UREDBA KOMISIJE (EU) 2017/771

оd 3. svibnja 2017.

o izmjeni Uredbe (EZ) br. 152/2009 u pogledu metoda za određivanje količina dioksina i polikloriranih bifenila

(Tekst značajan za EGP)

EUROPSKA KOMISIJA,

uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 882/2004 Europskog parlamenta i Vijeća od 29. travnja 2004. o službenim kontrolama koje se provode radi provjeravanja poštivanja propisa o hrani i hrani za životinje te propisa o zdravlju i dobrobiti životinja (1), a posebno njezin članak 11. stavak 4.,

budući da:

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

Dio B Priloga V. Uredbi (EZ) br. 152/2009 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.

Članak 2.

Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

(1) SL L 165, 30.4.2004., str. 1.

(2) Uredba Komisije (EZ) br. 152/2009 od 27. siječnja 2009. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje (SL L 54, 26.2.2009., str. 1.).

(3) Uredba (EZ) br. 183/2005 Europskog parlamenta i Vijeća od 12. siječnja 2005. o utvrđivanju zahtjeva u pogledu higijene hrane za životinje (SL L 35, 8.2.2005., str. 1.).

(4) Odluka Komisije 2002/657/EZ od 14. kolovoza 2002. o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata (SL L 221, 17.8.2002., str. 8.).

PRILOG

U Prilogu V. Uredbi (EZ) br. 152/2009 dio B, „ODREĐIVANJE RAZINA DIOKSINA (PCDD/PCDF) I PCB-ova”, zamjenjuje se sljedećim:

