HR Službeni list Europske unije 191

32000D0428



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 04.07.2000.

ODLUKA KOMISIJE

od 4. srpnja 2000.

o utvrđivanju dijagnostičkog postupka, metoda uzimanja uzoraka i kriterija za procjenu rezultata laboratorijskih ispitivanja za potvrđivanje i diferencijalno dijagnosticiranje vezikularne enterovirusne bolesti svinja

(priopćena pod brojem dokumenta C(2000) 1805)

(Tekst značajan za EGP)

(2000/428/EZ)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 92/119/EEZ od 17. prosinca 1992. o uvođenju općih mjera Zajednice za kontrolu određenih bolesti životinja i posebnih mjera koje se odnose na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja (1), kako je zadnje izmijenjena Aktom o pristupanju Austrije, Finske i Švedske, a posebno njezin Prilog II. stavak 3.,

budući da:

(1) Potrebno je na razini Zajednice utvrditi dijagnostički postupak, metode uzimanja uzoraka i kriterije za procjenu rezultata laboratorijskih ispitivanja za potvrđivanje vezikularne enterovirusne bolesti svinja, kao i za brzo diferenciranje te bolesti od slinavke i šapa, kako bi se osigurala bolja kontrola tih dviju bolesti.

(2) U Prilogu III. Direktivi Vijeća 92/119/EEZ utvrđuju se zadaće i dužnosti referentnog laboratorija Zajednice za vezikularnu enterovirusnu bolest svinja, kako bi se uz savjetovanje s Komisijom koordinirale metode koje se primjenjuju u državama članicama za dijagnosticiranje bolesti; te dužnosti i zadaće uključuju organizaciju periodičnih usporednih ispitivanja i opskrbu standardnim reagensima na razini Zajednice.

(3) Nedavno su razvijene laboratorijske pretrage kako bi se osiguralo brzo dijagnosticiranje vezikularne enterovirusne bolesti svinja i njezino razlikovanje od slinavke i šapa.

(4) Iz rezultata najnovijih usporednih ispitivanja provedenih na razini Zajednice može se posebno zaključiti da su razvijeni pouzdani testovi kojima se otkriva antigen ili genom virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja, te da ti testovi mogu uspješno dopuniti test izoliranja virusa za virološko dijagnosticiranje vezikularne enterovirusne bolesti svinja.

(5) Iskustva stečena nadzorom vezikularne enterovirusne bolesti svinja posljednjih godina rezultirala su utvrđivanjem najprikladnijih postupaka uzimanja uzoraka i kriterija za procjenu rezultata laboratorijskih ispitivanja za pravilno dijagnosticiranje te bolesti u različitim situacijama.

(6) Mišljenje i preporuke Znanstvenog odbora za zdravlje i dobrobit životinja o vezikularnoj enterovirusnoj bolesti svinja uzeti su u obzir.

(7) Mjere predviđene u ovoj Odluci u skladu su s mišljenjem Stalnog veterinarskog odbora,

DONIJELA JE OVU ODLUKU:

Članak 1.

1. Države članice osiguravaju da se potvrđivanje vezikularne enterovirusne bolesti svinja i diferencijalno dijagnosticiranje slinavke i šapa temelji na:

(a) utvrđivanju kliničkih znakova bolesti;

(b) dokazivanju virusa, antigena ili genoma u uzorcima epitelnog tkiva, vezikularne tekućine ili fecesa;

(c) utvrđivanju reakcije specifičnih protutijela u uzorcima seruma,

u skladu s postupcima, metodama uzimanja uzoraka i kriterijima za procjenu rezultata laboratorijskih testova utvrđenim u Priručniku koji je priložen ovoj Odluci.

2. Međutim, nacionalni dijagnostički laboratoriji navedeni u Prilogu II. dijelu 5. Direktivi 92/119/EEZ mogu primijeniti i prilagođene laboratorijske testove navedene u Priručniku koji je priložen ovoj Odluci ili koristiti druge testove pod uvjetom da oni osiguravaju istu osjetljivost i specifičnost.

Osjetljivost i specifičnost tih prilagođenih ili drugih testova mora se procijeniti u okviru redovitih usporednih testova koje organizira referentni laboratorij Zajednice za vezikularnu enterovirusnu bolest svinja.

Članak 2.

Ova se Odluka primjenjuje od 1. listopada 2000.

Članak 3.

Ova je Odluka upućena državama članicama.

Sastavljeno u Bruxellesu 4. srpnja 2000. Za Komisiju David BYRNE Član Komisije

(1) SL L 62, 15.3.1993., str. 69.

PRILOG

PRIRUČNIK DIJAGNOSTIČKIH POSTUPAKA, METODA UZIMANJA UZORAKA I KRITERIJA ZA PROCJENU REZULTATA LABORATORIJSKIH TESTOVA ZA POTVRĐIVANJE I DIFERENCIJALNO DIJAGNOSTICIRANJE VEZIKULARNE ENTEROVIRUSNE BOLESTI SVINJA

POGLAVLJE I.

Uvod, ciljevi i definicije

1. Ovaj Priručnik:

(a) utvrđuje smjernice i minimalne zahtjeve dijagnostičkog postupka, metode uzimanja uzoraka i kriterije procjene rezultata laboratorijskih testova za pravilno dijagnosticiranje vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Međutim, posebna se važnost također posvećuje diferencijalnom dijagnosticiranju za razgraničenje od slinavke i šapa;

(b) obuhvaća odredbe Priloga II. Direktivi 92/119/EEZ, a posebno stavaka 4., 7. i 8. navedenog Priloga;

(c) namijenjen je uglavnom nadležnim tijelima odgovornim za kontrolu vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Stoga je naglasak na načelima i primjenama laboratorijskih testova i procjeni njihovih rezultata, a ne na detaljnim laboratorijskim tehnikama.

