(15)

U dijelu B dodaju se sljedeća poglavlja: „B.59. Izazivanje preosjetljivosti kože in chemico: Test izravne reaktivnosti peptida (Direct Peptide Reactivity Assay – DPRA) UVOD Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD-a za ispitivanje (TG) 442C (2015.). Tvar koja izaziva preosjetljivost kože tvar je koja dovodi do alergijske reakcije nakon dodira s kožom, kako je definirana u Globalno usklađenom sustavu Ujedinjenih naroda za razvrstavanje i označivanje kemikalija (UN GHS) (1.) te u Uredbi Europske unije (EZ) 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (Uredba o CLP-u) (18). U ovoj se ispitnoj metodi opisuje postupak in chemico (test izravne reaktivnosti peptida – DPRA) koji treba primijeniti kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože u skladu sa sustavom UN GHS i Uredbom o CLP-u. Postoji opća suglasnost o ključnim biološkim događajima koji izazivaju preosjetljivost kože. Postojeće spoznaje o kemijskim i biološkim mehanizmima koji su povezani s izazivanjem preosjetljivosti kože sažeto su prikazane u obliku puta nastanka štetnog ishoda (engl. Adverse Outcome Pathway – AOP) (2.), koji se kreće od početnog molekularnog događaja preko međudogađaja do štetnog učinka, tj. alergijskog kontaktnog dermatitisa u ljudi ili kontaktne preosjetljivosti u glodavaca. U AOP-u koji se odnosi na izazivanje preosjetljivosti kože početni je molekularni događaj stvaranje kovalentne veze između elektrofilnih tvari i nukleofilnih središta u bjelančevinama kože. U procjenama preosjetljivosti kože tradicionalno se upotrebljavaju laboratorijske životinje. Klasičnim metodama u kojima se upotrebljavaju zamorci, a to su Magnusson–Kligmanov maksimizacijski test sa zamorcima (GMPT) i Buehlerov test (ispitna metoda B.6. (3.)), ispituje se i faza indukcije i faza elicitacije preosjetljivosti kože. Ispitivanja na miševima, tj. analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA, ispitna metoda B.42. (4.)) i njezine dvije inačice u kojima se ne upotrebljavaju radioaktivni izotopi, LLNA: DA (ispitna metoda B.50. (5.)) te LLNA: BrdU-ELISA (ispitna metoda B.51. (6.)), pri čemu se svima trima ispituje isključivo odgovor u fazi indukcije, isto tako su prihvaćena jer predstavljaju prednost u odnosu na ispitivanja na zamorcima u smislu dobrobiti životinja i objektivnog mjerenja faze indukcije preosjetljivosti kože. U novije se vrijeme in chemico te in vitro ispitne metode koje se temelje na mehanističkom pristupu smatraju znanstveno valjanima za ocjenjivanje opasnosti od izazivanja preosjetljivosti kože povezanih s kemikalijama. Međutim, potrebne su kombinacije metoda koje ne uključuju ispitivanja na životinjama (in silico, in chemico, in vitro), u okviru integriranih pristupa ispitivanju i procjeni (engl. Integrated Approaches to Testing and Assessment – IATA), kako bi se mogla u cijelosti zamijeniti ispitivanja na životinjama koja su trenutačno u upotrebi, s obzirom na ograničenu mehanističku domenu AOP-a svake od trenutačno dostupnih ispitnih metoda koje ne uključuju ispitivanja na životinjama (2., 7.). Metoda DPRA predlaže se za ispitivanje početnog molekularnog događaja u AOP-u preosjetljivosti kože, posebice reaktivnosti bjelančevina, kvantificiranjem reaktivnosti ispitivanih kemikalija u odnosu na modelne sintetičke peptide koji sadržavaju lizin ili cistein (8.). Na temelju postotaka potrošnje peptida koji sadržavaju cistein i peptida koji sadržavaju lizin tvari se potom razvrstavaju u jedan od četiriju razreda reaktivnosti, koji služe kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože (9.). Metoda DPRA ocijenjena je validacijskom studijom koju je proveo Referentni laboratorij Europske unije za alternative ispitivanju na životinjama (EURL ECVAM) i potom neovisnim stručnim pregledom koji je izvršio EURL ECVAM-ov Znanstveni savjetodavni odbor (ESAC) te je utvrđeno da je znanstveno valjana (10.) za primjenu u okviru IATA-e kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, u svrhu razvrstavanja i označivanja prema opasnosti. U literaturi su navedeni primjeri upotrebe podataka dobivenih metodom DPRA u kombinaciji s ostalim informacijama (11., 12., 13., 14.). Definicije su navedene u Dodatku 1. POČETNA RAZMATRANJA, PRIMJENJIVOST I OGRANIČENJA Jasno je utvrđena korelacija između reaktivnosti bjelančevina i potencijala izazivanja preosjetljivosti kože (15., 16., 17.). Međutim, iako je vezanje na bjelančevine početni molekularni događaj u AOP-u preosjetljivosti kože, to je samo jedan od ključnih događaja pa informacije o reaktivnosti bjelančevina dobivene ispitnim metodama i metodama koje ne uključuju ispitivanje možda same po sebi neće biti dovoljne za donošenje zaključka o odsutnosti potencijala kemikalija da izazovu preosjetljivost kože. Stoga bi podatke dobivene ovom ispitnom metodom trebalo razmatrati u kontekstu integriranih pristupa poput IATA-e te ih kombinirati s ostalim dodatnim informacijama, npr. onima dobivenima in vitro pokusima kojima se ispituju drugi ključni događaji AOP-a preosjetljivosti kože te metodama koje ne uključuju ispitivanje, kao i primjenom analogije s kemijski analognim tvarima. Ova se ispitna metoda može upotrijebiti, u kombinaciji s drugim dodatnim informacijama, kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože (tj. onih koje su razvrstane u kategoriju 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u) od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, u kontekstu IATA-e. Ova se ispitna metoda ne može upotrijebiti kao jedina metoda za razvrstavanje tvari koje izazivaju preosjetljivost kože u potkategorije 1.A i 1.B kako su definirane u sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u ni za predviđanje njihove jakosti pri donošenju odluka o ocjeni sigurnosti. Međutim, ovisno o regulatornom okviru pozitivan rezultat dobiven metodom DPRA može se samostalno upotrijebiti za razvrstavanje kemikalije u kategoriju 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u. Dokazano je da se ispitna metoda DPRA može prenijeti u laboratorije koji imaju iskustva u izvođenju analiza s pomoću tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC). Može se očekivati da će za predviđanja do kojih se dođe s pomoću ove ispitne metode stupanj obnovljivosti biti reda veličine 85 % unutar laboratorija i 80 % između laboratorija (10.). Rezultati dobiveni u validacijskoj studiji (18.) i objavljenim studijama (19.) općenito pokazuju da točnost metode DPRA u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost (tj. onih iz kategorije 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u) od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost iznosi 80 % (N = 157) uz osjetljivost od 80 % (88/109) i specifičnost od 77 % (37/48) u usporedbi s rezultatima dobivenima metodom LLNA. Veća je vjerojatnost da će se metodom DPRA podcijeniti kemikalije koje pokazuju nisku do umjerenu jakost u izazivanju preosjetljivosti kože (tj. potkategorija 1.B sustava UN GHS / prema Uredbi o CLP-u) nego što će se podcijeniti kemikalije koje pokazuju veliki potencijal izazivanja preosjetljivosti kože (tj. potkategorija 1.A sustava UN GHS / prema Uredbi o CLP-u) (18., 19.). Međutim, navedene vrijednosti koje se odnose na točnost metode DPRA kao samostalne ispitne metode samo su okvirne jer je tu metodu potrebno kombinirati s drugim izvorima informacija u kontekstu IATA-e te u skladu s odredbama prethodno navedenog stavka 9. Nadalje, pri ocjenjivanju metoda ispitivanja preosjetljivosti kože koje ne uključuju pokuse na životinjama potrebno je imati na umu da metoda LLNA i druga ispitivanja na životinjama možda neće u potpunosti odražavati situaciju kod vrste za koju se žele dobiti rezultati, tj. ljudi. Trenutačno dostupni podaci pokazuju da se metoda DPRA može primijeniti za ispitivanje kemikalija koje obuhvaćaju različite organske funkcionalne skupine, mehanizme reakcije, jakosti u izazivanju preosjetljivosti kože (kako su utvrđene istraživanjima in vivo) te fizikalno-kemijska svojstva (8., 9., 10., 19.). Prethodno navedene informacije upućuju na korisnost metode DPRA kao elementa koji pridonosi identifikaciji opasnosti od izazivanja preosjetljivosti kože. U ovoj se ispitnoj metodi izraz ‚ispitivana kemikalija’ upotrebljava za označivanje onoga što se ispituje te se ne odnosi na primjenjivost metode DPRA za ispitivanje tvari i/ili smjesa. Ova ispitna metoda nije primjenjiva za ispitivanje spojeva metala jer je poznato da oni reagiraju s bjelančevinama drugim mehanizmima, a ne stvaranjem kovalentnih veza. Ispitivana kemikalija trebala bi biti topljiva u odgovarajućem otapalu pri konačnoj koncentraciji od 100 mM (vidjeti stavak 18.). Međutim, ispitivane kemikalije koje nisu topljive pri toj koncentraciji mogu se ispitati pri nižim koncentracijama pri kojima jesu topljive. U tom se slučaju pozitivan rezultat može upotrijebiti kao potpora identifikaciji ispitivane kemikalije kao tvari koja izaziva preosjetljivost kože, ali se na temelju negativnog rezultata ne bi smio izvući čvrsti zaključak o nepostojanju reaktivnosti. Trenutačno su dostupne ograničene informacije o primjenjivosti metode DPRA na smjese poznatog sastava (18., 19.). Unatoč tomu, smatra se da je metoda DPRA tehnički primjenjiva za ispitivanje višekomponentnih tvari i smjesa poznatog sastava (vidjeti stavak 18.). Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se njome dobiti primjereni rezultati za tu svrhu te ako mogu, zašto. Ta razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. Trenutačni model predviđanja ne može se upotrijebiti za složene smjese nepoznatog sastava ili za tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složene reakcijske proizvode ili biološke materijale (tj. UVCB tvari) zbog utvrđenog molarnog omjera između ispitivane kemikalije i peptida. U tu je svrhu potrebno razviti novi model predviđanja koji se temelji na gravimetrijskom pristupu. U slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitna metoda ne može primijeniti za ispitivanje drugih specifičnih kategorija kemikalija, tu ispitnu metodu ne bi trebalo upotrebljavati za te specifične kategorije kemikalija. Ova je ispitna metoda in chemico metoda koja ne uključuje metabolički sustav. Ovom se ispitnom metodom ne mogu otkriti kemikalije koje zahtijevaju enzimsku bioaktivaciju da bi mogle pokazati svoj potencijal izazivanja preosjetljivosti kože (tj. prohapteni). U nekim su slučajevima ovom ispitnom metodom ispravno otkrivene kemikalije koje nakon abiotičke transformacije postaju tvari koje izazivaju preosjetljivost (tj. prehapteni) (18.). S obzirom na navedeno, negativne rezultate dobivene ispitnom metodom trebalo bi tumačiti u kontekstu navedenih ograničenja te u povezanosti s drugim izvorima informacija u okviru IATA-e. Ispitivane kemikalije koje se ne vežu kovalentnom vezom na peptid, ali potiču njegovu oksidaciju (tj. dimerizaciju cisteina), mogle bi dovesti do mogućeg precjenjivanja potrošnje peptida, što bi za posljedicu moglo imati moguća lažno pozitivna predviđanja i/ili razvrstavanje kemikalije u viši razred reaktivnosti (vidjeti stavke 29. i 30.). Kao što je opisano, metoda DPRA pomaže u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože. Međutim, ako se upotrebljava u okviru integriranih pristupa poput IATA-e, mogla bi pridonijeti i procjeni jačine izazivanja preosjetljivosti (11.). Ipak, kako bi se moglo utvrditi na koji bi način rezultati dobiveni metodom DPRA mogli pomoći