02009R0152 — HR — 24.05.2017 — 006.001

Ovaj je tekst namijenjen isključivo dokumentiranju i nema pravni učinak. Institucije Unije nisu odgovorne za njegov sadržaj. Vjerodostojne inačice relevantnih akata, uključujući njihove preambule, one su koje su objavljene u Službenom listu Europske unije i dostupne u EUR-Lexu. Tim službenim tekstovima može se izravno pristupiti putem poveznica sadržanih u ovom dokumentu.

►B UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 152/2009 od 27. siječnja 2009. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje (Tekst značajan za EGP) ( L 054 26.2.2009, 1)

Promijenio:









▼B

UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 152/2009

od 27. siječnja 2009.

o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje

(Tekst značajan za EGP)







▼M3

Članak 1.

Uzorkovanje za službenu kontrolu hrane za životinje, posebno u vezi s određivanjem sastojaka, uključujući materijal koji sadržava genetski modificirane organizme (GMO) ili se od njih sastoji ili proizvodi, dodataka u hrani za životinje kako su utvrđeni Uredbom (EZ) br. 1831/2003 Europskog parlamenta i Vijeća ( 1 ), nepoželjnih tvari kako su definirane Direktivom 2002/32/EZ Europskog parlamenta i Vijeća ( 2 ), provodi se u skladu s metodama iz Priloga I.)

Metoda uzorkovanja iz Priloga I. primjenjuje se za kontrolu hrane za životinje u vezi s određivanjem ostataka pesticida kako su utvrđeni Uredbom (EZ) br. 396/2005 Europskog parlamenta i Vijeća ( 3 ). i kontrolu sukladnosti s Uredbom (EU) br. 619/2011.

▼B

Članak 2.

Priprema uzoraka za analizu i prikazivanje rezultata izvode se u skladu s metodama iz Priloga II.

Članak 3.

Analiza za službenu kontrolu hrane za životinje izvodi se pomoću metoda iz Priloga III. (Analitičke metode za kontrolu sastava hrane za životinje i krmnih smjesa), Priloga IV. (Analitičke metode za kontrolu količine dopuštenih krmnih dodataka), Priloga V. (Analitičke metode za kontrolu nepoželjnih tvari u hrani za životinje) i Priloga VI. (Analitičke metode za određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u okviru službene kontrole hrane za životinje).

Članak 4.

Energetska vrijednost krmnih smjesa za perad izračunava se u skladu s Prilogom VII.

Članak 5.

U svrhu potvrđivanja koriste se metode analize za kontrolu nedopuštenih krmnih dodataka iz Priloga VIII.

Članak 6.

Direktive 71/250/EEZ, 71/393/EEZ, 72/199/EEZ, 73/46/EEZ, 76/371/EEZ, 76/372/EEZ, 78/633/EEZ, 81/715/EEZ, 84/425/EEZ, 86/174/EEZ, 93/70/EEZ, 93/117/EZ, 98/64/EZ, 1999/27/EZ, 1999/76/EZ, 2000/45/EZ, 2002/70/EZ i 2003/126/EZ stavljaju se izvan snage.

Upućivanja na Direktive stavljene izvan snage smatraju se upućivanjima na ovu Uredbu i tumače u skladu s korelacijskim tablicama iz Priloga IX.

Članak 7.

Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.

Ona se primjenjuje od 26. kolovoza 2009.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.

▼M3









PRILOG I.

METODE UZORKOVANJA

1. SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE

Uzorci za službenu kontrolu hrane za životinje uzimaju se u skladu s metodama opisanima u nastavku. Tako dobiveni uzorci smatraju se reprezentativnima za uzorkovane dijelove.

Svrha reprezentativnog uzorkovanja dobivanje je manje količine iz serije na način da određivanje bilo koje posebne osobine te količine predstavlja srednju vrijednost osobine serije. Serija se uzorkuje ponovljenim uzimanjem pojedinačnih uzoraka pri različitim jedinstvenim položajima u seriji. Ti pojedinačni uzorci kombiniraju se miješanjem kako bi se stvorio skupni uzorak iz kojeg se reprezentativnim dijeljenjem pripremaju reprezentativni konačni uzorci.

Ako se vizualnom inspekcijom utvrdi razlika u kvaliteti dijelova hrane za životinje namijenjene uzorkovanju u odnosu na preostali dio iste serije, takvi dijelovi razdvajaju se od ostatka hrane za životinje te se s njima postupa kao s odvojenom podserijom. Ako nije moguće razdijeliti hranu za životinje u odvojene podserije, hrana za životinje uzorkuje se kao jedna serija. Tada se to navodi u izvješću o uzorkovanju.

Ako se utvrdi da hrana za životinje, uzorkovana u skladu s odredbama ove Uredbe ne ispunjava uvjete EU-a i dio je jedne serije istovrsnog razreda ili opisa, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve sigurnosti EU-a.

2. DEFINICIJE POJMOVA

— Serija : identificirana količina hrane za životinje za koju je utvrđeno da posjeduje zajedničke osobine kao što je podrijetlo, sorta, način pakiranja, poduzeće koje pakira proizvode, pošiljatelj ili označivanje, a u slučaju proizvodnog postupka, proizvodna jedinica iz jedinstvenog postrojenja koja se koristi jedinstvenim proizvodnim parametrima ili nekoliko takvih jedinica pri neprekinutoj proizvodnji i skupnom skladištenju.

— Uzorkovani dio : serija ili identificirani dio serije ili podserije.

— Zapečaćeni uzorak : uzorak zapečaćen na način da uzorku nije moguće pristupiti bez lomljenja ili uklanjanja pečata.

— Pojedinačni uzorak : količina koja se uzima iz jedne točke uzorka.

— Skupni uzorak : skup pojedinačnih uzoraka uzetih iz istog uzorkovanog dijela.

— Reducirani uzorak : dio skupnog uzorka dobiven postupkom reprezentativnog smanjivanja skupnog uzorka.

— Konačni uzorak : dio reduciranog uzorka ili homogeniziranog skupnog uzorka.

— Laboratorijski uzorak : uzorak namijenjen za laboratorij (zaprimljen u laboratorij) koji može biti konačan, smanjeni ili skupni uzorak.

3. OPĆE ODREDBE

— Osoblje koje uzima uzorke: uzorke uzimaju osobe koje u tu svrhu ovlašćuju nadležna tijela.

— Uzorak mora biti zapečaćen na način da uzorku nije moguće pristupiti bez lomljenja ili uklanjanja pečata. Oznaka pečata treba biti jasno prepoznatljiva i vidljiva. Uzorak se može pohraniti u posudu koja se zatvara na način da se ne može otvoriti bez nepovratnog oštećivanja prijamnog spremnika ili posude čime se izbjegava ponovno korištenje prijamnog spremnika ili posude.

— Identifikacija uzorka: uzorak mora biti neizbrisivo označen i mora se identificirati na način da postoji nedvojbena veza s izvješćem o uzorku.

— Iz svakog skupnog uzorka uzimaju se najmanje dva konačna uzorka: najmanje jedan za kontrolu (za potrebe provedbe) i jedan za nositelja djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje (za potrebe prizivnog postupka). Naposljetku, za referencu se može uzeti jedan konačan uzorak. Ako je cjelokupan skupni uzorak homogeniziran, konačni uzorci uzimaju se iz homogeniziranog skupnog uzorka, osim ako je takav postupak u suprotnosti s pravilima država članica o pravima nositelja djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje.

4. OPREMA

4.1 Oprema za uzorkovanje mora biti izrađena od materijala koji ne mogu kontaminirati proizvode namijenjene uzorkovanju. Oprema namijenjena višestrukoj uporabi mora biti jednostavna za čišćenje kako bi se izbjegla križna kontaminacija.

4.2 Preporučena oprema za uzorkovanje krute hrane za životinje. 4.2.1 Ručno uzorkovanje 4.2.1.1 Lopatica s ravnim dnom i okomitim stranicama. 4.2.1.2 Sonda za uzorkovanje s dugim procjepom ili pregradama. Dimenzije sonde za uzorkovanje moraju odgovarati osobinama uzorka (dubina posude, veličina vreće itd.) i veličini čestica hrane za životinje. Ako sonda za uzorkovanje ima nekoliko otvora, oni se odvajaju pregradama ili raspoređenim otvorima kako bi se osiguralo da se uzorak uzima na različitim mjestima uzduž sonde. 4.2.2 Mehaničko uzorkovanje Za uzorkovanje hrane za životinje koja se kreće može se koristiti odgovarajuća mehanička oprema. Odgovarajuća mehanička oprema znači da se uzorkuje najmanje čitav dio protoka. Uzorkovanje hrane za životinje u pokretu (pri velikim brzinama protoka) može se provesti automatskim uzorkivačima. 4.2.3 Razdjelnik Ako je moguće i prikladno, oprema namijenjena za razdvajanje uzorka na približno jednake dijelove treba se koristiti za pripremu reduciranih uzoraka na reprezentativan način.

5. KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI S BROJEM POJEDINAČNIH UZORAKA

— Količinski zahtjevi iz točaka 5.1. i 5.2. u vezi s brojem pojedinačnih uzoraka primjenjuju se za uzorkovane dijelove u veličinama do najviše 500 tona koji se mogu uzorkovati na reprezentativan način. Opisani postupak uzorkovanja važeći je i za količine veće od propisane maksimalne veličine uzorkovanog dijela pod uvjetom da se najveći broj pojedinačnih uzoraka iz tablice koja slijedi zanemari, pri čemu se broj pojedinačnih uzoraka određuje formulom kvadratnog korijena navedenom u odgovarajućem dijelu postupka (više o tome u točki 5.3.), a najmanja skupna veličina uzorka proporcionalno se uvećala. Ovime se ne sprječava razdvajanje velike serije u nekoliko manjih podserija te uzorkovanje svake podserije u skladu s postupkom opisanim u točkama 5.1. i 5.2.

— Veličina uzorkovanog dijela mora biti takva da svaki od njegovih sastavnih dijelova može biti uzorkovan.

— Za jako velike serije ili podserije (> 500 tona) i za serije koje se prevoze ili skladište na takav način da je uzorkovanje nemoguće u skladu s postupkom uzorkovanja predviđenim točkama 5.1. i 5.2. ovog poglavlja, primjenjuje se postupak uzorkovanja predviđen točkom 5.3.

— U slučaju da je nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje prema propisima obvezan udovoljiti ovoj Uredbi u okviru obveznog sustava nadzora, nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje može odstupati od količinskih zahtjeva predviđenih ovim poglavljem kako bi se u obzir uzele operativne karakteristike pod uvjetom da je nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje dokazao nadležnim tijelima istovjetnost postupka uzorkovanja u pogledu reprezentativnosti i nakon dobivenog odobrenja od nadležnog tijela.

— Iznimno, ako nije moguće provesti navedenu metodu uzorkovanja u vezi s količinskim zahtjevima zbog neprihvatljive komercijalne štete na seriji (zbog oblika pakiranja, prijevoznih sredstava, načina skladištenja itd.), može se primijeniti alternativni način uzorkovanja pod uvjetom da je što reprezentativniji te u potpunosti opisan i dokumentiran.

5.1 Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje

5.1.1 Kruta hrana za životinje u rasutom stanju







Veličina uzorkovanog dijela Najmanji broj pojedinačnih uzoraka ≤ 2,5 tone 7 > 2,5 tone Kvadratni korijen iz dvadeseterokratnika broja tona u uzorkovanom dijelu (1), do 40 pojedinačnih uzoraka (*1) Kada dobiveni broj nije cijeli broj, zaokružuje se na sljedeći cijeli broj.

5.1.2 Tekuća hrana za životinje u rasutom stanju







Veličina uzorkovanog dijela Najmanji broj pojedinačnih uzoraka ≤ 2,5 tone ili ≤ 2 500 litara 4 (1) > 2,5 tone ili > 2 500 litara 7 (1) (*1) Ako nije moguće dobiti homogenu tekućinu, potrebno je uvećati broj pojedinačnih uzoraka.

5.1.3 Pakirana hrana za životinje

Hrana za životinje (u krutom ili tekućem stanju) može se pakirati u vreće, limenke, bačve itd. koje su u tablici označene kao jedinice. Velike jedinice (≥ 500 kg ili litara) moraju se uzorkovati u skladu s odredbama predviđenima za hranu za životinje u rasutom stanju (više o tome u točkama 5.1.1. i 5.1.2.).







Veličina uzorkovanog dijela Minimalan broj jedinica (najmanje jedna) namijenjenih uzimanju pojedinačnog uzorka (1) 1 do 20 jedinica 1 jedinica (2) 21 do 150 jedinica 3 jedinice (2) 151 do 400 jedinica 5 jedinica (2) > 400 jedinica Jedna četvrtina kvadratnog korijena iz broja jedinica u uzorkovanom dijelu (3), do 40 jedinica (*1) U slučaju kada otvaranje jedinice može utjecati na analizu (npr. kvarljiva vlažna hrana za životinje), neotvorena jedinica služi kao pojedinačni uzorak. (*2) Za jedinice čiji sadržaj ne prelazi 1 kilogram ili jednu litru, pojedinačni uzorak je sadržaj jedne izvorne jedinice. (*3) Kada dobiveni broj nije cijeli broj, zaokružuje se na sljedeći cijeli broj.

