PRILOG I.

Postupak provođenja testova u skladu s člancima 3., 4., 5. i 7.

1. OPĆA NAČELA O PRISUTNOSTI NAVEDENOG ŠTETNOG ORGANIZMA

1.1. Na prisutnost navedenog štetnog organizma sumnja se ako se dobije pozitivan rezultat prvim testom za otkrivanje provedenim na navedenom bilju odnosno na uzorcima vode.

1.2. Prisutnost navedenog štetnog organizma potvrđuje se u sljedećim slučajevima: (a) ako je prvi ili drugi test za otkrivanje selektivno izdvajanje koje rezultira kolonijama tipične morfologije, a dvama identifikacijskim testovima provedenima na tim kolonijama dobiveni su pozitivni rezultati; (b) ako prvi i drugi test nisu selektivno izdvajanje, a dvama se identifikacijskim testovima dobiju pozitivni rezultati nakon što se uzorak podvrgne selektivnom izdvajanju, koje je rezultiralo kolonijama tipične morfologije. Jedan od ta dva identifikacijska testa jest test iz točke 2.2. podtočaka (e), (f) i (g).

2. TESTOVI

2.1. Testovi za otkrivanje

Testovi za otkrivanje moraju biti takvi da se njima dosljedno otkriva najmanje 104 stanica/ml resuspendiranog taloga dobivenog iz asimptomatskih uzoraka.

Drugi test za otkrivanje temelji se na drukčijim biološkim načelima ili nukleotidnim regijama od prvog testa za otkrivanje.

Testovi za otkrivanje su sljedeći:

(a) testovi imunofluorescencije opisani u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(b) izdvajanje navedenog štetnog organizma na poluselektivnoj hranjivoj podlozi mSMSA, kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(c) konvencionalni PCR test uz upotrebu početnica koje su opisali Pastrik et al. (2002.) (1), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(d) PCR testovi TaqMan® u stvarnom vremenu uz upotrebu početnica i proba koje su opisali: i. Weller et al. (2000.) (2), kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama; ii. Vreeburg et al. (2016.) (3) (uz upotrebu probe TaqMan® izmijenjene u odnosu na izvornu probu koju su opisali Weller et al. 2000.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iii. Vreeburg et al. (2018.) (4) (takozvani test NYtor), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iv. Massart et al. (2014.) (5), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(e) test petljom posredovanog izotermalnog umnažanja (engl. loop-mediated isothermal amplification, LAMP) uz upotrebu početnica koje su opisali Lenarčič et al. (2014.) (6) (samo za simptomatski biljni materijal), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama.

2.2. Identifikacijski testovi

Identifikacijski testovi su sljedeći:

(a) testovi imunofluorescencije opisani u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(b) konvencionalni PCR testovi uz upotrebu početnica koje su opisali Pastrik et al. (2002.), kako su detaljno opisani u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(c) PCR testovi TaqMan® u stvarnom vremenu uz upotrebu početnica i proba koje su opisali: i. Weller et al. (2000.), kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama; ii. Vreeburg et al. (2016.) (uz upotrebu probe TaqMan® izmijenjene u odnosu na izvornu probu koju su opisali Weller et al. 2000.), kako je detaljno opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama; iii. Vreeburg et al. (2018.) (takozvani test NYtor), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama; iv. Massart et al. (2014.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(d) test LAMP uz upotrebu početnica koje su opisali Lenarčič et al. (2014.), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(e) konvencionalni multipleks PCR test specifičan za filotip (Opina et al. (1997.) (7); Fegan & Prior (2005.) (8)), kako je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(f) DNA barkodiranje (Wicker et al. (2007.) (9)), kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama;

(g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018.) (10)), kako je opisano u međunarodnim dijagnostičkim normama.

3. DIJAGRAMI POSTUPAKA

Dijagram br. 1: dijagnostički postupak za utvrđivanje prisutnosti navedenog štetnog organizma u uzorcima navedenog bilja.

a Izdvajanje se može primijeniti kao prvi ili drugi test za otkrivanje. Ako se sumnja na prisutnost navedenog štetnog organizma na hranjivoj podlozi, kolonije se pročišćavaju kako bi se dobile čiste kulture na kojima se provode dva identifikacijska testa.

b Jedan od ta dva identifikacijska testa jest test iz točke 2.2. podtočaka (e), (f) i (g). Za potvrdu prisutnosti štetnog organizma rezultati obaju identifikacijskih testova trebaju biti pozitivni.

c Treći test za otkrivanje temelji se na drukčijim biološkim načelima ili drukčijim nukleotidnim regijama.

Dijagram br. 2: dijagnostički postupak za navedeni štetni organizam u uzorcima vode.

a Jedan od ta dva identifikacijska testa jest test iz točke 2.2. podtočaka (e), (f) i (g). Za potvrdu prisutnosti štetnog organizma rezultati obaju identifikacijskih testova trebaju biti pozitivni.

4. PRIPREMA UZORKA

4.1 Uzorci asimptomatskih gomolja

Standardni uzorak sadržava 200 gomolja po testu. Odgovarajući laboratorijski postupak za obradu jezgara stolona radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma opisan je u međunarodnim dijagnostičkim normama.

4.2 Uzorci asimptomatskog navedenog bilja

Otkrivanje latentnih zaraza provodi se na kompozitnim uzorcima dijelova stabljike ili peteljki lista. Postupak se može provesti na najviše 200 dijelova stabljike ili 200 peteljki lista različitih biljaka u jednom uzorku. Odgovarajući laboratorijski postupak za dezinficiranje i obradu dijelova stabljike ili peteljki lista radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma opisan je u međunarodnim dijagnostičkim normama.

4.3 Uzorci simptomatskog materijala navedenog bilja

Dijelovi tkiva aseptično se uklanjaju iz žilnog prstena u gomolju krumpira ili iz žilnih snopića stabljike navedenog bilja koje pokazuje simptome venuća. Odgovarajući laboratorijski postupak za obradu tih tkiva radi dobivanja ekstrakta za otkrivanje navedenog štetnog organizma detaljno je opisan u međunarodnim dijagnostičkim normama.

4.4 Uzorci površinske vode ili vode iz sustava recirkulacije (uključujući tekući otpad nastao pri preradi krumpira ili otpadne vode)

Najvažniji je test za otkrivanje navedenog štetnog organizma u uzorcima površinskih voda, vode iz sustava recirkulacije i uzorcima otpadnih voda (industrija prerade krumpira) selektivno izdvajanje. Odgovarajući laboratorijski postupak za obradu uzoraka vode opisan je u međunarodnim dijagnostičkim normama.

(1) Pastrik, K. H., Elphinstone, J. G., Pukall, R. (2002.) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, str. 831.–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000.). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, str. 2853.–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016.). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, str. 112.–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018.). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, str. 86.–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014.). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, str. 29.–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014.). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997.). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, str. 19.–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005.). How complex is the„Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (ur. Allen C., Hayward A. C. & Prior P.), str. 449.–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (SAD).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007.). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, str. 6790.–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018.). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.