HR Službeni list Europske unije 3

31979L1067



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 13.11.1979.

PRVA DIREKTIVA KOMISIJE

od 13. studenoga 1979.

o utvrđivanju metoda Zajednice za analizu i ispitivanje nekih vrsta djelomično ili potpuno dehidriranog konzerviranog mlijeka za prehranu ljudi

(79/1067/EEZ)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske ekonomske zajednice,

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 76/118/EEZ od 18. prosinca 1975. o usklađivanju zakonodavstava država članica koji se odnose na neke vrste djelomično ili potpuno dehidriranog konzerviranog mlijeka za prehranu ljudi (1), a posebno njezin članak 11.,

budući da se u skladu s člankom 11. Direktive 76/118/EEZ sastav nekih vrsta djelomično ili potpuno dehidriranog mlijeka mora provjeriti analitičkim metodama Zajednice;

budući da je poželjno da se usvoji početna serija metoda u vezi kojih su već završena istraživanja;

budući da su mjere predviđene ovom Direktivom u skladu s mišljenjem Stalnog Odbora za prehrambene proizvode,

DONIJELA JE OVU DIREKTIVU:

Članak 1.

Države članice poduzimaju sve potrebne mjere kojima će osigurati da se analize neophodne za provjeru kriterija utvrđenih Prilogom I. obavljaju u skladu s metodama opisanim u Prilogu II.

Članak 2.

U slučajevima kad se navode alternativne metode za jednokratno utvrđivanje, uzorak se može analizirati bilo kojom od tih metoda. U izvještaju o ispitivanju koji se spominje u Prilogu II. mora se navesti metoda koja je bila upotrijebljena.

Članak 3.

„Države članice donose zakone i druge propise potrebne za usklađivanje s ovom Direktivom u roku od 18 mjeseci od njezina priopćenja. One o tome odmah obavješćuju Komisiju.”

Članak 4.

Ova je Direktiva upućena državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 13. studenoga 1979. Za Komisiju Étienne DAVIGNON Član Komisije

(1) SL L 24, 30.1.1976., str. 49.

PRILOG I.

PODRUČJE PRIMJENE PRVE DIREKTIVE ZAJEDNICE O METODAMA ANALIZE NEKIH VRSTA DJELOMIČNO ILI POTPUNO DEHIDRIRANOG KONZERVIRANOG MLIJEKA

I. Opće odredbe

II. Određivanje sadržaja suhe tvari u:

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku s visokim sadržajem masti (primjenom metode 1., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom obranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku (primjenom metode 1., Prilog II.).

III. Određivanje sadržaja vlage u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti (primjenom metode 2., Prilog II.),

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu (primjenom metode 2., Prilog II.),

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 2., Prilog II.),

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 2., Prilog II.).

IV. Određivanje sadržaja masti u:

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku s visokim sadržajem masti (primjenom metode 3., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— nezaslađenom kondenziranom obranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku (primjenom metode 3., Prilog II.),

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti (primjenom metode 4., Prilog II.),

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu (primjenom metode 4., Prilog II.),

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 4., Prilog II.),

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 4., Prilog II.).

V. Određivanje sadržaja saharoze u:

— zaslađenom kondenziranom mlijeku (primjenom metode 5., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku (primjenom metode 5., Prilog II.),

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku (primjenom metode 5., Prilog II.).

VI. Određivanje sadržaja mliječne kiseline i laktata u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti (primjenom metode 6., Prilog II.),

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu (primjenom metode 6., Prilog II.),

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 6., Prilog II.),

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 6., Prilog II.).

VII. Utvrđivanje aktivnosti fosfataze u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti (primjenom metode 7. ili 8., Prilog II.),

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu (primjenom metode 7. ili 8., Prilog II.),

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 7. ili 8., Prilog II.),

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu (primjenom metode 7. ili 8., Prilog II.).

PRILOG II.

METODE ANALIZE KOJE SE ODNOSE NA SASTAV NEKIH DJELOMIČNO ILI POTPUNO DEHIDRIRANIH KONZERVIRANIH MLIJEČNIH PROIZVODA NAMIJENJENIH ZA PREHRANU LJUDI

OPĆE ODREDBE

1. PRIPREMA UZORKA ZA KEMIJSKU ANALIZU

Nezaslađeno kondenzirano mlijeko s visokim sadržajem masti

Nezaslađeno kondenzirano mlijeko

Nezaslađeno kondenzirano djelomično obrano mlijeko

Nezaslađeno kondenzirano obrano mlijeko

Protresite i preokrenite zatvorenu limenku. Otvorite limenku i polako izlijte mlijeko u drugu posudu koja se može hermetički zatvoriti, miješajući ga ponovljenim pretakanjem. Pazite da sva preostala mast i mlijeko koji prianjaju uz stijenke i rubove limenke budu umiješani u uzorak. Zatvorite posudu. Ako sadržaj nije homogen, zagrijte u vodenoj kupelji na 40 °C. Svakih 15 minuta snažno protresite. Nakon dva sata izvadite posudu iz vodene kupelji i ostavite je da se ohladi na sobnu temperaturu. Skinite poklopac i sadržaj posude dobro promiješajte žlicom ili špatulom (ako je došlo do izdvajanja masti, uzorak se ne bi smio testirati). Čuvajte na hladnom mjestu.

Zaslađeno kondenzirano mlijeko

Zaslađeno kondenzirano djelomično obrano mlijeko

Zaslađeno kondenzirano obrano mlijeko

Limenke: Zagrijavajte zatvorenu limenku u vodenoj kupelji na 30 do 40 °C oko 30 minuta. Otvorite limenku i sadržaj posude dobro promiješajte špatulom ili žlicom čineći pokrete prema gore, prema dolje i kružno, kako biste temeljito izmiješali gornje i donje slojeve sa svim sadržajem. Pazite da sva preostala mast i mlijeko koje prianjaju na stijenke i rubove limenke budu umiješani u uzorak. Sadržaj prelijte, koliko je moguće do kraja, u drugu posudu koja ima hermetični poklopac. Zatvorite posudu i čuvajte na hladnom mjestu.

Tube: Odrežite kraj i izlijte sadržaj u posudu s hermetičnim poklopcem. Zatim tubu razrežite uzdužno. Sastružite sav materijal koji prianja na unutrašnju stijenku i pažljivo promiješajte s ostatkom sadržaja. Posudu čuvajte na hladnom mjestu.

Osušeno mlijeko s visokim sadržajem masti ili mlijeko u prahu s visokim sadržajem masti

Osušeno punomasno mlijeko ili punomasno mlijeko u prahu

Osušeno djelomično obrano mlijeko ili djelomično obrano mlijeko u prahu

Osušeno obrano mlijeko ili obrano mlijeko u prahu

Prebacite mlijeko u prahu u čistu, suhu posudu (s hermetičnim poklopcem) dva puta većeg kapaciteta od zapremine praha. Posudu odmah zatvorite i mlijeko u prahu dobro promiješajte višekratnim protresanjem i obrtanjem posude. Tijekom pripremanja uzorka koliko god je to moguće treba izbjegavati izlaganje mlijeka u prahu atmosferi da bi se apsorpcija vlage svela na minimum.

2. REAGENSI

2.1. Voda

2.1.1. Gdje god se spominje voda za otapanje, razrjeđivanje ili pranje, mora se upotrebljavati destilirana voda ili demineralizirana voda barem jednake čistoće.

2.1.2. Gdje god se navodi „rastvor”, „otopina” ili „razrjeđenje” bez daljnjeg pojašnjenja, misli se na „vodeni rastvor”, „vodenu otopinu” i „vodeno razrjeđenje”.

2.2. Kemikalije

Sve kemikalije koje se upotrebljavaju moraju imati priznatu kvalitetu analitičkih reagensa, osim u slučajevima kada se navede drukčije.

3. OPREMA

3.1. Popis opreme

Popisi opreme sadrže samo predmete za posebnu namjenu i predmete s posebnom specifikacijom.

3.2. Analitička vaga

Analitička vaga znači vaga koja može vagati s točnošću od najmanje 0,1 mg.

4. ISKAZIVANJE REZULTATA

4.1. Izračunavanje postotaka

Osim u slučajevima kada se navede drukčije, rezultati se trebaju izračunavati kao maseni postotak uzorka koji je primio laboratorij.

4.2. Broj signifikantnih znamenki

Rezultat ne smije sadržavati više signifikantnih znamenki nego što opravdava preciznost metode analize koja se primjenjuje.

5. IZVJEŠTAJ O ISPITIVANJU

U izvještaju o ispitivanju treba se navesti primijenjena metoda analize kao i dobiveni rezultati. Osim toga, u njemu treba navesti sve pojedinosti o postupku koje nisu navedene u metodi analize ili su neobvezne, kao i sve okolnosti koje su mogle utjecati na dobivene rezultate.

Izvještaj o ispitivanju treba dati sve potrebne informacije za potpunu identifikaciju uzorka.

METODA 1.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA SUHE TVARI

(sušionik, 99 °C)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje sadržaj suhe tvari u:

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku s visokim sadržajem masti,

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku,

— nezaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku,

— nezaslađenom kondenziranom obranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku.

2. DEFINICIJA

Sadržaj masti u kondenziranom mlijeku: sadržaj masti određen navedenom metodom.

3. PRINCIP

Poznata količina uzorka se razrijedi s vodom, pomiješa s pijeskom i osuši na temperaturi od 99 °C ± 1 °C. Masa nakon sušenja je masa suhe tvari i računa se kao maseni postotak uzorka.

