PROVEDBENA ODLUKA KOMISIJE (EU) 2015/1554

оd 11. rujna 2015.

o utvrđivanju pravila za primjenu Direktive 2006/88/EZ u pogledu zahtjeva u vezi s nadziranjem i dijagnostičkih metoda

(priopćeno pod brojem dokumenta C(2015) 6188)

(Tekst značajan za EGP)

EUROPSKA KOMISIJA,

uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 2006/88/EZ od 24. listopada 2006. o zahtjevima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te o sprečavanju i kontroli određenih bolesti akvatičnih životinja (1), a posebno njezin članak 49. stavak 3., članak 50. stavak 4., članak 57. točku (b) i članak 61. stavak 3.,

budući da:

U tom pogledu, za mnoge bolesti s popisa u Akvatičnom priručniku navedeno je nekoliko testova i postupaka kojima se potrebno služiti u svrhu laboratorijskih pretraživanja. Kako bi se na razini Unije ujednačila znanstvena osnova za dijagnosticiranje bolesti s popisa, potrebno je odabrati među dijagnostičkim testovima i postupcima koje je preporučio OIE i odrediti koji bi testovi trebali biti obvezni za laboratorijsko pretraživanje pri provedbi programa nadziranja te u svrhu isključivanja sumnje ili potvrđivanja prisutnosti bolesti s popisa. U određenim slučajevima bit će potrebno imati na raspolaganju alternativne metode i postupke te bi trebalo osigurati opis i određena znanstvena objašnjenja uvjeta i načina primjene tih metoda. To se posebno odnosi na detaljnije dijagnostičke postupke.

DONIJELA JE OVU ODLUKU:

Članak 1.

Predmet

Ovom se Odlukom utvrđuju pravila za sljedeće:

(c)

Članak 2.

Definicije

Za potrebe ove Odluke primjenjuju se sljedeće definicije:

(c)

Članak 3.

Minimalni zahtjevi za programe iskorjenjivanja i nadziranja

Države članice dužne su osigurati da se u slučaju odobravanja, povlačenja ili ponovnog uspostavljanja statusa područja slobodnog od bolesti za državu članicu ili njezinu zonu ili kompartment za jednu ili više bolesti s popisa poštuju pravila o programima nadziranja i iskorjenjivanja, zonama ograničenja, uzorkovanju i dijagnostičkim metodama iz Priloga I. te posebne metode i detaljni postupci iz Priloga II.

Članak 4.

Minimalni zahtjevi za dijagnostičke metode i posebne postupke

Države članice dužne su osigurati da se pri obavljanju laboratorijskih pretraživanja radi otklanjanja sumnje na bolest s popisa ili potvrđivanja prisutnosti bolesti s popisa poštuju metode kontrole iz Priloga I. i posebne dijagnostičke metode i detaljni postupci iz Priloga II.

Članak 5.

Minimalne mjere kontrole za suzbijanje bolesti s popisa i minimalni zahtjevi za ukidanje mjera za suzbijanje bolesti u državama članicama, zonama ili kompartmentima koji nisu proglašeni slobodnima od bolesti s popisa

Države članice dužne su osigurati da se pri provođenju mjera kontrole i ukidanju mjera za suzbijanje jedne ili više bolesti s popisa u državi članici ili njezinoj zoni ili kompartmentu koji nisu proglašeni slobodnima od tih bolesti s popisa poštuju minimalne mjere kontrole i minimalni zahtjevi za ukidanje mjera za suzbijanje bolesti iz Priloga I.

Članak 6.

Stavljanje izvan snage

Odluke 2001/183/EZ, 2002/878/EZ i 2003/466/EZ stavljaju se izvan snage.

Članak 7.

Datum primjene

Ova Odluka primjenjuje se od 1. travnja 2016.

Članak 8.

Adresati

Ova je Odluka upućena državama članicama.

(1) SL L 328, 24.11.2006., str. 14.

(2) Odluka Komisije 2001/183/EZ od 22. veljače 2001. o utvrđivanju planova uzorkovanja i dijagnostičkih metoda za otkrivanje i potvrđivanje određenih bolesti riba i stavljanju izvan snage Odluke 92/532/EEZ (SL L 67, 9.3.2001., str. 65.).

(3) Odluka Komisije 2003/466/EZ od 13. lipnja 2003. o utvrđivanju kriterija za zoniranje i službeno nadziranje u slučaju pojave sumnje ili potvrđene prisutnosti zarazne anemije lososa (ZAL) (SL L 156, 25.6.2003., str. 61.).

(4) Odluka Komisije 2002/878/EZ od 6. studenoga 2002. o uspostavi planova uzorkovanja i dijagnostičkih metoda za otkrivanje i potvrđivanje prisutnosti bolesti mekušaca bonamioze (Bonamia ostreae) i marteilioze (Marteilia refringens) (SL L 305, 7.11.2002., str. 57.).

(14) Uzorke je potrebno prikupljati i pretraživati tijekom dvaju jednomjesečnih razdoblja ispitivanja (točnije, u proljeće i jesen) ili kad je to potrebno u skladu s praktičnim zahtjevima.

(12) Uzorke je potrebno prikupljati, pohranjivati i pretraživati tijekom dvaju jednomjesečnih razdoblja ispitivanja (točnije, u proljeće i jesen) ili kad je to potrebno u skladu s praktičnim zahtjevima.

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2.1. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, uzgajališta se podvrgava alternativnoj mjeri kojom se pruža gotovo isto jamstvo za iskorjenjivanje WSSV-a iz okruženja uzgajališta;

Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima WSD-om ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

na prijelazno razdoblje do 31. prosinca 2020. rakovima iz država članica, zona ili kompartmenta s odobrenim programom nadziranja WSD-a.

(c)

jedan zdravstveni pregled; u uzgajalištima u kojima su za ispitivanja iz točke i. dobiveni negativni rezultati zdravstveni pregledi nastavljaju se jednom mjesečno u sezoni kad je vjerojatno da će temperatura vode dosegnuti svoje najviše godišnje vrijednosti, sve dok se ne povuče status zaraženog područja u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

kad se tijekom provedbe programa nadziranja utvrđenog u točki (a) zaraza WSSV-om potvrdi u uzgajalištu uključenom u taj program nadziranja te se stoga povuče zdravstveni status kategorije II. uzgajališta, to uzgajalište može odmah povratiti zdravstveni status kategorije II. i nastaviti s provedbom programa nadziranja radi postizanja statusa područja slobodnog od bolesti bez provedbe programa iskorjenjivanja bolesti kako je opisano u točki I.2.2. pod sljedećim uvjetima:

Država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije III. u skladu s dijelom B Priloga III. Direktivi 2006/88/EZ u pogledu WSD-a može postići zdravstveni status kategorije I. u pogledu te bolesti s popisa kad sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. toj Direktivi i koja se nalaze u toj državi članici, zoni ili kompartmentu ispune zahtjeve utvrđene u Prilogu V. toj Direktivi i kad su sva ta uzgajališta i, kad se to zahtijeva drugim podstavkom točke 2. dijela I. Priloga V. Direktivi 2006/88/EZ, točke uzorkovanja divljih populacija odabranih u skladu s tom točkom, podvrgnuta sljedećem dvogodišnjem programu nadziranja koji se sastoji od zdravstvenih pregleda i prikupljanja uzoraka za ispitivanje.

prisutnost Bonamije ostreae smatra se potvrđenom kad se pozitivan rezultat histopatologije, otisaka tkiva ili hibridizacije in situ kombinira s pozitivnim rezultatom PCR-a upotpunjenog sekvenciranjem u skladu s odobrenim metodama i postupcima utvrđenima u dijelu 5. Priloga II.;

tijekom razdoblja od dvije godine nakon provođenja mjera navedenih u točkama (a), (b) i (c) nije bilo potvrde pojave zaraze Bonamijom ostreaeom, a uklonjene su sve sumnje tijekom tog razdoblja, u skladu s postupcima uspostavljenima u točki II.3.

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, uzgajališta se podvrgava alternativnoj mjeri kojom se pruža gotovo isto jamstvo za iskorjenjivanje Bonamije ostreae iz okruženja uzgajališta;

sva uzgajališta ili područja uzgoja mekušaca koja su službeno proglašena zaraženima i sva druga uzgajališta ili područja uzgoja mekušaca u uspostavljenim zaraženim i ugroženim područjima u kojima je provedeno mirovanje poribljavaju se mekušcima koji su podrijetlom iz država članica, zona ili kompartmenta zdravstvenog statusa kategorije I. u pogledu zaraze Bonamijom ostreaeom. Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2. podtočkom (c);

sva uzgajališta i područja uzgoja mekušaca koja su službeno proglašena zaraženima Bonamijom ostreaeom prazne se i u njima se provodi mirovanje te ih se, ako je to moguće, čisti i dezinficira. Razdoblje mirovanja traje najmanje šest tjedana.

(c)

Iskorjenjivanje Bonamije ostreae u većini se slučajeva smatra nemogućim, ali ako država članica procijeni da je to izvedivo, primjenjuje se model programa iskorjenjivanja naveden u nastavku.

(c)

(c)

prisutnost Marteilije refringens smatra se potvrđenom kad se pozitivan rezultat histopatologije, otisaka tkiva ili hibridizacije in situ kombinira s pozitivnim rezultatom PCR-a nastalog sekvenciranjem;

tijekom razdoblja od dvije godine nakon provedbe mjera navedenih u točkama (a), (b) i (c) nije bilo potvrde zaraze Marteilijom refringens, a uklonjene su i sve sumnje tijekom tog razdoblja, u skladu s postupcima uspostavljenima u točki II.3.

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, uzgajališta se podvrgava alternativnoj mjeri kojom se pruža gotovo isto jamstvo za iskorjenjivanje Marteilije refringens iz okruženja uzgajališta;

Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima ispražnjena, očišćena, dezinficirana i njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2. podtočkom (c);

dva mjeseca u slučaju uzgajališta i područja uzgoja mekušaca s neograničenom povezanošću s okolnim vodama pod uvjetom da su zaraženi mekušci prijemljivih vrsta i oni mekušci prijemljivih vrsta koji su epidemiološki povezani sa zaraženim uzgajalištem ili područjem uzgoja mekušaca sakupljeni ili uklonjeni prije razdoblja godine kad je poznato da je prevalencija Marteilije refringens najveća ili, kad to razdoblje nije poznato, prije razdoblja u kojem temperatura vode prijeđe 17 °C;

sva uzgajališta i područja uzgoja mekušaca koja su službeno proglašena zaraženima Marteilijom refringens prazne se i u njima se provodi mirovanje te ih se, ako je to moguće, čisti i dezinficira;

(c)

Iskorjenjivanje Marteilije refringens u većini se slučajeva smatra nemogućim, ali ako država članica procijeni da je to izvedivo, primjenjuje se model programa iskorjenjivanja naveden u nastavku.

(c)

(c)

(c)

otkrivanje virusa ISA-e metodom RT-qPCR, uključujući sekvenciranje gena HE radi potvrde uklanjanja genotipa HPR i

otkrivanje virusa ISA-e metodom RT-qPCR, uključujući sekvenciranje gena HE radi potvrde uklanjanja genotipa HPR te otkrivanje virusa ISA-e tijekom pripreme tkiva upotrebom posebnih protutijela za virus ISA-e (točnije IHC-a na fiksiranim dijelovima ili IFAT-a na otiscima tkiva)

(c)

probiranje uzoraka metodom RT-qPCR, uključujući sekvenciranje gena HE radi potvrde uklanjanja genotipa HPR

(c)

tijekom razdoblja od dvije godine nakon provođenja mjera navedenih u točkama (a), (b) i (c) nije bilo potvrde pojave ISA-e s uklonjenim genotipom HPR, a uklonjene su i sve sumnje tijekom tog razdoblja, u skladu s postupcima uspostavljenima u točki II.3.

to je poribljavanje provedeno tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje ili su podvrgnuta alternativnim mjerama u skladu s točkom (a);

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2.1. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, uzgajališta se podvrgavaju alternativnoj mjeri kojom se pruža gotovo isto jamstvo za iskorjenjivanje ISA-e iz okruženja uzgajališta;

Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

(c)

jedan zdravstveni pregled; u uzgajalištima u kojima su za ispitivanja iz točke i. dobiveni negativni rezultati zdravstveni pregledi nastavljaju se jednom mjesečno sve dok se ne povuče status zaraženog područja u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

Država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije V. u pogledu ISA-e može postići zdravstveni status kategorije I. u pogledu te bolesti s popisa kad su sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. Direktivi 2006/88/EZ u toj državi članici, zoni ili kompartmentu podvrgnuta programu iskorjenjivanja koji je u skladu s točkama od (a) do (e) u nastavku.

(c)

Država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije III. u skladu s dijelom B Priloga III. Direktivi 2006/88/EZ u pogledu ISA-e može postići zdravstveni status kategorije I. u pogledu te bolesti s popisa kad sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. Direktivi 2006/88/EZ i koja se nalaze u toj državi članici, zoni ili kompartmentu ispune zahtjeve utvrđene u Prilogu V. toj Direktivi i kad su sva ta uzgajališta i, kada se to zahtijeva drugim podstavkom točke 2. dijela I. Priloga V. toj Direktivi, točke uzorkovanja divljih populacija odabranih u skladu s tom točkom, podvrgnuta sljedećem programu nadziranja:

(c)

odabiru se samo ugibajuće i svježe uginule ribe, ali ne one koje su u stanju raspadanja; kao prioritet se prikupljaju ribe kod kojih su vidljivi znakovi anemije, krvarenja ili drugi klinički znakovi koji ukazuju na poremećaje u cirkulaciji;

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2.1. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, predmetna se uzgajališta podvrgava alternativnoj mjeri kojom će se pružiti gotovo slično jamstvo za iskorjenjivanje KHV-a iz okruženja uzgajališta;

Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima KHV-om ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

na prijelazno razdoblje do 31. prosinca 2020. ribom iz država članica, zona ili kompartmenta s odobrenim programom nadziranja KHV-a.