u toj procjeni, potreban je dodatan rad, koji će se po mogućnosti temeljiti na podacima dobivenima na ljudima. NAČELO ISPITIVANJA DPRA je in chemico metoda kojom se količinski određuje preostala koncentracija peptida koji sadržava cistein ili lizin nakon 24 sata inkubacije s ispitivanom kemikalijom pri temperaturi od 25 ± 2,5 °C. Sintetički peptidi sadržavaju fenilalanin radi lakšeg otkrivanja. Relativna koncentracija peptida mjeri se tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti (HPLC) s gradijentnim eluiranjem i UV detekcijom na 220 nm. Potom se izračunavaju postotci potrošnje peptida koji sadržavaju cistein i peptida koji sadržavaju lizin te se te vrijednosti upotrebljavaju u modelu predviđanja (vidjeti stavak 29.) kojim se omogućuje razvrstavanje ispitivane kemikalije u jedan od četiriju razreda reaktivnosti, koji se potom upotrebljavaju kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost. Prije rutinske primjene ove ispitne metode laboratoriji bi trebali dokazati svoju tehničku osposobljenost izvodeći metodu na deset tvari navedenih u Dodatku 2. koje služe za dokazivanje osposobljenosti. POSTUPAK Ova se ispitna metoda temelji na protokolu DPRA DB-ALM br. 154 (20.), koji je upotrijebljen u validacijskoj studiji kojom je koordinirao EURL ECVAM. Preporučuje se primijeniti taj protokol pri provedbi i primjeni metode u laboratoriju. U nastavku su opisane glavne komponente i postupci za DPRA. Ako se upotrebljava alternativni sustav HPLC, trebalo bi dokazati da je on u skladu s validiranim sustavom opisanim u protokolu DB-ALM (npr. ispitivanjem tvari za dokazivanje osposobljenosti iz Dodatka 2.). Pripremanje peptida koji sadržavaju cistein ili lizin Radne otopine sintetičkih peptida koji sadržavaju cistein (Ac-RFAACAA-COOH) i lizin (Ac-RFAAKAA-COOH), čistoće veće od 85 %, po mogućnosti u rasponu od 90 do 95 %, trebalo bi pripremiti svježe neposredno prije inkubacije s ispitivanom kemikalijom. Konačna bi koncentracija peptida koji sadržava cistein trebala iznositi 0,667 mM u fosfatnom puferu pH-vrijednosti 7,5, dok bi konačna koncentracija peptida koji sadržava lizin trebala iznositi 0,667 mM u amonijevom acetatnom puferu pH-vrijednosti 10,2. Analitički ciklus u HPLC-u trebalo bi programirati tako da trajanje analize s pomoću HPLC-a bude kraće od 30 sati. U okviru sustava HPLC koji je upotrijebljen u validacijskoj studiji i opisan u ovoj ispitnoj metodi, u jednom se ciklusu HPLC-a može analizirati do 26 uzoraka (koji uključuju ispitivanu kemikaliju, pozitivnu kontrolu i odgovarajući broj kontrola s otapalom koji ovisi o broju pojedinačnih otapala upotrijebljenih u testu, od kojih se svaki ispituje kao triplikat). U svim bi ponovljenim uzorcima koji se analiziraju u istoj analitičkoj seriji trebalo upotrijebiti identične radne otopine peptida koji sadržavaju cistein odnosno lizin. Preporučuje se dokazati ispravnu topljivost pojedinačnih šarži peptida prije njihove upotrebe. Priprema ispitivane kemikalije Prije izvođenja pokusa trebalo bi ocijeniti topljivost ispitivane kemikalije u odgovarajućem otapalu u skladu s postupkom solubilizacije opisanim u protokolu DPRA DB-ALM (20.). Odgovarajuće otapalo je ono koje u cijelosti otopi ispitivanu kemikaliju. S obzirom na to da se kod metode DPRA ispitivana kemikalija inkubira u velikom omjeru s peptidima koji sadržavaju cistein ili lizin, smatra se da je vizualna provjera stvaranja bistre otopine dovoljna kako bi se utvrdilo je li se ispitivana kemikalija (i sve njezine komponente ako je riječ o višekomponentnoj tvari ili smjesi) dobro otopila. Prikladna su otapala acetonitril, voda, smjesa vode i acetonitrila u omjeru 1:1, izopropanol, aceton ili smjesa acetona i acetonitrila u omjeru 1:1. Mogu se upotrijebiti i druga otapala pod uvjetom da ne utječu na stabilnost peptida, što se provjerava s pomoću referentnih kontrola C (tj. uzoraka koji se sastoje samo od peptida otopljenog u odgovarajućem otapalu; vidjeti Dodatak 3.). Ako ispitivana kemikalija nije topljiva ni u jednom od navedenih otapala, trebalo bi je, kao zadnju mogućnost, pokušati otopiti u 300 μL DMSO-a te nastalu otopinu razrijediti s 2 700 μL acetonitrila; ako ispitivana kemikalija nije topljiva u toj smjesi, istu količinu ispitivane kemikalije trebalo bi pokušati otopiti u 1 500 μL DMSO-a te nastalu otopinu razrijediti s 1 500 μL acetonitrila. Ispitivanu kemikaliju trebalo bi prethodno odvagati u staklene bočice te neposredno prije ispitivanja otopiti u odgovarajućem otapalu kako bi se pripremila otopina koncentracije 100 mM. Za smjese i višekomponentne tvari poznatog sastava trebalo bi odrediti jedan stupanj čistoće, koji se utvrđuje na temelju zbroja udjela njihovih sastojaka (isključujući vodu), te jednu prividnu molekularnu masu, koja se utvrđuje uzimajući u obzir molekularnu masu svake komponente smjese (isključujući vodu) i njihove pojedinačne udjele. Tako dobiveni stupanj čistoće i prividna molekularna masa potom se upotrebljavaju za izračunavanje mase ispitivane kemikalije koja je potrebna za pripremu otopine koncentracije 100 mM. U slučaju polimera za koje se ne može odrediti dominantna molekularna masa, za pripremu otopine koncentracije 100 mM može se uzeti u obzir molekularna masa monomera (ili prividna molekularna masa različitih monomera od kojih se polimer sastoji). Međutim, pri ispitivanju smjesa, višekomponentnih tvari ili polimera poznatog sastava trebalo bi predvidjeti ispitivanje i čiste kemikalije. U slučaju tekućina čistu bi kemikaliju trebalo ispitati kao takvu, bez prethodnog razrjeđivanja, inkubiranjem u molarnom omjeru 1:10 i 1:50 s peptidima koji sadržavaju cistein odnosno peptidima koji sadržavaju lizin. U slučaju krutih tvari ispitivanu bi kemikaliju trebalo otopiti do najviše topljive koncentracije, u istom otapalu koje se upotrebljava za pripremu otopine koncentracije 100 mM. Potom bi je trebalo ispitati kao takvu, bez dodatnog razrjeđivanja, inkubiranjem u omjeru 1:10 i 1:50 s peptidima koji sadržavaju cistein odnosno peptidima koji sadržavaju lizin. Ako se ispitivanjem otopine prividne koncentracije od 100 mM i čiste kemikalije dobiju sukladni rezultati (reaktivni i nereaktivni), trebalo bi biti moguće donošenje čvrstog zaključka o rezultatu. Priprema pozitivne kontrole, referentnih kontrola i kontrola koelucije Cimetni aldehid (CAS 104-55-2; prehrambene čistoće ≥95 %) trebalo bi upotrijebiti kao pozitivnu kontrolu (PK) u koncentraciji od 100 mM u acetonitrilu. Mogu se upotrijebiti druge prikladne pozitivne kontrole koje po mogućnosti daju srednje vrijednosti potrošnje, pod uvjetom da su dostupni prijašnji podaci na temelju kojih se mogu odrediti usporedivi kriteriji prihvatljivosti za analitičku seriju. Osim toga, u analitički ciklus HPLC-a trebalo bi uključiti i referentne kontrole (tj. uzorke koji sadržavaju samo peptid otopljen u odgovarajućem otapalu), koje se upotrebljavaju kako bi se prije analize provjerila prikladnost sustava HPLC (referentne kontrole A), stabilnost referentnih kontrola tijekom vremena (referentne kontrole B) te da otapalo koje je upotrijebljeno za otapanje ispitivane kemikalije ne utječe na postotak potrošnje peptida (referentne kontrole C) (vidjeti Dodatak 3.). Za svaku se kemikaliju upotrebljava odgovarajuća referentna kontrola kako bi se izračunao postotak potrošnje peptida za tu kemikaliju (vidjeti stavak 26.). Osim toga, za svaku od kemikalija koje se analiziraju trebalo bi uključiti u analitičku seriju i kontrolu koelucije, koja se sastoji samo od ispitivane kemikalije i služi za otkrivanje moguće koelucije ispitivane kemikalije s peptidom koji sadržava lizin ili cistein. Inkubiranje ispitivane kemikalije s otopinom peptida koji sadržava cistein i peptida koji sadržava lizin Otopinu peptida koji sadržava cistein i otopinu peptida koji sadržava lizin trebalo bi inkubirati s ispitivanom kemikalijom u omjeru 1:10 odnosno 1:50 u staklenim bočicama za automatski dodavač uzoraka. Ako se odmah nakon dodavanja otopine ispitivane kemikalije u otopinu peptida opazi precipitacija do koje dolazi zbog toga što je ispitivana kemikalija slabo topljiva u vodi, neće se moći sa sigurnošću utvrditi koliko je ispitivane kemikalije ostalo u otopini da reagira s peptidom. U tom se slučaju stoga pozitivan rezultat ipak može upotrijebiti, ali negativan rezultat nije siguran i trebalo bi ga pažljivo tumačiti (vidjeti i odredbe stavka 11. za ispitivanje kemikalija koje nisu topljive do koncentracije od 100 mM). Reakcijsku otopinu trebalo bi držati u mraku na temperaturi od 25 ± 2,5 °C tijekom 24 ± 2 sata prije izvođenja analize s pomoću HPLC-a. Svaku bi ispitivanu kemikaliju trebalo analizirati kao triplikat za oba peptida. Uzorke bi trebalo vizualno pregledati prije izvođenja analize s pomoću HPLC-a. Ako se primijeti precipitacija ili razdvajanje faza, kao mjera opreza uzorci se mogu centrifugirati pri maloj brzini (100 – 400 xg) kako bi se talog slegnuo na dno bočice jer bi velike količine taloga mogle začepiti kromatografske cijevi ili kolone. Ako se precipitacija ili razdvajanje faza primijeti nakon inkubacijskog razdoblja, potrošnja peptida mogla bi biti podcijenjena te se u slučaju negativnog rezultata ne može izvući dovoljno pouzdan zaključak o nepostojanju reaktivnosti. Priprema kalibracijske krivulje standarda za HPLC Potrebno je izraditi kalibracijsku krivulju standarda za peptide koji sadržavaju cistein i za peptide koji sadržavaju lizin. Standarde peptida trebalo bi pripremiti u otopini s 20 % ili 25 % acetonitrila: puferirati fosfatnim puferom (pH 7,5) za peptid koji sadržava cistein i amonijevim acetatnim puferom (pH 10,2) za peptid koji sadržava lizin. Koristeći se standardima dobivenima serijskim razrjeđenjem radne otopine peptida (0,667 mM), trebalo bi pripremiti šest kalibracijskih otopina koje obuhvaćaju raspon od 0,534 do 0,0167 mM. U kalibracijsku krivulju standarda trebalo bi uključiti i slijepu probu koja sadržava pufer za razrjeđivanje. Prikladna kalibracijska krivulja mora imati koeficijent r2 > 0,99. Priprema i izvođenje analize s pomoću HPLC-a Prije izvođenja analize trebalo bi provjeriti prikladnost sustava HPLC. Potrošnja peptida prati se HPLC-om u kombinaciji s UV detektorom (detektorom s nizom fotodioda ili detektorom apsorbancije na fiksnoj valnoj duljini od 220 nm). Odgovarajuća se kolona postavlja u sustav HPLC. U sustavu HPLC postavljenom kako je opisano u validiranom protokolu kao preporučena se kolona upotrebljava Zorbax SB-C-18 2,1 mm x 100 mm x 3,5 mikrona. S tom HPLC-ovom kolonom obrnutih faza cijeli bi sustav prije početka analize trebalo uravnoteživati najmanje dva sata na 30°C s 50 % faze A (0,1 % (v/v) trifluoroctene kiseline u vodi) i 50 % faze B (0,085 % (v/v) trifluoroctene kiseline u acetonitrilu). Analizu HPLC-om trebalo bi izvesti primjenom brzine protoka od 0,35 ml/min i linearnog gradijenta od 10 % do 25 % acetonitrila tijekom deset minuta nakon čega slijedi brzo povećanje acetonitrila na 90 % kako bi se uklonili ostali materijali. Trebalo bi ubrizgati jednake volumene svakog standarda, uzorka i kontrole. Između ubrizgavanja kolonu bi trebalo sedam minuta uravnoteživati na početne uvjete. Ako se upotrebljava drukčija HPLC-ova kolona obrnutih faza, može biti potrebno prilagoditi prethodno opisane parametre kako bi se jamčila odgovarajuća eluacija i integracija peptida koji sadržavaju cistein odnosno lizin, uključujući i ubrizgani volumen, koji može varirati