2.

Dodaje se sljedeći dio D: „D. Metoda umjetne probave na magnetskoj miješalici za skupne uzorke/„s izdvajanjem na filtru” i otkrivanje ličinki pomoću lateks aglutinacijskog testa. Ova se metoda smatra ekvivalentnom samo za pretraživanje mesa domaće svinje. 1. Oprema i reagensi (a) Nož ili škare i pincete za rezanje uzorka. (b) Podlošci razdijeljeni na 50 kvadrata od kojih se u svaki može staviti uzorak od oko 2 g mesa, ili druga oprema koja pruža jednaka jamstva u odnosu na sljedivost uzoraka. (c) Sjeckalica s oštrom oštricom za usitnjavanje. Ako su uzorci veći od 3 g mora se koristiti uređaj za mljevenje mesa s otvorima veličine 2 – 4 mm ili škare. U slučaju zamrznutog mesa ili jezika (nakon uklanjanja površinskog sloja koji se ne može probaviti) potreban je uređaj za mljevenje mesa a veličina uzorka se mora znatno povećati. (d) Magnetske miješalice s termostatski kontroliranom pločom za zagrijavanje i štapićima za miješanje presvučenim teflonom dužine otprilike 5 cm. (e) Staklene posude zapremnine 3 litre. (f) Sita, vanjskog promjera 11 cm, s mrežicom od nehrđajućeg čelika čiji su otvori promjera 180 mikrona. (g) Čelični uređaj za filtraciju s filtrom pora 20 μm i čeličnim lijevkom. (h) Vakuum pumpa. (i) Metalne ili plastične posude, zapremnine 10 – 15 litara, za prikupljanje probavnog soka. (j) 3D klackalica. (k) Aluminijska folija. (l) 25 % klorovodična kiselina. (m) Pepsin, aktivnosti 1: 10 000 NF (US National Formulary) što odgovara 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia) i 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation), ili stabilizirani tekući pepsin s najmanje 660 European Pharmacopoeia jedinica/ml. (n) Voda iz vodovoda zagrijana na 46 – 48 °C. (o) Vaga s točnošću od 0,1 g. (p) Pipete različitih zapremnina (1, 10 i 25 ml), mikropipete prema uputama proizvođača lateks aglutinacije i pipetori. (q) Najlonski filtri s porama od 20 mikrona s promjerom koji odgovara filtracijskom sustavu. (r) Plastične ili čelične pincete od 10 – 15 cm. (s) Konične posudice od 15 ml. (t) Tučak s teflonskim ili čeličnim vrhom koji odgovara koničnoj posudici. (u) Termometar s točnošću od 0,5 °C s mjernim rasponom od 1 – 100 °C. (v) Lateks aglutinacijska karta u sklopu Trichin-L antigen test kita validirane pod oznakom br. EURLP_D_001/2011. (w) Pufer s konzervansom (razrjeđivač za uzorak) u sklopu Trichin-L antigen test kita validirane pod oznakom br. EURLP_D_001/2011. (x) Pufer s konzervansom (negativna kontrola) u sklopu Trichin-L antigen test kita validirane pod oznakom br. EURLP_D_001/2011. (y) Pufer s dodatkom Trichinella spiralis antigena i konzervansom (pozitivna kontrola) u sklopu Trichin-L antigen test kita validiranog pod oznakom br. EURLP_D_001/2011. (z) Pufer s polistirenskim kuglicama obloženim protutijelima s konzervansom (lateks kuglice) u sklopu Trichin-L antigen test kita validirane pod oznakom br. EURLP_D_001/2011. (aa) Štapići za jednokratnu upotrebu. 2. Prikupljanje uzoraka Kako je propisano u poglavlju I. dio 2. 3. Postupak I. Za skupni uzorak (u ukupnoj količini od 100 g uzoraka istodobno) mora se primijeniti postupak naveden u točkama (a) do i. poglavlja I. broja 3. dijela I. Dodatno se mora primijeniti slijedeći postupak: (a) Najlonski filtar, pora 20 mikrona, postavlja se na držač filtra. Konični čelični filtracijski lijevak se pričvršćuje na držač filtra, a čelični filtar promjera pora 180 mikrona se postavlja na lijevak. Vakuum pumpa se spoji preko držača filtra sa metalnom ili plastičnom posudom koja služi za sakupljanje probavne tekućine. (b) Miješanje se zaustavlja i probavna tekućina se filtrira kroz filtar u lijevak. Posuda se ispire s 250 ml tople