Ovaj je dokument samo dokumentacijska pomo ć za čiji sadržaj institucije ne preuzimaju odgovornost.  
►B UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 440/2008  
od 30. svibnja 2008.  
o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i 
Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograni čavanju kemikalija (REACH)  
(Tekst zna čajan za EGP)  
(SL L 142, 31.5.2008., str. 1)  
Promijenio:  
Službeni list  
br. stranica  datum  
►M1 Uredba Komisije (EZ) br. 761/2009 od 23. srpnja 2009.  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Uredba Komisije (EU) br. 1152/2010 od 8. prosinca 2010.  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Uredba Komisije (EU) br. 640/2012 od 6. srpnja 2012.  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Uredba Komisije (EU) br. 260/2014 оd 24. sije čnja 2014.  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Uredba Komisije (EU) br. 900/2014 оd 15. srpnja 2014.  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1
UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 440/2008  
od 30. svibnja 2008.  
o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) 
br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vije ća o registraciji, 
evaluaciji, autorizaciji i ograni čavanju kemikalija (REACH)  
(Tekst zna čajan za EGP)  
KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,  
uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,  
uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 od 18. prosinca 2006. 
Europskog parlamenta i Vije ća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i 
ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za 
kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage 
Uredbe Vije ća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 
kao i Direktive Vije ća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 
93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (  1 ), a posebno njezin članak 13. 
stavak 3.,  
budući da:  
(1) U skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006, na razini Zajednice 
treba usvojiti ispitne metode u svrhu ispitivanja tvari kad su ta ispitivanja potrebna za dobivanje podataka o unutarnjim svoj ­
stvima tvari.
 
(2) U Prilogu V. Direktivi Vije ća 67/548/EEZ od 27. lipnja 1967. o 
usklađivanju zakona i ostalih propisa o razvrstavanju, pakiranju i 
označivanju opasnih tvari (  2 ) utvrđene su metode za odre đivanje 
fizikalno-kemijskih svojstava, toksi čnosti i ekotoksi čnosti tvari i 
pripravaka. Prilog V. Direktivi 67/548/EEZ brisao se Direktivom 2006/121/EZ Europskog parlamenta i Vije ća s učinkom od 
1. lipnja 2008.
 
(3) Ispitne metode sadržane u Prilogu V. Direktivi 67/548/EEZ treba 
ugraditi u ovu Uredbu.  
(4) Ovom se Uredbom ne isklju čuje primjena drugih ispitnih metoda 
pod uvjetom da se primjenjuju u skladu s člankom 13. stavkom 
3. Uredbe 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 2  
( 1 ) SL L 396, 30.12.2006., str. 1. kako je ispravljena u SL L 136, 29.5.2007., str. 3. 
( 2 ) SL L 196, 16.8.1967., str. 1. Direktiva kako je zadnje izmijenjena Direktivom 
2006/121/EZ Europskog parlamenta i Vije ća (SL L 396, 30.12.2006., str. 
850. kako je ispravljena u SL L 136, 29.5.2007., str. 281.
 (5) U oblikovanju ispitnih metoda u potpunosti treba uzeti u obzir 
načela zamjene, smanjenja broja i usavršavanja postupaka u 
kojima se rabe životinje, posebno kad postanu dostupne valjane metode za zamjenu, smanjenje broja ili usavršavanje pokusa na životinjama.
 
(6) Odredbe ove Uredbe u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog 
na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,  
DONIJELA JE OVU UREDBU:  
Članak 1.  
Ispitne metode koje se trebaju primjenjivati u svrhe Uredbe 
1907/2006/EZ utvr đuju se u Prilogu ovoj Uredbi.  
Članak 2.  
Komisija prema potrebi preispituje ispitne metode obuhva ćene ovom 
Uredbom s ciljem zamjene, smanjenja broja ili usavršavanja pokusa na kralježnjacima.
 
Članak 3.  
Sva upućivanja na Prilog V. Direktivi 67/548/EEZ smatraju se upu ćiva­
njima na ovu Uredbu.  
Članak 4.  
Ova Uredba stupa na snagu sljede ćeg dana od dana objave u  Službenom 
listu Europske unije . 
Ona se primjenjuje od 1. lipnja 2008.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 3
 
PRILOG  
DIO A: METODE ZA ODRE ĐIVANJE FIZIKALNO-KEMIJSKIH 
SVOJSTAVA  
SADRŽAJ 
A.1. TEMPERATURA TALJENJA/SKRU ĆIVANJA  
A.2. TEMPERATURA VRENJA  
A.3. RELATIVNA GUSTO ĆA 
A.4. TLAK PARE  
A.5. POVRŠINSKA NAPETOST  
A.6. TOPLJIVOST U VODI  
A.8. KOEFICIJENT RAZDJELJENJA  
A.9. PLAMIŠTE  
A.10.  ZAPALJIVOST (KRUTINE)  
A.11.  ZAPALJIVOST (PLINOVI)  
A.12.  ZAPALJIVOST (U DODIRU S VODOM)  
A.13.  PIROFORNA SVOJSTVA KRUTINA I TEKU ĆINA 
A.14.  EKSPLOZIVNA SVOJSTVA  
A.15.  TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA (TEKU ĆINE I 
PLINOVI)  
A.16.  RELATIVNA TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA ZA 
KRUTINE  
A.17.  SVOJSTVA OKSIDACIJE (KRUTINE)  
A.18.  OP ĆI PROSJEK MOLEKULSKE TEŽINE I RASPODJELA 
MOLEKULSKE TEŽINE POLIMERA  
A.19.  SADRŽAJ MALE MOLEKULSKE TEŽINE U POLIMERIMA  
A.20.  PONAŠANJE POLIMERA U VODI - OTAPANJE/EKSTRAK ­
CIJA  
A.21.  SVOJSTVA OKSIDACIJE (TEKU ĆINE)  
A.22.  ODRE ĐIVANJE SREDNJEGA GEOMETRIJSKOG PROMJERA 
VLAKANA POMO ĆU DULJINE  
▼M4 
A.23.  KOEFICIJENT RAZDJELJENJA (1-OKTANOL/VODA): 
METODA SPOROG MIJEŠANJA  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 4
 
A.1. TEMPERATURA TALJENJA/SKRU ĆIVANJA  
1. METODA  
Većina opisanih metoda zasniva se na Smjernici za ispitivanje 
OECD-a (1). Temeljna na čela navedena su u referencama (2) i (3).  
1.1. UVOD  
Opisane metode i ure đaji koristit će se za odre đivanje temperature 
taljenja tvari, bez ikakvih ograni čenja s obzirom na stupanj njihove 
čistoće. 
Izbor metode ovisi o naravi tvari koja se ispituje. Stoga će ograni­ 
čavajući čimbenik biti činjenica može li se tvar fino usitniti lako, 
teško ili nikako.  
Za neke je tvari primjerenije odre đivati temperature skru ćivanja ili 
očvršćivanja te su u ovu metodu uklju čene i norme za njihovo 
određivanje.  
Ako, zbog posebnih svojstava tvari, niti jedan od navedenih para ­
metara nije prikladan za mjerenje, može biti prikladno izmjeriti to čku 
stinjavanja.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Temperatura taljenja definira se kao temperatura kod koje dolazi do 
faznog prijelaza iz krutog u teku će stanje pod atmosferskim tlakom, 
a ta temperatura idealno odgovara temperaturi skru ćivanja.  
Kako do faznog prijelaza mnogih tvari dolazi unutar temperaturnog 
područja, često se definira kao podru čje taljenja.  
Pretvaranje jedinica (K u °C)  
t = T – 273,15  
t: temperatura u Celzijusima, stupanj Celzijusa (°C)  
T: Termodinami čka temperatura, kelvin (K)  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja 
nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru 
primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.  
Neke tvari za kalibraciju navedene su u referencama (4).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 5
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Određuje se temperatura (temperaturno podru čje) faznog prijelaza iz 
krutog u teku će stanje ili iz teku ćeg u kruto stanje. U praksi, kad se 
uzorak ispitivane tvari zagrijava/hladi pod atmosferskim tlakom, 
određuju se temperature po četne faze taljenja/skru ćivanja i kona čne 
faze taljenja/skru ćivanja. Opisano je pet vrsta metoda, poimence: 
metoda kapilare, metode vru ćih faza, odre đivanja temperature skru ­ 
ćivanja, metode termi čke analize i odre đivanje to čke stinjavanja 
(metoda razvijena za naftne derivate).  
U određenim slučajevima možda je prikladnije mjeriti temperaturu 
skrućivanja nego temperaturu taljenja.  
1.4.1.  Metoda kapilare  
1.4.1.1.  Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki  
Mala koli čina fino usitnjene tvari stavlja se u kapilarnu cjev čicu i 
čvrsto sabije. Cjev čica se zagrijava zajedno s termometrom, a kad 
taljenje zaista zapo čne, porast temperature podešava se na manje od 
oko 1 K/min. Utvr đuju se po četna i kona čna temperatura taljenja.  
1.4.1.2.  Uređaji za mjerenje temperature taljenja u metalnom bloku  
Kao što je opisano u 1.4.1.1., osim što se kapilarna cjev čica i termo ­
metar stavljaju u zagrijani metalni blok i mogu se promatrati kroz otvore u bloku.
 
1.4.1.3.  Detekcija pomo ću fotoćelija 
Uzorak u kapilarnoj cjev čici automatski se zagrijava u metalnom 
cilindru. Zraka svjetlosti usmjerava se kroz tvar, putem otvora u 
cilindru, na precizno kalibriranu foto ćeliju. Opti čka svojstva ve ćine 
tvari taljenjem se mijenjaju iz mutnih u prozirne. Jakost svjetlosti koja dolazi na foto ćeliju pove ćava se i šalje signal za zaustavljanje 
digitalnom pokaziva ču na kojem se temperatura o čitava na otporni ­ 
čkom termometru izvedenom od platine koji se nalazi u komori za 
zagrijavanje. Ova metoda nije prikladna za neke jako obojene tvari.
 
1.4.2.  Vru će faze  
1.4.2.1.  Koflerov vru ći štap  
Koflerov vru ći štap ima dva komada metala razli čite termičke provo­
dljivosti, koji se zagrijavaju elektri čki, s tim da je štap izveden na 
način da je temperaturni gradijent cijelom svojom dužinom gotovo 
linearan. Temperatura vru ćeg štapa može se kretati u podru čju od 
283 do 573 K zahvaljuju ći spravi za o čitavanje temperature koja je 
posebno konstruirana za takav štap, a koja sadrži klizni pokaziva č sa 
strelicom na skali. Kako bi se odredila temperatura taljenja, tvar se postavlja u tankom sloju izravno na površinu vru ćega štapa. Za 
nekoliko sekundi razvija se oštra crta koja razdvaja teku ću od 
krute faze. Temperatura u visini razdjelne crte o čitava se podešava ­
njem pokaziva ča na tu crtu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 6
 
1.4.2.2.  Mikroskop za taljenje  
Za određivanje temperatura taljenja vrlo malih koli čina materijala u 
uporabi je nekoliko mikroskopskih vru ćih faza. U ve ćini se vru ćih 
faza temperatura mjeri osjetljivim termoparom, iako se ponekad 
koriste živini termometri. Tipi čni uređaj za mjerenje temperature 
taljenja mikroskopskom vru ćom fazom ima komoru za zagrijavanje 
koja sadrži metalnu plo čicu na koju se postavlja uzorak na stakalcu. 
Na sredini metalne plo čice nalazi se otvor koji omogu ćava prolaz 
svjetla sa zrcala za osvjetljavanje na mikroskopu. Kad je u upotrebi, 
komora se zatvara staklenom plo čom kako zrak ne bi ulazio u 
područje na kojem se nalazi uzorak.  
Zagrijavanje uzorka regulirano je reostatom. Za vrlo precizna 
mjerenja opti čki anizotropnih tvari može se koristiti polarizirano 
svjetlo.  
1.4.2.3.  Metoda meniska  
Ova se metoda koristi posebno za poliamide.  
Temperatura na kojoj dolazi do pomaka meniska silikonskog ulja, 
zatvorenog izme đu vruće faze i staklenog poklopca postavljenog 
iznad uzorka poliamida koji se ispituje, odre đuje se vizualno.  
1.4.3.  Metoda odre đivanja temperature skru ćivanja  
Uzorak se stavlja u posebnu epruvetu i zatim u ure đaj za odre đivanje 
temperature skru ćivanja. Uzorak se lagano miješa tijekom cijelog 
postupka hla đenja, a temperatura se mjeri u odgovaraju ćim interva ­
lima. Čim temperatura postane stalna u nekoliko o čitavanja, ta se 
temperatura (uz ispravak greške termometra) bilježi kao temperatura 
skrućivanja.  
Obvezno treba izbjegavati pretjerano hla đenje kako bi se održala 
ravnoteža izme đu krute i teku će faze.  
1.4.4.  Termi čka analiza  
1.4.4.1.  Diferencijalna termi čka analiza (DTA)  
Ovom se tehnikom bilježi razlika izme đu temperature tvari i 
temperature referentnog materijala kao funkcije temperature, dok su 
tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom tempera ­
turnom programu. Kad na uzorku do đe do prijelaza koji obuhva ća 
promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim (taljenje) 
ili egzotermnim (skru ćivanje) odstupanjem od osnovne crte zabilje ­ 
žene temperature.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 7
 
1.4.4.2.  Diferencijalna pretražna kalorimetrija (DSC)  
Ovom se tehnikom bilježi razlika izme đu ulaza energije u tvar i u 
referentni materijal, kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. 
Ta energija predstavlja energiju koja je potrebna kako bi se izme đu 
tvari i referentnog materijala postigla nulta temperaturna razlika. Kad na uzorku do đe do prijelaza koji obuhva ća promjenu entalpije, ta se 
promjena pokazuje endotermnim (taljenje) ili egzotermnim (skru ći­
vanje) odstupanjem od osnovne crte zabilježenog protoka topline.
 
1.4.5.  To čka stinjavanja  
Ova je metoda razvijena za primjenu kod naftnih derivata i pogodna 
je za primjenu kod naftnih tvari niskih temperatura taljenja.  
Nakon predgrijavanja, uzorak se hladi odre đenom brzinom i karak ­
teristike protoka ispituju se u intervalima od 3 K. Najniža tempera ­
tura na kojoj se uo čava gibanje tvari bilježi se kao to čka stinjavanja.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Primjenljivost i to čnost razli čitih metoda koje se rabe za odre đivanje 
temperature taljenja/podru čja taljenja navedene su u sljede ćoj tablici:  
TABLICA: PRIMJENLJIVOST METODA  
A. Metode kapilare  
Metoda mjerenja  Tvari koje je 
moguće fino 
usitniti  Tvari koje je teško 
fino usitniti  Temperaturno 
područje Procijenjena 
točnost (  1 ) Postojeće norme  
Uređaji za 
mjerenje tempera ­
ture taljenja u 
kupki  da samo na neke  273 do 573 K  ± 0,3 K  JIS K 0064  
Mjerenje tempera ­
ture taljenja 
metalnim blokom  da samo na neke  293 do 
> 573 K  ± 0,5 K  ISO 1218 (E)  
Detekcija pomo ću 
fotoćelija da nekoliko uz 
primjenu 
uređaja 253 do 573 K  ± 0,5 K  
( 1 ) Ovisno o tipu instrumenta i stupnju čistoće tvari  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 8
 
B. Metode vru ćih faza i metode skru ćivanja  
Metoda mjerenja  Tvari koje je 
moguće fino 
usitniti  Tvari koje je teško 
fino usitniti  Temperaturno 
područje Procijenjena 
točnost (  1 ) Postojeće norme  
Koflerov vru ći 
štap da ne  283 do 
> 573 K  ± 1 K  ANSI/ASTM D 
3451-76  
Mikroskop za 
taljenje  da samo na neke  273 do 
> 573 K  ± 0,5 K  DIN 53736  
Metoda meniska  ne  posebno za 
poliamide  293 do 
> 573 K  ± 0,5 K  ISO 1218 (E)  
Temperatura skru ­ 
ćivanja  da da  223 do 573 K  ± 0,5 K  Npr. BS 4695  
( 1 ) Ovisno o tipu instrumenta i stupnju čistoće tvari  
C. Termi čka analiza  
Metoda mjerenja  Tvari koje je 
moguće fino 
usitniti  Tvari koje je teško 
fino usitniti  Temperaturno 
područje Procijenjena 
točnost (  1 ) Postojeće norme  
Diferencijalna 
termička analiza  da da  173 do 
1 273 K  do 600 K 
± 0,5 K do 
1 273 K 
± 2,0 K  ASTM E 537-76  
Diferencijalna 
pretražna kalori ­
metrija  da da  173 do 
1 273 K  do 600 K 
± 0,5 K do 
1 273 K 
± 2,0 K  ASTM E 537-76  
( 1 ) Ovisno o tipu instrumenta i stupnju čistoće tvari  
D. Točka stinjavanja  
Metoda mjerenja  Tvari koje je 
moguće usitniti  Tvari koje je teško 
fino usitniti  Temperaturno 
područje Procijenjena 
točnost (  1 ) Postojeće norme  
Točka stinjavanja  Za naftne 
derivate i 
naftne tvari  Za naftne deri ­
vate i naftne 
tvari 223 do 323 K  ± 0,3 K  ASTM D 97-66  
( 1 ) Ovisno o tipu instrumenta i stupnju čistoće tvari  
1.6. OPIS METODA  
Postupci gotovo svih ispitnih metoda opisani su me đunarodnim i 
nacionalnim normama (vidjeti Dodatak 1.).  
1.6.1.  Metode s kapilarnom cjev čicom  
Kad su izložene polaganom rastu temperature, za fino usitnjene tvari 
obično vrijede faze taljenja prikazane na slici 1.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 9
 
Slika 1.
  
Tijekom odre đivanja temperature taljenja, temperature se bilježe na 
početku taljenja i u kona čnoj fazi.  
1.6.1.1.  Uređaji za mjerenje temperature taljenja u kupki  
Slika 2. prikazuje standardizirani ure đaj za mjerenje temperature 
taljenja izra đen od stakla (JIS K 0064); sve dimenzije izražene su 
u milimetrima.  
Slika 2.
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 10
 
Tekućina u kupki:  
Treba odabrati odgovaraju ću tekućinu. Izbor teku ćine ovisi o 
temperaturi taljenja koja se odre đuje, npr. teku ći parafin za tempera ­
ture taljenja do 473 K, silikonsko ulje za temperature taljenja do 573 K.
 
Za temperature taljenja iznad 523 K može se upotrijebiti mješavina 
koja se sastoji od tri dijela sumporne kiseline i dva dijela kalijevog 
sulfata (u masenom omjeru). Ako se upotrebljava takva mješavina, 
treba poduzeti odgovaraju će mjere opreza.  
Termometar:  
Treba koristiti samo termometre koji zadovoljavaju uvjete sljede ćih 
ili ekvivalentnih normi:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Postupak:  
Suha tvar fino se usitni u tarioniku, stavlja se u kapilarnu cjev čicu 
koja je stopljena na jednom kraju, na na čin da je nakon čvrstog 
sabijanja razina punjenja otprilike 3 mm. Kako bi se dobio jedno ­
lično sabijen uzorak, kapilarnu cjev čicu treba spustiti s visine od 
otprilike 700 mm kroz staklenu cijev vertikalno na pokazno staklo.  
Napunjena kapilarna cjev čica postavlja se u posudu na na čin da 
srednji dio kuglice termometra ispunjene živom dodiruje kapilarnu 
cjevčicu u dijelu u kojem je smješten uzorak. Kapilarna cjev čica 
obično se uvodi u ure đaj oko 10 K ispod temperature taljenja.  
Tekućina u posudi zagrijava se na na čin da temperatura raste otpri ­
like 3 K/min. Teku ćinu treba miješati. Na oko 10 K ispod o čekivane 
temperature taljenja, brzina porasta temperature podešava se do 
maksimalno 1 K/min.  
Izračun: 
Izračun temperature taljenja je sljede ći: 
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E ) n 
gdje je:  
T = ispravljena temperatura tališta u K  
T D = očitanje temperature na termometru D u K  
T E = očitanje temperature na termometru E u K  
n = broj stupnjeva žive na termometru D u pari koja se pojavljuje 
na površini  
1.6.1.2.  Uređaj za odre đivanje temperature taljenja u metalnom bloku  
Uređaj: 
Dijelovi ure đaja: 
— cilindri čni metalni blok čiji je gornji dio šupalj i oblikuje komoru 
(vidjeti sliku 3.),  
— metalni čep, s dva ili više otvora, za umetanje cjev čica u metalni 
blok, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 11
 
— sustav za zagrijavanje metalnog bloka, koji se uspostavlja primje ­
rice elektri čnim otpornikom ugra đenim u ku ćištu bloka,  
— reostat za regulaciju ulaza energije, ako se rabi elektri čno 
grijanje,  
— četiri prozora od termootpornog stakla na bo čnim stijenkama 
komore, me đusobno dijametralno raspore đena pod pravim 
kutem. Ispred jednog od tih prozora ugra đen je okular za proma ­
tranje kapilarne cjev čice. Druga tri prozora služe za osvjetlja ­
vanje unutrašnjosti ku ćišta pomo ću svjetiljki.  
— kapilarna cjev čica od termootpornog stakla zatvorena na jednom 
kraju (vidjeti 1.6.1.1.).  
Termometar:  
Vidjeti norme spomenute u 1.6.1.1. Mogu se primijeniti i termoelek ­
trični mjerni ure đaji usporedive to čnosti.  
Slika 3.
  
1.6.1.3.  Detekcija pomo ću fotoćelije 
Uređaj i postupak:  
Uređaj se sastoji od metalne komore s automatiziranim sustavom 
zagrijavanja. Tri kapilare pune se kako je opisano u 1.6.1.1. i postav ­
ljaju u pe ć. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 12
 
Kalibracija ure đaja postiže se u nekoliko lineranih pove ćanja 
temperature, a odgovaraju ći porast temperature uga đa se na pret ­
hodno odabranu stalnu linearnu brzinu, zapisiva či pokazuju stvarnu 
temperaturu pe ći i temperaturu tvari u kapilarnim cjev čicama.  
1.6.2.  Vru će faze  
1.6.2.1.  Koflerov vru ći štap  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.2.2.  Mikroskop za taljenje  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.2.3.  Metoda meniska (poliamidi)  
Vidjeti Dodatak.  
Brzina zagrijavanja u postupku odre đivanja temperature tališta 
trebala bi biti manja od 1 K/min.  
1.6.3.  Metode za odre đivanje temperature skru ćivanja  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.4.  Termi čka analiza  
1.6.4.1.  Diferencijalna termi čka analiza  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.4.2.  Diferencijalna pretražna kalorimetrija  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.5.  Odre đivanje to čke stinjavanja  
Vidjeti Dodatak.  
2. PODACI  
U nekim slu čajevima potrebna je korekcija termometra.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— primijenjena metoda,  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće) i prethodne 
mjere pro čišćivanja ako su poduzete,  
— procjena to čnosti.  
Kao temperatura taljenja u izvješ ću se navodi srednja vrijednost 
najmanje dvije izmjere koje se nalaze u podru čju procijenjene to čno­
sti. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 13
 
Ako je razlika izme đu temperatura u po četnoj i kona čnoj fazi taljenja 
unutar granica to čnosti metode, temperatura u kona čnoj fazi uzima se 
kao temperatura taljenja; u protivnom u izvješ ću se navode obje 
temperature.  
Ako se tvar razloži ili sublimira prije nego je postignuta temperatura 
taljenja, u izvješ će se unosi temperatura na kojoj je taj u činak 
opažen.  
U izvješće treba unijeti sve podatke i napomene relevantne za tuma ­ 
čenje rezultata, posebno s obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje 
tvari.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, str. 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, str. 505-515.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 14
 
Dodatak  
Dodatne tehni čke pojedinosti mogu će je naći npr. u sljede ćim normama:  
1. Metode kapilara  
1.1. Ure đaj za odre đivanje temperature taljenja u kupki 
ASTM E 324–69  Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals
 
BS 4634  Method for the determination of 
melting point and/or melting range  
DIN 53181  Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn  
JIS K 00–64  Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2. Ure đaj za odre đivanje temperature taljenja u metalnom bloku 
DIN 53736  Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen  
ISO 1218 (E)  Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  
2. Vru će faze  
2.1. Koflerov vru ći štap 
ANSI/ASTM D 3451–76  Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Mikroskop za taljenje 
DIN 53736  Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen  
2.3. Metoda meniska (poliamidi) 
ISO 1218 (E)  Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133–66  Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51–050  Resines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion” méthode du meni ­
sque 
3. Metode odre đivanja temperature skru ćivanja  
BS 4633  Method for the determination of 
crystallizing  
BS 4695  Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve)  
DIN 51421  Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
 
ISO 2207  Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage  
DIN 53175  Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsiiuren  
NF T 60–114  Point de fusion des paraffines  
NF T 20–051  Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation)  
ISO 1392  Method for the determination of the 
freezing point  
4. Termi čka analiza  
4.1. Diferencijalna termi čka analiza 
ASTM E 537–76  Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal 
analysis  
ASTM E 473–85  Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 16
 
ASTM E 472–86  Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data  
DIN 51005  Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Diferencijalna pretražna kalorimetrija 
ASTM E 537–76  Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal analysis
 
ASTM E 473–85  Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  
ASTM E 472–86  Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data  
DIN 51005  Thermische Analyse, Begriffe  
5. Odre đivanje to čke stinjavanja  
NBN 52014  Echantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: Point de trouble et point d’écoulement limite – 
Monsterneming en ontleding van 
aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
 
ASTM D 97-66  Standard test method for pour point of 
petroleum oils  
ISO 3016  Petroleum oils – Determination of pour 
point ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 17
 
A.2. TEMPERATURA VRENJA  
1. METODA  
Većina opisanih metoda zasniva se na Smjernici za ispitivanje 
OECD-a (1). Temeljna na čela navedena su u referencama (2) i (3).  
1.1. UVOD  
Ovdje opisane metode i ure đaji mogu se primijeniti na teku ćine i 
tvari s niskim talištem, pod uvjetom da kod njih ne dolazi do 
kemijske reakcije ispod temperature vrenja (na primjer: auto-oksidacija, premještanje grupa, degradacija itd.). Metode se mogu primijeniti na čiste i nečiste tekuće tvari.
 
Naglasak se stavlja na metode kod kojih se primjenjuje detekcija 
pomoću fotoćelije i termi čke analize jer te metode omogu ćuju odre­ 
đivanje ne samo temperatura taljenja nego i temperatura vrenja. 
Osim toga, mjerenja se mogu obavljati automatski.  
Prednost „dinami čke metode” je i u tome što pruža mogu ćnost odre ­ 
đivanja tlaka pare bez nužne korekcije temperature vrenja prema 
standardnom tlaku (101,325 kPa) jer se standardan tlak tijekom mjerenja može održavati pomo ću manostata.
 
Napomene:  
Utjecaj ne čistoća na odre đivanje temperature vrenja uvelike ovisi o 
naravi ne čistoće. Ako u uzorku postoje hlapljive ne čistoće, što bi 
moglo utjecati na rezultat, tvar se može pro čistiti.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Standardna temperatura vrenja definira se kao temperatura kod koje 
je tlak pare teku ćine 101,325 kPa.  
Ako se temperatura vrenja ne mjeri kod standardnog atmosferskog 
tlaka, zavisnost tlaka pare o temperaturi može se opisati Clausius-Clapeyronovom jednadžbom:
 
log p ¼ ΔH v 
2,3RT þ konst : 
gdje je:  
p = tlak pare tvari u paskalima  
Δ H v = njezina toplina isparavanja u J mol  -1 
R = univerzalna molarna plinska konstanta = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = termodinami čka temperatura u K  
Temperatura vrenja iskazuje se s obzirom na tlak okoline tijekom 
mjerenja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 18
 
Pretvaranje jedinica  
Tlak (jedinice: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 Mpa  
(„bar” je još dozvoljen, ali se ne preporu ča) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr  
(jedinice „mm Hg” i „Torr” nisu dozvoljene)  
1 atm = standardna atmosfera = 101 325 Pa  
(jedinica „atm” nije dozvoljena)  
Temperatura (jedinice: K)  
t = T – 273,15  
t: temperatura u Celzijusima, stupanj Celzijusa (°C)  
T: Termodinami čka temperatura, kelvin (K)  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari nije potrebno rabiti kod svakog istraživanja nove 
tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru 
primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.  
Neke tvari za kalibraciju mogu se prona ći u metodama navedenim u 
Dodatku.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Pet metoda za odre đivanje temperature vrenja (podru čja vrenja) 
temelji se na mjerenju temperature vrenja, preostale dvije temelje 
se na termi čkoj analizi.  
1.4.1.  Odre đivanje pomo ću ebuliometra  
Ebuliometri su prvobitno konstruirani za odre đivanje molekulske 
težine podizanjem temperature vrenja, ali su prikladni i za to čna 
mjerenja temperature vrenja. Vrlo jednostavan ure đaj opisan je u 
normi ASTM D 1120-72 (vidjeti Dodatak). U tom ure đaju tekućina 
se zagrijava u uvjetima ravnoteže kod atmosferskog tlaka dok ne 
zavri.  
1.4.2.  Dinami čka metoda  
Ova se metoda zasniva na mjerenju temperature na kojoj dolazi do 
ponovne kondenzacije pare, pomo ću odgovaraju ćeg termometra u 
refluksu za vrijeme vrenja. U ovoj metodi tlak se može mijenjati.  
1.4.3.  Odre đivanje temperature vrenja metodom destilacije  
Ova se metoda zasniva na destilaciji teku ćine i mjerenju temperature 
na kojoj dolazi do ponovne kondenzacije pare, te odre đivanju koli ­ 
čine destilata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 19
 
1.4.4.  Metoda prema Siwoloboffu  
Uzorak se zagrijava u epruveti koja je uronjena u teku ćinu toplinske 
kupke. Zataljena kapilarna cjev čica, koja ima zra čni mjehuri ć u 
donjem dijelu, uroni se u epruvetu s uzorkom.  
1.4.5.  Detekcija foto ćelijom  
Primjenjuju ći načelo prema Siwoloboffu, automatsko foto-elektri čno 
mjerenje vrši se pomo ću mjehuri ća koji se dižu.  
1.4.6.  Diferencijalna termi čka analiza  
Ovom se tehnikom bilježi razlika izme đu temperature tvari i 
temperature referentnog materijala kao funkcije temperature, dok su 
tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom tempera ­
turnom programu. Kad na uzorku do đe do prijelaza koji obuhva ća 
promjenu entalpije, ta se promjena pokazuje endotermnim odstupa ­
njem (vrenje) od osnovne crte zabilježene temperature.  
1.4.7.  Diferencijalna pretražna kalorimetrija  
Ovom se tehnikom bilježi razlika izme đu ulaza energije u tvar i u 
referentni materijal, kao funkcije temperature, dok su tvar i referentni materijal podvrgnuti istom kontroliranom temperaturnom programu. Ta energija predstavlja energiju koja je potrebna kako bi se izme đu 
tvari i referentnog materijala postigla nulta temperaturna razlika. Kad 
na uzorku do đe do prijelaza koji obuhva ća promjenu entalpije, ta se 
promjena pokazuje endotermnim odstupanjem (vrenje) od osnovne 
crte zabilježenog protoka topline.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Primjenljivost i to čnost razli čitih metoda koje se rabe za odre đivanje 
temperature vrenja/podru čja vrenja navedene su u tablici 1.  
Tablica 1.:  
Usporedba metoda  
Metoda mjerenja  Procijenjena to čnost Postoje ća norma  
Ebuliometar  ± 1,4 K (do 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (do 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dinamička metoda  ± 0,5 K (do 600 K) (  2 ) 
Postupak destilacije (podru čje 
vrenja)  ± 0,5 K (do 600 K)  ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71  
Prema Siwoloboffu  ± 2 K (do 600 K) (  2 ) 
Detekcija pomo ću fotoćelije ± 0,3 K (do 373 K) (  2 ) 
Diferencijalna termi čka kalorime ­
trija ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K)  ASTM E 537-76  
Diferencijalna pretražna kalorime ­
trija ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K)  ASTM E 537-76  
( 1 ) Ova to čnost vrijedi samo za jednostavan ure đaj kakav je, primjerice, opisan u normi ASTM D 1120-72; može se 
povećati složenijim ure đajima s ebuliometrom. 
( 2 ) Važi samo za čiste tvari. Uporabu u drugim slu čajevima treba posebno opravdati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 20
 
1.6. OPIS METODA  
Postupci nekih ispitnih metoda opisani su u me đunarodnim i nacio ­
nalnim normama (vidjeti Dodatak).  
1.6.1.  Ebuliometar  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.2.  Dinami čka metoda  
Vidjeti ispitnu metodu A.4. za odre đivanje tlaka pare.  
Bilježi se temperatura vrenja koja se opaža kod primijenjenog tlaka 
od 101,325 kPa.  
1.6.3.  Postupak destilacije (podru čje vrenja)  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.4.  Metoda prema Siwoloboffu  
Uzorak se zagrijava u ure đaju za mjerenje temperature taljenja u 
epruveti promjera približno 5 mm (Slika 1.).  
Slika 1. prikazuje tip standardiziranog ure đaja za odre đivanje 
temperature taljenja i vrenja (izra đenog od stakla, sve dimenzije 
izražene su u milimetrima).  
Slika 1.
  
Kapilarna cjev čica (kapilara za odre đivanje vrelišta), zataljena oko 
1 cm iznad donjeg kraja, stavlja se u epruvetu s uzorkom. Ispitivana tvar dodaje se do razine na kojoj je zataljeni dio kapilare ispod površine teku ćine. Epruveta s uzorkom koja sadrži kapilaru za odre ­ 
đivanje vrelišta pri čvršćena je za termometar gumenom trakom ili je 
učvršćena pomo ću bočnog nosa ča (vidjeti sliku 2).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 21
 
Slika 2.  
Načelo prema Siwoloboffu  Slika 3.  
Izmijenjeno na čelo
 
Tekućina kupke odabire se prema temperaturi vrenja. Na temperatu ­
rama do 573 K, može se koristiti silikonsko ulje. Teku ći parafin 
može se koristiti do 473 K. Teku ćina u posudi zagrijava se na 
način da temperatura najprije raste otprilike 3 K/min. Teku ćinu 
treba miješati. Na oko 10 K ispod o čekivane temperature vrenja 
zagrijavanje se smanjuje na na čin da temperatura raste brzinom 
manjom od 1 K/min. Približavanjem temperaturi vrenja, iz kapilare za određivanje vrelišta brzo po činju izlaziti mjehuri ći.
 
Temperatura vrenja je temperatura na kojoj se, kod momentalnog 
hlađenja, niz mjehuri ća zaustavlja, a teku ćina u kapilari naglo 
počinje rasti. Odgovaraju će očitanje na termometru temperatura je 
vrelišta doti čne tvari.  
Kod izmijenjenog na čela (Slika 3.), temperatura vrenja odre đuje se u 
kapilari za odre đivanje temperature taljenja. Kapilara je izdužena u 
tanki vrh duljine oko 2 cm (a) i u nju se usisa mala koli čina uzorka. 
Otvoreni kraj te kapilare zatvara se kad do đe do taljenja na na čin da 
se na kraju stvara mali zra čni mjehuri ć. Tijekom zagrijavanja u 
uređaju za mjerenje temperature taljenja (b), zra čni se mjehuri ć 
širi. Temperatura vrenja odgovara temperaturi kod koje uzorak tvari dostiže razinu površine teku ćine kupke (c).
 
1.6.5.  Detekcija pomo ću fotoćelije 
Uzorak se zagrijava u kapilarnoj cjev čici unutar zagrijavanog 
metalnog bloka.  
Zraka svjetlosti usmjerava se odgovaraju ćim otvorima u bloku kroz 
tvar na precizno kalibriranu foto ćeliju.  
Tijekom porasta temperature uzorka pojedina čni mjehuri ći zraka 
izlaze iz kapilare za odre đivanje vrelišta. Kad je dostignuta tempera ­
tura vrenja, broj mjehuri ća jako se pove ća. To uzrokuje promjenu 
jakosti svjetla koju bilježi foto ćelija i šalje signal za zaustavljanje 
pokazivaču na kojem se o čitava temperatura na otporni čkom termo ­
metru s platinom koji se nalazi u bloku.  
Ova je metoda posebno korisna jer omogu ćuje određivanje tempera ­
tura od sobne temperature prema dolje sve do 253,15 K (- 20 °C) 
bez ikakvih izmjena na ure đaju. Uređaj samo treba uroniti u posudu 
za hlađenje. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 22
 
1.6.6.  Termi čka analiza  
1.6.6.1.  Diferencijalna termi čka analiza  
Vidjeti Dodatak.  
1.6.6.2.  Diferencijalna pretražna kalorimetrija  
Vidjeti Dodatak.  
2. PODACI  
Kod malih odstupanja od standardnog tlaka (maksimalno ± 5 kPa), 
temperature vrenja normaliziraju se na T  n pomoću sljede će 
jednadžbe Sidneya Younga:  
T n = T + (f  T × Δp) 
gdje je:  
Δp = (101,325 – p) (obratiti pozornost na znak)  
P = izmjereni tlak u kPa  
f T = brzina promjene temperature vrenja u zavisnosti od tlaka u 
K/kPa  
T = izmjerena temperatura vrenja u K  
T n = temperatura vrenja ispravljena na standardni tlak u K  
Za mnoge tvari, faktori korekcije temperature, f  T , i jednadžbe za 
njihovo uskla đivanje obuhva ćene su gore navedenim me đunarodnim 
i nacionalnim normama.  
Na primjer, u metodi prema normi DIN 53171 spominju se sljede će 
grube korekcije za otapala koja su sadržana u bojama:  
Tablica 2.  
Faktori korekcije temperature f  T 
Temperatura T (K)  Korektivni faktor f  T (K/kPa)  
323,15  0,26  
348,15  0,28  
373,15  0,31  
398,15  0,33  
423,15  0,35  
448,15  0,37  
473,15  0,39  
498,15  0,41  
523,15  0,4  
548,15  0,45  
573,15  0,47  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 23
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— primijenjena metoda,  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće) i prethodne 
mjere pro čišćavanja ako su poduzete,  
— procjena to čnosti.  
Kao temperatura vrenja u izvješ ću se navodi srednja vrijednost 
najmanje dvije izmjere koje se nalaze u podru čju procijenjene 
točnosti (vidjeti tablicu 1.).  
Treba navesti izmjerene temperature vrenja i njihovu srednju vrijed ­
nost, a podatke o tlaku ili tlakovima kod kojih su mjerenja izvršena 
navesti u kPa. Tlak bi trebao biti blizak standardnom atmosferskom tlaku.
 
U izvješće treba unijeti sve podatke i napomene relevantne za tuma ­ 
čenje rezultata, posebno s obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje 
tvari.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, 
Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Inter ­
science Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 24
 
Dodatak  
Dodatne tehni čke pojedinosti mogu će je naći npr. u sljede ćim normama:  
1. Ebuliometar  
1.1. Ure đaji za mjerenje temperature taljenja u kupki 
ASTM D 1120-72  Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Postupak destilacije (podru čje vrenja)  
ISO/R 918  Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range)  
BS 4349/68  Method for determination of distillation of 
petroleum products  
BS 4591/71  Method for the determination of distilla ­
tion characteristics  
DIN 53171  Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes  
NF T 20-608  Distillation: détermination du rendement 
et de l’intervalle de distillation  
3. Diferencijalna termi čka analiza i diferencijalna pretražna 
kalorimetrija  
ASTM E 537-76  Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis  
ASTM E 473-85  Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis  
ASTM E 472-86  Standard practice for reporting thermoa ­
nalytical data  
DIN 51005  Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 25
 
A.3. RELATIVNA GUSTO ĆA 
1. METODA  
Opisane metode zasnivaju se na Smjernici za ispitivanje OECD-a 
(1). Temeljna na čela navedena su u referenci (2).  
1.1. UVOD  
Opisane metode za odre đivanje relativne gusto će mogu se koristiti za 
krute i za teku će tvari, bez ikakvih ograni čenja s obzirom na stupanj 
njihove čistoće. Rabe se razli čite metode navedene u tablici 1.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Relativna gusto ća D  20 4 krutina ili teku ćina omjer je mase volumena 
tvari koja se ispituje, odre đene na 20 °C, i mase istog volumena 
vode, odre đene na 4 °C. Relativna gusto ća nema jedinice.  
Gustoća, ρ, neke tvari kvocijent je mase, m, i njezinog volumena, v.  
Gustoća, ρ, u SI mjernom sustavu iskazuje se u kg/m  3 . 
1.3. REFERENTNE TVARI (1)(3)  
Referentne tvari nije potrebno rabiti kod svakog istraživanja nove 
tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru 
primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.  
1.4. NA ČELO METODA  
Koriste se četiri kategorije metoda.  
1.4.1.  Metode uzgona  
1.4.1.1.  Hidrometar (za teku će tvari)  
Zadovoljavaju će točno i brzo odre đivanje gusto će može se posti ći 
plutajućim hidrometrima, pomo ću kojih se gusto ća neke teku ćine 
može utvrditi prema dubini uranjanja o čitanjem na stupnjevanoj 
ljestvici.  
1.4.1.2.  Hidrostatska vaga (za teku će i krute tvari)  
Za određivanje gusto će uzorka može se iskoristiti razlika izme đu 
težine ispitivanog uzorka mjerene na zraku i u odgovaraju ćoj teku­ 
ćini (npr. vodi).  
Za krutine, izmjerena gusto ća reprezentativna je samo za odre đeni 
uzorak koji je korišten. Za odre đivanje gusto će tekućina, tijelo 
poznatog volumena, v, važe se prvo na zraku, a zatim u teku ćini. 
1.4.1.3.  Metoda uranjanja tijela (za teku će tvari) (4)  
U ovoj metodi, gusto ća tekućine određuje se iz razlike izme đu rezul­
tata vaganja teku ćine prije i nakon uranjanja tijela poznatog volu ­
mena u teku ćinu koja se ispituje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 26
 
1.4.2.  Metode pomo ću piknometra  
Za krutine ili teku ćine mogu se koristiti piknometri raznih oblika i 
poznatih volumena.  
Gustoća se izračunava iz razlike u težini punog i praznog piknometra 
i njegovog poznatog volumena.  
1.4.3.  Usporedba sa zrakom pomo ću piknometra  (za krutine)  
Gustoća krutine u bilo kojem obliku može se mjeriti na sobnoj 
temperaturi usporedbom plinova piknometrom. Volumen tvari mjeri 
se na zraku ili u inertnom plinu u cilindru varijabilnog kalibriranog volumena. Za izra čun gustoće uzima se jedno mjerenje mase nakon 
završetka mjerenja volumena.
 
1.4.4.  Osciliraju ći denzitometar  (5)(6)(7)  
Gustoća tekućine može se izmjeriti osciliraju ćim denzitometrom. 
Mehanički oscilator konstruiran u obliku U-cijevi vibrira rezo ­
nantnom frekvencijom oscilatora koja ovisi o njegovoj masi. Uvo đe­
njem uzorka mijenja se rezonantna frekvencija oscilatora. Ure đaj 
mora biti kalibriran pomo ću dvije teku ćine poznatih gusto ća. 
Poželjno je odabrati tvari čije su gusto će u rasponu podru čja koje 
se mjeri.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Primjenljivost razli čitih metoda koje se rabe za odre đivanje relativne 
gustoće navedene su u tablici.  
1.6. OPIS METODA  
Norme koje se navode kao primjeri, u kojima se mogu prona ći 
dodatne tehni čke pojedinosti, navedene su u Dodatku.  
Ispitivanja treba provoditi na 20 °C, uz najmanje dva mjerenja.  
2. PODACI  
Vidjeti norme.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— primijenjena metoda,  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće) i prethodne 
mjere pro čišćivanja ako su poduzete.  
Relativna gusto ća D 20 
4 u izvješću se bilježi kako je utvr đeno u 1.2., 
zajedno s fizikalnim stanjem mjerene tvari.  
U izvješće treba unijeti sve informacije i napomene relevantne za 
tumačenje rezultata, posebno s obzirom na ne čistoće i fizikalno 
stanje tvari.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 27
 
Tablica:  
Primjenljivost metoda  
Metoda mjerenja  Gustoća Najve ći mogući 
dinamički 
viskozitet  Postojeće norme  
krutina  teku ćina 
1.4.1.1. Hidrometar  da  5 Pa s  ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050  
1.4.1.2. Hidrostatska vaga  
(a) krutine  da  ISO 1183 (A)  
(b) tekućine da  5 Pa s  ISO 901 i 758  
1.4.1.3. Metoda uranjanja tijela  da  20 Pa s  DIN 53217  
1.4.2. Piknometar  ISO 3507  
(a) krutine  da  ISO 1183 (B), 
NF T 20-053  
(b) tekućine da  500 Pa s  ISO 758  
1.4.3. Usporedba sa zrakom - 
piknometar  da DIN 55990 dio 3. 
DIN 53243  
1.4.4. Osciliraju ći denzitometar  da  5 Pa s  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inter ­
science Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, str. 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, str. 427-430.
 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, str. 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeu ­
gnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeuti ­
sche Industrie, 1975, vol. 37, str. 717 -726.
 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, str. 253-255.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 28
 
Dodatak  
Dodatne tehni čke pojedinosti mogu će je naći npr. u sljede ćim normama:  
1. Metode uzgona  
1.1. Hidrometar 
DIN 12790, ISO 387  Hydrometer; general instructions  
DIN 12791  Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardised 
sizes, designation 
Part III: Use and test  
ISO 649-2  Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose  
NF T 20-050  Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method  
DIN 12793  Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Hidrostatska vaga  
Za krute tvari  
ISO 1183  Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics
 
NF T 20-049  Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids 
other than powders and cellular products 
– Hydrostatic balance method  
ASTM-D-792  Specific gravity and density of plastics by 
displacement  
DIN 53479  Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density  
Za tekuće tvari  
ISO 901  ISO 758  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 29
 
DIN 51757  Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density  
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 i ASTM D 1481-62  
ASTM D 1298  Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method  
BS 4714  Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3. Metoda uronjenog tijela 
DIN 53217  Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of 
density; immersed body method  
2. Metode piknometrom  
2.1. Za teku će tvari 
ISO 3507  Pycnometers  
ISO 758  Liquid chemical products; determination 
of density at 20 °C  
DIN 12797  Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous)  
DIN 12798  Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than l00. 
10 -6 m 2 s -1 at 15 °C)  
DIN 12800  Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798)  
DIN 12801  Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than l00. 
10 -6 m 2 s -1 at 15 °C applicable in parti ­
cular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with 
higher vapour pressure, approximately 
1 bar at 90 °C)
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 30
 
DIN 12806  Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)
 
DIN 12807  Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801)  
DIN 12808  Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture)  
DIN 12809  Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
 
DIN 53217  Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pycnometer
 
DIN 51757  Point 7: Testing of min eral oils and 
related materials; determination of density  
ASTM D 297  Section 15: Rubber products – chemical 
analysis  
ASTM D 2111  Method C: Halogenated organic 
compounds  
BS 4699  Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
 
BS 5903  Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary – stoppered pycnometer 
method  
NF T 20-053  Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 31
 
2.2. Za krute tvari 
ISO 1183  Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics.  
NF T 20-053  Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solidsin powder and liquids – Pyknometric 
method
 
DIN 19683  Determination of the density of soils  
3. Usporedba sa zrakom pomo ću piknometra  
DIN 55990  Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte  
DIN 53243  Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 32
 
A.4. TLAK PARE  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 104 (2004.).  
1.1. UVOD  
Ova izmijenjena verzija metode A 4. (1.) sadrži i jednu dodatnu 
metodu: „Metoda efuzije: izotermalna termogravimetrija”, koja je 
namijenjena tvarima s vrlo niskim tlakom (do 10  –10 Pa). U svjetlu 
potreba za postupcima, posebno kad je u pitanju odre đivanje tlaka 
pare za tvari s niskim tlakom pare, ponovno se ocjenjuju i drugi postupci u okviru ove metode u odnosu na druga podru čja primjene.
 
U termodinami čkoj ravnoteži tlak pare čiste tvari ovisi samo o 
temperaturi. Temeljna na čela opisana su na drugom mjestu (2.) (3.).  
Ne postoji jedinstveni mjerni postupak koji bi se mogao primijeniti 
na cjelokupno podru čje tlakova para, koji se mogu kretati od ispod 
10 –10 sve do 10  5 Pa. Ova metoda obuhva ća osam metoda za 
mjerenje tlaka pare koje se mogu primijeniti u razli čitim podru čjima 
tlaka pare. U tablici 1. dana je usporedba razli čitih metoda s obzirom 
na primjenu i mjerno podru čje. Te se metode mogu primijeniti samo 
na spojeve koji se ne razgra đuju u uvjetima ispitivanja. Ako se tlak 
pare iz tehni čkih razloga ne može odrediti nekom od navedenih 
pokusnih metoda, on se može i procijeniti; preporu čena metoda 
procjene utvr đena je u Dodatku.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Tlak pare tvari definira se kao tlak zasi ćenja iznad krute ili teku će 
tvari.  
Koristi se SI jedinica za tlak, paskal (Pa). U nastavku su navedene i 
druge jedinice koje su se koristile u prošlosti, zajedno s faktorima pretvorbe: 
1 torr
 =  1 mm Hg  =  1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera  =  1,013 × 10  5 Pa 
1 bar  =  10  5 Pa 
Jedinica za temperaturu u SI sustavu je kelvin (K). Za pretvorbu 
Celzijevih stupnjeva u kelvine koristi se sljede ća formula:  
T = t + 273,15  
gdje je T temperatura u kelvinima ili termodinami čka temperatura, a 
t je Celzijeva temperatura.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 33
 
Tablica 1.  
Mjerna metoda  Tvari  Procijenjena 
ponovljivost  Procijenjena 
reproducibilnost  Preporučeno 
područje Kruta tvar  Teku ćina 
Dinamička metoda  nisko talište  da  do 25 % 
od 1 do 5 %  do 25 % 
od 1 do 5 %  od 10  3 Pa 
do 2 × 10  3 Pa 
od 2 × 10  3 Pa 
do 10  5 Pa 
Statička metoda  da  da  od 5 do 10 %  od 5 do 10 %  od 10 Pa 
do 10  5 Pa 
od 10  –2 Pa 
do 10  5 Pa (  1 ) 
Metoda s 
izoteniskopom  da da  od 5 do 10 %  od 5 do 10 %  od 10  2 Pa 
do 10  5 Pa 
Metoda efuzije: 
vaganje tlaka pare  da da  od 5 do 20 %  do 50 %  od 10  –3 do 1 Pa  
Metoda efuzije: 
Knudsenova ćelija da da  od 10 do 
30 %  — od 10  –10 do 1 Pa  
Metoda efuzije: 
izotermalna termogravimetrija
 da da  od 5 do 30 %  do 50 %  od 10  –10 do 1 Pa  
Metoda zasi ćenja 
plina  da da  od 10 do 
30 %  do 50 %  od 10  –10 do 10  3 
Pa 
Metoda vrte ćeg 
rotora  da da  od 10 do 
20 %  — od 10  –4 do 0,5 Pa  
( 1 ) Ako se koristi kapacitivni manometar.  
1.3. NA ČELO ISPITIVANJA  
Tlak pare uglavnom se odre đuje pri razli čitim temperaturama. U 
ograničenom temperaturnom podru čju, logaritam tlaka pare čiste 
tvari linearna je funkcija recipro čne termodinami čke temperature, u 
skladu s pojednostavljenom Clapeyron-Clasiusovom jednadžbom:  
log p ¼ Δ Hv 
2,3 RT þ konst : 
gdje je:  
p = tlak pare u paskalima  
ΔH v = toplina isparavanja u J mol  –1 
R = univerzalna plinska konstanta, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura u K  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 34
 
1.4. REFERENTNE TVARI  
Uporaba referentnih tvari nije obvezna. One prvenstveno služe za 
povremenu provjeru metode te omogu ćuju usporedbu rezultata 
različitih metoda.  
1.5. OPIS METODE  
1.5.1.  Dinami čka metoda (Cottrellova metoda)  
1.5.1.1.  Načelo 
Tlak pare odre đuje se mjerenjem temperature vrenja tvari pri 
različitim zadanim tlakovima izme đu cca 10  3 i 10  5 Pa. Ova se 
metoda preporu čuje i za odre đivanje temperature vrenja. U tu se 
svrhu može koristiti do temperature od 600 K. Temperature vrenja tekućina su za približno 0,1 °C više na dubini od 3 do 4 cm nego na 
površini zbog hidrostatskog tlaka stupca teku ćine. Kod Cottrellove 
metode (4.) termometar se nalazi u pari iznad površine teku ćine, a 
uzavrela se teku ćina neprekidno pumpa preko glave termometra. 
Glava termometra prekrivena je tankim slojem teku ćine koja je u 
ravnoteži s parom pri atmosferskom tlaku. Termometar stoga poka ­
zuje stvarno vrelište bez grešaka zbog pregrijavanja i hidrostatskog tlaka. Izvorna Cottrellova crpka prikazana je na slici 1. Cijev A sadrži uzavrelu teku ćinu. U dno je utisnuta platinasta žica B, koja 
pospješuje ravnomjerno vrenje. Bo čna cjevčica C vodi do konden ­
zatora, dok plašt D onemogu ćuje da hladni kondenzat do đe do 
termometra E. Kad teku ćina u A vrije, mjehuri ći i tekućina koji 
dospiju u lijevak prolaze kroz krakove crpke F i prelijevaju se 
preko tijela termometra.  
Slika 1.
 Slika 2.
  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 35
 
Cottrellova crpka (4.)  
A: Termopar  
B: Vakuumski pufer-volumen  
C: Mjera č tlaka  
D: Vakuum  
E: Mjerna to čka 
F: Grija ći element cca 150 W  
1.5.1.2.  Aparatura  
Na slici 2. prikazana je vrlo to čna aparatura koja radi prema Cottrel ­
lovom na čelu. Ona se sastoji od cijevi s prostorom za vrenje u 
donjem dijelu, hladilom u srednjem dijelu i ispustom i prirubnicom 
u gornjem dijelu. Cottrellova je crpka smještena u prostoru za vrenje koji se zagrijava elektri čnom grija čem. Temperatura se mjeri termo ­
parom s plaštem ili otporni čkim termometrom, koji se umetne kroz 
prirubnicu na vrhu. Ispust je spojen na sustav regulacije tlaka. On se 
sastoji od vakuumske crpke, puferskog volumena, manostata za podešavanje dotoka dušika za regulaciju tlaka i manometra.
 
1.5.1.3.  Postupak  
Tvar se stavi u prostor za vrenje. Odre đeni se problemi mogu javiti u 
slučaju kad krute tvari nisu praškaste, ali to je ponekad mogu će 
riješiti zagrijavanjem rashladnog plašta. Aparatura se zabrtvi kod prirubnice i tvar odzra čuje. Ovom se metodom ne mogu mjeriti 
tvari koje se pjene.
 
Zatim se podesi najniži željeni tlak i uklju či zagrijavanje. Istovre ­
meno se temperaturni senzor priklju či na pisač. 
Ravnoteža je postignuta kad se pri stalnom tlaku bilježi stalna 
temperatura vrenja. Osobito je važno paziti da se izbjegne burno vrenje („bumping”). Osim toga, na hladilu mora do ći do potpune 
kondenzacije. Kod odre đivanja tlaka pare krutih tvari s niskim tali ­ 
štem treba voditi ra čuna da ne do đe do začepljenja kondenzatora.
 
Kad se zabilježi to čka ravnoteže, namjesti se viši tlak. Postupak se 
nastavlja na isti na čin dok se ne do đe do 10  5 Pa (sveukupno 
približno 5 do 10 mjernih to čaka). Za provjeru, to čke ravnoteže 
treba ponoviti pri padaju ćem tlaku.  
1.5.2.  Stati čka metoda  
1.5.2.1.  Načelo 
Kod stati čke metode (5.) tlak pare odre đuje se u termodinami čkoj 
ravnoteži pri zadanoj temperaturi. Ova je metoda prikladna za tvari i 
za višekomponentne teku ćine i krute materijale u podru čju od 10  –1 
do 10  5 Pa, a uz poseban oprez, i u podru čju od 1 do 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 36
 
1.5.2.2.  Aparatura  
Oprema se sastoji od kupelji sa stalnom temperaturom (preciznost 
± 0,2 K), posude za uzorak spojene s vakuumskom cijevi, mano ­
metra i sustava za regulaciju tlaka. Komora s uzorkom (slika 3.a) 
spojena je s vakuumskom cijevi preko ventila i diferencijalnog 
manometra (U-cijev koja sadrži prikladnu manometarsku teku ćinu) 
koji služi kao nulti pokaziva č. U diferencijalnom manometru mogu 
se koristiti živa, silikoni i ftalati, ovisno o podru čju tlaka i kemijskim 
svojstvima ispitivane tvari. Ipak, s obzirom na štetnost za okoliš, 
uporabu žive treba izbjegavati kad god je to mogu će. Ispitivana 
tvar ne smije se primjetno otapati u teku ćini U-cijevi niti s njom 
reagirati. Umjesto U-cijevi može se koristiti mjera č tlaka (slika 3.b). 
Živa se u manometru može koristiti u podru čju od normalnog tlaka 
do 10  2 Pa, dok su silikonske teku ćine i ftalati prikladni za tlakove 
ispod 10  2 Pa do 10 Pa. Postoje i drugi ure đaji za mjerenje tlaka koji 
se mogu koristiti i ispod 10  2 Pa, a membranski kapacitativni mano ­
metri prikladni za zagrijavanje mogu se koristiti čak i ispod 10  –1 . 
Temperatura se mjeri na vanjskoj stijenki posude s uzorkom ili u samoj posudi.
 
1.5.2.3.  Postupak  
Koristeći aparaturu prikazanu na slici 3.a, U-cijev napuni se 
odabranom teku ćinom koja se prije o čitavanja vrijednosti mora 
odzračiti na povišenoj temperaturi. Ispitivana tvar se stavi u apara ­
turu i odzra či na sniženoj temperaturi. U slu čaju višekomponentnih 
uzoraka temperatura mora biti dovoljno niska da ne do đe do 
promjene sastava materijala. Uspostava ravnoteže se može ubrzati miješanjem. Uzorak se može ohladiti teku ćim dušikom ili suhim 
ledom, ali treba paziti da ne do đe do kondenzacije zraka ili teku ćine 
u crpki. Otvori se ventil iznad posude s uzorkom i nekoliko minuta 
provodi usisavanje kako bi se uklonio zrak. Postupak odzra čivanja se 
prema potrebi ponovi više puta.  
Slika 3.a
 Slika 3.b
  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 37
 
Kad se uzorak zagrijava sa zatvorenim ventilom, tlak pare se pove ­ 
ćava. To mijenja ravnotežu teku ćine u U-cijevi. Da bi se povratila 
ravnoteža, u aparaturu se dovodi dušik ili zrak dok se pokaziva č 
diferencijalnog tlaka ne vrati na ništicu. Tlak koji je za to potreban može se o čitati na manometru ili na preciznijem instrumentu. Taj 
tlak odgovara tlaku pare tvari na temperaturi mjerenja. Ako se koristi 
aparatura opisana na slici 3.b, tlak pare može se izravno o čitati.
 
Tlak pare odre đuje se u odgovaraju će malim temperaturnim interva ­
lima (sveukupno približno 5 do 10 mjernih to čaka) do željene maksi ­
malne temperature.  
Za provjeru treba ponoviti mjerenja na niskim temperaturama. Ako 
se vrijednosti dobivene pri ponovljenom mjerenju ne podudaraju s krivuljom za rastu ću temperaturu, mogu ći razlozi su:
 
i. u uzorku još ima zraka (npr. u slu čaju jako viskoznih materijala) 
ili tvari s niskim vrelištem koje se osloba đaju prilikom 
zagrijavanja;  
ii. tvar kemijski reagira u temperaturnom podu čju koje se ispituje 
(npr. razlaganje, polimerizacija).  
1.5.3.  Metoda s izoteniskopom  
1.5.3.1.  Načelo 
Izoteniskop (6.) se temelji na na čelu statičke metode. Kod primjene 
ove metode uzorak se stavlja u balon sa stalnom temperaturom koji 
je spojen na manometar i vakuumsku crpku. Ne čistoće koje su 
hlapljivije od tvari uklanjaju se odzra čivanjem na sniženom tlaku. 
Tlak pare uzorka pri odabranim temperaturama izjedna čava se s 
poznatim tlakom inertnog plina. Izoteniskop je prvobitno izra đen 
za mjerenje tlaka pare nekih teku ćih ugljikovodika, ali je prikladan 
i za ispitivanje krutih tvari. Metoda u pravilu nije prikladna za više ­
komponentne sustave. Sitne greške u rezultatima mogu će su kod 
uzoraka koji sadrže nehlapljive ne čistoće. Preporu čeno podru čje je 
10 2 do 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Aparatura  
Primjer mjernog ure đaja prikazan je na slici 4. Potpun opis može se 
pronaći u ASTM D 2879-86 (6.).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 38
 
1.5.3.3.  Postupak  
Kad se ispituju teku ćine, sama tvar služi kao teku ćina diferencijalnog 
manometra. U izoteniskop stavi se koli čina tekućine koja je potrebna 
da se napuni balon i kra ći krak manometra. Izoteniskop se priklju či 
na vakuumski sustav kako bi se vakuumirao, a zatim napuni duši ­
kom. Pražnjenje i čišćenje sustava treba dvaput ponoviti kako bi se 
uklonio preostali kisik. Napunjeni izoteniskop stavi se u vodoravan 
položaj tako da se uzorak u tankom sloju raširi po balonu i mano ­
metru. Tlak sustava se smanji na 133 Pa i uzorak polako zagrijava dok ne zavrije (uklanjanje otopljenih plinova). Izoteniskop se zatim 
položi tako da se uzorak vrati u balon i napuni kra ći krak manome ­
tra. Tlak se održava na 133 Pa. Izduženi vrh balona s uzorkom se zagrijava na malom plamenu dok se para koja se osloba đa iz uzorka 
ne raširi dovoljno da istisne dio uzorka iz gornjeg dijela balona i 
kraka manometra u manometar, stvaraju ći prostor ispunjen parom u 
kojemu nema dušika. Izoteniskop se zatim stavi u kupelj sa stalnom temperaturom i tlak dušika podešava dok se ne izjedna či s tlakom 
pare uzorka. U ravnoteži je tlak dušika jednak tlaku pare tvari.
 
Slika 4.
  
Kod krutih tvari koriste se manometarske teku ćine kao što su sili ­
konske teku ćine ili ftalati, ovisno o podru čjima tlaka i temperature. 
Odzračena manometarska teku ćina stavi se u proširenje na dužem 
kraku izoteniskopa. Nakon toga se kruta tvar koja se ispituje stavi u 
balon za uzorak i odzra či na povišenoj temperaturi. Izoteniskop se 
zatim nagne tako da manometarska teku ćina može otjecati u U-cijev.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 39
 
1.5.4.  Metoda efuzije: vaganje tlaka pare (7.)  
1.5.4.1.  Načelo 
Uzorak ispitivane tvari se zagrije u maloj pe ći i stavi u vakuumirano 
zvono. Pe ć se prekrije poklopcem na kojemu se nalaze male rupice 
poznatoga promjera. Para tvari koja izlazi kroz jednu od rupica usmjeri se u zdjelicu vrlo osjetljive vage, koja je tako đer smještena 
u zvonu. Kod nekih je izvedbi zdjelica vage uložena u ku ćište za 
hlađenje, koje procesom vo đenja topline osigurava rasap topline 
prema van, i hladi se isijavanjem, tako da se izlaze ća para na njoj 
kondenzira. Moment mlaza pare djeluje kao sila na vagu. Tlak pare 
može se odrediti na dva na čina: izravno iz sile koja djeluje na 
zdjelicu vage ili iz brzine isparavanja pomo ću Hertz-Knudsenove 
jednadžbe (2.):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10 3 
M r 
gdje je:  
G = brzina isparavanja (kg s  –1 m –2 ) 
M = molarna masa (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K)  
R = univerzalna plinska konstanta (J mol  –1 K –1 ) 
P = tlak pare (Pa)  
Preporučeno podru čje je 10  –3 do 1 Pa.  
1.5.4.2.  Aparatura  
Opće načelo aparature prikazano je na slici 5.  
Slika 5.
  
A: Postolje  F:  Kućište i palica za hla đenje 
B: Instrument s pomi čnom zavoj ­
nicom  G: Peć za isparavanje  
C: Zvono  H:  Dewarova posuda s teku ćim dušikom  
D: Vaga sa zdjelicom  I:  Mjerenje temperature uzorka  
E: Vakuumski mjerni ure đaj J:  Ispitivana tvar  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 40
 
1.5.5.  Metoda efuzije: Knudsenova ćelija 
1.5.5.1.  Načelo 
Metoda se temelji na procjeni mase ispitivane tvari koja u obliku 
pare istje če kroz mikrootvor Knudsenove ćelije (8.) u jedinici 
vremena u uvjetima ultravakuuma. Masa pare može se dobiti odre ­ 
đivanjem gubitka mase ćelije ili kondenzacijom pare na niskoj 
temperaturi i kromatografskim odre đivanjem koli čine tvari koja je 
prešla u paru. Tlak pare izra čunava se primjenom 
Hertz-Knudsenovog odnosa (vidi odjeljak 1.5.4.1.) uz faktore korek ­
cije koji ovise o parametrima aparature (9.). Preporu čeno podru čje je 
10 –10 do 1 Pa (10.) (11.) (12.) (13.) (14.).  
1.5.5.2.  Aparatura  
Opće načelo aparature prikazano je na slici 6.  
Slika 6.
  
1: Priklju čak na vakuum  7:  Poklopac na navoj  
2: Otvori platinastog otporni čkog termo ­
metra ili mjerenje i nadzor temperature  8: Krilne matice  
3: Poklopac vakuumskog spremnika  9:  Vijci  
4: O-prsten  10:  Efuzijske ćelije od nehr đajućeg čelika  
5: Aluminijski vakuumski spremnik  11:  Grijaća patrona  
6: Uređaj za postavljanje i skidanje efuzij ­
skih ćelija ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 41
 
1.5.6.  Metoda efuzije: izotermalna termogravimetrija  
1.5.6.1.  Načelo 
Metoda se temelji na odre đivanju brzina ubrzanog isparavanja ispi ­
tivane tvari pri povišenim temperaturama i okolnom tlaku primjenom termogravimetrije (10.) (15.) (16.) (17.) (18.) (19.) (20.). Brzine isparavanja v
 T dobivaju se izlaganjem odabranog spoja atmosferi 
spore struje inertnog plina i pra ćenjem gubitka mase pri definiranim 
izotermalnim temperaturama T u kelvinima u odgovaraju ćim 
vremenskim razdobljima. Tlakovi pare p  T izračunavaju se iz vrijed ­
nosti v  T na temelju linearnog odnosa izme đu logaritma tlaka pare i 
logaritma brzine isparavanja. Ako je to potrebno, može se napraviti 
ekstrapolacija na temperature od 20 i 25 °C regresijskom analizom log p
 T u ovisnosti o 1/T. Ova je metoda prikladna za tvari s niskim 
tlakom pare čak do 10  –10 Pa (10  –12 mbar), s time da čistoća tvari 
mora biti blizu 100 % kako bi se izbjeglo pogrešno tuma čenje 
izmjerenih gubitaka mase.  
1.5.6.2.  Aparatura  
Opće načelo pokusne aparature prikazano je na slici 7.  
Slika 7.
  
Preko nosa ča uzorka obješenog na mikrovagi u komori s nadziranom 
temperaturom pušta se struja suhog plinovitog dušika koja sa sobom 
odnosi molekule pare ispitivane tvari. Plinska struja po izlasku iz 
komore pro čišćava se u sorpcijskoj jedinici.  
1.5.6.3.  Postupak  
Ispitivana se tvar homogeno nanese na površinu hrapave staklene 
ploče. U slučaju krutih tvari, plo ča se jednoliko navlaži otopinom 
tvari u prikladnom otapalu i osuši u inertnoj atmosferi. Kod mjere ­
nja, ploča s premazom objesi se u termogravimetrijski analizator i 
nakon toga gubitak mase neprekidno mjeri u ovisnosti o vremenu.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 42
 
Brzina isparavanja v  T pri određenoj temperaturi izra čunava se iz 
gubitka mase Δm ploče s uzorkom pomo ću sljedeće formule:  
v T ¼ Δm 
F · t gcm Ä2 h Ä1 Ä Ö  
gdje je F površina nanesene ispitivane tvari, u pravilu površina plo če 
s uzorkom, a t je vrijeme gubitka mase Δm. 
Tlak pare p  T izračunava se na temelju funkcije brzine isparavanja v  T : 
Log p  T = C + D · log v  T 
gdje su C i D specifi čne konstante pokusne aparature koje su ovisne 
o promjeru mjerne komore i brzini protoka plina. Te se kostante 
određuju jedanput mjerenjem niza spojeva poznatog tlaka pare i 
regresijom log p  T u ovisnosti o log v  T (11.) (21.) (22.).  
Odnos izme đu tlaka pare p  T i temperature T u kelvinima proizlazi iz 
sljedeće formule:  
Log p  T = A + B · 1/T 
gdje su A i B konstante dobivene regresijom log p  T u ovisnosti o 
1/T. Uz pomo ć ove jednadžbe tlak pare može se ekstrapolirati na 
bilo koju drugu temperaturu.  
1.5.7.  Metoda zasi ćenja plina  (23.)  
1.5.7.1.  Načelo 
Inertni se plin pri sobnoj temperaturi provodi kroz uzorak ispitivane 
tvari ili prevodi preko njega poznatom brzinom koja mora biti 
dovoljno niska da se postigne zasi ćenje. Postizanje zasi ćenja u plin ­
skoj fazi je od presudne važnosti. Tvar koja putuje s plinom odvaja 
se uglavnom pomo ću sorbensa i odre đuje njezina koli čina. Za kvan ­
titativno odre đivanje prenesenog materijala se umjesto odvajanja pare 
i naknadne analize mogu koristiti integrirani analiti čki postupci, kao 
što je plinska kromatografija. Kod izra čunavanja tlaka pare polazi se 
od pretpostavke da vrijedi zakon o idealnom plinu i da je ukupni tlak 
smjese plinova jednak zbroju tlakova plinskih komponenti. Parcijalni tlak ispitivane tvari tj. tlak pare izra čunava se iz poznatog ukupnog 
volumena plina i mase prenesenog materijala.
 
Postupak zasi ćenja plina može se primijeniti na krute i teku će tvari. 
On se može koristiti za tlak pare do najmanje 10  –10 Pa (10.) (11.) 
(12.) (13.) (14.). Metoda je najpouzdanija pri tlakovima pare ispod 
10 3 Pa. Iznad 10  3 Pa općenito se dobivaju precijenjene vrijednosti 
tlaka pare, vjerojatno zbog tvorbe aerosola. Budu ći da se mjerenja 
tlaka pare provode na sobnoj temperaturi, nema potrebe za ekstra ­
polacijom podataka od visokih temperatura koja bi mogla dovesti do 
ozbiljnih grešaka.  
1.5.7.2.  Aparatura  
Postupak zahtijeva korištenje ku ćišta sa stalnom temperaturom. 
Shema na slici 8. prikazuje ku ćište u koje su smještena tri drža ča 
za krute uzorke i tri drža ča za teku će uzorke, što omogu ćuje isto­
vremenu analizu tri kruta uzorka ili tri teku ća uzorka. Temperatura se 
održava unutar ± 0,5 °C ili manje.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 43
 
Slika 8.
  
Kao inertni plin nositelj obi čno se koristi dušik, ali ponekad može biti 
potreban i neki drugi plin (24.). Plin nositelj mora biti suh. Plinska se struja podijeli u 6 manjih struja koje se reguliraju igli čnim ventilima 
(otvora približno 0,79 mm), i odvodi u ku ćište bakrenim cijevima 
unutarnjeg promjera 3,8 mm. Kad se temperatura uravnoteži, plin 
protječe kroz uzorak i odvaja č sa sorbensom te izlazi iz ku ćišta.
 
Kruti se uzorci stavljaju u staklenu cjev čicu unutarnjeg promjera 5 mm 
između čepova od staklene vune (vidi sliku 9.). Na slici 10. prikazan je 
držač tekućeg uzorka i sustav sorbensa. Najobnovljivije mjerenje tlaka 
pare tekućina postiže se ako se teku ćina nanese na staklene kuglice ili na 
inertni sorbens, kao što je silikagel, i drža č napuni kuglicama. Druga 
mogućnost je da se plin nositelj prevodi preko grubog metalnog sita i 
propuhuje kroz kolonu teku će ispitivane tvari.  
Slika 9.
  Slika 10.
  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 44
 
Sustav sorbensa se sastoji od prednjeg i pomo ćnog dijela. Pri vrlo 
niskom tlaku pare, sorbens zadržava tek male koli čine tvari i adsorp ­
cija na staklenoj vuni i staklenoj cjev čici između uzorka i sorbensa 
može predstavljati ozbiljan problem.  
Odvajači hlađeni krutim CO  2 još su jedan u činkovit na čin skupljanja 
isparenog materijala. Oni ne stvaraju protutlak na koloni za zasi će­
nje, a odvojeni se materijal može lako kvantitativno ukloniti.  
1.5.7.3.  Postupak  
Brzina protoka izlaznog plina nositelja mjeri se pri sobnoj tempera ­
turi. Tijekom pokusa treba često provjeravati brzinu protoka kako bi 
se dobila to čna vrijednost ukupnog volumena plina nositelja. 
Poželjno je neprekidno pra ćenje mjera čem protoka mase. Za zasi ­ 
ćenje plinovite faze ponekad je potrebno dugo vrijeme kontakta, a 
time i prili čno male brzine protoka plina (25.).  
Na kraju pokusa prednji i pomo ćni dio sorbensa zasebno se analizi ­
raju. Spoj se iz svakog dijela desorbira dodavanjem otapala. Nastale se otopine kvantitativno analiziraju radi odre đivanja desorbirane 
mase iz svakog dijela. Izbor metode analize (tako đer i izbor sorbensa 
i desorpcijskog otapala) ovisi o vrsti ispitivanog materijala. U činko­
vitost desorpcije odre đuje se ubrizgavanjem poznate koli čine uzorka 
na sorbens, desorbiranjem tvari i analiziranjem dobivene koli čine. 
Važno je da se kod provjere u činkovitosti desorpcije koristi koncen ­
tracija koja je jednaka ili sli čna koncentraciji uzorka u ispitnim 
uvjetima.
 
Da bi se osiguralo zasi ćenje plina nositelja ispitivanom tvari, koriste 
se tri razli čite brzine protoka plina. Ako se izra čunani tlak pare ne 
mijenja s promjenom brzine protoka, smatra se da je plin zasi ćen. 
Tlak pare izra čunava se pomo ću sljedeće jednadžbe:  
p ¼ m 
V Ü RT 
M 
gdje je:  
p = tlak pare (Pa)  
m = masa isparene ispitivane tvari (g)  
V = volumen zasi ćenog plina (m  3 ) 
R = univerzalna plinska konstanta 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K)  
M = molarna masa ispitivane tvari (g mol  –1 ) 
Izmjerene volumene treba ispraviti za razliku u tlaku i temperaturi 
između mjerača protoka i zasi ćivača. ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 45
 
1.5.8.  Metoda vrte ćeg rotora  
1.5.8.1.  Načelo 
U ovoj se metodi koristi rotiraju ći viskozimetar čiji se mjerni 
element sastoji od male čelične kuglice obješene u magnetskom 
polju koja se vrti pod utjecajem okretnih polja (26.) (27.) (28.). Prijemne zavojnice omogu ćuju mjerenje brzine vrtnje. Kad kuglica 
postigne odre đenu brzinu vrtnje, obi čno oko 400 okretaja u sekundi, 
pobuda se prekida i nastupa usporavanje zbog trenja plina. Opadanje brzine vrtnje mjeri se u ovisnosti o vremenu. Tlak pare se izvodi iz usporavanja čelične kuglice, koje ovisi o tlaku. Preporu čeno podru čje 
je od 10
 –4 do 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Aparatura  
Raspored pokusne aparature prikazan je na slici 11. Mjerna se glava 
nalazi u ku ćištu sa stalnom temperaturom koja se regulira s to čnošću 
od 0,1 °C. Posuda s uzorkom stavi se u zasebno ku ćište gdje je 
temperatura tako đer regulirana s to čnošću od 0,1 °C. Svi ostali dije ­
lovi aparature se drže na višoj temperaturi kako bi se sprije čila 
kondenzacija. Čitava aparatura je spojena na visokovakuumski 
sustav.  
Slika 11.
  
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Tlak pare kod svake od prethodnih metoda treba odrediti za 
najmanje dvije temperature. Poželjno je odabrati tri ili više tempera ­
tura u podru čju od 0 do 50 °C kako bi se provjerila linearnost 
krivulje tlaka pare. U slu čaju metode efuzije (Knudsenova ćelija i 
izotermalna termogravimetrija) i metode zasi ćenja plina, za mjerenje 
se umjesto temperaturnog podru čja od 0 do 50 °C preporu čuje 
područje od 120 do 150 °C.  
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju sadrži sljede će informacije:  
— primijenjenu metodu,  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 46
 
— točnu specifikaciju tvari (identitet i ne čistoće) i (prema potrebi) 
postupak prethodnog pro čišćavanja,  
— najmanje dvije vrijednosti tlaka pare i temperature – poželjno je 
tri ili više – u podru čju između 0 i 50 °C (odnosno od 120 do 
150 °C),  
— najmanje jedna temperatura treba biti 25 °C ili niža, ako je to 
tehnički izvedivo kod odabrane metode,  
— sve izvorne podatke,  
— krivulju log p u ovisnosti o 1/T,  
— procjenu tlaka pare na 20 ili 25 °C.  
Ako se zapazi prijelaz tvari (u drugo agregatno stanje ili razlaganje), 
treba navesti sljede će informacije:  
— vrstu promjene,  
— temperaturu na kojoj dolazi do promjene pri atmosferskom tlaku,  
— tlak pare na 10 i 20 °C ispod temperature prijelaza i 10 i 20 °C 
iznad te temperature (osim u slu čaju prijelaza iz krutog u plino ­
vito stanje).  
U izvješću treba navesti sve podatke i primjedbe bitne za tuma čenje 
rezultata, posebno u vezi s ne čistoćama i fizikalnim stanjem tvari.  
3. LITERATURA  
1. Službeni list Europskih zajednica  L 383 A, 26-47 (1992.).  
2. Ambrose, D. (1975.). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
3. Weissberger R., ed. (1959.). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
4. Glasstone, S. (1946.). Textbook of Physical Chemistry, 2nd 
ed., Van Nostrand Company, New York.  
5. NF T 20-048 AFNOR (September 1985.). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static 
method.  
6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
7. NF T 20-047 AFNOR (rujan 1985.). Chemical products for 
industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909.). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975.). J. 
Chem. Thermodynamics 7, 1173.  
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000.), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521-532.  
11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000.).  
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 
(1964.), 22-28.  
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982.), 
269-278.  
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987.), 117-122.  
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973.) 137-147.
 
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974.) 393-400.
 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982.) 161-168.  
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995.) 27-31.
 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998.) 300-310.
 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical 
Science 87(12) (1998.) 1512-20.
 
21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81st ed. (2000.), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C.
 
22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002.).  
23. 40 CFR, 796. (1993.). pp 148-153, Office of the Federal Regi ­
ster, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985.). Thermochimica Acta 85, 435.  
25. Westcott et al. (1981.). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987.). J. 
Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980.). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
28. Fremerey, J.K. (1985.). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 49
 
Dodatak  
Metoda procjene  
UVOD  
Procijenjene vrijednosti tlaka pare mogu se koristiti:  
— za donošenje odluke o tome koja je pokusna metoda najprikladnija,  
— za navo đenje procijenjene ili grani čne vrijednosti u slu čaju kad se pokusna 
metoda ne može koristiti iz tehni čkih razloga.  
METODA PROCJENE  
Tlak pare teku ćina i krutih tvari može se procijeniti primjenom prilago đene 
Watsonove korelacije (a). Jedini pokusni podatak koji je potreban je uobi čajeno 
vrelište. Metoda se može primijeniti u podru čju tlaka od 10  5 Pa do 10  –5 Pa. 
Podrobne informacije o metodi nalaze se u priru čniku „Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods” (b). Vidi tako đer OECD Environmental Mono ­
graph No. 67 (c).  
RAČUNSKI POSTUPAK  
Tlak pare izra čunava se na sljede ći način: 
ln P vp Ô ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 Ä 3 Ä 2 T 
T b Í Î  m 
T 
T b Ä 2m 3 Ä 2 T 
T b Í Î  m Ä1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
gdje je:  
T = tražena temperatura  
T b = uobičajeno vrelište  
P vp = tlak pare na temperaturi T  
ΔH vb = toplina isparavanja  
ΔZ b = faktor stla čivosti (procijenjen na 0,97)  
m = empirijski faktor koji ovisi o fizikalnom stanju na relevantnoj tempera ­
turi 
Osim toga:  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8,75 þ R ln T b Þ 
gdje je K  F empirijski faktor koji uzima u obzir polaritet tvari. Faktori K  F za 
nekoliko vrsta spojeva navedeni su u literaturi (b).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 50
 
Prilično se često može nai ći na podatke gdje je vrelište navedeno pri sniženom 
tlaku. U tom se slu čaju tlak pare izra čunava na sljede ći način: 
ln P vp Ô ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 Ä 3 Ä 2 T 
T 1 Í Î  m T 1 
T Ä 2m 3 Ä 2 T 
T 1 Í Î  m Ä1 
ln T 
T 1 " #  
gdje je T  1 vrelište pri sniženom tlaku P  1 . 
IZVJEŠĆE 
Kad se koristi metoda procjene, u izvješ ću treba detaljno dokumentirati čitav 
računski postupak.  
LITERATURA  
(a) Watson, K.M. (1943.). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982.). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993.).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 51
 
A.5. POVRŠINSKA NAPETOST  
1. METODA  
Opisane metode zasnivaju se na Smjernici za ispitivanje OECD-a 
(1). Temeljna na čela navedena su u referenci (2).  
1.1. UVOD  
Opisane metode koristit će se za mjerenje površinske napetosti 
vodenih otopina.  
Prije provo đenja ovih ispitivanja korisno je raspolagati preliminarnim 
informacijama o topljivosti tvari u vodi, njezinoj strukturi, hidroliti ­ 
čkim svojstvima i kriti čnim koncentracijama za formiranje micela.  
Sljedeće metode primjenljive su na ve ćinu kemijskih tvari, bez 
ikakvog ograni čenja u pogledu stupnja njihove čistoće. 
Mjerenje površinske napetosti metodom prstenastog tenzometra ogra ­
ničeno je na vodene otopine čiji je dinami čki viskozitet manji od 
približno 200 mPa s.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Površinskom napetoš ću smatra se slobodna površinska entalpija po 
jedinici površine.  
Površinska napetost izražava se kao:  
N/m (SI jedinica) ili  
mN/m (SI pod-jedinica)  
1 N/m = 10  3 din/cm  
1 mN/m = 1 din/cm u zastarjelom CGS sustavu  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja 
nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.
 
Referentne tvari koje obuhva ćaju široko podru čje površinskih nape ­
tosti navedene su u referencama 1. i 3.  
1.4. NA ČELO METODA  
Metode se temelje na mjerenju maksimalne sile kojom je potrebno 
vertikalno djelovati na stremen ili na prsten u dodiru s površinom 
ispitivane teku ćine koja se nalazi u mjernoj posudi kako bi ga se 
odvojilo od te površine, ili na plo čicu čiji rub dodiruje površinu, 
kako bi se nastali film izvukao.  
Tvari koje su topljive u vodi kod koncentracija od minimalno 1 mg/l 
ispituju se u vodenoj otopini kod samo jedne koncentracije.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Ovim se metodama može posti ći veća preciznost nego što se obi čno 
zahtijeva za procjenu utjecaja na okoliš.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 52
 
1.6. OPIS METODA  
Pripremi se otopina tvari u destiliranoj vodi. Otopina bi trebala biti 
koncentracije 90 % zasi ćene otopine tvari u vodi; ako je ta koncen ­
tracija ve ća od 1 g/l, za ispitivanje se upotrebljava koncentracija od 
1 g/l. Tvari čija je topljivost u vodi manja od 1 mg/l nije potrebno 
ispitivati.  
1.6.1.  Metoda plo čice 
Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – 
određivanje površinske napetosti izvla čenjem teku ćeg filma).  
1.6.2.  Metoda stremena  
Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – 
određivanje površinske napetosti izvla čenjem teku ćeg filma).  
1.6.3.  Metoda prstena  
Vidjeti norme ISO 304 i NF T 73-060 (Površinski aktivni agensi – 
određivanje površinske napetosti izvla čenjem teku ćeg filma).  
1.6.4.  Harmonizirana OECD-ova metoda prstena  
1.6.4.1.  Uređaj 
Za ovo mjerenje prikladni su komercijalno dostupni tenzometri. 
Tenzometar se sastoji od sljede ćih elemenata:  
— pokretni stoli ć za uzorak,  
— sustav za mjerenje sile,  
— mjerno tijelo (prsten),  
— mjerna posuda.  
1.6.4.1.1. P o k r e t n i s t o l i ć z a u z o r a k  
Pokretni stoli ć za uzorak koristi se kao nosa č mjerne posude s regu ­
lacijom temperature koja sadrži teku ćinu koju treba ispitati. Montiran 
je na stalak, zajedno sa sustavom za mjerenje sile.  
1.6.4.1.2. S u s t a v z a m j e r e n j e s i l e  
Sustav za mjerenje sile (vidjeti sliku) smješten je iznad stoli ća za 
uzorak. Pogreška sustava za mjerenje sile ne smije biti ve ća od ± 10  - 
6 N, što kod mjerenja mase odgovara ograni čenju greške od 
± 0,1 mg. U ve ćini slučajeva mjerna ljestvica komercijalno dostupnih 
tenzometara kalibrirana je u mN/m pa je površinsku napetost mogu će 
očitati izravno u mN/m s to čnošću od 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 53
 
1.6.4.1.3. M j e r n o t i j e l o ( p r s t e n )  
Prsten je obi čno izrađen od platina-iridijeve žice debljine oko 
0,4 mm i srednjeg opsega 60 mm. Ži čani prsten horizontalno je 
obješen na metalni zatik i konzolu za montažu preko kojih se pove ­
zuje sa sustavom za mjerenje sile (vidjeti sliku).  
Slika  
Mjerno tijelo  
(Sve su dimenzije izražene u milimetrima)
  
1.6.4.1.4. M j e r n a p o s u d a  
Mjerna posuda s ispitnom otopinom koju treba izmjeriti staklena je 
posuda s regulacijom temperature. Mora biti konstruirana na na čin da 
tijekom mjerenja temperatura ispitne otopine i plinske faze iznad njezine površine ostane stalna i da uzorak ne može isparavati. Prih ­
vatljive su cilindri čne staklene posude unutarnjeg promjera najmanje 
45 mm.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 54
 
1.6.4.2.  Priprema ure đaja 
1.6.4.2.1. Č i š ć e n j e  
Staklene posude treba pažljivo o čistiti. Po potrebi treba ih oprati 
vrućom krom-sumpornom kiselinom i zatim gustom teku ćom 
fosfornom kiselinom (od 83 do 98 % težinskog udjela H  3 PO 4 ), u 
potpunosti isprati teku ćom vodom i na kraju prati dvostruko destili ­
ranom vodom sve dok se ne postigne neutralna reakcija, te zatim osušiti i isprati s dijelom teku ćeg uzorka koji će se mjeriti.
 
Prsten prvo treba potpuno namo čiti u vodu kako bi se s njega uklo ­
nile sve tvari topljive u vodi, nakratko uroniti u krom-sumpornu kiselinu, prati dvostruko destiliranom vodom sve dok se ne postigne 
neutralna reakcija, i na kraju kratkotrajno zagrijati iznad plamena 
metanola.
 
Napomena:  
Kontaminacija tvarima koje se ne tope u krom-sumpornoj ili 
fosfornoj kiselini niti ih ona uništava, npr silikonima, otklanja se pomoću odgovaraju ćeg organskog otapala.
 
1.6.4.2.2. K a l i b r a c i j a u r e đ a j a 
Validacija ure đaja sastoji se od verifikacije nulte to čke i njezinog 
podešavanja na na čin da indikacija na instrumentu omogu ćuje pouz­
dano odre đivanje vrijednosti u mN/m.  
Montaža:  
Uređaj mora biti postavljen na postolje tenzometra u ravnini, primje ­
rice pomo ću libele i podešavanjem nivelacijskih vijaka na postolju.  
Podešavanje nulte to čke: 
Nakon montaže prstena na ure đaj, a prije uranjanja u teku ćinu, treba 
provjeriti da je indikacija tenzometra podešena na nulu, a prsten postavljen paralelno s površinom teku ćine. U tu svrhu, površina 
tekućine može se upotrijebiti kao zrcalo.
 
Kalibracija:  
Kalibracija za odre đeni pokus može se izvršiti bilo kojim od sljede ća 
dva postupka:  
(a) Korištenjem mase: postupak pomo ću jahača poznate mase 
između 0,1 i 1,0 g koji se postavljaju na prsten. Faktor kalibra ­
cije, Φ a , kojim se množe sve o čitanja na instrumentu odre đuje se 
prema jednadžbi (1). 
Φ a ¼ σ r 
σ a 
gdje je:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = masa jaha ča (g)  
g = ubrzanje sile teže (981 cm s  -2 na morskoj razini)  
b = srednji opseg prstena (cm)  
σ a = očitanje tenzometra nakon stavljanja jaha ča na prsten 
(mN/m)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 55
 
(b) Korištenjem vode: postupak pomo ću čiste vode čija je površinska 
napetost, primjerice, na 23 °C jednaka 72,3 mN/m. Taj se 
postupak može provesti brže nego kalibracija utegom, ali uvijek postoji opasnost da površinska napetost vode bude lažno predstavljena zbog tragova kontaminacije surfaktantima.
 
Faktor kalibracije, Φ a , kojim se množe sve o čitanja na instru ­
mentu, odre đuje se prema jednadžbi (2): 
Φ b ¼ σ o 
σ g 
gdje je:  
σο = vrijednost koja se za površinsku napetost vode navodi u 
literaturi (mN/m)  
σ g = izmjerena vrijednost površinske napetosti vode (mN/m), 
obje kod iste temperature  
1.6.4.3.  Priprema uzoraka  
Vodene otopine prire đuju se od tvari koje će se ispitivati, u 
potrebnim koncentracijama u vodi, i ne smiju sadržavati neotopljene 
tvari.  
Otopina se mora održavati na stalnoj temperaturi (± 0,5 °C). Kako se 
površinska napetost otopine u mjernoj posudi tijekom vremena mije ­
nja, treba provesti nekoliko mjerenja u raznim vremenima, a krivulju koja pokazuje površinsku napetost iscrtati kao funkciju vremena. 
Kad više nema promjena, postignuto je stanje ravnoteže.
 
Kontaminacija prašinom i plinovima drugih tvari ometa mjerenje. 
Posao stoga treba obaviti ispod zaštitnog pokriva ča. 
1.6.5.  Ispitni uvjeti  
Mjerenje se provodi na približno 20 °C i kontrolira se unutar 
± 0,5 °C.  
1.6.6.  Provo đenje ispitivanja  
Otopine na kojima se obavljaju mjerenja prenose se u pažljivo 
očišćenu mjernu posudu, vode ći računa da se ne zapjene, pa se 
zatim mjerna posuda stavlja na stoli ć ispitnog ure đaja. Gornji dio 
stola s mjernom posudom podiže se sve dok se prsten ne uroni ispod 
površine otopine koja se mjeri. Nakon toga, sve dok se ne postigne maksimalna sila, gornji dio stola se postupno i jednoli čno spušta 
(brzinom od oko 0,5 cm/min) kako bi se prsten odvojio od površine. 
Sloj teku ćine koji se drži za prsten ne smije se odvojiti od njega. 
Kad su mjerenja završena, prsten se ponovno uranja ispod površine i mjerenje se ponavlja sve dok se ne postigne stalna napetost površine. Vrijeme od prenošenja otopine u mjernu posudu bilježi se za svako 
određivanje. Vrijednosti se o čitavaju kod maksimalne sile koja je 
potrebna da se prsten odvoji od površine teku ćine.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 56
 
2. PODACI  
Za izračun površinske napetosti, vrijednost o čitanja u mN/m na 
uređaju prvo se množi s faktorom kalibracije Φ a ili Φ b (u zavisnosti 
o tome koji je postupak kalibracije primijenjen). Time se dolazi samo 
do približne vrijednosti koju stoga treba ispraviti.  
Harkins i Jordan (4) empirijski su odredili korektivne faktore za 
vrijednosti površinske napetosti izmjerene metodom prstena koji ovise o promjerima prstena, gusto ći tekućine i njezinoj površinskoj 
napetosti.
 
Kako je utvr đivanje korektivnog faktora za svako pojedino mjerenje 
iz Harkinsovih i Jordanovih tablica mukotrpan posao, za izra čun 
površinske napetosti vodenih otopina može se primijeniti pojedno ­
stavnjeni postupak o čitavanja ispravljenih vrijednosti površinske 
napetosti izravno iz tablice. (Za o čitanja u podru čjima izme đu vrijed­
nosti navedenih u tablici primjenjuje se interpolacija.)  
Tablica:  
Korekcija izmjerene površinske napetosti  
Samo za vodene otopine, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (promjer prosje čnog prstena)  
r = 0,185 mm (promjer žice od koje je prsten izra đen) 
Eksperimentalna vrijednost (mN/m)  Korigirana vrijednost (mN/m)  
Kalibracija utegom (vidjeti 
1.6.4.2.2.(a))  Kalibracija vodom (vidjeti 
1.6.4.2.2.(b))  
20 16,9  18,1  
22 18,7  20,1  
24 20,6  22,1  
26 22,4  24,1  
28 24,3  26,1  
30 26,2  28,1  
32 28,1  30,1  
34 29,9  32,1  
36 31,8  34,1  
38 33,7  36,1  
40 35,6  38,2  
42 37,6  40,3  
44 39,5  42,3  
46 41,4  44,4  
48 43,4  46,5  
50 45,3  48,6  
52 47,3  50,7  
54 49,3  52,8  
56 51,2  54,9  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 57
 
Eksperimentalna vrijednost (mN/m)  Korigirana vrijednost (mN/m)  
Kalibracija utegom (vidjeti 
1.6.4.2.2.(a))  Kalibracija vodom (vidjeti 
1.6.4.2.2.(b))  
58 53,2  57,0  
60 55,2  59,1  
62 57,2  61,3  
64 59,2  63,4  
66 61,2  65,5  
68 63,2  67,7  
70 65,2  69,9  
72 67,2  72,0  
74 69,2  —  
76 71,2  —  
78 73,2  —  
Podaci u ovoj tablici prikupljeni su na temelju Harkins-Jordanove 
korekcije. Sli čna je tablici u normi DIN (DIN 53914) za vodu i 
vodene otopine (gusto ća ρ = 1 g/cm  3 i za komercijalno dostupan 
prsten dimenzije R = 9,55 mm (srednji promjer prstena) i r = 0,185 mm (promjer žice od koje je izra đen prsten). U tablici su 
navedene korigirane vrijednosti za vrijednosti mjerenja površinske 
napetosti nakon kalibracije s utezima ili kalibracije vodom.
 
Alternativno, bez prethodne kalibracije, površinska napetost može se 
izračunati prema sljede ćoj formuli:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
gdje je:  
F = sila izmjerena na dinamometru u to čki pucanja filma  
R = promjer prstena  
f = korektivni faktor (1)  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1 IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— primijenjena metoda,  
— tip vode ili otopine koja je upotrijebljena.  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— rezultati mjerenja: (o čitanje) površinske napetosti s tim da se 
navedu i pojedina čna očitanja i njihove aritmeti čke sredine kao 
i korigirana srednja vrijednost (uzimaju ći u obzir faktor opreme i 
tablicu s korekcijama),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 58
 
— koncentracija otopine,  
— ispitna temperatura,  
— starost otopine koja je upotrijebljena; posebno vrijeme izme đu 
pripreme i mjerenja otopine,  
— opis kako površinska napetost zavisi o vremenu nakon prijenosa 
otopine u mjernu posudu,  
— sve informacije i opaske relevantne za tuma čenje rezultata, 
posebno s obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje tvari.  
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Uzimajući u obzir da destilirana voda ima površinsku napetost od 
72,75 mN/m na 20 °C, tvari kod kojih je u uvjetima ove metode 
uočena površinska napetost niža od 60 mN/m treba smatrati povr ­ 
šinski aktivnim materijalima.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 1152, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.  
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, str. 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, str. 1751.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 59
 
A.6. TOPLJIVOST U VODI  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
105 (1995.). Ova je ispitna metoda revidirana verzija originalne smjernice TG 105 donesene 1981. Nema razlike u sadržaju izme đu aktualne verzije i 
verzije iz 1981. Promijenjen je uglavnom format. Revizija se temelji na 
ispitnoj metodi EU-a „Topljivost u vodi” (
 1 ). 
UVODNA RAZMATRANJA  
2. Prisutnost ne čistoća može znatno utjecati na topljivost tvari u vodi. Ova se 
ispitna metoda bavi odre đivanjem topljivosti u vodi tvari koje su na čelno 
čiste, stabilne u vodi i nehlapljive. Prije odre đivanja topljivosti u vodi 
korisno je imati neke preliminarne podatke o ispitivanoj tvari, kao što su strukturna formula, tlak pare, konstanta disocijacije i hidroliza kao funkcija pH.
 
3. U ovoj ispitnoj metodi opisane su dvije metode, metoda eluiranja kolone i 
metoda tikvice, koje obuhva ćaju odgovaraju ću topljivost ispod i iznad 10  –2 
g/l. Tako đer je opisan i jednostavni preliminarni test. Taj test omogu ćuje 
određivanje približno prikladnog broja uzoraka koji će se rabiti u završnom 
ispitivanju te vrijeme potrebno za postizanje zasi ćenja.  
DEFINICIJE I JEDINICE  
4. Topljivost tvari u vodi jest koncentracija mase zasi ćenosti tvari u vodi na 
zadanoj temperaturi.  
5. Topljivost u vodi izražava se masom otopljene tvari po volumenu otopine. 
Jedinica prema sustavu SI je kg/m  3 , ali se može rabiti i g/l.  
REFERENTNE KEMIKALIJE  
6. Pri istraživanju ispitivane tvari ne moraju se primjenjivati referentne 
kemikalije.  
OPIS METODA  
Uvjeti ispitivanja  
7. Ispitivanje valja provoditi na 20 ± 0,5 °C. Odabranu temperaturu valja 
održavati konstantnom u svim relevantnim dijelovima opreme.  
Preliminarno ispitivanje  
8. Sve ve ći volumeni vode na sobnoj temperaturi postupno se dodaju u otpri ­
like 0,1 g uzorka (krute ispitivane tvari moraju se fino usitniti) u cilindar od 
10 ml sa staklenim čepom. Nakon svakog dodavanja odre đene količine vode 
mješavinu treba protresati 10 minuta i zatim vizualno provjeriti ima li u uzorku još neotopljenih dijelova. Ako nakon dodavanja 10 ml vode uzorak 
ili dijelovi uzorka ostanu neotopljeni, pokus treba ponoviti u cilindru od 
100 ml. Približna topljivost navedena je u tablici 1. pod onim volumenom
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 60
 
vode u kojem dolazi do potpunog otapanja uzorka. Ako je topljivost niska, 
može biti potrebno dugo vrijeme za otapanje ispitivane tvari za što treba 
omogućiti najmanje 24 sata. Ako se nakon 24 sata ispitivana tvar još uvijek 
ne otopi, treba produljiti vrijeme otapanja (do 96 sati) ili je pokušati dodatno razrijediti kako bi se utvrdilo treba li primijeniti metodu eluiranja kolone ili 
metodu tikvice.
 
Tablica 1.  
ml vode na 0,1 g otopljene 
tvari 0,1 0,5  1  2  10  100  > 100  
približna topljivost u g/l  > 1 000  1 000 do 
200 200 do 
100 100 do 
50 50 do 10  10 do 1  < 1  
Metoda eluiranja kolone  
Načelo 
9. Ova se metoda zasniva na eluiranju vodom ispitivane tvari iz mikro-kolone 
koja je napunjena inertnim nosivim materijalom, prethodno obloženim 
prekomjernom koli činom ispitivane tvari (2). Topljivost u vodi odre đuje 
se kada koncentracija mase eluata dosegne plato kao funkciju vremena.  
Aparatura  
10. Aparatura obuhva ća mikro-kolonu (slika 1.) koja se održava na konstantnoj 
temperaturi. Mikro-kolona je povezana s recirkulacijskom crpkom (slika 2.) ili nivelacijskom posudom (slika 3.). Mikro-kolona sadrži inertni nosa č koji 
na mjestu drži mali čep od staklene vune koji tako đer služi i za filtriranje 
čestica. Materijali koji se mogu upotrijebiti kao nosa č jesu staklene kuglice, 
dijatomejska zemlja ili drugi inertni materijali.
 
11. Mikro-kolona prikazana na slici 1. prikladna je za povezivanje s recirkula ­
cijskom crpkom. U koloni iznad uzorka mora biti mjesta za pet volumena 
vode (koji se odbacuju na po četku pokusa) i volumen pet uzoraka (koji se 
uzimaju za analizu tijekom pokusa). Druga je mogu ćnost smanjiti veli činu 
ako se sustavu tijekom pokusa može dodavati voda kako bi se zamijenilo 
početnih pet volumena vode koji su uklonjeni s ne čistoćama. Kolona je 
preko cijevi od inertnog materijala povezana s recirkulacijskom crpkom koja može dobaviti približno 25 ml/h. Recirkulacijska crpka može biti, primjerice, peristalti čka ili membranska crpka. Treba voditi ra čuna da ne 
dođe do kontaminacije materijalom same cijevi i/ili adsorpcije na materijal 
cijevi.
 
12. Shematski raspored s nivelacijskom posudom prikazan je na slici 3. U tom 
je rasporedu mikro-kolona opremljena jednosmjernom slavinom. Spoj s nivelacijskom posudom sastoji se od ubrušenog staklenog spoja i cjevovoda 
od inertnog materijala. Brzina protoka iz nivelacijske posude trebala bi 
iznositi otprilike 25 ml/h.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 61
 
Slika 1.
  
Dimenzije u mm  
A. Priklju čak za ubrušeni stakleni spoj  
B. Prostor u koloni  
C. Unutrašnji 5  
D. Vanjski 19  
E. Čep od staklene vune  
F. Slavina  
Slika 2.
  
A. Atmosfersko uravnoteženje  
B. Mjera č protoka  
C. Mikro-kolona  
D. Termostatski kontrolirana crpka za cirkulaciju  
E. Recirkulacijska crpka  
F. Dvosmjerni ventil za uzorkovanje  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 62
 
Slika 3.
  
A. Nivelacijska posuda (npr. 2,5-litarska tikvica)  
B. Kolona  
C. Skuplja č frakcije  
D. Termostat  
E. Teflonski cjevovod  
F. Ubrušeni stakleni spoj  
G. Cjevovod (izme đu termostata i kolone, unutarnjeg promjera približno 
8 mm)  
13. Oko 600 mg nosivog materijala prebacuje se u tikvicu zaobljenog dna od 
50 ml. Odgovaraju ća količina ispitivane tvari otapa se u hlapljivom otapalu 
kvalitete analiti čkog reagensa, a odgovaraju ća količina te otopine dodaje se 
nosivom materijalu. Otapalo posve isparava, npr. primjenom okretnog ispa ­
rivača, jer se u protivnom ne će postići zasićenost nosa ča vodom tijekom 
faze eluacije zbog razdjeljivanja na površini. Napunjeni nosivi materijal 
namače se dva sata u oko 5 ml vode, a zatim se ta otopina ulijeva u 
mikro-kolonu. Kao druga mogu ćnost, suhi napunjeni nosivi materijal 
može se usuti u mikro-kolonu ispunjenu vodom i ostaviti dva sata da se uravnoteži.
 
14. Dodavanje nosivog materijala može izazvati probleme koji dovode do 
pogrešnih rezultata, npr. kad se ispitivana tvar taloži kao ulje. Takve 
probleme valja ispitati i izvijestiti o pojedinostima.  
Postupak s recirkulacijskom crpkom  
15. Zapo činje protok kroz kolonu. Preporu ča se primjena brzine protoka od 
približno 25 ml/h, što kod opisane kolone odgovara veli čini od 10 volumena 
punjenja na sat. Najmanje prvih pet volumena vode potroše se na uklanjanje nečistoća topljivih u vodi. Nakon toga, crpka se ostavi u radu dok se ne 
postigne ravnoteža, nasumice utvr đena s pet uzastopnih uzoraka čije se 
koncentracije ne razlikuju za više od ± 30 %. Te uzorke treba me đusobno 
razdvojiti vremenskim intervalima koji odgovaraju prolasku najmanje deset volumena punjenja. Ovisno o primijenjenoj analiti čkoj metodi, prednost se 
može dati izradi krivulje koncentracije u ovisnosti o vremenu kako bi se 
pokazalo da je postignuta ravnoteža.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 63
 
Postupak s nivelacijskom posudom  
16. Susljedne frakcije eluata treba prikupiti i analizirati odabranom metodom. Za 
određivanje topljivosti koriste se frakcije iz srednjeg podru čja eluata u 
kojem su koncentracije stalne unutar ± 30 % u najmanje pet uzastopnih 
frakcija.  
17. Najprikladniji je eluat dvostruko destilirana voda. Tako đer se može upotreb ­
ljavati i deionizirana voda s otpornoš ću većom od 10 megaohm/cm i 
ukupnim sadržajem organskog ugljika ispod 0,01 %.  
18. U oba slu čaja drugi krug pokusa treba provesti s pola brzine protoka prvog 
kruga. Ako se rezultati oba kruga slažu, ispitivanje se smatra zadovoljava ­
jućim. Ako je izmjerena topljivost ve ća s nižom brzinom protoka, tada se 
prepolavljanje brzine protoka mora nastaviti sve dok dva uzastopna kruga ne 
daju istu topljivost.  
19. U oba slu čaja kod frakcija treba provjeriti prisutnost koloidne tvari na na čin 
da se provjeri javlja li se Tyndallov efekt. Prisutnost takvih čestica ispiti ­
vanje čini nevaljanim te ispitivanje valja ponoviti nakon poboljšanja filtri ­
ranja kolone.  
20. Valja izmjeriti pH vrijednost svakog uzorka, po mogu ćnosti posebnim indi ­
katorskim trakama.  
Metoda tikvice  
Načelo 
21. Ispitivana tvar (krutine treba fino usitniti) otapa se u vodi na temperaturi 
malo višoj od ispitne temperature. Kada se postigne zasi ćenje, smjesa se 
hladi i održava na ispitnoj temperaturi. Ako je odgovaraju ćim uzorkovanjem 
potvrđeno da se postiglo uravnoteženje zasi ćenosti, mjerenje se alternativno 
može obaviti izravno na ispitnoj temperaturi. Zatim se koncentracija mase ispitivane tvari u vodenoj otopini, koja ne smije sadržavati neotopljene čestice, odre đuje prikladnom analiti čkom metodom (3).
 
Aparatura  
22. Potreban je sljede ći materijal:  
— obične laboratorijske staklene posude i instrumenti,  
— uređaj za miješanje otopina na kontroliranoj konstantnoj temperaturi,  
— centrifuga (poželjno termostatski regulirana), po potrebi s emulzijama, i  
— analiti čka oprema.  
Postupak  
23. Koli čina ispitivane tvari koja je potrebna za zasi ćenje željenog volumena 
vode procjenjuje se iz preliminarnog ispitivanja. U svaku od tri staklene posude opremljene staklenim zatvara čima (npr. cijevi centrifuge, tikvice) 
odmjerava se peterostruka gore odre đena količina tvari. U svaku posudu 
dodaje se volumen vode odabran ovisno o analiti čkoj metodi i podru čju 
topljivosti. Posude se čvrsto začepe i protresaju na 30 °C. Treba koristiti 
uređaj za protresanje ili miješanje koji može raditi na stalnoj temperaturi, 
npr. magnetsku miješalicu u termostatiranoj vodenoj kupki. Nakon jednog 
dana jedna od posuda uravnotežuje se 24 sata na temperaturi ispitivanja uz
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 64
 
povremeno protresanje. Sadržaj posude zatim se centrifugira na temperaturi 
ispitivanja, a koncentracija ispitivane tvari u jasnoj vodenoj fazi odre đuje se 
odgovaraju ćom analiti čkom metodom. S druge dvije tikvice postupa se na 
sličan način nakon po četnog uravnoteženja na 30 °C tijekom dva odnosno 
tri dana. Ako se koncentracije izmjerene u najmanje dvije posljednje posude 
ne razlikuje za više od 15 %, ispitivanje se smatra uspješnim. Ako rezultati 
iz posuda 1., 2. i 3. imaju tendenciju sve ve ćih vrijednosti, ispitivanje treba 
u potpunosti ponoviti s duljim vremenom uravnoteženja.  
24. Ispitivanje se tako đer može provoditi i bez prethodne inkubacije na 30 °C. 
Kako bi se procijenila brzina postizanja uravnoteženja zasi ćenja, uzorci se 
uzimaju sve do trenutka kada vrijeme miješanja više nema utjecaja na izmjerene koncentracije.
 
25. Valja izmjeriti pH vrijednost svakog uzorka, po mogu ćnosti posebnim indi ­
katorskim trakama.  
Analitička određivanja  
26. Za ova ispitivanja poželjno je analiti čku metodu odrediti to čno prema ispi ­
tivanoj tvari jer male koli čine topljivih ne čistoća mogu uzrokovati velike 
pogreške u izmjerenoj topljivosti. Te metode mogu biti primjerice plinska ili tekućinska kromatografija, titracija, fotometrija te voltametrija.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
Metoda eluiranja kolone  
27. Za svaki krug treba izra čunati srednju vrijednost i standardnu devijaciju 
najmanje pet uzastopnih uzoraka izmjerenih kod platoa zasi ćenja. Srednje 
vrijednosti dobivene iz prvih dvaju ispitivanja s razli čitim protocima ne 
smiju se razlikovati za više od 30 %.  
Metoda tikvice  
28. Za svaku od tri tikvice treba izra čunati prosjek pojedina čnih rezultata koji se 
ne bi smjeli razlikovati za više od 15 %.  
Izvješće o ispitivanju  
Metoda eluiranja kolone  
29. U izvješ ću o ispitivanju moraju se navesti sljede će informacije:  
— rezultati preliminarnog testa,  
— kemijski identitet i ne čistoće (preliminarni korak pro čišćavanja ako 
postoji),  
— koncentracije, brzine protoka i pH vrijednost svakog uzorka,  
— srednje vrijednosti i standardna odstupanja od najmanje pet uzoraka na 
platou zasi ćenja svakog kruga,  
— prosje čna vrijednost najmanje dva uzastopna kruga,  
— temperatura vode tijekom postupka zasi ćenja,  
— metoda analize,  
— narav nosivog materijala,  
— punjenje nosivog materijala,  
— primijenjeno otapalo,  
— dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja,  
— sve podatke i napomene relevantne za tuma čenje rezultata, posebno s 
obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje ispitivane tvari.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 65
 
Metoda tikvice  
30. U izvješ ću o ispitivanju moraju se navesti sljede će informacije:  
— rezultati preliminarnog testa,  
— kemijski identitet i ne čistoće (preliminarni korak pro čišćavanja ako 
postoji),  
— pojedina čna analiti čka određivanja i prosjek ako je za svaku tikvicu 
određeno više od jedne vrijednosti,  
— pH vrijednost svakog uzorka,  
— prosje čne vrijednosti za razli čite tikvice koje su me đusobno uskla đene, 
— temperatura ispitivanja,  
— analiti čka metoda,  
— dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja,  
— sve podatke i napomene relevantne za tuma čenje rezultata, posebno s 
obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje ispitivane tvari.  
LITERATURA  
1. Direktiva Komisije 92/69/EEZ od 31. srpnja 1992. o sedamnaestoj prilagodbi 
tehničkom napretku Direktive Vije ća 67/548/EEZ o uskla đivanju zakona i 
ostalih propisa o razvrstavanju, pakiranju i ozna čivanju opasnih tvari, SL 
L 383, 29.12.1992., str. 54.  
2. NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method.  
3. NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 66
 
A.8. KOEFICIJENT RAZDJELJENJA  
1. METODA  
Opisana metoda „protresanjem u tikvici” temelji se na Smjernici za 
ispitivanje OECD-a (1).  
1.1. UVOD  
Prije provo đenja ovog ispitivanja korisno je za tvar koja se ispituje 
posjedovati preliminarne informacije o strukturnoj formuli, konstanti 
disasocijacije, topljivosti u vodi, hidrolizi, topljivosti u n-oktanolu i površinskoj napetosti.
 
Mjerenja treba provoditi na ioniziraju ćim tvarima samo kad su u 
neioniziranom obliku (slobodne kiseline ili slobodne lužine) dobi ­
vene primjenom odgovaraju će pufer otopine pH vrijednosti najmanje 
jednu pH jedinicu ispod (za slobodne kiseline) ili iznad (za slobodne lužine) vrijednosti pK.
 
Ovom ispitnom metodom obuhva ćena su dva odvojena postupka: 
metoda protresanjem u tikvici i visokou činkovita teku ćinska 
kromatografija (HPLC). Prvi je primjenljiv kad log P  ow (vidjeti defi ­
niciju dalje u tekstu) pripada podru čju – 2 do 4, a drugi u podru čju 0 
do 6. Prije izvršenja bilo kojega od tih eksperimentalnih postupaka 
prvo treba dobiti preliminarnu procjenu koeficijenta razdjeljenja.  
Metoda protresanjem u tikvici primjenljiva je samo na bitno čiste 
tvari topljive u vodi i n-oktanolu. Nije primjenljiva na površinski 
aktivne materijale (za koje treba osigurati izra čunanu ili procijenjenu 
vrijednost na temelju pojedina čnih vrijednosti topljivosti u 
n-oktanolu i vodi).  
Metoda visokou činkovite teku ćinske kromatografije (HPLC) nije 
primjenljiva na jake kiseline ili lužine, metalne komplekse, povr ­ 
šinski aktivne materijale ili tvari koje reagiraju s eluensom. Za te 
materijale treba osigurati izra čunanu ili procijenjenu vrijednost na 
temelju pojedina čnih vrijednosti topljivosti u n-oktanolu i vodi.  
Metoda HPLC manje je osjetljiva na prisutnost ne čistoća u ispiti ­
vanim spojevima nego metoda protresanjem u tikvici. Bez obzira na 
to u nekim slu čajevima ne čistoće mogu otežati tuma čenje rezultata 
jer vršne vrijednosti nije mogu će odrediti sa sigurnoš ću. Za mješa ­
vine koje daju nerazlu čeni pojas, treba navesti gornju i donju granicu 
vrijednosti log P.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Koeficijent razdjeljenja (P) definira se kao omjer uravnoteženih 
koncentracija (c  i ) otopljene tvari u dvofaznom sustavu koji obuhva ća 
dva otapala koja uglavnom nije mogu će miješati. Kad se radi o 
n-oktanolu i vodi:  
p ow ¼ c nÄoctanol  
c water 
Dakle, koeficijent razdjeljenja (P) koli čnik je dviju koncentracija, a 
obično se izražava u obliku svojega logaritma na bazu 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 67
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Metoda protresanjem u tikvici  
Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja 
nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.
 
Metoda HPLC  
Radi postavljanja korelacije izme đu podataka koji su metodom 
HPLC izmjereni o nekom spoju s njegovom vrijednoš ću koeficijenta 
razdjeljenja P, treba uspostaviti kalibracijsku krivulju log P u odnosu 
na podatke dobivene kromatografijom pomo ću najmanje šest refe ­
rentnih to čaka. Odgovaraju će referentne tvari odabire sam korisnik. 
Kad god je to mogu će, najmanje jedan referentni spoj treba imati 
P ow iznad P  ow vrijednosti ispitivane tvari, a P  ow vrijednost drugog 
spoja treba biti ispod P  ow vrijednosti ispitivane tvari. Za vrijednosti 
log P ispod 4, kalibracija se može temeljiti na podacima dobivenim metodom protresanjem u tikvici. Za vrijednosti log P ve će od 4, 
kalibracija se može temeljiti na validiranim vrijednostima iz literature 
ako se te vrijednosti podudaraju s izra čunanim vrijednostima. Radi 
veće točnosti, poželjno je odabrati referentne spojeve koji su struk ­
turno srodni ispitivanoj tvari.
 
Dostupan je dugi popis vrijednosti log P  ow za mnogo skupina kemi ­
kalija (2)(3). Ako podaci o koeficijentima razdjeljenja strukturno 
srodnih spojeva nisu dostupni, može se primijeniti op ćenitija kali ­
bracija, utvr đena s drugim referentnim spojevima.  
Popis preporu čenih referentnih tvari i njihovih vrijednosti P  ow 
naveden je u Dodatku 2.  
1.4. NA ČELO METODE  
1.4.1.  Metoda protresanjem u tikvici  
Kako bi se odredio koeficijent razdjeljenja, izme đu svih sastavnih 
dijelova sustava treba posti ći ravnotežu i odrediti koncentracije tvari 
otopljenih u dvije faze. Prou čavanje te teme u literaturi pokazuje da 
za rješenje tog problema postoji nekoliko raznih tehnika, tj. potpunog miješanja dvije faze nakon kojega slijedi njihovo odvajanje kako bi 
se odredila koncentracija ravnoteže za tvari koje se ispituju.
 
1.4.2.  Metoda HPLC  
HPLC se provodi na analiti čkim kolonama punjenim komercijalno 
dostupnom krutom fazom koja sadrži duge lance ugljikovodika 
(npr.C  8 , C 18 ) kemijski vezane na silicijev dioksid. Kemikalije koje 
se ubrizgavaju u takvu kolonu kre ću se duž nje razli čitim brzinama 
zbog razli čitih stupnjeva razdjeljenja izme đu mobilne faze i stacio ­
narne faze ugljikovodika. Mješavine kemikalija eluiraju redom svoje 
hidrofobičnosti, s tim da kemikalije topljive u vodi eluiraju prve, a 
kemikalije topljive u ulju posljednje, proporcionalno svojem koefici ­
jentu razdjeljenja ugljikovodik/voda. To omogu ćuje uspostavljanje 
veze izme đu vremena zadržavanja na toj koloni (obrnuta faza) i 
koeficijenta razdjeljenja n-oktanol/voda. Koeficijent razdjeljenja 
dobiva se iz  faktora kapaciteta  k izraženog kao:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
gdje je t  r = vrijeme zadržavanja ispitivane tvari, a t  o = prosječno 
vrijeme koje molekuli otapala treba za prolaz kroz kolonu (mrtvo vrijeme).
 
Kvantitativne analiti čke metode nisu potrebne, ve ć treba samo odre ­
diti vremena eluiranja.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
1.5.1.  Ponovljivost  
Metoda protresanjem u tikvici  
Kako bi se osigurala to čnost koeficijenta razdjeljenja, u tri razli čita 
ispitna uvjeta treba provesti dvostruko odre đivanje, pri čemu količina 
konkretne tvari kao i omjer volumena otapala mogu biti razli čiti. 
Određene vrijednosti koeficijenta razdjeljenja izražene kao njihovi 
zajednički logaritmi trebaju se kretati u podru čju ± 0,3 log jedinica.  
Metoda HPLC  
Kako bi se pove ćala pouzdanost mjerenja, treba provoditi dvostruka 
određivanja. Vrijednosti log P derivirane iz pojedina čnih mjerenja 
trebaju se kretati u podru čju ± 0,1 log jedinica.  
1.5.2.  Osjetljivost  
Metoda protresanjem u tikvici  
Mjerno podru čje ove metode odre đeno je granicom detekcije analiti ­ 
čkog postupka. Taj bi postupak trebao omogu ćiti procjenu vrijed ­
nosti log P  ow u području od – 2 do 4 (povremeno, kad to uvjeti 
dopuštaju, to se podru čje može proširiti na vrijednosti log P  ow do 5) 
kad koncentracija topljive tvari u jednoj ili drugoj fazi nije ve ća od 
0,01 mol po litri.  
Metoda HPLC  
Metoda HPLC omogu ćuje procjenu koeficijenata razdjeljenja vrijed ­
nosti log P  ow u području od 0 do 6.  
Koeficijent razdjeljenja spoja obi čno se može procijeniti unutar ± 1 
log jedinice vrijednosti dobivene metodom protresanjem u tikvici. Tipična korelacija može se na ći u literaturi (4)(5)(6)(7)(8). Velika 
točnost obično se može posti ći kad se korelacijske krivulje temelje 
na strukturno srodnim referentnim spojevima (9).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 69
 
1.5.3.  Specifi čnost 
Metoda protresanjem u tikvici  
Nernstov zakon razdjeljenja važi samo kod stalne temperature, tlaka i 
pH vrijednosti za razrije đene otopine. Strogo važi za čistu tvar raspr ­ 
šenu izme đu dva čista otapala. Ako se nekoliko razli čitih topljivih 
tvari istodobno na đe u jednoj ili obje faze, to može imati utjecaja na 
rezultate.  
Disocijacija ili asocijacija otopljenih molekula vode do odstupanja 
od Nernstovog zakona razdjeljenja. Na ta odstupanja ukazuje činje­
nica da koeficijent razdjeljenja postaje ovisan o koncentraciji otopine.
 
S obzirom da se radi o višestrukim ravnotežama, ovu ispitnu metodu 
na ioniziraju će spojeve trebalo bi primjenjivati samo uz primjenu 
korekcije. Za takve spojeve treba razmotriti upotrebu pufer otopina 
umjesto vode; s tim da se pH vrijednost pufer otopine treba za 
najmanje 1 pH jedinicu razlikovati od vrijednosti pKa tvari, vode ći 
računa o relevantnosti te pH vrijednosti za okoliš.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Preliminarna procjena koeficijenta razdjeljenja  
Koeficijent razdjeljenja poželjno je procijeniti metodom izra čuna 
(vidjeti Dodatak 1.), ili kad je to primjereno, iz omjera topljivosti 
ispitivane tvari u čistim otapalima (10).  
1.6.2.  Metoda protresanjem u tikvici  
1.6.2.1.  Priprema  
n-oktanol: odre đivanje koeficijenta razdjeljenja treba provesti 
pomoću reagensa analiti čke kvalitete visoke čistoće. 
Voda: treba upotrebljavati vodu destiliranu ili dvostruko destiliranu u 
uređaju sa staklom ili kvarcnim pijeskom. Za ioniziraju će spojeve, 
kad je to opravdano, treba koristiti pufer otopinu umjesto vode.  
Napomena:  
Ne bi trebalo koristiti vodu uzetu izravno iz ionskog izmjenjiva ča. 
1.6.2.1.1. P r e t h o d n o z a s i ć e n j e o t a p a l a  
Prije odre đivanja koeficijenta razdjeljenja, faze sustava otapala 
obostrano se zasi ćuju protresanjem na temperaturi pokusa. Za to je 
praktično tresti dvije velike stock boce n-oktanola analiti čke kvalitete 
visoke čistoće ili vode, i jednog i drugog s dovoljnim koli činama 
drugog otapala, tijekom 24 sata na mehani čkoj miješalici pa ih zatim 
ostaviti da stoje dovoljno dugo kako bi se faze odvojile i postiglo 
stanje zasi ćenja. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 70
 
1.6.2.1.2. P r i p r e m a i s p i t i v a n j a  
Čitav volumen dvofaznog sustava treba gotovo ispuniti ispitnu 
posudu. Time će se sprije čiti gubitak materijala uslijed hlapljenja. 
Omjer volumena i koli čine tvari koje treba upotrijebiti utvr đuju se na 
sljedeći način: 
— prethodnom procjenom koeficijenta razdjeljenja (vidjeti gore),  
— minimalnom koli činom ispitivane tvari koja je potrebna za anali ­
tički postupak, i  
— ograni čenjem maksimalne koncentracije u svakoj od faza na 0,01 
mol po litri.  
Provode se tri ispitivanja. U prvom se primjenjuje izra čunani omjer 
volumena n-oktanola i vode; u drugom se taj omjer dijeli s dva; i u 
trećem, taj se omjer množi s dva (npr. 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. I s p i t i v a n a t v a r  
Matična otopina pripravlja se u n-oktanolu prethodno zasi ćenom 
vodom. Koncentraciju mati čne otopine treba to čno utvrditi prije 
određivanja koeficijenta razdjeljenja. Tu otopinu treba skladištiti u 
uvjetima koji će osigurati njezinu stabilnost.  
1.6.2.2.  Ispitni uvjeti  
Temperaturu ispitivanja treba držati stalnom (± 1 °C) i u podru čju od 
20 do 25 °C.  
1.6.2.3.  Postupak mjerenja  
1.6.2.3.1. U s p o s t a v l j a n j e r a v n o t e ž e r a z d j e l j e n j a  
Za svaki od uvjeta ispitivanja treba pripraviti dvostruke ispitne 
posude koje sadrže potrebnu to čno odmjerenu koli činu dva otapala 
zajedno s potrebnom koli činom mati čne otopine. N-oktanol faze 
treba odmjeriti volumenski. Ispitne posude treba postaviti u odgova ­
rajući uređaj za protresanje ili tresti rukom. Ako se koristi centrifu ­
galna cijev, preporu ča se metoda brze vrtnje cijevi kroz 180° oko 
njezine transverzalne osi kako bi se eventualno zaostali zrak mogao 
izdići kroz faze. Iskustvo je pokazalo da je 50 takvih rotacija obi čno 
dostatno za uspostavljanje ravnoteže razdjeljenja. Radi sigurnosti, preporuča se 100 rotacija u pet minuta.
 
1.6.2.3.2. F a z a s e p a r a c i j e  
Ako je potrebno, za odvajanje faza potrebno je provesti centrifugi ­
ranje mješavine. To se radi u laboratorijskoj centrifugi koja se drži na sobnoj temperaturi ili, ako se rabi centrifuga bez regulacije 
temperature, radi uravnoteženja, centrifugalne cijevi treba držati na 
temperaturi ispitivanja najmanje jedan sat prije analize.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 71
 
1.6.2.4.  Analiza  
Za određivanje koeficijenta razdjeljenja, potrebno je odrediti koncen ­
tracije ispitivanih tvari u obje faze. To se može u činiti na na čin da se 
uzme alikvot od svake od dviju faza iz svake cijevi za svaki ispitni 
uvjet i analizira odabranim postupkom. Ukupna koli čina tvari 
prisutna u obje faze izra čunava se i uspore đuje s koli činom tvari 
koja je prvobitna uvedena.  
Vodenu fazu treba uzorkovati postupkom kojim se minimalizira rizik 
uključivanja tragova n-oktanola: za uzimanje uzorka vodene faze 
može se koristiti staklena šprica s izmjenljivom iglom. Šprica mora najprije biti djelomi čno napunjena zrakom. Zrak treba nježno isti ­
skivati dok se igla uvodi kroz sloj n-oktanola. Odgovaraju ći volumen 
vodene faze uvu če se u špricu. Šprica se brzo izvadi iz otopine i igla 
odvoji. Sadržaj šprice sada se može koristiti kao uzorak vode. Koncentraciju u dvije odvojene faze poželjno je utvrditi metodom 
koja posebno odgovara za doti čnu tvar. Analiti čke metode koje bi 
mogle biti primjerene su, primjerice:
 
— fotometri čke metode,  
— plinska kromatografija,  
— visokou činkovita teku ćinska kromatografija.  
1.6.3.  Metoda HPLC  
1.6.3.1.  Priprema  
Uređaj 
Potreban je teku ćinski kromatograf opremljen crpkom sa stalnim 
protokom i odgovaraju ćim uređajem za detekciju. Preporu ča se 
upotreba ventila za ubrizgavanje s petljama za ubrizgavanje. Prisut ­
nost polarnih grupa u stacionarnoj fazi može ozbiljno ugroziti rad kolone kromotografa. Stoga bi stacionarna faza trebala sadržavati 
minimalni postotak polarnih grupa (11). Mogu se upotrebljavati trgo ­
vačka pakiranja mikro- čestica inverzne faze ili gotove kolone. 
Između sustava ubrizgavanja i analiti čke kolone može se postaviti 
sigurnosna kolona.
 
Mobilna faza  
Za pripremanje otapala za eluiranje upotrebljavaju se metanol kvali ­
tete predvi đene za HPLC i voda kvalitete previ đene za HPLC, a 
otapalo se prije upotrebe otplinjava. Treba primijeniti izokrati čnu 
eluaciju. Treba upotrijebiti omjere metanol/voda s minimalnim sadr ­ 
žajem vode od 25 %. Obi čno je omjer mješavine metanola i vode 3:1 
(v/v) zadovoljavaju ći za eluiranje spojeva s vrijednoš ću log P 6 
unutar jednog sata kod brzine protoka od 1 ml/min. Za spojeve 
koji imaju viši log P možda će trebati skratiti vrijeme eluiranja (i 
vrijeme eluiranja referentnih spojeva) smanjivanjem polariteta mobilne faze ili duljine kolone.
 
Kod metode HPLC, tvari jako niske topljivosti u n-oktanolu imaju 
tendenciju dati neuobi čajeno male vrijednosti log P  ow ; vršne vrijed ­
nosti takvih spojeva ponekad prate frontu otapala. To je vjerojatno zato što je postupak razdjeljivanja prespor da bi se ravnoteža postigla u vremenu koje obi čno treba za odvajanje kromatografijom HPLC. 
Stoga bi se do pouzdane vrijednosti u činkovito moglo do ći snižava­
njem brzine protoka i/ili smanjivanjem omjera metanol/voda.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 72
 
Ispitivani i referentni spojevi trebali bi biti topljivi u mobilnoj fazi u 
koncentracijama koje su dovoljne za njihovu detekciju. Samo u 
izuzetnim slu čajevima s mješavinom metanola i vode smiju se kori ­
stiti aditivi, jer aditivi mijenjaju svojstva kolone. Za kromatograme s aditivima obvezno je rabiti posebnu kolonu istog tipa. Ako mješa ­
vina metanol-voda nije prikladna, mogu se koristiti mješavine drugih 
otapala i vode, npr. etanol-voda ili acetonitril-voda.
 
pH eluensa od kriti čne je važnosti za ioniziraju će spojeve. pH vrijed ­
nost mora biti u radnom podru čju pH vrijednosti kolone, što je 
obično između 2 i 8. Preporu ča se puferiranje. Treba paziti da se 
izbjegne taloženje soli i propadanje kolone, do čega dolazi kod nekih 
organskih faza/pufer mješavina. Kod stacionarnih faza koje se 
temelje na silicijevom dioksidu s pH vrijednoš ću iznad 8, ne prepo ­
ruča se mjerenje kromatografijom HPLC jer upotreba alkalne 
mobilne faze može brzo uzrokovati slabije funkcioniranje kolone.  
Rastvori  
Referentni spojevi trebali bi biti što je mogu će čišći. Spojevi koji se 
koriste za ispitivanje ili u svrhu kalibracije otapaju se, po mogu ćno­
sti, u mobilnoj fazi.  
Ispitni uvjeti  
Za vrijeme mjerenja, temperatura ne bi smjela varirati za više od 
± 2 K.  
1.6.3.2.  Mjerenje  
Izračun mrtvog vremena t  o 
Mrtvo vrijeme t  o može se odrediti upotrebom homolognog niza (npr. 
n-alkil metil ketoni) ili nezadržanih organskih spojeva (npr. tiourea ili formamid). Za izra čun mrtvog vremena t
 o primjenom homolognog 
niza, ubrizgava se set od najmanje sedam članova homolognog niza i 
utvrđuju se njihova vremena zadržavanja. Sirovi podaci o vremenima 
zadržavanja t  r (nc + 1) ucrtavaju se kao funkcija vremena t  r(nc) , i 
određuju se sjecište a i kosina b regresijske jednadžbe:  
t r(nc + 1) = a + b t  r(nc) 
(n c = broj atoma ugljika). Dakle, mrtvo vrijeme t  o određeno je 
jednadžbom:  
t o = a/(1 – b)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 73
 
Kalibracijska krivulja  
Sljedeći je korak konstruiranje korelacijske krivulje vrijednosti log k 
u odnosu na log p za odgovaraju će referentne spojeve. U praksi, set 
od 5 do 10 standardnih referentnih spojeva čija je vrijednost log p 
oko očekivanog podru čja istodobno se ubrizgava te se odre đuju 
vremena zadržavanja, poželjno na integratoru za bilježenje rezultata 
spojenom na sustav za detekciju. Odgovaraju ći logaritmi faktora 
kapaciteta, log k, izra čunavaju se i ucrtavaju kao funkcija vrijednosti 
log p odre đena metodom protresanja tikvice. Kalibracija se obavlja u 
redovitim intervalima, najmanje jednom dnevno, kako bi se mogle 
uzeti u obzir eventualne promjene u funkcioniranju kolone.  
Utvrđivanje faktora kapaciteta ispitivane tvari  
Ispitivana tvar ubrizga se u najmanju mogu ću količinu mobilne faze. 
Odredi se vrijeme zadržavanja (dva puta), čime se omogu ćuje 
izračun faktora kapaciteta k. Iz korelacijske krivulje referentnih 
spojeva može se interpolirati koeficijent razdjeljenja ispitivane tvari. Za jako male i jako velike koeficijente razdjeljenja, ekstrapo ­
lacija je neophodna. U tim slu čajevima treba voditi ra čuna o grani ­
cama pouzdanosti linije regresije.
 
2. PODACI  
Metoda protresanja tikvice  
Pouzdanost utvr đenih vrijednosti P može se ispitati uspore đivanjem 
srednjih vrijednosti dvostrukih odre đivanja i sveukupne srednje 
vrijednosti.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— kad metode nisu primjenljive (npr. površinski aktivni materijali), 
treba osigurati izra čunanu ili procijenjenu vrijednost koja se 
temelji na pojedina čnim topljivostima n-oktanola i vode  
— svi podaci i napomene relevantne za tuma čenje rezultata, 
posebno s obzirom na ne čistoće i fizikalno stanje tvari.  
Za metodu protresanjem tikvice:  
— rezultat prethodne procjene, ako je provedena,  
— temperatura odre đivanja,  
— podaci o analiti čkim postupcima koji su primijenjeni u odre đi­
vanju koncentracija,  
— vrijeme i brzina centrifugiranja, ako je primijenjeno,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 74
 
— izmjerene koncentracije u obje faze za svako odre đivanje (to 
znači da u izvješ će treba unijeti ukupno 12 koncentracija),  
— težina ispitivane tvari, volumen svake faze koja je upotrijebljena 
u svakoj ispitnoj posudi i ukupna izra čunana koli čina ispitivane 
tvari prisutna u svakoj fazi nakon uravnoteženja,  
— izračunane vrijednosti koeficijenta razdjeljenja (P) i srednja 
vrijednost za svaki set ispitnih uvjeta kao i srednja vrijednost 
za sva odre đivanja. U izvješ ću treba navesti svaku indikaciju 
zavisnosti koncentracije o koeficijentu razdjeljenja,  
— treba navesti standardno odstupanje pojedina čnih vrijednosti P od 
njihove srednje vrijednosti,  
— srednja vrijednost P iz svih odre đivanja mora biti izražena i 
njezinim logaritmom (baza 10),  
— izračunati teoretski P  ow ako je ta vrijednost utvr đena ili ako je 
izmjerena vrijednost > 10  4 , 
— pH vrijednost vode koja je upotrijebljena i pH vodene faze 
tijekom pokusa,  
— ako su korišteni puferi, obrazloženje za upotrebu pufera umjesto 
vode, sastav, koncentracija i pH vrijednost pufera, pH vrijednost 
vodene faze prije i poslije pokusa.  
Za metodu kromatografijom HPLC:  
— rezultat prethodne procjene, ako je provedena,  
— ispitivanja i referentne tvari, i njihova čistoća, 
— temperaturno podru čje određivanja,  
— pH vrijednost na kojoj su odre đivanja provedena,  
— podaci o analiti čkoj i sigurnosnoj koloni, mobilnoj fazi i srednjim 
vrijednostima detekcije,  
— podaci o zadržavanju i vrijednosti log P koje se za referentne 
spojeve upotrijebljene u kalibraciji spominju u literaturi,  
— pojedinosti o prilago đenoj liniji regresije (log k u odnosu na 
log P),  
— podaci o prosje čnom zadržavanju i interpolirana vrijednost log P 
za ispitivani spoj,  
— opis opreme i radnih uvjeta,  
— profili eluiranja,  
— količine ispitivane i referentne tvari uvedene u kolonu,  
— mrtvo vrijeme i na čin na koji je mjereno.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 75
 
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Testing Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, str. 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, str. 219.  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, str. 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, str. 1.  
(8) J.E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
str. 675.  
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, str. 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, str. 223-339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, str. 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, str. 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of Partition Coefficients – Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, str. 
1459.  
(16) A.Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
str. 525.  
(17) C.Hansch, A.Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. 
J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, str. 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, str. 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
str. 382.  
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologi ­
sche Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base1, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, str. 615.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 77
 
Dodatak 1.  
Metode izra čuna/procjene  
UVOD  
Općeniti uvod u metode, podaci i primjeri izra čuna navedeni su u priru čniku o 
metodama procjene kemijskih svojstava „Handbook of Chemical Property Esti ­
mation Methods (a)”  
Izračunane vrijednosti P  ow mogu se koristiti:  
— za donošenje odluke o tome koja je eksperimentalna metoda primjerena 
(područje metode protresanjem tikvice: log P  ow : – 2 do 4, podru čje metode 
HPLC: log P  ow : 0 do 6),  
— za odabir primjerenih ispitnih uvjeta (npr. referentne tvari za postupke kroma ­
tografije HPLC, omjer volumena n-oktanol/voda za metodu protresanjem 
tikvice),  
— kao vlastita provjera radi otkrivanja eventualnih pogrešaka u pokusu koju 
provodi sam laboratorij,  
— kao procijenjene vrijednosti P  ow u slučajevima kad iz tehni čkih razloga nije 
moguće primijeniti eksperimentalne metode.  
METODA PROCJENE  
Preliminarna procjena koeficijenta razdjeljenja  
Vrijednost koeficijenta razdjeljenja može se procijeniti pomo ću topljivosti ispiti ­
vanih tvari u čistim otapalima.  
Tada je:  
P procijenjeni ¼ zasićenje c  nÄoktanol  
zasićenje c  voda 
METODE IZRA ČUNA  
Načelo metoda izra čuna 
Sve metode izra čuna temelje se na formalnoj fragmentaciji molekule na odgova ­
rajuće pod-strukture za koje su prirasti vrijednosti log P  ow poznati. Log P  ow cijele 
molekule tada se izra čunava kao zbroj odgovaraju ćih vrijednosti njezinih fragme ­
nata uvećan za zbroj korektivnih članova za intramolekulske interakcije.  
Postoje popisi konstanti fragmenata i korektivnih članova (b)(c)(d)(e) od kojih se 
neki redovito ažuriraju (b).  
Kriteriji kvalitete  
Općenito, što je složeniji spoj koji se prou čava, pouzdanost metode izra čuna je 
manja. Kad se radi o jednostavnim molekulama male molekulske težine i mole ­
kulama koje sadrže jednu ili dvije funkcionalne skupine, izme đu rezultata 
različitih metoda fragmentacije i izmjerene vrijednosti može se o čekivati odstu ­
panje od 0,1 do 0,3 log P  ow jedinica. Kad se radi o složenijim molekulama, 
margina greške može biti ve ća. To će ovisiti o pouzdanosti i dostupnosti 
konstanti fragmenata, kao i o sposobnosti prepoznavanja intramolekulskih inte ­
rakcija (npr. vodikove veze) i pravilne primjene korektivnih članova (nije toliki 
problem kod ra čunalnog programa CLOGP-3) (b). Kad se radi o ioniziraju ćim 
spojevima, važno je uzeti u obzir to čan naboj ili stupanj ionizacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 78
 
Postupci izra čuna 
Hanschova π-metoda  
Konstanta originalnog supstituenta, π, koju su uveli Fujira i ostali (f) definira se 
kao: 
π x = log P  ow (PhX) – log P  ow (PhH)  
gdje je P  ow (PhX) koeficijent razdjeljenja aromatskog derivata, a P  ow (PhH) 
koeficijent razdjeljenja roditeljskog spoja  
(npr. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) – log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71).  
Prema definiciji π-metoda primjenljiva je pretežito na aromatsku supstituciju. 
Prikupljene su π-vrijednosti za velik broj supstituenata (b)(c)(d). Pomo ću njih 
se izračunava log P  ow za aromatske molekule i podstrukture.  
Rekkerova metoda  
Prema Rekkeru (g), vrijednost log P  ow izračunava se kako slijedi:  
log P  ow ¼ X  
i a i f i þ X  
j ðinteraktivni članoviÞ 
gdje f  i predstavlja konstante razli čitih molekulskih fragmenata, a a  1 učestalost 
njihovog pojavljivanja u molekuli koja se ispituje. Korektivni članovi mogu se 
izraziti kao integralni višekratnik samo jedne konstante C  m (takozvane magi čne 
konstante). Konstante fragmenata, f  i i C m određene su iz popisa koji sadrži 1 054 
ekperimentalnu vrijednost P  ow (825 spojeva) primjenom višestruke regresijske 
analize (c)(h). Odre đivanje faktora interakcije provodi se u skladu s utvr đenim 
pravilima kako su opisana u literaturi (e)(h)(i).  
Hansch-Leova metoda  
Prema Hanschu i Leu (c), vrijednost log P  ow izračunava se iz:  
log P  ow ¼ X  
i a i f i þ X  
j b j F j 
gdje f  i predstavlja konstante razli čitih molekulskih fragmenata, F  j korektivne 
faktore, a a  i , b j predstavljaju njihovu u čestalost pojavljivanja. Izvedeni iz ekpe ­
rimentalnih vrijednost P  ow , popis atomskih i grupnih fragmentiranih vrijednosti i 
popis korektivnih članova F  j (tzv. faktori) odre đeni su putem pokušaja i pogre ­ 
ške. Korektivni članovi svrstani su u nekoliko razli čitih klasa (a)(c). Prili čno je 
složeno i vremenski zahtjevno uzeti u obzir sva pravila i korektivne članove. 
Razvijeni su programski paketi (b).  
Kombinirana metoda  
Izračun vrijednost log P  ow složenih molekula mogu će je znatno unaprijediti ako 
se molekula rasije če na veće podstrukture za koje su pouzdane vrijednosti log 
P ow dostupne bilo iz tablica (b)(c) ili iz vlastitih mjerenja. Takve fragmente (npr. 
heterocikli, antrakinon, azobenzen) tada je mogu će kombinirati s Hanschovim π- 
vrijednostima ili s Rekkerovim i Leovim konstantama fragmenata.  
Napomene  
i. Metode izra čuna mogu se primijeniti na djelomi čno ili potpuno ionizirane 
spojeve samo kad je mogu će uzeti u obzir potrebne korektivne faktore;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 79
 
ii. Ako se može pretpostaviti prisutnost intramolekulske vodikove veze, obvezno 
treba dodati odgovaraju će korektivne članove (približno + 0,6 do + 1,0 log 
P ow jedinica) (a). Pokazatelji prisutnosti tih veza dobivaju se stereo modelima 
ili spektroskopskim podacima o molekuli;  
iii. Ako je nekoliko tautomernih oblika mogu će, najvjerojatniji oblik treba uzeti 
kao osnovu izra čuna; 
iv. Revizije popisa konstanti fragmenata treba pažljivo pratiti.  
Izvješće 
Kad se koriste metode izra čuna/procjene, izvješ ća o ispitivanju, ako je mogu će, 
moraju sadržavati sljede će informacije:  
— opis tvari (mješavina, ne čistoće itd.),  
— indikaciju eventualne intramolekulske vodikove veze, disocijacije, naboja ili 
drugih neuobi čajenih učinaka (npr. tautomerija),  
— opis metode izra čuna, 
— identifikacija ili porijeklo baze podataka,  
— pojedinosti o izboru fragmenata,  
— sveobuhvatna dokumentacija izra čuna. 
LITERATURA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971., vol. 71, str. 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979., vol. 14, 
str. 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964., vol. 86, str. 
5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, NewYork, 1977., vol. 1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983., vol. 12, str. 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984., 
Symposium Series 255, str. 225.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 80
 
Dodatak 2.  
Preporučene referentne tvari za metodu HLPC  
Br. Referentna tvar  log P  ow pKa 
1 2- butanon  0,3  
2 4-acetilpiridin  0,5  
3 Anilin  0,9  
4 Acetanilid  1,0  
5 Benzilalkohol  1,1  
6 p-metoksifenol  1,3  pKa = 10,26  
7 Fenoksi octena kiselina  1,4  pKa = 3,12  
8 Fenol  1,5  pKa = 9,92  
9 2,4-dinitrofenol  1,5  pKa = 3,96  
10 Benzonitril  1,6  
11 Fenilacetonitril  1,6  
12 4-metilbenzil alkohol  1,6  
13 Acetofenon  1,7  
14 2-nitrofenol  1,8  pKa = 7,17  
15 3- nitrobenzojeva kiselina  1,8  pKa = 3,47  
16 4-kloranilin  1,8  pKa = 4,15  
17 Nitrobenzen  1,9  
18 Cinaminski alkohol  1,9  
19 Benzojeva kiselina  1,9  pKa = 4,19  
20 p-krezol  1,9  pKa = 10,17  
21 Cinaminska kiselina  2,1  pKa = 3,89 cis 4,44 trans  
22 Anizol  2,1  
23 Metilbenzoat  2,1  
24 Benzen  2,1  
25 3-metilbenzojeva kiselina  2,4  pKa = 4,27  
26 4-klorofenol  2,4  pKa = 9,1  
27 Tri-kloretilen  2,4  
28 Atrazin  2,6  
29 Etilbenzoat  2,6  
30 2,6-diklorobenzonitril  2,6  
31 3-klorobenzojeva kiselina  2,7  pKa = 3,82  
32 Toluen  2,7  
33 1-naftol  2,7  pKa = 9,34  
34 2,3-dikloroanilin  2,8  
35 Klorobenzen  2,8  
36 Alil-fenileter  2,9  
37 Bromobenzen  3,0  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 81
 
Br. Referentna tvar  log P  ow pKa 
38 Etilbenzen  3,2  
39 Benzofenon  3,2  
40 4-fenilfenol  3,2  pKa = 9,54  
41 Timol  3,3  
42 1,4-diklorobenzen  3,4  
43 Difenilamin  3,4  pKa = 0,79  
44 Naftalen  3,6  
45 Fenilbenzoat  3,6  
46 Izopropilbenzen  3,7  
47 2,4,6-triklorofenol  3,7  pKa = 6  
48 Bifenil  4,0  
49 Benzilbenzoat  4,0  
50 2,4-dinitro-6 sec. butilfenol  4,1  
51 1,2,4-triklorobenzen  4,2  
52 Dodekanska kiselina  4,2  
53 Difenileter  4,2  
54 n-butilbenzen  4,5  
55 Fenantren  4,5  
56 Floranten  4,7  
57 Dibenzil  4,8  
58 2,6-difenilpiridin  4,9  
59 Trifenilamin  5,7  
60 DDT  6,2  
Ostale referentne tvari niskog log P  ow 
1 Nikotinska kiselina  – 0,07  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 82
 
A.9. PLAMIŠTE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Prije provo đenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati prelimi ­
narnim informacijama o zapaljivosti tvari koja se ispituje. Ispitni postupak primjenjuje se na teku će tvari čije je pare mogu će zapaliti 
izvorom zapaljenja. Ispitne metode navedene u ovom tekstu pouz ­
dane su samo za podru čja plamišta koja su pojedina čno navedena za 
svaku metodu.
 
Kod odabira metode koja će se primijeniti treba uzeti u obzir mogu ć­
nost kemijske reakcije izme đu tvari i posude za uzorak.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Plamište je najniža temperatura, ispravljena na tlak od 101,325 kPa, 
kod koje, u uvjetima utvr đenim u ispitnoj metodi, teku ćina evolvira 
toliku koli činu para da u ispitnoj posudi nastane zapaljiva mješavina 
pare i zraka.  
Jedinice: °C  
t = T – 273,15  
(t u °C, a T u K)  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari nije potrebno upotrebljavati kod svakog istraživanja 
nove tvari. One bi trebale služiti prvenstveno za povremenu provjeru 
primijenjene metode i omogu ćiti usporedbu s rezultatima dobivenim 
drugim metodama.  
1.4. NA ČELO METODE  
Tvar se stavi u ispitnu posudu i zagrijava ili hladi do temperature 
ispitivanja u skladu s postupkom opisanim u pojedinoj ispitnoj 
metodi. Probe zapaljenja provode se kako bi se utvrdilo ho će li se 
uzorak zapaliti na temperaturi ispitivanja ili ne će. 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
1.5.1.  Ponovljivost  
Ponovljivost varira u skladu s podru čjem plamišta i primijenjenoj 
ispitnoj metodi; maksimalno 2 °C.  
1.5.2.  Osjetljivost  
Osjetljivost ovisi o primijenjenoj ispitnoj metodi.  
1.5.3.  Specifi čnost 
Posebnost nekih ispitnih metoda ograni čena je na odre đena podru čja 
plamišta i ovisi o podacima specifi čnim za pojedinu tvar (npr. velika 
viskoznost).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 83
 
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Pripravci  
Uzorak ispitivane tvari stavi se u ispitni ure đaj prema 1.6.3.1. i/ili 
1.6.3.2.  
Radi sigurnosnih razloga, za energetske i toksi čne tvari preporu ča se 
primjena metode kod koje se koristi mala koli čina uzorka, približno 
2 cm  3 . 
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Do mjere u kojoj je to mogu će iz sigurnosnih razloga, ure đaj treba 
postaviti u položaj zašti ćen od strujanja zraka.  
1.6.3.  Provo đenje ispitivanja  
1.6.3.1.  Metoda ravnoteže  
Vidjeti norme: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Metoda neravnoteže  
Uređaj Abel:  
Vidjeti norme: BS 2000 dio 170., NF M07-011, NF T66-009.  
Uređaj Abel-Pensky:  
Vidjeti norme: EN 57, DIN 51755 dio 1. (za temperature od 5 do 
65 °C), DIN 51755 dio 2. (za temperature ispod 5 °C), NF M07-036.  
Uređaj Tag:  
Vidjeti normu ASTM D 56.  
Uređaj Pensky-Martens:  
Vidjeti norme: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 
2000-34, NF M07-019.  
Napomene:  
Ako se metodom neravnoteže iz 1.6.3.2. utvrdi da je plamište na 
temperaturi 0 ± 2 °C, 21 ± 2 °C ili 55 ± 2 °C, to treba potvrditi 
metodom ravnoteže koriste ći isti uređaj. 
U svrhu prijavljivanja smiju se koristiti samo one metode koje daju 
temperaturu plamišta.  
Za određivanje plamišta viskoznih teku ćina (boje, gume i sli čno) 
koje sadrže otapala dozvoljeno je koristiti samo ure đaj i ispitne 
metode prikladne za odre đivanje plamišta viskoznih teku ćina. 
Vidjeti norme: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 dio 1.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 84
 
2. PODACI  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— treba navesti primijenjenu metodu kao i eventualna odstupanja,  
— rezultate i sve dodatne napomene relevantne za tuma čenje 
rezultata.  
4. REFERENCE  
Nema ih.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 85
 
A.10.  ZAPALJIVOST (KRUTINE)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Prije provo đenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati prelimi ­
narnim informacijama o potencijalno eksplozivnim svojstvima tvari.  
Ovo ispitivanje treba primjenjivati samo na tvari u obliku praha, 
granula ili paste.  
Kako se ne bi obuhvatile sve tvari koje gore ve ć samo one koje gore 
brzo ili one čije ponašanje kod zapaljenja je na bilo koji na čin 
izrazito opasno, lako zapaljivim tvarima smatraju se samo one tvari čija brzina gorenja premašuje odre đenu grani čnu vrijednost.
 
Usijanost koja se proširi kroz metalnu prašinu može biti izrazito 
opasna jer se takav požar teško gasi. Metalnu prašinu treba smatrati lako zapaljivom ako podržava širenje usijanja cijelom masom u određenom vremenu.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Vrijeme gorenja izraženo u sekundama  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nisu navedene.  
1.4. NA ČELO METODE  
Tvar se oblikuje kao neprekinuta traka ili pruga od praha duga čka 
oko 250 mm, te se provodi preliminarni test probira kako bi se odredilo dolazi li kod zapaljenja na plinskom plamenu do širenja 
plamena ili do tinjanja. Ako se plamen u odre đenom vremenu 
proširi na preko 200 mm u dužinu, treba provesti potpuni program ispitivanja kako bi se odredila brzina gorenja.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nisu navedeni.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 86
 
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Preliminarni test probira  
Tvar se oblikuje na nezapaljivoj, neporoznoj plo či slabe termi čke 
provodljivosti kao neprekinuta traka ili pruga od praha duga čka 
oko 250 mm, široka 20 mm i visoka 10 mm. Plamen iz plinskoga gorača (minimalnog promjera 5 mm) drži se na jednom kraju pruge 
od praha sve dok se prah ne zapali ili najduže dvije minute (pet 
minuta za prah metala ili metalnih legura). Treba pratiti širi li se gorenje uzduž 200 mm duga čke pruge u ispitnom razdoblju od 4 
minute (ili 40 minuta za metalnu prašinu). Ako se u ispitnom 
razdoblju od 4 minute (ili 40 minuta) tvar nije zapalila niti se 
gorenje nastavilo bilo kao plamen ili kao tinjanje uzduž 200 mm dugačke pruge, tvar ne treba smatrati lako zapaljivom i daljnje ispi ­
tivanje nije potrebno. Ako se širenje gorenja tvari nastavi na na čin da 
200 mm duga čka pruga izgori za manje od četiri minute, ili manje 
od 40 minuta za metalni prah, treba provesti postupak opisan dalje u tekstu (to čka 1.6.2. i dalje).
 
1.6.2.  Ispitivanje brzine gorenja  
1.6.2.1.  Priprema  
Praškaste ili zrnate tvari rahlo se napune u kalup duga čak 250 mm, 
trokutastog presjeka unutarnje visine 10 mm i širine 20 mm. S obje 
strane kalupa uzdužno su montirana dva metalna lima kao bo čni 
graničnici koji su za 2 mm viši od gornjeg ruba trokutastog presjeka 
(slika). Kalup se tri puta spusti s visine od 2 cm na čvrstu podlogu. 
Po potrebi kalup treba nadopuniti. Bo čni graničnici se zatim skinu, a 
višak tvari sastruže. Na vrh kalupa postavi se nezapaljiva, neporozna 
ploča slabe toplinske provodljivosti, ure đaj se preokrene naopako i 
kalup se odstrani.  
Tvari u obliku paste nanesu se na nezapaljivu, neporoznu plo ču slabe 
toplinske provodljivosti u obliku užeta duga čkog 250 mm, 
poprečnog presjeka oko 1 cm  2 . 
1.6.2.2.  Ispitni uvjeti  
Kad se radi o tvari koja je osjetljiva na vlagu, ispitivanje treba 
provesti što je mogu će brže nakon što je tvar izva đena iz spremnika.  
1.6.2.3.  Provo đenje ispitivanja  
Složite u digestor hrpicu uzorka na na čin da kroz njega struji zrak.  
Brzina strujanja zraka trebala bi biti dovoljna da se sprije či istjecanje 
para u laboratorij i ne bi je se smjelo mijenjati tijekom ispitivanja. Strujanjem zraka oko ure đaja mora se formirati zra čna zavjesa.
 
Plamen iz plinskoga gora ča (najmanje 5 mm u promjeru) koristi se 
za paljenje hrpice s jednog kraja. Kad tvar izgori u duljini od 
80 mm, mjeri se brzina gorenja na sljede ćih 100 mm.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 87
 
Ako se pozitivan rezultat ne zamijeti ranije, ispitivanje se provodi 
šest puta, svaki put na čistom limu za hla đenje.  
2. PODACI  
Za procjenu relevantno je vrijeme gorenja iz preliminarnog testa 
probira (1.6.1.) i najkra će vrijeme gorenja u najviše šest ispitivanja 
(1.6.2.3.)  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— opis tvari koja se ispituje, njezino fizikalno stanje uklju čujući 
sadržaj vlage  
— rezultati iz preliminarnog testa probira i ispitivanja brzine gore ­
nja, ako je to ispitivanje provedeno,  
— sve dodatne napomene relevantne za tuma čenje rezultata.  
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Tvari u obliku praha, granula ili paste smatraju se lako zapaljivima 
ako je vrijeme gorenja prilikom bilo kojih testiranja provedenih 
sukladno postupku ispitivanja iz 1.6.2. kra će od 45 sekundi. Prah 
metala ili metalnih legura smatra se lako zapaljivim ako se može zapaliti a plamen ili zona reakcije se proširi po cijelom uzorku u 
roku od 10 minuta ili manje.
 
4. REFERENCE  
NF T 20-042 (September 85) Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 88
 
Dodatak  
Slika  
Kalup i pribor za pripremu hrpice  
(Sve dimenzije izražene su u milimetrima)
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 89
 
A.11.  ZAPALJIVOST (PLINOVI)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Ovom metodom mogu će je odrediti jesu li plinovi pomiješani sa 
zrakom na sobnoj temperaturi (oko 20 °C) i atmosferskom tlaku zapaljivi i, ako jesu, u kojem podru čju koncentracija. Mješavine 
sve većih koncentracija ispitivanog plina i zraka izlažu se elektri čnoj 
iskri te se prati dolazi li do zapaljenja.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Područje zapaljivosti je podru čje koncentracija izme đu donje i gornje 
granice eksplozije. Donja i gornja granica eksplozivnosti su grani čne 
koncentracije zapaljivog plina u smjesama sa zrakom na kojima ne 
dolazi do širenja plamena.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nisu navedene.  
1.4. NA ČELO METODE  
Koncentracija plina u zraku postupno se pove ćava, te se kod svakog 
povećanja izlaže elektri čnoj iskri.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nisu navedeni.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Ure đaj 
Ispitna posuda je uspravni stakleni cilindar unutarnjeg promjera 
najmanje 50 mm i minimalne visine 300 mm. Elektrode za paljenje međusobno su odvojene od 3 do 5 mm, a postavljene su 60 mm 
iznad dna cilindra. Cilindar ima otvor za osloba đanje tlaka. Ure đaj 
mora imati zaštitni plašt kako bi se ograni čila eventualna šteta od 
eksplozije.
 
Kao izvor zapaljenja koristi se indukcijska iskra koja traje 0,5 sek., a 
nastaje visokonaponskim transformatorom izlaznog napona 10 do 15 
kV (maksimalne ulazne snage 300 W). Primjer odgovaraju ćeg 
uređaja opisan je u referenci (2).  
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje treba provoditi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 90
 
1.6.3.  Provo đenje ispitivanja  
Dozirnim crpkama u stakleni cilindar uvodi se poznata koncentracija 
plina u zraku. Kroz mješavinu se pušta iskra i promatra se ho će li se 
plamen odvojiti od izvora zapaljenja i neovisno širiti ili ne. Koncen ­
tracija plina mijenja se po 1 % vol. dok ne do đe do zapaljenja kako 
je gore opisano.  
Ako kemijska struktura plina ukazuje da bi mogao biti nezapaljiv, a 
sastav stehiometrijske mješavine sa zrakom može se izra čunati, tada 
postupno u rasponu od 1 % treba ispitivati samo mješavine u 
području od 10 % ispod do 10 % iznad stehiometrijskog sastava.  
2. PODACI  
Pojava širenja plamena jedini je relevantan podatak za odre đivanje 
ovog svojstva.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— opis i dimenzije ure đaja koji se koristi,  
— temperatura na kojoj je ispitivanje provedeno,  
— ispitane koncentracije i dobiveni rezultati,  
— rezultat ispitivanja: nezapaljivi plin ili lako zapaljivi plin,  
— ako je zaklju čeno da je plin nezapaljiv, tada treba navesti 
područje koncentracija u kojem je plin postupno ispitivan 
po 1 %,  
— sve informacije i napomene relevantne za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) NF T 20-041 (September 85) Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann „Ent ­
wicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explo ­
sionsgrenzen”. Chem.-Ing.- Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127., 
T. Redeker und H.Schacke, str. 126-127.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 91
 
A.12.  ZAPALJIVOST (U DODIRU S VODOM)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Ovom metodom mogu će je odrediti razvijaju li se kod reakcije tvari 
s vodom ili vlažnim zrakom opasne koli čine plina ili plinova koji 
mogu biti lako zapaljivi.  
Ova se ispitna metoda može primijeniti i na krute i na teku će tvari. 
Ova metoda nije primjenljiva na tvari koje se spontano pale u dodiru sa zrakom.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Lako zapaljive: tvari koje u dodiru s vodom ili vlažnim zrakom 
razvijaju lako zapaljive plinove u opasnim koli činama brzinom od 
najmanje 1 litra/kg na sat.  
1.3. NA ČELO METODE  
Tvar se ispituje postupno kako je opisano dalje u tekstu; ako u bilo 
kojoj fazi do đe do zapaljenja, daljnje ispitivanje nije potrebno. Ako 
je poznato da tvar ne reagira burno s vodom, treba odmah prije ći na 
fazu 4. (1.3.4.)  
1.3.1.  Faza 1.  
Ispitivana tvar postavlja se u korito koje sadrži destiliranu vodu na 
20 °C i bilježi se ho će li se razvijeni plin zapaliti ili ne.  
1.3.2.  Faza 2.  
Ispitivana tvar postavlja se na filtar papir koji pluta na površini 
posude koja sadrži destiliranu vodu na 20 °C i bilježi se ho će li 
se razvijeni plin zapaliti ili ne. Filtar papir služi samo da bi se tvar 
održala na mjestu, čime se pove ćava vjerojatnost zapaljenja.  
1.3.3.  Faza 3.  
Ispitivana tvar složi se u hrpicu otprilike 2 cm visoku i 3 cm u 
promjeru. Na hrpicu se doda nekoliko kapi vode i bilježi se ho će 
li se razvijeni plin zapaliti ili ne.  
1.3.4.  Faza 4.  
Ispitivana tvar miješa se s destiliranom vodom na 20 °C, brzina 
razvijanja plina mjeri se u razdoblju od sedam sati, u polusatnim intervalima. Ako se plin razvija nepravilnom brzinom, ili brzinom koja se pove ćava, trajanje mjerenja nakon sedam sati treba produžiti 
na maksimalno pet dana. Ako brzina u bilo koje vrijeme premaši 1 
litru/kg na sat, ispitivanje treba zaustaviti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 92
 
1.4. REFERENTNE TVARI  
Nije navedeno.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nije navedeno.  
1.6. OPIS METODA  
1.6.1.  Faza 1.  
1.6.1.1.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).  
1.6.1.2.  Provo đenje ispitivanja  
Malu koli činu (približno 2 mm u promjeru) ispitivane tvari treba 
staviti u korito koje sadrži destiliranu vodu. Treba zabilježiti i. 
razvija li se plin i ii. dolazi li do zapaljenja. Ako do đe do zapaljenja 
plina, daljnje ispitivanje tvari nije potrebno jer se tvar smatra opasnom.
 
1.6.2.  Faza 2.  
1.6.2.1.  Uređaj 
Filtar papir pluta na površini destilirane vode u bilo kojoj prikladnoj 
posudi, npr. posudi za isparavanje promjera 100 mm.  
1.6.2.2.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).  
1.6.2.3.  Provo đenje ispitivanja  
Mala koli čina ispitivane tvari (približno 2 mm u promjeru) stavi se 
na sredinu filtar papira. Treba zabilježiti i. razvija li se plin i ii. 
dolazi li do zapaljenja. Ako do đe do zapaljenja plina, daljnje ispiti ­
vanje tvari nije potrebno jer se tvar smatra opasnom.  
1.6.3.  Faza 3.  
1.6.3.1.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje se provodi na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).  
1.6.3.2.  Provo đenje ispitivanja  
Ispitivana tvar složi se u hrpicu približno 2 cm visoku i 3 cm u 
promjeru s udubljenjem na vrhu. U udubljenje se doda nekoliko kapi vode i bilježi se i. razvija li se plin i ii. dolazi li do zapaljenja. Ako 
dođe do zapaljenja plina, daljnje ispitivanje tvari nije potrebno jer se 
tvar smatra opasnom.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 93
 
1.6.4.  Faza 4.  
1.6.4.1.  Uređaj 
Uređaj se postavlja kako prikazuje slika.  
1.6.4.2.  Ispitni uvjeti  
Pregledati ima li u spremniku za ispitivanu tvar praha < 500 μm 
(veličina čestice). Ako prah čini više od 1 % (m/m) ukupne koli čine, 
ili ako se uzorak mrvi, tada prije ispitivanja cijelu koli činu tvari treba 
samljeti u prah kako bi se uzelo u obzir smanjenje veli čine čestica 
tijekom skladištenja i rukovanja; u protivnom tvar treba ispitati kako je primljena. Ispitivanje treba provesti na sobnoj temperaturi (oko 
20 °C) i pod atmosferskim tlakom.
 
1.6.4.3.  Provo đenje ispitivanja  
10 do 20 ml vode stavi se u lijevak za dokapavanje u ure đaju, a 10 g 
tvari u konusnu tikvicu. Volumen plina koji se razvija može se 
mjeriti svim prikladnim sredstvima. Slavina lijevka otvori se kako 
bi voda ušla u konusnu tikvicu i zapo činje mjerenje vremena štope ­
ricom. Nastajanje plina mjeri se svakog sata tijekom sedmosatnog razdoblja. Ako je u tom razdoblju nastajanje plina nepravilno ili ako 
se brzina nastajanja plina pove ćava, mjerenja treba nastaviti do 
najviše pet dana. Ako, u bilo koje vrijeme mjerenja, brzina nastajanja plina prije đe 1 litru/kg po satu, pokus treba prekinuti. Ovaj se pokus 
izvodi tri puta.
 
Ako kemijski identitet plina nije poznat, plin treba analizirati. Ako 
plin sadrži lako zapaljive komponente, a nije poznato je li cijela 
mješavina lako zapaljiva, treba pripraviti mješavinu istog sastava i 
ispitati je ispitnom metodom A.11.  
2. PODACI  
Smatra se da je tvar opasna ako:  
— u bilo kojoj fazi ispitnog postupka do đe do spontanog zapaljenja,  
ili 
— do nastajanja zapaljivog plina do đe brzinom ve ćom od 1 litre/kg 
tvari na sat.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— podatke o eventualnoj po četnoj pripremi ispitivane tvari,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 94
 
— rezultati pokusa (faze 1., 2., 3. i 4.),  
— kemijski sastav nastalog plina,  
— brzina nastajanja plina ako se provodi faza 4. (1.6.4.),  
— svi dodatni podaci relevantni za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (September 85) Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 95
 
Dodatak  
Slika  
Uređaj
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 96
 
A.13.  PIROFORNA SVOJSTVA KRUTINA I TEKU ĆINA 
1. METODA  
1.1. UVOD  
Ovaj ispitni postupak primjenljiv je na krute i teku će tvari koje će se 
u malim koli činama spontano zapaliti ubrzo nakon dodira sa zrakom 
na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).  
Tvari koje prije nego se zapale trebaju biti izložene zraku satima ili 
danima na sobnoj temperaturi ili na povišenim temperaturama nisu 
obuhvaćene ovom ispitnom metodom.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Smatra se da tvari imaju piroforna svojstva ako su zapaljive ili 
uzrokuju pougljenjivanje u uvjetima opisanim u 1.6.  
Možda treba ispitati i samozapaljivost teku ćina primjenom metode 
A.15. Temperatura samozapaljenja (teku ćine i plinovi).  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nije navedeno.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Tvar, bilo krutina ili teku ćina, dodaje se inertnom nosa ču i drži u 
dodiru sa zrakom na sobnoj temperaturi tijekom pet minuta. Teku će 
tvari koje se ne zapale upiju se na filtar papir i pet minuta izlažu 
zraku na temperaturi okoline (oko 20 °C). Ako se krutina ili teku ćina 
zapali, ili ako teku ćina zapali ili pougljeni filtar papir, tvar se smatra 
pirofornom.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Ponovljivost: zbog sigurnosnih razloga, dovoljan je samo jedan 
rezultat da bi se tvar smatrala pirofornom.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Ure đaj 
Porculanska šalica od oko 10 cm u promjeru napuni se dijatomej ­
skom zemljom do visine od oko 5 mm na sobnoj temperaturi (oko 20 °C).
 
Napomena:  
Dijatomejska zemlja ili bilo koja druga usporediva inertna tvar koju 
je jednostavno nabaviti uzima se kao reprezentativni uzorak tla po kojem se u slu čaju nezgode može izliti ispitivana tvar.
 
Za ispitivanje teku ćina koje nisu zapaljive u dodiru sa zrakom kada 
su u dodiru s inertnim nosa čem potreban je suhi filtar papir.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 97
 
1.6.2.  Provo đenje ispitivanja  
(a) Praškaste krutine  
1 do 2 cm  3 tvari koja se ispituje isipa se s visine od oko 1 m na 
nezapaljivu površinu, te se promatra ho će li se tvar zapaliti tijekom 
sipanja ili u roku od pet minuta nakon toga.  
Pokus se provodi šest puta ako prije ne do đe do zapaljenja;  
(b) tekućine 
Oko 5 cm  3 tekućine koja se ispituje ulije se u pripremljenu porcu ­
lansku šalicu, te se promatra ho će li se tvar zapaliti u roku od pet 
minuta.  
Ako u šest pokusa ne do đe do zapaljenja, provode se sljede ći pokusi:  
Ispitni uzorak od 0,5 ml štrcaljkom se uvodi na pripremljeni filtar 
papir, te se promatra ho će li se filtar papir zapaliti ili pougljeniti u 
roku pet minuta nakon dodavanja teku ćine. Pokus se provodi tri puta 
ako prije ne do đe do zapaljenja ili pougljenjivanja.  
2. PODACI  
2.1. OBRADA PODATAKA  
Ispitivanje se može prekinuti čim se u bilo kojem pokusu do đe do 
pozitivnog rezultata.  
2.2. PROCJENA  
Ako se tvar zapali u roku pet minuta nakon što je dodana inertnom 
nosaču i izložena zraku, ili teku ća tvar zapali ili pougljeni filtar papir 
u roku pet minuta nakon što je dodana i izložena zraku, smatra se 
pirofornom.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— rezultati pokusa,  
— svi dodatni podaci relevantni za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) NF T 20-039 (September 85) Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, NewYork.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 98
 
A.14.  EKSPLOZIVNA SVOJSTVA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Pomoću ove metode može se odrediti predstavlja li kruta tvar ili tvar 
u obliku paste opasnost od eksplozije ako se izloži djelovanju plamena (termi čka osjetljivost), ili udarcu ili trenju (osjetljivost na 
mehaničke podražaje), te predstavlja li teku ća tvar opasnost ako se 
izloži djelovanju plamena ili udarca.
 
Metoda obuhva ća tri elementa:  
(a) ispitivanje termi čke osjetljivosti (1);  
(b) ispitivanje mehani čke osjetljivosti s obzirom na udarac (1);  
(c) ispitivanje mehani čke osjetljivosti s obzirom na trenje (1).  
Ovom se metodom dolazi do podataka na temelju kojih je mogu će 
procijeniti vjerojatnost izazivanja eksplozije pomo ću određenih opće­
nitih podražaja. Metoda nije namijenjena za utvr đivanje može li tvar 
eksplodirati u bilo kojim uvjetima.  
Ova je metoda prikladna da se njome odredi ho će li tvar predstavljati 
opasnost od eksplozije (termi čka i mehani čka osjetljivost) u uvjetima 
koji su posebno navedeni u Direktivi. Temelji se na velikom broju 
uređaja koji su u širokoj upotrebi u mnogim zemljama (1) i koji 
obično daju smislene rezultate. Priznato je da metoda nije defini ­
tivna. Osim navedenih ure đaja, dozvoljena je upotreba i alternativnih 
uređaja pod uvjetom da su me đunarodno priznati i da se rezultati 
mogu dovesti u korelaciju s rezultatima dobivenim navedenim ure đa­
jima.  
Ispitivanja ne treba provoditi ako se na temelju dostupnih termodi ­
namičkih podataka (npr. toplina nastajanja, toplina raspadanja) i/ili 
nepostojanja odre đenih reaktivnih skupina (2) u strukturnoj formuli 
sa sigurnoš ću može utvrditi da s nastankom plinova ili osloba đanjem 
topline tvar nije sposobna za brzo razlaganje (npr. materijal ne pred ­
stavlja rizik od eksplozije). Ispitivanje mehani čke osjetljivosti s 
obzirom na trenje nije potrebno za teku ćine. 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Eksplozivne tvari:  
Tvari koje mogu eksplodirati pod djelovanjem plamena ili koje su 
osjetljive na udarac ili trenje u navedenom ure đaju (ili su mehani čki 
osjetljivije od 1,3-dinitrobenzena u alternativnom ure đaju). 
1.3. REFERENTNE TVARI  
1,3-dinitrobenzen, tehni čki kristalizirani proizvod prosijan kroz sito 
0,5 mm, za metode ispitivanja osjetljivosti na trenje i na udarac.  
Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, heksogen, ciklonit – CAS 
121-82-4), rekristaliziran iz vodenog cikloheksanona, prosijan na mokro kroz sito od 250 μm i zadržan na situ od 150 μm te sušen 
na 103 ± 2 °C (u trajanju od četiri sata) za drugi niz ispitivanja 
osjetljivosti na trenje i na udarac.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 99
 
1.4. NA ČELO METODE  
Preliminarni pokusi potrebni su kako bi se uspostavili sigurni uvjeti 
za provođenje tri pokusa osjetljivosti.  
1.4.1.  Pokusi sigurnosnog rukovanja (3)  
Iz sigurnosnih razloga, prije provo đenja glavnog pokusa, vrlo mali 
uzorci (oko 10 mg) tvari izlažu se zagrijavanju bez zatvaranja u 
plinskom plamenu, udarcima u bilo kojem ure đaju prikladnog 
oblika i trenju pomo ću čekića i nakovnja ili kojeg drugog ure đaja 
za trenje. Cilj je utvrditi je li tvar toliko osjetljiva i eksplozivna da 
propisana ispitivanja osjetljivosti, posebno termi čke osjetljivosti, 
treba provesti uz posebne mjere opreza kako bi se sprije čile ozljede.  
1.4.2.  Termi čka osjetljivost  
Metoda obuhva ća zagrijavanje tvari u čeličnoj cijevi koju zatvaraju 
ploče različitih promjera otvora, kako bi se odredilo ima li tvar 
tendenciju eksplodiranja pod uvjetima intenzivne topline i defini ­
ranog zatvaranja.  
1.4.3.  Mehani čka osjetljivost (udarac)  
Metoda obuhva ća izlaganje tvari udarcu odre đene mase koja se baca 
s određene visine.  
1.4.4.  Mehani čka osjetljivost (trenje)  
Metoda obuhva ća izlaganje krute tvari ili paste izme đu uobičajenih 
površina pod odre đenim uvjetima optere ćenja i relativnoga gibanja.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nije navedeno.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Termi čka osjetljivost (djelovanje plamena)  
1.6.1.1.  Uređaj 
Uređaj se sastoji od čelične cijevi za jednokratnu upotrebu s 
napravom za zatvaranje za višekratnu upotrebu (Slika 1.), koja je montirana u sigurnosnom ure đaju za zagrijavanje. Sve su cijevi od 
vučenog čeličnog lima (vidjeti Dodatak), imaju unutarnji promjer 
24 mm, duljinu 75 mm i debljinu stijenke 0,5 mm. Cijevi su spojene prirubnicama na otvorenom kraju kako bi ih se moglo zatvo ­
riti sklopom mjerne prigušnice. Taj se sklop sastoji od mjerne prigu ­ 
šnice otporne na tlak s otvorom u sredini, u čvršćene na cijev pomo ću 
dvodijelnog navojnog spoja (matica i navojna obujmica). Vijak i navojna obujmica izra đeni su od krom-manganovog čelika (vidjeti 
Dodatak) koji do 800 °C ne iskri. Mjerne prigušnice su plo če 
debljine 6 mm izra đene od čelika otpornog na toplinu (vidjeti Doda ­
tak), i dostupne su s razli čitim promjerima otvora.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 100
 
1.6.1.2.  Ispitni uvjeti  
Obično se tvar ispituje u obliku u kojem je primljena, ali u nekim 
slučajevima, npr. ako je prešana, lijevana ili na drugi na čin sažeta, 
tvar će prije pokusa možda trebati zdrobiti.  
Za krutine, masa materijala koji se koristi u svakom pokusu odre đuje 
se suhim postupkom u dvije faze. Tarirana cijev puni se s 9 cm  3 
tvari i sabije silom od 80 N kojom se djeluje na ukupni popre čni 
presjek cijevi. Iz sigurnosnih razloga ili ako bi se fizikalni oblik 
uzorka sabijanjem mogao promijeniti, mogu se primijeniti druge metode punjenja; npr. ako je tvar jako osjetljiva na trenje, sabijanje nije primjereno. Ako je materijal mogu će sažeti, dodaje se još i 
sabija sve dok se cijev ne napuni do 55 mm od vrha. Odredi se 
ukupna masa koja se koristi za punjenje cijevi do razine 55 mm, i dodaju se dva dodatna prirasta te se svaki sabije silom od 80 N. Zatim se kod sabijanja, prema potrebi, materijal dodaje, odnosno 
izuzima kako bi se cijev napunila do razine od 15 mm od vrha. 
Provodi se drugi po redu suhi postupak, na na čin da se po čne sa 
sabijenom koli činom trećine ukupne mase utvr đene u prvom suhom 
postupku. Dodaju se još dva dodatna inkremeta uz sabijanje silom od 
80 N, a razina u cijevi podešava se na 15 mm od vrha dodavanjem 
ili oduzimanjem materijala, prema potrebi. Koli čina krutine utvr đena 
u drugom suhom postupku koristi se za svaki pokus, s tim da se punjenje obavlja s tri jednake koli čine, pojedina čno sabijene na 
9 cm
 3 primjenom za to odgovaraju će sile. (To se može lakše provesti 
pomoću razdjelnih prstenova).  
Cijev se puni teku ćinama i gelovima do visine 60 mm s tim da kod 
gelova treba posebno paziti da se izbjegne stvaranje praznina. 
Navojna obujmica navu če se na cijev odozdo, umetne se odgovara ­
juća mjerna prigušnica i nakon što se stavi malo sredstva za podma ­
zivanje na osnovu molibdenovog disulfida, zategne matica. Klju čno 
je provjeriti da se čestice tvari nisu zaglavile izme đu prirubnice i 
ploče, ili u navojima.  
Za zagrijavanje se koristi propan iz boce za industrijsku primjenu 
koja je opremljena regulatorom tlaka (od 60 do 70 mbara), te se plin 
preko mjera ča jednakomjerno distribuira (što se vizualno opaža 
promatranjem plamena iz gora ča) cjevovodom do četiri gora ča. 
Gorači se nalaze oko ispitne komore kako prikazuje slika 1. Četiri 
gorača zajedno troše oko 3,2 litre propana u minuti. Mogu se upotri ­
jebiti alternativna plinska goriva i grija či, ali brzina zagrijavanja 
mora biti kako je navedeno na slici 3. Kod svih ure đaja neophodno 
je provoditi periodi čke provjere pomo ću cijevi napunjenih dibutil 
ftalatom kako je prikazano na slici 3.  
1.6.1.3.  Provo đenje ispitivanja  
Svako se ispitivanje provodi dok cijev ne fragmentira odnosno cijev 
se zagrijava pet minuta. U pokusu koji rezultira pucanjem cijevi na 
tri ili više komada koji u nekim slu čajevima mogu biti me đusobno 
povezani uskim trakama metala kako je prikazano na slici 2., smatra se da je došlo do eksplozije. Kod pokusa koji rezultiraju pucanjem 
na manji broj komada ili bez ijednog komada, smatra se da nije bilo 
eksplozije.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 101
 
Prvo se provodi niz od tri testa s mjernom prigušnicom promjera 
6,0 mm, pa ako se ne postigne eksplozija, provodi se drugi niz od tri 
testa s plo čom prigušnice promjera 2,0 mm. Ako u bilo kojem od ta 
dva pokusa do đe do eksplozije, daljnji pokusi nisu potrebni.  
1.6.1.4.  Procjena  
Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije do đe u bilo 
kojem od gornjih nizova pokusa.  
1.6.2.  Mehani čka osjetljivost (udarac)  
1.6.2.1.  Uređaj (Slika 4.)  
Osnovni dijelovi tipi čnog uređaja s padaju ćim maljem su blok od 
lijevanog čelika s postoljem, nakovanj, stupac, vodilice, utezi, ure đaj 
za osloba đanje i drža č uzorka. Čelični nakovanj 100 mm (promjer) × 
70 mm (visina) vijkom je pri čvršćen na čelični blok 230 mm 
(dužina) × 250 mm (širina) × 200 mm (visina) s lijevanim postoljem 
450 mm (dužina) × 450 mm (širina) × 60 mm (visina). Stupac, izrađen od bešavne cijevi od vu čenog čelika učvršćen je u drža ču 
koji je vijkom pri čvršćen na stražnji dio čeličnog bloka. Četiri vijka 
sidre uređaj na čvrsti betonski blok 60 × 60 × 60 cm na na čin da su 
vodilice postavljene potpuno okomito i da uteg pada slobodno. Koriste se utezi od 5 i 10 kg izra đeni od punog čelika. Udarna 
glava svakog utega izra đena je od otvrdnutog čelika, HRC 60 do 
63, i ima minimalno 25 mm u promjeru.
 
Uzorak koji se ispituje stavi se u ure đaj za pokus udarcem, koji se 
sastoji od dva koaksijalna čvrsta čelična cilindra, jedan iznad drugog, 
u šupljoj cilindri čnoj čeličnoj prstenastoj vodilici. Čvrsti čelični 
cilindri trebaju biti promjera 10 (– 0,003, – 0,005) mm i visine 10 mm i imati polirane površine, zaobljene rubove (radijus zakriv ­
ljenosti 0,5 mm) i tvrdo ću od HRC 58 do 65. Šuplji cilindar mora 
imati vanjski promjer 16 mm, ispolirani provrt 10 (+ 0,005, + 0,010) 
mm i visinu 13 mm. Ure đaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac 
postavlja se na nakovanj (26 mm u promjeru i 26 mm visine) izrađen od čelika i centriran pomo ću prstena s perforacijama za 
istjecanje para.
 
1.6.2.2.  Ispitni uvjeti  
Volumen uzorka treba biti 40 mm  3 , ili volumen koji odgovara alter ­
nativnom ure đaju. Krute tvari treba ispitati u suhom stanju i priprav ­
ljene kako slijedi:  
(a) praškaste tvari se prosiju (veli čina sita 0,5 mm); za ispitivanje se 
koristi sve što prolazi kroz sito;  
(b) tvari koje su prešane, lijevane ili na druga čiji način sažete, lome 
se na komadi će i siju; za ispitivanje se koriste prosijani koma ­
dići od 0,5 do 1,0 mm u promjeru koji se smatraju reprezenta ­
tivnim uzorkom izvorne tvari.  
Tvari koje se obi čno isporu čuju kao kreme treba ispitati u suhom 
stanju ako je to mogu će ili svakako nakon što se odstrani što je 
moguće veća količina razrje đivača. Tekuće tvari ispituju se s 
razmakom od 1 mm izme đu gornjeg i donjeg čeličnog cilindra.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 102
 
1.6.2.3.  Provo đenje ispitivanja  
Provodi se niz od šest pokusa bacanjem mase od 10 kg s visine od 
0,40 m (40 J). Ako se tijekom tih šest pokusa postigne eksplozija, provodi se drugi niz od šest pokusa, na na čin da se baca masa od 
5 kg s visine od 0,15 m (7,5 J). U drugom ure đaju, uzorak se 
uspoređuje s izabranom referentnom tvari primjenom utvr đenog 
postupka (npr. tehnikom gore-dolje itd.).
 
1.6.2.4.  Procjena  
Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije (pojava 
plamena i/ili praska ekvivalentna je eksploziji) do đe najmanje 
jednom u bilo kojem od pokusa kod navedenog ure đaja za ispiti ­
vanje osjetljivosti na udarac ili ako je uzorak osjetljiviji od 1,3- 
dinitrobenzen ili RDX u alternativnom ispitivanju osjetljivosti na 
udarac.  
1.6.3.  Mehani čka osjetljivost (trenje)  
1.6.3.1.  Uređaj (Slika 5.)  
Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje sastoji se od temeljne 
ploče od lijevanog čelika na koju je postavljena naprava za trenje. 
Ona se sastoji od fiksnog porculanskog klina/štipaljke i pokretne 
porculanske plo če. Porculanska plo ča nalazi se u kliza ču koji se 
kreće unutar dvije vodilice. Kliza č je spojen na elektromotor preko 
ojnice, ekscentra i odgovaraju ćeg zupčastog prijenosa na na čin da se 
porculanska plo ča pomakne natrag i naprijed ispod porculanskog 
klina samo jednom na udaljenosti od 10 mm. Porculanski klin 
može se opteretiti silom od, primjerice, 120 ili 360 N.  
Ravne porculanske plo če izrađene su od bijelog tehni čkog porculana 
(hrapavost 9 do 32 μm), veličine 25 mm (dužina) × 25 mm (širina) × 
5 mm (visina). Cilindri čni porculanski klin tako đer je izra đen od 
bijelog tehni čkog porculana, duga čak je 15 mm, ima promjer 
10 mm i grube površine sfernih rubova promjera zaobljenosti 
10 mm.  
1.6.3.2.  Ispitni uvjeti  
Volumen uzorka treba biti 10 mm  3 ili volumen koji odgovara alter ­
nativnom ure đaju. 
Krute tvari ispituju se u suhom stanju i pripravljene kako slijedi:  
(a) praškaste tvari prosiju se (veli čina sita 0,5 mm); za ispitivanje se 
koristi sve što pro đe kroz sito;  
(b) tvari koje su prešane, lijevane ili na druga čiji način sažete, lome 
se na komadi će i siju; za ispitivanje se koriste prosijani koma ­
dići < 0,5 mm u promjeru.  
Tvari koje se obi čno isporu čuju kao paste treba ispitati u suhom 
stanju ako je to mogu će. Ako tvar nije mogu će pripraviti u suhom 
stanju, pasta (nakon što se odstrani što je mogu će veća količina 
razrjeđivača) se ispituje kao 0,5 mm debeli, 2 mm širok, 10 mm 
dugačak film koji se pripravlja pomo ću šablone.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 103
 
1.6.3.3.  Provo đenje ispitivanja  
Porculanski klin postavlja se na uzorak koji se ispituje, i optereti se. 
Kod provo đenja pokusa, oznake nanesene spužvom na porculansku 
ploču moraju ležati transverzalno u odnosu na smjer kretanja. Treba 
paziti da se klin nalazi na uzorku, da ispod klina ima dovoljno 
materijala koji se ispituje kao i da se plo ča ispod klina pomi če 
propisno. Paste se nanašaju na plo ču pomoću 0,5 mm debele 
šablone s urezom veli čine 2 × 10 mm. Porculanska plo ča mora se 
pomaknuti 10 mm naprijed i natrag ispod porculanskog klina u 
vremenu od 0,44 sekunde. Svaki dio površine plo če i klina smije 
se koristiti samo jednom; dva kraja svakog klina služe za dva 
pokusa, a svaka od dvije površine plo če služi za tri pokusa.  
Niz od šest pokusa provodi se pod optere ćenjem od 360 N. Ako 
tijekom tih šest pokusa do đe do pozitivnog doga đaja, provodi se još 
jedan niz od šest pokusa s optere ćenjem od 120 N. U drugom 
uređaju, uzorak se uspore đuje s odabranom referentnom tvari 
primjenom utvr đenog postupka (npr. tehnika gore-dolje itd.).  
1.6.3.4.  Procjena  
Rezultat pokusa smatra se pozitivnim ako do eksplozije (pucketanje 
i/ili prasak ili pojava plamena ekvivalentni su eksploziji) do đe 
najmanje jednom u bilo kojem pokusu kod navedenog ure đaja za 
ispitivanje trenja ili ako su zadovoljeni ekvivalentni kriteriji u alter ­
nativnom ispitivanju osjetljivosti na trenje.  
2. PODACI  
U načelu smatra se da tvar predstavlja opasnost od eksplozije u 
smislu Direktive ako je ispitivanje termi čke osjetljivosti, osjetljivosti 
na udarac ili trenje dalo pozitivan rezultat.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE OISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— identitet, sastav, čistoća, sadržaj vlage itd. ispitivane tvari,  
— fizikalni oblik uzorka i je li uzorak bio drobljen, lomljen i/ili 
prosijavan ili ne,  
— zapažanja tijekom ispitivanja termi čke osjetljivosti (npr. masa 
uzorka, broj komadi ća itd.),  
— zapažanja tijekom ispitivanja mehani čke osjetljivosti (npr. nasta ­
janje znatnih koli čina dima ili potpuna razgradnja bez praska, 
plamena, iskri, praska, pucketanja itd.),  
— rezultate svakog tipa ispitivanja,  
— ako je korišten alternativni ure đaj, treba pružiti znanstveno 
opravdanje za to kao i dokaz o korelaciji izme đu rezultata dobi ­
venih navedenim ure đajem i rezultata dobivenih ekvivalentnim 
uređajem,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 104
 
— sve korisne napomene kao što su upute na pokuse sa sli čnim 
proizvodima koje bi mogle biti relevantne za pravilno tuma čenje 
rezultata,  
— sve dodatne napomene relevantne za tuma čenje rezultata.  
3.2. TUMA ČENJE I PROCJENA REZULTATA  
U izvješću o ispitivanju treba navesti sve rezultate koji se smatraju 
lažnim, neuobi čajenim, ili nereprezentativnim. Ako bilo koji od 
rezultata ne bi trebalo uzeti u obzir, za to treba dati objašnjenje i 
navesti rezultate eventualnog alternativnog ili dodatnog ispitivanja. Ako se neuobi čajeni rezultat ne može objasniti, mora se prihvatiti 
takav kakav jest i primijeniti za klasifikaciju tvari s tim u skladu.
 
4. REFERENCE  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750 -60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol.3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (September 85) Chemical products for industrial 
use — Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 105
 
Dodatak  
Primjer specifikacije materijala za ispitivanje termi čke osjetljivosti (vidjeti 
normu DIN 1623)  
(1) Cijev: Specifikacija materijala br. 1.0336.505 g  
(2) Mjerna prigušnica: Specifikacija materijala br. 1.4873  
(3) Navojna obujmica i matica: Specifikacija materijala br. 1.3817  
Slika 1.  
Uređaj za ispitivanje termi čke osjetljivosti  
(sve dimenzije izražene su u milimetrima)
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 106
 
Slika 2.  
Ispitivanje termi čke osjetljivosti  
(primjer fragmentacije)
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 107
 
Slika 3.  
Kalibracija brzine zagrijavanja za ispitivanje termi čke osjetljivosti
  
Krivulja temperature u odnosu na vrijeme koja se dobije zagrijavanjem dibutil ftalata (27 cm  3 ) u zatvo­
renoj (mjerna prigušnica s otvorom 1,5 mm) cijevi kod brzine protoka propana od 3,2 litre/minuti. Temperatura se mjeri termoparom od kromela/alumela u omota ču od nehr đajućeg čelika promjera 
1 mm, postavljenim u središte 43 mm ispod ruba cijevi. Brzina zagrijavanja izme đu 135 °C i 285 °C 
treba biti izme đu 185 i 215 K/minuti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 108
 
Slika 4.  
Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na udarac  
(sve dimenzije izražene su u milimetrima)
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 109
 
Slika 4.  
Nastavak s prethodne stranice
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 110
 
Slika 5.  
Uređaj za ispitivanje osjetljivosti na trenje
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA (TEKU ĆINE I PLINOVI)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Eksplozivne tvari i tvari koje se spontano zapale u dodiru sa zrakom 
na sobnoj temperaturi ne treba podvrgavati ovom ispitivanju. Ispitni postupak primjenljiv je na plinove, teku ćine i pare koje je u prisut ­
nosti zraka mogu će upaliti vru ćom površinom.
 
Temperatura samozapaljenja može se znatno smanjiti prisustvom 
katalitičkih nečistoća, površinskim materijalom ili ve ćim volumenom 
ispitne posude.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Stupanj samozapaljenja izražava se temperaturom samozapaljenja. 
Temperatura samozapaljenja je najniža temperatura na kojoj će se 
ispitivana tvar zapaliti ako se pomiješa sa zrakom u uvjetima utvr ­ 
đenim u ovoj ispitnoj metodi.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari navedene su u normama (vidjeti 1.6.3.) One prven ­
stveno služe za povremenu provjeru primijenjene metode te radi 
usporedbe s rezultatima dobivenim drugim metodama.  
1.4. NA ČELO METODE  
Ovom se metodom odre đuje minimalna temperatura unutarnje povr ­ 
šine kućišta koja će rezultirati zapaljenjem plina, pare ili teku ćine 
ubrizgane u to ku ćište. 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Ponovljivost varira u skladu s podru čjem temperatura samozapaljenja 
i primijenjene ispitne metode.  
Osjetljivost i specifi čnost ovise o primijenjenoj ispitnoj metodi.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Ure đaj 
Uređaj je opisan u metodi koja se spominje u 1.6.3.  
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Uzorak ispitivane tvari ispituje se u skladu s metodom navedenom u 
1.6.3.  
1.6.3.  Provo đenje ispitivanja  
Vidjeti norme IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF 
T 20-037.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 112
 
2. PODACI  
Bilježi se temperatura ispitivanja, atmosferski tlak, koli čina uzorka 
koja se koristi i vremenski pomak do pojave zapaljenja.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
podatke:  
— precizna specifikacija tvari (identitet i ne čistoće), 
— količina uzorka koja se koristi, atmosferski tlak,  
— uređaj koji se koristi,  
— rezultati mjerenja (temperature ispitivanja, rezultati u vezi zapa ­
ljenja, odgovaraju ći vremenski razmaci),  
— svi dodatni podaci relevantni za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
Nema ih.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 113
 
A.16.  RELATIVNA TEMPERATURA SAMOZAPALJENJA ZA 
KRUTINE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Eksplozivne tvari i tvari koje se spontano zapale u dodiru sa zrakom 
na temperaturi okoline ne treba podvrgavati ovom ispitivanju.  
Ovo se ispitivanje provodi sa svrhom dobivanja preliminarnih poda ­
taka o samozapaljivosti krutih tvari na povišenim temperaturama.  
Ako se toplina koja se razvija bilo reakcijom tvari s kisikom ili 
egzotermi čnim raspadanjem ne gubi dovoljno brzo u okolini, 
dolazi do samozagrijavanja koje vodi do samozapaljenja. Dakle, do 
samozapaljenja dolazi kad brzina kojom se toplina razvija premaši 
brzinu gubitka topline.  
Ovaj je ispitni postupak koristan kao preliminarni test probira za 
krute tvari. Radi složene naravi zapaljenja i izgaranja krutina, 
temperaturu samozapaljenja koja se odredi prema ovoj ispitnoj metodi treba koristiti samo u svrhe uspore đivanja.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Temperatura samozapaljenja koja se dobije ovom metodom mini ­
malna je temperatura okoline izražena u °C na kojoj će se u odre ­ 
đenim uvjetima zapaliti odre đeni volumen tvari.  
1.3. REFERENTNA TVAR  
Nema je.  
1.4. NA ČELO METODE  
Izvjestan volumen tvari koja se ispituje stavi se u pe ć na temperaturu 
okoline; bilježi se krivulja temperature u funkciji vremena s obzirom 
na uvjete u središtu uzorka dok se temperatura pe ći povećava 
brzinom od 0,5 °C/min do 400 °C, ili do tališta ako je ono na 
nižoj temperaturi. U svrhu ovog ispitivanja, temperatura pe ći u 
kojoj temperatura uzorka koji se samozagrijava dostiže 400 °C naziva se temperaturom samozapaljenja.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Ure đaj 
1.6.1.1.  Peć 
Laboratorijska pe ć (zapremnine oko 2 litre) s ugra đenom regulacijom 
temperature, prirodnom cirkulacijom zraka i sustavom za rastere će­
nje. Kako bi se izbjegao eventualan rizik od eksplozije, plinovi koji 
nastaju razlaganjem ne smiju do ći u dodir s elektri čnim grija ćim 
elementima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 114
 
1.6.1.2.  Kocka od ži čane mrežice  
Komad mrežice otvora 0,045 mm izra đene od nehr đajuće čelične 
žice treba izrezati prema modelu u slici 1. Mrežicu treba složiti savijanjem i pri čvrstiti žicom da se dobije kocka s otvorenim 
gornjim dijelom.
 
1.6.1.3.  Termoparovi  
Odgovaraju ći termoparovi.  
1.6.1.4.  Zapisiva č 
Bilo koji dvokanalni zapisiva č kalibriran za temperaturu od 0 do 
600 °C ili za odgovaraju ći napon.  
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Tvari se ispituju kako su primljene.  
1.6.3.  Provo đenje ispitivanja  
U kocku se stavi tvar koja će se ispitivati, lagano se potapka i dodaje 
još tvari sve dok kocka nije potpuno puna. Kocka se tada objesi u 
središtu pe ći na sobnoj temperaturi. Jedan termopar se postavi u 
središte kocke, a drugi izme đu kocke i stijenke pe ći na kojoj se 
mjeri temperatura pe ći. 
Temperature pe ći i uzorka mjere se cijelo vrijeme dok se temperatura 
peći povećava brzinom od 0,5 °C/min do 400 °C ili do tališta ako je 
ono na nižoj temperaturi.  
Kad tvar zapali uzorak, termopar će pokazati nagli porast tempera ­
ture iznad temperature pe ći. 
2. PODACI  
Za procjenu je relevantna temperatura pe ći na kojoj uzorak samoza ­
grijavanjem dostiže temperaturu od 400 °C (vidjeti sliku 2.).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— opis tvari koja se ispituje,  
— rezultati mjerenja uklju čujući krivulju temperatura/vrijeme,  
— svi podaci relevantni za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
NF T 20-036 (September 85) Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 115
 
Slika 1.  
Model 20 milimetarske ispitne kocke
  
Slika 2.  
Tipična krivulja temperatura/vrijeme
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 116
 
A.17.  SVOJSTVA OKSIDACIJE (KRUTINE)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Prije provo đenja ovog ispitivanja korisno je raspolagati prelimi ­
narnim informacijama o eventualno eksplozivnim svojstvima tvari.  
Ovo ispitivanje nije primjenljivo na teku ćine, plinove, eksplozivne ili 
lako zapaljive tvari, ili perokside.  
Ovo ispitivanje ne treba provoditi ako je provjerom strukturne 
formule sa sigurnoš ću utvrđeno da tvar nije u stanju egzotermi čki 
reagirati sa zapaljivim materijalom.  
Kako bi se utvrdilo treba li ispitivanje provesti uz posebne mjere 
opreza, provodi se preliminarni pokus.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Vrijeme gorenja: vrijeme reakcije, u sekundama, uzeto iz zone reak ­
cije potrebno za prolaz kroz hrpicu materijala, prema postupku opisanom u 1.6.
 
Brzina gorenja: izražena u milimetrima po sekundi.  
Maksimalna brzina gorenja: najve ća vrijednost brzine gorenja dobi ­
vena s mješavinama koje sadrže 10 do 90 % težinskog udjela oksidansa.
 
1.3. REFERENTNA TVAR  
Barijev nitrat (analiti čke kvalitete) koristi se kao referentna tvar za 
ispitivanje i za preliminarni test.  
Referentna mješavina je mješavina barijevog nitrata s celulozom u 
prahu, pripravljena u skladu s 1.6., koja ima maksimalnu brzinu 
gorenja (obi čno mješavina koja sadrži 60 % težinskog udjela bari ­
jevog nitrata).  
1.4. NA ČELO METODE  
Preliminarni test provodi se radi sigurnosti. Ako je preliminarnim 
testom jasno pokazano da ispitivana tvar ima svojstva oksidacije, 
daljnja ispitivanja nisu potrebna. Ako to nije slu čaj, tvar zatim 
treba u potpunosti ispitati.  
Kod punog ispitivanja, tvar koja se ispituje miješa se u raznim 
omjerima s odre đenom zapaljivom tvari. Od svake se mješavine 
napravi hrpica koja se s jednog kraja zapali. Maksimalna brzina gorenja koja se odredi uspore đuje se s maksimalnom brzinom 
gorenja referentne mješavine.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Prema potrebi, svaka metoda mljevenja i miješanja je valjana pod 
uvjetom da se najve ća brzina gorenja u šest odvojenih testova ne 
razlikuje od aritmeti čke srednje vrijednosti za više od 10 %.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 117
 
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Priprema  
1.6.1.1.  Ispitivana tvar  
Smanjiti ispitni uzorak na veli činu čestica < 0,125 mm primjenjuju ći 
sljedeći postupak: prosijati ispitnu tvar, samljeti preostali dio, pono ­
viti postupak sve dok cijela koli čina ispitnog uzorka ne pro đe kroz 
sito. 
Smije se koristiti bilo koja tehnika mljevenja i prosijavanja koja 
zadovoljava kriterije kvalitete.  
Prije pripreme mješavine, tvar se suši na 105 °C sve dok se ne 
postigne stalna težina. Ako je temperatura razlaganja tvari koja se ispituje ispod 105 °C, tvar treba sušiti na odgovaraju ćoj nižoj 
temperaturi.
 
1.6.1.2.  Zapaljiva tvar  
Kao zapaljiva tvar koristi se celuloza u prahu. Celuloza mora biti one 
vrste koja se koristi za kromatografiju u tankom sloju ili kromato ­
grafiju u koloni. Za vrstu koja sadrži više od 85 % vlakana u duži ­
nama izme đu 0,020 i 0,075 mm dokazano je da je odgovaraju ća. 
Celuloza u prahu propušta se kroz sito veli čine mrežice 0,125 mm. 
Istu partiju celuloze treba koristiti cijelo vrijeme ispitivanja.  
Prije pripreme mješavine, celuloza u prahu suši se na 105 °C sve 
dok se ne postigne stalna težina.  
Ako se u preliminarnom testu koristi piljevina, treba je pripraviti od 
drveta četinjača skupljanjem dijela koji je prošao kroz sito mrežice 
1,6 mm, dobro promiješati, te zatim sušiti na 105 °C tijekom četiri 
sata u sloju debljine do 25 mm. Ohladiti i do upotrebe, po mogu ć­
nosti unutar 24 sata od sušenja, skladištiti u hermeti čki zatvorenom 
spremniku koji se puni do mjere koliko je to prakti čno. 
1.6.1.3.  Izvor paljenja  
Kao izvor paljenja treba koristiti vru ći plamen iz plinskoga gora ča 
(minimalnog promjera 5 mm). Ako se koristi neki drugi izvor 
paljenja (npr. kod ispitivanja u inertnoj atmosferi), taj izvor u izvješću treba opisati i dati obrazloženje upotrebe takvog izvora.
 
1.6.2.  Provo đenje ispitivanja  
Napomena:  
Mješavine oksidansa s celulozom ili piljevinom smatraju se potenci ­
jalno eksplozivnim te njima treba oprezno rukovati.  
1.6.2.1.  Preliminarni test  
Osušena tvar dobro se izmiješa s osušenom celulozom ili piljevinom 
u omjerima 2 težinska udjela ispitivane tvari u odnosu na 1 težinski dio celuloze ili piljevine, te se oblikuje u malu konusnu hrpicu dimenzija 3,5 cm (promjer osnovice) × 2,5 cm (visina) rahlim punje ­
njem šablone konusnog oblika (npr. laboratorijski stakleni lijevak sa 
začepljenim otvorom).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 118
 
Hrpica se postavi na hladnu, nezapaljivu, neporoznu podlogu slabe 
toplinske provodljivosti. Pokus treba provoditi u digestoru kako je 
opisano u 1.6.2.2.  
Izvor zapaljenja dovede se u dodir s konusnom hrpicom. Promatraju 
se i bilježe ja čina i trajanje rezultiraju će reakcije.  
Ako je reakcija snažna, tvar treba smatrati oksidiraju ćom. 
U svakom slu čaju u kojem postoji sumnja potrebno je provesti cijeli 
postupak ispitivanja kako se opisuje dalje u tekstu.  
1.6.2.2.  Potpuno ispitivanje  
Pripraviti mješavine oksidansa i celuloze s težinskim udjelima od 10 
do 90 % oksidansa u 10 %-tnim prirastima. Kod grani čnih slučajeva 
treba upotrijebiti gotove mješavine oksidansa i celuloze kako bi se maksimalna brzina gorenja dobila to čnije.
 
Hrpica se oblikuje pomo ću kalupa. Kalup je izra đen od metala, 
duljine je 250 mm i trokutastog popre čnog presjeka unutarnje 
visine 10 mm i unutarnje širine 20 mm. S obje strane kalupa, u 
uzdužnom smjeru, postavljene su dvije metalne plo če kao bo čni 
graničnici koji se protežu 2 mm preko gornjega ruba trokutastog 
poprečnog presjeka (slika). Taj se sklop bez sabijanja puni mješa ­
vinom u nešto prekomjernoj koli čini. Nakon što se kalup spusti s 
visine od 2 cm na krutu površinu, preostala prekomjerna koli čina 
tvari poravna se tupim limom. Bo čni graničnici se skinu, a preostali 
se prah zagladi valjkom. Na vrh kalupa stavi se nezapaljiva, nepo ­
rozna podloga slabe toplinske provodljivosti, ure đaj se preokrene i 
kalup ukloni.  
Hrpicu treba postaviti u smjeru strujanja zraka u digestoru.  
Brzina zraka treba biti dostatna da sprije či istjecanje para u labora ­
torij i ne smije varirati tijekom testa. Strujanjem zraka oko ure đaja 
mora se formirati zra čna zavjesa.  
Uslijed higroskopi čnosti celuloze i nekih tvari koje se ispituju, ispi ­
tivanje treba provesti što je mogu će brže.  
Zapaliti jedan kraj hrpice na na čin da ga se dotakne plamenom.  
Mjeriti vrijeme reakcije u duljini od 200 mm nakon što se podru čje 
reakcije proširilo preko po četne udaljenosti od 30 mm.  
Ispitivanje se provodi s referentnom tvari i najmanje jednom sa 
svakom mješavinom iz podru čja mješavina ispitivane tvari s 
celulozom.  
Ako se utvrdi da je maksimalna brzina gorenja znatno ve ća od brzine 
referentne mješavine, ispitivanje treba zaustaviti; u suprotnom, pokus 
treba ponavljati pet puta za svaku od tri mješavine koje daju najve ću 
brzinu gorenja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 119
 
Ako se sumnja da bi rezultat mogao biti lažno pozitivan, pokus treba 
ponoviti s tim da se umjesto celuloze upotrijebi inertna tvar sli čne 
dimenzije čestica, kao što je dijatomejska zemlja. Alternativno, celu ­
loznu mješavinu ispitivane tvari koja ima najve ću brzinu gorenja 
treba ponovno ispitati u inertnoj atmosferi (< 2 % v/v udjela sadržaja 
kisika).  
2. PODACI  
Iz sigurnosnih razloga, karakteristi čnim oksidativnim svojstvom tvari 
koja se ispituje smatra se maksimalna brzina gorenja – a ne srednja vrijednost.
 
Za procjenu relevantna je najviša vrijednost brzine gorenja odre đene 
mješavine u nizu u šest pokusa.  
Iscrtati krivulju najviše vrijednosti brzine gorenja za svaku mješavinu 
u odnosu na koncentraciju oksidansa. S krivulje o čitati maksimalnu 
brzinu gorenja.  
Šest izmjerenih vrijednosti u jednom nizu dobivenih od mješavine 
kod maksimalne brzine gorenja ne smiju se razlikovati od aritmeti čke 
srednje vrijednosti za više od 10 %; u protivnom, treba primijeniti 
bolje metode mljevenja i miješanja.  
Usporediti maksimalnu brzinu gorenja koja je postignuta s maksi ­
malnom brzinom gorenja referentne mješavine (vidjeti 1.3.).  
Ako se ispitivanja provode u inertnoj atmosferi, maksimalna brzina 
reakcije uspore đuje se s maksimalnom brzinom reakcije referentne 
mješavine u inertnoj atmosferi.  
3. IZVJEŠ ĆE 
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— identitet, sastav, čistoća, sadržaj vlage itd. ispitivane tvari,  
— eventualna obrada ispitivanog uzorka (npr. mljevenje, sušenje),  
— izvor zapaljenja koji je upotrebljen u ispitivanju,  
— način reakcije (npr. gorenje uz bljesak na površini, gorenje kroz 
cijelu masu, sve informacije o zapaljivim proizvodima itd.),  
— sve dodatne napomene relevantne za tuma čenje rezultata, uklju ­ 
čujući opis jačine (plamen, iskre, dimne pare, polagano tinjanje 
itd.) i približno trajanje tijekom preliminarnog sigurnosnog testa/ testa probira i za ispitivanu tvar i za referentnu tvar,
 
— rezultati pokusa s inertnom tvari, ako su provedeni,  
— rezultati pokusa u inertnoj atmosferi, ako su provedeni.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 120
 
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA.  
Tvar treba smatrati oksidiraju ćom tvari ako:  
(a) u preliminarnom pokusu do đe do snažne reakcije;  
(b) je u punom ispitivanju maksimalna brzina gorenja mješavina 
veća ili jednaka maksimalnoj brzini gorenja referentne mješavine 
celuloze i barijevog nitrata.  
Kako bi se izbjegao lažni pozitivni rezultat, kod tuma čenja rezultata 
treba uzeti u obzir i rezultate ispitivanja tvari pomiješane s inertnim materijalom i/ili ispitivanja u inertnoj atmosferi.
 
4. REFERENCE  
NF T 20-035 (September 85) Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidising properties of solids.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 121
 
Dodatak  
Slika  
Kalup i pribor za pripravu hrpice  
(Sve dimenzije izražene su u milimetrima)
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 122
 
A.18.  OPĆI PROSJEK MOLEKULSKE TEŽINE I RASPODJELA 
MOLEKULSKE TEŽINE POLIMERA  
1. METODA  
Metoda kromatografije na permeabilnom gelu preslika je OECD-ove 
Smjernice za ispitivanje TG 118 (1996.). Temeljna na čela i daljnje 
tehničke informacije navedene su u referenci (1).  
1.1. UVOD  
Kako su svojstva polimera vrlo raznolika, nemogu će je opisati jednu 
metodu kojom se precizno utvr đuju uvjeti separacije i procjene koji 
obuhvaćaju sve slu čajnosti i posebnosti do kojih dolazi kod separa ­
cije polimera. Posebno, složeni sustavi polimera često nisu pogodni 
za kromatografiju na permeabilnom gelu (GPC). Kad kromatografija GPC nije u praksi provediva, molekulske mase mogu će je određivati 
drugim metodama (vidjeti Dodatak). U takvim slu čajevima treba 
potanko obrazložiti zašto se koristi baš odre đena metoda.
 
Opisana metoda temelji se na normi DIN 55672 (1). Ta DIN norma 
sadrži iscrpne informacije o na činu na koji treba provoditi pokuse i 
procjenjivati podatke. Ako su izmjene uvjeta pokusa nužne, takve je 
promjene potrebno opravdati. Dozvoljeno je koristiti druge norme ako se za njih u potpunosti navedu reference. U opisanoj metodi, za kalibraciju se koriste uzorci polistirena poznate polidisperzivnosti, 
i možda će je za odre đene polimere, npr. polimere dugih razgranatih 
lanaca i topljive u vodi, biti potrebno prilagoditi.
 
1.2. DEFINICIJE I MJERNE JEDINICE  
Opći prosjek molekulske težine M  n i prosječna molekulska težina 
M w određuju se sljede ćim jednadžbama: 
M n ¼ X  n 
i¼1 H i 
X  n 
i¼1 H i=M i M w ¼ X  n 
i¼1 H i Ü M i 
X  n 
i¼l H i 
gdje je:  
H i razina detektorskog signala od osnovice za volumen retencije V  i 
M i molekulska težina frakcije polimera kod volumena retencije V  i i 
n broj točaka s podacima  
Širina raspodjele molekulske težine, kojom se mjeri disperzivnost 
sustava, odre đena je omjerom M  w /M n . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 123
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Kako je kromatografija GPC relativna metoda, neophodno je provesti 
kalibraciju. Za to se obi čno koriste etaloni za usko raspodijeljene, 
linearno strukturirane polistirene poznatih prosje čnih molekulskih 
težina M  n i M  w , te poznate raspodjele molekulske težine. Kalibra ­
cijska krivulja može se koristiti za odre đivanje molekulske težine 
nepoznatog uzorka samo ako su uvjeti za separaciju uzorka i etaloni odabrani na istovjetan na čin.
 
