HR Službeni list Europske unije 3

32009R0152



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE

UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 152/2009

od 27. siječnja 2009.

o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje

(Tekst značajan za EGP)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 882/2004 Europskog parlamenta i Vijeća od 29. travnja 2004. o službenom nadzoru koji se provodi radi provjere pridržavanja propisa o hrani i hrani za životinje te pravila o zdravlju i dobrobiti životinja (1), a posebno njezin članak 11. stavak 4. točke (a), (b) i (c),

budući da:

(1) Sljedeći akti doneseni su za provedbu Direktive 70/373/EEZ i ostaju na snazi u skladu s člankom 61. stavkom 2. Uredbe (EZ) br. 882/2004: — Prva direktiva Komisije 71/250/EEZ od 15. lipnja 1971. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (2), — Druga direktiva Komisije 71/393/EEZ od 18. studenoga 1971. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (3), — Treća direktiva Komisije 72/199/EEZ od 27. travnja 1972. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (4), — Četvrta direktiva Komisije 73/46/EEZ od 5. prosinca 1972. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (5), — Prva direktiva Komisije 76/371/EEZ od 1. ožujka 1976. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (6), — Sedma direktiva Komisije 76/372/EEZ od 1. ožujka 1976. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (7), — Osma direktiva Komisije 78/633/EEZ od 15. lipnja 1978. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (8), — Deveta direktiva Komisije 81/715/EEZ od 31. srpnja 1981. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (9), — Deseta direktiva Komisije 84/425/EEZ od 25. srpnja 1984. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (10), — Direktiva Komisije 86/174/EEZ od 9. travnja 1986. o utvrđivanju metode izračuna energetske vrijednosti krmnih smjesa za perad (11), — Jedanaesta direktiva Komisije 93/70/EEZ od 28. srpnja 1993. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (12), — Dvanaesta direktiva Komisije 93/117/EZ od 17. prosinca 1993. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za službenu kontrolu hrane za životinje (13), — Direktiva Komisije 98/64/EZ od 3. rujna 1998. o utvrđivanju analitičkih metoda Zajednice za utvrđivanje aminokiselina, sirovih ulja i masti te olakvindoksa u hrani za životinje i o izmjeni Direktive 71/393/EEZ (14), — Direktiva Komisije 1999/27/EZ od 20. travnja 1999. o utvrđivanju metoda analize Zajednice za određivanje amproliuma, diklazurila i karbadoksa u hrani za životinje te kojom se izmjenjuju direktive 71/250/EEZ i 73/46/EEZ i stavlja izvan snage Direktiva 74/203/EEZ (15), — Direktiva Komisije 1999/76/EZ od 23. srpnja 1999. o utvrđivanju metode analize Zajednice za određivanje lasalocid natrija u hrani za životinje (16), — Direktiva Komisije 2000/45/EZ od 6. srpnja 2000. o utvrđivanju metode analize Zajednice za određivanje vitamina A, vitamina E i triptofana u hrani za životinje (17), — Direktiva Komisije 2002/70/EZ od 26. srpnja 2002. o utvrđivanju uvjeta za određivanje razina dioksina i PCB-a sličnih dioksinu u hrani za životinje (18), — Direktiva Komisije 2003/126/EZ od 23. prosinca 2003. o utvrđivanju metode analize za određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u okviru službene kontrole hrane za životinje (19).

(2) S obzirom da je Direktiva 70/373/EEZ zamijenjena Uredbom (EZ) br. 882/2004, prikladno je zamijeniti provedbene akte navedene Direktive jednom uredbom. Istodobno je potrebno prilagoditi metode s obzirom na znanstveno-tehnološki razvoj. Potrebno je staviti izvan snage metode koje više nisu valjane za njihovu predviđenu namjenu. Iako je predviđeno pravodobno ažuriranje odredaba o uzorkovanju kako bi se uzeli u obzir najnoviji rezultati razvoja u proizvodnji, skladištenju, prijevozu i trgovanju hranom za životinje, za sada je primjereno zadržati postojeće odredbe o uzorkovanju.

(3) Zbog toga treba staviti izvan snage direktive 71/250/EEZ, 71/393/EEZ, 72/199/EEZ, 73/46/EEZ, 76/371/EEZ, 76/372/EEZ, 78/633/EEZ, 81/715/EEZ, 84/425/EEZ, 86/174/EEZ, 93/70/EEZ, 93/117/EZ, 98/64/EZ, 1999/27/EZ, 1999/76/EZ, 2000/45/EZ, 2002/70/EZ i 2003/126/EZ.

(4) Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Stalnog odbora za prehrambeni lanac i zdravlje životinja,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

Uzorkovanje za službenu kontrolu hrane za životinje u vezi s određivanjem sastojaka, dodataka i nepoželjnih tvari, osim ostataka pesticida i mikroorganizama, provodi se u skladu s metodama iz Priloga I.

Članak 2.

Priprema uzoraka za analizu i prikazivanje rezultata izvode se u skladu s metodama iz Priloga II.

Članak 3.

Analiza za službenu kontrolu hrane za životinje izvodi se pomoću metoda iz Priloga III. (Analitičke metode za kontrolu sastava hrane za životinje i krmnih smjesa), Priloga IV. (Analitičke metode za kontrolu količine dopuštenih krmnih dodataka), Priloga V. (Analitičke metode za kontrolu nepoželjnih tvari u hrani za životinje) i Priloga VI. (Analitičke metode za određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u okviru službene kontrole hrane za životinje).

Članak 4.

Energetska vrijednost krmnih smjesa za perad izračunava se u skladu s Prilogom VII.

Članak 5.

U svrhu potvrđivanja koriste se metode analize za kontrolu nedopuštenih krmnih dodataka iz Priloga VIII.

Članak 6.

Direktive 71/250/EEZ, 71/393/EEZ, 72/199/EEZ, 73/46/EEZ, 76/371/EEZ, 76/372/EEZ, 78/633/EEZ, 81/715/EEZ, 84/425/EEZ, 86/174/EEZ, 93/70/EEZ, 93/117/EZ, 98/64/EZ, 1999/27/EZ, 1999/76/EZ, 2000/45/EZ, 2002/70/EZ i 2003/126/EZ stavljaju se izvan snage.

Upućivanja na Direktive stavljene izvan snage smatraju se upućivanjima na ovu Uredbu i tumače u skladu s korelacijskim tablicama iz Priloga IX.

Članak 7.

Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ona se primjenjuje od 26. kolovoza 2009.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama. Sastavljeno u Bruxellesu 27. siječnja 2009. Za Komisiju Androulla VASSILIOU Članica Komisije

(1) SL L 165, 30.4.2004., str. 1., ispravljeno u SL L 191, 28.5.2004., str. 1.

(2) SL L 155, 12.7.1971., str. 13.

(3) SL L 279, 20.12.1971., str. 7.

(4) SL L 123, 29.5.1972., str. 6.

(5) SL L 83, 30.3.1973., str. 21.

(6) SL L 102, 15.4.1976., str. 1.

(7) SL L 102, 15.4.1976., str. 8.

(8) SL L 206, 29.7.1978., str. 43.

(9) SL L 257, 10.9.1981., str. 38.

(10) SL L 238, 6.9.1984., str. 34.

(11) SL L 130, 16.5.1986., str. 53.

(12) SL L 234, 17.9.1993., str. 17.

(13) SL L 329, 30.12.1993., str. 54.

(14) SL L 257, 19.9.1998., str. 14.

(15) SL L 118, 6.5.1999., str. 36.

(16) SL L 207, 6.8.1999., str. 13.

(17) SL L 174, 13.7.2000., str. 32.

(18) SL L 209, 6.8.2002., str. 15.

(19) SL L 339, 24.12.2003., str. 78.

