1991R2568 — HR — 04.08.2016 — 029.001

Ovaj je tekst namijenjen isključivo dokumentiranju i nema pravni učinak. Institucije Unije nisu odgovorne za njegov sadržaj. Vjerodostojne inačice relevantnih akata, uključujući njihove preambule, one su koje su objavljene u Službenom listu Europske unije i dostupne u EUR-Lexu. Tim službenim tekstovima može se izravno pristupiti putem poveznica sadržanih u ovom dokumentu.

Promijenio:







(*) Ovaj akt nije nikada objavljen na hrvatskome.









▼B

UREDBA KOMISIJE (EEZ) br. 2568/91

od 11. srpnja 1991.

o karakteristikama maslinovog ulja i ulja komine maslina te o odgovarajućim metodama analize







▼M20

Članak 1.

1. Ulja čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točkama 1. i 2. Priloga I. ovoj Uredbi smatraju se djevičanskim maslinovim uljima u smislu točaka 1(a) i (b) Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

2. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 3. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se lampante maslinovim uljem u smislu točke 1(c) Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

3. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 5. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se rafiniranim maslinovim uljem u smislu točke 2. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

4. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 5. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se maslinovim uljem sastavljenim od rafiniranih maslinovih ulja i djevičanskih maslinovih ulja u smislu točke 3. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

5. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 6. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se sirovim uljem iz komine maslina u smislu točke 4. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

6. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 7. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se rafiniranim uljem iz komine maslina u smislu točke 5. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

7. Ulje čija su svojstva u skladu s onima iznesenima u točki 8. Priloga I. ovoj Uredbi smatra se uljem komine maslina u smislu točke 6. Priloga Uredbi br. 136/66/EEZ.

▼M26

Članak 2.

1. Svojstva ulja utvrđena u Prilogu I. određuju se u skladu sa sljedećim metodama analize:

(a) za određivanje slobodnih masnih kiselina, iskazanih kao postotak oleinske kiseline, metoda utvrđena u Prilogu II.;

(b) za određivanje peroksidnog broja, metoda utvrđena u Prilogu III.;

(c) za određivanje sadržaja voskova, metoda utvrđena u Prilogu IV.;

(d) za određivanje sastava i sadržaja sterola i triterpenskih alkohola kapilarnom plinskom kromatografijom, metoda utvrđena u Prilogu V.;

(e) za određivanje postotka 2- gliceril monopalmitata, metoda utvrđena u Prilogu VII.;

(f) za spektrofotometrijsku analizu, metoda utvrđena u Prilogu IX.;

▼M28

(g) za određivanje sastava masnih kiselina, metoda utvrđena u Prilogu X.;

▼M26

(h) za određivanje hlapivih halogeniranih otapala, metoda utvrđena u Prilogu XI.;

(i) za ocjenjivanje organoleptičkih svojstava djevičanskog maslinova ulja, metoda utvrđena u Prilogu XII.;

(j) za određivanje stigmastadiena, metoda utvrđena u Prilogu XVII.;

(k) za određivanje sadržaja triglicerida s ECN42, metoda utvrđena u Prilogu XVIII.;

▼M28

(l) za određivanje sadržaja alifatskih i triterpenskih alkohola, metoda utvrđena u Prilogu XIX.;

▼M26

(m) za određivanje sadržaja voskova, metil estera masnih kiselina i etil estera masnih kiselina, metoda utvrđena u Prilogu XX.;

▼M28 —————

▼M26

2. Provjeru organoleptičkih svojstava djevičanksih ulja od strane nacionalnih vlasti ili njihovih predstavnika obavljaju komisije za ocjenjivanje koje su odobrile države članice.

Organoleptička svojstva ulja u skladu s prvim podstavkom smatraju se usklađenima s deklariranom kategorijom ako komisija koju je odobrila država članica potvrdi predmetnu ocjenu.

Ako komisija ne potvrdi deklariranu kategoriju u vezi s organoleptičkim svojstvima, na zahtjev zainteresirane strane nacionalna tijela ili njihovi predstavnici obavljaju bez odgađanja dva protuocjenjivanja koja provode ostale odobrene komisije, s time da je najmanje jedna od njih komisija koju je odobrio proizvođač predmetne države članice. Predmetna se svojstva smatraju usklađenima s deklariranim svojstvima ako se najmanje dvama protuocjenjivanjima potvrdi deklarirana kategorija. Ako to nije slučaj, zainteresirana strana odgovorna je za trošak protuocjenjivanja.

3. Kad nacionalna tijela ili njihovi predstavnici potvrde svojstva ulja kako je predviđeno u stavku 1., uzorci se uzimaju u skladu s međunarodnim standardima EN ISO 661 o pripremi uzoraka za ispitivanje i EN ISO 5555 o uzorkovanju. Međutim, neovisno o točki 6.8. norme EN ISO 5555, u slučaju serija takvih ulja u unutarnjem pakiranju, uzorak se uzima u skladu s Prilogom I.a ovoj Uredbi. U slučaju ulja u velikim pakiranjima za koje se uzorkovanje ne može obaviti u skladu s EN ISO 5555, uzorkovanje će se obaviti u skladu s uputama koje omogućava nadležno tijelo države članice.

Ne dovodeći u pitanje normu EN ISO 5555, i Poglavlje 6. norme EN ISO 661, uzeti se uzorci odmah stavljaju na tamno mjesto dalje od izvora velike topline i šalju u laboratorij na analizu najkasnije pet radnih dana nakon uzimanja, u protivnom se uzorci čuvaju na način da ne propadnu ili se ne oštete tijekom prijevoza ili skladištenja prije nego što se pošalju u laboratorij.

4. Za potrebe provjere predviđene u stavku 3., analize iz priloga II., III., IX., XII. i XX. i, prema potrebi, sve protuanalize potrebne u skladu s nacionalnim zakonodavstvom izvršavaju se prije najkraćeg roka trajanja u slučaju pakiranih proizvoda. U slučaju uzorkovanja ulja u velikim pakiranjima te se analize obavljaju najkasnije šest mjeseci nakon mjeseca u kojem je uzet uzorak.

Za druge analize predviđene ovom Uredbom ne vrijedi nikakvo vremensko ograničenje.

Ako je uzorak uzet manje od dva mjeseca prije najkraćeg roka trajanja i ako rezultati analize ne odgovaraju svojstvima deklarirane kategorije maslinova ulja ili ulja komine maslina, predmetnu se stranu obavješćuje najkasnije mjesec dana prije završetka razdoblja utvrđenog u prvom podstavku.

5. U svrhu određivanja svojstava maslinovih ulja metodama utvrđenima u stavku 1. prvom podstavku, rezultate se analize izravno uspoređuje s ograničenjima iz ove Uredbe.

▼M25

Članak 2.a

1. Za potrebe ovog članka, „maslinovo ulje stavljeno na tržište” znači ukupna količina maslinovog ulja i ulja komine maslina odnosne države članice koje se konzumira u toj državi članici ili se izvozi iz te države članice.

2. Države članice osiguravaju da se provjere sukladnosti provode selektivno i odgovarajućom učestalošću te na temelju analize rizika kako bi se osiguralo da maslinovo ulje stavljeno na tržište bude u skladu s deklariranom kategorijom.

3. Kriteriji za procjenu rizika mogu uključivati:

(a) kategoriju ulja, razdoblje proizvodnje, cijenu ulja u odnosu na druga biljna ulja, postupke miješanja i pakiranja, skladišne prostore i uvjete, zemlju podrijetla, zemlju odredišta, prijevozno sredstvo ili količinu serije;

(b) položaj gospodarskih subjekata u trgovinskom lancu, opseg i/ili vrijednost koju stavljaju na tržište, raspon kategorija ulja koja stavljaju na tržište, vrstu poslovanja koje obavljaju, kao što su mljevenje, skladištenje, rafiniranje, miješanje, pakiranje ili maloprodaja;

(c) nalaze prijašnjih provjera koji uključuju broj i vrstu utvrđenih nedostataka, uobičajenu kvalitetu ulja stavljenih na tržište, učinkovitost korištene tehničke opreme;

(d) pouzdanost sustava osiguranja kvalitete ili sustava samoprovjere gospodarskih subjekata vezanih uz usklađenost s tržišnim standardima;

(e) mjesto provođenja provjere, posebno ako se radi o prvom mjestu ulaska u Uniju, posljednjem mjestu izlaska iz Unije ili mjestu gdje se ulja proizvode, pakiraju, utovaruju ili prodaju krajnjem potrošaču;

(f) sve druge informacije koje bi mogle ukazivati na rizik nesukladnosti.

4. Države članice unaprijed utvrđuju:

(a) kriterije za procjenu rizika nesukladnosti serija;

(b) na temelju analize rizika za svaku kategoriju rizika, najmanji broj gospodarskih subjekata ili serija i/ili količine koje podliježu provjeri sukladnosti.

Godišnje se provodi najmanje jedna provjera sukladnosti na tisuću tona maslinovog ulja stavljenog na tržište u državi članici.

5. Države članice provjeravaju sukladnost:

(a) provođenjem, bilo kojim redoslijedom, analiza utvrđenih Prilogom I.; ili

(b) slijedeći redoslijed utvrđen u Prilogu I.b na shemi odlučivanja sve dok se ne postigne jedna od odluka sa sheme odlučivanja.

▼M19 —————

▼M25

Članak 3.

Ako se utvrdi da ulje ne odgovara opisu svoje kategorije, dotična država članica, ne dovodeći u pitanje druge sankcije, primjenjuje učinkovite, proporcionalne i odvraćajuće sankcije koje se određuju s obzirom na ozbiljnost otkrivene nepravilnosti.

Ako provjere otkriju značajne nepravilnosti, države članice povećavaju učestalost provjera u odnosu na fazu prodaje, kategoriju ulja, podrijetlo ili druge kriterije.

▼M5

Članak 4.

▼M19

1. Države članice mogu odobriti ocjenjivačke komisije tako da nacionalna tijela ili njihovi predstavnici mogu ocijeniti i potvrditi organoleptičke karakteristike.

Uvjete odobrenja određuju države članice i osiguravaju da:

— su zahtjevi Priloga XII.4 ispunjeni,

— predsjednik komisije ima izobrazbu priznatu u tu svrhu od strane države članice,

— daljnje odobrenje ovisi o uspješnosti u godišnjim provjerama koje provodi država članica.

Države članice Komisiji priopćuju popis odobrenih komisija i mjere poduzete na temelju ovog stavka.

▼M5

2. U slučaju kad se pojedine države članice susretnu s poteškoćama u uspostavi komisije organoleptičkih ocjenjivačana svojem državnom području, mogu se obratiti komisiji ocjenjivačakoja je odobrena u nekoj drugoj državi članici.

3. Svaka država članica sastavlja popis komisija organoleptičkihocjenjivača koje su strukovne organizacije ili međustrukovne organizacije uspostavile u skladu s uvjetima utvrđenim u stavku 1. i osiguravaju se da se ti uvjeti poštuju.

▼M19 —————

▼B

Članak 6.

1. Sadržaj ulja u uljnoj pogači i drugim ostacima maslina koje nastaju ekstrakcijom maslinovog ulja (oznake KN 2306 90 11 i 2306 90 19 ) utvrđuju se primjenom metoda navedenih u Prilogu XV.

2. Sadržaj ulja na koje se odnosi stavak 1. iskazuje se kao postotak težine ulja u odnosu na težinu suhe tvari.

▼M20

Članak 7.

Primjenjuju se odredbe Zajednice koje se tiču prisustva kontaminanata.

U pogledu halogeniranih otapala, ograničenja za sve kategorije maslinovog ulja su sljedeća:

— otkriveni maksimalni sadržaj svakog halogeniranog otapala: 0,1 mg/kg,

— otkriveni maksimalni ukupni sadržaj svakog halogeniranog otapala: 0,2 mg/kg.

▼M25

Članak 7a.

Fizičke ili pravne osobe i skupine osoba koje drže maslinovo ulje i ulje komine masline od faze ekstrakcije u uljari do uključivo faze punjenja u boce, u bilo koje profesionalne ili komercijalne svrhe, za svaku kategoriju tih ulja vode registar ulaza i izlaza.

Država članica osigurava propisno ispunjavanje obveze utvrđene u stavku 1.

▼M25

Članak 8.

1. Države članice obavješćuju Komisiju o mjerama kojima se provodi ova Uredba. One obavješćuju Komisiju o svim naknadnim izmjenama.

2. Najkasnije do 31. svibnja svake godine države članice Komisiji dostavljaju izvješće o provedbi ove Uredbe tijekom prethodne kalendarske godine. Izvješće sadrži najmanje rezultate provjera sukladnosti provedenih na maslinovim uljima u skladu s obrascima iz Priloga XXI.

3. Obavijesti navedene u ovoj Uredbi sastavljaju se u skladu s Uredbom Komisije (EZ) br. 792/2009. ( 1 ).

▼B

Članak 9.

Uredba (EEZ) br. 1058/77 stavlja se izvan snage.

Članak 10.

1. Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europskih zajednica.

Bez obzira na to, metoda navedena u Prilogu XII. Primjenjuje se od ►M1 1. studenoga 1992. ◄ , osim kad su u pitanju djelatnosti vezane uz sustav intervencija.

▼M5

Ta se metoda ne primjenjuje na djevičansko maslinovo ulje pripremljeno za tržište prije 1. studenoga 1992.

▼B

2. Ova Uredba ne primjenjuje se na maslinova ulja i ulja komine maslina zapakirana prije stupanja ove Uredbe na snagu i stavljena na tržište do 31. listopada 1992.

Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.