Utvrđena veza izme đu molekulske težine i volumena eluiranja vrijedi 
jedino pod konkretnim uvjetima svakog pojedinog pokusa. Ti uvjeti 
uključuju prije svega temperaturu, otapalo (ili mješavinu otapala), 
uvjete kromatografije i separacijsku kolonu ili sustav kolona.  
Na taj na čin određene molekulske težine uzorka relativne su vrijed ­
nosti i opisujemo ih kao „ekvivalentne molekulske težine polistire ­
na”. To zna či da u zavisnosti o strukturnim i kemijskim razlikama 
između uzorka i etalona, molekulska težina može više ili manje 
odstupati od apsolutnih vrijednosti. Ako se koriste drugi etaloni, npr. polietilen glikol, polietilen oksid, polimetil metakrilat, polia ­
krilna kiselina, razlog za to treba navesti.
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
GPC kromatografijom mogu će je odrediti kako raspodjelu mole ­
kulske težine uzorka tako i prosje čne molekulske težine (M  n , M  w ). 
GPC metoda je poseban tip teku ćinske kromatografije kod kojeg se 
uzorak separira prema hidrodinami čkim volumenima pojedinih 
komponenata (2).  
Do separacije dolazi prolazom uzorka kroz kolonu koja je ispunjena 
propusnim materijalom, obi čno organskim gelom. Male molekule 
mogu penetrirati kroz pore dok se velike molekule isklju čuju. 
Dakle, put velikih molekula je kra ći i one prve eluiraju. Molekule 
srednje veli čine prolaze kroz neke od pora i eluiraju kasnije. 
Najmanje molekule, čiji je srednji hidrodinami čki promjer manji 
od pora gela, mogu u ći u sve pore. One eluiraju posljednje.  
U idealnom slu čaju, separaciju u potpunosti regulira veli čina mole­
kulskih vrsta, ali u praksi je teško izbje ći međudjelovanje barem 
nekih učinaka apsorpcije. Nejednoliko punjenje kolone i mrtvi volu ­
meni mogu pogoršati stanje (2).  
Detekcija se vrši, npr. refrakcijskim indeksom ili UV apsorpcijom, 
čime se dobije jednostavna krivulja raspodjele. Me đutim, kako bi se 
krivulji dodale stvarne vrijednosti molekulskih težina, potrebno je kalibrirati kolonu prolaskom polimera poznate molekulske težine i, 
u idealnom slu čaju, u širem smislu sli čne strukture, npr. raznih 
etalona polistirena. Tipi čni rezultati iz Gaussove krivulje ponekad 
iskrivljene manjim repom prema strani manje molekulske težine, kod koje okomita os pokazuje koli činu, izraženu težinom, raznih 
molekulskih težina koje su eluirane, a vodoravna os logaritamsku 
molekulsku težinu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 124
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Ponovljivost (relativno odstupanje etalona: RSD) volumena eluiranja 
treba biti bolja od 0,3 %. Propisana ponovljivost analize mora se osigurati korekcijom putem internog etalona ako se kromatogram 
procjenjuje u zavisnosti od vremena i ne odgovara gore navedenom 
kriteriju (1). Polidisperzivnosti ovise o molekulskim težinama etalona. Kod etalona polistirena tipi čne vrijednosti su: 
M
 p < 2 000  M  w /M n < 1,20  
2 000 ≤ M p ≤ 10  6 M w /M n < 1,05  
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p je molekulska težina etalona na tjemenu krivulje eluacije)  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema otopina polistirena za etalone  
Etaloni polistirena otapaju se opreznim miješanjem u odabranom 
eluentu. Kod pripreme otopina obvezno treba uzeti u obzir upute 
proizvođača. 
Koncentracije odabranih etalona ovise o raznim čimbenicima, npr. 
volumenu ubrizgavanja, viskozitetu otopine i osjetljivosti analiti čkog 
detektora. Maksimalni volumen ubrizgavanja mora se prilagoditi 
duljini kolone, kako bi se sprije čilo prekomjerno punjenje. Za anali ­
tičke separacije metodom GPC s kolonom dimenzija 30 cm × 
7,8 mm, tipi čni volumeni ubrizgavanja su obi čno između 40 i 100 
μl. Veći volumeni su mogu ći, ali ne bi trebali prije ći 250 μl. Opti­
malni omjer izme đu volumena ubrizgavanja i koncentracije mora se 
utvrditi prije stvarne kalibracije kolone.  
1.6.2.  Priprema otopine uzorka  
U načelu, isti zahtjevi vrijede za pripremu otopina uzorka. Uzorak se 
otapa u odgovaraju ćem otapalu, npr. tetrahidrofuranu (THF), na 
način da se oprezno protrese. Ni u kom slu čaju ne treba ga otapati 
pomoću ultrazvu čne kupke. Po potrebi otopinu uzorka treba pro čistiti 
preko membranskog filtra veli čine pora izme đu 0,2 i 2 μm. 
Prisutnost neotopljenih čestica mora se zabilježiti u kona čnom 
izvješću jer se kod vrsta velike molekulske težine one mogu javiti 
kao posljedica. Težinski postotak otopljenih čestica odre đuje se 
primjenom odgovaraju će metode. Otopine treba upotrijebiti u roku 
od 24 sata.  
1.6.3.  Ure đaj 
— spremnik za otapalo,  
— otplinja č (ako je potrebno),  
— crpka,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 125
 
— ublaživa č trzaja (ako je potrebno),  
— sustav za ubrizgavanje,  
— kromatografske kolone,  
— detektor,  
— mjera č protoka (ako je potrebno),  
— uređaj za bilježenje i obradu podataka,  
— posuda za otpad.  
Mora se osigurati inertnost sustava za kromatografiju GPC s obzirom 
na otapala koja se koriste (što se postiže npr. uporabom čeličnih 
kapilara za otapalo THF).  
1.6.4.  Ubrizgavanje i sustav dobave otapala  
Utvrđeni volumen otopine uzorka puni se u kolonu bilo ure đajem za 
automatsko uzimanje uzorka ili ru čno u točno određeno podru čje. 
Prebrzo povla čenje ili otpuštanje klipa brizgaljke, ako se radi ru čno, 
može uzrokovati promjene u raspodjeli molekulske težine koja se 
promatra. Sustav dobave otapala trebao bi, koliko je to mogu će, 
raditi bez trzaja, što se u idealnim uvjetima osigurava ublaživa čem 
trzaja. Brzina protoka je 1 ml/min.  
1.6.5.  Kolona  
U zavisnosti od uzorka, za karakterizaciju polimera koristi se ili 
jednostruka kolona ili nekoliko kolona povezanih u niz. Na tržištu 
postoji cijeli niz poroznih materijala za kolone, koji imaju odre đena 
svojstva (npr. veli činu pore, granice isklju čenja po veli čini). Odabir 
separacijskoga gela ili duljine kolone ovisi kako o svojstvima uzorka (hidrodinami čkim volumenima, raspodjeli molekulske težine) tako i 
o konkretnim uvjetima separacije, kao što su otapalo, temperatura i 
brzina protoka (1)(2)(3).
 
1.6.6.  Teoretski stupnjevi  
Kolona ili kombinacija kolona koja se koristi za separaciju mora biti 
karakterizirana brojem teoretskih stupnjeva. To obuhva ća, u slučaju 
kad se kao otapalo za eluaciju koristi THF, punjenje otopine etil 
benzena ili neke druge pogodne nepolarne topljive tvari na kolonu 
poznate duljine. Broj teoretskih stupnjeva odre đen je sljede ćom 
jednadžbom: 
N ¼ 5,54  V e 
W 1=2 Í Î  2 
ili N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
gdje je:  
N = broj teoretskih stupnjeva  
V e = volumen eluiranja na tjemenu krivulje eluiranja  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 126
 
W = širina osnovice krivulje  
W 1/2 = širina krivulje na pola visine  
1.6.7.  Učinkovitost separacije  
Osim broja teoretskih stupnjeva, što je koli čina koja odre đuje širinu 
pojasa, važna je u činkovitost separacije, a nju odre đuje kosina kali ­
bracijske krivulje. U činkovitost separacije kolone dobiva se iz slje ­
dećeg odnosa:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
poprečni presjek kolone ≥ 6,0 " 
cm 3 
cm 2 # 
gdje je:  
V e,Mx = volumen eluiranja za polistiren molekulske težine M  x 
V e,(10.Mx)  = volumen eluiranja za polistiren 10 puta ve će mole­
kulske težine  
Rezolucija sustava obi čno se definira kako slijedi:  
R 1,2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
gdje je:  
V e1 , V e2 = volumeni eluiranja dva etalona polistirena na tjemenu 
krivulje eluiranja  
W 1 , W  2 = širine osnovice krivulje  
M 1 , M  2 = molekulske težine na tjemenu krivulje (trebale bi se 
razlikovati faktorom 10)  
R-vrijednost sustava kolona treba biti ve ća od 1,7 (4).  
1.6.8.  Otapala  
Sva otapala moraju biti velike čistoće (za THF, uzima se čistoća od 
99,5 %). Spremnik za otapalo (ako je potreban u atmosferi inertnog 
plina) mora biti dovoljno velik za kalibraciju kolona i nekoliko 
analiza uzorka. Prije nego se crpkom prenosi do kolone, otapalo se mora otpliniti.
 
1.6.9.  Regulacija temperature  
Temperatura kriti čnih unutarnjih komponenata (petlje ubrizgavanja, 
kolona, detektora i cjevovoda) mora biti stalna i u skladu s izborom 
otapala.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Svrha detektora koli činski je bilježiti koncentraciju uzorka eluiranog 
iz kolone. Kako bi se izbjeglo nepotrebno širenje krivulje, volumen kivete ćelije detektora mora se držati što je mogu će manjim. Ne bi 
trebao biti ve ći od 10 μl, osim za detektore koji rade po metodama 
rasapa svjetlosti i viskozimetrije. Za detekciju se obi čno koristi dife ­
rencijalna refraktometrija. Me đutim, ako je to potrebno zbog 
posebnih svojstava uzorka ili otapala za eluaciju, mogu će je koristiti 
i druge tipove detektora, npr. UV/VIS, IR, viskozimetriju itd.
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Za pojedinosti u vezi s kriterijima procjene kao i za zahtjeve koji se 
odnose na prikupljanje i obradu podataka treba konzultirati normu DIN (1).
 
Za svaki je uzorak nužno provesti dva neovisna pokusa. Njih treba 
analizirati odvojeno.  
Za svako mjerenje treba imati vrijednosti M  n , M  w , M  w /M n i M  p . 
Potrebno je izri čito navesti da su izmjerene vrijednosti relativne 
vrijednosti ekvivalentne molekulskim težinama etalona koji je 
upotrijebljen.  
Nakon odre đivanja volumena retencije ili vremena retencije (koje je 
moguće korigirati upotrebom internog etalona), logaritamske se 
vrijednosti M  p (s tim da M  p predstavlja najviše to čke krivulje kali ­
bracijskog etalona) ucrtavaju u odnosu na jednu od tih koli čina. 
Najmanje dvije kalibracijske to čke nužne su po dekadi molekulske 
težine, a najmanje pet mjernih to čaka potrebno je za ukupnu krivu ­
lju, koja bi trebala obuhvatiti procijenjenu molekulsku težinu uzorka. 
Krajnja to čka kalibracijske krivulje za malu molekulsku težinu defi ­
nira se n-heksil benzenom ili drugom pogodnom nepolarnom topljivom tvari. Vrijednosti molekulskih težina M
 n i M  w obično se 
utvrđuju elektronskom obradom podataka, koja se temelji na formu ­
lama iz odjeljka 1.2. Ako se koristi ru čna obrada, upute se mogu 
naći u normi ASTM D 3536-91 (3).  
Krivulja raspodjele mora biti u obliku tablice ili kao slika (diferen ­
cijalna frekvencija ili zbroj postotaka u odnosu na logaritamsku vrijednost M). U grafi čkom prikazu, jedna dekada molekulske 
težine obi čno treba biti oko 4 cm u širinu, a najviša to čka krivulje 
oko 8 cm u visinu. Kod integralnih krivulja raspodjele, razlika na ordinati izme đu 0 i 100 % treba biti oko 10 cm.
 
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će podatke:  
2.2.1.  Ispitna tvar:  
— dostupne informacije o ispitivanoj tvari (identitet, aditivi, ne či­
stoće), ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 128
 
— opis obrade uzorka, opažanja, problemi.  
2.2.2.  Instrumentacija:  
— spremnik za eluent, inertni plin, otplinjavanje eluenta, sastav 
eluenta, ne čistoće, 
— crpka, ublaživa č trzaja, sustav ubrizgavanja,  
— kolone za separaciju (proizvo đač, sve informacije o karakteristi ­
kama kolona, kao što su veli čina pora, vrsta materijala za sepa ­
raciju itd., broj, duljina i red kolona koje se koriste),  
— broj teoretskih stupnjeva kolone (ili kombinacije), u činkovitost 
separacije (rezolucija sustava),  
— informacije o simetriji tjemena krivulja,  
— temperatura kolone, vrsta regulacije temperature,  
— detektor (mjerno na čelo, tip, volumen kivete),  
— mjera č protoka, ako se koristi (proizvo đač, mjerno na čelo), 
— sustav za bilježenje i obradu podataka (ure đaji i računalni progra ­
mi). 
2.2.3.  Kalibracija sustava:  
— iscrpan opis metode koja se koristi za konstruiranje kalibracijske 
krivulje,  
— informacije o kriterijima kvalitete za ovu metodu (npr. koeficijent 
korelacije, zbroj kvadrata odstupanja itd.),  
— informacije o svim ekstrapolacijama, pretpostavkama i približa ­
vanjima u činjenim tijekom postupka pokusa, kao i o procjeni i 
obradi podataka,  
— sva mjerenja poduzeta radi konstruiranja kalibracijske krivulje 
moraju biti dokumentirana u tablici koja obuhva ća sljedeće infor­
macije o svakoj to čki kalibracije:  
— naziv uzorka,  
— proizvo đač uzorka,  
— karakteristi čne vrijednosti etalona M  p , M  n , M  w i M  w /M n koje 
je dao proizvo đač ili koje proizlaze iz naknadnih mjerenja, 
zajedno s pojedinostima o metodi odre đivanja,  
— volumen ubrizgavanja i koncentracija ubrizgavanja,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 129
 
— vrijednost M  p koja je upotrijebljena za kalibraciju,  
— volumen eluiranja ili korigirano vrijeme retencije mjereno na 
tjemenu krivulje eluiranja,  
— vrijednost M  p izračunana na tjemenu krivulje,  
— postotak greške izra čunane vrijednosti M  p i kalibracijska 
vrijednost.  
2.2.4.  Procjena:  
— procjena na osnovi vremena: sve metode kojima se osigurava 
propisana mjerna obnovljivost (metoda korekcije, interni etalon itd.),
 
— informacija o tome je li procjena izvršena na temelju volumena 
eluiranja ili vremena retencije,  
— informacije o ograni čenjima procjene ako tjeme krivulje nije u 
potpunosti analizirano,  
— opis metoda poravnavanja (rezultata), ako su korištene,  
— priprema i postupci prethodne obrade uzorka,  
— eventualna prisutnost neotopljenih čestica,  
— volumen ubrizgavanja ( μl) i koncentracija ubrizgavanja (mg/ml)  
— opažanja o u čincima koji vode do odstupanja od idealnog profila 
GPC,  
— iscrpan opis svih izmjena postupaka ispitivanja,  
— pojedinosti o podru čjima greške,  
— sve ostale informacije i opažanja koja su bitna za tuma čenje 
rezultata.  
3. REFERENCE  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 130
 
Dodatak  
Primjeri ostalih metoda za odre đivanje prosjeka molekulske težine (M  n ) za 
polimere  
Metoda kromatografije na permeabilnom gelu (GPC) poželjna je metoda za 
određivanje M  n , pogotovo ako je dostupan komplet etalona čija je struktura 
usporediva sa strukturom polimera. Me đutim ako postoje prakti čne poteško će u 
korištenju metode GPC, ili ako se unaprijed o čekuje da tvar ne će zadovoljiti 
regulatorni kriterij za M  n (što se mora potvrditi), dostupne su alternativne 
metode, kao npr.:  
1. Metoda koligativnih svojstava  
1.1. Ebulioskopija/Krioskopija  
obuhvaća mjerenje podizanja vrelišta (ebulioskopija) ili spuštanja 
ledišta (krioskopija) otapala, ako se dodaje polimer. Metoda se zasniva na činjenici da u činak otopljenog polimera na vrelište/ledište 
tekućine zavisi o molekulskoj težini polimera (1)(2).
 
Primjenljivost, M  n < 20 000.  
1.2. Snižavanje tlaka pare  
obuhvaća mjerenje tlaka pare odabrane referentne teku ćine prije i 
nakon dodavanja poznatih koli čina polimera (1)(2).  
Primjenljivost, M  n < 20 000 (teoretski; me đutim, njezina je vrijed ­
nost u praksi ograni čena).  
1.3. Membranska osmometrija  
temelji se na na čelu osmoze, tj. prirodne sklonosti molekula otapala 
da prolaze kroz polu-propusnu membranu iz razrije đene u koncen ­
triranu otopinu radi postizanja ravnoteže. U ispitivanju, razrije đena 
otopina je nulte koncentracije, dok koncentrirana otopina sadrži poli ­
mer. Učinak provla čenja otapala kroz membranu uzrokuje diferenci ­
jalni tlak koji zavisi o koncentraciji i molekulskoj težini polimera (1)(3)(4).
 
Primjenljivost, M  n između 20 000-200 000.  
1.4. Osmometrija faze pare  
obuhvaća uspoređivanje brzine isparavanja aerosola čistog otapala do 
najmanje tri aerosola koji sadrže polimer u razli čitim koncentraci ­
jama (1)(2)(4).  
Primjenljivost, M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 131
 
2. Analiza krajne grupe  
Za primjenu ove metode potrebno je poznavati i ukupnu strukturu 
polimera i vrstu lanca kojim završavaju krajnje grupe (koji se mora razlikovati od glavnog kostura po, npr. NMR ili titraciji/derivatiza ­
ciji). Odre đivanje molekulske koncentracije krajnjih grupa koje se 
nalaze na polimeru može dovesti do vrijednosti molekulske težine (7)(8)(9).
 
Primjenljivost, M  n do 50 000 (uz smanjenje pouzdanosti).  
3. Reference  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984) Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A., (1975) Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, 
Jr. ed., Marcel Dekker, New York.  
(3) ASTM D 3750-79, (1979) Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.  
(4) Coll, H. (1989) Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.
 
(5) ASTM 3592-77, (1977) Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 
(6) Morris, C.E.M., (1989) Vapour Pressure Osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons.  
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989) Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975) End-Group Determinations, Chapter 3 In: 
Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel 
Dekker, New York.  
(9) Amiya, S., et al. (1990) Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 132
 
A.19.  SADRŽAJ MALE MOLEKULSKE TEŽINE U POLIMERIMA  
1. METODA  
Metoda kromatografije na permeabilnom gelu preslika je Smjernice 
OECD-a za ispitivanje TG 119 (1996.) Temeljna na čela i daljnje 
tehničke informacije navedeni su u referencama.  
1.1. UVOD  
Kako su svojstva polimera veoma raznolika, nemogu će je opisati 
jednu metodu kojom se precizno utvr đuju uvjeti separacije i procjene 
koji obuhva ćaju sve slu čajnosti i posebnosti do kojih dolazi kod 
separacije polimera. Posebno, složeni sustavi polimera često nisu 
pogodni za kromatografiju na permeabilnom gelu (GPC). Kad 
metoda GPC nije u praksi provediva, molekulske mase mogu će je 
određivati drugim metodama (vidjeti Dodatak). U takvim slu čaje­
vima treba potanko obrazložiti zašto se odre đena metoda koristi.  
Opisana metoda temelji se na normi DIN 55672 (1). Ta DIN norma 
sadrži iscrpne informacije o na činu na koji treba provoditi pokuse i 
procjenjivati podatke. Ako su izmjene uvjeta pokusa nužne, takve 
promjene treba opravdati. Dozvoljeno je koristiti druge norme ako se za njih u potpunosti navedu reference. U opisanoj metodi, za kali ­
braciju se koriste uzorci polistirena poznate polidisperzivnosti, i 
možda će je za odre đene polimere, npr. polimere dugih razgranatih 
lanaca i topljive u vodi, trebati prilagoditi.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Mala molekulska težina proizvoljno je definirana kao molekulska 
težina ispod 1 000 daltona.  
Opći prosjek molekulske težine M  n i prosječna molekulska težina 
M w određuju se sljede ćim jednadžbama: 
M n ¼ X  n 
i¼1 H i 
X  n 
i¼1 H i=M i M w ¼ X  n 
i¼1 H i Ü M i 
X  n 
i¼l H i 
gdje je:  
H i = razina detektorskog signala od osnovice za volumen retencije 
V i 
M i = molekulska težina frakcije polimera kod volumena retencije 
V i , a n je broj to čaka s podacima  
Širina raspodjele molekulske težine, kojom se mjeri disperzivnost 
sustava, odre đena je omjerom M  w /M n . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 133
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Kako je kromatografija GPC relativna metoda, neophodno je provesti 
kalibraciju. Za to se obi čno koriste etaloni za usko raspodijeljene, 
linearno strukturirane polistirene poznatih prosje čnih molekulskih 
težina M  n i M  w i poznate raspodjele molekulske težine. Kalibracijska 
krivulja može se koristiti za odre đivanje molekulske težine nepoz ­
natog uzorka samo ako su uvjeti za separaciju uzorka i etaloni odabrani na istovjetan na čin.
 
Utvrđena veza izme đu molekulske težine i volumena eluiranja vrijedi 
jedino pod konkretnim uvjetima svakog pojedinog pokusa. Ti uvjeti uključuju prije svega temperaturu, otapalo (ili mješavinu otapala), 
uvjete kromatografije i separacijsku kolonu ili sustav kolona.
 
Na taj na čin određene molekulske težine uzorka relativne su vrijed ­
nosti i opisujemo ih kao „ekvivalentne molekulske težine polistire ­
na”. To zna či da u ovisnosti o strukturnim i kemijskim razlikama 
između uzorka i etalona, molekulska težina može više ili manje 
odstupati od apsolutnih vrijednosti. Ako se koriste drugi etaloni, 
npr. polietilen glikol, polietilen oksid, polimetil metakrilat, polia ­
krilna kiselina, razlog za to treba navesti.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
GPC metodom mogu će je odrediti kako raspodjelu molekulske težine 
uzorka tako i prosje čne molekulske težine (M  n , M  w ). GPC je 
poseban tip teku ćinske kromatografije kod kojeg se uzorak separira 
prema hidrodinami čkim volumenima pojedinih komponenata (2).  
Do separacije dolazi prolazom uzorka kroz kolonu koja je ispunjena 
poroznim materijalom, obi čno organskim gelom. Male molekule 
mogu penetrirati kroz pore dok se velike molekule isklju čuju. 
Dakle, put velikih molekula je kra ći i one prve eluiraju. Molekule 
srednje veli čine prolaze kroz neke od pora i eluiraju kasnije. 
Najmanje molekule, čiji je srednji hidrodinami čki promjer manji 
od pora gela, mogu u ći u sve pore. One eluiraju posljednje.  
U idealnom slu čaju, separaciju u potpunosti regulira veli čina mole­
kulskih vrsta, ali u praksi je teško izbje ći međudjelovanje barem 
nekih učinaka apsorpcije. Nejednoliko punjenje kolone i prazni volu ­
meni mogu pogoršati stanje (2).  
Detekcija se vrši npr. refrakcijskim indeksom ili UV apsorpcijom, 
čime se dobije jednostavna krivulja raspodjele. Me đutim, kako bi se 
krivulji dodale stvarne vrijednosti molekulskih težina, potrebno je kalibrirati kolonu prolaskom polimera poznate molekulske težine, i 
u idealnom slu čaju, u širem smislu sli čne strukture, npr. raznih 
etalona polistirena. Tipi čni rezultati iz Gaussove krivulje, ponekad 
iskrivljene manjim repom prema strani manje molekulske težine, kod koje okomita os pokazuje koli činu, izraženu težinom, raznih mole ­
kulskih težina koje su eluirane, a vodoravna os logaritamsku mole ­
kulsku težinu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 134
 
Iz te krivulje izvodi se sadržaj male molekulske težine. Izra čun može 
biti točan samo ako se vrste polimera malih molekulskih težina na 
isti način odnose prema jedinici mase, kao prema polimeru u cjelini.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Ponovljivost (relativno odstupanje etalona: RSD) volumena eluiranja 
treba biti bolja od 0,3 %. Propisana ponovljivost analize mora se osigurati korekcijom putem internog etalona ako se kromatogram 
procjenjuje u zavisnosti od vremena, i ne odgovara gore navedenom 
kriteriju (1). Polidisperzivnosti ovise o molekulskim težinama etalona. Kod etalona polistirena tipi čne vrijednosti su: 
M
 p < 2 000  M  w /M n < 1,20  
2 000 ≤ M p ≤ 10  6 M w /M n < 1,05  
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p je molekulska težina etalona na tjemenu krivulje eluiranja)  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema otopina polistirena za etalone  
Etaloni polistirena otapaju se opreznim miješanjem u odabranom 
eluentu. U pripremi otopina obvezno treba uzeti u obzir upute proiz ­
vođača. 
Koncentracije odabranih etalona ovise o raznim čimbenicima, npr. 
volumenu ubrizgavanja, viskoznosti otopine i osjetljivosti analiti čkog 
detektora. Maksimalni volumen ubrizgavanja mora se prilagoditi duljini kolone, radi spre čavanja prekomjernog punjenja. Za analiti čke 
separacije metodom GPC s kolonom dimenzija 30 cm × 7,8 mm, 
tipični volumeni ubrizgavanja su obi čno između 40 i 100 μl. Veći 
volumeni su mogu ći, ali ne bi trebali prije ći 250 μl. Optimalni omjer 
između volumena ubrizgavanja i koncentracije mora se utvrditi prije 
stvarne kalibracije kolone.
 
1.6.2.  Priprema otopine uzorka  
U načelu, isti zahtjevi vrijede za pripremu otopina uzorka. Uzorak se 
otapa u odgovaraju ćem otapalu, npr. tetrahidrofuranu (THF), na 
način da se oprezno protrese. Ni u kom slu čaju ne treba ga otapati 
pomoću ultrazvu čne kupke. Po potrebi, otopinu uzorka treba pro či­
stiti preko membranskog filtra veli čine pora izme đu 0,2 i 2 μm. 
Prisutnost neotopljenih čestica mora se zabilježiti u kona čnom 
izvješću jer one mogu biti posljedica vrsta velike molekulske 
težine. Težinski postotak neotopljenih čestica odre đuje se primjenom 
odgovaraju će metode. Otopine treba upotrijebiti u roku od 24 sata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 135
 
1.6.3.  Korekcija radi sadržaja ne čistoća i aditiva  
Korekcija sadržaja vrsta koje imaju M < 1 000 za prinos iz prisutnih 
konkretnih nepolimernih komponenata (npr. ne čistoća i/ili aditiva) 
obično je potrebna, ako izmjereni sadržaj ve ć nije < 1 %. To se 
postiže neposrednom analizom otopine polimera ili eluata koji se 
koristi u metodi GPC.  
Ako je eluat nakon prolaza kroz kolonu prerazrije đen za daljnju 
analizu, potrebno ga je koncentrirati. Možda će eluat trebati prvo u 
potpunosti ispariti, a zatim ga ponovno otopiti. Koncentriranje eluata mora se vršiti pod uvjetima koji osiguravaju da na eluatu ne će doći 
ni do kakvih promjena. Postupak s eluatom nakon uporabe u GPC-u 
ovisi o analiti čkoj metodi koja je primijenjena za koli činsko odre đi­
vanje.
 
1.6.4.  Ure đaj 
Uređaj GPC obuhva ća sljedeće komponente:  
— spremnik za otapalo,  
— otplinja č (ako je potrebno),  
— crpku,  
— ublaživa č trzaja (ako je potrebno)  
— sustav za ubrizgavanje,  
— kromatografske kolone,  
— detektor,  
— mjera č protoka (ako je potrebno),  
— uređaj za bilježenje i obradu podataka – procesor,  
— posudu za otpad.  
Mora se osigurati inertnost sustava za kromatografiju GPC s obzirom 
na otapala koja se koriste (što se postiže npr. uporabom čeličnih 
kapilara za otapalo THF).  
1.6.5.  Ubrizgavanje i sustav dobave otapala  
Utvrđeni volumen otopine uzorka puni se u kolonu bilo ure đajem za 
automatsko uzimanje uzorka ili ru čno u točno određeno podru čje. 
Prebrzo povla čenje ili otpuštanje klipa brizgaljke, ako se radi ru čno, 
može uzrokovati promjene u raspodjeli molekulske težine koja se promatra. Sustav dobave otapala trebao bi, koliko je to mogu će, 
raditi bez trzaja, što se u idealnim uvjetima osigurava ublaživa čem 
trzaja. Brzina protoka je reda veli čine 1 ml/min.
 
1.6.6.  Kolona  
U zavisnosti od uzorka, za karakterizaciju polimera koristi se ili 
jednostruka kolona ili nekoliko kolona povezanih u niz. Na tržištu 
postoji cijeli niz poroznih materijala za kolone, koji imaju odre đena 
svojstva (npr. veli činu pore, granice isklju čenja po veli čini). Odabir 
separacijskoga gela ili duljine kolone ovisi kako o svojstvima uzorka (hidrodinami čkim volumenima, raspodjeli molekulske težine) tako i 
o konkretnim uvjetima separacije, kao što su otapalo, temperatura i 
brzina protoka (1)(2)(3).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 136
 
1.6.7.  Teoretski stupnjevi  
Kolona ili kombinacija kolona koja se koristi za separaciju mora biti 
karakterizirana brojem teoretskih stupnjeva. To obuhva ća, u slučaju 
kad se kao otapalo za eluaciju koristi THF, punjenje otopine etil 
benzena ili neke druge pogodne nepolarne topljive tvari na kolonu 
poznate duljine. Broj teoretskih stupnjeva odre đen je sljede ćom 
jednadžbom: 
N ¼ 5,54  V e 
W 1=2 Í Î  2 
ili N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
gdje je:  
N = broj teoretskih stupnjeva  
V e = volumen eluiranja na tjemenu krivulje eluiranja  
W = širina osnovice krivulje  
W 1/2 = širina krivulje na pola visine  
1.6.8.  Učinkovitost separacije  
Osim broja teoretskih stupnjeva, što je koli čina koja odre đuje širinu 
pojasa, važna je u činkovitost separacije, a nju odre đuje kosina kali ­
bracijske krivulje. U činkovitost separacije kolone dobiva se iz slje ­
dećeg odnosa:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
poprečni presjek kolone ≥ 6,0 " 
cm 3 
cm 2 # 
gdje je:  
V e , Mx = volumen eluiranja za polistiren molekulske težine M  x 
V e,(10.Mx)  = volumen eluiranja za polistiren 10 puta ve će molekulske 
težine  
Rezolucija sustava obi čno se definira kako slijedi:  
R 1,2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
gdje je:  
V e1 , V e2 = volumeni dva etalona polistirena na tjemenu krivulje 
eluiranja  
W 1 , W  2 = širine osnovice krivulje  
M 1 , M  2 = molekulske težine na tjemenu krivulje (trebali bi se 
razlikovati faktorom 10)  
R-vrijednost sustava kolona treba biti ve ća od 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 137
 
1.6.9.  Otapala  
Sva otapala moraju biti velike čistoće (za THF, uzima se čistoća od 
99,5 %). Spremnik za otapalo (ako je potreban u atmosferi inertnog plina) mora biti dovoljno velik za kalibraciju kolona i nekoliko 
analiza uzorka. Prije nego se crpkom prenosi do kolone, otapalo se 
mora otpliniti.
 
1.6.10.  Regulacija temperature  
Temperatura kriti čnih unutarnjih komponenata (petlje ubrizgavanja, 
kolona, detektora i cjevovoda) mora biti stalna, i u skladu s izborom otapala.
 
1.6.11.  Detektor  
Svrha detektora je koli činski bilježiti koncentraciju uzorka eluiranog 
iz kolone. Kako bi se izbjeglo nepotrebno širenje krivulje, volumen 
kivete ćelije detektora mora se držati što je mogu će manjim. Ne bi 
trebao biti ve ći od 10 μl, osim za detektore koji rade po metodama 
rasapa svjetlosti i viskozimetrije. Za detekciju se obi čno koristi dife ­
rencijalna refraktometrija. Me đutim, ako je to potrebno zbog 
posebnih svojstava uzorka ili otapala za eluaciju, mogu će je koristiti 
i druge tipove detektora, npr. UV/VIS, IR, viskozimetriju itd.  
1. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Za pojedinosti u vezi s kriterijima procjene kao i za zahtjeve koji se 
odnose na prikupljanje i obradu podataka treba konzultirati DIN normu (1).
 
Za svaki je uzorak nužno provesti dva neovisna pokusa. Te pokuse 
treba analizirati odvojeno. Uvijek je bitno odrediti i podatke iz 
slijepih proba koje su napravljene pod istim uvjetima kao s uzorkom.  
Treba izri čito navesti da su izmjerene vrijednosti relativne vrijednosti 
ekvivalentne molekulskim težinama etalona koji je upotrijebljen.  
Nakon odre đivanja volumena retencije ili vremena retencije (koje je 
moguće korigirati upotrebom internog etalona), logaritamske se 
vrijednosti M  p (s tim da M  p predstavlja najviše to čke krivulje kali ­
bracijskog etalona) ucrtavaju u odnosu na jednu od tih koli čina. 
Barem dvije kalibracijske to čke nužne su po dekadi molekulske 
težine, a barem pet mjernih to čaka potrebno je za ukupnu krivulju, 
koja bi trebala obuhvatiti procijenjenu molekulsku težinu uzorka. Krajnja to čka kalibracijske krivulje za malu molekulsku težinu defi ­
nira se n-heksil benzenom ili drugom pogodnom nepolarnom 
topljivom tvari. Dio krivulje koji odgovara molekulskim težinama ispod 1 000 odre đuje se i po potrebi ispravlja za ne čistoće i aditive. 
Krivulje eluacije obi čno se procjenjuju elektronskom obradom poda ­
taka. Ako se koristi ru čna obrada, upute se mogu na ći u normi 
ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 138
 
Ako se na koloni zadržao koji netopljivi polimer, njegova mole ­
kulska težina vjerojatno je ve ća od težine topljive frakcije, i ako 
se ne uzme u obzir, sadržaj malih molekulskih težina će biti precije ­
njen. Smjernice za korekcije sadržaja male molekulske težine za netopljive polimere navedene su u Dodatku.
 
Krivulja raspodjele mora biti u obliku tablice ili kao slika (diferen ­
cijalna frekvencija ili zbroj postotaka naprema logaritamskoj vrijed ­
nosti M). U grafi čkom prikazu, jedna dekada molekulske težine treba 
obično biti oko 4 cm u širinu, a najviša to čka krivulje oko 8 cm u 
visinu. Kod integralnih krivulja raspodjele, razlika na ordinati 
između 0 i 100 % treba biti oko 10 cm.  
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— dostupne informacije o tvari koja se ispituje (identitet, aditivi, 
nečistoće), 
— opis obrade uzorka, opažanja, problemi.  
2.2.2.  Instrumentacija:  
— spremnik za eluent, inertni plin, otplinjavanje eluenta, sastav 
eluenta, ne čistoće, 
— crpka, ublaživa č trzaja, sustav ubrizgavanja,  
— kolone za separaciju (proizvo đač, sve informacije o karakteristi ­
kama kolona, kao što su veli čina pora, vrsta materijala za sepa ­
raciju itd., broj, duljina i red kolona koje se koriste),  
— broj teoretskih stupnjeva kolone (ili kombinacije), u činkovitost 
separacije (rezolucija sustava),  
— informacije o simetriji krivulja eluiranja,  
— temperatura kolone, vrsta regulacije temperature,  
— detektor (mjerno na čelo, tip, volumen kivete),  
— mjera č protoka, ako se koristi (proizvo đač, mjerno na čelo), 
— sustav za bilježenje i obradu podataka (ure đaji i računalni progra ­
mi). 
2.2.3.  Kalibracija sustava:  
— iscrpan opis metode koja se koristi za konstruiranje kalibracijske 
krivulje,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 139
 
— informacije o kriterijima kvalitete za ovu metodu (npr. koeficijent 
korelacije, zbroj kvadrata odstupanja itd.),  
— informacije o svim ekstrapolacijama, pretpostavkama i približa ­
vanjima u činjenim tijekom postupka pokusa, kao i o procjeni i 
obradi podataka,  
— sva mjerenja poduzeta radi konstruiranja kalibracijske krivulje 
moraju biti dokumentirana u tablici koja obuhva ća sljedeće infor­
macije o svakoj to čki kalibracije:  
— naziv uzorka,  
— proizvo đač uzorka,  
— karakteristi čne vrijednosti etalona M  p , M  n , M  w, M w /M n , koje 
je dao proizvo đač ili koje proizlaze iz naknadnih mjerenja, 
zajedno s pojedinostima o metodi odre đivanja,  
— volumen ubrizgavanja i koncentracija ubrizgavanja,  
— vrijednost M  p koja je upotrijebljena za kalibraciju,  
— volumen eluiranja ili korigirano vrijeme retencije mjereno na 
tjemenu krivulje,  
— vrijednost M  p izračunana na tjemenu krivulje,  
— postotak greške izra čunane vrijednosti M  p i kalibracijska 
vrijednost.  
2.2.4.  Informacije o sadržaju male molekulske težine u polimerima:  
— opis metoda koje su primijenjene u analizi i na čin na koji su 
pokusi ra đeni, 
— informacije o postotku sadržaja vrsta male molekulske težine,  
— informacije o ne čistoćama, aditivima i ostalim nepolimerskim 
vrstama u težinskom postotku u odnosu na ukupan uzorak.  
2.2.5.  Procjena:  
— procjena na osnovi vremena; sve metode kojima se osigurava 
propisana mjerna obnovljivost (metoda korekcije, interni etalon 
itd.),  
— informacija o tome je li procjena izvršena na temelju volumena 
eluiranja ili vremena retencije,  
— informacije o ograni čenjima procjene ako krivulja nije u potpu ­
nosti analizirana,  
— opis metoda poravnavanja (rezultata), ako su korištene,  
— priprema i postupci prethodne obrade uzorka,  
— eventualna prisutnost neotopljenih čestica,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 140
 
— volumen ubrizgavanja ( μl) i koncentracija ubrizgavanja (mg/ml),  
— opažanja o u čincima koji vode do odstupanja od idealnog profila 
GPC,  
— iscrpan opis svih izmjena u postupcima ispitivanja,  
— pojedinosti o podru čjima greške,  
— sve ostale informacije i opažanja koja su bitna za tuma čenje 
rezultata.  
3. REFERENCE  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979) Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and 
Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 141
 
Dodatak  
Smjernice za korekciju sadržaja male molekulske mase s obzirom na 
prisutnost netopljivih polimera  
Prisutnost netopljivog polimera u uzorku ima za posljedicu gubitak mase tijekom 
analize metodom GPC. Netopljivi polimer trajno se zadržava na koloni ili filtru 
uzorka dok topljivi dio uzorka prolazi kroz kolonu. Ako je prirast refrakcijskog indeksa (dn/dc) polimera mogu će procijeniti ili izmjeriti, mogu će je procijeniti i 
gubitak mase uzorka na koloni. U tom se slu čaju radi korekcija putem vanjske 
kalibracije, a za etalone se uzimaju materijali poznate koncentracije i omjera 
dn/dc, kako bi se kalibrirala reakcija refraktometra. U primjeru koji slijedi kao etalon upotrijebljen je poli(metil metakrilat) (pMMA).
 
U vanjskoj kalibraciji, za analizu akrilnih polimera, etalon pMMA poznate 
koncentracije u tetrahidrofuranu, analiziran je metodom GPC, a dobiveni 
podaci upotrijebljeni su kako bi se odredila konstanta refraktometra prema 
jednadžbi:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
gdje je:  
K = konstanta refraktometra (u mikrovolt sekundama/ml),  
R = reakcija etalona pMMA (u mikrovolt/sekundi),  
C = koncentracija etalona pMMA (u mg/ml),  
V = volumen ubrizgavanja (u ml), i  
dn/dc = prirast refrakcijskog indeksa za pMMA u tetrahidrofuranu (u ml/mg)  
Sljedeći podaci tipi čni su za etalon pMMA:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg.  
Dobivena vrijednost K 3,05 × 10  11 zatim se koristi za izra čun teoretske reakcije 
detektora ako je 100 % ubrizganog polimera eluiralo kroz detektor.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 142
 
A.20.  PONAŠANJE POLIMERA U VODI - OTAPANJE/EKSTRAK ­
CIJA  
1. METODA  
Opisana metoda preslika je Smjernice OECD-a za ispitivanje TG 120 
(1997.). Daljnje tehni čke informacije navedene su u referenci (1).  
1.1. UVOD  
Za određene polimere, kao što su emulzijski polimeri, prije primjene 
metode opisane dalje u tekstu možda će trebati izvršiti odre đene 
pripremne radnje. Metoda nije primjenljiva na teku će polimere niti 
na polimere koji u ispitnim uvjetima reagiraju s vodom.  
Kad metoda nije prakti čna ili nije mogu ća, ponašanje kod otapanja/ 
ekstrakcije mogu će je istražiti drugim metodama. U takvim slu čaje­
vima, odabranu metodu treba iscrpno opisati i opravdati.  
1.2. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ponašanje polimera kod otapanja/ekstrakcije u vodenom mediju utvr ­ 
đuje se primjenom metode tikvice (vidjeti A.6. Topljivost u vodi, 
metoda tikvice) uz izmjene opisane u daljnjem tekstu.  
1.4. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Oprema  
Za ovu metodu potrebna je sljede ća oprema:  
— uređaj za drobljenje, npr. mlin za dobivanje čestica poznate veli ­ 
čine, 
— uređaj za protresanje s mogu ćnošću regulacije temperature,  
— membranski sustav za filtriranje,  
— odgovaraju ća analitička oprema,  
— standardizirana sita.  
1.5.2.  Priprema uzorka  
Reprezentativni uzorak prvo treba smanjiti na čestice veli čine između 
0,125 i 0,25 mm upotrebom odgovaraju ćih sita. Radi održavanja 
stabilnosti uzorka ili radi postupka mljevenja možda će biti potrebno 
hlađenje. Gumaste materijale mogu će je smrviti na temperaturi 
tekućeg dušika (1).  
Ako nije mogu će postići potrebnu veli činu čestica, treba poduzeti 
radnje da se čestice što je mogu će više smanje, te o tome treba 
izraditi izvješ će. U tom izvješ ću treba navesti na koji je na čin 
smrvljeni uzorak bio skladišten prije ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 143
 
1.5.3.  Postupak  
Tri uzorka po 10 g ispitne tvari odvagnu se u tri zasebne posude 
opremljene staklenim čepovima i u svaku se posudu doda 1 000 ml 
vode. Ako se rukovanje koli činom od 10 g polimera pokaže neprak ­
tičnim, treba uzeti prvu sljede ću količinu kojom se može rukovati i 
njoj prilago đen volumen vode.  
Posude se čvrsto začepe i zatim tresu na 20 °C. Treba upotrijebiti 
uređaj za protresanje ili miješanje koji radi na stalnoj temperaturi. 
Nakon razdoblja od 24 sata, sadržaj svake posude se centrifugira ili 
filtrira, a koncentracija polimera u čistoj vodenoj fazi utvr đuje se 
odgovaraju ćom analiti čkom metodom. Ako odgovaraju će analitičke 
metode za vodenu fazu nisu dostupne, ukupnu je topljivost/sposob ­
nost ekstrakcije mogu će procijeniti iz suhe težine taloga na filtru ili 
centrifugiranog precipitata.  
Obično je potrebno koli činski razlikovati ne čistoće i aditive s jedne 
strane i vrste male molekulske težine s druge strane. U slu čaju 
određivanja gravimetrijom, isto tako je važno napraviti slijepu 
probu bez ispitne tvari radi uzimanja u obzir taloga koji nastaju u postupku pokusa.
 
Ponašanje polimera kod otapanja/ekstrakcije u vodi na 37 °C kod pH 
2 i pH 9 može se utvrditi na isti na čin kao što je opisano za provo ­ 
đenje pokusa na 20 °C. pH vrijednosti mogu će je postići dodavanjem 
bilo odgovaraju ćih pufera ili odgovaraju ćih kiselina ili lužina, kao 
što su klorovodi čna kiselina, octena kiselina, natrij analiti čke kvali­
tete, ili kalijev hidroksid, ili NH  3 . 
Ovisno o metodi analize koja se primjenjuje treba provesti jedno ili 
dva ispitivanja. Ako su dostupne dovoljno konkretne metode za 
izravnu analizu vodene faze za polimernu komponentu, dovoljno je jedno ispitivanje kao što je opisano u gornjem tekstu. Me đutim, ako 
takve metode nisu dostupne pa se utvr đivanje ponašanja polimera 
kod otapanja/ekstrakcije ograni čava na posredne analize utvr điva­
njem samo ukupnog sadržaja organskog ugljika (TOC) vodenog ekstrakta, treba provesti i dodatno ispitivanje. To dodatno ispitivanje treba tako đer provesti tri puta, uporabom 10 puta manjih uzoraka 
polimera i istih koli čina vode od onih koje su bile upotrijebljene u 
prvom ispitivanju.
 
1.5.4.  Analiza  
1.5.4.1.  Ispitivanje koje se provodi na uzorku jedne veli čine 
Možda su dostupne metode za neposrednu analizu polimerne kompo ­
nente u vodenoj fazi. Alternativno, mogu će je razmotriti primjenu 
posredne analize otopljenih/izdvojenih polimernih komponenata utvr ­ 
đivanjem ukupnog sadržaja topljivih dijelova i korekcijom za 
komponente koje nisu konkretno polimerne.  
Analiza vodene faze ukupnih polimerskih vrsta mogu ća je: 
nekom dovoljno osjetljivom metodom, npr.  
— određivanjem ukupnog sadržaja organskog ugljika digestijom 
persulfata ili dikromata kojom nastaje CO  2 , nakon čega se vrši 
procjena metodom IR ili kemijskom analizom,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 144
 
— spektrometrijom atomske apsorpcije (AAS) ili njenim induktivno 
spregnutim plazma (ICP) emisijskim ekvivalentom za polimere 
koji sadrže silicij ili metale,  
— UV apsorpcijom ili spektrofluorometrijom za aril polimere,  
— LC-MS (teku ćinskom kromatografijom - masenom spektrometri ­
jom) za uzorke male molekulske težine,  
ili evaporacijom u vakuumu do isušivanja vodenog ekstrakta, i spek ­
troskopijom (IR, UV itd.) ili AAS/ICP analizom taloga.  
Ako takva analiza vodene faze nije prakti čna, vodeni ekstrakt treba 
izdvojiti organskim otapalom koje se ne miješa s vodom, npr. klori ­
ranim ugljikohidratom. Otapalo tada ishlapi, a talog se analizira s 
obzirom na prijavljeni sadržaj polimera, na na čin opisan u gornjem 
tekstu. Komponente koje se u tomu talogu utvrde kao ne čistoće ili 
aditivi treba suptrahirati radi utvr đivanja stupnja otapanja/ekstrakcije 
samog polimera.  
Kad su prisutne relativno velike koli čine takvih materijala, talog će 
možda trebati podvr ći analizi, npr. HPLC (visokodjelotvornoj teku ­ 
ćinskoj kromatografiji) ili GC (plinskoj kromatografiji), radi razliko ­
vanja nečistoća od monomera i vrsta koje potje ču od monomera, 
kako bi se mogao odrediti sadržaj ovih potonjih.  
U nekim slu čajevima, obi čno ishlapljivanje organskog otapala do 
potpune suho će i vaganje suhog taloga može biti dovoljno.  
1.5.4.2.  Ispitivanje koje se provodi na dvije razli čite veličine uzorka  
Svi vodeni ekstrakati analiziraju se s obzirom na ukupni sadržaj 
organskog ugljika.  
Gravimetrijsko odre đivanje provodi se na neotopljenom/neizdvo ­
jenom dijelu uzorka. Ako, nakon centrifugiranja ili filtriranja sadržaja 
svake posude, talog polimera ostane na stjenkama posude, posudu 
treba ispirati filtratom sve dok se sav vidljiv talog ne ukloni. Nakon toga, filtrat se ponovno centrifugira ili filtrira. Talog koji preostaje na filtru ili na cijevi centrifuge suši se na 40 °C u vakuumu i važe. 
Sušenje se nastavlja dok se ne postigne stalna težina.
 
2. PODACI  
2.1. ISPITIVANJE PROVEDENO NA UZORKU JEDNE VELI ČINE 
Pojedinačne rezultate za svaku od tri tikvice i prosje čne vrijednosti 
treba izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine (obi čno mg/l) 
ili mase po masi uzorka polimera (obi čno mg/g). Osim toga, treba 
navesti i gubitak težine uzorka (koji se izra čunava kao težina topljive 
tvari podijeljena po četnom težinom uzorka). Relativna odstupanja 
etalona (RSD) treba izra čunati. Podatke treba dati odvojeno za 
ukupnu tvar (polimer + glavni aditivi itd.) i odvojeno samo za 
polimer (tj. nakon oduzimanja udjela aditiva).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 145
 
2.2. ISPITIVANJE PROVEDENO NA DVIJE RAZLI ČITE VELI ČINE 
UZORKA  
Pojedinačne vrijednosti ukupnog sadržaja ugljika vodenih ekstrakata 
iz dvaju trostrukih pokusa i prosje čnu vrijednost za svaki pokus treba 
izraziti u jedinicama mase po volumenu otopine (obi čno mgC/l), ali i 
u jedinicama mase po po četnoj težini uzorka (obi čno mgC/g).  
Ako nema razlike izme đu rezultata velikih i malih omjera uzorak/ 
voda, to može ukazivati da su sve izdvojive komponente zaista 
izdvojene. U tom slu čaju, izravna analiza obi čno nije potrebna.  
Pojedinačne težine taloga treba izraziti u postotku po četnih težina 
uzoraka. Za svaki pokus treba izra čunati prosje čnu vrijednost. 
Razlike izme đu 100 % i utvr đenog postotka predstavljaju topljiv i 
izdvojiv materijal u prvobitnom uzorku.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
3.1.1.  Ispitivana tvar:  
— dostupne informacije o tvari koja se ispituje (identitet, aditivi, 
nečistoće, sadržaj vrsta male molekulske težine).  
3.1.2.  Uvjeti pokusa:  
— opis primijenjenih postupaka i uvjeta pokusa,  
— opis analiti čke metode i metode otkrivanja.  
3.1.3.  Rezultati:  
— rezultati topljivosti/sposobnosti ekstrakcije u mg/l; pojedina čne i 
srednje vrijednosti za ispitivanja ekstrakcije u raznim otopinama, razložene na sadržaj polimera i ne čistoće, aditive itd.,
 
— rezultati topljivosti/sposobnosti izdvajanja u mg/g polimera,  
— vrijednosti ukupnog sadržaja ugljika vodenih ekstrakata, težina 
topljive tvari i izra čunani postoci, ako je mjereno,  
— pH vrijednost svakog uzorka,  
— informacije o vrijednostima dobivenim u slijepim probama,  
— po potrebi, upute na kemijsku nestabilnost tvari koja se ispituje, 
tijekom postupka ispitivanja i postupka analize,  
— sve informacije koje su važne za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 146
 
A.21.  SVOJSTVA OKSIDACIJE (TEKU ĆINE)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Ova je ispitna metoda namijenjena za odre đivanje sposobnosti teku će 
tvari da pove ća brzinu gorenja ili ja činu gorenja zapaljive tvari, ili da 
sa zapaljivom tvari formira mješavinu koja će se spontano zapaliti 
ako se te dvije tvari homogeno izmiješaju. Temelji se na UN-ovom 
testu za oksidiraju će tekućine (1) i ekvivalentna je tom pokusu. 
Međutim, budu ći da je metoda A.21. razvijena prvenstveno kako 
bi se udovoljilo zahtjevima Uredbe (EZ) br. 1907/2006, propisuje 
se usporedba sa samo jednom referentnom tvari. Ispitivanje i uspo ­
ređivanje s dodatnim referentnim tvarima može biti potrebno ako se 
očekuje da se rezultati ispitivanja koriste u druge svrhe (  1 ). 
Ovaj test ne treba provoditi kad je ispitivanjem strukturne formule sa 
sigurnošću utvrđeno da tvar nije u stanju egzotermno reagirati sa 
zapaljivim materijalom.  
Prije provo đenja ovog ispitivanja korisno je posjedovati preliminarne 
informacije o mogu ćim eksplozivnim svojstvima tvari.  
Ovo se ispitivanje ne primjenjuje na krutine, plinove, eksplozivne ili 
lako zapaljive tvari, ili organske perokside.  
Ovo ispitivanje nije nužno provoditi ako su za ispitivanu tvar ve ć 
dostupni rezultati u okviru UN-ovog ispitivanja za oksidiraju će teku­ 
ćine (1).  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Srednje vrijeme porasta tlaka je prosje čno izmjereno vrijeme u kojem 
mješavina koja se ispituje proizvede porast tlaka od 690 kPa do 
2 070 kPa iznad atmosferskog tlaka.  
1.3. REFERENTNA TVAR  
Propisano je da referentna tvar bude 65 % (m/m) vodena nitritna 
kiselina (analiti čke kvalitete) (  2 ). ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 147  
( 1 ) Primjerice, u okviru UN-ovih propisa o prijevozu. 
( 2 ) Kiselinu prije ispitivanja treba podvr ći titranju kako bi se potvrdila njezina koncentracija.
 Postoji mogu ćnost da, ako ispitiva č predvidi da bi se rezultati ovog 
ispitivanja mogli koristiti u druge svrhe (  1 ), je prikladno ispitati i 
druge referentne tvari (  2 ). 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Tekućina koje se ispituje miješa se s vlaknastom celulozom u omjeru 
1 prema 1 masenog udjela i uvodi u tla čnu posudu. Ako tijekom 
miješanja ili punjenja spontano do đe do zapaljenja, daljnje ispitivanje 
nije potrebno.  
Ako do spontanog zapaljenja ne do đe, provodi se puno ispitivanje. 
Mješavina se zagrijava u tla čnoj posudi te se odre đuje srednje 
vrijeme koje je potrebno da bi se tlak podigao s 690 kPa na 2 070 
kPa iznad atmosferskog. To se uspore đuje sa srednjim vremenom 
porasta temperature za mješavinu 1:1 jedne ili više referentnih tvari i celuloze.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
U nizu od pet pokusa s jednom tvari niti jedan rezultat ne bi se smio 
razlikovati od aritmeti čke sredine za više od 30 %. Rezultate koji se 
od aritmeti čke sredine razlikuju za više od 30 % treba odbaciti, 
poboljšati postupak miješanja i punjenja te ponoviti ispitivanje.  
1.6. OPIS METODE  
1.6.1.  Priprema  
1.6.1.1.  Zapaljiva tvar  
Kao zapaljivi materijal koristi se sušena, vlaknasta celuloza duljine 
vlakana izme đu 50 i 250 μm i srednjeg promjera vlakana 25 μm (  3 ). 
Suši se na stalnu težinu u sloju debljine najviše 25 mm na 105 °C 
tijekom četiri sata i drži u eksikatoru, sa sredstvom za upijanje vlage, 
dok se ne ohladi i bude potrebna za upotrebu. Sadržaj vode sušene celuloze treba biti manji od 0,5 % suhe mase (
 4 ). Po potrebi, vrijeme 
sušenja treba produžiti kako bi se to postiglo (  5 ). U cijelom ispiti ­
vanju treba koristiti istu partiju celuloze.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 148  
( 1 ) Primjerice, u okviru UN-ovih propisa o prijevozu. 
( 2 ) Npr.: u referenci 1. rabi se 50 % (m/m) perklorna kiselina i 40 % (m/m) natrijev klorat. 
( 3 ) Npr. celuloza u prahu Whatman za kromatografiju na koloni CF 11, kataloški broj 
4021 050. 
( 4 ) Potvrđeno, npr. Karl-Fisherovom titracijom. 
( 5 ) Alternativno, taj sadržaj vode može se posti ći i npr. grijanjem na 105 °C pod vakuumom 
tijekom 24 sata.
 1.6.1.2.  Uređaj 
1.6.1.2.1. T l a č n a p o s u d a  
Potrebna je tla čna posuda. To je cilindri čna čelična tlačna posuda 
dugačka 89 mm, vanjskog promjera 60 mm (vidjeti sliku 1.). Na 
suprotnim stranama strojno su obra đene dvije ravnine (koje smanjuju 
poprečni presjek posude na 50 mm) kako bi se olakšalo držanje 
prilikom ugradnje mehanizma za paljenje i odzra čnika. Posuda, 
koja ima provrt promjera 20 mm, s unutrašnje strane na oba kraja 
smanjena je na dubinu od 19 mm i urezan je navoj za cijev 1” prema 
Britanskom standardu za cijevi (BSP) ili drugoj ekvivalentnoj metri ­ 
čkoj normi. Ventil za oduzimanje tlaka, u obliku bo čno postavljenog 
rukavca, vijkom je pri čvršćen za zakrivljenu površinu tla čne posude 
35 mm od jednog kraja i na 90° prema strojno obra đenim ravninama. 
Podloga za to probušena je do dubine od 12 mm i ima urezan navoj za cijev 1/2” prema BSP-u ili drugoj ekvivalentnoj metri čkoj normi, 
u koji se pri čvršćuje bočni rukavac. Po potrebi ugra đuje se brtva od 
inertnog materijala kako bi se osigurala plinonepropusnost. Bo čni 
rukavac izlazi iz tijela tla čne posude u duljinu od 55 mm i ima 
provrt od 6 mm. Kraj rukavca je smanjen i ima navojni priklju čak 
za pretvara č tlaka s dijafragmom. Može se koristiti bilo koja vrsta 
mjerača tlaka pod uvjetom da na njega ne djeluju vru ći plinovi ili 
proizvodi razlaganja i da je u stanju reagirati na brzine porasta tlaka od 690-2 070 kPa u najviše 5 ms.
 
Kraj tlačne posude koji je najdalje od bo čnog rukavca zatvoren je 
mehanizmom za paljenje koji ima dvije elektrode, jednu izoliranu od tijela mehanizma, a drugu uzemljenu. Drugi kraj tla čne posude 
zatvoren je rasprskavaju ćom pločom (tlak raspsrkavanja približno 
2 200 kPa) u čvršćen je vijkom s provrtom od 20 mm. Po potrebi, 
uz mehanizam za paljenje ugra đuje se brtva od inertnog materijala, 
čime se osigurava plinonepropusnost. Potporni stalak (Slika 2.) drži 
cijeli sklop u pravilnom položaju tijekom upotrebe. Stalak se obi čno 
sastoji od temeljne plo če od mekog čelika veli čine 235 mm × 
184 mm × 6 mm i šupljeg četvrtastog profila 70 mm × 70 mm × 
4 mm, duga čkog 185 mm.
 
S jednog kraja četvrtastog profila izrezane su po dužini dvije nasu ­
protne stranice, na na čin da se iznad dobije konstrukcija dijela netak ­
nutog kućišta dužine 86 mm na dvije noge ravnih stranica. Krajevi 
tih ravnih stranica odrežu se pod kutom od 60° na horizontalnu 
ravninu i zavare na temeljnu plo ču. Na jednoj strani gornjeg kraja 
podloge strojno se obradi utor 22 mm širine × 46 mm dubine kako bi se, kad se sklop tla čne posude spusti u potporni stalak dijela 
kućišta, s tim da prvo ide kraj s mehanizmom za paljenje, bo čni 
rukavac namjestio u utor. Na donju unutarnju površinu dijela 
kućišta zavari se komad čelika širine 30 mm i debljine 6 mm koji 
ima ulogu drža ča razmaka. Dva 7 milimetarska pritezna vijka postav ­
ljena u suprotne strane čvrsto drže tla čnu posudu. S donje strane 
tlačnu posudu nose dvije 12 mm široke čelične trake debljine 
6 mm zavarene na bo čne strane podnožja ku ćišta.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 149
 
1.6.1.2.2. S u s t a v p a l j e n j a  
Sustav paljenja sastoji se od Ni/Cr žice duljine 25 cm promjera 
0,6 mm i otpora 3,85 om/m. Žica je namotana na šipku promjera 
5 mm, u obliku svitka i prigra đena na elektrode mehanizma za 
paljenje. Svitak bi trebao imati jedan od oblika prikazanih na slici 3. Razmak izme đu dna posude i donje strane svitka za paljenje treba 
biti 20 mm. Ako elektrode nisu podesive, krajeve žice za paljenje 
između svitka i dna posude treba izolirati kerami čkom oblogom. Žica 
se grije stalnim izvorom koji može dati struju ja čine najmanje 10 A.
 
1.6.2.  Provo đenje ispitivanja  ( 1 ) 
Potpuno montiran ure đaj zajedno s pretvornikom tlaka i sustavom 
zagrijavanja, ali bez postavljenog rasprskavaju ćeg diska, postavljen 
je u svoj stalak mehanizmom za paljenje prema dolje. 2,5 g teku ćine 
koja se ispituje miješa se s 2,5 g sušene celuloze u staklenoj čaši 
pomoću staklenog štapi ća za miješanje (  2 ). Iz sigurnosnih razloga 
miješanje treba vršiti na na čin da izme đu vršitelja pokusa i mješavine 
postoji sigurnosni štit. Ako se mješavina zapali tijekom miješanja ili 
punjenja, daljnje ispitivanje nije potrebno. Mješavina se u tla čnu 
posudu dodaje u malim koli činama laganim tapkanjem kako bi se 
mješavina dobro sabila oko svitka za paljenje i bila u dobrom dodiru s njim. Važno je da se tijekom postupka sabijanja elektroda ne izvije 
jer to može dovesti do pogrešnih rezultata (
 3 ). Rasprskavaju ća ploča i 
vijak koji je drži čvrsto se stegnu. Napunjena posuda prenese se u 
potporni stalak za paljenje, s tim da je rasprskavaju ća ploča u kraj­
njem gornjem položaju, koji treba biti smješten u odgovaraju ći oblo­ 
ženi digestor ili ćeliju za paljenje. Izvor napajanja priklju či se na 
vanjske stezaljke mehanizma za paljenje i pusti se struja ja čine 10 A. 
Vrijeme izme đu početka miješanja i uklju čivanja napajanja ne bi 
smjelo biti duže od 10 minuta.  
Signal koji proizvodi pretvornik tlaka bilježi se u odgovaraju ćem 
sustavu koji omogu ćuje i procjenu i trajnu evidenciju kretanja 
tlaka u vremenu (npr. zapisiva č prijenosa spojen na ure đaj za ispi ­
sivanje krivulje). Mješavina se zagrijava sve dok se rasprskavaju ća 
ploča ne rasprsne ili do isteka najmanje 60 s. Ako se rasprskavaju ća 
ploča ne rasprsne, mješavinu treba ostaviti da se ohladi prije nego se 
uređaj oprezno rastavi, uz mjere opreza i vode ći računa o even ­
tualnoj pojavi tlaka. S ispitivanom tvari i jednom ili više referentnih 
tvari provodi se pet pokusa. Bilježi se vrijeme koje je potrebno da 
tlak poraste od 690 kPa do 2 070 kPa iznad atmosferskog. Izra ču­
nava se srednje vrijeme porasta tlaka.  
U nekim slu čajevima, tvari mogu proizvesti porast tlaka (prevelik ili 
premali) uslijed kemijskih reakcija koje nisu karakteristi čne za oksi ­
dativna svojstva tvari. U takvim slu čajevima možda će trebati pono ­
viti ispitivanje s inertnom tvari, npr. dijatomejskom zemljom, umjesto celuloze kako bi se razjasnila priroda reakcije.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 150  
( 1 ) Mješavine oksidansa s celulozom treba tretirati kao potencijalno eksplozivne i njima 
rukovati s dužnom pažnjom. 
( 2 ) U praksi se to postiže miješanjem mješavine 1:1 teku ćine koja se ispituje i celuloze u 
količini većoj od potrebne za pokus i prijenos 5 ± 0,1 g do tla čne posude. Mješavinu 
treba pripremiti svježu za svaki pokus. 
( 3 ) Posebno, treba izbjegavati dodir izme đu susjednih okretaja svitka.
 2. PODACI  
Vremena porasta tlaka i kod ispitivane tvari i kod jedne ili više 
referentnih tvari. Vremena porasta tlaka za ispitivanja s inertnim tvarima, ako su provedena.
 
2.1. OBRADA REZULTATA  
Izračunavaju se srednja vremena porasta tlaka i za ispitivanu tvar i za 
jednu ili više referentnih tvari.  
Izračunava se srednje vrijeme porasta tlaka za ispitivanja s inertnim 
tvarima (ako su provedena).  
Neki primjeri rezultata prikazani su u tablici 1.  
Tablica 1.  
Primjeri rezultata  ( a ) 
Tvar (  b ) Srednje vrijeme porasta tlaka za mješavinu celuloze 1:1 
(ms) 
Amonijev dikromat, zasi ćena vodena otopina  20 800  
Kalcijev nitrat, zasi ćena vodena otopina  6 700  
Željezov nitrat, zasi ćena vodena otopina  4 133  
Litijev perklorat, zasi ćena vodena otopina  1 686  
Magnezijev perklorat, zasi ćena vodena otopina  777  
Niklov nitrat, zasi ćena vodena otopina  6 250  
Nitratna kiselina, 65 %  4 767 (  c ) 
Perklorna kiselina, 50 %  121 (  c ) 
Perklorna kiselina, 55 %  59  
Kalijev nitrat, 30 % vodena otopina  26 690  
Srebrov nitrat, zasi ćena vodena otopina  (  d ) 
Natrijev klorat, 40 % vodena otopina  2 555 (  c ) 
Kalijev nitrat, 45 % vodena otopina  4 133  
Inertna tvar  
Voda, celuloza  (  d ) 
( a ) Vidjeti referencu (1) za klasifikaciju prema UN-ovom sustavu prijevoza. 
( b ) Zasićene otopine treba pripremati na 20 °C. 
( c ) Srednja vrijednost iz me đulaboratorijskih usporednih pokusa. 
( d ) Maksimalni tlak od 2 070 kPa nije dostignut.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 151
 
3. IZVJEŠ ĆE 
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba, ako je mogu će, navesti sljede će 
informacije:  
— identitet, sastav, čistoća itd. ispitivane tvari,  
— koncentracija ispitivane tvari,  
— primijenjeni postupak sušenja celuloze,  
— sadržaj vode u celulozi koja je korištena,  
— rezultati mjerenja,  
— rezultati ispitivanja s inertnom tvari, ako su provedena,  
— izračunana srednja vremena porasta tlaka,  
— eventualna odstupanja od ove metode i razloge za njih,  
— sve dodatne napomene relevantne za tuma čenje rezultata.  
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA (  1 ) 
Rezultati ispitivanja procjenjuju se na temelju:  
(a) činjenice je li se mješavina ispitivane tvari i celuloze spontano 
zapalila; i  
(b) uspore đivanja srednjeg vremena koje je potrebno da tlak poraste 
s 690 kPa na 2 070 kPa i srednjeg vremena jedne ili više refe ­
rentnih tvari.  
Tekuća tvar smatra se oksidansom ako:  
(a) se mješavina u omjeru 1:1 težinskog udjela tvari i celuloze 
spontano zapali; ili  
(b) mješavina tvari i celuloze u omjeru 1:1 masenog udjela tvari i 
celuloze pokazuje srednje vrijeme porasta temperature koje je manje od ili jednako srednjem vremenu porasta temperature mješavine 1:1 masenog udjela 65 % (m/m) vodene nitratne kise ­
line i celuloze.
 
Kako bi se izbjegli lažni pozitivni rezultati, prilikom tuma čenja 
rezultata po potrebi isto tako treba uzeti u obzir rezultate dobivene kod ispitivanja tvari s inertnim materijalom.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 152  
( 1 ) Vidjeti referencu 1. za tuma čenje rezultata prema UN-ovim propisima za prijevoz u 
kojima se primjenjuje nekoliko referentnih tvari.
 4. REFERENCE  
(1) Recommandations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publication 
No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, str. 342. Test O.2: Test for 
oxidising liquids.  
Slika 1  
Tlačna posuda
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 153
 
Slika 2.  
Nosivi stalak
  
Slika 3.  
Sustav paljenja
  
Napomena: može se koristiti bilo koja od ovih konfiguracija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 154
 
A.22.  ODRE ĐIVANJE SREDNJEGA GEOMETRIJSKOG 
PROMJERA VLAKANA POMO ĆU DULJINE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
U ovoj se metodi opisuje postupak za mjerenje srednjeg geometrij ­
skog promjera pomocu duljine (LWGMD – Length Weighted Geometric Mean Diameter) umjetnih mineralnih vlakana (MMMF 
– Man-Made Mineral Fibres). Buduci da se LWGMD vlakana s 
95 % vjerojatnosti nalazi izmedu razina pouzdanosti uzorka od 95 % (tj. LWGMD ± dvije standardne greške), vrijednost koja se navodi u izvješcu (ispitna vrijednost) odgovarat ce donjoj granici 
pouzdanosti uzorka od 95 % (tj. LWGMD – 2 standardne greške). 
Metoda se temelji na ažuriranoj verziji (lipanj 1994.) nacrta indu ­
strijskog postupka za zaštitu zdravlja, sigurnost i zaštitu okoliša (HSE) koji je dogovoren na sastanku izmedu ECFIA-a i 
HSE-a u Chesteru 26.9.1993. i koji je izraden za potrebe drugog 
medulaboratorijskog pokusa i na temelju tog pokusa (1., 2.). Ova mjerna metoda može se koristiti za opisivanje promjera vlakana materijala u rasutom stanju i proizvoda koji sadrže MMMF, uklju ­
cujuci vatrostalna keramicka vlakna (RCF – Refractory Ceramic 
Fibres), umjetna staklena vlakna (MMVF – Man-Made Vitreous Fibres), kristalna i polikristalna vlakna.
 
Odredivanje duljinom je nacin da se kompenzira utjecaj na razdiobu 
promjera zbog pucanja dugackih vlakana do kojega dolazi prilikom uzorkovanja i rukovanja materijalom. Za mjerenje razdiobe velicina 
promjera MMMF koristi se geometrijska statistika (geometrijska 
sredina) buduci da se njihove razdiobe velicina obicno pribiližavaju log-normalnoj razdiobi.
 
Mjerenje duljine i promjera je zamoran i dugotrajan posao, ali ako se 
mjere samo vlakna koja dodiruju beskonacno tanku crtu u vidnom polju SEM-a, tada je vjerojatnost da se odabere odredeno vlakno 
razmjerna duljini. Buduci da je pitanje duljine za potrebe odredivanja 
duljinom time riješeno, potrebno je samo izmjeriti promjer i LWGMD-2SE se tada može izracunati na nacin kako je opisano.
 
1.2. DEFINICIJE  
Cestica : Predmet ciji je omjer duljine i širine manji od 3:1.  
Vlakno : Predmet ciji je omjer duljine i širine (razmjer stranica) 
najmanje 3:1.  
1.3. PODRUCJE PRIMJENE I OGRANICENJA  
Metoda je namijenjena proucavanju razdioba promjera kod srednjih 
promjera od 0,5 μm do 6 μm. Veci se promjeri mogu mjeriti uz 
primjenu manjih SEM povecanja, ali se time povecavaju ogranicenja metode kod finijih razdioba vlakana, dok se u slucaju srednjih 
promjera ispod 0,5 μm preporucuje mjerenje uz pomoc TEM (tran ­
smisijski elektronski mikroskop) mikroskopa.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 155
 
1.4. NACELO ISPITNE METODE  
Uzme se odredeni broj reprezentativnih uzoraka iz jezgre mekane 
ploce ili slobodnih vlakana u rasutom stanju. Vlakna u rasutom stanju se skrate drobljenjem i reprezentativni poduzorak dispergira 
u vodi. Zatim se vade alikvoti i filtriraju kroz polikarbonatni filtar 
velicine pora 0,2 μm i pripreme za pregled pod skenirajucim elek ­
tronskim mikroskopom (SEM). Promjeri vlakana mjere se pod pove ­
canjem × 10 000 ili vecim (
 1 ) metodom presijecanja linija da bi se 
dobila nepristrana procjena srednjeg promjera. Izracuna se donji 
interval pouzdanosti 95 % (na temelju jednostranog testa) tako da se dobije procjena najniže vrijednosti srednjega geometrijskog 
promjera vlakana materijala.
 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Sigurnost/mjere opreza  
Izlaganje ljudi lebdecim vlaknima treba svesti na najmanju mogucu 
mjeru te kod rukovanja suhim vlaknima koristiti digestor ili komoru za rukovanje s rukavicama („glove box”). Izloženost ljudi treba 
periodicki provjeravati kako bi se utvrdila ucinkovitost zaštitnih 
mjera. Kod rukovanja MMMF vlaknima treba nositi rukavice za jednokratnu uporabu kako bi se umanjilo nadraživanje kože i sprije ­
cila križna kontaminacija.
 
1.5.2.  Aparatura/oprema  
— Preša i kalupi (10 MPa),  
— Polikarbonatni filtri s kapilarnim porama velicine pora 0,2 μm 
(promjer 25 mm),  
— Membranski filtar od celuloznog estera velicine pora 5 μm, koji 
se koristi kao pomocni filtar,  
— Stakleni uredaj za filtraciju (ili filtracijski sustavi za jednokratnu 
uporabu) za filtre promjera 25 mm (npr. stakleni komplet za 
mikroanalizu Milipore, tip XX10 025 00),  
— Svježe destilirana voda, filtrirana kroz filtar velicine pora 0,2 μm 
radi uklanjanja mikroorganizama,  
— Uredaj za naparivanje zlata ili zlata/paladija,  
— Skenirajuci mikroskop razlucivosti do 10 nm i povecanjem × 
10 000,  
— Razno: spatule, skalpelski nož tip 24, pinceta, SEM cjevcice, 
karbonsko ljepilo ili karbonska ljepljiva traka, koloidno srebro 
(„silver dag”),  
— Ultrazvucna sonda ili stolna ultrazvucna kupelj,  
— Svrdlo za uzorkovanje jezgre ili svrdlo za pluto za uzimanje 
uzoraka iz MMMF ploca.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 156  
( 1 ) Ova vrijednost povecanja odnosi se na vlakna od 3 μm, za vlakna od 6 μm možda je 
primjerenije koristiti povecanje × 5 000.
 1.5.3.  Ispitni postupak  
1.5.3.1.  Uzorkovanje  
Za uzimanje uzoraka iz presjeka tvrdih ili mekanih vlaknastih ploca 
koristi se svrdlo za uzorkovanje jezgre ili svrdlo za pluto od 25 mm. Uzorci se uzimaju u jednolikim razmacima po širini ploce, ako se radi o plocama male duljine, ili nasumicno, ako su raspoložive velike 
ploce. Ista se oprema može koristiti i za ekstrahiranje slucajnih 
uzoraka slobodnih vlakana. Po mogucnosti treba uzeti šest uzoraka kako bi se uzele u obzir prostorne varijacije unutar materijala.
 
Šest jezgrovanih uzoraka zdrobi se u kalupu promjera 50 mm pod 
tlakom od 10 MPa. Materijal se promiješa spatulom i ponovno stlaci na 10 MPa. Materijal se zatim izvadi iz kalupa i pohrani u cvrsto 
zatvorenoj staklenoj boci.
 
1.5.3.2.  Priprema uzorka  
Prema potrebi, vlakno treba ostaviti oko sat vremena u peci na 
temperaturi od 450 °C da bi se uklonilo organsko vezivo.  
Uzorak se podijeli na poduzorke postupkom cetvorenja stošca („cone 
and quarter”) (to treba uciniti u komori za zaštitu od prašine).  
Mala se kolicina uzorka (< 0,5 g) spatulom doda u 100 ml svježe 
destilirane vode koja je profiltrirana kroz membranski filtar od 0,2 μm (mogu se koristiti i drugi izvori ultraciste vode ako se 
dokaže da su zadovoljavajuce kakvoce). Uzorak se dobro rasprši 
uz pomoc ultrazvucne sonde snage 100 W koja je ugodena tako da izazove kavitaciju. (Ako sonda nije raspoloživa, koristi se sljedeci postupak: uzorak protresti i okrenuti, ponavljajuci postupak 30 
sekundi – petminutna obrada u stolnoj ultrazvucnoj kupelji – još 
30 sekundi protresati i okretati.)
 
Cim se vlakno dispergira, izvadi se odredeni broj alikvota (npr. tri 
alikvota od 3, 6 i 10 ml) pipetom širokoga grla (zapremine 2 – 5 ml).
 
Svaki se alikvot filtrira pod vakuumom kroz polikarbonatni filtar 
0,2 μm i pomocni MEC filtar velicine pora 5 μm, koristeci stakleni 
filtar-lijevak s cilindricnim spremnikom. U lijevak se ulije oko 5 ml 
filtrirane destilirane vode i alikvot polako pipetira u vodu držeci vrh 
pipete ispod meniskusa. Pipetu i spremnik treba temeljito isprati nakon pipetiranja jer se tanka vlakna znaju nakupljati na površini.
 
Filtar se oprezno ukloni i odvoji od pomocnog filtra te stavi u 
posudu da se osuši.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 157
 
Ljuljajucim pokretima odreže se jedna cetvrtina ili jedna polovina 
dijela filtra s filtarskim talogom koristeci skalpel tipa 24. Odrezani se 
dio pažljivo pricvrsti na SEM nosac („stub”) pomocu karbonske ljepljive trake ili karbonskog ljepila. Koloidno srebro treba nanijeti na najmanje tri mjesta kako bi se poboljšao elektricni kontakt na 
rubovima filtra i nosaca. Kad se ljepilo/koloidno srebro osuši, na 
površinu taloga se naparivanjem nanese cca 50 nm zlata ili zlato/ paladija.
 
1.5.3.3.  Kalibracija i rad SEM-a  
1.5.3.3.1. K a l i b r a c i j a  
Kalibraciju SEM-a treba provjeriti najmanje jedanput tjedno (u 
idealnom slucaju jedanput dnevno) pomocu ovjerene rešetke za kali ­
braciju. Kalibracija se provjerava u odnosu na odobreni standard; ako izmjerena vrijednost (SEM) nije u granicama ± 2 % odobrene 
vrijednosti, kalibraciju treba prilagoditi i ponovno provjeriti.
 
Na stvarnom matriksu uzorka, SEM mora imati mogucnost razluci ­
vanja barem minimalnog vidljivog promjera od 0,2 μm pri pove ­
canju × 2 000.  
1.5.3.3.2. R a d  
SEM treba podesiti na povecanje od 10 000 (  1 ) i osigurati uvjete koji 
daju dobru razlucivost i prihvatljivu kakvocu slike pri malim brzi ­
nama skeniranja, npr. 5 sekundi po slicici. Iako razliciti uredaji mogu 
imati razlicite radne postavke, za najbolju vidljivost i razlucivost kod 
rada s materijalima relativno niske atomske mase uglavnom treba koristiti ubrzavajuci napon od 5 – 10 keV i uredaj podesiti na 
malu velicinu tocke i kratku radnu udaljenost. Kad se provodi 
linearna traverza, treba koristiti nagib od 0° da bi se smanjila potreba za ponovnim fokusiranjem, a ako SEM ima eucentricnu fazu, treba koristiti eucentricnu radnu udaljenost. Može se koristiti 
i manje povecanje ako materijal ne sadrži mala vlakna (malog 
promjera) i promjeri vlakana su veliki (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Odredivanje velicine  
1.5.3.4.1. O c j e n j i v a n j e u z o r k a p r e g l e d o m p o d m a l i m p o v e ­
c a n j e m  
Na pocetku uzorak treba pregledati pod malim povecanjem da bi se 
otkrile eventualne naznake stvaranja grudica velikih vlakana i proci ­
jenila gustoca vlakana. U slucaju pretjeranog broja grudica, prepo ­
rucljivo je pripremiti novi uzorak.  
Da bi se postigla statisticka tocnost, potrebno je izmjeriti odredeni 
minimalni broj vlakana – velika gustoca vlakana može se smatrati 
poželjnom osobinom jer pregledavanje praznih polja oduzima vrijeme, a ne daje nikakav doprinos analizi. Medutim, ako je filtar preopterecen, bit ce teško izmjeriti sva mjerljiva vlakna, a neka se 
manja vlakna mogu i previdjeti ako su sakrivena iza velikih vlakana.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 158  
( 1 ) Za vlakna od 3 μm, vidi prethodnu napomenu.
 Ako je gustoca vlakana iznad 150 vlakana po milimetru linearne 
traverze, može se javiti pristranost u smislu previsoke procjene 
LWGMD. S druge strane, male koncentracije vlakana produžuju vrijeme analize i cesto je isplativije pripremiti uzorak cija je gustoca vlakana bliža optimalnoj gustoci nego nastaviti s brojenjem 
na filtrima s niskom koncentracijom. Kod optimalne gustoce vlakana 
treba prosjecno dobiti otprilike jedno do dva brojiva vlakna po vidnom polju pri povecanju od 5 000. Ipak, optimalna gustoca ovisi o velicini (promjeru) vlakana; stoga se ispitivac u odredenoj 
mjeri mora osloniti na vlastitu strucnu prosudbu kako bi odlucio je li 
gustoca vlakana približno optimalna ili nije.
 
1.5.3.4.2. O d r e d i v a n j e p r o m j e r a v l a k a n a d u l j i n o m  
Broje se samo vlakna koja dodiruju (ili sijeku) (beskonacno) tanku 
crtu na zaslonu SEM-a. Stoga treba povuci vodoravnu (ili okomitu) 
crtu kroz sredinu zaslona.  
Druga je mogucnost da se u sredinu zaslona stavi samo tocka i 
zapocne kontinuirano skeniranje u jednom smjeru preko filtra. Mjeri se i bilježi promjer svakog vlakna razmjera stranica veceg 
od 3:1 koje dodiruje ili sijece tu tocku.
 
1.5.3.4.3. O d r e d i v a n j e v e l i c i n e v l a k n a  
Preporucuje se da se izmjeri najmanje 300 vlakana. Svako se vlakno 
mjeri samo jedanput u tocki gdje sijece crtu ili tocku nacrtanu na slici (ili u blizini sjecišta ako su rubovi vlakna skriveni). Ako se 
naide na vlakna neujednacenog presjeka, uzima se u obzir mjerenje 
koje predstavlja prosjecni promjer vlakna. Definiranje ruba i mjerenje najkrace udaljenosti izmedu rubova vlakna zahtijeva poseban oprez. Odredivanje velicine može se provoditi izravno „on 
line” ili „off-line” na pohranjenim slikama odnosno fotografijama. 
Preporucuju se poluautomatski sustavi mjerenja slike koji podatke izravno ucitavaju u tablicu, jer se tako štedi vrijeme i izbjegavaju greške u prijepisu, a izracun se može automatizirati.
 
Krajeve dugackih vlakana treba pregledati pod malim povecanjem da 
bi se provjerilo da ne zavijaju natrag u vidno polje mjerenja i da ne 
bi bili izmjereni više puta.  
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Promjeri vlakana uglavnom nemaju normalnu razdiobu. Ipak, loga ­
ritamskom transformacijom može se dobiti približno normalna razdioba.
 
Izracuna se aritmeticka sredina (srednji lnD) i standardna devijacija 
(SD  lnD ) vrijednosti logaritma po bazi e (lnD) n promjera vlakana (D).  
sred : lnD ¼ P lnD 
n (1.) ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  P ðlnD Ä sredlnDÞ 2 
n Ä 1 s 
(2) 
Standardna se devijacija podijeli kvadratnim korijenom broja 
mjerenja (n) da bi se dobila standardna greška (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
n (3) 
Da bi se dobila geometrijska sredina umanjena za dvije geometrijske 
standardne greške, dvostruka standardna greška oduzme se od srednje vrijednosti i izracuna eksponent te vrijednosti (srednja vrijed ­
nost minus dvije standardne greške). 
LWGMD – 2SE = e
 (sred lnD – 2SE  
lnd ) (4.) 
3. IZVJEŠCIVANJE  
IZVJEŠCE O ISPITIVANJU  
Izvješce o ispitivanju sadrži barem ove informacije:  
— vrijednost LWGMD-2SE,  
— sva odstupanja, a posebno ona koja imaju utjecaja na preciznost 
ili tocnost rezultata, uz odgovarajuca obrazloženja.  
4. LITERATURA  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive, February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: 
Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. 
Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive, Research and Laboratory Services Division, 1994.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 160
 
A.23.  KOEFICIJENT RAZDJELJENJA (1-OKTANOL/VODA): METODA 
SPOROG MIJEŠANJA  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
123 (2006.). Vrijednosti koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (P  OW ) do 
log P  OW od 8,2 pažljivo se odre đuju metodom sporog miješanja (1). Stoga 
je to prikladan pokusni pristup za izravno odre đivanje vrijednosti P  OW jako 
hidrofobnih tvari.  
2. Ostale metode za odre đivanje koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (P  OW ) 
jesu metoda „protresanjem u tikvici” (2) i odre đivanje P  OW iz obrnute faze 
ponašanja pri retenciji kod visokou činkovite teku ćinske 
kromatografije (HPLC) (3). Metoda „protresanjem u tikvici” sklona je stva ­
ranju artefakata zbog transfera mikro-kapljica oktanola u vodenoj fazi. S porastom vrijednosti P
 OW prisutnost tih kapljica u vodenoj fazi dovodi do 
povećanja previsokih procjena koncentracije ispitivane tvari u vodi. Stoga je 
njezina primjena ograni čena na tvari kod kojih je log P  OW < 4. Druga 
metoda po čiva na pouzdanim podacima o izravno odre đenoj vrijednosti 
P OW kako bi se odredio odnos izme đu ponašanja pri zadržavanju kod 
HPLC-a i izmjerenih vrijednosti P  OW . Prijedlog smjernice OECD-a bio je 
dostupan za odre đivanje koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda ionizira ­
jućih tvari (4), ali se više ne će koristiti.  
3. Ova ispitna metoda razvijena je u Nizozemskoj. Preciznost ovdje opisanih 
metoda potvr đena je i optimizirana u validacijskoj studiji o prstenastim 
testovima u kojoj je sudjelovalo 15 laboratorija (5).  
UVODNA RAZMATRANJA  
Značenje i primjena  
4. Za inertne organske tvari utvr đeni su veoma zna čajni odnosi izme đu koefi­
cijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (P  OW ) i njihove bioakumulacije u ribama. 
Štoviše, pokazalo se da je P  OW u korelaciji s toksi čnošću za ribe kao i sa 
sorpcijom kemikalija u krute tvari, poput tala i sedimenata. Opsežan pregled 
tih odnosa naveden je u referenci (6).  
5. Utvr đene su razne vrste odnosa izme đu koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/ 
voda i drugih svojstava tvari relevantnih za toksi čnost u okolišu i kemiju. 
Kao posljedica toga, koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/voda razvio se u 
ključni parametar u procjeni opasnosti kemikalija po okoliš, kao i u pred ­
viđanju sudbine kemikalija u okolišu.  
Područje primjene  
6. Pokus sa sporim miješanjem zamišljen je kako bi se smanjilo stvaranje 
mikro-kapljica iz kapljica 1-oktanola u vodenoj fazi. Kao posljedica toga, 
nema previsoke procjene koncentracije u vodenoj otopini zbog molekula ispitivane tvari povezanih s tim kapljicama. Stoga je metoda sporog mije ­ 
šanja posebno prikladna za odre đivanje P
 OW za tvari o čekivanih log P  OW 
vrijednosti od 5 i ve ćih, za koje se metodom protresanja tikvice (2) često 
dobivaju pogrešni rezultati.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 161
 
DEFINICIJA I JEDINICE  
7. Koeficijent razdjeljenja tvari izme đu vode i lipofilnog otapala (1-oktanola) 
karakterizira uravnoteženu raspodjelu kemikalije izme đu dviju faza. Koefi ­
cijent razdjeljenja izme đu vode i 1-oktanola (P  OW ) definira se kao omjer 
uravnoteženih koncentracija ispitivane tvari u 1-oktanolu zasi ćenom vodom 
(C O ) i vodi zasi ćenoj 1-oktanolom (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Budući da je rije č o omjeru koncentracija, koeficijent razdjeljenja nema 
dimenzija. Naj češće se navodi kao logaritam s bazom 10 (log P  OW ). P  OW 
ovisi o temperaturi, a podaci iz izvješ ća trebaju uklju čivati temperaturu 
mjerenja.  
NAČELO METODE  
8. Kako bi se odredio koeficijent razdjeljenja, voda, 1-oktanol i ispitivana tvar 
uravnotežuju se jedni s drugima na konstantnoj temperaturi. Zatim se odre ­ 
đuju koncentracije ispitivane tvari u dvjema fazama.  
9. Poteško će u pokusu povezane s nastankom mikro-kapljica tijekom pokusa s 
protresanjem u tikvici mogu se smanjiti u (ovdje) predloženom pokusu sa sporim miješanjem. U pokusu sa sporim miješanjem voda, 1-oktanol i ispitivana 
tvar uravnotežuju se u termostatiranom reaktoru za miješanje. Izmjena faza 
ubrzava se miješanjem. Miješanje uvodi ograni čenu turbulenciju koja pospješuje 
razmjenu izme đu 1-oktanola i vode bez stvaranja mikro-kapljica (1).
 
PRIMJENJIVOST TESTA  
10. Budu ći da bi prisutnost drugih tvari osim ispitivane tvari mogla utjecati na 
koeficijent aktivnosti ispitivane tvari, ispitivanu tvar treba ispitivati kao čistu 
tvar. Za pokus s razdjeljivanjem 1-oktanol/vode treba upotrijebiti najviši 
stupanj čistoće koji se može nabaviti.  
11. Ova se metoda primjenjuje na čiste tvari koje se ne disociraju ili asociraju i 
koje ne pokazuju zna čajnu interfacijalnu aktivnost. Može se primijeniti za 
određivanje omjera razdjeljenja 1-oktanol/vode takvih tvari i smjesa. Ako se 
metoda primjenjuje za smjese, odre đeni omjeri razdjeljenja 1-oktanol/vode 
uvjetovani su i ovise o kemijskom sastavu ispitivane smjese te o sastavu 
elektrolita upotrijebljenih kao vodena faza. Ako se poduzmu dodatni koraci, metoda se tako đer može primijeniti za disocijativne ili asocijativne spojeve 
(stavak 12).
 
12. Zbog višestrukog uravnoteženja vode i 1-oktanola u razdjeljenju 1-oktanol/ 
vode disocijativnih tvari, kao što su organske kiseline i fenoli, organske 
lužine i organometalne tvari, omjer razdjeljenja 1-oktanol/vode uvjetovana je konstanta koja snažno ovisi o sastavu elektrolita (7)(8). Stoga je za određivanje omjera razdjeljenja 1-oktanol/vode nužno da se tijekom 
pokusa kontrolira pH vrijednost i sastav elektrolita te da se unesu u izvješ će. 
Za ocjenu tih omjera razdjeljenja valja pribaviti stru čno mišljenje. Uz 
primjenu vrijednosti konstante/i disocijacije treba odabrati prikladne pH vrijednosti, takve da se za svako stanje ionizacije odredi omjer razdjeljenja. 
Kada se ispituju organometalni spojevi (8), trebaju se upotrebljavati nekom ­
pleksiraju ći puferi. Uzimaju ći u obzir postoje će znanje o kemiji voda (kon ­
stante kompleksacije, konstante disocijacije), uvjeti pokusa trebaju se odabrati tako da se može procijeniti specijacija ispitivane tvari u vodenoj 
fazi. Ionska jakost morala bi biti jednaka u svim pokusima zbog primjene 
pozadinskog elektrolita.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 162
 
13. Poteško će u ispitivanju mogu se pojaviti u provo đenju ispitivanja tvari niske 
topljivosti u vodi ili visokog P  OW zbog činjenice da su koncentracije u vodi 
postale toliko niske da ih je teško precizno odrediti. Ova ispitna metoda pruža upute o rješavanju tog problema.
 
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
14. Kemijski reagensi trebali bi biti čistoće analitičkog stupnja ili ve će. Prepo­
ruča se primjena neozna čenih ispitivanih tvari poznatog kemijskog sastava i 
po mogućnosti čistoće od najmanje 99 % ili radioaktivno ozna čenih ispiti ­
vanih tvari poznatog kemijskog sastava i radio-kemijske čistoće. U slučaju 
obilježiva ča s kratkim vremenom poluraspada valja primijeniti korekcije za 
raspadanje. U slu čaju radioaktivno ozna čenih ispitivanih tvari valja primije ­
niti analiti čku metodu specifi čnu za tu kemikaliju kako bi se osiguralo da je 
izmjerena radioaktivnost izravno povezana s ispitivanom tvari.  
15. Procijenjeni log P  OW može se dobiti primjenom komercijalno dostupnog 
softvera za procjenu log P  OW ili primjenom omjera topljivosti u oba otapala.  
16. Prije provo đenja pokusa sa sporim miješanjem za odre đivanje P  OW dostupne 
trebaju biti sljede će informacije o ispitivanoj tvari:  
(a) strukturna formula;  
(b) prikladne analiti čke metode odre đivanja koncentracije tvari u vodi i 1- 
oktanolu;  
(c) konstanta/e disocijacije ioniziraju ćih tvari (Smjernica OECD-a 112 (9));  
(d) topljivost u vodenoj otopini (10);  
(e) abioti čka hidroliza (11);  
(f) laka biorazgradivost (12);  
(g) tlak pare (13).  
OPIS METODE  
Oprema i aparatura  
17. Potrebna je standardna laboratorijska oprema, a posebno sljede ći pribor:  
— za miješanje vodene faze koriste se magnetne miješalice i magnetni 
štapići za miješanje premazani teflonom,  
— analiti čki instrumenti prikladni za odre đivanje koncentracije ispitivane 
tvari u slu čaju očekivanih koncentracija,  
— posuda za miješanje sa slavinom na dnu. Ovisno o procijenjenom log 
P OW i granici detekcije (LOD) ispitivanog spoja u obzir valja uzeti 
primjenu reakcijske posude jednake geometrije, ve će od jedne litre 
kako bi se dobio dovoljan volumen vode za kemijsku ekstrakciju i analizu. To će rezultirati višim koncentracijama u vodenom ekstraktu 
te tako pouzdanijim analiti čkim odre đivanjem. Tablica s procjenama 
minimalnog potrebnog volumena, LOD-a spoja, njegova procijenjenog log P
 OW i njegove topljivosti u vodi nalazi se u Dodatku 1. Tablica se 
temelji na odnosu log P  OW i omjera topljivosti u oktanolu i vodi, kao što 
su pokazali Pinsuwan i sur. (14):  
log P  OW ¼ 0,88 log SR þ 0,41 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 163
 
gdje je  
SR ¼ S oct=S w (u molaritetu),  
te odnos koji navodi Lyman (15) za predvi đanje topljivosti u vodi. 
Vrijednosti topljivosti u vodi izra čunate jednadžbom iz Dodatka 1. 
trebaju se smatrati prvom procjenom. Valja primijetiti da korisnik 
može izraditi procjenu topljivosti u vodi pomo ću svih odnosa za koje 
smatra da bolje predstavljaju odnos izme đu hidrofobnosti i topljivosti. 
Za krute spojeve preporu čuje se, primjerice, uklju čivanje tališta u pred ­
viđanje topljivosti. U slu čaju primjene izmijenjene jednadžbe valja 
osigurati da je jednadžba za izra čun topljivosti u oktanolu još uvijek 
valjana. Shematski prikaz posude za miješanje obložene staklom volu ­
mena od oko jedne litre nalazi se u Dodatku 2. Proporcije posude prikazane u Dodatku 2. pokazale su se povoljnima i valja ih se pridrža ­
vati u slu čaju primjene aparature druk čije veličine;
 
— ključno je sredstvo za održavanje temperature konstantnom tijekom 
pokusa sa sporim miješanjem.  
18. Posude moraju biti izra đene od takvog inertnog materijala da adsorpcija na 
površinu posude bude zanemariva.  
Priprema ispitnih otopina  
19. Odre đivanje P  OW valja provesti s 1-oktanolom najviše čistoće koja se 
komercijalno može nabaviti (najmanje + 99 %). Preporu čuje se pro čišća­
vanje 1-oktanola ekstrakcijom kiselinom, lužinom i vodom te sušenjem 
nakon toga. Uz to se 1-oktanol može pro čistiti i destilacijom. Pro čišćeni 
1-oktanol treba upotrijebiti za pripremu standardnih otopina ispitivanih tvari. Voda za uporabu pri odre đivanju P
 OW treba biti destilirana u aparaturi od 
stakla ili kvarca ili dobivena sustavom pro čišćavanja, a može se upotrijebiti i 
voda stupnja čistoće HPLC. Za destiliranu vodu potrebna je filtracija kroz 
filtar od 0,22 μm, a treba uklju čiti i slijepe probe kako bi se provjerilo da u 
koncentriranim ekstraktima koji mogu utjecati na ispitivanu tvar nema ne či­
stoća. U slu čaju primjene filtra od staklenih vlakana, filtar treba čistiti 
pečenjem najmanje tri sata na 400 °C.  
20. Oba se otapala prije pokusa uzajamno zasi ćuju uravnoteženjem u posudi 
dovoljne veli čine. To se obavlja tijekom dva dana pomo ću dvofaznog 
sustava za sporo miješanje.  
21. Odabire se prikladna koncentracija ispitivane tvari i otapa se u 1-oktanolu 
(zasićenom vodom). Koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/vode valja odrediti u 
razrijeđenim otopinama 1-oktanola i vode. Stoga koncentracija ispitivane 
tvari ne bi smjela premašiti 70 % njezine topljivosti s maksimalnom koncen ­
tracijom od 0,1 M u bilo kojoj fazi (1). Otopine 1-oktanola upotrijebljene u pokusu ne smiju sadržavati otopljene krutine ispitivane tvari.
 
22. Prikladna koli čina ispitivane tvari otapa se u 1-oktanolu (zasi ćenom vodom). 
Ako procijenjeni log P  OW premaši pet, treba se pobrinuti da otopine 1- 
oktanola upotrijebljene za pokus ne sadržavaju otopljene krutine ispitivane tvari. S tim ciljem primjenjuje se sljede ći postupak za kemikalije čija je 
procijenjena vrijednost log P
 OW > 5: 
— ispitivana tvar otapa se u 1-oktanolu (zasi ćenom vodom),  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 164
 
— otopini se ostavi dovoljno vremena da se otopljena kruta tvar istaloži. 
Tijekom razdoblja taloženja nadzire se koncentracija ispitivane tvari,  
— kada izmjerene koncentracije otopine 1-oktanola postignu stabilne 
vrijednosti, radna otopina razrje đuje se odgovaraju ćim volumenom 1- 
oktanola,  
— mjeri se koncentracija razrije đene radne otopine. Ako se izmjerena 
koncentracija podudara s razrje đenjem, razrije đena radna otopina može 
se upotrijebiti u pokusu sa sporim miješanjem.  
Uzimanje i analiza uzoraka  
23. Za analizu ispitivane tvari treba upotrijebiti provjerenu analiti čku metodu. 
Istraživači moraju pružiti dokaz da su koncentracije u 1-oktanolu zasi ćenom 
vodom kao i u vodenoj fazi zasi ćenoj 1-oktanolom tijekom pokusa ve će od 
granice kvantifikacije korištenih analiti čkih postupaka u toj metodi. U slu ča­
jevima u kojima su potrebne metode ekstrakcije prije pokusa potrebno je 
uspostaviti analiti čke rekuperacije ispitivane tvari iz vodene faze i faze 1- 
oktanola. Analiti čke signale treba korigirati slijepim probama i treba se 
pobrinuti da se ne dogodi prenošenje analizirane tvari iz jednog uzorka u drugi.
 
24. Vjerojatno će prije analize biti potrebna ekstrakcija u vodenoj fazi organ ­
skim otapalom i prethodnom koncentracijom ekstrakta zbog relativno niskih 
koncentracija hidrofobnih ispitivanih tvari u vodenoj fazi. Iz istog razloga 
potrebno je smanjiti eventualne koncentracije u slijepim probama. Stoga je nužno upotrebljavati otapala visoke čistoće, po mogu ćnosti otapala za 
analizu ostataka. Štoviše, rad sa staklenom opremom koja je prethodno 
pažljivo o čišćena(npr. pranjem otapalom ili pe čenjem na povišenoj tempera ­
turi) može pomo ći pri izbjegavanju unakrsne kontaminacije.
 
25. Procijenjeni log P  OW može se dobiti pomo ću programa za procjenu ili 
stručnom procjenom. Ako je vrijednost ve ća od šest, treba pobliže nadzirati 
korekcije slijepih proba i prenošenje analizirane tvari. Sli čno tomu, ako 
procijenjeni log P  OW premašuje šest, obvezna je primjena surogatnog stan ­
darda za korekciju rekuperacije kako bi se mogli posti ći visoki faktori 
prethodne koncentracije. Komercijalno su dostupni brojni softverski programi za procjenu log P
 OW ( 1 ), npr. Clog P (16), KOWWIN (17), 
ProLogP (18) i ACD log P (19). Opis pristupa procjeni može se prona ći 
u referencama (20. - 22.).  
26. Granice kvantifkacije (LOQ) za odre đivanje ispitivane tvari u 1-oktanolu i 
vodi odre đuju se primjenom prihva ćenih metoda. Kao zlatno pravilo, 
granica kvantifikacije ove metode može se odrediti kao koncentracija u vodi ili 1-oktanolu koja proizvodi omjer signala i šuma jednak deset. Valja odabrati prikladnu metodu ekstrakcije i prethodne koncentracije, a 
također treba navesti i analiti čke rekuperacije. Odabire se prikladan faktor 
prethodne koncentracije kako bi se dobio signal željene veli čine nakon 
analitičkog određivanja.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 165  
( 1 ) Ova se informacija navodi samo kao pomo ć korisniku. Mogu se rabiti ostali ekvivalentni 
računalni programi ako se pokaže da pružaju jednake rezultate.
 27. Na temelju parametara analiti čke metode i o čekivanih koncentracija odre ­ 
đuje se približna veli čina uzorka potrebna za precizno odre đivanje koncen ­
tracije spoja. Treba izbjegavati primjenu uzoraka vode koji su premali za dobivanje dovoljnog analiti čkog signala. Tako đer valja izbjegavati primjenu 
prekomjerno velikih uzoraka vode jer bi u protivnom moglo preostati 
premalo vode za minimalni broj traženih analiza (n = 5). U Dodatku 1. 
minimalni volumen uzorka izražen je kao funkcija volumena posude, LOD-a ispitivane tvari i topljivosti ispitivane tvari.
 
28. Kvantifikacija ispitivanih tvari odvija se usporedbom s kalibracijskim krivu ­
ljama odgovaraju ćeg spoja. Koncentracije u analiziranim uzorcima moraju 
se točno odrediti pomo ću koncentracija standarda.  
29. Za ispitivane tvari s procijenjenom vrijednoš ću log P  OW višom od šest 
surogatni standard valja ubaciti u uzorak vode prije ekstrakcije kako bi se utvrdili gubici tijekom ekstrakcije i prethodne koncentracije uzoraka vode. Za preciznu korekciju rekuperacije surogati moraju imati svojstva vrlo sli čna 
ili identična svojstvima ispitivane tvari. Po mogu ćnosti se u tu svrhu 
upotrebljavaju (stabilne) izotopi čno označene analogne tvari od interesa 
(primjerice perdeuterirane ili ozna čene s
 13 C). Ako nije mogu će upotrijebiti 
označene stabilne izotope, npr.  13 C ili  2 H, iz pouzdanih podataka iz litera ­
ture treba dokazati da su fizikalno-kemijska svojstva surogata vrlo sli čna 
svojstvima ispitivane tvari. Tijekom ekstrakcije teku ćina-tekućina vodene 
faze mogu nastati emulzije. Emulzije se mogu smanjiti dodavanjem soli i puštanjem emulzije da se preko no ći istaloži. Treba izvijestiti o metodama 
koje su se koristile za ekstrakciju i prethodnu koncentraciju uzoraka.
 
30. Ako je potrebno, uzorci uzeti iz faze 1-oktanola mogu se prije analize 
razrijediti prikladnim otapalom. Štoviše, primjena surogatnih standarda za korekciju rekuperacije preporu čuje se za tvari za koje su pokusi rekuperacije 
pokazali visok stupanj varijacije u pokusima rekuperacije (relativna stan ­
dardna devijacija > 10 %).
 
31. Treba izvijestiti o pojedinostima analiti čke metode. To obuhva ća metodu 
ekstrakcije, prethodne koncentracije i faktore razrje đivanja, parametre instru ­
menata, rutinu kalibriranja, raspon kalibriranja, analiti čku rekuperaciju ispi ­
tivane tvari iz vode, dodavanje surogatnih standarda radi korekcije rekupe ­
racije, vrijednosti slijepih proba, granice detekcije i granice kvantifikacije.  
Provođenje ispitivanja  
Optimalni omjeri volumena 1-oktanola i vode  
32. Pri odabiru volumena vode i 1-oktanola u obzir valja uzeti LOQ u 1-okta ­
nolu i vodi, faktore prethodne koncentracije primijenjene na uzorke vode, 
količine uzorkovane u 1-oktanolu i vodi te o čekivane koncentracije. Zbog 
razloga vezanih uz pokus koli činu 1-oktanola u sustavu za sporo miješanje 
treba odabrati tako da je sloj 1-oktanola dovoljne debljine (> 0,5 cm) kako bi se omogu ćilo uzorkovanje faze 1-oktanola bez njegova miješanja.
 
33. Tipični omjeri faza koji se koriste za odre đivanje spojeva s log P  OW od 4,5 i 
višim iznose 20 do 50 ml 1-oktanola i 950 do 980 ml vode u posudi od 
jedne litre.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 166
 
Uvjeti ispitivanja  
34. Tijekom ispitivanja reakcijska posuda temperira se kako bi se variranje 
temperature smanjilo na ispod 1 °C. Analizu treba provesti na 25 °C.  
35. Sustav pokusa treba zaštititi od danjeg svjetla bilo provo đenjem pokusa u 
mračnoj prostoriji bilo pokrivanjem reakcijske posude aluminijskom folijom.  
36. Pokus treba provesti u okolišu bez prašine (koliko je to mogu će). 
37. Sustav 1-oktanola i vode miješa se dok se ne postigne ravnoteža. U pilot ­
skom pokusu trajanje razdoblja uravnoteženja odre đuje se provo đenjem 
pokusa sa sporim miješanjem i periodi čnim uzorkovanjem vode i 1-okta ­
nola. Trenutke uzorkovanja treba rasporediti tijekom minimalnog razdoblja 
od pet sati.  
38. Svako odre đivanje P  OW treba obaviti primjenom najmanje triju neovisnih 
pokusa sa sporim miješanjem.  
Određivanje trajanja uravnoteženja  
39. Pretpostavlja se da se ravnoteža postigla kad regresija omjera koncentracije 
1-oktanola i vode u ovisnosti o vremenu tijekom vremenskog razdoblja od 
četiri vremenske to čke rezultira nagibom koji se znatno ne razlikuje od nule 
na p-razini od 0,05. Minimalno trajanje uravnoteženja iznosi jedan dan prije početka uzorkovanja. Kao zlatno pravilo, uzorkovanje tvari čiji je procije ­
njeni log P
 OW manji od pet može se obaviti tijekom drugog i tre ćeg dana. 
Uravnoteženje će se možda produljiti za više hidrofobnih spojeva. Za spoj 
čiji je log P  OW 8,23 (dekaklorobifenil) za uravnoteženje su bila dovoljna 
144 sata. Uravnoteženje se ocjenjuje ponovljenim uzorkovanjem iz jedne posude.
 
Početak pokusa  
40. Na po četku pokusa reakcijska posuda puni se vodom zasi ćenom 1-oktano ­
lom. Treba omogu ćiti dovoljno vremena za postizanje temperature odre đene 
termostatom.  
41. Željena koli čina ispitivane tvari (otopljene u potrebnom volumenu 1-okta ­
nola zasi ćenog vodom) pažljivo se dodaje u reakcijsku posudu. Ovo je 
ključni korak u pokusu jer treba izbje ći turbulentno miješanje dviju faza. 
Stoga se faza 1-oktanola može polako pipetirati uza stjenku pokusne posude, 
blizu površine vode. Kasnije će teći niza staklenu stjenku i stvoriti film 
iznad vodene faze. Uvijek treba izbjegavati dekantiranje 1-oktanola izravno u tikvicu. Kapljice 1-oktanola ne smiju pasti izravno u vodu.
 
42. Kad se zapo čne s miješanjem, treba ga postupno ubrzavati. Ako se motori 
za miješanje ne mogu prikladno ugoditi, treba razmisliti o primjeni pretva ­
rača. Brzinu miješanja treba ugoditi tako da se na kontaktu vode i 1-okta ­
nola stvori vrtlog dubine od 0,5 do maksimalno 2,5 cm. Brzinu miješanja treba smanjiti ako je dubina vrtloga ve ća od 2,5 cm. U protivnom bi se 
mogle stvoriti mikro-kapljice iz kapljica 1-oktanola u vodenoj fazi, što bi 
dovelo do previsoke procjene koncentracije ispitivane tvari u vodi. Maksi ­
malna brzina miješanja od 2,5 cm preporu čuje se na temelju spoznaja vali ­
dacijske studije s prstenastim testovima (5). Rije č je o kompromisu izme đu 
postizanja velike brzine uravnoteženja, ujedno uz ograni čavanje formiranja 
mikro-kapljica 1-oktanola.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 167
 
Uzorkovanje i obrada uzoraka  
43. Prije uzorkovanja treba isklju čiti miješalicu i pustiti da se teku ćine prestanu 
gibati. Po završetku uzorkovanja miješalica se ponovno polako pokre će, kao 
što je gore opisano, a brzina miješanja postupno se pove ćava. 
44. Vodena faza uzorkuje se iz zapornog ventila na dnu reakcijske posude. 
Uvijek bacite volumen vode koji se nalazi u čepovima (otprilike 5 ml u 
posudi prikazanoj u Dodatku 2.). Voda u čepovima ne miješa se te stoga 
nije uravnotežena s ostatkom. Zabilježite volumen uzoraka vode i osigurajte 
da se pri izra čunu bilance mase u obzir uzme i koli čina ispitivane tvari u 
bačenoj vodi. Gubici radi isparavanja moraju se svesti na minimum na na čin 
da se pusti da voda mirno te če u lijevak za odvajanje tako da se ne 
uznemiruje sloj vode/1-oktanola.  
45. Uzorci 1-oktanola dobivaju se uzimanjem malog alikvota (oko 100 μl) iz 
sloja 1-oktanola pomo ću štrcaljke od stakla i metala od 100 mikrolitara. 
Treba biti pažljiv kako se ne bi uznemirila granica. Treba zabilježiti volumen uzorkovane teku ćine. Dovoljan je mali alikvot jer će se uzorak 
1-oktanola razrijediti.
 
46. Treba izbjegavati nepotrebne korake prijenosa uzoraka. Stoga volumen 
uzorka treba odrediti gravimetrijski. U slu čaju uzoraka vode to se može 
postići skupljanjem uzorka vode u lijevak za odvajanje koji ve ć sadržava 
potreban volumen otapala.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
47. Prema ovoj ispitnoj metodi P  OW se određuje provo đenjem triju pokusa sa 
sporim miješanjem (triju pokusnih jedinica) predmetnog spoja uz primjenu 
identičnih uvjeta. Regresija primijenjena za pokazivanje ste čenog uravnote ­ 
ženja treba se temeljiti na rezultatima najmanje četiri odre đivanja C  O /C W u 
uzastopnim vremenskim to čkama. To omogu ćuje izračun varijance kao 
mjere nesigurnosti prosje čne vrijednosti dobivene u svakoj pokusnoj 
jedinici.  
48. P  OW se može okarakterizirati varijancom podataka dobivenih za svaku 
pokusnu jedinicu. Taj se podatak upotrebljava za izra čun P  OW kao ponde ­
riranog prosjeka rezultata individualnih pokusnih jedinica. Za to se kao faktor ponderiranja upotrebljava obrnuta varijanca rezultata pokusnih jedi ­
nica. Kao rezultat toga, podaci s velikim odstupanjem (izraženim kao vari ­
janca) te time i s manjom pouzdanoš ću manje utje ču na rezultat od podataka 
s niskom varijancom.
 
49. Analogno tome izra čunava se ponderirana standardna devijacija. Ona karak ­
terizira ponavljanje mjerenja P  OW . Niska vrijednost ponderirane standardne 
devijacije ukazuje na to da je odre đivanje P  OW često ponavljano u jednom 
laboratoriju. U nastavku slijedi pregled formalne statisti čke obrade podataka.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 168
 
Obrada podataka  
Prikaz ste čenog stanja ravnoteže  
50. Logaritam omjera koncentracije ispitivane tvari u 1-oktanolu i vodi (log 
(C O /C w )) izračunava se za svako vrijeme uzorkovanja. Postizanje kemijske 
ravnoteže prikazuje se grafi čkim prikazom tog omjera u ovisnosti o 
vremenu. Plato u tom grafikonu temelji se na najmanje četiri uzastopne 
vremenske to čke pokazuje da je postignuta ravnoteža i da je spoj doista 
otopljen u 1-oktanolu. Ako tomu nije tako, ispitivanje treba nastaviti provo ­
diti sve dok četiri uzastopne vremenske to čke ne dadnu nagib koji se ne 
razlikuje zna čajno od 0 na p-razini od 0,05, pokazuju ći da log C  o /C w ne 
ovisi o vremenu.  
Izračun log P  OW - 
51. Vrijednost log P  OW pokusne jedinice izra čunava se kao ponderirana 
prosječna vrijednost log C  o /C w za dio krivulje log C  o /C w u ovisnosti o 
vremenu za koji se pokazuje ravnoteža. Ponderirani prosjek izra čunava se 
ponderiranjem podataka s obrnutom vrijednoš ću varijance tako da utjecaj 
podataka na kona čni rezultat bude obrnuto proporcionalan nesigurnosti 
podataka.  
Prosječni log P  OW 
52. Prosje čna vrijednost log P  OW iz različitih pokusnih jedinica izra čunava se 
kao prosjek rezultata pojedina čnih pokusnih jedinica ponderiran njihovim 
odgovaraju ćim varijancama.  
To se izra čunava na sljede ći način: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
gdje je  
log P  OW,i = vrijednost log P  OW pojedinačne pokusne jedinice i;  
log P  OW,Av  = ponderirana prosje čna vrijednost odre đivanja pojedina čnog 
P OW 
w i = statistički ponder dodijeljen vrijednosti log P  OW pokusne jedi ­
nice i.  
Recipročna vrijednost varijance log P  OW,i upotrebljava se kao 
w i ðw i ¼ var ðlog P  OW ;i Þ –1 Þ 
53. Pogreška u prosjeku vrijednosti log P  OW procjenjuje se kao ponovljivost log 
C o /C w određena tijekom faze ravnoteže u pojedina čnim pokusnim jedini ­
cama. Izražena je kao ponderirana standardna devijacija vrijednosti log 
P OW,Av  (σ log Pow,Av  ) koja je pak mjera pogreške povezane s log P  OW,Av  . 
Ponderirana standardna devijacija može se izra čunati iz ponderirane vari ­
jance var  log Pow,Av  na sljedeći način: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0,5 
Simbol n predstavlja broj pokusnih jedinica.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 169
 
Izvješće o ispitivanju  
54. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti sljede će informacije:  
Ispitivana tvar:  
— trivijalni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula (koja 
navodi položaj oznake ako se upotrebljava radioaktivno ozna čena tvar) 
te relevantna fizikalno-kemijska svojstva (vidjeti stavak 17.),  
— čistoća (nečistoće) ispitivane tvari,  
— čistoća oznake ozna čenih kemikalija i molarna aktivnost (po potrebi),  
— preliminarna procjena vrijednosti log P  ow kao i metoda korištena za 
dobivanje te vrijednosti.  
Uvjeti ispitivanja:  
— datumi provo đenja ispitivanja,  
— temperatura tijekom pokusa,  
— volumeni 1-oktanola i vode na po četku ispitivanja,  
— volumeni uzorkovanog 1-oktanola i vode,  
— volumeni 1-oktanola i vode preostali u ispitnim posudama,  
— opis ispitnih posuda i uvjeta miješanja (geometrija štapi ća za miješanje i 
ispitne posude, visina vrtloga u mm te, ako je dostupna, brzina miješa ­
nja), 
— analiti čke metode primijenjene za odre đivanje ispitivane tvari i granica 
kvantifikacije metode,  
— vremena uzorkovanja,  
— pH vodene faze i korišteni puferi ako je pH prilago đen za ioniziraju će 
molekule,  
— broj odre đivanja.  
Rezultati:  
— ponovljivost i osjetljivost korištenih analiti čkih metoda,  
— određene koncentracije ispitivane tvari u 1-oktanolu i vodi kao funkcija 
vremena,  
— prikaz bilance mase,  
— temperatura i standardna devijacija ili raspon temperature tijekom 
pokusa,  
— regresija omjera koncentracije u ovisnosti o vremenu,  
— prosje čna vrijednost log P  ow,Av  i njezina standardna pogreška,  
— rasprava i tuma čenje rezultata,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 170
 
— primjeri neobra đenih podataka, brojke reprezentativne analize (svi 
neobrađeni podaci moraju se spremati u skladu s GLP standardima), 
uključujući rekuperaciju surogata te broj razina upotrijebljenih pri kali ­
briranju (zajedno s kriterijima za koeficijent korelacije kalibracijske krivulje) te rezultati osiguranja kvalitete/kontrole kvalitete (QA/QC),
 
— ako je dostupno: izvješ će o potvr đivanju postupka analize (treba navesti 
među referencama).  
LITERATURA  
1. De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Environ. 
Toxicol. Chem. 8: 499-512.  
2. Poglavlje A.8 ovog Dodatka, Koeficijent razdjeljenja.  
3. Poglavlje A.8 ovog Dodatka, Koeficijent razdjeljenja.  
4. OECD (2000.). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Pariz.
 
5. Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01.  
6. Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7. Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8. Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
9. OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissocia ­
tion Constants in Water. Pariz.  
10. Poglavlje A.6 ovog Dodatka, Topljivost u vodi.  
11. Poglavlje C.7 ovog Dodatka, Razgradnja – abioti čka razgradnja: hidroliza 
kao funkcija pH.  
12. Poglavlje C.4 - Dio II –VII (Metoda A do F) ovog Dodatka, Odre đivanje 
„lake” biorazgradivosti.  
13. Poglavlje A.4 ovog Dodatka, Tlak pare.  
14. Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623-626.  
15. Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, 
Washington, DC, 2-1 to 2-52.
 
16. Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical 
Information Systems, Irvine, CA.  
17. Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18. Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19. ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 171
 
20. Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
21. Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 479- 
488. 
22. Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Chemie : 
386-390.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 172
 
Dodatak 1.  
Tablica za izra čun minimalnih volumena vode potrebnih za detekciju 
ispitivanih tvari rali čitih vrijednosti log P  OW u vodenoj fazi  
Pretpostavke:  
— Maksimalni volumen pojedina čnih alikvota = 10 % ukupnog volumena; 5 
alikvota = 50 % ukupnog volumena.  
— Koncentracija ispitivanih tvari  ¼ 0,7 Ü topljivosti u svakoj fazi . U slučaju 
nižih koncentracija bit će potrebni ve ći volumeni.  
— Volumen upotrijebljen za odre đivanje LOD-a = 100 ml.  
— log P  ow u ovisnosti o log S  w i log P  ow u ovisnosti o SR (S  oct /S w ) predstav ­
ljaju razumne odnose za ispitivane tvari.  
Procjena S  w 
log P  ow jednadžba  log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  0,496  3,133E+00  
4,5 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  0,035  1,084E+00  
5 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 0,426  3,750E-01  
5,5 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 0,887  1,297E-01  
6 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 1,348  4,487E-02  
6,5 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 1,809  1,552E-02  
7 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 2,270  5,370E-03  
7,5 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 2,731  1,858E-03  
8 ð –Þ0,922 Ü log P  ow þ 4,184  – 3,192  6,427E-04  
Procjena S  oct 
log P  ow jednadžba  S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,41  3,763E+04  
4,5 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,42  4,816E+04  
5 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,43  6,165E+04  
5,5 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,44  7,890E+04  
6 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,45  1,010E+05  
6,5 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,46  1,293E+05  
7 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,47  1,654E+05  
7,5 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,48  2,117E+05  
8 log P  ow ¼ 0,88log SR þ 0,49  2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 173
 
Ukupna masa 
ispitivane tvari 
(mg)  masa  oct /masa  water masa  H2O 
(mg)  konc  H2O 
(mg/l)  masa  oct 
(mg)  konc  oct 
(mg/l)  
1 319  526  2,5017  2,6333  1 317  26 333  
1 686  1 664  1,0127  1,0660  1 685  33 709  
2 158  5 263  0,4099  0,4315  2 157  43 149  
2 762  16 644  0,1659  0,1747  2 762  55 230  
3 535  52 632  0,0672  0,0707  3 535  70 691  
4 524  1664 36  0,0272  0,0286  4 524  90 480  
5 790  5263 16  0,0110  0,0116  5 790  115 807  
7 411  1 664 357  0,0045  0,0047  7 411  148 223  
9 486  5 263 158  0,0018  0,0019  9 486  189 713  
Izračun volumena  
Minimalni volumen potreban za fazu H  2 O za svaku koncentraciju LOD  
log K  ow LOD (mikrogram/l) → 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
4 0,04  0,38  3,80  38  380  
4,5 0,09  0,94  9,38  94  938  
5 0,23  2,32  23,18  232  2 318  
5,5 0,57  5,73  57,26  573  5 726  
6 1,41  14,15  141  1 415  14 146  
6,5 3,50  34,95  350  3 495  34 950  
7 8,64  86,35  864  8 635  86 351  
7,5 21,33  213  2 133  21 335  213 346  
8 52,71  527  5 271  52 711  527 111  
Volumen 
upotrijebljen za 
LOD (l)  0,1 
Legenda uz izra čun 
Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 
1 litre.  
Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 
2 litre.  
Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 
5 litre.  
Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 
10 litre.  
Premašuje 10 % čak i posude za izjedna čenje od 10 litri.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 174
 
Potrebni pregled volumena, kao funkcija topljivosti u vodi i log P  ow 
Minimalni volumen potreban za fazu H  2 O za svaku koncentraciju LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l)  LOD (mikrogram/l) → 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
4 10  0,01  0,12  1,19  11,90  118,99  
5 0,02  0,24  2,38  23,80  237,97  
3 0,04  0,40  3,97  39,66  396,62  
1 0,12  1,19  11,90  118,99  1 189,86  
4,5 5  0,02  0,20  2,03  20,34  203,37  
2 0,05  0,51  5,08  50,84  508,42  
1 0,10  1,02  10,17  101,68  1 016,83  
0,5 0,20  2,03  20,34  203,37  2 033,67  
5 1  0,09  0,87  8,69  86,90  869,01  
0,5 0,17  1,74  17,38  173,80  1 738,02  
0,375  0,23  2,32  23,18  231,75  2 317,53  
0,2 0,43  4,35  43,45  434,51  4 345,05  
5,5 0,4  0,19  1,86  18,57  185,68  1 856,79  
0,2 0,37  3,71  37,14  371,36  3 713,59  
0,1 0,74  7,43  74,27  742,72  7 427,17  
0,05 1,49  14,85  148,54  1 485,43  14 854,35  
6 0,1  0,63  6,35  63,48  634,80  6 347,95  
0,05 1,27  12,70  126,96  1 269,59  12 695,91  
0,025  2,54  25,39  253,92  2 539,18  25 391,82  
0,0125  5,08  50,78  507,84  5 078,36  50 783,64  
6,5 0,025  2,17  21,70  217,02  2 170,25  21 702,46  
0,0125  4,34  43,40  434,05  4 340,49  43 404,93  
0,006  9,04  90,43  904,27  9 042,69  90 426,93  
0,003  18,09  180,85  1 808,54  18 085,39  180 853,86  
7 0,006  7,73  77,29  772,89  7 728,85  77 288,50  
0,003  15,46  154,58  1 545,77  15 457,70  154 577,01  
0,0015  23,19  231,87  2 318,66  23 186,55  231 865,51  
0,001  46,37  463,73  4 637,31  46 373,10  463 731,03  
7,5 0,002  19,82  198,18  1 981,77  19 817,73  198 177,33  
0,001  39,64  396,35  3 963,55  39 635,47  396 354,66  
0,0005  79,27  792,71  7 927,09  79 270,93  792 709,32  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 175
 
log P  ow S w (mg/l)  LOD (mikrogram/l) → 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
0,00025  158,54  1 585,42  15 854,19  158 541,86  1 585 418,63  
8 0,001  33,88  338,77  3 387,68  33 876,77  338 767,72  
0,0005  67,75  677,54  6 775,35  67 753,54  677 535,44  
0,00025  135,51  1 355,07  13 550,71  135 507,09  1 355 070,89  
0,000125  271,01  2 710,14  27 101,42  271 014,18  2 710 141,77  
Volumen upotrijebljen za 
LOD (l)  0,1 
Dodatak 2.  
Primjer ispitne posude obložene staklom za pokus sa sporim miješanjem 
radi odre đivanja P  OW
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 176
 
DIO B: METODE UTVR ĐIVANJA TOKSI ČNOSTI I DRUGIH U ČINAKA 
NA ZDRAVLJE  
SADRŽAJ  
OPĆI UVOD  
B.1. bis.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA S FIKSNOM 
DOZOM  
B.1. tris.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA UTVR ­ 
ĐIVANJA KLASA AKUTNE TOKSI ČNOSTI  
B.2. AKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST  
B.3. AKUTNA TOKSI ČNOST (DERMALNA)  
B.4. AKUTNA TOKSI ČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE 
KOŽE  
B.5. AKUTNA TOKSI ČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE 
OČIJU 
B.6. SENZIBILIZACIJA KOŽE  
B.7. 28-DNEVNO ISPITIVANJE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
GLODAVACIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
B.8. SUBAKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST: 28-DNEVNA 
STUDIJA  
B.9. TOKSI ČNOST (DERMALNA) PRI PONAVLJANOJ DOZI (28 
DANA)  
B.10.  MUTAGENOST –  IN VITRO  TEST ZA DOKAZIVANJE 
KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOD SISAVACA  
B.11.  MUTAGENOST –  IN VIVO  TEST ZA DOKAZIVANJE 
KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOŠTANE SRŽI SISAVACA  
B.12.  IN VIVO  MIKRONUKLEUS TEST NA ERITROCITIMA SISA ­
VACA  
B.13./14.  MUTAGENOST: TEST ZA DETEKCIJU POVRATNIH MUTA ­
CIJA POMO ĆU BAKTERIJA  
B.15.  ISPITIVANJE MUTAGENOSTI I PROBIRNI TEST NA 
GENSKE MUTACIJE KOJE UKAZUJU NA KARCINOGE ­
NOST–  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16.  MITOTSKA REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.17.  IN VITRO TEST GENSKIH MUTACIJA STANICA SISAVACA  
B.18.  OŠTE ĆENJE I POPRAVAK – NEPLANIRANA SINTEZA DNK 
– STANICE SISAVACA  IN VITRO  
B.19.  IN VITRO  ANALIZA IZMJENE SESTRINSKIH KROMATIDA  
B.20.  TEST SPOLNO UVJETOVANE RECESIVNE SMRTNOSTI 
KOD VINSKE MUŠICE  DROSOPHILA MELANOGASTER  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 177
 
B.21.  IN VITRO  TESTOVI TRANSFORMACIJA STANICA SISA ­
VACA  
B.22.  ISPITIVANJE U ČINAKA DOMINANTNIH LETALNIH GENA 
NA GLODAVCIMA  
B.23.  TEST KROMOSOMSKIH ABERACIJA U SPERMATOGONI ­
JIMA SISAVACA  
B.24.  TEST POJAVE MRLJA U MIŠA  
B.25.  NASLJEDNA TRANSLOKACIJA U MIŠEVA  
B.26.  TEST SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
GLODAVCIMA – 90-DNEVNA STUDIJA ORALNE TOKSI Č­
NOSTI UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
B.27.  TEST SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI – 90- 
DNEVNO ISPITIVANJE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
NEGLODAVCIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
B.28.  TEST SUBKRONI ČNE DERMALNE TOKSI ČNOSTI – 90- 
DNEVNO ISPITIVANJE DERMALNE TOKSI ČNOSTI NA 
GLODAVCIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
B.29.  SUBKRONI ČNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST: 90- 
DNEVNA STUDIJA  
B.30.  STUDIJE KRONI ČNE TOKSI ČNOSTI  
B.31.  STUDIJA PRENATALNE RAZVOJNE TOKSI ČNOSTI  
B.32.  STUDIJE KARCINOGENOSTI  
B.33.  KOMBINIRANE STUDIJE KRONI ČNE TOKSI ČNOSTI/ 
KARCINOGENOSTI  
B.34.  TEST REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA JEDNOJ 
GENERACIJI  
B.35.  STUDIJA REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA DVIJE 
GENERACIJE  
B.36.  TOKSIKOKINETIKA  
B.37.  ODGO ĐENA NEUROTOKSI ČNOST ORGANOFOSPORNIH 
TVARI NAKON AKUTNOG IZLAGANJA  
B.38.  STUDIJA ODGO ĐENE NEUROTOKSI ČNOSTI ORGANOFO ­
SPORNIH TVARI – PONAVLJANO DOZIRANJE TIJEKOM 
28 DANA  
B.39.  TEST NEPLANIRANE SINTEZE DNK (UDS) NA STANI ­
CAMA JETRE SISAVACA  IN VIVO  
B.40.  NAGRIZANJE KOŽE  IN VITRO:  TEST TRANSKUTANOG 
ELEKTRI ČNOG OTPORA (TER)  
B.40.BIS  NAGRIZANJE KOŽE  IN VITRO : TEST NA MODELU 
LJUDSKE KOŽE  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 178
 
B.41.  TEST FOTOTOKSI ČNOSTI  IN VITRO  3T3 NRU  
B.42.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA  
B.43.  STUDIJA NEUROTOKSI ČNOSTI KOD GLODAVACA  
B.44.  APSORPCIJA PUTEM KOŽE: METODA  IN VIVO  
B.45.  APSORPCIJA PUTEM KOŽE: METODA  IN VITRO  
B.46.  TEST NADRAŽIVANJA KOŽE  IN VITRO  NA MODELU 
REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME  
B.47.  METODA ISPITIVANJA ZAMU ĆENJA I PROPUSNOSTI 
GOVEĐE ROŽNICE ZA IDENTIFIKACIJU TVARI NAGRIZA ­
JUĆIH I JAKO NADRAŽUJU ĆIH ZA O ČI 
B.48.  METODA ISPITIVANJA NA IZOLIRANIM O ČIMA PILI ĆA 
ZA IDENTIFIKACIJU TVARI NAGRIZAJU ĆIH I JAKO 
NADRAŽUJU ĆIH ZA O ČI 
B.49.  IN VITRO  MIKRONUKLEUS TEST STANICE SISAVCA  
B.50.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA: DA  
B.51.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA: BrdU-ELISA  
▼M4 
B.52.  AKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST - METODA 
AKUTNOG TOKSI ČNOG RAZREDA  
▼M5 
B.53.  STUDIJA RAZVOJNE NEUROTOKSI ČNOSTI  
B.54.  UTEROTROPNI BIOTEST KOD GLODAVACA: KRAT ­
KOROČNI TEST PROBIRA NA ESTROGENSKA SVOJSTVA  
B.55.  HERSHBERGEROV BIOTEST NA ŠTAKORIMA: KRAT ­
KOROČNI TEST PROBIRA ZA (ANTI)ANDROGENA SVOJ ­
STVA  
B.56.  PRODULJENA STUDIJA REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI 
NA JEDNOJ GENERACIJI  
B.57.  TEST STEROIDOGENEZE H295R  
B.58.  TRANSGENSKE ANALIZE MUTACIJE GENA SOMATSKIH I 
SPOLNIH STANICA GLODAVACA  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 179
 
OPĆI UVOD  
A. KARAKTERIZACIJA ISPITIVANE TVARI  
Prije početka bilo kakve studije toksi čnosti treba biti poznat sastav 
ispitivane tvari, uklju čujući glavne ne čistoće, te njezina relevantna 
fizikalno-kemijska svojstva koja uklju čuju i stabilnost.  
Fizikalno-kemijska svojstva ispitivane tvari osiguravaju važne infor ­
macije za odabir puta primjene, planiranje studije, te rukovanje ispi ­
tivanim tvarima i njihovo pohranjivanje.  
Početku studije mora prethoditi razvijanje analiti čke metode za kvali ­
tativno i kvantitativno odre đivanje ispitivane tvari (uklju čujući 
glavne ne čistoće kada je mogu će) u sredstvu za doziranje i biolo ­ 
škom materijalu.  
Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sve informacije vezane uz 
identifikaciju, fizikalno-kemijska svojstva, čistoću i ponašanje ispiti ­
vane tvari.  
B. ZAŠTITA ŽIVOTINJA  
Kod ispitivanja toksi čnosti bitna je stroga kontrola okolišnih uvjeta i 
pravilne metode zaštite životinja.  
i. Smještajni uvjeti  
Okolišni uvjeti u prostorijama i ogra đenim prostorima za držanje 
pokusnih životinja moraju odgovarati vrsti kojoj one pripadaju. Za 
štakore, miševe i zamorce odgovaraju ći su uvjeti sobna temperatura 
od 22 °C ± 3 °C uz relativnu vlažnost zraka od 30 do 70 %; za kuniće temperatura treba biti 20 °C ± 3 °C uz relativnu vlažnost 
zraka od 30 do 70 %.
 
Neke pokusne tehnike posebno su osjetljive na djelovanje tempera ­
ture i u takvim su slu čajevima pojedinosti o odgovaraju ćim uvjetima 
uključeni u opis ispitne metode. Pri svim istraživanjima toksi čkih 
učinaka temperaturu i vlažnost zraka treba pratiti, bilježiti i uklju čiti 
u završno izvješ će o studiji.  
Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati 
svjetla i 12 sati mraka. Pojedinosti o svjetlosnom režimu treba zabi ­
lježiti i uklju čiti u završno izvješ će o studiji.  
Ako u metodi nije predvi đeno druga čije, životinje mogu biti smje ­ 
štene pojedina čno ili se u kavezima mogu držati u malim skupinama 
istog spola; u slu čaju skupnog smještaja, u jedan kavez ne smije se 
staviti više od pet životinja.  
U izvješćima o pokusima na životinjama važno je navesti tip kaveza 
i broj životinja smještenih u svakom kavezu za vrijeme izloženosti 
kemikaliji, kao i tijekom opažanja koje slijedi nakon toga.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 180
 
ii. Prehrambeni uvjeti  
Prehrana treba zadovoljavati sve nutritivne zahtjeve životinjske vrste 
koja se koristi u ispitivanju. Kad se ispitivane tvari životinjama daju u hrani, nutritivna se vrijednost može sniziti me đusobnim djelova ­
njem ispitivane tvari i nekog prehrambenog sastojka. Pri tuma čenju 
rezultata ispitivanja treba uzeti u obzir mogu ćnost takve reakcije. 
Može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograni čene količine vode za pi će. Kad se ispitivana tvar primje ­
njuje ovom metodom, na izbor hrane može utjecati potreba da se u 
toj hrani osigura odgovaraju ća primjesa ispitivane tvari.
 
Prehrambeni kontaminanti za koje se zna da utje ču na toksi čnost ne 
smiju biti prisutni u koncentracijama u kojima bi utjecali na 
rezultate.  
C. ALTERNATIVNA ISPITIVANJA  
Europska unija obvezala se promicati razvoj i validaciju alternativnih 
tehnika koje mogu osigurati jednaku razinu informacija kao i testovi 
koji se sada obavljaju na životinjama, ali se pri njihovoj primjeni koristi manji broj životinja, uzrokuje manje patnje ili se u potpunosti izbjegava korištenje životinja.
 
Kad takve metode postanu dostupne, kad god je mogu će mora se 
razmotriti mogu ćnost njihove primjene pri karakterizaciji opasnosti 
na kojoj se temelji klasifikacija kemikalija, ozna čivanje kemikalija s 
obzirom na intrinzi čke opasnosti te procjena njihove sigurnosti.  
D. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Kod ocjenjivanja i tuma čenja rezultata ispitivanja obvezno treba 
uzeti u obzir granice do kojih se rezultati studija na životinjama i 
studija  in vitro  mogu izravno ekstrapolirati na čovjeka, pa se prema 
tome dokazi o štetnom djelovanju na ljude, kada su dostupni, mogu upotrijebiti za potvrdu rezultata ispitivanja.
 
E. REFERENTNA LITERATURA  
Većina navedenih metoda razvijena je u okviru programa OECD-a 
za Smjernice za ispitivanja i treba ih primjenjivati u skladu s na če­
lima dobre laboratorijske prakse, kako bi se osiguralo što je mogu će 
šire „međusobno prihva ćanje podataka”.  
Dodatne informacije mogu se na ći u referencama navedenim u 
OECD-ovim smjernicama i drugdje objavljenoj relevantnoj literaturi.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 181
 
B.1 bis.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA S FIKSNOM 
DOZOM  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 420 (2001.)  
1.1. UVOD  
Kod tradicionalnih metoda za ocjenjivanje akutne toksi čnosti, smrt 
životinje predstavlja krajnji toksi čki učinak. 1984. Britansko toksi ­
kološko društvo predložilo je novi pristup ispitivanju akutne toksi č­
nosti koji se temelji na primjeni niza fiksnih doza (1). Ovaj pristup 
nije uklju čivao smrt životinje kao krajnju to čku toksičkog učinka već 
se umjesto toga temeljio na jasnim znakovima toksi čnosti kod 
primjene jedne od niza fiksnih doza. Nakon britanskih (2) i me đu­
narodnih (3) validacijskih studija  in vivo , postupak je 1992. prih ­
vaćen kao ispitna metoda. Kasnije su vrednovana statisti čka svojstva 
postupka s fiksnim dozama pomo ću matemati čkih modela upotrijeb ­
ljenih u nizu studija (4)(5)(6). I modelske studije i studije  in vivo  
pokazale su da je postupak ponovljiv, da je za njegovu primjenu 
potreban manji broj životinja, da uzrokuje manje trpljenja nego tradi ­
cionalne metode, te da omogu ćuje rangiranje tvari na sli čan način 
kao i druge razvijene metode za ispitivanje akutne toksi čnosti.  
Upute za odabir najprikladnije ispitne metode za odre đenu namjenu 
mogu se na ći u Smjernicama za ispitivanje akutne oralne toksi čnosti 
(7). Ovaj dokument isto tako sadrži dodatne informacije o primjeni i tumačenju ispitne metode B.1 bis.
 
Načelo ove metode je da se u glavnoj studiji koriste samo blago 
toksične doze, a da se izbjegava primjena doza za koje se pretpo ­
stavlja da bi mogle biti smrtonosne. Isto tako ne treba primjenjivati doze koje uzrokuju znatnu bol ili stres kod životinja zbog nagriza ­
jućeg ili jakog nadražuju ćeg djelovanja. Životinje koje su na umoru 
ili životinje koje o čito trpe intenzivnu bol ili pokazuju znakove jakog 
i dugotrajnog stresa humano se usmr ćuju, a pri tuma čenju rezultata 
ispitivanja tretiraju se jednako kao i životinje koje su uginule tijekom 
ispitivanja. Kriteriji za donošenje odluke o usmr ćivanju životinja 
koje su na umoru ili jako trpe i smjernice za prepoznavanje simp ­
toma predvidive ili neminovne smrti navedeni su u zasebnom doku ­
mentu (8).
 
Ova metoda osigurava podatke o opasnim svojstvima i omogu ćuje 
rangiranje i klasifikaciju tvari prema Globalno uskla đenom 
sustavu (GHS) za klasifikaciju kemikalija koje uzrokuju akutnu 
toksičnost (9).  
Prije početka studije ispitni laboratorij treba razmotriti sve raspolo ­ 
žive podatke o ispitivanoj tvari. Ti podaci uklju čuju identitet i 
kemijsku strukturu tvari; njezina fizikalno-kemijska svojstva; rezul ­
tate drugih toksikoloških ispitivanja  in vitro  ili in vivo  obavljenih na 
toj tvari; toksikološke podatke o tvarima koje su joj srodne po strukturi; kao i predvi đenu primjenu tvari. Ovi su podaci neophodni 
kako bi se svim zainteresiranim stranama dokazalo da je ispitivanje 
važno za zaštitu ljudskog zdravlja, te će pomoći u odabiru odgova ­
rajuće početne doze.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 182
 
1.2. DEFINICIJE  
Akutna oralna toksi čnost:  odnosi se na štetne u činke koji se 
javljaju nakon primjene jedne doze ispitivane tvari ili nakon nekoliko doza danih unutar 24 sata.
 
Odgođena smrt:  znači da unutar 48 sati životinja ne ugine niti 
pokazuje znakove umiranja, ve ć ugine kasnije tijekom 14-dnevnog 
razdoblja opažanja.  
Doza:  količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava 
kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg).  
Evidentna toksi čnost:  opći naziv koji opisuje jasne znakove toksi č­
nosti nakon primjene ispitivane tvari (vidjeti (3) za primjere) koji su 
takvi da se kod sljede će više fiksne doze kod ve ćine životinja može 
očekivati ili jaka bol i trajni znaci jakog stresa, stanje umiranja 
(kriteriji su prikazani u Smjernicama za humano usmr ćivanje (8)), 
ili vjerojatna smrt.  
GHS:  Globalno uskla đeni sustav klasifikacije kemijskih tvari i 
mješavina. Zajedni čki projekt OECD-a (ljudsko zdravlje i okoliš), 
UN-ovog Odbora stru čnjaka za prijevoz opasnih tereta (fizikalno- 
kemijska svojstva), te ILO-a (obavještavanje o opasnostima), koor ­
diniran Me đuorganizacijskim programom za pravilno rukovanje 
kemikalijama (IOMC).  
Neminovna smrt:  kad se stanje umiranja ili smrt životinje o čekuje 
prije idućeg planiranog vremena opažanja. Simptomi koji ukazuju na 
ovo stanje kod glodavaca uklju čuju grčeve, bočni položaj, ležanje i 
drhtavicu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmr ­ 
ćivanje (8)).  
LD 50 (srednja smrtonosna doza):  statistički određena jednokratna 
doza tvari za koju se o čekuje da će kod 50 posto životinja izazvati 
smrt ako se primjeni oralnim putem. Vrijednost LD  50 izražava se kao 
masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg).  
Granična doza:  odnosi se na gornju grani čnu dozu koja se primje ­
njuje u ispitivanju (2 000 ili 5 000 mg/kg).  
Stanje umiranja:  kad je životinja na umoru, odnosno kad ne bi 
mogla preživjeti čak ni da se lije či. (Za više pojedinosti vidjeti 
Smjernice za humano usmr ćivanje (8)).  
Predvidiva smrt:  prisutnost klini čkih znakova koji pokazuju da će smrt 
nastupiti u znanom budu ćem vremenu prije planiranog kraja pokusa, na 
primjer: nesposobnnost životinje da dosegne vodu ili hranu. (Za više 
pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmr ćivanje (8)).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 183
 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Na skupine životinja istog spola postupno se primjenjuju fiksne doze 
od 5, 50, 300 i 2 000 mg/kg (iznimno može do ći u obzir i primjena 
dodatne fiksne doze od 5 000 mg/kg, vidjeti odjeljak 1.6.2). Po četna 
doza odabire se na temelju prethodnih opažanja kao doza za koju se 
očekuje da će uzrokovati pojavu nekih znakova toksi čnosti, ali ne će 
izazvati jaki toksi čki učinak ili smrtnost. Klini čki znakovi i stanja uz 
koja je vezana izrazita bol, trpljenje i neminovna smrt životinje 
detaljno su opisani u posebnim Smjernicama OECD-a (8). Na slje ­
deće skupine životinja mogu se primjenjivati više ili niže fiksne 
doze, ovisno o prisutnosti ili odsutnosti znakova toksi čnsti ili 
smrtnosti. Ovaj se postupak nastavlja sve dok se ne utvrdi doza 
koja uzrokuje evidentnu toksi čnost ili najviše jednu smrt, odnosno 
dok se ne utvrdi da nakon primjene najviše doze nema vidljivih toksičkih učinaka, ili pak da najniža doza uzrokuje smrt.
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Odabir životinjske vrste  
Najčešće korištena vrsta glodavaca je štakor, iako se mogu koristiti i 
neke druge vrste. Uobi čajeno je koristiti ženke (7). Razlog je tome 
što je pretraživanjem literature o uobi čajenim testovima u kojima se 
primjenjuje LD  50 utvrđeno da razlike u osjetljivosti spolova gotovo 
da i nema, ali u slu čajevima gdje su razlike opažene, ženke op ćenito 
pokazuju nešto ve ću osjetljivost (10). Me đutim, ako saznanja o toksi ­
kološkim ili toksikokineti čkim svojstvima strukturno srodnih kemi ­
kalija ukazuju na to da bi osjetljiviji mogli biti mužjaci, treba kori ­
stiti mužjake. Ako se ispitivanja provode na mužjacima, potrebno je 
navesti razloge za to.  
U ispitivanjima treba koristiti zdrave mlade odrasle primjerke živo ­
tinja koje pripadaju naj češće korištenim sojevima laboratorijskih 
životinja. Treba koristiti ženke koje nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na po četku primjene doze svaka životinja treba biti 
između 8 i 12 tjedana starosti, a njezina masa treba biti u okviru 
± 20 % srednje mase životinja kojima je tvar bila dozirana u prija ­ 
šnjim ispitivanjima.
 
1.4.2.  Uvjeti držanja i hranjenja životinja  
Temperatura prostorije za držanje pokusnih životinja treba biti 22 °C 
(± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 30 % i po mogućnosti ne više 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba 
je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i 
mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se 
tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laborato ­
rijske životinje uz neograni čene količine pitke vode. Životinje se 
mogu u kavezima držati skupno, razvrstane prema dozama, s tim 
da broj životinja koje se drže u jednom kavezu ne smije ometati 
nesmetano opažanje svake životinje.
 
1.4.3.  Priprema životinja  
Životinje se odabiru nasumce, ozna čavaju se kako bi se mogle poje ­
dinačno razlikovati i drže u kavezima barem 5 dana prije po četka 
primjene doza kako bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 184
 
1.4.4.  Priprema doza  
Općenito, ispitivane tvari treba primjenjivati u rasponu doza 
jednakog volumena, a mijenjati treba koncentraciju pripravka koji se dozira. Me đutim, pri ispitivanju nekog teku ćeg krajnjeg proizvoda 
ili mješavine, za kasniju ocjenu opasnosti ispitivane tvari može biti 
relevantnija primjena te tvari u nerazrije đenom obliku, tj. pri stalnoj 
koncentraciji, što neka regulatorna tijela postavljaju kao zahtjev. U svakom slu čaju ne smije se prekora čiti maksimalni volumen doze 
određene za primjenu. Maksimalni volumen teku ćine koji se smije 
odjednom primijeniti ovisi o veli čini pokusne životinje. Kod gloda ­
vaca, taj volumen obi čno ne smije biti ve ći od 1ml/100 g mase 
životinje: me đutim, u slu čaju primjene vodenih otopina može do ći 
u obzir i doza od 2 ml/100 g mase životinje. Što se ti če formulacije 
pripravka koji se dozira, gdje god je mogu će preporu ča se upotreba 
vodene otopine/suspenzije/emulzije, a tek onda, po prioritetnom 
redoslijedu, uljne otopine/suspenzije/emulzije (npr. kukuruzno ulje) 
ili otopine za koje se koriste drugi nosa či. Za sve nosa če, osim vode, 
moraju biti poznata njihova toksikološka svojstva. Doze se moraju pripremati neposredno prije primjene, osim ako se radi o pripravku 
za koji se zna da će tijekom upotrebe zadržati prihvatljivu stabilnost.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar primjenjuje u jednoj dozi oralnom intubacijom 
pomoću želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile. U 
izvanrednim okolnostima, kada jednokratna primjena doze nije moguća, jedna se doza može dati i u nekoliko manjih dijelova 
tijekom vremenskog razdoblja ne dužeg od 24 sata.
 
Prije primjene doza životinje trebaju postiti (npr. u slu čaju štakora, 
hranu, ali ne i vodu treba uskratiti preko no ći; kod miševa, hranu, ali 
ne i vodu treba uskratiti na 3-4 sata). Nakon posta životinje treba izvagati te primijeniti ispitivanu tvar. Nakon što se tvar primijeni, hrana se može uskratiti sljede ća 3-4 sata kad su u pitanju štakori ili 
1-2 sata kad se radi o miševima. U slu čajevima kad se doza primje ­
njuje u nekoliko manjih dijelova kroz odre đeno vremensko 
razdoblje, ovisno o dužini tog razdoblja, mogu će je da će životi­
njama trebati dati hranu i vodu.
 
1.5.2.  Inicijalna studija  
Svrha inicijalne studije je odabiranje odgovaraju će početne doze za 
glavnu studiju. Ispitivana tvar se primjenjuje na pojedina čne živo­
tinje po redoslijedu prikazanom u dijagramu toka u Dodatku 1. Inicijalna studija završava kada je mogu će odrediti po četnu dozu 
(ili ako do đe do smrtnog ishoda ve ć kod najniže fiksne doze).
 
Početna doza za inicijalnu studiju odabire se me đu fiksnim koncen ­
tracijama od 5, 50, 300 i 2 000 mg/kg kao doza za koju se o čekuje 
da će izazvati evidentnu toksi čnost na temelju dokaza koje, ako je 
moguće, treba temeljiti na podacima dobivenim ispitivanjima iste 
kemikalije ili strukturno srodnih kemikalija  in vivo  i in vitro . Ako 
takvih informacija nema, za po četnu dozu uzima se koncentracija od 
300 mg/kg.  
Između doza koje se primjenjuju na pojedina čne životinje treba 
napraviti pauzu od najmanje 24 sata. Životinje treba opažati 
najmanje 14 dana.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 185
 
Iznimno, i samo u slu čajevima kad je to opravdavano posebnim 
regulatornim potrebama, može se razmotriti primjena dodatne, više 
fiksne doze od 5 000 mg/kg (vidjeti Dodatak 3). Zbog brige o dobro ­
biti životinja, ispitivanje na životinjama u okviru GHS kategorije 5 (2 000-5 000 mg/kg) ne preporu ča se i može do ći u obzir samo u 
slučajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog 
ispitivanja biti od neposrednog zna čaja za zaštitu ljudskog zdravlja, 
zdravlja životinja, ili za zaštitu okoliša.
 
U slučajevima kad u okviru inicijalne studije pokusna životinja ugine 
već kod primjene najniže fiksne doze (5 mg/kg), uobi čajeni je 
postupak da se studija prekine, a ispitivana tvar svrsta u GHS kate ­
goriju 1 (kako je prikazano u Dodatku 1). Me đutim, ako je za 
ovakvu klasifikaciju potrebna dodatna potvrda, može se provesti još jedno dodatno neobvezno ispitivanje, na sljede ći način. Doza 
od 5 mg/kg primijeni se na još jednu životinju. Ako i ta druga 
životinja ugine, GHS kategorija 1 se potvr đuje i studija se odmah 
prekida. Ako druga životinja preživi, doza od 5 mg/kg primjenjuje se na još najviše tri životinje. Zbog visokog stupnja opasnosti od 
smrtnosti, doza se primjenjuje u slijedu na jednu po jednu životinju, 
radi zaštite njihove dobrobiti. Vremenski interval izme đu davanja 
doze svakoj životinji treba biti dovoljno dug da se utvrdi vjerojatnost 
da će prethodna životinja preživjeti. Ako se dogodi i druga smrt, 
slijed davanja odmah se prekida i doza se više ne smije primijeniti niti na jednu životinju. Budu ći da pojava drugog smrtnog slu čaja 
(bez obzira na broj životinja koje se testiraju u vrijeme prekida) 
spada pod ishod A (dvije ili više smrti) za fiksnu dozu od 
5 mg/kg primjenjuje se pravilo klasifikacije iz Dodatka 2. (kategorija 1 u slučaju dviju ili više smrti ili kategorija 2 u slu čaju najviše jedne 
smrti). Osim toga, u Dodatku 4. dane su smjernice za klasificiranje u 
sustavu EU-a dok se ne po čne primjenjivati novi GHS.
 
1.5.3.  Glavna studija  
1.5.3.1.  Broj životinja i visina doza  
Na dijagramu toka u Dodatku 2. prikazano je kako nastaviti s ispi ­
tivanjem nakon primjene prve fiksne doze. Treba poduzeti jedan od 
tri koraka: prekinuti ispitivanje i ispitivanu tvar svrstati u odgovara ­
juću klasu opasnih tvari, nastaviti ispitivanje s višom fiksnom 
dozom, ili nastaviti ispitivanje s nižom fiksnom dozom. Me đutim, 
radi zaštite životinja, doza koja je u inicijalnoj studiji uzrokovala 
smrt životinje u glavnoj se studiji ne će primjenjivati (vidjeti 
Dodatak 2). Iskustvo pokazuje da će najvjerojatniji ishod ispitivanja 
s početnom dozom biti takav da će se tvar mo ći klasificirati i da 
daljnja ispitivanja ne će biti potrebna.  
Za svaku visinu doze koja se ispituje obi čno se koristi po pet živo ­
tinja istog spola. Na tu skupinu od pet životinja, koju čini jedna 
životinja korištena u inicijalnoj studiji i još četiri životinje, primje ­
njuje se odabrana doza (osim u slu čajevima kad neka doza koja se 
koristi u glavnoj studiji nije bila korištena u inicijalnoj studiji, što 
nije uobičajeno).  
Vremenski interval izme đu primjene doza razli čitih visina odre đuje 
se prema po četku, trajanju i ja čini znakova toksi čnosti. Tretiranje 
životinja sljede ćom dozom treba odgoditi dok se ne utvrdi sigurno 
preživljavanje svih životinja na koje je primijenjena prethodna doza. 
Preporuča se da izme đu primjene dvije razli čite doze pro đe tri ili 
četiri dana, prema potrebi, kako bi se mogli uo čiti odgođeni simp­
tomi toksi čnosti. Taj se vremenski interval može prilago đavati prema 
potrebi, npr. u slu čaju reakcije na temelju koje se ne može donijeti 
zaključak. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 186
 
Kad se razmatra primjena gornje fiksne doze od 5 000 mg/kg, treba 
slijediti postupak opisan u Dodatku 3. (vidjeti tako đer odjeljak 
1.6.2.).  
1.5.3.2.  Grani čni test  
Granični se test prvenstveno koristi u situacijama kad izvoditelj ispi ­
tivanja ima informacije koje kazuju da ispitivani materijal vjerojatno nije toksi čan, tj. da postaje toksi čan samo iznad regulatornih 
graničnih doza. Informacije o toksi čnosti ispitivanog materijala 
mogu se temeljiti na saznanjima o sli čnim ispitanim spojevima ili 
sličnim ispitanim mješavinama ili proizvodima, uzimaju ći u obzir 
identitet i postotak komponenata za koje se zna da su toksikološki značajne. U situacijama kad podataka o toksi čnosti ima malo ili ih 
uopće nema, ili kad se o čekuje da će ispitivani materijal biti toksi ­ 
čan, treba obaviti glavni test.
 
Kao grani čni test u okviru ovih smjernica primjenjuje se uobi čajeni 
postupak, odnosno primjena po četne doze za inicijalnu studiju od 
2 000 mg/kg (ili, iznimno, 5 000 mg/kg) iza čega slijedi primjena 
jednako visoke doze na još četiri životinje.  
1.6. OPAŽANJA  
Nakon primjene doze životinje se pojedina čno opažaju barem 
jedanput tijekom prvih 30 minuta, povremeno tijekom prva 24 sata, uz posebnu pozornost tijekom prva 4 sata, a zatim jednom dnevno u trajanju od ukupno 14 dana, osim u slu čajevima kada je 
životinju potrebno izlu čiti iz studije i humano usmrtiti zbog njezine 
dobrobiti ili ako se utvrdi smrt životinje. Me đutim, trajanje opažanja 
ne bi smjelo biti strogo odre đeno. Treba ga utvrditi na temelju toksi ­ 
čkih reakcija, po četka i trajanja oporavka i prema potrebi ga se može 
produžiti. Važno je vrijeme pojave i nestajanja prvih znakova toksi č­
nosti, posebno ako postoji tendencija da se znakovi toksi čnosti 
pojave s odgodom (11). Svi rezultati opažanja sustavno se bilježe, pri čemu se za svaku životinju vodi posebna evidencija.
 
Dodatna opažanja bit će potrebna ako životinje nastave pokazivati 
znakove toksi čnosti. Treba opažati promjene na koži i dlaci, o čima i 
sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živ čanom sustavu, kao i promjene u somatomotori čkoj 
aktivnosti i obrascu ponašanja. S posebnom pozornoš ću treba opažati 
drhtavicu, gr čeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Treba 
poštovati na čela i kriterije navedene u Smjernicama za humano 
usmrćivanje (8). Životinje za koje se utvrdi da su u stanju umiranja 
i životinje koje pokazuju da trpe jake bolove ili dugotrajni stres treba 
humano usmrtiti. U slu čajevima kad se životinja usmr ćuje iz 
humanih razloga, ili se utvrdi njezina smrt, vrijeme smrti treba što točnije zabilježiti.
 
1.6.1.  Tjelesna masa  
Pojedinačnu masu životinja treba utvrditi neposredno prije primjene 
ispitivane tvari, a nakon tog najmanje jednom tjedno. Promjene u 
masi treba izra čunati i zabilježiti. Na kraju ispitivanja preživjele se 
životinje izvažu i potom humano usmrte.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 187
 
1.6.2.  Patologija  
Sve pokusne životinje (uklju čujući i one koje uginu za vrijeme ispi ­
tivanja ili ih se izlu či iz studije zbog zaštite dobrobiti životinja) treba 
podvrgnuti obdukciji. Za svaku životinju treba zabilježiti sve ve će 
patološke promjene. Treba razmotriti i mogu ćnost obavljanja mikro ­
skopskog pregleda organa životinja koje su nakon primjene prve doze preživjele 24 ili više sati i na kojima su obdukcijom utvr đene 
velike patološke promjene, budu ći da se na taj na čin mogu prikupiti 
korisne informacije.
 
2. PODACI  
Treba prikupiti podatke o svakoj pojedina čnoj životinji. Osim toga, 
sve podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku 
ispitnu skupinu biti naveden broj upotrijebljenih životinja, broj živo ­
tinja koje su pokazale znakove toksi čnosti, broj životinja kod kojih je 
tijekom ispitivanja utvr đena smrt ili su iz humanih razloga bile usmr ­ 
ćene, vrijeme smrti svake pojedina čne životinje, te opis i vremenski 
tijek toksi čkih učinaka i reverzibilnosti, kao i nalazi obdukcije.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije, prema 
potrebi:  
ispitivana tvar:  
— fizikalni oblik, čistoća i, tamo gdje je relevantno, 
fizikalno-kemijska svojstva (uklju čujući izomerizaciju),  
— identifikacijski podaci, uklju čujući CAS broj.  
Nosač (prema potrebi):  
— obrazloženje za odabir nosa ča, ako se ne radi o vodi.  
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— mikrobiološki status životinje, ako je poznat,  
— broj, starost i spol životinja (uklju čujući, prema potrebi, razloge 
za korištenje mužjaka umjesto ženki),  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari, uklju čujući pojedinosti 
o fizikalnom obliku primijenjenog materijala,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari koji uklju čuju volumene 
doza i vrijeme njihove primjene,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući pojedinosti o 
vrsti i izvoru vode),  
— obrazloženje za odabir po četne doze.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 188
 
Rezultati:  
— tablični prikaz podataka o reakcijama i visini doza za svaku 
životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti, 
uključujući smrtnost, te prirodu, ja činu i trajanje toksi čkog učin­
ka), 
— tablični prikaz tjelesne mase i promjena u tjelesnoj masi,  
— masa pojedina čnih životinja na dan primjene doze, zatim u 
tjednim intervalima, te u vrijeme smrti ili usmr ćivanja,  
— datum i vrijeme smrti, ako do nje do đe prije planiranog usmr ­ 
ćivanja,  
— vrijeme pojavljivanja znakova toksi čnosti i jesu li ti znakovi bili 
reverzibilni kod svake životinje,  
— nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju, ako su 
dostupni.  
Diskusija i tuma čenje rezultata.  
Zaključci. 
4. REFERENCE:  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984) 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, str. 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O (1987) 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances 
and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol.‚ 6, str. 279-291.
 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P (1990) The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, str. 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N (1992) Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, str. 313- 
324. 
(5) Stallard, N. and Whitehead, A (1995) Reducing numbers in the 
fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, str. 315-323.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A and Ridgeway, P. (2002) Statistical 
evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, str. 183-196.
 
(7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris
 
(8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment No 19.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 189
 
(9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, str. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/ home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521- 
14-no-24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C (1995) Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol. 33, str. 223-231.  
(11) Chan P.K and A. W Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, 
USA.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 190
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 191
 ▼B 
Dodatak 1.  
DIJAGRAM TOKA ZA INICIJALNU STUDIJU

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 192
 ▼B

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 193
 ▼B 
Dodatak 2  
DIJAGRAM TOKA ZA GLAVNU STUDIJU

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 194
 ▼B

 
Dodatak 3.  
KRITERIJI ZA KLASIFIKACIJU ISPITIVANIH TVARI ČIJA JE 
OČEKIVANA VRIJEDNOST LD  50 VIŠA OD 2 000 MG/KG BEZ 
POTREBE ZA ISPITIVANJEM  
Kriteriji za kategoriju opasnosti 5 omogu ćuju identifikaciju ispitivanih tvari rela ­
tivno niske akutne toksi čnosti koje, me đutim, u odre đenim uvjetima mogu pred ­
stavljati opasnost za osjetljive populacije. Pretpostavlja se da ove tvari imaju oralnu ili dermalnu vrijednost LD
 50 u rasponu od 2 000-5 000 mg/kg ili ekviva ­
lentne vrijednosti za druge puteve primjene. Ispitivane tvari mogu se svrstati u 
kategoriju opasnosti koju definira: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (katego ­
rija 5 u GHS-u) u sljede ćim slučajevima:  
(a) ako na ovu kategoriju upu ćuje bilo koja od ispitnih shema iz Dodatka 2., na 
temelju incidencije smrtnosti;  
(b) ako ve ć postoje pouzdani dokazi koji pokazuju da je LD  50 u okvirima 
vrijednosti koje odgovaraju kategoriji 5; ili ako druge toksikološke studije provedene na životinjama ili toksi čko djelovanje na ljude izazivaju zabrinu ­
tost za ljudsko zdravlje;
 
(c) ako ekstrapolacija, procjena ili prosudba podataka ne opravdavaju svrstavanje 
u višu klasu opasnosti; i  
— ako postoje pouzdani podaci koji ukazuju na zna čajno toksi čko djelo­
vanje na ljude, ili  
— ako se pri ispitivanju do razine vrijednosti kategorije 4, uz oralnu 
primjenu, zabilježi smrtnost, ili  
— ako se stru čnom procjenom pri ispitivanju do razine vrijednosti za kate ­
goriju 4 potvrde zna čajni klini čki znakovi toksi čnosti koji ne uklju čuju 
proljev, piloerekciju (naježenost dlake) ili neuredan izgled, ili  
— ako se stru čnom procjenom, koja se temelji na drugim studijama na 
životinjama, potvrde pouzdane informacije koje ukazuju na mogu ćnost 
značajnog akutnog djelovanja.  
ISPITIVANJA UZ PRIMJENU DOZA IZNAD 2 000 MG/KG  
Iznimno, i samo u slu čajevima kad je to opravdano zbog posebnih regulatornih 
potreba, može se razmotriti mogu ćnost primjene dodatne, više fiksne doze od 
5 000 mg/kg. Prepoznaju ći potrebu da se zaštiti dobrobit životinja, ispitivanje uz 
primjenu doze od 5 000 mg/kg ne preporu ča se i može do ći u obzir samo u 
slučajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja biti 
od neposrednog zna čaja za zaštitu ljudskog zdravlja ili zdravlja životinja (9).  
Inicijalna studija  
Pravila prema kojima se primjenjuje sekvencijski postupak prikazan u Dodatku 1. 
proširuju se kako bi obuhvatila i dozu od 5 000 mg/kg. Prema tome, kad se u 
inicijalnoj studiji primjenjuje po četna doza od 5 000 mg/kg, ishod A (smrt) 
nalaže ispitivanje još jedne životinje na dozu od 2 000 mg/kg; u slu čaju 
ishoda B i C (o čita toksičnost ili nema toksi čnosti) dozvoljeno je kao po četnu 
dozu u glavnoj studiji primijeniti dozu od 5 000 mg/kg. Isto tako, ako se primje ­
njuje početna doza razli čita od 5 000 mg/kg, u slu čaju ishoda B ili C pri dozi od 
2 000 mg/kg ispitivanje se nastavlja do 5 000 mg/kg; ishod A kod kasnije primijene doze od 5 000 mg/kg nalaže da po četna doza u glavnoj studiji bude 
2 000 mg/kg, ishod B ili C nalaže po četnu dozu od 5 000 mg/kg u glavnoj 
studiji.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 195
 
Glavna studija  
Pravila prema kojima se primjenjuje sekvencijski postupak iz Dodatka 2., proši ­
ruju se kako bi obuhvatila i dozu od 5 000 mg/kg. Prema tome, kad se u glavnom pokusu koristi po četna doza od 5 000 mg/kg, ishod A ( ≥ 2 smrti) 
nalaže ispitivanje još jedne skupine životinja na dozu od 2 000 mg/kg; u 
slučaju ishoda B (evidentna toksi čnost i/ili ≤ 1 smrt) ili C (nema toksi čnosti) 
tvar se ne klasificira prema GHS-u. Isto tako, ako se primjenjuje po četna doza 
različita od 5 000 mg/kg, u slu čaju ishoda C pri dozi od 2 000 mg/kg ispitivanje 
se nastavlja do 5 000 mg/kg; u slu čaju ishoda A kod primijene doze od 
5 000 mg/kg tvar se klasificira u GHS kategoriju 5, a u slu čaju ishoda B ili C 
tvar se ne klasificira prema GHS-u.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 196
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 197
 ▼B 
Dodatak 4.  
ISPITNA METODA B.1. bis  
Smjernice za klasifikaciju prema shemi EU-a koju treba primjenjivati tijekom prijelaznog razdoblja do potpune provedbe Globalno  usklađenog klasifikacijskog sustava (GHS) (uzeto iz 
referentnog dokumenta (8))

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 198
 ▼B

 
B.1 tris.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA 
UTVRĐIVANJA KLASA AKUTNE TOKSI ČNOSTI  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 423 (2001.)  
1.1. UVOD  
Metoda utvr đivanja klasa akutne oralne toksi čnosti (1) prikazana u 
ovom ispitivanju fazni je postupak u kojemu se u svakoj fazi koriste 
po tri životinje istog spola. Za utvr đivanje toksi čnosti ispitivane tvari 
u prosjeku mogu biti potrebne dvije do četiri faze, što ovisi o tome 
kad će kod životinje nastupiti smrt i/ili stanje umiranja. Ovaj je 
postupak ponovljiv, za njega se koristi vrlo mali broj životinja i 
omogućuje rangiranje tvari na sli čan način kao i ostale metode ispi ­
tivanja akutne toksi čnosti. Metoda utvr đivanja klasa akutne toksi č­
nosti temelji se na biometrijskim procjenama (2)(3)(4)(5) s fiksnim dozama, koje su na primjeren na čin odvojene kako bi se omogu ćilo 
rangiranje tvari u svrhu klasifikacije i procjene opasnosti. Nakon 
usvajanja 1996. provedena je obimna validacija ove metode  in vivo  
uz korištenje usporednih podataka o LD
 50 dobivenih iz literature, 
kako na nacionalnoj (6) tako i na me đunarodnoj razini (7).  
Upute za odabir najprimjerenije ispitne metode za odre đenu svrhu 
mogu se prona ći u Smjernicama za ispitivanje akutne oralne toksi č­
nosti (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (8). Taj dokument sadrži i dodatne informacije o provo đenju i tuma čenju 
rezultata ispitne metode B.1tris.
 
Ispitivane tvari ne treba primjenjivati u dozama za koje je poznato da 
uzrokuju znatnu bol i stres zbog nagrizaju ćeg i izrazito nadražuju ćeg 
djelovanja. Životinje koje su na umoru, odnosno životinje koje o čito 
trpe jake bolove ili pokazuju znakove jakog i dugotrajnog stresa treba humano usmrtiti, a pri tuma čenju rezultata ispitivanja tretirati 
jednako kao i životinje koje su uginule tijekom ispitivanja. Kriteriji 
za donošenje odluke o usmr ćivanju životinja koje su na umoru ili 
jako trpe i upute o prepoznavanju predvidive ili neminovne smrti, predmet su zasebnog dokumenta sa smjernicama (9).
 
U metodi se koriste unaprijed odre đene doze, a rezultati omogu ćuju 
da se tvar rangira i klasificira prema Globalnom uskla đenom sustavu 
za razvrstavanje kemikalija koje uzrokuju akutnu toksi čnost (10).  
U načelu ova metoda nije predvi đena za to čno izračunavanje LD  50 , 
ali ona omogu ćuje utvrđivanje definiranog raspona izloženosti kod 
kojega se o čekuje smrtnost, budu ći da smrt odre đenog broja životinja 
još uvijek predstavlja glavnu završnu to čku ovog ispitivanja. Metoda 
dozvoljava utvr đivanje vrijednosti LD  50 samo u slu čajevima kad 
najmanje dvije doze rezultiraju smrtnoš ću višom od 0 % i nižom 
od 100 %. Upotreba odabranih unaprijed utvr đenih doza, neovisno o 
ispitnoj tvari, uz klasifikaciju koja je izri čito povezana s brojem 
životinja opažanih u razli čitim stanjima pruža laboratorijima bolje 
mogućnosti u pogledu ponovljivosti i dosljednosti pri izvještavanju.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 199
 
Prije početka studije ispitni laboratorij mora razmotriti sve informa ­
cije o ispitivanoj tvari. Te informacije uklju čuju identitet i kemijsku 
strukturu tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate bilo kojih drugih  in vivo  ili in vitro  ispitivanja toksi čnosti te tvari, toksi ­
kološke podatke o strukturno srodnim tvarima, kao i predvi đenu 
primjenu tvari. Te su informacije neophodne kako bi se sve zainte ­
resirane strane uvjerile da je predmetno ispitivanje relevantno za zaštitu ljudskog zdravlja i da će pomoći pri odabiru najprikladnije 
početne doze.
 
1.2. DEFINICIJE  
Akutna oralna toksi čnost:  odnosi se na štetne u činke koji se 
javljaju nakon primjene prve doze ispitivane tvari ili nakon nekoliko doza danih unutar 24 sata.
 
Odgođena smrt:  znači da životinja ne ugine niti se čini da je na 
umoru unutar 48 sati, ve ć ugine kasnije tijekom 14-dnevnog 
razdoblja opažanja.  
Doza:  količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava 
kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg).  
GHS:  Globalno uskla đeni sustav klasifikacije kemijskih tvari i 
mješavina. Zajedni čki projekt OECD-a (ljudsko zdravlje i okoliš), 
UN-ovog Odbora stru čnjaka za prijevoz opasnih tereta (fizikalno- 
kemijska svojstva), te ILO-a (obavještavanje o opasnostima), koor ­
diniran Me đuorganizacijskim programom za pravilno rukovanje 
kemikalijama (IOMC).  
Neminovna smrt:  kad se stanje umiranja ili smrt životinje o čekuje 
prije idućeg planiranog vremena opažanja. Simptomi koji ukazuju na 
ovo stanje kod glodavaca uklju čuju grčeve, bočni položaj, ležanje i 
drhtavicu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmr ­ 
ćivanje (9)).  
LD 50 (srednja smrtonosna doza):  statistički određena jednokratna 
doza tvari za koju se o čekuje da će kod 50 posto životinja izazvati 
smrt ako se primjeni oralnim putem. Vrijednost LD  50 izražava se kao 
masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (mg/kg).  
Granična doza:  odnosi se na gornju grani čnu dozu koja se primje ­
njuje u ispitivanju (2 000 ili 5 000 mg/kg).  
Stanje umiranja:  kad je životinja na umoru, odnosno kad ne može 
preživjeti čak ni ako se tretira (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice 
za humano usmr ćivanje (9)).  
Predvidiva smrt:  prisutnost klini čkih znakova koji ukazuju na smrt 
koja će nastupiti u znanom budu ćem vremenu prije planiranog kraja 
pokusa, na primjer: nemogu ćnost životinje da dosegne vodu ili 
hranu. (Za više pojedinosti vidjeti Smjernice za humano usmr ćivanje 
(9)). ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 200
 
1.3. NA ČELO ISPITIVANJA  
Načelo ovog ispitivanja je da se na temelju faznog postupka uz 
upotrebu minimalnog broja životinja u svakoj fazi dobije dovoljna količina informacija o akutnoj toksi čnosti ispitivane tvari koja će 
omogućiti klasifikaciju te tvari. Tvar se oralno daje skupini pokusnih 
životinja u jednoj od utvr đenih doza. Tvar se ispituje uz primjenu 
faznog postupka kod kojega se u svakoj fazi koriste po tri životinje istog spola (obi čno ženke). Izostanak ili prisutnost smrtnosti životinja 
na koje je doza bila primijenjena u jednoj fazi odredit će sljedeću 
fazu, npr.:
 
— daljnje ispitivanje nije potrebno,  
— primjena jednake doze na sljede će tri životinje,  
— primjena sljede će više ili sljede će niže doze na sljede će tri živo ­
tinje.  
Pojedinosti o ispitnom postupku navedene su u Dodatku 1. Ova 
metoda omogu ćuje procjenu u svrhu klasifikacije ispitivane tvari u 
jednu od klasa toksi čnosti utvr đenih na temelju fiksne grani čne 
vrijednosti LD  50 . 
1.4. OPIS METODE  
1.4.1.  Odabir životinjske vrste  
Najprimjerenija vrsta glodavaca je štakor, iako se mogu koristiti i 
neke druge vrste glodavaca. Uobi čajeno je koristiti ženke (9). Razlog 
je tome što je pretraživanjem literature o uobi čajenim testovima u 
kojima se primjenjuje LD  50 utvrđeno da razlike u osjetljivosti 
spolova gotovo da i nema, ali u slu čajevima gdje su razlike opažene, 
ženke općenito pokazuju nešto ve ću osjetljivost (11). Me đutim, ako 
saznanja o toksikološkim ili toksikokineti čkim svojstvima strukturno 
srodnih kemikalija ukazuju na to da bi osjetljiviji mogli biti mužjaci, treba koristiti mužjake. Ako se ispitivanja provode na mužjacima, 
treba navesti razloge za njihovo korištenje.
 
U ispitivanjima treba koristiti zdrave mlade odrasle primjerke živo ­
tinja koje pripadaju naj češće korištenim sojevima laboratorijskih 
životinja. Treba koristiti ženke koje nisu imale potomstvo i nisu 
gravidne. Na po četku primjene doza svaka životinja treba biti 
između 8 i 12 tjedana starosti, a njezina masa treba biti u okviru 
± 20 % srednje mase svih prethodno testiranih životinja.  
1.4.2.  Uvjeti držanja i hranjenja životinja  
Temperatura prostorije za držanje pokusnih životinja treba biti 22 °C 
(± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti barem 30 % i po mogućnosti ne prelaziti 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, 
treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti 
umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati 
mraka. Što se ti če hranjenja, može se primjenjivati standardna 
hrana za laboratorijske životinje uz neograni čene količine pitke 
vode. Životinje se mogu u kavezima držati skupno, razvrstane 
prema primijenjenim dozama, ali broj životinja koji se drži u 
jednom kavezu ne smije ometati nesmetano opažanje svake životinje.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 201
 
1.4.3.  Priprema životinja  
Životinje se nasumce odabiru, ozna čavaju, kako bi se mogle pojedi ­
načno razlikovati, i drže u kavezima barem 5 dana prije po četka 
primjene doza da bi se prilagodile laboratorijskim uvjetima.  
1.4.4.  Priprema doza  
Općenito, ispitivane tvari treba primjenjivati u rasponu doza 
jednakog volumena, a mijenjati treba koncentraciju pripravka koji 
se dozira. Me đutim, kada treba testirati neki teku ći krajnji proizvod 
ili mješavinu, za kasniju ocjenu opasnosti ispitivane tvari relevantnija može biti primjena te tvari u nerazrije đenom obliku, tj. pri stalnoj 
koncentraciji, a neka regulatorna tijela takvu primjenu postavljaju 
kao zahtjev. U svakom slu čaju, kod primjene se ne smije prekora čiti 
maksimalni volumen doze. Maksimalni volumen teku ćine koji se 
smije odjednom primijeniti ovisi o veli čini pokusne životinje. Kod 
glodavaca, taj volumen obi čno ne smije biti ve ći od 1 ml/100 g mase 
životinje: me đutim, u slu čaju primjene vodenih otopina može do ći u 
obzir i doza od 2 ml/100 g mase životinje. Što se ti če formulacije 
pripravka koji se dozira, gdje god je mogu će preporu ča se upotreba 
vodene otopine/suspenzije/emulzije, a tek onda, po prioritetnom 
redoslijedu, uljne otopine/suspenzije/emulzije (npr. kukuruzno ulje) ili otopine za koje se koriste drugi nosa či. Za sve nosa če, osim vode, 
moraju biti poznata njihova toksikološka svojstva. Doze se moraju 
pripremati neposredno prije primjene, osim ako se radi o pripravku 
za koji se zna da će tijekom upotrebe zadržati prihvatljivu stabilnost.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar primjenjuje u jednoj dozi oralnom intubacijom 
pomoću želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile. U 
izvanrednim okolnostima, kad jednokratna primjena doze nije moguća, jedna se doza može dati i razdijeljena u nekoliko manjih 
dijelova tijekom vremenskog razdoblja ne dužeg od 24 sata.
 
Prije primjene doza životinje trebaju postiti (npr. u slu čaju štakora, 
hranu, ali ne i vodu treba uskratiti preko no ći; kod miševa, hranu, ali 
ne i vodu treba uskratiti na 3-4 sata). Nakon posta životinje treba izvagati te primijeniti ispitivanu tvar. Nakon što se tvar primijeni, 
hrana se može uskratiti sljede ća 3-4 sata kod štakora ili 1-2 sata kod 
miševa. U slu čajevima kad se doza primjenjuje u nekoliko manjih 
dijelova kroz odre đeno vremensko razdoblje, ovisno o dužini tog 
razdoblja možda će biti potrebno životinjama dati hranu i vodu.
 
1.5.2.  Broj životinja i visina doza  
U svakoj se fazi koriste po tri životinje. Doza koja će se koristiti kao 
početna doza odabire se izme đu četiri fiksne doze od 5, 50, 300 i 
2 000 mg/kg tjelesne mase. Po četna doza treba biti ona za koju je 
najvjerojatnije da će prouzro čiti smrtnost nekih od životinja na koje 
se primijeni. Dijagrami toka iz Dodatka 1. opisuju postupak koji treba provesti za svaku od po četnih doza. Osim toga, u Dodatku 
4. dane su smjernice za klasifikaciju u sustavu EU-a, dok se ne 
počne primjenjivati novi GHS.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 202
 
Kad se iz raspoloživih informacija može zaklju čiti da smrtnost pri 
najvišoj po četnoj dozi (2 000 mg/kg tjelesne mase) nije vjerojatna, 
treba obaviti grani čni test. Ako o tvari koju treba ispitati nema 
nikakvih informacija, radi dobrobiti životinja preporu ča se primjena 
početne doze od 300 mg/kg tjelesne mase.  
Vremenski interval izme đu tretiranja dviju skupina ovisi o nastupu, 
trajanju i ja čini znakova toksi čnosti. Tretiranje životinja sljede ćom 
dozom treba odgoditi dok nije sigurno preživljavanje životinja koje su primile prethodnu dozu.
 
Iznimno, i samo u slu čajevima kad je to opravdavano posebnim 
regulatornim potrebama, može se razmotriti primjena dodatne, više 
fiksne doze od 5 000 mg/kg (vidjeti Dodatak 2). Zbog brige o dobro ­
biti životinja, ispitivanje na životinjama u okviru GHS kategorije 5 (2 000-5 000 mg/kg) ne preporu ča se i može do ći u obzir samo u 
slučajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog 
ispitivanja biti od neposrednog zna čaja za zaštitu ljudskog zdravlja, 
zdravlja životinja, ili za zaštitu okoliša.
 
1.5.3.  Grani čni test  
Granični se test prvenstveno koristi u situacijama kad izvoditelj ispi ­
tivanja ima informacije koje kazuju da ispitivani materijal vjerojatno nije toksi čan, tj. da postaje toksi čan samo iznad regulatornih 
graničnih doza. Informacije o toksi čnosti ispitivanog materijala 
mogu se temeljiti na saznanjima o sli čnim ispitivanim spojevima 
ili sličnim ispitivanim mješavinama ili proizvodima, uzimaju ći u 
obzir identitet i postotak komponenata za koje se zna da su toksi ­
kološki zna čajne. U situacijama kad podataka o toksi čnosti ima malo 
ili ih uop će nema, ili kada se o čekuje da će ispitivani materijal biti 
toksičan, treba obaviti glavni test.
 
Granični test uz primjenu jedne doze od 2 000 mg/kg tjelesne mase 
može se obaviti na šest životinja (po tri životinje u svakoj fazi). 
Iznimno se može obaviti grani čni test uz primjenu jedne doze od 
5 000 mg/kg na tri životinje (vidjeti Dodatak 2.). Ako ispitivana tvar uzrokuje smrt životinje, možda će biti potrebno daljnje ispitivanje sa 
sljedećom nižom dozom.
 
1.6. OPAŽANJA  
Nakon primjene doze životinje se opažaju pojedina čno, barem 
jedanput tijekom prvih 30 minuta, periodi čno tijekom prva 24 sata, 
uz posebnu pozornost tijekom prva 4 sata, a zatim jednom dnevno u 
trajanju od ukupno 14 dana, osim u slu čajevima kada je životinju 
potrebno izlu čiti iz studije i humano usmrtiti zbog njezine dobrobiti 
ili ako se utvrdi smrt životinje. Me đutim, trajanje opažanja ne bi 
smjelo biti strogo odre đeno. Treba ga utvrditi na temelju toksi čkih 
reakcija, po četka i trajanja oporavka i prema potrebi ga se može 
produžiti. Važno je vrijeme pojave i nestajanja prvih znakova toksi č­
nosti, posebno ako postoji tendencija da se znakovi toksi čnosti 
pojave kasnije (12). Svi se rezultati opažanja sustavno bilježe, pri 
čemu se o svakoj životinji vode posebni zapisi.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 203
 
Dodatna opažanja bit će potrebna ako životinje nastave pokazivati 
znakove toksi čnosti. Treba opažati promjene na koži i dlaci, o čima i 
sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živ čanom sustavu, kao i promjene u somatomotori čkoj 
aktivnosti i ponašanju. S posebnom pozornoš ću treba opažati drhta ­
vicu, grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Treba pošto ­
vati načela i kriterije navedene u Smjernicama za humano usmr ­ 
ćivanje (9). Životinje za koje se utvrdi da su u stanju umiranja i 
životinje koje pokazuju da trpe jake bolove ili dugotrajni stres treba 
humano usmrtiti. U slu čajevima kad se životinje usmr ćuje iz 
humanih razloga ili se utvrdi njihova smrt, vrijeme smrti treba zabi ­
lježiti što to čnije.
 
1.6.1.  Tjelesna masa  
Pojedinačnu masu životinja treba utvrditi neposredno prije primjene 
ispitivane tvari, a nakon toga najmanje jednom tjedno. Promjene u masi treba izra čunati i zabilježiti. Na kraju ispitivanja preživjele se 
životinje izvažu i potom humano usmrte.
 
1.6.2.  Patologija  
Sve pokusne životinje (uklju čujući i one koje uginu za vrijeme ispi ­
tivanja ili ih se izlu či iz studije zbog njihove dobrobiti) treba 
podvrgnuti obdukciji. Za svaku životinju posebno treba zabilježiti sve veće patološke promjene. Treba razmotriti i mogu ćnost obav ­
ljanja mikroskopskog pregleda organa životinja koje su nakon 
primjene prve doze preživjele 24 ili više sati i na kojima su obduk ­
cijom utvr đene velike patološke promjene, budu ći da se na taj na čin 
mogu prikupiti korisne informacije.
 
2. PODACI  
Treba prikupiti podatke za svaku pojedina čnu životinju. Osim toga, 
sve podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku 
ispitnu skupinu biti naveden broj upotrijebljenih životinja, broj živo ­
tinja koje su pokazale znakove toksi čnosti, broj životinja kod kojih je 
tijekom ispitivanja utvr đena smrt ili su bile usmr ćene iz humanih 
razloga, vrijeme smrti svake pojedina čne životinje, te opis i 
vremenski tijek toksi čkih učinaka i reverzibilnosti, kao i nalazi 
obdukcije.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. Izvješ će o ispitivanju  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije, prema 
potrebi:  
ispitivana tvar:  
— fizikalni oblik, čistoća i, tamo gdje je relevantno, 
fizikalno-kemijska svojstva (uklju čujući izomerizaciju),  
— identifikacijski podaci, uklju čujući CAS broj.  
Nosač (prema potrebi):  
— obrazloženje za odabir nosa ča, ako se ne radi o vodi.  
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 204
 
— mikrobiološki status životinje, ako je poznat,  
— broj, starost i spol životinja (uklju čujući, prema potrebi, razloge 
za korištenje mužjaka umjesto ženki),  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari, uklju čujući pojedinosti 
o fizikalnom obliku materijala koji se primjenjivao,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari koji uklju čuju volumene 
doza i vrijeme doziranja,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući pojedinosti o 
vrsti i izvoru vode),  
— obrazloženje za odabir po četne doze.  
Rezultati:  
— tablični prikaz podataka o reakcijama i visini doza za svaku 
životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti, 
uključujući smrtnost, te priroda, ja čina i trajanje toksi čkog učin­
ka), 
— tablični prikaz tjelesne mase i promjena u tjelesnoj masi,  
— masa pojedina čnih životinja na dan primjene doze, zatim u 
tjednim intervalima, te u vrijeme smrti ili usmr ćivanja,  
— datum i vrijeme smrti, ako do nje do đe prije planiranog usmr ­ 
ćivanja,  
— vrijeme pojavljivanja znakova toksi čnosti i jesu li ti znakovi bili 
reverzibilni kod svake životinje,  
— nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju, ako su 
dostupni.  
Diskusija i tuma čenje rezultata.  
Zaključci. 
4. REFERENCE:  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D (1986) New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., 
Suppl. 31, str. 86.  
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D (1989) 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, str. 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E 
(1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, str. 559-610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, str. 729- 734.
 
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, str. 129- 
134. 
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
— An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455- 
470. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, str. 659-670.  
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.
 
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19.
 
(10) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, str. 11 [http://web ­
net1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R. L., Cotruvo, J.A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel 
K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J. 
A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, 
Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol 33, str. 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 206
 
Dodatak 1.  
POSTUPAK KOJI TREBA SLIJEDITI ZA SVAKU PO ČETNU DOZU  
OPĆE PRIMJEDBE  
U ispitnim shemama sadržanim u ovom Dodatku prikazan je postupak koji treba 
slijediti za svaku po četnu dozu.  
— Dodatak 1.A: Po četna doza je 5 mg/kg t.m. (tjelesne mase)  
— Dodatak 1.B: Po četna doza je 50 mg/kg t.m.  
— Dodatak 1.C: Po četna doza je 300 mg/kg t.m.  
— Dodatak 1.D: Po četna doza je 2 000 mg/kg t.m.  
Ovisno o broju humano usmr ćenih životinja, slijed postupka ozna čavaju strelice.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 207
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 208
 ▼B 
Dodatak 1.A  
ISPITNI POSTUPAK S PO ČETNOM DOZOM OD 5 MG/KG TJELESNE MASE

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 209
 ▼B 
Dodatak 1.B  
ISPITNI POSTUPAK S PO ČETNOM DOZOM OD 50 MG/KG TJELESNE MASE

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 210
 ▼B 
Dodatak 1.C  
ISPITNI POSTUPAK S PO ČETNOM DOZOM OD 300 MG/KG TJELESNE MASE

 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 211
 ▼B 
Dodatak 1.D  
ISPITNI POSTUPAK S PO ČETNOM DOZOM OD 2 000 MG/KG TJELESNE MASE

 Dodatak 2.  
KRITERIJI ZA KLASIFIKACIJU ISPITIVANIH TVARI ČIJA JE 
OČEKIVANA VRIJEDNOST LD  50 VIŠA OD 2 000 MG/KG, BEZ 
POTREBE ZA ISPITIVANJEM  
Kriteriji za kategoriju opasnosti 5 omogu ćuju identifikaciju ispitivanih tvari rela ­
tivno niske akutne toksi čnosti, koje u odre đenim uvjetima mogu predstavljati 
opasnost za osjetljive populacije. Pretpostavlja se da ove tvari imaju LD  50 
oralno ili dermalno u rasponu od 2 000-5 000 mg/kg ili ekvivalentne doze za 
druge puteve primjene. Ispitivane tvari mogu se svrstati u kategoriju opasnosti 
koju definira: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategorija 5 u GHS-u) u 
sljedećim slučajevima:  
(a) ako na ovu kategoriju upu ćuje bilo koja od ispitnih shema iz Dodatka 2., na 
temelju incidencije smrtnosti;  
(b) ako ve ć postoje pouzdani dokazi koji pokazuju da je LD  50 u okvirima 
vrijednosti koje odgovaraju kategoriji 5; ili ako druge toksikološke studije provedene na životinjama ili toksi čko djelovanje na ljude izazivaju zabrinu ­
tost za ljudsko zdravlje;
 
(c) ako ekstrapolacija, procjena ili prosudba podataka ne opravdavaju svrstavanje 
u višu klasu opasnosti; i  
— ako postoje pouzdani podaci koji ukazuju na zna čajno toksi čko djelo­
vanje na ljude, ili  
— ako se pri ispitivanju do razine vrijednosti kategorije 4, uz oralnu 
primjenu, zabilježi smrtnost, ili  
— ako se stru čnom procjenom pri ispitivanju do razine vrijednosti za kate ­
goriju 4 potvrde zna čajni klini čki znakovi toksi čnosti koji ne uklju čuju 
proljev, piloerekciju (naježenost dlake) ili neuredan izgled, ili  
— ako se stru čnom procjenom, koja se temelji na drugim studijama na 
životinjama, potvrde pouzdane informacije koje ukazuju na mogu ćnost 
značajnog akutnog djelovanja.  
ISPITIVANJE UZ PRIMJENU DOZA IZNAD 2 000 MG/KG  
Prepoznaju ći potrebu da se zaštiti dobrobit životinja, ispitivanje na životinjama u 
okviru vrijednosti kategorije 5 (5 000 mg/kg) ne preporu ča se i može do ći u obzir 
samo u slu čajevima kad postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispiti ­
vanja biti od neposrednog zna čaja za zaštitu ljudskog zdravlja ili zdravlja živo ­
tinja (10). Nikakva druga ispitivanja s višim dozama ne smiju se izvoditi.  
Ako je potrebno ispitivanje doze od 5 000 mg/kg, dovoljna je samo jedna faza 
(tj. tri životinje). Ako prva životinja na koju se primijeni ta doza ugine, ispiti ­
vanje se nastavlja uz primjenu doze od 2 000 mg/kg, u skladu s dijagramima toka iz Dodatka 1. Ako prva životinja preživi, doza se primjenjuje na sljede će dvije 
životinje. Ako ugine samo jedna od tri životinje, pretpostavlja se da je vrijednost 
LD
 50 viša od 5 000 mg/kg. Ako uginu obadvije životinje, ispitivanje se nastavlja 
uz primjenu doze od 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 212
 
Dodatak 3.  
ISPITNA METODA B.1 tris: Smjernice za klasifikaciju prema shemi EU-a koja 
vrijedi tijekom prijelaznog razdoblja do potpune provedbe Globalno uskla đenog 
klasifikacijskog sustava (GHS) (uzeto iz referentnog dokumenta (8))
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 213
 
▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 214
 
▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 215
 
▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 216
 
B.2. AKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 403 (2009.) 
(1). Originalna Smjernica za ispitivanje 403 (TG 403) o akutnoj inhalaciji usvojena je 1981. Ova revidirana ispitna metoda B.2 (kao ekvivalent revi ­
diranom TG 403) osmišljena je da bude fleksibilnija, da smanji uporabu 
životinja te da ispuni regulatorne potrebe. Revidiranu ispitnu metodu karak ­
teriziraju dva tipa ispitivanja: tradicionalni protokol LC
 50 i protokol koncen ­
tracija × vrijeme (C × t). Primarne karakteristike ove ispitne metode jesu 
mogućnost odre đivanja odnosa koncentracije i reakcije koji mogu imati 
posljedice od nesmrtonosnih do smrtonosnih kako bi se odredila srednja smrtonosna koncentracija (LC
 50 ), prag nesmrtonosne koncentracije (npr. 
LC01) i nagib te kako bi se utvrdila mogu ća osjetljivost u odnosu na 
spol. Protokol C × t treba primijeniti u slu čaju specifi čne regulatorne ili 
znanstvene potrebe koja zahtijeva testiranje životinja na dulje vrijeme, npr. u svrhu planiranja reakcije u slu čaju nužde (npr. odre đivanje vrijednosti  Acute 
Exposure Guideline Levels  (AEGL),  Emergency Response Planning 
Guidelines  (ERPG) ili  Acute Exposure Threshold Levels  (AETL)) ili plani ­
ranja iskorištenja površina.
 
2. Smjernice za provo đenje i tuma čenje studija ove ispitne metode mogu se 
pronaći u Smjernici za ispitivanje akutne inhalacijske toksi čnosti (GD 39) (2).  
3. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju 
ovog Poglavlja i u GD 39 (2).  
4. Ova ispitna metoda omogu ćuje karakterizaciju ispitivane kemikalije i kvan ­
titativnu procjenu rizika te omogu ćuje rangiranje i razvrstavanje ispitivanih 
kemikalija u skladu s Uredbom (EZ) br. 1272/2008 (3). GD 39 (2) donosi 
smjernice za odabir prikladne ispitne metode za ispitivanje akutnosti. Kada 
se traži samo informacija o razvrstavanju i ozna čavanju, op ćenito se prepo ­
ručuje poglavlje B.52 ovog Priloga (4) [vidjeti GD 39 (2)]. Ispitna metoda 
B.2 nije specifi čno namijenjena za ispitivanje specijaliziranih materijala, 
poput slabo topljivih izometrijskih ili vlaknastih materijala ili proizvedenih 
nanomaterijala.  
UVODNA RAZMATRANJA  
5. Kako bi se na minimum svela uporaba životinja, prije razmatranja ispiti ­
vanja u skladu s ovom ispitnom metodom ispitni laboratorij u obzir treba 
uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, uklju čujući postojeće 
studije (npr. poglavlje B.52 ovog Priloga (4)) čiji bi podaci opravdali nepro ­
vođenje dodatnih ispitivanja. Informacije koje mogu pomo ći u odabiru 
najprikladnijih vrsta, sojeva, spola, na čina izlaganja i prikladnih ispitnih 
koncentracija obuhva ćaju identitet, kemijsku strukturu te 
fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije; rezultate bilo kakvih ispi ­
tivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo ; očekivanu uporabu i potencijal za 
izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o 
tvarima srodne strukture [vidjeti GD 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 217
 
6. Ispitivanje korozivnih i/ili nadražuju ćih ispitivanih kemikalija u koncentra ­
cijama za koje se o čekuje da će izazvati ozbiljne bolove i/ili patnje treba 
izbjegavati koliko je god mogu će. Potencijal izazivanja korozije/nadraže ­
nosti treba ocijeniti stru čnom procjenom uz primjenu dokaza iz ljudskog i 
životinjskog iskustva (npr . iz ispitivanja uz primjenu ponavljanih doza 
provedenih u koncentracijama koje ne izazivaju koroziju/nadraženost), 
postojećih podataka  in vitro  (npr . iz poglavlja B.40, (5), B.40 bis (6) 
ovog Priloga ili OECD TG 425 (7)), vrijednosti pH, informacija o sli čnim 
tvarima ili drugih podataka koji se odnose na to radi odre đivanja može li se 
odustati od daljnjeg ispitivanja. Za specifi čne regulatorne potrebe (npr. u 
svrhu planiranja za slu čaj nužde) ova se ispitna metoda može upotrijebiti za 
izlaganje životinja tim materijalima jer voditelju istraživanja ili glavnom istraživaču pruža mogu ćnost kontrole odabira ciljanih koncentracija. Me đu­
tim, ciljane koncentracije ne smiju izazvati ozbiljne u činke korozije/nadra ­ 
ženosti nego u činke dovoljne za produljenje krivulje koncentracije i reakcije 
na razine koje postižu regulatorni i znanstveni cilj ispitivanja. Te koncen ­
tracije treba odabrati zasebno u svakom pojedina čnom slučaju i treba pružiti 
obrazloženje za odabir koncentracije [vidjeti GD 39 (2)].
 
NAČELO ISPITIVANJA  
7. Ova revidirana ispitna metoda B.2 osmišljena je da postigne dovoljno infor ­
macija o akutnoj toksi čnosti ispitivane kemikalije kako bi se omogu ćilo 
njezino razvrstavanje te kako bi se pružili podaci o smrtonosnom djelovanju 
(npr. LC  50, LC 01 i nagib) za jedan od oba spola, kao što je potrebno za 
kvantitativnu procjenu rizika. Ova ispitna metoda nudi dvije metode. Prva je metoda tradicionalni protokol u kojem se skupine životinja izlažu grani čnoj 
koncentraciji (grani čni test) ili seriji koncentracija u postupku korak po 
korak u prethodno odre đenom trajanju od obi čno 4 sata. Ostala trajanja 
izlaganja mogu se primijeniti u specifi čne regulatorne svrhe. Druga je 
metoda protokol (C × t) u kojem se skupine životinja izlažu jednoj (grani čna 
koncentracija) ili nizu višestrukih koncentracija tijekom više vremenskih 
razdoblja.
 
8. Životinje koje ugibaju ili pokazuju izrazite znakove stresa i boli treba 
humano usmrtiti i u tuma čenju rezultata ispitivanja tretirati jednako kao i 
životinje uginule pri ispitivanju. Kriteriji za donošenje odluke o usmr ćivanju 
životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijete će smrti predmet su Smjernice za humano usmr ćivanje 
br. 19 OECD-a (8).
 
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
9. Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle životinje sojeva koji se obi čno 
koriste u laboratorijima. Preferirana vrsta je štakor, a u slu čaju uporabe 
drugih vrsta treba dati obrazloženje.  
Priprema životinja  
10. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. 
Na dan izlaganja životinje moraju biti mlade odrasle jedinke izme đu 8 i 12 
tjedana starosti, srednje vrijednosti tjelesne mase od ± 20 % za svaki spol 
bilo koje prethodno izložene životinje iste dobi. Životinje se odabiru nasu ­
mice i ozna čavaju radi pojedina čne identifikacije. Životinje se drže u kave ­
zima najmanje 5 dana prije po četka ispitivanja kako bi im se omogu ćila 
aklimatizacija na laboratorijske uvjete. Životinje tako đer treba aklimatizirati 
na ispitnu aparaturu kratko vrijeme prije ispitivanja jer će se tako smanjiti 
stres izazvan uvo đenjem u novu okolinu.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 218
 
Uzgoj životinja  
11. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 
22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 70 % iako to možda ne će biti mogu će kad se kao 
nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje op ćenito treba 
smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos 
životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputa ­
vaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizi čki, 
toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke 
krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog 
minutnog volumena. Ako su dostupni generi čki podaci koji pokazuju da se 
takve promjene ne doga đaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna 
prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izlo ­ 
žene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedina čno kako bi se 
spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u 
istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laborato ­
rijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograni čenom 
zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati 
svjetla i 12 sati tame.
 
Komore za inhalaciju  
12. Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemi ­
kalije i cilj ispitivanja. Prednost se daje izlaganju samo nosom (koje uklju ­ 
čuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom op ćenito 
se daje prednost za ispitivanja teku ćih ili krutih aerosola te para koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješ ću 
o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slu čaju primjene 
komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije prema ­ 
šiti 5 % volumena komore. Na čela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim 
tijelom te njihove specifi čne prednosti i nedostaci opisani su u GD 39 (2).
 
UVJETI IZLAGANJA  
Primjena koncentracija  
13. Izlaganje samo nosom kod štakora može trajati do 6 sati. Ako se miševi 
izlažu samo nosom, izlaganje op ćenito ne smije biti dulje od 4 sata. Ako su 
potrebna istraživanja duljeg trajanja, treba dati obrazloženje [vidjeti GD 39 (2)]. Životinje izložene aerosolu u komorama za izlaganje čitavim tijelom 
treba smjestiti pojedina čno kako bi se sprije čilo gutanje ispitivane kemikalije 
zbog njegovanja životinja u istom kavezu. Tijekom izlaganja treba obustaviti hranjenje. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
 
14. Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili 
njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o 
fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentra ­
ciji i/ili fizikalnom obliku koji je obi čno prisutan tijekom manipulacije 
ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reak ­
tivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba 
paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 219
 
Distribucija veli čine čestica  
15. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogu ćilo izlaganje svih rele ­
vantnih podru čja respiratornog trakta, preporu čuje se aerosol srednjeg aero ­
dinamičkog promjera čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 4 μm s geome ­
trijskom standardnom devijacijom ( σ g ) u rasponu od 1,5 do 3,0 (2) (9) (10). 
Iako treba uložiti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se isti ne mogu posti ći, treba dati stru čno mišljenje. Primjerice, isparine metala mogu 
biti manje od tog standarda, a čestice, vlakna i higroskopni materijali pod 
nabojem ( čija se veli čina povećava u vlažnom okolišu respiratornog trakta) 
mogu premašiti taj standard.
 
Priprema ispitivane kemikalije u nosa ču 
16. Za stvaranje odgovaraju će koncentracije i veli čine čestica ispitivane kemi ­
kalije u atmosferi može se upotrijebiti nosa č. U pravilu se prednost daje 
vodi. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehani čkim procesima 
kako bi se postigla potrebna distribucija veli čine čestica, no treba paziti 
da se ispitivana kemikalija ne rastavi niti promijeni. U slu čajevima u 
kojima se smatra da mehani čki procesi mijenjaju ispitivanu kemikaliju 
(npr. ekstremne temperature uslijed prekomjernog mljevenja zbog trenja) treba analiti čki provjeriti sastav ispitivane kemikalije. Treba primijeniti 
dovoljnu razinu opreza da se ne bi kontaminirala ispitivana kemikalija. 
Nije nužno ispitivati nedrobive granulirane materijale koji su namjerno oblikovani tako da se ne mogu inhalirati. Treba primijeniti test atricijom kako bi se dokazalo da se tijekom rukovanja granuliranim materijalom ne 
stvaraju čestice koje se mogu udahnuti. Ako se tijekom testa atricijom stvore 
tvari koje se mogu udahnuti, treba provesti test inhalacijske toksi čnosti.
 
Kontrolne životinje  
17. Nije potrebna paralelna negativna skupina (zrak). U slu čaju primjene drugog 
nosača osim vode pri stvaranju ispitne atmosfere kontrolna skupina nosa ča 
treba se primijeniti samo ako nisu dostupni podaci o povijesnoj inhalacijskoj toksičnosti. Ako ispitivanje toksi čnosti ispitivane kemikalije formulirane u 
nosaču ne pokaže nikakvu toksi čnost, znači da nosač nije toksi čan u ispitnoj 
koncentraciji te stoga nema potrebe za kontrolnim nosa čem.
 
PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA  
Protok zraka u komori  
18. Protok zraka u komori treba pažljivo kontrolirati, neprestano pratiti te bilje ­ 
žiti najmanje jedanput svakog sata tijekom svakog izlaganja. Pra ćenje 
ispitne koncentracije (ili stabilnosti) u atmosferi sastavno je mjerenje svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih rele ­
vantnih parametara za stvaranje dinami čke atmosfere. Treba posebno obratiti 
pozornost na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom u slu čajevima gdje je protok zraka kroz sustav za izlaganje 
neadekvatan za pružanje dinami čkog protoka atmosfere ispitivane kemika ­
lije. Postoje propisane metodologije koje se mogu primijeniti kako bi se 
pokazalo da u odabranim uvjetima rada ne dolazi do ponovnog udisanja (2) (11). Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja 
da se takvi standardi ne mogu posti ći, treba mjeriti koncentraciju kisika i 
ugljikova dioksida.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 220
 
Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori  
19. Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost 
zraka u zoni gdje životinje dišu, za izlaganja samo nosom i čitavim tijekom, 
treba pratiti i bilježiti najmanje tri puta tijekom izlaganja do 4 sata te 
jedanput svakoga sata tijekom kra ćih izlaganja. Relativnu vlažnost zraka 
trebalo bi idealno održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemoguće (npr. u slu čaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo 
zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomo ću ispitne metode.
 
Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija  
20. Kad god je to mogu će, treba izra čunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u 
komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena s ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izla ­
ganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije 
daje uvid u u činkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može 
upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
 
Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija  
21. Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije u zoni udisanja 
životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može se dobiti speci ­
fičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim ili kemijskim 
reaktivnim metodama te analiti čkom karakterizacijom nakon toga) ili nespe ­
cifičnim metodama, poput filtriranja u gravimetrijskoj analizi. Primjena 
gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom 
komponentom u prahu ili aerosole teku ćina niskog stupnja hlapljivosti i 
treba je podržati odgovaraju ćom preliminarnom karakterizacijom speci ­
fičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti 
i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni 
analitički podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi 
zrakom sli čan početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, 
potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada 
se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, 
pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze. U izvješ ću o ispitivanju treba 
navesti ciljanu, nazivnu i stvarnu koncentraciju, ali samo se stvarne koncen ­
tracije koriste u statisti čkim analizama za izra čun vrijednosti smrtonosne 
koncentracije.
 
22. Ako je mogu će, treba upotrijebiti jednu šaržu ispitivane kemikalije, a ispi ­
tivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova 
čistoća, homogenost i stabilnost. Prije po četka ispitivanja treba odrediti svoj ­
stva ispitivane kemikalije, uklju čujući njezinu čistoću i, ako je tehni čki 
izvedivo, identitet te koli čine identificiranih kontaminiraju ćih tvari i ne či­
stoća. To se može pokazati sljede ćim podacima, ali nije ograni čeno na njih: 
vrijeme zadržavanja i relativno vršno podru čje, molekulska masa iz spek ­
troskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sli čnih procjena. 
Iako odre đivanje identiteta ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog 
laboratorija, za laboratorij može biti mudro, barem u ograni čenim okvirima, 
da potvrdi naru čiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalnu prirodu itd.).  
23. Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je to mogu će i 
pratiti neprestano i/ili na mahove, ovisno o metodi analize. Ako se primje ­
njuje uzorkovanje na mahove, uzorke atmosfere u komori treba uzimati najmanje dvaput tijekom ispitivanja od četiri sata. Ako to nije izvedivo 
zbog ograni čenog protoka zraka ili niskih koncentracija, tijekom čitavog 
razdoblja izlaganja može se uzeti jedan uzorak. Ako se pojave ozna čene 
fluktuacije uzorak po uzorak, sljede će ispitne koncentracije moraju
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 221
 
upotrijebiti četiri uzorka po izlaganju. Pojedina čni uzorci koncentracije u 
komori ne smiju od srednje koncentracije odstupati za više od ± 10 % za 
plinove i pare ili ± 20 % za teku ćine ili krute aerosole. Treba izra čunati i 
zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t  95 ). Trajanje izlaganja 
proteže se kroz vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije, a to uzima u obzir 
vrijeme potrebno za postizanje t  95 . Smjernica za procjenu t  95 može se 
pronaći u GD 39 (2).  
24. Za vrlo složene smjese koje se sastoje od plinova/para i aerosole (npr. 
zapaljive atmosfere i ispitivane kemikalije izba čene iz namjenskih proizvo ­
da/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati druk čije u 
komori za inhalaciju tako da treba odabrati najmanje jedan indikator (ana ­
liziranu tvar), obi čno glavnu aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i 
aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analiti čkoj 
koncentraciji smjese, a ne samo za aktivnu tvar ili komponentu (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se prona ći u 
GD 39 (2).
 
Ispitivana kemikalija: Distribucija veli čine čestica  
25. Distribuciju veli čine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje dvaput 
tijekom svakog izlaganja od 4 sata uporabom kaskadnog impaktora ili alter ­
nativnog instrumenta, poput ure đaja za aerodinami čku analizu veli čine 
čestica. Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impak ­
torom ili alternativnim instrumentom ekvivalentni, u cijelom se istraživanju 
može upotrebljavati alternativni instrument. Drugi ure đaj, poput gravimetrij ­
skog filtra ili ure đaja za sudaranje/ure đaja za mjerenje mjehuri ća plina, treba 
upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila u čin­
kovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena 
analizom veli čine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije 
mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalent ­
nost može dokazati u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja 
mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja 
kako bi se na minimum sveli nepotpuni podaci koji mogu dovesti do potrebe za ponovnim izlaganjem. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti 
za pare ako postoji ikakva mogu ćnost da bi kondenzacijom pare mogao 
nastati aerosol ili ako čestice detektirane u atmosferi pare imaju potencijal 
za miješane faze (vidjeti stavak 15.).
 
POSTUPAK  
26. U nastavku su opisane dvije vrste istraživanja: tradicionalni protokol i 
protokol C × t. Oba protokola mogu uklju čivati preliminarno istraživanje, 
glavno istraživanje i/ili grani čni test (tradicionalni protokol) ili ispitivanje na 
graničnoj koncentraciji (C × t). Ako se za jedan od spolova zna da je 
osjetljiviji, voditelj istraživanja može odabrati da se ta istraživanja provedu samo na osjetljivom spolu. Ako izlaganju samo nosom nisu izlo ­ 
ženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanja izlaganja treba prila ­
goditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. Prije po četka 
u obzir treba uzeti sve dostupne podatke kako bi se na minimum svela primjena životinja. Primjerice, podaci dobiveni primjenom Poglavlja B.52 
ovog Priloga (4) mogu eliminirati potrebu za preliminarnim istraživanjem te 
također mogu pokazati je li jedan od spolova osjetljiviji [vidjeti GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 222
 
TRADICIONALNI PROTOKOL  
Općenita razmatranja: Tradicionalni protokol  
27. U tradicionalnom istraživanju skupine životinja izlažu se ispitivanoj kemikaliji 
na određeno vremensko razdoblje (op ćenito 4 sata) u komori za izlaganje 
samo nosom ili čitavim tijelom. Životinje se izlažu grani čnoj koncentraciji 
(granični test) ili najmanje trima koncentracijama u postupku korak po korak 
(glavno istraživanje). Preliminarno istraživanje može prethoditi glavnom istra ­ 
živanju, osim ako ve ć ne postoje neke informacije o ispitivanoj kemikaliji, 
poput prethodno provedenog istraživanja B.52 [vidjeti GD 39 (2)].  
Preliminarno istraživanje: Tradicionalni protokol  
28. Preliminarno istraživanje primjenjuje se kako bi se procijenila snaga ispiti ­
vane kemikalije, identificirale razlike me đu spolovima po pitanju osjetlji ­
vosti te kako bi se pomoglo pri odabiru razina koncentracije pri izlaganju za glavno istraživanje ili grani čni test. Pri odabiru razina koncentracije za 
preliminarno istraživanje treba upotrijebiti sve dostupne informacije, uklju ­ 
čujući dostupne podatke o (Q)SAR i podatke za sli čne kemikalije. Na svakoj 
koncentraciji treba izložiti najviše tri mužjaka i tri ženke (potrebne su tri životinje svakog spola kako bi se odredila razlika me đu spolovima). Prelimi ­
narno istraživanje može obuhva ćati samo jednu koncentraciju, ali, ako je 
potrebno, može se ispitivati više koncentracija. Preliminarno istraživanje ne smije obuhva ćati ispitivanje tolikog broja životinja i koncentracija da nali ­
kuje glavnom istraživanju. Umjesto preliminarnog istraživanja može se 
upotrijebiti prethodno provedeno istraživanje B.52 (4) [vidjeti GD 39 (2)].
 
Granični test: Tradicionalni protokol  
29. Grani čni test primjenjuje se kada se za ispitivanu kemikaliju zna ili o čekuje da je 
zapravo netoksi čna, tj. izaziva toksi čne reakcije samo iznad regulatorne grani čne 
koncentracije. U grani čnom testu jedna skupina od tri mužjaka i tri ženke izlaže 
se ispitivanoj kemikaliji na grani čnoj koncentraciji. Informacije o toksi čnosti 
ispitivane kemikalije mogu se dobiti iz znanja o sli čnim ispitivanim kemikali ­
jama, uzimaju ći u obzir identitet i postotak komponenata za koje se zna da su od 
toksikološke važnosti. U takvim situacijama, u kojima postoji malo informacija 
o njezinoj toksi čnosti ili ih uop će nema ili se za ispitivanu kemikaliju o čekuje da 
je toksična, treba provesti glavno istraživanje.  
30. Odabir grani čnih koncentracija obi čno ovisi o regulatornim zahtjevima. Ako 
se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, grani čne koncentracije za 
plinove, pare i aerosole iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l (ili maksimalna koncentracija koja se može posti ći) (3). Tehni čki može biti 
zahtjevno proizvesti grani čne koncentracije nekih ispitivanih kemikalija, 
posebno para i aerosola. Kada se ispituje aerosol, primarni cilj treba biti 
postizanje veli čine čestica koja se može udahnuti (MMAD 1 - 4 μm). To je 
s većinom ispitivanih kemikalija mogu će na koncentraciji od 2 mg/l. Ispi ­
tivanje aerosola na koncentraciji ve ćoj od 2 mg/l treba pokušati samo ako se 
može posti ći veličina čestica koja se može udisati [vidjeti GD 39 (2)]. 
Uredba (EZ) br. 1272/2008 destimulira ispitivanja previše iznad grani čne 
koncentracije radi dobrobiti životinja (3). Grani čnu koncentraciju treba uzeti 
u obzir samo ako postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja 
biti izravno relevantni za zaštitu ljudskog zdravlja (3) te ako je u izvješ ću o 
istraživanju navedeno obrazloženje. U slu čaju potencijalno eksplozivnih 
ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o tome da se izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla nepotrebna primjena životinja, 
prije grani čnog testa treba provesti ispitivanje bez životinja kako bi se 
osiguralo da se u komori mogu posti ći uvjeti za grani čni test.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 223
 
31. Ako se na grani čnoj koncentraciji opazi ugibanje ili krajnja iscrpljenost, 
rezultati grani čnog testa mogu poslužiti kao preliminarno istraživanje za 
daljnje istraživanje na drugim koncentracijama (vidjeti glavno istraživanje). Ako fizikalna ili kemijska svojstva ispitivane kemikalije onemogu ćuju posti­
zanje grani čne koncentracije, treba ispitati maksimalnu koncentraciju koja se 
može posti ći. Ako se na maksimalnoj koncentraciji koja se može posti ći 
dogodi smrtonosno djelovanje manje od 50 %, nije potrebno daljnje ispiti ­
vanje. Ako se grani čna koncentracija ne može posti ći, izvješće o istraživanju 
mora pružiti objašnjenje i podatke koji to potkrjepljuju. Ako maksimalna 
koncentracija pare koja se može posti ći ne izazove toksi čnost, može biti 
potrebno proizvesti ispitivanu kemikaliju kao teku ći aerosol.
 