(c)

jedan zdravstveni pregled; u uzgajalištima u kojima su za ispitivanja iz točke III.2. dobiveni negativni rezultati zdravstveni pregledi nastavljaju se jednom mjesečno u sezoni kad je vjerojatno da će temperatura vode dosegnuti više od 15 °C sve dok se ne povuče status zaraženog područja u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

ako se tijekom provedbe četverogodišnjeg programa nadziranja utvrđenog u točki (a) zaraza KHV-om potvrdi u uzgajalištu uključenom u taj program nadziranja te se stoga uzgajalištu povuče zdravstveni status kategorije II., to uzgajalište može odmah povratiti zdravstveni status kategorije II. i nastaviti s provedbom programa nadziranja radi postizanja statusa područja slobodnog od bolesti bez provedbe programa iskorjenjivanja bolesti kako je opisano u točki I.2.2. pod uvjetom da to uzgajalište zadovoljava sljedeće uvjete:

država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije III. u pogledu KHV-a može postići zdravstveni status kategorije I. kad su sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. Direktivi 2006/88/EZ i koja se nalaze u toj državi članici, zoni ili kompartmentu u skladu sa zahtjevima u pogledu statusa područja slobodnog od bolesti utvrđenima u Prilogu V. toj Direktivi i kada su sva ta uzgajališta i, kada se to zahtijeva drugim podstavkom točke 2. dijela I. tog Priloga, točke uzorkovanja divljih populacija odabranih u skladu s tim dijelom, podvrgnuta jednom od sljedećih programa nadziranja:

Kad god je to moguće uzorkuju se ribe koje se drži dulje vrijeme na rasponu temperatura koji je povoljan za virus, točnije dva do tri tjedna na temperaturi od 15 °C do 26 °C. Međutim, može se prihvatiti sljedeći pristup:

(c)

(c)

(c)

(c)

U slučaju male mlađi, cijele ribe kraće od 4 cm mogu se usitniti sterilnim škarama ili skalpelom nakon što se ukloni stražnji dio tijela iza crijevnog otvora. Ako uzorak čine cijele ribe dužine tijela od 4 do 6 cm, prikuplja se utroba uključujući bubrege.

(c)

ispunjeni su uvjeti utvrđeni u točki I.2.2.1. podtočkama (a), (b) i (c). Ako provođenje mirovanja nije tehnički moguće, predmetna se uzgajališta podvrgava alternativnoj mjeri kojom se pruža gotovo isto jamstvo za iskorjenjivanje virusa IHN-a ili virusa VHS-a ili oboje iz okruženja uzgajališta;

Poribljavanje se provodi tek nakon što su sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima ispražnjena, očišćena, dezinficirana i u njima je provedeno mirovanje u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

sva uzgajališta koja su službeno proglašena zaraženima VHS-om ili IHN-om ili objema tim bolestima s popisa i sva druga uzgajališta u mirovanju u uspostavljenim zaraženim i ugroženim područjima kako su navedena u točki (c) poribljavaju se ribom koja je podrijetlom iz država članica, zona ili kompartmenta sa zdravstvenim statusom područja slobodnog od bolesti (kategorija I.) u pogledu VHS-a ili IHN-a ili obiju tih bolesti.

(c)

jedan zdravstveni pregled: u uzgajalištima u kojima su za ispitivanja iz točke i. dobiveni negativni rezultati zdravstveni pregledi nastavljaju se jednom mjesečno u razdoblju kad je temperatura vode niža od 14 °C, osim ako su ribnjaci ili kavezi prekriveni ledom, sve dok se ne povuče status zaraženog područja u skladu s točkom I.2.2.1. podtočkom (c);

Država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije V. u pogledu VHS-a ili IHN-a ili obiju tih bolesti može postići zdravstveni status kategorije I. u pogledu tih bolesti s popisa pod uvjetom da su sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. Direktivi 2006/88/EZ u toj državi članici, zoni ili kompartmentu podvrgnuta programu iskorjenjivanja koji je u skladu s točkama od (a) do (e):

ako se tijekom provedbe programa nadziranja navedenog u točki (a) zaraza VHS-om ili IHN-om ili objema tim bolestima potvrdi na uzgajalištu uključenom u taj program nadziranja te se stoga povuče zdravstveni status kategorije II. uzgajališta, to uzgajalište može odmah povratiti svoj zdravstveni status kategorije II. i nastaviti s provedbom programa nadziranja radi postizanja statusa područja slobodnog od bolesti bez provedbe programa iskorjenjivanja bolesti utvrđenog u točki I.2.2. pod uvjetom da to uzgajalište zadovoljava sljedeće uvjete:

država članica, zona ili kompartment zdravstvenog statusa kategorije III. kako je navedeno u dijelu B Priloga III. Direktivi 2006/88/EZ u pogledu VHS-a ili IHN-a ili obiju tih bolesti, može postići zdravstveni status kategorije I. u pogledu tih bolesti s popisa pod uvjetom da su sva uzgajališta koja drže prijemljive vrste navedene u dijelu II. Priloga IV. toj Direktivi i koja se nalaze u toj državi članici, zoni ili kompartmentu u skladu sa zahtjevima utvrđenima u Prilogu V. toj Direktivi i da su sva ta uzgajališta i, kada se to zahtijeva drugim stavkom točke 2. dijela I. Priloga V. toj Direktivi, točke uzorkovanja divljih populacija odabranih u skladu s tim dijelom podvrgnuta jednom od sljedećih programa nadziranja:

(c)

„kopnena zona” znači jasno određeno zemljopisno područje koje se nalazi u kopnenom predjelu jedne ili više država članica, s homogenim hidrološkim sustavom koje obuhvaća dijelove područja vodenog sliva od izvora do prirodne ili umjetne prepreke koja sprečava uzvodnu migraciju akvatičnih životinja iz donjih dijelova područja vodenog sliva, ili cijelo područje vodenog sliva od izvora do ušća, ili više područja vodenih slivova, uključujući njihova ušća, koja su međusobno epidemiološki povezana preko ušća;

(c)

(c)

PRILOG II.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI

I. Uvod

Ovim se Prilogom definiraju podrobni postupci za dijagnostičke metode koje je potrebno upotrebljavati u laboratorijskim pretraživanjima u programima iskorjenjivanja i nadziranja utvrđenima u Prilogu I. ovoj Odluci, a radi potvrđivanja ili otklanjanja sumnje na prisutnost sljedećih neegzotičnih bolesti navedenih u dijelu II. Priloga IV. Direktivi 2006/88/EZ („bolesti s popisa”) u skladu s člankom 57. točkom (b) te Direktive:

1. Virusna hemoragijska septikemija (VHS) Dio 1. 2. Zarazna hematopoetska nekroza (IHN) Dio 1. 3. Koi herpes viroza (KHV) Dio 2. 4. Zarazna anemija lososa (ISA) Dio 3. 5. Zaraza Marteilijom refringens Dio 4. 6. Zaraza Bonamijom ostreaeom Dio 5. 7. Bolest bijelih pjega rakova (WSD) Dio 6.

II. Definicije

Za potrebe ovog Priloga, „transportni medij” znači medij za staničnu kulturu s 10 % telećeg seruma i s 200 IJ penicilina, 200 μg streptomicina i 200 μg kanamicina po mililitru ili s drugim antibioticima dokazane djelotvornosti.

DIO 1.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI ZA NADZIRANJE I POTVRĐIVANJE IHN-a I VHS-a

I. Dijagnostičke metode i postupci za nadziranje VHS-a i IHN-a

Pri uzorkovanju i laboratorijskom pretraživanju koji se provode u svrhu postizanja i održavanja statusa područja slobodnog od bolesti u pogledu IHN-a ili VHS-a kako je utvrđeno u odjeljku I. dijela I. Priloga I. upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u točkama II.1. i II.2. dijela 1. tog Priloga primjenjuju se detaljne dijagnostičke metode i postupci utvrđeni u točkama od I.1. do I.6.

I.1. Pripremanje i slanje uzoraka riba

I.1.1. Tkiva za virološko pretraživanje na staničnoj kulturi

Prije slanja ili prijevoza u laboratorij, dijelovi organa koji će se ispitivati moraju biti uklonjeni iz ribe s pomoću sterilnog pribora za seciranje te preneseni u sterilne plastične epruvete koje sadržavaju transportni medij.

Količina ribljeg materijala prikladnog za virološko pretraživanje na staničnoj kulturi i metodom RT-qPCR ovisi o veličini ribe. Stoga su uzorci koje je potrebno uzorkovati čitava mlađ (duljina tijela < 4 cm), utroba uključujući bubrege (4 cm < duljina tijela < 6 cm) ili, kod većih riba, bubrezi, slezena, srce i/ili encefalon te ovarijalna tekućina uzgojnih riba u trenutku mriještenja.

Ovarijalna tekućina ili dijelovi organa od najviše 10 riba mogu se prikupiti u jednu sterilnu epruvetu koja sadržava najmanje 4 ml transportnog medija i koja predstavlja jedan skupni uzorak. Tkivo u svakom uzorku teži najmanje 0,5 grama (g).

Virološko pretraživanje na staničnoj kulturi mora započeti što je prije moguće, a najkasnije 48 sati nakon prikupljanja uzoraka. U iznimnim slučajevima virološko pretraživanje može započeti najkasnije unutar 72 sata od prikupljanja materijala, pod uvjetom da je materijal za pretraživanje zaštićen transportnim medijem i da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza.

I.1.2. Uzorci za analizu reverznom transkripcijom s lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR ili RT-qPC)

Uzorke se sakuplja od riba u skladu s postupkom opisanim u točki I.1.1. upotrebom sterilnog instrumenta te ih se prebacuje u sterilnu plastičnu epruvetu koja sadržava transportni medij. Tkivo uzeto od najviše 10 riba može se prikupiti u jednu epruvetu, što čini jedan skupni uzorak. Međutim, ako je količina inokuluma mala, moguće je upotrijebiti tkiva od najviše pet riba. Druga je mogućnost objedinjavanje uzoraka u reagensima za stabilizaciju RNA, poput reagensa od 0,2 g tkiva/ml u skladu s preporukom proizvođačâ iako se svaku ribu obrađuje pojedinačno i ne smiju se objediniti uzorci zbog male količine materijala koji se upotrebljava za ekstrakciju.

Moguće je u laboratorij poslati i cijelu ribu.

I.2. Slanje uzoraka riba

Epruvete koje sadržavaju tkivo riba u transportnom mediju za kultivaciju stanica ili analizu RT-PCR/RT-qPCR stavljaju se u izolirane posude, poput kutija od polistirena s debelim stijenkama, zajedno s dovoljnom količinom leda ili drugog rashladnog medija jednakog rashladnog učinka kako bi se osiguralo rashlađivanje uzoraka tijekom prijevoza u laboratorij. Međutim, trebalo bi izbjegavati zamrzavanje uzoraka. Temperatura uzorka tijekom prijevoza ne smije biti viša od 10 °C, a pri njegovu prijemu led mora još uvijek biti prisutan u transportnoj kutiji odnosno jedan ili više rashladnih blokova moraju još uvijek biti djelomično ili u cijelosti zamrznuti.

U laboratorij se mogu poslati cijele ribe pod uvjetom da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza navedeni u prvom stavku. Cijele ribe umataju se u upijajući papir i potom šalju u plastičnim vrećicama. Moguće je poslati i živu ribu.

I.3. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Kad to odobri dijagnostički laboratorij, za dodatna se pretraživanja mogu prikupiti i pripremiti i druga tkiva riba.

I.4. Pripremanje uzoraka za virološko pretraživanje i RT-qPCR

I.4.1. Zamrzavanje u iznimnim slučajevima

Kada je zbog praktičnih poteškoća nemoguće obraditi uzorke u roku od 48 sati nakon prikupljanja uzoraka tkiva riba, uzorci tkiva mogu se zamrznuti u transportnom mediju pri temperaturi od – 20 °C ili nižoj, a virološko pretraživanje obaviti u roku od 14 dana. Međutim, tkivo riba može se prije pretraživanja zamrznuti i otopiti samo jednom. Čuvaju se zapisi s podrobnim razlogom za svako zamrzavanje uzoraka tkiva riba.

I.4.2. Homogenizacija organa

U laboratoriju se tkivo riba iz epruveta potpuno homogenizira u homogenizatoru Stomacher, miješalici ili tarioniku i tučku sa sterilnim pijeskom i potom suspendira u izvornom transportnom mediju.

Ako se uzorak sastoji od cijelih riba kraćih od 4 cm, njih se usitnjava sterilnim škarama ili skalpelom nakon što se ukloni stražnji dio tijela iza crijevnog otvora. Ako uzorak čini cijela riba dužine tijela od 4 do 6 cm, prikuplja se utroba uključujući bubrege. Ako uzorak čini cijela riba dulja od 6 cm, prikupljaju se uzorci tkiva kako je opisano u točki I.1. Uzorke tkiva usitnjava se sterilnim škarama ili skalpelom i homogenizira kako je opisano u prvom stavku ove točke te suspendira u transportnom mediju.

Konačni se omjer tkiva i transportnog medija u laboratoriju postavlja u omjer 1:10.

I.4.3. Centrifugiranje homogenata

Homogenat se centrifugira na brzini od 2 000 do 4 000 × g u trajanju od 15 minuta u centrifugi ohlađenoj pri 2 do 5 °C te se supernatant prikuplja i može obrađivati antibioticima četiri sata na 15 °C ili preko noći na 4 do 8 °C s antibioticima. Ako je uzorak poslan u transportnom mediju, može se izostaviti obrada supernatanta antibioticima.

Ako je zbog praktičnih poteškoća poput kvara inkubatora ili problema sa staničnim kulturama nemoguće inokulirati stanice unutar 48 sati od prikupljanja uzoraka tkiva riba, supernatant se može zamrznuti na temperaturi od – 80 °C, a virološko pretraživanje obaviti unutar 14 dana.