„B. ODREĐIVANJE RAZINA DIOKSINA (PCDD/PCDF) I PCB-ova POGLAVLJE I. Metode uzorkovanja i tumačenje analitičkih rezultata 1. Područje primjene i definicije Uzorci za službenu kontrolu razina polikloriranih dibenzo-p-dioksina (PCDD-ovi), polikloriranih dibenzofurana (PCDF-ovi), polikloriranih bifenila sličnih dioksinima (PCB-ovi) (1) i PCB-ova koji nisu slični dioksinima u hrani za životinje uzimaju se u skladu s odredbama Priloga I. Primjenjuju se količinski zahtjevi za kontrolu tvari ili proizvoda ravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje kako je predviđeno točkom 5.1. Priloga I. Skupni uzorci dobiveni na taj način smatraju se reprezentativnima za serije ili podserije iz kojih su uzeti. Sukladnost s najvišim dopuštenim količinama određenima Direktivom 2002/32/EZ utvrđuje se na temelju količina utvrđenih na laboratorijskim uzorcima. Za potrebe ovog dijela B primjenjuju se definicije utvrđene u Prilogu I. Odluci Komisije 2002/657/EZ (2). Uz te definicije, za potrebe ovog dijela B primjenjuju se i sljedeće definicije: ‚Orijentacijske metode’ znači metode upotrijebljene za odabir onih uzoraka s količinama PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koje prelaze najveće dopuštene količine ili pragove za pokretanje postupka. Njima se omogućuje troškovno učinkovita velika propusnost uzoraka i tako povećava mogućnost za otkrivanje novih incidenata velike izloženosti i rizika za zdravlje potrošača. Orijentacijske metode temelje se na bioanalitičkim ili GC/MS metodama. Rezultati iz uzoraka koji prelaze cut-off vrijednost upotrijebljenu za provjeru sukladnosti s najvećom dopuštenom količinom provjeravaju se potpunom ponovljenom analizom originalnog uzorka upotrebom potvrdne metode. ‚Potvrdne metode’ znači metode kojima se osiguravaju potpune ili dopunske informacije kojima se omogućuje nedvosmisleno otkrivanje i kvantificiranje najveće dopuštene količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, ili u slučaju potrebe, praga za pokretanje postupka. U takvim metodama koriste se plinska kromatografija/masena spektrometrija visoke razlučivosti (GC-HRMS) ili plinska kromatografija/tandem masena spektrometrija (GC-MS/MS). 2. Sukladnost serije ili podserije s najvećom dopuštenom količinom 2.1. PCB-ovi koji nisu slični dioksinima Serija ili podserija u skladu je s najvećom dopuštenom količinom ako analitički rezultat za zbroj tvari PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180 (u nastavku: PCB-ovi koji nisu slični dioksinima) ne prelazi najveću dopuštenu količinu utvrđenu Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost (3). Serija ili podserija nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom kako je utvrđena Direktivom 2002/32/EZ ako srednja vrijednost dvaju gornjih (4) analitičkih rezultata dobivena dvostrukom analizom (5), uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost, bez sumnje prelazi najveću dopuštenu količinu, odnosno za ocjenu sukladnosti upotrebljava se analizirana koncentracija nakon oduzimanja proširene mjerne nesigurnosti. Proširena mjerna nesigurnost izračunava se upotrebom čimbenika pokrivanja 2, što daje razinu pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako srednja vrijednost izmjerenih vrijednosti, umanjena za proširenu nesigurnost srednje vrijednosti, prelazi najveću dopuštenu količinu. Pravila koja su navedena u prethodnim stavcima ove točke primjenjuju se na analitički rezultat dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize za potrebe sudskih sporova ili upućivanja primjenjuju se nacionalni propisi. 2.2. PCDD/F-ovi i dioksinima slični PCB-ovi Serija ili podserija u skladu je s najvećom dopuštenom količinom ako rezultat pojedinačne analize — provedene orijentacijskom metodom s udjelom lažno sukladnih rezultata manjim od 5 % ukazuje na to da razina ne prelazi odgovarajuću najveću dopuštenu količinu PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova kako je propisano u Direktivi 2002/32/EZ, — provedene potvrdnom metodom ne prelazi odgovarajuću najveću dopuštenu količinu PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova kako je propisano u Direktivi 2002/32/EZ, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost. Za orijentacijske testove potrebno je odrediti cut-off vrijednost za odluke o sukladnosti uzorka s odgovarajućim najvećim dopuštenim količinama određenima za PCDD/PCDF-ove ili za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. Serija ili podserija nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom kako je utvrđena Direktivom 2002/32/EZ ako srednja vrijednost dvaju gornjih (6) analitičkih rezultata dobivena dvostrukom analizom (7) upotrebom potvrdne metode, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost, bez sumnje prelazi najveću dopuštenu količinu, odnosno za ocjenu sukladnosti upotrebljava se analizirana koncentracija nakon oduzimanja proširene mjerne nesigurnosti. Proširena mjerna nesigurnost izračunava se upotrebom čimbenika pokrivanja 2, što daje razinu pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako srednja vrijednost izmjerenih vrijednosti, umanjena za proširenu nesigurnost srednje vrijednosti, prelazi najveću dopuštenu količinu. Zbroj procijenjenih proširenih nesigurnosti za odvojene analitičke rezultate PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova upotrebljava se za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. Pravila koja su navedena u prethodnim stavcima ove točke primjenjuju se na analitički rezultat dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize za potrebe sudskih sporova ili upućivanja primjenjuju se nacionalni propisi. 3. Rezultati koji prelaze pragove za pokretanje postupka kako je utvrđeno u Prilogu II. Direktivi 2002/32/EZ Pragovi za pokretanje postupka predstavljaju alat za odabir uzoraka u onim slučajevima u kojima je potrebno utvrditi izvor kontaminacije i poduzeti mjere za njezino smanjenje ili uklanjanje. Orijentacijskim metodama uspostavljaju se odgovarajuće cut-off vrijednosti za odabir tih uzoraka. Ako su potrebni znatni napori za otkrivanje izvora i za smanjenje ili uklanjanje kontaminacije, primjereno je potvrditi prelazak pragova za pokretanje postupka dvostrukom analizom koristeći potvrdnu metodu i uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost (8). POGLAVLJE II. Priprema uzorka i zahtjevi za metode analize koje se koriste za službenu kontrolu količina dioksina (PCDD/PCDF-ovi) i dioksinima sličnih PCB-ova u hrani za životinje 1. Područje primjene Zahtjevi iz ovog poglavlja primjenjuju se kad se hrana za životinje analizira za službenu kontrolu količina 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF-ova i PCB-ova koji nisu slični dioksinima te u pogledu pripreme uzoraka i analitičkih zahtjeva za druge regulatorne svrhe, uključujući kontrole koje provodi subjekt u poslovanju s hranom za životinje za osiguranje sukladnosti s odredbama Uredbe (EZ) br. 183/2005 Europskog parlamenta i Vijeća (9). Prisutnost PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u hrani za životinje može se pratiti s pomoću dvije različite vrste analitičkih metoda: (a) Orijentacijske metode Cilj je orijentacijskih metoda odabir uzoraka s količinama PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koje prelaze najveće dopuštene količine ili pragove za pokretanje postupka. Orijentacijskim metodama omogućuje se troškovno učinkovita velika propusnost uzoraka i tako povećava mogućnost za otkrivanje novih incidenata velike izloženosti i rizika za zdravlje potrošača. Cilj je njihove primjene izbjeći lažno sukladne rezultate. One mogu uključivati bioanalitičke metode i GC-MS metode. Orijentacijske metode temelje se na usporedbi analitičkog rezultata s cut-off vrijednošću, a donosi se odluka da/ne u pogledu mogućeg prelaska najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u uzorcima za koje se sumnja da su nesukladni s najvećom dopuštenom količinom određuje se ili potvrđuje potvrdnom metodom. Osim toga, orijentacijskim metodama mogu se dobiti naznake o tome kolike su količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova prisutne u uzorku. U slučaju primjene bioanalitičkih orijentacijskih metoda rezultati se izražavaju kao bioanalitički ekvivalenti (BEQ), dok se u slučaju primjene fizikalno-kemijskih GC-MS metoda izražavaju kao ekvivalenti toksičnosti (TEQ). Numerički navedeni rezultati orijentacijskih metoda prikladni su za dokazivanje sukladnosti ili sumnje na nesukladnost ili prelaska praga za pokretanje postupka i pokazuju raspon količina u slučaju daljnje analize s pomoću potvrdnih metoda. Oni nisu prikladni za potrebe kao što su ocjena količina prisutnosti, procjena unosa, praćenje vremenskih kretanja kod količina ili ponovna ocjena pragova za pokretanje postupka i najvećih dopuštenih količina. (b) Potvrdne metode Potvrdne metode omogućuju nedvosmisleno određivanje količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u uzorku i osiguravaju cjelovite informacije o količini kongenera. Stoga te metode omogućuju kontrolu najvećih dopuštenih količina i pragova za pokretanje postupka, uključujući potvrdu rezultata dobivenih orijentacijskim metodama. Osim toga rezultati se mogu koristiti za druge potrebe, kao što su određivanje niskih količina prisutnosti kod praćenja hrane za životinje, praćenje vremenskih kretanja, procjena izloženosti i stvaranje baze podataka zbog moguće ponovne ocjene pragova za pokretanje postupka i najvećih dopuštenih količina. One su važne i za određivanje uzoraka kongenera kako bi se ustanovio izvor moguće kontaminacije. U takvim metodama koristi se GC-HRMS. Za potvrđivanje sukladnosti ili nesukladnosti s najvećom dopuštenom količinom može se koristiti i GC-MS/MS. 2. Pozadina Za izračun koncentracija ekvivalenata toksičnosti (TEQ), koncentracije pojedinačnih tvari u danom uzorku pomnože se s odgovarajućim faktorom ekvivalentne toksičnosti (TEF) (vidjeti bilješku 1. poglavlja I.), a zatim zbroje kako bi se dobila ukupna koncentracija dioksinima sličnih spojeva izraženih kao TEQ. Za potrebe ovog dijela B, prihvaćena posebna granica kvantifikacije pojedinog kongenera znači najmanji udio analita koji se može izmjeriti s razumnom statističkom sigurnošću i koji ispunjuje kriterije identifikacije kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 (Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668 kako su revidirane. Granica kvantifikacije pojedinog kongenera može se odrediti na sljedeći način: (a) koncentracija analita u izolatu uzorka koja daje odgovor instrumenta na dva različita iona, koju treba pratiti uz omjer signala i šuma 3:1 pri manje osjetljivom signalu neobrađenih podataka; ili (b) ako zbog tehničkih razloga izračun signal-šum ne daje pouzdane rezultate, točka najniže koncentracije na kalibracijskoj krivulji koja daje prihvatljivo (≤ 30 %) i dosljedno (mjereno najmanje na početku i na kraju analitičkog niza uzoraka) odstupanje od prosječnog relativnog faktora odgovora izračunanog za sve točke na kalibracijskoj krivulji u svakoj seriji uzoraka. Granica kvantifikacije (LOQ) izračunava se iz točke najniže koncentracije uzimajući u obzir iskorištenje internih standarda i unos uzorka. Bioanalitičke orijentacijske metode ne daju rezultate na razini kongenera, već samo navode (10) vrijednosti TEQ izražene u bioanalitičkim ekvivalentima (BEQ), s obzirom na to da svi spojevi prisutni u izolatu uzorka koji proizvedu odgovor pri ispitivanju možda ne ispunjavaju sve zahtjeve načela TEQ. Orijentacijske i potvrdne metode mogu se koristiti za kontrolu određene matrice samo ako su metode dovoljno osjetljive za pouzdano otkrivanje količine koja dosegne prag za pokretanje postupka ili razinu najveće dopuštene količine. 