2. Za potrebe ovog Priručnika primjenjuju se sljedeće definicije:

(a) „serološki pozitivna svinja” znači svinja u čijem je serumu virus neutralizacijskim testom, koji se primjenjuje u nacionalnom laboratoriju, utvrđen titar specifičnih protutijela jednak ili veći od referentnog seruma 4 vezikularne enterovirusne bolesti svinja, navedenog u poglavlju X.;

(b) „nespecifični reaktor” znači bilo koja pojedinačna serološki pozitivna svinja na gospodarstvu, kod koje je serološki test na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja polučio pozitivan rezultat, a za koju se zna da nije bila u dodiru s virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, niti ima dokaza da je s nje zaraza prenesena na druge svinje s kojima je bila u kontaktu. Serološki pozitivna svinja potvrđuje se kao nespecifični reaktor, ako su ispunjeni uvjeti navedeni u poglavlju VIII. dijelu C;

(c) „svinje u kontaktu” znači svinje koje su izravno u kontaktu, ili su bile u izravnom kontaktu tijekom posljednjih 28 dana, s jednom ili više serološki pozitivnih svinja ili s jednom ili više svinja za koje se sumnja da su zaražene virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Svinje u kontaktu mogu biti, ili su mogle biti u istom boksu ili u susjednim boksovima, ako postoji mogućnost izravnog kontakta svinja između boksova.

POGLAVLJE II.

Smjernice za preglede svinja koje pokazuju kliničke znakove vezikularne enterovirusne bolesti svinja

1. Države članice osiguravaju da službeni veterinar pri sumnji na prisutnost vezikularne enterovirusne bolesti svinja na gospodarstvu, što je prije moguće, pregleda statistički značajan broj svinja, kako bi se otkrili klinički znakovi bolesti navedeni u poglavlju IX.

2. Države članice osiguravaju da se u slučaju kad svinje pokazuju kliničke znakove koji ukazuju na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja ili slinavku i šap provede, što je prije moguće, odgovarajuće uzorkovanje i laboratorijske pretrage u svrhu diferencijalnog dijagnosticiranja, u skladu s odredbama navedenim u poglavljima IV., VII. i VIII. ovog Priručnika.

POGLAVLJE III.

Opći postupci uzorkovanja i prijevoza uzoraka

1. Bilo koja osoba koja ulazi ili izlazi sa svinjogojskoga gospodarstva za koje se sumnja da na je njemu prisutna vezikularna enterovirusna bolest svinja, mora se pridržavati najstrožih higijenskih mjera potrebnih da se smanji opasnost od kontaminacije ili širenje virusa.

2. Sve svinje od kojih se uzimaju uzorci moraju biti označene tako da se uvijek mogu identificirati u slučaju ponovnog uzimanja uzoraka. Preporuča se da se zabilježi lokacija svake svinje na gospodarstvu od koje je uzet uzorak, kao i jedinstvena identifikacijska oznaka, posebno ako je uzorak uzet od svinje sumnjive na bolest.

3. Uzorci se moraju dostaviti u laboratorij popraćeni odgovarajućim obrascima, koji uključuju pojedinosti o povijesti bolesti svinja od kojih su uzeti uzorci kao i uočeni klinički znakovi, ako postoje.

4. Budući da svaka pojava vezikula kod svinja može biti i slinavka i šap, moraju se poduzeti posebne mjere sigurnosti pri pakiranju uzoraka za koje postoji sumnja na zarazu. Te su mjere uglavnom namijenjene sprečavanju loma ili prolijevanja posuda i opasnosti od zaraze, ali također moraju osigurati da uzorci stignu u zadovoljavajućem stanju. Ako se za pakiranje koristi led, mora se spriječiti prolijevanje vode. Posude s uzorcima za koje se sumnja da sadrže virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja ne smiju se otvarati nakon napuštanja zaraženih prostora i dok ne stignu u laboratorij.

5. Uzorci za koje se sumnja da sadrže virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja mogu biti analizirani samo u laboratoriju ovlaštenom za izdvajanje virusa slinavke i šapa u dijagnostičke svrhe, u skladu sa zakonodavstvom Zajednice o kontroli bolesti slinavke i šapa, osim ako slinavka i šap već nisu isključeni.

6. Svi se uzorci mogu prenositi na 4 °C, ako je očekivano vrijeme prijevoza do laboratorija kraće od 48 sati, u protivnom se moraju pohraniti na temperaturi ne višoj od -20 °C.

7. Za uzorke koji se upućuju u referentni laboratorij Zajednice, iz svih država članica osim Ujedinjene Kraljevine, jedina dozvoljena metoda prijevoza je zrakoplovom do zračnih luka London (Heathrow) ili London (Gatwick). Prije slanja pošiljke laboratorij se mora obavijestiti faksom ((44-1483) 23 26 21) ili elektroničkom poštom o pojedinostima leta, datumu, očekivanom vremenu dolaska i broju tovarnog lista u zračnom prometu, tako da se pošiljka može pronaći po dolasku. Pošiljka se mora uputiti na:

Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Community Reference Laboratory for swine vesicular disease, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF United Kingdom, UK

Sljedeće informacije moraju se navesti na etiketi: „Patološki materijal životinjskog podrijetla bez komercijalne vrijednosti. Pokvarljivo. Lomljivo. Primatelj preuzima u zrakoplovnoj luci. Ne smije se otvarati izvan laboratorija.”

Osoblje referentnog laboratorija Zajednice ovlašteno je za preuzimanje pošiljke u zrakoplovnoj luci prema posebnoj općoj uvoznoj dozvoli koju u tu svrhu izdaje Ministarstvo poljoprivrede, hrane i ribarstva Ujedinjene Kraljevine. To je ustaljeni postupak i posebna dozvola nije potrebna za svaki pojedini slučaj uvoza. Zabranjen je prijenos u Ujedinjenu Kraljevinu uzoraka za koje se sumnja da sadrže vezikularni virus u ručnoj prtljazi od strane neovlaštenog osoblja. Ne smiju se koristiti dostavne kurirske službe.

8. Prijevoz uzoraka u nacionalne laboratorije mora se provesti u skladu s uputama nadležnih tijela država članica.

POGLAVLJE IV.

