HR Službeni list Europske unije 16

31980L0891



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 25.07.1980.

DIREKTIVA KOMISIJE

od 25. srpnja 1980.

o metodi analize Zajednice za određivanje udjela eruka kiseline u uljima i mastima namijenjenim kao takvima za prehranu ljudi te u hrani koja sadrži dodana ulja ili masti

(80/891/EEZ)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske ekonomske zajednice,

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 76/621/EEZ od 20. srpnja 1976. o utvrđivanju maksimalne razine eruka kiseline u uljima i mastima namijenjenim kao takvima prehrani ljudi te u hrani koja sadrži dodana ulja ili masti (1), a posebno njezin članak 3.,

budući da se člankom 2. Direktive 76/621/EEZ utvrđuje da, od 1. srpnja 1979., udio eruka kiseline u proizvodima iz članka 1. te Direktive, računano na ukupne masne kiseline u masnoj komponenti ne smije biti veći od 5 %;

budući da se člankom 3. Direktive 76/621/EEZ utvrđuje da se udio eruka kiseline određuje metodom analize Zajednice;

budući da se Uredbom (EEZ) br. 1470/68 od 23. rujna 1968. o uzimanju uzoraka i smanjenju broja uzoraka te o određivanju sadržaja ulja, nečistoća i vlage u sjemenu uljarica (2), u Prilogu VI. utvrđuje, kako je uvedeno Uredbom (EEZ) br. 72/77 (3), metoda analize kojom se određuje udio eruka kiseline u uljanoj repici i sjemenu repice; budući da ovu metodu treba koristiti kao metodu probira;

budući da nije moguće razlikovati, kada se masne kiseline koje čine sastavni dio ulja i masti analiziraju plinskom kromatografijom pod uobičajenim uvjetima, eruka kiselinu od drugih izomera dokozenske kiseline kao što je cetoleinska kiselina;

budući da je potrebno odrediti razinu eruka kiseline u uljima i mastima, kao i u hrani u koju su dodana ulja i masti, koja može sadržavati cetoleinsku kiselinu i druge izomere dokozenske kiseline;

budući da razinu eruka kiseline ne treba određivati u uljima i mastima te u hrani u koju su dodana ulja i masti kada se utvrdi, nakon korištenja metoda probira, da ne sadrže više od 5 % ukupne dokozenske kiseline ili cis-dokozenske kiseline;

budući da se, u očekivanju uvođenja poboljšane metode analize za određivanje eruka kiseline, ova metoda analize trenutačno smatra najprikladnijom;

budući da su mjere predviđene ovom Direktivom u skladu s mišljenjem Stalnog odbora za hranu,

DONIJELA JE OVU DIREKTIVU:

Članak 1.

Države članice traže da se analiza potrebna za određivanje udjela eruka kiseline u proizvodima iz članka 1. Direktive 76/621/EEZ provodi kako je utvrđeno u članku 2.

Članak 2.

1. U svrhu probira, određuje se jedno od sljedećeg:

(a) ukupni udio dokozenske kiseline u proizvodima iz članka 1. po metodi navedenoj u Prilogu VI. Uredbi (EEZ) br. 1470/68; ili

(b) ukupni udio cis-dokozenske kiseline u proizvodima iz članka 1. po metodi navedenoj u Prilogu VI. Uredbi (EEZ) br. 1470/68 pri čemu se koristi plinska kromatografija u uvjetima koji omogućavaju razdvajanje cis- i trans-izomera dokozenske kiseline; stacionarne faze prikladne za ovu svrhu su, na primjer, cijanopropilpolisiloksani ili tekući kristali.

2. Ako ukupni udio:

(a) dokozenske kiseline, određen sukladno stavku 1. točki (a); ili

(b) cis-dokozenske kiseline, određen sukladno stavku 1. točki (b), u proizvodima iz članka 1., računano na ukupni udio masnih kiselina u masnoj komponenti, ne premašuje 5 %, daljnje određivanje nije potrebno. U suprotnom, udio eruka kiseline određuje se metodom navedenom u Prilogu ovoj Direktivi.

Članak 3.

Države članice donose zakone i druge propise potrebne za usklađivanje s odredbama ove Direktive najkasnije 1. veljače 1982. One o tome odmah obavješćuju Komisiju.

Članak 4.

Ova je Direktiva upućena državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 25. srpnja 1980. Za Komisiju Etienne DAVIGNON član Komisije

(1) SL. 202, 28.7.1976., str. 35.

(2) SL L 239, 28.9.1968., str. 2.

(3) SL L 12, 15.1.1977., str. 11.

