Dodaju se sljedeći prilozi:

„

Dodatak

METODA ZA DETEKCIJU KRAVLJEG MLIJEKA I KAZEINATA U SIREVIMA OD OVČJEG, KOZJEG ILI BIVOLJEG MLIJEKA ILI OD MJEŠAVINA OVČJEG, KOZJEG I BIVOLJEG MLIJEKA

1. PODRUČJE PRIMJENE

Detekcija kravljeg mlijeka i kazeinata u sirevima od ovčjeg, kozjeg ili bivoljeg mlijeka ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeina nakon plazminolize.

2. PODRUČJE PRIMJENE

Metoda je prikladna za osjetljivu i specifičnu detekciju sirovog i toplinski obrađenog kravljeg mlijeka i kazeinata u svježim ili zrelim sirevima od ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka, ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka. Nije primjerena za otkrivanje patvorenja mlijeka i sira toplinski obrađenim koncentratima bjelančevina sirutke od kravljeg mlijeka.

3. NAČELO METODE

3.1. Izolacija kazeina iz sira i referentni standardi

3.2. Otapanje izoliranih kazeina i njihovo podvrgavanje plazminskom cijepanju (EC.3.4.21.7)

3.3. Izoelektrično fokusiranje plazminski obrađenih kazeina u prisutnosti ureje i bojenje bjelančevina

3.4. Ocjenjivanje obojenih obrazaca γ3- i γ2-kazeina (dokaz kravljeg mlijeka) na temelju usporedbe obrasca dobivenog iz uzorka s obrascima dobivenim u istom gelu iz referentnih standarda koji sadržavaju 0 % i 1 % kravljeg mlijeka

4. REAGENSI

Ako nije navedeno drukčije, moraju se upotrebljavati kemikalije analitičke čistoće. Voda mora biti dvostruko destilirana ili jednake čistoće.

Napomena: Sljedeći detalji odnose se na laboratorijski pripravljene poliakrilamidne gelove koji sadržavaju ureju, dimenzija 265 × 125 × 0,25 mm. U slučajevima kad se upotrebljavaju druge veličine i vrste gelova, možda treba podesiti uvjete razdvajanja.

Izoelektrično fokusiranje

4.1. Reagensi za proizvodnju poliakrilamidnih gelova koji sadržavaju ureju

4.1.1. Osnovna otopina gela

Otopite:

4,85 g akrilamida,

0,15 g N, N′-metilen-bis-akrilamida (BIS),

48,05 g ureje,

15,00 g glicerola (87 % w/w)

u vodi, dopunite do 100 ml i pohranite u smeđoj staklenoj bočici u hladnjak.

Napomena: Umjesto navedenih fiksnih masa neurotoksičnih akrilamida može se upotrijebiti gotova mješavina otopina akrilamida/BIS-a, koja je dostupna na tržištu. Ako takva otopina sadržava 30 % w/v akrilamida i 0,8 % w/v BIS-a, umjesto navedenih fiksnih masa za pripravak upotrebljava se količina od 16,2 ml. Rok valjanosti osnovne otopine je najviše 10 dana; ako je njena vodljivost veća od 5 μS, otopinu treba deionizirati miješajući je 30 minuta s 2 g Amberlita MB-3 i potom profiltrirati kroz membranu od 0,45 μm.

4.1.2. Otopina gela

Pripremite otopinu gela miješanjem aditiva i amfolita (*) s osnovnom otopinom gela (vidjeti 4.1.1.).

9,0 ml osnovne otopine

24 mg β-alanina

500 μl amfolita pH 3,5-9,5

250 μl amfolita pH 5-7

250 μl amfolita pH 6-8

Otopinu gela pomiješajte i otplinjavajte dvije do tri minute u ultrazvučnoj kupelji ili vakuumu.

Napomena: Otopinu gela pripremite neposredno prije uporabe (vidjeti 6.2.).