PRILOZI

Sadržaj

Prilog I.: Svojstva maslinova ulja Prilog I.a: Uzorkovanje ulja od ploda ili komine maslina koje se dostavlja u unutarnjem pakiranju Prilog I.b: Shema odlučivanja za provjeru usklađenosti uzorka maslinova ulja sa deklariranom kategorijom Prilog II.: Određivanje slobodnih masnih kiselina, hladna metoda Prilog III.: Određivanje peroksidnog broja Prilog IV.: Određivanje sadržaja voska kapilarnom plinskom kromatografijom Prilog V.: Određivanje sastava i sadržaja sterola i triterpenskih dialkohola kapilarnom plinskom kromatografijom Prilog VII.: ►M21 Određivanje postotka 2-gliceril monopalmitata ◄ ▼M20 ————— ▼B Prilog IX.: Spektrofotometrijsko ispitivanje u ultraljubičastom području ▼M28 Prilog X.: Određivanje metilnih estera masnih kiselina plinskom kromatografijom ▼B Prilog XI.: Određivanje hlapivih halogeniranih otapala u maslinovom ulju Prilog XII.: Postupak međunarodnog vijeća za masline za organoleptičku ocjenjivanje djevičanskog maslinova ulja ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Prilog XV.: Sadržaj ulja u komini maslina Prilog XVI.: Određivanje jodnog broja Prilog XVII.: Metoda za određivanje stigmastadiena u biljnim uljima Prilog XVIII.: Određivanje razlike između stvarne i teoretske količine triacilglicerola s ecn 42 Prilog XIX.: ►M28 Određivanje sadržaja alifatskih i triterpenskih alkohola kapilarnom plinskom kromatografijom ◄ ▼M23 Prilog XX.: Metoda određivanja udjela voskova, metil estera masnih kiselina i etil estera masnih kiselina kapilarnom plinskom kromatografijom ▼M28 ————— ▼M25 Prilog XXI.: Rezultati provjera sukladnosti provedenih na maslinovim uljima iz članka 8. stavka 2.

▼M27









PRILOG I.

SVOJSTVA MASLINOVA ULJA







Kategorija Etilni esteri masnih kiselina (FAEE) (*) Kiselost (%) (*) Peroksidni broj mEq O2/kg (*) Voskovi mg/kg (**) 2-gliceril monopalmitat (%) Stigmastadieni mg/kg (1) Razlika: ECN42 (HPLC) i ECN42 (teoretski izračun) K232 (*) K268 ili K270 (*) Delta-K (*) Organoleptičko ocjenjivanje Medijan mana (Mm) (*) Organoleptičko ocjenjivanje Medijan voćnosti (Mv) (*) 1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje FAEE ≤ 40 mg/kg (godina usjeva 2013.–2014.) (2) FAEE ≤ 35 mg/kg (godina usjeva 2014.–2016.) FAEE ≤ 30 mg/kg (godine usjeva nakon 2016.) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Mm = 0 Mv > 0 ≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 % 2. Djevičansko maslinovo ulje — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Mm ≤ 3,5 Mv > 0 ≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 % 3. Maslinovo ulje lampante — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Mm > 3,5 (4) — ≤ 1,1 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 % 4. Rafinirano maslinovo ulje — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 % 5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranih i djevičanskih maslinovih ulja — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 % 6. Sirovo ulje komine maslina — — — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafinirano ulje komine maslina — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Ulje komine maslina — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Ukupni izomeri koji bi se mogli (ili ne) odijeliti kapilarnom kolonom. (2) Ovo se ograničenje primjenjuje na maslinova ulja proizvedena od 1. ožujka 2014. (3) Ulja s udjelom voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg smatraju se maslinovim uljima lampante ako je ukupni udjel alifatskih alkohola manji od ili jednak 350 mg/kg ili ako je udjel eritrodiola i uvaola manji od ili jednak 3,5 %. (4) Medijan mana može biti manji od ili jednak 3,5, a medijan voćnosti jednak 0. (5) Ulja s udjelom voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg smatraju se sirovim uljima komine maslina ako je ukupni udjel alifatskih alkohola iznad 350 mg/kg i ako je udjel eritrodiola i uvaola veći od 3,5 %.







Kategorija Sastav masnih kiselina (1) Ukupni transoleinski izomeri (%) Ukupni translinolni i translinolenski izomeri (%) Sastav sterola Ukupni steroli (mg/kg) Eritrodiol i uvaol (%) (**) Miristinska (%) Linolenska (%) Arahinska (%) Eikozenska (%) Behenska (%) Lignocerinska (%) Kolesterol (%) Brasikasterol (%) Kampesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App β-sitosterol (3) (%) (**) Delta-7-stigmastenol (2) (%) 1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Djevičansko maslinovo ulje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Maslinovo ulje lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafinirano maslinovo ulje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranih i djevičanskih maslinovih ulja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Sirovo ulje komine maslina ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafinirano ulje komine maslina ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Ulje komine maslina ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Udjel drugih masnih kiselina (%): palmitinska: 7,50-20,00; palmitoleinska: 0,30-3,50; heptadekanska: ≤ 0,30; heptadecenska: ≤ 0,30; stearinska: 0,50-5,00; oleinska: 55,00-83,00; linolna: 2,50-21,00. (2) Vidjeti Dodatak ovom Prilogu. (3) App β-sitosterol: Delta-5,23-stigmastadienol + klerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Ulja s udjelom voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg smatraju se maslinovim uljima lampante ako je ukupni udjel alifatskih alkohola manji od ili jednak 350 mg/kg ili ako je udjel eritrodiola i uvaola manji od ili jednak 3,5 %. (5) Ulja s udjelom voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg smatraju se sirovim uljima komine maslina ako je ukupni udjel alifatskih alkohola iznad 350 mg/kg i ako je udjel eritrodiola i uvaola veći od 3,5 %.

Napomene:

(a) Rezultati analiza moraju biti izraženi onim brojem decimalnih mjesta kojim je izražena granična vrijednost za pojedino svojstvo. Posljednja se znamenka mora uvećati za jednu jedinicu ako je znamenka koja slijedi veća od 4.

(b) Ako najmanje jedno od svojstava ne odgovara navedenim vrijednostima, za svrhu ove Uredbe kategorija ulja može se promijeniti ili se ulje može deklarirati kao onečišćeno.

(c) Ako je svojstvo koje se odnosi na kvalitetu ulja označeno jednom zvjezdicom (*), time se podrazumijeva sljedeće: – kod maslinova ulja lampante moguće je da se istodobno oba navedena ograničenja razlikuju od navedenih vrijednosti, – kod djevičanskih maslinovih ulja, ako se najmanje jedno od tih ograničenja razlikuje od navedenih vrijednosti, kategorija se ulja mijenja, iako se i dalje svrstava u jednu od kategorija djevičanskih maslinovih ulja.

(d) Ako je svojstvo označeno s dvije zvjezdice (**), to znači da je za sve tipove ulja komine maslina moguće da se istodobno oba navedena ograničenja razlikuju od navedenih vrijednosti.









Dodatak

SHEMA ODLUČIVANJA

Shema odlučivanja povezana s kampesterolom za djevičanska i ekstra djevičanska maslinova ulja:

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

Shema odlučivanja povezana s delta-7-stigmastenolom za:

— ekstra djevičanska i djevičanska maslinova ulja —

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

— ulja komine maslina (sirova i rafinirana) —

▼M26









PRILOG I.a

UZORKOVANJE ULJA OD PLODA ILI KOMINE MASLINA KOJE SE DOSTAVLJA U UNUTARNJEM PAKIRANJU

Ova metoda uzorkovanja primjenjuje se na serije ulja od ploda ili komine maslina u unutarnjem pakiranju. Primjenjuju se različite metode uzorkovanja, ovisno o tome prelazi li unutarnje pakiranje 5 litara ili ne.

„Serija” označava niz prodajnih jedinica koje se proizvode, izrađuju i pakiraju u uvjetima koji omogućuju da se ulje koje se nalazi u svakoj prodajnoj jedinici smatra homogenim u smislu svih analitičkih osobina. Individuacija serije mora biti u skladu s Direktivom 2011/91/EU Europskog parlamenta i Vijeća ( 2 ).

„Dodana količina” označava količinu ulja koja se nalazi u unutarnjem pakiranju i koja je uzeta s nasumično odabranog mjesta serije.

1. SADRŽAJ PRIMARNOG UZORKA

1.1. Unutarnje pakiranje koje ne prelazi 5 litara

„Primarni uzorak” za unutarnje pakiranje koje ne prelazi 5 litara označava broj dodanih količina uzetih iz serije i u skladu s Tablicom 1.







Tablica 1. Najmanja veličina primarnog uzorka mora sadržavati sljedeće Kada unutarnje pakiranje ima zapreminu Primarni se uzorak mora sastoji od ulja od (a) 1 litre ili više (a) 1-og unutarnjeg pakiranja; (b) manje od 1 litre (b) najmanjeg broja pakiranja ukupne zapremnine ne manje od 1,0 litre

Broj pakiranja iz Tablice 1. koji predstavlja unutarnje pakiranje može povećatisvaka država članica prema svojim vlastitim potrebama (na primjer, za organoleptičku ocjenu u laboratorijima različitim od onih koji su proveli kemijsku analizu, ponovnu analizu, itd.).

1.2. Unutarnje pakiranje koje prelazi 5 litara

„Primarni uzorak” za unutarnje pakiranje koje prelazi 5 litara označava reprezentativni dio ukupnih dodanih količina dobivenih postupkom smanjenja i u skladu s Tablicom 2. Primarni se uzorak mora sastoji od različitih primjera.

„Primjerak” primarnog uzorka označava svaki paket koji čini primarni uzorak.







Tablica 2. Minimalni broj dodanih količina koje se uzimaju Broj pakiranja u seriji Minimalni broj dodanih količina koje se uzimaju Do 10 1 Od … 11 do 150 2 Od … 151 do 500 3 Od … 501 do 1 500 4 Od … 1 501 do 2 500 5 > 2 500 na 1 000 pakiranja 1 rezervna dodana količina

Kako bi se smanjio volumen uzorkovanja unutarnjih pakiranja, za pripremu primarnog uzroka homogenizira se sadržaj dodanih količina za uzorkovanje. Kako bi se najbolje zaštitili od zraka, dijelovi različitih dodanih količina miješanjem se ulijevaju u zajednički spremnik za njihovu homogenizaciju.

Sadržaj primarnog uzorka mora se uliti u niz pakiranja najmanje zapremnine 1,0 l od kojih svaki predstavlja primjer primarnog uzorka.

Broj primarnih uzoraka može povećati svaka država članice prema svojim vlastitim potrebama (na primjer, za organoleptičku procjenu u laboratorijima različitima od onih koji su proveli kemijsku analizu, ponovno analizu, itd.).

Svako pakiranje puni se tako da se sloj zraka na vrhu svede na najmanju moguću mjeru i zatim se primjereno zatvori i zapečati kako bi se osiguralo da se proizvod ne može mijenjati.

Ti se primjeri moraju označavati kako bi se omogućila ispravna identifikacija.

2. ANALIZE I REZULTATI

2.1. Svaki primarni uzorak mora se podijeliti na laboratorijske uzorke, u skladu s točkom 2.5. norme EN ISO 5555, i analizirati prema redoslijedu prikazanom u shemi odlučivanja iz Priloga I.b ili bilo kojim drugim nasumičnim redoslijedom.

2.2. Kad svi rezultati analize odgovaraju svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija proglašava odgovarajućom. Ako samo jedan rezultat analize ne odgovara svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija proglašava neodgovarajućom

3. PROVJERA KATEGORIJE SERIJE

3.1. Kako bi se provjerila kategorija serije, nadležno tijelo može povećati broj primarnih uzoraka uzetih s različitih mjesta serije u skladu sa sljedećom tablicom:



Tablica 3. Broj primarnih uzoraka određenih veličinom serije Veličina serije (litre) Broj primarnih uzoraka manje od 7 500 2 Od 7 500 do manje od 25 000 3 Od 25 000 do manje od 75 000 4 Od 75 000 do manje od 125 000 5 Jednako i više od 125 000 6 + 1 za svakih dodatnih 50 000 litara Svaka dodana količinakoja predstavlja primarni uzorak mora se uzeti s neprekinutog mjesta u seriji; potrebno je zabilježiti položaj svakog primarnog uzorka i nedvosmisleno ga identificirati. Stvaranje svakog primarnog uzorka mora se provesti u skladu s postupcima iz točaka 1.1. i 1.2. Svaki primarni uzorak zatim podliježe analizi iz članka 2. stavka 1.

3.2. Ako jedan od rezultata analize iz članka 2. stavka 1. najmanje jednog primarnog uzorka nije u skladu sa svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija za uzorkovanje proglašava neodgovarajućom.









PRILOG I.b

SHEMA ODLUČIVANJA ZA PROVJERU USKLAĐENOSTI UZORKA MASLINOVA ULJA SA DEKLARIRANOM KATEGORIJOM

Tablica 1.

Tablica 2.

Tablica 3.









Dodatak 1.







Tablica podudarnosti između priloga ove Uredbe i analiza navedenih u shemi odlučivanja — Kiselost Prilog II. Određivanje slobodnih masnih kiselina, hladna metoda — Peroksidni broj Prilog III. Određivanje peroksidnog broja — UV spektrometrija Prilog IX. Spektrofotometrijska analiza — Organoleptičko ocjenjivanje Prilog XII. Organoleptičko ocjenjivanje djevičanskog maslinova ulja — Etil esteri Prilog XX. Metoda određivanja sadržaja voskova, metil estera masnih kiselina i etil estera masnih kiselina kapilarnom plinskom kromatografijom — 3,5-stigmastadieni PRILOG XVII. Metoda za određivanje stigmastadiena u biljnim uljima ▼M28 — Trans-izomeri masnih kiselina Prilog X. Određivanje metilnih estera masnih kiselina plinskom kromatografijom — Sadržaj masnih kiselina Prilog X. Određivanje metilnih estera masnih kiselina plinskom kromatografijom ▼M26 — ΔECN42 Prilog XVIII. Određivanje sastava triglicerida s ECN42 (razlika između podataka HPLC-a i teoretskog sadržaja) — Sastav sterola i ukupni steroli — Eritrodiol i uvaol Prilog V. Određivanje sastava i sadržaja sterola i triterpenskih dialkohola kapilarnom plinskom kromatografijom — Voskovi Prilog IV. Određivanje sadržaja voska kapilarnom plinskom kromatografijom ▼M28 — Alifatski i triterpenski alkoholi Prilog XIX. Određivanje sadržaja alifatskih i triterpenskih alkohola kapilarnom plinskom kromatografijom ▼M26 — Zasićene masne kiseline u položaju 2. Prilog VII. Determination of the percentage of 2-glyceryl monopalmitate

▼M29









PRILOG II.