ovisno o upotrijebljenom sustavu (obično u rasponu od 3 do 10 μl). Ako se upotrebljava alternativni sustav HPLC, važno je dokazati njegovu sukladnost s prethodno opisanim validiranim sustavom (npr. ispitivanjem tvari za dokazivanje osposobljenosti iz Dodatka 2.). Apsorbancija se očitava na valnoj duljini od 220 nm. Ako se upotrebljava detektor s nizom fotodioda, trebalo bi zabilježiti i apsorbanciju na 258 nm. Potrebno je naglasiti da bi u nekim slučajevima nabavljeni acetonitril mogao negativno utjecati na stabilnost peptida te bi tu mogućnost trebalo ocijeniti pri upotrebi nove šarže acetonitrila. Omjer između površine pikova na 220 nm i površine pikova na 258 nm može poslužiti kao pokazatelj koelucije. Za svaki uzorak omjer u rasponu od 90 % < do < 100 % srednje vrijednosti (19) omjera dobivenih za kontrolne uzorke dobar je pokazatelj da nije došlo do koelucije. Neke ispitivane kemikalije mogu potaknuti oksidaciju peptida koji sadržava cistein. Pik dimeriziranog peptida koji sadržava cistein može se vizualno promatrati. Ako se čini da je došlo do dimerizacije, trebalo bi je zabilježiti jer se postotak potrošnje peptida može precijeniti, što dovodi do lažnih pozitivnih predviđanja i/ili razvrstavanja u viši razred reaktivnosti (vidjeti stavke 29. i 30.). Analiza HPLC-om za peptide koji sadržavaju cistein i za peptide koji sadržavaju lizin može se provesti istodobno (ako su dostupna dva sustava HPLC) ili u različitim danima. Ako se analize ne provode istog dana, sve bi otopine ispitivane kemikalije trebalo pripremiti svježe za svako ispitivanje. Vrijeme izvođenja analize trebalo bi odrediti tako da se osigura da ubrizgavanje prvog uzorka započne 22 do 26 sati nakon miješanja ispitivane kemikalije s otopinom peptida. Analitički ciklus u HPLC-u trebalo bi programirati tako da trajanje analize s pomoću HPLC-a bude kraće od 30 sati. U okviru sustava HPLC koji je upotrijebljen u validacijskoj studiji i opisan u ovoj ispitnoj metodi u jednom se ciklusu HPLC-a može analizirati do 26 uzoraka (vidjeti i stavak 17.). U Dodatku 3. naveden je primjer analitičkog ciklusa HPLC-a. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Procjena podataka Koncentracija peptida koji sadržava cistein ili lizin određuje se fotometrijski u svakom uzorku na valnoj duljini od 220 nm i to tako da se za odgovarajuće pikove izmjeri površina pika (površina ispod krivulje, PIK) te izračuna koncentracija peptida primjenom linearne kalibracijske krivulje utvrđene na temelju standarda. Postotak potrošnje peptida određuje se u svakom uzorku tako da se izmjeri površina pika te podijeli sa srednjom vrijednošću površine pikova odgovarajućih referentnih kontrola C (vidjeti Dodatak 3.) u skladu s formulom navedenom u nastavku. Kriteriji prihvatljivosti Kako bi se ispitivanje smatralo valjanim, trebali bi biti ispunjeni sljedeći kriteriji: a) kalibracijska krivulja standarda trebala bi imati koeficijent r2 > 0,99; b) srednja vrijednost postotka potrošnje peptida kod tri ponovljena uzorka za pozitivne kontrole s cimetnim aldehidom trebala bi iznositi između 60,8 % i 100 % za peptid koji sadržava cistein te između 40,2 % i 69,0 % za peptid koji sadržava lizin, a najveće standardno odstupanje (SD) za ponovljene uzroke s pozitivnom kontrolom trebalo bi iznositi <14,9 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava cistein te <11,6 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava lizin i c) srednja vrijednost koncentracije peptida u referentnim kontrolama A trebala bi iznositi 0,50 ± 0,05 mM, a koeficijent varijacije (CV) površina pikova peptida za devet referentnih kontrola B i C u acetonitrilu trebao bi biti < 15,0 %. Ako nije ispunjen jedan od tih kriterija ili više njih, ispitivanje bi trebalo ponoviti. Da bi se rezultate dobivene za ispitivanu kemikaliju smatralo valjanima, trebali bi biti ispunjeni sljedeći kriteriji: a) najveće standardno odstupanje za ponovljene uzorke s ispitivanom kemikalijom trebalo bi iznositi < 14,9 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava cistein te < 11,6 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava lizin; b) srednja vrijednost koncentracije peptida za tri referentne kontrole C u odgovarajućem otapalu trebala bi iznositi 0,50 ± 0,05 mM. Ako navedeni kriteriji nisu ispunjeni, podatke bi trebalo odbaciti te bi za tu konkretnu ispitivanu kemikaliju ispitivanje trebalo ponoviti. Model predviđanja Za svaku se ispitivanu kemikaliju izračunava srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i postotka potrošnje lizina. Pri izračunavanju srednje vrijednost za negativnu potrošnju uzima se vrijednost ‚0’. Ako se primjenjuje model predviđanja s cisteinom u omjeru 1:10 / lizinom u omjeru 1:50, koji je prikazan u tablici 1., trebalo bi primjenjivati prag od 6,38 % prosječne potrošnje peptida kao jedan od kriterija za razlikovanje tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože u okviru IATA-e. Primjena modela predviđanja za razvrstavanje ispitivane kemikalije u određeni razred reaktivnosti (tj. niska, umjerena ili visoka reaktivnost) može se pokazati korisnom i za dobivanje informacija potrebnih za procjenu jakosti tvari u okviru IATA-e. Tablica 1. Model predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50 (20) Srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i lizina Razred reaktivnosti Predviđanje na temelju metode DPRA (21) 0 % ≤ srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 6,38 % Nepostojeća ili minimalna reaktivnost Negativno 6,38 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 22,62 % Niska reaktivnost Pozitivno 22,62 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 42,47 % Umjerena reaktivnost 42,47 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 100 % Visoka reaktivnost Može se dogoditi da ispitivana kemikalija (tvar ili jedan ili više sastojaka višekomponentne tvari ili smjese) značajno apsorbira na 220 nm te ima isto vrijeme zadržavanja kao i peptid (koelucija). Koelucija se može riješiti tako da se postavke sustava HPLC neznatno prilagode kako bi se još više odvojila vremena eluiranja ispitivane kemikalije i peptida. Ako se za rješavanje problema koelucije upotrebljava alternativni sustav HPLC, trebalo bi dokazati da je on u skladu s validiranim sustavom (npr. ispitivanjem tvari za dokazivanje osposobljenosti iz Dodatka 2.). U slučaju pojavljivanja koelucije pik peptida ne može se integrirati te nije moguće izračunati postotak potrošnje peptida. Ako takve ispitne kemikalije koeluiraju i s peptidima koji sadržavaju cistein i s peptidima koji sadržavaju lizin, trebalo bi smatrati da je analiza ‚bez jasnih rezultata’. Ako se koelucija pojavljuje samo s peptidima koji sadržavaju lizin, može se upotrijebiti model predviđanja s cisteinom 1:10, koji je naveden u tablici 2. Tablica 2. Model predviđanja s cisteinom 1:10 (22) Postotak potrošnje cisteina (Cys) Razred reaktivnosti Predviđanje na temelju metode DPRA (23) 0 % ≤ postotak potrošnje cisteina ≤ 13,89 % Nepostojeća ili minimalna reaktivnost Negativno 13,89 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 23,09 % Niska reaktivnost Pozitivno 23,09 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 98,24 % Umjerena reaktivnost 98,24 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 100 % Visoka reaktivnost Mogu isto tako postojati slučajevi u kojima se vrijeme zadržavanja ispitivane kemikalije i vrijeme zadržavanja jednog od peptida ne preklapaju u cijelosti. U takvim se slučajevima postotci potrošnje peptida mogu procijeniti i upotrijebiti u modelu predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50, ali ispitivanu kemikaliju nije moguće precizno razvrstati u razred reaktivnosti. Za ispitivanu kemikaliju trebala bi biti dovoljna jedna analiza HPLC-om za peptid koji sadržava cistein i peptid koji sadržava lizin ako se njome dobije jasan rezultat. Međutim, u slučajevima rezultata koji su blizu praga koji se upotrebljava za razlikovanje pozitivnih i negativnih rezultata (tj. graničnih rezultata) mogu biti potrebna dodatna ispitivanja. Ako je srednja vrijednost postotka potrošnje u rasponu od 3 % do 10 % za model predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50 ili ako je postotak potrošnje cisteina u rasponu od 9 % do 17 % za model predviđanja s cisteinom 1:10, trebalo bi razmotriti provođenje još jedne analize, a potom i treće ako se prvim dvjema analizama dobiju nesukladni rezultati. Izvješće o ispitivanju Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije: Ispitivana kemikalija — jednokomponentna tvar — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi), SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula i/ili druge identifikacijske oznake, — fizički izgled, topljivost u vodi, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni. — višekomponentna tvar, UVCB tvar i smjesa: — opisana koliko god je to moguće npr. kemijskim identitetom (vidjeti prethodno), čistoćom, količinskom zastupljenošću i relevantnim fizikalno-kemijskim svojstvima sastojaka (vidjeti prethodno), u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — fizički izgled, topljivost u vodi te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — molekularna masa ili prividna molekularna masa u slučaju smjesa/polimera poznatog sastava ili druge informacije koje su relevantne za provođenje istraživanja, — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni. Kontrole — pozitivna kontrola — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi), SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula i/ili druge identifikacijske oznake, — fizički izgled, topljivost u vodi, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — upućivanje na podatke koji se odnose na prijašnje pozitivne kontrole i pokazuju prikladnost kriterija prihvatljivosti analitičke serije, ako je primjenjivo. — Otapalo/nosač — upotrijebljeno otapalo/nosač te omjer njegovih sastojaka, ako je primjenjivo, — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi) i/ili druge identifikacijske oznake, — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — fizički izgled, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva u slučaju da su upotrijebljena otapala/nosači koji nisu navedeni u ispitnoj metodi, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — obrazloženje za odabir otapala za svaku ispitivanu kemikaliju, — za acetonitril, rezultati ispitivanja utjecaja na stabilnost peptida. Priprema peptida, pozitivna kontrola i ispitivana kemikalija — opis svojstava otopina peptida (dobavljač, serija, točna masa peptida, volumen dodan za pripremu radne otopine), — opis svojstava otopine koja sadržava pozitivnu kontrolu (točna masa tvari koja se upotrebljava za pozitivnu kontrolu, volumen dodan za pripremu ispitne otopine), — opis svojstava otopina ispitivane kemikalije (točna masa ispitivane kemikalije, volumen dodan za pripremu ispitne otopine). Postavke uređaja i analize HPLC-om — vrsta uređaja za HPLC, kolona za HPLC i pretkolona, detektor, automatski dodavač uzoraka, — parametri relevantni za analizu HPLC-om, kao što su temperatura kolone, ubrizgavani volumeni, brzina protoka i gradijent. Prikladnost sustava — površina pika peptida na 220 nm za svaki standard i svaki ponovljeni uzorak referentne kontrole A, — grafički prikaz linearne kalibracijske krivulje te iznos koeficijenta r2, — koncentracija peptida za svaki ponovljeni uzorak referentne kontrole