4.1.3. Otopine katalizatora

4.1.3.1. N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamin (Temed).

4.1.3.2. 40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Otopite 800 mg PER-a u vodi i dopunite do 2 ml.

Napomena: Uvijek upotrebljavajte svježe pripremljenu otopinu PER-a.

4.2. Kontaktna tekućina

Kerozin ili tekući parafin

4.3. Anodna otopina

Otopite 5,77 g fosforne kiseline (85 % w/w) u vodi i razrijedite do 100 ml.

4.4. Katodna otopina

Otopite 2,00 g natrijeva hidroksida u vodi i razrijedite vodom do 100 ml.

Priprema uzorka

4.5. Reagensi za izolaciju bjelančevina

4.5.1. Razrijeđena octena kiselina (25,0 ml ledene octene kiseline razrijedite vodom do 100 ml)

4.5.2. Diklorometan

4.5.3. Aceton

4.6. Pufer za rastapanje bjelančevina

Otopite:

5,75 g glicerola (87 % w/w),

24,03 g ureje,

250 mg ditiotreitola

u vodi i nadopunite do 50 ml.

Napomena: Spremite pufer u hladnjak; maksimalni rok trajanja jest tjedan dana.

4.7. Reagensi za plazminsko cijepanje kazeina

4.7.1. Pufer amonijeva karbonata

Titrirajte 0,2 mol/l otopine amonijeva hidrogen-karbonata (1,58 g/100 ml vode), koja sadržava 0,05 mol/l etilen-diamin-tetraoctene kiseline (EDTA, 1,46 g/100 ml), s 0,2 mol/l otopine amonijeva karbonata (1,92 g/100 ml vode), koja sadržava 0,05 mol/l kiseline EDTA do pH 8.

4.7.2. Plazmin kravljeg mlijeka (EC. 3.4.21.7), aktivnosti najmanje 5 U/ml

4.7.3. Otopina ε-aminokapronske kiseline za inhibiranje enzima

Otopite 2,624 g ε-aminokapronske kiseline (6-amino-n-heksanske kiseline) u 100 ml 40 %-tnog (v/v) etanola.

4.8. Standardi

4.8.1. Potvrđeni referentni standardi za mješavinu usirenog obranog ovčjeg i kozjeg mlijeka koja sadržava 0 % i 1 % kravljeg mlijeka dostupni su na Institutu Komisije za referentne materijale i mjerenja, B-2440, Geel, Belgija.

4.8.2. Priprema privremenih laboratorijskih standarda za usireno bivolje mlijeko koje sadržava 0 % i 1 % kravljeg mlijeka.

Obrano se mlijeko priprema centrifugiranjem 2 500 g bivoljeg ili kravljeg sirovog mlijeka na temperaturi od 37 °C u trajanju od 20 minuta. Nakon brzog hlađenja epruvete i sadržaja na 6 do 8 °C, potpuno uklonite gornji sloj masti. Za pripremu standarda od 1 % dodajte 5,00 ml obranog kravljeg mlijeka u 495 ml obranog bivoljeg mlijeka u laboratorijskoj čaši od 1 l, podesite pH na 6,4 dodavanjem razrijeđene mliječne kiseline (10 % w/v). Podesite temperaturu na 35 °C i dodajte 100 μl telećeg sirila (aktivnost sirila 1: 10 000, oko 3 000 U/ml), miješajte 1 minutu i potom ostavite posudu pokrivenu aluminijskom pločom jedan sat na temperaturi od 35 °C da bi se mogao formirati gruš. Nakon formiranja gruša, cijelo usireno mlijeko liofilizira se bez prethodne homogenizacije ili cijeđenja sirutke. Nakon liofilizacije, sitno ga sameljite da biste dobili homogeni prah. Za pripremu standarda od 0 % provodi se isti postupak uz uporabu isključivo obranog bivoljeg mlijeka. Standardi se čuvaju na temperaturi od – 20 °C.

Napomena: Prije pripreme standarda preporuča se provjeriti čistoću bivoljeg mlijeka metodom izoelektričnog fokusiranja kazeina razgrađenih djelovanjem plazmina.

