HR Službeni list Europske unije 116

32009R0761



SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE 23.07.2009.

UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 761/2009

od 23. srpnja 2009.

o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku

(Tekst značajan za EGP)

KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,

uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,

uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije, te o izmjenama Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktive Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 3.,

budući da:

(1) Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadrži ispitne metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari, koje se primjenjuju u smislu Uredbe (EZ) br. 1907/2006.

(2) Uredbu (EZ) br. 440/2008 potrebno je ažurirati kako bi se unijele izmjene pojedinih ispitnih metoda te dodalo nekoliko novih metoda koje je donio OECD. Zainteresirane strane već su konzultirane o tom prijedlogu. Tim se izmjenama metode u pitanju prilagođavaju znanstvenom i tehničkom napretku.

(3) Odredbe o tlaku pare trebalo bi revidirati kako bi se uključila nova metoda efuzije.

(4) Nužno je dodati novu metodu za mjerenje duljine srednjega geometrijskog promjera vlakana.

(5) Potrebno je ažurirati Uredbu (EZ) br. 440/2008 da bi se u nju prioritetno uključila nova in vitro metoda za ispitivanje nadraživanja kože u interesu smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima, u skladu s Direktivom Vijeća 86/609/EEZ od 24. studenoga 1986. o usklađivanju zakona i drugih propisa država članica u odnosu na zaštitu životinja koje se koriste u pokusne i druge znanstvene svrhe (3). Iako je nacrt in vitro metode za ispitivanje nadraživanja kože još uvijek predmet rasprave unutar OECD-a, u ovom je iznimnom slučaju primjereno uključiti u Uredbu metodu B 46 Metodu B 46 treba što prije ažurirati čim se postigne sporazum unutar OECD-a, ili ako se pojave dodatne informacije koje opravdavaju njezinu reviziju.

(6) Potrebno je revidirati odredbe koje se odnose na test inhibicije rasta algi radi uključenja dodatnih vrsta i ispunjenja zahtjeva ocjenjivanja opasnosti i razvrstavanja kemikalija.

(7) Nužno je dodati novu metodu za mjerenje aerobne mineralizacije u površinskoj vodi putem simulacijskog testa biorazgradnje i novu metodu ocjenjivanja toksičnosti za rod Lemna putem testa inhibicije rasta.

(8) Stoga bi Uredbu (EZ) br. 440/2008 trebalo izmijeniti.

(9) Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) 1907/2006,

DONIJELA JE OVU UREDBU:

Članak 1.

Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:

1. Dio A mijenja se kako slijedi: (a) poglavlje A 4. zamjenjuje se poglavljem A 4. iz Priloga I. ovoj Uredbi; (b) dodaje se poglavlje A 22. iz Priloga II. ovoj Uredbi.

2. Dio B mijenja se kako slijedi: Dodaje se poglavlje B 46. iz Priloga III. ovoj Uredbi.

3. Dio C mijenja se kako slijedi: (a) poglavlje C 3. zamjenjuje se poglavljem C 3. iz Priloga IV. ovoj Uredbi; (b) dodaju se poglavlja C 25. i C 26. iz Priloga V. i Priloga VI. ovoj Uredbi.

Članak 2.

Ova Uredba stupa na snagu trećega dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama. Sastavljeno u Bruxellesu 23. srpnja 2009. Za Komisiju Stavros DIMAS Član Komisije

(1) SL L 396, 30.12.2006., str. 1.

(2) SL L 142, 31.5.2008., str. 1.

(3) SL L 358, 18.12.1986., str. 1.

PRILOG I.

A 4. TLAK PARE

1. METODA

Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 104 (2004.).

1.1. UVOD

Ova izmijenjena verzija metode A 4. (1.) sadrži i jednu dodatnu metodu: „Metoda efuzije: izotermalna termogravimetrija”, koja je namijenjena tvarima s vrlo niskim tlakom (do 10–10 Pa). U svjetlu potreba za postupcima, posebno kad je u pitanju određivanje tlaka pare za tvari s niskim tlakom pare, ponovno se ocjenjuju i drugi postupci u okviru ove metode u odnosu na druga područja primjene.

U termodinamičkoj ravnoteži tlak pare čiste tvari ovisi samo o temperaturi. Temeljna načela opisana su na drugom mjestu (2.) (3.).

Ne postoji jedinstveni mjerni postupak koji bi se mogao primijeniti na cjelokupno područje tlakova para, koji se mogu kretati od ispod 10–10 sve do 105 Pa. Ova metoda obuhvaća osam metoda za mjerenje tlaka pare koje se mogu primijeniti u različitim područjima tlaka pare. U tablici 1. dana je usporedba različitih metoda s obzirom na primjenu i mjerno područje. Te se metode mogu primijeniti samo na spojeve koji se ne razgrađuju u uvjetima ispitivanja. Ako se tlak pare iz tehničkih razloga ne može odrediti nekom od navedenih pokusnih metoda, on se može i procijeniti; preporučena metoda procjene utvrđena je u Dodatku.

1.2. DEFINICIJE I JEDINICE

Tlak pare tvari definira se kao tlak zasićenja iznad krute ili tekuće tvari.

Koristi se SI jedinica za tlak, paskal (Pa). U nastavku su navedene i druge jedinice koje su se koristile u prošlosti, zajedno s faktorima pretvorbe:

1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa

Jedinica za temperaturu u SI sustavu je kelvin (K). Za pretvorbu Celzijevih stupnjeva u kelvine koristi se sljedeća formula:

T = t + 273,15

gdje je T temperatura u kelvinima ili termodinamička temperatura, a t je Celzijeva temperatura.

Tablica 1.

Mjerna metoda Tvari Procijenjena ponovljivost Procijenjena reproducibilnost Preporučeno područje Kruta tvar Tekućina Dinamička metoda nisko talište da do 25 % od 1 do 5 % do 25 % od 1 do 5 % od 103 Pa do 2 × 103 Pa od 2 × 103 Pa do 105 Pa Statička metoda da da od 5 do 10 % od 5 do 10 % od 10 Pa do 105 Pa od 10–2 Pa do 105 Pa (1) Metoda s izoteniskopom da da od 5 do 10 % od 5 do 10 % od 102 Pa do 105 Pa Metoda efuzije: vaganje tlaka pare da da od 5 do 20 % do 50 % od 10–3 do 1 Pa Metoda efuzije: Knudsenova ćelija da da od 10 do 30 % — od 10–10 do 1 Pa Metoda efuzije: izotermalna termogravimetrija da da od 5 do 30 % do 50 % od 10–10 do 1 Pa Metoda zasićenja plina da da od 10 do 30 % do 50 % od 10–10 do 103 Pa Metoda vrtećeg rotora da da od 10 do 20 % — od 10–4 do 0,5 Pa

1.3. NAČELO ISPITIVANJA

Tlak pare uglavnom se određuje pri različitim temperaturama. U ograničenom temperaturnom području, logaritam tlaka pare čiste tvari linearna je funkcija recipročne termodinamičke temperature, u skladu s pojednostavljenom Clapeyron-Clasiusovom jednadžbom:

gdje je:

p = tlak pare u paskalima ΔHv = toplina isparavanja u J mol–1 R = univerzalna plinska konstanta, 8,314 J mol–1 K–1 T = temperatura u K

1.4. REFERENTNE TVARI

Uporaba referentnih tvari nije obvezna. One prvenstveno služe za povremenu provjeru metode te omogućuju usporedbu rezultata različitih metoda.

1.5. OPIS METODE

1.5.1. Dinamička metoda (Cottrellova metoda)

1.5.1.1. Načelo

Tlak pare određuje se mjerenjem temperature vrenja tvari pri različitim zadanim tlakovima između cca 103 i 105 Pa. Ova se metoda preporučuje i za određivanje temperature vrenja. U tu se svrhu može koristiti do temperature od 600 K. Temperature vrenja tekućina su za približno 0,1 °C više na dubini od 3 do 4 cm nego na površini zbog hidrostatskog tlaka stupca tekućine. Kod Cottrellove metode (4.) termometar se nalazi u pari iznad površine tekućine, a uzavrela se tekućina neprekidno pumpa preko glave termometra. Glava termometra prekrivena je tankim slojem tekućine koja je u ravnoteži s parom pri atmosferskom tlaku. Termometar stoga pokazuje stvarno vrelište bez grešaka zbog pregrijavanja i hidrostatskog tlaka. Izvorna Cottrellova crpka prikazana je na slici 1. Cijev A sadrži uzavrelu tekućinu. U dno je utisnuta platinasta žica B, koja pospješuje ravnomjerno vrenje. Bočna cjevčica C vodi do kondenzatora, dok plašt D onemogućuje da hladni kondenzat dođe do termometra E. Kad tekućina u A vrije, mjehurići i tekućina koji dospiju u lijevak prolaze kroz krakove crpke F i prelijevaju se preko tijela termometra.

Slika 1. Slika 2.

Cottrellova crpka (4.)

A: Termopar

B: Vakuumski pufer-volumen

C: Mjerač tlaka

D: Vakuum

E: Mjerna točka

F: Grijaći element cca 150 W

1.5.1.2. Aparatura

Na slici 2. prikazana je vrlo točna aparatura koja radi prema Cottrellovom načelu. Ona se sastoji od cijevi s prostorom za vrenje u donjem dijelu, hladilom u srednjem dijelu i ispustom i prirubnicom u gornjem dijelu. Cottrellova je crpka smještena u prostoru za vrenje koji se zagrijava električnom grijačem. Temperatura se mjeri termoparom s plaštem ili otporničkim termometrom, koji se umetne kroz prirubnicu na vrhu. Ispust je spojen na sustav regulacije tlaka. On se sastoji od vakuumske crpke, puferskog volumena, manostata za podešavanje dotoka dušika za regulaciju tlaka i manometra.

1.5.1.3. Postupak

Tvar se stavi u prostor za vrenje. Određeni se problemi mogu javiti u slučaju kad krute tvari nisu praškaste, ali to je ponekad moguće riješiti zagrijavanjem rashladnog plašta. Aparatura se zabrtvi kod prirubnice i tvar odzračuje. Ovom se metodom ne mogu mjeriti tvari koje se pjene.

Zatim se podesi najniži željeni tlak i uključi zagrijavanje. Istovremeno se temperaturni senzor priključi na pisač.

Ravnoteža je postignuta kad se pri stalnom tlaku bilježi stalna temperatura vrenja. Osobito je važno paziti da se izbjegne burno vrenje („bumping”). Osim toga, na hladilu mora doći do potpune kondenzacije. Kod određivanja tlaka pare krutih tvari s niskim talištem treba voditi računa da ne dođe do začepljenja kondenzatora.

Kad se zabilježi točka ravnoteže, namjesti se viši tlak. Postupak se nastavlja na isti način dok se ne dođe do 105 Pa (sveukupno približno 5 do 10 mjernih točaka). Za provjeru, točke ravnoteže treba ponoviti pri padajućem tlaku.

1.5.2. Statička metoda

1.5.2.1. Načelo

Kod statičke metode (5.) tlak pare određuje se u termodinamičkoj ravnoteži pri zadanoj temperaturi. Ova je metoda prikladna za tvari i za višekomponentne tekućine i krute materijale u području od 10–1 do 105 Pa, a uz poseban oprez, i u području od 1 do 10 Pa.

1.5.2.2. Aparatura

Oprema se sastoji od kupelji sa stalnom temperaturom (preciznost ± 0,2 K), posude za uzorak spojene s vakuumskom cijevi, manometra i sustava za regulaciju tlaka. Komora s uzorkom (slika 3.a) spojena je s vakuumskom cijevi preko ventila i diferencijalnog manometra (U-cijev koja sadrži prikladnu manometarsku tekućinu) koji služi kao nulti pokazivač. U diferencijalnom manometru mogu se koristiti živa, silikoni i ftalati, ovisno o području tlaka i kemijskim svojstvima ispitivane tvari. Ipak, s obzirom na štetnost za okoliš, uporabu žive treba izbjegavati kad god je to moguće. Ispitivana tvar ne smije se primjetno otapati u tekućini U-cijevi niti s njom reagirati. Umjesto U-cijevi može se koristiti mjerač tlaka (slika 3.b). Živa se u manometru može koristiti u području od normalnog tlaka do 102 Pa, dok su silikonske tekućine i ftalati prikladni za tlakove ispod 102 Pa do 10 Pa. Postoje i drugi uređaji za mjerenje tlaka koji se mogu koristiti i ispod 102 Pa, a membranski kapacitativni manometri prikladni za zagrijavanje mogu se koristiti čak i ispod 10–1. Temperatura se mjeri na vanjskoj stijenki posude s uzorkom ili u samoj posudi.

