PRILOG

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:

Umeću se poglavlja B.53., B.54., B.55., B.56., B.57. i B.58.:

„B.53. STUDIJA RAZVOJNE NEUROTOKSIČNOSTI

UVOD

1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 426 (2007). U lipnju 1995. radna skupina OECD-a za reproduktivnu i razvojnu toksičnost raspravljala je u Kopenhagenu o potrebi za ažuriranjem postojećih smjernica OECD-a za ispitivanje reproduktivne i razvojne toksičnosti te razvojem novih smjernica za krajnje točke koje još nisu obuhvaćene (1). Radna skupina preporučila je da se smjernica za ispitivanje razvojne neurotoksičnosti sastavi na temelju smjernice Agencije za zaštitu okoliša SAD-a (USEPA) koja je od tada revidirana (2). U lipnju 1996. u Kopenhagenu je održano drugo savjetovanje na kojem je tajništvo obaviješteno o nacrtu nove smjernice za ispitivanje razvojne neurotoksičnosti, uključujući glavne elemente poput, primjerice, pojedinosti o odabiru životinjskih vrsta, razdoblja doziranja, razdoblja ispitivanja, krajnjih točaka koje treba procijeniti i kriterija za vrednovanje rezultata. Američka smjernica za procjenu rizika od neurotoksičnosti objavljena je 1998. (3). U listopadu 2000. održani su, jedno za drugim, stručno savjetovanje OECD-a i radionica Instituta za znanost o riziku Međunarodnog instituta za znanost o životu (ILSI), a 2005. u Tokiju je održano stručno savjetovanje. Ti su sastanci održani kako bi se raspravljalo o znanstvenim i tehničkim pitanjima povezanima s postojećom smjernicom za ispitivanje te su kod razvoja ove ispitne metode razmotrene preporuke s tih sastanaka (4) (5) (6) (7). Dodatne informacije o provedbi, tumačenju i terminologiji upotrijebljenoj za ovu ispitnu metodu nalaze se u Smjernicama OECD-a br. 43‚Ispitivanje i procjena reproduktivne toksičnosti’ (8) i br. 20‚Ispitivanje neurotoksičnosti’ (9).

UVODNA RAZMATRANJA

2. Poznato je da brojne kemikalije imaju učinke razvojne neurotoksičnosti u ljudi i drugih vrsta (10) (11) (12) (13). Za procjenu i vrednovanje toksičnih svojstava određene kemikalije može biti potrebno utvrđivanje potencijala razvojne neurotoksičnosti. Studije razvojne neurotoksičnosti namijenjene su osiguravanju podataka, uključujući karakterizacije doza-reakcija, o mogućim funkcionalnim i morfološkim učincima na živčani sustav potomaka u razvoju koji mogu nastati zbog izloženosti u maternici i u ranoj fazi života.

3. Studija razvojne neurotoksičnosti može se provesti kao zasebna studija, kao dio studije reproduktivne toksičnosti i/ili neurotoksičnosti u odrasloj dobi (primjerice, ispitne metode B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16)) ili kao dodatak studiji prenatalne razvojne toksičnosti (primjerice, ispitna metoda B.31. (17)). Ako je studija razvojne neurotoksičnosti dio druge studije ili njezin dodatak, ključno je očuvati cjelovitost obiju vrsta studija. Sva bi ispitivanja trebala biti u skladu s primjenjivim zakonodavstvom ili državnim i institucionalnim smjernicama za upotrebu laboratorijskih životinja u istraživanju (primjerice, 18).

4. Prije početka studije ispitni laboratorij trebao bi razmotriti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji. Takve će informacije uključivati identitet i kemijsku strukturu kemikalije, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih ostalih ispitivanja toksičnosti kemikalije in vitro ili in vivo, toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama te planiranu upotrebu (planirane upotrebe) kemikalije. Te su informacije nužne kako bi se svim zainteresiranim stranama dokazalo da je ispitivanje bitno za zaštitu zdravlja ljudi te će pomoći u odabiru odgovarajuće početne doze.

NAČELO ISPITNE METODE

5. Ispitivana kemikalija daje se životinjama tijekom gestacije i laktacije. Ženke se ispituju radi procjene učinaka u ženki koje su skotne i koje doje te radi mogućih usporednih informacija (ženke u usporedbi s potomcima). Potomci se nasumično biraju iz legala radi vrednovanja neurotoksičnosti. Vrednovanje se sastoji od opažanja radi otkrivanja velikih neuroloških abnormalnosti i abnormalnosti u ponašanju, uključujući procjenu fizičkog razvoja, bihevioralnu ontogenezu, motoričku aktivnost, motoričke i osjetilne funkcije te učenje i pamćenje te vrednovanja težine mozga i neuropatologije tijekom postnatalnog razvoja i u odrasloj dobi.

6. Ako se ispitna metoda provodi kao zasebna studija, dodatne dostupne životinje u svakoj skupini mogle bi se upotrebljavati za posebne neurobihevioralne, neuropatološke, neurokemijske ili elektrofiziološke postupke kojima se mogu dopuniti podaci dobiveni pregledima koji se preporučuju ovom ispitnom metodom (16) (19) (20) (21). Dopunski postupci mogu biti osobito korisni kada empirijsko opažanje, očekivani učinci ili mehanizam/način funkcioniranja ukazuju na posebnu vrstu neurotoksičnosti. Ti dopunski postupci mogu se upotrebljavati u ženki i u mladunaca. Osim toga, mogu se upotrebljavati i postupci ex vivo ili in vitro sve dok ne utječu na cjelovitost postupaka in vivo.

PRIPREME ZA ISPITIVANJE

Odabir životinjskih vrsta

7. Štakor je poželjna ispitna vrsta. Ostale se vrste mogu upotrebljavati prema potrebi. Međutim, treba uzeti u obzir da su gestacijski i postnatalni dani navedeni u ovoj ispitnoj metodi specifični za često upotrebljavane sojeve štakora te bi u slučaju upotrebe drugih vrsta ili neuobičajenog soja trebalo odabrati usporedive dane. Upotrebu druge vrste trebalo bi obrazložiti na temelju toksikoloških, farmakokinetičkih i/ili ostalih podataka. U obrazloženju bi trebalo navesti dostupnost postnatalnih neurobihevioralnih i neuropatoloških procjena specifičnih za vrstu. Ako postoji prethodno ispitivanje koje je izazvalo zabrinutost, trebalo bi razmotriti vrstu/soj koji su izazvali zabrinutost. Zbog različitih atributa učinka različitih sojeva štakora trebali bi postojati dokazi da soj koji je odabran za upotrebu ima odgovarajuću plodnost i reakciju. Trebalo bi dokumentirati pouzdanost i osjetljivost ostalih vrsta kod utvrđivanja razvojne neurotoksičnosti.

Uvjeti smještaja i hranjenja

8. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 ± 3 °C. Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost bi trebala biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Prije parenja i tijekom trajanja studije moguće je i obrnuti ciklus svjetlosti kako bi se procijenile funkcionalne i bihevioralne krajnje točke tijekom razdoblja tame (pod crvenim svjetlom), odnosno tijekom razdoblja uobičajene aktivnosti životinja (22). Sve promjene ciklusa svjetlo-tama trebale bi uključivati odgovarajuće razdoblje prilagodbe kako bi se životinje prilagodile na novi ciklus. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće. Trebalo bi navesti vrstu hrane i vode te bi ih trebalo analizirati s obzirom na kontaminate.

9. Životinje se mogu smjestiti odvojeno ili držati u kavezima u malim skupinama istog spola. Postupci parenja trebali bi se odvijati u kavezima koji odgovaraju toj svrsi. Nakon što je očito da je došlo do kopulacije ili najkasnije na 15. dan graviditeta životinje koje su se parile treba smjestiti u posebne kaveze za okot ili materinstvo. Kaveze treba urediti tako da se eventualni učinci držanja u kavezu svedu na minimum. Pred termin parturicije skotnim ženkama treba osigurati odgovarajući i utvrđeni materijal za pravljenje gnijezda. Poznato je da neodgovarajuće rukovanje ili stres tijekom graviditeta može imati nepovoljne ishode, uključujući prenatalni gubitak i izmijenjeni fetalni i postnatalni razvoj. Radi zaštite od fetalnoga gubitka zbog faktora nevezanih uz tretiranje, tijekom graviditeta životinjama treba pažljivo rukovati te treba izbjegavati stres izazvan vanjskim faktorima kao što je prekomjerna buka.

Priprema životinja

10. Treba upotrebljavati zdrave životinje koje su se prilagodile laboratorijskim uvjetima i koje ranije nisu bile podvrgavane eksperimentalnim postupcima, osim ako je studija dio druge studije (vidjeti stavak 3.). Ispitne životinje treba okarakterizirati u pogledu vrste, soja, spola, mase i starosti. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i označiti je njime. Životinje u svim ispitnim skupinama trebale bi u najvećoj mogućoj mjeri biti ujednačene mase i starosti te unutar uobičajenog raspona vrste i soja koji se ispituju. Za svaku visinu doze treba upotrebljavati mlade odrasle ženke koje još nisu imale potomstvo. Potrebno je osigurati izbjegavanje parenja između braće i sestara. Nulti dan gestacije dan je kad se opazi vaginalni čep i/ili sperma. Nakon nabave već gravidnih životinja od dobavljača treba predvidjeti odgovarajuće razdoblje prilagodbe (primjerice 2 do 3 dana). Parene ženke treba nasumično i u najvećoj mogućoj mjeri ravnomjerno rasporediti u kontrole skupine i skupine za tretiranje (npr., preporučuje se stratificirani nasumični postupak kako bi se osigurao ravnomjeran raspored u svim skupinama poput postupka na temelju tjelesne mase). Ženke koje je oplodio isti mužjak treba ujednačeno rasporediti po skupinama.

POSTUPAK

Broj i spol životinja

11. Svaka ispitna i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj skotnih ženki koje treba izložiti ispitivanoj kemikaliji kako bi se osiguralo da se okoti odgovarajući broj potomaka za vrednovanje neurotoksičnosti. Za svaku visinu doze preporučuje se ukupno 20 legala. Dopušteni su ponovljeni i postupni planovi doziranja skupinama ako se postigne ukupan broj legala po skupini te ako se u obrazloženju ponavljanja upotrebljavaju odgovarajući statistički modeli.