A, — srednja vrijednost koncentracije peptida (mM) za tri referentne kontrole A, SD i CV, — koncentracija peptida za referentne kontrole A i C. Analitički ciklus — za referentne kontrole: — površina pika peptida na 220 nm za svaki ponovljeni uzorak B i C, — srednja vrijednost površine pika peptida na 220 nm za devet referentnih kontrola B i C u acetonitrilu te SD i CV (za stabilnost referentnih kontrola za vrijeme trajanja analize), — za svako upotrijebljeno otapalo, srednja vrijednost površine pika peptida na 220 nm za tri odgovarajuće referentne kontrole C (za izračunavanje postotka potrošnje peptida), — za svako upotrijebljeno otapalo, koncentracija peptida (mM) za tri odgovarajuće referentne kontrole C, — za svako upotrijebljeno otapalo, srednja vrijednost koncentracije peptida (mM) za tri odgovarajuće referentne kontrole C, SD i CV; — za pozitivnu kontrolu: — površina pika peptida na 220 nm za svako ponavljanje, — postotak potrošnje peptida za svaki ponovljeni uzorak, — srednja vrijednost postotka potrošnje peptida za tri ponovljena uzorka, SD i CV; — za svaku ispitivanu kemikaliju: — pojava precipitacije u reakcijskoj smjesi na kraju razdoblja inkubacije, ako je zapažena. Navesti je li precipitat ponovno otopljen ili centrifugiran, — prisutnost koelucije, — opis svih drugih relevantnih opažanja, ako je primjenjivo, — površina pika peptida na 220 nm za svaki ponovljeni uzorak, — postotak potrošnje peptida za svaki ponovljeni uzorak, — srednja vrijednost postotka potrošnje peptida za tri ponovljena uzorka, SD i CV, — srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i postotka potrošnje lizina, — upotrijebljeni model predviđanja te predviđanje na temelju metode DPRA. Ispitivanje osposobljenosti — Ako je primjenjivo, postupak koji se koristi za dokazivanje osposobljenosti laboratorija za izvođenje ispitne metode (npr. ispitivanjem tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti) ili za dokazivanje obnovljive primjene ispitne metode tijekom vremena. Rasprava o rezultatima — rasprava o rezultatima dobivenima ispitnom metodom DPRA, — rasprava o rezultatima ispitne metode u kontekstu IATA-e ako su dostupni drugi relevantni podaci. Zaključak LITERATURA 1. United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupno na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html 2. OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris. 3. Poglavlje B.6. ovog Priloga: Senzibilizacija kože. 4. Poglavlje B.42. ovog Priloga: Analiza lokalnih limfnih čvorova 5. Poglavlje B.50. ovog Priloga: Izazivanje preosjetljivosti kože: Analiza lokalnih limfnih čvorova: DA. 6. Poglavlje B.51. ovog Priloga: Izazivanje preosjetljivosti kože: Analiza lokalnih limfnih čvorova BrdU-ELISA 7. Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367–485. 8. Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332–343. 9. Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417–427. 10. EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Dostupno na: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra 11. Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, objavljeno na internetu 14. svibnja 2013., DOI: 10.1002/jat.2869. 12. Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489–504. 13. Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618. 14. Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389–400. 15. Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625–639. 16. Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc. 17. Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin. 18. EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Dostupno na: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra 19. Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, objavljeno na internetu 9. travnja 2013., DOI:10.1002/jat.2868. 20. DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Dostupno na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/ 21. OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France. 22. FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Dostupno na: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138 23. ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). Dodatak 1. DEFINICIJE Točnost : stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. To je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata ‚relevantnosti’. Pojam je često međusobno zamjenjiv s pojmom ‚podudarnost’ u smislu udjela točnih ishoda ispitne metode (21.). AOP (engl. Adverse Outcome Pathway – put nastanka štetnog ishoda) : slijed događaja od kemijske strukture ciljne kemikalije ili skupine sličnih kemikalija preko početnog molekularnog događaja do in vivo štetnog ishoda (2.). Kalibracijska krivulja : odnos između vrijednosti odgovora dobivenog u pokusu i analitičke koncentracije (naziva se i standardna krivulja) poznate tvari. Kemikalija : tvar ili smjesa. Koeficijent varijacije : mjera varijabilnosti koja se za skupinu podataka dobivenih od ponovljenih uzoraka izračunava dijeljenjem standardnog odstupanja sa srednjom vrijednošću. Može se pomnožiti sa 100 da bi se izrazila u obliku postotka. Opasnost : intrinzično svojstvo nekog agensa ili stanje koji imaju potencijal da uzrokuju štetne učinke kada su organizam, sustav ili (sub)populacija izloženi tom agensu. IATA (engl. Integrated Approach to Testing and Assessment – integrirani pristup ispitivanju i procjeni ) : strukturiran pristup koji se primjenjuje za identifikaciju opasnosti (potencijal), karakterizaciju opasnosti (jakost) i/ili procjenu sigurnosti (potencijal/jakost i izloženost) kemikalije ili skupine kemikalija, kojim se na strateški način objedinjuju i ponderiraju svi relevantni podaci koji će služiti kao podloga za donošenje regulatornih odluka u vezi s potencijalnom opasnošću i/ili rizikom i/ili potrebom za daljnjim ciljnim, a time i minimalnim ispitivanjem. Početni molekularni događaj : poremećaj biološkog sustava na razini molekule koji je izazvala kemikalija, a koji je identificiran kao početni događaj u nastanku štetnog ishoda. Smjesa : smjesa ili otopina koja se sastoji od dviju ili više tvari koje u njoj ne reagiraju (1.). Jednokomponentna tvar : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je jedan glavni sastojak prisutan u koncentraciji od najmanje 80 % (w/w). Višekomponentna tvar : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je više od jednog glavnog sastojka prisutno u koncentraciji od 10 % (w/w) ili većoj, ali ne većoj od 80 % (w/w). Višekomponentna tvar rezultat je procesa proizvodnje. Smjesa i višekomponentna tvar razlikuju se po tome što se smjesa dobiva miješanjem dviju ili više tvari bez kemijske reakcije. Višekomponentna tvar rezultat je kemijske reakcije. Pozitivna kontrola : ponovljeni uzorak koji sadržava sve komponente ispitnog sustava i tretiran je s tvari za koju je poznato da izaziva pozitivan odgovor. Kako bi se osigurala mogućnost procjene varijabilnosti odgovora pozitivne kontrole tijekom vremena, odgovor ne bi smio biti presnažan. Referentna kontrola : netretirani uzorak koji sadržava sve komponente ispitnog sustava, uključujući otapalo ili nosač koji se obrađuje s uzorcima tretiranima ispitivanom kemikalijom i drugim kontrolnim uzorcima kako bi se utvrdila polazna reakcija za uzorke koji se tretiraju ispitivanom kemikalijom otopljenom u istom otapalu ili nosaču. Kada se ispituje s istodobnom negativnom kontrolom, taj uzorak pokazuje i jesu li otapalo ili nosač u interakciji s ispitnim sustavom. Relevantnost : opis odnosa između ispitivanja i istraživanog učinka te je li ispitivanje prikladno i korisno za određenu svrhu. Pokazuje u kojoj se mjeri ispitivanjem točno mjeri ili predviđa istraživani biološki učinak. Relevantnost uključuje i razmatranje o točnosti (sukladnosti) ispitne metode (21). Pouzdanost : pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može obnovljivo primijeniti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija tijekom vremena uz primjenu istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem obnovljivosti unutar jednog laboratorija i između više njih te ponovljivosti unutar jednog laboratorija (21). Obnovljivost : podudarnost rezultata dobivenih ispitivanjem iste kemikalije uz primjenu istog ispitnog protokola (vidjeti ‚pouzdanost’) (21.). Osjetljivost : udio svih pozitivnih/aktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (21.). Specifičnost : udio svih negativnih/neaktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom ispitne metode. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (21.). Tvar : kemijski elementi i njihovi spojevi u prirodnom stanju ili dobiveni proizvodnim postupkom, uključujući i dodatke (aditive) koji su nužni za održavanje stabilnosti proizvoda te nečistoće koje proizlaze iz primijenjenog postupka, ali isključujući otapala koja se mogu izdvojiti bez utjecaja na stabilnost tvari ili promjene njezina sastava (1.). Prikladnost sustava : određivanje radnih značajki uređaja (npr. osjetljivosti) analiziranjem referentnog standarda prije izvođenja testa na analitičkoj šarži (22.). Ispitivana kemikalija : izraz ‚ispitivana kemikalija’ upotrebljava se za označivanje onoga što se ispituje. Globalno usklađeni sustav Ujedinjenih naroda za razvrstavanje i označivanje kemikalija (UN GHS) : sustav za razvrstavanje kemikalija (tvari i smjesa) prema standardiziranim vrstama i stupnjevima fizičkih opasnosti i opasnosti za zdravlje i okoliš, kojim su obuhvaćena odgovarajuća komunikacijska sredstva kao što su piktogrami, oznake opasnosti, oznake upozorenja, oznake obavijesti i sigurnosno-tehnički listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim učincima u cilju zaštite ljudi (uključujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potrošače i interventno osoblje) i okoliša (1.). UVCB : tvari nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvodi ili biološki materijali. Valjana ispitna metoda : ispitna metoda za koju se smatra da je dovoljno relevantna i pouzdana za određenu svrhu te koja se temelji na znanstveno utemeljenim načelima. Ispitna metoda nije nikada valjana u apsolutnom smislu nego samo u odnosu na određenu svrhu (21.). Dodatak 2. TVARI ZA DOKAZIVANJE TEHNIČKE OSPOSOBLJENOSTI Izazivanje preosjetljivosti kože in chemico: test izravne reaktivnosti peptida Prije rutinske primjene ove ispitne metode laboratoriji bi trebali dokazati svoju tehničku osposobljenost tako što će za deset tvari koje su u tablici 1. preporučene za dokazivanje osposobljenosti dobiti očekivano predviđanje na temelju metode DPRA te za osam od deset tvari preporučenih za dokazivanje osposobljenosti za svaki peptid dobiti vrijednosti potrošnje cisteina i lizina koje su unutar odgovarajućeg referentnog raspona. Tvari za dokazivanje tehničke osposobljenosti izabrane su tako da predstavljaju niz odgovora povezanih s opasnostima od izazivanja preosjetljivosti kože. Drugi kriteriji za odabir bili su da tvari budu komercijalno dostupne, da su dostupni visokokvalitetni referentni podaci dobiveni in vivo i visokokvalitetni in vitro podaci dobiveni metodom DPRA te da su tvari upotrijebljene u validacijskoj studiji kojom je koordinirao EURL ECVAM za dokazivanje uspješne primjene ispitne metode u laboratorijima koji su sudjelovali u studiji. Tablica 1. Preporučene tvari za dokazivanje tehničke osposobljenosti za izvođenje testa izravne reaktivnosti peptida Tvari za dokazivanje tehničke osposobljenosti CAS br. Fizikalno stanje Predviđanje in vivo (24) Predviđanje na temelju metode DPRA (25) Raspon (26) postotka potrošnje peptida koji sadržava cistein Raspon (26) postotka potrošnje peptida koji sadržava lizin 2,4-dinitroklorbenzen 97-00-7 Kruta tvar Tvari koja izaziva preosjetljivost (ekstremno jaka) Pozitivno 90-100 15-45 Oksazolon 15646-46-5 Kruta tvar Tvari koja izaziva preosjetljivost (ekstremno jaka) Pozitivno 60-80 10-55 Formaldehid 50-00-0 Tekućina Tvari koja izaziva preosjetljivost (jaka) Pozitivno 30-60 0-24 Benziliden aceton 122-57-6 Kruta tvar Tvari koja izaziva preosjetljivost (umjerena) Pozitivno 80-100 0-7 Farnezal 19317-11-4 Tekućina Tvari koja izaziva preosjetljivost (slaba) Pozitivno 15-55 0-25 2,3-butandion 431-03-8 Tekućina Tvari koja izaziva preosjetljivost (slaba) Pozitivno 60-100 10-45 1-butanol 71-36-3 Tekućina Tvar koja ne izaziva preosjetljivost Negativno 0-7 0-5.5 6-metilkumarin 92-48-8 Kruta tvar Tvar koja ne izaziva preosjetljivost Negativno 0-7 0-5.5 Mliječna kiselina 50-21-5 Tekućina Tvar koja ne izaziva preosjetljivost Negativno 0-7 0-5.5 4-metoksiacetofenon 100-06-1 Kruta tvar Tvar koja ne izaziva preosjetljivost Negativno 0-7 0-5.5 Dodatak 3. PRIMJERI ANALITIČKOG CIKLUSA Kalibracijski standardi i referentne kontrole Standard 1. Standard 2. Standard 3. Standard 4. Standard 5. Standard 6. Pufer za razrjeđivanje Referentna kontrola A, ponov. uz. 1. Referentna kontrola A, ponov. uz. 2. Referentna kontrola A, ponov. uz. 3. Kontrole koelucije 1. kontrola koelucije za ispitivanu kemikaliju 1. 