ODREĐIVANJE SLOBODNIH MASNIH KISELINA, HLADNA METODA

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovom metodom opisuje se određivanje slobodnih masnih kiselina u maslinovim uljima i uljima komine. Sadržaj slobodnih masnih kiselina iskazuje se kao kiselost izračunata kao postotak oleinske kiseline.

2. PRINCIP

Uzorak se otopi u mješavini otapala i postojeće se slobodne masne kiseline odrede titracijom s otopinom kalijevog hidroksida ili natrijevog hidroksida.

3. REAGENSI

Svi reagensi trebaju biti priznate analitičke kvalitete, a voda koja se upotrebljava treba biti destilirana ili odgovarajuće čistoće.

3.1. Dietil eter; 95 % etanol (V/V), mješavina dijelova jednakih po volumenu. Neutralizirati točno u trenutku upotrebe otopine kalijevog hidroksida (3.2.) uz dodatak 0,3 ml otopine fenolftaleina (3.3.) na 100 ml mješavine. Bilješka 1.: Dietil eter visoko je zapaljiv i može stvoriti eksplozivne perokside. Prilikom njegove upotrebe treba biti posebno pažljiv. Bilješka 2.: Ako nije moguće upotrijebiti dietil eter, može se upotrijebiti mješavina otapala koja sadržava etanol i toluen. Ako je potrebno, etanol se može zamijeniti 2-propanolom.

3.2. Kalijev hidroksid ili natrijev hidroksid, titrirana etanolna ili vodena otopina, c(KOH) [ili c(NaOH)] približno 0,1 mol/l ili, ako je potrebno, c(KOH) [ili c(NaOH)] približno 0,5 mol/l. Na raspolaganju su otopine dostupne na tržištu. Neposredno prije upotrebe treba biti poznata i provjerena točna koncentracija otopine kalijevog hidroksida (ili otopine natrijevog hidroksida). Treba upotrijebiti otopinu koja je pripremljena najmanje pet dana prije upotrebe i dekantirana u smeđe staklene boce s gumenim čepom. Otopina treba biti bezbojna ili boje slame. Ako se pri upotrebi vodene otopine kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) uoči fazno razdvajanje, vodenu otopinu treba zamijeniti otopinom u etanolu. Bilješka 3.: Stabilna bezbojna otopina kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) može se pripremiti na sljedeći način: zavrite 1 000 ml etanola ili vode s 8 g kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) i 0,5 g aluminijskih strugotina i pustite da vrije pod povratnim hladilom sat vremena. Odmah destilirajte. Otopite potrebnu količinu kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) u destilatu. Pustite da odstoji nekoliko dana i zatim dekantirajte kako biste odvojili bistru, supernatantnu tekućinu od nataloženog kalijevog karbonata (ili natrijevog karbonata). Otopina se može pripremiti i bez destiliranja, na sljedeći način: na 1 000 ml etanola (ili vode) dodajte 4 ml aluminijevog butilata i pustite mješavinu da odstoji nekoliko dana. Dekantiranjem odvojite supernatantnu tekućinu i u njoj otopite potrebnu količinu kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida). Otopina je spremna za upotrebu.

3.3. Otopina 10 g/l fenolftaleina u 95 do 96 % etanolu (v/v) ili otopina 20 g/l alkalnog modrila 6B ili timolftaleina u 95 do 96 % etanolu (v/v). U slučaju snažno obojenih ulja upotrebljavaju se alkalno modrilo ili timolftalein.

4. OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, koja uključuje:

4.1. analitičku vagu;

4.2. Erlenmeyerovu tikvicu volumena 250 ml;

4.3. graduiranu biretu volumena 10 ml, razreda A, s podjelom po 0,05 ml ili odgovarajuću automatsku biretu.

5. POSTUPAK

5.1. Priprema uzorka za ispitivanje

Ako je uzorak mutan, potrebno ga je filtrirati.

5.2. Uzorak za ispitivanje

Uzorak treba odabrati ovisno o pretpostavljenoj kiselosti u skladu sa sljedećom tablicom:







Očekivana kiselost (oleinska kiselost g/100g) Masa uzorka (g) Preciznost vaganja (g) 0 do 2 10 0,02 > 2 do 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Uzorak treba odvagnuti u Erlenmeyerovoj tikvici (4.2.).

5.3. Određivanje

Uzorak (5.2.) treba otopiti u 50 do 100 ml prethodno neutralizirane mješavine dietil etera i etanola (3.1.).

Titrirati uz miješanje 0,1 mol/l otopinom kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) (3.2.) (vidjeti bilješku 4.) dok se ne promijeni boja indikatora (boja obojanog indikatora treba biti postojana najmanje 10 sekundi).

Bilješka 4.: Ako potrebna količina otopine kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) od 0,1 mol/l bude veća od 10 ml, treba upotrebljavati otopinu od 0,5 mol/l ili promijeniti masu uzorka u skladu s očekivanom kiselosti i predloženom tablicom.

Bilješka 5.: Ako otopina tijekom titriranja postane mutna, treba dodati dovoljno otapala (3.1.) da bi se dobila bistra otopina.

Provedite drugo određivanje samo ako je prvi rezultat viši od utvrđenog ograničenja za kategoriju ulja.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

Kiselost izražena u težinskim postocima oleinske kiseline jednaka je:

pri čemu je:

V = volumen otopine kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) utrošen za titriranje, u mililitrima;

c = točna koncentracija u mol po litri upotrebljene otopine kalijevog hidroksida (ili natrijevog hidroksida) za titriranje;

M = 282 g/mol, molarna masa u gramima po molu oleinske kiseline;

m = masa uzorka u gramima.

Oleinska kiselost iskazuje se kako slijedi:

(a) do dva decimalna mjesta za vrijednosti od 0 do uključivo 1;

(b) do jednog decimalnog mjesta za vrijednosti od 1 do uključivo 100.

▼B









PRILOG III.

ODREĐIVANJE PEROKSIDNOG BROJA

1. OPSEG

Ova norma opisuje metodu za određivanje peroksidnog broja ulja i masti.

2. PODRUČJE PRIMJENE

Ova norma primjenjuje se na ulja i masti životinjskog i biljnog podrijetla.

3. DEFINICIJA

Peroksidni broj je količina onih tvari u uzorku, iskazanih u obliku miliekvivalenata aktivnog kisika na kilogram, koji pod opisanim radnim uvjetima oksidiraju kalijev jodid.

4. PRINCIP

Reakcija ispitivanog dijela uzorka u otopini octene kiseline i kloroforma s otopinom kalijevog jodida. Titriranje oslobođenog joda standardiziranom otopinom natrijevog tiosulfata.

5. OPREMA

Sva oprema koja se koristi ne smije sadržavati tvari koje uzrokuju redukciju ili oksidaciju.

Bilješka: Površinu podloge ne zamastiti.

5.1. Staklena odmjerna posudica volumena 3 ml.

5.2. Tikvice s užim grlom i čepom, volumena približno 250 ml, prethodno osušene i ispunjene čistim, suhim, inertnim plinom (dušikom ili, još bolje, ugljičnim dioksidom).

5.3. Graduirana bireta volumena 25 ili 50 ml, s podjelom po 0,1 ml.

6. REAGENSI

6.1. Kloroform, kvalitete analitičkog reagensa, očišćen od kisika propuhivanjem strujom čistog, suhog inertnog plina.

6.2. Ledena octena kiselina, kvalitete analitičkog reagensa, očišćena od kisika propuhivanjem strujom čistog, suhog inertnog plina.

6.3. Kalijev jodid, zasićena vodena otopina, svježe pripremljena, bez joda i jodata.

6.4. Precizno standardizirana vodena otopina natrijevog tiosulfata 0,01 ili 0,002 mol/l, standardizirana neposredno prije korištenja.

6.5. Škrobna otopina, vodena otopina 10 g/l, svježe pripremljena korištenjem prirodnog topivog škroba.

7. UZORAK

Treba paziti da uzeti uzorak bude pohranjen na tamnom i hladnom mjestu u potpuno ispunjenim staklenim posudama, hermetički zatvorenima staklenim ili plutenim čepovima.

8. POSTUPAK

Ispitivanje treba provesti pri difuznom dnevnom svjetlu ili pod umjetnim svjetlom. U staklenoj odmjernoj posudici (5.1.), ili, ako to ne uspije, u tikvici (5.2.), treba izvagati masu uzorka s preciznošću od 0,001 g, u skladu sa sljedećom tablicom, u skladu s očekivanim peroksidnim brojem:







Očekivani peroksidni broj (meq) Težina ispitivanog dijela uzorka (g) 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

Tikvicu (5.2.) treba odčepiti i u nju staviti staklenu odmjernu posudicu koja sadrži ispitivani dio uzorka. Dodati 10 ml kloroforma (6.1.). Miješanjem brzo otopiti uzorak. Dodati 15 ml octene kiseline (6.2.), zatim 1 ml otopine kalijevog jodida (6.3.). Brzo začepiti, protresti jednu minutu i odložiti da odleži točno pet minuta na tamnom mjestu i na temperaturi između 15 i 25 °C.

Dodati približno 75 ml destilirane vode. Titrirati oslobođeni jod otopinom natrijevog tiosulfata (6.4.) (otopina 0,002 mol/l za očekivane vrijednosti niže od 12 i otopina 0,01 mol/l za očekivane vrijednosti više od 12), snažnim protresanjem uz korištenje škrobne otopine (6.5.) kao indikatora.

Treba provesti dva određivanja na istom uzorku.

Istodobno treba provesti slijepu probu. Ako rezultat slijepe probe prelazi 0,05 ml 0,01 mol/l otopine natrijevog tiosulfata (6.4.), treba zamijeniti onečišćeni reagens.

9. ISKAZIVANJE REZULTATA

Peroksidni broj (PB) iskazan u miliekvivalentima aktivnog kisika na kilogram dan je sljedećom formulom:

pri čemu je:

V = volumen standardizirane otopine natrijevog tiosulfata (6.4.) utrošen za ispitivanje, iskazan u mililitrima, ispravljen rezultatom za slijepu probu;

T = točna molarnost korištene otopine natrijevog tiosulfata (6.4.);

m = masa ispitivanog dijela uzorka u gramima.

Kao rezultat treba uzeti aritmetički prosjek dvaju provedenih određivanja.

▼M21









PRILOG IV.

ODREĐIVANJE SADRŽAJA VOSKA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. PREDMET

Ova metoda opisuje postupak za određivanje sadržaja voska u maslinovim uljima. Voskovi se odvajaju prema broju njihovih atoma ugljika. Metoda se posebno može koristiti za razlikovanje maslinovog ulja dobivenog prešanjem i onog dobivenog ekstrakcijom (ulje komine maslina).

2. PRINCIP

Dodaje se odgovarajući interni standard masti ili ulju, potom frakcioniramo pomoću kromatografije na hidratiziranoj koloni od silikagela. Frakcija koja je u početku eluirana u uvjetima testiranja, (čija je polarnost slabija od polarnosti triglicerida), vraća se i neposredno analizira kapilarnom plinskom kromatografijom.

3. OPREMA

3.1 Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml.

3.2. Staklena kolona za plinsku kromatografiju, unutarnjeg promjer 15,0 mm, dužine 30 do 40 cm, s pipcem.

3.3. Odgovarajući plinski kromatograf s kapilarnom kolonom, opremljen sustavom za neposredno uvođenje u kolonu koji se sastoji od sljedećeg: 3.3.1. Termostatska komora za kolone, opremljena regulatorom temperature. 3.3.2. Hladni injektor za izravno unošenje u kolonu. 3.3.3. Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom. 3.3.4. Snimač-integrator kompatibilan s pretvaračem s pojačalom (3.3.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira. (Također je moguće koristiti kompjutorizirane sustave koji omogućavaju dobivanje podataka o plinskoj kromatografiji putem osobnog računala.) 3.3.5. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona dužine 8 do 12 m, unutarnjeg promjera od 0,25 do 0,32 mm, s tekućom fazom, s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm. (Na tržištu su dostupne tekuće faze pogodne za tu svrhu tipa SE-52 ili SE-54.)

3.4. Mikroštrcaljka za izravno unošenje u kolonu volumena 10 μl s čvrsto fiksiranom iglom.

3.5. Električna tresilica.

3.6. Rotirajući isparivač.

3.7. Visokotemperaturna peć.

3.8. Analitička vaga sa zajamčenom preciznošću od ± 0,1 mg.

3.9. Uobičajeno laboratorijsko stakleno suđe.

4. REAGENSI

4.1. Silikagel veličine zrna između 60 i 200 μm. Silikagel staviti na četiri sata u peć na 500 °C. Nakon hlađenja, dodati 2 % vode u odnosu na količinu uzorkovanog silikagela. Dobro protresti da se suspenzija homogenizira. Čuvati na tamnom mjestu najmanje 12 sati prije uporabe.

4.2. n-heksan, za kromatografiju.

4.3. dietilni eter, za kromatografiju.

4.4. n-heptan, za kromatografiju.

4.5. Standardna otopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/v) u heksanu (interni standard). (Moguće je koristiti palmitil palmitat ili miristil stearat.) 4.5.1. Sudan 1 (1-fenil-azo-2-naftol).