12. Na 4. postnatalni dan (PND) ili prije njega (dan okota je nulti postnatalni dan) veličina svakog legla trebala bi se prilagoditi uklanjanjem dodatnih mladunaca slučajnim odabirom kako bi se postigla ista veličina svih legala (23). Veličina legla ne bi trebala premašivati prosječnu veličinu legla za upotrijebljeni soj glodavaca (8–12). Leglo bi po mogućnosti, trebalo imati jednak broj muških i ženskih mladunaca. Selektivno uklanjanje mladunaca, primjerice prema tjelesnoj masi, nije prihvatljivo. Nakon standardizacije legala (izdvajanje) i prije daljnjeg ispitivanja funkcionalnih krajnjih točaka pojedinačne mladunce koji su određeni za ispitivanje prije ili nakon odbijanja od sise trebalo bi jedinstveno identificirati s pomoću neke odgovarajuće humane metode identifikacije mladunaca (primjerice 24).

Raspodjela životinja za funkcionalna i bihevioralna ispitivanja, vrednovanje težine mozga i neuropatološko vrednovanje

13. Ispitnom metodom omogućeni su različiti pristupi u pogledu raspodjele životinja izloženih in utero i laktacijom za funkcionalna i bihevioralna ispitivanja, spolno sazrijevanje, utvrđivanje težine mozga i neuropatološko vrednovanje (25). Ostala ispitivanja neurobihevioralne funkcije (npr. društveno ponašanje), neurokemije ili neuropatologije mogu se dodavati u pojedinačnim slučajevima sve dok nije narušena cjelovitost izvornih nužnih ispitivanja.

14. Mladunci se biraju iz svake skupine koja je primila određenu dozu te se raspoređuju za procjene krajnjih točaka na 4. postnatalni dan ili nakon njega. Mladunce po mogućnosti, treba birati tako da su oba spola iz svakog legla u svakoj skupini koja prima određenu dozu jednako zastupljena u svim ispitivanjima. Kod ispitivanja motoričke aktivnosti isti par muških i ženskih mladunaca treba ispitivati u svim dobima prije odbijanja od sise (vidjeti stavak 35.). Pri svim ostalim ispitivanjima isti ili zasebni parovi muških i ženskih životinja mogu se rasporediti za različita bihevioralna ispitivanja. Različite mladunce će možda trebati rasporediti za ispitivanja kognitivne funkcije u životinja koje se odbijaju od sise i odraslih životinja kako bi se izbjeglo miješanje učinaka dobi i ranijeg treninga na te vrijednosti (26) (27). Nakon odbijanja od sise (21. postnatalni dan) mladunci koji nisu odabrani za ispitivanje mogu se humano usmrtiti. Treba zabilježiti sve promjene u raspodjeli mladunaca. Statistička mjerna jedinica trebala bi biti leglo (ili ženka), a ne mladunac.

15. Postoje različiti načini raspodjele mladunaca za preglede prije i nakon odbijanja od sise, kognitivna ispitivanja, patološke preglede itd. (vidjeti sliku 1. za opći plan i Dodatak 1. za primjere raspodjele). Preporučen je minimalan broj životinja u svakoj skupini koja prima određenu dozu za preglede prije i nakon odbijanja od sise kako slijedi:

Klinička opažanja i tjelesna masa Sve životinje Detaljna klinička opažanja 20/spol (1/spol/leglo) Težina mozga (nakon fiksacije) 11–22. PND 10/spol (1/leglo) Težina mozga (nefiksiranog) ~ 70. PDN 10/spol (1/leglo) Neuropatologija (uranjanje ili perfuzijska fiksacija) 11–22. PND 10/spol (1/leglo) Neuropatologija (perfuzijska fiksacija) 70. PND 10/spol (1/leglo) Spolno sazrijevanje 20/spol (1/spol/leglo) Ostale razvojne posebnosti (opcija) Sve životinje Bihevioralna ontogeneza 20/spol (1/spol/leglo) Motorička aktivnost 20/spol (1/spol/leglo) Motorička i osjetilna funkcija 20/spol (1/spol/leglo) Učenje i pamćenje 10/spol (1) (1/leglo)

Doziranje

16. Upotrebljavaju se najmanje tri visine doze i paralelna kontrola. Doze različitih visina treba primijeniti u određenim vremenskim razmacima kako bi se dobila gradacija toksičkog učinka. Osim u slučaju ograničenja zbog fizikalno-kemijske prirode ili bioloških svojstava kemikalije, treba odabrati najvišu dozu s ciljem izazivanja određene toksičnosti u majke (npr. kliničkih znakova, smanjenja porasta tjelesne mase (najviše 10 %) i/ili dokaza o toksičnosti na ciljnom organu zbog koje se mora ograničiti doza). Visoka doza može se ograničiti na 1 000 mg/kg/dan tjelesne mase, uz neke iznimke. Primjerice, očekivana izloženost ljudi može ukazati na potrebu za primjenom više doze. U suprotnom, trebalo bi provesti pokusne studije ili preliminarne studije za određivanje raspona kako bi se utvrdila najviša doza koju treba upotrebljavati koja bi trebala izazvati minimalni stupanj toksičnosti u majke. Ako je standardnom studijom razvojne toksičnosti ili pokusnom studijom dokazano da je ispitivana kemikalija razvojno toksična, najviša bi doza trebala biti maksimalna doza kojom se neće izazvati prekomjerna toksičnost u potomaka, smrt in utero ili neonatalna smrt ili malformacije, dostatna za isključivanje smislenog vrednovanja neurotoksičnosti. Najnižom dozom trebalo bi nastojati ne proizvesti nikakav dokaz toksičnosti niti za majku niti za plod u razvoju, uključujući neurotoksičnost. Kako bi se predočile sve reakcije povezane s dozom i doza kod koje nije zamijećen štetni učinak (NOAEL), treba odabrati niz sve nižih doza ili doze blizu granice detekcije kojima bi se omogućilo utvrđivanje referentne doze. Za utvrđivanje sve nižih razina doza često je najbolje doze primijeniti u dva do četiri kraća intervala te je često bolje dodati četvrtu skupinu koja prima određenu dozu nego između dva doziranja imati jako dugi interval (npr. gdje je faktor veći od 10).

17. Visine doza treba birati uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti, kao i dodatne informacije o metabolizmu i toksikinetici ispitivane kemikalije ili srodnih materijala. Te informacije isto tako mogu biti korisne kod dokazivanja primjerenosti režima doziranja. Izravno doziranje mladuncima treba razmotriti na temelju informacija o izloženosti i farmakokinetičkih informacija (28) (29). Prije provođenja studija o izravnom doziranju treba pažljivo razmotriti koristi i nedostatke (30).

18. Usporedna kontrolna skupina treba biti placebo kontrolna skupina ili kontrolna skupina tretirana samo nosačem ako se kod primjene ispitivane kemikalije upotrebljava nosač. Svim životinjama treba obično dati isti volumen ispitivane kemikalije ili nosača na temelju tjelesne mase. Ako se radi lakšeg doziranja upotrebljava nosač ili drugi aditiv, treba uzeti u obzir sljedeće karakteristike: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili zadržavanje ispitivane kemikalije, učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koji mogu izmijeniti njezine toksične karakteristike te učinke na potrošnju hrane i vode ili nutritivno stanje životinja. Nosač ne bi smio dovesti do učinaka koji bi mogli ometati tumačenje studije i ne bi smio biti neurobihevioralno toksičan te imati učinke na reprodukciju ili razvoj. Pri novim nosačima, osim skupine tretirane nosačem, treba uključiti i kontrolnu skupinu tretiranu placebom. Sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati na jednak način kao sa životinjama u ispitnoj skupini.

Primjena doza

19. Ispitivana kemikalija ili nosač trebali bi se primijeniti na način koji je najsličniji mogućoj izloženosti ljudi te na temelju dostupnih informacija o metabolizmu i distribuciji pri ispitnim životinjama. Treba općenito upotrebljavati oralni put primjene (npr. sondom, u hrani ili vodi za piće), ali se mogu primijeniti i drugi načini primjene (npr. dermalno, inhalacijom) ovisno o karakteristikama i očekivanim ili poznatim načinima izloženosti ljudi (daljnje smjernice nalaze se u Smjernici 43 (8)). Treba obrazložiti odabrani način primjene. Ispitivanu kemikaliju treba primjenjivati svakog dana po prilici u isto vrijeme.

20. Doza koja se daje svakoj životinji u pravilu uobičajeno bi se trebala temeljiti na najnovijem određivanju pojedinačne tjelesne mase. Međutim, pri prilagođavanju doza tijekom posljednjeg tromjesečja graviditeta potreban je oprez. Ako se pri tretiranim ženkama opazi previsoka toksičnost, te životinje treba humano usmrtiti.

21. Ispitivana kemikalija ili nosač trebali bi se davati barem jednom dnevno parenim ženkama od trenutka implantacije (6. dan gestacije) i tijekom laktacije (21. PND) tako da mladunci budu izloženi ispitivanoj kemikaliji tijekom prenatalnog i postnatalnog neurološkog razvoja. Dob u kojoj počinje doziranje te trajanje i učestalost doziranja mogu se prilagoditi ako postoje dokazi o planu pokusa koji je relevantniji za izloženost ljudi. Trajanja doziranja trebalo bi prilagoditi za ostale vrste kako bi se osigurala izloženost tijekom svih ranih razdoblja razvoja mozga (odnosno ekvivalentnih prenatalnom i ranom postnatalnom rastu ljudskog mozga). Doziranje može započeti od početka graviditeta (nulti gestacijski dan), iako treba razmotriti potencijal ispitivane kemikalije da uzrokuje predimplantacijski gubitak. Početkom primjene na šesti gestacijski dan taj bi se rizik izbjegao, ali se ne bi tretirale razvojne faze između nultog i šestoga gestacijskog dana. Ako laboratorij kupi već parene životinje, nepraktično je započeti doziranje na nulti gestacijski dan te bi stoga šesti gestacijski dan bio dobar početni dan. Ispitni bi laboratorij trebao odrediti režim doziranja u skladu s relevantnim informacijama o učincima ispitivane kemikalije, ranijim iskustvima i logističkim aspektima, što može uključivati produljenje doziranja nakon odbijanja od sise. Doziranje se ne bi trebalo obaviti na dan parturicije u onih životinja u kojih okot potomaka nije dovršen. Općenito, pretpostavlja se da će do izloženosti mladunaca doći majčinim mlijekom. Međutim, izravno doziranje mladuncima trebalo bi razmotriti u slučajevima nepostojanja dokaza o stalnoj izloženosti potomaka. Dokazi o stalnoj izloženosti mogu se naći, primjerice, u farmakokinetičkim informacijama, toksičnosti u potomaka ili promjenama u biomarkerima (28).

OPAŽANJA

Opažanja u ženki

22. Opažanja s obzirom na zdravstveno stanje, uključujući pobolijevanje i smrtnost, trebala bi se provoditi na svim ženkama najmanje jednom dnevno.

23. Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi periodično provoditi detaljnija klinička opažanja (najmanje dvaput tijekom gestacijskog razdoblja doziranja i dvaput tijekom laktacijskog razdoblja doziranja) upotrebom najmanje deset ženski po visini doze. Životinje bi izvan kaveza u kojem inače borave trebali promatrati obučeni tehničari koji nemaju informacija o tretmanu životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažili stres u životinja i pristranost promatrača te maksimizirala njihova pouzdanost. Savjetuje se da, po mogućnosti, isti tehničar provodi opažanja u predmetnoj studiji.

24. Treba bilježiti pojavu opaženih znakova. Kad god je to moguće, treba zabilježiti i jačinu opaženih znakova. Kliničkim opažanjima treba obuhvatiti, ali ne ih ograničiti na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, na pojavu iscjedaka i autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija, piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju i/ili disanje na usta i svi neuobičajeni znaci uriniranja ili defekacije).

25. Isto tako treba zabilježiti i sve neuobičajene reakcije s obzirom na položaj tijela, razinu aktivnosti (npr. povećana ili smanjena upotreba standardnog prostora) i koordinaciju pokreta. Treba zabilježiti i promjene u hodu (npr. šepanje, ataksija), držanju (primjerice, zgrbljenost) i reakciju na manipulaciju, postavljanje ili druge podražaje okoline kao i pojavu kloničnih ili toničnih pokreta, konvulzija ili tremora, stereotipnog ponašanja (npr. prekomjerno njegovanje dlake, neobični pokreti glave, stalno kretanje u krug) ili čudnog ponašanja (npr. griženje ili pretjerano lizanje, samoranjavanje, hodanje unatrag, vokalizacija) ili agresiju.

26. Treba zabilježiti znakove toksičnosti, uključujući početni dan, doba dana, stupanj i trajanje.

27. Životinje bi trebalo izvagati u trenutku doziranja najmanje jednom tjedno tijekom studije, na dan okota ili oko njega te na 21. PND (odbijanje od sise). Pri studijama u kojima se primjenjuje hranjenje na sondu ženke bi trebalo vagati najmanje dvaput tjedno. Doze bi, prema potrebi, trebalo prilagoditi u trenutku svakog utvrđivanja tjelesne mase. Unos hrane trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno tijekom gestacije i laktacije. Unos vode trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno ako do izloženosti dolazi opskrbom vodom.

Opažanja u potomaka

28. Svi bi se potomci trebalo pažljivo promatrati najmanje jednom dnevno radi znakova toksičnosti te pobolijevanja i smrtnosti.

29. Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi provoditi detaljnija klinička opažanja potomaka. Potomke (najmanje jedan mladunac po spolu i po leglu) bi trebali promatrati obučeni tehničari koji nemaju informacija o tretmanu životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažila pristranost te maksimizirala pouzdanost promatrača. Savjetuje se da, po mogućnosti, isti tehničar provodi opažanja. Po potrebi bi trebalo pratiti barem krajnje točke opisane u stavcima 24. i 25. za razvojnu fazu koja se promatra.

30. Treba zabilježiti sve znakove toksičnosti u potomaka, uključujući početni dan, doba dana, stupanj i trajanje.

Fizičke i razvojne posebnosti

31. Promjene u razvojnim posebnostima prije odbijanja od sise (npr. odvajanje uške, otvaranje očiju, izbijanje sjekutića) blisko su povezane s tjelesnom masom (30) (31). Tjelesna masa može biti najbolji pokazatelj fizičkog razvoja. Zato se mjerenje razvojnih posebnosti preporučuje samo kad postoje raniji dokazi da će te krajnje točke pružiti dodatne informacije. Trenutak za procjenu tih parametara navodi se u tablici 1. Ovisno o očekivanim učincima i rezultatima početnih mjerenja, može se savjetovati dodavanje dodatnih vremenskih točaka ili obavljanje mjerenja u drugim razvojnim fazama.

32. Pri procjeni fizičkog razvoja savjetuje se upotreba postkoitalne dobi umjesto postnatalne dobi (33). Ako se mladunci ispituju na dan odbijanja od sise, preporučuje se da se ispitivanje obavi prije odbijanja od sise kako bi se izbjegao zbunjujući učinak stresa povezanog s odbijanjem od sise. Osim toga, dva dana nakon odbijanja od sise ne bi trebalo obavljati nikakva ispitivanja mladunaca nakon odbijanja od sise.

Tablica 1.

Trenutak procjene fizičkih i razvojnih posebnosti te funkcionalnih/bihevioralnih krajnjih točaka (2)

Dob Krajnje točke Prije odbijanja od sise (3) Adolescencija (3) Mlada odrasla dob (3) Fizičke i razvojne posebnosti Tjelesna masa i klinička opažanja jednom tjedno (4) najmanje svaka dva tjedna najmanje svaka dva tjedna Težina mozga 22. PND (5) na završetku Neuropatologija 22. PND (5) na završetku Spolno sazrijevanje — prema potrebi — Ostale razvojne posebnosti (6) prema potrebi — — Funkcionalne/bihevioralne krajnje točke Bihevioralna ontogeneza Najmanje dvije vrijednosti Motorička aktivnost (uključujući habituaciju) 1–3 puta (7) — jednom Motorička i osjetilna funkcija — jednom jednom Učenje i pamćenje — jednom jednom

33. Trebalo bi utvrditi broj i spol živih mladunaca, npr. vizualnim pregledom ili mjerenjem anogenitalnog razmaka (34) (35), a svaki bi se mladunac iz legla trebao pojedinačno izvagati pri okotu i ubrzo nakon njega, najmanje jednom tjedno tijekom laktacije te najmanje jednom svaka dva tjedna nakon toga. Kod vrednovanja spolnog sazrijevanja za najmanje jednog mužjaka i najmanje jednu ženku po leglu trebalo bi utvrditi dob i tjelesnu masu životinje kad dođe do vaginalne prohodnosti (36) ili razdvajanja prepucija (37).

Bihevioralna ontogeneza

34. Ontogeneza odabranih ponašanja trebala bi se mjeriti u najmanje jednog mladunca po spolu i po leglu tijekom odgovarajuće dobi, pri čemu se isti mladunci upotrebljavaju svih dana ispitivanja za sva ponašanja koja se procjenjuju. Dani u kojima se obavljaju mjerenja trebali bi biti ravnomjerno raspoređeni tijekom tog razdoblja kako bi se utvrdilo uobičajeno ponašanje ili promjena povezana s tretmanom u ontogenezi tog ponašanja (38). U nastavku su navedeni neki primjeri ponašanja čija se ontogeneza mogla procijeniti: refleks uspravljanja, negativna geotaksija i motorička aktivnost (38)(39)(40).

Motorička aktivnost

35. Motoričku aktivnost treba pratiti (41) (42) (43) (44) (45) tijekom razdoblja prije odbijanja od sise i odrasle dobi. Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Ispitivanje bi trebalo trajati dovoljno dugo da se pokaže navikavanje tijekom ispitivanja kod netretiranih kontrolnih skupina. Osobito se preporučuje upotreba motoričke aktivnosti za procjenu bihevioralne ontogeneze. Ako se ono upotrebljava kao ispitivanje bihevioralne ontogeneze, tada bi se za ispitivanje trebale upotrebljavati iste životinje kod svih ispitivanja prije odbijanja od sise. Ispitivanje bi trebalo provoditi dovoljno često kako bi se procijenila ontogeneza habituacije tijekom ispitivanja (44). To može značiti tri vremenska razdoblja ili više njih prije dana odbijanja od sise, uključujući i taj dan (npr. 13., 17., 21. PND). Ispitivanje istih životinja ili članova legla trebalo bi se obaviti i u odrasloj dobi blizu završetka studije (npr. 60. do 70. PND). Ispitivanje u dodatnim danima može se obaviti prema potrebi. Motorička aktivnost trebala bi se pratiti automatskim aparatom za bilježenje aktivnosti kojim se može utvrditi povećanje i smanjenje aktivnosti (odnosno osnovna aktivnosti koju uređaj mjeri ne bi smjela biti toliko niska da to spriječi utvrđivanje smanjenja niti toliko visoka da to spriječi utvrđivanje povećanja aktivnosti). Svaki bi se uređaj trebao ispitati standardnim postupcima kako bi se u najvećoj mogućoj mjeri osigurala pouzdanost rada svih uređaja i u sve dane. Tretirane skupine bi u najvećoj mogućoj mjeri trebalo rasporediti na sve uređaje. Svaka bi se životinja trebala ispitivati pojedinačno. Tretirane skupine trebale bi biti raspoređene na sva vremena ispitivanja kako bi se izbjeglo zbunjivanje zbog cirkadijurnih ritmova aktivnosti. Trebalo bi nastojati da varijacije ispitnih uvjeta budu minimalne te da nisu sustavno povezane s tretiranjem. Među varijablama koje mogu utjecati na brojne vrijednosti ponašanja, uključujući motoričku aktivnost, nalaze se razina buke, veličina i oblik ispitnog kaveza, temperatura, relativna vlažnost, svjetlosni uvjeti, mirisi, upotreba kaveza u kojem životinje inače borave ili novog ispitnog kaveza te distrakcije iz okoline.

Motorička i osjetilna funkcija

36. Motorička i osjetilna funkcija trebala bi se detaljno ispitivati najmanje jednom u adolescentnoj dobi te jednom tijekom razdoblja rane odrasle dobi (npr. 60. do 70. PND). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Treba provesti dovoljno ispitivanja kako bi se osiguralo odgovarajuće količinsko uzorkovanje osjetilnih modaliteta (npr. somatosenzorni, vestibularni) i motoričkih funkcija (npr. snaga, koordinacija). Neki su primjeri ispitivanja motoričke i osjetilne funkcije refleks pružanja ekstenzora (46), refleks uspravljanja (47) (48), habituacija na iznenadnu buku (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) i evocirani potencijali (55).

