10.

Prilog IV. zamjenjuje se sljedećim tekstom i dijagramom:



„PRILOG IV. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VOSKA KAPILARNOM PLINSKO-TEKUĆINSKOM KROMATOGRAFIJOM 1. PODRUČJE PRIMJENE Ova metoda opisuje postupak za određivanje sadržaja voska u određenim mastima i uljima, u uvjetima testiranja. Može se posebno primijeniti kako bi se razlikovalo maslinovo ulje dobiveno prešanjem od maslinovog ulja dobivenog ekstrakcijom (ulje komine maslina). 2. PRINCIP Dodaje se odgovarajući interni standard masti ili ulju, potom frakcioniramo pomoću kromatografije na hidratiziranoj koloni od silikagela. Frakcija koja je u početku eluirana u uvjetima testiranja (čija je polarnost slabija od polarnosti triglicerida) vraća se i neposredno analizira kapilarnom plinsko-tekućinskom kromatografijom. 3. OPREMA 3.1. Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml. 3.2. Staklena kromatografska kolona unutarnjeg promjera 15 mm, dužine 30-40 cm. 3.3. Odgovarajući plinsko-tekućinski kromatograf s kapilarnom kolonom i s mogućnosti neposrednoga uvođenja u kolonu, a koji se sastoji iz sljedećeg: 3.3.1. Termostatski kontrolirana peć za kolone, koja može održavati željenu temperaturu unutar 1 °C. 3.3.2. Hladni injektor za direktno unošenje u kolonu. 3.3.3. Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom. 3.3.4. Snimač-integrator kompatibilan s pretvaračem s pojačalom (3.3.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira. 3.3.5. Staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, sa SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom tekućom fazom, s debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm. 3.4. Mikroštrcaljka za izravno unošenje u kolonu volumena 10 μl s čvrsto fiksiranom iglom. 4. REAGENSI 4.1. Silikagel, 70/230 mesh, artikl 7754 Merck. Silikagel staviti na četiri sata u peć na 500 °C. Ostaviti ga da se ohladi i dodati 2 % vode. Dobro protresti da se suspenzija homogenizira. Čuvati na tamnom mjestu najmanje 12 sati prije uporabe. 4.2. n-heksan, za kromatografiju. 4.3. dietilni eter, za kromatografiju. 4.4. n-heptan, za kromatografiju. 4.5. Standardna otopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/v) u heksanu (interni standard). 4.6. Plin nosač: vodik, čistoće za plinsko-tekućinsku kromatografiju. 4.7. Pomoćni plinovi: — vodik, čistoće za plinsko-tekućinsku kromatografiju, — zrak, čistoće za plinsko-tekućinsku kromatografiju. 5. POSTUPAK 5.1. Odvajanje frakcije koja sadrži vosak. 5.1.1. Priprema kromatografske kolone U bezvodnom n-heksanu otopiti 15 g silikagela tretiranog s 2 % vode i unijeti u kolonu. Ostaviti da se samo slegne. Taloženje dovršiti pomoću električne tresilice kako bi se postigla što homogenija kromatografska vrpca. Propustiti 30 ml n-heksana kako bi se odstranile sve eventualne nečistoće. 5.1.2. Kromatografija na koloni U tikvicu volumena 25 ml odvagati točno 500 mg uzorka i dodati odgovarajuću količinu internog standarda, ovisno o pretpostavljenom sadržaju voska, npr. za maslinovo ulje dodati 0,1 mg lauril arahidata, a za ulje komine maslina 0,25 do 0,5 mg. Tako pripremljen uzorak pomoću dva puta po 2 ml n-heksana prenijeti na kromatografsku kolonu pripremljenu u skladu s 5.1. Otapalo ispuštati dok ne dosegne 1 mm iznad gornje razine apsorbenta. Potom započeti kromatografsko eluiranje; skupiti 140 ml mješavine n-heksana/dietilnog etera, u omjeru 99:1 pri brzini protoka od oko 15 kapi svakih 10 sekundi (2,1 ml u minuti). Tako dobivenu frakciju osušiti u rotirajućem isparivaču dok se ne ukloni gotovo svo otapalo. Odstraniti preostala 2 ili 3 ml otapala pomoću slabe struje dušika, potom dodati 10 ml n-heptana. 