PRILOG I. METODE UZORKOVANJA 1. SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE Uzorci za službenu kontrolu hrane za životinje uzimaju se u skladu s dolje opisanim metodama. Tako dobiveni uzorci smatraju se reprezentativnima za uzorkovane dijelove. 2. OSOBLJE KOJE UZIMA UZORKE Uzorke uzimaju osobe koje za tu svrhu ovlašćuju države članice. 3. DEFINICIJE POJMOVA Uzorkovani dio: količina proizvoda koja čini cjelinu i ima osobine koje se smatraju jednolikima. Pojedinačni uzorak: količina koja se uzima iz jedne točke uzorka. Skupni uzorak: skup pojedinačnih uzoraka uzetih iz istog uzorka. Reducirani uzorak: reprezentativni dio skupnog uzorka dobiven postupkom smanjivanja skupnog uzorka. Konačni uzorak: dio reduciranog uzorka ili homogeniziranog skupnog uzorka. 4. OPREMA 4.1. Oprema za uzorkovanje mora biti izrađena od materijala koji ne mogu kontaminirati proizvode namijenjene uzorkovanju. Takvu opremu države članice mogu službeno odobriti. 4.2. Preporučena oprema za uzorkovanje krute hrane za životinje 4.2.1. Ručno uzorkovanje 4.2.1.1. Lopatica s ravnim dnom i okomitim stranicama. 4.2.1.2. Sonda za uzorkovanje s dugim procjepom ili pregradama. Dimenzije sonde za uzorkovanje moraju odgovarati osobinama uzorka (dubina posude, veličina vreće itd.) i veličini čestica hrane za životinje. 4.2.2. Mehaničko uzorkovanje Za uzorkovanje hrane za životinje koja se kreće može se koristiti odobrena mehanička oprema. 4.2.3. Razdjelnik Uređaj namijenjena za dijeljenje uzorka na približno jednake dijelove može se koristiti za uzimanje pojedinačnih uzoraka i za pripremu reduciranih i konačnih uzoraka. 5. KOLIČINSKI ZAHTJEVI 5.A. Kod kontrole tvari ili proizvoda koji su ravnomjerno raspodijeljeni u hrani za životinje. 5.A.1. Uzorkovani dio Veličina uzorka mora biti takva da se od svakog njegovog sastavnog dijela može načiniti uzorak. 5.A.2. Pojedinačni uzorci 5.A.2.1. Hrana za životinje u rasutom stanju: Najmanji broj pojedinačnih uzoraka: 5.A.2.1.1. uzorkovani dijelovi manji od 2,5 tone sedam 5.A.2.1.2. uzorkovani dijelovi veći od 2,5 tone Kvadratni korijen iz dvadeseterokratnika broja tona u uzorkovanom dijelu (*), do najviše 40 pojedinačnih uzoraka 5.A.2.2. Pakirana hrana za životinje: Najmanji broj pakovina za uzorkovanje (**): 5.A.2.2.1. Paketi mase veće od 1 kg: 5.A.2.2.1.1. uzorkovani dijelovi iz 1 do 4 pakovine sve pakovine 5.A.2.2.1.2. uzorkovani dijelovi iz 5 do 16 pakovina četiri 5.A.2.2.1.3. uzorkovani dijelovi iz više od 16 pakovina Kvadratni korijen iz broja paketa koji čine uzorkovani dio (*), do najviše 20 pakovina 5.A.2.2.2. Pakovine mase ne veće od 1 kg četiri 5.A.2.3. Tekuća ili polutekuća hrana za životinje: Najmanji broj spremnika za uzorkovanje (**): 5.A.2.3.1. Spremnici zapremnine do 1 litre: 5.A.2.3.1.1. uzorkovani dijelovi iz 1 do 4 spremnika svi spremnici 5.A.2.3.1.2. uzorkovani dijelovi iz 5 do 16 spremnika četiri 5.A.2.3.1.3. uzorkovani dijelovi iz više od 16 spremnka Kvadratni korijen iz broja spremnika koje čine uzorkovani dio (*), do najviše 20 spremnika 5.A.2.3.2. Spremnici zapremnine do 1 litre četiri 5.A.2.4. Krmni blokovi ili kameni za lizanje Najmanji broj blokova ili kamena za lizanje namijenjenih uzorkovanju (**): 1 blok ili kamen za lizanje na uzorkovani dio od 25 komada, do najviše 4 bloka ili kamena za lizanje 5.A.3. Skupni uzorak: Zahtijeva se samo jedan skupni uzorak na uzorkovani dio. Ukupan broj pojedinačnih uzoraka koji čine skupni uzorak ne smije biti manji od: 5.A.3.1. Hrana za životinje u rasutom stanju 4 kg 5.A.3.2. Pakirana hrana za životinje: 5.A.3.2.1. Pakovine mase veće od 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. Pakovine mase do 1 kg masa udjela četiri izvorne pakovine 5.A.3.3. Tekuća ili polutekuća hrana za životinje: 5.A.3.3.1. Spremnici zapremnine veće od 1 litra četiri litre 5.A.3.3.2. Spremnici zapremnine do od 1 litre zapremnina udjela četiri izvorne posude 5.A.3.4. Krmni blokovi ili kameni za lizanje: 5.A.3.4.1. pojedinačne mase veće od 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. pojedinačne mase ne veće od 1 kg masa četiri izvorna bloka ili kamena za lizanje 5.A.4. Konačni uzorci Iz skupnog se uzorka prema potrebi nakon smanjivanja dobiva konačni uzorak. Potrebna je analiza najmanje jednog konačnog uzorka. Količina konačnog uzorka za analizu ne smije biti manja od: Kruta hrana za životinje 500 g Tekuća ili polutekuća hrana za životinje 500 ml 5.B. Kod kontrole nepoželjnih tvari ili proizvoda, vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje, poput aflatoksina, ražene glavice, ricinusa i krotalarije u sirovini za dobivanje životinjske hrane (***) 5.B.1. Uzorkovani dio: vidjeti točku 5.A.1. 5.B.2. Pojedinačni uzorci 5.B.2.1. Hrana za životinje u rasutom stanju: vidjeti točku 5.A.2.1. 5.B.2.2. Pakirana hrana za životinje: Najmanji broj pakovina za uzorkovanje: 5.B.2.2.1. uzorkovani dijelovi koji se sastoje od 1 do 4 pakovine sve pakovine 5.B.2.2.2. uzorkovani dijelovi koji se sastoje od 5 do 16 pakovina 4 5.B.2.2.3. uzorkovani dijelovi koji se sastoje od više od 16 pakovina Kvadratni korijen iz broja pakovina koji čine uzorkovani dio (*), do najviše 40 pakovina 5.B.3. Skupni uzorci Broj skupnih uzoraka ovisi o veličini uzorka. Najmanji broj skupnih uzoraka po uzorkovanom dijelu, naveden je dolje. Ukupna masa pojedinačnih uzoraka koji čine svaki skupni uzorak ne smije biti manja od 4 kg 5.B.3.1. Hrana za životinje u rasutom stanju Masa uzorka u tonama: Najmanji broj skupnih uzoraka po uzorkovanom dijelu: do 1 1 više od 1 do 10 2 više od 10 do 40 3 više od 40 4 5.B.3.2. Pakirana hrana za životinje Broj pakovina uzorka: Najmanji broj skupnih uzoraka po uzorkovanom dijelu: 1 do 16 1 17 do 200 2 201 do 800 3 više od 800 4 5.B.4. Konačni uzorci Iz svakog se skupnog uzorka nakon smanjivanja dobiva konačni uzorak. Potrebno je napraviti analizu najmanje jednog konačnog uzorka po skupnom uzorku. Masa konačnog uzorka za analizu ne smije biti manja od 500 g. 6. UPUTE ZA UZIMANJE, PRIPREMANJE I PAKIRANJE UZORAKA 6.1. Općenito Uzorci se moraju uzimati i pripremiti u što kraćem vremenu uz pridržavanje mjera opreza kojima se sprečava promjena sastava ili kontaminacija proizvoda. Instrumenti, radne površine i posude za prihvat uzoraka moraju biti čisti i suhi. 6.2. Pojedinačni uzorci 6.2.A. Kod kontrole tvari ili proizvoda koji su ravnomjerno raspodijeljeni u hrani za životinje Pojedinačni uzorci moraju se uzeti nasumično iz cijeloga uzorka i moraju biti približno jednake veličine. 6.2.A.1. Hrana za životinje u rasutom stanju Uzorkovani se dio dijeli na približno jednake zamišljene dijelove. Nasumično se odabere broj dijelova koji odgovara traženom broju pojedinačnih uzoraka u skladu s točkom 5.A.2 i iz svakog od njih se uzme najmanje jedan uzorak. Prema potrebi se uzorkovanje može izvesti kod premještanja uzorka (pri utovaru ili istovaru). 6.2.A.2. Pakirana hrana za životinje Nakon odabira potrebnog broja paketa za uzorkovanje u skladu s točkom 5.A.2., sondom ili lopaticom uzima se dio udjela svakog paketa. Prema potrebi, uzorci se mogu uzeti nakon odvojenog pražnjenja paketa. U svakom skupnom uzorku zasebno razbiju se sve grude, prema potrebi, tako da se odvoje i zatim vrate u uzorak. 6.2.A.3. Homogenizirana ili za homogeniziranje primjerena tekuća ili polutekuća hrana za životinje Nakon odabira potrebnog broja posuda za uzorkovanje iz točke 5.A.2, njihov se udio prema potrebi homogenizira i iz svakog se spremnika uzima određena količina. Pojedinačni se uzorci mogu uzimati pri pražnjenju sadržaja spremnika. 6.2.A.4. Tekuća ili polutekuća hrana za životinje koja nije prikladna za homogeniziranje Nakon odabira traženog broja spremnika za uzimanje uzoraka iz točke 5.A.2, uzorci se uzimaju s različitih razina. Uzorci se mogu uzeti i za vrijeme pražnjenja udjela, ali se prva količina mora odbaciti. U oba slučaja ukupni obujam ne smije biti manji od 10 litara. 6.2.A.5. Krmni blokovi ili kameni za lizanje Nakon odabira traženog broja blokova ili kamena za lizanje namijenjenih uzorkovanju iz točke 5.A.2 uzme se dio svakog bloka ili kamena za lizanje. 6.2.B. Kod kontrole nepoželjnih tvari ili proizvoda, vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje, poput aflatoksina, ražene glavice, ricinusa i krotalarije u sirovini za dobivanje hrane za životinje Uzorkovani dio se razdijeli na približno jednake zamišljene dijelove koji odgovaraju broju ukupnih uzoraka iz točke 5.B.3. Ako je taj broj veći od jedan, ukupan broj pojedinačnih uzoraka iz točke 5.B.2 razdijeli se približno ravnomjerno po različitim dijelovima. Zatim se uzmu uzorci približno jednake veličine (1), koji moraju biti takvi da ukupna količina u uzorcima iz svakog dijela nije manja od 4 kg, što predstavlja minimalnu količinu za svaki skupni uzorak. Pojedinačni uzorci uzeti iz različitih dijelova ne smiju se spajati u skupni uzorak. 6.3. Priprema skupnih uzoraka 6.3.A. Kod kontrole tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje Pojedinačni uzorci se pomiješaju tako da tvore skupni uzorak. 6.3.B. Kod kontrole nepoželjnih tvari ili proizvoda, vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje, poput aflatoksina, ražene glavice, ricinusa i krotalarije u sirovini za dobivanje hrane za životinje Pojedinačni uzorci iz svakog dijela uzorka se pomiješaju i pripremi se broj skupnih uzoraka utvrđen točkom 5.B.3, pri čemu treba zabilježiti izvor svakog skupnog uzorka. 6.4. Priprema konačnih uzoraka Materijal u svakom skupnom uzorku treba pažljivo izmiješati kako bi se dobio homogenizirani uzorak (2). Prema potrebi se skupni uzorak najprije smanji na najmanje 2 kg ili 2 litre (smanjeni uzorak) mehaničkim ili automatskim razdjelnikom ili četvrtanjem. Potom se pripremi najmanje tri konačna uzorka približno jednake veličine u skladu s količinskim zahtjevima iz točke 5.A.4 ili 5.B.4. Svaki se uzorak pohrani u prikladni spremnik. Potrebno je poduzeti sve mjere opreza kako bi se tijekom prijevoza ili skladištenja spriječila promjena sastava uzorka, kontaminacija ili onečišćenje. 6.5. Pakiranje konačnih uzoraka Posude ili paketi moraju biti zapečaćeni i označeni etiketama (cijela etiketa mora biti uključena u pečat), tako da ih nije moguće otvoriti bez oštećenja pečata. 7. PODACI O UZORKOVANJU O svim obavljenim uzorkovanjima moraju se voditi evidencije kako bi se svaki uzorkovani dio mogao nedvojbeno prepoznati. 8. DOSTAVLJANJE UZORAKA Za svaki skupni uzorak treba u najkraćem mogućem roku najmanje jedan konačni uzorak dostaviti u ovlašteni laboratorij, zajedno sa svim podacima koji su potrebni osobi koja izvodi analizu. (*) Kada dobiveni broj nije cijeli broj, zaokružuje se na sljedeći cijeli broj. (**) Za pakovine ili spremnike udjela manjeg od 1 kg ili 1 litre, te za blokove ili kamene za lizanje pojedinačne mase ne veće od 1 kg, pojedinačni uzorak je udio pojedinačne izvorne pakovine ili spremnika, jednog bloka ili jednog kamena. (***) Metode iz 5.A. koriste se za kontrolu aflatoksina, ražene glavice, ricinusa i krotalarije u potpunim ili dopunskim krmnim smjesama. (1) Kod pakirane hrane za životinje, sondom ili lopaticom uzme se dio udjela paketa koji se uzorkuje, prema potrebi nakon odvojenog pražnjenja pakovine. (2) U svakom se skupnom uzorku zasebno razbiju sve grude, prema potrebi, tako da se odvoje i zatim vrate u uzorak.