Reagensi za bojenje bjelančevina

4.9. Fiksator

Otopite 150 g triklorooctene kiseline u vodi i dopunite do 1 000 ml.

4.10. Otopina za odbojavanje

Razrijedite 500 ml metanola i 200 ml ledene octene kiseline destiliranom vodom do količine od 2 000 ml.

Napomena: Svaki dan pripremite svježu otopinu za odbojavanje; možete je pripremiti miješanjem jednakih količina osnovnih otopina 50 %-tnog (v/v) metanola i 20 %-tne (v/v) ledene octene kiseline.

4.11. Otopine za bojenje

4.11.1. Otopina za bojenje (osnovna otopina 1)

Otopite 3,0 g boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) u 1 000 ml 90 %-tnog (v/v) metanola s pomoću magnetske miješalice (oko 45 minuta), filtrirajte kroz dva naborana filtra srednje brzine.

4.11.2. Otopina za bojenje (osnovna otopina 2)

Otopite 5,0 g bakrenog sulfata pentahidrata u 1 000 ml 20 %-tne (v/v) octene kiseline.

4.11.3. Otopina za bojenje (radna otopina)

Pomiješajte po 125 ml od svake osnovne otopine (4.11.1., 4.11.2.) neposredno prije bojenja.

Napomena: Otopina za bojenje priprema se na dan kad se koristi.

5. OPREMA

5.1. Staklene ploče (265 × 125 × 4 mm); gumeni valjak (širine 15 cm); stol s nagibnom radnom površinom

5.2. Noseća ploča za gel (265 × 125 mm)

5.3. Pokrivna ploča (280 × 125 mm). Na sve duge bridove (vidjeti sliku 1.) nanesite ljepljivu traku (280 × 6 × 0,25 mm).

5.4. Komora za elektrofokusiranje s rashladnom pločom (npr. 265 × 125 mm) i odgovarajućim električnim napajanjem (≥ 2,5 kV) ili uređajem za automatsku elektroforezu

5.5. Cirkulacijski kriostat, termostatski reguliran na 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifuga, podesiva do 3 000 g

5.7. Elektrodne trake (duljine ≥ 265 mm)

5.8. Plastične boce s kapaljkom za anodnu i katodnu otopinu

5.9. Aplikatori za uzorke (10 × 5 mm, od viskoze ili od filtar-papira koji slabo adsorbira bjelančevine)

5.10. Posude za bojenje i odbojavanje od nehrđajućeg čelika ili stakla (npr. plitice za instrumente dimenzija 280 × 150 mm)

5.12. Podesivi štapni homogenizator (promjera osovine 10 mm), raspona brzine od 8 000 do 20 000 o/min

5.13. Magnetska miješalica

5.14. Ultrazvučna kupelj

5.15. Uređaj za zavarivanje ploče

5.16. Mikropipete od 25 μl.

5.17. Vakuumski koncentrator ili liofilizator

5.18. Vodena kupelj, termostatski regulirana između 35 i 40 ± 1 °C s vibracijskom miješalicom

5.19. Denzitometar za očitavanje na valnoj duljini λ = 634 nm

6. POSTUPAK

6.1. Priprema uzorka

6.1.1. Izolacija kazeina

Odvagnite količinu koja je ekvivalent 5 g suhe mase sira ili referentnih standarda u epruvetu za centrifugiranje od 100 ml, dodajte 60 ml destilirane vode i homogenizirajte štapnim homogenizatorom (8 000 do 10 000 o/min). Podesite pH na 4,6 pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.) i centrifugirajte (5 minuta, 3 000 g). Dekantirajte mast i sirutku, ostatak homogenizirajte na 20 000 o/min u 40 ml destilirane vode čija je pH vrijednost od 4,5 podešena pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2.), ponovno homogenizirajte i centrifugirajte (5 minuta, 3 000 g). Špatulom uklonite sloj kazeina koji se nalazi između vodene i organske faze (vidjeti sliku 2.) i dekantirajte obje faze. Kazein ponovo homogenizirajte u 40 ml destilirane vode (vidjeti gore) i 20 ml diklorometana (4.5.2.) i centrifugirajte. Ponavljajte postupak sve dok obje faze ekstrakcije ne postanu bezbojne (dva do tri puta). Ostatak bjelančevina homogenizirajte pomoću 50 ml acetona (4.5.3.) i filtrirajte kroz naborani filtar-papir srednje brzine filtracije. Ostatak na filtru isperite dva puta, svaki put upotrebljavajući po 25 ml acetona, ostavite da se osuši na zraku ili u struji dušika te fino usitnite u tarioniku.