Ako se sakupljeni supernatant pohrani na – 80 °C unutar 48 sati nakon prikupljanja, može se još samo jednom ponovno upotrijebiti za virološko pretraživanje.

Prije inokulacije stanica supernatant se miješa s jednakim dijelovima odgovarajuće razrijeđenih skupina antiseruma za lokalne serotipove virusa zarazne nekroze gušterače (IPN) te se njima inkubira najmanje jedan sat na 15 °C ili najviše 18 sati na 4 °C. Titar antiseruma iznosi najmanje 1/2 000 u 50 % plak neutralizacijskom testu.

Svrha je tretiranja svih inokulata antiserumom za virus IPN-a spriječiti da se u inokuliranim staničnim kulturama razvije citopatogeni učinak (CPU) zbog virusa IPN-a. To će skratiti trajanje viroloških pretraživanja i smanjiti broj slučajeva u kojima bi se pojava CPU-a morala smatrati potencijalnim znakom prisustva virusa VHS-a ili IHN-a.

Kada uzorci dolaze iz proizvodnih jedinica koje se smatraju slobodnima od IPN-a, može se izostaviti tretiranje inokulata antiserumom za virus IPN-a.

I.4.4. Priprema uzoraka za programe nadziranja temeljene na metodama RT-PCR i RT-qPCR

Ako su uzorci prikupljeni u transportnom mediju, provodi se postupak utvrđen u točkama I.4.2. i I.4.3. Nakon centrifuge prikuplja se supernatant i ekstrahira RNA. Ako nije potrebno provesti naknadno pretraživanje neposredno nakon centrifugiranja, uzorke se odmah zamrzava pri temperaturi od – 20 °C ili nižoj.

Za analizu tkiva riba sačuvanog u reagensu za stabilizaciju RNA provode se radnje navedene u nastavku unutar vremenskih okvira navedenih u nastavku na uzorcima pohranjenima pri različitim temperaturama:

uzorci pohranjeni pri 37 °C: jedan dan;

uzorci pohranjeni pri 25 °C: jedan tjedan;

uzorci pohranjeni pri 4 °C: jedan mjesec;

uzorci pohranjeni pri – 20 °C: neograničeno

Sa skupnim uzorcima u reagensu za stabilizaciju RNA postupa se kao s pojedinačnim uzorcima u reagensu za stabilizaciju RNA. Za uzorke objedinjene u reagensu za stabilizaciju RNA količina uzorka ne smije biti veća od one koju preporučuje proizvođač za ekstrakciju RNA kompletima poput kompleta RNeasy Mini Kit (Qiagen) ili sličnog. Ako se objedinjuju veći uzorci, u kompletima za ekstrakciju ili metodama mora se odražavati to objedinjavanje.

Uzorci prikupljeni u reagensima za stabilizaciju RNA ne smiju se upotrebljavati za kultivaciju stanica.

I.4.5. Objedinjavanje uzoraka za RT-qPCR

Budući da su navedeni protokoli za RT-qPCR slične ili više osjetljivosti u usporedbi s metodama kultivacije stanica, moglo bi biti prihvatljivo upotrijebiti supernatant iz homogeniziranog materijala tkiva riba objedinjenog od najviše 10 riba u mediju stanične kulture za PCR. Međutim, zbog mnogo manjeg inokuluma upotrijebljenog za PCR u usporedbi s kultivacijom stanica, sva tkiva riba pažljivo se homogeniziraju prije sparivanja materijala za ekstrakciju.

Jednako se načelo primjenjuje ako se uzorci prikupljaju u reagensu za stabilizaciju RNA. Međutim, u tom je slučaju često teško prikupiti reprezentativan materijal od najviše 10 riba u jednoj epruveti te se broj riba po skupnom uzorku stoga smanjuje na dvije do pet.

I.5. Virološka pretraživanja na staničnoj kulturi

I.5.1. Stanične kulture i mediji

Mlađ ribe Lepomis macrochirus stanične linije – 2 (BF-2) ili gonade kalifornijske pastrve stanične linije – 2 (RTG-2) te stanice Epithelioma papulosum cyprini (EPC) ili Pimephales promelas (FHM) umnožavaju se na temperaturi od 20 do 30 °C u odgovarajućem mediju, točnije Eaglovom minimalnom esencijalnom mediju (MEM) ili njegovim modifikacijama, obogaćenom s 10 % fetalnog goveđeg seruma i antibioticima u standardnim koncentracijama.

Kada se stanice umnožavaju u zatvorenim posudama, medij se puferira bikarbonatom. Medij koji se upotrebljava za kulturu stanica u otvorenim jedinicama može se puferirati tris(hidroksimetil)aminometan-HCL-om (Tris-HCl) (23 mM) i natrijevim bikarbonatom (6 mM). Ph mora biti 7,6 ± 0,2.

Stanične su kulture koje je potrebno upotrijebiti za inokulaciju materijalom tkiva riba mlade, jednoslojne, uobičajeno jedan dan stare stanične kulture, ako je moguće. Međutim, mogu biti prihvatljive i kulture starosti od 4 do 48 sati. Stanice moraju aktivno rasti pri inokulaciji.

I.5.2. Inokulacija staničnih kultura

Suspenzija organa obrađena antibiotikom inokulira se u stanične kulture u dva razrjeđenja, točnije u osnovnom razrjeđenju i, pored toga, njegovu razrjeđenju 1:10, što dovodi do konačnih razrjeđenja tkivnog materijala u staničnoj kulturi 1:100 odnosno 1:1 000 kako bi se spriječila homologna interferencija. Najmanje dvije stanične linije inokuliraju se kako je navedeno u točki I.5.1. Omjer je veličine inokuluma i količine stanične kulture oko 1:10.

Za svako razrjeđenje i svaku staničnu liniju upotrebljava se najmanje oko 2 cm2 površine stanica, što odgovara jednoj jažici na 24-jažičnoj plitici za staničnu kulturu. Plitice za staničnu kulturu upotrebljavaju se kad je to moguće.

I.5.3. Inkubacija staničnih kultura

Inokulirane stanične kulture inkubiraju se sedam do deset dana pri 15 °C. Ako se boja medija za staničnu kulturu promijeni s crvene u žutu, što ukazuje na zakiseljenje medija, pH se prilagođava s pomoću sterilne otopine bikarbonata ili istovrijednim tvarima kako bi se osigurala osjetljivost stanica na virusnu infekciju.

Najmanje svakih šest mjeseci ili ako se sumnja na smanjenu osjetljivost stanica obavlja se titracija zamrznutih pohranjenih virusa VHS-a i IHN-a kako bi se verificirala osjetljivost staničnih kultura na infekciju. Ako je moguće, upotrebljava se postupak utvrđen u odjeljku III.

I.5.4. Mikroskopiranje

Inokulirane stanične kulture redovito se pregledavaju, najmanje tri puta tjedno, pri povećanju od 40 do 150 puta, kako bi se provjerilo je li došlo do pojave citopatogenog učinka (CPU). Ako se opazi očiti citopatogeni učinak (CPU), odmah se počinje s postupkom identifikacije virusa u skladu s točkom I.6.

I.5.5. Supkultiviranje

Ako se nakon primarne inkubacije od sedam do deset dana ne razvije citopatogeni učinak (CPU), provodi se supkultiviranje sa svježim staničnim kulturama korištenjem površine slične površini primarne kulture.

Alikvoti hranjive podloge (supernatant) svih kultura ili jažica koje čine primarnu kulturu objedinjavaju se prema staničnoj liniji sedam do deset dana nakon inokulacije. Tako dobiveni skupni uzorci inokuliraju se u homologne stanične kulture, nerazrijeđene i razrijeđene 1:10 (pri čemu se dobivaju konačna razrjeđenja supernatanta u omjeru 1:10 odnosno 1:100), kako je opisano u točki I.5.2. Druga je mogućnost da se alikvoti 10 % hranjive podloge koja čini primarnu kulturu inokuliraju izravno u jažicu sa svježom staničnom kulturom (točnije, supkultiviranje iz jažice u jažicu). Inokulaciji može prethoditi predinkubacija razrjeđenja s antiserumom za virus IPN-a u odgovarajućem razrjeđenju kako je opisano u točki I.4.3.

Inokulirane kulture potom se inkubiraju sedam do deset dana pri 15 °C i pregledavaju kako je opisano u točki I.5.4.

Ako se tijekom prva tri dana inkubacije javi toksični CPU, u toj se fazi može obaviti supkultiviranje, ali se stanice potom moraju inkubirati sedam dana i ponovno supkultivirati uz dodatnih sedam dana inkubacije. Kad se toksični CPU razvije nakon tri dana, stanice se jednom stavljaju u pasažu i inkubiraju dok ne prođe ukupno 14 dana od prve inokulacije. U zadnjih sedam dana inkubacije ne smiju se javiti znaci toksičnosti.

Ako unatoč obradi antibioticima dođe do bakterijske kontaminacije, prije supkultivacije provodi se centrifugiranje na 2 000 do 4 000 × g od 15 do 30 minuta pri temperaturi od 2 do 5 °C ili filtriranje supernatanta kroz filtar od 0,45 μm ili oboje (membrana s niskom sposobnošću vezivanja proteina). Nadalje, u supkultivaciji slijede se isti postupci kao oni koji su opisani za toksični CPU u četvrtom stavku ove točke.

Ako se ne razvije CPU, ispitivanje se može proglasiti negativnim.

I.6. Identifikacija virusa

Ako se u staničnoj kulturi uoči postojanje CPU-a, medij (supernatant) se prikuplja i pretražuje korištenjem jedne ili više sljedećih metoda: enzimski imunosorbentni test (ELISA), imunofluorescencija (IF), neutralizacija, RT-PCR ili RT-qPCR. Ako se ovim testovima ne može sa sigurnošću identificirati virus u roku od jednog tjedna, supernatant se prosljeđuje u nacionalni referentni laboratorij ili u referentni laboratorij Europske unije za bolesti riba naveden u prilogu VI. Direktivi 2006/88/EZ kako bi se virus odmah identificirao.

I.6.1. ELISA

Dvojni sendvič ELISA provodi se radi identifikacije izolata virusa. Plitice s mikrojažicama premazuju se s 50 μl/jažica (0,9 pg) pročišćenog imunoglobulina (Ig) proteina-A dokazane kvalitete iz kunićjih protutijela protiv virusa IHN-a ili VHS-a razrijeđenog u puferu karbonata (pH 9,6) koji sadržava 15 mM natrijevog azida i inkubiranog između 18 sati i 2 tjedna pri temperaturi od 4 °C.

Na plitici za razrjeđivanje svi uzorci koji sadržavaju 1 % Tritona X-100 i pozitivne kontrole razrjeđuju se otopinom pufera (točnije, fiziološkom otopinom puferiranom fosfatnim puferom (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) u četverostrukom razrjeđenju: nerazrijeđeno, 1:4, 1:16, 1:64. Plitice za ELISA-u peru se u PBS-u koji sadržava 0,05 % Tweena-20 (PBS-T) i 50 μl svakog razrjeđenja prebacuje se iz plitice za razrjeđivanje na opranu i premazanu pliticu za ELISA-u.

Plitice za ELISA-u zatim se inkubiraju 30 minuta pri temperaturi od 37 °C. Nakon toga, plitice se peru i inkubiraju 30 minuta pri temperaturi od 37 °C sa specifičnim monoklonskim protutijelima (točnije, za identifikaciju virusa VHS-a MAb IP5B11 odnosno Hyb 136-3 za virus IHN-a). 50μl kunićjeg protumišjeg konjugata obilježenog peroksidazom iz hrena (HRP) razrijeđenog 1:1 000 u PBS-T-BSA prebacuje se na pliticu za ELISA-u.

Konačno, nakon ponovnog pranja, reakcije se razvijaju dodavanjem 50 μl/jažica ortofenilenediamina (OPD). Plitice za ELISA-u inkubiraju se 20 minuta na sobnoj temperaturi u tami te se reakciju zaustavlja dodavanjem 100 μl/jažica 0,5 M H2SO4.

Apsorbancija se prati na valnoj duljini od 492 i 620 nm u ELISA čitaču. Uzorke se proglašava pozitivnima ili negativnima nakon usporedbe rezultata ispitivanja s vrijednostima apsorbancije za pozitivne i negativne kontrole. Općenito, uzorci s kombiniranom apsorbancijom (A) < 0,5 za nerazrijeđeni materijal smatraju se negativnima, uzorci s vrijednostima A između 0,5 i 1,0 smatraju se sumnjivima, a uzorci s vrijednostima A > 1,0 smatraju se pozitivnima.

Druge verzije ELISA-e dokazane slične učinkovitosti mogu se upotrijebiti umjesto onih navedenih u ovoj točki.