1.5.2.3. Postupak

Koristeći aparaturu prikazanu na slici 3.a, U-cijev napuni se odabranom tekućinom koja se prije očitavanja vrijednosti mora odzračiti na povišenoj temperaturi. Ispitivana tvar se stavi u aparaturu i odzrači na sniženoj temperaturi. U slučaju višekomponentnih uzoraka temperatura mora biti dovoljno niska da ne dođe do promjene sastava materijala. Uspostava ravnoteže se može ubrzati miješanjem. Uzorak se može ohladiti tekućim dušikom ili suhim ledom, ali treba paziti da ne dođe do kondenzacije zraka ili tekućine u crpki. Otvori se ventil iznad posude s uzorkom i nekoliko minuta provodi usisavanje kako bi se uklonio zrak. Postupak odzračivanja se prema potrebi ponovi više puta.

Slika 3.a Slika 3.b

Kad se uzorak zagrijava sa zatvorenim ventilom, tlak pare se povećava. To mijenja ravnotežu tekućine u U-cijevi. Da bi se povratila ravnoteža, u aparaturu se dovodi dušik ili zrak dok se pokazivač diferencijalnog tlaka ne vrati na ništicu. Tlak koji je za to potreban može se očitati na manometru ili na preciznijem instrumentu. Taj tlak odgovara tlaku pare tvari na temperaturi mjerenja. Ako se koristi aparatura opisana na slici 3.b, tlak pare može se izravno očitati.

Tlak pare određuje se u odgovarajuće malim temperaturnim intervalima (sveukupno približno 5 do 10 mjernih točaka) do željene maksimalne temperature.

Za provjeru treba ponoviti mjerenja na niskim temperaturama. Ako se vrijednosti dobivene pri ponovljenom mjerenju ne podudaraju s krivuljom za rastuću temperaturu, mogući razlozi su:

i. u uzorku još ima zraka (npr. u slučaju jako viskoznih materijala) ili tvari s niskim vrelištem koje se oslobađaju prilikom zagrijavanja;

ii. tvar kemijski reagira u temperaturnom podučju koje se ispituje (npr. razlaganje, polimerizacija).

1.5.3. Metoda s izoteniskopom

1.5.3.1. Načelo

Izoteniskop (6.) se temelji na načelu statičke metode. Kod primjene ove metode uzorak se stavlja u balon sa stalnom temperaturom koji je spojen na manometar i vakuumsku crpku. Nečistoće koje su hlapljivije od tvari uklanjaju se odzračivanjem na sniženom tlaku. Tlak pare uzorka pri odabranim temperaturama izjednačava se s poznatim tlakom inertnog plina. Izoteniskop je prvobitno izrađen za mjerenje tlaka pare nekih tekućih ugljikovodika, ali je prikladan i za ispitivanje krutih tvari. Metoda u pravilu nije prikladna za višekomponentne sustave. Sitne greške u rezultatima moguće su kod uzoraka koji sadrže nehlapljive nečistoće. Preporučeno područje je 102 do 105 Pa.

1.5.3.2. Aparatura

Primjer mjernog uređaja prikazan je na slici 4. Potpun opis može se pronaći u ASTM D 2879-86 (6.).

1.5.3.3. Postupak

Kad se ispituju tekućine, sama tvar služi kao tekućina diferencijalnog manometra. U izoteniskop stavi se količina tekućine koja je potrebna da se napuni balon i kraći krak manometra. Izoteniskop se priključi na vakuumski sustav kako bi se vakuumirao, a zatim napuni dušikom. Pražnjenje i čišćenje sustava treba dvaput ponoviti kako bi se uklonio preostali kisik. Napunjeni izoteniskop stavi se u vodoravan položaj tako da se uzorak u tankom sloju raširi po balonu i manometru. Tlak sustava se smanji na 133 Pa i uzorak polako zagrijava dok ne zavrije (uklanjanje otopljenih plinova). Izoteniskop se zatim položi tako da se uzorak vrati u balon i napuni kraći krak manometra. Tlak se održava na 133 Pa. Izduženi vrh balona s uzorkom se zagrijava na malom plamenu dok se para koja se oslobađa iz uzorka ne raširi dovoljno da istisne dio uzorka iz gornjeg dijela balona i kraka manometra u manometar, stvarajući prostor ispunjen parom u kojemu nema dušika. Izoteniskop se zatim stavi u kupelj sa stalnom temperaturom i tlak dušika podešava dok se ne izjednači s tlakom pare uzorka. U ravnoteži je tlak dušika jednak tlaku pare tvari.

Slika 4.

Kod krutih tvari koriste se manometarske tekućine kao što su silikonske tekućine ili ftalati, ovisno o područjima tlaka i temperature. Odzračena manometarska tekućina stavi se u proširenje na dužem kraku izoteniskopa. Nakon toga se kruta tvar koja se ispituje stavi u balon za uzorak i odzrači na povišenoj temperaturi. Izoteniskop se zatim nagne tako da manometarska tekućina može otjecati u U-cijev.

1.5.4. Metoda efuzije: vaganje tlaka pare (7.)

1.5.4.1. Načelo

Uzorak ispitivane tvari se zagrije u maloj peći i stavi u vakuumirano zvono. Peć se prekrije poklopcem na kojemu se nalaze male rupice poznatoga promjera. Para tvari koja izlazi kroz jednu od rupica usmjeri se u zdjelicu vrlo osjetljive vage, koja je također smještena u zvonu. Kod nekih je izvedbi zdjelica vage uložena u kućište za hlađenje, koje procesom vođenja topline osigurava rasap topline prema van, i hladi se isijavanjem, tako da se izlazeća para na njoj kondenzira. Moment mlaza pare djeluje kao sila na vagu. Tlak pare može se odrediti na dva načina: izravno iz sile koja djeluje na zdjelicu vage ili iz brzine isparavanja pomoću Hertz-Knudsenove jednadžbe (2.):

gdje je:

G = brzina isparavanja (kg s–1 m–2) M = molarna masa (g mol–1) T = temperatura (K) R = univerzalna plinska konstanta (J mol–1 K–1) P = tlak pare (Pa)

Preporučeno područje je 10–3 do 1 Pa.

1.5.4.2. Aparatura

Opće načelo aparature prikazano je na slici 5.

Slika 5.

A: Postolje F: Kućište i palica za hlađenje B: Instrument s pomičnom zavojnicom G: Peć za isparavanje C: Zvono H: Dewarova posuda s tekućim dušikom D: Vaga sa zdjelicom I: Mjerenje temperature uzorka E: Vakuumski mjerni uređaj J: Ispitivana tvar

1.5.5. Metoda efuzije: Knudsenova ćelija

1.5.5.1. Načelo

Metoda se temelji na procjeni mase ispitivane tvari koja u obliku pare istječe kroz mikrootvor Knudsenove ćelije (8.) u jedinici vremena u uvjetima ultravakuuma. Masa pare može se dobiti određivanjem gubitka mase ćelije ili kondenzacijom pare na niskoj temperaturi i kromatografskim određivanjem količine tvari koja je prešla u paru. Tlak pare izračunava se primjenom Hertz-Knudsenovog odnosa (vidi odjeljak 1.5.4.1.) uz faktore korekcije koji ovise o parametrima aparature (9.). Preporučeno područje je 10–10 do 1 Pa (10.) (11.) (12.) (13.) (14.).

1.5.5.2. Aparatura

Opće načelo aparature prikazano je na slici 6.

Slika 6.

1: Priključak na vakuum 7: Poklopac na navoj 2: Otvori platinastog otporničkog termometra ili mjerenje i nadzor temperature 8: Krilne matice 3: Poklopac vakuumskog spremnika 9: Vijci 4: O-prsten 10: Efuzijske ćelije od nehrđajućeg čelika 5: Aluminijski vakuumski spremnik 11: Grijaća patrona 6: Uređaj za postavljanje i skidanje efuzijskih ćelija

1.5.6. Metoda efuzije: izotermalna termogravimetrija

1.5.6.1. Načelo

Metoda se temelji na određivanju brzina ubrzanog isparavanja ispitivane tvari pri povišenim temperaturama i okolnom tlaku primjenom termogravimetrije (10.) (15.) (16.) (17.) (18.) (19.) (20.). Brzine isparavanja vT dobivaju se izlaganjem odabranog spoja atmosferi spore struje inertnog plina i praćenjem gubitka mase pri definiranim izotermalnim temperaturama T u kelvinima u odgovarajućim vremenskim razdobljima. Tlakovi pare pT izračunavaju se iz vrijednosti vT na temelju linearnog odnosa između logaritma tlaka pare i logaritma brzine isparavanja. Ako je to potrebno, može se napraviti ekstrapolacija na temperature od 20 i 25 °C regresijskom analizom log pT u ovisnosti o 1/T. Ova je metoda prikladna za tvari s niskim tlakom pare čak do 10–10 Pa (10–12 mbar), s time da čistoća tvari mora biti blizu 100 % kako bi se izbjeglo pogrešno tumačenje izmjerenih gubitaka mase.

1.5.6.2. Aparatura

Opće načelo pokusne aparature prikazano je na slici 7.

Slika 7.

Preko nosača uzorka obješenog na mikrovagi u komori s nadziranom temperaturom pušta se struja suhog plinovitog dušika koja sa sobom odnosi molekule pare ispitivane tvari. Plinska struja po izlasku iz komore pročišćava se u sorpcijskoj jedinici.

1.5.6.3. Postupak

Ispitivana se tvar homogeno nanese na površinu hrapave staklene ploče. U slučaju krutih tvari, ploča se jednoliko navlaži otopinom tvari u prikladnom otapalu i osuši u inertnoj atmosferi. Kod mjerenja, ploča s premazom objesi se u termogravimetrijski analizator i nakon toga gubitak mase neprekidno mjeri u ovisnosti o vremenu.

Brzina isparavanja vT pri određenoj temperaturi izračunava se iz gubitka mase Δm ploče s uzorkom pomoću sljedeće formule:

gdje je F površina nanesene ispitivane tvari, u pravilu površina ploče s uzorkom, a t je vrijeme gubitka mase Δm.

Tlak pare pT izračunava se na temelju funkcije brzine isparavanja vT:

Log pT = C + D · log vT

gdje su C i D specifične konstante pokusne aparature koje su ovisne o promjeru mjerne komore i brzini protoka plina. Te se kostante određuju jedanput mjerenjem niza spojeva poznatog tlaka pare i regresijom log pT u ovisnosti o log vT (11.) (21.) (22.).

Odnos između tlaka pare pT i temperature T u kelvinima proizlazi iz sljedeće formule:

Log pT = A + B · 1/T

gdje su A i B konstante dobivene regresijom log pT u ovisnosti o 1/T. Uz pomoć ove jednadžbe tlak pare može se ekstrapolirati na bilo koju drugu temperaturu.

1.5.7. Metoda zasićenja plina (23.)

1.5.7.1. Načelo

Inertni se plin pri sobnoj temperaturi provodi kroz uzorak ispitivane tvari ili prevodi preko njega poznatom brzinom koja mora biti dovoljno niska da se postigne zasićenje. Postizanje zasićenja u plinskoj fazi je od presudne važnosti. Tvar koja putuje s plinom odvaja se uglavnom pomoću sorbensa i određuje njezina količina. Za kvantitativno određivanje prenesenog materijala se umjesto odvajanja pare i naknadne analize mogu koristiti integrirani analitički postupci, kao što je plinska kromatografija. Kod izračunavanja tlaka pare polazi se od pretpostavke da vrijedi zakon o idealnom plinu i da je ukupni tlak smjese plinova jednak zbroju tlakova plinskih komponenti. Parcijalni tlak ispitivane tvari tj. tlak pare izračunava se iz poznatog ukupnog volumena plina i mase prenesenog materijala.

Postupak zasićenja plina može se primijeniti na krute i tekuće tvari. On se može koristiti za tlak pare do najmanje 10–10 Pa (10.) (11.) (12.) (13.) (14.). Metoda je najpouzdanija pri tlakovima pare ispod 103 Pa. Iznad 103 Pa općenito se dobivaju precijenjene vrijednosti tlaka pare, vjerojatno zbog tvorbe aerosola. Budući da se mjerenja tlaka pare provode na sobnoj temperaturi, nema potrebe za ekstrapolacijom podataka od visokih temperatura koja bi mogla dovesti do ozbiljnih grešaka.

1.5.7.2. Aparatura

Postupak zahtijeva korištenje kućišta sa stalnom temperaturom. Shema na slici 8. prikazuje kućište u koje su smještena tri držača za krute uzorke i tri držača za tekuće uzorke, što omogućuje istovremenu analizu tri kruta uzorka ili tri tekuća uzorka. Temperatura se održava unutar ± 0,5 °C ili manje.

Slika 8.

Kao inertni plin nositelj obično se koristi dušik, ali ponekad može biti potreban i neki drugi plin (24.). Plin nositelj mora biti suh. Plinska se struja podijeli u 6 manjih struja koje se reguliraju igličnim ventilima (otvora približno 0,79 mm), i odvodi u kućište bakrenim cijevima unutarnjeg promjera 3,8 mm. Kad se temperatura uravnoteži, plin protječe kroz uzorak i odvajač sa sorbensom te izlazi iz kućišta.

