(8)

u dijelu B dodaju se sljedeća poglavlja: „B.63. TEST PROBIRA ZA REPRODUKTIVNU/RAZVOJNU TOKSIČNOST UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 421 (TG) (2016.). Smjernice OECD-a za ispitivanje kemikalija periodično se preispituju uzimajući u obzir znanstveni napredak. Izvorna smjernica za test probira 421 donesena je 1995. na temelju protokola za preliminarni test probira za reproduktivnu toksičnost o kojem se raspravljalo na dva sastanka stručnjaka u Londonu 1990. (1.) i Tokiju 1992. (2.). 2. Ova je ispitna metoda ažurirana relevantnim krajnjim učincima endokrinih ometača, kao nastavno djelovanje na aktivnost visokog prioriteta koju je OECD pokrenuo 1998. kako bi revidirao postojeće smjernice za ispitivanje i razvio nove smjernice za probir i ispitivanje potencijalnih endokrinih ometača (3.). Na primjer, Smjernica OECD-a za ispitivanje 407 (28-dnevno ispitivanje oralne toksičnosti na glodavcima uz primjenu ponovljenih doza, poglavlje B.7. ovog Priloga) poboljšana je 2008. parametrima koji su primjereni za otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivanih kemikalija. Ažuriranjem Smjernice za ispitivanje 421 nastojalo se uključiti određene relevantne krajnje učinke endokrinih ometača u ispitne smjernice za probir ako razdoblja izlaganja obuhvaćaju neka od osjetljivih razdoblja tijekom razvoja (prenatalna razdoblja ili rana postnatalna razdoblja). 3. Odabrani dodatni relevantni krajnji učinci endokrinih ometača, koji su i dio Smjernice za ispitivanje 443 (produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji, poglavlje B.56. ovog Priloga), uključeni su u Smjernicu za ispitivanje 421 na temelju studije izvedivosti koja se bavi znanstvenim i tehničkim pitanjima povezanima s njihovim uključivanjem te mogućim prilagodbama plana ispitivanja koje su potrebne za njihovo uključivanje (4.). 4. Ova je ispitna metoda osmišljena za dobivanje ograničenih informacija o učincima ispitivane kemikalije na reproduktivnost mužjaka i ženki kao što su funkcija gonada, ponašanje kod parenja, začeće, razvoj zametka i parturicija. Ona nije alternativa i ne zamjenjuje postojeće ispitne metode B.31., B.34., B.35. ili B.56. POČETNA RAZMATRANJA 5. Ova se ispitna metoda za probir može upotrebljavati za dobivanje početnih informacija o mogućim učincima na reprodukciju i/ili razvoj, u ranoj fazi procjene toksikoloških svojstava kemikalija ili za zabrinjavajuće kemikalije. Može se upotrebljavati i kao dio testova početnog probira za postojeće kemikalije za koje je dostupno malo ili nimalo toksikoloških informacija, kao istraživanje o utvrđivanju raspona doze za opsežnije reproduktivne/razvojne studije ili ako se smatra relevantnom iz drugih razloga. Pri provođenju istraživanja treba slijediti opća načela i razmatranja navedena u OECD-ovoj Smjernici br. 19 o priznavanju, procjeni i korištenju kliničkih znakova kao humanih krajnjih točaka za pokusne životinje koje se upotrebljavaju u ocjenama sigurnosti (5.). 6. Ovom se ispitnom metodom ne dobivaju potpune informacije o svim aspektima reprodukcije i razvoja. Točnije, metoda pruža samo ograničena sredstva za otkrivanje postnatalnih manifestacija prenatalnog izlaganja ili učinaka koji se mogu inducirati tijekom postnatalnog izlaganja. Zbog (među ostalim) relativno malog broja životinja u skupinama koje primaju dozu, selektivnosti krajnjih učinaka i kratkog trajanja istraživanja ovom metodom neće se dobiti dokazi za konačne tvrdnje o nepostojanju učinaka. Osim toga, ako ne postoje podaci iz drugih ispitivanja reproduktivne/razvojne toksičnosti, pozitivni rezultati korisni su za početnu procjenu opasnosti i pridonose odlukama u pogledu potrebe za dodatnim ispitivanjem i njegova vremenskog okvira. 7. Rezultate dobivene parametrima povezanima s endokrinim sustavom treba promatrati u kontekstu „OECD-ova konceptualnog okvira za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija” (6.). U tom Konceptualnom okviru poboljšana Smjernica OECD-a za ispitivanje 421 nalazi se na razini 4. kao in vivo test i pruža podatke o štetnim učincima na relevantne endokrine krajnje točke. Međutim, endokrini signal ne mora se sam po sebi smatrati dovoljnim dokazom da je ispitivana kemikalija endokrini ometač. 8. U ovoj ispitnoj metodi pretpostavlja se oralna primjena ispitivane kemikalije. Ako se upotrebljavaju drugi načini izlaganja, mogu biti potrebne prilagodbe. 9. Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se te, ako se mogu, zašto se njome mogu dobiti primjereni rezultati za tu svrhu. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. 10. Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1. NAČELO ISPITIVANJA 11. Ispitivana kemikalija primjenjuje se u gradiranim dozama na nekoliko skupina mužjaka i ženki. Na mužjake treba primjenjivati dozu najmanje četiri tjedna te do dana i uključujući dan prije planiranog usmrćivanja (to uključuje najmanje dva tjedna prije parenja, tijekom razdoblja parenja i približno dva tjedna poslije parenja). S obzirom na ograničeno razdoblje doziranja prije parenja u mužjaka, plodnost možda neće biti osobito osjetljiv pokazatelj testikularne toksičnosti. Stoga je od ključne važnosti podroban histološki pregled sjemenika. Kombinacija razdoblja doziranja prije parenja od dva tjedna i naknadno promatranje parenja/plodnosti s ukupnim razdobljem doziranja od najmanje četiri tjedna, nakon čega slijedi podrobna histopatologija muških gonada smatraju se dovoljnima da bi se omogućilo otkrivanje većine učinaka na plodnost mužjaka i spermatogenezu. 12. Ženkama dozu treba davati tijekom cijelog istraživanja. To uključuje dva tjedna prije parenja (pri čemu je cilj obuhvatiti najmanje dva cijela ciklusa estrusa), promjenjivo vrijeme do začeća, trajanje graviditeta i najmanje 13 dana nakon okota, do dana i uključujući dan prije planiranog usmrćivanja. 13. Trajanje istraživanja, nakon aklimatizacije i procjene ciklusa estrusa prije doziranja, ovisi o ponašanju ženki i iznosi približno 63 dana [najmanje 14 dana prije parenja, (do) 14 dana parenja, 22 dana gestacije, 13 dana laktacije]. 14. Tijekom razdoblja primjene životinje se svakodnevno pažljivo promatraju radi uočavanja znakova toksičnosti. Životinje koje uginu ili su usmrćene tijekom razdoblja ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preživjele se životinje usmrćuju i podvrgavaju obdukciji. OPIS METODE Odabir životinjske vrste 15. Ova ispitna metoda osmišljena je za upotrebu na štakorima. Ako se parametri navedeni u ovoj ispitnoj metodi istražuju na drugoj vrsti glodavaca, treba pružiti detaljno obrazloženje. U međunarodnom validacijskom programu za određivanje endokrinih ometača u Smjernici OECD-a za ispitivanje 407 (koja odgovara poglavlju B.7. ovog Priloga) primjenjivali su se samo štakori. Sojeve slabe plodnosti ili poznate po velikoj učestalosti razvojnih defekata ne bi trebalo koristiti. Treba koristiti zdrave životinje koje se prethodno nisu parile i nisu sudjelovale u pokusima. Ispitne životinje treba opisati u pogledu vrste, soja, spola, mase i dobi. Na početku istraživanja razlike u tjelesnoj masi korištenih životinja trebale bi biti minimalne i ne bi trebale prelaziti 20 % srednje vrijednosti tjelesne mase svakog spola. Kad se istraživanje provodi kao preliminarno istraživanje u odnosu na dugotrajno istraživanje ili istraživanje cijele generacije, prednost se daje primjeni životinja istog soja i podrijetla u oba istraživanja. Smještaj i hranjenje 16. Svi postupci trebaju biti usklađeni s lokalnim standardima brige o životinjama u laboratoriju. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (±3 o ). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Rasvjeta treba biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća mješavina ispitivane kemikalije kad se ona daje na taj način. 17. Životinje trebaju biti smještene u malim skupinama istoga spola; ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama. U slučaju skupnog smještaja, u jednom kavezu ne smije biti smješteno više od pet životinja. Postupci parenja trebali bi se odvijati u kavezima koji odgovaraju toj svrsi. Gravidne ženke treba smjestiti u posebne kaveze i treba im osigurati materijale za izradu gnijezda. Ženke se tijekom laktacije smještaju pojedinačno s njihovom mladunčadi. 18. Treba redovito analizirati ima li u hrani kontaminanata. Uzorak hrane treba sačuvati do kraja izrade izvješća. Priprema životinja 19. Zdrave, mlade odrasle životinje nasumce se raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Životinje se označuju na jedinstven način i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka istraživanja kako bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima. Priprema doza 20. Preporučuje se da se ispitivana kemikalija daje oralno osim ako se neki drugi načini primjene smatraju prikladnijima. Ako se odabere oralna primjena, ispitivana kemikalija obično se primjenjuje oralnom intubacijom; međutim, u određenim slučajevima, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti i s hranom ili vodom za piće. 21. Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. Preporučuje se da se, kad je god moguće, u obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/emulzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim moguća otopina u drugim nosačima. Za nosače koji nisu voda moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Treba utvrditi stabilnost i homogenost ispitivane kemikalije u nosaču. POSTUPAK Broj i spol životinja 22. Preporučuje se da se u svakoj skupini započne s najmanje deset mužjaka i 12–13 ženki. Ženke će se prije izlaganja procijeniti u pogledu ciklusa estrusa i životinje koje ne pokažu uobičajeni ciklus od četiri do pet dana neće se uključiti u istraživanje; stoga se preporučuje više ženki kako bi se dobilo deset ženki po skupini. Osim u slučaju znatnih toksičnih učinaka, očekuje se da će se tako dobiti najmanje osam gravidnih ženki po skupini, a to je obično najmanji prihvatljivi broj gravidnih ženki po skupini. Cilj je dobiti dovoljno gravidnih životinja i potomaka kako bi se osigurala valjana procjena potencijala ispitivane kemikalije da utječe na plodnost, gravidnost, ponašanje ženki (majki) i potomaka koji sišu te rast i razvoj potomstva F 1 od začeća do 13. dana nakon okota. Doziranje 23. Općenito, treba upotrijebiti najmanje tri ispitne skupine i jednu kontrolnu skupinu. Visine doze mogu se temeljiti na informacijama iz ispitivanja akutne toksičnosti ili na rezultatima istraživanja s ponovljenim dozama. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na isti način kao sa životinjama iz ispitne skupine. Ako se pri primjeni ispitivane kemikalije koristi nosač, volumen nosača koji primi kontrolna skupina treba biti jednak najvećem upotrijebljenom volumenu. 24. Visine doza treba odabrati uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti i (toksiko)kinetici koji su dostupni. Treba uzeti u obzir i da je moguća razlika u osjetljivosti između gravidnih ženki i ženki koje nisu gravidne. Najvišu dozu treba odabrati s ciljem induciranja toksičnih učinaka, ali ne i smrti ili velike patnje životinja. Nakon toga treba odabrati slijed postupnog smanjivanja visine doze kako bi se dokazali svi odgovori povezani s doziranjem te da se kod najniže doze ne opažaju štetni učinci (NOAEL). Za određivanje sve nižih doza često su najpogodniji dvostruki do četverostruki intervali, i često je bolje dodati četvrtu ispitnu skupinu nego da između doziranja budu jako veliki intervali (npr. iznad faktora 10). 