresti kapljice konjugata sa stakalca. Isprati i oprati na prethodno opisani način (2.3.3.). Pažljivo ukloniti višak vlage.

2.3.7. U svaku jažicu pipetom odmjeriti 5 – 10 μl 0,1 M glicerola s fosfatnim puferom (Dodatak 3.) ili sličan pokrivni pufer i i staviti pokrovno stakalce.

2.4. Očitavanje testa imunofluorescencije

Pregledavati testna stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s filterima primjerenima za ekscitaciju FITC-a, u imerzijskom ulju uz povećanje 500 – 1 000. Pregledavati jažice duž dvaju promjera pod pravim kutom i duž vanjskog ruba.

Najprije je potrebno pregledati stakalce za pozitivnu kontrolu. Stanice moraju biti svijetlo fluorescentne i potpuno obojane.

Napomena: u slučaju odstupanja kod obojenosti test je potrebno ponoviti.

Pregledati testna stakalca. Prvo je potrebno utvrditi da u jažicama za FITC kontrolu nema fluorescentnih stanica. Prisutnost fluorescentnih stanica u FITC kontroli upućuje na nespecifično vezivanje konjugata, autofluorescenciju ili kontaminaciju.

Napomena: u tom je slučaju test potrebno ponoviti.

U testnim jamicama tražiti svijetle fluorescentne stanice s morfologijom karakterističnom za bakteriju Ralstonia solanacearum. Intenzitet fluorescencije mora biti jednak onom zamijećenom kod soja za pozitivnu kontrolu pri jednakom razrjeđenju antiseruma. Stanice s nepotpunim obojenjem ili slabom fluorescencijom ne uzimaju se u obzir, osim ako su prisutne u velikom broju (vidjeti: Tumačenje rezultata testa imunofluorescencije).

Tumačenje rezultata testa imunofluorescencije:

3. Test ELISA

Temelji se na Robinson-Smith et al., 1995.

Koristiti antiserum za bakteriju Ralstonia solanacearum, po mogućnosti protiv biotipa 3/biovara 2. Odrediti titar na suspenziji od 106 stanica po ml homolognog soja bakterije Ralstonia solanacearum.

Preporučuje se uporaba mikrotitarskih pločica NUNC-Polysorb.

Koristiti negativnu kontrolu s ekstraktom krumpira i kontrolu s fosfatnim puferom sa solju (PBS).

Koristiti pozitivnu kontrolu sa suspenzijom od > 106 stanica po ml soja odgovarajućeg biotipa/biovara bakterije Ralstonia solanacearum. Testiranje se vrši na jednak način kao i za uzorke, ali potpuno odvojeno od uzoraka na mikrotitarskoj pločici.

3.1. U mikroepruvetu pipetom odmjeriti 100 – 200 μl resuspendiranog peleta.

Zagrijavati 4 minute na teperaturi od 100 °C. Staviti mikroepruvetu u led.

3.2. Dodati jednaku količinu karbonatnog pufera za oblaganje dvostruke jačine (Dodatak 5.). Snažno promiješati.

3.3. Staviti alikvote od 100 μl u svaku od barem dvije jažice na mikrotitarskoj pločici. Inkubirati jedan sat na 37 °C ili preko noći na 4 °C.

3.4. Ukloniti ekstrakte iz jažica. Triput isprati jažice otopinom PBS-Tween (Dodatak 5.), a posljednju otopinu za ispiranje ostaviti u jažicama barem pet minuta.

3.5. Pripremiti odgovarajuće razrjeđenje antiseruma bakterije Ralstonia solanacearum u blokirajućem puferu (Dodatak 5.). Dodati 100 μl razrjeđenja antiseruma u svaku jažicu.

Inkubirati jedan sat na 37 °C.

3.6. Ukloniti antiserum iz jažica. Isprati jažice na gore opisani način (3.4.).

3.7. Pripremiti odgovarajuće razrjeđenje konjugata alkalne fosfataze u blokirajućem puferu. Dodati 100 μl razrjeđenja konjugata u svaku jažicu.