Glavno istraživanje: Tradicionalni protokol  
32. Glavno istraživanje obi čno se provodi uz primjenu pet mužjaka i pet ženki 
(ili 5 životinja osjetljivijeg spola ako je poznat) po razini koncentracije, s najmanje tri razine koncentracije. Za postizanje snažne statisti čke analize 
treba upotrijebiti dovoljan broj razina koncentracije. Vremensko razdoblje 
između izloženih skupina odre đuje se nastupom, trajanjem i ozbiljnoš ću 
znakova toksi čnosti. Izlaganje životinja sljede ćoj razini koncentracije treba 
odgoditi sve dok postoji opravdana mogu ćnost preživljavanja prethodno 
ispitivanih životinja. To voditelju istraživanja omogu ćuje prilagodbu 
ciljane koncentracije sljede ćoj skupini koja će biti izložena. Zbog ovisnosti 
o sofisticiranoj tehnologiji to nije uvijek primjenjivo u inhalacijskim studi ­
jama pa se izlaganje životinja na sljede ćoj razini koncentracije treba temeljiti 
na prethodnom iskustvu i znanstvenoj procjeni. U slu čaju ispitivanja smjesa 
treba se konzultirati s GD 39 (2).
 
PROTOKOL KONCENTRACIJA × VRIJEME (C × T)  
Općenita razmatranja: Protokol C × t  
33. Istraživanje C × t korak po korak može se smatrati alternativom tradicio ­
nalnom protokolu pri odre đivanju inhalacijske toksi čnosti (12) (13) (14). Taj 
pristup životinjama omogu ćuje izlaganje ispitivanoj kemikaliji na više razina 
koncentracije i na više vremenskih razdoblja. Čitavo ispitivanje provodi se u 
komori za izlaganje samo nosom (komore za izlaganje čitavim tijelom nisu 
primjenjive za ovaj protokol). Dijagram toka u Dodatku 1. ilustrira ovaj protokol. Simulacijska analiza pokazala je da su i tradicionalni protokol i 
protokol C × t u stanju prikazati snažne vrijednosti LC
 50 , ali je protokol C × 
t općenito bolji u prikazivanju snažnih vrijednosti LC  01 i LC  10 (15).  
34. Simulacijska analiza dokazala je da uporaba dviju životinja po intervalu C × 
t (po jedne od svakog spola ili po dvije osjetljivijeg spola) na čelno može biti 
prikladna pri ispitivanju 4 koncentracije i 5 trajanja izlaganja u glavnom 
istraživanju. U odre đenim okolnostima voditelj istraživanja može odabrati 
uporabu dvaju štakora svakog spola za interval C × t (15). Uporabom 2 životinja svakog spola za koncentraciju i vremensku to čku može se smanjiti 
pristranost i varijabilnost procjena, pove ćati stopa uspješnosti procjene te 
poboljšati obuhva ćenost intervalom pouzdanosti. Me đutim, u slu čaju nedo­
voljnog približavanja podacima za procjenu (u slu čaju primjene jedne živo ­
tinje svakog spola ili više životinja osjetljivijeg spola) može biti dovoljna i 
5. koncentracija izlaganja. Daljnje upute u svezi s brojem životinja i koncen ­
tracijama koje treba primijeniti u istraživanju C × t nalaze se u GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 224
 
Preliminarno istraživanje: Protokol C × t  
35. Preliminarno istraživanje primjenjuje se za procjenu djelovanja ispitivane 
kemikalije te za pomo ć pri odabiru razina koncentracije izlaganja u 
glavnom istraživanju. Preliminarno istraživanje uz primjenu do triju živo ­
tinja po spolu i koncentraciji [za detalje vidjeti Dodatak III. GD 39 (2)] 
može biti potrebno za odabir prikladne po četne koncentracije za glavno 
istraživanje te za svo đenje broja upotrijebljenih životinja na minimum. 
Može biti potrebno upotrijebiti tri životinje svakog spola kako bi se odredila 
razlika me đu spolovima. Te se životinje trebaju izložiti jedanput, na čelno 
240 minuta. Izvedivost stvaranja prikladne atmosfere za ispitivanje treba ocijeniti tijekom tehni čkih predispitivanja bez životinja. Preliminarno istra ­ 
živanje na čelno nije potrebno provoditi ako su podaci o smrtnosti dostupni 
iz istraživanja B.52 (4). Pri odabiru po četne ciljane koncentracije u istraži ­
vanju B.2 voditelj istraživanja u obzir treba uzeti opažene uzorke smrtnosti u svim dostupnim istraživanjima B.52 (4) za oba spola i za sve ispitne 
koncentracije [vidjeti GD 39 (2)].
 
Početna koncentracija: Protokol C × t  
36. Početna koncentracija (sesija izlaganja I.) (Dodatak 1.) bit će granična 
koncentracija ili koncentracija koju je odabrao voditelj istraživanja na 
temelju preliminarnog istraživanja. Skupine od 1 životinje po spolu izlažu se toj koncentraciji u više intervala (npr. 15, 30, 60, 120 ili 240 minuta) tako da se postigne ukupni broj od 10 životinja (takozvana sesija izlaganja I.) 
(Dodatak 1.).
 
37. Odabir grani čnih koncentracija obi čno ovisi o regulatornim zahtjevima. Ako 
se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, grani čne koncentracije za 
plinove, pare i aerosole iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l (ili maksimalna koncentracija koja se može posti ći) (3). Tehni čki može biti 
zahtjevno proizvesti grani čne koncentracije nekih ispitivanih kemikalija, 
posebno para i aerosola. U slu čaju ispitivanja aerosola cilj treba biti posti ­
zanje veli čine čestica koja se može udisati (npr. MMAD 1 - 4 μm) na 
graničnoj koncentraciji od 2 mg/l. To je mogu će s većinom ispitivanih 
kemikalija. Ispitivanje aerosola na koncentraciji ve ćoj od 2 mg/l treba poku ­ 
šati samo ako se može posti ći veličina čestica koja se može udisati [vidjeti 
GD 39 (2)]. Uredba (EZ) br. 1272/2008 destimulira ispitivanja previše iznad granične koncentracije radi dobrobiti životinja (3). Ispitivanje previše iznad 
granične koncentracije treba uzeti u obzir samo ako postoji velika vjerojat ­
nost da će rezultati takvog ispitivanja biti izravno relevantni za zaštitu ljud ­
skog zdravlja (3), a u izvješ ću o ispitivanju treba navesti obrazloženje. U 
slučaju potencijalno eksplozivnih ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o 
tome da se izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla 
nepotrebna primjena životinja, prije ispitivanja na po četnoj koncentraciji 
treba provesti ispitivanje bez životinja kako bi se osiguralo da se u komori mogu posti ći uvjeti za tu koncentraciju.
 
38. Ako se na po četnoj koncentraciji opazi ugibanje ili krajnja iscrpljenost, 
rezultati na toj koncentraciji mogu poslužiti kao po četak za daljnje ispiti ­
vanje na drugim koncentracijama (vidjeti glavno istraživanje). Ako fizikalna ili kemijska svojstva onemogu ćuju postizanje grani čne koncentracije, treba 
ispitati maksimalnu koncentraciju koja se može posti ći. Ako se na maksi ­
malnoj koncentraciji koja se može posti ći dogodi smrtonosno djelovanje 
manje od 50 %, nije potrebno daljnje ispitivanje. Ako se grani čna koncen ­
tracija ne može posti ći, izvješće o istraživanju mora pružiti objašnjenje i 
podatke koji to potkrjepljuju. Ako maksimalna koncentracija pare koja se 
može posti ći ne izazove toksi čnost, može biti potrebno proizvesti ispitivanu 
kemikaliju kao teku ći aerosol.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 225
 
Glavno istraživanje: Protokol C × t  
39. Početna koncentracija (sesija izlaganja I.) (Dodatak 1.) ispitana u glavnom 
istraživanju bit će granična koncentracija ili koncentraciju koju je odabrao 
voditelj istraživanja na temelju preliminarnog istraživanja. Ako se tijekom 
sesije izlaganja I. ili nakon nje opazi smrtnost, minimalno izlaganje (C × t) 
koje izaziva smrtnost uzet će se kao smjernica za odre đivanje koncentracije i 
razdoblja izlaganja za sesiju izlaganja II. Svaka sljede ća sesija izlaganja 
ovisit će o prethodnoj sesiji (vidjeti Dodatak 1.).  
40. Za mnoge ispitivane kemikalije rezultati dobiveni na po četnoj koncentraciji 
zajedno s tri dodatne sesije izlaganja s manjim vremenskim rasterom ( npr. 
geometrijski razmaci razdoblja izlaganja kao što je navedeno faktorom između uzastopnih razdoblja, na čelno √2) bit će dovoljni za odre đivanje 
odnosa smrtnosti C × t (15), ali može biti korisno primijeniti 5. koncen ­
traciju izlaganja [vidjeti Dodatak 1. i GD 39 (2)]. Za matemati čku obradu 
rezultata za protokol C × t vidjeti Dodatak 1.
 
OPAŽANJA  
41. Životinje treba često klini čki promatrati tijekom razdoblja izlaganja. Nakon 
izlaganje klini čka promatranja treba obavljati najmanje dvaput na dan izla ­
ganja ili češće ako to zahtijeva reakcija životinja na tretman te najmanje 
jedanput dnevno u sljede ćih 14 dana. Duljina razdoblja promatranja nije 
fiksno odre đena, ali treba je odrediti u skladu s prirodom i vremenom 
nastupanja klini čkih znakova i duljinom razdoblja oporavka. Važni su 
trenuci u kojima se pojavljuju i nestaju znakovi toksi čnosti, posebno ako 
postoji tendencija ka kašnjenju znakova toksi čnosti. Sva se opažanja 
sustavno bilježe u pojedina čnoj evidenciji za svaku životinju. Životinje u 
stanju ugibanja te životinje koje pokazuju znakove jake patnje i/ili trajne znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti radi njihove dobrobiti. Pri 
provođenju ispitivanja radi otkrivanja klini čkih znakova toksi čnosti treba 
paziti na to da se po četno slabo pojavljivanje i prolazne promjene u disanju, 
koje su rezultat postupka izlaganja, ne zamijene s toksi čnošću povezanom s 
ispitivanom kemikalijom, što bi izazvalo prijevremeno usmr ćivanje životi ­
nja. U obzir treba uzeti na čela i kriterije sažete u Smjernici o humanom 
usmrćivanju (GD 19) (7). Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili 
ih se prona đe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je mogu će 
preciznije.
 
42. Promatranja u kavezu moraju obuhva ćati promjene na koži i krznu, o čima i 
sluznicama te dišnom, cirkulacijskom, autonomnom i središnjem živ čanom 
sustavu te somatomotori čkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Ako je 
moguće, treba zamijetiti razliku izme đu lokalnih i sistemskih u činaka. 
Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, 
letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanima s tretmanom ili držanjem u zatvorenom.
 
Tjelesna masa  
43. Pojedina čnu tjelesnu masu životinja treba zabilježiti jedanput tijekom 
razdoblja aklimatizacije, na dan izlaganja prije samog izlaganja (0. dana), 
barem 1., 3. i 7. dana (i jedanput tjedno nakon toga) te u trenutku ugibanja 
ili usmrćenja ako nastupe iza 1. dana. Tjelesna masa prepoznaje se kao 
kritični pokazatelj toksi čnosti pa treba pobliže pratiti životinje kod kojih 
je primije ćen neprekidan pad od ≥ 20 % u usporedbi s vrijednostima prije 
istraživanja. Životinje koje prežive važu se i humano usmr ćuju na kraju 
razdoblja nakon izlaganja.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 226
 
Patologija  
44. Sve pokusne životinje, uklju čujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule 
ili usmrćene i uklonjene iz istraživanja radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti 
makroskopskoj obdukciji. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno 
nakon otkri ća uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na 
dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju treba provesti što je mogu će prije, obi čno u roku od jednog ili 
dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke 
promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
 
45. Dodatne pretrage, a priori obuhva ćene planom ispitivanja, mogu se uzeti u 
obzir radi proširenja interpretacijske vrijednosti istraživanja, poput mjerenja 
mase plu ća preživjelih štakora i/ili pružanja dokaza o iritaciji pomo ću 
mikroskopske pretrage respiratornog trakta. Ispitani organi tako đer mogu 
obuhvaćati organe koji pružaju dokaze o makroskopskoj patologiji kod 
životinja koje su preživjele 24 sata ili dulje te organa za koje se zna ili 
očekuje da su pogo đeni. Mikroskopska pretraga cijelog respiratornog trakta 
može pružiti korisne informacije za ispitivane kemikalije koje reagiraju s vodom, poput kiselina i higroskopskih ispitivanih kemikalija.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
46. Treba pribaviti pojedina čne podatke o tjelesnoj masi i nalazima obdukcije za 
svaku životinju. Podatke prikupljene klini čkim promatranjem treba sažeti u 
obliku tablice, koja za svaku ispitnu skupinu pokazuje broj upotrijebljenih 
životinja, broj životinja koje pokazuju specifi čne znakove toksi čnosti, broj 
životinja koje su tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz 
humanih razloga, vrijeme uginu ća svake životinje, opis i vremenski tijek te 
reverzibilnost toksi čnih učinaka i nalaze obdukcije.  
Izvješće o ispitivanju  
47. Izvješ će o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljede će 
informacije:  
Pokusne životinje i njihov uzgoj  
— opis uvjeta u kavezu, uklju čujući: broj (ili promjenu broja) životinja u 
svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane,
 
— korištenu vrstu/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora,  
— broj, dob i spol životinja,  
— metodu nasumi čnog odabira,  
— detalje o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući i vrstu/podrijetlo prehrane, 
izvor vode),  
— opis kondicioniranja prije ispitivanja, uklju čujući i prehranu, karantenu i 
liječenje bolesti,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 227
 
Ispitivana kemikalija  
— Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva 
(uključujući i izomerizaciju),  
— Identifikacijski podaci i broj registracije  Chemical Abstract 
Services  (CAS), ako je poznat,  
Nosač 
— Obrazloženje za uporabu nosa ča i obrazloženje za odabir nosa ča (ako 
nije voda),  
— Povijesni ili odgovaraju ći podaci koji pokazuju da nosa č ne ometa rezul ­
tate istraživanja,  
Komora za inhalaciju  
— Opis komore za inhalaciju, uklju čujući i dimenzije i volumen,  
— Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje 
atmosfere,  
— Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veli čine čestica te stvarne 
koncentracije,  
— Izvor zraka i obrada dovoda/odvoda zraka i sustav korišten za 
kondicioniranje,  
— Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene 
atmosfere za ispitivanje,  
— Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna),  
— Otvori za izlaganje po komori (samo nos), lokacija životinja u sustavu 
(čitavo tijelo),  
— Privremena homogenost/stabilnost atmosfere za ispitivanje,  
— Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmos ­
fere u komori,  
— Brzine protoka zraka, otvor za brzinu protoka zraka po izlaganju (samo 
nos) ili dovod životinja po komori ( čitavo tijelo),  
— Informacije o opremi upotrijebljenoj za mjerenje kisika i ugljikova 
dioksida, ako je primjenjivo,  
— Vrijeme potrebno za postizanje uravnoteženja u komori za inhalaciju 
(t 95 ) 
— Broj promjena u volumenu po satu,  
— Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo),  
Podaci o izlaganju  
— Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnom istraživanju,  
— Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u 
komori za inhalaciju podijeljena s volumenom zraka koji je prošao kroz 
komoru),  
— Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za 
smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) 
svaka se može analizirati odvojeno,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 228
 
— Sve koncentracije zraka moraju se prikazati u jedinicama mase (npr. 
mg/l, mg/m  3 itd.); i jedinice volumena (npr . ppm, ppb itd.) tako đer se 
mogu usput prikazati,  
— Distribucija veli čine čestica, srednji aerodinami čki promjer 
čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija ( σg), uključujući 
i metode za njihov izra čun. Treba prijaviti pojedina čne analize veli čine 
čestica,  
Uvjeti ispitivanja  
— Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uklju čujući i detalje o svim 
postupcima korištenima za smanjenje veli čine čestica krutih tvari ili za 
pripremu otopina ispitivane kemikalije. U slu čajevima u kojima su 
mehanički postupci mogli izmijeniti sastav ispitivane kemikalije uklju čiti 
rezultat analiza za utvr đivanje sastava ispitivane tvari,  
— Opis (po mogu ćnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje atmos ­
fere za ispitivanje te izlaganje životinja atmosferi za ispitivanje,  
— Detalji korištene kemijske analiti čke metode i potvrda metode (uklju ču­
jući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorko ­
vanje),  
— Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija,  
Rezultati  
— Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori,  
— Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori,  
— Tablični prikaz podataka o veli čini čestica, uklju čujući i podatke o 
skupljenim analiti čkim uzorcima, distribuciju veli čina čestica te izra čune 
MMAD i σ g , 
— Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku živo ­
tinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti, uklju čujući 
smrtnost, prirodu, ozbiljnost, vrijeme nastupanja i trajanja u činaka),  
— Individualne tjelesne mase životinja prikupljene tijekom istraživanja; 
datum i vrijeme uginu ća ako je nastupilo prije planiranog usmr ćenja, 
vremenski tijek nastupanja znakova toksi čnosti te jesu li bili reverzibilni 
za svaku životinju,  
— Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su 
dostupni,  
— Procjena smrtonosnog djelovanja (npr. LC  50 , LD  01 ), uključujući i 
granice pouzdanosti od 95 % te nagib (ako je dobiven metodom vred ­
novanja),  
— Statisti čki odnos, uklju čujući i procjenu eksponenta n (protokol C × t). 
Treba navesti naziv korištenog statisti čkog softvera,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 229
 
Rasprava i tuma čenje rezultata  
— Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje 
kriterija ove ispitne metode, npr. grani čnu koncentraciju ili veli činu 
čestica,  
— Treba se pozabaviti sposobnoš ću udisanja čestica u svjetlu op ćih nalaza, 
posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veli činu čestica,  
— U slu čaju humanog usmr ćenja životinja koje su patile ili pokazivale 
znakove teškog ili trajnog stresa treba dati objašnjenje na temelju krite ­
rija Smjernice za humano usmr ćivanje OECD-a (8),  
— Ako je ispitivanje s poglavljem B.52 ovog Priloga (4) prekinuto u korist 
ove ispitne metode B.2, treba pružiti obrazloženje,  
— U opću ocjenu istraživanja treba uklju čiti dosljednost metoda korištenih 
za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne 
koncentracije prema nazivnoj,  
— Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavaju ćim načinom djelo ­
vanja (sistemski u odnosu na lokalni).  
LITERATURA  
1. OECD (2009.). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines].
 
2. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines].  
3. Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 16. prosinca 
2008. o razvrstavanju, ozna čavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se 
izmjenjuju i dopunju te ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., 
str. 1.
 
4. Poglavlje B.52 ovog Priloga, Akutna inhalacijska toksi čnost - Metoda ATC 
(Acute Toxic Class).  
5. Poglavlje B.40 ovog Priloga, Nagrizanje kože  in vitro : test transkutanog 
električnog otpora (TER).  
6. Poglavlje B.40 bis ovog Priloga, Nagrizanje kože  in vitro : test na modelu 
ljudske kože.  
7. OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
8. OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Pariz. Dostupno na: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
9. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
 
10. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 230
 
11. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160- 
167. 
12. Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
13. Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determi ­
nation of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
14. Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute 
Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
15. OECD (2009.). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
16. Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 231
 
Dodatak 1.  
Protokol C × t  
1. Istraživanje koncentracija × vrijeme (C × t) korak po korak može se smatrati 
alternativom tradicionalnom protokolu za odre đivanje inhalacijske toksi č­
nosti (12) (13) (14). Treba mu dati prednost ako postoji specifi čna regula ­
torna ili znanstvena potreba za ispitivanjem životinja kroz više razdoblja, 
kao i za planiranje reakcije u slu čaju nužde ili planiranje iskorištenja povr ­ 
šina. Taj pristup obi čno počinje s ispitivanjem na grani čnoj koncentraciji 
(sesija izlaganja I.), u kojem se životinje izlažu ispitivanoj kemikaliji pet puta (npr. 15, 30, 60, 120 i 240 minuta) tako da se tijekom jedne sesije 
izlaganja postigne više izlaganja (vidjeti sliku 1.). Ako se primjenjuje 
Uredba (EZ) br. 1272/2008, grani čne koncentracije za plinove, pare i 
aerosol iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l. Te razine smiju se prekoračiti samo u slu čaju regulatorne ili znanstvene potrebe za ispitivanjem 
na tim razinama (vidjeti stavak 37. u glavnom tekstu B.2).
 
2. U situacijama u kojima ima malo informacija o toksi čnosti ispitivane kemi ­
kalije ili ih uop će nema treba provesti preliminarno istraživanje u kojemu se 
skupine od najviše 3 životinje svakog spola izlažu ciljanim koncentracijama koje odabire voditelj istraživanja, op ćenito na 240 minuta.
 
3. Ako se tijekom sesije izlaganja I. ispituje grani čna koncentracija i ako se 
uoči smrtnost manja od 50 %, nije potrebno dodatno ispitivanje. Ako postoji 
regulatorna ili znanstvena potreba za odre đivanjem odnosa koncentracije, 
vremena, reakcije na višim razinama nego što pokazuje grani čna koncen ­
tracija, sljede će izlaganje treba provesti na višoj razini jednakoj dvostrukoj 
graničnoj koncentraciji (npr. 2L na slici 1.).  
4. Ako se na grani čnoj koncentraciji uo či toksičnost, potrebno je dodatno 
ispitivanje (glavno istraživanje). Ta dodatna izlaganja mogu se provesti na nižim koncentracijama (na slici 1.: sesije izlaganja II., III. ili IV.’) ili na višim koncentracijama uz kra će trajanje (na slici 1.: sesija izlaganja IV.) uz 
prilagođena i ne toliko razmaknuta trajanja.
 
5. Ispitivanje (po četna koncentracija i dodatne koncentracije) provodi se 
uporabom jedne životinje svakog spola po koncentraciji i vremenskoj točki ili s dvije životinje osjetljivijeg spola po koncentraciji i vremenskoj 
točki. U odre đenim okolnostima voditelj istraživanja može odabrati primjenu 
dva štakora svakog spola po koncentraciji i vremenskoj to čki (ili četiri 
životinje osjetljivijeg spola po koncentraciji i vremenskoj to čki) (15). 
Uporabom dviju životinja po spolu po koncentraciji i vremenskoj to čki 
može se op ćenito smanjiti pristranost i varijabilnost procjena, pove ćati 
stopa uspješnosti procjene te poboljšati obuhva ćenost intervalom pouzda ­
nosti u odnosu na ovdje opisani protokol. Ostali detalji nalaze se u GD 39 (2).
 
6. U idealnom slu čaju svaka sesija izlaganja provodi se jedan dan. Time se 
pruža mogu ćnost odgode sljede ćeg izlaganja do opravdane mogu ćnosti 
preživljavanja, a voditelju istraživanja omogu ćuje se prilago đavanje ciljane 
koncentracije i trajanja sljede ćoj sesiji izlaganja. Preporu čuje se da se svaka 
sesija izlaganja zapo čne sa skupinom koja će se najdulje izlagati, npr. 
skupinom koja će biti izložena 240 minuta, a zatim skupinom koja će biti 
izložena 120 minuta i tako dalje. Ako, primjerice, životinje u skupini izlo ­ 
ženoj 240 minuta ugibaju nakon 90 minuta ili pokazuju jake znakove toksi č­
nosti (npr. ekstremne promjene u uzorcima disanja poput otežana disanja), nema smisla izlagati skupinu do 120 minuta jer će smrtnost vjerojatno 
iznositi 100 %. Stoga voditelj istraživanja treba odabrati kra ća izlaganja 
za tu koncentraciju (npr. 90, 65, 45, 33 i 25 minuta).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 232
 
7. Koncentraciju u komori treba često mjeriti kako bi se odredio prosjek 
koncentracije u ovisnosti o vremenu za svako trajanje izlaganja. Kad god 
je to mogu će, u statisti čkoj analizi treba upotrijebiti vrijeme ugibanja svake 
životinje (radije nego trajanje izlaganja).  
8. Treba ispitati rezultate prvih četiriju sesija izlaganja kako bi se identificirale 
praznine u podacima u krivulji koncentracija-vrijeme (vidjeti sliku 1.). U slučaju nedovoljne prikladnosti može se provesti dodatno izlaganje (5. 
koncentracija). Koncentraciju i trajanje izlaganja za 5. izlaganje treba 
odabrati kako bi se pokrila ta praznina.
 
9. Sve sesije izlaganja (uklju čujući prvu sesiju izlaganja) upotrijebit će se za 
izračun odnosa koncentracije, vremena i reakcije primjenom statisti čke 
analize (16). Ako je mogu će, za svaki interval C × t treba upotrijebiti 
prosječnu koncentraciju ponderiranu vremenom i trajanje izlaganja do 
uginuća (ako isto nastupi tijekom izlaganja).  
Slika 1.  
Hipotetska ilustracija odnosa koncentracija-vrijeme-smrtnost kod štakora
  
Otvoreni simboli = preživjeli; zatvoreni simboli = uginule životinje  
Trokuti = ženke; krugovi = mužjaci  
Puna linija = vrijednosti LC  50 (interval 7,5 - 240 min) za mužjake s n = 1  
Isprekidana linija = vrijednosti LC  50 (interval 7,5 - 240 min) za ženke s n = 1  
Istočkana linija = hipotetske vrijednosti LC  50 za mužjake i ženke ako je n 
jednak 2 (12).  
Pojmovnik  
Koncentracija:  
Vrijeme izlaganja:  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 233
 
10. U nastavku slijedi primjer postupka korak po korak:  
Sesija izlaganja I. –  ispitivanje na grani čnoj koncentraciji (vidjeti sliku 1.)  
— Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj to čki; ukupno 
deset životinja (  a ) 
— Ciljana koncentracija (  b ) = grani čna koncentracija.  
— Izlaganje pet skupina životinja na toj ciljanoj koncentraciji na vrijeme od 
redom 15, 30, 60, 120 i 240 minuta.  
↓ 
Sesija izlaganja II.  ( c )– glavno istraživanje  
— Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj to čki; ukupno 
deset životinja.  
— Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (  d ) (1/2L) uz nešto 
dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).  
↓ 
Sesija izlaganja III. –  glavno istraživanje  
— Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj to čki; ukupno 
deset životinja.  
— Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (  d ) (1/4L) uz nešto 
dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).  
↓ 
Sesija izlaganja IV. ′ – glavno istraživanje  
— Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj to čki; ukupno 
deset životinja.  
— Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (  d ) (1/8L) uz nešto 
dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).  
↓ ili ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 234  
( a ) Ako nije dostupna informacija o osjetljivosti spolova, upotrijebit će se štakori oba spola, 
tj. 1 životinja svakog spola po koncentraciji. Na temelju postoje ćih informacija ili ako 
tijekom ove sesije izlaganja postane o čito da je jedan od spolova osjetljiviji, upotrijebit 
će se deset životinja osjetljivijeg spola (dvije životinje po koncentraciji i vremenskoj 
točki) na svakoj razini koncentracije tijekom sljede ćeg ispitivanja. 
( b ) Ako se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, grani čne koncentracije za plinove, pare i 
aerosol iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l. U slu čaju očekivane toksi čnosti ili 
na temelju rezultata preliminarnih istraživanja treba odabrati niže po četne koncentracije. 
U slučaju regulatornih ili znanstvenih potreba mogu se upotrijebiti više koncentracije. 
( c ) U idealnom slu čaju izlaganje životinja sljede ćoj razini koncentracije treba odgoditi sve 
dok postoji opravdana mogu ćnost preživljavanja prethodno ispitivanih životinja. To vodi ­
telju istraživanja omogu ćuje prilagodbu ciljane koncentracije i trajanja za sljede ću sesiju 
izlaganja. 
( d ) Minimalna doza (koncentracija × vrijeme) koja rezultira smrtnoš ću tijekom ispitivanja na 
početnoj koncentraciji (prva sesija izlaganja) uzet će se kao smjernica za odre đivanje 
sljedeće kombinacije koncentracije i trajanja izlaganja. Koncentracija će se tipi čno 
smanjivati upola (1/2L), a životinje će biti izložene kroz novo vremensko razdoblje s 
finijim razmakom uz primjenu geometrijske podjele razdoblja izlaganja s faktorom 1,4 (√2; vidjeti referencu 11.) oko vremena u skladu s minimalnom razinom smrtonosne 
doze (vrijeme × koncentracija) uo čenoj tijekom prvog izlaganja. Na ovoj je slici (Slika 
1.) smrtnost tijekom sesije izlaganja I. uo čena tek u 15. minuti; stoga se trajanja sesije II. 
centriraju oko 30. minute i iznose 15, 21 30, 42 i 60 minuta. Nakon prva dva izlaganja 
preporučuje se da se podaci unesu u dijagram nalik gornjem dijagramu te da se provjeri 
je li odnos izme đu koncentracije i vremena pod kutom od 45° (n = 1) ili je li odnos 
koncentracije, vremena i reakcije manje strm (npr. n = 2) ili strmiji (npr. n = 0,8). U 
posljednjim se slu čajevima preporu čuje da se u skladu s tim primjene sljede će koncen­
tracije i trajanja.
 Sesija izlaganja IV. –  glavno istraživanje  
— Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj to čki; ukupno 
deset životinja.  
— Izlaganje pet skupina životinja na višoj koncentraciji (  e ) (2L) uz nešto 
kraće trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).  
Matemati čka obrada rezultata za protokol C × t  
11. Postupak C × t s 4 ili 5 koncentracija izlaganja i pet trajanja prikazat će 20 
odnosno 25 podatkovnih to čaka. S podatkovnim to čkama može se izra čunati 
odnos C × t uz primjenu statisti čke analize (16):  
Jednadžba 1  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
gdje je C = koncentracija; t = trajanje izlaganja ili  
Jednadžba 2  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
gdje je  n ¼ b 1=b 2: 
Primjenom jednadžbe 1 može se izra čunati vrijednost LC  50 za zadano 
razdoblje (npr. 4 sata, 1 sat, 30 minuta ili bilo koje razdoblje unutar ispi ­
tivanih razdoblja) uz primjenu P = 5 (reakcija 50 %). Obratite pozornost da se Haberovo pravilo može primijeniti samo ako je n = 1. LC
 01 može se 
izračunati primjenom P = 2.67.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 235  
( e ) U odre đenim slu čajevima može biti nužno pove ćati koncentraciju (2L) kroz novo 
razdoblje s još finijim razmakom uz primjenu geometrijske podjele razdoblja izlaganja 
s faktorom 1,4 ( √2) u blizini vremena u skladu s minimalnom razinom smrtonosne 
koncentracije uo čenom tijekom prvog izlaganja. Minimalno trajanje izlaganja po mogu ć­
nosti treba biti dulje od 5 minuta; maksimalno trajanje izlaganja ne bi smjelo biti dulje od 
8 sati.
 B.3. AKUTNA TOKSI ČNOST (DERMALNA)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Korisno je imati preliminarne podatke o tvari kao što su raspored 
veličine čestica, tlak para, talište, vrelište, to čka zapaljenja i eksplo ­
zivnost (ako je tvar eksplozivna).  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (A).  
1.2. DEFINICIJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (B).  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana se tvar u stupnjevanim dozama nanosi na kožu nekoliko 
skupina pokusnih životinja, pri čemu se na svaku skupinu primje ­
njuje po jedna visina doze. Nakon tog opažaju se u činci i smrtnost. 
Životinje koje uginu tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje su preživjele ispitivanje usmr ­ 
ćuju se i obduciraju.
 
Životinje koje pokazuju izrazite znakove stresa i boli treba humano 
usmrtiti. Ispitivane tvari ne smiju se primjenjivati na na čin za koji je 
poznato da životinjama uzrokuje znatnu bol i stres zbog snažnih 
nagrizajućih i nadražuju ćih svojstava.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema  
Životinje se drže u kavezima za obavljanje ispitivanja, u pokusnim 
uvjetima što se ti če smještaja i hranjenja, najmanje pet dana prije 
početka pokusa. Prije ispitivanja zdrave mlade životinje nasumce se 
odabiru i raspore đuju u skupine u kojima će biti tretirane. Približno 
24 sata prije ispitivanja na hrptenom dijelu trupa životinja treba 
ukloniti dlaku šišanjem ili brijanjem. Pri šišanju ili brijanju treba 
izbjeći struganje kože, jer bi to moglo promijeniti njezinu propus ­
nost. Za nanošenje ispitivane tvari dlaku treba ukloniti s najmanje 10 % tjelesne površine. Pri ispitivanju krutih tvari koje se prema 
potrebi mogu usitniti u prah, ispitivanu tvar treba u dovoljnoj 
mjeri navlažiti vodom ili, tamo gdje je to potrebno, odgovaraju ćim 
nosačem, kako bi se osigurao dobar kontakt s kožom. Kad se 
upotrebljava nosa č, u obzir treba uzeti utjecaj tog nosa ča na prodi ­
ranje ispitivane tvari u kožu. Teku će ispitivane tvari op ćenito se 
primjenjuju nerazrije đene.
 
1.6.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.6.2.1.  Pokusne životinje  
Mogu se koristiti odrasli štakori ili kuni ći. Moguće je koristiti i 
druge vrste, ali je za to potrebno navesti opravdane razloge. Treba koristiti sojeve životinja koji se obi čno koriste u laboratorijima. Na 
početku ispitivanja, bez obzira na spol, masa životinja ne smije 
varirati za više od ± 20 % odgovaraju će srednje vrijednosti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 236
 
1.6.2.2.  Broj i spol  
Za svaku visinu doze treba upotrijebiti najmanje pet životinja. Sve 
moraju biti istog spola. Ako se koriste ženke, treba koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. U slu čajevima kad postoje 
informacije koje dokazuju da je jedan od spolova izrazito osjetljiviji, 
doze treba primjenjivati na životinje tog spola.
 
Napomena: kod ispitivanja akutne toksi čnosti na životinjama višeg 
reda od glodavaca, treba razmotriti mogu ćnost upotrebe manjeg broja 
životinja. Treba pažljivo odabirati doze i poduzeti sve mjere da se ne 
premaše srednje toksi čne doze. U ovakvim ispitivanjima treba izbje ­
gavati primjenu smrtonosnih doza ispitivane tvari.  
1.6.2.3.  Visine doza  
Treba koristiti dovoljan broj razli čitih doza, najmanje tri, te ih 
primjenjivati u odgovaraju ćim vremenskim intervalima kako bi se 
na ispitnim skupinama mogli uo čiti različiti toksički učinci i razli čite 
stope smrtnosti. Kod odabiranja visine doze treba uzeti u obzir 
nadražuju ća i nagrizaju ća svojstva ispitivane tvari. Ti podaci 
moraju biti dostatni da se na temelju njih izradi krivulja doza i reakcija i, kada je izvedivo, da omogu će prihvatljivo utvr đivanje 
vrijednosti LD
 50 . 
1.6.2.4.  Grani čni test  
Na skupini od pet mužjaka i pet ženki može se obaviti grani čni test 
uz primjenu samo jedne visine doze, najmanje 2 000 mg/kg tjelesne 
mase, primjenjuju ći gore opisani postupak. U slu čaju pojave 
smrtnosti povezane s ispitivanom tvari, možda će biti potrebna 
cijela studija.  
1.6.2.5.  Razdoblje opažanja  
Razdoblje opažanja treba biti najmanje 14 dana. Me đutim, trajanje 
opažanja ne treba biti strogo odre đeno. Treba ga odrediti na temelju 
toksičkih reakcija, brzine njihova pojavljivanja i vremena potrebnog 
za oporavak; ako se smatra potrebnim ono se može produžiti. 
Vrijeme pojavljivanja ili nestajanja znakova toksi čnosti i vrijeme 
smrti su važni, posebno ako postoji tendencija kasnijeg nastupanja smrti.
 
1.6.3.  Postupak  
U kavezu treba držati po jednu životinju. Ispitivanu tvar treba 
jednakomjerno nanijeti na površinu koja čini oko 10 % ukupne 
površine tijela. Kad su u pitanju visoko toksi čne tvari, površina 
nanošenja može biti i manja, ali i na takvu površinu tvar treba 
nanijeti u što tanjem i ravnomjernijem sloju.  
Ispitivanu tvar treba držati u kontaktu s kožom tijekom cijelog 24- 
satnog razdoblja izloženosti pomo ću poroznog obloga od gaze i 
samoljepive trake koja ne nadražuje kožu. Ispitnu površinu treba 
dodatno prekriti na odgovaraju ći način kako bi oblog i ispitivana 
tvar ostali na mjestu i kako bi se osiguralo da životinje ne mogu ispitivanu tvar unijeti ingestijom (oralno). Da bi se životinju sprije ­ 
čilo da ispitivanu tvar unese ingestijom (oralnim putem) mogu se 
upotrijebiti pomagala za sputavanje, ali potpuna imobilizacija nije 
preporučena metoda.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 237
 
Na kraju razdoblja izloženosti ostatke ispitivane tvari treba ukloniti, 
ako je mogu će vodom ili primjenom neke druge prikladne metode 
čišćenja kože.  
Rezultate opažanja treba sustavno bilježiti redoslijedom kojim se 
obavljaju. Za svaku životinju treba voditi zasebnu evidenciju. Tijekom prvog dana životinje treba opažati često. Najmanje 
jednom svakog radnog dana treba obaviti temeljiti klini čki pregled, 
a ostala opažanja treba obavljati dnevno, uz poduzimanje odgovara ­
jućih mjera kako bi se gubitak životinja tijekom studije sveo na 
minimum, npr. obdukcija ili pohranjivanje uginulih životinja u hladnjak i izolacija ili usmr ćivanje slabih životinja i životinja na 
umoru.
 
Opažati treba promjene na dlaci, tretiranoj koži, o čima i sluznicama, 
na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom 
živčanom sustavu, kao i promjene u somatomotori čkoj aktivnosti i 
obrascu ponašanja. S posebnom pozornoš ću treba opažati drhtavicu, 
grčeve, slinjenje, proljev, otupjelost, san i komu. Vrijeme smrti mora 
se zabilježiti što je mogu će preciznije. Životinje koje uginu tijekom 
ispitivanja kao i one koje prežive do kraja ispitivanja podvrgavaju se obdukciji. Treba zabilježiti sve ve će patološke promjene. Kad za to 
postoje indikacije, treba uzeti uzorak tkiva za histopatološki pregled.
 
Ocjenjivanje toksi čnosti kod drugog spola  
Po završetku studije na jednom spolu doza se primjenjuje na 
najmanje jednu skupinu od pet životinja drugog spola kako bi se 
utvrdilo da životinje tog spola nisu izrazito osjetljivije na ispitivanu 
tvar. U odre đenim okolnostima može biti opravdano koristiti manji 
broj životinja. Ako ve ć postoje odgovaraju ći podaci koji pokazuju da 
su životinje ispitanog spola izrazito osjetljivije, ispitivanje na životi ­
njama drugog spola može se izostaviti.  
2. PODACI  
Podatke treba rezimirati u obliku tablice, u kojoj će za svaku ispitnu 
skupinu biti naveden broj životinja na po četku ispitivanja, vrijeme 
smrti svake životinje, broj životinja koje pokazuju druge znakove 
toksičnosti, opis toksi čkih učinaka i nalazi obdukcije. Masu svake 
pojedinačne životinje treba utvrditi i zabilježiti neposredno prije 
nanošenja ispitivane tvari, a zatim jednom tjedno i nakon smrti; 
promjene u masi treba izra čunavati u slu čajevima kad životinja 
preživi duže od jednog dana. Životinje koje se humano usmrte zbog stresa i boli izazvanih ispitivanom tvari svrstavaju se pod slučajeve smrti povezane s tom tvari. LD
 50 treba utvrditi prema 
nekoj od priznatih metoda.  
Ocjena podataka treba uklju čivati eventualni odnos izme đu izlože­
nosti životinje ispitivanoj tvari i pojave i ozbiljnosti svih abnormal ­
nosti, uklju čujući abnormalnosti u ponašanju, klini čke abnormalnosti, 
velike lezije, promjene u tjelesnoj masi, smrtnost i druge toksi čke 
učinke.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, po mogu ćnosti, sadržavati slijede će 
informacije:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 238
 
— vrsta, soj, podrijetlo, okolišni uvjeti, prehrana itd.,  
— uvjeti ispitivanja (uklju čujući metodu čišćenja kože i vrstu 
obloga: okluzivni ili neokluzivni),  
— visine doza (s otapalom, ako se koristi, i koncentracijama),  
— spol životinja kojima se tvar dozira,  
— tabelarni prikaz podataka o reakcijama (tj. broj životinja koje su 
uginule ili bile usmr ćene tijekom ispitivanja, broj životinja koje 
pokazuju znakove toksi čnosti, broj izloženih životinja),  
— sva opažanja,  
— vrijednost LD  50 za spol na kojem je provedena studija, utvr đena 
nakon 14 dana prema navedenoj metodi utvr đivanja,  
— interval 95 %-tne pouzdanosti za LD  50 (kad ga je mogu će nave­
sti), 
— krivulja doza/smrtnost i nagib krivulje (gdje to dopušta metoda 
određivanja),  
— nalazi obdukcije,  
— svi histopatološki nalazi,  
— rezultati svih ispitivanja na drugom spolu,  
— diskusija o rezultatima (posebnu pozornost treba posvetiti 
mogućem učinku humanog usmr ćivanja životinja tijekom ispiti ­
vanja na izra čunanu vrijednost LD  50 ), 
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (D).  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (E).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 239
 
B.4. AKUTNA TOKSI ČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE 
KOŽE  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 404 (2002.).  
1.1. UVOD  
Kod pripreme ove nove dopunjene metode posebna je pozornost 
posvećena mogu ćim poboljšanjima s obzirom na dobrobit životinja, 
kao i procjeni svih postoje ćih informacija o ispitivanoj tvari kako bi 
se izbjegla nepotrebna ispitivanja na laboratorijskim životinjama. Ova metoda sadrži preporuku da se prije provo đenja opisanog ispi ­
tivanja nagrizaju ćih/nadražuju ćih svojstava tvari  in vivo , obavi 
analiza ve ć postojećih relevantnih znanstvenih dokaza. Ako nema 
dovoljno raspoloživih podataka, mogu će ih je dobiti kroz primjenu 
sekvencijskog ispitivanja (1). Strategija ispitivanja uklju čuje provo ­ 
đenje validiranih i prihva ćenih ispitivanja  in vitro , a opisana je u 
Dodatku ovoj metodi. Osim toga, prema potrebi, kod inicijalnog 
ispitivanja  in vivo  preporuča se postupna, a ne istovremena primjena 
triju ispitnih krpica (patch test) na životinju.
 
U interesu ispravnog korištenja znanosti i dobrobiti životinja, ispiti ­
vanja  in vivo  ne bi se smjela obavljati dok se putem analize posto ­
jećih znanstvenih dokaza ne procijene svi raspoloživi podaci koji su 
relevantni za nagrizaju će/nadražuju će djelovanje predmetne tvari na 
kožu. Takvi će podaci obuhva ćati dokaze koji proizlaze iz postoje ćih 
studija provedenih na ljudima i/ili laboratorijskim životinjama, 
dokaze o nagrizaju ćim/nadražuju ćim svojstvima jedne ili više struk ­
turno srodnih tvari ili mješavina tih tvari, podatke koji ukazuju na jaku kiselost ili lužnatost ispitivane tvari (2)(3) i rezultate validiranih 
i prihvaćenih in vitro  ili ex vivo  ispitivanja (4)(5)(5a). Ova bi analiza 
trebala smanjiti potrebu za  in vivo  ispitivanjima nagrizaju ćeg/nadra­ 
žujućeg djelovanja tvari na kožu, za koje u tom smislu postoji ve ć 
dovoljno dokaza na temelju drugih studija.
 
Strategija sekvencijskog ispitivanja kojoj se daje prednost i koja 
uključuje provo đenje validiranih i prihva ćenih in vitro  i ex vivo  
ispitivanja nagrizaju ćih/nadražuju ćih svojstava tvari sadržana je u 
Dodatku ovoj metodi. Ova je strategija razvijena u okviru radionice u organizaciji OECD-a (6) i sudionici te radionice jednoglasno je 
preporučuju, a usvojena je kao preporu čena strategija ispitivanja u 
okviru Globalno uskla đenog sustava klasifikacije kemijskih 
tvari (GHS) (7). Preporu ča se primjena ove strategije prije ispitivanja  
in vivo . Kad su u pitanju nove tvari, za ispitivanja se preporu ča fazni 
pristup, kako bi se o nagrizaju ćim/nadražuju ćim svojstvima ispiti ­
vane tvari dobili znanstveno ispravni podaci. Kad su u pitanju otprije poznate tvari o čijem nagrizaju ćem/nadražuju ćem djelovanju 
na kožu i o či nema dovoljno podataka, istu strategiju treba primije ­
niti za dopunu podataka. Za primjenu druga čije strategije ili postupka 
ispitivanja, odnosno za odluku da se ne primijeni metoda faznog ispitivanja, treba navesti razloge.
 
Ako se nagrizaju ća i nadražuju ća svojstva ne mogu utvrditi na 
temelju analize ve ć postojećih znanstvenih dokaza, u skladu sa stra ­
tegijom sekvencijskog ispitivanja, treba razmotriti mogu ćnost provo ­ 
đenja ispitivanja  in vivo  (vidjeti Dodatak).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 240
 
1.2. DEFINICIJE  
Nadraživanje kože:  uzrokovanje reverzibilnog ošte ćenja kože nakon 
primjene ispitivane tvari tijekom razdoblja od najviše 4 sata.  
Nagrizanje kože:  uzrokovanje ireverzibilnog ošte ćenja kože; to čnije, 
pojava vidljive nekroze epiderme i derme, nakon primjene ispitivane 
tvari tijekom razdoblja od najviše 4 sata. Za nagrizanje kože tipi čna 
je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, do kraja opažanja od 
14 dana, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, čitave površine 
zahvaćene alopecijom (gubitak dlake) i ožiljci. Za ocjenjivanje 
sumnjivih lezija treba razmotriti mogu ćnost histopatoloških pretraga.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Jedna doza ispitivane tvari nanosi se na kožu pokusne životinje; 
netretirani dijelovi kože pokusne životinje služe za kontrolu. Stupanj nadraženosti/nagriženosti kože o čitava se i bilježi u odre ­ 
đenim vremenskim intervalima i zatim se dodatno opisuje kako bi 
se mogla napraviti kompletna ocjena u činaka. Studija treba trajati 
dovoljno dugo da bude mogu će ocijeniti jesu li opaženi u činci rever ­
zibilni ili ireverzibilni.
 
Životinje koje pokazuju stalne znakove jakog stresa i/ili boli u bilo 
kojoj fazi ispitivanja treba humano usmrtiti, a ispitivanu tvar ocijeniti 
s tim u skladu. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmr ­ 
ćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate mogu se na ći 
u referentnoj literaturi pod brojem (8).  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema za ispitivanje  in vivo  
1.4.1.1.  Odabir životinjske vrste  
Preporuča se korištenje albino kuni ća, i to zdravih odraslih primje ­
raka. U slu čaju da se koristi neka druga životinjska vrsta, treba 
navesti razloge za to.  
1.4.1.2.  Priprema životinja  
Otprilike 24 sata prije ispitivanja životinjama se s le đnog dijela trupa 
uklanja dlaka šišanjem neposredno uz kožu. Pritom treba paziti da se koža ne ošteti, a treba koristiti samo životinje sa zdravom, netak ­
nutom kožom.
 
Kod nekih su sojeva kuni ća određeni dijelovi kože prekriveni vrlo 
gustom dlakom, što je posebno izraženo u odre đeno doba godine. Na 
takvima se gusto obraslim dijelovima kože ispitivanja ne bi smjela obavljati.
 
1.4.1.3.  Uvjeti držanja i hranjenja životinja  
Životinje trebaju biti smještene pojedina čno. Temperatura prostorije 
za držanje pokusnih životinja, kad su u pitanju kuni ći, treba biti 
20 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 
30 % i po mogu ćnosti ne više od 70 %, osim za vrijeme čišćenja 
prostorije, treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati 
mraka. Što se ti če hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana 
za laboratorijske životinje uz neograni čene količine pitke vode.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 241
 
1.4.2.  Ispitni postupak  
1.4.2.1.  Nanošenje ispitivane tvari  
Ispitivanu tvar treba nanijeti na malu površinu (približno 6 cm  2 ) kože 
i prekriti gazenom krpicom koju treba pri čvrstiti nenadražuju ćom 
ljepljivom trakom. U slu čajevima kad izravno nanošenje nije 
moguće (npr. teku ćine ili neke paste) ispitivanu tvar treba nanijeti 
na gazenu krpicu koja se zatim stavi na kožu. Krpicu treba držati 
labavo u kontaktu s kožom pomo ću odgovaraju ćeg poluokluzivnog 
obloga tijekom čitavog razdoblja izlaganja. Ako se ispitivana tvar 
nanese na krpicu, na kožu je treba pri čvrstiti na takav na čin da se 
ostvari dobar kontakt izme đu tvari i kože i da tvar bude jednoliko 
raspoređena po koži. Životinju treba sprije čiti da dosegne kompresu i 
tvar unese u organizam kroz usta ili udisanjem.  
Tekuće ispitivane tvari op ćenito se koriste nerazrije đene. Kad se 
ispituju krute tvari (koje mogu biti usitnjene u prah (ako se to 
smatra potrebnim), ispitivanu tvar treba navlažiti najmanjom mogućom količinom vode (ili, prema potrebi, nekim drugim odgo ­
varajućim nosačem) dovoljnom da omogu ći dobar kontakt s kožom. 
Kad se koriste drugi nosa či, a ne voda, potencijalni utjecaj nosa ča na 
nadraženost kože izazvanu ispitivanom tvari treba biti minimalan, ili nikakav.
 
Na kraju izlaganja koje obi čno traje četiri sata, ostatke ispitivane 
tvari treba ukloniti po mogu ćnosti vodom ili odgovaraju ćim otapa­
lom, ne mijenjaju ći nastalu reakciju ili integritet epiderme.  
1.4.2.2.  Visina doze  
Na pripremljeni dio kože nanosi se od 0,5 ml tvari u teku ćem obliku 
ili 0,5 g u krutom obliku ili u obliku paste.  
1.4.2.3.  Inicijalni test (ispitivanje nadražuju ćih/nagrizaju ćih svojstava in vivo 
na jednoj životinji)  
Posebno se preporu ča da se ispitivanje  in vivo  najprije provede na 
jednoj životinji, posebno ako se pretpostavlja da bi ispitivana tvar mogla imati nagrizaju ća svojstva. Ova je preporuka u skladu sa 
strategijom sekvencijskog ispitivanja (vidjeti Dodatak 1).
 
Ako se na temelju postoje ćih znanstvenih dokaza ocijeni da je neka 
tvar nagrizaju ća, daljnja ispitivanja na životinjama nisu potrebna. U 
načelu, za ve ćinu tvari za koje se sumnja da imaju nagrizaju ća svoj­
stva in vivo  ispitivanja nisu potrebna. Me đutim, u slu čajevima kad se 
zbog nedovoljnih dokaza osje ća da bi trebalo prikupiti dodatne poda ­
tke, mogu se provesti ograni čena ispitivanja na životinjama primje ­
njujući sljedeći pristup: na kožu jedne životinje u slijedu se stavljaju 
najviše tri krpice. Prva se krpica uklanja nakon tri minute. Ako se na koži ne uo či jaka reakcija stavlja se druga krpica koja se uklanja 
nakon jednog sata. Ako se na temelju opažanja u ovoj fazi može 
zaključiti da ne bi bilo nehumano produžiti izlaganje, stavlja se tre ća 
krpica koja se uklanja nakon četiri sata i utvr đuje stupanj reakcije.
 
Ako se nakon bilo kojega od tri izlaganja u nizu opazi nagrizaju će 
djelovanje, ispitivanje se odmah prekida. Ako se nakon uklanjanja 
prve krpice ne uo či nagrizaju će djelovanje, životinje se opažaju 14 
dana, osim u slu čaju da do nagrizanja do đe ranije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 242
 
U slučajevima kad se ne o čekuje da će ispitivana tvar uzrokovati 
nagrizanje, ali da može biti nadražuju ća treba na jednu životinju 
staviti jednu krpicu i držati je četiri sata.  
1.4.2.4.  Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja kože in vivo na dodatnim 
životinjama)  
Ako se tijekom inicijalnog testa ne opazi nagrizaju ći učinak, nadra ­ 
žujući učinak ili negativan nalaz treba potvrditi ispitivanjem na 
najviše dvije dodatne životinje, od kojih na svaku treba primijeniti po jednu krpicu u trajanju od četiri sata. Ako se tijekom inicijalnog 
testa opazi nadražuju ći učinak, potvrdni se test može izvesti sekven ­
cijski, ili istovremenim izlaganjem dviju dodatnih životinja. U iznimnim slu čajevima kod kojih se inicijalni test ne provodi, može 
se tretirati dvije ili tri životinje sa po jednom krpicom koja se nakon 
četiri sata uklanja. Ako pri korištenju dviju životinja obje pokažu istu 
reakciju, daljnje ispitivanje nije potrebno. U suprotnom se ispitivanju podvrgava i tre ća životinja. Nejasne reakcije ponekad treba ocijeniti 
ispitivanjem na dodatnim životinjama.
 
1.4.2.5.  Razdoblje opažanja  
Opažanje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvr ­
diti reverzibilnost opažanih u činaka. Me đutim pokus treba prekinuti 
u bilo kojem trenutku ako životinja pokazuje trajne znakove jake 
boli ili stresa. Da bi se utvrdila reverzibilnost u činaka, životinje 
treba opažati do 14 dana nakon uklanjanja krpica. Ako se reverzi ­
bilnost utvrdi prije isteka 14 dana, pokus odmah treba prekinuti.  
1.4.2.6.  Klini čka opažanja i stupnjevanje reakcija na koži  
Sve životinje treba pregledati kako bi se vidjelo pokazuju li znakove 
crvenila kože (eritema) ili oteklina (edema) i to nakon 60 minuta, a 
zatim nakon 24, 48 i 72 sata po skidanju krpice. Stupanj reakcije na 
koži utvr đuje se i bilježi prema stupnjevima opisanim u donjoj 
tablici. Ako se na koži pojavi ošte ćenje koje se nakon 72 sata ne 
može definirati kao nadraženost ili nagriženost, možda će za utvr ­ 
đivanje reverzibilnosti u činaka biti potrebno opažanje u trajanju od 
14 dana. Uz opažanja vezana uz nadraženost kože treba detaljno opisati i zabilježiti sve lokalne toksi čke učinke, kao što je isušivanje 
kože, i sve sustavne štetne u činke (npr. klini čki znakovi toksi čnosti i 
promjene u tjelesnoj masi). U slu čaju nejasnih reakcija treba obaviti 
histopatološki pregled.
 
Stupnjevanje kožnih reakcija po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi 
se poboljšala uskla đenost u stupnjevanju kožnih reakcija te da bi se u 
tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i laboratorijima u kojima 
se obavljaju opažanja i tuma če rezultati, osoblje koje obavlja te 
poslove treba pro ći odgovaraju ću obuku za primjenu sustava ocje ­
njivanja (vidjeti tablicu dolje). Od pomo ći bi mogao biti i ilustrirani 
priručnik za utvr đivanje stupnja nadraženosti i drugih lezija kože (9).  
2. PODACI  
2.1. TUMA ČENJE REZULTATA  
Rezultate studije, koji obuhva ćaju sve stavke iz odjeljka 3.1., treba 
rezimirati u obliku tablice u kona čnom izvješ ću o ispitivanju.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 243
 
2.2. OCJENA REZULTATA  
Pokazatelje nadraženosti kože treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju 
lezija i o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedina čni 
rezultati ne predstavljaju apsolutni standard za nadražuju ća svojstva 
nekog materijala, budu ći da se ocjenjuju i njegovi drugi u činci. 
Umjesto toga, na pojedina čne rezultate treba gledati kao na refe ­
rentne vrijednosti koje se ocjenjuju u kombinaciji sa svim ostalim opažanjima iz studije.
 
Kod ocjenjivanja nadraženosti kože treba uzeti u obzir reverzibilnost 
lezija. Ako reakcije kao što su alopecija (ograni čena površina), hiper ­
keratoza, hiperplazija i perutanje ostanu prisutne do kraja 14- dnevnog razdoblja opažanja, ispitivanu tvar treba smatrati nadražu ­
jućom.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
Razloge za ispitivanje  in vivo : analiza postoje ćih znanstvenih dokaza 
koji se temelje na ranijim ispitivanjima, uklju čujući rezultate dobi ­
vene primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja:  
— opis relevantnih podataka dobivenih ranijim ispitivanjima,  
— podaci dobiveni u svakoj fazi primijenjene strategije ispitivanja,  
— opis obavljenih  in vitro  ispitivanja, uklju čujući pojedinosti o 
postupku i rezultate dobivene ispitivanjem ispitivane/referentne 
tvari,  
— analiza postoje ćih znanstvenih dokaza radi provo đenja studije  in 
vivo. 
Ispitivana tvar:  
— identifikacijski podaci (npr. CAS broj, podrijetlo, čistoća, poznate 
nečistoće, broj šarže),  
— fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva (npr. pH, hlaplji ­
vost, topljivost, stabilnost)  
— ako se radi o mješavini, sastav i relativni postoci komponenata.  
Nosač: 
— identifikacijska oznaka, koncentracija (prema potrebi), upotrijeb ­
ljeni volumen,  
— obrazloženje za odabir nosa ča. 
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj, razlozi za korištenje drugih životinja 
umjesto albino kuni ća, 
— broj životinja svakog spola,  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku i na kraju 
ispitivanja,  
— starost na po četku studije,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 244
 
Uvjeti ispitivanja:  
— tehnika pripreme površine za stavljanje krpice,  
— pojedinosti o materijalu koji se koristi za krpice i tehnika 
primjene krpice,  
— pojedinosti o pripremi ispitivane tvari, nanošenju i uklanjanju.  
Rezultati:  
— tablični prikaz stupnjeva reakcije na nadraživanje/nagrizanje za 
svaku životinju za svako razdoblje opažanja,  
— opis svih opaženih lezija,  
— narativni opis vrste i stupnja opažene nadraženosti ili nagrizanja i 
svi histopatološki nalazi,  
— opis drugih štetnih lokalnih (npr. isušivanje kože) i sustavnih 
promjena koje se javljaju pored nadraživanja i nagrizanja kože.  
— Diskusija o rezultatima  
4. REFERENCE  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, str. 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicollogy  In Vitro , 2, str. 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, str. 709-720.  
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, „Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. 
(1998) The ECVAM international validation study on in vitro 
tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  12, str. 483-524.
 
(5a) Ispitna metoda B.40 Nagrizanje kože.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:// 
www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Envi ­
ronmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/mo ­
nos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
(Mogu se dobiti na zahtjev u tajništvu OECD-a).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 246
 
Tablica 1.  
UTVRĐIVANJE STUPNJA KOŽNE REAKCIJE  
Nastanak eritema i eshara (crvenila kože i krasta)  
Nema eritema  0  
Lagano izraženi eritemi (jedva uo čljivi)  1  
Dobro definirani eritemi  2  
Srednje do jako izraženi eritemi  3  
Jako izraženi eritemi (tamno crvenilo, poput boje govedine) uz stvaranje 
eshara koje spre čavaju utvr đivanje stupnja eritema  4  
Najviši mogu ći stupanj: 4  
Nastanak edema  
Nastanak edema  0  
Nema edema  1  
Lagani edemi (rubovi površine izdignuti i jasno definirani)  2  
Srednji edemi (izdignuti približno 1 mm)  3  
Jaki edemi (izdignuti više od 1 mm i šire se izvan površine izlaganja)  4  
Najviši mogu ći stupanj: 4  
U slučaju nejasnih reakcija može se obaviti histopatološki pregled.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 247
 
Dodatak  
A. Strategija sekvencijskog ispitivanja nadraživanja i nagrizanja kože  
OPĆENITA RAZMATRANJA  
U interesu ispravnog korištenja znanosti i dobrobiti životinja, važno je izbjegavati 
nepotrebno korištenje životinja i svesti na minimum sva ispitivanja koja bi mogla uzrokovati teške reakcije. Prije razmatranja mogu ćnosti ispitivanja neke tvari  in 
vivo treba procijeniti sve postoje će informacije koje se odnose na mogu ća nadra­ 
žujuća/nagrizaju ća svojstva predmetne tvari. Možda ve ć postoji dovoljno dokaza 
da se tvar može klasificirati s obzirom na njezino nagrizaju će ili nadražuju će 
djelovanje na kožu, bez potrebe za provo đenjem ispitivanja na laboratorijskim 
životinjama. Prema tome, primjenom analize ve ć postojećih znanstvenih dokaza i 
strategije sekvencijskog ispitivanja, potreba za ispitivanjima  in vivo  svest će se na 
minimum, što je posebno važno ako postoji vjerojatnost da će predmetna tvar 
izazvati teške reakcije.
 
Preporuča se korištenje analize postoje ćih znanstvenih dokaza kako bi se na 
temelju raspoloživih informacija o nadražuju ćem i nagrizaju ćem djelovanju 
tvari na kožu moglo ocijeniti je li potrebno obaviti neke druge studije koje ne uključuju ispitivanja na koži  in vivo , i koje bi pomogle u karakterizaciji takvog 
potencijala tvari. U slu čajevima kad su potrebna daljnja istraživanja preporu ča se 
primjena sekvencijske strategije ispitivanja kako bi se postupno došlo do rele ­
vantnih pokusnih podataka. Kad se radi o tvarima koje nisu bile prethodno ispitane, treba primijeniti strategiju sekvencijskog ispitivanja kako bi se dobila skupina podataka koji su relevantni za ocjenjivanje potencijala ispitivane tvari da 
na kožu djeluje nagrizaju će/nadražuju će. Strategija opisana u ovom Dodatku 
razvijena je u okviru jedne OECD-ove radionice (1), a kasnije je potvr đena i 
proširena u sklopu Uskla đenog integriranog sustava za klasifikaciju opasnosti od 
štetnog djelovanja kemijskih tvari na ljudsko zdravlje i okoliš, koji je odobren na 
28. zajedni čkom sastanku Odbora za kemikalije i radne skupine za kemikalije, u 
studenome 1998. (2).
 
Iako ova strategija sekvencijskog ispitivanja nije sastavni dio ispitne metode B.4, 
ona odražava preporu čeni pristup utvr đivanju nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelo­
vanja tvari na kožu. Ovaj pristup predstavlja najbolje prakti čno i etičko polazište 
za in vivo  ispitivanja vezana uz nadraživanje/nagrizanje kože. Ova ispitna metoda 
daje smjernice za izvo đenje in vivo  ispitivanja i sažeti prikaz faktora na koje je 
potrebno obratiti pozornost prije razmatranja takvog ispitivanja. Strategija sekvencijskog ispitivanja odre đuje pristup ocjenjivanju postoje ćih podataka o 
nadražuju ćem/nagrizaju ćem djelovanju ispitivanih tvari na kožu i slojeviti 
pristup dobivanju relevantnih podataka o tvarima za koje su potrebne dodatne studije, ili za koje studije još nisu provedene. Prema toj se strategiji isto tako preporučuje provo đenje validiranih i prihva ćenih in vitro  ili ex vivo  ispitivanja 
nagrizajućeg/nadražuju ćeg djelovanja tvari na kožu u odre đenim okolnostima.
 
OPIS STRATEGIJE OCJENJIVANJA I ISPITIVANJA  
Prije obavljanja ispitivanja u okviru strategije sekvencijskog ispitivanja (Slika), 
treba ocijeniti sve raspoložive informacije kako bi se utvrdilo je li  in vivo  ispi­
tivanje na koži uop će potrebno. Iako se ocjenjivanjem pojedina čnih parametara 
mogu dobiti zna čajne informacije (npr. ekstremni pH), treba imati na umu cjelo ­
vitost postoje ćih informacija. Kod donošenja odluke na temelju postoje ćih znan­
stvenih dokaza, treba ocijeniti sve relevantne podatke o djelovanju predmetne 
tvari, ili tvari koje su joj sli čne, te navesti na čemu se odluka temelji. Naglasak 
prvenstveno treba staviti na postoje će podatke o djelovanju tvari na ljude i 
životinje, a odmah iza tog slijede rezultati ispitivanja  in vitro  ili ex vivo . Kad 
god je mogu će treba izbjegavati studije nagrizaju ćih tvari  in vivo . Čimbenici koje 
treba uzeti u obzir u strategiji ispitivanja uklju čuju: ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 248
 
Ocjenjivanje postoje ćih podataka dobivenih ispitivanjima na ljudima i životi ­
njama (Faza 1.).  Najprije treba razmotriti postoje će podatke o djelovanju na 
ljude npr. klini čke ili profesionalne studije i izvješ ća o pojedinim slu čajevima 
i/ili podatke o ispitivanjima na životinjama, npr. na temelju ispitivanja toksi čkog 
djelovanja na kožu pri jednokratnoj ili višekratnoj izloženosti, budu ći da se tako 
dobiju informacije koje se izravno odnose na djelovanje na kožu. Tvari za koje 
se zna da djeluju nadražuju će ili nagrizaju će i tvari za koje postoje jasni dokazi 
da nemaju niti nagrizaju ća niti nadražuju ća svojstva, ne moraju se ispitivati u  in 
vivo studijama.  
Analiza odnosa strukture i djelovanja (SAR) (Faza 2.).  Treba uzeti u obzir 
rezultate ispitivanja strukturno srodnih tvari, ako takvi rezultati postoje. Ako 
ima dovoljno podataka o djelovanju strukturno srodnih tvari ili mješavina 
takvih tvari na ljude i/ili životinje, iz kojih je vidljiv njihov potencijal za nagri ­
zanje/nadraživanje kože, može se pretpostaviti da će ispitivana tvar koja je 
predmet procjene proizvesti iste reakcije. U takvim slu čajevima može se utvrditi 
da predmetnu tvar nije potrebno ispitivati. Negativni rezultati proizašli iz studija strukturno srodnih tvari ili mješavina takvih tvari ne čine dovoljan dokaz da tvar 
nije nagrizaju ća/nadražuju ća, u skladu sa strategijom sekvencijskog ispitivanja. 
Za utvrđivanje nagrizaju ćeg i nadražuju ćeg potencijala tvari treba primijeniti 
validirani i prihva ćeni SAR pristup.
 
Fizikalno-kemijska svojstva i kemijska reaktivnost (Faza 3.).  Tvari koje pokazuju 
ekstremne pH vrijednosti kao npr. ≤ 2,0 i ≥ 11,5 mogu imati jako lokalno 
djelovanje. Ako ekstremna pH vrijednost predstavlja osnovu po kojoj se neka tvar svrstava kao nagrizaju ća za kožu, onda se isto tako može uzeti u obzir 
njezina kisela/alkalna rezerva (ili puferski kapacitet) (3)(4). Ako se na temelju 
puferskog kapaciteta može zaklju čiti da neka tvar možda ne nagriza kožu, da bi 
se to potvrdilo treba obaviti daljnja ispitivanja, pri čemu se preporu ča primjena 
nekog validiranog i prihva ćenog  in vitro  ili ex vivo  testa. (vidjeti faze 5. i 6.).
 
Dermalna toksi čnost (Faza 4.)  Ako se za neku kemikaliju dokaže da je jako 
toksična kad se unese u organizam preko kože,  in vivo  ispitivanje nadražuju ćeg/ 
nagrizajućeg djelovanja na kožu se ne preporu ča budući da količina ispitivane 
tvari koja se obi čno nanosi može biti viša od vrlo toksi čne doze, pa prema tome 
može uzrokovati smrt ili jako trpljenje životinja. Osim toga, ako su ve ć na albino 
kunićima provedene studije dermalne toksi čnosti do grani čne visine doze od 
2 000 mg/kg tjelesne mase ili više, a da pritom nisu opaženi znakovi nadraženosti ili nagrizanja kože, dodatna ispitivanja nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelovanja 
mogu biti sasvim nepotrebna. Kod procjene akutne dermalne toksi čnosti na 
temelju prethodnih studija treba imati na umu nekoliko stvari. Na primjer, zabi ­
lježeni podaci o kožnim lezijama mogu biti nepotpuni. Ispitivanja i opažanja možda nisu bila provedena na kuni ćima već na nekoj drugoj životinjskoj vrsti, 
a vrste se mogu znatno razlikovati po osjetljivosti, odnosno po reakcijama. Isto 
tako oblik ispitivane tvari primijenjene na životinje možda nije bio prikladan za ocjenjivanje nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelovanja na kožu (npr. tvari za ispiti ­
vanje dermalne toksi čnosti u razrije đenom obliku (5)). Me đutim, u slu čajevima 
kad su dobro uobli čene i provedene studije dermalne toksi čnosti bile provedene 
na kunićima, negativni nalazi mogu se smatrati dovoljnim dokazom da tvar nije 
nagrizajuća odnosno nadražuju ća.
 
Rezultati in vitro ili ex vivo ispitivanja (faze 5. i 6.).  Tvari koje su pokazale 
nagrizajuća ili jaka nadražuju ća svojstva kod validiranih i prihva ćenih ispitivanja  
in vitro  ili ex vivo  (6)(7) koja su bila osmišljena za ocjenjivanje upravo tih 
učinaka, ne treba ispitivati na životinjama. Može se pretpostaviti da će te tvari 
proizvesti sli čne učinke in vivo . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 249
 
In vivo ispitivanja na kuni ćima (faze 7. i 8.).  U slučaju da se na temelju posto ­
jećih znanstvenih dokaza donese odluka o provo đenju ispitivanja  in vivo , ono 
treba zapo četi inicijalnim testom na jednoj životinji. Ako rezultati tog testa 
pokažu da tvar nagriza kožu, daljnja ispitivanja ne treba provoditi. Ako se u inicijalnom testu ne opazi nagrizaju će djelovanje tvari, njezino nadražuju će djelo­
vanje ili negativnu reakciju treba potvrditi na dvije dodatne životinje koje se 
četiri sata izlažu ispitivanoj tvari. Ako se kod inicijalnog testa opazi nadražuju će 
djelovanje, potvrdni se test može obaviti sekvencijski ili istovremenim izlaganjem dviju dodatnih životinja.
 
REFERENCE  
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECDWor ­
kshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 
1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). An Evaluation of the Proposed OECD 
Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, str. 709-720.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology  In Vitro , 
2(1), str. 19-26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 56032-356-6, Chapter 31, str. 411-436.
 
(6) Ispitna metoda B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  12, str. 
483-524.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 250
 
Slika  
STRATEGIJA ISPITIVANJA I OCJENJIVANJA NADRAŽUJU ĆEG/NAGRIZAJU ĆEG 
DJELOVANJA NA KOŽU
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 251
 
B.5. AKUTNA TOKSI ČNOST: NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE 
OČIJU 
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 405 (2002.).  
1.1 UVOD  
Kod pripreme ove nove dopunjene metode posebna pozornost posve ­ 
ćena je mogu ćim poboljšanjima u smislu procjenjivanja svih posto ­
jećih informacija o ispitivanoj tvari kako bi se izbjeglo nepotrebno 
ispitivanje na laboratorijskim životinjama i pridonijelo njihovoj 
dobrobiti. Ova metoda sadrži preporuku da se prije provo đenja 
opisanog  in vivo  ispitivanja akutnog nagrizaju ćeg/nadražuju ćeg 
djelovanja tvari na o či obavi analiza ve ć postojećih relevantnih znan ­
stvenih dokaza (1). Ako nema dovoljno raspoloživih podataka, 
preporuča se njihovo prikupljanje kroz primjenu sekvencijskog ispi ­
tivanja (2)(3). Strategija ispitivanja uklju čuje provo đenje validiranih i 
prihvaćenih ispitivanja  in vitro , a opisana je u Dodatku ispitnoj 
metodi. Osim toga, preporu ča se primjena testa na nadraživanje/na ­
grizanje kože kako bi se nagrizaju će djelovanje na o či moglo pred ­
vidjeti prije razmatranja mogu ćnosti provo đenja in vivo  ispitivanja na 
očima. 
U interesu ispravnog korištenja znanosti i dobrobiti životinja, ispiti ­
vanja  in vivo  ne bi smjela do ći u obzir sve dok se primjenom analize 
postojećih znanstvenih dokaza ne procijene svi raspoloživi podaci 
koji su relevantni za nagrizaju će/nadražuju će djelovanje predmetne 
tvari na o či. Takvi će podaci obuhva ćati dokaze koji proizlaze iz 
postojećih studija provedenih na ljudima i/ili laboratorijskim životi ­
njama, dokaze o nagrizaju ćim/nadražuju ćim svojstvima jedne ili više 
strukturno srodnih tvari ili mješavina tih tvari, podatke koji ukazuju 
na jaku kiselost ili lužnatost ispitivane tvari (4)(5) i rezultate validi ­
ranih i prihva ćenih in vitro  ili ex vivo  ispitivanja (6)(6a). Te studije 
mogu se obaviti prije analize postoje ćih znanstvenih dokaza, ili 
mogu proiza ći iz te analize.  
Kod nekih tvari takva analiza može ukazati na potrebu za  in vivo  
ispitivanjem potencijalnog nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelovanja tvari 
na oči. U svim se takvim slu čajevima prije razmatranja primjene  in 
vivo testa na o čima preporu ča provesti  in vivo  studiju djelovanja tvari 
na kožu i ocijeniti je u skladu s Ispitnom metodom B.4. (7). 
Primjena analize postoje ćih znanstvenih dokaza i strategija sekvencij ­
skog ispitivanja trebala bi smanjiti potrebu za  in vivo  ispitivanjem 
nagrizajućeg/nadražuju ćeg djelovanja tvari na o či, za koje postoje 
dostatni dokazi iz drugih studija. Ako se potencijal tvari za nagriza ­
juće ili nadražuju će djelovanje na o či ne može odrediti primjenom 
strategije sekvencijskog ispitivanja, čak ni nakon provedene  in vivo  
studije nagrizaju ćeg i nadražuju ćeg djelovanja na kožu,  in vivo  ispi­
tivanje nagrizaju ćeg/nadražuju ćeg djelovanja na o či smije se 
provesti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 252
 
Strategija sekvencijskog ispitivanja kojoj se daje prednost i koja 
uključuje provo đenje validiranih i prihva ćenih in vitro  i ex vivo  
ispitivanja nagrizaju ćih/nadražuju ćih svojstava tvari sadržana je u 
Dodatku ovoj metodi. Ova je strategija razvijena u okviru radionice u organizaciji OECD-a (8) i sudionici te radionice jednoglasno je 
preporučuju, a usvojena je kao preporu čena strategija ispitivanja u 
okviru Globalno uskla đenog sustava klasifikacije kemijskih 
tvari (GHS) (9). Primjena ove strategije preporu ča se prije ispitivanja  
in vivo . Kad su u pitanju nove tvari, za ispitivanja se preporu ča fazni 
pristup, kako bi se o nagrizaju ćim/nadražuju ćim svojstvima tih tvari 
dobili znanstveno ispravni podaci. Kad su u pitanju otprije poznate tvari o čijem nagrizaju ćem/nadražuju ćem djelovanju na kožu i o či 
nema dovoljno podataka, istu strategiju treba primijeniti za dopunu 
podataka. Za primjenu druga čije strategije ili postupka ispitivanja, 
odnosno za odluku da se ne primijeni metoda faznog ispitivanja, treba navesti razloge.
 
1.2. DEFINICIJE  
Nadraživanje oka:  promjene na oku koje su rezultat primjene ispi ­
tivane tvari na vanjsku površinu oka i koje su potpuno reverzibilne u roku 21 dan nakon primjene tvari.
 
Nagrizanje oka:  oštećenja oka, ili ozbiljno fizi čko pogoršanje vida, 
koje je rezultat primjene ispitivane tvari na vanjsku površinu oka i 
koje nisu u potpunosti reverzibilne u roku 21 dan nakon primjene 
tvari.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Jedna doza ispitivane tvari primjenjuje se na jedno oko pokusne 
životinje; netretirano oko služi za kontrolu. Stupanj nadraženosti/na ­
griženosti oka ocjenjuje se na temelju zabilježenih lezija o čne spoj­
nice (sluznice), rožnice i šarenice u odre đenim intervalima. Opisuju 
se i ostale promjene na oku, kao i sustavne promjene, kako bi se 
osigurala kompletna procjena djelovanja tvari. Studija treba trajati 
dovoljno dugo da se ocijeni reverzibilnost, odnosno ireverzibilnost učinaka.
 
Životinje koje pokazuju stalne znakove jakog stresa i/ili boli u bilo 
kojoj fazi ispitivanja treba humano usmrtiti, a ispitivanu tvar ocijeniti 
s tim u skladu. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmr ­ 
ćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate mogu se na ći 
u referentnoj literaturi pod brojem (10).  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema za ispitivanje  in vivo  
1.4.1.1.  Odabir životinjske vrste  
Preporuča se korištenje albino kuni ća, i to zdravih odraslih primje ­
raka. U slu čaju da se koristi neka druga životinjska vrsta, treba 
navesti razloge za to.  
1.4.1.2.  Priprema životinja  
Oba oka svake pokusne životinje odabrane za ispitivanje treba 
pregledati 24 sata prije po četka ispitivanja. Životinje kod kojih se 
utvrdi nadraženost o čiju, očni defekti ili ve ć postojeća ozljeda 
rožnice ne smiju se koristiti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 253
 
1.4.1.3.  Uvjeti držanja i hranjenja životinja  
Životinje trebaju biti smještene pojedina čno. Kad su u pitanju kuni ći, 
temperatura prostorije u kojoj se životinje drže treba biti 20 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba biti najmanje 30 % i 
po mogućnosti ne više od 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, 
treba je nastojati održavati na 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i mora se u slijedu izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se ti če hranjenja, može se primjenjivati standardna 
hrana za laboratorijske životinje uz neograni čene količine pitke vode.
 
1.4.2.  Ispitni postupak  
1.4.2.1.  Primjena ispitivane tvari  
Ispitivanu tvar treba staviti u konjunktivalnu vre ćicu jednog oka 
svake životinje, pri čemu donji kapak treba lagano odmaknuti od 
očne jabučice. Kapke zatim treba lagano držati spojenima oko 
jedne sekunde da bi se sprije čilo istjecanje materijala. Drugo oko 
koje se ne tretira služi za kontrolu.  
1.4.2.2.  Ispiranje  
Oči pokusnih životinja ne smiju se ispirati najmanje 24 sata od 
primjene ispitivane tvari, osim ako su u pitanju krute tvari (vidjeti 
odjeljak 1.4.2.3.2.) te u slu čaju da odmah do đe do nagrizaju ćeg ili 
nadražuju ćeg djelovanja. Nakon 24 sata o či se mogu isprati, ako se 
to smatra potrebnim.  
Upotreba satelitske skupine životinja za istraživanje utjecaja ispiranja 
ne preporu čuje se ako za to ne postoji znanstveno opravdanje. Ako 
je satelitska skupina potrebna, treba upotrijebiti dva kuni ća. Uvjete 
ispiranja treba detaljno dokumentirati, npr. vrijeme ispiranja; sastav i temperatura otopine za ispiranje; trajanje, koli čina i brzina primjene 
otopine.
 
1.4.2.3.  Visina doze  
1.4.2.3.1.  Ispitivanje teku ćina 
Za ispitivanje teku ćina koristi se doza od 0,1 ml. Sprejevi na 
pumpicu ne smiju se koristiti za primjenu tvari izravno na oko. 
Ako je teku ćina u spreju, najprije je treba istisnuti u posudu, iz 
nje uzeti 0,1 ml i nakapati u oko.  
1.4.2.3.2.  Ispitivanje krutih tvari  
Kad se ispituju krute tvari, paste i tvari u obliku čestica, volumen 
korištene doze treba iznositi 0,1 ml, odnosno njena masa ne smije 
biti veća od 100 mg. Ispitni materijal treba biti usitnjen u fini prah. 
Volumen krutog materijala treba izmjeriti nakon što se lagano nati ­
sne, npr. lupkanjem po mjernoj posudi. Ako kruta tvar nije odstra ­
njena iz oka pokusne životinje djelovanjem fizioloških mehanizama 
kod prvog opažanja, jedan sat nakon tretiranja oko se može isprati 
fiziološkom otopinom ili destiliranom vodom.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 254
 
1.4.2.3.3. Ispitivanje aerosola  
U slučaju sprejeva na pumpicu i aerosola, prije kapanja u oko prepo ­
ruča se tekućinu staviti u posudu. Jedini izuzetak čine tvari u obliku 
aerosola pod tlakom koje se u posudu ne mogu staviti zbog hlaplje ­
nja. U takvim slu čajevima oko treba držati otvorenim i ispitivanu 
tvar nanijeti na oko jednostavnim prskanjem u trajanju od oko 1 
sekunde, s udaljenosti od oko 10 cm ravno ispred oka. Ova 
razdaljina može varirati ovisno o tlaku i sadržaju spreja. Mora se paziti da ne do đe do ošte ćenja oka koje može izazvati tlak spreja. U 
nekim slu čajevima može biti potrebno procijeniti mogu ćnost „meha ­
ničkih” ozljeda koje bi mogao izazvati jaki mlaz iz spreja.
 
Procjena doze iz aerosola može se napraviti simuliranjem testa na 
sljedeći način:tvar se spreja na papir za vaganje kroz otvor veli čine 
oka kunića postavljen ravno ispred papira. Pove ćanje težine papira 
približno odgovara koli čini tekućine koja se naspreja u oko. Kod 
hlapljivih tvari doza se može utvrditi vaganjem posude u koju se naspreja ispitivana tvar prije i nakon pražnjenja posude.
 
1.4.2.4.  Inicijanli test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na 
jednoj životinji).  
Kako je navedeno u strategiji sekvencijskog ispitivnja (vidjeti 
Dodatak 1.), čvrsta je preporuka da se test  in vivo  na početku 
provodi samo na jednoj životinji.  
Ako rezultati ovog testa pokažu da tvar uz primjenu opisanog 
postupka djeluje na oko nagrizaju će ili jako nadražuju će, daljnja 
ispitivanja nadraživanja oka ne smiju se provoditi.  
1.4.2.5.  Lokalni anestetici  
Od slučaja do slu čaja mogu se upotrijebiti lokalni anestetici. Ako 
analiza postoje ćih znanstvenih dokaza pokaže da bi ispitivana tvar 
mogla izazvati bol, ili ako inicijalno ispitivanje pokaže da će doći do 
bolne reakcije, prije primjene ispitivane tvari može se upotrijebiti 
neki lokalni anestetik. Vrstu, koncentraciju i dozu lokalnog aneste ­
tika treba pažljivo odabrati kako bi se osiguralo da njegova upotreba neće izazvati druga čiju reakciju životinje na ispitivanu tvar. Aneste ­
ziju treba primijeniti i na kontrolno oko.
 
1.4.2.6.  Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na 
dodatnim životinjama)  
Ako se nagrizaju će djelovanje ne opazi tijekom inicijalnog testa, 
nadražuju ću ili negativnu reakciju treba potvrditi koriste ći do dvije 
dodatne životinje. Ako se tijekom inicijalnog testa opazi jako nadra ­ 
žujuće djelovanje koje upu ćuje na mogu ći jaki (ireverzibilni) u činak 
kod potvrdnog testa, preporuka je da se potvrdni test obavi sekven ­
cijski, na jednoj po jednoj životinji, a ne da se istodobno izlože dvije dodatne životinje. Ako se na drugoj životinji otkrije nagrizaju će ili 
jako nadražuju će djelovanje, ispitivanje se ne nastavlja. U slu čaju 
slabih ili srednje jakih nadražuju ćih učinaka može se ukazati 
potreba za korištenjem dodatnih životinja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 255
 
1.4.2.7.  Razdoblje opažanja  
Opažanje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvr ­
diti jačina i reverzibilnost opaženih u činaka. Me đutim, pokus treba 
prekinuti čim životinja po čne pokazivati trajne znakove jake boli ili 
stresa (9). Da bi se utvrdila reverzibilnost u činaka, životinje obi čno 
treba opažati 21 dan od primjene ispitivane tvari. Ako se reverzibil ­
nost uoči prije 21. dana, pokus treba odmah prekinuti.  
1.4.2.7.1.  Klinička opažanja i stupnjevanje reakcija oka  
Oči treba pregledati nakon jednog, 24, 48 i 72 sata od primjene 
ispitivane tvari. Životinje ne treba držati u uvjetima ispitivanja duže nego što je potrebno za dobivanje kona čnih rezultata. Životinje 
koje pokazuju znakove trajne jake boli ili stresa treba bez odlaganja 
humano usmrtiti, a tvar ocijeniti u skladu s tim. Životinje kod kojih 
se nakon primjene tvari uo če sljedeće lezije oka treba humano usmr ­
titi: perforacija ili znatna ulceracija rožnice, uklju čujući stafilom; krv 
u prednjoj o čnoj komori; zamu ćenje rožnice 4. stupnja u trajanju od 
48 sati; nedostatak svjetlosnog refleksa (reakcija šarenice 2. stupnja) 
u trajanju od 72 sata; ulceracija konjunktivalne membrane; nekroza očne spojnice (konjunktive) ili tre ćeg kapka (membrane nictitans); ili 
ljuštenje. Razlog je tome što takve lezije op ćenito nisu reverzibilne.
 
Životinje kod kojih se ne pojave o čne lezije mogu se usmrtiti 
najranije tri dana nakon primjene tvari. Životinje s laganim do srednjim lezijama treba opažati dok lezije ne nestanu ili 21 dan, 
kada se ispitivanje prekida. Opažanja treba provoditi sedmi, 14., i 
21. dan kako bi se utvrdilo stanje lezija i njihova reverzibilnost ili i reverzibilnost.
 
Kod svakog pregleda treba zabilježiti stupnjeve reakcija oka (o čne 
spojnice, rožnice i šarenice) (Tablica 1.). Isto tako treba zabilježiti 
bilo kakve druge lezije oka (npr. panus, obojenje), kao i sustavne štetne učinke.
 
Pregled reakcija može se olakšati upotrebom binokularne lupe, ru čne 
slit-lampe, biomikroskopa i drugih prikladnih pomagala. Nakon bilje ­ 
ženja opažanja nakon 24 sata, o či se mogu dodatno pregledati 
pomoću fluoroesceina.  
Stupnjevanje o čnih reakcija po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi se 
poboljšala uskla đenost u stupnjevanju kožnih reakcija te da bi se u 
tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i laboratorijima u kojima se obavljaju opažanja i tuma če rezultati, osoblje koje obavlja te 
poslove treba pro ći odgovaraju ću obuku za primjenu sustava 
ocjenjivanja.
 
2. PODACI  
2.2. OCJENA REZULTATA  
Pokazatelje nadraženosti o čiju treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju 
lezija i o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedina čni 
rezultati ne predstavljaju apsolutni standard za nadražuju ća svojstva 
nekog ispitnog materijala, budu ći da se ocjenjuju i njegovi drugi 
učinci. Umjesto toga, na pojedina čne rezultate treba gledati kao na 
referentne vrijednosti koje imaju zna čenje samo ako su potkrijepljene 
potpunim opisom i ocjenom svih opažanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 256
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
razlozi za ispitivanje  in vivo:  analiza postoje ćih znanstvenih dokaza 
koji se temelje na ranijim ispitivanjima, uklju čujući rezultate dobi ­
vene primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja:  
— opis relevantnih podataka dobivenih ranijim ispitivanjima,  
— podaci dobiveni u svakoj fazi strategije ispitivanja,  
— opis obavljenih  in vitro  ispitivanja, uklju čujući pojedinosti o 
postupku i rezultate dobivene ispitivanjem ispitivane/referentne 
tvari,  
— opis obavljene  in vivo  studije nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelo­
vanja na kožu, uklju čujući dobivene rezultate,  
— analiza postoje ćih znanstvenih dokaza radi provo đenja studije  in 
vivo. 
Ispitivana tvar:  
— identifikacijski podaci (npr. CAS broj, podrijetlo, čistoća, poznate 
nečistoće, broj šarže),  
— fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva (npr. pH, hlaplji ­
vost, topljivost, stabilnost, reaktivnost s vodom),  
— ako se radi o mješavini, sastav i relativni postotci komponenata,  
— ako se koristi lokalni anestetik, identifikacijska oznaka, čistoća, 
vrsta, doza i mogu ća interakcija s ispitivanom tvari.  
Nosač: 
— identifikacijska oznaka, koncentracija (prema potrebi), upotrijeb ­
ljeni volumen,  
— obrazloženje za odabir nosa ča. 
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj, razlozi za korištenje drugih životinja 
umjesto albino kuni ća, 
— starost svake životinje na po četku studije,  
— broj životinja svakog spola u ispitnim i kontrolnim skupinama 
(prema potrebi),  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku i na kraju 
ispitivanja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.  
Rezultati:  
— opis upotrijebljene metode za utvr đivanje stupnja nadraženosti 
kod svakog opažanja (npr. ru čna slit-lampa, biomikroskop, fluo ­
rescein),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 257
 
— tablični prikaz podataka o reakcijama na nadraživanje/nagrizanje 
za svaku životinju kod svakog opažanja sve do izlu čivanja živo ­
tinje iz ispitivanja,  
— narativni opis stupnja i vrste opažene nadraženosti ili nagriženo ­
sti, 
— opis svih drugih lezija opaženih na oku (npr. vaskularizacija, 
formiranje panusa, adhezije),  
— opis štetnih lokalnih i sustavnih štetnih u činaka koji nisu na oku i 
histopatološki nalazi, ako postoje.  
Diskusija o rezultatima.  
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Ekstrapolacija rezultata studija nadraživanja oka kod laboratorijskih 
životinja na ljude valjana je samo do odre đene granice. U mnogim 
slučajevima albino kuni ći puno su osjetljiviji na tvari koje nadražuju 
ili nagrizaju o či. 
Pri tumačenju podataka treba paziti da se isklju či nadraženost uzro ­
kovana sekundarnom infekcijom.  
4. REFERENCE  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, str. 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, str. 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, str. 161-177  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicollogy  In Vitro , 2, str. 19-26.  
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, str. 227-231.
 
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  In Vitro  12, str. 483-524.
 
(6a) Ispitna metoda B.40 Nagrizanje kože.  
(7) Ispitna metoda B.4. Akutna toksi čnost: nadraživanje/nagrizanje 
kože.  
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:// 
www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 258
 
(9) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6. 
htm).
 
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Envi ­
ronmental Health and Safety Publications. Series on Testing 
and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos. 
htm).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 259
 
Tablica 1.  
STUPNJEVANJE O ČNIH LEZIJA  
Rožnica  
Zamućenost: stupanj neprozirnosti (treba o čitati vrijednosti za najneprozirniji dio 
rožnice (*) 
Nema ulceracije ni zamu ćenosti  0  
Razbacana ili difuzna podru čja zamućenosti (osim blagog zamu ćenja 
normalnog sjaja); detalji šarenice jasno vidljivi  1  
Jasno vidljiva prozirna podru čja; detalji šarenice lagano zasjenjeni  2  
Sedefasta podru čja; nisu vidljivi detalji šarenice; veli čina zjenice jedva 
vidljiva  3  
Zamućena rožnica: šarenica se ne razaznaje zbog zamu ćenosti  4  
Najviši mogu ći stupanj: 4  
NAPOMENE  
(*) Podru čje zamućenosti rožnice treba zabilježiti  
Šarenica  
Normalno  0  
Izrazito produbljeni nabori, kongestija, oteklina, umjerena hiperemija 
oko rožnice; ili kongestija (proširenje krvnih sudova); šarenica reagira na svjetlo (usporena reakcija smatra se takvim u činkom ispitivane tvari)
 1  
Krvarenje, veliko ošte ćenje, ili nema reakcije na svjetlo  2  
Najviši mogu ći stupanj: 2  
Očna spojnica (konjunktiva)  
Crvenilo (odnosi se na palpebralnu i bulbarnu konjunktivu; isklju čujući rožnicu i 
šarenicu) 
Normalno  0  
Neki krvni sudovi hiperemi čni (pokazuju abnormalnu akumulaciju krvi)  1  
Difuzna, skarletno crvena boja; pojedina čni sudovi ne mogu se jasno 
razaznati  2  
Difuzno tamno crvenilo (boje mesa)  3  
Najviši mogu ći stupanj: 3  
Kemoza  
Oteklina (odnosi se na kapak i/ili tre ći kapak) 
Normalno  0  
Oteklina nešto iznad normale  1  
Očita oteklina, s djelomi čnim iskretanjem kapka prema van (everzija)  2  
Oteklina, kapak napola zatvoren  3  
Oteklina, kapak više od napola zatvoren  4  
Najviši mogu ći stupanj: 4  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 260
 
Dodatak  
Strategija sekvencijskog ispitivanja nadražuju ćeg i nagrizaju ćeg djelovanja 
na oko  
OPĆENITA RAZMATRANJA  
U interesu ispravne primjene znanosti i dobrobiti životinja važno je izbjegavati 
nepotrebno korištenje životinja i svesti na minimum ispitivanja koja bi mogla 
uzrokovati teške reakcije kod životinja. Prije nego bi došlo u obzir ispitivanje  in 
vivo, treba procijeniti sve postoje će informacije o nekoj tvari, vezane uz mogu će 
nadražuju će/nagrizaju će djelovanje te tvari na o či. Možda ve ć postoji dovoljno 
dokaza da se tvar može klasificirati s obzirom na njezino nagrizaju će ili nadra ­ 
žujuće djelovanje na o či, bez potrebe za provo đenjem ispitivanja na laboratorij ­
skim životinjama. Prema tome, primjenom analize postoje ćih znanstvenih dokaza 
i strategije sekvencijskog ispitivanja potreba za  in vivo  ispitivanjima svodi se na 
minimum, posebno ako postoji vjerojatnost da će tvar izazvati teške reakcije.  
Preporuča se korištenje analize postoje ćih znanstvenih dokaza kako bi se na 
temelju raspoloživih informacija o nadražuju ćem i nagrizaju ćem djelovanju 
tvari na o či moglo ocijeniti je li potrebno obaviti neke druge studije koje ne 
uključuju ispitivanja na o čima in vivo  i koje bi pomogle u karakterizaciji takvog 
potencijala tvari. Ako su potrebne dodatne studije, za dobivanje relevantnih pokusnih podataka preporu ča se primjena strategije sekvencijskog ispitivanja. 
Kada se radi o tvarima koje nikada nisu bile podvrgnute ispitivanjima, treba 
primijeniti strategiju sekvencijskog ispitivanja kako bi se dobili relevantni podaci za ocjenjivanje njezinog nagrizaju ćeg/nadražuju ćeg djelovanja na o či. 
Strategija ispitivanja opisana u Dodatku razvijena je u okviru jedne OECD-ove 
radionice (1). Kasnije je potvr đena i proširena u sklopu Uskla đenog integriranog 
sustava za klasifikaciju opasnosti od štetnog djelovanja kemijskih tvari na ljudsko zdravlje i okoliš, koji je odobren na 28. zajedni čkom sastanku Odbora za kemi ­
kalije i radne skupine za kemikalije, održanom u studenome 1998. (2).
 
Iako ova strategija ispitivanja ne čini sastavni dio ispitne metode B.5., ona 
odražava preporu čeni pristup utvr đivanju nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg djelovanja 
tvari na o či. Ovaj pristup predstavlja najbolje prakti čno i etičko polazište za  in 
vivo ispitivanja vezana uz nadraživanje/nagrizanje o čiju. Ova ispitna metoda daje 
smjernice za izvo đenje in vivo  ispitivanja i sažeti prikaz faktora na koje je 
potrebno obratiti pozornost prije razmatranja takvog ispitivanja. Strategija 
sekvencijskog ispitivanja odre đuje pristup ocjenjivanju postoje ćih podataka o 
nadražuju ćem/nagrizaju ćem djelovanju ispitivanih tvari na o či i slojeviti pristup 
dobivanju relevantnih podataka o tvarima za koje su potrebne dodatne studije, ili za koje studije još nisu provedene. Prema toj strategiji najprije se provode vali ­
dirana i prihva ćena ispitivanja  in vitro  ili ex vivo , a nakon tog studije nadražu ­
jućeg/nagrizaju ćeg djelovanja na kožu u odre đenim uvjetima, prema ispitnoj 
metodi B.4. (3)(4).
 
OPIS STRATEGIJE FAZNOG ISPITIVANJA  
Prije obavljanja ispitivanja u okviru strategije sekvencijskog ispitivanja (Slika), 
treba procijeniti sve raspoložive informacije kako bi se utvrdilo je li  in vivo  
ispitivanje na o čima uopće potrebno. Iako se ocjenjivanjem pojedina čnih para­
metara mogu dobiti zna čajne informacije (npr. ekstremni pH), treba procijeniti 
cjelovitost postoje ćih informacija. Kod donošenja odluke na temelju postoje ćih 
znanstvenih dokaza, treba ocijeniti sve relevantne podatke o djelovanju pred ­
metne tvari, ili tvari koje su joj sli čne o strukturi, te navesti na čemu se 
odluka temelji. Naglasak prvenstveno treba staviti na postoje će podatke o djelo ­
vanju tvari na ljude i životinje, a odmah iza tog slijede rezultati ispitivanja  in 
vitro  ili ex vivo . Studije nagrizaju ćih tvari  in vivo  treba izbjegavati kad god je 
moguće. Čimbenici koje treba uzeti u obzir u strategiji ispitivanja uklju čuju: ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 261
 
Ocjenjivanje postoje ćih podataka dobivenih ispitivanjima na ljudima i životi ­
njama (Faza 1.).  Najprije treba razmotriti postoje će podatke o djelovanju na 
ljude npr. klini čke i profesionalne studije i izvješ ća o pojedinim slu čajevima 
i/ili podatke o ispitivanjima na životinjama u okviru studija o djelovanju na oči, budući da se tako dobiju informacije koje se izravno odnose na djelovanje 
na oči. Nakon tog treba ocijeniti raspoložive podatke dobivene na temelju studija 
provedenih na ljudima i/ili životinjama, predmet kojih je bilo istraživanje nagri ­
zajućeg/nadražuju ćeg djelovanja na kožu. U o či životinja ne smiju se stavljati 
tvari za koje se zna da djeluju nadražuju će ili nagrizaju će na oči, kao ni tvari 
koje su pokazale nagrizaju će ili nadražuju će djelovanje na kožu; takve se tvari 
smatraju nagrizaju ćima i/ili nadražuju ćima i za o či. Tvari za koje na temelju 
prijašnjih studija na o čima postoji dovoljno dokaza da nemaju niti nagrizaju ća 
niti nadražuju ća svojstva isto se tako ne moraju ispitivati u  in vivo  studijama.
 
Analiza odnosa strukture i djelovanja (SAR) (Faza 2.).  Treba uzeti u obzir 
rezultate ispitivanja strukturno srodnih tvari, ako takvi postoje. Ako ima dovoljno 
podataka o djelovanju strukturno srodnih tvari ili mješavina takvih tvari na ljude i/ili životinje, iz kojih je vidljiv njihov potencijal za nagrizanje/nadraživanje očiju, može se pretpostaviti da će ispitivana tvar proizvesti iste reakcije. U 
takvim slu čajevima može se utvrditi da predmetnu tvar nije potrebno ispitivati. 
Negativni rezultati proizašli iz studija strukturno srodnih tvari ili mješavina takvih tvari ne čine dovoljan dokaz da tvar nije nagrizaju ća/nadražuju ća u 
skladu sa strategijom sekvencijskog ispitivanja. Za utvr đivanje nagrizaju ćeg i 
nadražuju ćeg potencijala tvari, s obzirom na njezino djelovanje i na kožu i o či, 
treba primijeniti validirani i prihva ćeni SAR pristup.
 
Fizikalno-kemijska svojstva i kemijska reaktivnost (Faza 3.).  Tvari koje pokazuju 
ekstremne pH vrijednosti kao npr. ≤ 2,0 ili ≥ 11,5 mogu imati jako lokalno 
djelovanje. Ako ekstremna pH vrijednost predstavlja osnovu po kojoj se neka 
tvar svrstava kao nagrizaju ća ili nadražuju ća za oči, onda se isto tako može uzeti 
u obzir njezina kisela/alkalna rezerva (ili puferski kapacitet) (5)(6). Ako se na temelju puferskog kapaciteta može zaklju čiti da neka tvar možda ne nagriza o či, 
da bi se to potvrdilo treba obaviti daljnja ispitivanja, pri čemu se preporu ča 
primjena nekog validiranog i prihva ćenog  in vitro  ili ex vivo  testa. (vidjeti faze 
5. i 6.).
 
Razmatranje drugih postoje ćih informacija (Faza 4.).  U ovoj fazi treba prou čiti 
sve raspoložive informacije o sustavnoj toksi čnosti kod primjene dermalnim 
putem. Isto tako treba uzeti u obzir i akutnu dermalnu toksi čnost ispitivane 
tvari. Ako se ispitivana tvar pokazala vrlo toksi čnom kod primjene dermalnim 
putem, može se zaklju čiti da je nije potrebno ispitivati na o čima. Iako ne mora 
uvijek postojati povezanost izme đu akutne dermalne toksi čnosti i nadraživanja/ 
nagrizanja o čiju, može se pretpostaviti da će neko sredstvo koje je vrlo toksi čno 
kad se primjenjuje dermalnim putem isto tako pokazati visoku toksi čnost ako se 
nakapa u oko. Takvi se podaci isto tako mogu razmatrati izme đu faza 2. i 3.  
Rezultati in vitro ili ex vivo ispitivanja (faze 5. i 6.).  Tvari koje su pokazale 
nagrizajuća ili jaka nadražuju ća svojstva kod ispitivanja  in vitro  ili ex vivo  (7)(8) 
koja su bila validirana i prihva ćena posebno za ocjenjivanje nagrizaju ćeg/nadra­ 
žujućeg djelovanja na o či ili kožu, ne treba ispitivati na životinjama. Može se 
pretpostaviti da će te tvari proizvesti sli čne učinke in vivo . Ako ne postoje 
validirani i prihva ćeni testovi  in vitro/ex vivo , treba presko čiti faze 5. i 6. i 
odmah prije ći na fazu 7.  
In vivo procjena nadražuju ćeg ili nagrizaju ćeg djelovanja tvari (Faza 7.).  Ako se 
analiza postoje ćih znanstvenih dokaza o potencijalnim nadražuju ćim/nagrizaju ćim 
svojstvima neke tvari, koji se temelje na podacima iz gore navedenih studija ne može napraviti jer nema dovoljno takvih dokaza, najprije treba ocijeniti nadra ­ 
žujući/nagrizaju ći potencijal tvari ispitivanjem  in vivo  na koži, primjenjuju ći 
ispitnu metodu B.4. (4) i njezin Dodatak (9). Ako se pokaže nagrizaju ćom ili 
jako nadražuju ćom za kožu, treba se smatrati isto tako nagrizaju ćom i nadražu ­
jućom za oči, ako neke druge informacije ne idu u prilog druga čijem zaklju čku. 
Tada nema potrebe za provo đenjem ispitivanja  in vivo . Ako tvar nije nagrizaju ća 
ili jako nadražuju ća za kožu,  in vivo  ispitivanje treba provesti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 262
 
In vivo  ispitivanje na kuni ćima (faze 8 i 9):  in vivo  ispitivanje na o čima treba 
započeti inicijalnim testom na jednoj životinji. Ako rezultati tog testa pokažu da 
tvar jako nadražuje ili nagriza o či, daljnja ispitivanja ne bi se smjela provoditi. 
Ako se tim testom ne utvrdi nikakvo nagrizaju će ili nadražuju će djelovanje, 
provodi se potvrdni test na dvije dodatne životinje.  
REFERENCE  
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22- 
24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, str. 161-177.  
(4) Ispitna metoda B.4. Akutna toksi čnost: nadraživanje/nagrizanje kože.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicolohy  In Vitro , 27, 
str. 19-26.  
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, str. 
227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  12, str. 
483-524.
 
(8) Ispitna metoda B.40. Nagrizanje kože.  
(9) Dodatak ispitnoj metodi B.4: Sekvencijska ispitna strategija za nadraživanje 
i nagrizanje kože.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 263
 
Slika  
STRATEGIJA ISPITIVANJA I OCJENJIVANJA NADRAŽUJU ĆEG/NAGRIZAJU ĆEG 
DJELOVANJA NA O ČI
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 264
 
▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 265
 
B.6. SENZIBILIZACIJA KOŽE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Napomene:  
Osjetljivost testova i njihova sposobnost otkrivanja mogu ćih senzi­
bilizatora ljudske kože smatraju se važnima u sustavu klasifikacije 
toksičnosti relevantne za ljudsko zdravlje.  
Ne postoji niti jedna ispitna metoda kojom se na primjeren na čin 
mogu utvrditi sve tvari koje mogu senzibilizirati ljudsku kožu i koja 
je relevantna za sve tvari.  
Pri odabiru testa treba uzeti u obzir čimbenke kao što su fizikalna 
svojstva predmetne tvari, uklju čujući njezinu sposobnost prodiranja u 
kožu.  
Razvijene su dvije vrste testova koji se provode na zamorcima: 
testovi u kojima se koristi adjuvans, kod kojih se alergijska reakcija pojačava otapanjem ili suspendiranjem ispitivane tvari u Freundovom 
potpunom adjuvansu (FCA) i testovi u kojima se adjuvans ne koristi.
 
U načelu su testovi kod kojih se upotrebljava adjuvans to čniji u 
predviđanju vjerojatnog senzibilizacijskog u činka tvari na ljudsku 
kožu od onih kod kojih se Freundov potpuni adjuvans ne upotreb ­
ljava, pa su zato kao metoda primjereniji.  
Maksimizacijski test sa zamorcima (GPMT) često je primjenjivani 
test s adjuvansom. Iako se može koristiti nekoliko drugih metoda za 
utvrđivanje potencijala tvari da prouzro či senzibilizacijsku reakciju 
kože, GPMT se smatra najprimjerenijom tehnikom u kojoj se koristi adjuvans.
 
Za mnoge se kemijske klase manje osjetljivima smatraju testovi u 
kojima se adjuvans ne koristi (preferira se Buehlerov test).  
U određenim slučajevima mogu postojati utemeljeni razlozi za odabir 
Buehlerovog testa u kojem se ispitivana tvar primjenjuje lokalno, a 
ne intramedalnom injekcijom koja se koristi u maksimizacijskom 
testu sa zamorcima. U slu čajevima kad se koristi Buehlerov test 
potrebno je dati znanstveno opravdanje.  
Maksimizacijski test na zamorcima (GPMT) i Buehlerov test opisani 
su u ovoj metodi. Druge se metode mogu koristiti ako su ispravno 
validirane i znanstveno opravdane.  
Ako se kod nekog priznatog testa probira utvrdi pozitivan rezultat, 
ispitivana se tvar može odrediti kao potencijalni senzibilizator pa nije 
potrebno provoditi daljnja ispitivanja na zamorcima. Me đutim, ako 
se kod takvog testa utvrdi negativan rezultat, mora se provesti ispi ­
tivanje na zamorcima, uz primjenu postupka opisanog u ovoj ispitnoj 
metodi.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 266
 
1.2. DEFINICIJE  
Senzibilizacija kože:  (alergijski kontaktni dermatitis) imunološki 
posredovana kožna reakcija na odre đenu tvar. Kod ljudi reakciju 
može karakterizirati pruritis (svrbež), eritemi (crvenilo), edemi (otek ­
line), papule (kožne izbo čine), vezikule (mjehuri ći), bule (mjehuri) ili 
kombinacija navedenog. Kod drugih životinjskih vrsta reakcije se mogu razlikovati, te se mogu javiti samo eritemi i edemi.
 
Indukcijsko izlaganje:  pokusno izlaganje subjekta ispitivanoj tvari s 
namjerom izazivanja stanja preosjetljivosti.  
Indukcijsko razdoblje:  razdoblje od najmanje jednog tjedna nakon 
indukcijske izloženosti tijekom kojega se može razviti stanje 
preosjetljivosti.  
Provokacijsko izlaganje:  pokusno izlaganje prethodno tretiranog 
subjekta ispitivanoj tvari nakon indukcijskog razdoblja, kako bi se 
utvrdilo javlja li se kod subjekta reakcija preosjetljivosti.  
1.3. REFERENTNE TVARI:  
Osjetljivost i pouzdanost pokusne tehnike koja se koristi treba ocje ­
njivati svakih šest mjeseci pomo ću tvari za koje se zna da izazivaju 
blagu do srednju preosjetljivost kože.  
Kod pravilno provedenog ispitivanja tvari koje izazivaju blagu do 
srednju preosjetljivost treba o čekivati reakciju od najmanje 30 % u 
testu u kojem se adjuvans koristi i najmanje 15 % u testu u kojem se 
adjuvans ne koristi.  
Prvenstveno se upotrebljavaju sljede će tvari:  
CAS brojevi  EINECS brojevi  EINECS nazivi  Uobi čajeni nazivi  
101-86-0  202-983-3  α-heksilcinamaldehid  α-heksilcinamaldehid  
149-30-4  205-736-8  benzotiazol-2-tiol (merkapto ­
benzotiazol)  kaptaks  
94-09-7  202-303-5  benzokain  norkain  
U nekim se okolnostima, ako za to postoji primjereno opravdanje, 
mogu koristiti neke druge kontrolne tvari koje ispunjavaju gore nave ­
deni kriterije.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Na početku se pokusne životinje izlažu ispitivanoj tvari intrame ­
dalnim injekcijama i/ili epidermalnim nanošenjem (indukcijsko izla ­
ganje). Nakon razdoblja odmora od 10 do 14 dana (indukcijsko 
razdoblje), tijekom kojega se može razviti imuna reakcija, životinje 
se izlažu provokacijskoj dozi. Obim i stupanj kožne reakcije na provokacijsku izloženost kod pokusnih životinja uspore đuje se s 
reakcijama opaženim kod kontrolnih životinja koje se tijekom induk ­
cije podvrgavaju simuliranom tretiranju i primaju provokacijsku 
dozu.
 
1.5. OPIS ISPITNIH METODA  
Ako se uklanjanje ispitivane tvari smatra neophodnim, to treba 
učiniti vodom ili odgovaraju ćom otopinom, ne izazivaju ći promjene 
u postoje ćoj reakciji i ne narušavaju ći cjelovitost epiderme.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 267
 
1.5.1.  Maksimizacijski test na zamorcima (GPMT)  
1.5.1.1. P r i p r e m a  
Zdravi mladi odrasli albino zamorci prilago đavaju se laboratorijskim 
uvjetima najmanje pet dana prije ispitivanja. Životinje se prije testa nasumce biraju i raspore đuju u skupine za tretiranje. Dlaka se odstra ­
njuje šišanjem, brijanjem ili eventualno kemijskom depilacijom, 
ovisno o ispitnoj metodi koja se koristiti. Mora se paziti da se 
pritom ne ošteti površina kože. Životinje se važu prije nego ispiti ­
vanje zapo čne i na kraju ispitivanja.
 
1.5.1.2. U v j e t i i s p i t i v a n j a  
1.5.1.2.1. Pokusne životinje  
Koriste se albino zamorci sojeva koji se obi čno koriste u 
laboratorijima.  
1.5.1.2.2. Broj i spol  
Mogu se koristiti mužjaci i/ili ženke. Ako se koriste ženke, treba 
koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.  
Koristi se najmanje 10 životinja u skupini za tretiranje i najmanje pet 
životnija u kontrolnoj skupini. Ako se upotrijebi manje od 20 poku ­
snih i 10 kontrolnih zamoraca i pritom nije mogu će zaključiti da 
ispitivana tvar spada u senzibilizatore, posebno se preporu ča ispiti­
vanje na dodatnim životinjama kako bi se dobio ukupan broj od 
najmanje 20 pokusnih i 10 kontrolnih životinja.  
1.5.1.2.3. Visina doza  
Koncentracija ispitivane tvari koja se koristi za svako indukcijsko 
izlaganje treba biti koncentracija koju životinja sustavno dobro 
podnosi i najviša koncentracija koja izaziva blagu do srednju nadra ­ 
ženost kože. Koncentracija koja se koristi za provokacijsko izlaganje treba odgovarati najvišoj dozi koja ne izaziva nadraženost. Odgova ­
rajuće koncentracije treba utvrditi na temelju pilotske studije prove ­
dene na dvije ili tri životinje, ako nisu raspoložive druge informacije. Treba paziti da se za tu svrhu koriste životinje tretirane uz primjenu potpunog Freundovog adjuvansa (FCA).
 
1.5.1.3. P o s t u p a k  
1.5.1.3.1. Indukcija  
Dan 0 – tretirana skupina  
U području ramena, s kojega je prethodno odstranjena dlaka, daju se 
tri para intradermalnih injekcija volumena 0,1 ml, po jedna injekcija 
iz svakog para sa svake strane zamišljene središnje linije.  
Injekcija 1: mješavina 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina.  
Injekcija 2: ispitivana tvar u odabranoj koncentraciji u odgovaraju ćoj 
otopini.  
Injekcija 3: ispitivana tvar u odabranoj koncentraciji, formulirana u 
mješavini 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina.  
U injekciji 3 tvari topljive u vodi otopljene su u vodenoj fazi prije 
miješanja s potpunim Freundovim adjuvansom (FCA). Tvari koje su topljive u mastima ili netopljive suspendiraju se u potpunom Freun ­
dovom adjuvansu (FCA) prije miješanja s vodenom fazom. Kona čna 
koncentracija ispitivane tvari mora biti jednaka koncentraciji upotri ­
jebljenoj u injekciji 2.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 268
 
Injekcije 1 i 2 daju se blizu jedna drugoj i najbliže glavi, dok se 
injekcija 3 daje više prema kaudalnom (zadnjem) kraju ispitne povr ­ 
šine. 
Dan 0 – kontrolna skupina  
Na ista podru čja kao i kod tretiranih životinja daju se po tri para 
intradermalnih injekcija volumena 0,1 ml.  
Injekcija 1: mješavina 1:1 (v/v) FCA/voda ili fiziološka otopina.  
Injekcija 2: nerazrije đeni nosač. 
Injekcija 3: 50 %-tna w/v formulacija nosa ča u mješavini 1:1 (v/v) 
FCA/voda ili fiziološka otopina.  
Dan 5-7 – tretirana i kontrolna skupina  
Oko 24 sata prije lokalne indukcijske primjene, ako tvar ne nadra ­ 
žuje kožu, ispitna se površina nakon šišanja uz kožu i/ili brijanja tretira s 0,5 ml 10 %-tne otopine natrijevog lauril sulfata u vazelinu, 
kako bi se izazvala lokalna nadraženost.
 
Dan 6-8 – tretirana skupina  
S ispitne površine se ponovo odstranjuje dlaka. Filtarski papir (2 × 
4 cm), potpuno se natopi ispitivanom tvari u odgovaraju ćem nosaču, 
stavi na ispitnu površinu i drži u kontaktu s kožom 48 sati pomo ću 
okluzivnog obloga. Treba navesti razloge za odabir nosa ča. Krute se 
tvari usitne u fini prah i sjedine u odgovaraju ćem nosaču. Prema 
potrebi, teku ćine se mogu nanositi nerazrije đene. 
Dan 6-8 – kontrolna skupina  
S ispitne se površine ponovo odstranjuje dlaka. Na sli čan se način na 
ispitnu površinu nanosi sami nosa č i pomoću okluzivnog obloga drži 
u kontaktu s kožom 48 sati.  
1.5.1.3.2. Provokacija  
Dan 20-22 – tretirana i kontrolna skupina  
Sa slabina tretiranih i kontrolnih životinja odstrani se dlaka. Krpica 
ili okluzivna komora (HTC) s ispitivanom tvari stavi se na jednu stranu slabina životinje i, ako je to relevantno za pokus, isto se tako može staviti jedna krpica ili okluzivna komora (HTC) koja sadrži 
samo nosa č. Krpice se 24 sata drže u kontaktu s kožom pomo ću 
okluzivnog obloga.
 
1.5.1.3.3. Opažanje i ocjenjivanje: tretirana i kontrolna skupina  
— oko 21 sat nakon skidanja komprese provokacijska površina se 
opere i ošiša uz kožu i/ili obrije i, ako je potrebno, depilira,  
— oko tri sata kasnije (oko 48 sati od po četka provokacijske 
primjene) kožna se reakcija opaža i bilježi prema stupnjevima prikazanim u Dodatku,
 
— oko 24 sata nakon ovog opažanja provodi se drugo opažanje (72 
sata), a rezultati se ponovo bilježe.  
Preporuča se slijepa proba na pokusnim i kontrolnim životinjama.  
Ako rezultate dobivene u prvoj provokaciji treba pojasniti, treba 
razmotriti mogu ćnost izvedbe druge provokacije (tj. ponovne provo ­
kacije) na novoj kontrolnoj skupini, tamo gdje je to primjereno, oko 
tjedan dana nakon prve provokacije. Ponovna provokacija može se 
jednako tako provesti na istoj kontrolnoj skupini.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 269
 
Sve kožne reakcije i sve neuobi čajene nalaze, uklju čujući sustavne 
reakcije, koji proizlaze iz indukcijskog i provokacijskog postupka 
treba opažati i bilježiti prema skali za stupnjevanje po Magnussonu/ Kligmanu (vidjeti Dodatak). U svrhu pojašnjavanja dvojbenih rezul ­
tata mogu se provoditi i drugi postupci, npr. histopatološki pregled, 
mjerenje debljine kožnih nabora.
 
1.5.2.  Buehlerov test  
1.5.2.1. P r i p r e m a  
Zdravi mladi odrasli albino zamorci prilago đavaju se laboratorijskim 
uvjetima najmanje pet dana prije ispitivanja. Životinje se prije testa 
nasumce biraju i raspore đuju u skupine za tretiranje. Dlaka se odstra ­
njuje šišanjem, brijanjem ili eventualno kemijskom depilacijom, ovisno o ispitnoj metodi koja će se koristiti. Mora se paziti da se 
pritom ne ošteti površina kože. Životinje se važu prije po četka ispi­
tivanja i na kraju ispitivanja.
 
1.5.2.2. U v j e t i i s p i t i v a n j a  
1.5.2.2.1. Pokusne životinje  
Koriste se albino zamorci sojeva koji se obi čno koriste u 
laboratorijima.  
1.5.2.2.2. Broj i spol  
Mogu se koristiti mužjaci i/ili ženke. Ako se koriste ženke, treba 
koristiti one koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.  
Koristi se najmanje 20 životinja u skupini za tretiranje i najmanje 10 
životinja u kontrolnoj skupini.  
1.5.2.2.3. Visina doza  
Koncentracija ispitivane tvari koja se koristi za svako indukcijsko 
izlaganje treba biti najviša mogu ća koncentracija koja izaziva blagu, 
a ne pretjeranu nadraženost kože. Koncentracija koja se koristi za provokacijsko izlaganje treba odgovarati najvišoj dozi koja ne izaziva nadraženost. Ako je potrebno, odgovaraju će koncentracije 
mogu se utvrditi na temelju pilotske studije provedene na dvije ili 
tri životinje.
 
Kad se radi o tvarima topljivima u vodi, kao nosa č je primjereno 
koristiti vodu ili razrije đenu nenadražuju ću otopinu surfaktanta. Za 
druge ispitivane tvari primjerenija je 80 %-tna mješavina etanola i 
vode za indukciju i aceton za provokaciju.  
1.5.2.3. P o s t u p a k  
1.5.2.3.1. Indukcija  
Dan 0 – tretirana skupina  
S jedne strane slabina odstrani se dlaka (šišanjem uz kožu). Ispitni 
epikutani sustav (patch sustav) treba biti potpuno natopljen ispiti ­
vanom tvari u odgovaraju ćem nosa ču (za odabir nosa ča treba 
navesti razloge; teku će ispitivane tvari mogu se prema potrebi primi ­
jeniti nerazrije đene).  
Ispitni epikutani sustav stavi se na ispitnu površinu i drži u kontaktu 
s kožom pomo ću okluzivne krpice ili komore (HTC) i odgovaraju ćeg 
obloga šest sati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 270
 
Ispitni epikutani sustav mora biti okluzivan. Primjereno je upotrije ­
biti pamu čnu blazinicu koja može biti okrugla ili četverokutna, 
približne površine 4-6 cm  2 . Da bi se osigurala okluzija preporu ča 
se životinju sputati pomo ću odgovaraju ćeg pomagala za sputavanje. 
Ako se upotrijebi oblog možda će biti potrebna dodatna izlaganja.  
Dan 0 – kontrolna skupina  
S jedne strane slabina odstrani se dlaka (šišanjem uz kožu). Na 
ispitnu se površinu nanese sami nosa č, na isti na čin koji se primje ­
njuje na tretiranu skupinu. Ispitni epikutani sustav drži se u kontaktu s kožom pomo ću okluzivne krpice ili komore (HTC) i odgovaraju ćeg 
obloga šest sati. Ako se može dokazati da lažna kontrolna skupina 
nije potrebna, može se upotrijebiti netretirana kontrolna skupina.
 
Dan 6-8 i 13-15 – tretirana i kontrolna skupina  
Na dan 6-8 i zatim ponovo na dan 13-15 ispitivana tvar se nanese 
jednako kao na dan 0 na isto podru čje (s kojeg se prema potrebi 
odstrani dlaka).  
1.5.2.3.2. Provokacija  
Dan 27-29 – tretirana i kontrolna skupina  
S netretirane strane slabina tretiranih i netretiranih životinja odstrani 
se dlaka (šišanjem uz kožu). Okluzivna krpica ili komora (HTC) koja sadrži odgovaraju ću količinu ispitivane tvari u maksimalnoj koncen ­
traciji koja ne izaziva nadraženost stavi se na stražnji dio netretirane 
strane slabina tretiranih i kontrolnih životinja.
 
U slučajevima kad je to relevantno, okluzivna krpica ili 
komora (HTC) natopljena samo nosa čem stavi se na prednji dio 
netretirane strane slabina kako tretiranih tako i kontrolnih životinja. Krpice ili komore (HTC) drže se u kontaktu s kožom pomo ću odgo­
varajućeg obloga šest sati.
 
1.5.2.3.3. Opažanje i ocjenjivanje  
— oko 21 sat nakon skidanja komprese s provokacijske se površine 
odstrani dlaka,  
— oko tri sata kasnije (oko 30 sati nakon primjene krpice za provo ­
kaciju) kožne se reakcije opažaju i bilježe prema stupnjevima 
prikazanim u Dodatku,  
— približno 24 sata nakon 30-satnog opažanja (oko 54 sata nakon 
stavljanja krpice za provokaciju) kožne se reakcije ponovo 
opažaju i bilježe.  
Preporuča se slijepa proba na pokusnim i kontrolnim životinjama.  
Ako je potrebno pojasniti rezultate dobivene u prvoj provokaciji, 
treba razmotriti mogu ćnost izvedbe druge provokacije (tj. ponovne 
provokacije) na novoj kontrolnoj skupini, tamo gdje je to primjereno, 
oko tjedan dana nakon prve provokacije. Ponovna provokacija može 
se provesti na istoj kontrolnoj skupini.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 271
 
Sve kožne reakcije i sve neuobi čajene nalaze, uklju čujući sustavne 
reakcije, koji proizlaze iz indukcijskog i provokacijskog postupka 
treba opažati i bilježiti prema skali za stupnjevanje po Magnussonu/ Kligmanu (vidjeti Dodatak). U svrhu pojašnjavanja dvojbenih rezul ­
tata mogu se provoditi i drugi postupci, npr. histopatološki pregled, 
mjerenje debljine kožnih nabora.
 
2. PODACI (GPMT i Buehlerov test)  
Podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će biti prikazane 
kožne reakcije za svaku životinju, zabilježene kod svakog opažanja.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE (GPMT i Buehlerov test)  
Ako se prije testa na zamorcima provede test probira, pored rezultata 
dobivenih s ispitivanom i referentnom tvari, mora se dati opis ili 
uputa na taj test (npr. test oticanja ušiju kod miševa (MEST) uklju ­ 
čujući detaljne podatke o postupku.  
Izvješće o ispitivanju (GPMT i Buehlerov test)  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
pokusne životinje:  
— upotrijebljeni soj zamoraca,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— tehnika pripremanja mjesta na koje će se staviti krpica,  
— pojedinosti o upotrijebljenim materijalima i tehnici stavljanja 
krpice,  
— rezultat pilotske studije sa zaklju čkom o indukcijskim i provoka ­
cijskim koncentracijama koje će se koristiti u ispitivanju,  
— pojedinosti o pripremi, nanošenju i uklanjanju ispitivane tvari,  
— obrazloženje za odabir nosa ča, 
— koncentracije nosa ča i ispitivane tvari, korištene pri indukcijskom 
i provokacijskom izlaganju i ukupna koli čina tvari upotrijebljene 
za indukciju i provokaciju.  
Rezultati:  
— kratki pregled rezultata zadnje provjere osjetljivosti i pouzdanosti 
(vidjeti 1.3.) uklju čujući informacije o upotrijebljenoj tvari, 
koncentraciji i nosa ču, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 272
 
— za svaku životinju, uklju čujući sustav stupnjevanja,  
— narativni opis vrste i stupnja opaženih u činaka,  
— svi histopatološki nalazi.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 273
 
Dodatak  
TABLICA  
Ljestvica stupnjevanja po Magnussonu/Klingmanu za ocjenjivanje reakcija 
kod provokacijskog epikutanog (patch) testa  
0 = nema vidljive promjene  
1 = lagani ili nepovezani (u obliku mrlja) eritem  
2 = srednji ili konfluentni (povezan u jednu cjelinu) eritem  
3 = jaki eritem i oteklina  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 274
 
B.7. 28-DNEVNO ISPITIVANJE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
GLODAVACIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 407 (2008.). 
Originalna Smjernica za ispitivanje 407 usvojena je 1981. 1995. usvojena je 
revidirana verzija kako bi se od životinja upotrijebljenih u ispitivanju dobile 
dodatne informacije, posebno o neurotoksi čnosti i imunotoksi čnosti.  
2. 1998. godine OECD je zapo čeo djelovanje visokog prioriteta radi revizije 
postojećih Smjernica za ispitivanje te radi razvoja novih Smjernica za 
preventivno ispitivanje i ispitivanje potencijalnih endokrinih ometa ča (8). 
Jedan od elemenata aktivnosti bilo je ažuriranje postoje će smjernice 
OECD za „28-dnevno ispitivanje oralne toksi čnosti na glodavacima uz 
primjenu ponavljanih doza” (TG 407) parametrima prikladnim za otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivanih kemikalija. Taj je postupak bio podvrgnut opsežnom me đunarodnom programu za ispitivanje relevantnosti i provedi ­
vosti dodatnih parametara, održavanja tih parametara za kemikalije s 
(anti)estrogenom, (anti)androgenom i (anti)tiroidnom aktivnoš ću, intra- i 
interlaboratorijske mjerne obnovljivosti te utjecanja novih parametara na parametre koje zahtijeva prethodna smjernica TG 407. Velika koli čina poda­
taka dobivenih na taj na čin prikupljena je i detaljno ocijenjena u opsežnom 
izvješću OECD-a (9). Ova ažurirana ispitna metoda B.7 (kao ekvivalent TG 
407) rezultat je iskustva i rezultata dobivenih tijekom me đunarodnog 
programa ispitivanja. Ova ispitna metoda omogu ćuje stavljanje odre đenih 
neizravnih endokrinih u činaka u kontekst s drugim toksikološkim u čincima.
 
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
3. Pri odre đivanju i ocjenjivanju toksi čnih svojstava kemikalije odre đivanje 
oralne toksi čnosti uz primjenu ponavljanih doza može se provesti nakon 
dobivanja po četnih informacija o toksi čnosti iz ispitivanja akutne toksi čno­
sti. Ova ispitna metoda namijenjena je istraživanju u činaka na vrlo širok 
spektar potencijalnih meta toksi čnosti. Pruža informacije o mogu ćnim rizi­
cima po zdravlje za koje je vjerojatno da će nastati iz ponovljenog izlaganja 
tijekom relativno ograni čenog vremenskog razdoblja, uklju čujući i učinke na 
živčani, imunološki i endokrini sustav. Što se ti če tih konkretnih kona čnih 
učinaka, treba identificirati kemikalije s neurotoksi čnim potencijalom koji 
može opravdati daljnja dublja istraživanja tog aspekta i kemikalija koje 
ometaju fiziologiju štitnja če. Također može pružiti podatke o kemikalijama 
koje poga đaju muške i/ili ženske reproduktivne organe u mladih odraslih 
životinja te može pružiti upozorenje na imunološke u činke.  
4. Rezultate ove ispitne metode B.7 treba upotrijebiti za identifikaciju 
opasnosti i procjenu rizika. Rezultate dobivene parametrima povezanima s endokrinim sustavom treba promatrati u kontekstu „ OECD Conceptual 
Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals ” 
(11). Ta metoda obuhva ća osnovno istraživanje toksi čnosti s ponavljanim 
dozama koje se može upotrijebiti za kemikalije za koje nije opravdano 90- dnevno ispitivanje (npr. ako proizvedena koli čina ne prelazi odre đene 
granice) ili kao preliminarno ispitivanje za neko dugotrajno ispitivanje. 
Izlaganje mora trajati 28 dana.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 275
 
5. Provedeni me đunarodni program za potvrdu parametara prikladnih za poten ­
cijalno otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivane kemikalije pokazao je da 
će kvaliteta podataka dobivenih ovom ispitnom metodom B.7 uvelike ovisiti 
o iskustvu ispitnog laboratorija. To se posebno dovodi u vezu s histopatolo ­ 
škim odre đivanjem cikli čkih promjena u ženskim reproduktivnim organima 
te s određivanjem mase malih organa koji ovise o hormonima koji se teško 
seciraju. Razvijena je smjernica za histopatologiju (19). Ona je dostupna na OECD-ovoj javnoj stranici o Smjernicama za ispitivanje. Namijenjena je kao pomo ć patolozima u njihovim pregledima i kao pomo ć pri pove ćanju 
osjetljivosti analize. Pokazalo se da je čitav niz parametara indikativan za 
toksičnost povezanu s endokrinim sustavom te su oni uklju čeni u ovu 
ispitnu metodu. Parametri za koje nije bilo dovoljno dostupnih podataka koji bi dokazali korisnost ili koji su pružili samo slabe dokaze u programu 
potvrde njihove sposobnosti u pomaganju pri odre đivanju endokrinih 
ometača predloženi su kao opcijski kona čni učinci (vidjeti Dodatak 2.).
 
6. Na temelju podataka dobivenih postupkom potvrde treba naglasiti da osje ­
tljivost ove analize nije dovoljna za identifikaciju svih tvari s (anti)andro ­
genim ili (anti)estrogenim na činima djelovanja (9). Ova ispitna metoda ne 
provodi se u životnom razdoblju koje je najosjetljivije na endokrine pore ­
mećaje. Unato č tomu ova je ispitna metoda tijekom postupka potvrde iden ­
tificirala tvari koje slabo i snažno utje ču na funkciju štitnja če te tvari snažne 
i umjerene endokrinološke aktivnosti, koje djeluju kroz estrogenske ili androgenske receptore, ali u ve ćini slučajeva nije uspjela identificirati endo ­
krinološki aktivne tvari koje slabo utje ču na estrogenske ili androgenske 
receptore. Stoga se ne može opisati kao preventivna analiza za endokrino ­
lošku aktivnost.
 
7. Dakle, nedostatak u činaka povezanih s tim na činima djelovanja ne može se 
uzeti kao dokaz za nedostatak u činaka na endokrini sustav. Što se ti če 
neizravnih endokrinih u činaka, karakterizacija tvari se stoga ne treba teme ­
ljiti samo na rezultatima ove ispitne metode, nego je treba upotrijebiti u pristupu težine dokaza uz primjenu svih postoje ćih podataka o kemikaliji 
radi karakterizacije potencijalne endokrinološke aktivnosti. Stoga, regula ­
torna odluka o endokrinološkoj aktivnosti (karakterizacija tvari) mora biti utemeljena na širokom pristupu, a ne samo na rezultatima primjene ove ispitne metode.
 
8. Potvr đeno je da će svi postupci utemeljeni na životinjama potvrditi lokalne 
standarde brige o životinjama; opisi brige i tretmana navedeni u nastavku jesu minimalni standardi postupanja i zamijenit će ih lokalna regulativa u 
slučajevima gdje je stroža. Ostale smjernice za humano tretiranje životinja 
dao je OECD (14).
 
9. Korištene definicije nalaze se u Dodatku 1.  
NAČELO ISPITIVANJA  
10. Ispitivana se kemikalija 28 dana svakodnevno oralno primjenjuje u stup ­
njevanim dozama za nekoliko skupina pokusnih životinja, po jedna visina 
doze na svaku skupinu. Tijekom razdoblja primjene životinje se svakod ­
nevno pažljivo promatraju radi uo čavanja simptoma toksi čnosti. Na životi ­
njama koje uginu ili budu usmr ćene tijekom ispitivanja obavlja se obduk ­
cija, s tim da se po završetku ispitivanja preživjele životinje usmr ćuju i 
također obduciraju. 28-dnevno ispitivanje pruža informacije o u čincima  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 276
 
ponovljenog oralnog izlaganja i može ukazati na potrebu za daljnjim dugo ­
trajnim ispitivanjima. Tako đer, može pružiti informacije o odabiru koncen ­
tracija za dugotrajna ispitivanja. Podaci dobiveni primjenom ove ispitne metode moraju omogu ćiti karakterizaciju toksi čnosti ispitivane kemikalije, 
ukazivanje na odnos doze i reakcije te odre đivanje vrijednosti visine doze 
bez vidljivih štetnih u činaka (NOAEL, No Observed Adverse Effect Level).
 
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
11. Najčešće korištena životinjska vrsta je štakor iako se mogu koristiti i neke 
druge vrste glodavaca. Ako se parametri navedeni u ovoj ispitnoj metodi B.7 istražuju na drugoj vrsti glodavaca, treba pružiti detaljno obrazloženje. Iako je biološki logi čno da druge vrste moraju na sli čan način kao i štakor 
reagirati na toksi čne tvari, primjena manjih vrsta može rezultirati pove ćanom 
raznolikoš ću zbog tehni čkih izazova pri seciranju manjih organa. U 
programu me đunarodne potvrde za odre đivanje endokrinih ometa ča primje­
njivali su se samo štakori. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje 
sojeva koji su uobi čajeni u laboratorijskoj praksi. Odabiru se ženke koje 
prethodno nisu imale leglo i koje nisu gravidne. S doziranjem treba po četi 
što je prije mogu će nakon odbijanja mladunaca od sise, a u svakom slu čaju 
prije nego što životinje navrše devet tjedana. Na po četku ispitivanja razlike 
u tjelesnoj masi korištenih životinja smiju biti minimalne i ne premašivati 
± 20 % prosje čne tjelesne mase svakog spola. Kada se ponovljena oralna 
doza upotrebljava kao preliminarna u odnosu na dugotrajno istraživanje, prednost se daje primjeni životinja istog soja i istog podrijetla u oba istra ­ 
živanja.
 
Smještaj i hranjenje  
12. Svi postupci trebaju biti uskla đeni s lokalnim standardima brige o životi ­
njama u laboratoriju. Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama 
trebala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka 
trebala iznositi najmanje 30 % te po mogu ćnosti ne premašivati 70 % 
osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta 
treba biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje 
se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograni ­ 
čene količine pitke vode. Na odabir prehrane može utjecati potreba za 
osiguranjem prikladne primjese ispitivane kemikalije ako se ista primjenjuje tom metodom. Životinje trebaju biti smještene u malim skupinama istoga 
spola; životinje se mogu smjestiti i pojedina čno ako je to znanstveno oprav ­
dano. U slu čaju skupnog smještaja, u jednom kavezu ne smije biti smješteno 
više od pet životinja.
 
13. Hranu treba redovito analizirati radi kontaminiraju ćih tvari. Uzorak prehrane 
treba zadržati do kraja izrade izvješ ća. 
Priprema životinja  
14. Zdrave, mlade odrasle životinje nasumi čno se raspore đuju u kontrolne 
skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba rasporediti na na čin da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na minimum. 
Životinje se identificiraju na jedinstven na čin i drže u kavezima najmanje 
pet dana prije po četka istraživanja kako bi im se omogu ćila aklimatizacija 
na laboratorijske uvjete.  
Priprema doza  
15. Ispitivana se kemikalija primjenjuje oralnom intubacijom pomo ću želučane 
sonde, odnosno preko hrane ili vode za pi će. Metoda oralne primjene ovisi o 
svrsi studije i fizikalnim/kemijskim/toksikokineti čkim svojstvima ispitivane 
kemikalije.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 277
 
16. Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovaraju ćem 
nosaču. Kad god je mogu će, preporu ča se najprije razmotriti mogu ćnost 
primjene vodene otopine/suspenzije, zatim mogu ćnost primjene otopine/su ­
spenzije u ulju (npr. kukuruzno ulje), i tek na kaju mogu ćnost otapanja u 
ostalim nosa čima. Za sve nosa če, osim vode, moraju biti poznata toksi čna 
svojstva nosa ča. Treba odrediti stabilnost ispitivane kemikalije u nosa ču. 
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
17. Najmanje deset životinja (pet ženki i pet mužjaka) treba upotrijebiti za 
ispitivanje svake visine doze. Ako se planira usmr ćivanje životinja u me đu­
vremenu, prije završetka studije navedeni broj treba pove ćati za broj živo ­
tinja predvi đen za takvo usmr ćivanje. Treba razmotriti i mogu ćnost uklju ­ 
čivanja i dodatne satelitske skupine od deset životinja (pet od svakoga 
spola) u kontrolnu skupinu i skupinu koja će primiti najvišu dozu radi 
opažanja reverzibilnosti, postojanosti ili zakašnjelog nastupa toksi čnih 
učinaka najmanje 14 dana nakon tretiranja.  
Doziranje  
18. Općenito gledano, treba upotrijebiti najmanje tri ispitne skupine i kontrolnu 
skupinu, ali ako se iz procjene drugih podataka ne o čekuju učinci kod doze 
od 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu, može se provesti grani čni test. Ako 
nisu dostupni prikladni podaci, može se provesti preliminarno ispitivanje za određivanje raspona (životinje istog soja i podrijetla) kako bi se pomoglo pri 
određivanju visina doze koje će se primjenjivati. Osim tretiranja ispitivanom 
kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na jednak način kao i sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se pri primjeni ispitivane 
kemikalije koristi nosa č, volumen nosa ča koji primi kontrolna skupina treba 
biti jednak najve ćem upotrijebljenom volumenu.
 
19. Visine doza treba odabrati uzimaju ći u obzir sve postoje će podatke o toksi č­
nosti i (toksiko)kinetici koji su dostupni za ispitivanu kemikaliju ili srodne 
kemikalije. Najvišu dozu treba odabrati s ciljem da se izazovu toksi čni 
učinci, ali ne i smrt ili velika patnja životinja. Nakon toga treba odabrati 
niz sve nižih doza koje će se primjenjivati za utvr đivanje svih reakcija 
vezanih uz doziranje, kao i dozu kod koje nema vidljivih štetnih 
učinaka (NOAEL) kao najnižu dozu. Za odre đivanje sve nižih doza često 
su najpogodniji dvostruki do četverostruki intervali, i često je bolje dodati 
četvrtu pokusnu skupinu nego da izme đu doziranja budu jako veliki intervali 
(npr. iznad faktora 10).  
20. U slu čaju prisutnosti opažene op će toksičnosti (npr. smanjene tjelesne mase, 
učinaka na jetri, srcu, plu ćima ili bubrezima itd.) ili drugih promjena koje ne 
moraju biti reakcija na toksi čnost (npr. smanjeno uzimanje hrane, pove ćanje 
jetre), opažene u činke na imunološkim, neurološkim ili endokrinim krajnjim 
učincima treba tuma čiti s oprezom.  
Granični test  
21. Ako test s jednom visinom doze, koja iznosi najmanje 1 000 mg/kg tjelesne 
mase na dan, ili je zbog davanja hrane ili pitke vode jednaka postotku u 
hrani ili pitkoj vodi (na temelju odre đivanja tjelesne mase), uz primjenu 
postupaka opisanih za ovu studiju, ne izazove vidljive štetne u činke i ako 
se toksičnost ne o čekuje na temelju podataka o strukturno srodnim tvarima, 
potpuna studija uz primjenu tri visine doza ne će se smatrati neophodnom. 
Granični test ne vrijedi samo u slu čajevima kad izloženost ljudi ukazuje na 
potrebu za primjenom više doze.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 278
 
Primjena doza  
22. Životinjama se ispitivana kemikalija dozira svakodnevno 7 dana u tjednu u 
razdoblju od 28 dana. U slu čaju primjene oralnom intubacijom ispitivanu 
kemikaliju treba dati u jednoj dozi pomo ću želučane sonde ili prikladne 
intubacijske kanile. Maksimalni volumen teku ćine koji se može primijeniti 
odjednom ovisi o veli čini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti ve ći 
od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slu čaju vodenih otopina gdje je dopu ­ 
šteno upotrijebiti 2 ml/100 g tjelesne mase. Osim u slu čaju nadražuju ćih ili 
nagrizajućih kemikalija kod kojih se štetni u činci obično javljaju pri višim 
koncentracijama, varijabilnost ispitnog volumena treba prilago đavanjem 
koncentracije svesti na najmanju mogu ću mjeru kako bi se zajam čio stalni 
volumen pri svim visinama doza.  
23. Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane kemikalije ne utje ču na uravnoteženi unos 
hrane ili vode. Kad se ispitivana kemikalija daje u hrani, može se koristiti ili 
stalna koncentracija u odnosu na koli činu hrane (ppm) ili stalna visina doze 
u odnosu na tjelesnu masu životinje; alternativa koja se koristi u pokusu mora se specificirati. U slu čajevima kad se kemikalija daje oralnom intuba ­
cijom, dozu treba davati svaki dan otprilike u isto vrijeme te je po potrebi 
prilagođavati kako bi se održala stalna visina doze u odnosu na tjelesnu 
masu životinje. Kad se prije dugotrajnog ispitivanja radi preliminarna studija s ponovljenim dozama, u obje studije prehrana životinja treba biti sli čna.
 
Opažanja  
24. Opažanje bi trebalo trajati 28 dana. Životinje u satelitskoj skupini za koje se 
planira naknadno opažanje treba najmanje 14 dana držati bez tretiranja kako 
bi se utvrdilo jesu li toksi čni učinci zakašnjeli ili postojani i jesu li se 
životinje od njih oporavile.  
25. Opća bi klini čka opažanja trebalo obavljati barem jednom dnevno, najbolje 
u isto vrijeme svakog dana, uzimaju ći u obzir vršno razdoblje o čekivanih 
učinaka nakon doziranja. Zdravstveno stanje životinja treba zabilježiti. 
Barem dvaput dnevno sve životinje treba pregledati radi otkrivanja mogućih simptoma morbiditeta i mortaliteta.
 
26. Jednom prije prvog izlaganja, te barem jednom tjedno nakon toga, treba 
obaviti detaljno klini čko opažanje stanja svih životinja (ovo će omogućiti 
utvrđivanje promjena u stanju istih subjekata). Ta opažanja treba obaviti 
izvan kaveza u kojem životinja ina če boravi, najbolje u standardnom ogra ­ 
đenom prostoru i svaki put otprilike u isto vrijeme. Rezultate opažanja treba 
pažljivo bilježiti, pri čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno 
definiran od strane laboratorija koji obavlja ispitivanje. Treba poduzeti sve što je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima ispitivanja budu minimalna te da opažanja po mogu ćnosti provode promatra či koji ne 
znaju za tretiranje. Opaženi simptomi trebaju obuhva ćati, ali ne biti ograni ­ 
čeni na, promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, pojavu sekreta i 
ekskreta te aktivnost autonomnog živ čanog sustava (npr. lakrimacija (suze ­
nje), piloerekcija (naježenost dlake), veli čina zjenica, nepravilnosti u disa ­
nju). Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, 
kao i prisutnost kloni čkih ili toni čkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano 
njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili neobi čnog ponašanja 
(npr. samoozlje đivanje, hodanje unatrag) (2).
 
27. U četvrtom tjednu izlaganja treba obaviti ocjenu senzorne reaktivnosti na 
različite podražaje (2) (npr. zvu čne, vizualne i proprioceptivne) (3)(4)(5), 
ocjenu jakosti stiska (6) te ocjenu motori čke aktivnosti (7). Daljnje pojedi ­
nosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovaraju ćoj 
referentnoj literaturi. Me đutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i 
alternativni postupci.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 279
 
28. Funkcionalna opažanja koja se obavljaju u četvrtom tjednu izlaganja mogu 
se izostaviti ako se studija provodi kao preliminarno ispitvanje za naknadnu 
(90-dnevnu) studiju subkroni čnosti. U tom slu čaju funkcionalna opažanja 
treba uklju čiti u tu sljede ću studiju. S druge strane, kad postoje podaci o 
funkcionalnim opažanjima iz studije uz primjenu ponavljanih doza, može se 
povećati mogućnost odabira visina doza za naknadnu studiju subkroni čnosti.  
29. U iznimnim slu čajevima funkcionalna opažanja mogu izostati i kod skupina 
koje na drugi na čin pokazuju simptome toksi čnosti do mjere koja bi znatno 
ometala obavljanje funkcionalnog ispitivanja.  
30. Pri obdukciji treba uzimanjem vaginalnih razmaza (opcijski) odrediti cikluse 
estrusa svih ženki. Ta će opažanja pružiti informacije o stadiju ciklusa 
estrusa u vrijeme usmr ćivanja te pomo ći pri histološkoj ocjeni tkiva osje ­
tljivih na estrogen [vidjeti smjernicu o histopatologiji (19)].  
Tjelesna masa i unos hrane/vode  
31. Sve životinje treba vagati barem jednom tjedno. Unos hrane treba mjeriti 
najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za 
piće, unos vode treba isto tako mjeriti najmanje na tjednoj osnovi.  
Hematologija  
32. Na kraju razdoblja ispitivanja treba obaviti sljede će hematološke pretrage: 
hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, retikulocite, ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i mjerenje vremena/potencijala zgrušavanja krvi. Ostala odre đivanja koja treba provesti ako ispitivana kemi ­
kalija ili njezini navodni metaboliti imaju ili se sumnja da imaju oksida ­
cijska svojstva obuhva ćaju koncentraciju metaemoglobina i Heinzova tjele ­ 
šca.
 
33. Uzorke krvi je potrebno uzeti na specificiranom mjestu i pohraniti u odgo ­
varajućim uvjetima neposredno prije ili u tijeku usmr ćivanja životinja. Živo ­
tinje trebaju postiti tijekom no ći prije usmr ćivanja (  1 ). 
Klinička biokemija  
34. Klini čke biokemijske pretrage za utvr đivanje jakog toksi čnog djelovanja na 
tkiva i posebno na bubrege i jetru, treba obaviti na uzorcima krvi uzetim od 
svake životinje neposredno prije usmr ćivanja ili u okviru postupka usmr ­ 
ćivanja životinja (osim u uvjetima za koje je utvr đeno da su na umoru i/ili 
su neplanirano usmr ćene prije završetka studije). Pretrage koje se rade na 
plazmi ili serumu trebaju obuhvatiti mjerenje natrija, kalija, glukoze, ukupne 
količine kolesterola, ureje, kreatinina, ukupne koli čine proteina i albumina te 
više od dva enzima indikativna za hepatocelularna ošte ćenja (kao što su 
alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i glutamat dehidrogenaza) te žu čne kiseline. 
Mjerenja dodatnih enzima (jetrenog ili drugog podrijetla) i bilirubina 
mogu u odre đenim okolnostima pružiti korisne informacije.
 
35. U zadnjem tjednu studije neobvezno se mogu obaviti analize urina dobi ­
venog sabiranjem u odre đenim vremenskim razmacima: izgled, koli čina, 
osmolalnost ili specifi čna težina, pH, protein, glukoza i krv/krvne stanice.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 280  
( 1 ) Post tijekom no ći preporu ča se za niz mjerenja u serumu i plazmi, a najviše za glukozu. 
Najvažniji razlog za tu preporuku jest činjenica da bi pove ćana varijabilnost, koja bi 
neizbježno nastala kao rezultat izostanka posta, pokazivala sklonost zamagljivanju 
suptilnih u činaka i otežala tuma čenje rezultata. S druge pak strane post preko no ći 
može utjecati na op ći metabolizam životinja, a posebno u studijama o hranjenju 
moglo bi ometati dnevno izlaganje ispitivanoj kemikaliji. Ako se primjenjuje post 
preko no ći, klinička biokemijska odre đivanja treba obaviti nakon provo đenja funkcio ­
nalnih opažanja u 4. tjednu studije.
 36. Osim toga, treba razmisliti i o ispitivanju plazmatskih ili serumskih markera 
koji ozna čavaju ošte ćenja tkiva. Ako poznata svojstva ispitivane kemikalije 
mogu, ili se o čekuje da će, utjecati na odre đene metaboli čke profile, treba 
obaviti i druge pretrage koje uklju čuju kalcij, fosfor, trigliceride, specifi čne 
hormone i kolinesterazu. Te vrijednosti treba izmjeriti kod izloženosti kemi ­
kalijama odre đenih klasa opasnosti ili od slu čaja do slu čaja. 
37. Iako u me đunarodnoj procjeni krajnjih u činaka povezanih s endokrinim 
sustavom nije dokazana jasna prednost za odre đivanje hormona štitnja če 
(T3, T4) i TSH, može biti korisno zadržati uzorke plazme ili seruma radi mjerenja T3, T4 i TSH (opcijski) ako postoji indikacija za djelovanje na osovinu hipofiza-štitna žlijezda. Ti se uzorci mogu zamrznuti na -20° radi 
skladištenja. Sljede ći čimbenici mogu utjecati na varijabilnost i apsolutne 
koncentracije za odre đivanje hormona:
 
— vrijeme usmr ćivanja zbog varijacije koncentracije hormona kroz dan  
— metoda usmr ćivanja radi izbjegavanja pretjeranog stresa za životinje koji 
može utjecati na koncentraciju hormona  
— pribor za odre đivanje hormona koji se može razlikovati od njihovih 
standardnih krivulja.  
Konačna identifikacija kemikalija koje djeluju na štitnja ču pouzdanija je 
pomoću histopatološke analize nego pomo ću razine hormona.  
38. Uzorke plazme koji su posebno namijenjeni odre đivanju hormona treba 
uzeti u usporedivo doba dana. Preporu ča se da se obrati pozornost na 
određivanje T3, T4 i TSH potaknuto na temelju promjena u histopatologiji 
štitnjače. Brojčane vrijednosti dobivene analizom koncentracija hormona 
razlikuju se ovisno o razli čitom, komercijalno dostupnom priboru. Stoga 
se može dogoditi da nije mogu će pružiti kriterije o djelovanju na temelju 
ujednačenih povijesnih podataka. Druga je mogu ćnost da laboratoriji nastoje 
održavati koeficijente varijacije ispod 25 za T3 i T4 te ispod 35 za TSH. Sve koncentracije treba zabilježiti u mg/ml.
 
39. Ako su povijesni polazni podaci neprikladni, u obzir valja uzeti odre đivanje 
hematoloških i klini čkih biokemijskih varijabli prije po četka doziranja ili po 
mogućnosti na skupini životinja koje nisu uklju čene u pokusne skupine.  
PATOLOGIJA  
Makroskopska analiza  
40. Sve životinje korištene u studiji moraju se podvrgnuti kompletnoj, detaljnoj 
makroskopskoj analizi koja obuhva ća pažljivi pregled vanjske površine 
tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. 
S jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, testisa, epididimisa, prostate +  
sjemenskih mjehuri ća s koagulacijskim žlijezdama kao cjeline,  timusa,  
slezene, mozga i  srca svih životinja (osim onih za koje je utvr đeno da su 
na umoru i/ili se neplanirano usmrte prije završetka studije) treba obrezati 
sve okolno tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo sušenje organa. Treba biti pažljiv pri obrezivanju kompleksa prostate da se izbjegne punkcija sjemenskih mjehuri ća ispunjenih 
tekućinom. Druga je mogu ćnost da se sjemenski mjehuri ći i prostata obrežu 
i izvažu nakon fiksacije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 281
 
41. Osim toga, još dva tkiva mogu se opcijski izvagati što prije nakon sekcije 
kako bi se izbjeglo njihovo sušenje: jajnici u paru (mokra težina) i mater ­
nica, uklju čujući i grlić maternice (upute za uklanjanje i pripremu mater ­
ničnih tkiva radi vaganja dane su u OECD TG 440 (18)).  
42. Masa štitnja če (opcijski) može se odrediti nakon fiksacije. Obrezivanje 
također treba obaviti vrlo pažljivo te samo nakon fiksacije kako bi se 
izbjeglo ošte ćivanje tkiva. Ošte ćena tkiva mogu kompromitirati histopato ­
lošku analizu.  
43. Sljede ća tkiva treba čuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najprimjerenije i 
za tu vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled (vidjeti stavak 
47): sve  velike lezije, mozak (reprezentativne regije uklju čujući veliki 
mozak, mali mozak i medulu/most),  leđnu moždinu, oko, želudac, tanko i  
debelo crijevo (uklju čujući Peyerove plo če), jetru, bubrege, nadbubdrežne  
žlijezde, slezenu, srce, timus, štitnja ču, dušnik i  pluća (preparirane upuhiva ­
njem fiksativa i zatim uranjanjem),  spolne žlijezde (testise i jajnike),  
pomoćne spolne organe (maternicu i cerviks, epididimise, prostatu + 
sjemenske mjehuri će s koagulacijskim žlijezdama),  vaginu, mokra ćni 
mjehur, limfne čvorove [osim najbližeg drenažnog čvora treba uzeti još 
jedan limfni čvor na temelju laboratorijskog iskustva (15)],  periferni živac 
(bedreni ili tibijalni) po mogu ćnosti smješten uz miši ć, skeletni miši ć i kost, 
s leđnom moždinom (sekcija ili alternativno svježi aspirat koštane srži). 
Preporuča se da se testisi fiksiraju uranjanjem u Bouinov ili izmijenjeni 
Davidsonov fiksativ (16) (17). Vezivnu ovojnicu treba nježno i plitko punk ­
tirati na oba pola organa iglom koja omogu ćuje brzu penetraciju fiksativa. 
Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. 
Treba sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima 
ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni.  
44. Sljede ća tkiva mogu dati dragocjenu indikaciju za u činke na endokrini 
sustav: Spolne žlijezde (jajnici i testisi), pomo ćni spolni organi (maternica 
s cerviksom, epididimisi, sjemenski mjehuri ći s koagulacijskim žlijezdama, 
dorzolateralna i ventralna prostata), vagina, hipofiza, muška mlije čna žlije­
zda, štitnja ča i nadbubrežna žlijezda. Promjene u muškim mlije čnim žlijez ­
dama nisu dovoljno dokumentirane, ali taj parametar može biti vrlo osjetljiv 
na tvari s estrogenskim djelovanjem. Opažanja organa/tkiva koja nisu nisu 
popisana u stavku 43. su opcijska (vidjeti Dodatak 2.).  
45. Smjernica o histopatologiji (19) pruža dodatne detaljne informacije o sekciji, 
fiksaciji, seciranju i histopatologiji endokrinih tkiva.  
46. U me đunarodnom programu ispitivanja dobiveni su neki dokazi da se 
suptilni u činci na endokrini sustav uzrokovani kemikalijama male snage 
utjecaja na homeostazu spolnih hormona mogu identificirati pomo ću 
smetnje u sinkronizaciji ciklusa estrusa u razli čitim tkivima, a ne toliko 
očitim histopatološkim promjenama na ženskim spolnim organima. Iako 
nije dobiven kona čan dokaz za takve u činke, preporu ča se da se pri tuma ­ 
čenju histopatologije jajnika (folikularnih, tekalnih i granuloznih stanica), 
maternice, cerviksa i vagine u obzir uzmu dokazi mogu će asinkronije 
ciklusa estrusa. Ako se tako procijeni, u tu usporedbu može se tako đer 
uključiti i stadij ciklusa odre đen vaginalnim razmazima.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 282
 
Histopatologija  
47. Na sa čuvanim organima i tkivima svih životinja u kontrolnoj skupini i 
skupini s visokom dozom treba provesti potpunu histopatologiju. Ta ispiti ­
vanja treba proširiti na životinje svih drugih skupina doziranja ako su u 
skupini s visokom dozom opažene promjene povezane s tretiranjem.  
48. Treba pregledati sve ve će lezije.  
49. Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki pregled onih 
tkiva i organa na kojima su kod tretiranih skupina primije ćene promjene.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
50. Podatke treba prikazati pojedina čno za svaku životinju. Osim toga, najbolje 
ih je rezimirati u obliku tablice iz koje se za svaku testiranu skupinu vidjeti 
broj životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje uginule ili su iz 
humanih razloga usmr ćene tijekom ispitivanja, vrijeme smrti ili humanog 
usmrćivanja, broj životinja kod kojih su opaženi znakovi toksi čnosti, opis 
opaženih znakova toksi čnosti, uklju čujući i vrijeme pojavljivanja, trajanje i 
stupanj svih toksi čkih učinaka, broj životinja kod kojih su se javile lezije, 
vrsta lezija i postotak životinja koje pokazuju odre đene vrste lezija.  
51. Tamo gdje je to mogu će, brojčane rezultate treba analizirati uz primjenu 
odgovaraju će opće prihvatljive statisti čke metode. Usporedbe u činaka po 
rasponu visina doza trebala bi sprije čiti uporabu višestrukih t-ispitivanja. 
Statističke metode treba odabrati još u fazi planiranja studije.  
52. Radi kontrole kvalitete predlaže se da se skupljaju povijesni kontrolni 
podaci te da se izra čunaju koeficijenti varijacije za broj čane podatke, 
posebno za parametre povezane s otkrivanjem endokrinih ometa ča. Ti se 
podaci mogu upotrijebiti za uspore đivanje kada se ocjenjuju stvarne studije.  
Izvješće o ispitivanju  
53. Izvješ ću o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija:  
— fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,  
— identifikacijski podaci.  
Nosač (po potrebi):  
— dokaz opravdanosti odabira nosa ča, ako se ne radi o vodi.  
Pokusne životinje:  
— korištena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— pojedina čne tjelesne mase životinja na po četku ispitivanja.  
— obrazloženje odabira vrste, ako se ne radi o štakorima.  
Uvjeti ispitivanja:  
— obrazloženje za odabir visina doza,  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripremanju hrane, posti ­
gnuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravaka,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 283
 
— podaci o primjeni ispitivane kemikalije,  
— preračunavanje koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za pi će 
(ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), prema potrebi,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Opcijski istraživani krajnji u činci 
— popis istraživanih opcijskih krajnjih u činaka.  
Rezultati:  
— tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,  
— unos hrane i unos vode, po potrebi,  
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i visini doza, uklju čujući 
znakove toksi čnosti,  
— vrsta, stupanj i trajanje opaženih klini čkih promjena (jesu li reverzibilne 
ili nisu),  
— senzorska aktivnost, ocjena jakosti stiska i motorne aktivnosti,  
— hematološka ispitivanja s relevantnim normalnim vrijednostima,  
— klinička biokemijska ispitivanja s relevantnim normalnim vrijednostima,  
— podaci o tjelesnoj masi nakon smrti i podaci o masi organa,  
— nalazi obdukcije,  
— detaljni opis svih histopatoloških nalaza,  
— podaci o apsorpciji, ako postoje,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 284
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Androgeni u činak  je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni androgeni 
hormon (npr. testosteron) u organizmu sisavaca.  
Antiandrogeni u činak  je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje 
prirodnog androgenog hormona (npr. testosterona) u organizmu sisavaca.  
Antiestrogeni u činak  je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog 
estrogenog hormona (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca.  
Antitiroidna aktivnost  jest sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje 
prirodnog hormona štitnja če (npr. T  3 ) u organizmu sisavaca.  
Doziranje  je opći pojam koji obuhva ća dozu, njenu u čestalost i trajanje 
doziranja.  
Doza  je količina ispitivane kemikalije koja se primjenjuje. Doza se izražava kao 
masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase pokusne životinje po danu 
(npr. mg/kg tjelesne mase po danu) ili kao stalna koncentracija u hrani.  
Evidentna toksi čnost je opći naziv koji opisuje jasne znakove toksi čnosti nakon 
primjene ispitivane kemikalije. Ti bi znakovi trebali biti dovoljni za utvr đivanje 
opasnosti i trebaju biti takvi da se za primjenu povišene doze može o čekivati da 
će rezultirati razvojem ozbiljnih znakova toksi čnosti i mogu ćom smrću. 
NOAEL  je kratica za veli činu doze bez vidljivih štetnih u činaka. To je najviša 
doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni u činci vezani uz tretiranje.  
Estrogeni u činak  je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni estrogeni 
hormon (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca.  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  
Tiroidna aktivnost  je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni hormon 
štitnjače (npr. T  3 ) u organizmu sisavaca.  
Validacija  je znanstveni postupak s ciljem karakterizacije operativnih zahtjeva i 
ograničenja ispitne metode, za pokazivanje njezine pouzdanosti i relevantnosti za 
dotičnu svrhu.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 285
 
Dodatak 2.  
Krajnji u činci preporu čeni za detekciju endokrinih ometa ča (ED-ova) u ovoj 
ispitnoj metodi B.7  
Obvezni krajnji u činci Opcijski krajnji u činci 
Masa  
— testisi 
— epididimisi 
— nadbubrežne žlijezde 
— prostata + sjemenski mjehuri ći s 
koagulacijskim žlijezdama  — jajnici 
— maternica s cerviksom 
— štitnja ča 
Histopatologija  
— spolne žlijezde: 
— testisi i — jajnici 
— pomo ćni spolni organi: 
— epididimisi — prostata + sjemenski mjehuri ći s 
koagulacijskim žlijezdama 
— maternica s cerviksom 
— nadbubrežna žlijezda — štitnja ča 
— vagina
 — vaginalni razmazi 
— muške mlije čne žlijezde 
— hipofiza  
Mjerenje hormona  
— razine cirkuliraju ćih hormona T3, 
T4 
— razine cirkuliraju ćeg hormona 
TSH  
LITERATURA  
1. OECD (Pariz, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuroto ­
xicity.  
2. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60
 
3. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
4. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
5. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects 
of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
6. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 286
 
7. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  
8. OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9. OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10. OECD (2002.). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11. OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endo ­
crine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.ht ml
 
12. OECD (2006.). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13. OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14. OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
15. Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
16. Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
 
17. Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
18. OECD (2007.). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19. OECD (2009.). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 287
 
B.8. SUBAKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST: 28-DNEVNA 
STUDIJA  
SAŽETAK  
Ova revidirana ispitna metoda B.8 osmišljena je za potpunu karakterizaciju 
toksičnosti ispitivane kemikalije inhalacijom pomo ću ponovljenog izlaganja u 
ograničenom vremenskom razdoblju (28 dana) te za pružanje podataka za 
procjenu kvantitativnog rizika od inhalacije. Skupine od najmanje pet mužjaka i pet ženki glodavaca izlažu se šest sati dnevno 28 dana a) ispitivanoj kemikaliji 
na tri ili više razina koncentracije, b) filtriranom zraku (negativna kontrola) i/ili c) 
nosaču (kontrola nosa ča). Životinje se op ćenito izlažu pet dana tjedno, ali tako đer 
je dopušteno i izlaganje sedam dana tjedno. Uvijek se ispituju mužjaci i ženke, ali se oni mogu izlagati razli čitim razinama koncentracije ako je poznato da je 
jedan od spolova osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje. Ova 
metoda voditelju istraživanja omogu ćuje fleksibilnost uklju čivanja satelitskih 
(reverzibilnih) skupina, bronhoalveolarnog ispiranja (BAL), neuroloških ispiti ­
vanja te dodatnih klini čko-patoloških i histopatoloških procjena s ciljem bolje 
karakterizacije toksi čnosti ispitivane kemikalije.
 
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 412 (2009.). 
Originalna Smjernica za ispitivanje 412 (TG 412) o subakutnoj inhalaciji usvojena je 1981. (1). Ova ispitna metoda B.8 (kao ekvivalent revidiranoj TG 412) ažurirana je kako bi odrazila stanje znanosti te kako bi ispunila 
aktualne i budu će regulatorne potrebe.
 
2. Ova metoda omogu ćuje karakterizaciju štetnih u činaka nakon ponovljenog 
svakodnevnog inhalacijskog izlaganja ispitivanoj kemikaliji 28 dana. Podaci 
dobiveni 28-dnevnom studijom subakutne inhalacijske toksi čnosti mogu se 
upotrijebiti za procjene kvantitativnog rizika [ako ne slijedi 90-dnevna studija subkroni čne inhalacijske toksi čnosti (Poglavlje B.29 ovog Priloga)]. 
Podaci tako đer mogu pružiti informacije o odabiru koncentracija za dugo ­
trajne studije, kao što je 90-dnevna studija subkroni čne inhalacijske toksi č­
nosti. Ova ispitna metoda nije specijalno namijenjena testiranju nanomate ­
rijala. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog Poglavlja i u Smjernici 39. (2).
 
UVODNA RAZMATRANJA  
3. Laboratorij koji provodi ispitivanje mora prije provo đenja studije u obzir 
uzeti sve raspoložive informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi pove ćao 
kvalitetu studije i na minimum sveo primjenu životinja. Informacije koje će 
pomoći u odabiru najprikladnijih ispitnih koncentracija mogu obuhva ćati 
identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemi ­
kalije, rezultate bilo kakvih ispitivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo , očeki­
vanu(-e) uporabu(-e) i potencijal za izlaganje ljudi, dostupne podatke o (Q)SAR i toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture te podatke dobivene ispitivanjem akutne inhalacijske toksi čnosti. Ako se 
tijekom studije o čekuje ili uo či neurotoksi čnost, voditelj istraživanja može 
odlučiti da obuhvati prikladne procjene kao što su serije funkcionalnih 
opažanja (FOB) te mjerenje motori čke aktivnosti. Iako odre đivanje 
vremena izlaganja u svezi sa specifi čnim ispitivanjima može biti klju čno, 
obavljanje tih dodatnih aktivnosti ne bi trebalo utjecati na osnovni plan 
studije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 288
 
4. Razrije đene nagrizaju će ili nadražuju će ispitivane kemikalije mogu se ispi ­
tivati na koncentracijama koje će proizvesti željeni stupanj toksi čnosti 
[vidjeti GD 39 (2)]. Kada se životinje izlažu tim materijalima, ciljane koncentracije moraju biti dovoljno niske da ne bi izazvale zna čajnu patnju 
ili stres, ali biti dovoljno visoke za proširenje krivulje koncentracije i reak ­
cije na razine koje ispunjavaju regulatorni i znanstveni cilj ispitivanja. Te 
koncentracije treba odabirati u svakom pojedinom slu čaju, najbolje na 
temelju odgovaraju će isplanirane studije za utvr đivanje raspona koja pruža 
informacije o kriti čnim krajnjim u čincima, pragu nadraženosti te vremenu 
pojavljivanja (vidjeti stavke 11. - 13.). Treba pružiti obrazloženje za odabir 
koncentracija.
 
5. Životinje u stanju ugibanja ili životinje koje o čito trpe bol ili pokazuju 
znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti. Životinje u stanju ugibanja 
uzimaju se u obzir jednako kao i životinje koje uginu pri ispitivanju. Krite ­
riji za odlu čivanje o usmr ćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško 
pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijete će smrti predmet su 
Smjernice za humano usmr ćivanje br. 19 OECD-a (3).  
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
6. Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle glodavce sojeva koji se obi čno 
koriste u laboratorijima. Prednost se daje vrsti štakora. U slu čaju primjene 
drugih vrsta treba priložiti obrazloženje.  
Priprema životinja  
7. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. 
Na dan nasumi čnog odabira životinje moraju biti mlade odrasle jedinke u 
dobi izme đu 7 i 9 tjedana. Tjelesna masa mora biti u rasponu ± 20 % 
prosječne mase svakog spola. Životinje se nasumi čno odabiru, ozna čavaju 
radi pojedina čne identifikacije te drže u kavezima najmanje pet dana prije 
početka ispitivanja kako bi im se omogu ćila aklimatizacija na laboratorijske 
uvjete.  
Uzgoj životinja  
8. Životinje treba pojedina čno identificirati, po mogu ćnosti potkožnim tran ­
sponderima, kako bi se olakšalo opažanje i izbjegla zamjena. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. 
Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 
70 % iako to možda ne će biti mogu će kad se kao nosa č primjenjuje voda. 
Prije i nakon izlaganja životinje op ćenito treba smjestiti u kaveze u skupi ­
nama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati 
jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici 
zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizi čki, toplinski ili 
imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje 
učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog 
volumena. Ako su dostupni generi čki podaci koji pokazuju da se takve 
promjene ne doga đaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prila ­
godba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene 
aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedina čno kako bi se sprije čilo 
da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, 
osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograni čenom zalihom javne pitke 
vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 289
 
Komore za inhalaciju  
9. Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemi ­
kalije i predmet ispitivanja. Prednost se daje metodi izlaganja samo nosom (koja uklju čuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo 
nosom op ćenito se daje prednost za ispitivanja teku ćih ili krutih aerosola 
te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje posti ći uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba oprav ­
dati u izvješ ću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u 
slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja 
ne smije premašiti 5 % volumena komore. Na čela tehnika izlaganja samo 
nosom i čitavim tijelom te njihove specifi čne prednosti i nedostaci opisani 
su u GD 39 (2).
 
STUDIJE TOKSI ČNOSTI  
Granične koncentracije  
10. Za razliku od akutnih studija, u 28-dnevnoj studiji subakutne inhalacijske 
toksičnosti nema odre đenih grani čnih koncentracija. Maksimalna ispitna 
koncentracija treba uzeti u obzir: 1) maksimalnu koncentraciju koja se može posti ći, 2) razinu za izlaganje ljudi s „najgorim scenarijem ”, 3) 
potrebu za održavanjem odgovaraju će opskrbe kisikom i/ili 4) pretpostavke 
za dobrobit životinja. U nedostatku ograni čenja na temelju podataka mogu 
se upotrijebiti akutne granice iz Uredbe (EZ) br. 1272/2008 (13) (tj. do maksimalne koncentracije od 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za pare i 
20 000 ppm za plinove); vidjeti GD 39 (2). Ako je pri ispitivanju plinova 
ili vrlo hlapljivih ispitivanih kemikalija (npr. rashladnih sredstava) potrebno premašiti te granice, treba priložiti obrazloženje. Grani čna koncentracija 
trebala bi izazvati nedvojbenu toksi čnost, a da pritom ne izazove pretjerani 
stres za životinje ili utje če na njihovu dugovje čnost (3).
 
Studija za utvr đivanje raspona  
11. Prije po četka glavne studije može biti potrebno provesti studiju za utvr ­ 
đivanje raspona. Studija za utvr đivanje raspona opsežnija je od preliminarne 
studije jer nije ograni čena na odabir koncentracije. Znanje prikupljeno u 
studiji za utvr đivanje raspona može dovesti do uspješne glavne studije. 
Studija za utvr đivanje raspona može, primjerice, pružiti tehni čke informacije 
u svezi s analiti čkim metodama, odre đivanjem veli čine čestica, otkrivanjem 
toksičnih mehanizama, klini čko-patološkim i histopatološkim podacima i 
procjenama mogu ćih NOAEL i MTC koncentracija u glavnoj studiji. Vodi ­
telj istraživanja može odlu čiti primijeniti studiju za utvr đivanje raspona radi 
identifikacije praga nadraženosti respiratornog trakta (npr. s histopatologijom respiratornog trakta, ispitivanjem plu ćnih funkcija ili bronhoalveolarnim 
ispiranjem), gornje koncentracije koja se tolerira bez prekomjernog stresa 
za životinje i parametara koji će najbolje okarakterizirati toksi čnost ispiti ­
vane kemikalije.
 
12. Studija za utvr đivanje raspona može obuhva ćati jednu ili više razina koncen ­
tracije. Svakoj razini koncentraciji ne smije se izlagati više od tri mužjaka i tri ženke. Studija za utvr đivanje raspona treba trajati najmanje pet dana i 
općenito ne dulje od 14 dana. U izvješ ću o studiji treba pružiti argumenta ­
ciju za odabir koncentracije za glavnu studiju. Cilj glavne studije jest poka ­
zati odnos koncentracije i reakcije temeljen na o čekivanjima za najosjetljiviji 
krajnji učinak. Niska koncentracija idealno bi trebala biti koncentracija s 
neopaženim štetnim u čincima dok visoka koncentracija treba izazvati 
nedvojbenu toksi čnost bez izazivanja pretjeranog stresa za životinje ili bez 
utjecaja na njihovu dugovje čnost (3).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 290
 
13. Pri odabiru razina koncentracije za studiju za utvr đivanje raspona u obzir 
treba uzeti sve raspoložive informacije uklju čujući odnose strukture i aktiv ­
nosti te podatke za sli čne kemikalije (vidjeti stavak 3.). Studija za utvr ­ 
đivanje raspona može potvrditi/opovrgnuti mehanisti čki utemeljene krajnje 
učinke koje se smatra najosjetljivijima, npr. inhibiciju kolinesteraze organo ­
fosfatima, formaciju methemoglobina eritrocitotoksi čnim agensima, hormone 
štitnjače (T  3 , T 4 ) za tirotoksikante, proteine, LDH ili neutrofile u bronhoal ­
veolarnom ispiranju za neškodljive, slabo topljive čestice ili aerosole koji 
nadražuju plu ća. 
Glavna studija  
14. Glavna studija subakutne toksi čnosti općenito obuhva ća tri razine koncen ­
tracije kao i paralelnu negativnu kontrolu (zrak) i/ili kontrolu nosa ča po 
potrebi (vidjeti stavak 17.). Sve raspoložive podatke treba upotrijebiti kao 
pomoć pri odabiru odgovaraju ćih razina izlaganja, uklju čujući rezultate 
sustavnih studija toksi čnosti, metabolizma i kinetike (poseban naglasak 
treba staviti na izbjegavanje visokih razina koncentracije koje zasi ćuju 
kinetičke procese). Svaka ispitna skupina sadrži najmanje deset glodavaca 
(pet mužjaka i pet ženki) koji se izlažu ispitivanoj kemikaliji šest sati dnevno pet dana u tjednu u razdoblju od četiri tjedna (ukupno trajanje 
studije 28 dana). Životinje se mogu tako đer izlagati i sedam dana tjedno 
(npr. kada se ispituju inhalirani lijekovi). Ako je za jedan od spolova 
poznato da je osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje, spolovi se mogu izlagati razli čitim razinama koncentracije kako bi se opti ­
mizirao odnos koncentracije i reakcije, kao što je opisano u stavku 15. Ako 
izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksi ­
malno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. Ako se primjenjuje izlaganje kra će od šest 
sati dnevno ili ako je potrebno provesti dugotrajno izlaganje (npr. 22 sata 
dnevno) u sklopu studije izlaganja čitavim tijelom [vidjeti GD 39 (2)], treba 
pružiti argumente. Tijekom izlaganja treba obustaviti davanje hrane osim ako izlaganje nije dulje od šest sati. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
 
15. Odabrane ciljane koncentracije moraju identificirati ciljni(-e) organ(-e) i 
pokazati jasan odnos koncentracije i reakcije:  
— Visoka razina koncentracije trebala bi rezultirati toksi čnim učincima, ali 
ne izazvati znakove dugotrajnosti ili smrtnosti koji bi sprije čili suvislu 
ocjenu.  
— Srednju(-e) razinu(-e) koncentracije trebalo bi prorijediti kako bi se 
proizvelo stupnjevanje toksi čnih učinaka izme đu visoke i niske 
koncentracije.  
— Niska koncentracija treba pružiti malo ili nimalo dokaza o toksi čnosti.  
Satelitska (reverzibilna) studija  
16. Satelitska (reverzibilna) studija može se primijeniti kako bi se promatrala 
reverzibilnost, postojanost ili zakašnjelo pojavljivanje toksi čnosti u razdoblju 
nakon tretiranja, odgovaraju ćeg trajanja, ali ne kra ćeg od 14 dana. Satelitske 
(reverzibilne) skupine sastoje se od pet mužjaka i pet ženki koji se izlažu istodobno s pokusnim životinjama u glavnoj studiji. Skupine za satelitsku (reverzibilnu) studiju treba izlagati ispitivanoj kemikaliji na najvišoj razini 
koncentracije i moraju se provoditi paralelne kontrole zraka i/ili nosa ča 
(vidjeti stavak 17.).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 291
 
Kontrolne životinje  
17. Sa životinjama iz paralelnih negativnih kontrola (zrak) treba postupati na 
jednak na čin kao i sa životinjama iz ispitne skupine osim što ih se izlaže 
filtriranom zraku, a ne ispitivanoj kemikaliji. Ako se voda ili druga tvar 
primjenjuje kao pomo ć u stvaranju ispitne atmosfere, u studiju treba uklju ­ 
čiti kontrolni nosa č umjesto negativne (zrak) kontrolne skupine. Kada god je 
to moguće, kao nosa č treba upotrebljavati vodu. Kada se kao nosa č koristi 
voda, životinje iz kontrolne skupine treba izlagati zraku jednake relativne 
vlažnosti kao i izložene skupine. Odabir prikladnog nosa ča treba se temeljiti 
na prikladno provedenoj predstudiji ili povijesnim podacima. Ako nije poznata toksi čnost medija, voditelj istraživanja može odlu čiti da upotrijebi 
negativnu (zrak) kontrolu i kontrolu nosa ča, ali to se izri čito destimulira. 
Ako povijesni podaci pokažu da nosa č nije toksi čan, nema potrebe za nega ­
tivnom (zrak) kontrolnom skupinom i treba rabiti samo kontrolu nosa ča. 
Ako predstudija ispitivane kemikalije formulirane u nosa ču ne pokaže 
nikakvu toksi čnost, znači da nosa č nije toksi čan u ispitnoj koncentraciji te 
stoga ne treba provoditi kontrolu nosa ča.
 
UVJETI IZLAGANJA  
Primjena koncentracija  
18. Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili 
njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o 
fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentra ­
ciji i/ili fizikalnom obliku koji je obi čno prisutan tijekom manipulacije 
ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reak ­
tivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija. Materijal u 
česticama može se podvrgnuti mehani čkim procesima za smanjenje veli čine 
čestica. Ostale upute nalaze se u GD 39 (2).
 
Distribucija veli čine čestica  
19. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogu ćilo izlaganje svih rele ­
vantnih podru čja respiratornog trakta, preporu ča se aerosol sa srednjim aero ­
dinamičkim promjerom čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 3 μm s geome ­
trijskom standardnom devijacijom ( σ g ) u rasponu od 1,5 do 3,0 (4). Iako 
treba učiniti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se ne mogu 
postići, treba podnijeti stru čno mišljenje. Primjerice, metalne čestice u ispa ­
rini mogu biti manje od tog standarda, a napunjene čestice i vlakna mogu 
biti veći. 
Priprema ispitivane kemikalije u nosa ču 
20. Idealno bi bilo da se ispitivana kemikalija ispituje bez nosa ča. Ako je 
potrebno primijeniti nosa č za stvaranje odgovaraju će koncentracije ispitivane 
tvari i veli čine čestica, prednost treba dati vodi. Kad god se ispitivana 
kemikalija otapa u nosa ču, treba dokazati njegovu stabilnost.  
PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA  
Protok zraka u komori  
21. Protok zraka u komori za izlaganje treba pažljivo kontrolirati, neprestano 
nadzirati te bilježiti najmanje jedanput u sat vremena tijekom svakog izlaga ­
nja. Nadziranje koncentracije (ili privremene stabilnosti) u ispitnoj atmosferi, provedeno u stvarnom vremenu, sastavna je mjera svih dinami čkih parame ­
tara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara 
dinamičke inhalacije. Ako se koncentracija nadzire u stvarnom vremenu, 
učestalost mjerenja protoka zraka može se smanjiti na jedno mjerenje po
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 292
 
izlaganju dnevno. Posebnu pažnju treba obratiti na izbjegavanje ponovnog 
udisanja u komorama za izlaganje samo nosom. Koncentracija kisika mora 
iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije prema ­ 
šivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takav standard ne može postići, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida. Ako mjerenja 
prvog dana izlaganja pokažu da su plinovi na pravilnoj razini, nisu potrebna 
daljnja mjerenja.
 
Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori  
22. Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost 
zraka u podru čju udisanja životinja za izlaganje samo nosom i čitavim 
tijelom treba neprestano nadzirati i bilježiti svakoga sata tijekom svakog 
izlaganja kad je to mogu će. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi po mogu ć­
nosti održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemogu će (npr. u 
slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na 
ispitivanu kemikaliju pomo ću ispitne metode.  
Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija  
23. Kad god je to mogu će, treba izra čunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u 
komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja 
životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije 
daje uvid u u činkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može 
upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
 
Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija  
24. Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije uzorkovana u 
zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može 
se dobiti specifi čnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim 
ili kemijskim reaktivnim metodama te analiti čkom karakterizacijom nakon 
toga) ili nespecifi čnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. 
Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo 
jednom komponentom u prahu ili aerosole teku ćina niskog stupnja hlaplji ­
vosti i treba je podržati odgovaraju ćom preliminarnom karakterizacijom 
specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se 
odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to 
su potrebni analiti čki podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se 
prenosi zrakom sli čan početnom materijalu. Ako ta informacija nije 
dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u 
stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. 
Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze.
 
25. Ako je mogu će, tijekom trajanja studije treba upotrijebiti jednu partiju ispi ­
tivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će 
biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije po četka studije 
treba karakterizirati ispitivanu kemikaliju uklju čujući njezinu čistoću, ako je 
tehnički izvedivo, identitet te koli čine identificiranih kontaminiraju ćih tvari i 
nečistoća. To se može dokazati sljede ćim podacima, ali nije ograni čeno na 
njih: vrijeme retencije i relativno vršno podru čje, molekulska masa iz spek ­
troskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sli čnih procjena. 
Iako identitet ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za 
laboratorij može biti mudro barem u ograni čenim okvirima potvrditi naru ­ 
čiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalno stanje itd.).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 293
 
26. Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je god mogu će. 
Uređaj za nadzor u stvarnom vremenu, kao što je fotometar za aerosol ili 
uređaj za analizu ukupnih ugljikovodika za paru, može se upotrijebiti za 
dokazivanje stabilnosti uvjeta izlaganja. Stvarnu koncentraciju u komori treba mjeriti najmanje 3 puta tijekom svakog dana izlaganja za svaku 
razinu izlaganja. Ako to nije izvedivo zbog ograni čenog protoka zraka ili 
niskih koncentracija, prihvatljiv je jedan uzorak po razdoblju izlaganja. Uzorak se u idealnom slu čaju uzima tijekom cijelog razdoblja izlaganja. 
Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije 
u komori odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare i ne za više od 
± 20 % za teku ćine ili kruti aerosol. Treba izra čunati i zabilježiti vrijeme za 
postizanje ravnoteže u komori (t
 95 ). Trajanje izlaganja zahva ća vrijeme 
proizvodnje ispitivane kemikalije. Pritom se vodi ra čuna o vremenu 
potrebnom za postizanje ravnoteže u komori (t  95 ) i vremenu raspada. Smjer ­
nica za procjenu t  95 može se prona ći u GD 39 (2).  
27. Za vrlo složene smjese sastavljene od plinova/para i aerosola (npr. zapaljive 
atmosfere i i ispitivane kemikalije izba čene iz namjenskih proizvoda/ure đaja 
za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati druk čije u komori za inhalaciju. 
Stoga treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obi čno glavnu 
aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispitivana kemi ­
kalija smjesa, treba izvijestiti o analiti čkoj koncentraciji ukupne smjese, a ne 
samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se prona ći u GD 39 (2).
 
Ispitivana kemikalija: Distribucija veli čine čestica  
28. Distribuciju veli čine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje jedanput 
tjedno za svaku razinu koncentracije uporabom kaskadnog impaktora ili 
alternativnog instrumenta poput ure đaja za aerodinami čku analizu veli čine 
čestica (APS). Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim 
impaktorom i alternativnim instrumentom ekvivalentni, u studiji se može 
upotrebljavati alternativni instrument.  
29. Drugi ure đaj, poput gravimetrijskog filtra ili ure đaja za sudaranje/ure đaja za 
mjerenje mjehuri ća plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instru ­
mentom kako bi se potvrdila u činkovitost skupljanja primarnog instrumenta. 
Koncentracija mase dobivena analizom veli čine čestica trebala bi biti u 
razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati na svim koncen ­
tracijama ispitanima u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja 
mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se minimalizirali nedefinitivni podaci koji mogu izazvati potrebu za ponavljanjem studije.
 
30. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva 
mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako su u 
čestice otkrivene u atmosferi pare s potencijalom za miješane faze.  
OPAŽANJA  
31. Životinje treba klini čki promatrati prije, tijekom i nakon razdoblja izlaganja. 
Češća opažanja mogu biti potrebna ovisno o reakciji životinja tijekom izla ­
ganja. Ako primjena cijevi koje sputavaju, slabo osvijetljenih komora za čitavo tijelo ili neprozirna atmosfera ometaju opažanje na životinjama, 
opažanje treba pažljivo obaviti nakon izlaganja. Opažanja prije izlaganja 
sljedećeg dana mogu ocijeniti reverzibilnost ili pogoršanje toksi čnih učinaka.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 294
 
32. Sva se opažanja bilježe u pojedina čnim evidencijama za svaku životinju. 
Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se prona đe uginule, 
vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je mogu će preciznije.  
33. Opažanja u kavezu moraju uklju čivati promjene na koži i krznu, o čima i 
sluznicama te promjene u dišnom i cirkulacijskom sustavu, promjene u 
živčanom sustavu te promjene u somatomotori čkoj aktivnosti i uzorcima 
ponašanja. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, saliva ­
cije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj 
s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom. U protokol studije mogu se uklju čiti 
i dodatna odre đivanja, kao što su kinetika, biološki monitoring, funkcija 
pluća, retencija slabo topljivih materijala koji se nakupljaju u plu ćnom 
tkivu te promjene u ponašanju.
 
TJELESNA MASA  
34. Pojedina čnu masu životinja treba zabilježiti neposredno prije prvog izlaganja 
(0. dan), dvaput tjedno nakon toga (primjerice, petkom i ponedjeljkom kako bi se dokazao oporavak preko vikenda bez izlaganja ili u vremenskom razdoblju koje omogu ćuje utvrđivanje sistemske toksi čnosti) te u vrijeme 
uginuća ili usmr ćenja. Ako u prva dva tjedna nema u činaka, tijekom ostatka 
studije tjelesna se masa može mjeriti jedanput tjedno. Satelitske (reverzi ­
bilne) životinje (ako se koriste) treba nastaviti vagati jedanput tjedno tijekom čitavog razdoblja oporavka. Na kraju istraživanja sve životinje treba izvagati 
kratko prije usmr ćenja kako bi se omogu ćilo nepristrano odre đivanje odnosa 
mase organa i tjelesne mase.
 
UNOS HRANE I VODE  
35. Unos hrane treba mjeriti jedanput tjedno. Tako đer se može mjeriti i unos 
vode.  
KLINIČKA PATOLOGIJA  
36. Klini čko-patološke pretrage treba obaviti za sve životinje uklju čujući 
kontrolnu i satelitsku (reverzibilnu) skupinu u trenutku usmr ćivanja. Treba 
zabilježiti vremensko razdoblje izme đu kraja izlaganja i prikupljanja krvi, 
posebno ako je rekonstrukcija ciljanog krajnjeg u činka brza. Uzorkovanje 
nakon završetka izlaganja indicirano je za parametre s kratkim poluvre ­
menom plazme (npr. COHb, CHE, i MetHb).  
37. U tablici 1. navedeni su klini čko-patološki parametri koji se op ćenito traže 
za sva toksikološka ispitivanja. Analiza urina ne traži se rutinski, ali se može provesti ako se smatra korisnom na temelju o čekivane ili opažene toksi čno­
sti. Voditelj istraživanja može odlu čiti da odredi i dodatne parametre radi 
bolje karakterizacije toksi čnosti ispitivane kemikalije (npr. kolinesteraza, 
lipidi, hormoni, ravnoteža kiselina i lužina, methemoglobin ili Heinzova tjelešca, kreatin kinaza, omjer mijeloida i eritroida, troponin, plinovi u arte ­
rijskoj krvi, laktat dehidrogenaza, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidro ­
genaza i gama glutamil transpeptidaza).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 295
 
Tablica 1.  
Standardni klini čko-patološki parametri  
Hematologija  
Broj eritrocita 
Hematokrit 
Koncentracija hemoglobina Prosječna masa hemoglobina 
Prosječni volumen eritrocita 
Prosječna koncentracija hemoglobina u 
eritrocitima 
Retikulociti
 Ukupni broj leukocita 
Diferencijalni broj leukocita 
Broj trombocita Vrijeme zgrušavanja (odabrati 
jedno): 
— Protrombinsko vrijeme 
— Vrijeme zgrušavanja — Parcijalno tromboplastinsko 
vrijeme
 
Klinička kemija  
Glukoza (*) 
Ukupni kolesterol Trigliceridi 
Dušična urea u krvi 
Ukupni bilirubin Kreatinin 
Ukupni proteini 
Albumini Globulini
 Alanin aminotransferaza 
Aspartat aminotransferaza Alkalna fosfataza 
Kalij 
Natrij Kalcij 
Fosfor 
Kloridi
 
Analiza urina (opcija)  
Izgled (boja i zamu ćenost) 
Volumen Specifična težina ili osmolalnost 
pH
 Ukupni proteini 
Glukoza Krv/krvne stanice
 
(*) Budu ći da dulji post može izazvati pristranost u mjerenju glukoze za tretirane i 
kontrolne životinje, voditelj istraživanja treba odrediti trebaju li životinje postiti. 
Ako se primjenjuje razdoblje posta, ono treba biti primjereno korištenim vrstama; 
za štakore to može biti 16 h (post preko no ći). Određivanje glukoze u razdoblju 
posta može se provesti nakon prekono ćnog posta u zadnjem tjednu izlaganja ili 
nakon prekono ćnog posta prije obdukcije (u posljednjem slu čaju zajedno sa svim 
ostalim klini čko-patološkim parametrima).  
38. Ako postoji dokaz da je donji respiratorni trakt (tj. alveole) primarno mjesto 
taloženja i retencije, bronhoalveolarno ispiranje (BAL) može biti tehnika izbora za kvantitativnu analizu hipotetski utemeljenih parametara u činka 
doze fokusiranih na alveolitis, upalu plu ća i fosfolipidozu. To omogu ćuje 
prikladno i temeljito istraživanje promjena u ozljedama na alveolama pove ­
zanih s reakcijama na dozu i protok vremena. Teku ćina za BAL mora se 
analizirati radi ukupnog i diferencijalnog broja leukocita, ukupnog broja 
proteina i laktat dehidrogenaze. Drugi parametri koji se mogu uzeti u 
obzir jesu parametri indikativni za lizosomalne bolesti, fosfolipidozu te iritacijske ili alergijske upale koje mogu uklju čivati odre đivanje proupalnih 
citokineza/kemokineza. Mjerenja BAL obi čno upotpunjuju rezultate histopa ­
toloških pretraga, ali ih ne mogu zamijeniti. Upute za provo đenje ispiranja 
pluća nalaze se u GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 296
 
MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA I MASA ORGANA  
39. Sve pokusne životinje, uklju čujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule 
ili su uklonjene iz studije radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti kompletnim pretragama (ako je izvedivo) i makroskopskoj analizi. Treba zabilježiti 
vrijeme izme đu kraja posljednjeg izlaganja svake životinje i njezina usmr ­ 
ćivanja. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkri ća 
uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju 
treba provesti što je mogu će prije, obi čno u roku od jednog ili dva dana. Za 
svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
 
40. U tablici 2. nalazi se popis organa i tkiva koje tijekom makroskopske 
analize treba sa čuvati u odgovaraju ćem mediju radi histopatoloških pretraga. 
Čuvanje [to čno određenih] organa i tkiva te drugih organa i tkiva prepušteno 
je voditelju istraživanja.  Masno otisnute  organe treba obrezati i izvagati što 
je moguće prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo njihovo sušenje. Štitnja ču 
i epididimise treba izvagati samo ako je potrebno jer obrezivanje artefakata može sprije čiti histopatološku procjenu. Tkiva i organe treba fiksirati u 
puferiranom 10 % formalinu ili drugom prikladnom fiksativu odmah 
nakon provedene obdukcije, i to, dakle, ne kra će od 24 - 48 sati prije 
obrezivanja ovisno o primijenjenom fiksativu.
 
Tablica 2.  
Organi i tkiva sa čuvani tijekom makroskopske analize  
Nadbubrežne žlijezde  
Koštana srž (i/ili svježi aspirat)  
Mozak  (uključujući sekcije velikog i malog 
mozga te medule/mosta)  
[Oči (mrežnica, o čni živac) i o čni kapci]  
Srce  
Bubrezi  
Grkljan (3 razine, 1 razina za uklju čivanje u 
bazu epiglotisa)  
Jetra  
Pluća (svi režnjevi na jednoj razini, uklju ču­
jući glavni bronh)  
Limfni čvorovi iz hilusne regije plu će, 
posebno za slabo topljive ispitivane kemika ­
lije u česticama, za dublje pretrage i/ili studije 
s imunološkim fokusom u obzir se mogu 
uzeti dodatni limfni čvorovi, npr. limfni 
čvorovi iz medijastinalne, cervikalne/subman ­
dibularne i/ili aurikularne regije.  
Nazofaringealna tkiva (najmanje 4 razine: 1 
razina za uklju čivanje nazofaringealnog 
kanala i nazalno limfati čko tkivo (NALT))  
Jednjak  
[Olfaktorni bulbus]  
Jajnici  Sjemenski mjehuri ći 
Kralježnica (vratna, srednja prsna i slabin ­
ska) 
Slezena  
Želudac  
Testisi  
Timus  
Štitnjača 
Dušnik (najmanje 2 razine uklju čujući 1 
longitudinalnu sekciju kroz greben i 1 tran ­
sverzalnu sekciju)  
[Mokraćni mjehur]  
Maternica  
Sve makroskopske lezije  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 297
 
41. Pluća treba ukloniti netaknuta, izvagati te polako nalijevati prikladnim fiksa ­
tivom pod tlakom od 20 - 30 cm vode kako bi se osiguralo održanje 
strukture plu ća (5). Sekcije treba prikupiti za sve režnjeve jedne razine, 
uključujući glavni bronh, ali ako je provedeno ispiranje plu ća, neisprani 
režanj treba secirati na tri razine (ne serijske sekcije).  
42. Treba ispitati najmanje 4 razine nazofaringealnih tkiva, a jedna od njih mora 
uključivati nazofaringealni kanal (5, 6, 7, 8, 9) kako bi se omogu ćilo 
potpuno ispitivanje ljuskavog, tranzicijskog (necilijarnog respiratornog), 
respiratornog (cilijarnog respiratornog) i olfaktornog epitela te drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Treba ispitati tri razine grkljana, a jedna 
od njih mora obuhva ćati bazu epiglotisa (12). Treba ispitati najmanje dvije 
razine dušnika uklju čujući jednu longitudinalnu sekciju kroz greben mjesta 
razdvajanja ekstrapulmonalnog bronha te jednu transverzalnu sekciju.
 
HISTOPATOLOGIJA  
43. Treba provesti histopatološku procjenu svih organa i tkiva navedenih u 
tablici 2. za kontrolnu skupinu i skupinu izloženu visokoj koncentraciji te 
za sve životinje koje uginu ili su usmr ćene tijekom studije. Posebnu pozor ­
nost treba posvetiti respiratornom traktu, organima metama te makroskop ­
skim lezijama. Organe i tkiva s lezijama u skupini izloženoj visokoj koncen ­
traciji treba ispitati u svim skupinama. Voditelj istraživanja može odlu čiti 
provesti histopatološke pretrage za dodatne skupine kako bi dokazao jasnu 
reakciju na koncentraciju. Ako se upotrebljava satelitska (reverzibilna) skupina, histopatološku procjenu treba provesti na svim tkivima i organima 
za koje je u tretiranim skupinama utvr đeno da pokazuju u činke. U slu čaju 
pojavljivanja prekomjernog broja uginulih životinja ili drugih problema u skupini izloženoj visokoj koncentraciji, koje kompromitiraju zna čenje poda ­
taka, histopatološku analizu treba provesti na sljede ćoj nižoj koncentraciji. 
Treba pokušati povezati makroskopska opažanja s mikroskopskim nalazima.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
44. Treba navesti individualne podatke o tjelesnoj masi, potrošnji hrane, klini ­ 
čkoj patologiji, makroskopskoj patologiji, masi organa te histopatologiji. 
Podatke prikupljene klini čkim promatranjem treba skupiti u obliku tablice, 
prikazuju ći za svaku ispitnu skupinu broj upotrijebljenih životinja, broj 
životinja koje pokazuju specifi čne znakove toksi čnosti, broj životinja koje 
su tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz humanih razloga, 
vrijeme uginu ća pojedinih životinja, opis i vremenski tijek te reverzibilnost 
toksičnih učinaka i nalaze obdukcije. Sve rezultate, kvantitativne i popratne, 
treba ocijeniti odgovaraju ćom statisti čkom metodom. Može se upotrijebiti 
bilo koja op će prihvaćena statisti čka metoda, a statisti čke metode treba 
odabrati tijekom planiranja studije.  
Izvješće o ispitivanju  
45. Izvješ će o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljede će 
informacije:  
Pokusne životinje i njihov uzgoj  
— Opis uvjeta držanja u kavezu, uklju čujući: broj (ili promjenu broja) 
životinja u svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu 
vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 298
 
— Korištena vrsta/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora. 
Mogu se navesti podrijetlo i povijesni podaci ako potje ču od životinja 
izloženih u sli čnim uvjetima izlaganja, smještaja i posta.  
— Broj, dob i spol životinja.  
— Metoda nasumi čnog odabira.  
— Opis svih kondicioniranja prije ispitivanja, uklju čujući prehranu, karan ­
tenu i lije čenje bolesti.  
Ispitivana kemikalija  
— Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva 
(uključujući izomerizaciju).  
— Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract 
Services (CAS) ako je poznat.  
Nosač 
— Obrazloženje za uporabu nosa ča i obrazloženje za odabir nosa ča (ako 
nije voda).  
— Povijesni ili odgovaraju ći podaci koji pokazuju da nosa č ne ometa rezul ­
tate studije.  
Komora za inhalaciju  
— Detaljan opis komore za inhalaciju, uklju čujući volumen i dijagram.  
— Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje 
atmosfere.  
— Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veli čine čestica te stvarne 
koncentracije.  
— Izvor zraka i sustav za klimatizaciju.  
— Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene 
atmosfere za ispitivanje.  
— Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna).  
— Otvori za izlaganje po komori (samo nos); lokacija životinja u sustavu 
(čitavo tijelo).  
— Stabilnost ispitne atmosfere.  
— Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmos ­
fere u komori.  
— Tretiranje dovodnog/ekstrahiranog zraka.  
— Količina protoka zraka, otvor za koli činu protoka zraka po izlaganju 
(samo nos) ili dovod životinja po komori ( čitavo tijelo).  
— Vrijeme za postizanje ravnoteže u komori za inhalaciju (t95).  
— Broj promjena u volumenu po satu.  
— Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo).  
Podaci o izlaganju  
— Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnoj studiji.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 299
 
— Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u 
komori za inhalaciju podijeljena volumenom zraka koji je prošao kroz 
komoru).  
— Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za 
smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) 
svaka se može analizirati odvojeno.  
— Sve koncentracije zraka treba navesti u jedinicama mase (mg/l mg/m  3 
itd.), a ne u jedinicama volumena (ppm, ppb itd.).  
— Distribucija veli čine čestica, srednji aerodinami čki promjer 
čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija ( σ g ) uključujući 
metode za njihov izra čun. Treba prikazati pojedina čne analize veli čine 
čestica.  
Uvjeti ispitivanja  
— Pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije, uklju čujući pojedinosti o 
svim postupcima korištenim za smanjenje veli čine čestica krutina ili za 
pripremu otopina ispitivane kemikalije.  
— Opis (po mogu ćnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje ispitne 
atmosfere te izlaganje životinja ispitnoj atmosferi.  
— Pojedinosti o opremi korištenoj za nadziranje temperature, vlažnosti i 
protoku zraka u komori (tj. razvoj kalibracijske krivulje).  
— Pojedinosti o opremi korištenoj za skupljanje uzoraka za odre đivanje 
koncentracije u komori i distribuciju veli čine čestica.  
— Pojedinosti o korištenoj kemijskoj analiti čkoj metodi i potvrdi metode 
(uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za 
uzorkovanje).  
— Metoda nasumi čnog odabira za svrstavanje životinja u ispitnu i 
kontrolnu skupinu.  
— Pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući tip/izvor hrane, izvor 
vode).  
— Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija.  
Rezultati  
— Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori.  
— Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori.  
— Tablični prikaz podataka u veli čini čestica, uklju čujući podatke o 
skupljenim analiti čkim uzorcima, distribuciju veli čina čestica te izra čune 
MMAD i σ g . 
— Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku živo ­
tinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti uklju čujući 
smrtnost, narav, stupanj, vrijeme nastupanja i trajanja u činaka).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 300
 
— Tablični prikaz pojedina čne mase životinja.  
— Tablični prikaz unosa hrane.  
— Tablični prikaz klini čko-patoloških podataka.  
— Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su 
dostupni.  
— Tablični prikaz svih ostalih izmjerenih parametara.  
Rasprava i tuma čenje rezultata  
— Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje 
kriterija ove ispitne metode, npr. grani čnu koncentraciju ili veli činu 
čestica.  
— Treba raspravljati o sposobnosti udisanja čestica u svjetlu op ćih nalaza, 
posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veli činu čestica.  
— U opću ocjenu studije treba uklju čiti dosljednost metoda korištenih za 
određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncen ­
tracije prema nazivnoj.  
— Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavaju ćim načinom djelo ­
vanja (sistemski u odnosu na lokalni).  
— U slu čaju humanog usmr ćivanja životinja koje su patile ili pokazivale 
znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju kriterija iz Smjernice za humano usmr ćivanje OECD-a (3).
 
— Treba identificirati organ/e metu/e.  
— Treba odrediti NOAEL i LOAEL.  
LITERATURA  
1. OECD (1981.). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Pariz.  
2. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.  
3. OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
 
4. Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, str. 229-258.
 
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231- 
238. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 301
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
 
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13. Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 16. prosinca 
2008. o razvrstavanju, ozna čavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se 
izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te 
izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 302
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 303
 
B.9. TOKSI ČNOST (DERMALNA) PRI PONAVLJANOJ DOZI (28 
DANA)  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (A).  
1.2. DEFINICIJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (B).  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana se tvar 28 dana svakodnevno nanosi na kožu nekoliko 
skupina pokusnih životinja u stupnjevanim dozama, pri čemu se na 
svaku skupinu primjenjuje po jedna visina doze. Tijekom razdoblja nanošenja tvari, životinje se svaki dan opažaju kako bi se otkrili znakovi toksi čnosti. Životinje koje uginu tijekom ispitivanja 
podvrgavaju se obdukciji, a po završetku ispitivanja životinje koje 
su preživjele ispitivanje usmr ćuju se i obduciraju.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema  
Životinje se drže u pokusnim uvjetima u pogledu smještaja i 
hranjenja najmanje pet dana prije po četka pokusa. Prije ispitivanja 
zdrave mlade životinje nasumce se odabiru i raspore đuju u skupine 
za tretiranje i u kontrolne skupine. Neposredno prije ispitivanja na hrptenom dijelu trupa pokusnih životinja ošiša se dlaka. Dlaka se može i obrijati, ali to treba napraviti približno 24 sata prije ispitiva ­
nja. Šišanje ili brijanje treba ponavljati otprilike svaki tjedan. Pri 
šišanju ili brijanju dlake treba paziti da se ne ostruže koža. Za nanošenje ispitivane tvari najmanje 10 % tjelesne površine mora biti bez dlake. Pri odlu čivanju o površini s koje će odstraniti dlaka 
i o dimenzijama krpice kojom će se ta površina prekriti treba uzeti u 
obzir tjelesnu masu životinje. Kad se ispituju krute tvari koje se prema potrebi mogu usitniti u prah, ispitivanu tvar treba u dovoljnoj 
mjeri navlažiti vodom ili, tamo gdje je to potrebno, odgovaraju ćim 
nosačem kako bi se osigurao dobar kontakt s kožom. Teku će ispiti­
vane tvari op ćenito se primjenjuju nerazrije đene. Ispitivana se tvar 
nanosi jednom na dan, pet do sedam dana u tjednu.
 
1.6.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.6.2.1.  Pokusne životinje  
Mogu se koristiti odrasli štakori ili kuni ći. Moguće je koristiti i 
druge vrste, ali je za to potrebno navesti opravdane razloge.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 304
 
Na početku studije tjelesna masa korištenih životinja ne smije varirati 
za više od ± 20 % odgovaraju će srednje vrijednosti.  
1.6.2.2.  Broj i spol  
Za svaku visinu doze treba upotrijebiti najmanje 10 životinja (pet 
ženki i pet mužjaka) koji imaju zdravu kožu. Ženke ne smiju pret ­
hodno imati potomstvo i ne smiju biti gravidne. Ako se planira usmrćivanje životinja u me đuvremenu, prije završetka studije, nave ­
deni broj treba pove ćati za broj životinja predvi đen za takvo usmr ­ 
ćivanje. Osim toga, jednu se satelitsku skupinu od 10 životinja (po 
pet od svakog spola) može tretirati visokom dozom 28 dana, te nakon tretiranja opažati s obzirom na reverzibilnost, trajanje ili odgo ­ 
đenu pojavu toksi čkih učinaka. Koristi se i jedna satelitska skupina 
od 10 kontrolnih životinja (po pet životinja od svakog spola).
 
1.6.2.3.  Visina doza  
Potrebne su najmanje 3 visine doza s jednom kontrolom ili, ako se 
koristi otapalo, s kontrolom koju čini otapalo. Izlaganje treba trajati 
najmanje šest sati dnevno. Ispitivanu tvar treba nanositi u približno 
isto vrijeme svaki dan, uz povremena podešavanja (u tjednim ili dvotjednim intervalima) kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Izuzimaju ći tretiranje ispiti ­
vanom tvari, sa životinjama iz kontrolne skupine treba postupati na 
jednak na čin kao sa životinjama koje se podvrgavaju ispitivanju. 
Ako se radi lakšeg doziranja koristi nosa č, kontrolnoj skupini na 
koju se primjenjuje nosa č doze se daju na jednak na čin kao i treti ­
ranim skupinama i one moraju primiti iste koli čine kao skupina 
tretirana najvišom dozom. Najviša koncentracija treba izazvati toksičke učinke, ali smrtnih ishoda ne smije biti ili se mogu javiti 
u rijetkim slu čajevima. Najniža koncentracija ne bi smjela izazvati 
nikakve znakove toksi čkog učinka. Tamo gdje postoji primjenljiva 
procjena razine ljudske izloženosti, najniža koncentracija treba biti malo viša od te procijenjene razine. U idealnom slu čaju, srednja bi 
koncentracija trebala proizvesti minimalne vidljive toksi čke učinke. 
Ako se izme đu najviše i najniže koncentracije koristi više od jedne 
koncentracije, one se moraju primjenjivati u intervalima, kako bi se njihovi toksi čki učinci mogli stupnjevati. U skupinama tretiranim 
niskim i srednjim dozama i u kontrolnim skupinama, stopa smrtnosti 
treba biti niska da bi ocjena rezultata uop će imala smisla.
 
Ako primjena ispitivane tvari izazove tešku nadraženost kože, 
koncentracije treba smanjiti, što može dovesti do smanjenja ili 
izostanka drugih toksi čkih učinaka kod primjene visokih doza. 
Štoviše, ako do đe do jakog ošte ćenja kože, možda će trebati preki ­
nuti studiju i zapo četi novu s nižim koncentracijama.  
1.6.2.4.  Grani čni test  
Ako u preliminarnom ispitivanju primjena doze od 1 000 mg/kg ili 
više, doze vezane uz mogu ću ljudsku izloženost, ako je poznata, ne 
proizvede nikakve toksi čke učinke, daljnje ispitivanje smatra se 
nepotrebnim.  
1.6.2.5.  Razdoblje opažanja  
Opažanje pokusnih životinja radi otkrivanja znakova toksi čnosti 
treba provoditi svakodnevno. Vrijeme smrti kao i vrijeme pojave i 
nestanka znakova toksi čnosti treba zabilježiti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 305
 
1.6.3.  Postupak  
Životinje treba smjestiti u kaveze pojedina čno. U idealnim uvjetima, 
životinje se tretiraju sedam dana u tjednu, kroz vremensko razdoblje od 28 dana. Životinje iz bilo koje satelitske skupine koje su pred ­
viđene za dodatna opažanja treba držati dodatnih 14 dana bez treti ­
ranja kako bi se utvrdio oporavak od toksi čkih učinaka ili njihova 
trajnost. Izlaganje treba trajati najmanje šest sati dnevno.
 
Ispitivanu tvar treba jednakomjerno nanijeti na površinu koja čini 
približno 10 % ukupne tjelesne površine. Kod jako toksi čnih tvari 
površina na koju se tvar nanosi može biti i manja, ali čim veći dio te 
površine treba prekriti što tanjim i jednakomjernijim slojem.  
Tijekom izlaganja ispitivana tvar se drži u kontaktu s kožom pomo ću 
poroznog obloga od gaze i samoljepljive trake koja ne nadražuje kožu. Ispitnu površinu treba dodatno prekriti na odgovaraju ći način 
kako bi oblog i ispitivana tvar ostali na mjestu i kako bi se osiguralo 
da životinje ne mogu ispitivanu tvar unijeti oralno. Da bi se životinju spriječilo da ispitivanu tvar unese oralnim putem mogu se upotrije ­
biti pomagala za sputavanje, ali potpuna imobilizacija nije preporu ­ 
čena metoda. Kao alternativno rješenje može se koristiti „zaštitni 
ovratnik”.
 
Na kraju razdoblja izloženosti ostatke ispitivane tvari treba ukloniti, 
ako je mogu će vodom ili primjenom neke druge prikladne metode 
čišćenja kože.  
Sve životinje treba opažati svaki dan i bilježiti znakove toksi čnosti, 
navodeći vrijeme njihove pojave, stupanj i trajanje. Opažanje treba 
obuhvaćati promjene na koži i dlaci, o čima i sluznicama, na dišnom i 
cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živ čanom 
sustavu, kao i promjene u somatomotori čkoj aktivnosti i obrascu 
ponašanja. Svaki tjedan treba mjeriti tjelesnu masu životinja. Isto 
se tako preporu čuje tjedno mjeriti unos hrane. Redovito je opažanje 
životinja neophodno da bi se sprije čio gubitak životinja uslijed kani ­
balizma, autolize tkiva ili pogrešnog smještanja. Na kraju studije sve 
preživjele životinje iz nesatelitskih tretiranih skupina podvrgavaju se 
obdukciji. Životinje na umoru i životinje koje trpe jaki stres ili bol treba po uo čavanju ukloniti, humano usmrtiti i obducirati.
 
Na kraju ispitivanja na svim životinjama, uklju čujući i kontrolne 
životinje, obavljaju se sljede će pretrage:  
(1) hematološke, koje uklju čuju najmanje utvr đivanje hematokrita, 
koncentracije hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni 
broj leukocita i mjerenje sposobnosti zgrušavanja;  
(2) kliničke biokemijske pretrage krvi koje uklju čuju najmanje jedan 
parametar funkcije jetre i bubrega: serumsku alanin aminotrans ­
ferazu (prije poznatu pod nazivom glutamat-piruvat transami ­
naza), serumsku aspartat aminotransferazu (prije poznatu pod 
nazivom glutamat-oksaloacetat transaminaza), dušik u ureji, albumin, kreatinin u krvi, ukupni bilirubin i ukupne serumske bjelančevine.
 