25. Ako se opaze znakovi opće toksičnosti (npr. smanjena tjelesna masa, učinci na jetri, srcu, plućima ili bubrezima itd.) ili druge promjene koje ne moraju biti toksični odgovori (npr. smanjeno uzimanje hrane, povećanje jetre), uočene učinke na endokrinim krajnjim točkama treba tumačiti s oprezom. Granični test 26. Ako istraživanje provedeno oralnom primjenom jedne doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase na dan, ili kod davanja doze s hranom ili vodom za piće, primjenom doze koja se u ekvivalentnom postotku daje s hranom ili vodom za piće, u skladu s postupcima opisanima u ovom istraživanju, ne proizvede uočljive toksične učinke i ako na temelju podataka iz strukturno srodnih tvari ne treba očekivati toksičnost, može se smatrati da provođenje potpune studije s nekoliko visina doza nije neophodno. Granični test je relevantan samo ako izloženost ljudi ne ukazuje na potrebu za primjenom veće oralne doze. Za druge vrste primjene doza, kao što su inhalacija ili dermalna primjena, maksimalna koncentracija koja se može postići često je određena fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivanih kemikalija. Primjena doza 27. Životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemikalija sedam dana tjedno. U slučaju primjene oralnom intubacijom ispitivanu kemikaliju treba životinjama dati u jednoj dozi s pomoću želučane sonde ili prikladne intubacijske kanile. Maksimalni volumen tekućine koji se može jednokratno dati ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim kad se radi o vodenim otopinama koje dopuštaju primjenu volumena od 2 ml/100 g tjelesne mase. Osim u slučaju nadražujućih ili nagrizajućih ispitivanih kemikalija kod kojih se štetni učinci obično javljaju pri višim koncentracijama, varijabilnost ispitnog volumena treba prilagođavanjem koncentracije svesti na najmanju moguću mjeru kako bi se zajamčio stalni volumen pri svim visinama doza. 28. Kod ispitivane kemikalije koja se primjenjuju s hranom ili vodom za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. Kad se ispitivana kemikalija daje s hranom, može se koristiti ili stalna koncentracija u odnosu na količinu hrane (ppm) ili stalna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje; treba navesti iskorištenu opciju. Za ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje oralnom intubacijom, dozu treba davati u podjednako vrijeme ili vremena svakog dana i prilagoditi je najmanje jednom tjedno kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Plan pokusa 29. Doziranje životinja oba spola trebalo bi započeti najmanje dva tjedna prije parenja, nakon aklimatizacije od najmanje pet dana te nakon što se ženke proberu u pogledu normalnog ciklusa estrusa (u razdoblju od dva tjedna prije tretiranja). Istraživanje treba planirati tako da procjena ciklusa estrusa počne ubrzo nakon što životinje postignu punu spolnu zrelost. To se može malo razlikovati za različite sojeve štakora u različitim laboratorijima, npr. deset tjedana kod štakora soja Sprague Dawley i 12 tjedana kod soja Wistar. Ženke (majke) s potomstvom trebalo bi usmrtiti 13. dana nakon okota ili ubrzo nakon toga. Dan okota (tj. kad se dovrši parturicija) definira se kao nulti dan nakon okota. Ženke koje ne pokazuju znakove kopulacije usmrćuju se 24–26 dana nakon posljednjeg dana razdoblja parenja. Doziranje se nastavlja kod oba spola tijekom razdoblja parenja. Mužjake bi i dalje trebalo dozirati nakon razdoblja parenja barem dok ne istekne ukupno razdoblje doziranja od 28 dana. Zatim se usmrćuju ili se zadržavaju i nastavljaju dozirati radi mogućeg provođenja drugog parenja ako se to smatra primjerenim. 30. Svakodnevno doziranje roditeljskih ženki trebalo bi se nastaviti tijekom cijele gravidnosti i najmanje do 13. dana nakon okota, uključujući i taj dan, ili dan prije usmrćivanja. Kod istraživanja u kojima se ispitivana kemikalija primjenjuje inhalacijom i/ili dermalnim putem doziranje bi se trebalo nastaviti barem do 19. dana gestacije, uključujući i taj dan, i s doziranjem bi se trebalo ponovno početi što prije, a najkasnije na 4. postnatalni dan (PND). 31. Dijagram plana pokusa prikazan je u Dodatku 2. Postupak parenja 32. U ovom bi se istraživanju obično trebalo upotrebljavati parenje 1:1 (jedan mužjak na jednu ženku). Iznimke se mogu javiti ako dođe do smrti mužjaka. Ženku bi trebalo smjestiti s istim mužjakom dok se ne uoče znakovi kopulacije ili dok ne isteknu dva tjedna. Svako jutro ženke treba pregledati s obzirom na prisutnost sperme ili vaginalnog čepa. Nultim danom graviditeta smatra se dan kad je potvrđeno parenje (pronađen je vaginalni čep ili sperma). Ako je parenje neuspješno, može se razmotriti mogućnost ponovnog parenja ženki s dokazanim mužjacima iste skupine. Veličina legla 33. Četiri dana nakon okota veličina svakog legla može se prilagoditi nasumičnim selekcijskim uklanjanjem suvišnih mladunaca tako da se po jednom leglu po mogućnosti ostavi četiri ili pet mladunaca svakog spola ovisno o uobičajenoj veličini legla soja štakora koji se upotrebljavaju. Uzorke krvi treba prikupiti od dva dodatna mladunca, objediniti ih i upotrijebiti za određivanje razina seruma T4. Nije prihvatljivo selektivno uklanjanje mladunaca, npr. prema tjelesnoj masi ili anogenitalnom razmaku. Kad je god broj muških ili ženskih mladunaca takav da nije moguće imati četiri ili pet mladunaca svakog spola po leglu, prihvatljivo je djelomično prilagođavanje (npr. šest mužjaka i četiri ženke). Mladunci se ne uklanjaju ako bi se veličina legla time smanjila ispod cilja izdvajanja mladunaca (osam ili deset mladunaca po leglu). Ako je dostupan samo jedan mladunac povrh cilja izdvajanja mladunaca, uklanja se samo jedan mladunac i od njega se uzima krv za moguću procjenu seruma T4. 34. Ako se veličina legla ne prilagođava, 4. dana nakon okota usmrćuju se dva mladunca po leglu i uzimaju se uzorci krvi radi mjerenja koncentracija seruma hormona štitnjače. Ako je moguće, ta dva mladunca po leglu trebale bi biti ženke kako bi se mužjaci sačuvali za procjenu zadržavanja bradavica osim ako uklanjanjem tih mladunaca više ne bi ostalo ženki za procjenu pri završetku ispitivanja. Mladunci se neće uklanjati ako bi se time veličina legla smanjila na manje od osam ili deset mladunaca po leglu (ovisno o uobičajenoj veličini legla kod soja štakora koji se upotrebljava). Ako je dostupan samo jedan mladunac povrh uobičajene veličine legla, uklanja se samo jedan mladunac i od njega se uzima krv za moguću procjenu seruma T4. Opažanja uživo Klinička opažanja 35. Tijekom cijelog razdoblja ispitivanja treba provoditi opća klinička opažanja barem jednom dnevno te češće ako se uoče znakovi toksičnosti. Poželjno ih je provoditi u isto vrijeme ili vremena svakog dana vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon doziranja. Treba zabilježiti značajne promjene ponašanja, znakove otežane ili produljene parturicije i sve znakove toksičnosti, uključujući smrtnost. Te bi bilješke trebale uključivati vrijeme početka, stupanj i trajanje znakova toksičnosti. Tjelesna masa i unos hrane/vode 36. Mužjake i ženke treba vagati prvog dana primjene doze, a zatim najmanje jednom tjedno i zadnji dan. Tijekom graviditeta ženke bi trebalo vagati 0., 7., 14. i 20. dana te u roku od 24 sata od parturicije (0. ili 1. dan nakon okota) te barem 4. i 13. dana nakon okota. Ta opažanja treba unijeti u izvješće za svaku odraslu životinju posebno. 37. Tijekom razdoblja prije parenja, graviditeta i laktacije unos hrane trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno. Mjerenje unosa hrane tijekom parenja nije obvezno. Trebalo bi mjeriti i unos vode tijekom tih razdoblja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje s vodom za piće. Ciklusi estrusa 38. Cikluse estrusa trebalo bi pratiti prije početka tretiranja kako bi se za studiju izabrale ženke s uobičajenim ciklusom (vidjeti stavak 22.). Svakodnevno bi se trebali pratiti i vaginalni brisovi od početka razdoblja tretiranja do pojave znakova parenja. Ako postoji zabrinutost u pogledu učinaka akutnog stresa koji bi mogli izmijeniti cikluse estrusa kad se počnu primjenjivati doze, laboratoriji mogu izlagati ispitne životinje dva tjedna, zatim svaki dan prikupiti vaginalne brisove kako bi pratili ciklus estrusa najmanje dva tjedna tijekom razdoblja prije parenja, uz stalno praćenje tijekom razdoblja parenja do pojave znakova parenja. Ako se uzimaju vaginalne/cervikalne stanice, treba paziti da se ne poremeti mukoza jer to može inducirati lažnu trudnoću (7. i 8.). Parametri potomaka 39. Vrijeme gestacije treba zabilježiti i računati od nultog dana graviditeta. Svako leglo nakon okota treba što prije pregledati kako bi se utvrdio broj i spol mladunaca, mrtvorođenih, živorođenih, patuljastih životinja (mladunci koji su znatno manji od odgovarajućih kontrolnih mladunaca) i prisutnost velikih abnormalnosti. 40. Žive mladunce trebalo bi prebrojati i odrediti njihov spol te bi legla trebalo izvagati u roku od 24 sata od parturicije (0. ili 1. dan nakon okota) te barem 4. i 13. dana nakon okota. Uz opažanja opisana u stavku 35. trebalo bi zabilježiti i svako abnormalno ponašanje potomaka. 41. Treba izmjeriti anogenitalni razmak u svakog mladunca na isti postnatalni dan, od nultog do 4. postnatalnog dana. Tjelesnu masu mladunaca treba utvrditi na dan mjerenja anogenitalnog razmaka, a njega treba normalizirati u odnosu na veličinu mladunca (najbolje kubni korijen tjelesne mase (9.)). Broj bradavica/areola u mužjaka mladunaca trebalo bi utvrditi 12. ili 13. postnatalnog dana, kako se preporučuje u Smjernici OECD-a 151 (10.). Klinička biokemija 42. Uzorci krvi uzimaju se s utvrđenog mjesta na temelju sljedećeg rasporeda: — od najmanje dva mladunca po leglu 4. dana nakon okota ako broj mladunaca to omogućuje (vidjeti stavke 33.–34.), — od svih ženki (majki) i najmanje dva mladunaca po leglu pri završetku ispitivanja 13. dana, i — od svih odraslih mužjaka pri završetku ispitivanja. Svi uzorci krvi spremaju se u odgovarajućim uvjetima. Uzorci krvi mladunaca i odraslih mužjaka uzeti 13. dana procjenjuju se u pogledu razina seruma hormona štitnjače (T4). Daljnja procjena hormona T4 u uzorcima krvi ženki (majki) i mladunaca uzetih 4. dana obavlja se po potrebi. Moguće je i mjerenje drugih hormona ako je to relevantno. Krv mladunaca može se izvaditi po leglu radi analiza hormona štitnjače. Hormone štitnjače (T4 i TSH) po mogućnosti bi trebalo mjeriti kao „ukupni broj”. 43. Sljedeći čimbenici mogu utjecati na varijabilnost i apsolutne koncentracije za određivanje hormona: — vrijeme usmrćivanja zbog dnevne varijacije koncentracije hormona, — metoda usmrćivanja radi izbjegavanja pretjeranog stresa za životinje koji može utjecati na koncentraciju hormona, — pribori za određivanje hormona koji se mogu razlikovati po njihovim standardnim krivuljama. 44. Uzorke plazme koji su posebno namijenjeni određivanju hormona treba uzeti u usporedivo doba dana. Brojčane vrijednosti dobivene analizom koncentracija hormona razlikuju se ovisno o različitom, komercijalno dostupnom priboru. Patologija Makroskopska nekropsija 45. U trenutku usmrćivanja ili u slučaju smrti tijekom istraživanja, odrasle životinje treba makroskopski pregledati radi otkrivanja bilo kakvih abnormalnosti ili patoloških promjena. Posebnu pozornost treba obratiti na organe reproduktivnog sustava. Broj mjesta za implantaciju treba zabilježiti. Vaginalne briseve treba pregledati ujutro na dan nekropsije kako bi se utvrdila faza ciklusa estrusa i omogućila korelacija s histopatologijom jajnika. 46. Sjemenike i sjemene kanaliće (epididimis) te prostatu i sjemene mjehuriće s koagulacijskim žlijezdama, kao cjelinu, svih odraslih mužjaka treba po potrebi obrezivanjem osloboditi od svih prianjajućih tkiva te ih treba izvagati u mokrom stanju što prije nakon seciranja kako bi se spriječilo njihovo sušenje. Osim toga, mase neobaveznih organa mogle bi uključivati kompleks anusnog podizača i bulbokavernoznog mišića, Cowperove žlijezde i glans penisa kod mužjaka te jajnike u paru (mokra masa) i maternicu (uključujući cerviks) kod ženki; ako se uključuju, te bi mase trebalo prikupiti što prije nakon seciranja. 