4. REAGENSI

Kvarcni ili morski pijesak, obrađen klorovodičnom kiselinom (veličina zrnaca: 0,18 do 0,5 mm, koji prolaze kroz sito od 500 mikrona i zadržavaju se na situ od 180 mikrona). On treba zadovoljiti sljedeći kontrolni test:

zagrijavajte oko 25 g pijeska dva sata u sušioniku (5.3) kako je opisano u točkama 6.1. do 6.3. Dodajte 5 ml vode, ponovo zagrijavajte u sušioniku dva sata, ohladite i ponovo izvažite. Razlika između dviju izmjerenih masa ne smije biti veća od 0,5 mg.

Po potrebi stavite pijesak u 25 %-tnu otopinu klorovodične kiseline i ostavite ga u njoj tri dana uz povremeno miješanje. Ispirite vodom dok ne nestane kiselinska reakcija ili dok iz vode kojom se pijesak ispire ne nestane klorid. Osušite na 160 °C i ponovite gore opisani test.

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Metalno posuđe, najbolje od nikla, aluminija ili nehrđajućeg čelika. Posude moraju imati poklopce koji dobro prianjaju, ali se lako skidaju. Odgovarajuće dimenzije su: promjer 60 do 80 mm i dubina oko 25 mm.

5.3. Sušionik za sušenje pod atmosferskim tlakom, s dobrim prozračivanjem i termostatskom regulacijom, s temperaturom podešenom na 99 °C ± 1 °C. Temperatura treba biti ujednačena u cijelom sušioniku.

5.4. Eksikator, koji sadrži svježe aktiviran silika-gel s indikatorom sadržaja vode ili ekvivalentni desikant.

5.5. Stakleni štapići spljošteni na jednom kraju, takve duljine da stanu u metalne posude (točka 5.2.).

5.6. Vodena kupelj, kipuća.

6. POSTUPAK

6.1. Stavite oko 25 g pijeska (4) i kratki stakleni štapić (točka 5.5.) u posudu (točka 5.2.).

6.2. Stavite nepoklopljenu posudu sa sadržajem i poklopac u sušionik (točka 5.3.) i zagrijavajte dva sata.

6.3. Poklopite posudu i prenesite je u eksikator (točka 5.4). Ostavite da se ohladi na sobnu temperaturu i precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg (M0).

6.4. Nagnite posudu da se pijesak skupi na jednoj strani posude. U čisti dio posude stavite oko 1,5 g uzorka zaslađenog kondenziranog mlijeka i 3,0 g nezaslađenog kondenziranog mlijeka. Vratite poklopac i precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg (M1).

6.5. Skinite poklopac, dodajte 5 ml vode i staklenim štapićem promiješajte tekućine, a zatim pijesak i tekući dio. Ostavite štapić u mješavini.

6.6. Stavite posudu u kipuću vodenu kupelj (točka 5.6.) dok voda ne ispari; za to je obično potrebno 20 minuta. Mješavinu povremeno promiješajte štapićem kako bi bila dobro prozračena i da se ne stisne kad bude suha. Položite štapić u posudu.

6.7. Stavite posudu i poklopac u sušionik na sat i pol.

6.8. Poklopite posudu, prenesite posudu u eksikator (točka 5.4.), ostavite da se ohladi na sobnu temperaturu i precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg.

6.9. Vratite posudu s poklopcem u sušionik, otklopite posudu i zagrijavajte je, zajedno s poklopcem, još jedan sat.

6.10. Ponovite postupak iz točke 6.8.

6.11. Ponavljajte postupke opisane u točkama 6.9. i 6.10. dok razlika između masa izmjerenih u dvama uzastopnim vaganjima ne bude manja od 0,5 mg ili dok se masa ne poveća. Ako dođe do povećanja mase, u izračunu (točka 7.1.) upotrijebite najnižu izmjerenu masu. Neka konačna zabilježena masa bude M2 g.

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Metoda izračunavanja

Sadržaj suhe tvari kao maseni postotak uzorka izračunava se prema formuli:

pri čemu je:

M0 = masa posude, poklopca i pijeska u gramima nakon postupka iz točke 6.3; M1 = masa posude, poklopca, pijeska i uzorka u gramima nakon postupka iz točke 6.4; M2 = masa posude, poklopca pijeska i osušenog uzorka u gramima nakon postupka iz točke 6.11.

7.2. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar ne smije biti veća od 0,2 g suhe tvari na 100 g proizvoda.

8. IZRAČUNAVANJE UKUPNE SUHE TVARI I SUHE TVARI BEZ MASTI

8.1. Sadržaj ukupne mliječne suhe tvari u zaslađenom kondenziranom mlijeku računa se prema formuli:

ukupna suha tvar (dobivena metodom 1., Prilog II.) – saharoza (dobivena metodom 5., Prilog II.).

8.2 Sadržaj mliječne suhe tvari bez masti u zaslađenom kondenziranom mlijeku računa se prema formuli:

ukupna suha tvar (dobivena metodom 1., Prilog II.) – (sadržaj saharoze dobiven metodom 5., Prilog II.) i sadržaj masti (dobiven metodom 3., Prilog II.).

8.3 Sadržaj mliječne suhe tvari bez masti u nezaslađenom kondenziranom mlijeku računa se prema formuli:

ukupna suha tvar (dobivena metodom 1., Prilog II.) – sadržaj masti (dobiven metodom 3., Prilog II.).

METODA 2.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA VLAGE

(sušionik 102 °C)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje gubitak mase nakon sušenja, kod:

— osušenog mlijeka s visokim sadržajem masti ili mlijeka u prahu s visokim sadržajem masti,

— osušenog punomasnog mlijeka ili punomasnog mlijeka u prahu,

— osušenog djelomično obranog mlijeka ili djelomično obranog mlijeka u prahu,

— osušenog obranog mlijeka ili obranog mlijeka u prahu.

2. DEFINICIJA

Sadržaj vlage: gubitak mase nakon sušenja koji se utvrđuje navedenom metodom.

3. PRINCIP

Preostala masa ispitnog dijela se određuje nakon sušenja pri atmosferskom tlaku u sušioniku na 102 °C ± 1 °C do stalne mase. Gubitak mase se izračunava kao maseni postotak (vlage) u uzorku.

4. APARATURA I PRIBOR

4.1. Analitička vaga

4.2. Posuđe, najbolje od nikla, aluminija, nehrđajućeg čelika ili stakla. Posude moraju imati poklopce koji dobro prianjaju, ali se lako skidaju. Odgovarajuće dimenzije su: promjer 60 do 80 mm i dubina oko 25 mm.

4.3. Sušionik za sušenje pri atmosferskom tlaku, s dobrim prozračivanjem i termostatskom regulacijom, s temperaturom podešenom na 102 °C ± 1 °C. Temperatura treba biti ujednačena u cijelom sušioniku.

4.4. Eksikator, koji sadrži svježe aktiviran silika-gel s indikatorom sadržaja vode, ili ekvivalentni desikant.

5. POSTUPAK

5.1. Otklopite posudu (točka 4.2.) i stavite je zajedno s poklopcem u sušionik (točka 4.3.) i zagrijavajte oko jedan sat.

5.2. Stavite poklopac na posudu i prenesite pokrivenu posudu u eksikator (točka 4.4). Ostavite da se ohladi na sobnu temperaturu i precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg (M0).

5.3. Stavite oko 2 g uzorka osušenog mlijeka u posudu, pokrijte posudu poklopcem i pokrivenu posudu što brže precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg (M1).

5.4. Otkrijte posudu i stavite je zajedno s poklopcem u sušionik na dva sata.

5.5. Ponovo stavite poklopac, prebacite poklopljenu posudu u eksikator, ostavite je da se ohladi na sobnu temperaturu te što brže precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg.

5.6. Posudu otkrijte i zagrijavajte zajedno s poklopcem jedan sat u sušioniku.

5.7. Ponovite postupak iz točke 5.5.

5.8. Ponavljajte postupke opisane u točkama 5.6. i 5.5. dok razlika u masama zabilježenima u dvama uzastopnim vaganjima ne bude manja od 0,5 mg ili dok se masa ne poveća. Ako dođe do povećanja mase, u izračunu (točka 6.1) upotrijebite najnižu izmjerenu masu. Neka konačna zabilježena masa bude M2 g.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

6.1. Metoda izračunavanja

Izračunajte gubitak mase nakon sušenja uzorka, iskazan kao maseni postotak, prema formuli:

pri čemu je:

M0 = masa posude i njezinog poklopca u gramima nakon postupka iz točke 5.2; M1 = masa posude, njezinog poklopca i uzorka u gramima nakon postupka iz točke 5.3; M2 = masa posude i njezinog poklopca i konačnog uzorka nakon postupka iz točke 5.5.

6.2 Ponovljivost

Razlika rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar ne smije biti veća od 0,1 g vode na 100 g proizvoda.

METODA 3.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA MASTI U KONDENZIRANOM MLIJEKU (RÖSE-GOTTLEIBOVA METODA)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje sadržaj masti u:

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku s visokim sadržajem masti,

— nezaslađenom kondenziranom mlijeku,

— nezaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku,

— nezaslađenom kondenziranom obranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku.

2. DEFINICIJA

Sadržaj masti u kondenziranom mlijeku: sadržaj masti određen prema navedenoj metodi.

3. PRINCIP

Sadržaj masti se određuje ekstrakcijom masti iz amonijačne alkoholne otopine uzorka pomoću dietil etera i petroletera, nakon čega slijedi isparavanje otapala, vaganje ostatka i izračunavanje masenog postotka masti u uzorku prema Röse–Gottliebovom postupku.