3. Zahtjevi za osiguranje kvalitete 3.1. Mjere za sprečavanje uzajamne kontaminacije poduzimaju se u svakoj fazi uzorkovanja i analize. 3.2. Uzorci se čuvaju i prevoze u spremnicima od stakla, aluminija, polipropilena ili polietilena koji su primjereni za čuvanje i ne utječu na količine PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u uzorcima. Tragovi papirne prašine uklanjaju se iz spremnika za uzorke. 3.3. Skladištenje i prijevoz uzorka provode se tako da se očuva cjelovitost uzorka hrane za životinje. 3.4. Gdje je to primjenjivo, svaki se laboratorijski uzorak sitno melje i dobro promiješa s pomoću postupka kojim se postiže potpuna homogenizacija (npr. prosijavanjem samljevenog uzorka kroz sito otvora 1 mm). Ako je sadržaj vlage u uzorku previsok, uzorak se prije mljevenja mora osušiti. 3.5. Provodi se kontrola reagensa, staklenog pribora i opreme zbog mogućeg utjecaja na rezultate izražene u TEQ ili BEQ. 3.6. Slijepu probu treba obaviti provedbom cijelog analitičkog postupka, ali bez uzorka. 3.7. Za bioanalitičke metode sav stakleni pribor i otapala koji se koriste u analizi ispituju se da ne sadržavaju spojeve koji utječu na detekciju ciljnih spojeva u radnom rasponu. Stakleni pribor treba isprati otapalima ili grijati na temperaturama koje su primjerene za otklanjanje tragova PCDD/PCDF-ova, dioksinima sličnih spojeva te interferirajućih spojeva s njihove površine. 3.8. Količina uzorka za ekstrakciju dovoljna je za ispunjavanje zahtjeva u pogledu dovoljno niskog radnog raspona uključujući koncentracije na razini najveće dopuštene količine ili pragova za pokretanje postupka. 3.9. U posebnim postupcima pripreme uzorka koji se koriste za dotične proizvode moraju se slijediti međunarodno priznate smjernice. 4. Zahtjevi za laboratorije 4.1. U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa smjernicom ISO 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025. Načela opisana u tehničkim smjernicama za procjenu mjerne nesigurnosti i granica kvantifikacije za analizu PCDD/PCDF-ova i PCB-ova poštuju se ako su primjenjiva (11). 4.2. Sposobnost laboratorija dokazuje se kontinuiranim uspješnim sudjelovanjem u međulaboratorijskim studijama za određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u relevantnim matricama hrane za životinje i rasponima koncentracija. 4.3. Laboratoriji koji provode orijentacijske metode pri rutinskim kontrolama uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdne metode, i radi kontrole kvalitete i radi potvrde analitičkih rezultata sumnjivih uzoraka. 5. Osnovni zahtjevi za analitičke postupke za dioksine (PCDD/PCDF-ovi) i dioksinima slične PCB-ove 5.1. Nizak radni raspon i granice kvantifikacije Za PCDD/PCDF-ove osjetljivost određivanja u gornjem je femtogramskom (10– 15 g) rasponu zbog iznimno visoke toksičnosti nekih od tih spojeva. Za većinu PCB kongenera dovoljna je granica kvantifikacije u nanogramskom (10– 9 g) rasponu. Za mjerenje toksičnijih kongenera dioksinima sličnih PCB-ova (posebno ne-orto supstituiranih kongenera) donji dio radnog raspona doseže donje pikogramsko područje (10– 12 g). Za sve druge kongenere PCB-ova, dovoljna je granica kvantifikacije u nanogramskom rasponu (10– 9 g). 5.2. Visoka selektivnost (specifičnost) 5.2.1. Potrebno je praviti razliku između PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova i mnogobrojnih drugih istodobno ekstrahiranih i vjerojatno interferirajućih spojeva prisutnih u koncentracijama koje su za nekoliko redova veličine veće od koncentracija predmetnih analita. Kod metoda GC-MS potrebno je praviti razliku između različitih kongenera, npr. između toksičnih (primjerice sedamnaest 2,3,7,8-supstituiranih PCDD/PCDF-ova i dvanaest dioksinima sličnih PCB-ova) i drugih kongenera. 5.2.2. Bioanalitičke metode moraju moći otkriti ciljne spojeve kao zbroj PCDD/PCDF-ova i/ili dioksinima sličnih PCB-ova. Čišćenje uzorka ima za cilj uklanjanje spojeva koji uzrokuju lažnu nesukladnost rezultata ili spojeva koji mogu smanjiti odgovor i prouzročiti lažno sukladne rezultate. 5.3. Visoka točnost (istinitost i preciznost, očito iskorištenje pri biološkim testovima) 5.3.1. Kod metoda GC-MS određivanjem se mora osigurati valjana procjena prave koncentracije u uzorku. Visoka točnost potrebna je da bi se izbjeglo odbijanje rezultata analize uzorka na temelju niske pouzdanosti utvrđene vrijednosti TEQ. Točnost se izražava kao istinitost (razlika između izmjerene srednje vrijednosti za analit u certificiranome materijalu i njegove certificirane vrijednosti, izražene kao postotak te vrijednosti) i preciznost (RSDR relativna standardna devijacija izračunana iz rezultata dobivenih u uvjetima ponovljivosti). 5.3.2. Kod bioanalitičkih metoda potrebno je odrediti očito iskorištenje pri biološkim testovima. Očito iskorištenje pri biološkim testovima znači vrijednost BEQ izračunana iz kalibracijske krivulje za TCDD ili PCB 126, korigirana za vrijednost slijepe probe i zatim podijeljena s vrijednošću TEQ određenom potvrdnom metodom. Tom se metodom pokušavaju korigirati faktori kao što su gubitak PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih spojeva tijekom ekstrakcije i čišćenja, koekstrakcijski spojevi koji povećavaju ili smanjuju odgovor (agonistički i antagonistički učinci), kvaliteta prilagodbe krivulje ili razlike između vrijednosti TEF-a i REP-a (relativne učinkovitosti). Očito iskorištenje pri biološkim testovima izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka koji imaju reprezentativno raspoređene kongenere u blizini predmetne količine. 5.4. Validacija u rasponu najveće dopuštene količine i opće mjere za kontrolu kvalitete 5.4.1. Laboratoriji moraju dokazati učinkovitost izvedbe metode u određenom rasponu najveće dopuštene količine, npr. 0,5 puta, 1 puta i 2 puta većom količinom od najveće dopuštene količine, s prihvatljivim koeficijentom varijacije ponovljene analize tijekom validacijskog postupka i rutinske analize. 5.4.2. Redovite slijepe probe i pokusi s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka (ako je dostupan, poželjan je certificirani referentni materijal) provode se kao mjere unutarnje kontrole kvalitete. Dijagrami kontrole kvalitete za slijepe probe, pokuse s dodavanjem ili analize kontrolnih uzoraka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je provedba analiza u skladu sa zahtjevima. 5.5. Granica kvantifikacije 5.5.1. Za bioanalitičku orijentacijsku metodu određivanje granice kvantifikacije (LOQ) nije nužno, ali je potrebno dokazati da metoda može razlikovati slijepu vrijednost od cut-off vrijednosti. Pri određivanju vrijednosti BEQ određuje se prag izvještavanja zbog postupanja s uzorcima za koje je odgovor ispod te razine. Za prag izvještavanja potrebno je dokazati da se razlikuje najmanje za tri puta od postupka sa slijepim uzorcima s odgovorom ispod radnog raspona. Stoga ga se izračunava na temelju uzoraka koji sadrže ciljne spojeve blizu najniže zahtijevane količine, a ne na temelju omjera između signala i šuma ili slijepe probe. 5.5.2. Granica određivanja (LOQ) za potvrdnu metodu mora biti približno jedna petina najveće dopuštene količine. 5.6. Analitički kriteriji Za pouzdane rezultate potvrdnih ili orijentacijskih metoda moraju se ispuniti sljedeći kriteriji u rasponu najveće dopuštene količine za vrijednosti TEQ ili BEQ, koje se određuju kao ukupna vrijednost TEQ ili ukupna vrijednost BEQ (kao zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova), ili odvojeno za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove. Orijentacijske metode s bioanalitičkim ili fizikalno-kemijskim metodama Potvrdne metode Učestalost lažno sukladnih rezultata (*1) < 5 % Istinitost – 20 % do + 20 % Ponovljivost (RSDr) < 20 % Srednja preciznost (RSDR) < 25 % < 15 % 5.7. Posebni zahtjevi za orijentacijske metode 5.7.1. Mogu se koristiti GC-MS metode i bioanalitičke metode. Za GC-MS metode primjenjuju se zahtjevi utvrđeni u točki 6. Za stanične bioanalitičke metode primjenjuju se posebni zahtjevi utvrđeni u točki 7. 5.7.2. Laboratoriji koji provode orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji provode potvrdnu metodu. 5.7.3. Tijekom rutinske analize potrebno je provesti provjeru mogućnosti orijentacijske metode s pomoću kontrole analitičke kvalitete i stalnog vrednovanja metoda. Mora se kontinuirano provoditi program za kontrolu sukladnih rezultata. 5.7.4. Provjera mogućeg smanjenja staničnog odgovora i citotoksičnosti: 20 % izolata uzoraka mjeri se u rutinskom orijentacijskom pregledu bez dodane tvari 2,3,7,8-TCDD i s njom, koja odgovara najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka kako bi se provjerilo je li odgovor možda smanjen zbog interferirajućih tvari prisutnih u izolatu uzorka. Izmjerena koncentracija uzorka s dodatkom uspoređuje se sa zbrojem koncentracija izolata bez dodatka i koncentracije za dodavanje. Ako je ta izmjerena koncentracija za više od 25 % manja od izračunane (zbirne) koncentracije, to ukazuje na moguće smanjenje signala i dotični rezultat podvrgava se potvrdnoj analizi GC-HRMS. Rezultati se prate na dijagramima kontrole kvalitete. 