4.6. Plin nosač: vodik ili helij, plinsko-kromatografska čistoća.

4.7. Pomoćni plinovi: — vodik, čistoće za plinsku kromatografiju, — zrak, čistoće za plinsku kromatografiju.

5. POSTUPAK

5.1. Priprema kromatografske kolone.

Otopiti 15 g silikagela (4.1.) u n-heksanu (4.2.) i unijeti u kolonu (3.2.). Ostaviti da se samo slegne. Dovršiti taloženje pomoću električne tresilice (3.5.) kako bi se postigao što ujednačeniji kromatografski sloj. Propustiti 30 ml n-heksana kako bi se odstranile sve eventualne nečistoće. Korištenjem vage (3.8.) odvagati točno 500 mg uzorka u Erlenmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.), dodati odgovarajuću količinu internog standarda (4.5.), ovisno o pretpostavljenom sadržaju voska. Na primjer, dodati 0,1 mg lauril arahidata za maslinovo ulje i 0,25 do 0,5 mg za ulje komine maslina. Prenijeti pripravljen uzorak na kromatografsku kolonu pomoću dva puta po 2 ml n-heksana (4.2.).

Otapalo ispuštati dok ne dostigne 1 mm iznad gornje razine absorbenta, potom filtrirati daljnjih 70 ml n-heksana kako bi se uklonili prirodno prisutni n-alkani. Potom započeti kromatografsko eluiranje sakupljanjem 180 ml mješavine n-heksana/dietilnog etera (omjer 99:1), pri brzini protoka od oko 15 kapi svakih 10 sekundi. Eluiranje uzorka se izvodi na sobnoj temperaturi pri 22 ± 4 °C.

BILJEŠKA:

— Mješavina n-heksana/dietilnog etera, (99:1), priprema se svakodnevno.

— Za vizualnu provjeru ispravnog eluiranja voskova, može se dodati 100 μm 1 % sudana iz elucijske mješavine u uzorak u otopini. S obzirom da bojilo ima retenciju između voskova i triglicerida, kad obojenje dostigne dno kolone, elucijsku otopinu treba otopiti jer će tada svi voskovi biti eluirani.

Osušiti tako dobivenu frakciju u rotirajućem isparivaču (3.6.) dok se ne ukloni gotovo svo otapalo. Ukloniti preostala 2 ml otpala pomoću slabe struje dušika; potom dodati 2-4 ml n-heptana.

5.2. Analiza plinskom kromatografijom

5.2.1. Pripremne radnje

Postaviti kolonu na plinski kromatograf (3.3) spajajući ulazni otvor na sustav neposredno na koloni i izlazni otvor na detektor. Obaviti opću provjeru plinskog kromatografa (funkcioniranje protoka plina, učinkovitost detektora i snimača itd.).

Ako se kolona koristi po prvu put, potrebno ju je najprije kondicionirati. Pustiti da kroz kolonu proteče malo plina, potom uključiti plinski kromatograf. Postupno zagrijavati do dostizanja temperature od 350 °C nakon približno četiri sata. Održavati temperaturu najmanje dva sata te potom regulirati aparat na radne uvjete, (reguliranje protoka plina, paljenje plamena, spoj na elektronički snimač (3.3.4), prilagođavanje temperature peći za kolonu, prilagođavanje detektora itd.), i zapisati signal pri osjetljivosti koja je najmanje dvostruka od one koju zahtijeva analiza. Bazna linija mora biti linearna, bez pikova i bez bilo kakvih znakova otklona.

Negativan pravocrtni otklon ukazuje da spojevi kolone nisu dobro postavljeni; pozitivan otklon da kolona nije pravilno kondicionirana.

5.2.2. Odabir radnih uvjeta

Radni uvjeti su uglavnom sljedeći:

— temperatura kolone: —



20 °C/minuti 5 °C/minuti 20 °C/minuti Inicijalno 80 °C (1’) → 240 °C → 325 °C (6’) → 340 °C (10’)

— temperatura detektora: 350 °C,

— količina ubrizgane tvari: 1 μl otopine n-heptana (2-4ml),

— plin nosač: helij ili vodik pri ispravnoj linearnoj brzini za odabrani plin (vidjeti Dodatak),

— osjetljivost instrumenta: pogodno za sljedeće uvjete:

Uvjete se može modificirati u skladu s karakteristikama kolone i plinskog kromatografa kako bi se dobilo odvajanje svih voskova i zadovoljavajuća rezolucija pika, (vidjeti sliku); retencijsko vrijeme internog standarda C32 mora biti 18 ± 3 minute. Najreprezentativniji pik voska mora biti najmanje 60 % pune skale.

Parametre za integraciju pikova potrebno je odrediti na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira.

BILJEŠKA: Zbog visoke konačne temperature, dopušten je pozitivan otklon od najviše 10 % pune skale.

5.3. Provođenje analize

Pomoću mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl otopine; klip štrcaljke izvući dok se igla ne isprazni. Iglu uvesti u sustav za injektiranje i nakon 1-2 sekunde brzo injektirati; nakon otprilike pet sekundi, lagano izvući iglu.

Bilježiti sve dok voskovi nisu u potpunosti eluirani.

Bazna linija u svakom trenutku mora zadovoljavati tražene uvjete.

5.4. Identificiranje pikova

Pikovi se identificiraju pomoću retencijskih vremena uspoređivanjem s mješavinama voskova čije je retencijsko vrijeme poznato, a koji su analizirani u istim uvjetima.

Na slici je prikazan kromatogram voskova djevičanskog maslinovog ulja.

5.5. Ocjena količina

Pomoću integratora odrediti površine pikova koje odgovaraju internom standardu i alifatskim esterima od C40 do C46.

Izračunati sadržaj voska svakog pojedinog estera u mg/kg masti određujemo prema sljedećoj formuli: ester, mg/kg =

pri čemu je:

Ax = površina pika svakog estera, u kvadratnim milimetrima;

As = površina pika internog standarda, u kvadratnim milimetrima;

ms = masa dodanog internog standarda, u miligramima;

m = masa uzorka za analizu, u gramima.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

Iskazati ukupan sadržaj različitih voskova C40 do C46 u mg/kg masti (ppm).

BILJEŠKA: Sastojci koje treba kvantificirati se odnose na pikove s brojevima parova ugljika između C40 do C46 estera, korištenjem primjera kromatograma voska maslinovog ulja prikazanog na donjoj slici. U slučaju da se C46 ester pojavi dva puta, preporuča se da se za njegovu identifikaciju analizira frakcija voskova ulja komine maslina gdje je pik C46 jednostavno identificirati jer je u očiglednoj većini.

Rezultati trebaju biti izraženi na jednu decimalu.

Slika

Kromatogram voskova maslinovog ulja ( 3 )

Legenda:

I.S. = Lauril arahidat

1. = Diterpenski esteri

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5. = Esteri C46

6. = Sterolni esteri i triterpenski alkohol









Dodatak

Određivanje linearne brzine plina

U plinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se 1-3 μl metana (ili propana). Mjeri se vrijeme potrebno za protok plina kroz kolonu od trenutka injektiranja do pojave pika (tM).

Linearna brzina u cm/s zadana je formulom L/tM, pri čemu je L duljina kolone u cm, a tM je vrijeme mjereno u sekundama.;

▼M26









PRILOG V.

ODREĐIVANJE SASTAVA I SADRŽAJA STEROLA I TRITERPENSKIH DIALKOHOLA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. PODRUČJE PRIMJENE

U ovoj se metodi opisuje postupak određivanja udjela pojedinačnih i ukupnih sterola i triterpenskih dialkohola u maslinovim uljima i uljima komine maslina.

2. NAČELO

Ulje s dodatkom α-kolestanola koji služi kao interni standard saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira etil eterom.

Frakcija sterola i triterpenskih dialkohola odjeljuje se od neosapunjivog ekstrakta tankoslojnom kromatografijom na osnovnoj silikagel ploči. Frakcije koje se dobiju sa silikagela pretvaraju se u trimetilsilil etere i zatim analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom.

3. APARATURA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

3.1. Tikvica od 250 ml s povratnim hladilom i nastavcima od brušenog stakla.

3.2. Lijevak za odjeljivanje od 500 ml.

3.3. Tikvice od 250 ml.

3.4. Cjeloviti instrument za analizu tankoslojnom kromatografijom, korištenjem staklenih ploča veličine 20 × 20 cm.

3.5. Ultraljubičasta svjetiljka valne duljine 254 ili 366 nm.

3.6. Mikroštrcaljke od 100 μl i 500 μl.

3.7. Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i visine 5 cm, primjeren za filtriranje pod vakuumom s muškim spojem od brušenog stakla.

3.8. Vakuumska tikvica od 50 ml, sa ženskim spojem od brušenog stakla koji se može pričvrstiti na lijevak za filtriranje (točka 3.7.).

3.9. Epruveta od 10 ml s konusnim dnom i brtvenim staklenim čepom.

3.10. Plinski kromatograf koji se može koristiti s kapilarnom kolonom s razdjelnim sustavom za injektiranje koji se sastoji od: 3.10.1. Termostatske komore za kolone koja može održavati željenu temperaturu s točnošću od ± 1 °C; 3.10.2. Jedinice za injektiranje s mogućnošću podešavanja temperature, s elementom za uparavanje od persilaniziranog stakla i razdjelnim sustavom; 3.10.3. Plameno-ionizacijskog detektora (FID); 3.10.4. Sustava za prikupljanje podataka koji se može koristiti s detektorom FID (točka 3.10.3.) koji se može uključiti ručno.

3.11. Kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, sa slojem 5 % difenila - 95 % dimetilpolisiloksana (SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom stacionarnom fazom), s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm.

3.12. Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju volumena 10 l s čvrsto učvršćenom iglom primjerenom za razdjelno injektiranje.

3.13. Eksikator s kalcijevim kloridom

4. REAGENSI

4.1. Kalijev hidroksid, minimalne koncentracije 85 %

4.2. Otopina kalijevog hidroksida u etanolu približno 2 mol/l Otopiti 130 g kalijevog hidroksida (točka 4.1.), uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.10). Otopinu treba čuvati u dobro začepljenim bocama od tamnog stakla i čuvati najviše dva dana.

4.3. Etil eter, analitičke kvalitete.

4.4. Otopina kalijevog hidroksida u etanolu približno 0,2 N Otopiti 13 g kalijevog hidroksida (točka 4.1.) u 20 ml destilirane vode i nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.10.).

4.5. Bezvodni natrijev sulfat, analitičke kvalitete.

4.6. Staklene ploče (20 × 20 cm) sa slojem silikagela, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 mm (na tržištu su dostupne ploče spremne za uporabu).

4.7. Toluen, za kromatografiju.

4.8. Aceton, za kromatografiju.

4.9. n-heksan, za kvalitetu kromatografije.

4.10. Etil eter, za kvalitetu kromatografije.

4.11. Etanol analitičke kvalitete.

4.12. Etil acetat analitičke kvalitete.

4.13. Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: 5 %-tna otopina kolesterola ili fitosterola i eritrodiola u etil acetatu (točka 4.11.).

4.14. 2,7-diklorofluorescein, 0,2 %-tna otopina u etanolu. Može se učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 N kalijevog hidroksida u alkoholu (točka 4.2.).

4.15. Bezvodni piridin, za kvalitetu kromatografije (vidi Napomenu 5).

4.16. Heksametildisilazan analitičke kvalitete.

4.17. Trimetilklorosilan analitičke kvalitete.

4.18. Otopine sterolnih trimetilsilil etera iz uzorka. Treba ih se pripremiti neposredno prije korištenja od sterola i eritrodiola dobivenih iz ulja koja ih sadrže.

4.19 α-kolestanol, čistoće veće od 99 % (čistoća se mora provjeriti plinskom kromatografijom).

4.20. Otopina α-kolestanola internog standarda, 0,2 %-tna otopina (m/V) u etil acetatu (točka 4.11.).

4.21. Otopina 10 g/l fenolftaleina u etanolu (točka 4.10.).

4.22. Plinovi nosači: vodik ili helij, plinsko-kromatografske čistoće.

4.23. Pomoćni plinovi: vodik, helij, dušik i zrak, plinsko-kromatografske čistoće.

4.24. Smjesa n-heksana (točka 4.9.) i etil etera (točka 4.10.) 65:35 (V/V).

4.25. Reagens za sililaciju koji se sastoji od smjese piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana.

5. POSTUPAK

5.1. Pripremanje neosapunjive tvari. 5.1.1. S pomoću mikroštrcaljke (točka 3.6.) od 500 μl u tikvicu volumena 250 ml ubrizgati onu količinu 0,2 %-tne otopine α-kolestanola internog standarda (točka 4.20.) koja sadržava količinu kolestanola koja je približno jednaka 10 % sadržaja sterola uzorka. Primjerice, na 5 g uzorka maslinova ulja treba dodati 500 μl otopine α-kolestanola (točka 4.20.) i 1 500 μl za ulje komine maslina. Upariti do suha pod blagom strujom dušika u toploj vodenoj kupelji i, nakon što se tikvica ohladi, izvagati 5 ± 0,01 g suhog filtriranog uzorka u istu tikvicu. Napomena 1.: Ulja i masti životinjskog ili biljnog podrijetla koja sadrže znatne količine kolesterola mogu pokazati pik s retencijskim vremenom koje je blizu onome kolestanola. U tom slučaju frakcija sterola treba se analizirati dvostruko - s internim standardom i bez njega. 5.1.2. Dodati 50 ml 2 mol/l otopine kalijevog hidroksida u etanolu (točka 4.2.) i nešto plovućca, namjestiti povratno hladilo i zagrijavati do točke slabog vrenja dok se ne završi saponificiranje (otopina postane bistra). Nastaviti zagrijavanje još 20 minuta, zatim dodati 50 ml destilirane vode u vrh hladila, odvojiti hladilo i ohladiti tikvicu na približno 30 °C. 5.1.3. Kvantitativno prenijeti sadržaj tikvice u lijevak za odjeljivanje od 500 ml (točka 3.2.) s nekoliko obroka destilirane vode (50 ml). Dodati približno 80 ml etil etera (točka 4.10.), snažno protresti približno 60 sekundi, povremeno ispuštajući pritisak okretanjem lijevka za odjeljivanje i otvaranjem zaustavnog pipca. Odložiti dok se dvije faze potpuno ne odvoje (Napomena 2.). Odvojiti sapunastu otopinu što je moguće potpunije u drugi lijevak za odjeljivanje. Provesti još dvije ekstrakcije na vodeno-alkoholnoj fazi na jednak način, uz korištenje između 60 i 70 ml etil etera (točka 4.10.). Napomena 2.: Svaka se emulzija može uništiti dodavanjem malih količina etanola (točka 4.11.). 5.1.4. Kombinirati tri ekstrakta etera u jednom lijevku za odjeljivanje koji sadržava 50 ml vode. Nastaviti ispirati s vodom (50 ml) sve dok se u vodi kojom se ispiralo više ne pojavljuje ružičasto obojenje prilikom dodavanja kapljica otopine fenolftaleina (točka 4.21.). Nakon uklanjanja vode kojom se ispiralo profiltrirati kroz bezvodni natrijev sulfat (točka 4.5.) u prethodno izvaganoj tikvici od 250 ml perući lijevak i filtar malim količinama etil etera (točka 4.10.). 5.1.5. Otapalo ispariti destiliranjem pod vakuumom u rotirajućem isparivaču na 30 °C. Dodati 5 ml acetona i potpuno odstraniti hlapivo otapalo pod blagom strujom zraka. Ostatak osušiti u peći 15 min na 103 ± 2 °C. Ohladiti u eksikatoru i izvagati uz odstupanje do 0,1 mg.