4. REAGENSI

Svi reagensi trebaju ispunjavati uvjete navedene u slijepoj probi (točka 6.1.). Po potrebi se reagensi mogu ponovo destilirati uz prisustvo oko 1 g maslačne masti na 100 ml otapala.

4.1. Amonijačna otopina, približno 25 % (m/m) NH3 (gustoće približno 0,91 g/ml na 20 °C) ili jača otopina poznate koncentracije.

4.2. Etanol, 96 ± 2 % (v/v) ili, ako nije na raspolaganju, etanol denaturiran metanolom, etil metil ketonom ili petroleterom.

4.3. Dietil eter, bez peroksida.

Napomena 1:

Za ispitivanje na perokside, u 10 ml etera u bočici sa staklenim poklopcem koju ste prethodno isprali eterom dodajte 1 ml svježe pripravljene 10 %-tne otopine kalijevog jodida. Promućkajte i ostavite stajati jednu minutu. Ni u jednom od dva sloja se ne smije pojaviti žuta boja.

Napomena 2:

Dietil eter se može održavati bez peroksida dodavanjem mokre cinkove folije koju ste jednu minutu držali potpuno umočenu u razrijeđenu zakiseljenu otopinu bakrenog sulfata i zatim je isprali vodom. Na litru upotrijebite približno 8 000 mm2 cinkove folije, izrezane u trake koje su dovoljno duge da dosegnu barem do polovine posude.

4.4. Lagani benzin (petroleter), s rasponom vrelišta od 30 do 60 °C.

4.5. Mješavina otapala, pripremljena neposredno prije upotrebe miješanjem jednakog volumena dietil etera (točka 4.3) i petroletera (točka 4.4) (kada je indicirana upotreba mješavine otapala, ona se može zamijeniti samim dietil eterom ili petroleterom).

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Odgovarajuće epruvete ili tikvice za ekstrakciju s čepovima od brušenog stakla ili drugim zatvaračima otpornim na otapala koja se koriste.

5.3. Tikvice, tankih stijenki i ravnog dna, kapaciteta 150 do 250 ml.

5.4. Sušionik za sušenje pri atmosferskom tlaku, dobro prozračen i s termostatskom regulacijom (podešen za rad na 102 °C ± 1 °C).

5.5. Granule za kuhanje, nezamašćene, neporozne, koje se pri upotrebi ne drobe, npr. staklene kuglice ili komadići silicijevog karbida (upotreba ovog materijala nije obvezatna; vidjeti točku 6.2.1).

5.6. Sifon (odvodna cijev) koja pristaje na ekstrakcijske epruvete.

5.7. Centrifuga (neobvezna).

6. POSTUPAK

6.1. Slijepa proba

Istodobno s određivanjem sadržaja masti u uzorku napravite slijepu probu na 10 ml vode, upotrebljavajući istu vrstu aparature i pribora za ekstrakciju, iste reagense u istim količinama, primjenjujući isti postupak koji je opisan u daljnjem tekstu isključujući točku 6.2.2. Ako slijepa proba pokaže više od 0,5 mg, trebate provjeriti reagense a nečisti reagens ili reagense pročistiti ili zamijeniti.

6.2. Određivanje

6.2.1. Tikvicu (točka 5.3.) (po potrebi zajedno s nešto granula (točka 5.5.) koje pospješuju lagano ključanje tijekom kasnijeg uklanjanja otapala) sušite u sušioniku (točka 5.4.) od pola sata do jednog sata. Ostavite tikvicu da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje i precizno izvažite ohlađenu tikvicu s točnošću od 0,1 mg.

6.2.2. Promiješajte pripremljeni uzorak i s točnošću od 1 mg odmah odvagnite 2 do 2,5 g uzorka ako je zaslađen ili 4 do 5 g uzorka ako je nezaslađen, neposredno u epruveti ili tikvici za ekstrakciju (točka 5.2.) ili odlijte u epruvetu ili tikvicu za ekstrakciju (točka 5.2.) važući ostatak. Dodajte do 10,5 ml vode i lagano protresite uz lagano zagrijavanje (40 do 50 °C). Uzorak se mora potpuno raspršiti, inače se postupak određivanja treba ponoviti.

6.2.3. Dodajte 1,5 ml amonijaka (25 %) (točka 4.1.) ili odgovarajuću količinu jače otopine i dobro promiješajte.

6.2.4. Dodajte 10 ml etanola (točka 4.2) i tekućine lagano ali temeljito promiješajte u nezatvorenoj epruveti (tikvici).

6.2.5. Dodajte 25 ml dietil etera (točka 4.3). Ohladite pod tekućom vodom. Zatvorite epruvetu (tikvicu) te je energično tresite i okrećite jednu minutu.

6.2.6. Pažljivo skinite čep i dodajte 25 ml petroletera (točka 4.4) tako da prvih nekoliko mililitara upotrijebite za ispiranje čepa i unutrašnjosti vrata epruvete (tikvice), puštajući tekućinu da se nakon ispiranja slijeva u epruvetu (tikvicu). Ponovo je zatvorite čepom, pa je tresite i okrećite 30 sekundi. Nemojte prejako tresti ako nećete upotrijebiti centrifugu (točka 6.2.7.).

6.2.7. Ostavite epruvetu (tikvicu) stajati dok gornji sloj tekućine ne postane bistar i jasno se ne odijeli od donjega vodenog sloja. Alternativno separaciju možete obaviti pomoću odgovarajuće centrifuge (točka 5.7.).

Napomena:

Kad se upotrebljava centrifuga koju ne pogoni trofazni elektromotor, može doći do iskrenja i zato se mora paziti da se izbjegne eksplozija ili požar uzrokovan eterskim parama koje, na primjer, mogu izlaziti iz napukle epruvete.

6.2.8. Skinite poklopac i isperite ga, kao i unutrašnjost vrata epruvete (tikvice), s nekoliko mililitara mješavine otapala (točka 4.5.) i pustite da se tekućina nakon ispiranja slijeva u epruvetu (tikvicu). Pažljivo prebacite, koliko god možete, gornjeg sloja odlijevanjem ili koristeći sifon (točka 5.6.) u tikvicu pripremljenu prema točki 6.2.1.

Napomena:

Ako se za prebacivanje ne upotrebljava sifon, može biti potrebno dodati malo vode kako bi se povisila dodirna površina između dvaju slojeva i na taj način olakšalo odlijevanje.

6.2.9. Isperite izvana i iznutra vrat epruvete (tikvice) za ekstrakciju, odnosno vrh i donji dio sifona, s nekoliko mililitara mješavine otapala (točka 4.5.). Pustite da se tekućina upotrijebljena za ispiranje epruvete (tikvice) za ekstrakciju izvana slijeva u tikvicu a da se tekućina upotrijebljena za ispiranje unutrašnjosti vrata i sifona slijeva u epruvetu (tikvicu) za ekstrakciju.

6.2.10 Napravite drugu ekstrakciju ponavljajući postupak od točke 6.2.5. uključno do točke 6.2.9., ali upotrijebivši samo 15 ml dietil etera i 15 ml petroletera.

6.2.11 Napravite treću ekstrakciju prema postupku iz točke 6.2.10., ali izostavite posljednje ispiranje (točka 6.2.9.).

Napomena:

Ovu treću ekstrakciju ne morate izvesti ako se analiziraju uzorci obranog nezaslađenog kondenziranog mlijeka i obranog zaslađenog kondenziranog mlijeka.

6.2.12. Isparavanjem ili destilacijom pažljivo odstranite što više otapala (uključujući etanol). Ako je tikvica malog kapaciteta, bit će potrebno odstraniti nešto otapala, kako je gore navedeno, nakon svake ekstrakcije.

6.2.13. Kada ne bude osjetnog mirisa otapala, tikvicu bočno položite u sušionik i zagrijavajte jedan sat.

6.2.14. Izvadite tikvicu iz sušionika, ostavite je da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje i precizno je izvažite s točnošću od 0,1 mg.

6.2.15. Ponavljajte postupak opisan u točki 6.2.13. i 6.2.14. uz zagrijavanje u trajanju od 30 do 60 minuta, sve dok razlika u masama zabilježenim u dvama uzastopnim vaganjima ne bude manja od 0,5 mg ili dok se masa ne poveća. Ako dođe do povećanja mase, za izračun (točka 7.1.) uzmite najnižu izmjerenu masu. Neka konačna zabilježena masa bude M1 g.

Dodajte 15 do 25 ml petroletera da biste potvrdili da je ekstrahirana tvar u potpunosti topiva. Lagano zagrijavajte i rotirajte otapalo dok se ne otopi sva mast.

6.2.16.1. Ako je ekstrahirana tvar potpuno topiva u petroleteru, masa masti je razlika između masa utvrđenih u fazama opisanim u točkama 6.2.1. i 6.2.15.

6.2.16.2. Ako je prisutna bilo kakva netopiva tvar ili ako postoji takva sumnja, potpuno ekstrahirajte mast iz tikvica tako da ih nekoliko puta operete toplim petroleterom, puštajući da se neotopljeni materijal istaloži prije svakog odlijevanja. Vrat tikvice isperite izvana tri puta. U sušioniku jedan sat zagrijavajte tikvicu položenu na bok, pustite je da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje kao i ranije (točka 6.2.1.) i izvažite je s točnošću od 0,1 mg. Masa masnoće je razlika između mase izmjerene u skladu s točkom 6.2.15. i ove zadnje mase.