2. kontrola koelucije za ispitivanu kemikaliju 2. Referentne kontrole Referentna kontrola B, ponov. uz. 1. Referentna kontrola B, ponov. uz. 2. Referentna kontrola B, ponov. uz. 3. Prva serija ponovljenih uzoraka Referentna kontrola C, ponov. uz. 1. Cimetni aldehid, ponov. uz. 1. Uzorak 1., ponov. uz. 1. Uzorak 2., ponov. uz. 1. Druga serija ponovljenih uzoraka Referentna kontrola C, ponov. uz. 2. Cimetni aldehid, ponov. uz. 2. Uzorak 1., ponov. uz. 2. Uzorak 2., ponov. uz. 2. Treća serija ponovljenih uzoraka Referentna kontrola C, ponov. uz. 3. Cimetni aldehid, ponov. uz. 3. Uzorak 1., ponov. uz. 3. Uzorak 2., ponov. uz. 3. Referentne kontrole Referentna kontrola B, ponov. uz. 4. Referentna kontrola B, ponov. uz. 5. Referentna kontrola B, ponov. uz. 6. U analitički ciklus trebalo bi uključiti tri serije referentnih kontrola (tj. uzoraka koji se sastoje samo od peptida otopljenog u odgovarajućem otapalu): referentna kontrola A: upotrebljava se za provjeravanje prikladnosti sustava HPLC, referentna kontrola B: uključuje se na početku i na kraju analitičkog ciklusa kako bi se provjerila stabilnost referentnih kontrola za vrijeme trajanja analize referentna kontrola C: uključuje se u analitički ciklus kako bi se provjerilo da otapalo koje je upotrijebljeno za otapanje ispitivane kemikalije ne utječe na postotak potrošnje peptida. B.60. Izazivanje preosjetljivosti kože in vitro: test luciferaze ARE-Nrf2 UVOD Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD-a za ispitivanje (TG) 442D (2015.). Tvar koja izaziva preosjetljivost kože tvar je koja dovodi do alergijske reakcije nakon dodira s kožom, kako je definirana u Globalno usklađenom sustavu Ujedinjenih naroda za razvrstavanje i označivanje kemikalija (UN GHS) (1.) te u Uredbi Europske unije (EZ) 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (Uredba o CLP-u) (27). U ovoj se ispitnoj metodi opisuje postupak in vitro (test luciferaze ARE-Nrf2) koji treba primijeniti kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože u skladu sa sustavom UN GHS (1.) i Uredbom o CLP-u. Postoji opća suglasnost o ključnim biološkim događajima koji izazivaju preosjetljivost kože. Postojeće spoznaje o kemijskim i biološkim mehanizmima koji su povezani s izazivanjem preosjetljivosti kože sažeto su prikazane u obliku puta nastanka štetnog ishoda (AOP) (2.), koji se kreće od početnog molekularnog događaja preko međudogađaja do štetnog učinka na zdravlje, tj. alergijskog kontaktnog dermatitisa u ljudi ili kontaktne preosjetljivosti u glodavaca (2., 3.). Početni molekularni događaj jest stvaranje kovalentne veze između elektrofilnih tvari i nukleofilnih središta u bjelančevinama kože. Drugi se ključni događaj u tom AOP-u odvija u keratinocitima i uključuje upalne odgovore te gensku ekspresiju povezanu sa specifičnim staničnim signalnim putovima poput putova koji ovise o elementu antioksidacijskog/elektrofilnog odgovora (engl. antioxidant/electrophile response element, ARE). Treći je ključni događaj aktiviranje dendritičnih stanica, koje se obično ocjenjuje prema ekspresiji specifičnih staničnih površinskih biljega, kemokina i citokina. Četvrti je ključni događaj proliferacija T-stanica, koja se neizravno ocjenjuje analizom lokalnih limfnih čvorova na miševima (4.). U procjenama preosjetljivosti kože tradicionalno se upotrebljavaju laboratorijske životinje. Klasičnim metodama u kojima se upotrebljavaju zamorci, a to su Magnusson–Kligmanov maksimizacijski test sa zamorcima (GMPT) i Buehlerov test (ispitna metoda B.6. (5.)), ispituje se i faza indukcije i faza elicitacije preosjetljivosti kože. Ispitivanja na miševima, tj. analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA) (ispitna metoda B.42. (4.)) i njezine dvije inačice u kojima se ne upotrebljavaju radioaktivni izotopi, LLNA: DA (ispitna metoda B.50. (6.)) te LLNA: BrdU-ELISA (ispitna metoda B.51. (7.)), pri čemu se svima trima ispituje isključivo odgovor u fazi indukcije, isto tako su prihvaćena jer predstavljaju prednost u odnosu na ispitivanja na zamorcima u smislu dobrobiti životinja i objektivnog mjerenja faze indukcije preosjetljivosti kože. U novije se vrijeme in chemico i in vitro ispitne metode koje se temelje na mehanističkom pristupu smatraju znanstveno valjanima za ocjenjivanje opasnosti od izazivanja preosjetljivosti kože povezanih s kemikalijama. Međutim, potrebne su kombinacije metoda koje ne uključuju ispitivanja na životinjama (in silico, in chemico, in vitro), u okviru integriranih pristupa ispitivanju i procjeni (IATA), kako bi se mogla u cijelosti zamijeniti ispitivanja na životinjama koja su trenutačno u upotrebi, s obzirom na ograničenu mehanističku domenu AOP-a svake od trenutačno dostupnih ispitnih metoda koje ne uključuju ispitivanja na životinjama (2., 3.). Ova se ispitna metoda (test luciferaze ARE-Nrf2) predlaže za ispitivanje drugog ključnog događaja kako je objašnjeno u stavku 2. Postoje izvješća o tome da tvari koje izazivaju preosjetljivost kože induciraju gene koje regulira element antioksidacijskog odgovora (ARE) (8., 9.). Male elektrofilne tvari poput tvari koje izazivaju preosjetljivost kože mogu djelovati na senzorski protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), npr. kovalentnom modifikacijom njegovog cisteinskog ostatka, uzrokujući time njegovu disocijaciju od transkripcijskog faktora Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). Disocirani Nrf2 može potom aktivirati gene koji ovise o ARE-u, kao što su geni koji kodiraju detoksificirajuće enzime faze II. (8., 10., 11.). Ovom je ispitnom metodom trenutačno obuhvaćena samo jedna in vitro metoda ispitivanja luciferaze ARE-Nrf2, a to je test KeratinoSensTM za koji su provedene validacijske studije (9., 12., 13.) te potom neovisan stručni pregled koji je izvršio Referentni laboratorij Europske unije za alternative ispitivanju na životinjama (EURL ECVAM) (14.). Ocijenjeno je da je test KeratinoSensTM znanstveno valjan za primjenu u okviru IATA-e kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, a u svrhu razvrstavanja i označivanja prema opasnosti (14.). Laboratoriji koji žele primijeniti ispitnu metodu mogu dobiti rekombinantnu staničnu liniju koja se upotrebljava u testu KeratinoSensTM sklapanjem sporazuma o licenciji sa subjektom koji je razvio ispitnu metodu (15.). Definicije su navedene u Dodatku 1. POČETNA RAZMATRANJA, PRIMJENJIVOST I OGRANIČENJA S obzirom na to da se aktivacija puta Keap1-Nrf2-ARE odnosi isključivo na drugi ključni događaj u AOP-u preosjetljivosti kože, informacije dobivene ispitnim metodama koje se temelje na aktivaciji tog puta možda same po sebi neće biti dovoljne za donošenje zaključka o potencijalu kemikalija da izazovu preosjetljivost kože. Stoga bi podatke dobivene ovom ispitnom metodom trebalo razmatrati u kontekstu integriranih pristupa poput IATA-e te ih kombinirati s ostalim dodatnim informacijama, npr. onima dobivenima in vitro pokusima kojima se ispituju drugi ključni događaji AOP-a preosjetljivosti kože te metodama koje ne uključuju ispitivanje, kao i primjenom analogije s kemijski analognim tvarima. U literaturi su navedeni primjeri upotrebe testa luciferaze ARE-Nrf2 u kombinaciji s ostalim informacijama (13., 16., 17., 18., 19.). Ova se ispitna metoda može upotrijebiti kao pomoć u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože (tj. onih koje su razvrstane u kategoriju 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u) od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, u kontekstu IATA-e. Ova se ispitna metoda ne može upotrijebiti kao jedina metoda za razvrstavanje tvari koje izazivaju preosjetljivost kože u potkategorije 1.A i 1.B kako su definirane u sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u ni za predviđanje njihove jakosti pri donošenju odluka o ocjeni sigurnosti. Međutim, ovisno o regulatornom okviru pozitivan se rezultat može samostalno upotrijebiti za razvrstavanje kemikalije u kategoriju 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u. Skup podataka iz validacijske studije i podataka dobivenih internim ispitivanjem provedenim za potrebe neovisnog stručnog pregleda ispitne metode dokazuje da se test KeratinoSensTM može prenijeti u laboratorije koji imaju iskustva u uzgoju stanica. Može se očekivati da će za predviđanja donesena s pomoću ove ispitne metode unutarlaboratorijska i međulaboratorijska obnovljivost biti reda veličine 85 % (14.). Točnost (77 % – 155/201), osjetljivost (78 % – 71/91) i specifičnost (76 % – 84/110) testa KeratinoSensTM za razlikovanje tvari koje izazivaju preosjetljivost kože (tj. onih koje su razvrstane u kategoriju 1. prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u) od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, u usporedbi s rezultatima dobivenima metodom LLNA, izračunati su uzimajući u obzir sve podatke koji su dostavljeni EURL ECVAM-u za potrebe ocjenjivanja i stručnog pregleda ispitne metode (14.). Te su brojke slične onima koje su nedavno objavljene na temelju internog ispitivanja oko 145 tvari (točnost od 77 %, osjetljivost od 79 %, specifičnost od 72 %) (13.). Veća je vjerojatnost da će se testom KeratinoSensTM podcijeniti kemikalije koje pokazuju nisku do umjerenu jakost u izazivanju preosjetljivosti kože (tj. potkategorija 1.B sustava UN GHS / prema Uredbi o CLP-u) nego što će se podcijeniti kemikalije koje pokazuju visoku jakost u izazivanju preosjetljivosti kože (tj. potkategorija 1.A sustava UN GHS / prema Uredbi o CLP-u) (13., 14.). Prethodno navedene informacije upućuju na to da se testom KeratinoSensTM može korisno pridonijeti identifikaciji opasnosti od izazivanja preosjetljivosti kože. Međutim, navedene vrijednosti koje se odnose na točnost testa KeratinoSensTM kao samostalne ispitne metode samo su okvirne jer je tu metodu potrebno kombinirati s drugim izvorima informacija u kontekstu IATA-e te u skladu s