HR Službeni list Europske unije 10

31995L0032



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 07.07.1995.

ŠESTA DIREKTIVA KOMISIJE 95/32/EZ

od 7. srpnja 1995.

o metodama analize potrebnim za provjeru sastava kozmetičkih proizvoda

(Tekst značajan za EGP)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 76/768/EEZ od 27. srpnja 1976. o usklađivanju zakonodavstava država članica u odnosu na kozmetičke proizvode (1), kako je zadnje izmijenjena Direktivom Komisije 94/32/EZ (2), a posebno njezin članak 8. stavak 1.,

budući da Direktiva 76/768/EEZ predviđa službeno testiranje kozmetičkih proizvoda kako bi se osiguralo poštivanje uvjeta propisanih odredbama Komisije koje se odnose na sastav kozmetičkih proizvoda;

budući da sve metode analize moraju biti postavljene što je prije moguće i da su određene metode već usvojene direktivama Komisije 80/1335/EEZ (3), kako je izmijenjena Direktivom 87/143/EEZ (4), 82/434/EEZ (5), kako je izmijenjena Direktivom 90/207/EEZ (6), 83/514/EEZ (7), 85/490/EEZ (8) i 93/73/EEZ (9);

budući da identifikacija i određivanje benzojeve kiseline, 4-hidroksibenzojeve kiseline, sorbinske kiseline, salicilne kiseline i propionske kiseline u kozmetičkim proizvodima i identifikacija i određivanje hidrokinona, hidrokinon monometiletera, hidrokinon monoetiletera i hidrokinin monobenziletera u kozmetičkim proizvodima čine šesti korak;

budući da su odredbe ove Direktive u skladu s mišljenjem Odbora za prilagodbu Direktive 76/768/EEZ tehničkom napretku,

DONIJELA JE OVU DIREKTIVU:

Članak 1.

Države članice poduzimaju sve potrebne mjere kako bi se tijekom službenog ispitivanja kozmetičkih proizvoda:

— identifikacija i određivanje benzojeve kiseline, 4-hidrobenzojeve kiseline, sorbinske kiseline, salicilne kiseline i propionske kiseline,

— identifikacija i određivanje hidrokinona, hidrokinon monometiletera, hidrokinon monoetiletera i hidrokinon monobenziletera,

provodili u skladu s metodama opisanim u Prilogu.

Članak 2.

1. Države članice donose zakone i druge propise potrebne za usklađivanje s ovom Direktivom najkasnije do 30. rujna 1996. One o tome odmah obavješćuju Komisiju.

Kada države članice donose ove odredbe, te odredbe prilikom njihove službene objave sadržavaju uputu na ovu Direktivu ili se uz njih navodi takva uputa. Načine tog upućivanja određuju države članice.

2. Države članice Komisiji dostavljaju tekst odredaba nacionalnog prava koje donesu u području na koje se odnosi ova Direktiva.

Članak 3.

Ova Direktiva stupa na snagu 20. dana od dana objave u Službenom listu Europskih zajednica.

Članak 4.

Ova je Direktiva upućena državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 7. srpnja 1995. Za Komisiju Emma BONINO Članica Komisije

(1) SL L 262, 27.9.1976., str. 169.

(2) SL L 181, 15.7.1994., str. 31.

(3) SL L 383, 31.12.1980., str. 27.

(4) SL L 57, 27.2.1987., str. 56.

(5) SL L 185, 30.6.1982., str. 1.

(6) SL L 108, 28.4.1990., str. 92.

(7) SL L 291, 24.10.1983., str. 9.

(8) SL L 295, 7.11.1985., str. 30.

(9) SL L 231, 14.9.1993., str. 34.

PRILOG

I. IDENTIFIKACIJA I ODREĐIVANJE BENZOJEVE KISELINE, 4-HIDROKSIBENZOJEVE KISELINE, SORBINSKE KISELINE, SALICILNE KISELINE I PROPIONSKE KISELINE U KOZMETIČKIM PROIZVODIMA

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda primjenjuje za identifikaciju i određivanje benzojeve kiseline, 4-hidroksibenzojeve kiseline, sorbinske kiseline, salicilne kiseline i propionske kiseline u kozmetičkim proizvodima. Odvojeni postupci opisuju identifikaciju tih konzervansa; određivanje propionske kiseline; i određivanje 4-hidroksibenzojeve kiseline, salicilne kiseline, sorbinske kiseline i benzojeve kiseline.

2. Definicija

Količine benzojeve kiseline, 4-hidroksibenzojeve kiseline, salicilne kiseline, sorbinske kiseline i propionske kiseline određene ovom metodom izražene su kao maseni udio slobodnih kiselina.

A. IDENTIFIKACIJA

1. Načelo

Nakon kiselobazne ekstrakcije konzervansa, ekstrakt se analizira tankoslojnom kromatografijom (TLC) uz primjenu istovremene derivatizacije. Ovisno o rezultatima, identifikacija se potvrđuje tekućinskom kromatografijom (HPLC) visoke djelotvornosti ili u slučaju propionske kiseline, plinskom kromatografijom (GC).

2. Reagensi

2.1. Općenito

Svi reagensi moraju biti analitičke čistoće. Voda koja se rabi mora biti destilirana ili najmanje jednake čistoće.

