A.

Blokirajući ili kompetitivni test ELISA provodi se u skladu sa sljedećim protokolom: Kompetitivna ELISA s pomoću monoklonskog protutijela 3-17-A3 može utvrditi protutijela na sve poznate serotipove virusa bolesti plavog jezika (BTV). Načelo testa je prekid reakcije između antigena virusa bolesti plavog jezika (BTV) i grupno specifičnog monoklonskog protutijela (3-17-A3) dodavanjem pretraživanog seruma. Protutijela na BTV, prisutna u pretraživanom serumu, blokiraju reaktivnost monoklonskog protutijela (Mab) i uzrokuju smanjenje očekivanog obojenja nakon dodavanja enzimom označenog protumišjeg protutijela kromogena/supstrata. Serumi se mogu testirati u jednostrukom razrjeđenju 1:5 (spot test – Dodatak 1.) ili se mogu titrirati (titracija seruma – Dodatak 2.) do završne točke razrjeđenja. Vrijednosti inhibicije iznad 50 % mogu se smatrati pozitivnima. Materijali i reagensi: 1. Odgovarajuće mikrotitarske pločice za test ELISA. 2. Antigen: dostupan u obliku koncentrata ekstrahiranog iz staničnih kultura koji se priprema kao što je opisano dalje u tekstu te skladišti pri temperaturama – 20 °C ili – 70 °C. 3. Blokirajući pufer: fiziološku otopinu puferiranu fosfatom (PBS), koji sadrži 0,3 % BTV negativnoga goveđeg seruma (odraslih goveda), 0,1 % (v/v) Tween-20 (dostupan kao sirup polioksietilen sorbitan monolaurat) u PBS. 4. Monoklonsko protutijelo: 3-17-A3 (dostupno kao supernatant kulture tkiva hibridoma), usmjereno na grupno specifični polipeptid VP7, čuvano pri temperaturi od – 20 °C ili liofilizirano te prije uporabe razrijeđeno u omjeru 1:100 s blokirajućim puferom. 5. Konjugat: protumišji globulin kunića (adsorbiran ili eluiran), konjugiran na peroksidazu hrena i čuvan u tamnom prostoru na 4 °C. 6. Kromogen i supstrat: orto-fenildiamin (kromogen OPD) s konačnom koncentracijom 0,4 mg/ml u sterilnoj destiliranoj vodi. Vodikov peroksid (30 % w/v supstrat) 0,05 % v/v dodan neposredno prije uporabe (5 μl H2O2 na 10 ml OPD). (S OPD-om postupajte pažljivo – nosite gumene rukavice – moguće mutagene tvari). 7. 1-molarna sumporna kiselina: 26,6 ml dodamo u 473,4 ml destilirane vode. (Zapamtite: uvijek dodajte kiselinu u vodu, a nikada vodu u kiselinu). 8. Rotacijska tresilica. 9. Čitač mikropločica testa ELISA (test se može očitati vizualno). Oblik testa Cc: kontrola konjugata (bez seruma/bez monoklonskih protutijela); C++: snažna pozitivna kontrola sa serumom; C+: slaba pozitivna kontrola sa serumom; C-: negativna kontrola sa serumom; Cm: kontrola s monoklonskim protutijelom (bez seruma).



DODATAK 1.: Jednostruko razrjeđenje uzorka (1:5) (40 seruma/pločica) Kontrole Pretraživani serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



DODATAK 2.: Titracija seruma (10 seruma/pločica) Kontrole Pretraživani serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protokol testa: Kontrola konjugata (Cc) : Jažice 1.A i 1.B predstavljaju slijepu kontrolu koja se sastoji od antigena BTV i konjugata. Može se koristiti za namještanje čitača ELISA. Kontrola Mab (Cm) : Stupci 1. i 2. redovi G i H predstavljaju kontrolu s monoklonskim protutijelom i sadržavaju antigen protiv BTV-a, monoklonsko protutijelo i konjugat. Obojenje je najintenzivnije u navedenim jažicama. Srednja vrijednost očitavanja optičke gustoće te kontrole predstavlja vrijednost inhibicije 0 %. Pozitivna kontrola (C++, C+) : Stupci 1. i 2. redovi C-D-E-F. Navedene jažice sadrže antigen protiv BTV-a, snažno pozitivan i slabo pozitivan antiserum protiv BTV-a, Mab i konjugat. Negativna kontrola (C-) : Jažice 2.A i 2.B su negativne kontrole, koje sadrže antigen protiv BTV-a, negativni antiserum protiv BTV-a, Mab i konjugat. Pretraživani serumi : Za opsežna serološka istraživanja i brze orijentacijske testove, kako bi se serumi se mogu pretraživati u jednostrukom razrjeđenju 1:5 (Dodatak 1.). Deset seruma može se pretraživati u rasponu od 1:5 do 1:640 (Dodatak 2.). Na taj se način može približno utvrditi titar protutijela u pretraživanom serumu. Postupak: 1. Razrijedimo antigen na BTV na predtitriranu koncentraciju u PBS stavimo ga nakratko u ultrazvučnu kupelj kako bi se nagomilani virus raspršio (ako ona nije na raspolaganju, snažno pipetiramo) i dodamo 50 μl u sve jažice na pliticu ELISA. Stresemo lijevu i desnu stranu plitice kako bi se antigen ravnomjerno raspršio. 