odredbama prethodnog stavka 9. Nadalje, pri ocjenjivanju metoda ispitivanja preosjetljivosti kože koje ne uključuju pokuse na životinjama potrebno je imati na umu da metoda LLNA i druga ispitivanja na životinjama možda neće u potpunosti odražavati situaciju kod vrste za koju se žele dobiti rezultati, tj. ljudi. U ovoj se ispitnoj metodi izraz ‚ispitivana kemikalija’ upotrebljava za označivanje onoga što se ispituje te se ne odnosi na primjenjivost testa luciferaze ARE-Nrf2 za ispitivanje tvari i/ili smjesa. Trenutačno dostupni podaci pokazuju da se test KeratinoSensTM može primijeniti za ispitivanje kemikalija koje obuhvaćaju različite organske funkcionalne skupine, mehanizme reakcije, jakosti u izazivanju preosjetljivosti kože (kako su utvrđene istraživanjima in vivo) te fizikalno-kemijska svojstva (9., 12., 13., 14.). Uglavnom su ispitane jednokomponentne tvari, iako postoji ograničena količina podataka i o ispitivanju smjesa (20.). Unatoč tomu, ova je ispitna metoda tehnički primjenjiva i za ispitivanje višekomponentnih tvari i smjesa. Međutim, prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se njome dobiti primjereni rezultati za tu svrhu te ako mogu, zašto. Takva razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese. Osim toga, kada se ispituju višekomponentne tvari ili smjese, trebalo bi razmotriti moguću interferenciju citotoksične komponente sa zapaženim odgovorima. Ova se ispitna metoda primjenjuje za ispitivanje kemikalija koje su topljive ili tvore stabilnu disperziju (tj. koloid ili suspenziju u kojoj se ispitivana kemikalija ne taloži ili ne odvaja od otapala stvarajući različite faze) u vodi ili DMSO-u (ovo vrijedi za sve komponente ispitivane kemikalije u slučaju ispitivanja višekomponentne tvari ili smjese). Ispitivane kemikalije koje ne ispunjuju te uvjete pri najvišoj potrebnoj konačnoj koncentraciji od 2 000 μM (vidjeti stavak 22.) mogu se ispitati i pri nižim koncentracijama. U tom se slučaju rezultati koji ispunjuju kriterije pozitivnosti opisane u stavku 39. mogu ipak upotrijebiti kao potpora identifikaciji ispitivane kemikalije kao tvari koja izaziva preosjetljivost kože, dok bi negativan rezultat dobiven s koncentracijama manjima od 1 000 μM trebalo smatrati nejasnim (vidjeti model predviđanja u stavku 39.). Općenito, uspješno su ispitane tvari kod kojih vrijednost LogP iznosi 5 ili manje, dok se krajnje hidrofobne tvari čija je vrijednost LogP veća od 7 nalaze izvan poznatih granica primjenjivosti ispitne metode (14). Za tvari kod kojih je vrijednost LogP između 5 i 7 dostupne su samo ograničene informacije. Negativne rezultate trebalo bi tumačiti s oprezom jer se tvari koje su reaktivne isključivo na lizinski ostatak mogu ovom metodom identificirati kao negativne. Nadalje, zbog ograničene metaboličke sposobnosti upotrijebljene stanične linije (21.) i uvjeta pokusa prohapteni (tj. kemikalije koje zahtijevaju enzimsku aktivaciju, na primjer preko enzima P450) i prehapteni (tj. kemikalije koje se aktiviraju autooksidacijom), posebno oni sa sporom oksidacijom, mogu isto tako dati negativne rezultate. S druge strane, ispitivane kemikalije koje ne izazivaju preosjetljivost, ali ipak uzrokuju kemijski stres, mogu dati lažno pozitivne rezultate (14). Nadalje, ispitivane kemikalije koje su vrlo citotoksične ne mogu se uvijek pouzdano ocijeniti. Konačno, ispitivane kemikalije koje utječu na enzim luciferazu mogu remetiti aktivnost luciferaze u staničnim analizama uzrokujući prividnu inhibiciju ili povećanu luminiscenciju (22.). Na primjer, postoje izvješća o tome da su koncentracije fitoestrogena veće od 1 μM u drugim luciferaznim testovima utjecale na signale luminiscencije zbog pretjerane aktivacije reporterskog gena za luciferazu (23.). Stoga je potrebno pažljivo ispitati ekspresiju luciferaze dobivenu pri visokim koncentracijama fitoestrogena ili sličnih kemikalija za koje se pretpostavlja da poput fitoestrogena dovode do pretjerane aktivacije reporterskog gena za luciferazu (23.). U slučajevima u kojima se može dokazati da se ispitna metoda ne može primijeniti za ispitivanje drugih specifičnih kategorija kemikalija, tu ispitnu metodu ne bi trebalo upotrebljavati za te specifične kategorije kemikalija. Osim što pomaže u razlikovanju tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože, testom KeratinoSensTM isto se tako dobivaju informacije o odnosu koncentracije i odgovora koje bi mogle pridonijeti procjeni jakosti izazivanja preosjetljivosti u okviru integriranih pristupa poput IATA-e (19.). Međutim, da bi se moglo utvrditi na koji način rezultati dobiveni testom KeratinoSensTM mogu pridonijeti procjeni jakosti (24.) te razvrstavanju tvari koje izazivaju preosjetljivost u potkategorije prema sustavu UN GHS / Uredbi o CLP-u, potreban je dodatan rad koji će se po mogućnosti temeljiti na pouzdanim podacima dobivenim na ljudima. NAČELO ISPITIVANJA U testu luciferaze ARE-Nrf2 upotrebljava se imortalizirana adherentna stanična linija dobivena iz ljudskih keratinocita HaCaT stabilno transficiranih selektibilnim plazmidom. Stanična linija sadržava gen luciferaze pod transkripcijskom kontrolom konstitutivnog promotora vezanog na element ARE gena za koji je poznato da mu se ekspresija pojačava pod utjecajem kontaktnih senzibilizatora (25., 26.). Signal luciferaze odražava aktivaciju endogenih gena ovisnih o faktoru Nrf2 koju izazivaju senzibilizatori, a dokazano je da signal luciferaze u rekombinantnoj staničnoj liniji ovisi o faktoru Nrf2 (27.). To omogućuje kvantitativno mjerenje (otkrivanjem luminiscencije) indukcije gena luciferaze, uporabom supstrata luciferaze za koje je poznato da stvaraju svjetlost, kao pokazatelja aktivnosti transkripcijskog faktora Nrf2 u stanicama nakon izlaganja elektrofilnim tvarima. U testu KeratinoSens™ ispitivane se kemikalije smatraju pozitivnima ako izazivaju statistički značajnu indukciju aktivnosti luciferaze iznad utvrđenog praga (tj. > pomnoženo s 1,5 ili povećanje od 50 %), ispod određene koncentracije koja ne utječe znatno na sposobnost preživljavanja stanica (tj. ispod 1 000 μM te pri koncentraciji pri kojoj je preživljavanje stanica veće od 70 % (9., 12.)). U tu se svrhu utvrđuje maksimalan multiplikacijski faktor (Imax) za indukciju aktivnosti luciferaze u odnosu na (negativnu) kontrolu s otapalom. Nadalje, s obzirom na to da se stanice izlaže nizu koncentracija ispitivanih kemikalija, koncentraciju potrebnu za statistički značajnu indukciju aktivnosti luciferaze iznad praga (tj. vrijednost EC1,5) trebalo bi interpolirati iz krivulje doza – odgovor (za izračune vidjeti stavak 32.). Konačno, trebalo bi provesti paralelna mjerenja citotoksičnosti kako bi se procijenilo dolazi li do indukcije aktivnosti luciferaze pri subcitotoksičnim koncentracijama. Prije rutinske primjene testa luciferaze ARE-Nrf2 koji je u skladu s ovom ispitnom metodom laboratoriji bi trebali dokazati tehničku osposobljenost izvodeći test na deset tvari navedenih u Dodatku 2. koje služe za dokazivanje tehničke osposobljenosti. Utvrđene su norme za djelovanje (28.) kako bi olakšale validaciju novih ili modificiranih in vitro testova luciferaze ARE-Nrf2 koji su slični testu KeratinoSens™ te omogućile pravodobnu izmjenu ove ispitne metode radi njihova uključenja u nju. Uzajamno prihvaćanje podataka na temelju sporazuma OECD-a jamči se samo za ispitne metode koje su validirane u skladu sa standardima djelovanja ako je OECD pregledao te ispitne metode i uključio ih u odgovarajuću smjernicu OECD-a za ispitivanje. POSTUPAK Ovom je ispitnom metodom trenutačno obuhvaćen samo znanstveno valjani test KeratinoSensTM (9., 12., 13., 14). Dostupni su standardni operativni postupci (SOP) za test KeratinoSensTM te bi ih trebalo primjenjivati pri provedbi i primjeni ispitne metode u laboratoriju (15.). Laboratoriji koji žele primijeniti ispitnu metodu mogu dobiti rekombinantnu staničnu liniju koja se upotrebljava u testu KeratinoSensTM sklapanjem sporazuma o licenciji sa subjektom koji je razvio ispitnu metodu. U sljedećim se stavcima navodi opis glavnih komponenata i postupaka testa luciferaze ARE-Nrf2. Priprema kultura keratinocita Trebalo bi upotrijebiti transgeničnu staničnu liniju koja ima stabilnu inserciju reporterskog gena za luciferazu pod kontrolom elementa ARE (npr. staničnu liniju KeratinoSens™ ). Nakon primitka stanice se razmnožavaju (npr. 2 do 4 pasaža) te čuvaju zamrznute kao homogena zaliha. Stanice iz izvorne zalihe mogu se razmnožiti do maksimalnog broja pasaža (npr. 25 u slučaju testa KeratinoSensTM) te se upotrebljavaju za rutinsko ispitivanje koristeći se pritom odgovarajućim medijem za održavanje (u slučaju testa KeratinoSensTM to je DMEM koji sadržava serum i geneticin). Za ispitivanje, stanice bi trebale biti 80 – 90 % konfluentne te bi trebalo paziti da nikada ne dosegnu punu konfluenciju. Dan prije ispitivanja stanice se izdvajaju i raspoređuju na pločice s 96 jažica (10 000 stanica po jažici u slučaju testa KeratinoSensTM). Potrebno je paziti da se izbjegne taloženje stanica tijekom nasađivanja kako bi se osigurala homogena distribucija broja stanica među jažicama. Ako to nije slučaj, ova faza može izazvati veliku varijabilnost među jažicama. Za svako ponavljanje upotrebljavaju se tri ponovljena uzorka za mjerenje aktivnosti luciferaze te jedan paralelni ponovljeni uzorak za ispitivanje sposobnosti preživljavanja stanica. Priprema ispitivane kemikalije i tvari koje služe kao kontrola Ispitivana kemikalija i tvari koje služe kao kontrola pripremaju se na dan ispitivanja. Za test KeratinoSensTM ispitivane kemikalije otapaju se u dimetil sulfoksidu (DMSO) do konačne željene koncentracije (npr. 200 mM). Otopine DMSO-a mogu se smatrati samosterilizirajućima te nije potrebna sterilna filtracija. Ispitivana kemikalija koja nije topljiva u DMSO-u otapa se u sterilnoj vodi ili hranjivoj podlozi za uzgoj kulture i otopine se steriliziraju, npr. filtriranjem. Za ispitivanu kemikaliju koja nema utvrđenu molekularnu masu (MM) priprema se radna otopina do zadane koncentracije (40 mg/mL ili 4 % (w/v)) u testu KeratinoSensTM. Ako se upotrebljavaju druga otapala, a ne DMSO, voda ili hranjiva podloga za uzgoj kulture, potrebno je navesti dovoljno znanstveno obrazloženje. Od radnih otopina ispitivane kemikalije u DMSO-u pripremaju se serijska razrjeđenja s pomoću DMSO-a kako bi se dobilo 12 glavnih koncentracija kemikalije koje će se ispitivati (od 0,098 do 200 mM u testu KeratinoSensTM). Za ispitivanu kemikaliju koja nije topljiva u DMSO-u razrjeđenja za dobivanje glavnih koncentracija pripremaju se s pomoću sterilne vode ili sterilne hranjive podloge za uzgoj kulture. Neovisno o upotrijebljenom otapalu glavne se koncentracije potom razrjeđuju dvadesetpeterostruko u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture koja sadržava serum te se na kraju upotrebljavaju za tretiranje nakon još jednog četverostrukog razrjeđivanja tako da konačne koncentracije ispitivane kemikalije budu u rasponu od 0,98 do 2 000 μM u testu KeratinoSensTM. U opravdanim je slučajevima moguće upotrijebiti druge koncentracije (npr. u slučaju citotoksičnosti ili slabe topljivosti). U testu KeratinoSensTM kao negativna kontrola (s otapalom) upotrebljava se DMSO (CAS br. 67-68-5, čistoće ≥ 99 %), za koju se priprema šest jažica po pločici. Razrjeđuje se na isti način kako je opisano za glavne koncentracije u stavku 22., tako da konačna koncentracija negativne