Ispitivanja učenja i pamćenja

37. Trebalo bi provesti ispitivanje asocijativnog učenja i pamćenja nakon odbijanja od sise (npr. 25. dan ± 2) i u mladih odraslih životinja (60. PND i starijih). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Ista ili zasebna ispitivanja mogu se upotrijebiti u ovim dvjema fazama razvoja. Dopušta se određena fleksibilnost kod odabira ispitivanja učenja i pamćenja u štakora koji se odbijaju od sise i odraslih štakora. Međutim, ispitivanja bi trebala biti oblikovana tako da se ispune dva kriterija. Kao prvo, učenje bi se trebalo procjenjivati kao promjena među nekoliko ponovljenih postupaka učenja ili prilikom ispitivanja koja uključuju jedan postupak učenja s upućivanjem na uvjet kojim se kontroliraju neasocijativni učinci iskustva učenja. Kao drugo, ispitivanja bi trebala uključivati neku vrstu mjerne vrijednosti pamćenja (kratkoročnog ili dugoročnog) osim izvornog učenja (stjecanja), ali se ona ne može navesti zbog izostanka mjerne vrijednosti stjecanja dobivene istim ispitivanjem. Ako se ispitivanjima učenja i pamćenja otkrije učinak ispitivane kemikalije, mogu se razmotriti dodatna ispitivanja kako bi se isključila alternativna tumačenja na temelju promjena u osjetilnim, motivacijskim i/ili motoričkim sposobnostima. Uz gornja dva kriterija, preporučuje se odabir ispitivanja učenja i pamćenja na temelju njegove dokazane osjetljivosti na klasu opasnosti kemikalije koja se ispituje, ako su takve informacije dostupne u literaturi. U izostanku takvih informacija primjeri ispitivanja koja bi mogla ispuniti gornje kriterije uključuju pasivno izbjegavanje (43) (56) (57), zakašnjeli dolazak na položaj u odraslih štakora (58) i u mladih štakora (59), olfaktorno kondicioniranje (43) (60), Morrisov vodeni labirint (61) (62) (63), labirint vrste Biel ili Cincinnati (64) (65), labirint s radijalnim kracima (66), labirint u obliku slova T (43) te stjecanje i zadržavanje ponašanja kontroliranog rasporedom (26) (67) (68). Dodatna ispitivanja opisana su u literaturi za štakore koji se odbijaju od sise (26) (27) i odrasle štakore (19) (20).

Pregled post-mortem

38. Majke se može eutanazirati nakon odbijanja potomaka od sise.

39. Neuropatološko vrednovanje potomaka obavit će se s pomoću tkiva životinja koje su humano usmrćene 22. postnatalnog dana ili ranije u razdoblju između 11. i 22. postnatalnog dana, kao i nakon završetka studije. U potomaka usmrćenih do 22. postnatalnog dana trebalo bi vrednovati moždana tkiva, a u životinja usmrćenih po završetku studije tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava. Životinje usmrćene na 22. PND ili ranije mogu se fiksirati uranjanjem ili perfuzijom. Životinje usmrćene nakon završetka studije trebale bi se fiksirati perfuzijom. Svi aspekti pripreme uzoraka tkiva, od perfuzije životinja, preko disekcije uzoraka tkiva, obrada tkiva te bojenje preparata trebali bi se obaviti prema uravnoteženom planu tako da svaka serija uključuje reprezentativne uzorke svake skupine koja je primala određenu dozu. Dodatne smjernice o neuropatologiji nalaze se u OECD-ovoj Smjernici br. 20 (9), vidjeti i (103).

Obrada uzoraka tkiva

40. Treba zabilježiti sve velike abnormalnosti vidljive u trenutku nekropsije. Uzeti uzorci tkiva trebali bi predstavljati sve glavne regije živčanog sustava. Uzorci tkiva trebali bi se čuvati u odgovarajućem fiksativu i obraditi prema standardiziranim objavljenim histološkim protokolima (69) (70) (71) (103). Uklapanje u parafin prihvatljivo je za tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava, ali upotreba osmija nakon fiksacije, uz uklapanje u epoksi-smolu, može biti primjerena ako je potreban viši stupanj rezolucije (npr. za periferne živce kad se sumnja na perifernu neuropatiju i/ili za morfometrijsku analizu perifernih živaca). Moždano tkivo prikupljeno za morfometrijsku analizu trebalo bi uklopiti u odgovarajući medij na svim visinama doze u isto vrijeme kako bi se izbjegli artefakti skupljanja koji mogu biti povezani s produljenim stajanjem u fiksativu (6).

Neuropatološki pregled

41. Svrha kvalitativnih pregleda je:

i. utvrditi regije živčanog sustava pri kojima su uočljivi dokazi neuropatoloških promjena;

ii. utvrditi vrste neuropatoloških promjena koje su posljedica izloženosti ispitivanoj kemikaliji;

iii. utvrditi raspon težine neuropatoloških promjena.

Odgovarajuće osposobljeni patolog trebao bi mikroskopski pregledati reprezentativne histološke sekcije uzoraka tkiva radi dokazivanja neuropatoloških promjena. Svim neuropatološkim promjenama treba dodijeliti subjektivnu ocjenu kojom se opisuje njihova težina. Bojenje hematoksilinom i eozinom može biti dostatno za vrednovanje sekcija mozga životinja koje su humano usmrćene 22. postnatalnog dana ili ranije. Međutim, bojenje mijelina (npr. luxol fast plavom/cresyl ljubičastom) i bojenje srebrom (npr. Bielschowskyjevom ili Bodianovom bojom) preporučuju se kod sekcija tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava životinja usmrćenih nakon završetka studije. U skladu sa stručnom prosudbom patologa i vrstom uočenih promjena druge se boje mogu smatrati primjerenima za identifikaciju i karakterizaciju određenih vrsta promjena (npr. glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) ili histokemija lektina za procjenu glijalnih i mikroglijalnih promjena (72), fluoro-žad za utvrđivanje nekroze (73) (74) ili srebrno bojenje specifično za neuralnu degeneraciju (75)).

42. Morfometričko (količinsko) vrednovanje trebalo bi se obaviti jer ti podaci mogu biti korisni kod utvrđivanja učinka koji je povezan s tretiranjem te tumačenja razlika povezanih s tretiranjem u težini ili morfologiji mozga (76) (77). Uzorci tkiva živčanog sustava trebaju se uzeti i pripremiti kako bi se omogućilo morfometričko vrednovanje. Morfometrička vrednovanja mogu uključivati npr. linearna ili prostorna mjerenja određenih regija mozga (78). Za linearna ili prostorna mjerenja potrebna je upotreba homolognih sekcija koje su pažljivo odabrane na temelju pouzdanih mikroskopskih posebnosti (6). Stereologija se može upotrebljavati za identifikaciju učinaka povezanih s tretiranjem na parametre poput volumena ili broja stanica za specifične neuroanatomske regije (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. Mozgove treba pregledati radi dokazivanja svih neuropatoloških promjena povezanih s tretiranjem te treba uzeti odgovarajuće uzorke iz svih glavnih regija mozga (npr. iz olfaktornog bulbusa, cerebralnog korteksa, hipokampusa, bazalnih ganglija, talamusa, hipotalamusa, srednjeg mozga (krova, tegmentuma i moždanih krakova), mosta, produžene moždine, malog mozga) kako bi se osigurao temeljit pregled. Važno je da se sekcije u svih životinja uzimaju u istoj ravnini. U odraslih životinja koje su humano usmrćene nakon završetka studije trebalo bi uzeti uzorak reprezentativnih sekcija leđne moždine i perifernog živčanog sustava. Pregledana područja trebala bi uključivati oko s vidnim živcem i mrežnicu, leđnu moždinu na cervikalnom i lumbarnom zadebljanju, dorzalne i ventralne korjenove, proksimalni ishijadični živac, proksimalni tibijalni živac (na koljenu) i ogranke tibijalnog živca u lisnom mišiću. Sekcije leđne moždine i perifernog živca trebale bi obuhvatiti i poprečne ili dijagonalne i uzdužne sekcije.

44. Neuropatološko vrednovanje trebalo bi uključivati pregled radi utvrđivanja naznaka razvojnih oštećenja živčanog sustava (6) (85) (86) (87) (88) (89), uz stanične promjene (npr. neuronska vakuolacija, degeneracija, nekroza) i promjene tkiva (npr. glioza, infiltracija leukocita, nastanak cista). U tom je pogledu važno razlikovati učinke povezane s tretiranjem od uobičajenih razvojnih događaja za koje je poznato da se odvijaju u razvojnoj fazi koja odgovara trenutku usmrćivanja (90). Primjeri znatnih promjena koje ukazuju na razvojni inzult uključuju, ali se ne ograničavaju na:

— promjene u veličini ili obliku olfaktornog bulbusa, mozga ili malog mozga,

— promjene u relativnoj veličini različitih regija mozga, uključujući smanjenja ili povećanja veličine regija koje su posljedica gubitka ili postojanosti uobičajeno prolaznih populacija stanica ili aksonalnih projekcija (npr. vanjski zametni sloj cerebeluma, žuljevito tijelo),

— promjene u proliferaciji, migraciji i diferencijaciji na što upućuju područja prekomjerne apoptoze ili nekroze, nakupine ili raspršene populacije ektopijskih stanica, dezorijentirani ili malformirani neuroni ili promjene u relativnoj veličini različitih slojeva kortikalnih struktura,

— promjene u uzorcima mijelinacije, uključujući ukupno smanjenje veličine ili promijenjeno bojenje mijeliniranih struktura,

— dokaze hidrocefalusa, osobito povećanje klijetki, stenozu cerebralnog akvedukta i stanjivanje moždanih polutki.

Analiza odnosa doza-reakcija neuropatoloških promjena

45. Sljedeći se fazni postupak preporučuje za kvalitativnu i kvantitativnu neuropatološku analizu. Kao prvo, sekcije iz skupine koja je primala visoku dozu uspoređuju se sa sekcijama kontrolne skupine. Ako nema dokaza o neuropatološkim promjenama u životinja iz skupine koja je primala visoku dozu, nije potrebna daljnja analiza. Ako postoje dokazi o neuropatološkim promjenama u skupini koja je primala visoku dozu, pregledavaju se životinje iz skupina koje su primale srednju odnosno nisku dozu. Ako se skupina koja je primala visoku dozu uništi zbog smrti ili druge zbunjujuće toksičnosti, trebalo bi analizirati skupine koje su primale visoke odnosno srednje doze radi neuropatoloških promjena. Ako je u skupina koje su primale niže doze uočena neuropatologija, potrebno je obaviti neuropatološku analizu tih skupina. Ako se pri kvalitativnom ili kvantitativnom pregledu utvrde bilo kakve neuropatološke promjene povezane s tretiranjem, na temelju vrednovanja svih životinja iz svih skupina koje su primale određenu dozu trebalo bi utvrditi ovisnost pojave o dozi, učestalost i stupanj težine lezija ili morfometričkih promjena. Tim vrednovanjem treba obuhvatiti sve regije mozga kod kojih su uočeni dokazi o neuropatološkim promjenama. Za svaku vrstu lezija treba opisati obilježja koja se upotrebljavaju za utvrđivanje svih stupnjeva težine, navodeći svojstva za razlikovanje svakog stupnja. Treba zabilježiti učestalost pojave svake vrste lezije i njezin stupanj težine te izvršiti statističku analizu kako bi se ocijenila priroda odnosa doza-reakcija. Preporučuje se upotreba kodiranih mikroskopskih preparata (91).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Podaci

46. Podaci bi se trebali dostavljati pojedinačno i sažeti u tablici navođenjem za svaku ispitnu skupinu vrste promjena i broja ženki, potomaka po spolu te legla kod kojih je uočena svaka vrsta promjene. Ako je izvršeno izravno postnatalno izlaganje potomaka, treba zabilježiti način, trajanje i razdoblje izloženosti.