Inkubirati jedan sat na 37 °C.

3.8. Ukloniti konjugat iz jažica. Isprati jažice na gore opisani način (3.4. i 3.6.).

3.9. Pripremiti razrjeđenje supstrata alkalne fosfataze (Dodatak 5.). Dodati 100 μl u svaku jažicu. Inkubirati 30 minuta do jednog sata u zatamnjenom prostoru na sobnoj temperaturi.

3.10. Očitati apsorbanciju pri 409 nm.

Tumačenje testa ELISA:

Test ELISA je negativan ako je optička gustoća (OG) uzorka < 2 × OG negativne kontrole.

Test ELISA je pozitivan ako je optička gustoća (OG) uzorka > 2 × OG negativne kontrole.

4. Test PCR

Temelji se na Seal et al., 1993.

Napomena: U svim fazama pripremanja uzorka i drugim postupcima koji uključuju PCR potrebno je koristiti pipete s filterom u vršku.

Za pozitivnu kontrolu pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz soja biotipa 3/biovara 2 bakterije Ralstonia solanacearum. Testiranje se vrši na jednak način kao i za uzorke.

4.1. Pipetom odmjeriti u mikroepruvetu 100 μl resuspendiranog peleta.

Alternativno je moguće staviti 90 μl resuspendiranog peleta u mikroepruvetu koja sadrži 10 μl 0,5 M NaOH. Promiješati uzastopnim preokretanjem mikroepruvete.

4.2. Zagrijavati četiri minute na 100 °C. Mikroepruvetu odmah staviti u led.

4.3. Pripremiti barem dva decimalna razrjeđenja, npr. 1/10 i 1/100, a po potrebi i više, u sterilnoj destiliranoj vodi ili ultra čistoj vodi.

4.4. U sterilnoj epruveti pripremiti reakcijsku smjesu za PCR (Dodatak 6.) dodavanjem sljedećih reagensa u navedenom redoslijedu:

Za 50 μl reakcijske smjese:

Za veći broj reakcija:

Izračunati količinu svakog reagensa za potreban broj reakcija.

Pomiješati reagense i staviti 45 – 48 μl smjese u sterilne epruvete za PCR.

Čuvati epruvete s reakcijskom smjesom za PCR u ledu.

Za 25 μl reakcijske smjese:

Proporcionalno smanjiti količine reagensa.

4.5. PCR umnožavanje

4.5.1. Neobvezno: impulsno centrifugirati epruvete s prokuhanim uzorcima i pozitivnom kontrolom.

U epruvete s reakcijskom smjesom za PCR navedenim redoslijedom dodati 2 – 5 μl uzorka(-aka), vodene kontrole i pozitivne kontrole. Staviti epruvete u blok za zagrijavanje DNA-termociklera.

4.5.2. Provesti sljedeći program:

1 ciklus od:

i. 2 minute na 96 °C: denaturacija kalupa

50 ciklusa od:

ii. 20 sekundi na 94 °C: denaturacija

iii. 20 sekundi na 68 °C: sparivanje početnica

iv. 30 sekundi na 72 °C: produljivanje kopije

1 ciklus od:

v. 10 minuta na 72 °C: dodatno produljivanje

1 ciklus od:

Napomena: Ovi su parametri namijenjeni za uređaj Perkin Elmer 9600. Drugi termocikleri mogu zahtijevati pokrovni sloj mineralnog ulja u PCR reakcijskim epruvetama i/ili prilagodbu trajanja ciklusa ii., iii. i iv. u profilu umnožavanja.

4.5.3. Ukloniti epruvete iz termociklera. Analizirati PCR produkt. Ako se analiza ne izvrši odmah, potrebno je čuvati epruvete na 4 °C za uporabu istog dana ili na – 18 °C za dulje razdoblje.

4.6. Analiza PCR produkta

Fragmenti PCR otkrivaju se elektroforezom u agaroznom gelu i bojanjem etidijevim bromidom.