5.7.5. Kontrola kvalitete sukladnih uzoraka: Približno 2 do 10 % sukladnih uzoraka, ovisno o matrici uzorka i iskustvu laboratorija, potvrđuje se primjenom GC/HRMS-a. 5.7.6. Određivanje učestalosti lažno sukladnih rezultata na temelju podataka kontrole kvalitete: Određuje se učestalost lažno sukladnih rezultata dobivenih orijentacijskim metodama analize uzoraka ispod i iznad najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Stvarna učestalost lažno sukladnih rezultata mora biti ispod 5 %. Kada je najmanje 20 potvrđenih rezultata po matrici/skupini matrica dostupno iz kontrole kvalitete sukladnih uzoraka, donose se zaključci o učestalosti lažno sukladnih rezultata iz te baze podataka. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama ili tijekom incidenata kontaminacije koji pokrivaju raspon koncentracije do npr. 2 puta najveće dopuštene količine, mogu se uključiti i u minimum od 20 rezultata za procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore. Iako su orijentacijske metode usmjerene prvenstveno na otkrivanje uzoraka koji prelaze prag za pokretanje postupka, kriterij za određivanje lažno sukladnih rezultata jest najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost potvrdne metode. 5.7.7. Mogući nesukladni uzorci iz orijentacijske metode moraju se uvijek provjeriti cijelom ponovljenom analizom na originalnom uzorku potvrdnom metodom analize. Ti se uzorci mogu koristiti i za procjenu učestalosti lažno nesukladnih rezultata. Kod orijentacijskih metoda učestalost lažnih nesukladnih rezultata dio je rezultata za koje je potvrdnom analizom potvrđeno da su sukladni, dok je prethodnom orijentacijskom metodom analize za uzorak izražena sumnja da nije sukladan. Procjena prednosti orijentacijske metode temelji se na usporedbi lažno nesukladnih uzoraka s ukupnim brojem pregledanih uzoraka. Ta učestalost mora biti dovoljno niska da uporaba orijentacijske metode bude korisna. 5.7.8. Bioanalitičke metode moraju u uvjetima validacije valjano pokazati količinu TEQ, izračunanu i izraženu kao BEQ. I kod bioanalitičkih metoda provedenih u ponovljenim uvjetima interna laboratorijska ponovljivost RSDr uobičajeno je manja nego u uvjetima ponovljivosti RSDR. 6. Posebni zahtjevi koje moraju ispunjavati GC-MS metode za potrebe orijentacije ili potvrđivanja 6.1. Prihvatljive razlike između gornje i donje granice razina WHO-TEQ Razlika između gornje i donje granice ne smije biti veća od 20 % da bi se potvrdio prelazak najveće dopuštene količine ili, u slučaju potrebe, prelazak praga za pokretanje postupka. 6.2. Kontrola iskorištenja 6.2.1. Dodavanje 13C-označenih 2,3,7,8-klor supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove provodi se na samom početku analitičke metode, na primjer prije ekstrakcije, kako bi se vrednovao analitički postupak. Dodaje se najmanje po jedan kongener za sve tetra- do okta-klorirane homologne skupine za PCDD/PCDF-ove i najmanje po jedan kongener za svaku homolognu skupinu za dioksinima slične PCB-ove (odnosno najmanje po jedan kongener za svaki izabrani ion u masenoj spektrometriji koja se koristi za praćenje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova). U slučaju potvrdnih metoda koristi se svih 17 13C-označenih 2,3,7,8-supstituiranih unutarnjih standarda za PCDD/PCDF-ove i svih 12 13C-označenih unutarnjih standarda za dioksinima slične PCB-ove. 6.2.2. Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje ni jedan 13C-označen analog, i to upotrebom odgovarajuće kalibracijske otopine. 6.2.3. Za hranu za životinje biljnog i životinjskog podrijetla koja sadržava manje od 10 % masti, interni se standardi obavezno dodaju prije ekstrakcije. Za hranu za životinje životinjskoga podrijetla u kojoj je udio masti veći od 10 %, interni se standardi mogu dodati prije ili poslije ekstrakcije masti. Provodi se odgovarajuće vrednovanje učinkovitosti ekstrakcije, što ovisi o fazi kada se dodaju interni standardi. 6.2.4. Prije GC-MS analize dodaje se 1 ili 2 (surogat) standarda za iskorištenje. 6.2.5. Potrebno je kontrolirati iskorištenje. Za potvrdne metode iskorištenje pojedinačnih internih standarda mora biti u rasponu između 60 % i 120 %. Manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere, a posebno za neke hepta- i okta-klorirane dibenzo-p-dioksine i dibenzofurane, prihvatljivo je pod uvjetom da je njihov doprinos TEQ vrijednosti manji od 10 % ukupne TEQ vrijednosti (dobivene na temelju zbroja PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova). Za orijentacijske metode GC-MS iskorištenje je u rasponu između 30 % i 140 %. 6.3. Uklanjanje interferirajućih tvari — Odvajanje PCDD/PCDF-ova od interferirajućih kloriranih spojeva kao što su PCB-ovi koji nisu slični dioksinima i klorirani difenil eteri provodi se s pomoću odgovarajućih kromatografskih tehnika (najbolje s pomoću kolone s florisilom, aluminijevim oksidom i/ili ugljenom). — Razdvajanje izomera plinskom kromatografijom iznosi < 25 % od vrha do vrha između 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF. 6.4. Kalibracija sa standardnom krivuljom Raspon kalibracijske krivulje obuhvaća relevantni raspon najvećih dopuštenih količina ili pragova za pokretanje postupka. 6.5. Posebni kriteriji za potvrdne metode — Za GC-HRMS: — U HRMS-u razlučivost je tipično veća ili jednaka 10 000 za cijeli maseni raspon pri 10 % najmanjeg razmaka između dviju vršnih vrijednosti jednakog intenziteta. — Ispunjavanje daljnjih kriterija za identifikaciju i potvrđivanje kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 (Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668, kako su revidirane. — Za GC-MS/MS: — Praćenje barem dvaju specifičnih prekursor iona, svakoga s jednim posebnim odgovarajućim prijelaznim ionom produkta za sve označene i neoznačene analite u okviru analize. — Najveće dopušteno odstupanje relativnih intenziteta iona od ± 15 % za odabranu tranziciju iona produkta u usporedbi s izračunanim ili izmjerenim vrijednostima (prosjek iz kalibracijskih normi), primjenjujući identične MS/MS uvjete, posebno energiju kolizije i tlak plina kolizije, za svaku tranziciju jednog analita. — Razlučivost za svaki kvadropol treba postaviti jednako ili bolje od jedinične masene razlučivosti (jedinična masena razlučivost: razlučivost koje je dostatna da dvije vršne točke razdvoji za jednu masenu jedinicu) kako bi se smanjila moguća međudjelovanja predmetnih analita. — Ispunjavanje daljnjih kriterija kako su opisani u međunarodno priznatim normama, na primjer u normi EN 16215:2012 (Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS) i/ili u metodama EPA 1613 i 1668, kako su revidirane, osim obveze da se koristi GC-HRMS. 7. Posebni zahtjevi za bioanalitičke metode Bioanalitičke metode su metode koje se temelje na uporabi bioloških načela kao što su testovi na staničnoj osnovi, testovi na temelju receptora ili imunološki testovi. U ovoj točki 7. utvrđuju se općeniti zahtjevi za bioanalitičke metode. Orijentacijskom metodom u načelu se uzorak klasificira kao sukladan ili kao uzorak sa sumnjom na nesukladnost. U tu svrhu izračunana vrijednost BEQ uspoređuje se s cut-off vrijednošću (vidjeti točku 7.3.). Uzorci ispod cut-off vrijednosti smatraju se sukladnima, za uzorke jednake ili iznad cut-off vrijednosti sumnja se da nisu sukladni, što zahtijeva analizu potvrdnom metodom. U praksi BEQ vrijednost koja odgovara dvjema trećinama najveće dopuštene količine može se koristiti kao najprimjerenija cut-off vrijednost, uz uvjet da se osigura učestalost lažno sukladnih rezultata ispod 5 % i prihvatljiva učestalost lažno nesukladnih rezultata. Kako su najveće dopuštene količine odvojene za PCDD/PCDF-ove i za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, provjera sukladnosti uzoraka bez frakcioniranja zahtijeva odgovarajuće cut-off vrijednosti za PCDD/PCDF-ove kod bioloških testova. Za provjeru uzoraka koji prelaze pragove za pokretanje postupka kao cut-off vrijednost upotrebljava se odgovarajući postotak dotičnog praga za pokretanje postupka. Ako je okvirna vrijednost izražena u BEQ, rezultati uzorka moraju biti u radnom rasponu i prelaziti prag izvještavanja (vidjeti točke 7.1.1. i 7.1.6.) 7.1. Procjena odgovora na ispitivanje 7.1.1. Opći zahtjevi — Kada se koncentracije izračunavaju iz kalibracijske krivulje za TCDD, vrijednosti na gornjem kraju krivulje pokazuju velike varijacije (visok koeficijent varijacije (CV)). Radni raspon je raspon u kojem je CV manji od 15 %. Donji dio radnog raspona (prag izvještavanja) određuje se u mjeri najmanje tri puta većoj od postupka sa slijepim uzorcima. Gornji dio radnog raspona obično predstavlja vrijednost EC70 (70 % najveće učinkovite koncentracije), ali je niži ako je CV u tom rasponu veći od 15 %. Radni raspon se određuje tijekom validacije. Cut-off vrijednosti (vidjeti točku 7.3.) moraju biti potpuno unutar radnog raspona. — Standardne otopine i izolati uzoraka ispituju se trostrukom ili barem dvostrukom analizom. Kad se upotrebljavaju dvostruke analize, standardne otopine ili izolati kontrolnih uzoraka ispitani u četiri do šest udubina raspoređenih po pločici pokazuju odgovor ili koncentraciju (moguće samo u radnom rasponu) na temelju CV < 15 %. 7.1.2. Kalibracija 7.1.2.1. Kalibracija sa standardnom krivuljom — Količine u uzorcima procjenjuju se usporedbom odgovora na ispitivanje s kalibracijskom krivuljom TCDD (ili PCB 126 ili standardna mješavina PCDD/PCDF-ova/dioksinima sličnih PCB-ova) za izračun BEQ vrijednosti u izolatu i zatim u uzorku. — Kalibracijska krivulja sadrži 8 do 12 koncentracija (barem za dvostruku analizu) s dovoljno koncentracija u donjem dijelu krivulje (radni raspon). Posebnu pažnju treba obratiti na kvalitetu prilagodbe krivulje u radnom rasponu. Tako R2 vrijednost ima malu ili nikakvu korist u procjeni ispravnosti prilagodbe pri nelinearnoj regresiji. Bolja prilagodba postiže se smanjenjem razlike između izračunatih i primijećenih vrijednosti u radnom rasponu krivulje, npr. smanjenjem zbroja kvadrata rezidua. — Procijenjena vrijednost u izolatu uzorka zatim se korigira za vrijednost BEQ, izračunanu za slijepi uzorak matrice ili otapala (kako bi se uzele u obzir nečistoće iz upotrijebljenih otapala i kemikalija), i za očito iskorištenje (izračunano iz vrijednosti BEQ odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim uzorcima kongenera u području najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka). Za korekciju iskorištenja, očito iskorištenje je unutar zahtijevanog raspona (vidjeti točku 7.1.4.). Referentni uzorci koji se koriste za korekciju iskorištenja sukladni su zahtjevima iz točke 7.2. 