Postupci uzorkovanja na gospodarstvu s klinički sumnjivim svinjama

1. Kad se na temelju uočenih kliničkih znakova bolesti posumnja na prisutnost virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja na gospodarstvu, moraju se prikupiti odgovarajući uzorci od reprezentativne skupine svinja koja pokazuje te znakove kako bi se potvrdila bolest i diferencijalnim dijagnosticiranjem isključila slinavka i šap.

2. Na tim gospodarstvima za postavljanje dijagnoze najprimjereniji uzorci su epitelno tkivo i vezikularna tekućina iz neprobušenih ili netom probušenih vezikula uzetih od svinja koje pokazuju tipične znakove bolesti, u kojima se može utvrditi virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja, njegova antitijela ili genom. Preporučuje se uzimanje uzoraka od pet ili šest takvih svinja.

3. Čak kad su svježe epitelno tkivo i vezikularna tekućina na raspolaganju u dovoljnoj količini (1 g ili više), moraju se također uzeti sljedeći uzorci:

(a) uzorci krvi svinja za koje se sumnja da su zaražene, kao i svinja koje su bile u kontaktu, za serološko testiranje; i

(b) uzorci fecesa svinja za koje se sumnja da su zaražene, kao i uzorci s poda njihovih boksova i susjednih boksova za virološko testiranje.

4. Uzorci se moraju prikupljati i prevoziti u skladu sa sljedećim postupcima:

(a) za uzorke epitelnog tkiva i vezikularne tekućine: — ako je moguće mora se uzeti najmanje 1 g epitelnog tkiva iz neprobušene ili netom probušene vezikule. Preporuča se da se radi zaštite životinja i izbjegavanja povreda osoblja, prije uzimanja uzoraka svinjama da umirujuće sredstvo, — ako se uzorci odmah prevoze u nacionalni laboratorij (manje od tri sata), uzorci epitelnog tkiva mogu se prevoziti suhi i u hladnjaku. Međutim, ako je vjerojatno da će prijevoz trajati više od tri sata, uzorci se moraju staviti u malu količinu transportnog medija koji sadrži jednake dijelove glicerola i 0,04 M fosfatnog pufera ili drugog odgovarajućeg pufera (npr. Hepes), kako bi se pH vrijednost održala na optimalnoj razini za preživljavanje virusa slinavke i šapa (pH od 7,2 do 7,6). Transportni medij mora sadržavati antibiotike za dodatno antimikrobno djelovanje. Pogodni antibiotici i njihova krajnja koncentracija na ml su: i. penicilin 1 000 IJ, ii. neomicin sulfat 100 IJ, iii. polimiksin B sulfat 50 IJ, iv. mikostatin 100 IJ, — ako je moguće vezikularnu tekućinu uzeti iz neprobušene vezikule, ona se mora pohraniti nerazrijeđena u posebnim spremnicima;

(b) za uzorke krvi: — uzorci krvi se mogu uzeti za serološka ili virološka ispitivanja. Međutim, za utvrđivanje prisutnosti protutijela u pravilu se prikupljaju uzorci samo od svinja za koje se sumnja da su preboljele kliničku ili subkliničku infekciju, jer su epitelno tkivo, vezikularna tekućina i uzorci fecesa svinja koje pokazuju kliničke znakove bolesti pogodnije za otkrivanje virusa od uzoraka krvi. Preporučuje se da se uzimaju uzorci pune krvi uz uporabu vakuumskih epruveta bez antikoagulansa te da se vakuumske epruvete ne otvaraju za vrijeme prijevoza;

(c) za uzorke fecesa: — uzorci fecesa s poda prostorija, za koje se sumnja da u njima borave ili da su u njima boravile svinje zaražene vezikularnom enterovirusnom bolesti svinja, ili brisovi fecesa i uzorci fecesa živih svinja za koje se sumnja da su zaražene, moraju se staviti u čvrste, nepropusne spremnike.

Spremnici s uzorcima za koje se sumnja da su zaraženi virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja moraju se prije prijevoza u laboratorij izvana dezinficirati. Odgovarajući dezinficijensi su:

— natrijev hidroksid (razrijeđen u omjeru 1:100),

— formalin (u omjeru 1:9 razrijeđena otopina formalina koja sadrži najmanje 34 % formaldehida), i

— natrijev hipoklorit (2 % raspoloživog klora).

Navedenim dezinficijensima mora se oprezno rukovati.

POGLAVLJE V.

Postupci uzorkovanja za serološko nadziranje vezikularne enterovirusne bolesti svinja

1. Kad se serološka kontrola provodi u sljedeće svrhe:

(a) za nadziranje na gospodarstvima na kojima nema dokaza ili sumnje da bi bolest mogla biti prisutna;

(b) za nadziranje u klaonicama, stočnim sajmovima, sabirnim centrima ili sličnim mjestima rutinskim uzimanjem uzoraka za serološko pretraživanje;

(c) nediskriminirajućeg nadziranja svinja podrijetlom iz drugih država članica na gospodarstvu na koje su uvezene,

uzorci krvi za serološko testiranje moraju se uzimati od svinja u skladu s odredbama utvrđenim u programima ili planovima za praćenje ili iskorjenjivanje odobrenih u okviru Odluke 90/424/EEZ (1) ili Direktive 90/425/EEZ (2), ili, u nedostatku takvih odredaba, u skladu s postupkom koji su utvrdila nadležna tijela država članica.