47. Mrtve mladunce i mladunce koje se usmrti 13. dana nakon okota, ili ubrzo nakon toga, trebalo bi pažljivo pregledati kako bi se utvrdile barem vanjske velike abnormalnosti. Posebnu pozornost treba posvetiti vanjskim reproduktivnim genitalijama koje se pregledava kako bi se utvrdili mogući znakovi promijenjenog razvoja. Na 13. bi se dan trebala sačuvati štitnjača jednog muškog i jednog ženskog mladunca po leglu. 48. Treba sačuvati jajnike, sjemenike, sekundarne spolne organe (maternica i cerviks, sjemeni kanalići, prostata, sjemeni mjehurići zajedno s koagulirajućim žlijezdama), štitnjaču i sve organe koji pokazuju makroskopske lezije svih odraslih životinja. Za rutinski pregled sjemenika i sjemenih kanalića ne preporučuje se fiksiranje u formalinu. Za ta je tkiva prihvatljiva metoda upotreba Bouinova fiksativa ili izmijenjenog Davidsonova fiksativa (11.). Vezivna ovojnica može se nježno i plitko punktirati na oba pola organa iglom koja omogućuje brzu penetraciju fiksativa. Histopatologija 49. Treba obaviti podroban histološki pregled jajnika, sjemenika i sjemenih kanalića (uz poseban naglasak na faze spermatogeneze i histopatologiju strukture intersticijskih stanica sjemenika) životinja iz skupine koja je primala najveću dozu i iz kontrolne skupine. Po potrebi se mogu pregledati i ostali sačuvani organi, uključujući štitnjaču mladunaca i odraslih životinja. Masa štitnjače može se odrediti nakon fiksacije. Obrezivanje također treba obaviti vrlo pažljivo te samo nakon fiksacije kako bi se izbjeglo oštećenje tkiva. Oštećena tkiva mogu kompromitirati histopatološku analizu. Ispitivanja treba proširiti na životinje iz drugih skupina doziranja ako su u skupini s najvećom dozom uočene promjene. Smjernice o histopatologiji (11.) pružaju dodatne podrobne informacije o sekciji, fiksaciji, seciranju i histopatologiji endokrinih tkiva. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Podaci 50. Treba navesti podatke za svaku pojedinačnu životinju. Osim toga, sve podatke treba sažeti u obliku tablice, tako da se za svaku ispitnu skupinu navede broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su uginule tijekom ispitivanja ili su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme smrti ili humanog usmrćenja, broj plodnih životinja, broj gravidnih ženki, broj životinja koje pokazuju znakove toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme prve pojave, trajanje i ozbiljnost toksičnih učinaka, vrste histopatoloških promjena i sve relevantne podatke o leglu. Format sažetog izvješća u obliku tablice koji se pokazao vrlo korisnim za procjenu reproduktivnog/razvojnog učinka naveden je u Dodatku 3. 51. Zbog ograničenih dimenzija istraživanja, statističke analize kojima se nastoji ispitati važnost rezultata imaju ograničenu vrijednost za mnoge krajnje točke, osobito za reproduktivne krajnje točke. Ako se upotrebljavaju statističke analize, odabrana metoda trebala bi biti primjerena za distribuciju varijable koja se ispituje i treba je odabrati prije početka istraživanja. Statistička analiza anogenitalnog razmaka i zadržavanja bradavica trebala bi se temeljiti na podacima za pojedinačne mladunce, uzimajući u obzir učinke na leglo. Ako je primjereno, jedinicu analize čini leglo. Statistička analiza tjelesne mase mladunaca trebala bi se temeljiti na podacima za pojedinačne mladunce, uzimajući u obzir veličinu legla. Zbog toga što su skupine male, kao pomoć u tumačenju istraživanja mogu biti korisni podaci iz prijašnjih kontrola (npr. za veličinu legla) ako su dostupni. Ocjena rezultata 52. Nalaze ovog istraživanja toksičnosti treba ocijeniti s obzirom na uočene učinke, nekropsiju i mikroskopske nalaze. Evaluacija treba obuhvatiti odnos između doze ispitivane kemikalije i prisutnosti ili izostanka, učestalosti i ozbiljnosti abnormalnosti, uključujući makrolezije, identificirane ciljne organe, neplodnost, kliničke abnormalnosti, promjene sposobnosti reprodukcije i legla, promjene tjelesne mase, učinke na smrtnost i sve ostale toksične učinke. 53. Zbog kratkog razdoblja tretiranja mužjaka, pri procjeni učinaka na reprodukciju mužjaka uz podatke o plodnosti trebalo bi razmotriti histopatologiju sjemenika i sjemenih kanalića. Kao pomoć u tumačenju istraživanja može biti korisna i upotreba podataka o prijašnjim kontrolama u vezi s reprodukcijom/razvojem (npr. za veličinu legla, anogenitalni razmak, zadržavanje bradavica, razine seruma T4) ako su dostupni. 54. Radi kontrole kvalitete predlaže se da se prikupljaju podaci o prijašnjim kontrolama te da se izračunaju koeficijenti varijacije za brojčane podatke, posebno za parametre povezane s otkrivanjem endokrinih ometača. Ti se podaci mogu upotrijebiti za uspoređivanje kad se ocjenjuju konkretna istraživanja. Izvješće o ispitivanju 55. Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije: Ispitivana kemikalija: — izvor, broj serije, rok uporabe, ako su dostupni, — stabilnost ispitivane kemikalije, ako je poznata. Tvar s jednim sastojkom: — fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva, — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd. Tvari s više sastojaka, UVCB tvari i smjese: — opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka. Nosač (po potrebi): — obrazloženje odabira nosača ako nije riječ o vodi. Ispitne životinje: — korištena vrsta/soj, — broj, dob i spol životinja, — podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd., — pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja, — obrazloženje odabira vrste ako se ne radi o štakorima. Ispitni uvjeti: — obrazloženje odabira visine doze, — pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripremanju hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravka, — pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije, — preračunavanje koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), prema potrebi, — pojedinosti o kvaliteti hrane i vode, — podroban opis postupka nasumičnog odabira mladunaca za izdvajanje ako se ono obavlja. Rezultati: — tjelesna masa/promjene tjelesne mase, — unos hrane i unos vode, ako su dostupni, — podaci o toksičnom odgovoru po spolu i dozi, uključujući plodnost, gestaciju i sve druge znakove toksičnosti, — duljina gestacije, — toksični ili drugi učinci na reprodukciju, potomstvo, rast nakon rođenja itd., — vrsta, stupanj i trajanje uočenih kliničkih promjena (reverzibilne ili ireverzibilne), — broj odraslih ženki s normalnim ili abnormalnim ciklusom estrusa i trajanje ciklusa, — broj živorođenih i gubitaka nakon implantacija, — podaci o tjelesnoj masi mladunaca, — anogenitalni razmak svih mladunaca (i tjelesna masa na dan mjerenja anogenitalnog razmaka), — zadržavanje bradavica kod mužjaka mladunaca, — razine hormona štitnjače, u mladunaca starih 13 dana i odraslih mužjaka (i u ženki (majki) i mladunaca starih 4 dana ako se mjeri), — broj mladunaca s jako izraženim abnormalnostima, ukupna procjena vanjskih genitalija, broj patuljastih životinja, — vrijeme smrti tijekom istraživanja ili je li životinja preživjela do kraja, — broj implantacija, veličina i masa legla u trenutku evidentiranja, — tjelesna masa u trenutku usmrćenja i podaci o masi organa za roditeljske životinje, — nalazi nekropsije, — iscrpan opis histopatoloških nalaza, — podaci o apsorpciji (ako su dostupni), — statistička obrada rezultata, prema potrebi. Rasprava o rezultatima. Zaključci. Tumačenje rezultata 56. Istraživanjem će se pružiti procjene reproduktivne/razvojne toksičnosti povezane s primjenom ponovljenih doza (vidjeti stavke 5. i 6.). Ono bi moglo dati naznaku u vezi s tim treba li provesti daljnja ispitivanjima te daje smjernice za osmišljavanje naknadnih istraživanja. Za pomoć pri tumačenju rezultata u pogledu reprodukcije i razvoja (12.) treba pogledati Smjernicu OECD-a 43. U Smjernici OECD-a br. 106 o histološkoj procjeni endokrinih i reproduktivnih ispitivanja na glodavcima (11.) navedene su informacije o pripremi i procjeni (endokrinih) organa i vaginalnih brisova koje mogu biti korisne za ovu smjernicu za ispitivanje. LITERATURA 1. OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 2. OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokio, 27–29. listopada 1992. Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 3. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. – 11. ožujka 1998. Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 4. OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 5. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 6. OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 7. Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84.–97. 8. Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. 9. Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383.–390. 10. OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 11. OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 12. OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. Dodatak 1. DEFINICIJE (VIDJETI I SMJERNICU OECD-A 150 (6.)) Androgeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni androgeni hormon (npr. testosteron) u organizmu sisavaca. Antiandrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog androgenog hormona (npr. testosterona) u organizmu sisavaca. Antiestrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog estrogenog hormona (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca. Antitiroidna aktivnost je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog hormona štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca. Kemikalija je tvar ili smjesa. Razvojna toksičnost: manifestacija reproduktivne toksičnosti koju čine prenatalni, postnatalni, strukturni ili funkcionalni poremećaji potomstva. Doziranje je opći pojam koji obuhvaća dozu, njezinu učestalost i trajanje doziranja. Doza je količina ispitivane kemikalije koja se primjenjuje. Doza se izražava kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitne životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase po danu) ili kao stalna koncentracija u hrani. Evidentna toksičnost je opći naziv koji opisuje jasne znakove toksičnosti nakon primjene ispitivane kemikalije. Ti bi znakovi trebali biti dovoljni za utvrđivanje opasnosti i trebaju biti takvi da se za primjenu povišene doze može očekivati da će rezultirati razvojem ozbiljnih znakova toksičnosti i mogućom smrtnošću. Ometanje plodnosti čine poremećaji muških ili ženskih reproduktivnih funkcija ili reproduktivne sposobnosti. Toksičnost kod majke: štetni učinci na gravidne ženke do kojih dolazi specifično (izravni učinak) ili nespecifično (neizravni učinak). NOAEL je kratica za visinu doze bez vidljivih štetnih učinaka. To je najviša doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni učinci povezani s tretiranjem. Estrogeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni estrogeni hormon (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca. Reproduktivna toksičnost predstavlja štetne učinke na potomstvo i/ili oštećenje muške i ženske reproduktivne funkcije ili sposobnosti. Ispitivana kemikalija je svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom. Tiroidna aktivnost je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni hormon štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca. Validacija je znanstveni postupak s ciljem karakterizacije operativnih zahtjeva i ograničenja ispitne metode te pokazivanja njezine pouzdanosti i relevantnosti za određenu svrhu. Dodatak 2. DIJAGRAM PLANA POKUSA IZ KOJEG SE VIDI MAKSIMALNO TRAJANJE STUDIJE, NA TEMELJU