Kruti se uzorci stavljaju u staklenu cjevčicu unutarnjeg promjera 5 mm između čepova od staklene vune (vidi sliku 9.). Na slici 10. prikazan je držač tekućeg uzorka i sustav sorbensa. Najobnovljivije mjerenje tlaka pare tekućina postiže se ako se tekućina nanese na staklene kuglice ili na inertni sorbens, kao što je silikagel, i držač napuni kuglicama. Druga mogućnost je da se plin nositelj prevodi preko grubog metalnog sita i propuhuje kroz kolonu tekuće ispitivane tvari.

Slika 9. Slika 10.

Sustav sorbensa se sastoji od prednjeg i pomoćnog dijela. Pri vrlo niskom tlaku pare, sorbens zadržava tek male količine tvari i adsorpcija na staklenoj vuni i staklenoj cjevčici između uzorka i sorbensa može predstavljati ozbiljan problem.

Odvajači hlađeni krutim CO2 još su jedan učinkovit način skupljanja isparenog materijala. Oni ne stvaraju protutlak na koloni za zasićenje, a odvojeni se materijal može lako kvantitativno ukloniti.

1.5.7.3. Postupak

Brzina protoka izlaznog plina nositelja mjeri se pri sobnoj temperaturi. Tijekom pokusa treba često provjeravati brzinu protoka kako bi se dobila točna vrijednost ukupnog volumena plina nositelja. Poželjno je neprekidno praćenje mjeračem protoka mase. Za zasićenje plinovite faze ponekad je potrebno dugo vrijeme kontakta, a time i prilično male brzine protoka plina (25.).

Na kraju pokusa prednji i pomoćni dio sorbensa zasebno se analiziraju. Spoj se iz svakog dijela desorbira dodavanjem otapala. Nastale se otopine kvantitativno analiziraju radi određivanja desorbirane mase iz svakog dijela. Izbor metode analize (također i izbor sorbensa i desorpcijskog otapala) ovisi o vrsti ispitivanog materijala. Učinkovitost desorpcije određuje se ubrizgavanjem poznate količine uzorka na sorbens, desorbiranjem tvari i analiziranjem dobivene količine. Važno je da se kod provjere učinkovitosti desorpcije koristi koncentracija koja je jednaka ili slična koncentraciji uzorka u ispitnim uvjetima.

Da bi se osiguralo zasićenje plina nositelja ispitivanom tvari, koriste se tri različite brzine protoka plina. Ako se izračunani tlak pare ne mijenja s promjenom brzine protoka, smatra se da je plin zasićen.

Tlak pare izračunava se pomoću sljedeće jednadžbe:

gdje je:

p = tlak pare (Pa) m = masa isparene ispitivane tvari (g) V = volumen zasićenog plina (m3) R = univerzalna plinska konstanta 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatura (K) M = molarna masa ispitivane tvari (g mol–1)

Izmjerene volumene treba ispraviti za razliku u tlaku i temperaturi između mjerača protoka i zasićivača.

1.5.8. Metoda vrtećeg rotora

1.5.8.1. Načelo

U ovoj se metodi koristi rotirajući viskozimetar čiji se mjerni element sastoji od male čelične kuglice obješene u magnetskom polju koja se vrti pod utjecajem okretnih polja (26.) (27.) (28.). Prijemne zavojnice omogućuju mjerenje brzine vrtnje. Kad kuglica postigne određenu brzinu vrtnje, obično oko 400 okretaja u sekundi, pobuda se prekida i nastupa usporavanje zbog trenja plina. Opadanje brzine vrtnje mjeri se u ovisnosti o vremenu. Tlak pare se izvodi iz usporavanja čelične kuglice, koje ovisi o tlaku. Preporučeno područje je od 10–4 do 0,5 Pa.

1.5.8.2. Aparatura

Raspored pokusne aparature prikazan je na slici 11. Mjerna se glava nalazi u kućištu sa stalnom temperaturom koja se regulira s točnošću od 0,1 °C. Posuda s uzorkom stavi se u zasebno kućište gdje je temperatura također regulirana s točnošću od 0,1 °C. Svi ostali dijelovi aparature se drže na višoj temperaturi kako bi se spriječila kondenzacija. Čitava aparatura je spojena na visokovakuumski sustav.

Slika 11.

2. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

2.1. PODACI

Tlak pare kod svake od prethodnih metoda treba odrediti za najmanje dvije temperature. Poželjno je odabrati tri ili više temperatura u području od 0 do 50 °C kako bi se provjerila linearnost krivulje tlaka pare. U slučaju metode efuzije (Knudsenova ćelija i izotermalna termogravimetrija) i metode zasićenja plina, za mjerenje se umjesto temperaturnog područja od 0 do 50 °C preporučuje područje od 120 do 150 °C.

2.2. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju sadrži sljedeće informacije:

— primijenjenu metodu,

— točnu specifikaciju tvari (identitet i nečistoće) i (prema potrebi) postupak prethodnog pročišćavanja,

— najmanje dvije vrijednosti tlaka pare i temperature – poželjno je tri ili više – u području između 0 i 50 °C (odnosno od 120 do 150 °C),

— najmanje jedna temperatura treba biti 25 °C ili niža, ako je to tehnički izvedivo kod odabrane metode,

— sve izvorne podatke,

— krivulju log p u ovisnosti o 1/T,

— procjenu tlaka pare na 20 ili 25 °C.

Ako se zapazi prijelaz tvari (u drugo agregatno stanje ili razlaganje), treba navesti sljedeće informacije:

— vrstu promjene,

— temperaturu na kojoj dolazi do promjene pri atmosferskom tlaku,

— tlak pare na 10 i 20 °C ispod temperature prijelaza i 10 i 20 °C iznad te temperature (osim u slučaju prijelaza iz krutog u plinovito stanje).

U izvješću treba navesti sve podatke i primjedbe bitne za tumačenje rezultata, posebno u vezi s nečistoćama i fizikalnim stanjem tvari.

3. LITERATURA

1. Službeni list Europskih zajednica L 383 A, 26-47 (1992.).

2. Ambrose, D. (1975.). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.

3. Weissberger R., ed. (1959.). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.

4. Glasstone, S. (1946.). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York.

5. NF T 20-048 AFNOR (September 1985.). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method.

6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

7. NF T 20-047 AFNOR (rujan 1985.). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

8. Knudsen, M. (1909.). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593.

9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975.). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173.

10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000.), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.

11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000.).

12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964.), 22-28.

13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982.), 269-278.

14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987.), 117-122.

15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973.) 137-147.

16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974.) 393-400.

17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982.) 161-168.

18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995.) 27-31.

19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998.) 300-310.

20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998.) 1512-20.

21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81st ed. (2000.), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C.

22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002.).

23. 40 CFR, 796. (1993.). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC.

24. Rordorf B.F. (1985.). Thermochimica Acta 85, 435.

25. Westcott et al. (1981.). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.

26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987.). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.

27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980.). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642.

28. Fremerey, J.K. (1985.). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.

(1) Ako se koristi kapacitivni manometar.

Dodatak

Metoda procjene

UVOD

Procijenjene vrijednosti tlaka pare mogu se koristiti:

— za donošenje odluke o tome koja je pokusna metoda najprikladnija,

— za navođenje procijenjene ili granične vrijednosti u slučaju kad se pokusna metoda ne može koristiti iz tehničkih razloga.

METODA PROCJENE

Tlak pare tekućina i krutih tvari može se procijeniti primjenom prilagođene Watsonove korelacije (a). Jedini pokusni podatak koji je potreban je uobičajeno vrelište. Metoda se može primijeniti u području tlaka od 105 Pa do 10–5 Pa.

Podrobne informacije o metodi nalaze se u priručniku „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Vidi također OECD Environmental Monograph No. 67 (c).

RAČUNSKI POSTUPAK

Tlak pare izračunava se na sljedeći način:

gdje je:

T = tražena temperatura Tb = uobičajeno vrelište Pvp = tlak pare na temperaturi T ΔHvb = toplina isparavanja ΔZb = faktor stlačivosti (procijenjen na 0,97) m = empirijski faktor koji ovisi o fizikalnom stanju na relevantnoj temperaturi

Osim toga:

gdje je KF empirijski faktor koji uzima u obzir polaritet tvari. Faktori KF za nekoliko vrsta spojeva navedeni su u literaturi (b).

Prilično se često može naići na podatke gdje je vrelište navedeno pri sniženom tlaku. U tom se slučaju tlak pare izračunava na sljedeći način:

gdje je T1 vrelište pri sniženom tlaku P1.

IZVJEŠĆE

Kad se koristi metoda procjene, u izvješću treba detaljno dokumentirati čitav računski postupak.

LITERATURA

(a) Watson, K.M. (1943.). Ind. Eng. Chem, 35, 398.

(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill.

(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993.).

PRILOG II.

A 22. ODREĐIVANJE SREDNJEGA GEOMETRIJSKOG PROMJERA VLAKANA POMOĆU DULJINE

1. METODA

1.1. UVOD

U ovoj se metodi opisuje postupak za mjerenje srednjeg geometrijskog promjera pomoću duljine (LWGMD – Length Weighted Geometric Mean Diameter) umjetnih mineralnih vlakana (MMMF – Man-Made Mineral Fibres). Budući da se LWGMD vlakana s 95 % vjerojatnosti nalazi između razina pouzdanosti uzorka od 95 % (tj. LWGMD ± dvije standardne greške), vrijednost koja se navodi u izvješću (ispitna vrijednost) odgovarat će donjoj granici pouzdanosti uzorka od 95 % (tj. LWGMD – 2 standardne greške). Metoda se temelji na ažuriranoj verziji (lipanj 1994.) nacrta industrijskog postupka za zaštitu zdravlja, sigurnost i zaštitu okoliša (HSE) koji je dogovoren na sastanku između ECFIA-a i HSE-a u Chesteru 26.9.1993. i koji je izrađen za potrebe drugog međulaboratorijskog pokusa i na temelju tog pokusa (1., 2.). Ova mjerna metoda može se koristiti za opisivanje promjera vlakana materijala u rasutom stanju i proizvoda koji sadrže MMMF, uključujući vatrostalna keramička vlakna (RCF – Refractory Ceramic Fibres), umjetna staklena vlakna (MMVF – Man-Made Vitreous Fibres), kristalna i polikristalna vlakna.

Određivanje duljinom je način da se kompenzira utjecaj na razdiobu promjera zbog pucanja dugačkih vlakana do kojega dolazi prilikom uzorkovanja i rukovanja materijalom. Za mjerenje razdiobe veličina promjera MMMF koristi se geometrijska statistika (geometrijska sredina) budući da se njihove razdiobe veličina obično pribiližavaju log-normalnoj razdiobi.

Mjerenje duljine i promjera je zamoran i dugotrajan posao, ali ako se mjere samo vlakna koja dodiruju beskonačno tanku crtu u vidnom polju SEM-a, tada je vjerojatnost da se odabere određeno vlakno razmjerna duljini. Budući da je pitanje duljine za potrebe određivanja duljinom time riješeno, potrebno je samo izmjeriti promjer i LWGMD-2SE se tada može izračunati na način kako je opisano.

1.2. DEFINICIJE

Čestica: Predmet čiji je omjer duljine i širine manji od 3:1.

Vlakno: Predmet čiji je omjer duljine i širine (razmjer stranica) najmanje 3:1.

1.3. PODRUČJE PRIMJENE I OGRANIČENJA

Metoda je namijenjena proučavanju razdioba promjera kod srednjih promjera od 0,5 μm do 6 μm. Veći se promjeri mogu mjeriti uz primjenu manjih SEM povećanja, ali se time povećavaju ograničenja metode kod finijih razdioba vlakana, dok se u slučaju srednjih promjera ispod 0,5 μm preporučuje mjerenje uz pomoć TEM (transmisijski elektronski mikroskop) mikroskopa.

1.4. NAČELO ISPITNE METODE

Uzme se određeni broj reprezentativnih uzoraka iz jezgre mekane ploče ili slobodnih vlakana u rasutom stanju. Vlakna u rasutom stanju se skrate drobljenjem i reprezentativni poduzorak dispergira u vodi. Zatim se vade alikvoti i filtriraju kroz polikarbonatni filtar veličine pora 0,2 μm i pripreme za pregled pod skenirajućim elektronskim mikroskopom (SEM). Promjeri vlakana mjere se pod povećanjem × 10 000 ili većim (1) metodom presijecanja linija da bi se dobila nepristrana procjena srednjeg promjera. Izračuna se donji interval pouzdanosti 95 % (na temelju jednostranog testa) tako da se dobije procjena najniže vrijednosti srednjega geometrijskog promjera vlakana materijala.