2.2. Aceton

2.3. Dietil eter

2.4. Acetonitril

2.5. Toluen

2.6. n-heksan

2.7. Parafin, tekući

2.8. Klorovodična kiselina, 4 M

2.9. Kalijev hidroksid, vodena otopina, 4 M

2.10. Kalcijev klorid, CaCl2.2H2O

2.11. Litijev karbonat, Li2CO3

2.12. 2-bromo-2'-acetonafton

2.13. 4-hidroksibenzojeva kiselina

2.14. Salicilna kiselina

2.15. Benzojeva kiselina

2.16. Sorbinska kiselina

2.17. Propionska kiselina

2.18. Referentne otopine

Pripremi se 0,1 % (m/v) otopine (100 mg/100 mL) svakog od pet konzervansa (2.13. do 2.17.) u dietil eteru.

2.19. Reagens za derivatizaciju

0,5 % (m/v) otopina 2-bromo-2'-acetonaftona (2.12.) u acetonitrilu (2.4.) (50 mg/10 mL). Otopina se mora pripravljati tjedno i čuvati u hladnjaku.

2.20. Otopina katalizatora

0,3 % (m/v) otopina litijeva karbonata (2.11.) u vodi (300 mg/100 mL). Ta otopina mora biti svježe pripremljena.

2.21. Otapalo za razvijanje

Toluen (2.5.)/Aceton (2.2.) (20:0,5 v/v)

2.22. Tekući parafin (2.7.)/n-heksan (2.6.) (1:2 v/v)

3. Aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema.

3.1. Vodena kupelj, koja može održavati temperaturu na 60 °C

3.2. Posuda za razvijanje

3.3. Izvor ultraljubičastog zračenja, 254 i 366 nm

3.4. Ploče za tankoslojnu kromatografiju, Kieselgel 60, bez fluorescentnog indikatora, 20 × 20 cm, sloj debljine 0,25 mm s koncentracijskim područjem 2,5 × 20 cm (Merck 11845, ili ekvivalent)

3.5. Mikrošprica, 10 μl

3.6. Mikrošprica, 25 μl

3.7. Peć, koja može održavati temperature do 105 °C

3.8. Staklene epruvete od 50 mL s čepom na navoj

3.9. Filtrirni papir, promjera 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband br. 5892, ili ekvivalent

3.10. Univerzalni pH indikatorski papir, pH 1-11

3.11. Staklene bočice od 5 mL za uzorke

3.12. Rotirajući film isparivač (Rotavapor ili ekvivalent)

3.13. Grijaća ploča

4. Postupak

4.1. Priprema uzorka

U staklenu epruvetu od 50 mL s čepom na navoj (3.8.) odvaže se približno 1 g uzorka. Doda se četiri kapi 4 M klorovodične kiseline (2.8.) i 40 mL acetona (2.2.). Za vrlo lužnate proizvode kao što je toaletni sapun, potrebno je dodati 20 kapi 4 M klorovodične kiseline (2.8.). Indikatorskim papirom (3.10.) provjeri se je li pH vrijednost približno dva. Epruveta se zatvori i snažno trese jednu minutu.

Ako je potrebno olakšati ekstrakciju konzervansa u acetonskoj fazi, smjesa se pažljivo zagrije na oko 60 °C kako bi se sve rastalilo u tekuću fazu.

Ostaviti da se otopina ohladi na sobnu temperaturu i filtrirati kroz filtrirni papir (3.9.) u Erlenmeyer tikvicu.

20 mL filtrata se prenese u Erlenmeyer tikvicu od 200 mL, doda se 20 mL vode i promiješa. Podesiti pH smjesu 4 M kalijevim hidroksidom (2.9.) na 10, a vrijednost pH se odredi indikatorskim papirom (3.10.).

Doda se 1 g kalcijeva klorida (2.10.) i snažno trese. Filtrira se kroz filtrirni papir (3.9.) u lijevak za odjeljivanje od 250 mL, koji sadrži 75 mL dietil etera (2.3.) i snažno trese jednu minutu. Pusti se da se slojevi razdvoje, te se vodeni sloj ispusti u Erlenmeyer tikvicu od 250 mL. Eterski sloj se baci. Rabeći indikatorski papir (3.10.), pH vodene otopine se podesi 4 M klorovodičnom kiselinom (2.8.) na približno dva. Doda se 10 mL dietil etera (2.3.), tikvica se začepi i snažno trese jednu minutu. Pusti se da se slojevi razdvoje i eterski sloj se prenese u rotirajući film isparivač (3.12.). Vodeni sloj se baci.

Eterski sloj se ispari gotovo do suha, a ostatak se ponovno otopi u 1 mL dietil etera (2.3.). Otopina se prenese u bočicu za uzorke (3.11.).

4.2. Tankoslojna kromatografija

Za svaku referentnu otopinu i uzorke koje treba kromatografirati, mikrošpricom (3.5.) se na jednakim udaljenostima nanese na početnu crtu koncentracijskog područja TLC ploče (3.4.) približno 3 μl otopine litijeva karbonata (2.20.) i suši u struji hladnog zraka.

TLC ploča se prenese na grijaću ploču (3.13.), zagrijanu na 40 °C, kako bi mrlje bile najmanje moguće. Mikrošpricom (3.5.) se na početnu crtu ploče, točno na mjesta na koja je nanesena otopina litijeva karbonata, nanese po 10 μl svake od referentnih otopina (2.18.) i otopine uzorka (4.1.).

Konačno se nanese približno 15 μL reagensa za derivatizaciju (2.19.) (otopina 2-bromo-2'-acetonaftona) točno na mjesta na koja su nanesene referentne otopine, otopine uzorka i otopina litijeva karbonata.