CIJELOG 14-DNEVNOG RAZDOBLJA PARENJA ﻿Dodatak 3. SAŽETO IZVJEŠĆE U OBLIKU TABLICE O UČINCIMA NA REPRODUKCIJU/RAZVOJ OPAŽANJA VRIJEDNOSTI Doziranje (jedinice) 0 (kontrola) … … … … Formirani parovi (N) Ciklus estrusa (barem srednja vrijednost duljine i učestalost nepravilnih ciklusa) Ženke koje pokazuju znakove kopulacije (N) Ženke koje su postale gravidne (N) Dani začeća 1–5 (N) Dani začeća 6–… (21) (N) Graviditet ≤ 21 dan (N) Graviditet = 22 dana (N) Graviditet ≥ 23 dana (N) Ženke (majke) sa živim mladuncima (N) Ženke (majke) sa živim mladuncima 4. dana nakon okota (N) Implantati po ženki (majci) (srednja vrijednost) Živi mladunci po ženki (majci) pri okotu (srednja vrijednost) Živi mladunci po ženki (majci) 4. dana (srednja vrijednost) Omjer spolova (m/ž) pri okotu (srednja vrijednost) Omjer spolova (m/ž) 4. dana (srednja vrijednost) Masa legla pri okotu (srednja vrijednost) Masa legla 4. dana (srednja vrijednost) Masa mladunaca pri okotu (srednja vrijednost) Masa mladunaca u trenutku mjerenja anogenitalnog razmaka (srednja vrijednost za mužjake i srednja vrijednost za ženke) Anogenitalni razmak na isti postnatalni dan, dan okota – 4. dan (srednja vrijednost za mužjake i ženke, naznaka postnatalnog dana) Masa mladunaca 4. dana (srednja vrijednost) Zadržavanje bradavica kod mužjaka mladunaca 13. dana (srednja vrijednost) Masa mladunaca 13. dana (srednja vrijednost) ABNORMALNI MLADUNCI Ženke (majke) s 0 Ženke (majke) s 1 Ženke (majke) s ≥ 2 GUBITAK POTOMAKA Prenatalno/nakon implantacije (implantacije umanjene za broj živorođenih) Ženke s 0 Ženke s 1 Ženke s 2 Ženke s ≥ 3 Postnatalno (broj živorođenih umanjen za broj živih mladunaca 13. dana nakon okota) Ženke s 0 Ženke s 1 Ženke s 2 Ženke s ≥ 3 B.64. KOMBINIRANO ISTRAŽIVANJE TOKSIČNOSTI S PONOVLJENIM DOZAMA S TESTOM PROBIRA ZA REPRODUKTIVNU/RAZVOJNU TOKSIČNOST UVOD 1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 422 (TG) (2016.). Smjernice OECD-a za ispitivanje kemikalija periodično se preispituju uzimajući u obzir znanstveni napredak. Izvorna smjernica za test probira 422 donesena je 1996. na temelju protokola za kombinirani test s ponovljenim dozama i testa probira za reproduktivnu/razvojnu toksičnost o kojem se raspravljalo na dva sastanka stručnjaka u Londonu 1990. (1.) i Tokiju 1992. (2.). 2. U ovoj se ispitnoj metodi kombinira dio koji se odnosi na probir za reproduktivnu/razvojnu toksičnost, koji se temelji na iskustvu koje su zemlje članice stekle upotrebom izvorne metode o postojećim kemikalijama koje se proizvode u velikim količinama i na temelju istraživačkih ispitivanja s tvarima za pozitivnu kontrolu (3. i 4.), te dio koji se odnosi na toksičnost s ponovljenim dozama, u skladu sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje 407 (28-dnevno ispitivanje oralne toksičnosti na glodavcima uz primjenu ponovljenih doza; odgovara poglavlju B.7. ovog Priloga). 3. Ova je ispitna metoda ažurirana relevantnim krajnjim točkama endokrinih ometača, kao nastavno djelovanje na aktivnost visokog prioriteta koju je OECD pokrenuo 1998. kako bi revidirao postojeće smjernice za ispitivanje i razvio nove smjernice za probir i ispitivanje potencijalnih endokrinih ometača (5.). U tom kontekstu Smjernica za ispitivanje 407 (koja odgovara poglavlju B.7. ovog Priloga) poboljšana je 2008. parametrima koji su primjereni za otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivanih kemikalija. Ažuriranjem Smjernice za ispitivanje 422 nastojalo se uključiti određene relevantne krajnje točke endokrinih ometača u ispitne smjernice za probir kod kojih razdoblja izlaganja obuhvaćaju neka od osjetljivih razdoblja tijekom razvoja (prenatalna razdoblja ili rana postnatalna razdoblja). 4. Odabrane dodatne relevantne krajnje točke endokrinih ometača, koje su i dio Smjernice za ispitivanje 443 (produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji, koja odgovara poglavlju B.56. ovog Priloga), uključeni su u Smjernicu za ispitivanje 422 na temelju studije izvedivosti koja se bavi znanstvenim i tehničkim pitanjima povezanima s njihovim uključivanjem te mogućim prilagodbama plana ispitivanja koje su potrebne za njihovo uključivanje (6.). 5. Ova je ispitna metoda osmišljena za dobivanje ograničenih informacija o učincima ispitivane kemikalije na reproduktivnost mužjaka i ženki, kao što su funkcija gonada, ponašanje kod parenja, začeće, razvoj zametka i parturicija. Ona nije alternativa i ne zamjenjuje postojeće ispitne metode B.31., B.34., B.35. ili B.56. POČETNA RAZMATRANJA 6. Pri procjeni i ocjenjivanju toksičnih svojstava ispitivane kemikalije određivanje oralne toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza može se provesti nakon dobivanja početnih informacija o toksičnosti iz ispitivanja akutne toksičnosti. To istraživanje pruža informacije o mogućnim opasnostima po zdravlje do kojih bi moglo doći zbog ponovljenog izlaganja tijekom relativno ograničenog vremenskog razdoblja. Ta metoda obuhvaća osnovno istraživanje toksičnosti s ponovljenim dozama koje se može upotrijebiti za kemikalije za koje nije opravdano 90-dnevno istraživanje (npr. ako proizvedena količina ne prelazi određene granice) ili kao preliminarno istraživanje za dugotrajno istraživanje. Pri provođenju istraživanja treba slijediti osnovna načela i razmatranja navedena u OECD-ovoj Smjernici br. 19 o priznavanju, procjeni i korištenju kliničkih znakova kao humanih krajnjih točaka za pokusne životinje koje se upotrebljavaju u ocjenama sigurnosti (7.). 7. Nadalje, obuhvaća test probira za reproduktivnu/razvojnu toksičnost i stoga se može upotrebljavati i za dobivanje početnih informacija o mogućim učincima na reproduktivnost mužjaka i ženki kao što su funkcija gonada, ponašanje kod parenja, začeće, razvoj zametka i parturicija, u ranoj fazi procjene toksikoloških svojstava ispitivanih kemikalija ili za zabrinjavajuće ispitivane kemikalije. Ovom se ispitnom metodom ne dobivaju potpune informacije o svim aspektima reprodukcije i razvoja. Točnije, metoda pruža samo ograničena sredstva za otkrivanje postnatalnih manifestacija prenatalnog izlaganja ili učinaka koji se mogu inducirati tijekom postnatalnog izlaganja. Zbog (među ostalim) selektivnosti krajnjih točaka i kratkog trajanja istraživanja ovom metodom neće se dobiti dokazi za konačne tvrdnje o nepostojanju reproduktivnih/razvojnih učinaka. Osim toga, ako ne postoje podaci iz drugih ispitivanja reproduktivne/razvojne toksičnosti, pozitivni rezultati korisni su za početnu procjenu opasnosti i pridonose odlukama u pogledu potrebe za dodatnim ispitivanjem i njegova vremenskog okvira. 8. Rezultate dobivene parametrima povezanima s endokrinim sustavom treba promatrati u kontekstu „OECD-ova konceptualnog okvira za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija” (8.). U tom konceptualnom okviru poboljšana Smjernica OECD-a za ispitivanje 422 nalazi se na razini 4. kao in vivo test i pruža podatke o štetnim učincima na relevantne endokrine krajnje točke. Međutim, endokrini signal ne mora se sam po sebi smatrati dovoljnim dokazom da je ispitivana kemikalija endokrini ometač. 9. Ova ispitna metoda naglasak stavlja i na neurološke učinke kao specifičnu krajnju točku, a naglašava i potrebu za pozornim kliničkim opažanjem životinja kako bi se dobilo što više informacija. Cilj je ove metode identificirati kemikalije koje imaju neurotoksički potencijal, što može zahtijevati daljnja podrobna istraživanja tog aspekta. Osim toga, metoda može pokazati i osnovne imunološke učinke. 10. Ako ne postoje podaci iz drugih istraživanja sustavne toksičnosti, reproduktivne/razvojne toksičnosti, neurotoksičnosti i/ili imunotoksičnosti, pozitivni rezultati korisni su za početnu procjenu opasnosti i pridonose odlukama u pogledu potrebe za dodatnim ispitivanjem i njegova vremenskog okvira. Ispitivanje može biti osobito korisno kao dio OECD-ova podatkovnog skupa za informacije o probiru (SIDS) za procjenu postojećih kemikalija za koje je dostupno malo ili nimalo toksikoloških informacija i može služiti kao alternativa provođenju dvaju zasebnih ispitivanja toksičnosti s ponovljenim dozama (Smjernica OECD-a za ispitivanje 407, koja odgovara poglavlju B.7. ovog Priloga) odnosno reproduktivne/razvojne toksičnosti (Smjernica OECD-a za ispitivanje 421, koja odgovara poglavlju B.63. ovog Priloga). Može se upotrebljavati i kao istraživanje o utvrđivanju raspona doze za opsežnija reproduktivna/razvojna istraživanja ili ako se smatra relevantnim iz drugih razloga. 11. Općenito se pretpostavlja da postoje razlike u osjetljivosti između gravidnih životinja i onih koje nisu gravidne. Stoga u ovom kombiniranom testu može biti teže odrediti visine doza koje su primjerene i za procjenu opće sustavne toksičnosti i specifične reproduktivne/razvojne toksičnosti nego kod zasebnog provođenja pojedinačnih ispitivanja. Nadalje, tumačenje rezultata ispitivanja u pogledu opće sustavne toksičnosti može biti teže nego kod provođenja zasebnog istraživanja s ponovljenim dozama, osobito ako se serumski i histopatološki parametri ne procjenjuju u isto vrijeme tijekom istraživanja. Zbog te tehničke složenosti za provođenje ovog kombiniranog testa probira potrebno je znatno iskustvo u području ispitivanja toksičnosti. S druge strane, osim manjeg broja životinja koje sudjeluju, kombinirani test može pružiti bolji način za razlikovanje izravnih učinaka na reprodukciju/razvoj od učinaka koji su sekundarni u odnosu na druge (sustavne) učinke. 12. U ovom je ispitivanju razdoblje doziranja dulje nego kod uobičajenog 28-dnevnog istraživanja s ponovljenim dozama. Međutim, upotrebljava se manje životinja svakog spola po skupini u usporedbi sa situacijom u kojoj se uz test probira za reproduktivnu/razvojnu toksičnost provodi uobičajeno 28-dnevno istraživanje s ponovljenim dozama. 13. U ovoj ispitnoj metodi pretpostavlja se oralna primjena ispitivane kemikalije. Ako se upotrebljavaju drugi načini izlaganja, mogu biti potrebne prilagodbe. 14. Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se te, ako se mogu, zašto se njome mogu dobiti primjereni rezultati za tu svrhu. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. 15. Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1. NAČELO ISPITIVANJA 16. Ispitivana kemikalija primjenjuje se u gradiranim dozama na nekoliko skupina mužjaka i ženki. Na mužjake treba primjenjivati dozu najmanje četiri tjedna, do dana i uključujući dan prije planiranog usmrćivanja (to uključuje najmanje dva tjedna prije parenja, tijekom razdoblja parenja i približno dva tjedna poslije parenja). S obzirom na ograničeno razdoblje doziranja prije parenja u mužjaka, plodnost možda neće biti osobito osjetljiv pokazatelj testikularne toksičnosti. Stoga je od ključne važnosti podroban histološki pregled sjemenika. Kombinacija razdoblja doziranja prije parenja od dva tjedna i naknadno promatranje parenja/plodnosti s ukupnim razdobljem doziranja od najmanje četiri tjedna, nakon čega slijedi podrobna histopatologija muških gonada smatraju se dovoljnima da bi se omogućilo otkrivanje većine učinaka na plodnost mužjaka i spermatogenezu. 17. Ženkama dozu treba davati tijekom cijelog istraživanja. To uključuje dva tjedna prije parenja (pri čemu je cilj obuhvatiti najmanje dva cijela ciklusa estrusa), promjenjivo vrijeme do začeća, trajanje graviditeta i najmanje 13 dana nakon okota, do dana i uključujući dan prije planiranog usmrćivanja. 18. Trajanje istraživanja, nakon aklimatizacije i procjene ciklusa estrusa prije doziranja, ovisi o ponašanju ženki i iznosi približno 63 dana [najmanje 14 dana prije parenja, (do) 14 dana parenja, 22 dana gestacije, 13 dana laktacije]. 