5.1.4 Krmni blokovi ili kameni za lizanje

Najmanje 1 blok ili kamen za lizanje za uzorkovanje po uzorkovanom dijelu od 25 jedinica, do najviše 4 bloka ili kamena za lizanje.

Za četiri bloka ili kamena za lizanje kojima pojedinačna težina nije veća od 1 kg, pojedinačni uzorak sadržaj je jednog bloka ili jednog kamena za lizanje.

5.1.5 Vlaknasta krma/krmivo







Veličina uzorkovanog dijela Najmanji broj pojedinačnih uzoraka (1) ≤ 5 tona 5 > 5 tona Kvadratni korijen iz peterokratnika broja tona u uzorkovanom dijelu (2), do 40 pojedinačnih uzoraka (*1) Uzima se u obzir da u određenim situacijama (npr. kod silaža) nije moguće uzeti potrebne pojedinačne uzorke bez uzrokovanja neprihvatljive štete na seriji. U tim situacijama može se primijeniti druga metoda uzorkovanja, a smjernice za uzorkovanje takvih serija objasnit će se prije stupanja na snagu ove Uredbe. (*2) Kada dobiveni broj nije cijeli broj, zaokružuje se na sljedeći cijeli broj.

5.2 Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje

Ti količinski zahtjevi u pogledu pojedinačnih uzoraka koriste se u sljedećim situacijama:

— kontrola aflatoksina, raženih gljivica, ostalih mikotoksina i štetnih botaničkih nečistoća u hrani za životinje;

— kontrola križne kontaminacije sastojkom, uključujući i genetski modificiranim materijalom, ili tvari za koju se očekuje neujednačena distribucija u hrani za životinje.

Ako kontrolno tijelo utemeljeno sumnja u postojanje takve neujednačene distribucije i u slučaju križne kontaminacije sastojkom ili tvari u krmnoj smjesi, primjenjuju se količinski zahtjevi navedeni u tablici u nastavku.







Veličina uzorkovanog dijela Najmanji broj pojedinačnih uzoraka < 80 tona Vidjeti količinske zahtjeve u točki 5.1. Broj pojedinačnih zahtjeva koji se moraju uzeti množi se sa 2,5. ≥ 80 tona 100

5.3 Količinski zahtjevi u vezi s pojedinačnim uzorcima kod vrlo velikih serija

U slučaju velikih uzorkovanih dijelova (uzorkovani dijelovi > 500 tona), broj pojedinačnih uzoraka namijenjenih uzorkovanju = 40 pojedinačnih uzoraka + kvadratni korijen iz količine tona pri kontroli tvari ili proizvoda ravnomjerno raspoređenih u cijelom uzorku ili 100 pojedinačnih uzoraka + kvadratni korijen iz količine tona pri kontroli sastojaka ili tvari vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje.

6. KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI SA SKUPNIM UZORKOM







Zahtijeva se samo jedan skupni uzorak na uzorkovani dio. Vrsta hrane za životinje Najmanja veličina skupnog uzorka (1) (2) 6.1. Hrana za životinje u rasutom stanju 4 kg 6.2. Pakirana hrana za životinje: 4 kg (3) 6.3. Tekuća ili polutekuća hrana za životinje: 4 litara 6.4. Krmni blokovi ili kameni za lizanje: 6.4.1. pojedinačne mase veće od 1 kg 4 kg 6.4.2. pojedinačne mase ne veće od 1 kg masa četiri izvorna bloka ili kamena za lizanje 6.5. Vlaknasta krma/krmivo 4 kg (4) (*1) Ako se uzorkuje hrana za životinje visoke vrijednosti, može se uzeti manja količina skupnog uzorka pod uvjetom da se to opiše i navede u izvješću o uzorkovanju. (*2) U skladu s odredbama Uredbe Komisije (EU) br. 619/2011 od 24. lipnja 2011. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje s obzirom na prisutnost genetski modificiranog materijala za koji je postupak odobravanja u tijeku ili je odobrenje isteklo (SL L 166, 25.6.2011. str. 9), skupni uzorak za kontrolu prisutnosti genetski modificiranog materijala mora sadržavati najmanje 35 000 sjemenki/zrna. Prema tome, veličina skupnog uzorka za kukuruz mora biti najmanje 10,5 kg, a za soju 7 kg. Za ostalo sjemenje kao što je ječam, proso, zob, riža, raž, pšenica i sjeme repe, skupna veličina uzorka od 4 kg odgovara količini od 35 000 sjemenki. (*3) U slučaju pakirane hrane za životinje, možda neće biti moguće postići veličinu od 4 kg za skupni uzorak, ovisno o veličini pojedinačnih jedinica. (*4) U slučaju vlaknaste krme ili krmiva niske specifične težine (npr. sijeno, slama), skupni uzorak treba imati najmanje 1 kg.

7. KOLIČINSKI ZAHTJEVI U VEZI S KONAČNIM UZORCIMA

Konačni uzorci

Potrebna je analiza najmanje jednog konačnog uzorka. Količina konačnog uzorka za analizu ne smije biti manja od:







kruta hrana za životinje 500 g (1) (2) (3) tekuća ili polutekuća hrana za životinje 500 ml (1) (*1) U skladu s odredbama Uredbe (EU) 619/2011 od, konačni uzorak za kontrolu prisutnosti genetski modificiranog materijala mora sadržavati najmanje 10 000 sjemenki/zrna. Prema tome, za kukuruz veličina konačnog uzorka mora biti najmanje 3 000 g, a za soju 2 000 g. Za ostalo sjemenje kao što je ječam, proso, zob, riža, raž, pšenica i sjeme repe, skupna veličina uzorka od 500 g odgovara više od 10 000 sjemenki. (*2) Ako je skupni uzorak znatno manji od 4 kg ili litara (vidjeti u bilješkama točku 6.), može se uzeti i manja količina konačnog uzorka pod uvjetom da se to opiše i navede u izvješću o uzorkovanju. (*3) Pri uzorkovanju mahunarki, zrna žitarica i orašastog voća za određivanje ostataka pesticida, najmanja veličina konačnog uzorka iznosi 1 kg u skladu s odredbama Direktive Komisije 2002/63/EZ (SL L 187, 16.7.2002., str. 30).

8. METODE UZORKOVANJA ZA VRLO VELIKE SERIJE ILI SERIJE KOJE SE SKLADIŠTE ILI PREVOZE NA NAČIN DA UZORKOVANJE U ČITAVOJ SERIJI NIJE MOGUĆE

8.1 Opća načela

Ako način prijevoza ili skladištenja serije onemogućuje uzimanje pojedinačnih uzoraka u čitavoj seriji, uzorkovanje takvih serija treba se provoditi kada je serija u protoku.

Kod velikih skladišta namijenjenih skladištenju hrane za životinje, nositelje djelatnosti treba se poticati da ugrade opremu u skladištu koja omogućuje (automatsko) uzorkovanje u čitavoj skladištenoj seriji.

Kod primjene postupaka uzorkovanja predviđenih u poglavlju 8. nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njihov predstavnik obavještava se o postupku uzorkovanja. Ako nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njegov predstavnik dovede u pitanje taj postupak uzorkovanja, nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje ili njegov predstavnik omogućuje nadležnom tijelu uzrokovanje u čitavoj seriji na vlastiti trošak.

8.2 Velike serije koje se prevoze brodom

8.2.1 Dinamičko uzorkovanje velikih serija koje se prevoze brodom

Uzorkovanje velikih serija u brodovima provodi se po mogućnosti dok je proizvod u protoku (dinamičko uzorkovanje).

Uzorkovanje se vrši po brodskom skladištu (subjekt koji se može fizički odvojiti). Međutim, brodska skladišta djelomično se prazne jedno za drugim tako da početno fizičko odvajanje više ne postoji nakon prijenosa u skladišnim objektima. Uzorkovanje se stoga može provesti u funkciji početnog fizičkog razdvajanja ili u funkciji razdvajanja nakon prijenosa u skladišne objekte.

Istovar broda može trajati nekoliko dana. Obično se uzorkovanje mora provesti u redovnim intervalima tijekom trajanja istovara. Međutim, nije uvijek moguće ili prikladno da službeni inspektor bude prisutan na uzorkovanju tijekom čitavog trajanja istovara. Stoga je dopušteno provesti uzorkovanje za dio (uzorkovani dio) čitave serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se uzimanjem u obzir uzorkovanog dijela.

Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

Prisutnost inspektora potrebna je čak i kada je službeni uzorak uzet automatski. Međutim, ako se automatsko uzorkovanje provodi s unaprijed zadanim parametrima koji se ne mogu mijenjati tijekom uzorkovanja, a pojedinačni uzorci se skupljaju u zapečaćeni prijamni spremnik čime se sprječava svaka moguća prijevara, tada je prisutnost inspektora potrebna samo na početku uzorkovanja, pri svakoj promjeni prijamnog spremnika za uzorak i na kraju uzorkovanja.

8.2.2 Statičko uzorkovanje serija koje se prevoze brodom

Ako se uzorkovanje provodi statičkim uzorkovanjem, primjenjuje se istovjetni postupak koji je predviđen za skladišne objekte (silose) kojima se pristupa s gornje strane (vidjeti točku 8.4.1.).

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu (odozgo) serije/brodskog skladišta. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se vodeći računa o veličini uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne ispunjava zahtjeve EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.3 Uzorkovanje velikih serija koje se skladište u skladištima

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se uzimajući u obzir veličinu uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.4 Uzorkovanje skladišnih objekata (silosa)

8.4.1 Uzorkovanje silosa kojima se (jednostavno) pristupa odozgo

Uzorkovanje se mora provesti na pristupačnom dijelu serije. Broj pojedinačnih uzoraka određuje se vodeći računa o veličini uzorkovanog dijela. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.4.2 Uzorkovanje silosa kojima se ne pristupa odozgo (zatvoreni silosi)

8.4.2.1 Silosi kojima se ne pristupa odozgo (zatvoreni silos) veličine > 100 tona

Hrana za životinje u tim silosima ne može se uzorkovati na statički način. Prema tome, ako se hrana za životinje u silosu mora uzorkovati i ne postoji mogućnost premještanja pošiljke, potrebno je s nositeljem djelatnosti sklopiti dogovor prema kojem je on ili ona dužan obavijestiti inspektora o tome kada će se silos istovariti kako bi se omogućilo uzorkovanje u trenutku kada je hrana za životinje u protoku.

8.4.2.2 Silos kojemu se ne pristupa odozgo (zatvoreni silos) veličine < 100 tona

Postupak uzorkovanja uključuje ispuštanje u prijamni spremnik količine od 50 do 100 kg i uzimanje uzorka iz njega. Veličina skupnog uzorka odgovara čitavoj seriji, a broj pojedinačnih uzoraka odnosi se na količinu iz silosa puštenu u prijamni spremnik za uzorkovanje. Ako se uzorkuje dio serije hrane za životinje istovrsnog razreda ili opisa i utvrdi se da taj dio serije ne odgovara zahtjevima EU-a, smatra se da sva hrana za životinje iz te serije također ne ispunjava zahtjeve EU-a, osim ako se detaljnom analizom utvrdi da nema dokaza da ostatak serije ne ispunjava zahtjeve EU-a.

8.5 Uzorkovanje hrane za životinje u rasutom stanju u zatvorenim posudama

Takve serije često se mogu uzorkovati samo nakon istovara. U određenim slučajevima nije moguće obaviti istovar na mjestu utovara ili kontrole stoga se uzorkovanje obavlja pri istovaru tih posuda.

9. UPUTE ZA UZIMANJE, PRIPREMANJE I PAKIRANJE UZORAKA

9.1 Općenito

Uzorci se moraju uzimati i pripremiti bez nepotrebnog odlaganja uz pridržavanje mjera opreza kojima se sprečava promjena sastava ili kontaminacija proizvoda. Instrumenti, radne površine i posude za prihvat uzoraka moraju biti čisti i suhi.

9.2 Pojedinačni uzorci

Pojedinačni uzorci moraju se uzeti nasumično iz cijeloga uzorka i moraju biti približno jednake veličine.

Veličina pojedinačnog uzorka iznosi najmanje 100 grama ili 25 grama za vlaknastu krmu ili krmivo niske specifične težine.

Ako se u skladu s pravilima postupka uzorkovanja utvrđenima u točki 8. mora uzeti manje od 40 pojedinačnih uzoraka, veličina pojedinačnih uzoraka određuje se u funkciji potrebne veličine skupnog uzorka koji se mora postići (vidjeti točku 6).

U slučaju uzorkovanja malih serija pakirane hrane za životinje gdje je prema količinskim zahtjevima potrebno uzeti ograničen broj pojedinačnih uzoraka, pojedinačni uzorak je sadržaj jedne izvorne jedinice čiji sadržaj ne prelazi 1 kg ili jednu litru.

U slučaju uzorkovanja pakirane hrane za životinje sastavljene od malih jedinica (npr. < 250 g), veličina pojedinačnog uzorka ovisi o veličini jedinice.

9.2.1 Hrana za životinje u rasutom stanju

Prema potrebi uzorkovanje se može izvesti pri premještanju uzorka (pri utovaru ili istovaru).

9.2.2 Pakirana hrana za životinje

Nakon odabira potrebnog broja jedinica za uzorkovanje u skladu s poglavljem 5., sondom ili lopaticom uzima se dio sadržaja svake jedinice. Prema potrebi, uzorci se mogu uzeti nakon odvojenog pražnjenja jedinica.