7.1.2.2. Kalibracija s referentnim uzorcima Druga mogućnost jest da se upotrijebi kalibracijska krivulja pripremljena od barem četiri referentna uzorka (vidjeti točku 7.2.4.): jedna slijepa matrica te tri referentna uzorka s 0,5 puta, 1 puta i 2 puta većom vrijednosti od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka, zbog čega korekcija vrijednosti slijepih proba i iskorištenja više nije potrebna ako značajke matrice referentnih uzoraka odgovaraju onima nepoznatih uzoraka. U tom se slučaju odgovor na ispitivanje koji odgovara dvije trećine najveće dopuštene količine (vidjeti točku 7.3.) može izračunati neposredno iz tih uzoraka i upotrijebiti kao cut-off vrijednost. Za provjeru uzoraka koji prelaze pragove za pokretanje postupka, odgovarajući postotak tih pragova za pokretanje postupka koristi se kao cut-off vrijednost. 7.1.3. Odvojeno određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova Izolati se mogu podijeliti u frakcije koje sadržavaju PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove, omogućujući odvojeno iskazivanje vrijednosti TEQ za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove (u BEQ). Za procjenu rezultata za frakciju koja sadržava dioksinima slične PCB-ove po mogućnosti se koristi standardna kalibracijska krivulja PCB 126. 7.1.4. Očito iskorištenje pri biološkim testovima ‚Očito iskorištenje pri biološkim testovima’ izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim uzorcima kongenera u području oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka i izražava se kao postotak vrijednosti BEQ u usporedbi s vrijednošću TEQ. Ovisno o vrsti ispitivanja i upotrijebljenih TEF-ova (12), razlike između faktora TEF i REP za dioksinima slične PCB-ove mogu prouzročiti manje očito iskorištenje za dioksinima slične PCB-ove u usporedbi s PCDD/PCDF-ovima. Stoga, ako se provodi odvojeno određivanje PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova, očito iskorištenje pri biološkim testovima iznosi: za dioksinima slične PCB-ove 20 % do 60 %, za PCDD/PCDF-ove od 50 % do 130 % (rasponi vrijede za TCDD kalibracijsku krivulju). S obzirom na to da doprinos dioksinima sličnih PCB-ova zbroju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova može varirati kod različitih matrica i uzoraka, očito iskorištenje pri biološkim testovima za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova odražava te raspone koji iznose od 30 % do 130 %. Bilo koja implikacija bitno revidiranih vrijednosti TEF-a na zakonodavstvo Unije za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove zahtijeva reviziju tih raspona. 7.1.5. Kontrola iskorištenja pri čišćenju Gubitak spojeva tijekom čišćenja provjerava se tijekom validacije. Slijepa proba s dodatkom mješavine različitih kongenera podvrgava se čišćenju (najmanje n = 3), a iskorištenje i varijabilnost provjeravaju se potvrdnom metodom. Iskorištenje iznosi od 60 % do 120 % naročito za kongenere koji doprinose više od 10 % vrijednosti TEQ u različitim mješavinama. 7.1.6. Prag izvještavanja Za izvještavanje o vrijednostima BEQ prag izvještavanja određuje se na temelju odgovarajućih uzoraka matrica koji uključuju tipične uzorke kongenera, ali ne na temelju kalibracijske krivulje standarda zbog niske preciznosti u donjem rasponu krivulje. Učinci ekstrakcije i čišćenja moraju se uzeti u obzir. Prag izvještavanja određuje se u mjeri najmanje tri puta većoj od postupka sa slijepim uzorcima. 7.2. Korištenje referentnih uzoraka 7.2.1. Referentni uzorci predstavljaju uzorke matrica, uzorke kongenera i raspone koncentracija za PCDD/PCDF-ove i dioksinima slične PCB-ove oko najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. 7.2.2. Uz svaku seriju uzoraka koja se ispituje uključuje se jedna slijepa matrica ili, gdje to nije moguće, postupak sa slijepim uzorcima i jedan referentni uzorak s najvećom dopuštenom količinom ili na pragu za pokretanje postupka. Ti se uzorci ekstrahiraju i ispituju istodobno u istovjetnim uvjetima. Referentni uzorak pokazuje izrazito veći odgovor od slijepog uzorka, čime se osigurava primjerenost ispitivanja. Ti se uzorci mogu koristiti za korekciju slijepe probe i iskorištenja. 7.2.3. Referentni uzorci koji se odabiru za korekciju iskorištenja reprezentativni su za pokusne uzorke, što znači da uzorci kongenera ne uzrokuju preniske procjene vrijednosti. 7.2.4. Dodatnim referentnim uzorcima kojima su, npr., količine 0,5x i 2x veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka mogu se uključiti radi dokazivanja ispravnosti ispitivanja u rasponu propisanih količina za kontrolu najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. Ako se kombiniraju, ti se uzorci mogu koristiti za izračun vrijednosti BEQ u pokusnim uzorcima (vidjeti točku 7.1.2.2.). 7.3. Određivanje cut-off vrijednosti Utvrđuje se odnos između bioanalitičkih rezultata u BEQ-u i rezultata potvrdne metode u TEQ-u, npr. kalibracijskim pokusima u matrici, koji uključuju referentne uzorke s dodatkom 0, 0,5 puta, 1 puta i 2 puta najveće dopuštene količine sa šest ponavljanja na svakoj razini (n = 24). Faktori korekcije (slijepa proba i iskorištenje) mogu se procijeniti iz ovog odnosa, ali ih se mora provjeravati u skladu s točkom 7.2.2. Cut-off vrijednosti određuju se za donošenje odluka o sukladnosti uzorka s najvećim dopuštenim količinama ili za kontrolu pragova za pokretanje postupka, ako je relevantno, s obzirom na dotične najveće dopuštene količine ili prag za pokretanje postupka određene posebno za PCDD/PCDF-ove i za dioksinima slične PCB-ove ili za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. Prikazuje ih donja krajnja točka distribucije bioanalitičkih rezultata (korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje), što odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode na temelju 95 % razine pouzdanosti, što podrazumijeva da je udio lažno sukladnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %. Odlučujuća granica potvrdne metode najveća je dopuštena količina uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost. U praksi se cut-off vrijednost (u BEQ) može izračunati u skladu s jednim od pristupa navedenih u točkama 7.3.1., 7.3.2. i 7.3.3. (vidjeti sliku 1.). 7.3.1. Korištenje donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode pri čemu je: BEQDL BEQ koji odgovara odlučujućoj granici potvrdne metode, koja je najveća dopuštena količina uzimajući u obzir proširenu mjernu nesigurnost sy,x standardna devijacija rezidua t α,f = m – 2 student faktor (α = 5 %, f = stupnjevi slobode, jednostrani) m ukupan broj kalibracijskih točaka (indeks j) n broj ponavljanja na svakoj razini xi koncentracija uzorka (u TEQ) kalibracijske točke i određena potvrdnom metodom srednja vrijednost koncentracija (u TEQ) svih kalibriranih uzoraka parametar zbroja kvadrata, i = indeks za kalibracijsku točku i 7.3.2. Izračun iz bioanalitičkih rezultata (korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje) višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode, kao donja krajnja točka distribucije podataka pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti: Cut-off vrijednost = BEQDL – 1,64 × SDR pri čemu je: SDR standardna devijacija rezultata bioloških testova pri BEQDL, izmjereno u uvjetima unutarnje laboratorijske ponovljivosti. 7.3.3. Izračun kao srednja vrijednost bioanalitičkih rezultata (u BEQ, korigirano za vrijednost slijepe probe i za iskorištenje) iz višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na dvije trećine najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka, na temelju zapažanja da će se ta vrijednost kretati oko cut-off vrijednosti određene u točkama 7.3.1. ili 7.3.2.: Izračun cut-off vrijednosti na temelju 95 % razine pouzdanosti, što znači da je udio lažno sukladnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %: 1. iz donjeg raspona 95 % intervala predviđanja pri odlučujućoj granici potvrdne metode; 2. iz višestrukih analiza uzoraka (n ≥ 6) kontaminiranih na odlučujućoj granici potvrdne metode kao donja krajnja točka distribucije podataka (na slici prikazana s krivuljom u obliku zvona) pri odgovarajućoj srednjoj BEQ vrijednosti. Slika 1. 7.3.4. Ograničenja cut-off vrijednosti Cut-off vrijednosti na temelju BEQ, izračunane iz RSDR postignute tijekom validacije koristeći ograničen broj uzoraka s različitim uzorcima matrice/kongenera mogu biti veće od najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka na temelju TEQ zbog veće preciznosti od one rutinski dobivene kada je potrebno kontrolirati nepoznati spektar mogućih uzoraka kongenera. U takvim se slučajevima cut-off vrijednosti izračunavaju iz RSDR = 25 %, ili se daje prednost dvjema trećinama najveće dopuštene količine ili praga za pokretanje postupka. 7.4. Karakteristike izvedivosti 7.4.1. S obzirom na to da se u bioanalitičkim metodama ne mogu koristiti interni standardi, moraju se provoditi ispitivanja ponovljivosti bioanalitičkih metoda kako bi se dobili podaci o standardnoj devijaciji unutar i između serija ispitivanja. Ponovljivost mora biti manja od 20 %, a interna laboratorijska ponovljivost manja od 25 %. To se temelji na razinama izračunatima u BEQ nakon korekcije za vrijednost slijepe probe i za iskorištenja. 7.4.2. U postupku validacije mora se dokazati da se u ispitivanju pravi razlika između slijepe probe i razine na cut-off vrijednosti omogućujući identifikaciju uzoraka iznad odgovarajuće cut-off vrijednosti (vidjeti točku 7.1.2.). 7.4.3. Moraju se utvrditi ciljni spojevi, moguće interferencije i najveće prihvatljive količine za slijepe probe. 7.4.4. Postotak standardne devijacije u odgovoru ili koncentraciji izračunan iz odgovora (moguće samo u radnom rasponu) pri trostrukom određivanju izolata uzorka ne smije biti iznad 15 %. 7.4.5. Nekorigirani rezultati referentnih uzoraka izraženi u BEQ (vrijednost slijepe probe i pri najvećoj dopuštenoj količini ili pragu za pokretanje postupka) koriste se za ocjenu izvedivosti bioanalitičke metode kroz kontinuirano vremensko razdoblje. 