19. Tijekom razdoblja primjene životinje se svakodnevno pažljivo promatraju radi uočavanja znakova toksičnosti. Životinje koje ugibaju ili su usmrćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preživjele se životinje usmrćuju i podvrgavaju obdukciji. OPIS METODE Odabir životinjske vrste 20. Ova ispitna metoda osmišljena je za upotrebu na štakorima. Ako se parametri navedeni u ovoj Smjernici za ispitivanje 422 istražuju na drugoj vrsti glodavaca, treba pružiti detaljno obrazloženje. U međunarodnom validacijskom programu za određivanje endokrinih ometača o Smjernici za ispitivanje 407 primjenjivali su se samo štakori. Sojeve slabe plodnosti ili poznate po velikoj učestalosti razvojnih defekata ne bi trebalo koristiti. Treba koristiti zdrave životinje koje se prethodno nisu parile i nisu sudjelovale u pokusima. Ispitne životinje treba opisati u pogledu vrste, soja, spola, mase i dobi. Na početku istraživanja razlike u tjelesnoj masi korištenih životinja trebale bi biti minimalne i ne bi trebale prelaziti ±20 % srednje vrijednosti tjelesne mase svakog spola. Ako se istraživanje provodi kao preliminarno istraživanje u odnosu na dugotrajno istraživanje ili istraživanje cijele generacije, prednost se daje primjeni životinja istog soja i podrijetla u oba istraživanja. Smještaj i hranjenje 21. Svi postupci trebaju biti usklađeni s lokalnim standardima brige o životinjama u laboratoriju. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Relativna vlaga trebala bi iznositi najmanje 30 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Rasvjeta treba biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća mješavina ispitivane kemikalije kad se ona daje na taj način. 22. Životinje trebaju biti smještene u malim skupinama istoga spola; ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama. U slučaju skupnog smještaja, u jednom kavezu ne smije biti smješteno više od pet životinja. Postupci parenja trebali bi se odvijati u kavezima koji odgovaraju toj svrsi. Gravidne ženke treba smjestiti u posebne kaveze i treba im osigurati materijale za izradu gnijezda. Ženke se tijekom laktacije smještaju pojedinačno s njihovom mladunčadi. 23. Treba redovito analizirati ima li u hrani kontaminanata. Uzorak hrane treba sačuvati do kraja izrade izvješća. Priprema životinja 24. Zdrave, mlade odrasle životinje nasumce se odabiru i raspoređuju u skupine za tretiranje i kaveze. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Životinje se označuju na jedinstven način i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka istraživanja kako bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima. Priprema doza 25. Preporučuje se da se ispitivana kemikalija daje oralno osim ako se neki drugi načini primjene smatraju prikladnijima. Ako se odabere oralna primjena, ispitivana kemikalija obično se daje oralnom intubacijom; međutim, u određenim slučajevima, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti i s hranom ili vodom za piće. 26. Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. Kad je god moguće, preporuča se najprije razmotriti mogućnost primjene vodene otopine/suspenzije, zatim mogućnost primjene otopine/suspenzije u ulju (npr. kukuruzno ulje) i tek na kaju mogućnost otapanja u ostalim nosačima. Za nosače bez vodene otopine moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Treba utvrditi stabilnost i homogenost ispitivane kemikalije u nosaču. POSTUPAK Broj i spol životinja 27. Preporučuje se da se u svakoj skupini započne s najmanje deset mužjaka i 12–13 ženki. Ženke će se prije izlaganja procijeniti u pogledu ciklusa estrusa pa se životinje koje ne pokažu uobičajeni ciklus od četiri do pet dana neće uključiti u istraživanje; stoga se preporučuje više ženki kako bi se dobilo deset ženki po skupini. Osim u slučaju znatnih toksičnih učinaka, očekuje se da će se tako dobiti najmanje osam gravidnih ženki po skupini, a to je obično najmanji prihvatljivi broj gravidnih ženki po skupini. Cilj je dobiti dovoljno gravidnih životinja i potomaka kako bi se osigurala valjana procjena potencijala ispitivane kemikalije da utječe na plodnost, gravidnost, ponašanje ženki (majki) i potomaka koji sišu te rast i razvoj potomstva F 1 od začeća do 13. dana nakon okota. Ako se planira usmrćivanje životinja u međuvremenu, navedeni broj treba povećati za broj životinja predviđenih za usmrćivanje prije završetka istraživanja. Treba razmotriti mogućnost uključivanja dodatne satelitske skupine od pet životinja svakoga spola u kontrolnu skupinu i skupinu koja će primiti najvišu dozu radi opažanja reverzibilnosti, postojanosti ili zakašnjelog nastupa sustavnih toksičnih učinaka najmanje 14 dana nakon tretiranja. Životinje iz satelitskih skupina neće se pariti i stoga se ne upotrebljavaju za procjenu reproduktivne/razvojne toksičnosti. Doziranje 28. Općenito, treba upotrijebiti najmanje tri ispitne skupine i jednu kontrolnu skupinu. Ako nisu dostupni prikladni podaci o općoj toksičnosti, može se provesti istraživanje o utvrđivanju raspona (životinje istog soja i podrijetla) kako bi se pomoglo pri određivanju visina doze koje će se primjenjivati. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na isti način kao sa životinjama iz ispitne skupine. Ako se pri primjeni ispitivane kemikalije koristi nosač, volumen nosača koji primi kontrolna skupina treba biti jednak najvećem upotrijebljenom volumenu. 29. Visine doza treba odabrati uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti i (toksiko)kinetici koji su dostupni. Treba uzeti u obzir i da je moguća razlika u osjetljivosti između gravidnih ženki i ženki koje nisu gravidne. Najvišu dozu treba odabrati s ciljem induciranja toksičnih učinaka, ali ne i smrti ili očite patnje. Nakon toga, treba odabrati slijed postupnog smanjivanja visine doze kako bi se dokazali svi odgovori povezani s doziranjem te da kod najniže doze nema štetnih učinaka. Često je optimalno doze primijeniti u dvostrukim do četverostrukim intervalima te je često bolje dodati i četvrtu ispitnu skupinu nego između primjene doza koristiti veoma velike vremenske intervale (npr. iznad faktora 10). 30. Ako se opaze znakovi opće toksičnosti (npr. smanjena tjelesna masa, učinci na jetri, srcu, plućima ili bubrezima itd.) ili druge promjene koje ne moraju biti toksični odgovori (npr. smanjeno uzimanje hrane, povećanje jetre), uočene učinke na endokrinim krajnjim točkama treba tumačiti s oprezom. Granični test 31. Ako istraživanje provedeno oralnom primjenom jedne doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase na dan ili, kod davanja doze s hranom, primjenom doze koja se u ekvivalentnom postotku daje s hranom ili vodom za piće (na temelju određivanja tjelesne mase), u skladu s postupcima opisanima za ovo istraživanje, ne proizvede uočljive toksične učinke i ako na temelju podataka iz strukturno srodnih tvari ne treba očekivati toksičnost, može se smatrati da provođenje potpunog istraživanja s nekoliko visina doza nije neophodno. Granični test je relevantan samo ako izloženost ljudi ne ukazuje na potrebu za primjenom veće doze. Za druge vrste primjene doza, kao što su inhalacija ili dermalna primjena, maksimalno izlaganje koje se može postići često je određeno fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivanih kemikalija. Primjena doza 32. Životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemikalija sedam dana tjedno. U slučaju primjene oralnom intubacijom ispitivanu kemikaliju treba dati životinjama u jednoj dozi s pomoću želučane sonde ili prikladne intubacijske kanile. Maksimalni volumen tekućine koji se može jednokratno dati ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim kad se radi o vodenim otopinama koje dopuštaju primjenu volumena od 2 ml/100 g tjelesne mase. Osim u slučaju nadražujućih ili nagrizajućih ispitivanih kemikalija kod kojih se štetni učinci obično javljaju pri višim koncentracijama, varijabilnost ispitnog volumena treba prilagođavanjem koncentracije svesti na najmanju moguću mjeru kako bi se zajamčio stalni volumen pri svim visinama doza. 33. Kod ispitivanih kemikalija koje se primjenjuju s hranom ili vodom za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. Kad se ispitivana kemikalija daje s hranom, može se koristiti ili stalna koncentracija u odnosu na količinu hrane (ppm) ili stalna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje; treba navesti iskorištenu opciju. Za ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje oralnom intubacijom, dozu treba davati u podjednako vrijeme ili vremena svakog dana i prilagoditi je najmanje jednom tjedno kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Kad se prije dugotrajnog ili potpunog istraživanja reproduktivne toksičnosti provodi kombinirano preliminarno istraživanje, u oba istraživanja prehrana životinja treba biti slična. Plan pokusa 34. Doziranje životinja oba spola trebalo bi započeti dva tjedna prije parenja, nakon aklimatizacije od najmanje pet dana te nakon što se ženke proberu u pogledu normalnog ciklusa estrusa (u razdoblju od dva tjedna prije tretiranja). Istraživanje treba planirati tako da procjena ciklusa estrusa počne ubrzo nakon što životinje postignu punu spolnu zrelost. To se može malo razlikovati za različite sojeve štakora u različitim laboratorijima, npr. deset tjedana kod štakora soja Sprague Dawley i 12 tjedana kod soja Wistar. Ženke (majke) s potomstvom trebalo bi usmrtiti 13. dana nakon okota ili ubrzo nakon toga. Kako bi se omogućio post ženki (majki) preko noći prije uzimanja krvi (ako se prednost daje toj opciji), ženke i njihovi potomci ne moraju se nužno usmrtiti istog dana. Dan okota (tj. kada se dovrši parturicija) definira se kao nulti dan nakon okota. Ženke koje ne pokazuju znakove kopulacije usmrćuju se 24–26 dana nakon posljednjeg dana razdoblja parenja. Doziranje se nastavlja kod oba spola tijekom razdoblja parenja. Mužjake bi i dalje trebalo dozirati nakon razdoblja parenja barem dok ne istekne ukupno razdoblje doziranja od 28 dana. Zatim se usmrćuju ili se zadržavaju i nastavljaju dozirati radi mogućeg provođenja drugog parenja ako se to smatra primjerenim. 35. Svakodnevno doziranje roditeljskih ženki trebalo bi se nastaviti tijekom cijele gravidnosti i najmanje do 13. dana nakon okota, uključujući i taj dan, ili dan prije usmrćivanja. Kod istraživanja u kojima se ispitivana kemikalija primjenjuje inhalacijom i/ili dermalnim putem doziranje bi se trebalo nastaviti barem do 19. dana gestacije, uključujući i taj dan, i s doziranjem bi se trebalo ponovno početi što prije, a najkasnije na 4. postnatalni dan (PND). 36. Životinje u satelitskoj skupini za koje se planira naknadno opažanje, ako su uključene, ne pare se. One se trebaju držati još najmanje 14 dana nakon prvog planiranog usmrćivanja ženki (majki), bez tretiranja, kako bi se otkrili zakašnjeli toksični učinci, postojanost toksičnih učinaka ili oporavak od toksičnih učinaka. 