9.2.3 Homogenizirana ili za homogeniziranje primjerena tekuća ili polutekuća hrana za životinje

Nakon odabira potrebnog broja jedinica za uzorkovanje iz poglavlja 5., njihov se udio prema potrebi homogenizira i iz svake se jedinice uzima određena količina.

Pojedinačni se uzorci mogu uzimati pri pražnjenju sadržaja spremnika.

9.2.4 Tekuća ili polutekuća hrana za životinje koja nije prikladna za homogeniziranje

Nakon odabira traženog broja jedinica za uzorkovanje iz poglavlja 5., uzorci se uzimaju s različitih razina.

Uzorci se mogu uzeti i za vrijeme pražnjenja udjela, ali se prva količina mora odbaciti.

U oba slučaja ukupni obujam ne smije biti manji od 10 litara.

9.2.5 Krmni blokovi ili kameni za lizanje

Nakon odabira traženog broja blokova ili kamena za lizanje namijenjenih uzorkovanju iz poglavlja 5. može se uzeti dio svakog bloka ili kamena za lizanje. U slučaju sumnje da blok ili kamen za lizanje nije prikladan za homogeniziranje, čitav blok ili kamen za lizanje može se uzeti kao uzorak.

Za četiri bloka ili kamena za lizanje kojima pojedinačna težina nije veća od 1 kg, pojedinačni uzorak je sadržaj jednog bloka ili jednog kamena za lizanje.

9.3 Priprema skupnih uzoraka

Pojedinačni uzorci pomiješaju se tako da tvore skupni uzorak.

9.4 Priprema konačnih uzoraka

Materijal skupnog uzorka mora se pažljivo izmiješati ( 4 ).

— Svaki se uzorak pohrani u prikladnu posudu/prijamni spremnik. Potrebno je poduzeti sve mjere opreza kako bi se tijekom prijevoza ili skladištenja spriječila promjena sastava uzorka, kontaminacija ili onečišćenje.

— U slučaju kontrole tvari ili proizvoda ravnomjerno raspodijeljenih u hrani za životinje, skupni uzorak može se reprezentativno smanjiti na najmanje 2,0 kg ili 2,0 litre (reducirani uzorak) ( 5 ), po mogućnosti mehaničkim ili automatskim razdjelnikom. Za kontrolu prisutnosti ostataka pesticida u mahunarkama, zrnima žitarica i orašastom voću, najmanja veličina reduciranog uzorka iznosi 3 kg. Ako svojstva hrane za životinje ne dozvoljavaju korištenje razdjelnika ili razdjelnik nije dostupan, uzorak se smanjuje četvrtanjem. Potom se iz smanjenih uzoraka pripreme konačni uzorci (za potrebe kontrole, prizivnog postupka i u referentne svrhe) približno jednake veličine u skladu s količinskim zahtjevima iz poglavlja 7. U slučaju kontrole proizvoda, uključujući genetski modificiranih materijala, ili tvari vjerojatno neravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje, skupni uzorak je: — — potpuno homogeniziran i naknadno razdijeljen u konačne uzorke ili — reduciran na najmanje 2 kg ili 2 litre ( 6 ) mehaničkim ili automatskim razdjelnikom. Samo u slučaju kada svojstva hrane za životinje onemogućuju korištenje razdjelnika, uzorak se može po potrebi smanjiti četvrtanjem. Za kontrolu prisutnosti genetski modificiranog materijala u okviru Uredbe (EU) br. 619/2011, reducirani uzorak mora sadržavati najmanje 35 000 sjemenki/zrna kako bi se omogućilo dobivanje konačnih uzoraka za potrebe provedbe, prizivnog postupka i u referentne svrhe od najmanje 10 000 sjemenki zrna (vidjeti bilješku (**) u poglavlju 6. i bilješku (*) u poglavlju 7.).

9.5 Pakiranje uzoraka

Posude ili pakiranja zapečaćeni su i označeni tako da ih nije moguće otvoriti bez oštećivanja pečata. Cijela etiketa mora biti uključena u pečat.

9.6 Slanje uzoraka u laboratorij

Uzorak se bez nepotrebnog odlaganja šalje u određeni analitički laboratorij, zajedno s podacima potrebnima analitičaru.

10. PODACI O UZORKOVANJU

O svakom uzorku moraju se voditi evidencije kako bi se svaki uzorkovani dio i njegova veličina mogao nedvojbeno prepoznati.

U evidencijama se također navodi svako odstupanje od postupka uzorkovanja predviđenog ovom Uredbom.

Osim stavljanja evidencija na raspolaganje službenom kontrolnom laboratoriju, evidencije se stavljaju na raspolaganje nositelju djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje i/ili laboratoriju koji je odredio nositelj djelatnosti u poslovanju s hranom za životinje.









PRILOG II.

OPĆE ODREDBE O ANALITIČKIM METODAMA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE

A. PRIPREMA UZORAKA ZA ANALIZU

1. Svrha

U navedenim postupcima opisuje se priprema uzoraka za analizu, koji se šalju nadzornim laboratorijima nakon uzorkovanja provedenog u skladu s odredbama iz Priloga I.

Ti se laboratorijski uzorci moraju pripremiti tako da izvagane količine budu homogene i reprezentativne za konačne uzorke, kako su predviđene za metode analize.

2. Mjere opreza

Postupak pripremanja uzoraka ovisi o analitičkim metodama koje se koriste te proizvodima i tvarima koji se kontroliraju. Stoga je vrlo važno osigurati da primijenjeni postupak za pripremanje uzorka bude primjeren analitičkoj metodi koja se koristi te proizvodima ili tvarima koji se kontroliraju.

Svi potrebni postupci moraju se provesti na način kojim se u najvećoj mogućoj mjeri sprečava kontaminacija i promjena sastava uzorka.

Mljevenje, miješanje i prosijavanje mora se vršiti bez odlaganja kako bi se uzorak čim manje izlagao zraku i svjetlu. Ne smiju se koristiti mlinovi i drobilice koji bi mogli znatno zagrijati uzorak.

Preporuča se ručno mljevenje hrane za životinje koja je posebno osjetljiva na toplinu. Treba se pobrinuti da sama oprema ne bude izvor kontaminacije.

Ako se priprema ne može obaviti bez znatne promjene udjela vlage u uzorku, određuje se udio vode prije i nakon pripreme, u skladu s metodom utvrđenom u dijelu A Priloga III.

3. Postupak

3.1 Opći postupci

Testni alikvot uzima se iz konačnog uzorka. Ne preporuča se dijeljenje uzoraka metodom stožaste hrpe i četvrtanja jer se na taj način mogu dobiti testni alikvoti s visokom pogreškom dijeljenja.

3.1.1 Hrana za životinje koja se može samljeti bez dodatne obrade

— Prosijani konačni uzorak se promiješa i prikupi u prikladno čistu i suhu posudu s hermetičkim zatvaračem. Neposredno prije vaganja količine za analizu (testni alikvot), uzorak se ponovno promiješa kako bi se osigurala potpuna homogenizacija.

3.1.2 Hrana za životinje koja se može samljeti nakon sušenja

— Ako se u analitičkim metodama ne navodi drukčije, konačni uzorak se, u skladu s postupkom za prethodno sušenje iz točke 4.3. metode za određivanje udjela vlage iz dijela A Priloga III., suši, tako da se udio vode snizi na 8 % – 12 %. Zatim se nastavlja u skladu s točkom 3.1.1.

3.1.3 Tekuća ili polutekuća hrana za životinje

— Konačni uzorak se prikupi u prikladno čistu i suhu posudu s hermetičkim zatvaračem. Neposredno prije vaganja količine za analizu (testni alikvot), uzorak se temeljito promiješa kako bi se osigurala potpuna homogenizacija.

3.1.4 Ostala hrana za životinje

— Konačni uzorci koji se ne mogu pripremiti u skladu s jednim od gore navedenih postupaka obrađuju se bilo kojim drugim postupkom kojim se osigurava da je količina uzorka odvagana za analizu (testni alikvot) homogena i reprezentativna za konačne uzorke.

3.2 Posebni postupak pri provjeri vizualnom inspekcijom ili mikroskopijom ili kada je čitav skupni uzorak homogeniziran

— U slučaju provjere vizualnom inspekcijom (bez korištenja mikroskopa), za provjeru se koristi čitav laboratorijski uzorak.

— U slučaju mikroskopske provjere, u laboratoriju se može smanjiti skupni uzorak ili dodatno smanjiti reducirani uzorak. Konačni uzorci za potrebe prizivnog postupka i u referentne svrhe uzimaju se nakon postupka koji je jednak postupku koji se slijedi za konačni uzorak u provedbene svrhe.

— Ako je čitav skupni uzorak homogeniziran, konačni uzorci uzimaju se iz homogeniziranog skupnog uzorka.

4. Pohranjivanje uzoraka

Uzorci se moraju pohraniti na temperaturi koja neće promijeniti njihov sastav. Uzorci namijenjeni za analizu vitamina ili tvari posebno osjetljivih na svjetlost moraju se pohraniti u uvjetima u kojima uzorak nije pod štetnim utjecajem svijetla.

B. ODREDBE O REAGENSIMA I OPREMI KOJI SE KORISTE U ANALITIČKIM METODAMA

1. Ako se u analitičkim metodama ne navodi drukčije, svi reagensi moraju biti analitičke čistoće (pro analisi (p.a.)). Kod analize tragova, čistoća reagensa mora se provjeriti slijepom probom. Ovisno o dobivenim rezultatima, može biti potrebno dodatno pročišćivanje reagensa.

2. Kod svih postupaka iz analitičkih metoda koji uključuju pripremanje otopina, razrjeđivanje, ispiranje ili pranje, a kod kojih se ne navodi vrsta korištenog otapala ili razrjeđivača, koristi se voda. U pravilu, voda mora biti demineralizirana ili destilirana. U posebnim slučajevima, navedenima u analitičkim metodama, vodu treba pročistiti posebnim postupcima.

3. S obzirom na opremu koja se uobičajeno nalazi u kontrolnim laboratorijima, u analitičkim se metodama navode samo posebni instrumenti i oprema ili oni koji zahtijevaju poseban način uporabe. Oni moraju biti čisti, posebno kod određivanja vrlo malih količina tvari.

C. PRIMJENA ANALITIČKIH METODA I PRIKAZ REZULTATA

1. Postupak ekstrakcije

U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak ekstrakcije. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci ekstrakcije, pod uvjetom da je učinkovitost korištenog postupka ekstrakcije za analiziranu matricu dokazano jednakovrijedna postupku navedenom u metodi.

2. Postupak pročišćivanja

U nekoliko metoda utvrđen je poseban postupak pročišćivanja. U pravilu se, osim postupka navedenog u metodi, mogu koristiti i drugi postupci pročišćivanja, pod uvjetom da se korištenim postupkom pročišćivanja za analiziranu matricu dokazano postižu analitički rezultati jednakovrijedni postupku navedenom u metodi.

3. Broj postupaka određivanja

Kod analize nepoželjnih tvari, ako je rezultat prvog određivanja znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. U ostalim slučajevima potrebna je dvostruka analiza (sekundarno određivanje) kako bi se isključila mogućnost unutarnje križne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Za potvrdu sukladnosti koristi se srednja vrijednost dvaju određivanja, uzimajući u obzir nesigurnost mjerenja.

Pri kontroli označenog udjela tvari ili sastojka, ako se rezultatom prvog određivanja potvrdi označeni udio, tj. ako je rezultat analize unutar prihvatljivih granica odstupanja od označenog udjela, nisu potrebni dodatni postupci određivanja pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete. U ostalim slučajevima potrebna je dvostruka analiza (sekundarno određivanje) kako bi se isključila mogućnost unutarnje križne kontaminacije ili slučajne zamjene uzoraka. Za potvrdu sukladnosti koristi se srednja se vrijednost dvaju određivanja, uzimajući u obzir nesigurnost mjerenja.

U nekim slučajevima ta prihvatljiva granica odstupanja definirana je u zakonodavstvu kao što je Uredba (EZ) br. 767/2009 Europskog parlamenta i Vijeća od 13. srpnja 2009. o stavljanju na tržište i korištenju hrane za životinje, izmjeni Uredbe (EZ) br. 1831/2003 Europskog parlamenta i Vijeća i stavljanju izvan snage Direktive Vijeća 79/373/EEZ, Direktive Komisije 80/511/EEZ, Direktive Vijeća 82/471/EEZ, 83/228/EEZ, 93/74/EEZ, 93/113/EZ i 96/25/EZ te Odluke Komisije 2004/217EZ ( 7 ).

4. Izvješćivanje o korištenoj analitičkoj metodi

Korištena analitička metoda navodi se u izvješću o analizi.

5. Izvješćivanje o rezultatima analize

Rezultat analize prikazuje se na način utvrđen analitičkom metodom, s primjerenim brojem značajnih znamenki, a prema potrebi se korigira s obzirom na udio vode u konačnom uzorku prije priprave.