PRILOG

ODREĐIVANJE UDJELA ERUKA KISELINE U ULJIMA I MASTIMA NAMIJENJENIM KAO TAKVIMA ZA PREHRANU LJUDI TE U MASNOM ILI ULJNOM DIJELU HRANE U KOJU SU DODANA ULJA I MASTI

I. UVOD

1. PRIPREMA UZORKA

1.1. Općenito

Masa uzorka koji se dostavlja u laboratorij na analizu uobičajeno iznosi 50 g osim ako se ne zahtijeva veća količina.

1.2. Priprema uzorka za analizu u laboratoriju

Prije analize uzorak se mora homogenizirati.

1.3. Posude

Tako pripremljen uzorak treba pohraniti u dobro zatvorenoj posudi.

2. REAGENSI

2.1. Voda

2.1.1. Ako se voda koristi kao otapalo, za razrjeđivanje ili za pranje, treba koristiti destiliranu ili demineraliziranu vodu najmanje jednake čistoće.

2.1.2. Pojam „otapanje” ili „razrjeđivanje” bez navođenja bilo kakvog drugog reagensa, podrazumijeva otapanje u vodi ili razrjeđivanje vodom.

2.2. Kemikalije

Sve kemikalije koje se koriste moraju biti priznate analitičke čistoće, osim ako nije drugačije navedeno.

3. OPREMA

3.1. Popis opreme

Popis sadrži samo opremu za posebnu namjenu koja ima specifikaciju.

3.2. Analitička vaga

„Analitička vaga” označava vagu osjetljivosti najmanje 0,1 mg.

4. IZRAŽAVANJE REZULTATA

4.1. Rezultati

Rezultat naveden u službenom izvješću o analizi predstavlja srednju vrijednost dobivenu iz najmanje dva određivanja koja zadovoljavaju kriterij ponovljivosti.

4.2. Izračun postotka

Osim ako nije drugačije navedeno, rezultati moraju biti izraženi kao postoci (m/m) ukupnih masnih kiselina u uzorku zaprimljenom u laboratoriju.

4.3. Broj značajnih znamenki

Broj značajnih znamenki u tako izraženom rezultatu određen je preciznošću metode.

II. ODREĐIVANJE ERUKA KISELINE

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Metodom se određuje udio eruka kiseline:

i. u uljima i mastima koje sadrže cetoleinsku kiselinu (poseban cis-izomer dokozenske kiseline koji se javlja u ribljim uljima); te

ii. u hidrogeniziranim uljima i mastima koje sadrže trans- i cis-izomere dokozenske kiseline.

2. DEFINICIJA

Udio eruka kiseline: udio eruka kiseline određen opisanom metodom.

3. NAČELO

Metilni esteri masnih kiselina ulja i masti odvajaju se pri niskoj temperaturi tankoslojnom kromatografijom i kvantitativno određuju plinskom kromatografijom.

4. REAGENSI

4.1. Svježe destiliran dietil-eter bez peroksida.

4.2. n-heksan.

4.3. Silikagel G, za tankoslojnu kromatografiju.

4.4. Silikagel, za kolonsku kromatografiju.

4.5. Otopina srebrnog nitrata, 200 g u litri. Otopiti 24 g srebrnog nitrata u vodi i dopuniti vodom do 120 ml.

4.6. Otopina metil erukata 5 mg/ml. Otopiti 50 mg metil erukata u nekoliko ml n-heksana i razrijediti s n-heksanom do 10 ml.

4.7. Metil tetrakozanoat, otopina internog standarda, 0,25 mg/ml. Otopiti 25 mg metil tetrakozanoata u nekoliko ml n-heksana (kao 4.6.) te razrijediti s n-heksanom do 100 ml.

4.8. Otapalo za razvijanje. Toluen: n-heksan 90:10 (v/v).

4.9. Otopina 2,7-diklorofluoresceina 0,5 g/l. Uz zagrijavanje i miješanje otopiti 50 mg 2,7-diklorofluoresceina u 100 ml 50 %-tne vodene otopine metanola.

5. PRIBOR

Pribor za tankoslojnu kromatografiju treba sadržavati:

5.1.1. Jedinicu za duboko zamrzavanje koja održava temperaturu kade za razvijanje i sadržaja od – 20 do – 25 °C.

5.1.2. Staklene ploče veličine 200 × 200 mm.

5.1.3. Ultraljubičastu (UV-) svjetiljku.

5.1.4. Staklene cijevi, dužine oko 200 mm, unutarnjeg promjera oko 10 mm s filtrom od staklene vune ili sinter stakla. Kao alternativa mogu se koristiti mali lijevci s filtrima od sinter stakla.