5.2. Odjeljivanje frakcija sterola i triterpenskih dialkohola (eritrodiol + uvaol) 5.2.1. Pripremanje osnovnih ploča za tankoslojnu kromatografiju. Uroniti silikagel ploče (točka 4.6.) u otopinu 0,2 mol/l kalijevog hidroksida u etanolu (točka 4.5.) na 10 sekundi, zatim ih ostaviti da se dva sata suše u digestoru i na kraju ih staviti u peć na sat vremena na 100 °C. Izvaditi ploče iz peći i pohraniti u eksikator s kalcijevim kloridom (točka 3.13.) do upotrebe (ploče obrađene na ovaj način moraju se upotrijebiti u roku od 15 dana). Napomena 3.: Kad se za odjeljivanje frakcije sterola koriste osnovne silikagel ploče, nema potrebe da se neosapunjive tvari obrađuju aluminijem. Na taj način svi sastojci koji su po prirodi kiseli (masne kiseline i drugi) zadržavaju se na liniji raspršivanja, a vrpca sterola jasno se odvaja od vrpce alifatskih i triterpenskih alkohola. 5.2.2. U komoru za razvijanje unijeti smjesu heksana i etil etera (točka 4.24.) (Napomena 4.) do razine od približno 1 cm. Komoru zatvoriti odgovarajućim poklopcem i ostaviti tako na najmanje pola sata, na hladnom mjestu, kako bi se uspostavila ravnoteža tekućine ipare. Trake filtar-papira namočene u eluens mogu se postaviti na unutarnje površine komore. Time se skraćuje vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobiva jednoličnija, pravilna eluacija komponenata. Napomena 4.: Smjesa za razvijanje treba se zamijeniti za svako ispitivanje da bi se postigli savršeni reproducibilni uvjeti eluacije ili se umjesto toga može koristiti otapalo n-heksana i etilnog etera 50:50 (V/V). 5.2.3. Pripremiti približno 5 %-tnu otopinu neosapunjivih tvari (točka 5.1.5.) u etil acetatu (točka 4.12.) i s pomoću mikroštrcaljke od 100 μl nanijeti 0,3 ml te otopine u tankoj i ujednačenoj liniji na donji rub (2 cm) kromatografske ploče (točka 5.2.1.). Poravnato s nanosom nanijeti između 2 i 3 μl referentne otopine tvari (točka 4.13.) tako da se vrpca sterola i triterpenskih dialkohola može identificirati nakon razvijanja. 5.2.4. Postaviti ploču unutar komore za razvijanje koja je pripremljena kako je navedeno u točki 5.2.2. Sobnu temperaturu treba održavati između 15 i 20 °C (Napomena 5.). Komoru odmah zatvoriti poklopcem i ostaviti da eluira dok prednji dio otapala ne dosegne približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja još neko kraće vrijeme u digestoru. Napomena 5.: Na višim temperaturama odjeljivanje se može pogoršati. 5.2.5. Blago i jednoliko pošpricati ploču otopinom 2,7-diklorofluoresceina (točka 4.14.) i zatim je ostaviti da se osuši. Kad se ploča promatra pod ultraljubičastom svjetlošću, vrpce sterola i triterpenskih dialkohola mogu se identificirati tako što su poravnate s mrljama dobivenima od referentne otopine (točka 4.13.). Rubovi trake označe se uz rub fluorescencije crnom olovkom (vidi TLC ploču na slici 3). 5.2.6. Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se s pomoću metalne spatule. Tako dobiveni fino usitnjeni materijal unijeti u lijevak za filtriranje (točka 3.7.). Dodati 10 ml vrućeg etil acetata (točka 4.13.), pažljivo izmiješati metalnom spatulom i filtrirati pod vakuumom, skupljajući filtrat u vakuumsku tikvicu (točka 3.8.) spojenu na lijevak za filtriranje. Ostatak u tikvici isprati tri puta etil eterom (točka 4.3.) (približno 10 ml svaki put), skupljajući filtrat u istu tikvicu spojenu na lijevak, ispariti filtrat do volumena od 4 do 5 ml, preostalu otopinu prenijeti u prethodno izvaganu epruvetu volumena 10 ml (točka 3.9.), upariti do suha laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika, ponovno nadopuniti s nekoliko kapi acetona (točka 4.8.) i ponovno upariti do suha. Ostatak unutar epruvete mora se sastojati od frakcija sterola i triterpenskih dialkohola.

5.3. Pripremanje trimetilsilil etera. 5.3.1. Dodati reagens za silaniziranje (točka 4.25.) (Napomena 6.), u omjeru od po 50 μl na svaki miligram sterola i triterpenskih alkohola, u epruvetu koja sadržava frakciju sterola i triterpena tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (Napomena 7.) Napomena 6.: Otopine spremne za uporabu dostupne su na tržištu. Dostupni su i drugi reagensi za silaniziranje kao što su npr. bistrimetilsililtrifluoracetamid + 1 % trimetilklorosilan za miješanje s jednakim volumenom bezvodnog piridina. Piridin se može zamijeniti jednakom količinom acetonitrila. 5.3.2. Epruvetu treba začepiti i pažljivo protresti (bez preokretanja) sve dok se sastojci u potpunosti ne rastope. Ostaviti da odstoji najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi te zatim centrifugirati nekoliko minuta. Bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom. Napomena 7.: Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće uzrokovati anomalije. Stvaranje bijelog floka ili pojava ružičastog obojenja znakovi su prisutnosti vlage ili propadanja reagensa. U tom slučaju treba ponoviti ispitivanje (samo ako se koristi heksametildisilazan ili trimetilklorosilan).

5.4. Analiza plinskim kromatografom 5.4.1. Pripremne djelatnosti i kondicioniranje kapilarne kolone. 5.4.1.1. Namjestiti kolonu (točka 3.11.) u plinski kromatograf tako da se početak kolone spoji na razdjelni injektor, a izlazni kraj kolone na detektor. Provesti opću provjeru stanja jedinice plinskog kromatografa (curenje iz plinskih tokova, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava za razdvajanje i sustava za bilježenje, itd.). 5.4.1.2. Ako se kolona koristi prvi put, preporučljivo je podvrgnuti je postupku kondicioniranja: kroz kolonu se pusti malo plina, a zatim se jedinica plinskog kromatografa uključi i postupno zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (Napomena 8.). Ta se temperatura treba održavati najmanje dva sata, zatim se cijela jedinica stavlja u radne uvjete (prilagođavanje protoka plina i razdvajanja, paljenja plamena, provjera spoja s računalnim sustavom, prilagođavanje komore za kolonu, temperature detektora i injektora, itd.), a zatim se bilježi signal uz osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od razine predviđene za analizu. Bazna linija za praćenje treba biti linearna, bez pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da je došlo do curenja iz spojeva kolone, a pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije kondicionirana na odgovarajući način. Napomena 8.: Temperatura kondicioniranja mora uvijek biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature utvrđene za primijenjenu stacionarnu fazu. 5.4.2. Odabir radnih uvjeta. 5.4.2.1. Opći radni uvjeti su kako slijedi: — Temperatura kolone: 260 ± 5 °C; — Temperatura injektora: 280 - 300 °C; — Temperatura detektora: 280 - 300 °C; — Linearna brzina plina nosača: helij između 20 i 35 cm/s, vodik između 30 i 50 cm/s; — Omjer razdvajanja: između 1:50 i 1:100, — Osjetljivost instrumenta: između 4 i 16 puta viša od minimalne atenuacije; — Osjetljivost bilježenja: - Između 1 i 2 mV pune skale; — Količina injektirane tvari: između 0,5 i 1 μl otopine TMSE. Gore navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu sa svojstvima kolone i svojstvimaplinskog kromatografa ne bi li se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim zahtjevima: — Retencijsko vrijeme pika β-sitosterola treba biti 20 ± 5 minuta; — Pik kampesterola treba biti: za maslinovo ulje (prosječni udjel 3 %) 20 ± 5 % vrijednosti pune skale; za sojino ulje (prosječni udjel 20 %) 80 ± 10 % vrijednosti pune skale; — Svi prisutni steroli moraju biti odijeljeni. Osim odjeljivanja, pikovi tmoraju biti i potpuno razdvojeni, tj. trag pika mora se vratiti na baznu liniju prije no što krene stvarati novi pik. Međutim, nepotpuno razdvajanje tolerira se u slučaju da se pik pri RRT 1,02 može kvantificirati korištenjem okomice. 5.4.3. Analitički postupak 5.4.3.1. Korištenjem mikroštrcaljke volumena 10 μl unijeti 1 μl heksana, 0,5 μl zraka, i zatim između 0,5 i 1 μl otopine uzorka. Pritom podignuti klip mikroštrcaljke da bi se igla ispraznila. Igla se uvodi kroz membranu injektora; nakon jedne do dvije sekunde otopina se brzo injektira, a nakon približno pet sekundi igla se polako izvlači. Može se upotrijebiti i automatski injektor. 5.4.3.2. Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE prisutnih triterpenskih dialkohola u potpunosti ne eluiraju. Bazna linija treba u svakom trenutku odgovarati zahtjevima (točka 5.4.1.2.). 5.4.4. Identificiranje pikova Identificiranje pojedinačnih pikova provodi se na temelju retencijskog vremena i uspoređivanjem s mješavinom sterolnih i triterpenskih dialkohola TMSE koja se analizirala u jednakim uvjetima (vidi Dodatak). Steroli i triterpenski dialkoholi se eluiraju sljedećim redoslijedom: kolesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7-kampesterol, Δ 5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24-stigmastadienol, Δ 7-stigmasterol, Δ 7-avenasterol, eritrodiol i uvaol. Retencijska vremena ß-sitosterola za kolone SE-52 i SE-54 prikazana su u Tablici 1. Slike 1. i 2. prikazuju tipične kromatograme za neka ulja. 5.4.5. Kvantitativna procjena. 5.4.5.1. Površine pikova α-kolestanola i sterola i triterpenskih dialkohola izračunavaju se korištenjem računalnog sustava. Pikove bilo kojega od spojeva koji nisu uključeni među one navedene u Tablici 1. (ergosterol se ne smije izračunavati) ne treba uzimati u obzir. Koeficijent odziva za α-kolestanol treba biti jednak 1. 5.4.5.2. Treba izračunati koncentraciju svakog pojedinačnog sterola u mg/kg masnog materijala kako slijedi: pri čemu je: Ax = površina pika sterola x, u izračunima računalnog sustava; As = površina pika α-kolestanola; u izračunima računalnog sustava; ms = masa dodanog α-kolestanola, u miligramima; m = masa uzorka korištenog za određivanje, u gramima.

6. IZRAŽAVANJE REZULTATA

6.1. Koncentracije pojedinačnih sterola iskazuju se kao mg/kg masnog materijala, a njihov zbroj kao „ukupni steroli”. Sastav svakog pojedinačnog sterola i eritrodiola i uvaola iskazuje se jednim decimalnim mjestom. Ukupni sastav sterola mora se iskazati bez ijednog decimalnog mjesta.

▼M28

6.2. Izračunati postotak svakog pojedinačnog sterola iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova za sterole: pri čemu je: Ax = površina pika za x; ΣA = ukupna površina pikova za sterole.

▼M26

6.3. Beta-sitosterol: 5-23-stigmastadienol + klerosterol + -sitosterol + sitostanol + 5-avenasterol + 5-24-stigmastadienol.

6.4. Izračunavanje postotka eritrodiola i uvaola: pri čemu je ΣA = zbroj površine sterola u izračunima računalnog sustava; Er = površina eritrodiola u izračunima računalnog sustava; Uv = površina uvaola u izračunima računalnog sustava;









DODATAK

Određivanje linearne brzine plina

U plinski kromatograf postavljen na normalne radne uvjete injektira se između 1 i 3 μl metana (ili propana) i zatim se mjeri vrijeme koje je plinu potrebno da proteče kroz kolonu od trenutka injektiranja do trenutka pojavljivanja pika (tM).

Linearna brzina u cm/s zadana je s L/tM, pri čemu je L duljina kolone u cm, a tM izmjereno vrijeme u sekundama.







Tablica 1. Relativna retencijska vremena za sterole Pik Identifikacija Relativno retencijsko vrijeme SE 54 kolona SE 54 kolona 1 Kolesterol Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Kolestanol 5α-kolestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brasikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 meti Δ5-7-22 kolestatrien 3β-ol 0,78 0,76 4 24-metilen-kolesterol 24-metilen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Kampesterol (24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Kampestanol (24R)-24-metil-kolestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol (24S)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Klerosterol (24S)-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-etil-kolestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-kolesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Eritrodiol 5α olean-12en-3b28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52

Slika 1.

Plinski kromatogram frakcije sterola i triterpenskih alkohola maslinova ulja lampante (dodan unutarnji standard)

Slika 2.

Plinski kromatogram frakcije sterola i triterpenskih alkohola rafiniranog maslinova ulja (dodan unutarnji standard)

Slika 3.