6. Nesigurnost mjerenja i stupanj iskorištenja pri analizi nepoželjnih tvari

U vezi s nepoželjnim tvarima u smislu Direktive 2002/32/EZ, smatra se da proizvod namijenjen za hranu za životinje nije u skladu s najvećom dopuštenom količinom ako je rezultat analize, u odnosu na hranu za životinje s udjelom vode od 12 %, veći od najveće dopuštene količine, uzimajući u obzir proširenu nesigurnost mjerenja i korekciju za iskorištenje. Za ocjenu usklađenosti koristi se analizirana koncentracija nakon korekcije za iskorištenje i nakon oduzimanja proširene nesigurnosti mjerenja. Taj se postupak primjenjuje samo u slučajevima kada analitička metoda omogućuje procjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje (na primjer, nije moguć u slučaju mikroskopske analize).

Rezultati analize iskazuju se na sljedeći način (ako korištena analitička metoda omogućuje ocjenu nesigurnosti mjerenja i korekciju za iskorištenje):

(a) s korekcijom za iskorištenje, pri čemu se navodi razina iskorištenja. Korekcija za iskorištenje nije potrebna ako je postotak iskorištenja između 90 % i 110 %.

(b) kao „x +/– U”, pri čemu je x rezultat analize, a U proširena nesigurnost mjerenja uz uporabu obuhvatnog faktora 2, čime se postiže razina pouzdanosti od približno 95 %.

Međutim, ako je rezultat analize znatno (> 50 %) niži od specifikacije koja se kontrolira i pod uvjetom da su korišteni primjereni postupci za osiguranje kvalitete, a svrha analize je samo provjera usklađenosti sa zakonskim odredbama, rezultat analize može se iskazati bez korekcije za iskorištenje i u tim se slučajevima korekcija za iskorištenje i nesigurnost mjerenja mogu izostaviti.

▼B









PRILOG III.

ANALITIČKE METODE ZA KONTROLU SASTAVA SIROVINA ZA HRANU ZA ŽIVOTINJE I KRMNIH SMJESA

A. ODREĐIVANJE VLAGE

1. Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje udjela vlage u hrani za životinje. Kada hrana za životinje sadrži hlapljive tvari, poput organskih kiselina, treba uzeti u obzir da se pri određivanju vlage obuhvaća i znatna količina hlapljivih tvari.

Ova metoda ne obuhvaća analizu mliječnih proizvoda kao sirovina za hranu za životinje, analizu mineralnih tvari i smjesa sastavljenih uglavnom od mineralnih tvari, analizu životinjskih i biljnih masti i ulja ili analizu sjemenki uljarica i uljanog voća.

2. Načelo

Uzorak se osuši pod određenim uvjetima koji se mijenjaju ovisno o vrsti hrane za životinje. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem. Kod krute hrane za životinje s visokim udjelom vode potrebno je prethodno sušenje.

3. Oprema

3.1. Drobilica od materijala koji ne apsorbira vlagu i lako se čisti, omogućuje brzo i ravnomjerno drobljenje bez pretjeranog zagrijavanja, u najvećoj mogućoj mjeri sprečava kontakt s vanjskim zrakom te ispunjava zahtjeve iz točaka 4.1.1 i 4.1.2 (npr. udarne ili vodom hlađene mikrodrobilice, konusni mlinovi sa sklopivim konusima, spore drobilice ili drobilice sa zupčanicima).

3.2. Analitička vaga s preciznošću do 1 mg

3.3. Suhe posude od nehrđajuće kovine ili stakla s poklopcima koji omogućuju hermetičko zatvaranje; radna površina koja omogućuje rasprostiranje testnog uzorka na približno 0,3 g/cm2.

3.4. Izotermičko sušilo (± 2 °C) s električnim grijanjem i primjerenim provjetravanjem koje omogućuje brzu regulaciju temperature ( 8 ).

3.5. Podesivo električno vakuumsko sušilo opremljeno uljnom crpkom i mehanizmom za dovod vrućeg suhog zraka ili sredstva za isušivanje (npr. kalcijevog oksida).

3.6. Eksikator s debelom metalnom ili porculanskom perforiranom pločom koja sadrži učinkovito sredstvo za isušivanje.

4. Postupak

Napomena : Postupci opisani u ovom odjeljku moraju se provesti odmah po otvaranju pakovina s uzorcima. Analiza se mora provesti najmanje dvaput zaredom.

4.1. Priprema

4.1.1. Hrana za životinje osim one iz točaka 4.1.2 i 4.1.3

Uzme se najmanje 50 g uzorka. Prema potrebi se usitni ili razdijeli tako da se spriječi promjena udjela vlage (vidjeti točku 6).

4.1.2. Žitarice i gruba krupica

Uzme se najmanje 50 g uzorka. Uzorak se samelje tako da najmanje 50 % čestica prolazi kroz sito s očicama veličine 0,5 mm, a na situ s okruglim očicama veličine 1 mm ostane najviše 10 % čestica.

4.1.3. Tekuća ili kašasta hrana za životinje i hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti

Odvagne se približno 25 g uzorka s preciznošću od 10 mg, doda se primjerena količina bezvodnog pijeska izvagana s preciznošću od 10 mg te se miješa dok se ne dobije homogena masa.

4.2. Sušenje

4.2.1. Hrana za životinje, osim one iz točaka 4.2.2. i 4.2.3.

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 1 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 103 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje četiri sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 103 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg.

Hrana za životinje koja se sastoji uglavnom od ulja i masti suši se u sušilu dodatnih 30 minuta na 130 °C. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage.

4.2.2. Žitarice, brašno, gruba krupica i sitna krupica

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g usitnjenog uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u sušilo prethodno zagrijano na 130 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature. Sušenje traje 2 sata od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 130 °C. Posuda se pokrije poklopcem, izvadi iz sušila, ostavi hladiti u eksikatoru (točka 3.6.) 30 do 45 minuta i izvaže s preciznošću od 1 mg.

4.2.3. Krmne smjese koje sadrže više od 4 % saharoze ili laktoze: sirovine za hranu za životinje poput rogača, hidroliziranih žitnih proizvoda, sjemena slada, sušene mljevene repe, ribe i otopine šećera; krmne smjese koje sadrže više od 25 % mineralnih soli, uključujući kristalnu vodu.

Izvaže se posuda (točka 3.3.) s poklopcem s preciznošću od 0,5 mg. U izvaganu se posudu odvagne približno 5 g uzorka s preciznošću od 1 mg i ravnomjerno raširi. Posuda se bez poklopca stavi u vakuumsko sušilo (točka 3.5.) prethodno zagrijano na 80 – 85 °C. Posuda se stavi u sušilo što je moguće brže kako bi se spriječio prevelik pad temperature.

Tlak se poveća na 100 torra i na tom se tlaku ostavi sušiti četiri sata na vrućem suhom zraku ili upotrebom sredstva za isušivanje (približno 300 g za 20 uzoraka). U potonjem se slučaju vakuumska crpka isključi kad se dosegne traženi tlak. Vrijeme sušenja računa se od trenutka kada temperatura u sušilu ponovno dosegne 80 – 85 °C. Oprezno se izjednači tlak u sušilu s atmosferskim tlakom. Sušilo se otvori, posuda se odmah pokrije poklopcem i izvadi iz sušila, ostavi se hladiti 30 do 45 minuta u eksikatoru (točka 3.6.) i izvaže s preciznošću od 1 mg. Suši se dodatnih 30 minuta u vakuumskom sušilu na 80 – 85 °C i ponovo važe. Razlika između dvaju vaganja ne smije biti veća od 0,1 % vlage.

4.3. Prethodno sušenje

4.3.1. Hrana za životinje, osim one iz točke 4.3.2.

Kruta hrana za životinje s visokim udjelom vode koja se teško drobi mora se prethodno sušiti na sljedeći način:

U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog uzorka s preciznošću od 10 mg (sabijena ili zgusnuta hrana za životinje može se prema potrebi grubo razdijeliti). Ostavi se sušiti u sušilu na 60 – 70 °C, sve dok se udio vode ne smanji na 8 – 12 %. Posuda se izvadi iz sušila i jedan sat hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Hrana za životinje se odmah usitni, u skladu s točkom 4.1.1., i suši, u skladu s točkom 4.2.1. ili 4.2.3., ovisno o vrsti hrane za životinje.

4.3.2. Žitarice

Zrna sa udjelom vode većim od 17 % moraju se prethodno sušiti na sljedeći način:

U prikladnu se posudu (npr. aluminijski tanjur veličine 20 × 12 cm s rubom 0,5 cm) odvagne 50 g neusitnjenog zrnja s preciznošću od 10 mg. Ostavi se sušiti 5 do 7 minuta u sušilu na 130 °C. Posuda se izvadi iz sušila i 2 sata hladi bez poklopca u laboratoriju, zatim se izvaže s preciznošću od 10 mg. Odmah se usitni, u skladu s točkom 4.1.2., i osuši, u skladu s točkom 4.2.2.

5. Izračun rezultata

Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

5.1. Sušenje bez prethodnog sušenja

pri čemu je:

m = početna masa uzorka u gramima,

m0 = masa suhog uzorka u gramima.

5.2. Sušenje s prethodnim sušenjem

pri čemu je:

m = početna masa uzorka u gramima,

m1 = masa uzorka nakon prethodnog sušenja u gramima,

m2 = masa uzorka nakon usitnjavanja ili mljevenja u gramima,

m0 = masa suhog uzorka u gramima.

5.3. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prelaziti 0,2 % apsolutne vrijednosti vode.

6. Napomena

U slučaju kada je potrebno mljevenje za koje se pokaže da mijenja udio vode u proizvodu, potrebno je korigirati rezultate analize sastojaka hrane za životinje s obzirom na udio vode u uzorku u početnom stanju.

B. ODREĐIVANJE VODE U MASTIMA I ULJIMA ŽIVOTINJSKOG I BILJNOG PODRIJETLA

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela vode i hlapljivih tvari u mastima i uljima životinjskog i biljnog podrijetla.

2. Načelo

Uzorak se osuši do konstantne mase (gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne smije prijeći 1 mg) na 103 °C. Gubitak mase utvrđuje se vaganjem.

3. Oprema

3.1. Posuda s ravnim dnom izrađena od nehrđajućeg materijala, promjera 8 do 9 cm i visine približno 3 cm.

3.2. Termometar s ojačanom kuglicom i ekspanzijskom komorom na gornjem dijelu, baždaren od približno 80 °C do najmanje 110 °C i duljine približno 10 cm.

3.3. Pješčana kupelj ili električna grijaća ploča

3.4. Eksikator s učinkovitim sredstvom za isušivanje

3.5. Analitička vaga

4. Postupak

Odvagne se približno 20 g homogeniziranog uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese u suhu izvaganu posudu (točka 3.1.) u kojoj se nalazi termometar (točka 3.2.). Zagrijava se na pješčanoj kupelji ili grijaćoj ploči (točka 3.3.) uz stalno miješanje termometrom, tako da temperatura dosegne 90 °C u približno 7 minuta.

Smanji se unos topline, pri čemu se nadzire učestalost podizanja mjehurića s dna posude. Temperatura ne smije prijeći 105 °C. Nastavi se miješati uz struganje dna posude sve dok ne prestane stvaranje mjehurića.

Kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje vode, nekoliko puta se zagrije na 103 ± 2 °C uz hlađenje na 93 °C između uzastopnih zagrijavanja. Zatim se uzorak ostavi hladiti na sobnu temperaturu u eksikatoru (točka 3.4.) i izvaže. Postupak se ponavlja sve dok gubitak mase između dvaju uzastopnih vaganja ne bude manji od 2 mg.

Napomena : Povećanje mase uzorka nakon uzastopnog zagrijavanja upućuje na oksidaciju masti i u tom se slučaju rezultat izračunava na temelju vaganja izvedenog neposredno prije početka povećavanja mase.

5. Izračun rezultata

Udio vode (X), iskazan kao postotni dio uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m = masa uzorka u gramima,

m1 = masa posude sa sadržajem prije zagrijavanja, u gramima,

m2 = masa posude sa sadržajem nakon zagrijavanja, u gramima.

Rezultati manji od 0,05 % navode se kao „manji od 0,05 %”.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 0,05 % apsolutne vrijednosti.

C. ODREĐIVANJE UDJELA SIROVIH BJELANČEVINA

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela sirovih bjelančevina u hrani za životinje na temelju udjela dušika određenog Kjeldahlovom metodom.

2. Postupak

Uzorak se mineralizira sumpornom kiselinom u prisutnosti katalizatora. Kisela se otopina prevede u bazičnu dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Amonijak se destilira i prikupi u odmjerenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira standardnom otopinom natrijevog hidroksida.

Druga je mogućnost destilacija oslobođenog amonijaka u višku otopine borne kiseline, nakon čega slijedi titriranje otopinom klorovodične ili sumporne kiseline.

3. Reagensi

3.1. Kalijev sulfat.

3.2. Katalizator: bakrov(II) oksid CuO ili bakrov(II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O.

3.3. Cink u zrncima.

3.4. Sumporna kiselina, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5 Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Sumporna kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Indikator metil crvenilo; otopi se 300 mg metil crvenila u 100 ml etanola, σ = 95 – 96 % (v/v).

3.9. Otopina natrijevog hidroksida (moguća uporaba tehničke čistoće) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Natrijev hidroksid, standardna volumetrijska otopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Natrijev hidroksid, standardna volumetrijska otopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Plovućac u zrnu, ispran u klorovodičnoj kiselini i kalciniran.