7.4.6. Dijagrami kontrole kvalitete za postupke sa slijepim uzorcima i svaka vrsta referentnog uzorka bilježe se i provjeravaju kako bi se osiguralo da je izvedivost analiza u skladu sa zahtjevima, a posebno za postupak sa slijepim uzorcima u pogledu zahtijevane najmanje razlike do donjeg dijela radnog raspona i za referentne uzorke u pogledu unutarlaboratorijske obnovljivosti. Postupke sa slijepim uzorcima potrebno je kontrolirati tako da se izbjegnu lažno sukladni rezultati kada se oduzimaju. 7.4.7. Rezultati analiza potvrdnim metodama sumnjivih uzoraka i 2 do 10 % sukladnih uzoraka (najmanje 20 uzoraka po matrici) prikupljaju se i koriste za procjenu izvedivosti orijentacijske metode i odnosa između BEQ-a i TEQ-a. Ova baza podataka može se koristiti za ponovljenu evaluaciju cut-off vrijednosti koje se primjenjuju na rutinske uzorke za validirane matrice. 7.4.8. Uspješna izvedivost metode može se dokazati i prstenastim probama. Rezultati uzoraka analiziranih prstenastim probama koje obuhvaćaju raspon koncentracija do npr. 2 puta najveće dopuštene količine mogu biti uključeni u procjenu učestalosti lažno sukladnih rezultata ako laboratorij može dokazati uspješnu izvedivost. Uzorci moraju uključivati najčešće uzorke kongenera koji predstavljaju različite izvore. 7.4.9. Tijekom incidenata se mogu ponovo procijeniti cut-off vrijednosti uzimajući u obzir posebne uzorke matrica i kongenera koji se pojavljuju u tom incidentu. 8. Izvještavanje o rezultatima 8.1. Potvrdne metode 8.1.1. Analitički rezultati moraju sadržavati količine pojedinačnih PCDD/PCDF-ova i kongenera dioksinima sličnih PCB-ova, a o TEQ vrijednostima se izvještava kao o donjima, gornjima ili srednjima kako bi se u izvješće uključilo što više podataka o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata prema posebnim zahtjevima. 8.1.2. U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. 8.1.3. Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena ako su izvan raspona navedenog u točki 6.2.5., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize) te u drugim slučajevima na zahtjev. 8.1.4. S obzirom na to da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odluci o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/– U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %. U slučaju kada se PCDD/PCDF-ovi i dioksinima slični PCB-ovi određuju odvojeno, tada se zbroj procijenjene proširene nesigurnosti za pojedinačne analitičke rezultate PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova koristi za zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. 8.1.5. Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ. 8.2. Bioanalitičke orijentacijske metode 8.2.1. Rezultat orijentacijske metode izražava se kao ‚sukladan’ ili se za njega ‚sumnja da je nesukladan’ (‚sumnjiv’). 8.2.2. Osim toga, okvirni rezultat za PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB-ove može se izraziti u BEQ, a ne TEQ. 8.2.3. Za uzorke s odgovorom ispod granice izvještavanja navodi se da su ‚ispod granice izvještavanja’. Za uzorke s odgovorom iznad radnog raspona navodi se da ‚prelaze radni raspon’ i odgovarajuća količina do gornjeg dijela radnog raspona navodi se u BEQ. 8.2.4. Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji. 8.2.5. U izvješću se mora navesti vrsta ispitivanja koje se koristi, osnovno načelo ispitivanja i vrsta kalibracije. 8.2.6. U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. 8.2.7. U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom. 8.2.8. Nesukladni rezultati navode se samo iz potvrdne analize. 8.3. Fizikalno-kemijske orijentacijske metode 8.3.1. Rezultat orijentacijske metode izražava se kao ‚sukladan’ ili se za njega ‚sumnja da je nesukladan’ (‚sumnjiv’). 8.3.2. Za svaku vrstu uzorka matrice u izvješću se mora navesti najveća dopuštena količina ili prag za pokretanje postupka na kojima se procjena temelji. 8.3.3. Osim toga mogu se navesti količine za pojedine PCDD/PCDF-ove i/ili dioksinima slične PCB kongenere te TEQ vrijednosti izražene kao donje, gornje i srednje. Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ. 8.3.4. Iskorištenja pojedinih internih standarda moraju biti navedena ako su izvan raspona navedenog u točki 6.2.5., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najveće dopuštene količine (u tom slučaju iskorištenja za jednu ili dvije dvostruke analize) te u drugim slučajevima na zahtjev. 8.3.5. U izvješću se navodi primijenjena GC-MS metoda. 8.3.6. U izvješće je potrebno uključiti metodu koja se koristi za ekstrakciju PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova. 8.3.7. U slučaju uzoraka za koje se sumnja da nisu sukladni, izvješće treba uključivati napomenu o postupku koji treba poduzeti. Koncentracija PCDD/PCDF-ova i zbroj PCDD/PCDF-ova i dioksinima sličnih PCB-ova u tim uzorcima s povišenim razinama mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom. 8.3.8. O nesukladnosti se može odlučiti samo nakon potvrdne analize. POGLAVLJE III. Priprema uzorka i zahtjevi za metode analize koje se koriste za službenu kontrolu količina PCB-ova koji nisu slični dioksinima u hrani za životinje 1. Područje primjene Zahtjevi iz ovog poglavlja primjenjuju se kad se hrana za životinje analizira za službenu kontrolu količina PCB-ova koji nisu slični dioksinima i u pogledu pripreme uzoraka i analitičkih zahtjeva za druge regulatorne svrhe, uključujući kontrole koje provodi subjekt u poslovanju s hranom za životinje za osiguranje sukladnosti s odredbama Uredbe (EZ) br. 183/2005. 2. Metode detekcije koje se koriste Plinska kromatografija/detektor hvatanja elektrona (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS ili istovjetne metode. 3. Identifikacija i potvrđivanje predmetnih analita 3.1. Relativno retencijsko vrijeme u odnosu na interne standarde ili referentne standarde (prihvaćena devijacija od +/– 0,25 %). 3.2. Plinsko kromatografsko odvajanje PCB-ova koji nisu slični dioksinima od interferirajućih tvari, posebno ko-eluiranih PCB-ova, a posebno ako su uzorci u rasponu zakonski dozvoljenih granica i nesukladnost se mora potvrditi (13). 3.3. Zahtjevi za tehnike GC-MS Praćenje najmanje sljedećeg broja molekularnih iona ili karakterističnih iona iz molekularnog klastera: (a) dva specifična iona za HRMS; (b) tri specifična iona za LRMS; (c) dva specifična prekursor iona, svakog s jednim posebnim odgovarajućim prijelaznim ionom produkta za MS-MS. Najveća dozvoljena odstupanja za omjere brojnosti odabranih masenih fragmenata: Relativna devijacija intenziteta omjera brojnosti odabranih masenih fragmenata u odnosu na teoretsku brojnost ili kalibracijski standard za ciljni ion (praćeni ion s najvećom brojnosti) i kvalifikacijskih iona: ± 15 % 3.4. Zahtjevi za tehnike GC-ECD Potvrda rezultata koji prelaze najveću dopuštenu količinu s dva stupca GC sa stacionarnim fazama različitog polariteta. 4. Prikazivanje izvođenja metode Izvođenje metode validira se u rasponu najveće dopuštene količine (0,5 do 2 puta više od najveće dopuštene količine) s prihvatljivim koeficijentom varijacije za ponovljene analize (vidjeti zahtjeve za srednju preciznost u točki 9.). 5. Granica kvantifikacije Zbroj LOQ-ova (14) PCB-ova koji nisu slični dioksinima ne smije biti veći od jedne trećine najveće dopuštene količine (15). 6. Kontrola kvalitete Redovite slijepe probe, analize uzoraka s dodatkom, analize uzoraka za kontrolu kvalitete, sudjelovanje u međulaboratorijskim studijama relevantnih matrica. 7. Kontrola iskorištenja 7.1. Korištenje primjerenih internih standarda s fizikalno-kemijskim svojstvima koji odgovaraju predmetnim analitima. 7.2. Dodavanje internih standarda: Dodavanje proizvodima (prije ekstrakcije i postupka čišćenja). 7.3. Zahtjevi za metode u kojima se koristi svih šest izotopski označenih kongenera PCB-ova koji nisu slični dioksinima (a) korekcija rezultata za iskorištenje unutarnjih standarda; (b) iskorištenje izotopski označenih unutarnjih standarda je između 60 i 120 %; (c) prihvatljivo je manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere s doprinosom manjim od 10 % zbroju PCB-ova koji nisu slični dioksinima. 7.4. Zahtjevi za metode u kojima se ne koristi svih šest izotopski označenih internih standarda ili se koriste drugi interni standardi: (a) kontrola iskorištenja unutarnjih standarda za svaki uzorak; (b) iskorištenje unutarnjih standarda između 60 i 120 %; (c) korekcija rezultata u pogledu iskorištenja unutarnjih standarda. 7.5. Iskorištenje neoznačenih kongenera provjerava se analizom uzoraka s dodatkom ili kontrolnih uzoraka s koncentracijama u rasponu najveće dopuštene količine. Prihvatljivo iskorištenje za te je kongenere između 60 i 120 %. 8. Zahtjevi za laboratorije U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditiraju priznata tijela koja rade u skladu sa smjernicom ISO 58 kako bi se osiguralo da primjenjuju analitičko osiguranje kvalitete. Laboratoriji se akreditiraju prema normi EN ISO/IEC 17025. Osim toga, načela opisana u tehničkim smjernicama za procjenu mjerne nesigurnosti i granica kvantifikacije za analizu PCB-ova poštuju se ako su primjenjiva (16). 9. Karakteristike izvedivosti: kriteriji za zbroj PCB-ova koji nisu slični dioksinima pri najvećoj dopuštenoj količini Razrjeđivanje izotopa – masena spektrometrija (17) Ostale tehnike Istinitost – 20 do + 20 % – 30 do + 30 % Srednja preciznost (RSD %) ≤ 15 % ≤ 20 % Razlika između izračuna gornje i donje granice ≤ 20 % ≤ 20 % 10. Izvještavanje o rezultatima 10.1. Analitički rezultati sadržavaju količine pojedinačnih PCB-ova koji nisu slični dioksinima i zbroj kongenera PCB-ova koji se navode kao donji, gornji ili srednji kako bi se u izvješće uključilo što više informacija o rezultatima i na taj način omogućilo tumačenje rezultata u skladu s posebnim zahtjevima. 10.2. Izvješće obuhvaća metodu koja se koristi za ekstrakciju PCB-ova. 10.3. Iskorištenja pojedinih internih standarda navode se u slučaju da su izvan raspona navedenog u točki 7., u slučaju da je dobiveni rezultat veći od najvećih dopuštenih količina te u drugim slučajevima na zahtjev. 10.4. S obzirom na to da proširenu mjernu nesigurnost treba uzeti u obzir pri odlučivanju o sukladnosti uzorka, potrebno je navesti i taj parametar. Stoga se analitički rezultati prikazuju kao x +/– U, pri čemu je x analitički rezultat, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor pokrivanja 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od približno 95 %. 10.5. Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i zaokružuju se barem na isti broj bitnih decimalnih mjesta kao najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.”