1.5. OPIS ISPITNE METODE

1.5.1. Sigurnost/mjere opreza

Izlaganje ljudi lebdećim vlaknima treba svesti na najmanju moguću mjeru te kod rukovanja suhim vlaknima koristiti digestor ili komoru za rukovanje s rukavicama („glove box”). Izloženost ljudi treba periodički provjeravati kako bi se utvrdila učinkovitost zaštitnih mjera. Kod rukovanja MMMF vlaknima treba nositi rukavice za jednokratnu uporabu kako bi se umanjilo nadraživanje kože i spriječila križna kontaminacija.

1.5.2. Aparatura/oprema

— Preša i kalupi (10 MPa),

— Polikarbonatni filtri s kapilarnim porama veličine pora 0,2 μm (promjer 25 mm),

— Membranski filtar od celuloznog estera veličine pora 5 μm, koji se koristi kao pomoćni filtar,

— Stakleni uređaj za filtraciju (ili filtracijski sustavi za jednokratnu uporabu) za filtre promjera 25 mm (npr. stakleni komplet za mikroanalizu Milipore, tip XX10 025 00),

— Svježe destilirana voda, filtrirana kroz filtar veličine pora 0,2 μm radi uklanjanja mikroorganizama,

— Uređaj za naparivanje zlata ili zlata/paladija,

— Skenirajući mikroskop razlučivosti do 10 nm i povećanjem × 10 000,

— Razno: spatule, skalpelski nož tip 24, pinceta, SEM cjevčice, karbonsko ljepilo ili karbonska ljepljiva traka, koloidno srebro („silver dag”),

— Ultrazvučna sonda ili stolna ultrazvučna kupelj,

— Svrdlo za uzorkovanje jezgre ili svrdlo za pluto za uzimanje uzoraka iz MMMF ploča.

1.5.3. Ispitni postupak

1.5.3.1. Uzorkovanje

Za uzimanje uzoraka iz presjeka tvrdih ili mekanih vlaknastih ploča koristi se svrdlo za uzorkovanje jezgre ili svrdlo za pluto od 25 mm. Uzorci se uzimaju u jednolikim razmacima po širini ploče, ako se radi o pločama male duljine, ili nasumično, ako su raspoložive velike ploče. Ista se oprema može koristiti i za ekstrahiranje slučajnih uzoraka slobodnih vlakana. Po mogućnosti treba uzeti šest uzoraka kako bi se uzele u obzir prostorne varijacije unutar materijala.

Šest jezgrovanih uzoraka zdrobi se u kalupu promjera 50 mm pod tlakom od 10 MPa. Materijal se promiješa spatulom i ponovno stlači na 10 MPa. Materijal se zatim izvadi iz kalupa i pohrani u čvrsto zatvorenoj staklenoj boci.

1.5.3.2. Priprema uzorka

Prema potrebi, vlakno treba ostaviti oko sat vremena u peći na temperaturi od 450 °C da bi se uklonilo organsko vezivo.

Uzorak se podijeli na poduzorke postupkom četvorenja stošca („cone and quarter”) (to treba učiniti u komori za zaštitu od prašine).

Mala se količina uzorka (< 0,5 g) spatulom doda u 100 ml svježe destilirane vode koja je profiltrirana kroz membranski filtar od 0,2 μm (mogu se koristiti i drugi izvori ultračiste vode ako se dokaže da su zadovoljavajuće kakvoće). Uzorak se dobro rasprši uz pomoć ultrazvučne sonde snage 100 W koja je ugođena tako da izazove kavitaciju. (Ako sonda nije raspoloživa, koristi se sljedeći postupak: uzorak protresti i okrenuti, ponavljajući postupak 30 sekundi – petminutna obrada u stolnoj ultrazvučnoj kupelji – još 30 sekundi protresati i okretati.)

Čim se vlakno dispergira, izvadi se određeni broj alikvota (npr. tri alikvota od 3, 6 i 10 ml) pipetom širokoga grla (zapremine 2 – 5 ml).

Svaki se alikvot filtrira pod vakuumom kroz polikarbonatni filtar 0,2 μm i pomoćni MEC filtar veličine pora 5 μm, koristeći stakleni filtar-lijevak s cilindričnim spremnikom. U lijevak se ulije oko 5 ml filtrirane destilirane vode i alikvot polako pipetira u vodu držeći vrh pipete ispod meniskusa. Pipetu i spremnik treba temeljito isprati nakon pipetiranja jer se tanka vlakna znaju nakupljati na površini.

Filtar se oprezno ukloni i odvoji od pomoćnog filtra te stavi u posudu da se osuši.

Ljuljajućim pokretima odreže se jedna četvrtina ili jedna polovina dijela filtra s filtarskim talogom koristeći skalpel tipa 24. Odrezani se dio pažljivo pričvrsti na SEM nosač („stub”) pomoću karbonske ljepljive trake ili karbonskog ljepila. Koloidno srebro treba nanijeti na najmanje tri mjesta kako bi se poboljšao električni kontakt na rubovima filtra i nosača. Kad se ljepilo/koloidno srebro osuši, na površinu taloga se naparivanjem nanese cca 50 nm zlata ili zlato/paladija.

1.5.3.3. Kalibracija i rad SEM-a

1.5.3.3.1. Kalibracija

Kalibraciju SEM-a treba provjeriti najmanje jedanput tjedno (u idealnom slučaju jedanput dnevno) pomoću ovjerene rešetke za kalibraciju. Kalibracija se provjerava u odnosu na odobreni standard; ako izmjerena vrijednost (SEM) nije u granicama ± 2 % odobrene vrijednosti, kalibraciju treba prilagoditi i ponovno provjeriti.

Na stvarnom matriksu uzorka, SEM mora imati mogućnost razlučivanja barem minimalnog vidljivog promjera od 0,2 μm pri povećanju × 2 000.

1.5.3.3.2. Rad

SEM treba podesiti na povećanje od 10 000 (2) i osigurati uvjete koji daju dobru razlučivost i prihvatljivu kakvoću slike pri malim brzinama skeniranja, npr. 5 sekundi po sličici. Iako različiti uređaji mogu imati različite radne postavke, za najbolju vidljivost i razlučivost kod rada s materijalima relativno niske atomske mase uglavnom treba koristiti ubrzavajući napon od 5 – 10 keV i uređaj podesiti na malu veličinu točke i kratku radnu udaljenost. Kad se provodi linearna traverza, treba koristiti nagib od 0° da bi se smanjila potreba za ponovnim fokusiranjem, a ako SEM ima eucentričnu fazu, treba koristiti eucentričnu radnu udaljenost. Može se koristiti i manje povećanje ako materijal ne sadrži mala vlakna (malog promjera) i promjeri vlakana su veliki (> 5 μm).

1.5.3.4. Određivanje veličine

1.5.3.4.1. Ocjenjivanje uzorka pregledom pod malim povećanjem

Na početku uzorak treba pregledati pod malim povećanjem da bi se otkrile eventualne naznake stvaranja grudica velikih vlakana i procijenila gustoća vlakana. U slučaju pretjeranog broja grudica, preporučljivo je pripremiti novi uzorak.

Da bi se postigla statistička točnost, potrebno je izmjeriti određeni minimalni broj vlakana – velika gustoća vlakana može se smatrati poželjnom osobinom jer pregledavanje praznih polja oduzima vrijeme, a ne daje nikakav doprinos analizi. Međutim, ako je filtar preopterećen, bit će teško izmjeriti sva mjerljiva vlakna, a neka se manja vlakna mogu i previdjeti ako su sakrivena iza velikih vlakana.

Ako je gustoća vlakana iznad 150 vlakana po milimetru linearne traverze, može se javiti pristranost u smislu previsoke procjene LWGMD. S druge strane, male koncentracije vlakana produžuju vrijeme analize i često je isplativije pripremiti uzorak čija je gustoća vlakana bliža optimalnoj gustoći nego nastaviti s brojenjem na filtrima s niskom koncentracijom. Kod optimalne gustoće vlakana treba prosječno dobiti otprilike jedno do dva brojiva vlakna po vidnom polju pri povećanju od 5 000. Ipak, optimalna gustoća ovisi o veličini (promjeru) vlakana; stoga se ispitivač u određenoj mjeri mora osloniti na vlastitu stručnu prosudbu kako bi odlučio je li gustoća vlakana približno optimalna ili nije.

1.5.3.4.2. Određivanje promjera vlakana duljinom

Broje se samo vlakna koja dodiruju (ili sijeku) (beskonačno) tanku crtu na zaslonu SEM-a. Stoga treba povući vodoravnu (ili okomitu) crtu kroz sredinu zaslona.

Druga je mogućnost da se u sredinu zaslona stavi samo točka i započne kontinuirano skeniranje u jednom smjeru preko filtra. Mjeri se i bilježi promjer svakog vlakna razmjera stranica većeg od 3:1 koje dodiruje ili siječe tu točku.

1.5.3.4.3. Određivanje veličine vlakna

Preporučuje se da se izmjeri najmanje 300 vlakana. Svako se vlakno mjeri samo jedanput u točki gdje siječe crtu ili točku nacrtanu na slici (ili u blizini sjecišta ako su rubovi vlakna skriveni). Ako se naiđe na vlakna neujednačenog presjeka, uzima se u obzir mjerenje koje predstavlja prosječni promjer vlakna. Definiranje ruba i mjerenje najkraće udaljenosti između rubova vlakna zahtijeva poseban oprez. Određivanje veličine može se provoditi izravno „on line” ili „off-line” na pohranjenim slikama odnosno fotografijama. Preporučuju se poluautomatski sustavi mjerenja slike koji podatke izravno učitavaju u tablicu, jer se tako štedi vrijeme i izbjegavaju greške u prijepisu, a izračun se može automatizirati.

Krajeve dugačkih vlakana treba pregledati pod malim povećanjem da bi se provjerilo da ne zavijaju natrag u vidno polje mjerenja i da ne bi bili izmjereni više puta.

2. PODACI

2.1. OBRADA REZULTATA

Promjeri vlakana uglavnom nemaju normalnu razdiobu. Ipak, logaritamskom transformacijom može se dobiti približno normalna razdioba.

Izračuna se aritmetička sredina (srednji lnD) i standardna devijacija (SDlnD) vrijednosti logaritma po bazi e (lnD) n promjera vlakana (D).

(1.) (2)

Standardna se devijacija podijeli kvadratnim korijenom broja mjerenja (n) da bi se dobila standardna greška (SElnD).

(3)

Da bi se dobila geometrijska sredina umanjena za dvije geometrijske standardne greške, dvostruka standardna greška oduzme se od srednje vrijednosti i izračuna eksponent te vrijednosti (srednja vrijednost minus dvije standardne greške).

LWGMD – 2SE = e(sred lnD – 2SElnd) (4.)

3. IZVJEŠĆIVANJE

IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju sadrži barem ove informacije:

— vrijednost LWGMD-2SE,

— sva odstupanja, a posebno ona koja imaju utjecaja na preciznost ili točnost rezultata, uz odgovarajuća obrazloženja.

4. LITERATURA

1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive, February 1999.

2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive, Research and Laboratory Services Division, 1994.

(1) Ova vrijednost povećanja odnosi se na vlakna od 3 μm, za vlakna od 6 μm možda je primjerenije koristiti povećanje × 5 000.

(2) Za vlakna od 3 μm, vidi prethodnu napomenu.

PRILOG III.

B.46. TEST NADRAŽIVANJA KOŽE IN VITRO NA MODELU REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME

1. METODA

1.1. UVOD

Nadraživanje kože je izazivanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane tvari u trajanju do najviše 4 sata (prema definiciji u Globalno usklađenom sustavu razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN)) (1.). Ova ispitna metoda predviđa in vitro postupak koji, ovisno o zahtjevima pružanja informacija, nudi mogućnost da se nadražujuće djelovanje tvari na kožu odredi samostalnim zamjenskim testom u okviru strategije ispitivanja, u skladu s pristupom ocjenjivanja dokazne snage („Weight of Evidence Approach”) (2.).

Ocjenjivanje nadraživanja kože do sada je uglavnom zahtijevalo korištenje laboratorijskih životinja (vidi metodu B 4.) (3.). Vodeći računa o dobrobiti životinja, metoda B 4. dopušta da se kod određivanja nagrizanja/nadraživanje kože primijeni strategija stupnjevitog ispitivanja i koriste validirane in vitro i ex vivo metode, kako bi se izbjegla bol i patnja životinja. Za ocjenjivanje nagrizajućeg djelovanja u okviru strategije stupnjevitog ispitivanja iz metode B 4., korisne su tri validirane in vitro ispitne metode odnosno smjernice – B 40, B 40.a i TG 435 (4., 5., 6.).