TLC ploča se zagrijava u peći (3.7.) na 80 °C tijekom 45 minuta. Nakon hlađenja, ploča se razvija u posudi za razvijanje (3.2.), koja je bila uravnotežena 15 minuta (bez uporabe ovoja filtrirnog papira), otapalom za razvijanje 2.21. (toluen/aceton), dok fronta otapala ne dosegne udaljenost od 15 cm (to može trajati približno 80 minuta).

Sušiti ploču u struji hladnog zraka, a dobivene mrlje ispitati pod UV svjetlošću (3.3.). Kako bi se pojačala fluorescencija slabih mrlja, TLC ploča se može uroniti u tekući parafin/n-heksan (2.22.).

5. Identifikacija

Izračuna se Rf za svaku mrlju.

Usporedi se Rf i ponašanje pod UV zračenjem dobiveno za uzorak i ono dobiveno za referentne otopine.

Donese se preliminarni zaključak o prisutnosti i identitetu konzervansa. Provede se HPLC opisana u Odjeljku B, ili, ako je prisutna propionska kiselina, GC opisana u Odjeljku C. Uspoređuju se dobivena retencijska vremena s onima referentnih otopina.

Združe se rezultati dobiveni pomoću TLC i HPLC ili GC i na temelju združenih rezultata konačno se identificiraju konzervansi prisutni u uzorku.

B. ODREĐIVANJE BENZOJEVE KISELINE, 4-HIDROKSIBENZOJEVE KISELINE, SORBINSKE KISELINE I SALICILNE KISELINE

1. Načelo

Nakon zakiseljavanja, uzorak se ekstrahira sa smjesom etanola i vode. Nakon filtriranja, konzervansi se određuju tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti (HPLC).

2. Reagensi

2.1. Svi reagensi moraju biti analitičke čistoće i prikladni za HPLC gdje je potrebno. Voda koja se rabi mora biti destilirana, ili najmanje ekvivalentne čistoće.

2.2. Apsolutni etanol

2.3. 4-hidroksibenzojeva kiselina

2.4. Salicilna kiselina

2.5. Benzojeva kiselina

2.6. Sorbinska kiselina

2.7. Natrijev acetat, (CH3COONa · 3 H2O)

2.8. Octena kiselina, (α)20 4 = 1,05 g/mL

2.9. Acetonitril

2.10. Sumporna kiselina, 2 M

2.11. Vodena otopina kalijeva hidroksida, 0,2 M

2.12. 2-metoksibenzojeva kiselina

2.13. Smjesa etanol/voda

Pomiješa se devet volumnih dijelova etanola (2.2.) i jedan volumni dio vode (2.1.)

2.14. Otopina unutarnjeg standarda

Pripremi se otopina koja sadrži približno 1 g 2-metoksibenzojeve kiseline (2.12.) u 500 mL smjese etanol/voda (2.13.)

Pokretna faza za HPLC

2.15.1. Acetatni pufer: u 1 L vode doda se 6,35 g natrijeva acetata (2.7.) i 20,0 mL octene kiseline (2.8.) i promiješa

2.15.2. Pripremi se pokretna faza miješanjem devet volumnih dijelova acetatnog pufera (2.15.1.) i jednog volumnog dijela acetonitrila (2.9.)

2.16. Ishodišna otopina konzervansa

U odmjernu tikvicu točno se odvaže približno 0,05 g 4-hidroksibenzojeve kiseline (2.3.), 0,2 g salicilne kiseline (2.4.), 0,2 g benzojeve kiseline (2.5.) i 0,05 g sorbinske kiseline (2.6.) i nadopuni na puni volumen smjesom etanol/voda (2.13.). Ta se otopina spremi u hladnjak. Otopina je stabilna jedan tjedan.

2.17. Standardne otopine konzervansa

U niz odmjernih tikvica od 20 mL prenese se po 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 i 0,50 mL ishodišne otopine (2.16.). U svaku se tikvicu doda 10,00 mL otopine unutarnjeg standarda (2.14.) i 0,5 mL sumporne kiseline 2 M (2.10.). Nadopuni se do punog volumena smjesom etanol/voda (2.13.). Te se otopine moraju svježe pripremiti.

3. Aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema, osim ako nije predviđeno drugačije, i:

3.1. Vodena kupelj podešena na 60 °C

3.2. Kromatograf za tekućinsku kromatografiju visoke djelotvornosti s UV detektorom promjenjive valne duljine i injekcijska petlja od 10 μl

3.3. Analitička kolona

Nehrđajući čelik, duljine 12,5 do 25 cm, unutarnjeg promjera 4,6 mm, punjena s Nucleosil 5C18 ili ekvivalentom

3.4. Filtrirni papir, promjer: 90 mm, Schleicher i Schull, Weissband br. 5892 ili ekvivalent

3.5. Staklene epruvete od 50 mL s čepom na navoj

3.6. Staklene bočice od 5 mL za uzorke

3.7. Komadići za vrenje, karborund, veličine 2 do 4 mm ili ekvivalent

4. Postupak

Priprema uzorka

4.1.1. Priprema uzorka bez dodatka unutarnjeg standarda

U staklenu epruvetu od 50 mL s čepom na navoj (3.5.) odvaže se 1 g uzorka. U epruvetu se pipetom doda 1,00 mL sumporne kiseline 2 M (2.10.) i 40,0 mL smjese etanol/voda (2.13.). Doda se približno 1 g komadića za vrenje (3.7.), epruveta se zatvori i snažno trese najmanje jednu minutu dok se ne dobije homogena suspenzija. Kako bi se olakšala ekstrakcija konzervansa u etanolnu fazu, epruveta se stavi na točno pet minuta u vodenu kupelj (3.1.) podešenu na 60 °C.