PRILOG II. OPĆE ODREDBE O ANALITIČKIM METODAMA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE A. PRIPREMA UZORAKA ZA ANALIZU 1. Svrha U dolje navedenim postupcima opisuje se priprema konačnih uzoraka za analizu, koji se šalju nadzornim laboratorijima nakon uzorkovanja izvršenog u skladu s odredbama iz Priloga I. Ti se uzorci moraju pripremiti tako da izvagane količine budu homogene i reprezentativne za konačne uzorke, kako je predviđeno za metode analize. 2. Mjere opreza Postupak za pripremanje uzoraka ovisi o analitičkoj metodi koja se koristi. Stoga je vrlo važno osigurati da primijenjeni postupak za pripremanje uzorka bude primjeren analitičkoj metodi koja se koristi. Svi potrebni postupci moraju se izvesti na način kojim se u najvećoj mogućoj mjeri sprečava kontaminacija i promjena sastava uzorka. Mljevenje, miješanje i prosijavanje mora se vršiti se na najbrži mogući način kako bi se uzorak čim manje izlagao zraku i svjetlu. Ne smiju se koristiti mlinovi i drobilice koji bi mogli znatno zagrijati uzorak. Preporuča se ručno mljevenje za hranu za životinje koja je posebno osjetljiva na toplinu. Treba se pobrinuti da sama oprema ne bude izvor kontaminacije elementima u tragovima. Ako se priprema ne može obaviti bez znatne promjene udjela vlage u uzorku, određuje se udio vode prije i nakon pripreme, u skladu s metodom utvrđenoj u dijelu A Priloga III. 3. Postupak Uzorak se prikladnim tehnikama dijeljenja, poput naizmjeničnog uzimanja uzorka lopaticom ili uzimanja uzorka pri stacionarnom ili rotacijskom miješanju, razdijeli na prikladne manje uzorke za analizu i za referentne namjene. Ne preporuča se dijeljenje uzoraka metodom stožaste hrpe i četvrtanja, budući da se na taj način mogu dobiti poduzorci s visokom pogreškom dijeljenja. Referentni se uzorak drži u primjereno čistoj i suhoj posudi s hermetičkim zatvaračem, a poduzorci mase od najmanje 100 g pripremaju se za analizu kako je navedeno u daljnjem u tekstu. 3.1. Hrana za životinje koja se može samljeti bez dodatne obrade Ako se u analitičkim metodama ne navodi drukčije, cijeli se uzorak nakon usitnjavanja prosije kroz sito s kvadratnim očicama veličine stranice 1 mm (u skladu s preporukom ISO R565). Treba izbjegavati pretjerano usitnjavanje. Prosijani se uzorak promiješa i prikupi u prikladno čistu i suhu posudu s hermetičkim zatvaračem. Neposredno prije vaganja količine za analizu, uzorak se ponovo promiješa. 3.2. Hrana za životinje koja se može samljeti nakon sušenja Ako se u analitičkim metodama ne navodi drukčije, uzorak se, u skladu s postupkom za prethodno sušenje iz točke 4.3. metode za određivanje udjela vlage iz dijela A Priloga III., suši, tako da se udio vode snizi na 8 % – 12 %. Zatim se nastavlja u skladu s točkom 3.1. 3.3. Tekuća ili polutekuća hrana za životinje Uzorak se prikupi u prikladno čistu i suhu posudu s hermetičkim zatvaračem. Neposredno prije vaganja količine za analizu, uzorak se temeljito promiješa. 3.4. Ostala hrana za životinje Uzorci koji se ne mogu pripremiti u skladu s jednom od gore navedenih postupaka obrađuju se bilo kojim drugim postupkom kojim se osigurava da je količina uzorka odvagana za analizu homogena i reprezentativna za konačne uzorke. 4. Pohranjivanje uzoraka Uzorci se moraju pohraniti na temperaturi koja neće promijeniti njihov sastav. Uzorci namijenjeni za analizu vitamina ili tvari posebno osjetljivih na svjetlost moraju se pohraniti u spremnicima od smeđeg stakla. B. ODREDBE O REAGENSIMA I OPREMI, KOJI SE KORISTE U ANALITIČKIM METODAMA 1. Ako se u analitičkim metodama ne navodi drukčije, svi reagensi moraju biti analitičke čistoće (pro analisi (p.a.)). Kod analize tragova, čistoća reagensa mora se provjeriti slijepom probom. Ovisno o dobivenim rezultatima, može biti potrebno dodatno pročišćivanje reagensa. 2. Kod svih postupaka iz analitičkih metoda koji uključuju pripremanje otopina, razrjeđivanje, ispiranje ili pranje, a kod kojih se ne navodi vrsta korištenog otapala ili razrjeđivača, koristi se voda. U pravilu, voda mora biti demineralizirana ili destilirana. U posebnim slučajevima, navedenim u analitičkim metodama, vodu treba pročistiti posebnim postupcima. 3. S obzirom na opremu koja se uobičajeno nalazi u kontrolnim laboratorijima, u analitičkim se metodama navode samo posebni instrumenti i oprema ili oni koji zahtijevaju poseban način uporabe. Oni moraju biti čisti, posebno kod određivanja vrlo malih količina tvari. C. PRIMJENA ANALITIČKIH METODA I PRIKAZ REZULTATA 1. Postupak ekstrakcije U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak ekstrakcije. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci ekstrakcije, pod uvjetom da je učinkovitost korištenog postupka ekstrakcije za analiziranu matricu dokazano jednakovrijedna postupku navedenom u metodi. 2. Postupak pročišćivanja U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak pročišćivanja. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci pročišćivanja, pod uvjetom da se korištenim postupkom pročišćivanja za analiziranu matricu dokazano postižu analitički rezultati jednakovrijedni postupku navedenom u metodi. 3. Izvješćivanje o korištenoj analitičkoj metodi Općenito je za određivanje svake tvari u hrani za životinje određena samo jedna metoda. Kada je određeno više metoda, kontrolni laboratorij u izvješću o analizi mora navesti korištenu metodu. 4. Broj postupaka određivanja Rezultat naveden u izvješću o analizi je srednja vrijednost najmanje dvaju postupaka određivanja zadovoljavajuće ponovljivosti, izvedenih na odvojenim dijelovima uzorka. Međutim, kod analize nepoželjnih tvari, ako je rezultat prvog određivanja znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. Pri kontroli označenog udjela tvari ili sastojka, ako rezultat prvog određivanja potvrdi označeni udio, tj. ako je rezultat analize unutar prihvatljivih granica odstupanja od označenog udjela, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. U nekim je slučajevima ta prihvatljiva granica odstupanja utvrđena propisima poput Direktive Vijeća 79/373/EEZ (1). 5. Izvješćivanje o rezultatima analize Rezultat analize prikazuje se na način utvrđen analitičkom metodom, s primjerenim brojem značajnih znamenki, i prema potrebi se korigira s obzirom na udio vode u konačnom uzorku prije priprave. 6. Nesigurnost mjerenja i stupanj iskorištenja pri analizi nepoželjnih tvari U vezi s nepoželjnim tvarima u smislu Direktive 2002/32/EZ, uključujući dioksine i PCB-e slične dioksinu, proizvod namijenjen za hranu za životinje smatra se da nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom ako je rezultat analize veći od najveće dopuštene količine, uzimajući u obzir proširenu nesigurnost mjerenja i korekciju za iskorištenje. Za ocjenu usklađenosti koristi se analizirana koncentracija nakon korekcije za iskorištenje i nakon oduzimanja proširene nesigurnosti mjerenja. Taj se postupak primjenjuje samo u slučajevima kada analitička metoda omogućuje procjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje (na primjer, nije moguć u slučaju mikroskopske analize). Rezultati analize iskazuju se na sljedeći način (ako korištena analitička metoda omogućuje ocjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje): (a) s korekcijom za iskorištenje, pri čemu se navodi razina iskorištenja. Korekcija za iskorištenje nije potrebna ako je postotak iskorištenja između 90 % i 110 %; (b) kao „x +/– U”, pri čemu je x rezultat analize, a U proširena nesigurnost mjerenja uz uporabu obuhvatnog faktora 2, čime se postiže razina pouzdanosti od približno 95 %. Međutim, ako je rezultat analize znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira i pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete, a svrha analize je samo provjera usklađenosti sa zakonskim odredbama, rezultat analize može se iskazati bez korekcije za iskorištenje i u tim se slučajevima korekcija za iskorištenje i nesigurnost mjerenja mogu izostaviti. (1) SL L 86, 6.4.1979., str. 30.