37. Dijagram plana pokusa prikazan je u Dodatku 2. Ciklusi estrusa 38. Cikluse estrusa trebalo bi pratiti prije početka tretiranja kako bi se za istraživanje odabrale ženke s uobičajenim ciklusom (vidjeti stavak 27.). Svakodnevno bi se trebali pratiti i vaginalni brisovi od početka razdoblja tretiranja do pojave znakova parenja. Ako postoji zabrinutost u pogledu učinaka akutnog stresa koji bi mogli izmijeniti cikluse estrusa kad se počnu primjenjivati doze, laboratoriji mogu izlagati ispitne životinje dva tjedna, zatim svaki dan prikupiti vaginalne brisove kako bi pratili ciklus estrusa najmanje dva tjedna tijekom razdoblja prije parenja, uz stalno praćenje tijekom razdoblja parenja do pojave znakova parenja. Ako se uzimaju vaginalne/cervikalne stanice, treba paziti da se ne poremeti mukoza, što bi moglo inducirati lažnu trudnoću (8. i 9.). Postupak parenja 39. U ovom bi se istraživanju obično trebala upotrebljavati parenja 1:1 (jedan mužjak na jednu ženku). Iznimke se mogu javiti ako dođe do smrti mužjaka. Ženku bi trebalo smjestiti s istim mužjakom dok se ne uoče znakovi kopulacije ili dok ne isteknu dva tjedna. Svako jutro ženke treba pregledati u pogledu prisutnosti sperme ili vaginalnog čepa. Nultim danom graviditeta smatra se dan kad je potvrđeno parenje (pronađen je vaginalni čep ili sperma). Ako je parenje bilo neuspješno, može se razmotriti mogućnost ponovnog parenja ženki s dokazanim mužjacima iste skupine. Veličina legla 40. Četiri dana nakon okota veličina svakog legla može se prilagoditi nasumičnim selekcijskim uklanjanjem suvišnih mladunaca tako da se po jednom leglu po mogućnosti ostavi četiri ili pet mladunaca svakog spola ovisno o uobičajenoj veličini legla soja štakora koji se upotrebljavaju. Uzorke krvi treba prikupiti od dva suvišna mladunca, objediniti ih i upotrijebiti za određivanje razina seruma T4. Nije prihvatljivo selektivno uklanjanje mladunaca, npr. prema tjelesnoj masi ili anogenitalnom razmaku. Kad je god broj muških ili ženskih mladunaca takav da nije moguće imati četiri ili pet mladunaca svakog spola po leglu, prihvatljivo je djelomično prilagođavanje (npr. šest mužjaka i četiri ženke). Mladunci se ne uklanjaju ako bi se veličina legla time smanjila ispod cilja izdvajanja mladunaca (osam ili deset mladunaca po leglu). Ako je dostupan samo jedan mladunac povrh cilja izdvajanja mladunaca, uklanja se samo jedan mladunac i od njega se uzima krv za moguću procjenu seruma T4. 41. Ako se veličina legla ne prilagođava, 4. dana nakon okota usmrćuju se dva mladunca po leglu i uzimaju se uzorci krvi radi mjerenja koncentracija seruma hormona štitnjače. Ako je moguće, ta dva mladunca po leglu trebale bi biti ženke kako bi se mužjaci sačuvali za procjenu zadržavanja bradavica, osim ako uklanjanjem tih mladunaca više ne bi ostalo ženki za procjenu pri završetku ispitivanja. Mladunci se neće uklanjati ako bi se time veličina legla smanjila na manje od osam ili deset mladunaca po leglu (ovisno o uobičajenoj veličini legla kod soja štakora koji se upotrebljava). Ako je dostupan samo jedan mladunac povrh uobičajene veličine legla, uklanja se samo jedan mladunac i od njega se uzima krv za moguću procjenu seruma T4. Opažanja 42. Opća klinička opažanja treba provoditi najmanje jednom dnevno, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme ili vremena, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon doziranja. Zdravstveno stanje životinja treba zabilježiti. Barem dvaput dnevno sve životinje treba pregledati radi otkrivanja mogućih simptoma morbiditeta i smrtnosti. 43. Jednom prije prvog izlaganja i barem jednom tjedno nakon toga treba obaviti detaljno kliničko opažanje stanja svih roditeljskih životinja (to će omogućiti utvrđivanje promjena u stanju istih subjekata). Ta opažanja treba obavljati izvan kaveza u kojima se životinje drže, u standardnom ograđenom prostoru i, po mogućnosti, svaki dan u isto vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri čemu je najbolje koristiti se sustavom ocjenjivanja koji je jasno definirao laboratorij koji obavlja ispitivanje. Treba poduzeti sve što je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima ispitivanja budu minimalna te da opažanja po mogućnosti provode promatrači koji nisu upoznati s tretiranjem. Znakovi koji se bilježe trebaju, među ostalim, uključivati promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, pojavu iscjedaka, izlučine i autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija (lučenje suza), piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju). Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na postupanje sa životinjama, kao i pojavu kloničkih ili toničkih pokreta, stereotipije (npr. pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug), otežane ili produljene parturicije ili neobičnog ponašanja (npr. samoozljeđivanje, hodanje unatrag) (10.). 44. U određenom trenutku tijekom istraživanja treba procijeniti osjetilnu reaktivnost na podražaje raznih vrsta (npr. auditivne, vizualne i proprioceptivne podražaje) (8., 9. i 11.), jakost stiska (12.) i motornu aktivnost (13.) u pet mužjaka i pet ženki nasumično odabranih iz svake skupine. Daljnje pojedinosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovarajućoj referentnoj literaturi. Međutim, mogu se primjenjivati i drugi postupci koji nisu u njoj navedeni. Kod mužjaka bi se ta funkcionalna opažanja trebala provoditi pred kraj razdoblja doziranja, neposredno prije planiranog usmrćivanja, ali prije uzimanja uzoraka krvi za hematologiju ili kliničku kemiju (vidjeti stavke 53.–56., uključujući bilješku 1.). Ženke bi tijekom tih funkcionalnih ispitivanja trebale biti u fiziološki sličnom stanju i po mogućnosti bi ih trebalo ispitati jednom tijekom posljednjeg tjedna laktacije (npr. od 6. do 13. dana laktacije), neposredno prije planiranog usmrćivanja. Vrijeme razdvajanja ženki (majki) i mladunaca trebalo bi se smanjiti u mjeri u kojoj je to moguće. 45. Funkcionalna opažanja koja se obavljaju jednom pred kraj istraživanja mogu se izostaviti ako se istraživanje provodi kao preliminarno istraživanje za naknadno (90-dnevno) istraživanje subkroničnosti ili dugotrajno istraživanje. U tom slučaju funkcionalna opažanja treba uključiti u to sljedeće istraživanje. S druge strane, dostupnost podataka o funkcionalnim opažanjima iz tog istraživanja uz primjenu ponovljenih doza može biti od pomoći u odabiru visina doza u naknadnom istraživanju subkroničnosti ili dugotrajnom istraživanju. 46. U iznimnim slučajevima funkcionalna opažanja mogu izostati i kod skupina koje inače pokazuju simptome toksičnosti do mjere koja bi znatno ometala uspješnost funkcionalnog ispitivanja. 47. Vrijeme gestacije treba zabilježiti i računati od nultog dana graviditeta. Svako leglo nakon okota treba što prije pregledati kako bi se utvrdio broj i spol mladunaca, mrtvorođenih, živorođenih, patuljastih životinja (mladunci koji su znatno manji od odgovarajućih kontrolnih mladunaca) i prisutnost velikih abnormalnosti. 48. Žive mladunce trebalo bi prebrojati i odrediti njihov spol te bi legla trebalo izvagati u roku od 24 sata od parturicije (0. ili 1. dan nakon okota) te barem 4. i 13. dana nakon okota. Uz opažanja roditeljskih životinja (vidjeti stavke 43. i 44.) trebalo bi zabilježiti i svako abnormalno ponašanje potomaka. 49. Treba izmjeriti anogenitalni razmak u svakog mladunca na isti postnatalni dan, od nultog do 4. postnatalnog dana. Tjelesnu masu mladunaca treba utvrditi na dan mjerenja anogenitalnog razmaka, a njega treba normalizirati u odnosu na veličinu mladunca (najbolje kubni korijen tjelesne mase (14.)). Broj bradavica/areola u mužjaka mladunaca trebalo bi utvrditi 12. ili 13. postnatalnog dana, kako se preporučuje u Smjernici OECD-a 151 (15.). Tjelesna masa i unos hrane/vode 50. Mužjake i ženke treba vagati prvog dana primjene doze, a zatim najmanje jednom tjedno i zadnji dan. Tijekom graviditeta ženke bi trebalo vagati 0., 7., 14. i 20. dana te u roku od 24 sata od parturicije (0. ili 1. dan nakon okota) te barem 4. i 13. dana nakon okota. Ta opažanja treba unijeti u izvješće za svaku odraslu životinju posebno. 51. Tijekom razdoblja prije parenja, graviditeta i laktacije unos hrane trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno. Mjerenje unosa hrane tijekom parenja nije obvezno. Trebalo bi mjeriti i unos vode tijekom tih razdoblja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje tim putem. Hematologija 52. Na pet mužjaka i pet ženki koji se nasumično odaberu iz svake skupine trebalo bi jednom tijekom istraživanja provesti sljedeće hematološke preglede: hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, retikulociti, ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i mjerenje vremena/potencijala zgrušavanja krvi. Ostala određivanja koja treba provesti ako ispitivana kemikalija ili njezini navodni metaboliti imaju ili se sumnja da imaju oksidacijska svojstva obuhvaćaju koncentraciju methemoglobina i Heinzova tjelešca. 53. Uzorke krvi treba uzeti na specificiranom mjestu. Ženke bi tijekom uzimanja uzoraka trebale biti u fiziološki sličnom stanju. Kako bi se izbjegle praktične poteškoće povezane s varijabilnosti početka gestacije, krv se kod ženki može uzimati na kraju razdoblja prije parenja kao alternativa uzimanju uzoraka neposredno prije ili kao dio postupka za eutanaziju životinja. Uzorke krvi mužjaka po mogućnosti bi trebalo uzimati neposredno prije ili kao dio postupka za eutanaziju životinja. Kao alternativa, krv se kod mužjaka može uzimati i na kraju razdoblja prije parenja ako je tom vremenu uzorkovanja dana prednost kod ženki. 54. Uzorke krvi trebalo bi pohraniti u primjerenim uvjetima. Klinička biokemija 55. Kliničko-biokemijske pretrage za istraživanje glavnih toksičnih učinaka u tkivima i posebno učinaka na bubrege i jetru treba obaviti na uzorcima krvi dobivenima od pet mužjaka i pet ženki odabranih iz svake skupine. Preporučuje se da životinje tijekom noći pred uzimanje uzoraka krvi poste ( 22 ) . Pretrage koje se rade na plazmi ili serumu trebale bi obuhvatiti mjerenje natrija, kalija, glukoze, ukupne količine kolesterola, ureje, kreatinina, ukupne količine proteina i albumina te najmanje dva enzima koji su pokazatelji hepatocelularnih učinaka (kao što su alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza i sorbitol dehidrogenaza) te žučne kiseline. Mjerenja dodatnih enzima (jetrenog ili drugog podrijetla) i bilirubina mogu u određenim okolnostima pružiti korisne informacije. 56. Uzorci krvi uzimaju se s utvrđenog mjesta na temelju sljedećeg rasporeda: — od najmanje dva mladunca po leglu 4. dana nakon okota ako broj mladunaca to omogućuje (vidjeti stavke 40.–41.), — od svih ženki (majki) i najmanje dva mladunaca po leglu pri završetku ispitivanja 13. dana, i — od svih odraslih mužjaka pri završetku ispitivanja. Svi uzorci krvi spremaju se u odgovarajućim uvjetima. Uzorci krvi mladunaca i odraslih mužjaka uzeti 13. dana procjenjuju se u pogledu razina seruma hormona štitnjače (T4). Daljnja procjena hormona T4 u uzorcima krvi ženki (majki) i mladunaca uzetih 4. dana obavlja se po potrebi. Moguće je i mjerenje drugih hormona ako je to relevantno. Krv mladunaca može se izvaditi po leglu radi analiza hormona štitnjače. Hormone štitnjače (T4 i TSH) po mogućnosti bi trebalo mjeriti kao „ukupni broj”. 57. U zadnjem tjednu istraživanja, po izboru, mogu se obaviti analize urina pet nasumično odabranih mužjaka iz svake skupine dobivenog prikupljanjem u određenim vremenskim razmacima: izgled, količina, osmolalnost ili specifična težina, pH, protein, glukoza i krv/krvne stanice. 58. Osim toga, treba razmisliti i o ispitivanju serumskih markera koji označavaju opće oštećenja tkiva. Ostale pretrage, koje bi trebalo obaviti ako poznata svojstva ispitivane kemikalije mogu ili se sumnja da bi mogla utjecati na povezane metaboličke profile uključuju utvrđivanje razine kalcija, fosfata, triglicerida natašte, glukoze natašte, razine specifičnih hormona, methemoglobina i aktivnosti kolinesteraze. Njih treba identificirati od slučaja do slučaja. 59. Sljedeći čimbenici mogu utjecati na varijabilnost i apsolutne koncentracije za određivanje hormona: — vrijeme usmrćivanja zbog dnevne varijacije koncentracije hormona, — metoda usmrćivanja radi izbjegavanja pretjeranog stresa za životinje koji može utjecati na koncentraciju hormona, — pribori za određivanje hormona koji se mogu razlikovati po njihovim standardnim krivuljama. 60. Uzorke plazme koji su posebno namijenjeni određivanju hormona treba uzeti u usporedivo doba dana. Brojčane vrijednosti dobivene analizom koncentracija hormona razlikuju se ovisno o različitom, komercijalno dostupnom priboru. 