Vrednovanje i tumačenje rezultata

47. Studija razvojne neurotoksičnosti pružit će informacije o učincima višekratnog izlaganja kemikaliji tijekom razvoja in utero i ranog postnatalnog razvoja. Kako je naglasak stavljen i na opću toksičnost i na krajnje točke razvojne neurotoksičnosti, rezultati studije omogućit će razlikovanje neurorazvojnih učinaka koji se javljaju u izostanku opće toksičnosti u majke i onih koji se javljaju samo kod doza koje su toksične i za majku. Zahvaljujući složenom međuodnosu dizajna studije, statističke analize i biološkog značaja podataka odgovarajuće tumačenje podataka o razvojnoj neurotoksičnosti uključivat će stručno mišljenje (107) (109). Pri tumačenju rezultata ispitivanja treba upotrebljavati pristup koji se temelji na važnosti dokaza (20) (92) (93) (94). Treba raspravljati o uzorcima bihevioralnih ili morfoloških nalaza, ako postoje, kao i dokazima u pogledu doze-reakcije. U tu karakterizaciju treba uključiti podatke iz svih studija relevantnih za vrednovanje razvojne neurotoksičnosti, uključujući epidemiološke studije na ljudima ili izvješća o slučajevima te eksperimentalnih studija na životinjama (npr. toksokinetičke podatke, informacije o odnosu strukture i djelovanja, podatke iz drugih studija toksičnosti). To uključuje i odnos između doza ispitivane kemikalije i prisutnosti ili izostanka, pojave i opsega svih neurotoksičnih učinaka kod svakog spola (20) (95).

48. Vrednovanjem podataka treba obuhvatiti i raspravu o biološkoj i statističkoj značajnosti. Statistička analiza trebala bi se smatrati alatom kojim se usmjerava, a ne utvrđuje tumačenje podataka. Izostanak statističke značajnosti ne bi trebao biti jedini razlog za zaključak o izostanku učinka povezanog s tretiranjem, kao što ni statistička značajnost ne bi trebala biti jedino opravdanje za zaključak o učinku povezanom s tretiranjem. Kako bi se spriječili mogući lažno negativni nalazi i inherentne poteškoće pri ‚dokazivanju negativnog nalaza’, trebalo bi razmotriti dostupne pozitivne i povijesne kontrolne podatke, osobito ako nema učinaka povezanih s tretiranjem (102) (106). Vjerojatnost lažno negativnih nalaza trebalo bi razmotriti u smislu ukupnog statističkog vrednovanja podataka (96). Vrednovanje bi trebalo uključivati odnos, ako postoji, između uočenih neuropatoloških i bihevioralnih promjena.

49. Sve bi rezultate trebalo analizirati s pomoću statističkih modela koji odgovaraju planu pokusa (108). Odabir parametrijske ili neparametrijske analize treba obrazložiti uzimajući u obzir čimbenike poput prirode podataka (transformirani ili netransformirani) i njihove distribucije, kao i relativne robusnosti odabrane statističke analize. Odabir statističke analize trebao bi se temeljiti na svrsi i dizajnu studije kako bi se pogreške vrste I. (lažno pozitivni nalazi) i vrste II. (lažno negativni nalazi) svele na najmanju moguću mjeru (96) (97) (104) (105). Statističkim modelom razvojnih studija u kojima se upotrebljavaju vrste koje mogu okotiti više mladunaca u kojima se ispituje više mladunaca iz legla trebala bi biti obuhvaćena legla kako bi se spriječio porast stopa pogrešaka vrste I. (98) (99) (100) (101). Statistička mjerna jedinica trebala bi biti leglo, a ne mladunac. Pokusi bi se trebali provoditi tako da se članovi istog legla ne tretiraju kao neovisna opažanja. Sve krajnje točke koje su višekratno izmjerene kod istog predmeta pokusa trebale bi se analizirati s pomoću statističkih modela kojima se uzima u obzir činjenica da te izmjerene vrijednosti nisu neovisne.

Izvješće o ispitivanju

50. Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:

Ispitivana kemikalija

— fizikalna svojstva, i prema potrebi, fiziokemijska svojstva,

— podaci za identifikaciju, uključujući podrijetlo,

— čistoća pripravka te poznate i/ili očekivane nečistoć.,

Nosač (prema potrebi)

— obrazloženje za odabir nosača, ako nije riječ o vodi ili fiziološkoj otopini.

Pokusne životinje

— upotrijebljena vrsta i soj te obrazloženje ako se ne radi o štakorima,

— dobavljač pokusnih životinja,

— broj, starost na početku ispitivanja i spol životinja,

— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, voda itd.,

— pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja.

Uvjeti ispitivanja

— podloge za odabir visine doze,

— podloge za način doziranja i vremensko razdoblje,

— specifikacije primijenjenih doza, uključujući pojedinosti o nosaču, volumenu i fizičkom obliku primijenjenog materijala,

— pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripravku u hrani, postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti pripravka,

— metoda za jedinstvenu identifikaciju ženki i potomaka,

— detaljan opis postupaka slučajnog odabira za raspodjelu ženki u skupine za tretiranje, za odabir mladunaca za izdvajanje te za raspodjelu mladunaca u ispitne skupine,

— pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,

— način preračunavanja koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće ili inhalatu (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), prema potrebi,

— okolišni uvjeti,

— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (npr. iz slavine, destilirana),

— datum početka i završetka studije.

Opažanja i ispitni postupci

— detaljan opis postupaka upotrijebljenih za standardizaciju opažanja i postupaka, kao i operativne definicije za bodovanje opažanja,

— popis svih upotrijebljenih ispitnih postupaka i obrazloženje za njihovu upotrebu,

— pojedinosti o upotrijebljenim bihevioralnim/funkcionalnim, patološkim, neurokemijskim ili elektrofiziološkim postupcima, uključujući informacije i pojedinosti o automatskim uređajima,

— postupci za kalibriranje i osiguranje istovjetnosti uređaja i ujednačavanje skupina za tretiranje u ispitnim postupcima,

— kratko obrazloženje svih odluka koje uključuju stručno mišljenje.

Rezultati (pojedinačni i sažeti, uključujući srednje vrijednosti i varijance prema potrebi)

— broj životinja na početku i na završetku studije,

— broj životinja i legala upotrijebljenih za svaku ispitnu metodu,

— identifikacijski broj svake životinje i leglo iz kojeg potječe,

— veličina legla i srednja težina pri okotu i po spolu,

— tjelesna masa i podaci o promjeni tjelesne mase, uključujući tjelesnu masu ženki i potomaka kod usmrćenja,

— podaci o unosu hrane te, prema potrebi, o unosu vode (npr. ako se ispitivana kemikalija daje s vodom),

— podaci o toksičnoj reakciji po spolu i visini doze, uključujući znakove toksičnosti ili smrtnost, uključujući vrijeme i uzrok smrti, prema potrebi,

— priroda, težina, trajanje, dan početka, doba dana te naknadni tijek detaljnih kliničkih opažanja,

— bodovanje svake razvojne posebnosti (težina, spolno sazrijevanje i bihevioralna ontogeneza) u svim vremenima opažanja,

— detaljan opis svih bihevioralnih, funkcionalnih, neuropatoloških, neurokemijskih i elektrofizioloških nalaza po spolu, uključujući povećanja i smanjenja u usporedbi s kontrolnim skupinama,

— nalazi nekropsije,

— težina mozga,

— sve dijagnoze postavljene na temelju neuroloških znakova i lezija, uključujući prirodne bolesti ili stanja,

— slike egzemplarnih nalaza,

— mikroskopske slike za procjenu homologije sekcija upotrijebljenih za morfometriju,

— podaci o apsorpciji i metabolizmu, uključujući komplementarne podatke iz zasebne toksokinetičke studije, ako su dostupni,

— statistička analiza rezultata, uključujući statističke modele upotrijebljene za analizu podataka te rezultati neovisno o tome jesu li značajni ili ne,

— popis osoblja koje je sudjelovalo u studiji, uključujući stručno usavršavanje.

Rasprava o rezultatima

— informacije o dozi-reakciji po spolu i skupini,

— utjecaj ostalih toksičnih učinaka na zaključak o neurotoksičnom potencijalu ispitivane kemikalije po spolu i skupini,

— utjecaj toksokinetičkih informacija na zaključke,

— sličnosti učinaka s učincima poznatih neurotoksičnih tvari,

— podaci kojima se potvrđuje pouzdanost i osjetljivost ispitne metode (npr. pozitivni i povijesni kontrolni podaci),

— odnosi, ako postoje, između neuropatoloških i funkcionalnih učinaka,

— vrijednosti kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL) ili referentna doza za ženke i potomke po spolu i skupini.

Zaključci

— rasprava o sveukupnom tumačenju podataka na temelju rezultata, uključujući zaključak o tome je li razvojna neurotoksičnost posljedica ispitivane kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL).

LITERATURA

(1) OECD (1995.). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Danska, od 13. do 14. lipnja 1995.

(2) US EPA (1998.). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupno na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998.). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Dostupno na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79. 91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101. 111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93. 100.

(7) OECD (2003.). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., SAD, od 23. do 25. listopada 2000.

(8) OECD (2008.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Pariz. srpanj 2008. Dostupno na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Pariz, rujan 2003. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990.) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000.) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002.) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188..197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998.) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Poglavlje B.34. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji.

(15) Poglavlje B.35. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksičnosti na dvije generacije.

(16) Poglavlje B.43. ovog Priloga, Studija neurotoksičnosti kod glodavaca.

(17) Poglavlje B.31. ovog Priloga, Studija prenatalne razvojne toksičnosti.

(18) Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. SL L 276, 20.10.2010., str. 33.

(19) WHO (1986.) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupno na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001.) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Dostupno na: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995.) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997.) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499. 509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997.) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2. 6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977.) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989.) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118. 136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979.) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987.) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003.) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005.) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87. 94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999.) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1. 4.

(31) ICH (1993.) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987.) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433. 439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998.) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449. 457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999.) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383. 390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000.) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350. 365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985.) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579. - 586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977.) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298. 303.

(38) Spear, L.P. (1990.) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489. - 95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975.) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896. 920.

(40) Adams, J. (1986.) Methods in Behavioral Teratology. U: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67. 100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979.) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53. 66.

(42) Robbins, T.W. (1977.) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, str. 37. 82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993.) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117. - 129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985.) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247. - 260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991.) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599. 609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997.) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405. 411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998.) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. Physiol. Behav., 64:661. 669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977.) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589. 591.