TLC ploča ulja komine maslina sa područjem koja se sastruže za određivanje sterola i triterpenskih alkohola

1 – Skvalen

2 – Triterpen i alifatski alkoholi

3 – Steroli i alifatski dialkoholi

4 – Početak i slobodne masne kiseline

▼M26 —————

▼M21









PRILOG VII.

ODREĐIVANJE POSTOTKA 2-GLICERIL MONOPALMITATA

1. SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE

Ova metoda opisuje postupak za određivanje postotka palmitinske kiseline u položaju 2. na trigliceridima određivanjem 2-gliceril monopalmitata.

Ova metoda se može primijeniti na biljna ulja koja su tekuća na sobnoj temperaturi (20 °C).

2. PRINCIP

Nakon pripreme, uzorak ulja se podvrgava djelovanju pankreasne lipaze: parcijalna i specifična hidroliza u položajima 1. i 3. na molekuli triglicerida uzrokuje pojavu monoglicerida u položaju 2. Postotak 2-gliceril monopalmitata u frakciji monoglicerida se određuje nakon sizlaniziranja kapilarnom plinskom kromatografijom.

3. OPREMA I MATERIJALI

3.1. Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml

3.2. Laboratorijske čaše volumena 100, 250 i 300 ml,

3.3. Staklena kromatografska kolona unutarnjeg promjera 21-33 mm, dužina 400 mm, s pločom od sinter-stakla i pipcem

3.4. Menzure volumena 10, 50, 100 i 200 ml

3.5. Tikvice volumena 100 i 250 ml

3.6. Rotirajući isparivač

3.7. Epruvete za centrifugiranje s konusnim dnom volumena 10 ml s čepom od brušenog stakla

3.8. Centrifuga za epruvete volumena 10 i 100 ml

3.9. Termostat koji omogućava stabilnu temperaturu od 40 ± 0,5 °C

3.10. Graduirane pipete volumena 1 i 2 ml

3.11. Štrcaljka volumena 1 ml

3.12. Mikroštrcaljka volumena 100 μm

3.13. Lijevak volumena 1 000 ml

3.14. Kapilarni plinski kromatograf opremljen hladnim injektorom za neposredno ubrizgavanje uzorka u kolonu i peći koja može održavati odabranu temperaturu u granicama od oko 1 °C

3.15. Hladni injektor na koloni za neposredno ubrizgavanje uzorka u kolonu

3.16. Plameno-ionizacijski detektor i elektrometar

3.17. Snimač-integrator prilagođen elektrometru s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira

3.18. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine 8-12 metara, unutarnjeg promjera 0,25-0,32 mm, prekrivena metilpolisiloksanom ili fenil metilpolisiloksanom 5 %, debljine 0,10-0,30 μm, koja se može koristiti na 370 °C

3.19. Mikroštrcaljka volumena 10 μl s tvrdom iglom (od kaljenog stakla), dužine najmanje 7,5 cm za neposredno ubrizgavanje na koloni.

4. REAGENSI

4.1. Silikagel veličine zrna između 0,063 i 0,200 mm, (70/280 mesh), pripremljen kako slijedi: staviti silikagel u porculansku posudu, osušiti u inkubatoru pri 160 °C četiri sata, potom ga ostaviti da se ohladi u eksikatoru pri sobnoj temperaturi. Dodati 5 % vode na masu silikagela kako slijedi: izvagati 152 g silikagela u Erlenmeyerovu tikvicu, potom dodati 8 g destilirane vode, začepiti i lagano protresti da se voda jednakomjerno rasporedi. Ostaviti da odstoji najmanje 12 sati prije uporabe.

4.2. n-heksan (za kromatografiju)

4.3. Izopropanol

4.4. Izopropanol, 1/1 (v/v) vodena otopina

4.5. Pankreasna lipaza. Mora imati aktivnost između 2,0 i 10 jedinica lipaze po mg. (Pankreasne lipaze s aktivnošću između 2 i 10 jedinica po mg enzima su dostupne na tržištu.)

4.6. Pufer otopina tris-hidroksimetilaminometana: 1 M otopine prilagođene na pH 8, (potenciomentrijska kontrola), koncentracijom HCl (1/1 v/v)

4.7. Natrijev holat, enzimatske kvalitete, vodena otopina 0,1 % (ova otopina se mora iskoristiti u roku od dva tjedna od njezine pripreme)

4.8. Kalcijev klorid, 22 % -tna vodena otopina

4.9. Dietilni eter za kromatografiju

4.10. Otopina za razvijanje: mješavina n-heksana/dietilnog etera (87:13 v:v)

4.11. Natrijev hidroksid, otopina 12 % po težini

4.12. Fenolftalein, 1 %-tna otopina u etanolu

4.13. Plin nosač: vodik ili helij, za plinsku kromatografiju

4.14. Pomoćni plinovi: vodik, čistoće najmanje 99 %, bez vlage i organskih tvari i zraka, za plinsku kromatografiju, iste čistoće

4.15. Reagens za silaniziranje: mješavina piridina/heksametildisilazana, trimetilklorosilana 9/3/1 (v/v/v). (Otopine spremne za uporabu su dostupne na tržištu. Mogu se koristiti drugi reagensi za silaniziranje, posebno bistrimetilsilil trifloracetamid + 1 % trimetilklorosilan, razrijeđen jednakim volumenom bezvodnog piridina.)

4.16. Referentni uzorci: čisti monogliceridi ili mješavine monoglicerida s poznatim postotnom udjelom sličnim uzorku.

5. METODA

5.1. Priprema uzorka

5.1.1. Ulja sa slobodnom kiselošću manjom od 3 % ne treba neutralizirati prije kromatografije na koloni silikagela. Ulja sa slobodnom kiselošću većom od 3 % se moraju neutralizirati kao u točki 5.1.1.1. 5.1.1.1. Uliti 50 g ulja i 200 ml n-heksana u lijevak volumena 1 000 ml (3.13.). Dodati 100 ml izopropanola i količinu otopine 12 % natrijevog nitroksida (4.11.) istovrijednu slobodnoj kiselosti ulja uvećanu za 5 %. Snažno tresti jednu minutu. Dodati 100 ml destilirane vode, ponovo protresti i ostaviti da odstoji. Nakon dekantiranja ukloniti donji sloj koji sadrži sapune. Skinuti međuslojeve (sluz i netopive tvari). Isprati heksansku otopinu neutraliziranog ulja uzastopnim dodavanjem otopine 1/1 (v/v) izopropanol/voda (4.4.) u obrocima od 50-60 ml dok ne nestane ružičasta boja fenolftaleina. Ukloniti najveći dio heksana vakuumskom destilacijom, (pomoću rotacijskog isparivača, na primjer), i prenijeti ulje u tikvicu volumena 100 ml (3.5.). Osušiti ulje u vakuumu dok se otapalo potpuno ne ukloni. Nakon okončanja postupka, kiselost ulja treba biti manja od 0,5 %.

5.1.2. Staviti 1,0 g ulja pripravljenog kao što je gore navedeno u Erlenmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.) i otopiti u 10 ml mješavine za razvijanje (4.10.). Ostaviti otopinu da odstoji najmanje 15 minuta prije kolonske kromatografije sa silikagelom. Ako je otopina mutna, centrifugirati istu kako bi se osigurali optimalni uvjeti za kromatografiju. (Mogu se koristiti kapsule gotovog silikagela SPE od 500 mg pripremljene za uporabu.)

5.1.3. Priprema kromatografske kolone Uliti oko 30 ml otopine za razvijanje (4.10.) u kolonu (3.3.), staviti komad vate u donji dio kolone pomoću staklenog štapića; utisnuti da se ukloni zrak. U laboratorijskoj čaši pripremiti otopinu od 25 g silikagela (4.1.) u približno 80 ml otopine za razvijanje i prenijeti istu u kolonu pomoću lijevka. Provjeriti nalazi li se sav silikagel u koloni; isprati otopinom za razvijanje (4.10.), otvoriti pipac i pustiti da tekućina dostigne razinu od oko 2 mm iznad razine silikagela.

5.1.4. Kolonska kromatografija Točno odvagati 1,0 g uzorka pripremljenog kao u točki 5.1 u Erelnmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.). Rastopiti uzorak u 10 ml otopine za razvijanje (4.10.). Unijeti otopinu u kromatografsku kolonu pripremljenu kao u točki 5.1.3. Izbjeći remećenje površine kolone. Otvoriti pipac i uliti otopinu uzorka dok ne dostigne razinu silikagela. Razviti sa 150 ml otopine za razvijanje. Prilagoditi brzinu protoka na 2 ml/min (tako da 150 ml uđe u kolonu za oko 60-70 minuta). Sakupiti eluat u prethodno izvaganu tikvicu volumena 250 ml. Upariti otopinu pod vakuumom i skinuti konačne tragove otapala pod strujom dušika. Izvagati tikvicu i izračunati dobiven ekstrakt (Ako se koriste kapsule gotovog silikagela SPE spremnog za uporabu, primijeniti sljedeću metodu: staviti 1 ml otopine (5.1.2.) u pripremljene kapsule s 3 ml n-heksana. Nakon filtriranja otopine, razviti s 4 ml n-heksana/dietilnog etera 9/1 (v/v). Sakupiti eluat u epruvetu volumena 10 ml i osušiti pod strujom dušika. Izložiti suhi ostatak pankreasnoj lipazi (5.2.). (Bitno je provjeriti sastav masne kiseline prije i nakon prelaska kapsule SPE.)

5.2. Hidroliza pankreasnom lipazom

5.2.1. Odvagati u epruvetu za centrifugiranje 0,1 g ulja pripremljenog kao u točki 5.1. Dodati 2 ml pufer otopine, (4.6.), 0,5 ml otopine natrijevog holata, (4.7.), i 0,2 ml otopine kalcijevog klorida, dobro promiješati nakon svakog dodavanja. Zatvoriti epruvetu čepom od brušenog stakla i staviti u termostat na 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Dodati 20 mg lipaze, pažljivo protresti, (izbjeći močenje čepa), i staviti epruvetu u termostat na točno dvije minute. Potom ga skinuti, snažno tresti točno 1 minutu i ostaviti da se hladi.

5.2.3. Dodati 1 ml dietilnog etera, začepiti i snažno protresti, potom centrifugirati i prenijeti otopinu etera u čistu, suhu epruvetu pomoću mikroštrcaljke.

5.3. Priprema silaniziranih derivata i plinska kromatografija

5.3.1. Mikroštrcaljkom prenijeti 100 μm otopine, (5.2.3.), u epruvetu s konusnim dnom volumena 10 ml.

5.3.2. Ukloniti otapalo pod blagom strujom dušika, dodati 200 μm reagensa za silaniziranje (4.15.), začepiti epruvetu i ostaviti da stoji 20 minuta.

5.3.3. Nakon 20 minuta, dodati 1 do 5 ml n-heksana (ovisno o kromatografskim uvjetima): dobivena otopina je spremna za plinsku kromatografiju.

5.4. Plinska kromatografija

Radni uvjeti:

— temperatura injektora, (injektor neposredno na koloni), niža od vrelišta otapala (68 °C),

— temperatura detektora: 350 °C,

— temperatura kolone; programiranje temperature peći: 60 °C u trajanju od 1 minute, povećavanje za 15 °C u minuti do 180 °C, potom po 5 °C u minuti do 340 °C, potom 340 °C u trajanju od 13 minuta,

— plin nosač: vodik ili helij, postavljen na linearnu brzinu dostatnu da se dobije rezolucija naznačena na slici 1. Retencijsko vrijeme triglicerida C54 mora biti 40 ± 5 minuta (vidjeti sliku 2.). (Gore naznačeni radni uvjeti su indikativni. Operateri će ih morati optimizirati kako bi dobili željenu rezoluciju. Pik koji odgovara 2-gliceril monopalmitatu mora imati minimalnu visinu jednaku 10 % skale snimača.),

— količina injektirane tvari: 0,5-1 μm otopine n-heksana (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1. Identificiranje pikova

Pojedini monogliceridi mogu se identificirati na temelju svojih retencijskih vremena i usporedbom s onim dobivenim za standardne monogliceridne smjese pod istim uvjetima.

5.4.2. Kvantitativna procjena

Površina svakog pika izračunava se pomoću elektroničkog integratora.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

Postotak gliceril monopalmitata se izračunava iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova monoglicerida, (vidjeti sliku 2.), korištenjem formule:

gliceril monopalmitat (%):

gdje je:

Ax = površina pika koja odgovara gliceril monopalmitatu

ΣΑ = ukupna površina pikova za monogliceride

Rezultat mora biti izražen na jednu decimalu.

7. IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

Izvješće o ispitivanju mora navoditi:

— upućivanje na ovu metodu,

— sve informacije potrebne za punu identifikaciju uzorka,

— rezultat analize,

— svako odstupanje od metode, bilo da je posljedica odluke predmetnih stranaka ili drugog razloga,

— podaci za identifikaciju laboratorija, datum analize i potpis onih koji su odgovorni za analizu.

Slika 1.

Kromatogram proizvoda reakcije silaniziranja dobivenih djelovanjem lipaze na rafinirano maslinovo ulje s dodatkom 20 % esterificiranog ulja (100 %)

Legenda: „acides gras libres” = slobodne masne kiseline; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = rafinirano maslinovo ulje + 20 % esterificirano ulje; „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat.” = nezasićeni 1-2 mono C18

Slika 2.