2. Inkubiramo pri temperaturi od 37 °C 60 minuta na rotacijskoj tresilici. Isperemo plitice tri puta, prelijevajući i prazneći jažice nesterilnim PBS-om te ih stavimo na upijajući papir kako bi se osušile. 3. Kontrolne jažice: dodamo 100 μl blokirajućeg pufera u jažice Cc. Dodamo 50 μl pozitivnog i negativnog kontrolnog seruma, pri razrjeđenju 1:5 (10 μl seruma + 40 μl blokirajućeg pufera), u odgovarajuću jažicu C-, C+ i C++. Dodamo 50 μl blokirajućeg pufera u kontrolne jažice Mab. Metoda jednokratne titracije: Svaki pretraživani serum, razrijeđen 1:5 u blokirajućem puferu, dodamo kako bi se udvostručile jažice u stupcima 3. do 12. (10 μl seruma + 40 μl blokirajućeg pufera), ili Metoda titracije seruma: pripremimo serije dvostrukog razrjeđenja svakog pretraživanog uzorka (1:5 do 1:640) u blokirajućem puferu u osam jažica svakog pojedinog stupca od 3. do 12. 4. Nakon dodavanja pretraživanih seruma odmah razrijedimo Mab 1:100 u blokirajućem puferu te dodamo 50 μl u sve jažice na plitici, osim za slijepu kontrolu. 5. Inkubiramo 60 minuta na 37 °C na rotacijskoj tresilici. Isperemo tri puta PBS-om i osušimo. 6. Razrijedimo kunićji protumišji koncentrat na 1:5 000 u blokirajućem puferu i dodamo 50 μl u svaku jažicu na plitici. 7. Inkubiramo 60 minuta na 37 °C na rotacijskoj tresilici. Isperemo tri puta PBS-om i osušimo. 8. Otopimo orto-fenildiamin dihidroklorid (OPD) i netom prije upotrebe dodamo 5 μl 30-postotnog vodikovog peroksida u svakih 10 ml OPD-a. Dodamo 50 μl u svaku jažicu na mikropločici. Pričekamo približno 10 minuta da se razvije obojenje i zaustavimo reakciju s 1-molarne sumporne kiseline (50 μl na jažicu). Moraju se obojiti kontrolne jažice Mab i one jažice u kojima su serumi bez protutijela na BTV. 9. Mikropločice pregledamo vizualno ili spektrofotometričnim čitačem i zapišemo rezultate. Analiza rezultata: S pomoću računalnog programskog paketa ispišemo vrijednost optičke gustoće (OD) i postotke inhibicije (PI) za testne i kontrolne serume, na temelju srednje vrijednosti, zabilježene u kontrolnim jažicama za antigen. Na temelju podataka izraženih kao OD i PI vrijednosti, određujemo je li test obavljen unutar prihvatljivih granica. Gornje kontrolne granice (GKG) i donje kontrolne granice (DKG) za kontrolu Mab (antigeni Mab, bez pretraživanih seruma) nalaze se između OD vrijednosti 0,4 i 1,4. Potrebno je odbaciti svaku pliticu koja ne ispunjava gore navedena mjerila. Ako računalni programski paket nije na raspolaganju, ispišemo vrijednosti OD na pisaču testa ELISA. Izračunamo srednju vrijednost OD za kontrolne jažice za antigen, koja je jednaka 100-postotnoj vrijednosti. Utvrdimo 50-postotnu vrijednost OD i ručno izračunamo pozitivnost i negativnost svakog uzorka. Vrijednost postotka inhibicije (PI) = 100 - (OD od svake pretraživane kontrole/srednja vrijednost OD kontrole za monoklonsko protutijelo (Cm)) × 100. Dvostruke jažice s negativnim kontrolnim serumom i dvostruke jažice za slijepu kontrolu moraju dosegnuti vrijednosti PI između +25 % i – 25 % te između +95 % i +105 %. Ako vrijednosti nisu unutar navedenih granica, to ne znači da je plitica neprihvatljiva, već upućuje na razvoj pozadinske boje. Snažno i slabo pozitivni kontrolni serumi