PRILOG III. ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU SASTAVA SIROVINA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE I KRMNIH SMJESA A. ODREĐIVANJE VLAGE 1. Svrha i područje primjene Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela vlage u hrani za životinje. Kada hrana za životinje sadrži hlapljive tvari, poput organskih kiselina, treba uzeti u obzir da se pri određivanju vlage obuhvaća i znatna količina hlapljivih tvari. Ova metoda ne obuhvaća analizu mliječnih proizvoda kao sirovina za hranu za životinje, analizu mineralnih tvari i smjesa sastavljenih uglavnom od mineralnih tvari, analizu životinjskih i biljnih masti i ulja ili analizu sjemenki uljarica i uljanog voća. 2. Načelo Uzorak se osuši pod određenim uvjetima koji se mijenjaju ovisno o vrsti hrane za životinje. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem. Kod krute hrane za životinje s visokim udjelom vode potrebno je prethodno sušenje. 3. Oprema 3.1. Drobilica od materijala koji ne apsorbira vlagu i lako se čisti, omogućuje brzo i ravnomjerno drobljenje bez pretjeranog zagrijavanja, u najvećoj mogućoj mjeri sprečava kontakt s vanjskim zrakom te ispunjava zahtjeve iz točaka 4.1.1 i 4.1.2 (npr. udarne ili vodom hlađene mikrodrobilice, konusni mlinovi sa sklopivim konusima, spore drobilice ili drobilice sa zupčanicima). 3.2. Analitička vaga s preciznošću do 1 mg 3.3. Suhe posude od nehrđajuće kovine ili stakla s poklopcima koji omogućuju hermetičko zatvaranje; radna površina koja omogućuje rasprostiranje testnog uzorka na približno 0,3 g/cm2. 3.4. Izotermičko sušilo (± 2 °C) s električnim grijanjem i primjerenim provjetravanjem koje omogućuje brzu regulaciju temperature (1). 3.5. Podesivo električno vakuumsko sušilo opremljeno uljnom crpkom i mehanizmom za dovod vrućeg suhog zraka ili sredstva za isušivanje (npr. kalcijevog oksida). 3.6. Eksikator s debelom metalnom ili porculanskom perforiranom pločom koja sadrži učinkovito sredstvo za isušivanje. 4. Postupak Napomena : Postupci opisani u ovom odjeljku moraju se provesti odmah po otvaranju pakovina s uzorcima. Analiza se mora provesti najmanje dvaput zaredom. 4.1. Priprema 4.1.1. Hrana za životinje osim one iz točaka 4.1.2 i 4.1.3 Uzme se najmanje 50 g uzorka. Prema potrebi se usitni ili razdijeli tako da se spriječi promjena udjela vlage (vidjeti točku 6). 4.1.2. Žitarice i gruba krupica Uzme se najmanje 50 g uzorka. Uzorak se samelje tako da najmanje 50 % čestica prolazi kroz sito s očicama veličine 0,5 mm, a na situ s okruglim očicama veličine 1 mm ostane najviše 10 % čestica. 4.1.3. Tekuća ili kašasta hrana za životinje i hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti Odvagne se približno 25 g uzorka s preciznošću od 10 mg, doda se primjerena količina bezvodnog pijeska izvagana s preciznošću od 10 mg te se miješa dok se ne dobije homogena masa. 4.2. Sušenje 4.2.1. Hrana za životinje, osim one iz točaka 4.2.2. i 4.2.3. Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 1 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 103 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje četiri sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 103 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg. Hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti suši se u sušilu dodatnih 30 minuta na 130 °C. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage. 4.2.2. Žitarice, brašno, gruba krupica i sitna krupica Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g usitnjenog uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 130 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje 2 sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 130 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg. 4.2.3. Krmne smjese koje sadrže više od 4 % saharoze ili laktoze: sirovine za hranu za životinje poput rogača, hidroliziranih žitnih proizvoda, sjemena slada, sušene mljevene repe, ribe i otopine šećera; krmne smjese koje sadrže više od 25 % mineralnih soli, uključujući kristalnu vodu. Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u vakuumsko sušilo (točka 3.5.) prethodno zagrijano na 80 – 85 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Tlak se poveća na 100 torra i na tom se tlaku ostavi sušiti četiri sata na vrućem suhom zraku ili upotrebom sredstva za isušivanje (približno 300 g za 20 uzoraka). U potonjem se slučaju vakuumska crpka isključi kad se dosegne traženi tlak. Vrijeme sušenja računa se od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 80 – 85 °C. Oprezno se izjednači tlak u sušilu s atmosferskim tlakom. Sušilo se otvori, posuda se odmah pokrije poklopcem i izvadi iz sušila, ostavi se hladiti 30 do 45 minuta u eksikatoru (točka 3.6.) i izvaže s preciznošću od 1 mg. Suši se dodatnih 30 minuta u vakuumskom sušilu na 80 – 85 °C i ponovo važe. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage. 4.3. Prethodno sušenje 4.3.1. Hrana za životinje, osim one iz točke 4.3.2. Kruta hrana za životinje s visokim udjelom vode koja se teško drobi mora se prethodno sušiti na sljedeći način: U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog uzorka s preciznošću od 10 mg (sabijena ili zgusnuta hrana za životinje može se prema potrebi grubo razdijeliti). Ostavi se sušiti u sušilu na 60 – 70 °C, sve dok se udio vode ne smanji na 8 – 12 %. Posuda se izvadi iz sušila i jedan sat hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Hrana za životinje se odmah usitni, u skladu s točkom 4.1.1., i suši, u skladu s točkom 4.2.1. ili 4.2.3., ovisno o vrsti hrane za životinje. 4.3.2. Žitarice Zrna sa udjelom vode većim od 17 % moraju se prethodno sušiti na sljedeći način: U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog zrnja s preciznošću od 10 mg. Ostavi se sušiti 5 do 7 minuta u sušilu na 130 °C. Posuda se izvadi iz sušila i 2 sata hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Odmah se usitni, u skladu s točkom 4.1.2., i osuši, u skladu s točkom 4.2.2. 5. Izračun rezultata Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom: 5.1. Sušenje bez prethodnog sušenja pri čemu je: m = početna masa uzorka u gramima, m0 = masa suhog uzorka u gramima. 5.2. Sušenje s prethodnim sušenjem pri čemu je: m = početna masa uzorka u gramima, m1 = masa uzorka nakon prethodnog sušenja u gramima, m2 = masa uzorka nakon usitnjavanja ili mljevenja u gramima, m0 = masa suhog uzorka u gramima. 5.3. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prelaziti 0,2 % apsolutne vrijednosti vode. 6. Napomena U slučaju kada je potrebno mljevenje za koje se pokaže da mijenja udio vode u proizvodu, potrebno je korigirati rezultate analize sastojaka hrane za životinje s obzirom na udio vode u uzorku u početnom stanju. B. ODREĐIVANJE VODE U MASTIMA I ULJIMA ŽIVOTINJSKOG I BILJNOG PODRIJETLA 1. Svrha i područje primjene Ova se metoda koristi za određivanje udjela vode i hlapljivih tvari u mastima i uljima životinjskog i biljnog podrijetla. 2. Načelo Uzorak se osuši do konstantne mase (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 1 mg) na 103 °C. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem. 3. Oprema 3.1. Posuda s ravnim dnom izrađena od nehrđajućeg materijala, promjera 8 do 9 cm i visine približno 3 cm. 3.2. Termometar s ojačanom kuglicom i ekspanzijskom komorom na gornjem dijelu, baždaren od približno 80 °C do najmanje 110 °C i duljine približno 10 cm. 3.3. Pješčana kupelj ili električna grijaća ploča 3.4. Eksikator s učinkovitim sredstvom za isušivanje 3.5. Analitička vaga 4. Postupak Odvagne se približno 20 g homogeniziranog uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u suhu izvaganu posudu (točka 3.1.) u kojoj se nalazi termometar (točka 3.2.). Zagrijava se na pješčanoj kupelji ili grijaćoj ploči (točka 3.3.) uz stalno miješanje termometrom, tako da temperatura dosegne 90 °C u približno 7 minuta. Smanji se unos topline, pri čemu se nadzire učestalost podizanja mjehurića s dna posude. Temperatura ne smije prijeći 105 °C. Nastavi se miješati uz struganje dna posude sve dok ne prestane stvaranje mjehurića. Kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje vode, nekoliko puta se zagrije na 103 ± 2 °C uz hlađenje na 93 °C između uzastopnih zagrijavanja. Zatim se uzorak ostavi hladiti na sobnu temperaturu u eksikatoru (točka 3.4.) i izvaže. Postupak se ponavlja sve dok gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne bude manji od 2 mg. Napomena : Povećanje mase uzorka nakon uzastopnog zagrijavanja upućuje na oksidaciju masti i u tom se slučaju rezultat izračunava na temelju vaganja izvedenog neposredno prije početka povećavanja mase. 5. Izračun rezultata Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom: pri čemu je: m = masa uzorka u gramima, m1 = masa posude sa sadržajem prije zagrijavanja, u gramima, m2 = masa posude sa sadržajem nakon zagrijavanja, u gramima. Rezultati manji od 0,05 % navode se kao „manji od 0,05 %”. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 0,05 % apsolutne vrijednosti. C. ODREĐIVANJE UDJELA SIROVIH BJELANČEVINA 1. Svrha i područje primjene Ova se metoda koristi za određivanje udjela sirovih bjelančevina u hrani za životinje na temelju udjela dušika određenog Kjeldahlovom metodom. 2. Postupak Uzorak se mineralizira sumpornom kiselinom u prisutnosti katalizatora. Kisela se otopina prevede u bazičnu dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Amonijak se destilira i prikupi u odmjerenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira standardnom otopinom natrijevog hidroksida. Druga je mogućnost destilacija oslobođenog amonijaka u višku otopine borne kiseline, nakon čega slijedi titriranje otopinom klorovodične ili sumporne kiseline. 3. Reagensi 3.1. Kalijev sulfat. 3.2. Katalizator: bakrov(II) oksid CuO ili bakrov(II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O. 3.3. Cink u zrncima. 3.4. Sumporna kiselina, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5 Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Indikator metil crvenilo; otopi se 300 mg metil crvenila u 100 ml etanola, σ = 95 – 96 % (v/v). 3.9. Otopina natrijevog hidroksida (moguća uporaba tehničke čistoće) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Natrijev hidroksid, standardna volumetrijska otopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Natrijev hidroksid, standardna volumetrijska otopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Plovućac u zrnu, ispran u klorovodičnoj kiselini i kalciniran. 3.13. Acetanilid (talište = 114 °C, udio N = 10,36 %). 3.14. Saharoza (bez dušika). 3.15. Borna kiselina (H3BO3). 3.16. Otopina indikatora metilnog crvenila: otopi se 100 mg metilnog crvenila u 100 ml etanola ili metanola. 3.17. Otopina bromkrezol zelenila: otopi se 100 mg bromkrezol zelenila u 100 ml etanola ili metanola. 3.18. Otopina borne kiseline (10 – 40 g/l, ovisno o opremi koja se koristi). Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, otopinama borne kiseline moraju se dodati indikatori metil crvenilo i bromkrezol zelenilo. Kod pripreme 1 litre otopine borne kiseline, prije prilagodbe volumena, doda se 7 ml otopine indikatora metil crvenila (točka 3.16.) i 10 ml otopine bromkrezol zelenila (točka 3.17.). Ovisno o vodi koja se koristi, pH vrijednost otopine borne kiseline može se razlikovati od serije do serije. Za dobivanje pozitivne slijepe probe često treba izvesti prilagodbu malim volumenom alkalija. Napomena : Obično je dovoljno dodati 3 do 4 ml NaOH (točka 3.11.) u 1 litru borne kiseline 10 g/l. Otopina se pohrani na sobnoj temperaturi i zaštiti od svjetla i para amonijaka. 3.19. Klorovodična kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(HCl) = 0,10 mol/l. Napomena : Mogu se koristiti i druge koncentracije volumetrijskih otopina (točka 3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. i 3.19.), ako se to uzima u obzir u izračunima. Koncentracije se uvijek navode na četiri decimalna mjesta. 4. Oprema Uređaj prikladna za izvođenje postupaka mineralizacije, destilacije i titracije prema Kjeldahlovoj metodi. 5. Postupak 5.1. Razgradnja Odvagne se 1 g uzorka s preciznošću od 0,001 g i prenese u tikvicu naprave za mineralizaciju. Doda se 15 g kalijevog sulfata (točka 3.1.), prikladna količina katalizatora (točka 3.2.) (0,3 – 0,4 g bakrovog(II) oksida ili 0,9 – 1,2 g bakrovog(II) sulfat pentahidrata), 25 ml sumporne kiseline (točka 3.4.), prema potrebi nekoliko zrnaca plovućca (točka 3.12.) i promiješa. Tikvica se prvo umjereno zagrijava i prema potrebi povremeno trese, sve dok masa potpuno ne pougljeni i nestane pjena; zatim se jače zagrijava do ravnomjernog vrenja tekućine. Zagrijavanje je primjereno ako se vrela kiselina kondenzira na stijenkama tikvice. Treba spriječiti pregrijavanje stijenki i prianjanje organskih čestica na njih. Kada se otopina razbistri i postane svijetlozelena, ostavi se da ključa još 2 sata, a zatim se ostavi da se ohladi. 5.2. Destilacija Oprezno se doda dovoljna količina vode kako bi se sulfati potpuno otopili. Ostavi se da se ohladi i prema potrebi doda nekoliko zrnaca cinka (točka 3.3.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.2.1. ili 5.2.2. 5.2.1. Destilacija u sumpornoj kiselini U tikvicu za prikupljanje naprave za destilaciju doda se točno odmjerena količina od 25 ml sumporne kiseline (točka 3.5.) ili (točka 3.7.) ovisno o pretpostavljenom udjelu dušika. Doda se nekoliko kapi indikatora metil crvenila (točka 3.8.). Tikvica za mineralizaciju priključi se na kondenzator naprave za destilaciju i vršak kondenzatora uroni u tekućinu u tikvici za prikupljanje, najmanje do dubine od 1 cm (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.3.). U tikvicu za mineralizaciju polagano se ulije 100 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.) bez gubitka amonijaka (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.1.). Tikvica se zagrijava do potpune destilacije amonijaka. 5.2.2. Destilacija u bornoj kiselini Kod ručne titracije amonijaka iz destilata koristi se dolje navedeni postupak. Kod destilacijskih jedinica koje su u potpunosti automatizirane i obuhvaćaju titraciju amonijaka iz destilata, postupa se prema uputama proizvođača za rukovanje destilacijskom jedinicom. Tikvica za prikupljanje s 25 – 30 ml otopine borne kiseline (točka 3.18.) postavi se ispod izlaznog otvora kondenzatora tako da ispusna cijev bude ispod površine viška otopine borne kiseline. Destilacijska se jedinica namjesti tako da isporučuje 50 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.). Destilacijskom se jedinicom rukuje u skladu s uputama proizvođača, a oslobođeni se amonijak destilira dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Destilat se prikupi u otopini borne kiseline. Količina destilata (vrijeme parne destilacije) ovisi o količini dušika u uzorku. Treba se pridržavati uputa proizvođača. Napomena : U poluautomatskoj destilacijskoj jedinici dodavanje viška natrijevog hidroksida i parna destilacija automatizirani su postupci. 5.3. Titracija Postupa se u skladu s točkom 5.3.1. ili 5.3.2. 5.3.1. Sumporna kiselina VIšak sumporne kiseline titrira se u tikvici za prikupljanje do točke ekvivalencije otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.), ovisno o koncentraciji korištene sumporne kiseline. 5.3.2. Borna kiselina Udio tikvice za prikupljanje titrira se standardnom volumetrijskom otopinom klorovodične kiseline (točka 3.19.) ili standardnom volumetrijskom otopinom sumporne kiseline (točka 3.6.), pri čemu se koristi bireta i očita se količina korištenog titranta. Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, točka ekvivalencije se dostiže kod prve pojave ružičastog obojenja udjela. Očita se obujam birete s preciznošću od 0,05 ml. Za pomoć kod vizualizacije točke ekvivalencije mogu se koristiti magnetna mješalica s osvjetljenjem ili fotometrijski detektor. Ovaj se postupak može izvesti automatski upotrebom parnog destilatora s automatskom titracijom. Kod rukovanja određenim tipom destilatora ili destilatora/titratora treba se pridržavati uputa proizvođača. Napomena : Kod automatskog sustava titriranja, titracija započinje odmah po početku destilacije, a koristi se otopina borne kiseline 1 % (točka 3.18.). Kod potpuno automatizirane destilacijske jedinice, postupak automatske titracije amonijaka može se izvoditi i određivanjem točke ekvivalencije metodom potenciometrijske titracije pH. U tom se slučaju koristi automatski titrator s pH-metrom. Pravilno baždarenje pH metra izvodi se u području vrijednosti pH 4 do pH 7 uobičajenim laboratorijskim postupcima za baždarenje pH-metra. Točka ekvivalencije pH titracije dosiže se pri pH 4,6, kada je nagib titracijske krivulje najviši (točka infleksije). 5.4. Slijepa proba Kao potvrda da reagensi ne sadrže dušik koristi se slijepa proba (mineralizacija, destilacija i titracija), u kojoj se umjesto uzorka koristi 1 g saharoze (točka 3.14). 6. Izračun rezultata Izračuni se izvode u skladu s točkom 6.1. ili 6.2. 6.1. Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.1. Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom: pri čemu je: V0 = volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten u slijepoj probi, V1 = volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten kod titracije uzorka, c = koncentracija (mol/l) natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.), m = masa (g) uzorka. 6.2. Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.2. 6.2.1. Titracija klorovodičnom kiselinom Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom: pri čemu je: m = masa (g) uzorka, c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine klorovodične kiseline (točka 3.19.), V0 = volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u slijepoj probi, V1 = volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u uzorkovanom dijelu. 6.2.2. Titracija sa sumpornom kiselinom Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom: pri čemu je: m = masa (g) uzorka, c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine sumporne kiseline (točka 3.6.), V0 = volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u slijepoj probi, V1 = volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u uzorkovanom dijelu. 7. Provjera metode 7.1. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći: — 0,2 % apsolutne vrijednosti za udio sirovih bjelančevina manji od 20 %, — 1,0 % veće vrijednosti za udio sirovih bjelančevina u rasponu od 20 – 40 %, — 0,4 % apsolutne vrijednosti za udio sirovih bjelančevina veći od 40 %. 7.2. Točnost Za analizu (mineralizacija, destilacija, titracija) koristi se 1,5 do 2,0 g acetanilida (točka 3.13.) u prisutnosti 1 g saharoze (točka 3.14.); za 1 g acetanilida koristi se 14,80 ml sumporne kiseline (točka 3.5.). Iskorištenje mora iznositi najmanje 99 %. 8. Napomene 8.1. Oprema može biti ručna, poluautomatska ili automatska. Ako je u radu naprave potreban prijelaz između mineralizacije i destilacije, taj se prijelaz mora izvesti bez gubitka. Ako tikvica naprave za destilaciju nije opremljena lijevkom za dokapavanje, natrijev se hidroksid dodaje neposredno prije priključivanja tikvice na kondenzator, pri čemu se tekućina ulijeva polako niz stijenke tikvice. 8.2. Ako se udio tikvice stvrdnjava, postupak određivanja započinje se iznova, ali s količinom sumporne kiseline (točka 3.4.) većom od gore navedene. 8.3. Kod proizvoda s niskim udjelom dušika volumen sumporne kiseline (točka 3.7.) koji se dodaje u tikvicu za prikupljanje, prema potrebi se može smanjiti na 10 ili 15 ml, a tikvica se dopuni vodom do 25 ml. 8.4. Kod rutinske analize za određivanje sirovih bjelančevina mogu se koristiti zamjenske metode analize, iako je Kjeldahlova metoda, opisana u ovom dijelu C, referentna metoda. Za svaku matricu pojedinačno treba dokazati da su rezultati dobiveni zamjenskom metodom (npr. DUMAS) jednakovrijedni rezultatima dobivenim referentnom metodom. U izvješću o analizi treba navesti analitičku metodu korištenu za određivanje sirovih bjelančevina budući da rezultati dobiveni zamjenskom metodom, čak i nakon potvrde jednakovrijednosti, mogu odstupati od rezultata dobivenih referentnom metodom. D. ODREĐIVANJE UREE 1. Svrha i područje primjene Ovom se metodom omogućuje određivanje razine uree u hrani za životinje. 2. Načelo Uzorak se suspendira u vodi u prisutnosti tvari za bistrenje. Suspenzija se filtrira. Udio uree u filtratu određuje se nakon dodavanja 4-dimetilaminobenzaldehida (4-DMAB) mjerenjem optičke gustoće na valnoj duljini od 420 nm. 3. Reagensi 3.1. Otopina 4-dimetilaminobenzaldehida: otopi se 1,6 g 4-DMAB u 100 ml etanola 96 % i doda 10 ml klorovodične kiseline (ρ20 1,19 g/ml). Taj se reagens može čuvati najviše dva tjedna. 3.2. Otopina Carrez I: u vodi se otopi 21,9 g cinkovog acetata Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g ledene octene kiseline. Dopuni se vodom do 100 ml. 3.3. Otopina Carrez II: u vodi se otopi 10,6 g kalijevog ferocijanida K4 Fe (CN)6 3H2O. Dopuni se vodom do 100 ml. 3.4. Aktivni ugljen koji ne apsorbira ureu (treba provjeriti). 3.5. Urea, otopina 0,1 % (m/v). 4. Oprema 4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min. 4.2. Epruvete: 160 × 16 mm s ubrušenim čepovima. 4.3. Spektrofotometar 5. Postupak 5.1. Analiza uzorka Odvagne se 2 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese s 1 g aktivnog uglja (točka 3.4.) u graduiranu tikvicu obujma 500 ml. Doda se 400 ml vode i 5 ml otopine Carrez I (točka 3.2.), miješa približno 30 sekundi i doda 5 ml otopine Carrez II (točka 3.3.). Miješa se 30 minuta u mješalici. Dopuni se vodom do oznake, protrese i filtrira. Uzme se 5 ml prozirnog bezbojnog filtrata i prenese u epruvete s ubrušenim čepovima, doda se 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.) i promiješa. Epruvete se postave u vodenu kupelj na 20 °C (+/- 4 °C). Nakon 15 minuta spektrofotometrom se izmjeri optička gustoća otopine uzorka na 420 nm. Rezultat se usporedi s otopinom reagensa iz slijepe probe. 5.2. Kalibracijska krivulja Uzme se 1, 2, 4, 5 i 10 ml otopine uree (točka 3.5.) i prenese u odmjerne tikvice obujma 100 ml koje se dopune vodom do oznake. Iz svake se otopine odstrani 5 ml, te se u svaku doda 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.), homogenizira i izmjeri optička gustoća, kako je gore navedeno, u usporedbi s kontrolnom otopinom koja sadrži 5 ml 4-DMAB i 5 ml vode bez uree. Pripremi se kalibracijska krivulja. 6. Izračun rezultata Količina uree u uzorku određuje se iz kalibracijske krivulje. Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka. 7. Napomene 7.1. Ako udio uree prelazi 3 %, uzorak se smanji na 1 g ili se početna otopina razrijedi tako da u 500 ml nema više od 50 mg uree. 7.2. Ako je udio uree nizak, uzorak se povećava sve dok je filtrat proziran i bezbojan. 7.3. Ako uzorak sadrži jednostavne dušične spojeve, poput aminokiselina, optička se gustoća mjeri na 435 nm. E. ODREĐIVANJE HLAPLJIVIH DUŠIKOVIH BAZA I. MIKRODIFUZIJA 1. Svrha i područje primjene Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza u hrani za životinje iskazanog kao amonijak. 2. Načelo Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina se izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze istiskuju se mikrodifuzijom uporabom otopine kalijevog karbonata, prikupe u otopinu borne kiseline i titriraju sumpornom kiselinom. 3. Reagensi 3.1. Trikloroctena kiselina, otopina 20 % (m/v). 3.2. Indikator: otopi se 33 mg bromkrezol zelenila i 65 mg metilnog crvenila u 100 ml etanola 95 – 96 % (v/v). 3.3. Otopina borne kiseline: u odmjernoj tikvici volumena od 1 litre otopi se 10 g borne kiseline u 200 ml etanola 95 – 96 % (v/v) i 700 ml vode. Doda se 10 ml indikatora (točka 3.2.). Promiješa se, a prema potrebi boja otopine promijeni u svijetlo crvenu dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Količina od 1 ml te otopine vezat će najviše 300 μg NH3. 3.4. Zasićena otopina kalijevog karbonata: u 100 ml vrele vode otopi se 100 g kalijevog karbonata. Ostavi se da se ohladi, a zatim se filtrira. 3.5. Sumporna kiselina, 0,01 mol/l. 4. Oprema 4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min. 4.2. Stakleni ili plastični Conwayevi članci (vidjeti dijagram). 4.3. Mikrobirete graduirane s podjelom 1/100 ml. 5. Postupak Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar. Pipetom se doda 1 ml otopine borne kiseline (točka 3.3.) u srednji dio Conwayevog članka i 1 ml filtrata uzorka u gornji dio članka. Djelomično se pokrije namašćenim poklopcem. U gornji dio članka brzo se nakapa 1 ml zasićene otopine kalijevog karbonata (točka 3.4.) i poklopac hermetički zatvori. Članak se oprezno okreće u vodoravnoj ravnini tako da se reagensi pomiješaju. Ostavi se najmanje četiri sata na sobnoj temperaturi ili jedan sat na temperaturi 40 °C. Mikrobiretom (točka 4.3.) se hlapljive baze u otopini borne kiseline titriraju sumpornom kiselinom (točka 3.5.). Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu. 6. Izračun rezultata 1 ml H2SO4 0,01 mol/l odgovara 0,34 mg amonijaka. Rezultat analize iskazuje se kao postotni udio uzorka. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći: — 10 % relativne vrijednosti za udio amonijaka manji od 1,0 %, — 0,1 % apsolutne vrijednosti za udio amonijaka 1,0 % ili veći. 7. Napomena Ako je udio amonijaka u uzorku veći od 0,6 % početni se filtrat razrijedi. CONWAYEV ČLANAK Omjer 1/1 II. DESTILACIJA 1. Svrha i područje primjene Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza, iskazanih kao amonijak, u ribljem brašnu koje praktično ne sadrži ureu. Koristi se samo za udio amonijaka niži od 0,25 %. 2. Načelo Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze se istisnu na temperaturi vrelišta dodavanjem magnezijevog oksida i prikupe u određenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira otopinom natrijevog hidroksida. 3. Reagensi 3.1. Trikloroctena kiselina, otopina 20 % (m/v). 3.2. Magnezijev oksid. 3.3. Emulzija protiv pjenjenja (npr. silikon). 3.4. Sumporna kiselina, 0,05 mol/l. 3.5. Otopina natrijevog hidroksida, 0,1 mol/l. 3.6. Otopina metilnog crvenila 0,3 % u etanolu 95 % – 96 % (v/v). 4. Oprema 4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min. 4.2. Uređaj za destilaciju po Kjeldahlu. 5. Postupak Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar papir. Pipetom se prenese količina bistrog filtrata koja odgovara očekivanom sadržaju hlapljivih dušikovih baza (obično je dovoljno 100 ml). Razrijedi se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevog oksida (točka 3.2.) i nekoliko kapljica emulzije protiv pjenjenja (točka 3.3.). Otopina mora biti alkalna pri pokusu s lakmusovim papirom; ako to nije slučaj, doda se magnezijev oksid (točka 3.2.). Postupa se u skladu s točkama 5.2. i 5.3. metode analize za određivanje udjela sirovih bjelančevina (dio C ovog Priloga). Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu. 6. Izračun rezultata 1 ml H2SO4 0,05 mol/l odgovara 1,7 mg amonijaka. Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % relativne vrijednosti amonijaka. F. ODREĐIVANJE AMINOKISELINA (OSIM TRIPTOFANA) 1. Svrha i područje primjene Ova se metoda koristi za određivanje slobodnih (sintetičkih i prirodnih) i ukupnih (vezanih na peptide i slobodnih) aminokiselina u hrani za životinje pomoću analizatora aminokiselina. Koristi se za sljedeće aminokiseline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartatna kiselina, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin i valin. Ovom se metodom ne mogu razlikovati soli aminokiselina niti je moguće utvrditi razliku između oblika D i L aminokiselina. Ova metoda nije primjerena za određivanje triptofana ili hidroksi-analoga aminokiselina. 2. Načelo 2.1. Slobodne aminokiseline Slobodne aminokiseline ekstrahiraju se razrijeđenom klorovodičnom kiselinom. Koekstrahirane dušične makromolekule istalože se sulfosalicilnom kiselinom i uklone filtriranjem. Vrijednost pH filtrirane otopine podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdvoje ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm. 2.2. Ukupne aminokiseline Odabir postupka ovisi o ispitivanim aminokiselinama. Cist(e)in i metionin se prije hidrolize moraju oksidirati u cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon. Tirozin se mora odrediti u hidrolizatima neoksidiranih uzoraka. Sve druge aminokiseline navedene u točki 1 mogu se odrediti u oksidiranom ili neoksidiranom uzorku. Oksidacija se izvodi na 0 °C mješavinom peroksimravlje kiseline i fenola. Višak oksidacijskog reagensa razgradi se natrijevim disulfitom. Oksidirani ili neoksidirani uzorak se 23 sata hidrolizira klorovodičnom kiselinom (točka 3.20.). Vrijednost pH hidrolizata podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdijele ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm (440 nm za prolin). 3. Reagensi Obvezno se koristi dvostruko destilirana voda ili voda jednake kakvoće (provodljivost < 10 μS) 3.1. Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %. 3.2. Mravlja kiselina, m (m/m) = 98 % – 100 %. 3.3. Fenol. 3.4. Natrijev disulfit. 3.5. Natrijev hidroksid. 3.6. 5-sulfosalicilna kiselina dihidrat. 3.7. Klorovodična kiselina, gustoće približno 1,18 g/ml. 3.8. Trinatrij citrat dihidrat. 3.9. 2,2’-tiodietanol (tiodiglikol). 3.10. Natrijev klorid. 3.11. Ninhidrin. 3.12. Lagani petrolej, vrelište 40 – 60 °C. 3.13. Norleucin ili drugi spoj primjeren za uporabu kao interni standard 3.14. Plinoviti dušik (< 10 ppm kisika). 3.15. 1-oktanol. 3.16. Aminokiseline. 3.16.1. Standardne tvari iz točke 1. Čisti spojevi koji ne sadrže kristalnu vodu. Prije uporabe suše se 1 tjedan pod vakuumom s P2O5 ili H2SO4. 3.16.2. Cisteinska kiselina. 3.16.3. Metionin-sulfon. 3.17. Otopina natrijevog hidroksida, c = 7,5 mol/l: U vodi se otopi 300 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.18. Otopina natrijevog hidroksida, c = 1 mol/l: U vodi se otopi 40 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.19. Mravlja kiselina – otopina fenola: Pomiješa se 889 g mravlje kiseline (točka 3.2.) sa 111 g vode i doda 4,73 g fenola (točka 3.3.). 3.20. Smjesa za hidrolizu, c = 6 mol HCl/l koja sadrži 1 g fenola/l: Doda se 1 g fenola (točka 3.3.) u 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.21. Smjesa za ekstrakciju, c = 0,1 mol HCl/l koja sadrži 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (točka 3.7.) se razrijedi s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (točka 3.9.) i dopuni vodom do 1 litre (ne smiju se izravno miješati tvari iz točaka 3.7. i 3.9.). 3.22. 5-sulfosalicilna kiselina, ß = 6 %: U vodi se otopi 60 g 5-sulfosalicilne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.23. Oksidacijska smjesa (peroksimravlja kiselina – fenol): Pomiješa se 0,5 ml vodikovog peroksida (točka 3.1.) s 4,5 ml otopine mravlje kiseline i fenola (točka 3.19.) u maloj čaši. Inkubira se 1 sat na 20 – 30 °C kako bi se dobila peroksimravlja kiselina, zatim se hladi u ledenoj kupelji (15 min) prije dodavanja u uzorak. Upozorenje: Izbjegavati dodir s kožom i nositi zaštitnu odjeću. 