Kromatogram:

(A) neesterificirano maslinovo ulje, nakon djelovanja lipaze; nakon silaniziranja; pod ovim uvjetima, (kapilarna kolona 8-12 m), frakcija voska se eluira istodobno kao i frakcija diglicerida ili malo nakon nje. Nakon lipaze, sadržaj triglicerida ne smije prijeći 15 % Legenda: 1. = Slobodne masne kiseline 2. = Monogliceridi 3. = Digliceridi 4. = Trigliceridi * = 2-monopalmitin ** = Triglicerid C54

Kromatogram:

(B) neesterificirano ulje nakon djelovanja lipaze; nakon silaniziranja; pod ovim uvjetima, (kapilarna kolona 8-12 m), frakcija voska se eluira istodobno kad i frakcija diglicerida ili malo nakon nje. Nakon lipaze, sadržaj triglicerida ne smije prelaziti 15 %. Legenda: 1. = Slobodne masne kiseline 2. = Monogliceridi 3. = Digliceridi 4. = Trigliceridi * = 2-monopalmitin ** = Triglicerid C54

8. BILJEŠKE

PRIPREMANJE LIPAZE

Lipaze sa zadovoljavajućom aktivnošću su dostupne na tržištu. One se također mogu pripraviti u laboratoriju na sljedeći način:

Ohladite 5 kg svježe svinjske gušterače na 0 °C. Odstranite okolnu krutu mast i vezivno tkivo i sameljite u gustu tekućinu u mikseru. Miješajte pastu s 2,5 litara bezvodnog acetona 4-6 sati, potom centrifugirati. Ekstrahirajte ostatak još tri puta s jednakim volumenom bezvodnog acetona, a zatim dva puta s mješavinom acetona/dietilnog etera (1/1 v/v) i dva puta s dietilnim eterom.

Osušiti ostatak u vakuumu 48 sati da biste dobili stabilan prah koji se može dugotrajno spremiti u hladnjaku, zaštićen od vlage.

PRAĆENJE AKTIVNOSTI LIPAZE

Pripraviti emulziju maslinovog ulja kako slijedi:

U mikseru miješajte 10 minuta mješavinu 165 ml otopine gumi arabike 100 g/l, 15 g zdrobljenog leda i 20 ml prethodno neutraliziranog maslinovog ulja.

Ulijte 10 ml emulzije u laboratorijsku čašu volumena 50 ml, zatim dodajte 0,3 ml otopine natrijevog holata 0,2 g/ml i potom 20 ml destilirane vode.

Stavite laboratorijsku čašu u termostat namješten na 37 °C; umetnite elektrode pH-metra i spiralnu miješalicu.

Biretom dodajte otopinu 0,1 N natrijevog hidroksida, kap po kap, dok se ne dobije pH od 8,3.

Dodajte alikvot vodene suspenzije praha lipaze (0,1 g/ml lipaze). Čim pH-metar pokaže 8,3, uključite zapornu uru i ukapajte otopinu natrijevog hidroksida brzinom kojom se održava pH na 8,3. Očitajte svake minute volumen potrošene otopine.

Zabilježite podatke na x/y grafu s vremenom na osi x i milimetrima potrošene alkalne otopine 0,1 N da se zadrži konstantan pH na y osi. Trebali biste dobiti linearni graf.

Aktivnost lipaze, izražena u jedinicama lipaze po mg, dana je u sljedećoj formuli:

pri čemu je:

A aktivnost lipaze u jedinicama/mg

V broj mililitara otopine 0,1 N natrijevog hidroksida u minuti (izračun iz grafa)

N titar otopine natrijevog hidoksida

m masa u mg ispitne lipaze.

Jedinica lipaze definirana je kao količina enzima koja oslobađa 10 mikroekvivalenata kiseline u minuti.

▼M20 —————

▼M28









PRILOG IX.

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ISPITIVANJE U ULTRALJUBIČASTOM PODRUČJU

UVOD

Spektrofotometrijskim ispitivanjem u ultraljubičastom području mogu se dati informacije o kvaliteti masti, njezinoj očuvanosti i promjenama koje su uzrokovane tehnološkim procesima. Do apsorpcija na valnim duljinama utvrđenima u ovoj metodi dolazi zbog prisutnosti konjugiranih dienskih i trienskih sustava koji nastaju kao posljedica oksidacijskih procesa i/ili postupaka rafiniranja. Te se apsorpcije iskazuju kao specifične ekstinkcije

(ekstinkcija 1 %-tnog masenog udjela otopine masti u određenom otapalu, u kiveti od 10 mm) što se uobičajeno označava s K (naziva se i „koeficijentom ekstinkcije”).

1. OPSEG

U ovom se Prilogu opisuje postupak provođenja spektrofotometrijske analize maslinovog ulja u ultraljubičastom području.

2. PRINCIP METODE

Uzorak se otapa u propisanom otapalu, a sposobnost apsorpcije otopine mjeri se na utvrđenim valnim duljinama u odnosu na čisto otapalo.

Specifične ekstinkcije na 232 nm i 268 nm u izo-oktanu ili na 232 nm i 270 nm u cikloheksanu izračunavaju se za koncentraciju 1 %-tnog masenog udjela u kiveti od 10 mm.

3. OPREMA

3.1. Spektrofotometar pogodan za mjerenja na valnim duljinama ultraljubičaste svjetlosti (220 nm do 360 nm), s mogućnošću očitavanja pojedinačnih nanometrijskih jedinica. Preporučuju se redovite provjere radi postizanja točnosti i obnovljivosti sposobnosti apsorpcije i ljestvica valnih duljina te za rasipnu svjetlost. 3.1.1. Ljestvica valnih duljina: Ona se može provjeriti upotrebom referentnog materijala koji se sastoji od filtra od optičkog stakla koje sadržava holmijev oksid ili otopinu holmijevog oksida (zapečaćen ili nezapečaćen) s jasnim apsorpcijskim frekvencijama. Referentni materijali namijenjeni su provjeri i baždarenju ljestvica valnih duljina vidljivih i ultraljubičastih spektrofotometara s nominalnim spektralnim frekvencijskim širinama od 5 nm ili manje. Mjerenja se provode u odnosu na zrak kao slijepu probu u intervalu valnih duljina od 640 do 240 nm, u skladu s uputama priloženim referentnim materijalima. Provodi se ispravljanje bazne linije s praznim putem snopa pri svakoj promjeni širine procjepa. Standardne valne duljine navedene su u certifikatu referentnog materijala. 3.1.2. Ljestvica apsorpcije: Ona se može provjeriti upotrebom komercijalno dostupnog zapečaćenog referentnog materijala koji se sastoji od kisele otopine kalijeva dikromata u određenim koncentracijama i potvrđenim vrijednostima apsorpcije pri njihovim λmax (četiri otopine kalijeva dikromata u perklornoj kiselini zapečaćenog u četiri UV kvarcne kivete za mjerenje referentne vrijednosti linearnosti i fotometrijske točnosti u UV-području). Otopine kalijevog dikromata mjere se u odnosu na slijepu probu kiseline koja se primjenjuje nakon ispravljanja bazne linije u skladu s uputama priloženim referentnom materijalu. Vrijednosti apsorpcije navedene su u certifikatu referentnog materijala. U cilju provjeravanja odziva fotoćelije i fotomultiplikatora druga je mogućnost postupiti na sljedeći način: odvagnuti 0,2000 g čistog kalijevog kromata za spektrofotometriju i otopiti ga u 0,05 mol/l otopini kalijevog hidroksida u graduiranoj tikvici volumena 1 000 ml i nadopuniti do oznake. Uzeti točno 25 ml dobivene otopine, staviti ju u graduiranu tikvicu volumena 500 ml i razrijediti do oznake upotrebljavajući istu otopinu kalijevog hidroksida. Izmjeriti ekstinkciju tako dobivene otopine na 275 nm, upotrebljavajući otopinu kalijevog hidroksida kao referentnu. Ekstinkcija izmjerena upotrebom kivete od 1 cm treba biti 0,200 ± 0,005.

3.2. Pravokutne kvarcne kivete, s poklopcima, pogodne za mjerenja na valnim duljinama ultraljubičaste svjetlosti (220 do 360 nm) s duljinom optičke putanje od 10 mm. Kivete napunjene vodom ili drugim prikladnim otapalom ne bi trebale pokazivati međusobne razlike u ekstinkciji veće od 0,01 ekstinkcijskih jedinica.

3.3. Odmjerne tikvice od 25 ml s jednom oznakom, klase A.

3.4. Analitička vaga s mogućnošću očitanja uz odstupanje do 0,0001 g

4. REAGENSI

Tijekom analize, osim ako nije drukčije navedeno, upotrebljavati isključivo reagense priznate analitičke čistoće te destiliranu ili demineraliziranu vodu ili vodu jednakovrijedne čistoće.

Otapalo: Izo-oktan (2,2,4-trimetilpentan) za mjerenja na 232 nm i 268 nm i cikloheksan za mjerenja na 232 nm i 270 nm, sa sposobnošću apsorpcije manjom od 0,12 na 232 nm i manjom od 0,05 na 270 nm u odnosu na destiliranu vodu, izmjereno u kiveti od 10 mm.

5. POSTUPAK

5.1. Uzorak mora biti savršeno homogen i bez lebdećih nečistoća. U protivnom, mora ga se profiltrirati kroz papir na temperaturi od približno 30 °C.

5.2. Od tako pripremljenog uzorka precizno odvagnuti približno 0,25 g (uz odstupanje do 1 mg) tako pripremljenog uzorka u graduiranoj tikvici od 25 ml, nadopuniti propisanim otapalom do oznake i homogenizirati. Dobivena otopina mora biti savršeno bistra. Ako je došlo do opalescencije ili zamućenosti, brzo profiltrirati kroz papir. NAPOMENA: U pravilu je masa od 0,25 – 0,30 g dostatna za mjerenja sposobnosti apsorpcije djevičanskog ili ekstra djevičanskog maslinovog ulja na 268 nm i 270 nm. Za mjerenja na 232 nm uobičajeno je potrebno 0,05 g uzorka te se tako u pravilu pripremaju dvije različite otopine. Za mjerenja sposobnosti apsorpcije ulja komine maslina, rafiniranih maslinovih ulja i krivotvorenih maslinovih ulja, a zbog njihove veće sposobnosti apsorpcije, u pravilu je potrebna manja količina uzorka, npr. 0,1 g.

5.3. Prema potrebi ispraviti baznu liniju (220 – 290 nm) otapalom u obje kvarcne kivete (uzorak i referenca), potom napuniti kvarcnu kivetu uzorka dobivenom ispitnom otopinom i izmjeriti ekstinkcije na 232, 268 ili 270 nm u odnosu na otapalo koje je upotrijebljeno kao referenca. Očitane vrijednosti ekstinkcije moraju biti unutar intervala od 0,1 do 0,8 ili unutar linearnog raspona spektrofotometra koji treba provjeriti. Ako nije tako, mjerenja se moraju ponoviti upotrebljavajući, prema potrebi, otopine veće ili manje koncentracije.

5.4. Nakon mjerenja sposobnosti apsorpcije na 268 ili 270 nm izmjeriti sposobnost apsorpcije pri λmax, λmax + 4 i λmax – 4. Te se vrijednosti sposobnosti apsorpcije upotrebljavaju radi određivanja odstupanja u specifičnoj ekstinkciji (ΔΚ). NAPOMENA: smatra se da λmax iznosi 268 nm za izo-oktan koji se upotrebljava kao otapalo te 270 nm za cikloheksan.

6. ISKAZIVANJE REZULTATA

6.1. Zabilježiti specifične ekstinkcije (koeficijente ekstinkcije) na različitim valnim duljinama, izračunate kako slijedi: pri čemu je: Kλ = specifična ekstinkcija na valnoj duljini λ; Eλ = ekstinkcija mjerena na valnoj duljini λ; c = koncentracija otopine u g/100 ml; s = duljina puta kvarcne kivete u cm; iskazano s dva decimalna mjesta.

6.2. Odstupanje specifične ekstinkcije (ΔΚ) Odstupanje apsolutne vrijednosti ekstinkcije (ΔΚ) iskazuje se kao: pri čemu je Km specifična ekstinkcija na valnoj duljini za maksimalnu apsorpciju na 270 nm i 268 nm ovisno o upotrijebljenom otapalu. Rezultati trebaju biti iskazani s dva decimalna mjesta.









PRILOG X.

ODREĐIVANJE METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. OPSEG

Ovim se Prilogom daju smjernice za određivanje plinskom kromatografijom slobodnih i vezanih masnih kiselina u biljnim mastima i uljima nakon njihovog pretvaranja u metilne estere masnih kiselina (engl. fatty acid methyl esters – FAME).

Vezane masne kiseline triacilglicerola (engl. triacylglycerols – TAGs) te, ovisno o metodi esterifikacije, slobodne masne kiseline (engl. free fatty acids – FFA) pretvaraju se u metilne estere masnih kiselina (FAME) koji se određuju kapilarnom plinskom kromatografijom.

Metodom koja je opisana u ovom Prilogu dozvoljava se određivanje FAME-a od C12 do C24, uključujući zasićene, cis- i trans-jednostruko nezasićene i cis- i trans-višestruko nezasićene metilne estere masnih kiselina.

2. PRINCIP

Plinska kromatografija (engl. Gas chromatography – GC) upotrebljava se za kvantitativnu analizu FAME-a. Metilne estere masnih kiselina (FAME) priprema se u skladu s dijelom A. Zatim ih se injektira u injektor u kojem isparavaju. Odjeljivanje FAME-a izvršava se na analitičkoj koloni specifičnog polariteta i duljine. Plameno-ionizacijski detektor (engl. Flame Ionisation Detector – FID) upotrebljava se za uočavanje FAME-a. Uvjeti analize navedeni su u dijelu B.

Vodik ili helij mogu se upotrebljavati kao plin nosač (mobilna faza) u plinskoj kromatografiji FAME-a s FID-om. Vodik ubrzava odjeljivanje i daje oštrije pikove. Stacionarna faza je mikroskopski sloj tankog tekućeg filma na inertnoj čvrstoj površini od kvarca.

Kako prolaze kroz kapilarnu kolonu, hlapivi spojevi koje se analizira međusobno djeluju sa stacionarnom fazom ostavljajući premaz na unutarnjoj površini kolone. Zbog takvog različitog međusobnog djelovanja različitih spojeva oni eluiraju u različito vrijeme koje se naziva retencijskim vremenom spoja za dani skup analitičkih parametara. Usporedba retencijskih vremena upotrebljava se za identifikaciju različitih spojeva.

DIO A.

