10.

Dodaju se poglavlja C.27, C.28, C.29 i C.30: „C.27 TEST TOKSIČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI IZ SEDIMENTA SA SEDIMENTOM OBRAĐENIM SPIKINGOM UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 218 (2004). Ova ispitna metoda namijenjena je procjeni učinaka produljenog izlaganja kemikalija ličinkama iz sedimenta vrste slatkovodnih dvokrilaca (diptera) Chironomus sp. Temelji se na postupcima postojećih testova toksičnosti za Chironomus riparius i Chironomus tentans koji su razvijeni u Europi (1)(2)(3) i Sjevernoj Americi (4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prstenastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima postoji dobra dokumentacija, npr. Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest obogaćivanje sedimenta ispitnom tvari spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja ovisi o cilju provođenja testa. Cilj scenarija obogaćivanja sedimenta spikingom jest simulirati akumulirane razine kemikalija koje postoje u sedimentu. Ovaj sustav izlaganja obuhvaća spiking sedimenta iz ispitnog sustava sediment/voda. 3. Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obično u njemu opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na razne načine. Relativna važnost svakog načina izlaganja i vrijeme potrebno da bi svaki od tih načina pridonio općim učincima toksičnosti ovise o fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log Kow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kovalentnim vezama, značajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane hrane. Kako se ne bi podcijenila toksičnost jako lipofilnih tvari, može se u obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni načini izlaganja, ova se ispitna metoda usredotočuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, te 28 - 65 dana za C. tentans. Ako su za neku specifičnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi istraživanja učinaka neke nestabilne kemikalije, višestruka određivanja mogu se ukinuti nakon deset dana. 4. Izmjereni konačni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u vrijeme preobrazbe. Preporučuje se da se preživljavanje i rast ličinki mjere tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to prikladno. 5. Preporučuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima: — pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu ‚standardiziranu matricu’ te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontaminiranih i čistih izvora sedimenta; — testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suočava sa sezonskom varijabilnošću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja urođene faune; uporaba formuliranog sedimenta također snižava troškove povezane s terenskim prikupljanjem dovoljnih količina sedimenta za rutinsko testiranje; — uporaba formuliranog sedimenta omogućuje usporedbe toksičnosti i razvrstavanje tvari sukladno tome. 6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1. NAČELO ISPITIVANJA 7. Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija ispitne kemikalije u sustavima sediment/voda. Ispitna tvar dodaje se u sediment, a nakon toga se ličinke u prvom stadiju razvoja uvode u ispitne laboratorijske čaše, u kojima su već stabilizirane koncentracije sedimenta i vode. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. Također se mogu mjeriti i preživljavanje i masa ličinki nakon deset dana, ako je to potrebno (pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je primjereno). Ti se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem određivanja koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preobrazbi ili preživaljavanju i rastu ličinki (npr. EC15, EC50 itd.) bilo statističkim hipotetskim testiranjem s ciljem određivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje je potrebna usporedba vrijednosti učinka s kontrolnim vrijednostima pomoću statističkih testova. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI 8. Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, izmjerena ili izračunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. Treba biti dostupna pouzdana analitička metoda kvantifikacije ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznošću i granicama detekcije. Korisne informacije obuhvaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abiotička i biotička razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12). REFERENTNE KEMIKALIJE 9. Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodično kako bi se osigurala pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksičnih tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studijama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev klorid (1)(2)(5)(6)(13). VALJANOST ISPITIVANJA 10. Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljedeći uvjeti: — postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi najmanje 70 %. (1)(6); — preobrazba vrsti C. riparius i C. yoshimatsui u odrasle životinje u kontrolnim posudama treba se odviti između 12. i 23. dana nakon njihova umetanja u posude; za vrstu C. tentans potrebno je razdoblje od 20 do 65 dana. — na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 posto vrijednosti zasićenosti kisikom (ASV) na određenoj temperaturi, a pH vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim posudama; — temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. Temperatura vode može se kontrolirati izotermičkom sobom i u tom slučaju temperatura u prostoriji treba se potvrđivati u odgovarajućim vremenskim razmacima. OPIS METODE Ispitne posude 11. Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajamčiti da je i u njima prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj ličinki bude 2 do 3 cm2 površine. Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja treba biti načinjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog materijala (npr. teflona). Odabir vrste 12. Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogućnosti je Chironomus riparius. I vrsta Chironomus tentans također je prikladna, ali je njome teže rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i vrsta Chironomus yohimatsui. Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se u Dodatku 2. za vrstu Chironomus riparius. Podaci o uvjetima uzgoja kulture dostupni su također i za druge vrste, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju. Sediment 13. Po mogućnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obrađeni, umjetni ili sintetički sediment). Međutim, ako se koristi prirodni sediment, on se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i određivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nikakvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Također se preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporučuje se sljedeći formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), (1)(15)(16): (a) 4-5 % (suhe mase) treseta: što je moguće bliže pH od 5,5 do 6,0; važno je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veličine čestica ≤ 1 mm) i isključivo sušen na zraku. (b) 20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogućnosti iznad 30 %). (c) 75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevladavati s više od 50 posto čestica između 50 i 200 μm). (d) Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobio sadržaj vlage konačne smjese u rasponu od 30 - 50 %. (e) Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvoće (CaCO3) kako bi se pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5. Sadržaj organskog ugljika konačne smjese trebao bi iznositi 2 % (± 0,5 %) i treba se prilagoditi dodavanjem odgovarajućih količina treseta i pijeska prema (a) i (c). 14. Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formuliranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka također je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni. Voda 15. Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna voda (površinske ili podzemne vode), obrađena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na početku testa pH ispitne vode treba biti između 6 i 9, a ukupna tvrdoća ne viša od 400 mg/l kao CaCO3. Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (samim time, u toj se situaciji ne smije koristiti medij Elendt M4). Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvoće vode navedena u Dodatku 4. značajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva. Radne otopine - sedimenti obrađeni spikingom 16. Sedimenti obrađeni spikingom odabrane koncentracije obično se pripremaju dodavanjem otopine ispitivane tvari izravno u sediment. Radna otopina ispitivane tvari otopljena u deioniziranoj vodi miješa se s formuliranim sedimentom valjkastim mlinom, miješalicom hrane ili ručnim miješanjem. Ako je ispitivana tvar slabo topljiva u vodi, može se otopiti u što je moguće manjem volumenu prikladnog organskog otapala (npr. heksan, aceton ili klorofor). Ta se otopina potom miješa s 10 g finog kremenog pijeska za jednu ispitnu posudu. Otapalo se pusti da ispari i mora se u cijelosti ukloniti iz pijeska; potom se pijesak miješa s prikladnom količinom sedimenta po ispitnoj laboratorijskoj čaši. Samo lako hlapljiva sredstva mogu se koristiti za otapanje, dispergiranje ili emulgiranje ispitivane tvari. Treba imati na umu da se pijesak koji nastane miješanjem ispitivane tvari i pijeska mora uzeti u obzir prilikom pripreme sedimenta (tj. sediment stoga treba pripremiti s manje pijeska). Treba se pobrinuti da se ispitivana tvar koja se dodaje u sediment temeljito i ravnomjerno rasprši u sedimentu. Ako je potrebno, mogu se analizirati i poduzorci kako bi se odredio stupanj homogenosti. PLAN ISPITIVANJA 17. Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj ličinki po posudi. Opisani su planovi za procjenu točke koncentracije s učinkom (EC), za procjenu najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC) i za provođenje graničnog ispitivanja. Plan za regresijsku analizu 18. Koncentracija s učinkom (npr. EC15, EC50) i raspon koncentracije, iznad kojega je učinak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhvaćati koncentracije uključene u ispitivanje. Općenito, preciznost, a posebno valjanost, s kojom se mogu procijeniti koncentracije s učinkom (ECx), poboljšavaju se kad se koncentracija s učinkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija. Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za određivanje raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti (vidjeti stavak 27.). 19. Ako treba procijeniti ECx, treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri višestruka određivanja. U svakom se slučaju savjetuje korištenje dovoljnog broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva (iznimka se može učiniti u slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj višestrukih određivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se poveća broj ispitnih koncentracija različitog odgovora. Povećanjem broja višestrukih određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obično dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka određivanja potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast ličinki. Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a 20. Ako treba procijeniti LOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom) i NOEC (najvišu koncentraciju bez vidljivog učinka), treba koristiti pet ispitnih koncentracija u najmanje četiri višestruka određivanja, a faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva. Broj višestrukih određivanja trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statističku snagu kojom će otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod brzine razvoja obično je prikladna analiza varijance (ANOVA), kao što su Dunnettov test i Williamsov test (17)(18)(19)(20). Kod omjera preobrazbe mogu se koristiti Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test. Granično ispitivanje 21. Može se provesti granično ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za određivanje raspona ne vide nikakvi učinci. Svrha graničnog ispitivanja jest provesti ispitivanje na koncentracijama dovoljno visokim da omogući donositeljima odluke da isključe moguće toksične učinke ispitivane tvari, a granica se postavlja na koncentraciju za koju se ne očekuje da će se pojaviti u bilo kojoj situaciji. Preporučuje se 1 000 mg/kg (suha masa). Obično je potrebno najmanje šest višestrukih određivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba pokazati adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metričkog odgovora (brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statistička metoda ako podaci zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili neparametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera preobrazbe prikladan je Fisherov test. POSTUPAK Uvjeti izlaganja Priprema sustava sediment/voda spikingom 22. Postupak spikinga opisan u ispitnoj metodi C.8: Toksičnost za gujavice preporučuje se za primjenu ispitivane tvari (14). Sedimenti obrađeni spikingom stavljaju se u posude pa se dodaje voda iznad sedimenta, i to u omjeru sedimenta i vode 1:4 (vidjeti stavke 11. i 15.). Dubina sloja sedimenta trebala bi se kretati u rasponu od 1,5 - 3 cm. Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti plastičnim diskom dok se na njega lijeva voda, a disk se miče odmah nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi predmeti. 23. Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim pločama). Ako je potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomoću destilirane ili deionizirane vode kako bi se spriječilo stvaranje soli. Stabilizacija 24. Kad se pripremi sediment postupkom spikinga s vodom iznad sedimenta, poželjno je dopustiti razdiobu ispitivane tvari iz tekućeg stanja u sediment (3)(4)(6)(13). To bi se po mogućnosti trebalo učiniti u uvjetima temperature i dozračivanja koji se koriste u ispitivanju. Prikladno vrijeme uravnoteženja specifično je za svaki sediment i kemikaliju, a može se kretati od nekoliko sati pa sve do nekoliko dana, pa čak u rijetkim slučajevima i do nekoliko tjedana (4-5 tjedana). Budući da je time ostavljeno dovoljno vremena za razgradnju brojnih kemikalija, ne čeka se uravnoteženje, ali se preporučuje vrijeme uravnoteženja od 48 sati. Na kraju tog dodatnog vremena uravnoteženja treba izmjeriti koncentraciju ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i u sedimentu, barem u najvišoj koncentraciji i u jednoj nižoj (vidjeti stavak 38.). Ta analitička određivanja ispitivane tvari omogućuju izračun bilance mase i izražavanje rezultata na temelju izmjerenih koncentracija. Dodavanje ispitnih organizama 25. Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz matične kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture treba dodati manju količinu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica suspenzije fino usitnjenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje ličinki obično počinje nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za Chironomus riparius na 20 °C i 1 do 4 dana za Chironomus tentans na 23 °C i za Chironomus yoshimatui na 25 °C), a ličinke se razvijaju u četiri stadija razvoja, od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti ličinke iz prvog stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica moguće je provjeriti pomoću širine kapsule glave (6). 26. Dvadeset ličinki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obrađen spikingom, i to pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozračivanje vode tijekom dodavanja ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja ličinki (vidjeti stavke 25. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja (vidjeti stavke 19. i 20.) broj ličinki po koncentraciji iznosi najmanje 60 za procjenu točke EC-a i 80 za određivanje NOEC-a. Ispitne koncentracije 27. Ispitivanje za određivanje raspona može biti korisno za određivanje raspona koncentracija za konačno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gustoća površine po trzalcu, koja će se koristiti i u konačnom ispitivanju, trzalci se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogućuje procjenu odgovarajućih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna višestruka određivanja. 28. O ispitnim koncentracijama za konačno ispitivanje odlučuje se na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20. Kontrolne posude 29. U ispitivanje bi, s odgovarajućim brojem višestrukih određivanja, trebalo uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta. Sustav ispitivanja 30. Koriste se statički sustavi. Polustatični ili protočni sustavi sa stalnim ili isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u iznimnim slučajevima, na primjer ako specifikacije kakvoće vode postanu neprikladne za ispitni organizam ili ako utječu na uravnoteženje kemikalije (npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlučivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji utječu na pH i/ili tvrdoću vode). Međutim, obično su dostatne i daje se prednost drugim metodama poboljšanja kakvoće vode iznad sedimenta, kao što je dozračivanje. Hrana 31. Potrebno je hraniti ličinke, po mogućnosti svakodnevno ili najmanje triput tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino usitnjene hrane, npr. Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u količini od 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za C. yoshimatui) dnevno po ličinki prikladna za mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po ličinki trebalo bi biti dostatno za ostatak ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako adsorptive tvari (npr. čiji je log Kow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije može dodati količina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora koristiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog lišća npr. velike koprive (Urtica dioica), duda (Morus alba), bijele djeteline (Trifolium repens), špinata (Spinacia oleracea) ili nekog drugog biljnog materijala (Cerophyl ili alfa-celuloze). Uvjeti za inkubaciju 32. Blago dozračivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja ličinki i traje tako tijekom cijelog ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne ispod 60 posto ASV-a). Dozračivanje se vrši putem staklene pasterove pipete pričvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehurića/s). Pri ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozračuje sustav sediment/voda. 33. Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans i C. yoshimatui preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C (± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a jačina svjetlosti treba biti 500 do 1 000 luksa. Trajanje izlaganja 34. Izlaganje počinje dodavanjem ličinki u posude sa sedimentom obrađenim spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 65 dana za C. tentans. Ako se ličinke prije preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana nakon što se i zadnja ličinka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu životinju. Promatranja Preobrazba 35. Određuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima. 36. Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuobičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase jajašaca položene prije prekida ispitivanja te iste treba izvaditi kako bi se spriječilo ponovno uvođenje ličinki u sediment. Također se bilježi i broj vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju preobrazbe navedene su u Dodatku 5. Rast i preživljavanje 37. Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu ličinki, na samom početku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm kako bi se zadržale ličinke. Kriteriji za smrt jesu nepomičnost ili izostanak reakcije na mehaničke podražaje. I neoporavljene ličinke treba prebrojati kao mrtve (možda su mikrobi već razgradili ličinke koje su uginule na početku ispitivanja). Određuje se suha masa (bez pepela) preživjelih ličinki po svakoj ispitnoj posudi pa se izračunava srednja pojedinačna suha masa po posudi. Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele ličinke; za to se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake ličinke. Analitička mjerenja Koncentracija ispitivane tvari 38. Prije početka ispitivanja (tj. dodavanja ličinki) vade se uzorci cjelovitog sedimenta iz najmanje jedne posude po tretmanu radi analitičkog određivanja koncentracije ispitivane tvari u sedimentu. Preporučuje se da se na početku (vidjeti stavak 24.) i na kraju ispitivanja analiziraju, kao minimum, uzorci vode iznad sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncentraciji i u nekoj nižoj. Ta određivanja koncentracije ispitivane tvari daju informacije o ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment. 39. Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to pritom ne utječe na sustav ispitivanja, analitička određivanja treba provoditi na uzorcima iz dodatnih ispitnih posuda koje se tretiraju na isti način (uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za biološka promatranja. 40. Preporučeni postupak za izoliranje međuprostorne vode jest centrifugiranje na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Međutim, ako se pokaže da se ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U nekim slučajevima možda neće biti moguće analizirati koncentracije u pornoj vodi jer je uzorak premalen. Fizikalno-kemijski parametri 41. Na odgovarajući način treba izmjeriti pH i temperaturu u ispitnim posudama (vidjeti stavak 10.). Tvrdoću i amonijak treba mjeriti u kontrolnim posudama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Obrada rezultata 42. Cilj ovog ispitivanja jest odrediti učinak ispitivane tvari na brzinu razvoja i ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slučaju 10-dnevnog ispitivanja, učinke na preživljavanje i masu ličinki. Ako ne postoje naznake statistički različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki mogu se ujediniti radi statističke analize. Razlike u osjetljivosti spolova mogu se statistički prosuditi, npr. tabličnim testom χ2-r × 2. Preživljavanje ličinki i njihova srednja pojedinačna suha masa po posudi moraju se odrediti nakon deset dana kada je to potrebno. 43. Koncentracije s učinkom izražene i utemeljene na suhoj masi izračunavaju se po mogućnosti na temelju koncentracija u sedimentu izmjerenih na početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.). 44. Za izračun procjene točke EC50 ili bilo koje druge ECx kao dodatna ponovna određivanja mogu se koristiti statistički podaci dobiveni za svaku posudu. U izračunu intervala pouzdanosti za bilo koji ECx u obzir treba uzeti varijabilnost između posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost toliko neznatna da se može ignorirati. Kad se model prilagođava metodi najmanjih kvadrata, na statističke podatke za svaku posudu treba primijeniti transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Međutim, vrijednosti ECx trebale bi se izračunati tek nakon što se odgovor transformira natrag u izvornu vrijednost. 45. Kada je cilj statističke analize određivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost među posudama, npr. ugniježđenom ANOVA-om. Kao druga mogućnost, u situacijama kada se pobiju pretpostavke uobičajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispitivanja (21). Omjer preobrazbe 46. Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po korak kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad se ti podaci slažu s tim očekivanjem. Ako to nije slučaj, mogu se koristiti Fisherov test ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilagođenim p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još veću varijabilnost između višestrukih određivanja u istoj koncentraciji nego što bi to naznačila binomijalna raspodjela (često zvana i ‚ekstra-binomijalna’ varijacija), treba primijeniti robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21). Određuje se broj mušica preobraženih po posudi, ne, koji se onda dijeli brojem uvedenih ličinki, na: gdje je: ER = omjer preobrazbe ne = broj preobraženih mušica po posudi na = broj uvedenih ličinki po posudi 47. Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primijeniti postupke poput Williamovog testa kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio prikladan gdje nema monotoničnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica veći od pet, i to na osnovi ponovljenog određivanja (posude). 48. Za primjenu vrijednosti ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo transformirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili Freeman-Tukeyovom transformacijom kako bi se dobila približna normalna raspodjela i ujednačile varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primjenjuje se tako što se uzme inverzni sinus (sin–1) drugog korijena ER-a. 49. Za omjere preobrazbe vrijednosti ECx računaju se regresijskom analizom (ili npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomična odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomični prosjek ili jednostavna interpolacija. Brzina razvoja 50. Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena između uvođenja ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. (Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost ličinki u trenutku uvođenja). Brzina razvoja recipročna je vremenu razvoja (jedinica: 1/dan) i predstavlja dio razvoja ličinki koji se odvija tijekom jednog dana. Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksičnosti sedimenta jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti moćni postupci parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti ECx regresijskom analizom (npr. (23), (24)). 51. Za sljedeće statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamijećen na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu između dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obično 1 dan). Srednja brzina razvoja po posudi (‾x) računa se prema: gdje je: : srednja brzina razvoja po posudi i : indeks intervala pregleda m : maksimalni broj intervala pregleda : broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i ne : ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (= ) xi : brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i gdje je: dayi : dan pregleda (dani od primjene) li : trajanje intervala pregleda i (dani, obično 1 dan) Izvješće o ispitivanju 52. Izvješće o ispitivanju mora sadržavati barem sljedeće podatke: Ispitivana tvar: — fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (topljivost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako postoji), stabilnost u vodi itd.); — podaci za identifikaciju kemikalije (opći naziv, kemijski naziv, CAS broj itd.), uključujući i čistoću i analitičku metodu kvantifikacije ispitivane tvari. Ispitne vrste: — korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i uvjeti uzgoja; — podaci o rukovanju masama jajašaca i ličinkama; — starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude. Uvjeti ispitivanja: — korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment; — za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uključujući, po mogućnosti, povijest onečišćenja, svojstva: pH, sadržaj organskog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno); — priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog ugljika, pH, vlaga itd. na početku ispitivanja); — priprema ispitne vode (ako se koristi obrađena voda) i svojstva (koncentracija kisika, pH, provodljivost, tvrdoća itd. na početku ispitivanja); — dubina sedimenta i vode iznad sedimenta; — volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa i bez porne vode; — ispitne posude (materijal i veličina); — metoda obrađivanja sedimenta spikingom: korištene ispitne koncentracije, broj višestrukih određivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten; — faza stabilizacijskog uravnoteženja sustava sediment/voda obrađenog spikingom: trajanje i uvjeti; — uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i jačina svjetlosti, dozračivanje (učestalost i intenzitet); — detaljni podaci o hranjenju, uključujući i vrstu hrane, pripremu, količinu i režim hranjenja. Rezultati: — nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati svih analiza za određivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj posudi; — kakvoća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, tvrdoća i amonijak; — nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo; — broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu; — broj ličinki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi; — srednja pojedinačna suha masa ličinki po posudi i po stadiju razvoja, ako je to primjereno; — postotak preobrazbe po određivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i ženske mušice zajedno); — srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po određivanju i brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno); — procjena toksičnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani intervali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statističke metode korištene za njihovo određivanje; — rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode. LITERATURA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 2. Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Ispitna metoda C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice. 15. Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. 16. Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. 17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. 18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. 19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. 20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. 21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. 22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. 23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. 24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Dodatak 1. DEFINICIJE Za potrebe ove ispitne metode koriste se sljedeće definicije: Formulirani sediment ili obrađeni, umjetni ili sintetički sediment je smjesa tvari koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta. Voda iznad sedimenta je voda koja se ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta. Međuprostorna voda ili porna voda je voda u prostoru između sedimenta i čestica tla. Sediment obrađen spikingom je sediment u koji je dodana ispitivana tvar. Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom. Dodatak 2. Preporuke za uzgoj kulture Chironomus riparius 1. Ličinke vrste Chironomus mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Također se pokazalo da je dijatomejska zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgubljena isparavanjem i spriječilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadolijevati. Treba osigurati blago dozračivanje. Posude za uzgoj ličinki trebale bi se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda neće doći do kopulacije (minimalno oko 30 × 30 × 30 cm). 2. Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (jačine oko 1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješća saznajemo da vlažnost zraka ispod 60 % RV može spriječiti razmnožavanje. Voda za razrjeđivanje 3. Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sintetička voda. Obično se koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. mediji Elendt ‚M4’ ili ‚M7’, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije uporabe mora dozračiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjevčice s ličinkama. Hranjenje ličinki 4. Ličinke vrste Chironomus treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra Min®, Tetra Phyll® ili neka druga slična robna marka riblje hrane), i to otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane. 5. Hranjenje se prilagođava kakvoći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj kultura postane ‚mutna’, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja ličinki prema vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do povećane aktivnosti mikroba i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta. 6. Također se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kada se postavljaju nove posude za uzgoj kultura. Hranjenje preobraženih odraslih životinja 7. Neki izvođači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namočen u zasićenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle životinje. Preobrazba 8. Na 20 ± 2 °C ličinke se počinju preobražavati u odrasle životinje iz posuda za uzgoj ličinki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima. Mase jajašaca 9. Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksičnosti. 10. Valjenje ličinki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana. Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture 11. Kad se kulture razviju, trebalo bi biti moguće postaviti novu posudu za uzgoj kulture jedanput tjedno ili rjeđe, ovisno o potrebama ispitivanja, i ukloniti starije posude nakon što se ličinke preobraze u odrasle mušice. Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih životinja. Priprema ispitnih otopina ‚M4’ i ‚M7’ 12. Elendt (1990.) je opisao medij ‚M4’. Medij ‚M7’ priprema se kao medij ‚M4’, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u ‚M7’ od onih u ‚M4’. Publikacija o mediju ‚M7’ trenutačno se priprema (Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 i K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne. Priprema medija ‚M7’ 13. Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija ‚M7’ miješa se pedeset ml kombinirane radne otopine (II) i količine svake radne otopine makronutrijenata navedene u tablici 2. do ukupno 1 litre deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je naznačeno u tablici 3., a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine dodaje se konačnom mediju ‚M7’ tik prije uporabe. (Vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima). Medij se dozrači i stabilizira. LITERATURA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Tablica 1. Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7 Radne otopine (I) Količina (mg) od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode Za pripremu kombinirane radne otopine (II): pomiješajte sljedeće količine (mg) radnih otopina (I) u do 1 litre deionizirane vode Konačne koncentracije u ispitnim otopinama (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tablica 2. Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7 Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode (mg) Količina radnih otopina makronutrijenata koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7 (ml/l) Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KC1 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tablica 3. Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7. Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u jednu vitaminsku radnu otopinu. Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode (mg) Količina vitaminske radne otopine koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7 (ml/l) Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7 (mg/l) Tiamin-hidroklorid 750 0,1 0,075 Cijanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITERATURA Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Dodatak 3. PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA Sastav sedimenta Formulirani sediment trebao bi imati sljedeći sastav: Sastojak Svojstva % sedimenta suha masa Treset Sphagnum moss treset, što bliže pH području od 5,5-6,0, bez vidljivih ostataka biljaka, fino usitnjen (veličina čestica ≤ 1 mm) i sušen na zraku 4 - 5 Kremeni pijesak Veličina zrna: > 50 % čestica trebalo bi biti u rasponu od 50-200 μm 75 - 76 Kaolinitska glina Sadržaj kaolinita ≥ 30 % 20 Organski ugljik Prilagođava se dodavanjem treseta i pijeska 2 (± 0,5) Kalcijev karbonat CaCO3, u prahu, kemijski čist 0,05 (- 0,1) Voda Provodljivost ≤ 10 μS/cm 30 (- 50) Priprema Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomoću uređaja za homogenizaciju visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u području od 5,5 ± 0,5 pomoću CaCO3. Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna komponenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deioniziranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u području od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH konačne smjese i podešava na 6,5 do 7,5 pomoću CaCO3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom ispitivanju. Skladištenje Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu. LITERATURA Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksičnost za gujavice. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Dodatak 4. Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje Tvar Koncentracije Lebdeće čestice < 20 mg/l Ukupni organski ugljik < 2 mg/l Neionizirani amonijak < 1 μg/l Tvrdoća kao CaCO3 < 400 mg/l (17) Rezidualni klor < 10 μg/l Ukupni organofosforni pesticidi < 50 ng/l Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bifenili < 50 ng/l Ukupni organski klor < 25 ng/l Dodatak 5. Smjernice za praćenje preobrazbe ličinki trzalaca U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih zamki: A: najlonski zaslon B: obrnute plastične čaše C: laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika D: priključci na zaslonu za promjenu vode E: voda F: sediment C.28. TEST TOKSIČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI IZ SEDIMENTA S VODOM OBRAĐENOM SPIKINGOM UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara OECD TG 219 (2004.). Ova je ispitna metoda namijenjena procjeni učinaka produljenog izlaganja kemikalija ličinkama slatkovodnih dvokrilaca trzalaza (Chironomus sp) koje borave u sedimentu. Uglavnom se temelji na smjernici BBA u kojoj se koristi sustav ispitivanja sediment/voda s umjetnim tlom i scenarij izlaganja u vodenom stupcu (1). Ona također uzima u obzir i postojeće protokole testova toksičnosti za Chironomus riparius i Chironomus tentans koji su razvijeni u Europi i Sjevernoj Americi (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prstenastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima postoji dobra dokumentacija, npr. Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest obrađivanje vode spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja ovisi o cilju provođenja testa. Cilj scenarija izlaganja u vodi, uključujući i obrade vodenog stupca spikingom, jest simulirati rasap pesticida, a obuhvaća i početne vršne koncentracije u pornoj vodi. Koristan je i za druge vrste izlaganja (uključujući i izlijevanja kemikalija), osim procesa akumulacije koji traju dulje od razdoblja ispitivanja. 3. Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obično u njemu opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na razne načine. Relativna važnost svakog načina izlaganja i vrijeme potrebno da bi svaki od tih načina pridonio općim učincima toksičnosti ovise o fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log Kow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kovalentnim vezama značajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane hrane. Kako se ne bi podcijenila toksičnost jako lipofilnih tvari, može se u obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni načini izlaganja, ova se ispitna metoda usredotočuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 28 - 65 dana za C. tentans. Ako su za neku specifičnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi istraživanja učinaka nestabilnih kemikalija, višestruka određivanja mogu se ukinuti nakon deset dana. 4. Izmjereni konačni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u vrijeme preobrazbe. Preporučuje se da se preživljavanje i rast ličinki mjere tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to prikladno. 5. Preporučuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima: — pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu ‚standardiziranu matricu’ te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontaminiranih i čistih izvora sedimenta; — testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suočava sa sezonskom varijabilnošću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja urođene faune; uporaba formuliranog sedimenta također snižava troškove povezane s terenskim prikupljanjem dovoljnih količina sedimenta za rutinsko testiranje; — uporaba formuliranog sedimenta omogućuje usporedbu toksičnosti i razvrstavanje tvari u skladu s tim: podaci o toksičnosti iz testova s prirodnim i umjetnim sedimentom mogli su se usporediti za nekoliko kemikalija (2). 6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1. NAČELO ISPITIVANJA 7. Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija ispitivane tvari u sustavima sediment/voda. Ispitivanje počinje stavljanjem ličinki u prvom stadiju razvoja u ispitne laboratorijske čaše u kojima se nalazi sustav sediment/voda i naknadnom obradom ispitivane tvari u vodi spikingom. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. Također se mogu mjeriti i preživljavanje i masa ličinki nakon deset dana, ako je to potrebno (pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to primjereno). Ti se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem određivanja koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preobrazbi, preživljavanju ili rastu ličinki (npr. EC15, EC50 itd.) bilo statističkim hipotetskim testiranjem s ciljem određivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje je potrebna usporedba vrijednosti učinka s kontrolnim vrijednostima pomoću statističkih testova. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI 8. Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, izmjerena ili izračunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. Treba biti dostupna pouzdana analitička metoda kvantifikacije ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznošću i granicama detekcije. Korisne informacije obuhvaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abiotička i biotička razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12). REFERENTNE KEMIKALIJE 9. Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodično kako bi se osigurala pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksičnih tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studijama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev klorid. (1)(2)(5)(6)(13). VALJANOST ISPITIVANJA 10. Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljedeći uvjeti: — postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi najmanje 70 %. (1)(6); — preobrazba vrsti C. riparius i C. yoshimatsui u odrasle životinje u kontrolnim posudama treba se odviti između 12. i 23. dana nakon njihova umetanja u posude; za vrstu C. tentans potrebno je razdoblje od 20 do 65 dana. — na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 % vrijednosti zasićenosti kisikom (ASV) na određenoj temperaturi, a pH vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim posudama; — temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. Temperatura vode može se kontrolirati izotermičkom sobom i u tom slučaju temperatura u prostoriji treba se potvrđivati u odgovarajućim vremenskim razmacima. OPIS METODE Ispitne posude 11. Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajamčiti da je i u njima prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj ličinki bude 2 do 3 cm2 površine. Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja treba biti načinjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog materijala (npr. teflona). Odabir vrste 12. Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogućnosti je Chironomus riparius. I vrsta Chironomus tentans također je prikladna, ali je njome teže rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i vrsta Chironomus yohimatsui. Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se u Dodatku 2. za vrstu Chironomus riparius. Podaci o uvjetima uzgoja kulture dostupni su također i za druge vrste, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju. Sediment 13. Po mogućnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obrađeni, umjetni ili sintetički sediment). Međutim, ako se koristi prirodni sediment, isti se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i određivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nikakvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Također se preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporučuje se sljedeći formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), (1)(15)(16): (a) 4-5 % (suhe mase) treseta: što je moguće bliže pH od 5,5 do 6,0; važno je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veličine čestica ≤ 1 mm) i isključivo sušen na zraku. (b) 20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogućnosti iznad 30 %). (c) 75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevladavati s više od 50 % čestica između 50 i 200 μm). (d) Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobila vlaga konačne smjese u rasponu od 30 - 50 %. (e) Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvoće (CaCO3) kako bi se pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5. (f) Sadržaj organskog ugljika konačne smjese trebao bi iznositi 2 % (± 0,5 %) i treba se prilagoditi dodavanjem odgovarajućih količina treseta i pijeska prema (a) i (c). 14. Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formuliranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka također je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni. Voda 15. Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna voda (površinske ili podzemne vode), obrađena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na početku testa pH ispitne vode treba biti između 6 i 9, a ukupna tvrdoća ne viša od 400 mg/l kao CaCO3. Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (u toj se situaciji stoga ne smije koristiti medij Elendt M4). Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvoće vode navedena u Dodatku 4. značajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva. Radne otopine - voda obrađena spikingom 16. Ispitne koncentracije izračunavaju se na temelju koncentracija u vodenom stupcu, tj. u vodi iznad sedimenta. Ispitne otopine u odabranoj koncentraciji pripremaju se razrjeđivanjem radne otopine. Radne otopine trebalo bi, po mogućnosti, pripremiti otapanjem ispitivane tvari u ispitnom mediju. Možda će u nekim slučajevima biti potrebno upotrijebiti otapala ili dispergente kako bi se dobila prikladno koncentrirana radna otopina. Primjeri prikladnih otapala jesu: aceton, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamid i trietilen glikol. Dispergenti koji se mogu koristiti jesu Cremophor RH40, Tween 80, metil-celuloza 0,01 % i HCO-40. Koncentracija otapajućeg sredstva u konačnom ispitnom mediju trebala bi biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) i trebala bi biti ista u svim tretmanima. Kada se koristi otapajuće sredstvo, ono ne smije imati nikakve značajne učinke na preživljavanje ili nikakav vidljiv negativan učinak na ličinke trzalaca, što se otkriva kontrolom samo s otapalom. Međutim, treba uložiti sve napore da se izbjegne uporaba takvih tvari. PLAN ISPITIVANJA 17. Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj ličinki po posudi. Opisani su planovi za procjenu točke koncentracije s učinkom (EC), za procjenu najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC) i za provođenje graničnog ispitivanja. Regresijskoj se analizi daje prednost nad pristupom testiranja hipoteze. Plan za regresijsku analizu 18. Koncentracija s učinkom (npr. EC15, EC50) i raspon koncentracije, iznad kojega je učinak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhvaćati koncentracije uključene u ispitivanje. Općenito, preciznost, a posebno valjanost, s kojom se mogu procijeniti koncentracije s učinkom (ECx), poboljšavaju se kad se koncentracija s učinkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija. Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za određivanje raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti (vidjeti stavak 27.). 19. Ako treba procijeniti ECx, treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri višestruka određivanja. U svakom se slučaju savjetuje korištenje dovoljnog broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva (iznimka se može učiniti u slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj višestrukih određivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se poveća broj ispitnih koncentracija različitog odgovora. Povećanjem broja višestrukih određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obično dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka određivanja potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast ličinki. Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a 20. Ako treba procijeniti LOEC/NOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom/najvišu koncentraciju bez vidljivog učinka), treba koristiti pet ispitnih koncentracija u najmanje četiri višestruka određivanja, a faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva. Broj višestrukih određivanja trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod brzine razvoja obično je prikladna analiza varijance (ANOVA), kao što su Dunnettov test i Williamsov test (17)(18)(19)(20). Kod omjera preobrazbe mogu se koristiti Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test. Granično ispitivanje 21. Može se provesti granično ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za određivanje raspona ne vide nikakvi učinci. Cilj graničnog ispitivanja jest naznačiti da je vrijednost toksičnosti ispitivane tvari veća od ispitivane granične koncentracije. U ovoj se ispitnoj metodi ne mogu dati nikakvi prijedlozi preporučene koncentracije; to se prepušta prosudbi zakonodavca. Obično je potrebno najmanje šest višestrukih određivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba pokazati adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metričkog odgovora (brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statistička metoda ako podaci zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili neparametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera preobrazbe prikladan je Fisherov test. POSTUPAK Uvjeti izlaganja Priprema sustava voda/sediment obrađenog spikingom 22. Odgovarajuće količine formuliranog sedimenta (vidjeti stavke 13.-14. i Dodatak 3.) dodaju se u ispitne posude gdje tvore sloj debljine najmanje 1,5 cm. Voda se nadolijeva do 6 cm (vidjeti stavak 15.). Omjer debljine sloja sa sedimentom i dubine vode ne bi smio premašivati 1:4, a sloj sa sedimentom ne bi trebao biti deblji od 3 cm. Sustav sediment/voda treba blago dozračivati sedam dana prije dodavanja ispitnih organizama (vidjeti stavak 14. i Dodatak 3.). Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti plastičnim diskom dok se na njega lijeva voda, a disk se miče odmah nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi predmeti. 23. Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim pločama). Ako je potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomoću destilirane ili deionizirane vode kako bi se spriječilo stvaranje soli. Dodavanje ispitnih organizama 24. Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz matične kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture treba dodati manju količinu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica suspenzije fino mljevenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje ličinki obično počinje nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za Chironomus riparius na 20 °C i 1 do 4 dana za Chironomus tentans na 23 °C i za Chironomus yoshimatui na 25 °C), a ličinke se razvijaju u četiri stadija razvoja, od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti ličinke iz prvog stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica moguće je provjeriti pomoću širine kapsule glave (6). 25. Dvadeset ličinki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obrađen spikingom, i to pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozračivanje vode tijekom dodavanja ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja ličinki (vidjeti stavke 24. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja (vidjeti stavke 19. i 20.) broj ličinki po koncentraciji iznosi najmanje 60 za procjenu točke EC-a i 80 za određivanje NOEC-a. 26. Dvadeset i četiri sata nakon dodavanja ličinki ispitivana tvar dodaje se spikingom u vodeni stupac iznad sedimenta i ponovno se osigura blago dozračivanje. Male količine otopina ispitivane tvari stavljaju se ispod površine vode pipetom. Voda iznad sedimenta trebala bi se potom pažljivo promiješati kako se sediment ne bi umiješao. Ispitne koncentracije 27. Ispitivanje za određivanje raspona može biti korisno za određivanje raspona koncentracija za konačno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gustoća površine po trzalcu, koja će se koristiti i u konačnom ispitivanju, trzalci se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogućuje procjenu odgovarajućih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna višestruka određivanja. 28. O ispitnim koncentracijama za konačno ispitivanje odlučuje se na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20. Kontrolne posude 29. U ispitivanje bi, s odgovarajućim brojem višestrukih određivanja, trebalo uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta. Sustav ispitivanja 30. Koriste se statički sustavi. Polustatični ili protočni sustavi sa stalnim ili isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u iznimnim slučajevima, na primjer ako specifikacije kakvoće vode postanu neprikladne za ispitni organizam ili ako utječu na uravnoteženje kemikalije (npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlučivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji utječu na pH i/ili tvrdoću vode). Međutim, obično su dostatne i daje se prednost drugim metodama poboljšanja kakvoće vode iznad sedimenta, kao što je dozračivanje. Hrana 31. Potrebno je hraniti ličinke, po mogućnosti svakodnevno ili najmanje triput tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino mljevene hrane, npr. Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u količini od 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za C. yoshimatui) dnevno po ličinki prikladna za mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po ličinki trebalo bi biti dostatno za ostatak ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako adsorptive tvari (npr. čiji je log Kow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije može dodati količina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora koristiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog lišća npr. velike koprive (Urtica dioica), duda (Morus alba), bijele djeteline (Trifolium repens), špinata (Spinacia oleracea) ili nekog drugog biljnog materijala (Cerophyl ili alfa-celuloze). Uvjeti za inkubaciju 32. Blago dozračivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja ličinki i traje tako tijekom cijelog ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne ispod 60 % ASV-a). Dozračivanje se vrši putem staklene pasterove pipete pričvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehurića/s). Pri ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozračuje sustav sediment/voda. 33. Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans i C. yoshimatui preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C (± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a jačina svjetlosti treba biti 500 do 1 000 luksa. Trajanje izlaganja 34. Izlaganje počinje dodavanjem ličinki u posude sa sedimentom obrađenim spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 65 dana za C. tentans. Ako se ličinke prije preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana nakon što se i zadnja ličinka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu životinju. PROMATRANJA Preobrazba 35. Određuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima. 36. Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuobičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase jajašaca položene prije prekida ispitivanja te ih treba izvaditi kako bi se spriječilo ponovno uvođenje ličinki u sediment. Također se bilježi i broj vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju preobrazbe navedene su u Dodatku 5. Rast i preživljavanje 37. Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu ličinki, na samom početku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm kako bi se zadržale ličinke. Kriteriji za smrt jesu nepomičnost ili izostanak reakcije na mehaničke podražaje. I neoporavljene ličinke treba prebrojati kao mrtve (možda su mikrobi već razgradili ličinke koje su uginule na početku ispitivanja). Određuje se suha masa (bez pepela) preživjelih ličinki po svakoj ispitnoj posudi pa se izračunava srednja pojedinačna suha masa po posudi. Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele ličinke; za to se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake ličinke. Analitička mjerenja Koncentracija ispitivane tvari 38. Kao minimum, na početku (po mogućnosti sat vremena poslije dodavanja ispitivane tvari) i na kraju ispitivanja moraju se analizirati uzorci vode iznad sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncentraciji i u nekoj nižoj. Ta određivanja koncentracije ispitivane tvari daju informacije o ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment. Uzorkovanje sedimenta na početku ispitivanja može utjecati na sustav ispitivanja (npr. uklanjanje ispitnih ličinki) pa bi stoga trebalo koristiti dodatne ispitne posude za provođenje analitičkih određivanja na početku i tijekom ispitivanja, po potrebi (vidjeti stavak 39.). Možda neće biti potrebno provoditi mjerenja u sedimentu ako je razdioba ispitivane tvari i između vode i sedimenta jasno određena u studiji vode/sedimenta u poredbenim uvjetima (npr. omjer sedimenta i vode, vrsta primjene, sadržaj organskog ugljika u sedimentu). 39. Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to pritom ne utječe na sustav ispitivanja, analitička određivanja treba provoditi na uzorcima iz dodatnih ispiinih posuda koje se tretiraju na isti način (uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za biološka promatranja. 40. Preporučeni postupak za izoliranje međuprostorne vode jest centrifugiranje na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Međutim, ako se pokaže da se ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U nekim slučajevima možda neće biti moguće analizirati koncentracije u pornoj vodi jer je uzorak premalen. Fizikalno-kemijski parametri 41. Na odgovarajući način treba izmjeriti pH, otopljeni kisik u ispitnoj vodi i temperaturu u ispitnim posudama (vidjeti stavak 10.). Tvrdoću i amonijak treba mjeriti u kontrolnim posudama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Obrada rezultata 42. Cilj ovog ispitivanja jest odrediti učinak ispitivane tvari na brzinu razvoja i ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slučaju 10-dnevnog ispitivanja, učinke na preživljavanje i masu ličinki. Ako ne postoje naznake statistički različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki mogu se ujediniti radi statističke analize. Razlike u osjetljivosti spolova mogu se statistički prosuditi, npr. tabličnim testom χ2-r × 2. Preživljavanje ličinki i njihova srednja pojedinačna suha masa po posudi moraju se odrediti nakon 10 dana kada je to potrebno. 43. Koncentracije s učinkom izražene kao koncentracije u vodi iznad sedimenta izračunavaju se po mogućnosti na temelju koncentracija izmjerenih na početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.). 44. Za izračun procjene točke EC50 ili bilo koje druge ECx kao dodatna ponovna određivanja mogu se koristiti statistički podaci dobiveni za svaku posudu. U izračunu intervala pouzdanosti za bilo koji ECx u obzir treba uzeti varijabilnost između posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost toliko neznatna da se može ignorirati. Kada se model prilagođava metodi najmanjih kvadrata, na statističke podatke za svaku posudu treba primijeniti transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Međutim, vrijednosti ECx trebale bi se izračunati tek nakon što se odgovor transformira natrag u izvornu vrijednost. 45. Kada je cilj statističke analize određivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost među posudama, npr. ugniježđenom ANOVA-om. Kao druga mogućnost, u situacijama kada se pobiju pretpostavke uobičajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispitivanja (21). Omjer preobrazbe 46. Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po korak kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad se ti podaci slažu s tim očekivanjem. Ako to nije slučaj, mogu se koristiti Fisherov test ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilagođenim p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još veću varijabilnost između višestrukih određivanja u istoj koncentraciji nego što bi to naznačila binomijalna raspodjela (često zvana i ‚ekstra-binomijalna’ varijacija), treba primijeniti robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21). 47. Određuje se broj mušica preobraženih po posudi, ne, koji se onda dijeli brojem uvedenih ličinki, na: gdje je: ER = omjer preobrazbe ne = broj preobraženih mušica po posudi na = broj uvedenih ličinki po posudi 48. Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primijeniti postupke poput Williamovog testa kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio prikladan gdje nema monotoničnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica veći od pet, i to na osnovi ponovljenog određivanja (posude). 49. Za primjenu vrijednosti metode ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo transformirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili Freeman-Tukeyovom transformacijom kako bi se dobila približna normalna raspodjela i ujednačile varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primjenjuje se tako što se uzme inverzni sinus (sin–1) drugog korijena ER-a. 50. Za omjere preobrazbe vrijednosti ECx računaju se regresijskom analizom (ili npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomična odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomični prosjek ili jednostavna interpolacija. Brzina razvoja 51. Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena između uvođenja ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. (Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost ličinki u trenutku uvođenja). Brzina razvoja recipročna je vremenu razvoja (jedinica: 1/dan) i predstavlja dio razvoja ličinki koji se odvija tijekom jednog dana. Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksičnosti sedimenta jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti moćni postupci parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti ECx regresijskom analizom (npr. (23), (24)). 52. Za sljedeće statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamijećen na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu između dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obično 1 dan). Srednja brzina razvoja po posudi x računa se prema: gdje je: : srednja brzina razvoja po posudi i : indeks intervala pregleda m : maksimalni broj intervala pregleda : broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i ne : ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (= ) xi : brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i gdje je: dayi : dan pregleda (dani od primjene) li : trajanje intervala pregleda i (dani, obično 1 dan) Izvješće o ispitivanju 53. Izvješće o ispitivanju mora sadržavati barem sljedeće podatke: Ispitivana tvar: — fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (topljivost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako postoji), stabilnost u vodi itd.); — podaci za identifikaciju kemikalije (opći naziv, kemijski naziv, CAS broj itd.), uključujući i čistoću i analitičku metodu kvantifikacije ispitivane tvari. Ispitne vrste: — korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i uvjeti uzgoja; — podaci o rukovanju masama jajašaca i ličinkama; — starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude. Uvjeti ispitivanja: — korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment; — za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uključujući, po mogućnosti, povijest onečišćenja, svojstva: pH, sadržaj organskog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno). — priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog ugljika, pH, vlaga itd. na početku ispitivanja); — priprema ispitne vode (ako se koristi obrađena voda) i svojstva (koncentracija kisika, pH, provodljivost, tvrdoća itd. na početku ispitivanja); — dubina sedimenta i vode iznad sedimenta; — volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa i bez porne vode; — ispitne posude (materijal i veličina); — metoda pripreme radnih otopina i ispitnih koncentracija; — uporaba ispitivane tvari: korištene ispitne koncentracije, broj višestrukih određivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten; — uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i jačina svjetlosti, dozračivanje (učestalost i intenzitet); — detaljni podaci o hranjenju, uključujući i vrstu hrane, pripremu, količinu i režim hranjenja. Rezultati: — nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati svih analiza za određivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj posudi; — kakvoća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, tvrdoća i amonijak; — nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo; — broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu; — broj ličinki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi; — srednja pojedinačna suha masa ličinki po posudi i po stadiju razvoja, ako je to primjereno; — postotak preobrazbe po određivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i ženske mušice zajedno); — srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po određivanju i brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno); — procjena toksičnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani intervali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statističke metode korištene za njihovo određivanje; — rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode. LITERATURA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. 2. Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Poglavlje C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice, 15. Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. 16. Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. 17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. 18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. 19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. 20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. 21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. 22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. 23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. 24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Dodatak 1. DEFINICIJE Za potrebe ove metode koriste se sljedeće definicije: Formulirani sediment ili obrađeni, umjetni ili sintetički sediment je smjesa tvari koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta. Voda iznad sedimenta je voda koja se u ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta. Međuprostorna voda ili porna voda je voda u prostoru između sedimenta i čestica tla. Voda obrađena spikingom je voda u koju je dodana ispitivana tvar. Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom. Dodatak 2. Preporuke za uzgoj kulture Chironomus riparius 1. Ličinke vrste Chironomus mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Također se pokazalo da je dijatomejska zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgubljena isparavanjem i spriječilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadolijevati. Treba osigurati blago dozračivanje. Posude za uzgoj ličinki trebale bi se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda neće doći do kopulacije (minimalno oko 30 x 30 x 30 cm). 2. Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (jačine oko 1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješća saznajemo da vlažnost zraka ispod 60 % RV može spriječiti razmnožavanje. Voda za razrjeđivanje 3. Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sintetička voda. Obično se koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. mediji Elendt ‚M4’ ili ‚M7’, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije uporabe mora dozračiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjevčice s ličinkama. Hranjenje ličinki 4. Ličinke vrste Chironomus treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra Min®, Tetra Phyll® ili neka druga slična robna marka riblje hrane), i to otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane. 5. Hranjenje se prilagođava kakvoći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj kultura postane ‚mutna’, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja ličinki prema vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do povećane aktivnosti mikroba i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta. 6. Također se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kada se postavljaju nove posude za uzgoj kultura. Hranjenje preobraženih odraslih životinja 7. Neki izvođači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namočen u zasićenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle životinje. Preobrazba 8. Na 20 ± 2 °C ličinke se počinju preobražavati u odrasle životinje iz posuda za uzgoj ličinki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima. Mase jajašaca 9. Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksičnosti. 10. Valjenje ličinki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana. Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture 11. Kad se kulture razviju, trebalo bi biti moguće postaviti novu posudu za uzgoj kulture jedanput tjedno ili rjeđe, ovisno o potrebama ispitivanja, i ukloniti starije posude nakon što se ličinke preobraze u odrasle mušice. Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih životinja. Priprema ispitnih otopina ‚M4’ i ‚M7’ 12. Elendt (1990.) je opisao medij ‚M4’. Medij ‚M7’ priprema se kao medij ‚M4’, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u ‚M7’ od onih u ‚M4’. Publikacija o mediju ‚M7’ trenutačno se priprema (Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 i K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne. Priprema medija ‚M7’ 13. Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija ‚M7’ miješa se 50 ml kombinirane radne otopine (II) i količine svake radne otopine makronutrijenata navedene u tablici 2. do ukupno 1 l deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je naznačeno u tablici 3., a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine dodaje se konačnom mediju ‚M7’ tik prije uporabe. (Vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima). Medij se dozrači i stabilizira. Tablica 1. Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7 Radne otopine (I) Količina (mg) od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode Za pripremu kombinirane radne otopine (II): pomiješajte sljedeće količine (mg) radnih otopina (I) u do 1 litre deionizirane vode Konačne koncentracije u ispitnim otopinama (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Tablica 2. Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7 Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode (mg) Količina radnih otopina makronutrijenata koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7 (ml/l) Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KC1 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Tablica 3. Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7 Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u jednu vitaminsku radnu otopinu.

Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode (mg) Količina vitaminske radne otopine koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7 (ml/l) Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7 (mg/l) Tiamin-hidroklorid 750 0,1 0,075 Cijanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITERATURA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Dodatak 3. PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA Sastav sedimenta Formulirani sediment trebao bi imati sljedeći sastav: Sastojak Svojstva % sedimenta suha masa Treset Sphagnum moss treset, što bliže pH području od 5,5-6,0, bez vidljivih ostataka biljaka, fino usitnjen (veličina čestica ≤ 1 mm) i sušen na zraku 4-5 Kremeni pijesak Veličina zrna: > 50 % čestica trebalo bi biti u rasponu od 50-200 μm 75-76 Kaolinitska glina Sadržaj kaolinita ≥ 30 % 20 Organski ugljik Prilagođava se dodavanjem treseta i pijeska 2 (± 0,5) Kalcijev karbonat CaCO3, u prahu, kemijski čist 0,05 (- 0,1) Voda Provodljivost ≤ 10 μS/cm 30 (- 50) Priprema Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomoću uređaja za homogenizaciju visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u području od 5,5 ± 0,5 pomoću CaCO3. Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna komponenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deioniziranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u području od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH konačne smjese i podešava na 6,5 do 7,5 pomoću CaCO3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom ispitivanju. Skladištenje Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu. LITERATURA: Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksičnost za gujavice. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Dodatak 4. Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje Tvar Koncentracije Lebdeće čestice < 20 mg/l Ukupni organski ugljik < 2 mg/l Neionizirani amonijak < 1 μg/l Tvrdoća kao CaCO3 < 400 mg/l (20) Rezidualni klor < 10 μg/l Ukupni organofosforni pesticidi < 50 ng/l Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bifenili < 50 ng/l Ukupni organski klor < 25 ng/l Dodatak 5. Smjernice za praćenje preobrazbe ličinki trzalaca U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih zamki: A : najlonski zaslon B : obrnute plastične čaše C : laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika D : priključci na zaslonu za promjenu vode E : voda F : sediment C.29. LAKA BIORAZGRADIVOST - CO2 U ZAČEPLJENIM POSUDAMA (TEST PLINSKOG PROSTORA (HEADSPACE)) UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 310 (2006.). Ova ispitna metoda je metoda probira za evaluaciju lake biorazgradivosti kemikalija, a informacije sadržane u njoj slične su informacijama o šest metoda opisanih u poglavlju C.4 Priloga A do F. Dakle, kemikalija koja pokazuje pozitivne rezultate u ovoj ispitnoj metodi može se smatrati lako biorazgradivom te, slijedom toga, i brzo razgradivom u okolišu. 2. Poznata metoda za određivanje ugljikovog dioksida (CO2) (1), utemeljena na Sturmovom izvornom testu (2) za procjenu biorazgradivosti organskih kemikalija, obično je, zbog mjerenja ugljikova dioksida koji nastaje djelovanjem mikroba, prvi izbor za ispitivanje slabo topljivih kemikalija i jako adsorptivnih kemikalija. Također se odabire i za topljive (ali nehlapljive) kemikalije jer mnogi smatraju da je nastajanje ugljikova dioksida jedini nedvosmisleni dokaz djelovanja mikroba. Na opadanje otopljenog organskog ugljika mogu utjecati fizikalno-kemijski procesi - adsorpcija, hlapljenje, precipitacija (taloženje), hidroliza - kao i djelovanje mikroba, a i u mnogim nebiološkim reakcijama troši se kisik; rijetko kad CO2 nastaje od organskih kemikalija abiotički. U izvornom i izmijenjenom Sturmovom testu (1)(2) do opadanja CO2 dolazi u tekućem stanju u apsorpcijske posude propuhivanjem (tj. tretiranjem mjehurića zraka da uklanjaju CO2 iz tekućeg medija), dok se u Larsonovoj verziji (3)(4) CO2 transferira iz reakcijske posude do apsorbera propuštanj