Napomena: Suhe izolate kazeina treba držati na temperaturi od – 20 °C.

6.1.2. Plazminsko cijepanje β-kazeina radi intenzifikacije γ-kazeina

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeina (6.1.1.) u 0,5 ml puferske otopine amonijeva karbonata (4.7.1.) i homogenizirajte 20 minuta, npr. ultrazvučnim postupkom. Zagrijte do 40 °C i dodajte 10 μl plazmina (4.7.2.), promiješajte i inkubirajte jedan sat na 40 °C uz neprestano tresenje. Radi inhibicije enzima dodajte 20 μl otopine ε-aminokapronske kiseline (4.7.3.) te potom dodajte 200 mg ureje u krutom obliku i 2 mg ditiotreitola.

Napomena: Radi postizanja veće simetrije fokusiranih kazeinskih vrpci, preporučuje se liofiliziranje otopine nakon dodavanja ε-aminokapronske kiseline i potom otapanje ostatka u 0,5 ml pufera za otapanje bjelančevina (4.6.).

6.2. Priprema poliakrilamidnih gelova koji sadržavaju ureju

S pomoću nekoliko kapi vode i valjka noseću ploču za gel (5.2.) stavite na staklenu ploču (5.1.), a višak vode uklonite papirnatim ubrusom ili ručnikom. Na isti način pokrivnu ploču (5.3.) s odstojnicima (0,25 mm) stavite na drugu staklenu ploču. Položite ploču vodoravno na stol s nagibnom radnom površinom.

Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1.) u pripremljenu i deaeriranu otopinu gela (4.1.2.), promiješajte i dodajte 10 μl otopine PER (4.1.3.2.), dobro izmiješajte i jednakomjerno razlijte po sredini pokrivne ploče. Stavite jedan rub noseće ploče za gel (ploča okrenuta prema dolje) na pokrivnu ploču i preostali dio polagano spuštajte tako da se između dvije plohe stvori tanki sloj gela koji će se jednakomjerno raširiti bez stvaranja mjehurića (slika 3.). Pažljivo spustite noseću ploču do kraja, koristeći se pritom tankom špatulom, i na nju položite još tri staklene ploče koje će poslužiti kao utezi. Po završetku polimerizacije (oko 60 minuta), gel koji se polimerizirao na nosećoj ploči maknite zajedno s pokrivnom pločom, laganim nakretanjem staklenih ploča. Pažljivo očistite naličje noseće ploče da biste uklonili ostatake gela i ureje. Zatvorite „gel-sendvič” u cjevastu foliju i pohranite u hladnjak (najviše šest tjedana).

Napomena: Pokrivna ploča s odstojnicima može se ponovo upotrebljavati. Poliakrilamidni gel može se razrezati na manje dijelove, što se preporučuje u slučaju manjeg broja uzoraka ili ako se upotrebljava uređaj za automatsku elektroforezu (dva gela, dimenzija 4,5 × 5 cm).

6.3. Izoelektrično fokusiranje

Termostat za hlađenje podesite na 12 °C. Kerozinom očistite stražnju stranu noseće ploče za gel i potom dodajte nekoliko kapljica kerozina (4.2.) u sredinu rashladnog bloka. Zatim na njega stavite gel-sendvič s nosećom stranom okrenutom prema dolje i povaljajte ga valjkom, pazeći da se pritom ne stvaraju mjehurići. Obrišite višak kerozina i skinite pokrivnu ploču. Elektrodne trake natopite elektrodnim otopinama (4.3., 4.4.), izrežite ih prema duljini gela i položite na predviđena mjesta (razmak između elektroda 9,5 cm).