I.6.2. Imunofluorescencija

Identifikacija navedenih patogena virusa VHS-a i IHN-a provodi se infekcijom stanica u pliticama s 96 jažica „Black”, konvencionalnim pliticama s 24 jažice ili pokrovnim stakalcima u pliticama s 24 jažice. Kad se virus VHS-a ili IHN-a ili obiju bolesti identificira infekcijom stanica na pokrovnim stakalcima, primjenjuje se sljedeći protokol:

(a) pokrovna stakalca nasađuju se stanicama u gustoći tako da se postigne približno 60 % do 90 %-tna konfluencija nakon 24 sata kultivacije. U tu se svrhu upotrebljavaju stanice EPC gdje god je moguće jer one snažno prianjaju za staklenu površinu, ali se mogu upotrebljavati i druge stanične linije kao što su BF-2, RTG-2 ili FHM. 150 μl supernatanta stanične kulture u dva različita razrjeđenja (1:10 i 1:1 000) inokuliraju se dvostruko na jednostruke slojeve stare jedan dan i inkubiraju 24 sata pri temperaturi od 15 °C;

(b) naknadno se uklanja medij stanične kulture, a zaraženi jednostruki slojevi stanica fiksiraju se s 0,5 ml ledene vodene otopine acetona (80 % vol/vol). Fiksacija se provodi u odsisniku dima 15 minuta na sobnoj temperaturi, a tada se otopina acetona uklanja i pokrovna stakalca suše na zraku najmanje 30 minuta. U ovoj fazi plitice treba obraditi odmah ili ih pohraniti pri temperaturi od – 20 °C za daljnju upotrebu;

(c) određena monoklonska protutijela (točnije za identifikaciju virusa VHS-a, MAb IP5B11 odnosno za virus IHN-a, Hyb 136-3) razrjeđuju se u 0,01 M PBST pri pH 7,2 u otopini koju je preporučio dobavljač MAbs-a; 50 do 100 μl/jažica dodaje se u fiksiran jednostruki sloj te se plitice inkubiraju jedan sat pri temperaturi od 37 °C u vlažnoj komori;

(d) pokrovna stakalca peru se oprezno tri puta PBS-om koji sadržava 0,05 % Tweena-20 (PBS-T), a pufer se u potpunosti uklanja nakon zadnjeg ispiranja. Stanice se naknadno inkubiraju jedan sat pri temperaturi od 37 °C protutijelima konjugiranima fluorescein-izotiocijanatom (FITC) ili tetrametilrodamin-5- (i -6-) izotiocijanatom protiv mišjeg imunoglobulina upotrijebljenog kao primarno protutijelo, razrjeđuju u skladu s uputama dobavljača, ponovno ispiru u PBS-T a zatim suše. Obojene kulture nanose se na staklene pločice upotrebom fiziološke otopine s dodatkom glicerola te ih se pregledava pod ulaznim ultraljubičastim (UV) svjetlom. Upotrebljavajte okulare s povećanjem od 10 ili 12 puta te objektive s povećanjem od 25 ili 40 puta, s numeričkim otvorima > 0,7 odnosno > 1,3.

Umjesto njega mogu se upotrijebiti i drugi postupci imunofluorescencije s obzirom na stanične kulture, fiksiranje i protutijela referentne kvalitete dokazane slične učinkovitosti.

I.6.3. Neutralizacija

Iz prikupljenog supernatanta uklanjaju se stanice centrifugiranjem (2 000 do 4 000 × g) ili membranskim filtriranjem kroz filtar s membranom (0,45 μm) s niskom apsorpcijom proteina, a supernatant se razrjeđuje u omjerima 1:100 i 1:10 000 u mediju za staničnu kulturu.

Alikvoti najmanje dvaju razrjeđenja supernatanta pomiješaju se i odvojeno inkubiraju 60 minuta na 15 °C s jednakim dijelovima sljedećih reagensa:

(a) serum koji sadržava skupinu specifičnih protutijela za virus VHS-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);

(b) serum koji sadržava skupinu specifičnih protutijela za virus IHN-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);

(c) skupni uzorak antiseruma za lokalne serotipove virusa IPN-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);

(d) sâm medij (pozitivna kontrola).

Za svaku mješavinu supernatanta i seruma inokuliraju se najmanje dvije stanične kulture svaka s 50 μl te se inkubiraju pri 15 °C. Razvoj CPU-a provjerava se kako je opisano u točki I.5.4.

Sojevi virusa VHS-a i izolati koji ne reagiraju u neutralizacijskim testovima identificiraju se IF-om ili ELISA-om.

Mogu se upotrijebiti i drugi neutralizacijski testovi dokazane slične učinkovitosti.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Priprema virusne RNA

Sve radnje s RNA izvršavaju se na ledu, uz upotrebu rukavica.

RNA se ekstrahira upotrebom fenol-kloroform metode ili afinitetnom kolonom za pročišćavanje RNA, u skladu s uputama proizvođača. Mogu se upotrebljavati komercijalno dostupni kompleti za ekstrakciju RNA kojima se dobiva RNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za RT-PCR opisanima u nastavku.

RNA se resuspendira u destiliranoj vodi slobodnoj od RNAza (u prvom redu vodi tretiranoj 0,1 %-tnim dietil pirokarbonatom) ili odgovarajućim puferom za eluaciju.

I.6.4.2. RT-PCR

Sljedeće početnice upotrebljavaju se za otkrivanje virusa IHN-a:

Prednja početnica 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

Stražnja početnica 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Upotrebljavaju se sljedeći ciklusi (RT-PCR u jednom koraku): 1 ciklus: 30 minuta na 50 °C; 1 ciklus: 2 minute na 95 °C; 30 ciklusa: 30 sekundi na 95 °C, 30 sekundi na 50 °C, 60 sekundi na 72 °C; 1 ciklus: 7 minuta na 72 °C i namakati na 4 °C.

Sljedeće početnice upotrebljavaju se za otkrivanje virusa VHS-a:

Prednji VN 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

Stražnji VN 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Upotrebljavaju se sljedeći ciklusi (RT-PCR u jednom koraku): 30 minuta na 50 °C, 15 minuta na 95 °C, 35 ciklusa 30 sekundi na 94 °C, 30 sekundi na 55 °C i 60 sekundi na 68 °C. Naknadno se reakciju održava 7 minuta na 68 °C.

Količina i specifičnost reakcija RT-PCR-a ocjenjuje se gel elektroforezom u 1,5 %-tnom agar gelu s etidijevim bromidom i promatra upotrebom UV transiluminacije. Može se opaziti umnoženi produkt PCR-a od 693 bp za virus IHN-a. Za virus VHS-a veličina je 505 bp.

Rezultati PCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava. Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije u laboratoriju. Stoga se radi izbjegavanja bilo kakvih sumnji uključuje odgovarajuće pozitivne i negativne kontrole i sljedove umnoženih produkata. Kod početnica virusa VHS-a posebnu je pažnju potrebno obratiti na upotrebu stanica BF-2 jer početnice mogu reagirati sa staničnom linijom DNA/RNA te tako proizvesti lažne pozitivne rezultate slične veličine. Pri ispitivanju supernatanta iz stanica BF-2 sekvenciraju se svi umnoženi PCR fragmenti.

I.6.4.3. RT-qPCR za virus VHS-a

Za virus VHS-a umnožavanje se provodi upotrebom sljedećih početnica i sonde:

Prednja početnica: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

Stražnja početnica: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

i sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR u jednom koraku:

Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. Uvjeti za cikluse: 30 minuta na 50 °C, 15 minuta na 95 °C, 40 ciklusa 15 sekundi na 94 °C, 40 sekundi na 60 °C, 20 sekundi na 72 °C; prilagoditi prema potrebi. Umjesto njega mogu se upotrijebiti i druge verzije metoda RT-PCR ili RT-qPCR dokazane slične učinkovitosti.

I.6.4.4. RT-qPCR za virus IHN-a

Za virus IHN-a umnožavanje se provodi upotrebom sljedećih početnica i sonde:

Prednja početnica: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Stražnja početnica: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

i sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR u dva koraka:

Budući da sljedeći test ovisi o umnožavanju u dva koraka, potrebno je obratiti posebnu pozornost pri rukovanju epruvetama u prelasku iz jedne reakcije na drugu kako bi se spriječila kontaminacija.

Uvjeti za cikluse (nakon koraka RT): 2 minute na 50 °C, 10 minuta na 95 °C, nakon čega slijedi 40 ciklusa 15 sekundi na 95 °C i 1 minutu na 60 °C; prilagođava se prema potrebi.

Umjesto njega mogu se upotrijebiti i druge verzije metoda RT-PCR ili RT-qPCR dokazane slične učinkovitosti.

II. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za potvrđivanje ili otklanjanje sumnje na VHS ili IHN ili obje te bolesti u slučaju sumnje na pojavu

Kad su potrebna laboratorijska pretraživanja radi potvrđivanja prisutnosti IHN-a ili VHS-a ili obiju tih bolesti ili otklanjanja sumnje na njihovu prisutnost u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u točki II.3. dijela 1. Priloga I., primjenjuju se sljedeće detaljne dijagnostičke metode i postupci:

(a) uobičajeno izdvajanje virusa nakon kojeg slijedi identifikacija serum neutralizacijskim testom, imunokemijskim testom ili molekularna identifikacija virusa;

(b) otkrivanje virusa metodom RT-PCR ili RT-qPCR;

(c) druge dijagnostičke tehnike poput IFAT-a, ELISA-e, RT-PCR-a, IHC-a.

II.1. Uobičajeno izdvajanje virusa nakon kojeg slijedi identifikacija virusa

II.1.1. Odabir uzoraka

Za pretraživanje se uzima najmanje 10 riba koje pokazuju tipične znakove IHN-a ili VHS-a.

II.1.2. Pripremanje i slanje uzoraka riba

Za pripremanje i slanje za potrebe uobičajenog izdvajanja virusa slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.2.

II.1.3. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Za prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala za potrebe uobičajenog izdvajanja virusa slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.3.

II.1.4. Pripremanje uzoraka za pretraživanje stanične kulture

Za pripremanje i slanje uzoraka za pretraživanje stanične kulture za potrebe uobičajenog izdvajanja virusa slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.4.

II.1.5. Virološka pretraživanja na staničnoj kulturi

Za virološka pretraživanja na staničnoj kulturi za potrebe uobičajenog izdvajanja virusa slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.5.

II.1.6. Identifikacija virusa

Za identifikaciju virusa za potrebe uobičajenog izdvajanja virusa slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.6.

II.2. Otkrivanje virusa metodom RT-qPCR

II.2.1. Odabir uzoraka

Za odabir uzoraka za potrebe otkrivanja virusa metodom RT-qPCR slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.1.2.

II.2.2. Pripremanje i slanje uzoraka riba

Za pripremanje i slanje uzoraka riba za potrebe otkrivanja virusa metodom RT-qPCR slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.2.

II.2.3. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Za prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala za potrebe otkrivanja virusa metodom RT-qPCR slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.3.

II.2.4. Pripremanje uzorka za metodu RT-qPCR

Za pripremanje uzoraka za potrebe otkrivanja virusa metodom RT-qPCR slijede se metode i postupci utvrđeni u točki I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

Za otkrivanje virusa metodom RT-qPCR slijede se metode i postupci utvrđeni u točkama I.6.4.1, I.6.4.3 i I.6.4.4.

II.3. Druge dijagnostičke tehnike

Supernatant pripremljen kako je opisano u točki I.4.3. može se podvrgnuti ELISA-i, indirektnom testu fluorescentnim protutijelima (IFAT) ili RT-PCR-u u skladu s točkom I.6.1., točkom I.6.2. odnosno točkom I.6.4. Materijal tkiva može se podvrgnuti drugim dijagnostičkim tehnikama, kao što su IFAT na zamrznutim rezovima, imunohistokemija na formalinom fiksiranom materijalu tkiva. Ove se brze tehnike trebaju dopuniti virološkim pretraživanjem u skladu s točkom II. podtočkom (a) ili (b) u roku od 48 sati od uzorkovanja ako se dobije:

(a) negativan rezultat ili

(b) pozitivan rezultat iz materijala koji predstavlja prvi slučaj IHN-a ili VHS-a.

III. Postupak titracije za provjeru osjetljivosti staničnih kultura na infekciju

Kad se provodi titracija radi provjere prijemljivosti staničnih kultura na zarazu kako je navedeno u točki I.5.3., slijede se postupci utvrđeni u stavcima ove točke u nastavku.

Treba upotrebljavati najmanje dva izolata virusa VHS-a i jedan izolat virusa IHN-a. Izolati predstavljaju glavnu skupinu virusa unutar Europske unije, točnije, za virus VHS-a treba odabrati jedan patogeni izolat koji potječe od kalifornijske pastrve iz slatke vode i jedan izolat koji je patogen za romba iz morske vode, a za virus IHN-a treba odabrati jedan soj koji je patogen za kalifornijsku pastrvu u Europskoj uniji. Upotrebljavaju se dobro definirani izolati podrijetlom iz država članica. Serije virusa u staničnim kulturama niske pasaže umnažaju se u bocama sa staničnom kulturom na stanicama BF-2 ili RTG-2 za virus VHS-a i na stanicama EPC ili FHM za virus IHN-a. Upotrebljava se medij za staničnu kulturu s najmanje 10 % seruma. Za inokulaciju se upotrebljava niski MOI (< 1).

Kod punog citopatogenog učinka (CPU) virus se sakuplja centrifugiranjem supernatanta stanične kulture na 2 000 × g 15 minuta, sterilizira se filtriranjem kroz membranski filtar od 0,45 μm te raspodijeli u označene krioepruvete. Virus se drži na – 80 °C.

Tjedan dana nakon zamrzavanja, pod mlazom hladne vode otope se po tri epruvete svakog virusa te se titriraju na odgovarajućim staničnim linijama. Svaki izolat virusa se odmrzava i titrira najmanje svakih šest mjeseci ili ako se sumnja da je osjetljivost stanične linije smanjena.

Postupci titracije moraju se detaljno opisati i svaki se put mora primijeniti isti postupak.

Titracija s razrjeđenjem do završne točke uključuje najmanje šest ponavljanja u svakoj fazi razrjeđenja. Titri se uspoređuju s prethodno dobivenim titrima. Ako titar bilo kojeg od tri izolata virusa padne za faktor od 2 log ili više u odnosu na početni titar, stanična se linija ne bi trebala više upotrebljavati u svrhe nadzora.

Ako se u laboratoriju drže različite stanične linije, svaku se liniju ispituje odvojeno.

Evidencija se čuva najmanje 10 godina.