Epruveta se odmah ohladi u struji hladne vode te se ekstrakt pohrani na 5 °C na jedan sat.

Ekstrakt se filtrira kroz filtrirni papir (3.4.). Približno 2 mL ekstrakta se prenese u bočicu za uzorke (3.6.). Ekstrakt se pohrani na 5 °C i provede se HPLC određivanje u roku od 24 sata od pripreme uzorka.

4.1.2. Priprema uzorka koja uključuje dodatak unutarnjeg standarda

U staklenu epruvetu od 50 mL s čepom na navoj (3.5.) odvaže se na tri decimalna mjesta 1 ± 0,1 g (a grama) uzorka. Pipetom se doda 1,00 mL sumporne kiseline 2 M (2.10.) i 30,0 mL smjese etanol/voda (2.13.). Doda se približno 1 g komadića za vrenje (3.7.) i 10,00 mL otopine unutarnjeg standarda (2.14.). Epruveta se zatvori i snažno trese najmanje jednu minutu dok se ne dobije homogena suspenzija. Kako bi se olakšala ekstrakcija konzervansa u etanolnoj fazi, epruveta se stavi točno na pet minuta u vodenu kupelj (3.1.) podešenu na 60 °C.

Epruveta se odmah ohladi u struji hladne vode te se ekstrakt pohrani na 5 °C na jedan sat.

Ekstrakt se filtrira kroz filtrirni papir (3.4.). Približno 2 mL filtrata se prenese u bočicu za uzorke (3.6.). Filtrat se pohrani na 5 °C i provede se HPLC određivanje u roku od 24 sata od pripreme uzorka.

Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti

Pokretna faza: acetonitril/acetatni pufer (2.15.).

Brzina protoka pokretne faze kroz kolonu podesi se na 2,0 ± 0,5 mL/minuta. Valna duljina detektora namjesti se na 240 nm.

4.2.1. Kalibracija

Po 10 μl svake od standardnih otopina konzervansa (2.17.) injektira se u aparat za tekućinsku kromatografiju (3.2.). Za svaku otopinu odredi se omjer visine vrha ispitivanog konzervansa i visine vrha unutarnjeg standarda, dobivenog iz kromatograma. Grafički se za svaki konzervans prikaže odnos visine vrha prema koncentraciji standardne otopine.

Provjeri se da li je kalibracijskim postupkom za standardne otopine dobiven linearni odziv.

4.2.2. Određivanje

U aparat za tekućinsku kromatografiju (3.2.) injektira se 10 μl ekstrakta uzorka (4.1.1.) i snimi se kromatogram. Injektira se 10 μl standardne otopine konzervansa (2.17.) i snimi kromatogram. Dobiveni kromatogrami se usporede. Ako se na kromatogramu ekstrakta uzorka (4.1.1.) ne pojavi vrh koji ima približno jednako retencijsko vrijeme kao 2-metoksibenzojeva kiselina (preporučeni unutarnji standard), u aparat za tekućinsku kromatografiju injektira se 10 μl ekstrakta uzorka kojem je dodan unutarnji standard (4.1.2.) i snimi se kromatogram.

Ako se na kromatogramu ekstrakta uzorka (4.1.1.) opazi interferirajući vrh koji ima jednako retencijsko vrijeme kao 2-metoksibenzojeva kiselina, treba odabrati drugi, prikladni unutarnji standard. (Ako na kromatogramu nema jednog od ispitivanih konzervansa, taj konzervans se može uporabiti kao unutarnji standard.)

Provjeri se da li kromatogrami dobiveni za standardnu otopinu i otopinu uzorka udovoljavaju sljedećim uvjetima:

— razdvajanje vrhova za najlošije razdvojen par treba biti najmanje 0,90 (Za definiciju razdvajanja vrhova, vidjeti sliku 1). Ako zahtijevano razdvajanje nije postignuto, treba ili uporabiti učinkovitiju kolonu, ili se sastav pokretne faze treba podesiti tako da se postigne zahtijevani rezultat.

— Faktor asimetrije As svih dobivenih vrhova treba biti između 0,9 i 1,5. (Za definiciju faktora asimetrije, vidjeti sliku 2). Za određivanje faktora asimetrije preporuča se brzina zapisivanja kromatograma od najviše 2 cm u minuti.

— Treba dobiti ravnu osnovnu crtu.

5. Račun

Za izračun koncentracije kiselih konzervansa u uzorku, uporabe se omjeri visina vrhova ispitivanih konzervansa prema visini vrha 2-metoksibenzojeve kiseline (unutarnji standard) i kalibracijska krivulja. Računa se sadržaj benzojeve kiseline, 4-hidroksibenzojeve kiseline, sorbinske kiseline ili salicilne kiseline u uzorku kao maseni udio (xi ) pomoću formule:

gdje je:

a= masa (g) obroka za ispitivanje (4.1.2.),

b= koncentracija (μg/mL) konzervansa u ekstraktu uzorka (4.1.2.) dobivena iz kalibracijske krivulje.

6. Ponovljivost (1)

Za maseni udio 4-hidroksibenzojeve kiseline od 0,40 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,035 %.

Za maseni udio benzojeve kiseline od 0,50 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,050 %.