Uvjeti za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1. Veličina gela 265 × 125 × 0,25 mm

Faza Vrijeme (min) Napon (V) Jakost (mA) Snaga (W) Volt-sati (Vh) 1. Predfokusiranje 30 maksimalni 2 500 maksimalna 15 konstantna 4 oko 300 2. Fokusiranje uzorka (7) 60 maksimalni 2 500 maksimalna 15 konstantna 4 oko 1 000 3. Konačno fokusiranje 60 maksimalni 2 500 maksimalna 5 maksimalna 20 oko 3 000 40 maksimalni 2 500 maksimalna 6 maksimalna 20 oko 3 000 30 maksimalni 2 500 maksimalna 7 maksimalna 25 oko 3 000

Napomena: Ako se promijeni debljina ili širina gela, vrijednosti za jakost i snagu treba podesiti u skladu s promjenom (npr. udvostručiti vrijednosti jakosti i snage ako se upotrebljava gel dimenzija 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Primjer naponskog režima za uređaj za automatsku elektroforezu (2 gela dimenzija 5,0 × 4,5 cm); elektrode bez traka nanesene izravno na gel

Faza Napon Jakost Snaga Temp. Volt-sati 1. Predfokusiranje 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Fokusiranje uzorka 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusiranje 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusiranje 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Postavite aplikator za uzorak u fazi 2. pri 0 Vh.

Uklonite aplikator za uzorak u fazi 2. pri 30 Vh.

6.4. Bojenje bjelančevina

6.4.1. Fiksacija bjelančevina

Čim isključite struju, uklonite elektrodne trake i odmah stavite gel u posudu za bojenje/odbojavanje s 200 ml fiksatora (4.9.); ostavite 15 minuta uz neprekidno mućkanje.

6.4.2. Ispiranje i bojenje ploče s gelom

Dobro ocijedite fiksator i ploču s gelom dva puta ispirite po 30 sekundi, svaki put s po 100 ml otopine za odbojavanje (4.10.). Izlijte otopinu za odbojavanje i u posudu nalijte 250 ml otopine za bojenje (4.11.3.); ostavite 45 minuta da boja djeluje, uz lagano protresanje.

6.4.3. Odbojavanje ploče s gelom

Izlijte otopinu za bojenje, ploču s gelom dva puta isperite, svaki put sa 100 ml otopine za odbojavanje (4.10.), zatim 15 minuta protresajte sa 200 ml otopine za odbojavanje te ponavljajte postupak odbojavanja, najmanje dva do tri puta, dok pozadina ne postane bistra i bezbojna. Ploču s gelom isperite destiliranom vodom (2 × 2 minute) i osušite na zraku (2 do 3 sata) ili sušilom za kosu (10 do 15 minuta).

Napomena 1.: Izvršite fiksaciju, ispiranje, bojenje i odbojavanje na temperaturi od 20 °C. Ne koristite više temperature.

Napomena 2.: Ako radije primjenjujete osjetljiviju metodu bojenja srebrom (npr. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, oznaka br. 17-1150-01), uzorke kazeina obrađene plazminom treba razrijediti na 5 mg/ml.

7. OCJENJIVANJE

Ocjenjivanje se provodi usporedbom struktura bjelančevina u nepoznatim uzorcima s referentnim standardima na istom gelu. Prisutnost kravljeg mlijeka u sirevima od ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka i mješavinama ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka utvrđuje se na temelju γ 3 - and γ 2 -kazeina, čije se izoelektrične točke nalaze između pH 6,5 i pH 7,5 (slike 4.a i b i slika 5.). Granica detekcije niža je od 0,5 %.