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Izračunavanje

Masa ekstrahirane masti izražena u gramima je:

a sadržaj masti u uzorku, izražen kao postotak je:

pri čemu je:

M1 = masa tikvice M u gramima, s masti nakon faze opisane u točki 6.2.15.; M2 = masa tikvice M u gramima nakon faze opisane u točki 6.2.1. ili, u slučaju neotopljenog materijala ili sumnje o njegovu prisustvu, faze opisane u točki 6.2.16.2.; B1 = masa tikvice B u gramima, slijepog uzorka nakon faze opisane u točki 6.2.15.; B2 = masa tikvice B u gramima nakon faze opisane u točki 6.2.1. ili, u slučaju neotopljenog materijala ili sumnje o njegovu prisustvu, faze opisane u točki 6.2.16.2.; S = masa upotrijebljenog uzorka u gramima.

7.2. Ponovljivost

Razlika rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu, na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 0,05 g masti na 100 g proizvoda.

METODA 4.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA MASTI U OSUŠENOM MLIJEKU (RÖSE–GOTTLIEBOVA METODA)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje sadržaj masti u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti,

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu,

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu,

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu.

2. DEFINICIJA

Sadržaj masti u osušenom mlijeku: sadržaj masti određen prema navedenoj metodi.

3. PRINCIP

Sadržaj masti određuje se ekstrakcijom masti iz amonijačne alkoholne otopine uzorka pomoću dietil etera i petroletera, nakon čega slijedi isparavanje otapala, vaganje ostatka i izračunavanje masenog postotka masti u uzorku prema Röse–Gottliebovom postupku.

4. REAGENSI

Svi reagensi trebaju ispunjavati uvjete navedene u slijepoj probi (točka 6.1). Po potrebi se reagensi mogu ponovo destilirati uz prisustvo oko 1 g maslačne masti na 100 ml otapala.

4.1. Amonijačna otopina, približno 25 % (m/m) NH3 (gustoće približno 0,91 g/ml na 20 °C) ili jača otopina poznate koncentracije.

4.2. Etanol, 96 ± 2 % (v/v) ili, ako nije na raspolaganju, etanol denaturiran metanolom, etil metil ketonom ili petroleterom.

4.3. Dietil eter bez peroksida.

Napomena 1:

Za ispitivanje na perokside, u 10 ml etera u bočici sa staklenim čepom koju ste prethodno isprali eterom, dodajte 1 ml svježe pripravljene 10 %-tne otopine kalijevog jodida. Protresite i ostavite stajati jednu minutu. Ni u jednom od dva sloja se ne smije pojaviti žuta boja.

Napomena 2:

Dietil eter se može održavati bez peroksida dodavanjem mokre cinkove folije koju ste jednu minutu držali potpuno umočenu u razrijeđenu zakiseljenu otopinu bakrenog sulfata i zatim je isprali vodom. Na litru upotrijebite približno 8 000 mm2 cinkove folije izrezane u trake koje su dovoljno duge da dosegnu barem do polovine posude.

4.4. Lagani benzin (petroleter) s rasponom vrelišta od 30 do 60 °C.

4.5. Mješavina otapala pripremljena neposredno prije upotrebe miješanjem jednakog volumena dietil etera (točka 4.3) i petroletera (točka 4.4). (Kada je indicirana upotreba mješavine otapala, ona se može zamijeniti samim dietil eterom ili petroleterom).

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Odgovarajuće epruvete ili tikvice za ekstrakciju s čepovima od brušenog stakla ili drugim zatvaračima otpornim na otapala koja se koriste.

5.3. Tikvice tankih stijenki i ravnog dna kapaciteta 150 do 250 ml.

5.4. Sušionik za sušenje pri atmosferskom tlaku, dobro prozračen i s termostatskom regulacijom (podešen za rad na 102 °C ± 1 °C).

5.5. Granule za kuhanje, nezamašćene i neporozne, koje se pri upotrebi ne drobe, npr. staklene kuglice ili komadići silicijevog karbida (upotreba ovog materijala nije obvezatna; vidjeti točku 6.2.1.).

5.6. Vodena kupelj podešena na 60 do 70 °C.

5.7. Sifon (odvodna cijev) koja pristaje na epruvete za ekstrakciju.

5.8. Centrifuga (neobvezna).

6. POSTUPAK

6.1 Slijepa proba

Istodobno s određivanjem sadržaja masti u uzorku napravite slijepu probu na 10 ml vode, upotrebljavajući istu vrstu aparature i pribora za ekstrahiranje, iste reagense u istim količinama, primjenjujući isti postupak koji je opisan u daljnjem tekstu isključujući točku 6.2.2. Ako slijepa proba pokaže više od 0,5 mg, trebate provjeriti reagense a nečisti reagens ili reagense pročistiti ili zamijeniti.

6.2. Određivanje

6.2.1. Tikvicu (točka 5.3.) (po potrebi zajedno s nešto granula (točka 5.5.) koje pospješuju lagano ključanje tijekom kasnijeg uklanjanja otapala) sušite u sušioniku (točka 5.4.) od pola sata do jednog sata. Ostavite tikvicu da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje i ohlađenu tikvicu precizno izvažite s točnošću od 0,1 mg.

6.2.2. Precizno izvažite, s točnošću od 1 mg, neposredno u epruveti ili tikvici za ekstrakciju (točka 5.2.), ili odsipajte u epruvetu ili tikvicu za ekstrakciju (točka 5.2.) važući ostatak, oko 1 g punomasnog mlijeka u prahu ili oko 1,5 g djelomično obranog ili obranog mlijeka u prahu. Dodajte 10 ml vode i lagano mućkajte dok se mlijeko u prahu potpuno ne rasprši (za neke uzorke može biti potrebno zagrijavanje).

6.2.3. Dodajte 1,5 ml amonijaka (25 %) (točka 4.1.) ili odgovarajuću količinu jače otopine i zagrijavajte u vodenoj kupelji (točka 5.6.) 15 minuta na 60 do 70 °C uz povremeno protresanje. Ohladite, na primjer, pod tekućom vodom.

6.2.4. Dodajte 10 ml etanola (točka 4.2.) i tekućine lagano, ali temeljito, promiješajte u nezatvorenoj epruveti (tikvici) za ekstrakciju.

6.2.5. Dodajte 25 ml dietil etera (točka 4.3.). Ohladite pod tekućom vodom. Začepite epruvetu (tikvicu) i energično je tresite i preokrećite jednu minutu.

6.2.6. Pažljivo skinite čep i dodajte 25 ml petroletera (točka 4.4.), tako da prvih nekoliko mililitara upotrijebite za ispiranje čepa i unutrašnjosti vrata epruvete (tikvice) za ekstrakciju, puštajući tekućinu da se nakon ispiranja slijeva u epruvetu (tikvicu). Ponovo je zatvorite čepom, pa je tresite i preokrećite 30 sekundi. Nemojte prejako tresti ako nećete koristiti centrifugu (točka 6.2.7.).

6.2.7. Ostavite epruvetu (tikvicu) za ekstrakciju da stoji dok gornji sloj tekućine ne postane bistar i jasno se ne odijeli od donjeg vodenog sloja. Alternativno separaciju možete obaviti pomoću odgovarajuće centrifuge (točka 5.8.).

Napomena:

Kad se upotrebljava centrifuga koju ne pogoni trofazni elektromotor, može doći do iskrenja i zato se mora paziti da se izbjegne eksplozija ili požar uzrokovan eterskim parama koje, na primjer, mogu izlaziti iz napukle epruvete.

6.2.8. Skinite čep, isperite ga, kao i unutrašnjost vrata epruvete (tikvice), s nekoliko mililitara mješavine otapala (točka 4.5.) i pustite da se tekućina nakon ispiranja slijeva u epruvetu (tikvicu). Pažljivo prebacite, koliko god možete, gornjeg sloja odlijevanjem ili koristeći sifon (točka 5.6.) u tikvicu pripremljenu prema točki 6.2.1.

Napomena:

Ako se za prebacivanje ne upotrebljava sifon, može biti potrebno dodati malo vode kako bi se povisila dodirna površina između dvaju slojeva i na taj način olakšalo odlijevanje.

6.2.9. Isperite, izvana i iznutra, vrat epruvete (tikvice) za ekstrakciju, odnosno vrh i donji dio sifona s nekoliko mililitara mješavine otapala. Pustite da se tekućina upotrijebljena za ispiranje epruvete (tikvice) za ekstrakciju izvana slijeva u tikvicu, a da se tekućina upotrijebljena za ispiranje unutrašnjosti vrata i sifona slijeva u epruvetu (tikvicu) za ekstrakciju.

6.2.10. Napravite drugu ekstrakciju ponavljajući postupak od točke 6.2.5. uključno do točke 6.2.9, ali upotrijebite samo 15 ml dietil etera i 15 ml petroletera.

6.2.11. Napravite treću ekstrakciju prema postupku iz točke 6.2.10., ali izostavite posljednje ispiranje (točka 6.2.9.).

Napomena:

Ovu treću ekstrakciju ne morate izvesti ako se analiziraju uzorci osušenog obranog mlijeka.

6.2.12. Pažljivo isparavanjem ili destilacijom odstranite što više otapala (uključujući etanol). Ako je tikvica malog kapaciteta, bit će potrebno odstraniti nešto otapala, kako je gore navedeno, nakon svake ekstrakcije.

6.2.13. Kada ne bude osjetnog mirisa otapala, tikvicu bočno položite u sušionik i zagrijavajte jedan sat.

6.2.14. Izvadite tikvicu iz sušionika, ostavite je da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje kao i ranije (točka 6.2.1.) i precizno je izvažite s točnošću od 0,1 mg.