Druge pretrage koje mogu biti potrebne za adekvatnu toksikološku 
ocjenu uklju čuju određivanje kalcija, fosfora, klorida, natrija, kalija, 
glukoze (natašte), analizu lipida, hormona, ravnoteže kiselina i 
lužina, metemoglobina i aktivnosti kolinesteraze.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 306
 
Za detaljnije prou čavanje toksi čkih učinaka mogu se po potrebi 
obaviti dodatne klini čke biokemijske analize.  
1.6.4.  Makroskopska obdukcija  
Sve životinje iz studije treba podvrgnuti detaljnoj makroskopskoj 
obdukciji. Najmanje jetru, bubrege, nadbubrežne žlijezde, plu ća i 
testise treba izvagati mokre, čim prije nakon seciranja, kako bi se 
spriječilo njihovo isušivanje. Organe i tkiva, tj. normalnu i tretiranu 
kožu, jetru, bubrege, slezenu, testise, nadbubrežne žlijezde, srce i 
ciljne organe (to jest sve organe na kojima su vidljive makroskopske 
lezije i promjene u veli čini) treba čuvati u odgovaraju ćem mediju za 
eventualne daljnje histopatološke pretrage.  
1.6.5.  Histopatološki pregled  
Kod skupine tretirane visokim koncentracijama i kod kontrolne 
skupne treba obaviti histološki pregled sa čuvanih organa i tkiva. 
Organi i tkiva s ošte ćenjima koja se mogu pripisati visokim koncen ­
tracijama ispitivane tvari moraju se detaljno ispitati i kod životinja iz skupina tretiranih niskim koncentracijama. Životinje iz satelitskih skupina treba histološki obraditi s posebnim naglaskom na one 
organe i tkiva kod kojih su u drugim tretiranim skupinama bili utvr ­ 
đeni toksički učinci.
 
2. PODACI  
Podatke je najbolje rezimirati u obliku tablice u kojoj je za svaku 
testiranu skupinu životinja prikazan broj životinja na po četku ispiti ­
vanja i broj životinja koje pokazuju pojedine vrste lezija.  
Sve dobivene rezultate treba ocijeniti prema odgovaraju ćoj statisti ­ 
čkoj metodi. Može se koristiti bilo koja priznata statisti čka metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— podaci o životinjama (vrsta, soj, podrijetlo, okolišni uvjeti, 
prehrana itd.),  
— uvjeti ispitivanja (uklju čujući vrstu obloga: okluzivni ili neoklu ­
zivni),  
— visine doza (uklju čujući nosač, ako se koristio) i koncentracije,  
— razina kod koje nema toksi čkih učinaka, tamo gdje je to mogu će, 
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i dozi,  
— vrijeme smrti tijekom studije, odnosno podaci o preživljavanju 
životinja do kraja ispitivanja,  
— toksički i drugi u činci, 
— vrijeme opažanja svakog znaka abnormalnosti i kasnije promjene,  
— podaci o hrani i tjelesnoj masi,  
— obavljena hematološka ispitivanja i dobiveni rezultati,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 307
 
— obavljena klini čka biokemijska ispitivanja i dobiveni rezultati,  
— nalazi obdukcije,  
— detaljni opis svih histopatoloških nalaza,  
— statisti čka obrada rezultata tamo gdje je to mogu će, 
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (D).  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B slovo (E).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 308
 
B.10.  MUTAGENOST –  IN VITRO  TEST ZA DOKAZIVANJE 
KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOD SISAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 473,  In vitro  ispitivanje 
kromosomskih aberacija kod sisavaca (1997.)  
1.1. UVOD  
Svrha  in vitro  testa za dokazivanje kromosomskih aberacija je utvr ­ 
đivanje agensa koji uzrokuju strukturne kromosomske aberacije u 
uzgojenim stanicama sisavaca (1)(2)(3). Postoje dvije vrste struk ­
turnih aberacija, kromosomska i kromatidna. Aberacije koje izaziva većina mutagena kromatidnog su tipa, ali javljaju se i aberacije 
kromosomskog tipa. Pove ćanje poliploidnosti može ukazivati na to 
da kemikalija ima potencijal za izazivanje numeri čkih aberacija. 
Međutim, ta metoda nije namijenjena za mjerenje numeri čkih abera ­
cija i rutinski se ne koristi u tu svrhu. Kromosomske mutacije i 
srodne pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja ljudi i postoje 
čvrsti dokazi da su kromosomske mutacije i srodne pojave koje 
uzrokuju promjene u onkogenima i genima supresorima tumora somatskih stanica povezane s pojavom raka kod ljudi i pokusnih 
životinja.
 
Kod in vitro  testa za dokazivanje kromosomskih aberacija mogu se 
koristiti kulture trajnih stani čnih linija, stani čni sojevi ili primarne 
stanične kulture. Stanice koje se koriste odabiru su na temelju 
sposobnosti rasta u kulturi, stabilnosti kariotipa, broja kromosoma, raznolikosti kromosoma i spontane u čestalosti kromosomskih 
aberacija.
 
Ispitivanja koja se obavljaju  in vitro  općenito zahtijevaju korištenje 
egzogenih izvora metaboli čke aktivacije. Taj sustav metaboli čke akti­
vacije ne može u cijelosti oponašati  in vivo  uvjete kod sisavaca. 
Mora se paziti da se izbjegava stvaranje uvjeta koji bi doveli do 
pozitivnih rezultata koji ne odražavaju suštinsku mutagenost i 
mogu proiza ći iz promjena u pH, osmolalnosti ili iz visokih razina 
citotoksičnosti (4)(5).  
Ovaj se test koristi za pregledavanje tvari koje mogu mutageno i 
karcinogeno djelovati na sisavce. Mnoge tvari koje su u tom testu pozitivne karcinogene su za sisavce; me đutim, ne postoji savršena 
povezanost izme đu tog testa i karcinogenosti. Ta povezanost ovisi o 
klasi opasnosti u koju je kemikalija svrstana i sve je više dokaza da postoje karcinogeni koji se ovim testom ne otkrivaju jer izgleda da djeluju kroz druge mehanizme, a ne na na čin da izravno ošte ćuju 
DNA.
 
Vidjeti i Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma izra ­ 
ženo kao lom pojedina čnih kromatida ili lom i ponovno spajanje 
kromatida.  
Aberacija kromosomskog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma 
izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na 
istom mjestu.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 309
 
Endoreduplikacija:  proces kod kojeg nakon S razdoblja DNA repli ­
kacije jezgra ne ulazi u mitozu, nego zapo činje drugo S razdoblje. 
Rezultat su kromosomi s četiri, osam, 16,... kromatida.  
Prekid (tijesni spoj):  akromatska lezija manja od širine jedne 
kromatide i s minimalnim otklonom (neporavnatoš ću) kromatida.  
Mitotski indeks:  omjer stanica u metafazi podijeljen s ukupnim 
brojem stanica opažanih u populaciji stanica; pokazatelj stupnja proliferacije (umnožavanja) te populacije.
 
Numerička aberacija:  promjena u broju kromosoma u odnosu na 
normalni broj koji je karakteristi čan za korištene stanice.  
Poliploidnost:  višekratnik haploidnog broja kromosoma ( n) osim 
diploidnog broja (tj. 3 n, 4n itd.).  
Strukturna aberacija:  promjena u strukturi kromosoma koja se 
može otkriti mikroskopskim pregledom podjele stanica u metafazi, 
koja se opaža kao delecije i fragmenti, inverzija ili translokacija.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Stanične kulture izlažu se ispitivanoj tvari s metaboli čkom aktiva ­
cijom i bez nje. Nakon izlaganja ispitivanoj tvari stani čne se kulture 
u prethodno odre đenim vremenskim intervalima tretiraju tvarima za 
zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid® ili kolchicin), izdvoji se i oboji dio stani čnog materijala te se metafazne stanice mikroskopski 
analiziraju na prisutnost kromosomskih aberacija.
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema  
1.4.1.1.  Stanice  
Mogu se koristiti razli čite stanične linije, sojevi ili primarne stani čne 
kulture, ukljuju ći ljudske stanice (npr. fibroblasti kineskog hr čka, 
limfociti periferne krvi čovjeka ili drugih sisavaca).  
1.4.1.2  Hranjive podloge i uvjeti za uzgoj kultura  
Za održavanje kultura treba upotrijebiti hranjive podloge za uzgoj 
kultura i osigurati uvjete za inkubaciju (posude za kulture, koncen ­
tracija CO  2 , temperatura i vlažnost). Trajne stani čne linije i sojevi 
moraju se rutinski pregledati na stabilnost u modalnom broju kromo ­
soma i odsustvo mikoplazmatske kontaminacije, te se ne smiju kori ­
stiti ako su kontaminirane. Mora se znati normalno trajanje stani čnog 
ciklusa i uvjeti za uzgoj kulture koja se koristi.  
1.4.1.3.  Priprema kultura  
Trajne stani čne linije i sojevi: stanice se razmnožavaju iz mati čnih 
kultura koje se nasade na hranjivu podlogu za uzgoj kultura tako 
gusto da kulture ne dosegnu konfluenciju prije izdvajanja stanica, te 
se inkubiraju na 37 °C.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 310
 
Limfociti: puna krv tretirana antikoagulantom (npr. heparinom) ili 
izdvojeni limfociti dobiveni od zdrave životinje stavljaju se u 
hranjivu podlogu za uzgoj kultura koja sadrži neki mitogen (npr. fitohemaglutinin) te se inkubiraju na 37 °C.
 
1.4.1.4.  Metaboli čka aktivacija  
Stanice treba izložiti ispitivanoj tvari uz prisutnost i bez prisutnosti 
prikladnog sustava za metaboli čku aktivaciju. Naj češće korišteni 
sustav je post-mitohodrijska frakcija (S9) u kompleksu s kofaktorom, pripremljena od jetre glodavaca tretiranih sredstvima za enzimsku indukciju kao što su: Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9), ili mješavina feno ­
barbitona i ß-naftoflavona (10)(11)(12).
 
Post-mitohondrijska frakcija obi čno se koristi u koncentracijama u 
rasponu od 1-10 % v/v u kona čnoj ispitnoj podlozi. Primjena sustava 
metaboličke aktivacije može ovisiti o klasi opasnosti u koju je 
svrstana kemikalija koja se ispituje. U nekim slu čajevima može 
biti prikladno koristiti više od jedne koncentracije 
post-mitohondrijske frakcije.  
Više promjena, uklju čujući genetski uzgojene stani čne linije u 
kojima su izraženi specifi čni aktivacijski enzimi, može odrediti 
potencijal za endogenu aktivaciju. Odabir korištenih stani čnih linija 
mora biti znanstveno opravdan (npr. relevantnost citokromnog P450 izoenzima za metabolizam ispitivane tvari).
 
1.4.1.5.  Ispitivana tvar/priprema  
Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim 
otapalima ili nosa čima i prije tretiranja stanica prema potrebi razrije ­
diti. Teku će ispitivane tvari mogu se u sustave ispitivanja dodavati 
izravno i/ili se prije obrade mogu razrijediti. Treba koristiti svježe 
pripravke ispitivane tvari, osim u slu čaju da podaci o stabilnosti 
pokazuju da ih je prihvatljivo pohranjivati.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/nosa č 
Ne smije postojati sumnja da će otapala/nosa či kemijski reagirati s 
ispitivanim tvarima te oni trebaju biti pogodni za preživljavanje 
stanica i djelovanje S9. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/ nosači, njihovo bi uklju čivanje u ispitivanje trebalo biti potkrije ­
pljeno podacima koji dokazuju njihovu pogodnost. Kad god je to 
moguće, preporu čuje se najprije razmotriti mogu ćnost primjene 
vodenog otapala/nosa ča. Pri ispitivanju tvari koje su u vodi nesta ­
bilne, ne smiju se koristiti organska otapala koja sadrže vodu. Voda se može ukloniti pomo ću molekularnog sita.
 
1.4.2.2  Koncentracije izlaganja  
Među kriterijima koja treba razmotriti kod odre đivanja najviših 
koncentracija su toksi čnost, topljivost u ispitnom sustavu i promjene 
u pH ili osmolalnost.  
Citotoksičnost treba odrediti sa i bez metaboli čke aktivacije u 
glavnom pokusu, uz korištenje ogovaraju ćih pokazatelja stani čnog 
integriteta i rasta, kao što su stupanj konfluencije, broj živih 
stanica ili mitotski indeks. Može biti korisno preliminarnim 
pokusom odrediti citotoksi čnost i topljivost.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 311
 
Treba koristiti najmanje tri koncentracije koje se mogu analizirati. U 
slučajevima gdje se javlja citotoksi čnost, te koncentracije moraju 
pokrivati raspon od maksimalne do male ili nikakve toksi čnosti; to 
obično znači da razlika me đu koncentracijama ne bi smjela biti ve ća 
od faktora izme đu 2 i √10. U vrijeme izdvajanja stanica pri najvišoj 
koncentraciji treba biti vidljivo znatno smanjenje stupnja konfluen ­
cije (stvaranja sloja), broja stanica ili mitotskog indeksa (sve iznad 50 %). Mitotski indeks samo je posredni kriterij citotoksi čkih/cito­
statskih u činaka i ovisi o vremenu koje pro đe nakon obrade. Me đu­
tim, mitotski indeks prihvatljiv je za suspenzijske kulture, kod kojih 
bi druga mjerenja toksi čnosti mogla biti komplicirana i neprakti čna. 
Informacije o kinetici stani čnog ciklusa kao što je prosje čno vrijeme 
generiranja (AGT) može se koristiti kao dodatna informacija. Me đu­
tim, AGT je prosje čna vrijednost koja ne otkriva uvijek postojanje 
kasnijih subpopulacija, a čak i mali porast prosje čnog vremena 
generiranja može se povezati sa zna čajnim kašnjenjem u nastajanju 
optimalnog broja aberacija.
 
Za relativno necitotoksi čne tvari, najviša koncentracija kod ispiti ­
vanja treba biti 5 μl/ml, 5 mg/ml ili 0,01 M, ovisno o tome koja 
je niža.  
Za relativno netopljive tvari koje nisu toksi čne pri koncentracijama 
nižim od onih u kojima su netopljive, najviša korištena doza treba 
biti koncentracija iznad granice topljivosti u kona čnoj hranjivoj 
podlozi za uzgoj kultura na kraju razdoblja tretiranja. U nekim slu ča­
jevima (npr. kad se toksi čnost pojavljuje samo kod koncentracija 
koje su više od najnižih koncentracija pri kojima tvar nije topljiva), 
savjetuje se obavljanje ispitivanja na više od jedne koncentracije s vidljivim taloženjem. Moglo bi biti korisno procijeniti topljivost na početku i na kraju tretiranja, jer se ona može za vrijeme izloženosti 
mijenjati u ispitnom sustavu uslijed prisutnosti stanica, S9, seruma 
itd. Netopljivost se može otkriti golim okom. Talog ne smije utjecati na određivanje stupnja toksi čnosti.
 
1.4.2.3.  Negativne i pozitivne kontrole  
U svaki pokus treba istodobno uklju čiti pozitivne i negativne 
kontrole (otapala ili nosa či) sa i bez metaboli čke aktivacije. Kad se 
primjenjuje metaboli čka aktivacija kemikalija za pozitivnu kontrolu 
treba koristiti kemikalije kod kojih je za mutagenu reakciju potrebna 
aktivacija.  
Kod pozitivnih kontrola treba koristiti poznati klastogen na razinama 
izlaganja kod kojih se o čekuje ponovljivo pove ćanje koje se može 
uočiti u odnosu na podlogu (pozadinu), koji pokazuje osjetljivost 
ispitnog sustava.  
Koncentracije pozitivne kontrole moraju biti odabrane tako da u činci 
budu jasni, ali da osoba koja o čitava rezultate ne može odmah vidjeti 
identitet kodiranih mikroskopskih preparata. Treba razmotriti kori ­ 
štenje kemikalija za pozitivnu kontrolu koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhva ćaju:
 
Stanje metaboli čke aktivacije  Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Odsutnost egzogene metaboli čke 
aktivacije  Metil metansulfonat  66-27-3  200-625-0  
Etil metansulfonat  62-50-0  200-536-7  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 312
 
Stanje metaboli čke aktivacije  Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Etil nitrosourea  759-73-9  212-072-2  
Mitomicin C  50-07-7  200-008-6  
4-Nitrokinolin-N-oksid  56-57-5  200-281-1  
Prisutnost egzogene metaboli čke 
aktivacije  Benzo[ a]piren  50-32-8  200-028-5  
Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat  50-18-0 
6055-19-2  200-015-4  
Za pozitivnu kontrolu mogu se koristiti i druge tvari. Treba 
razmotriti mogu ćnost korištenja kemikalija za pozitivnu kontrolu 
koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive.
 
Kod svakog izdvajanja stanica treba uklju čiti i negativne kontrole 
koje se sastoje samo od otapala ili nosa ča u hranjivoj podlozi za 
tretiranje i tretirane su na jednak na čin kao i kulture. Dodatno treba 
upotrijebiti i netretirane kontrole, osim ako postoje podaci iz ranijih 
studija koji dokazuju da odabrano otapalo ne proizvodi nikakve štetne ili mutagene u činke.
 
1.4.3.  Postupak  
1.4.3.1.  Tretiranje ispitivanom tvari  
Stanice koje se razmonožavaju tretiraju se ispitivanom tvari uz 
prisutnost i odsutnost metaboli čkog aktivacijskog sustava. Tretiranje 
limfocita treba zapo četi oko 48 sati nakon mitogene stimulacije.  
1.4.3.2. Obi čno se kod svake koncentracije koriste dvije usporedne kulture, a 
upotreba dviju usporednih kultura posebno se preporu čuje kod nega ­
tivnih kontrolnih kultura/kultura koje se tretiraju samo s otapalima. 
Ako se na temelju podataka iz ranijih studija dokaže da su razlike između dviju usporednih kultura minimalne (13)(14), može biti prih ­
vatljiva upotreba samo po jedne kulture za svaku koncentraciju.
 
Plinovite ili hlapive tvari treba ispitivati odgovaraju ćim metodama, 
na primjer u nepropusnim posudama za kulture (15)(16).  
1.4.3.3.  Vrijeme izdvajanja („ubiranja”) stanica iz kulture  
U prvom pokusu stanice treba tri do šest sati izlagati ispitivanoj tvari 
sa i bez metaboli čke aktivacije i uzorkovati ih po isteku vremena 
koje odgovara vremenu 1,5 normalnog stani čnog ciklusa od po četka 
tretiranja (12). Ako se ovim postupkom dobiju negativni rezultati sa i bez aktivacije, treba obaviti još jedan pokus bez aktivacije, uz nepre ­
kidno tretiranje sve do uzorkovanja po isteku vremena koje odgovara 
vremenu 1,5 normalnog stani čnog ciklusa. Neke će kemikalije 
možda biti lakše otkriti ako vrijeme tretiranja/vrijeme do uzorkovanja bude duže od 1,5 dužine ciklusa. Negativne rezultate s metaboli čkom 
aktivacijom treba potvrditi od slu čaja do slu čaja. U onim slu čajevima 
gdje se potvrda negativnih rezultata ne smatra potrebnom, nužno je 
navesti razloge za to.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 313
 
1.4.3.4.  Priprema kromosoma  
Stanične kulture tretiraju se Colcemidom® ili kolhicinom, obi čno 
jedan do tri sata prije izdvajanja stanica. Iz svake stani čne kulture 
zasebno izdvajaju se i obra đuju stanice za pripremu kromosoma. 
Priprema kromosoma obuhva ća hipotoni čku obradu stanica, fiksi ­
ranje i bojenje.  
1.4.3.5.  Analiza  
Sve preparate, uklju čujući i preparate pozitivnih i negativnih 
kontrola, treba prije mikroskopske analize nezavisno kodirati. Budući da postupak fiksiranja često uzrokuje lomljenje jednog 
dijela metafaznih stanica uz gubitak kromosoma, stanice koje se 
očitavaju moraju sadržavati broj centromera koji je jednak modalnom 
broju ± 2 za sve vrste stanica. Za svaku koncentraciju i kontrolu treba očitati najmanje 200 dobro vidljivih (raširnih) metafaza 
jednakomjerno raspodijeljenih u usporednim kulturama. Ako se 
opazi visoki broj aberacija taj se broj može smanjiti.
 
Iako je svrha ovog testa otkrivanje kromosomskih aberacija, važno je 
zabilježiti poliploidnost i endoreduplikaciju, u slu čaju da se opaze te 
pojave.  
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Pokusna jedinica je stanica i stoga treba utvrditi postotak stanica sa 
strukturnim kromosomskim aberacijama. Razli čite vrste strukturnih 
kromosomskih aberacija treba zabilježiti zajedno s njihovim broje ­
vima i učestalošću za pokusne i kontrolne kulture. Prekidi (tijesni 
spojevi) se upisuju odvojeno i navode u izvješ ću, no općenito nisu 
uključeni u ukupnu u čestalost aberacija.  
Isto tako treba zabilježiti i rezultate istodobnog mjerenja citotoksi č­
nosti za sve tretirane i negativne kontrolne kulture u glavnim poku ­
sima za dokazivanje aberacija.  
Podaci se navode za svaku kulturu zasebno. Dodatno sve podatke 
treba rezimirati u tabli čnom obliku.  
Potvrda jasne pozitivne reakcije nije potrebna. Dvosmislene rezultate 
treba pojasniti daljnjim ispitivanjem, po mogu ćnosti uz izmjenu 
pokusnih uvjeta. O potrebi za potvr đivanjem negativnih rezultata 
govori se u to čki 1.4.3.3. U daljnjim pokusima treba razmotriti 
mogućnost izmjene ispitnih parametara, kako bi se pove ćao obim 
uvjeta koji se analiziraju. Parametri koji bi se mogli izmijeniti uklju ­ 
čuju vremenske intervale izme đu primjena razli čitih koncentracija i 
uvjete metaboli čke aktivacije.  
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnog rezultata, kao na 
primjer koncentracijom uvjetovano ili ponovljivo pove ćanje broja 
stanica s kromosomskim aberacijama. Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Kao pomo ć u ocjeni rezultata ispiti ­
vanja mogu se koristiti statisti čke metode (3)(13). Kod utvr đivanja 
pozitivne reakcije statisti čki značaj ne može biti jedini odlu čujući 
faktor.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 314
 
Porast broja poliploidnih stanica može zna čiti da ispitivana tvar 
može inhibirati mitotske procese i izazvati numeri čke kromosomske 
aberacije. Pove ćanje broja stanica s endoredupliciranim kromoso ­
mima može zna čiti da ispitivana tvar može inhibirati progresiju 
(odvijanje) stani čnog ciklusa (17)(18).  
Smatra se da ispitivana tvar kod koje rezultati ne udovoljavaju gore 
navedenim kriterijima u ovom sustavu nije mutagena.  
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima odre đeni će podaci onemogu ćiti donošenje 
konačne procjene djelovanja ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati 
dvosmisleni ili upitni bez obzira na to koliko se puta eksperiment ponavlja.
 
Pozitivni rezultati  in vitro  testa za dokazivanje kromosomskih abera ­
cija pokazuju da ispitivana tvar izaziva strukturnu aberaciju kromo ­
soma u uzgojenim somatskih stanicama sisavaca. Negativni rezultati 
pokazuju da ispitivana tvar u ispitnim uvjetima ne izaziva kromo ­
somsku aberaciju u uzgojenim somatskim stanicama sisavaca.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
Otapalo/nosa č: 
— opravdanje za odabir nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako su 
poznate.  
Stanice:  
— vrsta i podrijetlo stanica,  
— kariotipne karakteristike i podesnost korištene vrste stanica,  
— odsustvo mikoplazme, ovisno o slu čaju, 
— podaci o dužini stani čnog ciklusa,  
— spol davatelja krvi, puna krv ili izdvojeni limfociti, upotrijebljeni 
mitogen,  
— broj postupaka, ovisno o slu čaju, 
— metode za održavanje stani čne kulture, ovisno o slu čaju, 
— modalni broj kromosoma.  
Uvjeti ispitivanja:  
— identifikacijska oznaka (naziv) tvari za zaustavljanje metafaze, 
njena koncentracija i trajanje izlaganja stanica,  
— obrazloženje za odabir koncentracija i broj kultura, uklju čujući 
npr. podatke o citotoksi čnosti i granicama topljivosti, ako su 
raspoloživi,  
— sastav hranjive podloge, koncentracija CO  2 , ovisno o slu čaju, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 315
 
— koncentracija ispitivane tvari,  
— volumen nosa ča i dodane ispitivane tvari,  
— temperatura inkubacije,  
— vrijeme inkubacije,  
— trajanje tretiranja,  
— gustoća stanica kod nasa đivanja, ovisno o slu čaju, 
— vrsta i sastav sustava metaboli čke aktivacije, uklju čujući kriterije 
prihvatljivosti,  
— pozitivne i negativne kontrole,  
— metode pripreme mikroskopskih preaprata,  
— kriteriji za ocjenjivanje (o čitavanje) aberacija,  
— broj analiziranih metafaza,  
— metode za mjerenje toksi čnosti,  
— kriteriji na temelju kojih se studija smatra pozitivnom, nega ­
tivnom ili dvosmislenom.  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti, tj. stupanj združivanja (konfluencije), podaci 
o staničnom ciklusu, broj stanica, mitotski indeks,  
— znakovi taloženja,  
— podaci o pH i osmolalnosti podloge za tretiranje, ako su utvr đeni, 
— definicija aberacija, uklju čivši oštećenja (prekide),  
— broj stanica s kromosomskim aberacijama i vrste kromosomskih 
aberacija, zasebno za svaku tretiranu i kontrolnu kulturu,  
— promjene u ploidnosti, ako su opažene,  
— ovisnost reakcije o dozi, tamo gdje je mogu će, 
— statisti čke analize, ako su ra đene, 
— podaci o istovremenim negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama,  
— podaci o ranije obavljenim negativnim (otapalo/nosa č) i pozi­
tivnim kontrolama, uklju čujući raspone, sredstva i standardne 
devijacije.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) 
Plenum Press, New York and London, str. 1-29.  
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985). The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, str. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 316
 
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Ander ­
son, G. and Zeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 
(suppl. 10), str. 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, str. 147-204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, str. 297-305.  
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, str. 347-364.
 
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173- 215.
 
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. 
and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/Car ­
cinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. 
Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence 
of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, str. 83-90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro . Mutation Res., 66, str. 277-290.  
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alter ­
natives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds)  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, str. 85-88.
 
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations. Mutation Res., 312, str. 241-261.  
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, str. 141-154.  
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, str. 139-149.  
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
str. 91-103.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 317
 
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795-801.
 
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 
119, str. 403-413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) 
Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, str. 1362-1364.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 318
 
B.11.  MUTAGENOST –  IN VIVO  TEST ZA DOKAZIVANJE 
KROMOSOMSKIH ABERACIJA KOŠTANE SRŽI SISAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 475, Test za dokazi ­
vanje kromosomskih aberacija koštane srži sisavaca (1997.).  
1.1. UVOD  
In vivo  test za dokazivanje kromosomskih aberacija sisavaca primje ­
njuje se za utvr đivanje strukturnih kromosomskih aberacija u stani ­
cama koštane srži životinja, obi čno glodavaca (1)(2)(3)(4). Postoje 
dva tipa strukturnih aberacija kromosoma – kromosomski i kromati ­
dni. Pove ćanje poliploidnosti može zna čiti da kemikalija ima poten ­
cijal za induciranje (izazivanje) numeri čkih aberacija. Kod ve ćine 
kemijskih mutagena inducirane aberacije kromatidnog su tipa, ali 
javljaju se i aberacije kromosomskog tipa. Kromosomske mutacije i srodne pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja ljudi i postoje dostatni dokazi da su kromosomske mutacije i srodne pojave koje 
uzrokuju promjene u onkogenima i genima supresorima tumora 
povezane s pojavom raka kod ljudi i u pokusnim sustavima.
 
U ovom se ispitivanju rutinski koriste glodavci. Ciljno tkivo u ovom 
ispitivanju je koštana srž, budu ći da je to tkivo jako prokrvljeno i 
sadrži populaciju stanica čiji se ciklus odvija brzo i koje se mogu 
lako izolirati i obra đivati. Ostale životinjske vrste i ciljna tkiva nisu 
predmet ove metode.  
Ovo ispitivanje kromosomskih aberacija posebno je relevantno za 
procjenjivanje opasnosti od mutagenosti, budu ći da omogu ćuje 
analizu faktora metabolizma, farmakokonetike i procesa popravljanja 
DNK  in vivo , iako oni kod razli čitih životinjskih vrsta i tkiva mogu 
biti različiti. In vivo  test tako đer je koristan za daljnja istraživanja 
mutagenih u činaka koji se otkriju  in vitro  testovima.  
Ako ima dokaza da ispitivana tvar ili reaktivni metabolit ne će stići 
do ciljnog tkiva, ovo ispitivanje nije primjereno provoditi.  
Vidjeti i Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma izra ­ 
ženo kao lom samo jedne kromatide ili lom i ponovno spajanje kromatida.
 
Aberacija kromosomskog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma 
izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na istom mjestu.
 
Endoreduplikacija:  proces kod kojeg nakon S faze replikacije DNA 
ne slijedi mitoza (dioba) jezgre, nego zapo činje druga S faza. 
Rezultat su kromosomi s četiri, osam, 16,... kromatida.  
Prekid (tijesni spoj):  akromatska lezija manja od širine jedne 
kromatide i s minimalnim otklonom (neporavnatoš ću) kromatida.  
Numerička aberacija:  promjena u broju kromosoma u odnosu na 
normalni broj koji je karakteristi čan za korištene stanice.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 319
 
Poliploidnost:  višekratnik haploidnog broja kromosoma ( n) osim 
diploidnog broja (tj. 3 n, 4n itd.).  
Strukturna aberacija:  promjena u strukturi kromosoma koja se 
može otkriti mikroskopskim pregledom podjele stanica u metafazi, koja se opaža kao delecije i ulomci, intrakromosomske promjene ili interkromosomske promjene.
 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Životinje se na odgovaraju ći način izlažu ispitivanoj tvari te se u 
odgovaraju će vrijeme nakon tretiranja usmr ćuju. Prije usmr ćivanja, 
životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. Colce ­
midom® ili kolhicinom). Nakon toga, naprave se i oboje kromo ­
somski preparati stanica koštane srži te se analizom utvr đuju kromo ­
somske aberacije metafaznih stanica.  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema  
1.4.1.1.  Odabir životinjske vrste  
Obično se koriste štakori, miševi i kineski hr čci, iako može poslužiti 
bilo koja odgovaraju ća vrsta sisavaca. Treba koristiti mlade zdrave 
odrasle životinje sojeva koji su uobi čajeni u laboratorijskoj praksi. 
Na početku studije variranje tjelesne mase životinja treba biti što 
manje i ne smije prelaziti ± 20 % od odgovaraju će srednje vrijed ­
nosti mase svakog spola.  
1.4.1.2.  Uvjeti držanja i prehrana  
Primjenjuju se op ći uvjeti iz Op ćeg uvoda u dijelu B, iako ciljna 
vlažnost zraka treba biti 50-60 %.  
1.4.1.3.  Priprema životinja  
Zdrave mlade odrasle životinje nasumce se raspore đuju u kontrolne 
skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba smjestiti tako da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog njihovog položaja svedu na 
minimum. Životinje se ozna čavaju jedinstvenim oznakama. Životinje 
se najmanje pet dana prilago đavaju laboratorijskim uvjetima.  
1.4.1.4.  Priprema doza  
Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim 
otapalima ili nosa čima i prije doziranja životinjama prema potrebi 
razrijediti. Teku će ispitivane tvari može se dozirati izravno i/ili ih se 
prije obrade može razrijediti. Treba koristiti svježe pripravke ispiti ­
vane tvari, osim u slu čajevima kad podaci o stabilnosti pokazuju da 
ih je prihvatljivo pohraniti.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/nosa č 
Otapalo/nosa č ne smije proizvesti toksi čke učinke pri upotrijebljenim 
visinama doza i ne smije postojati sumnja da će kemijski reagirati s 
ispitivanom tvari. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/nosa či, 
njihovo bi uklju čivanje u ispitivanje trebalo biti potkrijepljeno poda ­
cima iz kojih je vidljivo da su prikladni. Kad god je to mogu će, 
preporučuje se najprije razmotriti mogu ćnost primjene vodenog 
otapala/nosa ča. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 320
 
1.4.2.2  Kontrole  
U svaki test treba uklju čiti istovremene pozitivne i negativne 
kontrole (otapalo/nosa č) za svaki spol. Izuzimaju ći tretiranje ispiti ­
vanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati 
jednako kao sa životinjama u tretiranim skupinama.  
Pozitivne bi kontrole trebale proizvesti strukturne aberacije  in vivo  
pri razinama izlaganja kod kojih se o čekuje pove ćanje koje je 
vidljivo u odnosu na pozadinu. Doze pozitivnih kontrola treba odabrati tako da u činci budu jasni, ali da osoba koja o čitava rezultate 
ne može odmah vidjeti identitet kodiranih mikroskopskih preparata. 
Prihvatljivo je pozitivne kontrole primjenjivati na životinje drugim 
putevima, razli čitim od puteva korištenih za primjenu ispitivane 
tvari, te ih uzorkovati samo jednom.
 
Može se razmotriti korištenje kemikalija za pozitivnu kontrolu koje 
spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhva ­ 
ćaju:
 
Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Etil metansulfonat  62-50-0  200-536-7  
Etil nitrosourea  759-73-9  212-072-2  
Mitomicin C  50-07-7  200-008-6  
Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat  50-18-0 
6055-19-2  200-015-4  
Trietilenmelamin  51-18-3  200-083-5  
Kod svakog uzorkovanja treba upotrijebiti negativne kontrolne 
skupine tretirane samo otapalom ili nosa čem, s kojima se ina če 
postupa jednako kao i s tretiranim skupinama, osim kad podaci iz 
prijašnjih studija ukazuju na prihvatljivu varijabilnost i u čestalost 
pojave stanica s kromosomskim aberacijama me đu drugim životi ­
njama. Dodatno treba upotrijebiti i netretirane kontrolne skupine, 
osim ako postoje podaci iz ranijih studija koji dokazuju da odabrano 
otapalo ne proizvodi nikakve štetne niti mutagene u činke.  
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Broj i spol životinja  
Svaka tretirana i kontrolna skupina mora uklju čivati najmanje pet 
životinja svakog spola koje je mogu će analizirati. Ako su u 
vrijeme studije raspoloživi podaci iz studija provedenih na istoj živo ­
tinjskoj vrsti uz primjenu istog puta izlaganja, koji dokazuju da nema 
znatnih razlika u toksi čnosti s obzirom na spol, ispitivanje na jednom 
spolu bit će dovoljno. U slu čajevima kad izloženost ljudi nekoj 
kemikaliji može biti vezana uz spol, kao što je slu čaj s nekim 
farmaceutskim sredstvima, ispitivanja treba obaviti na životinjama 
odgovaraju ćeg spola.  
1.5.2.  Režim tretiranja  
Ispitivane tvari najbolje je primijeniti jednokratno. Ispitivanu je tvar 
moguće primijeniti u dozi podijeljenoj u dva dijela, tj. dva doziranja 
isti dan u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšala 
primjena velike koli čine materijala. Za druge režime doziranja 
treba postojati znanstveno opravdanje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 321
 
Kod skupine na koju se primjenjuje najviša doza, nakon tretiranja 
uzorke treba uzeti dvaput. Prvi interval uzorkovanja nakon tretiranja 
glodavaca po dužini je jednak 1,5 normalnom stani čnom ciklusu (s 
tim da normalni ciklus obi čno traje 12-18 sati). Budu ći da vrijeme 
potrebno za unos i metabolizam (metaboli čku izmjenu) ispitivane 
tvari, kao i za njezino djelovanje na kinetiku stani čnog ciklusa, 
može utjecati na optimalno vrijeme potrebno za otkrivanje kromo ­
somskih aberacija, preporu ča se još jedno uzimanje uzorka 24 sata 
nakon prvog uzimanja. Ako se koriste režimi kod kojih primjena 
doza traje duže od jednog dana, nakon posljednjeg tretiranja treba 
obaviti jedno uzorkovanje s vremenskim odmakom koji po dužini odgovara 1,5 normalnom stani čnom ciklusu.
 
Prije usmr ćivanja životinjama se intraperitonealno ubrizga odgovara ­
juća doza sredstva za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemida® ili 
kolhicina). Životinjama se nakon toga u odgovaraju ćim vremenskim 
intervalima uzimaju uzorci. Za miševe taj interval iznosi približno tri do pet sati; za kineske hr čke je to interval od približno 4-5 sati. 
Stanice se izdvajaju iz koštane srži i analiziraju radi otkrivanja 
kromosomskih aberacija.
 
1.5.3.  Visina doza  
Ako se provodi studija za utvr đivanje raspona doza jer nema raspo ­
loživih odgovaraju ćih podataka, treba je provesti u istom laborato ­
riju, koriste ći životinje iste vrste, soja i spola, i isti režim tretiranja 
koji će se koristiti i u glavnoj studiji (5). Ako toksi čnost postoji, za 
prvo uzorkovanje koriste se tri visine doza. Te visine doza trebaju pokriti raspon od maksimalne do male toksi čnosti, odnosno netoksi č­
nosti. Za kasnija uzorkovanja treba primjenjivati samo najviše doze. 
Najviša se doza definira kao doza koja uzrokuje takve znakove 
toksičnosti da je za o čekivati da bi više doze pri istom režimu 
doziranja prouzro čile smrt. Tvari (poput hormona i mitogena) koje 
u niskim netoksi čnim dozama imaju specifi čno biološko djelovanje 
mogu biti izuzete od kriterija za utvr đivanje doza te ih se može 
ocjenjivati od slu čaju do slu čaja. Najviša se doza isto tako može 
definirati kao doza koja uzrokuje pojavu nekih pokazatelja toksi č­
nosti u koštanoj srži (npr. smanjenje mitotskog indeksa preko 50 %).
 
1.5.4.  Grani čni test  
Ako test s jednom visinom doze od najmanje 2 000 mg/kg tjelesne 
mase, koja se primijeni odjednom ili u dva puta u istom danu, ne 
proizvede nikakve vidljive toksi čke učinke i ako se na temelju poda ­
taka o strukturno srodnim tvarima ne o čekuje genotoksi čnost, 
kompletna studija uz primjenu tri visine doze ne smatra se potreb ­
nom. Grani čna doza za dugotrajnije studije je 2 000 mg/kg tjelesne 
mase/dan za tretiranje do 14 dana, odnosno 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje koje traje duže od 14 dana. O čekivana izlo ­ 
ženost čovjeka može ukazati na potrebu za primjenom viših doza u 
graničnom testu.
 
1.5.5.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar obi čno primjenjuje oralnom intubacijom pomo ću 
želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile, ili pomo ću intra­
peritonealne injekcije. Drugi putevi primjene mogu biti prihvatljivi ako za to postoji opravdanje. Maksimalni volumen teku ćine koji se 
odjednom može primijeniti putem sonde ili injekcije ovisi o veli čini 
pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti ve ći od 2 ml/100 g 
tjelesne mase. Primjenu ve ćih volumena od navedenog treba oprav ­
dati. Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih tvari, koje pri višim 
koncentracijama obi čno izazivaju negativne u činke, variranje ispitnih 
volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako 
bi se kod svih koncentracija osigurao stalni volumen.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 322
 
1.5.6.  Kromosomski preparat  
Odmah po usmr ćivanju životinje koštana se srž uzme, izloži hipoto ­
ničkoj otopini i fiksira. Stanice se zatim nanesu na mikroskopsko 
stakalce i oboje.  
1.5.7.  Analiza  
Kao mjerilo toksi čnosti treba odrediti mitotski indeks u najmanje 
1 000 stanica po životinji za sve tretirane životinje (uklju čujući pozi­
tivne kontrole) i netretirane životinje koje služe kao negativna kontrola.
 
Za svaku životinju treba analizirati najmanje 100 stanica. Ako se 
opazi veliki broj aberacija ovaj se broj može smanjiti. Sve preparate, uključujući i preparate pozitivnih i negativnih kontrola, treba neza ­
visno kodirati prije mikroskopske analize. Budu ći da postupak 
pripreme preparata često za posljedicu ima lom odre đenog broja 
metafaza uz gubitak kromosoma, stanice koje ulaze u o čitavanje 
rezultata trebale bi zato sadržavati broj centromera jednak broju 2n ± 2.
 
2. PODACI  
2.1 OBRADA REZULTATA  
Podatke o pojedina čnim životinjama treba prikazati u obliku tablice. 
Pokusna jedinica je životinja. Za svaku je životinju potrebno odrediti 
broj vrednovanih (o čitanih) stanica, broj aberacija po stanici i 
postotak stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama. Treba navesti razli čite vrste strukturnih kromosomskih aberacija zajedno s 
njihovim brojem i u čestalošću za tretirane i kontrolne skupine. 
Kromosomski se prekidi bilježe odvojeno i navode u izvješ ću, ali 
se općenito ne uklju čuju u ukupnu u čestalost aberacija. Ako ne 
postoje dokazi o razlikama u reakcijama me đu spolovima, u stati ­
stičkoj analizi mogu se kombinirati podaci dobiveni ispitivanjima na 
oba spola.
 
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnog rezultata, kao što je 
povećanje relativnog broja stanica s kromosomskim aberacijama 
vezano uz visinu doze ili jasno pove ćanje broja stanica s aberacijama 
u skupini koja je primala istu dozu, uo čeno kod jednog uzorkovanja. 
Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Statisti čke 
metode mogu se primijeniti kao pomo ćno sredstvo za vrednovanje 
rezultata ispitivanja (6). Kod utvr đivanja pozitivne reakcije statisti čki 
značaj ne bi trebao biti jedini odlu čujući faktor. Dvosmislene rezul ­
tate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, najbolje uz izmjene u pokusnim uvjetima.
 
Porast broja poliploidnih stanica može zna čiti da ispitivana tvar 
može inducirati numeri čke kromosomske aberacije. Pove ćanje 
učestalosti endoreduplikacije može zna čiti da ispitivana tvar može 
inhibirati progresiju stani čnog ciklusa (7)(8).  
Kod ovog se testa smatra da ispitivana tvar kod koje rezultati ne 
udovoljavaju gore navedenim kriterijima nije mutagena.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 323
 
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima na temelju dobivenih podataka nije mogu će 
donijeti kona čan zaklju čak o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati 
mogu ostati dvosmisleni ili upitni bez obzira na to koliko se puta pokus ponavlja.
 
Pozitivni rezultati ispitivanja kromosomske aberacije  in vitro  poka­
zuju da ispitivana tvar u koštanoj srži sisavaca izaziva strukturnu 
aberaciju kromosoma. Negativni rezultati pokazuju da u ispitnim uvjetima ispitivana tvar u koštanoj srži testiranih vrsta ne izaziva kromosomsku aberaciju.
 
Treba razmotriti koja je vjerojatnost da ispitivana tvar ili njeni meta ­
boliti dopru do glavnog krvotoka ili, konkretno, do ciljnog tkiva 
(npr. sustavna toksi čnost).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
otapalo/nosa č: 
— opravdanje za odabir nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako su 
poznate,  
pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja, 
uključujući raspon masa, srednju i standardnu devijaciju za 
svaku skupinu,  
uvjeti ispitivanja:  
— pozitivna i negativna (nosa č/otapalo) kontrola,  
— podaci iz studije za utvr đivanje raspona, ako je obavljena,  
— obrazloženje za odabir visine doza,  
— pojedinosti o pripravljanju ispitivane tvari,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— obrazloženje za odabir puta primjene,  
— metode potvr đivanja da je ispitivana tvar stigla do glavnog krvo ­
toka ili ciljnog tkiva, ovisno o slu čaju, 
— način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ovisno 
o slučaju, 
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
— detaljan opis rasporeda tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 324
 
— naziv tvari koja zaustavlja metafazu, njena koncentracija i 
trajanje tretiranja,  
— metode pripravljanja mikroskopskih preparata,  
— kriteriji za ocjenjivanje aberacija,  
— broj analiziranih stanica po životinji,  
— kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom 
ili dvosmislenom.  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti,  
— mitotski indeks,  
— vrsta i broj aberacija, navedeni zasebno za svaku životinju,  
— ukupan broj aberacija po skupini, sa srednjim vrijednostima i 
standardnim odstupanjima,  
— broj stanica s aberacijama po skupini, sa srednjim vrijednostima i 
standardnim odstupanjima,  
— promjene u ploidnosti, ako su zamije ćene, 
— odnos doze i reakcije, tamo gdje je mogu će, 
— statisti čke analize, ako postoje,  
— podaci o istovremenoj negativnoj kontroli,  
— podaci o negativnim kontrolama iz prijašnjih studija s rasponima, 
prosječnim vrijednostima i standardnim odstupanjima,  
— podaci o istovremenoj pozitivnoj kontroli.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry 
(Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., str. 275-306.  
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, 
A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, str. 157-165.
 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Boot ­
man, J. and Henderson, L., (1990)  In Vivo  Cytogenetic Assays. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS 
Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, str. 115-141.
 
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., 
Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the 
Working Group on the  In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chro ­
mosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, str. 305-312.
 
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose setting in  In vivo  Mutagenicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 325
 
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge. str. 184-232.
 
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, str. 403-413.
 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) 
Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster 
cells. Cancer Res., 43, str. 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 326
 
B.12.  MUTAGENOST –  IN VIVO  MIKRONUKLEUS TEST NA 
ERITROCITIMA SISAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 474, Mikronukleus test 
na eritrocitima sisavaca (1997.) (Mammalian Erythrocyte Micronuc ­
leus Test (1997)).  
1.1. UVOD  
In vivo  mikronukleus test kod sisavaca koristi se za otkrivanje ošte ­ 
ćenja koja ispitivana tvar izaziva na kromosomima ili mitotskom 
aparatu eritroblasta, na temelju analize eritrocita uzorkovanih iz koštane srži i/ili perifernih krvnih stanica životinja, obi čno 
glodavaca.
 
Svrha mikronukleus testa je identificirati tvari koje izazivaju citoge ­
netska ošte ćenja zbog kojih dolazi do stvaranja mikronukleusa koji 
sadrže zaostale fragmente kromosoma ili čitave kromosome.  
Kad se eritroblast koštane srži razvije u polikromatski eritrocit, 
glavni nukleus (stani čna jezgra) biva istisnut; bilo koji nastali mikro ­
nukleus može zaostati u citoplazmi koja ina če nema jezgru. Vidlji ­
vost mikronukleusa u ovim je stanicama olakšana s obzirom da im nedostaje glavni nukleus (jezgra). Pove ćanje učestalosti polikromat ­
skih eritrocita s mikronukleusima kod tretiranih životinja pokazatelj 
je izazvanih kromosomskih ošte ćenja.
 
Za ovo se ispitivanje obi čno koristi koštana srž glodavaca budu ći da 
polikromatski eritrociti nastaju u tom tkivu. Mjerenje nezrelih (poli ­
kromatskih) eritrocita s mikronukleusima u perifernoj krvi jednako je prihvatljivo kod bilo koje vrste kod koje je dokazano da slezena ne 
može ukloniti eritrocite s mikronukleusima, ili koja je pokazala 
odgovaraju ću osjetljivost na otkrivanje agensa koji uzrokuju struk ­
turne ili numeri čke kromosomske aberacije. Mikronukleuse je 
moguće razlikovati na temelju više kriterija. Ti kriteriji obuhva ćaju 
identifikaciju postojanja ili nepostojanja kinetohore ili centromerne 
DNA u mikronukleusima. U čestalost nezrelih (polikromatskih) 
eritrocita s mikronukleusima predstavlja glavnu krajnju to čku ispiti­
vanja. Broj zrelih (normokromatskih) eritrocita s mikronukleusima, 
koji se nalaze u perifernoj krvi uz odre đeni broj zrelih eritrocita, 
također je mogu će koristiti kao krajnju to čku ispitivanja u slu čaje­
vima kad se životinje neprekidno tretiraju tijekom 4 tjedna ili duže.
 
Ovaj  in vivo  mikronukleus test na sisavcima posebno je relevantan 
za ocjenjivanje opasnosti od pojave mutagenosti zato što omogu ćuje 
sagledavanje faktora  in vivo  metabolizma, farmakokinetku i procese 
popravka DNA, iako oni mogu varirati kod razli čitih životinjskih 
vrsta, razli čitih tkiva, kao i kod razli čitih genetskih kona čnih 
učinaka. Ispitivanje  in vivo  isto je tako korisno za daljnja istraživanja 
mutagenih u činaka otkrivenih pomo ću nekog sustava  in vitro . 
Ako se pojave dokazi da ispitivana tvar ili reaktivni metabolit ne će 
stići do ciljnog tkiva, ovo ispitivanje nije primjereno provoditi.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 327
 
1.2. DEFINICIJE  
Centromer (kinetohora):  područje(-a) kromosoma s kojima su 
tijekom stani čne diobe povezane niti diobenog vretena, što omogu ­ 
ćuje uredno kretanje kromosoma k ćeri prema polovima stanica k ćeri. 
Mikronukleusi:  Maleni nukleusi (jezgre), koji se nalaze uz glavne 
stanične jezgre i od njih su odvojeni, koje tijekom telofaze mitoze 
(mejoze) proizvode zaostali fragmenti kromosoma ili čitavi 
kromosomi.  
Normokromatski eritrocit:  Zreli eritrocit kojemu nedostaju ribo ­
somi i mogu će ga je razlikovati od nezrelih polikromatskih eritrocita 
pomoću bojila selektivnih za ribosome.  
Polikromatski eritrocit:  Nezreli eritrocit u prijelaznoj fazi razvoja 
koji još uvijek sadrži ribosome pa ga je mogu će razlikovati od zrelih, 
normokromatskih eritrocita pomo ću bojila selektivnih za ribosome.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Životinje se na odgovaraju ći način izlažu ispitivanoj tvari. Ako se 
koristi koštana srž, životinje se po isteku odgovaraju ćih vremenskih 
razdoblja nakon tretiranja usmr ćuju, uzima se koštana srž i rade se 
odgovaraju ći mikroskopski preparati koji se zatim boje 
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Kad se koristi periferna krv, po isteku odgova ­
rajućih vremenskih razdoblja nakon tretiranja uzima se krv i rade 
odgovaraju ći mikroskopski preparati koji se zatim boje (4)(8)(9)(10). 
Kod studija s perifernom krvi, izme đu zadnjeg izlaganja i izdvajanja 
stanica treba pro ći što manje vremena. Preparati se analiziraju na 
prisutnost mikronukleusa.  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Preparati  
1.4.1.1.  Odabir životinjske vrste  
Ako se koristi koštana srž preporu čuju se miševi ili štakori, iako se 
može koristiti bilo koja druga odgovaraju ća vrsta sisavaca. Kad se 
koristi periferna krv, preporu čuju se miševi. Me đutim, može se kori ­
stiti bilo koja druga odgovaraju ća vrsta sisavaca, pod uvjetom da se 
radi o vrsti kod koje slezena ne uklanja eritrocite s mikronukleusima, odnosno o vrsti koja je pokazala primjerenu osjetljivost za otkrivanje 
agensa koji uzrokuju strukturne ili numeri čke aberacije kromosoma. 
Treba koristiti sojeve mladih zdravih životinja koji se obi čno koriste 
u laboratorijima. Na po četku studije raspon tjelesnih masa životinja 
ne smije varirati za više od ± 20 % od odgovaraju će srednje tjelesne 
mase svakog spola.
 
1.4.1.2.  Uvjeti držanja i hranjenja  
Primjenjuju se op ći uvjeti iz Op ćeg uvoda u dijelu B, iako ciljna 
vlažnost treba iznositi 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 328
 
1.4.1.3.  Priprema životinja  
Prije ispitivanja odabiru se zdrave mlade životinje i nasumce raspo ­
ređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Životinje se 
označavaju jedinstvenim oznakama. Životinje se najmanje pet dana 
prilagođavaju laboratorijskim uvjetima. Kaveze treba tako rasporediti 
da se učinci do kojih bi moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na 
minimum.  
1.4.1.4.  Priprema doza  
Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim 
otapalima ili nosa čima i prije doziranja životinjama prema potrebi 
razrijediti. Teku će ispitivane tvari mogu se odmah dozirati ili razrije ­
diti prije doziranja. Treba koristiti svježe preparate ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da je njihovo pohra ­
njivanje prihvatljivo.
 
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/nosa č 
Otapalo/nosa č ne smije izazvati toksi čke učinke pri dozama koje se 
primjenjuju, i ne smije postojati sumnja da bi s ispitivanom tvari mogli proizvesti kemijsku reakciju. Ako se koriste otapala/nosa či 
koji nisu dobro poznati, njihovo uklju čivanje u ispitivanje treba 
potkrijepiti referentnim podacima koji pokazuju njihovu sukladnost. 
Preporuka je da se, kad god je to mogu će, najprije razmotri mogu ć­
nost upotrebe vodenog otapala/nosa ča.
 
1.4.2.2.  Kontrole  
Za svaki spol u svaki test treba uklju čiti paralelne pozitivne i nega ­
tivne (otapalo/nosa č) kontrole. Izuzimaju ći tretiranje ispitivanom 
tvari, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na jednaki na čin kao sa životinjama u skupinama koje se tretiraju.
 
Tvari koje se koriste za pozitivnu kontrolu trebale bi, pri razinama 
izloženosti za koje se o čekuje da će izazvati uo čljivo pove ćanje s 
obzirom na podlogu, trebale prouzro čiti nastanak mikronukleusa  in 
vivo. Pozitivne kontrole treba dozirati tako da njihovi u činci budu 
jasni, ali da osobi koja o čitava rezultate ne otkriju odmah identitet 
kodiranih mikroskopskih preparata. Prihvatljivo je za pozitivne kontrole koristiti puteve primjene razli čite od onih koji se koriste 
za primjenu ispitivane tvari, a uzorke uzeti samo jednom. Osim 
toga, ako su raspoložive, kao pozitivne kontrole smiju se upotrijebiti 
kemikalije koje su svrstane u istu klasu opasnosti kao i ispitivana kemikalija. Primjeri pozitivnih kontrola uklju čuju sljede će tvari:
 
Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Etil metansulfonat  62-50-0  200-536-7  
N-etil-N-nitrozourea  759-73-9  212-072-2  
Mitomicin C  50-07-7  200-008-6  
Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat  50-18-0 
6055-19-2  200-015-4  
Trietilenmelamin  51-18-3  200-083-5  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 329
 
Životinje za negativnu kontrolu koje se tretiraju samo otapalom ili 
nosačem, a s kojima se ina če postupa jednako kao s tretiranim skupi ­
nama, treba uklju čiti u svako uzorkovanje, osim u slu čajevima kad 
podaci o kontrolama u prijašnjim ispitivanjima pokazuju prihvatljivu varijabilnost me đu životinjama i u čestalost stanica s mikronukleu ­
sima. Ako se za negativnu kontrolu uzima samo jedan uzorak, 
najbolje ga je uzeti kod prvog uzorkovanja. Osim toga, treba upotri ­
jebiti i netretirane kontrolne životinje osim ako postoje prijašnji ili objavljeni podaci koji dokazuju da odabrano otapalo/nosa č ne izaziva 
mutagene u činke.
 
Ako se koristi periferna krv, uzorak koji se uzme prije tretiranja 
prihvatljiv je kao negativni kontrolni uzorak, ali samo u studijama periferne krvi (npr. 1-3 tretiranja) kad su rezultati u okviru raspona koji se očekuje na temelju prijašnjih kontrola.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Broj i spol životinja  
U svakoj tretiranoj i kontrolnoj skupini mora biti najmanje po pet 
životinja svakog spola koje je mogu će analizirati (11). Ako su u 
vrijeme studije raspoloživi podaci iz studija obavljenih na istim živo ­
tinjskim vrstama uz upotrebu istog puta primjene, koji dokazuju da 
među spolovima nema zna čajnih razlika u toksi čnosti, dovoljno će 
biti testiranje na jednom spolu. U slu čajevima kad izloženost kemi ­
kalijama može biti vezana uz jedan spol, na primjer kad se radi o određenim farmaceutskim sredstvima, test treba obaviti na životi ­
njama odgovaraju ćeg spola.
 
1.5.2.  Režim tretiranja  
Ne može se preporu čiti nijedan standardni režim tretiranja (npr. 
jedno, dva ili više tretiranja u vremenskim razmacima od 24 sata). 
Uzorci uzeti nakon primjene produženog režima doziranja prihva ­
tljivi su pod uvjetom da je u toj studiji bio dokazan pozitivan učinak, ili kod negativne studije, pod uvjetom da je bila dokazana 
toksičnost ili da je bila korištena grani čna doza, te da je doziranje 
bilo nastavljeno do uzorkovanja. Ispitivane tvari mogu se primjenji ­
vati i u podijeljenoj dozi koja se daje npr. u dva puta u istom danu, u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se olakšalo davanje 
velikog volumena materijala.
 
Ispitivanje se može obaviti na dva na čina: 
(a) životinje se ispitivanom tvari tretiraju jedanput. Uzorci koštane 
srži uzimaju se najmanje dvaput, prvi put najranije 24 sata nakon tretiranja ili najkasnije 48 sati nakon tretiranja, uz odgovaraju će 
intervale izme đu uzorkovanja. Ako se prvi uzorak uzme prije 
isteka 24 sata nakon tretiranja, za to treba navesti opravdane 
razloge. Uzorci periferne krvi uzimaju se najmanje dvaput, počevši najranije 36 sati nakon tretiranja i nakon tog u odgova ­
rajućim vremenskim razmacima, ali ukupni postupak ne smije 
biti duži od 72 sata. Ako se kod jednog od uzorkovanja opazi 
pozitivna reakcija, dodatno uzorkovanje nije potrebno;
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 330
 
(b) ako se doza primjenjuje dva ili više puta dnevno (npr. dva ili 
više tretiranja u vremenskim razmacima od 24 sata) uzorke treba 
uzeti jedanput u razdoblju izme đu 18 i 24 sata nakon zadnjeg 
tretiranja kad se radi o koštanoj srži i jedanput u razdoblju između 36 i 48 sati nakon zadnjeg tretiranja kad je u pitanju 
periferna krv (12).
 
Mogu se uzeti i dodatni uzorci u drugim vremenskim razmacima, 
kada je to relevantno.  
1.5.3.  Visina doza  
Ako je potrebno napraviti studiju radi utvr đivanja raspona doza jer 
nema raspoloživih odgovaraju ćih podataka, tu studiju treba provesti 
u istom laboratoriju, uz korištenje iste životinjske vrste i soja te 
režima doziranja koji će se koristiti u glavnoj studiji (13). Ako 
toksičnost postoji, za prvo uzorkovanje upotrebljavaju se tri visine 
doza. Te doze trebaju pokriti raspon od maksimalne do male toksi č­
nosti ili netoksi čnosti. Kod kasnijih uzorkovanja treba koristiti samo 
najvišu dozu. Najviša doza definira se kao doza koja uzrokuje takve znakove toksi čnosti da je za o čekivati da će pri istom režimu dozi ­
ranja više doze prouzro čiti smrt. Tvari sa specifi čnim biološkim 
djelovanjem pri niskim netoksi čnim dozama (kao što su hormoni i 
mitogeni) mogu se izuzeti od kriterija za utvr đivanje doza i treba ih 
ocjenjivati od slu čaja do slu čaja. Najviša doza može se definirati i 
kao doza koje izaziva neke znakove toksi čnosti u koštanoj srži (npr. 
smanjenje udjela nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita u koštanoj srži ili perifernoj krvi).
 
1.5.4.  Grani čni test  
Ako test s jednom dozom od najmanje 2 000 mg/kg tjelesne mase, 
koja se primijeni odjednom ili u dva puta isti dan, ne prouzro či 
primjetljive toksi čne učinke i ako se na temelju podataka o struk ­
turno srodnim tvarima ne o čekuje genotoksi čnost, potpuna studija uz 
primjenu tri razine doza ne smatra se potrebnom. Za dugotrajnije studije grani čna doza je 2 000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje 
do 14 dana i 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan za tretiranje duže od 14 
dana. Očekivana izloženost ljudi može ukazati na potrebu za 
primjenom više doze u grani čnom testu.
 
1.5.5.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar obi čno primjenjuje oralnom intubacijom pomo ću 
želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile ili ubrizgavanjem 
pomoću intraperitonealne injekcije. Prihvatljivi su i drugi putevi 
primjene ako za to postoje opravdani razlozi. Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti pomo ću sonde ili injek ­
cije ovisi o veli čini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti ve ći 
od 2 ml/100 g tjelesne mase. Za primjenu ve ćih volumena od nave ­
denog moraju postojati opravdani razlozi. Izuzimaju ći nadražuju će ili 
nagrizajuće tvari koje pri višim koncentracijama obi čno djeluju 
štetno, variranje ispitnih volumena treba svesti na minimum podeša ­
vanjem koncentracije i tako osigurati stalni volumen pri svim visi ­
nama doza.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 331
 
1.5.6.  Preparati koštane srži/krvi  
Stanice koštane srži obi čno se uzimaju iz femura (bedrene kosti) ili 
tibije (potkoljenice) odmah nakon usmr ćivanja. Stanice se obi čno iz 
bedrene kosti ili potkoljenice vade, prepariraju i boje uz primjenu 
uobičajenih metoda. Periferna krv vadi se iz repne vene ili nekog 
drugog odgovaraju ćeg krvnog suda. Krvne stanice odmah se supra ­
vitalno oboje (8)(9)(10) ili se naprave preparati razmaza koji se zatim oboje. Upotreba boja koje su specifi čne za DNK (npr. akridin oranž 
(14) ili Hoechst 33258 i pironin-Y (15)) može sprije čiti stvaranje 
nekih od artefakta koji se povezuju s upotrebom bojila koja nisu specifična za DNK. Ova prednost ne isklju čuje upotrebu konvencio ­
nalnih bojila (npr. Giemsa). Mogu se upotrebljavati i dodatni sustavi 
(npr. celuloznih kolona za uklanjanje stanica s jezgrom (16)) pod uvjetom da se pokazalo da navedeni sustavi funkcioniraju na odgo ­
varajući način prilikom izrade mikronukleusnih preparata u 
laboratoriju.
 
1.5.7.  Analiza  
Za svaku se životinju utvr đuje udio nezrelih eritrocita u ukupnom 
broju (nezrelih + zrelih) eritrocita, tako da se ukupno prebroji najmanje 200 eritrocita kad je u pitanju koštana srž i 1 000 eritrocita kad je u pitanju periferna krv (17). Sve mikroskopske preparate, 
uključujući i pozitivne i negativne kontrole, treba prije mikroskopske 
analize nezavisno kodirati. Za utvr đivanje incidencije (u čestalosti) 
eritrocita s mikronukleusima za svaku životinju treba pregledati 
najmanje 2 000 nezrelih eritrocita. Dodatne informacije mogu se 
dobiti utvr đivanjem broja zrelih eritrocita s mikronukleusima. Kod 
analize mikroskopskih preparata, udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita ne bi smio prije ći 20 % kontrolne vrijednosti. Kad se 
životinje neprekidno tretiraju četiri tjedna ili više, incidencija mikro ­
nukleusa može se utvrditi analizom najmanje 2 000 zrelih eritrocita po životinji. Sustavi za automatsku analizu (slikovna analiza i protočna citometrija stani čnih suspenzija) prihvatljiva su alternativa 
za ručno prebrojavanje, ako su primjereno opravdani i validirani.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Podatke za pojedina čne životinje treba prikazati u tabli čnom obliku. 
Pokusna jedinica je životinja. Za svaku analiziranu životinju posebno 
treba navesti utvr đeni broj nezrelih eritrocita, broj nezrelih eritrocita 
s mikronukleusima i broj nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritro ­
cita. Ako se životinje neprekidno tretiraju četiri ili više tjedana, treba 
navesti i podatke o zrelim eritrocitima, ako su prikupljeni. Za svaku 
životinju treba navesti, ako se to smatra primjerenim, udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita i, postotak eritrocita s mikronu ­
kleusima. Ako nema dokaza o razlikama u reakcijama me đu spolo­
vima, za statisti čku analizu mogu se kombinirati podaci prikupljeni 
za oba spola.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 332
 
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnog rezultata, kao na 
primjer pove ćanje broja stanica s mikronukleusima povezano s 
dozom ili jasni porast broja stanica s mikronukleusima utvr đen na 
temelju samo jednog uzorkovanja kod skupine na koju je primije ­
njena samo jedna doza. Najprije treba razmotriti biološku relevant ­
nost rezultata. Kao pomo ć pri ocjenjivanju rezultata ispitivanja mogu 
se koristiti statisti čke metode (18)(19). Statisti čki značaj ne može biti 
jedini odlu čujući faktor pri utvr đivanju pozitivne reakcije. Nejasne 
rezultate treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogu ćnosti uz 
variranje uvjeta pokusa.  
Smatra se da ispitivana tvar za koju rezultati ovog testa ne ispunja ­
vaju gore navedene kriterije nije mutagena.  
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima dobiveni podaci ne će omogućiti donošenje defi ­
nitivne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa.
 
Pozitivni rezultati u mikronukleus testu zna če da tvar uzrokuje stva ­
ranje mikronukleusa, koji su posljedica ošte ćenja kromosoma ili 
oštećenja mitotskog aparata kod eritroblasta pokusne vrste. Negativni 
rezultati zna če da ispitivana tvar u ispitnim uvjetima ne uzrokuje 
stvaranje mikronukleusa u nezrelim eritrocitima pokusne vrste.  
Treba razmotriti vjerojatnost da ispitivana tvar ili njezini metaboliti 
uđu u glavni krvotok i posebno u ciljno tkivo (npr. sustavna toksi č­
nost).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
otapalo/nosa č: 
— obrazloženje za odabir nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako je 
poznata.  
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja, 
uključujući raspon masa te srednju i standardnu devijaciju za 
svaku skupinu.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosa č/otapalo),  
— podaci iz studije za utvr đivanje raspona, ako je obavljena,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 333
 
— obrazloženje za odabir visina doza,  
— pojedinosti o pripravljanju ispitivane tvari,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— obrazloženje za odabir puta primjene,  
— metode potvr đivanja da je ispitivana tvar stigla do glavnog krvo ­
toka ili ciljnog tkiva, ako je primjereno,  
— način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ako je 
primjereno,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
— detaljan opis rasporeda tretiranja i uzorkovanja,  
— metode pripreme mikroskopskih preparata,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— kriteriji za utvr đivanje nezrelih eritrocita s mikronukleusima,  
— broj analiziranih stanica po životinji,  
— kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom 
ili dvosmislenom.  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti,  
— udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita,  
— broj nezrelih eritrocita s mikronukleusima, naveden zasebno za 
svaku životinju,  
— srednja ± standardna devijacija nezrelih eritrocita s mikronukleu ­
sima za svaku skupinu,  
— odnos reakcije i doze, tamo gdje je mogu će, 
— primijenjene statisti čke analize i metode,  
— podaci o paralelnim i prijašnjim negativnim kontrolama,  
— podaci o paralelnim pozitivnim kontrolama.  
— Diskusija o rezultatima.  
— Zaklju čci. 
4. REFERENCE  
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, str. 187-190.  
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
str. 9-15.  
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induc ­
tion of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, str. 61-118.
 
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, 
M.F. and Heddle, J.A., (1990) The  In Vivo  Micronucleus 
Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res., 239, str. 29-80.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 334
 
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., 
(1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. Iin: „Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, str. 555-558.
 
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., 
Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, str. 103-112.
 
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., 
(1990) The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits 
Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, str. 513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. 
Mutation Res., 245, str. 245-249.
 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, 
(1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryt ­
hrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/ JEMMS. MMS. Mutation Res., str. 278, 83-98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis 
Study Group of the Environmental Mutagen Society of 
Japan), (1995) Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, str. 153-159.
 
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., 
Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacc ­
hierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, 
B., (1994)  In Vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. 
Mutation Res., 312, str. 293-304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, str. 313- 
319.
 
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, 
D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 313-319.
 
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test. Mutation Res., 120, str. 241-247.  
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, str. 269- 275.
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, str. 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 
347, str. 97-99.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L., (1990)  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, str. 115-141.
 
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, str. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENOST: TEST ZA OTKRIVANJE POVRATNIH 
MUTACIJA POMO ĆU BAKTERIJA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 471, Bakterijski test 
povratnih mutacija (Bacterial Reverse Mutation Test) (1997.).  
1.1. UVOD  
Pri ispitivanju povratnih mutacija koriste se sojevi bakterija  Salmo­
nella typhimurium  i Escherichia coli  kojima su potrebne aminokise ­
line, za otkrivanje to čkastih mutacija koje uklju čuju supstituciju, 
adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova DNK (1)(2)(3). Načelo ovog bakterijskog testa povratnih mutacija je da test 
otkriva mutacije koje povratno djeluju na mutacije prisutne kod 
pokusnih sojeva i ponovo uspostavljaju funkcionalnu sposobnost 
bakterija da sintetiziraju esencijalne amino kiseline. Povratno muti ­
rane bakterije raspoznaju se po njihovoj sposobnosti rasta u odsut ­
nosti aminokiseline koja je potrebna za rast roditeljskom pokusnom 
soju.
 
Točkaste mutacije uzrokuju mnoge genetske bolesti u ljudi i postoje 
čvrsti dokazi da su povratne mutacije u onkogenima i 
tumor-supresorskim genima somatskih stanica povezane s nastaja ­
njem tumora kod ljudi i pokusnih životinja. Test bakterijskih povratnih mutacija je brz, jeftin i relativno lako izvediv. Mnogi od 
pokusnih sojeva imaju nekoliko svojstava koja ih čine osjetljivijima 
za otkrivanje mutacija, uklju čujući i osjetljive nizove DNK na 
mjestima povratnih mutacija, pove ćanu propusnost stanica za 
velike molekule i eliminaciju sustava za popravak DNK ili poticanje 
procesa popravljanja DNK podložnih pojavi grešaka. Na specifi čno­
stima pokusnih sojeva mogu se temeljiti neke korisne informacije o vrstama mutacija koje uzrokuju genotoksi čni agensi. Za testove 
bakterijskih povratnih mutacija postoji vrlo velika baza podataka u 
kojoj su sadržani rezultati za veliki broj razli čitih struktura, a 
razvijene su i dobro uhodane metode za ispitivanje kemikalija različitih fizikalno-kemijskih svojstava, uklju čujući hlapive spojeve.
 
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Test povratnih mutacija  na bakterijama  Salmonella typhimurium  ili 
Escherichia coli  otkriva mutacije kod sojeva kojima je potrebna 
aminokiselina (histidin odnosno triptofan) za stvaranje sojeva koji ne ovise egzogenoj opskrbi aminokiselinom.
 
Mutageni supstitucije baznih parova  su agensi koji uzrokuju 
zamjenu baza DNK. Kod testa povratnih mutacija ova se zamjena u bakterijskom genomu može javiti na mjestu izvorne mutacije ili na 
nekom drugom mjestu.
 
Frameshift mutageni  (mutageni pomaka o čitavanja) su agensi koji 
uzrokuju adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova u DNK, 
mijenjenju ći na taj na čin okvir o čitavanja RNK.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 337
 
1.3. UVODNA RAZMATRANJA  
Kod bakterijskog testa povratnih mutacija koriste se prokariotske 
stanice, koje se razlikuju od stanica sisavaca po faktorima kao što su unos, metabolizam, struktura kromosoma i procesi popravljanja 
DNK.  In vitro  testovi op ćenito zahtijevaju upotrebu egzogenog 
izvora metaboli čke aktivacije. Sustavi metaboli čke aktivacije  in 
vitro  ne mogu u potpunosti oponašati  in vivo  uvjete kod sisavaca. 
Prema tome, ovaj test ne pruža izravne informacije o mutagenom i 
karcinogenom potencijalu tvari s obzirom na sisavce.
 
Bakterijski test povratnih mutacija obi čno se koristi kao inicijalni 
probir za genotoksi čko djelovanje i posebno za djelovanje koje uzro ­
kuje točkaste mutacije. Obimna baza podataka dokazuje da mnoge 
kemikalije koje su pozitivne na ovaj test pokazuju mutageno djelo ­
vanje i u drugim testovima. Postoje primjeri mutagenih agensa koje 
ovaj test ne otkriva; razlozi za taj nedostatak mogu se pripisati specifičnoj prirodi krajnjeg u činka koji se otkriva, razlike u metabo ­
ličkoj aktivaciji ili razlike u bioraspoloživosti. S druge strane, faktori 
koji poja čavaju osjetljivost bakterijskog testa povratnih mutacija 
mogu dovesti do precjenjivanja mutagenog djelovanja.
 
Bakterijski test povratnih mutacija možda nije pogodan za ocjenji ­
vanje nekih klasa kemikalija kao što su spojevi s jakim baktericidnim djelovanjem (npr. neki antibiotici) i spojevi koji posebno utje ču na 
sustav razmnožavanja stanica sisavaca (npr. neki inhibitori topoizo ­
meraze i neki nukleozidni analozi). U takvim slu čajevima mogli bi 
biti prikladniji testovi mutacija koji se provode na sisavcima.
 
Iako su se mnogi spojevi koji su pozitivni na ovaj test pokazali 
karcinogenima za sisavce, ova korelacija nije apsolutna. Ona ovisi 
o kemijskoj klasi, a postoje i karcinogeni koje ovaj test ne otkriva jer 
djeluju preko drugih, negenotoksi čkih mehanizama ili mehanizama 
kojih u bakterijskim stanicama nema.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Suspenzije bakterijskih stanica izlažu se ispitivanoj tvari uz prisut ­
nost ili odsutnost egzogenog sustava metaboli čke aktivacije. Kod 
metode inkorporacije u agarnu plo ču, te se suspenzije pomiješaju s 
top agarom i razliju izravno na minimalnu podlogu. Kod metode 
predinkubacije mješavina za tretiranje najprije se inkubira i potom pomiješa s top agarom, prije razlijevanja na minimalnu podlogu. Kod obje tehnike, nakon dva ili tri dana inkubacije, prebroje se kolonije 
revertanata (mutanti dobiveni povratnom mutacijom) i uspore đuju s 
brojem kolonija spontanih revertanata na kontrolnim plo čama s 
otapalom.
 
Opisano je više postupaka za izvo đenje bakterijskog testa povratne 
mutacije. Me đu onima koji se obi čno koriste su metoda inkorporacije 
u agarnu plo ču (1)(2)(3)(4), metoda predinkubacije (2)(3)(5)(6)(7)(8), 
metoda fluktuacije (9)(10) i metoda suspenzije (11). Opisane su i 
prilagodbe za ispitivanje plinova ili para (12).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 338
 
Postupci opisani u ovoj metodi odnose se prvenstveno na metode 
inkorporacije i predinkubacije. Obje su prihvatljive za izvo đenje 
pokusa sa i bez metaboli čke aktivacije. Neke se tvari mogu lakše 
otkriti primjenom metode predinkubacije. Te tvari spadaju u klase kemikalija koje uklju čuju kratkolan čane alifatske nitrozamine, 
dvovalentne metale, aldehide, azo-bojila i diazo spojeve, pirolizi ­
dinske alkaloide, alilne spojeve i nitro spojeve (3). Priznaje se da neke klase mutagena nije uvijek mogu će otkriti standardnim postup ­
cima kao što su metoda inkorporacije u agarnu plo ču ili metoda 
predinkubacije. Njih treba smatrati „posebnim slu čajevima” i čvrsto 
se preporu čuje da se za njihovo otkrivanje primijene alternativni 
postupci. U takve „posebne slu čajeve” mogu se svrstati (zajedno s 
primjerima postupaka koji se mogu upotrijebiti za njihovo otkriva ­
nje): azo-bojila i diazo spojevi (3)(5)(6)(13), plinovi i hlapive kemi ­
kalije (12)(14)(15)(16) i glikozidi (17)(18). Odstupanja od stan ­
dardnog postupka treba znanstveno opravdati.
 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Priprema  
1.5.1.1.  Bakterije  
Svježe kulture bakterija treba uzgojiti do kasne eksponencijalne ili 
rane stacionarne faze rasta (oko 10  9 stanica na ml). Kulture u kasnoj 
stacionarnoj fazi ne treba koristiti. Bitno je da kulture upotrijebljene 
u pokusu sadrže visoki titar živih bakterija. Taj se titar može utvrditi ili na temelju kontrolnih podataka o krivuljama rasta iz ranijih ispi ­
tivanja ili na temelju svakog ispitivanja kod kojega se utvr đuje broj 
živih stanica u kulturama uzgojenim na agarnim plo čama.
 
Preporučena temperatura inkubacije je 37 °C.  
Treba upotrijebiti najmanje pet sojeva bakterija. Oni trebaju uklju či­
vati četiri soja  S. typhimurium  (TA 1535; TA 1537 ili TA97a ili 
TA97; TA98 i TA100) koji su u laboratorijskoj praksi pokazali da su pouzdani i da su njihove reakcije ponovljive. Ta četiri soja  S. typhi­
murium  imaju na primarnom mjestu povratne mutacije bazne parove 
GC i poznata je mogu ćnost da oni ne će pokazati neke oksidiraju će 
mutagene, agense koji stvaraju popre čne veze i hidrazine. Takve 
tvari mogu se otkriti pomo ću sojeva  E.coli  WP2 ili  S. typhimurium  
TA102 (19) koji na primarnom mjestu povratne mutacije imaju bazni 
par AT. Prema tome, preporu čena kombinacija sojeva je:
 
— S. typhimurium  TA1535, i  
— S. typhimurium  TA1537 ili TA97 ili TA97a, i  
— S. typhimurium  TA98, i  
— S. typhimurium  TA100, i  
— E. coli  WP2 uvrA, ili  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), ili  S. typhi­
murium  TA102.  
Da bi se otkrili mutageni koji stvaraju popre čne veze, možda bi bilo 
bolje uklju čiti TA102 ili dodati soj  E. coli  koji ima sposobnost 
popravljanja DNA (npr.  E. coli  WP2 ili  E. coli  WP2 (pKM101)).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 339
 
Treba koristiti utvr đene postupke za pripravljanje mati čnih kultura, 
provjeru markera i pohranjivanje. Za svaki pripravak liofilizirane 
matične kulture treba dokazati da je toj kulturi za rast potrebna 
aminokiselina (histidin za sojeve  S. typhimurium  i triptofan za 
sojeve  E. coli ). Slično treba provjeriti i druge fenotipske karakteri ­
stike, na primjer: prisutnost ili odsutnost r-plazmida, tamo gdje je to 
primjereno (tj. otpornost na ampicilin kod sojeva TA98, TA100 i TA97a ili TA97, WP2 uvrA i WP2 uvrA (pKM101), te otpornost na ampicilin + tetraciklin kod soja TA 102G); prisutnost karakteristi čnih 
mutacija (tj. rfa mutacije kod  S. typhimurium  kroz osjetljivost na 
kristal ljubi často i uvrA mutacije kod  S. typhimurium  ili uvrB muta ­
cije kod  S. typhimurium  kroz osjetljivost na ultraljubi často svjetlo) 
(2)(3). Ti sojevi tako đer trebaju proizvesti broj kolonija spontanih 
revertanata (spontanih povratnih mutanata) u okvirima u čestalosti 
koja se o čekuje na temelju kontrolnih podataka iz prijašnjih ispiti ­
vanja i po mogu ćnosti unutar okvira navedenih u literaturi.
 
1.5.1.2.  Hranjiva podloga  
Koristi se odgovaraju ći minimalni agar (npr. koji sadrži 
Vogel-Bonnerovu minimalnu podlogu E i glukozu) i top agar koji 
sadrži histidin i biotin ili triptofan, koji omogu ćuju nekoliko 
staničnih dioba (1)(2)(9).  
1.5.1.3.  Metaboli čka aktivacija  
Bakterije treba izložiti ispitivanoj tvari uz prisutnost i uz odsutnost 
odgovaraju ćeg metaboli čkog aktivacijskog sustava. Naj češće 
upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim 
kofaktorom (S9) pripravljena od jetre glodavaca tretiranih agensima za enzimsku indukciju, kao što su Aroclor 1254 (1)(2), ili kombi ­
nacija fenobarbitona i β-naftoflavona (18)(20)(21). Postmitohon ­
drijska frakcija obi čno se upotrebljava u koncentracijama od 5 do 
30 % v/v u mješavini S9. Izbor i stanje sustava mataboli čke aktiva ­
cije može ovisiti o klasi opasnosti kemikalije koja se testira. U nekim slučajevima može biti primjereno upotrijebiti više od jedne koncen ­
tracije postmitohondrijske frakcije. Za azo-bojila i diazo spojeve 
možda je primjerenija upotreba redukcijskog sustava metaboli čke 
aktivacije (6)(13).
 
1.5.1.4.  Ispitivana tvar/priprema  
Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim 
otapalima ili nosa čima i prema potrebi razrijediti prije tretiranja 
bakterija. Teku će ispitivane tvari mogu se izravno dodati u ispitne 
sustave i/ili razrijediti prije tretiranja. Treba koristiti svježe preparate ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da 
je njihovo pohranjivanje prihvatljivo.
 
Ne smije postojati sumnja da bi otapalo/nosa č s ispitivanom tvari 
moglo/mogao proizvesti kemijsku reakciju i treba biti pogodno/po ­
godan za preživljavanje bakterija i djelovanje S9 (22). Ako se koriste 
otapala/nosa či koji nisu dobro poznati, njihovo uklju čivanje u ispi ­
tivanje treba potkrijepiti referentnim podacima koji dokazuju njihovu prikladnost. Preporuka je da se, kad god je to mogu će, najprije 
razmotri mogu ćnost upotrebe vodenog otapala/nosa ča. Kad se ispi ­
tuju tvari koje u vodi nisu stabilne, korištena organska otapala ne 
smiju sadržavati vodu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 340
 
1.5.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.5.2.1.  Pokusni sojevi (vidjeti 1.5.1.1.)  
1.5.2.2.  Koncentracije izlaganja  
Među kriterijima koje treba uzeti u obzir kod utvr đivanja najve će 
količine tvari koja će se koristiti su citotoksi čnost i topljivost u 
konačnoj mješavini za tretiranje.  
Može biti korisno toksi čnost i netopljivost utvrditi preliminarnim 
pokusom. Citotoksi čnost se može otkriti po smanjenju broja kolonija 
revertanata, po čistim dijelovima ili smanjenju površine podloge, ili 
po stopi preživljavanja tretiranih kultura. Citotoksi čnost tvari može 
se promijeniti uz prisutnost sustava metaboli čke aktivacije. Netoplji ­
vost se može ocijeniti kao talog u kona čnoj mješavini u stvarnim 
ispitnim uvjetima koji je vidljiv prostim okom.  
Preporučena maksimalna ispitna koncentracija za topljive necitoto ­
ksične tvari je 5 mg/plo ča ili 5μl/ploča. Za necitotoksi čne tvari koje 
nisu topljive pri koncentraciji od 5 mg/plo ča ili 5μl/ploča, jedna ili 
više testiranih koncentracija treba biti netopljiva u kona čnoj mješa ­
vini za tretiranje. Ispitivane tvari koje su citotoksi čne već pri koncen ­
tracijama ispod 5 mg/plo ča ili 5μl/ploča treba testirati do citotoksi čne 
koncentracije. Talog ne smije smetati o čitavanju.  
Za inicijalni pokus treba koristiti najmanje pet razli čitih koncentracija 
ispitivane tvari koje je mogu će analizirati, s intervalima od približno 
pola log (tj. √10) između ispitnih to čaka. Manji intervali mogu biti 
primjereni kad se istražuje ovisnost izme đu koncentracija i reakcija. 
Kad se ocjenjuju tvari koje sadrže zna čajne koli čine potencijalno 
mutagenih ne čistoća može se razmotriti mogu ćnost testiranja s 
koncentracijama viši od 5 mg/plo ča ili 5 μl/ploča. 
1.5.2.3.  Negativne i pozitivne kontrole  
U svaki pokus treba uklju čiti paralelne pozitivne i negativne kontrole 
(otapalo ili nosa č), specifične za odre đene sojeve, sa i bez metabo ­
ličke aktivacije. Treba odabrati koncentracije pozitivnih kontrola koje 
dokazuju u činkovitost izvedbe svakog pokusa.  
Kod pokusa kod kojih se koristi sustav metaboli čke aktivacije, refe ­
rentna(-e) tvar(-i) treba odabrati na temelju bakterijskih sojeva koji se koriste.
 
Sljedeće tvari su primjeri odgovaraju ćih pozitivnih kontrola za 
pokuse s metaboli čkom aktivacijom:  
CAS broj  EINECS broj  Naziv tvari  
781-43-1  212-308-4  9,10-dimetilantracen  
57-97-6  200-359-5  7,12-dimetilbenz [ α]antracen  
50-32-8  200-028-5  benzo[a]piren  
613-13-8  210-330-9  2-aminoantracen  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 341
 
CAS broj  EINECS broj  Naziv tvari  
50-18-0  ciklofosfamid  
6055-19-2  200-015-4  ciklofosfamid monohidrat  
Sljedeća tvar je odgovaraju ća pozitivna kontrola za metodu reduk ­
cijske metaboli čke aktivacije:  
CAS broj  EINECS broj  Naziv tvari  
573-58-0  209-358-4  kongo crvenilo  
2-aminoantracen ne treba koristiti kao jedini pokazatelj u činkovitosti 
mješavine S9. Ako se koristi 2-aminoantracen, svaku šaržu S9 isto tako treba okarakterizirati pomo ću mutagena kojemu je potrebna 
metabolička aktivacija mikrosomskim enzimima, npr. benzo[a]piren, 
dimetilbenzantracen.
 
Sljedeće tvari su primjeri pozitivnih kontrola specifi čnih za odre đene 
sojeve, za pokuse koji se izvode bez egzogenog sustava metaboli čke 
aktivacije:  
CAS brojevi  EINECS brojevi  Naziv tvari  Soj  
26628-22-8  247-852-1  natrijev azid  TA 1535 i TA 100  
607-57-8  210-138-5  2-nitrofluoren  TA 98  
90-45-9  201-995-6  9-aminoakridin  TA 1537, TA 97 i TA 97a  
17070-45-0  241-129-4  ICR 191  TA 1537, TA 97 i TA 97a  
80-15-9  201-254-7  kumen hidroperoksid  TA 102  
50-07-7  200-008-6  mitomicin C  WP2 uvrA i TA l02  
70-25-7  200-730-1  N-metil-N-nitro-N-nitrozogva ­
nidin  WP2, WP2uvrA i WP2uvrA(pK 
M101)  
56-57-5  200-281-1  4-nitrokinolin-1-oksid  WP2, WP2uvrA in 
WP2uvrA(pK M101)  
3688-53-7  furilfuramid (AF2)  tvari koje sadrže plazmide  
Mogu se koristiti i druge odgovaraju će referentne tvari pozitivne 
kontrole. Treba razmotriti mogu ćnost upotrebe kontrolnih kemikalija 
svrstanih u istu klasu opasnosti kao ispitivana tvar, ako su takve 
kemikalije raspoložive.  
Treba koristiti i negativne kontrole koje se sastoje samo od otapala 
ili nosača, bez ispitivane tvari, s kojima se ina če postupa jednako 
kao s tretiranim skupinama. Osim toga treba koristiti i netretirane kontrole osim ako postoje podaci o kontrolama iz ranijih pokusa koji 
dokazuju da odabrano otapalo ne izaziva nikakve štetne ili mutagene 
učinke.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 342
 
1.5.3.  Postupak  
Kod metode inkorporacije u agarnu plo ču (1)(2)(3)(4), bez metabo ­
ličke aktivacije, obi čno se pomiješa 0,05 ml ili 0,1 ml ispitne 
otopine, 0,1 ml svježe bakterijske kulture (koja sadrži približno 
10 8 živih stanica) i 0,5 ml sterilnog pufera s 2,0 ml top agara. 
Kod pokusa s metaboli čkom aktivacijom obi čno se 0,5 ml mješavine 
za metaboli čku aktivaciju koja sadrži odgovaraju ću količinu 
post-mitohondrijske frakcije (u rasponu od 5 do 30 % v/v u mješa ­
vini za metaboli čku aktivaciju) pomiješa se s top agarom (2,0 ml), 
kao i s bakterijama i ispitivanom tvari/ispitnom otopinom. Sadržaj svake epruvete se promiješa i prelije po površini minimalne agarne 
podloge. Prije inkubacije top agar treba pustiti da se stvrdne.
 
Kod predinkubacijske metode (2)(3)(5)(6), uobi čajeno je da se ispi ­
tivana tvar/ispitna otopina predinkubira zajedno s pokusnim sojem 
(oko 10  8 živih stanica) i sterilnim puferom ili sustavom za metabo ­
ličku aktivaciju (0,5 ml), obi čno 20 minuta ili duže na 30-37 °C, 
prije nego se pomiješa s top agarom i prelije po površini minimalne agarne podloge. Obi čno se 0,05 ml ili 0,1 ml ispitivane tvari/ispitne 
otopine, 0,1 ml bakterija i 0,5 ml mješavine S9 ili sterilnog pufera 
pomiješa s 2,0 ml top agara. Za vrijeme predinkubacije epruvete treba prozra čivati pomo ću tresilice.
 
Za adekvatnu procjenu varijacija, za svaku visinu doze treba nasaditi 
po tri plo če. Upotreba dviju plo ča je prihvatljiva ako za to postoji 
znanstveno opravdanje. Ako se povremeno dogodi da se plo ča 
izgubi, to ne mora nužno zna čiti da su rezultati pokusa nevaže ći. 
Plinovite ili hlapive tvari treba ispitivati odgovaraju ćim metodama, 
na primjer u nepropusnim posudama (12)(14)(15)(16).  
1.5.4.  Inkubacija  
Sve ploče u određenom pokusu treba inkubirati 48-72 sata na 37 °C. 
Nakon inkubacije na svakoj se plo či utvrđuje broj kolonija 
revertanata.  
2. PODACI  
2.1. OBRADA PODATAKA  
Podatke treba prikazati kao broj kolonija revertanata po agarnoj 
ploči. Treba navesti i broj kolonija revertanata na agarnim plo čama 
negativne kontrole (kontrolni uzorak tretiran otapalom i, ako se kori ­
sti, netretirani kontrolni uzorak) i pozitivne kontrole. Treba navesti ukupni broj na pojedina čnim pločama, srednju vrijednost broja kolo ­
nija revertanata po plo či i standardnu devijaciju za ispitivanu tvar 
kao i za pozitivne i negativne kontrole (netretirane i/ili kontrole tretirane otapalom).
 
Potvrđivanje jasne pozitivne reakcije nije potrebno. Nejasne rezultate 
treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogu ćnosti uz modifikaciju 
uvjeta ispitivanja. Negativne rezultate treba potvr đivati od slu čaja do 
slučaja. Kad se smatra da potvrda negativnih rezultata nije potrebna, 
takvo mišljenje treba znanstveno opravdati. U daljnjim pokusima 
treba razmotriti mogu ćnost modifikacije ispitnih parametara kako 
bi se pove ćao broj uvjeta koji će se analizirati. Ispitni parametri 
koji se mogu modificirati uklju čuju vremenske razmake izme đu 
primjene razli čitih koncentracija, metode tretiranja (inkorporacija u 
ploču ili predinkubacija u teku ćini) i uvjete metaboli čke aktivacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 343
 
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Ima više kriterija za utvr đivanje pozitivnih rezultata, kao što je pove ­ 
ćanje broja kolonija revertanata vezano uz koncentraciju unutar ispi ­
tivanog raspona i/ili ponovljivi porast pri jednoj ili više koncentracija 
po ploči, kod najmanje jednog soja, sa ili bez sustava za metaboli čku 
aktivaciju (23). Najprije treba razmotriti biološku relevantnost rezul ­
tata. Kao pomo ć pri ocjenjivanju rezultata ispitivanja mogu se kori ­
stiti statisti čke metode (24). Me đutim, statisti čki značaj ne smije biti 
jedini odlu čujući faktor za utvr đivanje pozitivne reakcije.  
Kod ovog se testa smatra da ispitivana tvar kod koje rezultati ne 
udovoljavaju gore navedenim kriterijima nije mutagena.  
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima dobiveni podaci ne će omogućiti donošenje defi ­
nitivne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati 
nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa.  
Pozitivni rezultati testa povratnih mutacija zna če da tvar uzrokuje 
točkaste mutacije zamjenom baza ili pomakom okvira o čitavanja u 
genomu bakterije  Salmonella typhimurium  i/ili  Escherichia coli.  
Negativni rezultati zna če da, u uvjetima pokusa, ispitivana tvar 
nije mutagena za pokusnu vrstu.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
Otapalo/nosa č: 
— obrazloženje za odabir otapala/nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako su 
poznate.  
Sojevi:  
— upotrijebljeni sojevi,  
— broj stanica po kulturi,  
— karakteristike soja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— količina ispitivane tvari po plo či (mg/plo ča ili μl/ploča) kao i 
razlozi za odabir doze i broja plo ča za svaku koncentraciju,  
— upotrijebljene hranjive podloge,  
— vrsta i sastav sustava metaboli čke aktivacije, uklju čujući kriterije 
prihvatljivosti,  
— postupci tretiranja.  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti,  
— znakovi taloženja,  
— ukupan broj na pojedina čnim pločama, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 344
 
— srednji broj kolonija revertanata po plo či i standardna devijacija,  
— ovisnost doze i reakcije, tamo gdje je mogu će, 
— statisti čke analize, ako su ra đene, 
— podaci o istovremenim negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama, s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama,
 
— podaci o negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim kontrolama iz 
prijašnjih ispitivanja, s rasponima, srednjim vrijednostima i stan ­
dardnim devijacijama.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 
31, str. 347-364.  
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173- 
215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays. Mutation Res., 312, str. 217-233.  
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., 
Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortel ­
mans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The  
Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency 
Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, str. 69-240.  
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 
str. 91-96.  
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. str. 273-285.
 
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. 
Kirkland, Cambridge University Press, str. 13-61.
 
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 
str. 167-177.  
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of 
a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, str. 33-42.
 
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. 
Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, 
Amsterdam-New York-Oxford, str. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 345
 
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium . Environmental Mutage ­
nesis, 3, str. 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, str. 335-344.
 
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, str. 33-47.
 
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, str. 2-141.
 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, str. 249-258.
 
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, 
L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmo ­
nella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, str. 421-441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Occur ­
ring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in  Salmonella typhimurium . Cancer Res., 39, str. 
3780-3782.  
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, str. 4961-4965.
 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., 
(1990) Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, str. 285- 
291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „ In vitro  meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing” Eds. F.J. de Serres et 
al. Elsevier, North Holland, str. 85-88.
 
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alter ­
natives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Micro ­
some Test. Mutation Res., str. 88343-350.  
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity. Mutation Res. 189, str. 83-91.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 346
 
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., 
Cambridge University Press, str. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 347
 
B.15.  ISPITIVANJE MUTAGENOSTI I PROBIRNI TEST NA 
GENSKE MUTACIJE KOJE UKAZUJU NA KARCINOGE ­
NOST–  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Za mjerenje nastanka genskih mutacija induciranih kemijskim agen ­
sima sa ili bez metaboli čke aktivacije može se koristiti niz 
haploidnih i diploidnih sojeva kvasca  Saccharomyces cerevisiae . 
Koriste se sustavi naprednih mutacija u haploidnim sojevima, kao što 
je mjerenje mutacije iz crvenih mutanata kojima je potreban adenin (ade-1, ade-2) u dvostruke bijele mutante kojima je potreban adenin 
i selektivni sustavi kao što je indukcija otpornosti na kanavnain i 
cikloheksamid.
 
Najopsežnije validirani sustav povratnih mutacija uklju čuje upotrebu 
haploidnog soja XV 185-14C koji nosi oker besmislene mutacije  ade 
2-1, arg 4-17,  lys 1-1 i  trp 5-48, koje su povratne pod utjecajem 
mutagena bazne supstitucije koji induciraju mutacije specifi čne za 
mjesto pojavljivanja ili oker supresorske mutacije. XV 185-14C isto tako nosi marker  his 1-7, odnosno mutaciju krivog smisla koja 
postaje povratnom uglavnom mutiranjem na drugom mjestu i marker  
hom 3-10, mutaciju koja postaje povratnom pod utjecajem frameshift 
mutagena (mutagena pomaka o čitavanja).
 
Što se tiče diploidnih sojeva  S. cerevisiae  jedini soj koji se koristi u 
velikoj mjeri je D  7 koji je homozigotan za  ilv1-92.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Prije ispitivanja treba pripremiti otopinu ispitivane tvari i kontrole, 
koristeći odgovaraju ći nosač. Kad se radi o organskim spojevima 
koji nisu topljivi u vodi, treba upotrijebiti najviše 2 %-tnu otopinu v/v organskog otapala kao što je etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). Kona čna koncentracija nosa ča ne smije 
znatno utjecati na sposobnost preživljavanja stanica i karakteristike 
rasta.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 348
 
M e t a b o l i č k a a k t i v a c i j a  
Stanice treba izlagati ispitivanim kemikalijama u prisutnosti i u 
odsutnosti odgovaraju ćih egzogenih sustava metaboli čke aktivacije.  
Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s 
dodanim kofaktorom, iz jetre glodavaca prethodno tretiranih agen ­
sima za enzimsku indukciju. Isto tako za metaboli čku aktivaciju 
može biti primjerena i upotreba drugih vrsta, tkiva, postmitohondrij ­
skih frakcija ili postupaka.  
Uvjeti ispitivanja  
P o k u s n i s o j e v i  
Haploidni soj XV 185-14C i diploidni soj D  7 najčešće se koriste u 
studijama mutacije gena. Mogu biti pogodni i neki drugi sojevi.  
H r a n j i v e p o d l o g e  
Za utvrđivanje stope preživljavanja i broja mutanata koriste se odgo ­
varajuće hranjive podloge za uzgoj kultura.  
U p o t r e b a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Pozitivne kontrole, kontrole bez tretiranja i kontrole uz upotrebu 
otopina treba obavljati istodobno. Za svaki specifi čni konačni muta­
cijski učinak treba upotrijebiti odgovaraju će kemikalije pozitivne 
kontrole.  
K o n c e n t r a c i j e i z l a g a n j a  
U odgovaraju ćim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje 
pet koncentracija ispitivane tvari. Kad su u pitanju toksi čne tvari, pri 
najvišim koncentracijama preživljavanje ne smije pasti ispod 5 do 10 %. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do 
granice njihove topljivosti primjenjuju ći odgovaraju će postupke. Za 
netoksične tvari koje su lako topljive u vodi gornje koncentracije 
treba utvr đivati od slu čaja do slu čaja.
 
U v j e t i i n k u b a c i j e  
Ploče se inkubiraju u mraku četiri do sedam dana na 28 do 30 °C.  
U č e s t a l o s t s p o n t a n i h m u t a c i j a  
Treba koristiti subkulture s u čestalošću spontanih mutacija unutar 
prihvaćenog normalnog raspona.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 349
 
B r o j r e p l i k a t a  
Za analizu prototrofa nastalih genskom mutacijom i sposobnosti 
preživljavanja stanica, za svaku koncentraciju treba upotrijebiti najmanje tri jednake plo če (replikata). Kad se radi o pokusima kod 
kojih se koriste markeri kao što je  hom  3-10 s niskom stopom 
mutacija, broj upotrijebljenih plo ča mora biti ve ći kako bi se osigu ­
rali statisti čki relevantni podaci.
 
Postupak  
Tretiranje sojeva  S. cerevisiae  obično se izvodi ispitnim postupkim u 
tekućini, koji se primjenjuje ili na stacionarne ili na rastu će stanice. 
Inicijalne pokuse treba obaviti na rastu ćim stanicama: 1-5 × 10  7 
stanica/ml izlaže se ispitivanoj kemikaliji do 18 sati na 28 do 
37 °C, uz tresenje. Tijekom tretiranja prema potrebi se dodaju odgo ­
varajuće količine metaboli čkog aktivacijskog sustava. Na kraju treti ­
ranja stanice se centrifugiraju, isperu i nasade ne odgovaraju ću 
hranjivu podlogu za uzgoj kultura. Nakon inkubacije plo če se očita­
vaju radi utvr đivanja stope preživaljavanja i indukcije genskih muta ­
cija. Ako je prvi pokus negativan, treba napraviti drugi pokus za koji 
se koriste stanice u stacionarnoj fazi rasta (u fazi mirovanja). Ako je 
prvi pokus pozitivan, potvr đuje se odgovaraju ćim nezavisnim 
pokusom.  
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u tabli čnom obliku, pri čemu treba navesti 
broj prebrojenih kolonija, broj mutanata te u čestalost preživljavanja i 
pojave mutanata. Sve rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusom. 
Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgovaraju ćih statisti čkih 
metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljeni soj,  
— uvjeti ispitivanja: stanice u stacionarnoj fazi (u fazi mirovanja) ili 
fazi rasta, sastav hranjive podloge, temperatura i trajanje inkuba ­
cije, sustav metaboli čke aktivacije,  
— uvjeti tretiranja: razine izlaganja, postupak i trajanje tretiranja, 
temperatura tretiranja, pozitivne i negativne kontrole,  
— broj prebrojenih kolonija, broj mutanata, u čestalost preživljavanja 
i pojave mutacija, odnos doze i reakcije, ovisno o slu čaju, stati­
stička procjena podataka,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 350
 
B.16.  MITOTSKA REKOMBINACIJA –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Mitotska rekombinacija u  Saccharomyces Cerevisiae  može se otkriti 
između gena (ili op ćenitije izme đu gena i njegovog centromera) i 
unutar gena. Prvi je slu čaj poznat kao krosing-over i stvara reci ­
pročne produkte, dok je drugi naj češće nerecipro čan i naziva se 
genskom konverzijom. Krosing-over se op ćenito analizira prema 
proizvodnji recesivnih homozigotnih kolonija ili sektora koji nastanu u heterozigotnom soju, dok se genska konverzija analizira 
na temelju proizvodnje prototrofnih revertanata koji nastanu u aukso ­
trofnom heteroalelnom soju koji nosi dva razli čita defektna alela 
istoga gena. Naj češće korišteni sojevi za otkrivanje mitotske konver ­
zije gena su sojevi D
 4 (heteroalelni na  ade 2 i trp 5), D  7 (heteroalelni 
na trp 5), BZ  34 (heteroalelni na  arg 4) i JDl (heteroalelni na  his 4 i 
trp 5). Mitotski krosing-over koji proizvodi crvene i ruži časte homo ­
zigotne sektore može se analizirati u D  5 ili u D  7 (čime se tako đer 
mjeri mitotska konverzija gena i povratne mutacije na  ilv 1-92), pri 
čemu su oba soja heteroalelna za komplementarne alele  ade 2. 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Otopine ispitivanih kemikalija i kontrole ili referentne spojeve treba 
pripremiti neposredno prije ispitivanja, uz upotrebu odgovaraju ćeg 
nosača. Kad se radi o organskim spojevima koji nisu topljivi u 
vodi, treba upotrijebiti najviše 2 %-tnu otopinu v/v organskog 
otapala kao što je etanol, aceton ili dimetilsulfoksid (DMSO). 
Konačna koncentracija nosa ča ne smije znatno utjecati na sposobnost 
preživljavanja stanica i karakteristike rasta.  
M e t a b o l i č k a a k t i v a c i j a  
Stanice treba izlagati ispitivanim kemikalijama u prisutnosti i u 
odsutnosti odgovaraju ćih egzogenih sustava metaboli čke aktivacije. 
Najčešće upotrebljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s 
dodanim kofaktorom iz jetre glodavaca prethodno tretiranih agen ­
sima za enzimsku indukciju. Isto tako za metaboli čku aktivaciju 
može biti primjerena i upotreba drugih životinjskih vrsta, tkiva, post ­
mitohondrijskih frakcija ili postupaka.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 351
 
Uvjeti ispitivanja  
P o k u s n i s o j e v i  
Najčešće korišteni sojevi su diploidi D  4 , D  5 , D  7 i JDl. Mogu biti 
pogodni i neki drugi sojevi.  
H r a n j i v e p o d l o g e  
Za utvrđivanje stope preživljavanja i u čestalosti mitotske rekombi ­
nacije koriste se odgovaraju će hranjive podloge za uzgoj kultura.  
U p o t r e b a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Pozitivne kontrole, kontrole bez tretiranja i kontrole s otopinama 
treba obavljati paralelno. Za svaki specifi čni konačni učinak rekom ­
binacije treba upotrijebiti odgovaraju će kemikalije pozitivne 
kontrole.  
K o n c e n t r a c i j e i z l a g a n j a  
U odgovaraju ćim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje 
pet koncentracija ispitivane tvari. Najniža koncentracija ne smije 
utjecati na sposobnost preživljavanja stanica. Kad su u pitanju toksične tvari, pri najvišim koncentracijama preživljavanje ne smije 
pasti ispod 5 do 10 %. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba 
ispitivati do granice njihove topljivosti, primjenjuju ći odgovaraju će 
postupke. Za netoksi čne tvari koje su dobro topljive u vodi gornje 
koncentracije treba utvr đivati od slu čaja do slu čaja.
 
Stanice se mogu izlagati ispitivanim kemikalijama ili u stacionarnoj 
fazi (fazi mirovanja) ili tijekom rasta u trajanju od najviše 18 sati. Međutim, u slu čaju dugotrajnijeg tretiranja kulture treba mikro ­
skopski pregledati na stvaranje spora čija prisutnost test čini neva­ 
žećim.
 
U v j e t i i n k u b a c i j e  
Ploče se inkubiraju u mraku četiri do sedam dana na 28 °C do 
30 °C. Plo če koje se koriste za analizu crvenih ili ruži častih homo ­
zigotnih sektora nastalih mitotskim krosing-overom treba držati u hladnjaku (oko 4 °C) daljnjih dan dva prije o čitavanja kako bi se 
omogućio razvoj odgovaraju ćih pigmentiranih kolonija.
 
U č e s t a l o s t s p o n t a n i h m i t o t s k i h r e k o m b i n a c i j a  
Treba koristiti subkulture s u čestalošću spontanih mitotskih rekombi ­
nacija u okviru prihva ćenog normalnog raspona.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 352
 
B r o j j e d n a k i h a g a r n i h p l o č a 
Za svaku koncentraciju treba upotrijebiti najmanje tri jednake agarne 
ploče za analizu prototrofa nastalih mitotskom konverzijom i sposob ­
nosti preživljavanja stanica. U slu čaju analize recesivne homozigot ­
nosti nastale mitotskim krosing-overom, broj plo ča treba pove ćati 
kako bi se dobio adekvatan broj kolonija.  
Postupci  
Tretiranje sojeva  S. cerevisiae  obično se provodi u okviru ispitnog 
postupka u teku ćini, uz korištenje stanica u stacionarnoj fazi ili 
stanica u fazi rasta. Inicijalne pokuse treba provoditi na rastu ćim 
stanicama. 1-5 × 10  7 stanica/ml izlaže se ispitivanoj kemikaliji do 
18 sati na 28 °C do 37 °C, uz protresanje; prema potrebi se tijekom tretiranja dodaje odgovaraju ća količina sustava za metaboli čku 
aktivaciju.
 
Na kraju tretiranja stanice se centrifugiraju, peru i nasa đuju na odgo ­
varajuću podlogu za uzgoj kultura. Nakon inkubacije plo če se očita­
vaju s obzirom na stupanj preživljavanja i indukciju mitotske rekombinacije.
 
Ako je prvi pokus negativan, treba napraviti drugi pokus sa stani ­
cama u stacionarnoj fazi. Ako je prvi pokus pozitivan, potvr đuje ga 
se neovisnom pokusom.  
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u obliku tablice iz koje se može vidjeti 
ukupni broj kolonija, broj rekombinanata, stopa preživljavanja i učestalost rekombinanata.
 
Rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusom.  
Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgovaraju ćih statisti čkih 
metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljeni soj,  
— uvjeti ispitivanja: stanice u stacionarnoj fazi (u fazi mirovanja) ili 
fazi rasta, sastav hranjive podloge, temperatura i trajanje inkuba ­
cije, sustav metaboli čke aktivacije,  
— uvjeti tretiranja: koncentracije izlaganja, postupak i trajanje treti ­
ranja, temperatura tretiranja, pozitivne i negativne kontrole,  
— utvrđeni broj kolonija, broj rekombinanata, u čestalost preživlja ­
vanja i pojave rekombinacija, odnos doze i reakcije, ovisno o 
slučaju, statisti čka procjena podataka,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 353
 
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 354
 
B.17.  IN VITRO  TEST GENSKIH MUTACIJA STANICA SISAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 476,  In Vitro  Mamma­
lian Cell Gene Mutation Test (1997) ( In vitro  test genskih mutacija 
stanica sisavaca (1997.)).  
1.1. UVOD  
In vitro  test genskih mutacija stanica sisavaca može se koristiti za 
otkrivanje genskih mutacija induciranih (uzrokovanih) kemijskim tvarima. Odgovaraju će stanične linije uklju čuju stanice limfoma 
miša L5178Y, linije stanica kineskog hr čka CHO, CHO-AS52 i 
V79 i stanice ljudskih limfoblastoidnih stanica TK6 (1). Kod tih staničnih linija na temelju naj češće primjenljivanih kona čnih 
genetskih u činaka mjeri se mutacija na timidin kinazi (TK) i 
hipoksantin-guanin-fosforibozil-transferazi (HPRT) te na transgenu 
ksantin-guanin-fosforibozil-transferaze (XPRT). Testovi mutacija TK, HPRT i XPRT otkrivaju razli čite spektre genetskih pojava. 
Autosomalna lokacija TK i XPRT može omogu ćiti otkrivanje 
genetskih pojava (npr. velike delecije) koje se ne otkriju na lokusu 
HPRT-a na X-kromosomima (2)(3)(4)(5)(6).
 
U in vitro  testu genskih mutacija stanica sisavaca mogu se koristiti 
kulture trajnih stani čnih linija ili stani čnih sojeva. Stanice koje se 
koriste biraju se na temelju sposobnosti rasta u kulturi i stabilnosti učestalosti spontanih mutacija.
 
Testovi koji se obavljaju  in vitro  zahtijevaju primjenu egzogenog 
(vanjskog) izvora metaboli čke aktivacije. Taj sustav metaboli čke 
aktivacije ne može u potpunosti oponašati uvjete  in vivo  kod sisa ­
vaca. Treba paziti da se izbjegavaju uvjeti koji bi doveli do rezultata 
koji ne odražavaju intrinzi čnu mutagenost. Pozitivni rezultati koji ne 
odražavaju intrinzi čnu mutagenost mogu proiza ći iz promjena u pH, 
osmolalnosti ili visoke razine citotoksi čnosti (7).  
Ovaj se test koristi za probir na mogu će mutagene i karcinogene u 
sisavaca. Mnogi spojevi koji se kod ovog testa pokažu pozitivnim karcinogeni su za sisavce; me đutim, ne postoji savršena korelacija 
između ovog testa i karcinogenosti. Korelacija ovisi o klasi opasnosti 
kemikalije i sve je više dokaza da postoje karcinogeni koje ovaj test 
ne otkriva jer izgleda da djeluju kroz druge negenotoksi čke mehan ­
izme ili mehanizme kojih nema u bakterijskim stanicama (6).
 
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Napredna mutacije:  genska mutacija od roditeljskog tipa u 
mutantni oblik, koja uzrokuje promjenu ili gubitak enzimskog djelo ­
vanja kodirane bjelan čevine.  
Mutageni supstitucije baznih parova:  tvari koje uzrokuju supstitu ­
ciju jednog ili više baznih parova u DNK.  
Mutageni pomaka okvira o čitavanja (frameshift mutageni):  tvari 
koje uzrokuju adiciju ili deleciju jednog ili više baznih parova u 
molekuli DNK.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 355
 
Vrijeme ekspresije fenotipa:  razdoblje tijekom kojega se nepromi ­
jenjeni genski produkti odstranjuju iz novomutiranih stanica.  
Učestalost pojave mutanata:  broj opaženih mutiranih stanica podi ­
jeljen s brojem živih stanica.  
Relativni ukupan rast:  povećanje broja stanica tijekom vremena u 
usporedbi s kontrolnom populacijom stanica; izra čunava se kao 
umnožak rasta u suspenziji u odnosu na negativnu kontrolu i u čin­
kovitosti kloniranja u odnosu na negativnu kontrolu.  
Relativni rast u suspenziji:  povećanje broja stanica tijekom 
razdoblja ekspresije u odnosu na negativnu kontrolu.  
Sposobnost preživljavanja:  učinkovitost kloniranja tretiranih stanica 
u vrijeme nasa đivanja nakon razdoblja ekspresije u selektivnim 
uvjetima.  
Preživljavanje:  učinkovitost kloniranja tretiranih stanica kad se 
nasade na kraju tretiranja; preživljavanje se obi čno izražava u 
odnosu na preživljavanje populacije kontrolnih stanica.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Stanice bez timidin kinaze (TK) su radi mutacije TK  +/– →TK +/– 
otporne na citotoksi čko djelovanje analoga primidona, 
trifluorotimidina (TFT). Stanice koje sadrže dosta timidin kinaze osjetljive su na TFT, što uzrokuje inhibiciju stani čnog metabolizma 
i daljnju diobu stanica. Tako se mutantne stanice uz prisutnost TFT-a 
mogu razmnožavati dok se normalne stanice koje sadrže timidin kinazu ne mogu. Isto tako, stanice koje nemaju HPRT ili XPRT selektiraju se prema otpornosti na 6-tioguanin (TG) ili 8- 
azoguanin (AG). Ako se u okviru bilo kojeg testa genskih mutacija 
stanica sisavaca ispituje neki bazni analog ili spoj srodan selek ­
tivnom agensu pažljivo treba razmotriti svojstva ispitivane tvari. Na primjer, treba istražiti svaku pretpostavljenu selektivnu toksi čnost 
ispitivane tvari za mutirane i nemutirane stanice. Prema tome, kad se 
testiraju kemikalije koje su strukturno srodne selektivnom agensu, mora se potvrditi djelovanje selektivnog sustava/agensa (8).
 
Stanice u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi izlažu se u odgovara ­
jućem trajanju ispitivanoj tvari, sa i bez metaboli čke aktivacije, i 
uzgoji se subkultura na novoj podlozi, da bi se utvrdila citotoksi č­
nost i omogu ćila ekspresija fenotipa prije selekcije mutanata 
(9)(10)(11)(12)(13). Citotoksi čnost se obi čno utvrđuje mjerenjem 
relativne u činkovitosti kloniranja (preživljavanje) ili relativnog 
ukupnog rasta kultura nakon razdoblja tretiranja. Tretirane se kulture drže u hranjivoj podlozi za rast tijekom dovoljno dugog 
vremenskog razdoblja koje je karakteristi čno za svaki odabrani 
lokus i tip stanice, što omogu ćuje skoro optimalnu ekspresiju feno ­
tipa induciranih mutacija. U čestalost pojave mutanata utvr đuje se 
nasađivanjem poznatog broja stanica na hranjivu podlogu koja 
sadrži selektivni agens za otkrivanje mutantnih stanica, a u podlozi 
bez selektivnog agensa za odre đivanje učinkovitosti kloniranja (spo ­
sobnosti preživljavanja). Nakon odgovaraju ćeg razdoblja inkubacije 
kolonije se prebroje. U čestalost pojave mutanata dobije se iz broja 
mutiranih kolonija u selektivnoj hranjivoj podlozi i broja kolonija u 
neselektivnoj hranjivoj podlozi.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 356
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema  
1.4.1.1.  Stanice  
Postoji više vrsta stanica koje se mogu koristiti u ovom testu, uklju ­ 
čujući i podklonove stanica L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 ili 
TK6. Vrste stanica koje se koriste u ovom testu trebaju imati doka ­
zanu osjetljivost na kemijske mutagene, visoku u činkovitost kloni ­
ranja i stabilnu u čestalost spontanih mutacija. Stanice treba provjeriti 
na prisutnost mikoplazmatske kontaminacije i ako su kontaminirane 
ne smiju se koristiti.  
Test treba biti dizajniran tako da njegova osjetljivost i jakost budu 
unaprijed odre đene. Broj stanica, kultura i koncentracije ispitivane 
tvari koje se koriste trebaju odražavati tako definirane parametre (14). Minimalni broj živih stanica koje se koriste u svakoj fazi 
ispitivanja a prežive tretiranje treba se temeljiti na u čestalosti spon ­
tanih mutacija. Op ća je uputa da se koristi broj stanica koji je 
najmanje 10 puta obrnuto proporcionalan s u čestalošću spontanih 
mutacija. Me đutim, preporu čuje se korištenje najmanje 10
 6 stanica. 
Kako bi se pokazalo da se test provodi dosljedno, trebali bi biti 
dostupni odgovaraju ći povijesni podaci o upotrijebljenom stani čnom 
sustavu.  
1.4.1.2.  Hranjive podloge i uvjeti za uzgoj kultura  
Treba koristiti odgovaraju će hranjive podloge za uzgoj kultura i 
osigurati odgovaraju će uvjete za inkubaciju (posude za uzgoj kultura, 
temperatura, koncentracija CO  2 , vlažnost zraka). Hranjive podloge 
treba odabrati prema selektivnim sustavima i vrsti stanica koji se 
koriste u testu. Posebno je važno odabrati uvjete za uzgoj kultura 
koji osiguravaju optimalni rast stanica tijekom razdoblja ekspresije i sposobnost stvaranja kolonija kako mutiranih tako i nemutiranih stanica.
 
1.4.1.3.  Priprema kultura  
Stanice se dobivaju iz mati čnih kultura, nasa đuju u/na podlogu za 
uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C. Prije upotrebe u ovom testu iz kultura će možda trebati odstraniti mutirane stanice koje postoje 
otprije.
 
1.4.1.4.  Metaboli čka aktivacija  
Stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti 
odgovaraju ćeg sustava za aktivaciju metabolizma. Naj češće upotreb ­
ljavani sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom 
(S9) pripravljena od jetre glodavaca tretiranih agensima za enzimsku 
indukciju, kao što su Aroclor 1254 (15)(16)(17)(18), ili kombi ­
nacijom fenobarbitona i β-naftoflavona (19)(20).  
Postmitohondrijska frakcija obi čno se upotrebljava u koncentraci ­
jama od 1 do 10 % v/v u kona čnoj ispitnoj podlozi. Izbor i stanje 
sustava mataboli čke aktivacije može ovisiti o klasi opasnosti kemi ­
kalije koja se testira. U nekim slu čajevima može biti primjereno 
upotrijebiti više od jedne koncentracije postmitohondrijske frakcije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 357
 
Više promjena, uklju čujući stvaranje stani čnih linija s izraženim 
specifičnim aktivacijskim enzimima pomo ću genetskog inženjeringa 
može osigurati potencijal za endogenu aktivaciju. Odabir stani čnih 
linija koje se koriste treba biti znanstveno opravdan (npr. na temelju relevantnosti izoenzima citokrom P450 za metabolizam ispitivane 
tvari).
 
1.4.1.5.  Ispitivana tvar/priprema  
Krute ispitivane tvari treba prije tretiranja stanica otopiti ili suspen ­
dirati u odgovaraju ćim otapalima ili nosa čima i prema potrebi 
razrijediti. Teku će ispitivane tvari mogu se izravno dodati u ispitne 
sustave i/ili prije tretiranja razrijediti. Treba koristiti svježe preparate 
ispitivane tvari, osim ako podaci o njihovoj stabilnosti dokazuju da 
je njihovo pohranjivanje prihvatljivo.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/nosa č 
Ne smije postojati sumnja da bi otapalo/nosa č s ispitivanom tvari 
moglo/mogao proizvesti kemijsku reakciju i treba biti pogodno/po ­
godan za preživljavanje bakterija i djelovanje S9. Ako se koriste otapala/nosa či koji nisu dobro poznati, njihovo uklju čivanje u ispi ­
tivanje treba potkrijepiti podacima koji ukazuju na njihovu priklad ­
nost. Preporuka je da se, kad god je to mogu će, najprije razmotri 
mogućnost upotrebe vodenog otapala/nosa ča. Kad se ispituju tvari 
koje u vodi nisu stabilne, korištena organska otapala ne smiju sadr ­ 
žavati vodu. Voda se može odstraniti pomo ću molekularnog sita.
 
1.4.2.2.  Koncentracije izlaganja  
Među kriterijima koje treba razmotriti pri utvr đivanju najviše 
koncentracije su citotoksi čnost, topljivost u ispitnom sustavu i 
promjene u pH ili osmolalnosti.  
Citotoksičnost treba utvrditi sa i bez metaboli čke aktivacije u 
glavnom pokusu uz upotrebu odgovaraju ćih pokazatelja stani čnog 
integriteta i rasta, kao što je relativna u činkovitost kloniranja (preživ ­
ljavanje) ili relativni ukupni rast. Može biti korisno preliminarnim pokusom utvrditi citotoksi čnost i topljivost.
 
Treba upotrijebiti najmanje četiri koncentracije koje je mogu će anali­
zirati. Ako postoji citotoksi čnost, te koncentracije trebaju biti u 
rasponu od maksimalne do male toksi čnosti, ili netoksi čnosti; to 
najčešće znači da razlika u razinama koncentracija ne smije biti 
veća od faktora 2 i √10. Ako se najviša koncentracija temelji na 
citotoksičnosti, rezultat njezine primjene trebala bi biti relativna 
stopa preživljavanja (relativna u činkovitost kloniranja) ili relativan 
ukupni rast od 10-20 % (ali ne ispod 10 %). Za relativno necitoto ­
ksične tvari maksimalna ispitna koncentracija treba biti 5 mg/ml, 
5μl/ml ili 0,01 M, ovisno o tome koja je od njih najniža.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 358
 
Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice 
njihove topljivosti u uvjetima kultiviranja. Dokaze o netopljivosti 
treba utvrditi u kona čnom sredstvu za tretiranje kojem se stanice 
izlažu. Može biti korisno procijeniti topljivost na po četku i na 
kraju tretiranja, budu ći da se ona tijekom izlaganja u ispitnom 
sustavu može promijeniti zbog prisutnosti stanica, S9, seruma itd. 
Netopljivost se može otkriti golim okom. Talog ne smije smetati očitavanju.
 
1.4.2.3.  Kontrole  
U svaki pokus treba uklju čiti istovremene pozitivne i negativne (ota ­
palo ili nosa č) kontrole, sa i bez metaboli čke aktivacije. Kad se 
koristi metaboli čka aktivacija, kemikalija pozitivne kontrole treba 
biti kemikalija kojoj je potrebna aktivacija da bi proizvela mutagenu reakciju.
 
Primjeri pozitivnih kontrolnih tvari uklju čuju: 
Stanje metaboli čke 
aktivacije  Lokus  Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Odsutnost 
egzogene 
metaboličke 
aktivacije  HPRT  Etil metansulfonat  62-50-0  200-536-7  
Etil-nitrozourea  759-73-9  212-072-2  
TK (male i 
velike 
kolonije  Metil metansulfonat  66-27-3  200-625-0  
XPRT  Etil metansulfonat  62-50-0  200-536-7  
Etil-nitrozourea  759-73-9  212-072-2  
Odsutnost 
egzogene 
metaboličke 
aktivacije  HPRT  3-metilkolantren  56-49-5  200-276-4  
N-nitrozodimetilamin  62-75-9  200-549-8  
7,12-dimetilbenzantracen  57-97-6  200-359-5  
TK (male i 
velike 
kolonije  Ciklofosfamid  50-18-0  200-015-4  
Ciklofosfamid monohidrat  6055-19-2  
Benzo[a]piren  50-32-8  200-028-5  
3-metilkolantren  56-49-5  200-276-5  
XPRT  N-nitrozodimetilamin (za visoke 
razine S-9)  62-75-9  200-549-8  
Benzo[a]piren  50-32-8  200-028-5  
Mogu se upotrijebiti i druge odgovaraju će referentne tvari pozitivne 
kontrolne, npr. ako laboratorij ima bazu podataka o ranijim ispitiva ­
njima 5-bromo 2’-deoksiuridina (CAS br. 59-14-3, EINECS br. 200- 415-9) može se upotrijebiti i ova referentna tvar. Treba razmotriti 
mogućnost upotrebe kemikalija pozitivne kontrole koje spadaju u 
istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, kad god su raspoložive.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 359
 
Treba uklju čiti i negativne kontrole koje se sastoje samo od otapala 
ili nosača u podlozi za tretiranje i s kojima se postupa na jednaki 
način kao s tretiranim skupinama. Osim toga, treba koristiti i netre ­
tirane kontrole ako ne postoje podaci o prijašnjim kontrolama koji dokazuju da odabrano otapalo ne izaziva nikakve mutagene u činke.
 
1.4.3.  Postupak  
1.4.3.1.  Tretiranje ispitivanom tvari  
Stanice koje se razmnožavaju treba izlagati ispitivanoj tvari sa i bez 
metaboličke aktivacije. Izlaganje treba trajati odgovaraju će vrijeme 
(obično je dovoljno tri do šest sati). Vrijeme izlaganja može obuh ­
vatiti jedan ili više stani čnih ciklusa.  
Za svaku ispitivanu koncentraciju mogu se paralelno koristiti dvije 
kulture ili samo jedna. Kad se koristi samo jedna kultura, broj 
koncentracija treba pove ćati kako bi se osigurao dovoljan broj 
kultura za analizu (npr. najmanje osam koncentracija koje se mogu analizirati). Treba koristiti dvostruke negativne kontrole (otapalo).
 
Plinovite ili hlapive tvari treba testirati primjenjuju ći odgovaraju će 
metode, npr. u nepropusnim posudama za uzgoj kultura (21)(22).  
1.4.3.2.  Mjerenje stope preživljavanja, sposobnosti preživljavanja i u česta­
losti pojave mutanata  
Na kraju razdoblja izlaganja stanice se isperu i kultiviraju kako bi se 
utvrdila stopa preživljavanja i omogu ćila ekspresija fenotipa muta ­
nata. Mjerenje citotoksi čnosti utvr đivanjem relativne u činkovitosti 
kloniranja (preživljavanja) ili relativnog ukupnog rasta kultura 
obično započinje nakon tretiranja.  
Za svaki lokus utvr đeno je minimalno vrijeme koje je potrebno da bi 
bila mogu ća optimalna ekspresija fenotipa novoinduciranih mutacija 
(za HPRT i XPRT potrebno je najmanje šest do osam dana, a za TK najmanje dva dana). Stanice se uzgajaju u podlozi sa i bez selek ­
tivnih agensa za utvr đivanje broja mutanata, odnosno u činkovitosti 
kloniranja. Mjerenje stope preživljavanja (koja se koristi za izra ču­
navanje u čestalosti pojave mutanata) zapo činje na kraju razdoblja 
ekspresije nasa đivanjem na neselektivnu hranjivu podlogu.
 
Ako je ispitivana tvar u testu L5178Y TK  +/– pozitivna, treba 
razvrstati po veli čini kolonije najmanje jedne od ispitnih kultura 
(najviša pozitivna koncentracija) kao i negativnih i pozitivnih kontrola. Ako je ispitivana tvar u testu L5178Y TK
 +/– negativna, 
po veličini treba razvrstati kolonije negativnih i pozitivnih kontrola. 
Razvrstavanje kolonija po veli čini može se obaviti i u studijama kod 
kojih se koristi TK6TK  +/– . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 360
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Obrađuju se podaci o mjerenju citotoksi čnosti i sposobnosti preživ ­
ljavanja, broju kolonija i u čestalosti pojave mutanata za tretirane i 
kontrolne kulture. Kad je kod testa L5178Y TK  +/– rezultat pozitivan, 
kolonije se razvrstavaju prema kriterijima za male i velike kolonije 
kod najmanje jedne koncentracije ispitivane tvari (najviša pozitivna 
koncentracija) i kod negativnih i pozitivnih kontrola. Molekularna i citogenetska svojstva mutanata u velikim i malim kolonijama detaljno su ispitana (23)(24). Kod testa TK
 +/– kolonije se razvrsta ­
vaju prema kriterijima za kolonije normalnog rasta (velike) i sporog 
rasta (male) (25). Kod kolonija mutanata koje su pretrpjele najve ća 
genetska ošte ćenja vrijeme udvostru čivanja je duže i zato tvore male 
kolonije. Tipi čno je za ova ošte ćenja da variraju od gubitka čitavoga 
gena do kariotipski vidljivih kromosomskih aberacija. Indukcija 
mutanata koji tvore male kolonije povezuje se s kemikalijama koje izazivaju velike kromosomske aberacije (26). Manje ošte ćene muti­
rane stanice rastu brzinom sli čnom brzini rasta roditeljskih stanica i 
stvaraju velike kolonije.
 
Treba navesti stopu preživljavanja (relativnu u činkovitost kloniranja) 
ili relativni ukupni rast. U čestalost pojave mutanata treba izraziti kao 
broj mutantnih stanica u odnosu na broj preživjelih stanica.  
Treba navesti podatke za pojedina čne kulture. Osim toga, sve 
podatke treba rezimirati u obliku tablice.  
Jasne pozitivne reakcije nije potrebno verificirati. Nejasne rezultate 
treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, po mogu ćnosti uz promjenu 
pokusnih uvjeta. Negativne rezultate treba potvr đivati od slu čaja 
do slučaja. U slu čajevima kod kojih se smatra da potvrda negativnih 
rezultata nije potrebna, za to treba navesti opravdane razloge. U 
daljnjim ispitivanjima koja se obavljaju u slu čaju nejasnih ili nega ­
tivnih rezultata treba razmotriti mogu ćnost izmjene ispitnih parame ­
tara kako bi se pove ćao obim analiziranih uvjeta. Ispitni parametri 
koji bi se mogli modificirati uklju čuju intervale primjene razli čitih 
koncentracija i uvjete metaboli čke aktivacije.  
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnih rezultata, kao na 
primjer pove ćanje ili ponovljivo pove ćanje učestalosti pojave muta ­
nata povezano s koncentracijom. Najprije treba razmotriti biološku 
relevantnost podataka. Statisti čke metode mogu se koristiti kao 
pomoć u ocjenjivanju rezultata ispitivanja. Statisti čki značaj ne 
smije biti jedini odlu čujući faktor za pozitivnu reakciju.  
Ispitivana tvar čija ispitivanja ne ispunjavaju gornje kriterije u ovom 
se sustavu ne smatra mutagenom.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 361
 
Iako će većina studija dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima na temelju dobivenih podataka ne će se moći 
donijeti kona čno mišljenje o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati 
mogu ostati nejasni ili upitni bez obzira na broj ponavljanja pokusa.  
Pozitivni rezultati  in vitro  testa genskih mutacija stanica sisavaca 
pokazuju da ispitivana tvar izaziva genske mutacije u upotrijebljenim uzgojenim stanicama sisavaca. Ponovljiva pozitivna reakcija na odre ­ 
đenu koncentraciju je najzna čajnija. Negativni rezultati zna če da 
ispitivana tvar u uvjetima ispitivanja ne izaziva genske mutacije 
kod upotrijebljenih uzgojenih stanica sisavaca.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora uklju čivati sljede će informacije:  
otapalo/nosa č: 
— obrazloženje za odabir otapala/nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako je 
poznata.  
Stanice:  
— vrsta i podrijetlo stanica,  
— broj pasaža stanica, ako je primjereno,  
— metode održavanja stani čnih kultura, ako je primjereno,  
— odsutnost mikoplazme.  
Uvjeti ispitivanja:  
— obrazloženje za odabir koncentracija i broj kultura, uklju čujući 
npr. podatke o citotoksi čnosti i granice topljivosti, ako su raspo ­
loživi,  
— sastav hranjivih podloga, koncentracija CO  2 , 
— koncentracija ispitivane tvari,  
— volumen dodanog nosa ča i ispitivane tvari,  
— temperatura inkubacije,  
— vrijeme inkubacije,  
— trajanje tretiranja,  
— gustoća stanica za vrijeme tretiranja,  
— vrsta i sastav sustava metaboli čke aktivacije, uklju čujući kriterije 
prihvatljivosti,  
— pozitivne i negativne kontrole,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 362
 
— dužina razdoblja ekspresije (uklju čujući broj nasa đenih stanica te 
režim uzgoja podkultura i dodavanja hranjivih tvari, ako je 
primjereno),  
— selektivni agensi,  
— kriteriji na temelju kojih se test smatra pozitivnim, negativnim ili 
dvosmislenim,  
— metode korištene za utvr đivanje broja živih i mutiranih stanica,  
— definicija kolonija kod kojih se razmatra veli čina i vrsta (uklju ­ 
čujući kriterije za „male” i „velike” kolonije, ako je primjereno).  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti,  
— znakovi taloženja,  
— podaci o pH i osmolalnosti tijekom izloženosti ispitivanoj tvari, 
ako su utvr đeni, 
— veličina kolonija, ako je utvr đena, barem za negativne i pozitivne 
kontrole,  
— osposobljenost laboratorija za otkrivanje malih kolonija mutanata 
pomoću sustava L5178Y TK  +/– , ako je primjereno,  
— odnos doza i reakcija, ako je mogu će, 
— statisti čke analize, ako su ra đene, 
— podaci o paralelnim negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama,  
— podaci o negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim kontrolama iz 
prijašnjih ispitivanja s rasponima, srednjim vrijednostima i stan ­
dardnim devijacijama,  
— učestalost pojave mutanata.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell 
Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., 
USA, 61, str. 1306-1312.  
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, str. 467-485.
 
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, str. 
394-403.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 363
 
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, str. 121-128.  
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E., (1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, str. 235-239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, str. 147-204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, str. 225-251.
 
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S., (1988) 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypo ­
xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Deter ­
mine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program. Mutation Res., 196, str. 17-36.
 
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phospho ­
ribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, str. 135-141.
 
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, str. 9-17.
 
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W., (1986) 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, str. 133-147.
 
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984) Procedures 
for the L5178Y/TK  +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Muta ­
genicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New 
York, str. 239-268.  
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, str. 66-101.
 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by 
Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, str. 365-373.
 
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 
str. 347-364.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay 
System. Mutat. Res., 59, str. 61-108.  
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 173- 
215. 
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alter ­
natives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, 
J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, 
North-Holland, str. 85-88.
 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
str. 91-103.
 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795-801.
 
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 51-55.  
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis of 
Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK  +/- 
Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, str. 161-174.  
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, str. 
89-102.
 
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- - 3.7.2C 
Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, str. 609-614.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 365
 
B.18.  OŠTE ĆENJE I POPRAVAK – NEPLANIRANA SINTEZA DNK 
– STANICE SISAVACA  IN VITRO  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Testom neplanirane sinteze DNK (UDS) mjeri se reparaturna sinteza 
DNK nakon ekscizije (izrezivanja) i odstranjivanja dijela DNK na kojem se nalazi podru čje oštećenja izazvanog kemijskim i fizikalnim 
agensima. Test se temelji na inkorporaciji timidina ozna čenog 
tritijem (
 3 H-TdR) u DNK stanicama sisavaca koje nisu u S-fazi 
staničnog ciklusa. Unos  3 H-TdR može se utvrditi autoradiografijom 
ili brojenjem DNK iz tretiranih stanica pomo ću tekućinskog scinti ­
lacijskog broja ča (LSC). Stanice sisavaca u kulturi, ako se ne koriste 
primarni hepatociti štakora, tretiraju se ispitnim agensom sa ili bez 
egzogene metaboli čke aktivacije. UDS se isto tako može mjeriti u  in 
vivo sustavima.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Ispitivane tvari i kontrolne ili referentne tvari treba pripremiti u 
hranjivoj podlozi za rast, odnosno otopiti ili suspendirati u odgova ­
rajućim nosačima, a zatim za upotrebu u pokusu dodatno razrijediti u 
hranjivoj podlozi za rast. Kona čna koncentracija nosa ča ne smije 
utjecati na sposobnost preživljavanja stanica.  
U pokusu se mogu koristiti kulture primarnih hepatocita štakora, 
ljudskih limfocita ili trajnih stani čnih linija (npr. ljudski diploidni 
fibroblasti).  
Stanice treba izlagati ispitivanoj kemikaliji u prisutnosti i u odsut ­
nosti odgovaraju ćeg sustava metaboli čke aktivacije.  
Uvjeti ispitivanja  
B r o j k u l t u r a  
Za svaku fazu pokusa potrebne su najmanje dvije stani čne kulture za 
autoradiografiju i šest kultura (ili manje ako je to znanstveno oprav ­
dano) za utvr đivanje neplanirane sinteze DNK (UDS) pomo ću teku­ 
ćinskog scintilacijskog broja ča (LSC).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 366
 
U p o t r e b a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
U svaki pokus treba uklju čiti paralelne pozitivne i negativne kontrole 
(netretirane i/ili tretirane nosa čem) sa i bez metaboli čke aktivacije.  
Primjeri pozitivnih kontrolnih tvari za pokus s hepatocitima štakora 
uključuju 7,12- dimetilbenzatracen (7,12- DMBA) ili 2-acetilaminof ­
luoren (2-AAF). Kada se radi o trajnim stani čnim linijama, 4-nitro ­
kvinolin-N-oksid (4-NQO) je primjer pozitivne kontrolne tvari i za autoradiografske pokuse i za pokuse s teku ćinskim scintilacijskim 
brojačem obavljene bez metaboli čke aktivacije; N-dimetilnitrozamin 
je primjer kontrolnog pozitivnog spoja ako se koriste sustavi meta ­
boličke aktivacije.
 
K o n c e n t r a c i j e i z l a g a n j a  
Treba upotrijebiti više koncentracija ispitivane tvari u rasponu 
adekvatnom za definiranje reakcija. Najviše koncentracije bi trebale izazvati neke cititoksi čke učinke. Spojeve koji su relativno netopljivi 
u vodi treba testirati do granice njihove topljivosti. Za netoksi čne 
kemikalije koje su lako topljive u vodi gornju ispitnu koncentraciju treba utvrditi za svaki slu čaj posebno.
 
S t a n i c e  
Za održavanje kultura treba upotrijebiti odgovaraju će hranjive 
podloge za rast, odgovaraju ću koncentraciju CO  2 , temperaturu i vlaž ­
nost zraka. Trajne stani čne linije treba periodi čno provjeravati s 
obzirom na eventualnu kontaminaciju mikoplazmom.  
M e t a b o l i č k a a k t i v a c i j a  
Sustavi metaboli čke aktivacije ne upotrebljavaju se kod kultura 
primarnih hepatocita. Trajne stani čne linije i limfociti izlažu se ispi ­
tivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti odgovaraju ćeg sustava meta ­
boličke aktivacije.  
Postupak  
P r i p r e m a k u l t u r a  
Trajne stani čne linije dobivaju se iz mati čnih kultura (npr. tripsini ­
zacijom ili otresanjem), nasa đuju se u odgovaraju ćoj gustoći u 
posude za uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C.  
Kratkotrajne kulture hepatocita štakora pripremaju se tako da se 
svježe izdvojeni hepatociti suspendirani u odgovaraju ćoj podlozi 
stave na hranjivu podlogu za rast dok se ne pri čvrste za njezinu 
površinu.  
Kulture ljudskih limfocita pripremaju se uz primjenu odgovaraju ćih 
tehnika.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 367
 
T r e t i r a n j e k u l t u r a i s p i t i v a n o m t v a r i  
Primarni hepatociti štakora  
Svježe izolirani hepatociti štakora tretiraju se u odgovaraju ćem 
vremenskom razdoblju ispitivanom tvari u teku ćoj podlozi koja 
sadrži  3 H-TdR. Na kraju razdoblja tretiranja podlogu treba ocijediti 
sa stanica koje se potom ispiru, fiksiraju i osuše. Mikroskopske preparate treba namo čiti u autoradiografsku emulziju (alternativno 
se preparat može prekriti tankim slojem emulzije („stripping film”)).
 
Trajne stani čne linije i limfociti  
Autoradiografske tehnike: stani čne kulture izlažu se ispitivanoj tvari 
tijekom odgovaraju ćeg vremena, nakon čega se tretiraju  3 H-TdR-om. 
Vrijeme tretiranja ovisit će o vrsti tvari, djelovanju metaboli čkih 
sustava i vrsti stanica. Za otkrivanje vrhunca neplanirane sinteze 
DNK (UDS)  3 H-TdR treba dodati ili istodobno s ispitivanom tvari 
ili u roku od nekoliko minuta nakon izlaganja ispitivanoj tvari. Na odabir jednog od ova dva postupka utje ču moguće interakcije 
između ispitivane tvari i
 3 H-TdR. Da bi se mogla razlikovati nepla ­
nirana sinteza DNK (UDS) od semikonzervativne replikacije DNK, ova druga se može inhibirati, na primjer primjenom podloge bez arginina, niskog sadržaja seruma ili pomo ću hidroksiureje u hranjivoj 
podlozi za uzgoj kultura.
 
Mjerenje neplanirane sinteze DNK pomo ću tekućinskog scintilacij ­
skog broja ča (LSC): prije tretiranja ispitivanom tvari treba blokirati 
ulazak stanica u S-fazu, kako je opisano gore; stanice zatim treba 
izložiti ispitivanoj kemikaliji, kako je opisano u slu čaju radiografije. 
Na kraju inkubacije DNK treba ekstrahirati iz stanica i utvrditi njezin ukupni sadržaj, kao i stupanj inkorporacije
 3 H-TdR.  
Treba napomenuti da kod primjene gore opisanih tehnika na ljudske 
limfocite, u nestimuliranim kulturama supresija semikonzervativne 
replikacije DNK nije potrebna.  
Analiza  
A u t o r a d i o g r a f s k a m j e r e n j a  
Pri utvrđivanju neplanirane sinteze DNK (UDS) stanica u kulturi, za 
vrijeme S-faze jezgre se ne broje. Treba prebrojiti najmanje 50 stanica po koncentraciji. Prije brojenja preparate treba kodirati. Na svakom preparatu treba prebrojiti nekoliko široko razmaknutih nepra ­
vilnih polja. Koli činu
 3 H-TdR inkorporiranog u citoplazmu treba 
utvrditi prebrojavanjem triju podru čja veličine jezgre u citoplazmi 
svake prebrojene stanice.  
M j e r e n j e p o m o ć u t e k u ć i n s k o g s c i n t i l a c i j s k o g 
b r o j a č a ( L S C )  
Kod utvr đivanja neplanirane sinteze DNK (UDS) pomo ću tekućin­
skog scintilacijskog broja ča (LSC) pri svakoj koncentraciji treba 
upotrijebiti odgovaraju ći broj kultura.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 368
 
Sve rezultate treba potvrditi nezavisnim pokusima.  
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u obliku tablice.  
2.1. AUTORADIOGRAFSKA MJERENJA  
Stupanj inkorporacije  3 H-TdR u citoplazmi i broj zrnaca na đenih na 
staničnoj jezgri treba zabilježiti posebno.  
Za opis distribucije stupnja inkorporacije  3 H-TdR u citoplazmi i broj 
zrnaca po jezgri mogu se koristiti aritmeti čka sredina, medijana i 
modus.  
2.2. MJERENJE POMO ĆU TEKU ĆINSKOG SCINTILACIJSKOG 
BROJAČA (LSC)  
Kod mjerenja pomo ću tekućinskog scintilacijskog broja ča (LSC) 
inkorporaciju  3 H-TdR treba prikazati kao dpm/ μg DNK. Za opis 
distribucije inkorporacije može se upotrijebiti srednja vrijednost (arit ­
metička sredina) dpm/ μg DNK sa standardnom devijacijom.  
Podatke treba ocjenjivati uz primjenu odgovaraju ćih statisti čkih 
metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljene stanice, gusto ća i broj pasaža u vrijeme tretiranja, 
broj stani čnih kultura,  
— metode korištene za održavanje stani čnih kultura, uklju čujući 
hranjive podloge, temperature i koncentracije CO  2 , 
— ispitivana tvar, nosa č, koncentracije i obrazloženje za odabir 
koncentracija korištenih u pokusu,  
— pojedinosti o sustavima metaboli čke aktivacije,  
— režim tretiranja,  
— pozitivne i negativne kontrole,  
— upotrijebljena autoradiografska tehnika,  
— primijenjeni postupci za blokiranje ulaska stanice u S-fazu,  
— primijenjeni postupci za ekstrakciju i utvr đivanje ukupnog sadr ­ 
žaja DNK pri mjerenju pomo ću tekućinskog scintilacijskog 
brojača (LSC),  
— odnos doza/reakcija, gdje je mogu će, 
— statisti čka procjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 369
 
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 370
 
B.19.  IN VITRO  ANALIZA IZMJENE SESTRINSKIH KROMATIDA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Analiza izmjene sestrinskih kromatida je kratkotrajni test za otkri ­
vanje recipro čnih izmjena DNK izme đu dviju sestrinskih kromatida 
kromosoma koji se udvostru čuju. Izmjena sestrinskih 
kromatida (SCE) predstavlja me đusobnu razmjenu produkata repli ­
kacije DNK na naizgled homolognim lokusima. Pretpostavka je da 
proces izmjene uklju čuje lom i ponovno spajanje DNK, iako se malo 
zna o njegovoj molekularnoj osnovi. Za otkrivanje izmjena sestrin ­
skih kromatida (SCE) potrebno je imati neko sredstvo za diferenci ­
jalno ozna čivanje sestrinskih kromatida, a to se može posti ći inkor­
poracijom bromodeoksiuridina (BrdU) u kromosomsku DNK za dva 
stanična ciklusa.  
Stanice sisavaca izlažu se ispitivanoj kemikaliji  in vitro  sa ili bez 
egzogenog sustava metaboli čke aktivacije za sisavce, ako je primje ­
reno, i kultiviraju dva kruga replikacije u hranjivoj podlozi koja sadrži BrdU. Nakon tretiranja inhibitorom diobenog vretena (npr. 
kolhicinom), da bi se stanice akumulirale u fazi mitoze koja 
izgleda poput metafaze (c-metafaza), stanice se izdvajaju iz kulture i pripremaju se kromosomski preparati.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema  
— u pokusu se mogu upotrijebiti primarne kulture (ljudski limfociti) 
ili trajne stani čne linije (npr. stanice jajnika kineskog hr čka). 
Stanične linije treba provjeriti na eventualnu kontaminaciju 
mikoplazmom,  
— treba primjenjivati odgovaraju će hranjive podloge za uzgoj 
kultura i odgovaraju će uvjete inkubacije (npr. temperatura, 
posude za uzgoj kultura, koncentracije CO  2 i vlažnost zraka),  
— ispitivane tvari mogu se pripremiti u hranjivoj podlozi za uzgoj 
kultura, odnosno otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim nosa­ 
čima prije tretiranja stanica. Kona čna koncentracija nosa ča u 
sustavu kulture ne smije znatno utjecati na sposobnost preživlja ­
vanja ili na rast stanica, a djelovanje na izmjenu sestrinskih 
kromatida (SCE) treba često nadzirati kroz primjenu kontrole 
pomoću otapala,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 371
 
— stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti 
egzogenog sustava metaboli čke aktivacije. Alternativno, kad se 
upotrebljavaju vrste stanica s intrinzi čnom (endogenom) metabo ­
ličkom aktivacijom, stupanj i vrsta aktivnosti trebaju odgovarati 
klasi u koju je svrstana kemikalija koja se ispituje.  
1.6.2.  Uvjeti ispitivanja  
B r o j k u l t u r a  
Za svaku pokusnu to čku treba upotrijebiti najmanje po dvije jednake 
kulture.  
P r i m j e n a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Pozitivne kontrole, kod kojih se koriste i spojevi direktnog djelo ­
vanja i spojevi za koje je potrebna metaboli čka aktivacija, treba 
uključiti u svaki pokus: treba primjenjivati i kontrolu pomo ću 
otapala.  
Slijede primjeri tvari koje se mogu upotrijebiti kao pozitivne 
kontrole.  
— spoj direktnog djelovanja:  
— etilmetansulfonat,  
— spoj indirektnog djelovanja:  
— ciklofosfamid.  
Prema potrebi se može uklju čiti i dodatna pozitivna kontrola svrstana 
u istu klasu opasnosti kao i kemikalija koja se ispituje.  
K o n c e n t r a c i j e i z l a g a n j a  
U odgovaraju ćim vremenskim razmacima treba upotrijebiti najmanje 
tri koncentracije. Najviša koncentracija treba izazvati zna čajan 
toksički učinak, ali ipak mora omogu ćiti odvijanje odgovaraju će 
replikacije stanica. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba 
ispitivati do granice njihove topljivosti, primjenjuju ći odgovaraju će 
postupke. Za netoksi čne ispitivane tvari koje su lako topljive u vodi 
gornje koncentracije treba utvr đivati od slu čaja do slu čaja. 
1.6.3.  Postupak  
P r i p r e m a k u l t u r a  
Trajne stani čne linije dobivaju se iz mati čnih kultura (npr. tripsini ­
zacijom ili otresanjem), nasa đuju se u odgovaraju ćoj gustoći u 
posude za uzgoj kultura i inkubiraju na 37 °C. Kad se radi o jedno ­
slojnim kulturama broj stanica po posudi za uzgoj kultura treba 
prilagoditi tako da kulture u vrijeme izdvajanja stanica ne budu konfluentne za puno više od 50 %. Alternativno se stanice mogu koristiti u suspenzijskoj kulturi. Kulture ljudskih limfocita dobivaju 
se uz primjenu odgovaraju ćih tehnika iz heparinizirane krvi i inku ­
biraju na 37 °C.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 372
 
T r e t i r a n j e  
Stanice u fazi eksponencijalnog rasta izlažu se ispitivanoj tvari 
tijekom odgovaraju ćeg vremenskog razdoblja; u ve ćini slučajeva 
učinkovito je ve ć izlaganje od jednog do dva sata, ali vrijeme izla ­
ganja može se produžiti do trajanja dva kompletna stani čna ciklusa. 
Stanice čija intrinzi čna (endogena) metaboli čka aktivnost nije 
dovoljna treba izložiti ispitivanoj kemikaliji u prisutnosti ili odsut ­
nosti odgovaraju ćeg sustava za metaboli čku aktivaciju. Na kraju 
razdoblja izlaganja ispire se ispitivana tvar sa stanica koje se zatim 
kultiviraju uz prisutnost BrdU-a u trajanju od dva kruga replikacije. Alternativni je postupak da se stanice istodobno izlažu ispitivanoj 
tvari i BrdU-u tijekom cijele kultivacije u trajanju od dva stani čna 
ciklusa.
 
Kulture ljudskih limfocita tretiraju se dok su u polusinkronom stanju.  
Stanice se analiziraju tijekom njihove druge diobe koja slijedi nakon 
tretiranja, s tim da se mora paziti da su stanice bile izložene kemi ­
kaliji u najosjetljivijim fazama stani čnog ciklusa. Svim kulturama 
kojima se dodaje BrdU sve do izdvajanja stanica treba rukovati u 
mraku ili uz prigušeno svjetlo lampi sa žarnom niti, kako bi se fotoliza DNK koja sadrži BrdU svela na minimum.
 
I z d v a j a n j e s t a n i c a  
Stanične kulture tretiraju se inhibitorom diobenog vretena (npr. 
kolhicinom) jedan do četiri sata prije izdvajanja stanica. Iz svake 
se kulture stanice izdvajaju zasebno i obra đuju za pripravu preparata 
kromosoma.  
P r i p r a v a p r e p a r a t a i b o j e n j e k r o m o s o m a  
Preparati kromosoma pripravljaju se uz primjenu standardnih citoge ­
netskih tehnika. Bojenje preparata radi prikaza izmjene sestrinskih 
kromatida (SCE) može se izvesti uz primjenu više tehnika (npr. fluorescencija plus Giemsa metoda).
 
A n a l i z a  
Broj analiziranih stanica temelji se na u čestalosti spontane kontrole 
izmjene sestrinskih kromatida (SCE). Obi čno se na izmjenu sestrin ­
skih kromatida (SCE) analizira najmanje 25 dobro raširenih meta ­
faza. Prije analize se mikroskopski preparati kodiraju. Kod ljudskih 
limfocita analiziraju se samo metafaze koje sadrže 46 centromera. Kod trajnih stani čnih linija analiziraju se samo metafaze koje sadrže 
± 2 centromera. Treba navesti je li centromerna zamjena oznaka 
zabilježena kao izmjena sestrinskih kromatida. Rezultate treba potvr ­
diti nezavisnim pokusom.
 
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u tabli čnom obliku. Za svaku tretiranu i 
kontrolnu kulturu zasebno treba navesti broj izmjena sestrinskih 
kromatida (SCE).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 373
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljene stanice, metode održavanja stani čnih kultura,  
— uvjeti ispitivanja: sastav hranjive podloge, koncentracija CO  2 , 
koncentracija ispitivane tvari, upotrijebljeni nosa č, temperatura 
inkubacije, vrijeme tretiranja, upotrijebljeni inhibitor diobenog 
vretena, njegova koncentracija i vrijeme tretiranja njime, vrsta upotrijebljenog sustava metaboli čke aktivacije, pozitivne i nega ­
tivne kontrole,
 
— broj stani čnih kultura po pokusnoj to čki, 
— pojedinosti o tehnici upotrijebljenoj za pripremu mikroskopskih 
preparata,  
— broj analiziranih metafaza (podaci navedeni zasebno za svaku 
kulturu),  
— srednji broj izmjena sestrinskih kromatida (SCE) po stanici i po 
kromosomu (podaci navedeni zasebno za svaku kulturu),  
— kriteriji za utvr đivanje broja izmjena sestrinskih 
kromatida (SCE),  
— obrazloženje za odabir doze,  
— odnos doze i reakcije, ako je primjereno,  
— statisti čka procjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 374
 
B.20.  TEST SPOLNO UVJETOVANE RECESIVNE SMRTNOSTI 
KOD VINSKE MUŠICE  DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Testom spolno uvjetovane recesivne smrtnosti kod kojeg se koristi 
vinska mušica  Drosophila melanogaster , u zametnoj lozi insekta 
otkriva se pojava mutacija, uklju čujući točkaste mutacije i male 
delecije. Ovaj se test sastoji u analizi naprednih mutacija, koja omogućuje probir na mutacije oko 800 lokusa na kromosomu X; 
oni čine oko 80 % svih lokusa kromosoma X. Kromosom X pred ­
stavlja oko jedne petine čitavog haploidnoga genoma.
 
Mutacije u kromosomu X vinske mušice  Drosophila melanogaster  
fenotipski su izražene kod mužjaka koji nose mutirani gen. Kad je mutacija smrtonosna u hemizigotnom stanju, o njezinoj se prisutnosti 
zaključuje na temelju izostanka jedne fenotipske klase u muškom 
potomstvu, od dvije koje obi čno proizvede heterozigotna ženka. U 
testu spolno uvjetovane recesivne smrtnosti (SLRL) navedene se činjenice koriste kroz primjenu posebno ozna čenih i strukturiranih 
kromosoma.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
M a t i č n e s k u p i n e  
Mogu se upotrijebiti mužjaci iz dobro definiranih mati čnih skupina 
divljeg tipa ili ženke iz mati čnih skupina tipa Muller-5. Mogu se 
upotrijebiti i primjereno ozna čene matične skupine ženki s višestruko 
invertiranim kromosomom X.  
I s p i t i v a n a t v a r  
Ispitivanu tvar treba otopiti u vodi. Tvari koje su netopljive u vodi 
mogu se otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim nosačima (npr. 
mješavina etanola i Tween-60 ili 80) i zatim prije primjene razrijediti 
u vodi ili fiziološkoj otopini. Korištenje dimetilsulfoksida (DMSO) 
kao nosača treba izbjegavati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 375
 
B r o j ž i v o t i n j a  
Test treba osmisliti tako da njegova osjetljivost i snaga budu 
unaprijed odre đene. Učestalost spontanih mutacija koje se opažaju 
u odgovaraju ćim kontrolama snažno će utjecati na broj tretiranih 
kromosoma koje se mora analizirati.  
P u t p r i m j e n e  
Izlaganje može biti oralno, putem injekcije, ili se koristi inhalacijski 
put primjene plinova, ili para. Ispitivana se tvar može davati oralno u šećernoj otopini. Prema potrebi tvari se mogu otopiti u 0,7 %-tnoj 
otopini soli i ubrizgati u toraks (grudni koš) ili abdomen (trbuh).
 
U p o t r e b a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
U test treba uklju čiti negativne (nosa či) i pozitivne kontrole. Me đu­
tim, ako postoje odgovaraju ći laboratorijski kontrolni podaci iz 
ranijih ispitivanja, paralelne kontrole nisu potrebne.  
R a z i n e i z l o ž e n o s t i  
Primjenjuju se tri razine izloženosti. Kod preliminarnog ocjenjivanja 
može se primijeniti jedna razina izloženosti ispitivanoj tvari, s tim da 
se pritom koriste najviša prihvatljiva koncentracija ili koncentracija 
koja već izaziva neke znakove toksi čnosti. Kad su u pitanju neto ­
ksične tvari životinje treba izložiti najvišim koncentracijama koje je 
moguće primijeniti.  
P o s t u p a k  
Mužjaci divljeg tipa (stari tri do pet dana) tretiraju se ispitivanom 
tvari i pojedina čno se pare s brojnim ženkama, koje se prethodno 
nisu parile, iz mati čne skupine Muller-5 ili iz neke druge mati čne 
skupine, primjereno ozna čene (višestruko invertiranim kromosomima 
X). Ženke se svaka dva do tri dana zamjenjuju novim ženkama koje 
se još nisu parile, kako bi se obuhvatio cijeli ciklus zametnih stanica. 
Kod potomaka tih ženki bilježe se smrtonosni u činci koji odgovaraju 
učincima na zreloj spermi, spermatidima srednje ili zadnje faze, 
ranim spermatidima, spermatocitima i spermatogonijima u vrijeme 
tretiranja.  
Heterozigotnim ženkama F  1 dobivenim gore navedenim križanjem 
omogući se pojedina čno parenje (tj. jedna ženka po bo čici (fijali)) 
s njihovom bra ćom. U generaciji F  2 kod svake se kulture bilježi 
odsutnost mužjaka divljeg tipa. Ako se čini da kultura potje če od 
ženke F  1 koja u roditeljskom kromosomu X nosi smrtonosni gen (tj. 
ne opaža se nijedan mužjak s tretiranim kromosomom), k ćeri te 
ženke s istim genotipom treba testirati kako bi se utvrdilo ponavlja 
li se smrtnost u sljede ćoj generaciji.  
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u obliku tablice u kojoj će biti naveden broj 
testiranih kromosoma X, broj sterilnih mužjaka i broj smrtonosnih kromosoma pri svakoj koncentraciji izlaganja i to za svako razdoblje parenja svakog tretiranog mužjaka. Treba navesti i broj klastera 
(skupina) razli čitih veličina po mužjaku. Predmetne rezultate treba 
potvrditi zasebnim pokusom.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 376
 
Kod ocjenjivanja testa spolno uvjetovane recesivne smrtnosti treba 
primjenjivati odgovaraju će statističke metode. Statisti čki treba anali ­
zirati i ocijeniti nakupljanje recesivnih smrtonosnih gena koji potje ču 
od jednog mužjaka.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— matične skupine: korištene mati čne skupine, odnosno sojevi 
mušice  Drosophila , dob insekata, broj tretiranih mužjaka, broj 
sterilnih mužjaka, broj utvr đenih F2 kultura, broj F2 kultura 
bez potomstva, broj kromosoma koji nose smrtonosne gene 
opažene u svakom stadiju zametne stanice,  
— kriteriji za utvr đivanje veli čine tretiranih skupina,  
— uvjeti ispitivanja, detaljan režim tretiranja i uzorkovanja, razine 
izlaganja, podaci o toksi čnosti, negativne (otapalo) i pozitivne 
kontrole, ovisno o slu čaju, 
— kriteriji za bilježenje smrtonosnih mutacija,  
— odnos izloženosti i u činaka, gdje je mogu će, 
— ocjenjivanje podataka,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 377
 
B.21.  IN VITRO  TESTOVI TRANSFORMACIJA STANICA 
SISAVACA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Sustavi kultura stanica sisavaca mogu se koristiti za otkrivanje feno ­
tipskih promjena  in vitro  izazvanih kemijskim tvarima koje su pove ­
zane s malignim transformacijama  in vivo . Najčešće se koriste 
stanice C3H10T  1/2 , 3T3, SHE, te stanice štakora soja Fischer, a 
testovi se temelje na promjenama u stani čnoj morfologiji, formiranju 
fokusa (guste nakupine stanica koje su izgubile kontaktnu inhibiciju) 
ili promjenama u ovisnosti rasta stanica o tvrdoj podlozi za prihva ­ 
ćanje u polukrutom agaru (u kojem ina če ne bi rasle). Nijedan od 
konačnih učinaka  in vitro  testa nema utvr đenu mehanisti čku vezu s 
karcinomom. Neki od ispitnih sustava mogu otkriti promotore 
tumora. Citotoksi čnost se može utvrditi mjerenjem u činka ispitnog 
materijala na sposobnost stvaranja kolonija (u činkovitost kloniranja) 
ili na brzinu rasta kultura. Mjerenjem citotoksi čnosti treba utvrditi je 
li izlaganje ispitivanoj kemikaliji bilo toksikološki relevantno, ali se 
ono ne može upotrijebiti za izra čunavanje transformacije u čestalosti 
kod svih analiza s obzirom da neke od njih mogu uklju čivati produ ­ 
ženu inkubaciju i/ili ponovno nasa đivanje na agarne plo če. 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
S t a n i c e  
Ovisno o testu transformacije koji se provodi, raspoloživ je čitav niz 
različitih stani čnih linija ili primarnih stanica. Ispitiva č se mora 
pobrinuti da u testu koji se obavlja stanice pokažu odgovaraju će 
fenotipske promjene nakon izlaganja poznatim karcinogenima i da 
za valjanost i pouzdanost testa koji se provodi u laboratoriju ispiti ­
vača postoje dokumentirani dokazi.  
H r a n j i v a p o d l o g a  
Treba primjenjivati hranjive podloge i pokusne uvjete koji odgova ­
raju analizi transformacija koja se primjenjuje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 378
 
I s p i t i v a n a t v a r  
Ispitivane tvari mogu se pripremiti u hranjivoj podlozi za uzgoj 
kultura, odnosno otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim nosačima 
prije tretiranja stanica. Kona čna koncentracija nosa ča u sustavu 
kulture ne smije utjecati na sposobnost preživljavanja stanica, 
brzinu rasta ili pojavu transformacija.  
M e t a b o l i č k a a k t i v a c i j a  
Stanice treba izlagati ispitivanoj tvari u prisutnosti i u odsutnosti 
odgovaraju ćeg sustava metaboli čke aktivacije. Alternativno, u slu ča­
jevima korištenja stani čnih tipova s endogenom (intrinzi čnom) meta ­
boličkom aktivnoš ću unaprijed treba biti poznato da ta aktivnost po 
svojoj prirodi odgovara klasi opasnosti u koju je svrstana kemikalija koja se ispituje.
 
Uvjeti ispitivanja  
P r i m j e n a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
U svaki pokus treba uklju čiti pozitivne kontrole uz primjenu spojeva 
izravnog djelovanja, kao i spojeva kojima je potrebna metaboli čka 
aktivacija; isto tako treba primjenjivati i negativne kontrole (nosa č). 
Slijede primjeri tvari koje se mogu upotrijebiti kao pozitivne 
kontrole:  
— Kemikalije izravnog djelovanja:  
— etilmetansulfonat.  
— β-propiolakton,  
— Spojevi koji zahtijevaju metaboli čku aktivaciju:  
— 2-acetilaminofluoren,  
— 4-dimetilaminoazobenzen,  
— 7,12-dimetilbenzantracen.  
Prema potrebi u ispitivanje treba uklju čiti dodatnu pozitivnu kontrolu 
svrstanu u istu klasu kemikalija kao i spoj koji se ispituje.  
K o n c e n t r a c i j e i z l a g a n j a  
Treba upotrijebiti nekoliko koncentracija ispitivane tvari. Navedene 
koncentracije trebaju prouzro čiti toksički učinak razmjeran koncen ­
traciji, pri čemu će pri najvišoj koncentraciji razina preživljavanja 
biti niska, dok će preživljavanje kod najniže koncentracije biti otpri ­
like jednako onome koje izaziva negativna kontrola. Tvari koje su relativno netopljive u vodi treba ispitivati do granice njihove toplji ­
vosti, primjenjuju ći odgovaraju će postupke. Za netoksi čne tvari koje 
su lako topljive u vodi gornje koncentracije treba utvr đivati od 
slučaja do slu čaja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 379
 
Postupak  
Stanice se izlažu ispitivanoj tvari tijekom odgovaraju ćeg vremenskog 
razdoblja, ovisno o ispitnom sustavu koji se primjenjuje, što u slučaju produženog izlaganja može uklju čivati i ponovljeno doziranje 
uz promjenu hranjive podloge (te, ako je potrebno, svježu mješavinu 
za metaboli čku aktivaciju). Stanice bez dovoljne endogene (intrinzi ­ 
čne) metaboli čke aktivnosti treba izlagati ispitivanoj tvari u prisut ­
nosti i odsutnosti odgovaraju ćeg sustava metaboli čke aktivacije. Po 
završetku razdoblja izlaganja stanice se ispiru radi uklanjanja osta ­
taka ispitivane tvari i kultiviraju u uvjetima koji pogoduju pojavlji ­
vanju transformiranog fenotipa koji se promatra, te se utvr đuje 
pojava transformacija. Svi se rezultati potvr đuju nezavisnim 
pokusom.
 
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u obliku tablice, što se može u činiti na više 
načina ovisno o provedenom ispitivanju, na primjer, može se navesti 
ukupan broj stanica, broj pozitivnih agarnih plo ča, ili broj transfor ­
miranih stanica. Tamo gdje je to primjereno, razina preživljavanja 
iskazuje se u obliku postotka kontrolnih razina, a u čestalost trans ­
formacija kao broj transformanata (transformiranih stanica) u odnosu na broj preživjelih stanica. Podatke treba ocijeniti uz primjenu odgo ­
varajućih statisti čkih metoda.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljena vrsta stanica, broj stani čnih kultura, metode održa ­
vanja stani čnih kultura,  
— uvjeti ispitivanja: koncentracija ispitivane tvari, upotrijebljeni 
nosač, vrijeme inkubacije, trajanje i u čestalost tretiranja, 
gustoća stanica tijekom tretiranja, vrsta upotrijebljenog egzo ­
genog sustava metaboli čke aktivacije, pozitivne i negativne 
kontrole, detaljan opis promatranog fenotipa, upotrijebljeni selek ­
tivni sustav (ovisno o slu čaju), obrazloženje za odabir doze,  
— metoda upotrijebljena za brojenje živih i transformiranih stanica,  
— statisti čka ocjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 380
 
B.22.  TEST DOMINANTNIH LETALNIH GENA NA GLODAVCIMA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Učinci dominantnih letalnih gena uzrokuju embrionalnu ili fetalnu 
smrt. Indukcija dominantnih letalnih gena izlaganjem kemijskoj tvari 
ukazuje na činjenicu da je tvar djelovala na zametno tkivo ispitivane 
životinjske vrste. Op ćenito je prihva ćeno mišljenje da su dominantni 
letalni geni posljedica kromosomskih ošte ćenja (strukturnih i nume ­
ričkih anomalija). Isto tako, ako se tretiraju ženke, toksi čki učinci 
mogu dovesti do embrionalne smrti.  
Obično se životinje muškog roda izlažu djelovanju ispitivanog spoja 
te se pare s netretiranim ženkama koje se prethodno nisu parile. 
Različite stadije zametnih stanica može se odvojeno ispitati 
primjenom uzastopnih intervala parenja. Pove ćanje broja mrtvih 
implanata po ženki u tretiranoj skupini u odnosu na broj mrtvih implanata po ženki u kontrolnoj skupini odražava postimplantacijski 
gubitak. Predimplantacijski gubitak može se procijeniti na temelju 
broja žutih tijela ili usporedbom ukupnog broja implanata po ženki u kontrolnoj i tretiranoj skupini. Ukupni u činak dominantnih letalnih 
gena predstavlja zbroj pred- i post- implantacijskoga gubitka. Izra čun 
ukupnog u činka dominantnih letalnih gena temelji se na usporedbi 
živih implanata po ženki u ispitnoj skupini i živih implanata po ženki u kontrolnoj skupini. Smanjenje broja implanata u odre đenim 
vremenskim razmacima može biti posljedica ubijanja stanica (tj. 
spermatocita i/ili spermatogonija).
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Kada je mogu će, ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u izoto ­
ničnoj fiziološkoj otopini. Kemikalije netopljive u vodi mogu se 
otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim nosačima. Nosa č koji se 
koristi ne smije utjecati na djelovanje ispitivane kemikalije, niti izazi ­
vati toksi čne učinke. Treba koristiti svježe pripravke ispitivane 
kemikalije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 381
 
Uvjeti ispitivanja  
P u t p r i m j e n e  
Ispitivani se spoj op ćenito primjenjuje samo jednom. Na temelju 
toksikoloških informacija može se primijeniti režim ponavljanog tretiranja. Uobi čajeni putevi primjene su oralna intubacija ili intrape ­
ritonealna injekcija. Prikladni mogu biti i drugi putevi primjene.
 
P o k u s n e ž i v o t i n j e  
Za pokusne životinje se kao vrsta preporu čuju štakori i miševi. 
Zdrave i potpuno spolno zrele životinje nasumce se biraju i raspo ­
ređuju u skupine predvi đene za tretiranje, odnosno kontrolu.  
B r o j i s p o l  
Treba koristiti odgovaraju ći broj tretiranih mužjaka, pri čemu treba 
uzeti u obzir spontano variranje bioloških svojstava koja se ocje ­
njuju. Odabrani broj trebao bi se temeljiti na unaprijed utvr đenoj 
osjetljivosti detekcije i snazi testa koji će proizvesti u činke od stati ­
stičkog značaja. Na primjer, kod tipi čnog testa broj mužjaka u svakoj 
skupini koja prima odre đenu dozu trebao bi biti dovoljan da osigura 
između 30 i 50 gravidnih ženki po intervalu parenja.  
P r i m j e n a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Općenito u svaki pokus treba uklju čiti paralelne pozitivne i negativne 
(nosač) kontrole. Kad postoje prihvatljivi rezultati pozitivne kontrole, 
dobiveni nedavno obavljenim pokusima u istom laboratoriju, ti se rezultati mogu upotrijebiti umjesto paralelne pozitivne kontrole. Tvari pozitivne kontrole trebale bi se koristiti u odgovaraju ćoj 
niskoj dozi (npr. MMS, intraperitonealno pri 10 mg/kilogram), da 
bi se dokazala osjetljivost ispitivanja.
 
V i s i n e d o z a  
Obično se koriste tri visine doza. Visoka doza treba dovesti do 
pojave znakova toksi čnosti ili smanjene plodnosti kod tretiranih 
životinja. U nekim slu čajevima može biti dovoljna samo jedna 
razina doziranja.  
G r a n i č n i t e s t  
Netoksične tvari treba ispitati pri koncentraciji od 5 g/kilogram 
nakon jednog doziranja ili pri koncentraciji od 1 g/kilogram/dan 
nakon ponovljenog doziranja.  
Postupak  
Postoji više vremenskih režima tretiranja. Naj češće se primjenjuje 
jednokratno doziranje ispitivane tvari. Mogu ća je i primjena ostalih 
vremenskih režima.  
Svaki se mužjak u odgovaraju ćim vremenskim razmacima po treti ­
ranju uzastopno pari s jednom ili dvije netretirane ženke koje se prethodno nisu parile. Ženke treba ostaviti s mužjacima barem tijekom jednog estrusnog ciklusa ili dok ne do đe do parenja, što 
se utvrđuje na temelju prisutnosti sperme u vagini ili na temelju 
prisutnosti vaginalnog čepa.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 382
 
Broj parenja nakon tretiranja ovisi o režimu tretiranja i trebao bi biti 
dovoljan da se uzmu uzorci zametnih stanica u svim stadijima 
staničnog ciklusa koji slijede iza tretiranja.  
U drugoj polovini gravidnosti ženke se usmr ćuju i pregledava se 
sadržaj maternice kako bi se utvrdio broj mrtvih i živih implanata. Mogu se pregledati jajnici kako bi se utvrdio broj žutih tijela.
 
2. PODACI  
Podatke treba prikazati u obliku tablice iz koje se može vidjeti broj 
mužjaka, broj gravidnih ženki i broj negravidnih ženki. Rezultate 
svakog parenja, uklju čujući identifikacijsku oznaku svakog 
mužjaka i ženke, treba bilježiti pojedina čno. Za svaku ženku treba 
zabilježiti tjedan u kojemu je došlo do parenja, visinu doze koju su 
primili mužjaci, kao i u čestalost pojave živih i mrtvih implanata.  
Izračun ukupnog u činka dominantnih letalnih gena temelji se na 
usporedbi živih implanata po ženki u tretiranoj skupini sa živim implantima po ženki u kontrolnoj skupini. Analizira se omjer 
mrtvih i živih implanata iz tretirane skupine u usporedbi s istim 
omjerom u kontrolnoj skupini kako bi se utvrdio postimplantacijski gubitak.
 
Ako se zabilježeni podaci odnose na slu čajeve rane i kasne smrti, iz 
tablica to treba biti jasno vidljivo. Ako su procijenjeni gubici prije 
implantacije, treba ih zabilježiti. Predimplantacijski gubitak može se izračunati kao razlika izme đu broja žutih tijela i broja implanata, ili 
kao smanjenje prosje čnog broja implanata po maternici u usporedbi s 
brojem implanata dobivenih parenjima u kontrolnoj skupini.
 
Podaci se ocjenjuju uz primjenu odgovaraju ćih statisti čkih metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— upotrijebljeni soj, starost i tjelesna masa upotrijebljenih životinja, 
broj životinja svakog spola u pokusnim i kontrolnim skupinama,  
— ispitivana tvar, nosa č, ispitivane visine doza i obrazloženje za 
njihov odabir, negativne i pozitivne kontrole, podaci o toksi čno­
sti, 
— put primjene i vremenski režim tretiranja,  
— vremenski režim parenja,  
— metoda korištena da bi se utvrdilo da je došlo do parenja,  
— vrijeme usmr ćivanja,  
— kriteriji za utvr đivanje dominantnih letalnih gena  
— odnos doze i reakcije, ako je primjereno,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 383
 
— statisti čka ocjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 384
 
B.23.  TEST KROMOSOMSKIH ABERACIJA U 
SPERMATOGONIJIMA SISAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 483, Mammalian Sper ­
matogonial Chromosome Aberration Test (1997) (Test kromosom ­
skih aberacija na spermatogonijima sisavaca (1997.))  
1.1. UVOD  
Svrha je  in vivo  testa kromosomskih aberacija u spermatogonijima 
sisavaca utvrditi tvari koje uzrokuju strukturne kromosomske abera ­
cije u stanicama spermatogonija sisavaca (1)(2)(3)(4)(5). Razliku ­
jemo dva tipa strukturnih kromosomskih aberacija, kromosomski i kromatidni. Ve ćina kemijskih mutagena uzrokuje aberacije kroma ­
tidnog tipa, ali dolazi i do pojave aberacija kromosomskog tipa. 
Predmetna metoda nije namijenjena mjerenju numeri čkih aberacija 
i obično se u tu svrhu ne upotrebljava. Kromosomske mutacije i s 
njima povezane pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja kod ljudi.
 
Ovim se testom mjere kromosomske pojave u zametnim stanicama 
spermatogonija te se o čekuje da se tim testom može predvidjeti 
indukcija nasljednih mutacija u zametnim stanicama.  
Za ovaj se test obi čno koriste glodavci. Ovim se  in vivo  citoge­
netskim testom otkrivaju kromosomske aberacije pri mitozi sperma ­
togonija. Ostale ciljne stanice nisu predmet ove metode.  
Kako bi se moglo otkriti aberacije kromatidnog tipa u stanicama 
spermatogonija treba ispitati prvu mitotsku diobu stanica nakon treti ­
ranja, prije nego se nastale lezije izgube u kasnijim stani čnim 
diobama. Dodatne informacije o tretiranim mati čnim stanicama sper ­
matogonija mogu se dobiti analizom aberacija kromosomskog tipa 
kod kromosoma tijekom mejoze u dijakinezi-metafazi I, kada treti ­
rane stanice postaju spermatociti.  
Svrha je ovog  in vivo  testa ispitati jesu li mutageni somatskih stanica 
aktivni i u zametnim stanicama. Osim toga, ovaj test na spermato ­
gonijima relevantan je za ocjenjivanje rizika od mutagenosti, zato što omogućuje razmatranje faktora metabolizma, farmakokinetike i 
procesa popravka DNA  in vivo .
 
U testisu se nalaze brojne generacije spermatogonija razli čito osje­
tljivih na tretiranje kemikalijama. Prema tome, opažene aberacije 
predstavljaju skupnu reakciju tretiranih stani čnih populacija sperma ­
togonija, pri čemu prevladavaju brojnije diferencirane stanice sper ­
matogonija. Uslijed fizi čke i fiziološke barijere Sertolijevih stanica i 
barijere izme đu krvi i testisa, razli čite generacije spermatogonija 
mogu ili ne moraju biti izložene glavnom krvotoku, ovisno o 
njihovom položaju unutar testisa.  
Ako postoje dokazi da ispitivana tvar ili reaktivni metabolit ne će 
stići do ciljnog tkiva, ovaj oblik ispitivanja nije primjeren.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 385
 
1.2. DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma izra ­ 
ženo kao lom pojedina čnih kromatida ili lom i ponovno spajanje 
kromatida.  
Aberacija kromosomskog tipa:  strukturno ošte ćenje kromosoma 
izraženo kao lom ili lom i ponovno spajanje obiju kromatida na istom mjestu.
 
Prekid (tijesni spoj):  akromatska lezija manja od širine jedne 
kromatide i s minimalnim otklonom (neporavnatoš ću) kromatida.  
Numerička aberacija:  promjena u broju kromosoma u odnosu na 
normalni broj koji je karakteristi čan za korištene stanice.  
Poliploidnost:  višekratnik haploidnog broja kromosoma ( n) osim 
diploidnog broja (tj. 3 n, 4n itd.).  
Strukturne aberacije:  promjene u strukturi kromosoma koje se 
mogu otkriti mikroskopskim pregledom podjele stanica u metafazi, 
a opažaju se kao delecije (intrakromosomske), inverzije (intrakromo ­
somske), ili translokacije (interkromosomske).  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Životinje se na odgovaraju ći način izlažu ispitivanoj tvari te se u 
odgovaraju će vrijeme nakon tretiranja usmr ćuju. Prije usmr ćivanja, 
životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. Colce ­
midom® ili kolhicinom). Nakon toga naprave se i oboje preparati 
zametnih stanica, te se analizom utvr đuje je li došlo do kromosom ­
skih aberacija metafaznih stanica.  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema  
1.4.1.1.  Odabir životinjske vrste  
Obično se koriste kineski hr čci. Međutim, mogu se koristiti i druge 
odgovaraju će vrste sisavaca. Treba koristiti mlade zdrave odrasle 
životinje sojeva koji su uobi čajeni u laboratorijskoj praksi. Na 
početku studije variranje tjelesne mase životinja treba biti što 
manje i ne smije prelaziti ± 20 % srednje vrijednosti mase.  
1.4.1.2.  Uvjeti držanja i prehrana  
Primjenjuju se op ći uvjeti iz Op ćeg uvoda u dijelu B, iako ciljna 
vlažnost zraka treba biti 50-60 %.  
1.4.1.3.  Priprema životinja  
Zdrave mlade odrasle životinje nasumce se raspore đuju u kontrolne 
skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba razmjestiti tako da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog njihovog položaja svedu na 
minimum. Životinje se ozna čivaju jedinstvenim oznakama. Životinje 
se prilago đavaju laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana prije 
početka studije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 386
 
1.4.1.4.  Priprema doza  
Krute ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim 
otapalima ili nosa čima i prije doziranja životinjama prema potrebi 
razrijediti. Teku će ispitivane tvari mogu se dozirati izravno i/ili ih se 
prije obrade može razrijediti. Treba koristiti svježe pripravke ispiti ­
vane tvari, osim u slu čajevima kad podaci o stabilnosti pokazuju da 
ih je prihvatljivo pohraniti.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/nosa č 
Otapalo/nosa č ne smije proizvesti toksi čke učinke pri upotrijebljenim 
visinama doza i ne smije postojati sumnja da će kemijski reagirati s 
ispitivanom tvari. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/nosa či, 
njihovo bi uklju čivanje u ispitivanje trebalo biti potkrijepljeno poda ­
cima iz kojih je vidljivo da su prikladni. Kad god je to mogu će, 
preporučuje se najprije razmotriti mogu ćnost primjene vodenog 
otapala/nosa ča. 
1.4.2.2.  Kontrole  
U svaki test treba uklju čiti istovremene pozitivne i negativne 
kontrole (otapalo/nosa č). Izuzimaju ći tretiranje ispitivanom tvari, sa 
životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama u tretiranim skupinama.
 
Pozitivne kontrole trebale bi uzrokovati nastanak strukturnih abera ­
cija in vivo  u stanicama spermatogonija pri razinama izlaganja kod 
kojih se o čekuje pove ćanje koje je vidljivo u odnosu na podlogu.  
Doze pozitivnih kontrola treba odabrati tako da u činci budu jasni, ali 
da osoba koja o čitava rezultate ne može odmah vidjeti identitet 
kodiranih mikroskopskih preparata. Prihvatljivo je kontrole dozirati 
nekim drugim putem primjene, razli čitim od puta primjene ispitivane 
tvari, te ih uzorkovati samo jednom. Osim toga, može se razmotriti korištenje kemikalija za pozitivnu kontrolu koje spadaju u istu klasu opasnosti kao i ispitivana tvar, ako su takve kemikalije raspoložive. 
Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhva ćaju:
 
Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat  50-18-0 
6055-19-2  200-015-4  
Cikloheksamin  108-91-8  203-629-0  
Mitomicin C  50-07-7  200-008-6  
Monomerni akrilamid  79-06-1  201-173-7  
Trietilenmelamin  51-18-3  200-083-5  
Kod svakog uzorkovanja treba upotrijebiti negativne kontrolne 
skupine tretirane samo otapalom ili nosa čem, sa kojima se ina če 
postupa jednako kao i s tretiranim skupinama, osim kad podaci iz 
prijašnjih studija dokazuju da me đu životinjama postoji prihvatljiva 
varijabilnost i u čestalost pojave stanica s kromosomskim aberaci ­
jama. Dodatno treba upotrijebiti i netretirane kontrolne skupine, 
osim ako postoje podaci iz ranijih studija koji dokazuju da odabrano 
otapalo/nosa č ne izaziva nikakve štetne niti mutagene u činke. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 387
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Broj životinja  
U svakoj tretiranoj i kontrolnoj skupina mora biti barem 5 mužjaka 
na kojima je mogu će obaviti analizu.  
1.5.2.  Režim tretiranja  
Ispitivanu tvar najbolje je primijeniti jednom ili dvaput (tj. kao jedno 
ili dva tretiranja). Isto se tako ispitivana tvar može primijeniti kao podijeljena doza, odnosno doza koja se primjenjuje u dva puta 
tijekom istog dana u razmaku od najviše nekoliko sati, kako bi se 
olakšala primjena velike koli čine materijala. Za druge režime dozi ­
ranja treba postojati znanstveno opravdanje.
 
Kod skupine na koju se primjenjuje najviša doza uzorci se uzimaju 
dvaput nakon tretiranja. S obzirom da ispitivana tvar može utjecati 
na kinetiku stani čnog ciklusa, jedno se uzorkovanje obavlja ranije, 
oko 24 sata nakon tretiranja, a jedno kasnije, oko 48 sati nakon 
tretiranja. Kod ostalih doza uzorke treba uzeti nakon tretiranja po 
isteku 24 sata ili vremena koje odgovara 1,5 dužini stani čnog 
ciklusa, osim ako je poznato da bi drugo vrijeme uzorkovanja bilo prikladnije za otkrivanje u činaka (6).
 
Mogu se uzeti i dodatni uzorci u neko drugo vrijeme. Na primjer, 
kad su u pitanju kemikalije koje mogu uzrokovati zaostajanje kromo ­
soma ili u činke neovisne o S-fazi, uzorkovanje bi bilo primjerenije 
obaviti ranije (1).  
Primjerenost režima ponavljanog tretiranja treba utvrditi za svaki 
slučaj posebno. Ako se slijedi režim ponavljanog tretiranja, životinje 
treba usmrtiti 24 sata nakon posljednjeg tretiranja (nakon vremena koje odgovara 1,5 dužini stani čnog ciklusa). Prema potrebi mogu se 
uzeti i dodatni uzorci u neko drugo vrijeme.
 
Prije usmr ćivanja životinjama se intraperitonealno ubrizgava odgo ­
varajuća doza tvari za zaustavljanje metafaze (npr. Colcemid  ® ili 
kolhicin). Zatim se nakon odgovaraju ćeg vremena životinje podvrga ­
vaju uzorkovanju. Za miševe navedeni interval iznosi otprilike 3-5 
sati, a za kineske hr čke otprilike 4-5 sati.  
1.5.3.  Visine doza  
Ako se obavlja studija za utvr đivanje raspona jer nema prikladnih 
podataka, treba je obaviti u istom laboratoriju, na istoj životinjskoj vrsti i soju te uz isti režim tretiranja, koji će se koristiti u glavnoj 
studiji (7). Ako toksi čnost postoji, za prvo uzorkovanje koriste se tri 
visine doza. Te bi doze trebale obuhvatiti raspon od maksimalne do male ili nikakve toksi čnosti. Za kasnije uzorkovanje treba upotrijebiti 
samo najvišu dozu. Najviša se doza definira kao doza koja uzrokuje 
takve simptome toksi čnosti da je za o čekivati da bi više doze uz isti 
režim doziranja prouzro čile smrt životinje.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 388
 
Tvari specifi čnog biološkog djelovanja u malenim netoksi čnim 
dozama (poput hormona i mitogena) mogu biti izuzete od kriterija 
za utvrđivanje doza te ih treba ocjenjivati od slu čaja do slu čaja. 
Najviša se doza tako đer može definirati kao doza pri kojoj se javljaju 
znakovi toksi čnosti u stanicama spermatogonija (npr. smanjenje 
omjera izme đu mitoza spermatogonija u prvoj i drugoj mejotskoj 
metafazi; navedeno smanjenje ne bi smjelo premašiti 50 %).  
1.5.4.  Grani čni test  
Ako test pri jednoj visini doze od najmanje 2 000 mg/kg tjelesne 
mase/dan, koja se primijeni odjednom ili u dva puta tijekom istog dana, ne proizvede vidljive toksi čke učinke i ako se na temelju 
podataka o strukturno srodnim tvarima genotoksi čnost ne o čekuje, 
potpuna studija uz primjenu tri visine doza može se smatrati nepo ­
trebnom. O čekivana ljudska izloženost može ukazati na potrebu za 
primjenom viših doza u grani čnom testu.
 
1.5.5.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar obi čno primjenjuje oralnom intubacijom pomo ću 
želučane sonde, ili odgovaraju će intubacijske kanile, ili intraperito ­
nealnom injekcijom. Ostali putevi izlaganja mogu biti prihvatljivi u slučajevima kad se može dokazati njihova opravdanost. Maksimalni 
volumen teku ćine koji se odjednom može unijeti u životinju bilo 
intubacijom ili putem injekcije ovisi o veli čini pokusne životinje. 
Taj volumen ne smije biti ve ći od 2 ml/100 g tjelesne mase. Za 
primjenu volumena ve ćih od ovog treba navesti opravdani razlog. 
Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih tvari, koje pri višim koncen ­
tracijama odmah izazivaju pogoršanje, variranje ispitnih volumena 
treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doza osigurao stalni volumen.
 
1.5.6.  Kromosomski preparat  
Odmah po usmr ćivanju životinje napravi se suspenzija stanica iz 
jednog ili oba testisa, koja se izlaže hipotoni čkoj otopini i fiksira. 
Zatim se stanice razmažu po mikroskopskom stakalcu i oboje.  
1.5.7.  Analiza  
Za svaku životinju treba analizirati najmanje 100 dobro vidljivih 
metafaza (tj. najmanje 500 metafaza po skupini). Ako se opazi visoki broj aberacija taj se broj može smanjiti. Sve preparate, uklju ­ 
čujući i preparate pozitivnih i negativnih kontrola, treba prije mikro ­
skopske analize nezavisno kodirati. Budu ći da postupak fiksiranja 
često za posljedicu imaju lom jednog dijela metafaza uz gubitak 
kromosoma, stanice koje se o čitavaju moraju sadržavati broj centro ­
mera jednak broju 2n ± 2.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Podatke o pojedina čnim životinjama treba prikazati u obliku tablice. 
Pokusna jedinica je životinja. Za svaku životinju treba odrediti broj 
stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama i broj kromosom ­
skih aberacija po stanici. Treba navesti razli čite vrste strukturnih 
kromosomskih aberacija zajedno s njihovim brojem i u čestalošću 
za tretirane i kontrolne skupine. Kromosomski se prekidi bilježe 
odvojeno i navode u izvješ ću, ali se op ćenito ne uklju čuju u 
ukupnu u čestalost aberacija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 389
 
Ako se promatra i mitoza i mejoza, treba kod spermatogonija utvrditi 
omjer mitoza u odnosu na metafaze prve i druge mejotske diobe, kao 
mjerilo citotoksi čnosti za sve tretirane životinje i životinje negativne 
kontrole, na ukupnom uzorku od 100 stanica u fazi diobe po životi ­
nji, radi utvr đivanja mogu ćih citotoksi čkih učinaka. Ako se promatra 
samo mitoza, potrebno je utvrditi mitotski indeks u barem 1 000 
stanica za svaku životinju.  
2.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnih rezultata, kao na 
primjer porast relativnog broja stanica s kromosomskim aberacijama povezan s visinom doze, ili jasni porast broja stanica s aberacijama kod primjene jedne doze, utvr đen jednim uzorkovanjem. Najprije 
treba razmotriti biološku relevantnost rezultata. Statisti čke metode 
mogu se primijeniti kao pomo ćno sredstvo za ocjenjivanje rezultata 
ispitivanja (6). Kod utvr đivanja pozitivne reakcije statisti čki značaj 
ne bi trebao biti jedini odlu čujući faktor. Dvosmislene rezultate treba 
pojasniti daljnjim ispitivanjima, najbolje u modificiranim uvjetima 
izvođenja pokusa.
 
Kod ovog se testa smatra da ispitivana tvar kod koje rezultati ne 
udovoljavaju gore navedenim kriterijima nije mutagena.  
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima dobiveni podaci ne će omogućiti donošenje defi ­
nitivne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Rezultati mogu ostati dvosmisleni ili upitni bez obzira na to koliko se puta pokus ponavlja.
 
Pozitivni rezultati  in vivo  testa kromosomskih aberacija u spermato ­
gonijima pokazuju da ispitivana tvar uzrokuje strukturne kromo ­
somske aberacije u zametnim stanicama pokusne vrste. Negativni rezultati pokazuju da u pokusnim uvjetima ispitivana tvar ne 
izaziva kromosomske aberacije u zametnim stanicama pokusne vrste.
 
Treba raspraviti je li vjerojatno da će ispitivana tvar ili njeni meta ­
boliti doprijeti do ciljnog tkiva.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora obuhva ćati sljedeće informacije:  
otapalo/nosa č: 
— obrazloženje za odabir otapala,  
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako su 
poznate.  
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja, 
uključujući raspon tjelesnih masa, srednju i standardnu devijaciju 
za svaku skupinu.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 390
 
Uvjeti ispitivanja:  
— podaci iz studije za utvr đivanje raspona, ako je obavljena,  
— obrazloženje za odabir visina doza,  
— obrazloženje za odabir puta primjene,  
— pojedinosti o pripravljanju ispitivane tvari,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— logička osnova po kojoj se utvr đuje vrijeme usmr ćivanja životi ­
nja, 
— način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), ako je 
primjereno,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
— detaljan opis režima tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— naziv (identifikacijska oznaka) tvari za zaustavljanje metafaze, 
njezina koncentracija i trajanje primjene,  
— metode pripreme mikroskopskih preparata,  
— kriteriji za utvr đivanje broja aberacija,  
— broj analiziranih stanica po životinji,  
— kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom 
ili dvosmislenom.  
Rezultati:  
— znakovi toksi čnosti,  
— mitotski indeks,  
— omjer stanica spermatogonija u mitozi i prvoj i drugoj mejotskoj 
metafazi,  
— vrsta i broj aberacija, navedeni za svaku životinju zasebno,  
— ukupan broj aberacija po skupini,  
— broj stanica s aberacijama po skupini,  
— odnos doze i reakcije, ako je mogu će, 
— statisti čke analize, ako su ra đene, 
— podaci o paralelnim negativnim kontrolama,  
— podaci o negativnim kontrolama iz prijašnjih ispitivanja, s raspo ­
nima, srednjim vrijednostima i standardnim devijacijama,  
— podaci o istovremenim pozitivnim kontrolama,  
— promjene u ploidnosti, ako su uo čene. 
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 391
 
4. REFERENCE  
(1) Adler, I.D., (1986) Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., 
Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, str. 477- 484.
 
(2) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. 
Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, str. 275-306.  
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964) An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, str. 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L., (1990)  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115-141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y., (1978) A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. 
Mutation Res., 52, str. 207-209.  
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N., (1994) International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, str. 313-318.
 
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992) Report of 
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 313-319.
 
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
str. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 392
 
B.24.  TEST POJAVE MRLJA U MIŠEVA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ovo je  in vivo  test na miševima kod kojega se embriji u razvoju 
izlažu kemikalijama. Ciljne stanice u embrijima u razvoju su mela ­
noblasti, dok su ciljni geni oni koji kontroliraju pigmentaciju dlake krzna. Embriji u razvoju su heterozigotni zbog odre đenog broja ovih 
gena koji uvjetuju boju krzna. Mutacija ili gubitak (uslijed niza 
genetskih promjena) dominantnih alela takvoga gena u melanoblastu za posljedicu ima ekspresiju recesivnog fenotipa u stanicama poto ­
maka, stvaraju ći mrlju druga čije boje na krznu dobivenog miša. 
Utvrđuje se broj potomaka s takvim mrljama, odnosno mutacijama, 
a njihova se u čestalost uspore đuje s učestalošću među potomcima 
koji se razviju iz embrija tretiranih isklju čivo otapalom. Test pojave 
mrlja na mišu otkriva pretpostavljene somatske mutacije u fetalnim 
stanicama.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Kada je mogu će, ispitivane tvari treba otopiti ili suspendirati u izoto ­
ničnoj fiziološkoj otopini. Kemikalije netopljive u vodi mogu se 
otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim nosačima. Nosa č koji se 
koristi ne smije utjecati na djelovanje ispitivane kemikalije, niti izazi ­
vati toksi čne učinke. Treba koristiti svježe pripravke ispitivane 
kemikalije.  
P o k u s n e ž i v o t i n j e  
Miševi soja T (nonagouti, a/a; chincilla, pink eye, cchp/cchp; brown, 
b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) pare se ili sa 
sojem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) ili s C57BL (nonagouti, a/a). Mogu se koristiti i drugi odgovaraju ći križanci kao što su križanci izme đu 
NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) i DBA (nonagouti, a/a; brown, 
b/b; dilute d/d) pod uvjetom da njihovo potomstvo bude nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 393
 
B r o j i s p o l  
Tretira se dovoljan broj gravidnih ženki kako bi se za svaku primi ­
jenjenu visinu doze osigurao odgovaraju ći broj preživjelih potomaka. 
Prikladna veli čina uzorka utvr đuje se prema broju mrlja opaženih 
kod tretiranih miševa i opsegu kontrolnih podataka. Negativan 
rezultat prihvatljiv je tek kad se utvrdi kod najmanje 300 potomaka ženki tretiranih najvišom dozom.
 
P r i m j e n a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Treba imati na raspolaganju podatke o paralelnim kontrolama obav ­
ljenim na miševima tretiranima samo nosa čem (negativne kontrole). 
Da bi se pove ćala osjetljivost testa, navedenim podacima mogu se 
dodati i kontrolni podaci iz ranijih ispitivanja obavljenih u istom laboratoriju, pod uvjetom da su ti podaci homogeni. Ako se ne 
utvrdi mutagenost ispitivane kemikalije, trebaju biti raspoloživi 
podaci o pozitivnoj kontroli dobiveni nedavno u istom laboratoriju na temelju primjene kemikalije za koju je poznato da u ovome testu pokazuje mutagenost.
 
P u t p r i m j e n e  
Uobičajeni putevi primjene su oralna intubacija ili intraperitonealna 
injekcija, a kemikalija se daje gravidnim ženkama. Inhalacija i drugi 
putevi primjene koriste se prema potrebi.  
V i s i n e d o z a  
Primjenjuju se barem dvije visine doza, uklju čujući jednu kod koje 
se javljaju simptomi toksi čnosti ili se smanjuje veli čina legla. Što se 
tiče netoksičnih kemikalija, životinje treba izložiti maksimalnoj dozi 
koju je mogu će primijeniti.  
Postupak  
Obično se životinje jednom tretiraju u 8. 9. ili 10. danu trudno će, pri 
čemu se kao prvi dan ra čuna dan kad se prvi put opazi vaginalni čep. 
Ti se dani poklapaju s vremenom od 7,25, 8,25 i 9,25 dana nakon začeća. U tim se danima životinje mogu uzastopno tretirati.
 
A n a l i z a  
Potomstvo se ozna čava kodovima, a izme đu tri i četiri tjedna po 
rođenju utvrđuje se pojava mrlja. Razlikuju se tri tipa mrlja:  
(a) bijele mrlje unutar podru čja od 5 mm od središnje ventralne 
(trbušne) linije, za koje se pretpostavlja da su posljedica uništa ­
vanja stanica (WMVS);  
(b) žute mrlje, nalik boji agutija, obi čno se nalaze u podru čju grudi, 
genitalija, grla, pazuha i prepona te na sredini čela, za koje se 
pretpostavlja da su posljedica pogrešne diferencijacije (MDS); i  
(c) pigmentirane i bijele mrlje nasumi čno raspore đene po krznu, za 
koje se pretpostavlja da su posljedica somatskih mutacija (RS).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 394
 
Bilježe se sva tri tipa mrlja, ali samo zadnji, RS, ima genetski zna čaj. 
Poteškoće pri razlikovanju izme đu MDS i RS mogu se riješiti fluore ­
scentnom mikroskopijom uzoraka dlake.  
Treba zabilježiti makromorfološke abnormalnosti koje su o čigledne 
kod potomstva.  
2. PODACI  
Podaci prikazuju ukupan broj pregledanih potomaka i broj kod 
kojega se pojavila jedna ili više mrlja za koje se pretpostavlja da su posljedica somatske mutacije. Podaci o tretiranju uspore đuju se s 
podacima negativne kontrole uz primjenu odgovaraju ćih metoda. 
Podaci se isto tako prikazuju po leglima.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— sojevi upotrijebljeni za križanje,  
— broj gravidnih ženki u pokusnim i kontrolnim skupinama,  
— prosje čna veličina legla u pokusnim i kontrolnim skupinama kod 
okota i odbijanja od sise,  
— visina(-e) doze(-a) ispitivane tvari,  
— upotrijebljeni nosa č, 
— dan gravidnosti na koji je životinja bila tretirana ispitivanom 
kemikalijom,  
— put primjene,  
— ukupan broj pregledanih mladunaca i broj s mrljama tipa 
WMVS, MDS i RS u tretiranim i kontrolnim skupinama,  
— makromorfološke abnormalnosti,  
— odnos doza/reakcija kod RS-a kad je mogu će, 
— statisti čka ocjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 395
 
B.25.  NASLJEDNA TRANSLOKACIJA U MIŠEVA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Test nasljedne translokacije kod miša otkriva strukturne i numeri čke 
kromosomske promjene u zametnim stanicama sisavaca koje se javljaju kod potomstva prve generacije. Vrste otkrivenih kromosom ­
skih promjena obuhva ćaju recipro čne translokacije i, ako je uklju ­ 
čeno potomstvo ženskog roda, gubitak kromosoma X. Kod nositelja 
translokacija i XO-ženki javlja se smanjena plodnost koja se koristi kako bi se odabralo potomstvo F
 1 za citogenetsku analizu. Potpunu 
sterilnost izazivaju odre đeni tipovi translokacija (autosom X i tip c-t). 
Translokacije se citogenetski promatraju u mejotskim stanicama u dijakinezi-metafazi I pojedinih mužjaka, bilo mužjaka F
 1 ili 
muških potomaka ženki F  1 . Ženke tipa XO citogenetski se prepoz ­
naju po prisutnosti samo 39 kromosoma u mitozi koštane srži.  
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Priprema  
Ispitivane kemikalije otope se u izotoni čnoj fiziološkoj otopini. Ako 
su netopljive u navedenoj otopini, otope se ili suspendiraju u odgo ­
varajućem nosaču. Koriste se svježe pripravljene otopine ispitivane 
tvari. Ako se radi lakšeg doziranja koristi nosa č, on ne smije ometati 
djelovanje ispitivanog spoja, niti izazvati toksi čne učinke.  
P u t p r i m j e n e  
Uobičajeni putevi primjene su oralna intubacija ili intraperitonealna 
injekcija. Prikladni mogu biti i drugi putevi primjene.  
P o k u s n e ž i v o t i n j e  
Radi lakšeg razmnožavanja i citološke verifikacije predmetni se 
pokusi obavljaju na miševima. Nije potreban nikakav specifi čni 
mišji soj. Ipak, u prosje čno velikom leglu korištenog soja trebalo 
bi biti više od osam mladunaca i taj bi broj trebao biti relativno postojan.
 
Koriste se zdrave i spolno zrele životinje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 396
 
B r o j ž i v o t i n j a  
Potreban broj životinja ovisi o u čestalosti spontanih translokacija i 
najnižem stupnju indukcije koji je potreban za pozitivan rezultat.  
Ispitivanje se obi čno obavlja analizom muškog potomstva F  1 . Po 
svakoj skupini koja je primila odre đenu dozu treba ispitati barem 
500 muških potomaka F  1 . Ako je u ispitivanje uklju čeno i žensko 
potomstvo F  1 , potrebno je 300 mužjaka i 300 ženki.  
P r i m j e n a n e g a t i v n i h i p o z i t i v n i h k o n t r o l a  
Trebalo bi imati na raspolaganju odgovaraju će kontrolne podatke 
dobivene paralelnim kontrolama i kontrolama iz prijašnjih ispitiva ­
nja. Kad postoje prihvatljivi rezultati pozitivne kontrole iz pokusa 
koji su nedavno provedeni u istom laboratoriju, ti se rezultati mogu 
upotrijebiti umjesto paralelne pozitivne kontrole.  
V i s i n e d o z a  
Ispituje se jedna visina doze, obi čno najviša doza vezana uz izazi ­
vanje minimalnih toksi čkih učinaka, ali bez utjecaja na reprodukciju 
ili preživljavanje. Kako bi se utvrdio odnos izme đu doze i reakcije, 
potrebne su i dvije dodatne niže doze. Kad su u pitanju netoksi čne 
tvari životinje treba izložiti najvišim koncentracijama koje je mogu će 
primijeniti.  
Postupak  
T r e t i r a n j e i p a r e n j e  
Postoje dva režima tretiranja. Naj češća je jednokratna primjena ispi ­
tivane tvari. Ispitivana se tvar isto tako može primjenjivati sedam dana u tjednu tijekom razdoblja od 35 dana. Broj parenja koji slijedi nakon tretiranja odre đen je režimom tretiranja i trebao bi biti dovo ­
ljan da se tretirane zametne stanice mogu uzorkovati u svim fazama. 
Na kraju razdoblja parenja ženke se u kaveze stavljaju pojedina čno. 
Kada se ženke okote, bilježi se datum, broj i spol potomaka. Svi se muški potomci odbijaju od sise, dok se svi ženski potomci izlu čuju 
ako nisu obuhva ćeni pokusom.
 
T e s t i r a n j e n a t r a n s l o k a c i j s k u h e t e r o z i g o t n o s t  
Koristi se jedna od dvije mogu će metode:  
— ispitivanje plodnosti potomstva F  1 i naknadna verifikacija 
mogućih nositelja translokacije citogenetskom analizom,  
— citogenetska analiza svih potomaka F  1 bez prethodne selekcije na 
temelju ispitivanja plodnosti.  
(a) Ispitivanje plodnosti  
Smanjena plodnost jedinke F  1 može se utvrditi pra ćenjem veli ­ 
čine legla i/ili analizom materi čnog sadržaja kod parenih ženki.  
Treba utvrditi kriterije za odre đivanje normalne i smanjene plod ­
nosti za korišteni soj miševa.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 397
 
Opažanje veli čine legla: mužjaci F  1 koji će se testirati pojedi ­
načno se stavljaju u kaveze sa ženkama iz istog pokusa ili iz 
kolonije. Kavezi se svakodnevno provjeravaju, po čevši od 18. 
dana po parenju. Nakon okota bilježi se veli čina legla i spol 
potomaka F  2 , nakon čega se legla izlu čuju. Ako se test 
provodi na ženskom potomstvu F  1 , potomstvo F  2 iz malih 
legla zadržava se za daljnja ispitivanja. Ženski nositelji translo ­
kacija provjeravaju se citogenetskom analizom translokacije kod bilo kojega od njihovih muških potomaka. Ženke tipa XO 
prepoznaju se po promjeni omjera jedinki muškog spola 
naprama jedinkama ženskog spola u njihovom potomstvu iz 1:1 u 1:2. Kod primjene sekvencijskog postupka normalne živo ­
tinje F
 1 eliminiraju se iz daljnjeg ispitivanja ako prvo leglo F  2 
dosegne ili premaši unaprijed odre đenu normalnu vrijednost, a 
ako do tog ne do đe opaža se drugo ili tre će leglo F  2 . 
Životinje F  1 koje se po opažanju najviše tri legla F  2 ne mogu 
klasificirati kao normalne, ili se dalje ispituju analizom mate ­
ričnog sadržaja u ženki ili se izravno podvrgavaju citogenetskoj 
analizi.  
Analiza materi čnog sadržaja: do smanjenja veli čine legla nosi ­
telja translokacije dolazi uslijed smrti embrija, pa visoki broj 
mrtvih implanata ukazuje na prisutnost translokacije kod živo ­
tinje koja se ispituje. Svaki mužjak F  1 na kojemu će se obaviti 
ispitivanje pari se s dvije do tri ženke. Za čeče se utvr đuje 
pregledom na postojanje vaginalnih čepova koji se obavlja 
svakog jutra. Ženke se usmr ćuju 14 do 16 dana kasnije te se 
bilježe živi i mrtvi implanti u njihovim maternicama.  
(b) Citogenetska analiza  
Preparati testisa pripremaju se tehnikom sušenja na zraku. Nosi ­
telji translokacija prepoznaju se po postojanju multivalentnih struktura u primarnim spermatocitima u dijakinezi-metafazi I. Opažanje barem dviju stanica s multivalentnom asocijacijom 
čini potreban dokaz da je ispitana životinja nositelj translokacije.
 
Ako nije obavljena uzgojna selekcija svi se mužjaci F  1 podvrga­
vaju citogenetskom pregledu. Nužno je mikroskopski utvrditi 
postojanje barem 25 stanica u dijakinezi-metafazi I po mužjaku. 
Potreban je pregled mitotskih metafaza u spermatogonijima ili koštanoj srži kod mužjaka F
 1 s malenim testisima i mejotskom 
diobom prije dijakineze ili kod ženki F1 za koje se sumnja da su 
tipa XO. Postojanje neobi čno dugog i/ili kratkog kromosoma u 
svakoj od 10 stanica dokaz je posebne translokacije koja izaziva sterilnost u mužjaka (c-t tip). Neke translokacije autosoma X koje uzrokuju sterilnost mužjaka mogu će je utvrditi samo analizom uz 
primjenu metode pruganja mitotskih kromosoma. Postojanje 39 
kromosoma u svih 10 mitoza dokaz je postojanja stanja XO kod ženke.
 
2. PODACI  
Podaci se prikazuju u obliku tablice.  
Za svaki interval parenja, nakon parenja roditelja, bilježi se srednja 
veličina legla i omjer spolova potomaka, odmah po okotu i nakon 
odbijanja od sise.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 398
 
Za ocjenu plodnosti životinja F  1 navodi se srednja veli čina legla 
nakon parenja svih normalnih jedinki i veli čine pojedina čnih legla 
nositelja translokacija F1. Za analizu materi čnog sadržaja navodi se 
prosječni broj živih i mrtvih implanata nastalih parenjem normalnih 
jedinki, te broj živih i mrtvih implanata nastalih svakim pojedi ­
načnim parenjem nositelja translokacije F  1 . 
Za citogenetsku analizu dijakineze-metafaze I za svakog se nositelja 
translokacije bilježi broj tipova multivalentnih struktura i ukupan 
broj stanica.  
Za sterilne jedinke F  1 bilježi se ukupan broj parenja i trajanje 
razdoblja parenja. Navodi se i težina testisa i pojedinosti dobivene 
citogenetskom analizom.  
Za ženke tipa XO bilježi se srednja veli čina legla, omjer spolova kod 
potomaka F  1 i rezultati citogenetske analize.  
Kad je mogu će, nositelji translokacije F  1 prethodno se selektiraju na 
temelju testova plodnosti pa u tablice treba unijeti podatke o tome koliki broj njih su potvr đeni translokacijski heterozigoti.
 
Treba navesti i podatke dobivene pokusima s pozitivnom i nega ­
tivnom kontrolom.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— soj miševa, dob životinja, tjelesna masa tretiranih životinja,  
— broj roditeljskih životinja svakog spola u pokusnim i kontrolnim 
skupinama,  
— uvjeti ispitivanja, detaljan opis tretiranja, visine doza, otapala, 
režim parenja,  
— broj i spol potomaka svake ženke, broj i spol potomaka uzgo ­
jenih za analizu translokacije,  
— vrijeme i kriteriji analize translokacije,  
— broj i detaljan opis nositelja translokacije, uklju čujući podatke o 
parenju i podatke o materi čnom sadržaju, ovisno o slu čaju, 
— citogenetski postupci i pojedinosti o mikroskopskoj analizi, po 
mogućnosti uz slike,  
— statisti čka ocjena,  
— diskusija o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 399
 
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 400
 
B.26.  TEST SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
GLODAVCIMA 90-DNEVNA STUDIJA ORALNE 
TOKSIČNOSTI UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 408 (1998.)  
1.1. UVOD  
Pri ocjenjivanju toksi čkih svojstava neke kemikalije, subkroni čna 
oralna toksi čnost može se utvrditi metodom ponavljanih doza 
nakon što se testom akutne toksi čnosti ili 28-dnevnim testom toksi č­
nosti uz primjenu ponavljanih doza dobiju po četne informacije o 
njezinoj toksi čnosti. 90-dnevnom studijom dobiju se informacije o 
mogućim opasnostima za zdravlje za koje je vjerojatno da će se javiti 
pri ponavljanoj dugotrajnoj izloženosti u razdoblju sazrijevanja i razvoja nakon odbijanja od sise, te dobrim dijelom i u odrasloj dobi. Ta studija omogu ćuje dobivanje informacija o zna čajnijim 
toksičnim učincima, o ciljnim organima i mogu ćnosti akumulacije, 
kao i procjenu razine izloženosti kod koje nema vidljivih štetnih učinaka (NOAEL) koja se može upotrijebiti pri odabiru visina 
doza za studije kroni čne toksičnosti i za utvr đivanje sigurnosnih 
kriterija za izloženost čovjeka.
 
Ova metoda stavlja dodatni naglasak na neurološke krajnje u činke i 
ukazuje na mogu će imunološke i reproduktivne u činke. Isto tako 
naglašena je i potreba za pažljivim klini čkim opažanjem životinja 
kako bi se prikupilo što više informacija. Ova bi studija trebala 
omogućiti prepoznavanje kemikalija koje imaju potencijal za izazi ­
vanje neurotoksi čkih i imunoloških u činaka, kao i u činaka na repro ­
duktivnim organima, što može opravdati daljnja detaljna istraživanja.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Doza:  količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava 
kao masa (g, mg) ili kao masa ispitivane tvari po jedinici tjelesne mase pokusne životinje (npr. mg/kg) ili kao stalna koncentracija u hrani (ppm).
 
Doziranje:  opći pojam koji obuhva ća dozu, njenu u čestalost i 
trajanje doziranja.  
NOAEL:  skraćenica za visinu doze bez vidljivih štetnih u činaka 
(No Observed Adverse Effect Level) i najviša je doza pri kojoj se 
ne opažaju nikakvi štetni u činci vezani uz tretiranje.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana se tvar 90 dana svakodnevno oralno primjenjuje u stup ­
njevanim dozama na nekoliko skupina pokusnih životinja, po jedna 
visina doze na svaku skupinu. Tijekom razdoblja primjene životinje se pažljivo promatraju radi uo čavanja simptoma toksi čnosti. Na živo ­
tinjama koje uginu ili budu usmr ćene tijekom ispitivanja obavlja se 
obdukcija, s tim da se po završetku ispitivanja preživjele životinje 
usmrćuju i tako đer obduciraju.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 401
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Priprema životinja  
Treba koristiti zdrave životinje koje su se barem 5 dana privikavale 
na laboratorijske uvjete i koje nisu bile podvrgnute prethodnim ispitnim postupcima. Životinje treba okarakterizirati s obzirom na njihovu vrstu, soj, podrijetlo, spol, tjelesnu masu i/ili dob. Životinje 
se nasumi čno raspore đuju u kontrolne skupine i skupine koje će se 
tretirati. Kaveze treba rasporediti na na čin da se u činci do kojih bi 
moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Svakoj se 
životinji dodjeljuje jedinstveni identifikacijski broj.
 