(1) Tablica faktora ekvivalentne toksičnosti (TEF) za PCDD-ove, PCDF-ove i PCB-ove slične dioksinima: WHO-TEF-ovi za procjenu rizika za zdravlje ljudi na temelju zaključaka sa stručnog zasjedanja Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) – Međunarodni program za sigurnost kemikalija (IPCS) održanog u Ženevi u lipnju 2005. (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241. (2006.)).

Kongener Vrijednost TEF-a Kongener Vrijednost TEF-a Dibenzo-p-dioksini (‚PCDD-ovi’) i dibenzo-p-furani (‚PCDF-ovi’) ‚Dioksinima slični’ PCB-ovi Ne-orto PCB-ovi + mono-orto PCB-ovi 2,3,7,8-TCDD 1 1,2,3,7,8-PeCDD 1 Ne-orto PCB-ovi 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,1 PCB 77 0,0001 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,1 PCB 81 0,0003 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,1 PCB 126 0,1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,01 PCB 169 0,03 OCDD 0,0003 Mono-orto PCB-ovi 2,3,7,8-TCDF 0,1 PCB 105 0,00003 1,2,3,7,8-PeCDF 0,03 PCB 114 0,00003 2,3,4,7,8-PeCDF 0,3 PCB 118 0,00003 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 PCB 123 0,00003 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 156 0,00003 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 PCB 157 0,00003 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 167 0,00003 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 PCB 189 0,00003 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 OCDF 0,0003