2. Kad se serološko nadziranje provodi u sljedeće svrhe:

(a) za nadziranje gospodarstava smještenih unutar zaraženih i ugroženih područja, koje su određene nakon potvrde izbijanja bolesti u skladu s Prilogom II. točkama 7. i 8. Direktivi 92/119/EEZ; ili

(b) za nadziranje gospodarstava navedenih u članku 9. Direktive Vijeća 92/119/EEZ,

uzorci krvi za serološko testiranje moraju se uzimati od svinja u skladu sa sljedećim:

— u slučaju gospodarstava koja se bave uzgojem za rasplod, postupak nasumičnog uzimanja uzoraka mora se provoditi na način koji osigurava otkrivanje 5 % prevalencije serokonverzije sa 95 % sigurnošću;

— u slučaju gospodarstava koja drže svinje samo za tov, postupak uzimanja uzoraka mora osigurati da je ukupan broj uzetih uzoraka barem jednak broju koji je potreban da se otkrije prevalencija od 5 % sa 95 % sigurnošću. U svakom slučaju uzorci se moraju uzeti iz što je više moguće nasumično odabranih boksova;

— u slučaju miješanih gospodarstava koja se bave uzgojem za rasplod i tovom, od svake skupine svinja koje žive u odvojenim prostorima mora se uzeti toliko uzoraka koliko je potrebno da se otkrije 5 % prevalencija serokonverzije sa 95 % sigurnošću.

POGLAVLJE VI.

Daljnje aktivnosti i postupci ponovnog uzimanja uzoraka u slučaju otkrivanja seropozitivnih svinja

1. Ako se na gospodarstvu, provodeći nadziranje navedeno u poglavlju V. točki 1.(a) ili poglavlju V. točki 2., otkrije samo jedna seropozitivna svinja, nadležno tijelo mora osigurati da se:

(a) ako već nisu primijenjene, na gospodarstvu provedu mjere iz članka 4. Direktive Vijeća 92/119/EEZ;

(b) na gospodarstvu provede pregled u skladu s odredbama navedenim u poglavlju II. dijelu 1.;

(c) uzmu uzorci krvi za serološko testiranje od: — sumnjive svinje, — svinja koje su bile u kontaktu, a koje žive u istom ili susjednim boksovima; od tih svinja uzorci se uzimaju tako da se u boksu može otkriti 50 % prevalencija serokonverzije sa 95 % sigurnošću.

2. Međutim, nadležno tijelo može donijeti odluku o ukidanju mjera navedenih u stavku 1. podstavku (a), ako:

(a) iz epidemiološkog istraživanja provedenog u skladu s člankom 8. Direktive Vijeća 92/119/EEZ proizlazi da vezikularna enterovirusna bolest svinja nije unesena na gospodarstvo;

(b) na gospodarstvu nisu utvrđeni klinički znakovi vezikularne enterovirusne bolesti svinja; i

(c) se gospodarstvo ne nalazi u zoni pod nadzorom ili ograničenjem, koja je uspostavljena nakon potvrde o izbijanju bolesti, ili nije predmet drugih ograničenja koja se primjenjuju u odnosu na potvrđeno izbijanje bolesti,

i pod uvjetom da:

— ni jedna svinja ne napusti gospodarstvo u svrhu stavljanja u promet unutar Zajednice, i

— se svinje s dotičnoga gospodarstva premještaju samo u klaonicu na neodgodivo klanje ili na neko drugo gospodarstvo s kojeg svinje isto tako neće biti stavljene u promet unutar Zajednice,

sve dok se na temelju rezultata daljnjih kontrola i seroloških testiranja ne dokaže da se u potpunosti može isključiti sumnja na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja.

3. Ako provjere i serološka testiranja provedena u skladu s točkom 1. podtočkama (b) i (c):

(a) daju negativne rezultate ili se pozitivan nalaz dokaže samo kod jedne, prethodno pozitivne svinje („nespecifični reaktor”), vezikularna enterovirusna bolest svinja može se isključiti. Mjere navedene u točki 1.(a) se ukidaju, osim ako se gospodarstvo ne nalazi u zaraženoj ili ugroženoj zoni određenoj oko mjesta izbijanja zaraze u kojoj mjere za iskorjenjivanje bolesti u skladu s Prilogom II. dijelom 7. ili 8. Direktivi Vijeća 92/119/EEZ moraju ostati na snazi;

(b) pokažu da je na gospodarstvu prisutno više od jedne serološki pozitivne svinje, onda vezikularna enterovirusna bolest svinja mora biti potvrđena, ili ako nisu ispunjeni uvjeti iz Priloga II. dijela 4. Direktivi Vijeća 92/119/EEZ, kojima se potvrđuje prisutnost bolesti, na gospodarstvu se moraju uzeti daljnji uzorci u skladu s postupkom uzimanja uzoraka navedenom u stavku 4.

4. Ako se otkrije više od jedne seropozitivne svinje nakon uzimanja uzoraka i seroloških testiranja navedenih u poglavlju V. točki 1.(a), stavku 1. podstavku (c) ili stavku 2., a nisu ispunjeni uvjeti utvrđeni u Prilogu II. dijelu 4. Direktivi Vijeća 92/119/EEZ kojima se potvrđuje vezikularna enterovirusna bolest svinja, nadležno tijelo osigurava da se:

(a) primijene, ili se i dalje primjenjuju, odredbe navedene u članku 4. Direktive Vijeća 92/119/EEZ;

(b) na gospodarstvu provede kontrola u skladu s odredbama navedenim u poglavlju II. točki 1.;

(c) za serološka testiranja uzmu dodatni uzorci krvi od seropozitivnih svinja i svinja koje su bile u kontaktu, u skladu s točkom 1 (c);

(d) za serološka testiranja uzmu uzorci krvi od svinja iz drugih objekata na gospodarstvu, u skladu s postupkom navedenim u poglavlju V. točki 2.;

(e) uzme dovoljan broj uzoraka fecesa za virološka ispitivanja: — od seropozitivnih svinja, — s podova boksova u kojima su seropozitivne svinje i iz susjednih boksova, — iz nasumično odabranih boksova iz drugih objekata na gospodarstvu. Uzorci fecesa prikupljeni u skladu s prvom i drugom alinejom moraju se pretražiti što je prije moguće. Ako su ti uzorci negativni, ali se na temelju rezultata seroloških testiranja sumnja da se vezikularna enterovirusna bolest svinja možda proširila i na druge objekte, također se moraju testirati uzorci fecesa prikupljeni u skladu s trećom alinejom;

Ako na temelju dodatnih kontrola i testiranja još uvijek nisu zadovoljeni uvjeti iz Priloga II. točke 4. Direktivi Vijeća 92/119/EEZ, kojima se potvrđuje prisutnost vezikularne enterovirusne bolesti svinja, seropozitivne svinje moraju biti usmrćene ili zaklane, u skladu s odredbama iz Priloga II. točke 4.d) Direktivi Vijeća 92/119/EEZ. Međutim, ako se utvrdi da su i daljnje svinje seropozitivne, dodatno onima za koje se već dokazalo da su seropozitivne u prethodnom uzimanju uzoraka, odredbe i postupci predviđeni u podtočkama (a), (b), (c) (d) i (e) primjenjuju se i dalje mutatis mutantis.