DIO 2.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI ZA NADZIRANJE I POTVRĐIVANJE KHV-a

I. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za potvrđivanje prisutnosti KHV-a ili otklanjanje sumnje na njezinu prisutnost

Kad su potrebna laboratorijska pretraživanja radi potvrđivanja prisutnosti KHV-a ili otklanjanje sumnje na njezinu prisutnost u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u odjeljku III. dijela 2. Priloga I., primjenjuju se detaljne dijagnostičke metode i postupci utvrđeni u točkama I.1. i I.2. ovog dijela:

I.1. Priprema uzoraka od riba

Za dijagnostičke se potrebe riba (poslana živa ili usmrćena i pakirana odvojeno u zapečaćenim aseptičnim posudama) ili, u alternativnom slučaju, zamrznuti organi ili dijelovi organa sačuvani u 80 %-tnom ili čistom etanolu ili transportnom mediju za viruse (radi obrade u roku od 48 sati od prikupljanja) mogu upotrijebiti za ispitivanje uobičajenim metodama temeljenima na PCR-u ili qPCR-u.

Za otkrivanje KHV-a prikupljaju se škrge i bubrezi. Nadalje, u dodatnom odvojenom uzorku mogu se uključiti i slezena, encefalon i crijeva. U akutnim slučajevima može se objedinjavati materijal tkiva od najviše pet riba.

Nadalje, uzorci radi kojih nije potrebno usmrtiti ribu, poput krvi, brisa škrgi, biopsije škrgi, brisa sluznice, mogu se upotrijebiti u određenim slučajevima (točnije, u slučaju sumnje na prisutnost KHV-a moguće je upotrijebiti vrlo vrijedne ribe).

I.1.1. Ekstrakcija DNA

DNA se ekstrahira u skladu sa standardnim postupcima.

Mogu se upotrebljavati komercijalno dostupni kompleti za ekstrakciju DNA kojima se dobiva DNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za PCR navedenima u točki I.2.

I.2. Otkrivanje i identifikacija uzročnika metodama koje se temelje na lančanoj reakciji polimeraze (PCR)

I.2.1. qPCR za otkrivanje KHV-a

Za otkrivanje KHV-a metodom qPCR upotrebljava se sljedeći test qPCR:

Prednja početnica (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Stražnja početnica (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

i sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Uvjeti za cikluse: jedan ciklus od 15 minuta na 95 °C nakon kojeg slijedi 40 ciklusa od 15 sekundi na 94 °C i 60 sekundi na 60 °C. Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. No umjesto nje mogu se upotrijebiti i druge verzije metode qPCR dokazane slične učinkovitosti.

I.2.2. Uobičajena metoda PCR za otkrivanje KHV-a

Upotrebljava se test opisan u ovoj točki koji je usmjeren na gen timidin kinaze (TK) KHV-a. No umjesto njega mogu se upotrijebiti drugi PCR testovi s osjetljivostima i posebnostima koje su dokazano slične opisanome testu.

Prednja početnica (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

Stražnja početnica (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Uvjeti za cikluse: jedan ciklus od 5 minuta na 95 °C nakon kojeg slijedi 35 ciklusa od 30 sekundi na 95 °C, 30 sekundi na 52 °C, jednu minutu na 72 °C i jedan ciklus od 10 minuta na 72 °C. Veličina produkta trebala bi iznositi 409 bp.

Rezultati PCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava. Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije. Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. No umjesto nje mogu se upotrijebiti i druge verzije metode PCR dokazane slične učinkovitosti.

Prvo otkrivanje u određenom području mora se potvrditi sekvenciranjem ili poslati u nacionalni referentni laboratorij ili u referentni laboratorij Europske unije za bolesti riba naveden u Prilogu VI. Direktivi 2006/88/EZ kako bi se virus odmah identificirao.

II. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za nadziranje KHV-a

Pri uzorkovanju i laboratorijskom pretraživanju koji se provode u svrhu postizanja i održavanja određenih zdravstvenih statusa u pogledu KHV-a kako je utvrđeno u odjeljku I. dijela 2. Priloga I. upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u odjeljku II. ili III. dijela 2. tog Priloga primjenjuju se detaljne dijagnostičke metode i postupci utvrđeni u točkama I.1. i I.2. ovog dijela.

II.1. Priprema uzoraka od riba

Ako je moguće uzorkuju se ribe koje se drži dulje vrijeme na rasponu temperatura koji je povoljan za virus (točnije dva do tri tjedna na temperaturi od 15 °C do 26 °C). Ako je moguće, uzorke se prikuplja 24 sata, a najkasnije 72 sata, nakon gospodarenja zbog kojeg bi moglo doći do reaktivacije virusa u ribi koja ima status nositelja, poput stavljanja u kaveze ili prijevoza, radi poboljšanja mogućnosti otkrivanja KHV-a.

Za potrebe nadziranja KHV-a riba može biti poslana živa ili usmrćena i pakirana odvojeno u zapečaćenim aseptičnim posudama ili, u alternativnom slučaju, zamrznuti organi ili dijelovi organa sačuvani u 80 %-tnom ili 100 %-tnom alkoholu ili transportnom mediju za viruse (radi obrade u roku od 48 sati od prikupljanja) mogu se upotrijebiti za ispitivanje metodama temeljenima na PCR-u. Za nadziranje KHV-a prikupljaju se tkiva škrgi i bubrega.

Za potrebe nadziranja KHV-a potrebno je izbjegavati objedinjavanje kad god je to moguće. Ako je objedinjavanje potrebno, može se objediniti materijal tkiva od najviše dviju riba. Veće uzorke potrebno je homogenizirati u tarioniku i tučku ili homogenizatoru Stomacher te uzeti poduzorke radi ekstrakcije DNA prije bistrenja. Alternativno se poduzorci mogu prikupiti iz svih tkiva uključenih u uzorak i staviti u „tube za lizu”.

II.1.1. Ekstrakcija DNA

DNA se ekstrahira u skladu sa standardnim postupcima. Mogu se upotrebljavati komercijalno dostupni kompleti za ekstrakciju DNA kojima se dobiva DNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za PCR utvrđenima u točki II.2.

Prihvatljiv omjer tkiva i medija je 1:9 w/v. U ispitivanja se uključuje 20 do 25 mg materijala tkiva.

II.2. Nadziranje KHV-a metodama koje se temelje na PCR-u

Za nadziranje KHV-a upotrebljava se metoda qPCR. Ako se pozitivni uzorci pojave u području koje prethodno nije bilo potvrđeno kao pozitivno, rezultati ispitivanja potvrđuju se:

(a) sekvenciranjem produkta PCR-a ili ugniježđenog PCR-a iz uzoraka. Dobiveni čisti niz podudara se (u najmanje 98 %) s tim referentnim nizovima.

(b) ili alternativno, uzorke se može poslati u nacionalni referentni laboratorij radi potvrđivanja.

II.2.1. qPCR za otkrivanje KHV-a

Upotrebljava se metoda qPCR opisana u nastavku:

Prednja početnica (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Stražnja početnica (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

i sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Uvjeti za cikluse: jedan ciklus od 15 minuta na 95 °C nakon kojeg slijedi 50 ciklusa od 15 sekundi na 94 °C i 60 sekundi na 60 °C.

Rezultati qPCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava. Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije u laboratoriju. Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. No umjesto nje mogu se upotrijebiti i druge verzije metode qPCR dokazane slične učinkovitosti.

II.2.2. Uobičajena metoda PCR za potvrdu otkrivanja KHV-a

Za potvrđivanje prisutnosti zaraze KHV-om upotrebljava se generički ugniježđeni PCR opisan u tablici 2.1. u nastavku, a nakon njega se provodi sekvenciranje umnoženog produkta.

Tablica 2.1.

Početnice i uvjeti za test ugniježđenog PCR-a usmjerenog na sve ciprinidne herpes viruse (CyHV-1, CyHV-2 i CyHV-3).

Naziv početnice Niz Uvjeti za cikluse Veličina produkta CyHVpol-prednji 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Prvi krug PCR-a 1 ciklus: 2 minute na 95 °C 40 ciklusa: 30 sekundi na 95 °C 30 sekundi na 55 °C 45 sekundi na 72 °C 1 ciklus: 10 minuta na 72 °C 362 bp CyHVpol-stražnji 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-unutarnji prednji 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Drugi krug PCR-a 1 ciklus: 2 minute na 95 °C, 40 ciklusa: 30 sekundi na 95 °C 30 sekundi na 55 °C 45 sekundi na 72 °C 1 ciklus: 10 minuta na 72 °C 339 bp CyHVpol-unutarnji stražnji 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Rezultati PCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava. Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije u laboratoriju. Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. Umjesto nje mogu se upotrijebiti i druge verzije metode PCR dokazane slične učinkovitosti.

Sekvenciranje se može provesti u laboratoriju ili u vanjskim društvima koja su specijalizirana za sekvenciranje. Rezultati sekvenciranja analiziraju se poravnavanjem nizova na poznate referentne nizove KHV-a (pristupni brojevi Gen Banka AP008984, DQ657948 i DQ177346). Dobiveni čisti niz podudara se u najmanje 98 % s tim referentnim nizovima.

DIO 3.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI ZA NADZIRANJE I POTVRĐIVANJE ZARAZNE ANEMIJE LOSOSA (ISA)

I. Postupci uzorkovanja za nadziranje i kontrolu ISA-e

Pri uzorkovanju i laboratorijskom pretraživanju koji se provode u svrhu programâ nadziranja ili iskorjenjivanja utvrđenih u dijelu 3. Priloga I. ili za potvrđivanje prisutnosti ili otklanjanje sumnje na prisutnost ISA-e u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ primjenjuju se detaljne dijagnostičke metode i postupci utvrđeni u točkama I.1., I.2. i I.3. ovog odjeljka.

I.1. Priprema uzoraka od riba

Za potrebe laboratorijskog pretraživanja prisutnosti ISA-e uzroci riba ne smiju se objedinjavati, ako je to moguće. Međutim, za potrebe nadziranja ISA-e prihvatljivo je objedinjavanje dviju do pet riba.

Uzorci za analizu reverznom transkripcijom s lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR) uzimaju se od svih uzorkovanih riba. Upotrebom sterilnog instrumenta iz ribe se vadi komadić srednjeg bubrega te se prebacuje u epruvetu mikrocentrifuge koja sadržava 1 ml otopine za konzerviranje RNA s dokazanom djelotvornošću. Tkivo uzeto od najviše pet riba može se prikupiti u jednu transportnu otopinu, što čini jedan skupni uzorak. Težina tkiva u jednom uzorku iznosi 0,5 g. Kada je riba premala da bi se dobio uzorak potrebne težine, uzimaju se komadići bubrega, srca, slezene, jetre ili piloričnih nastavaka (cekuma), upravo navedenim redoslijedom, dok se ne postigne težina od 0,5 g.

Tkiva za histološko pretraživanje uzimaju se samo od svježe usmrćenih riba uobičajene građe koje pokazuju kliničke znakove ili post-mortem znakove koji odgovaraju prisutnosti ISA-e. Sve vanjske ili unutarnje lezije uzorkuju se i u svakom se slučaju uzorci srednjeg bubrega, srca, jetre, gušterače, utrobe, škrga i slezene vade iz ribe s pomoću skalpela i prebacuju u 8 %-tnu do 10 %-tnu (vol:vol) puferiranu fiziološku otopinu formalina. Omjer između fiksira i tkiva iznosi najmanje 20:1 kako bi se osiguralo zadovoljavajuće očuvanje tkiva. Za imunohistokemiju (IHC) uzimaju se uzorci srednjeg bubrega i srca.

Tkiva za virološko pretraživanje na staničnoj kulturi uzimaju se od svih uzorkovanih riba. Dijelovi jetre, prednjeg i srednjeg bubrega, srca i slezene vade se iz ribe s pomoću sterilnog instrumenta i prebacuju u plastične epruvete koje sadržavaju 9 ml transportnog medija. Tkiva uzeta od najviše pet riba mogu se prikupiti u jednu epruvetu koja sadržava transportnu otopinu, što čini jedan skupni uzorak. Težina tkiva u jednom uzorku iznosi 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Slanje uzoraka riba

U laboratorij se mogu poslati cijele ribe pod uvjetom da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza, kako su opisani u stavku 3. ove točke. Cijelu ribu umata se u upijajući papir i šalje u plastičnim vrećicama, rashlađene kako je opisano u tom stavku.

Moguće je slati i živu ribu, ali samo pod nadzorom nacionalnog referentnog laboratorija za bolesti riba i uzimajući u obzir dodatne probleme u pogledu dezinfekcije i biosigurnosti pri prijevozu živih riba.

Uzorci krvi i epruvete koje sadržavaju tkivo riba namijenjeno virološkom pretraživanju ili analizi RT-PCR stavljaju se u izolirane posude poput kutija od polistirena s debelim stijenkama, zajedno s dovoljnom količinom leda ili „rashladnih blokova” kako bi se osiguralo rashlađivanje uzoraka tijekom prijevoza u laboratorij. Izbjegava se zamrzavanje, a po primitku pošiljke u kutijama za prijevoz još uvijek mora biti leda ili jedan ili više „rashladnih blokova” još uvijek mora biti djelomično ili potpuno zamrznut. U izuzetnim okolnostima uzorci za analizu RT-PCR i uzorci za virološko pretraživanje mogu se naglo zamrznuti i transportirati u laboratorij pri temperaturi od – 20 °C ili nižoj.

Za analizu RT-PCR tkiva sačuvanih u ribonukleinskoj kiselini (RNA) kasnije se provodi ekstrakcija RNA unutar sljedećih vremenskih okvira ovisno o temperaturi pri kojoj se čuvaju uzorci:

uzorci pohranjeni pri 37 °C: jedan dan;

uzorci pohranjeni pri 25 °C: jedan tjedan;

uzorci pohranjeni pri 4 °C: jedan mjesec;

uzorci pohranjeni pri – 20 °C: neograničeno.

Ako se tkivo riba prevozi u fiksiru radi histološkog pretraživanja, prevozi ih se u nepropusnim epruvetama u posudama otpornima na udarce. Trebalo bi izbjegavati zamrzavanje uzoraka.

Virološko pretraživanje na staničnoj kulturi mora započeti što je prije moguće, a najkasnije 48 sati nakon prikupljanja uzoraka. U iznimnim slučajevima virološko pretraživanje može započeti najkasnije unutar 72 sata od prikupljanja materijala, pod uvjetom da je materijal za pretraživanje zaštićen transportnim medijem i da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza.