7.1. Vizualna procjena

Za vizualnu procjenu količine kravljeg mlijeka preporuča se izjednačiti koncentracije uzoraka i standarda radi dobivanja istih razina intenziteta ovčjih, kozjih i/ili bivoljih γ2- i γ3-kazeina (vidjeti „γ2 E, G, B” i „γ3 E, G, B” na slikama 4.a, 4.b i 5.). Nakon toga se količina kravljeg mlijeka (manje, jednako ili više od 1 %) u nepoznatom uzorku može izravno procijeniti usporedbom intenziteta kravljih γ3- i γ2-kazeina (vidjeti „γ3 C” i „γ2 C” na slikama 4.a i b te na slici 5.) s onima u referentnim standardima od 0 % i 1 % (ovčji, kozji) ili u privremenim laboratorijskim standardima (bivolji).

7.2. Denzitometrijska procjena

Za utvrđivanje omjera površina pikova kravljih i ovčjih, kozjih i/ili bivoljih kazeina γ2 i γ3 (vidjeti sliku 5.) primijenite denzitometriju (5.19.), ako je moguće. Usporedite tu vrijednost s omjerom površina pikova kazeina γ2- i γ3 referentnog standarda od 1 % (ovčji, kozji) ili privremenog laboratorijskog standarda (bivolji) analiziranih na istom gelu.

Napomena: Ova je metoda zadovoljavajuća ako postoji jasan pozitivan signal za oba kravlja γ2- i γ3-kazeina, u referentnom standardu od 1 %, ali ne i u referentnom standardu od 0 %. U protivnom, optimizirajte postupak pažljivo slijedeći detaljne upute navedene u metodi.

Uzorak se smatra pozitivnim ako su oba kravlja γ2- i γ3-kazeina ili odgovarajući omjeri površina pikova jednaki razini u referentnoj normi od 1 % ili veći od te razine.

8. REFERENTNA LITERATURA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in bovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins, Milchwissenschaft 45, 1990., str. 708–711.

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting, Milchwissenschaft 50, 1995., str. 83–85.

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier, v: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ur.), Bode-Verlag, München, 1989., str. 389–393.

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 1982., str. 195–199.

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 1980., str. 43–56.

Slika 1.

Shematski crtež pokrivne ploče

Slika 2.

Sloj kazeina koji nakon centrifugiranja pluta između vodene i organske faze

Slika 3.

Tehnika lijevanja ultratankih poliakrilamidnih gelova poklapanjem

a = odstojnik (0,25 mm); b = pokrivna ploča (5.3.); c, e = staklene ploče (5.1.); d = otopina gela (4.1.2.); f = noseća ploča za gel (5.2.)

Slika 4.a

Izoelektrično fokusiranje kazeina obrađenih plazminom iz sireva od ovčjeg i kozjeg mlijeka koji sadržavaju različite količine kravljeg mlijeka

% CM = postotak kravljeg mlijeka, C = krava, E = ovca, G = koza

Prikazana je gornja polovica IEF gela.

Slika 4.b

Izoelektrično fokusiranje kazeina obrađenih plazminom iz sireva od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka koji sadržavaju različite količine kravljeg mlijeka

% CM = postotak kravljeg mlijeka; 1+ = uzorak koji sadržava 1 % kravljeg mlijeka s dodatkom čistog kravljeg kazeina u sredini traga; C = krava, E = ovca, G = koza, B = bivol

Prikazana je potpuna razdaljina razdvajanja IEF gela.

Slika 5.

Preklapanje denzitograma standarda (STD) i uzoraka sireva od mješavine ovčjeg i kozjeg mlijeka nakon izoelektričnog fokusiranja

a,b = standardi koji sadržavaju 0 % i 1 % kravljeg mlijeka; c-g = uzorci sireva koji sadržavaju 0, 1, 2, 3 i 7 % kravljeg mlijeka; C = krava, E = ovca, G = koza

Skenirana je gornja polovica IEF gela na λ = 634 nm.