4.6.1. Pripremiti odgovarajući agarozni gel polaganim zagrijavanjem agaroze do tališta u tris-acetatnom puferu za elektroforezu (TAE).

4.6.2 Ohladiti rastaljenu agarozu na 50 – 60 °C, uliti u kalup uređaja za elektroforezu i umetnuti češalj. Ostaviti otopinu da se stvrdne.

4.6.3 Ukloniti češalj. Potopiti gel u TAE na način da bude prekriven samo puferom (2 – 3 mm).

4.6.4 Nakapati 3 μl pufera za nanošenje na parafilm. Dodati 12 μl PCR produkta iz uzoraka, bilo pozitivne kontrole, bilo vodene kontrole, te prije punjenja promiješati laganim usisavanjem u vrh pipete. Navedene je količine moguće prilagoditi kako bi odgovarale obujmu jažica u agaroznom gelu.

4.6.5 Pažljivo napuniti jažice u gelu. U barem jednu jažicu dodati odgovarajući DNK marker kao referencu.

4.6.6 Priključiti žicama uređaj za elektroforezu s napajanjem električne energije. Izvršiti elektroforezu pri naponu 5 – 8 V/cm dok fronta indikatora za praćenje ne bude 1 cm od kraja gela.

4.6.7 Isključiti dovod električne energije. Odspojiti žice s uređaja za elektroforezu.

Pažljivo ukloniti gel. Potopiti gel u otopinu etidijevog bromida 30 – 45 minuta.

Napomena: Prilikom rukovanja etidijevim bromidom, koji je snažan mutagen, čitavo je vrijeme potrebno nositi rukavice za jednokratnu uporabu.

4.6.8 Ukloniti boju u destiliranoj vodi 10 – 15 minuta.

4.6.9 Pogledati umnožene fragmente DNK pomoću UV transiluminatora. Duljina PCR produkta bakterije Ralstonia solanacearum s početnicama OLI-1 i Y-2 iznosi 288 bp. Usporediti s DNK markerom i pozitivnom kontrolom.

Napomena: Vodena kontrola mora biti negativna u svakom slučaju. Ako je pozitivna, test je potrebno ponoviti.

4.6.10. Fotografirati gel ako je potreban trajan dokaz.

4.6.11. Potvrditi autentičnost umnoženog fragmenta analizom restrikcijskih enzima (REA).

4.7 Analiza restrikcijskih enzima (REA)

4.7.1. Staviti 8,5 μl PCR produkta (4.5.3.) u novu mikroepruvetu. Dodati 1 μl 10x enzimskog pufera i 0,5 μl restrikcijskog enzima Ava II.

4.7.2 Promiješati laganim usisavanjem u vrh pipete. Ako na stijenkama epruvete ostanu kapljice, impulsno centrifugirati u mikrocentrifugi. Inkubirati jedan sat na 37 °C.

4.7.3 Analizirati pocijepani fragment PCR elektroforezom u agaroznom gelu na prethodno opisani način (4.6.).

Tumačenje rezultata testa PCR:

Test PCR je negativan ako u uzorku nije vidljiv karakteristični fragment duljine 288 bp, ali je isti vidljiv u pozitivnim kontrolama za soj bakterije Ralstonia solanacearum.

Test PCR je pozitivan ako je u uzorku vidljiv fragment duljine 288 bp, a REA analiza umnoženog fragmenta jednaka je pozitivnoj kontroli soja bakterije Ralstonia solanacearum.

5. Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi

Temelji se na Elphinstone et al., 1996.

5.1 Izvršiti test odgovarajućom tehnikom nanošenja razrjeđenja, npr.:

5.2 Istom tehnikom nanošenja razrjeđenja nanijeti na niz zasebnih pločica s modificiranom hranjivom podlogom SMSA suspenziju od 106 stanica po ml virulentnog soja biotipa 3/biovara 2 bakterije Ralstonia solanacearum.

5.3 Inkubirati pločice na 28 °C. Započeti s očitavanjem pločica nakon tri dana. Ako su negativne, nastaviti s inkubacijom do najviše šest dana. Kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum mliječno su bijele boje, plosnate, nepravilne i tekuće, s krvavo crvenim obojenjem u sredini s unutarnjim prugama ili spiralama.