Ova se ispitna metoda temelji na modelima rekonstruirane ljudske epiderme koji u cjelokupnoj svojoj izvedbi (korištenje keratinocita iz ljudske epiderme kao izvora stanica, reprezentativnog tkiva i citoarhitekture) vjerno oponašaju biokemijska i fiziološka svojstva gornjih dijelova ljudske kože tj. epiderme. Postupak opisan u ovoj ispitnoj metodi omogućuje utvrđivanje opasnosti nadražujućih tvari u skladu s 2. kategorijom UN GHS. Ova ispitna metoda obuhvaća i niz referentnih normi koje se koriste za ocjenjivanje sličnih ispitnih metoda i varijanti metoda na temelju rekonstruirane ljudske epiderme (7.).

Za dvije in vitro ispitne metode (8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17.) u kojima se koriste modeli rekonstruirane ljudske epiderme, koji su dostupni na tržištu kao EpiSkinTM i EpiDermTM, već su dovršene predvalidacijske, optimizacijske i validacijske studije. Gore spomenuta literatura temelji se na označavanju R 38. Određeni aspekti preračunavanja za potrebe GHS-a obrađeni su u literaturi pod brojem 25. Metode čije su radne značajke istovjetne metodi EpiSkinTM (validirana referentna metoda 1.) preporučuju se kao samostalni zamjenski test za in vivo pokus na kunićima za potrebe razvrstavanja nadražujućih tvari u 2. kategoriju GHS. Što se tiče metoda čije su radne značajke istovjetne metodi EpiDermTM (validirana referentna metoda 2.), one se u odnosu na razvrstavanje nadražujućih tvari u 2. kategoriju GHS preporučuju samo kao test pretraživanja ili kao dio strategije stupnjevitog ispitivanja u okviru pristupa ocjenjivanja dokazne snage. Da bi se predloženi in vitro test nadraživanja kože na modelu rekonstruirane ljudske epiderme mogao koristiti u regulatorne svrhe, potrebno je odrediti njegovu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograničenja s obzirom na predloženu uporabu i usporediti ih s validiranom referentnom metodom 1., u skladu s referentnim normama utvrđenim u ovoj ispitnoj metodi (Dodatak).

Još su dvije in vitro ispitne metode s modelom rekonstruirane ljudske epiderme validirane u skladu sa zahtjevima ove ispitne metode te daju slične rezultate kao validirana referentna metoda 1. (18.). To su varijanta ispitne metode EpiDermTM (varijanta referentne metode 2.) i ispitna metoda SkinEthic RHETM („me-too” metoda 1.).

1.2. DEFINICIJE

U okviru ove ispitne metode primjenjuju se sljedeće definicije:

Točnost: Stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. Ona je mjerilo radnih značajki ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Izraz se često koristi u istom značenju kao „podudarnost” kako bi se označio udio točnih rezultata metode.

Tvar za kontrolu šarže: Referentna tvar kod koje stanice tkiva pokazuju srednji stupanj vijabilnosti.

Vijabilnost stanica: Parametar za mjerenje ukupne aktivnosti populacije stanica, npr. sposobnost staničnih mitohondrijskih dehidrogenaza da reduciraju vitalnu boju MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavo;), koji, ovisno o krajnjoj točki koja se mjeri i planu ispitivanja, korelira s ukupnim brojem i/ili vitalnošću živih stanica.

ET50 : Vrijeme izlaganja u kojem se vijabilnost stanica smanji za 50 % nakon primjene markerske tvari u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji, vidi također IC50.

Lažno negativna kvota: Udio svih pozitivnih tvari koje je ispitna metoda pogrešno identificirala kao negativne. Ona je jedan od pokazatelja radnih značajki ispitne metode.

Lažno pozitivna kvota: Udio svih negativnih (neaktivnih) tvari koje su pogrešno identificirane kao pozitivne. Ona je jedan od pokazatelja radnih značajki ispitne metode.

Beskonačna doza: Količina ispitivane tvari nanesena na kožu koja prelazi količinu koja je potrebna da se potpuno i jednoliko prekrije površina kože.

GHS (Globalno usklađeni sustav razvrstavanja i označivanja kemikalija): Sustav za razvrstavanje tvari i smjesa prema standardiziranim vrstama i stupnjevima fizikalnih opasnosti i opasnosti za zdravlje i okoliš, koji obuhvaća odgovarajuća komunikacijska sredstva kao što su piktogrami, signalne riječi, obavijesti o opasnosti, obavijesti o mjerama opreza i sigurnosno-tehnički listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim učincima s ciljem zaštite ljudi (uključujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potrošače i pružatelje pomoći) i okoliša (1.), i proveden je u EU-u Uredbom (EZ) br. 1272/2008.

IC50 : Koncentracija pri kojoj markerska tvar smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja, vidi također ET50.

Referentne norme: Norme na temelju validirane referentne metode koje čine osnovu za ocjenjivanje usporedivosti predložene ispitne metode koja je mehanicistički i funkcionalno slična validiranoj referentnoj metodi. One obuhvaćaju (I.) bitne elemente ispitne metode, (II.) minimalni popis referentnih tvari odabranih među tvarima koje su korištene za dokazivanje prihvatljivih radnih značajki validirane referentne metode i (III.) usporedive razine točnosti i pouzdanosti koje mora pokazati predložena ispitna metoda kod ocjenjivanja primjenom minimalnog popisa referentnih tvari u odnosu na validiranu referentnu metodu.

Pouzdanost: Pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može obnovljivo primijeniti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija u određenom vremenu uz primjenu istog protokola. Ona se ocjenjuje izračunavanjem obnovljivosti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija.

Osjetljivost: Udio svih pozitivnih/aktivnih tvari koje su pravilno razvrstane primjenom testa. Ona je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.

Specifičnost: Udio svih negativnih/neaktivnih tvari koje su pravilno razvrstane primjenom testa. Ona je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.

Nadraživanje kože: Izazivanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane tvari u trajanju do najviše 4 sata. Nadraživanje kože je lokalna neimunogena reakcija koja se javlja ubrzo nakon podražaja (24.). Njezina glavna značajka je reverzibilan proces koji uključuje upalne reakcije i većinu karakterističnih kliničkih znakova nadraživanja (eritem, edem, svrbež i bol) koji se povezuju s upalnim procesom.

1.3. PODRUČJE PRIMJENE I OGRANIČENJA

Ograničenje testova s rekonstruiranom ljudskom epidermom u skladu s ovom ispitnom metodom sastoji se u tome što se pomoću njih tvari mogu razvrstavati samo u 2. kategoriju nadražujućih tvari u okviru sustava UN GHS. Budući da oni ne omogućuju razvrstavanje u fakultativnu 3. kategoriju prema definiciji UN GHS, sve će ostale tvari ostati nerazvrstane (izvan kategorije). Ovu ispitnu metodu treba revidirati ovisno o regulatornim potrebama i mogućem uključenju novih krajnjih točaka i poboljšanja, ali i u slučaju pojave novih zamjenskih „me-too” testova.

Ova ispitna metoda omogućuje utvrđivanje opasnosti monokonstituentnih nadražujućih tvari (19.), ali ne pruža odgovarajuće informacije o nagrizanju kože. Plinovi i aerosoli se ne mogu ispitivati, a smjese još nisu ocijenjene u validacijskoj studiji.

1.4. NAČELO ISPITIVANJA

Ispitivana se tvar topikalno nanosi na trodimenzionalni model rekonstruirane ljudske epiderme, koji čine obični ljudski epidermalni keratinociti uzgojeni u svrhu dobivanja visoko izdiferenciranog modela ljudske epiderme. Sastoji se od organiziranih bazalnih, trnastih i zrnatih slojeva te višeslojnog rožnatog sloja (stratum corneum) koji između stanica sadrži lamelarne masne slojeve raspoređene analogno obrascu koji se susreće in vivo.

Načelo ispitivanja s modelom rekonstruirane ljudske epiderme temelji se na pretpostavci da nadražujuće tvari mogu prodrijeti u rožnati sloj difuzijom i da su citotoksične za stanice u nižim slojevima. Vijabilnost stanica mjeri se pretvorbom vitalne boje MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plava; EINECS broj 206-069-5, CAS broj 298-93-1)] u plavu sol formazana djelovanjem dehidrogenaza, koja se kvantitativno mjeri nakon ekstrakcije iz tkiva (20.). Nadražujuće tvari prepoznaju se po tome što spuštaju vijabilnost stanica ispod definiranih pragova (tj. ≤ 50 % za 2. kategoriju nadražujućih tvari UN GHS). Tvari kod kojih je vijabilnost stanica iznad definiranog praga se ne razvrstavaju (tj. > 50 %, izvan kategorije).

Sustavi koji se temelje na modelu rekonstruirane ljudske epiderme mogu se koristiti za ispitivanje krutih tvari, tekućina, polukrutih tvari i voskova. Tekućine mogu biti vodene i bezvodne; krute tvari mogu biti topljive ili netopljive u vodi. Kad god je to moguće krute tvari treba ispitivati u obliku sitnog praha. Budući da je validacijom ispitnih sustava s modelom rekonstruirane ljudske epiderme obuhvaćeno 58 pomno odabranih tvari koje predstavljaju širok spektar kemijskih razreda, očekuje se da će metode biti opće primjenjive u svim kemijskim razredima (16.). Validacijom je obuhvaćeno 13 nadražujućih tvari iz 2. kategorije GHS. Valja naglasiti da u validaciju nisu uključene nenagrizajuće kiseline, baze, soli i druge anorganske tvari kao i neki poznati razredi organskih nadražljivaca, kao što su hidroperoksidi, fenoli i površinski aktivne tvari, ili su uključeni tek u ograničenoj mjeri.

1.5. DOKAZIVANJE OSPOSOBLJENOSTI

Poželjno je da laboratoriji prije rutinske primjene validirane metode koja ispunjava zahtjeve ove ispitne metode dokažu tehničku osposobljenost na deset preporučenih tvari koje su navedene u tablici 1. U okviru ove ispitne metode fakultativna 3. kategorija UN GHS ne smatra se kategorijom. Da bi se nove („me-too”) ispitne metode proizašle iz ove metode koje su strukturno i funkcionalno slične validiranim referentnim metodama kao i varijante validiranih metoda mogle koristiti u ispitivanjima za zadovoljavanje regulatornih zahtjeva, potrebno je dokazati usporedivu pouzdanost i točnost nove metode primjenom referentnih normi navedenih u Dodatku ove ispitne metode.

Tablica 1.

Tvari za provjeru tehničke osposobljenosti, koje predstavljaju podskup referentnih tvari iz Dodatka

Tvar CAS broj Rezultat in vivo Agregatno stanje Kategorija GHS naftalenoctena kiselina 86-87-3 0 K izvan kat. izopropanol 67-63-0 0,3 T izvan kat. metil-stearat 112-61-8 1 K izvan kat. heptil-butirat 5870-93-9 1,7 T fakultativna 3. kat heksil-salicilat 6259-76-3 2 T fakultativna 3. kat ciklamen-aldehid 103-95-7 2,3 T 2. kat. 1-bromheksan 111-25-1 2,7 T 2. kat. butil-metakrilat 97-88-1 3 T 2. kat. 1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 3,3 K 2. kat. heptanal 111-71-7 4 T 2. kat.

1.6. OPIS METODE

U nastavku se nalazi opis elemenata i postupaka u vezi s testom na modelu rekonstruirane ljudske epiderme za potrebe ocjenjivanja nadraživanja kože. Model rekonstruirane ljudske epiderme može se izraditi, preparirati ili nabaviti na tržištu (npr. EpiSkinTM, EpiDermTM i SkinEthic RHETM). Standardni ispitni protokoli za EpiSkinTM, EpiDermTM i SkinEthic RHETM mogu se preuzeti na (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu)(21., 22., 23.)). Ispitivanje se provodi na sljedeći način:

1.6.1. Elementi modela rekonstruirane ljudske epiderme

1.6.1.1. Opći uvjeti koje model mora zadovoljiti

Za izgradnju epitela koriste se normalni ljudski keratinociti. Ispod funkcionalnog rožnatog sloja (stratum corneum) nalaze se višestruki slojevi vitalnih epitelnih stanica (bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj). I sam rožnati sloj je višeslojan te sadrži esencijalni profil lipida kao čvrstu funkcionalnu barijeru koja je sposobna zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih tvari, npr. natrijev dodecil-sulfat (SDS) ili Triton X-100. Funkcija barijere može se ocijeniti određivanjem koncentracije markerske tvari koja smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja ili određivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se vijabilnost tkiva smanji za 50 % (ET50) nakon primjene markerske tvari u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji. Model mora biti dovoljno nepropustan da spriječi prolazak materijala oko rožnatog sloja do vitalnog tkiva jer bi to značilo loše modeliranje izlaganja kože. Kožni model ne smije biti onečišćen bakterijama, virusima, mikroplazmama i gljivicama.

1.6.1.2. Funkcionalni uvjeti koje model mora zadovoljiti

1.6.1.2.1. Vijabilnost

Preferirani test za određivanje stupnja vijabilnosti je MTT test (20.). Optička gustoća (OD) ekstrahirane (otopljene) boje iz tkiva obrađenog negativnom kontrolom (NK) treba biti najmanje 20 puta veća od vrijednosti OD samog ekstrakcijskog otapala. Potrebno je dokumentirati da je tkivo obrađeno negativnom kontrolom stabilno u kulturi (tj. daje slična mjerenja vijabilnosti) za vrijeme trajanja ispitnog izlaganja.