1.4.2.  Priprema doza  
Ispitivana se tvar primjenjuje oralnom intubacijom pomo ću želučane 
sonde, odnosno preko hrane ili vode za pi će. Metoda oralne primjene 
ovisi o svrsi studije i fizikalnim/kemijskim svojstvima ispitivanog 
materijala.  
Prema potrebi, ispitivana se tvar otapa ili suspendira u odgovara ­
jućem nosaču. Kad god je mogu će, preporu ča se najprije razmotriti 
mogućnost primjene vodene otopine/suspenzije, zatim mogu ćnost 
primjene otopine/emulzije u ulju (npr. kukuruzno ulje), i tek na 
kraju mogu ćnost otapanja u ostalim nosa čima. Za sve nosa če, osim 
vode, moraju biti poznata toksi čka svojstva. Treba utvrditi stabilnost 
ispitivane tvari u uvjetima primjene.  
1.4.3.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.3.1.  Pokusne životinje  
Najčešće korištena životinjska vrsta je štakor, iako se mogu koristiti i 
neke druge vrste glodavaca, npr. miš. Treba upotrijebiti mlade zdrave 
odrasle životinje sojeva koji su uobi čajeni u laboratorijskoj praksi. 
Odabiru se ženke koje prethodno nisu imale leglo i koje nisu gravi ­
dne. S doziranjem treba zapo četi što je prije mogu će nakon odbijanja 
mladunaca od sise, a u svakom slu čaju, prije nego životinje navrše 
devet tjedana. Na po četku ispitivanja razlike u tjelesnoj masi kori ­ 
štenih životinja smiju biti minimalne i ne premašivati ± 20 % prosječne tjelesne mase svakog spola. U slu čajevima kad se prije 
dugotrajne studije kroni čne toksičnosti provodi preliminarna studija, 
u obje studije treba koristiti životinje istog soja i istog podrijetla.
 
1.4.3.2.  Broj i spol  
Najmanje 20 životinja (10 ženki i 10 mužjaka) treba upotrijebiti za 
ispitivanje svake visine doze. Ako se planira usmr ćivanje životinja u 
međuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj treba pove ćati 
za broj životinja predvi đen za takvo usmr ćivanje. Na temelju prija ­ 
šnjih saznanja o kemikaliji ili nekom bliskom analogu, treba 
razmotriti mogu ćnost uklju čivanja dodatne satelitske skupine od 
deset životinja (pet od svakog spola) u kontrolnu skupinu i u skupinu koja će primiti najvišu dozu, radi opažanja reverzibilnosti 
ili postojanosti bilo kojega od toksi čkih učinaka nakon razdoblja 
tretiranja. Odgovaraju će trajanje ovog razdoblja odre đuje se s 
obzirom na u činke koji će se opažati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 402
 
1.4.3.3.  Visine doza  
Treba upotrijebiti najmanje tri visine doza i paralelne kontrole, osim 
u slučajevima kad se izvodi grani čni test (vidjeti 1.4.3.4.). Visine 
doza mogu se utvr đivati na temelju rezultata studija s ponavljanim 
dozama ili studija za utvr đivanje raspona doza, pri čemu treba uzeti 
u obzir sve postoje će toksikološke podatke i podatke o toksikoki ­
netici koji se odnose na ispitivanu tvar ili srodne materijale. Ako nije ograničena fizikalno-kemijskim svojstvima ili biološkim djelovanjem 
ispitivane tvari, najvišu dozu treba odabrati s ciljem da se izazove 
toksičnost, ali ne i smrt ili velika patnja životinja. Treba odabrati niz 
sve nižih doza koje će se primjenjivati za utvr đivanje svih reakcija 
vezanih uz doziranje, kao i dozu kod koje nema vidljivih štetnih 
učinaka (NOAEL) kao najnižu dozu. Za odre đivanje sve nižih 
doza često su najpogodniji dvostruki do četverostruki intervali, i 
često je bolje dodati četvrtu pokusnu skupinu nego da izme đu dozi­
ranja budu jako veliki intervali (npr. iznad faktora 6-10).
 
Kontrolna skupina je netretirana skupina ili skupina tretirana samo 
nosačem, ako se kod primjene ispitivane tvari koristi nosa č. Osim 
tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba 
postupati na jednak na čin kao i sa životinjama u tretiranoj skupini. 
Ako se koristi nosa č, volumen nosa ča koji primi kontrolna skupina 
treba biti jednak najve ćem upotrijebljenom volumenu. Ako se ispi ­
tivana tvar daje u hrani i time se prouzro či smanjeni unos hrane, 
korištenje paralelno hranjene kontrolne skupine životinja može se 
pokazati korisnim pri razlikovanju smanjenja uzrokovanog okusom od smanjenja uzrokovanog toksikološkim promjenama u ispitnom modelu.
 
Treba uzeti u obzir sljede ća svojstva nosa ča i drugih aditiva, ovisno 
o slučaju: djelovanje na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili 
retenciju (zadržavanje) ispitivane tvari; djelovanje na kemijska svoj ­
stva ispitivane tvari, koje može promijeniti njezina toksi čka svojstva; 
i djelovanje na unos hrane i vode ili na stanje uhranjenosti životinja.  
1.4.3.4.  Grani čni test  
Ako test s jednom visinom doze, koja iznosi najmanje 1 000 mg/kg 
tjelesne mase/dan uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne izazove vidljive štetne u činke i ako se toksi čnost ne o čekuje na 
temelju podataka o strukturno srodnim tvarima, potpuna studija uz 
primjenu tri visine doza ne će se smatrati neophodnom. Grani čni test 
ne vrijedi samo u slu čajevima kad izloženost ljudi ukazuje na 
potrebu za primjenom više doze.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Primjena doza  
Životinjama se ispitivana tvar dozira svakodnevno, sedam dana u 
tjednu, u razdoblju od 90 dana. U slu čaju bilo kojeg drugog 
režima doziranja, npr. pet dana u tjednu, treba dokazati njegovu opravdanost. U slu čaju primjene oralnom intubacijom, ispitivanu 
tvar treba dati u jednoj dozi pomo ću želučane sonde ili odgovaraju će 
intubacijske kanile. Maksimalni volumen teku ćine koji se može 
primijeniti odjednom ovisi o veli čini pokusne životinje. Taj 
volumen ne smije biti ve ći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u 
slučaju vodenih otopina gdje je dopušteno upotrijebiti 2 ml/100 g 
tjelesne mase. Osim u slu čaju nadražuju ćih ili nagrizaju ćih tvari kod 
kojih se štetni u činci obično javljaju pri višim koncentracijama, 
varijabilnost ispitnog volumena treba prilago đavanjem koncentracije 
svesti na najmanju mogu ću mjeru, kako bi se zajam čio stalni 
volumen pri svim visinama doza.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 403
 
Kod tvari koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane tvari o kojoj je rije č ne utječu na 
uravnoteženi unos hrane ili vode. Kad se ispitivana tvar daje u hrani, može se koristiti ili stalna koncentracija u odnosu na koli činu 
hrane (ppm) ili stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životi ­
nje; alternativa koja se koristi u pokusu mora se specificirati. U 
slučajevima kad se ispitivana tvar daje oralnom intubacijom, dozu 
treba davati svaki dan otprilike u isto vrijeme te je po potrebi prila ­
gođavati kako bi se održala stalna visina doze u odnosu na tjelesnu 
masu životinje. Kada se prije dugotrajnog ispitivanja kroni čne toksič­
nosti radi 90-dnevna preliminarna studija, u obje studije prehrana životinja treba biti sli čna.
 
1.5.2.  Opažanja  
Opažanje bi trebalo trajati najmanje 90 dana. Životinje u satelitskoj 
skupini za koje se planira naknadno opažanje treba tijekom odgova ­
rajućeg vremenskog razdoblja držati bez tretiranja kako bi se utvrdilo 
jesu li toksi čki učinci postojani ili su se životinje od njih oporavile.  
Opća bi klini čka opažanja trebalo obavljati barem jednom dnevno, 
nabolje u isto vrijeme svakog dana, uzimaju ći u obzir vršno 
razdoblje o čekivanih u činaka nakon doziranja. Klini čko stanje živo ­
tinja treba zabilježiti. Barem dvaput dnevno, obi čno početkom i 
krajem svakog dana, sve životinje treba pregledati radi otkrivanja 
mogućih simptoma morbiditeta i mortaliteta.  
Barem jednom prije prvog izlaganja, te jednom tjedno nakon toga, 
treba obaviti detaljno klini čko opažanje stanja svih životinja (što će 
omogućiti utvrđivanje promjena u stanju istih subjekata). Ta 
opažanja treba obaviti izvan kaveza u kojem životinja ina če 
boravi, najbolje u standardnom ogra đenom prostoru i svaki put otpri ­
like u isto vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo zabilježiti, pri čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od 
strane laboratorija koji obavlja ispitivanje. Treba poduzeti sve što 
je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima opažanja 
budu minimalna. Opažani simptomi trebaju obuhva ćati, ali ne biti 
ograničeni na, promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, pojavu 
sekreta i ekskreta te aktivnost autonomnog živ čanog sustava (npr. 
lakrimacija (suzenje), piloerekcija (naježenost dlake), veli čina 
zjenica, nepravilnosti u disanju). Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloni čkih 
ili toničkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano njegovanje krzna, 
ponavljano kretanje u krug) ili neobi čnog ponašanja (npr. samoo ­
zljeđivanje, hodanje unatrag) (1).
 
Oftalmološki pregled, pomo ću oftalmoskopa ili druge odgovaraju će 
opreme, treba obaviti prije primjene ispitivane tvari i po završetku studije, najbolje na svim životinjama, ili barem u skupinama koje primaju visoke doze i kontrolnim skupinama. Ako se otkriju 
promjene na o čima, treba pregledati sve životinje.
 
Prema kraju razdoblja izlaganja, a u svakom slu čaju ne ranije od 11. 
tjedna, treba obaviti ocjenu senzorne reaktivnosti na razli čite podra­ 
žaje (1) (npr. zvu čne, vizualne i proprioceptivne) (2)(3)(4), ocjenu 
jakosti stiska (5) te ocjenu motori čke aktivnosti (6). Daljnje pojedi ­
nosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgo ­
varajućoj referentnoj literaturi. Me đutim, osim referentnih, mogu se 
primjenjivati i alternativni postupci.  
Funkcionalna opažanja koja se obavljaju prema kraju ispitivanja 
mogu se izostaviti kad postoje podaci o funkcionalnim opažanjima 
iz drugih studija, a dnevnim klini čkim opažanjima nisu otkriveni 
nikakvi funkcionalni nedostaci.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 404
 
U izuzetnim slu čajevima funkcionalna opažanja mogu izostati i kod 
skupina koje na drugi na čin pokazuju simptome toksi čnosti do mjere 
koja bi znatno ometala obavljanje funkcionalnog ispitivanja.  
1.5.2.1.  Tjelesna masa i unos hrane/vode  
Sve životinje treba vagati barem jednom tjedno. Unos hrane treba 
mjeriti najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana tvar daje s vodom za pi će, unos vode isto tako treba mjeriti najmanje na 
tjednoj osnovi. Unos vode može se pratiti i u studijama koje se 
odnose na normalno hranjenje ili prisilno hranjenje na sondu, pri 
čemu može do ći do promjena u unosu teku ćine.
 
1.5.2.2.  Hematologija i klini čka biokemija  
Uzorke krvi je potrebno uzeti na specificiranom mjestu i pohraniti u 
odgovaraju ćim uvjetima, ovisno o konkretnom slu čaju. Na kraju 
razdoblja ispitivanja uzorci se prikupljaju neposredno prije ili u okviru postupka usmr ćivanja životinja.
 
Na kraju razdoblja ispitivanja kad god se u me đuvremenu prikupe 
bilo kakvi uzorci krvi, treba obaviti sljede će hematološke pretrage: 
hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i dife ­
rencijalni broj leukocita, broj trombocita i mjerenje vremena/poten ­
cijala zgrušavanja krvi.  
Kliničke biokemijske pretrage za utvr đivanje jakog toksi čkog djelo ­
vanja na tkiva i posebno na bubrege i jetru, treba obaviti na uzor ­
cima krvi uzetim od svake životinje neposredno prije usmr ćivanja ili 
u okviru postupka usmr ćivanja, (osim od životinja za koje je utvr ­ 
đeno da su na umoru i/ili su neplanirano usmr ćene tijekom pokusa). 
Za klinička biološka ispitivanja uzorci se mogu uzimati i u me đu­
vremenu, sli čno kao kod hematoloških pretraga. Preporu ča se da 
životinje tijekom no ći pred uzimanje uzoraka krvi poste (  1 ). Pretrage 
koje se rade na plazmi ili serumu trebaju obuhvatiti mjerenje natrija, kalija, glukoze, ukupne koli čine kolesterola, ureje, dušika iz ureje u 
krvi (BUN), kreatinina, ukupne koli čine proteina i albumina te više 
od dva enzima indikativna za hepatocelularna ošte ćenja (kao što su 
alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i sorbitol dehidrogenaza). Mogu se uključiti i mjerenja dodatnih enzima (jetrenog ili drugog podrijetla) 
i žučnih kiselina, kojima se pod odre đenim okolnostima mogu dobiti 
korisne informacije.
 
U zadnjem tjednu studije neobvezno se mogu obaviti analize urina 
dobivenog sabiranjem u odre đenim vremenskim razmacima: izgled, 
količina, osmolalnost ili specifi čna težina, pH, protein, glukoza i 
krv/krvne stanice.  
Osim toga, treba razmisliti i o ispitivanju serumskih markera koji 
označivaju ošte ćenja tkiva. Ako poznata svojstva ispitivane tvari 
mogu, ili se o čekuje da će, utjecati na odre đene metaboli čke 
profile treba obaviti i druge pretrage koje uklju čuju kalcij, fosfor, 
trigliceride natašte, specifi čne hormone, methemoglobin i kolineste ­
razu. Te vrijednosti treba izmjeriti kod izloženosti kemikalijama određenih klasa opasnosti ili od slu čaja do slu čaja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 405  
( 1 ) Kod niza mjerenja u serumu i plazmi, osobito kad se mjeri glukoza, preporu ča se post 
životinja preko no ći. Glavni razlog tome je činjenica da pove ćana varijabilnost, do koje 
bi neminovno došlo u slu čaju da se životinjama hrana ne uskrati, vjerojatno bi prikrila 
suptilnije u činke i otežala tuma čenje rezultata. S druge strane, me đutim, post tijekom 
noći može omesti op ći metabolizam životinje i, osobito u studijama čiji je predmet 
prehrana, može utjecati na dnevnu izloženost ispitivanoj tvari. Ako se odlu či za post 
tijekom no ći, klinička biokemijska ispitivanja treba obaviti nakon provo đenja funkcio ­
nalnih opažanja u okviru studije.
 Uglavnom, ovdje je potreban fleksibilan pristup, ovisno o životinj ­
skoj vrsti i opaženim i/ili o čekivanim u čincima predmetne tvari.  
Ako podaci o normalnim vrijednostima korišteni u prijašnjim pokusima 
nisu adekvatni, treba razmotriti je li potrebno utvrditi hematološke i kliničke biokemijske varijable prije nego se zapo čne s doziranjem; op će­
nito se ne preporu ča te podatke utvr đivati prije tretiranja (7).
 
1.5.2.3.  Obdukcija (makroskopska analiza)  
Sve životinje korištene u studiji moraju se podvrgnuti kompletnoj, 
detaljnoj makroskopskoj analizi koja uklju čuje pažljivi pregled 
vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne 
šupljine i njihovog sadržaja. S jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, testisa, epididimisa (pasjemenika), maternice, jajnika, timusa, slezene, mozga i srca svih životinja (osim onih za koje je utvr đeno 
da su na umoru i/ili se neplanirano usmrte tijekom pokusa) treba 
obrezati svo okolno tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon sekcije, kako bi se izbjeglo sušenje organa.
 
Slijedeća tkiva treba čuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najpri ­
mjerenije i za vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled: 
sve velike lezije, mozak (reprezentativne regije, uklju čujući veliki 
mozak, mali mozak i medulu/most), le đnu moždinu (uzetu na tri 
razine: cervikalnoj (vratnoj), srednjoj torakalnoj (prsnoj) i lumbalnoj (slabinskoj)), hipofizu, štitnja ču, paratiroidnu žlijezdu, timus (prsnu 
žlijezdu), jednjak, žlijezde slinovnice, želudac, tanko i debelo crijevo 
(uključujući Peyerove plo če), jetru, guštera ču, bubrege, nadbubrežne 
žlijezde, slezenu, srce, dušnik i plu ća (preparirane upuhivanjem 
fiksativa i zatim uranjanjem), aortu, spolne žlijezde, maternicu, 
pomoćne spolne organe, mlije čnu žlijezdu ženke, prostatu, mokra ćni 
mjehur, žu čni mjehur (miš), limfne čvorove (po mogu ćnosti, jedan 
koji pokriva put unosa ispitivane tvari u organizam i drugi koji je udaljen od puta unosa, kako bi se vidjeli sistemski u činci), periferni 
živac (bedreni ( n. ischiadicus ) ili tibijalni ( n. tibialis )) po mogu ćnosti 
smješten uz miši ć, odsječak koštane srži (ili, alternativno, svježi 
aspirat koštane srži), kožu i o či (ako se prilikom oftalmoloških 
pregleda opaze promjene). Klini čki i drugi nalazi mogu ukazati na 
potrebu za ispitivanjem dodatnih tkiva. Treba sa čuvati i sve one 
organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane tvari smatra da bi mogli biti ciljni.
 
1.5.2.4.  Histopatologija  
Ako se kod životinja na koje su primijenjene visoke doze ispitivane 
tvari primijete promjene, histopatološki pregled treba obaviti i na životinjama iz svih ostalih skupina.
 
Treba pregledati sve ve će lezije.  
Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki 
pregled onih tkiva i organa na kojima su kod tretiranih životinja 
primijećene promjene.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 406
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Podatke treba prikazati pojedina čno za svaku životinju. Osim toga, 
najbolje ih je rezimirati u obliku tablice iz koje se za svaku testiranu skupinu vidi broj životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje 
su uginule ili su iz humanih razloga bile usmr ćene tijekom ispitiva ­
nja, vrijeme smrti ili humanog usmr ćivanja, broj životinja kod kojih 
su opaženi znakovi toksi čnosti, opis opažanih znakova toksi čnosti, 
uključujući vrijeme pojavljivanja, trajanje i stupanj svih toksi čkih 
učinaka, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i 
postotak životinja koje pokazuju odre đene vrste lezija.
 
Tamo gdje je to mogu će, sve rezultate treba analizirati uz primjenu 
odgovaraju će opće prihvatljive statisti čke metode. Statisti čke metode 
i podatke koji će se analizirati treba odabrati još u fazi planiranja 
studije.  
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalni oblik (agregatno stanje), čistoća i fizikalno-kemijska 
svojstva,  
— identifikacijski podaci,  
— nosač (ovisno o slu čaju): dokaz opravdanosti odabira nosa ča, ako 
se ne radi o vodi.  
2.2.2.  Vrsta pokusnih životinja:  
— korištena vrsta i soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— pojedina čne tjelesne mase životinja na po četku ispitivanja.  
2.2.3.  Uvjeti ispitivanja:  
— obrazloženje za odabir visina doza,  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari/pripremanju hrane, 
postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravaka,  
— podaci o primjeni ispitivane tvari,  
— stvarne doze (mg/kg tjelesne težine/dan) i faktor za prera ču­
navanje koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za pi će 
(ppm) u stvarnu dozu, prema potrebi,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
2.2.4.  Rezultati:  
— tjelesna masa i promjene u tjelesnoj masi,  
— unos hrane i unos vode, prema potrebi,  
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i visini doza, uklju čujući 
znakove toksi čnosti,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 407
 
— vrsta, stupanj i trajanje opaženih klini čkih promjena (jesu li 
reverzibilne ili nisu),  
— rezultati oftalmološkog pregleda,  
— senzorska aktivnost, ocjena ja čine stiska i motorne aktivnosti 
(ako su raspoloživi),  
— hematološka ispitivanjima s relevantnim normalnim 
vrijednostima,  
— klinička biokemijska ispitivanja s relevantnim normalnim 
vrijednostima,  
— tjelesna masa nakon smrti, masa organa, te omjer mase organa i 
tjelesne mase,  
— nalazi obdukcije,  
— detaljni opis svih histopatoloških nalaza,  
— podaci o apsorpciji, ako postoje,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
3. REFERENCE  
(1) IPCS (1986) Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, str. 999-1003.  
(3) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, str. 691-704.  
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M., (1991) Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, str. 267-283.
 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T., (1979) A 
Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, str. 233-236.
 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C., (1991) Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, str. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al ., (1996) „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety 
Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, str. 198-201.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 408
 
B.27.  TEST SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI 90-DNEVNO 
ISPITIVANJE ORALNE TOKSI ČNOSTI NA 
NEGLODAVCIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
1. METODA  
Ova ispitna metoda subkroni čne oralne toksi čnosti istovjetna je 
metodi OECD TG 409 (1998.).  
1.1. UVOD  
Kod ocjenjivanja toksi čnih svojstava neke kemikalije, utvr đivanje 
subkronične oralne toksi čnosti pomo ću ponavljanih doza može usli ­
jediti nakon dobivanja po četnih informacija o toksi čnosti 28-dnevnim 
ispitivanjem uz primjenu akutne (jednokratne) doze ili ponavljanih doza. 90-dnevnim ispitivanjem dobivaju se informacije o mogu ćim 
opasnostima po zdravlje koje bi mogle proiza ći iz ponavljane izlo ­ 
ženosti tijekom razdoblja ubrzanog razvoja i ulaska u mla đu odraslu 
dob. Tim se ispitivanjima dobivaju podaci o zna čajnim toksi čkim 
učincima, utvr đuju ciljni organi i mogu ćnost akumulacije, te se 
procjenjuje razina izloženosti kod koje nema vidljivih štetnih 
učinaka izlaganja, što se može upotrijebiti kod odabira visina doza 
za studije kroni čne toksičnosti i za utvr đivanje sigurnosnih kriterija 
za izloženost ljudi.
 
Ispitna metoda omogu ćuje utvrđivanje štetnih u činaka izlaganja 
kemikalijama kod neglodavaca te bi je isklju čivo trebalo koristiti:  
— kad u činci opaženi u drugim studijama ukazuju na potrebu za 
pojašnjenjem/karakterizacijom uz upotrebu neke druge vrste 
neglodavaca, ili  
— kad toksikokineti čke studije pokazuju da odre đena vrsta neglo ­
davaca predstavlja najrelevantniji izbor laboratorijske životinje, 
ili 
— u slučajevima kad drugi specifi čni razlozi opravdavaju upotrebu 
određene vrste neglodavaca.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Doza:  količina ispitivane tvari koja se primjenjuje. Doza se izražava 
kao masa (g, mg) ili kao masa ispitivane tvari po jedinici tjelesne 
mase pokusne životinje (npr. mg/kg) ili kao stalna koncentracija u 
hrani (ppm).  
Doziranje:  opći pojam koji obuhva ća dozu, njenu u čestalost i 
trajanje doziranja.  
NOAEL:  skraćenica za visinu doze bez vidljivih štetnih u činaka 
(No Observed Adverse Effect Level) i najviša je doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni u činci vezani uz tretiranje.
 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana se tvar 90 dana svakodnevno oralno primjenjuje u stup ­
njevanim dozama na nekoliko skupina pokusnih životinja, po jedna 
visina doze na svaku skupinu. Tijekom razdoblja primjene životinje se pažljivo promatraju radi uo čavanja simptoma toksi čnosti. Na živo ­
tinjama koje uginu ili budu usmr ćene tijekom ispitivanja obavlja se 
obdukcija, s tim da se po završetku ispitivanja, preživjele životinje 
usmrćuju i tako đer obduciraju.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 409
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Odabir životinjske vrste  
Najčešće korištena životinjska vrsta osim glodavaca je pas, koji bi 
trebao biti odre đene pasmine; često se koristi bigl. Mogu se koristiti i 
druge životinjske vrste, npr. svinja i patuljasta svinja. Korištenje primata se ne preporu čuje, a njihova eventualna upotreba treba biti 
znanstveno opravdana. Treba koristiti mlade zdrave životinje i ako se 
radi o psima doziranje je najbolje zapo četi kad su životinje stare 4-6 
mjeseci, a najviše 9 mjeseci. Kad se studija obavlja kao preliminarna, prije dugotrajne studije kroni čne toksičnosti, u obje studije treba 
upotrijebiti istu životinjsku vrstu/pasminu.
 
1.4.2.  Priprema životinja  
Treba koristiti mlade zdrave životinje koje su se prilagodile labora ­
torijskim uvjetima i prethodno nisu bile podvrgavane pokusnim postupcima. Trajanje prilago đavanja ovisit će o odabranoj vrsti poku ­
snih životinja i njihovom podrijetlu. Preporu ča se prilago đavanje u 
trajanju od najmanje 5 dana za pse ili svinje uzgojene za tu svrhu u okviru kolonije životinja koja trajno obitava na lokaciji ispitivanja, te 
barem 2 tjedna za istu vrstu životinja ako potje ču iz vanjskih izvora. 
Pokusne životinje treba okarakterizirati s obzirom na njihovu vrstu, soj, podrijetlo, spol, tjelesnu masu i/ili dob. Životinje treba nasumce rasporediti u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Kaveze treba 
tako rasporediti da se u činci do kojih bi moglo do ći zbog položaja 
kaveza svedu na minimum. Svakoj životinji treba dodijeliti jedin ­
stveni identifikacijski broj.
 
1.4.3.  Priprema doza  
Ispitivana se tvar može davati u hrani ili vodi za pi će, oralnom 
intubacijom ili u kapsulama. Metoda oralne primjene ovisi o svrsi 
studije i fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivanog materijala.  
Prema potrebi, ispitivana se tvar otapa ili suspendira u odgovara ­
jućem nosaču. Kad god je mogu će, preporu ča se najprije razmotriti 
mogućnost primjene vodene otopine/suspenzije, zatim mogu ćnost 
primjene otopine/emulzije u ulju (npr. kukuruzno ulje), i tek na kraju mogu ćnost otapanja u ostalim nosa čima. Za sve nosa če, osim 
vode, moraju biti poznata toksi čka svojstva. Treba utvrditi stabilnost 
ispitivane tvari u uvjetima primjene.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Broj i spol  
Za ispitivanje svake visine doze treba upotrijebiti najmanje osam 
životinja ( četiri ženke i četiri mužjaka). Ako se planira usmr ćivanje 
životinja u me đuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj treba 
povećati za broj životinja predvi đen za takvo usmr ćivanje. Broj 
životinja na kraju ispitivanja mora biti dovoljan da ocjenjivanje toksičkih učinaka bude od zna čaja. Na temelju prijašnjih saznanja 
o kemikaliji ili nekom bliskom analogu, treba razmotriti mogu ćnost 
uključivanja dodatne satelitske skupine od osam životinja (po četiri 
od svakog spola) u kontrolnu skupinu i u skupinu koja će primiti 
najvišu dozu, radi opažanja reverzibilnosti ili postojanosti bilo kojega od toksičkih učinaka nakon razdoblja tretiranja. Treba utvrditi odgo ­
varajuće trajanje ovog razdoblja s obzirom na u činke koji će se 
promatrati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 410
 
1.5.2.  Doziranje  
Treba upotrijebiti najmanje tri visine doza i paralelne kontrole, osim 
u slučajevima kad se izvodi grani čni test (vidjeti 1.5.3.). Visine doza 
mogu se utvr đivati na temelju rezultata studija s ponavljanim dozama 
ili studija za utvr đivanje raspona doza, pri čemu treba uzeti u obzir 
sve postoje će toksikološke podatke i podatke o toksikokinetici koji 
se odnose na ispitivanu tvar ili srodne materijale. Ako nije ograni ­ 
čena fizikalno-kemijskim svojstvima ili biološkim djelovanjem ispi ­
tivane tvari, najvišu dozu treba odabrati s ciljem da se izazove 
toksičnost, ali ne i smrt ili velika patnja životinje. Treba odabrati 
niz sve nižih doza koje će se primjenjivati za utvr đivanje svih reak ­
cija vezanih uz doziranje, kao i dozu kod koje nema vidljivih štetnih 
učinaka (NOAEL) kao najnižu dozu. Za odre đivanje sve nižih doza 
često su najpogodniji dvostruki do četverostruki intervali i često je 
bolje dodati četvrtu pokusnu skupinu nego izme đu doziranja upotri ­
jebiti jako velike intervale (npr. iznad faktora 6-10).  
Kontrolna skupina je netretirana skupina ili skupina tretirana samo 
nosačem, ako se kod primjene ispitivane tvari koristi nosa č. Osim 
tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba 
postupati na jednak na čin kao i sa životinjama u tretiranoj skupini. 
Ako se koristi nosa č, volumen nosa ča koji primi kontrolna skupina 
treba biti jednak najve ćem upotrijebljenom volumenu. Ako se ispi ­
tivana tvar daje u hrani i time se prouzro či smanjeni unos hrane, 
korištenje paralelno hranjene kontrolne skupine životinja može se pokazati korisnim pri razlikovanju smanjenja uzrokovanog okusom od smanjenja uzrokovanog toksikološkim promjenama u ispitnom 
modelu.
 
Treba uzeti u obzir sljede ća svojstva nosa ča i drugih aditiva, ovisno 
o slučaju: djelovanje na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili 
retenciju (zadržavanje) ispitivane tvari; djelovanje na kemijska svoj ­
stva ispitivane tvari, koje može promijeniti njezina toksi čka svojstva; 
i djelovanje na unos hrane ili vode ili na stanje uhranjenosti životi ­
nja. 
1.5.3.  Grani čni test  
Ako test s jednom visinom doze koja iznosi najmanje 1 000 mg/kg 
tjelesne mase/dan, uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne 
izazove vidljive štetne u činke i ako se toksi čnost ne o čekuje na 
temelju podataka o strukturno srodnim tvarima, potpuna studija uz primjenu tri visine doza ne smatra se potrebnom. Grani čni test ne 
vrijedi samo u slu čajevima kad izloženost ljudi ukazuje na potrebu 
za primjenom više doze.
 
1.5.4.  Primjena doza  
Životinjama se ispitivana tvar dozira svakodnevno, sedam dana u 
tjednu, u razdoblju od 90 dana. U slu čaju bilo kojeg drugog 
režima doziranja, npr. pet dana u tjednu, treba dokazati njegovu 
opravdanost. U slu čaju primjene oralnom intubacijom, ispitivanu 
tvar treba primijeniti kao jednu dozu pomo ću želučane sonde ili 
odgovaraju će intubacijske kanile. Maksimalni volumen teku ćine 
koji se može primijeniti odjednom ovisi o veli čini pokusne životinje. 
Taj volumen treba biti što je mogu će manji. Osim u slu čaju nadra ­ 
žujućih ili nagrizaju ćih tvari kod kojih se štetni u činci obično javljaju 
pri višim koncentracijama, varijabilnost ispitnog volumena treba 
prilagođavanjem koncentracije svesti na najmanju mogu ću mjeru, 
kako bi se zajam čio stalni volumen pri svim visinama doza.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 411
 
Kod tvari koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane tvari o kojoj je rije č ne utječu na 
uravnoteženi unos hrane ili vode. Kad se ispitivana tvar daje u hrani, može se koristiti ili stalna koncentracija u odnosu na koli činu 
hrane (ppm) ili stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životi ­
nje; alternativa koja se koristi u pokusu mora se specificirati. U 
slučajevima kad se ispitivana tvar daje oralnom intubacijom ili u 
kapsulama, dozu treba davati svaki dan otprilike u isto vrijeme te je po potrebi prilago đavati kako bi se održala stalna visina doze u 
odnosu na tjelesnu masu životinje. Kada se prije dugotrajnog ispiti ­
vanja kroni čne toksičnosti radi 90-dnevna preliminarna studija, u 
obje studije prehrana životinja treba biti sli čna.
 
1.5.5.  Opažanja  
Opažanje bi trebalo trajati najmanje 90 dana. Životinje u satelitskoj 
skupini za koje se planira naknadno opažanje treba tijekom odgova ­
rajućeg vremenskog razdoblja držati bez tretiranja kako bi se utvrdilo 
jesu li toksi čki učinci postojani ili su se životinje od njih oporavile.  
Opća bi klini čka opažanja trebalo obavljati barem jednom dnevno, 
nabolje u isto vrijeme svakog dana, uzimaju ći u obzir vršno 
razdoblje o čekivanih u činaka nakon doziranja. Klini čko stanje živo ­
tinja treba zabilježiti. Barem dvaput dnevno, obi čno početkom i 
krajem svakog dana, sve životinje treba pregledati radi otkrivanja 
mogućih simptoma morbiditeta i mortaliteta.  
Barem jednom prije prvog izlaganja, te jednom tjedno nakon toga, 
treba obaviti detaljno klini čko opažanje stanja svih životinja (što će 
omogućiti utvrđivanje promjena u stanju istih subjekata). Ta 
opažanja treba obaviti izvan kaveza u kojem životinja ina če 
boravi, najbolje u standardnom ogra đenom prostoru i svaki put otpri ­
like u isto vrijeme. Treba poduzeti sve što je potrebno kako bi se 
osiguralo da odstupanja u uvjetima opažanja budu minimalna. Opažani simptomi trebaju obuhva ćati, ali ne biti ograni čeni na, 
promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, pojavu sekreta i ekskreta 
te aktivnost autonomnog živ čanog sustava (npr. lakrimacija (suze ­
nje), piloerekcija (naježenost dlake), veli čina zjenica, nepravilnosti u 
disanju). Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloni čkih ili toni čkih pokreta, stereotipa 
(npr. pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili bilo 
kakvog neobi čnog ponašanja.
 
Oftalmološki pregled pomo ću oftalmoskopa ili druge odgovaraju će 
opreme, treba obaviti prije primjene ispitivane tvari i po završetku 
studije, najbolje na svim životinjama ili barem u skupinama koje primaju visoke doze te u kontrolnim skupinama. Ako se otkriju promjene na o čima, treba pregledati sve životinje.
 
1.5.5.1.  Tjelesna masa i unos hrane/vode  
Sve životinje treba vagati barem jednom tjedno. Unos hrane treba 
mjeriti najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana tvar daje s vodom za pi će, treba mjeriti i unos vode, i to barem na tjednoj 
razini. Unos vode može se pratiti i u studijama koje se odnose na 
normalno hranjenje ili prisilno hranjenje na sondu, pri čemu može 
doći do promjena u unosu teku ćine.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 412
 
1.5.5.2.  Hematologija i klini čka biokemija  
Uzorke krvi treba uzeti na specificiranom mjestu i, ovisno o slu čaju, 
pohraniti u odgovaraju ćim uvjetima. Na kraju razdoblja ispitivanja 
uzorci se prikupljaju neposredno prije ili u okviru postupka usmr ­ 
ćivanja životinja.  
Na početku studije, a potom ili u mjese čnim intervalima ili sredinom 
ispitnog razdoblja i, kona čno, na kraju ispitnog razdoblja treba 
napraviti hematološke pretrage koje uklju čuju hematokrit, koncentra ­
ciju hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leuko ­
cita, broj trombocita te mjerenje potencijala zgrušavanja, odnosno vremena zgrušavanja, protrombinskog vremena ili tromboplastinskog vremena.
 
Kliničke biokemijske pretrage za utvr đivanje jakog toksi čkog djelo ­
vanja na tkiva i posebno na bubrege i jetru, treba obaviti na uzor ­
cima krvi uzetima od svih životinja na po četku, a potom ili u 
mjesečnim intervalima, ili sredinom ispitnog razdoblja i, kona čno, 
na kraju ispitnog razdoblja. Podru čja koja treba ispitati uklju čuju 
ravnotežu elektrolita, metabolizam ugljikohidrata te funkciju jetre i bubrega. Na odabir specifi čnih oblika ispitivanja utjecat će zapažanja 
o načinu djelovanja ispitivane tvari. Prije uzimanja uzoraka krvi 
preporuča se da životinje poste odre đeno vrijeme koje će ovisiti o 
životinjskoj vrsti. Preporu čene pretrage obuhva ćaju mjerenje razine 
kalcija, fosfora, klorida, natrija, kalija, glukoze natašte, alanin amino ­
transferaze, aspartat aminotransferaze, ornitin dekarboksilaze, gama 
glutamil transpeptidaze, dušika iz ureje, albumina, kreatinina u krvi, 
te mjerenje ukupne vrijednosti bilirubina i proteina u serumu.
 
Analizu urina treba napraviti najmanje na po četku, zatim oko sredine 
i, konačno, na kraju studije uz primjenu metode prikupljanja urina u 
određenim vremenskim razmacima. Analiza urina uklju čuje: izgled, 
količinu, osmolalnost ili specifi čnu težinu, pH, protein, glukozu i 
krv/krvne stanice. Ako istraživanje opaženih u činaka treba proširiti, 
prema potrebi se mogu uvesti dodatni parametri.  
Osim toga, treba razmisliti i o ispitivanju serumskih markera op ćih 
tkivnih ošte ćenja. Ostale pretrage koje mogu biti potrebne radi dono ­ 
šenja odgovaraju će toksikološke ocjene obuhva ćaju analizu lipida, 
hormona, acido-bazne ravnoteže, methemoglobina i inhibicije koli ­
nesteraze. Ako istraživanje opaženih u činaka treba proširiti, prema 
potrebi se mogu uvesti dodatne biokemijske pretrage. Njih treba 
utvrditi za kemikalije svrstane u odre đene klase opasnosti, ili od 
slučaja do slu čaja. 
Uglavnom, ovdje je potreban fleksibilan pristup, ovisno o životinj ­
skoj vrsti i opaženim i/ili o čekivanim u čincima predmetne tvari.  
1.5.5.3.  Obdukcija (makroskopska analiza)  
Sve životinje korištene u studiji moraju se podvrgnuti kompletnoj, 
detaljnoj makroskopskoj analizi koja uklju čuje pažljivi pregled 
vanjske površine tijela, svih otvora, te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. S jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, testisa, epididimisa (pasjemenika), jajnika, maternice, tiroidne 
žlijezde (štitnja če) (s paratiroidnim žlijezdama) timusa (prsne žlije ­
zde), slezene, mozga i srca svih životinja (osim onih za koje je utvrđeno da su na umoru i/ili se neplanirano usmrte tijekom 
pokusa) treba obrezati svo okolno tkivo, prema potrebi, te ih još 
mokre izvagati što prije nakon sekcije, kako bi se izbjeglo sušenje 
organa.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 413
 
Slijedeća tkiva treba sa čuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najpri ­
mjerenije i za vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled: 
sve velike lezije, mozak (reprezentativne regije, uklju čujući veliki 
mozak, mali mozak i medulu/most), le đnu moždinu (s tri podru čja: 
cervikalnog (vratnog), srednjeg torakalnog (prsnog) i lumbalnog (sla ­
binskog)), hipofizu, o či, tiroidnu žlijezdu (štitnja ču), paratiroidnu 
žlijezdu, timus (prsnu žlijezdu), jednjak, žlijezde slinovnice, želudac, tanko i debelo crijevo (uklju čujući Peyerove plo če), jetru, žu čni 
mjehur, guštera ču, bubrege, nadbubrežne žlijezde, slezenu, srce, 
dušnik i plu ća, aortu, spolne žlijezde, maternicu, pomo ćne spolne 
organe, mlije čnu žlijezdu ženke, prostatu, mokra ćni mjehur, limfne 
čvorove (po mogu ćnosti, jedan koji pokriva put unosa ispitivane 
tvari u organizam i drugi koji je udaljen od puta unosa, kako bi se 
vidjeli sistemski u činci), periferni živac (bedreni ( n. ischiadicus ) ili 
tibijalni ( n. tibialis )) po mogu ćnosti smješten uz miši ć, odsječak 
koštane srži (ili svježi aspirat koštane srži) i kožu. Klini čki i drugi 
nalazi mogu ukazati na potrebu za ispitivanjem dodatnih tkiva. Treba 
sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svoj ­
stvima ispitivane tvari smatra da bi mogli biti ciljni.
 
1.5.5.4.  Histopatologija  
Na sačuvanim organima i tkivima svih životinja iz kontrolne skupine 
i skupine tretirane visokim dozama treba napraviti kompletan histo ­
patološki pregled. Ako se kod životinja na koje su primijenjene 
visoke doze ispitivane tvari primijete promjene, tada histopatološkim pregledom treba obuhvatiti i životinje iz svih ostalih skupina.
 
Treba pregledati sve ve će lezije.  
Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki 
pregled onih tkiva i organa na kojima su kod tretiranih životinja primijećene promjene.
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Podatke treba prikazati za svaku životinju pojedina čno. Osim toga, 
najbolje ih je rezimirati u obliku tablice u kojoj za svaku pokusnu 
skupinu treba navesti broj životinja na po četku ispitivanja, broj živo ­
tinja koje su uginule ili su iz humanih razloga bile usmr ćene tijekom 
ispitivanja, vrijeme smrti ili humanog usmr ćivanja, broj životinja kod 
kojih su opaženi znakovi toksi čnosti, opis opažanih znakova toksi č­
nosti, uklju čujući vrijeme pojavljivanja, trajanje i stupanj svih toksi ­ 
čkih učinaka, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i 
postotak životinja koje pokazuju odre đene vrste lezija.  
Tamo gdje je to mogu će, sve rezultate treba analizirati uz primjenu 
odgovaraju će opće prihvatljive statisti čke metode. Statisti čke metode 
i podatke koji će se analizirati treba odabrati još u fazi planiranja 
studije.  
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 414
 
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalni oblik (agregatno stanje), čistoća i fizikalno-kemijska 
svojstva,  
— identifikacijski podaci,  
— nosač (ovisno o slu čaju): dokaz opravdanosti odabira nosa ča, ako 
se ne radi o vodi.  
2.2.2.  Vrsta pokusnih životinja:  
— korištena životinjska vrsta i soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja.  
2.2.3.  Uvjeti ispitivanja:  
— obrazloženje za odabir visina doza,  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari/pripremanju hrane, 
postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravka,  
— podaci o primjeni ispitivane tvari,  
— stvarne doze (mg/kg tjelesne težine/dan) i faktor za prera ču­
navanje koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za pi će 
(ppm) u stvarnu dozu, prema potrebi,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
2.2.4.  Rezultati:  
— tjelesna masa i promjene u tjelesnoj masi,  
— unos hrane i unos vode, prema potrebi,  
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i visini doza, uklju čujući 
znakove toksi čnosti,  
— vrsta, stupanj i trajanje opaženih klini čkih promjena (jesu li 
reverzibilne ili nisu),  
— rezultati oftalmološkog pregleda,  
— hematološka ispitivanja s relevantnim normalnim vrijednostima,  
— klinička biokemijska ispitivanja s relevantnim normalnim 
vrijednostima,  
— tjelesna masa nakon smrti, masa organa, te omjer mase organa i 
tjelesne mase,  
— nalazi obdukcije,  
— detaljni opis svih histopatoloških nalaza,  
— podaci o apsorpciji, ako postoje,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 415
 
B.28.  TEST SUBKRONI ČNE DERMALNE TOKSI ČNOSTI 
90-DNEVNO ISPITIVANJE DERMALNE TOKSI ČNOSTI 
NA GLODAVCIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana se tvar svakodnevno i u sve ve ćim dozama nanosi na kožu 
nekoliko skupina pokusnih životinja, po jedna doza po skupini tijekom 90 dana. Za vrijeme primjene životinje se svakodnevno 
promatraju radi uo čavanja simptoma toksi čnosti. Na životinjama 
koje uginu tijekom ispitivanja obavlja se obdukcija, a po završetku ispitivanja, preživjele se životinje usmr ćuju i tako đer obduciraju.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Priprema  
Životinje se drže u pokusnim uvjetima s obzirom na smještaj i hranu 
najmanje pet dana prije ispitivanja. Zdrave mlade životinje prije 
ispitivanja se nasumce odabiru i raspore đuju u skupine koje će se 
tretirati i u kontrolne skupine. Neposredno prije ispitivanja na leđnom dijelu trupa životinja ošiša se dlaka. Dlaka se može i obrijati, 
ali to se mora u činiti oko 24 sata prije po četka ispitivanja. Šišanje, 
odnosno brijanje, obi čno treba ponavljati u tjednim intervalima. Pri 
šišanju ili brijanju dlake treba paziti da se ne ošteti površina kože. Za nanošenje ispitivane tvari dlaku treba ukloniti s najmanje 10 % tjelesne površine. Kad se odlu čuje o veli čini površine s koje će 
biti uklonjena dlaka i o dimenzijama obloga treba uzeti u obzir 
tjelesnu masu životinje. Pri ispitivanju krutih tvari koje se prema potrebi mogu usitniti u prah, ispitivanu tvar treba u dovoljnoj mjeri navlažiti vodom ili, tamo gdje je to potrebno, odgovaraju ćim 
nosačem, kako bi se osigurao dobar kontakt s kožom. Teku će ispi­
tivane tvari obi čno se koriste nerazrije đene. Ispitivana tvar primje ­
njuje se pet do sedam dana tjedno.
 
1.6.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.6.2.1. P o k u s n e ž i v o t i n j e  
Može se upotrijebiti odrasli štakor, zec ili zamorac. Mogu se koristiti 
i druge vrste, ali pod uvjetom da za to postoji znanstveno opravda ­
nje. Kada se prije dugotrajnog ispitivanja preliminarno obavlja ispi ­
tivanje subkroni čne dermalne toksi čnosti, u oba ispitivanja treba 
upotrijebiti životinje iste vrste i istog soja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 416
 
1.6.2.2. B r o j i s p o l  
Za ispitivanje svake visine doze treba upotrijebiti najmanje 20 živo ­
tinja (10 ženki i 10 mužjaka). Ženke ne smiju prethodno imati potomstvo i ne smiju biti gravidne. Ako se planira usmr ćivanje 
životinja u me đuvremenu, prije završetka studije, navedeni broj 
treba pove ćati za broj životinja predvi đen za takvo usmr ćivanje. 
Osim toga, jedna satelitska skupina od 20 životinja (10 životinja svakog spola) može se 90 dana tretirati visokom dozom i nakon 
tretiranja 28 dana opažati s obzirom na reverzibilnost, trajanje ili 
odgođenu pojavu toksi čkih učinaka.
 
1.6.2.3. V i s i n e d o z a  
Potrebne su najmanje 3 visine doza s jednom kontrolom ili, ako se 
koristi otapalo, s kontrolom koju čini otapalo. Izlaganje treba trajati 
najmanje šest sati dnevno. Ispitivanu tvar treba nanositi u približno 
isto vrijeme svaki dan, uz povremena podešavanja (u tjednim ili 
dvotjednim intervalima) kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Izuzimaju ći tretiranje ispiti ­
vanom tvari, sa životinjama iz kontrolne skupine treba postupati na 
jednak na čin kao sa životinjama koje se podvrgavaju testiranju. Ako 
se radi lakšeg doziranja koristi nosa č, kontrolnoj skupini na koju se 
primjenjuje nosa č doze se daju na jednak na čin kao i tretiranim 
skupinama i one moraju primiti iste koli čine kao skupina tretirana 
najvišom dozom. Najviša doza treba izazvati toksi čke učinke, ali 
smrtnih ishoda ne smije biti ili se mogu javiti u rijetkim slu čajevima. 
Najniža doza ne bi smjela izazvati nikakve znakove toksi čkog 
učinka. Tamo gdje postoji primjenljiva procjena razine ljudske izlo ­ 
ženosti, najniža koncentracija treba biti malo viša od te procijenjene 
razine. U idealnom slu čaju, srednja bi koncentracija trebala proiz ­
vesti minimalne vidljive toksi čke učinke. Ako se koristi više od 
jedne me đudoze, one se moraju primjenjivati u intervalima kako bi 
se njihovi toksi čki učinci mogli stupnjevati. U skupinama tretiranim 
niskim i srednjim dozama i u kontrolnim skupinama, stopa smrtnosti treba biti niska da bi ocjena rezultata uop će imala smisla.
 
Ako primjena ispitivane tvari izazove tešku nadraženost kože, 
koncentracije treba smanjiti, što može dovesti do smanjenja ili 
izostanka drugih toksi čkih učinaka kod primjene visokih doza. 
Ako dođe do jakog ošte ćenja kože, možda će trebati prekinuti 
studiju i zapo četi novu s nižim koncentracijama.  
1.6.3. G r a n i č n i t e s  t 
Ako u preliminarnom ispitivanju primjena doze od 1 000 mg/kg ili 
više doze vezane uz mogu ću ljudsku izloženost, ako je poznata, ne 
proizvede nikakve toksi čke učinke, daljnje ispitivanje smatra se 
nepotrebnim.  
1.6.4. R a z d o b l j e o p a ž a n j a  
Opažanje pokusnih životinja radi otkrivanja znakova toksi čnosti 
treba provoditi svakodnevno. Vrijeme smrti kao i vrijeme pojave i 
nestanka znakova toksi čnosti treba zabilježiti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 417
 
1.6.5. P o s t u p a k  
Životinje se u kaveze smještaju pojedina čno. U idealnim uvjetima, 
životinje se tretiraju sedam dana u tjednu, kroz vremensko razdoblje od 90 dana.
 
Životinje iz bilo koje satelitske skupine koje su predvi đene za 
dodatna opažanja treba držati dodatnih 28 dana bez tretiranja kako 
bi se utvrdio oporavak od toksi čkih učinaka ili njihova trajnost. 
Izlaganje treba trajati najmanje šest sati dnevno.  
Ispitivanu tvar treba jednakomjerno nanijeti na površinu koja čini 
približno 10 % ukupne tjelesne površine. Kod jako toksi čnih tvari 
površina na koju se tvar nanosi može biti i manja, ali čim veći dio te 
površine treba prekriti što tanjim i jednakomjernijim slojem.  
Tijekom izlaganja ispitivana tvar se drži u kontaktu s kožom pomo ću 
poroznog obloga od gaze i samoljepive trake koja ne nadražuje kožu. Ispitnu površinu treba dodatno prekriti na odgovaraju ći način kako bi 
oblog i ispitivana tvar ostali na mjestu i kako bi se osiguralo da 
životinje ne mogu ispitivanu tvar unijeti oralno. Da bi se životinju 
spriječilo da ispitivanu tvar unese oralnim putem mogu se upotrije ­
biti pomagala za sputavanje, ali potpuna imobilizacija nije preporu ­ 
čena metoda.
 
Na kraju razdoblja izloženosti ostatke ispitivane tvari treba ukloniti, 
ako je mogu će vodom ili primjenom neke druge prikladne metode 
čišćenja kože.  
Sve životinje treba opažati svaki dan i bilježiti znakove toksi čnosti, 
navodeći vrijeme njihove pojave, stupanj i trajanje. Opažanje živo ­
tinja u kavezu treba obuhva ćati promjene na koži i dlaci, o čima i 
sluznicama, na dišnom i cirkulacijskom sustavu, te na autonomnom i centralnom živ čanom sustavu, kao i promjene u somatomotori čkoj 
aktivnosti i obrascu ponašanja. Unos hrane treba mjeriti na tjednoj 
osnovi i životinje treba svaki tjedan vagati. Redovito je opažanje 
životinja neophodno da bi se sprije čio gubitak životinja uslijed kani ­
balizma, autolize tkiva ili pogrešnog smještanja. Na kraju studije sve se preživjele životinje iz nesatelitskih tretiranih skupina usmr ćuju i 
podvrgavaju obdukciji. Životinje na umoru i životinje koje trpe jaki 
stres ili bol treba po uo čavanju izlu čiti, humano usmrtiti i obducirati.
 
Na kraju ispitivanja na svim životinjama, uklju čujući i kontrolne 
životinje, obavljaju se sljede ći pregledi:  
(a) oftalmološki pregled pomo ću oftalmoskopa ili druge odgovara ­
juće opreme, koji treba obaviti prije primjene ispitivane tvari i po 
završetku studije, najbolje na svim životinjama, ili barem u skupinama koje primaju visoke doze i kontrolnim skupinama. Ako se otkriju promjene na o čima, treba pregledati sve životinje;
 
(b) hematološke pretrage koje uklju čuju hematokrit, koncentraciju 
hemoglobina, broj eritrocita, ukupni i diferencijalni broj leuko ­
cita i mjerenje sposobnosti zgrušavanja koje obuhva ća vrijeme 
zgrušavanja, protrombinsko vrijeme, tromboplastinsko vrijeme, 
ili broj tromocita, treba obaviti na kraju ispitnog razdoblja;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 418
 
(c) kliničke biokemijske pretrage krvi treba obaviti na kraju ispitnog 
razdoblja. Podru čja ispitivanja koja se smatraju primjerenim za 
sve studije obuhva ćaju ravnotežu elektrolita, metabolizam uglji ­
kohidrata, funkciju jetre i bubrega. Izbor konkretnih testova koji će se obavljati ovisit će o načinu djelovanja ispitivane tvari. 
Predlaže se utvr đivanje razina kalcija, fosfora, klorida, natrija, 
kalija, glukoze natašte (uz trajanje posta primjereno predmetnoj životinjskoj vrsti) serumske glutamat-piruvat transaminaze (
 1 ), 
serumske glutamat-oksaloacetat transaminaze (  2 ), 
ornitin-dekarboksilaze, gama-glutamil-transpeptidaze, dušika u 
ureji, albumina, kreatinina u krvi, ukupnog bilirubina i ukupnih serumskih bjelan čevina. Ostale pretrage koje mogu biti potrebne 
radi donošenja odgovaraju će toksikološke ocjene obuhva ćaju 
analizu lipida, hormona, acido-bazne ravnoteže, methemoglobina 
i aktivnosti kolinesteraze. Ako istraživanje opaženih u činaka 
treba proširiti, prema potrebi se mogu uvesti dodatna klini čka 
biokemijska ispitivanja;
 
(d) pretraga urina nije dio uobi čajene prakse i obavlja se samo ako 
je indicirana na temelju o čekivane ili opažene toksi čnosti.  
Ako podaci o normalnim vrijednostima korišteni u prijašnjim poku ­
sima nisu adekvatni, treba razmotriti koje hematološke i klini čke 
biokemijske parametre treba utvrditi prije doziranja.  
O b d u k c i j a ( m a k r o s k o p s k a a n a l i z a )  
Sve životinje treba podvrgnuti kompletnoj, detaljnoj makroskopskoj 
analizi koja uklju čuje pažljivi pregled vanjske površine tijela, svih 
otvora, te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. S 
jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, testisa, sjemenovoda, timusa, 
slezene, mozga i srca svih životinja treba obrezati svo okolno tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon sekcije, kako bi se izbjeglo sušenje organa. Slijede će organe i tkiva treba čuvati u 
odgovaraju ćem mediju za mogu ći kasniji histopatološki pregled: sve 
velike lezije, mozak – uklju čujući odsječke medule/mosta, kore 
malog i velikog mozga, hipofize, štitanja če/paratiroidne žlijezde, 
tkivo prsne žlijezde, (dušnik), plu ća, srce, aortu, žlijezde slinovnice, 
jetru, slezenu, bubrege, nadbubrežne žlijezde, guštera ču, spolne žlije ­
zde, maternicu, pomo ćne spolne organe, žu čni mjehur (ako postoji), 
jednjak, želudac, dvanaesnik, tašto crijevo, vito crijevo, slijepo crijevo, debelo crijevo, rektum, mokra ćni mjehur, reprezentativni 
limfni čvor (žensku mlije čnu žlijezdu), (muskulaturu bedra), periferni 
živac, (oči), (prsnu kost s koštanom srži), (bedrenu kost – uklju čujući 
površinu zgloba), (le đnu moždinu na tri razine: vratnoj, srednjoj 
prsnoj i slabinskoj) i (eksorbitalne suzne žlijezde). Tkiva navedena 
u zagradama treba pregledati samo ako na to ukazuju znakovi toksi č­
nosti ili ako su u pitanju ciljni organi.
 
H i s t o p a t o l o š k i p r e g l e d  
(a) Kompletne histopatološke pretrage treba napraviti na normalnoj i 
tretiranoj koži i na organima i tkivima životinja iz kontrolne 
skupine i skupine tretirane visokom dozom.  
(b) Treba pregledati sve velike lezije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 419  
( 1 ) Sada poznata kao serumska alanin aminotransferaza. 
( 2 ) Sada poznata kao aspartat aminotransferaza.
 (c) Treba pregledati ciljne organe kod skupina tretiranih ostalim 
dozama.  
(d) Ako se koriste štakori, plu ća životinja iz skupina tretiranih 
niskim i srednjim dozama treba podvrgnuti histopatološkim 
pregledu radi otkrivanja dokaza o mogu ćim infekcijama, 
budući da se na taj na čin može donijeti odgovaraju ća ocjena 
zdravstvenog stanja životinja. Uobi čajena praksa ne nalaže 
daljnje histopatološke pretrage na životinjama iz tih skupina, 
ali moraju se uvijek obaviti na organima životinja iz skupine tretirane visokom dozom, na kojima su vidljivi znakovi lezija.
 
(e) Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki 
pregled onih tkiva i organa na kojima su kod ostalih tretiranih skupina primije ćene promjene.
 
2. PODACI  
Podatke treba rezimirati u obliku tablice u kojoj će za svaku testiranu 
skupinu životinja biti naveden broj životinja na po četku ispitivanja i 
broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrste lezija i za svaku 
vrstu lezija postotak životinja kod kojih su utvr đene. Dobivene rezul ­
tate treba analizirati prema odgovaraju ćoj statisti čkoj metodi. Može 
se koristiti bilo koja priznata statisti čka metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati sljede će 
informacije:  
— vrsta, soj i podrijetlo životinja, okolišni uvjeti, prehrana,  
— uvjeti ispitivanja,  
— visine doza (uklju čujući nosač, ako se koristio) i koncentracije,  
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i dozi,  
— razina kod koje nema toksi čkih učinaka, tamo gdje je to mogu će, 
— vrijeme smrti tijekom studije, odnosno podaci o preživljavanju 
životinja do kraja ispitivanja,  
— opis toksi čkih i drugih u činaka,  
— vrijeme opažanja svakog znaka abnormalnosti i daljnjih 
promjena,  
— podaci o hrani i tjelesnoj masi,  
— oftalmološki nalazi,  
— obavljena hematološka ispitivanja i svi rezultati,  
— obavljena klini čka biokemijska ispitivanja i svi rezultati (uklju ­ 
čujući rezultate svih analiza urina),  
— nalazi obdukcije,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 420
 
— detaljni opis svih histopatoloških nalaza,  
— statisti čka obrada rezultata tamo gdje je to mogu će, 
— diskusija o rezultatima.  
3.2. OCJENA I TUMA ČENJE REZULTATA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 421
 
B.29.  SUBKRONI ČNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST: 90-DNEVNA 
STUDIJA  
SAŽETAK  
Ova revidirana ispitna metoda B.29 osmišljena je za potpunu karakterizaciju 
toksičnosti ispitivane kemikalije inhalacijom u subkroni čnom trajanju (90 dana) 
te za pružanje podataka za procjenu kvantitativnog rizika od inhalacije. Skupine 
od deset mužjaka i deset ženki glodavaca izlažu se šest sati dnevno 90 dana (13 tjedana) a) ispitivanoj kemikaliji na tri ili više razina koncentracije, b) filtriranom zraku (negativna kontrola) i/ili c) nosa ču (kontrola nosa ča). Životinje se op ćenito 
izlažu pet dana tjedno, ali tako đer je dopušteno i izlaganje sedam dana tjedno. 
Uvijek se ispituju mužjaci i ženke, ali se oni mogu izlagati razli čitim razinama 
koncentracije ako je poznato da je jedan od spolova osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje. Ova metoda voditelju istraživanja omogu ćuje 
fleksibilnost uklju čivanja satelitskih (reverzibilnih) skupina, usmr ćivanja u me đu­
vremenu, bronhoalveolarnog ispiranja (BAL), neuroloških ispitivanja te dodatnih kliničko-patoloških i histopatoloških procjena s ciljem bolje karakterizacije 
toksičnosti ispitivane kemikalije.
 
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 413 (2009.). 
Originalna Smjernica za ispitivanje 413 (TG 413) usvojena je 1981 (1). Ova ispitna metoda B.29 (kao ekvivalent revidirane TG 413 (2009)) ažurirana je 
kako bi odrazila stanje znanosti te kako bi ispunila aktualne i budu će regu­
latorne potrebe.
 
2. Studije subkroni čne inhalacijske toksi čnosti primarno se primjenjuju radi 
određivanja regulatornih koncentracija za odre đivanje rizika po radnike u 
radnim uvjetima. Tako đer se primjenjuju za odre đivanje rezidencijalnih 
rizika po ljude, transport te okoliš. Ova metoda omogu ćuje karakterizaciju 
štetnih učinaka nakon ponovljenog svakodnevnog inhalacijskog izlaganja 
ispitivanoj kemikaliji tijekom 90 dana (otprilike 10 % životnog vijeka štako ­
ra). Podaci dobiveni iz studija subkroni čne inhalacijske toksi čnosti mogu se 
upotrijebiti za procjenu kvantitativnog rizika te za odabir koncentracija za 
kronične studije. Ova ispitna metoda nije specijalno namijenjena testiranju 
nanomaterijala. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog poglavlja i u Smjernici (GD) 39 (2).
 
UVODNA RAZMATRANJA  
3. Ispitni laboratorij mora u obzir uzeti sve raspoložive informacije o ispiti ­
vanoj kemikaliji prije provo đenja studije kako bi pove ćao kvalitetu istraži ­
vanja i na minimum sveo primjenu životinja. Informacije koje će pomoći u 
odabiru najprikladnijih ispitnih koncentracija mogu obuhva ćati identitet, 
kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije; 
rezultate bilo kakvih ispitivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo ; očekivanu 
uporabu i potencijal za izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksiko ­
loške podatke o tvarima srodne strukture te podatke dobivene ostalim istra ­ 
živanjima s ponovljenim izlaganjem. Ako se tijekom studije o čekuje ili uo či 
neurotoksi čnost, voditelj istraživanja može odlu čiti da obuhvati prikladne 
procjene kao što su serije funkcionalnih opažanja (FOB) te mjerenje moto ­
ričke aktivnosti. Iako odre đivanje vremena izlaganja u svezi sa specifi čnim 
ispitivanjima može biti klju čno, obavljanje tih dodatnih aktivnosti ne bi 
trebalo utjecati na osnovni plan studije.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 422
 
4. Razrije đene nagrizaju će ili nadražuju će ispitivane kemikalije mogu se ispi ­
tivati na koncentracijama koje će proizvesti željeni stupanj toksi čnosti. Za 
više informacija pogledajte GD 39 (2). Kada se životinje izlažu tim mate ­
rijalima, ciljane koncentracije moraju biti dovoljno niske da ne bi izazvale značajnu patnju ili stres, ali biti dovoljno visoke za proširenje krivulje 
koncentracije i reakcije na razine koje ispunjavaju regulatorni i znanstveni 
cilj ispitivanja. Te koncentracije treba odabirati u svakom pojedinom slučaju, najbolje na temelju odgovaraju će isplanirane studije za utvr đivanje 
raspona koja pruža informacije o kriti čnim krajnjim u čincima, pragu nadra ­ 
ženosti te vremenu pojavljivanja (vidjeti stavke 11. - 13.). Treba pružiti 
obrazloženje za odabir koncentracija.
 
5. Životinje u stanju ugibanja ili životinje koje o čito trpe bol ili pokazuju 
znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti. Životinje u stanju ugibanja 
uzimaju se u obzir jednako kao i životinje koje uginu pri ispitivanju. Krite ­
riji za odlu čivanje o usmr ćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško 
pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijete će smrti predmet su 
Smjernice za humano usmr ćivanje br. 19 OECD-a (3).  
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
6. Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle glodavce sojeva koji se obi čno 
koriste u laboratorijima. Prednost se daje vrsti štakora. U slu čaju primjene 
drugih vrsta treba priložiti obrazloženje.  
Priprema životinja  
7. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. 
Na dan nasumi čnog odabira životinje moraju biti mlade odrasle jedinke u 
dobi izme đu sedam i devet tjedana. Tjelesna masa mora biti u rasponu 
± 20 % prosje čne mase svakog spola. Životinje se nasumi čno odabiru, 
označavaju radi pojedina čne identifikacije te drže u kavezima najmanje 
pet dana prije po četka ispitivanja kako bi im se omogu ćila aklimatizacija 
na laboratorijske uvjete.  
Uzgoj životinja  
8. Životinje treba pojedina čno identificirati, po mogu ćnosti potkožnim tran ­
sponderima, kako bi se olakšalo opažanje i izbjegla zamjena. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. 
Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 
70 % iako to možda ne će biti mogu će kad se kao nosa č primjenjuje voda. 
Prije i nakon izlaganja životinje op ćenito treba smjestiti u kaveze u skupi ­
nama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati 
jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici 
zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizi čki, toplinski ili 
imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje 
učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog 
volumena. Ako su dostupni generi čki podaci koji pokazuju da se takve 
promjene ne doga đaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prila ­
godba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene 
aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedina čno kako bi se sprije čilo 
da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, 
osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograni čenom zalihom javne pitke 
vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 423
 
Komore za inhalaciju  
9. Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemi ­
kalije i predmet ispitivanja. Prednost se daje metodi izlaganja samo nosom (koja uklju čuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo 
nosom op ćenito se daje prednost za ispitivanja teku ćih ili krutih aerosola 
te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje posti ći uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba oprav ­
dati u izvješ ću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u 
slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja 
ne smije premašiti 5 % volumena komore. Na čela tehnika izlaganja samo 
nosom i čitavim tijelom te njihove specifi čne prednosti i nedostaci navedeni 
su u GD 39 (2).
 
STUDIJE TOKSI ČNOSTI  
Granične koncentracije  
10. Za razliku od akutnih studija, u studijama subkroni čne inhalacijske toksi č­
nosti nema odre đenih grani čnih koncentracija. Maksimalna ispitna koncen ­
tracija treba uzeti u obzir: 1) maksimalnu koncentraciju koja se može postići, 2) razinu za izlaganje ljudi s „najgorim scenarijem ”, 3) potrebu 
za održavanjem odgovaraju će opskrbe kisikom i/ili 4) pretpostavke za 
dobrobit životinja. U nedostatku ograni čenja na temelju podataka mogu se 
upotrijebiti akutne granice iz Uredbe (EZ) br. 1272/2008 (13) (tj. do maksi ­
malne koncentracije od 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za pare i 20 000 ppm za 
plinove); vidjeti GD 39 (2). Ako je potrebno premašiti te granice pri ispi ­
tivanju plinova ili vrlo hlapljivih ispitivanih kemikalija (npr. rashladnih sredstava), treba priložiti obrazloženje. Grani čna koncentracija trebala bi 
izazvati nedvojbenu toksi čnost, a da pritom ne izazove pretjerani stres za 
životinje ili utje če na njihovu dugovje čnost (3).
 
Studija za utvr đivanje raspona  
11. Prije po četka glavne studije op ćenito je potrebno provesti studiju za utvr ­ 
đivanje raspona. Studija za utvr đivanje raspona opsežnija je od preliminarne 
studije jer nije ograni čena na odabir koncentracije. Znanje prikupljeno u 
studiji za utvr đivanje raspona može dovesti do uspješne glavne studije. 
Studija za utvr đivanje raspona može, primjerice, pružiti tehni čke informacije 
u svezi s analiti čkim metodama, odre đivanjem veli čine čestica, otkrivanjem 
toksičnih mehanizama, klini čko-patološkim i histopatološkim podacima i 
procjenama mogu ćih NOAEL i MTC koncentracija u glavnoj studiji. Vodi ­
telj istraživanja može odlu čiti primijeniti studiju za utvr đivanje raspona radi 
identifikacije praga nadraženosti respiratornog trakta (npr. s histopatologijom respiratornog trakta, ispitivanjem plu ćnih funkcija ili bronhoalveolarnim 
ispiranjem), gornje koncentracije koja se tolerira bez prekomjernog stresa 
za životinje i parametara koji će najbolje okarakterizirati toksi čnost ispiti ­
vane kemikalije.
 
12. Studija za utvr đivanje raspona može obuhva ćati jednu ili više razina koncen ­
tracije. Ovisno o odabranim krajnjim u čincima, tri do šest mužjaka i tri do 
šest ženki treba izložiti svakoj razini koncentracije. Studija za utvr đivanje 
raspona treba trajati najmanje pet dana i op ćenito ne dulje od 28 dana. U 
izvješću o studiji treba pružiti argumentaciju za odabir koncentracije za 
glavnu studiju. Cilj glavne studije jest pokazati odnos koncentracije i reak ­
cije temeljen na o čekivanjima za najosjetljiviji krajnji u činak. Niska koncen ­
tracija idealno bi trebala biti koncentracija s neopaženim štetnim u čincima 
dok visoka koncentracija treba izazvati nedvojbenu toksi čnost bez izazivanja 
pretjeranog stresa za životinje ili bez utjecaja na njihovu dugovje čnost (3).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 424
 
13. Pri odabiru razina koncentracije za studiju za utvr đivanje raspona u obzir 
treba uzeti sve raspoložive informacije uklju čujući odnose strukture i aktiv ­
nosti te podatke za sli čne kemikalije (vidjeti stavak 3.). Studija za utvr ­ 
đivanje raspona može potvrditi/opovrgnuti mehanisti čki utemeljene krajnje 
učinke koje se smatra najosjetljivijima, npr. inhibiciju kolinesteraze organo ­
fosfatima, formaciju methemoglobina eritrocitotoksi čnim agensima, hormone 
štitnjače (T  3 , T 4 ) za tirotoksikante, proteine, LDH ili neutrofile u bronhoal ­
veolarnom ispiranju za neškodljive, slabo topljive čestice ili aerosole koji 
nadražuju plu ća. 
Glavna studija  
14. Glavna studija subkroni čne toksičnosti općenito obuhva ća tri razine koncen ­
tracije, kao i, po potrebi, paralelnu negativnu kontrolu (zrak) i/ili kontrolu 
nosača (vidjeti stavak 18.). Sve raspoložive podatke treba upotrijebiti kao 
pomoć pri odabiru odgovaraju ćih razina izlaganja, uklju čujući rezultate 
sustavnih studija toksi čnosti, metabolizma i kinetike (poseban naglasak 
treba staviti na izbjegavanje visokih razina koncentracije koje zasi ćuju 
kinetičke procese). Svaka ispitna skupina sadrži deset mužjaka i deset 
ženki glodavaca koji se izlažu ispitivanoj kemikaliji šest sati dnevno pet dana tjedno u razdoblju od 13 tjedana (ukupno trajanje studije najmanje 90 dana). Životinje se mogu tako đer izlagati i sedam dana tjedno (npr. kada se 
ispituju inhalirani lijekovi). Ako je za jedan od spolova poznato da je osje ­
tljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje, spolovi se mogu izlagati različitim razinama koncentracije kako bi se optimizirao odnos koncentracije 
i reakcije, kao što je opisano u stavku 15. Ako izlaganju samo nosom nisu 
izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba 
prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. Ako 
se primjenjuje izlaganje kra će od šest sati dnevno ili ako je potrebno 
provesti dugotrajno izlaganje (npr. 22 sata dnevno) u sklopu studije izla ­
ganja čitavim tijelom (vidjeti GD 39 (2)), treba pružiti argumente. Tijekom 
izlaganja treba obustaviti davanje hrane osim ako izlaganje nije dulje od šest sati. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
 
15. Odabrane ciljane koncentracije moraju identificirati ciljni(-e) organ(-e) i 
pokazati jasan odnos koncentracije i reakcije:  
— Visoka razina koncentracije trebala bi rezultirati toksi čnim učincima, ali 
ne izazvati znakove dugotrajnosti ili smrtnosti koji bi sprije čili suvislu 
ocjenu.  
— Srednju(-e) razinu(-e) koncentracije trebalo bi prorijediti kako bi se 
proizvelo stupnjevanje toksi čnih učinaka izme đu visoke i niske 
koncentracije.  
— Niska koncentracija treba pružiti malo ili nimalo dokaza o toksi čnosti.  
Usmrćivanje u me đuvremenu  
16. Ako se planiraju usmr ćivanja u me đuvremenu, broj životinja na svakoj 
razini izlaganja treba pove ćati za broj životinja usmr ćenih prije završetka 
studije. Treba navesti argumentaciju za primjenu usmr ćivanja u me đuvre­
menu i valja ga prikladno razjasniti statisti čkim analizama.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 425
 
Satelitska (reverzibilna) studija  
17. Satelitska (reverzibilna) studija može se primijeniti kako bi se promatrala 
reverzibilnost, postojanost ili zakašnjelo pojavljivanje toksi čnosti u razdoblju 
nakon tretiranja, odgovaraju ćeg trajanja, ali ne kra ćeg od 14 dana. Satelitske 
(reverzibilne) skupine sastoje se od deset mužjaka i deset ženki koji se 
izlažu istodobno s pokusnim životinjama u glavnoj studiji. Skupine za sate ­
litsku (reverzibilnu) studiju treba izlagati ispitivanoj kemikaliji na najvišoj razini koncentracije i moraju se provoditi paralelne kontrole zraka i/ili 
nosača (vidjeti stavak 18.).
 
Kontrolne životinje  
18. Sa životinjama iz paralelnih negativnih kontrola (zrak) treba postupati na 
jednak na čin kao i sa životinjama iz ispitne skupine osim što ih se izlaže 
filtriranom zraku, a ne ispitivanoj kemikaliji. Ako se voda ili druga tvar 
primjenjuje kao pomo ć u stvaranju ispitne atmosfere, u studiju treba uklju ­ 
čiti kontrolni nosa č umjesto negativne (zrak) kontrolne skupine. Kada god je 
to moguće, kao nosa č treba upotrebljavati vodu. Kada se kao nosa č koristi 
voda, životinje iz kontrolne skupine treba izlagati zraku jednake relativne 
vlažnosti kao i izložene skupine. Odabir prikladnog nosa ča treba se temeljiti 
na prikladno provedenoj predstudiji ili povijesnim podacima. Ako nije poznata toksi čnost medija, voditelj istraživanja može odlu čiti da upotrijebi 
negativnu (zrak) kontrolu i kontrolu nosa ča, ali to se izri čito destimulira. 
Ako povijesni podaci pokažu da nosa č nije toksi čan, nema potrebe za nega ­
tivnom (zrak) kontrolnom skupinom i treba rabiti samo kontrolu nosa ča. 
Ako predstudija ispitivane kemikalije formulirane u nosa ču ne pokaže 
nikakvu toksi čnost, znači da nosa č nije toksi čan u ispitnoj koncentraciji te 
stoga ne treba provoditi kontrolu nosa ča.
 
UVJETI IZLAGANJA  
Primjena koncentracija  
19. Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili 
njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o 
fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranim koncentra ­
cijama i/ili fizikalnom stanju koje je obi čno prisutno tijekom manipulacije 
ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reak ­
tivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehani čkim procesima radi smanjenja 
veličine čestica. Ostale upute nalaze se u GD 39 (2).
 
Distribucija veli čine čestica  
20. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogu ćilo izlaganje svih rele ­
vantnih podru čja respiratornog trakta, preporu ča se aerosol sa srednjim aero ­
dinamičkim promjerom čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 3 μm s geome ­
trijskom standardnom devijacijom ( σ g ) u rasponu od 1,5 do 3,0 (4). Iako 
treba učiniti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se ne mogu 
postići, treba podnijeti stru čno mišljenje. Primjerice, metalne čestice u ispa ­
rini mogu biti manje od tog standarda, a napunjene čestice i vlakna mogu 
biti veći. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 426
 
Priprema ispitivane kemikalije u nosa ču 
21. Idealno bi bilo da se ispitivana kemikalija ispituje bez nosa ča. Ako je 
potrebno primijeniti nosa č za stvaranje odgovaraju će koncentracije ispitivane 
tvari i veli čine čestica, prednost treba dati vodi. Kad god se ispitivana 
kemikalija otapa u nosa ču, treba dokazati njegovu stabilnost.  
PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA  
Protok zraka u komori  
22. Protok zraka u komori za izlaganje treba pažljivo kontrolirati, neprestano 
nadzirati te bilježiti najmanje jedanput u sat vremena tijekom svakog izlaga ­
nja. Nadziranje koncentracije (ili privremene stabilnosti) u ispitnoj atmosferi, provedeno u stvarnom vremenu, sastavna je mjera svih dinami čkih parame ­
tara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara 
dinamičke inhalacije. Ako se koncentracija nadzire u stvarnom vremenu, 
učestalost mjerenja protoka zraka može se smanjiti na jedno mjerenje po 
izlaganju dnevno. Posebnu pozornost treba obratiti na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom. Koncentracija 
kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne 
smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takav standard ne može posti ći, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida. Ako 
mjerenja prvog dana izlaganja pokažu da su plinovi na pravilnoj razini, nisu 
potrebna daljnja mjerenja.
 
Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori  
23. Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost 
zraka u podru čju udisanja životinja za izlaganje samo nosom i čitavim 
tijelom treba neprestano nadzirati i bilježiti svakoga sata tijekom svakog izlaganja kad je to mogu će. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi po mogu ć­
nosti održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemogu će (npr. u 
slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na 
ispitivanu kemikaliju pomo ću ispitne metode.
 
Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija  
24. Kad god je to mogu će, treba izra čunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u 
komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav 
komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja 
životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u u činkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može 
upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
 
Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija  
25. Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije uzorkovana u 
zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarne koncentracije mogu 
se dobiti specifi čnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim 
ili kemijskim reaktivnim metodama te analiti čkom karakterizacijom nakon 
toga)ili nespecifi čnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. 
Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo 
jednom komponentom u prahu ili aerosole teku ćina niskog stupnja hlaplji ­
vosti i treba je podržati odgovaraju ćom preliminarnom karakterizacijom  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 427
 
specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se 
odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to 
su potrebni analiti čki podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se 
prenosi zrakom sli čan početnom materijalu. Ako ta informacija nije 
dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u 
stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. 
Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze.
 
26. Ako je mogu će, tijekom trajanja studije treba upotrijebiti jednu partiju ispi ­
tivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će 
biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije po četka studije 
treba odrediti svojstva ispitivane kemikalije, uklju čujući njezinu čistoću i, 
ako je tehni čki izvedivo, identitet te koli čine identificiranih kontaminiraju ćih 
tvari i ne čistoća. To se može pokazati sljede ćim podacima, ali nije ograni ­ 
čeno na njih: vrijeme zadržavanja i relativno vršno podru čje, molekulska 
masa iz spektroskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sli čnih 
procjena. Iako identitet ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog labo ­
ratorija, za laboratorij može biti mudro barem u ograni čenim okvirima 
potvrditi naru čiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalno stanje itd.).  
27. Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je god mogu će. 
Uređaj za nadzor u stvarnom vremenu, kao što je fotometar za aerosol ili 
uređaj za analizu ukupnih ugljikovodika za paru može se upotrijebiti za 
dokazivanje stabilnosti uvjeta izlaganja. Stvarnu koncentraciju u komori treba mjeriti najmanje tri puta tijekom svakog dana izlaganja za svaku razinu izlaganja. Ako to nije izvedivo zbog ograni čenog protoka zraka ili 
niskih koncentracija, prihvatljiv je jedan uzorak po razdoblju izlaganja. 
Uzorak se u idealnom slu čaju uzima tijekom cijelog razdoblja izlaganja. 
Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije 
u komori odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare i ne za više od 
± 20 % za teku ćine ili kruti aerosol. Treba izra čunati i zabilježiti vrijeme za 
postizanje ravnoteže u komori (t
 95 ). Trajanje izlaganja zahva ća vrijeme 
proizvodnje ispitivane kemikalije. Pritom se vodi ra čuna o vremenu 
potrebnom za postizanje ravnoteže u komori (t  95 ) i vremenu raspada. Smjer ­
nica za procjenu t  95 može se prona ći u GD 39 (2).  
28. Za vrlo složene smjese sastavljene od plinova/para i aerosola (npr. zapaljive 
atmosfere i i ispitivane kemikalije izba čene iz namjenskih proizvoda/ure đaja 
za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati druk čije u komori za inha ­
laciju. Stoga treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obi čno 
glavni aktivni sastojak smjese, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispi ­
tivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analiti čkoj koncentraciji ukupne 
smjese, a ne samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne 
informacije o stvarnim koncentracijama mogu se prona ći u GD 39 (2).  
Ispitivana kemikalija: Distribucija veli čine čestica  
29. Distribuciju veli čine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje jedanput 
tjedno za svaku razinu koncentracije uporabom kaskadnog impaktora ili alternativnog instrumenta poput ure đaja za aerodinami čku analizu veli čine 
čestica (APS). Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim 
impaktorom i alternativnim instrumentom ekvivalentni, u studiji se može 
upotrebljavati alternativni instrument.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 428
 
30. Drugi ure đaj, poput gravimetrijskog filtra ili ure đaja za sudaranje/ure đaja za 
mjerenje mjehuri ća plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instru ­
mentom kako bi se potvrdila u činkovitost skupljanja primarnog instrumenta. 
Koncentracija mase dobivena analizom veli čine čestica trebala bi biti u 
razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom 
[vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati na svim koncen ­
tracijama ispitanima u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se minimalizirali nedefinitivni podaci koji mogu izazvati potrebu 
za ponavljanjem studije.
 
31. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva 
mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako su u 
čestice otkrivene u atmosferi pare s potencijalom za miješane faze.  
OPAŽANJA  
32. Životinje treba klini čki promatrati prije, tijekom i nakon razdoblja izlaganja. 
Češća opažanja mogu biti potrebna ovisno o reakciji životinja tijekom izla ­
ganja. Ako primjena cijevi koje sputavaju, slabo osvijetljenih komora za 
čitavo tijelo ili neprozirna atmosfera ometaju opažanje na životinjama, 
opažanje treba pažljivo obaviti nakon izlaganja. Opažanja prije izlaganja sljedećeg dana mogu ocijeniti reverzibilnost ili pogoršanje toksi čnih učinaka.
 
33. Sva se opažanja bilježe u pojedina čnim evidencijama za svaku životinju. 
Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se prona đe uginule, 
vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je mogu će preciznije.  
34. Opažanja u kavezu moraju uklju čivati promjene na koži i krznu, o čima i 
sluznicama te promjene u dišnom i cirkulacijskom sustavu, promjene u živčanom sustavu te promjene u somatomotori čkoj aktivnosti i uzorcima 
ponašanja. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, saliva ­
cije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može 
pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom. U protokol studije mogu se uklju čiti 
i dodatna odre đivanja, kao što su kinetika, biološki monitoring, funkcija 
pluća, retencija slabo topljivih materijala koji se nakupljaju u plu ćnom 
tkivu te promjene u ponašanju.
 
TJELESNA MASA  
35. Pojedina čnu masu životinja treba zabilježiti kratko prije prvog izlaganja (0. 
dan) te zatim dvaput tjedno (na primjer: petkom i ponedjeljkom kako bi se 
dokazao oporavak preko vikenda bez izlaganja ili u vremenskim intervalima 
kako bi se omogu ćilo utvrđivanje sistemske toksi čnosti) te u vrijeme 
ugibanja ili usmr ćivanja. Ako u prva četiri tjedna nema u činaka, tijekom 
ostatka studije tjelesna se masa može mjeriti jedanput tjedno. Satelitske 
(reverzibilne) životinje (ako se koriste) treba nastaviti vagati jedanput 
tjedno tijekom čitavog razdoblja oporavka. Na kraju istraživanja sve živo ­
tinje treba izvagati kratko prije usmr ćenja kako bi se omogu ćilo nepristrano 
određivanje odnosa mase organa i tjelesne mase.  
UNOS HRANE I VODE  
36. Unos hrane treba mjeriti jedanput tjedno. Tako đer se može mjeriti i unos 
vode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 429
 
KLINIČKA PATOLOGIJA  
37. Klini čko-patološke pretrage treba obaviti za sve životinje uklju čujući 
kontrolnu i satelitsku (reverzibilnu) skupinu u trenutku usmr ćivanja. Treba 
zabilježiti vremensko razdoblje izme đu kraja izlaganja i prikupljanja krvi, 
posebno ako je rekonstrukcija ciljanog krajnjeg u činka brza. Uzorkovanje 
nakon završetka izlaganja indicirano je za parametre s kratkim poluvre ­
menom plazme (npr. COHb, CHE, i MetHb).  
38. U tablici 1. navedeni su klini čko-patološki parametri koji se op ćenito traže 
za sva toksikološka ispitivanja. Analiza urina ne traži se rutinski, ali se može 
provesti ako se smatra korisnom na temelju o čekivane ili opažene toksi čno­
sti. Voditelj istraživanja može odlu čiti da odredi i dodatne parametre radi 
bolje karakterizacije toksi čnosti ispitivane kemikalije (npr. kolinesterazu, 
lipide, hormone, ravnotežu kiselina i lužina, methemoglobin ili Heinzova 
tjelešca, kreatin kinazu, omjer mijeloida i eritroida, troponin, plinove u 
arterijskoj krvi, laktat dehidrogenazu, sorbitol dehidrogenazu, glutamat dehi ­
drogenazu i gama glutamil transpeptidazu).  
Tablica 1.  
Standardni klini čko-patološki parametri  
Hematologija  
Broj eritrocita 
Hematokrit Koncentracija hemoglobina 
Prosječna masa hemoglobina 
Prosječni volumen eritrocita 
Prosječna koncentracija hemoglobina u 
eritrocitima 
Retikulociti
 Ukupni broj leukocita 
Diferencijalni broj leukocita Broj trombocita 
Vrijeme zgrušavanja (odabrati 
jedno): 
— Protrombinsko vrijeme 
— Vrijeme zgrušavanja 
— Parcijalno tromboplastinsko 
vrijeme
 
Klinička kemija  
Glukoza (*) 
Ukupni kolesterol Trigliceridi 
Dušična urea u krvi 
Ukupni bilirubin Kreatinin Ukupni proteini 
Albumini 
Globulini
 Alanin aminotransferaza 
Aspartat aminotransferaza Alkalna fosfataza 
Kalij 
Natrij Kalcij Fosfor 
Kloridi
 
Analiza urina (opcija)  
Izgled (boja i zamu ćenost) 
Volumen 
Specifična težina ili osmolalnost 
pH Ukupni proteini 
Glukoza 
Krv/krvne stanice  
(*) Budu ći da dulji post može izazvati pristranost u mjerenju glukoze za tretirane i 
kontrolne životinje, voditelj istraživanja treba odrediti trebaju li životinje postiti. 
Ako se primjenjuje razdoblje posta, ono treba biti primjereno korištenim vrstama; 
za štakore to može biti 16 h (post preko no ći). Određivanje glukoze u razdoblju 
posta može se provesti nakon prekono ćnog posta u zadnjem tjednu izlaganja ili 
nakon prekono ćnog posta prije obdukcije (u posljednjem slu čaju zajedno sa svim 
ostalim klini čko-patološkim parametrima).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 430
 
39. Ako postoji dokaz da je donji respiratorni trakt (tj. alveole) primarno mjesto 
taloženja i retencije, bronhoalveolarno ispiranje (BAL) može biti tehnika 
izbora za kvantitativnu analizu hipotetski utemeljenih parametara u činka 
doze fokusiranih na alveolitis, upalu plu ća i fosfolipidozu. To omogu ćuje 
prikladno i temeljito istraživanje promjena u ozljedama na alveolama pove ­
zanih s reakcijama na dozu i protok vremena. Teku ćina za BAL mora se 
analizirati radi ukupnog i diferencijalnog broja leukocita, ukupnog broja proteina i laktat dehidrogenaze. Drugi parametri koji se mogu uzeti u obzir jesu parametri indikativni za lizosomalne bolesti, fosfolipidozu te 
iritacijske ili alergijske upale koje mogu uklju čivati odre đivanje proupalnih 
citokineza/kemokineza. Mjerenja BAL obi čno upotpunjuju rezultate histopa ­
toloških pretraga, ali ih ne mogu zamijeniti. Upute za provo đenje ispiranja 
pluća nalaze se u GD 39 (2).
 
OFTALMOLOŠKI PREGLED  
40. Primjenom oftalmoskopa ili ekvivalentnog ure đaja treba obaviti pregled 
fundusa, refrakcijskih medija, šarenice i konjunktive za sve životinje prije 
primjene ispitivane kemikalije te za sve na skupine izložene visokoj koncen ­
traciji i kontrolne skupine na kraju. Ako se otkriju promjene u o čima, treba 
pregledati sve životinje u ostalim skupinama uklju čujući satelitsku (reverzi ­
bilnu) skupinu.  
MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA I MASA ORGANA  
41. Sve pokusne životinje, uklju čujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule 
ili su uklonjene iz studije radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti kompletnim pretragama (ako je izvedivo) i makroskopskoj analizi. Treba zabilježiti 
vrijeme izme đu kraja posljednjeg izlaganja svake životinje i njezina usmr ­ 
ćivanja. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkri ća 
uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju 
treba provesti što je mogu će prije, obi čno u roku od jednog ili dva dana. Za 
svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
 
42. U tablici 2. nalazi se popis organa i tkiva koje tijekom makroskopske 
analize treba sa čuvati u odgovaraju ćem mediju radi histopatoloških pretraga. 
Čuvanje [to čno određenih] organa i tkiva te drugih organa i tkiva prepušteno 
je voditelju istraživanja.  Masno otisnute  organe treba obrezati i izvagati što 
je moguće prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo njihovo sušenje. Štitnja ču 
i epididimise treba izvagati samo ako je potrebno jer obrezivanje artefakata može sprije čiti histopatološku procjenu. Tkiva i organe treba fiksirati u 
puferiranom 10 % formalinu ili drugom prikladnom fiksativu odmah 
nakon provedene obdukcije, i to, dakle, ne kra će od 24 - 48 sati prije 
obrezivanja ovisno o primijenjenom fiksativu.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 431
 
Tablica 2.  
Organi i tkiva sa čuvani tijekom makroskopske analize  
Nadbubrežne žlijezde  
Aorta  
Koštana srž (i/ili svježi aspirat)  
Mozak  (uključujući sekcije velikog i malog 
mozga te medule/mosta)  
Cekum  
Debelo crijevo  
Dvanaesnik  
[Epididimisi ] 
[Oči (mrežnica, o čni živac) i o čni kapci]  
Bedrena kost i zglob koljena  
Žučni mjehur (ako postoji)  
[Harderove žlijezde]  
Srce  
Ileum  
Jejunum  
Bubrezi  
[Suzne žlijezde (ekstraorbitalne)]  
Grkljan (3 razine uklju čujući bazu epiglotisa)  
Jetra  
Pluća (svi režnjevi na jednoj razini, uklju ču­
jući glavni bronh)  
Limfni čvorovi iz hilarne regije plu ća, 
posebno za slabo topljive ispitivane kemika ­
lije u česticama. Za dublje pretrage i/ili istra ­ 
živanja s imunološkim fokusom u obzir se 
mogu uzeti dodatni limfni čvorovi, npr. iz 
medijastinalne, cervikalne/submandibularne i/ili aurikularne regije.
 
Limfni čvorovi (udaljeni od ulaza)  
Mliječne žlijezde (ženske)  
Mišić (bedro)  
Nazofaringealna tkiva (najmanje 4 razine: 1 
razina za uklju čivanje nazofaringealnog 
kanala i nazalno limfati čko tkivo (NALT))  Jednjak  
[Olfaktorni bulbus]  
Jajnici  
Gušterača 
Paraštitna žlijezda  
Periferni živac (bedreni ili tibijalni, po 
mogućnosti blizu miši ća) 
Hipofiza  
Prostata  
Rektum  
Žlijezde slinovnice  
Sjemenski mjehuri ći 
Koža  
Kralježnica (vratna, srednja prsna i slabin ­
ska) 
Slezena  
Prsna kost  
Želudac  
Zubi  
Testisi  
Timus  
Štitne žlijezde  
[Jezik]  
Dušnik (najmanje 2 razine uklju čujući 1 
longitudinalnu sekciju kroz greben i 1 tran ­
sverzalnu sekciju)  
[Mokraćovod]  
[Mokraćna cijev]  
Mokraćni mjehur  
Maternica  
Organi mete  
Sve makroskopske lezije i mase  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 432
 
43. Pluća treba ukloniti netaknuta, izvagati te polako nalijevati prikladnim fiksa ­
tivom pod tlakom od 20 - 30 cm vode kako bi se osiguralo održanje 
strukture plu ća (5). Sekcije treba prikupiti za sve režnjeve jedne razine, 
uključujući glavni bronh, ali ako je provedeno ispiranje plu ća, neisprani 
režanj treba secirati na tri razine (ne serijske sekcije).  
44. Treba ispitati najmanje četiri razine nazofaringealnih tkiva, a jedna od njih 
mora uklju čivati nazofaringealni kanal (5) (6) (7) (8) (9) kako bi se omogu ­ 
ćilo potpuno ispitivanje ljuskavog, tranzicijskog (necilijarnog respiratornog), 
respiratornog (cilijarnog respiratornog) i olfaktornog epitela te drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Treba ispitati tri razine grkljana, a jedna 
od njih mora obuhva ćati bazu epiglotisa (12). Treba ispitati najmanje dvije 
razine dušnika uklju čujući jednu longitudinalnu sekciju kroz greben mjesta 
razdvajanja ekstrapulmonalnog bronha te jednu transverzalnu sekciju.
 
HISTOPATOLOGIJA  
45. Treba provesti histopatološku procjenu svih organa i tkiva navedenih u 
tablici 2. za kontrolnu skupinu i skupinu izloženu visokoj koncentraciji te 
za sve životinje koje uginu ili su usmr ćene tijekom studije. Posebnu pozor ­
nost treba posvetiti respiratornom traktu, organima metama te makroskop ­
skim lezijama. Organe i tkiva s lezijama u skupini izloženoj visokoj koncen ­
traciji treba ispitati u svim skupinama. Voditelj istraživanja može odlu čiti 
provesti histopatološke pretrage za dodatne skupine kako bi dokazao jasnu 
reakciju na koncentraciju. Ako se upotrebljava satelitska (reverzibilna) skupina, histopatološku procjenu treba provesti na svim tkivima i organima 
za koje je u tretiranim skupinama utvr đeno da pokazuju u činke. U slu čaju 
pojavljivanja prekomjernog broja uginulih životinja ili drugih problema u skupini izloženoj visokoj koncentraciji, koje kompromitiraju zna čenje poda ­
taka, histopatološku analizu treba provesti na sljede ćoj nižoj koncentraciji. 
Treba pokušati povezati makroskopska opažanja s mikroskopskim nalazima.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
46. Treba navesti individualne podatke o tjelesnoj masi, potrošnji hrane, klini ­ 
čkoj patologiji, makroskopskoj patologiji, masi organa te histopatologiji. 
Podatke prikupljene klini čkim promatranjem treba skupiti u obliku tablice, 
prikazuju ći za svaku ispitnu skupinu broj upotrijebljenih životinja, broj 
životinja koje pokazuju specifi čne znakove toksi čnosti, broj životinja koje 
su tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz humanih razloga, 
vrijeme uginu ća pojedinih životinja, opis i vremenski tijek te reverzibilnost 
toksičnih učinaka i nalaze obdukcije. Sve rezultate, kvantitativne i popratne, 
treba ocijeniti odgovaraju ćom statisti čkom metodom. Može se upotrijebiti 
bilo koja op će prihvaćena statisti čka metoda, a statisti čke metode treba 
odabrati tijekom planiranja studije.  
Izvješće o ispitivanju  
47. Izvješ će o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljede će 
informacije:  
Pokusne životinje i njihov uzgoj  
— Opis uvjeta u kavezu, uklju čujući: broj (ili promjenu broja) životinja u 
svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka 
u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 433
 
— Korištena vrsta/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora. 
Mogu se navesti podrijetlo i povijesni podaci ako potje ču od životinja 
izloženih u sli čnim uvjetima izlaganja, smještaja i posta.  
— Broj, dob i spol životinja.  
— Metoda nasumi čnog odabira.  
— Opis svih kondicioniranja prije ispitivanja, uklju čujući prehranu, karan ­
tenu i lije čenje bolesti.  
Ispitivana kemikalija  
— Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva 
(uključujući izomerizaciju).  
— Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract 
Services (CAS) ako je poznat.  
Nosač 
— Obrazloženje za uporabu nosa ča i obrazloženje za odabir nosa ča (ako 
nije voda).  
— Povijesni ili odgovaraju ći podaci koji pokazuju da nosa č ne ometa rezul ­
tate studije.  
Komora za inhalaciju  
— Detaljan opis komore za inhalaciju, uklju čujući volumen i dijagram.  
— Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje 
atmosfere.  
— Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veli čine čestica te stvarne 
koncentracije.  
— Izvor zraka i sustav za klimatizaciju.  
— Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene 
atmosfere za ispitivanje.  
— Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna).  
— Otvori za izlaganje po komori (samo nos); lokacija životinja u sustavu 
(čitavo tijelo).  
— Stabilnost ispitne atmosfere.  
— Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmos ­
fere u komori.  
— Tretiranje dovodnog/ekstrahiranog zraka.  
— Količina protoka zraka, otvor za koli činu protoka zraka po izlaganju 
(samo nos) ili dovod životinja po komori ( čitavo tijelo).  
— Vrijeme za postizanje ravnoteže u komori za inhalaciju (t95).  
— Broj promjena u volumenu po satu.  
— Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo).  
Podaci o izlaganju  
— Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnoj studiji.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 434
 
— Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u 
komori za inhalaciju podijeljena volumenom zraka koji je prošao kroz 
komoru).  
— Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za 
smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) 
svaka se može analizirati odvojeno.  
— Sve koncentracije zraka treba navesti u jedinicama mase (mg/l, mg/m  3 
itd.), a ne u jedinicama volumena (ppm, ppb itd.).  
— Distribucija veli čine čestica, srednji aerodinami čki promjer 
čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija ( σ g ) uključujući 
metode za njihov izra čun. Treba prikazati pojedina čne analize veli čine 
čestica.  
Uvjeti ispitivanja  
— Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uklju čujući i detalje o svim 
postupcima korištenima za smanjenje veli čine čestica krutih tvari ili za 
pripremu otopina ispitivane kemikalije.  
— Opis (po mogu ćnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje ispitne 
atmosfere te izlaganje životinja ispitnoj atmosferi.  
— Pojedinosti o opremi korištenoj za nadziranje temperature, vlažnosti i 
protoku zraka u komori (tj. razvoj kalibracijske krivulje).  
— Pojedinosti o opremi korištenoj za skupljanje uzoraka za odre đivanje 
koncentracije u komori i distribuciju veli čine čestica.  
— Pojedinosti o korištenoj kemijskoj analiti čkoj metodi i potvrdi metode 
(uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za 
uzorkovanje).  
— Metoda nasumi čnog odabira za svrstavanje životinja u ispitnu i 
kontrolnu skupinu.  
— Pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući tip/izvor hrane, izvor 
vode).  
— Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija.  
Rezultati  
— Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori.  
— Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori.  
— Tablični prikaz podataka u veli čini čestica, uklju čujući podatke o 
skupljenim analiti čkim uzorcima, distribuciju veli čina čestica te izra čune 
MMAD i σ g . 
— Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku živo ­
tinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti uklju čujući 
smrtnost, narav, stupanj, vrijeme nastupanja i trajanja u činaka).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 435
 
— Tablični prikaz pojedina čne mase životinja.  
— Tablični prikaz unosa hrane.  
— Tablični prikaz klini čko-patoloških podataka.  
— Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su 
dostupni.  
Rasprava i tuma čenje rezultata  
— Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje 
kriterija ove ispitne metode, npr. grani čnu koncentraciju ili veli činu 
čestica.  
— Treba raspravljati o sposobnosti udisanja čestica u svjetlu op ćih nalaza, 
posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veli činu čestica.  
— U opću ocjenu studije treba uklju čiti dosljednost metoda korištenih za 
određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncen ­
tracije prema nazivnoj.  
— Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavaju ćim načinom djelo ­
vanja (sistemski u odnosu na lokalni).  
— U slu čaju humanog usmr ćivanja životinja koje su patile ili pokazivale 
znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju 
kriterija iz Smjernice za humano usmr ćivanje OECD-a (3).  
— Treba identificirati organ/e metu/e.  
— Treba odrediti NOAEL i LOAEL.  
LITERATURA  
1. OECD (1981.).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Pariz.  
2. OECD (2009.).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.  
3. OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, 
OECD, Pariz.
 
4. Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231- 
238. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 436
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
 
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13. Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 16. prosinca 
2008. o razvrstavanju, ozna čavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se 
izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te 
izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 437
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 438
 
B.30.  STUDIJE KRONI ČNE TOKSI ČNOSTI  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
452 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 452 usvojena je 1981. 
Smatralo se da je nužno razviti ovu revidiranu ispitnu metodu B.30 kako 
bi se odrazio skorašnji razvoj u podru čju dobrobiti životinja i regulatornih 
zahtjeva (1) (2) (3) (4). Ažuriranje ove ispitne metode B.30 provedeno je paralelno s revizijom Poglavlja B.32 ovog Priloga, Test karcinogenosti te 
Poglavlja B.33 ovog Priloga, Kombinirani test kroni čne toksičnosti/karcino ­
genosti, s ciljem dobivanja dodatnih informacija od korištenih životinja i skupljanja daljnjih pojedinosti o odabiru doza. Ova ispitna metoda namije ­
njena je primjeni u ispitivanju širokog spektra kemikalija, uklju čujući pesti­
cide i industrijske kemikalije.
 
2. Većina studija kroni čne toksičnosti provodi se na vrstama glodavaca, stoga i 
ovu ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u studijama koje se provode na tim vrstama. Ako se takve studije traže na vrstama 
ne-glodavaca, tako đer se mogu primijeniti na čela i postupci izloženi u 
ovoj ispitnoj metodi, zajedno s onima izloženima u Poglavlju B.27 ovog Priloga, 90-dnevno ispitivanje oralne toksi čnosti na ne-glodavcima uz 
primjenu ponavljanih doza (5), uz odgovaraju će izmjene, kao što je izneseno 
u Smjernici za OECD-a br. 116 u vezi s planiranjem i provo đenjem studija 
kronične toksičnosti i karcinogenosti (6).
 
3. Tri glavna na čina primjene upotrijebljena u studijama toksi čnosti jesu oralni, 
dermalni i inhalacijski. Odabir na čina primjene ovisi o fizikalnim i kemij ­
skim svojstvima ispitivane kemikalije te o pretežnom na činu izlaganja ljudi. 
Dodatne informacije o odabiru na čina izlaganja navedene su u Smjernici 
OECD-a br. 116 (6).  
4. Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je naj češće 
korišteni na čin u studijama kroni čne toksičnosti. Dok dugotrajne studije 
kronične toksičnosti, koje uklju čuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, 
mogu tako đer biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod odre đenim regulatornim 
režimima radi odre đivanja rizika za ljude, oba na čina izlaganja uklju čuju 
znatnu tehni čku složenost. Takve studije treba isplanirati za svaki slu čaj 
posebno iako ovdje izložena ispitna metoda za utvr đivanje i procjenu 
kronične toksičnosti oralnom primjenom može činiti temelj protokola za 
studije primjene inhalacijom i/ili dermalnim putem, s obzirom na preporuke za razdoblja tretiranja, klini čke i patološke parametre itd. Dostupna je 
Smjernica OECD-a za primjenu ispitivanih kemikalija inhalacijom (6) (7) 
i dermalnim putem (6). Poglavlje B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlje B.29 ovog Priloga (9), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (7), trebaju se pomno prou čiti pri planiranju dugotrajnijih 
studija koje uklju čuju izlaganje inhalacijom. Poglavlje B.9 ovog Priloga 
(10) treba uzeti kao pomo ć pri ispitivanju provedenom dermalnim putem.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 439
 
5. Studija kroni čne toksičnosti pruža informacije o mogu ćim rizicima za 
zdravlje koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponovljenog izlaganja kroz 
dulje životno razdoblje korištenih vrsta. Ta će studija pružiti informacije o 
toksičnim učincima ispitivane kemikalije, ukazati na organe mete te mogu ć­
nost akumulacije. Tako đer može pružiti procjenu neopaženih štetnih u činaka 
koja se može upotrijebiti za odre đivanje sigurnosnih kriterija za izlaganje 
ljudi. Tako đer je naglašena potreba za pažljivim klini čkim opažanjima živo ­
tinja radi dobivanja što je mogu će više informacija.  
6. Ciljevi studije obuhva ćeni ovom ispitnom metodom uklju čuju: 
— identifikaciju kroni čne toksičnosti ispitivane kemikalije,  
— identifikaciju organa meta,  
— karakterizaciju odnosa doze i reakcije,  
— identifikaciju razine neopaženih štetnih u činaka (NOAEL) ili polazne 
točke za odre đivanje referentne doze za usporedbu (benchmark dose, 
BMD),  
— predvi đanje učinaka kroni čne toksičnosti na razinama ljudskog izlaganja,  
— pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s na činom djelo ­
vanja (6).  
UVODNA RAZMATRANJA  
7. U odre đivanju i procjeni toksikoloških svojstava ispitivane kemikalije ispitni 
laboratorij prije provo đenja studije mora u obzir uzeti sve dostupne infor ­
macije o ispitivanoj kemikaliji kako bi se planiranje studije usmjerilo na 
učinkovitije ispitivanje potencijala kroni čne toksičnosti te kako bi se na 
minimum svela primjena životinja. Informacije koje će pomoći u planiranju 
studije obuhva ćaju identitet, kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva 
ispitivane kemikalije, sve informacije o na činu djelovanja, rezultate svih 
ispitivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo , očekivanu/e primjenu/e i potencijal 
za ljudsko izlaganje, dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture, dostupne toksikokineti čke podatke (kinetika 
jedne doze i ponovljene doze ako je dostupno) te podatke dobivene u 
drugim studijama s ponovljenim izlaganjem. Odre đivanje kroni čne toksič­
nosti treba provesti nakon dobivanja po četnih informacija o toksi čnosti iz 
28-dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksi čnosti uz primjenu ponavljanih 
doza. Pristup s fazama u ispitivanju kroni čne toksičnosti treba smatrati 
dijelom ukupnog utvr đivanja potencijalno štetnih u činaka doti čne ispitivane 
kemikalije po zdravlje (11) (12) (13) (14).
 
8. Prije po četka studije treba odrediti najprikladnije statisti čke metode za 
analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Pitanja koja valja 
uzeti u obzir jesu treba li statistika uklju čivati prilagodbu za preživljavanje 
i analizu u slu čaju prijevremenog kraja jedne ili više skupina. Smjernice o 
odgovaraju ćim statisti čkim analizama i klju čnim referencama na me đu­
narodno prihva ćene statisti čke metode nalaze se u Smjernici br. 116. (6) 
te također u Smjernici br. 35. za analizu i ocjenu studija kroni čne toksičnosti 
i karcinogenosti (15).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 440
 
9. Pri provo đenju studije kroni čne toksičnosti uvijek treba slijediti na čela i 
razloge izložene u OECD-ovoj Smjernici br. 19. o prepoznavanju, utvr ­ 
đivanju i primjeni klini čkih znakova kao humanih krajnjih u činaka za 
pokusne životinje korištene u procjeni sigurnosti (16), posebno u njezinom stavku 62. U tom stavku stoji da „u studijama uz primjenu ponovljenog 
doziranja, kada životinje pokazuju progresivne klini čke znakove koji izazi ­
vaju daljnje pogoršanje stanja, treba donijeti upu ćenu odluku o tome treba li 
humano usmrtiti životinje ili ne. Odluka treba uklju čivati razloge s obzirom 
na vrijednost informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u 
studiji s obzirom na njezino op će stanje. Ako se odlu či zadržati životinju 
u ispitivanju, u čestalost opažanja treba pove ćati u skladu s potrebama. 
Također se može privremeno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati 
patnju ili stres ili smanjiti ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispiti ­
vanja.”
 
10. Detaljne upute za na čela odabira doza za studije kroni čne toksičnosti i 
karcinogenosti te rasprava o njima mogu se prona ći u Smjernici br. 116. 
(6), kao i u dvije publikacije instituta International Life Sciences Institute (17) (18). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili 
primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovaraju ćih razina 
doza treba posti ći ravnotežu izme đu procjene opasnosti s jedne strane i 
karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo zna čenje s druge strane. 
To je posebno relevantno u situaciji u kojoj treba provesti kombiniranu 
studiju kroni čne toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) 
(stavak 11.).
 
11. Treba navesti razloge za provo đenje kombinirane studije kroni čne toksič­
nosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga), a ne odvojeno provo ­ 
đenje studije kroni čne toksičnosti (ova ispitna metoda B.30) i karcinogenosti 
(Poglavlje B.32 ovog Priloga). Kombinirano ispitivanje pruža ve ću učinko­
vitost što se ti če vremena i troškova u usporedbi s provo đenjem dviju 
zasebnih studija, bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroni čnoj fazi 
niti u kancerogenoj fazi. Pri provo đenju kombinirane studije kroni čne 
toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) treba pažljivo 
razmisliti o na čelima odabira doza (stavci 9. i 20. - 25.) te se tako đer 
priznaje da pod odre đenim regulatornim okvirima mogu biti nužne odvojene 
studije.  
12. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju 
ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (6).  
NAČELO ISPITIVANJA  
13. Ispitivana kemikalija daje se svakodnevno u postupnim dozama raznim 
skupinama pokusnih životinja, obi čno u razdoblju od 12 mjeseci iako se 
mogu odabrati dulja ili kra ća trajanja ovisno o regulatornim zahtjevima 
(vidjeti stavak 33.). Odabire se dovoljno dugo vrijeme koje bi omogu ćilo 
manifestaciju u činaka kumulativne toksi čnosti bez miješanja s u čincima 
gerijatrijskih promjena. Treba obrazložiti odstupanja od trajanja izlaganja 
od 12 mjeseci, posebno u slu čajevima kra ćeg trajanja. Ispitivana kemikalija 
obično se primjenjuje oralnim putem iako se može primijeniti i ispitivanje 
inhalacijom ili dermalnim putem. Planiranje studije tako đer može uklju čivati 
jedno ili više usmr ćivanja u me đuvremenu, npr. s tri i šest mjeseci, i mogu 
se uključiti dodatne skupine životinja kako bi se to kompenziralo (vidjeti 
stavak 19.). Tijekom razdoblja primjene životinje se pomno promatraju radi otkrivanja znakova toksi čnosti. Životinje koje ugibaju ili su usmr ćene 
tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preži ­
vjele se životinje usmr ćuju i podvrgavaju obdukciji.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 441
 
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
14. Ova ispitna metoda prvenstveno obuhva ća određivanje i ocjenu kroni čne 
toksičnosti u glodavaca (vidjeti stavak 2.) iako se priznaje da pod odre đenim 
regulatornim režimima mogu biti potrebne sli čne studije na ne-glodavcima. 
Treba obrazložiti odabir vrsta. Planiranje i provo đenje studija kroni čne 
toksičnosti na vrstama ne-glodavaca, ako je potrebno, treba temeljiti na 
načelima izloženima u ovoj ispitnoj metodi zajedno s na čelima iz Poglavlja 
B.27 ovog Priloga, 90-dnevna studija oralne toksi čnosti uz primjenu 
ponavljanih doza na ne-glodavcima (5). Dodatne informacije o odabiru 
vrste i soja navedene su u Smjernici br. 116. (6).  
15. Prednost se u ovoj ispitnoj metodi daje štakorima kao vrsti glodavaca iako 
se mogu upotrijebiti i druge vrste glodavaca, npr. miševi. Štakori i miševi 
preferirani su pokusni modeli zbog relativno kratkog životnog vijeka, raši ­
rene primjene u farmakološkim i toksikološkim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao 
posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo informacija o njihovoj fiziolo ­
giji i patologiji. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Studiju kroni čne toksičnosti treba 
provesti na životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje korištene u 
preliminarnoj/im studiji/-ama toksi čnosti kraćeg trajanja. Treba upotreblja ­
vati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
 
Uvjeti smještaja i hranjenja  
16. Životinje moraju biti smještene pojedina čno ili u kavezima u malim skupi ­
nama istog spola; pojedina čni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je 
znanstveno opravdan (19) (20) (21). Kaveze treba rasporediti na na čin da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na minimum. 
Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama morala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % 
te po mogu ćnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograni čene količine pitke vode. Prehrana mora 
ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje konta ­
miniraju hranu - uklju čujući ostatke pesticida, postojane organske zaga đi­
vače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograni čeno na njih - 
koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je mogu će manji. 
Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i 
prehranu treba izra đivati periodi čno, barem na po četku studije te u slu čaju 
promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uklju čiti u završno izvješ će. 
Također treba pružiti analiti čke informacije o vodi za pi će korištenoj u 
istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem 
prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.
 
Priprema životinja  
17. Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske 
uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim 
postupcima. U slu čaju glodavaca doziranje životinja treba po četi što je 
moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po 
mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje 
treba karakterizirati što se ti če vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. 
Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 442
 
biti minimalno i ne smije biti ve će od ± 20 % prosje čne mase svih životinja 
u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumi čno odrediti za 
kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumi čnog odabira ne smije biti 
značajne razlike u prosje čnoj tjelesnoj masi izme đu skupina svakog spola. 
U slučaju statisti čki značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumi čnog odabi ­
ranja ako je mogu će. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifika ­
cijski broj i treba je trajno ozna čiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikro ­ 
čipa ili drugom odgovaraju ćom metodom.  
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
18. Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja kako 
bi na kraju studije u svakoj skupini bilo dovoljno životinja za temeljitu biološku i statisti čku ocjenu. Za glodavce obi čno treba upotrijebiti najmanje 
20 životinja svakog spola po skupini za svaku visinu doze dok se za 
ne-glodavce preporu čuje minimalno četiri životinje svakog spola po skupini. 
U studijama koje uklju čuju miševe u svakoj skupini za doziranje mogu biti 
potrebne dodatne životinje kako bi se provele sve tražene hematološke pretrage.
 
Opskrba za usmr ćivanje u me đuvremenu, satelitske skupine i 
indikatorske životinje  
19. Studija može uklju čivati opskrbu za usmr ćivanje u me đuvremenu (najmanje 
deset životinja po spolu i skupini), npr. s tri i šest mjeseci, kako bi se pribavile informacije o napredovanju toksikoloških promjena i mehanisti čke 
informacije ako je to znanstveno opravdano. Ako su takve informacije ve ć 
dostupne iz prethodnih studija toksi čnosti ispitivane kemikalije uz primjenu 
ponavljanih doza, usmr ćivanje u me đuvremenu nije znanstveno opravdano. 
Također se mogu uklju čiti i satelitske skupine radi nadzora reverzibilnosti 
svih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom koja se 
ispituje; one su obi čno ograni čene na najvišu visinu doze u studiji plus 
kontrola. Ako je potrebno, tijekom studije tako đer se može uklju čiti i 
dodatna skupina indikatorskih životinja (tipi čno pet životinja po spolu) 
radi praćenja stanja bolesti (22). Ako se planiraju usmr ćivanja u me đuvre­
menu ili satelitske ili indikatorske skupine, broj životinja uklju čenih u plani ­
ranje studije treba pove ćati za broj životinja odre đenih za usmr ćivanje prije 
završetka studije. Te životinje moraju normalno pro ći sva opažanja uklju ­ 
čujući tjelesnu masu, unos hrane/vode, hematološka i biokemijska mjerenja 
te patološke pretrage kao i životinje u fazi kroni čne toksičnosti glavne 
studije iako se tako đer može osigurati (u skupinama za usmr ćivanje u 
međuvremenu) da se mjerenja ograni če na specifi čna, ključna mjerenja 
poput neurotoksi čnosti ili imunotoksi čnosti.
 
Skupine za doziranje i doziranje  
20. Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak me đu visinama 
doza nalaze se u Smjernici br. 116. (6). Treba upotrijebiti najmanje tri visine 
doza i paralelnu kontrolu, osim ako je proveden grani čni test (vidjeti stavak 
27.). Visine doza op ćenito se temelje na rezultatima kra ćih studija uz 
primjenu ponavljanih doza ili studija za odre đivanje raspona i u obzir 
moraju uzeti sve toksikološke i toksikokineti čke podatke dostupne o ispiti ­
vanoj kemikaliji ili srodnim kemikalijama.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 443
 
21. Osim ako nije ograni čeno fizikalno-kemijskom naravi ili biološkim u čincima 
ispitivane kemikalije, obi čno treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se 
identificirali organi mete i toksi čni učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne 
toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Uzimaju ći u obzir čimbenike izložene u 
stavku 22. u nastavku, treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se izveli 
dokazi o toksi čnosti, kao što je, primjerice, dokazano padom pove ćanja 
tjelesne mase (otprilike 10 %).  
22. No, ovisno o ciljevima studije (vidjeti stavak 6.), može se odabrati najviša 
visina doze manja od doze koja pruža dokaze o toksi čnosti npr. ako doza 
izaziva štetan, zabrinjavaju ć učinak koji unato č tomu utje če na životni vijek 
ili tjelesnu masu. Najviša doza ne smije biti ve ća od 1 000 mg/kg tjelesne 
mase dnevno (grani čna doza, vidjeti stavak 27.).  
23. Visine doza i razmaci izme đu visina doza mogu se odabrati kako bi se 
odredio ishod doza-reakcija i NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, 
npr. BMD (vidjeti stavak 25.) na najnižoj visini doze. Čimbenici koje treba 
uzeti u obzir pri dodjeljivanju nižih doza uklju čuju očekivani nagib krivulje 
doze i reakcije, doze na kojima se mogu dogoditi važne promjene u meta ­
bolizmu ili na činu toksičnog djelovanja, gdje se o čekuje prag ili gdje se 
očekuje polazna to čka za ekstrapolaciju za niske doze.  
24. Odabrani razmak izme đu visina doza ovisit će o svojstvima ispitivane kemi ­
kalije i ova ispitna metoda ne može ga propisati, ali dva do četiri intervala 
smanjenja često pružaju dobru uspješnost ispitivanja kada se koriste za 
određivanje silaznih visina doza, a često se daje prednost dodavanju 
četvrte ispitne skupine nego primjeni vrlo velikih intervala (npr. više od 
faktora izme đu 6 - 10) me đu dozama. Op ćenito treba izbjegavati primjenu 
faktora ve ćih od deset i treba ih opravdati ako se primjenjuju.  
25. Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (6), to čke koje treba uzeti 
u obzir pri odabiru doze uklju čuju: 
— Poznate nelinearnosti ili to čke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one 
na koje se sumnja,  
— Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se doga đaju ili ne doga đaju 
metabolička indukcija, zasi ćenje ili nelinearnost izme đu vanjskih i 
unutarnjih doza,  
— Prethodne lezije, markeri u činka ili indikatori operacije klju čnih 
temeljnih bioloških procesa,  
— Ključni aspekti ili na čini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput 
doza na kojima po činje rasti citotoksi čnost, razina hormona se poremeti, 
homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,  
— Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, 
npr. u rasponu o čekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,  
— Uzimanje u obzir o čekivanih razina ljudskog izlaganja.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 444
 
26. Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu 
nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosa č. Osim 
radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini treba tretirati na jednak na čin kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako 
se primjenjuje nosa č, kontrolna skupina mora primiti nosa č u najvećoj koli­ 
čini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemi ­
kalija daje kroz hranu i ako izaziva zna čajno smanjeno unosa hrane zbog 
smanjene te čnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja 
se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.
 
27. Ako se na temelju informacija iz preliminarnih studija može o čekivati da 
ispitivanje na jednoj visini doze, ekvivalentnoj najmanje 1 000 mg/kg 
tjelesne mase po danu, uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne može izazvati štetne u činke te ako se na temelju podataka od kemikalija 
srodne strukture ne o čekuje toksi čnost, ne mora biti nužna potpuna studija 
uz primjenu tri visine doza. Granica od 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu 
vrijedi osim ako izlaganje ljudi ne pokaže potrebu za primjenom više visine doze.
 
Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije  
28. Ispitivana kemikalija obi čno se daje oralno, kroz hranu ili vodu za pi će ili 
pak sondom. Dodatne informacije o na činima i metodama davanja navedene 
su u Smjernici br. 116. (6). Na čin i metoda primjene ovisi o svrsi studije, 
fizikalnim/kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspolo ­ 
živosti te pretežnom na činu i metodi izlaganja ljudi. Treba predo čiti argu­
mentaciju za odabrani na čin i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja 
sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koje taj na čin i metoda primjene 
opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemika ­
lije iz hrane ili okoliša, uklju čujući pesticide, obi čno se primjenjuju kroz 
hranu ili vodu za pi će. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaga ­
nju, prikladnije izlaganje na druge na čine. 
29. Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovaraju ćem 
nosaču. U obzir treba uzeti sljede ća svojstva nosa ča i drugih aditiva po 
potrebi: u činke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispiti ­
vane kemikalije; u činke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se 
mogu promijeniti u toksi čna svojstva te u činke na unos hrane ili vode ili 
nutritivnog statusa životinja. Preporu čuje se da se, kada je god mogu će, u 
obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u 
ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim mogu ća otopina u drugim nosa čima. Za 
nosače različite od vode moraju biti poznata toksi čna svojstva nosa ča. 
Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homo ­
genosti otopina za doziranje ili prehranu (odgovaraju ći) pod uvjetima 
primjene (npr. prehrana).  
30. Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane kemikalije ne utje ču na uravnoteženi unos 
hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksi čnosti uz primjenu davanja 
kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obi čno ne smije 
premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotri ­
jebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna 
visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) 
izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 445
 
31. U slu čaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemi ­
kalija (sedam dana svakog tjedna), obi čno u razdoblju od 12 mjeseci (vidjeti 
i stavak 33.) iako, ovisno o regulatornim zahtjevima, može biti potrebno i dulje trajanje. Svaki druk čiji režim primjene, npr. pet dana tjedno, treba 
obrazložiti. U slu čaju dermalne primjene životinje se ispitivanom kemika ­
lijom obično tretiraju najmanje šest sati dnevno, sedam dana tjedno, kao što 
je navedeno u Poglavlju B.9 ovog Priloga (10), u razdoblju od 12 mjeseci. Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. Razdoblje izla ­
ganja obi čno traje 12 mjeseci. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi 
štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. Treba pružiti 
argumentaciju za primjenu izlaganja kra ćeg od šest sati dnevno. Vidjeti 
također i Poglavlje B.8 ovog Priloga (8).
 
32. Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti 
želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u sli čno vrijeme 
svakog dana. Obi čno se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u 
slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no mogu će je zadržati 
dnevnu koli činu doze na na čin da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksi ­
malni volumen teku ćine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veli čini 
pokusne životinje. Koli činu treba održavati toliko niskom da bude prakti čna, 
a obično ne bi trebala biti ve ća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce 
(22). Varijabilnost u ispitnoj koli čini treba svesti na minimum prilagodbom 
koncentracije kako bi se osigurala konstantna koli čina na svim visinama 
doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizaju će ili nadražuju će kemi­
kalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni u činci. Treba 
izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizaju će ili 
nadražuju će za gastrointestinalni trakt.  
Trajanje studije  
33. Dok je ova ispitna metoda primarno planirana kao studija kroni čne toksič­
nosti u trajanju od 12 mjeseci, planiranje studije omogu ćuje i kraća (npr. 6 
ili 9 mjeseci) ili dulja (npr. 18 ili 24 mjeseci) trajanja, ovisno o zahtjevima posebnih regulatornih režima ili radi specifi čnih mehanisti čkih svrha. Treba 
obrazložiti odstupanja od trajanja izlaganja od 12 mjeseci, posebno u slu ča­
jevima kra ćeg trajanja. Satelitske skupine uklju čene radi nadzora reverzibil ­
nosti bilo kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom tijekom studije treba održavati bez doziranja u razdoblju ne kra ćem od četiri 
tjedna te ne dulje od tre ćine ukupnog trajanja studije nakon prestanka izla ­
ganja. Ostale smjernice, uklju čujući razmatranja o preživljavanju u istraži ­
vanju, nalaze se u Smjernici br. 116. (6).
 
OPAŽANJA  
34. Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obi čno na 
početku i kraju svakog dana, uklju čujući vikend i praznike. Op ća klinička 
opažanja valja provoditi najmanje jedanput dnevno, po mogu ćnosti u isto 
vrijeme/ista vremena svakog dana te uzimaju ći u obzir vršno razdoblje 
očekivanih u činaka nakon doziranja u slu čaju primjene sondom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 446
 
35. Detaljna klini čka opažanja valja provoditi na svim životinjama najmanje 
jedanput prije prvog izlaganja (kako bi se omogu ćila usporedba za svaku 
jedinku), na kraju prvog tjedna studije te zatim mjese čno. Protokol za 
opažanja treba organizirati tako da se na minimum svedu varijacije između pojedinih promatra ča i ovisno o ispitnoj skupini. Ta opažanja 
treba obaviti izvan domicilnog kaveza, po mogu ćnosti u standardnoj areni 
te svaki put u sli čno vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri 
čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od strane labo ­
ratorija koji obavlja ispitivanje. Treba se potruditi osigurati da su varijacije u 
uvjetima opažanja minimalne. Zabilježeni znakovi moraju obuhva ćati 
promjene na koži, krznu, o čima, sluznicama, pojavu iscjedaka i izlu čevina 
te autonomne aktivnosti (npr. lakrimaciju, piloerekciju, veli činu zjenica te 
nepravilnosti u disanju), ali ne biti ograni čeni na njih. Tako đer treba zabi ­
lježiti promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost 
kloničkih ili toni čkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano njegovanje krzna, 
ponavljano kretanje u krug) ili neobi čnog ponašanja (npr. samoozlje đivanje, 
hodanje unatrag) (24).
 
36. Oftalmološke preglede uz primjenu oftalmoskopa ili druge odgovaraju će 
opreme treba obaviti na svim životinjama prije prve primjene ispitivane kemikalije. Na kraju studije te preglede treba po mogu ćnosti obaviti na 
svim životinjama, ali barem u skupini s visokom dozom i kontrolnoj 
skupini. Ako se na o čima opaze promjene povezane s tretiranjem, treba 
pregledati sve životinje. Ako strukturna analiza ili druge informacije upućuju na okularnu toksi čnost, treba pove ćati učestalost oftalmoloških 
pregleda.
 
37. Za kemikalije za koje prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksi č­
nosti uz primjenu ponavljanih doza ukazuju na potencijalno uzrokovanje 
neurotoksi čnih učinaka, senzori čke reaktivnosti na stimulanse razli čitih 
tipova (24) (npr. zvu čne, vizualne i proprioceptivne stimulanse) (25), (26), 
(27), prije po četka studije te u razdobljima od 3 mjeseca nakon po četka 
studije pa do 12 mjeseci, uklju čujući i 12. mjesec, te na kraju studije (ako ne 
traje dulje od 12 mjeseci) mogu se opcijski provesti i odre đivanje jakosti 
stiska (28) i odre đivanje motori čke aktivnosti (29). Daljnje pojedinosti o 
postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovaraju ćoj refe­
rentnoj literaturi. Me đutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i drugi 
postupci.  
38. Za kemikalije, za koje su prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksi č­
nosti uz primjenu ponavljanih doza ukazala na potencijalno izazivanje 
imunotoksi čnih učinaka, na kraju se opcijski mogu provesti daljnja istraži ­
vanja tog krajnjeg u činka.  
Tjelesna masa, unos hrane/vode i u činkovitost hrane  
39. Sve životinje treba izvagati na po četku tretiranja, najmanje jedanput tjedno u 
prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Mjerenja unosa i u čin­
kovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Unos vode treba mjeriti najmanje 
jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno ako 
se kemikalija primjenjuje preko vode za pi će. Mjerenje unosa vode treba 
također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 447
 
Hematologija i klini čka biokemija  
40. U studijama koje uklju čuju glodavce hematološke pretrage treba obaviti 
najmanje na deset mužjaka i deset ženki po skupini, nakon 3, 6 i 12 mjeseci te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci) uz primjenu 
istih životinja svaki put. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje 
kako bi se provele sve potrebne hematološke pretrage (vidjeti stavak 18.). Kod studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme 
uzorkovanja u me đuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. 
Mjerenja nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi ako na hematološkim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji 
provedenoj na usporedivim visinama doze nisu uo čeni učinci. Uzorke krvi 
treba uzimati iz odre đenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroor ­
bitalnog sinusa, pod anestezijom.
 
41. Treba ispitati sljede ći popis parametara (30): Ukupni i diferencijalni broj 
leukocita, broj eritrocita, broj trombocita, koncentracija hemoglobina, hema ­
tokrit (volumen eritrocita), prosje čni volumen eritrocita (MCV), prosje čna 
masa hemoglobina u eritrocitima (MCH), prosje čna koncentracija hemoglo ­
bina u eritrocitima (MCHC), protrombinsko vrijeme te aktivirano parcijalno 
tromboplastinsko vrijeme. Ostali hematološki parametri poput Heinzovih tjelešaca ili druge atipi čne morfologije eritrocita ili methemoglobin mogu 
se mjeriti po potrebi, ovisno o toksi čnosti ispitivane kemikalije. Op ćenito 
gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili o čeki­
vanim učincima davane ispitivane kemikalije. Ako ispitivana kemikalija ne 
utječe na hematopoetski sustav, može biti indiciran i broj retikulocita i 
citologija koštane srži iako se te pretrage ne moraju provoditi rutinski.
 
42. Klini čko-biokemijske pretrage za ispitivanje toksi čnih učinaka u tkivima i 
posebno u činaka na bubrege i jetru treba obaviti na uzorcima krvi dobive ­
nima od najmanje deset mužjaka i deset ženki po skupini u jednakim 
vremenskim intervalima kao što je navedeno u hematološkim pretragama uz primjenu istih životinja. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske živo ­
tinje kako bi se provele sve potrebne klini čko-biokemijske pretrage. Kod 
studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. 
četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorko ­
vanja u me đuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja 
nakon 3 mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi 
ako na klini čko-biokemijskim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji 
provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi u činci. Preporu čuje se 
post životinja preko no ći (izuzev miševa) prije uzimanja uzoraka krvi. Treba 
ispitati sljede ći popis parametara (30): glukoza, urea (duši čna urea), kreati ­
nin, ukupni proteini, albumini, kalcij, natrij, kalij, ukupani kolesterol, 
najmanje dvije prikladne pretrage za hepatocelularnu ocjenu (alanin amino ­
transferaza, aspartat aminotransferaza, glutamat dehidrogenaza, ukupne žučne kiseline) (31) te najmanje dvije prikladne pretrage za hepatobilijarnu 
ocjenu (alkalna fosfataza, gama glutamil transferaza, 5 ′-nukleotidaza, ukupni 
bilirubin, ukupne žu čne kiseline) (31). Ostali klini čko-kemijski parametri 
poput triglicerida tijekom posta, specifi čnih hormona i kolinesteraze mogu 
se mjeriti ako je potrebno, ovisno o toksi čnosti ispitivane kemikalije. Op će­
nito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili 
očekivanim u čincima davane ispitivane kemikalije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 448
 
43. Pretrage analize urina treba provesti na najmanje deset mužjaka i deset ženki 
po skupini na uzorcima skupljenim u jednakim intervalima kao i za hema ­
tologiju i klini čku kemiju. Mjerenja nakon 3 mjeseca ne moraju se provoditi 
ako na analizi urina u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na uspore ­
divoj visini doze nisu opaženi u činci. Sljede ći popis parametara bio je 
uključen u stru čne preporuke za klini čko-patološke studije (30): izgled, 
volumen, osmolalnost ili specifi čna težina, pH, ukupni proteini i glukoza. 
Ostale pretrage uklju čuju ketone, urobilinogen, bilirubin i okultnu krv. Ako 
je potrebno, mogu se upotrijebiti i drugi parametri radi proširenog istraži ­
vanja opaženog u činka/opaženih u činaka.  
44. Općenito se smatra da su osnovne hematološke i klini čko-biokemijske vari ­
jable potrebne prije tretiranja za studije na psima, ali ih se ne mora odrediti u studijama na glodavcima (30). No, ako su povijesni osnovni podaci (vidjeti stavak 50.) neprikladni, treba se pobrinuti da se ti podaci izrade.
 
Patologija  
Makroskopska analiza  
45. Sve životinje korištene u studiji obi čno se moraju podvrgnuti kompletnoj, 
detaljnoj makroskopskoj analizi koja obuhva ća pažljivi pregled vanjske 
površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog 
sadržaja. No, može se odlu čiti (kod skupina za usmr ćivanje u me đuvremenu 
ili satelitskih skupina) da se mjerenja ograni če na specifi čne, ključne mjere, 
poput neurotoksi čnosti ili imunotoksi čnosti (vidjeti stavak 19.). Te životinje 
ne treba podvrgnuti obdukciji i sljede ćim postupcima opisanima u stavcima 
u nastavku. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedi ­
načnim slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja.  
46. Treba prikupiti masu organa svih životinja, osim onih isklju čenih zadnjim 
dijelom stavka 45. Nadbubrežne žlijezde, mozak, epididimise, srce, bubrege, jetru, jajnike, slezenu, štitnja ču (izvaganu poslije fiksacije, s paraštitnim 
žlijezdama) i maternicu svih životinja (osim onih prona đenih u stanju 
ugibanja i/ili usmr ćenih u me đuvremenu) treba obrezivanjem osloboditi od 
svih prianjaju ćih tkiva po potrebi te ih treba izvagati u mokrom stanju što 
prije nakon seciranja kako bi se sprije čilo njihovo sušenje. U studijama na 
miševima nadbubrežne žlijezde važu se opcijski.
 
47. Sljede ća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba 
tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (32) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su): 
sve makroskopske lezije
 srce  guštera ča želudac (predželudac, 
žljezdani želudac)  
nadbubrežna žlijezda  ileum  paraštitna žlijezda  [zubi]  
aorta  jejunum  periferni živac  testis  
mozak (uklju čujući sekcije 
velikog i malog mozga te medule/mosta)
 bubreg  hipofiza  timus  
cekum  suzna žlijezda (eksorbi ­
talna)  prostata  štitnja ča 
cerviks  jetra  rektum  [jezik]  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 449
 
koagulacijska žiljezda  plu ća žlijezda slinovnica  dušnik  
debelo crijevo  limfni čvorovi (povr ­ 
šinski i dubinski)  sjemenski mjehuri ć mokra ćni mjehur  
dvanaesnik  mlije čna žlijezda 
(obvezno za ženke i ako 
se mogu secirati, od mužjaka)
 skeletni miši ć maternica (uklju čujući 
cerviks)  
epididimis  [gornji respiratorni trakt 
uključujući nos, turbinate 
i paranazalne sinuse]  koža  [mokra ćovod]  
oko (uklju čujući mrežnicu)  jednjak  kralježnica (na tri 
razine: vratna, srednja 
prsna i slabinska)  [mokraćna cijev]  
[femur sa zglobom]  [olfaktorni bulbus]  slezena  vagina  
žučni mjehur (za vrste druk ­ 
čije od štakora)  jajnik  [prsna kost],  sekcija koštane srži i/ili 
aspirat svježe koštane srži  
Harderova žlijezda  
U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sa čuvati 
oba organa. Klini čki i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom 
dodatnih tkiva. Treba sa čuvati i sve one organe za koje se na temelju 
saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni. 
U studijama koje uklju čuju dermalni na čin primjene treba sa čuvati popis 
organa sastavljen za oralni na čin primjene, s tim da je vrlo važno specifi čno 
uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom 
popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti prepo ­
ruke Poglavlja B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (9). Za 
ostale organe/tkiva (te uz posebno sa čuvana tkiva iz respiratornog trakta) 
treba ispitati popis organa zadan za oralni na čin primjene.  
Histopatologija  
48. Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provo đenju istraživanja toksi ­
kološke patologije (32). Minimalne histopatološke pretrage moraju uklju či­
vati: 
— sva tkiva iz skupine izložene visokoj dozi i kontrolne skupine,  
— sva tkiva životinja uginulih ili usmr ćenih tijekom studije,  
— sva tkiva s makroskopskim anomalijama,  
— tkiva mete ili tkiva koja pokazuju promjene povezane s tretiranjem u 
skupini izloženoj visokoj dozi, od svih životinja u svih drugim skupi ­
nama doza,  
— u slu čaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba 
ispitati oba organa.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 450
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
49. Treba pružiti pojedina čne podatke o životinjama za sve ocijenjene parame ­
tre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazuju ći za svaku 
ispitnu skupinu broj životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje su 
tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz humanih razloga te 
vrijeme smrti ili usmr ćivanja, broj uo čenih znakova toksi čnosti, opis 
uočenih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme nastupanja, trajanje i 
ozbiljnost svakog toksi čnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te 
postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka 
trebaju pružiti prosje čne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitiva ­
nja) za životinje koje pokazuju toksi čne učinke ili lezije uz stupnjevanje 
lezija.  
50. U tuma čenju rezultata studije, npr. u slu čaju kada postoje indikacije da su 
podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa 
skorašnjim podacima od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/ko ­
lonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povijesne kontrolne podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija i povezati sa životinjama iste dobi i vrste proizvedenih tijekom pet godina prije doti čne 
studije.
 
51. Ako je mogu će, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i op će prihva­ 
ćenom statisti čkom metodom. Statisti čke metode i podatke koji će se anali ­
zirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 8.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
 
Izvješće o ispitivanju  
52. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija:  
— fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,  
— identifikacijski podaci,  
— podrijetlo kemikalije,  
— broj serije,  
— potvrda kemijske analize.  
Nosač (po potrebi):  
— obrazloženje odabira nosa ča (ako nije voda).  
Pokusne životinje:  
— korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,  
— broj, dob i spol životinja na po četku ispitivanja,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 451
 
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— pojedina čne tjelesne mase životinja na po četku ispitivanja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— argumentacija za na čin primjene i odabir doze,  
— ako je primjenjivo, statisti čka metoda korištena za analizu podataka,  
— pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,  
— analiti čki podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti 
preparata,  
— način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,  
— stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz 
koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za pi će (mg/kg ili 
ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Rezultati (treba prikazati tabli čno sažete podatke i pojedina čne podatke za 
životinje):  
— podaci o preživljavanju,  
— tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,  
— unos hrane, izra čun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode 
ako je primjenjivo,  
— podaci o toksi čkim reakcijama po spolu i visini doza, uklju čujući 
znakove toksi čnosti,  
— narav, u čestalost (te ako je zabilježeno, ozbiljnost) i trajanje klini čkih 
opažanja (prolaznih ili trajnih),  
— oftalmološki pregledi,  
— hematološke pretrage,  
— kliničko-biokemijske pretrage,  
— analiza urina,  
— ishod svih istraživanja neurotoksi čnosti ili imunotoksi čnosti,  
— tjelesna masa na kraju,  
— mase organa (i njihovi omjeri ako je primjenjivo),  
— nalazi obdukcije,  
— detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem,  
— podaci o apsorpciji, ako postoje.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 452
 
Statistička obrada rezultata po potrebi  
Rasprava o rezultatima uklju čujući: 
— Odnose doza i reakcija,  
— Razmatranja o svim na činima djelovanja informacija,  
— Rasprava o svim modelima pristupa,  
— Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL,  
— Povijesni kontrolni podaci,  
— Relevantnost za ljude.  
Zaključci 
LITERATURA  
1. OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz.
 
2. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
3. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
4. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
5. Poglavlje B.27 ovog Priloga, Test subkroni čne oralne toksi čnosti - 90- 
dnevna studija oralne toksi čnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih 
doza.  
6. OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ env/testguidelines.
 
7. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
 
8. Poglavlje B.8 ovog Priloga, Subakutna inhalacijska toksi čnost: 28-dnevna 
studija.  
9. Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkroni čna inhalacijska toksi čnost: 90-dnevna 
studija.  
10. Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksi čnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 
dana).  
11. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human 
Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
12. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
13. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 453
 
14. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
15. OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
 
16. OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
 
17. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
18. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19. Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o 
zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
 
20. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
21. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
22. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
23. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
24. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
25. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
26. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
27. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects 
of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
28. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
29. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 454
 
30. Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
31. EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK i sur. (2004). Smjernica za 
najbolju praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 455
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 456
 
B.31.  STUDIJA PRENATALNE RAZVOJNE TOKSI ČNOSTI  
1. METODA  
Ova je metoda istovjetna metodi OECD TG 414 (2001.).  
1.1. UVOD  
Ova metoda za ispitivanje razvojne toksi čnosti namijenjena je za 
dobivanje op ćih podataka o u čincima prenatalne izloženosti na 
gravidnu pokusnu životinju i na organizam koji se razvija u mater ­
nici; tu može biti uklju čena procjena u činaka na majku, kao i smrt, 
strukturne abnormalnosti ili promijenjeni rast fetusa. Funkcionalni 
nedostaci, iako čine važan dio razvoja, nisu sastavni dio ove 
ispitne metode. Oni se mogu ispitivati u nekoj drugoj studiji ili kao dodatak ovaj studiji, uz primjenu metode ispitivanja razvojne 
neurotoksi čnosti. Radi informiranja o ispitivanju funkcionalnih nedo ­
stataka i drugih postnatalnih u činaka treba razmotriti ispitnu metodu 
za studiju dvogeneracijske reproduktivne toksi čnosti ili studiju 
razvojne neurotoksi čnosti, prema potrebi.
 
Ova ispitna metoda može u pojedina čnim slučajevima zahtijevati 
posebne prilagodbe na osnovi posebnih saznanja o npr. fizikalno 
kemijskim ili toksikološkim svojstvima ispitivane tvari. Takva je 
prilagodba prihvatljiva ako uvjerljivi znanstveni dokazi pokazuju da će se testom nakon prilagodbe dobiti više informacija. U 
takvom slu čaju, spomenute znanstvene dokaze treba temeljito doku ­
mentirani u studiji.
 
1.2. DEFINICIJE  
Razvojna toksikologija:  studija o štetnim u čincima na organizam u 
razvoju, koji mogu biti posljedica izlaganja prije za čeća, tijekom 
prenatalnog razvoja ili postnatalno do vremena spolne zrelosti. 
Glavne manifestacije razvojne toksi čnosti uklju čuju: 1. smrt organ ­
izma, 2. strukturne abnormalnosti, 3. promijenjen rast, 4. funkcio ­
nalne nedostatke. Razvojna toksikologija prije se često nazivala 
teratologijom.  
Štetni učinak:  svaka promjena normalnih vrijednosti povezana s 
tretiranjem, koja umanjuje sposobnost organizma za preživljavanje, 
razmnožavanje ili prilago đavanje okolišu. Kad je povezan s 
razvojnom toksikologijom, ovaj pojam u najširem smislu obuhva ća 
svaki učinak koji spre čava normalan razvoj konceptusa prije i nakon 
rođenja.  
Promijenjen rast:  promjena mase ili veli čine organa ili tijela 
potomka.  
Promjene (anomalije):  strukturne promjene u razvoju koje uklju ­ 
čuju i malformacije i varijacije.  
Malformacija/velika abnormalnost:  strukturna promjena koja se 
smatra štetnom za životinju (može isto tako biti i smrtonosna) koja 
se obično rijetko javlja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 457
 
Varijacija/manja abnormalnost:  strukturna promjena za koju se 
smatra da ima neznatan ili nikakav štetni u činak na životinju; 
može biti privremena i relativno često se može pojaviti u kontrolnoj 
populaciji.  
Konceptus (zametak):  ukupni derivati oplo đenog jajašca u bilo 
kojoj fazi razvoja od oplodnje do ro đenja, uklju čujući izvanembrio ­
nalne ovojnice, kao i embrij ili fetus.  
Implantacija (nidacija):  pričvršćenje blastociste za epitelni sloj 
maternice, uklju čujući njezino prodiranje kroz epitel maternice i 
ugnježđenje u endometrij.  
Embrij:  rana ili razvojna faza bilo kojeg organizma, posebno 
razvojni produkt oplodnje jajašca nakon pojave uzdužne osi i do 
nastanka svih glavnih struktura.  
Embriotoksi čnost:  toksičnost koja ima štetni u činak na normalnu 
strukturu, razvoj, rast i/ili sposobnost preživljavanja embrija.  
Fetus:  nerođeni potomak u post-embrionalnoj fazi.  
Fetotoksi čnost:  toksičnost koja ima štetni u činak na normalnu struk ­
turu, razvoj, rast i/ili sposobnost preživljavanja fetusa.  
Pobačaj: prijevremeno izbacivanje proizvoda za čeća iz maternice: 
embrija ili fetusa koji nije sposoban za preživljavanje.  
Resorpcija:  pojava kad se konceptus, koji odumre nakon ugnjež ­ 
đenja u maternicu, resorbira ili je ve ć resorbiran.  
Rana resorpcija:  dokaz o implantiranju bez prepoznatljivog embri ­
ja/fetusa.  
Kasna resorpcija:  mrtvi embrij ili fetus s vanjskim degenerativnim 
promjenama.  
NOAEL:  skraćenica za visinu doze bez vidljivih štetnih u činaka 
(No Observed Adverse Effect Level) i najviša je doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni u činci vezani uz tretiranje.
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Obično se ispitivana tvar daje gravidnim životinjama najmanje od 
implantacije do jednog dana prije dana planiranog usmr ćivanja, koji 
mora biti što bliži danu normalnog poroda bez rizika od gubitka podataka zbog preranog poroda. Ova ispitna metoda nije namijenjena samo za ispitivanje razdoblja organogeneze (tj. 5-15 dana kod gloda ­
vaca i 6-18 dana kod kuni ća), nego i za ispitivanje u činaka od 
vremena prije implantacije, prema potrebi, kroz cijelo razdoblje gestacije do dana koji prethodi carskom rezu. Neposredno prije carskog reza ženke se usmr ćuju, sadržaj maternice pregledava, a 
kod ploda se traže vanjske vidljive anomalije, kao i promjene na 
mekim tkivima i kosturu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 458
 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Odabir životinjske vrste  
Preporuča se da se ispitivanje obavlja na najrelevantnijim vrstama, te 
da se upotrebljavaju laboratorijske vrste i sojevi koji se obi čno 
koriste za ispitivanja prenatalne razvojne toksi čnosti. Preporu čena 
vrsta glodavca je štakor, a preporu čena vrsta neglodavca je kuni ć. 
Kad god se koriste životinje drugih vrsta, treba navesti opravdane 
razloge.  
1.5.2.  Uvjeti smještaja i hranjenja životinja  
Temperatura u prostoriji gdje se drže pokusne životinje treba biti 
22 °C (± 3 °C) za glodavce i 18 °C (± 3 °C) za kuni će. Iako bi 
relativna vlažnost zraka trebala biti najmanje 30 % i po mogu ćnosti 
ne prelaziti 70 % osim za vrijeme čišćenja prostorije, ciljna bi vrijed ­
nost trebala biti 50-60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno i u slijedu se izmjenjivati 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Što se hranjenja ti če, 
može se primjenjivati uobi čajena laboratorijska prehrana uz neogra ­
ničene količine vode za pi će.
 
Postupak parenja treba provoditi u kavezima koji su prikladni za tu 
svrhu. Iako je životinje koje su se parile najbolje smjestiti pojedi ­
načno, prihvatljiv je i smještaj u malim skupinama.  
1.5.3.  Priprema životinja  
Treba koristiti zdrave životinje koje su se barem 5 dana privikavale 
na laboratorijske uvjete i koje prethodno nisu bile podvrgavane 
ispitnim postupcima. Pokusne životinje treba okarakterizirati s 
obzirom na njihovu vrstu, soj, podrijetlo, spol, tjelesnu masu i/ili dob. Tjelesna bi masa i starost životinja u svim pokusnim skupinama trebala biti ujedna čena u najve ćoj mogućoj mjeri. Za svaku visinu 
doze treba koristiti mlade odrasle ženke koje još nisu imale potom ­
stvo. Ženke se trebaju pariti s mužjacima iste vrste i soja, a parenje između braće i sestara treba izbjegavati. Kod glodavaca nulti dan 
gestacije je dan kad se opazi vaginalni čep i/ili sperma; za kuni će je 
nulti dan obi čno dan koitusa ili umjetne oplodnje, ako se primjenjuje 
ta tehnika. Parene ženke treba nasumi čno rasporediti u kontrolne 
skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba rasporediti na 
način da se u činci do kojih bi moglo do ći zbog njihovog položaja 
svedu na minimum. Svakoj se životinji dodjeljuje jedinstveni iden ­
tifikacijski broj. Parene ženke se nasumi čno raspore đuju u kontrolne 
skupine i skupine koje će se tretirati, a ako su se parile skupno, 
životinje iz svake skupine jednakomjerno treba rasporediti u 
skupine za tretiranje i kontrolu. Isto tako, ženke koje je oplodio isti mužjak treba ujedna čeno rasporediti po skupinama.
 
1.6. POSTUPAK  
1.6.1.  Broj i spol životinja  
Svaka ispitivana i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj 
ženki koji će za obdukciju osigurati oko 20 ženki s implantima. 
Skupine s manje od 16 životinja s implantima mogu biti nedovoljne. 
Nije nužno da će smrtnost majki ugroziti studiju, pod uvjetom da 
nije viša od oko 10 %.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 459
 
1.6.2.  Priprema doza  
Ako se radi lakšeg doziranja koristi nosa č ili neki drugi dodatak, 
treba obratiti pozornost na sljede će karakteristike: djelovanje na 
apsorpciju, distribuciju, metabolizam i zadržavanje ili izlu čivanje 
ispitivane tvari; djelovanje na kemijska svojstva ispitivane tvari 
koja mogu izmijeniti njene toksi čke karakteristike; djelovanje na 
unos hrane ili vode ili na uhranjenost životinja. Nosa č ne smije 
imati toksi čno djelovanje u vrijeme razvoja niti smije djelovati na 
reprodukciju.  
1.6.3.  Doziranje  
Obično se ispitivana tvar primjenjuje svakodnevno, od implantacije 
(npr. 5. dan nakon parenja) do dana prije planiranog carskog reza. 
Ako preliminarne studije, kada se rade, ne upu ćuju na veliku vjero ­
jatnost predimplantacijskoga gubitka, tretiranje se može produžiti kroz cijelo razdoblje gestacije, od parenja do dana koji prethodi 
planiranom usmr ćivanju. Dobro je poznato da neprimjereno postu ­
panje ili stres tijekom gravidnosti mogu dovesti do prenatalnih gubi ­
taka. Radi zaštite od prenatalnoga gubitka uslijed faktora nevezanih 
uz tretiranje, treba izbjegavati nepotrebno rukovanje gravidnim živo ­
tinjama, kao i stres izazvan vanjskim faktorima kao što je buka.
 
Koriste se najmanje tri visine doze i parelelna kontrola. Zdrave 
životinje nasumce se raspore đuju u kontrolne skupine i skupine za 
tretiranje. Doze razli čitih visina treba primijeniti u odre đenim 
vremenskim razmacima kako bi se dobila gradacija toksi čkog 
učinka. Ako nije ograni čena fizikalno kemijskom prirodom ili biolo ­ 
škim svojstvima ispitivane tvari, najviša doza odabire se s ciljem da izazove odre đenu razvojnu toksi čnost i/ili toksi čnost za majku (kli ­
nički znakovi ili smanjenje tjelesne mase), ali ne i smrt ili tešku 
patnju životinja. Najmanje jedna od srednjih doza treba proizvesti minimalne toksi čne učinke koji se mogu promatrati. Najniža doza ne 
smije proizvesti nikakav dokaz toksi čnosti, niti za majku niti za plod 
u razvoju. Nakon toga treba odabrati niz sve nižih doza kako bi se 
pokazale sve reakcije vezane uz doziranje, i na kraju najnižu dozu kod koje nema vidljivih toksi čkih učinaka (NOAEL). Za utvr đivanje 
slijeda silaznih doza često je najbolje doze primijeniti u dva do četiri 
kraća intervala te je često bolje dodati četvrtu ispitnu skupinu nego 
između dva doziranja imati jako dugi interval (npr. faktor ve ći od 
10). Iako je cilj utvr đivanje NOAEL-a za majku, studije u kojima se 
ta visina doze ne utvr đuje mogu isto tako biti prihvatljive (1).
 
Visine doza treba birati uzimaju ći u obzir postoje će podatke o toksi č­
nosti, kao i dodatne informacije o metabolizmu i toksikinetici ispiti ­
vane tvari ili srodnih materijala. Te će informacije tako đer biti od 
pomoći kod dokazivanja primjerenosti režima doziranja.  
Istodobno treba koristiti i kontrolnu skupinu. Ta skupina treba biti 
placebo kontrolna skupina ili kontrolna skupina tretirana samo nosa ­ 
čem, ako se kod primjene ispitivane tvari koristi nosa č. Svim skupi ­
nama treba dozirati isti volumen ispitivane tvari ili nosa ča. Sa živo ­
tinjama u kontrolnim skupinama treba postupati na jednak na čin kao 
sa životinjama u tretiranim skupinama. Kontrolne skupine tretirane 
nosačem trebaju primiti najvišu korištenu koli činu nosača (kao i 
skupina tretirana najnižom dozom ispitivane tvari).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 460
 
1.6.4.  Grani čni test  
Ako test pri jednoj visini doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne 
mase/dan, koja se primjenjuje oralno prema postupku opisanom za ovu studiju, ne proizvede vidljive toksi čke učinke niti kod gravidnih 
ženki niti kod njihovog potomstva i ako se u činci ne o čekuju na 
temelju postoje ćih podataka (npr. o strukturno i/ili metaboli čki 
srodnim spojevima) potpuna studija uz primjenu tri visine doza može se smatrati nepotrebnom. O čekivana ljudska izloženost može 
ukazati na potrebu da se u grani čnom testu primijeni viša oralna 
doza. Za druge vrste primjene, kao što su inhalacijska i dermalna, fizikalno-kemijska svojstva ispitivane tvari često mogu indicirati ili 
ograničavati najvišu mogu ću razinu izloženosti (na primjer, dermalna 
primjena ne smije uzrokovati jaku lokalnu toksi čnost).
 
1.6.5.  Primjena doza  
Ispitivana tvar ili nosa č obično se primjenjuje oralno, intubacijom. 
Ako se koristi drugi put primjene, osoba koja obavlja test mora 
opravdati i obrazložiti svoj izbor, a možda će biti potrebne i odgo ­
varajuće izmjene (2)(3)(4). Ispitivanu tvar treba primjenjivati svakog 
dana po prilici u isto vrijeme.  
Doza koja se daje pojedina čnim životinjama obi čno se temelji na 
zadnje izmjerenoj tjelesnoj masi. Me đutim, kod prilago đavanja doze 
tijekom posljednje tre ćine gravidnosti potreban je oprez. Kod odabira 
doze treba koristiti postoje će podatke kako bi se sprije čila previsoka 
toksičnost za majku. Me đutim, ako se kod tretiranih ženki opazi 
previsoka toksi čnost, te životinje treba humano usmrtiti. Ako neko ­
licina gravidnih životinja pokaže znakove previsoke toksi čnosti, 
treba razmotriti prekid pokusa na skupini koja prima tu dozu. Ako se tvar primjenjuje oralnom intubacijom, najbolje je životinjama dati jednu dozu pomo ću želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske 
kanile. Maksimalni volumen teku ćine koji se može primijeniti 
odjednom ovisi o veli čini pokusne životinje. Taj volumen ne smije 
biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim kad se radi o vodenim 
otopinama koje dopuštaju primjenu volumena od 2 ml/100 g tjelesne 
mase. Ako se kao nosa č koristi kukuruzno ulje, taj volumen ne smije 
biti veći od 0,4 ml/100 g tjelesne mase. Variranje ispitnih volumena 
treba svesti na minimum podešavanjem koncentracije, kako bi se kod svih visina doza osigurao stalni volumen.
 
1.6.6.  Opažanje ženki  
Klinička opažanja treba obavljati i bilježiti barem jednom dnevno, 
najbolje svaki dan u isto vrijeme, uzimaju ći u obzir vršno razdoblje 
predviđenog djelovanja nakon doziranja. Bilježi se stanje životinja, 
uključujući smrtnost, stanje umiranja, relevantne promjene u 
ponašanju i sve jasne znakove toksi čnosti.  
1.6.7.  Tjelesna masa i unos hrane  
Životinje treba vagati na nulti ili najkasnije tre ći dan gestacije u 
slučaju da vanjski uzgajiva č isporučuje već parene životinje, zatim 
prvi dan doziranja, tijekom razdoblja doziranja najmanje svaki tre ći 
dan i na dan predvi đenog usmr ćivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 461
 
Unos hrane treba bilježiti u trodnevnim intervalima, na iste dane kad 
se mjeri i tjelesna masa životinja.  
1.6.8.  Pregled post-mortem  
Ženke treba usmrtiti jedan dan prije o čekivanog dana ko ćenja. Ženke 
koje pokazuju simptome poba čaja ili preranog ko ćenja prije plani ­
ranog usmr ćivanja treba usmrtiti i podvrgnuti temeljitom makroskop ­
skom pregledu.  
Na kraju studije ili u slu čaju smrti u tijeku studije, ženke treba 
maksroskopski pregledati radi otkrivanja bilo kakvih strukturnih abnormalnosti ili patoloških promjena. Ocjenjivanje stanja majki 
tijekom carskog reza i naknadne analize fetusa treba po mogu ćnosti 
obaviti ne znaju ći kojoj tretiranoj skupini pripadaju, kako bi se 
pristranost pri donošenju ocjene svela na minimum.
 
1.6.9.  Pregled sadržaja maternice  
Odmah po svršetku studije, odnosno čim je prije mogu će nakon 
smrti, treba odstraniti maternice i utvrditi stanje gravidnosti životinja. 
Maternice koje ne izgledaju gravidne treba dalje pregledati (npr. 
bojenje amonijevim sulfidom kod glodavaca i bojenje metodom po Salewskom ili nekom drugom prikladnom metodom kod kuni ća) 
kako bi se potvrdilo da nema graviditeta (5).
 
Gravidne maternice, uklju čujući cerviks (vrat maternice) treba izva ­
gati. Masa gravidne maternice ne mjeri se kod životinja koje su uginule tijekom studije.
 
Kod gravidnih životinja utvr đuje se broj žutih tijela ( corpora lutea ). 
Kod sadržaja maternice utvr đuje se broj mrtvih embrija ili fetusa i 
broj fetusa sposobnih za preživljavanje. Da bi se procijenilo relativno 
vrijeme smrti zametka (vidjeti odjeljak 1.2.) treba opisati stupanj 
resorpcije.  
1.6.10.  Pregled fetusa  
Treba utvrditi spol i tjelesnu masu svakog fetusa.  
Svaki se fetus pregledava radi utvr đivanja vanjskih promjena (6).  
Pregledom se kod fetusa utvr đuju promjene na kosturu i mekim 
tkivima (npr. varijacije i malformacije ili anomalije) (7)(8)(9)(10) (11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22) (23)(24). Kategori ­
zacija fetalnih promjena je poželjna, ali se ne zahtijeva. Ako se radi 
kategorizacija, jasno treba navesti kriterije za utvr đivanje svake kate ­
gorije. Posebnu pozornost treba posvetiti reproduktivnom traktu koji se pregledava kako bi se utvrdili mogu ći znakovi promijenjenog 
razvoja.
 
Kod glodavaca treba pripremiti oko polovine svakog legla i 
pregledom utvrditi promjene na kostima. Na ostatku legla pregledom se utvrđuju promjene na mekim tkivima, uz primjenu prihva ćenih i 
odgovaraju ćih metoda serijskih rezova ili tehnika preciznog makro ­
skopskog seciranja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 462
 
Kod neglodavaca, npr. kuni ća, kod svih se fetusa pregledom utvr ­ 
đuju promjene na mekim tkivima i na kostima. Na tijelima tih fetusa 
promjene na mekim tkivima utvr đuju se preciznim seciranjem koje 
može uklju čivati i postupke za daljnju analizu unutarnje strukture 
srca (25). Glave polovice fetusa pregledanih na ovaj na čin treba 
odstraniti i obraditi za analizu promjena na mekim tkivima (uklju ču­
jući oči, mozak, nosne šupljine i jezik) uz primjenu standardnih 
metoda serijskih rezova (26) ili neke druge jednako osjetljive metode. Tijela tih fetusa i preostale cijele fetuse treba obraditi i 
pregledati radi utvr đivanja promjena na kostima, uz primjenu istih 
metoda koje su opisane za glodavce.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Podaci se bilježe pojedina čno za svaku ženku kao i za njeno potom ­
stvo i rezimiraju u obliku tablice, gdje se za svaku pokusnu skupinu i 
svaku generaciju navodi broj životinja na po četku ispitivanja, broj 
životinja uginulih tijekom ispitivanja ili usmr ćenih iz humanih 
razloga, vrijeme svake smrti, odnosno svakog humanog usmr ćenja, 
broj gravidnih ženki, broj životinja koje pokazuju znakove toksi čno­
sti, opis opaženih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme pojavlji ­
vanja, trajanje i težinu svih toksi čkih učinaka, vrste opažanja obav ­
ljenih na embrijima/fetusima i svi relevantni podaci o leglima.  
Brojčani se rezultati ocjenjuju odgovaraju ćom statisti čkom metodom, 
pri čemu je leglo jedinica za analizu podataka. Treba upotrijebiti 
neku opće prihvaćenu statisti čku metodu; statisti čke metode se 
odabiru u okviru plana studije i njihov odabir treba obrazložiti. Podaci o životinjama koje nisu preživjele do planiranog usmr ćivanja 
također se navode u izviješ ću. Ti se podaci mogu uklju čiti u srednje 
vrijednosti za skupinu tamo gdje je to relevantno. Relevantnost poda ­
taka dobivenih od takvih životinja, pa prema tome i uklju čivanje ili 
isključivanje iz srednjih vrijednosti za bilo koju skupinu, treba obra ­
zložiti i ocijeniti na individualnoj osnovi.
 
2.2. OCJENA REZULTATA  
Nalazi studije prenatalne razvojne toksi čnosti ocjenjuju se u okviru 
promatranih u činaka. Ocjena obuhva ća slijedeće informacije:  
— rezultate ispitivanja majke i embrija/fetusa, uklju čujući procjenu 
ili nepostojanje odnosa izme đu izloženosti životinja ispitivanoj 
tvari i pojave i težine svih utvr đenih promjena,  
— kriterije korištene za kategorizaciju vanjskih promjena, promjena 
na mekim tkivima i kostima fetusa, ako je kategorizacija 
napravljena,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 463
 
— kad je primjereno, podatke o kontrolama iz ranijih ispitivanja, 
radi boljeg tuma čenja rezultata studije,  
— brojeve upotrijebljene u izra čunu svih postotaka ili indeksa,  
— odgovaraju ću statističku analizu nalaza studije, tamo gdje je 
primjereno, koja treba obuhva ćati dovoljno informacija o 
metodi analize kako bi nezavisni revizor/statisti čar mogao 
ponovo rekonstruirati i ocijeniti analizu.  
U svakoj studiji koja pokazuje nepostojanje toksi čkih učinaka treba 
razmotriti mogu ćnost daljnjeg istraživanja s ciljem utvr đivanja 
apsorpcije i bioraspoloživosti ispitivane tvari.  
2.3. TUMA ČENJE REZULTATA  
Studija prenatalne razvojne toksi čnosti dat će informacije o u čincima 
ponavljanog izlaganja ispitivanoj tvari tijekom gravidnosti na ženke i 
na intrauterini razvoj njihovih potomaka. Rezultate studije treba tuma ­ 
čiti zajedno s nalazima subkroni čnih, reprodukcijskih, toksikokineti ­ 
čkih i drugih studija. Kako je naglasak stavljen i na op ću toksičnost, u 
smislu toksi čnosti za majku, i na kona čne toksične učinke na razvoj 
potomstva, rezultati studije omogu ćuju da se do neke mjere razlikuju 
razvojni u činci koji se javljaju bez prisutnosti op će toksičnosti i onih 
koji se javljaju samo kod doza koje su toksi čne za majku (27).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora obuhva ćati sljede će specifi čne 
informacije:  
ispitivana tvar:  
— fizikalna svojstva, i gdje je relevantno, fizikalno-kemijska 
svojstva,  
— identifikacijska oznaka, uklju čujući CAS broj ako je poznat/utvr ­ 
đen, 
— čistoća. 
Nosač (prema potrebi):  
— obrazloženje za odabir nosa ča, ako nije u pitanju voda.  
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta i soj,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti držanja, prehrana itd.  
— tjelesna masa pojedina čnih životinja na po četku ispitivanja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— obrazloženje za odabir visine doze,  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari/pripravi hrane, posti ­
gnutim koncentracijama, stabilnosti i homogenosti pripravka,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 464
 
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— metoda prera čunavanja koncentracije ispitivane tvari predvi đene 
za primjenu putem hrane ili vode (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg 
tjelesne težine/dan), ovisno o slu čaju, 
— okolišni uvjeti,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Rezultati:  
Podaci o toksi čkim reakcijama majke po dozama, uklju čujući, no ne 
ograničavajući se na:  
— broj životinja na po četku ispitivanja, broj preživjelih životinja, 
broj gravidnih ženki i broj poba čaja, broj životinja koje su se 
prerano okotile,  
— dan smrti tijekom studije, odnosno jesu li životinje preživjele do 
završetka ispitivanja,  
— podatke o životinjama koje nisu preživjele do planiranog usmr ­ 
ćivanja treba navesti, ali ih se ne uklju čuje u statisti čke uspo­
redbe izme đu skupina,  
— dan opažanja svakog klini čkog znaka abnormalnosti i kasnije 
promjene,  
— tjelesnu masu, promjenu tjelesne mase i masu gravidne mater ­
nice, uklju čujući, neobvezno, promjenu tjelesne mase korigiranu 
za masu gravidne maternice,  
— unos hrane i, ako je mjeren, unos vode,  
— nalaze obdukcije, uklju čujući masu maternice,  
— treba navesti visine doza bez vidljivih toksi čkih učinaka na 
majku i na razvoj ploda.  
Konačni razvojni toksi čki učinci po dozama za legla s implantima, 
uključujući: 
— broj žutih tijela,  
— broj implantacija, broj i postotak živih i mrtvih fetusa i 
resorpcija,  
— broj i postotak gubitaka prije i poslije implantacije.  
Krajnji razvojni u činci po dozama za legla sa živim fetusima, uklju ­ 
čujući: 
— broj i postotak živih potomaka,  
— omjer spolova,  
— tjelesnu masu fetusa, po mogu ćnosti za svaki spol zasebno i 
kombinirano za oba spola,  
— vanjske malformacije, malformacije mekih tkiva i kostiju i druge 
relevantne promjene,  
— kriterije za kategorizaciju, ako je primjereno,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 465
 
— ukupan broj i postotak fetusa i legala s bilo kakvim vanjskim 
promjenama i promjenama na mekim tkivima i kostima, kao i 
vrste i u čestalost pojedina čnih anomalija i drugih relevantnih 
promjena.  
Diskusija o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Kavlock R.J. et al., (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; str. 399-410.
 
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z., (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; str. 386-398.  
(3) Wong, B.A., et al., (1997) Developing Specialised Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; str. 1-8.  
(4) US Environmental Protection Agency, (1985) Subpart 
E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhala ­
tion Developmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E., (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie , 247, 367.  
(6) Edwards, J.A., (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology . D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16, str. 171-173.  
(8) Igarashi, E. et al., (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32, str. 381-391.  
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology , 47 str. 229-242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.
 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy, 127, str. 291-306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology , 11 str. 313-320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology , 9, str. 398- 
408. 
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology , 8, str. 309-316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology , 46, str. 169-181.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual , str. 163-173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy , 41, str. 411-445.  
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology , 39, str. 61-63.  
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  
American Journal of Anatomy , 36, str. 313-355.  
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity 
Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis , 4, 
str. 181-188.  
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, str. 251-277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of Tera ­
tology , Vol. 4. Plenum, NY. (24) Varnagy, L. (1980) Use of 
Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. Acad. Sci. Hung , 28, str. 
233-239.
 
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung , 28, str. 233-239.  
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology , 9, str. 37-38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, 
D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, str. 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register , 
56, str. 63798-63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology, 55, str. 249-292.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 467
 
B.32.  STUDIJE KARCINOGENOSTI  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
451 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 451 o studijama karcino ­
genosti usvojena je 1981. Smatralo se da je nužno razviti ovu revidiranu 
ispitnu metodu B.32 kako bi se odrazio skorašnji razvoj u podru čju dobro­
biti životinja i regulatornih zahtjeva (2) (3) (4) (5) (6). Ova ispitna metoda B.32 ažurirana je paralelno s revizijama Poglavlja B.30 ovog Priloga, Studije kroni čne toksičnosti te Poglavlja B.33 ovog Priloga, Kombinirane 
studije kroni čne toksičnosti/karcinogenosti te s ciljem pribavljanja dodatnih 
informacija od životinja korištenih u studiji te prikupljanja daljnjih pojedi ­
nosti o odabiru doze. Ova ispitna metoda B.32 namijenjena je primjeni u ispitivanju širokog spektra kemikalija, uklju čujući pesticide i industrijske 
kemikalije. No, treba imati na umu da neke pojedinosti i zahtjevi mogu 
biti različiti za ljude (vidjeti Smjernicu S1B o Ispitivanju kancerogenosti 
lijekova Me đunarodne konferencije o uskla đivanju ( International conference 
on Harmonisation  (ICH)).
 
2. Većina studija karcinogenosti provodi se na vrstama glodavaca, stoga i ovu 
ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u studijama koje se provode 
na tim vrstama. Ako se traži da se studije provode na neglodavcima, treba primijeniti na čela i postupke izložene u ovoj ispitnoj metodi uz odgovara ­
juće modifikacije zajedno s na čelima i postupcima izloženima u Poglavlju 
B.27 ovog Priloga, Studija subkroni čne oralne toksi čnosti-90-dnevna studija 
oralne toksi čnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza (6)-. 
Ostale upute dostupne su u Smjernici br. 116. o planiranju i provo đenju 
studija kroni čne toksičnosti i kancerogenosti (7).
 
3. Tri glavna na čina primjene korištena u studijama kancerogenosti jesu oralni, 
dermalni i inhalacijski. Odabir na čina primjene ovisi o fizikalnim i kemij ­
skim svojstvima ispitivane kemikalije te o pretežnom na činu izlaganja ljudi. 
Dodatne informacije o odabiru na čina izlaganja navedene su u Smjernici 
br. 116. (7).  
4. Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je naj češće 
korišteni na čin u studijama karcinogenosti. Dok dugotrajne studije karcino ­
genosti, koje uklju čuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, mogu tako đer 
biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod odre đenim regulatornim režimima radi 
određivanja rizika za ljude, oba na čina izlaganja uklju čuju znatnu tehni čku 
složenost. Takve studije treba planirati za svaki slu čaj posebno iako ovdje 
izložena ispitna metoda za odre đivanje i ocjenu karcinogenosti putem oralne 
primjene može poslužiti kao temelj za protokol za studije inhalacijom i/ili dermalnim putem, uzimaju ći u obzir razdoblja tretiranja, klini čke i patološke 
parametre itd. Dostupna je OECD-ova Smjernica za primjenu ispitivane 
kemikalije dermalnim (7) i inhalacijskim putem (7) (8). Poglavlje B.8 
ovog Priloga (9) i Poglavlje B.29 ovog Priloga (10), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (8), treba poslužiti kao detaljna konzultacija pri planiranju dugotrajnijih studija koje uklju čuju izlaganje 
inhalacijom. Poglavlje B.9 ovog Priloga (11) treba uzeti kao pomo ć pri 
ispitivanju provedenom dermalnim putem.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 468
 
5. Studija karcinogenosti pruža informacije o mogu ćim rizicima za zdravlje 
koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponovljenog izlaganja kroz gotovo 
čitavo ili čitavo životno razdoblje korištenih vrsta. Ta će studija pružiti 
informacije o toksi čnim učincima ispitivane kemikalije, uklju čujući i poten­
cijalnu karcinogenost te može ukazati na organe mete i mogu ćnost akumu ­
lacije. Može pružiti procjenu razine neopaženih štetnih u činaka te u slu čaju 
negenotoksi čnih karcinogena za tumorske reakcije koje se mogu upotrijebiti 
za određivanje sigurnosnih kriterija za izlaganje ljudi.– Tako đer je naglašena 
potreba za pažljivim klini čkim opažanjima životinja radi dobivanja što je 
moguće više informacija.  
6. Ciljevi studija karcinogenosti obuhva ćenih ovom ispitnom metodom uklju ­ 
čuju: 
— Identifikaciju karcinogenih svojstava ispitivane kemikalije koja rezulti ­
raju pove ćanjem u čestalosti pojavljivanja neoplazmi, pove ćanim 
omjerom malignih neoplazmi ili smanjenjem u vrijeme pojavljivanja neoplazmi u usporedbi s konkurentnim kontrolnim skupinama,
 
— Identifikaciju organa meta karcinogenosti,  
— Identifikaciju vremena pojavljivanja neoplazmi,  
— Karakterizaciju odnosa doze i reakcije za tumor,  
— Identifikaciju razine neopaženih štetnih u činaka (NOAEL) ili polazne 
točke za odre đivanje referente doze za usporedbu (benchmark dose, 
BMD),  
— Ekstrapolaciju karcinogenih u činaka na niskim razinama izlaganja ljudi,  
— Pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s na činom djelo ­
vanja (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
UVODNA RAZMATRANJA  
7. U odre đivanju i procjeni potencijalne karcinogenosti ispitivane kemikalije 
laboratorij koji provodi ispitivanje prije provo đenja studije mora u obzir 
uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi se plan studije usmjerio na u činkovitije ispitivanje potencijala karcinogenosti te 
kako bi se na minimum svela primjena životinja. Informacije i razmatranja 
o svim na činima djelovanja karcinogena na koji se sumnja (2) (7) (12) (13) 
(14) (15) posebno su važne jer se optimalan plan može razlikovati ovisno o 
tome zna li se ili sumnja za ispitivanu kemikaliju da je genotoksi čni karci­
nogen. Ostale upute o razmatranju na čina djelovanja mogu se prona ći u 
Smjernici br. 116 (9).
 
8. Informacije koje će pomoći u planiranju istraživanja obuhva ćaju identitet, 
kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, rezul ­
tate svih ispitivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo  uključujući ispitivanja 
genotoksi čnosti; očekivanu/e primjenu/e i potencijal za ljudsko izlaganje, 
dostupne podatke (Q)SAR, mutagenost/genotoksi čnost, karcinogenost i 
druge toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture, dostupne toksi ­
kokinetičke podatke (kinetika jedne doze i ponovljene doze ako je dostupno)  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 469
 
te podatke dobivene drugim istraživanjima s ponovljenim izlaganjem. Odre ­ 
đivanje karcinogenosti treba provesti nakon dobivanja po četnih informacija 
o toksičnosti iz 28-dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksi čnosti uz 
primjenu ponavljanih doza. Kratkoro čno ispitivanje po četnog razvoja raka 
također može pružiti korisne informacije. Pristup s fazama u ispitivanju 
karcinogenosti treba smatrati dijelom ukupnog utvr đivanja potencijalno 
nepovoljnih u činaka doti čne ispitivane kemikalije po zdravlje (16) (17) 
(18) (19).  
9. Prije po četka studije treba odrediti najprikladnije statisti čke metode za 
analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Problemi koja treba 
razmatrati uklju čuju treba li statistika uklju čivati prilagodbu preživjelih, 
analizu ukupnog rizika od tumora u odnosu na trajanje preživljavanja, analizu vremena za stvaranje tumora te analizu u slu čaju prijevremenog 
svršetka jedne ili više skupina. Smjernice o odgovaraju ćim statisti čkim 
analizama i klju čnim referencama na me đunarodno prihva ćene statisti čke 
metode nalaze se u Smjernici br. 116. (7) te tako đer u Smjernici br. 35. 
za analizu i ocjenu studija kroni čne toksičnosti i karcinogenosti (20).
 
10. Pri provo đenju istraživanja karcinogenosti uvijek treba slijediti na čela i 
razloge izložene u OECD-ovoj Smjernici br. 19. o prepoznavanju, odre đi­
vanju i primjeni klini čkih znakova kao humanih krajnjih ishoda za pokusne 
životinje korištene u procjeni sigurnosti (21) posebno u stavku 62. U tom 
stavku stoji da „u studijama uz primjenu ponovljenog doziranja, kada živo ­
tinje pokazuju progresivne klini čke znakove koji izazivaju daljnje pogor ­ 
šanje stanja, treba donijeti upu ćenu odluku o tome treba li humano usmrtiti 
životinje ili ne. Odluka treba uklju čivati razloge s obzirom na vrijednost 
informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u studiji s obzirom 
na njezino op će stanje. Ako se odlu či zadržati životinju u ispitivanju, u česta­
lost opažanja treba pove ćati u skladu s potrebama. Tako đer se može privre ­
meno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati patnju ili stres ili smanjiti 
ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispitivanja.”  
11. Detaljne upute za na čela odabira doza za studije kroni čne toksičnosti i 
karcinogenosti te rasprava o njima mogu se prona ći u Smjernici br. 116. 
(7), kao i u dvije publikacije instituta International Life Sciences Institute 
(22) (23). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili 
primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovaraju ćih razina 
doza treba posti ći ravnotežu izme đu procjene opasnosti s jedne strane i 
karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo zna čenje s druge strane. 
To je posebno relevantno u situaciji u kojoj treba provesti kombiniranu 
studiju kroni čne toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) 
(stavak 12.).  
12. Treba navesti razloge za provo đenje kombinirane studije kroni čne toksič­
nosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga), a ne odvojeno provo ­ 
đenje studije kroni čne toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga) i studije 
karcinogenosti (ova ispitna metoda B.32). Kombinirano ispitivanje pruža veću učinkovitost što se ti če vremena i troškova u usporedbi s provo đenjem 
dviju zasebnih studija, bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroni čnoj 
fazi niti u kancerogenoj fazi. Pri provo đenju kombinirane studije kroni čne 
toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) treba pažljivo 
razmisliti o na čelima odabira doza (stavci 11. i 22. - 25.) te se tako đer 
priznaje da pod odre đenim regulatornim okvirima mogu biti nužne odvojene 
studije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 470
 
13. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju 
ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (7).  
NAČELO ISPITIVANJA  
14. Ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno u stupnjevanim dozama 
raznim skupinama pokusnih životinja tijekom najve ćeg dijela njihova 
životnog vijeka, obi čno oralnim putem. Može biti prikladno i ispitivanje 
inhalacijom ili dermalnim putem. Životinje se pomno promatraju radi znakova toksi čnosti i razvoja neoplazmi čkih lezija. Životinje koje ugibaju 
ili su usmr ćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju 
ispitivanja preživjele se životinje usmr ćuju i podvrgavaju obdukciji.
 
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
15. Ova ispitna metoda prvenstveno obuhva ća određivanje i ocjenu karcinoge ­
nosti u glodavaca (stavak 2.). U obzir se može uzeti primjena vrsta neglo ­
davaca ako dostupni podaci sugeriraju da su oni relevantniji za predvi đanje 
zdravstvenih u činaka po ljude. Treba obrazložiti odabir vrsta. Preferirana 
vrsta glodavaca jesu štakori iako se mogu upotrijebiti i druge vrste gloda ­
vaca, npr. miš. Iako uporaba miševa u ispitivanju karcinogenosti može biti 
ograničeno korisna (24) (25) (26), u nekim aktualnim regulatornim progra ­
mima još se uvijek traži ispitivanje karcinogenosti u miševa osim ako je utvrđeno da nema znanstvene potrebe za takvom studijom. Štakori i miševi 
preferirani su pokusni modeli zbog relativno kratkog životnog vijeka, raši ­
rene primjene u farmakološkim i toksikološkim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo informacija o njihovoj fiziolo ­
giji i patologiji. Dodatne informacije o odabiru vrsta i sojeva navedene su u 
Smjernici br. 116. (7).
 
16. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobi čajeni u 
laboratorijskoj praksi. Studiju karcinogenosti treba po mogu ćnosti obaviti na 
životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje korištene u prelimi ­
narnoj/im studiji/-ama toksi čnosti kra ćeg trajanja ako se za životinje tog 
soja i podrijetla zna da imaju problema u postizanju uobi čajeno prihva ćenih 
kriterija za preživljavanje u dugotrajnim istraživanjima [vidjeti Smjernicu br. 116. (9)], treba razmotriti primjenu životinjskog soja s prihvatljivom 
stopom preživljavanja za dugotrajnu studiju. Treba upotrebljavati ženke 
koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
 
Smještaj i hranjenje  
17. Životinje moraju biti smještene pojedina čno ili u kavezima u malim skupi ­
nama istog spola; pojedina čni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je 
znanstveno opravdan (27) (28) (29). Kaveze treba rasporediti na na čin da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na minimum. 
Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama trebala bi iznositi 22 °C 
(± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogu ćnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati 
svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna 
laboratorijska prehrana uz neograni čene količine pitke vode. Prehrana mora
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 471
 
ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje konta ­
miniraju hranu - uklju čujući ostatke pesticida, postojane organske zaga đi­
vače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograni čeno na njih - 
koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je mogu će manji. 
Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i 
prehranu treba izra đivati periodi čno, barem na po četku studije te u slu čaju 
promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uklju čiti u završno izvješ će. 
Također treba pružiti analiti čke informacije o vodi za pi će korištenoj u 
istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem 
prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih 
potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.  
Priprema životinja  
18. Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske 
uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim postupcima. U slu čaju glodavaca doziranje životinja treba po četi što je 
moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po 
mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje 
treba karakterizirati što se ti če vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. 
Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora 
biti minimalno i ne smije biti ve će od ± 20 % prosje čne mase svih životinja 
u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumi čno odrediti za 
kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumi čnog odabira ne smije biti 
značajne razlike u prosje čnoj tjelesnoj masi izme đu skupina svakog spola. 
U slučaju statisti čki značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumi čnog odabi ­
ranja ako je mogu će. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifika ­
cijski broj i treba je trajno ozna čiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikro ­ 
čipa ili drugom odgovaraju ćom metodom.
 
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
19. Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja tako 
da se omogu ći temeljita biološka i statisti čka ocjena. Stoga svaka skupina 
koja prima dozu i paralelna kontrolna skupina moraju sadržavati najmanje 
50 životinja svakog spola. Ovisno o namjeni studije, može biti mogu će 
povećati statisti čku snagu klju čnih procjena druk čijom raspodjelom životinja 
tako da bude druk čija u raznim skupinama koje primaju dozu s više od 50 
životinja u skupinama s niskom dozom, npr. radi procjene karcinogenog 
potencijala na niskim dozama. No, treba priznati da umjereno pove ćanje 
skupine daje relativno malo pove ćanje statisti čke snage studije. Daljnje 
informacije o statisti čkom planiranju studije i odabiru visina doza radi pove ­ 
ćanja statisti čke snage na maksimum nalaze se u Smjernici br. 116. (7).  
Odabir za usmr ćivanje u me đuvremenu i satelitske (indikatorske) 
skupine  
20. Studija može omogu ćivati usmr ćivanje u me đuvremenu, npr. s 12 mjeseci, 
kako bi se pribavile informacije o napredovanju neoplazmi čkih promjena i 
mehanisti čke informacije ako je to znanstveno opravdano. Ako su takve 
informacije ve ć dostupne iz prethodnih studija toksi čnosti ispitivane kemi ­
kalije uz primjenu ponavljanih doza, usmr ćivanje u me đuvremenu nije znan ­
stveno opravdano. Ako su usmr ćivanja u me đuvremenu uklju čena u plan 
studije, broj životinja u svakoj skupini koja prima dozu odre đen za usmr ­ 
ćivanje u me đuvremenu obi čno će biti deset životinja svakog spola, a 
ukupni broj životinja uklju čenih u plan studije treba pove ćati za broj živo ­
tinja odre đenih za usmr ćivanje prije završetka studije. Ako je potrebno, 
tijekom studije može se uklju čiti i dodatna skupina indikatorskih životinja 
(tipično pet životinja po spolu) radi nadzora stanja bolesti (30). Ostale upute 
nalaze se u Smjernici br. 116. (7).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 472
 
Skupine za doziranje i doziranje  
21. Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak me đu visinama 
doza nalaze se u Smjernici br. 116. (7). Treba upotrijebiti najmanje tri visine doza i paralelnu kontrolu. Visine doza op ćenito se temelje na rezultatima 
kraćih studija uz primjenu ponavljanih doza ili studija za odre đivanje 
raspona i u obzir moraju uzeti sve toksikološke i toksikokineti čke podatke 
dostupne o ispitivanoj kemikaliji ili srodnim kemikalijama.
 
22. Osim ako nije ograni čeno fizikalno-kemijskom prirodom ili biološkim u čin­
cima ispitivane kemikalije, obi čno treba odabrati najvišu visinu doze kako bi 
se identificirali organi mete i toksi čni učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne 
toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Uzimaju ći u obzir čimbenike izložene u 
stavku 23. u nastavku, obi čno treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se 
izveli dokazi o toksi čnosti kao što je, primjerice, dokazano padom pove ćanja 
tjelesne mase (otprilike 10 %). No, ovisno o ciljevima studije (vidjeti stavak 6.), može se odabrati najviša visina doze manja od doze koja pruža dokaze o toksičnosti npr. ako doza izaziva štetan, zabrinjavaju ć učinak koji unato č 
tomu utje če na životni vijek ili tjelesnu masu.
 
23. Visine doza i razmaci izme đu visina doza mogu se odabrati kako bi se 
odredio ishod doza-reakcija i, ovisno o na činu djelovanja ispitivane kemi ­
kalije, NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, npr. BMD (vidjeti stavak 25.) na najnižoj visini doze. Čimbenici koje treba uzeti u obzir pri dodje ­
ljivanju nižih doza uklju čuju očekivani nagib krivulje doze i reakcije, doze 
na kojima se mogu dogoditi važne promjene u metabolizmu ili na činu 
toksičnog djelovanja, gdje se o čekuje prag ili gdje se o čekuje polazna 
točka za ekstrapolaciju za niske doze.
 
24. Odabrani razmak izme đu visina doza ovisit će o svojstvima ispitivane kemi ­
kalije i ova ispitna metoda ne može ga propisati, ali dva do četiri intervala 
smanjenja često pružaju dobro uspješnost ispitivanja za odre đivanje silaznih 
visina doza, a često se daje prednost dodavanju četvrte ispitne skupine nego 
primjeni vrlo velikih intervala (npr. više nego čimbenik izme đu 6 - 10) 
među dozama. Op ćenito treba izbjegavati primjenu faktora ve ćih od deset 
i treba ih opravdati ako se primjenjuju.  
25. Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (7), to čke koje treba uzeti 
u obzir pri odabiru doze uklju čuju: 
— Poznate nelinearnosti ili to čke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one 
na koje se sumnja,  
— Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se doga đaju ili ne doga đaju 
metabolička indukcija, zasi ćenje ili nelinearnost izme đu vanjskih i 
unutarnjih doza,  
— Prethodne lezije, markeri u činka ili indikatori operacije klju čnih 
temeljnih bioloških procesa,  
— Ključni aspekti ili na čini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput 
doza na kojima po činje rasti citotoksi čnost, razina hormona se poremeti, 
homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 473
 
— Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, 
npr. u rasponu o čekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,  
— Uzimanje u obzir o čekivanih razina ljudskog izlaganja.  
26. Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu 
nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosa č. Osim 
radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini treba tretirati na jednak na čin kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako 
se primjenjuje nosa č, kontrolna skupina mora primiti nosa č u najvećoj koli­ 
čini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemi ­
kalija daje kroz hranu i ako izaziva zna čajno smanjeno unosa hrane zbog 
smanjene te čnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja 
se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.
 
Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije  
27. Ispitivana kemikalija obi čno se daje oralno, kroz hranu ili vodu za pi će ili 
pak sondom. Dodatne informacije o na činima i metodama davanja navedene 
su u Smjernici br. 116. (7). Na čin i metoda primjene ovise o svrsi studije, 
fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspoloži ­
vosti te pretežnom na činu i metodi izlaganja ljudi. Treba predo čiti argumen ­
taciju za odabrani na čin i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja oralnu 
sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koja taj na čin i metoda primjene 
opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemika ­
lije iz hrane ili okoliša, uklju čujući pesticide, obi čno se primjenjuju kroz 
hranu ili vodu za pi će. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaga ­
nju, prikladnije izlaganje na druge na čine. 
28. Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovaraju ćem 
nosaču. U obzir treba uzeti sljede ća svojstva nosa ča i drugih aditiva po 
potrebi: u činke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispiti ­
vane kemikalije; u činke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se 
mogu promijeniti u toksi čna svojstva te u činke na unos hrane ili vode ili 
nutritivnog statusa životinja. Preporu čuje se da se, kada je god mogu će, u 
obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim mogu ća otopina u drugim nosa čima. Za 
nosače različite od vode moraju biti poznata toksi čna svojstva nosa ča. 
Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homo ­
genosti otopina za doziranje ili prehranu (ono što je odgovaraju će) pod 
uvjetima primjene (npr. prehrana).
 
29. Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane kemikalije ne utje ču na uravnoteženi unos 
hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksi čnosti uz primjenu davanja 
kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obi čno ne smije 
premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotri ­
jebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna 
visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) 
izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 474
 
30. U slu čaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemi ­
kalija (sedam dana tjedno) obi čno u razdoblju od 24 mjeseca za glodavce 
(vidjeti i stavak 32.). Svaki druk čiji režim primjene, npr. pet dana tjedno, 
treba obrazložiti. U slu čaju dermalne primjene životinje se ispitivanom 
kemikalijom obi čno tretiraju najmanje šest sati dnevno, sedam dana 
tjedno, kao što je navedeno u Poglavlju B.9 ovog Priloga (11), u razdoblju 
od 24 mjeseci. Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. Razdoblje izlaganja obi čno traje 24 mjeseci. Ako izlaganju samo nosom 
nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja 
treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. 
Treba pružiti argumentaciju za primjenu izlaganja kra ćeg od šest sati 
dnevno. Vidjeti tako đer i Poglavlje B.8 ovog Priloga (9).
 
31. Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti 
želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u sli čno vrijeme 
svakog dana. Obi čno se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u 
slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no mogu će je zadržati 
dnevnu koli činu doze na na čin da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksi ­
malni volumen teku ćine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veli čini 
pokusne životinje. Koli činu treba održavati toliko niskom da bude prakti čna, 
a obično ne bi trebala biti ve ća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce 
(31). Varijabilnost u ispitnoj koli čini treba svesti na minimum prilagodbom 
koncentracije kako bi se osigurala konstantna koli čina na svim visinama 
doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizaju će ili nadražuju će kemi­
kalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni u činci. Treba 
izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizaju će ili 
nadražuju će za gastrointestinalni trakt.  
Trajanje studije  
32. Studija obi čno traje 24 mjeseci za glodavce, što predstavlja najve ći dio 
uobičajenog životnog vijeka korištenih životinja. Mogu se primijeniti 
kraće ili dulje studije, ovisno o životnom vijeku vrste životinja korištenih 
u studiji, ali to treba obrazložiti. Za specifi čne sojeve miševa, npr. AKR/J, 
C3H/J ili C57BL/6J, može biti prikladnije trajanje od 18 mjeseci. U 
nastavku se nalaze neke upute u vezi s trajanjem, završetkom studije i preživljavanjem; ostale upute uklju čujući razmatranja o prihvatljivosti nega ­
tivne karcinogenosti povezane s preživljavanjem u studiji nalaze se u 
OECD-ovoj Smjernici br. 116. o planiranju i provo đenju studija kroni čne 
toksičnosti i karcinogenosti (7).
 
— Završetak studije treba uzeti u obzir kada broj preživjelih u skupinama s 
nižim dozama ili kontrolnoj skupini padne na manje od 25 %.  
— Ako samo skupina s visokom dozom prijevremeno ugine zbog toksi čno­
sti, to ne smije izazvati završetak studije.  
— Treba posebno bilježiti preživljavanje svakog spola.  
— Studija ne treba trajati dulje od to čke u kojoj podaci dostupni iz studije 
više nisu dovoljni za omogu ćivanje statisti čki valjane ocjene.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 475
 
OPAŽANJA  
33. Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obi čno na 
početku i kraju svakog dana uklju čujući vikend i praznike. Životinje treba 
dodatno jedanput dnevno prekontrolirati radi specifi čnih znakova od toksi ­
kološke važnosti uzimaju ći u obzir vršno razdoblje o čekivanih u činaka 
nakon doziranja u slu čaju davanja sondom. Posebnu pažnju valja obratiti 
na razvoj tumora, te treba zabilježiti vrijeme nastanka tumora, lokaciju, dimenzije, izgled i napredovanje svakog makroskopski vidljivog ili palpa ­
bilnog tumora.
 
Tjelesna masa, unos hrane/vode i u činkovitost hrane  
34. Sve životinje treba izvagati na po četka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u 
prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Mjerenja unosa i u čin­
kovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana 
te zatim barem jedanput mjese čno. Unos vode treba mjeriti najmanje 
jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno ako 
se kemikalija primjenjuje preko vode za pi će. Mjerenje unosa vode treba 
također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.  
Hematologija, klini čka biokemija i druga mjerenja  
35. Kako bi se na maksimum pove ćala količina informacija dobivenih iz studije, 
posebno za na čin djelovanja, mogu se uzeti uzorci krvi za hematologiju i 
kliničku biokemiju, o čemu odlu čuje voditelj istraživanja. Tako đer može biti 
prikladna i analiza urina. Ostale upute o vrijednosti uzimanja tih uzoraka kao dio studije karcinogenosti nalaze se u Smjernici br. 116. (7). Ako se 
smatra prikladnim, uzorkovanje krvi za hematološke i klini čko-kemijske 
pretrage te analiza urina mogu se provesti kao dio usmr ćivanja u me đuvre­
menu (stavak 20.) te na kraju studije na najmanje dest životinja svakog spola u svakoj skupini. Uzorke krvi treba uzimati iz odre đenog mjesta, 
primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog sinusa, pod anestezijom te 
pohraniti pod odgovaraju ćim uvjetima ako je potrebno. Razmazi krvi 
također se mogu pripremiti za pretrage, posebno ako se čini da je organ 
meta koštana srž, iako se propituje vrijednosti takvih pretraga za odre đivanje 
karcinogenog/onkogenog potencijala (32).
 
PATOLOGIJA  
Makroskopska analiza  
36. Sve životinje u studiji, osim indikatorskih životinja (vidjeti stavak 20.) i 
drugih satelitskih životinja, moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj makro ­
skopskoj obdukciji koja obuhva ća pažljiv pregled vanjske površine tijela, 
svih otvora te lubanjske, prsne i trbušnje šupljine i njihovog sadržaja. Indi ­
katorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedina čnim slučajevima, a 
odluka je prepuštena voditelju istraživanja. Mase organa nisu uobi čajeni dio 
studije karcinogeneze budu ći da gerijatrijske promjene te, u kasnijim 
fazama, razvoj tumora remete korisnost podataka o masi organa. No mogu biti klju čne pri provo đenju ocjene težine dokaza te posebno za 
razmatranje o na činu djelovanja. Ako su dio satelitske studije, treba ih 
skupiti ne kasnije od godine dana nakon po četka studije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 476
 
37. Sljede ća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba 
tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (33) (tkiva u 
uglatim zagradama opcijska su): 
sve makroskopske lezije  srce  guštera ča želudac (predželudac, 
žljezdani želudac)  
nadbubrežna žlijezda  ileum  paraštitna žlijezda  [zubi]  
aorta  jejunum  periferni živac  testis  
mozak (uklju čujući sekcije 
velikog i malog mozga te 
medule/mosta)  bubreg  hipofiza  timus  
cekum  suzna žlijezda (eksorbi ­
talna)  prostata  štitnja ča 
cerviks  jetra  rektum  [jezik]  
koagulacijska žiljezda  plu ća žlijezda slinovnica  dušnik  
debelo crijevo  limfni čvorovi (povr ­ 
šinski i dubinski)  sjemenski mjehuri ć mokra ćni mjehur  
dvanaesnik  mlije čna žlijezda 
(obvezno za ženke i ako 
se mogu secirati, od mužjaka)
 skeletni miši ć maternica (uklju čujući 
cerviks)  
epididimis  [gornji respiratorni trakt 
uključujući nos, turbinate 
i paranazalne sinuse]  koža  [mokra ćovod]  
oko (uklju čujući mrežnicu)  jednjak  kralježnica (na tri 
razine: vratna, srednja prsna i slabinska)
 [mokraćna cijev]  
[femur sa zglobom]  [olfaktorni bulbus]  slezena  vagina  
žučni mjehur (za vrste 
drukčije od štakora)  jajnik  [prsna kost],  sekcija koštane srži i/ili 
aspirat svježe koštane srži  
Harderova žlijezda  
U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sa čuvati 
oba organa. Klini čki i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom 
dodatnih tkiva. Treba tako đer sačuvati sve organe za koje se smatra da bi 
mogli biti meta na temelju poznatih svojstava ispitivane kemikalije. U studi ­
jama koje uklju čuju dermalni na čin primjene treba sa čuvati popis organa 
sastavljen za oralni na čin primjene, s tim da je vrlo važno specifi čno uzor­
kovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis 
sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke 
Poglavlja B.8 i B.29 ovog Priloga. Za ostale organe/tkiva (te uz posebno 
sačuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba ispitati popis organa zadan za 
oralni način primjene.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 477
 
Histopatologija  
38. Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provo đenju istraživanja toksi ­
kološke patologije (33). Minimum tkiva na kojima su obavljene pretrage mora uklju čivati:
 
— Sva tkiva iz skupina izloženih visokoj dozi i kontrolnih skupina,  
— Sva tkiva životinja uginulih ili usmr ćenih tijekom studije,  
— Sva tkiva s makroskopskim anomalijama uklju čujući tumore,  
— Ako se u skupini izloženoj visokoj dozi opaze histopatološke promjene 
povezane s tretmanom, ta tkiva treba analizirati na svim životinjama u 
svim skupinama izloženima drugim dozama,  
— U slu čaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba 
ispitati oba organa.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
39. Treba pružiti pojedina čne podatke o životinjama za sve ocijenjene parame ­
tre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazuju ći za svaku 
ispitnu skupinu broj životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje su 
tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz humanih razloga te 
vrijeme smrti ili usmr ćivanja, broj uo čenih znakova toksi čnosti, opis 
uočenih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme nastupanja, trajanje i 
ozbiljnost svakog toksi čnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te 
postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka 
trebaju pružiti prosje čne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitiva ­
nja) za životinje koje pokazuju toksi čne učinke ili lezije uz stupnjevanje 
lezija.  
40. U tuma čenju rezultata studije, npr. u slu čaju kada postoje indikacije da su 
podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa skorašnjim podacima od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/ko ­
lonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povijesne kontrolne 
podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija i povezati sa životinjama iste dobi i vrste proizvedenih tijekom pet godina prije doti čne 
studije.
 
41. Ako je mogu će, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i op će prihva­ 
ćenom statisti čkom metodom. Statisti čke metode i podatke koji će se anali ­
zirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 9.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
 
Izvješće o ispitivanju  
42. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija:  
— fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,  
— identifikacijski podaci,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 478
 
— podrijetlo kemikalije,  
— broj serije,  
— potvrda kemijske analize,  
Nosač (po potrebi):  
— obrazloženje odabira nosa ča (ako nije voda),  
Pokusne životinje:  
— korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,  
— broj, dob i spol životinja na po četku ispitivanja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— pojedina čna masa životinja na po četku ispitivanja,  
Uvjeti ispitivanja:  
— argumentacija za na čin primjene i odabir doze,  
— ako je primjenjivo, statisti čka metoda korištena za analizu podataka,  
— pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,  
— analiti čki podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti 
preparata,  
— način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,  
— stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz 
koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za pi će (mg/kg ili 
ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
Rezultati (treba prikazati tabli čno sažete podatke i pojedina čne podatke za 
životinje):  
Općenito  
— podaci o preživljavanju,  
— tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,  
— unos hrane, izra čun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode,  
— ako je primjenjivo,  
— toksikokineti čki podaci ako su raspoloživi,  
— oftalmoloskopija (ako je raspoloživa),  
— hematologija (ako je raspoloživa),  
— klinička kemija (ako je raspoloživa),  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 479
 
Klinički nalazi  
— Znakovi toksi čnosti,  
— Učestalost (te, ako je zabilježena, ozbiljnost) svih anomalija,  
— Narav, ozbiljnost i trajanje klini čkih opažanja (prolaznih ili trajnih),  
Obdukcijski podaci  
— Tjelesna masa na kraju,  
— Mase organa i njihovi omjeri ako je primjenjivo,  
— Nalazi obdukcije, U čestalost i ozbiljnost anomalija,  
Histopatologija  
— Neneoplasti čni histopatološki nalazi,  
— Neoplasti čni histopatološki nalazi,  
— Međusobni odnos izme đu makroskopskih i mikroskopskih nalaza,  
— Detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem, uklju ­ 
čujući stupnjeve ozbiljnosti,  
— Izvješ će svih pregleda objektnih stakalaca mikroskopa provedenih od 
kolega,  
Statistička obrada rezultata po potrebi  
Diskusija o rezultatima uklju čujući 
— Diskusiju o svim modelima pristupa,  
— Odnos doze i reakcije,  
— Povijesne kontrolne podatke,  
— Razmatranja o svim na činima djelovanja informacija,  
— Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL,  
— Relevantnost za ljude,  
Zaključci 
LITERATURA  
1. OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Pariz.  
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 480
 
6. Poglavlje B.27 ovog Priloga, Test subkroni čne oralne toksi čnosti - 90- 
dnevna studija oralne toksi čnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih 
doza.  
7. OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
8. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Pariz.  
9. Poglavlje B.8 ovog Priloga, Subakutna inhalacijska toksi čnost: 28-dnevna 
studija.  
10. Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkroni čna ihnalacijska toksi čnost: 90-dnevna 
studija.  
11. Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksi čnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 
dana).  
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 
36:793-801.  
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
 
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Appli ­
cation of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data 
in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxico ­
logy 36: 9-35.  
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic 
Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
 
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
20. OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
 
21. OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pariz.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 481
 
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on 
Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
27. Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o 
zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
 
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
32. Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
33. Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Smjernica za najbolju 
praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 126-131.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 482
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 483
 
B.33.  KOMBINIRANE STUDIJE KRONI ČNE TOKSI ČNOSTI/KARCI ­
NOGENOSTI  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
453 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 453 usvojena je 1981. 
Smatralo se da je nužno razviti ovu ažuriranu ispitnu metodu B.33 kako bi se odrazio recentni razvoj u podru čju dobrobiti životinja i regulatornih 
zahtjeva (1) (2) (3) (4) (5). Ova ispitna metoda B.33 ažurirana je paralelno s 
revizijama Poglavlja B.32 ovog Priloga, Studije karcinogenosti te Poglavlja 
B.30 ovog Priloga, Studije kroni čne toksičnosti s ciljem pribavljanja 
dodatnih informacija od životinja korištenih u studiji te prikupljanja daljnjih detalja o odabiru doze. Ova ispitna metoda namijenjena je primjeni u ispi ­
tivanju širokog spektra kemikalija, uklju čujući pesticide i industrijske kemi ­
kalije. No, treba imati na umu da neke pojedinosti i zahtjevi mogu biti različiti za ljude [vidjeti Smjernicu S1B o Ispitivanju kancerogenosti lije ­
kova Međunarodne konferencije o uskla đivanju ( International conference on 
Harmonisation  (ICH)].
 
2. Većina studija kroni čne toksičnosti i karcinogenosti provode se na vrstama 
glodavaca, stoga i ovu ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u 
studijama koje se provode na tim vrstama. Ako se traži da se takve studije provode na neglodavcima, tako đer se mogu primijeniti izložena 
načela i postupci uz odgovaraju će modifikacije, zajedno s na čelima i postup ­
cima izloženima u Poglavlju B.27 ovog Priloga, Studija subkroni čne oralne 
toksičnosti 90-dnevno ispitivanje oralne toksi čnosti na ne-glodavcima uz 
primjenu ponavljanih doza (6), kao što je izloženo u OECD-ovoj Smjernici br. 116. o planiranju i provo đenju studija kroni čne toksičnosti i karcinoge ­
nosti (7).
 
3. Tri glavna na čina primjene upotrijebljena u studijama kroni čne toksičnosti/ 
karcinogenosti jesu oralni, dermalni i inhalacijski. Odabir na čina primjene 
ovisi o fizikalnim i kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije te o 
pretežnom na činu izlaganja ljudi. Dodatne informacije o odabiru na čina 
izlaganja navedene su u Smjernici br. 116. (7).  
4. Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je naj češće 
korišteni na čin u studijama kroni čne toksičnosti i karcinogenosti. Dok dugo ­
trajne studije, koje uklju čuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, mogu 
također biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod odre đenim regulatornim reži ­
mima radi odre đivanja rizika za ljude, oba na čina izlaganja uklju čuju znatnu 
tehničku složenost. Takve studije treba planirati za svaki slu čaj posebno iako 
ovdje izložena ispitna metoda za odre đivanje i ocjenu kroni čne toksičnosti i 
karcinogenosti putem oralne primjene može poslužiti kao temelj za protokol 
za studije inhalacijom i/ili dermalnim putem, uzimaju ći u obzir preporuke za 
razdoblja tretiranja, klini čke i patološke parametre itd. Dostupna je 
OECD-ova Smjernica za primjenu ispitivane kemikalije inhalacijom (7) 
(8) i dermalnim putem (7). Poglavlje B.8 ovog Priloga (9) i Poglavlje 
B.29 ovog Priloga (10), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (8), trebaju poslužiti kao detaljna konzultacija pri plani ­
ranju dugotrajnijih studija koje uklju čuju izlaganje inhalacijom. Poglavlje 
B.9 ovog Priloga (11) treba uzeti kao pomo ć pri ispitivanju provedenom 
dermalnim putem.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 484
 
5. Kombinirana studija kroni čne toksičnosti/karcinogenosti pruža informacije o 
mogućim rizicima za zdravlje koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponov ­
ljenog izlaganja kroz gotovo čitavo ili čitavo životno razdoblje korištenih 
vrsta. Ta će studija pružiti informacije o toksi čnim učincima ispitivane 
kemikalije, uklju čujući i potencijalnu karcinogenost, te može ukazati na 
organe mete i mogu ćnost akumulacije. Može pružiti procjenu razine neopa ­ 
ženih štetnih u činaka te, u slu čaju negenotoksi čnih karcinogena, za tumorske 
reakcije koje se mogu upotrijebiti za odre đivanje sigurnosnih kriterija za 
izlaganje ljudi. Tako đer je naglašena potreba za pažljivim klini čkim opaža ­
njima životinja radi dobivanja što je mogu će više informacija.  
6. Ciljevi studija kroni čne toksi čnosti/karcinogenosti obuhva ćeni ovom 
ispitnom metodom uklju čuju: 
— Identifikaciju karcinogenih svojstava ispitivane kemikalije koja rezulti ­
raju pove ćanjem u čestalosti pojavljivanja neoplazmi, pove ćanim 
omjerom malignih neoplazmi ili smanjenjem u vrijeme pojavljivanja 
neoplazmi u usporedbi s paralelnim kontrolnim skupinama,  
— Identifikaciju vremena pojavljivanja neoplazmi,  
— Identifikaciju kroni čne toksičnosti ispitivane kemikalije,  
— Identifikaciju organa meta kroni čne toksičnosti i karcinogenosti,  
— Karakterizaciju odnosa doze i reakcije,  
— Identifikaciju razine neopaženih štetnih u činaka (NOAEL) ili polaznu 
točku za utvr đivanje referentne doze za usporedbu (benchmark dose, 
BMD),  
— Ekstrapolaciju karcinogenih u činaka na niskim razinama izlaganja ljudi,  
— Predvi đanje učinaka kroni čne toksičnosti na razinama ljudskog izlaganja.  
— Pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s na činom djelo ­
vanja (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
UVODNA RAZMATRANJA  
7. U odre đivanju i procjeni potencijalne karcinogenosti i kroni čne toksičnosti 
ispitivane kemikalije laboratorij koji provodi ispitivanje prije provo đenja 
studije mora u obzir uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji 
kako bi se plan studije usmjerio na u činkovitije ispitivanje toksikoloških 
svojstava te kako bi se na minimum svela primjena životinja. Informacije i razmatranja o svim na činima djelovanja karcinogena na koji se sumnja (2) 
(7) (12) (13) (14) (15) posebno su važne jer se optimalan plan može 
razlikovati, ovisno o tome zna li se ili sumnja za ispitivanu kemikaliju da je genotoksi čni karcinogen. Ostale upute o razmatranju na čina djelovanja 
mogu se prona ći u Smjernici br. 116. (7).
 
8. Informacije koje će pomoći u planiranju studije obuhva ćaju identitet, 
kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, sve informacije o na činu djelovanja, rezultate svih ispitivanja toksi čnosti  in vitro  
ili in vivo  uključujući ispitivanja genotoksi čnosti, očekivanu/e primjenu/e i 
potencijal za ljudsko izlaganje, dostupne podatke (Q)SAR, mutagenost/ge ­
notoksičnost, karcinogenost i druge toksikološke podatke o kemikalijama 
srodne strukture, dostupne toksikokineti čke podatke (kinetika jedne doze i 
ponovljene doze ako je dostupno) te podatke dobivene u drugim studijama s 
ponovljenim izlaganjem. Odre đivanje kroni čne toksičnosti/karcinogenosti
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 485
 
treba provesti nakon dobivanja po četnih informacija o toksi čnosti iz 28- 
dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksi čnosti uz primjenu ponovljenih 
doza. Kratkoro čno ispitivanje po četnog razvoja raka tako đer može pružiti 
korisne informacije. Pristup s fazama u ispitivanju karcinogenosti treba smatrati dijelom ukupnog utvr đivanja potencijalno štetnih u činaka doti čne 
ispitivane kemikalije po zdravlje (16) (17) (18) (19).
 
9. Prije po četka studije treba odrediti najprikladnije statisti čke metode za 
analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Problemi koja treba razmatrati uklju čuju treba li statistika uklju čivati prilagodbu preživjelih, 
analizu ukupnog rizika od tumora u odnosu na trajanje preživljavanja, 
analizu vremena za stvaranje tumora te analizu u slu čaju prijevremenog 
svršetka jedne ili više skupina. Smjernice o odgovaraju ćim statisti čkim 
analizama i klju čnim referencama na me đunarodno prihva ćene statisti čke 
metode nalaze se u Smjernici br. 116. (7) te tako đer u Smjernici br. 35. 
za analizu i ocjenu studija kroni čne toksičnosti i karcinogenosti (20).
 
10. Pri provo đenju studije karcinogenosti uvijek treba slijediti na čela i razloge 
izložene u OECD-ovoj Smjernici o prepoznavanju, odre đivanju i primjeni 
kliničkih znakova kao humanih krajnjih u činaka za pokusne životinje kori ­ 
štene u procjeni sigurnosti (21), a posebno u njezinom stavku 62. U tom stavku stoji da „u studijama uz primjenu ponovljenog doziranja, kada živo ­
tinje pokazuju progresivne klini čke znakove koji izazivaju daljnje pogor ­ 
šanje stanja, treba donijeti upu ćenu odluku o tome treba li humano usmrtiti 
životinje ili ne. Odluka treba uklju čivati razloge s obzirom na vrijednost 
informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u studiji s obzirom na njezino op će stanje. Ako se odlu či zadržati životinju u ispitivanju, u česta­
lost opažanja treba pove ćati u skladu s potrebama. Tako đer se može privre ­
meno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati patnju ili stres ili smanjiti 
ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispitivanja.”
 
11. Detaljne upute za na čela odabira doza za studije kroni čne toksičnosti i 
karcinogenosti te rasprava o njima mogu se prona ći u Smjernici br. 116. 
(7), kao i u dvije publikacije instituta  International Life Sciences Institute  
(22) (23). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovaraju ćih razina 
doza treba posti ći ravnotežu izme đu procjene opasnosti s jedne strane i 
karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo zna čenje s druge strane. 
To je posebno relevantno u slu čaju ove kombinirane studije kroni čne toksič­
nosti i karcinogenosti.
 
12. Treba navesti razloge za provo đenje ove kombinirane studije kroni čne 
toksičnosti i karcinogenosti, a ne odvojeno provo đenje studije kroni čne 
toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga) i studije karcinogenosti (Poglavlje 
B.32 ovog Priloga). Kombinirano ispitivanje pruža ve ću učinkovitost što se 
tiče vremena i troškova u usporedbi s provo đenjem dviju odvojenih studija, 
bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroni čnoj fazi niti u karcinogenoj 
fazi. Pri provo đenju kombinirane studije kroni čne toksičnosti i karcinoge ­
nosti treba pažljivo razmisliti o na čelima odabira doza (stavci 11. i 22. - 26.) 
te se tako đer priznaje da u odre đenim regulatornim okvirima mogu biti 
nužne odvojene studije. Daljnje upute za planiranje kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti s ciljem postizanja maksimalne u čin­
kovitosti studije u smislu mogu ćnosti smanjenja broja korištenih životinja, 
kao i modernizacije raznih pokusnih postupaka, nalaze se u Smjernici 
br. 116. (7).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 486
 
13. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju 
ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (7).  
NAČELO ISPITIVANJA  
14. Planiranje studije obuhva ća dvije paralelne faze, kroni čnu fazu i fazu karci ­
nogenosti (za trajanje vidjeti redom stavke 34. i 35.). Ispitivana kemikalija obično se primjenjuje oralnim putem iako se može primijeniti i ispitivanje 
inhalacijom ili dermalnim putem. Za kroni čnu fazu ispitivana kemikalija 
primjenjuje se svakodnevno u postupnim dozama raznim skupinama poku ­
snih životinja, jedna visina doze po skupini, obi čno u razdoblju od 12 
mjeseci iako se mogu odabrati dulja ili kra ća trajanja ovisno o regulatornim 
zahtjevima (vidjeti stavak 34.). Odabire se dovoljno dugo vrijeme koje bi 
omogućilo manifestaciju u činaka kumulativne toksi čnosti bez miješanja s 
učincima gerijatrijskih promjena. Planiranje studije tako đer može uklju čivati 
jedno ili više usmr ćivanja u me đuvremenu, npr. s tri i šest mjeseci, i mogu 
se uključiti dodatne skupine životinja kako bi se to kompenziralo (vidjeti 
stavak 20.). Za fazu karcinogenosti ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno raznim skupinama pokusnih životinja tijekom najve ćeg dijela 
njihova života. Životinje se u objema fazama pomno promatraju radi 
znakova toksi čnosti i razvoja neoplazmi čkih lezija. Životinje koje ugibaju 
ili su usmr ćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju 
ispitivanja preživjele se životinje usmr ćuju i podvrgavaju obdukciji.
 