PRIPREMA METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA IZ MASLINOVOG ULJE I ULJA KOMINE MASLINA

1. OPSEG

U ovom se dijelu navodi način pripreme metilnih estera masnih kiselina. Njime su obuhvaćene metode pripreme metilnih estera masnih kiselina iz maslinovog ulja i ulja komine maslina.

2. PODRUČJE PRIMJENE

Priprema metilnih estera masnih kiselina iz maslinovog ulja i ulja komine maslina vrši se postupkom transesterifikacije s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu na sobnoj temperaturi. Pitanje potrebe za pročišćavanjem uzorka prije transesterifikacije ovisi o sadržaju slobodnih masnih kiselina u uzorku i analitičkom parametru koji treba odrediti, a koji je moguće odabrati u skladu sa sljedećom tablicom:







Kategorija ulja Metoda Djevičansko maslinovo ulje kiselosti ≤ 2,0 % 1. Masne kiseline 2. Trans-masne kiseline 3. ΔECN42 (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi) Rafinirano maslinovo ulje Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja Rafinirano ulje komine maslina Ulje komine maslina Djevičansko maslinovo ulje kiselosti > 2,0 % Sirovo ulje komine maslina 1. Masne kiseline (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi) 2. Trans-masne kiseline (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi) 3. ΔECN42 (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi)

3. METODOLOGIJA

3.1. Transesterifikacija s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu na sobnoj temperaturi

3.1.1. Princip

Metilni esteri formiraju se transesterifikacijom s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu, kao međuprodukti prije nego što nastupi saponifikacija.

3.1.2. Reagensi

3.1.2.1. Metanol koji ne sadržava više od 0,5 % (m/m) vode.

3.1.2.2. Heksan, kromatografske čistoće.

3.1.2.3. Heptan, kromatografske čistoće.

3.1.2.4. Dietilni eter, stabiliziran za analizu.

3.1.2.5. Aceton, kromatografske čistoće.

3.1.2.6. Otapalo za eluiranje za čišćenje ulja kolonskom/SPE kromatografijom, smjesa heksana/dietil etera 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Kalijev hidroksid, otopina u metanolu koncentracije oko 2 mol/l: otopiti 11,2 g kalijevog hidroksida u 100 ml metanola.

3.1.2.8. Silikagel ulošci, 1 g (6 ml) za ekstrakciju na čvrstu fazu.

3.1.3. Oprema

3.1.3.1. Epruvete volumena 5 ml s navojnim čepom s PTFE spojem.

3.1.3.2. Graduirane ili automatske pipete od 2 ml i 0,2 ml.

3.1.4. Pročišćavanje uzoraka ulja

Prema potrebi se uzorak pročišćava prolaskom ulja kroz silikagel uloške za ekstrakciju na čvrstu fazu. Silikagel uložak (3.1.2.8.) se stavi u vakuumski instrument za eluaciju i ispere pod vakuumom sa 6 ml heksana (3.1.2.2.); ispiranje se odvija bez vakuuma. Zatim se otopina ulja (približno 0,12 g) u 0,5 ml heksana (3.1.2.2.) stavi u kolonu. Kad otopina prodre u silikagel, eluira se pod vakuumom s 10 ml smjese heksana/dietil etera (87:13 v/v) (3.1.2.6.). Ukupni eluat se homogenizira i podjeli na dva po volumenu približno jednaka dijela. Alikvot se upari do suhoće rotirajućim isparivačem pod sniženim tlakom na sobnoj temperaturi. Ostatak se otopi u 1 ml heptana te je otopina spremna za analizu masnih kiselina plinskom kromatografijom. Drugi alikvot se upari, a ostatak otopi u 1 ml acetona za analizu triglicerida HPLC metodom, ako je potrebno.

3.1.5. Postupak

U epruvetu s navojnim čepom volumena 5 ml (3.1.3.1.) odvagati oko 0,1 g uzorka ulja. Dodati 2 ml heptana (3.1.2.2.) i protresti. Dodati 0,2 ml otopine kalijevog hidroksida u metanolu (3.1.2.7.), zatvoriti čepom s PTFE spojem, čvrsto zatvoriti i jako tresti 30 sekundi. Ostaviti da se slegne dok se gornja otopina ne razbistri. Dekantirati gornji sloj koji sadržava metilne estere. Heptanska otopina spremna je za injektiranje u plinski kromatograf. Preporučuje se čuvanje otopine u hladnjaku do plinsko-kromatografske analize. Ne preporučuje se čuvanje otopine dulje od 12 sati.

DIO B.

ANALIZA METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1. OPSEG

U ovom se dijelu daju opće smjernice za primjenu kapilarne plinske kromatografije radi utvrđivanja kvalitativnog i kvantitativnog sastava smjese metilnih estera masnih kiselina dobivenih u skladu s metodom utvrđenom u dijelu A.

Ovaj se dio ne primjenjuje na polimerizirane masne kiseline.

2. REAGENSI

2.1. Plin nosač

Inertni plin (helij ili vodik), temeljito osušen, sa sadržajem kisika manjim od 10 mg/kg.

Napomena 1.: Vodikom se može udvostručiti brzina analize, no opasan je. Dostupni su sigurnosni uređaji.

2.2. Pomoćni plinovi

2.2.1. Vodik (čistoće ≥ 99,9 %), bez organskih nečistoća.

2.2.2. Zrak ili kisik, bez organskih nečistoća.

2.2.3. Dušik (čistoće > 99 %).

2.3. Referentni standard

Smjesa metilnih estera čistih masnih kiselina ili metilnih estera masti poznatog sastava, po mogućnosti nalik onoj masne tvari koju se analizira. Cis-izomeri i trans-izomeri oktadecenoičnih, oktadekadienoičnih i oktadekatrienoičnih metilnih estera korisni su za identifikaciju trans-izomera nezasićenih kiselina.

Posebnu pažnju potrebno je posvetiti sprečavanju oksidacije višestruko nezasićenih masnih kiselina.

3. OPREMA

Navedene upute odnose se na uobičajenu opremu koja se upotrebljava za plinsku kromatografiju, uključujući kapilarne kolone i plameno-ionizacijski detektor.

3.1. Plinski kromatograf

Plinski kromatograf treba sadržavati sljedeće elemente.

3.1.1. Sustav za injektiranje

Upotrijebiti sustav za injektiranje s kapilarnim kolonama, u kojem slučaju sustav za injektiranje treba biti izrađen posebno za upotrebu s takvim kolonama. Po vrsti injektor može biti s dijeljenjem uzorka ili bez dijeljenja uzorka u koloni.

3.1.2. Peć

Peć je u stanju zagrijati kapilarnu kolonu na temperaturu od najmanje 260 °C i održavati željenu temperaturu unutar 0,1 °C. Ovaj posljednji zahtjev posebno je važan kad se upotrebljava kvarcna cijev.

U svim se slučajevima preporučuje upotreba zagrijavanja programiranom temperaturom, a posebno za masne kiseline koje imaju manje od 16 atoma ugljika.

3.1.3. Kapilarna kolona

3.1.3.1. Cijev, izrađena od materijala koji je inertan u odnosu prema tvari koja će se analizirati (uobičajeno, staklo ili kvarc). Unutarnji promjer je između 0,20 i 0,32 mm. Unutarnju površinu obrađuje se na odgovarajući način (na primjer pripremanje površine, deaktiviranje) prije nanošenja premaza stacionarne faze. Za masne kiseline i cis- i trans-izomere masnih kiselina dostatna je duljina od 60 m.

3.1.3.2. Prikladne su i vezane odnosno umrežene stacionarne faze tipa polarni polisiloksan (cijanosilikoni). Napomena 2.: Postoji opasnost od mogućnosti da polarni polisiloksani prouzroče poteškoće pri identificiranju i odjeljivanju linolenske kiseline i C20 kiselina. Premazi su tanki, odnosno, od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.3.3. Sastavljanje i kondicioniranje kolone Uvažavati normalne mjere predostrožnosti pri sastavljanju kapilarnih kolona, odnosno namještanje kolone u peći (nositelj), odabir i sastavljanje priključaka (čvrsto zabrtvljeni da ne bi došlo do curenja), pozicioniranje krajeva kolone u injektoru i na detektoru (smanjivanje slobodnog (neiskorištenog) volumena). Kolonu staviti pod struju plina nosača (na primjer 0,3 bar (30 kPa) za kolonu duljine 25 m i unutarnjeg promjera 0,3 mm). Kolonu kondicionirati temperaturnim programiranjem peći na 3 °C/min od temperature okoline na temperaturu koja je 10 °C niža od granične temperature raspadanja stacionarne faze. Održavati ovu temperaturu peći jedan sat, dok se bazna linija ne stabilizira. Vratiti ju na 180 °C da bi radila u izotermnim uvjetima. Napomena 3.: Odgovarajuće unaprijed kondicionirane kolone dostupne su u slobodnoj trgovini.

3.1.4. Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom

3.2. Štrcaljka

Štrcaljka ima maksimalni volumen 10 μl i graduirana je s podjelom po 0,1 μl.

3.3. Sustav prikupljanja podataka

Sustav prikupljanja podataka internetski povezan s detektorima i u kojem se upotrebljava računalni program prikladan za integraciju i normalizaciju pika.

4. POSTUPAK

Aktivnosti opisane u točkama od 4.1. do 4.3. odnose se na upotrebu plameno-ionizacijskog detektora.

4.1. Uvjeti ispitivanja

4.1.1. Odabir optimalnih radnih uvjeta za kapilarne kolone

Zbog učinkovitosti i propusnosti kapilarne kolone odjeljivanje sastojaka i trajanje analize uvelike ovise o brzini protoka plina nosača kroz kolonu. Stoga je potrebno optimizirati radne uvjete djelovanjem na ovaj parametar (ili, jednostavnije, na glavni gubitak kolone), ovisno o tome želi li se poboljšati odjeljivanje ili ubrzati analiza.

Sljedeći su se uvjeti pokazali prikladni za odjeljivanje FAME-ova (C4 do C26). Primjeri kromatograma prikazani su u Dodatku B:







Temperatura injektora: 250 °C Temperatura detektora: 250 °C Temperatura peći: 165 °C (8 min) do 210 °C na 2 °C/min Plin nosač vodik: pritisak na vrhu kolone, 179 kPa Ukupni protok: 154,0 ml/min Omjer razdvajanja: 1:100 Volumen injektiranja: 1 μl

4.1.2. Određivanje rezolucije (vidi Dodatak A)

Izračunati rezoluciju R dva susjedna pika I i II upotrebljavajući sljedeću formulu:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (engl. United States Pharmacopeia),

ili

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (engl. Japanese Pharmacopeia), EP (fr. Pharmacopée Européenne), BP (engl. British Pharmacopeia))

pri čemu je:

d r(I) retencijska udaljenost pika I;

d r(II) retencijska udaljenost pika II;

t r(I) retencijsko vrijeme pika I;

t r(II) retencijsko vrijeme pika II;

ω(I) širina baze pika I;

ω(II) širina baze pika II;

ω0,5 širina pika određenog spoja, na srednjoj visini pika;

Ako je ω(I) ≈ ω(II), izračunati R upotrebljavajući sljedeće formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

pri čemu je:

σ standardno odstupanje (vidi Dodatak A, sliku 1.).

Ako je udaljenost dr između dva pika dr(II) - dr(I) jednaka 4σ, faktor rezolucije R = 1.

Ako dva pika nisu u potpunosti razdvojena, tangente na točkama infleksije dva pika križaju se u točki C. Radi potpunog razdvajanja dva pika udaljenost između dva pika mora biti jednaka:

d r(II) – d r(I) = 6 σ iz čega je R = 1,5 (vidi Dodatak A, sliku 3.).

5. ISKAZIVANJE REZULTATA

5.1. Kvalitativna analiza

Identificirati pikove metilnog estera za uzorak iz kromatograma u Dodatku B., slici 1., ako je potrebno interpolacijom ili njihovom usporedbom s referentnim mješavinama smjesa metilnih estera (kako je navedeno u točki 2.3.).

5.2. Kvantitativna analiza

5.2.1. Određivanje sastava

Izračunati odlomke mase w i pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina, iskazane kao maseni udio metilnih estera, kako slijedi:

5.2.2. Metoda izračunavanja

5.2.2.1. Općeniti slučaj

Izračunati sadržaj danog sastojka i, iskazan kao maseni udio metilnih estera, određivanjem postotka kojega predstavlja površina odgovarajućeg pika u odnosu na zbroj površina svih pikova, upotrebljavajući sljedeću formulu:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemu je:

Ai površina ispod pika pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina i;

ΣA zbroj površina pod svim pikovima svih pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina.

Rezultate se iskazuje s dva decimalna mjesta.

Napomena 4.: Za masti i ulja odlomak mase metilnih estera masnih kiselina jednak je odlomku mase triacilglicerola u gramima na 100 g. U slučajevima u kojima ova pretpostavka nije dopuštena, vidi točku 5.2.2.2.

5.2.2.2. Upotreba korekcijskih faktora

U određenim slučajevima, na primjer kad su prisutne masne kiseline s manje od osam atoma ugljika ili kiselina sa sekundarnim skupinama, vrše se korekcije površine s pomoću specifičnih korekcijskih faktora (Fci). Te se faktore određuje za svaki pojedinačni instrument. U tu se svrhu upotrebljavaju prikladni referentni materijali čiji je sastav masnih kiselina odgovarajućeg raspona.

Napomena 5.: Ti korekcijski faktori nisu identični teoretskim korekcijskim faktorima FID-a koji su navedeni u Dodatku A s obzirom na to da uključuju i radnu učinkovitost sustava za injektiranje itd. Međutim, u slučaju većih razlika treba provjeriti radnu učinkovitost cijelog sustava.

Za ovu referentnu smjesu maseni udio FAME i zadan je sljedećom formulom:

wi = (mi /Σm) × 100

pri čemu je:

m i masa FAME i u referentnoj smjesi;

Σm zbroj masa raznih sastojaka kao FAME-ovi referentne smjese.

Iz kromatograma referentne smjese izraču