6.2.15. Ponavljajte postupak opisan u točki 6.2.13. i 6.2.14. uz zagrijavanje u trajanju od 30 do 60 minuta, dok razlika u masama zabilježenim u dvama uzastopnim vaganjima ne bude manja od 0,5 mg ili dok se masa ne poveća. Ako dođe do povećanja mase, za izračun (točka 7.1.) uzmite najnižu izmjerenu masu. Neka konačna zabilježena masa bude M1 g.

Dodajte 15 do 25 ml petroletera da biste potvrdili da je ekstrahirana tvar u potpunosti topiva. Lagano zagrijavajte i rotirajte otapalo dok se ne otopi sva mast.

6.2.16.1. Ako je ekstrahirana tvar potpuno topiva u petroleteru, masa masti je razlika između masa određenih u fazama opisanima u točkama 6.2.1. i 6.2.15.

6.2.16.2. Ako je prisutna bilo kakva netopiva tvar ili ako postoji takva sumnja, potpuno ekstrahirajte mast iz tikvica tako da ih nekoliko puta operete toplim petroleterom, puštajući da se neotopljeni materijal istaloži prije svakog odlijevanja. Vrat tikvice isperite izvana tri puta.

U sušioniku jedan sat zagrijavajte tikvicu položenu na bok, pustite je da se ohladi na temperaturu prostorije za vaganje kao i ranije (točka 6.2.1.) i izvažite je s točnošću od 0,1 mg. Masa masnoće je razlika između mase dobivene prema točki 6.2.15. i ove zadnje mase.

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Izračunavanje

Masa ekstrahirane masti iskazana u gramima je:

a sadržaj masti u uzorku iskazan kao postotak je:

pri čemu je:

M1 = masa tikvice M u gramima, s masti nakon faze opisane u točki 6.2.15.; M2 = masa tikvice M u gramima nakon faze opisane u točki 6.2.1 ili, u slučaju neotopljenog materijala ili sumnje o njegovu prisustvu, faze opisane u točki 6.2.16.2; B1 = masa tikvice B u gramima slijepog uzorka nakon faze opisane u točki 6.2.15; B2 = masa tikvice B u gramima nakon faze opisane u točki 6.2.1 ili, u slučaju neotopljenog materijala ili sumnje o njegovu prisustvu, faze opisane u točki 6.2.16.2; S = masa upotrijebljenog uzorka u gramima.

7.2. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu, na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 0,2 g masti na 100 g proizvoda, uz izuzetak obranog mlijeka u prahu kod kojega razlika ne smije biti veća od 0,1 g masti na 100 g proizvoda.

METODA 5.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA SAHAROZE

(POLARIMETRIJSKA METODA)

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje sadržaj saharoze u:

— zaslađenom kondenziranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom djelomično obranom mlijeku,

— zaslađenom kondenziranom obranom mlijeku.

Uzorci ne smiju sadržavati invertni šećer.

2. DEFINICIJA

Sadržaj saharoze u zaslađenom kondenziranom mlijeku: sadržaj saharoze određen prema navedenoj metodi.

3. PRINCIP

Metoda se temelji na principu Clergetove inverzije, lagane obrade uzorka kiselinom koja izaziva potpunu hidrolizu saharoze, ali gotovo nikakvu hidrolizu laktoze ili drugih šećera. Sadržaj saharoze se dobije na temelju promjene snage rotacije otopine.

Čisti filtrat uzorka, bez mutarotacije laktoze, priprema se tako da se otopina obradi amonijakom, nakon čega se neutralizira uzastopnim dodavanjem otopina cinkovog acetata i kalijevog heksacijanoferata II.

U jednom dijelu filtrata saharoza se hidrolizira na poseban način.

Na temelju rotacije filtrata prije i nakon inverzije izračunava se sadržaj saharoze pomoću odgovarajućih formula.

4. REAGENSI

4.1. Otopina cinkovog acetata, 1 M: otopite 21,9 g kristaliziranog cinkovog acetat dihidrata Zn(C2H3O2)2.2H2O i 3 ml ledene octene kiseline u vodi i do 100 ml dopunite vodom.

4.2. Otopina kalijevog heksacijanoferata (II), 0,25 M: otopite 10,6 g kristaliziranog kalijevog heksacijanoferata (II) trihidrata K4[Fe(CN)6]. 3H2O i do 100 ml dopunite vodom.

4.3. Otopina klorovodične kiseline, 6,35 ± 0,20 M (20 do 22 %) ili 5,0 ± 0,2 M (16 do 18 %).

4.4. Otopina amonijaka, 2,0 ± 0,2 M (3,5 %).

4.5. Otopina octene kiseline, 2,0 ± 0,2 M (12 %).

4.6. Indikator bromitol plavo, 1 %-tna (m/v) otopina u etanolu.

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Vaga, osjetljivosti 10 mg.

5.2. Polarimetrijska cjevčica, 2 dm, točno kalibrirane duljine.

5.3. Polarimetar ili saharimetar:

(a) Polarimetar s natrijevim svjetlom ili živinim zelenim svjetlom (lampa na živinu paru s prizmom ili posebni Wrattenov zaslon br. 77A) s točnošću očitavanja od najmanje 0,05 kutnih stupnjeva;

(b) Saharimetar s međunarodnom šećernom skalom, s bijelim svjetlom koje prolazi kroz 15-milimetarski filtar od 6 %-tne otopine kalijevog bikromata ili natrijevim svjetlom s točnošću očitavanja od najmanje 0,1o na međunarodnoj šećernoj skali.

5.4. Vodena kupelj podešena na 60 °C ± 1 °C.

6. POSTUPAK

6.1. Kontrolno određivanje

Za standardizaciju postupka, reagensa, opreme i pribora, paralelno izvedite kontrolno određivanje kako je opisano u daljnjem tekstu, upotrebljavajući mješavinu od 100 g mlijeka i 18 g čiste saharoze ili mješavinu 110 g obranog mlijeka i 18 g čiste saharoze, od kojih svaka odgovara količini od 40 g kondenziranog mlijeka sa sadržajem saharoze od 45 %. Izračunajte sadržaj šećera pomoću formula iz točke 7.; u formulu 1 umjesto M, F i P unesite količinu uzetog mlijeka, odnosno sadržaja masti i sadržaja proteina u tom mlijeku, a u formulu 2 umjesto M unesite vrijednost 40,00. Dobivena srednja vrijednost ne smije se od 45,0 % razlikovati za više od 0,2 %.

6.2. Određivanje

6.2.1. Odvagnite, s točnošću od 10 mg, oko 40 g dobro promiješanog uzorka u staklenu čašu od 100 ml. Dodajte 50 ml vruće vode (80 do 90 °C) i dobro promiješajte.

6.2.2. Kvantitativno prenesite mješavinu u 200-mililitarsku odmjernu tikvicu ispirući čašu dodatnim količinama vode zagrijane na 60 °C, dok ukupna zapremina ne bude između 120 i 150 ml. Promiješajte i ohladite na sobnu temperaturu.

6.2.3. Dodajte 5 ml razrijeđene amonijačne otopine (točka 4.4.). Ponovo promiješajte i ostavite stajati 15 minuta.

6.2.4. Neutralizirajte amonijak dodavanjem jednake količine razrijeđene otopine octene kiseline (točka 4.5). Prethodno odredite točan broj mililitara titracijom amonijačne otopine, koristeći bromtimol plavo kao indikator (točka 4.6). Promiješajte.

6.2.5. Uz lagano miješanje okretanjem nakošene odmjerne tikvice, dodajte 12,5 ml otopine cinkovog acetata (točka 4.1.).

6.2.6. Dodajte 12,5 ml otopine kalijevog heksacijanoferata (II) (točka 4.2.) na isti način kao i otopinu acetata.

6.2.7. Dovedite sadržaj posude na 20 °C i do oznake za 200 ml dolijte vodu temperature 20 °C.

Napomena:

Kod svih dosad opisanih faza voda ili reagens se trebaju dodavati tako se izbjegne stvaranje mjehurića, a iz istog razloga miješanje se obavlja rotiranjem posude, a ne trešnjom. Ako se utvrdi prisustvo mjehurića prije nego se dosegne količina od 200 ml, pri njihovu uklanjanju može pomoći privremeno priključivanje posude na vakuumsku pumpu i rotiranje posude.

6.2.8. Zatvorite posudu suhim čepom i dobro promiješajte energičnim mućkanjem.

6.2.9. Ostavite stajati nekoliko minuta, a zatim filtrirajte kroz suhi papirni filtar; prvih 25 ml filtrata bacite.

6.2.10. Neposredna polarizacija: Odredite optičku rotaciju filtrata na 20 °C ± 1 °C.

6.2.11. Inverzija: pipetom odmjerite 40 ml gore dobivenog filtrata i prenesite u volumetrijsku tikvicu od 50 ml. Dodajte 6,0 ml 6,35 M klorovodične kiseline ili 7,5 ml 5,0 M klorovodične kiseline (slika 4.3.).

Stavite posudu na 15 minuta u vodenu kupelj čija je temperatura 60 °C, pazeći da cijeli balon tikvice bude uronjen. Miješajte kružnim pokretima tijekom prvih pet minuta, u kojem vremenu sadržaj tikvice treba postići temperaturu kupelji. Ohladite na 20 °C i do oznake dopunite vodom temperature 20 °C. Promiješajte i ostavite stajati jedan sat na ovoj temperaturi.

6.2.12. Invertna polarizacija

Odredite rotaciju invertne otopine na 20 °C ± 2 °C. (Međutim, ako se tijekom mjerenja temperatura T tekućine u polarizacijskoj cjevčici razlikuje za više od 0,2 °C, mora se primijeniti korekcija temperature, spomenuta u točki 7.2.).