3.13. Acetanilid (talište = 114 °C, udio N = 10,36 %).

3.14. Saharoza (bez dušika).

3.15. Borna kiselina (H3BO3).

3.16. Otopina indikatora metilnog crvenila: otopi se 100 mg metilnog crvenila u 100 ml etanola ili metanola.

3.17. Otopina bromkrezol zelenila: otopi se 100 mg bromkrezol zelenila u 100 ml etanola ili metanola.

3.18. Otopina borne kiseline (10 – 40 g/l, ovisno o opremi koja se koristi).

Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, otopinama borne kiseline moraju se dodati indikatori metil crvenilo i bromkrezol zelenilo. Kod pripreme 1 litre otopine borne kiseline, prije prilagodbe volumena, doda se 7 ml otopine indikatora metil crvenila (točka 3.16.) i 10 ml otopine bromkrezol zelenila (točka 3.17.).

Ovisno o vodi koja se koristi, pH vrijednost otopine borne kiseline može se razlikovati od serije do serije. Za dobivanje pozitivne slijepe probe često treba izvesti prilagodbu malim volumenom alkalija.

Napomena : Obično je dovoljno dodati 3 do 4 ml NaOH (točka 3.11.) u 1 litru borne kiseline 10 g/l. Otopina se pohrani na sobnoj temperaturi i zaštiti od svjetla i para amonijaka.

3.19. Klorovodična kiselina, standardna volumetrijska otopina, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Napomena : Mogu se koristiti i druge koncentracije volumetrijskih otopina (točka 3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. i 3.19.), ako se to uzima u obzir u izračunima. Koncentracije se uvijek navode na četiri decimalna mjesta.

4. Oprema

Uređaj prikladna za izvođenje postupaka mineralizacije, destilacije i titracije prema Kjeldahlovoj metodi.

5. Postupak

5.1. Razgradnja

Odvagne se 1 g uzorka s preciznošću od 0,001 g i prenese u tikvicu naprave za mineralizaciju. Doda se 15 g kalijevog sulfata (točka 3.1.), prikladna količina katalizatora (točka 3.2.) (0,3 – 0,4 g bakrovog(II) oksida ili 0,9 – 1,2 g bakrovog(II) sulfat pentahidrata), 25 ml sumporne kiseline (točka 3.4.), prema potrebi nekoliko zrnaca plovućca (točka 3.12.) i promiješa.

Tikvica se prvo umjereno zagrijava i prema potrebi povremeno trese, sve dok masa potpuno ne pougljeni i nestane pjena; zatim se jače zagrijava do ravnomjernog vrenja tekućine. Zagrijavanje je primjereno ako se vrela kiselina kondenzira na stijenkama tikvice. Treba spriječiti pregrijavanje stijenki i prianjanje organskih čestica na njih.

Kada se otopina razbistri i postane svijetlozelena, ostavi se da ključa još 2 sata, a zatim se ostavi da se ohladi.

5.2. Destilacija

Oprezno se doda dovoljna količina vode kako bi se sulfati potpuno otopili. Ostavi se da se ohladi i prema potrebi doda nekoliko zrnaca cinka (točka 3.3.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.2.1. ili 5.2.2.

5.2.1. Destilacija u sumpornoj kiselini

U tikvicu za prikupljanje naprave za destilaciju doda se točno odmjerena količina od 25 ml sumporne kiseline (točka 3.5.) ili (točka 3.7.) ovisno o pretpostavljenom udjelu dušika. Doda se nekoliko kapi indikatora metil crvenila (točka 3.8.).

Tikvica za mineralizaciju priključi se na kondenzator naprave za destilaciju i vršak kondenzatora uroni u tekućinu u tikvici za prikupljanje, najmanje do dubine od 1 cm (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.3.). U tikvicu za mineralizaciju polagano se ulije 100 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.) bez gubitka amonijaka (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 8.1.). Tikvica se zagrijava do potpune destilacije amonijaka.

5.2.2. Destilacija u bornoj kiselini

Kod ručne titracije amonijaka iz destilata koristi se dolje navedeni postupak. Kod destilacijskih jedinica koje su u potpunosti automatizirane i obuhvaćaju titraciju amonijaka iz destilata, postupa se prema uputama proizvođača za rukovanje destilacijskom jedinicom.

Tikvica za prikupljanje s 25 – 30 ml otopine borne kiseline (točka 3.18.) postavi se ispod izlaznog otvora kondenzatora tako da ispusna cijev bude ispod površine viška otopine borne kiseline. Destilacijska se jedinica namjesti tako da isporučuje 50 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.9.). Destilacijskom se jedinicom rukuje u skladu s uputama proizvođača, a oslobođeni se amonijak destilira dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Destilat se prikupi u otopini borne kiseline. Količina destilata (vrijeme parne destilacije) ovisi o količini dušika u uzorku. Treba se pridržavati uputa proizvođača.

Napomena : U poluautomatskoj destilacijskoj jedinici dodavanje viška natrijevog hidroksida i parna destilacija automatizirani su postupci.

5.3. Titracija

Postupa se u skladu s točkom 5.3.1. ili 5.3.2.

5.3.1. Sumporna kiselina

VIšak sumporne kiseline titrira se u tikvici za prikupljanje do točke ekvivalencije otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.), ovisno o koncentraciji korištene sumporne kiseline.

5.3.2. Borna kiselina

Udio tikvice za prikupljanje titrira se standardnom volumetrijskom otopinom klorovodične kiseline (točka 3.19.) ili standardnom volumetrijskom otopinom sumporne kiseline (točka 3.6.), pri čemu se koristi bireta i očita se količina korištenog titranta.

Kod metode kolorimetrijskog određivanja točke ekvivalencije, točka ekvivalencije se dostiže kod prve pojave ružičastog obojenja udjela. Očita se obujam birete s preciznošću od 0,05 ml. Za pomoć kod vizualizacije točke ekvivalencije mogu se koristiti magnetna mješalica s osvjetljenjem ili fotometrijski detektor.

Ovaj se postupak može izvesti automatski upotrebom parnog destilatora s automatskom titracijom.

Kod rukovanja određenim tipom destilatora ili destilatora/titratora treba se pridržavati uputa proizvođača.

Napomena : Kod automatskog sustava titriranja, titracija započinje odmah po početku destilacije, a koristi se otopina borne kiseline 1 % (točka 3.18.). Kod potpuno automatizirane destilacijske jedinice, postupak automatske titracije amonijaka može se izvoditi i određivanjem točke ekvivalencije metodom potenciometrijske titracije pH. U tom se slučaju koristi automatski titrator s pH-metrom. Pravilno baždarenje pH metra izvodi se u području vrijednosti pH 4 do pH 7 uobičajenim laboratorijskim postupcima za baždarenje pH-metra. Točka ekvivalencije pH titracije dosiže se pri pH 4,6, kada je nagib titracijske krivulje najviši (točka infleksije).

5.4. Slijepa proba

Kao potvrda da reagensi ne sadrže dušik koristi se slijepa proba (mineralizacija, destilacija i titracija), u kojoj se umjesto uzorka koristi 1 g saharoze (točka 3.14).

6. Izračun rezultata

Izračuni se izvode u skladu s točkom 6.1. ili 6.2.

6.1. Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.1.

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

V0 = volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten u slijepoj probi,

V1 = volumen (ml) NaOH (točka 3.10. ili 3.11.) korišten kod titracije uzorka,

c = koncentracija (mol/l) natrijevog hidroksida (točka 3.10. ili 3.11.),

m = masa (g) uzorka.

6.2. Izračun za titraciju u skladu s točkom 5.3.2.

6.2.1. Titracija klorovodičnom kiselinom

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m = masa (g) uzorka,

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine klorovodične kiseline (točka 3.19.),

V0 = volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u slijepoj probi,

V1 = volumen (ml) klorovodične kiseline korišten u uzorkovanom dijelu.

6.2.2. Titracija sa sumpornom kiselinom

Udio sirovih bjelančevina, iskazan kao maseni postotak, izračunava se sljedećom formulom:

pri čemu je:

m = masa (g) uzorka,

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrijske otopine sumporne kiseline (točka 3.6.),

V0 = volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u slijepoj probi,

V1 = volumen (ml) sumporne kiseline (točka 3.6.) korišten u uzorkovanom dijelu.

7. Provjera metode

7.1. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

— 0,2 % apsolutne vrijednosti za udio sirovih bjelančevina manji od 20 %,

— 1,0 % veće vrijednosti za udio sirovih bjelančevina u rasponu od 20 – 40 %,

— 0,4 % apsolutne vrijednosti za udio sirovih bjelančevina veći od 40 %.

7.2. Točnost

Za analizu (mineralizacija, destilacija, titracija) koristi se 1,5 do 2,0 g acetanilida (točka 3.13.) u prisutnosti 1 g saharoze (točka 3.14.); za 1 g acetanilida koristi se 14,80 ml sumporne kiseline (točka 3.5.). Iskorištenje mora iznositi najmanje 99 %.

8. Napomene

8.1. Oprema može biti ručna, poluautomatska ili automatska. Ako je u radu naprave potreban prijelaz između mineralizacije i destilacije, taj se prijelaz mora izvesti bez gubitka. Ako tikvica naprave za destilaciju nije opremljena lijevkom za dokapavanje, natrijev se hidroksid dodaje neposredno prije priključivanja tikvice na kondenzator, pri čemu se tekućina ulijeva polako niz stijenke tikvice.

8.2. Ako se udio tikvice stvrdnjava, postupak određivanja započinje se iznova, ali s količinom sumporne kiseline (točka 3.4.) većom od gore navedene.

8.3. Kod proizvoda s niskim udjelom dušika volumen sumporne kiseline (točka 3.7.) koji se dodaje u tikvicu za prikupljanje, prema potrebi se može smanjiti na 10 ili 15 ml, a tikvica se dopuni vodom do 25 ml.

8.4. Kod rutinske analize za određivanje sirovih bjelančevina mogu se koristiti zamjenske metode analize, iako je Kjeldahlova metoda, opisana u ovom dijelu C, referentna metoda. Za svaku matricu pojedinačno treba dokazati da su rezultati dobiveni zamjenskom metodom (npr. DUMAS) jednakovrijedni rezultatima dobivenim referentnom metodom. U izvješću o analizi treba navesti analitičku metodu korištenu za određivanje sirovih bjelančevina budući da rezultati dobiveni zamjenskom metodom, čak i nakon potvrde jednakovrijednosti, mogu odstupati od rezultata dobivenih referentnom metodom.

D. ODREĐIVANJE UREE

1. Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje razine uree u hrani za životinje.

2. Načelo

Uzorak se suspendira u vodi u prisutnosti tvari za bistrenje. Suspenzija se filtrira. Udio uree u filtratu određuje se nakon dodavanja 4-dimetilaminobenzaldehida (4-DMAB) mjerenjem optičke gustoće na valnoj duljini od 420 nm.

3. Reagensi

3.1. Otopina 4-dimetilaminobenzaldehida: otopi se 1,6 g 4-DMAB u 100 ml etanola 96 % i doda 10 ml klorovodične kiseline (ρ20 1,19 g/ml). Taj se reagens može čuvati najviše dva tjedna.

3.2. Otopina Carrez I: u vodi se otopi 21,9 g cinkovog acetata Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g ledene octene kiseline. Dopuni se vodom do 100 ml.

3.3. Otopina Carrez II: u vodi se otopi 10,6 g kalijevog ferocijanida K4 Fe (CN)6 3H2O. Dopuni se vodom do 100 ml.

3.4. Aktivni ugljen koji ne apsorbira ureu (treba provjeriti).

3.5. Urea, otopina 0,1 % (m/v).

4. Oprema

4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min.

4.2. Epruvete: 160 × 16 mm s ubrušenim čepovima.

4.3. Spektrofotometar

5. Postupak

5.1. Analiza uzorka

Odvagne se 2 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese s 1 g aktivnog uglja (točka 3.4.) u graduiranu tikvicu obujma 500 ml. Doda se 400 ml vode i 5 ml otopine Carrez I (točka 3.2.), miješa približno 30 sekundi i doda 5 ml otopine Carrez II (točka 3.3.). Miješa se 30 minuta u mješalici. Dopuni se vodom do oznake, protrese i filtrira.

Uzme se 5 ml prozirnog bezbojnog filtrata i prenese u epruvete s ubrušenim čepovima, doda se 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.) i promiješa. Epruvete se postave u vodenu kupelj na 20 °C (+/- 4 °C). Nakon 15 minuta spektrofotometrom se izmjeri optička gustoća otopine uzorka na 420 nm. Rezultat se usporedi s otopinom reagensa iz slijepe probe.

5.2. Kalibracijska krivulja

Uzme se 1, 2, 4, 5 i 10 ml otopine uree (točka 3.5.) i prenese u odmjerne tikvice obujma 100 ml koje se dopune vodom do oznake. Iz svake se otopine odstrani 5 ml, te se u svaku doda 5 ml otopine 4-DMAB (točka 3.1.), homogenizira i izmjeri optička gustoća, kako je gore navedeno, u usporedbi s kontrolnom otopinom koja sadrži 5 ml 4-DMAB i 5 ml vode bez uree. Pripremi se kalibracijska krivulja.

6. Izračun rezultata

Količina uree u uzorku određuje se iz kalibracijske krivulje.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

7. Napomene

7.1. Ako udio uree prelazi 3 %, uzorak se smanji na 1 g ili se početna otopina razrijedi tako da u 500 ml nema više od 50 mg uree.