5.2. Plinsko-tekućinska kromatografska analiza 5.2.1. Pripremni radovi, kondicioniranje kolone 5.2.1.1. Kolonu pripojiti na plinsko-tekućinski kromatograf spajajući ulazni otvor na sustav neposredno na koloni i izlazni otvor na detektor. Provjeriti aparat za plinsko-tekućinsku kromatografiju (funkcioniranje protoka plina, učinkovitost detektora i snimača itd.). 5.2.1.2. Ako se kolone koriste prvi puta, preporučuje se kondicioniranje kolona. Pustiti da kroz kolonu proteče malo plina i potom uključiti plinsko-tekućinski kromatograf. Postupno zagrijavati do temperature koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (napomena). Održavati tu temperaturu barem dva sata, potom dovesti aparat na radne uvjete (reguliranje protoka plina, paljenje plamena, spoj na elektronički snimač, prilagođavanje temperature peći za kolonu, prilagođavanje detektora itd.). Prilagoditi signal na osjetljivost koja je najmanje dvostruko veća od one koja je potrebna za analizu. Bazna linija mora biti linearna, bez pikova i bez bilo kakvih znakova otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje da spojevi između kolone i instrumenta nisu dobro postavljeni; pozitivni otklon ukazuje da kolona nije pravilno kondicionirana. Napomena: Održavati temperaturu kondicioniranja cijelo vrijeme najmanje 20 °C nižom od maksimalne temperature navedene za upotrijebljeni eluent. 5.2.2. Odabir radnih uvjeta 5.2.2.1. Radni su uvjeti uglavnom sljedeći: — temperatura kolone: inicijalno 80 °C, uz povećanje do 120 °C brzinom od 30 °C u minuti, potom se programira da se povećava do 340 °C brzinom od 5 °C u minuti, — temperatura detektora: 350 °C, — linearna brzina plina nosača: vodik, 20 do 35 cm/s, — osjetljivost instrumenta: 4 do 16 puta veća od najmanje atenuacije, — osjetljivost snimača: 1 do 2 mV, od donjeg dijela skale, — brzina papira: 30 cm/h, — količina injektirane tvari: 0,5 – 1 ml otopine. Ovi se uvjeti mogu modificirati u skladu s karakteristikama kolone i plinsko-tekućinskog kromatografa (kako bi se dobilo kromatograme koji odgovaraju sljedećim uvjetima: retencijsko vrijeme internog standarda C32 mora biti 25 ± 2 minute, a najreprezentativniji pik voskova mora biti između 60 i 100 % od donjega dijela skale). 5.2.2.2. Parametre za integraciju pikova potrebno je odrediti na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira. 5.2.3. Provođenje analize 5.2.3.1. Pomoću mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 ml otopine; klip izvući dok se igla ne isprazni. Iglu uvesti u sustav za injektiranje i nakon jedne do dvije sekunde brzo injektirati. Nakon otprilike pet sekundi, lagano izvući iglu. 5.2.3.2. Snimanje provoditi sve dok voskovi nisu u potpunosti eluirani. Bazna linija u svakom trenutku mora zadovoljavati tražene uvjete (5.2.1.2.). 5.2.4. Identificiranje pikova Pikovi se identificiraju pomoću retencijskih vremena uspoređivanjem s mješavinama voskova čije je retencijsko vrijeme poznato, a koji su analizirani u istim uvjetima. Na slici 1 prikazan je kromatogram voskova djevičanskog maslinovog ulja. 5.2.5. Kvantitativna procjena 5.2.5.1. Pomoću integratora odrediti površine pikova koje odgovaraju internom standardu i alifatskim esterima od C40 do C46. 5.2.5.2. Sadržaj voska svakog pojedinog estera u mg/kg masti određuje se prema sljedećoj formuli: pri čemu : Ax = površina pika svakog estera; As = površina pika lauril arahidata; ms = masa dodanog lauril arahidata, u miligramima; m = masa uzorka uzetog za određivanje, u gramima. 6. ISKAZIVANJE REZULTATA Sadržaj pojedinih voskova kao i zbroj tih količina iskazuje se u mg/kg masti.



DODATAK Određivanje linearne brzine plina U plinsko-tekućinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se od 1 do 3 μl metana (propana). Mjeri se vrijeme potrebno za protok plina kroz kolonu od trenutka injektiranja do pojave pika (tM). Linearna brzina u cm/s zadana je formulom L/tM, pri čemu je L duljina kolone izražena u cm, a tM je vrijeme mjereno u sekundama.