5.

Prilog IV. zamjenjuje se sljedećim: „ PRILOG IV. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VOSKA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM 1. PREDMET Ova metoda opisuje postupak za određivanje sadržaja voska u maslinovim uljima. Voskovi se odvajaju prema broju njihovih atoma ugljika. Metoda se posebno može koristiti za razlikovanje maslinovog ulja dobivenog prešanjem i onog dobivenog ekstrakcijom (ulje komine maslina). 2. PRINCIP Dodaje se odgovarajući interni standard masti ili ulju, potom frakcioniramo pomoću kromatografije na hidratiziranoj koloni od silikagela. Frakcija koja je u početku eluirana u uvjetima testiranja, (čija je polarnost slabija od polarnosti triglicerida), vraća se i neposredno analizira kapilarnom plinskom kromatografijom. 3. OPREMA 3.1 Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml. 3.2. Staklena kolona za plinsku kromatografiju, unutarnjeg promjer 15,0 mm, dužine 30 do 40 cm, s pipcem. 3.3. Odgovarajući plinski kromatograf s kapilarnom kolonom, opremljen sustavom za neposredno uvođenje u kolonu koji se sastoji od sljedećeg: 3.3.1. Termostatska komora za kolone, opremljena regulatorom temperature. 3.3.2. Hladni injektor za izravno unošenje u kolonu. 3.3.3. Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom. 3.3.4. Snimač-integrator kompatibilan s pretvaračem s pojačalom (3.3.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira. (Također je moguće koristiti kompjutorizirane sustave koji omogućavaju dobivanje podataka o plinskoj kromatografiji putem osobnog računala.) 3.3.5. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona dužine 8 do 12 m, unutarnjeg promjera od 0,25 do 0,32 mm, s tekućom fazom, s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm. (Na tržištu su dostupne tekuće faze pogodne za tu svrhu tipa SE-52 ili SE-54.) 3.4. Mikroštrcaljka za izravno unošenje u kolonu volumena 10 μl s čvrsto fiksiranom iglom. 3.5. Električna tresilica. 3.6. Rotirajući isparivač. 3.7. Visokotemperaturna peć. 3.8. Analitička vaga sa zajamčenom preciznošću od ± 0,1 mg. 3.9. Uobičajeno laboratorijsko stakleno suđe. 4. REAGENSI 4.1. Silikagel veličine zrna između 60 i 200 μm. Silikagel staviti na četiri sata u peć na 500 °C. Nakon hlađenja, dodati 2 % vode u odnosu na količinu uzorkovanog silikagela. Dobro protresti da se suspenzija homogenizira. Čuvati na tamnom mjestu najmanje 12 sati prije uporabe. 4.2. n-heksan, za kromatografiju. 4.3. dietilni eter, za kromatografiju. 4.4. n-heptan, za kromatografiju. 4.5. Standardna otopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/v) u heksanu (interni standard). (Moguće je koristiti palmitil palmitat ili miristil stearat.) 4.5.1. Sudan 1 (1-fenil-azo-2-naftol). 4.6. Plin nosač: vodik ili helij, plinsko-kromatografska čistoća. 4.7. Pomoćni plinovi: — vodik, čistoće za plinsku kromatografiju, — zrak, čistoće za plinsku kromatografiju. 5. POSTUPAK 5.1. Priprema kromatografske kolone. Otopiti 15 g silikagela (4.1.) u n-heksanu (4.2.) i unijeti u kolonu (3.2.). Ostaviti da se samo slegne. Dovršiti taloženje pomoću električne tresilice (3.5.) kako bi se postigao što ujednačeniji kromatografski sloj. Propustiti 30 ml n-heksana kako bi se odstranile sve eventualne nečistoće. Korištenjem vage (3.8.) odvagati točno 500 mg uzorka u Erlenmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.), dodati odgovarajuću količinu internog standarda (4.5.), ovisno o pretpostavljenom sadržaju voska. Na primjer, dodati 0,1 mg lauril arahidata za maslinovo ulje i 0,25 do 0,5 mg za ulje komine maslina. Prenijeti pripravljen uzorak na kromatografsku kolonu pomoću dva puta po 2 ml n-heksana (4.2.). Otapalo ispuštati dok ne dostigne 1 mm iznad gornje razine absorbenta, potom filtrirati daljnjih 70 ml n-heksana kako bi se uklonili prirodno prisutni n-alkani. Potom započeti kromatografsko eluiranje sakupljanjem 180 ml mješavine n-heksana/dietilnog etera (omjer 99:1), pri brzini protoka od oko 15 kapi svakih 10 sekundi. Eluiranje uzorka se izvodi na sobnoj temperaturi pri 22 ± 4 °C. BILJEŠKA: — Mješavina n-heksana/dietilnog etera, (99:1), priprema se svakodnevno. — Za vizualnu provjeru ispravnog eluiranja voskova, može se dodati 100 μm 1 % sudana iz elucijske mješavine u uzorak u otopini. S obzirom da bojilo ima retenciju između voskova i triglicerida, kad obojenje dostigne dno kolone, elucijsku otopinu treba otopiti jer će tada svi voskovi biti eluirani. Osušiti tako dobivenu frakciju u rotirajućem isparivaču (3.6.) dok se ne ukloni gotovo svo otapalo. Ukloniti preostala 2 ml otpala pomoću slabe struje dušika; potom dodati 2-4 ml n-heptana. 