5.1.5. Pribor za nanošenje otopina u obliku traka ili pruga na ploče za tankoslojnu kromatografiju (TLC ploče).

5.2. Plinski kromatograf, s elektronskim integratorom, kao što je opisano u odjeljku III. Priloga VI. Uredbi Komisije (EEZ) br. 72/77.

6. POSTUPAK

6.1. Priprema metilnih estera masnih kiselina

Uzeti približno 400 mg uljne ili masne komponente uzorka za analizu i pripremiti otopinu koja sadrži oko 20 do 50 mg/ml metilnih estera masnih kiselina u n-heksanu pomoću metode opisane u odjeljku II.3. Priloga VI. Uredbi Komisije (EEZ) br. 72/77.

6.2. Tankoslojna kromatografija

6.2.1. Priprema ploča

Staviti 60 g. silikagela (4.3.) u tikvicu s okruglim dnom od 500 ml, dodati 120 ml otopine srebrnog nitrata (4.5.) i tresti jednu minutu kako bi se dobila potpuno homogena suspenzija. Suspenziju nanijeti na ploče na uobičajen način; debljina sloja trebala bi biti približno 0,5 mm. Ova količina suspenzije dovoljna je za pripremu pet ploča veličine 200 × 200 mm.

Pustiti da se ploče djelomično osuše na zraku (najbolje tako da ih se ostavi u mraku približno 30 minuta). U potpunosti osušiti i aktivirati ploče stavljanjem u sušionik, na temperaturu od 100 °C, 2 sata i 30 minuta. Nakon aktiviranja upotrijebiti ploče što prije ili ih pažljivo spremiti u tamnu komoru te ih ponovno aktivirati prije uporabe. (Napomena: aktiviranje pri 110 °C u trajanju od sat vremena može se smatrati zadovoljavajućim pod uvjetom da ploče ne potamne). Prije uporabe povući crte kroz sloj na udaljenosti 10 mm od rubova i vrha svake ploče kako bi se smanjili rubni učinci tijekom razvijanja.

6.2.2. Nanošenje metilnih estera

Koristeći pribor za nanošenje (5.1.5.) nanijeti 50 μl otopine metilnih estera (6.1.) pripremljene iz uzorka, u uskoj pruzi duljine približno 50 mm, najmanje 40 mm od ruba ploče i 10 mm od dna. Na sličan način nanijeti 100 μl otopine koja sadrži jednaku količinu pripremljene otopine metilnih estera (6.1.) i otopine metil erukata (4.6.). Zbog osjetljivosti sloja, otopine treba pažljivo nanositi (Napomena: ako se to želi, na ploču se može nanijeti 50 μl otopine metil erukata (4.6.) kako bi se olakšalo utvrđivanje trake koja sadrži metil erukat nakon razvijanja: vidjeti sliku). Nakon nanošenja metilnih estera uroniti donji rub ploče u dietil-eter sve dok se eter ne uzdigne na približno 5 mm iznad područja nanošenja uzorka. Na ovaj se način metilni esteri koncentriraju u uskoj traci.

6.2.3. Razvijanje ploča

Uliti otapalo za razvijanje (4.8.) u kadu do visine od 5 mm i staviti kadu s poklopcem u jedinicu za duboko zamrzavanje (5.1.1.), držati na temperaturi od – 25 °C ili što je moguće bliže toj temperaturi. (Ako je potrebno, kadu treba poravnati). Nakon dva sata pažljivo staviti ploču u kadu i pričekati da se otapalo uzdigne do približno polovice ili dvije trećine visine ploče. Nakon toga izvaditi ploču i nježno ukloniti otapalo pomoću slabe struje dušika. Ponovno staviti ploču u kadu i pričekati da se otapalo uzdigne do vrha ploče. Izvaditi ploču te ju kao i prethodno osušiti u struji dušika i tada po njoj pažljivo raspršiti otopinu 2,7-diklorofluoresceina (4.9.).

Pregledati ploču pod ultraljubičastim (UV-) svjetlom i odrediti traku koja sadrži metil erukat u uzorku koristeći za usporedbu referentnu traku uzorka u koji je dodan metil erukat (vidjeti sliku).