61. Ako su prijašnji polazni podaci neprikladni, u obzir treba uzeti određivanje hematoloških i kliničkih biokemijskih varijabli prije početka doziranja ili po mogućnosti na skupini životinja koje nisu uključene u pokusne skupine. Kod ženki se podaci moraju dobiti od životinja koje doje. PATOLOGIJA Makroskopska nekropsija 62. Sve odrasle životinje korištene u istraživanju trebale bi se podvrgnuti kompletnoj, podrobnoj makroskopskoj nekropsiji koja obuhvaća pažljiv pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihova sadržaja. Posebnu pozornost treba obratiti na organe reproduktivnog sustava. Broj mjesta za implantaciju treba zabilježiti. Vaginalne briseve treba pregledati na dan nekropsije kako bi se utvrdila faza ciklusa estrusa i omogućila korelacija s histopatologijom ženskih reproduktivnih organa. 63. Sjemenike i sjemene kanaliće te prostatu i sjemene mjehuriće s koagulacijskim žlijezdama, kao cjelinu, svih odraslih mužjaka treba po potrebi obrezivanjem osloboditi od svih prianjajućih tkiva te ih treba izvagati u mokrom stanju što prije nakon seciranja kako bi se spriječilo njihovo sušenje. Osim toga, mase neobaveznih organa mogle bi uključivati kompleks anusnog podizača i bulbokavernoznog mišića, Cowperove žlijezde i glans penisa kod mužjaka te jajnike u paru (mokra masa) i maternicu (uključujući cerviks) kod ženki; ako se uključuju, te bi mase trebalo prikupiti što prije nakon seciranja. Treba sačuvati jajnike, sjemenike, sjemene kanaliće, sekundarne spolne organe i sve organe koji pokazuju makroskopske lezije svih odraslih životinja. 64. Štitnjača svih odraslih mužjaka i ženki te jednog mužjaka i jedne ženke starih 13 dana iz svakog legla trebala bi se sačuvati u najprimjerenijem sredstvu za fiksiranje radi planiranog kasnijeg histopatološkog pregleda. Masa štitnjače može se odrediti nakon fiksacije. Obrezivanje također treba obaviti vrlo pažljivo te samo nakon fiksacije kako bi se izbjeglo oštećenje tkiva. Oštećena tkiva mogu kompromitirati histopatološku analizu. Uzorke krvi treba uzeti na specificiranom mjestu i pohraniti u odgovarajućim uvjetima neposredno prije ili kao dio postupka za eutanaziju životinja (vidjeti stavak 56.). 65. Osim toga, kod najmanje pet odraslih mužjaka i ženki nasumično odabranih iz svake skupine (osim onih za koje je utvrđeno da su na umoru i/ili su eutanazirani prije kraja istraživanja) s jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, timusa, slezene, mozga i srca treba obrezati sve prianjajuće tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon seciranja kako bi se spriječilo da se osuše. Sljedeća tkiva treba sačuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najprimjerenije i za vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled: sve makrolezije, mozak (reprezentativne regije uključujući veliki mozak, mali mozak i medulu/most), leđnu moždinu, oko, želudac, tanko i debelo crijevo (uključujući Peyerove ploče), jetru, bubrege, nadbubrežne žlijezde, slezenu, srce, timus, dušnik i pluća (preparirane upuhivanjem fiksativa i zatim uranjanjem), spolne žlijezde (sjemenike i jajnike), sekundarne spolne organe (maternicu i cerviks, sjemene kanaliće, prostatu, sjemene mjehuriće s koagulacijskim žlijezdama), vaginu, mokraćni mjehur, limfne čvorove (osim najbližeg drenažnog čvora treba uzeti još jedan limfni čvor na temelju laboratorijskog iskustva (16.)), periferni živac (ishijadični ili tibijalni) po mogućnosti smješten uz mišić, skeletni mišić i kost, s leđnom moždinom (sekcija ili, kao alternativna, svježe pripremljen aspirat koštane srži). Preporučuje se da se sjemenici fiksiraju uranjanjem u Bouinov ili izmijenjeni Davidsonov fiksativ (16., 17. i 18.); za ta se tkiva ne preporučuje fiksacija u formalinu. Vezivna ovojnica može se nježno i plitko punktirati na oba pola organa iglom koja omogućuje brzu penetraciju fiksativa. Klinički i drugi nalazi mogu ukazati na potrebu za ispitivanjem dodatnih tkiva. Treba sačuvati i sve organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni. 66. Sljedeća tkiva mogu dati dragocjenu indikaciju za učinke na endokrini sustav: spolne žlijezde (jajnici i sjemenici), sekundarni spolni organi (maternica s cerviksom, sjemeni kanalići, sjemeni mjehurići s koagulacijskim žlijezdama, dorzolateralna i ventralna prostata), vagina, hipofiza, muška mliječna žlijezda i nadbubrežna žlijezda. Promjene u muškim mliječnim žlijezdama nisu dovoljno dokumentirane, ali taj parametar može biti vrlo osjetljiv na tvari s estrogenskim djelovanjem. Opažanja organa/tkiva koja nisu navedena u stavku 65. nisu obvezna. 67. Mrtve mladunce i mladunce koje se usmrti 13. dana nakon okota, ili ubrzo nakon toga, trebalo bi pažljivo pregledati kako bi se utvrdile barem vanjske velike abnormalnosti. Posebnu pozornost treba posvetiti vanjskim reproduktivnim genitalijama koje se pregledava kako bi se utvrdili mogući znakovi promijenjenog razvoja. Histopatologija 68. Na sačuvanim organima i tkivima odabranih životinja iz kontrolne skupine i skupina tretiranih visokim dozama treba napraviti kompletan histopatološki pregled (uz poseban naglasak na faze spermatogeneze kod muških spolnih žlijezdi i histopatologiju strukture intersticijskih stanica sjemenika). Po potrebi se mogu pregledati štitnjače mladunaca i preostalih odraslih životinja. Ta ispitivanja treba proširiti na životinje drugih skupina doziranja ako su u skupini s visokom dozom uočene promjene povezane s tretiranjem. Smjernica o histopatologiji (10.) pruža dodatne podrobne informacije o sekciji, fiksaciji, seciranju i histopatologiji endokrinih tkiva. 69. Treba pregledati sve makrolezije. Kako bi se pomoglo pojasniti NOAEL-e, treba pregledati ciljne organe kod skupina tretiranih ostalim dozama, osobito u skupinama kod kojih se tvrdi da pokazuju NOAEL. 70. Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki pregled tkiva i organa kod kojih su u tretiranim skupinama uočeni učinci. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Podaci 71. Treba navesti podatke za svaku pojedinačnu životinju. Osim toga, sve podatke treba sažeti u obliku tablice, tako da se za svaku ispitnu skupinu navede broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su uginule tijekom ispitivanja ili su eutanazirane iz humanih razloga, vrijeme smrti ili eutanazije, broj plodnih životinja, broj gravidnih ženki, broj životinja koje pokazuju znakove toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme pojavljivanja, trajanje i ozbiljnost toksičnih učinaka, vrste histopatoloških promjena i sve relevantne podatke o leglu. Format sažetog izvješća u obliku tablice koji se pokazao vrlo korisnim za procjenu reproduktivnih/razvojnih učinaka naveden je u Dodatku 3. 72. Ako je moguće, brojčane rezultate treba ocijeniti odgovarajućom i opće prihvaćenom statističkom metodom. Za usporedbe učinaka unutar raspona visina doza trebala bi se izbjeći uporaba višestrukih t-testova. Statističke metode treba odabrati u fazi planiranja istraživanja. Statistička analiza anogenitalnog razmaka i zadržavanja bradavica trebala bi se temeljiti na podacima za pojedinačne mladunce, uzimajući u obzir učinke na leglo. Ako je primjereno, jedinicu analize čini leglo. Statistička analiza tjelesne mase mladunaca trebala bi se temeljiti na podacima za pojedinačne mladunce, uzimajući u obzir veličinu legla. Zbog ograničenih dimenzija istraživanja, statističke analize kojima se nastoji ispitati važnost rezultata imaju ograničenu vrijednost za mnoge krajnje točke, osobito za reproduktivne krajnje točke. Nisu primjerene neke od često korištenih metoda, osobito parametrijska ispitivanja za mjerenje središnje tendencije. Ako se upotrebljavaju statističke analize, odabrana metoda trebala bi biti primjerena za distribuciju varijable koja se ispituje te je treba odabrati prije početka istraživanja. Ocjena rezultata 73. Nalaze ovog istraživanja toksičnosti treba ocijeniti s obzirom na uočene učinke, nekropsiju i mikroskopske nalaze. Evaluacija treba obuhvatiti odnos između doze ispitivane kemikalije i prisutnosti ili izostanka, učestalosti i ozbiljnosti abnormalnosti, uključujući makrolezije, identificirane ciljne organe, neplodnost, kliničke abnormalnosti, promjene sposobnosti reprodukcije i legla, promjene tjelesne mase, učinke na smrtnost i sve ostale toksične učinke. 74. Zbog kratkog razdoblja tretiranja mužjaka, uz podatke o plodnosti trebalo bi razmotriti i histopatologiju sjemenika i sjemenih kanalića pri procjeni učinaka na reprodukciju mužjaka. Kao pomoć u tumačenju istraživanja može biti korisna i upotreba podataka o prijašnjim kontrolama u pogledu reprodukcije/razvoja (npr. za veličinu legla, anogenitalni razmak, zadržavanje bradavica, razine seruma T4), ako su dostupni. 75. Radi kontrole kvalitete predlaže se prikupljanje podataka o prijašnjim kontrolama te izračunavanje koeficijenata varijacije za brojčane podatke, posebno za parametre povezane s otkrivanjem endokrinih ometača. Ti se podaci mogu upotrijebiti za uspoređivanje kad se ocjenjuju konkretna istraživanja. Izvješće o ispitivanju 76. Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije: Ispitivana kemikalija: — izvor, broj serije, rok uporabe, ako su dostupni, — stabilnost ispitivane kemikalije, ako je poznata. Tvar s jednim sastojkom: — fizički izgled, topljivost u vodi i druga relevantna fizikalno-kemijska svojstva, — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv, CAS broj, SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula, čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd. Tvari s više sastojaka, UVCB tvari i smjese: — opis (koliko je to moguće) kemijskog identiteta (vidjeti gore), kvantitativnog udjela i relevantnih fizikalno-kemijskih svojstava sastojaka . Nosač (po potrebi): — obrazloženje odabira nosača ako nije riječ o vodi. Ispitne životinje: — korištena vrsta/soj, — broj, dob i spol životinja, — podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd., — pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja, — obrazloženje odabira vrste ako se ne radi o štakorima. Ispitni uvjeti: — obrazloženje odabira visine doze, — pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripremanju hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravka, — pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije, — preračunavanje koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), prema potrebi, — pojedinosti o kvaliteti hrane i vode, — podroban opis postupka nasumičnog odabira mladunaca za izdvajanje ako se ono obavlja. Rezultati: — tjelesna masa/promjene tjelesne mase, — unos hrane i unos vode, po potrebi, — podaci o toksičnom odgovoru po spolu i dozi, uključujući plodnost, gestaciju i sve druge znakove — toksičnosti, — duljina gestacije, toksični ili drugi učinci na reprodukciju, potomstvo, rast nakon rođenja itd., — vrsta, stupanj i trajanje uočenih kliničkih promjena (reverzibilne ili ireverzibilne), — ocjena osjetilne aktivnosti, jakosti stiska i motorne aktivnosti, — hematološka ispitivanja s odgovarajućim referentnim vrijednostima, — klinička biokemijska ispitivanja s odgovarajućim referentnim vrijednostima, — broj odraslih ženki s normalnim ili abnormalnim ciklusom estrusa i trajanje ciklusa, — broj živorođenih i gubitaka nakon implantacije, — broj mladunaca s jako izraženim abnormalnostima, ukupna procjena vanjskih genitalija, broj patuljastih životinja, — vrijeme smrti tijekom istraživanja ili je li životinja preživjela do kraja, — broj implantacija, veličina i masa legla u trenutku evidentiranja, — podaci o tjelesnoj masi mladunaca, — anogenitalni razmak svih mladunaca (i tjelesna masa na dan mjerenja anogenitalnog razmaka), — zadržavanje bradavica kod mužjaka mladunaca, — razine hormona štitnjače, u mladunaca starih 13 dana i odraslih mužjaka (te u ženki (majki) i mladunaca starih 4 dana ako se mjeri), — tjelesna masa u trenutku usmrćenja i podaci o masi organa za roditeljske životinje, — nalazi nekropsije, — iscrpan opis histopatoloških nalaza, — podaci o apsorpciji (ako su dostupni), — statistička obrada rezultata, prema potrebi. Rasprava o rezultatima Zaključci Tumačenje rezultata 77. U ovom će se istraživanju pružiti procjene reproduktivne/razvojne toksičnosti povezane s primjenom ponovljenih doza. Točnije, s obzirom na to da je naglasak stavljen i na opću toksičnost i na krajnje točke reproduktivne/razvojne toksičnosti, rezultati istraživanja omogućit će razlikovanje reproduktivnih/razvojnih učinaka koji se javljaju kad nema opće toksičnosti i onih koji se javljaju samo kod doza koje su toksične i za roditeljske životinje (vidjeti stavke 7.