Za maseni udio salicilne kiseline od 0,50 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,045 %.

Za maseni udio sorbinske kiseline od 0,60 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,035 %.

7. Primjedbe

7.1. Rezultati grubog testiranja ove metode ukazuju da količina sumporne kiseline koja se dodaje kako bi se ekstrahirale kiseline iz uzorka znatno utječe na konačni rezultat, pa količina uzorka koji se obrađuje treba biti unutar propisanih granica.

7.2. Ako je potrebno, može se uporabiti prikladna zaštitna kolona.

C. ODREĐIVANJE PROPIONSKE KISELINE

1. Svrha i područje primjene

Ova metoda je primjerena za određivanje propionske kiseline najvećeg masenog udjela 2 % u kozmetičkim proizvodima.

2. Definicija

Sadržaj propionske kiseline mjeren ovom metodom izražen je kao maseni udio u proizvodu.

3. Načelo

Nakon ekstrakcije propionske kiseline iz proizvoda, određivanje se provodi plinskom kromatografijom uz 2-metilpropionsku kiselinu kao unutarnji standard.

4. Reagensi

Svi reagensi moraju biti analitičke čistoće; voda koja se rabi mora biti destilirana ili najmanje jednake čistoće.

4.1. Etanol volumnog udjela 96 %

4.2. Propionska kiselina

4.3. 2-metilpropionska kiselina

4.4. Ortofosforna kiselina, 10 % (m/v)

4.5. Otopina propionske kiseline

U odmjernu tikvicu od 50 mL točno se odvaže približno 1,00 g (p grama) propionske kiseline i nadopuni na puni volumen etanolom (4.1.).

4.6. Otopina unutarnjeg standarda

U odmjernu tikvicu od 50 mL točno se odvaže približno 1,00 g (e grama) 2-metilpropionske kiseline i nadopuni do punog volumena etanolom (4.1.).

5. Aparatura

5.1. Uobičajena laboratorijska oprema, i:

5.2. Plinski kromatograf s plameno-ionizacijskim detektorom

5.3. Staklena epruveta (20 × 150 mm) s čepom na navoj

5.4. Vodena kupelj na 60 °C

5.5. Staklena šprica od 10 mL s filtrirnom membranom (promjer pora:0,45 μm)

6. Postupak

Priprema uzorka

6.1.1. Priprema uzorka bez unutarnjeg standarda

U staklenu epruvetu (5.3.) odvaže se približno 1 g uzorka. Doda se 0,5 mL fosforne kiseline (4.4.) i 9,5 mL etanola (4.1.).

Epruveta se zatvori i snažno trese. Ako je potrebno, epruveta se stavi u vodenu kupelj zagrijanu na 60 °C (5.4.) na pet minuta kako bi se masna faza u potpunosti otopila. Brzo se ohladi pod tekućom vodom. Dio otopine se filtrira kroz membranski filtar (5.5.). Filtrat se kromatografira isti dan.

6.1.2. Priprema uzorka s unutarnjim standardom

U staklenu epruvetu (5.3.) se odvaže na tri decimalna mjesta 1 ± 0,1 g (a grama) uzorka. Doda se 0,5 mL fosforne kiseline (4.4.), 0,5 mL otopine unutarnjeg standarda (4.6.) i 9 mL etanola (4.1.).

Epruveta se zatvori i snažno trese. Ako je potrebno, epruveta se stavi u vodenu kupelj zagrijanu na 60 °C (5.4.) na pet minuta kako bi se otopila masna faza. Brzo se ohladi pod tekućom vodom. Dio otopine se filtrira kroz membranski filtar (5.5.). Filtrat se kromatografira isti dan.

Uvjeti plinske kromatografije

Preporučaju se sljedeći operativni uvjeti:

Kolona

Tip Nehrđajući čelik Duljina 2 m Promjer 1/8″ Punjenje 10 % SPTM 1000 (ili ekvivalent) + 1 % H3PO4 na Chromosorbu WAW 100 do 120 umreženja (mesh)

Temperatura

Injektor 200 °C Kolona 120 °C Detektor 200 °C Nosivi plin dušik Brzina protoka 25 mL/min

Kromatografija

6.3.1. Kalibracija

U niz odmjernih tikvica od 20 mL prenese se pipetom 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 i 4,00 mL otopine propionske kiseline (4.5.). U svaku odmjernu tikvicu prenese se pipetom 1,00 mL otopine unutarnjeg standarda (4.6.); nadopuni se do punog volumena etanolom (4.1.) i promiješa. Tako pripremljene otopine sadrže e mg/mL 2-metilpropionske kiseline kao unutarnjeg standarda (to znači, 1 mg/mL ako je e = 1 000) i p/4, p, 2p 4p mg/mL propionske kiseline (to znači 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 mg/mL ako je p = 1 000).

Injektira se 1 μl svake od tih otopina i dobije se kalibracijska krivulja na način da se na os x nanese omjer masa propionska kiselina/2-metilpropionska kiselina, a na os y odgovarajuće površine vrhova.

Svaka otopina se injektira tri puta pa se izračuna prosječni omjer površine vrha.

6.3.2. Određivanje

Injektira se 1 μl filtrata uzorka 6.1.1. Usporedi se kromatogram s kromatogramom jedne od standardnih otopina (6.3.1.). Ako vrh ima približno jednako retencijsko vrijeme kao 2-metilpropionska kiselina, promijeni se unutarnji standard. Ako se interferencija ne opaža, injektira se 1 μl filtrata uzorka 6.1.2. i mjere se površine vrha propionske kiseline i vrha unutarnjeg standarda.