3.24. Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: U približno 800 ml vode otopi se 19,61 g natrijevog citrata (točka 3.8.), 5 ml tiodiglikola (točka 3.9.), 1 g fenola (točka 3.3.) i 16,50 ml HCl (točka 3.7.). Vrijednost pH se podesi na 2,20. Dopuni se vodom do 1 litre. 3.25. Puferi za eluiranje, pripravljeni u skladu s uputama za analizator koji se koristi (točka 4.9.). 3.26. Reagens ninhidrin, pripravljen u skladu s uputama za analizator koji se koristi (točka 4.9.). 3.27. Standardne otopine aminokiselina. Ove se otopine drže na temperaturi nižoj od 5 °C. 3.27.1. Osnovna standardna otopina aminokiselina (točka 3.16.1.). c = 2,5 μmol/ml za svaku u klorovodičnoj kiselini. Može se nabaviti u slobodnoj prodaji. 3.27.2. Osnovna standardna otopina cisteinske kiseline i metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml. U odmjernoj tikvici obujma 1 l otopi se 0,2115 g cisteinske kiseline (točka 3.16.2.) i 0,2265 g metionin-sulfona (točka 3.16.3.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do oznake. Može se pohraniti najviše 12 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C. Ova se otopina ne koristi ako osnovna standardna otopina (točka 3.27.1.) sadrži cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon. 3.27.3. Osnovna standardna otopina internog standarda, npr. norleucina, c = 20 μmol/ml. U odmjernoj se tikvici otopi 0,6560 g norleucina (točka 3.13.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do 250 ml. Može se pohraniti najviše 6 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C. 3.27.4. Kalibracijska otopina standardnih aminokiselina koja se koristi s hidrolizatima, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon i c = 10 nmol/50 μl za druge aminokiseline. U čaši obujma 100 ml otopi se 2,2 g natrijevog klorida (točka 3.10.) s 30 ml citratnog pufera (točka 3.24.). Doda se 4,00 ml osnovne standardne otopine aminokiseline (točka 3.27.1.), 4,00 ml osnovne standardne otopine cisteinske kiseline i metionin-sulfona (točka 3.27.2.) i 0,50 ml osnovne standardne otopine internog standarda (točka 3.27.3.) ako se isti koristi. Vrijednost pH se natrijevim hidroksidom podesi na 2,20 (točka 3.18.). Udio se kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake i promiješa. Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C. Vidjeti također napomenu pod točkom 9.1. 3.27.5. Pripremi se kalibracijska otopina standardnih aminokiselina koja se koristi s hidrolizatima u skladu s točkom 5.3.3.1., a za ekstrakte u skladu s točkom 5.2. Kalibracijska otopina se pripremi u skladu s točkom 3.27.4., ali bez natrijevog klorida. Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C. 4. Oprema 4.1. Tikvica s okruglim dnom volumena 100 ili 250 ml s povratnim hladilom. 4.2. Staklena posuda od borosilikatnog stakla obujma 100 ml s navojnim čepom obloženim gumom/teflonom (npr. Duran, Schott) za uporabu u sušilu. 4.3. Sušilo s prisilnom ventilacijom i regulatorom temperature točnosti veće od ± 2 °C. 4.4. pH metar (na tri decimalna mjesta). 4.5. Membranski filtar (0,22 μm). 4.6. Centrifuga. 4.7. Rotacijski vakuumski otparivač. 4.8. Mehanička tresilica ili magnetska mješalica. 4.9. Analizator aminokiselina ili oprema za HPLC opremljena kolonom za izmjenu iona, napravom za ninhidrin i derivatizaciju nakon kolone te fotometrijskim detektorom. Kolona se napuni smolama sulfoniranog polistirena koje mogu razdvajati aminokiseline jedne od drugih i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. Tok u puferskoj i ninhidrinskoj liniji osigurava se crpkama s tokom stabilnosti ± 0,5 % u vremenu koje obuhvaća izvođenje standardnog kalibriranja i analizu uzorka. Kod nekih analizatora aminokiselina mogu se koristiti postupci hidrolize kod kojih je koncentracija natrija u hidrolizatu c = 0,8 mol/l, a hidrolizat sadrži svu ostatnu mravlju kiselinu iz oksidacije. Drugim metodama ne postiže se zadovoljavajuće razdvajanje nekih aminokiselina ako se u hidrolizatu nalazi višak mravlje kiseline i/ili visoka koncentracija natrijevih iona. U tom se slučaju obujam kiseline nakon hidrolize i prije podešavanja pH smanjuje isparavanjem na približno 5 ml. Isparavanje se vrši pod vakuumom na najviše 40 °C. 5. Postupak 5.1. Priprema uzorka Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije mljevenja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili smrzavanjem. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.12.) prije mljevenja. 5.2. Određivanje slobodnih aminokiselina u hrani za životinje i premiksima Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u konusnu tikvicu, te se doda 100,0 ml smjese za ekstrakciju (točka 3.21.). Smjesa se 60 minuta trese mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.8.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu obujma 100 ml. Tijekom miješanja doda se 5,0 ml otopine sulfosalicilne kiseline (točka 3.22.) i nastavi 5 minuta miješati magnetskom mješalicom. Supernatant se filtrira ili centrifugira kako bi se uklonio cjelokupni talog. U čašu obujma 100 ml izlije se 10,0 ml dobivene otopine i vrijednost pH podesi na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.), prenese citratnim puferom (točka 3.24.) u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake. Ako se koristi interni standard, za svakih 100 ml konačne otopine doda se 1,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake. Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4. Ako se ekstrakti ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C. 5.3. Određivanje ukupnih aminokiselina 5.3.1. Oksidacija Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u: — tikvicu s okruglim dnom volumena 100 ml (točka 4.1.) za otvorenu hidrolizu (točka 5.3.2.3.) ili, — tikvicu s okruglim dnom volumena 250 ml (točka 4.1.) ako se zahtijeva niska koncentracija natrija (točka 5.3.3.1.) ili, — staklenu bocu s navojnim čepom volumena 100 ml (točka 4.2.) za zatvorenu hidrolizu (točka 5.3.2.4.). U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg, a udio vode ne smije biti veći od 100 mg. Tikvica/boca se postavi u ledenu kupelj i ohladi na 0 °C, doda se 5 ml oksidacijske smjese (točka 3.23.) i miješa staklenom lopaticom sa zakrivljenim vrhom. Tikvica/boca s lopaticom se hermetički zatvori filmom, a ledena kupelj s hermetički zatvorenom posudom stavi u hladnjak na 0 °C i ostavi 16 sati. Nakon 16 sati posuda se izvadi iz hladnjaka, a višak oksidacijskog reagensa se razgradi dodavanjem 0,84 g natrijevog disulfita (točka 3.4.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.1. 5.3.2. Hidroliza 5.3.2.1. Hidroliza oksidiranih uzoraka U oksidirani uzorak, pripravljen u skladu s točkom 5.3.1., doda se 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.), pri čemu treba brižljivo isprati sve ostatke uzorka sa stijenke posude i lopatice. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4., ovisno o korištenom postupku hidrolize. 5.3.2.2. Hidroliza neoksidiranih uzoraka U tikvicu s okruglim dnom obujma 100 ml ili 250 ml (točka 4.1.) ili u bocu s navojnim čepom obujma 100 ml (točka 4.2.) odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg. U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg. Oprezno se doda 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.) i pomiješa s uzorkom. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. 5.3.2.3. Otvorena hidroliza U smjesu koja se nalazi u tikvici (pripremljenu u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2.) dodaju se 3 staklene kuglice, zatim se ostavi ključati 23 sata uz stalno vrenje pod refluksom. Po završetku hidrolize kondenzator ispere se s 5 ml citratnog pufera (točka 3.24.). Tikvica se odvoji i ohladi u ledenoj kupelji. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3. 5.3.2.4. Zatvorena hidroliza Boca sa smjesom pripravljenom u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2. postavi se u sušilo (točka 4.3.) na temperaturi od 110 °C. Kako bi se tijekom prvog sata spriječilo povećanje tlaka i eksplozija (zbog nastanka plinovitih tvari), poklopac s navojem treba postavi na vrh posude. Posuda se ne smije zatvoriti poklopcem. Nakon jednog sata posuda se zatvori poklopcem i ostavi 23 sata u sušilu (točka 4.3.). Po završetku hidrolize boca se izvadi iz sušila, oprezno se otvori poklopac boce i boca položi u ledenu kupelj. Ostavi se da se ohladi. Ovisno o postupku podešavanja pH (točka 5.3.3.) udio posude se citratnim puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u čašu obujma 250 ml ili tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3. 5.3.3. Podešavanje pH Ovisno o odstupanju analizatora aminokiselina (točka 4.9.) za natrij, podešavanje pH se provodi u skladu s točkom 5.3.3.1. ili 5.3.3.2. 5.3.3.1. Kromatografski sustavi (točka 4.9.) koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija Pri upotrebi analizatora aminokiselina koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija (kada treba smanjiti volumen kiseline) preporučuje se uporaba otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.). U tom se slučaju hidrolizatu prije otparivanja dodaje 2,00 ml otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.). U hidrolizat dobiven postupkom u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. dodaje se 2 kapljice 1-oktanola (točka 3.15.). Obujam se smanji na 5 – 10 ml rotacijskim otparivačem (točka 4.7.) pod vakuumom na 40 °C. Ako se obujam slučajno smanji na manje od 5 ml, hidrolizat se mora odbaciti i iznova započeti analizu. Otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.) vrijednost pH podesi se na 2,20 i zatim nastavi u skladu s točkom 5.3.4. 5.3.3.2. Za sve druge analizatore aminokiselina (točka 4.9.) Hidrolizati dobiveni u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. djelomično se neutraliziraju opreznim dodavanjem, uz miješanje, 17 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.17.), pri čemu se temperatura mora održavati na manje od 40 °C. Na sobnoj temperaturi podesi se vrijednost pH na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.17.) i zatim otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.4. 5.3.4. Otopina uzorka za kromatografiju Hidrolizat (točka 5.3.3.1. ili 5.3.3.2.) s podešenom vrijednosti pH, citratnim se puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml i dopuni puferom (točka 3.24.) do oznake. Ako dotada nije korišten interni standard, doda se 2,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i zatim dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake. Temeljito se promiješa. Nastavlja se s kromatografijom (točka 5.4.). Ako se otopine uzorka ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C. 5.4. Kromatografija Prije kromatografije temperaturu ekstrakta (točka 5.2.) ili hidrolizata (točka 5.3.4.) treba izjednačiti sa sobnom temperaturom. Smjesa se protrese i prikladna količina filtrira kroz membranski filtar 0,22 μm (točka 4.5.). Dobivena bistra otopina se podvrgne kromatografiji s izmjenom iona uporabom analizatora aminokiselina (točka 4.9.). Ubrizgavanje se može izvesti ručno ili automatski. Važno je na kolonu za analizu standarda i uzoraka dodati istu količinu otopine (± 0,5 %) osim kada se koristi interni standard, a omjeri natrija i aminokiselina u otopinama standarda i uzorka trebaju biti što je moguće sličniji. Općenito učestalost kalibriranja ovisi o stabilnosti reagensa ninhidrina i sustava za analizu. Standard ili uzorak se razrijede citratnim puferom (točka 3.24.) tako da površina vršaka standarda dostiže 30 – 200 % površine vršaka aminokiselina u uzorku. Kromatografija aminokiselina neznatno se razlikuje s obzirom na vrstu korištenog analizatora i smole. Odabrani sustav mora imati mogućnost razdvajanja aminokiselina međusobno i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. U radnom području kromatografski sustav mora imati linearan odziv na promjene količina aminokiselina dodanih u kolonu. U fazi kromatografije primjenjuju se dolje navedeni omjeri između najnižih i najviših vrijednosti kod analize ekvimolarnih otopina (aminokiselina koje se određuju). Ekvimolarna otopina mora sadržavati najmanje 30 % maksimalnog udjela svake aminokiseline koji se može točno izmjeriti sustavom za analizu aminokiselina (točka 4.9.). Kod postupka razdvajanja treonina od serina, omjer između najniže i najviše vrijednosti za aminokiselinu s nižom vrijednosti između dviju aminokiselina koje se preklapaju na kromatogramu ne smije prijeći 2:10. (Ako se određuju samo cist(e)in, metionin, treonin i lizin, nedovoljno razdvajanje između susjednih vršaka štetno će djelovati na postupak određivanja). Za sve druge aminokiseline razdvajanje mora biti veće od 1:10. Sustav mora jamčiti razdvajanje lizina od „lizinskih artefakata” i ornitina. 6. Izračun rezultata Za svaku pojedinačnu aminokiselinu izmjeri se površina vršaka uzorka i standarda, a količina (X), iskazana u g aminokiseline na kg uzorka, izračunava se na sljedeći način: Ako se koristi interni standard pomnoži se s: A = površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta B = površina vršaka standardne kalibracijske otopine C = površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta kao internog standarda D = površina vršaka standardne kalibracijske otopine kao internog standarda M = molarna masa aminokiseline koja se određuje c = koncentracija standarda u μmol/ml m = masa uzorka u gramima (ispravljena na početnu masu ako je uzorak isušen ili odmašćen) V = ml ukupnog hidrolizata (točka 5.3.4.) ili izračunani ukupni volumen otopine ekstrakta (točka 6.1.) u ml Cistin i cistein se određuju kao cisteinska kiselina u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunavaju kao cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) uporabom molarne mase 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metionin se određuje kao metionin-sulfon u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunava kao metionin uporabom molarne mase metionina: 149,21 g/mol. Dodani slobodni metionin određuje se nakon ekstrakcije kao metionin, a za izračun se koristi ista molekulska masa. 6.1. Ukupni volumen otopine ekstrakata (F) za određivanje slobodnih aminokiselina (točka 5.2.) izračunava se sljedećom formulom: V = volumen konačnog ekstrakta 7. Vrednovanje metode Metoda je provjerena u međulaboratorijskom ispitivanju na međunarodnoj razini provedenom 1990. na četiri različite vrste hrane za životinje (miješana hrana za svinje, smjesa za brojlere, proteinski koncentrat, premiks). Rezultati srednjih vrijednosti i standardnih devijacija, bez ekstremnih vrijednosti, prikazani su u tablicama u ovoj točki: Srednje vrijednosti u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Smjesa za brojlere 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinski koncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija. 7.1. Ponovljivost Ponovljivost gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazana kao „unutarlaboratorijska standardna devijacija”, prikazana je u donjim tablicama: Unutarlaboratorijska standardna devijacija (Sr), iskazana u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Smjesa za brojlere 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinski koncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.