I.3. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Podložno odobrenju dijagnostičkog laboratorija, tkiva riba osim onih navedenih u točki I.1. mogu se prikupiti i pripremiti radi dodatnog pretraživanja.

II. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za nadziranje i potvrđivanje prisutnosti ISA-e ili otklanjanje sumnje na njezinu prisutnost

Pri laboratorijskim pretraživanjima koja se provode u svrhu postizanja i održavanja određenog zdravstvenog statusa u pogledu ISA-e kako je utvrđeno u odjeljku I. dijela 3. Priloga I. ili u svrhu potvrđivanja prisutnosti ISA-e ili otklanjanja sumnje na njezinu prisutnost u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u odjeljku II. dijela 3. Priloga I. primjenjuju se detaljne metode i postupci utvrđeni u točkama od II.1. do II.5. u nastavku.

II.1. Pretraživanje uzoraka metodom RT-PCR

Dijagnostička je metoda koja se upotrebljava za pregled u pogledu ISA-e RT-qPCR. Budući da rezultati metode RT-qPCR mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima je provedena, uključuju se odgovarajuće pozitivne i negativne kontrole i umnoženi produkti radi izbjegavanja svake sumnje.

II.1.1. Ekstrakcija ukupnog RNA

Sve radnje s RNA izvršavaju se na ledu, uz upotrebu rukavica.

Ukupan RNA ekstrahira se upotrebom fenol-kloroform metode ili afinitetnom kolonom za pročišćavanje RNA, u skladu s uputama proizvođača.

Pročišćeni RNA resuspendira se u destiliranoj vodi slobodnoj od RNAza (u prvom redu vodi tretiranoj 0,1 %-tnim dietil pirokarbonatom).

Koncentracija i čistoća ekstrahiranog RNA procjenjuje se mjerenjem optičke gustoće pri 260 nm i 280 nm. Alternativni pristup može biti uključivanje unutarnjih kontrola usmjerenih na genom virusa kako je navedeno u točki II.1.3.

II.1.2. Otkrivanje virusa ISA-e metodom RT-PCR

Nekoliko metoda RT-PCR može se upotrijebiti za umnažanje genoma virusa ISA-e. RT-PCR u dva koraka može se provesti ako se reakcije RT i PCR odvijaju u dvije odvojene epruvete. Međutim, može se provesti i reakcija u jednom koraku, pri čemu se obje reakcije odvijaju u jednoj epruveti. Metoda od jednog koraka upotrebljava se kad god je to moguće jer se testom u jednoj epruveti smanjuje rizik unakrsne kontaminacije jer nije potrebno prebacivati sadržaj, a smatra je se jednako osjetljivom kao metodu od dva koraka.

Upotrebljavaju se početnice i testovi opisani u ovoj točki, točnije par početnica ILA1 ili ILA2 koje su usmjerene na segment 8 i dokazano je da su primjerene za otkrivanje virusa ISA-e u slučaju pojave i kod riba nositelja. Stražnja početnica ILA2 ne odgovara izolatima iz Sjeverne Amerike te se u tim slučajevima upotrebljava drugi niz početnica.

Prednja početnica (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

Stražnja početnica (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Uvjeti za cikluse: jedan ciklus od 30 minuta na 50 °C, 1 ciklus od 15 minuta na 94 °C, 40 ciklusa od 30 sekundi na 94 °C, 30 sekundi na 55 °C, 60 sekundi na 72 °C; jedan ciklus od 5 minuta na 72 °C. Veličina produkta iznosi 155 bp.

Rezultati PCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava. Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije u laboratoriju. Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. No umjesto nje mogu se upotrijebiti i druge verzije metode RT-PCR dokazane slične učinkovitosti.

II.1.3. Otkrivanje virusa ISA-e metodom RT-qPCR

Upotrebom metode RT-qPCR može se povećati specifičnost, a vjerojatno i osjetljivost. Metodu je moguće provesti brže jer nije potrebna gel elektroforeza, a smanjuje se i rizik unakrsne kontaminacije jer je moguće procijeniti količinu virusnoga genomskog RNA u epruveti s uzorkom. Nedostatak testa RT-qPCR je taj što često nije moguće sekvencirati umnožene produkte. Međutim, ako postoje sumnje u pogledu specifičnosti umnoženog produkta, mora se provesti još jedan test specifičan za virus ISA-e radi provjere rezultata.

Upotrebljava se test opisan u ovoj točki, koji je usmjeren na segment 8. Tim se testom obuhvaćaju izolati iz Europske unije, Europskog udruženja slobodne trgovine i Sjeverne Amerike. Metoda od jednog koraka upotrebljava se kad god je to moguće jer se testom u jednoj epruveti smanjuje rizik od unakrsne kontaminacije.

Prednja početnica: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

Stražnja početnica: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

i sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. Uvjeti za cikluse: jedan ciklus od 30 minuta na 50 °C, jedan ciklus od 15 minuta na 95 °C, 40 ciklusa od 15 sekundi na 94 °C, 60 sekundi na 60 °C; prilagođava se prema potrebi. Umjesto njega mogu se upotrijebiti i druge verzije metoda RT-PCR ili RT-qPCR dokazane slične učinkovitosti.

II.1.4. Sekvenciranje umnoženih produkata PCR-a

Prednja početnica (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

Stražnja početnica (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica. Uvjeti za cikluse (RT-PCR od jednog koraka): jedan ciklus od 30 minuta na 50 °C, jedan ciklus od 15 minuta na 94 °C, 40 ciklusa od 30 sekundi na 94 °C, 30 sekundi na 55 °C, 60 sekundi na 72 °C; jedan ciklus od 5 minuta na 72 °C; prilagođava se prema potrebi. Umjesto njega mogu se upotrijebiti i druge verzije metoda RT-PCR ili RT-qPCR dokazane slične učinkovitosti.

Alternativno se može upotrijebiti metoda sekvenciranja HPR-a u segmentu 6 navedena u nastavku:

Prednja početnica: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

Stražnja početnica: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.

Veličina produkta: 304 nt ako je HPR0.

Mogu se upotrijebiti i testovi RT-PCR slične osjetljivosti i specifičnosti testovima opisanima u ovoj točki.

Čistoća umnoženog produkta RT-PCR-a provjerava se gel elektroforezom prije sekvenciranja. Ako se pojavi samo jedan čisti fragment, pročišćava ga se izravno iz reakcije PCR-a. Ako je prisutno više umnoženih fragmenata, fragment od interesa pročišćava se gel elektroforezom. Pročišćavanje fragmenata PCR-a iz otopina ili agar gelova provodi se s pomoću PCR afinitetnih kolona za pročišćavanje, u skladu s uputama proizvođača.

Sekvenciranje se provodi upotrebom početnica za umnožavanje u vanjskim društvima koja su specijalizirana za sekvenciranje. Rezultati se analiziraju alatom za pretraživanje BLAST, a nizovi se uspoređuju s drugim poznatim nizovima u bazi podataka o nukleotidima Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) u SAD-u.

Sekvenciranjem se moraju otkloniti sve sumnje u pogledu specifičnosti umnoženog produkta RT-PCR-a.

II.2. Izolacija virusa ISA-e na staničnim kulturama

II.2.1. Priprema uzoraka

Tkiva se može čuvati na temperaturi od – 80 °C. Tkivo se zamrzava i otapa samo jednom prije pretraživanja. Pretraživanje se provodi što je brže moguće u svrhu nadziranja i kontrole.

Svaki uzorak (skupni uzorak tkiva u transportnoj otopini) mora se potpuno homogenizirati upotrebom odobrenog homogenizatora centrifugiranjem pri 2 000 do 4 000 × g kroz 15 minuta na temperaturi od 0 do 6 °C, nakon čega se supernatant filtrira (0,45 μm) i inkubira s jednakim volumenom odgovarajućim razrjeđenjem skupnog antiseruma za autohtone serotipove virusa IPN-a. Titar antiseruma mora biti najmanje 1:2 000 s neutralizacijom plaka od 50 % u testu neutralizacije. Mješavina se inkubira jedan sat na 15 °C. To predstavlja inokulum.

Svrha je tretiranja svih inokuluma antiserumom za virus zarazne nekroze gušterače (virus koji se u nekim dijelovima Europe javlja u 50 % uzoraka ribe) spriječiti da se u inokuliranim staničnim kulturama razvije citopatogeni učinak (CPU) zbog virusa IPN-a. Taj se postupak može provesti radi smanjenja trajanja virološkog pretraživanja kao i broja slučajeva u kojima bi se pojava CPU-a morala smatrati mogućim pokazateljem virusa ISA-e. Kada uzorci dolaze iz proizvodnih jedinica koje se smatraju slobodnima od IPN-a, može se izostaviti tretiranje inokulata antiserumom za virus IPN-a.

II.2.2. Inokulacija staničnih kultura

Stanice bubrega atlantskog lososa (ASK) mogu se upotrijebiti za primarnu izolaciju virusa ISA-e. Mogu se upotrijebiti i druge stanične linije s dokazanom djelotvornošću i osjetljivošću za izolaciju virusa ISA-e, uvažavajući varijabilnost sojeva i sposobnost različitih sojeva da se umnožavaju u različitim staničnim linijama. Čini se da stanice ASK-a podržavaju izolaciju i rast dosad poznatih izolata virusa dok god se upotrebljava niska razina pasaže. U stanicama ASK-a može se pojaviti izraženiji citopatogeni učinak (CPU) nego u drugim osjetljivim staničnim linijama poput SHK-1 (pronefros lososa-1).

Stanice ASK-a (pasaža 65 ili niža) uzgajaju se u mediju L-15 koji sadržava 10 % fetalnoga goveđeg seruma, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamina i 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanola u pliticama s više jažica. Suspenzija organa obrađena antiserumom inokulira se u mlade stanične kulture koje aktivno rastu radi konačnog razrjeđenja materijala tkiva u mediju stanične kulture od 1:1 000. Za svaki se organ suspenzija od 40 μl inokuluma dodaje u jednu jažicu koja sadržava 2 ml medija stanične kulture. Kako bi se smanjio rizik unakrsne kontaminacije, odvojene plitice s 12 ili 24 jažice upotrebljavaju se za uzorke iz različitih uzgajališta riba.

Jedna plitica se ostavlja neinokulirana da bi služila kao negativna kontrola. Odvojena plitica se inokulira referentnim izolatom virusa ISA-a kao pozitivna kontrola na sljedeći način. Stotinu μl radnog pripravka virusa ISA-e (minimalni titar 107, infektivna doza kulture tkiva od 50 % na završnoj točki (TCID50 ml– 1)) inokulira se u prvu jažicu i promiješa. Volumen tog materijala iz prve jažice prenosi se u drugu jažicu da bi se dobila otopina s omjerom 1:10 te se promiješa. Taj se postupak ponavlja kroz cijelu pliticu da bi se dobilo šest deseterostrukih razrjeđenja. Standardni virus ISA-e može se pohraniti na – 80 °C najmanje dvije godine, ali kada se jednom odmrzne mora se upotrijebiti u roku od tri dana. Treba paziti da se spriječi unakrsna kontaminacija testne plitice s materijalom pozitivne kontrole. Kako bi se izbjegao taj rizik, pozitivne se kontrole pripremaju i njima se rukuje odvojeno od testne plitice. Testom osjetljivosti stanica ASK-a u odnosu na izolate virusa ISA-e koji se provodi jednom u šest mjeseci može se zamijeniti uključivanje pozitivne kontrole pri svakoj inokulaciji.

Uzorci se inkubiraju pri 15 ± 2 °C kroz razdoblje do 15 dana. Stanične se kulture dva puta mikroskopski pregledavaju na pojavu CPU-a između 5. i 7. te između 12. i 14. dana nakon inokulacije. Ako se pri bilo kojem objedinjavanju pojavi CPU, odmah se započinje s postupcima identifikacije virusa u skladu s točkom II.2.4. Ako se do četrnaestog dana ne zapazi CPU, provodi se indirektni test fluorescentnim protutijelima (IFAT), test hemadsorpcije ili RT-PCR.

II.2.3. Supkultiviranje

Supkultiviranje se izvodi između trinaestog i petnaestog dana. Supernatant kulture dodaje se u jažice koje sadržavaju svježe stanice u aktivnom rastu u odgovarajućem razrjeđenju (1/10) u pliticama s više jažica i inkubira ga se na temperaturi od 14 ± 2 °C tijekom najviše 18 dana. Stanične se kulture dva puta mikroskopski pregledavaju na pojavu CPU-a između petog i sedmog te između četrnaestog i osamnaestog dana nakon inokulacije. Ako se pri bilo kojem objedinjavanju pojavi CPU, odmah se započinje s postupcima identifikacije virusa u skladu s točkom II.2.4. Ako se do četrnaestog odnosno osamnaestog dana ne zapazi CPU, provodi se test hemadsorpcije ili RT-PCR.

Ako se tijekom prvih sedam dana inkubacije pojavi citotoksičnost, u toj fazi provodi se supkultiviranje i stanice se inkubira 14 do 18 dana te ponovno supkultivira s daljnjih 14 do 18 dana inkubacije. Ako se citotoksičnost pojavi nakon sedam dana, supkultiviranje se provodi jedanput, a stanice se inkubiraju tako da se postigne ukupno 28 do 36 dana inkubacije od primarne inokulacije.

Ako se u primarnoj kulturi pojavi bakterijska kontaminacija, test se ponovno priprema upotrebom homogenata pohranjenog na – 80 °C. Prije inokulacije tkivo homogenata centrifugira se na 4 000 × g tijekom 15 do 30 minuta na temperaturi od 0 do 6 °C te se supernatant filtrira kroz 0,22 μm. Ako se bakterijska kontaminacija pojavi tijekom faze supkultiviranja, supernatant se filtrira kroz 0,22 μm, inokulira u svježe stanice i inkubira daljnjih 14 do 18 dana.