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Metoda izračunavanja

Izračunajte sadržaj saharoze pomoću sljedećih formula:

(1)

(2)

pri čemu je:

S = sadržaj saharoze; M = masa izvaganog uzorka u gramima; F = postotak masti u uzorku; P = postotak proteina (N × 6,38) u uzorku; V = volumen u ml na koji je uzorak razrijeđen prije filtracije; v = korekcija u ml za volumen taloga koji se stvara tijekom bistrenja; D = neposredno očitanje polarimetra (polarizacija prije inverzije); I = očitanje polarimetra nakon inverzije; L = duljina u dm polarimetrijske cjevčice Q = faktor inverzije, čije su vrijednosti navedene u daljnjem tekstu

Primjedbe:

(a) Kad se odvagne točno 40,00 g kondenziranog mlijeka i upotrijebi polarimetar s natrijevim svjetlom, kutnim stupnjevima i polarimetrijskom cjevčicom od 2 dm na 20 °C ± 1 °C, sadržaj saharoze u normalnom kondenziranom mlijeku (C = 9) se može izračunati prema sljedećoj formuli: ;

(b) Ako se invertna polarizacija mjeri na temperaturi različitoj od 20 °C, vrijednosti se trebaju pomnožiti sa: .

7.2. Vrijednosti faktora inverzije Q

Sljedeće formule daju točne vrijednosti za Q, za različite izvore svjetlosti s korekcijama za koncentraciju i temperaturu:

Natrijevo svjetlo i polarimetar s kutnim supnjevima: Q = 0,8825 + 0,0006 (C – 9) – 0,0033 (T – 20).

Živino zeleno svjetlo i polarimetar s kutnim stupnjevima: Q = 1,0392 + 0,0007 (C – 9) – 0,0039 (T –20).

Bijelo svjetlo s dikromatskim filtrom i saharimetar sa stupnjevima međunarodne šećerne skale: Q = 2,549 + 0,0017 (C – 9) – 0,0095 (T – 20).

U gornjim formulama:

C = postotak ukupnih šećera u invertnoj otopini nakon polarizacije T = Temperatura invertne otopine pri polarimetrijskom očitanju.

Napomena 1:

Postotak ukupnih šećera C u invertnoj otopini može se izračunati iz neposrednog očitanja a promjena nakon inverzije na uobičajeni način, korištenjem uobičajenih vrijednosti za specifične rotacije saharoze, laktoze i invertnog šećera.

Korekcija 0,0006 (C–9) itd. točna je jedino kad je C približno 9; za normalno kondenzirano mlijeko ova se korekcija može zanemariti, budući da je C blizu 9.

Napomena 2:

Odstupanje temperature od 20 °C za 1 °C nije bitno za neposredno očitanje, ali odstupanje za više od 0,2 °C kod invertnog očitanja zahtijeva korekciju. Korekcija – 0,0033 (T – 20) itd. točna je samo između 18 °C i 22 °C.

7.3. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 0,3 g saharoze na 100 g kondenziranog mlijeka.

METODA 6.: ODREĐIVANJE SADRŽAJA MLIJEČNE KISELINE I LAKTATA

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ovom se metodom određuje sadržaj mliječne kiseline i laktata, koji se izražavaju kao mliječna kiselina, u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti,

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu,

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu,

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu.

2. DEFINICIJA

Sadržaj mliječne kiseline i laktata u osušenom mlijeku: sadržaj mliječne kiseline i laktata, izražen kao mliječna kiselina, određen prema navedenoj metodi:

3. PRINCIP

Mast, protein i laktoza se istodobno uklanjaju iz otopine uzorka dodavanjem bakrenog sulfata i kalcijevog hidroksida, nakon čega slijedi filtracija.

Mliječna kiselina i laktati u filtratu se mijenjanju u acetaldehid pomoću koncentrirane sumporne kiseline uz prisustvo bakrenog II sulfata.

Sadržaj mliječne kiseline određuje se kolorimetrijski, uz upotrebu p–hidroksidifenila.

Sadržaj mliječne kiseline i laktata se izražava u mg mliječne kiseline na 100 g suhe bezmasne tvari.

4. REAGENSI

4.1. Otopina bakrenog (II) sulfata: otopite 250 g bakrenog (II) sulfata (CuSO4.5H20) u vodi i razrijedite do 1 000 ml vodom.

Suspenzija kalcijevog hidroksida.

4.2.1. Smrvite 300 g kalcijevog hidroksida (Ca(OH)2) u tarioniku s vodom; upotrijebite ukupno 900 ml vode. Suspenziju treba pripremiti neposredno prije upotrebe.

4.2.2. Suspenzija kalcijevog hidroksida: Smrvite 300 g kalcijevog hidroksida (Ca(OH)2) u tarioniku s vodom; upotrijebite ukupno 1 400 ml vode. Suspenziju treba pripremiti neposredno prije upotrebe.

4.3. Sumporna kiselina – otopina bakrenog (II) sulfata: u 300 ml sumporne kiseline, 95,9 do 97,0 % (m/m) H2S04, dodajte 0,5 ml otopine bakrenog (II) sulfata (točka 4.1.).

4.4. Otopina p-hidroksidifenila (C6H5C6H4OH): otopite, protresajući i lagano zagrijavajući 0,75 g p-hidroksidifenila u 5 ml vodene otopine natrijevog hidroksida koji sadrži 5 g NaOH na 100 ml. Do 50 ml razrijedite vodom u volumetrijskoj tikvici. Otopinu držite u boci od smeđeg stakla na tamnom i hladnom mjestu. Nemojte koristiti ako dođe do promjene boje ili zamućenja. Maksimalna trajnost je 72 sata.

4.5. Standardna otopina mliječne kiseline: otopite u vodi, neposredno prije upotrebe, 0,1067 g litijevog laktata (CH3 CHOHCOOLi) i do 1 000 ml razrijedite u volumetrijskoj tikvici. 1 ml ove otopine odgovara 0,1 mg mliječne kiseline.

4.6. Standardno rekonstituirano mlijeko: unaprijed napravite analizu nekoliko uzoraka visokokvalitetnog osušenog mlijeka. Za izradu kalibracijske krivulje odaberite uzorak koji ima najniži sadržaj mliječne kiseline, odnosno koji ne sadrži više od 30 mg mliječne kiseline na 100 g bezmasne suhe tvari. Slijedite postupak opisan u točkama 6.2.1. i 6.2.2. dolje.

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Spektrofotometar prikladan za očitanja pri valnoj duljini od 570 nm.

5.3. Vodena kupelj podešena na 30 °C ± 2 °C.

5.4. Tarionik i tučak.

5.5. Filtarski papir (Schleicher i Schull 595, Whatman 1 ili papir jednake kvalitete).

5.6. Epruvete od pireksa ili materijala jednake kvalitete (dimenzije 25 × 150 mm).

Napomena:

Sve stakleno posuđe i pribor moraju biti savršeno čisti i namijenjeni samo za upotrebu u ovom određivanju. Prije pranja isperite staklene posude koje sadrže ostatke taloga koncentriranom klorovodičnom kiselinom.

6. POSTUPAK

6.1. Slijepa proba

Napravite slijepu probu tako da stavite 30 ml vode u graduiranu epruvetu od 50 ml i tretirajte tu epruvetu kako je opisano u točkama 6.2.4. do uključno 6.2.11. Ako rezultat slijepe probe napravljene na vodi prelazi ekvivalentnu koncentraciju od 20 mg mliječne kiseline na 100 g bezmasne suhe tvari, treba provjeriti reagense, odnosno nečiste reagense ili reagens treba zamijeniti. Slijepu probu izvedite istodobno kad i analizu uzorka.

6.2. Određivanje

Napomena: Izbjegavajte kontaminaciju nečistoćama, posebno slinom i znojem.

6.2.1. Odredite sadržaj bezmasne suhe tvari (a) uzorka u gramima oduzimanjem sadržaja masti (dobivenog metodom 4.) i sadržaja vlage (dobivenog metodom 2.) od 100.

6.2.2. Odvagnite uzorka s točnošću od 0,1 g. Dodajte ovu količinu uzorka u 100 ml vode i dobro promiješajte.

6.2.3. Pipetom odmjerite 5 ml dobivene otopine u graduiranu epruvetu od 50 ml i razrijedite vodom do oko 30 ml.

6.2.4. Dodajte polako, istodobno protresajući epruvetu, 5 ml otopine bakrenog (II) sulfata (točka 4.1.) i ostavite stajati 10 minuta.

6.2.5. Dodajte polako, istodobno protresajući epruvetu, 5 ml suspenzije kalcijevog hidroksida (točka 4.2.1.) ili 10 ml suspenzije kalcijevog hidroksida (točka 4.2.2.).

6.2.6. Do 50 ml razrijedite vodom, energično protresite, ostavite stajati 10 minuta i zatim profiltrirajte. Prvi dio filtrata bacite.

6.2.7. Pipetom odmjerite 1 ml filtrata i prenesite u epruvetu (točka 5.6.).

6.2.8. Biretom ili graduiranom pipetom dodajte u epruvetu 6,0 ml otopine sumporne kiseline–bakrenog (II) sulfata (točka 4.3.). Promiješajte.

6.2.9. Zagrijavajte u vodenoj kupelji pet minuta. Ohladite na sobnu temperaturu pod hladnom vodom.

6.2.10. Dodajte dvije kapi reagensa p-hidroksidifenila (točka 4.4.) i energično protresite da se reagens jednakomjerno rasporedi po tekućini. Stavite epruvetu u vodenu kupelj na 30 °C ± 2 °C; ostavite da odstoji 15 minuta uz povremeno protresanje.