Koeficijent varijacije (%) za unutarlaboratorijsku standardnu devijaciju (Sr) Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Smjesa za brojlere 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinski koncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija. 7.2. Ponovljivost Rezultati gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazani kao standardna devijacija između laboratorija, prikazani su u donjoj tablici: Standardna devijacija između laboratorija (SR) u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Smjesa za brojlere 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinski koncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.

Koeficijent varijacije (%) za standardnu devijaciju između laboratorija (SR) Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Smjesa za brojlere 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinski koncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija. 8. Upotreba referentnih materijala Pravilna primjena metode provjerava se ponovljenim mjerenjima na certificiranim referentnim materijalima, kada su dostupni. Preporučuje se izvršiti kalibraciju upotrebom certificirane otopine za kalibraciju aminokiselina. 9. Napomene 9.1. Zbog razlika između analizatora aminokiselina, kao smjernice se uzimaju konačne koncentracije otopina standardnih aminokiselina za kalibraciju (vidjeti točke 3.27.4. i 3.27.5.) i hidrolizata (vidjeti točku 5.3.4.). Za sve aminokiseline treba provjeriti područje linearnog odziva uređaja. Standardna se otopina razrijedi citratnim puferom tako da se površine vršaka nalaze u sredini područja. 9.2. Kada se za analizu hidrolizata koristi oprema za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti, uvjeti pokusa se moraju optimizirati u skladu s preporukama proizvođača. 9.3. Kod primjene metode za hranu za životinje koja sadrži više od 1 % klorida (koncentrat, mineralna hrana za životinje, dodaci hrani za životinje) može doći do preniske procjene udjela metionina, što zahtijeva posebnu obradu. G. ODREĐIVANJE TRIPTOFANA 1. Svrha i područje primjene Ovom se metodom omogućuje određivanje ukupnog i slobodnog triptofana u hrani za životinje. Njom se ne omogućuje razlikovanje između oblika D i L. 2. Načelo Za određivanje ukupnog triptofana uzorak se hidrolizira u bazičnim uvjetima zasićenom otopinom barijevog hidroksida i 20 sati grije na 110 °C. Nakon hidrolize dodaje se interni standard. Za određivanje slobodnog triptofana uzorak se ekstrahira u lagano kiselim uvjetima u prisutnosti internog standarda. Triptofan i interni standard u hidrolizatu ili ekstraktu određuju se postupkom HPLC s fluorescentnom detekcijom. 3. Reagensi 3.1. Obvezno se koristi redestilirana voda ili voda jednake kakvoće (provodljivost < 10 μS/cm). 3.2. Standardna tvar: triptofan (čistoća/udio ≥ 99 %), osušen pod vakuumom iznad fosfornog pentoksida. 3.3. Interna standardna tvar: α-metil-triptofan (čistoća/udio ≥ 99 %), osušen pod vakuumom iznad fosfornog pentoksida. 3.4. Barijev hidroksid oktahidrat (treba paziti da se Ba(OH)2.8 H2O pretjerano ne izlaže zraku kako bi se izbjeglo nastajanje BaCO3 koji može remetiti postupak određivanja) (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 9.3.). 3.5. Natrijev hidroksid. 3.6. Ortofosforna kiselina, m (m/m) = 85 %. 3.7. Klorovodična kiselina, ρ20 1,19 g/ml. 3.8. Metanol, za HPLC. 3.9. Lagani petrolej, raspon vrelišta 40 – 60 °C. 3.10. Otopina natrijevog hidroksida, c = 1 mol/l: U vodi se otopi 40,0 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre (točka 3.1.). 3.11. Klorovodična kiselina, c = 6 mol/l: Uzme se 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.12. Klorovodična kiselina, c = 1 mol/l: Uzme se 82 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.13. Klorovodična kiselina, c = 0,1 mol/l: Uzme se 8,2 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre. 3.14. Ortofosforna kiselina, c = 0,5 mol/l: Uzme se 34 ml ortofosforne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom (točka 3.1.) do 1 litre. 3.15. Koncentrirana otopina triptofana (točka 3.2.), c = 2,50 μmol/ml: U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2553 g triptofana (točka 3.2.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C. 3.16. Koncentrirana otopina internog standarda, c = 2,50 μmol/ml: U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2728 g α-metil-triptofana (točka 3.3.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C. 3.17. Standardna otopina triptofana i internog standarda za kalibraciju: Pripremi se 2,00 ml koncentrirane otopine triptofana (točka 3.15.) i 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofan) (točka 3.16.). Razrijedi se vodom (točka 3.1.) i metanolom (točka 3.8.) na približno jednak obujam i približno jednaku koncentraciju metanola (10 – 30 %) kao kod konačnog hidrolizata. Ta se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe. Tijekom pripreme treba je zaštiti od izravnog sunčevog svjetla. 3.18. Octena kiselina. 3.19. 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanol. 3.20. Etanolamin, m (m/m) > 98 %. 3.21. Otopina 1 g 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u 100 ml metanola (točka 3.8.). 3.22. Mobilna faza za HPLC: 3,00 g octene kiseline (točka 3.18.) + 900 ml vode (točka 3.1.) + 50,0 ml otopine (točka 3.21.) 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u metanolu (točka 3.8.) (1 g/100 ml). Etanolaminom (točka 3.20.) se vrijednost pH podesi na 5,00. Dopuni se vodom (točka 3.1.) do 1 000 ml. 4. Oprema 4.1. Oprema za HPLC sa spektrofluorometrijskim detektorom. 4.2. Kolona za tekućinsku kromatografiju, 125 mm × 4 mm C18, veličina čestica punjenja 3 μm ili jednakovrijedna. 4.3. pH metar. 4.4. Polipropilenska tikvica, obujma 125 ml, sa širokim vratom i navojnim čepom. 4.5. Membranski filtar, 0,45 μm. 4.6. Autoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar. 4.7. Mehanička tresilica ili magnetska mješalica. 4.8. Vrtložna mješalica. 5. Postupak 5.1. Priprema uzoraka Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije usitnjavanja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili liofilizacijom. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.9.) prije usitnjavanja. 5.2. Određivanje slobodnog triptofana (ekstrakt) Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 1 mg i prenese u konusnu tikvicu. Doda se 100,0 ml klorovodične kiseline (točka 3.13.) i 5,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.). Trese se ili miješa 60 minuta mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu. Doda se 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Natrijevim hidroksidom (točka 3.10.) se pH vrijednost otopine podesi na 3. Doda se dovoljno metanola (točka 3.8.) kako bi u konačnom volumenu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog volumena i razrijedi vodom na volumen potreban za kromatografiju (približno jednak volumen kao kod standardne kalibracijske otopine (točka 3.17.)). Prije ubrizgavanja na kolonu za HPLC filtrira se nekoliko ml otopine kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4. Standardna otopina i ekstrakti se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana. 5.3. Određivanje ukupnog triptofana (hidrolizat) Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u polipropilensku tikvicu (točka 4.4.). Udio dušika u odvaganom dijelu uzorka mora iznositi približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevog hidroksid oktahidrata (točka 3.4.) i 10 ml vode. Miješa se vrtložnom mješalicom (točka 4.8.) ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). U smjesi se ostavi magnet obložen teflonom. Stijenke posude se isperu s 4 ml vode. Tikvica se poklopi navojnim čepom i lagano zatvori. Prenese se u autoklav (točka 4.6.) s vrelom vodom i ostavi u pari 30 – 60 minuta. Autoklav se zatvori i 20 sati autoklavira na 110 (± 2) °C. Prije otvaranja autoklava, temperatura se snizi na malo ispod 100 °C. Kako bi se spriječila kristalizacija Ba(OH)2.8 H2O, u toplu se smjesu doda 30 ml vode temperature okoliša. Lagano se protrese ili promiješa. Doda se 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofana) (točka 3.16.). Posude se 15 minuta hlade u vodenoj/ledenoj kupelji. Zatim se doda 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Posuda se drži u rashladnoj kupki i uz miješanje neutralizira s HCl (točka 3.11.), a pH vrijednost se podesi na 3,0 s HCl (točka 3.12.). Doda se dovoljno metanola kako bi u konačnom obujmu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i razrijedi vodom do obujma potrebnog za kromatografiju (na primjer, 100 ml). Dodavanje metanola ne smije izazvati taloženje. Prije ubrizgavanja na HPLC kolonu nekoliko ml otopine se filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4. Standardna otopina i hidrolizati se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana. 5.4. Određivanje HPLC-om Za izokratsko se eluiranje kao smjernice predlažu sljedeći uvjeti; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati (vidjeti također napomene pod točkama 9.1. i 9.2.). Kolona za tekućinsku kromatografiju (točka 4.2): 125 mm × 4 mm, C18, veličina čestica punjenja 3 μm ili jednakovrijedna Temperatura kolone: sobna temperatura Mobilna faza (točka 3.22.): 3,00 g octene kiseline (točka 3.18.) + 900 ml vode (točka 3.1.) + 50,0 mlotopine točka (točka 3.21.) 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u metanolu (točka 3.8.) (1 g/100 ml). Etanolaminom (točka 3.20.) se pH vrijednost otopine podesi na 5,00. Dopuni se vodom (točka 3.1.) do 1 000 ml. Brzina protoka: 1 ml/min Ukupno trajanje eluiranja: oko 34 min Valna duljina detekcije: ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm. Volumen za ubrizgavanje: 20 μl 6. Izračun rezultata Količina triptofana (X), iskazana u g na 100 g uzorka, izračunava se sljedećom formulom: A = površina vrška internog standarda, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.) B = površina vrška triptofana, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.) V1 = obujam, u ml (2 ml), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.) c = koncentracija, u μmol/ml (= 2,50), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.) V2 = obujam, u ml, koncentrirana otopina internog standarda (točka 3.16.) dodana pri ekstrakciji (točka 5.2.) (= 5,00 ml) ili hidrolizat (točka 5.3.) (= 2,00 ml) C = površina vrška internog standarda, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.) D = površina vrška triptofana, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.) V3 = obujam, u ml (= 2,00 ml), koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.), dodana standardnoj kalibracijskoj otopini (točka 3.17.) m = masa uzorka u g (korigirana na izvornu masu ako je uzorak isušen i/ili odmašćen) M = molarna masa triptofana (= 204,23 g/mol). 7. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % u odnosu na najviši rezultat. 8. Rezultati međulaboratorijske studije Provedena je međulaboratorijska studija na razini EZ-a (četvrta međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 12 laboratorija analiziralo 3 uzorka za potvrđivanje metode za hidrolizu. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici: Uzorak 1 Hrana za svinje Uzorak 2 Hrana za svinje s dodanim L-triptofanom Uzorak 3 Koncentrat hrane za svinje L 12 12 12 n 50 55 50 Srednja vrijednost [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2 L = broj laboratorija koji su dostavili rezultate n = broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednosti (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti) sr = standardna devijacija ponovljivosti SR = standardna devijacija obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficijent varijacije ponovljivosti u % CVR = koeficijent varijacije obnovljivosti u %. Provedena je još jedna međulaboratorijska studija na razini EZ-a (treća međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 13 laboratorija analiziralo 2 uzorka za potvrđivanje metode za ekstrakciju slobodnog triptofana. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici: Uzorak 4 Smjesa pšenice i soje Uzorak 5 Smjesa pšenice i soje (= uzorak 4) s dodanim triptofanom (0,457 g/kg1) L 12 12 n 55 60 Srednja vrijednost [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11 L = broj laboratorija koji su dostavili rezultate n = broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednosti (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti) sr = standardna devijacija ponovljivosti SR = standardna devijacija obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficijent varijacije ponovljivosti u % CVR = koeficijent varijacije obnovljivosti u %. Provedena je još jedna međulaboratorijska studija na razini EZ-a u kojoj se u 7 laboratorija analiziralo 4 uzorka za potvrđivanje triptofana za hidrolizu. Rezultati su prikazani dolje. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Uzorak 1 Miješana hrana za svinje (CRM 117) Uzorak 2 Riblje brašno s niskim udjelom masti (CRM 118) Uzorak 3 Sojino brašno (CRM 119) Uzorak 4 Obrano mlijeko u prahu (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Srednja vrijednost [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [%] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = broj laboratorija koji su dostavili rezultate n = broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednost (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti sr = standardna devijacija ponovljivosti SR = standardna devijacija obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficijent varijacije ponovljivosti u % CVR = koeficijent varijacije obnovljivosti u %. 9. Napomene 9.1. Bolje razdvajanje triptofana i α-metil-triptofana može se postići sljedećim kromatografskim uvjetima. Izokratsko eluiranje, nakon kojeg slijedi gradijentno pročišćivanje kolone: Kolona za tekućinsku kromatografiju: 125 mm × 4 mm, C18, veličina čestica punjenja 5 μm ili jednakovrijedna Temperatura kolone: 32 °C Mobilna faza: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V). B: Metanol Gradijentni program: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Brzina protoka: 1,2 ml/min Ukupno trajanje eluiranja: oko 33 min 9.2. Postupak kromatografije se razlikuje s obzirom na vrstu HPLC-a i korišteni materijal za punjenje kolone. Odabrani sustav mora osiguravati razdvajanje bazne linije triptofana i internog standarda. Osim toga, važno je dobro odijeliti produkte razgradnje od triptofana i internog standarda. Izvede se postupak s hidrolizatima bez internog standarda za provjeru bazne linije internog standarda na nečistoće. Važno je da vrijeme eluiranja bude dovoljno za eluiranje svih produkata razgradnje, inače bi zakašnjeli vršci eluiranja mogli remetiti kasnije postupke kromatografiranja. U radnom području kromatografski sustav mora imati linearni odziv. Linearni se odziv mjeri s konstantnom (uobičajenom) koncentracijom internog standarda i različitim koncentracijama triptofana. Važno je da veličine vršaka triptofana i internog standarda budu u linearnom području sustava za HPLC/fluorescenciju. Ako su vršci triptofana i/ili internog standarda preniski ili previsoki, analizu treba ponoviti s drugom količinom uzorka i/ili drugim konačnim obujmom. 9.3. Barijev hidroksid S vremenom se topljivost barijevog hidroksida smanjuje. Posljedica toga je mutna otopina za HPLC, što može dovesti do niskih rezultata za triptofan. H. ODREĐIVANJE SIROVIH ULJA I MASTI 1. Svrha i područje primjene Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela sirovih ulja i masti u hrani za životinje. Ona ne obuhvaća analizu sjemenki uljarica i uljnog voća. Primjena dolje navedenih postupaka ovisi o vrsti i sastavu hrane za životinje i razlogu za provedbu analize. 1.1. Postupak A – Sirova ulja i masti koje se ekstrahiraju izravno Ova se metoda koristi za hranu za životinje biljnog podrijetla, osim one koja je obuhvaćena područjem primjene postupka B. 1.2. Postupak B –Ukupna sirova ulja i masti Ova se metoda koristi za hranu za životinje životinjskog podrijetla i za sve krmne smjese. Koristi se za sve sirovine za dobivanje životinjske hrane iz kojih se bez prethodne hidrolize ne mogu potpuno ekstrahirati ulja i masti (npr. gluteni, kvasac, krumpirovi proteini i proizvodi koji se podvrgavaju postupcima poput istiskivanja, pahuljičanja i zagrijavanja). 1.3. Tumačenje rezultata Kada je rezultat dobiven postupkom B viši od rezultata dobivenog postupkom A uvijek se kao točna vrijednost uzima rezultat dobiven postupkom B. 2. Načelo 2.1. Postupak A Uzorak se ekstrahira laganim petrolejem. Otapalo se ukloni destilacijom, a ostatak osuši i izvaže. 2.2. Postupak B Uzorak se uz zagrijavanje obradi klorovodičnom kiselinom. Smjesa se ohladi i filtrira. Ostatak se ispere i osuši, a zatim se provede određivanje u skladu s postupku A. 3. Reagensi 3.1. Lagani petrolej, raspon vrelišta 40 – 60 °C. Bromni broj mora biti niži od 1, a ostatak nakon isparavanja manji od 2 mg/100 ml. 3.2. Natrijev sulfat, bezvodni. 3.3. Klorovodična kiselina, c = 3 mol/l. 3.4. Filtracijsko sredstvo, npr. Kieselguhr, Hyflo-supercel. 4. Oprema 4.1. Uređaj za ekstrakciju. Ako je opremljena sifonom (uređaj Soxhlet), brzina refluksa mora biti takva da proizvodi približno 10 ciklusa na sat; ako nije opremljena sifonom, brzina povratnog toka mora iznositi približno 10 ml na minutu. 4.2. Kartuše za ekstrakciju, bez tvari topljivih u laganom petroleju i poroznosti u skladu s zahtjevima iz točke 4.1. 4.3. Sušilo, bilo vakuumsko, postavljeno na 75 °C ± 3 °C, ili zračno, postavljeno na 100 °C ± 3 °C. 5. Postupak 5.1. Postupak A (vidjeti točku 8.1.) Odvagne se 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg, prenese u kartušu za ekstrakciju (točka 4.2.) i pokrije čepom od vate koji ne sadrži masti. Kartuša se postavi u ekstraktor (točka 4.1.) i šest sati ekstrahira laganim petrolejem (točka 3.1.). Ekstrakt laganog petroleja se prikupi u suhu, izvaganu tikvicu koja sadrži krhotine plovućca (2). Otapalo se ukloni destilacijom. Ostatak se osuši tako da se tikvica sat i pol drži u sušilu (točka 4.3.). Ostavi se da se ohladi u eksikatoru te se izvaže. Ponovo se suši 30 minuta kako bi se osigurala konstantna masa ulja i masti (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 1 mg). 5.2. Postupak B Odvagne se 2,5 g uzorka s preciznošću od 1 mg (vidjeti točku 8.2.), prenese u čašu obujma 400 ml ili konusnu tikvicu obujma 300 ml i doda 100 ml klorovodične kiseline (točka 3.3.) i krhotine plovućca. Čaša se pokrije satnim staklom ili se konusna tikvica spoji s kondenzatorom s povratnim protokom. Smjesa se polagano dovede do ključanja iznad niskog plamena ili na električnoj grijaćoj ploči i tamo ostavi jedan sat. Treba paziti da se uzorak ne zalijepi za stijenke posude. Ohladi se i doda onoliko sredstva za filtriranje (točka 3.4.) koliko je potrebno da tijekom filtriranja ne dođe do gubitka ulja i masti. Filtrira se kroz navlažen dvostruki filtar papir koji ne sadrži masti. Ostatak se ispire hladnom vodom sve dok filtrat ne postane neutralan. Treba provjeriti da filtrat ne sadrži nikakva ulja ili masti. Njihova prisutnost znači da se uzorak prije hidrolize mora ekstrahirati laganim petrolejem primjenom postupka A. Dvostruki filtar papir na kojem je ostatak prenese se na satno staklo i sat i pol suši u sušilu (točka 4.3.) na 100 °C ± 3 °C. Dvostruki filtar papir sa suhim ostatkom se prenese u kartušu za ekstrahiranje (točka 4.2.) i pokrije čepom od vate koji ne sadrži masti. Kartuša se postavi u ekstraktor (točka 4.1.) i postupak nastavi kako je navedeno u drugom i trećem stavku točke 5.1. 6. Prikaz rezultata Masa ostatka iskazuje se kao postotni udio uzorka. 7. Ponovljivost Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja koja na istom uzorku izvodi isti analitičar ne smije prijeći: — 0,2 % apsolutne vrijednosti za udio sirovih ulja i masti manje od 5 %, — 4,0 % višeg rezultata za udio od 5 – 10 %, — 0,4 % apsolutne vrijednosti za udio iznad 10 %. 8. Napomene 8.1. Kod proizvoda s visokim udjelom ulja i masti koji se teško usitnjavaju ili nisu primjereni za pripremanje homogenog smanjenog pokusnog uzorka primjenjuje se sljedeći postupak. Odvagne se 20 g uzorka s preciznošću od 1 mg i pomiješa s 10 g ili više bezvodnog natrijevog sulfata (točka 3.2.). Ekstrahira se laganim petrolejem (točka 3.1.) u skladu s točkom 5.1. Ekstrakt se dopuni laganim petrolejem (točka 3.1.) do 500 ml i promiješa. Uzme se 50 ml otopine i prenese u malenu, suhu, izvaganu tikvicu s krhotinama plovućca. Destilacijom se ukloni otapalo, osuši se i nastavi u skladu s zadnjem stavku točke 5.1. Iz ostatka ekstrakcije koji se nalazi u tuljcu ukloni se otapalo, ostatak se usitni do veličine čestica 1 mm i vrati u tuljac za ekstrakciju (ne dodaje se natrijev sulfat), zatim se nastavi kako je navedeno u drugom i trećem stavku točke 5.1. Ucio ulja i masti kao postotni udio uzorka izračunava se sljedećom formulom: (10 m1 + m2) × 5 pri čemu je: m1 = masa ostatka nakon prve ekstrakcije (alikvotni dio ekstrakta) u gramima, m2 = masa ostatka nakon druge ekstrakcije u gramima. 8.2. Kod proizvoda s niskim sadržajem ulja i masti pokusni se uzorak može povećati na 5 g. 8.3. Hranu za kućne ljubimce s visokim sadržajem vode ponekad prije hidrolize i ekstrakcije trebati pomiješati s bezvodnim natrijevim sulfatom, u skladu s postupku B. 8.4. U točki 5.2, za ispiranje ostatka nakon filtracije učinkovitije bi bilo koristiti vruću vodu umjesto hladne vode. 8.5. Za određenu hranu za životinje možda će trebati produžiti vrijeme sušenja na više od 1,5 h. Treba izbjegavati prekomjerno sušenje zato što može dovesti do niskih rezultata. Može se koristiti i mikrovalna pećnica. 8.6. Ako je udio sirovih ulja/masti viši od 15 %, preporučuje se prije hidrolize izvesti prethodnu ekstrakciju u skladu s postupku A i ponovnu ekstrakciju u skladu s postupku B. U određenoj mjeri, to ovisi o vrsti hrane za životinje i vrsti ulja/masti u hrani za životinje. I. ODREĐIVANJE SIROVE VLAKNINE 1. Svrha i područje primjene Ovom se metodom omogućuje određivanje bezmasnih organskih tvari u hrani za životinje koje su netopljive u kiselim i baznim medijima i uobičajeno se nazivaju sirove vlaknine. 2. Načelo Uzorak se prema potrebi odmasti i uzastopno obradi vrelim otopinama sumporne kiseline i kalijevog hidroksida u navedenim koncentracijama. Ostatak se odvaja filtracijom kroz filtar od sinteriranog stakla, ispere, osuši, izvaže i žari na 475 – 500 °C. Gubitak mase zbog žarenja odgovara udjelu sirove vlaknine u pokusnom uzorku. 3. Reagensi 3.1. Sumporna kiselina, c = 0,13 mol/l. 3.2. Sredstvo protiv pjenjenja (npr. n-oktanol). 3.3. Sredstvo za filtriranje (Celite 545 ili jednakovrijedno), koje se četiri sata grije na 500 °C (točka 8.6.). 3.4. Aceton. 3.5. Lagani petrolej s rasponom vrelišta od 40 – 60 °C. 3.6. Klorovodična kiselina, c = 0,5 mol/l. 3.7. Otopina kalijevog hidroksida, c = 0,23 mol/l. 4. Oprema 4.1. Grijaća jedinica za mineralizaciju otopinama sumporne kiseline i kalijevog hidroksida, opremljena dodatkom za filtarski lončić (točka 4.2.) i ispusnom cijevi koja je preko slavine priključena na tekućinu i vakuum, po mogućnosti sa stlačenim zrakom. Svakog dana prije početka upotrebe jedinica se pet minuta zagrijava vrelom vodom. 4.2. Stakleni filtarski lončić s filtarskom pločom od sinteriranog stakla, veličine pora 40 – 90 μm. Prije prve upotrebe treba se nekoliko minuta grijati na 500 °C i ohladiti (točka 8.6.). 4.3. Valjak obujma najmanje 270 ml s kondenzatorom s povratnim protokom, pogodan za ključanje. 4.4. Sušilo s termostatom 4.5. Mufolna peć s termostatom 4.6. Jedinica za ekstrakciju sastavljena od nosive ploče za filtarski lončić (točka 4.2.) i ispusne cijevi koja je preko slavine priključena na tekućinu i vakuum. 4.7. Spojni prstenovi za sklapanje grijaće jedinice (točka 4.1.), lončića (točka 4.2.) i valjka (točka 4.3.) i za priključivanje jedinice za hladnu ekstrakciju (točka 4.6.) i lončića. 5. Postupak Odvagne se 1 g pripravljenog u