moraju prikazati vrijednosti PI između +81 % i 100 % te između 51 % i 80 %. Dijagnostički je prag za pretraživane serume 50 % (PI 50 % i OD 50 %). Uzorci koji prikazuju vrijednosti PI > 50 % smatraju se negativnima. Uzorci koji imaju vrijednosti PI iznad i ispod praga kod dvostrukih jažica smatraju se sumnjivima; takvi se uzorci mogu ponovno ispitati spot testom i/ili titracijom. Pozitivni se uzorci također mogu titrirati kako bi se utvrdio stupanj pozitivnosti. Vizualno očitavanje: pozitivne i negativne uzorke lako razlikujemo prostim okom; slabije pozitivne ili snažno negativne uzorke teže je ocijeniti prostim okom. Priprema antigena protiv BTV-a (bolesti plavog jezika) za test ELISA: 1. 40 – 60 Rouxouvih stanica protočne stanične linije BHK-21 triput isperemo s Eagle’s Medium bez seruma te ih inficiramo virusom bolesti plavog jezika, serotip 1 Eagle’s Medium bez seruma. 2. Inkubiramo na 37 °C i svaki dan provjerimo citopatski učinak (CPE). 3. Kada su citopatski učinci (CPE) dovršeni u 90 do 100 % u svakoj Rouxovoj stanici protočne stanične linije BHK-21, pokupimo virus otresajući sve stanice priljubljene uz staklo. 4. Centrifugiramo pri 2 000 do 3 000 okr./min. kako bismo peletirali stanice. 5. Odbacimo supernatant i pripremimo novu suspenziju stanica u približno 30 ml PBS-a koji sadrži 1 % „Sarkosyla” i 2 ml fenilmetilsulfonil flourida (lizni pufer). Pri tom stanice mogu stvoriti gel te se može dodati više liznog pufera kako bi se taj učinak smanjio. (Napomena: fenilmetilsulfonil flourid je štetan – postupati krajnje oprezno.) 6. 60 sekundi razbijamo stanice ultrazvučnom sondom amplitude od 30 mikrona. 7. Centrifugiramo 10 minuta pri brzini od 10 000 okretaja u minuti. 8. Supernatant pohranimo na temperaturi od + 4 °C i pripremimo novu suspenziju preostalog staničnog peleta u 10 do 20 ml liznog pufera. 9. Triput obradimo u ultrazvučnoj kupelji i pročistimo te na svakom stupnju pohranimo supernatant. 10. Pripremimo skupni uzorak supernatanta te ga centrifugiramo u Beckmannovoj centrifugi s 30 ml epruvetama i rotorom SW 28, pri 24 000 okr./min. (100 000 g) 120 minuta, pri temperaturi od + 4 °C, na 5 milititarskoj podlozi 40-postotne otopine saharoze (w/v u PBS). 11. Odstranimo supernatant, temeljito isperemo epruvete i pripremimo novu suspenziju peleta u PBS s pomoću ultrazvučne kupelji. Pohranimo antigen u jednakim dijelovima na temperaturi od – 20 °C. Titracija antigena za BTV za ELISA test: Za titraciju antigena za BTV koristi se indirektna ELISA. Dvostruka razrjeđenja antigena titriraju se u odnosu na konstantno razrjeđenje (1/100) monoklonskih protutijela 3-17-A3. Protokol je kako slijedi: 1. Antigen protiv BTV-a razrijeđen u PBS-u u omjeru 1:20 titriramo duž mikrotitarskih plitica u serijama dvostrukog razrjeđenja (50 μl po jažici) s pomoću višekanalne pipete. 2. Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici. 3. Isperemo plitice tri puta PBS-om. 4. Dodamo 50 μl monoklonskog protutijela 3-17-A3 (razrijeđenog u omjeru 1/100) u svaku jažicu na mikrotitarskoj plitici. 5. Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici. 6. Isperemo plitice tri puta PBS-om. 7. U svaku jažicu mikrotitarske plitice dodamo 50 μl kunićjeg protumišjeg globulina, konjugiranog na peroksidazu iz hrena, razrijeđenog na predtitranu optimalnu koncentraciju. 8. Inkubiramo jedan sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici. 9. Dodamo supstrat i kromogen, kao što je prethodno opisano. Prekinemo reakciju nakon 10 minuta dodavanjem 1-molarne sumporne kiseline (50 μl po jažici). Kod kompetitivnog testa ELISA mora biti suvišak monoklonskih protutijela te zato odabiremo razrjeđenje antigena koje leži na titracijskoj krivulji (a ne na ravnini) koja daje približno 0,8 OD nakon 10 minuta.