kontrole (s otapalom) bude 1 %, za koju je poznato da ne utječe na preživljavanje stanica te odgovara istoj koncentraciji DMSO-a u ispitanoj kemikaliji i pozitivnoj kontroli. Za ispitivanu kemikaliju koja nije topljiva u DMSO-u i za koju su razrjeđenja pripremljena u vodi, koncentracija DMSO-a u svim jažicama konačne ispitne otopine mora se prilagoditi tako da iznosi 1 % kao i kod drugih ispitivanih kemikalija i tvari koje služe kao kontrola. U testu KeratinoSensTM kao pozitivna kontrola upotrebljava se cimetni aldehid (CAS br. 14371-10-9, čistoće ≥ 98 %) te se za nju priprema serija od pet glavnih koncentracija u rasponu od 0,4 do 6,4 mM u DMSO-u (od radne otopine od 6,4 mM), koje se razrjeđuju kako je opisano za glavne koncentracije u stavku 22. tako da konačna koncentracija pozitivne kontrole bude u rasponu od 4 do 64 μM. Mogu se upotrijebiti i druge prikladne pozitivne kontrole koje po mogućnosti daju srednje vrijednosti EC1,5, pod uvjetom da su dostupni prijašnji podaci na temelju kojih se mogu odrediti usporedivi kriteriji prihvatljivosti za analitičku seriju. Primjena ispitivane kemikalije i tvari koje služe kao kontrola Za svaku ispitivanu kemikaliju i tvar koja se upotrebljava za pozitivnu kontrolu potreban je jedan pokus za izvođenje predviđanja (pozitivnog ili negativnog), koji se sastoji od najmanje dva neovisna ponavljanja od kojih svako sadržava tri ponovljena uzorka (tj. n = 6). Ako se dvama neovisnim ponavljanjima dobiju nesukladni rezultati, trebalo bi provesti treće ponavljanje s tri ponovljena uzorka (tj. n = 9). Neovisna se ponavljanja provode u različite dane svaki put sa svježom radnom otopinom ispitivanih kemikalija i neovisno izdvojenim stanicama. Međutim, stanice mogu biti iz iste pasaže. Nakon što se nasade kako je opisano u stavku 20., stanice se uzgajaju 24 sata na mikrotitracijskim pločicama s 96 jažica. Medij se potom uklanja i zamjenjuje svježom hranjivom podlogom za uzgoj kulture (150 μl hranjive podloge za uzgoj kulture koja sadržava serum, ali bez geneticina u slučaju testa KeratinoSensTM) u koju se dodaje 50 μl dvadesetpeterostruko razrijeđene ispitivane kemikalije i tvari koje služe za kontrolu. Najmanje jednu jažicu po pločici trebalo bi ostaviti praznu (bez stanica i tretiranja) radi određivanja osnovnih vrijednosti. Tretirane se pločice potom inkubiraju oko 48 sati na 37 ± 1 °C u prisutnosti 5 % CO2 u testu KeratinoSensTM. Potrebno je paziti da ne dođe do isparavanja hlapljivih ispitivanih kemikalija te unakrsne kontaminacije jažica ispitivanim kemikalijama, npr. pokrivanjem pločica metalnom folijom prije inkubacije s ispitivanim kemikalijama. Mjerenja aktivnosti luciferaze Tri su faktora ključna za osiguranje pravilnih očitavanja luminiscencije: — odabir osjetljivog luminometra, — upotreba formata pločice dovoljne visine da se izbjegne unakrsna kontaminacija svjetlom i — upotreba supstrata luciferaze koji emitira dovoljno svjetlosti da osigura dovoljnu osjetljivost i nisku varijabilnost. Prije ispitivanja trebalo bi provesti kontrolni pokus kako je opisano u Dodatku 3. kako bi se osiguralo ispunjavanje tih triju zahtjeva. Nakon 48 sati izlaganja ispitivanoj kemikaliji i tvarima koje služe za kontrolu u testu KeratinoSensTM stanice se ispiru fiziološkom otopinom puferiranom fosfatnim puferom te se u svaku jažicu doda odgovarajući lizni pufer za očitavanje luminiscencije i ostavi 20 minuta na sobnoj temperaturi. Potom se pločice koje sadržavaju stanični lizat radi očitavanja stavljaju u luminometar koji je u testu KeratinoSensTM programiran tako da: i. u svaku jažicu dodaje supstrat luciferaze (tj. 50 μl), ii. čeka jednu sekundu te iii. integrira aktivnost luciferaze dvije sekunde. Ako se upotrebljavaju drukčiji parametri, npr. ovisno o modelu luminometra, potrebno ih je obrazložiti. Nadalje, može se upotrijebiti i tinjavi supstrat pod uvjetom da je pokus za kontrolu kvalitete iz Dodatka 3. uspješno izveden. Procjena citotoksičnosti Za test preživljavanja stanica KeratinoSensTM medij se nakon 48 sati izlaganja zamjenjuje svježim medijem koji sadržava MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavi tetrazolijev bromid; CAS br. 298-93-1) te se stanice inkubiraju četiri sata na 37 oC u prisutnosti 5 % CO2. Potom se medij MTT uklanja i stanice se tijekom noći liziraju (npr. dodavanjem 10 %-tne otopine SDS-a u svaku jažicu). Nakon protresanja fotometrom se mjeri apsorpcija na 600 nm. PODACI I IZVJEŠĆIVANJE Procjena podataka U testu KeratinoSensTM izračunavaju se sljedeći parametri: — najveći prosječni multiplikacijski faktor indukcije aktivnosti luciferaze (Imax) za svaku koncentraciju ispitane kemikalije i pozitivne kontrole, — vrijednost EC1,5 koja predstavlja koncentraciju za koju je dobivena indukcija aktivnosti luciferaze iznad praga koji odgovara povećanju pomnoženom s 1,5 (tj. povećanju aktivnosti luciferaze od 50 %) i — vrijednosti koncentracije IC50 i IC30 koje odgovaraju smanjenju preživljavanja stanica od 50 % i 30 %. — multiplikacijski faktor indukcije aktivnosti luciferaze izračunava se s pomoću jednadžbe 1., a ukupni maksimalni multiplikacijski faktor indukcije (Imax) izračunava se kao prosjek pojedinačnih ponavljanja. Jednadžba 1.: pri čemu je: Luzorak = luminiscencija izmjerena u jažici koja sadržava ispitivanu kemikaliju Lprazno = luminiscencija izmjerena u praznoj jažici koja ne sadržava stanice i nije tretirana Lotapalo = prosječna vrijednost luminiscencije izmjerene u jažicama koje sadržavaju stanice i negativnu kontrolu (s otapalom) EC1,5 se izračunava linearnom interpolacijom s pomoću jednadžbe 2., a ukupan EC1,5 izračunava se kao geometrijska sredina pojedinačnih ponavljanja. Jednadžba 2.: pri čemu je: Ca = najniža koncentracija u μM pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta Cb = najviša koncentracija u μM pri kojoj je povećanje indukcije < 1,5 puta Ia = multiplikacijski faktor indukcije izmjerene pri najnižoj koncentraciji pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta (srednja vrijednost za tri jažice kao ponovljeni uzorak) Ib = multiplikacijski faktor indukcije izmjerene pri najvišoj koncentraciji pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta (srednja vrijednost za tri jažice kao ponovljeni uzorak) Preživljavanje se izračunava s pomoću jednadžbe 3.: jednadžba 3.: pri čemu je: Vuzorak = apsorbancija izmjerena testom MTT u jažici koja sadržava ispitivanu kemikaliju Vprazno = apsorbancija izmjerena testom MTT u praznoj jažici koja ne sadržava stanice i nije tretirana Votapalo = prosječna apsorbancija izmjerena testom MTT u jažicama koje sadržavaju stanice i negativnu kontrolu (s otapalom) IC50 i IC30 izračunavaju se linearnom interpolacijom s pomoću jednadžbe 4., a ukupni IC50 i IC30 izračunavaju se kao geometrijska sredina pojedinačnih ponavljanja. Jednadžba 4.: pri čemu je: X = smanjenje od % pri koncentraciji koju treba izračunati (50 i 30 za IC50 i IC30) Ca = najniža koncentracija u μM za koju je smanjenje preživljavanja > x % Cb = najviša koncentracija u μM za koju je smanjenje preživljavanja > x % Va = preživljavanje od % pri najnižoj koncentraciji za koju je smanjenje preživljavanja > x % Vb = preživljavanje od % pri najvišoj koncentraciji za koju je smanjenje preživljavanja < x % Za svaku se koncentraciju koja pokazuje povećanje indukcije aktivnosti luciferaze > 1,5 puta izračunava statistička značajnost (npr. dvosmjernim Studentovim t-testom) uspoređivanjem vrijednosti luminiscencije za tri ponovljena uzorka s vrijednostima luminiscencije u jažicama koje sadržavaju (negativnu) kontrolu s otapalom kako bi se utvrdilo je li indukcija aktivnosti luciferaze statistički značajna (p < 0,05). Najniža koncentracija pri kojoj je povećanje indukcije aktivnosti luciferaze > 1,5 puta vrijednost je koja određuje EC1,5. U svakom se slučaju provjerava je li ta vrijednost niža od vrijednosti IC30, dakle je li pri koncentraciji koja određuje vrijednost EC1,5 smanjenje preživljavanja stanica manje od 30 %. Preporučuje se da se podaci vizualno provjeravaju s pomoću grafikona. Ako se ne uočava jasna krivulja doza – odgovor ili ako dobivena krivulja doza – odgovor ima dvofazičan izgled (tj. dva puta presijeca prag od 1,5), pokus bi trebalo ponoviti kako bi se provjerilo je li taj rezultat specifičan za ispitivanu kemikaliju ili je riječ o analitičkom artefaktu. U slučaju da je dvofazični odgovor obnovljiv u neovisnom pokusu, u izvješću bi trebalo navesti nižu vrijednost EC1,5 (koncentraciju pri kojoj krivulja prvi put presijeca prag od 1,5). U rijetkim se slučajevima u kojima se iznad praga od 1,5 puta uočava indukcija koja nije statistički značajna, a nakon koje slijedi statistički značajna indukcija pri višoj koncentraciji, rezultati tog ponavljanja smatraju valjanima i pozitivnima jedino ako je statistički značajna indukcija iznad praga od 1,5 dobivena za koncentraciju koja nije citotoksična. Konačno, za ispitivane kemikalije kod kojih se već i pri najnižoj ispitnoj koncentraciji od 0,98 μM javlja 1,5 puta ili veća indukcija, vrijednost EC1,5 < 0,98 utvrđuje se na temelju vizualnog pregleda krivulje doza – odgovor. Kriteriji prihvatljivosti Sljedeći bi kriteriji prihvatljivosti trebali biti ispunjeni kada se primjenjuje test KeratinoSensTM. Prvo, indukcija aktivnosti luciferaze dobivena s pozitivnom kontrolom, cimetnim aldehidom, trebala bi biti statistički značajna iznad praga od 1,5 (npr. na temelju T-testa) za najmanje jednu od ispitanih koncentracija (od 4 do 64 μM). Drugo, vrijednost EC1,5 trebala bi biti unutar dvaju standardnih odstupanja prijašnje srednje vrijednosti ispitnog laboratorija (npr. između 7 μM i 30 μM na temelju podataka upotrijebljenih za validaciju), koju bi trebalo redovito ažurirati. Osim toga, prosječna indukcija u tri ponovljena uzorka za cimetni aldehid pri 64 μM trebala bi iznositi između 2 i 8. Ako nije ispunjen potonji kriterij, odnos doza – odgovor za cimetni aldehid trebalo bi pažljivo provjeriti, a testovi mogu biti prihvaćeni jedino ako postoji jasan odnos između doze i odgovora u kojemu se indukcija aktivnosti luciferaze povećava s povećanjem koncentracija za pozitivnu kontrolu. Konačno, prosječan koeficijent varijacije očitanih vrijednosti luminiscencije za negativnu kontrolu (s otapalom) s DMSO-om trebao bi biti ispod 20 % u svakom ponavljanju koje obuhvaća šest jažica ispitanih kao triplikat. Ako je varijabilnost veća, rezultati se odbacuju. Tumačenje rezultata i model predviđanja Predviđanje na temelju testa KeratinoSensTM smatra se pozitivnim ako su ispunjena sva četiri sljedeća uvjeta u dva od dva ponavljanja ili u ta ista dva od tri ponavljanja; u protivnom se predviđanje na temelju testa KeratinoSensTM smatra negativnim (slika 1.): 1. Imax veće je od (>) 1,5 puta i statistički se znatno razlikuje od vrijednosti dobivene za (negativnu) kontrolu s otapalom (kako je utvrđeno dvostranim Studentovim t-testom za neuparene podatke); 2. preživljavanje stanica veće je od (>) 70 % pri najnižoj koncentraciji za koju je povećanje indukcije luciferaze veće od 1,5 puta povećanja (tj. pri koncentraciji koja određuje EC1,5); 3. vrijednost EC1,5 manja je od (<) 1 000 μM (ili < 200 μg/ml za ispitivane kemikalije čija molekularna masa nije utvrđena); 4. općenito se uočava jasan odnos između doze i odgovora za indukciju luciferaze (ili dvofazičan odgovor kako je navedeno u stavku 33.). Ako su u određenom ponavljanju ispunjena sva tri prva uvjeta, ali