6.2.11. Stavite epruvetu u kipuću kupelj na 90 sekundi. Ohladite na sobnu temperaturu pod tekućom vodom.

6.2.12. Izmjerite optičku gustoću prema slijepoj probi (točka 6.1.) unutar razdoblja od tri sata pri valnoj dužini navedenoj u točki 5.2.

6.2.13. Ako je optička gustoća veća od gustoće najviše točke standardne krivulje, ponovite test upotrebljavajući odgovarajuće razrjeđenje filtrata dobivenog prema točki 6.2.6.

6.3. Priprema standarda

6.3.1. Odmjerite pipetom 5 ml rekonstituiranog mlijeka (točka 4.6.) i prenesite ga u pet graduiranih epruveta od 50 ml. U te epruvete pipetom odmjerite i dodajte 0, 1, 2, 3, odnosno 4 ml standardne otopine (točka 4.5.) da dobijete raspon standarda koji odgovaraju 0, 20, 40, 60 i 80 mg dodane mliječne kiseline na 100 g bezmasne suhe tvari osušenog mlijeka.

6.3.2. Razrijedite vodom na oko 30 ml i obradite prema opisu od točke 6.2.4. do 6.2.11.

6.3.3. Izmjerite optičke gustoće standardnih otopina (točka 6.3.1.) prema slijepoj probi (točka 6.1.) pri valnoj dužini navedenoj u točki 5.2. Unesite u dijagram optičke gustoće za količine mliječne kiseline navedene u točki 6.3.1., tj. 0 mg, 20 mg, 40 mg, 60 mg i 80 mg na 100 g bezmasne suhe tvari. Između tih točaka nacrtajte pravac podesivši ga tako da im bude što bliže, a standardnu krivulju napravite tako taj pravac pomaknete paralelno u odnosu na samog sebe, da bi prošao kroz ishodište (sjecište) koordinata.

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Metoda izračunavanja

Optičku gustoću izmjerenu u skladu s točkama 6.2.12. ili 6.2.13. pretvorite u mg mliječne kiseline na 100 g bezmasne suhe tvari u uzorku služeći se standardnom krivuljom. U slučajevima kad se filtrat razrjeđuje u skladu s točkom 6.2.13., ovaj rezultat pomnožite s faktorom razrjeđenja.

7.2. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno, ili u brzom slijedu, na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 8 mg mliječne kiseline na 100 g bezmasne suhe tvari za sadržaje do 80 mg.

METODA 7.: DOKAZIVANJE AKTIVNOSTI FOSFATAZE

(IZMIJENJEN POSTUPAK SANDERSA I SAGERA)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ova metoda opisuje dokazivanje aktivnosti fosfataze u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti,

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu,

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu,

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu.

2. DEFINICIJA

Aktivnost fosfataze u osušenom mlijeku je mjerilo prisutne količine alkalne fosfataze. Izražava se kao količina fenola u μg koji se oslobađa iz 1 ml rekonstituiranog mlijeka, koja se određuje prema dolje opisanom postupku.

3. PRINCIP

Aktivnost fosfataze u osušenom mlijeku određuje se prema sposobnosti fosfataze da oslobodi fenol iz dinatrijfenilfosfata. Količina fenola koja se oslobodi pod propisanim uvjetima određuje se spektrofotometrijskim mjerenjem boje koja se razvije pomoću Gibbovog reagensa.

4. REAGENSI

4.1. Otopina A

Pufer barijev borat hidroksid: pH 10,6 ± 0,1 na 20 °C.

Otopite: 25,0 g barijevog hidroksida (Ba(OH)28H2O) u vodi i razrijedite do 500 ml.

Otopite: 11,0 g borne kiseline (H3B03) u vodi i razrijedite do 500 ml.

Zagrijte ove dvije otopine na 50 °C i promiješajte.

Mješavinu promućkajte i ohladite na sobnu temperaturu.

Podesite pH na 10,6 ± 0,1 pomoću otopine barijevog hidroksida i filtra.

Čuvajte otopinu u čvrsto začepljenoj posudi.

Prije upotrebe razrijedite pufer s jednakom količinom vode.

4.2. Otopina B:

Pufer za razvijanje boje.

Otopite: 6,0 g natrijevog metaborata (NaBO2) (ili 12,6 g NaBO2.4H20) i 20,0 g natrijevog klorida (NaCl) u vodi i razrijedite vodom do 1 000 ml.

4.3. Otopina C

Otopina puferskog supstrata.

4.3.1. Otopite 0,5 g dinatrijfenilfosfata (Na2C6H5PO4.2H2O) u 4,5 ml otopine B (točka 4.2.). Dodajte 2 kapi otopine E (točka 4.5.) i ostavite stajati 30 minuta. Ekstrahirajte boju pomoću 2,5 ml butanola (točka 4.10.). Po potrebi ponovite ekstrakciju boje. Nakon separacije bacite butanol. Ova se otopina može držati u hladnjaku nekoliko dana. Prije upotrebe još jednom razvijte i ekstrahirajte boju.

4.3.2. Pipetom odmjerite i izlijte 1 ml ove otopine u 100-mililitarsku volumetrijsku tikvicu i do punog volumena dolijte otopinu A. Ovu pufersku otopinu napravite neposredno prije upotrebe.

4.4. Otopina D

Precipitator.

Otopite 3,0 g cinkovog (II) sulfata (ZnSO4.7H2O) i 0,6 g bakrenog (II) sulfata (CuSO4.5 H2O) u vodi i do 100 ml dolijte vodu.

4.5. Otopina E

Gibbov reagens.

Otopite 0,040 g 2,6-dibromkinona 1,4 – kloromida (O.C6H2Br2.NCl) u 10 ml 96 %-tnog etanola. Ovu otopinu čuvajte u hladnjaku u boci od tamnog stakla. Bacite ovaj reagens kad izgubi boju.

4.6. Pufer za razrjeđivanje boje

Razrijedite 10 ml otopine B (točka 4.2.), pufera za razvijanje boje, do 100 ml vodom.

4.7. Otopina bakrenog sulfata

Otopite 0,05 g bakrenog (II) sulfata (CuSO4.5H2O) u vodi i dodajte vodu do 100 ml.

4.8. Standardna otopina fenola

Otopite 0,200 ± 0,001 g čistog fenola u vodi i dodajte vode do 100 ml u volumetrijskoj tikvici. Ova se otopina može čuvati u hladnjaku nekoliko mjeseci. Razrijedite 10 ml ove otopine do 100 ml vodom. Ova razrijeđena otopina sadrži 200 μg fenola u 1 ml i može se koristiti za pripremu jače razrijeđenih otopina.

4.9. Prokuhana destilirana voda.

4.10. n-butanol.

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Vodena kupelj s termostatskom regulacijom, podešena na 37 °C ± 1 °C.

5.3. Spektrofotometar pogodan za očitavanje pri valnoj dužini od 610 nm.

5.4. Filtarski papir (Schleicher i Schull 595, Whatman 42 ili filtarski papir jednake kvalitete).

5.5. Vodena kupelj, kipuća.

5.6. Aluminijska folija.

6. POSTUPAK

Mjere opreza:

1. Izbjegavajte direktno izlaganje sunčevom svjetlu.

2. Sve stakleno posuđe i pribor, čepovi i materijal za odstranjivanje moraju biti savršeno čisti. Preporučuje se da se isperu i prokuhaju u vodi ili da se tretiraju parom.

3. Izbjegavajte upotrebu plastičnih materijala (na primjer čepova) budući da oni mogu sadržati fenole.

4. Slina sadrži fosfatazu; zato se kontaminacija tragovima sline mora pažljivo izbjegavati.

6.1. Priprema uzorka

6.1.1. Odvagnite, s točnošću od 0,1 g, 10 g uzorka i otopite ga u 90 ml vode. Temperatura za otapanje praha ni u kojem slučaju ne smije prijeći 35 °C.

6.2. Određivanje

6.2.1 U svaku epruvetu stavite 1 ml rekonstituiranog mlijeka pripremljenog prema opisu u točki 6.1.1.

6.2.2. Zagrijavajte jednu od epruveta u kipućoj vodi dvije minute. Aluminijskom folijom (točka 5.6.) prekrijte epruvetu i vodenu kupelj (točka 5.5.) ili, na primjer, čašu s aluminijskom folijom, da biste osigurali zagrijavanje cijele epruvete. U hladnoj vodi rashladite na sobnu temperaturu. Ovu epruvetu upotrijebite za slijepu probu. Za sve kasnije operacije tretirajte obje epruvete jednako.

6.2.3. Dodajte 10 ml otopine C (točka 4.3.2.). Promiješajte i stavite epruvetu u vodenu kupelj na 37 °C (točka 5.2.).

6.2.4. Inkubirajte 60 minuta u vodenoj kupelji uz povremeno protresanje.

6.2.5. Epruvete odmah prebacite u kipuću vodenu kupelj (točka 5.5.) i zagrijavajte dvije minute; rashladite na sobnu temperaturu u hladnoj vodi.

6.2.6. Dodajte 1 ml otopine D (točka 4.4.), promiješajte i profiltrirajte kroz suhi filtarski papir; prve filtrate bacajte dok ne dobijete čistu tekućinu.

6.2.7. Stavite po 5 ml svakog od filtrata u epruvete, dodajte 5 ml otopine B (točka 4.2.) i 0,1 ml otopine E (točka 4.5.). Primiješajte.