6.2.4. Odvajanje frakcija metilnih estera

Ostrugati traku koja sadrži metil erukat dobiven iz uzorka u čašu od 50 ml pazeći da ne bude gubitaka. Na isti način prenijeti silikagel smješten iznad i ispod trake koja sadrži metil erukat u drugu čašu od 50 ml. Ova traka sadržavat će sve ostale frakcije metilnih estera masnih kiselina. U svaku čašu dodati 1 ml standardne otopine metil tetrakozanoata (4.7.) i 10 ml dietil-etera (4.1.). Promiješati i prebaciti sadržaj čaša u odvojene kolone ili lijevke (5.1.4.), od kojih svaki sadrži približno 1 g silikagela (4.4.); ekstrahirati metilne estere koristeći tri do četiri porcije dietil-etera od 10 ml. Sakupiti filtrate u malene tikvice. Ispariti svaki filtrat do malenog volumena koristeći slabu struju dušika i prebaciti metilne estere u malene epruvete s konusnim dnom. Ukloniti ostatak otapala isparavanjem u struji dušika na način da se metilni esteri koncentriraju na dnu. Otopiti metilne estere u 25 do 50 μl n-heksana (4.2.).

6.3. Plinska kromatografija

6.3.1. Provesti postupak kao što je u opisano u odjeljku III. Priloga VI. Uredbi Komisije (EEZ) br. 72/77 i analizirati 1 do 2 ml otopine metilnih estera dobivenih iz i. frakcije koja sadrži metil erukat, te ii. frakcija koje sadrže ostatak metilnih estera masnih kiselina.

6.3.2. Pomoću elektroničkog integratora dobivamo sljedeće površine pikova:

i. iz kromatograma frakcije koja sadrži metil erukat: (a) metil erukat [E] (b) interni standard [L1] (c) ukupne površine pikova metilnih estera masnih kiselina bez internog standarda [EF]

ii. iz kromatograma frakcija koje sadrže ostatak metilnih estera masnih kiselina: (a) ukupne površine pikova metilnih estera masnih kiselina bez internog standarda [RF] (b) interni standard [L2]

7. PRIKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Metoda izračuna i formula

7.1.1. Sadržaj eruka kiseline uzorka, prikazan kao postotak metil erukata u odnosu na ukupan postotak metilnih estera svih masnih kiselina prisutnih u uzorku dobiva se na sljedeći način:

pri čemu su

E, EF, RF, L1 i L2 površine pikova (6.3.2.), prema potrebi ispravljene uporabom korektivnih faktora.

Za praktične svrhe, vrijednost metil erukata dobivena gore navedenom formulom jednaka je razini eruka kiseline izražene kao postotak ukupnih masnih kiselina u uzorku.

7.1.2. Ako su površine pikova dobivene u postocima, vrijednosti EF-a i RF-a mogu se izračunati na sljedeći način:

EF = 100 – L1

RF = 100 – L2.

7.1.3. Metoda izračuna (7.1.1.) pretpostavlja da je udio tetrakosanske kiseline u uzorku zanemariv. Ako se pokaže da je navedena kiselina u uzorku prisutna u značajnoj količini, vrijednost tetrakosanske kiseline (L2) dobivene iz kromatograma frakcija koje sadrže ostatak metilnih estera masnih kiselina mora se smanjiti na:

L2 – T2,

pri čemu je

a

T2 = površina pika metil tetrakozanoata dobivena iz uzorka koja čini dio površine vrijednosti internog standarda u kromatogramu preostale frakcije metilnih estera masnih kiselina, P2 = površina pika metil palmitata dobivena iz kromatograma preostale frakcije, To = površina pika metil tetrakozanoata dobivena iz kromatograma metilnih estera ukupnih masnih kiselina utvrđenih analizom iz članka 2. ove Direktive, Po = površina pika metil palmitata dobivena iz kromatograma metilnih estera ukupnih masnih kiselina utvrđenih analizom iz članka 2. ove Direktive.

7.1.4. Izvođenje formule

Odnos masnih kiselina u frakciji koja sadrži metil erukat, izražen kao postotak ukupnih masnih kiselina u uzorku dobiva se na sljedeći način:





ili

Udio eruka kiseline, u frakciji koja sadrži metil erukat, dobiva se na sljedeći način:

Udio eruka kiseline u uzorku izražava se kao postotak ukupnih masnih kiselina na sljedeći način:





ili

7.1.5. Ponovljivost

Razlika između vrijednosti dvaju određivanja koja se provode istodobno ili odmah jedno iza drugog na istom uzorku, od strane istog analitičara te pod istim uvjetima, ne smije prijeći 10 % rezultata ili 0,5 g u 100 g uzorka, uzimajući u obzir višu vrijednost.

SLIKA

Tipičan tankoslojni kromatogram koji pokazuje odvajanje metil erukata, metil cetoleata i trans-izomera dokozenske kiseline