Svaka otopina se injektira tri puta pa se izračuna prosječni omjer površine vrha.

7. Račun

7.1. Iz kalibracijske krivulje dobivene u 6.3.1., dobije se omjer mase (K) koji odgovara omjeru površine vrha izračunanog u 6.3.2.

7.2. Iz tako dobivenog omjera masa, izračuna se sadržaj propionske kiseline u uzorku (X) kao maseni udio pomoću formule:

gdje je:

K= omjer izračunan u 7.1.

e= masa u gramima unutarnjeg standarda odvagana u 4.6.

a= masa u gramima uzorka odvagana u 6.1.2.

Rezultat se zaokruži na jedno decimalno mjesto.

8. Ponovljivost (1)

Za maseni udio propionske kiseline od 2 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije biti veća od 0,12 %.

II. IDENTIFIKACIJA I ODREĐIVANJE HIDROKINONA, HIDROKINON MONOMETILETERA, HIDROKINON MONOETILETERA I HIDROKINON MONOBENZILETERA U KOZMETIČKIM PROIZVODIMA

A. IDENTIFIKACIJA

1. Svrha i područje primjene

Metoda opisuje otkrivanje i identifikaciju hidrokinona, hidrokinon monometiletera, hidrokinon monoetiletera i hidrokinon monobenziletera (monobenzona) u kozmetičkim proizvodima za posvjetljavanje kože.

2. Načelo

Hidrokinon i njegovi eteri identificiraju se tankoslojnom kromatografijom (TLC).

3. Reagensi

Svi reagensi moraju biti analitičke čistoće.

3.1. Etanol volumnog udjela 96 %

3.2. Kloroform

3.3. Dietileter

3.4. Otapalo za razvijanje:

Kloroform/Dietil eter, 66:33 (v/v)

3.5. Amonijak masenog udjela 25 % (d4 20 = 0,91 g/ml)

3.6. Askorbinska kiselina

3.7. Hidrokinon

3.8. Hidrokinon monometileter

3.9. Hidrokinin monoetileter

3.10. Hidrokinon monobenzileter (monobenzon)

Referentne otopine

Svježe se pripreme sljedeće referentne otopine, stabilne jedan dan.

3.11.1. U graduiranu epruvetu za ispitivanje od 10 mL odvaže se 0,05 g hidrokinona (3.7.). Doda se 0,250 g askorbinske kiseline (3.6.) i 5 mL etanola (3.1.). Doda se amonijak (3.5.) do vrijednosti pH = 10 i nadopuni do volumena od 10 mL etanolom (3.1.).

3.11.2. U graduiranu epruvetu za ispitivanje od 10 mL odvaže se 0,05 g hidrokinon monometiletera (3.8.). Doda se 0,250 g askorbinske kiseline (3.6.) i 5 mL etanola (3.1.). Doda se amonijak (3.5.) do vrijednosti pH = 10 i nadopuni do volumena od 10 mL etanolom (3.1.).

3.11.3. U graduiranu epruvetu za ispitivanje od 10 mL odvaže se 0,05 g hidrokinon monoetiletera (3.9.). Doda se 0,250 g askorbinske kiseline (3.6.) i 5 mL etanola (3.1.). Doda se amonijak (3.5.) do vrijednosti pH = 10 i nadopuni do volumena od 10 mL etanolom (3.1.).

3.11.4. U graduiranu epruvetu za ispitivanje od 10 mL odvaže se 0,05 g hidrokinon monobenziletera (3.10.). Doda se 0,250 g askorbinske kiseline (3.6.) i 5 mL etanola (3.1.). Doda se amonijak (3.5.) do vrijednosti pH = 10 i nadopuni do volumena od 10 mL etanolom (3.1.).

3.12. Srebrov nitrat

3.13. 12-molibdofosforna kiselina

3.14. Kalijev fericijanid heksahidrat

3.15. Željezov (III) klorid, heksahidrat

Reagensi za raspršivanje

U 5 %-tnu (m/v) vodenu otopinu srebrova nitrata (3.12.) doda se amonijaka (3.5.) dok se nastali talog ne otopi.

Upozorenje:

stajanjem otopina postaje eksplozivno nestabilna, pa se nakon uporabe mora baciti.

3.16.2. 10 %-tna (m/v) otopina 12-molibdofosforne kiseline (3.13.) u etanolu (3.1.).

3.16.3. Pripremi se 1 %-tna (m/v) vodena otopina kalijeva fericijanida (3.14.) i 2 %-tna (m/v) vodena otopina željezova klorida (3.15.). Pomiješaju se jednaki dijelovi obiju otopina neposredno prije uporabe.

4. Aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema, i:

4.1. Uobičajena TLC oprema

4.2. TLC ploče, spremne za uporabu: silika gel GHR/UV254; 20 × 20 cm (Machery, Nagel ili ekvivalent). Debljina sloja 0,25 mm.

4.3. Ultrazvučna kupelj

4.4. Centrifuga

4.5. UV lampa, 254 nm

5. Postupak

5.1. Priprema uzorka

U 10 ml graduiranu epruvetu se odvaže 3,0 g uzorka. Doda se 0,250 g askorbinske kiseline (3.6.) i 5 mL etanola (3.1.). pH otopine se amonijakom (3.5.) podesi na 10. Nadopuni se na volumen od 10 mL etanolom (3.1.). Epruveta se zatvori čepom i sadržaj homogenizira 10 minuta u ultrazvučnoj kupelji. Filtrira se kroz filtrirni papir ili centrifugira pri 3 000 okretaja u minuti.