6.2.8. Pustite da se boja razvija 30 minuta na sobnoj temperaturi, ne izlažući tekućinu izravnom sunčevom svjetlu.

6.2.9. Izmjerite optičku gustoću otopine uzorka, prema slijepom uzorku, pri valnoj dužini navedenoj u točki 5.3.

6.2.10. Određivanje ponovite ako je optička gustoća otopine veća od optičke gustoće standardnog uzorka s 20 μg fenola, pripremljenog u skladu s točkom 7.

Ako je ova granica prijeđena, razrijedite odgovarajuću količinu rekonstituiranog mlijeka u skladu s točkom 6.1.1. s odgovarajućom količinom ovog mlijeka koje ste pažljivo prokuhali kako je navedeno u točki 6.2.2., da biste neutralizirali prisutnu fosfatazu.

7. IZRADA STANDARDNE KRIVULJE

7.1. Odmjerite pipetom 1, 3, 5 odnosno 10 ml standardne otopine razrijeđene prema točki 4.8. u četiri volumetrijske tikvice od 100 ml i do oznake volumena dopunite vodom; dobivene otopine sadrže 2, 6, 10, odnosno 20 μg fenola po mililitru.

7.2. Odmjerite pipetom 1 ml vode odnosno po 1 ml svake standardne otopine (točka 7.1.) u epruvete da biste dobili seriju uzoraka koji sadrže 0 (slijepa vrijednost dobivena upotrebom 1 ml vode) – 2 – 6 – 10 i 20 μg fenola.

7.3. U svaku epruvetu za redom odmjerite pipetom po 1 ml otopine bakrenog (II) sulfata (točka 4.7.), 5 ml puferske otopine za razrjeđivanje boje, 3 ml vode i 0,1 ml otopine E (točka 4.5.). Promiješajte.

7.4. Epruvete ostavite stajati 30 minuta na sobnoj temperaturi ne izlažući ih izravnom sunčevom svjetlu.

7.5. Izmjerite apsorbanciju otopine u svakoj od epruveta, uspoređujući dobivenu vrijednost sa slijepom vrijednošću, pri valnoj dužini navedenoj u točki 5.3.

7.6. Napravite standardnu krivulju ucrtavajući vrijednosti apsorbancije prema količinama fenola u μg kako je navedeno u točki 7.2.

8. ISKAZIVANJE REZULTATA

8.1. Izračunavanje

8.1.1. Vrijednosti određene u skladu s točkom 6.2.9. pretvorite u μg fenola služeći se standardnom krivuljom.

8.1.2. Izračunajte aktivnost fosfataze izražene u μg fenola po ml rekonstituiranog mlijeka prema sljedećoj formuli:

Aktivnost fosfataze = 2,4 × P

pri čemu je P = količina fenola u μg prema točki 8.1.1.

8.1.3. Ako je potrebno razrjeđivanje kako je navedeno u točki 6.2.10., pomnožite rezultat dobiven u skladu s točkom 8.1.2. s faktorom razrjeđenja.

8.2. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 2 μg fenola oslobođenog iz 1 ml rekonstituiranog mlijeka.

METODA 8.: ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI FOSFATAZE

(ASCHAFFENBURGOV I MÜLLENOV POSTUPAK)

1. OPSEG I POLJE PRIMJENE

Ova metoda opisuje određivanje aktivnosti fosfataze u:

— osušenom mlijeku s visokim sadržajem masti ili mlijeku u prahu s visokim sadržajem masti,

— osušenom punomasnom mlijeku ili punomasnom mlijeku u prahu,

— osušenom djelomično obranom mlijeku ili djelomično obranom mlijeku u prahu,

— osušenom obranom mlijeku ili obranom mlijeku u prahu.

2. DEFINICIJA

Aktivnost fosfataze osušenog mlijeka je mjera količine aktivne alkalne fosfataze koja je prisutna u proizvodu. Izražava se kao količina p–nitrofenola u mikrogramima oslobođenim iz 1 ml rekonstituiranog mlijeka, u opisanim uvjetima.

3. PRINCIP

Rekonstituirani uzorak se razrijedi s puferskim supstratom pri pH 10,2 i inkubira na temperaturi od 37 °C dva sata. Bilo kakva alkalna fosfataza prisutna u uzorku će u tim okolnostima osloboditi p-nitrofenol iz dodanog dinatrij p-nitrofenil fosfata. Oslobođeni p-nitrofenol se određuje izravnom usporedbom sa standardnim obojenim stakalcima u jednostavnom komparatoru, uz primjenu reflektiranog svjetla.

4. REAGENSI

4.1. Puferska otopina natrijeva karbonatna-bikarbonatna.

U volumetrijskoj tikvici otopite u vodi 3,5 g bezvodnog natrijevog karbonata i 1,5 g natrijevog bikarbonata i razrijedite vodom do 1 000 ml.

4.2. Puferski supstrat

Otopite 1,5 g dinatrij p-nitrofenil fosfata u puferskoj otopini natrijeva karbonata-bikarbonata (4.1) u volumetrijskoj tikvici i do 1 000 ml dopunite puferom (točka 4.1). Ova je otopina stabilna ako se čuva u hladnjaku (≤ 4 °C) mjesec dana, ali na tako pohranjenim otopinama se mora provoditi kontrolno ispitivanje boje – vidjeti točku 6., mjera opreza broj 3.

Otopine za bistrenje.

4.3.1. Otopina cinkovog sulfata.

U volumetrijskoj tikvici otopite 30,0 g cinkovog sulfata (ZnSO4) u vodi i do 100 ml razrijedite vodom.

4.3.2. Otopina kalijevog heksacijanoferata (II).

U volumetrijskoj tikvici otopite 17,2 g kalijevog heksacijanoferata (II) trihidrata (K4Fe(CN)6.3H2O) i do 100 ml razrijedite vodom.

5. APARATURA I PRIBOR

5.1. Analitička vaga

5.2. Vodena kupelj, termostatski regulirana, podešena na 37 °C ± 1 °C.

5.3. Komparator s posebnim diskom koji sadrži standardna obojena stakalca kalibrirana u μg p-nitrofenola na 1 ml mlijeka i kivete dimenzija 2 × 25 mm.

6. POSTUPAK

Mjere opreza:

1. Nakon upotrebe epruvete se moraju isprazniti, isprati vodom, oprati u vrućoj vodi koja sadrži alkalni deterdžent, nakon čega slijedi temeljito ispiranje čistom vrućom tekućom vodom. Na kraju se prije upotrebe moraju isprati vodom i osušiti. Pipete se moraju temeljito isprati čistom hladnom tekućom vodom odmah nakon upotrebe, nakon čega slijedi ponovno ispiranje vodom i sušenje prije upotrebe.

2. Čepovi epruveta se moraju temeljito isprati vrućom tekućom vodom odmah nakon upotrebe, nakon čega se dvije minute kuhaju u vodi.

3. Otopina puferskog supstrata (točka 4.2.) bi trebala ostati stabilna najmanje mjesec dana ako se čuva u hladnjaku na 4 °C ili manje. Svaka nestabilnost se pokaže tako da se pojavi žuta boja. Dok se test uvijek očitava prema prokuhanom kontrolnom uzorku koji sadrži istu otopinu puferskog supstrata, preporučuje se da se ta otopina ne koristi ako je vrijednost boje veća od 10 μg kad se očita u 25-milimetarskoj kiveti komparatora prema destiliranoj vodi u drugoj 25-milimetarskoj kiveti.

4. Upotrijebite zasebnu pipetu za svaki uzorak i izbjegavajte kontaminaciju pipete slinom.

5. Ovaj se test nikada ne smije izlagati direktnom sunčevom svjetlu.

6.1. Priprema uzorka

Otopite 10 g praha u 90 ml vode. Temperatura pri kojoj se otapa prah ne smije biti veća od 35 °C.

6.2. Određivanje

6.2.1. Pipetom odmjerite 15 ml puferskog supstrata (točka 4.2.) u čistu, suhu epruvetu, nakon čega dodajte 2 ml rekonstituiranog uzorka (točka 6.1.) koji se ispituje. Začepite epruvetu, promiješajte obrtanjem i stavite u vodenu kupelj (točka 5.2.) zagrijanu na 37 °C.

6.2.2. Istodobno stavite u vodenu kupelj kontrolnu epruvetu s 15 ml puferskog supstrata i 2 ml prokuhanog rekonstituiranog uzorka, sličnog onomu koji se ispituje.

6.2.3. Nakon dva sata izvadite obje epruvete iz vodene kupelji, dodajte 0,5 ml cinkovog sulfata za taloženje (točka 4.3.1), ponovo stavite čep, energično promućkajte i ostavite stajati tri minute. Dodajte 0,5 ml kalijevog heksacijanoferata (II) za taloženje (točka 4.3.2.) dobro promiješajte i profiltrirajte kroz naborani filtarski papir (točka 5.4.) i skupite bistri filtrat u čistu epruvetu.

6.2.4. Prebacite filtrat u 25-milimetarsku kivetu i usporedite prema filtratu prokuhanog kontrolnog uzorka u komparatoru, upotrebljavajući poseban disk (točka 5.3.)

7. ISKAZIVANJE REZULTATA

7.1. Izračunavanje

Neposredno očitanje koje dobijete u skladu s točkom 6.2.4. bilježi se kao μg p-nitrofenola po ml uzorka ili po ml rekonstituiranog uzorka.

7.2. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju određivanja koja je istodobno ili u brzom slijedu na istom uzorku u istim uvjetima obavio isti analitičar, ne smije biti veća od 2 μg p-nitrofenola oslobođenog iz 1 ml rekonstituiranog mlijeka.