7.2. Ako je udio uree nizak, uzorak se povećava sve dok je filtrat proziran i bezbojan.

7.3. Ako uzorak sadrži jednostavne dušične spojeve, poput aminokiselina, optička se gustoća mjeri na 435 nm.

E. ODREĐIVANJE HLAPLJIVIH DUŠIKOVIH BAZA

I. MIKRODIFUZIJA

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza u hrani za životinje iskazanog kao amonijak.

2. Načelo

Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina se izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze istiskuju se mikrodifuzijom uporabom otopine kalijevog karbonata, prikupe u otopinu borne kiseline i titriraju sumpornom kiselinom.

3. Reagensi

3.1. Trikloroctena kiselina, otopina 20 % (m/v).

3.2. Indikator: otopi se 33 mg bromkrezol zelenila i 65 mg metilnog crvenila u 100 ml etanola 95 – 96 % (v/v).

3.3. Otopina borne kiseline: u odmjernoj tikvici volumena od 1 litre otopi se 10 g borne kiseline u 200 ml etanola 95 – 96 % (v/v) i 700 ml vode. Doda se 10 ml indikatora (točka 3.2.). Promiješa se, a prema potrebi boja otopine promijeni u svijetlo crvenu dodavanjem otopine natrijevog hidroksida. Količina od 1 ml te otopine vezat će najviše 300 μg NH3.

3.4. Zasićena otopina kalijevog karbonata: u 100 ml vrele vode otopi se 100 g kalijevog karbonata. Ostavi se da se ohladi, a zatim se filtrira.

3.5. Sumporna kiselina, 0,01 mol/l.

4. Oprema

4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min.

4.2. Stakleni ili plastični Conwayevi članci (vidjeti dijagram).

4.3. Mikrobirete graduirane s podjelom 1/100 ml.

5. Postupak

Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar.

Pipetom se doda 1 ml otopine borne kiseline (točka 3.3.) u srednji dio Conwayevog članka i 1 ml filtrata uzorka u gornji dio članka. Djelomično se pokrije namašćenim poklopcem. U gornji dio članka brzo se nakapa 1 ml zasićene otopine kalijevog karbonata (točka 3.4.) i poklopac hermetički zatvori. Članak se oprezno okreće u vodoravnoj ravnini tako da se reagensi pomiješaju. Ostavi se najmanje četiri sata na sobnoj temperaturi ili jedan sat na temperaturi 40 °C.

Mikrobiretom (točka 4.3.) se hlapljive baze u otopini borne kiseline titriraju sumpornom kiselinom (točka 3.5.).

Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu.

6. Izračun rezultata

1 ml H2SO4 0,01 mol/l odgovara 0,34 mg amonijaka.

Rezultat analize iskazuje se kao postotni udio uzorka.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći:

— 10 % relativne vrijednosti za udio amonijaka manji od 1,0 %,

— 0,1 % apsolutne vrijednosti za udio amonijaka 1,0 % ili veći.

7. Napomena

Ako je udio amonijaka u uzorku veći od 0,6 % početni se filtrat razrijedi.

CONWAYEV ČLANAK

Omjer 1/1

II. DESTILACIJA

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje udjela hlapljivih dušikovih baza, iskazanih kao amonijak, u ribljem brašnu koje praktično ne sadrži ureu. Koristi se samo za udio amonijaka niži od 0,25 %.

2. Načelo

Uzorak se ekstrahira vodom, a otopina izbistri i filtrira. Hlapljive dušične baze se istisnu na temperaturi vrelišta dodavanjem magnezijevog oksida i prikupe u određenoj količini sumporne kiseline, višak koje se titrira otopinom natrijevog hidroksida.

3. Reagensi

3.1. Trikloroctena kiselina, otopina 20 % (m/v).

3.2. Magnezijev oksid.

3.3. Emulzija protiv pjenjenja (npr. silikon).

3.4. Sumporna kiselina, 0,05 mol/l.

3.5. Otopina natrijevog hidroksida, 0,1 mol/l.

3.6. Otopina metilnog crvenila 0,3 % u etanolu 95 % – 96 % (v/v).

4. Oprema

4.1. Mješalica (rotacijska): približno 35 do 40 okr./min.

4.2. Uređaj za destilaciju po Kjeldahlu.

5. Postupak

Odvagne se 10 g uzorka s preciznošću od 1 mg i prenese sa 100 ml vode u graduiranu tikvicu obujma 200 ml. Trese se ili miješa 30 minuta u rotacijskoj mješalici. Doda se 50 ml otopine trikloroctene kiseline (točka 3.1.), dopuni vodom do oznake, snažno protrese i filtrira kroz nabrani filtar papir.

Pipetom se prenese količina bistrog filtrata koja odgovara očekivanom sadržaju hlapljivih dušikovih baza (obično je dovoljno 100 ml). Razrijedi se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevog oksida (točka 3.2.) i nekoliko kapljica emulzije protiv pjenjenja (točka 3.3.). Otopina mora biti alkalna pri pokusu s lakmusovim papirom; ako to nije slučaj, doda se magnezijev oksid (točka 3.2.). Postupa se u skladu s točkama 5.2. i 5.3. metode analize za određivanje udjela sirovih bjelančevina (dio C ovog Priloga).

Slijepa se proba izvodi istim postupkom, ali bez uzorka za analizu.

6. Izračun rezultata

1 ml H2SO4 0,05 mol/l odgovara 1,7 mg amonijaka.

Rezultat se iskazuje kao postotni udio uzorka.

Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupaka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % relativne vrijednosti amonijaka.

F. ODREĐIVANJE AMINOKISELINA (OSIM TRIPTOFANA)

1. Svrha i područje primjene

Ova se metoda koristi za određivanje slobodnih (sintetičkih i prirodnih) i ukupnih (vezanih na peptide i slobodnih) aminokiselina u hrani za životinje pomoću analizatora aminokiselina. Koristi se za sljedeće aminokiseline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartatna kiselina, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin i valin.

Ovom se metodom ne mogu razlikovati soli aminokiselina niti je moguće utvrditi razliku između oblika D i L aminokiselina. Ova metoda nije primjerena za određivanje triptofana ili hidroksi-analoga aminokiselina.

2. Načelo

2.1. Slobodne aminokiseline

Slobodne aminokiseline ekstrahiraju se razrijeđenom klorovodičnom kiselinom. Koekstrahirane dušične makromolekule istalože se sulfosalicilnom kiselinom i uklone filtriranjem. Vrijednost pH filtrirane otopine podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdvoje ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm.

2.2. Ukupne aminokiseline

Odabir postupka ovisi o ispitivanim aminokiselinama. Cist(e)in i metionin se prije hidrolize moraju oksidirati u cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon. Tirozin se mora odrediti u hidrolizatima neoksidiranih uzoraka. Sve druge aminokiseline navedene u točki 1 mogu se odrediti u oksidiranom ili neoksidiranom uzorku.

Oksidacija se izvodi na 0 °C mješavinom peroksimravlje kiseline i fenola. Višak oksidacijskog reagensa razgradi se natrijevim disulfitom. Oksidirani ili neoksidirani uzorak se 23 sata hidrolizira klorovodičnom kiselinom (točka 3.20.). Vrijednost pH hidrolizata podesi se na 2,20. Aminokiseline se razdijele ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom i odrede reakcijom s ninhidrinom fotometrijskom detekcijom na 570 nm (440 nm za prolin).

3. Reagensi

Obvezno se koristi dvostruko destilirana voda ili voda jednake kakvoće (provodljivost < 10 μS)

3.1. Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %.

3.2. Mravlja kiselina, m (m/m) = 98 % – 100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Natrijev disulfit.

3.5. Natrijev hidroksid.

3.6. 5-sulfosalicilna kiselina dihidrat.

3.7. Klorovodična kiselina, gustoće približno 1,18 g/ml.

3.8. Trinatrij citrat dihidrat.

3.9. 2,2’-tiodietanol (tiodiglikol).

3.10. Natrijev klorid.

3.11. Ninhidrin.

3.12. Lagani petrolej, vrelište 40 – 60 °C.

3.13. Norleucin ili drugi spoj primjeren za uporabu kao interni standard

3.14. Plinoviti dušik (< 10 ppm kisika).

3.15. 1-oktanol.

3.16. Aminokiseline.

3.16.1. Standardne tvari iz točke 1. Čisti spojevi koji ne sadrže kristalnu vodu. Prije uporabe suše se 1 tjedan pod vakuumom s P2O5 ili H2SO4.

3.16.2. Cisteinska kiselina.

3.16.3. Metionin-sulfon.

3.17. Otopina natrijevog hidroksida, c = 7,5 mol/l:

U vodi se otopi 300 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.18. Otopina natrijevog hidroksida, c = 1 mol/l:

U vodi se otopi 40 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.19. Mravlja kiselina – otopina fenola:

Pomiješa se 889 g mravlje kiseline (točka 3.2.) sa 111 g vode i doda 4,73 g fenola (točka 3.3.).

3.20. Smjesa za hidrolizu, c = 6 mol HCl/l koja sadrži 1 g fenola/l:

Doda se 1 g fenola (točka 3.3.) u 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.21. Smjesa za ekstrakciju, c = 0,1 mol HCl/l koja sadrži 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (točka 3.7.) se razrijedi s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (točka 3.9.) i dopuni vodom do 1 litre (ne smiju se izravno miješati tvari iz točaka 3.7. i 3.9.).

3.22. 5-sulfosalicilna kiselina, ß = 6 %:

U vodi se otopi 60 g 5-sulfosalicilne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.23. Oksidacijska smjesa (peroksimravlja kiselina – fenol):

Pomiješa se 0,5 ml vodikovog peroksida (točka 3.1.) s 4,5 ml otopine mravlje kiseline i fenola (točka 3.19.) u maloj čaši. Inkubira se 1 sat na 20 – 30 °C kako bi se dobila peroksimravlja kiselina, zatim se hladi u ledenoj kupelji (15 min) prije dodavanja u uzorak.

Upozorenje: Izbjegavati dodir s kožom i nositi zaštitnu odjeću.

3.24. Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20:

U približno 800 ml vode otopi se 19,61 g natrijevog citrata (točka 3.8.), 5 ml tiodiglikola (točka 3.9.), 1 g fenola (točka 3.3.) i 16,50 ml HCl (točka 3.7.). Vrijednost pH se podesi na 2,20. Dopuni se vodom do 1 litre.

3.25. Puferi za eluiranje, pripravljeni u skladu s uputama za analizator koji se koristi (točka 4.9.).

3.26. Reagens ninhidrin, pripravljen u skladu s uputama za analizator koji se koristi (točka 4.9.).

3.27. Standardne otopine aminokiselina. Ove se otopine drže na temperaturi nižoj od 5 °C.

3.27.1. Osnovna standardna otopina aminokiselina (točka 3.16.1.).

c = 2,5 μmol/ml za svaku u klorovodičnoj kiselini.

Može se nabaviti u slobodnoj prodaji.

3.27.2. Osnovna standardna otopina cisteinske kiseline i metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml.

U odmjernoj tikvici obujma 1 l otopi se 0,2115 g cisteinske kiseline (točka 3.16.2.) i 0,2265 g metionin-sulfona (točka 3.16.3.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do oznake. Može se pohraniti najviše 12 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C. Ova se otopina ne koristi ako osnovna standardna otopina (točka 3.27.1.) sadrži cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon.

3.27.3. Osnovna standardna otopina internog standarda, npr. norleucina, c = 20 μmol/ml.

U odmjernoj se tikvici otopi 0,6560 g norleucina (točka 3.13.) u citratnom puferu (točka 3.24.) i dopuni citratnim puferom do 250 ml. Može se pohraniti najviše 6 mjeseci na temperaturi nižoj od 5 °C.

3.27.4. Kalibracijska otopina standardnih aminokiselina koja se koristi s hidrolizatima, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsku kiselinu i metionin-sulfon i c = 10 nmol/50 μl za druge aminokiseline. U čaši obujma 100 ml otopi se 2,2 g natrijevog klorida (točka 3.10.) s 30 ml citratnog pufera (točka 3.24.). Doda se 4,00 ml osnovne standardne otopine aminokiseline (točka 3.27.1.), 4,00 ml osnovne standardne otopine cisteinske kiseline i metionin-sulfona (točka 3.27.2.) i 0,50 ml osnovne standardne otopine internog standarda (točka 3.27.3.) ako se isti koristi. Vrijednost pH se natrijevim hidroksidom podesi na 2,20 (točka 3.18.).

Udio se kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 50 ml, dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake i promiješa.

Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C.

Vidjeti također napomenu pod točkom 9.1.

3.27.5. Pripremi se kalibracijska otopina standardnih aminokiselina koja se koristi s hidrolizatima u skladu s točkom 5.3.3.1., a za ekstrakte u skladu s točkom 5.2. Kalibracijska otopina se pripremi u skladu s točkom 3.27.4., ali bez natrijevog klorida.

Pohrani se najviše 3 mjeseca na temperaturi nižoj od 5 °C.

4. Oprema

4.1. Tikvica s okruglim dnom volumena 100 ili 250 ml s povratnim hladilom.

4.2. Staklena posuda od borosilikatnog stakla obujma 100 ml s navojnim čepom obloženim gumom/teflonom (npr. Duran, Schott) za uporabu u sušilu.

4.3. Sušilo s prisilnom ventilacijom i regulatorom temperature točnosti veće od ± 2 °C.

4.4. pH metar (na tri decimalna mjesta).