II.2.4. Testovi identifikacije virusa

Ako se u bilo kojoj fazi uoči dokaz CPU-a, ili ako je test hemadsorpcije pozitivan, provodi se identifikacija virusa. Metode koje se mogu upotrijebiti za identifikaciju virusa ISA-e jesu RT-PCR u skladu s točkom II.1. i imunofluorescencija (IF) u skladu s točkom II.2.6. Ako se sumnja na prisutnost drugih virusa, provode se dodatni testovi za identifikaciju virusa. Ako se tim testovima ne identificira virus sa sigurnošću unutar tjedan dana, supernatant se radi hitne identifikacije prosljeđuje:

(a) referentnom laboratoriju za ISA-u Svjetske organizacije za zdravlje životinja (OIE) ili

(b) nacionalnom referentnom laboratoriju ili referentnom laboratoriju EU-a za bolesti riba kako je navedeno u Prilogu VI. Direktivi 2006/88/EZ.

II.2.5. Hemadsorpcija

Budući da replikacijom virusa ISA-e u staničnim kulturama ne dolazi uvijek do CPU-a, svaku se jažicu podvrgava testu RT-PCR ili testu hemadsorpcije u skladu s ovom točkom, ili testu IP u skladu s točkom II.2.6.

Medij stanične kulture uklanja se iz svake jažice, uključujući one koje se upotrebljavaju za pozitivnu i negativnu kontrolu, te je se stavlja u obilježene sterilne epruvete. 500 μl 0,2 %-tne (vol:vol) suspenzije ispranih crvenih krvnih zrnaca kunića ili konja, ili 0,05 %-tne (vol:vol) suspenzije ispranih crvenih krvnih zrnaca kalifornijske pastrve ili atlantskog lososa dodaje se u svaku jažicu i inkubira 45 minuta na sobnoj temperaturi. Crvena se krvna zrnca odstranjuju i svaka se jažica dvaput ispire medijem L-15. Svaka se jažica mikroskopski pregledava.

Postojanje nakupina stanica crvenih krvnih zrnaca pričvršćenih uz površinu stanica ASK-a ukazuje na vjerojatnu zarazu ortomiksovirusom. Ako je test hemadsorpcije pozitivan, odmah se provodi test identifikacije virusa u skladu s točkom II.2.4.

II.2.6. Imunofluorescencija

Stanice ASK-a (pasaža 65 ili niža) uzgajaju se u mediju L-15 koji sadržava 10 % fetalnoga goveđeg seruma, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamina i 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanola u pliticama s više jažica i upotrebljavaju se pri konfluenciji većoj od 50 %. Mogu se upotrijebiti i druge stanične linije i hranjive podloge s dokazanom djelotvornošću. 225 μl supernatanta kulture za koju se smatra da je zaražena virusom dodaje se u svaku od dviju jažica, pomiješa se i 225 μl prenosi u dvije sljedeće jažice, pri razrjeđenju od 1:5. Dvije dodatne jažice ostavljaju se neinokulirane i služe kao kontrola. Za uzorke iz različitih ribljih uzgajališta upotrebljavaju se posebne plitice kao i kontrole virusa. Kontrola virusa uspostavlja se upotrebom referentnog izolata virusa ISA-e.

Plitice se inkubiraju na 14 ± 2 °C i mikroskopski pregledavaju tijekom najviše sedam dana. Kada se zapazi rani CPU ili se u roku od sedam dana uopće ne zapazi CPU, sljedeći je korak fiksiranje. Jažice se ispiru fiziološkom otopinom puferiranom fosfatnim puferom (PBS) i fiksiraju inkubacijom s 80 % acetona 20 minuta na sobnoj temperaturi. Plitice se suše na zraku i odmah boje ili se pohranjuju na temperaturi od 0 do 6 °C najviše 24 sata prije bojenja.

Umnožene se jažice boje monoklonskim protutijelima (MAb) 3H6F8 i 1OC9F5 za virus ISA-e ili nekim drugim monoklonskim protutijelom koje ima dokazanu učinkovitost i specifičnost, razrjeđuju u PBS-u i inkubiraju 30 minuta pri temperaturi od 37 ± 4 °C. Monoklonsko se protutijelo odstranjuje, a plitice se ispiru tri puta 0,05 %-tnom otopinom Tween 20 u PBS-u. Konjugat protumišjeg IgG fluorescein izotiocijanata (FITC) razrijeđen u PBS-u dodaje se u svaku jažicu i inkubira 30 minuta na 37 ± 4 °C. Razrjeđenja različitih serija MAb-a i konjugata FITC-a optimiziraju se u svakom laboratoriju. Protutijelo se odstranjuje a plitice se tri puta ispiru 0,05 %-tnom otopinom Tween 20 u PBS-u.

Jažice se odmah pregledava upotrebom invertiranog mikroskopa podešenog za fluorescentnu mikroskopiju s prikladnim filterom za ekscitaciju FITC-a. Test se smatra pozitivnim ako se uoče fluorescentne stanice. Da bi test bio valjan, rezultati pozitivne kontrole moraju biti pozitivni, a rezultati negativne kontrole negativni.

II.3. Pretraživanje drugih tkiva

Tehnika navedena u točki II.2.6. može se primijeniti na druga tkiva ribe, kao što su jetra, slezena i srce, pod uvjetom da se na stakalce može prenijeti dovoljna količina endotelnih stanica, leukocita ili limfocita. Postupak bojenja ostaje isti za sva tkiva, iako je kod nekih tkiva bolje izostaviti bojenje propidijevim jodidom i očekivati da će se tipovi stanica prisutni u otisku identificirati faznim osvjetljenjem.

II.4. Histologija

Dijelovi preparirani parafinom režu se na veličinu od 5 μm i boje upotrebom hematoksilina i eozina.

Histološke promjene kod klinički bolesnog atlantskog lososa različite su, ali mogu uključivati sljedeće:

(a) mnogobrojne eritrocite u središnjem venoznom sinusu i lamelarnim kapilarama škrga, gdje mogu nastati i trombovi eritrocita;

(b) multifokalne i konfluentne petehije ili nekroza hepatocita ili oboje na određenoj udaljenosti od većih žila u jetri; multifokalna akumulacija eritrocita u proširenim hepatičnim sinusoidima;

(c) nakupljanje eritrocita u krvnim žilama lamine proprije crijeva i moguće krvarenje u laminu propriju;

(d) stroma slezene raširena zbog nakupljanja eritrocita;

(e) slabo multifokalno do obilno rašireno intersticijsko krvarenje s tubularnom nekrozom u područjima krvarenja, nakupljanje eritrocita u glomerulima u bubregu;

(f) eritrofagocitoza u slezeni i sekundarna krvarenja u jetri i bubregu.

II.5. Imunohistokemija (IHC)

Poliklonalno protutijelo protiv nukleoproteina virusa ISA-e upotrebljava se na parafinskim dijelovima tkiva fiksiranog formalinom. Organi koje se pretražuje jesu srednji bubreg i srce (prijelazno područje, uključujući sve tri komore i zaliske). Slučajeve koji su sumnjivi zbog patoloških znakova provjerava se pozitivnim IHC-om. Histološke se dijelove priprema u skladu s uobičajenim postupcima.

1. Priprema dijelova tkiva Tkiva se fiksira u neutralnom 10 %-tnom formalinu puferiranom fosfatnim puferom najmanje jedan dan, dehidrira uzastopnim uranjanjem u etanol rastuće koncentracije, pročisti u ksilenu i utisne u parafin, u skladu s uobičajenim protokolima. Dijelovi debljine oko 5 μm (za IHC stavljeni na stakalce premazano poli-L-lizinom) zagrijavaju se 20 minuta na temperaturi od 56 °C do 58 °C (najviše 60 °C), deparafiniraju u ksilenu, rehidriraju uzastopnim uranjanjem u etanol rastuće koncentracije i boje hematoksilinom i eozinom radi patomorfologije i IHC-a u skladu s točkom 2.

2. Postupak bojenja za IHC Sve se inkubacije provode na sobnoj temperaturi na pomičnoj mjernoj ploči, osim ako nije drukčije predviđeno u ovoj odluci: (a) antigeni se uzimaju vrenjem dijelova u 0,1 M citratnog pufera pH 6,0 tijekom 2 × 6 minuta nakon čega slijedi blokiranje 5 %-tnim bezmasnim mlijekom u prahu i 2 %-tnim kozjim serumom u 50 mM TBS-a (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) tijekom 20 minuta; (b) dijelove se zatim inkubira preko noći s primarnim protutijelom (monospecifično kunićje protutijelo protiv nukleoproteina virusa ISA-e) razrijeđenim u TBS-u s 1 %-tnim bezmasnim mlijekom u prahu, nakon čega slijede tri ispiranja u TBS-u s 0,1 %-tnim Tween 20; (c) za otkrivanje vezanih protutijela dijelove se 60 minuta inkubira protutijelima konjugiranima alkalnom fosfatazom za kunićji IgG. Nakon konačnog se ispiranja dodaju Fast Red (1 mg ml– 1) i Naphthol AS-MX fosfat (0,2 mg ml– 1) s 1 mM levamizola u 0,1 M TBS-a (pH 8,2) i razvija se 20 minuta. Dijelove se zatim ispire vodom iz slavine prije protubojenja hematoksilinom Harris i stavlja u vodeni medij za uklapanje uzoraka. Dijelovi tkiva pozitivni na virus ISA-e i dijelovi tkiva negativni na virus ISA-e uključuju se kao kontrole u svakom slučaju.

3. Tumačenje rezultata IHC-a Tumačenje rezultata ispitivanja IHC-om provodi se kako je utvrđeno u točkama (a) i (b): (a) kontrolne dijelove smatra se pozitivnima kad se zapazi da kontrolni dijelovi imaju jasno vidljiva crvena (crvenkasta) citoplazmatska i intranuklearna obojenja endotelnih stanica u krvnim žilama endokarda. Dio testnog uzorka smatra se pozitivnim samo ako se otkrije takvo jasno, intranuklearno crveno obojenje endotelnih stanica; (b) kontrolne dijelove smatra se negativnima ako nemaju nikakve znatne reakcije u pogledu obojenja. Budući da je intranuklearna lokalizacija specifična za nukleoprotein ortomiksovirusa u fazi replikacije virusa, ali često je dominantno popratno citoplazmatsko obojenje, citoplazmatski i drugi uzorci obojenja bez intranuklearne lokalizacije smatraju se neodređenima ili nepotpunima. Najjače pozitivne reakcije obojenja uobičajeno nastaju u endotelnim stanicama srca i bubrega. Reakcije endotelnog obojenja unutar vrlo velikih hemoragijskih lezija mogu biti male ili nepostojeće, a to je moguće zbog lize zaraženih endotelnih stanica.

DIO 4.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI ZA NADZIRANJE I POTVRĐIVANJE ZARAZE MARTEILIJOM REFRINGENS

I. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za nadziranje i potvrđivanje zaraze Marteilijom refringens

Pri uzorkovanju i laboratorijskom pretraživanju koja se provode u svrhu postizanja i održavanja određenog zdravstvenog statusa u pogledu zaraze Marteilijom refringens kako je utvrđeno u odjeljku I. dijela 4. Priloga I. ili u svrhu potvrđivanja prisutnosti te bolesti s popisa ili otklanjanja sumnje na njezinu prisutnost u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u odjeljku II. dijela 4. Priloga I. primjenjuju se detaljne metode i postupci utvrđeni u točkama I.1., I.2. i I.3. ovog dijela.

I.1. Postupak uzorkovanja

Otvoreni ili svježe uginuli pojedinačni mekušci uzorkuju se u skladu s prioritetima kako bi se povećale šanse pronalaska zaraženih životinja.

Kamenice ili dagnje se nakon uzorkovanja održavaju na temperaturi od 4 °C ili na rashlađenom ledu najviše 24 sata ako su u uzorke uključeni otvoreni mekušci i najviše 72 sata ako nisu, u plastičnoj vrećici s etiketom na kojoj su navedene pojedinosti u pogledu vrste i podrijetla kamenica ili dagnji. Otvorene ili svježe uginule mekušce drži se odvojeno od ostalih mekušaca.

Dio tkiva debljine od 3 do 5 mm, uključujući tkivo škrgi i srca, upotrebljava se za histološku dijagnozu Marteilije refringens. Dio probavne žlijezde upotrebljava se u određenim ispitivanjima, uključujući otiske i lančanu reakciju polimeraze (PCR).

I.2. Mikroskopske tehnike

I.2.1. Citologija (citologija otiska)

Nakon sušenja tkiva probavne žlijezde na upijajućem papiru na staklenim pločicama radi se nekoliko otisaka. Pločice se suši na zraku, fiksira metanolom ili čistim etanolom te oboji upotrebom komercijalno dostupnog kompleta za bojenje krvi kao što je Diff-Quik®/Hemacolor®, u skladu s uputama proizvođača. Nakon ispiranja u vodi iz slavine i sušenja pločice se postavlja na mikroskop s pokrovnim stakalcem upotrebom odgovarajućeg sintetičkog ljepila. Pločice se promatra prvo pri povećanju od 200 puta, a zatim uranjanjem u ulje pri povećanju od 1 000 puta.

Rezultat je pozitivan ako se uoče stanice najveće veličine od između 30 i 40 μm. Citoplazma se boji bazofilno, a jezgra eozinofilno. Zapaženi su blijedi krugovi oko velikih, jako obojenih (refringentnih) zrnaca i, u većim stanicama, stanice unutar stanica.

Tehnika nije specifična za parazitne vrste.

I.2.2. Histologija

Dijelovi tkiva u koje su uključene škrge, probavna žlijezda, pokrov i gonade fiksiraju se najmanje 24 sata u Davidsonovu fiksiru nakon čega slijedi uobičajena obrada za parafinsku histologiju i bojenje, na primjer hematoksilinom i eozinom. Uzorak se promatra uvećavanjem povećanja do 1 000 puta.