TLC

5.2.1. Kromatografska posuda se zasiti otapalom za razvijanje (3.4.).

5.2.2. Na ploču se stavi 2 μl referentnih otopina (3.11.) i 2 μl otopine uzorka (5.1.). Razvija se u tami pri sobnoj temperaturi dok se fronta otapala ne pomakne 15 cm od početka.

5.2.3. Ploča se makne i pusti da se osuši na sobnoj temperaturi.

Dokazivanje

5.3.1. Ploča se promatra pod UV svjetlom na 254 nm i označi se položaj mrlja.

5.3.2. Ploča se poprska s:

— reagensom srebrovim nitratom (3.16.1.) ili

— reagensom 12-molibdofosfornom kiselinom (3.16.2.); zagrije se na približno 120 °C ili

— otopinom kalijeva fericijanida i otopinom željezova klorida (3.16.3.).

6. Identifikacija

Izračuna se Rf vrijednost za svaku mrlju.

Mrlje dobivene za otopinu uzorka uspoređuju se s mrljama referentnih otopina s obzirom na: njihove Rf vrijednosti; boju mrlja pod UV zračenjem; i boje mrlja nakon njihova pojavljivanja izazvana reagensom za raspršivanje.

Provede se HPLC opisana u sljedećem Odjeljku (B) i usporede se retencijska vremena dobivena za vrh(ove) uzorka s onima dobivenim za referentne otopine.

Kako bi se identificirala prisutnost hidrokinona i/ili njegovih etera, združe se rezultati dobiveni TLC i HPLC metodom.

7. Primjedbe

Pod opisanim uvjetima opažene su sljedeće Rf vrijednosti:

hidrokinon 0,32 hidrokinon monometileter 0,53 hidrokinon monoetileter 0,55 hidrokinon monobenzileter 0,58

B. ODREĐIVANJE

1. Svrha i područje primjene

Ova metoda opisuje postupak za određivanje hidrokinona, hidrokinon monometiletera, hidrokinon monoetiletera i hidrokinon monobenziletera u kozmetičkim proizvodima za posvjetljavanje kože.

2. Načelo

Uzorak se ekstrahira smjesom voda/metanol uz pažljivo zagrijavanje kako bi se rastalio masni materijal. Određivanje analita u dobivenoj otopini provodi se tekućinskom kromatografijom s reverznom fazom i UV detekcijom.

3. Reagensi

3.1. Svi reagensi moraju biti analitičke čistoće. Voda koja se rabi mora biti destilirana ili najmanje jednake čistoće.

3.2. Metanol

3.3. Hidrokinon

3.4. Hidrokinon monometileter

3.5. Hidrokinon monoetileter

3.6. Hidrokinon monobenzileter (monobenzon)

3.7. Tetrahidrofuran, HPLC stupnja čistoće

3.8. Smjesa voda/metanol 1:1 (v/v). Pomiješa se jedan volumni dio vode i jedan volumni dio metanola (3.2.).

3.9. Pokretna faza: smjesa tetrahidrofuran/voda 45:55 (v/v). Pomiješa se 45 volumnih dijelova tetrahidrofurana (3.7.) i 55 volumnih dijelova vode.

3.10. Referentna otopina

U odmjernu tikvicu od 50 mL odvaže se 0,06 g hidrokinona (3.3.), 0,08 g hidrokinon monometiletera (3.4.), 0,10 g hidrokinon monoetiletera (3.5.) i 0,12 g hidrokinon monobenziletera (3.6.). Otopi se i nadopuni na puni volumen metanolom (3.2.). Pripremi se referentna otopina razrjeđivanjem 10,00 mL te otopine na 50,00 mL sa smjesom voda/metanol (3.8.). Te se otopine moraju svježe pripremiti.

4. Aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema i:

4.1. Vodena kupelj koja može održavati temperaturu na 60 °C

4.2. Kromatograf za tekućinsku kromatografiju visoke djelotvornosti s UV detektorom promjenjive valne duljine i injekcijska petlja od 10 μl

4.3. Analitička kolona:

Kromatografska kolona od nehrđajućeg čelika, duljine 250 mm, unutarnjeg promjera 4,6 mm, punjena Zorbax fenilom (kemijski vezan fenetilsilan na Zorbax SIL, na kraju zatvoren trimetilklorosilanom), veličine čestica 6 μm, ili ekvivalent. Ne smije se rabiti zaštitna kolona, osim fenilne, ili ekvivalent

4.4. Filtrirni papir, promjera 90 mm, Schleicher i Schull, Weissband br. 5892, ili ekvivalent.

5. Postupak

5.1. Priprema uzorka

U odmjernu tikvicu od 50 mL odvaže se na tri decimalna mjesta 1 ± 0,1 g (a grama) uzorka. Uzorak se dispergira u 25 mL smjese voda/metanol (3.8.). Tikvica se zatvori i snažno trese sve dok se ne dobije homogena suspenzija. Trese se najmanje jednu minutu. Tikvica se stavi u vodenu kupelj (4.1.) podešenu na 60 °C kako bi se olakšala ekstrakcija. Tikvica se ohladi, nadopuni do punog volumena smjesom voda/metanol (3.8.). Ekstrakt se filtrira kroz filtrirni papir (4.4.). Provede se HPLC određivanje u roku od 24 sata od pripreme ekstrakta.

Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti.

5.2.1. Brzina pokretne faze (3.9.) podesi se na 1,0 mL/min i valna duljina detektora se namjesti na 295 nm.

5.2.2. Injektira se 10 μl otopine uzorka dobivene kao što je opisano u Odjeljku 5.1. i snimi se kromatogram. Izmjere se površine vrhova. Provede se kalibracija kao što je opisano u 5.2.3. Usporede se kromatogrami dobiveni za otopinu uzorka i standardne otopine. Površine vrhova i faktori odziva (Rf) izračunani u 5.2.3. uporabe se za izračunavanje koncentracije analita u otopini uzorka.

5.2.3. Kalibracija

Injektira se 10 μL referentne otopine (3.10.) i snimi se kromatogram. Injektira se nekoliko puta dok se ne dobije konstantna površina vrha.

Odredi se faktor odziva RFi:

gdje je:

pi= površina vrha za hidrokinon, hidrokinon monometileter, hidrokinon monoetileter ili hidrokinon monobenzileter, i

ci= koncentracija (g/50 mL) hidrokinona, hidrokinon monometiletera, hidrokinon monoetiletera ili hidrokinon benziletera u referentnoj otopini (3.10.).

Provjeri se da li kromatogrami dobiveni za standardnu otopinu i otopinu uzorka udovoljavaju sljedećim uvjetima:

— razdvajanje vrhova za najlošije razdvojen par treba biti najmanje 0,90. (Za definiciju razdvajanja vrhova, vidjeti sliku 1.) Ako zahtijevano razdvajanje nije postignuto, treba ili uporabiti učinkovitiju kolonu, ili se sastav pokretne faze treba podesiti tako da se postigne zahtijevani rezultat.

— Faktor asimetrije As svih dobivenih vrhova treba biti između 0,9 i 1,5. (Za definiciju faktora asimetrije, vidjeti sliku 2). Za određivanje faktora asimetrije preporuča se brzina zapisivanja kromatograma od najviše 2 cm u minuti.

— Treba dobiti ravnu osnovnu crtu.

6. Račun

Za izračun koncentracije(-a) analita u uzorku uporabe se površine vrhova analita. Sadržaj analita u uzorku, izražen kao maseni udio xi. računa se pomoću formule:

gdje je:

a= masa uzorka u gramima, i

bi= površina vrha analita u uzorku.

7. Ponovljivost (1)

7.1. Za maseni udio hidrokinona od 2,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,13 %.

7.2. Za maseni udio hidrokinon monometiletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,1 %.

7.3. Za maseni udio hiodrokinon monoetiletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,11 %.

7.4. Za maseni udio hidrokinon monobenziletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,11 %.

8. Ponovljivost postupka (1)

8.1. Za maseni udio hidrokinona od 2,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku u različitim uvjetima (različiti laboratoriji, različiti ispitivači, različite aparature i/ili različito vrijeme) ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,37 %.

8.2. Za maseni udio hidrokinon monometiletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku u različitim uvjetima (različiti laboratoriji, različiti ispitivači, različite aparature i/ili različito vrijeme) ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,21 %.

8.3. Za maseni udio hiodrokinon monoetiletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku u različitim uvjetima (različiti laboratoriji, različiti ispitivači, različite aparature i/ili različito vrijeme) ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,19 %.

8.4. Za maseni udio hidrokinon monobenziletera od 1,0 %, razlika između dva rezultata dobivena u dva određivanja provedena usporedno na istom uzorku u različitim uvjetima (različiti laboratoriji, različiti ispitivači, različite aparature i/ili različito vrijeme) ne smije premašiti apsolutnu vrijednost od 0,11 %.

9. Primjedbe

9.1. Ako je dobiveni sadržaj hidrokinona značajno veći od 2 % i ako je potrebna točna procjena sadržaja, ekstrakt uzorka (5.1.) mora se razrijediti na koncentraciju jednaku onoj koja bi se dobila od uzorka koji sadrži 2 % hidrokinona te se određivanje ponavlja.

(U nekim instrumentima apsorbanca za velike koncentracije hidrokinona može biti izvan linearnog područja detektora.)

9.2. Interferencije

Gore opisana metoda omogućuje određivanje hidrokinona i njegovih etera u jednom izokratnom postupku. Uporaba fenilne kolone osigurava dovoljnu retenciju za hidrokinon, što uporaba C18 kolone s opisanom pokretnom fazom ne jamči.

Međutim, ta je metoda osjetljiva na interferenciju mnogih parabensa. U takvim slučajevima određivanje treba ponoviti uz primjenu drugog sustava pokretne/stacionarne faze. Prikladne metode se mogu naći u referencama 1 i 2, to jest:

Kolona: Zorbax ODS, 4,6 mm × 25 mm ili ekvivalent:

temperatura: 36 °C

protok: 1,5 mL/min

pokretna faza:

za hidrokinon: metanol/voda 5/95 (v/v)

za hidrokinon monometileter: metanol/voda 30/70 (v/v)

za hidrokinon monobenzileter: metanol/voda 80/20 (v/v) (2).

Kolona: Spherisorb S5-ODS, ili ekvivalent:

pokretna faza: voda/metanol 90/10 (v/v)

protok: 1,5 mL/min.

Ti su uvjeti prikladni za hidrokinon (3).

(1) ISO 5725.

(2) M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau, Int. j. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986.).

(3) J. Firth and I. Rix, Determination of hidroqunone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, str. 129.