se ne može uočiti jasan odnos između doze i odgovora za indukciju luciferaze, tada bi se trebalo smatrati da je rezultat tog ponavljanja nejasan te mogu biti potrebna dodatna ispitivanja (slika 1.). Osim toga, i negativan rezultat dobiven s koncentracijama < 1 000 μM (ili < 200 μg/ml za ispitivane kemikalije čija molekularna masa nije utvrđena) isto bi tako trebalo smatrati nejasnim (vidjeti stavak 11.). Slika 1. Model predviđanja koji se upotrebljava u testu KeratinoSensTM. Predviđanje na temelju testa KeratinoSensTM trebalo bi razmatrati u okviru IATA-e te u skladu s odredbama stavaka 9. i 11. U rijetkim slučajevima, ispitivane kemikalije koje induciraju aktivnost luciferaze vrlo blizu citotoksičnih razina mogu u nekim ponavljanjima biti pozitivne pri razinama koje nisu citotoksične (tj. koncentracija koja određuje EC1,5 niža je od (<) vrijednosti IC30), a u drugim ponavljanjima samo pri razinama koje su citotoksične (tj. koncentracija koja određuje EC1,5 veća je od (>) vrijednosti IC30). Takve bi ispitivane kemikalije trebalo ponovno ispitati užom analizom odnosa između doze i odgovora primjenjujući niži faktor razrjeđenja (npr. 1,33 ili Ö2 (= 1,41) puta između jažica) kako bi se utvrdilo je li do indukcije došlo na citotoksičnim razinama ili nije (9.). Izvješće o ispitivanju Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije: Ispitivana kemikalija — Jednokomponentna tvar — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi), SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula i/ili druge identifikacijske oznake, — fizički izgled, topljivost u vodi, topljivost u DMSO-u, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni; — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni. — Višekomponentna tvar, UVCB tvar i smjesa: — opisane koliko god je to moguće npr. kemijskim identitetom (vidjeti prethodno), čistoćom, količinskom zastupljenošću i relevantnim fizikalno-kemijskim svojstvima sastojaka (vidjeti prethodno), u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — fizički izgled, topljivost u vodi, topljivost u DMSO-u te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni; — molekularna masa ili prividna molekularna masa u slučaju smjesa/polimera poznatog sastava ili druge informacije koje su relevantne za provođenje ispitivanja, — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni. Kontrole — Pozitivna kontrola — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi), SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula i/ili druge identifikacijske oznake, — fizički izgled, topljivost u vodi, topljivost u DMSO-u, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni i gdje je primjenjivo; — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje), — ispitana koncentracija (ispitane koncentracije), — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — upućivanje na podatke koji se odnose na prijašnje pozitivne kontrole i pokazuju prikladnost kriterija prihvatljivosti analitičke serije, ako je primjenjivo. — Negativna kontrola (s nosačem) — kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi) i/ili druge identifikacijske oznake, — čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd., — fizički izgled, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva u slučaju da su upotrijebljene negativne kontrole / nosači drukčiji od onih koji su navedeni u ovoj ispitnoj metodi, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni, — obrazloženje za odabir otapala za svaku ispitivanu kemikaliju. Uvjeti primjene ispitne metode — naziv i adresa naručitelja, ustanove koja provodi ispitivanje i voditelja istraživanja, — opis upotrijebljene ispitne metode, — upotrijebljena stanična linija, uvjeti njezina skladištenja i izvor (npr. objekt iz kojeg su dobiveni), — broj pasaža i stupanj konfluencije stanica upotrijebljenih za ispitivanje, — metoda brojenja stanica koja je upotrijebljena za nasađivanje prije ispitivanja i mjere koje su poduzete kako bi se osigurao ujednačen raspored broja stanica (vidjeti stavak 20.), — upotrijebljeni luminometar (npr. model), uključujući postavke instrumenta, upotrijebljeni supstrat luciferaze te dokaz o primjerenom mjerenju luminiscencije na temelju kontrolnog ispitivanja opisanog u Dodatku 3, — postupak koji je primijenjen za dokazivanje osposobljenosti laboratorija za izvođenje ispitne metode (npr. ispitivanjem tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti) ili za dokazivanje obnovljive primjene ispitne metode tijekom vremena. Ispitni postupak — broj primijenjenih ponavljanja i ponovljenih uzoraka, — koncentracije ispitivane kemikalije, postupak primjene i vrijeme izloženosti (ako je drukčije od preporučenog), — opis primijenjenih kriterija ocjenjivanja i odlučivanja, — opis primijenjenih kriterija prihvatljivosti istraživanja, — opis mogućih izmjena ispitne metode. Rezultati — tablični prikaz vrijednosti Imax, EC1,5 i preživljavanja (tj. IC50, IC30) dobivenih za ispitivanu kemikaliju te za pozitivnu kontrolu pri svakom ponavljanju, kao i srednje vrijednosti (Imax: prosjek; EC1,5 i preživljavanje: geometrijska sredina), te standardno odstupanje izračunato s pomoću podataka iz svih ponavljanja i klasifikacija ispitivane kemikalije prema modelu predviđanja, — koeficijent varijacije vrijednosti luminiscencije očitanih za negativnu kontrolu u svakom pokusu, — grafički prikaz krivulja doza – odgovor za indukciju aktivnosti luciferaze i za preživljavanje, — opis svih drugih relevantnih zapažanja, ako je primjenjivo. Rasprava o rezultatima — rasprava o rezultatima dobivenima testom KeratinoSensTM, — rasprava o rezultatima ispitne metode u kontekstu IATA-e ako su dostupni drugi relevantni podaci. Zaključak LITERATURA 1. United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupno na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html. 2. OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris. 3. Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367–485. 4. Poglavlje B.42. ovog Priloga: Preosjetljivost kože: Analiza lokalnih limfnih čvorova. 5. Poglavlje B.6. ovog Priloga: Senzibilizacija kože. 6. Poglavlje B.50. ovog Priloga: Preosjetljivost kože: Analiza lokalnih limfnih čvorova: DA. 7. Poglavlje B.51. ovog Priloga: Preosjetljivost kože: Analiza lokalnih limfnih čvorova: BrdU-ELISA. 8. Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284–292. 9. Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281–290. 10. Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779–1791. 11. Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45–49. 12. Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733–744. 13. Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337–1352. 14. EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, str. 42. Dostupno na: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation. 15. DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM, str. 17. Dostupno na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index 16. Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106–121. 17. Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389–400. 18. Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489–504. 19. Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353–1364. 20. Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220–1225. 21. Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683–1969. 22. Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646–657. 23. OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris. 24. ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). 25. Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813–1822. 26. Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301–316. 27. Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225–2232. 28. OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris. 29. OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France. 30. NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. str. 186. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf Dodatak 1. DEFINICIJE Točnost : stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. To je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata ‚relevantnosti’. Pojam je često međusobno zamjenjiv s pojmom ‚podudarnost’ u smislu udjela točnih ishoda ispitne metode (29.). AOP (engl. Adverse Outcome Pathway – put nastanka štetnog ishoda) : slijed događaja od kemijske strukture ciljne kemikalije ili skupine sličnih kemikalija preko početnog molekularnog događaja do in vivo štetnog ishoda (2.). ARE : element antioksidacijskog odgovora (naziva se i EpRE, element odgovora na elektrofile) je element odgovora smješten u uzvodnoj promotorskoj regiji mnogih citoprotektivnih gena i gena faze II. Ako ga aktivira Nfr2, posreduje u transkripcijskoj indukciji tih gena. Kemikalija : tvar ili smjesa. Koeficijent varijacije : mjera varijabilnosti koja se za skupinu podataka dobivenih od ponovljenih uzoraka izračunava dijeljenjem standardnog odstupanja sa srednjom vrijednošću. Može se pomnožiti sa 100 da bi se izrazila u obliku postotka. EC1,5 : interpolirana koncentracija za indukciju luciferaze pomnoženu s 1,5. IC30 : koncentracija pri kojoj je preživljavanje stanica smanjeno za 30 %. IC50 : koncentracija pri kojoj je preživljavanje stanica smanjeno za 50 %. Opasnost : intrinzično svojstvo nekog agensa ili stanje koji imaju potencijal da uzrokuju štetne učinke kada su organizam, sustav ili (sub)populacija izloženi tom agensu. IATA (engl. Integrated Approach to Testing and Assessment – integrirani pristup ispitivanju i procjeni) : strukturiran pristup koji se primjenjuje za identifikaciju opasnosti (potencijal), karakterizaciju opasnosti (jakost) i/ili procjenu sigurnosti (potencijal/jakost i izloženost) kemikalije ili skupine kemikalija, kojim se na strateški način objedinjuju i ponderiraju svi relevantni podaci koji će služiti kao podloga za donošenje regulatornih odluka u vezi s potencijalnom opasnošću i/ili rizikom i/ili potrebom za daljnjim ciljnim, a time i minimalnim ispitivanjem. Imax : maksimalni faktor indukcije luciferaze u usporedbi s (negativnom) kontrolom s otapalom izmjeren pri bilo kojoj koncentraciji ispitivane kemikalije. Keap1 ( Kelch-like ECH-associated protein 1 ): senzorski protein koji može regulirati aktivnost faktora Nrf2. U neinduciranim uvjetima senzorski protein Keap1 ciljano djeluje na transkripcijski faktor Nrf2 radi njegove ubikvitinacije i proteolitičke razgradnje u proteasomu. Kovalentna modifikacija reaktivnih cisteinskih ostataka proteina Keap 1 s malim molekulama može dovesti do disocijacije faktora Nrf2 od proteina Keap1 (8) (10) (11). Smjesa : smjesa ili otopina koja se sastoji od dviju ili više tvari koje u njoj ne reagiraju (1.). Jednokomponentna tvar : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je jedan glavni sastojak prisutan u koncentraciji od najmanje 80 % (w/w). Višekomponentna tvar : tvar, definirana količinskim sastavom, u kojoj je više od jednog glavnog sastojka prisutno u koncentraciji od 10 % (w/w) ili većoj, ali ne većoj od 80 % (w/w). Višekomponentna tvar rezultat je procesa proizvodnje. Smjesa i višekomponentna tvar razlikuju se po tome što se smjesa dobiva miješanjem dviju ili više tvari bez kemijske reakcije. Višekomponentna tvar rezultat je kemijske reakcije. Nrf2 (nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) : transkripcijski faktor koji je uključen u put antioksidacijskog odg