4.5. Membranski filtar (0,22 μm).

4.6. Centrifuga.

4.7. Rotacijski vakuumski otparivač.

4.8. Mehanička tresilica ili magnetska mješalica.

4.9. Analizator aminokiselina ili oprema za HPLC opremljena kolonom za izmjenu iona, napravom za ninhidrin i derivatizaciju nakon kolone te fotometrijskim detektorom.

Kolona se napuni smolama sulfoniranog polistirena koje mogu razdvajati aminokiseline jedne od drugih i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. Tok u puferskoj i ninhidrinskoj liniji osigurava se crpkama s tokom stabilnosti ± 0,5 % u vremenu koje obuhvaća izvođenje standardnog kalibriranja i analizu uzorka.

Kod nekih analizatora aminokiselina mogu se koristiti postupci hidrolize kod kojih je koncentracija natrija u hidrolizatu c = 0,8 mol/l, a hidrolizat sadrži svu ostatnu mravlju kiselinu iz oksidacije. Drugim metodama ne postiže se zadovoljavajuće razdvajanje nekih aminokiselina ako se u hidrolizatu nalazi višak mravlje kiseline i/ili visoka koncentracija natrijevih iona. U tom se slučaju obujam kiseline nakon hidrolize i prije podešavanja pH smanjuje isparavanjem na približno 5 ml. Isparavanje se vrši pod vakuumom na najviše 40 °C.

5. Postupak

5.1. Priprema uzorka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije mljevenja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili smrzavanjem. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.12.) prije mljevenja.

5.2. Određivanje slobodnih aminokiselina u hrani za životinje i premiksima

Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u konusnu tikvicu, te se doda 100,0 ml smjese za ekstrakciju (točka 3.21.). Smjesa se 60 minuta trese mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.8.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu obujma 100 ml.

Tijekom miješanja doda se 5,0 ml otopine sulfosalicilne kiseline (točka 3.22.) i nastavi 5 minuta miješati magnetskom mješalicom. Supernatant se filtrira ili centrifugira kako bi se uklonio cjelokupni talog. U čašu obujma 100 ml izlije se 10,0 ml dobivene otopine i vrijednost pH podesi na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.), prenese citratnim puferom (točka 3.24.) u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake.

Ako se koristi interni standard, za svakih 100 ml konačne otopine doda se 1,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i dopuni otopinom pufera (točka 3.24.) do oznake.

Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Ako se ekstrakti ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C.

5.3. Određivanje ukupnih aminokiselina

5.3.1. Oksidacija

Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u:

— tikvicu s okruglim dnom volumena 100 ml (točka 4.1.) za otvorenu hidrolizu (točka 5.3.2.3.) ili,

— tikvicu s okruglim dnom volumena 250 ml (točka 4.1.) ako se zahtijeva niska koncentracija natrija (točka 5.3.3.1.) ili,

— staklenu bocu s navojnim čepom volumena 100 ml (točka 4.2.) za zatvorenu hidrolizu (točka 5.3.2.4.).

U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg, a udio vode ne smije biti veći od 100 mg.

Tikvica/boca se postavi u ledenu kupelj i ohladi na 0 °C, doda se 5 ml oksidacijske smjese (točka 3.23.) i miješa staklenom lopaticom sa zakrivljenim vrhom. Tikvica/boca s lopaticom se hermetički zatvori filmom, a ledena kupelj s hermetički zatvorenom posudom stavi u hladnjak na 0 °C i ostavi 16 sati. Nakon 16 sati posuda se izvadi iz hladnjaka, a višak oksidacijskog reagensa se razgradi dodavanjem 0,84 g natrijevog disulfita (točka 3.4.).

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.1.

5.3.2. Hidroliza

5.3.2.1. Hidroliza oksidiranih uzoraka

U oksidirani uzorak, pripravljen u skladu s točkom 5.3.1., doda se 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.), pri čemu treba brižljivo isprati sve ostatke uzorka sa stijenke posude i lopatice.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4., ovisno o korištenom postupku hidrolize.

5.3.2.2. Hidroliza neoksidiranih uzoraka

U tikvicu s okruglim dnom obujma 100 ml ili 250 ml (točka 4.1.) ili u bocu s navojnim čepom obujma 100 ml (točka 4.2.) odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg. U odvaganom dijelu uzorka udio dušika mora iznositi približno 10 mg. Oprezno se doda 25 ml smjese za hidrolizu (točka 3.20.) i pomiješa s uzorkom. Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4.

5.3.2.3. Otvorena hidroliza

U smjesu koja se nalazi u tikvici (pripremljenu u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2.) dodaju se 3 staklene kuglice, zatim se ostavi ključati 23 sata uz stalno vrenje pod refluksom. Po završetku hidrolize kondenzator ispere se s 5 ml citratnog pufera (točka 3.24.). Tikvica se odvoji i ohladi u ledenoj kupelji.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3.

5.3.2.4. Zatvorena hidroliza

Boca sa smjesom pripravljenom u skladu s točkom 5.3.2.1. ili 5.3.2.2. postavi se u sušilo (točka 4.3.) na temperaturi od 110 °C. Kako bi se tijekom prvog sata spriječilo povećanje tlaka i eksplozija (zbog nastanka plinovitih tvari), poklopac s navojem treba postavi na vrh posude. Posuda se ne smije zatvoriti poklopcem. Nakon jednog sata posuda se zatvori poklopcem i ostavi 23 sata u sušilu (točka 4.3.). Po završetku hidrolize boca se izvadi iz sušila, oprezno se otvori poklopac boce i boca položi u ledenu kupelj. Ostavi se da se ohladi.

Ovisno o postupku podešavanja pH (točka 5.3.3.) udio posude se citratnim puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u čašu obujma 250 ml ili tikvicu s okruglim dnom obujma 250 ml.

Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.3.

5.3.3. Podešavanje pH

Ovisno o odstupanju analizatora aminokiselina (točka 4.9.) za natrij, podešavanje pH se provodi u skladu s točkom 5.3.3.1. ili 5.3.3.2.

5.3.3.1. Kromatografski sustavi (točka 4.9.) koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija

Pri upotrebi analizatora aminokiselina koji zahtijevaju nisku koncentraciju natrija (kada treba smanjiti volumen kiseline) preporučuje se uporaba otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.).

U tom se slučaju hidrolizatu prije otparivanja dodaje 2,00 ml otopine internog osnovnog standarda (točka 3.27.3.).

U hidrolizat dobiven postupkom u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. dodaje se 2 kapljice 1-oktanola (točka 3.15.).

Obujam se smanji na 5 – 10 ml rotacijskim otparivačem (točka 4.7.) pod vakuumom na 40 °C. Ako se obujam slučajno smanji na manje od 5 ml, hidrolizat se mora odbaciti i iznova započeti analizu.

Otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.) vrijednost pH podesi se na 2,20 i zatim nastavi u skladu s točkom 5.3.4.

5.3.3.2. Za sve druge analizatore aminokiselina (točka 4.9.)

Hidrolizati dobiveni u skladu s točkom 5.3.2.3. ili 5.3.2.4. djelomično se neutraliziraju opreznim dodavanjem, uz miješanje, 17 ml otopine natrijevog hidroksida (točka 3.17.), pri čemu se temperatura mora održavati na manje od 40 °C.

Na sobnoj temperaturi podesi se vrijednost pH na 2,20 otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.17.) i zatim otopinom natrijevog hidroksida (točka 3.18.). Nastavlja se u skladu s točkom 5.3.4.

5.3.4. Otopina uzorka za kromatografiju

Hidrolizat (točka 5.3.3.1. ili 5.3.3.2.) s podešenom vrijednosti pH, citratnim se puferom (točka 3.24.) kvantitativno prenese u graduiranu tikvicu obujma 200 ml i dopuni puferom (točka 3.24.) do oznake.

Ako dotada nije korišten interni standard, doda se 2,00 ml internog standarda (točka 3.27.3.) i zatim dopuni citratnim puferom (točka 3.24.) do oznake. Temeljito se promiješa.

Nastavlja se s kromatografijom (točka 5.4.).

Ako se otopine uzorka ne pregledavaju isti dan, moraju se pohraniti na temperaturi nižoj od 5 °C.

5.4. Kromatografija

Prije kromatografije temperaturu ekstrakta (točka 5.2.) ili hidrolizata (točka 5.3.4.) treba izjednačiti sa sobnom temperaturom. Smjesa se protrese i prikladna količina filtrira kroz membranski filtar 0,22 μm (točka 4.5.). Dobivena bistra otopina se podvrgne kromatografiji s izmjenom iona uporabom analizatora aminokiselina (točka 4.9.).

Ubrizgavanje se može izvesti ručno ili automatski. Važno je na kolonu za analizu standarda i uzoraka dodati istu količinu otopine (± 0,5 %) osim kada se koristi interni standard, a omjeri natrija i aminokiselina u otopinama standarda i uzorka trebaju biti što je moguće sličniji.

Općenito učestalost kalibriranja ovisi o stabilnosti reagensa ninhidrina i sustava za analizu. Standard ili uzorak se razrijede citratnim puferom (točka 3.24.) tako da površina vršaka standarda dostiže 30 – 200 % površine vršaka aminokiselina u uzorku.

Kromatografija aminokiselina neznatno se razlikuje s obzirom na vrstu korištenog analizatora i smole. Odabrani sustav mora imati mogućnost razdvajanja aminokiselina međusobno i od drugih materijala koji reagiraju na ninhidrin. U radnom području kromatografski sustav mora imati linearan odziv na promjene količina aminokiselina dodanih u kolonu.

U fazi kromatografije primjenjuju se dolje navedeni omjeri između najnižih i najviših vrijednosti kod analize ekvimolarnih otopina (aminokiselina koje se određuju). Ekvimolarna otopina mora sadržavati najmanje 30 % maksimalnog udjela svake aminokiseline koji se može točno izmjeriti sustavom za analizu aminokiselina (točka 4.9.).

Kod postupka razdvajanja treonina od serina, omjer između najniže i najviše vrijednosti za aminokiselinu s nižom vrijednosti između dviju aminokiselina koje se preklapaju na kromatogramu ne smije prijeći 2:10. (Ako se određuju samo cist(e)in, metionin, treonin i lizin, nedovoljno razdvajanje između susjednih vršaka štetno će djelovati na postupak određivanja). Za sve druge aminokiseline razdvajanje mora biti veće od 1:10.

Sustav mora jamčiti razdvajanje lizina od „lizinskih artefakata” i ornitina.

6. Izračun rezultata

Za svaku pojedinačnu aminokiselinu izmjeri se površina vršaka uzorka i standarda, a količina (X), iskazana u g aminokiseline na kg uzorka, izračunava se na sljedeći način:

Ako se koristi interni standard pomnoži se s:

A = površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta

B = površina vršaka standardne kalibracijske otopine

C = površina vršaka hidrolizata ili ekstrakta kao internog standarda

D = površina vršaka standardne kalibracijske otopine kao internog standarda

M = molarna masa aminokiseline koja se određuje

c = koncentracija standarda u μmol/ml

m = masa uzorka u gramima (ispravljena na početnu masu ako je uzorak isušen ili odmašćen)

V = ml ukupnog hidrolizata (točka 5.3.4.) ili izračunani ukupni volumen otopine ekstrakta (točka 6.1.) u ml

Cistin i cistein se određuju kao cisteinska kiselina u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunavaju kao cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) uporabom molarne mase 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin se određuje kao metionin-sulfon u hidrolizatima oksidiranog uzorka, ali se izračunava kao metionin uporabom molarne mase metionina: 149,21 g/mol.

Dodani slobodni metionin određuje se nakon ekstrakcije kao metionin, a za izračun se koristi ista molekulska masa.

6.1. Ukupni volumen otopine ekstrakata (F) za određivanje slobodnih aminokiselina (točka 5.2.) izračunava se sljedećom formulom:

V = volumen konačnog ekstrakta

7. Vrednovanje metode

Metoda je provjerena u međulaboratorijskom ispitivanju na međunarodnoj razini provedenom 1990. na četiri različite vrste hrane za životinje (miješana hrana za svinje, smjesa za brojlere, proteinski koncentrat, premiks). Rezultati srednjih vrijednosti i standardnih devijacija, bez ekstremnih vrijednosti, prikazani su u tablicama u ovoj točki:







Srednje vrijednosti u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Smjesa za brojlere 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinski koncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.

7.1. Ponovljivost

Ponovljivost gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazana kao „unutarlaboratorijska standardna devijacija”, prikazana je u donjim tablicama:







Unutarlaboratorijska standardna devijacija (Sr), iskazana u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Smjesa za brojlere 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinski koncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.







Koeficijent varijacije (%) za unutarlaboratorijsku standardnu devijaciju (Sr) Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Smjesa za brojlere 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinski koncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.

7.2. Ponovljivost

Rezultati gore navedene međulaboratorijske usporedbe, iskazani kao standardna devijacija između laboratorija, prikazani su u donjoj tablici:







Standardna devijacija između laboratorija (SR) u g/kg Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Smjesa za brojlere 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinski koncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.







Koeficijent varijacije (%) za standardnu devijaciju između laboratorija (SR) Referentni materijal Aminokiselina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Miješana hrana za svinje 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Smjesa za brojlere 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinski koncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Broj uključenih laboratorija.