1.6.1.2.2. Funkcija barijere

Rožnati sloj i njegov sastav lipida mora biti sposoban zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih tvari, npr. SDS ili Triton X-100, procijenjeno na temelju IC50 ili ET50.

1.6.1.2.3. Morfologija

Histološki pregled rekonstruirane kože/epiderme mora obavljati odgovarajuće osposobljeno osoblje koje mora dokazati da je njezina struktura slična strukturi ljudske kože/epiderme (uključujući višeslojni rožnati sloj).

1.6.1.2.4. Obnovljivost

Treba dokazati da su rezultati metode kod primjene određenog modela obnovljivi u vremenu, po mogućnosti putem odgovarajuće tvari za kontrolu šarže (referentne tvari) (vidi Dodatak).

1.6.1.2.5. Kontrole kakvoće (KK) modela

Svaka šarža modela epiderme mora ispuniti definirane kriterije za odobrenje proizvoda, među kojima su najvažniji vijabilnost (stavak 1.6.1.2.1.) i funkcija barijere (stavak 1.6.1.2.2.). Područje prihvatljivosti (gornja i donja granica prihvatljivosti) za IC50 odnosno ET50 određuje dobavljač kožnog modela (ili ispitivač, ako se koristi vlastiti model). Svojstvo barijere tkiva provjerava laboratorij po primitku tkiva. Za pouzdano predviđanje nadražujućih učinaka prihvatljivi su isključivo rezultati dobiveni s tkivima koja ispunjavaju zadane kriterije. U nastavku su kao primjer navedena područja prihvatljivosti za validirane referentne metode.

Tablica 2.

Primjeri kriterija za odobrenje šarže u okviru kontrole kakvoće

Donja granica prihvatljivosti Srednja vrijednost područja prihvatljivosti Gornja granica prihvatljivosti Validirana referentna metoda 1. (18-satna obrada SDS-om) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validirana referentna metoda 2. (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 sati ET50 = 6,7 sati ET50 = 8,7 sati

1.6.1.3. Primjena ispitivanih i kontrolnih tvari

U svakoj obradi i kontrolama treba upotrijebiti dovoljan broj ponavljanja tkiva (najmanje tri po ispitivanju). Bilo da se radi o tekućinama ili o krutim tvarima, treba nanijeti dovoljnu količinu ispitivane tvari da površina kože bude ravnomjerno prekrivena, ali pazeći da se izbjegne beskonačna doza (vidi točku 1.2. Definicije), tj. najmanje 25 μl/cm2 ili 25 mg/cm2. U slučaju krutih tvari površinu epiderme treba prije nanošenja navlažiti deioniziranom ili destiliranom vodom kako bi se osiguralo dobro prianjanjenje uz kožu. Kad god je to moguće, krute tvari treba ispitivati u obliku sitnog praha. Na kraju razdoblja izlaganja ispitivanu tvar treba pažljivo oprati s površine kože vodenom puferskom otopinom ili 0,9 %-tnom NaCl. Ovisno o primijenjenom modelu rekonstruirane ljudske epiderme, razdoblje izlaganja može biti između 15 i 60 minuta, a temperatura inkubacije između 20 i 37 °C. Za podrobnije informacije vidi standardne radne postupke („Standard Operating Procedures”) za te tri metode (21., 22., 23.).

U svakom istraživanju treba paralelno koristiti negativne kontrole (NK) i pozitivne kontrole (PK) kako bi se dokazalo da se vijabilnost (NK), funkcija barijere i posljedična osjetljivost (PK) tkiva kreću u okvirima propisanog područja prihvatljivosti. Predlaže se da se kao PK tvar koristi 5 %-tna vodena otopina SDS. Predložene NK tvari su voda ili otopina soli puferirana fosfatom (PBS).

1.6.1.4. Mjerenja vijabilnosti stanica

Najvažniji element ispitnog postupka je da se mjerenja vijabilnosti ne provode neposredno nakon izlaganja ispitivanoj tvari, već nakon dovoljno dugog razdoblja inkubacije nakon obrade tijekom koje se oprana tkiva drže u svježem mediju. Ova faza ostavlja dovoljno vremena da se tkivo oporavi od blago nadražujućih učinaka, ali i da se pojave jasni znakovi citotoksičnih učinaka. U fazi opitimizacije testa (9., 10., 11., 12., 13.) pokazalo se da je optimalno razdoblje inkubacije nakon obrade 42 sata te je ono korišteno i u validaciji referentnih metoda.

Test pretvorbe MTT je kvantitativna validirana metoda za mjerenje vijabilnosti stanica. Taj je test prikladan za trodimenzionalni model tkiva. Uzorak kože se stavi u otopinu MTT odgovarajuće koncentracije (npr. 0,3 – 1 mg/ml) i ostavi u njoj tri sata. Nataloženi plavi formazan se zatim ekstrahira iz tkiva pomoću otapala (npr. izopropanol, kiseli izopropanol) i koncentracija formazana izmjeri određivanjem vrijednosti OD na 570 nm uz pojas propuštanja do najviše ± 30 nm.

Optička svojstva ispitivane tvari odnosno njezino kemijsko djelovanje na MTT mogu ometati analizu i dovesti do pogrešne procjene vijabilnosti (budući da ispitivana tvar može spriječiti ili obrnuti proces nastajanja boje, ali ga i izazvati). To se može dogoditi kad se određena ispitivana tvar ne spere u potpunosti s kože ili prodre u epidermu. Ako ispitivana tvar izravno djeluje na MTT ili je prirodno obojena ili se oboji tijekom obrade tkiva, treba upotrijebiti dodatne kontrole kako bi se utvrdio i ispravio utjecaj ispitivane tvari na mjernu tehniku koja se koristi za mjerenje vijabilnosti. Podroban opis ispitivanja izravne redukcije MTT može se pronaći u ispitnom protokolu za validirane referentne metode (21., 22., 23.). Nespecifična boja („Non-Specific Colour”, NSC) zbog tih utjecaja ne smije prijeći 30 % NK (za ispravke). Ako je NSC > 30 %, smatra se da ispitivana tvar nije prikladna za ovu metodu.

1.6.1.5. Kriteriji za prihvaćanje ispitivanja

U svakom pokusu s valjanim šaržama (vidi stavak 1.6.1.2.5.) OD vrijednost tkiva obrađenih negativnom kontrolom ukazuje na kakvoću tkiva nakon što su dovršeni svi koraci dopreme i preuzimanja te čitav postupak u skladu s protokolom za ispitivanje nadraživanja. OD vrijednosti kontrola ne smiju biti ispod propisanih donjih granica. Isto tako, tkiva obrađena pozitivnom kontrolom tj. 5 %-tnom vodenom otopinom SDS trebaju pokazivati zadržanu osjetljivost tkiva i sposobnost da reagiraju na nadražujuću tvar u uvjetima svakog pojedinog pokusa (npr. vijabilnost ≤ 40 % za validiranu referetnu metodu 1 i ≤ 20 % za validiranu referetnu metodu 2.). Potrebno je definirati odgovarajuće mjere varijabilnosti između tkiva u ponavljanjima (npr. ako se koriste standardne devijacije, one trebaju biti ≤ 18 %).

2. PODACI

2.1. PODACI

Podatke pojedinačnih ponavljanja u svakoj obradi (npr. vrijednosti OD i izračunani postoci vijabilnosti stanica za svaku ispitivanu tvar, zajedno s razvrstavanjem) treba prikazati u tabličnom obliku, uključujući eventualne podatke iz ponovljenih pokusa. Osim toga, za svaki pokus treba navesti srednje vrijednosti ± standardnu devijaciju. Za svaku ispitanu tvar treba navesti zapažene interakcije s MTT reagensom i obojenim ispitnim tvarima.

2.2. TUMAČENJE REZULTATA

Na temelju OD vrijednosti za pojedinačne ispitne uzorke može se izračunati postotak vijabilnosti u odnosu na negativnu kontrolu, koja je određena kao 100 %. Potrebno je jasno utvrditi i dokumentirati prijelomnu vrijednost postotka vijabilnosti stanica koja se koristi za razlikovanje nadražujućih tvari od nerazvrstanih ispitivanih tvari i statistički postupak ili postupke koji su korišteni za vrednovanje rezultata i identifikaciju nadražujućih tvari te dokazati njihovu prikladnost. Prijelomne vrijednosti za predviđanje nadraživanja u vezi s validiranim referentnim metodama navedene su u nastavku:

Smatra se da je ispitivana tvar nadražujuća za kožu u smislu 2. kategorije UN GHS:

i. ako je vijabilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade manja ili jednaka (≤) 50 %.

Smatra se da je ispitivana tvar izvan kategorije:

ii. ako je vijabilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade viša od (>) 50 %.

3. IZVJEŠĆIVANJE

3.1. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju sadrži sljedeće informacije:

Ispitivane i kontrolne tvari:

— kemijski naziv(i), npr. naziv iz nomenklature IUPAC ili CAS naziv i CAS broj, ako su poznati,

— čistoća i sastav tvari (u masenom postotku/cima),

— fizikalno-kemijska svojstva bitna za provedbu istraživanja (npr. fizikalno stanje, stabilnost i hlapljivost, pH, topljivost u vodi, ako su poznati),

— obrada ispitivanih/kontrolnih tvari prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje),

— uvjeti skladištenja.

Obrazloženje kožnog modela i protokola koji je primijenjen.

Ispitni uvjeti:

— sustav stanica koji je upotrijebljen,

— informacije o umjeravanju mjernog uređaja i pojasu propuštanja koji je upotrijebljen kod mjerenja vijabilnosti stanica (npr. spektrofotometar),

— potpune popratne informacije o konkretnom kožnom modelu koji je korišten, uključujući njegove radne značajke; to između ostalog uključuje sljedeće podatke: i. vijabilnost; ii. funkcija barijere; iii. morfologija; iv. obnovljivost i prediktivnost; v. kontrole kakvoće (KK) modela;

— detalji ispitnog postupka,

— ispitne doze, trajanje izlaganja i razdoblje inkubacije nakon obrade,

— opis mogućih izmjena ispitne metode,

— uputa na postojeće podatke o modelu; to između ostalog uključuje: i. prihvatljivost podataka o kontroli kakvoće s uputom na postojeće podatke o šarži; ii. prihvatljivost vrijednosti pozitivnih i negativnih kontrola s uputom na srednje vrijednosti i područja za pozitivne i negativne kontrole,

— opis primijenjenih kriterija vrednovanja, uključujući obrazloženje odabrane/ih prijelomne/ih vrijednosti modela predviđanja.

Rezultati:

— tablični prikaz podataka za pojedinačne ispitne uzorke,

— opis drugih zapaženih učinaka.

Rasprava rezultata.

Zaključci.

4. LITERATURA

1. United Nations (UN) (2007.). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Dostupno na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html.

2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Dostupno na: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time= 1232447649.

3. Ispitna metoda B.4. ACUTE TOXICITY; DERMAL IRRITATION/CORROSION.

4. Ispitna metoda B.40. IN VITRO SKIN CORROSION: TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST TER.

5. Ispitna metoda B.40. BIS. IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST.

6. OECD (2006.). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adopted July 19, 2006. Dostupno na: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html.

7. ECVAM (2009.) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostupno na: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001.). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57-93.

9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002.). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770.

10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004.). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114.

11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005.) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351-367.

12. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005.). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329-249.

13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002.). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109-129.

14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007.) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601.

15. Hoffmann, S. (2006.). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Dostupno na: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007.) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619.

17. J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007.). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351-358.

18. ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5 November 2008.

19. EZ (2006.) Uredba (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku, osnivanju Europske agencije za kemikalije, izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća br. 793/93, i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Uredbe Vijeća 76/769/EEZ i direktive Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ. Službeni list Europske unije L 396 od 30. prosinca 2006., str. 1. OPOCE Luksemburg.

20. Mosman, T. (1983.) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63.

21. EpiSkinTM SOP, Version 1.6 (January 2005.). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Dostupno na: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

22. EpiDermTM SOP, Version 5.0 (October 2004.). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDermTM- 200. Dostupno na: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

23. SkinEthic RHETM SOP. Bit će dostupno na: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

24. Harvell, J.D., Lammintausta, K., Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7-18

25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008.