Rezultat je pozitivan ako se uoče stanice veličine u rasponu od 4 do najviše 40 μm. Rane se faze sastoje od multinuklearnih stanica čiji je oblik u rasponu od sferičnog do izduljenog. One se uobičajeno nalaze u epitelu jednjaka i želuca, a ponekad u labijalnim zaliscima. U sporulaciju je uključena podjela stanica unutar stanica i odvija se u tubulusima i duktusima probavne žlijezde. Refringentna zrnca pojavljuju se tijekom sporulacije, ali ne primjećuje ih se u ranim fazama. U kasnim fazama zaraze primjećuju se slobodni sporangiji u šupljini probavnog trakta. Citoplazma se boji bazofilno, a jezgra eozinofilno. Boja zrnaca može biti u rasponu od intenzivno narančaste do intenzivno crvene.

Tehnika nije specifična za parazitne vrste.

I.3. Molekularne tehnike

I.3.1. Ekstrakcija DNA

DNA se ekstrahira u skladu sa standardnim postupcima.

Mogu se upotrebljavati kompleti za ekstrakciju DNA koji su komercijalno dostupni i kojima se uobičajeno dobiva DNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za PCR navedenima u točki I.3.2.

I.3.2. Lančana reakcija polimerazom (PCR)

Razvijeno je i objavljeno nekoliko protokola za PCR.

Upotrebljavaju se PCR početnice usmjerene na područje unutarnje prepisujuće razmaknice (ITS1) jer je s pomoću njih moguće umnožiti samo M. refringens.

PCR se provodi u volumenu od 50 μl. Mješavine za PCR sadržavaju pufer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 pri 25 °C] i 1 %-tni Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, mješavinu 0,2 mM dNTP, 1 μM prednjih i stražnjih početnica, 0,02 jedinice μl– 1 Taq DNA polimeraze i 10 do 100 ng ekstrahirane DNA. Nakon denaturacije DNA pet minuta na temperaturi od 94 °C, provodi se 30 ciklusa kako slijedi: denaturacija jednu minutu na 94 °C, prianjanje jednu minutu na 55 °C te produživanje jednu minutu na 72 °C po paru kilobaze. Provodi se konačni korak produživanja od 10 minuta na 72 °C. Za otkrivanje M. refringens PCR se provodi s početnicama koje su usmjerene na područje ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ i 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

Pozitivne se kontrole sastoje od genomske DNA iz vrlo zaraženog domaćina ili plazmidne DNA, uključujući ciljano područje.

Negativne se kontrole sastoje od genomske DNA iz nezaraženih domaćina i PCR reaktanata bez ciljane DNA.

Pozitivan rezultat čini pozitivno umnažanje PCR-om na očekivanoj veličini (412 bp), pri čemu su negativne kontrole negativne, a pozitivne kontrole pozitivne.

I.3.3. Hibridizacija in situ (ISH)

Razvijeno je i objavljeno nekoliko protokola za ISH.

Upotrebljava se sonda koja je usmjerena na malu podjedinicu genskog kompleksa ribosomskog RNA jer je validirana u odnosu na histologiju.

Dijelovi tkiva u koje su uključene škrge i probavna žlijezda fiksiraju se najmanje 24 sata u Davidsonovu fiksiru nakon čega slijedi uobičajena obrada za parafinsku histologiju. Dijelovi od 5 μm režu se i stavljaju na pločice premazane aminoalkilsilanom koje se zatim preko noći zagrijava u pećnici na 40 °C. Dijelove se deparafinira uranjanjem u ksilen na 10 minuta. Taj se korak ponavlja jednom, a zatim se otapalo uklanja uranjanjem u dvije zastupne kupke od čistog etanola od po 10 minuta. Dijelove se zatim dehidrira uzastopnim uranjanjem u etanol rastuće koncentracije. Dijelove se tretira proteinazom K (100 μg ml– 1) u TE puferu (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), 30 minuta na 37 °C. Pločice se dehidrira uzastopnim uranjanjem u etanol rastuće koncentracije te zatim suši na zraku. Dijelove se inkubira sa 100 μl pufera za hibridizaciju (4 × SSC [citrat standardne fiziološke otopine], 50 % formamida, 1 × Denhardtove otopine, 250 μg ml– 1 tRNA kvasca, 10 % dekstran sulfata) koji sadržava 10 ng (1 μl PCR reaktanta pripremljenog kako je opisano u točki I.3.2. upotrebom početnica CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG i TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) sonde označene dioksigeninom. Dijelove se prekriva in-situ plastičnim pokrovnim stakalcima i stavlja na zagrijani blok pet minuta na 95 °C. Pločice se zatim hladi na ledu jednu minutu prije hibridizacije preko noći na 42 °C u vlažnoj komori. Dijelove se zatim dvaput ispire po pet minuta u 2 × SSC na sobnoj temperaturi i jednom 10 minuta u 0,4 × SSC na 42 °C. Koraci za otkrivanje provode se u skladu s uputama proizvođača. Pločice se zatim ispire u sterilnoj destiliranoj vodi (dH2O). Dijelove se protuboji bojom Bismarck Brown Yellow, ispire u dH2O te se na njih stavljaju pokrovna stakalca upotrebom vodenog medija za uklapanje uzoraka.

Pozitivne i negativne kontrole čine dijelovi iz domaćina koji su provjereno zaraženi odnosno nezaraženi.

Pozitivan rezultat dokazuje se ljubičastocrnim označivanjem stanica M. refringens bez poznatih ciljanih tkiva, pri čemu su sve negativne kontrole negativne, a sve pozitivne kontrole pozitivne.

I.3.4. Sekvenciranje

Sekvenciranje se provodi kao jedan od završnih koraka potvrdne dijagnostike. Ciljana su područja SSU rDNA i ITS1.

II. Detaljne dijagnostičke metode i postupci za nadziranje i potvrđivanje zaraze Marteilijom refringens

Za potrebe programa nadziranja i radi potvrđivanja prisutnosti zaraze Marteilijom refringens ili radi otklanjanja sumnje na tu bolest s popisa, u skladu sa zahtjevima utvrđenima u odjeljku II. dijela 4. Priloga I., dijagnostičke metode i odgovarajući postupci koji se upotrebljavaju u skladu su sa smjernicama utvrđenima u tablici 4.1. u nastavku.

Tablica 4.1.

Smjernice za upotrebu dijagnostičkih metoda za programe nadziranja i za potvrđivanje ili otklanjanje sumnje na zarazu Marteilijom refringens

Metoda Ciljano nadziranje Vjerojatna dijagnoza Potvrđena dijagnoza Otisci probavne žlijezde X X X, ili Histopatologija X X, ili Hibridizacija in situ X i PCR X X X i Sekvenciranje X

DIO 5.

DETALJNE DIJAGNOSTIČKE METODE I POSTUPCI ZA NADZIRANJE I POTVRĐIVANJE ZARAZE BONAMIJOM OSTREAEOM

I. Postupci za dijagnozu zaraze Bonamijom ostreaeom

Pri uzorkovanju i laboratorijskom pretraživanju koja se provode u svrhu postizanja i održavanja određenog zdravstvenog statusa u pogledu Bonamije ostreae kako je utvrđeno u odjeljku I. dijela 5. Priloga I. ili u svrhu potvrđivanja prisutnosti te bolesti s popisa ili otklanjanja sumnje na njezinu prisutnost u skladu s člankom 57. točkom (b) Direktive 2006/88/EZ upotrebom dijagnostičkih metoda utvrđenih u odjeljku II. dijela 5. Priloga I. primjenjuju se detaljne metode i postupci utvrđeni u točkama I.1., I.2. i I.3. u nastavku.

I.1. Postupak uzorkovanja

Otvoreni ili svježe uginuli pojedinačni mekušci uzorkuju se u skladu s prioritetima kako bi se povećale šanse pronalaska zaraženih životinja.

Kamenice se nakon uzorkovanja održavaju na temperaturi od 4 °C ili na rashlađenom ledu najviše 24 sata ako su u uzorke uključeni otvoreni mekušci i 72 sata ako nisu, u plastičnoj vrećici s etiketom na kojoj su navedene pojedinosti u pogledu vrste i podrijetla kamenica. Otvorene ili svježe uginule mekušce drži se odvojeno od ostalih mekušaca.

Dio tkiva debljine od 3 do 5 mm, uključujući tkivo škrgi i srca, upotrebljava se za histološku dijagnozu Bonamije ostreae. Dio probavne žlijezde upotrebljava se u određenim ispitivanjima, uključujući otiske i lančanu reakciju polimeraze (PCR).

I.2. Mikroskopske tehnike

I.2.1. Citologija (citologija otiska)

Nakon sušenja tkiva škrgi ili srca na upijajućem papiru na staklenim pločicama radi se nekoliko otisaka. Pločice se suši na zraku, fiksira metanolom ili čistim etanolom te oboji upotrebom komercijalno dostupnog kompleta za bojenje krvi (kao što je Diff-Quik®/Hemacolor®) u skladu s uputama proizvođača. Nakon ispiranja u vodi iz slavine i sušenja pločice se postavlja na mikroskop s pokrovnim stakalcem upotrebom odgovarajućeg sintetičkog ljepila. Pločice se promatra prvo pri povećanju od 200 puta, a zatim uranjanjem u ulje pri povećanju od 1 000 puta.

Rezultat je pozitivan ako su prisutni mali sferični ili jajoliki organizmi (široki od 2 do 5 μm) unutar hemocita. Međutim, parazit se može pojaviti i izvan stanice. Ti organizmi imaju bazofilnu citoplazmu i eozinofilnu jezgru (boje mogu varirati ovisno o upotrijebljenom bojilu) te se, zbog toga što se šire po pločici, mogu činiti širima na otiscima nego u histološkim pretraživanjima. Mogu se primijetiti i stanice s više jezgri. Tehnika nije specifična za parazitne vrste.

I.2.2. Histologija

Dijelovi tkiva u koje su uključene škrge i probavna žlijezda fiksiraju se najmanje 24 sata u Davidsonovu fiksiru nakon čega slijedi uobičajena obrada za parafinsku histologiju i bojenje, na primjer hematoksilinom i eozinom. Uzorak se promatra uvećavanjem povećanja do 1 000 puta.

Rezultat je pozitivan ako su prisutni paraziti vrlo malih stanica širine od 2 do 5 μm unutar hemocita ili slobodni u vezivnom tkivu ili sinusima škrgi, utrobe i epitelu pokrova, što se često povezuje s jakom upalom. Radi izbjegavanja sumnji, parazit se promatra unutar hemocita radi pozitivne dijagnoze. Tehnika nije specifična za parazitne vrste.

I.3. Molekularne tehnike

I.3.1. Ekstrakcija DNA

DNA se ekstrahira u skladu sa standardnim postupcima.

Mogu se upotrebljavati kompleti za ekstrakciju DNA koji su komercijalno dostupni i kojima se uobičajeno dobiva DNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za PCR opisanima u nastavku.

I.3.2. Lančana reakcija polimerazom (PCR)

Razvijeno je i objavljeno nekoliko protokola za PCR.

Mogu se upotrijebiti dva protokola za PCR usmjerena na malu podjedinicu (SSU) rDNA:

(a) prvi je uobičajeni PCR kojim se umnožava nekoliko članova obitelji Haplosporidia, uključujući Bonamiju spp. Početnice označene kao Bo i Boas jesu 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ odnosno 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ te se njima umnožava produkt od 300 bp. Mješavine za PCR sadržavaju pufer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 pri 25 °C] i 1 %-tni Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, mješavinu 0,2 mM dNTP, 1 μM prednjih i stražnjih početnica, 0,02 jedinice μl– 1 Taq DNA polimeraze i 0,2 ng μl– 1 predloška DNA u ukupnom volumenu od 50 μl. Uzorke se denaturira u uređaju za PCR (thermocycler) pet minuta na 94 °C prije no što se na njima provede 30 ciklusa (jednu minutu na 94 °C, jednu minutu na 55 °C, jednu minutu na 72 °C) nakon čega slijedi konačno produljenje 10 minuta na 72 °C. Pozitivne se kontrole sastoje od genomske DNA iz vrlo zaraženog domaćina ili plazmidne DNA, uključujući ciljano područje. Negativne se kontrole sastoje od genomske DNA iz nezaraženih domaćina i PCR reaktanata bez ciljane DNA. Pozitivan rezultat čini pozitivno umnažanje PCR-om na očekivanoj veličini (300 bp), s negativnim kontrolama koje su negativne i pozitivnim kontrolama koje su pozitivne;

(b) drugi je protokol za test PCR SYBR® Green za PCR u stvarnom vremenu. Njime se omogućuje jasno otkrivanje B. ostreae (opisano u nastavku) te ga se može kombinirati s testom PCR SYBR® Green za PCR u stvarnom vremenu kojim se omogućuje jasno otkrivanje B. exitiose (Ramilo i sur., 2013.). Početnicama BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) i BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) umnožava se produkt od 208 bp. Mješavine za PCR sadržavaju mješavinu SYBR® Green Master (1X), 0,3 μM prednjih i stražnjih početnica te 200 ng ekstrahirane DNA. Uzorke se denaturira u sustavu za otkrivanje u stvarnom vremenu 10 minuta na 95 °C prije no što se na njima provede 35 ciklusa (30 sekundi na 95 °C, 45 sekundi na 55 °C i jednu minutu na 72 °C). Analiza krivulje temperature taljenja provodi se uvećanjima temperature od 0,5 °C/s, počevši na 55 °C i završavajući na 95 °C te bilježenjem fluorescencije pri svakoj promjeni temperature. Pozitivne se kontrole sastoje od genomskog DNA iz vrlo zaraženog domaćina ili plazmidnog DNA, uključujući ciljano područje. Negativne se kontrole sastoje od genomskog DNA iz nezaraženih domaćina i PCR reaktanata bez ciljanog DNA. Rezultat je pozitivan ako dođe do pozitivnog PCR umnažanja s jedinstvenim vrhuncem temperature taljenja (78,25 ±