(49) Davis, M. (1984.) The mammalian startle response. U: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, str. 287. 351.

(50) Koch, M. (1999.) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107. 128.

(51) Crofton, K.M. (1992.) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. U Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, str. 181. 211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989.) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199. 211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994.) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25. – 30.

(54) Ison, J.R. (1984.) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437. – 445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992.) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. U: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. str. 125. 145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990.) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321. 332.

(57) Bammer, G. (1982.) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247. 296.

(58) Bushnell, P.J. (1988.) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237. 244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989.) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98. 105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984.) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465. 479.

(61) Morris, R. (1984.) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47. 60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989.) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29. 69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001.) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60. 90.

(64) Vorhees, C.V. (1987.) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235. 241.

(65) Vorhees, C.V. (1997.) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387. 399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988.) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327. 332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983.) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342. 352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981.) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338. – 341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000.) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122. 131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994.) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, str. 84. 107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002.) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996.) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291. 304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000.) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123. 130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001.) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365. 372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994.) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545. 561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005.a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745. 755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005.b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417. 432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979.) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129. – 135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998.) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998.) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305. 310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993.) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262. 268.

(82) Schmitz, C. (1997.) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707. 710.

(83) West, M.J. (1999.) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51. 61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005.) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813. – 831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994.) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113. 121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995.) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294. 298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998.) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. U: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, str. 3. 41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999.) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70. 74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000.) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056. – 1060.

(90) Friede, R. L. (1989.) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992.) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127. 133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996.) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401. 405.

(93) US EPA (2005.) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996.) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274. 56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995.) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984.). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113. 126.

(97) Gad, S.C. (1989.) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21 27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973.) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329. 335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975.) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165. 172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992.) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221. 228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985.) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587. 90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004.) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345. 352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006.) A ‚best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296. 313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992.) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205. 210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985.) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295. 301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008.) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266. 287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008.) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288. 325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008.) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326. 348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008.) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349. 381.

Slika 1.

Opća shema ispitivanja za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja, neuropatološko vrednovanje i težinu mozga. Ovaj se dijagram temelji na opisu iz stavaka 13–15. (PND = postnatalni dan). Primjeri raspodjele životinja nalaze su u Dodatku 1.

Dodatak 1. 1. Primjeri mogućih raspodjela opisani su i prikazani u tablicama u nastavku. Ti su primjeri navedeni kako bi se pokazalo da se raspodjela životinja koje se upotrebljavaju u studiji različitim ispitnim paradigmama može postići na nekoliko različitih načina. Primjer 1. 2. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 22. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po visini doze. 3. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja nakon odbijanja od sise (detaljna klinička opažanja, motorička aktivnost, reakcija na iznenadnu buku i ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih životinja) te procjenu dobi spolnog sazrijevanja. Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja i obrađuje za neuropatološko vrednovanje. 4. Za ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (npr. 60. do 70. PND) upotrebljava se treća skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po skupini (1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmrćuju se na završetku studije, a mozak se odstranjuje i važe. 5. Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini čuva se za moguća dodatna ispitivanja. Tablica 1. Br. mladunca (8) Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje Pregled/ispitivanje m ž 1 5 20 m + 20 ž Bihevioralna ontogeneza 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 22. PND 10 m + 10 ž Težina mozga na 22. PND 2 6 20 m + 20 ž Detaljna klinička opažanja 20 m + 20 ž Motorička aktivnost 20 m + 20 ž Spolno sazrijevanje 20 m + 20 ž Motorička i osjetilna funkcija 20 m + 20 ž Učenje i pamćenje (25. PND) 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND 3 7 20 m + 20 ž Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje) 10 m + 10 ž Težina mozga u mladih odraslih životinja ~ 70. PND 4 8 — Rezervne životinje kao zamjena ili za dodatna ispitivanja Primjer 2. 6. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 11. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje. 7. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za preglede nakon odbijanja od sise (detaljna klinička opažanja, motorička aktivnost, procjena dobi spolnog sazrijevanja te motorička i osjetilna funkcija). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja, važe i obrađuje za neuropatološko vrednovanje. 8. Za ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih i mladih odraslih životinja upotrebljava se 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Za ispitivanje kognitivne funkcije na 23. postnatalni dan i u mladih odraslih životinja upotrebljavaju se različite životinje. Na završetku studije 10 životinja po spolu i po skupini koje su ispitivane kao odrasle usmrćuju se, a mozak se odstranjuje i važe. 9. Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini koje nisu odabrane za ispitivanje usmrćuju se i izlučuju kod odbijanja od sise. Tablica 2. Br. mladunca (a) Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje Pregled/ispitivanje m ž 1 5 20 m + 20 ž Bihevioralna ontogeneza 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 11. PND 2 6 20 m + 20 ž Detaljna klinička opažanja 20 m + 20 ž Motorička aktivnost 20 m + 20 ž Spolno sazrijevanje 20 m + 20 ž Motorička i osjetilna funkcija 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND 3 7 10 m + 10 ž (9) Učenje i pamćenje (23. PND) 3 7 10 m + 10 ž (10) Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje) Težina mozga u mladih odraslih životinja 4 8 — Životinje koje su usmrćene i izlučene 21. postnatalnog dana. Primjer 3. 10. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za procjenu težine mozga i neuropatologije na 11. PND. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 11. postnatalnog dana, a mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po visini doze. 11. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za bihevioralnu ontogenezu (motorička aktivnost), preglede nakon odbijanja od sise (motorička aktivnost i procjena dobi spolnog sazrijevanja) te ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih životinja. 12. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanja motoričke i osjetilne funkcije (reakcija na iznenadnu buku) i detaljna klinička opažanja. Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ, mozak se uklanja, važe i obrađuje za neuropatološko vrednovanje. 13. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze upotrebljava se za ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po skupini (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmrćuju se na završetku studije, a mozak se odstranjuje i važe. Tablica 3. Br. mladunca (11) Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje Pregled/ispitivanje m ž 1 5 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 11. PND 10 m + 10 ž Težina mozga na 11. PND 2 6 20 m + 20 ž Bihevioralna ontogeneza (motorička aktivnost) 20 m + 20 ž Motorička aktivnost 20 m + 20 ž Spolno sazrijevanje 20 m + 20 ž Učenje i pamćenje (27. PND) 3 7 20 m + 20 ž Reakcija na buku (adolescentne i mlade odrasle životinje) 20 m + 20 ž Detaljna klinička opažanja 10 m + 10 ž Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND 4 8 20 m + 20 ž Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje) 10 m + 10 ž Težina mozga u mladih odraslih životinja

Dodatak 2. Definicije Kemikalija: Tvar ili smjesa Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom

B.54. UTEROTROPNI BIOTEST KOD GLODAVACA: KRATKOROČNI TEST PROBIRA NA ESTROGENSKA SVOJSTVA

UVOD

1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 440 (2007.). OECD je 1998. godine pokrenuo aktivnost visokog prioriteta revizije postojećih i razvoja novih smjernica za probir i ispitivanje potencijalnih endokrinih disruptora (1). Jedan je element aktivnosti bio razvoj smjernice za ispitivanje za uterotropni biotest u glodavaca. Uterotropni biotest u glodavaca tada je podvrgnut opsežnom programu validacije, uključujući sastavljanje detaljnog popratnog dokumenta (2) (3) te provođenje opsežnih studija unutar laboratorija i među njima, kako bi se pokazala važnost i obnovljivost biotesta s potentnim referentnim estrogenom, slabim agonistima receptora estrogena, jakim antagonistom receptora estrogena i negativnom referentnom kemikalijom (4) (5) (6) (7) (8) (9). Ova je ispitna metoda B.54. rezultat iskustva stečenog tijekom programa validacije ispitivanja i njegovih rezultata za estrogenske agoniste.

2. Uterotropni biotest kratkoročni je test probira nastao u 1930-ima (27) (28) te ga je stručni odbor prvi put standardizirao za probir 1962. (32) (35). On se temelji na povećanju mase maternice ili uterotropnoj reakciji (za recenziju vidjeti 29.). Njime se vrednuje sposobnost kemikalije da potakne biološke aktivnosti konzistentne agonistima i antagonistima prirodnih estrogena (npr. 17ß-estradiol). Međutim, njegova upotreba za utvrđivanje antagonista manje je uobičajena nego za utvrđivanje agonista. Maternica reagira na estrogene na dva načina. Početna je reakcija povećanje mase zbog zadržavanja vode. Ta je reakcija praćena porastom mase zbog rasta tkiva (30). Reakcije maternice u štakora i miševa kvalitativno su usporedive.

3. Ovaj biotest služi kao test probira in vivo, a njegova bi se primjena trebala promatrati u kontekstu ‚OECD-ovog konceptualnog okvira za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija’ (Dodatak 2.). U tom se konceptualnom okviru uterotropni biotest nalazi na 3. razini kao test in vivo koji pruža podatke o jedinstvenom endokrinom mehanizmu, odnosno estrogenizaciji.

4. Planira se uključivanje uterotropnog biotesta u bateriju testova in vitro i in vivo radi identifikacije kemikalija s potencijalom za interakciju s endokrinim sustavom, što na kraju dovodi do procjena rizika po ljudsko zdravlje i okoliš. U programu validacije OECD-a upotrebljavali su se jaki i slabi agonisti estrogena radi vrednovanja učinka testa pri identifikaciji estrogenskih kemikalija (4) (5) (6) (7) (8). Na taj je način, uz dobru obnovljivost unutar jednog laboratorija i između više njih, dobro predstavljena osjetljivost ispitnog postupka za agoniste estrogena.

5. Kad je riječ o negativnim spojevima, samo je jedna ‚negativna’ referentna kemikalija, za koju su uterotropni test, kao i vezivanje receptora in vitro i testovi receptora, pokazali negativnu vrijednost, obuhvaćena programom validacije, ali su ocijenjeni dodatni podaci o ispitivanju koji nisu povezani s programom validacije OECD-a, čime je dodatno potkrijepljena specifičnost uterotropnog biotesta za probir agonista estrogena (16).

POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA

6. Agonisti i antagonisti estrogena djeluju kao ligandi za receptore estrogena α i β te mogu aktivirati odnosno inhibirati transkripcijsko djelovanje receptora. To može dovesti do opasnosti po zdravlje, uključujući reproduktivne i razvojne učinke. Stoga postoji potreba za brzom procjenom i vrednovanjem kemikalije kao mogućeg agonista ili antagonista estrogena. Iako informativan, afinitet liganda za receptor estrogena ili transkripcijsku aktivaciju gena izvjestitelja in vitro samo je jedna od nekoliko odrednica moguće opasnosti. Ostale odrednice mogu uključivati metaboličku aktivaciju i deaktivaciju pri ulasku u tijelo, distribuciju u ciljna tkiva i uklanjanje iz tijela, barem djelomično ovisno o načinu primjene i kemikaliji koja se ispituje. To dovodi do potrebe za probirom mogućeg djelovanja kemikalije in vivo u odgovarajućim uvjetima, osim ako se odgovarajuće informacije već nalaze u karakteristikama kemikalije u pogledu apsorpcije – distribucije – metabolizma – eliminacije (ADME). Tkiva maternice na stimulaciju estrogenima odgovaraju brzim i snažnim rastom, posebno u laboratorijskih glodavaca u kojih ciklus estrusa traje približno 4 dana. Vrste glodavaca, osobito štakori, u širokoj su upotrebi i u studijama toksičnosti za karakterizaciju opasnosti. Zato je maternica glodavaca odgovarajući ciljni organ za probir in vivo agonista i antagonista estrogena.

7. Ova se metoda temelji na onim protokolima iz OECD-ove validacijske studije za koje je dokazano da su pouzdani i ponovljivi u studijama unutar laboratorija i između njih (5)(7). Trenutačno postoje dvije metode, odnosno metoda na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici te metoda na nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici. OECD-ovim programom validacije ispitivanja dokazano je da obje metode imaju usporedivu osjetljivost i obnovljivost. Međutim, metoda na nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici, s obzirom na to da imaju netaknutu os hipotalamus-hipofiza-gonade (HPG), nešto je manje specifična, ali je njome obuhvaćen veći raspon ispitivanja u usporedbi s metodom na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici, zato što može reagirati na kemikalije koje djeluju na os HPG, a ne samo na receptor estrogena. Os HPG u štakora funkcionalna je na približno 15. dan starosti. Prije toga pubertet se ne može ubrzati tretmanima poput GnRH. Početkom ulaska u pubertet, prije otvaranja vagine, ženka će imati nekoliko tihih ciklusa čije posljedice neće biti otvaranje vagine ili ovulacija, ali će postojati hormonalne fluktuacije. Ako se kemikalijom izravno ili neizravno stimulira os HPG, posljedice će biti preuranjeni pubertet, rana ovulacija i ubrzano otvaranje vagine. Osim kemikalija koje djeluju na os HPG, stimulacija rasta i ubrzanje otvaranja vagine posljedice su nekih vrsta prehrane s višim razinama metabolizirajuće energije, bez estrogenskih obilježja. Takve kemikalije ne bi izazvale uterotropnu reakciju u odraslih životinja kojima su odstranjeni jajnici jer njihova os HPG ne funkcionira.

8. Radi dobrobiti životinja prednost bi trebalo dati metodi u kojoj se upotrebljavaju nezreli štakori, uključujući kiruršku pripremu životinja i izbjegavanje mogućeg neupotrebljavanja onih životinja koje pokazuju znakove ulaska u ciklus estrusa (vidjeti stavak 30.).

9. Uterotropna reakcija nije posve estrogenskog podrijetla, odnosno kemikalije koje nisu agonisti ili antagonisti estrogena isto tako mogu uzrokovati reakciju. Primjerice, razmjerno visoke doze progesterona, testosterona ili različitih sintetičkih progestina mogu dovesti do stimulativne reakcije (30). Sve reakcije mogu se histološki analizirati u pogledu keratinizacije i kornifikacije vagine (30). Neovisno o mogućem podrijetlu reakcije, radnje radi daljnjeg pojašnjenja obično bi se trebale pokrenuti zbog pozitivnog ishoda uterotropnog biotesta. Dodatni dokazi estrogenizacije mogli bi se pronaći u testovima in vitro, poput testova vezivanja ER-a i testova transkripcijske aktivacije, ili u drugim testovima in vivo poput testa ženskog puberteta.

10. Uzimajući u obzir da se uterotropni biotest upotrebljava kao test probira in vivo, primijenjeni validacijski pristup bio je u funkciji dobrobiti životinja i stupnjevane strategije ispitivanja. U tu su svrhu napori bili usmjereni na strogu validaciju obnovljivosti i osjetljivosti za estrogenizaciju – glavni problem za brojne kemikalije, dok su skromni napori bili usmjereni na antiestrogenizacijsku sastavnicu testa. Ispitivan je samo jedan antiestrogen s jakim djelovanjem s obzirom na to da je broj kemikalija s jasnim antiestrogenskim profilom (koji ne ometa određeno estrogensko djelovanje) vrlo ograničen. Zato je ta ispitna metoda ograničena na estrogenski protokol, dok je protokol kojim se opisuje antagonistički način testa obuhvaćen Smjernicom (37). Obnovljivost i osjetljivost testa za kemikalije s isključivo antiestrogenskim djelovanjem bolje će se definirati kasnije, nakon što ispitni postupak bude u rutinskoj upotrebi neko vrijeme te nakon identifikacije više kemikalija ovim načinom djelovanja.

11. Potvrđuje se da će svi postupci koji se temelje na životinjama biti u skladu s lokalnim standardima brige za životinje; opisi brige i postupanja utvrđeni u nastavku minimalni su standardi učinka te će biti zamijenjeni lokalnim propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja, koje se koriste u znanstvene svrhe (38). OECD daje daljnje smjernice za humano postupanje sa životinjama (25).

12. Kao i u svim testovima u kojima se upotrebljavaju žive životinje, prije početka testa ključno je osigurati da podaci doista budu nužni. Primjerice, u dvama uvjetima podaci mogu biti nužni:

— visok potencijal izloženosti (1. razina konceptualnog okvira, Dodatak 2.) ili indikacije za estrogenizaciju (2. razina), za ispitivanje mogu li takvi učinci nastati in vivo,

— učinci kojima se ukazuje na estrogenizaciju na 4. ili 5. razini testova in vivo radi dokazivanja da su učinci bili povezani s estrogenskim mehanizmom koji je nemoguće razjasniti pomoću testa in vivo.

13. Definicije upotrijebljene u ovoj ispitnoj metodi navedene su u Dodatku 1.

NAČELO ISPITIVANJA

14. Osjetljivost uterotropnog biotesta oslanja se na sustav ispitivanja životinja u kojem os hipotalamus-hipofiza-jajnici nije funkcionalna, što dovodi do niskih endogenskih razina cirkulacije estrogena. Na taj će se način osigurati mala osnovna masa maternice i najveći raspon reakcije na primijenjene estrogene. Dva stanja osjetljivosti na estrogen u ženki glodavaca ispunjavaju ovaj uvjet:

i. nezrele ženke nakon odbijanja od sise i prije puberteta; te

ii. mlade odrasle ženke nakon odstranjivanja jajnika uz dovoljno vremena za vraćanje tkiva maternice.

15. Ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno oralnom sondom ili potkožnom injekcijom. Graduirane doze ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje dvije skupine pokusnih životinja za tretiranje (za smjernice vidjeti stavak 33.), upotrebom jedne visine doze po skupini u razdoblju primjene od tri uzastopna dana za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici, odnosno razdoblju primjene od najmanje tri uzastopna dana za metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. Životinje se podvrgavaju nekropsiji približno 24 sata nakon posljednje doze. Za agoniste estrogena procjenjuje se srednja masa maternice tretiranih skupina životinja u odnosu na skupinu na kojoj se primjenjuje nosač radi statistički znatnog povećanja. Statistički znatno povećanje srednje mase maternice u ispitnoj skupini ukazuje na pozitivnu reakciju u ovom biotestu.

OPIS METODE

Odabir životinjskih vrsta

16. Mogu se upotrebljavati glodavci koji se obično upotrebljavaju u laboratorijima. Primjerice, sojevi štakora Sprague Dawley i Wistar upotrebljavani su tijekom validacije. Ne bi se trebali upotrebljavati sojevi za koje se zna ili pretpostavlja da imaju manje osjetljive maternice. Laboratorij bi trebao pokazati osjetljivost upotrebom soja prema opisu iz stavaka 26. i 27.

17. Štakor i miš rutinski se upotrebljavaju za uterotropni biotest od 1930-ih. OECD-ove validacijske studije provodile su se samo na štakorima, na temelju shvaćanja da se očekuje da su obje vrste istovjetne te bi zato jedna vrsta trebala biti dovoljna za validaciju širom svijeta kako bi se sačuvali resursi i životinje. Štakor je odabrana vrsta u većini studija reproduktivne i razvojne toksičnosti. Uzimajući u obzir postojanje velike historijske baze podataka za miševe, ograničena validacijska studija praćenja provedena je na miševima (16) kako bi se proširio raspon ispitne metode uterotropnog biotesta u glodavaca na upotrebu miševa kao ispitne vrste. U skladu s izvornom namjerom očuvanja resursa i životinja odabran je povezujući pristup s ograničenim brojem ispitivanih kemikalija, sudjelujućih laboratorija i bez kodiranog ispitivanja uzoraka. Tom povezujućom validacijskom studijom utvrđeno je da se, kad je riječ o uterotropnom biotestu na mladim odraslim miševima kojima su odstranjeni jajnici, podaci dobiveni za štakore i miševe u velikoj mjeri podudaraju. U slučajevima kad rezultati uterotropnog biotesta mogu prethoditi dugotrajnoj studiji, u obje se studije mogu upotrebljavati životinje istog soja i istog podrijetla. Povezujući pristup bio je ograničen na odrasle miševe kojima su odstranjeni jajnici pa izvješće ne pruža pouzdan skup podataka za validaciju modela nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici, zbog čega se taj model u miševa ne razmatra u okviru postojeće ispitne metode.

18. Zato se u nekim slučajevima mogu upotrebljavati miševi umjesto štakora. Za tu bi vrstu trebalo navesti obrazloženje na temelju toksikoloških, farmakokinetičkih i/ili drugih kriterija. Za miševe bi mogle biti potrebne izmjene protokola. Primjerice, unos hrane u miševa na temelju tjelesne mase veći je nego u štakora te bi zato udjel fitoestrogena u hrani trebao biti niži u miševa nego u štakora (9) (20) (22).

Uvjeti smještaja i hranjenja

19. Svi bi postupci trebali biti u skladu s lokalnim standardima brige o laboratorijskim životinjama. Ti opisi brige i postupanja minimalni su standardi i zamijenit će se lokalnim propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (38). Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi biti 22 °C (uz približan raspon od ± 3 °C). Relativna vlažnost trebala bi biti barem 30 %, a poželjno je da ne prelazi najviših 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Ciljna relativna vlažnost trebala bi biti od 50–60 %. Svjetlo bi trebalo biti umjetno. Dnevni redoslijed svjetla trebao bi biti 12 sati svjetla, 12 sati tame.

20. Laboratorijsku prehranu i vodu za piće trebalo bi osigurati ad libitum. Mlade odrasle životinje mogu se smjestiti pojedinačno ili u kaveze u skupinama do tri životinje. Zbog mladosti nezrelih životinja preporučuje se smještaj prema socijalnoj skupini.