5. Ne dovodeći u pitanje mjere navedene u članku 9. Direktive Vijeća 92/119/EEZ, u slučaju da se utvrdi da je jedna ili više svinja seropozitivna nakon provedbe aktivnosti nadziranja navedenih u poglavlju V. točki 1.(b) ili poglavlju V. točki 1.(c), nadležno tijelo osigurava da se:

(a) provedu, kad je potrebno i moguće, daljnje odgovarajuće kontrole uključujući uzimanje uzoraka, kako bi se potvrdila ili isključila sumnja na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja na mjestima na kojima su te svinje otkrivene, uzimajući u obzir stanje lokalnom okruženju;

(b) na gospodarstvu s kojeg potječu svinje provedu mjere navedene u članku 4. Direktive Vijeća 92/119/EEZ;

(c) na gospodarstvu s kojeg potječu svinje provedu kontrole u skladu s odredbama navedenim u poglavlju II. točki 1.; i

(d) od svinja na gospodarstvu, s kojeg potječu seropozitivne svinje, prikupe uzorci krvi za serološko testiranje u skladu s odredbama navedenim u poglavlju V. točki 2.;

6. Međutim, nadležno tijelo može donijeti odluku o ukidanju mjera iz točke 5.(b), ako:

(a) se na temelju epidemiološkog istraživanja provedenog u skladu s člancima 4. i 8. Direktive Vijeća 92/119/EEZ može zaključiti da vezikularna enterovirusna bolest svinja nije unesena na gospodarstvo;

(b) na gospodarstvu nisu otkriveni klinički znakovi vezikularne enterovirusne bolesti svinja;

(c) se gospodarstvo ne nalazi u zoni pod nadzorom ili ograničenjem, koja je uspostavljena nakon potvrde o izbijanju bolesti, ili nije predmet drugih ograničenja koja se primjenjuju u odnosu na potvrđeno izbijanje bolesti,

i pod uvjetom da:

— ni jedna svinja ne napusti gospodarstvo u svrhu stavljanja u promet unutar Zajednice, i

— se svinje s dotičnoga gospodarstva premještaju samo u klaonicu na neodgodivo klanje ili na neko drugo gospodarstvo s kojeg svinje isto tako neće biti stavljene u promet unutar Zajednice;

sve dok se na temelju rezultata daljnjih kontrola i seroloških testiranja na mjestu gdje su otkrivene seropozitivne svinje i na gospodarstvu s kojeg potječu ne potvrdi da se u potpunosti može isključiti sumnja na vezikularnu enterovirusnu bolest svinja.

POGLAVLJE VII.

Načela i primjena viroloških testiranja i procjena njihovih rezultata

A. Dokazivanje virusnog antigena

1. Neizravna ELISA (engl. Indirect sandwich ELISA) zamijenila je reakciju vezanja komplemenata kao metoda izbora za dokazivanje virusnog antigena vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Test je isti kao onaj koji se koristi za dijagnosticiranje slinavke i šapa. Testiranje na obje bolesti mora se provoditi istodobno, osim ako slinavka i šap već nije isključena. Osobito se preporučuje koristiti uzorke epitelnog tkiva ili tekućine iz vezikularnih lezija, u kojima su već za nekoliko sati u akutno oboljelih svinja prisutni i dokazivi u visokom titru virusi vezikularne enterovirusne bolesti svinja, kao i slinavke i šapa (3).

Po dva reda na mikrotitražnim pločicama premažu se zečjim protutijelima za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja i za svaki od sedam virusa serotipova slinavke i šapa. To su serumi na koje se veže virusni antigen. Svakom od tih redova dodaje se testna suspenzija uzoraka. Uključene su i odgovarajuće kontrole. U sljedećoj se fazi u odgovarajuće redove dodaje homologeni serum zamoraca za dokazivanje, a potom anti-zamorčev serum kunića konjugiran enzimom peroksidazom (konjugat). Između svake faze poduzima se temeljito ispiranje kako bi se odstranili nevezani reagensi. Nakon dodavanja kromogena i supstrata promjena boje ukazuje na pozitivnu reakciju. Kod jake pozitivne reakcije to se vidjeti golim okom, ali se rezultati mogu očitati i spektrofotometrijski, pri čemu apsorpcija svjetla od 0,1 iznad pozadine upućuje na pozitivnu reakciju.

2. Za dokazivanje vezikularne enterovirusne bolesti svinja i za diferencijalno dijagnosticiranje slinavke i šapa u uzorcima epitelnog tkiva, vezikularnoj tekućini ili kulturi zaraženog tkiva, može se, alternativno, koristiti i ELISA uz uporabu monoklonskih protutijela, uz primjenu odabranih monoklonskih protutijela kao antitijela za vezivanje, a s monoklonalskim protutijelima konjugiranim peroksidazom kao protutijelima za dokazivanje.

3. ELISA uz uporabu monoklonskih protutijela može se koristiti za pretraživanje antigenih varijanti među sojevima virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Virusni antigeni uzgojeni na kulturama tkiva vezuju se na hiperimuni serum kunića za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja, koji je naslojen na čvrstu fazu. Odgovarajući paneli monoklonskih protutijela reagiraju i vezivanjem monoklonskih protutijela na terenske sojeve uspoređuje se s vezivanjem monoklonalnih antitijela na roditeljske sojeve. Slično vezivanje upućuje na prisutnosti epitopa koji su zajednički roditeljskim sojevima i terenskim sojevima.