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
15. Ova ispitna metoda prvenstveno obuhva ća određivanje i ocjenu kroni čne 
toksičnosti i karcinogenosti u glodavaca (stavak 2.). U obzir se može 
uzeti primjena vrsta neglodavaca ako dostupni podaci sugeriraju da su oni relevantniji za predvi đanje zdravstvenih u činaka po ljude. Treba obrazložiti 
odabir vrsta. Preferirana vrsta glodavaca jesu štakori iako se mogu upotri ­
jebiti i druge vrste glodavaca, npr. miš. Iako uporaba miševa u ispitivanju 
karcinogenosti može biti ograni čeno korisna (24) (25) (26), u nekim 
aktualnim regulatornim programima još se uvijek traži ispitivanje karcino ­
genosti u miševa osim ako je utvr đeno da nema znanstvene potrebe za 
takvom studijom. Štakori i miševi preferirani su pokusni modeli zbog rela ­
tivno kratkog životnog vijeka, raširene primjene u farmakološkim i toksiko ­
loškim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo 
informacija o njihovoj fiziologiji i patologiji. Plan i provo đenje studija 
kronične toksičnosti/karcinogenosti na vrstama neglodavaca, ako je potre ­
bno, treba temeljiti na na čelima izloženima u ovoj ispitnoj metodi zajedno s 
načelima iz Poglavlja B.27 ovog Priloga, Studija subkroni čne oralne toksi č­
nosti - 90-dnevna studija oralne toksi čnosti na neglodavcima uz primjenu 
ponavljanih doza (6). Dodatne informacije o odabiru vrste i soja navedene su u Smjernici br. 116. (7).
 
16. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobi čajeni u 
laboratorijskoj praksi. Kombiniranu studiju kroni čne toksičnosti/karcinoge ­
nosti treba obaviti na životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje 
korištene u preliminarnoj/im studiji/-ama toksi čnosti kraćeg trajanja iako, 
ako se za životinje tog soja i podrijetla zna da imaju problema u postizanju uobičajeno prihva ćenih kriterija za preživljavanje u dugotrajnim studijama 
[vidjeti Smjernicu br. 116. (7)], treba razmotriti primjenu životinjskog soja s 
prihvatljivom stopom preživljavanja za dugotrajnu studiju. Treba upotreb ­
ljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 487
 
Uvjeti smještaja i hranjenja  
17. Životinje moraju biti smještene pojedina čno ili u kavezima u malim skupi ­
nama istog spola; pojedina čni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je 
znanstveno opravdan (27) (28) (29). Kaveze treba rasporediti na na čin da 
se učinci do kojih bi moglo do ći zbog položaja kaveza svedu na minimum. 
Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama morala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogu ćnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati 
svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograni čene količine pitke vode. Prehrana mora 
ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje konta ­
miniraju hranu - uklju čujući ostatke pesticida, postojane organske zaga đi­
vače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograni čeno na njih - 
koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je mogu će manji. 
Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i 
prehranu treba izra đivati periodi čno, barem na po četku studije te u slu čaju 
promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uklju čiti u završno izvješ će. 
Također treba pružiti analiti čke informacije o vodi za pi će korištenoj u 
istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem 
prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.
 
Priprema životinja  
18. Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske 
uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim postupcima. U slu čaju glodavaca doziranje životinja treba po četi što je 
moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po 
mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje 
treba karakterizirati što se ti če vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. 
Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora 
biti minimalno i ne smije biti ve će od ± 20 % prosje čne mase svih životinja 
u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumi čno odrediti za 
kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumi čnog odabira ne smije biti 
značajne razlike u prosje čnoj tjelesnoj masi izme đu skupina svakog spola. 
U slučaju statisti čki značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumi čnog odabi ­
ranja ako je mogu će. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifika ­
cijski broj i treba je trajno ozna čiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikro ­ 
čipa ili drugom odgovaraju ćom metodom.
 
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
19. Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja tako 
da se omogu ći temeljita biološka i statisti čka ocjena. Stoga za glodavce, 
svaka skupina koja prima dozu (kao što je izloženo u stavku 22.) i paralelna 
kontrolna skupina namijenjena za fazu karcinogenosti studije stoga mora 
sadržavati najmanje 50 životinja svakog spola. Ovisno o cilju studije, može biti mogu će povećati statisti čku snagu klju čnih procjena druk čijom 
raspodjelom životinja tako da bude druk čija u raznim skupinama koje 
primaju dozu s više od 50 životinja u skupinama s niskom dozom, npr. 
radi procjene karcinogenog potencijala na niskim dozama. No, treba priznati da umjereno pove ćanje skupine daje relativno malo pove ćanje statisti čke 
snage studije. Svaka skupina koja prima dozu (kao što je izloženo u 
stavku 22.) i paralelna kontrolna skupina namijenjena za fazu kroni čne 
toksičnosti studije mora sadržavati najmanje deset životinja svakog spola
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 488
 
u slučaju glodavaca. Treba imati na umu da je taj broj manji od broja u 
studiji kroni čne toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga). Tuma čenje poda ­
taka dobivenih od smanjenog broja životinja po skupini u fazi kroni čne 
toksičnosti ove kombinirane studije bit će poduprto podacima dobivenima 
od većeg broja životinja u fazi karcinogenosti studije. U studijama koje 
uključuju miševe u svakoj skupini za doziranje u fazi kroni čne toksičnosti 
mogu biti potrebne dodatne životinje kako bi se provele sve tražene hema ­
tološke pretrage. Daljnje informacije o statisti čkom planiranju studije i 
odabiru visina doza radi pove ćanja statisti čke snage na maksimum nalaze 
se u Smjernici br. 116. (7).  
Omogućivanje usmr ćivanja u me đuvremenu, satelitske skupine i indi ­
katorske životinje  
20. Studija može omogu ćiti usmrćivanje u me đuvremenu, npr. sa šest mjeseci za 
fazu kroni čne toksičnosti, kako bi se pribavile informacije o napredovanju 
neoplazmi čkih promjena i mehanisti čke informacije ako je to znanstveno 
opravdano. Ako su takve informacije ve ć dostupne iz prethodnih studija 
toksičnosti ispitivane kemikalije uz primjenu ponavljanih doza, usmr ćivanje 
u međuvremenu nije znanstveno opravdano. Životinje upotrijebljene u fazi 
kronične toksičnosti studije, obi čno u trajanju od 12 mjeseci (stavak 34.) 
pružaju podatke o usmr ćivanju u me đuvremenu za fazu karcinogenosti 
studije uz postizanje smanjenja ukupnog broja upotrijebljenih životinja. U 
fazu kroni čne toksičnosti studije mogu se tako đer uključiti i satelitske 
skupine radi nadzora reverzibilnosti bilo kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom. To se može ograni čiti na najvišu 
visinu doze u studiji plus kontrola. Ako je potrebno, tijekom studije može 
se uključiti i dodatna skupina indikatorskih životinja (tipi čno 5 životinja po 
spolu) radi pra ćenja stanja bolesti (30). Daljnje upute za planiranje studije 
uključuju usmrćivanja u me đuvremenu, satelitske i indikatorske životinje uz 
svođenje na minimum ukupnog broja upotrijebljenih životinja nalaze se u 
Smjernici br. 116. (7).
 
21. Ako su u plan studije uklju čene satelitske životinje i/ili usmr ćivanja u 
međuvremenu, broj životinja u svakoj skupini koja prima dozu odre đen 
za tu svrhu obi čno će biti deset životinja svakog spola, a ukupni broj 
životinja uklju čenih u plan studije treba pove ćati za broj životinja odre đenih 
za usmrćivanje prije završetka studije. Životinje za usmr ćivanje u me đuvre­
menu i satelitske životinje moraju normalno pro ći sva opažanja uklju čujući 
tjelesnu masu, unos hrane/vode, hematološka i klini čko-biokemijska 
mjerenja te patološke pretrage kao i životinje u fazi kroni čne toksičnosti 
glavne studije iako se tako đer može osigurati (u skupinama za usmr ćivanje u 
međuvremenu) da se mjerenja ograni če na specifi čna, ključna mjerenja 
poput neurotoksi čnosti ili imunotoksi čnosti.  
Skupine za doziranje i doziranje  
22. Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak me đu visinama 
doza nalaze se u Smjernici br. 116. (7). U obje faze, kroni čnoj i karcino ­
genoj, treba primijeniti najmanje tri visine doza i paralelnu kontrolu. Visine doza općenito se temelje na rezultatima kra ćih studija uz primjenu 
ponavljanih doza ili studija za odre đivanje raspona i u obzir moraju uzeti 
sve toksikološke i toksikokineti čke podatke dostupne o ispitivanoj kemikaliji 
ili srodnim kemikalijama.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 489
 
23. Za fazu kroni čne toksičnosti studije možda ne će biti potrebna potpuna 
studija uz primjenu tri visine doza ako se može pretpostaviti da ispitivanje 
na jednoj visini doze, jednakoj najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu, neće izazvati štetne u činke. To mora biti utemeljeno na informacijama 
iz preliminarnih studija te uzevši u obzir da se ne o čekuje toksi čnost na 
temelju podataka o kemikalijama srodne strukture. Granica od 1 000 mg/kg 
tjelesne mase po danu vrijedi osim ako izlaganje ljudi ne pokaže potrebu za primjenom više visine doze.
 
24. Osim ako nije ograni čeno fizikalno-kemijskom prirodom ili biološkim u čin­
cima ispitivane kemikalije, obi čno treba odabrati najvišu visinu doze kako bi 
se identificirali organi mete i toksi čni učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne 
toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Obi čno treba odabrati najvišu visinu doze 
kako bi se izveli dokazi o toksi čnosti kao što je, primjerice, dokazano 
padom pove ćanja tjelesne mase (otprilike 10 %). No, ovisno o ciljevima 
studije (vidjeti stavak 6.) može se odabrati najviša visina doze manja od 
doze koja pruža dokaze o toksi čnosti npr. ako doza izaziva štetan, zabri ­
njavajući učinak koji unato č tomu utje če na životni vijek ili tjelesnu masu.  
25. Visine doza i razmaci izme đu visina doza mogu se odabrati kako bi se 
odredio ishod doza-reakcija i, ovisno o na činu djelovanja ispitivane kemi ­
kalije, NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, npr. BMD (vidjeti stavak 27.). Čimbenici koje treba uzeti u obzir pri dodjeljivanju nižih doza uklju ­ 
čuju očekivani nagib krivulje doze i reakcije, doze na kojima se mogu 
dogoditi važne promjene u metabolizmu ili na činu toksi čnog djelovanja, 
gdje se o čekuje prag ili gdje se o čekuje polazna to čka za ekstrapolaciju 
za niske doze. U provo đenju kombinirane studije karcinogenosti/kroni čne 
toksičnosti primarni će cilj biti dobivanje informacija u svrhe odre đivanja 
rizika od karcinogenosti, a informacije o kroni čnoj toksičnosti obično će biti 
dopunski cilj. To treba imati u vidu pri odabiru visina doze i razmaka između visina doza za studiju.
 
26. Odabrani razmak izme đu visina doza ovisit će o ciljevima studije i svoj ­
stvima ispitivane kemikalije i ova ispitna metoda ne može ga detaljno 
propisati, ali dva do četiri intervala smanjenja često pružaju dobru uspješ ­
nost ispitivanja kada se koriste za odre đivanje silaznih visina doza, a često 
se prednost dodavanju četvrte ispitne skupine nego primjeni vrlo velikih 
intervala (npr. više od faktora izme đu 6 - 10) me đu dozama. Op ćenito 
treba izbjegavati primjenu faktora ve ćih od 10 i treba ih opravdati ako se 
primjenjuju.  
27. Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (7), to čke koje treba uzeti 
u obzir pri odabiru doze uklju čuju: 
— Poznate nelinearnosti ili to čke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one 
na koje se sumnja,  
— Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se doga đaju ili ne doga đaju 
metabolička indukcija, zasi ćenje ili nelinearnost izme đu vanjskih i 
unutarnjih doza,  
— Prethodne lezije, markeri u činka ili indikatori operacije klju čnih 
temeljnih bioloških procesa,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 490
 
— Ključni aspekti ili na čini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput 
doza na kojima po činje rasti citotoksi čnost, razina hormona se poremeti, 
homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,  
— Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, 
npr. u rasponu o čekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,  
— Uzimanje u obzir o čekivanih razina ljudskog izlaganja, posebno pri 
odabiru srednjih i niskih doza.  
28. Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu 
nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosa č. Osim 
radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini 
treba tretirati na jednak na čin kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako 
se primjenjuje nosa č, kontrolna skupina mora primiti nosa č u najvećoj koli­ 
čini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemi ­
kalija daje kroz hranu i ako izaziva zna čajno smanjeno unosa hrane zbog 
smanjene te čnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja 
se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.  
Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije  
29. Ispitivana kemikalija obi čno se daje oralno, kroz hranu ili vodu za pi će ili 
pak sondom. Dodatne informacije o na činima i metodama davanja navedene 
su u Smjernici br. 116. (7). Na čin i metoda primjene ovisi o svrsi studije, 
fizikalnim/kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspolo ­ 
živosti te pretežnom na činu i metodi izlaganja ljudi. Treba predo čiti argu­
mentaciju za odabrani na čin i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja 
sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koje taj na čin i metoda primjene 
opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemika ­
lije iz hrane ili okoliša, uklju čujući pesticide, obi čno se primjenjuju kroz 
hranu ili vodu za pi će. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaga ­
nju, prikladnije izlaganje na druge na čine. 
30. Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovaraju ćem 
nosaču. U obzir treba uzeti sljede ća svojstva nosa ča i drugih aditiva po 
potrebi: u činke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispiti ­
vane kemikalije; u činke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se 
mogu promijeniti u toksi čna svojstva te u činke na unos hrane ili vode ili 
nutritivnog statusa životinja. Preporu čuje se da se, kada je god mogu će, u 
obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u 
ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim mogu ća otopina u drugim nosa čima. Za 
nosače različite od vode moraju biti poznata toksi čna svojstva nosa ča. 
Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homo ­
genosti otopina za doziranje ili prehranu (odgovaraju ći) pod uvjetima 
primjene (npr. prehrana).  
31. Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za pi će važno je 
osigurati da koli čine ispitivane kemikalije ne utje ču na uravnoteženi unos 
hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksi čnosti uz primjenu davanja 
kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obi čno ne smije 
premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotri ­
jebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna 
visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) 
izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 491
 
32. U slu čaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemi ­
kalija (sedam dana tjedno) obi čno u razdoblju od 12 mjeseci (kroni čna faza) 
ili 24 mjeseca (faza karcinogenosti), vidjeti stavke 33. i 34. Svaki druk čiji 
režim primjene, npr. pet dana tjedno, treba obrazložiti. U slu čaju dermalne 
primjene životinje se ispitivanom kemikalijom obi čno tretiraju najmanje šest 
sati dnevno, sedam dana tjedno, kao što je navedeno u Poglavlju B.9 ovog 
Priloga (11), u razdoblju od 12 mjeseci (kroni čna faza) ili 24 mjeseca (faza 
karcinogenosti). Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. 
Razdoblje izlaganja obi čno će trajati 12 mjeseci (kroni čna faza) ili 24 
mjeseca (faza karcinogenosti). Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za tu vrstu. Treba pružiti 
argumentaciju za primjenu izlaganja kra ćeg od šest sati dnevno. Vidjeti 
također i Poglavlje B.8 ovog Priloga (9).
 
33. Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti 
želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u sli čno vrijeme 
svakog dana. Obi čno se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u 
slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no mogu će je zadržati 
dnevnu koli činu doze na na čin da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksi ­
malni volumen teku ćine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veli čini 
pokusne životinje. Koli činu treba održavati toliko niskom da bude prakti čna, 
a obično ne bi trebala biti ve ća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce 
(31). Varijabilnost u ispitnoj koli čini treba svesti na minimum prilagodbom 
koncentracije kako bi se osigurala konstantna koli čina na svim visinama 
doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizaju će ili nadražuju će kemi­
kalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni u činci. Treba 
izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizaju će ili 
nadražuju će za gastrointestinalni trakt.  
Trajanje studije  
34. Razdoblje doziranja i trajanje kroni čne faze ove studije obi čno je 12 mjeseci 
iako plan studije tako đer dopušta i primjenu kra ćeg (npr. 6 ili 9 mjeseci) ili 
duljeg (npr. 18 ili 24 mjeseca) trajanja studije, ovisno o zahtjevima posebnih regulatornih režima ili radi specifi čnih mehanisti čkih svrha. Treba obrazlo ­ 
žiti odstupanja od trajanja izlaganja od 12 mjeseci, posebno u slu čajevima 
kraćeg trajanja. Sve skupine koje primaju dozu dodijeljene toj fazi bit će 
završene u odre đeno vrijeme radi ocjene kroni čne toksičnosti i neoplasti čne 
patologije. Satelitske skupine uklju čene radi nadzora reverzibilnosti bilo 
kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom tijekom 
studije treba održavati bez doziranja u razdoblju ne kra ćem od četiri tjedna 
te ne dulje od tre ćine ukupnog trajanja studije nakon prestanka izlaganja.
 
35. Faza karcinogenosti studije obi čno traje 24 mjeseca za glodavce, što pred ­
stavlja najve ći dio uobi čajenog životnog vijeka korištenih životinja. Mogu 
se primijeniti kra će ili dulje studije, ovisno o životnom vijeku soja životinja 
korištenih u studiji, ali to treba obrazložiti. Za specifi čne sojeve miševa, npr. 
AKR/J, C3H/J ili C57BL/6J, može biti prikladnije trajanje od 18 mjeseci. U nastavku se nalaze neke upute u vezi s trajanjem, završetkom studije i preživljavanjem; ostale upute uklju čujući razmatranja o prihvatljivosti 
studije negativne karcinogenosti povezane s preživljavanjem u studiji 
nalaze se u OECD-ovoj Smjernici br. 116. (7):
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 492
 
— Završetak studije treba uzeti u obzir kada broj preživjelih u skupinama s 
nižim dozama ili kontrolnoj skupini padne na manje od 25 %.  
— Ako samo skupina s visokom dozom prijevremeno ugine zbog toksi čno­
sti, to ne smije izazvati završetak studije.  
— Treba posebno bilježiti preživljavanje svakog spola.  
— Studija ne treba trajati dulje od to čke u kojoj podaci dostupni iz studije 
više nisu dovoljni za omogu ćivanje statisti čki valjane ocjene.  
OPAŽANJA (FAZA KRONI ČNE TOKSI ČNOSTI)  
36. Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obi čno na 
početku i kraju svakog dana, uklju čujući vikend i praznike. Op ća klinička 
opažanja valja provoditi najmanje jedanput dnevno, po mogu ćnosti u isto 
vrijeme/ista vremena svakog dana te uzimaju ći u obzir vršno razdoblje 
očekivanih u činaka nakon doziranja u slu čaju primjene sondom.  
37. Detaljna klini čka opažanja valja provoditi na svim životinjama najmanje 
jedanput prije prvog izlaganja (kako bi se omogu ćila usporedba za svaku 
jedinku), na kraju prvog tjedna studije te zatim mjese čno. Protokol za 
opažanja treba organizirati tako da se na minimum svedu varijacije između pojedinih promatra ča i ovisno o ispitnoj skupini. Ta opažanja 
treba obaviti izvan domicilnog kaveza, po mogu ćnosti u standardnoj areni 
te svaki put u sli čno vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri 
čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od strane labo ­
ratorija koji obavlja ispitivanje. Treba se potruditi osigurati da su varijacije u uvjetima opažanja minimalne. Opaženi simptomi moraju obuhva ćati, ali ne 
biti ograni čeni na, promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, pojavu 
sekreta i ekskreta te aktivnost autonomnog živ čanog sustava (npr. lakrima ­
cija (suzenje), piloerekcija (naježenost dlake), veli čina zjenica, nepravilnosti 
u disanju). Tako đer treba zabilježiti promjene u hodu, držanju i reakcijama 
na rukovanje, kao i prisutnost kloni čkih ili toni čkih pokreta, stereotipa (npr. 
pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili neobi čnog 
ponašanja (npr. samoozlje đivanje, hodanje unatrag) (32).
 
38. Oftalmološke preglede uz primjenu oftalmoskopa ili druge odgovaraju će 
opreme treba obaviti na svim životinjama prije prve primjene ispitivane kemikalije. Na kraju studije te preglede treba po mogu ćnosti obaviti na 
svim životinjama, ali barem u skupini s visokom dozom i kontrolnoj 
skupini. Ako se na o čima opaze promjene povezane s tretiranjem, treba 
pregledati sve životinje. Ako strukturna analiza ili druge informacije upućuju na okularnu toksi čnost, treba pove ćati učestalost oftalmoloških 
pregleda.
 
39. Za kemikalije za koje prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksi č­
nosti uz primjenu ponavljanih doza ukazuju na potencijalno uzrokovanje 
neurotoksi čnih učinaka, senzori čke reaktivnosti na stimulanse razli čitih 
tipova (32) (npr. zvu čne, vizualne i proprioceptivne stimulanse) (33) (34) 
(35), prije po četka studije te u razdobljima od 3 mjeseca nakon po četka 
studije pa do 12 mjeseci, uklju čujući i 12. mjesec, te na kraju studije (ako ne 
traje dulje od 12 mjeseci) mogu se opcijski provesti i odre đivanje jakosti 
stiska (36) i odre đivanje motori čke aktivnosti (37). Daljnje pojedinosti o 
postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovaraju ćoj refe­
rentnoj literaturi. Me đutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i drugi 
postupci.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 493
 
40. Za kemikalije, za koje su prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksi č­
nosti uz primjenu ponavljanih doza ukazala na potencijalno izazivanje 
imunotoksi čnih učinaka, na kraju se opcijski mogu provesti daljnja istraži ­
vanja tog krajnjeg u činka.  
Tjelesna masa, unos hrane/vode i u činkovitost hrane  
41. Sve životinje treba izvagati na po četka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u 
prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Mjerenja unosa i u čin­
kovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Unos vode treba mjeriti najmanje 
jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno ako 
se kemikalija primjenjuje preko vode za pi će. Mjerenje unosa vode treba 
također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
 
Hematologija i klini čka biokemija  
42. U studijama koje uklju čuju glodavce hematološke pretrage treba obaviti na 
svim pokusnim životinjama (deset mužjaka i deset ženki iz svake skupine) 
nakon 3, 6 i 12 mjeseci te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci). Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje kako bi se provele sve potrebne hematološke pretrage (vidjeti stavak 19.). Kod 
studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. 
četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorko ­
vanja u me đuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja 
nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi 
ako na hematološkim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji prove ­
denoj na usporedivim visinama doze nisu uo čeni učinci. Uzorke krvi treba 
uzimati iz odre đenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog 
sinusa, pod anestezijom.
 
43. Treba ispitati sljede ći popis parametara (38): ukupni i diferencijalni broj 
leukocita, broj eritrocita, broj trombocita, koncentraciju hemoglobina, hema ­
tokrit (volumen eritrocita), prosje čni volumen eritrocita (MCV), prosje čnu 
masu hemoglobina u eritrocitima (MCH), prosje čnu koncentraciju hemoglo ­
bina u eritrocitima (MCHC), protrombinsko vrijeme te aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme. Ostali hematološki parametri poput Heinzovih 
tjelešaca ili druge atipi čne morfologije eritrocita ili methemoglobin mogu 
se mjeriti po potrebi, ovisno o toksi čnosti ispitivane kemikalije. Op ćenito 
gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili o čeki­
vanim učincima davane ispitivane kemikalije. Ako ispitivana kemikalija ne 
utječe na hematopoetski sustav, može biti indiciran i broj retikulocita i 
citologija koštane srži iako se te pretrage ne moraju provoditi rutinski.
 
44. Klini čko-biokemijske pretrage za istraživanje glavnih toksi čnih učinaka u 
tkivima i posebno u činaka na bubrege i jetru treba obaviti na uzorcima 
krvi dobivenima od svih pokusnih životinja (deset mužjaka i deset ženki po skupini) u jednakim vremenskim intervalima, kao što je navedeno u hematološkim pretragama. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske živo ­
tinje kako bi se provele sve potrebne klini čko-biokemijske pretrage. Kod 
studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorko ­
vanja u me đuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja 
nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi 
ako na klini čko-biokemijskim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 494
 
provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi u činci. Preporu čuje se 
post životinja preko no ći (izuzev miševa) prije prikupljanja uzoraka krvi (  1 ). 
Treba ispitati sljede ći popis parametara (38): glukoza, urea (duši čna urea), 
kreatinin, ukupni proteini, albumini, kalcij, natrij, kalij, ukupni kolesterol, najmanje dvije prikladne pretrage za hepatocelularnu ocjenu (alanin amino ­
transferaza, aspartat aminotransferaza, glutamat dehidrogenaza, ukupne 
žučne kiseline) (39) te najmanje dvije prikladne pretrage za hepatobilijarnu 
ocjenu (alkalna fosfataza, gama glutamil transferaza, 5 ′-nukleotidaza, ukupni 
bilirubin, ukupne žu čne kiseline) (39). Ostali klini čko-kemijski parametri 
poput triglicerida tijekom posta, specifi čnih hormona i kolinesteraze mogu 
se mjeriti ako je potrebno, ovisno o toksi čnosti ispitivane kemikalije. Op će­
nito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili očekivanim u čincima davane ispitivane kemikalije.
 
45. Pretrage analize urina treba provesti na svim pokusnim životinjama (deset 
mužjaka i deset ženki po skupini) na uzorcima skupljenim u jednakim 
intervalima kao i za hematologiju i klini čku kemiju. Mjerenja nakon tri 
mjeseca ne moraju se provoditi ako na analizi urina u prethodnoj 90- dnevnoj studiji provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi u činci. 
Sljedeći popis parametara bio je uklju čen u stru čnu preporuku za studije 
kliničke patologije (38): izgled, koli čina, osmolalnost ili specifi čna težina, 
pH, ukupan broj proteina i glukoza. Ostale pretrage uklju čuju ketone, urobi ­
linogen, bilirubin i okultnu krv. Ako je potrebno, mogu se upotrijebiti i drugi parametri radi proširenog istraživanja opaženog u činka/opaženih 
učinaka.
 
46. Općenito se smatra da osnovne hematološke i klini čko-biokemijske varijable 
treba odrediti prije tretiranja za studije na psima, ali ih se ne mora odrediti u 
studijama na glodavcima (38). No, ako su povijesni osnovni podaci (vidjeti stavak 58.) neprikladni, treba se pobrinuti da se ti podaci izrade.
 
PATOLOGIJA  
Makroskopska analiza  
47. Sve životinje u studiji moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj, makroskop ­
skoj obdukciji koja obuhva ća pažljiv pregled vanjske površine tijela, svih 
otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. No, može se odlučiti (kod skupina za usmr ćivanje u me đuvremenu ili satelitskih 
skupina) da se mjerenja ograni če na specifi čne, ključne mjere, poput neuro ­
toksičnosti ili imunotoksi čnosti (vidjeti stavak 21.). Te životinje ne treba 
podvrgnuti obdukciji i sljede ćim postupcima opisanima u stavcima u 
nastavku. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedina čnim 
slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 495  
( 1 ) Post preko no ći preporučuje se za niz mjerenja u serumu i plazmi, a najviše za glukozu. 
Najvažniji razlog za tu preporuku jest činjenica da bi pove ćana varijabilnost, koja bi 
neizbježno nastala kao rezultat izostanka posta, pokazivala sklonost zamagljivanju 
suptilnih u činaka i otežala tuma čenje rezultata. S druge pak strane post preko no ći 
može utjecati na op ći metabolizam životinja, a posebno u studijama o hranjenju 
moglo bi ometati dnevno izlaganje ispitivanoj kemikaliji. Sve životinje treba procjenjivati 
u istom fiziološkom stanju, a detaljne ili neurološke procjene po mogu ćnosti treba 
odrediti za dan kada se ne provodi biokemijsko uzimanje uzoraka.
 48. Treba prikupiti masu organa svih životinja, osim onih isklju čenih zadnjim 
dijelom stavka 47. Nadbubrežne žlijezde, mozak, epididimise, srce, bubrege, 
jetru, jajnike, slezenu, štitnja ču (izvaganu poslije fiksacije, s paraštitnim 
žlijezdama) i maternicu svih životinja (osim onih prona đenih u stanju 
ugibanja i/ili usmr ćenih u me đuvremenu) treba obrezivanjem osloboditi od 
svih prianjaju ćih tkiva po potrebi te ih treba izvagati u mokrom stanju što 
prije nakon seciranja kako bi se sprije čilo njihovo sušenje.  
49. Sljede ća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba 
tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (40) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su): 
sve makroskopske lezije
 srce  guštera ča želudac (predželudac, 
žljezdani želudac)  
nadbubrežna žlijezda  ileum  paraštitna žlijezda  [zubi]  
aorta  jejunum  periferni živac  testis  
mozak (uklju čujući sekcije 
velikog i malog mozga te medule/mosta)
 bubreg  hipofiza  timus  
cekum  suzna žlijezda (eksorbi ­
talna)  prostata  štitnja ča 
cerviks  jetra  rektum  [jezik]  
koagulacijska žiljezda  plu ća žlijezda slinovnica  dušnik  
debelo crijevo  limfni čvorovi (povr ­ 
šinski i dubinski)  sjemenski mjehuri ć mokra ćni mjehur  
dvanaesnik  mlije čna žlijezda 
(obvezno za ženke i ako se mogu secirati, od 
mužjaka)
 skeletni miši ć maternica (uklju čujući 
cerviks)  
epididimis  [gornji respiratorni trakt 
uključujući nos, turbinate 
i paranazalne sinuse]  koža  [mokra ćovod]  
oko (uklju čujući mrežnicu)  jednjak  kralježnica (na tri 
razine: vratna, srednja 
prsna i slabinska)  [mokraćna cijev]  
[femur sa zglobom]  [olfaktorni bulbus]  slezena  vagina  
žučni mjehur (za vrste 
drukčije od štakora)  jajnik  [prsna kost],  sekcija koštane srži i/ili 
aspirat svježe koštane srži  
Harderova žlijezda  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 496
 
U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sa čuvati 
oba organa. Klini čki i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom 
dodatnih tkiva. Treba sa čuvati i sve one organe za koje se na temelju 
saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni. U studijama koje uklju čuju dermalni na čin primjene treba ispitati popis 
organa sastavljen za oralni na čin primjene, s tim da je nužno specifi čno 
uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom 
popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti prepo ­
ruke Poglavlja B.8 ovog Priloga (9) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (10). Za 
ostale organe/tkiva (te uz posebno sa čuvana tkiva iz respiratornog trakta) 
treba ispitati popis organa zadan za oralni na čin primjene.
 
Histopatologija  
50. Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provo đenju istraživanja toksi ­
kološke patologije (40). Minimalne histopatološke pretrage moraju uklju či­
vati: 
— sva tkiva iz skupine izložene visokoj dozi i kontrolne skupine,  
— sva tkiva životinja uginulih ili usmr ćenih tijekom studije,  
— sva tkiva s makroskopskim anomalijama,  
— tkiva mete ili tkiva koja pokazuju promjene povezane s tretiranjem u 
skupini izloženoj visokoj dozi, od svih životinja u svih drugim skupi ­
nama doza,  
— u slu čaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba 
ispitati oba organa.  
OPAŽANJA (FAZA KARCINOGENOSTI)  
51. Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obi čno na 
početku i kraju svakog dana uklju čujući vikend i praznike. Životinje treba 
dodatno provjeravati jedanput dnevno radi specifi čnih znakova od toksiko ­
loške važnosti. U slu čaju studije uz primjenu sonde životinje treba provje ­
ravati u razdoblju odmah nakon doziranja. Posebnu pažnju valja obratiti na 
razvoj tumora, te treba zabilježiti vrijeme nastanka tumora, lokaciju, dimen ­
zije, izgled i napredovanje svakog makroskopski vidljivog ili palpabilnog tumora.
 
52. Sve životinje treba izvagati na po četka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u 
prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Mjerenja unosa i u čin­
kovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno. Unos vode treba mjeriti najmanje 
jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjese čno ako 
se kemikalija primjenjuje preko vode za pi će. Mjerenje unosa vode treba 
također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 497
 
Hematologija, klini čka biokemija i druga mjerenja  
53. Kako bi se na maksimum pove ćala količina informacija dobivenih iz studija, 
posebno za na čin djelovanja, mogu se uzeti uzorci krvi za hematologiju i 
kliničku biokemiju, o čemu odlu čuje voditelj istraživanja. Tako đer može biti 
prikladna i analiza urina. Podaci o životinjama upotrijebljenima u fazi 
kronične toksičnosti studije, obi čno u trajanju od 12 mjeseci (stavak 34.) 
pružit će informacije o tim parametrima. Ostale upute o vrijednosti uzimanja 
tih uzoraka kao dio studije karcinogenosti nalaze se u Smjernici br. 116. (7). 
Ako se uzimaju uzorci krvi, treba ih prikupiti na kraju razdoblja ispitivanja, 
neposredno prije ili kao dio postupka usmr ćivanja životinja. Treba ih 
uzimati iz odre đenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog 
sinusa, pod anestezijom. Razmazi krvi tako đer se mogu pripremiti za 
pretrage, posebno ako se čini da je organ meta koštana srž, iako se propituje 
vrijednosti takvih pretraga razmaza krvi u fazi karcinogenosti za odre đivanje 
karcinogenog/onkogenog potencijala (38).  
PATOLOGIJA  
Makroskopska analiza  
54. Sve životinje u studiji, osim indikatorskih životinja ili drugih satelitskih 
životinja (vidjeti stavak 20.), moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj makroskopskoj obdukciji koja obuhva ća pažljiv pregled vanjske površine 
tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. 
Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedina čnim slučaje­
vima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja. Mase organa nisu uobi ­ 
čajeni dio studije karcinogeneze budu ći da gerijatrijske promjene te, u 
kasnijim fazama, razvoj tumora remete korisnost podataka o masi organa. 
No mogu biti klju čne pri provo đenju ocjene težine dokaza te posebno za 
razmatranje o na činu djelovanja. Ako su dio satelitske studije, treba ih 
skupiti ne kasnije od godine dana nakon po četka studije.
 
55. Sljede ća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba 
tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (40) (tkiva u 
uglatim zagradama opcijska su): 
sve makroskopske lezije  srce  guštera ča želudac (predželudac, 
žljezdani želudac)  
nadbubrežna žlijezda  ileum  paraštitna žlijezda  [zubi]  
aorta  jejunum  periferni živac  testis  
mozak (uklju čujući sekcije 
velikog i malog mozga te medule/mosta)
 bubreg  hipofiza  timus  
cekum  suzna žlijezda (eksorbi ­
talna)  prostata  štitnja ča 
cerviks  jetra  rektum  [jezik]  
koagulacijska žiljezda  plu ća žlijezda slinovnica  dušnik  
debelo crijevo  limfni čvorovi (povr ­ 
šinski i dubinski)  sjemenski mjehuri ć mokra ćni mjehur  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 498
 
dvanaesnik  mlije čna žlijezda 
(obvezno za ženke i ako 
se mogu secirati, od mužjaka)
 skeletni miši ć maternica (uklju čujući 
cerviks)  
epididimis  [gornji respiratorni trakt 
uključujući nos, turbinate 
i paranazalne sinuse]  koža  [mokra ćovod]  
oko (uklju čujući mrežnicu)  jednjak  kralježnica (na tri 
razine: vratna, srednja 
prsna i slabinska)  [mokraćna cijev]  
[femur sa zglobom]  [olfaktorni bulbus]  slezena  vagina  
žučni mjehur (za vrste druk ­ 
čije od štakora)  jajnik  [prsna kost],  sekcija koštane srži i/ili 
aspirat svježe koštane srži  
Harderova žlijezda  
U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sa čuvati 
oba organa. Klini čki i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom 
dodatnih tkiva. Treba tako đer sačuvati sve organe za koje se smatra da bi 
mogli biti meta na temelju poznatih svojstava ispitivane kemikalije. U studi ­
jama koje uklju čuju dermalni na čin primjene treba ispitati popis organa 
sastavljen za oralni na čin primjene, s tim da je nužno specifi čno uzorko ­
vanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis 
sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke 
Poglavlja B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (9). Za ostale 
organe/tkiva (te uz posebno sa čuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba 
ispitati popis organa zadan za oralni na čin primjene.  
Histopatologija  
56. Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provo đenju istraživanja toksi ­
kološke patologije (40). Minimum tkiva na kojima su obavljene pretrage mora uklju čivati:
 
— Sva tkiva iz skupina izloženih visokoj dozi i kontrolnih skupina,  
— Sva tkiva životinja uginulih ili usmr ćenih tijekom studije,  
— Sva tkiva s makroskopskim anomalijama uklju čujući tumore,  
— Ako se u skupini izloženoj visokoj dozi opaze histopatološke promjene 
povezane s tretmanom, ta tkiva treba analizirati na svim životinjama u 
svim skupinama izloženima drugim dozama,  
— U slu čaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba 
ispitati oba organa.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 499
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE (KARCINOGENOST I KRONI ČNA 
TOKSIČNOST)  
Podaci  
57. Treba pružiti pojedina čne podatke o životinjama za sve ocijenjene parame ­
tre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazuju ći za svaku 
ispitnu skupinu broj životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje su 
tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz humanih razloga te 
vrijeme smrti ili usmr ćivanja, broj uo čenih znakova toksi čnosti, opis 
uočenih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme nastupanja, trajanje i 
ozbiljnost svakog toksi čnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te 
postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka 
trebaju pružiti prosje čne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitiva ­
nja) za životinje koje pokazuju toksi čne učinke ili lezije uz stupnjevanje 
lezija.  
58. U tuma čenju rezultata studije, npr. u slu čaju kada postoje indikacije da su 
podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa skorašnjim podacima dobivenim od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/kolonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povi ­
jesne kontrolne podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija 
i povezati sa životinjama iste dobi i soja proizvedenih tijekom pet godina prije doti čne studije.
 
59. Ako je mogu će, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i op će prihva­ 
ćenom statisti čkom metodom. Statisti čke metode i podatke koji će se anali ­
zirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 9.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
 
60. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija:  
— fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,  
— identifikacijski podaci,  
— podrijetlo kemikalije,  
— broj serije,  
— potvrda kemijske analize.  
Nosač (po potrebi):  
— obrazloženje odabira nosa ča (ako nije voda).  
Pokusne životinje:  
— korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,  
— broj, dob i spol životinja na po četku ispitivanja,  
— podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,  
— pojedina čne tjelesne mase životinja na po četku ispitivanja.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 500
 
Uvjeti ispitivanja:  
— argumentacija za na čin primjene i odabir doze,  
— ako je primjenjivo, statisti čka metoda korištena za analizu podataka,  
— pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,  
— analiti čki podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti 
preparata,  
— način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,  
— stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz 
koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za pi će (mg/kg ili 
ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Rezultati (treba prikazati tabli čno sažete podatke i pojedina čne podatke za 
životinje):  
Općenito  
— Podaci o preživljavanju,  
— Tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,  
— Unos hrane, izra čun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode 
ako je primjenjivo,  
— Toksikokineti čki podaci ako su raspoloživi,  
— Oftalmoloskopija (ako je raspoloživa)  
— Hematologija (ako je raspoloživa)  
— Klinička kemija (ako je raspoloživa)  
Klinički nalazi  
— Znakovi toksi čnosti,  
— Učestalost (te, ako je zabilježena, ozbiljnost) svih anomalija,  
— Narav, ozbiljnost i trajanje klini čkih opažanja (prolaznih ili trajnih),  
Obdukcijski podaci  
— Tjelesna masa na kraju,  
— Mase organa i njihovi omjeri ako je primjenjivo,  
— Nalazi obdukcije, U čestalost i ozbiljnost anomalija.  
Histopatologija  
— Neneoplasti čni histopatološki nalazi,  
— Neoplasti čni histopatološki nalazi,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 501
 
— Međusobni odnos izme đu makroskopskih i mikroskopskih nalaza  
— Detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem, uklju ­ 
čujući stupnjeve ozbiljnosti,  
— Izvješ će svih pregleda objektnih stakalaca mikroskopa provedenih od 
kolega  
Statistička obrada rezultata po potrebi  
Rasprava o rezultatima uklju čujući: 
— Rasprava o svim modelima pristupa  
— Odnosi doza i reakcija  
— Povijesni kontrolni podaci  
— Razmatranja o svim na činima djelovanja informacija  
— Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL  
— Relevantnost za ljude  
Zaključci 
LITERATURA  
1. OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz.
 
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208  
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445  
6. Poglavlje B.27 ovog Priloga, Studija subkroni čne oralne toksi čnosti - 90- 
dnevna studija oralne toksi čnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih 
doza.  
7. OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
8. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
 
9. Poglavlje B.8 ovog Priloga. Subakutna inhalacijska toksi čnost: 28-dnevna 
studija.  
10. Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkroni čna inhalacijska toksi čnost: 90-dnevna 
studija.  
11. Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksi čnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 
dana).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 502
 
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The 
human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Over ­
view. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.  
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
 
20. OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
 
21. OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pariz.  
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF 
& Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results 
and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 503
 
27. Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o 
zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 
20.10.2010., str. 33.  
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.
 
32. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
33. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
34. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
35. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects 
of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
36. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
37. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  
38. Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
39. EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  i sur.  (2004). Smjernica za 
najbolju praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 504
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 505
 
B.34.  TEST REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA JEDNOJ 
GENERACIJI  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema ih.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar primjenjuje se u graduiranim dozama na nekoliko 
skupina mužjaka i ženki. Mužjacima se doza daje tijekom rasta i tijekom najmanje jednog punog ciklusa spermatogeneze (približno 56 
dana kod miševa i 70 dana kod štakora) kako bi izazvala štetne 
učinke ispitivane tvari na spermatogenezu.
 
Ženkama roditeljske generacije (P) dozu tvari treba davati najmanje 
tijekom puna dva ciklusa estrusa kako bi se izazvali štetni u činci 
ispitivane tvari na estrus. Nakon tog životinje se pare. U razdoblju 
parenja ispitivana tvar daje se i mužjacima i ženkama, a zatim samo 
ženkama dok su skotne i u razdoblju dojenja. Za primjenu ispitivane tvari inhalacijom ovu će metodu trebati modificirati.
 
1.5. KRITERIJI KVALITETE  
Nema ih.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Pripreme  
Prije ispitivanja, zdrave mlade odrasle životinje biraju se nasumice i 
raspodjeljuju u skupine za tretiranje i kontrolne skupine. Životinje treba smjestiti i hraniti u uvjetima pokusa najmanje pet dana pred 
ispitivanje. Preporu ča se ispitivanu tvar davati u hrani ili vodi za 
piće. Prihvatljivi su i drugi putevi primjene. U odgovaraju ćem poku­
snom razdoblju svim životinjama doze se moraju davati na isti na čin. 
Ako se, radi jednostavnije primjene, koristi neki nosa č ili drugi 
aditivi, za njih se mora znati da ne proizvode toksi čne učinke. 
Doze se daju sedam dana u tjednu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 506
 
1.6.2. P o k u s n e ž i v o t i n j e  
Odabir vrsta  
Poželjne vrste su štakori ili miševi. Treba koristiti zdrave životinje 
koje prethodno nisu sudjelovale u pokusima. Sojeve slabe plodnosti 
ne bi trebalo koristiti. Ispitne životinje treba okarakterizirati u 
pogledu vrste, soja, spola, mase i/ili dobi.  
Za primjerenu procjenu plodnosti, istraživanjem treba obuhvatiti i 
mužjake i ženke. Sve životinje iz ispitnih i kontrolnih skupina trebaju biti odbijene od sise prije nego što zapo čne primjena doza.
 
Broj i spol  
Svaka tretirana i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj 
životinja kako bi se dobilo oko 20 ženki koje su skotne ili pred okot.  
Cilj je dobiti dovoljno skotnih životinja i potomaka kako bi se 
osigurala valjana procjena potencijala tvari da utje če na plodnost, 
skotnost i maj činsko ponašanje životinja generacije P te na sisanje, 
rast i razvoj potomstva F  1 od začeća do odbijanja od sise.  
1.6.3. U v j e t i i s p i t i v a n j a  
Hranu i vodu treba osigurati  ad libitum . Pred parturiciju, skotne 
ženke treba smjestiti u posebne kaveze za okot ili materinstvo, te 
im po potrebi treba osigurati materijale za izradu gnijezda.  
1.6.3.1. V i s i n e d o z a  
Treba koristiti najmanje tri tretirane skupine i jednu kontrolnu 
skupinu. Ako se kod primjene ispitivane tvari koristi neki nosa č, 
kontrolna skupina treba primiti taj nosa č u najvećoj količini koja 
je primijenjena. Ako ispitivana tvar uzrokuje smanjenje unosa ili 
iskorištenja hrane, treba razmotriti eventualnu potrebu uvo đenja 
kontrolne skupine koja će biti hranjena na isti na čin. U idealnom 
slučaju, ako nije ograni čena fizikalnim/kemijskim prirodnim svoj ­
stvima ili biološkim u čincima ispitivane tvari, doza bi trebala biti 
takve visine koja će dovesti do toksi čnosti, ali ne i do smrtnosti 
roditeljskih životinja (P). Srednja doza ili doze trebale bi uzrokovati minimalne toksi čne učinke koji se mogu pripisati ispitivanoj tvari, a 
male doze ne bi trebale dovesti ni do kakvih zamjetnih štetnih 
učinaka na roditelje ili na potomstvo. Kod primjene pomo ću želu­ 
čane sonde ili u kapsulama, dozu koja se daje svakoj životinji treba 
temeljiti na masi tijela pojedine životinje i prilago đavati tjedno 
prema promjenama u masi tijela. Za skotne ženke, doziranje se 
može temeljiti na masi tijela na dan graviditeta 0 ili 6, po želji.
 
1.6.3.2. G r a n i č n i t e s t  
Kad se radi o tvarima niske toksi čnosti, ako se visinom doze od 
najmanje 1 000 mg/kilogramu ne dokaže utjecaj na reproduktivnu 
sposobnost, može se smatrati da ispitivanja s drugim visinama doza nisu potrebna. Ako istraživanje s primjenom velike doze i definitivnim dokazom toksi čnosti na majci ne pokazuje štetne 
učinke na plodnost, može se smatrati kako istraživanja s drugim 
dozama nisu potrebna.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 507
 
1.6.3.3.  Provo đenje ispitivanja  
P l a n p o k u s a  
Dnevnu primjenu doza kod roditeljskih mužjaka (P) treba po četi u 
dobi od pet do devet tjedana, nakon što su odbijeni od sise i nakon minimalno petodnevne aklimatizacije. Kod štakora, doziranje se nastavlja tijekom 10 tjedana prije razdoblja parenja (za miševe, 
osam tjedana). Mužjake treba usmrtiti i pregledati ili na kraju 
razdoblja parenja ili ih, alternativno, zadržati na ispitnom režimu prehrane kako bi se eventualno dobio drugi okot, pa ih onda, negdje pred kraj istraživanja, usmrtiti i pregledati. Kod roditeljskih 
ženki (P), s doziranjem treba po četi nakon najmanje pet dana akli ­
matizacije i nastaviti još najmanje dva tjedna pred parenje. Dnevnu primjenu doza kod ženki generacije p treba nastaviti tijekom puna tri tjedna razdoblja parenja, trudno će i sve do odbijanja potomstva F
 1 
od sise. Treba razmotriti eventualne izmjene u rasporedu doziranja 
na temelju drugih dostupnih informacija o ispitivanoj tvari, primje ­
rice indukciji metabolizma ili bioakumulaciji.  
P o s t u p a k p a r e n j a  
Za studije reproduktivne toksi čnosti može se koristiti parenje bilo 1:1 
(jedan mužjak na jednu ženku) ili 1:2 (jedan mužjak na dvije ženke).  
Na temelju parenja 1:1, jedna ženka ostavlja se s istim mužjakom 
sve dok ne do đe do oplodnje ili do isteka tri tjedna. Svako jutro 
ženke treba pregledati s obzirom na prisutnost sperme ili vaginalnih 
čepova. Danom graviditeta 0 smatra se dan kad je na đen vaginalni 
čep ili sperma.  
Parove koji se nisu uspjeli pariti treba pregledati kako bi se utvrdio 
uzrok očite neplodnosti.  
To može obuhvatiti postupke kao što su pružanje dodatne mogu ć­
nosti za parenje s drugim mužjacima i ženkama čije je roditeljstvo 
dokazano, mikroskopski pregled reproduktivnih organa i preispiti ­
vanje ciklusa estrusa ili spermatogeneze.  
V e l i č i n e l e g l a  
Životinjama na koje se doze primjenjuju tijekom istraživanja plod ­
nosti dozvoljava se da se normalno okote i da podignu svoje potom ­
stvo do faze odbijanja od sise bez standardizacije legla.  
Ako se provodi standardizacija, predlaže se sljede ći postupak. 
Između 1. i 4. dana nakon okota, veli čina svakog legla može se 
prilagoditi selekcijskim uklanjanjem dodatnih mladunaca na na čin 
da se po jednom leglu ostave, po mogu ćnosti, četiri mužjaka i 
četiri ženke.  
Kad god je broj muških ili ženskih mladunaca takav da nije mogu će 
imati četiri mladunca svakog spola po leglu, prihvatljivo je djelo ­
mično prilago đavanje (npr. pet mužjaka i tri ženke).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 508
 
1.6.4. O p a ž a n j a  
Cijelo razdoblje ispitivanja svaku životinju treba opažati najmanje 
jednom dnevno. Treba bilježiti zna čajne promjene ponašanja, 
znakove otežane ili produžene parturicije i sve znakove toksi čnosti, 
uključujući smrtnost. U razdobljima pred parenje i tijekom parenja, 
potrošnja hrane može se mjeriti svaki dan. Nakon okota i za vrijeme laktacije, potrošnju hrane (i potrošnju vode ako se ispitivana tvar primjenjuje u vodi za pi će) treba mjeriti istog dana kad se obavlja 
vaganje legla. Mužjake i ženke roditeljske generacije P treba vagati 
prvog dana primjene doze, a zatim jednom tjedno. Ta opažanja treba unijeti u izvješ će pojedina čno za svaku odraslu životinju.
 
Vrijeme gestacije treba ra čunati od nultog dana graviditeta. Svako 
leglo nakon poroda treba što prije pregledati kako bi se utvrdio broj i 
spol mladunaca, mrtvoro đenih, živoro đenih i prisutnost velikih 
anomalija.  
Mladunčad koja je mrtvoro đena i usmr ćena četvrtog dana treba 
konzervirati i prou čiti kako bi se utvrdili eventualni defekti. Živu 
mladunčad treba prebrojiti i legla izvagati jutro nakon okota te 
četvrtog i sedmog dana, a zatim jednom tjedno sve do završetka 
istraživanja, kad životinje treba izvagati pojedina čno. 
Uočene fizičke anomalije ili anomalije u ponašanju roditeljskih ženki 
ili potomaka treba zabilježiti.  
1.6.5. P a t o l o g i j a  
1.6.5.1. N e k r o p s i j a  
U vrijeme usmr ćenja ili smrti tijekom istraživanja životinje rodi ­
teljske generacije P treba pregledati makroskopski radi utvr đivanja 
eventualnih strukturnih anomalija ili patoloških promjena, s tim da 
posebnu pozornost treba posvetiti organima reproduktivnog sustava. Mladunčad koja je uginula ili je na umoru treba pregledati kako bi se 
utvrdile patološke promjene.
 
1.6.5.2. H i s t o p a t o l o g i j a  
Ovarije, uterus, cerviks, vaginu, testise, epididimise, sjemene vezi ­
kule, prostatu, prednji režanj prostate, hipofizu i ciljne organe svih 
roditeljskih životinja P treba konzervirati za mikroskopski pregled. U 
slučaju da ti organi nisu bili pregledani kod drugih istraživanja s 
višestrukim dozama, treba ih mikroskopski pregledati po mogu ćnosti 
kod svih životinja koje su bile izložene velikim dozama i kontrolnih 
životinja koje su uginule tijekom istraživanja.  
Organe na kojima su kod tih životinjama na đene anomalije zatim 
treba pregledati kod ostalih roditeljskih životinja P. U takvim slu ča­
jevima, mikroskopski treba pregledati sva tkiva kod kojih su utvr ­ 
đene velike patološke promjene. Kao što je predloženo u stavku o 
postupcima parenja, reproduktivne organe životinja za koje se 
sumnja da su neplodne može se podvrgnuti mikroskopskoj pretrazi.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 509
 
2. PODACI  
Podaci se mogu sažeto prikazati u obliku tablice, na na čin da se za 
svaku ispitnu skupinu navede broj životinja na po četku pokusa, broj 
plodnih mužjaka, broj skotnih ženki, tipovi promjena i postotak 
životinja kod kojih je pojedina vrsta promjene primije ćena. 
Kad je to mogu će, numeri čke podatke treba vrednovati odgovara ­
jućom statisti čkom metodom. Može se primijeniti bilo koja op će 
prihvaćena statisti čka metoda.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati slijede će 
informacije:  
— vrsta/soj koji je upotrijebljen,  
— podaci o toksi čkoj reakciji po spolu i dozi, uklju čujući plodnost, 
gestaciju i sposobnost preživljavanja,  
— vrijeme smrti tijekom istraživanja ili jesu li životinje preživjele 
do trenutka planiranog usmr ćenja ili završetka istraživanja,  
— tablica koja prikazuje mase svakog legla, srednje mase mladun ­ 
čadi i pojedina čne mase mladun čadi na završetku istraživanja,  
— toksički ili drugi u činci na reprodukciju, potomke i postnatalni 
rast, 
— dan opažanja svakog neuobi čajenog znaka i njegov daljnji razvoj,  
— podaci o tjelesnoj masi roditeljskih životinja (P),  
— nalazi nekropsije,  
— detaljan opis svih mikroskopskih nalaza,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi,  
— rasprava o rezultatima,  
— tumačenje rezultata.  
3.2. VREDNOVANJE I TUMA ČENJE REZULTATA  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
4. REFERENCE  
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 510
 
B.35.  STUDIJA REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA DVIJE 
GENERACIJE  
1. METODA  
Ova je metoda replika Smjernice za ispitivanje OECD–a TG 416 
(2001).  
1.1. UVOD  
Ova metoda za ispitivanje reprodukcije na dvije generacije namije ­
njena je za dobivanje op ćenitih informacija o u čincima ispitivane 
tvari na integritet i funkcioniranje muških i ženskih reproduktivnih 
sustava, uklju čujući i funkciju spolnih žlijezda, ciklus estrusa, 
ponašanje kod parenja, za čeće, gestaciju, parturiciju, laktaciju i odbi ­
janje od sise, te rast i razvoj potomaka. Ovom studijom može se do ći 
i do informacija o u čincima ispitivane tvari na neonatalni morbiditet, 
mortalitet kao i do preliminarnih podataka o prenatalnoj i post ­
natalnoj razvojnoj toksi čnosti, pa može služiti kao smjernica za 
daljnja ispitivanja. Osim za istraživanja rasta i razvoja generacije F1, ova je ispitna metoda namijenjena i procjeni integriteta i funk ­
cioniranja muških i ženskih reproduktivnih sustava kao i rasta i 
razvoja generacije F2. Za dodatne informacije o razvojnoj toksi čnosti 
i funkcionalnim nedostacima u ovaj protokol mogu se ugraditi dodatna istraživanja, te po potrebi konzultirati metode za ispitivanje 
razvojne toksi čnosti i/ili razvojne neurotoksi čnosti, ili se te krajne 
točke mogu prou čavati u odvojenim istraživanjima, primjenom odgo ­
varajućih ispitnih metoda.
 
1.2. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar primjenjuje se u graduiranim dozama na nekoliko 
skupina mužjaka i ženki. Mužjacima generacije P doza se daje 
tijekom rasta i tijekom najmanje jednog punog ciklusa spermatoge ­
neze (približno 56 dana kod miševa i 70 dana kod štakora) kako bi izazvala štetne u činke ispitivane tvari na spermatogenezu. U činci na 
spermu odre đuju se nizom parametara (npr. morfologija i pokretlji ­
vost sperme), i na pripravcima tkiva te detaljnom histopatologijom. Ako su podaci o spermatogenezi poznati iz ranijeg dovoljno dugog istraživanja o ponavljanoj primjeni doze, npr. 90–dnevnog istraživa ­
nja, procjenom ne treba obuhvatiti mužjake generacije P. Me đutim, 
uzorke ili digitalna o čitanja sperme generacije P preporu čljivo je 
spremiti za kasniju procjenu. Ženkama generacije P dozu treba davati tijekom rasta i nekoliko potpunih ciklusa estrusa kako bi se 
izazvali štetni u činci ispitivane tvari na normalan ciklus estrusa. 
Ispitivana tvar dozira se roditeljskim životinjama (P) u razdoblju parenja, tijekom nastale trudno će i za vrijeme dok se njihovo potom ­
stvo F1 odbija od sise. Nakon odbijanja od sise tvar se potomcima 
F1 nastavlja davati u razdoblju rasta i odrasle dobi, parenja i produk ­
cije generacije F2, sve dok se generacija F2 ne odbije od sise.
 
Na svim životinjama provode se klini čka opažanja i patološka ispi ­
tivanja kako bi se utvrdili znakovi toksi čnosti s posebnim naglaskom 
na integritet i funkcioniranje muških i ženskih reproduktivnih sustava 
kao i rasta i razvoja potomstva.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 511
 
1.3. OPIS ISPITNE METODE  
1.3.1.  Odabir životinjskih vrsta  
Poželjna vrsta za ispitivanje su štakori. Ako se koriste druge vrste, 
opravdanost toga treba dokazati, a bit će potrebne i primjerene modi ­
fikacije. Sojeve slabe plodnosti ili poznate po velikoj u čestalosti 
razvojnih defekata ne bi trebalo koristiti. Na po četku studije, odstu ­
panje mase životinja koje se koriste treba biti minimalno, odnosno ne 
veće od 20 % srednje mase za svaki spol.  
1.3.2.  Uvjeti smještaja i prehrane  
Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 
22 °C (± 3 °). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a 
poželjno je da ne prije đe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti 
konvencionalna laboratorijska hrana s neograni čenom koli činom 
vode za pi će. Na izbor hrane može utjecati potreba da se osigura 
odgovaraju ća mješavina s ispitivanom tvari koja se daje u hrani.
 
Životinje se mogu smjestiti odvojeno ili držati u kavezima u malim 
skupinama istog spola. Postupci parenja trebaju se odvijati u kave ­
zima koji odgovaraju toj svrsi. Nakon što je o čito da je došlo do 
kopulacije, u kaveze za okot ili potomstvo skotne ženke treba smje ­
stiti same. Štakori se nakon parenja mogu držati u malim skupinama, pa ih onda dan ili dva prije parturicije treba odvojiti. Pred termin parturicije skotnim životinjama treba osigurati odgovaraju ći i utvr­ 
đeni materijal za pravljenje gnijezda.
 
1.3.3.  Priprema životinja  
Treba koristiti zdrave mlade životinje koje su najmanje pet dana 
prilagođavane laboratorijskim uvjetima i koje ranije nisu podvrga ­
vane pokusnim postupcima. Pokusne životinje treba okarakterizirati 
u pogledu vrste, soja, spola, mase i/ili starosti. Eventualno srodstvo 
između životinja treba biti poznato kako bi se izbjeglo parenje srod ­
nika. Životinje se nasumice biraju i raspodjeljuju u kontrolnu 
skupinu i skupinu koja će se tretirati (preporu ča se regrupiranje 
prema masi tijela). Kaveze treba rasporediti na na čin da se maksi ­
malno umanje mogu ći učinci boravka u kavezu. Svakoj životinji 
treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj. Za generaciju P, to 
treba učiniti prije po četka doziranja. Za generaciju F1, to treba u činiti 
u trenutku kad se životinje odabrane za parenje odbiju od sise. Za sve odabrane životinje F1 treba voditi evidenciju o po četnom leglu. 
Osim toga, za potrebe pojedina čnog vaganja mladunaca ili provo ­ 
đenja bilo kojeg funkcionalnog ispitivanja preporu ča se pojedina čna 
identifikacija mladun čadi odmah nakon ro đenja.
 
Prije početka doziranja roditeljske životinje (P) moraju biti stare oko 
pet do devet tjedana. Životinje u svim ispitnim skupinama po 
mogućnosti trebaju biti podjednake mase i starosti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 512
 
1.4. POSTUPAK  
1.4.1.  Broj i spol životinja  
Svaka ispitna i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj 
životinja kako bi se dobio poželjan broj od najmanje 20 ženki koje su skotne ili pred okot. Kod tretiranja tvarima koje uzrokuju neželjene u činke (npr. sterilnost, prekomjernu toksi čnost kod velike 
doze), to možda ne će biti mogu će. Cilj je proizvesti dovoljno skotnih 
ženki kako bi se osigurala valjana procjena potencijala tvari da utje če 
na plodnost, trudno ću i majčinsko ponašanje, te na sisanje, rast i 
razvoj potomstva F
 1 od začeća do odbijanja od sise, i na razvoj 
potomstva (F2) do odbijanja od sise. Stoga nepostizanje željenog 
broja skotnih životinja (tj. 20) ne zna či nužno da istraživanje nije 
neuspjelo, ve ć procjenu treba provoditi od slu čaja do slu čaja. 
1.4.2.  Priprema doza  
Preporuča se ispitivanu tvar davati oralno (u hrani, vodi za pi će ili 
sondom) ako se neki drugi na čin primjene (npr. dermalno ili inha ­
lacijom) ne smatra prikladnijim.  
Prema potrebi, ispitivana tvar se otapa ili suspendira u odgovara ­
jućem otapalu ili nosa ču. Preporu ča se, kad god je to mogu će, 
prvo razmotriti upotrebu vodene otopine/suspenzije, pa onda otopinu/ emulziju u ulju (npr. kukuruzno ulje) i na kraju eventualnu otopinu u drugim otapalima. Za sve druge nosa če osim vode treba poznavati 
toksičke karakteristike nosa ča. Stabilnost ispitivane tvari u pomo ćnoj 
tvari treba odrediti.
 
1.4.3.  Doziranje  
Treba koristiti najmanje tri ja čine doze i istodobno jednu kontrolnu. 
Ako nije ograni čena fizikalno–kemijskim svojstvima ili biološkim 
učincima ispitivane tvari, najja ču dozu treba odabrati s ciljem da 
se izazove toksi čnost, a ne smrt ili teška patnja. U slu čaju neočeki­
vane smrtnosti, studije sa stopom smrtnosti manjom od oko 10 % 
kod roditeljskih životinja (P) obi čno se još smatraju prihvatljivima. 
Treba odabrati slijed postepenog smanjivanja doze koji će ukazati na 
sve učinke odre đenih doza i visine kod kojih se ne opažaju štetni 
učinci (NOAEL vrijednosti). Za utvr đivanje visine sve slabijih doza 
često je optimalno doze primijeniti u dva do tri intervala, a može biti 
bolje dodati i četvrtu ispitnu skupinu nego izme đu primjene doza 
koristiti veoma velike vremenske intervale (npr. iznad faktora 10). U svrhu prehrambenih istraživanja interval doziranja ne bi smio biti 
veći od faktora tri. Visinu doze treba odabrati imaju ći u vidu posto ­
jeće podatke o toksi čnosti, posebno rezultate istraživanja s 
ponavljanim dozama. Treba uzeti u obzir sve dostupne informacije o metabolizmu i kinetici ispitivanog spoja ili s njim povezanih mate ­
rijala. Tim će se informacijama mo ći opravdati i prikladnost režima 
doziranja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 513
 
Kontrolna skupina je netretirana skupina ili kontrolna skupina za 
nosač ako se za davanje ispitivane tvari nosa č koristi. Osim tretiranja 
ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se koristi nosa č, kontrolna skupina taj nosa č mora primiti u najve ćem 
volumenu koji je upotrijebljen. Ako se ispitivana tvar daje pomije ­ 
šana s hranom, a uzrokuje smanjeni unos ili iskorištenje hrane, može se smatrati potrebnim uvo đenje paralelne kontrolne skupine za 
prehranu. Alternativno, umjesto takve paralelno hranjene kontrolne 
skupine mogu se upotrijebiti podaci iz kontrolnih studija koje su 
provedene s ciljem procjene u činaka smanjene potrošnje hrane na 
reproduktivne parametre.
 
Treba uzeti u obzir sljede će karakteristike nosa ča i drugih aditiva: 
učinci na apsorpciju, distribuciju, metabolizam, ili zadržavanje ispi ­
tivane tvari; u činci na kemijska svojstva ispitivane tvari koji mogu 
izmijeniti njezine toksi čke karakteristike; i u činci na potrošnju hrane 
ili vode ili nutritivno stanje životinja.  
1.4.4.  Grani čni test  
Ako istraživanje provedeno oralnom primjenom jedne doze od 
najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan, ili kod davanja doze u hrani ili vodi za pi će, primjenom doze koja se u ekvivalentnom 
postotku daje u hrani ili vodi za pi će u skladu s postupcima opisanim 
u ovoj studiji, ne proizvede uo čljive toksi čke učinke niti kod roditelj ­
skih životinja niti njihovih potomaka, i ako na temelju podataka iz strukturno i/ili metaboli čki srodnih spojeva ne treba o čekivati toksi č­
nost, u takvim slu čajevima može se smatrati da provo đenje potpune 
studije s nekoliko visina doza nije neophodno. Grani čni je test rele ­
vantan samo ako izloženost ljudi ne ukazuje na potrebu za primjenom ve će oralne doze. Za druge puteve primjene doza, kao 
što su udisanje ili primjena putem kože, fizikalno–kemijska svojstva 
ispitivane tvari, npr. topljivost, često mogu odre đivati i ograni čavati 
najvišu mogu ću razinu izlaganja koja se smije posti ći.
 
1.4.5.  Primjena doza  
Životinjama treba davati doze ispitivane tvari 7 dana u tjednu. 
Poželjna je oralna primjena (u hrani, vodi za pi će, ili želu čanom 
sondom). Ako se koristi drugi put primjene, za to treba navesti 
opravdane razloge, a mogu biti potrebne i odgovaraju će modifika ­
cije. U odgovaraju ćem razdoblju pokusa svim se životinjama doze 
moraju davati istom metodom. Ako se ispitivana tvar daje na sondu, 
to treba u činiti primjenom želu čane sonde. Volumen teku ćine koja se 
daje odjednom ne smije prije ći 1 ml/100 g tjelesne mase (0,4 ml/100 g 
tjelesne mase je maksimum za kukuruzno ulje), osim u slu čaju 
vodenih otopina kod kojih se smije koristiti 2 ml/100 g tjelesne 
mase. Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih tvari, za koje je 
normalno da u ve ćim koncentracijama izazivaju intenzivnije 
učinke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem koncentra ­
cije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao 
stalni volumen. Kod studija u kojima se primjenjuje hranjenje na 
sondu, mladunci će, naravno, ispitnu tvar primati samo posredno, 
u mlijeku, sve dok za njih ne zapo čne izravno doziranje nakon 
odbijanja od sise. Kod studija u kojima se tvar daje u hrani ili 
vodi za pi će, mladunci će dodatno primati ispitivanu tvar izravno 
kad sami po čnu jesti tijekom posljednjeg tjedna razdoblja laktacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 514
 
Za tvari koje se daju u hrani ili vodi za pi će, važno je osigurati da 
količine ispitivane tvari o kojoj se radi nemaju utjecaja na uobi čajen 
unos hrane ili vode. Ako se ispitivana tvar daje u hrani, može se koristiti stalna koncentracija u hrani (ppm) ili stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje; treba navesti koja se od te dvije 
mogućnosti koristi. Za tvar koja se daje na sondu, dozu treba davati 
u podjednako vrijeme svakog dana i prilagoditi je najmanje jednom tjedno kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje. Kod prilago đavanja doze koja se daje na sondu, a 
temelji se na masi, treba uzeti u obzir informacije o difuziji kroz 
posteljicu.
 
1.4.6.  Plan pokusa  
Dnevna primjena doza kod roditeljskih mužjaka i ženki (P) treba 
početi kad su stari pet do devet tjedana. Dnevno davanje doze kod 
mužjaka i ženki F1 po činje nakon što su odbijeni od sise; treba imati 
na umu da je u slu čajevima kad se ispitivana tvar daje u hrani ili 
vodi za pi će, do izravnog izlaganja mladunaca F1 ispitivanoj tvari 
već došlo tijekom razdoblja laktacije. Za oba spola (P i F1), dozi ­
ranje se nastavlja do najmanje 10 tjedana prije razdoblja parenja. 
Doziranje se nastavlja kod oba spola tijekom dvotjednog razdoblja parenja. Kad više nisu potrebni za procjenu reproduktivnih u činaka, 
mužjake treba humano usmrtiti i pregledati. Za roditeljske ženke (P), 
doziranje se nastavlja cijelo vrijeme graviditeta i sve do odbijanja od 
sise potomaka F1. Na temelju dostupnih informacija o ispitivanoj tvari, uklju čujući postojeće podatke o toksi čnosti, indukciji metabol ­
izma ili bioakumulaciji, treba razmotriti eventualne izmjene u raspo ­
redu doziranja. Doza za svaku životinju svakako se mora temeljiti na 
najnovijem odre đivanju pojedina čne tjelesne mase. Me đutim, kod 
prilagođavanja doze u tijeku posljednjeg tromjese čja graviditeta 
potreban je oprez.
 
Tretiranje mužjaka i ženki P i F1 nastavlja se do kraja studije. Kad 
više nisu potrebni za procjenu u činaka na reprodukciju, sve odrasle 
mužjake i ženke P i F1 treba humano usmrtiti. Potomke F1 koji nisu 
izabrani za parenje i sve potomke F2 treba humano usmrtiti nakon što su odbijeni od sise.
 
1.4.7.  Postupak parenja  
1.4.7.1.  Parenje roditeljske generacije (P)  
Za svako parenje svaku se ženku stavi s jednim mužjakom iz istog 
ranga visine doze (parenje 1:1) sve dok ne do đe do kopulacije ili do 
isteka dva tjedna. Svakog dana ženke treba pregledati s obzirom na 
prisutnost sperme ili vaginalnih čepova. Danom graviditeta 0 smatra 
se dan kad je na đen vaginalni čep ili sperma. Ako je parenje neus ­
pješno, može se razmotriti mogu ćnost ponovnog parenja ženki s 
dokazanim mužjacima iste skupine. Parove koji se pare treba jasno 
identificirati u podacima. Parenje srodnika treba izbjegavati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 515
 
1.4.7.2.  Parenje generacije F1  
Za parenje potomaka F1, u trenutku odbijanja od sise iz svakog legla 
treba odabrati najmanje jednog mužjaka i jednu ženku za parenje s drugim mladuncima tretiranim istom visinom doze, ali iz razli čitog 
legla, kako bi se dobila generacija F2. Ako u tjelesnoj masi ili 
izgledu muških mladunaca u leglu nema znatnih razlika, odabir mladunaca iz svakog legla treba provesti nasumice. Ako se te razlike opažaju, iz svakog legla treba odabrati najbolje predstavnike. 
To je najbolje provesti na temelju tjelesne mase iako je možda 
prikladnije na temelju izgleda. Potomke F1 ne treba pariti dok ne postignu punu spolnu zrelost.
 
Parove koji se nisu uspjeli pariti treba pregledati kako bi se utvrdio 
uzrok očite neplodnosti. To može obuhvatiti postupke kao što su 
pružanje dodatne mogu ćnosti za parenje s drugim mužjacima i 
ženkama čije je roditeljstvo dokazano, mikroskopski pregled repro ­
duktivnih organa te preispitivanje ciklusa estrusa ili spermatogeneze.  
1.4.7.3.  Drugo parenje  
U nekim slu čajevima, primjerice kad su zbog tretiranja u prvom 
parenju u činjene odre đene promjene u veli čini legla ili je opažen 
dvosmislen u činak, preporu ča se ponovno parenje odraslih životinja 
P ili F1 kako bi se dobilo drugo leglo. Preporu ča se ženke ili 
mužjake koji nisu dali leglo ponovno pariti s dokazanom rasplodnom životinjom suprotnog spola. Ako se proizvodnja drugog legla u bilo 
kojoj generaciji smatra neophodnom, životinje treba pariti približno 
tjedan dana nakon odbijanja od sise prvog legla.
 
1.4.7.4.  Veličina legla  
Životinjama se dozvoljava da se normalno okote i da podignu svoje 
potomstvo do faze odbijanja od sise. Standardizacija veli čine legla 
nije obvezna. Kad se standardizacija poduzima, metodu koja se rabi treba iscrpno opisati.
 
1.5. OPAŽANJA  
1.5.1.  Klini čka opažanja  
Opća klinička opažanja treba provoditi svakog dana, a u slu čaju 
davanja doze putem sonde, kod odre đivanja u koje će se vrijeme 
opažanje obavljati treba uzeti u obzir vrijeme u koje se predvi đa da 
će učinci imati maksimalnu ja činu nakon doziranja. Promjene 
ponašanja, znakove otežane ili produžene parturicije i sve znakove 
toksičnosti treba bilježiti. Uz to, svaku životinju treba detaljnije 
pregledati najmanje jednom tjedno, što je prikladno u činiti kod 
vaganja životinja. Dvaput dnevno, i ako je primjereno jednom 
dnevno tijekom vikenda, sve životinje treba opažati s obzirom na 
morbiditet i mortalitet.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 516
 
1.5.2.  Tjelesna masa i potrošnja vode/hrane roditeljskih životinja  
Roditeljske životinje (P i F1) važu se prvog dana primjene doze, a 
zatim najmanje jednom tjedno. Roditeljske ženke (P i F1) treba vagati najmanje 0., 7., 14. i 20. ili 21. dana gestacije i tijekom 
laktacije na iste dane na koje se obavlja vaganje legla i na dan 
kad se životinje usmr ćuju. Ta opažanja treba unijeti u izvješ će za 
svaku odraslu životinju posebno. Za vrijeme razdoblja pred parenje i tijekom gestacije potrošnju hrane treba mjeriti najmanje jednom 
tjedno. Ako se ispitivana tvar daje u vodi, potrošnju vode treba 
mjeriti najmanje jednom tjedno.
 
1.5.3.  Ciklus estrusa  
Duljina i normalno odvijanje ciklusa estrusa procjenjuje se kod ženki 
P i F1 na temelju vaginalnog brisa prije parenja, i neobvezno tijekom parenja, sve dok se ne dokaže da je došlo do parenja. Ako se 
uzimaju vaginalne/cervikalne stanice, treba paziti da se ne poremeti 
mukoza, i kasnije, ne izazove lažna trudno ća (1).
 
1.5.4.  Parametri sperme  
Po završetku studije, za sve mužjake generacija P i F1 bilježi se 
masa testisa i epididimisa, i po jedan organ od svakog čuva se za 
histopatološki pregled (vidjeti odjeljak 1.5.7., 1.5.8.1.). Preostali 
testisi i epididimisi podskupine od najmanje 10 mužjaka iz svake 
skupine mužjaka generacija P i F1, koriste se kako bi se pobrojali spermatidi otporni na homogenizaciju, odnosno zalihe sperme iz repa epididimisa. Za tu istu podskupinu mužjaka treba sakupiti zalihu 
sperme iz repa epididimisa ili sjemenovoda za procjenu pokretljivosti 
i morfologije sperme. Ako se opaze u činci povezani s tretiranjem ili 
na temelju drugih studija u kojima su dokazani mogu ći učinci na 
spermatogenezu, procjenu sperme treba provesti na svim mužjacima 
u svakoj tretiranoj skupini; u protivnom brojanje se može ograni čiti 
na mužjake generacija P i F1 iz kontrolne skupine i skupine izložene velikim dozama.
 
Treba pobrojati ukupan broj spermatida iz testisa koji su otporni na 
homogenizaciju, odnosno iz zalihe sperme iz repa epididimisa (2)(3). 
Zalihe sperme iz repa epididimisa mogu se izra čunati iz koncentra ­
cije i volumena sperme u suspenziji koja se rabi za kvalitativne procjene, a broj rekuperirane sperme naknadnim seciranjem i/ili 
homogenizacijom preostalog tkiva repi ća. Brojanje se provodi na 
odabranoj podskupini mužjaka iz svih tretiranih skupina odmah nakon što su životinje usmr ćene, ako se ne provodi video ili digi ­
talno snimanje ili ako se uzorci ne zamrzavaju za kasniju analizu. U 
tim slučajevima, prvo se mogu analizirati kontrolna skupina i 
skupina izložena velikim dozama. Ako nema vidljivih u činaka treti ­
ranja (npr. u činaka na broj, pokretljivost ili morfologiju sperme), 
druge skupine ne treba analizirati. Ako su u činci koji se javljaju 
kao posljedica tretiranja zabilježeni u skupini izloženoj velikim 
dozama, treba procijeniti i skupine koje su primale manje doze.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 517
 
Pokretljivost sperme iz epididimisa (ili iz  ductus deferens ) treba 
procijeniti ili snimiti video snimkom odmah nakon što je životinja 
usmrćena. Spermu treba izvaditi uz minimalna ošte ćenja i razrijediti 
za analizu pokretljivosti primjenjuju ći prihvatljive metode (4). 
Postotak progresivno pokretljive sperme treba odrediti subjektivno 
ili objektivno. Ako se analiza pokretljivosti radi pomo ću računala 
(5)(6)(7)(8)(9)(10), progresivna pokretljivost vrednuje se prema graničnim vrijednostima koje odredi korisnik za prosje čnu brzinu 
puta i pravocrtnost ili indeks linearnosti. Ako se kod nekropsije 
uzorci snimaju video kamerom (11) ili na drugi na čin slikaju, 
naknadnom analizom mogu se obuhvatiti samo mužjaci generacija P i F1 iz kontrolne skupine i skupine izložene velikim dozama, osim ako se ne opažaju u činci uzrokovani tretiranjem; u tom slu čaju, 
skupine s nižim dozama tako đer treba procijeniti. U nedostatku 
video ili digitalnog zapisa, kod nekropsije treba analizirati sve uzorke u svim tretiranim skupinama.
 
Potrebno je izvršiti procjenu morfologije sperme iz epididimisa (ili iz  
vas deferens ). Spermu (najmanje 200 spermatozoida po uzorku) treba 
pregledati kao fiksirane mokre pripravke (12) i klasificirati je kao 
normalnu ili ne. Primjeri morfoloških anomalija spermatozoida obuh ­
vaćaju fuziju, odvojene glave i deformirane glave i/ili repove. 
Procjenu treba provesti na odabranoj podskupini mužjaka iz svih skupina razli čitih visina doze odmah nakon usmr ćenja životinja ili 
kasnije, na temelju video ili digitalnog zapisa. Brisove, koji se 
jednom fiksiraju, mogu će je očitavati i kasnije. U tim slu čajevima, 
prvo se mogu analizirati kontrolna skupina i skupina izložena velikim dozama. Ako nema vidljivih u činaka tretiranja (npr. 
učinaka na morfologiju sperme), druge tretirane skupine ne treba 
analizirati. Ako su u činci koji se javljaju kao posljedica tretiranja 
zabilježeni u skupini izloženoj velikim dozama, treba procijeniti i skupine koje su primale manje doze.
 
Ako je bilo koji od gore spomenutih parametara za procjenu sperme 
već ranije bio ispitan u okviru sustavne studije toksi čnosti u trajanju 
od najmanje 90 dana, nije ga nužno ponavljati u ovom istraživanju 
koje se provodi na dvije generacije. Me đutim, preporu ča se uzorke ili 
digitalne zapise sperme generacije P pohraniti radi eventualne kasnije analize.
 
1.5.5.  Potomstvo  
Svako leglo treba pregledati što je prije mogu će nakon okota (nulti 
dan laktacije) i utvrditi broj i spol mladunaca, broj mrtvoro đenih, 
broj živoro đenih, prisutnost velikih anomalija. Mladunce koji su 
nultog dana na đeni mrtvi, ako nisu macerirani, svakako bi trebalo 
pregledati s obzirom na postojanje nepravilnosti i uzrok smrti, te 
konzervirati. Živu mladun čad treba prebrojiti i pojedina čno izvagati 
kod okota (nulti dan laktacije) ili na dan 1., a zatim redovito na dane vaganja, npr. 4., 7., 14. i 21. dan laktacije. Fizi čke anomalije ili 
anomalije u ponašanju opažene kod ženki ili potomaka treba zabi ­
lježiti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 518
 
Fizički razvoj potomaka treba bilježiti uglavnom kroz dobivanje 
tjelesne mase. Drugi fizi čki parametri (npr. otvaranje ušiju i o čiju, 
izbijanje zuba, rast kose) mogu dati dodatne informacije, ali njih je poželjno vrednovati u kontekstu podataka o spolnom sazrijevanju (npr. dob i tjelesna masa kod otvaranja vagine ili razdvajanja prepu ­
cija na glavici penisa) (13). Ako takva istraživanja nisu obuhva ćena 
posebnim studijama, preporu čaju se funkcionalna istraživanja (npr. 
motorna aktivnost, osjetilne funkcije, ontogeneza refleksa) potomaka generacije F1 prije i/ili nakon odbijanja od sise, posebno istraživanja 
koja se odnose na spolno sazrijevanje. Za generaciju F1 upravo 
odbijenu od sise koja je odabrana za parenje treba utvrditi dob u kojoj je došlo do otvaranja vagine ili razdvajanja prepucija. Ako je utvrđeno da je u generaciji F1 došlo do izmjene u omjeru mužjaka i 
ženki ili dobi spolne zrelosti, u postnatalnom danu 0 kod mladunaca 
generacije F2 treba izmjeriti anogenitalni razmak.
 
Funkcionalna opažanja nisu neophodna u skupinama koje ina če 
pokazuju jasne znakove štetnih u činaka (npr. znatno smanjenje 
porasta tjelesne mase itd.). Ako se uop će provode, funkcionalna 
istraživanja ne treba provoditi na mladuncima odabranim za parenje.  
1.5.6.  Makroskopska nekropsija  
Na završetku studije ili u slu čaju smrti tijekom studije sve roditeljske 
životinje (P i F1), sve mladunce s vanjskim anomalijama ili klini ­ 
čkim znakovima, kao i nasumice odabrane mladunce/spol/leglo iz 
generacija F1 i F2 treba makroskopski pregledati s obzirom na struk ­
turne anomalije ili patološke promjene. Posebnu pozornost treba 
obratiti na organe reproduktivnog sustava. Mladunce koji su humano usmr ćeni, na samrti ili mrtvi, ako nisu macerirani, treba 
pregledati s obzirom na mogu će patološke promjene i/ili uzrok 
smrti, i konzervirati.
 
Treba pregledati uteruse svih prvorotki, na na čin koji ne će dovesti u 
pitanje histološku analizu, kako bi se utvrdilo ima li i koliki je broj 
mjesta za implantaciju embrija.  
1.5.7.  Mase organa  
Na kraju istraživanja odre đuje se tjelesna masa i masa sljede ćih 
organa roditeljskih životinja generacija P i F1 (organe u paru treba 
vagati pojedina čno): 
— uterus, ovariji,  
— testisi, epididimisi (ukupno i kaudalni),  
— prostata,  
— sjemene vezikule s prednjim režnjem prostate i njihovim fluidima 
i prostatom (kao jedna cjelina),  
— mozak, jetra, bubrezi, slezena, hipofiza, tiroidna žlijezda, nadbu ­
brežna žlijezda i poznati ciljni organi.  
Kod mladunaca generacije F1 i F2 koji su odabrani za nekropsiju 
treba odrediti tjelesne mase kod usmr ćenja. Treba izvagati sljede će 
organe nasumice izabranog mladunca/spola/legla (vidjeti odjeljak 
1.5.6.): mozak, slezena i timus.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 519
 
Kad je to izvedivo, rezultate makroskopske nekropsije i vaganja 
organa treba procijeniti u svjetlu opažanja dobivenih u drugim 
studijama.  
1.5.8.  Histopatologija  
1.5.8.1.  Roditeljske životinje  
Sljedeće organe i tkiva roditeljskih životinja (generacije P i F1), ili 
njihove reprezentativne uzorke, treba fiksirati i pohraniti u odgova ­
rajućem mediju za histopatološki pregled.  
— vagina, uterus s cerviksom, i ovariji (konzervirani u odgovara ­
jućem sredstvu),  
— jedan testis (konzerviran u Bouinovom ili sli čnom fiksativu), 
jedan epididimis, sjemene vezikule, prostata, i prednji režanj 
prostate,  
— ranije identificirani ciljni organ(i) životinja generacija P i F1 
odabranih za parenje.  
Gore navedene konzervirane organe i tkiva treba potpuno histopato ­
loški obraditi kod svih životinja generacija P i F1 koje su odabrane za parenje iz skupine izložene visokim dozama i kontrolne skupine. Pregled jajnika roditeljskih životinja P nije obvezan. Organe kod 
kojih se uo čavaju promjene uzrokovane tretiranjem treba pregledati 
i kod skupina koje su primale male ili srednje doze, a kod kojih se sumnja na smanjenu plodnost, npr. kod životinja koje se nisu parile, nisu začele, proizvele ni porodile zdravo potomstvo, ili kod kojih je 
bilo utjecaja na javljanje ciklusa estrusa ili broj, pokretljivost ili 
morfologiju spermatozoida, treba histopatološki obraditi. Obvezno treba ispitati sve makro lezije kao što su atropija ili tumori.
 
Treba obaviti detaljni histopatološki pregled testisa (npr. upotrebom 
Bouinovog fiksativa, uklapanjem u parafin i popre čnim rezovima 
debljine 4–5 μm) kako bi se utvrdili u činci vezani uz tretiranje, 
primjerice zadržani spermatidi, nepostojanje odre đenih slojeva ili 
tipova zametnih stanica, divovske stanice s više jezgri ili odbacivanje 
spermatogenih stanica u lumen (14). Pregledom intaktnog epididi ­
misa treba obuhvatiti glavu, tijelo i rep, što se može posti ći analizom 
uzdužnog presjeka. Epididimis treba pregledati s obzirom na infil ­
traciju leukocita, promjenu prevladavaju ćih tipova stanica, atipi čne 
tipove stanica i fagocitozu spermatozoida. Za pregled muških repro ­
duktivnih organa može se koristiti bojenje Periodic Acid–Schiff (PAS) metodom ili bojenje hematoksilinom.
 
Nakon razdoblja laktacije jajnik bi trebao sadržavati primordijalne 
folikule i folikule u rastu kao i velika žuta tijela iz laktacije. Histo ­
patološkim pregledom treba otkriti kvalitativno pražnjenje populacije primordijalnih folikula. Kvantitativnu procjenu primordijalnih foli ­
kula treba provesti za ženke generacije F1; broj životinja, odabir 
presjeka jajnika i veli čina presjeka koji se koristi kao uzorak 
trebaju statisti čki odgovarati postupku procjene koji se koristi. Radi 
usporedbe tretiranih i kontrolnih jajnika, pregled treba obuhvatiti 
brojanje primordijalnih folikula, kombinirano s malim folikulima u 
rastu (15)(16)(17 (18)(19).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 520
 
1.5.8.2.  Životinje upravo odbijene od sise  
Kod svih mladunaca s vanjskim anomalijama ili klini čkim znako ­
vima, kao i od nasumice odabranog mladunca/spola/legla iz obje generacije F1 i F2, koji nisu bili odabrani za parenje, treba fiksirati 
tkivo i ciljne organe s makro anomalijama i pohraniti u odgovaraju ći 
medij za histopatološki pregled. Potpunu histopatološku karakteriza ­
ciju konzerviranog tkiva treba obaviti s posebnim naglaskom na organe reproduktivnog sustava.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
U izvješću treba navesti pojedina čne podatke, sažete u obliku tablice, 
o broju životinja na po četku ispitivanja, broju životinja koje su 
uginule tijekom ispitivanja ili su usmr ćene iz humanih razloga, 
vrijeme smrti ili humanog usmr ćenja, broj plodnih životinja, broj 
skotnih ženki, broj životinja koje pokazuju znakove toksi čnosti, 
opis opaženih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme prve pojave, 
trajanje i ozbiljnost toksi čkih učinaka, vrste opažanja generacija rodi ­
telja i potomaka, vrste histopatoloških promjena i sve relevantne 
podatke o leglu, za svaku ispitnu skupinu i svaku generaciju.  
Numeričke rezultate treba procijeniti primjerenom, op će prihvaćenom 
statističkom metodom; odabir statisti čke metode obavlja se u okviru 
planiranja studije i njegovu opravdanost treba dokazati. Za analizi ­
ranje podataka mogu biti korisni statisti čki modeli doza–reakcija. 
Izvješće treba sadržavati dovoljno informacija o analiti čkoj metodi 
i računalnom programu koji je korišten, kako bi neovisni revizor/ 
statističar mogao procijeniti i rekonstruirati analizu.  
2.2. VREDNOVANJE REZULTATA  
Nalaze studije reproduktivne toksi čnosti na dvije generacije treba 
vrednovati s obzirom na opažene u činke uklju čujući nekropsiju i 
mikroskopske nalaze. Vrednovanje treba obuhvatiti postojanje ili 
izostanak odnosa izme đu doze ispitivane tvari i prisutnosti ili 
izostanka, u čestalosti ili ozbiljnosti anomalija, uklju čujući makro 
lezije, identificirane ciljne organe, promjene u pogledu plodnosti, 
kliničke anomalije, promjene sposobnosti reprodukcije i legla, 
promjene tjelesne mase, u činke na smrtnost i sve ostale toksi čke 
učinke. Kod vrednovanja rezultata ispitivanja treba uzeti u obzir 
fizikalno–kemijska svojstva ispitivane tvari i, ako su dostupni, toksi ­
kokinetičke podatke.  
Pravilno provedeno ispitivanje reproduktivne toksi čnosti treba osigu ­
rati zadovoljavaju ću procjenu visine doze bez štetnog djelovanja i 
razumijevanje štetnih u činaka na reprodukciju, parturiciju, laktaciju, 
postnatalni razvoj uklju čujući rast i spolni razvoj.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 521
 
2.3. TUMA ČENJE REZULTATA  
Studija reproduktivne toksi čnosti na dvije generacije dat će informa ­
cije o učincima ponavljanog izlaganja nekoj tvari tijekom svih faza 
reproduktivnog ciklusa. Studija će dati informacije posebno o repro ­
duktivnim parametrima, i o razvoju, rastu, sazrijevanju i preživlja ­
vanju potomaka. Rezultate studije treba tuma čiti u vezi s nalazima 
subkroničnih studija, studija o prenatalnom razvoju, toksikokineti ­ 
čkim i drugim dostupnim studijama. Rezultati ove studije mogu se 
iskoristiti za procjenu potrebe daljnjeg ispitivanja kemikalije. Ekstra ­
polacija rezultata ove studije na čovjeka vrijedi u ograni čenoj mjeri. 
Najbolje ih je iskoristiti kao informacije o visinama bez štetnih 
učinaka i dozvoljenom izlaganju ljudi (20)(21)(22)(23).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati slijede će 
informacije:  
ispitivana tvar:  
— fizikalna priroda i, ako je relevantno, fizikalno–kemijska 
svojstva,  
— podaci o identifikaciji,  
— čistoća. 
Nosač (ako je primjereno):  
— opravdanost izbora nosa ča, za sve nosa če osim vode.  
Ispitne životinje:  
— vrsta/soj koji je upotrijebljen,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, materijal za izradu gnijezda 
itd. 
— pojedina čne mase životinja na po četku istraživanja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podloge za odabir visine doze,  
— pojedinosti o sastavu ispitivane tvari/pripremi hrane, postignutim 
koncentracijama,  
— stabilnost i homogenost pripravka,  
— pojedinosti o davanju ispitivane tvari,  
— preračunavanje koncentracije (ppm) ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće u postignutu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), ako je 
primjenljivo,  
— podaci o kvaliteti hrane i vode.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 522
 
Rezultati:  
— potrošnja hrane i, ako je dostupno, potrošnja vode, stupanj isko ­
rištenja hrane (porast tjelesne mase po gramu utrošene hrane) i 
utrošak ispitnog materijala za životinje generacije P i F1, osim u 
razdoblju kohabitacije i minimalno zadnju tre ćinu razdoblja 
laktacije,  
— podaci o apsorpciji (ako su dostupni),  
— podaci o tjelesnoj masi za životinje generacije P i F1 koje su bile 
odabrane za parenje,  
— podaci o masi mladunaca i legla,  
— tjelesna masa u trenutku usmr ćenja i podaci o apsolutnoj i rela ­
tivnoj masi organa za roditeljske životinje,  
— karakter, ozbiljnost i trajanje klini čkih opažanja (jesu li reverzi ­
bilna ili ne),  
— vrijeme smrti tijekom studije ili preživljavanje životinja do zavr ­ 
šetka studije,  
— podaci o toksi čkoj reakciji po spolu i dozi, uklju čujući pokaza­
telje o parenju, plodnosti, gestaciji, ro đenju, preživljavanju i 
laktaciji; u izvješ će treba navesti brojeve koji su poslužili za 
izračun tih pokazatelja,  
— toksički ili drugi u činci na reprodukciju, potomstvo, rast nakon 
rođenja itd.,  
— nalazi nekropsije,  
— iscrpan opis svih histoloških nalaza,  
— broj ženki generacija P i F1 koje su imale normalne cikluse, i 
dužina ciklusa,  
— ukupan broj spermatozoida iz kaudalnog epididimisa, postotak 
progresivno pokretljivih spermatozoida, postotak morfološki 
normalnih spermatozoida, i postotak spermatozoida po svakoj identificiranoj anomaliji,
 
— vrijeme koje je proteklo do parenja, izraženo u danima,  
— duljina gestacije,  
— broj implantacija, žutih tijela, veli čina legla,  
— broj živoro đenih i gubitaka nakon implantacija,  
— broj mladunaca s jako izraženim anomalijama; treba navesti broj 
patuljaka, ako je utvr đen, 
— podaci o fizi čkim posebnostima potomaka i drugi postnatalni 
podaci, s tim da za ocijenjene fizi čke posebnosti treba navesti 
razloge,  
— podaci o funkcionalnim opažanjima kod mladunaca i odraslih 
životinja, ako je primjenljivo,  
— prema potrebi, statisti čka obrada rezultata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 523
 
Rasprava o rezultatima  
Zaključci, uključujući vrijednosti kod kojih nisu zamije ćeni štetni 
učinci (NOAEL) na roditelje i potomstvo.  
4. REFERENCE  
(1) Sadleir, R.M.F.S., (1979) Cycles and Seasons, In:  Reproduc ­
tion in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilisation, C.R. Auston 
and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al., (1989) A Dose-Response Analysis of 
Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Develop ­
ment and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxi ­
cology , 12, str. 92-108.  
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54:103-107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991) The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology , 5, str. 39-44.  
(5) Seed, J. et al., (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report.  Reproductive Toxicology , 10(3), str. 237-244.
 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992) Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology , 6, str. 267-273  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992) Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology , 13, str. 409-421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991) Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology , 5, str. 449- 
458. 
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993) Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using 
the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy, Part A., Academic, Orlando, Florida, str. 319-333.  
(10) Toth, G.P. et al., (1989) The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admini ­
stration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal 
of Andrology, 10, str. 401-415.  
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987) Computerised Videomi ­
crographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy, 8, str. 330-337.  
(12) Linder, R.E. et al., (1992) Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology, 6, str. 491-505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977) Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction, 17, str. 298-303.  
(14) Russell, L.D. et al., (1990) Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993) Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
 
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, str. 421-426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989) Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al., (1991) Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology, 5, str. 379-383.  
(19) Heindel, J.J., (1999) Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. 
and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(20) Thomas, J. A., (1991) Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull’s Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989) Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles 
and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K., (1981) In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K., (1978) In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 525
 
B.36.  TOKSIKOKINETIKA  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 
417 (2010.). Studije kojima se istražuje toksikokinetika (TK) ispitivane kemikalije provode se radi prikupljanja odgovaraju ćih informacija o njezinoj 
apsorpciji, distribuciji, biotransformaciji (tj. metabolizmu) i izlu čivanju te 
radi pomo ći u povezivanju koncentracije ili doze s opaženom toksi čnošću 
te radi pomo ći pri razumijevanju mehanizma njezine toksi čnosti. TK može 
pomoći pri razumijevanju studija toksi čnosti na na čin da se pokaže da se 
pokusne životinje sustavno izlažu ispitivanoj kemikaliji te otkrivanjem 
cirkuliraju ćih dijelova (po četna kemikalija/metaboliti). Osnovni parametri 
TK određeni tim studijama tako đer će pružiti informacije o potencijalu za 
akumulaciju ispitivane kemikalije u tkivima i/ili organima te potencijal indu ­
ciranja biotransformacije kao rezultat izlaganja ispitivanoj kemikaliji.
 
2. Podaci o TK mogu pridonijeti odre đivanju prikladnosti i relevantnosti poda ­
taka o toksi čnosti za životinje radi ekstrapolacije rizika po ljude i/ili 
procjenu rizika. Osim toga, studije toksi čnosti mogu pružiti korisne infor ­
macije za odre đivanje visina doze za studije toksi čnosti (linearna i neli ­
nearna kinetika), u činaka načina primjene, bioraspoloživosti te probleme 
povezane s planiranjem studija. Odre đeni tipovi TK podataka mogu se 
upotrijebiti u razvoja modela fiziološki utemeljene toksikokinetike (PBTK).  
3. Postoje važne primjene za podatke o metabolitu/TK poput sugeriranja 
mogućih toksičnosti i na čina djelovanja te njihova odnosa s visinom doze 
i načinom izlaganja. Povrh toga, podaci o metabolizmu mogu pružiti korisne 
informacije za odre đivanje toksikološkog zna čaja izlaganja za egzogeno 
proizvedene metabolite ispitivane kemikalije.  
4. Odgovaraju ći toksikokineti čki podaci pomo ći će u podršci daljnje prihva ­
tljivosti i primjenjivosti kvantitativnih odnosa strukture i aktivnosti, pristu ­
pima analognog predvi đanja (read-across) i grupiranja u procjeni sigurnosti 
kemikalija. Podaci o kinetici tako đer se mogu upotrijebiti za vrednovanje 
toksikološke relevantnosti drugih studija (npr.  in vivo /in vitro ). 
5. Osim ako nije spomenut drugi na čin primjene (vidjeti posebno stavke 74. - 
78.), ova ispitna metoda može se primijeniti na oralnu primjenu ispitivane kemikalije.
 
UVODNA RAZMATRANJA  
6. Regulatorni sustavi imaju druk čije zahtjeve i potrebe u svezi s mjerenjem 
konačnih učinaka i parametara povezanih s toksikokinetikom za razli čite 
razrede kemikalija (npr. pesticida, biocida, industrijskih kemikalija). Za 
razliku od ve ćine ispitnih metoda, ove ispitna metoda opisuje ispitivanje 
toksikokinetike koje uklju čuje višestruka mjerenja i kona čne učinke. U 
budućnosti će se možda razviti nekoliko novih ispitnih metoda i/ili smjer ­
nica za poseban i detaljniji opis svakog kona čnog učinka. U slu čaju ove 
ispitne metode zahtjevi i/ili potrebe svakog regulatornog sustava odre đuju 
koja će se ispitivanja ili odre đivanja provoditi.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 526
 
7. Postoje brojne studije koje se mogu provesti za vrednovanje TK ponašanja 
ispitivane kemikalije u regulatorne svrhe. Me đutim, ovisno o specifi čnim 
regulatornim potrebama ili situacijama, za vrednovanje ispitivane kemikalije nisu potrebne sve od tih mogu ćih studija. U planiranju studija toksikoki ­
netičnosti potrebna je fleksibilnost, uzimaju ći u obzir svojstva ispitivane 
kemikalije. U nekim je slu čajevima mogu će istraživati samo odre đeni 
komplet pitanja kako bi se odredila opasnost povezana s ispitivanom kemi ­
kalijom i udjelom rizika. U nekim se slu čajevima TK podaci mogu priku ­
pljati kao dio vrednovanja u drugim toksikološkim studijama. Za druge pak 
situacije mogu biti potrebna dodatne i/ili opsežnije studije TK-a, ovisno o 
regulatornim potrebama i/ili u slu čaju pojavljivanja novih pitanja kao dijela 
vrednovanja ispitivane kemikalije.
 
8. Laboratorij koji provodi ispitivanje u obzir mora uzeti sve raspoložive infor ­
macije o ispitivanoj kemikaliji i relevantnim metabolitima i analognim 
tvarima prije provo đenja studije kako bi pove ćao kvalitetu studije i na 
minimum sveo primjenu životinja. To može obuhva ćati podatke iz drugih 
relevantnih ispitnih metoda (studije  in vivo , studije  in vitro  i/ili vrednovanja  
in silico ). Fizikalno-kemijska svojstva, kao što su koeficijent razdjeljenja 
oktanol-voda (izražen kao log P  OW ), pKa, topljivost u vodi, tlak pare i 
molekularna masa kemikalije mogu biti korisna za planiranje studije i tuma ­ 
čenje rezultata. Ona se mogu odrediti primjenom odgovaraju ćih metoda, kao 
što je opisano u relevantnoj ispitnoj metodi.  
OGRANI ČENJA  
9. Ova ispitna metoda nije osmišljena kao odgovor na posebne okolnosti, kao 
što su gravidne životinje ili životinje tijekom laktacije i mladun čad, ni za 
vrednovanje potencijalnih ostataka u izloženih životinja koje proizvode 
hranu. Me đutim, podaci dobiveni iz studije B.36 mogu pružiti pozadinske 
informacije za vo đenje pri planiranju specifi čnih studija za takva istraživa ­
nja. Ova ispitna metoda nije namijenjena testiranju nanomaterijala. Izvješ će 
o preliminarnoj reviziji OECD-ovih smjernica za ispitivanje za njihovu 
primjenjivost na nanomaterijale pokazuje da se TG 417 (ekvivalentna ovoj 
ispitnoj metodi B.36) ne može primijeniti na nanomaterijale (1).  
DEFINICIJE  
10. Definicije upotrijebljene u svrhu ove ispitne metode navedene su u Dodatku.  
RAZMATRANJA O DOBROBITI ŽIVOTINJA  
11. Upute o humanom postupanju sa životinjama dostupne su u OECD-ovoj 
Smjernici (GD) 19 (2). Preporu čuje se konzultiranje s OECD-ovom Smjer ­
nicom 19. za sve studije  in vivo  i in vitro  opisane u ovoj ispitnoj metodi.  
OPIS METODA  
Pilotske studije  
12. Primjena pilotskih studija preporu čuje se i poti če za odabir pokusnih para ­
metara za studije toksikokinetike (npr. metabolizam, bilanca mase, analiti čki 
postupci, pronalaženje doza, izdisanje CO  2 itd.). Za karakterizaciju nekih od 
tih parametara nije potrebna primjena radioaktivno ozna čenih kemikalija.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 527
 
Odabir životinja  
Vrste  
13. Vrste (i sojevi) životinja upotrijebljenih za ispitivanje TK po mogu ćnosti 
trebaju biti jednaki kao i životinja upotrijebljenih u drugim toksikološkim studijama provedenima s predmetnom ispitivanom kemikalijom. Obi čno se 
treba primijeniti štakor, kao što je raširen obi čaj u toksikološkim studijama. 
Primjena drugih ili dodatnih vrsta može biti opravdana ako studije kriti čne 
toksičnosti dadnu dokaze o zna čajnoj toksi čnosti u tih vrsta ili ako se 
pokaže da je njihova toksi čnost/toksikokinetika relevantnija za ljude. 
Treba pružiti obrazloženje za odabir vrsta i sojeva životinja.
 
14. Osim ako nije druk čije navedeno, ova ispitna metoda odnosi se na štakore 
kao pokusnu vrstu. Odre đeni aspekti ove metode mogu se promijeniti za 
primjenu drugih pokusnih vrsta.  
Starost i soj  
15. Treba upotrebljavati mlade, zdrave, odrasle jedinke (obi čno u dobi od 6 - 12 
tjedana u vrijeme doziranja) (vidjeti još i stavke 13. i 14.). Treba pružiti obrazloženje za primjenu životinja koje nisu mlade odrasle jedinke. Sve životinje moraju biti sli čne dobi na po četku studije. Varijacije u masi poje ­
dinih životinja ne smiju biti ve će od ± 20 % prosje čne mase ispitne skupine. 
U idealnom slu čaju treba upotrijebiti isti soj koji se upotrijebio i za dobi ­
vanje toksikološke baze podataka za ispitivanu kemikaliju.
 
Broj i spol životinja  
16. Za svaku ispitnu dozu treba upotrijebiti najmanje četiri životinje istog spola. 
Treba pružiti obrazloženje za spol upotrijebljenih životinja. Primjenu obaju 
spolova ( četiri mužjaka i četiri ženke) treba uzeti u obzir ako postoji dokaz 
o značajnim razlikama u toksi čnosti povezanima sa spolom.  
Uvjeti smještaja i hranjenja  
17. Tijekom razdoblja ispitivanja životinje na čelno treba smjestiti pojedina čno. 
Skupni smještaj može biti opravdan u posebnim uvjetima. Rasvjeta mora 
biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati tame. Temperatura prostorije za ispitivanje životinje mora iznositi 22 °C (± 3 °C), a relativna vlažnost zraka 30 - 70 %. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna labo ­
ratorijska prehrana uz neograni čene količine pitke vode.
 
Ispitivana kemikalija  
18. Ispitivana kemikalija koja je radioaktivno obilježena pomo ću 14 C treba se 
primijeniti za sve aspekte studije u svezi s bilancom mase i identifikacijom metabolita, me đutim može se pokazati:
 
— da se bilanca mase i identifikacija metabolita može prikladno vrednovati 
primjenom neobilježene ispitivane kemikalije,  
— da je analiti čka specifi čnost i osjetljivost metode upotrijebljene s nera ­
dioaktivnom ispitivanom kemikalijom jednaka ili ve ća od one koja se 
može posti ći s radioaktivno obilježenom ispitivanom kemikalijom,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 528
 
da se tada ne mora upotrijebiti radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija. 
Nadalje, mogu se upotrijebiti i drugi radioaktivni i stabilni izotopi, posebno 
ako je element odgovoran za toksi čni segment ispitivane kemikalije ili je dio 
tog toksičnog segmenta. Ako je mogu će, radioaktivnu oznaku treba locirati 
u središnjem dijelu molekule koja je metaboli čki stabilna (ne može se 
zamijeniti, ne uklanja se metaboli čki kao CO  2 i ne postaje dio monokar ­
bonske zalihe organizma). Ozna čavanje više mjesta ili specifi čnih regija 
molekule može biti potrebno radi pra ćenja metaboli čke sudbine ispitivane 
kemikalije.  
19. Radioaktivno obilježene i radioaktivno neobilježene ispitivane kemikalije 
treba analizirati primjenom odgovaraju ćih metoda radi utvr đivanja čistoće 
i identiteta. Radioaktivna čistoća radioaktivne ispitivane kemikalije mora biti 
najveća koja se može posti ći za određenu ispitivanu kemikaliju (u idealnom 
slučaju mora biti ve ća od 95 %) i treba uložiti razuman napor za identifi ­
kaciju nečistoća prisutnih na 2 % ili više. Treba podnijeti izvješ će o čistoći, 
identitetu i udjelu identificiranih ne čistoća. Individualni regulatorni programi 
mogu odabrati pružanje dodatnih uputa za podršku pri definiranju i speci ­
fikacijama ispitivanih kemikalija složenih od smjesa i metoda za odre đivanje 
čistoće. 
Odabir doza  
Pilotska studija  
20. Za pilotsku je studiju obi čno dovoljna jedna oralna doza. Doza mora biti 
netoksična, ali dovoljno visoka kako bi omogu ćila identifikaciju metabolita 
u izlučevinama (i plazmi ako je potrebno) te kako bi ispunila odre đeni cilj 
pilotske studije, kao što je navedeno u stavku 12. ove ispitne metode.  
Glavne studije  
21. Za glavne studije prednost se daje najmanje dvjema dozama jer informacije 
prikupljene od najmanje dviju skupina koje primaju dozu mogu pomo ći pri 
određivanju doza u drugim studijama toksi čnosti te pomo ći pri odre đivanju 
reakcije na dozu u ve ć dostupnim ispitivanjima toksi čnosti.  
22. Ako se daju dvije doze, obje moraju biti dovoljno visoke kako bi omogu ćile 
identifikaciju metabolita u izlu čevinama (i plazmi ako je potrebno). Za 
odabir doza u obzir treba uzeti informacije iz dostupnih podataka o toksi č­
nosti. Ako te informacije nisu dostupne (npr. iz studija akutne oralne toksi č­
nosti koje bilježe klini čke znakove toksi čnosti ili iz studija toksi čnosti uz 
primjenu ponovljenih doza), u obzir se mogu uzeti vrijednost za višu dozu koja je manja od procijenjenog LD
 50 (oralni i dermalni na čin primjene) ili 
LC 50 (primjena inhalacijom) ili manja od niže vrijednosti procijenjenog 
raspona akutne toksi čnosti. Niža doza mora biti razlomak više doze.  
23. Ako se ispituje samo jedna visina doze, u idealnom slu čaju doza mora biti 
dovoljno visoka kako bi omogu ćila identifikaciju metabolita u izlu čevinama 
(i plazmi ako je potrebno), a da ne izaziva o čitu toksičnost. Treba pružiti 
argumente za neuklju čivanje druge visine doze.  
24. Ako treba ustanoviti u činak doze na kineti čke procese, dvije doze ne će biti 
dovoljne, a barem jedna doza mora biti dovoljno visoka kako bi došlo do zasićenja tih procesa. Ako podru čje ispod krivulje koncentracije plazme u 
ovisnosti o vremenu (AUC) nije linearno izme đu dviju visina doza kori ­ 
štenih u glavnoj studiji, to snažno upu ćuje na to da se zasi ćenje jednog ili 
više kineti čkih procesa odvija negdje izme đu dviju visina doza.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 529
 
25. Za ispitivane kemikalije niske toksi čnosti treba upotrijebiti maksimalnu dozu 
od 1 000 mg/kg tjelesne mase (oralna i dermalna primjena) (ako se daje 
inhalacijom, upute potražite u Poglavlju B.2 ovog Priloga, ta doza obi čno ne 
prelazi 2 mg/l). Za razmatranja o specifi čnostima kemikalije nije potrebna 
viša doza, ovisno o regulatornim potrebama. Uvijek treba obrazložiti odabir 
doze.  
26. Podaci o toksikokinetici jedne doze i podaci o distribuciji u tkivu mogu biti 
prikladni za odre đivanje potencijala za akumulaciju i/ili postojanost. No, u 
nekim je slu čajevima potrebna primjena ponovljene doze i) kako bi se 
cjelovitije pristupilo potencijalu akumulacije i/ili postojanosti promjena u 
TK (npr. indukcija i inhibicija enzima) ili ii) kao što zahtijeva primjenjivi regulatorni sustav. U studijama koje uklju čuju ponovljenu primjenu doza, 
dok je obi čno dovoljna ponovljena primjena niske doze, u odre đenim uvje ­
tima može tako đer biti potrebna ponovljena primjena visoke doze (vidjeti 
još i stavak 57.).
 
Primjena ispitivane kemikalije  
27. Ispitivanu kemikaliju treba otopiti ili homogeno suspendirati u istom nosa ču 
koji se koristio i za druge studije provedene primjenom oralnom sondom s istom ispitivanom kemikalijom ako su dostupne informacije o tom nosa ču. 
Treba navesti argumentaciju za odabir nosa ča. Pri planiranju studije treba 
razmotriti odabir nosa ča i količinu doziranja. Uobi čajena metoda primjene 
jest primjena sondom, no, u specifi čnim situacijama može biti korisna 
primjena preko želatinozne kapsule ili kao primjesa hrani (u oba slu čaja 
treba pružiti obrazloženje). Treba pružiti dokaz o stvarnoj dozi primijenjenoj 
na svakoj životinji.
 
28. Maksimalna koli čina tekućine koja se primjenjuje oralnom sondom odje ­
danput ovisi o veli čini pokusne životinje, tipu nosa ča za doziranje te o 
tome je li hranjenje obustavljeno prije primjene ispitivane kemikalije ili 
nije. Treba navesti argumentaciju za davanje ili uskra ćivanje hrane prije 
doziranja. Koli činu obično treba održavati što je mogu će manjom za 
nosače s vodenom otopinom ili nosa če bez vodene otopine. Koli čina doze 
obično ne bi smjela biti ve ća od 10 ml/kg tjelesne mase za glodavce. 
Količine nosača korištenih za više lipofilnih ispitivanih kemikalija mogu 
početi od 4 ml/kg tjelesne mase. Za ponovljenu primjenu doza, u slu čaju 
da je kontraindiciran svakodnevni post, u obzir treba uzeti manje koli čine 
doza (npr. 2 - 4 ml/kg tjelesne mase). Ako je mogu će, u obzir treba uzeti 
primjenu koli čine doze uskla đene s dozom primijenjenoj u drugim studijama 
primjene ispitivane kemikalije pomo ću oralne sonde.  
29. Za odre đivanje bioraspoloživosti ili relativne oralne apsorpcije može se 
upotrijebiti intravenozna (IV) primjena ispitivane kemikalije i mjerenje ispi ­
tivane kemikalije u krvi i/ili izlu čevinama. Za IV studije jedna doza (obi čno 
ekvivalentna nižoj oralnoj dozi, ali da nije ve ća od nje - vidjeti odabir doza) 
ispitivane kemikalije daje se uz primjenu odgovaraju ćeg nosača. Taj mate ­
rijal treba primjenjivati u prikladnoj koli čini (npr. 1 ml/kg tjelesne mase) na 
odabrano mjesto primjene najmanje četirima životinjama odgovaraju ćeg 
spola (ako je opravdano, mogu se upotrebljavati oba spola, vidjeti stavak 16.). Za IV primjenu ispitivane kemikalije potreban je posve rastopljen ili 
otopljen pripravak doze. Nosa č za IV primjenu ne smije negativno utjecati 
na integritet krvi ili protok krvi. Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 530
 
preko infuzije, brzinu infuzije treba zabilježiti i standardizirati me đu životi­
njama te se pobrinuti da se upotrebljava infuzijska pumpa. Ako se kanila 
uvodi u jugularnu venu (radi primjene ispitivane kemikalije i/ili prikupljanje krvi) ili ako se za primjenu koristi femoralna arterija, treba primijeniti anesteziju. Dovoljnu pozornost treba obratiti na tip anestezije jer isti može 
utjecati na toksikokinetiku. Životinjama se prije primjene ispitivane kemi ­
kalije s nosa čem mora omogu ćiti odgovaraju ći oporavak.
 
30. Drugi na čini primjene, kao što je dermalni na čin i inhalacija (vidjeti stavke 
74. - 78.), mogu se primjenjivati za odre đene ispitivane kemikalije uzimaju ći 
u obzir njihova fizikalno-kemijska svojstva i o čekivanu ljudsku uporabu ili 
izlaganje.  
Mjerenja  
Bilanca mase  
31. Bilanca mase odre đena je zbrojem postotka primijenjene (radioaktivne) doze 
izlučene u urinu, izmetu i izdahnutom zraku i postotka prisutnog u tkivima, 
ostacima trupla te ispirku kaveza (vidjeti stavak 46.). Op ćenito se ukupan 
oporavak od primijenjene ispitivane kemikalije (radioaktivnost) smatra 
prikladnim ako je > 90 %.  
Apsorpcija  
32. Početna procjena apsorpcije može se posti ći isključivanjem postotka doze u 
gastrointestinalnom (GI) traktu i/ili izmetu iz odre đivanja bilance mase. Za 
izračun postotka apsorpcije vidjeti stavak 33. Za ispitivanje izlu čevina 
vidjeti stavke 44. - 49. Ako se to čna mjera apsorpcije uz primjenu 
oralnog doziranja ne može odrediti iz studija bilance mase (npr. ako je u 
izmetu prisutno više od 20 % primijenjene doze), mogu biti potrebna daljnja istraživanja. Te studije mogu kompromitirati 1) oralnu primjenu ispitivane kemikalije i mjerenje ispitivane kemikalije u žu či ili 2) oralnu i IV primjenu 
ispitivane kemikalije i mjerenje neto ispitivane kemikalije prisutne u 
mokraći plus truplu za svaki od dvaju na čina primjene. U oba plana 
studije mjerenje radioaktivnosti provodi se kao surogatna metoda za speci ­
fičnu kemijsku analizu ispitivane kemikalije i metabolita.
 
33. Ako se provodi studija žu čnih izlučevina, obi čno se koristi oralni na čin 
primjene. U tom slu čaju u žučne kanale najmanje četiriju životinja odgova ­
rajućeg spola (ili obaju spolova ako je opravdano) treba uvesti kanilu i 
primijeniti jednu dozu ispitivane kemikalije. Sljede ća primjena ispitivane 
kemikalije, izlu čivanja radioaktivnosti/ispitivane kemikalije u žu či treba 
nadzirati dokle god je potrebno kako bi se procijenio postotak primijenjene doze koja se izlu čuje tim putem, što se može upotrijebiti za izravan izra čun 
opsega oralne apsorpcije na sljede ći način:
 
postotak apsorpcije  ¼ ðkoličina u žuči þ mokraći þ izdahnutom zraku þ 
truplu bez sadržaja u GI traktu Þ=primijenjena koli čina Ü 100 
34. S nekim razredima ispitivane kemikalije može se dogoditi izravna sekrecija 
apsorbirane doze preko crijevnih membrana. U tim se slu čajevima mjerenje 
postotka doze u izmetu nakon oralne primjene u glodavaca s kanilom u žučnom kanalu ne smatra reprezentativnim za neapsorbiranu dozu. Preporu ­ 
čuje se da se u slu čaju sumnje na crijevnu sekreciju postotak apsorbirane 
doze temelji na apsorpciji izra čunatoj iz usporedbe izlu čevina nakon oralne i 
IV primjene (netretirani štakori ili štakori s kanilom u žu čnom kanalu) 
(vidjeti stavak 35.). Tako đer se preporu čuje da se u slu čaju da se kvantifi ­
kacija crijevne sekrecije smatra potrebnom, izlu čivanje kod štakora s 
kanilom u žu čnom kanalu izmjeri nakon IV primjene doze.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 531
 
Bioraspoloživost  
35. Bioraspoloživost se može odrediti iz kinetike plazme/krvi oralnih i IV 
skupina kao što je opisano u stavcima 50. - 52., specifi čnom kemijskom 
analizom ispitivane kemikalije i/ili relevantnog/ih metabolita tako da nije 
potrebna radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija. 
Bioraspoloživost (F) ispitivane kemikalije ili relevantnog/ih metabolita može se izra čunati na sljede ći način:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðdoza  IV=doza  exp Þ 
gdje je AUC podru čje ispod krivulje koncentracije plazme u ovisnosti o 
vremenu, a exp je pokusni na čin primjene (oralni, dermalni ili inhalacijom).  
36. Za primjenu i odre đivanje rizika od sistemskih u činaka, bioraspoloživosti 
toksične komponente op ćenito se daje prednost nad postotkom apsorpcije pri 
usporedbi sistemskih koncentracija iz studija na životinjama s analognim 
podacima dobivenima biološkim nadzorom iz studija o izlaganju radnika. Situacija može postati složenija ako su doze u nelinearnom omjeru tako da je važno da se u preventivnom ispitivanju toksikokinetike odrede doze u 
linearnom rasponu.
 
Distribucija u tkivu  
37. Poznavanje distribucije ispitivane kemikalije i/ili njezinih metabolita u tkivu 
važno je za identifikaciju tkiva meta, razumijevanje temeljnih mehanizama toksičnosti te dobivanje informacija o potencijalu akumulacije i postojanosti 
ispitivane kemikalije i metabolita. Postotak ukupne (radioaktivne) doze u 
tkivima i ostacima trupla treba minimalno mjeriti na kraju pokusa s izlu čevi­
nama (npr. tipi čno do 7 dana nakon primjene doze ili manje, ovisno o 
specifičnom ponašanju ispitivane kemikalije). Ako se na završetku studije 
u tkivima ne otkrije ispitivana kemikalija (npr. zato što je ispitivana kemi ­
kalija uklonjena prije završetka studije zbog kratkog vremena poluraspada), 
treba se pobrinuti da se podaci ne protuma če pogrešno. U takvoj situaciji 
treba ispitati distribuciju u tkivu u vrijeme vršne koncentracije ispitivane tvari (i/ili metabolita) u plazmi/krvi (T
 max ) ili vršnu stopu mokra ćnih izlu­ 
čevina ako je potrebno (vidjeti stavak 8.). Nadalje, može biti potrebno 
skupljati tkivo u dodatnim vremenskim to čkama kako bi se odredila distri ­
bucija ispitivane kemikalije i/ili njezinih metabolita u tkivu, kako bi se ocijenila ovisnost o vremenu (ako je potrebno), kako bi se pomoglo u 
utvrđivanju bilance mase i/ili ako to zahtijeva nadležno tijelo. Tkiva koja 
treba prikupiti uklju čuju jetru, mast, GI trakt, bubreg, slezenu, cijelu krv, 
ostatke trupla, tkiva organa meta i sva druga tkiva (npr. štitnja ču, eritrocite, 
reproduktivne organe, kožu, oko (posebno u pigmentiranih životinja) od 
potencijalnog zna čenja u toksikološkoj ocjeni ispitivane kemikalije. Treba 
razmotriti analizu dodatnih tkiva u isto vrijeme kako bi se na maksimum povećala primjena životinja te u slu čaju da je u studijama subkroni čne ili 
kronične toksičnosti opažena toksi čnost organa meta. Treba tako đer podni­
jeti izvješ će o (radioaktivnoj) preostaloj koncentraciji i omjerima tkiva i 
plazme (krv).
 
38. Nadležno tijelo tako đer može trebati ili tražiti vrednovanje distribucije u 
tkivima u dodatnim vremenskim to čkama poput vremena vršne koncentra ­
cije plazme/krvi (npr. T  max ) ili vršne stope mokra ćnih izlučevina dobivenu iz 
odgovaraju ćih pokusa kinetike plazme/krvi ili izlu čevina. Ta informacija 
može biti korisna za razumijevanje toksi čnosti i potencijala ispitivane kemi ­
kalije i akumuliranja i postojanosti metabolita. Treba pružiti obrazloženje za 
odabir uzoraka, uzorci za analizu op ćenito moraju biti jednaki kao i oni gore 
(vidjeti stavak 37.).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 532
 
39. Kvantifikacija radioaktivnosti za studije distribucije u tkivu može se provesti 
uz primjenu seciranja organa, homogenizacije, izgaranja i/ili solubilizacije 
uz zatim teku ćinsko scintilacijsko brojanje (LSC) uhva ćenih ostataka. Odre ­ 
đene tehnike, trenuta čno u raznim stadijima razvoja, npr. kvantitativna auto ­
radiografija cijelog tijela i mikroskopska autoradiografija receptora, mogu se 
pokazati korisnima pri odre đivanju distribucije ispitivane kemikalije u orga ­
nima i/ili tkivima (3) (4).  
40. Za druk čije načine primjene osim oralnog treba prikupiti i analizirati speci ­
fična tkiva kao što su plu ća u studijama pomo ću inhalacije te koža u 
dermalnim studijama. Vidjeti stavke 74. - 78.  
Metabolizam  
41. Izlučevine (i plazmu ako je potrebno) treba skupiti radi identifikacije i 
kvantifikacije nepromijenjene ispitivane kemikalije i metabolita, kao što je 
opisano u stavcima 44. - 49. Prihvatljivo je udruživanje izlu čevina radi 
olakšanja identifikacije metabolita unutar zadane skupine koja prima dozu. Preporučuje se profiliranje metabolita iz svakog vremenskog razdoblja. No, 
ako nedostatak uzoraka i/ili radioaktivnosti to ne dopusti, udruživanje urina i 
izmeta iz nekoliko vremenskih to čaka je prihvatljivo, ali nije prihvatljivo 
udruživanje iz razli čitih spolova ili doza. Za analizu urina, izmeta, istekle 
radioaktivnosti tretiranih životinja te žu či, ako je potrebno, treba primijeniti 
odgovaraju će kvalitativne i kvantitativne metode.
 
42. Treba se razumno potruditi oko identifikacije metabolita prisutnih u 5 % ili 
više primijenjene doze te oko izrade metaboli čke sheme za ispitivanu kemi ­
kaliju. Treba identificirati ispitivane kemikalije koje su karakterizirane u 
izlučevinama koje obuhva ćaju 5 % ili više primijenjene doze. Identifikacija 
se odnosi na to čno određenje strukture komponenti. Tipi čno se identifikacija 
obavlja ko-kromatografijom metabolita s poznatim standardima uz primjenu 
dvaju disimilarnih sustava ili tehnikama koje omogu ćuju pozitivnu identifi ­
kaciju strukture, kao što je spektrometrija masa, nuklearna magnetska rezonanca (NMR) itd. U slu čaju ko-kromatografije kromatografske tehnike 
uz primjenu iste stacionarne faze s dvama razli čitim sustavima otapala ne 
smatraju se prikladnom dvometodnom provjerom identiteta metabolita jer te 
da metode nisu neovisne. Identifikaciju ko-kromatografijom treba provesti uz primjenu dvaju disimilarnih, analiti čki neovisnih sustava kao što su 
reverzna i normalna faza tankoslojne kromatografije (TLC) i teku ćinska 
kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC). Ako se pokaže da je kromato ­
grafska separacija odgovaraju će kvalitete, nije potrebna dodatna potvrda 
spektroskopskim srednjim vrijednostima. Alternativno se jednozna čna iden­
tifikacija može posti ći primjenom metoda koje pružaju informacije o struk ­
turi kao što su: teku ćinska kromatografija/spektrometrija masa (LC-MS) ili 
tekućinska kromatografija/tandemska spektrometrija masa (LC-MS/MS), 
plinska kromatografija/spektrometrija masa (GC-MS) i spektrometrija NMR.
 
43. Ako na 5 % ili više primijenjene doze nije mogu će identificirati metabolite, 
u završnom izvješ ću treba pružiti obrazloženje. Može biti prikladno identi ­
ficirati metabolite u manje od 5 % primijenjene doze kako bi se postiglo bolje razumijevanje metaboli čkog tijeka procjene opasnosti i/ili rizika od 
ispitivane kemikalije. Kad god je mogu će, treba pružiti potvrdu strukture. 
To može uklju čivati profiliranje u plazmi ili krvi ili drugim tkivima.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 533
 
Ekskrecija  
44. Brzinu i opseg ekskrecije primijenjene doze treba odrediti mjerenjem 
postotka rekuperirane (radioaktivne) doze iz urina, izmeta i izdahnutog zraka. Ti će podaci pomo ći i u odre đivanju bilance mase. Koli čine ispitivane 
kemikalije (radioaktivnost) elimirane putem urina, izmeta i izdahnutog zraka 
treba odrediti u odgovaraju ćim vremenskim intervalima (vidjeti stavke 47. - 
49.). Pokusi s primjenom ponavljanih doza moraju se pravilno isplanirati kako bi se omogu ćilo prikupljanje podataka o ekskreciji radi ispunjenja 
ciljeva opisanih u stavku 26. To će omogu ćiti usporedbu s pokusima s 
primjenom jedne doze.
 
45. Ako pilot studija pokaže da se u izdahnutom zraku ne eliminira zna čajna 
količina ispitivane kemikalije (radioaktivnost) (u skladu sa stavkom 49.), u 
konačnoj studiji ne treba skupljati izdahnuti zrak.  
46. Svaku životinju treba smjestiti u odvojenu metaboli čku jedinicu za 
skupljanje izlu čevina (urina, izmeta i izdahnutog zraka). Na kraju svakog 
razdoblja skupljanja (vidjeti stavke 47. - 49.), metaboli čke jedinice treba 
isprati prikladnim otapalom (to je poznato kao „ispiranje kaveza”) kako bi 
se osigurala maksimalna rekuperacija ispitivane kemikalije (radioaktivnost). Skupljanje izlu čevina treba završiti nakon 7 dana ili nakon rekuperacije 
najmanje 90 % primijenjene doze, ovisno o tome što nastupi prvo.
 
47. Ukupne koli čine ispitivane kemikalije (radioaktivnost) u mokra ći treba odre ­
diti u najmanje dvije vremenske to čke 1. dana skupljanja, od kojih jedna 
mora biti na 24 h nakon primjene doze, a zatim svakodnevno do završetka 
studije. Savjetuje se odabir više od dva trenutka uzorkovanja prvog dana (npr. na 6, 12 i 24 h). Rezultate pilot studija treba analizirati radi informacije o drugim ili dodatnim vremenskim to čkama za skupljanje. Treba pružiti 
argumentaciju za raspored skupljanja.
 
48. Ukupne koli čine ispitivane kemikalije (radioaktivnost) u izmetu treba odre ­ 
đivati svakodnevno po čevši s 24 h nakon primjene doze pa do završetka 
studije, osim ako pilot studije ne sugeriraju druge ili dodatne vremenske točke za skupljanje. Treba pružiti argumentaciju za druk čiji raspored 
skupljanja.
 
49. Skupljanje izdahnutog CO  2 i drugih hlapljivih materijala može se prekinuti 
u pokusu predmetne studije ako je u izdahnutom zraku tijekom razdoblja 
skupljanja od 24 h prona đeno manje od 1 % primijenjene doze.  
Studije s vremenskim tijekom  
Kinetika plazme/krvi  
50. Svrha je ovih studija dobiti procjenu osnovnih parametara TK [npr. C  max , 
T max poluvrijeme (t  1/2 ), AUC] za ispitivanu kemikaliju. Te se studije mogu 
provoditi sa samo jednom dozom ili bolje s još dvjema dozama. Namje ­ 
štanje doza treba odrediti na temelju naravi pokusa i/ili ciljanog problema. 
Za rješavanje problema kao što su bioraspoloživost ispitivane kemikalije i/ili za pojašnjenje u činka doze na klirens (npr. za pojašnjenje je li klirens 
zasićen u obliku koji ovisi o dozi) mogu biti potrebni kineti čki podaci.
 
51. Za te studije treba primijeniti najmanje četiri životinje jednog spola po 
skupini koja prima dozu. Treba pružiti obrazloženje za spol upotrijebljenih životinja. Primjenu obaju spolova ( četiri mužjaka i četiri ženke) treba uzeti u 
obzir ako postoji dokaz o zna čajnim razlikama u toksi čnosti povezanima sa 
spolom.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 534
 
52. Nakon primjene ispitivane kemikalije (radioaktivno obilježene) u odgovara ­
jućim vremenskim to čkama od svake životinje treba uzeti uzorke krvi uz 
primjenu prikladne metode uzorkovanja. Koli čina i broj uzoraka krvi koji se 
mogu dobiti po životinji može biti ograni čena potencijalnim u čincima 
ponovljenog uzorkovanja ili zdravlja/fiziologije životinje i/ili osjetljivosti 
analitičke metode. Treba analizirati uzorke za svaku pojedina čnu životinju. 
U nekim okolnostima (npr. karakterizacija metabolita) tako đer može biti 
potrebno udruživanje uzoraka više od jedne životinje. Udružene uzorke treba jasno identificirati te pružiti objašnjenje za udruživanje. Ako se primje ­
njuje radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija, može biti prikladna 
analiza ukupne radioaktivnosti. Ako je tako, treba analizirati ukupnu radioaktivnost u cijelom tijelu i plazmi ili plazmi i crvenim krvnim tjele ­ 
šcima kako bi se omogu ćio izračun omjera krvi i plazme. U drugim okolno ­
stima mogu biti potrebne specifi čnije pretrage koje zahtijevaju identifikaciju 
početnog spoja i/ili metabolita ili odre đivanje proteinskih veza.
 
Kinetika drugih tkiva  
53. Svrha ovih studija jest dobivanje informacija o vremenskom tijeku kako bi 
se pristupilo pitanjima u svezi s problemima, kao što su toksi čni način 
djelovanja, bioakumulacija i biopostojanost putem odre đivanja razina ispiti ­
vane kemikalije u raznim tkivima. Odabir tkiva i broj vrednovanih vremen ­
skih točaka ovisit će o problemu kojemu se pristupa i toksikološkoj bazi 
podataka za ispitivanu kemikaliju. Plan tih studija kinetike dodatnih tkiva 
treba uzeti u obzir informacije skupljene kao što je opisano u stavcima 37. - 
40. Te studije mogu uklju čivati jednu dozu ili ponovljene doze. Treba 
podnijeti detaljnu argumentaciju za pristup.  
54. Razlozi za obavljanje studija kinetike drugih tkiva mogu uklju čivati:  
— dokaz o produženom poluvijeku krvi, koji sugerira mogu ću akumulaciju 
ispitivane kemikalije u raznim tkivima ili  
— zanimanje u ispitivanju je li postignuta razina stabilnog stanja u speci ­
fičnim tkivima (npr. u studijama uz primjenu ponovljene doze iako nije 
postignuta o čita razina stabilnog stanja ispitivane kemikalije, može 
postojati zanimanje za utvr đivanje je li razina stabilnog stanja postignuta 
i u dobivenim tkivima meti).  
55. Za ove tipove studija vremenskog tijeka odgovaraju ću oralnu dozu ispiti ­
vane kemikalije treba primijeniti na najmanje četirima životinjama po dozi 
po vremenskoj to čki te tijekom vremena distribucije koje se nadzire u 
odabranim tkivima. Može se upotrijebiti samo jedan spol osim ako se ne uoči specifična toksičnost u nekom spolu. Ho će li se analizirati ukupna 
radioaktivnost ili po četni spoj i/ili metaboliti tako đer ovisi o problemu 
kojemu se pristupa. Distribucija u tkivu treba se odrediti primjenom odgo ­
varajućih tehnika.
 
Indukcija/inhibicija enzima  
56. Studije usmjerena na mogu će učinke indukcije/inhibicije enzima ili biotrans ­
formaciju ispitivane kemikalije na kojoj se vrši studija mogu biti potrebne u 
jednom ili više od sljede ćih slučajeva:  
1. Raspoloživ dokaz koji ukazuje na odnos izme đu biotransformacije ispi ­
tivane kemikalije i pove ćane toksičnosti,  
2. Raspoloživi podaci o toksi čnosti koji ukazuju na nelinearan odnos 
između doze i metabolizma,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 535
 
3. Rezultati studija identifikacije metabolita pokazuju identifikaciju potenci ­
jalnog toksi čnog metabolita koji je možda proizveden enzimskim tijekom 
koji je inducirala ispitivana kemikalija,  
4. Pri objašnjavanju u činaka za koje se pretpostavlja da su povezani s 
fenomenom indukcije enzima,  
5. Ako se u metaboli čkom profilu ispitivane kemikalije opaze toksikološki 
značajne promjene bilo u pokusima  in vitro  ili in vivo  s različitim 
vrstama ili uvjetima, može biti potrebna karakterizacija uklju čenog(ih) 
enzima (npr. enzimi faze I enzimi kao što su izoenzimi sustava monoo ­
ksigenaze koji ovise o Citokromu P450, enzimi faze II kao što su izoen ­
zimi sulfotransferaze ili uridin difosfat glukuronozil transferaza ili bilo 
koji drugi relevantni enzimi). Ta se informacija može upotrijebiti za vrednovanje odnosa vrsta s ekstrapolacijom vrsta.
 
57. Treba primijeniti odgovaraju će, prikladno ocijenjene i obrazložene protokole 
studija za vrednovanje promjena u TK povezanih s ispitivanom kemikali ­
jom. Planovi studija kao primjer sastoje se od primjene ponavljanih doza s neoznačenom ispitivanom kemikalijom, nakon čega slijedi jedna radioak ­
tivno obilježena doza 14. dana ili primjena ponavljanih doza s radioaktivno 
obilježenom ispitivanom kemikalijom te uzorkovanja 1., 7. i 14. dana radi određivanja profila metabolita. Primjena ponavljanih doza s radioaktivno 
obilježenom ispitivanom kemikalijom tako đer može pružiti informacije o 
bioakumulaciji (vidjeti stavak 26.).
 
DODATNI PRISTUPI  
58. Dodatni pristupi, osim pokusa  in vivo  opisanih u ovoj ispitnoj metodi, mogu 
pružiti korisne informacije o apsorpciji, distribuciji, metabolizmu ili elimi ­
naciji ispitivane kemikalije u odre đenih vrsta.  
Primjena informacija  in vitro  
59. U studijama  in vitro  uz primjenu odgovaraju ćih sustava ispitivanja može se 
pristupiti nekolicini pitanja u svezi s metabolizmom ispitivane kemikalije. Svježe izolirani ili uzgojeni hepatociti i substani čne frakcije (npr. mikrosomi 
i citosol ili frakcija S9) iz jetre mogu se upotrijebiti u studiji mogu ćih 
metabolita. Lokalni metabolizam u organu meti, npr. plu ćima, može biti 
koristan za procjenu rizika. U te svrhe mogu biti korisne mikrosomalne frakcije tkiva meta. Studije s mikrosomima mogu biti korisne za pristup 
potencijalnim razlikama i spolu i životnom stadiju te karakterizirati para ­
metre enzima (K
 m i V max ) koji mogu pomo ći u određivanju ovisnosti doze o 
metabolizmu u odnosu na razine izlaganja. Mikrosomi uz to mogu biti korisni za identifikaciju specifi čnih mikrosomalnih enzima uklju čenih u 
metabolizam ispitivane kemikalije, što može biti relevantno u ekstrapolaciji 
vrsta (vidjeti još i stavak 56.). Potencijal indukcije biotransformacije tako đer 
se može ispitati uz primjenu jetrenih substani čnih frakcija (npr. mikrosoma i 
citosola) životinja koje su prethodno tretirane ispitivanom kemikalijom,  in 
vitro  pomoću studija o indukciji hepatocita ili iz specifi čnih staničnih linija 
koje pokazuju relevantne enzime. U odre đenim okolnostima i u odgovara ­
jućim uvjetima substani čne frakcije iz ljudskih tkiva tako đer se mogu uzeti u 
obzir za odre đivanje potencijalnih razlika u biotransformaciji me đu vrstama. 
Rezultati istraživanja  in vitro  također mogu biti korisni u razvoju modela 
PBTK (5).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 536
 
60. Studije o dermalnoj apsorpciji  in vitro  mogu pružiti dodatne informacije za 
karakterizaciju apsorpcije (6).  
61. Za pristup sli čnim pitanjima mogu se upotrijebiti primarne stani čne kulture 
stanica jetre i svježi presjeci tkiva te mikrosomi iz jetre. U odre đenim 
slučajevima na specifi čna se pitanja može odgovoriti uporabom stani čnih 
linija s definiranom ekspresijom relevantnog enzima ili proizvedenih staničnih linija. U odre đenim slučajevima može biti korisno istražiti inhibi ­
ciju i indukciju izoenzima specifi čnog citokroma P450 (npr. CYP1A1, 2E1, 
1A2 i drugih) i/ili enzima faze II pomo ću početnog spoja uz primjene 
studija  in vitro . Dobivene informacije mogu biti korisne za spojeve sli čne 
strukture.
 
Uporaba podataka o toksikokinetici iz studija o toksi čnosti kao 
dodatnih informacija  
62. Analiza uzoraka krvi, tkiva i/ili izlu čevina dobivenih tijekom provo đenja 
drugih studija toksi čnosti mogu pružiti podatke o bioraspoloživosti, promje ­
nama u koncentraciji plazme tijekom vremena (AUC, C  max ), potencijalu 
bioakumulacije, klirensu te promjenama u metabolizmu i kinetici ovisno o spolu ili životnom stadiju.
 
63. Razmatranja o planiranju studije mogu se primijeniti za odgovor na pitanja u 
vezi sa: zasi ćenjem apsorpcije, tijekom biotransformacije ili ekskrecije na 
visokim razinama doze; djelovanjem novih metaboli čkih tijekova na višim 
dozama i ograni čenjem toksi čnih metabolita na više doze.  
64. Ostala razmatranja o odre đivanju opasnosti mogu obuhva ćati probleme kao 
što su:  
— Osjetljivost povezana s dobi zbog razlika u statusu barijere krv-mozak, 
kapaciteta bubrega i/ili detoksikacije,  
— Subpopulacijska osjetljivost zbog razlika u kapacitetu biotransformacije 
ili drugim TK razlikama,  
— Opseg izlaganja fetusa transplacentarnim transferima ili kemikalijama ili 
novog mladun četa laktacijom.  
Primjena toksikokineti čkog modeliranja  
65. Toksikokineti čki modeli mogu biti korisni za razne aspekte procjene 
opasnosti i rizika, kao primjerice u predvi đanju sistemskog izlaganja i 
interne doze u tkivu. Osim toga, može se pristupiti specifi čnim pitanjima 
o načinu djelovanja, a ti modeli mogu pružiti temelj za ekstrapolaciju vrsta, 
načina izlaganja, uzoraka doziranja i procjene rizika za ljude. Podaci korisni 
za razvoj modela PBTK za ispitivanu kemikaliju u svim danim vrstama 
obuhvaćaju 1) koeficijente razdjeljenja, 2) biokemijske konstante i fiziološke 
parametre, 3) parametre specifi čne za način izlaganja te 4)  in vivo  kinetičke 
podatke za ocjenu modela [npr. parametre klirensa za relevantne (> 10 %) 
tijekove ekskrecije, K  m i V max za metabolizam]. Pokusne podatke upotrijeb ­
ljene u razvoju modela treba proizvesti znanstveno opravdanim metodama i treba ocijeniti rezultate modela. Parametri specifi čni za ispitivanu kemikaliju 
i vrstu, kao što su brzina apsorpcije, parcioniranje krvi u tkivu i konstanta 
brzine metabolizma, često se odre đuju kako bi se olakšao razvoj modela za 
neodjeljke ili modela utemeljenog na fiziologiji (7).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 537
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
66. Preporu čuje se da se izvješ će o studiji obuhva ća i sadržaj.  
Tijelo izvješ ća 
67. U tijelu izvješ ća moraju se nalaziti informacije pokrivene ovom ispitnom 
metodom, organizirane u odjeljke i odlomke na sljede ći način: 
Sažetak  
68. Ovaj odjeljak izvješ ća o studiji treba obuhva ćati sažetak plana studije te opis 
korištenih metoda. Tako đer, mora istaknuti klju čne nalaze što se ti če bilance 
mase, naravi i magnitude metabolita, ostataka u tkivu, klirensa, potencijala bioakumulacije, razlika me đu spolovima itd. Sažetak treba predstaviti s 
dovoljno detalja kako bi se omogu ćilo vrednovanje nalaza.
 
Uvod  
69. Ovaj odjeljak izvješ ća treba obuhva ćati ciljeve studije, razloge i plan te 
odgovaraju će reference i pozadinsku povijest.  
Materijali i metode  
70. Ovaj odjeljak izvješ ća treba obuhva ćati detaljan opis svih primjerenih infor ­
macija kao što su:  
(a) Ispitivana kemikalija  
Ovaj pododjeljak treba obuhva ćati identifikaciju ispitivane kemikalije: 
kemijski naziv, molekularnu strukturu, kvalitativno i kvantitativno odre ­ 
đenje njezina kemijskog spoja, kemijsku čistoću te, ako je mogu će, tip i 
količinu nečistoća. Tako đer treba obuhva ćati informacije o 
fizikalno-kemijskim svojstvima, uklju čujući fizikalno stanje, boju, 
makroskopsku topljivost i/ili koeficijent razdjeljenja, stabilnost te po potrebi korozivnost. Ako je primjenjivo, treba pružiti informacije o 
izomerima. Ako je ispitivana kemikalija radioaktivno obilježena, u 
ovaj pododjeljak treba uklju čiti sljedeće informacije: tip radioaktivnih 
nuklida, položaj oznake, specifi čnu aktivnost te radiokemijsku čistoću.
 
Treba navesti tip opisa svih nosa ča, diluensa, sredstava za suspenziju i 
emulgatora ili drugih materijala korištenih u primjeni ispitivane 
kemikalije.  
(b) Pokusne životinje  
Ovaj pododjeljak treba obuhva ćati informacije o pokusnim životinjama, 
uključujući odabir i obrazloženje za vrstu, soj i starost na po četku 
studije, spol i tjelesnu masu, zdravstveni status te uzgoj životinja.  
(c) Metode  
Ovaj pododjeljak treba obuhva ćati detalje o planu studije i korištenoj 
metodologiji. Treba uklju čivati opis:  
1. Obrazloženje za sve modifikacije na čina izlaganja i uvjeta izlaganja, 
ako je primjenjivo,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 538
 
2. Obrazloženje za odabir visina doze,  
3. Opis pilot studija korištenih u planiranju pokusa sljede ćih studija, 
ako je primjenjivo. Treba navesti podatke iz pilot studija koji služe kao podrška,
 
4. Kako je pripremana otopina doze te tip korištenog otapala ili 
nosača, ako je neki korišten,  
5. Broj tretiranih skupina i broj životinja po skupini,  
6. Visine i koli čine doza (te specifi čnu aktivnost doze ako je korištena 
radioaktivnost),  
7. Način(i) i metode primjene,  
8. Učestalost doziranja,  
9. Razdoblje posta (ako je primijenjeno),  
10. Ukupna radioaktivnost po životinji,  
11. Postupanje sa životinjama,  
12. Skupljanje uzoraka i manipulacija uzorcima,  
13. Analiti čke metode korištene za odvajanje, kvantitaciju i identifika ­
ciju metabolita,  
14. Granica detekcije korištenih metoda,  
15. Druga korištena pokusna mjerenja i postupci (uklju čujući i ocjenu 
metoda za analizu metabolita).  
(d) Statisti čka analiza  
Ako se za analizu nalaza studije koristi statisti čka analiza, treba obuh ­
vatiti dovoljno informacija o metodi analize i korištenom ra čunalnom 
programu tako da neovisni revizor/statisti čar može ponovno vrednovati i 
rekonstruirati analizu.  
U slučaju studije za modeliranje sustava, kao što je PBTK, predstav ­
ljanje modela treba obuhva ćati potpun opis modela kako bi se omogu ­ 
ćila neovisna rekonstrukcija i ocjena modela (vidjeti stavak 65. i Doda ­
tak: Definicije).  
Rezultati  
71. Sve podatke treba sažeti i tabli čno prikazati s odgovaraju ćim statisti čkim 
vrednovanjem te opisati u tekstu ovog odjeljka. Podatke o radioaktivnosti treba sažeti i prikazati ako je potrebno za studiju, obi čno kao mikrogramske 
ili miligramske ekvivalente po jedinici uzorka iako se mogu upotrijebiti i 
druge jedinice. Ovaj odjeljak treba obuhva ćati grafičke ilustracije nalaza, 
reprodukciju reprezentativnih kromatografskih i spektrometrijskih podataka, identifikaciju/kvantifikaciju metabolita i predložene metaboli čke tijekove 
uključujući molekularnu strukturu metabolita. Treba obuhvatiti i sljede će 
informacije, ako je primjenjivo:
 
1. Količinu i postotak rekuperacije radioaktivnosti u urinu, izmetu, izdah ­
nutom zraku te ispiranje kaveza od urina i izmeta.  
— Za dermalne studije tako đer obuhvatite i podatke o rekuperaciji ispi ­
tivane kemikalije iz tretirane kože, ispiraka kože te ostataka radioak ­
tivnosti u aparatu koji pokriva kožu i metaboli čkoj jedinici, kao i 
rezultate studije dermalnog ispiranja. Za ostale rasprave vidjeti 
stavke 74. - 77.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 539
 
— Za inhalacijske studije tako đer obuhvatite i podatke o rekuperaciji 
ispitivane kemikalije iz plu ćnog i nazalnog tkiva (8). Za ostale 
rasprave vidjeti stavak 78.  
2. Distribucija u tkivu navedena kao postotak primijenjene doze i koncen ­
tracije (mikrogramski ekvivalent po gramu tkiva) i omjer tkiva i krvi ili 
tkiva i plazme,  
3. Bilanca materijala razvijena iz svake studije koja obuhva ća analizu tjele ­
snih tkiva i izlu čevina,  
4. Koncentracije plazme i toksikokineti čki parametri (bioraspoloživost, 
AUC, Cmax, Tmax, klirens, polutijek) nakon primjene relevantnim na či­
nom/načinima izlaganja,  
5. Brzina i opseg apsorpcije ispitivane kemikalije nakon primjene rele ­
vantnih na činom/načinima izlaganja,  
6. Količine ispitivane kemikalije i metabolita (navedenih kao postotak 
primijenjene doze) skupljenih u izlu čevinama,  
7. Reference na podatke iz dodatka koji sadrže pojedina čne podatke o 
životinjama za sva mjerenja kona čnih učinaka (npr. primjena doze, 
postotak rekuperacije, koncentracije, TK parametre itd.),  
8. Slika s predloženim metaboli čkim tijekovima i molekularnim strukturama 
metabolita.  
Rasprava i zaklju čci 
72. Autor u ovom odjeljku treba:  
1. Pružiti predloženi metaboli čki tijek utemeljen na rezultatima metabolizma 
i dispozicije ispitivane kemikalije,  
2. Raspravljati o svim potencijalnim razlikama izme đu vrsta i spolova po 
pitanju dispozicije i/ili biotransformacije ispitivane kemikalije,  
3. Tablično prikazati i raspravljati o identifikaciji i magnitudi metabolita, 
klirensu, potencijalu bioakumulacije te razini ostataka po četnog spoja i/ili 
metabolita u tkivu, kao i o mogu ćim promjenama u TK parametrima koje 
ovise o dozi, ako je potrebno,  
4. U ovaj odjeljak treba integrirati sve relevantne TK podatke dobivene 
tijekom provo đenja studije toksi čnosti,  
5. Pružiti sažet zaklju čak koji se može poduprijeti nalazima studije,  
6. Dodati odjeljke (ako je potrebno ili prikladno).  
73. Dodatni odjeljci trebaju se upotrijebiti kako bi se uklju čile dodatne biblio ­
grafske informacije, tablice, slike, dodaci itd.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 540
 
ALTERNATIVNI NA ČINI IZLAGANJA  
Dermalni  
Dermalni tretman  
74. U ovom odjeljku nalaze se specifi čne informacije o istraživanju toksikoki ­
netike ispitivane kemikalije dermalnim putem. Za dermalnu apsorpciju treba 
proučiti poglavlje B.44 ovog Priloga [Apsorpcija putem kože: metoda  in 
vivo (9)]. Za ostale kona čne učinke, kao što su distribucija i metabolizam, 
može se primijeniti ispitna metoda B.36. Pri dermalnom tretmanu treba se 
upotrijebiti jedna ili više visina doza za ispitivanu kemikaliju. Ispitivana 
kemikalija (npr. čisti, razrije đeni ili formulirani materijal koji sadrži ispiti ­
vanu kemikaliju koja se primjenjuje na kožu) mora biti jednaka (ili reali ­
stičan surogat) kemikaliji kojoj mogu biti izloženi ljudi ili druge potencijalne 
vrste meta. Visinu/e doza treba odabrati u skladu sa stavcima 20. - 26. ove 
ispitne metode. Čimbenici koji se mogu uzeti u obzir pri odabiru dermalne 
doze uklju čuju očekivano ljudsko izlaganje i/ili doze na kojima je u drugim 
studijama dermalne toksi čnosti opažena toksi čnost. Dermalnu dozu/dermalne 
doze treba razrijediti, po potrebi, u prikladnom nosa ču te primijeniti u 
količini prikladnoj za davanje doze. Krzno kratko prije ispitivanja treba 
štipaljkama u čvrstiti tako da se ukloni s dorzalnog podru čja trupa pokusnih 
životinja. Može se obaviti brijanje, ali to se mora obaviti otprilike 24 h prije 
ispitivanja. Pri u čvršćivanju krzna štipaljkama ili brijanju treba paziti da se 
ne ošteti koža jer bi to moglo promijeniti njezinu propusnost. Otprilike 10 % površine tijela treba o čistiti radi primjene ispitivane kemikalije. U slu čaju 
kemikalija visoke toksi čnosti površina može biti manja od 10 %, ali što više 
površine treba biti pokriveno tankim i ravnomjernim slojem. Za sve ispiti ­
vane skupine treba primijeniti jednak tretman površine. Dozirna podru čja 
treba zaštititi prikladnom zaštitom osiguranom protiv micanja. Životinje treba smjestiti odvojeno.
 
75. Studiju s primjenom dermalnog ispiranja treba provesti kako bi se odredila 
količina primijenjene doze ispitivane kemikalije koja se može ukloniti s 
kože ispiranjem tretiranog podru čja blagim sapunom i vodom. Ta studija 
također može pomo ći pri utvr đivanju bilance mase ako se ispitivana kemi ­
kalija primjenjuje dermalnim putem. Za tu studiju s primjenom dermalnog ispiranja jednu dozu ispitivane kemikalije treba dati dvjema životinjama. Odabir visine doze u skladu je sa stavkom 23. ove ispitne metode (vidjeti 
još i stavak 76. za raspravu o vremenu kontakta s kožom). Treba odrediti 
količine rekuperirane ispitivane kemikalije u ispircima kako bi se odredila 
učinkovitost uklanjanja ispitivane kemikalije pranjem.
 
76. Osim ako to korozivnost ne dopusti, ispitivanu kemikaliju treba primijeniti i 
zadržati na koži najmanje 6 sati. U trenutku uklanjanja zaštite tretirano područje treba isprati pridržavaju ći se postupka izloženog u studiji uz 
primjenu dermalnog ispiranja (vidjeti stavak 75.). I zaštitu i ispirke treba 
analizirati na ostatke ispitivane kemikalije. Na završetku studije sve životinje 
treba humano usmrtiti u skladu s (2) te ukloniti tretiranu kožu. Odgovara ­
juću sekciju tretirane kože treba analizirati kako bi se odredili ostaci ispiti ­
vane kemikalije (radioaktivnost).
 
77. Za toksikokineti čko određivanje lijekova mogu biti potrebni razli čiti 
postupci u skladu s odgovaraju ćim regulatornim sustavom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 541
 
Inhalacija  
78. Treba primijeniti jednu koncentraciju (ili više ako je potrebno) ispitivane 
kemikalije. Koncentraciju/e treba odabrati u skladu sa stavcima 20. - 26. ove ispitne metode. Inhalacijske tretmane treba provoditi uz primjenu aparature 
„glava rakete” ili „samo glava” kako bi se sprije čila apsorpcija drugim 
načinima izlaganja (8). Ako se primjenjuju druk čiji uvjeti za inhalaciju, 
treba dokumentirati obrazloženje za modifikaciju. Treba definirati trajanje izlaganja inhalacijom. Tipi čno izlaganje traje 4 - 6 sati.
 
LITERATURA  
1. OECD (2009.). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Pariz.  
2. OECD (2000.). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pariz.
 
3. Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regu ­
latory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
4. Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 
25-40.  
5. Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist 
H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based 
pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regula ­
tory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
6. Poglavlje B.45 ovog Priloga, Apsorpcija putem kože: metoda  in vitro . 
7. IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, 
International Programme on Chemical Safety.  
8. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Pariz.  
9. Poglavlje B.44 ovog Priloga, Apsorpcija putem kože: metoda  in vivo . 
10. Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
11. Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 542
 
Dodatak  
DEFINICIJE  
Apsorpcija:  proces(i) preuzimanja kemikalije u tkiva ili kroz tkiva. Apsorpcija se 
odnosi na po četni spoj i sve njegove metabolite. Ne treba je pomiješati s ‚biora ­
spoloživoš ću’. 
Akumulacija (bioakumulacija):  povećanje koli čine ispitivane kemikalije 
tijekom vremena u tkivima (obi čno u masnim tkivima nakon ponovljenog izla ­
ganja). Ako je unos ispitivane kemikalije u tijelo ve ći od stope eliminacije, 
organizam akumulira ispitivanu kemikaliju i mogu se posti ći toksične koncen ­
tracije ispitivane kemikalije.  
ADME:  kratica za apsorpciju, distribuciju, metabolizam i ekskreciju (‚Absorp ­
tion, Distribution, Metabolism, and Excretion’).  
AUC:  (područje ispod krivulje koncentracije plazme i vremena): podru čje ispod 
krivulje u dijagramu koncentracije ispitivane kemikalije u plazmi tijekom 
vremena. Predstavlja ukupnu koli činu ispitivane kemikalije koju tijelo apsorbira 
tijekom unaprijed odre đenog vremenskog razdoblja. Pod linearnim uvjetima 
AUC (od po četka vremena do beskona čnosti) je proporcionalan ukupnoj koli čini 
ispitivane kemikalije koju je tijelo apsorbiralo, bez obzira na stopu apsorpcije.  
Autoradiografija:  (autoradiografija cijelog tijela): primjenjuje se za kvalitativno 
i/ili kvantitativno odre đivanje mjesta radioaktivne ispitivane kemikalije. Ova se 
tehnika koristi filmom s X-zrakama ili novije digitalnim radiološkim prikazom uz 
pomoć fosfora kako bi vizualizirala radioaktivno obilježene molekule ili frag ­
mente molekula bilježenjem zra čenja koje emitiraju u predmetu koji se istražuje. 
Kvantitativna autoradiografija cijelog tijela u usporedbi sa seciranjem organa može imati neke prednosti za ocjenu distribucije ispitivane kemikalije i utvr ­ 
đivanje ukupne rekuperacije i razlu čivanja radioaktivnog materijala u tkivima. 
Značajna je prednost, primjerice, što se može primijeniti na modelu pigmenti ­
ranih životinja radi utvr đivanja mogu ćih asocijacija ispitivane kemikalije s mela ­
ninom koji može vezati odre đene molekule. No, iako može pružiti pogodne 
preglede veznih mjesta niskog afiniteta i visokog kapaciteta u cijelom tijelu, 
ova tehnika može biti ograni čena u prepoznavanju specifi čnih mjesta meta kao 
što su vezna mjesta receptora, gdje je za odre đivanje potrebna relativno visoka 
rezolucija i velika osjetljivost. Kada se primjenjuje autoradiografija, pokusi s 
ciljem odre đivanja bilance mase primijenjenog spoja moraju se provoditi kao 
odvojena skupina ili u studiji odvojenoj od pokusa distribucije u tkivu, gdje su sve izlučevine (koje mogu obuhva ćati i izdahnuti zrak) i cijela trupla homoge ­
nizirana i odre đena tekućinskim scintilacijskim brojanjem.
 
Žučno izlučivanje:  izlučivanje putem žu čnih kanala.  
Bioakumulacija:  vidjeti ‚akumulacija’.  
Bioraspoloživost:  dio primijenjene doze koja postiže sistemsku cirkulaciju ili je 
dostupna na mjestu fiziološke aktivnosti. Bioraspoloživost ispitivane kemikalije 
obično se odnosi na po četni spoj, ali se može odnositi i na njegov metabolit. U 
obzir se uzima samo na jedan kemijski oblik.  Nota bene:  bioraspoloživost i 
apsorpcija nisu isto. Razlika izme đu npr. oralne apsorpcije (tj. prisutnosti u 
stijenci crijeva i portalnoj cirkulaciji) i bioraspoloživosti (tj. prisutnosti u sistem ­
skoj krvi i tkivima) može nastati kemijskim raspadanjem zahvaljuju ći metabol ­
izmu stijenke crijeva ili transportu odljevom natrag u šupljinu crijeva ili presi ­
stemski metabolizam u jetri izme đu ostalih čimbenika (10). Bioraspoloživost 
toksične komponente (po četni spoj ili metabolit) klju čni je parametar u procjeni 
rizika za ljude (ekstrapolacija visoke do niske doze, ekstrapolacija izme đu načina 
primjene) za izvo đenje interne vrijednosti iz ekstremnih NOAEL ili BMD (pri ­
mijenjena doza). Za u činke na jetru nakon oralne primjene dovoljna je oralna 
apsorpcija. No za svaki u činak, osim onog na ulazu, bioraspoloživost je op ćenito 
pouzdaniji parametar za daljnju uporabu u procjeni rizika od apsorpcije.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 543
 
Biopostojanost:  vidjeti ‚postojanost’.  
Biotransformacija:  (obično enzimska) kemijska konverzija ispitivane kemikalije 
u drugu kemikaliju unutar tijela. Sinonim za ‚metabolizam’.  
C max : maksimalna (vršna) koncentracija u krvi (plazmi/serumu) nakon primjene 
ili maksimalna (vršna) ekskrecija (u urinu ili izmetu) nakon primjene.  
Klirens:  kvantitativno mjerenje brzine kojom se ispitivana kemikalija uklanja iz 
krvi, plazme ili odre đenog tkiva u jedinici vremena.  
Odjeljak:  strukturalni ili biokemijski dio (ili jedinica) tijela, tkiva ili stanice, koji 
je odvojen od ostatka.  
Tijek detoksikacije:  niz koraka koji dovode do eliminacije toksi čnih kemikalija 
iz tijela, bilo metaboli čkom izmjenom ili izlu čivanjem.  
Distribucija:  raspršenje ispitivane kemikalije i njezinih derivata kroz organizam.  
Enzimi/izozimi:  proteini koji kataliziraju kemijske reakcije. Izozimi i enzimi koji 
kataliziraju sli čne kemijske reakcije, ali se razlikuju po svojem aminokiselinskom 
slijedu.  
Enzimski parametri:  K m : Michaelisova konstanta i V  max : maksimalna brzina.  
Ekskrecija:  proces(i) kojim(a) se primijenjena ispitivana kemikalija i/ili njezini 
metaboliti uklanjanju iz tijela.  
Egzogeno:  uvedeno izvana ili proizvedeno izvan organizma ili sustava.  
Ekstrapolacija:  utjecaj jedne ili više nepoznatih vrijednosti na temelj onoga što 
je poznato ili što se promatra.  
Poluvrijeme (t  1/2 ): vrijeme potrebno za koncentraciju ispitivane kemikalije da se 
u odjeljku smanji za pola. Obi čno se odnosi na koncentraciju plazme ili koli činu 
ispitivane kemikalije u cijelom tijelu.  
Indukcija/indukcija enzima:  sinteza enzima kao odgovor na stimulans iz 
okoliša ili induktorsku molekulu.  
Linearnost/linearna kinetika:  proces je linearan po pitanju kinetike ako su sve 
brzine transfera izme đu odjeljaka proporcionalne koli čini prisutnih koncentracija, 
tj. prvom redu. Posljedi čno su konstantni klirens i koli čine distribucije te polu ­
vijeka. Postignute su koncentracije proporcionalne brzini doziranja (izlaganja) te 
se lakše predvi đa akumulacija. Linearnost/nelinearnost se može utvrditi uspo ­
redbom relevantnih parametara, npr. AUC nakon izlaganja razli čitim dozama 
ili nakon jednog i ponovljenog izlaganja. Nedostatak ovisnosti može biti indika ­
tivan za zasi ćenje enzima uklju čenih u metabolizam spoja, pove ćanje AUC 
nakon ponovljenog izlaganja u usporedbi s jednim izlaganjem može biti indika ­
cija za inhibiciju metabolizma, a smanjenje u AUC može biti indikacija za indukciju metabolizma [vidjeti i (11)].
 
Bilanca mase:  izračun ulaza ispitivane kemikalije u sustav i njezina izlaza iz 
sustava.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 544
 
Bilanca materijala:  vidjeti ‚bilanca mase’.  
Mehanizam (na čin) toksi čnosti/mehanizam (na čin) djelovanja:  mehanizam 
djelovanja odnosi se na specifi čne biokemijske interakcije kroz koje ispitivana 
kemikalija proizvodi svoj u činak. Način djelovanja odnosi se na op ćenitije tije ­
kove koji izazivaju toksi čnost ispitivane kemikalije.  
Metabolizam:  sinonim za ‚biotransformaciju’.  
Metaboliti:  proizvodi metabolizma ili metaboli čkih procesa.  
Oralna apsorpcija:  postotak doze ispitivane kemikalije apsorbirane na mjestu 
davanja (npr. GI trakt). Ovaj klju čni parametar može se upotrijebiti za razumi ­
jevanje frakcije primijenjene ispitivane kemikalije koja dolazi do portalne vene te 
zatim jetre.  
Koeficijent razdjeljenja:  poznat i kao koeficijent distribucije, predstavlja mjeru 
diferencijalne topljivosti kemikalije u dvama otapalima.  
Vršne razine krvi (plazma/serum):  maksimalna (vršna) koncentracija krvi (pla ­
zma/serum) nakon davanja (vidjeti i ‚C  max ’). 
Postojanost (biopostojanost):  dugoročna prisutnost kemikalije (u biološkom 
sustavu) zbog otpornosti na degradaciju/eliminaciju.  
Analogno predvi đanje (read-across):  informacija o kona čnom učinku za jednu 
ili više kemikalija upotrebljava se za predvi đanje kona čnog učinka za ciljanu 
kemikaliju.  
Mikroskopska autoradiografija receptora  (ili mikroautoradiografija receptora): 
ova se tehnika može primjenjivati za temeljito ispitivanje ksenobioti čke interak ­
cije sa specifi čnim tkivima ili populacijama stanica kao što su na primjer u 
studijama receptorskih veza ili specifi čnog načina djelovanja koja mogu zahtije ­
vati visoku rezoluciju i visoku osjetljivost koja se ne može posti ći drugim tehni ­
kama, kao što je autoradiografija cijelog tijela.  
Način primjene  (oralno, IV, dermalno, inhalacija itd.): odnosi se na na čin kojim 
se kemikalije daju u tijelo (npr. oralno sondom, oralno prehranom, dermalno, inhalacijom, intravenozno itd.).
 
Zasićenje:  stanje u kojem je jedan ili više kineti čkih procesa (npr. apsorpcija, 
metabolizam ili klirens) na maksimumu ( čitaj ‚zasićen’). 
Osjetljivost:  sposobnost metode ili instrumenta da razlikuje izme đu reakcija na 
mjerenja uz predo čenje razli čitih razina varijable koju se ispituje.  
Razine krvi (plazma) u stabilnom stanju:  stanje neravnoteže otvorenog sustava 
u kojem su sve sile, koje djeluju na sustav, to čno uravnotežene suprotnim silama 
tako da su sve njegove komponente stacionarne u koncentraciji iako tvar prolazi 
sustavom.  
Modeliranje sustava  (toksikokinetika na bazi psihologije, na bazi farmakoki ­
netike, farmakokinetika na bazi fiziologije, na bazi biologije itd.): Apstraktni 
model koji se za opis ponašanja sustava koristi matemati čkim jezikom.  
Tkivo meta:  tkivo u kojem se manifestira glavni nepovoljni u činak ili toksikant.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 545
 
Ispitivana kemikalija:  bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  
Distribucija u tkivu:  reverzibilno kretanje ispitivane kemikalije s jedne lokacije 
u tijelu do druge. Distribucija u tkivu može se istraživati seciranjem organa, homogenizacijom, izgaranjem i teku ćinskim scintilacijskim brojanjem ili kvalita ­
tivnom i/ili kvantitativnom autoradiografijom cijelog tijela. Prvospomenuto je 
korisno za postizanje koncentracije i postotka rekuperacije iz tkiva i ostataka 
trupla istih životinja, ali može pokazati nedostatak za sva tkiva i može imati manje od idealne ukupne rekuperacije (< 90 %). Definiciju posljednjeg vidjeti gore.
 
T max : vrijeme za postizanje C  max . 
Toksikokinetika  (farmakokinetika): istraživanje apsorpcije, distribucije, metabol ­
izma i ekskrecije kemikalija tijekom vremena.  
Ocjena modela:  postupak procjene prikladnosti modela za dosljedno opisivanje 
raspoloživih toksikokineti čkih podataka. Modeli se mogu vrednovati statisti čkom 
i vizualnom usporedbom predvi đanja modela s pokusnim vrijednostima u odnosu 
na opću neovisnu varijablu (npr. vrijeme). Treba obrazložiti opseg vrednovanja u 
odnosu na namjeravanu primjenu modela.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 546
 
B.37.  ODGO ĐENA NEUROTOKSI ČNOST ORGANOFOSPORNIH 
TVARI NAKON AKUTNOG IZLAGANJA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Kod procjene i vrednovanja toksi čkih učinaka tvari važno je uzeti u 
obzir potencijal odre đenih klasa tvari da uzrokuju posebne tipove 
neurotoksi čnosti koje možda nije mogu će otkriti u drugim studijama 
toksičnosti. Za neke organofosforne tvari opaženo je da uzrokuju 
odgođenu neurotoksi čnost pa bi trebale postati predmetom prou čava­
nja. 
Za utvrđivanje tvari koje mogu uzrokovati odgo đenu polineuoropa ­
tiju mogu se upotrijebiti  in vitro  testovi probira; me đutim, negativni 
nalazi  in vitro  studija nisu dokaz da ispitivana tvar nije neurotoksi ­ 
čna. 
Vidjeti Op ći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Organofosforne tvari obuhva ćaju organofosforne estere bez naboja, 
tioestere ili anhidride organofosforne, organofosfonske ili organofos ­
foramidne kiseline ili srodne fosforotio, fosfonotio ili fosforotioa ­
midne kiseline, ili druge tvari koje mogu uzrokovati odgo đenu 
neurotoksi čnost koje se ponekad vide u toj klasi tvari.  
Odgođena neurotoksi čnost je sindrom koji se povezuje s produženim 
odgođenim vremenom prve pojave ataksije, distalnih aksonopatija u 
leđnoj moždini i perifernom živcu, i inhibiciju i starenje esteraze 
koja je povezana s neuropatskim djelovanjem organofosfornih 
spojeva (neuropathy target esterase — NTE) u neuralnom tkivu.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentna tvar može se ispitati s pozitivnom kontrolnom skupinom 
te na taj na čin dokazati da se u laboratorijskim ispitnim uvjetima 
reakcija ispitivanih vrsta nije zna čajno promijenila,.  
Tri-o-tolil fosfat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5. CAS nomen ­
klatura: fosforna kiselina, tris(2metilfenil)ester) primjer je neuroto ­
ksične tvari široke uporabe, poznate i kao tris-o-kresilfosfat.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar daje se oralno u jednoj dozi doma ćim kokošima koje 
su po potrebi zašti ćene od akutnih kolinergi čkih učinaka. Životinje 
se opažaju 21 dan s obzirom na anomalije u ponašanju, ataksiju i 
paralizu. Biokemijska mjerenja, posebno inhibicija esteraze koja je 
povezana s neuropatskim djelovanjem organofosfornih spojeva (NTE), provode se na kokošima koje su nasumice odabrane iz svake skupine, obi čno 24 i 48 sati nakon tretiranja. Dvadeset jedan 
dan nakon izlaganja, preostali broj kokoši se usmrti i provede se 
histopatološka pretraga odabranog neuralnog tkiva.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 547
 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Pripreme  
Zdrave mlade odrasle kokoši bez virusnih oboljenja koja bi mogla 
utjecati na istraživanje, koje ne primaju nikakve lijekove i ne poka ­
zuju nepravilnosti u hodu treba nasumice odabrati i svrstati u treti ­
ranu i kontrolnu skupinu, te prilago đavati laboratorijskim uvjetima 
najmanje pet dana prije po četka studije.  
Treba koristiti kaveze ili ogra đeni prostor dovoljne veli čine da se 
kokošima omogu ći slobodno kretanje, te se treba koristiti lako 
opažanje hoda.  
Doziranje ispitivane tvari obi čno se provodi oralno, sondom, želatin ­
skim kapsulama, ili nekom usporedivom metodom. Teku ćine se 
mogu davati nerazrije đene ili otopljene u odgovaraju ćem otapalu 
kao što je kukuruzno ulje; ako je mogu će, krute tvari treba otopiti 
jer apsorpcija velikih doza krute tvari u želatinskim kapsulama može 
biti nedovoljno u činkovita. Za sve nosa če i otapala osim vode, 
toksičke karakteristike moraju biti poznate, a ako nisu, treba ih utvr ­
diti prije ispitivanja.  
1.5.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.5.2.1.  Ispitne životinje  
Preporuča se koristiti mlade odrasle doma će nesilice ( Gallus gallus 
domesticus ), stare do 12 mjeseci. Treba koristiti pasmine i sojeve 
standardne veli čine i kokoši koje su odrasle u uvjetima koji su im 
omogućivali slobodno kretanje.  
1.5.2.2.  Broj i spol  
Uz tretiranu skupinu, treba rabiti i kontrolnu skupinu za nosa č i 
pozitivnu kontrolnu skupinu. Kontrolnu skupinu za nosa č treba treti ­
rati na identi čan način kao i tretiranu skupinu, osim što se ispitivana 
tvar ne daje.  
U svakoj skupini treba biti dovoljan broj kokoši kako bi ih se 
najmanje šest moglo usmrtiti za biokemijsku analizu (tri u svakoj od dvije vremenske to čke), a šest može preživjeti 21-dnevno 
razdoblje opažanja patologije.
 
Pozitivna kontrolna skupina može se voditi istodobno, ili kao 
kontrolna skupina na temelju nedavnih iskustava. Ta skupina treba 
sadržavati najmanje šest kokoši tretiranih poznatom tvari s odgo ­ 
đenim neurotoksi čkim djelovanjem, tri kokoši za biokemijsku 
analizu i tri kokoši za patologiju. Preporu ča se periodi čno ažuriranje 
prethodno prikupljenih podataka. Ako laboratorij koji provodi ispiti ­
vanje mijenja neke od bitnih elemenata (npr. soj, prehranu, uvjete 
smještaja), treba razviti nove pozitivne kontrolne podatke.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 548
 
1.5.2.3.  Visine doza  
Za utvrđivanje visine doze koja će se koristiti u glavnoj studiji treba 
provesti preliminarnu studiju u kojoj će se koristiti odgovaraju ći broj 
kokoši i skupina tretiranih razli čitim visinama doze. U preliminarnoj 
studiji obi čno je nužna odre đena smrtnost kako bi se odredila odgo ­
varajuća doza za glavnu studiju. Me đutim, za prevenciju smrti 
uslijed akutnih kolinergi čkih učinaka, mogu se primijeniti atropin 
ili neki drugi zaštitni agens za koji je poznato da ne ometa odgo đene 
neurotoksi čke reakcije. Za procjenu maksimalne doze ispitivane tvari 
koja ne dovodi do smrtnosti može se upotrijebiti čitav niz ispitnih 
metoda (vidjeti metodu B.1. bis). U odabiru doze isto tako mogu biti 
korisni i ranije prikupljeni podaci o kokošima ili druge toksikološke 
informacije.  
Visina doze ispitivane tvari u glavnoj studiji treba biti što je mogu ća 
viša uzimaju ći u obzir rezultate preliminarne studije za odabir doze i 
gornju granicu visine doze od 2 000 mg/kg tjelesne mase. Even ­
tualna smrtnost do koje može do ći ne bi smjela utjecati na preživ ­
ljavanje dostatnog broja životinja za biokemijsku analizu (šest) i 
histološku analizu (šest) nakon 21 dan. Za prevenciju smrti uslijed akutnih kolinergi čkih učinaka treba koristiti atropin ili neki drugi 
zaštitni agens za koji se zna da ne ometa odgo đene neurotoksi čke 
reakcije.
 
1.5.2.4.  Grani čni test  
Ako test pri visini doze od najmanje 2 000 mg/kg tjelesne mase/dan, 
uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne proizvede vidljive 
toksičke učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim 
tvarima toksi čnost ne o čekuje, studija uz primjenu više doze može se 
smatrati nepotrebnom. Grani čni je test relevantan samo ako izlože ­
nost ljudi ne ukazuje na potrebu za primjenom više doze.  
1.5.3.  Razdoblje opažanja  
Razdoblje opažanja treba biti 21 dan.  
1.5.4.  Postupak  
Nakon primjene zaštitnog agensa kojim se spre čava smrt uslijed 
akutnog kolinergi čkog učinka, ispitivana tvar daje se u jednoj dozi.  
Opća opažanja  
Opažanja trebaju po četi odmah nakon izlaganja. Sve kokoši treba 
pomno opažati nekoliko puta tijekom prva dva dana, a zatim najmanje jednom dnevno tijekom razdoblja od 21 dan ili do plani ­
ranog usmr ćenja. Treba bilježiti sve znakove toksi čnosti, uklju čujući 
vrijeme prve pojave, vrstu, ozbiljnost i trajanje anomalija u ponaša ­
nju. Ataksiju treba mjeriti na uobi čajenoj ljestvici koja obuhva ća 
četiri razine, a paralizu treba zabilježiti. Najmanje dvaput tjedno 
kokoši odabrane za patologiju treba izvaditi iz kaveza i odre đeno 
vrijeme podvrgnuti prisilnoj motornoj aktivnosti, kao što je penjanje po ljestvama, čime će se olakšati opažanje minimalnih toksi čnih 
učinaka. Životinje na umoru i životinje u stanju teške patnje ili 
bola treba ukloniti čim su uo čene, humano usmrtiti i izvršiti 
nekropsiju.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 549
 
Tjelesna masa  
Sve kokoši treba vagati neposredno pred primjenu ispitivane tvari i 
najmanje jednom tjedno nakon toga.  
Biokemijska analiza  
Šest nasumice izabranih kokoši iz svake tretirane skupine i kontrolne 
skupine za nosa č, i tri kokoši iz pozitivne kontrolne skupine (ako se 
ta skupina vodi istodobno), treba usmrtiti nekoliko dana nakon dozi ­
ranja, a mozak i lumbarnu le đnu moždinu preparirati i procijeniti s 
obzirom na aktivnost inhibicije esteraze povezane s neuropatskim 
djelovanjem. Povrh toga, može biti korisno preparirati i analizirati tkivo bedrenog živca s obzirom na aktivnost inhibicije esteraze pove ­
zane s neuropatskim djelovanjem. Obi čno se po tri kokoši iz 
kontrolne i svake tretirane skupine usmrti nakon 24 sata, a tri 
nakon 48 sati, dok se po tri kokoši iz pozitivnih kontrolnih skupina usmrti nakon 24 sata. Ako opažanje klini čkih znakova into ­
ksikacije (koja se često procjenjuje opažanjem vremena prve pojave 
kolinergičkih znakova) ukazuje na to da se toksi čni agens razgra đuje 
vrlo sporo, u tom slu čaju možda je bolje uzorkovati tkivo iz tri 
kokoši dvaput u vremenu izme đu 24 i tek 72 sata nakon doziranja.
 
Na tim uzorcima, ako se smatraju prikladnim, mogu se provoditi i 
analize acetilkolinesteraze (AChE). Me đutim, do spontane reaktiva ­
cije AChE može do ći in vivo , i time dovesti do podcijenjenog poten ­
cijala tvari kao inhibitora esteraze AchE.  
Makroskopska nekropsija  
Makroskopska nekropsija svih životinja (planirano usmr ćenih i usmr ­ 
ćenih zato što su bile na umoru) treba obuhvatiti opažanje izgleda 
mozga i le đne moždine.  
Histopatološki pregled  
Živčano tkivo životinja koje su preživjele razdoblje opažanja i nisu 
upotrijebljene za biokemijske analize treba mikroskopski pregledati. 
Tkiva treba fiksirati  in situ , tehnikama perfuzije. Sekcijom treba 
obuhvatiti  cerebellum  (srednju uzdužnu razinu),  medulla oblongata , 
leđnu moždinu i periferne živce. Sekcije le đne moždine uzimaju se 
iz gornjeg cervikalnog segmenta, regije srednjeg toraksa i 
lumbo-sakralne regije. Treba uzeti sekcije distalne regije tibijalnog 
živca i njegovih grana prema gastrocnemiusu, i sekcije bedrenog živca. Sekcije treba obojiti odgovaraju ćim bojilima za mijelin i 
aksone.
 
2. PODACI  
Negativni rezultati analiza odabranih u ovoj metodi (biokemijske 
pretrage, histopatološke pretrage i opažanje ponašanja) u pravilu ne znače potrebu daljnjeg ispitivanja odgo đene toksičnosti. Za dvosmi ­
slene rezultate ili rezultate iz kojih nije mogu će proizvesti zaklju čke 
može biti potrebno dodatno vrednovanje.
 
Treba osigurati pojedina čne podatke. Dodatno, sve podatke treba 
sažeti u tablici u kojoj treba prikazati broj životinja u svakoj skupini na po četku ispitivanja, broj životinja s lezijama, u čincima 
na ponašanje ili biokemijskim u čincima, tipove i ozbiljnost tih 
lezija ili u činaka te postotak životinja po vrsti i ozbiljnosti lezije 
ili učinka.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 550
 
Nalaze ove studije treba vrednovati s obzirom na u čestalost, ozbilj ­
nost i korelaciju u činaka na ponašanje te biokemijskih i histopatolo ­ 
ških učinaka i eventualnih drugih opaženih u činaka kod tretiranih i 
kontrolnih skupina.  
Numeričke rezultate treba vrednovati odgovaraju ćim opće prihva­
tljivim statisti čkim metodama. Odabir statisti čke metode koja će se 
koristiti obavlja se u okviru planiranja studije.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati slijede će 
informacije:  
3.1. Ispitne životinje:  
— soj koji je upotrijebljen,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja itd.,  
— pojedina čne mase životinja na po četku istraživanja.  
3.2. Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o pripremi ispitivane tvari, njezinoj stabilnosti i 
homogenosti, prema potrebi,  
— opravdanost izbora nosa ča, 
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— pojedinosti o kvaliteti vode i hrane,  
— podloge za odabir visine doze,  
— specifikacija primijenjenih doza, s uklju čenim podacima o 
nosaču, volumenu i fizi čkom obliku u kojem je materijal 
primijenjen,  
— identitet i pojedinosti o eventualnoj primjeni zaštitnog agensa.  
3.3. Rezultati:  
— podaci o tjelesnoj masi,  
— podaci o toksi čkoj reakciji po skupini, uklju čujući smrtnost,  
— karakter, ozbiljnost i trajanje klini čkih opažanja (jesu li reverzi ­
bilna ili ne),  
— iscrpan opis metoda i nalaza biokemijske analize,  
— nalazi nekropsije,  
— iscrpan opis svih histopatoloških nalaza,  
— prema potrebi, statisti čka obrada rezultata.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
Ova je metoda analogna Smjernici za ispitivanje OECD–a TG 418.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 551
 
B.38.  STUDIJA ODGO ĐENE NEUROTOKSI ČNOSTI ORGANOFO ­
SPORNIH TVARI – PONAVLJANO DOZIRANJE TIJEKOM 
28 DANA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Kod procjene i vrednovanja toksi čkih učinaka tvari važno je uzeti u 
obzir potencijal odre đenih klasa tvari da uzrokuju posebne tipove 
neurotoksi čnosti koje možda nije mogu će otkriti u drugim studijama 
toksičnosti. Za neke organofosforne tvari opaženo je da uzrokuju 
odgođenu neurotoksi čnost pa bi trebale postati predmetom 
vrednovanja.  
Za utvrđivanje tvari koje mogu uzrokovati odgo đenu polineuoropa ­
tiju mogu se upotrijebiti testovi probira  in vitro ; međutim, negativni 
nalazi  in vitro  studija nisu dokaz da ispitivana tvar nije neurotoksi ­ 
čna. 
Ovim 28-dnevnim ispitivanjem odgo đene neurotoksi čnosti dobivaju 
se informacije o mogu ćim opasnostima po zdravlje koje bi mogle biti 
izazvane ponavljanim izlaganjem u ograni čenom vremenskom 
razdoblju. Dobivaju se informacije o reakciji na dozu, a može se 
dobiti i procjena visine kod koje se ne opaža štetni u činak, što može 
biti korisno za utvr đivanje sigurnosnih kriterija u pogledu izlaganja.  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Organofosforne tvari obuhva ćaju organofosforne estere bez naboja, 
tioestere ili anhidride organofosforne, organofosfonske ili organofos ­
foramidne kiseline ili srodne fosforotio, fosfonotio ili fosforotioa ­
midne kiseline, ili druge tvari koje mogu uzrokovati odgo đenu 
neurotoksi čnost koje se ponekad vide u toj klasi tvari.  
Odgođena neurotoksi čnost je sindrom koji se povezuje s produženim 
odgođenim vremenom prve pojave ataksije, distalnih aksonopatija u 
leđnoj moždini i perifernom živcu, i inhibiciju i starenje esteraze 
koja je povezana s neuropatskim djelovanjem (neuropathy target 
esterase — NTE) u neuralnom tkivu.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Dnevne doze ispitivane tvari daju se oralno doma ćim kokošima 
kontinuirano 28 dana Životinje se opažaju najmanje jednom dnevno s obzirom na anomalije u ponašanju, ataksiju i paralizu tijekom 14 dana nakon posljednje doze. Biokemijska mjerenja, 
posebno inhibicija esteraze koja je povezana s neuropatskim 
djelovanjem (NTE), provode se na kokošima koje su nasumice odabrane iz svake skupine, obi čno 24 i 48 sati nakon posljednje 
doze. Dva tjedna nakon posljednje doze, preostali broj kokoši se 
usmrti i provede se histopatološka pretraga odabranog neuralnog 
tkiva.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 552
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Pripreme  
Zdrave mlade odrasle kokoši bez virusnih oboljenja koja bi mogla 
utjecati na istraživanje, koje ne primaju nikakve lijekove i ne poka ­
zuju nepravilnosti u hodu treba nasumice odabrati i svrstati u treti ­
rane i kontrolne skupine, te prilago đavati laboratorijskim uvjetima 
najmanje pet dana prije po četka istraživanja.  
Treba koristiti kaveze ili ogra đeni prostor dovoljne veli čine da se 
kokošima omogu ći slobodno kretanje te treba koristiti lako opažanje 
hoda.  
Svakodnevno oralno doziranje ispitivane tvari, sedam dana u tjednu, 
poželjno je provoditi sondom ili primjenom želatinskih kapsula. 
Tekućine se mogu davati nerazrije đene ili otopljene u odgovaraju ćem 
otapalu kao što je kukuruzno ulje; ako je mogu će, krute tvari treba 
otopiti jer apsorpcija velikih doza krute tvari u želatinskim kapsu ­
lama može biti nedovoljno u činkovita. Za sva otapala osim vode, 
toksičke karakteristike moraju biti poznate, a ako nisu, treba ih utvr ­
diti prije ispitivanja.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Ispitne životinje  
Preporuča se koristiti mlade odrasle doma će nesilice ( Gallus gallus 
domesticus ), stare do 12 mjeseci. Treba koristiti pasmine i sojeve 
standardne veli čine i kokoši koje su odrasle u uvjetima koji su im 
omogućivali slobodno kretanje.  
1.4.2.2.  Broj i spol  
Obično se koriste tri tretirane skupine i kontrolna skupina za 
nosač. Kontrolnu skupinu za nosa č treba tretirati na identi čan 
način kao i tretiranu skupinu, osim što se ispitivana tvar ne daje.  
U svakoj skupini treba biti dovoljan broj kokoši kako bi ih se 
najmanje šest moglo usmrtiti za biokemijsku analizu (tri u svakoj 
od dvije vremenske to čke), a šest može preživjeti 14-dnevno 
razdoblje opažanja patologije nakon tretiranja.  
1.4.2.3.  Visine doza  
Visine doza treba odabrati uzimaju ći u obzir rezultate iz testa odgo ­ 
đene neurotoksi čnosti nakon akutnog izlaganja i drugih postoje ćih 
podataka o toksi čnosti ili kinetici ispitivanog spoja. Najvišu dozu 
treba odabrati s ciljem da se izazove toksi čko djelovanje, poželjno 
odgođena neurotoksi čnost, ali ne i smrt ili o čita patnja. Nakon toga 
treba odabirati sve niže doze kako bi se dobile sve reakcije vezane 
uz dozu, i na kraju najniža doza kod koje nema opaženih štetnih 
učinaka.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 553
 
1.4.2.4.  Grani čni test  
Ako test pri visini doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan, 
uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne proizvede vidljive toksičke učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim 
tvarima toksi čnost ne o čekuje, studija uz primjenu više visine doze 
može se smatrati nepotrebnom. Grani čni je test relevantan samo ako 
izloženost ljudi ne ukazuje na potrebu za primjenom više doze.
 
1.4.2.5.  Razdoblje opažanja  
Sve životinje treba opažati najmanje jednom dnevno tijekom 
razdoblja izlaganja i 14 dana nakon toga, osim u slu čajevima plani ­
rane nekropsije.  
1.4.3.  Postupak  
Životinjama se ispitivana tvar daje svakodnevno tijekom 28 dana.  
Opća opažanja  
Opažanja trebaju po četi odmah nakon po četka tretiranja. Sve kokoši 
treba pomno opažati najmanje jednom dnevno svakog dana 28- dnevnog tretiranja i 14 dana nakon doziranja ili do planiranog usmr ­ 
ćenja. Treba bilježiti sve znakove toksi čnosti, uklju čujući vrijeme 
prve pojave, vrstu, ozbiljnost i trajanje anomalija u ponašanju. Opažanjima treba obuhvatiti anomalije u ponašanju, ali se ne smiju ograničiti na njih. Ataksiju treba mjeriti na uobi čajenoj ljestvici koja 
obuhvaća četiri razine, a paralizu treba zabilježiti. Najmanje dvaput 
tjedno kokoši treba izvaditi iz kaveza i odre đeno vrijeme podvrgnuti 
prisilnoj motornoj aktivnosti, kao što je penjanje po ljestvama, čime 
će se olakšati opažanje minimalnih toksi čnih učinaka. Životinje na 
umoru, u stanju teške patnje ili bola treba ukloniti čim su uo čene, 
humano usmrtiti i izvršiti nekropsiju.
 
Tjelesna masa  
Sve kokoši treba vagati neposredno pred prvu primjenu ispitivane 
tvari i najmanje jednom tjedno nakon toga.  
Biokemijska analiza  
Šest nasumice izabranih kokoši iz svake tretirane skupine i kontrolne 
skupine za nosa č treba usmrtiti nekoliko dana nakon posljednje doze, 
a mozak i lumbarnu le đnu moždinu preparirati i analizirati s obzirom 
na aktivnost inhibicije esteraze povezane s neuropatskim djelovanjem (NTE). Povrh toga, može biti korisno preparirati i anali ­
zirati tkivo bedrenog živca s obzirom na aktivnost inhibicije esteraze 
povezane s neuropatskim djelovanjem (NTE). Obi čno se po tri 
kokoši iz kontrolne i svake tretirane skupine usmrti nakon 24 sata, a po tri 48 sati nakon posljednje doze. Ako rezultati studije akutnog djelovanja ili drugih studija (npr. toksikokineti čkih) ukazuju da je 
poželjno odrediti druga čije rokove usmr ćivanja nakon posljednjeg 
doziranja, tada te rokove treba primijeniti i dokumentirati razloge.
 
Na tih uzorcima, ako se smatraju prikladnim, mogu se provoditi i 
analize acetilkolinesteraze (AChE). Me đutim, spontana reaktivacija 
AChE može se dogoditi  in vivo , zbog čega se potencijal tvari da 
djeluje kao inhibitor esteraze AchE može podcijeniti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 554
 
Makroskopska nekropsija  
Makroskopska nekropsija svih životinja (planirano usmr ćenih i usmr ­ 
ćenih zato što su bile na umoru) treba obuhvatiti opažanje izgleda 
mozga i le đne moždine.  
Histopatološki pregled  
Živčano tkivo životinja koje su preživjele razdoblje opažanja i nisu 
upotrijebljene za biokemijske analize treba mikroskopski pregledati. Tkiva treba fiksirati  in situ , tehnikama perfuzije. Sekcijom treba 
obuhvatiti  cerebellum  (mali mozak) (srednju uzdužnu razinu),  
medullu oblongatu  (produljenu moždinu), le đnu moždinu i periferne 
živce. Sekcije le đne moždine uzimaju se iz gornjeg cervikalnog 
segmenta, regije srednjeg toraksa i lumbo-sakralne regije. Treba 
uzeti sekcije distalne regije tibijalnog živca i njegovih grana prema 
gastrocnemiusu, i sekcije bedrenog živca. Sekcije treba obojiti odgo ­
varajućim bojama za mijelin i aksone. U po četku, mikroskopski 
pregled treba provoditi na konzerviranom tkivu svih životinja u 
kontrolnoj skupini i skupini koja je tretirana velikom dozom. Ako 
se učinci utvrde u skupini koja je primala velike doze, mikroskopsku 
pretragu treba provesti i na kokošima iz skupina koje su primale srednju i malu dozu.
 
2. PODACI  
Negativni rezultati analiza odabranih u ovoj metodi (biokemijske 
pretrage, histopatološke pretrage i opažanje ponašanja) u pravilu znače da dodatno ispitivanje odgo đene toksi čnosti nije potrebno 
nastaviti. Kod dvosmislenih rezultata ili rezultata iz kojih nije 
moguće proizvesti zaklju čke može biti potrebno dodatno 
vrednovanje.
 
Treba osigurati pojedina čne podatke. Dodatno, sve podatke treba 
sažeti u tablici u kojoj treba navesti broj životinja u svakoj skupini na početku ispitivanja, broj životinja s lezijama, u čincima na 
ponašanje ili biokemijskim u čincima, tipove i ozbiljnost tih lezija 
ili učinaka, i postotak životinja po vrsti i ozbiljnosti lezije ili u činka.
 
Nalaze ove studije treba vrednovati s obzirom na u čestalost, ozbilj ­
nost i korelaciju u činaka na ponašanje, te biokemijskih i histopatolo ­ 
ških učinaka i eventualnih drugih opaženih u činaka kod tretiranih ili 
kontrolnih skupina.  
Numeričke rezultate treba vrednovati odgovaraju ćim opće prihva­
tljivim statisti čkim metodama. Odabir statisti čke metode koja će se 
koristiti obavlja se u okviru planiranja studije.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju treba, ako je mogu će, sadržavati slijede će 
informacije:  
3.1. Ispitne životinje:  
— soj koji je upotrijebljen,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja itd.,  
— pojedina čne mase životinja na po četku ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 555
 
3.2. Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o pripremi ispitivane tvari, njezinoj stabilnosti i 
homogenosti, prema potrebi,  
— opravdanost izbora nosa ča, 
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
— podloge za odabir visine doze,  
— specifikacija primijenjenih doza, s uklju čenim podacima o 
nosaču, volumenu i fizi čkom obliku u kojem je materijal 
primijenjen,  
— podloge za izbor drugih rokova za biokemijsku analizu, ako nisu 
24 i 48 sati.  
3.3. Rezultati:  
— podaci o tjelesnoj masi,  
— podaci o toksi čkoj reakciji po visini doze, uklju čujući smrtnost,  
— visina doze kod koje se ne uo čava štetni u činak,  
— karakter, ozbiljnost i trajanje klini čkih opažanja (jesu li reverzi ­
bilna ili ne),  
— iscrpan opis metoda i nalaza biokemijske analize,  
— nalazi nekropsije,  
— iscrpan opis svih histopatoloških nalaza,  
— prema potrebi, statisti čka obrada rezultata.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
Ova je metoda analogna Smjernici za ispitivanje OECD–a TG 419.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 556
 
B.39.  TEST NEPLANIRANE SINTEZE DNK (UDS) NA STANICAMA 
JETRE SISAVACA IN VIVO  
1. METODA  
Ova je metoda replika Smjernice za ispitivanje OECD–a TG 486, 
Test neplanirane sinteze DNK (UDS) na stanicama jetre sisavaca  in 
vivo (1997.)  
1.1. UVOD  
Test neplanirane sinteze DNK (Unscheduled DNA Synthesis, UDS) 
na stanicama jetre sisavaca  in vivo  provodi se kako bi se utvrdilo 
koje ispitivane tvari u stanicama jetre tretiranih životinja induciraju popravak DNK (vidjeti 1., 2., 3., 4.).
 
Ovaj  in vivo  test predstavlja metodu za istraživanje genotoksi čkih 
učinaka kemikalija u jetri. Izmjereni u činak pokazatelj je ošte ćenja 
i naknadnog popravka DNK u stanicama jetre. Jetra je obi čno glavno 
mjesto metabolizma apsorbiranih spojeva. Stoga je prikladna za mjerenje ošte ćenja DNK  in vivo .
 
Ovaj test nije primjeren ako je o čito da ispitivana tvar ne će stići do 
ciljnog tkiva.  
Neplanirana sinteza DNK (UDS) mjeri se odre đivanjem ugradnje 
obilježenih nukleozida u stanice u kojima se ne odvija planirana sinteza DNK (S-faza). Naj češće primjenjivana tehnika je odre đivanje 
ugradnje timidina obilježenog tritijem (
 3 H-TdR) autoradiografijom. 
Za ispitivanja neplanirane sinteze DNK  in vivo  poželjno je koristiti 
jetru štakora. Mogu se koristiti i druga tkiva osim jetre, ali ona nisu predmet ove metode.
 
Otkrivanje neplanirane sinteze DNK (UDS) ovisi o broju baza DNK 
odstranjenih ekscizijom i zamijenjenih na mjestu ošte ćenja. Stoga je 
test neplanirane sinteze DNK (UDS) posebno koristan za otkrivanje 
popravaka dugih sekvenci (20-30 baza). Suprotno tomu, popravak kratkih sekvenci (1-3 baze) otkriva se uz znatno nižu osjetljivost. Nadalje, uslijed izostanka popravka, pogrešnog popravka ili pogre ­ 
šnog repliciranja DNK lezija može do ći do mutagenih doga đanja. 
Jačina neplanirane sinteze DNK (UDS) nije pokazatelj da je 
postupak popravka vjeran. Nadalje, mogu će je da mutagen reagira 
s DNK, ali da se ošte ćenje DNK ne popravi postupkom ekscizije. 
Izostanak posebnih informacija o aktivnosti mutagena u testu nepla ­
nirane sinteze DNK (UDS) nadokna đuje se potencijalnom osjetlji ­
vošću tog kriterija jer se isti mjeri u cijelom genomu.
 
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio B.  
1.2. DEFINICIJE  
Stanice u tijeku popravka:  neto broj zrnaca u jezgri (NNG) ve ći od 
unaprijed postavljene vrijednosti, razlog čega treba utvrditi u labora ­
toriju koji provodi test.  
Neto broj zrnaca u jezgri (NNG):  količinski izmjerena aktivnost 
neplanirane sinteze DNK stanica u autoradiografskom UDS testu, 
koja se izra čunava oduzimanjem prosje čnog broja zrnaca na površi ­
nama citoplazme koje su ekvivalentne jezgri (CG) od broja zrnaca u jezgri (NG): NNG = NG – CG. Iznosi NNG izra čunavaju se za 
pojedinačne stanice i zatim objedinjuju za stanice u kulturi, para ­
lelnim kulturama itd.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 557
 
Neplanirana sinteza DNK (UDS):  sinteza za popravak DNK nakon 
ekscizije i odstranjenja onog niza DNK koji obuhva ća područje 
oštećenja koje je izazvano kemijskim tvarima ili fizi čkim agensom.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivanje neplanirane sinteze DNK (UDS) u stanicama jetre sisa ­
vaca in vivo  pokazatelj je sinteze za popravak DNK nakon ekscizije i 
odstranjenja niza DNK koji sadrži podru čje oštećenja izazvanog 
kemijskim tvarima ili fizi čkim agensom. Pokus se obi čno temelji 
na ugradnji  3 H-TdR u DNK stanica jetre koje imaju nisku frekven ­
ciju stanica u S fazi stani čnog ciklusa. Ugradnja  3 H-TdR obi čno se 
određuje autoradijografijom, jer ta tehnika nije toliko osjetljiva na 
interferenciju uslijed stanica S-faze kao, primjerice, scintilacijski 
brojači. 
1.4. OPIS METODE  
1.4.1.  Pripreme  
1.4.1.1.  Odabir životinjskih vrsta  
Obično se koriste štakori, iako se može koristiti bilo koja prikladna 
vrsta sisavaca. Treba koristiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji se obi čno koriste u laboratorijskim istraživanjima. Na po četku 
studije odstupanje mase životinja treba biti minimalno i ne smije 
prelaziti ± 20 % srednje mase za svaki spol.
 
1.4.1.2.  Uvjeti smještaja i prehrane  
Primjenjuju se op ći uvjeti navedeni u Op ćem uvodu, dio B, iako bi 
ciljna vrijednost vlage trebala biti 50-60 %.  
1.4.1.3.  Priprema životinja  
Zdrave mlade odrasle životinje biraju se nasumice i raspodjeljuju u 
kontrolne skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba urediti 
na način da se eventualni u činci držanja u kavezu svedu na mini ­
mum. Životinje se jednozna čno identificiraju i drže u kavezima 
najmanje pet dana prije po četka studije kako bi se prilagodile labo ­
ratorijskim uvjetima.  
1.4.1.4.  Ispitivana tvar/Pripravak  
Prije no što se doza daje životinjama, krute ispitivane tvari po 
potrebi treba otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim otapalima ili 
nosačima i razrijediti. Teku će ispitivane tvari mogu se dozirati 
izravno ili razrijediti prije doziranja. Ako prema podacima o stabil ­
nosti skladištenje nije prihvatljivo, pripravke ispitivane tvari treba 
koristiti svježe.  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Otapalo/Nosa č 
Pri visinama doza koje se koriste, otapalo/nosa č ne smije imati 
toksičke učinke i ne smije postojati sumnja da bi mogao kemijski 
reagirati s ispitivanim tvarima. Ako se primjenjuju manje poznata otapala/nosa či, njihovo bi uklju čivanje u ispitivanje trebalo biti 
potkrijepljeno podacima koji dokazuju njihovu pogodnost. Kad god 
je to mogu će preporu ča se najprije razmotriti mogu ćnost primjene 
vodenog otapala/nosa ča.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrole  
U svaki dio pokusa koji se provodi neovisno, treba uklju čiti para­
lelne pozitivne i negativne kontrole (otapalo/nosa č). Osim tretiranja 
ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba 
postupati jednako kao sa životinjama u tretiranim skupinama.  
Pozitivne kontrole su tvari za koje je poznato da izazivaju neplani ­
ranu sintezu DNK (UDS) ako se primjenjuju na razinama izlaganja kod kojih se o čekuje uočljivo pove ćanje u odnosu na podlogu. Pozi ­
tivne kontrole za koje je potrebna metaboli čka aktivacija treba kori ­
stiti u dozama koje izazivaju umjerenu reakciju (4). Doze se mogu birati na na čin da učinci budu jasni, ali da osoba koja o čitava rezul ­
tate ipak ne može odmah vidjeti identitet kodiranih mikroskopskih 
preparata. Primjeri tvari za pozitivnu kontrolu obuhva ćaju:
 
Vrijeme uzorkovanja  Tvar  CAS br.  EINECS br.  
Rano uzorkovanje (2-4 sata)  N-Nitrosodimetilamin  62-75-9  200-249-8  
Kasno uzorkovanje (12-16 sati)  N-2-Fluorenilacetamid (2-AAF)  53-96-3  200-188-6  
Za pozitivnu kontrolu mogu se koristiti i druge tvari. Prihvatljivo je 
tvari za pozitivnu kontrolu primijeniti putem koji se razlikuje od puta primjene ispitivane tvari.
 
1.5. POSTUPAK  
1.5.1.  Broj i spol životinja  
Treba koristiti odgovaraju ći broj životinja kako bi se mogle uzeti u 
obzir prirodne biološke razlike u pojedinoj ispitivanoj reakciji. Broj životinja treba odrediti na na čin da po skupini bude najmanje tri 
životinje pogodne za analizu. Ako iz ranijih studija postoji zna čajna 
baza podataka, u paralelnim negativnim i pozitivnim kontrolnim skupinama dovoljno je imati samo jednu ili dvije životinje.
 
Ako su u vrijeme provo đenja studije dostupni podaci iz studija 
provedenih na istoj životinjskoj vrsti uz primjenu istog puta izlaga ­
nja, koji dokazuju da nema znatnih razlika u toksi čnosti s obzirom 
na spol, ispitivanje na jednom spolu, po mogu ćnosti mužjacima, bit 
će dovoljno. U slu čajevima kad izloženost ljudi nekoj kemikaliji 
može biti vezana uz spol, kao što je slu čaj s nekim farmaceutskim 
sredstvima, test treba obaviti na životinjama odgovaraju ćeg spola.  
1.5.2.  Plan tretiranja  
Ispitivane tvari obi čno se primjenjuju jednokratno.  
1.5.3.  Visine doze  
Obično se koriste barem dvije visine doze. Najviša se doza definira 
kao doza koja uzrokuje takve znakove toksi čnosti da je za o čekivati 
da bi više doze pri istom režimu doziranja prouzro čile smrt. Op će­
nito, niža doza treba iznositi 50 % do 25 % visoke doze.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 559
 
Tvari koje u niskim netoksi čnim dozama imaju specifi čno biološko 
djelovanje (poput hormona i mitogena) mogu biti izuzete od kriterija 
za utvrđivanje doza te ih se treba ocjenjivati od slu čaju do slu čaja. 
Ako se u nedostatku odgovaraju ćih podataka provodi studija za utvr ­ 
đivanje raspona, studiju treba provesti isti laboratorij, na istoj vrsti, 
soju, spolu i s istim režimom tretiranja kao i u glavnoj studiji.  
Najviša se doza isto tako može definirati kao doza koja uzrokuje 
pojavu nekih pokazatelja toksi čnosti u jetri (npr. piknotiza jezgre).  
1.5.4.  Grani čni test  
Ako test pri jednoj visini doze od najmanje 2 000 mg/kg tjelesne 
mase, primijenjenoj jednokratno ili u dva tretiranja istog dana, ne proizvede vidljive toksi čke učinke i ako se na temelju podataka o 
strukturno srodnim tvarima genotoksi čnost ne o čekuje, potpuna 
studija možda nije potrebna. O čekivana izloženost ljudi može 
ukazati na potrebu da se u grani čnom testu primijeni viša doza.
 
1.5.5.  Primjena doza  
Ispitivana se tvar obi čno primjenjuje unošenjem pomo ću želučane 
sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile. Drugi putevi primjene 
mogu biti prihvatljivi ako se za njih može dokazati da su opravdani. 
Međutim, intraperiotonealni put primjene ne preporu ča se jer bi na 
taj način jetra bila izložena ispitivanoj tvari izravno, a ne preko 
sustava cirkulacije. Maksimalni volumen teku ćine koji se odjednom 
može primijeniti putem sonde ili injekcije ovisi o veli čini pokusne 
životinje. Taj volumen ne bi smio biti ve ći od 2 ml/100 g tjelesne 
mase. Opravdanost primjene ve ćih volumena od navedenog treba 
dokazati. Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih tvari, koje pri 
višim koncentracijama obi čno izazivaju negativne u činke, variranje 
ispitnih volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih koncentracija osigurao stalni volumen.
 
1.5.6.  Pripravci stanica jetre  
Stanice jetre tretiranih životinja prepariraju se 12-16 sati nakon dozi ­
ranja. Dodatno ranije uzorkovanje (naj češće dva do četiri sata nakon 
tretiranja) obi čno je potrebno ako u tom roku 12-16 sati izostane 
jasna pozitivna reakcija. Me đutim, mogu će je primijeniti i alter ­
nativne rokove uzorkovanja ako je to opravdano na temelju toksiko ­
kinetičkih podataka.  
Kratkotrajne kulture stanica jetre sisavaca obi čno se dobivaju perfu ­
zijom jetre  in situ  kolagenazom nakon čega se pusti da se svježe 
odvojene stanice jetre priljube uz prikladnu površinu. Stanice jetre životinja iz negativne kontrolne skupine životinja trebaju imati 
preživljavanje (5) od najmanje 50 %.
 
1.5.7.  Odre đivanje neplanirane sinteze DNK (UDS)  
Svježe izolirane stanice jetre sisavaca obi čno se dovoljno dugo, npr. 
3-8 sati, inkubiraju medijem koji sadrži  3 H-TdR. Na kraju razdoblja 
inkubacije, medij treba odstraniti iz stanica koje zatim treba inkubi ­
rati medijem koji sadrži prekomjernu koli činu neobilježenog timidina 
kako bi se umanjila radioaktivnost preostala nakon ugradnje („cold 
chase”). Stanice se zatim isperu, fiksiraju i osuše. Za produžena 
vremena inkubacije postupak „cold chase” možda ne će biti potreban. 
Preparati se umo če u emulziju za autoradiografiju i ostave izloženi u 
mraku (npr. hla đeni tijekom 7-14 dana), razviju se, boje, te se zatim 
prebrojavaju izložena srebrna zrnca. Za svaku životinju pripreme se 
dva do tri preparata.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 560
 
1.5.8.  Analiza  
Pripremljeni preparati moraju sadržavati dovoljan broj stanica 
normalne morfologije kako bi se omogu ćila smislena procjene nepla ­
nirane sinteze DNK (UDS). Preparati se pregledavaju mikroskopski 
kako bi se utvrdili znakovi otvorene citotoksi čnosti (npr. piknoza, 
smanjene razine obilježavanja radioaktivnim izotopom).  
Prije brojanja zrnca preparate treba kodirati. Obi čno se analizira 100 
stanica svake životinje na temelju najmanje dva preparata; ako se analizira manje od 100 stanica/životinji, za to treba navesti opravdani 
razlog. Broj zrnaca ne analizira se za jezgru S-faze, ali omjer stanica 
S-faze može se zabilježiti.
 
Količinu 3 H-TdR ugra đenu u jezgru i citoplazmu morfološki 
normalnih stanica, koja se uo čava deponiranim srebrnim zrncima, 
treba utvrditi prikladnim metodama.  
Broj zrnaca odre đuje se u jezgri (zrnca jezgre, NG) i na površinama 
citoplazme koje su ekvivalentne jezgri (zrnca citoplazme, CG). Broj 
zrnaca CG odre đuje se bilo na temelju najja če obilježene površine 
citoplazme, ili iz prosjeka od dva do tri broja zrnaca citoplazme iz nasumice odabranih površina u blizini jezgre. Mogu se primijeniti i druge metode brojanja (npr. brojanje cijele stanice), ako se njihova 
opravdanost može dokazati (6).
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Treba osigurati preparate i podatke za svaku životinju pojedina čno. 
Dodatno, podatke treba sažeti u tabli čnom obliku. Neto broj zrnaca 
jezgre (NNG) izra čunava se za svaku stanicu, svaku životinju i za 
svaku dozu i vrijeme oduzimanjem broja CG od broja NG. Ako se broje „stanice u tijeku popravka”, opravdanost kriterija za njihovo definiranje treba dokazati i temeljiti na ranije poznatim podacima ili 
podacima iz paralelne negativne kontrolne skupine. Ako se primje ­
njuju, statisti čke testove treba odabrati i njihovu opravdanost doka ­
zati prije provo đenja studije.
 
2.2. VREDNOVANJE I TUMA ČENJE REZULTATA  
Primjeri kriterija na temelju kojih se može donijeti zaklju čak o pozi ­
tivnoj/negativnoj reakciji uklju čuju: 
pozitivna  i.  vrijednosti NNG iznad unaprijed postavljenog 
praga čija je opravdanost dokazana na temelju 
povijesnih laboratorijskih podataka; ili  
ii. vrijednosti NNG znatno ve će od paralelne 
kontrole;  
negativna  i.  vrijednosti NNG unutar/ispod povijesnog 
praga kontrole; ili  
ii. vrijednosti NNG koje nisu znatno ve će od 
paralelne kontrole.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 561
 
Treba razmotriti biološku relevantnost podataka: tj. uzeti u obzir 
parametre kao što su varijacije izme đu pojedinih životinja, odnos 
doza-reakcija i citotoksi čnost. Kao pomo ć u vrednovanju rezultata 
testa mogu se koristiti statisti čke metode. Me đutim, statisti čki značaj 
ne bi smio biti jedini čimbenik na temelju kojeg se zaklju čuje da je 
reakcija pozitivna.  
Iako će većina pokusa dati jasne pozitivne ili negativne rezultate, u 
rijetkim slu čajevima set prikupljenih podataka ne će omogućiti dono­ 
šenje kategori čkog zaklju čka o aktivnosti ispitivane tvari. Bez obzir 
na broj ponavljanja pokusa, rezultati mogu ostati dvosmisleni ili 
upitni.  
Pozitivan rezultat testa neplanirane sinteze DNK (UDS) na stanicama 
jetre sisavaca  in vivo  pokazuje da ispitivana tvar inducira ošte ćenje 
DNK u stanicama jetre sisavaca  in vivo  koje se može popraviti 
neplaniranom sintezom DNK  in vitro . Negativan rezultat pokazuje 
da, u ispitnim uvjetima, ispitivana tvar ne inducira ošte ćenje DNK 
koje se može otkriti ovim pokusom.  
Vjerojatnost da je ispitivana tvar stigla do glavnog krvotoka ili 
konkretno do ciljnog tkiva (npr. sustavna toksi čnost) treba raspraviti.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora, sadržavati slijede će informacije:  
Otapalo/nosa č: 
— opravdanost odabira nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, ako su 
poznate.  
Ispitne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku ispitivanja, uklju ­ 
čujući raspon tjelesnih masa, srednje i standardno odstupanje za 
svaku skupinu.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pozitivna i negativna kontrola za nosa č/otapalo,  
— podaci iz studije za utvr đivanje raspona, ako je provedena,  
— podloge za odabir visine doze,  
— pojedinosti o pripravcima ispitivane tvari,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— podloge za odabir puta primjene,  
— metode za verifikaciju da je ispitivani agens stigao do glavnog 
krvotoka ili ciljnog tkiva, ako je primjenljivo,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 562
 
— način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), ako je 
primjenljivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,  
— detaljan opis plana tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— metoda za izradu pripravaka i kulture stanica jetre,  
— upotrijebljena tehnika autoradiografije,  
— broj pripravljenih preparata i broj analiziranih stanica,  
— kriteriji za vrednovanje,  
— kriteriji prema kojima se studija smatra pozitivnom, negativnom 
ili dvosmislenom.  
Rezultati:  
— srednje vrijednosti broja zrnaca u jezgri, zrnaca u citoplazmi i 
neto broja zrnaca u jezgri po pojedina čnom preparatu, životinji i 
skupini,  
— odnos doza-reakcija, ako je dostupan,  
— statisti čka procjena, ako postoji,  
— znakovi toksi čnosti,  
— podaci o paralelnoj negativnoj kontroli (otapalo/nosa č) i pozi­
tivnoj kontroli,  
— povijesni podaci o negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama s rasponima, prosje čnim vrijednostima i standardnim 
odstupanjima,  
— broj „stanica u tijeku popravka”, ako je utvr đen 
— broj stanica S-faze, ako je utvr đen, 
— preživljavanje stanica.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G., 
(1985) An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, str. 1-18.  
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G., (1987) A Protocol 
and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. 
Mutation Res., 189, str. 123-133.  
(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G., (1993)  In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) 
Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, str. 52-77.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, H., (1993) Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and  In Vivo . Mutation Res., 312, str. 263-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C., (1993) Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Muta ­
tion Res., 291, str. 21-27.  
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E., (1982) Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  Hepato­
cyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, str. 553-562.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 564
 
B.40.  NAGRIZANJE KOŽE  IN VITRO:  TEST TRANSKUTANOG 
ELEKTRI ČNOG OTPORA (TER)  
1. METODA  
Ova je ispitna metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispiti ­
vanje OECD–a TG 430 (2004.).  
1.1. UVOD  
Nagrizanje kože odnosi se na uzrokovanje ireverzibilnog ošte ćenja 
kože nakon primjene ispitivanog materijala (prema definiciji iz Globalno uskla đenog sustava razvrstavanja i ozna čavanja kemijskih 
tvari i mješavina (GHS)) (1). Ova metoda predvi đa postupak kojim 
se procjena nagrizaju ćeg djelovanja ne provodi na živim životinjama.
 