5.4 Pročistiti kolonije karakteristične morfologije precjepljivanjem na univerzalnu hranjivu podlogu (Dodatak 1.).

5.5 Identificirati čiste kulture (odjeljak II. točka 4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II. točka 4.3.).

Tumačenje testa razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi:

Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi je negativan ako se nakon šest dana ne izoliraju ikakve bakterijske kolonije ili ako se ne izoliraju kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum, pod uvjetom da ne postoji sumnja na inhibiciju od strane kolonija drugih bakterija te ako su u pozitivnoj kontroli identificirane kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum.

Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi je pozitivan ako se izoliraju kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum.

6. Biološki test

Temelji se na Janse, 1988.

6.1 Za svaki uzorak upotrijebiti 10 testnih biljaka osjetljivog kultivara rajčice ili patlidžana u fazi trećeg pravog lista. Ne zalijevati biljke 24 sata prije inokulacije.

6.2 Rasporediti 100 μl resuspendiranog peleta na testne biljke. Inokulirati u stabljiku između supki i na jednom ili više drugih mjesta.

6.3 Inokulirati istom tehnikom 10 sadnica suspenzijom od 106 stanica po ml virulentnog soja biovara 2/biotipa 3 bakterije Ralstonia solanacearum za pozitivnu kontrolu i peletnim puferom za negativnu kontrolu. Odvojiti biljke za pozitivnu kontrolu od ostalih biljaka kako bi se spriječila unakrsna kontaminacija.

6.4 Uzgajati biljke do najviše četiri tjedna na temperaturi 22 – 28 °C i uz visoku relativnu vlažnost i svakodnevno zalijevanje. Pratiti pojavu venuća, epinastije, kloroze i/ili zaostajanja u rastu.

6.5 Pripremiti izolate iz zaraženih biljaka (odjeljak II.). Identificirati čiste kulture karakteristične morfologije (odjeljak II.4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II.4.3.).

6.6 Prema potrebi provjeriti odsutnost zaraze na serijama testnih biljaka koje ne pokazuju nikakve znakove zaraze. Ukloniti sa svake testne biljke dio stabljike duljine jedan cm na mjestu koje se nalazi dva cm iznad točke inokulacije. Homogenizirati tkiva u puferu za maceraciju. Pripremiti test razmaza razrjeđenja na hranjivu podlogu (odjeljak III.5.1.). Ako je rezultat pozitivan, identificirati čiste kulture karakteristične morfologije (odjeljak II.4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II.4.3.).

Tumačenje rezultata biološkog testa:

Biološki je test negativan ako testne biljke nisu zaražene bakterijom Ralstonia solanacearum pod uvjetom da su u pozitivnoj kontroli otkrivene bakterije Ralstonia solanacearum.

Biološki je test pozitivan ako su testne biljke zaražene bakterijom Ralstonia solanacearum.

7. Testovi obogaćivanja

Temelji se na Elphinstone et al., 1996.

7.1 Odmjeriti 100 μl resuspendiranog peleta u tri ml modificiranog bujona SMSA (Dodatak 7.).

7.2 Inkubirati 48 sati, ali nikako dulje od 72 sata, na temperaturi od 28 °C u epruveti s labavim čepom kako bi se omogućilo prozračivanje.

7.3 Dobro zatvoriti čep na epruveti i snažno promiješati. Pripremiti alikvote za test imunofluorescencije (ovaj odjeljak točka 2.), test ELISA (ovaj odjeljak točka 3.) i/ili test PCR (ovaj odjeljak točka 4.)

8. Test patogenosti

Vidjeti odjeljak II.4.3.

Reference

Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.

Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113—121.

Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133—142.

Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.

Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3—5.

Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265—277.

Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127—135.

Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343—351.

Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335—345.

Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293—695.

Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.

Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528—536.

Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.

Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029—1034.

Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67—79.

Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587—1594.

Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262—4268.

Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76—111.

Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281—295.

Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266—269.