B. Izdvajanje i uzgoj virusa

1. Pročišćene suspenzije uzoraka epitelnog tkiva, vezikularne tekućine ili fecese za koje se sumnja da sadrže virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja rutinski se nacjepljuju na osjetljive stanične kulture. Ako količina i kakvoća uzoraka iz vezikularnih lezija dostavljenih na pretraživanje nije dovoljna za trenutačno ispitivanje ELISA-om, potrebno je virus uzgojiti u kulturi tkiva, kako bi se povećala količina virusnih antigena.

2. Za izdvajanje i uzgoj virusa, pročišćenom suspenzijom epitelnog tkiva nacjepljuju se jednoslojne kulture IB-RS-2 stanica. Treba primijeniti suspenzije epitelnog tkiva dvije razrijeđenosti, jedna visoko razrijeđena (1:500) i jedna nisko (1:10), kako bi se izbjeglo ometanje rasta virusa inteferonom, čije oslobađanje ometa rast virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Za izdvajanje virusa mediju za održavanje dodaju se samo antibiotici. Za diferencijalno dijagnosticiranje virusa slinavke i šapa, kulture treba također nacijepiti i na primarne kulture stanica goveđe štitnjače ili na bubrežne stanice hrčka (BHK-2).

3. Ako se razvije citopatski učinak, nadtalog se mora prikupiti iz pozitivnih kultura, po završetku citopatskog učinka i kao takav koristiti za identifikaciju virusa ELISA-om. Negativne kulture se moraju nacijepiti na svježe kulture tkiva za 48 ili 72 sata i ta slijepa pasaža se pretražuje unutar 72 sata. Ako ne nastupi citopatski učinak nakon ponovljene slijepe pasaže, uzorak se može proglasiti negativnim na prisutnost živog virusa.

4. Suspenzije uzoraka fecesa mogu se preraditi kako je opisano u točki 1. Budući da je u pravilu u fecesu prisutno manje virusa nego u epitelnom tkivu, važno je, ako ne nastane citopatski učinak u prvoj i drugoj pasaži, provodi se i treća slijepa pasaža.

5. Simultano cijepljenje linijske kulture stanica svinja i jedne od gore navedenih kultura tkiva (daje se prednost primarnim kulturama stanica štitnjače goveda) korisna je smjernica za određivanje sadrže li uzorci vezikula virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja ili slinavke i šapa, jer virus vezikularne enterovirusne bolesti raste samo u stanicama svinjskog podrijetla. Međutim, izolati virusa slinavke i šapa, koji su više put prenošeni među svinjama, mogu također rasti u staničnim kulturama svinja.

C. Lančana reakcija polimerazom (PCR) za dokazivanje genoma

1. Metoda prepoznavanja nukleinske kiseline može se koristiti za dokazivanje virusnoga genoma vezikularne enterovirusne bolesti svinja u kliničkom materijalu pomoću PCR-a i za utvrđivanje odnosa između izolata virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja određivanjem nukleotidnog niza dijela genoma. Tehnike koje se koriste PCR-om razvijene su kako bi se poboljšala osjetljivost dijagnosticiranja. Opisane su male razlike u RT-PCR postupcima kod kojih se primjenjuju početnice (primeri) koje ciljaju jako konzervativne regije u 1C i 1D genima.

2. PCR je brza metoda (rezultati su dostupni obično u roku od 24 sata), dokazuje sve genotipove virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja i dovoljno je osjetljiva da se može koristiti i na uzorcima prikupljenim od klinički sumnjivih slučajeva.

3. Kad se sumnja na subkliničku infekciju, ili kad se prikupljaju uzorci nakon što je klinička slika bolesti jasna, ili kad se pripremaju uzorci fecesa, poboljšane RT-PCR metode, kao što su ugniježđena RT-PCR, imunosna PCR, ELISA-PCR i bolje razrađene metode ekstrakcije RNA, pokazale su se kao barem jednako osjetljivi, no mnogo brži, sustavi dokazivanja u odnosu na višestruke pasaže na kulturi tkiva.

4. Sekvencioniranjem približno 200 nukleotida unutar gena 1D, koji kodira sintezu glavnog strukturnog proteina VP1, moguće je grupirati sojeve virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja prema njihovoj homolognosti sekvence, te epidemiološki razvrstati sojeve koji uzrokuju bolest u različitim regijama ili u različito vrijeme.

D. Procjena rezultata viroloških testova

Dokazivanje antigena ili genoma virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja pomoću ELISA-om ili PCR-om ima istu dijagnostičku vrijednost kao i izdvajanje virusa.

Ipak, izdvajanje virusa mora se uzimati kao referentni test i mora se koristiti kao potvrdni test, kada je to potrebno, a posebno ako pozitivni rezultat ELISA-e ili PCR-a nije potkrepljen s:

(a) otkrivanjem kliničkih znakova bolesti;

(b) otkrivanjem seropozitivnih svinja; ili

(c) izravnom epidemiološkom povezanošću s potvrđenom pojavom bolesti.

POGLAVLJE VIII.

Načela i primjene seroloških testiranja i procjena njihovih rezultata

A. Test neutralizacije virusa (VN)

1. Kvantitativni VN mikro-test za otkrivanje protutijela za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja provodi se na stanicama IB-RS-2 ili jednakovrijednim sustavom stanica u mikrotitracijskim pločama za kulturu tkiva s ravnim dnom.

2. Virus se uzgaja u jednoslojnim staničnim kulturama IB-RS-2 i pohranjuje ili pri -20 °C nakon dodavanja 50 % glicerola ili pri -70 °C bez glicerola. Serumi se prije testiranja inaktiviraju 30 minuta pri 56 °C.

B. ELISA testovi

1. ELISA za otkrivanje protutijela je kompetitivna ELISA na temelju monoklonskih protutijela. Ako uzorak seruma sadrži protutijela za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja, vezivanje monoklonskog protutijela na antigen virusa konjugiranog peroksidazom na antigen bit će spriječeno.