8. Upotreba referentnih materijala

Pravilna primjena metode provjerava se ponovljenim mjerenjima na certificiranim referentnim materijalima, kada su dostupni. Preporučuje se izvršiti kalibraciju upotrebom certificirane otopine za kalibraciju aminokiselina.

9. Napomene

9.1. Zbog razlika između analizatora aminokiselina, kao smjernice se uzimaju konačne koncentracije otopina standardnih aminokiselina za kalibraciju (vidjeti točke 3.27.4. i 3.27.5.) i hidrolizata (vidjeti točku 5.3.4.).

Za sve aminokiseline treba provjeriti područje linearnog odziva uređaja.

Standardna se otopina razrijedi citratnim puferom tako da se površine vršaka nalaze u sredini područja.

9.2. Kada se za analizu hidrolizata koristi oprema za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti, uvjeti pokusa se moraju optimizirati u skladu s preporukama proizvođača.

9.3. Kod primjene metode za hranu za životinje koja sadrži više od 1 % klorida (koncentrat, mineralna hrana za životinje, dodaci hrani za životinje) može doći do preniske procjene udjela metionina, što zahtijeva posebnu obradu.

G. ODREĐIVANJE TRIPTOFANA

1. Svrha i područje primjene

Ovom se metodom omogućuje određivanje ukupnog i slobodnog triptofana u hrani za životinje. Njom se ne omogućuje razlikovanje između oblika D i L.

2. Načelo

Za određivanje ukupnog triptofana uzorak se hidrolizira u bazičnim uvjetima zasićenom otopinom barijevog hidroksida i 20 sati grije na 110 °C. Nakon hidrolize dodaje se interni standard.

Za određivanje slobodnog triptofana uzorak se ekstrahira u lagano kiselim uvjetima u prisutnosti internog standarda.

Triptofan i interni standard u hidrolizatu ili ekstraktu određuju se postupkom HPLC s fluorescentnom detekcijom.

3. Reagensi

3.1. Obvezno se koristi redestilirana voda ili voda jednake kakvoće (provodljivost < 10 μS/cm).

3.2. Standardna tvar: triptofan (čistoća/udio ≥ 99 %), osušen pod vakuumom iznad fosfornog pentoksida.

3.3. Interna standardna tvar: α-metil-triptofan (čistoća/udio ≥ 99 %), osušen pod vakuumom iznad fosfornog pentoksida.

3.4. Barijev hidroksid oktahidrat (treba paziti da se Ba(OH)2.8 H2O pretjerano ne izlaže zraku kako bi se izbjeglo nastajanje BaCO3 koji može remetiti postupak određivanja) (vidjeti napomenu pod točkom pod točkom 9.3.).

3.5. Natrijev hidroksid.

3.6. Ortofosforna kiselina, m (m/m) = 85 %.

3.7. Klorovodična kiselina, ρ20 1,19 g/ml.

3.8. Metanol, za HPLC.

3.9. Lagani petrolej, raspon vrelišta 40 – 60 °C.

3.10. Otopina natrijevog hidroksida, c = 1 mol/l:

U vodi se otopi 40,0 g NaOH (točka 3.5.) i dopuni vodom do 1 litre (točka 3.1.).

3.11. Klorovodična kiselina, c = 6 mol/l:

Uzme se 492 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.12. Klorovodična kiselina, c = 1 mol/l:

Uzme se 82 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.13. Klorovodična kiselina, c = 0,1 mol/l:

Uzme se 8,2 ml HCl (točka 3.7.) i dopuni vodom do 1 litre.

3.14. Ortofosforna kiselina, c = 0,5 mol/l:

Uzme se 34 ml ortofosforne kiseline (točka 3.6.) i dopuni vodom (točka 3.1.) do 1 litre.

3.15. Koncentrirana otopina triptofana (točka 3.2.), c = 2,50 μmol/ml:

U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2553 g triptofana (točka 3.2.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C.

3.16. Koncentrirana otopina internog standarda, c = 2,50 μmol/ml:

U odmjernoj tikvici obujma 500 ml otopi se 0,2728 g α-metil-triptofana (točka 3.3.) u klorovodičnoj kiselini (točka 3.13.) i dopuni klorovodičnom kiselinom (točka 3.13.) do oznake. Pohrani se najviše 4 tjedna na –18 °C.

3.17. Standardna otopina triptofana i internog standarda za kalibraciju:

Pripremi se 2,00 ml koncentrirane otopine triptofana (točka 3.15.) i 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofan) (točka 3.16.). Razrijedi se vodom (točka 3.1.) i metanolom (točka 3.8.) na približno jednak obujam i približno jednaku koncentraciju metanola (10 – 30 %) kao kod konačnog hidrolizata.

Ta se otopina mora pripremiti svježa prije uporabe.

Tijekom pripreme treba je zaštiti od izravnog sunčevog svjetla.

3.18. Octena kiselina.

3.19. 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanol.

3.20. Etanolamin, m (m/m) > 98 %.

3.21. Otopina 1 g 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u 100 ml metanola (točka 3.8.).

3.22. Mobilna faza za HPLC: 3,00 g octene kiseline (točka 3.18.) + 900 ml vode (točka 3.1.) + 50,0 ml otopine (točka 3.21.) 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u metanolu (točka 3.8.) (1 g/100 ml). Etanolaminom (točka 3.20.) se vrijednost pH podesi na 5,00. Dopuni se vodom (točka 3.1.) do 1 000 ml.

4. Oprema

4.1. Oprema za HPLC sa spektrofluorometrijskim detektorom.

4.2. Kolona za tekućinsku kromatografiju, 125 mm × 4 mm C18, veličina čestica punjenja 3 μm ili jednakovrijedna.

4.3. pH metar.

4.4. Polipropilenska tikvica, obujma 125 ml, sa širokim vratom i navojnim čepom.

4.5. Membranski filtar, 0,45 μm.

4.6. Autoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7. Mehanička tresilica ili magnetska mješalica.

4.8. Vrtložna mješalica.

5. Postupak

5.1. Priprema uzoraka

Uzorak se samelje tako da prolazi kroz sito veličine 0,5 mm. Uzorci s visokim udjelom vode moraju se prije usitnjavanja osušiti na zraku na temperaturi koja ne prelazi 50 °C ili liofilizacijom. Uzorci s visokim sadržajem masti ekstrahiraju se laganim petrolejem (točka 3.9.) prije usitnjavanja.

5.2. Određivanje slobodnog triptofana (ekstrakt)

Odvagne se primjerena količina (1 – 5 g) pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 1 mg i prenese u konusnu tikvicu. Doda se 100,0 ml klorovodične kiseline (točka 3.13.) i 5,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.). Trese se ili miješa 60 minuta mehaničkom tresilicom ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). Pričeka se da talog padne na dno i pipetom prenese 10,0 ml supernatanta u čašu. Doda se 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Natrijevim hidroksidom (točka 3.10.) se pH vrijednost otopine podesi na 3. Doda se dovoljno metanola (točka 3.8.) kako bi u konačnom volumenu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog volumena i razrijedi vodom na volumen potreban za kromatografiju (približno jednak volumen kao kod standardne kalibracijske otopine (točka 3.17.)).

Prije ubrizgavanja na kolonu za HPLC filtrira se nekoliko ml otopine kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Standardna otopina i ekstrakti se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana.

5.3. Određivanje ukupnog triptofana (hidrolizat)

Odvagne se 0,1 – 1 g pripravljenog uzorka (točka 5.1.) s preciznošću od 0,2 mg i prenese u polipropilensku tikvicu (točka 4.4.). Udio dušika u odvaganom dijelu uzorka mora iznositi približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevog hidroksid oktahidrata (točka 3.4.) i 10 ml vode. Miješa se vrtložnom mješalicom (točka 4.8.) ili magnetskom mješalicom (točka 4.7.). U smjesi se ostavi magnet obložen teflonom. Stijenke posude se isperu s 4 ml vode. Tikvica se poklopi navojnim čepom i lagano zatvori. Prenese se u autoklav (točka 4.6.) s vrelom vodom i ostavi u pari 30 – 60 minuta. Autoklav se zatvori i 20 sati autoklavira na 110 (± 2) °C.

Prije otvaranja autoklava, temperatura se snizi na malo ispod 100 °C. Kako bi se spriječila kristalizacija Ba(OH)2.8 H2O, u toplu se smjesu doda 30 ml vode temperature okoliša. Lagano se protrese ili promiješa. Doda se 2,00 ml koncentrirane otopine internog standarda (α-metil-triptofana) (točka 3.16.). Posude se 15 minuta hlade u vodenoj/ledenoj kupelji.

Zatim se doda 5 ml ortofosforne kiseline (točka 3.14.). Posuda se drži u rashladnoj kupki i uz miješanje neutralizira s HCl (točka 3.11.), a pH vrijednost se podesi na 3,0 s HCl (točka 3.12.). Doda se dovoljno metanola kako bi u konačnom obujmu koncentracija metanola iznosila 10 – 30 %. Prenese se u graduiranu tikvicu primjerenog obujma i razrijedi vodom do obujma potrebnog za kromatografiju (na primjer, 100 ml). Dodavanje metanola ne smije izazvati taloženje.

Prije ubrizgavanja na HPLC kolonu nekoliko ml otopine se filtrira kroz membranski filtar 0,45 μm (točka 4.5.). Nastavlja se s kromatografijom u skladu s točkom 5.4.

Standardna otopina i hidrolizati se zaštite od izravnog sunčevog svjetla. Ako se ekstrakti ne mogu analizirati istog dana, mogu se pohraniti na temperaturi od 5 °C na razdoblje od najviše 3 dana.

5.4. Određivanje HPLC-om

Za izokratsko se eluiranje kao smjernice predlažu sljedeći uvjeti; mogu se koristiti i drugi uvjeti ako se njima jamče jednakovrijedni rezultati (vidjeti također napomene pod točkama 9.1. i 9.2.).







Kolona za tekućinsku kromatografiju (točka 4.2): 125 mm × 4 mm, C18, veličina čestica punjenja 3 μm ili jednakovrijedna Temperatura kolone: sobna temperatura Mobilna faza (točka 3.22.): 3,00 g octene kiseline (točka 3.18.) + 900 ml vode (točka 3.1.) + 50,0 mlotopine točka (točka 3.21.) 1,1,1-triklor-2-metil-2-propanola (točka 3.19.) u metanolu (točka 3.8.) (1 g/100 ml). Etanolaminom (točka 3.20.) se pH vrijednost otopine podesi na 5,00. Dopuni se vodom (točka 3.1.) do 1 000 ml. Brzina protoka: 1 ml/min Ukupno trajanje eluiranja: oko 34 min Valna duljina detekcije: ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm. Volumen za ubrizgavanje: 20 μl

6. Izračun rezultata

Količina triptofana (X), iskazana u g na 100 g uzorka, izračunava se sljedećom formulom:

A = površina vrška internog standarda, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.)

B = površina vrška triptofana, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.)

V1 = obujam, u ml (2 ml), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

c = koncentracija, u μmol/ml (= 2,50), koncentrirana otopina triptofana (točka 3.15.) dodana kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

V2 = obujam, u ml, koncentrirana otopina internog standarda (točka 3.16.) dodana pri ekstrakciji (točka 5.2.) (= 5,00 ml) ili hidrolizat (točka 5.3.) (= 2,00 ml)

C = površina vrška internog standarda, ekstrakt (točka 5.2.) ili hidrolizat (točka 5.3.)

D = površina vrška triptofana, standardna kalibracijska otopina (točka 3.17.)

V3 = obujam, u ml (= 2,00 ml), koncentrirane otopine internog standarda (točka 3.16.), dodana standardnoj kalibracijskoj otopini (točka 3.17.)

m = masa uzorka u g (korigirana na izvornu masu ako je uzorak isušen i/ili odmašćen)

M = molarna masa triptofana (= 204,23 g/mol).

7. Ponovljivost

Razlika između rezultata dvaju usporednih postupka određivanja, izvedenih na istom uzorku, ne smije prijeći 10 % u odnosu na najviši rezultat.

8. Rezultati međulaboratorijske studije

Provedena je međulaboratorijska studija na razini EZ-a (četvrta međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 12 laboratorija analiziralo 3 uzorka za potvrđivanje metode za hidrolizu. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:







Uzorak 1 Hrana za svinje Uzorak 2 Hrana za svinje s dodanim L-triptofanom Uzorak 3 Koncentrat hrane za svinje L 12 12 12 n 50 55 50 Srednja vrijednost [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2

L = broj laboratorija koji su dostavili rezultate

n = broj korištenih pojedinačnih rezultata bez ekstremnih vrijednosti (identificiranih Cochran-Dixonovim testom za ekstremne vrijednosti)

sr = standardna devijacija ponovljivosti

SR = standardna devijacija obnovljivosti

r = ponovljivost

R = obnovljivost

CVr = koeficijent varijacije ponovljivosti u %

CVR = koeficijent varijacije obnovljivosti u %.

Provedena je još jedna međulaboratorijska studija na razini EZ-a (treća međulaboratorijska usporedba), u kojoj se u 13 laboratorija analiziralo 2 uzorka za potvrđivanje metode za ekstrakciju slobodnog triptofana. Svaki se uzorak analizirao pet puta. Rezultati su prikazani u donjoj tablici:







Uzorak 4 Smjesa pšenice i soje Uzorak 5 Smjesa pšenice i soje (= uzorak 4) s dodanim