Upotrijebljene kratice: ‚T’ = tetra; ‚Pe’ = penta; ‚Hx’ = heksa; ‚Hp’ = hepta; ‚O’ = okta; ‚CDD’ = klordibenzodioksin; ‚CDF’ = klordibenzofuran; ‚CB’ = klorbifenil.

(2) Odluka Komisije 2002/657/EZ od 14. kolovoza 2002. o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata (SL L 221, 17.8.2002., str. 8.).

(3) Načela opisana u smjernicama ‚Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry’ (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) poštuju se ako su primjenjiva.

(4) Pojam ‚gornji’ zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera. Pojam ‚donji’ zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera. Pojam ‚srednji’ zahtijeva primjenu polovine granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera.

(5) Dvostruka analiza: odvojena analiza predmetnih analita upotrebom drugog alikvota istog homogeniziranog uzorka. Općenito, primjenjuju se zahtjevi za dvostruku analizu iz Priloga II. poglavlja C točke 3. Međutim, za metode u kojima se upotrebljava 13C-obilježeni unutarnji standard za odgovarajuće analite dvostruka analiza potrebna je samo ako rezultat prvog određivanja nije sukladan. Dvostruka analiza potrebna je kako bi se isključila mogućnost unutarnje uzajamne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Ako se analiza izvodi tijekom incidenta kontaminacije, potvrđivanje dvostrukom analizom može se izostaviti u slučaju da su uzorci koji su odabrani za analizu sljedivošću povezani s incidentom kontaminacije i otkrivena je količina znatno veća od najveće dopuštene količine.

(6) Pojam ‚gornji’ zahtijeva primjenu granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ). Pojam ‚donji’ zahtijeva primjenu nule za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ). Pojam ‚srednji’ zahtijeva primjenu polovine granice kvantifikacije za izračun doprinosa svakog pojedinačnog nekvantificiranog kongenera ekvivalentu toksičnosti (TEQ).

(7) Općenito, primjenjuju se zahtjevi za dvostruku analizu iz Priloga II. poglavlja C točke 2. Međutim, za potvrdne metode u kojima se upotrebljava 13C-obilježeni unutarnji standard za odgovarajuće analite dvostruka analiza potrebna je samo ako rezultat prvog određivanja nije sukladan. Dvostruka analiza potrebna je kako bi se isključila mogućnost unutarnje uzajamne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Ako se analiza izvodi tijekom incidenta kontaminacije, potvrđivanje dvostrukom analizom može se izostaviti u slučaju da su uzorci koji su odabrani za analizu sljedivošću povezani s incidentom kontaminacije i otkrivena je količina znatno veća od najveće dopuštene količine.

(8) Jednako obrazloženje i zahtjevi za dvostruku analizu za kontrolu pragova za pokretanje postupka kao u bilješci 2. za najveće dopuštene količine.

(9) Uredba (EZ) br. 183/2005 Europskog parlamenta i Vijeća od 12. siječnja 2005. o utvrđivanju zahtjeva u pogledu higijene hrane za životinje (SL L 35, 8.2.2005., str. 1.).

(10) Bioanalitičke metode nisu specifične za te kongenere koji su uključeni u sustav TEF. U izolatu uzorka mogu biti prisutni i drugi strukturno povezani spojevi koji se vežu na receptor aromatskih ugljikovodika (AhR), što pridonosi općem odgovoru. Stoga bioanalitički rezultati nisu procjena, već više pokazatelj vrijednosti TEQ u uzorku.

(11) ‚Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry’ (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), ‚Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food’ (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

(*1) U odnosu na najveće dopuštene količine.

(12) Trenutačni zahtjevi temelje se na TEF-ovima objavljenima u: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241. (2006.).

(13) Kongeneri za koje je često ustanovljeno da ko-eluiraju su npr. PCB 28/31, PCB 52/69 i PCB 138/163/164. Za GC-MS uzimaju se u obzir i moguće interferencije fragmenata viših kloriranih kongenera.

(14) Načela opisana u smjernicama ‚Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food’ (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) poštuju se ako su primjenjiva.

(15) Izrazito se preporučuje niži doprinos razine reagensa u slijepoj probi od razine kontaminanta u uzorku. Laboratorij je odgovoran kontrolirati varijaciju razina vrijednosti slijepih proba, posebno ako su te vrijednosti oduzete.

(16) Trenutačni zahtjevi temelje se na TEF-ovima objavljenima u: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241. (2006.).

(17) Korištenje svih šest 13C-označenih analoga prema zahtjevima internih standarda.