U procjenama nagrizaju ćeg djelovanja na kožu tradicionalno se 
upotrebljavaju laboratorijske životinje (2). U brizi za životinje i u 
nastojanju da se životinjama u tom postupku ne nanosi bol i patnja, 
ispitna metoda B.4. revidirana je kako bi se njome omogu ćilo odre­ 
đivanje nagrizaju ćeg djelovanja na kožu alternativnim,  in vitro  
metodama.  
Prvi korak prema definiranju alternativnih pokusa koji se mogu kori ­
stiti za ispitivanje nagrizaju ćeg djelovanja na kožu u regulatorne 
svrhe bilo je provo đenje predvalidacijskih studija (3). Nakon toga, 
za in vitro  metode za procjenu nagrizaju ćeg djelovanja na kožu 
(4)(5) provedena je formalna validacijska studija (6)(7)(8). Na temelju rezultata tih istraživanja i druge objavljene literature dana je preporuka da se za procjenu nagrizaju ćeg djelovanja na kožu  in 
vivo mogu koristiti sljede ći testovi (9)(10)(11): test na modelu 
ljudske kože (vidjeti metodu B.40. bis) i test transkutanog elektri čnog 
otpora (ova metoda).
 
U validacijskoj studiji i drugim objavljenim studijama utvr đeno je da 
je testom transkutanog elektri čnog otpora (TER) na koži štakora 
(12)(13) mogu će pouzdano razlikovati poznata i nepoznata sredstva 
s nagrizaju ćim djelovanjem na kožu (5)(9).  
U ovoj metodi opisuje se pokus koji omogu ćuje identifikaciju nagri ­
zajućih kemijskih tvari i mješavina. Osim toga, oslanjaju ći se na 
druge elemente za odre đivanje utemeljene na postoje ćim informaci ­
jama (npr. pH vrijednost, odnos izme đu strukture i aktivnosti, podaci 
za ljude/životinje) (1)(2)(11)(14), metoda omogu ćuje identifikaciju i 
nenagrizaju ćih tvari i mješavina. Ne pruža informacije o nadražu ­
jućem djelovanju na kožu niti omogu ćuje daljnje razvrstavanje nagri ­
zajućih tvari prema Globalno uskla đenom sustavu 
razvrstavanja (GHS) (1).  
Za potpuno vrednovanje lokalnih u činaka na kožu nakon jedno ­
strukog dermalnog izlaganja, preporu ča se poštivati strategiju 
sekvencijalnog ispitivanja predstavljenu u Dodatku ispitnoj metodi 
B.4. (2) i predvi đenu Globalno uskla đenim sustavom (1). Ta ispitna 
strategija obuhva ća provođenje in vitro  pokusa za dokazivanje nagri ­
zajućeg (kao što se opisuje u ovoj metodi) i nadražuju ćeg djelovanja 
na kožu prije eventualnog provo đenja ispitivanja na živim životi ­
njama.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 565
 
1.2. DEFINICIJE  
Nagrizanje kože  in vivo : uzrokovanje ireverzibilnog ošte ćenja kože; 
točnije, pojava vidljive nekroze epiderme i derme nakon što je ispi ­
tivana tvar primjenjivana u trajanju od najviše 4 sata. Za nagrizanje 
kože tipična je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, na kraju 
14-dnevnog opažanja, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, čitave površine zahva ćene alopecijom i ožiljci. Za ocjenjivanje 
sumnjivih lezija treba razmotriti mogu ćnost histopatoloških pretraga.
 
Transkutani elektri čni otpor (TER):  mjera elektri čne impedancije 
kože, izražena kao vrijednost otpora u kilo omima. Jednostavna, 
robusna metoda za procjenu zaštitne funkcije bilježenjem prolaza 
iona kroz kožu primjenom Wheatstoneovog mosta.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Tablica 1.  
Referentne kemikalije  
Naziv  EINECS br.  CAS br.  
1,2-diaminopropan  201-155-9  78-90-0  Jako nagrizaju ća tvar  
Akrilna kiselina  201-177-9  79-10-7  Jako nagrizaju ća tvar  
2-tert. butilfenol  201-807-2  88-18-6  Nagrizaju ća tvar  
Kalijev hidroksid (10 %)  215-181-3  1310-58-3  Nagrizaju ća tvar  
Sumporna kiselina (10 %)  231-639-5  7664-93-9  Nagrizaju ća tvar  
Oktanska kiselina (kaprilna kise ­
lina) 204-677-5  124-07-02  Nagrizaju ća tvar  
4-amino-1,2,4-triazol  209-533-5  584-13-4  Nije nagrizaju ća tvar  
Eugenol  202-589-1  97-53-0  Nije nagrizaju ća tvar  
Fenetil bromid  203-130-8  103-63-9  Nije nagrizaju ća tvar  
Tetrakloroetilen  204-825-9  27-18-4  Nije nagrizaju ća tvar  
Izostearinska kiselina  250-178-0  30399-84-9  Nije nagrizaju ća tvar  
4-(metiltio)-benzaldehid  222-365-7  3446-89-7  Nije nagrizaju ća tvar  
Većina navedenih kemikalija uzeta je iz popisa kemikalija odabranih 
za međunarodnu validacijsku studiju Europskog centra za validaciju 
alternativnih metoda (ECVAM). Odabrane su na temelju sljede ćih 
kriterija:  
i. jednak broj tvari koje imaju nagrizaju će djelovanje i tvari bez 
nagrizajućeg djelovanja;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 566
 
ii. komercijalno dostupne tvari iz ve ćine relevantnih kemijskih 
klasa;  
iii. uključivanje jako nagrizaju ćih kao i manje nagrizaju ćih tvari 
kako bi se omogu ćilo razlikovanje na temelju sposobnosti 
nagrizanja;  
iv. izbor kemikalija kojima se može rukovati u laboratoriju jer ne 
predstavljaju druge velike opasnosti osim nagrizanja.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivani materijal primjenjuje se u trajanju od 24 sata na epider ­
malne površine diskova kože u dvodjelnom ispitnom sustavu u 
kojem diskovi kože djeluju kao pregrada izme đu dva odjeljka. 
Diskovi kože uzeti su od humano usmr ćenih štakora u dobi 28-30 
dana. Nagrizaju ći materijali identificirani su prema sposobnosti da 
dovedu do gubitka integriteta i zaštitne funkcije normalnog  stratum 
corrneum , koja se mjeri kao smanjenje TER vrijednosti ispod razine 
praga (12). Za TER vrijednosti za štakore, vrijednost praga u iznosu od 5 κΩ odabrana je na temelju mnogobrojnih podataka za široki niz 
kemikalija kod kojih je velika ve ćina vrijednosti jasno bila ili znatno 
iznad (često > 10 κΩ), ili znatno ispod ( često < 3 κΩ) te vrijednosti 
(12). Općenito, materijali koji na životinje ne djeluju nagrizaju će već 
su nadražuju ći ili nenadražuju ći ne smanjuju TER ispod te vrijed ­
nosti praga. Nadalje, uporaba drugih pripravaka kože ili druge 
opreme može modificirati vrijednost praga, što zna či da je potrebna 
dodatna validacija.
 
U ispitni postupak ugra đena je i faza vezanja boje kojom se potvr ­ 
đuju pozitivni rezultati za TER u vrijednostima oko 5 κΩ. 
Postupkom vezanja boje odre đuje se može li se pove ćanje ionske 
permeabilnosti pripisati fizi čkom uništenju  stratum corrneum . Poka­
zalo se da se TER metodom uz primjenu kože štakora može pred ­
vidjeti nagrizaju će djelovanje  in vivo  kod zečeva koji su procjenji ­
vani ispitnom metodom B.4. (2). U tom smislu, treba napomenuti da 
je pokus koji se provodi  in vivo  na zečevima izuzetno konzervativan 
s obzirom na nagrizanje kože i na nadraživanje kože u usporedbi s testom krpice na modelu ljudske kože (human skin patch test) (15).
 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Životinje  
Štakori su najprikladnije životinje za ovu metodu jer je osjetljivost 
njihove kože na kemikalije u ovom testu prethodno dokazana (10). Dob (u kojoj se koža prikuplja) i soj štakora posebno su važni kako 
bi se osiguralo da folikuli dlake budu u latentnoj fazi prije po četka 
rasta odraslih dlaka.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 567
 
Dlaka na le đima i bokovima mladih, približno 22 dana starih 
mužjaka ili ženki štakora (soja Wistar ili nekog usporedivog soja) 
pažljivo se ukloni malim škarama. Životinje se zatim operu nježnim brisanjem dok se ošišana površina umo či u antibiotsku otopinu (koja 
sadrži, primjerice, streptomicim, penicilin, kloramfenikol i amfote ­
ricin u koncentracijama koje su u činkovite u inhibiciji rasta bakteri ­
ja). Životinje se ponovno operu antibioticima tre ćeg ili četvrtog dana 
nakon prvog pranja i koriste u roku tri dana nakon drugog pranja, kad se  stratum corrneum  oporavio od odstranjivanja dlake.
 
1.5.2.  Priprema diskova kože  
Životinje se humano usmrte kad su stare 28-30 dana; ta je dob 
veoma važna. Sa svake životinje odstrani se bo čna koža na le đima 
s koje se opreznim ljuštenjem oguli prekomjerna potkožna mast. 
Odstrane se diskovi kože, u promjeru približno 20 mm svaki. Prije 
uporabe diskova koža se može skladištiti ako se pokaže da su rezul ­
tati za pozitivnu i negativnu skupinu istovjetni rezultatima dobivenim sa svježom kožom.
 
Po jedan disk stavi se preko jednog kraja teflonske (politetrafluoroe ­
tilenske) cijevi, osiguravaju ći da je epidermalna površina u dodiru s 
cijevi. Gumeni O-prsten pritisne se preko ruba cijevi kako bi se učvrstila koža, a višak tkiva se odreže. Dimenzije cijevi i 
O-prstenova prikazane su na slici 2. Gumeni O-prsten zatim se 
dužinom ruba teflonske cijevi oprezno zabrtvi petrolejskim gelom. 
Cijev se uvede u prihvatnu komoru koja sadrži otopinu MgSO
 4 (154 
mM) u kojoj je pridržava opružna štipaljka (Slika 1.). Disk kože treba potpuno potopiti u otopinu MgSO
 4 . Od kože jednog štakora 
može se dobiti čak 10-15 diskova kože za pokus.  
Prije početka pokusa, mjeri se elektri čni otpor dva kožna diska kao 
postupak kojim se kontrolira kvaliteta kože svake životinje. Kako bi se preostali diskovi te kože mogli koristiti u pokusu, oba kontrolna diska moraju dati vrijednosti otpora iznad 10 κΩ. Ako je vrijednost 
otpora ispod 10 κΩ, preostale diskove te kože treba baciti.
 
1.5.3.  Primjena ispitivanih i kontrolnih tvari  
Kako bi se osigurala odgovaraju ća učinkovitost pokusnog modela, za 
svaku studiju treba koristiti paralelne pozitivne i negativne kontrole. 
Treba koristiti diskove kože jedne životinje. Kao pozitivne i nega ­
tivne kontrolne tvari predlaže se 10 M klorovodi čna kiselina, 
odnosno destilirana voda.  
Tekuće ispitivane tvari (150 μL) primjenjuju se ravnomjerno na 
epidermalnu površinu unutar cijevi. Kod ispitivanja krutih materijala, 
dovoljna koli čina krute tvari primjenjuje se ravnomjerno na disk 
kako bi se osigurala pokrivenost cijele epiderme. Na krutu tvar dodaje se deionizirana voda (150 μL), i cijev se pažljivo protrese. 
Za postizanje maksimalnog dodira s kožom, krute tvari možda treba 
zagrijati na 30 °C kako bi se ispitivana tvar rastopila ili omekšala, ili 
samljeti kako bi se dobio zrnati materijal ili prah.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 568
 
Za svaki pokus i kontrolnu tvar koriste se tri diska kože. Ispitivane 
tvari primjenjuju se 24 sata na 20-23 °C. Ispitivana tvar uklanja se 
ispiranjem pod mlazom vode iz vodovoda temperature do 30 °C sve dok sav materijal nije odstranjen.
 
1.5.4.  Mjerenja transkutanog elektri čnog otpora (TER)  
Impedancija kože, odnosno transkutani elektri čni otpor (TER) mjeri 
se Wheatstoneovim mjernim mostom na niskonaponsku izmjeni čnu 
struju (13). Op će specifikacije mosta su radni napon 1-3 Volti, 
izmjenična struja sinusnog ili pravokutnog oblika 50 – 1 000 Hz, i 
mjerno podru čje od najmanje 0,1 – 30 κΩ. Mjerni most koji je 
korišten u validacijskoj studiji mjerio je indukciju, kapacitet i otpor 
do vrijednosti 2 000 H, 2 000 μF, odnosno 2 ΜΩ, kod frekvencija 
od 100 Hz ili 1 kHz, primjenom serijskih ili paralelnih vrijednosti. U svrhu pokusa otkrivanja nagrizaju ćeg djelovanja, mjerenja transku ­
tanog elektri čnog otpora bilježena su kod frekvencije 100 Hz 
primjenom serijskih vrijednosti. Prije mjerenja elektri čnog otpora, 
površinska napetost kože smanjuje se dodavanjem dovoljnog volu ­
mena 70 %-tnog etanola koji se nanosi na epidermu. Nakon nekoliko 
sekundi, etanol se uklanja iz cijevi, a tkivo se hidratizira dodavanjem 
3 ml otopine MgSO
 4 (154 mM). Elektrode mjernog mosta postav ­
ljaju se na drugu stranu diska kože i mjeri se otpor u κΩ/disku kože 
(Slika 1.). Dimenzije elektrode i duljina elektrode izložena ispod 
krokodilskih štipaljki prikazane su na slici 2. Štipaljka na unutarnjoj 
elektrodi za vrijeme mjerenja stoji na vrhu teflonske cijevi kako bi se osiguralo da u otopinu MgSO
 4 bude uronjena stalno ista duljina 
elektrode. Vanjska elektroda postavlja se unutar komore na na čin 
da stoji na dnu komore. Razmak izme đu opružne štipaljke i dna 
teflonske cijevi održava se stalnim (Slika 2.), jer ta udaljenost utječe na dobivene vrijednosti otpora. Zbog toga, razmak izme đu 
unutarnje elektrode i diska kože treba biti stalan i minimalan 
(1-2 mm).
 
Ako je izmjerena vrijednost otpora ve ća od 20 κΩ, to može biti 
posljedica preostalog sloja ispitivane tvari na epidermalnoj površini 
diska kože. Ponovno treba pokušati ukloniti taj sloj, primjerice, na način da se teflonska cijev zatvori pritiskom prsta zašti ćenog ruka ­
vicom i protresa približno 10 sekundi; otopina MgSO
 4 baca se i 
mjerenje otpora ponavlja se s novom otopinom MgSO  4 . 
Svojstva i dimenzije ispitnog ure đaja i primijenjen ispitni postupak 
mogu utjecati na dobivene vrijednosti transkutanog elektri čnog 
otpora. Prag od 5 κΩ za nagrizaju će djelovanje odre đen je iz poda ­
taka dobivenih konkretnim ure đajem i postupkom opisanim u ovoj 
metodi. Ako se ispitni uvjeti izmijene ili se primijeni druga čiji 
uređaj, mogu vrijediti druga čiji pragovi i kontrolne vrijednosti. 
Stoga je potrebno kalibrirati metodologiju i vrijednosti praga otpora ispitivanjem niza referentnih etalona odabranih izme đu kemi­
kalija koje su korištene u validacijskoj studiji (4)(5), ili kemikalija 
koje su iz kemijski sli čnih klasa kao kemikalije koje se istražuju. Niz 
odgovaraju ćih referentnih kemikalija naveden je u tablici 1.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 569
 
1.5.5.  Metode vezanja boje  
Izlaganje odre đenih nenagrizaju ćih materijala može rezultirati 
smanjenjem otpora na vrijednost ispod praga od 5 κΩ koja dozvo ­
ljava prolaz iona kroz  stratum corneum , čime se elektri čni otpor 
smanjuje (5). Na primjer, neutralne organske kemikalije i kemikalije 
koje imaju površinski aktivna svojstva (uklju čujući deterdžente, 
emulgatore i druge surfaktante) mogu iz kože odstraniti lipide i time pove ćati propusnost zaštite za ione. Zna či, ako su vrijednosti 
transkutanog elektri čnog otpora (TER) ispitivanih tvari manje od ili 
oko 5 κΩ bez vidljivog ošte ćenja, na kontrolnom i tretiranom tkivu 
treba provesti procjenu penetracije boje kako bi se odredilo jesu li te 
dobivene vrijednosti TER rezultat pove ćane propusnosti kože, ili 
nagrizanja kože (3)(5). Ako se radi o nagrizaju ćem djelovanju, 
odnosno o pucanju  stratum corneum , boja sulfo-rodamin B, kad se 
nanese na površinu kože, brzo prodire i boji potkožno tkivo. Ta 
konkretna boja stabilna je na širok raspon kemikalija i na nju ne 
utječe postupak ekstrakcije opisan dalje u tekstu.
 
1.5.5.1.  Primjena i odstranjivanje boje sumpor-rodamin B  
Nakon procjene vrijednosti TER, magnezijev se sulfat evakuira iz 
cijevi i koža se pažljivo pregleda s obzirom na vidljiva ošte ćenja. 
Ako očitih velikih ošte ćenja nema, 150 μl 10 %-tne (w/v) otopine 
boje sulfo-rodamin B (Acid Red 52; C.I. 45100; EINECS broj 222- 
529-8; CAS broj 3520-42-1) u destiliranoj vodi primjenjuje se na 
epidermalnu površinu svakog diska kože tijekom dva sata. Zatim se ti diskovi kože približno 10 sekundi ispiru vodom iz slavine čija 
temperatura nije viša od temperature okoline kako bi se time 
uklonio višak boje ili nevezana boja. Svaki se disk kože oprezno 
skine s teflonske cijevi i stavi u tikvicu (npr. tikvicu od 20 ml za scintilaciju koja sadrži deioniziranu vodu (8 ml). Tikvice se nježno tresu pet minuta kako bi se odstranila eventualna preostala nevezana 
boja. Zatim se ponavlja postupak ispiranja, nakon kojega se diskovi 
kože skidaju i stavljaju u tikvice koje sadrže 5 ml 30 %-tnog (w/v) natrijevog dodecil sulfata (SDS) u destiliranoj vodi i ostave se inku ­
birati preko no ći na 60 °C.
 
Nakon inkubacije, svaki disk kože skida se i baca, a preostala 
otopina centrifugira se osam minuta na 21 °C (relativna centrifugalna snaga ~175 × g). Uzorak od 1 ml supernatanta razrijedi se u omjeru 1:5 (v/v) (tj. 1 ml + 4 ml) s 30 %-tnim (w/v) natrijevim dodecil 
sulfatom (SDS) u destiliranoj vodi. Opti čka gustoća (OD) otopine 
mjeri se na 565 nm.
 
1.5.5.2.  Izračun sadržaja boje  
Sadržaj boje sulfo-rodamin B po disku izra čunava se iz vrijednosti 
optičke gusto će (OD) (5) (koeficijent molarne ekstinkcije 
sulfo-rodamina B na 565 nm = 8,7 × 10  4 ; molekulska masa = 
580). Sadržaj boje odre đuje se za svaki disk kože primjenom odgo ­
varajuće kalibracijske krivulje, zatim se za ponovljene pokuse izra ču­
nava srednji sadržaj boje.  
2. PODACI  
Po mogućnosti, vrijednosti otpora ( κΩ) i srednje vrijednosti sadržaja 
boje (μg/disku) za ispitivani materijal, kao i za pozitivne i negativne 
kontrole, treba zabilježiti u tabli čnom obliku (podaci pojedina čnih 
pokusa ± standardno odstupanje), uklju čujući podatke za ponovljene 
pokuse, srednje i pojedina čne vrijednosti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 570
 
2.1. TUMA ČENJE REZULTATA  
Srednji rezultati TER vrijednosti prihvatljivi su ako su vrijednosti 
paralelne pozitivne i negativne kontrole unutar prihvatljivog podru čja 
za dotičnu laboratorijsku metodu ispitivanja. Prihvatljivo podru čje 
otpora za metodologiju i ure đaj opisano u gornjem tekstu navedeno 
je u sljede ćoj tablici:  
Kontrola  Tvar  Područje otpora 
(κΩ) 
Pozitivna  10M klorovodi čna kiselina  0,5-1,0  
Negativna  Destilirana voda  10-25  
Srednji rezultati vezanja boje prihvatljivi su pod uvjetom da su 
vrijednosti paralelne kontrole unutar podru čja za doti čnu metodu. 
Predloženi prihvatljivi rasponi sadržaja boje za kontrolne tvari za 
metodologiju i ure đaj opisan u gornjem tekstu navedeni su u slje ­
dećoj tablici:  
Kontrola  Tvar  Raspon 
sadržaja boje 
(μg/disku)  
Pozitivna  10M klorovodi čna kiselina  40-100  
Negativna  Destilirana voda  15-35  
Ispitivana tvar ne smatra se nagrizaju ćom za kožu:  
i. ako je za ispitivanu tvar postignuta srednja vrijednost TER ve ća 
od 5 κΩ; ili 
ii. je srednja vrijednost TER manja od ili jednaka 5 κΩ; i 
— disk kože ne pokazuje vidljivo ošte ćenje, i  
— srednji sadržaj boje po disku znatno je ispod srednjeg sadržaja 
boje po disku koji je dobiven u paralelnom pokusu za tvar 10M HCl u pozitivnoj kontroli.
 
Ispitivana tvar smatra se nagrizaju ćom za kožu:  
i. ako je srednja vrijednost TER manja od ili jednaka 5 κΩ i disk 
kože je vidljivo ošte ćen; ili  
ii. je srednja vrijednost TER manja od ili jednaka 5 κΩ; i 
— disk kože ne pokazuje vidljivo ošte ćenje, ali  
— srednji sadržaj boje po disku ve ći je ili jednak srednjem sadr ­ 
žaju boje po disku koji je dobiven u paralelnom pokusu za 
tvar 10M HCl u pozitivnoj kontroli.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 571
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
Ispitivana i kontrolna tvar:  
— kemijski naziv(i) kao što su IUPAC ili CAS naziv, i CAS broj, 
ako je poznat,  
— čistoća i sastav tvari ili pripravka (u težinskom postotku) i fizi ­
kalna priroda,  
— fizikalno-kemijska svojstva kao što su fizikalna priroda, pH, 
stabilnost, topljivost u vodi, relevantna za provo đenje studije,  
— obrada ispitivanih/kontrolnih tvari prije ispitivanja, ako je 
primjenljivo (npr. grijanje, mljevenje),  
— stabilnost, ako je poznata.  
Ispitne životinje:  
— soj i spol koji je upotrijebljen,  
— starost životinja kad su upotrijebljene kao donorske životinje,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,  
— pojedinosti o pripravcima kože.  
Uvjeti ispitivanja:  
— kalibracijske krivulje za ispitni ure đaj, 
— kalibracijske krivulje za provo đenje testa vezanja boje,  
— pojedinosti o ispitnom postupku upotrijebljenom za mjerenja 
TER,  
— pojedinosti o ispitnom postupku za procjenu vezivanja boje; ako 
je primjereno,  
— opis svake eventualne izmjene ispitnih postupaka,  
— opis kriterija koji su primijenjeni za vrednovanje.  
Rezultati:  
— tablični podaci iz pokusa za utvr đivanje vrijednosti TER i vezi ­
vanja boje (ako je primjereno) za pojedina čne životinje i pojedi ­
načne uzorke kože,  
— opis svih zapaženih u činaka.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) OECD, (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. 
olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 572
 
(2) Ispitna metoda B.4. Akutna toksi čnost: nadraživanje/nagrizanje 
kože.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., 
Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and 
Balls, M., (1995) A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, str. 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxicology.  In Vitro  12, 
str. 471-482.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology.  In Vitro  12, str. 483- 524.
 
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, str. 62.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, str. 129-147.
 
(8) ICCVAM, (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods)., (1997) Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.  
(9) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275-280.  
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 
1st–2nd November 2001, Secretariat’s Final Summary 
Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
 
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C., (1986) An  
in vitro  skin corrosivity test – modifications and validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J., (1992) The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic.  In Vitro  6, str. 191-194.  
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile D.J., Liebsch, M., (1998) An Evalua ­
tion of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corro ­
sion. ATLA 26, str. 709-720  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M., (1997) The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, str. 
845-852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C., (1988) An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxicology  In Vitro . 2, str. 7-17.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 574
 
Slika 1.  
Uređaj za pokus transkutanog elektri čnog otpora (TER) na koži štakora
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 575
 
Slika 2.  
Dimenzije upotrijebljene teflonske (politetrafluoroetilenske – PTFE) i prihvatne cijevi i 
elektroda
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 576
 
Kritični faktori ure đaja prikazanog na gornjoj slici:  
— unutarnji promjer teflonske (PTFE) cijevi,  
— duljina elektroda u odnosu na teflonsku i prihvatnu cijev: duljina 
treba biti takva da elektrode ne dodiruju disk kože i da je duljina 
elektrode u dodiru s otopinom MgSO  4 standardna,  
— količina otopine MgSO  4 u prihvatnoj cijevi: dubina teku ćine u 
odnosu na razinu u teflonskoj cijevi treba biti kao što prikazuje 
slika 1.,  
— disk kože treba biti dobro pri čvršćen na teflonsku cijev, kako bi 
izmjereni elektri čni otpor vjerno odražavao svojstva kože.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 577
 
B.40 BIS.  NAGRIZANJE KOŽE  IN VITRO:  TEST NA MODELU 
LJUDSKE KOŽE  
1. METODA  
Ova je ispitna metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispiti ­
vanje OECD–a TG 431 (2004).  
1.1. UVOD  
Nagrizanje kože odnosi se na uzrokovanje ireverzibilnog ošte ćenja 
kože nakon primjene ispitivanog materijala (prema definiciji iz 
Globalno uskla đenog sustava razvrstavanja i ozna čavanja kemijskih 
tvari i mješavina (GHS)) (1). Kod ove ispitne metode, za procjenu nagrizajućeg djelovanja na kožu nije potrebno upotrebljavati žive 
životinje ni životinjsko tkivo.
 
U procjenama nagrizaju ćeg djelovanja na kožu tradicionalno se 
upotrebljavaju laboratorijske životinje (2). U brizi za životinje i u nastojanju da se u tom postupku izbjegne bol i patnja životinja, 
ispitna metoda B.4. revidirana je kako bi se njome omogu ćilo odre­ 
đivanje nagrizaju ćeg djelovanja na kožu alternativnim  in vitro  meto­
dama kojima se životinjama ne nanosi bol ni patnja.
 
Prvi korak prema definiranju alternativnih pokusa koji se mogu kori ­
stiti za ispitivanje nagrizaju ćeg djelovanja na kožu u regulatorne 
svrhe bilo je provo đenje predvalidacijskih studija (3). Nakon toga, 
za metode za procjenu nagrizaju ćeg djelovanja na kožu  in vitro  
(4)(5), provedena je formalna validacijska studija (6)(7)(8). Na 
temelju rezultata tih studija i druge objavljene literature (9) dana je preporuka da se za procjenu nagrizaju ćeg djelovanja na kožu  in vivo  
mogu koristiti sljede ći testovi (10)(11)(12)(13): test na modelu 
ljudske kože (ova metoda) i test transkutanog elektri čnog otpora 
(vidjeti ispitnu metodu B.40.).
 
Validacijske studije pokazale su da je testovima na modelima ljudske 
kože (3)(4)(5)(9) mogu će pouzdano razlikovati poznata sredstva s 
nagrizajućim djelovanjem na kožu od sredstava koja na kožu ne 
djeluju nagrizaju će. Ispitni protokol tako đer može sadržavati poka ­
zatelje na temelju kojih je mogu će razlikovati sredstva s jakim nagri ­
zajućim djelovanjem od sredstava sa slabijim nagrizaju ćim 
djelovanjem.  
U ovoj metodi opisuje se pokus koji omogu ćuje identifikaciju nagri ­
zajućih kemijskih tvari i mješavina. Osim toga, oslanjaju ći se na 
druge elemente za odre đivanje utemeljene na postoje ćim informaci ­
jama (npr. pH vrijednost, odnos izme đu strukture i aktivnosti, podaci 
za ljude i/ili životinje) (1)(2)(13)(14), metoda dodatno omogu ćuje 
identifikaciju i nenagrizaju ćih tvari i mješavina. Obi čno ne pruža 
adekvatne informacije o nadražuju ćem djelovanju na kožu niti 
omogućuje daljnje razvrstavanje nagrizaju ćih tvari prema Globalno 
usklađenom sustavu razvrstavanja (GHS) (1).  
Za potpuno vrednovanje lokalnih u činaka na kožu nakon jedno ­
strukog dermalnog izlaganja, preporu ča se poštivati strategiju 
sekvencijskog ispitivanja predstavljenu u Dodatku ispitnoj metodi 
B.4. (2) i predvi đenu Globalno uskla đenim sustavom (GHS) (1). 
Ta ispitna strategija obuhva ća provođenje in vitro  pokusa za doka ­
zivanje nagrizaju ćeg (kao što se opisuje u ovoj metodi) i nadražu ­
jućeg djelovanja na kožu prije eventualnog provo đenja ispitivanja na 
živim životinjama.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 578
 
1.2. DEFINICIJE  
Nagrizanje kože  in vivo : uzrokovanje ireverzibilnog ošte ćenja kože; 
točnije, vidljive nekroze epiderme i derme nakon što je ispitivana 
tvar primjenjivana u trajanju od najviše 4 sata. Za nagrizanje kože 
tipična je pojava čireva, krvarenja, krvavih krasta te, na kraju 14- 
dnevnog opažanja, gubitak boje kože zbog nestajanja pigmenta, čitave površine zahva ćene alopecijom i ožiljci. Za ocjenjivanje 
sumnjivih lezija treba razmotriti mogu ćnost histopatoloških pretraga.
 
Preživljavanje stanica:  parametar koji mjeri ukupnu aktivnost popu ­
lacije stanica (npr. sposobnost stani čnih mitohondrijskih dehidroge ­
naza da reduciraju vitalnu boju MTT) i koji, u zavisnosti o mjerenom 
kriteriju i izvedbi testa koji se upotrebljava, korelira s ukupnim 
brojem i/ili vitalnoš ću stanica.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Tablica 1.  
Referentne kemikalije  
Naziv  EINECS br.  CAS br.  
1,2-diaminopropan  201-155-9  78-90-0  Jako nagrizaju ća tvar  
Akrilna kiselina  201-177-9  79-10-7  Jako nagrizaju ća tvar  
2-tert. butilfenol  201-807-2  88-18-6  Nagrizaju ća tvar  
Kalijev hidroksid (10 %)  215-181-3  1310-58-3  Nagrizaju ća tvar  
Sumporna kiselina (10 %)  231-639-5  7664-93-9  Nagrizaju ća tvar  
Oktanska kiselina (kaprilna kise ­
lina) 204-677-5  124-07-02  Nagrizaju ća tvar  
4-amino-1,2,4-triazol  209-533-5  584-13-4  Nije nagrizaju ća tvar  
Eugenol  202-589-1  97-53-0  Nije nagrizaju ća tvar  
Fenetil bromid  203-130-8  103-63-9  Nije nagrizaju ća tvar  
Tetrakloroetilen  204-825-9  27-18-4  Nije nagrizaju ća tvar  
Izostearinska kiselina  250-178-0  30399-84-9  Nije nagrizaju ća tvar  
4-(metiltio)-benzaldehid  222-365-7  3446-89-7  Nije nagrizaju ća tvar  
Većina navedenih kemikalija preuzeta je iz popisa kemikalija 
odabranih za me đunarodnu validacijsku studiju Europskog centra 
za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) (4). Odabrane su na 
temelju sljede ćih kriterija:  
i. jednak broj nagrizaju ćih i nenagrizaju ćih tvari;  
ii. komercijalno dostupne tvari iz ve ćine relevantnih kemijskih 
klasa;  
iii. uključivanje jako nagrizaju ćih kao i slabije nagrizaju ćih tvari 
kako bi se omogu ćilo razlikovanje na temelju potencijala 
nagrizanja;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 579
 
iv. izbor kemikalija kojima se može rukovati u laboratoriju, a da ne 
predstavljaju druge velike opasnosti osim nagrizanja.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitni materijal primjenjuje se lokalno na trodimenzionalni model 
ljudske kože koji minimalno obuhva ća rekonstruiranu epidermu s 
funkcionalnim  stratum corneum . Nagrizaju ći materijali utvr đuju se 
na temelju toga koliko su sposobni smanjiti preživljavanje stanica 
(kako se utvr đuje, primjerice, pokusom MTT redukcije (15)) ispod 
utvrđene grani čne vrijednosti kod odre đenih razdoblja izlaganja. 
Načelo testa s modelom ljudske kože temelji se na pretpostavci da 
nagrizajuće kemikalije mogu penetrirati kroz  stratum corneum  putem 
difuzije ili erozije, i citotoksi čne su za slojeve stanice ispod tog sloja.  
1.4.1.  Postupak  
1.4.1.1.  Modeli ljudske kože  
Modeli ljudske kože mogu se izraditi ili komercijalno nabaviti (npr. 
modeli EpiDerm™ i EPISKIN™) (16)(17)(18)(19) ili se mogu 
razviti ili izraditi u ispitnom laboratoriju (20)(21). Uvažava se da upotreba ljudske kože podliježe nacionalnim i me đunarodnim 
etičkim načelima i okolnostima. Svaki novi model treba validirati 
(najmanje do mjere opisane u 1.4.1.1.2.). Modeli ljudske kože koji 
se upotrebljavaju za ovo ispitivanje moraju ispunjavati sljede će 
uvjete:
 
1.4.1.1.1. O p ć i u v j e t i k o j e m o d e l m o r a z a d o v o l j a v a t i :  
Za izgradnju epitela treba koristiti ljudske keratinocite. Model kože 
mora sadržavati funkcionalni  stratum corneum  ispod kojega se 
nalaze višestruki slojevi živih epitelnih stanica. Model kože mora imati i stromalni sloj.  Stratum corneum  mora biti višeslojni s 
takvim profilom lipida koji je potreban kako bi funkcionirao kao 
robusna zaštita protiv brze penetracije citotoksi čnih markera. 
Model mora imati svojstvo izolacije kako bi sprije čio prolaz mate ­
rijala oko  stratum corneum  na živo tkivo. Prolaz ispitivanih kemi ­
kalija oko  stratum corneum  dovest će do lošeg modela izlaganja 
kože. Model kože ne smije pokazivati nikakav oblik kontaminacije bakterijama (uklju čujući mikoplazmu) ili gljivicama.
 
1.4.1.1.2. F u n k c i o n a l n i u v j e t i k o j e m o d e l m o r a 
z a d o v o l j a v a t i :  
Razina preživljavanja obi čno se odre đuje bojom MTT ili drugim 
metabolički pretvorenim vitalnim bojama. U ovim primjerima 
optička gustoća (OD) boje koja je ekstrahirana (otopljena) iz nega ­
tivnog kontrolnog tkiva treba biti najmanje 20 puta ve ća od opti čke 
gustoće ekstrakcijskog otapala (za pregled, vidjeti (22)). Negativno 
kontrolno tkivo mora biti stabilno u kulturi (tj. treba dati sli čne 
rezultate mjerenja preživljavanja) za vrijeme trajanja izlaganja za 
potrebe testa.  Stratum corneum  treba biti dovoljno čvrst kako bi 
onemogućio brzu penetraciju odre đenih citotoksi čnih markera (npr. 
1 % Triton X-100). Ovo je svojstvo mogu će procijeniti na temelju 
vremena izlaganja koje je potrebno da bi se preživljavanje stanice 
umanjilo 50 % (ET  50 ) (npr. za modele EpiDerm™ i EPISKIN™, to 
je > 2 sata). Za tkivo mora postojati dokaz sposobnosti reprodukcije u vremenu, a poželjno je da ti dokazi potje ču iz razli čitih laborato ­
rija. Osim toga, kad se koristi u odabranom ispitnom protokolu, mora 
omogućiti predvi đanje potencijalnog nagrizaju ćeg djelovanja refe ­
rentnih kemikalija (vidjeti tablicu 1.).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 580
 
1.4.1.2.  Primjena ispitivanih i kontrolnih tvari  
Za svako tretiranje (vrijeme izlaganja), uklju čujući i kontrole, koriste 
se dva identi čna primjerka tkiva. Za teku će materijale, dovoljna 
količina ispitivane tvari primjenjuju se ravnomjerno na površinu 
kože: treba upotrijebiti minimalno 25 μl/cm  2 . Kod ispitivanja 
krutih materijala, koža se ravnomjerno prekrije dovoljnom koli činom 
krute tvari i navlaži deioniziranom ili destiliranom vodom kako bi se osiguralo dobro prianjanje s kožom. Prema potrebi, krutine prije 
primjene treba samljeti u prah. Metodu primjene treba prilagoditi 
ispitivanoj tvari (vidjeti npr. referencu 5). Na kraju razdoblja izla ­
ganja ispitivanu tvar treba pažljivo oprati s površine kože odgovara ­
jućom puferskom otopinom, ili 0,9 % NaCl.
 
Za svaku studiju treba koristiti paralelne pozitivne i negativne 
kontrole kako bi se postigao odgovaraju ći učinak pokusnog 
modela. Kao pozitivna kontrolna tvar predlaže se ledena octena kiselina ili 8N KOH. Kao negativna kontrolna tvar predlaže se 
0,9 % NaCl ili voda.
 
1.4.1.3.  Mjerenja preživljavanja stanica  
Za mjerenje preživljavanja stanica mogu se koristiti samo validirane 
kvantitativne metode. Osim toga, mjerilo preživljavanja mora biti 
kompatibilno upotrebi u trodimenzionalnom uzroku tkiva. Nespeci ­
fično vezanje boje ne smije biti prepreka za mjerenje preživljavanja. 
Stoga boje koje za vezivanje koriste protein i boje koje ne prolaze metaboličku pretvorbu (npr. neutralno crvena) nisu prikladne. U 
pokusu se naj češće upotrebljava redukcija MTT (3-(4,5-dimetiltia ­
zol-2il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavi: EINECS br. 206-069-5, CAS br. 298-93-1)), za koju je dokazano da daje točne i ponovljive rezultate (5), ali se mogu koristiti i druge. 
Uzorak kože ostavi se u otopini MTT odgovaraju će koncentracije 
(npr. 0,3-1 mg/ml) na primjerenoj temperaturi inkubacije tijekom tri sata. Talog plavog formazona zatim se ekstrahira upotrebom otapala 
(izopropanol), a koncentracija formazona mjeri se odre đivanjem 
optičke gustoće OD na valnim duljinama izme đu 540 i 595 nm.
 
Kemijsko djelovanje ovog ispitivanog materijala na vitalnu boju 
može oponašati djelovanje stani čnog metabolizma, što može 
dovesti do pogrešne procjene preživljavanja. Dokazano je da se to 
događa ako taj ispitivani materijal nije u potpunosti odstranjen s kože 
ispiranjem (9). Ako ispitivani materijal izravno djeluje na vitalnu boju, treba primijeniti dodatne kontrole kako bi se otkrio i ispravio utjecaj ispitivanih tvari na mjerenje preživljavanja (9)(23).
 
2. PODACI  
Za svako tkivo treba navesti u tabli čnom obliku vrijednosti opti čke 
gustoće i izračunati prosjek podataka o stani čnom preživljavanju za 
ispitivani materijal, pozitivne i negativne kontrole, uklju čujući 
podatke o srednjim i pojedina čnim vrijednostima iz istovjetnih 
ponovljenih pokusa.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 581
 
2.1. TUMA ČENJE REZULTATA  
Vrijednosti opti čke gustoće OD mogu se koristiti za izra čun postotka 
preživljavanja koji se odnosi na negativnu kontrolu, a proizvoljno je postavljen na 100 %. Grani čnu vrijednost preživljavanja stanica, izra ­ 
ženu postotkom, koja služi za razlikovanje nagrizaju ćih od nenagriza ­
jućih ispitivanih materijala (ili za razlikovanje izme đu raznih klasa 
nagrizajućeg djelovanja), ili statisti čki postupak ili postupke koji se 
koriste za vrednovanje rezultata i identifikaciju nagrizaju ćih materijala 
treba jasno definirati i dokumentirati, te dokazati da su odgovaraju ći. 
Općenito, te se grani čne vrijednosti utvr đuju tijekom optimalizacije 
pokusa, ispituju u predvalidacijskoj fazi i potvr đuju u validacijskoj 
studiji. Primjeri predvi đanja nagrizaju ćeg djelovanja na kožu koje se 
dovodi u vezu s modelom EpiDerm™ su (9):
 
Ispitivana tvar smatra se nagrizaju ćom za kožu:  
i. ako je preživljavanje nakon tri minute izlaganja manje od 50 %; 
ili 
ii. ako je preživljavanje nakon tri minute izlaganja ve će od ili 
jednako 50 %, a preživljavanje nakon izlaganja od 1 sat manje od 15 %.
 
Ispitivana tvar ne smatra se nagrizaju ćom za kožu:  
i. ako je preživljavanje nakon tri minute izlaganja ve će od ili 
jednako 50 %, a preživljavanje nakon izlaganja od 1 sat ve će 
od ili jednako 15 %.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
Ispitivana i kontrolna tvar:  
— kemijski naziv(i) kao što su IUPAC ili CAS naziv i CAS broj, 
ako je poznat,  
— čistoća i sastav tvari ili pripravka (u težinskom postotku),  
— fizikalno-kemijska svojstva kao što su fizikalna priroda, pH, 
stabilnost, topljivost u vodi, relevantna za provo đenje studije,  
— obrada ispitivanih/kontrolnih tvari prije ispitivanja, ako je 
primjenljivo (npr. grijanje, mljevenje),  
— stabilnost, ako je poznata.  
Dokazivanje opravdanosti odabranog modela kože i protokola koji 
su upotrijebljeni.  
Uvjeti ispitivanja:  
— stanični sustav koji je upotrijebljen,  
— informacije o kalibraciji mjernog ure đaja koji je upotrijebljen za 
mjerenje preživljavanja stanica (npr. spektrofotometar),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 582
 
— potpune popratne informacije o konkretnom modelu kože koji je 
upotrijebljen, uklju čujući i rok trajanja,  
— pojedinosti o ispitnom postupku koji je primijenjen,  
— doze koje su primijenjene u testu,  
— opis svake eventualne izmjene ispitnog postupka,  
— reference na povijesne podatke za doti čni model,  
— opis kriterija vrednovanja koji su primijenjeni.  
Rezultati:  
— tablični prikaz podataka za pojedina čne ispitne uzorke,  
— opis drugih zapaženih u činaka.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključak. 
4. REFERENCE  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical 
Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 
(2) Ispitna metoda B.4. Akutna toksi čnost: nadraživanje/nagrizanje 
kože.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., 
Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., (1995) A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report recommendations of ECVAM 
Workshop 6 ATLA 23, str. 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxicology In Vitro 12, str. 471-482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  In Vitro  12, str. 483-524.
 
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, str. 62.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, str. 129-147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods)., (1997) Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, 
P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G., (2000) The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, str. 371-401.
 
(10) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, str. 
275-280.  
(11) ECVAM, (2000) ECVAM News & Views. ATLA 28, str. 
365-67.  
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(13) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 
1st–2nd November 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
 
(14) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M., (1998) An Evalua ­
tion of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corro ­
sion. ATLA 26, str. 709-720.  
(15) Mosmann, T., (1983) Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, str. 55-63.  
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klau ­
sner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicology  In Vitro  8, str. 889-891.
 
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terisation of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, str. 211-225.
 
(18) Tinois, E., Gaetani, Q., Gayraud, B., Dupont, D., Rougier, A., 
Pouradier, D.X., (1994) The Episkin model: Successful recon ­
struction of human epidermis in vitro. In  In vitro  Skin Toxi ­
cology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach, str. 133-140
 
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post–transplantation differentia ­
tion of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193, str. 310-319
 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H., (1992) The organotypic culture of human 
skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, str. 163-171.
 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L., (1994) Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, str. 747-756.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J., (1995) A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, str. 69-84.
 
(23) Fentem, J.H., Briggs, D. „Chesne”, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, 
J.J.M., and Botham, P.A., (2001) A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology In Vitro 15, str. 57-93.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 585
 
B.41.  TEST FOTOTOKSI ČNOSTI  IN VITRO  3T3 NRU  
1. METODA  
Ova je metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispitivanje 
OECD–a TG 432 (2004).  
1.1. UVOD  
Fototoksi čnost je definirana kao toksi čka reakcija uslijed primjene 
tvari na tijelo, koja je ili izazvana ili pove ćana (očita kod nižih razina 
doze) nakon naknadnog izlaganja svjetlu, ili koja je inducirana izla ­
ganjem kože zra čenju nakon sustavne primjene tvari.  
Test fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU koristi se za utvr đivanje foto ­
toksičnog potencijala ispitivane tvari koji inducira pobu đena kemi ­
kalija nakon izlaganja svjetlu. Ovim se testom foto-citotoksi čnost 
procjenjuje relativnim smanjenjem preživljavanja stanica koje su izložene kemikaliji u prisutnosti odnosno izostanku svjetla. Tvari identificirane ovim testom vjerojatno su fototoksi čne in vivo  nakon 
sustavne primjene na kožu i difuzije u kožu, ili nakon lokalne 
primjene.
 
Za mnoge vrste kemikalija navedeno je da izazivaju fototoksi čne 
učinke (1)(2)(3)(4). Zajedni čka im je osobina sposobnost apsorpcije 
svjetlosne energije u spektru sun čeve svjetlosti. Prema prvom zakonu 
fotokemije (Grotthaus-Draperov zakon), za fotoreakciju potrebna je 
apsorpcija dovoljnog broja kvanata svjetla. Stoga, prije nego što se razmišlja o provo đenju biološkog ispitivanja, za ispitivanu tvar treba 
odrediti UV/vidljivi spektar apsorpcije prema Smjernici o ispitivanju 
OECD-a 101. Ako je koeficijent molarne ekstinkcije/apsorpcije 
manji od 10 litara × mol
 -1 × cm  -1 , smatra se da kemikalija nema 
fotoreaktivni potencijal. Takvu kemikaliju nije potrebno podvr ći testu 
fototoksičnosti  in vitro  3T3 NRU niti bilo kojem drugom biološkom 
ispitivanju s ciljem utvr đivanja štetnih fotokemijskih u činaka (1)(5). 
Također vidjeti Dodatak 1.  
Pouzdanost i relevantnost testa fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU 
vrednovana je nedavno (6)(7)(8)(9). Pokazalo se da je testom fototo ­
ksičnosti  in vitro  3T3 NRU mogu će predvidjeti u činke akutne foto ­
toksičnosti kod životinja i ljudi  in vivo . Test nije namijenjen za 
predviđanje drugih štetnih u činaka do kojih može do ći kombiniranim 
djelovanjem kemikalije i svjetla, tj. test ne ispituje fotogenotoksi č­
nost, fotoalergiju i fotokarcinogenost niti omogu ćuje procjenu foto ­
toksičnog potencijala. Osim toga, ovaj je test namijenjen ispitivanju 
posrednih mehanizama fototoksi čnosti, učinaka metabolita ispitivane 
tvari, ili u činaka smjesa.  
Dok je upotreba metaboli čkih sustava op ći uvjet kod svih pokusa  in 
vitro  koji se koriste za predvi đanje genotoksi čkog i karcinogenog 
potencijala, kad se radi o fototoksikologiji, do sada je poznat tek poneki rijetki primjer kemikalije kojoj je potrebna metaboli čka trans­
formacija kako bi mogla djelovati kao fototoksin  in vivo  ili in vitro . 
Stoga se smatra da u prisutnosti sustava metaboli čke aktivacije ovaj 
test nije potrebno niti je znanstveno opravdano provoditi.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 586
 
1.2. DEFINICIJE  
Zračenje:  jakost pojave ultraljubi častog (UV) ili vidljivog svjetla na 
nekoj površini, mjerena u W/m  2 ili mW/cm  2 . 
Doza svjetla:  količina (= jakost × vrijeme) pojave 
ultraljubičastog (UV) ili vidljivog zra čenja na nekoj površini, izra ­ 
žena u džulima (= W × s) po jedinici površine, npr. J/m  2 ili J/cm  2 . 
Valne duljine UV svjetla:  oznake koje preporu ča Međunarodna 
komisija za osvjetljenje, CIE (Commission International de l’Eclai ­
rage) su: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) i UVC (100-280 
nm). Koriste se i druge oznake; podjela izme đu UVB i UVA obi čno 
se postavlja na 320 nm, a UVA se može podijeliti na UV-A1 i UV-A2 s podjelom na oko 340 nm.
 
Preživljavanje stanica:  parametar za mjerenje ukupne aktivnosti 
populacije stanica (npr. ugradnja vitalne boje Neutral Red u stani čne 
lizosome) koji, u zavisnosti o mjerenom kriteriju i izvedbi testa koji se upotrebljava, korelira s ukupnim brojem i/ili vitalnoš ću stanica.
 
Relativno preživljavanje stanica:  preživljavanje stanica izraženo u 
odnosu na kontrole otapala (negativne) tijekom cijelog ispitnog postupka (bilo + Irr ili –Irr), ali bez tretiranja ispitivanom kemikalijom.
 
PIF (Photo Irritation Factor – faktor foto-nadražuju ćeg djelova ­
nja):  faktor koji se dobije usporedbom dvije jednako u činkovite 
citotoksične koncentracije (IC  50 ) ispitivane kemikalije dobivene bez 
prisutnosti (-Irr) i u prisutnosti (+ Irr) necitotoksi čnog zračenja UVA/ 
vidljivog svjetla.  
IC 50 : koncentracija ispitivane kemikalije kod koje je preživljavanje 
stanice smanjeno 50 %.  
MPE (Mean Photo Effect – srednji foto u činak):  mjerenje izve ­
deno iz matemati čke analize krivulja reakcija na koncentracije dobi ­
vene bez prisutnosti (-Irr) i u prisutnosti (+ Irr) necitotoksi čnog 
zračenja UVA/vidljivog svjetla.  
Fototoksi čnost:  akutna toksi čka reakcija koja je izazvana nakon 
prvog izlaganja kože odre đenim kemikalijama i naknadnog izlaganja 
svjetlu, ili koja je inducirana na sli čan način zračenjem kože nakon 
sustavne primjene tvari.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Test fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU temelji se na usporedbi cito ­
toksičnosti kemikalije kad se testira sa i bez izlaganja necitotoksi čnoj 
dozi simuliranog sun čevog svjetla. Citotoksi čnost se u ovom testu 
izražava kao redukcija, u zavisnosti od koncentracije, ugradnje 
vitalne boje Neutral Red mjerena 24 sata nakon tretiranja ispitivanom kemikalijom i zra čenja (10). NR je slaba kationska boja koja brzo 
penetrira kroz stani čne membrane nedifuzno i nakuplja se me đusta­
nično u lizosomima. Promjenama na površini osjetljive lizosomske 
membrane, lizosomi postaju krhki i nastaju druge promjene koje postupno postaju nepopravljive. Te promjene izazvane djelovanjem ksenobiotika rezultiraju smanjenom ugradnjom i vezivanjem NR. 
Stoga je mogu će razlikovati žive, ošte ćene ili mrtve stanice, na 
čemu se temelji ovaj test.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 587
 
Stanice Balb/c 3T3 održavaju se u kulturi 24 sata radi formiranja 
monoslojeva. Za svaku ispitivanu tvar, dvije plo če s 96 bunari ća 
prethodno se inkubira s osam razli čitih koncentracija ispitivane 
tvari u trajanju od 1 h. Nakon toga se jedna od te dvije plo če 
izlože najvišoj dozi necitotoksi čnog zračenja, dok se druga plo ča 
drži na tamnom mjestu. U obje plo če tretirani medij zatim se zami ­
jeni hranjivom podlogom za uzgoj kultura i nakon sljede ćih 24 sata 
inkubacije, odre đuje se preživljavanje stanica ugradnjom boje 
Neutral Red. Preživljavanje stanica izražava se kao postotak netreti ­
ranih kontrola otapala i izra čunava se za svaku ispitnu koncentraciju. 
Za predvi đanje fototoksi čnog potencijala, reakcije na koncentracije 
dobivene sa i bez zra čenja uspore đuju se, obi čno na razini IC  50 , s 
tim da se koncentracija koja smanjuje preživljavanje stanica na 50 % 
uspoređuje s netretiranim kontrolama.  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Pripravci  
1.4.1.1.  Stanice  
U validacijskoj studiji upotrijebljena je stalna stani čna linija mišjih 
fibroblasta, Balb/c 3T3, klon 31, bilo iz zbirke American Type 
Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, SAD, ili iz zbirke Euro ­
pean Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Ujedinjena Kraljevina, pa se stoga preporu ča nabaviti stanice iz 
dobro kvalificiranog depozitorija stanica. Uz isti ispitni postupak 
mogu se koristiti druge stanice i stani čne linije ako su uvjeti 
kulture prilago đeni posebnim potrebama stanica, ali ekvivalentnost 
se mora dokazati.
 
Stanice treba redovito provjeravati kako bi se potvrdilo da nisu 
kontaminirane mikoplazmama i koristiti samo ako nijedna nije utvrđena (11).
 
Važno je redovito provjeravati osjetljivost stanica na UV zra čenje u 
skladu s postupkom kontrole kvalitete opisanoj u ovoj metodi. Kako 
osjetljivost stanica na UVA zrake može porasti s brojem prolaza, treba upotrebljavati stanice Balb/c 3T3 s najnižim brojem prolaza koji se može posti ći, poželjno manjim od 100. (Vidjeti odjeljak 
1.4.2.2.2. i Dodatak 2.).
 
1.4.1.2.  Uvjeti koje moraju zadovoljavati mediji i kulture  
Za rutinski prolaz kroz stanice i tijekom ispitnog postupka treba 
koristiti odgovaraju će hranjive podloge za uzgoj kulture i odgovara ­
juće uvjete inkubacije, npr. za stanice Balb/c 3T3 to je podloga 
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium) oboga ćena 10 %- 
tnim serumom novoro đenog teleta, 4 nM glutamina, pencilinom (100 
JU), i streptomicinom (100 μg/ml), te vlažnu inkubaciju na 37 °C, sa 
sadržajem CO  2 od 5 do 7,5 % u zavisnosti od puferske otopine 
(vidjeti odjeljak 1.4.1.4., drugi stavak). Posebno je važno da uvjeti 
uzgoja stani čne kulture dozvole da se trajanje stani čnog ciklusa održi 
u normalnim povijesnim granicama za stanice ili stani čne linije.  
1.4.1.3.  Priprema kultura  
Stanice iz zamrznutih mati čnih kultura nasade se na hranjivu 
podlogu za uzgoj kultura odgovaraju ćom gusto ćom i ponovno 
presiju najmanje jednom prije nego se upotrijebe u testu fototoksi č­
nosti  in vitro  3T3 NRU.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 588
 
Stanice koje se koriste za test fototoksi čnosti nasade se na hranjivu 
podlogu za uzgoj kultura tolikom gusto ćom da kulture ne dosegnu 
konfluenciju do kraja ispitivanja, tj. kad se utvr đuje preživljavanje 
stanica, 48 sati nakon sijanja stanica. Za stanice Balb/c 3T3 koje se uzgajaju na plo čama s 96 bunari ća, preporu ča se gusto ća nasada 
1 × 10
 4 stanica po bunari ću. 
Za svaku ispitivanu kemikaliju stanice se na isti na čin nasade u dvije 
odvojene plo če s 96 bunari ća koje se zatim paralelno koriste tijekom 
cijelog ispitnog postupka, u identi čnim uvjetima kulture osim za 
vrijeme u kojem je jedna plo ča izložena zra čenju (+ Irr), a druga 
je držana u mraku (-Irr).  
1.4.1.4.  Priprema ispitivane tvari  
Ispitivane se tvari moraju pripremati svježe, neposredno prije 
uporabe, osim ako postoje podaci o njihovoj stabilnosti kod skla ­
dištenja. Preporu ča se da se svako rukovanje kemikalijom i po četna 
obrada stanica provedu u takvim uvjetima svjetla kojima će se 
izbjeći fotoaktivacija ili razgradnja ispitivane tvari prije izlaganja 
zračenju.  
Ispitivane kemikalije treba otopiti u slanim puferskim otopinama, 
npr. Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS), ili drugim fiziološki 
uravnoteženim puferskim otopinama koje ne smiju sadržavati sastojke bjelan čevina, sastojke koji apsorbiraju svjetlo (npr. 
ph-indikatorske boje i vitamine) kako bi se izbjegla interferencija 
tijekom izlaganja zra čenju. Kako se tijekom izlaganja zra čenju 
stanice otprilike 50 minuta drže izvan inkubatora CO
 2 , treba paziti 
da se izbjegne alkalizacija. Ako se koriste slabi puferi poput EBSS, 
to se može posti ći inkubiranjem stanica na 7,5 % CO  2 . Ako se 
stanice inkubiraju na samo 5 % CO  2 , treba odabrati ja či pufer.  
Ispitivane kemikalije ograni čene topljivosti treba otopiti u odgovara ­
jućem otapalu. Ako se koristi otapalo, ono mora u svim kulturama 
biti prisutno u stalnom volumenu, tj. u negativnim kontrolama (ota ­
palo) kao i u svim koncentracijama ispitivane kemikalije, i kod tih koncentracija ne smije biti toksi čno. Koncentracije ispitivane tvari 
treba odabrati na na čin da se izbjegne nastajanje taloga ili mutnih 
otopina.
 
Kao otapala preporu čaju se dimetilsulfoksid (DMSO) i 
etanol (ETOH). I druga otapala male citotoksi čnosti mogu biti 
primjerena. Prije uporabe, za svako otapalo treba procijeniti 
posebna svojstva, npr. reakciju s ispitivanom kemikalijom, ublaža ­
vanje fototoksi čnog učinka, svojstva fiksiranja radikala i/ili kemijsku 
stabilnost u otapalu.  
Ako to ne utje če na stabilnost ispitivane kemikalije, za bolju toplji ­
vost može se primijeniti vrtložno miješanje i/ili sonikacija i/ili zagri ­
javanje na odgovaraju će temperature  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 589
 
1.4.1.5.  Uvjeti izlaganja zra čenju 
1.4.1.5.1. I z v o r s v j e t l o s t i  
Izbor odgovaraju ćeg izvora svjetlosti i filtra klju čni je čimbenik kod 
ispitivanja fototoksi čnosti. Svjetlo iz UVA i vidljivog podru čja 
obično se povezuje s fototoksi čkim reakcijama  in vivo  (3)(12), 
budući da je svjetlo iz UVB podru čja obično manje važno, ali 
jako citotoksi čno; između vrijednosti valne duljine od 313 do 280 
nm (13), citotoksi čnost se pove ćava 1 000 puta. Jedan od kriterija za 
odabir odgovaraju ćeg izbora svjetla mora biti uvjet da izvor svjetlosti 
emitira valne duljine koje ispitivana kemikalija apsorbira (spektar apsorpcije) i da je doza svjetla (koju je mogu će postići u razumnom 
vremenu izlaganja) bude dovoljna za utvr đivanje poznatih fototo ­
ksičnih kemikalija. Nadalje, valne duljine i doze koje se primjenjuju 
ne smiju nepotrebno štetno djelovati na ispitni sustav, npr. emisija topline (infracrveno podru čje).
 
Simulacija sun čeve svjetlosti solarnim simulatorima smatra se opti ­
malnim izvorom umjetnog svjetla. Distribucija snage filtriranog 
zračenja solarnog simulatora treba biti sli čna distribuciji vanjskog 
dnevnog svjetla navedenog u (14). Kao solarni simulatori (15) 
koriste se i ksenonovi lukovi i lukovi (dopirani) metalnog halida 
žive. Prednost ovog potonjeg je u tome što emitira manje topline i jeftiniji je, ali sli čnost sa sun čevom svjetloš ću je manja nego kod 
ksenonovog luka. Budu ći da svi solarni simulatori emitiraju znatne 
količine UVB zraka treba ih opremiti odgovaraju ćim filtrima kako bi 
se ublažile njihove jako toksi čne UVB valne duljine. Kako plasti čni 
materijali za stani čne kulture sadrže UV stabilizatore, spektar treba 
mjeriti kroz poklopac plo če s 96 bunari ća istog tipa koji će se kori­
stiti u pokusu. Neovisno o mjerama koje se poduzimaju za ublaža ­
vanje dijelova spektra filtriranjem ili neizbježnim filtar djelovanjem opreme, spektar koji se bilježi ispod tih filtara ne bi trebao odstupati od standardnog dnevnog svjetla (14). Primjer distribucije filtriranog 
zračenja spektra solarnog simulatora koji se koristi u validacijskoj 
studiji testa fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU naveden je u (8)(16). 
Vidjeti tako đer Dodatak 2., sliku 1.
 
1.4.1.5.2. D o z i m t e r i j a  
Prije svakog testa fototoksi čnosti, jakost svjetla (zra čenje) treba redo ­
vito provjeravati pomo ću odgovaraju ćeg širokopojasnog UV-metra. 
Jakost treba mjeriti kroz poklopac plo če s 96 bunari ća istog tipa koji 
će se koristiti u pokusu. UV-metar mora biti kalibriran prema izvoru. 
Rad UV-metra treba provjeravati, a u tu svrhu preporu ča se rabiti 
drugi, referentni UV-metar istog tipa i identi čne kalibracije. Idealno 
je, u većim intervalima, za mjerenje zra čenja spektra filtriranog 
izvora svjetla i za kalibriranje širokopojasnog UV-metra koristiti 
spektroradiometar.  
Doza od 5 J/cm  2 (izmjerena u UVA podru čju) određena je kao 
netoksična za stanice Balb/c 3T3, ali s dovoljnim potencijalom da 
pobudi kemikalije da izazovu fototoksi čne reakcije, (6)(17) npr. kako 
bi se postiglo 5 J/cm  2 u vremenu od 50 min, zra čenje je podešeno na 
1,7 mW/cm  2 . Vidjeti Dodatak 2., sliku 2. Ako se koristi druga 
stanična linija ili druga čiji izvor svjetla, dozu zra čenja možda će 
trebati kalibrirati kako bi se mogao odabrati režim doziranja koji 
ne djeluje štetno na stanice, ali je dostatan za pobudu standardnih 
fototoksina. Vrijeme izlaganja svjetlu izra čunava se na sljede ći način: ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 590
 
tðminÞ ¼ doza zračenja ð J=cm 2 Þ Ü 1000 
gustoća zračenja ð mW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Ws)  
1.4.2.  Uvjeti ispitivanja  
1.4.2.1.  Koncentracije ispitivane tvari  
Raspon koncentracija tvari ispitivane u prisutnosti (+ Irr) i bez 
prisutnosti (-Irr) svjetla odre đuje se na odgovaraju ći način u poku ­
sima za odre đivanje raspona doze. Topljivost može biti korisno 
procijeniti na po četku i nakon 60 min (ili ve ć prema vremenu treti ­
ranja koje se će se koristiti), jer se topljivost može promijeniti u 
vremenu ili tijekom izlaganja. Kako bi se izbjegla toksi čnost indu ­
cirana držanjem kulture u nepravilnim uvjetima ili uzrokovana jako kiselim ili alkalnim kemikalijama, pH vrijednost stani čnih kultura 
kojima se dodaje ispitivana tvari treba biti u podru čju 6,5 – 7,8.
 
Najviša koncentracija ispitivane tvari treba biti unutar fizioloških 
uvjeta ispitivanja, npr. osmoti čki i pH šok treba izbjegavati. 
Ovisno o ispitivanoj tvari, kao čimbenike koji ograni čavaju najvišu 
ispitnu koncentraciju možda će trebati uzeti u obzir druga 
fizikalno-kemijska svojstva. Za relativno netopljive tvari koje nisu 
toksične u koncentracijama do to čke zasićenja treba testirati najvišu 
koncentraciju koja se može posti ći. Općenito, u svim ispitnim 
koncentracijama treba izbje ći taloženje ispitivane kemikalije. Maksi ­
malna koncentracija ispitivane tvari ne bi smjela biti ve ća od 1 000 
μg/ml; osmolarnost ne smije prije ći 10 mmolar. Treba koristiti 
geometrijski niz od osam koncentracija ispitivane tvari stalnog faktora razrje đenja (vidjeti odjeljak 2.1., drugi stavak).
 
Ako postoji informacija (iz pokusa za odre đivanje raspona doze) da 
ispitivana kemikalija do grani čne koncentracije nije citotoksi čna u 
pokusu u mraku (-Irr), ali je jako citotoksi čna kad je izložena 
zračenju (+ Irr), kako bi se zadovoljio uvjet za odgovaraju ćom kvali­
tetom podataka, rasponi koncentracija koji se odabiru za pokus u 
mraku (+ Irr) mogu se razlikovati od raspona koncentracija 
odabranih za pokus s izlaganjem zra čenju (-Irr).  
1.4.2.2.  Kontrole  
1.4.2.2.1. O s j e t l j i v o s t s t a n i c a n a z r a č e n j e , u t v r đ i v a n j e 
p o v i j e s n i h p o d a t a k a :  
Kod stanica redovito (otprilike svaki peti prolaz) treba provjeravati 
osjetljivost na izvor svjetla procjenom njihovog preživljavanja nakon 
izlaganju pove ćanim dozama zra čenja. U toj procjeni treba koristiti 
nekoliko doza zra čenja, uklju čujući i razine znatno ve će od razina 
koje se koriste u testu fototoksi čnosti 3T3 NRU. Koli čina tih doza 
najlakše se odredi mjerenjem UV dijelova izvora svjetla. Stanice se 
nasade gusto ćom koja se rabi u testu fototoksi čnosti  in vitro  3T3 
NRU i sljede ći dan izlože se zra čenju. Dan kasnije odre đuje se 
preživljavanje stanica na temelju apsorpcije boje Neutral Red. Treba dokazati da je najviša netoksi čna doza koja je dobivena kao 
rezultat (npr. u validacijskoj studiji: 5 J/cm
 2 (UVA)) dovoljna za 
ispravnu klasifikaciju referentnih kemikalija (Tablica 1.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 591
 
1.4.2.2.2. O s j e t l j i v o s t n a z r a č e n j e , p r o v j e r a t e s t a k o j i j e u 
t i j e k u :  
Test zadovoljava kriterije kvalitete ako se u ozra čenim negativnim 
kontrolama (otapalima) postiže preživljavanje ve će od 80 % u uspo ­
redbi s neozra čenim negativnim kontrolama (otapalima).  
1.4.2.2.3. P r e ž i v l j a v a n j e k o d n e g a t i v n i h k o n t r o l a :  
Apsolutna opti čka gustoća (OD  540 NRU  ) boje Neutral Red ekstrahi ­
rane iz negativnih kontrola pokazuje je li 1 × 10  4 stanica nasa đenih 
po bunari ću naraslo s normalnim vremenom dupliciranja u dvod ­
nevnom razdoblju provo đenja testa. Test zadovoljava kriterije prih ­
vatljivosti ako je srednja opti čka gustoća OD  540 NRU  netretiranih 
kontrola ≥ 0,4 (tj. približno 20 puta ve ća od osnovne apsorbancije 
otapala).  
1.4.2.2.4. P o z i t i v n a k o n t r o l a :  
Istodobno sa svakim testom fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU treba 
ispitati neku poznatu fototoksi čnu kemikaliju. Preporu ča se da to 
bude klorpromazin (CPZ). Za CPZ koji se u testu fototoksi čnosti  
in vitro  3T3 NRU testira standardnim protokolom definirani su slje ­
deći kriteriji prihvatljivosti testa: CPZ izložen zra čenju (+ Irr): IC  50 = 
0,1 do 2,0 μg/ml, CPZ koji nije izložen zra čenju (-Irr): IC  50 = 7,0 do 
90,0 μg/ml. Faktor foto-nadražuju ćeg djelovanja Photo Irritation 
Factor (PIF) treba biti > 6. Treba pratiti povijesne podatke pozitivne kontrole.
 
Kao paralelne pozitivne kontrole umjesto klorpromazina mogu se 
koristiti druge kemikalije koje u pogledu kemijske klase ili karakteri ­
stika topljivosti odgovaraju kemikaliji koja se procjenjuje.  
1.4.3.  Ispitni postupak (6)(7)(8)(16)(17):  
1.4.3.1.  Prvi dan:  
Uliti 100 μL hranjive podloge za uzgoj kultura u periferne bunari će 
mikrotiter plo če s 96 bunari ća s tkivom kulture (= slijepe probe). U 
preostale bunari će uliti 100 μL stanične suspenzije sa sadržajem 1 × 
10 5 stanica/ml u hranjivoj podlozi za uzgoj stanica (= 1 × 10  4 
stanica/bunari ću). Za svaki niz koncentracija pojedine ispitivane 
kemikalije i za otapalo i pozitivne kontrole treba pripremiti dvije 
ploče. 
Inkubirati stanice 24 sata (vidjeti odjeljak 1.4.1.2.) dok se ne združe 
u polu-konfluentan monosloj. Takvo vrijeme inkubacije osigurava 
rekuperaciju, prianjanje i eksponencijalni rast stanica.  
1.4.3.2.  Drugi dan:  
Nakon inkubacije, dekantirati hranjivu podlogu iz stanica i oprezno 
oprati s 150 μL puferske otopine koja je korištena za inkubaciju. 
Dodati 100 μL pufera koji sadrži odgovaraju ću koncentraciju ispiti ­
vane kemikalije ili otapala (kontrola otapala). Primijeniti osam 
različitih koncentracija ispitivane kemikalije. Inkubirati stanice s ispi ­
tivanom kemikalijom u mraku 60 minuta (vidjeti odjeljak 1.4.1.2. i 1.4.1.4., drugi stavak).
 
Od dvije plo če priređene za svaki niz koncentracija ispitivane tvari i 
kontrola, izabrati jednu, obi čno nasumice, za odre đivanje citotoksi č­
nosti (-Irr) (tj. kontrolnu plo ču), i jednu (tretiranu plo ču) za odre đi­
vanje citotoksi čnosti (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 592
 
Za provo đenje izlaganja + Irr, izložiti zra čenju stanice na sobnoj 
temperaturi tijekom 50 minuta, kroz poklopac plo če s 96 bunari ća 
s najvišom dozom zra čenja koja nije citotoksi čna (vidjeti tako đer 
Dodatak 2.). Držati neozra čene ploče (-Irr) na sobnoj temperaturi u 
mračnoj kutiji tijekom 50 min (= vrijeme izlaganja svjetlu).  
Dekantirati ispitnu otopinu i pažljivo oprati dva puta sa 150 μl 
puferske otopine koja je korištena za inkubaciju, ali koja ne sadrži ispitivani materijal. Zamijeniti pufer s hranjivom podlogom i inku ­
birati (vidjeti odjeljak 1.4.1.2.) preko no ći (18-22 h).
 
1.4.3.3.  Treći dan:  
1.4.3.3.1. M i k r o s k o p s k a p r o c j e n a  
Rast i morfologiju stanica te integritet monosloja treba pregledati 
faznim kontrastnim mikroskopom. Promjene u morfologiji stanica i 
učinke na rast stanica treba zabilježiti.  
1.4.3.3.2. T e s t u g r a d n j e b o j e N e u t r a l R e d  
Oprati stanice s 150 μl prethodno zagrijane puferske otopine. Odstra ­
niti otopinu za pranje nježnim tapkanjem. Dodati 100 μl 50 μg/ml 
boje Neutral Red (NR) (3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazin 
hidroklorida, EINECS br. 209-035-8; CAS br. 553-24-2; C.I. 50040) u medij bez seruma (16) i 3 sata inkubirati kako je opisano u stavku 1.4.1.2. Nakon inkubacije, odstraniti medij NR, 
oprati stanice s 150 μl puferske otopine. Dekantirati i odstraniti 
preostali pufer blotiranjem ili centrifugiranjem.
 
Dodati to čno 150 μl pufer otopine boje NR (svježe pripremljene od 
49 dijelova vode + 50 dijelova etanola + 1 dio octene kiseline).  
Nježno tresti mikrotiter plo ču na tresalici mikrotiter plo če u trajanju 
od 10 minuta dok se NR ne ekstrahira iz stanica i ne formira homo ­
genu otopinu.  
Izmjeriti opti čku gustoću ekstrakta NR na 540 nm u spektrofotome ­
tru, koriste ći slijepe probe kao referencu. Pohraniti podatke u odgo ­
varajućem formatu elektronske datoteke za naknadnu analizu.  
2. PODACI  
2.1. KVALITETA I KVANTITETA PODATAKA  
Rezultati testa trebaju omogu ćiti smislenu analizu odnosa 
koncentracije-reakcije u prisutnosti i bez prisutnosti zra čenja, i po 
mogućnosti koncentracije ispitivane kemikalije kod koje se preživ ­
ljavanje stanica smanjuje na 50 % (IC  50 ). Ako se utvrdi citotoksi č­
nost, treba podesiti i raspon koncentracija i interval izme đu svake 
koncentracije, kako bi krivulja bila u skladu s eksperimentalnim podacima.
 
I za jasno pozitivne i jasno negativne rezultate (vidjeti odjeljak 2.3., 
prvi stavak), možda je dovoljan samo primarni pokus, uz jedan ili 
više pokusa provedenih s ciljem utvr đivanja raspona preliminarne 
doze).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 593
 
Dvosmislene, grani čne ili nejasne rezultate treba pojasniti daljnjim 
ispitivanjem (tako đer vidjeti odjeljak 2.4., drugi stavak). U takvim 
slučajevima treba razmisliti o eventualnim modifikacijama pokusnih 
uvjeta. Me đu pokusnim uvjetima koji se mogu mijenjati su raspon 
koncentracija ili interval izme đu dvije koncentracije, vrijeme predin ­
kubacije i vrijeme izlaganja zra čenju. Za kemikalije nestabilne u vodi 
može biti prikladno kra će vrijeme izlaganja.  
2.2. VREDNOVANJE REZULTATA  
U svrhu vrednovanja podataka mogu se izra čunati faktor 
foto-nadražuju ćeg djelovanja (Photo Irritation Factor - PIF) ili 
srednji foto u činak (Mean Photo Effect – MPE).  
Za izračun mjerila fototoksi čnosti (vidjeti dolje), set proizvoljnih 
vrijednosti koncentracija-reakcija treba uskladiti na temelju odgova ­
rajuće stalne krivulje koncentracija-reakcija (model). Uskla đivanje 
krivulje prema podacima provodi se metodom nelinearne regresije (18). Za procjenu kako varijabilnost podataka utje če na uskla đenu 
krivulju preporu ča se samodopunjuju ći, tzv. „bootstrap” postupak.
 
Faktor foto-nadražuju ćeg djelovanja (Photo Irritation Factor - PIF) 
izračunava se na temelju sljede će formule:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Ako IC  50 u ili bez prisutnosti svjetla nije mogu će izračunati, za 
ispitivani materijal nije mogu će odrediti faktor PIF. Srednji foto 
učinak (MPE) temelji se na usporedbi svih krivulja 
koncentracija-reakcija (19). On se definira kao ponderirani prosjek reprezentativnog seta vrijednosti foto u činaka.
 
MPE ¼ X  n 
i¼l w i PE c i 
X  n 
i¼l w i 
Foto učinak PE  C kod neke koncentracije C definira se kao produkt 
učinka reakcije RE  C i učinka doze DE  C , tj. PE  C = RE  C × DE  C . 
Učinak reakcije RE  C razlika je izme đu reakcija zapaženih bez i u 
prisutnosti svjetla tj. RE  C = R  C (-Irr) – R  C (+ Irr). Odnos 
doza-učinak izračunava se iz:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
gdje C  * predstavlja koncentraciju ekvivalencije tj. koncentraciju na 
kojoj je reakcija + Irr jednaka reakciji –Irr kod koncentracije C. Ako 
C * nije mogu će odrediti jer su vrijednosti reakcije krivulje + Irr 
sustavno više ili niže od R  C (-Irr), učinak doze se podešava na 1. 
Faktori ponderiranja w  i određeni su vrijednoš ću najveće reakcije, tj. 
w i = MAX {R  i (+ Irr), R  i (-Irr)}. Mreža koncentracija C  i odabrana je 
na način da isti broj to čaka pada u svaki od intervala koncentracija 
definiran vrijednostima koncentracija koje se rabe u pokusu. Izra čun 
srednjeg foto u činka MPE ograni čen je na maksimalnu vrijednost 
koncentracije na kojoj najmanje jedna od dvije krivulje i dalje poka ­
zuje vrijednost reakcije od najmanje 10 %. Ako je ta maksimalna 
vrijednost koncentracije ve ća od najve će koncentracije koja je upotri ­
jebljena u pokusu + Irr, preostali dio krivulje + Irr podešava se na vrijednost reakcije „0”. Ovisno o tomu je li vrijednost MPE ve ća od 
pravilno odabrane grani čne vrijednosti (MPE
 C = 0,15) ili nije, kemi ­
kalija se klasificira kao fototoksi čna. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 594
 
Računalni programski paket za izra čun vrijednosti PIF i MPE 
dostupan je iz (20).  
2.3. TUMA ČENJE REZULTATA  
Na temelju validacijske studije (8), za ispitivanu tvar čije su vrijed ­
nosti PIF < 2 ili MPE < 0,1 smatra se da „fototoksi čnosti nema”. PIF 
> 2 i < 5 ili MPE > 0,1 i < 0,15 pokazatelji su „vjerojatne fototo ­
ksičnosti”; a PIF > 5 ili MPE > 0,15 predvi đaju „fototoksi čnost”.  
Tablica 1.  
Naziv kemikalije  EINECS br.  CAS br.  PIF  MPE  Granična 
vrijednost 
apsorpcije  Otapalo (  1 ) 
Amiodaron 
HCL  243-293-2  [19774-82-4]  > 3,25  0,2-0,54  242 nm 
300 nm 
(zakrivljeni 
dio krivulje)  etanol  
Kloropromazin 
HCL  200-701-3  [69-09-0]  > 14,4  0,33-0,63  309 nm  etanol  
Norfloksacin  274-614-4  [70458-96-7]  > 71,6  0,34-0,90  316 nm  acetonitril  
Antracen  204-371-1  [120-12-7]  > 18,5  0,19-0,81  356 nm  acetonitril  
Protoporfirin 
IX, dinatrij  256-815-9  [50865-01-5]  > 45,3  0,54-0,74  402 nm  etanol  
L-histidin  [7006-35-1]  nema 
faktora PIF
 0,05-0,10  211 nm  voda  
Heksaklorofen  200-733-8  [70-30-4]  1,1-1,7  0,00-0,05  299 nm 
317 nm 
(zakrivljeni 
dio krivulje)  etanol  
Natrijev lauril 
sulfat  205-788-1  [151-21-3]  1,0-1,9  0,00-0,05  nema 
apsorpcije  voda  
( 1 ) Otapalo koje se koristi za mjerenje apsorpcije.  
2.4. TUMA ČENJE PODATAKA  
Ako su fototoksi čni učinci opaženi samo kod najviše ispitne koncen ­
tracije (posebno za ispitivane kemikalije koje su topljive u vodi), za procjenu rizika mogu biti potrebna dodatne analize. To može uklju ­ 
čivati podatke o apsorpciji kože, i akumulaciji kemikalije u koži i/ili 
podatke iz drugih testova, npr. ispitivanja kemikalije  in vitro  na koži 
životinja i ljudi, ili modelima kože.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 595
 
Ako toksi čnost nije dokazana (+ Irr i –Irr) i ako je slaba topljivost 
ograničila koncentracije koje su mogle biti ispitane, možda je 
prikladnost testa za doti čnu ispitivanu tvar upitna, pa treba pred ­
vidjeti potvrdno ispitivanje, npr. upotrebom nekog drugog modela.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— identifikacijski podaci, op ći generički nazivi i IUPAC i CAS 
broj, ako je poznat,  
— fizikalna priroda i čistoća, 
— fizikalno-kemijska svojstva relevantna za provo đenje studije,  
— spektar apsorpcije UV/vidljivog svjetla,  
— stabilnost i fotostabilost, ako je poznata.  
Otapalo:  
— opravdanost izbora nosa ča, 
— topljivost ispitivane kemikalije u otapalu,  
— postotak prisutnosti otapala u mediju u kojem se vrši tretiranje.  
Stanice:  
— vrsta i izvor stanica,  
— nepostojanje mikoplazama,  
— broj prolaza kroz stanicu, ako je poznat,  
— osjetljivost stanica na zra čenje utvr đena opremom za izlaganje 
zračenju koja se koristi u testu fototoksi čnosti  in vitro  3T3 NRU.  
Uvjeti ispitivanja (1);  inkubacija prije i nakon tretiranja:  
— vrsta i sastav hranjive podloge za uzgoj kulture,  
— uvjeti inkubacije (koncentracija CO  2 ; temperatura; vlaga),  
— trajanje inkubacije (prije tretiranja; poslije tretiranja),  
Uvjeti ispitivanja (2);  tretiranje kemikalijom:  
— razlog za odabir koncentracija ispitivane kemikalije koje se 
koriste u i bez prisutnosti zra čenja,  
— u slučaju ograni čene topljivosti ispitivane kemikalije i izostanka 
citotoksičnosti: obrazloženje razloga za odabir najviše ispitivane 
koncentracije,  
— vrsta i sastav medija u kojem se vrši tretiranje (puferirana slana 
otopina),  
— trajanje tretiranja kemikalije.  
Uvjeti ispitivanja (3);  izlaganje zra čenju:  
— obrazloženje razloga za odabir izvora svjetla koji je upotrijebljen,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 596
 
— proizvo đač i tip izvora svjetla i radiometra,  
— spektralne karakteristike zra čenja izvora svjetla,  
— karakteristike upotrijebljenih filtra u pogledu transmisije i 
apsorpcije,  
— karakteristike radiometra i pojedinosti o njegovoj kalibraciji,  
— udaljenost izvora svjetla od ispitnog sustava,  
— gustoća zračenja UVA na toj udaljenosti, izražena u mW/cm  2 , 
— trajanje izlaganja UV/vidljivom svjetlu,  
— doza UVA zra čenja (gusto ća zračenja × vrijeme), izražena u 
mJ/cm  2 , 
— temperatura stani čnih kultura za vrijeme izlaganja zra čenju i 
staničnih kultura koje su istodobno držane u mraku.  
Uvjeti ispitivanja (4);  test preživljavanja pomo ću boje Neutral Red:  
— sastav medija za tretiranje bojom Neutral Red,  
— trajanje inkubacije u boji Neutral Red,  
— uvjeti inkubacije (koncentracija CO  2 ; temperatura; vlaga),  
— uvjeti ekstrakcije boje Neutral Red (sredstvo za ekstrakciju; traja ­
nje) 
— valna duljina upotrijebljena za spektrofotometrijsko o čitanje 
optičke gustoće boje Neutral Red,  
— druga valna duljina (referentna), ako je upotrijebljena,  
— sadržaj uzorka namijenjen slijepoj probi spektrofotometra, ako je 
upotrijebljen.  
Rezultati:  
— preživljavanje stanica kod svake koncentracije ispitivane tvari, 
izraženo u postotku preživljavanja srednje vrijednosti paralelnih 
kontrola otapala,  
— krivulje reakcije na koncentraciju (koncentracija ispitivane kemi ­
kalije – relativno preživljavanje stanica) u paralelnim pokusima 
+ Irr i -Irr,  
— analiza krivulje koncentracija-reakcija; po mogu ćnosti, izra čun/ 
određivanje IC  50 (+ Irr) i IC  50 (-Irr),  
— uspore đivanje dviju krivulje reakcije na koncentracije dobivene 
bez i u prisutnosti zra čenja, bilo izra čunom faktora 
foto-nadražuju ćeg djelovanja PIF (Photo Irritation Factor), ili 
izračunom srednjeg foto u činka MPE (Mean Photo Effect),  
— kriteriji prihvatljivosti testa; paralelna kontrola otapala:  
— apsolutno preživljavanje (opti čka gustoća ekstrakta Neutral Red) 
ozračenih i neozra čenih stanica,  
— povijesni podaci o negativnim kontrolama i kontrolama otapala; 
srednje vrijednosti i standardna odstupanja,  
— kriteriji prihvatljivosti testa; paralelna pozitivna kontrola,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 597
 
— IC  50 (+ Irr) i IC  50 (-Irr) i vrijednosti faktora PIF/MPE pozitivne 
kontrolne kemikalije,  
— povijesni podaci za kemikaliju u pozitivnoj kontroli: IC  50 (+ Irr) i 
IC 50 (-Irr) i PIF/MPE; srednje vrijednosti i standardna 
odstupanja.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Lovell W.W., (1993) A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxicology  In Vitro  
7, str. 95-102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G., (1972) List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p. XI-XXXV.
 
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D., (1994)  In vitro  phototoxicity testing: The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, str. 314-348.
 
(4) Spikes, J.D., (1989) Photosensitisation. In „The science of 
Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, str. 79-110.  
(5) OECD, (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No 7 „Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.  
(6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., 
Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A., (1994) EEC/COLIPA project on  in vitro  
phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 
cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, str. 793-796.
 
(7) Anon, (1998) Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, str. 7-8.
 
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, 
P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfan ­
nenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Stei ­
ling, W., and Brantom, P., (1998) The international EU/CO ­
LIPA  In vitro  phototoxicity validation study: results of phase II 
(blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxico ­
logy In Vitro  12, str. 305-327.  
(9) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  
In Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, 
Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 15th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon 
request from the Secretariat.
 
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A., (1985) Toxicity determi ­
nation  in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, str. 119-124.  
(11) Hay, R.J., (1988) The seed stock concept and quality control 
for cell lines. Analytical Biochemistry 171, str. 225-237.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A., (1996) 
Animal models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicolo ­
gy”, edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5
 th Edition, str. 515-530.  
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M., (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, str. 1825-1829.  
(14) ISO 10977., (1993) Photography — Processed photographic 
colour films and paper prints — Methods for measuring image stability.
 
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
 
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure:  
In Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 
September, 1998. str. 18.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U., (1998) A study on UV filter 
chemicals from Annex VII of the European Union  Directive 
76/768/EEC,  in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. 
ATLA 26, str. 679-708.
 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J., (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. 
Systems 3, str. 127-138.  
(19) Holzhütter, H.G., (1997) A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 
25, str. 445-462.
 
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34 377_ 
2349687_1_1_1_1,00.html  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 599
 
Dodatak 1.  
Uloga testa fototoksi čnosti 3T3 NRU u sekvencijalnom pristupu ispitivanju fototoksi čnosti 
kemikalija
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 600
 
Dodatak 2.  
Slika 1.  
Spektralna distribucija energije na solarnom simulatoru opremljenom filtrom
  
(vidjeti odjeljak 1.4.1.5., drugi stavak)  
Slika 1. prikazuje primjer prihvatljive distribucije spektralnog zra čenja na solarnom simulatoru 
opremljenom filtrom. Zra čenje dolazi iz izvora dopiranog metalnog halida koji je korišten u vali ­
dacijskom pokusu testa fototoksi čnosti 3T3 NRU (6)(8)(17). Prikazan je u činak dva razli čita filtra i 
učinak dodatnog filtriranja poklopca plo če s 96 bunari ća za stani čne kulture. Filtar H2 koristi se 
samo kod ispitnih sustava koji podržavaju ve ću količinu zračenja UVB (test na modelu kože i test 
fotohemolize stanica crvenih krvnih zrnaca. U testu fototoksi čnosti 3T3 NRU korišten je filtar H1. 
Slika prikazuje da se u činak dodatnog filtriranja poklopca plo če uglavnom opaža u UVB podru čju, 
s tim da u spektru ostaje još uvijek dovoljno UVB zra čenja za pobu đivanje kemikalija koje obi čno 
apsorbiraju svjetlo u UVB podru čju, kao što je amiodaron (vidjeti tablicu 1.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 601
 
Slika 2.  
Osjetljivost stanica Balb/c 3T3 na zra čenje (mjerena u podru čju UVA)  
Sposobnost preživljavanja stanice (% postotak apsorpcije neutralnog crvenila za kontrole u mraku)
  
(vidjeti odjeljke 1.4.1.5.2., drugi stavak; 1.4.2.2.1., 1.4.2.2.2.)  
Osjetljivost stanica Balb/c 3T3 na izloženost zra čenju iz solarnog simulatora opremljenog filtrom 
koji je korišten u validacijskom pokusu testa fototoksi čnosti 3T3 NRU, mjerena u podru čju UVA. 
Slika prikazuje rezultate dobivene u sedam razli čitih laboratorija u predvalidacijskog studiji (1). 
Dok su dvije krivulje s prozirnim simbolima dobivene sa starijim stanicama (veliki broj prolaza) koje su morale biti zamijenjene novim stani čnim materijalom, krivulje s masno otisnutim simbolima 
prikazuju stanice s dopuštenom tolerancijom izlaganja zra čenju.
 
Iz tih podataka izvedena je najve ća necitotoksi čna doza zra čenja od 5 J/cm  2 (vertikalna isprekidana 
crta). Horizontalna isprekidana crta prikazuje još i maksimalno prihvatljiv u činak zračenja naveden 
u stavku 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 602
 
B.42.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA  
UVOD  
1. Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitne metode EU-a koje 
se na njima temelje, periodi čki se preispituju u svjetlu znanstvenog napre ­
tka, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. 
Originalna ispitna metoda (TM) za utvr đivanje preosjetljivosti kože kod 
miševa, analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje 
OECD-a 429; Poglavlje B.42 ovog Priloga) je prethodno donesena (1). 
Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelo ­
vanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Ažurirana metoda LLNA se temelji na ocjeni iskustva i znanstvenih podataka (12). To je druga ispitna metoda za procjenu potencijala kemikalija da senzibiliziraju kožu kod živo ­
tinja (tvari i smjese). U drugoj metodi (Smjernica za ispitivanje OECD-a 
406; Poglavlje B.6. ovog Priloga) primjenjuju se testovi na zamorcima, konkretnije maksimizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA ima odre đene prednosti u odnosu na B.6 i Smjernicu za 
ispitivanje OECD-a 406 (13) s obzirom na dobrobit životinja. Ova ažurirana 
ispitna metoda LLNA obuhva ća niz referentnih normi (Dodatak 1.) koje se 
mogu koristiti za ocjenjivanje statusa validacije novih i/ili izmijenjenih ispitnih metoda koje su u funkcionalnom i mehanicisti čkom smislu sli čne 
metodi LLNA u skladu s na čelima iz Smjernice OECD-a br. 34 (14).
 
2. Metodom LLNA prou čava se indukcijska faza senzibilizacije kože i dobi ­
vaju kvantitativni podaci pogodni za procjenjivanje reakcije na dozu. Treba 
napomenuti da su blagi/umjereni senzibilizatori, koji se preporu čuju kao 
prikladne pozitivne kontrolne tvari za test sa zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), prikladni i za uporabu kod metode LLNA 
(6)(8)(15). Kao opcija ove ispitne metode tako đer je opisan smanjeni pristup 
LLNA (rLLNA) pri kojem bi se moglo koristiti do 40 % manje životinja. Metoda rLLNA se može koristiti kada postoji regulatorna potreba za potvr ­ 
đivanjem negativnog predvi đanja potencijala preosjetljivosti kože pod 
uvjetom da su ispunjene sve ostale specifikacije protokola LLNA, kako je 
opisano u ovoj metodi. Predvi đanje negativnog rezultata treba se temeljiti 
na svim dostupnim informacijama opisanim u stavku 4. Prije primjene pristupa rLLNA potrebno je dostaviti jasna obrazloženja i znanstvenu 
utemeljenost njegove uporabe. Ako se unato č očekivanjima dobiju pozitivan 
ili dvosmislen rezultat rLLNA, mogu biti potrebna dodatna ispitivanja radi tumačenja ili razjašnjenja nalaza. Metoda rLLNA se ne smije koristiti za 
utvrđivanje opasnosti ispitivanih tvari koje uzrokuju preosjetljivost kože ako 
su potrebni podaci o reakciji na dozu, kao što je potkategorizacija za 
Uredbu (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, ozna čivanju i pakiranju tvari 
i smjesa i Globalno uskla đeni sustav razvrstavanja i ozna čivanja kemikalija 
Ujedinjenih naroda (UN).
 
DEFINICIJE  
3. Korištene definicije navedene su u Dodatku 2.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
4. Metoda LLNA alternativna je metoda za utvr đivanje kemikalija koje imaju 
potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože. To nužno ne zna či da u svim 
slučajevima metodu LLNA treba primijeniti umjesto testa sa zamorcima 
(B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), ve ć da je pokus jednako ­
vrijedan i da se može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obi čno nije potrebna daljnja potvrda. Ispitni laboratoriji 
trebaju uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari prije provo ­ 
đenja studije. Spomenuti podaci uklju čuju identitet i kemijsku strukturu
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 603
 
ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih  in vitro  
ili in vivo  ispitivanja toksi čnosti i toksikološke podatke o strukturno pove ­
zanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvr đivanja priklad ­
nosti metode LLNA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost odre ­ 
đenih vrsta kemikalija s metodom LLNA - vidjeti stavak 5.) i pomo ći kod 
odabira doze.  
5. Metoda LLNA je metoda  in vivo , pa kao takva ne isklju čuje uporabu 
životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Me đutim, ona 
ima potencijala smanjiti broj životinja koje su potrebne za tu svrhu. Nadalje, 
metoda LLNA nudi znatno finiji na čin uporabe životinja (manje boli i 
patnje) u ispitivanju kontaktne senzibilizacije. Metoda LLNA temelji se na analizi imunoloških doga đanja koja stimuliraju kemikalije za vrijeme 
indukcijske faze senzibilizacije. Za razliku od testa sa zamorcima (B.6; 
Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), kod metode LLNA nije 
potrebno izazivati provokacijski inducirane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Nadalje, za metodu LLNA nije potrebno koristiti adjuvans, kao što je to slu čaj s maksimizacijskim testom sa zamorcima (13). Metoda 
LLNA stoga smanjuje bol i patnju životinja. Unato č prednostima metode 
LLNA u odnosu na B.6 i Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406, treba priznati da postoje neka ograni čenja zbog kojih može biti potrebno primi ­
jeniti B.6 ili Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406 (13) (npr. lažni negativni 
nalazi metode LLNA kod odre đenih metala, lažni pozitivni nalazi kod nekih 
sredstava s nadražuju ćim djelovanjem na kožu (kao što su neke površinski 
aktivne tvari) (19) (20) ili topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja 
na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže 
funkcionalne skupine za koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjujući faktori (21) (npr. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) 
(13). Nadalje, s obzirom na ograni čenu bazu podataka za validaciju koja 
se prije svega sastoji od formulacija pesticida, pozitivni rezultat za ove vrste 
ispitivanih tvari se može vjerojatnije posti ći metodom LLNA nego ispitiva ­
njem na zamorcima (22). Me đutim, kod ispitivanja formulacija mogu se 
uzeti u obzir sli čne tvari s poznatim rezultatima kao referentne vrijednosti 
za dokazivanje ispravnog djelovanja metode LLNA (vidjeti stavak 16.). 
Pored takvih utvr đenih ograni čenja LLNA se može primjenjivati za ispiti ­
vanje bilo koje tvari, osim ako ne postoji mogu ćnost da bi njezina svojstva 
mogla utjecati na to čnost metode LLNA.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
6. Metoda LLNA po čiva na temeljnom na čelu prema kojem senzibilizatori 
induciraju primarnu proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime dolazi 
do drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcionalna primijenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja jedno ­
stavan na čin za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. Prolifera ­
cija se mjeri usporedbom prosje čne proliferacije svake ispitivane skupine s 
prosječnom proliferacijom u kontrolama tretiranim nosa čem. Odre đuje se 
omjer prosje čne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i proliferacije u 
kontrolama s nosa čem, nazvan indeks stimulacije, koji mora biti najmanje 
tri da bi se ispitivana tvar mogla dalje vrednovati kao potencijalni senzibi ­
lizator kože. Ovdje opisane metode temelje se na uporabi  in vivo  radioak­
tivnih oznaka za mjerenje pove ćanog broja stanica koje proliferiraju u auri ­
kularnim limfnim čvorovima koji uzrokuju drenažu. Me đutim, za procjenu 
broja proliferiraju ćih stanica mogu se koristiti drugi parametri ako su u 
potpunosti ispunjeni zahtjevi izvedbe (Dodatak 1.).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 604
 
OPIS ANALIZE  
Odabir životinjskih vrsta  
7. Za ovaj su test odabrana vrsta miševi. Koriste se mlade odrasle ženke soja 
CBA/Ca ili CBA/J koje još nisu imale potomstvo i nisu skotne. Na po četku 
studije životinje trebaju biti stare izme đu osam do 12 tjedana, a odstupanje 
mase životinja treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. 
Drugi sojevi i mužjaci mogu se koristiti ako postoji dovoljno podataka da u 
reakciji prema metodi LLNA nema razlika specifi čnih za soj i/ili spol.  
Uvjeti smještaja i prehrane  
8. Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (23), osim ako se ne dokaže 
prikladna znanstvena utemeljenost za pojedina čni smještaj. Temperatura u 
prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako 
bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prije đe 
70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost 
treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograni ­ 
čenom koli činom vode za pi će.
 
Priprema životinja  
9. Životinje se nasumice biraju, jednozna čno identificiraju (ali ne bilo kojim 
oblikom ozna čavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije 
početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije 
početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da 
nemaju zapaženih lezija kože.  
Priprema ispitnih otopina  
10. Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspen ­
dirati u otapalima/nosa čima i prema potrebi razrijediti. Teku će kemikalije se 
mogu nanijeti čiste ili razrije đene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje 
se obično koriste u medicinskim ure đajima, trebaju se podvrgnuti postupku 
pretjerane ekstrakcije u odgovaraju ćem otapalu kako bi se prije primjene na 
uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se 
pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihva ­
tljivost njihova skladištenja.  
Provjera pouzdanosti  
11. Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus 
provodi na odgovaraju ći način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom 
preosjetljivoš ću kao ispitivana tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je 
stupanj reakcije to čno utvrđen. Preporu čuje se uvo đenje paralelne pozitivne 
kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku analizu i kako bi se omogu ćilo ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti 
unutar jednog ili izme đu više laboratorija. Odre đena regulatorna tijela zahti ­
jevaju pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se stoga korisnici pozivaju da 
prije izvo đenja metode LLNA kontaktiraju relevantna tijela. Sukladno tomu, 
potiče se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole kako bi se izbjeglo 
dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu 
javiti zbog periodi čke uporabe paralelne kontrole (vidjeti stavak 12.). Pozi ­
tivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju na metodu LLNA kod
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 605
 
razine izlaganja za koju se o čekuje da će dati porast indeksa stimulacije (SI) 
> 3 u odnosu na negativnu kontrolnu skupinu. Dozu pozitivne kontrole 
treba odabrati tako da ne uzrokuje prekomjerno nadraživanje kože ili sustavnu toksi čnost i da je indukcija ponovljiva, ali ne prekomjerna (tj. 
SI > 20 se smatra pretjeranim). Poželjne pozitivne kontrole su 25 %-tni 
heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v) 
i 5 %-tni merkaptobenzotiazol (CAS br. 149-30-4) i N,N-N-dimetilfor ­
mamid (vidjeti Dodatak 1., Tablicu 1.). Mogu će su okolnosti u kojima 
se, uz odgovaraju će obrazloženje, mogu koristiti druge pozitivne kontrole 
koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
 
12. Iako se preporu čuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u odre ­ 
đenim situacijama periodi čko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) 
pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode 
metode LLNA (tj. najmanje jednom mjese čno) i imaju povijesnu bazu 
podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laboratorija da dobiva ponovljive i to čne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovaraju ća ospo­
sobljenost za metodu LLNA može se uspješno dokazati dobivanjem 
dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje 10 neovisnih 
ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju (manje od jedne godine).
 
13. Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada do đe 
do proceduralne promjene metode LLNA (zamjena stru čnog osoblja, 
promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, promjena opreme, 
promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene moraju navesti u laboratorijskim izvješ ćima. Potrebno je uzeti u obzir u činak tih promjena 
na primjerenost prethodno uspostavljene baze podataka prilikom utvr đivanja 
potrebe za uspostavom nove baze povijesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
 
14. Istraživa či trebaju biti svjesni da odluka o provo đenju periodi čke umjesto 
paralelne studije pozitivne kontrole utje če na prikladnost i prihvatljivost 
negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju 
između svake periodi čke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodi ­ 
čkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se 
dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju 
između posljednje prihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije i 
neprihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije. Kod odlu čivanja o 
uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provo đenju samo periodi čkih pozi­
tivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. 
Također je potrebno razmotriti mogu ćnost uporabe manjeg broja životinja u 
skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka 
dokaže da se može koristiti manje miševa (12).
 
15. Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosa ču za koji je poznato da 
izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom 
nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (24). Ako se paralelna 
pozitivna kontrola ispituje u druga čijem nosa ču od ispitivane tvari, potrebno 
je uključiti posebnu kontrolu s nosa čem za paralelnu pozitivnu kontrolu.
 
16. U slu čajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili 
raspona reakcija, referentne tvari mogu tako đer biti korisne za dokazivanje 
ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih 
vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljede će 
značajke:  
— strukturnu i funkcionalnu sli čnost s razredom ispitivane tvari,  
— poznata fizikalna/kemijska svojstva,  
— popratne podatke iz LLNA,  
— popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 606
 
ISPITNI POSTUPAK  
Broj životinja i visine doze  
17. Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje, s najmanje tri 
koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina tretirana samo nosa čem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (para ­
lelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimaju ći u 
obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza 
pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim 
skupinama.
 
18. Odabir doze i nosa ča treba se temeljiti na preporukama navedenim u refe ­
rencama (3) i (5). Uzastopne doze se obi čno odabiru iz odgovaraju ćih serija 
koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 
0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popra ćena 
odgovaraju ćim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne 
koncentracije treba uzeti u obzir sve postoje će toksikološke podatke (o 
akutnoj toksi čnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske 
podatke, ako dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo 
izlaganje, ali istodobno izbjegla sustavna toksi čnost i/ili prekomjerno 
lokalno nadraživanje kože (3)(25). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti po četno predprobiranje (vidjeti stavke 21.-24.).
 
19. Nosa č ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se 
odabrati na temelju pove ćanja topljivosti s ciljem postizanja što viših 
koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za primjenu ispitivane tvari. Kao nosa či preporučuju se aceton: maslinovo ulje 
(4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil 
sulfoksid (19), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klini čki rele­
vantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar 
prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosa ča 
budu ugra đene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se 
odmah, uklju čivanjem odgovaraju ćih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim 
Pluronic® L92). Zna či, nosače koji su u potpunosti vodeni treba 
izbjegavati.
 
20. Obrada limfnih čvorova pojedina čnih miševa omogu ćuje ocjenjivanje 
promjenljivosti me đu životinjama i statisti čku usporedbu razlika izme đu 
mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosa čem (vidjeti 
stavak 35.). Pored toga, ocjenjivanje mogu ćnosti smanjenja broja miševa 
u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedina čni 
podaci o životinjama (12). Odre đena regulatorna tijela zahtijevaju da se 
prikupe pojedina čni podaci o životinjama. Me đutim, neka regulatorna 
tijela mogu prihvatiti skupne podatke o životinjama i u tim slu čajevima 
korisnici mogu sami odabrati ho će li prikupljati pojedina čne ili skupne 
podatke o životinjama.  
Predprobiranje  
21. Ako nisu dostupne informacije za odre đivanje najviše doze za ispitivanje 
(vidjeti stavak 18.), potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila odgovaraju ća visina doze za ispitivanje u LLNA. Svrha predprobiranja je 
pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj studiji LLNA 
ako nisu dostupne informacije o koncentraciji koja uzrokuje sustavnu toksičnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože 
(vidjeti stavak 23.). Najve ća ispitana visina doze je 100 %-tna ispitivana 
tvar za teku ćine ili najve ća moguća koncentracija za krute tvari ili 
suspenzije.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 607
 
22. Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identi čni glavnoj studiji LLNA, 
s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i može se kori ­
stiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporu čuje se uporaba jedne ili 
dvije životinje po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakodnevno prate s ciljem otkrivanja klini čkih znakova sustavne toksi čnosti ili lokalnog nadra ­ 
živanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije ispitivanja i prije 
završetka (6. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju radi otkrivanja eritema i boduju se prema tablici 1. (25). Debljina uha se mjeri posebnim mjernim instrumentom (pr. digitalnim mikrometrom ili mjera čem debljine 
Peacock Dial) prvi dan (prije doze), tre ći dan (otprilike 48 sati nakon prve 
doze) i šesti dan. Pored toga, šesti dan se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probijanjem, što se izvodi nakon humanog usmr ćenja. Prekomjerno lokalno nadraživanje kože se ozna čuje 
bodovima za eriteme ≥ 3 i/ili pove ćanjem debljine uha za ≥ 25 % na bilo 
koji dan mjerenja (26) (27). Najviša odabrana doza za glavnu studiju LLNA je sljedeća niža doza iz serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 
18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno nadra ­ 
živanje kože.
 
Tablica 1.  
Bodovanje eritema  
Zapažanja  Bodovi  
Bez eritema  0  
Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)  1  
Dobro vidljiv eritem  2  
Umjeren do jak eritem  3  
Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogu ćuje 
stupnjevanje eritema  4 
23. Pored 25 %-tnog pove ćanja debljine uha (26) (27), statisti čki značajno 
povećanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne 
miševe se tako đer koristi za odre đivanje nadražuju ćih tvari u LLNA (28) 
(29) (30) (31) (32) (33) (34). Me đutim, iako se statisti čki značajna pove ­ 
ćanja debljine uha mogu javiti, kada su ona manja od 25 % ne povezuju se 
posebno s prekomjernim nadraživanjem (30) (32) (33) (34).  
24. Kada se koriste u okviru cjelokupne ocjene, sljede ća klinička opažanja 
mogu ukazivati na sustavnu toksi čnost (35) (36) te stoga mogu nazna čiti 
najvišu dozu za uporabu u glavnoj LLNA: promjene u djelovanju živ čanog 
sustava (npr. piloerekcija, ataksija, tremori i gr čevi); promjene u ponašanju 
(npr. agresivnost, promjene u njezi, zna čajna promjena u stupnju aktiv ­
nosti); promjene u disanju (npr. promjene u čestalosti i intenziteta disanja 
kao što su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane 
i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve klini čke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenuta čni, 
ili gubitak težine > 5 % od prvog do šestog dana i smrtnost. Životinje koje 
su pred uginu ćem ili koje o čito trpe bol ili pokazuju znakove teške i trajne 
patnje trebaju se humano usmrtiti (37).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 608
 
Plan pokusa glavne studije  
25. Plan pokusa je sljede ći: 
— Prvi dan:  Pojedina čno identificirati životinje i zabilježiti masu svake 
životinje i sva klini čka opažanja. Primijeniti 25 μl odgovaraju će 
otopine ispitivane tvari, samog nosa ča ili pozitivne kontrole (paralelna 
ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimaju ći u 
obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio uha.  
— Drugi i tre ći dan:  Ponoviti postupak primjene proveden prvog dana.  
— Četvrti i peti dan:  Bez tretiranja.  
— Šesti dan:  Zabilježiti masu svake životinje. Svim miševima u ispitnoj i 
kontrolnoj skupini u venu na repu ubrizgati 250 μl sterilnog fosfatnog 
pufera (PBS) sa sadržajem 20 μCi (7,4e + 10  5 Bq)  3 H-metil timidina. 
Alternativno svim miševima u venu na repu ubrizgati 250 μl sterilnog 
fosfatnog pufera (PBS) sa sadržajem 2 μCi (7,4e + 10  4 Bq)  125 I-jododeo ­
ksiuridina i 10  –5 M fluorodeoksiuridina. Nakon pet sati životinje 
humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz 
svakog uha i staviti zajedno u pufer PBS za svaku životinju (pojedi ­
načni pristup); alternativno uzeti limfne čvorove iz svakog uha i staviti u 
pufer PBS za svaku tretiranu skupinu (skupni pristup). Pojedinosti i 
sheme za identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se na ći u 
referenci (12). Za daljnje pra ćenje lokalne reakcije kože u glavnoj 
studiji mogu se u protokol studije uklju čiti dodatni parametri kao što 
su ocjenjivanje eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni 
uređajem za mjerenje debljine ili odre đivanjem mase uzorka uha pri 
obdukciji).  
Priprema suspenzije stanica  
26. Suspenzija pojedina čnih stanica limfnih čvorova (LNC), odstranjenih bila ­
teralno iz pojedina čnih životinja ili iz tretiranih skupina, priprema se 
nježnom mehani čkom dezagregacijom kroz mrežicu od 200 μm od nehr đa­
jućeg čelika ili drugom prihvatljivom metodom za dobivanje suspenzije 
pojedinačnih stanica. Stanice limfnog čvora dva se puta peru preostalim 
puferom PBS i DNA se ostave 18 sati taložiti s 5 % trikloroctenom kise ­
linom (TCA) pri 4 °C (3). Peleti se ponovno suspendiraju u 1 ml TCA i 
prenose u scintilacijske bo čice koje sadrže 10 ml scintilacijske teku ćine za 
brojanje  3 H, ili se prenose izravno u kušalice za brojanje joda  125 I pomoću 
gama zraka.  
Određivanje proliferacije stanica (ugra đena radioaktivnost)  
27. Ugradnja  3 H-metil timidina mjeri se β-scintilacijskim broja čem kao raspa ­
danje u minuti (DPM). Ugradnja  125 I-jododeoksiuridina mjeri se brojanjem 
joda  125 I i također se izražava kao DPM. Ovisno o pristupu, ugradnja će se 
izražavati kao DPM/miš (individualni pristup) ili DPM/tretirana skupina 
(skupni pristup).  
Smanjena LLNA  
28. U odre đenim slučajevima kada postoji regulatorna potreba za potvr đivanjem 
negativnog predvi đanja potencijala preosjetljivosti kože, može se koristiti 
neobavezni protokol rLLNA (16) (17) (18) s manjim brojem životinja, pod 
uvjetom da su ispunjene sve ostale specifikacije protokola LLNA iz ove ispitne metode. Prije primjene pristupa rLLNA potrebno je dostaviti jasna obrazloženja i znanstvenu utemeljenost njegove uporabe. Ako se dobije 
pozitivan ili dvosmislen rezultat, mogu biti potrebna dodatna ispitivanja 
radi tuma čenja ili razjašnjenja nalaza.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 609
 
29. Jedina razlika izme đu protokola ispitnih metoda LLNA i rLLNA je manji 
broj dozirnih skupina zbog čega rLLNA ne daje podatke o odnosu 
doza-učinak. Metoda rLLNA se stoga ne treba koristiti kada su potrebni 
podaci o odnosu doza-u činak. Kao i kod LLNA s više doza, koncentracija 
ispitivane tvari koja se ocjenjuje u rLLNA mora biti najve ća koncentracija 
koja ne uzrokuje o čitu sustavnu toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno nadra ­ 
živanje kože kod miševa (vidjeti stavak 18.).  
OPAŽANJA  
Klinička opažanja  
30. Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve 
kliničke znakove lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne 
toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe te se za svaku životinju 
bilješke vode pojedina čno. Programi pra ćenja uklju čuju kriterije za pravo ­
dobno identificiranje miševa koji pokazuju znakove sustavne toksi čnosti, 
prekomjernog lokalnog nadraživanja kože ili korozije kože za eutanaziju (37).
 
Tjelesne mase  
31. Kao što je navedeno u stavku 25., pojedina čne tjelesne mase treba mjeriti 
na početku testa i u vrijeme planiranog usmr ćivanja životinja.  
IZRAČUN REZULTATA  
32. Rezultati za svaku tretiranu skupinu izraženi su kao indeks stimulacije (SI). 
Ako se primjenjuje individualni pristup, SI se dobiva dijeljenjem prosje čnog 
raspadanja u minuti (DPM) po životinji unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozitivne kontrolne skupine s prosje čnim DPM po živo ­
tinji za kontrolnu skupinu s otopinom/nosa čem. Prosje čan SI za kontrolne 
skupine tretirane nosa čem tada iznosi 1. Ako se primjenjuje skupni pristup, 
SI se dobiva tako da se za svaku tretiranu skupinu skupno ugra đena 
radioaktivnost podijeli sa skupnom ugradnjom kontrolne skupine za otapalo; 
tako se dobiva prosje čni indeks SI.
 
33. U postupku odlu čivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 3. Među­
tim, kod odlu čivanja da se neki grani čni rezultat proglasi pozitivnim može 
se, također, koristiti snaga u činka na dozu, statisti čki značaj i dosljednost 
reakcija u otapalu/nosa ču i pozitivnoj kontroli (4) (5) (6).  
34. Ako je potrebno razjasniti dobivene rezultate, valja uzeti u obzir razna 
svojstva ispitivane tvari, uklju čujući i to ima li strukturne veze s poznatim 
senzibilizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa opažene reakcije na dozu. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (7).
 
35. Prikupljanje podataka o radioaktivnosti na razini pojedina čnog miša 
omogućit će statističku analizu prisutnosti i stupnja odnosa izme đu doze i 
učinka. Svaka statisti čka procjena može uklju čiti ocjenu odnosa izme đu 
doze i u činka te odgovaraju ći prilago đene usporedbe ispitnih skupina 
(npr. skupina s doziranjem u parovima u odnosu na paralelne kontrolne 
skupine s nosa čem). Statisti čke analize mogu uklju čiti linearnu regresiju 
ili Williamsov test za ocjenu trendova odnosa doza-u činak i Dunnettov 
test za usporedbe u parovima. Prilikom odabira prikladne metode statisti čke 
analize istraživa č treba biti svjestan eventualnih razlika izme đu varijanata 
kao i drugih problema s tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna trans ­
formacija podataka ili neparametarska statisti čka analiza. U svakom slu čaju 
istraživač će možda morati izvršiti izra čune SI i statisti čke analize sa 
sigurnim to čkama podataka (koji se ponekad nazivaju „netipi čne vrijedno ­
sti”) i bez njih.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 610
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
36. Podatke treba sažeti u tabli čnom obliku. Kad se koristi pristup pojedina čne 
životinje, navode se vrijednosti DPM za pojedina čnu životinju, srednje 
vrijednosti DPM za skupinu/životinja, s tim povezana razlika izme đu 
stvarne i predvi đene pogreške (npr. SD, SEM) i srednja vrijednost SI za 
svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s nosa čem. 
Kad se koristi skupni pristup za tretiranu skupinu, navode se srednje/pro ­
sječne vrijednosti DPM i srednja vrijednost SI za svaku dozirnu skupinu u 
odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s nosa čem. 
Izvješće o ispitivanju  
37. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivane i kontrolne tvari:  
— identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako su poznati, podri ­
jetlo, čistoća, poznate ne čistoće, broj šarže),  
— fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabil ­
nost, topljivost),  
— ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.  
Otapalo/nosa č: 
— identifikacijski podaci ( čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijeb ­
ljeni volumen),  
— dokaz opravdanosti izbora nosa ča. 
Ispitne životinje:  
— podrijetlo miševa CBA,  
— mikrobiološki status životinja, ako je poznat,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,  
— dokaz opravdanosti odabira doze (uklju čujući rezultate predprobiranja, 
ako je provedeno),  
— koncentracije nosa ča i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna 
količina tvari koja je primijenjena,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući vrstu/podrijetlo hrane, 
izvor vode),  
— pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— kriteriji za odre đivanje studija pozitivnima ili negativnima,  
— pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje 
učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,  
Provjera pouzdanosti:  
— sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uklju čujući informa ­
cije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosa ču, 
— podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim 
negativnim kontrolama za ispitni laboratorij,  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 611
 
— ako nije uklju čena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko 
izvješće za posljednju periodi čku pozitivnu kontrolu i izvješ će u kojem 
se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se opravdava neprovo đenje paralelne pozitivne kontrole,
 
Rezultati:  
— pojedina čne mase miševa na po četku doziranja i u vrijeme planiranog 
usmrćenja, srednja i s tim povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene 
pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,  
— vrijeme prve pojave i znakova toksi čnosti, uklju čujući eventualno nadra ­ 
živanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju  
— tablica DPM vrijednosti za pojedina čne miševe (individualni pristup) ili 
srednjih/prosje čnih (skupni pristup za tretiranu skupinu) DPM vrijed ­
nosti i indeksi stimulacije za svaku tretiranu skupinu,  
— srednja i povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene pogreške (npr. 
SD, SEM) za DPM/miš za svaku tretiranu skupinu i rezultati analize netipičnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu ako se koristi pojedi ­
načni pristup,
 
— izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir 
promjenljivost izme đu životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim skupi ­
nama kada se koristi pojedina čni pristup,  
— odnos doza – reakcija,  
— statisti čka analiza, ako je primjereno,  
Rasprava o rezultatima:  
— kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije i, prema potrebi, 
statističke analize, sa zaklju čkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati 
senzibilizatorom kože.  
REFERENCE  
1. OECD (2002.), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guide ­
line for the Testing of Chemicals No 429, Pariz. Dostupno na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
2. Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992.), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. Toxi ­
col., 30, str. 165-169.  
3. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, str. 13- 
31. 
4. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. 
(1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medica ­
ments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, str. 563-79.  
5. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, str. 999-1002.  
6. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, str. 985-997.  
7. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, str. 327-33.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 612
 
8. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, str. 49-59.
 
9. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: str. 258-273.
 
10. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, str. 274-286.
 
11. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: str. 249-257.
 
12. ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]
 
13. OECD (1992.),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines]  
14. OECD (2005.),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment 
No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
15. Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, 
I. (1998.), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl 
cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, str. 281-284.  
16. Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006.), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, str. 181-185.  
17. ESAC (2007.), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate-General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for 
the Validation of Alternative Methods, April 2007. Dostupno na: [http://ec ­
vam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]  
18. ICCVAM (2009.), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The 
Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method 
Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
19. ICCVAM (1999.), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated 
by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No 99-4494, Research Triangle Park, NC: 
National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 613
20. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, str. 1896-1904.
 
21. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, str. 90-96.
 
22. ICCVAM (2009.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
23. ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
24. McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, str. 71-89.  
25. OECD (2002.), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No 404, Pariz, France. Dostupno na: [http://www. oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_3 7051368_1_1_1_1,00.html]
 
26. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, str. 235.
 
27. ICCVAM (2009.), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft 
Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]  
28. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in 
female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, str. 195-206.  
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, str. 83-94.
 
30. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, str. 245-256.
 
31. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, str. 491-506.  
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints 
of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, str. 60-68.
 
33. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, str. 721-728.  
34. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007.), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
str. 1023-1028.  
35. OECD (1987.),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Pariz, France. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 614
 
36. ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
37. OECD (2000.),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, 
OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 615
 
Dodatak 1.  
Zahtjevi izvedbe za ocjenjivanje predloženih sli čnih ili izmijenjenih ispitnih 
metoda llna za preosjetljivost kože  
UVOD  
1. Cilj zahtjeva izvedbe je pružiti temelj na kojem se za nove ispitne metode, 
zaštićene (autorskim pravima, žigom, registrirane) i nezašti ćene, može odre ­
diti njihova dostatna to čnost i pouzdanost za posebne svrhe ispitivanja. Ti 
zahtjevi izvedbe koji se temelje na validiranim i prihva ćenim ispitnim meto ­
dama, mogu se koristiti za ocjenjivanje pouzdanosti i to čnosti drugih sli čnih 
metoda (kolokvijalno nazvanih „i ja tako đer” testovi) koje se temelje na 
sličnim znanstvenim na čelima i mjere ili predvi đaju isti biološki ili toksi čni 
učinak (14).  
2. Prije donošenja izmijenjenih metoda (tj. predloženih mogu ćih poboljšanja 
odobrene ispitne metode) potrebno je ocijeniti u činak predloženih izmjena 
na rezultat ispitivanja i mjeru u kojoj će te izmjene utjecati na dostupne 
podatke o ostalim sastavnicama validacijskog postupka. Ovisno o broju i vrsti predloženih izmjena, dobivenim podacima i pripadaju ćoj dokumentaciji 
o tim izmjenama, one trebaju pro ći isti validacijski postupak kako je opisan 
za novo ispitivanje ili, ako je prikladno, trebaju biti predmet ograni čenog 
ocjenjivanja pouzdanosti i važnosti na temelju utvr đenih zahtjeva izvedbe 
(14).
 
3. Za sli čne ili izmijenjene metode, koje su predložene za uporabu u okviru ove 
ispitne metode, treba se odrediti njihova pouzdanost i to čnost koriste ći kemi­
kalije koje predstavljaju puni raspon bodova LLNA. Kako bi se izbjegla 
neopravdana uporaba životinja, čvrsto se preporu čuje da prije zapo činjanja 
validacijskih studija u skladu sa zahtjevima izvedbe i smjernicama iz ove ispitne metode kreatori modela konzultiraju odgovaraju ća tijela.
 
4. Ti se zahtjevi izvedbe temelje na uskla đenim zahtjevima izvedbe 
US-ICCVAM, EC-ECVAM i japanskim JaCVAM (12) za ocjenjivanje valja ­
nosti sličnih ili izmijenjenih verzija LLNA. Zahtjevi izvedbe sadrže klju čne 
elemente ispitne metode, preporu čene referentne kemikalije i standarde za 
točnost i pouzdanost koje predložena metoda mora ispuniti ili premašiti.  
I. Ključni elementi ispitne metode  
5. Kako bi se osiguralo da je sli čna ili izmijenjena metoda LLNA funkcionalno 
i mehanicisti čki analogna LLNA i da mjeri isti biološki u činak, u protokol 
ispitne metode moraju se uklju čiti sljedeći elementi:  
— ispitivana tvar se primjenjuje lokalno na oba uha miša,  
— proliferacija limfocita se mjeri u limfnim čvorovima koji dreniraju 
područje primjene ispitivane tvari,  
— proliferacija limfocita se mjeri tijekom indukcijske faze senzibilizacije 
kože,  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 616
 
— najviša odabrana doza za ispitivane tvari je najve ća koncentracija koja ne 
uzrokuje sustavnu toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože 
kod miša. Za pozitivne referentne kemikalije najviša doza treba biti visoka barem kao vrijednosti LLNA EC3 za odgovaraju će referentne 
kemikalije (vidjeti tablicu 1.) i ne smije uzrokovati sustavnu toksi čnost 
i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože kod miša,
 
— u svaku studiju treba uklju čiti paralelnu kontrolu s nosa čem i prema 
potrebi se tako đer koristi paralelna pozitivna kontrola,  
— koriste se najmanje četiri životinje po dozirnoj skupini,  
— mogu se prikupljati pojedina čni ili skupni podaci o životinjama.  
Ako neki od ovih kriterija nije ispunjen, tada se ovi zahtjevi izvedbe ne 
mogu koristiti za validaciju sli čne ili izmijenjene metode.  
II. Minimalni popis referentnih kemikalija  
6. Uskla đeni zahtjevi izvedbe US-ICCVAM, EC-ECVAM i japanski –JaCVAM 
(12) odredili su 18 minimalnih referentnih kemikalija koje se mogu koristiti i 
četiri neobavezne referentne kemikalije (tj. tvari koje su proizvele lažne 
pozitivne ili lažne negativne rezultate u LLNA u usporedbi s rezultatima na ljudima i zamorcima (B.6, ili Smjernica OECD-a 406) (13), te stoga omogućuju dokazivanje jednake ili bolje izvedbe u odnosu na LLNA) koje 
su uključene u zahtjeve izvedbe LLNA. Kriteriji odabira za odre đivanje tih 
kemikalija su bili sljede ći:
 
— popis referentnih kemikalija sadržava one vrste tvari koje se obi čno 
testiraju radi njihova potencijala za senzibilizaciju kože i opseg reakcija 
koje je LLNA u mogu ćnosti izmjeriti ili predvidjeti,  
— tvari imaju jasno definiranu kemijsku strukturu,  
— za svaku tvar su dostupni podaci o LLNA iz pokusa na zamorcima (tj. 
B.6; Smjernica OECD-a 406) (13) i, ako je mogu će, podaci iz pokusa na 
ljudima, i  
— tvari su lako dostupne na tržištu.  
Preporučene referentne kemikalije su navedene u tablici 1. Studije koje 
koriste predložene referentne kemikalije ocjenjuju se u nosa ču uz koji su 
navedene u tablici 1. U slu čajevima kada navedena tvar nije dostupna, mogu 
se koristiti druge tvari koje ispunjavaju spomenute kriterije odabira uz odgo ­
varajuće obrazloženje.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 617
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 618
 ▼M3 
Tablica 1.  
Preporučene referentne kemikalije za zahtjeve izvedbe LLNA  
Broj Kemikalije (  1 ) broj CAS  Stanje  Nosa č ( 2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x CE3  Stvarni 
raspon EC3  LLNA u 
usporedbi sa 
zamorcima  LLNA u 
usporedbi s 
ljudima  
1 5-kloro-2-metil-4-izotiazolin-3-on (CMI)/2-metil- 
4-izotiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4  tekuće DMF  0,009  1  0,0045-0,018  NC  +/+  +/+  
2 DNCB  97-00-7  kruto  AOO  0,049  15  0,025-0,099  0,02- 
0,094  +/+ +/+  
3 4- fenilenediamin  106-50-3  kruto  AOO  0,11  6  0,055-0,22  0,07-0,16  +/+  +/+  
4 kobaltov klorid  7646-79-9  kruto  DMSO  0,6  2  0,3-1,2  0,4-0,8  +/+  +/+  
5 izoeugenol  97-54-1  teku će AOO  1,5  47  0,77-3,1  0,5-3,3  +/+  +/+  
6 2- merkaptobenzotiazol  149-30-4  kruto  DMF  1,7  1  0,85-3,4  NC  +/+  +/+  
7 citral  5392-40-5  teku će AOO  9,2  6  4,6-18,3  5,1-13  +/+  +/+  
8 HCA  101-86-0  teku će AOO  9,7  21  4,8-19,5  4,4-14,7  +/+  +/+  
9 eugenol  97-53-0  teku će AOO  10,1  11  5,05-20,2  4,9-15  +/+  +/+  
10 fenil benzoat  93-99-2  kruto  AOO  13,6  3  6,8-27,2  1,2-20  +/+  +/+  
11 cimetov alkohol  104-54-1  kruto  AOO  21  1  10,5-42  NC  +/+  +/+  
12 Imidazolidinil uree  39236-46-9  kruto  DMF  24  1  12-48  NC  +/+  +/+  
13 metil metakrilat  80-62-6  teku će AOO  90  1  45-100  NC  +/+  +/+  
14 klorobenzen  108-90-7  teku će AOO  25  1  NA  NA  –/–  –/ (*)  
15 izopropanol  67-63-0  teku će AOO  50  1  NA  NA  –/–  –/+
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 619
 ▼M3 
Broj Kemikalije (  1 ) broj CAS  Stanje  Nosa č ( 2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x CE3  Stvarni 
raspon EC3  LLNA u 
usporedbi sa 
zamorcima  LLNA u 
usporedbi s 
ljudima  
16 mlije čna kiselina  50-21-5  teku će DMSO  25  1  NA  NA  –/–  –/ (*)  
17 metil salicilat  119-36-8  teku će AOO  20  9  NA  NA  –/–  –/–  
18 salicilna kiselina  69-72-7  kruto  AOO  25  1  NA  NA  –/–  –/–  
Neobavezne tvari za dokazivanje poboljšane izvedbe u odnosu na LLNA  
19 natrijev laurilsulfat  151-21-3  kruto  DMF  8,1  5  4,05-16,2  1,5-17,1  +/–  +/–  
20 etilen glikol dimetakrilat  97-90-5  teku će MEK  28  1  14-56  NC  +/–  +/+  
21 ksilen  1330-20-7  teku će AOO  95,8  1  47,9-100  NC  +/ (**)  +/–  
22 niklov klorid  7718-54-9  kruto  DMSO  5  2  NA  NA  –/+  –/+  
Skraćenice: AOO = aceton: maslinovo ulje (4:1, v/v); CAS br. = Broj iz me đunarodnog popisa kemijskih tvari; DMF = N,N-dimetilformamid; DMSO = dimetil sulfoksid; DNCB = 2,4-dinitroklorobenzen; EC3 = pot rebna 
procijenjena koncentracija za proizvodnju indeksa stimulacije 3; GP = rezultati testova na zamorcima (tj. B.6 ili Smjernica OEC D-a 406) (13); HCA = heksil cimetov aldehid; Liq = teku će; LLNA = rezultat lokalne analize 
limfnih čvorova kod miševa tj. B.42 ili Smjernica OECD-a 429) (1); MEK = metil etil keton; NA = nije primjenjivo budu ći da je indeks stimulacije < 3; NC = nije izra čunano budu ći da su podaci dobiveni iz jedne studije; Sol = 
kruto; Veh = nosa č. 
(*) Pretpostavlja se da nije senzibilizator kod ljudi budu ći da nisu na đeni nikakvi rezultati klini čkih epikutalnih testova, nije uklju čen u komplet za epikutalno testiranje kao alergen i nisu prona đena nikakva izvješ ća o 
slučajevima senzibilizacije kod ljudi. 
(**) Podaci o zamorcima nisu dostupni. 
( 1 ) Kemikalije treba pripravljati svakodnevno, osim ako podaci o stabilnosti dokažu da je skladištenje prihvatljivo. 
( 2 ) Zbog mogu ćeg učinka razli čitih nosača na učinkovitost LLNA, za svaku referentnu kemikaliju treba koristiti preporu čeni nosač (24) (32). 
( 3 ) Prosje čna vrijednost ako je dostupno više od jedne vrijednosti EC3. Za negativne tvari (tj. sa stimulacijskim indeksom < 3) navodi se najviša ispitana koncentracija. 
( 4 ) Broj studija LLNA iz kojih su dobiveni podaci. 
( 5 ) Na tržištu je dostupan pod nazivom Kathon CG (br. CAS 55965-84-9), koji je smjesa CMI i MI u odnosu 3:1. Relativne koncentrac ije svakog sastojka su od 1,1 % do 1,25 % (CMI) i od 0,3 % do 0,45 % (MI). Neaktivni 
sastojci su magnezijeve soli (21,5 % do 24 %) i bakrov nitrat (0,15 % do 0,17 %), s preostalom formulacijom 74 % do 77 % vode. Kathon CG je lako dostupan preko Sigma-Aldrich i Rohm and Haas (sada Dow Chemical 
Corporation).
 III. Utvrđeni standardi pouzdanosti i to čnosti  
7. Točnost slične ili izmijenjene metode LLNA treba ispuniti ili premašiti 
zahtjeve izvedbe LLNA kada se ocjenjuje uporabom 18 minimalnih refe ­
rentnih kemikalija koje su obavezne. Nova ili izmijenjena metoda mora se 
pravilno razvrstati na temelju odluke „da/ne”. Me đutim, nova ili izmijenjena 
metoda možda ne će pravilno razvrstati sve minimalne referentne kemikalije 
koje se trebaju koristiti. Ako je, na primjer, neki blagi senzibilizator pogrešno razvrstan, za dokazivanje jednake u činkovitosti može se uzeti u 
obzir obrazloženje takve pogreške i prikladni dodatni podaci (rezultati ispi ­
tivanja koji pokazuju pravilno razvrstavanje za ostale tvari s fizikalnim, kemijskim i senzibilizacijskim svojstvima sli čnim onima pogrešno razvrstane 
referentne kemikalije). U tim okolnostima validacijski status nove ili izmije ­
njene ispitne metode LLNA se ocjenjuje pojedina čno za svaki slu čaj.
 
Ponovljivost u laboratoriju  
8. Za utvr đivanje ponovljivosti u laboratoriju nova ili izmijenjena metoda 
LLNA se ocjenjuje uporabom jasno definirane tvari koja uzrokuje preosje ­
tljivost. Zahtjevi izvedbe LLNA temelje se na promjenljivosti rezultata iz 
ponovljenih testova s heksil cimetovim aldehidom (HCA). Za ocjenjivanje 
pouzdanosti u laboratoriju potrebno je u četiri zasebne prilike s razmakom od 
najmanje tjedan dana izme đu testova dobiti grani čne vrijednosti ocijenjene 
koncentracije (ECt) za HCA. Za prihvatljivu ponovljivost u laboratoriju svaki 
laboratorij mora dobiti vrijednosti ECt od 5 % do 20 % za HCA i od 
0,025 % do 0,1 % za DNCB, što predstavlja raspon od 0,5 do 2,0-puta prosječne koncentracije EC3, odre đene za HCA (10 %) u LLNA (vidjeti 
tablicu 1.).
 
Ponovljivost izme đu laboratorija  
9. Međulaboratorijska ponovljivost nove ili izmijenjene metode LLNA ocje ­
njuje se uporabom dviju jasno definiranih tvari koje uzrokuju preosjetljivost. Zahtjevi izvedbe LLNA temelje se na promjenljivosti rezultata iz testova s HCA i 2,4-dinitroklorobenzenom (DNCB) u razli čitim laboratorijima. ECt 
vrijednosti se dobivaju neovisno i u samo jednoj studiji koja se provodi u 
najmanje tri zasebna laboratorija. Za dokazivanje prihvatljive ponovljivosti između laboratorija svaki laboratorij mora dobiti vrijednosti ECt od 5 % do 
20 % za HCA i od 0,025 % do 0,1 % za DNCB, što predstavlja raspon od 
0,5 do 2,0-puta prosje čne koncentracije EC3, odre đene za HCA (10 %) i 
DNCB (0,05 %), u LLNA (vidjeti tablicu 1.).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 620
 
Dodatak 2.  
Definicije  
Točnost:  stupanj podudarnosti izme đu rezultata ispitne metode i prihva ćenih 
referentnih vrijednosti. To je mjerilo u činkovitosti ispitne metode i jedan od 
aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto „podudarnosti” 
kako bi se ozna čio udio to čnih rezultata ispitne metode (14).  
Referentna tvar:  tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi 
kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati slje ­
deća svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sli č­
nost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske zna čajke; iv. 
popratni podaci o poznatim u čincima; i v. poznata u činkovitost u okviru željene 
reakcije.  
Ocijenjeni prag koncentracije (ECt):  ocijenjena koncentracija ispitivane tvari 
potrebna da se proizvede indeks stimulacije koji ukazuje na pozitivnu reakciju.  
Ocijenjena koncentracija tri (EC3):  ocijenjena koncentracija ispitivane tvari 
potrebna da se proizvede indeks stimulacije tri.  
Lažno negativna tvar:  ispitivana tvar koja je ispitnom metodom neto čno odre­ 
đena kao negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna.  
Lažno pozitivna tvar:  ispitivana tvar koja je ispitivanjem neto čno određena kao 
pozitivna ili aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna.  
Opasnost:  potencijal štetnog u činka na zdravlje ili okoliš. Štetni u činak se javlja 
samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.  
Ponovljivost izme đu laboratorija:  mjera u kojoj razli čiti kvalificirani laboratoriji 
koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvan ­
titativno sli čne rezultate. Ponovljivost izme đu laboratorija se odre đuje prije i 
tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje 
može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, tako đer navedena kao 
međulaboratorijska ponovljivost (14).  
Ponovljivost u laboratoriju:  određivanje u kojoj mjeri stru čno osoblje u okviru 
istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koriste ći određeni protokol u 
različitim trenucima. Tako đer se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost (14).  
I ja također test:  kolokvijalni izraz za ispitnu metodu koja je strukturno i funk ­
cionalno sli čna validiranoj i prihva ćenoj referentnoj ispitnoj metodi. Takva 
ispitna metoda je kandidat za catch-up validaciju. Izraz se često koristi umjesto 
slične ispitne metode (14).  
Netipična vrijednost:  netipična vrijednost je zapažanje koje zna čajno odstupa od 
ostalih vrijednosti u nasumi čnom uzorku populacije.  
Zahtjevi izvedbe:  zahtjevi koji se temelje na validiranoj ispitnoj metodi i pružaju 
temelj za ocjenjivanje usporedivosti predložene, funkcionalno i mehanicisti čki 
slične, ispitne metode. Oni uklju čuju: i. klju čne elemente ispitne metode; ii. mini ­
malni popis referentnih kemikalija odabranih izme đu kemikalija koje se koriste za 
dokazivanje prihvatljive u činkovitosti validirane ispitne metode, i iii. sli čne razine 
točnosti i pouzdanosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za validiranu ispitnu 
metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati predloženom ispitnom 
metodom koriste ći minimalni popis referentnih kemikalija (14).  
Zaštićena ispitna metoda:  ispitna metoda čija je proizvodnja ili distribucija ogra ­
ničena patentima, autorskim pravima, žigom itd.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 621
 
Osiguranje kvalitete:  postupak upravljanja pri kojem pojedinci, neovisni od 
osoba koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog 
ispitivanja, zahtjeve i postupke vo đenja evidencije te to čnost prijenosa podataka.  
Referentne kemikalije:  kemikalije odabrane za uporabu u validacijskom postupku, 
za koje su reakcije u referentnom sustavu ispitivanja  in vitro  i in vivo  ili željenim 
vrstama ve ć poznate. Te kemikalije trebaju biti reprezentativne za razrede kemi ­
kalija za koje se o čekuje da će ispitna metoda biti uporabljena i trebaju pred ­
stavljati puni raspon reakcija koje se mogu o čekivati od kemikalija za koje se 
može koristiti, u rasponu od jake do slabe i negativne reakcije. Za razli čite faze 
validacijskog postupka te razli čite ispitne metode i uporabe mogu biti potrebne 
različite skupine referentnih kemikalija (14).  
Relevantnost:  opis odnosa ispitivanja i željenog u činka te njegova zna čajnost i 
korisnost za posebnu namjenu. Radi se o mjeri u kojoj ispitivanje to čno mjeri ili 
predviđa željeni biološki u činak. Relevantnost uklju čuje i razmatranje o to čnosti 
(sukladnosti) ispitne metode (14).  
Pouzdanost:  mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i izme đu 
laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izra čunava­
njem unutarlaboratorijske i me đulaboratorijske ponovljivosti (14).  
Preosjetljivost kože:  imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac 
lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja 
može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.  
Indeks stimulacije (SI):  izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosje ­
tljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosa čem.
 
Ispitivana tvar (navodi se tako đer i kao ispitivana kemikalija):  svaka tvar ili 
smjesa koja je ispitana ovom metodom.  
Validirana ispitna metoda:  ispitna metoda za koju su dovršene validacijske 
studije radi odre đivanja relevantnosti (uklju čujući točnost) i pouzdanosti za 
posebnu namjenu. Važno je primijetiti da validirana ispitna metoda možda neće biti dovoljno u činkovita u smislu prihvatljive to čnosti i pouzdanosti za 
predloženu namjenu (14).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 622
 
B.43.  STUDIJA NEUROTOKSI ČNOSTI KOD GLODAVACA  
1. METODA  
Ova je metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispitivanje 
OECD–a TG 424 (1997.).  
Ova je ispitna metoda razvijena s ciljem dobivanja informacija koje 
su potrebne kako bi se potvrdila ili detaljnije okarakterizirala poten ­
cijalna neurotoksi čnost kemikalija kod odraslih životinja. Može se 
kombinirati s postoje ćim ispitnim metodama za studije toksi čnosti s 
ponavljanim dozama ili provesti kao zasebna studija. Kod planiranja studija koje se temelje na ovoj metodi preporu ča se konzultirati 
smjernice OECD-a o strategijama i metodama za ispitivanje neuroto ­
ksičnosti (1). To je posebno važno ako se razmišlja o modifikacijama 
preporučenih opažanja i ispitnih postupaka koji se rutinski koriste u 
ovoj metodi. Smjernice su isto tako korisne za odabir drugih ispitnih 
postupaka za uporabu u specifi čnim okolnostima.
 
Procjena razvojne neurotoksi čnosti nije predmet ove metode.  
1.1. UVOD  
U procjeni i vrednovanju toksi čnih karakteristika kemikalija važno je 
uzeti u obzir potencijal za izazivanje neurotoksi čnih učinaka. 
Opažanja kojima se provodi probir na potencijalnu neurotoksi čnost 
već su obuhva ćena metodom za ispitivanje sustavne toksi čnosti 
primjenom ponavljanih doza. Ova ispitna metoda može se primijeniti 
za planiranje studija s ciljem dobivanja dodatnih informacija o neuro ­
toksičnim učincima opaženim u studijama sustavne toksi čnosti kod 
primjene ponavljanih doza, ili za potvr đivanje tih u činaka. Me đutim, 
analizom potencijalne neurotoksi čnosti odre đenih klasa kemikalija 
može se pretpostaviti da bi se ti u činci mogli primjerenije vrednovati 
ako se ova metoda primijeni izravno, bez prethodnih pokazatelja potencijalne neurotoksi čnosti dobivenih u studijama sustavne neuro ­
toksičnosti s ponavljanom dozom. To je, primjerice, slu čaj:
 
— opažanja neuroloških znakova ili neuropatoloških lezija u toksi ­
kološkim studijama koje nisu studije sustavne toksi čnosti kod 
primjene ponavljane doze, ili  
— strukturnog odnosa ili drugih informacija koje ih povezuju s 
poznatim neurotoksi čnim tvarima.  
Osim toga, može biti i drugih primjera primjerene uporabe ove 
ispitne metode; za dodatne pojedinosti vidjeti (1).  
Ova je metoda razvijena na takav na čin da se može prilago đavati 
kako bi zadovoljila posebne potrebe potvr đivanja specifi čne histopa ­
tološke neurotoksi čnosti kemikalije i neurotoksi čnog učinka kemika ­
lije na ponašanje te kako bi omogu ćila karakterizaciju i kvantifika ­
ciju neurotoksi čnih reakcija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 623
 
Neurotoksi čnost su u prošlosti poistovje ćivali s neuropatijom, 
odnosno neuropatološkim lezijama ili neurološkim disfunkcijama, 
kao što su napadi, paraliza ili tremor. Iako je neuropatija važna manifestacija neurotoksi čnosti, danas je jasno da postoji mnogo 
drugih znakova toksi čnosti živčanog sustava (npr. gubitak motorike, 
smanjene osjetilne funkcije, disfunkcije u čenja i pam ćenja), koji se 
ne moraju manifestirati u neuropatološkim i drugim vrstama studija.
 
Ova metoda ispitivanja neurotoksi čnosti razvijena je s ciljem otkri ­
vanja jakih neuropatoloških u činaka i neuroloških u činaka na 
ponašanje odraslih glodavaca. Dok u činci na ponašanje, čak i kod 
izostanka morfoloških promjena, mogu biti odraz negativnog u činka 
na organizam, nisu sve promjene ponašanja vezane isklju čivo za 
živčani sustav. Stoga svaku opaženu promjenu treba vrednovati u 
korelaciji s histološkim, hematološkim ili biokemijskim podacima 
kao i s podacima o drugim vrstama sustavne toksi čnosti. Ispitivanje 
koje se u ovoj metodi zahtijeva za karakterizaciju i kvantifikaciju neurotoksi čnih reakcija obuhva ća posebne histopatološke i behaviori ­
stičke postupke koje je mogu će dopuniti elektrofiziološkim i/ili 
biokemijskim istraživanjima (1)(2)(3)(4).
 
Neurotoksi čne tvari mogu razli čitim mehanizmima djelovati na čitav 
niz točaka u živ čanom sustavu. Budu ći da niti jedan jedinstveni test 
nije u stanju u potpunosti procijeniti neurotoksi čni potencijal svih 
tvari, može biti potrebno primijeniti druge  in vivo  ili in vitro  testove 
specifične za vrstu neurotoksi čnosti koja se opaža ili se pridvi đa. 
Ova ispitna metoda može poslužiti, zajedno sa smjernicama OECD-a 
o strategijama i metodama za ispitivanje neurotoksi čnosti (1), kao 
pomoć kod planiranja studija namijenjenih dodatnoj karakterizaciji 
odnosa doza-reakcija ili ve ćoj osjetljivosti kvantifikacije tog odnosa, 
kako bi se dobila bolja procjena razine kod koje se ne opažaju štetni učinci ili kako bi se dokazali poznati ili o čekivani rizici kemikalije. 
Primjerice, mogu se planirati studije namijenjene identifikaciji i vred ­
novanju jednog ili više neurotoksi čnih mehanizama ili dopuni ve ć 
postojećih podataka dobivenih iz primjene osnovnih postupaka 
opažanja ponašanja i neuropatoloških opažanja. U tim studijama ne 
treba duplicirati podatke do kojih bi se ionako došlo primjenom 
standardnih postupaka preporu čenih ovom metodom, ako su ti 
podaci ve ć dostupni i ne smatraju se nužnim za tuma čenje rezultata 
studije.
 
Studijom neurotoksi čnosti, kad se primjenjuje sama ili u kombinaciji, 
dolazi se do podataka pomo ću kojih je mogu će: 
— utvrditi ima li ispitivana kemikalija na živ čani sustav trajni ili 
reverzibilni u činak,  
— doprinijeti karakterizaciji promjena živ čanog sustava koje se 
dovode u vezu s izlaganjem kemikaliji, i boljem razumijevanju 
mehanizma koji na to utje če, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 624
 
— odrediti odnose doza-reakcija i vrijeme-reakcija radi procjene 
razine kod koje nema opaženog štetnog u činka (razina koja se 
može primijeniti za utvr đivanje kriterija u pogledu sigurnosti 
kemikalije).  
U ovoj ispitnoj metodi ispitivana tvar primjenjuje se oralno. Drugi 
putevi primjene (npr. dermalno ili inhalacijom) mogu biti prikladniji i za njih će možda trebati modificirati preporu čene postupke. Odluka 
o izboru puta primjene uvjetovana je okolnostima izlaganja ljudi i 
dostupnim toksikološkim ili kineti čkim informacijama.
 
1.2. DEFINICIJE  
Štetni učinak:  svaka alteracija u odnosu na referentno stanje koja se 
pripisuje tretiranju, a koja umanjuje sposobnost organizma da 
preživi, da se razmnožava ili prilagodi okolišu.  
Doza:  količina primijenjene ispitivane tvari. Doza se izražava kao 
masa (g, mg) ili kao masa ispitivane tvari po jedinici mase pokusne životinje (npr. mg/kg) ili kao konstantne koncentracije u hrani (ppm).
 
Doziranje:  općeniti pojam koji obuhva ća dozu, u čestalost primjene 
doze i trajanje doziranja.  
Neurotoksi čnost:  štetna promjena strukture ili funkcije živ čanog 
sustava do koje dolazi uslijed izlaganja kemikaliji, biološkom ili fizikalnom agensu.
 
Neurotoksi čna tvar:  svaka kemikalija, biološki ili fizikalni agens 
koji ima potencijal uzrokovanja neurotoksi čnosti.  
NOAEL:  kratica za engleski izraz „no-observed-adverse-effects 
level” koji ozna čava najvišu razinu doze kod koje se ne opažaju 
štetni učinci tretiranja.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar primjenjuje se na nekoliko skupina laboratorijskih 
glodavaca oralnim putem u cijelom rasponu doza. Obi čno se traži 
ponavljanje doze, a režim doziranja može biti 28-dnevni, subkroni čni 
(90 dana) ili kroni čni (1 godina ili dulje). Postupci utvr đeni u ovoj 
ispitnoj metodi mogu se primijeniti i za studiju akutne neurotoksi č­
nosti. Životinje se ispituju kako bi se omogu ćilo otkrivanje ili karak ­
terizacija neutroloških anomalija ili anomalija u ponašanju. Tijekom svakog razdoblja opažanja procjenjuju se razni aspekti ponašanja koji bi mogli biti posljedica neurotoksi čnih tvari. Na kraju testa, 
na dijelu životinja svakog spola iz svake skupine provodi se perfu ­
zija in situ , a od sekcija mozga, le đne moždine i perifernih živaca 
prave se pripravci koji se pregledavaju.
 
Ako se studija provodi kao samostalna studija radi probira na neuro ­
toksičnost ili radi karakterizacije neurotoksi čnih učinaka, životinje iz 
svih skupina koje nisu upotrijebljene za perfuziju i naknadnu histo ­
patologiju (vidjeti tablicu 1.) mogu se upotrijebiti za specifi čna ispi­
tivanja ponašanja, te posebne neuropatološke, neurokemijske ili elek ­
trofiziološke postupke koji mogu dopuniti podatke dobivene stan ­
dardnim opažanjima predvi đenim ovom metodom (1). Ti dodatni 
postupci mogu biti posebno korisni ako empirijska opažanja ili 
očekivani u činci ukazuju na posebno ciljno tkivo ili posebnu vrstu 
neurotoksi čnosti neke kemikalije. Druga je mogu ćnost da se preo ­
stale životinje iskoriste za vrednovanja kao što su ona predvi đena u 
metodama ispitivanja toksi čnosti uslijed primjene ponavljanih doza 
na glodavcima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 625
 
Kad se postupci ove ispitne metode kombiniraju s postupcima drugih 
ispitnih metoda, treba imati dovoljan broj životinja kako bi se zado ­
voljili zahtjevi opažanja u obje studije.  
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Odabir životinjskih vrsta  
Poželjna vrsta glodavaca su štakori iako se mogu koristiti i druge 
vrste glodavaca ako se za to navede opravdani razlog. Treba koristiti 
mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji se obi čno koriste u labo ­
ratorijskim istraživanjima. Ženke ne smiju prethodno imati potom ­
stvo i ne smiju biti skotne. Primjena doza treba zapo četi čim prije 
nakon odbijanja od sise, najbolje prije nego što životinje napune šest 
tjedana a, u svakom slu čaju, prije nego napune devet tjedana starosti. 
Međutim, ako se studija kombinira s drugim studijama, uvjet u 
pogledu starosti životinja možda će trebati prilagoditi. Na po četku 
studije razlike u masi korištenih životinja trebaju biti minimalne i ne 
smiju prije ći ± 20 % od srednje mase životinja svakog spola. Ako se 
kao preliminarni test za dugoro čnu studiju provodi studija s 
ponavljanjem doze, preporu ča se u obje studije koristiti životinje 
istog soja i istog podrijetla.  
1.4.2.  Uvjeti smještaja i prehrane  
Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 
22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a 
poželjno je da ne prije đe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Glasnu povremenu buku 
treba maksimalno smanjiti. Za hranjenje se može koristiti konvencio ­
nalna laboratorijska hrana s neograni čenom koli činom vode za pi će. 
Na izbor hrane može utjecati potreba da se osigura odgovaraju ća 
mješavina ispitivane tvari ako se ona daje u hrani. Životinje se 
mogu smjestiti odvojeno ili držati u kavezima u malim skupinama 
istog spola.
 
1.4.3.  Priprema životinja  
Zdrave mlade odrasle životinje biraju se nasumice i raspodjeljuju u 
kontrolne skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba urediti 
na način da se eventualni u činci držanja u kavezu svedu na mini ­
mum. Životinje se jednozna čno identificiraju i drže u kavezima 
najmanje pet dana prije po četka ispitivanja kako bi se prilagodile 
laboratorijskim uvjetima.  
1.4.4.  Put primjene i priprema doza  
Ova ispitna metoda bavi se posebno primjenom ispitivane tvari 
oralnim putem. Oralna primjena podrazumijeva primjenu želu čanom 
sondom, u hrani, u vodi za pi će ili kapsulama. Mogu se primijeniti i 
drugi putevi (npr. dermalno ili inhalacijom), ali za to će možda 
trebati modificirati preporu čene postupke. Odluka o izboru puta 
primjene uvjetovana je o okolnostima izlaganja ljudi i dostupnim toksikološkim ili kineti čkim informacijama. Opravdanost odabira 
određenog puta primjene kao i eventualnih modifikacija postupaka 
ove ispitne metode treba dokazati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 626
 
Prema potrebi, ispitivana tvar može se otopiti ili suspendirati u 
odgovaraju ćem nosaču. Preporu ča se kad god je to mogu će prvo 
razmotriti upotrebu vodene otopine/suspenzije, pa onda otopinu/ emulziju u ulju (npr. kukuruzno ulje), i na kraju eventualnu otopinu/ suspenziju u drugom nosa ču. Toksičke karakteristike nosa ča moraju 
biti poznate. Osim toga, treba uzeti u obzir sljede će karakteristike 
nosača: učinci nosa ča na apsorpciju, distribuciju, metabolizam, ili 
zadržavanje ispitivane tvari; u činci na kemijska svojstva ispitivane 
tvari koji mogu modificirati njezine toksi čke karakteristike; i u činci 
na potrošnju hrane ili vode ili nutritivno stanje životinja.
 
1.5. POSTUPCI  
1.5.1.  Broj i spol životinja  
Kad se studija provodi kao zasebna, za vrednovanje detaljnih klini ­ 
čkih i funkcionalnih opažanja treba koristiti najmanje 20 životinja 
(10 ženki i 10 mužjaka) u svakoj tretiranoj i kontrolnoj skupini. Na 
kraju studije, najmanje pet mužjaka i pet ženki odabranih od tih 10 
mužjaka i 10 ženki uzima se za perfuziju  in situ  radi detaljne neuro ­
histopatološke obrade. U slu čajevima u kojima se znakovi neuroto ­
ksičnih učinaka opažaju na samo ograni čenom broju životinja, treba 
razmotriti treba li te životinje uklju čiti među životinje koje se 
odabiru za perfuziju. Ako se ova studija provodi u kombinaciji sa studijom toksi čnosti kod primjene ponavljane doze, treba imati dovo ­
ljan broj životinja kako bi se mogli zadovoljiti ciljevi obje studije. 
Minimalni broj životinja po skupini za razne kombinacije studija 
naveden je u tablici 1. Ako se planiraju usmr ćenja u tijeku studije 
ili formiranje skupina namijenjenih opažanju reverzibilnosti u činaka, 
njihovog trajanja ili odgo đene pojave toksi čkih učinaka nakon treti ­
ranja ili ako se predvi đaju dodatna opažanja, broj životinja treba biti 
veći kako bi se osiguralo dovoljno životinja za opažanje i 
histopatologiju.
 
1.5.2.  Tretirana i kontrolna skupina  
Obično se koriste najmanje tri skupine na koje se primjenjuje doza i 
jedna kontrolna skupina, ali ako se iz procjene drugih podataka učinci ne o čekuju kod ponavljane doze od 1 000 mg/kg tjelesne 
mase/dan, može se provesti grani čni test. Ako odgovaraju ći podaci 
nisu dostupni, kao pomo ć za odre đivanje doza može se provesti 
studija za utvr đivanje raspona doze. Osim tretiranja ispitivanom 
tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati 
jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se u primjeni 
doze koristi nosa č, kontrolna skupina mora primiti taj nosa č u 
najvećem upotrijebljenom obimu.
 
1.5.3.  Provjera pouzdanosti  
Laboratorij koji provodi studiju treba predo čiti podatke kojima doka ­
zuje svoju sposobnost za provo đenje studije i osjetljivost postupaka 
koje koristi. Ti podaci trebaju osigurati o čiti dokaz sposobnosti 
detekcije i kvantifikacije, prema potrebi, izmjena razli čitih kriterija 
koji se preporu čaju za opažanje, kao što se autonomni znaci, osje ­
tilna reaktivnost, ja čina stiska ekstremiteta i motorna aktivnost. Infor ­
macije o kemikalijama koje uzrokuju razne tipove neurotoksi čnih 
reakcija i mogu se upotrijebiti kao tvari za pozitivnu kontrolu 
mogu se na ći u referencama od 2 do 9. Povijesni podaci mogu se 
upotrijebiti ako bitni aspekti pokusnih postupaka ostaju isti. Prepo ­
ruča se periodi čno ažuriranje povijesnih podataka. Kad laboratorij 
koji provodi studiju izmijeni neki od bitnih elemenata provo đenja 
testa ili postupaka, novim podacima treba dokazati da je osjetljivost 
postupaka održana.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 627
 
1.5.4.  Odabir doze  
Visinu doze treba odabrati uzimaju ći u obzir eventualnu ranije 
opaženu toksi čnost i kineti čke podatke dostupne za ispitivani spoj 
ili s njim povezane materijale. Najja ču dozu treba odabrati s ciljem 
da se izazovu neurotoksi čni učinci ili jasni sustavni toksi čni učinci. 
Nakon toga, treba odabrati slijed postepenog smanjivanja visine doze koji će dokazati reakcije na sve doze i najnižu dozu kod koje se ne 
opažaju štetni u činci (NOAEL vrijednosti). U na čelu, visine doza 
treba tako odrediti da je primarne toksi čke učinke na živ čani 
sustav mogu će razlikovati od u činaka koji se povezuju sa sustavnom 
toksičnošću. Često je optimalno doze primijeniti u dva do tri inter ­
vala, a možda je bolje dodati i četvrtu ispitnu skupinu nego izme đu 
primjene doza koristiti veoma velike vremenske intervale (npr. iznad faktora 10). Ako postoji razumna procjena izloženosti ljudi, to treba također uzeti u obzir.
 
1.5.5.  Grani čni test  
Ako istraživanje provedeno primjenom jedne doze od najmanje 
1 000 mg/kg tjelesne mase/dan u skladu s postupcima opisanim u 
ovoj studiji ne proizvede opažene toksi čke učinke i ako na temelju 
podataka iz strukturno srodnih spojeva ne treba o čekivati toksi čnost, 
u takvim slu čajevima može se smatrati da provo đenje potpunog 
istraživanja s nekoliko visina doza nije neophodno. O čekivana izlo ­ 
ženost ljudi može ukazati na potrebu da se u grani čnom testu primi ­
jeni viša doza. Za druge puteve primjene doza, kao što su inhalacija ili dermalna primjena, fizikalno–kemijska svojstva ispitivane tvari 
često mogu odre đivati i ograni čavati najvišu mogu ću razinu izlaganja 
koja se može posti ći. Za provo đenje studije akutne oralne toksi čno­
sti, doza za grani čni test treba biti najmanje 2 000 mg/kg.
 
1.5.6.  Primjena doza  
Životinjama treba davati doze ispitivane tvari svakodnevno, 7 dana u 
tjednu, tijekom 28 dana; opravdanost primjene petodnevnog režima 
doziranja ili kra ćeg razdoblja izlaganja potrebno je dokazati. Ako se 
ispitivana tvar daje na sondu, to treba u činiti primjenom jednokratne 
doze pomo ću želučane sonde ili odgovaraju će intubacijske kanile. 
Maksimalni volumen teku ćine koja se daje odjednom ovisi o veli čini 
ispitnih životinja. Taj volumen ne smije prije ći 1 ml/100 g tjelesne 
mase. Me đutim kod vodenih otopina moglo bi se koristiti do 
2 ml/100 g tjelesne mase. Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih 
tvari, za koje je normalno da u ve ćim koncentracijama izazivaju 
intenzivnije u činke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem 
koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao stalni volumen.
 
Za tvari koje se daju u hrani ili vodi za pi će, važno je osigurati da 
količine ispitivane tvari o kojoj se radi nemaju utjecaja na uobi čajen 
unos hrane ili vode. Ako se ispitivana tvar daje u hrani, može se 
koristiti stalna koncentracija u hrani (ppm) ili stalna visina doze s 
obzirom na tjelesnu masu životinje; treba navesti koja se od te dvije mogućnosti koristi. Za tvar koja se daje na sondu, dozu treba davati 
u podjednako vrijeme svakog dana i prilagoditi je najmanje jednom 
tjedno kako bi se održala stalna visina doze s obzirom na tjelesnu 
masu životinje. Ako se studija s ponavljanom primjenom doze koristi kao preliminarna za dugoro čnu studiju, preporu ča se u obje studije 
primijeniti sli čnu prehranu. Za studije akutnih u činaka, ako nije 
moguća primjena jedne doze, doza se može davati u malim frakci ­
jama tijekom najviše 24 sata.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 628
 
1.6. OPAŽANJA  
1.6.1.  Učestalost opažanja i testova  
U studijama s ponavljanim dozama, razdoblje opažanja treba obuh ­
vatiti razdoblje doziranja. U studijama akutne toksi čnosti treba 
opažati 14-dnevno razdoblje nakon tretiranja. Za životinje u satelit ­
skim skupinama koje se u razdoblju nakon tretiranja drže bez izla ­
ganja, opažanjima treba obuhvatiti i to razdoblje.  
Opažanja treba provoditi dovoljno često kako bi se postigla maksi ­
malna vjerojatnost otkrivanja anomalija u ponašanju i/ili neuroloških 
anomalija. Opažanja je poželjno provoditi u isto vrijeme svakog dana vodeći računa o razdoblju najve ćeg intenziteta o čekivanih u činaka 
nakon doziranja. U čestalost klini čkih opažanja i funkcionalnih 
testova sažeto je prikazana u tablici 2. Ako kineti čki ili drugi 
podaci dobiveni iz prethodnih studija ukazuju na potrebu uporabe drugačijih vremenskih rokova za opažanja, testove ili razdoblja 
nakon opažanja, treba donijeti alternativni plan, kako bi se prikupio 
maksimalan broj informacija. Opravdanost izmjene plana treba 
dokazati.
 
1.6.1.1.  Opažanja op ćeg zdravstvenog stanja i mortalitet/morbiditet  
Opažanja s obzirom na zdravstveno stanje treba provoditi na svim 
životinjama najmanje jednom dnevno, a najmanje dva puta dnevno 
treba provjeravati ima li slu čajeva pobolijevanja ili smrti.  
1.6.1.2.  Detaljna klini čka opažanja  
Detaljna klini čka opažanja svih životinja odabranih u tu svrhu 
(vidjeti tablicu 1.) treba provoditi jednom prije prvog izlaganja 
(kako bi se omogu ćila usporedba na istom subjektu), a nakon tog 
u različitim intervalima, u zavisnosti od trajanja studije (vidjeti 
tablicu 2.). Detaljna klini čka opažanja na satelitskim skupinama 
namijenjenim opažanju reverzibilnosti u činaka treba provesti na 
kraju razdoblja rekuperacije. Detaljna klini čka opažanja treba provo ­
diti izvan kaveza u kojima se životinje drže, u standardnom ogra ­ 
đenom prostoru. Opažanja treba pažljivo bilježiti, koriste ći sustav 
određivanja rezultata koji obuhva ća kriterije ili skale za svako 
mjerenje u okviru opažanja. Te kriterije ili skale jasno definira ispitni laboratorij. Treba u činiti sve što je potrebno da variranje 
ispitnih uvjeta bude minimalno (da nije sustavno povezano s tretira ­
njem) i da opažanja obavljaju osposobljene osobe koje nemaju 
saznanja da se tretiranje zaista provodi.
 
Preporuča se opažanja provoditi strukturirano, sustavnom primjenom 
dobro utvr đenih kriterija (uklju čujući definiranje što je to standardni 
„raspon”) na svaku životinju prilikom svakog pojedinog opažanja. „Standardni raspon” treba odgovaraju će dokumentirati. Sve opažene 
znakove treba bilježiti. Kad kod je to mogu će, treba zabilježiti i 
značaj opaženih znakova. Klini čkim opažanjima treba obuhvatiti, a 
ne ih ograni čiti na promjene na koži, dlaci, o čima, sluznici, na 
pojavu iscjedaka i izlu čina, i autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija, 
piloerekcija, veli čina zjenica, nepravilnosti u disanju i/ili disanje na 
usta, svi neuobi čajeni znaci uriniranja ili defekacije te urin bez boje),
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 629
 
Također treba zabilježiti i sve neuobi čajene reakcije s obzirom na 
položaj tijela, razinu aktivnosti (npr. pove ćano ili smanjeno iskori ­ 
štavanje standardnog prostora izvan kaveza) i koordinaciju pokreta. Treba zabilježiti i promjene u hodu (npr. šepanje, ataksija), držanju (primjerice zgrbljenost) i reakciju na manipulaciju, postavljanje ili 
druge podražaje okoline kao i pojavu kloni čnih ili toni čnih pokreta, 
konvulzija ili tremora, stereotipnog ponašanja (npr. prekomjerno njegovanje dlake, neobi čni pokreti glave, stalno kretanje u krug) ili 
čudnog ponašanja (npr. griženje ili pretjerano lizanje, samoranjava ­
nje, hodanje unatrag, vokalizacija) ili agresiju.
 
1.6.1.3.  Funkcionalna ispitivanja  
Slično detaljnim klini čkim opažanjima, i funkcionalne pokuse na 
životinjama odabranim u tu svrhu (vidjeti tablicu 1.) treba provesti jednom prije izlaganja i zatim provoditi često. Učestalost funkcio ­
nalnih pokusa ovisi i o trajanju studije (vidjeti tablicu 2.). Osim u 
razdobljima klini čkih opažanja kako su navedena u tablici 2., funk ­
cionalna opažanja na satelitskim skupinama namijenjenim opažanju reverzibilnosti u činaka treba provesti što neposrednije pred planirano 
usmrćivanje na kraju pokusa. Funkcionalnim pokusima treba obuh ­
vatiti osjetilnu reakciju na podražaje raznih vrsta (npr. auditivne, vizualne i proprioceptivne podražaje (5)(6)(7)), procjenu sposobnosti 
stiska ekstremiteta (8) i procjenu motorne aktivnosti. Motornu aktiv ­
nost treba mjeriti automatskim ure đajem koji je u stanju detektirati i 
smanjenja i pove ćanja aktivnosti. Ako se koristi neki drugi definirani 
sustav, isti mora biti kvantitativan, a njegovu pouzdanost i osjetlji ­
vost treba dokazati. Svaki ure đaj treba ispitati kako bi se kod svih 
osigurala trajna pouzdanost i me đusobna uskla đenost. Dodatni detalji 
o postupcima koji se mogu primijeniti nalaze se u referencama. U nedostatku pokazatelja potencijalnih neurotoksi čnih učinaka (npr. 
podataka o odnosu struktura-aktivnost, epidemioloških podataka, 
drugih toksikoloških studija), treba predvidjeti specijalizirane testove osjetilnih i motornih funkcija ili pam ćenja i sposobnosti 
učenja kojima bi se ti mogu ći učinci mogli još detaljnije prou čiti. 
Više informacija o tim specijaliziranim testovima i njihovoj primjeni 
navedeno je u (1).
 
Iznimno se funkcionalna ispitivanja mogu izostaviti kod životinja 
koje inače pokazuju znakove toksi čnosti takvog stupnja da bi to 
moglo utjecati na izvedbu ispitivanja. Opravdanost odluke da se životinje isklju če iz funkcionalnog ispitivanja treba dokazati.
 
1.6.2.  Tjelesna masa i potrošnja hrane/vode  
Kod studija u trajanju do 90 dana, sve životinje treba vagati 
najmanje jednom tjedno i najmanje jednom tjedno treba mjeriti potrošnju hrane (potrošnju vode, ako se ispitivana tvar primjenjuje tim putem). Kod dugoro čnih studija, sve životinje treba vagati 
najmanje jednom tjedno prvih 13 tjedana, a nakon toga najmanje 
jednom svaka četiri tjedna. Mjerenje potrošnje hrane (i potrošnje 
vode ako se ispitivana tvar primjenjuje tim putem) treba provoditi najmanje jednom tjedno prvih 13 tjedana, a zatim u otprilike tromje ­
sečnim intervalima, ako zdravstveno stanje ili promjene tjelesne 
mase ne zahtijevaju druga čije.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 630
 
1.6.3.  Oftalmologija  
Za studije dulje od 28 dana oftalmološki pregled uz korištenje oftal ­
moskopa ili sli čnog odgovaraju ćeg instrumenta treba obaviti prije 
primjene ispitivane tvari i po završetku studije, poželjno na svim 
životinjama, ili barem na životinjama iz skupina kod koje je primje ­
njivana velika doza i na životinjama iz kontrolne skupine. Ako se primijete promjene u o čima ili ako klini čki znakovi ukazuju da je to 
potrebno, treba pregledati sve životinje. Kod dugoro čnih studija, 
oftalmološki pregled tako đer treba obavljati nakon 13 tjedana. Oftal ­
mološke preglede ne treba obavljati ako su ovi podaci ve ć dostupni 
iz drugih studija sli čnog trajanja i sli čnih visina doze.
 
1.6.4.  Hematologija i klini čka biokemija  
Ako se studija neurotoksi čnosti provodi u kombinaciji sa studijom 
sustavne toksi čnosti kod ponavljanih doza, treba provesti hemato ­
loške preglede i klini čka biokemijska odre đivanja utvr đena u odgo ­
varajućoj metodi studije sustavne toksi čnosti. Prikupljanje uzoraka 
treba obaviti na na čin da eventualni potencijalni u činci neurotoksi č­
nosti na ponašanje budu minimalni.  
1.6.5.  Histopatologija  
Neuropatološkim pregledom treba dopuniti i proširiti opažanja prove ­
dena u  in vivo  fazi studije. Tkiva najmanje pet životinja/spolu/sku ­
pini (vidjeti tablicu 1. i slijede ći stavak) treba fiksirati  in situ , kori­ 
štenjem op će priznatih tehnika perfuzije i fiksiranja (vidjeti referencu 
3. poglavlje 5. i referencu 4. poglavlje 50.). Sve uo čljive velike 
promjene treba zabilježiti. Ako se studija provodi kao samostalna 
studija radi probira na neurotoksi čnost ili radi karakterizacije neuro ­
toksičnih učinaka, preostale životinje mogu se upotrijebiti za speci ­
fična ispitivanja ponašanja (10)(11), te posebne neuropatološke 
(10)(11)(12)(13), neurokemijske (10)(11)(14)(15), ili elektrofizio ­
loške postupke (10)(11)(16)(17) koji mogu dopuniti ovdje opisane podatke i ispitivanja, ili kao dodatni broj životinja za histopatološku analizu. Ti dodatni postupci posebno su korisni ako empirijska 
opažanja ili o čekivani u činci ukazuju na posebnu vrstu ili poseban 
cilj neurotoksi čnosti (2)(3). Druga je mogu ćnost da se preostale 
životinje iskoriste za rutinska patološka vrednovanja opisana u meto ­
dama za studije s ponavljanim dozama.
 
Na svim uzorcima tkiva uklopljenim u parafin treba provesti op ći 
postupak bojenja, npr. hematoksilin i eozin (H&E) i mikroskopski ih pregledati. Ako se opaze znakovi periferne neuropatije ili se na njih 
sumnja, treba pregledati uzorke perifernog živ čanog tkiva uklopljene 
u plastiku. Klini čki znakovi isto tako mogu ukazati da je potrebno 
pregledati i dodatne lokacije ili primijeniti posebne postupke bojenja. Smjernice o dodatnim lokacijama koje treba pregledati mogu se na ći 
u (3)(4). Odgovaraju će posebne boje mogu biti od pomo ći i za 
dokazivanje posebnih tipova patoloških promjena (18).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 631
 
Reprezentativne sekcije središnjeg i perifernog živ čanog sustava 
treba histopatološki pregledati (vidjeti referencu 3. poglavlje 5. i 
referencu 4. poglavlje 50.). Pregledom treba obuhvatiti sljede ća 
područja: veliki mozak, središnji dio cerebruma, uklju čujući sekciju 
hipokampusa, srednji mozak,  cerebellum , Varolijev most,  mendulla 
oblongata , oko s vidnim živcem i mrežnicom, le đnu moždinu na 
cervikalnom i lumbarnom zadebljanju, spinalne ganglije, dorsalne bazalne ganglije, dorsalno i ventralno bazalno tkivo, proksimalni bedreni živac, proksimalni tibijalni živac (na koljenu) i ogranke tibi ­
jalnog živca u lisnom miši ću. Sekcije le đne moždine i perifernog 
živca trebaju obuhvatiti kako popre čne ili dijagonalne tako i 
uzdužne sekcije. Pozornost treba obratiti na krvne žile živ čanog 
sustava. Treba pregledati i jedan uzorak skeletnog miši ća, posebno 
lisnog miši ća. Posebno treba paziti na lokacije stani čne ili vlaknaste 
strukture i uzorka u središnjem živ čanom sustavu (CNS) i peri ­
fernom živ čanom sustavu (PNS) za koje se zna da su posebno 
podložni u čincima neurotoksi čnih tvari.
 
Smjernice u pogledu neuropatoloških alteracija koje su obi čno 
rezultat izlaganja toksi čnoj tvari mogu se na ći u referencama 
(3)(4). Preporu ča se stupnjevani pregled uzoraka tkiva, na na čin da 
se sa sekcijama iz kontrolne skupine prvo uspore đuju sekcije iz 
skupine koja je primala veliku dozu. Ako u uzorcima iz tih skupina nisu opažene neuropatološke alteracije, daljnje analize nisu 
potrebne. Ako su u skupini koja je primala veliku dozu neuropato ­
loške alteracije opažene, uzorak svakog od potencijalno ugroženog tkiva iz skupina koje su primale srednju i malu dozu treba kodirati i naknadno pregledati.
 
Ako je prisutnost neuropatoloških alteracija utvr đena u kvalitativnom 
ispitivanju, sve regije živ čanog sustava u kojima su prisutne altera ­
cije treba još jednom pregledati. U svim dozirnim skupinama, sekcije 
svake potencijalno ugrožene regije treba šifrirati i nasumice pregle ­
dati bez saznanja o šiframa. U čestalost i težinu svake lezije treba 
zabilježiti. Nakon što je provedena procjena svih regija iz svih dozirnih skupina, kodovi se dešifriraju i provodi se statisti čka 
analiza kojom se vrednuju odnosi doza-reakcija. Primjere razli čitih 
stupnjeva težine svake lezije treba opisati.
 
Neuropatološke nalaze treba vrednovati u kontekstu opažanja i 
mjerenja ponašanja, kao i drugih podataka iz prethodnih ili paralelnih studija sustavne toksi čnosti ispitivane tvari.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA PODATAKA  
Treba osigurati pojedina čne podatke. Dodatno, sve podatke treba 
sažeti u tablici u kojoj treba navesti broj životinja u svakoj tretiranoj 
ili kontrolnoj skupini na po četku ispitivanja, broj životinja koje su 
uginule tijekom pokusa ili su usmr ćene iz humanih razloga i vrijeme 
smrti ili humanog usmr ćenja, broj životinja koje pokazuju znakove 
toksičnosti, opis opaženih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme 
prve pojave, trajanje i težinu toksi čkih učinaka, broj životinjama s 
lezijama, uklju čujući vrstu i težini lezije ili lezija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 632
 
2.2. VREDNOVANJE I TUMA ČENJE REZULTATA  
Nalaze ovog istraživanja treba vrednovati s obzirom na u čestalost, 
težinu i korelaciju u činaka neurotoksi čnih tvari na ponašanje i neuro ­
patoloških u činaka (i neurokemijskih ili elektrofizioloških u činaka 
ako su dodatna ispitivanja uklju čena) i svih ostalih uo čenih štetnih 
učinaka. Kad je to mogu će, numeri čke rezultate treba vrednovati 
odgovaraju ćom opće prihvaćenom statisti čkom metodom. Odabir 
statističke metode provodi se u vrijeme planiranja studije.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati slijede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— fizikalna priroda (uklju čujući izomeriju, čistoću i 
fizikalno-kemijska svojstva),  
— identifikacijski podaci.  
Nosač (ako je primjenljivo):  
— opravdanost odabira nosa ča. 
Pokusne životinje:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, aklimatizacija, prehrana itd.,  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku ispitivanja.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane tvari/pripravku u hrani, posti ­
gnutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti pripravka,  
— specifikacija primijenjenih doza, uklju čujući pojedinosti o 
nosaču, volumenu i fizi čkom obliku primijenjenog materijala,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane tvari,  
— obrazloženje razloga za odabir visina doze,  
— obrazloženje razloga za odabir puta i trajanja izlaganja,  
— način preračunavanja koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi 
za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), ako je 
primjenljivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Opažanja i ispitni postupci:  
— pojedinosti o raspore đivanju životinja iz svake skupine u podsku ­
pine za perfuziju,  
— pojedinosti o sustavu bodovanja rezultata, uklju čujući kriterije i 
vrijednosti za odre đivanje rezultata za svako mjerenje u detaljnim 
kliničkim opažanjima,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 633
 
— pojedinosti o funkcionalnim pokusima za osjetilnu reakciju na 
podražaje razli čitih modaliteta (npr. auditivne, vizualne i propio ­
ceptivne), za procjenu sposobnosti stiska ekstremiteta i procjenu motorne aktivnosti (uklju čujući pojedinosti o automatskim ure đa­
jima za detekciju aktivnosti) i drugim primijenjenim postupcima,
 
— pojedinosti o oftalmološkim pregledima i, prema potrebi, hema ­
tološkim pregledima i klini čkim biokemijskim pokusima s rele ­
vantnim po četnim vrijednostima,  
— pojedinosti o posebnim neurobihevioristi čkim, neuropatološkim, 
neurokemijskim ili elektrofiziološkim postupcima.  
Rezultati:  
— tjelesna masa/promjene tjelesne mase uklju čujući tjelesnu masu 
kod usmr ćenja,  
— potrošnja hrane i potrošnja vode, ako je primjerno,  
— podaci o toksi čnoj reakciji po spolu i visini doze, uklju čujući 
znakove toksi čnosti ili mortaliteta,  
— karakter, težina i trajanje (vrijeme prve pojave i daljnji tijek) 
detaljnih klini čkih opažanja (bez obzira jesu li u činci reverzibilni 
ili ne),  
— detaljan opis svih rezultata funkcionalnih testova,  
— nalazi nekropsije,  
— detaljan opis svih neurobihevioristi čkih, neuropatoloških, neuro ­
kemijskih ili elektrofizioloških nalaza, ako su dostupni,  
— podaci o apsorpciji i metabolizmu, ako su dostupni,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi.  
Rasprava o rezultatima:  
— informacija o odnosu doza-reakcija,  
— utjecaj bilo kojih drugih toksi čnih učinaka na donošenje 
zaključka o neurotoksi čnom potencijalu ispitivane tvari,  
— visina doze kod koje se ne opažaju štetni u činci. 
Zaključci: 
— potiče se davanje konkretne izjave o sveukupnoj neurotoksi čnosti 
ispitivane kemikalije.  
4. REFERENCE  
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
(3) World Health Organisation (WHO) (1986) Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals.  
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980) Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, str. 
999-1003.  
(6) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, str. 691-704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M., (1991) Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, str. 267-283.  
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T., 
(1979) A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., 1, str. 233-236.  
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
str. 599-609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds., (1992) Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed., (1995) Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B., (1991) Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, str. 689-695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C., 
(1992) Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, str. 343-352.  
(14) O’Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, str. 445-452.
 
(15) O’Callaghan J.P. and Miller, D.B., (1988) Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, str. 368-378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G., (1982) Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, str. 299-335.
 
(17) Johnson, B.L., (1980) Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co.,. Baltimore/London, str. 726-742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A., (1990) Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Living ­
stone.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 635
 
Tablica 1.  
Minimalni broj životinja po skupini za studije neurotoksi čnosti koje se provode zasebno ili u kombinaciji s 
drugim studijama  
STUDIJA NEUROTOKSI ČNOSTI PROVEDENA KAO:  
Zasebna studija  Studija kombinirana s 
28-dnevnom studijom  Studija kombinirana s 
90-dnevnom studijom  Studija kombinirana sa 
studijom kroni čne 
toksičnosti 
Ukupan broj životinja po 
skupini  10 mužjaka i 10 
ženki  10 mužjaka i 10 
ženki  15 mužjaka i 15 
ženki  25 mužjaka i 25 
ženki  
Broj životinja odabranih za 
funkcionalno ispitivanje 
uključujući detaljna klini čka 
opažanja  10 mužjaka i 10 
ženki  10 mužjaka i 10 
ženki  10 mužjaka i 10 
ženki  10 mužjaka i 10 
ženki  
Broj životinja odabranih za 
perfuziju  in situ  i neurohi ­
stopatologiju  5 mužjaka i 5 ženki  5 mužjaka i 5 ženki  5 mužjaka i 5 ženki  5 mužjaka i 5 ženki  
Broj životinja odabranih za 
opažanja toksi čnosti kod 
primjene ponavljane doze/ 
subkronične toksičnosti/ 
kronične toksičnosti, hema ­
tologiju, medicinsku bioke ­
miju, histopatologiju itd. 
kako je navedeno u odgo ­
varajućim smjernicama  5 mužjaka i 5 ženki  10 mužjaka () 
i 10 ženki ()  20 mužjaka () 
i 20 ženki ()  
Dodatna opažanja, prema 
potrebi  5 mužjaka i 5 ženki  
† Uklju čuje pet životinja odabranih za funkcionalno ispitivanje i detaljna klini čka opažanja kao dio studije neurotoksi čnosti. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 636
 
Tablica 2.  
Učestalost klini čkog opažanja i funkcionalnih pokusa  
Vrsta opažanja  Trajanje studije  
Akutni učinci 28-dana  90-dana  Kroni čni učinci 
Kod svih životinja  Opće zdrav­
stveno stanje  dnevno  dnevno  dnevno  dnevno  
Mortalitet/morbi ­
ditet Dva puta dnevno  Dva puta dnevno  Dva puta dnevno  Dva puta dnevno  
Kod životinja 
odabranih za funk ­
cionalna opažanja  Detaljna klini čka 
opažanja  — prije prvog 
izlaganja 
— u roku od 8 
sati nakon doziranja u vrijeme kad 
se očekuje 
najveći 
učinak 
— na 7. i 14. 
dan nakon 
doziranja
 — prije prvog 
izlaganja 
— nakon toga 
jednom tjedno
 — prije prvog 
izlaganja 
— jednom 
tijekom prvog ili drugog 
tjedna izla ­
ganja 
— nakon toga 
jednom 
mjesečno
 — prije prvog 
izlaganja 
— jednom na 
kraju prvog mjeseca izla ­
ganja 
— nakon toga 
svaka tri mjeseca
 
Funkcionalna 
ispitivanja  — prije prvog 
izlaganja 
— u roku od 8 
sati nakon 
doziranja u 
vrijeme kad se očekuje 
najveći 
učinak 
— na 7. i 
14.dan 
nakon dozi ­
ranja
 — prije prvog 
izlaganja 
— tijekom 
četvrtog 
tjedna treti ­
ranja što je moguće 
bliže kraju 
razdoblja izlaganja
 — prije prvog 
izlaganja 
— jednom 
tijekom 
prvog ili 
drugog tjedna izla ­
ganja 
— nakon toga 
jednom mjesečno
 — prije prvog 
izlaganja 
— jednom na 
kraju prvog 
mjeseca izla ­
ganja 
— nakon toga 
svaka tri 
mjeseca  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 637
 
B.44.  APSORPCIJA PUTEM KOŽE: METODA  IN VIVO  
1. METODA  
Ova je ispitna metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispiti ­
vanje OECD–a TG 427 (2004.).  
1.1. UVOD  
Izlaganje mnogim kemikalijama doga đa se uglavnom putem kože 
dok se u ve ćini toksikoloških studija koje se provode na laboratorij ­
skim životinjama koristi oralni put primjene. Studija perkutane 
apsorpcije  in vivo  opisana u ovoj smjernici nudi poveznice potrebne 
za ekstrapolaciju rezultata iz studija s oralnim putem primjene, prilikom procjenjivanja sigurnosti nakon izlaganja dermalnim putem.
 
Prije nego do đe do krvotoka, tvar mora pro ći kroz čitav niz slojeva 
stanice kože. Sloj koji se kod ve ćine kemikalija uzima za odre đi­
vanje brzine prolaza je  stratum corneum  koji se sastoji od mrtvih 
stanica. Permeabilnost kože ovisi kako o lipofilnosti kemikalije tako i o debljini vanjskog sloja epiderme i čimbenicima kao što su mole ­
kulska masa i koncentracija tvari. Op ćenito, koža štakora i ze čeva 
permeabilnija je nego koža čovjeka, dok je permeabilnost kože 
zamoraca i majmuna sli čnija permeabilnosti ljudske kože.
 
Metode za mjerenje perkutane apsorpcije mogu se podijeliti u dvije 
kategorije:  in vivo  i in vitro . Metodom  in vivo  dobivaju se dobre 
informacije o apsorpciji putem kože kod raznih laboratorijskih vrsta. Metode  in vitro  razvijene su u novije vrijeme. U njima se primje ­
njuje prijenos kroz punu ili djelomi čnu debljinu životinjske ili 
ljudske kože na spremnik fluida. Metoda  in vitro  opisana je u 
posebnoj metodi ispitivanja (1). Za pomo ć pri odabiru najprimjere ­
nije metode u odre đenoj situaciji, preporu ča se konzultirati smjernice 
OECD-a za provo đenje studija apsorpcije putem kože (2), koje daju 
više pojedinosti o prikladnim  in vivo  i in vitro  metodama.
 
Ovdje opisana metoda  in vivo  omogućuje određivanje penetracije 
ispitivane tvari kroz kožu u segment sustava. Tehnika je u širokoj primjeni niz godina (3)(4)(5)(6)(7). Iako studija perkutane apsorpcije  
in vitro  može biti primjerena u mnogim slu čajevima, ima situacija u 
kojima je do potrebnih podataka mogu će doći samo studijom  in vivo .
 
Prednosti metode  in vivo  su u tome što se u njoj koristi sustav koji je 
intaktni u pogledu fiziologije i metabolizma, što se koriste vrste koje 
se koriste i u mnogim drugim studijama toksi čnosti i što se može 
modificirati za primjenu drugih vrsta. Nedostaci su korištenje živih životinja, potreba da se radi dobivanja pouzdanih rezultata koristi 
materijal obilježen radioaktivnim izotopom, poteško će u određivanju 
rane faze apsorpcije i razlike u permeabilnosti kože poželjnih vrsta (štakori) i ljudske kože. Životinjska koža op ćenito je permeabilnija, 
pa se uslijed tog može dogoditi da se procijeni ve ća perkutana 
apsorpcija kod čovjeka (6)(8)(9). Kausti čne/nagrizaju će tvari ne 
treba ispitivati na živim životinjama.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 638
 
1.2. DEFINICIJE  
Neapsorbirana doza:  predstavlja koli činu opranu s površine kože 
nakon izlaganja, i eventualno prisutnu koli činu na neokluzivnom 
oblogu te svaku koli činu za koju se dokaže da je ishlapila iz kože 
tijekom izlaganja.  
Apsorbirana doza ( in vivo ): obuhvaća količine prisutne u urinu, 
tekućini s kojom je opran kavez, fekalijama, izdahnutom zraku 
(ako se mjeri), krvi, tkivu (ako se skuplja) i preostalim truplima, nakon uklanjanja s kože na mjestu primjene.
 
Doza koja se može apsorbirati:  predstavlja dozu prisutnu na ili u 
koži nakon pranja.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar za koju je poželjno da bude obilježena radioaktivnim 
izotopom primjenjuje se na životinjsku kožu s koje je skinuta dlaka, 
u jednoj ili više odgovaraju ćih jačina doze u obliku reprezentativnog 
pripravka koji je u op ćoj upotrebi. Ispitni pripravak ostavi se u 
dodiru s kožom to čno utvrđeno vrijeme pod oblogom (neokluzivnim, 
poluokluzivnim, ili okluzivnim) kako ga životinja ne bi progutala. 
Prije, za vrijeme i nakon izlaganja životinje se smještaju u zasebne metaboličke kaveze, a izlu čevine i izdahnuti zrak se u tom razdoblju 
skupljaju za analizu. Skupljanje izdahnutog zraka može se izostaviti 
ako postoji dovoljno informacija koje potvr đuju da hlapljivih 
radioaktivnih metabolita nema ili da nastaju u malom broju. Svaka studija obi čno obuhva ća nekoliko skupina životinja koje se izlažu 
ispitnom pripravku. Jedna skupina se na kraju razdoblja izlaganja 
usmrćuje. Druge se skupine usmr ćuju u planiranim vremenskim 
intervalima nakon toga (2). Na kraju uzorkovanja, preostale životinje se usmrćuju, krv se skuplja za analizu, mjesto primjene se odstra ­
njuje za analizu, a truplo se analizira na prisutnost neo čekivanog 
materijala. Uzorci se analiziraju odgovaraju ćim metodama i procje ­
njuje se stupanj perkutane apsorpcije (6)(8)(9).
 
1.4. OPIS METODE  
1.4.1.  Odabir životinjskih vrsta  
Najčešće upotrebljavana vrsta su štakori, ali mogu se koristi i druge 
vrste i sojevi bez dlake čija je brzina apsorpcije u koži sli čnija 
apsorpciji kod ljudi (3)(6)(7)(8)(9). Treba upotrebljavati mlade 
zdrave životinje samo jednog spola (zadani spol je muški) iz sojeva koji se obi čno koriste u laboratoriju. Na po četku studije 
razlike u masi korištenih životinja ne smiju prije ći ± 20 % vrijednosti 
srednje mase. Pogodni su npr. štakori muškog spola, težine 200 g – 
250 g, posebno u gornjoj polovici tog podru čja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 639
 
1.4.2.  Broj i spol životinja  
Za svaki ispitni pripravak i svako planirano vrijeme završetka treba 
koristiti skupinu od najmanje četiri životinje jednog spola. Pojedi ­
načne skupine životinja usmrtit će se u razli čitim vremenskim inter ­
valima, npr. na kraju razdoblja izlaganja (obi čno 6 ili 24 sata) i zatim 
u daljnjim rokovima (npr. 48 i 72 sata). Ako su dostupni podaci koji dokazuju zna čajne razlike dermalne toksi čnosti izme đu mužjaka i 
ženki, treba odabrati osjetljiviji spol. Ako takvi podaci ne postoje, 
može se upotrijebiti bilo koji spol.
 
1.4.3.  Uvjeti smještaja i prehrane  
Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 
22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prije đe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj 
bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je 
redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana koja treba biti dostupna po volji i s neograni čenom koli činom vode za pi će. Za vrijeme studije, a 
poželjno je i tijekom aklimatizacije, životinje se smještaju pojedi ­
načno u metaboli čke kaveze. Budu ći da bi rasipanje hrane i vode 
moglo dovesti do sumnjivih rezultata, vjerojatnost takvih doga đaja 
treba minimalizirati.
 
1.4.4.  Priprema životinja  
Životinje se ozna čavaju radi pojedina čne identifikacije i drže u kave ­
zima najmanje pet dana prije po četka studije kako bi se prilagodile 
laboratorijskim uvjetima.  
Nakon razdoblja aklimatizacije i približno 24 sata prije doziranja, na 
leđnom i hrptenom dijelu trupa životinja treba ukloniti dlaku šiša ­
njem. Pri tome treba izbje ći struganje kože, jer se karakteristike 
propusnosti ošte ćene kože razlikuju od propusnosti intaktne kože. 
Nakon šišanja i približno 24 sata prije primjene ispitivane tvari na 
kožu (vidjeti odjeljak 1.4.7.), površinu kože treba obrisati acetonom 
kako bi se odstranio sebum. Dodatno pranje vodom i sapunom ne preporuča se jer eventualni talog sapuna može pove ćati apsorpciju 
ispitivane tvari. Površina mora biti dovoljno velika kako bi omogu ­ 
ćila pouzdan izra čun apsorbirane koli čine ispitivane tvari po cm
 2 , a 
poželjno je da bude najmanje 10 cm  2 . Takvu je površinu mogu će 
postići kod štakora tjelesne mase 200-250 g. Nakon pripreme, živo ­
tinje se vra ćaju u metaboli čke kaveze.  
1.4.5.  Ispitivana tvar  
Ispitivana tvar je proizvod čije karakteristike penetracije se prou ča­
vaju. U idealnom slu čaju, ispitivana tvar treba biti obilježena 
radioaktivnim izotopom.  
1.4.6.  Priprema ispitivanja  
Pripravak ispitivane tvari (npr. čisti, razrije đeni ili formulirani mate ­
rijal koji sadrži ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje na kožu) 
treba biti isti (ili predstavljati realisti čan surogat) kao i pripravak 
kojem bi mogli biti izloženi ljudi ili druge potencijalne ciljne vrste. Prema potrebi, ispitivana se tvar otapa ili suspendira u odgo ­
varajućem otapalu ili nosa ču. Za sve nosa če osim vode trebaju biti 
poznate karakteristike apsorpcije i potencijalna interakcija s ispiti ­
vanom tvari.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 640
 
1.4.7.  Primjena na kožu  
Na površini kože odredi se mjesto primjene odre đene veličine. 
Poznata koli čina pripravka ravnomjerno se nanese na mjesto 
primjene. Ta bi koli čina trebala odgovarati koli čini kojoj bi potenci ­
jalno mogli biti izloženi ljudi, obi čno 1-5 mg/cm  2 za krute tvari ili 
do 10 μl/cm  2 za tekućine. Opravdanost svih drugih koli čina treba 
dokazati o čekivanim uvjetima upotrebe, ciljevima studije ili fizi ­
kalnim karakteristikama ispitnog pripravka. Nakon primjene, treti ­
rano mjesto treba zaštiti kako ga životinja ne bi lizala. Primjer 
tipičnog uređaja prikazan je na slici 1. Mjesto primjene obi čno se 
zaštiti neokluzivnim oblogom (npr. propusnim najlonskim oblogom). 
Međutim, kod neograni čene primjene mjesto primjene treba biti 
okluzivno zašti ćeno. U slu čaju kad isparavanje poluhlapljivih ispiti ­
vanih tvari u neprihvatljivoj mjeri smanjuje brzinu rekuperacije ispi ­
tivane tvari (vidjeti tako đer odjeljak 1.4.10., prvi stavak), isparenu 
tvar treba sakupljati na ugljenom filtru na poklopcu ure đaja (vidjeti 
sliku 1.). Važno je da niti jedan ure đaj ne ošte ćuje kožu, da ne 
apsorbira ispitni pripravak i da ne reagira s njim. Životinje se vraćaju svaka u svoj kavez kako bi se sakupile njihove izlu čevine.
 
1.4.8.  Trajanje izlaganja i uzorkovanje  
Trajanje izlaganja vremenski je interval izme đu primjene i odstranji ­
vanja ispitnog pripravka ispiranjem kože. Treba primijeniti rele ­
vantno razdoblje izlaganja (obi čno 6 ili 24 sata), temeljeno na o čeki­
vanom trajanju izlaganja ljudi. Nakon razdoblja izlaganja, životinje 
se drže u metaboli čkim kavezima do planiranog uništenja. U redo ­
vitim intervalima tijekom cijelog trajanja studije životinje treba opažati na znakove toksi čnosti/abnormalne reakcije. Na kraju 
razdoblja izlaganja tretiranu kožu treba opažati na vidljive znakove 
nadraženosti.
 
Metabolički kavezi trebaju omogu ćiti zasebno skupljanje urina i 
fekalija cijelo vrijeme studije. Isto tako trebaju omogu ćiti skupljanje 
ugljikovog dioksida obilježenog izotopom  14 C i hlapljivih ugljikovih 
spojeva obilježenih izotopom  14 C, koje treba analizirati ako se jave u 
količinama > 5 %. Urin, fekalije i isparene fluide (npr. ugljikov 
dioksid obilježen izotopom  14 C i hlapljive ugljikove spojeve obilje ­ 
žene izotopom  14 C) treba skupljati pojedina čno iz svake skupine u 
svako vrijeme uzorkovanja. Ako postoji dovoljno informacija koje 
potvrđuju da hlapljivi radioaktivni metaboliti nastaju u malom broju 
ili da ih nema, mogu se koristiti otvoreni kavezi.  
Izlučevine se skupljaju tijekom razdoblja izlaganja, do 24 sata nakon 
prvog dodira s kožom, a zatim svakodnevno do završetka pokusa. Iako su tri intervala skupljanja izlu čevina obi čno dovoljna, za 
konkretnu studiju mogu se odrediti dodatne ili primjerenije 
vremenske to čke skupljanja izlu čevina, prema predvi đenoj svrsi 
ispitnog pripravka ili postoje ćim kinetičkim podacima.
 
Na kraju razdoblja izlaganja, zaštita se skida sa životinja i pojedi ­
načno pohranjuje za analizu. Tretiranu kožu životinja treba isprati 
najmanje tri puta agensom za čišćenje i odgovaraju ćim sredstvima za 
brisanje. Treba paziti da se ne one čiste drugi dijelovi tijela. Agens za 
čišćenje treba biti reprezentativan za uobi čajene postupke obavljanja 
higijene, npr. vodena otopina sapuna. Na kraju kožu treba osušiti. Sva sredstva za brisanje i sredstva kojima je pranje provedeno treba sačuvati za analizu. Životinjama u posljednjim skupinama koje su 
sudjelovale u pokusu, prije povratka u pojedina čne kaveze na treti ­
rano mjesto treba staviti svježi zavoj.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 641
 
1.4.9.  Postupci usmr ćenja 
U svakoj skupini, životinje treba usmrtiti pojedina čno, u planirano 
vrijeme i skupiti krv za analizu. Zaštitno sredstvo ili oblog treba skinuti za analizu. Sa svake životinje, za posebnu analizu treba 
skinuti kožu s mjesta primjene i sli čnu površinu netretirane, 
ošišane kože. Mjesto primjene može se frakcionirati kako bi se  
stratum corneum  odvojio od epidermalne podloge i na taj na čin 
dobilo više informacija o tome kako je ispitivana kemikalija raspo ­
ređena. Analiza tog razmještaja u vremenu nakon razdoblja izlaganja 
treba pokazati sudbinu ispitivane tvari u  stratum corneum . Radi 
lakšeg frakcioniranja kože (nakon završnog pranja kože i usmr ­ 
ćivanja životinja) skida se svaki zaštitni oblog. Koža na mjestu 
primjene, zajedno s prstenastim pojasom okolne kože, izreže se iz životinje i pribada čama pričvrsti na plo ču. Na površinu kože lagano 
se pritisne ljepljiva traka koja se zatim skine zajedno s dijelom  
stratum corneum.  Taj se postupak ponavlja sve dok se traka više 
ne lijepi za površinu, što zna či da je  stratum corneum  u potpunosti 
odstranjen. Sve ljepljive trake za svaku životinju mogu se držati u jednoj posudi u koju se doda stimulator digestije tkiva kako bi se  
stratum corneum  otopio. Sva potencijalna ciljna tkiva mogu se 
odstraniti za zasebna mjerenja prije nego se preostalo truplo analizira s obzirom na dozu apsorbiranu u truplu. Trupla pojedina čnih živo­
tinja treba zadržati za analizu. Obi čno će biti dostatna analiza sveu ­
kupnog sadržaja. Ciljni organi mogu se izvaditi za zasebnu analizu 
(ako je indicirana drugim studijama). Urin koji se nalazi u mjehuru u vrijeme planiranog usmr ćenja treba dodati ranije skupljenom urinu. 
Nakon skupljanja izlu čina iz metaboli čkih kaveza u vrijeme plani ­
ranog usmr ćenja, kaveze i posude za skupljanje treba oprati odgo ­
varajućim otapalom. I drugu potencijalno kontaminiranu opremu isto 
tako treba analizirati.
 
1.4.10.  Analiza  
U svim studijama treba posti ći određenu razinu rekuperacije (tj. 
srednju vrijednost radioaktivnosti od 100 ± 10 %). Za rekuperaciju izvan tog podru čja treba navesti razlog. Koli činu primijenjene doze u 
svakom uzorku treba analizirati postupcima koji su vrednovani na 
odgovaraju ći način.
 
U statisti čke podatke treba uklju čiti stupanj odstupanja ponovljenih 
pokusa kod svake primjene.  
2. PODACI  
Sljedeća mjerenja treba provesti za svaku životinju, kod svakog 
uzorkovanja ispitne kemikalije i/ili metabolita. Uz pojedina čne poda­
tke, u izviješ će treba unijeti i podatke grupirane prema vremenskim 
točkama uzorkovanja, kao srednje vrijednosti.  
— količina koja se povezuje sa zaštitnim sredstvima,  
— količina koju je mogu će ukloniti s kože,  
— količina u/na koži koju nije mogu će isprati s kože,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 642
 
— količina u uzorkovanoj krvi,  
— količina u izlu čevini i izdahnutom zraku (prema potrebi),  
— količina preostala u truplu i organima odstranjenim za zasebnu 
analizu.  
Količina ispitivane tvari i/ili metabolita u izlu čevinama, izdahnutom 
zraku i truplu omogu ćuje određivanje ukupne koli čine koja je apsor ­
birana u svakoj to čki vremena. Može se do ći i do izra čuna količine 
ispitivane tvari apsorbirane po cm  2 kože izložene ispitivanoj tvari 
tijekom razdoblja izlaganja.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati uvjete navedene u protokolu, 
uključujući dokaze o opravdanosti primijenjenog ispitnog sustava, 
kao i sljede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— identifikacijski podaci (npr. CAS broj, ako je poznat, izvor, 
čistoća (radiološko-kemijska čistoća), poznate ne čistoće, broj 
partije),  
— fizikalna priroda, fizikalno-kemijska svojstva (npr. pH, hlaplji ­
vost, topljivost, stabilnost, molekulska težina i log P  ow ). 
Ispitni pripravak:  
— formulacija i opravdanost upotrebe,  
— pojedinosti o ispitnom pripravku, primijenjenoj koli čini, posti ­
gnutoj koncentraciji, nosa ču, stabilnosti i homogenosti.  
Pokusna životinja:  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku pokusa.  
Uvjeti ispitivanja:  
— pojedinosti o primjeni ispitnog pripravka (mjesto primjene, 
ispitne metode, okluzija/bez okluzije, volumen, ekstrakcija, 
detekcija),  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.  
Rezultati:  
— eventualni znaci toksi čnosti,  
— tablični prikaz podataka o apsorpciji (podaci izraženi kao brzina, 
količina ili postotak),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 643
 
— sveukupna rekuperacija na razini pokusa,  
— tumačenje rezultata, usporedba sa svim dostupnim podacima o 
perkutanoj apsorpciji ispitivanog spoja.  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centre 
for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No 20.  
(4) Zendzian R.P. (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), str. 829-835.  
(5) Kemppainen, B.W., Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
(6) EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
 
(7) EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
(8) Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks, D., Maibach H.I. and 
Sarason, R., (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans.  Fd. 
Chem. Toxic.  28, str. 369-373.
 
(9) Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, str. 399-404.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 644
 
Slika 1.  
Primjer konstrukcije tipi čnog uređaja koji se koristi za ome đivanje i zaštitu mjesta dermalnog 
puta primjene tijekom studija perkutane apsorpcije  in vivo
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 645
 
B.45.  APSORPCIJA PUTEM KOŽE: METODA  IN VITRO  
1. METODA  
Ova je ispitna metoda ekvivalentna metodi iz Smjernice za ispiti ­
vanje OECD–a TG 428 (2004.).  
1.1. UVOD  
Ova je metoda razvijena s ciljem dobivanja informacija o apsorpciji 
ispitivane tvari primijenjene na isje čak kože. Može se kombinirati s 
metodom apsorpcije putem kože: metodom  in vivo  (1), ili provoditi 
odvojeno. Kao pomo ć kod planiranja studija koje se temelje na ovoj 
metodi preporu ča se konzultirati smjernice OECD-a za provo đenje 
studija apsorpcije putem kože (2). Smjernice su izra đene kako bi se 
olakšao odabir primjerenih postupaka  in vitro  u konkretnim okolno ­
stima i osigurala pouzdanost rezultata dobivenih ovom metodom.  
Metode za mjerenje apsorpcije putem kože i difuzije dermalnim 
putem mogu se podijeliti u dvije kategorije:  in vivo i in vitro . 
Metode  in vivo  za istraživanje apsorpcije putem kože daju farmako ­
loško-kineti čke informacije kod velikog broja životinjskih vrsta i 
dobro su poznate. Metoda  in vivo  opisana je zasebno u drugoj 
ispitnoj metodi (1). Metode  in vitro  također se godinama koriste 
za mjerenje apsorpcije putem kože. Iako za metode  in vitro  obuhva­ 
ćene ovom ispitnom metodom nisu provedene formalne validacijske 
studije, stru čnjaci OECD-a procijenili su 1999. da je koli čina vred­
novanih podataka dovoljna za dokumentiranje metode  in vitro  (3). 
Dodatne pojedinosti koje podupiru takvu odluku, uklju čujući i 
značajan broj izravnih usporedbi metoda  in vivo  i in vitro,  navedene 
su u Smjernicama (2). Postoji čitav niz monografija koje obra đuju tu 
temu i daju iscrpne podloge o primjeni metode  in vitro  
(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Metodama  in vitro  mjeri se difuzija 
kemikalija u i kroz kožu u spremnik fluida i u njima se za mjerenje 
samo difuzije može rabiti neaktivna koža, a svježa, metaboli čki 
aktivna koža, za istodobno mjerenje difuzije i metabolizma kože. Ove su metode posebno našle primjenu kao metode probira za uspo ­
redbu kutane i perkutane dobave kemikalija iz razli čitih formulacija i 
mogu dati korisne modele za procjenu perkutane apsorpcije kod ljudi.
 
Metoda  in vitro  ne mora biti primjenljiva u svim situacijama i na sve 
klase kemikalija. Ispitna metoda  in vitro  može se primijeniti za 
inicijalno kvalitativno vrednovanje penetracije kroz kožu. U nekim slučajevima, možda će to trebati potvrditi podacima dobivenim 
metodom  in vivo . Za dodatne pojedinosti o situacijama u kojima bi 
primjena metode  in vitro  bila odgovaraju ća treba konzultirati smjer ­
nice (2). Dodatne iscrpne informacije koje mogu biti od pomo ći kod 
donošenja odluke navedene su u (3).
 
U ovoj metodi navode se op ća načela za mjerenje dermalne apsorp ­
cije i difuzije ispitivane tvari na isje čku kože. Za to se može upotri ­
jebiti koža velikog broja vrsta sisavaca, uklju čujući i ljude. Svojstva 
permeabilnosti kože o čuvana su i nakon ekscizije uzorka s tijela jer 
neaktivan  stratum corneum  predstavlja glavnu prepreku za difuziju; 
nikakav oblik aktivnog prijenosa kemikalija kroz kožu nije utvr đen. 
S druge strane, dokazano je da koža ima sposobnost metaboliziranja nekih kemikalija tijekom perkutane apsorpcije (6), čime se stvarna 
apsorbirana doza ne ograni čava, iako to može utjecati na prirodna 
svojstva materijala koji ulazi u krvotok.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 646
 
1.2. DEFINICIJE  
Neapsorbirana doza:  predstavlja koli činu opranu s površine kože 
nakon izlaganja i eventualno prisutnu koli činu na neokluzivnom 
oblogu te svaku koli činu za koju se dokaže da je ishlapila iz kože 
tijekom izlaganja.  
Apsorbirana doza ( in vitro ): masa ispitivane tvari koja u nave ­
denom vremenu dopre do fluida- receptora ili sustavnog krvotoka.  
Doza koja se može apsorbirati ( in vitro ): predstavlja dozu prisutnu 
na ili u koži nakon pranja.  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivana tvar, koja može biti obilježena radioaktivnim izotopom, 
primjenjuje se na površinu uzorka kože koja odvaja dvije komore ćelije za difuziju. Kemikalija odre đeno vrijeme ostaje na koži pod 
određenim uvjetima te se zatim odstranjuje odgovaraju ćim 
postupkom čišćenja. Uzorci prihvatnog fluida uzimaju se u odre ­ 
đenim vremenskim rokovima cijelo vrijeme trajanja pokusa i anali ­
ziraju se s obzirom na prisutnost ispitivane kemikalije i/ili njezinih 
metabolita.
 
Ako se upotrebljavaju metaboli čki aktivni sustavi, metabolite ispiti ­
vane kemikalije mogu će je analizirati odgovaraju ćim metodama. Na 
završetku pokusa odre đuje se distribucija ispitivane kemikalije i koli ­ 
činski se odre đuju njezini metaboliti, prema potrebi.  
Primjenom odgovaraju ćih uvjeta opisanih u ovoj metodi i smjerni ­
cama (2), apsorpcija ispitivane tvari u danom vremenu odre đuje se 
analizom prihvatnog fluida i tretirane kože. Ispitivanu tvar preostalu 
u koži treba smatrati apsorbiranom ako se ne može dokazati da je 
apsorpciju mogu će odrediti samo iz vrijednosti u prihvatnom fluidu. 
Analiza drugih sastojaka (materijal ispran s kože i zadržan unutar slojeva kože) omogu ćuje vrednovanje dodatnih podataka, uklju čujući 
točno određivanje razmještaja ukupne ispitivane tvari i postotka 
rekuperacije.
 
Kako bi se dokazala u činkovitost i pouzdanost ispitnog sustava u 
laboratoriju koji provodi ovaj pokus trebaju biti dostupni rezultati za relevantne referentne kemikalije koji moraju biti u skladu s litera ­
turom objavljenom za primijenjenu metodu. Taj je uvjet mogu će 
zadovoljiti na na čin da se odgovaraju ća referentna tvar (za čiju je 
lipofilnost poželjno da bude sli čna lipofilnosti ispitivane tvari) ispi ­
tuje istodobno s ispitivanom tvari ili da se navedu odgovaraju ći 
povijesni podaci za izvjestan broj referentnih tvari razli čite lipofil ­
nosti (npr. kafein, benzojeva kiselina i testosteron).
 
1.4. OPIS ISPITNE METODE  
1.4.1.  Difuzijska ćelija 
Difuzijska ćelija sastoji se od donorske komore i receptorske komore 
između kojih se postavlja koža (primjer tipi čne konstrukcije prikazan 
je na slici 1.). Ćelija ima više zada ća: treba osigurati da koža bude 
dobro zabrtvljena po rubovima, treba omogu ćiti jednostavno uzorko ­
vanje i dobro miješanje otopine koja je u dodiru s donjom stranom 
kože te dobru regulaciju temperature ćelije i njezinog sadržaja. Prih ­
vatljive su i stati čke i proto čne difuzijske ćelije. Obi čno se donorske 
komore tijekom izlaganja kona čnoj dozi ispitnog pripravka ostavljaju 
nepokrivene. Me đutim kod beskona čnih primjena i odre đenih 
scenarija za kona čne doze, donorske komore mogu se pokriti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 647
 
1.4.2.  Receptorski fluid  
Poželjno je upotrijebiti fiziološki provodljiv prihvatni fluid iako se i 
drugi mogu koristiti pod uvjetom da se dokaže opravdanost njihove primjene. Sastav prihvatnog fluida treba precizno navesti. Treba 
dokazati odgovaraju ću topljivost ispitivane tvari u prihvatnom 
fluidu kako ne bi predstavljao prepreku za apsorpciju. Osim toga, prihvatni fluid ne smije utjecati na integritet pripravka kože. U protočnom sustavu, brzina protoka ne smije biti prepreka difuziji 
ispitivane tvari u prihvatni fluid. U sustavu stati čne ćelije, fluid 
stalno treba miješati i redovito uzorkovati. Ako se prou čava meta ­
bolizam, prihvatni fluid mora podržavati aktivnost kože tijekom 
cijelog pokusa.
 
1.4.3.  Pripravci kože  
Može se koristiti koža ljudskog ili životinjskog porijekla. Podrazu ­
mijeva se da upotreba ljudske kože podliježe nacionalnim i me đu­
narodnim etni čkim pitanjima i uvjetima. Iako je poželjna aktivna 
koža, može se upotrijebiti i neaktivna, pod uvjetom da se integritet kože može dokazati. Prihvatljive su obje epidermalne membrane (odvojene enzimski, toplinski ili kemijski) ili odre đeni slojevi kože 
(debljine obi čno 200-400 μm) pripremljeni pomo ću dermatoma. 
Može se koristiti koža pune debljine, ali prekomjernu debljinu (pri ­
bližno > 1 mm) treba izbjegavati, osim ako se to posebno zahtijeva za određivanje ispitivane kemikalije po slojevima kože. Opravdanost 
odabira vrste, anatomskog mjesta i tehnike pripravljanja treba doka ­
zati. Potrebno je pokus ponoviti najmanje četiri puta za svaki ispitni 
pripravak.
 