21. Poznato je da visoke razine fitoestrogena u laboratorijskoj prehrani povećavaju masu maternice u glodavaca do stupnja koji je dostatan za ometanje uterotropnog biotesta (13) (14) (15). Visoke razine fitoestrogena i metabolizirajuće energije u laboratorijskoj prehrani mogu uzrokovati i preuranjeni pubertet ako se upotrebljavaju nezrele životinje. Prisutnost fitoestrogena ponajprije je posljedica uključivanja soje i alfalfa proizvoda u laboratorijsku prehranu, a dokazano je da koncentracije fitoestrogena variraju od serije do serije standardne laboratorijske prehrane (23). Tjelesna masa važna je varijabla s obzirom na to da je količina konzumirane hrane povezana s tjelesnom masom. Zato stvarne doze fitoestrogena koje se konzumiraju prema istoj prehrani mogu varirati između vrsta i prema dobi (9). U nezrelih ženki štakora unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno dvostruko veći od unosa mladih odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. U mladih odraslih miševa unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno četverostruko veći od unosa mladih odraslih ženki štakora kojima su odstranjeni jajnici.

22. Međutim, rezultati uterotropnog testa (9) (17) (18) (19) ukazuju na to da su ograničene količine prehrambenih fitoestrogena prihvatljive te da se njima ne umanjuje osjetljivost biotesta. Primjerice, prehrambene razine fitoestrogena ne bi trebale premašiti 350 μg ekvivalenata genisteina po gramu laboratorijske prehrane u nezrelih ženki štakora sojeva Sprague Dawley i Wistar (6) (9). Takva bi se prehrana trebala primijeniti i pri ispitivanju mladih odraslih štakora kojima su odstranjeni jajnici jer je unos hrane na temelju tjelesne mase manji u mlade odrasle životinje nego u nezrelih životinja. Ako treba upotrebljavati miševe kojima su odstranjeni jajnici ili štakore koji su osjetljiviji na fitoestrogen, potrebno je razmotriti razmjerno smanjenje razina prehrambenog fitoestrogena (20). Osim toga, razlike u raspoloživoj metaboličkoj energiji iz različitih vrsta prehrane mogu dovesti do vremenskih pomaka za početak puberteta (21) (22).

23. Prije studije potreban je pažljiv odabir prehrane bez povišene razine fitoestrogena (za primjer vidjeti (6) (9)) ili metabolizirajuće energije, koji mogu poremetiti rezultate (15) (17) (19) (22) (36). Važna je provjera oba navedena čimbenika osiguranje pravilnog funkcioniranja ispitnog sustava koji laboratorij upotrebljava kako je predviđeno stavcima 26. i 27. Kao zaštitu u skladu s dobrom laboratorijskom praksom potrebno je provesti reprezentativno uzorkovanje svake serije prehrane koja se primjenjuje tijekom studije radi moguće analize udjela fitoestrogena (npr. u slučaju velike kontrolne mase maternice u odnosu na historijske kontrole ili neodgovarajuće reakcije na referentni estrogen, 17 alfa-etinilestradiol). Alikvote treba analizirati kao dio studije ili zamrznuti na – 20 °C, odnosno tako da se spriječi propadanje uzorka prije analize.

24. Neke vrste stelje mogu sadržavati prirodne estrogenske ili antiestrogenske kemikalije (npr. poznato je da klip kukuruza utječe na ciklus štakora pa se čini da je antiestrogenski). Odabrana stelja trebala bi sadržavati minimalnu razinu fitoestrogena.

Priprema životinja

25. Pokusne životinje bez utvrđenih bolesti ili fizičkih abnormalnosti nasumično se raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Kaveze treba urediti tako da se eventualni učinci držanja u kavezu svedu na minimum. Životinje treba označiti jedinstvenim oznakama. Poželjno je nezrele životinje smjestiti u kaveze sa ženkama ili zamjenskim ženkama do odbijanja od sise tijekom aklimatizacije. Razdoblje aklimatizacije prije početka studije trebalo bi trajati približno 5 dana za mlade odrasle životinje te za nezrele životinje isporučene sa ženkama ili zamjenskim ženkama. Ako se nezrele životinje nabavljaju kao životinje upravo odbijene od sise bez ženki, kraće razdoblje aklimatizacije može biti potrebno jer bi doziranje trebalo započeti neposredno nakon odbijanja od sise (vidjeti stavak 29.).

POSTUPAK

Provjera osposobljenosti laboratorija

26. Za provjeru osposobljenosti laboratorija mogu se upotrebljavati dvije različite mogućnosti:

— periodična provjera koja se temelji na početnoj studiji osnovne pozitivne kontrole (vidjeti stavak 27.). Najmanje svakih 6 mjeseci i u slučaju svake promjene koja može utjecati na provođenje testa (npr. nova formulacija prehrane, promjena osoblja koje obavlja disekcije, promjene soja životinja ili dobavljača itd.) treba provjeriti reakciju ispitnog sustava (životinjski model) pomoću odgovarajuće doze (na temelju studije osnovne pozitivne kontrole iz stavka 27.) referentnog estrogena 17α-etinilestradiola (CAS br. 57-63-6) (EE),

— upotreba usporednih kontrola uključivanjem u svaki test skupine kojoj se daje odgovarajuća doza referentnog estrogena.

Ako sustav ne reagira prema očekivanjima, eksperimentalne uvjete treba ispitati i izmijeniti prema potrebi. Preporučuje se da doza referentnog estrogena koju treba upotrijebiti u bilo kojem pristupu bude približno ED70 do 80.

27. Studija osnovne pozitivne kontrole – prije nego što laboratorij prvi put provodi studiju na temelju ove ispitne metode, potrebno je dokazati njegovu osposobljenost ispitivanjem reakcije životinjskog modela utvrđivanjem doze reakcije referentnog estrogena 17α-etinilestradiola (CAS br. 57-63-6) (EE) pomoću najmanje četiri doze. Reakcija mase maternice usporedit će se s utvrđenim povijesnim podacima (vidjeti referencu (5)). Ako se pomoću studije osnovne pozitivne kontrole ne dobiju očekivani rezultati, potrebno je ispitati i izmijeniti eksperimentalne uvjete.

Broj i stanje životinja

28. Sve skupine za tretiranje i kontrolne skupine trebale bi se sastojati od najmanje šest životinja (u protokolu za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici i metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici).

Dob nezrelih životinja

29. U uterotropnim testovima na nezrelim životinjama potrebno je odrediti dan okota. S doziranjem treba započeti dovoljno rano kako bi se osiguralo da po završetku primjene kemikalije još nije došlo do fiziološkog povećanja endogenih estrogena povezanih s pubertetom. S druge strane, postoje dokazi da vrlo mlade životinje mogu biti manje osjetljive. U definiranju optimalne dobi svaki bi laboratorij trebao uzeti u obzir vlastite podatke o sazrijevanju.

Opće je pravilo da se s doziranjem u štakora može započeti neposredno nakon ranog odbijanja od sise na 18. postnatalni dan (pri čemu je dan okota nulti postnatalni dan). Doziranje u štakora treba okončati na 21. postnatalni dan, a svakako prije 25. postnatalnog dana zato što nakon te dobi os hipotalamus-hipofiza-jajnici postaje funkcionalna, a razine endogenih estrogena mogu početi rasti uz istodobno povećanje osnovne srednje mase maternice te standardnih devijacija skupine (2) (3) (10) (11) (12).

Postupak odstranjivanja jajnika

30. U ženki štakora i miševa kojima su odstranjeni jajnici (skupine za tretiranje i kontrolne skupine) odstranjivanje jajnika trebalo bi obaviti između šestog i osmog tjedna života. Štakorima je potrebno najmanje 14 dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene kako bi se maternica vratila na minimalnu, stabilnu osnovu. Miševima je potrebno najmanje sedam dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene. S obzirom na to da su male količine tkiva jajnika dovoljne za proizvodnju znatnih cirkulirajućih razina estrogena (3), životinje bi trebalo ispitati prije upotrebe promatranjem vaginalnih stanica epitela najmanje pet uzastopnih dana (npr. od 10. do 14. dana od odstranjivanja jajnika u štakora). Ako se kod njih uoče bilo kakvi dokazi ulaska u ciklus estrusa, životinje ne bi trebalo upotrebljavati. Osim toga, pri nekropsiji treba pregledati ostatke jajnika radi dokaza o prisutnosti tkiva jajnika. U tom slučaju životinju ne bi trebalo upotrebljavati u izračunima (3).

31. Postupak odstranjivanja jajnika započinje kad je životinja u ventralnom položaju nakon što je odgovarajuće anestezirana. Rez kojim se otvara dorsolateralni trbušni zid trebao bi se nalaziti približno 1 cm uzdužno od središnje točke između kostalnog ruba rebara i zdjelične kosti te nekoliko milimetara lateralno od lateralnog ruba lumbalnog mišića. Jajnik treba odstraniti iz trbušne šupljine na aseptičnu podlogu. Jajnik treba odvojiti na spoju jajovoda i tijela maternice. Nakon potvrde da nema opsežnog krvarenja, trbušni zid treba zatvoriti šavom, a kožu kopčama ili odgovarajućim šavom. Točke podvezivanja shematski su prikazane na slici 1. Potrebno je upotrebljavati odgovarajuće postoperativne analgetike prema preporuci veterinara s iskustvom u njezi glodavaca.

Tjelesna masa

32. U metodi odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici, tjelesna masa i masa maternice nisu povezane zato što na masu maternice utječu hormoni poput estrogena, a ne čimbenici rasta kojima se regulira tjelesna masa. Međutim, tjelesna masa povezana je s masom maternice tijekom sazrijevanja kod modela nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici (34). Zato na početku studije variranje tjelesne mase životinja koje se upotrebljavaju u modelu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici treba biti što manje i ne bi trebalo premašiti ± 20 % srednje vrijednosti mase. To znači da bi uzgajivač trebao standardizirati veličinu legla kako bi osigurao da će se potomci različitih životinja majki približno jednako hraniti. Životinje bi trebalo rasporediti u skupine (kontrolne skupine i skupine za tretman) prema slučajnoj distribuciji mase, tako da se srednja tjelesna masa svake skupine statistički ne razlikuje od ostalih skupina. Trebalo bi po mogućnosti izbjegavati raspodjelu članova istog legla u istu skupinu za tretiranje bez povećavanja broja leglā koje treba upotrebljavati za ispitivanje.

Doziranje

33. Kako bi se utvrdilo može li ispitna kemikalija imati estrogensko djelovanje in vivo, obično su dovoljne dvije skupine kojima se daje određena doza pa