–11.). Mogla bi dati naznaku u vezi s tim treba li provesti daljnja ispitivanjima i dati smjernice za osmišljavanje naknadnih istraživanja. Za pomoć pri tumačenju rezultata u pogledu reprodukcije i razvoja (19.) treba pogledati Smjernicu OECD-a 43. U Smjernici OECD-a 106 o histološkoj procjeni endokrinih i reproduktivnih ispitivanja na glodavcima (16.) navedene su informacije o pripremi i procjeni (endokrinih) organa i vaginalnih brisova koje mogu biti korisne za ovu ispitnu metodu. LITERATURA 1. OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 2. OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokio, 27–29. listopada 1992. Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 3. Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141.–149. 4. Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89.–95. 5. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. ožujka 1998., Na zahtjev dostupno kod Organizacije za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 6. OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 7. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 8. Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84.–97. 9. Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. 10. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). 11. Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267.–283. 12. Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233.–236. 13. Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599.–609. 14. Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383.–390. 15. OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 16. OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 17. Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. U: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, str. 52.–85. 18. Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524.–533. 19. OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. 20. OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organizacija za gospodarsku suradnju i razvoj, Pariz. Dodatak 1. DEFINICIJE (VIDJETI I (20.) SMJERNICU OECD-A 150) Androgeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni androgeni hormon (npr. testosteron) u organizmu sisavaca. Antiandrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog androgenog hormona (npr. testosterona) u organizmu sisavaca. Antiestrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog estrogenog hormona (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca. Antitiroidna aktivnost je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog hormona štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca. Kemikalija je tvar ili smjesa. Razvojna toksičnost manifestacija reproduktivne toksičnosti koju čine prenatalni, postnatalni, strukturni ili funkcionalni poremećaji potomstva. Doza je količina ispitivane kemikalije koja se primjenjuje. Doza se izražava kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitne životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase po danu) ili kao stalna koncentracija u hrani. Doziranje je opći pojam koji obuhvaća dozu, njezinu učestalost i trajanje doziranja. Evidentna toksičnost je opći naziv koji opisuje jasne znakove toksičnosti nakon primjene ispitivane kemikalije. Ti bi znakovi trebali biti dovoljni za utvrđivanje opasnosti i trebaju biti takvi da se za primjenu povišene doze može očekivati da će rezultirati razvojem ozbiljnih znakova toksičnosti i mogućom smrtnošću. Ometanje plodnosti čine poremećaji muških ili ženskih reproduktivnih funkcija ili reproduktivne sposobnosti. Toksičnost kod majke štetni učinci na gravidne ženke do kojih dolazi specifično (izravni učinak) ili nespecifično (neizravni učinak) i koji su povezani sa stanjem gravidnosti. NOAEL je kratica za visinu doze bez vidljivih štetnih učinaka. To je najviša doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni učinci povezani s tretiranjem. Estrogeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni estrogeni hormon (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca. Reproduktivna toksičnost predstavlja štetne učinke na potomstvo i/ili oštećenje muške i ženske reproduktivne funkcije ili sposobnosti. Ispitivana kemikalija je svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom. Tiroidna aktivnost je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni hormon štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca. Validacija je znanstveni postupak s ciljem karakterizacije operativnih zahtjeva i ograničenja ispitne metode te pokazivanja njezine pouzdanosti i relevantnosti za određenu svrhu. Dodatak 2. DIJAGRAM PLANA POKUSA IZ KOJEG SE VIDI MAKSIMALNO TRAJANJE STUDIJE, NA TEMELJU CIJELOG 14-DNEVNOG RAZDOBLJA PARENJA Dodatak 3. SAŽETO IZVJEŠĆE U OBLIKU TABLICE O UČINCIMA NA REPRODUKCIJU/RAZVOJ OPAŽANJA VRIJEDNOSTI Doziranje (jedinice)……. 0 (kontrola) … … … … Formirani parovi (N) Ciklus estrusa (barem srednja vrijednost duljine i učestalost nepravilnih ciklusa) Ženke koje pokazuju znakove kopulacije (N) Ženke koje su postale gravidne (N) Dani začeća 1–5 (N) Dani začeća 6–… (23) (N) Graviditet ≤ 21 dan (N) Graviditet = 22 dana (N) Graviditet ≥ 23 dana (N) Ženke (majke) sa živim mladuncima (N) Ženke (majke) sa živim mladuncima 4. dana nakon okota (N) Implantati po ženki (majci) (srednja vrijednost) Živi mladunci po ženki (majci) pri okotu (srednja vrijednost) Živi mladunci po ženki (majci) 4. dana (srednja vrijednost) Omjer spolova (m/ž) pri okotu (srednja vrijednost) Omjer spolova (m/ž) 4. dana (srednja vrijednost) Masa legla pri okotu (srednja vrijednost) Masa legla 4. dana (srednja vrijednost) Masa mladunaca pri okotu (srednja vrijednost) Masa mladunaca u trenutku mjerenja anogenitalnog razmaka (srednja vrijednost za mužjake i srednja vrijednost za ženke) Anogenitalni razmak na isti postnatalni dan, dan okota – 4. dan (srednja vrijednost za mužjake i ženke, naznaka postnatalnog dana) Masa mladunaca 4. dana (srednja vrijednost) Masa mladunaca 13. dana (srednja vrijednost) Zadržavanje bradavica kod mužjaka mladunaca 13. dana (srednja vrijednost) ABNORMALNI MLADUNCI Ženke (majke) s 0 Ženke (majke) s 1 Ženke (majke) s ≥ 2 GUBITAK POTOMAKA Prenatalno (implantacije umanjene za broj živorođenih) Ženke s 0 Ženke s 1 Ženke s 2 Ženke s ≥ 3 Postnatalno (broj živorođenih umanjen za broj živih mladunaca 13. dana nakon okota) Ženke s 0 Ženke s 1 Ženke s 2 Ženke s ≥ 3 B.65. IN VITRO ISPITNA METODA ZA NAGRIZANJE KOŽE S MEMBRANSKOM BARIJEROM UVOD 1. in vitro ispitnu metodu za nagrizanje kože s membranskom barijerom koja se može upotrebljavati za identifikaciju nagrizajućih kemikalija. U ispitnoj metodi upotrebljava se umjetna membrana koja je osmišljena tako da reagira na nagrizajuće kemikalije na sličan način kao i životinjska koža in situ . Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 435 (TG) (2015.). Nagrizanje kože odnosi se na izazivanje ireverzibilnog oštećenja kože koje se manifestira kao vidljiva nekroza koja kroz epidermu prodire u dermu nakon primjene ispitivane kemikalije, kako je utvrđeno Globalno usklađenim sustavom razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) (1.) i Uredbom (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (CLP) ( 24 ) Europske unije. Ova ispitna metoda, ekvivalentna ažuriranoj Smjernici OECD-a za ispitivanje 435, pružaispitnu metodu za nagrizanje kože s membranskom barijerom koja se može upotrebljavati za identifikaciju nagrizajućih kemikalija. U ispitnoj metodi upotrebljava se umjetna membrana koja je osmišljena tako da reagira na nagrizajuće kemikalije na sličan način kao i životinjska koža 2. Nagrizajuće djelovanje na kožu tradicionalno se procjenjivalo primjenom ispitivane kemikalije na kožu živih životinja i procjenom razmjera oštećenja tkiva nakon određenog vremenskog razdoblja (2.). Uz sadašnju ispitnu metodu donesen je niz drugih in vitro ispitnih metoda (3. i 4.) kao alternativa standardnom in vivo postupku na koži kunića (poglavlje B.4. ovog Priloga; ekvivalentan Smjernici OECD-a za ispitivanje 404) koji se upotrebljava za identifikaciju nagrizajućih kemikalija (2.). U stupnjevanoj strategiji ispitivanja i ocjenjivanja UN GHS-a za procjenu i razvrstavanje nagrizanja kože te u Smjernicama OECD-a o integriranim pristupima ispitivanju i procjeni (IATA) za nadraživanje/nagrizanje kože preporučuje se upotreba validiranih i prihvaćenih in vitro ispitnih metoda u okviru modula 3. i 4. (1. i 5.). U IATA-i je opisano nekoliko modula u kojima se grupiraju izvori informacija i alati za analizu te i. pružaju se smjernice o tome kako integrirati i upotrijebiti postojeće podatke o ispitivanju i podatke koji se dobivaju bez ispitivanja za procjenu potencijala kemikalija da uzrokuju nadraživanje i nagrizanje kože te ii. predlaže se pristup kad je potrebno daljnje ispitivanje, među ostalim i ako se dobiju negativni rezultati (5.). U tom modularnom pristupu pozitivni rezultati iz in vitro ispitnih metoda mogu se upotrebljavati za razvrstavanje kemikalije kao nagrizajuće bez potrebe za ispitivanjem na životinjama, čime se smanjuje i poboljšava upotreba životinja te se izbjegavaju bol i patnja do kojih može doći kada bi se u tu svrhu upotrebljavale životinje. 3. Dovršene su validacijske studije za in vitro model membranske barijere koji je komercijalno dostupan pod nazivom Corrositex ® (6., 7. i 8.) i koji pokazuje ukupnu točnost predviđanja nagrizanja kože od 79 % (128/163), osjetljivost od 85 % (76/89) i specifičnost od 70 % (52/74) za bazu podataka od 163 tvari i smjesa (7.). Na temelju njezine potvrđene valjanosti, ova je validirana referentna metoda (VRM) preporučena za upotrebu kao dio stupnjevane strategije ispitivanja za procjenu potencijalne opasnosti kemikalija da uzrokuju nagrizanje kože (5. i 7.). Prije nego što se in vitro model membranske barijere za nagrizanje kože može upotrijebiti u regulatorne svrhe, trebalo bi utvrditi njegovu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograničenja za njegovu predloženu uporabu kako bi se osigurala njegova sličnost s validiranom referentnom metodom (9.), u skladu s unaprijed utvrđenim zahtjevima izvedbe (10.). OECD-ovo uzajamno prihvaćanje podataka jamčit će se samo nakon što se svaka predložena nova ili ažurirana metoda koja je u skladu sa zahtjevima izvedbe pregleda i uključi u ekvivalentnu smjernicu OECD-a za ispitivanje. Smjernica OECD-a za ispitivanje 435 trenutačno obuhvaća samo jednu in vitro metodu i ovu ispitnu metodu – komercijalno dostupan model Corrositex ® . 4. Ostale ispitne metode za ispitivanje nagrizanja kože temelje se na upotrebi rekonstituirane ljudske kože (Smjernica OECD-a za ispitivanje 431) (3.) i izolirane kože štakora (Smjernica OECD-a za ispitivanje 430) (4.). Ova smjernica za ispitivanje omogućuje i daljnje razvrstavanje nagrizajućih