Dodatak

Ocjenjivanje radnih značajki predloženih in vitro modela rekonstruirane ljudske epiderme za ispitivanje nadraživanja kože

UVOD

Predložene postupke u okviru ove ispitne metode potrebno je ocijeniti kako bi se odredila njihova pouzdanost i točnost, koristeći tvari koje predstavljaju čitavo područje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu. Kod ocjenjivanja predloženih postupaka primjenom 20 preporučenih referentnih tvari (tablica 2.) treba dobiti vrijednosti pouzdanosti i točnosti usporedive s vrijednostima validirane referentne metode 1. (tablica 3.) (1.). Norme točnosti i pouzdanosti koje pritom treba ispuniti nalaze se u točkama I. i II. u nastavku. Obuhvaćene su nerazvrstane i razvrstane tvari (2. kategorija UN GHS) koje predstavljaju relevantne kemijske razrede, tako da se pouzdanost i radne značajke (osjetljivost, specifičnost, lažno negativne kvote, lažno pozitivne kvote i točnost) predložene ispitne metode mogu usporediti s odgovarajućim vrijednostima validirane ispitne metode 1. Prije nego što se ispitna metoda primijeni za ispitivanje novih tvari treba odrediti njezinu pouzdanost kao i sposobnost da točno identificira nadražujuće tvari 2. kategorije UN GHS.

REFERENTNE NORME

Referentne norme obuhvaćaju tri elementa I.) bitne elemente ispitne metode, II.) referentne tvari i III.) definirane vrijednosti točnosti i pouzdanosti (2.). Ove se referentne norme temelje na referentnim normama koje su definirane po dovršetku validacijske studije nadraživanja kože Europskoga centra za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) (3.).

(I.) Bitni elementi ispitne metode

Opći uvjeti koje model mora zadovoljiti

Za izgradnju epitela koriste se normalni ljudski keratinociti. Ispod funkcionalnog rožnatog sloja (stratum corneum) nalaze se višestruki slojevi vitalnih epitelnih stanica (bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj). I sam rožnati sloj je višeslojan te sadrži esencijalni profil lipida kao čvrstu funkcionalnu barijeru koja je sposobna zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih tvari, npr. SDS ili Triton X-100. Funkcija barijere može se ocijeniti određivanjem koncentracije markerske tvari koja smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja ili određivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se vijabilnost tkiva smanji za 50 % (ET50) nakon primjene markerske tvari u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji. Model mora biti dovoljno nepropustan da spriječi prolazak materijala oko rožnatog sloja do vitalnog tkiva, jer bi to značilo loše modeliranje izlaganja kože. Kožni model ne smije biti onečišćen bakterijama, virusima, mikroplazmama i gljivicama.

Funkcionalni uvjeti koje model mora zadovoljiti

Vijabilnost

Preferirani test za određivanje stupnja vijabilnosti je MTT test (4.). OD ekstrahirane (otopljene) boje iz tkiva obrađenog negativnom kontrolom (NK) treba biti najmanje 20 puta veća od vrijednosti OD samog ekstrakcijskog otapala. Potrebno je dokumentirati da je tkivo obrađeno negativnom kontrolom stabilno u kulturi (tj. daje slična mjerenja vijabilnosti) za vrijeme trajanja ispitnog izlaganja.

Funkcija barijere

Rožnati sloj i njegov sastav lipida mora biti sposoban zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih tvari, npr. SDS ili Triton X-100, procijenjeno na temelju IC50 ili ET50.

Morfologija

Histološki pregled rekonstruirane kože/epiderme mora obavljati odgovarajuće osposobljeno osoblje koje mora dokazati da je njezina struktura slična strukturi ljudske kože/epiderme (uključujući višeslojni rožnati sloj).

Obnovljivost

Treba dokazati da su rezultati metode kod primjene određenog modela obnovljivi u vremenu, po mogućnosti putem odgovarajuće tvari za kontrolu šarže (referentne tvari) (vidi definicije u odjeljku 1.2.).

Kontrole kakvoće (KK) modela

Svaka šarža modela epiderme mora ispuniti definirane kriterije za odobrenje proizvoda, među kojima su najvažniji vijabilnost i funkcija barijere. Područje prihvatljivosti (gornja i donja granica prihvatljivosti) za IC50 odnosno ET50 određuje dobavljač kožnog modela (ili ispitivač, ako se koristi vlastiti model). Svojstvo barijere tkiva provjerava laboratorij po primitku tkiva. Za pouzdano predviđanje nadražujućih učinaka prihvatljivi su isključivo rezultati dobiveni s tkivima koja ispunjavaju zadane kriterije. U nastavku su kao primjer navedena područja prihvatljivosti za validirane referentne metode.

Tablica 1.

Primjeri kriterija za odobrenje šarže u sklopu kontrole kakvoće

Donja granica prihvatljivosti Srednja vrijednost područja prihvatljivosti Gornja granica prihvatljivosti Validirana referentna metoda 1. (18-satna obrada SDS-om) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validirana referentna metoda 2. (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 sati ET50 = 6,7 sati ET50 = 8,7 sati

(II.) Referentne tvari

Referentne tvari se koriste da bi se utvrdilo je li pouzdanost i točnost predložene nove in vitro ispitne metode s rekonstruiranom ljudskom epidermom za koju je dokazano da je strukturno i funkcionalno dovoljno slična validiranim referentnim metodama, ili koja predstavlja neznatno izmijenjenu varijantu validirane referentne metode, usporediva s pouzdanošću i točnošću validirane ispitne metode 1. (1.). 20 referentnih tvari u tablici 2. obuhvaćaju tvari iz različitih relevantnih kemijskih razreda kao i tvari iz 2. kategorije UN GHS. Popis sadrži 10 tvari iz 2. kategorije UN GHS, 3 tvari iz fakultativne 3. kategorije UN GHS i 7 nerazvrstanih tvari. U okviru ove ispitne metode fakultativna 3. kategorija se ne smatra kategorijom. Ove referentne tvari predstavljaju minimalni broj tvari koji se mora koristiti kod ocjenjivanja točnosti i pouzdanosti predložene metode za ispitivanje nadraživanja kože na modelu rekonstruirane ljudske epiderme. U slučajevima kad tvar s popisa nije raspoloživa, mogu se koristiti i druge tvari za koje su raspoloživi odgovarajući referentni podaci in vivo. Minimalnom popisu referentnih tvari se prema želji mogu dodati još neke tvari koje predstavljaju druge kemijske razrede i za koje su raspoloživi odgovarajući referentni podaci in vivo, kako bi se dodatno ocijenila točnost predložene ispitne metode.

Tablica 2.

Referentne tvari za određivanje točnosti i pouzdanosti modela rekonstruirane ljudske epiderme koji se koriste u ispitivanju nadraživanja kože

Tvar (1) CAS br. EINECS br. Fizikalno stanje Rezultat ocjenjivanja in vivo Kat. GHS in vitro Kat. GHS in vivo 1-brom-4-klorbutan 6940-78-9 230-089-3 T 0 2. kat. izvan kat. dietil-ftalat 84-66-2 201-550-6 T 0 izvan kat. izvan kat. naftalenoctena kiselina 86-87-3 201-705-8 K 0 izvan kat. izvan kat. alil-fenoksiacetat 7493-74-5 231-335-2 T 0,3 izvan kat. izvan kat. izopropanol 67-63-0 200-661-7 T 0,3 izvan kat. izvan kat. 4-metil-tio-benzaldehid 3446-89-7 222-365-7 T 1 2. kat. izvan kat. metil-stearat 112-61-8 203-990-4 K 1 izvan kat. izvan kat. heptil-butirat 5870-93-9 227-526-5 T 1,7 izvan kat. fakultativna 3. kat heksil-salicilat 6259-76-3 228-408-6 T 2 izvan kat. fakultativna 3. kat tri-izobutil-fosfat 126-71-6 204-798-3 T 2 2. kat. fakultativna 3. kat 1-dekanol 112-30-1 203-956-9 T 2,3 2. kat. 2. kat. ciklamen-aldehid 103-95-7 203-161-7 T 2,3 2. kat. 2. kat. 1-bromheksan 111-25-1 203-850-2 T 2,7 2. kat. 2. kat. 2-klormetil-3,5-dimetil-4-metoksipiridin-hidroklorid 86604-75-3 434-680-9 K 2,7 2. kat. 2. kat. a-terpineol 98-55-5 202-680-6 T 2,7 2. kat. 2. kat. di-n-propil disulfid 629-19-6 211-079-8 T 3 izvan kat. 2 kat. butil-metakrilat 97-88-1 202-615-1 T 3 2. kat. 2. kat. benzenetiol, 5-(1,1-dimetiletil)-2-metil 7340-90-1 438-520-9 T 3,3 2. kat. 2. kat. 1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 431-180-2 K 3,3 2. kat. 2. kat. heptanal 111-71-7 203-898-4 T 4 2. kat. 2. kat.

Tvari navedene u tablici 2. predstavljaju reprezentativni izbor između 58 tvari korištenih u međunarodnoj validacijskoj studiji nadraživanja kože Europskoga centra za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) (1.). Njihov se odabir temelji na sljedećim kriterijima:

— dostupne su na tržištu,

— reprezentativne su za čitavo područje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu (od nenadražujuće do jako nadražujuće),

— imaju dobro definiranu kemijsku strukturu,

— reprezentativne su za obnovljivost i prediktivnu sposobnost validirane metode, kako je utvrđeno u validacijskom istraživanju ECVAM-a,

— reprezentativne su za kemijsku funkcionalnost koja je korištena u validacijskom postupku,

— nemaju ekstremni toksični profil (npr. kancerogeno ili reproduktivno toksično djelovanje) i nisu povezane s neprimjerno visokim troškovima zbrinjavanja.

(III.) Definirane vrijednosti točnosti i pouzdanosti

Radne značajke (osjetljivost, specifičnost, lažno negativna kvota, lažno pozitivna kvota i točnost) predložene ispitne metode moraju biti usporedive s odgovarajućim vrijednostima validirane referentne metode 1. (tablica 3.), tj. osjetljivost treba biti jednaka ili viša (≥) od 80 %, specifičnost treba biti jednaka ili viša (≥) 70 % i točnost treba biti jednaka ili viša (≥) od 75 %. One se izračunavaju na temelju svih razvrstavanja 20 tvari dobivenih u različitim laboratorijima koji su sudjelovali u istraživanju. Razvrstavanje tvari u pojedinom laboratoriju određuje se na temelju srednje vrijednosti vijabilnosti iz različitih ispitivanja (najmanje tri valjana ispitivanja).

Tablica 3.

Radne značajke validirane referentne metode 1. (2)

Ispitna metoda Broj tvari Osjetljivost Specifičnost Lažno negativna kvota Lažno negativna kvota Točnost Validirana referentna metoda 1. (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Validirana referentna metoda 1. (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 %

Pouzdanost predložene ispitne metode mora biti usporediva s pouzdanošću validiranih referentnih metoda.

Obnovljivost unutar laboratorija

Kod ocjenjivanja varijabilnosti unutar laboratorija podudarnost između razvrstavanja (2. kategorija/izvan kategorije) dobivenih u različitim nezavisnim ispitivanjima 20 referentnih tvari u istom laboratoriju mora biti ≥ 90 %.

Obnovljivost između laboratorija

Ocjenjivanje obnovljivosti između laboratorija nije nužno ako će se predložena ispitna metoda koristiti samo u jednom laboratoriju. Ako će se metoda koristiti u više laboratorija, podudarnost između razvrstavanja (2. kategorija/izvan kategorije) dobivenih u različitim nezavisnim ispitivanjima 20 referentnih tvari, po mogućnosti u najmanje tri laboratorija, mora iznositi ≥ 80 %.

LITERATURA

1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007.) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601.

2. OECD (2005.) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris.

3. ECVAM (2007.) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostupno na http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Accessed on 27.10.2008.

4. Mosman, T. (1983.) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63.

5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007.) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619.

(1) Ovih 20 referentnih tvari predstavljaju reprezentativni izbor između 58 tvari koje su korištene u validaciji referentne metode 1. (EpiSkinTM). Raspoloživ je cjelovit popis ispitivanih tvari i kriterija za njihov odabir (5.).

(2) U tablici 3. prikazane su radne značajke validirane referentne metode 1. s obzirom na sposobnost točnog identificiranja nadražujućih tvari (2. kategorija UN GHS) i nerazvrstanih tvari (izvan kategorije, uključujući fakultativnu 3. kategoriju) za 58 odnosno 20 referentnih tvari (tablica 2.).

(3) EpiSkin TM

(4) Na temelju 13 nadražujućih tvari 2. kat. GHS.

(5) Na temelju 45 nadražujućih tvari 3. kat. GHS ili kemikalija izvan kategorija GHS.

PRILOG IV.

C.3. TEST INHIBICIJE RASTA SLATKOVODNIH ALGI I CIJANOBAKTERIJA

1. METODA

Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 201 (2006.) (1.).

1.1. UVOD

Ispitne metode se periodički preispituju i ažuriraju u svjetlu znanstvenoga napretka. Ispitnu metodu C.3. bilo je potrebno revidirati kako bi se uključile još neke vrste i ispunili zahtjevi ocjenjivanja opasnosti i razvrstavanja kemikalija. Revizija je provedena na temelju širokog praktičnog iskustva, znanstvenog napretka u području toksikoloških istraživanja s algama i široke regulatorne primjene koja je uslijedila nakon njezinoga donošenja.