5.2. Analiza plinskom kromatografijom 5.2.1. Pripremne radnje Postaviti kolonu na plinski kromatograf (3.3) spajajući ulazni otvor na sustav neposredno na koloni i izlazni otvor na detektor. Obaviti opću provjeru plinskog kromatografa (funkcioniranje protoka plina, učinkovitost detektora i snimača itd.). Ako se kolona koristi po prvu put, potrebno ju je najprije kondicionirati. Pustiti da kroz kolonu proteče malo plina, potom uključiti plinski kromatograf. Postupno zagrijavati do dostizanja temperature od 350 °C nakon približno četiri sata. Održavati temperaturu najmanje dva sata te potom regulirati aparat na radne uvjete, (reguliranje protoka plina, paljenje plamena, spoj na elektronički snimač (3.3.4), prilagođavanje temperature peći za kolonu, prilagođavanje detektora itd.), i zapisati signal pri osjetljivosti koja je najmanje dvostruka od one koju zahtijeva analiza. Bazna linija mora biti linearna, bez pikova i bez bilo kakvih znakova otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje da spojevi kolone nisu dobro postavljeni; pozitivan otklon da kolona nije pravilno kondicionirana. 5.2.2. Odabir radnih uvjeta Radni uvjeti su uglavnom sljedeći: — temperatura kolone: 20 °C/minuti 5 °C/minuti 20 °C/minuti Inicijalno 80 °C (1’) → 240 °C → 325 °C (6’) → 340 °C (10’) — temperatura detektora: 350 °C, — količina ubrizgane tvari: 1 μl otopine n-heptana (2-4ml), — plin nosač: helij ili vodik pri ispravnoj linearnoj brzini za odabrani plin (vidjeti Dodatak), — osjetljivost instrumenta: pogodno za sljedeće uvjete: Uvjete se može modificirati u skladu s karakteristikama kolone i plinskog kromatografa kako bi se dobilo odvajanje svih voskova i zadovoljavajuća rezolucija pika, (vidjeti sliku); retencijsko vrijeme internog standarda C32 mora biti 18 ± 3 minute. Najreprezentativniji pik voska mora biti najmanje 60 % pune skale. Parametre za integraciju pikova potrebno je odrediti na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira. BILJEŠKA: Zbog visoke konačne temperature, dopušten je pozitivan otklon od najviše 10 % pune skale. 5.3. Provođenje analize Pomoću mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl otopine; klip štrcaljke izvući dok se igla ne isprazni. Iglu uvesti u sustav za injektiranje i nakon 1-2 sekunde brzo injektirati; nakon otprilike pet sekundi, lagano izvući iglu. Bilježiti sve dok voskovi nisu u potpunosti eluirani. Bazna linija u svakom trenutku mora zadovoljavati tražene uvjete. 5.4. Identificiranje pikova Pikovi se identificiraju pomoću retencijskih vremena uspoređivanjem s mješavinama voskova čije je retencijsko vrijeme poznato, a koji su analizirani u istim uvjetima. Na slici je prikazan kromatogram voskova djevičanskog maslinovog ulja. 5.5. Ocjena količina Pomoću integratora odrediti površine pikova koje odgovaraju internom standardu i alifatskim esterima od C40 do C46. Izračunati sadržaj voska svakog pojedinog estera u mg/kg masti određujemo prema sljedećoj formuli: ester, mg/kg = pri čemu je: Ax = površina pika svakog estera, u kvadratnim milimetrima; As = površina pika internog standarda, u kvadratnim milimetrima; ms = masa dodanog internog standarda, u miligramima; m = masa uzorka za analizu, u gramima. 6. ISKAZIVANJE REZULTATA Iskazati ukupan sadržaj različitih voskova C40 do C46 u mg/kg masti (ppm). BILJEŠKA: Sastojci koje treba kvantificirati se odnose na pikove s brojevima parova ugljika između C40 do C46 estera, korištenjem primjera kromatograma voska maslinovog ulja prikazanog na donjoj slici. U slučaju da se C46 ester pojavi dva puta, preporuča se da se za njegovu identifikaciju analizira frakcija voskova ulja komine maslina gdje je pik C46 jednostavno identificirati jer je u očiglednoj većini. Rezultati trebaju biti izraženi na jednu decimalu. Slika Kromatogram voskova maslinovog ulja (9) Dodatak Određivanje linearne brzine plina U plinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se 1-3 μl metana (ili propana). Mjeri se vrijeme potrebno za protok plina kroz kolonu od trenutka injektiranja do pojave pika (tM). Linearna brzina u cm/s zadana je formulom L/tM, pri čemu je L duljina kolone u cm, a tM je vrijeme mjereno u sekundama.;