vode. Tekućina za ispiranje mora se uliti u sustav za filtraciju nakon što je probavna tekućina filtrirana. (c) S pincetom uzeti filtracijsku membranu držeći je za rub. Presavinuti filtracijsku membranu na četiri dijela i staviti u koničnu posudu od 15 ml. (d) Filtracijska membrana se potisne do dna konične posude od 15 ml pomoću tučka i čvrsto pritisne te pomiče stalnim pokretima tučka naprijed nazad koji se nalazi iznutra u presavijenoj filtracijskoj membrani, u skladu s uputama proizvođača. (e) Pipetom se dodaje razrjeđivač u koničnu posudu od 15 ml te se filtracijska membrana homogenizira tučkom stalnim laganim pokretima naprijed nazad, izbjegavajući nagle pokrete kako bi se spriječilo prskanje tekućine, u skladu s uputama proizvođača. (f) Svaki uzorak, negativna kontrola i pozitivna kontrola, pipetama rasporedi u različita polja aglutinacijske karte, u skladu s uputama proizvođača. (g) Lateks kuglice dodaju se pipetom u svako polje aglutinacijske karte, u skladu s uputama proizvođača, pri čemu ona ne smiju doći u dodir s uzorcima i kontrolama. U svakom polju lateks kuglice oprezno se miješaju štapićima za jednokratnu upotrebu sve dok homogenizirana tekućina ne prekrije cijelo polje. (h) Aglutinacijska karta se stavi na 3D klackalicu i klacka se u skladu s uputama proizvođača. (i) Nakon isteka vremena prema uputama proizvođača, klackanje se prekida i aglutinacijska karta stavlja se na ravnu površinu i očitavaju se rezultati reakcije. U slučaju pozitivnog nalaza, moraju se pojaviti aglutinirane čestice. U slučaju negativnog nalaza, otopina ostaje homogena bez aglutinacije. (j) Između svake pretrage sva oprema koja je bila u kontaktu s mesom mora se pažljivo dekontaminirati umakanjem na nekoliko sekundi u vruću vodu (60 – 90 °C). Površine na kojima je moglo zaostati meso ili inaktivirane ličinke mogu se očistiti čistom spužvom i vodom iz slavine. Kad je postupak jednom dovršen, može se dodati nekoliko kapi deterdženta kako bi se odmastila oprema. Potom se svaki dio mora nekoliko puta temeljito isprati, kako bi se odstranili tragovi deterdženta. (k) Između svake pretrage tučak se mora pažljivo dekontaminirati umakanjem na nekoliko sekundi u najmanje 250 ml vruće vode (60 – 90 °C). Ostaci mesa ili inaktiviranih ličinki koji bi mogli ostati na površini moraju se odstraniti čistom spužvom i vodom iz slavine. Kad je jednom postupak dovršen, može se dodati nekoliko kapi deterdženta kako bi se tučak odmastio. Potom se tučak mora temeljito isprati nekoliko puta kako bi se odstranili tragovi deterdženta. II. Skupni uzorci ukupne težine manje od 100 g, kako je propisano u poglavlju I. broj 3. dio II. Za skupne uzorke težine manje od 100 g, mora se slijediti postupak naveden u poglavlju I. broju 3. dijelu II. III. Pozitivni ili sumnjivi rezultati Kada pregled skupnog uzorka pokaže pozitivan ili sumnjiv rezultat lateks aglutinacije, uzima se daljnji uzorak od 20 g od svake svinje u skladu s poglavljem I. stavkom 2. točkom (a). Uzorci od po 20 g od pet svinja pretražuju se kao skupni uzorak metodom opisanom u točki I. Na taj se način moraju pretražuju uzorci od 20 skupina od po pet svinja. Kada se dobije pozitivan rezultat lateks aglutinacije od neke skupine od pet svinja, uzima se daljnji uzorak od 20 g od svake pojedine svinje iz te skupine i svaki se pretražuje zasebno uz primjenu metoda opisanih u poglavlju I. Uzorci parazita moraju se držati u 90 %-tnom etilnom alkoholu za konzerviranje i identificiranje na razini vrste uzročnika u referentnom laboratoriju EU-a ili nacionalnom referentnom laboratoriju. Nakon sakupljanja parazita, pozitivne tekućine moraju se dekontaminirati zagrijavanjem na najmanje 60 °C.”