1.2. DEFINICIJE

Za potrebe ove ispitne metode koriste se sljedeće definicije i skraćenice:

Biomasa: je suha masa žive tvari u populaciji izražena u odnosu na dani volumen; npr. mg algi/l ispitne tekućine. „Biomasa” se obično definira kao masa, ali se u ovom testu izraz „biomasa” odnosi na masu po volumenu. Osim toga, u ovom se testu u pravilu mjere i zamjenski parametri biomase, kao što je broj stanica, fluorescencija itd., pa se izraz „biomasa” odnosi i na te zamjenske mjere.

Koeficijent varijacije: je bezdimenzionalna mjera varijabilnosti parametra, definirana kao omjer standardne devijacije i srednje vrijednosti. On se može izraziti i kao postotak. Srednji koeficijent varijacije prosječne specifične brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura izračunava se na sljedeći način:

1. Izračuna se postotak koeficijenta varijacije (KV) prosječne specifične brzine rasta iz dnevnih/etapnih brzina rasta za odgovarajuće ponavljanje.

2. Izračuna se srednja vrijednost svih izračunanih vrijednosti iz točke 1. kako bi se dobio srednji koeficijent varijacije dnevne/etapne specifične brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura.

ECx : je koncentracija ispitivane tvari otopljene u ispitnom mediju koja rezultira x %-tnim (npr. 50 %) smanjenjem rasta ispitnog organizma unutar navedenoga razdoblja izlaganja (koje treba izričito navesti ako odstupa od punog ili uobičajenog trajanja ispitivanja). Da bi se nedvosmisleno pokazalo je li vrijednost EC dobivena iz brzine rasta („growth rate”) ili iz prirasta („yield”) koriste se simboli „ErC” i „EyC”.

Uzgojni medij: je kompletan sintetički medij kulture u kojemu ispitivane alge rastu kad se izlože ispitivanoj tvari. Ispitivana se tvar u pravilu otapa u ispitnom mediju.

Brzina rasta (prosječna specifična brzina rasta): je logaritamsko povećanje biomase u razdoblju izlaganja.

Najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC): je najniža ispitana koncentracija kod koje je unutar određenog razdoblja izlaganja zapažen statistički značajan negativni učinak tvari na rast (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom. Ipak, sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili veći štetan učinak od onoga koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova dva uvjeta ne mogu zadovoljiti, treba detaljno objasniti kako je odabran LOEC (a prema tomu i NOEC).

Najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC): je ispitna koncentracija neposredno ispod LOEC-a.

Varijabla odgovora: je varijabla za procjenu toksičnosti izvedena iz bilo kojeg mjerenog parametra koji opisuje biomasu primjenom različitih računskih metoda. Kod ove metode brzina rasta i prirast su varijable odgovora dobivene izravnim mjerenjem biomase ili bilo kojeg navedenog zamjenskog parametra.

Specifična brzina rasta: je varijabla odgovora definirana kao kvocijent razlike prirodnih logaritama promatranog parametra (kod ove ispitne metode biomasa) i odgovarajućeg vremenskog razdoblja.

Prirast: je vrijednost mjerne varijable na kraju razdoblja izlaganja umanjena za vrijednost mjerne varijable na početku razdoblja izlaganja, kojom se izražava povećanje biomase tijekom ispitivanja.

1.3. PRIMJENJIVOST TESTA

Ova se metoda najlakše primijenjuje kod tvari topljivih u vodi za koje se može pretpostaviti da će u ispitnim uvjetima ostati u vodi. Opisani postupak ponekad je potrebno izmijeniti (npr. zatvoreni sustav, kondicioniranje ispitnih posuda) kad se ispituju tvari koje su hlapljive, jako adsorptivne, obojene, slabo topljive u vodi i tvari koje mogu utjecati na raspoloživost nutrijenata ili minerala u ispitnom mediju. Smjernice za neke izmjene mogu se pronaći u literaturi pod 2., 3. i 4.

1.4. NAČELO ISPITIVANJA

Svrha je ispitivanja odrediti učinke tvari na rast slatkovodnih mikroalgi i/ili cijanobakterija. Eksponencijalno rastući ispitni organizmi izlažu se ispitivanoj tvari u šaržnim kulturama, u pravilu tijekom 72 sata. Unatoč relativno kratkom trajanju ispitivanja mogu se ocijeniti učinci na nekoliko generacija.

Odgovor sustava sastoji se u smanjenju rasta niza kultura algi (ispitne jedinice) koje su izložene različitim koncentracijama ispitivane tvari. Odgovor se ocjenjuje kao funkcija koncentracije izlaganja u odnosu na prosječni rast neizloženih kontrolnih kultura. Da bi se u punoj mjeri izrazila reakcija sustava na toksične učinke (optimalna osjetljivost), kulturama treba prije mjerenja smanjenja specifične brzine rasta ostaviti dovoljno vremena da postignu neograničeni eksponencijalni rast, uz dovoljno nutrijenata i neprekidno osvjetljenje.

Rast i inhibicija rasta kvantificiraju se mjerenjima biomase algi u ovisnosti o vremenu. Biomasa algi definirana je kao suha masa po volumenu, npr. mg algi/l ispitne otopine. Ipak, suhu je masu teško mjeriti pa se stoga koriste zamjenski parametri. Od zamjenskih parametara najčešće se koristi broj stanica. Ostali zamjenski parametri su volumen stanica, fluorescencija, optička gustoća itd. Mora biti poznat faktor pretvorbe za prevođenje izmjerenih zamjenskih parametara u biomasu.

Krajnja točka ispitivanja je inhibicija rasta, izražena kao logaritamsko povećanje biomase (prosječna specifična brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosječnih specifičnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina određuje se koncentracija koja izaziva određeno x %-tno smanjenje brzine rasta (npr. 50 %), koja se izražava kao ErCx (npr. ErC50).

Da bi se ova ispitna metoda mogla primijeniti unutar regulatornog okvira EU-a, izračun rezultata se zbog navedenih u odjeljku 2.2. u nastavku mora temeljiti na prosječnoj specifičnoj brzini rasta. U ovoj se ispitnoj metodi koristi i dodatna varijabla odgovora, prirast, koja je potrebna da bi se ispunili određeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Prirast se definira kao biomasa na kraju razdoblja izlaganja umanjena za biomasu na početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izračunava se koncentracija koja izaziva određeno x %-tno smanjenje prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao EyCx (npr. EyC50).

Osim toga, može se statistički odrediti najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC).

1.5. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI

Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispitivanoj tvari kao što su strukturna formula, čistoća, stabilnost na svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, svojstva apsorpcije svjetlosti, pKa i rezultati istraživanja pretvorbe, uključujući biorazgradivost u vodi.

Treba biti poznata topljivost u vodi, podjelni koeficijent oktanol/voda (Pow) i tlak pare ispitivane tvari te biti raspoloživa validirana metoda za kvantifikaciju tvari u ispitnim otopinama s dokumentiranim iskorištenjem i granicom detekcije.

1.6. REFERENTNA TVAR

Jedna ili više referentnih tvari (npr. 3,5-diklorfenol korišten u međunarodnom prstenastom testu (4.)) mogu se ispitati za provjeru ispitnog postupka. Kao referentna tvar za zelene alge može se koristiti i kalijev dikromat. Poželjno je da se referentna tvar ispita najmanje dvaput godišnje.

1.7. VALJANOST ISPITIVANJA

Da bi ispitivanje bilo valjano, ono mora ispuniti sljedeće kriterije:

— Biomasa u kontrolnim kulturama mora se eksponencijalno povećati barem za faktor 16 u razdoblju ispitivanja od 72 sata. To odgovara specifičnoj brzini rasta od 0,92 dan–1. Kod vrsta koje se najčešće koriste brzina rasta je uglavnom znatno viša (vidi Dodatak 1.). Ovaj kriterij možda neće biti zadovoljen ako se koriste vrste koje rastu sporije od onih koje su navedene u Dodatku 1. U tom slučaju razdoblje ispitivanja treba produžiti koliko je potrebno da se u kontrolnim kulturama dobije barem 16-struki rast, uz eskponencijalni rast tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja. Razdoblje ispitivanja može se skratiti na najmanje 48 sati da bi se održao neograničeni eksponencijalni rast tijekom ispitivanja, pod uvjetom da je postignut minimalni faktor povećanja 16.

— Srednji koeficijent varijacije etapnih specifičnih brzina rasta (dan 0 – 1, 1 – 2, 2 – 3, za ispitivanje koje traje 72 sata) u kontrolnim kulturama (vidi odjeljak 1.2. „koeficijent varijacije”) ne smije biti viši od 35 %. Za izračunavanje etapne specifične brzine rasta vidi odjeljak 2.2.1. stavak 2. Ovaj kriterij vrijedi za srednju vrijednost koeficijenata varijacije izračunanih za ponavljanja kontrolnih kultura.

— Kod ispitivanja s vrstama Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus koeficijent varijacije prosječnih specifičnih brzina rasta u ponavljanjima s kontrolnim kulturama tijekom ukupnog razdoblja ispitivanja ne smije biti viši od 7 %. Kod ostalih ispitnih vrsta koje se rjeđe koriste ta vrijednost ne smije biti viša od 10 %.

1.8. OPIS METODE

1.8.1. Aparatura

Ispitne posude i ostala aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopinama mora biti u cijelosti izrađena od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Aparaturu treba temeljito oprati kako organski i anorganski onečišćivači ne bi utjecali na rast algi ili na sastav ispitnih otopina.

Ispitne posude su u pravilu staklene tikvice dovoljnih dimenzija da se osigura potreban volumen kulture za mjerenja tijekom ispitivanja i dovoljan prijenos mase CO2 iz atmosfere (vidi odjeljak 1.8.9. stavak 2.). Volumen tekućine mora biti dovoljan za analitička određivanja (vidi odjeljak 1.8.1.1. stavak 5.).

Osim toga, potrebna je sljedeća oprema odnosno dijelovi opreme:

— Inkubator za uzgoj: preporučuje se ormar ili komora u kojoj se može održavati odabrana temperatura inkubacije u granicama ± 2 °C.

— Instrumenti za mjerenje svjetlosti: važno je napomenuti da metoda koja se koristi za mjerenje intenziteta svjetlosti, a posebno vrsta prijamnika (senzora), može utjecati na mjernu vrijednost. Mjerenja po mogućnosti treba provoditi uz pomoć sferičnog prijamnika (4 π) (koji reagira na izravnu i reflektiranu svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) ili prijamnika 2 π (koji reagira na svjetlost iz svih kutova iznad mjerne ravnine).

— Aparatura za određivanje biomase algi. Broj stanica, najčešće korišteni zamjenski parametar za biomasu algi, može se odrediti pomoću elektroničnog brojača čestica, mikroskopa s komorom za brojenje ili protočnog citometra. Ostali se zamjenski parametri za biomasu mogu mjeriti pomoću protočnog citometra, fluorimetra, spektrofotometra i kolorimetra. Korisno je izračunati faktor pretvorbe broj stanica – suha masa. Da bi se kod mjerenja spektrofotometrom dobile upotrebive mjerne vrijednosti pri niskim koncentracijama biomase, ponekad je potrebno upotrijebiti kivete s putom svjetlosti od najmanje 4 cm.

1.8.2. Ispitni organizmi

Može se koristiti nekoliko vrsta slobodno plivajućih mikroalgi i cijanobakterija. Za sojeve navedene u Dodatku 1. dokazano je da su prikladni za ispitni postupak iz ove ispitne metode.

Ako se koriste druge vrste, treba navesti soj i/ili podrijetlo. Treba se uvjeriti da se eksponencijalni rast odabranih ispitnih algi može održati u odgovarajućim ispitnim uvjetima tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja.

1.8.3. Uzgojni medij

Preporučuju se dva alternativna uzgojna medija, OECD i AAP. Sastav tih medija prikazan je u Dodatku 2. Valja napomenuti da ta dva medija imaju različitu početnu pH vrijednost i puferski kapacitet (za regulaciju povećanja pH vrijednosti). Stoga se kod ispitivanja mogu dobiti različiti rezultati ovisno o mediju koji se koristi, posebno kad se ispituju ionizirajuće tvari.

U određenim je slučajevima potrebno izmijeniti uzgojni medij npr. kad se ispituju metali i kelatna sredstva ili kad se ispitivanje provodi s različitim pH vrijednostima. Korištenje izmijenjenog medija treba detaljno opisati i obrazložiti (3.) (4.).

1.8.4. Početna koncentracija biomase

Početna biomasa mora biti jednaka u svim ispitnim kulturama i mora biti dovoljno niska da se može postići eksponencijalni rast tijekom čitavog razdoblja inkubacije bez bojazni da