U navedenoj ELISA metodi antigen virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja veže se na čvrstu fazu pomoću monoklonskih protutijela; nakon čega se odgovarajuće razrijeđeni uzorci seruma inkubiraju, te se zatim dodaju peroksidazom konjugirana monoklonska protutijela. Potom se pomoću supstrata i kromogena mjeri inhibicija vezivanja monoklonskih protutijela.

2. Neizravna ELISA „trapping” metoda, uz primjenu izotip-specifičnih monoklonskih protutijela za otkrivanje IgG ili IgM, specifičnih za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja pomaže pri dokazivanju vremena zaražavanja svinja ili kontaminacije prostora.

Kod izotipski specifične ELISE virusni antigen vezikularne enterovirusne bolesti svinja veže se na čvrstu fazu uz primjenu protutijela za vezivanje antigena. Ako uzorak seruma sadrži protutijela za virus vezikularne enterovirusne bolesti svinja, ona se otkrivaju uz primjenu anti-svinjskih IgG ili IgM monoklonskih protutijela, konjugiranih peroksidazom. Potom se pomoću supstrata i kromogena mjeri vezivanje.

Izotipski specifična ELISA može također pomoći pri razlikovanju „nespecifičnih reaktora” od stvarno pozitivnih svinja, kako je navedeno u dijelu C.

C. Primjena seroloških testova i procjena rezultata

1. Testovi VN i ELISA preporučuju se kao serološki testovi. U poglavlju X. navedena je lista referentnih seruma, koji se mogu dobiti od referentnog laboratorija Zajednice za primjenu standardiziranih seroloških testova koji se provode u Zajednici.

VN-test smatra se referentnim testom, no njegova je loša strana što traje od 2 do 3 dana i zahtijeva prostore i opremu za uzgoj kulture tkiva.

ELISA je brža i lakše se standardizira. Kompetitivna ELISA monoklonskim protutijelima je najpouzdaniji test za otkrivanje protutijela za vezikularnu enterovirusnu bolest svinja dosad opisan. Preporučuje se za orijentacijsko (engl. „screening”) testiranje velikog broja uzoraka.

Ipak, VN-test mora se koristiti kao potvrdni test kad je to potrebno, posebno nakon prvog otkrivanja pozitivnog uzorka na gospodarstvu. Svinje pozitivne uporabom ELISE testa, no negativne kod VN-testa, ne trebaju se uzimati u obzir.

2. Može se sumnjati na prisutnost „nespecifičnog reaktora” (4) kad se identificira samo jedna seropozitivna svinja i kad su ispunjeni sljedeći kriteriji:

(a) na gospodarstvu nema kliničkih znakova bolesti;

(b) na gospodarstvu ni u prošlosti nije bilo pojave kliničke zaraze;

(c) ni u prošlosti nije bilo kontakta s poznatim izbijanjem bolesti.

3. Svinja je potvrđena kao „nespecifični reaktor” kad:

(a) u daljnjim testiranjima nisu identificirane druge seropozitivne svinje;

(b) uzorkovanjem provedenim na svinjama koje su bile u kontaktu, nakon prvog utvrđivanja „nespecifičnog reaktora” ne pokazuju serokonverziju;

(c) titar protutijela ostaje konstantan ili opada nakon ponovljenog uzimanja uzoraka.

4. Međutim, sljedeći dodatni kriteriji i načela moraju se također uzimati u obzir kod potvrđivanja „nespecifičnog reaktora”:

(a) „nespecifični reaktori” pojavljuju se kod svinja u prevalenciji od oko 1:1 000;

(b) serumi od „nespecifičnog reaktora” imaju općenito sljedeća obilježja: — nizak titar protutijela kod VN-testa, — kod kompetitivne ELISE monoklonskim protutijelima na granici su pozitivne reakcije, — nalaz isključivo IgM i bez IgG u vezikularnoj enterovirusnoj bolesti svinja kod izotipično specifičnog ELISA testa (5).

POGLAVLJE IX.

Klinički znakovi i obilježja vezikularne enterovirusne bolesti svinja

Vezikularna enterovirusna bolest svinja je zarazna bolest svinja koju uzrokuje enterovirus iz porodice Picornaviridae, koja može imati subklinički, blag ili žestok tijek vezikularne bolesti, ovisno o soju virusa koji je uzrokuje, načinu prijenosa i dozi virusa, kao i stanju na gospodarstvu na kojem se svinje drže. Dodatni čimbenici stresa poput prijevoza, miješanje s drugim svinjama i ekstremne temperature mogu pogodovati razvoju kliničkih znakova.

Obilježja bolesti su blago povišena temperatura i stvaranje vezikula na koronarnim mišićnim tetivama, korijenu pete, koži udova i rjeđe na gubici, usnicama, jeziku i sisama. Pobol može biti do 100 %, no smrtnost je vrlo niska ili jednaka nuli.

Bolest se može razviti u ne uočljivom ili blagom obliku uz neznatno pogoršanje općeg stanja svinja, no unutar nekoliko dana razviju se antitijela koja neutraliziraju virus (6).

Zbog subkliničke ili blage prirode bolesti, na nju se u pravilu najprije posumnja tek nakon seroloških testova koji se provode u okviru nadziranja bolesti ili za izdavanje izvoznih certifikata. Nedavna izbijanja vezikularne enterovirusne bolesti svinja u Europi bila su praćena relativno blagim kliničkim znakovima ili ih uopće nije bilo, pa dijagnoza često ovisi o serološkim testiranjima.

Međutim, klinički znakovi vezikularne enterovirusne bolesti svinja ne razlikuju se od kliničkih znakova slinavke i šapa. Svako vezikularno stanje mora se od početka tretirati kao sumnja na slinavku i šap, a diferencijalno dijagnosticiranje mora biti provedeno što je prije moguće.

Razdoblje inkubacije vezikularne enterovirusne bolesti kod pojedinih svinja je obično između dva i sedam dana, nakon čega se može pojaviti prolazna temperatura do 41 °C, dok na gospodarstvu klinički znakovi mogu biti vidljivi tek nakon dužeg vremena. Vezikule se mogu razviti na koronarnom pojasu, obično na spoju s petom. One mogu zahvatiti cijelu koronarnu mišićnu tetivu i mogu uzrokovati gubitak papka. Rjeđe se vezikule pojavljuju na gubici, pogotovo na dorzalnoj površini, na usnama, jeziku i sisama, a površinske erozije vide se na koljenima. Oboljele svinje mogu nekoliko dana šepati i slabije uzimati hranu.

U mlađih kategorija svinja je to jače izraženo, iako je smrtnost od vezikularne enterovirusne bolesti svinja vrlo rijetka, za razliku od smrtnosti mlađih kategorija svinja kod slinavke i šapa.

Zabilježeni su i neurološki znakovi, no oni nisu uobičajeni. Pobačaji nisu tipična pojava kod vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Zakazivanje rada srca zbog multifokalnog mikarditisa može ukazivati na slinavku i šap i encefalomiokarditis, pogotovo kod mlađe prasadi, ali se ne dovodi u vezu s vezikularnom enterovirusnom bolesti svinja.

Potpuno ozdravljenje nastupa u pravilu za dva do tri tjedna, a jedan jedini znak bolesti ostaje tamna, vodoravna crta na rožini papka, gdje je rast bio privremeno prekinut.

Zaražene svinje izlučuju virus iz nosa i gubice i fecesom do 48 sati prije početka kliničkih znakova. Virus je većinom umnožen u prvih sedam dana po infekciji, a izlučivanje virusa iz nosa i gubice obično prestaje u roku od dva tjedna. Virus se iz fecesa može izdvojiti do 20 dana po infekciji, iako je zabilježena njegova prisutnost i do tri mjeseca po infekciji. Uzročnik može dugo vremena preživjeti u nekrotičnom tkivu nastalom na mjestu probušenih vezikula, kao i u fecesu.

POGLAVLJE X.

Referentni serumi vezikularne enterovirusne bolesti svinja

Referentni serum Podrijetlo Napomena (7) 1 Serum zdrave svinje (SZS) Negativni kontrolni serum 2 Serum prikupljen 21 dan poslije infekcije (dpi) od svinje zaražene virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja soj, UKG 27/72 (čisti virus) Pozitivan kontrolni serum u visokom titru. 3 SZS razrjeđuje se serumom bolesne svinje prikupljenim petog dpi virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, soj Italy 8/94, u omjeru 1:10 Slabo pozitivan serum od svinje netom po infekciji s nedavnim europskim izolatom virusa vezikularne enterovirusne bolesti svinja. Serum je razrijeđen kako bi se dobio slabo pozitivan rezultat ELISA-om i VN-testom. 4 Serum svinje prikupljen 21dpi od svinje zaražene virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, soj UKG 27/72, razrijeđen u omjeru 1:40 Slabo pozitivan serum koji određuje najnižu razinu protutijela, kod koje bi nacionalni referentni laboratoriji EU-a trebali uvijek dobivati pozitivan rezultat ELISA-om i VN-testom. Ekvivalent serumu RS 01-04-94 (8) 5 Serum prikupljen četvrtog dpi od svinje zaražene virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, soj UKG 27/72 (čisti virus) Slabo pozitivan serum od svinje u ranoj fazi infekcije. 6 Serum prikupljen peti dpi od svinje zaražene virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, soj UKG 27/72 (čisti virus) Slabo pozitivan serum od svinje u ranoj fazi infekcije.

(1) SL L 224, 18.8.1990., str. 19.

(2) SL L 224, 18.8.1990., str. 29.

(3) Pozitivni rezultati metode ELISA povezuju se s prisutnosti od najmanje 105 TCID50 (Tissue culture infectious doses – zarazne doze kulture tkiva) virusa u uzorku.

(4) Mali udio „nespecifičnih reaktora” može se dokazati bilo kojim uobičajenim serološkim testom za vezikularnu enterovirusnu bolest svinja. Nepoznati su čimbenici za nastanak „nespecifičnog reaktora”. Možda dolazi do serološke unakrižne aktivnosti s virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja zbog infekcije nekim drugim, do sada neidentificiranim picornavirusom ili drugim nespecifičnim čimbenicima prisutnim u serumu.

(5) Specifična IgG protutijela sama, ili zajedno IgG i IgM protutijela, obično se nalaze u uzorcima seruma svinja zaraženih virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja, dok serumi iz „nespecifičnog reaktora” obično sadrže samo IgM. Specifična IgG protutijela ne mogu se dokazati u uzorcima seruma svinja zaraženih virusom vezikularne enterovirusne bolesti svinja tijekom prethodnih 10 ili 14 dana, iako bi ih se trebalo dokazati u drugom uzorku krvi. Ipak, nedavno zaražene svinje ne mogu se pouzdano razlučiti od „nespecifičnog reaktora” prije nego njihova imunološka reakcija prijeđe od IgM na IgG proizvodnju protutijela. Vidjeti također poglavlje IX. i bilješku 7.

(6) Specifična IgM protutijela mogu se obično dokazati u krvi dva do tri dana nakon infekcije, koja nestaju poslije otprilike 30 do 50 dana; specifična IgG protutijela mogu se obično dokazati u krvi od 10 do 14 dana nakon infekcije i ustraju nekoliko godina. Ig izotip može se odrediti pomoću metode ELISA opisane u poglavlju VIII. dijelu B točki 2.

(7) Ove napomene se odnose na ispitivanje pojedinačnih svinja. Za serološko nadziranje potrebno je uzeti u obzir osjetljivost primijenjenih testova.

(8) Npr. serum s titrom protutijela koji je dovoljno viši od granične vrijednosti kod koje se uvijek dobiva pozitivan rezultat pri ponovljenim ispitivanjima ELISA-om i VN-testom.