1.4.4.  Integritet pripravka kože  
Pravilna je priprema kože od presudne važnosti. Neodgovaraju će 
rukovanje može rezultirati ošte ćenjem sloja  stratum corneum , pa je 
zato provjera integriteta pripravka neophodna. Ako se istražuje meta ­
bolizam kože, svježi isje čak kože treba što je mogu će brže upotrije ­
biti, i to pod uvjetima za koje je poznato da podržavaju metaboli čku 
aktivnost. Op ćenito se smatra da svježi isje čak kože treba upotrijebiti 
u roku 24 sata, ali prihvatljivo vrijeme skladištenja može varirati u zavisnosti o kojem se enzimskom sustavu u metabolizmu radi i o 
temperaturama skladištenja (13). Ako su pripravci kože prije 
upotrebe bili uskladišteni, treba podastrijeti dokaze da je funkcija zaštite sa čuvana.
 
1.4.5.  Ispitivana tvar  
Ispitivana tvar je proizvod čije se karakteristike penetracije prou ča­
vaju. U idealnom slu čaju, ispitivana tvar treba biti obilježena 
radioaktivnim izotopom.  
1.4.6.  Ispitni pripravak  
Pripravak ispitivane tvari (npr. čisti, razrije đeni ili formulirani mate ­
rijal koji sadrži ispitivanu tvar koja se primjenjuje na kožu) treba biti isti (ili predstavljati realisti čan surogat) kao i pripravak kojem bi 
mogli biti izloženi ljudi ili druge potencijalne ciljne vrste. Opravda ­
nost svakog odstupanja od pripravka koji se obi čno rabi treba 
dokazati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 648
 
1.4.7.  Koncentracije i formulacije ispitivanih tvari  
Obično se ispitivana tvar primjenjuje u nekoliko koncentracija koje 
obuhvaćaju gornje vrijednosti potencijalnog izlaganja ljudi. Isto tako, 
studija se može proširiti na cijeli niz tipi čnih formulacija.  
1.4.8.  Primjena na kožu  
U redovnim uvjetima u kojima su ljudi izloženi kemikalijama, 
obično se sre ću konačne doze. Stoga treba upotrijebiti primjenu 
koja oponaša izlaganje ljudi, obi čno 1-5 mg/cm  2 kože za krutu 
tvar i do 10 μl/cm  2 za tekućine. Količinu treba opravdati o čekivanim 
uvjetima upotrebe ili fizikalnim karakteristikama ispitnog pripravka. Na primjer, primjene na površinu kože mogu biti beskona čne ako se 
primjenjuju veliki volumeni po jedinici površine.
 
1.4.9.  Temperatura  
Pasivna difuzija kemikalija (pa stoga i apsorpcija putem kože) pod 
utjecajem je temperature. Komoru za difuziju i kožu treba održavati 
na stalnoj temperaturi bliskoj temperaturi normalne kože od 32 ± 1 °C. 
Za različite konstrukcije ćelija bit će potrebne razli čite temperature 
vodene kupke ili zagrijanog bloka, kako bi se osiguralo da prihvatna komora/koža budu u razini fiziološke norme. Poželjno je da vlažnost 
bude izme đu 30 i 70 %.
 
1.4.10.  Trajanje izlaganja i uzrokovanje  
Koža se može ispitnom pripravku izlagati cijelo vrijeme trajanja 
pokusa ili u kra ćim rokovima (tj. treba oponašati posebnu vrstu 
izlaganja kojem su podvrgnuti ljudi). S kože treba isprati višak ispi ­
tivane tvari odgovaraju ćim sredstvom za čišćenje, a ispranu teku ćinu 
sakupiti za analizu. Postupak uklanjanja ispitnog pripravka ovisit će 
o očekivanom uvjetu upotrebe i njegovu opravdanost treba dokazati. 
Za odgovaraju ću karakterizaciju profila apsorpcije obi čno je 
potrebno razdoblje uzorkovanja od 24 sata. Budu ći da se po isteku 
tih 24 sata integritet kože može po četi pogoršavati, uzorkovanje treba 
provesti unutar 24 sata. Za tvari koje brzo prodiru u kožu to možda 
neće biti potrebno, ali za ispitivane tvari koje prodiru polagano, 
možda će trebati duže vrijeme. U čestalo uzimanje uzorka prihvatnog 
fluida treba omogu ćiti izradu grafi čkog prikaza profila apsorpcije 
ispitivane tvari.  
1.4.11.  Zaklju čni postupci  
Sve sastavne dijelove ispitnog sustava treba analizirati i odrediti 
razinu rekuperacije. Sustav obuhva ća donorsku komoru, ispiranje 
površine kože, pripravak kože i prihvatni fluid/komoru. U nekim 
slučajevima, koža se može frakcionirati na površinu kože koja se 
izlaže i površinu kože ispod ruba ćelije te na sloj  stratum corneum , 
epidermu i dermu, za zasebnu analizu.  
1.4.12.  Analiza  
U svim studijama treba posti ći odgovaraju ću razinu rekuperacije (cilj 
bi trebao biti srednja vrijednost od 100 ± 10 % radioaktivnosti, a svako odstupanje od toga treba opravdati). Koli činu ispitivane tvari u 
prihvatnom fluidu, pripravku kože, sredstvu s kojim se ispire povr ­ 
šina kože i ure đaj treba analizirati odgovaraju ćom tehnikom.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 649
 
2. PODACI  
Treba predo čiti analizu prihvatnog fluida, distribuciju ispitivane 
kemikalije u ispitnom sustavu i profil apsorpcije s obzirom na vrijeme. Ako se primjenjuju uvjeti izlaganja s kona čnom dozom, 
treba izra čunati koli činu ispranu s kože, koli činu u koži (i razli čitim 
slojevima kože, ako se analiziraju), te koli činu prisutnu u prihvatnom 
fluidu (stopa i koli čina ili postotak primijenjene doze). Apsorpcija 
putem kože se ponekad može izraziti samo pomo ću podataka o 
prihvatnom fluidu. Me đutim, ako na kraju studije ispitivana tvar 
ostaje u koži, možda će je trebati uklju čiti u ukupnu apsorbiranu 
količinu (vidjeti stavak 66. u referenci (3)). Ako se primjenjuju 
uvjeti izlaganja s beskona čnom dozom, podaci mogu omogu ćiti 
izračun konstante permeabilnosti (Kp). Pod uvjetima izlaganja s 
beskonačnom dozom, apsorbirani postotak nije relevantan.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju moraju biti navedeni uvjeti propisani u 
protokolu, uklju čujući dokaz o opravdanosti primijenjenog ispitnog 
sustava, kao i sljede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— fizikalna priroda, fizikalno-kemijska svojstva (najmanje mole ­
kulska težina i log P  ow ), čistoća (radio-kemijska čistoća), 
— identifikacijski podaci (npr. broj partije),  
— topljivost u prihvatnom fluidu.  
Ispitni pripravak:  
— formulacija i opravdanost upotrebe,  
— homogenost.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podrijetlo i mjesto uzimanja kože, metoda izrade pripravka, uvjeti 
skladištenja prije uporabe, eventualna obrada prije tretiranja (čišćenje, tretiranje antibioticima itd.), mjerenje integriteta kože, 
metabolički status, opravdanost upotrebe,
 
— konstrukcija ćelije, sastav prihvatnog fluida, brzina protoka prih ­
vatnog fluida ili vrijeme i postupci uzorkovanja,  
— pojedinosti o primjeni ispitnog pripravka i kvantifikacija primije ­
njene doze,  
— trajanje izlaganja,  
— pojedinosti o uklanjanju ispitnog pripravka s kože, npr. ispiranje 
kože,  
— pojedinosti analize kože i eventualnih tehnika frakcioniranja koje 
su primijenjene u dokazivanju distribucije u koži,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 650
 
— postupci pranja ćelije i opreme,  
— pokusne metode, tehnike ekstrakcije, granice detekcije i vredno ­
vanje analiti čke metode.  
Rezultati:  
— sveukupna rekuperacija na razini pokusa (primijenjena doza = 
ispiranje kože + koža + prihvatni fluid + ispiranje ćelije),  
— tablični prikaz rekuperacije po pojedina čnim ćelijama u svakom 
odjeljku,  
— profil apsorpcije,  
— tablični prikaz podataka apsorpcije (podaci izraženi kao brzina, 
količina ili postotak).  
Rasprava o rezultatima.  
Zaključci. 
4. REFERENCE  
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In Vivo  Method.  
(2) OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for In vitro 
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications , RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, str. 237-241.
 
(6) Bronaugh R.L. and Maibach H.I., (1991)  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s. CRC 
Press, Boca Raton.  
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
(8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W., 
(1999) Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal 
Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingre ­
dients, Fd Chem Tox, 37, str. 191-205.  
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.  
(10) Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R.  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 651
 
(11) Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier: prin ­
ciples of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
(12) Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermal absorption 
and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, str. 356-365.  
Slika 1.  
Primjer tipi čne konstrukcije stati čke difuzijske ćelije za studije perkutane 
apsorpcije  in vitro
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 652
 
B.46.  TEST NADRAŽIVANJA KOŽE  IN VITRO  NA MODELU 
REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME  
UVOD  
1. Nadraživanje kože je izazivanje reverzibilnog ošte ćenja kože nakon 
primjene ispitivane kemikalije u trajanju do najviše 4 sata (prema definiciji 
u Globalno uskla đenom sustavu razvrstavanja i ozna čivanja 
kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) i Uredbi (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, 
označivanju i pakiranju tvari i smjesa (1) (3)). Ova ispitna metoda predvi đa 
in vitro  postupak koji se može koristiti za odre đivanje opasnosti nadražu ­
jućih kemikalija (tvari i smjesa) u skladu s kategorijom 2. UN GHS i EU 
CLP (1) (2) (3). U EU-u i drugim regijama koje nisu donijele neobaveznu kategoriju 3. UN GHS (blago nadražuju će tvari), ova se ispitna metoda 
može tako đer koristiti za odre đivanje nerazvrstanih kemikalija, tj. „Bez 
kategorije” prema UN GHS i U CLP (1) (3). Ova se ispitna metoda može koristiti za odre đivanje nadražuju ćeg djelovanja kemikalija na kožu 
kao samostalni zamjenski test za ispitivanje nadraživanja kože  in vivo  u 
okviru strategije stupnjevitog ispitivanja (4. i poglavlje B.4. iz ovog 
Priloga).
 
2. Ocjenjivanje nadraživanja kože do sada je uglavnom zahtijevalo korištenje 
laboratorijskih životinja (Smjernica OECD-a 404; poglavlje B.4. iz ovog Priloga) (4). Vode ći računa o dobrobiti životinja, metoda B.4 je revidirana 
2004. tako da se dopustilo da se za odre đivanje nagrizanja/nadraživanja 
kože primijeni strategija stupnjevitog ispitivanja i koriste validirane  in 
vitro  ili ex vivo  metode, kako bi se izbjegla bol i patnja životinja. Za 
ocjenjivanje nagrizaju ćeg djelovanja u okviru strategije stupnjevitog ispiti ­
vanja iz metode B.4 ili Smjernice OECD-a 404 (4) donijete su tri validirane  
in vitro  ispitne metode kao Smjernice OECD-a 430, 431 i 435 (5) (6) (7) i 
dvije od njih kao poglavlja B.40 i B.40a ovog Priloga.
 
3. Ova se ispitna metoda bavi kona čnim učinkom nadraživanja kože na 
zdravlje ljudi. Ona se temelji na rekonstruiranoj ljudskoj epidermi (RhE) koja u cjelokupnoj svojoj izvedbi (korištenje netransformiranih keratinocita 
iz ljudske epiderme kao izvora stanica i korištenje reprezentativnog tkiva i 
citoarhitekture) vjerno oponašaju biokemijska i fiziološka svojstva gornjih dijelova ljudske kože tj. epiderme. Ova ispitna metoda, tako đer, obuhva ća i 
niz zahtjeva izvedbe (Dodatak 2.) za ocjenjivanje sli čnih i izmijenjenih 
ispitnih metoda na temelju rekonstruirane ljudske epiderme, koje razvije EC-ECVAM (8), u skladu s na čelima iz Smjernice OECD-a br. 34 (9).
 
4. Postoje tri validirane metode koje su sukladne ovoj ispitnoj metodi. Pred ­
validacijske, optimizacijske i validacijske studije su dovršene za  in vitro  
metodu (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) u kojoj se 
koristi model rekonstruirane ljudske epiderme i koja je dostupna na tržištu 
kao EpiSkin  TM (validirana referentna metoda - VRM). Još su dvije  in vitro  
metode za ispitivanje nadraživanja kože na temelju rekonstruirane ljudske epiderme, dostupne na tržištu i validirane u skladu sa zahtjevima izvedbe 
(21), pokazale sli čne rezultate kao validirana referentna metoda i one su 
EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) i SkinEthic  TM RHE metode (22).  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 653
 
5. Da bi se predložena, sli čna ili izmijenjena,  in vitro  metoda na temelju 
rekonstruirane ljudske epiderme, osim validirane referentne metode i 
metoda EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ili SkinEthic  TM RHE, mogla koristiti u 
regulatorne svrhe, potrebno je odrediti njezinu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograni čenja s obzirom na predloženu uporabu kako bi se osigu ­
ralo da se može smatrati sli čnom validiranoj referentnoj metodi, u skladu sa 
zahtjevima izvedbe utvr đenim u ovoj ispitnoj metodi (Dodatak 2.). Pored 
toga, preporu čuje se da se prije razvoja i validacije sli čne ili izmijenjene  in 
vitro  metode rekonstruirane ljudske epiderme te prije njezina podnošenja na 
zakonsko usvajanje konzultira referentni dokument OECD-a za pojašnjenje 
ispitivanja nadraživanja kože  in vitro  (23).
 
DEFINICIJE  
6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
7. Ograni čenje ispitne metode, kako je dokazala validacijska studija (16), je da 
ne omogu ćuje razvrstavanje kemikalija u neobaveznu kategoriju 3. UN 
GHS (blago nadražuju će tvari). Kada se koristi kao djelomi čni zamjenski 
test, može se zatražiti provo đenje daljnjeg  in vivo  ispitivanja kako bi se u 
potpunosti utvrdio potencijal nadraživanja kože (4. i poglavlje B.4 ovog Priloga). Priznaje se da je uporaba ljudske kože podložna nacionalnim i međunarodnim eti čkim načelima i uvjetima.
 
8. Ova se ispitna metoda odnosi na  in vitro  komponentu nadraživanja kože u 
okviru strategije stupanjskog ispitivanja B.4. (Smjernica OECD-a 404) nagrizanja/nadraživanja kože (4). Iako ova ispitna metoda ne pruža odgo ­
varajuće informacije o nagrizanju kože, treba primijetiti da se B.40a (Smjer ­
nica OECD-a 431) o nagrizanju kože temelji na istom sustavu ispitivanja RhE, ali koristi drugi protokol (poglavlje B.40a). Ova se metoda temelji na modelima rekonstruirane ljudske epiderme koriste ći ljudske keratinocite koji 
stoga predstavljaju  in vitro  ciljni organ vrste koja se prou čava. Pored toga 
neposredno uklju čuje početnu fazu upalne kaskade/mehanizma djelovanja 
(oštećenje stanica i tkiva koje dovodi do lokalizirane ozljede) koja se javlja 
tijekom nadraživanja  in vivo . U postupku validacije na kojem se temelji ova 
ispitna metoda ispitan je široki raspon kemikalija i empirijska baza podataka 
validacijske studije sadržavala je ukupno 58 kemikalija (16) (18) (23). To se odnosi na krute tvari, teku ćine, polukrute tvari i voskove. Teku ćine mogu 
biti vodene ili bezvodne, a krute tvari mogu biti topljive ili netopljive u 
vodi. Kada god je to mogu će, krute se tvari trebaju samljeti u fini prah prije 
primjene. Ne zahtijeva se nikakva druga čija obrada uzorka prije tretiranja. U 
validacijskoj studiji još nisu ocijenjeni plinovi i aerosoli (24). Iako se može zamisliti da se plinovi i aerosoli mogu ispitati tehnologijom rekonstruirane 
ljudske epiderme, trenuta čna ispitna metoda ne dopušta njihovo testiranje. 
Potrebno je tako đer primijetiti da vrlo obojene kemikalije mogu utjecati na 
mjerenja održivosti stanica te da je za korekcije potrebno upotrijebiti prila ­
gođene kontrole (vidjeti stavke 24.-26.).
 
9. Jedan ciklus testiranja koji se sastoji od tri ponavljanja tkiva trebao bi biti 
dovoljan za ispitivanu kemikaliju, ako je razvrstavanje nedvosmisleno. Međutim, u slu čaju grani čnih rezultata, kao što su neskladna ponavljana 
mjerenja i/ili prosje čni postotak održivosti jednak 50 ± 5 %, potrebno je 
razmotriti mogu ćnost provo đenja drugog ciklusa, a potom i tre ćeg ako 
rezultati prvih dvaju ciklusa nisu uskla đeni.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 654
 
NAČELO ISPITIVANJA  
10. Ispitivana se kemikalija nanosi lokalno na trodimenzionalni model rekon ­
struirane ljudske epiderme, koji čine netransformirani ljudski epidermalni 
keratinociti uzgojeni u svrhu dobivanja visoko izdiferenciranog modela 
ljudske epiderme. Sastoji se od organiziranih bazalnih, trnastih i zrnatih 
slojeva te višeslojnog rožnatog sloja ( stratum corneum ) koji izme đu 
stanica sadrži lamelarne masne slojeve, koji predstavljaju glavne razrede lipida, analogno onima koji se nalaze  in vivo .
 
11. Kemijski izazvano nadraživanje kože koje se o čituje u pojavi eritema i 
edema je rezultat kaskade doga đaja koja zapo činje prodiranjem u rožnati 
sloj i ošte ćenjem nižih slojeva keratinocita. Umiru ći keratinociti otpuštaju 
posrednike koji zapo činju upalnu kaskadu koja djeluje na stanice dermisa, a 
posebno stromalne i endotelne stanice. Zamije ćeni eritemi i edemi (24) 
posljedica su dilatacije i pove ćane propusnosti endotelnih stanica. Metode 
na temelju rekonstruirane ljudske epiderme mjere po četne doga đaje u 
kaskadi.  
12. Vijabilnost stanica u modelima rekonstruirane ljudske epiderme mjeri se 
enzimskom pretvorbom vitalne boje MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- 
difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plava); CAS broj 298-93-1 u plavu sol 
formazana, koja se kvantitativno mjeri nakon ekstrakcije iz tkiva (25). Nadražuju će kemikalije prepoznaju se po tome što spuštaju vijabilnost 
stanica ispod definiranih pragova (tj. ≤ 50 % za 2. kategoriju UN 
GHS/EU CLP). Ovisno o regulatornom okviru u kojem se koriste rezultati 
ove ispitne metode, kemikalije kod kojih je vijabilnost stanica iznad defi ­
niranog praga se mogu smatrati tvarima koje ne nadražuju (tj. > 50 %, izvan kategorije).
 
DOKAZIVANJE OSPOSOBLJENOSTI  
13. Prije rutinske primjene bilo koje od tri validirane metode koje ispunjavaju 
zahtjeve ove ispitne metode, laboratoriji moraju dokazati tehni čku osposob ­
ljenost na deset referentnih kemikalija koje su navedene u tablici 1. Za slične metode, razvijene u okviru ove ispitne metode, ili izmjene neke od 
triju validiranih metoda, prije po četka uporabe metode za regulatorno ispi ­
tivanje potrebno je ispuniti zahtjeve izvedbe opisane u Dodatku 2. ove ispitne metode.
 
14. U okviru dokazivanja osposobljenosti preporu čuje se da korisnik po 
primitku provjeri svojstva pregrade tkiva u skladu sa specifikacijama proiz ­
vođača modela rekonstruirane ljudske epiderme. To je posebno važno ako 
se tkiva pošiljaju na velike udaljenosti/duga vremenska razdoblja. Nakon što 
metoda bude uspješno uspostavljena i osposobljenost u pogledu njene 
uporabe dokazana, takav rutinski pregled ne će biti potreban. Me đutim, 
kod rutinske uporabe metode preporu čuje se daljnje ocjenjivanje svojstava 
pregrade u pravilnim vremenskim razmacima.  
Tablica 1.  
Referentne kemikalije  ( 1 ) 
Kemikalija  CAS broj  Rezultat  in vivo  ( 2 ) Agregatno stanje  Kategorija UN GHS/ 
EU CLP  
naftalenoctena kiselina  86-87-3  0  K  bez kat.  
Izopropanol  67-63-0  0,3  T  bez kat.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 655
 
Kemikalija  CAS broj  Rezultat  in vivo  ( 2 ) Agregatno stanje  Kategorija UN GHS/ 
EU CLP  
metil-stearat  112-61-8  1  K  bez kat.  
heptil-butirat  5870-93-9  1,7  T  bez kat.  
fakultativna 3. 
kat ( 3 ) ( 4 ) 
heksil-salicilat  6259-76-3  2  T  bez kat.  
fakultativna 3. 
kat ( 3 ) ( 4 ) 
ciklamen-aldehid  103-95-7  2,3  T  2.kat.  
1-bromheksan  111-25-1  2,7  T  2.kat.  
Kalijev hidroksid (5 % aq.)  1310-58-3  3  T  2.kat.  
1-metil-3-fenil-1-piperazin  5271-27-2  3,3  K  2.kat.  
Heptanal  111-71-7  4  T  2. kat.  
( 1 ) Ove referentne kemikalije su podskup referentnih kemikalija koje su uporabljene u validacijskoj studiji. 
( 2 ) Broj bodova  in vivo  u skladu s B.4. i Smjernicom OECD-a 404 (4). 
( 3 ) U ovoj ispitnoj metodi neobavezna kategorija 3. UN GHS (blago nadražuju će tvari) (1) smatra se kao Bez kategorije. 
( 4 ) Neobavezna kategorija 3. UN GHS se ne primjenjuje prema EU CLP.  
POSTUPAK  
15. U nastavku se nalazi opis elemenata i postupaka u vezi s metodom na 
temelju rekonstruirane ljudske epiderme za potrebe ocjenjivanja nadraži ­
vanja kože. Model rekonstruirane ljudske epiderme treba se rekonstruirati 
i može se preparirati interno ili nabaviti na tržištu. Dostupni su standardni 
operativni postupci za EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) i SkinEthic 
RHE (26) (27) (28). Ispitivanje se provodi na sljede ći način: 
Elementi ispitne metode rekonstruirane ljudske epiderme  
Opći uvjeti  
16. Za obnovu epitela koriste se netransformirani ljudski keratinociti. Ispod 
funkcionalnog rožnatog sloja ( stratum corneum ) nalaze se višestruki 
slojevi vitalnih epitelnih stanica (bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj). I sam rožnati sloj je višeslojan te sadrži esencijalni profil lipida kao čvrstu 
funkcionalnu barijeru koja je sposobna zaustaviti brzi prodor citotoksi čnih 
markerskih tvari, npr. natrijev dodecil-sulfat (SDS) ili Triton X-100. Funk ­
cija barijere treba se dokazati i može se ocijeniti odre đivanjem koncentracije 
markerske kemikalije koja smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC
 50 ) nakon 
fiksnog vremena izlaganja ili odre đivanjem vremena izlaganja koje je 
potrebno da se vijabilnost tkiva smanji za 50 % (ET  50 ) nakon primjene 
markerske kemikalije u unaprijed odre đenoj fiksnoj koncentraciji. Model 
rekonstruirane ljudske epiderme mora biti dovoljno nepropustan da sprije či 
prolazak materijala oko rožnatog sloja do vitalnog tkiva jer bi to zna čilo 
loše modeliranje izlaganja kože. Model rekonstruirane ljudske epiderme ne 
smije biti one čišćen bakterijama, virusima, mikroplazmama i gljivicama.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 656
 
Funkcionalni uvjeti  
Vijabilnost  
17. Test za odre đivanje stupnja vijabilnosti je MTT test (25). Korisnici modela 
rekonstruirane ljudske epiderme trebaju osigurati da svaka šarža uporab ­
ljenog modela ispunjava utvr đene kriterije za negativnu kontrolu (NC). 
Optička gustoća (OD) samog ekstrakcijskog otapala treba biti dovoljno 
mala tj. OD< 0,1. Raspon prihvatljivosti (gornja i donja granica) negativnih 
kontrolnih vrijednosti opti čke gustoće (u uvjetima ispitne metode nadraži ­
vanja kože) odre đuje kreator/dobavlja č modela RhE, a rasponi prihvatlji ­
vosti za tri validirane metode su navedeni u Tablici 2. Potrebno je doku ­
mentirati da je tkivo, obra đeno negativnom kontrolom, stabilno u kulturi (tj. 
daje slična mjerenja vijabilnosti) za vrijeme trajanja ispitnog izlaganja.  
Tablica 2.  
Rasponi prihvatljivosti za negativne kontrolne vrijednosti opti čke gustoće 
Donja granica prihvatljivosti  Gornja granica prihvatljivosti  
EpiSkin  TM (SM)  ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200)  ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE  ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Funkcija barijere  
18. Rožnati sloj i njegov sastav lipida mora biti sposoban zaustaviti brzi prodor 
citotoksičnih markerskih kemikalija, npr. SDS ili Triton X-100, procijenjeno 
na temelju IC  50 ili ET  50 (tablica 3.).  
Morfologija  
19. U izvedbi histološkog pregleda modela rekonstruirane ljudske epiderme 
mora se dokazati da je struktura sli čna strukturi ljudske epiderme (uklju ču­
jući višeslojni rožnati sloj).  
Obnovljivost  
20. Rezultati pozitivne i negativne kontrole ispitne metode moraju dokazati 
obnovljivost tijekom vremena.  
Kontrole kakvo će (KK)  
21. Kreator/dobavlja č modela rekonstruirane ljudske epiderme treba osigurati i 
dokazati da svaka šarža uporabljenog modela epiderme ispunjava definirane 
kriterije za odobrenje proizvoda, me đu kojima su najvažniji vijabilnost 
(stavak 17.), funkcija barijere (stavak 18.) i morfologija (stavak 19.). Ti se podaci trebaju dostaviti korisnicima metode tako da ih mogu uklju čiti 
u izvješća o ispitivanju. Podru čje prihvatljivosti (gornja i donja granica 
prihvatljivosti) za IC
 50 i ET  50 određuje kreator/dobavlja č modela rekonstrui ­
rane ljudske epiderme (ili ispitiva č ako koristi vlastiti model). Za pouzdano 
predviđanje razvrstavanja nadraživanja prihvatljivi su isklju čivo rezultati 
dobiveni s tkivima koja ispunjavaju zadane kriterije. U tablici 3. su kao 
primjer navedena podru čja prihvatljivosti za tri validirane metode.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 657
 
Tablica 3.  
Primjeri kriterija za kontrolu kakvo će šarže  
Donja granica prihvatljivosti  Gornja granica prihvatljivosti  
EpiSkin  TM (SM) 
(18-satna obrada SDS-om) (26)  IC 50 = 1,0 mg/ml  IC  50 = 3,0 mg/ml  
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27)  ET 50 = 4,8 sati  ET  50 = 8,7 sati  
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28)  ET 50 = 4,0 sati  ET  50 = 9,0 sati  
Primjena ispitivanih i kontrolnih tvari  
22. Za svaku ispitivanu kemikaliju i kontrole u svakom ciklusu treba upotrije ­
biti najmanje tri ponavljanja. Bilo da se radi o teku ćinama ili krutim 
tvarima, treba nanijeti dovoljnu koli činu ispitivane kemikalije tako da povr ­ 
šina kože bude ravnomjerno prekrivena, ali paze ći da se izbjegne besko ­
načna doza, tj. najmanje 25 μl/cm  2 ili 25 mg/cm  2 . U slučaju krutih tvari 
površinu epiderme treba prije nanošenja navlažiti deioniziranom ili destili ­
ranom vodom kako bi se poboljšao kontakt izme đu ispitivane kemikalije i 
površine kože. Kad god je to mogu će, krute tvari treba ispitivati u obliku 
sitnog praha. Na kraju razdoblja izlaganja ispitivanu kemikaliju treba 
pažljivo isprati s površine kože vodenom puferskom otopinom ili 0,9 %- 
tnom NaCl. Ovisno o tome koja je od triju validiranih metoda rekonstrui ­
rane ljudske epiderme primijenjena, razdoblje izlaganja može biti izme đu 15 
i 60 minuta, a temperatura inkubacije izme đu 20 i 37 °C. Ta se razdoblja 
izlaganja i temperature optimiziraju za svaku metodu rekonstruirane ljudske 
epiderme i predstavljaju razli čita intrinzi čna svojstva metoda. Za podrobnije 
informacije vidjeti standardne operativne postupke ( Standard Operating 
Procedures ) za metode (26) (27) (28).  
23. U svakom ciklusu ispitivanja treba paralelno koristiti negativne 
kontrole (NK) i pozitivne kontrole (PK) kako bi se dokazalo da se 
vijabilnost (NK), funkcija barijere i posljedi čna osjetljivost (PK) tkiva 
kreću u okvirima propisanog podru čja prihvatljivosti. Predlaže se da se 
kao PK koristi 5 %-tna vodena otopina SDS. Predložene NK kemikalije 
su voda ili otopina soli puferirana fosfatom (PBS).  
Mjerenja vijabilnosti stanica  
24. Najvažniji element ispitnog postupka je da se mjerenja vijabilnosti ne 
provode neposredno nakon izlaganja ispitivanoj kemikaliji, ve ć nakon 
dovoljno dugog razdoblja inkubacije po obradi, tijekom koje se oprana tkiva drže u svježem mediju. Ova faza ostavlja dovoljno vremena da se tkivo oporavi od slabih citotoksi čnih učinaka, ali i da se pojave jasni 
znakovi citotoksi čnih učinaka. U fazi optimizacije testa (11) (12) (13) 
(14) (15) pokazalo se da optimalno razdoblje inkubacije nakon obrade iznosi 42 sata.
 
25. Analiza MTT je validirana kvantitativna validirana metoda koja se treba 
koristiti za mjerenje vijabilnosti stanica prema ovoj ispitnoj metodi. Ta je 
analiza prikladna za trodimenzionalni model tkiva. Uzorak tkiva se stavi u 
otopinu MTT odgovaraju će koncentracije (npr. 0,3 – 1 mg/ml) i ostavi u 
njoj tri sata. Nataloženi plavi formazan se zatim ekstrahira iz tkiva pomo ću 
otapala (npr. izopropanol, kiseli izopropanol) i koncentracija formazana 
izmjeri odre đivanjem vrijednosti OD na 570 nm uz pojas propuštanja do 
najviše ± 30 nm.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 658
 
26. Opti čka svojstva ispitivane kemikalije odnosno njezino kemijsko djelovanje 
na MTT mogu ometati analizu i dovesti do pogrešne procjene vijabilnosti 
(budući da ispitivana kemikalija može sprije čiti ili obrnuti proces nastajanja 
boje, ali ga i izazvati). To se može dogoditi kad se odre đena ispitivana 
kemikalija ne ispere u potpunosti s kože ili prodre u epidermu. Ako ispi ­
tivana kemikalija izravno djeluje na MTT (smanjenjem MTT), prirodno je 
obojena ili se oboji tijekom obrade tkiva, treba upotrijebiti dodatne kontrole kako bi se utvrdio i ispravio utjecaj ispitivane kemikalije na mjernu tehniku koja se koristi za mjerenje vijabilnosti. Podroban opis na čina na koji se 
ispravlja izravna redukcija MTT i interferencije bojila može se prona ći u 
standardnim operativnim postupcima za tri validirane metode (26) (27) (28).
 
Kriteriji prihvatljivosti  
27. Za svaku metodu koja koristi valjane šarže modela rekonstruirane ljudske 
epiderme (vidjeti stavak 21.), OD vrijednost tkiva obra đenih negativnom 
kontrolom ukazuje na kakvo ću tkiva nakon što su dovršeni koraci dopreme 
i preuzimanja te čitav postupak u skladu s protokolom. OD vrijednosti 
kontrola ne smiju biti ispod propisanih donjih granica. Isto tako, tkiva obrađena pozitivnom kontrolom tj. 5 %-tnom vodenom otopinom SDS 
trebaju pokazivati sposobnost da reagiraju na nadražuju ću kemikaliju u 
uvjetima ispitne metode (26) (27) (28). Potrebno je definirati odgovaraju će 
mjere varijabilnosti izme đu tkiva u ponavljanjima (npr. ako se koriste stan ­
dardne devijacije, one trebaju biti u okviru jednostranog 95 %-tnog inter ­
vala tolerancije, izra čunanog na temelju povijesnih podataka; pri validiranoj 
referentnoj metodi SD < 18 %).
 
Tumačenje rezultata i model predvi đanja 
28. Na temelju OD vrijednosti dobivenih za pojedina čne ispitane kemikalije 
može se izra čunati postotak vijabilnosti u odnosu na negativnu kontrolu, 
koja je odre đena kao 100 %. Potrebno je jasno utvrditi i dokumentirati 
prijelomnu vrijednost postotka vijabilnosti stanica koja se koristi za razliko ­
vanje nadražuju ćih kemikalija od nerazvrstanih ispitivanih kemikalija i stati ­
stički postupak ili postupke koji su korišteni za vrednovanje rezultata i 
identifikaciju nadražuju ćih kemikalija te dokazati njihovu prikladnost. Prije ­
lomne vrijednosti za predvi đanje nadraživanja navedene su u nastavku:  
— smatra se da je ispitivana kemikalija nadražuju ća za kožu u smislu 2. 
kategorije UN GHS/EU CLP ako je vijabilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade manja ili jednaka ( ≤) 50 %,
 
— ovisno o regulatornom okviru u kojem se koriste rezultati ispitne 
metode, može se smatrati da ispitivana kemikalija nije nadražuju ća za 
kožu u smislu oznake „bez kategorije” UN GHS/EU CLP ako je vija ­
bilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade viša od (>) 
50 %.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
29. Podaci iz pojedina čnih ponavljanja tkiva u svakom ciklusu (npr. vrijednosti 
OD i izra čunati postoci vijabilnosti stanica za svaku ispitivanu kemikaliju 
zajedno s razvrstavanjem) trebaju se prikazati u tabli čnom obliku, uklju ču­
jući eventualne podatke iz ponovljenih pokusa. Osim toga, za svaki ciklus 
treba navesti srednje vrijednosti ± standardnu devijaciju. Za svaku ispitanu 
kemikaliju treba navesti zapažene interakcije s MTT reagensom i obojenim 
ispitnim kemikalijama.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 659
 
Izvješće o ispitivanju  
30. Izvješ će o ispitivanju sadrži sljede će informacije:  
Ispitivane i kontrolne kemikalije:  
— kemijski naziv(i), npr. CAS naziv i CAS broj, EZ naziv i broj, ako 
poznati,  
— čistoća i sastav kemikalija (u masenom postotku/cima),  
— fizikalno-kemijska svojstva bitna za provedbu istraživanja (npr. fizikalno 
stanje, stabilnost i hlapljivost, pH, topljivost u vodi, ako poznati),  
— obrada ispitivanih/kontrolnih kemikalija prije ispitivanja, prema potrebi 
(npr. zagrijavanje, usitnjavanje),  
— uvjeti skladištenja.  
Obrazloženje modela rekonstruirane ljudske epiderme i protokola koji je 
primijenjen.  
Ispitni uvjeti:  
— sustav stanica koji je upotrijebljen,  
— potpune popratne informacije o konkretnom modelu rekonstruirane 
ljudske epiderme koji je korišten, uklju čujući njegove radne zna čajke; 
to među ostalim uklju čuje sljede će podatke:  
i. vijabilnost;  
ii. funkcija barijere;  
iii. morfologija;  
iv. ponovljivost i prediktivnost;  
v. kontrole kakvo će (KK) modela;  
— detalji ispitnog postupka,  
— ispitne doze, trajanje izlaganja i razdoblje inkubacije nakon obrade,  
— opis mogu ćih izmjena ispitne metode,  
— uputa na postoje će podatke o modelu; to me đu ostalim uklju čuje: 
i. prihvatljivost podataka o kontroli kakvo će s uputom na postoje će 
podatke o šarži;  
ii. prihvatljivost vrijednosti pozitivnih i negativnih kontrola s uputom na 
srednje vrijednosti i raspone za pozitivne i negativne kontrole,  
— opis primijenjenih kriterija vrednovanja, uklju čujući obrazloženje 
odabrane/ih prijelomne/ih vrijednosti modela predvi đanja,  
— uputa na postoje će kontrolne podatke;  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 660
 
Rezultati:  
— tablični prikaz podataka za pojedina čne ispitne kemikalije za svaki 
ciklus i svako mjerenje ponavljanja,  
— oznake kontrola koje se koriste za tvari koje neposredno smanjuju MTT 
i/ili ispitivanih kemikalija za bojenje,  
— opis drugih zapaženih u činaka.  
Rasprava rezultata.  
Zaključci. 
REFERENCE  
1. UN (2009.), United Nations Globally Harmonised System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and 
Geneva. Dostupno na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_rev03/03files_e.html]  
2. EC-ECVAM (2009.), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.euro ­
pa.eu]
 
3. Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the 
Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging 
of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008., str. 1.
 
4. OECD (2004.), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No 404, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
5. OECD (2004.),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 430, 
OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
6. OECD (2004.),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 431, OECD, Pariz. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
7. OECD (2006.),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 435, OECD, Pariz. 
Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
8. EC-ECVAM (2009.), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Dostupno na: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
9 OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No 34, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
10. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001.), A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team,  Toxicol. in Vitro  15, str. 57-93.
 
11. Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002.), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemi ­
cals: follow-up to the ECVAM prevalidation study,  Toxicol. in Vitro  16, 
str. 765-770.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 661
 
12. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. 
and Spielmann, H. (2004.), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the 
upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, ALTEX 
21, str. 107-114.  
13. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005.), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests — An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, str. 351-367.  
14. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005.), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, str. 329-349.
 
15. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002.), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irrita ­
tion Task Force report 2, ATLA 30, str. 109-129.
 
16. Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007.), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: Report 
on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity 
function test, ATLA 35, str. 559-601.
 
17. Hoffmann, S. (2006.), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
18. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007.), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, str. 603- 
619. 
19. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007.),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, str. 351-358.
 
20. EC-ECVAM (2007.), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
21. EC-ECVAM (2007.), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.eu ­
ropa.eu]  
22. EC-ECVAM (2008.), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
23. OECD (2010.), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No 137, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/do ­
cument/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1 _1,00.html]  
24. Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004.),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, str. 231-243.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 662
 
25. Mosmann, T. (1983.), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, str. 55-63.  
26. EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009.), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 
min-42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. 
Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
27. EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009.), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT., For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
28. SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009.), SkinEthic skin irrita ­
tion test-42a test method for the prediction of acute skin irritation of chemi ­
cals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
29. Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995.), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, str. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
30. Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical 
progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approxima ­
tion of laws, regulations and administrative provisions relating to the classi ­
fication, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001., str. 1.
 
31. Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004.), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, str. 1-4.  
32. Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal  in 
vivo data, ALTEX, 14, str. 359-365.
 
33. Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010.), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, str. 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 663
 
Dodatak 1.  
Definicije  
Točnost:  Stupanj podudarnosti izme đu rezultata ispitne metode i prihva ćenih 
referentnih vrijednosti. Ona je mjerilo u činkovitosti ispitne metode i jedan od 
aspekata relevantnosti. Izraz se često koristi u istom zna čenju kao „podudarnost” 
kako bi se ozna čio udio to čnih rezultata ispitne metode (9).  
Vijabilnost stanica:  Parametar za mjerenje ukupne aktivnosti populacije stanica, 
npr. sposobnost stani čnih mitohondrijskih dehidrogenaza da reduciraju vitalnu 
boju MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavo;), koji ovisno o krajnjoj to čki koja se mjeri i planu ispitivanja korelira s 
ukupnim brojem i/ili vitalnoš ću živih stanica.
 
Podudarnost:  Mjerilo u činkovitosti ispitnih metoda koje daju kategorijske rezul ­
tate i jedan od aspekata relevantnosti. Izraz se koristi u istom zna čenju kao 
„točnost” i odre đen je kao udio svih ispitanih kemikalija koje su pravilno 
razvrstane kao pozitivne ili negativne. (9).  
ET 50 : Može se izra čunati odre đivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se 
vijabilnost stanica smanji za 50 % nakon primjene markerske kemikalije u 
unaprijed odre đenoj fiksnoj koncentraciji, vidjeti tako đer IC  50 . 
EU CLP (Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 
16. prosinca 2008. o razvrstavanju, ozna čivanju i pakiranju tvari i smjesa):  
provodi u Europskoj uniji (EU) sustav GHS Ujedinjenih naroda za razvrstavanje 
i označivanje kemikalija (tvari i smjesa) (3).  
GHS (Globalno uskla đeni sustav razvrstavanja i ozna čivanja kemikalija Ujedi ­
njenih naroda (UN)):  Sustav za razvrstavanje kemikalija (tvari i smjesa) prema 
standardiziranim vrstama i stupnjevima fizikalnih opasnosti i opasnosti za zdravlje i okoliš, koji obuhva ća odgovaraju ća komunikacijska sredstva kao što 
su piktogrami, signalne rije či, obavijesti o opasnosti, obavijesti o mjerama opreza 
i sigurnosno-tehni čki listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim 
učincima s ciljem zaštite ljudi (uklju čujući poslodavce, radnike, prijevoznike, 
potrošače i pružatelje pomo ći) i okoliša (1.).
 
IC 50 : Može se izra čunati odre đivanjem koncentracije pri kojoj markerska kemi ­
kalija smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC  50 ) nakon fiksnog vremena izlaganja, 
vidjeti tako đer ET  50 . 
Beskonačna doza:  Količina ispitivane kemikalije nanesena na epidermu koja 
prelazi koli činu koja je potrebna da se potpuno i jednoliko prekrije površina 
epiderme.  
I ja tako đer test:  Kolokvijalni izraz za ispitnu metodu koja je strukturno i 
funkcionalno sli čna validiranoj i prihva ćenoj referentnoj ispitnoj metodi. Takva 
ispitna metoda je kandidat za catch-up validaciju. Izraz se često koristi u istom 
značenju kao sli čna ispitna metoda (9).  
Zahtjevi izvedbe:  Zahtjevi na temelju validirane ispitne metode koji čine osnovu 
za ocjenjivanje usporedivosti predložene metode koja je mehanicisti čki i funkcio ­
nalno slična ispitnoj metodi. Oni uklju čuju: i. klju čne elemente ispitne metode; ii. 
minimalni popis referentnih kemikalija odabranih izme đu kemikalija koje se 
koriste za dokazivanje prihvatljive u činkovitosti validirane ispitne metode, i iii. 
usporedive razine to čnosti i pouzdanosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za 
validiranu ispitnu metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati pred ­
loženom ispitnom metodom koriste ći minimalni popis referentnih kemikalija (9).  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 664
 
Referentne kemikalije:  Kemikalije odabrane za uporabu u validacijskom 
postupku, za koje su reakcije u referentnom sustavu ispitivanja  in vitro  i in 
vivo ili željenim vrstama ve ć poznate. Te kemikalije trebaju biti reprezentativne 
za razrede kemikalija za koje se o čekuje da će ispitna metoda biti uporabljena i 
trebaju predstavljati puni raspon reakcija koje se mogu o čekivati od kemikalija za 
koje se može koristiti, u rasponu od jake do slabe i negativne reakcije. Za 
različite faze validacijskog postupka te razli čite ispitne metode i uporabe mogu 
biti potrebne razli čite skupine referentnih kemikalija (9).  
Relevantnost:  Opis odnosa ispitivanja i željenog u činka te njegova zna čajnost i 
korisnost za posebnu namjenu. Radi se o mjeri u kojoj ispitivanje to čno mjeri ili 
predviđa željeni biološki u činak. Relevantnost uklju čuje i razmatranje o to čnosti 
(podudarnosti) ispitne metode (9).  
Pouzdanost:  Pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može ponoviti unutar 
jednog laboratorija i izme đu više laboratorija tijekom vremena uz primjenu 
istog protokola. Ocjenjuje se izra čunavanjem unutarlaboratorijske i me đulabora­
torijske ponovljivosti (9).  
Zamjenski test:  Test koji zamjenjuje rutinsko ispitivanje za odre đivanje opasnosti 
i/ili procjenu rizika, za koji je utvr đeno da osigurava istovjetnu ili bolju zaštitu 
zdravlja ljudi, zdravlja životinja ili okoliša u odnosu na prihva ćeno ispitivanje u 
svim mogu ćim okolnostima ispitivanja i za sve kemikalije (9).  
Osjetljivost:  Udio svih pozitivnih/aktivnih ispitivanih kemikalija koje su pravilno 
razvrstane primjenom testa. Ona je mjera to čnosti ispitne metode koja daje kate ­
gorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (9).  
Nadraživanje kože:  Izazivanje reverzibilnog ošte ćenja kože nakon primjene ispi ­
tivane kemikalije u trajanju do najviše 4 sata. Nadraživanje kože je lokalna 
neimunogena reakcija koja se javlja ubrzo nakon podražaja (29). Njezina glavna zna čajka je reverzibilan proces koji uklju čuje upalne reakcije i ve ćinu 
karakteristi čnih klini čkih znakova nadraživanja (eritem, edem, svrbež i bol) 
koji se povezuju s upalnim procesom.
 
Specifičnost:  Udio svih negativnih/neaktivnih ispitnih kemikalija koje su pravilno 
razvrstane primjenom testa. Ona je mjera to čnosti ispitne metode koja daje kate ­
gorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (9).  
Strategija stupanjskog ispitivanja:  Ispitivanje koje koristi metode prema na čelu 
sekvencijalnosti; odabrane metode na svakoj sljede ćoj razini odre đuju se na 
temelju rezultata ispitivanja na prethodnoj razini (9).  
Ispitivana kemikalija (navedena i kao ispitivana tvar):  Svaka tvar ili smjesa koja 
se ispituje ovom metodom.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 665
 
Dodatak 2.  
Zahtjevi izvedbe za ocjenjivanje predloženih sli čnih ili izmijenjenih metoda 
in vitro rekonstruirane ljudske epiderme za ispitivanje nadraživanja kože  
UVOD  
1. Cilj zahtjeva izvedbe je pružiti temelj na kojem se za nove ispitne metode, 
zaštićene (autorskim pravima, žigom, registrirane) i nezašti ćene, može odre ­
diti njihova dostatna to čnost i pouzdanost u posebne svrhe ispitivanja. Ti 
zahtjevi izvedbe koji se temelje na validiranim i prihva ćenim metodama, 
mogu se koristiti za ocjenjivanje pouzdanosti i to čnosti drugih sli čnih 
metoda (kolokvijalno nazvanih „i ja tako đer” testovi) koje se temelje na 
sličnim znanstvenim na čelima i mjere ili predvi đaju isti biološki ili toksi čni 
učinak (9).  
2. Prije donošenja izmijenjenih metoda tj. predloženih mogu ćih poboljšanja 
odobrene metode, potrebno je ocijeniti u činak predloženih izmjena na rezul ­
tate ispitivanja i mjeru u kojoj će te izmjene utjecati na dostupne podatke o 
ostalim sastavnicama validacijskog postupka. Ovisno o broju i vrsti pred ­
loženih izmjena, dobivenim podacima i popratnoj dokumentaciji o tim 
izmjenama, one trebaju pro ći isti validacijski postupak, kako je opisan za 
novo ispitivanje, ili ako je prikladno, trebaju biti predmet ograni čenog 
ocjenjivanja pouzdanosti i relevantnosti na temelju utvr đenih zahtjeva 
izvedbe (9).  
3. Za sli čne („i ja tako đer”) ili izmijenjene metode bilo koje od tri validirane 
metode (EpiSkin™ (validirana referentna metoda – VRM), EpiDerm™ SIT (EPI-200) i SkinEthic™ RHE) koje su predložene za uporabu u okviru ove ispitne metode, treba se odrediti njihova pouzdanost i to čnost koriste ći 
kemikalije koje predstavljaju čitavo podru čje vrijednosti nadraživanja 
prema Draizeu. Kod ocjenjivanja primjenom 20 preporu čenih referentnih 
kemikalija iz zahtjeva izvedbe (tablica 1.), treba dobiti vrijednosti pouzda ­
nosti i to čnosti za predložene sli čne ili izmijenjene metode usporedive ili 
bolje od onih dobivenim validiranom referentnom metodom (tablica 2.) (2) 
(16). Vrijednosti pouzdanosti i to čnosti koje se moraju posti ći navedene su 
u stavcima 8. do 12. u ovome dodatku. Obuhva ćene su nerazvrstane kemi ­
kalije (bez kategorije prema UN GHS/EU CLP) i razvrstane kategorije 
(kategorija 2. prema UN GHS/EU CLP) (1) koje predstavljaju razli čite 
kemijske razrede, tako da se pouzdanost i to čnost (osjetljivost, specifi čnost 
i opća točnost) predložene metode mogu usporediti s odgovaraju ćim vrijed­
nostima validirane referentne metode. Prije nego što se ispitna metoda 
primijeni za ispitivanje novih kemikalija treba odrediti njezinu pouzdanost 
kao i sposobnost da pravilno odredi nadražuju će kemikalije 2. kategorije 
prema UN GHS/EU CLP te, ovisno o regulatornom okviru za koji se dostavljaju podaci, njezina sposobnost da pravilno odredi kemikalije bez 
kategorije prema UN GHS/EU.
 
4. Ovi se zahtjevi izvedbe temelje na zahtjevima izvedbe EC-ECVAM PS (8), 
ažuriranim u skladu s UN GHS i EU CLP sustavima za razvrstavanje i označivanje (1) (3). Izvorni zahtjevi izvedbe utvr đeni su nakon dovršenja 
validacijske studije (21) i temelje se na sustavu razvrstavanja EU-a, kako je 
određeno u Direktivi Komisije 2001/59/EZ od 6. kolovoza 2001. o dvade ­
setosmoj prilagodbi tehni čkom napretku Direktive Vije ća 67/548/EEZ o 
usklađivanju zakona i drugih propisa u odnosu na razvrstavanje, pakiranje 
i označivanje opasnih tvari (
 1 ). Budući da je u razdoblju izme đu dovršenja  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 666  
( 1 ) SL L 225, 21.8.2001., str. 1.
 validacijske studije i uspostave ove ispitne metode prema GHS UN donesen 
sustav za razvrstavanje i ozna čivanje u EU-u (CLP EU) (3), zahtjevi 
izvedbe su ažurirani (8). To se ažuriranje uglavnom odnosilo na izmjene i. skupine referentnih kemikalija zahtjeva izvedbe i ii. odre đenih vrijednosti 
pouzdanosti i to čnosti (2) (23).
 
ZAHTJEVI IZVEDBE ZA ISPITNE METODE REKONSTRUIRANE 
LJUDSKE EPIDERME  IN VITRO  ZA NADRAŽIVANJE KOŽE  
5. Zahtjevi izvedbe obuhva ćaju sljede ća tri elementa:  
I. ključne elemente ispitne metode;  
II. minimalni popis referentnih kemikalija;  
III. definirane vrijednosti to čnosti i pouzdanosti.  
I. Ključni elementi ispitne metode  
6. Sastoje se od klju čnih strukturnih, funkcionalnih i proceduralnih elemenata 
validirane metode koji se trebaju uklju čiti u protokol predložene metode 
koja je mehanicisti čki i funkcionalno sli čna ispitnoj metodi ili je njezina 
inačica. Ti elementi uklju čuju jedinstvena svojstva metode, kriti čne proce­
duralne pojedinosti i mjere kontrole kakvo će. Sukladnost s klju čnim 
elementima ispitne metode pomaže osigurati da se sli čna ili izmijenjena 
predložena metoda temelji na istim na čelima kao i odgovaraju ća validirana 
referentna metoda (9). Klju čni elementi ispitne metode detaljno su opisani u 
stavcima 16. do 21. ispitne metode, a ispitivanje se izvodi u skladu sa sljedećim:
 
— opći uvjeti (stavak 16.),  
— funkcionalni uvjeti koji uklju čuju: 
— vijabilnost (stavak 17.),  
— funkciju barijere (stavak 18.),  
— morfologiju (stavak 19.),  
— obnovljivost (stavak 20.),  
— kontrolu kakvo će (stavak 21.).  
II. Minimalni popis referentnih kemikalija  
7. Referentne kemikalije se koriste da bi se utvrdilo jesu li pouzdanost i 
točnost predložene sli čne ili izmijenjene metode, za koju je dokazano da 
je strukturno i funkcionalno dovoljno sli čna validiranim referentnim meto ­
dama, ili koja predstavlja neznatno izmijenjenu varijantu jedne od triju validiranih metoda, usporedive ili bolje od pouzdanosti i to čnosti validirane 
referentne metode (2) (8) (16) (23). Dvadeset preporu čenih referentnih 
kemikalija popisanih u tablici 1. uklju čuju kemikalije iz razli čitih kemijskih 
razreda (tj. kategorije kemikalija na temelju funkcionalnih skupina) koje predstavljaju čitavo podru čje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu (od 
nenadražuju ćih do jako nadražuju ćih). Kemikalije na ovome popisu 
sadrže 10 kemikalija iz 2. kategorije UN GHS/EU CLP i 10 kemikalija 
bez kategorije, od kojih su tri neobavezne kemikalije iz 3. kategorije UN GHS. U okviru ove ispitne metode neobavezna 3. kategorija se smatra kao „bez kategorije”. Kemikalije iz tablice 1. su odabrane izme đu kemikalija 
koje se koriste u fazi optimizacije nakon faze predvalidacije i u validacijskoj 
studiji validirane referentne metode s obzirom na kemijsku funkcionalnost i
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 667
 
agregatno stanje (14) (18). Te referentne kemikalije predstavljaju minimalni 
broj kemikalija koje se trebaju koristiti za ocjenjivanje to čnosti i pouzda ­
nosti predložene sli čne ili izmijenjene metode, ali se ne smiju koristiti za 
razvoj novih metoda. Ako neka od popisanih kemikalija nije dostupna, mogu se koristiti druge kemikalije za koje postoje odgovaraju ći referentni 
podaci  in vivo , odabrane prvenstveno izme đu kemikalija koje se koriste u 
fazi optimizacije nakon faze predvalidacije ili u validacijskoj studiji validi ­
rane referentne metode. Dodatne kemikalije koje predstavljaju druge razrede kemikalija i za koje postoje odgovaraju ći referentni podaci  in vivo , mogu se 
po želji uvrstiti u minimalni popis referentnih kemikalija radi daljnjeg ocje ­
njivanja to čnosti predložene metode.
 
Tablica 1.  
Minimalni popis referentnih kemikalija za odre đivanje to čnosti i pouzdanosti sli čnih ili izmijenjenih metoda 
rekonstruirane ljudske epiderme koje se koriste u ispitivanju nadraživanja kože  ( 1 ) 
Kemikalija  CAS br.  Agregatno stanje  Rezultat 
ocjenjivanja  
in vivo  Kat. VRM  
in vitro  Kat. GHS/EU CLP  
in vivo  
1-brom-4-klorbutan  6940-78-9  T  0  2. kat.  izvan kat.  
dietil-ftalat  84-66-2  T  0  izvan kat.  izvan kat.  
naftalenoctena kiselina  86-87-3  K  0  izvan kat.  izvan kat.  
alil-fenoksiacetat  7493-74-5  T  0,3  izvan kat.  izvan kat.  
izopropanol  67-63-0  T  0,3  izvan kat.  izvan kat.  
4-metil-tio-benzaldehid  3446-89-7  T  1  2. kat.  izvan kat.  
metil-stearat  112-61-8  K  1  izvan kat.  izvan kat.  
heptil-butirat  5870-93-9  T  1,7  izvan kat.  izvan kat.  
heksil-salicilat  6259-76-3  T  2  izvan kat.  izvan kat.  
cinamaldehid  104-55-2  T  2  2. kat.  Izvan kat. 
(fakultativna 3. 
kat) ( 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1  T  2,3  2. kat.  2. kat.  
ciklamen-aldehid  103-95-7  T  2,3  2. kat.  2. kat.  
1-bromheksan  111-25-1  T  2,7  2. kat.  2. kat.  
2-klormetil-3,5-dimetil-4- 
metoksipiridin-hidroklorid  86604-75-3  K  2,7  2. kat.  2. kat.  
di-n-propil disulfid  ( 2 ) 629-19-6  T  3  izvan kat.  2 kat.  
kalijev hidroksid (5 % vode)  1310-58-3  T  3  2. kat.  2. kat.  
benzenetiol, 5-(1,1-dimetile ­
til)-2-metil  7340-90-1  T  3,3  2. kat.  2. kat.  
1-metil-3-fenil-1-piperazin  5271-27-2  K  3,3  2. kat.  2. kat.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 668
 
Kemikalija  CAS br.  Agregatno stanje  Rezultat 
ocjenjivanja  
in vivo  Kat. VRM  
in vitro  Kat. GHS/EU CLP  
in vivo  
heptanal  111-71-7  T  3,4  2. kat.  2. kat.  
tetrakloroetilen  127-18-4  T  4  2. kat.  2. kat.  
( 1 ) Odabir kemikalija se temelji na sljede ćim kriterijima: i. kemikalije su dostupne na tržištu, ii. reprezentativne su za čitavo podru čje 
vrijednosti nadraživanja prema Draizeu (od nenadražuju ćih do jako nadražuju ćih), iii. imaju jasno definiranu kemijsku strukturu, iv. 
reprezentativne su za kemijsku funkcionalnost koja je korištena u validacijskom postupku, i v. nemaju ekstremni toksi čni profil (npr. 
kancerogeno ili reproduktivno toksi čno djelovanje) i nisu povezane s neprimjereno visokim troškovima zbrinjavanja. 
( 2 ) Sukladno UN GHS, nije u EU CLP. 
( 3 ) Kemikalije koje su nadražuju će za kuni će, ali za koje postoje pouzdani dokazi da nisu nadražuju će za ljude (31) (32) (33).  
III. Definirane vrijednosti to čnosti i pouzdanosti  
8. Za utvr đivanje pouzdanosti i relevantnosti predloženih sli čnih ili izmije ­
njenih metoda koje se trebaju prenositi izme đu laboratorija, potrebno je 
ispitati svih 20 referentnih kemikalija iz tablice 1. u najmanje tri laborato ­
rija. Međutim, ako će se predložena metoda koristiti isklju čivo u jednom 
laboratoriju, za validaciju nije potrebno provesti ispitivanje u više laborato ­
rija. Ipak je klju čno da spomenute validacijske studije neovisno ocjenjuju 
međunarodno priznata validacijska tijela u skladu s me đunarodnim smjer ­
nicama (9). U svakom laboratoriju moraju se ispitati svih 20 referentnih 
kemikalija u tri neovisna ciklusa s razli čitim šaržama tkiva i u dovoljno 
udaljenim vremenskim intervalima. Svaki ciklus se sastoji od najmanje tri, paralelno ispitana, ponavljanja tkiva za svaku uklju čenu ispitanu kemikaliju, 
negativnu i pozitivnu kontrolu.
 
9. Vrijednosti pouzdanosti i to čnosti predložene metode se izra čunavaju 
uzimajući u obzir sva četiri dolje navedena kriterija i osiguravaju ći da se 
vrijednosti pouzdanosti i relevantnosti izra čunavaju na unaprijed odre đeni i 
dosljedni na čin: 
1. Za izra čun promjenljivosti i prediktivne sposobnosti (to čnosti) metode 
unutar jednog laboratorija i izme đu više laboratorija mogu se koristiti 
isključivo podaci dobiveni iz u cijelosti izvedenih sekvenci ciklusa.  
2. Svaki uklju čeni laboratorij kona čno razvrstava svaku referentnu kemika ­
liju na temelju prosje čne vrijednosti vijabilnosti u razli čitim ciklusima 
kompletne sekvence.  
3. Za izra čun promjenljivosti metode izme đu laboratorija mogu se koristiti 
isključivo podaci dobiveni za kemikalije za koje su u svim uklju čenim 
laboratorijima u cijelosti dovršene sekvence ciklusa.  
4. Izračun vrijednosti to čnosti treba se temeljiti na pojedina čnim laborato ­
rijskim predvi đanjima koja su razli čiti uključeni laboratoriji ostvarili za 
20 referentnih kemikalija.  
U tom kontekstu, sekvenca ciklusa sastoji se od tri neovisna ciklusa koje 
izvodi jedan laboratorij za jednu ispitivanu kemikaliju. Kompletna sekvenca je sekvenca ciklusa koju izvede jedan laboratorij za jednu ispitivanu kemi ­
kaliju, pri čemu su sva tri ciklusa valjana. To zna či da bilo koji nevaljani 
pojedinačni ciklus poništava cjelokupnu sekvencu od tri ciklusa.
 
Obnovljivost unutar laboratorija  
10. Kod ocjenjivanja varijabilnosti unutar laboratorija podudarnost izme đu 
razvrstavanja (2. kategorija/izvan kategorije UN GHS/EU CLP) dobivenih 
u različitim nezavisnim ispitivanjima 20 referentnih kemikalija u istom 
laboratoriju mora biti ≥ 90 %.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 669
 
Obnovljivost izme đu laboratorija  
11. Ocjenjivanje obnovljivosti izme đu laboratorija nije nužno ako će se pred ­
ložena ispitna metoda koristiti samo u jednom laboratoriju. Ako će se 
metoda koristiti u više laboratorija, podudarnost izme đu razvrstavanja (2. 
kategorija/izvan kategorije UN GHS/EU CLP) dobivenih u razli čitim neza ­
visnim ispitivanjima 20 referentnih kemikalija, po mogu ćnosti u najmanje 
tri laboratorija, mora iznositi ≥ 80 %.  
Prediktivna sposobnost (to čnost)  
12. Točnost (osjetljivost, specifi čnost i ukupna to čnost) predložene sli čne ili 
izmijenjene metode mora biti usporediva ili bolja od odgovaraju ćih vrijed­
nosti validirane referentne metode uzimaju ći u obzir dodatne podatke o 
relevantnosti željenih vrsta (tablica 2.). Osjetljivost treba biti jednaka ili viša (≥) od 80 % (2) (8) (23). Me đutim, dodatno posebno ograni čenje 
primjenjuje se na osjetljivost predložene metode  in vitro  s obzirom da 
više od jednog uklju čenog laboratorija mogu pogrešno razvrstati samo 
dvije kemikalije  in vivo  iz 2. kategorije, 1-dekanol i di-n-propil disulfid, 
kao bez kategorije. Specifi čnost treba biti jednaka ili viša ( ≥) 70 % (2) (8) 
(23). Ne postoje dodatna ograni čenja s obzirom na specifi čnost predložene 
metode  in vitro , tj. bilo koji uklju čeni laboratorij može pogrešno razvrstati 
bilo koju kemikaliju  in vivo  bez kategorije, sve dok je kona čna specifi čnost 
ispitne metode unutar prihvatljivog okvira. Ukupna to čnost treba biti 
jednaka ili viša ( ≥) od 75 % (2) (8) (23). Iako je osjetljivost validirane 
referentne metode, izra čunana za 20 referentnih kemikalija iz tablice 1., 
jednaka 90 %, da bi se bilo koja sli čna ili izmijenjena metoda smatrala 
valjanom, definirana minimalna vrijednost osjetljivosti iznosi 80 %, budu ći 
da je poznato da 1-dekanol (grani čna kemikalija) i di-n-propil disulfid 
(lažna negativna validirane referentne metode) nisu nadražuju ći za ljude 
(31) (32) (33), iako je ispitivanjima utvr đeno da su nadražuju ći za 
kuniće. Budući da se modeli rekonstruirane ljudske epiderme temelje na 
stanicama ljudskog podrijetla, oni mogu predvidjeti da te kemikalije nisu 
nadražuju će (UN GHS/EU CLP bez kategorije).
 
Tablica 2.  
Zahtijevane prediktivne vrijednosti osjetljivosti, specifi čnosti i ukupne to čnosti za bilo koju 
sličnu ili izmijenjenu metodu da bi se smatrale valjanima  
Osjetljivost  Specifi čnost Ukupna to čnost 
≥ 80 %  ≥ 70 %  ≥ 75 %  
Kriteriji prihvatljivosti studije  
13. Mogu će je da jedno ili više ispitivanja koja se odnose na jednu ili više 
ispitivanih kemikalija ne ispunjavaju kriterije prihvatljivosti ispitivanja za ispitivane i kontrolne kemikalije ili nisu prihvatljiva iz drugih razloga. Kako 
bi se dopunili podaci koji nedostaju, za svaku ispitivanu kemikaliju mogu će 
je provesti najviše dva dodatna ispitivanja („ponovno ispitivanje”). To čnije, 
budući da se kod ponovnog ispitivanja trebaju paralelno ispitati i pozitivna i 
negativna kontrola, za svaku ispitivanu kemikaliju mogu će je provesti 
najviše dva dodatna ciklusa.
 
14. Postoji vjerojatnost da čak i nakon ponovnog ispitivanja svaki uklju čeni 
laboratorij za svaku referentnu kemikaliju ne postigne minimum od tri 
valjana ciklusa koji su potrebni za svaku ispitivanu kemikaliju, zbog čega 
je matrica podataka nepotpuna. U tim je slu čajevima potrebno ispuniti 
sljedeća tri kriterija kako bi se podaci smatrali prihvatljivima:  
1. Svih 20 referentnih kemikalija imaju barem jednu kompletnu sekvencu 
ciklusa.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 670
 
2. U svakome od najmanje tri uklju čena laboratorija potrebno je dovršiti 
najmanje 85 % sekvenci ciklusa (za 20 kemikalija; tj. u pojedina čnom 
laboratoriju dopuštene su tri nevaljane sekvence ciklusa).  
3. Mora biti dovršeno najmanje 90 % svih mogu ćih sekvenci ciklusa iz 
najmanje tri laboratorija (za 20 kemikalija ispitanih u 3 laboratorija; tj. ukupno je dopušteno šest nevaljanih sekvenci ciklusa).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 671
 
B. 47.  METODA ISPITIVANJA ZAMU ĆENJA I PROPUSNOSTI 
GOVEĐE ROŽNICE ZA IDENTIFIKACIJU TVARI NAGRIZA ­
JUĆIH I JAKO NADRAŽUJU ĆIH ZA O ČI 
UVOD  
1. Metoda ispitivanja zamu ćenja i propusnosti gove đe rožnice (Bovine Corneal 
Opacity and Permeability - BCOP) je  in vitro  ispitna metoda koja se u 
određenim okolnostima i uz konkretna ograni čenja može primijeniti za 
razvrstavanje tvari i mješavina kao „tvari nagrizaju ćih i jako nadražuju ćih 
za oči” (1) (2) (3). U smislu ove ispitne metode, jako nadražuju će tvari 
definirane su kao tvari koje izazivaju okularne lezije koje kod ze čeva traju 
najmanje 21 dan nakon primjene tvari. Iako se ne smatra da vrijedi kao 
potpuna zamjena za  in vivo  test na o čima zečeva, BCOP metoda preporu čuje 
se za primjenu kao dio strategije stupnjevanog ispitivanja za regulatorno razvrstavanje i ozna čivanje u okviru konkretne domene primjenjivosti (4) 
(5). Ispitne tvari i mješavine (6) mogu se bez dodatnog testiranja na ze če­
vima razvrstati kao tvari nagrizaju će i jako nadražuju će za oči. Tvar koja 
daje negativan rezultat na testu trebalo bi testirati na ze čevima strategijom 
sekvencijskog ispitivanja kako je opisana u Smjernici za ispitivanje OECD-a 
405 (7) (poglavlje B. 5 ovog Priloga).
 
2. Svrha ove ispitne metode je opisati postupke koji se koriste za ocjenjivanje 
potencijalno nagrizaju ćeg ili jako nadražuju ćeg djelovanja ispitne tvari, koje 
se mjeri sposobnoš ću te tvari da izazove zamu ćenje i pove ćanu propusnost 
izolirane gove đe rožnice. Toksi čki učinci na rožnicu mjere se: i. smanjenim 
prijenosom svjetla (zamu ćenje) i ii. pove ćanim prolazom boje natrijevog 
fluoresceina (propusnost). Procjene zamu ćenja i propusnosti rožnice nakon 
izlaganja ispitnoj tvari kombiniraju se kako bi se dobio nalaz nadraživanja  in 
vitro  - In Vitro  Irritancy Score (IVIS), koji se koristi za razvrstavanje ispitne 
tvari prema razini nadražuju ćeg djelovanja.  
3. Primjenom BCOP ispitne metode ispitane su i tvari nadražuju će za oči koje 
uzrokuju lezije koje se povuku za manje od 21 dan i nenadražuju će tvari. 
Međutim, točnost i pouzdanost BCOP ispitne metode za tvari u tim katego ­
rijama nisu formalno ocijenjene.  
4. Definicije su dane u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
5. Ova ispitna metoda temelji se na protokolu BCOP ispitne metode Me đua­
gencijskog koordinacijskog odbora za validaciju alternativnih 
metoda (ICCVAM) (8) koji je razvijen prema me đunarodnoj validacijskoj 
studiji (4) (5) (9), uz doprinose iz Europskog centra za validaciju alter ­
nativnih metoda (ECVAM) i Japanskog centra za validaciju alternativnih 
metoda (JaCVAM). Protokol se zasniva na podacima dobivenim od Instituta 
za in vitro  znanosti (IIVS) i INVITTOX protokolu 124 (10) kao protokolu 
koji je upotrijebljen za predvalidacijsku studiju BCOP pokusa provedenu 1997.-1998. pod pokroviteljstvom Europske zajednice. Oba ta protokola 
temelje se na metodologiji BCOP pokusa o kojoj su prvi izvijestili Gaut ­
heron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 672
 
6. Identificirana ograni čenja ove ispitne metode temelje se na visokim stopama 
lažno pozitivnih rezultata za alkohole i ketone i visokoj stopi lažno nega ­
tivnih rezultata za krute tvari, primije ćenih u validacijskoj bazi podataka 
(vidjeti stavak 44.) (5). Ako se tvari u tim kemijskim i fizikalnim kategori ­
jama isklju če iz baze podataka, to čnost metode BCOP u sustavima za 
razvrstavanje EU-a, EPA-e i GHS sustavu bitno je bolja. Na temelju svrhe 
ovog pokusa (tj. identifikacije samo onih tvari koje su nagrizaju će i jako 
nadražuju će za oči), stopa lažno negativnih rezultata nije od presudne 
važnosti jer te tvari treba sekvencijski testirati na ze čevima ili drugim odgo ­
varajuće validiranim  in vitro  testovima u zavisnosti od regulatornih zahtjeva, 
primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja i pristupa ocjenjivanja dokazne snage. Nadalje, postoje ća validacijska baza podataka nije omogu ći­
vala odgovaraju će ocjenjivanje nekih kategorija kemikalija ili proizvoda 
(npr. mješavine). Ispitiva či bi ipak mogli razmotriti primjenu ove ispitne 
metode za ispitivanje svih vrsta materijala (uklju čujući i mješavine), a pozi ­
tivan bi se rezultat mogao prihvatiti kao pokazatelj nagrizaju će ili jako 
nadražuju će reakcije za o či. Međutim, pozitivne rezultate dobivene s alko ­
holima treba oprezno tuma čiti zbog rizika postizanja precijenjenih rezultata.
 
7. Kod svih postupaka s gove đim očima i gove đim rožnicama treba poštovati 
važeće propise ispitnog laboratorija i postupke za rukovanje materijalom 
dobivenim od životinja koji obuhva ća ali se ne ograni čava na tkiva i 
tkivne teku ćine. Preporu čuju se op ćenite mjere opreza za laboratorije (12).  
8. Ograni čenje ove ispitne metode je u tome da, iako se u njoj uzimaju u obzir 
učinci na oči ocijenjeni metodom ispitivanja nadražuju ćeg djelovanja na o či 
kod zečeva i u odre đenom stupnju ja čina tih u činaka, ne razmatraju se 
ozljede konjunktive i šarenice. Isto tako, iako se reverzibilnost ošte ćenja 
rožnica ne može  per se  ocijeniti pokusom BCOP, na temelju studija na 
očima zečeva predloženo je da se za razlikovanje ireverzibilnih i reverzi ­
bilnih učinaka može koristiti procjena inicijalne dubine ošte ćenja rožnice 
(13). I kona čno, BCOP metoda ne omogu ćuje procjenu potencijala sustavne 
toksičnosti koja se povezuje s izlaganjem oka.  
9. I dalje se nastoji dodatno okarakterizirati koristi i ograni čenja pokusa BCOP 
za identifikaciju tvari koje nisu jako nadražuju će ili uopće nisu nadražuju će 
(vidjeti tako đer stavak 45.). Korisnike se isto tako poti če da organizacijama 
za validaciju dostave uzorke i/ili podatke za formalno ocjenjivanje mogu ćih 
budućih primjena BCOP ispitne metode i za tvari koje nisu jako nadražuju će 
ili uopće nisu nadražuju će. 
10. U svakom laboratoriju koji po prvi put provodi ovaj pokus treba koristiti set 
odobrenih kemikalija naveden u Dodatku 2. Laboratorij može koristiti te 
kemikalije kako bi dokazao svoju tehni čku osposobljenost za provo đenje 
BCOP ispitne metode prije nego podatke iz BCOP testa dostavi za razvrsta ­
vanje prema stupnju opasnosti u regulatorne svrhe.  
NAČELO ISPITIVANJA  
11. BCOP ispitna metoda je organotipski model koji kratkoro čno osigurava 
održavanje normalne fiziološke i biokemijske funkcije gove đe rožnice  in 
vitro . U ovoj ispitnoj metodi, ošte ćenje koje uzrokuje ispitna tvar procjenjuje 
se kvantitativnim mjerenjima promjene zamu ćenja i propusnosti rožnice 
pomoću opacimetra odnosno spektrofotometra vidljivog svjetla. Oba 
mjerenja koriste se za izra čun IVIS-a koji se upotrebljava kako bi se  in 
vitro  utvrđena kategorija razvrstavanja prema opasnosti nadraživanja mogla 
iskoristiti za  in vivo  procjenu potencijala neke ispitne tvari da nadraži oko 
(vidjeti „Kriterije za donošenje odluke”).’  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 673
 
12. U BCOP ispitnoj metodi koriste se izolirane rožnice iz o čiju svježe zaklane 
stoke. Zamu ćenje rožnice mjeri se kvantitativno kao koli čina prijenosa 
svjetla kroz rožnicu. Propusnost se mjeri kvantitativno kao koli čina boje 
natrijevog fluoresceina koja prolazi punom debljinom rožnice, kako je detek ­
tirana u sredini stražnje komore. Ispitne tvari nanose se na epitelnu površinu 
rožnice u prednjoj komori drža ča rožnice. U Dodatku 3. dat je opis i 
shematski prikaz drža ča rožnice koji se koristi kod BCOP metode. Ti se 
uređaji mogu komercijalno nabaviti iz razli čitih izvora ili se mogu izraditi.  
Izvor i starost gove đih očiju i odabir životinjskih vrsta  
13. Stoka koja se šalje u klaonicu obi čno se kolje bilo za ljudsku potrošnju ili za 
druge komercijalne svrhe. Samo zdrave životinje koje se smatraju pogodnim za uvrštavanje u lanac ljudske prehrane koriste se kao izvor rožnica koje se upotrebljavaju u BCOP metodi. Budu ći da stoka varira u težini ovisno o 
pasmini, starosti i spolu, ne navodi se preporu čena težina životinje u vrijeme 
klanja.
 
14. Kada se koriste o či životinja razli čite starosti, može do ći do varijacija u 
dimenzijama rožnica. Rožnice horizontalnog promjera > 30,5 mm i vrijed ­
nosti debljine srednjeg dijela rožnice (CCT) ≥ 1 100 μm obično se dobiju od 
stoke starije od osam godina, dok se horizontalni promjer > 28,5 mm i CCT 
≥ 900 μm obično dobiju od stoke mla đe od pet godina (14). Iz tog razloga, 
oči stoke starije od 60 mjeseci obi čno se ne koriste. O či stoke mla đe od 12 
mjeseci obi čno se ne koriste jer su one još u razvoju pa su debljina i promjer 
rožnice znatno manji nego kod odrasle stoke. Me đutim, upotreba rožnice 
mladih životinja (tj. 6 do 12 mjeseci starosti) dozvoljena je budu ći da ima 
nekih prednosti, kao što su ve ća dostupnost, uži raspon starosti i manje 
opasnosti povezane s potencijalnom izloženosti radnika gove đoj spongi ­
formnoj encefalopatiji (15). Budu ći da bi dodatno ocjenjivanje u činka veli­ 
čine i debljine rožnice na osjetljivost na nagrizaju će i nadražuju će tvari bilo 
korisno, korisnike se poti če da za životinje od kojih se uzima rožnica koja se 
koristi u studiji navedu približnu dob i/ili težinu.  
Prikupljanje i prijevoz o čiju u laboratorij  
15. Oči prikupljaju radnici u klaonici. Kako bi se mehani čka i druga ošte ćenja 
očiju svela na minimum, o či treba enukleirati što je mogu će brže nakon što 
je životinja usmr ćena. Kako bi se izbjegla izloženost o čiju potencijalno 
nadražuju ćim tvarima, kod ispiranja glave životinje radnici u klaonici ne 
bi trebali koristiti sredstva za pranje.  
16. Oči treba potpuno potopiti u Hankovu otopinu (Hanks’ Balanced Salt Solu ­
tion = HBSS) u odgovaraju će dimenzioniranom spremniku i prevesti do 
laboratorija paze ći da ne do đe do ošte ćenja i/ili bakteriološke kontaminacije. 
Budući da se o či prikupljaju tijekom postupka klanja, mogu biti izložene 
krvi i drugim biološkim tvarima, uklju čujući i bakterije i druge mikroorgan ­
izme. Stoga je važno osigurati da rizik kontaminacije bude minimalni (npr. spremnik s o čima treba držati na mokrom ledu, otopini HBSS u kojoj se o či 
skladište tijekom transporta treba dodati antibiotike [npr. 100 IU/mL penici ­
lina i 100 μg/mL streptomicina]).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 674
 
17. Vrijeme izme đu prikupljanja o čiju i upotrebe rožnica u BCOP testu treba biti 
što kraće (obično se koriste u istom danu u kojem su prikupljene) i treba 
dokazati da se njime ne dovodi u pitanje vjerodostojnost rezultata ispitivanja. Ti rezultati ovise o kriterijima odabira o čiju kao i reakcijama pozitivnih i 
negativnih kontrola. Sve o či koje se upotrebljavaju u testu trebaju biti iz iste 
skupine o čiju prikupljenih odre đenog dana.
 
Kriteriji za odabir o čiju koje se koriste u metodi BCOP  
18. Kada stignu u laboratorij, o či se odmah pažljivo pregledaju kako bi se 
utvrdili eventualni nedostaci, poput pove ćanog zamu ćenja, ogrebotina i 
neovaskularizacije. Treba upotrijebiti samo one o či koje nemaju takvih ošte ­ 
ćenja.  
19. Kvaliteta svake rožnice ocjenjuje se i u kasnijim fazama pokusa. Rožnice 
koje imaju zamu ćenje veće od sedam jedinica zamu ćenja (NAPOMENA: 
Opacimetar treba biti umjeren prema normama zamu ćenja koje se koriste 
za utvrđivanje jedinica zamu ćenja, vidjeti Dodatak 3.) nakon po četnog 
jednosatnog uravnoteživanja treba odbaciti.  
20. Svaka tretirana skupina (ispitna tvar, paralelne negativne i pozitivne 
kontrole) sadrži najmanje tri oka. Za negativnu kontrolu u pokusu BCOP treba koristiti tri rožnice. Budu ći da je ekscizija svih rožnica izvršena sa 
cijelih očnih jabučica pa su onda stavljane u komore drža ča rožnice, zbog tih 
manipulacija postoji mogu ćnost za artefakte u vrijednostima zamu ćenja i 
propusnosti rožnica (uklju čujući i negativne kontrole). Nadalje, vrijednosti 
zamućenja i propusnosti mjerene na negativnim kontrolnim rožnicama 
koriste se za korekciju vrijednosti zamu ćenja i propusnosti rožnice ispitnih 
uzoraka i tretiranih pozitivnih kontrolnih rožnica u izra čunima nalaza nadra ­ 
živanja  in vitro  (IVIS).
 
POSTUPAK  
Priprema o čiju 
21. Kod disekcije neošte ćenih rožnica, rub od 2-3 mm sklere ostavi se za kasniju 
upotrebu, paze ći da se ne oštete epitel i endotel rožnice. Izolirane rožnice 
postave se na posebno konstruirane drža če tako da je prednji odjeljak u 
kontaktu s epitelnom stranom rožnice a stražnji s endotelnom stranom 
rožnice. Obje komore se do ruba pune prethodno zagrijanim medijem - 
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) (prvo stražnja komora) pazeći da se ne stvaraju mjehuri ći zraka. Ure đaj se tada uravnotežuje na 
32 ± 1 °C najmanje jedan sat kako bi se rožnice uravnotežile s medijem i, 
koliko je to mogu će, postigle normalnu metaboli čku aktivnost (približna 
temperatura površine rožnice  in vivo  iznosi 32 °C).
 
22. Nakon uravnoteženja, u obje komore dodaje se svježi prethodno zagrijani 
medij EMEM i za svaku rožnicu uzimaju se polazni podaci o zamu ćenju. 
Svaka rožnica koja pokazuje makroskopsko ošte ćenje tkiva (npr. ogrebotine, 
pigmentaciju, neovaskularizaciju) ili zamu ćenje > 7 jedinica zamu ćenja 
odbacuje se. Ra čuna se srednje zamu ćenje svih uravnoteženih rožnica. 
Kao rožnice za negativnu kontrolu (ili kontrolu otapalom) izabiru se mini ­
malno tri rožnice s vrijednostima zamu ćenja blizu medijan vrijednosti za sve 
rožnice. Preostale rožnice zatim se razdjeljuju u tretirane i pozitivne 
kontrolne skupine.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 675
 
23. Budu ći da je toplinski kapacitet vode ve ći od toplinskog kapaciteta zraka, 
voda osigurava stabilnije temperaturne uvjete za inkubaciju. Stoga se za 
održavanje drža ča rožnice i njegovog sadržaja na 32 ± 1 °C preporu ča 
upotreba vodene kupelji. Me đutim, mogu se koristiti i zra čni inkubatori uz 
mjere opreza kako bi se održala stabilnost temperature (npr. predgrijavanjem 
držača i medija).  
Primjena ispitne tvari  
24. Za tretiranje se koriste dva razli čita protokola, jedan za teku ćine i surfaktante 
(krutine ili teku ćine) i jedan za krutine koje nisu surfaktanti.  
25. Teku ćine se ispituju nerazrije đene dok se surfaktanti ispituju u koncentraciji 
od 10 % w/v u 0,9 %-tnoj otopini natrijevog klorida, destiliranoj vodi ili 
drugom otapalu za koje je dokazano da nema negativnih u činaka na ispitni 
sustav. Polu-krutine, paste i voskovi obi čno se ispituju kao teku ćine. Za 
alternativne koncentracije razrje đivanja treba navesti odgovaraju će obrazlo ­ 
ženje. Rožnice se izlažu teku ćinama ili surfaktantima u vremenu od 10 
minuta. Za primjenu drugih vremena izlaganja treba dati odgovaraju će znan­
stveno opravdanje.  
26. Površinski neaktivne krute tvari obi čno se ispituju kao otopine ili suspenzije 
u 20 %-tnoj koncentraciji u 0,9 %-tnoj otopini natrijevog klorida, destiliranoj vodi ili drugom otapalu za koje je dokazano da nema negativnih u činaka na 
ispitni sustav. U nekim okolnostima i uz primjereno znanstveno opravdanje, 
krute tvari se mogu ispitivati i čiste, izravnim nanošenjem na površinu 
rožnice metodom otvorene komore (vidjeti stavak 29.). Rožnice se izlažu krutim tvarima u vremenu od četiri sata, ali kao i kod teku ćina i surfakta ­
nata, alternativna vremena izlaganja mogu ća su uz odgovaraju će znanstveno 
opravdanje.
 
27. Mogu se upotrijebiti razli čite metode tretiranja u zavisnosti od agregatnog 
stanja i kemijskih svojstava ispitivane tvari (npr. krutine, teku ćine, viskozne 
ili neviskozne teku ćine). Od presudne je važnosti osigurati da ispitna tvar 
dovoljno pokriva epitelnu površinu i da se u fazama ispiranja pravilno odstrani. Za neviskozne do slabo viskozne teku će ispitne tvari obi čno se 
koristi metoda zatvorene komore dok se metoda otvorene komore obi čno 
koristi za poluviskozne i viskozne teku će ispitne tvari i za čiste krutine.
 
28. Kod metode sa zatvorenom komorom, koli čina ispitne tvari (750 μL) 
dovoljna da pokrije epitelnu stranu rožnice uvodi se u prednju komoru kroz dozirne otvore na gornjoj površini komore koji se kasnije nepropusno 
zatvore čepovima dok traje izlaganje. Važno je osigurati da svaka rožnica 
bude izložena ispitnoj tvari u odgovaraju ćem vremenu.
 
29. Kod metode s otvorenom komorom, prije tretiranja s prednje komore se 
ukloni stakleni prozor čić i njegov prstenasti osigura č. Kontrolna ili ispitna 
tvar (750 μL ili koli čina ispitne tvari koja je dovoljna da u potpunosti 
prekrije rožnicu) nanosi se izravno na epitelnu površinu rožnice pomo ću 
mikropipete. Ako je ispitnu tvar teško usisati pipetom, radi preciznijeg dozi ­
ranja, ispitna tvar može se pod tlakom napuniti u pipetu s pozitivnim poma ­
kom. Vrh pipete s pozitivnim pomakom uvede se u dozirni vrh štrcaljke tako da se materijal može pod tlakom napuniti u vrh pipete. Klip štrcaljke poti ­
skuje se istodobno s povla čenjem klipa pipete prema gore. Ako se u vrhu 
pipete pojave mjehuri ći zraka, ispitni uzorak se uklanja (izbacuje) i postupak 
se ponavlja dok vrh nije napunjen bez mjehuri ća zraka. Prema potrebi, može 
se koristiti obi čna štrcaljka (bez igle) jer ona omogu ćuje točno mjerenje 
zapremine ispitne tvari i lakše nanošenje na epitelnu površinu rožnice. 
Nakon doziranja, stakleni prozor čić se vraća na prednju komoru čime se 
ponovno dobiva zatvoreni sustav.
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 676
 
Inkubacija nakon izlaganja  
30. Nakon razdoblja izlaganja, ispitna tvar, negativna kontrola ili pozitivna 
kontrolna tvar uklanja se iz prednje komore i epitel se ispire najmanje tri puta (ili dok ne nestanu vidljivi dokazi ispitne tvari) medijem EMEM (koji 
sadrži fenolno crvenilo). Za ispiranje koristi se medij koji sadrži fenolno 
crvenilo budu ći da se u fenolnom crvenilu može pratiti promjena boje, 
čime se odre đuje učinkovitost ispiranja kiselih ili lužnatih materijala. 
Rožnice se ispiru više od tri puta ako fenolno crvenilo još nije obojeno 
(ako je žuto ili ljubi často) ili ako je ispitna tvar još uvijek vidljiva. Čim u 
mediju više nema tvari, rožnice se završno ispiru medijem EMEM (bez fenolnog crvenila). EMEM (bez fenolnog crvenila) koristi se kao sredstvo 
za završno ispiranje kojim se osigurava da je prije mjerenja zamu ćenja 
fenolno crvenilo odstranjeno iz prednje komore. Prednja komora se zatim ponovno napuni svježim medijem EMEM bez fenolnog crvenila.
 
31. Za teku ćine i surfaktante, rožnice se nakon ispiranja inkubira dodatna dva 
sata na 32 ± 1 °C. U odre đenim okolnostima može biti korisno produljiti 
vrijeme nakon izlaganja pa se od slu čaja do slu čaja može razmotriti. Rožnice 
tretirane krutim tvarima obilno se ispiru po isteku četverosatnog razdoblja 
izlaganja, ali daljnja inkubacija nije potrebna.  
32. Na kraju razdoblja inkubacije nakon izlaganja za teku ćine i surfaktante i na 
kraju četverosatnog razdoblja izlaganja za površinski neaktivne krute tvari, 
bilježi se zamu ćenje i propusnost svake rožnice. Isto tako, svaku se rožnicu 
vizualno promatra i relevantna opažanja se bilježe (npr. ljuštenje kože, rezi ­
dualna ispitna tvar, nejednoli čni obrasci zamu ćenja). Ta bi opažanja mogla 
biti važna jer se mogu odraziti kao varijacije o čitanja na opacimetru.  
Kontrolne tvari  
33. Svaki eksperiment obuhva ća paralelne negativne kontrole ili kontrole otapa ­
lom/nosačem i pozitivne kontrole.  
34. Kada se ispituje nerazrije đena tekuća tvar, u ispitnu metodu BCOP paralelno 
se uvodi negativna kontrolna tvar (npr. 0,9 %-tna otopina natrijevog klorida ili destilirana voda) kako bi se otkrile nespecifi čne promjene u ispitnom 
sustavu i dobila referentna to čka za kriterije za ocjenu testa. Tom se 
metodom isto tako jam či da se uvjetima provo đenja pokusa ne izazovu 
neželjene reakcije nadraživanja.
 
35. Kada se ispituje razrije đena tekućina, surfaktant ili kruta tvar, u ispitnu 
metodu BCOP paralelno se uvodi skupina za kontrolu otapalom/nosa čem 
kako bi se dobila referentna to čka za kriterije za ocjenu u činaka testa. 
Može se upotrijebiti samo ono otapalo/nosa č koji dokazano nemaju nega ­
tivnih učinaka na ispitni sustav.  
36. Tvar za koju se zna da nadražuje o či uvodi se u svaki eksperiment kao 
paralelna pozitivna kontrolna tvar radi verifikacije da je izazvana reakcija odgovaraju ća. Budući da se BCOP pokus upotrebljava kao ispitna metoda za 
identifikaciju nagrizaju ćih i jako nadražuju ćih tvari, idealna pozitivna 
kontrolna tvar trebala bi biti referentna tvar koja u toj ispitnoj metodi 
izaziva jaku reakciju. Me đutim, kako bi se osigurala mogu ćnost procjene 
varijabilnosti reakcije pozitivne kontrole tijekom vremena, ja čina reakcije na 
nadražuju ću tvar ne bi trebala biti prekomjerna.
 
37. Preporu čuje pozitivnih kontrolnih tvari za teku će ispitne tvari su dimetilfor ­
mamid ili 1 %-tni natrijev hidroksid. Primjer pozitivne kontrolne tvari za 
krute ispitne tvari je 20 % (maseno volumnih) imodazola u 0,9 %-tnoj 
otopini natrijevog klorida.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 677
 
38. Etaloni su tvari korisne za ocjenjivanje potencijala nadražuju ćeg djelovanja 
na oči nepoznatih kemikalija iz specifi čne kategorije kemikalija ili proizvoda 
ili za ocjenjivanje relativnog potencijala nadražuju ćeg djelovanja tvari nadra ­ 
žujuće za oči unutar specifi čnog raspona nadražuju ćih reakcija.  
Izmjereni u činci 
39. Zamu ćenje se odre đuje količinom prolaska svjetla kroz rožnicu. Zamu ćenje 
rožnice mjeri se kvantitativno pomo ću opacimetra, koji daje vrijednosti 
zamućenja mjerene na kontinuiranoj skali.  
40. Propusnost se odre đuje količinom boje natrijevog fluoresceina koja penetrira 
kroz sve slojeve stanice rožnice (tj. od epitela na vanjskoj površini rožnice 
do endotela na unutarnoj površini rožnice). 1 mL otopine natrijevog fluore ­
sceina (4 ili 5 mg/mL kada se ispituju teku će tvari i surfaktanti ili krute tvari 
koje nisu površinski aktivne) dodaje se u prednju komoru drža ča rožnice koji 
je u kontaktu s epitelnom stranom rožnice dok se stražnja komora koja je u 
kontaktu s endotelnom stranom rožnice puni svježim medijem EMEM. Držač se zatim inkubira u vodoravnom položaju u trajanju od 90 ± 5 min 
na 32 ± 1 °C. Koli čina natrijevog fluoresceina koja prije đe u stražnju 
komoru kvantitativno se mjeri UV/VIS spektrofotometrijom. Spektrofotome ­
trijska mjerenja koja se ocjenjuju na 490 nm bilježe se kao opti čka gustoća 
(OD
 490 ) ili vrijednosti apsorbancije, koje se mjere na kontinuiranoj skali. 
Vrijednosti propusnosti fluoresceina odre đuju se primjenom vrijednosti 
OD  490 pomoću spektrofotometra vidljivog svjetla standardne duljine puta 
od 1 cm.  
41. Alternativno, mikrotiterski plo časti čitač s 96 bunari ća može se koristiti pod 
uvjetom da: i. se za odre đivanje OD  490 vrijednosti fluoresceina može utvrditi 
linearni niz plo častog čitača; i (ii.), da se u plo či s 96 bunari ća koriste uzorci 
fluoresceina to čnog volumena kako bi se dobile OD  490 vrijednosti ekviva ­
lentne standardnoj duljini puta od 1 cm (za to bi moglo trebati potpuno napuniti sve bunari će na ploči [obično 360 mL]).
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Ocjenjivanje podataka  
42. Čim su vrijednosti zamu ćenja i srednje propusnosti (OD  490 ) korigirane za 
osnovno zamu ćenje i vrijednosti OD  490 propusnosti negativne kontrolne 
tvari, srednje zamu ćenje i vrijednosti OD  490 srednje propusnosti za svaku 
tretiranu skupinu treba kombinirati u empirijski izvedenoj formuli za izra čun 
nalaza nadraživanja in vitro (IVIS) za svaku tretiranu skupinu kako slijedi:  
IVIS = srednja vrijednost zamu ćenja + (15 × vrijednost OD  490 srednje 
propusnosti)  
Sina et al.  (16) izvijestili su da je ta formula izvedena tijekom internih i 
među-laboratorijskih istraživanja. Podaci prikupljeni za niz od 36 spojeva u 
multilaboratorijskom istraživanju podvrgnuti su multivarijantnoj analizi radi 
utvrđivanja jednadžbe koja najbolje odgovara podacima dobivenim  in vivo  i 
in vitro . Tu su analizu radili znanstvenici u dvije odvojene tvrtke, a izveli su 
gotovo identi čne jednadžbe.  
43. Vrijednosti zamu ćenja i propusnosti tako đer treba neovisno ocjenjivati kako 
bi se kroz jedan ili dva mjerena u činka utvrdilo da li ispitna tvar izazva 
nagrizanje ili jaku nadraženost (vidjeti „Kriterije za donošenje odluke”).  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 678
 
Kriteriji za donošenje odluke  
44. Tvar koja izaziva IVIS ≥ 55,1 definira se kao nagrizaju ća ili jako nadražu ­
juća tvar. Kao što je navedeno u stavku 1., ako ispitna tvar nije identificirana 
kao tvar koja nagriza ili jako nadražuje o či, za razvrstavanje i ozna čivanje 
treba provesti dodatna ispitivanja. BCOP ispitna metoda ima sveukupnu 
točnost od 79 % (113/143) do 81 % (119/147), stopu lažno pozitivnih 
rezultata od 19 % (20/103) do 21 % (22/103) i stopu lažno negativnih rezultata od 16 % (7/43) do 25 % (10/40) u odnosu na podatke dobivene  
in vivo  ispitnom metodom na o čima zečeva, razvrstane prema sustavima 
razvrstavanja EPA-a (1), EU-a (2) ili GHS sustavu (3). Ako se iz baze podataka izbace tvari odre đenih kemijskih (tj. alkoholi, ketoni) ili fizi čkih 
(tj. krutine) kategorija, to čnost BCOP metode u sustavima razvrstavanja 
EU-a, EPA-a i GHS nalazi se u rasponu od 87 % (72/83) do 92 % (78/85), stopa lažno pozitivnih rezultata od 12 % (7/58) do 16 % (9/56) i stopa lažno negativnih rezultata od 0 % (0/27) do 12 % (3/26).
 
45. Čak i ako se ovim testom ispitna tvar ne razvrsta kao nagrizaju ća i jako 
nadražuju ća za oči, podaci dobiveni BCOP metodom, zajedno s podacima iz  
in vivo  ispitivanja na o čima zečeva ili iz odgovaraju će validiranog  in vitro  
testa, mogu biti korisni za daljnje ocjenjivanje koristi i ograni čenja BCOP 
ispitne metode za identifikaciju tvari koje nisu jako nadražuju će ili uopće 
nisu nadražuju će (Dokument sa smjernicama za primjenu metode ispitivanja 
okularne toksi čnosti  in vitro  je u izradi).  
Kriteriji za prihva ćanje studije  
46. Test se smatra prihvatljivim ako pozitivna kontrolna tvar daje nalaz IVIS 
između dva standardna odstupanja postoje će povijesne srednje vrijednosti, 
koja se ažurira najmanje svaka tri mjeseca ili svaki put kada se u laborato ­
rijima u kojima se testovi ne provode često (tj. manje nego jednom mjese ­ 
čno) provede prihvatljivi test. Reakcije negativne kontrolne tvari i 
kontrolnog otapala/nosa ča trebaju rezultirati vrijednostima zamu ćenja i 
propusnosti koje su manje od utvr đenih gornjih granica za polazne vrijed ­
nosti zamu ćenja i propusnosti za gove đe rožnice tretirane odgovaraju ćom 
negativnom kontrolnom tvari ili kontrolnim otapalom/nosa čem. 
Izvješće o ispitivanju  
47. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će podatke ako su relevantni za 
provođenje studije:  
Ispitne i kontrolne tvari  
Kemijski naziv(i) kao što je strukturni naziv iz popisa Chemical Abstract 
Service (CAS) i ostali nazivi ako su poznati;  
Broj iz popisa CAS ako je poznat;  
Čistoća i sastav tvari ili mješavine (u masenim postocima), do mjere u kojoj 
je podatak dostupan;  
Fizikalno-kemijska svojstva ispitne tvari relevantna za provo đenje studije, 
npr. agregatno stanje, hlapljivost, pH, stabilnost, kemijska kategorija, toplji ­
vost u vodi;  
Obrada ispitnih/kontrolnih tvari prije ispitivanja, ako je primjenjivo (npr. 
zagrijavanje, mljevenje);  
Stabilnost, ako je poznata.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 679
 
Podaci koji se odnose na pokrovitelja i ispitni laboratorij  
Naziv i adresa pokrovitelja, ispitnog laboratorija i direktora studije;  
Identifikacija dobavlja ča očiju (tj. pogona u kojem su prikupljene);  
Uvjeti skladištenja i prijevoza o čiju (npr. dan i vrijeme prikupljanja o čiju, 
vrijeme proteklo do po četka ispitivanja, prijevozna sredstva i temperaturni 
uvjeti, eventualno korišteni antibiotici);  
Ako su dostupne, posebne karakteristike životinja od kojih su o či priku­
pljene (npr. dob, spol, težina životinje donora).  
Opravdanost ispitne metode i primijenjeni protokol  
Integritet ispitne metode  
Postupak kojim se osigurava integritet (tj. to čnost i pouzdanost) ispitne 
metode tijekom vremena (npr. periodi čno testiranje kemikalija za dokazi ­
vanje tehni čke osposobljenosti, primjena povijesnih podataka o negativnim 
i pozitivnim kontrolnim tvarima).  
Kriteriji za prihva ćanje testa  
Prihvatljiv raspon paralelnih pozitivnih i negativnih kontrolnih tvari na 
temelju povijesnih podataka;  
Ako je primjenjivo, prihvatljiv raspon vrijednosti paralelnih kontrolnih 
etalona, prema povijesnim podacima.  
Uvjeti ispitivanja  
Opis ispitnog sustava koji se koristi;  
Tip držača rožnice koji se koristi;  
Podaci o umjeravanju ure đaja koji se koriste za mjerenje zamu ćenja i propu ­
snosti (npr. opacimetar i spektrofotometar);  
Podaci o gove đim rožnicama koje se koriste, uklju čujući i izjave u pogledu 
njihove kvalitete;  
Pojedinosti o primijenjenom ispitnom postupku;  
Koncentracija/koncentracije ispitne tvari koja se koristi;  
Opis eventualnih modifikacija ispitnog postupka;  
Upućivanje na povijesne podatke modela (npr. negativne i pozitivne 
kontrole, kemikalije za dokazivanje tehni čke osposobljenosti, etaloni);  
Opis kriterija koji se primjenjuju za ocjenjivanje.  
Rezultati  
Tablični prikaz podataka za pojedina čne ispitne uzorke (npr. vrijednost 
zamućenja i vrijednost OD  490 i izračunani nalazi IVIS za ispitnu tvar i 
pozitivne i negativne kontrolne tvari i za kontrolni etalon [ako postoji], prikazani u obliku tablice uklju čujući, ako je primjereno, i podatke ponov ­
ljenih replika pokusa i srednju vrijednost ± standardno odstupanje za svaki 
pokus);
 
Opis ostalih opaženih u činaka.  
Diskusija o rezultatima  
Zaključak 
LITERATURA  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 680
 
(2) Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 
16. prosinca 2008. o razvrstavanju, ozna čivanju i pakiranju tvari i 
smjesa, o izmjeni te stavljanju izvan snage Direktive 67/548/EEZ i Direktive 1999/45/EZ i o izmjeni Uredbe (EZ) br. 1907/2006. SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
 
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Label ­
ling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Dostupno na sljede ćoj 
adresi:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular Corrosives and severe eye irritants. Dostupno na slje ­
dećoj adresi:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. 
Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) Uredba (EZ) br. 1907/2006 od 18. prosinca 2006. Europskog parla ­
menta i Vije ća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograni čavanju 
kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe 
Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i 
Direktive Vije ća 76/769/EEZ i Direktiva Komisije 91/155/EEZ, 
93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ. SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Dostupno na sljede ćoj adresi:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html]  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. 
Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identi ­
fying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Dostupno na sljede ćoj 
adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permea ­
bility Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: 
European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents 
in Healthcare Settings. Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., 
Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A colla ­
borative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl Toxicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Dostupno na sljede ćoj 
adresi:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 682
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Točnost: Tijesno slaganje rezultata ispitne metode i prihva ćenih referentnih 
vrijednosti. To je mjera uspješnosti ispitne metode i jedan od aspekata „relevant ­
nosti”. Često se koristi u zna čenju izraza „podudarnost” u smislu omjera to čnih 
ishoda ispitne metode.  
Etalon : Tvar koja se koristi kao standard za usporedbu s ispitnom tvari. Etalon 
treba imati sljede ća svojstva: i. podrijetlo iz dosljednih i pouzdanih izvora; ii. 
strukturnu i funkcionalnu sli čnost s kategorijom tvari koja se ispituje; iii. poznata 
fizikalna/kemijska svojstva; iv. podatke koji dokazuju njegove poznate u činke i 
v. poznatu snagu u opsegu željenih reakcija.  
Rožnica : Transparentni dio smješten s prednje strane o čne jabučice koji prekriva 
šarenicu i zjenicu i propušta svjetlost u unutrašnjost oka.  
Zamućenje rožnice : Izmjereni stupanj zamu ćenja rožnice nakon izlaganja 
ispitnoj tvari. Pove ćano zamu ćenje rožnice je pokazatelj ošte ćenja rožnice. Zamu ­ 
ćenje se može ocjenjivati subjektivno kao što se to radi u Draizovom testu na 
zečjem oku ili objektivno pomo ću instrumenta, npr. „opacimetra”.  
Propusnost rožnice : Kvantitativno izmjereno ošte ćenje epitela rožnice odre điva­
njem koli čine boje natrijevog fluoresceina koja prolazi kroz sve slojeve stanice 
rožnice.  
EPA Kategorija 1. : Nagrizaju ći učinak (ireverzibilna destrukcija o čnog tkiva) ili 
komplikacija rožnice ili nadraženost koji traju dulje od 21 dan (1).  
EU Kategorija R41 : Pojava ošte ćenja očnog tkiva ili teško fizi čko pogoršanje 
vida izazvano primjenom ispitne tvari na prednjoj površini oka koje nije u 
potpunosti reverzibilno unutar 21 dana od primjene (2).  
Stopa lažno negativnih rezultata : Omjer svih pozitivnih tvari koje su ispitnom 
metodom lažno identificirane kao negativne. Jedan je od pokazatelja uspješnosti 
ispitne metode.  
Stopa lažno pozitivnih rezultata : Omjer svih negativnih tvari koje su ispitnom 
metodom lažno identificirane kao pozitivne. Jedan je od pokazatelja uspješnosti ispitne metode.
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals) Globalno uskla đeni sustav razvrstavanja i ozna čivanja kemika ­
lija: Sustav predlaganja razvrstavanja kemikalija (tvari i mješavina) prema stan ­
dardiziranim tipovima i razinama fizi čkih opasnosti, opasnosti za zdravlje i 
opasnosti za okoliš koji obuhva ća i odgovaraju će komunikacijske elemente kao 
što su piktogrami, oznake opasnosti, oznake upozorenja, oznake obavijesti i liste sigurnosnih podataka kojima se prenose informacije o njihovim štetnim u čincima 
s ciljem zaštite ljudi (uklju čujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potroša če i 
osoblje na hitnim intervencijama) i okoliša (3).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 683
 
GHS Kategorija 1. : Pojava ošte ćenja očnog tkiva ili teško fizi čko pogoršanje 
vida izazvano primjenom ispitne tvari na prednjoj površini oka koje nije u 
potpunosti reverzibilno unutar 21 dana od primjene (3).  
Opasnost : Intrinzično svojstvo nekog agensa ili stanje koji imaju potencijal da 
uzrokuju štetne u činke kada su organizam, sustav ili (sub)populacija izloženi tom 
agensu.  
Nalaz nadraživanja  in vitro  (IVIS) : Empirijski izvedena formula upotrijebljena 
u BCOP pokusu u kojoj se srednje vrijednosti zamu ćenja i srednje vrijednosti 
propusnosti za svaku tretiranu skupinu kombiniraju u jedan  in vitro  nalaz za 
svaku tretiranu skupinu. IVIS = srednja vrijednost zamu ćenja + (15 × srednja 
vrijednost propusnosti).  
Negativna kontrola : Netretirana replika koja sadrži sve komponente ispitnog 
sustava. Taj se uzorak obra đuje s uzorcima koji se tretiraju ispitnom tvari i 
drugim kontrolnim uzorcima kako bi se utvrdilo je li otapalo u interakciji s 
ispitnim sustavom.  
Nenadražuju ća tvar : Tvari koje nisu razvrstane kao tvari nadražuju će za oči 
EPA Kategorije I., II. ili III.; EU Kategorije R41 ili R36; ili GHS Kategorije 1., 2.A ili 2.B.
 
Tvar nagrizaju ća za oči: (a) Tvar koja uzrokuje ireverzibilno ošte ćenje očnog 
tkiva; (b) Tvari koje su razvrstane kao tvari nadražuju će za oči GHS Kategorije 
1., EPA Kategorije I. ili EU Kategorije R41 (1) (2) (3).  
Tvar nadražuju ća za oči: (a) Tvar koja nakon primjene na prednju površinu oka 
dovodi do reverzibilne promjene u oku; (b) Tvari koje su razvrstane kao tvari nadražuju će za oči EPA Kategorije II. ili III., EU Kategorije R36 ili GHS 
Kategorije 2.A ili 2.B (1) (2) (3).
 
Tvar jako nadražuju ća za oči: (a) Tvar koja nakon primjene na prednju povr ­ 
šinu oka uzrokuje ošte ćenje očnog tkiva koje nije reverzibilno unutar 21 dan od 
primjene ili uzrokuje ozbiljno fizi čko pogoršanje vida. (b) Tvari koje su 
razvrstane kao tvari nadražuju će za oči GHS Kategorije 1., EPA Kategorije I. 
ili EU Kategorije R41 (1) (2) (3).  
Opacimetar : Instrument koji se koristi za mjerenje „zamu ćenja rožnice” kvanti ­
tativnim ocjenjivanjem prijenosa svjetla kroz rožnicu. Tipi čni instrument ima dva 
odjeljka, svaki s vlastitim izvorom svjetla i foto ćelijom. Jedan odjeljak koristi se 
za tretiranu rožnicu, a drugi za umjeravanje instrumenta i podešavanje na nulu. 
Svjetlo iz halogene svjetiljke šalje se kroz kontrolni odjeljak (prazna komora bez 
prozorčića ili teku ćina) na foto ćeliju i uspore đuje sa svjetlom koje se šalje na 
fotoćeliju kroz odjeljak za pokus u kojem je smještena komora s rožnicom. 
Uspoređuje se razlika u prijenosu svjetla s foto ćelija, a numeri čka vrijednost 
zamućenja prikazuje se na digitalnom displeju.  
Pozitivna kontrola : Replika koja sadrži sve komponente ispitnog sustava i treti ­
rana je tvari za koju se zna da izaziva pozitivnu reakciju. Kako bi se osigurala 
mogućnost procjene varijabilnosti reakcije pozitivne kontrole tijekom vremena, 
reakcija ne bi trebala biti prejaka.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 684
 
Pouzdanost : Stupanj mjerne obnovljivosti provedene ispitne metode koji se 
može posti ći u jednom ili izme đu više laboratorija, tijekom vremena i uz 
primjenu istog protokola. Procjenjuje se izra čunom intra i inter-laboratorijske 
mjerne obnovljivosti i intra-laboratorijske ponovljivosti.  
Kontrola otapalom/nosa čem: Netretirani uzorak koji sadrži sve komponente 
ispitnog sustava, uklju čujući i otapalo ili nosa č, koji se obra đuje s uzorcima 
tretiranim ispitnom tvari i drugim kontrolnim uzorcima kako bi se utvrdila 
polazna reakcija za uzorke koji se tretiraju ispitnom tvari otopljenoj u istom otapalu ili nosa ču. Kada se testira s paralelnom negativnom kontrolom, ovaj 
uzorak tako đer dokazuje jesu li otapalo ili nosa č u interakciji s ispitnim 
sustavom.
 
Stupnjevano testiranje : Strategija testiranja korak po korak u kojoj se svi 
postojeći podaci o ispitnoj tvari pregledavaju po to čno utvrđenom redu, s tim 
da se prije prelaska na sljede ću razinu na svakoj razini primjenjuje postupak 
ocjenjivanja dokazne snage kako bi se odredilo ima li dovoljno podataka da se 
donese odluka o razvrstavanju tvari kao opasne. Ako se na temelju postoje ćih 
podataka ispitnoj tvari može pripisati potencijal nadražuju ćeg djelovanja, daljnje 
testiranje nije potrebno. Ako se na temelju postoje ćih podataka ispitnoj tvari ne 
može pripisati potencijal nadražuju ćeg djelovanja, korak po korak provodi se 
sekvencijski postupak testiranja na životinjama dok razvrstavanje ne bude nedvo ­
smisleno utvr đeno. 
Validirana ispitna metoda : Ispitna metoda za koju su provedene validacijske 
studije kojima je utvr đena relevantnost (uklju čujući i točnost) i pouzdanost za 
specifičnu svrhu. Važno je napomenuti da validirana ispitna metoda ne mora biti 
dostatno uspješna u smislu to čnosti i pouzdanosti da bi se smatrala prihvatljivom 
za predloženu svrhu.  
Ocjenjivanje dokazne snage : Postupak razmatranja snage i slabosti raznih poda ­
taka u donošenju i dokazivanju zaklju čka o potencijalu opasnosti neke tvari.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 685
 
Dodatak 2.  
Kemikalije za dokazivanje tehni čke osposobljenosti za BCOP ispitnu metodu  
Prije rutinske primjene ispitne metode koja odgovara ovoj ispitnoj metodi, labo ­
ratoriji možda žele dokazati tehni čku osposobljenost tako da za 10 tvari prepo ­
ručenih u Tablici 1. to čno identificiraju kategoriju nagrizaju ćeg djelovanja na o či. 
Te su tvari tako izabrane da predstavljaju niz reakcija na lokalno nadraživanje/ 
nagrizanje o čiju koje se temelje na rezultatima  in vivo  testa na o čima zečeva (TG 
405) (tj. Kategorije 1., 2.A, 2.B ili „Nije razvrstano ni ozna čeno” prema sustavu 
GHS UN-a (3) (7). Me đutim, uzimaju ći u obzir da je korisnost tih pokusa 
validirana (samo za identifikaciju tvari s nagrizaju ćim/jako nadražuju ćim djelo­
vanjem na o či), za dokazivanje tehni čke osposobljenosti postoje samo dva ishoda 
testa u svrhe razvrstavanja tvari (nagrizaju ća/jako nadražuju ća ili nije nagrizaju ća/ 
nije jako nadražuju ća). Drugi kriteriji za odabir bili su da tvari budu komercijalno 
dostupne, da su dostupni visokokvalitetni  in vivo  referentni podaci i da postoje 
visokokvalitetni podaci iz dvije  in vitro  metode za koje su izra đene Smjernice za 
testiranje (Test Guidelines). Iz tog razloga nadražuju će tvari odabrane su s popisa 
od 122 referentne tvari koje ICCVAM preporu čuje za validaciju  in vitro  ispitnih 
metoda toksi čnosti za o či (vidjeti Dodatak H: Referentne tvari prema preporuci 
ICCVAM-a) (5). Referentni podaci dostupni su u dokumentima ICCVAM-a 
(Background Review Documents ) za ispitne metode BCOP i ICE (Isolated 
Chicked Eye, metoda testiranja na izoliranim o čima pilića) (17) (18).  
Tablica 1.  
Preporučene tvari za dokazivanje tehni čke osposobljenosti za metodu BCOP  
Tvar  CAS br.  Kemijska 
kategorija (  1 ) Agregatno 
stanje  In Vivo  
razvrstavanje (  2 ) In Vitro  razvrstavanje (  3 ) 
Benzalkonijev 
klorid (5 %)  8001-54-5  Onijev spoj  Teku ćina Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Klorheksidin  55-56-1  Amin, Amidin  Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Dibenzoil-L- 
vinska kiselina  2743-38-6  Karboksilna 
kiselina, ester  Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Imidazol  288-32-4  Heterocikli čni Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Triklorooctena 
kiselina (30 %)  76-03-9  Karboksilna 
kiselina  Tekućina Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
2,6-diklorobenz- 
oil klorid  4659-45-4  Acil halid  Teku ćina Kategorija 
2.A Nije nagrizaju ća/Nije jako 
nadražuju ća tvar  
Etil-2-metilaceto- 
acetat  609-14-3  Keton, ester  Teku ćina Kategorija 
2.B Nije nagrizaju ća/Nije jako 
nadražuju ća tvar  
Amonijev nitrat  6484-52-2  Anorganska sol  Krutina  Kategorija 
2.A Nije nagrizaju ća/Nije jako 
nadražuju ća tvar  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 686
 
Tvar  CAS br.  Kemijska 
kategorija (  1 ) Agregatno 
stanje  In Vivo  
razvrstavanje (  2 ) In Vitro  razvrstavanje (  3 ) 
Glicerol  56-81-5  Alkohol  Teku ćina Nije 
označeno Nije nagrizaju ća/Nije jako 
nadražuju ća tvar  
n-Heksan  110-54-3  Ugljikovodik 
(aciklički) Tekućina Nije 
označeno Nije nagrizaju ća/Nije jako 
nadražuju ća tvar  
Kratice: CAS br. = Broj iz popisa kemikalija Chemical Abstracts Service Registry 
( 1 ) Kemijska kategorija odre đena je za svaku ispitnu tvar primjenom standardnog sustava razvrstavanja koji se zasniva na sustavu 
razvrstavanja Medical Subject Headings (MeSH) Nacionalne medicinske biblioteke SAD-a (dostupno na adresi http:// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na temelju rezultata  in vivo  testa na o čima zečeva (Smjernica OECD-a za ispitivanje TG 405) i primjenom GHS UN-a (3)(7). 
( 3 ) Na temelju rezultata ispitnih metoda BCOP i ICE.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 687
 
Dodatak 3.  
DRŽAČ ROŽNICE ZA BCOP METODU  
1. Drža či rožnice za BCOP metodu izra đeni su od inertnog materijala (npr. 
polipropilen). Drža či se sastoje od dvije polovice (prednja i stražnja 
komora) i imaju dvije sli čne cilindri čne unutarnje komore. Svaka komora 
ima zapreminu 5 mL i završava staklenim prozor čićem kroz koji se bilježe 
izmjerena zamu ćenja. Svaka od unutarnjih komora je 1,7 cm u promjeru i 
2,2 cm duboka (  1 ). O-prsten smješten na stražnjoj komori služi za spre ča­
vanje curenja. Rožnice se postavljaju endotelnom stranom prema dolje na O-prsten stražnjih komora, a prednje komore se postavljaju na epitelnu 
stranu rožnica. Komore su u čvršćene s tri vijka od nehr đajućeg čelika smje ­ 
štena na vanjskim rubovima komore. Na kraju svake komore nalazi se stakleni prozor čić koji se može skinuti radi lakšeg pristupa rožnici. Radi 
sprečavanja curenja, jedan O-prsten smješten je i izme đu staklenog prozor ­ 
čića i komore. Dva otvora s gornje strane svake komore omogu ćuju 
uvođenje i odstranjivanje medija i ispitnih spojeva. Za vrijeme tretiranja i 
inkubacije zatvaraju se gumenim čepovima.
 
Glosar  
Glass disc:  Stakleni disk  
PTFE-O-ring:  Teflonski O-prsten  
Refill:  Otvor za punjenje  
Hanger:  Kukica  
Cap:  Čep 
Nut: Matica  
O-ring:  O-prsten  
Posterior compartment:  Stražnja komora  
Anterior compartment:  Prednja komora  
Fixing screws:  Vijci za u čvršćivanje  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 688  
( 1 ) Navedene dimenzije su dimenzije drža ča rožnice koji se koristi za goveda stara 12 do 60 
mjeseci. Kada se koriste životinje stare 6 do 12 mjeseci, drža č treba biti tako konstruiran 
da svaka komora ima zapreminu 4 mL i da svaka od unutarnjih komora bude 1,5 cm u 
promjeru i 2,2 cm duboka. Kod svakog novo konstruiranog drža ča rožnice, jako je važno 
da omjer izložene površine rožnice i zapremine stražnje komore bude isti kao omjer kod 
tradicionalnog drža ča rožnice. To je nužno kako bi se osiguralo da vrijednosti propu ­
snosti za izra čun nalaza IVIS predloženom formulom budu to čno utvrđene.
 OPACIMETAR  
2. Opacimetar je ure đaj za mjerenje prijenosa svjetla. Svjetlo iz halogene svje ­
tiljke šalje se kroz kontrolni odjeljak (prazna komora bez prozor čića ili 
tekućina) na foto ćeliju i uspore đuje sa svjetlom koje se šalje na foto ćeliju 
kroz odjeljak za pokus u kojem je smještena komora s rožnicom. Uspore đuje 
se razlika u prijenosu svjetla s foto ćelija, a numeri čka vrijednost zamu ćenja 
prikazuje se na digitalnom displeju. Utvr đuju se jedinice zamu ćenja.  
3. Opacimetar daje linearnu reakciju koja ima oblik niza o čitanja zamu ćenja 
koji obuhva ća granične vrijednosti upotrijebljene za razli čita razvrstavanja 
opisana modelom predvi đanja (tj. do grani čne vrijednosti koja odre đuje 
nagrizajuće djelovanje/jako nadražuju će djelovanje). Kako bi se osigurala 
linearna i to čna očitanja do 75-80 jedinica zamu ćenja, opacimetar treba 
umjeriti pomo ću serije kalibratora. Kalibratori se (neprozirne poliesterske 
folije) postave u komoru za kalibraciju (komora u koju se stavlja rožnica treba biti tako konstruirana da se to može u činiti) i očita se vrijednost na 
opacimetru. Kalibracijska komora je tako konstruirana da kalibratori stoje na 
približno istoj udaljenosti izme đu svjetla i foto ćelije na koju se kod mjerenja 
zamućenja postavljaju rožnice. Opacimetar se najprije umjerava na 0 jedinica 
zamućenja tako da se kalibracijska komora koristi bez kalibratora. Zatim se u 
kalibracijsku komoru postave tri razli čita kalibratora jedan po jedan i mjere 
se zamućenja. Kalibratori 1, 2 i 3 trebali bi dati o čitanja zamu ćenja jednaka 
njihovim podešenim vrijednostima od 75, 150 odnosno 225 jedinica zamu ­ 
ćenja ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 689
 
B. 48.  METODA ISPITIVANJA NA IZOLIRANIM O ČIMA PILI ĆA ZA 
IDENTIFIKACIJU TVARI NAGRIZAJU ĆIH I JAKO 
NADRAŽUJU ĆIH ZA O ČI 
UVOD  
1. Metoda ispitivanja na izoliranim o čima pilića (ICE) je  in vitro  ispitna metoda 
koja se u odre đenim okolnostima i uz konkretna ograni čenja može primijeniti 
za razvrstavanje tvari i mješavina kao tvari nagrizaju ćih i jako nadražuju ćih 
za oči (1) (2) (3). U smislu ove ispitne metode, jako nadražuju će tvari 
definirane su kao tvari koje izazivaju okularne lezije koje kod ze čeva traju 
najmanje 21 dan nakon primjene tvari. Iako se ne smatra potpunom zamjenom za  in vivo  test na o čima zečeva, ICE metoda preporu čuje se za 
primjenu kao dio strategije stupnjevanog ispitivanja za regulatorno razvrsta ­
vanje i ozna čivanje u okviru konkretne domene primjenjivosti (4) (5). Ispitne 
tvari i mješavine (6) koje su pozitivne u ovom pokusu mogu se bez dodatnog testiranja na ze čevima razvrstati kao tvari nagrizaju će i jako nadražuju će za 
oči. Tvar koja daje negativan rezultat na testu trebat će testirati na ze čevima 
strategijom sekvencijskog ispitivanja kako je prikazana u Smjernici za ispi ­
tivanje OECD–a 405 (7) (poglavlje B. 5 ovog Priloga).
 
2. Svrha ove ispitne metode je opisati postupke koji se koriste za ocjenjivanje 
potencijalno nagrizaju ćeg ili jako nadražuju ćeg djelovanja ispitne tvari koje 
se mjeri sposobnoš ću te tvari da izazove toksi čnost u enukleiranom oku 
pileta. Toksi čki učinci na rožnicu mjere se: i. kvalitativnom procjenom 
zamućenja, ii. kvalitativnom procjenom ošte ćenja epitela zbog primjene fluo ­
resceina na oko (retencija fluoreceina), iii. kvantitativnim mjerenjem pove ­ 
ćane debljine (oteklina) i kvalitativnim ocjenjivanjem makroskopskog morfo ­
loškog ošte ćenja površine. Zamu ćenje rožnice, otekline i ošte ćenja nakon 
izlaganja ispitnoj tvari procjenjuju se pojedina čno, a zatim se kombiniraju 
radi utvrđivanja da li tvar treba razvrstati kao nadražuju ću za oči. 
3. ICE ispitnom metodom testirane su i tvari nadražuju će za oči koje izazivaju 
lezije koje nestaju u manje od 21 dan i tvari koje nisu nadražuju će. Međutim, 
točnost i pouzdanost ICE ispitne metode za tvari u tim kategorijama nisu 
formalno ocijenjene.  
4. Definicije su dane u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
5. Ova ispitna metoda temelji se na protokolu ICE ispitne metode Me đuagen­
cijskog koordinacijskog odbora za validaciju alternativnih metoda (ICCVAM) (8) koji je razvijen prema me đunarodnoj validacijskoj 
studiji (4) (5) (9), uz doprinose iz Europskog centra za validaciju alter ­
nativnih metoda, Japanskog centra za validaciju alternativnih metoda i Odsjeka za toksikologiju i primijenjenu farmakologiju organizacije „TNO Quality of Life” (Nizozemska). Protokol se zasniva na podacima dobivenim 
iz objavljenih protokola kao i protokola koji organizacija TNO trenuta čno 
koristi (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 690
 
6. Identificirana ograni čenja ove ispitne metode temelje se na postotku lažno 
pozitivnih rezultata za alkohole i lažno negativnih rezultata za krute tvari i 
surfaktante (vidjeti stavak 47.) (4). Ako se tvari u tim kemijskim i fizikalnim kategorijama isklju če iz baze podataka, to čnost metode ICE u sustavima za 
razvrstavanje EU-a, EPA-e i GHS sustavu bitno je bolja (4). Na temelju 
svrhe ovog pokusa (tj. identifikacije samo onih tvari koje su nagrizaju će i 
jako nadražuju će za oči), postotak lažno negativnih rezultata nije od 
presudne važnosti jer se te tvari sekvencijski testiraju na ze čevima ili 
drugim odgovaraju će validiranim  in vitro  testovima u zavisnosti od regula ­
tornih zahtjeva, primjenom strategije sekvencijskog ispitivanja i pristupa 
ocjenjivanja dokazne snage. Nadalje, postoje ća validacijska baza podataka 
nije omogu ćivala odgovaraju će ocjenjivanje nekih kategorija kemikalija ili 
proizvoda (npr. mješavine). Ispitiva či bi ipak mogli razmotriti primjenu ove 
ispitne metode za ispitivanje svih vrsta materijala (uklju čujući i mješavine), a 
pozitivan bi se rezultat mogao prihvatiti kao pokazatelj nagrizaju će ili jako 
nadražuju će reakcije za o či. Međutim, pozitivne rezultate dobivene s alko ­
holima treba oprezno tuma čiti zbog rizika postizanja precijenjenih rezultata.
 
7. Kod svih postupaka s o čima pilića treba poštovati važe će propise ispitnog 
laboratorija i postupke za rukovanje materijalom dobivenim od ljudi ili životinja koji obuhva ća ali se ne ograni čava na tkiva i tkivne teku ćine. 
Preporučuju se op ćenite mjere opreza za laboratorije (15).
 
8. Ograni čenje ove ispitne metode je u tome da, iako se njome uzimaju u obzir 
neki od u činaka na o či koji su ocijenjeni metodom ispitivanja nadražuju ćeg 
djelovanja na o či kod zečeva i u odre đenom stupnju ja čina tih učinaka, ne 
razmatraju se ozljede konjunktive i šarenice. Isto tako, iako se reverzibilnost lezija rožnica ne može  per se  ocijeniti ICE ispitnom metodom, na temelju 
studija na o čima zečeva predloženo je da se za razlikovanje ireverzibilnih i 
reverzibilnih u činaka može koristiti procjena inicijalne dubine ošte ćenja 
rožnice (16). I kona čno, ICE ispitna metoda ne omogu ćuje procjenu poten ­
cijala sustavne toksi čnosti koja se povezuje s izlaganjem oka.
 
9. I dalje se nastoji dodatno okarakterizirati koristi i ograni čenja ICE ispitne 
metode za identifikaciju tvari koje nisu jako nadražuju će ili uop će nisu 
nadražuju će (vidjeti tako đer stavak 48.). Korisnike se isto tako poti če da 
organizacijama za validaciju dostave uzorke i/ili podatke za formalno ocje ­
njivanje mogu ćih budućih primjena ICE ispitne metode i za tvari koje nisu 
jako nadražuju će za oči ili uopće nisu nadražuju će. 
10. U svakom laboratoriju koji po prvi put provodi ovaj pokus treba koristiti set 
odobrenih kemikalija naveden u Dodatku 2. Laboratorij može koristiti te kemikalije kako bi dokazao svoju tehni čku osposobljenost za provo đenje 
ICE ispitne metode prije nego podatke iz ICE testa dostavi za razvrstavanje 
prema stupnju opasnosti u regulatorne svrhe.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
11. ICE ispitna metoda je organotipski model koji kratkoro čno osigurava održa ­
vanje pile ćeg oka  in vitro . U ovoj ispitnoj metodi, ošte ćenje koje uzrokuje 
ispitna tvar procjenjuje se odre đivanjem oticanja rožnice, zamu ćenja i reten ­
cije fluoresceina. Dok posljednja dva parametra podrazumijevaju kvalitativnu procjenu, za analizu oticanja rožnice potrebna je kvantitativna procjena. 
Svaka se izmjera pretvara bilo u kvantitativni nalaz koji se koristi za 
izračun sveukupnog indeksa nadraživanja, ili joj se dodjeljuje kvalitativna 
kategorizacija za razvrstavanje tvari kao  in vitro  nagrizaju će ili jako nadra ­ 
žujuće za oči. Bilo koji od ta dva ishoda mogu se zatim upotrijebiti za 
predviđanje potencijala ispitne tvari za nagrizaju će i jako nadražuju će djelo­
vanje na o či in vivo . (vidjeti „Kriterije za donošenje odluke”).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 691
 
Izvor i starost pile ćih očiju 
12. Povijesno, u ovom pokusu upotrebljavaju se o či prikupljene od pili ća iz 
klaonice gdje su usmr ćeni za ljudsku prehranu, čime je eliminirana potreba 
za laboratorijskim životinjama. Koriste se o či samo zdravih životinja koje se 
smatraju pogodnim za uvrštavanje u lanac prehrane ljudi.  
13. Iako nije provedena kontrolna studija za ocjenu optimalne dobi pili ća, dob i 
težina pili ća koji se povijesno upotrebljavaju u ovoj ispitnoj metodi uobi ča­
jeni su za mlade pili će koji se tradicionalno prera đuju u klaonici peradi (tj. 
približno 7 tjedana stari, 1,5-2,5 kg teški).  
Prikupljanje i prijevoz o čiju u laboratorij  
14. Glave treba odstraniti odmah nakon sedacije pili ća koja se obi čno provodi 
elektrošokom i incizijom vrata radi otjecanja krvi. Treba na ći lokalni izvor 
pilića u blizini laboratorija kako bi se pile će glave mogle prevesti iz klaonice 
u laboratorij dovoljno brzo da ne do đe do kvarenja i/ili bakteriološke konta ­
minacije. Vrijeme izme đu prikupljanja pile ćih glava i upotrebe o čiju u ICE 
ispitnoj metodi treba biti što je mogu će kraće (obično dva sata) i treba 
dokazati da nema utjecaja na rezultate pokusa. Ti se rezultati temelje na kriteriju odabira o čiju kao i na pozitivnim i negativnim kontrolnim reakci ­
jama. Sve o či koje se upotrebljavaju u testu trebaju biti iz iste skupine o čiju 
prikupljene odre đenog dana.
 
15. Budu ći da se disekcija o čiju obavlja u laboratoriju, intaktne glave prevoze se 
iz klaonice na temperaturi okoline u plasti čnim kutijama s navlaženim ru čni­
cima natopljenim fiziološkom otopinom.  
Kriteriji za odabir o čiju koje se koriste u metodi ICE  
16. Oči koje imaju visoku polaznu obojanost fluoresceinom (tj. > 0,5) ili visok 
nalaz zamu ćenja rožnice (tj. > 0,5) nakon enukleacije odbacuju se.  
17. Svaka tretirana skupina i paralelna pozitivna kontrola sadrži najmanje tri oka. 
Negativna kontrolna skupina ili skupina koja se kontrolira otapalom (ako se kao otapalo ne koristi fiziološka otopina) sadrži barem jedno oko.
 
POSTUPAK  
Priprema o čiju 
18. Očni kapci oprezno se izrežu paze ći da se ne ošteti rožnica. Integritet rožnice 
se brzo procijeni kapljicom 2 %-tnog (w/v) natrijevog fluoresceina koji se nanese i ostavi na površini rožnice nekoliko sekundi i zatim ispere fiziolo ­ 
škom otopinom. O či tretirane fluoresceinom zatim se pregleda 
bio-mikroskopom kako bi se provjerilo da je rožnica neošte ćena (tj. da su 
nalazi retencije fluoresceina i zamu ćenja rožnice ≤ 0,5).
 
19. Ako je neošte ćeno, oko se zatim dalje enukleira paze ći da se ne ošteti 
rožnica. O čna jabučica se izvu če iz orbite, tako da se tre ći očni kapak 
čvrsto drži kirurškim forcepsom, a o čni živci se prerežu zakrivljenim 
škarama s tupim vrhom. Važno je da se prejakim pritiskom ne ošteti rožnica (tj. treba izbje ći artefakte tla čenja).
 
20. Kada se oko izvadi iz orbite, na njemu treba ostati vidljiv dio o čnog živca. 
Čim je izva đeno iz orbite, oko se stavlja na upijaju ći podložak i odrežu se 
treći kapak i ostalo spojno tkivo.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 692
 
21. Enukleirano oko se stavi u stezaljku od nehr đajućeg čelika s rožnicom 
postavljenom vertikalno. Stezaljka se zatim prenese u komoru ure đaja za 
superfuziju (16). Stezaljke treba tako postaviti u ure đaj za superfuziju da 
drip fiziološke otopine zahvati cijelu rožnicu. Komore ure đaja za superfuziju 
trebaju biti u uvjetima kontrolirane temperature na 32 ± 1,5 °C. U Dodatku 
3. dana je shema tipskog ure đaja za superfuziju i stezaljke za o či, koji se 
mogu komercijalno nabaviti ili izraditi. Ure đaj se može prilagoditi da zado ­
volji potrebe pojedinih laboratorija (npr. da može primiti razli čiti broj očiju). 
22. Nakon što su stavljene u ure đaj za superfuziju, o či se ponovno pregledaju 
biomikroskopom kako bi se osiguralo da nisu ošte ćene u postupku disekcije. 
Za to vrijeme na apeksu rožnice treba izmjeriti i debljinu rožnice pomo ću 
alata za mjerenje dubine na biomikroskopu. O či s: i. nalazom retencije 
fluoresceina > 0,5; ii. zamu ćenjem rožnice > 0,5; ili iii. drugim znacima 
oštećenja treba zamijeniti. Za o či koje nisu odba čene zbog bilo kojeg od 
ovih kriterija, treba odbaciti svako oko s debljinom rožnice koja za više od 
10 % odstupa od srednje vrijednosti za sve o či. Korisnike se upozorava da s 
različito podešenom širinom procjepa svjetiljke mikroskopa, biomikroskopi 
mogu dati razli čite izmjere debljine rožnice. Širina procjepa treba biti pode ­ 
šena na 0,095 mm.  
23. Čim su sve o či pregledane i odobrene, o či se inkubira približno 45 do 60 
minuta da se uravnoteže s ispitnim sustavom prije doziranja. Nakon uravno ­
teženja, za debljinu rožnice i zamu ćenje kao referentna izmjerena vrijednost 
bilježi se nula (tj. vrijeme = 0) koja služi kao polazna vrijednost. Nalaz 
fluoresceina utvr đen kod disekcije koristi se kao polazno mjerenje za taj 
kriterij ocjenjivanja.  
Primjena ispitne tvari  
24. Odmah nakon nultih referentnih mjerenja, oko se (u drža ču) vadi iz ure đaja 
za superfuziju, postavlja u horizontalni položaj i ispitna tvar se nanese na 
rožnicu.  
25. Teku će ispitne tvari obi čno se ispituju nerazrije đene, ali ih se može razrijediti 
ako se to smatra nužnim (npr. kao dio koncepta studije). Poželjno otapalo za 
razrijeđene tvari je fiziološka otopina. Me đutim, pod kontroliranim uvjetima 
mogu se koristiti i alternativna otapala, ali primjerenost drugih otapala osim fiziološke otopine treba dokazati.
 
26. Teku će ispitne tvari primjenjuju se na rožnicu tako da je cijela površina 
rožnice jednakomjerno pokrivena ispitnom tvari; standardni volumen iznosi 
0,03 mL.  
27. Ako je mogu će, krute tvari treba što finije zdrobiti pomo ću mužara i tu čka ili 
samljeti sli čnim alatom. Prah se nanosi na rožnicu tako da je površina 
jednolično pokrivena ispitnom tvari; standardna koli čina iznosi 0,03 g.  
28. Ispitna tvar (teku ća ili kruta) ostavi se djelovati 10 sekundi i zatim se ispire 
iz oka fiziološkom otopinom (približno 20 mL) kod temperature okoline. Oko se (u svojem drža ču) zatim vra ća u uređaj za superfuziju u prvobitnom 
uspravnom položaju.
 
Kontrolne tvari  
29. Paralelne negativne kontrole ili kontrole otapalom/nosa čem i pozitivne 
kontrole treba uvrstiti u svaki eksperiment.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 693
 
30. Kada se ispituju nerazrije đene tekućine ili krute tvari, kako bi se otkrile 
nespecifične promjene u ispitnom sustavu i osiguralo da uvjeti provo đenja 
pokusa ne dovodu do neprimjerene reakcije nadraživanja, kao paralelna negativna kontrola u ispitnoj metodi ICE koristi se fiziološka otopina.
 
31. Kada se ispituju razrije đene tekućine, u ispitnu metodu paralelno se uvodi 
skupina za kontrolu otapalom/nosa čem kako bi se otkrile nespecifi čne 
promjene u ispitnom sustavu i osiguralo da uvjeti provo đenja pokusa ne 
dovodu do neprimjerene reakcije nadraživanja. Kao što je navedeno u stavku 25., smije se koristiti samo otapalo/nosa č za koji je dokazano da 
nemaju štetnih u činaka na ispitni sustav.
 
32. Tvar za koju se zna da nadražuje o či uvodi se u svaki eksperiment kao 
paralelna pozitivna kontrolna tvar radi verifikacije da je izazvana odgovara ­
juća reakcija. Budu ći da se ICE pokus upotrebljava kao ispitna metoda za 
identifikaciju nagrizaju ćih ili jako nadražuju ćih tvari, pozitivna kontrolna tvar 
trebala bi biti referentna tvar koja u toj ispitnoj metodi izaziva jaku reakciju. Međutim, kako bi se osigurala mogu ćnost procjene varijabilnosti reakcije 
pozitivne kontrolne tvari tijekom vremena, ja čina reakcije na nadražuju ću 
tvar ne bi trebala biti prekomjerna. Treba proizvesti dostatne  in vitro  
podatke za pozitivnu kontrolnu tvar kako bi se za pozitivnu kontrolu mogao izra čunati statisti čki definirani prihvatljivi raspon. Ako za odre đenu 
pozitivnu kontrolnu tvar nisu dostupni odgovaraju ći povijesni podaci iz ICE 
ispitnih metoda, možda će biti potrebno provesti studije kako bi se došlo do 
tih podataka.
 
33. Primjeri pozitivnih kontrolnih tvari za teku će ispitne tvari su 10 %-tna octena 
kiselina ili 5 %-tni benzalkonijev klorid, a primjeri pozitivnih kontrolnih tvari za krute ispitne tvari su natrijev hidroksid ili imidazol.
 
34. Etaloni su tvari korisne za ocjenjivanje potencijala nadražuju ćeg djelovanja 
na oči nepoznatih kemikalija iz specifi čne kategorije kemikalija ili proizvoda 
ili za ocjenjivanje potencijala relativnog nadražuju ćeg djelovanja tvari nadra ­ 
žujuće za oči unutar specifi čnog raspona nadražuju ćih reakcija.  
Izmjereni u činci 
35. Tretirane rožnice ocjenjuju se prije tretiranja i 30, 75, 120, 180 i 240 minuta 
(± 5 minuta) nakon ispiranja poslije tretiranja. Ti intervali osiguravaju dovo ­
ljan broj mjerenja tijekom četverosatnog tretiranja, ostavljaju ći dovoljno 
vremena izme đu mjerenja za propisana promatranja koja treba provesti na 
svim očima. 
36. Izmjereni u činci koji se ocjenjuju su zamu ćenje i oticanje rožnice, retencija 
fluoresceina i morfološki u činci (tj. pojava rupica ili slabljenja epitela). Svi 
učinci, uz izuzetak retencije fluoresceina (koja se odre đuje samo prije treti ­
ranja i 30 minuta nakon izlaganja ispitnoj tvari) odre đuju se u svakom od 
gore navedenih intervala.  
37. Preporu čuje se fotografijama dokumentirati zamu ćenje rožnice, retenciju 
fluoresceina, morfološke u činke i, ako je provedena, histopatologiju.  
38. Nakon zadnjeg pregleda po isteku četiri sata, korisnike se poti če da oči 
konzerviraju u odgovaraju ćem fiksativu (npr. puferiranom neutralnom forma ­
linu) za eventualnu histopatološku pretragu.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 694
 
39. Oticanje rožnice odre đuje se mjerenjima debljine rožnice opti čkim pahime ­
trom na biomikroskopu. Izražava se kao postotak, a izra čunava se iz izmjera 
debljine rožnice prema sljede ćoj formuli:  
debljina rožnice u vremenu t  Ä debljina rožnice u vremenu t  ¼ 0 
debljina rožnice u vremenu t  ¼ 0 Í Î  
Ü 100 
40. Srednji postotak oticanja rožnice za sve testirane o či izračunava se za sva 
vremena opažanja. Na temelju najve ćeg srednjeg nalaza za oticanje rožnice 
bez obzira u kojem je vremenu opažanja utvr đen, dobiva se op ći nalaz 
kategorije za svaku ispitnu tvar.  
41. Za izra čunavanje zamu ćenja rožnice uzima se najja če zamućena površina 
rožnice. Srednja vrijednost zamu ćenja rožnice za sve testirane o či izračunava 
se u svim vremenskim to čkama opažanja. Na temelju najve ćeg srednjeg 
nalaza zamu ćenja rožnice bez obzira u kojoj je vremenskoj to čki opažanja 
utvrđen, dobiva se op ći nalaz kategorije za svaku ispitnu tvar (Tablica 1.).  
Tablica 1.  
Nalazi zamu ćenja rožnice  
Nalaz  Opažanje  
0 Nema zamu ćenja 
0,5 Vrlo slabo zamu ćenje 
1 Rijetke ili difuzne površine; detalji šarenice jasno vidljivi  
2 Lako zamjetna napola providne površine; detalji šarenice lagano zatamnjeni  
3 Jako zamu ćenje rožnice; konkretni detalji šarenice nisu vidljivi; veli čina zjenice 
jedva je zamjetna  
4 Potpuno zamu ćenje rožnice; šarenica nije vidljiva  
42. Srednja vrijednost retencije fluoresceina za sve testirane o či izračunava se 
samo za 30-minutnu to čku opažanja i koristi za op ći nalaz kategorije za 
svaku ispitnu tvar (Tablica 2.).  
Tablica 2.  
Nalazi retencije fluoresceina  
Nalaz  Opažanje  
0 Nema retencije fluoresceina  
0,5 Vrlo slaba obojanost pojedina čnih stanica  
1 Obojanost rijetkih pojedina čnih stanica po cijeloj tretiranoj površini rožnice  
2 Gusta obojanost pojedina čnih stanica, fokalno ili konfluentno  
3 Retencija fluoresceina na velikim površinama rožnice, konfluentno  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 695
 
43. Morfološki u činci obuhva ćaju ‚rupice na epitelnim stanicama rožnice, „slab ­
ljenje epitela”, „grublju” površinu rožnice i „lijepljenje” ispitne tvari za 
rožnicu. Ti nalazi mogu varirati u ja čini i mogu se javiti istodobno. Kate ­
gorizacija tih nalaza subjektivna je, prema tuma čenju ispitiva ča. 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Ocjenjivanje podataka  
44. Rezultate zamu ćenja i oticanja rožnice i retencije fluoresceina treba ocjenji ­
vati odvojeno kako bi se dobila ICE kategorija za svaki mjereni u činak. ICE 
kategorije za svaki mjereni u činak zatim se kombiniraju i zajedno odre đuju 
razvrstavanje svake ispitne tvari s obzirom na njezino nadražuju će 
djelovanje.  
Kriteriji za donošenje odluke  
45. Kada je svaki mjereni u činak ocijenjen, ICE kategorije dodjeljuju se na 
temelju unaprijed odre đenog raspona. Tuma čenje debljine rožnice (Tablica 
3.), zamu ćenja (Tablica 4.) i retencije fluoresceina (Tablica 5.) primjenom 
četiri ICE kategorije provodi se prema sljede ćim ljestvicama:  
Tablica 3.  
ICE kriteriji razvrstavanja za debljinu rožnice  
Srednje oticanje rožnice (%) (*)  ICE Kategorija  
0 do 5  I.  
> 5 do 12  II.  
> 12 do 18 (> 75 min nakon tretiranja)  II.  
> 12 do 18 ( ≤ 75 min nakon tretiranja)  III.  
> 18 do 26  III.  
> 26 do 32 (> 75 min nakon tretiranja)  III.  
> 26 do 32 ( ≤ 75 min nakon tretiranja)  IV.  
> 32  IV.  
(*) Nalazi oticanja rožnice vrijede samo ako je debljina izmjerena biomikroskopom Haag-Streit BP900 s 
uređajem za mjerenje dubine br. 1 i procjep svjetiljke podešen na 9½ odnosno 0,095 mm. Korisnici 
trebaju biti svjesni da biomikroskopi daju razli čite izmjere debljine rožnice kod razli čito podešenih 
širina procjepa.  
Tablica 4.  
ICE kriteriji razvrstavanja za zamu ćenje  
Srednja vrijednost maksimalnih nalaza 
zamućenja (*)  ICE Kategorija  
0,0-0,5  I.  
0,6-1,5  II.  
1,6-2,5  III.  
2,6-4,0  IV.  
(*) Vidjeti Tablicu 1.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 696
 
Tablica 5.  
ICE kriteriji razvrstavanja za srednju retenciju fluoresceina  
Srednji nalaz retencije fluoresceina 30 minuta nakon 
tretiranja (*)  ICE Kategorija  
0,0-0,5  I.  
0,6-1,5  II.  
1,6-2,5  III.  
2,6-3,0  IV.  
(*) Vidjeti Tablicu 2.  
46. Opće razvrstavanje nadražuju ćih učinaka ispitne tvari  in vitro  određuje se 
nalazom kategorije nadraživanja koja odgovara kombinaciji kategorija dobi ­
venih za oticanje rožnice, zamu ćenje rožnice i retenciju fluoresceina prema 
shemi prikazanoj u Tablici 6.  
Tablica 6.  
Opće kategorije nadražuju ćih učinaka  in vitro  
Razvrstavanje  Kombinacije 3 mjerena u činka 
Nagrizaju ća/jako nadražuju ća tvar  3 × IV. 
2 × IV., 1 × III. 2 × IV., 1 × II. (*) 
2 × IV., 1 × I. (*) 
Zamućenje rožnice > 3 nakon 30 min (na 
najmanje 2 oka) Zamućenje rožnice = 4 u svakoj vremenskoj 
točki (na najmanje 2 oka) 
Jako slabljenje epitela (na najmanje 1 oku)
 
(*) Manje vjerojatne kombinacije.  
47. Kao što je navedeno u stavku 1., ako ispitna tvar nije identificirana kao tvar 
koja nagriza ili jako nadražuje o či, za razvrstavanje i ozna čivanje treba 
provesti dodatna ispitivanja. Za identifikaciju tvari s nagrizaju ćim i jako 
nadražuju ćim djelovanjem na o či ICE ispitna metoda ima sveukupnu 
točnost od 83 % (120/144) do 87 % (134/154), stopu lažno pozitivnih 
rezultata od 6 % (7/122) do 8 % (9/116) i stopu lažno negativnih rezultata 
od 41 % (13/32) do 50 % (15/30) u odnosu na podatke dobivene  in vivo  
ispitnom metodom na o čima zečeva razvrstane prema sustavima razvrsta ­
vanja EPA-a (1), EU-a (2) ili GHS sustavu (3). Ako se iz baze podataka 
izbace tvari odre đenih kemijskih (tj. alkoholi i surfaktanti) i fizi čkih (tj. 
krutine) kategorija, to čnost ICE metode u sustavima razvrstavanja EU-a, 
EPA-a i GHS sustavu nalazi se u rasponu od 91 % (75/82) do 92 % (69/75), stopa lažno pozitivnih rezultata od 5 % (4/73) do 6 % (4/70) i stopa lažno 
negativnih rezultata od 29 % (2/7) do 33 % (3/9) (4).
 
48. Čak ako se ovim testom ispitna tvar i ne razvrsta kao nagrizaju ća ili jako 
nadražuju ća za oči, podaci dobiveni ICE metodom, zajedno s podacima iz  in 
vivo ispitivanja na o čima zečeva ili iz odgovaraju će validiranog  in vitro  testa, 
mogu biti korisni za daljnje ocjenjivanje koristi i ograni čenja ICE ispitne 
metode za identifikaciju tvari koje nisu jako nadražuju će ili uop će nisu 
nadražuju će (Dokument sa smjernicama za primjenu metode ispitivanja 
okularne toksi čnosti  in vitro  je u izradi).  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 697
 
Kriteriji za prihva ćanje studije  
49. Test se smatra prihvatljivim ako se njime paralelne negativne kontrole ili 
kontrole nosa čem/otapalom i paralelne pozitivne kontrole razvrstaju unutar 
kategorija nenadražuju ćeg odnosno jako nadražuju ćeg/nagrizaju ćeg 
djelovanja.  
Izvješće o ispitivanju  
50. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će podatke ako su relevantni za 
provođenje studije:  
Ispitne i kontrolne tvari  
Kemijski naziv(i) kao što je strukturni naziv iz popisa Chemical Abstract 
Service (CAS) i ostali nazivi ako su poznati;  
Broj iz popisa CAS ako je poznat;  
Čistoća i sastav tvari ili mješavine (u masenim postocima), do mjere u kojoj 
je podatak dostupan;  
Fizikalno-kemijska svojstva relevantna za provo đenje studije, npr. agregatno 
stanje, hlapljivost, pH, stabilnost, kemijska kategorija, topljivost u vodi;  
Obrada ispitnih/kontrolnih tvari prije ispitivanja, ako je primjenjivo (npr. 
zagrijavanje, mljevenje);  
Stabilnost, ako je poznata.  
Podaci koji se odnose na pokrovitelja i ispitni laboratorij  
Naziv i adresa pokrovitelja, ispitnog laboratorija i direktora studije;  
Identifikacija dobavlja ča očiju (tj. pogona u kojem su prikupljene);  
Uvjeti skladištenja i prijevoza o čiju (npr. dan i vrijeme prikupljanja o čiju, 
vrijeme proteklo do po četka ispitivanja);  
Ako su dostupne, posebne karakteristike životinja od kojih su o či prikupljene 
(npr. dob, spol, težina životinje donora);  
Opravdanost ispitne metode i primijenjeni protokol  
Integritet ispitne metode  
Postupak kojim se osigurava integritet (tj. to čnost i pouzdanost) ispitne 
metode tijekom vremena (npr. periodi čno testiranje kemikalija za dokazi ­
vanje tehni čke osposobljenosti, primjena povijesnih podataka o negativnim 
i pozitivnim kontrolnim tvarima).  
Kriteriji za prihva ćanje testa  
Ako je primjenjivo, prihvatljiv raspon vrijednosti paralelnih kontrolnih 
etalona, prema povijesnim podacima.  
Uvjeti ispitivanja  
Opis ispitnog sustava koji se koristi;  
Biomikroskop koji se koristi (npr. model);  
Podaci o podešavanju instrumenata biomikroskopa koji se koristi;  
Podaci o pile ćim očima koje se koriste, uklju čujući i izjave u pogledu 
njihove kvalitete;  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 698
 
Pojedinosti o primijenjenom ispitnom postupku;  
Koncentracija/koncentracije ispitne tvari koja se koristi;  
Opis eventualnih modifikacija ispitnog postupka;  
Upućivanje na povijesne podatke modela (npr. negativne i pozitivne 
kontrole, kemikalije za dokazivanje tehni čke osposobljenosti, etaloni);  
Opis kriterija koji se primjenjuju za ocjenjivanje.  
Rezultati  
Opis ostalih opaženih u činaka;  
Ako je primjereno, fotografije oka;  
Diskusija o rezultatima  
Zaključak 
LITERATURA  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 
16. prosinca 2008. o razvrstavanju, ozna čivanju i pakiranju tvari i 
smjesa, o izmjeni te stavljanju izvan snage Direktive 67/548/EEZ i Direktive 1999/45/EZ i o izmjeni Uredbe (EZ) br. 1907/2006. SL 
L 353, 31.12.2008., str. 1.
 
(3) United nations UN (2007). Globally Harmonized System of Classifi ­
cation and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, UN 
New York and Geneva, 2007. Dostupno na sljede ćoj adresi:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Dostupno na slje ­
dećoj adresi:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(6) Uredba (EZ) br. 1907/2006 od 18. prosinca 2006. Europskog parla ­
menta i Vije ća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograni čavanju 
kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te 
o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe 
Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i 
Direktive Vije ća 76/769/EEZ i Direktiva Komisije 91/155/EEZ, 
93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ. SL L 396, 30.12.2006., str. 1.  
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Dostupno na sljede ćoj 
adresi:  
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. NIH Publication No: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Dostupno na sljede ćoj adresi:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Dostupno na sljede ćoj adresi:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline 
for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents 
in Healthcare Settings. Dostupno na sljede ćoj adresi:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Dostupno na sljede ćoj adresi:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Dostupno na sljede ćoj 
adresi:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 701
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Točnost:  Tijesno slaganje rezultata ispitne metode i prihva ćenih referentnih 
vrijednosti. To je mjera uspješnosti ispitne metode i jedan od aspekata „relevant ­
nosti”. Često se koristi u istom zna čenju kao i izraz „podudarnost” u smislu 
omjera to čnih ishoda ispitne metode.  
Etalon:  Tvar koja se koristi kao standard za usporedbu s ispitnom tvari. Etalon 
treba imati sljede ća svojstva: i. podrijetlo iz dosljednih i pouzdanih izvora; ii. 
strukturna i funkcionalna sli čnost s kategorijom tvari koja se ispituje; iii. poznata 
fizikalna/kemijska svojstva; iv. postojanje podataka koji potvr đuju njezine 
poznate u činke i v. poznatu snagu u rasponu željenih reakcija.  
Rožnica:  Transparentni dio smješten s prednje strane o čne jabučice koji prekriva 
šarenicu i zjenicu i propušta svjetlost u unutrašnjost oka.  
Zamućenje rožnice:  Izmjereni stupanj zamu ćenja rožnice nakon izlaganja 
ispitnoj tvari. Pove ćano zamu ćenje rožnice je pokazatelj ošte ćenja rožnice.  
Oteklina rožnice:  Objektivno izmjeren, u ICE testu, stupanj distenzije rožnice 
nakon izlaganja ispitnoj tvari. Izražava se postotkom, a izra čunava se iz polaznih 
izmjera (pred doziranje) debljine rožnice i debljine koja se bilježi u redovitim intervalima nakon izlaganja ispitnom materijalu u ICE testu. Stupanj otekline rožnice upu ćuje na ošte ćenje rožnice.
 
EPA Kategorija 1.:  Nagrizaju ći učinak (ireverzibilna destrukcija o čnog tkiva) ili 
komplikacija rožnice ili nadraženost koji traju dulje od 21 dan (1).  
EU Kategorija R41:  Pojava ošte ćenja očnog tkiva ili teško fizi čko pogoršanje 
vida izazvano primjenom ispitne tvari na prednjoj površini oka koje nije u 
potpunosti reverzibilno unutar 21 dana od primjene (2).  
Stopa lažno negativnih rezultata:  Omjer svih pozitivnih tvari koje su ispitnom 
metodom lažno identificirane kao negativne. Jedan je od pokazatelja uspješnosti ispitne metode.
 
Stopa lažno pozitivnih rezultata:  Omjer svih negativnih tvari koje su ispitnom 
metodom lažno identificirane kao pozitivne. Jedan je od pokazatelja uspješnosti 
ispitne metode.  
Retencija fluoresceina:  Subjektivno mjerenje, u ICE testu, stupnja zadržavanja 
fluorescein natrija u epitelnim stanicama rožnice nakon izlaganja ispitnoj tvari. Stupanj retencije floresceina upu ćuje na ošte ćenje epitela rožnice.
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals) Globalno uskla đeni sustav razvrstavanja i ozna čivanja kemika ­
lija: Sustav predlaganja razvrstavanja kemikalija (tvari i mješavina) prema stan ­
dardiziranim tipovima i razinama fizi čkih opasnosti, opasnosti za zdravlje i 
opasnosti za okoliš koji obuhva ća i odgovaraju će komunikacijske elemente kao 
što su piktogrami, oznake opasnosti, oznake upozorenja, oznake obavijesti i liste sigurnosnih podataka kojima se prenose informacije o njihovim štetnim u čincima 
s ciljem zaštite ljudi (uklju čujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potroša če i 
osoblje na hitnim intervencijama) i okoliša (3).
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 702
 
GHS Kategorija 1.:  Pojava ošte ćenja očnog tkiva ili teško fizi čko pogoršanje 
vida izazvano primjenom ispitne tvari na prednjoj površini oka koje nije u 
potpunosti reverzibilno unutar 21 dana od primjene (3).  
Opasnost:  Intrinzično svojstvo nekog agensa ili stanje koji imaju potencijal da 
uzrokuju štetne u činke kada su organizam, sustav ili (sub)populacija izloženi tom 
agensu.  
Negativna kontrola:  Netretirana replika koja sadrži sve komponente ispitnog 
sustava. Taj se uzorak obra đuje s uzorcima koji se tretiraju ispitnom tvari i 
drugim kontrolnim uzorcima kako bi se utvrdilo je li otapalo u interakciji s ispitnim sustavom.
 
Nenadražuju ća tvar:  Tvari koje nisu razvrstane kao tvari nadražuju će za oči 
EPA Kategorije I., II. ili III.; EU Kategorije R41 ili R36; ili GHS Kategorije 1., 2.A ili 2.B.
 
Tvar nagrizaju ća za oči: (a) Tvar koja uzrokuje ireverzibilno ošte ćenje očnog 
tkiva; (b) Tvari koje su razvrstane kao tvari nadražuju će za oči GHS Kategorije 
1., EPA Kategorije I. ili EU Kategorije R41 (1) (2) (3).  
Tvar nadražuju ća za oči: (a) Tvar koja nakon primjene na prednju površinu 
oka dovodi do reverzibilne promjene u oku; (b) Tvari koje su razvrstane kao tvari 
nadražuju će za oči EPA Kategorije II. ili III., EU Kategorije R36 ili GHS 
Kategorije 2.A ili 2.B (1) (2) (3).  
Tvar jako nadražuju ća za oči: (a) Tvar koja nakon primjene na prednju povr ­ 
šinu oka uzrokuje ošte ćenje očnog tkiva koje nije reverzibilno unutar 21 dan od 
primjene ili uzrokuje ozbiljno fizi čko pogoršanje vida. (b) Tvari koje su 
razvrstane kao tvari nadražuju će za oči GHS Kategorije 1., EPA Kategorije I. 
ili EU Kategorije R41 (1) (2) (3).  
Pozitivna kontrola:  Replika koja sadrži sve komponente ispitnog sustava i 
tretirana je s tvari za koju se zna da izaziva pozitivnu reakciju. Kako bi se 
osigurala mogu ćnost procjene varijabilnosti reakcije pozitivne kontrole tijekom 
vremena, ja čina reakcije ne bi trebala biti prekomjerna.  
Pouzdanost:  Stupanj mjerne obnovljivosti provedene ispitne metode koji se 
može posti ći u jednom ili izme đu više laboratorija, tijekom vremena i uz 
primjenu istog protokola. Procjenjuje se izra čunom intra i inter-laboratorijske 
mjerne obnovljivosti i intra-laboratorijske ponovljivosti.  
Biomikroskop:  Instrument koji se koristi za izravan pregled oka pod pove ćalom 
binokularnog mikroskopa koji stvara uspravnu stereoskopsku sliku. Kod ICE ispitne metode taj se instrument koristi za gledanje prednjih struktura pile ćeg 
oka kao i za objektivno mjerenje debljine rožnice pomo ću prigrađenog uređaja 
za mjerenje dubine.
 
Kontrola otapalom/nosa čem: Netretirani uzorak koji sadrži sve komponente 
ispitnog sustava, uklju čujući i otapalo ili nosa č, koji se obra đuje s uzorcima 
tretiranim ispitnom tvari i drugim kontrolnim uzorcima kako bi se utvrdila polazna reakcija za uzorke koji se tretiraju ispitnom tvari otopljenoj u istom otapalu ili nosa ču. Kada se testira s paralelnom negativnom kontrolom, ovaj 
uzorak tako đer dokazuje jesu li otapalo ili nosa č u interakciji s ispitnim 
sustavom.
 ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 703
 
Stupnjevano testiranje:  Strategija testiranja korak po korak u kojoj se svi 
postojeći podaci o ispitnoj tvari pregledavaju po to čno utvrđenom redu s tim 
da se prije prelaska na sljede ću razinu, na svakoj razini primjenjuje postupak 
ocjenjivanja dokazne snage kako bi se odredilo ima li dovoljno podataka da se donese odluka o razvrstavanju tvari kao opasne. Ako se na temelju postoje ćih 
podataka ispitnoj tvari može pripisati potencijal nadražuju ćeg djelovanja, daljnje 
testiranje nije potrebno. Ako se na temelju postoje ćih podataka ispitnoj tvari ne 
može pripisati potencijal nadražuju ćeg djelovanja, korak po korak provodi se 
sekvencijski postupak testiranja na životinjama dok razvrstavanje ne bude nedvo ­
smisleno utvr đeno.
 
Validirana ispitna metoda:  Ispitna metoda za koju su provedene validacijske 
studije kojima je utvr đena relevantnost (uklju čujući i točnost) i pouzdanost za 
specifičnu svrhu. Važno je napomenuti da validirana ispitna metoda ne mora biti 
dostatno uspješna u smislu to čnosti i pouzdanosti da bi se smatrala prihvatljivom 
za predloženu svrhu.  
Ocjenjivanje dokazne snage:  Postupak razmatranja snage i slabosti raznih poda ­
taka u donošenju i dokazivanju zaklju čka o potencijalu opasnosti neke tvari.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 704
 
Dodatak 2.  
KEMIKALIJE ZA DOKAZIVANJE TEHNI ČKE OSPOSOBLJENOSTI ZA ICE 
ISPITNU METODU  
Prije rutinske primjene ispitne metode koja odgovara ovoj ispitnoj metodi, labo ­
ratoriji možda žele dokazati tehni čku osposobljenost tako da za 10 tvari prepo ­
ručenih u Tablici 1. to čno identificiraju kategoriju nagrizaju ćeg djelovanja na o či. 
Te su tvari tako izabrane da predstavljaju niz reakcija na lokalno nadraživanje/ 
nagrizanje o čiju koje se temelje na rezultatima  in vivo  testa na o čima zečeva (TG 
405) (tj. Kategorije 1., 2.A, 2.B ili „Nije razvrstano ni ozna čeno” prema sustavu 
GHS UN-a (3) (7). Me đutim, uzimaju ći u obzir da je korisnost tih pokusa 
validirana (samo za identifikaciju tvari s nagrizaju ćim/jako nadražuju ćim djelo­
vanjem na o či), za dokazivanje tehni čke osposobljenosti postoje samo dva ishoda 
testa u svrhe razvrstavanja tvari (nagrizaju ća/jako nadražuju ća ili nije nagrizaju ća/ 
nije jako nadražuju ća). Drugi kriteriji za odabir bili su da tvari budu komercijalno 
dostupne, da su dostupni visokokvalitetni  in vivo  referentni podaci i da postoje 
visokokvalitetni podaci iz dvije  in vitro  metode za koje su izra đene Smjernice za 
testiranje (Test Guidelines). Iz tog razloga nadražuju će tvari odabrane su s popisa 
od 122 referentne tvari koje ICCVAM preporu čuje za validaciju  in vitro  ispitnih 
metoda toksi čnosti za o či (vidjeti Dodatak H, Popis referentnih tvari prema 
preporuci ICCVAM-a) (4). Referentni podaci dostupni su u dokumentima ICCVAM-a ( Background Review Documents ) za ispitne metode BCOP (Bovine 
Corneal Opacity and Permeability – Zamu ćenje i propusnost gove đe rožnice) i 
ICE (18) (19).
 
Tablica 1.  
Preporučene tvari za dokazivanje tehni čke osposobljenosti za metodu ICE  
Tvar  CAS br.  Kemijska 
kategorija (  1 ) Agregatno stanje  In Vivo  
razvrstavanje (  2 ) In Vitro  
razvrstavanje (  3 ) 
Benzalkonijev klorid 
(5 %)  8001-54-5  Onijev spoj  Teku ćina Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Klorheksidin  55-56-1  Amin, Amidin  Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Dibenzoil-L-vinska 
kiselina  2743-38-6  Karboksilna 
kiselina, ester  Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Imidazol  288-32-4  Heterocikli čni Krutina  Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
Triklorooctena 
kiselina (30 %)  76-03-9  Karboksilna 
kiselina  Tekućina Kategorija 1.  Nagrizaju ća/Jako 
nadražuju ća tvar  
2,6-diklorobenz-oil 
klorid  4659-45-4  Acil halid  Teku ćina Kategorija 2.A  Nije nagrizaju ća/Nije 
jako nadražuju ća tvar  
Etil-2-metilaceto- 
acetat  609-14-3  Keton, ester  Teku ćina Kategorija 2.B  Nije nagrizaju ća/Nije 
jako nadražuju ća tvar  
Amonijev nitrat  6484-52-2  Anorganska sol  Krutina  Kategorija 2.A  Nije nagrizaju ća/Nije 
jako nadražuju ća tvar  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 705
 
Tvar  CAS br.  Kemijska 
kategorija (  1 ) Agregatno stanje  In Vivo  
razvrstavanje (  2 ) In Vitro  
razvrstavanje (  3 ) 
Glicerol  56-81-5  Alkohol  Teku ćina Nije ozna čeno Nije nagrizaju ća/Nije 
jako nadražuju ća tvar  
n-Heksan  110-54-3  Ugljikovodik 
(aciklički) Tekućina Nije ozna čeno Nije nagrizaju ća/Nije 
jako nadražuju ća tvar  
Kratice: CAS br. = Broj iz popisa kemikalija Chemical Abstracts Service Registry 
( 1 ) Kemijska kategorija odre đena je za svaku ispitnu tvar primjenom standardnog sustava razvrstavanja koji se zasniva na sustavu 
razvrstavanja Medical Subject Headings (MeSH) Nacionalne medicinske biblioteke SAD-a (dostupno na adresi http:// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na temelju rezultata  in vivo  testa na o čima zečeva (Smjernica OECD-a za ispitivanje TG 405) i primjenom GHS UN-a (3)(7). 
( 3 ) Na temelju rezultata ispitnih metoda BCOP i ICE.  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 706
 
Dodatak 3.  
Shematski prikaz ure đaja za superfuziju i stezaljke za oko  
(Za dodatne generi čke opise ure đaja za superfuziju i stezaljke za oko, vidjeti Burton et al. (17))
  ▼M2 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 707
 
B.49.  IN VITRO  MIKRONUKLEUS TEST STANICE SISAVCA  
UVOD  
1. Mikronukleus test  in vitro  je test genotoksi čnosti za otkrivanje 
mikronukleusa (MN) u citoplazmi interfaznih stanica. Mikronukleusi 
mogu nastati iz acentri čnih kromosomskih fragmenata (tj. nedostatka centro ­
mera) ili cijelih kromosoma koji tijekom anafaze razdiobe stanice nisu sposobni putovati na polove. Testom se otkriva aktivnost klastogenih i 
aneugenih kemikalija (tvari i smjesa) (1) (2) u stanicama u kojima je 
tijekom ili nakon izloženosti ispitivanoj tvari došlo do razdiobe. Ova ispitna metoda dopušta uporabu protokola s citohalazinom B (citoB), inhi ­
bitorom polimerizacije aktina, ili bez njega. Dodavanje citohalazina B prije 
ciljane mitoze omogu ćuje identifikaciju i selektivnu analizu u čestalosti 
mikronukleusa u stanicama koje su dovršile jednu mitozu, budu ći da 
takve stanice imaju dvije jezgre (3) (4). Ova ispitna metoda tako đer omogu ­ 
ćuje uporabu protokola bez blokirane citokineze pod uvjetom da postoje 
dokazi da je u analiziranoj stani čnoj populaciji mitoza ve ć dovršena.
 
2. Pored analize mikronukleusa  in vitro  za odre đivanje kemikalija (tvari i 
smjesa) koje uzrokuju nastajanje mikronukleusa, uporabom blokirane citoki ­
neze, imunokemijskog ozna čivanja kinetohora ili hibridizacije centromer ­
nim/telomernim sondama (fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)) mogu se također dobiti podaci o mehanizmima ošte ćenja kromosoma i nastajanja 
mikronukleusa (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postupci 
označivanja i hibridizacije mogu se koristiti u slu čaju povećanog nastajanja 
mikronukleusa kada istraživa č želi utvrditi je li pove ćanje posljedica klasto ­
genih i/ili aneugenih djelovanja.
 
3. Mikronukleusi predstavljaju ošte ćenje koje je preneseno na stanice k ćeri, 
dok se kromosomske aberacije u metafaznim stanicama ne moraju nužno prenijeti. Budu ći da se mikronukleusi u interfaznim stanicama mogu ocije ­
niti relativno objektivno, laboratorijsko osoblje treba utvrditi samo je li 
došlo do razdiobe stanica i koliko stanica sadrži mikronukleus. Pripravci 
se stoga mogu vrednovati relativno brzo i analiza može biti automatizirana, zbog čega je postalo prakti čno pri svakom tretiranju vrednovati na tisu će 
umjesto na stotine stanica pove ćavajući moć analize. Budu ći da mikronu ­
kleusi mogu nastati iz zaostalih kromosoma, postoji mogu ćnost otkrivanja 
tvari koje uzrokuju aneuploidiju i koje se teško prou čavaju u klasi čnim 
ispitivanjima kromosomskih aberacija, npr. Smjernica OECD-a 473 (poglavlje B.10 ovog Priloga) (17). Me đutim, analiza mikronukleusa  in 
vitro  ne omogu ćuje razlikovanje kemikalija koje uzrokuju poliploidiju od 
onih koje uzrokuju klastogenost bez posebnih tehnika kao što je fluore ­
scentna in situ hibridizacija (FISH), opisana u stavku 2.
 
4. Analiza mikronukleusa  in vitro  je metoda  in vitro  koja obično koristi uzgo ­
jene ljudske stanice ili stanice glodavaca. Pruža sveobuhvatnu osnovu za istraživanje potencijala kromosomskog ošte ćenja in vitro  budući da se mogu 
otkriti aneugeni i klastogeni agensi.
 
5. Analiza mikronukleusa  in vitro  je pouzdana i u činkovita za razli čite vrste 
stanica u prisutnosti ili odsutnosti citohalazina B. Postoje opširni podaci koji podupiru valjanost analize mikronukleusa  in vitro  kod razli čitih staničnih 
linija glodavaca (CHO, V79, CHL/IU, and L5178Y) i ljudskih limfocita 
(18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Oni 
posebno uklju čuju međunarodne validacijske studije kojima koordinira 
Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) i izvješ ća International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). 
Dostupni podaci su, tako đer, bili ponovno ocijenjeni u retrospektivnoj vali ­
dacijskoj studiji s obzirom na težinu dokaza, koju je proveo Europski centar
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 708
 
za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) Europske komisije, dok je 
Znanstveni savjetodavni odbor ECVAM-a (ESAC) ispitnu metodu potvrdio 
kao znanstveno valjanu (32) (33) (34). Opisana je uporaba ljudske limfo ­
blastične stanične linije TK6 (35), stanica HepG2 (36) (37) i primarnih 
embrionalnih stanica sirijskog hr čka (38), iako one nisu bile korištene u 
validacijskim studijama.  
DEFINICIJE  
6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA  
7. Za izvo đenje testova  in vitro  obično se koristi egzogeni izvor metaboli čke 
aktivacije, osim ako stanice imaju metaboli čko djelovanje u odnosu na tvari 
koje se ispituju. Egzogeni sustav metaboli čke aktivacije ne oponaša u cije ­
losti uvjete  in vivo . Potrebno je paziti da se izbjegnu uvjeti koji bi mogli 
dovesti do neprirodnih pozitivnih rezultata koji ne ukazuju na intrinzi čnu 
mutagenost, a mogu nastati zbog zna čajnih promjena pH ili osmolalnosti ili 
zbog visoke razine citotoksi čnosti (39) (40) (41). Ako dodavanjem ispiti ­
vane kemikalije do đe do promjene pH medija, potrebno je prilagoditi pH, 
po mogu ćnosti dodavanjem pufera u koncentriranu otopinu tako da svi 
obujmi za sve ispitane koncentracije i za sve kontrole ostanu isti.  
8. Za analizu nastanka mikronukleusa klju čno je da je došlo do mitoze u 
tretiranim i netretiranim kulturama. Najviše podataka za vrednovanje mikro ­
nukleusa dobije se u stanicama koje su dovršile jednu mitozu tijekom ili nakon tretiranja ispitivanom tvari.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
9. Stani čne kulture ljudskog podrijetla ili stani čne kulture sisavaca izlažu se 
ispitivanoj tvari s egzogenim izvorom metaboli čke aktivacije i bez njega, 
osim ako se koriste stanice s odgovaraju ćim metaboli čkim djelovanjem. U 
sve testove uklju čuju se paralelne kemikalije s otapalom/nosa čem (VC) i 
pozitivne kontrolne kemikalije.  
10. Tijekom ili nakon izlaganja ispitivanoj tvari stanice se uzgajaju dovoljno 
dugo da zbog ošte ćenja kromosoma ili vretena do đe do nastajanja mikronu ­
kleusa u interfaznim stanicama. Za nastanak aneuploidije ispitivana tvar obično mora biti prisutna tijekom mitoze. Dobivene i obojane interfazne 
stanice analiziraju se s obzirom na prisutnost mikronukleusa. Idealno bi se 
mikronukleusi trebali vrednovati isklju čivo u stanicama koje su dovršile 
mitozu tijekom izloženosti ispitivanoj tvari ili u razdoblju nakon izloženosti, ako se koristi. U kulturama koje su tretirane blokatorom citokineze to se postiže vrednovanjem isklju čivo stanica s dvije jezgre. U nedostatku bloka ­
tora citokineze važno je dokazati da je u analiziranim stanicama vjerojatno 
došlo do razdiobe stanica tijekom ili nakon izlaganja ispitivanoj tvari. Za sve protokole važno je dokazati da je došlo do proliferacije stanica i u kontrolnim i u tretiranim kulturama, dok je u kulturama (ili paralelnim 
kulturama) u kojima se vrednuju mikronukleusi potrebno ocijeniti opseg 
citotoksičnosti ili citostaze uzrokovanih ispitivanom tvari.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 709
 
OPIS ANALIZE  
Pripravci  
11. Mogu se koristiti uzgojeni primarni ljudski limfociti periferne krvi (5) (19) 
(42) (43) i odre đeni broj stani čnih linija glodavaca kao što su CHO, V79, 
CHL/IU i L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Uporaba drugih stani čnih linija i vrsta mora se opravdati na temelju 
njihove dokazane u činkovitosti u analizi, kako je opisano u odjeljku Krite ­
riji prihvatljivosti. Budu ći da učestalost mikronukleusa u pozadini utje če na 
osjetljivost analize, preporu čuje se uporaba stani čnih vrsta s niskom i 
stabilnom u čestalosti nastajanja mikronukleusa u pozadini.
 
12. Ljudski limfociti periferne krvi dobivaju se od mladih (približno 18- 
35 godina starosti), zdravih pojedinaca nepuša ča koji nisu nedavno bili 
izloženi genotoksi čnim kemikalijama ili zra čenju. Ako se za uporabu ujedi ­
njuju stanice više donora, potrebno je odrediti broj donora. U čestalost 
mikronukleusa raste s dobi, i taj je trend izraženiji kod žena nego kod 
muškaraca (44), što treba uzeti u obzir kod odabira donorskih stanica.  
Mediji i uvjeti uzgajanja  
13. Za održavanje kultura koriste se odgovaraju ći mediji i uvjeti inkubacije 
(posude za kulture, koncentracija CO  2 , temperatura i vlažnost). Kontinui ­
rane stani čne linije i sojevi se redovito provjeravaju s obzirom na stabilnost 
modalnog kromosomskog broja i odsutnost kontaminacije mikoplazme i ne 
smiju se koristiti ako su kontaminirane ili ako do đe do promjene u 
modalnom broju kromosoma. Uobi čajeno trajanje stani čnog ciklusa za 
uvjete uzgajanja koji se koriste u ispitnom laboratoriju treba biti poznato. Ako se koristi metoda blokiranja citokineze, koncentracija citokinetskog 
inhibitora mora biti optimizirana za odre đenu vrstu stanica i mora biti 
dokazana njegova sposobnost da proizvede dobar broj stanica s dvije jezgre za vrednovanje.
 
Priprema kultura  
14. Kontinuirane stani čne linije i sojevi: stanice se razmnažaju iz primarnih 
kultura, nacijepe na medij takvom gusto ćom da se izbjegne konfluencija 
kultura u jednom sloju i da kulture suspenzije ne dosegnu preveliku gusto ću 
prije ubiranja, i inkubiraju se pri 37 °C.  
15. Limfociti: cjelokupna krv, tretirana antikoagulansom (npr. heparinom), ili 
izdvojeni limfociti, kultiviraju se u prisutnosti mitogena, npr. 
fitohemaglutinina (PHA) prije izlaganja ispitivanoj tvari i citohalazinu B.  
Metabolička aktivacija  
16. Kod uporabe stanica s neodgovaraju ćom endogenom sposobnoš ću metabol ­
izma potrebno je koristiti egzogene sustave metaboliziranja. Naj češće kori­ 
šteni sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9), pripravljena iz jetre glodavaca, koja je bila tretirana sredstvima za enzimsku 
indukciju, kao što je Aroclor 1254 (45) (46), ili smjesom fenobarbitona i β- 
naftoflavona (46) (47) (48) (49). Posljednja kombinacija nije u suprotnosti sa Stockholmskom konvencijom o postojanim organskim one čišćujućim 
tvarima (50) i Uredbom (EZ) br. 850/2004 o postojanim organskim one či­ 
šćujućim tvarima (66), i dokazano je da je za nastanak oksidaza s mije ­ 
šanom funkcijom jednako u činkovita kao Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). 
Frakcija S9 se obi čno uporablja u koncentracijama 1–10 % (v/v) u 
konačnom ispitivanom mediju. Uvjeti sustava za aktivaciju metabolizma 
mogu ovisiti o razredu ispitivane kemikalije i u nekim slu čajevima može 
biti primjereno uporabiti više od jedne koncentracije S9.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 710
 
17. Stani čne linije modificirane genetskim inženjeringom, koje izražavaju speci ­
fične aktiviraju će enzime ljudi ili glodavaca, mogu ukloniti potrebu za 
egzogenim sustavom aktivacije metabolizma i mogu se koristiti kao ispiti ­
vane stanice. U takvim slu čajevima odabir uporabljenih stani čnih linija 
mora biti znanstveno utemeljen, npr. zbog važnosti oksidaze s miješanom 
funkcijom za metabolizam ispitivane tvari (51) i njihove reaktivnosti na 
poznate aneugene i klastogene tvari (vidjeti zasebni odjeljak o kriterijima prihvatljivosti). Treba priznati da postoji mogu ćnost da izražene oksidaze s 
miješanom funkcijom ne metaboliziraju ispitivanu tvar; u tom slu čaju nega­
tivni rezultati ne zna če da ispitivana tvar ne može uzrokovati nastanak 
mikronukleusa.
 
Priprema ispitivane tvari  
18. Prije tretiranja stanica krute kemikalije se otapaju u odgovaraju ćim otapa­
lima ili nosa čima i prema potrebi razrje đuju. Teku će se kemikalije mogu 
dodati neposredno u ispitivane sustave i/ili razrijediti prije tretiranja. Plino ­
vite ili hlapive kemikalije ispituju se nakon što se prikladno izmijene stan ­
dardni protokoli, kao što je tretiranje u hermeti čki zatvorenim posudama 
(52) (53). Koriste se svježi pripravci ispitivane tvari, osim ako podaci o 
stabilnosti dokažu da je pohranjivanje prihvatljivo.  
Uvjeti testiranja  
Otapala/nosa či 
19. Otapalo/nosa č ne smije reagirati u dodiru s ispitivanom tvari i mora biti 
kompatibilan s preživljavanjem stanica ili održavanjem djelovanja S9 pri 
uporabljenoj koncentraciji. Ako se koriste manje poznata otapala/nosa či 
(npr. voda, medij za kultiviranje stanica, dimetil sulfoksid), njihovu uporabu trebaju podupirati podaci koji ukazuju na njihovu kompatibilnost 
s ispitivanom tvari i nepostojanje genotoksi čnosti. Preporu čuje se da se, 
kada god je to mogu će, prvo uzme u obzir uporaba vodenog otapala/nosa ča.
 
Uporaba citohalazina B kao blokatora citokineze  
20. Za u činkovitost analize mikronukleusa  in vitro  vrlo je važno osigurati da u 
stanicama koje se vrednuju mitoza bude dovršena tijekom tretiranja ili u 
razdoblju inkubacije nakon tretiranja, ako se koristi. Citohalazin B je agens koji se naj češće koristi za blokadu citokineze budu ći da sprje čava sastav ­
ljanje aktina i time onemogu ćava odvajanje stanica k ćeri nakon mitoze, 
zbog čega nastaju stanice s dvije jezgre (5) (54) (55). Vrednovanje mikro ­
nukleusa stoga se može ograni čiti na stanice u kojima je došlo do mitoze 
tijekom tretiranja ili nakon njega. U činak ispitivane tvari na kinetiku proli ­
feracija stanica može se mjeriti istodobno. Citohalazin B koristi se kao 
blokator citokineze kada se koriste ljudski limfociti, budu ći da se trajanje 
staničnih ciklusa razlikuje od kulture do kulture i izme đu donora, te budu ći 
da svi limfociti ne reagiraju na fitohemaglutinin (PHA). Kod ispitivanja staničnih linija koriste se i druge metode za odre đivanje jesu li se stanice 
koje se vrednuju podijelile; te su metode opisane u nastavku (vidjeti stavak 
26.).
 
21. Za svaku vrstu stanica laboratorij odre đuje prikladnu koncentraciju citoha ­
lazina B kako bi se postigla optimalna u čestalost stanica s dvije jezgre u 
kontrolnim kulturama s otapalom/nosa čem. Prikladna koncentracija citoha ­
lazina B je obi čno između 3 i 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 711
 
Mjerenje proliferacija stanica i citotoksi čnosti te odabir koncentracija izlo ­ 
ženosti  
22. Kod odre đivanja najviše koncentracije tvari koja se ispituje, treba izbjega ­
vati koncentracije koje imaju sposobnost izazivanja nepravilnih pozitivnih reakcija, kao što su koncentracije koje izazivaju pretjeranu citotoksi čnost, 
oborine u mediju kultiviranja i zna čajne promjene pH ili osmolalnosti (39) 
(40) (41).
 
23. Proliferacija stanica se mjeri kako bi se osiguralo da je u tretiranim stani ­
cama tijekom analize došlo do mitoze i da se stanice tretiraju na odgova ­
rajućim razinama citotoksi čnosti (vidjeti stavak 29.). Citotoksi čnost se odre ­ 
đuje sa i bez aktivacije metabolizma u stanicama koje zahtijevaju aktivaciju 
metabolizma uporabom relativnog pove ćanja broja stanica (relative increase 
in cell counts, RICC) ili relativnog udvostru čenja populacije (relative popu ­
lation doubling, RPD) (vidjeti Dodatak 2. za formule), osim ako se koristi citohalazin B. Ako se koristi citohalazin B, citotoksi čnost se može odrediti 
indeksom ponavljanja (RI) (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
 
24. Tretiranje kultura citohalazinom B i mjerenje relativne u čestalosti stanica s 
jednom, dvije ili više jezgri u kulturi predstavlja preciznu metodu za kvan ­
tificiranje u činka na proliferaciju stanica i citotoksi čno ili citostati čno djelo­
vanje tretiranja (5) i osigurava da se vrednuju samo one stanice u kojima je 
došlo do razdiobe tijekom ili nakon tretiranja.  
25. U studijama s citohalazinom B citostaza/citotoksi čnost mogu se kvantifici ­
rati pomo ću indeksa proliferacije s blokiranom citokinezom (cytokinesis- 
block proliferation index, CBPI) (5) (26) (56) ili se mogu dobiti pomo ću 
indeksa ponavljanja iz najmanje 500 stanica po kulturi (vidjeti Dodatak 2. 
za formule). Kada se za ocjenu proliferacija stanica koristi citohalazin B, CBPI ili RI se trebaju odrediti na temelju najmanje 500 stanica po kulturi. Ta se mjerenja, me đu ostalim, mogu koristiti za ocjenu citotoksi čnosti 
usporedbom vrijednosti u tretiranim i kontrolnim kulturama. Ocjenjivanje 
drugih markera citotoksi čnosti (npr. konfluentnost, broj stanica, apoptoza, 
nekroza, broj metafazi) može pružiti korisne informacije.
 
26. U studijama bez citohalazina B potrebno je dokazati da je tijekom ili nakon 
tretiranja ispitivanom tvari došlo do razdiobe stanica koje se vrednuju u 
kulturi, jer se u suprotnome mogu dobiti lažni negativni rezultati. Metode 
koje su bile uporabljene kako bi se osiguralo da se vrednuju podijeljene stanice uklju čuju ugradnju i naknadno otkrivanje bromdeoksiuridina (BrdU) 
za određivanje stanica koje se udvostru čile (57), stvaranje klonova kada su 
stanice iz stalnih stani čnih linija tretirane i vrednovane  in situ  na mikro ­
skopskom stakalcu (indeks proliferacije (PI)) (25) (26) (27) (28), ili mjerenje relativnog udvostru čenja populacije (RPD) ili relativnog pove ćanja 
broja stanica (RICC) ili druge provjerene metode (16) (56) (58) (59) (vidjeti 
Dodatak 2. za formule). Ocjenjivanje drugih markera citotoksi čnosti ili 
citostaze (npr. konfluentnost, broj stanica, apoptoza, nekroza, broj metafazi) može pružiti korisne informacije.
 
27. Potrebno je ocijeniti najmanje tri koncentracije koje se mogu analizirati. Da 
bi se to postiglo, može biti potrebno izvesti pokus koriste ći veći broj 
koncentracija u bliskom slijedu i analizirati nastajanje mikronukleusa u tim koncentracijama koje osiguravaju odgovaraju ći opseg citotoksi čnosti. 
Druga strategija je izvo đenje preliminarnog testa citotoksi čnosti kako bi 
se suzio raspon za kona čni test.
 
28. Najviša koncentracija trebala bi proizvesti 55 ± 5 % citotoksi čnosti. Više bi 
razine mogle uzrokovati ošte ćenja kromosoma kao sekundarni u činak cito­
toksičnosti (60). Ako se pojavi citotoksi čnost, odabrane ispitivane koncen ­
tracije trebale bi pokriti raspon od one koja proizvede 55 ± 5 % citoto ­
ksičnosti do one koja proizvede malu citotoksi čnost ili je uop će ne 
proizvodi.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 712
 
29. Ako se ne uo či toksičnost niti oborina, najviša ispitivana koncentracija 
trebala bi iznositi 0,01 M, 5 mg/ml ili 5 μl/ml, koja god je niža. Razmak 
između koncentracija koje su odabrane za analizu obi čno ne bi trebao biti 
veći od 10. Za ispitivane tvari koje pokažu strmu krivulju reakcije na 
koncentraciju, može biti potrebno smanjiti razmak izme đu koncentracija 
tako da se vrednuju i kulture u umjerenom i niskom rasponu toksi čnosti.  
30. Kada je topljivost ograni čujući faktor, najviša koncentracija, ako nije ogra ­
ničena citotoksi čnošću, treba biti najniža koncentracija pri kojoj je u kultu ­
rama vidljiva minimalna oborina, pod uvjetom da nema nikakvih ometanja pri vrednovanju. Oborina se ocjenjuje metodama kao što je svjetlosno 
mikroskopiranje, kojim se opaža oborina koja je postojana ili se pojavi 
tijekom kultiviranja (do kraja tretiranja).
 
Kontrole  
31. U svaki pokus se uvode paralelne pozitivne kontrole i kontrole s otapalom/ 
nosačem s aktivacijom metabolizma ili bez nje.  
32. Pozitivne kontrole su potrebne za dokazivanje sposobnosti uporabljenih 
stanica, i protokola ispitivanja, za odre đivanje klastogenih i aneugenih 
tvari te za potvr đivanje metaboli čke sposobnosti pripravka S9. Pozitivne 
kontrole trebaju koristiti poznate pokreta če tvorbe mikronukleusa pri 
koncentracijama za koje se o čekuje malo, ali ponovljivo pove ćanje s 
obzirom na pozadinu, i pokazuju osjetljivost sustava ispitivanja. Koncen ­
tracije pozitivne kontrole odabiru se tako da su u činci jasni, ali prilikom 
čitanja ne otkrivaju odmah identitet kodiranih slajdova.  
33. Za dokazivanje metaboli čke kompetencije i sposobnosti sustava da otkriva 
klastogene potrebno je koristiti klastogen koji zahtijeva aktivaciju metabol ­
izma (npr. ciklofosfamid; benzo[a]piren). Mogu se koristiti i druge pozitivne 
kontrole, ako je to utemeljeno. Budu ći da u odre đenim uvjetima tretiranja ili 
određenim stani čnim linijama neke pozitivne kontrole, kojima je potrebna 
aktivacija metabolizma, mogu biti aktivne bez egzogene aktivacije metabol ­
izma, potrebno je ispitati potrebu za aktivacijom metabolizma i djelovanje 
pripravka S9 na odabranoj stani čnoj liniji i uz odabrane koncentracije.  
34. Trenuta čno nisu poznati aneugeni koji za svoje genotoksi čno djelovanje 
zahtijevaju aktivaciju metabolizma (16). Pozitivne kontrole koje su trenu ­
tačno prihva ćene za aneugeno djelovanje su, na primjer, kolhicin i vinbla ­
stin. Mogu se koristiti i druge kemikalije ako utje ču na nastanak mikronu ­
kleusa isklju čivo ili prvenstveno kroz aneugeno djelovanje. Da bi se 
izbjegla potreba za dvjema pozitivnim kontrolama (za klastogenost i 
aneugenost) bez aktivacije metabolizma, kontrola aneugenosti može poslu ­ 
žiti kao pozitivna kontrola bez S9, dok se kontrola klastogenosti može 
upotrijebiti za ispitivanje prikladnosti uporabljenog sustava za aktivaciju 
metabolizma. Pozitivna kontrola za klastogenost i aneugenost treba se kori ­
stiti u stanicama koje ne zahtijevaju S9. Preporu čene pozitivne kontrole su 
navedene u Dodatku 3.  
35. Ako su dostupne prikladne kemikalije, može se razmotriti mogu ćnost 
uporabe pozitivnih kontrola povezanih s razredom kemikalija. Sve uporab ­
ljene pozitivne kontrole trebaju biti prikladne za vrstu stanica i uvjete 
aktivacije.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 713
 
36. Za svaku fazu prikupljanja potrebno je uklju čiti kontrole s otapalom/nosa ­ 
čem. Pored toga, koriste se tako đer i netretirane kontrole, osim ako objav ­
ljeni ili laboratorijski povijesni kontrolni podaci dokazuju da odabrano otapalo pri uporabljenim koncentracijama ne izaziva nikakve genotoksi čne 
niti druge štetne u činke.
 
ISPITNI POSTUPAK  
Program tretiranja  
37. Kako bi vjerojatnost otkrivanja aneugenih ili klastogenih tvari koje djeluju u 
određenoj fazi stani čnog ciklusa bila što ve ća, važno je da u svim fazama 
njihovih stani čnih ciklusa dovoljan broj stanica bude tretiran ispitivanom 
tvari. Program tretiranja stani čnih linija i primarnih stani čnih kultura može 
se, stoga, nešto razlikovati od onoga za limfocite koji zahtijevaju mito ­
gensku stimulaciju za zapo činjanje stani čnog ciklusa, kako se razmatra u 
stavcima 41.–43. (16).  
38. Teoretska razmatranja zajedno s objavljenim podacima (18) ukazuju da će 
većina aneugenih i klastogenih tvari biti otkrivene kratkotrajnim tretiranjem 
u trajanju od 3 do 6 sati s dodanim pripravkom S9 ili bez njega, nakon čega 
slijedi odstranjivanje ispitivane tvari i razdoblje rasta 1,5–2,0 stani čnih 
ciklusa (6). Stanice se uzorkuju u vremenu koje je ekvivalentno približno 1,5–2,0 puta uobi čajenog (tj. netretiranog) stani čnog ciklusa nakon po četka 
ili na kraju tretiranja (vidjeti tablicu 1.). Vrijeme uzorkovanja ili obnavljanja 
se može produljiti ako je poznato ili se sumnja da ispitivana tvar utje če na 
duljinu stani čnog ciklusa (npr. pri ispitivanju analognih nukleozida).
 
39. Zbog mogu će citotoksi čnosti pripravaka S9 za kultivirane stanice sisavca, 
produljena izloženost u trajanju od 1,5–2,0 puta uobi čajenih stani čnih 
ciklusa se uporablja isklju čivo ako nije prisutan S9. Kod produljenog treti ­
ranja nudi se mogu ćnost tretiranja stanica s ispitivanom kemikalijom u 
odsutnosti ili prisutnosti citohalazina B. Ta se mogu ćnosti odnosi na situa ­
cije gdje se može javiti zabrinutost zbog mogu ćih interakcija izme đu ispi­
tivane tvari i citohalazina B.  
40. U tablici 1. su predstavljeni preporu čeni programi tretiranja stanica. Ti se 
opći programi tretiranja mogu izmijeniti ovisno o stabilnosti ili reaktivnosti 
ispitivane tvari ili posebnim zna čajkama rasta uporabljenih stanica. Sva 
tretiranja moraju po četi i završiti tijekom eksponencijalnog rasta stanica. 
Ti programi su detaljnije predstavljeni u stavcima 41.-47. u nastavku.  
Tablica 1.  
Razdoblja tretiranja i prikupljanja stanica za analizu mikronukleusa  in vitro  
Limfociti, primarne stanice i stani čne linije 
tretirane citohalazinom B  + S9  Tretirati 3-6 sati u prisutnosti S9; 
odstraniti S9 i hranjivu podlogu; dodati svježu podlogu i citohalazin B; 
prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobi čajenih 
staničnih ciklusa.
 
– S9 
Kratkotrajna izlože ­
nost Tretirati 3-6 sati; 
odstraniti hranjivu podlogu; 
dodati svježu podlogu i citohalazin B; 
prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobi čajenih 
staničnih ciklusa.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 714
 
– S9 
Dugotrajna izloženost  Opcija A:  Tretirati u trajanju od 1,5-2,0 uobi ­ 
čajenih stani čnih ciklusa u prisutnosti citohala ­
zina B; 
prikupiti na kraju razdoblja izloženosti.  
Opcija B:  Tretirati u trajanju od 1,5-2,0 uobi ­ 
čajenih stani čnih ciklusa; 
odstraniti ispitivanu tvar; dodati svježu podlogu i citohalazin B; prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobi čajenih 
staničnih ciklusa.
 
Stanične linije tretirane bez citohalazina B 
(Identično gore navedenim programima tretiranja, ali bez dodavanja citohalazina B)  
Limfociti, primarne stanice i stani čne linije s citohalazinom B  
41. Naju činkovitiji pristup za limfocite je zapo četi s izlaganjem ispitivanoj tvari 
44-48 sati nakon stimulacije PHA, kada više nema sinkronizacije ciklusa 
(5). U po četnoj analizi stanice se tretiraju 3 do 6 sati ispitivanom tvari u 
prisutnosti ili odsutnosti S9. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom koja sadrži citohalazin B i stanice se prikupljaju nakon 
1,5–2,0 uobi čajenih stani čnih ciklusa.
 
42. Ako su oba po četna testa kratkoro čnog tretiranja (3–6 sati) negativna ili 
dvojbena, izvodi se naknadno tretiranje s duljom izloženosti bez S9. Postoje 
dvije opcije tretiranja koje su jednako prihvatljive. Me đutim, ako se ekspo ­
nencijalni rast nakon 96 sati od stimulacije smanjuje, za stimulirane limfo ­
cite može biti primjerenija opcija A. U opciji B, tako đer, stanične kulture ne 
smiju konfluirati prije kona čnog uzorkovanja.  
— Opcija A: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 
uobičajenih stani čnih ciklusa i prikupljaju na kraju tretiranja.  
— Opcija B: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 
uobičajenih stani čnih ciklusa. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamje ­
njuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon dodatnih 1,5–2,0 uobičajenih stani čnih ciklusa.
 
43. Primarne stanice i stani čne linije tretiraju se na sli čan način kao i limfociti, 
osim što ih nije potrebno stimulirati s PHA 44-48 sati. Stanice koje nisu limfociti, izlažu se tako da na kraju studije budu još uvijek u fazi logaritam ­
skog rasta.
 
Stanične linije bez citohalazina B  
44. Stanice se tretiraju 3-6 sati u prisutnosti ili odsutnosti S9. Hranjiva podloga 
se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon 
1,5–2,0 uobi čajenih stani čnih ciklusa  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 715
 
45. Ako su oba po četna testa kratkotrajnog tretiranja (3–6 sati) negativna ili 
dvojbena, izvodi se naknadno tretiranje s duljom izloženosti (bez S9). 
Postoje dvije opcije tretiranja koje su jednako prihvatljive.  
— Opcija A: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 
uobičajenih stani čnih ciklusa i prikupljaju na kraju tretiranja.  
— Opcija B: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 
uobičajenih stani čnih ciklusa. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamje ­
njuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon dodatnih 1,5–2,0 uobičajenih stani čnih ciklusa.
 
46. Na kraju tretiranja u trajanju od 3 do 6 sati u monoslojevima mogu biti 
prisutne mitoti čke stanice (prepoznatljive kao okrugle i odvajaju se od 
površine). Budu ći da se te mitoti čke stanice lako odvajaju, mogu se izgubiti 
prilikom odstranjivanja podloge s ispitivanom tvari. Te se stanice pažljivo prikupljaju prilikom ispiranja kultura i potom pažljivo vra ćaju u kulture, 
kako se u trenutku prikupljanja ne bi izgubile stanice koje se nalaze u fazi 
mitoze i koje su rizi čne za nastajanje mikronukleusa.
 
Broj kultura  
47. Za svaku koncentraciju ispitivane tvari i kulture s nosa čem/otapalom i 
kulture negativne kontrole koriste se dvojne kulture. Ako se na temelju 
povijesnih laboratorijskih podataka može dokazati da su razlike izme đu 
dvojih kultura minimalne, prihvatljiva je uporaba jedne kulture. Ako se koristi jedna kultura, preporu čuje se analiza ve ćeg broja koncentracija.
 
Prikupljanje stanica i priprema stakalca  
48. Svaka kultura se prikuplja i obra đuje zasebno. Priprema stanica može uklju ­ 
čiti hipotoni čno tretiranje, iako taj korak nije potreban ako se na drugi na čin 
može ostvariti primjereno širenje stanica. U pripremi stakalca mogu se koristiti razli čite tehnike, pod uvjetom da se za vrednovanje dobiju pripravci 
sa stanicama visoke kakvo će. Potrebno je zadržati citoplazmu stanica kako 
bi se omogu ćilo otkrivanje mikronukleusa i (u metodi blokirane citokineze) 
pouzdana identifikacija binuklearnih stanica.
 
49. Stakalca se mogu obojiti razli čitim metodama, kao što su Giemsa ili 
DNA-specifi čna fluorescentna bojila (59). Uporaba DNA-specifi čnog 
bojila (npr. akridin oranž (61) ili Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) 
može ukloniti neke artefakte povezane s uporabom bojila koja nisu speci ­
fična za DNA. Za odre đivanje sadržaja (kromosom/kromosomski fragment) 
mikronukleusa, ako se žele dobiti mehanicisti čke informacije o njihovom 
nastajanju, mogu se koristiti antikinetohorna antitijela, fluorescentna  in situ  
hibridizacija (FISH) pancentromernim sondama DNA ili primarno ozna či­
vanje in situ po četnicama specifi čnim za centromere zajedno s odgovara ­
jućim bojanjem DNA (15) (16). Za razlikovanje izme đu klastogenih i 
aneugenih tvari mogu se koristiti i druge metode, ako su dokazano u čin­
kovite.  
Analiza  
50. Sva stakalca, uklju čujući one s otapalom/nosa čem i kontrolna, neovisno se 
kodiraju prije mikroskopske analize. Umjesto toga, kodirani uzorci mogu se 
analizirati validiranim, automatiziranim sustavom analize proto čnom citome ­
trijom ili slikovnom analizom.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 716
 
51. U kulturama tretiranim s citohalazinom B potrebno je analizirati u čestalost 
mikronukleusa u najmanje 2 000 binuklearnih stanica po koncentraciji (naj ­
manje 1 000 binuklearnih stanica po kulturi; dvije kulture po koncentraciji). Ako se koristi jedna kultura, potrebno je vrednovati najmanje 2 000 binu ­
klearnih stanica po koncentraciji iz te kulture. Ako je za vrednovanje pri 
svakoj koncentraciji dostupno znatno manje od 1 000 binuklearnih stanica 
po kulturi ili 2 000 binuklearnih stanica ako se koristi jedna kultura te ako nije utvrđeno značajno pove ćanje mikronukleusa, potrebno je ponoviti ispi ­
tivanje koriste ći više stanica ili pri manje toksi čnim koncentracijama, koje 
god je primjerenije. Treba paziti da se ne vrednuju binuklearne stanice 
nepravilnog oblika ili ako postoji velika razlika u veli čini jezgre; isto 
tako binuklearne stanice se ne smiju zamijeniti sa slabo raširenim multinu ­
klearnim stanicama. Stanice koje imaju više od dvije glavne jezgre ne 
analiziraju se u vezi s mikronukleusima, budu ći da osnovna u čestalost 
mikronukleusa u tim stanicama može biti ve ća (63) (64). Vrednovanje 
mononuklearnih stanica je prihvatljivo, ako je dokazano da ispitivana tvar utječe na djelovanje citohalazina B.
 
52. U stani čnim linijama, analiziranim bez tretiranja citohalazinom B, mikronu ­
kleusi se vrednuju u najmanje 2 000 stanica po koncentraciji (najmanje 
1 000 stanica po kulturi; dvije kulture po koncentraciji). Ako se koristi 
samo jedna kultura po koncentraciji, potrebno je vrednovati najmanje 2 000 stanica iz te kulture.
 
53. Ako se koristi citohalazin B, za ocjenu proliferacije stanica potrebno je 
odrediti CBPI ili RI (vidjeti Dodatak 2.) koriste ći najmanje 500 stanica 
po kulturi. Ako se tretiranje izvodi bez dodanog citohalazina B, klju čno 
je dostaviti dokaz da je došlo do proliferacije stanica koje se vrednuju, kako 
je raspravljeno u stavcima 24.–27.  
Kriteriji prihvatljivosti  
54. Laboratorij koji predlaže uporabu analize mikronukleusa  in vitro , opisane u 
ovoj ispitnoj metodi, uporabom referentnih kemikalija iz Dodatka 3. mora dokazati svoju sposobnost da pouzdano i precizno otkriva kemikalije s poznatim aneugenim i klastogenim djelovanjem, s metaboli čkom aktiva ­
cijom ili bez nje, kao i poznate negativne kemikalije. Kao dokaz svoje 
sposobnosti da pravilno izvodi ovu ispitnu metodu laboratorij dostavlja dokaz da su stanice koje su predmet vrednovanja s obzirom na nastanak mikronukleusa dovršile jednu diobu jezgre ako se ispitivanje izvodi bez 
uporabe citohalazina B.
 
55. Preporu čuje se uporaba kemikalija iz Dodatka 3. kao referentnih kemikalija. 
Mogu se uklju čiti zamjenske ili dodatne kemikalije, ako je njihovo djelo ­
vanje poznato, ako induciraju mikronukleuse istim mehanizmima djelovanja i ako se pokaže da su relevantne za kemikalije koje će se ispitivati 
postupkom analize mikronukleusa  in vitro . Obrazloženje može uklju čiti 
validacijsku studiju u kojoj su uporabljene razli čite tvari ili studiju usmje ­
renu na uži spektar koji se temelji na kemijskom razredu ispitivane tvari ili mehanizmu ošte ćivanja koji se prou čava.
 
56. Kontrolne kulture s otapalom/nosa čem i netretirane kulture moraju ponov ­
ljivo dati nisku i dosljednu u čestalost mikronukleusa (obi čno 5–25 mikro ­
nukleusa/1 000 stanica za vrste stanica iz stavka 11.). Druge vrste stanica 
mogu imati razli čne raspone reakcija koje se trebaju odrediti prilikom 
njihove validacije za uporabu u analizi mikronukleusa  in vitro . Podaci 
dobiveni negativnom kontrolom, kontrolom s otapalom i pozitivnom kontrolom koriste se za utvr đivanje povijesnih kontrolnih raspona. Te se 
vrijednosti koriste kod odlu čivanja o prikladnosti paralelne negativne/pozi ­
tivne kontrole za ispitivanje.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 717
 
57. Ako se za analizu predlažu manje izmjene protokola (npr. uporaba automa ­
tizirane umjesto ru čne tehnike brojanja; uporaba nove vrste stanica), u čin­
kovitost izmjene se mora dokazati prije nego što se izmijenjeni protokol može smatrati prihvatljivim za uporabu. Dokazivanje u činkovitosti uklju čuje 
dokaz da se mogu otkriti glavni mehanizmi loma kromosoma i dodavanje ili 
gubitak, i da se za razred pojedina čne tvari ili širi opseg tvari koje će se 
ispitivati, mogu dobiti odgovaraju ći pozitivni i negativni rezultati.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
58. Ako se koristi tehnika blokirane citokineze, za ocjenjivanje indukcije mikro ­
nukleusa koristi se isklju čivo učestalost binuklearnih stanica s mikronukleu ­
sima (bez obzira na broj mikronukleusa po stanici). Brojanje stanica s jednim, dvama ili više mikronukleusa može pružiti korisne informacije, ali nije obvezno.
 
59. Potrebno je odrediti paralelna mjerenja citotoksi čnosti i/ili citostaze za sve 
tretirane kulture i kontrolne kulture s otapalom/nosa čem (58). Za sve treti ­
rane i kontrolne kulture potrebno je izra čunati CBPI ili RI kao mjerenja 
kašnjenja stani čnog ciklusa, ako se koristi metoda blokirane citokineze. U 
odsutnosti citohalazina B koristi se RPD, RICC ili PI (vidjeti Dodatak 2.).  
60. Potrebno je dostaviti podatke o pojedina čnoj kulturi. Pored toga, svi se 
podaci sažimaju u obliku tablice.  
61. U analizi mikronukleusa  in vitro  kemikalije mogu inducirati mikronukleuse 
zato što uzrokuju lom kromosoma, gubitak kromosoma ili njihovu kombi ­
naciju. Za odre đivanje je li mehanizam indukcije mikronukleusa posljedica 
klastogenog i/ili aneugenog djelovanja, može se koristiti daljnja analiza 
uporabom antikinetohornih antitijela, in situ sonda specifi čnih za centromere 
ili drugih metoda.  
Ocjenjivanje i tuma čenje rezultata  
62. Jasnu pozitivnu ili negativnu reakciju nije potrebno provjeravati dodatnim 
ispitivanjem. Dvosmisleni rezultati se mogu pojasniti analizom dodatnih 
1 000 stanica iz svih kultura kako se ne bi izgubili slijepi uzorci. Ako takav pristup ne riješi pitanje dvosmislenosti rezultata, potrebno je provesti dodatno ispitivanje. U daljnjim pokusima potrebno je razmotriti mogu ćnost 
izmjene parametara studije u proširenom ili suženom rasponu uvjeta, kako 
je primjereno. Mogu se izmijeniti sljede ći parametri: razmak izme đu ispitnih 
koncentracija, raspored tretiranja i prikupljanja stanica i/ili uvjeti metabo ­
ličke aktivacije.
 
63. Postoji nekoliko kriterija za odre đivanje pozitivnog rezultata, kao što je na 
primjer pove ćanje povezano s koncentracijom ili statisti čki značajno pove ­ 
ćanje broja stanica s mikronukleusima. Najprije se treba razmotriti biološka 
relevantnost rezultata. Ovisno o tome smatraju li se opažene vrijednosti 
unutar ili izvan povijesnog raspona kontrola, pružaju se smjernice kod 
ocjenjivanja biološke važnosti reakcije. Kod ocjenjivanja rezultata ispiti ­
vanja mogu se kao pomo ć koristiti odgovaraju će statističke metode (65). 
Međutim, rezultati statisti čkog ispitivanja trebaju se ocijeniti s obzirom na 
odnos izme đu doze i reakcije. Potrebno je, tako đer, uzeti u obzir ponov ­
ljivost i povijesne podatke.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 718
 
64. Iako ve ćina pokusa daje jasne pozitivne ili negativne rezultate, u nekim 
slučajevima dobiveni podaci onemogu ćavaju donošenje kona čne ocjene o 
djelovanju ispitivane tvari. Te dvosmislene ili upitne reakcije se mogu javiti bez obzira na broj ponavljanja pokusa.
 
65. Pozitivni rezultati analize mikronukleusa  in vitro  ukazuju da u kultiviranim 
stanicama sisavca ispitivana tvar uzrokuje lom ili gubitak kromosoma. Negativni rezultati ukazuju da u primijenjenim uvjetima ispitivana tvar ne uzrokuje lom i/ili gubitak ili udvostru čenje kromosoma u kultiviranim stani ­
cama sisavca.
 
Izvješće o ispitivanju  
66. Izvješ će o ispitivanju uklju čuje najmanje sljede će informacije, ako su rele ­
vantne za provo đenje studije:  
Ispitivana kemikalija:  
— identifikacijski podaci i brojevi CAS i EZ,  
— fizikalna priroda i čistoća, 
— fizikalno-kemijska svojstva relevantna za izvo đenje studije,  
— reakcija ispitivane kemikalije s otapalom/nosa čem ili hranjivom 
podlogom.  
Otapalo/nosa č: 
— dokaz opravdanosti izbora otapala/nosa ča, 
— topivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosa ču, 
Stanice:  
— vrsta i podrijetlo uporabljenih stanica,  
— prikladnost uporabljene stani čne vrste,  
— odsutnost mikoplazme, ako se primjenjuje,  
— podaci o duljini stani čnog ciklusa, vremenu udvostru čenja ili indeksu 
proliferacije,  
— ako se koriste limfociti, spol, dob i broj donora krvi, ako se primjenjuje,  
— ako se koriste limfociti, je li izložena puna krv ili odvojeni limfociti,  
— broj pasaža, ako se primjenjuje,  
— metode održavanja stani čnih kultura, ako se primjenjuje,  
— modalni broj kromosoma,  
— uobičajeno (negativna kontrola) trajanje stani čnog ciklusa,  
Uvjeti ispitivanja:  
— identitet tvari koja blokira citokinezu (npr. citohalazin B), ako se koristi, 
njezina koncentracija i trajanje izloženosti stanice,  
— dokaz opravdanosti odabira koncentracija i broj kultura uklju čujući 
podatke o citotoksi čnosti i ograni čenja topivosti, ako postoje,  
— sastav podloge, koncentracija CO  2 , ako se primjenjuje,  
— koncentracija ispitivane tvari,  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 719
 
— koncentracija (i/ili obujam) nosa ča i dodane ispitivane tvari,  
— temperatura i vrijeme inkubacije,  
— trajanje tretiranja,  
— vrijeme prikupljanja nakon tretiranja,  
— gustoća stanica kod nasa đivanja, ako se primjenjuje,  
— vrsta i sastav sustava metaboli čke aktivacije uklju čujući kriterije 
prihvatljivosti,  
— pozitivne kontrolne kemikalije i negativne kontrole,  
— metode pripreme stakalca i uporabljene tehnike bojenja,  
— kriteriji za identifikaciju mikronukleusa,  
— broj analiziranih stanica,  
— metode mjerenja citotoksi čnosti,  
— sve dodatne informacije o citotoksi čnosti,  
— kriteriji za odre đivanje studija pozitivnima, negativnima ili 
dvosmislenima,  
— uporabljena(e) metoda(e) statisti čke analize,  
— metode, kao što je uporaba kinetohornih antitijela, za odre đivanje sadrže 
li mikronukleusi cijele ili fragmentirane kromosome, ako se primjenjuje,  
Rezultati:  
— uporabljena metoda mjerenja citotoksi čnosti, npr. CBPI ili RI u slu čaju 
metode blokirane citokineze; RICC, RPD ili PI kada se ne koriste 
metode blokirane citokineze; druga zapažanja ako je primjereno, npr. 
konfluencija stanica, aptoza, nekroza, brojanje u metafazi, u čestalost 
binuklearnih stanica,  
— znakovi oborina,  
— podaci o pH i osmolalnosti hranjive podloge, ako odre đeni, 
— definicija prihvatljivih stanica za analizu,  
— raspodjela mononuklearnih, binuklearnih i višenuklearnih stanica ako se 
koristi metoda blokirane citokineze,  
— broj stanica s mikronukleusima, koji se navodi zasebno za svaku treti ­
ranu i kontrolnu kulturu, i odre đivanje jesu li iz binuklearnih ili mono ­
nuklearnih stanica, ako je primjereno,  
— odnos koncentracija – reakcija, ako je mogu će, 
— kemijski podaci o paralelnim negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama (koncentracije i otapala),  
— kemijski podaci o povijesnim negativnim (otapalo/nosa č) i pozitivnim 
kontrolama, zajedno s rasponima, prosjecima i standardnom devijacijom i intervalom pouzdanosti (npr. 95 %),
 
— statisti čka analiza, vrijednosti p, ako postoje,  
Rasprava o rezultatima  
Zaključci ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 720
 
REFERENCE  
1. Kirsch-Volders, M. (1997.), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, str. 1-4.  
2. Parry, J.M. and Sors, A. (1993.), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, str. 3-15.  
3. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985.), Solutions to the kinetic problem in the 
micronucleus assay,  Cytobios. , 43, str. 233-246.  
4. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000.), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, str. 167-172.
 
5. Fenech, M. (2007.), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), str. 1084-1104.  
6. Fenech, M. and Morley, A.A. (1986.), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, str. 193-198.  
7. Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989.), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, str. 34-43.
 
8. Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990.), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, str. 9-20.  
9. Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991.), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, str. 297-302.
 
10. Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993.), The use of fluore ­
scence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, str. 329-334.  
11. Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993.), Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and 
micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a centro ­
meric probe,  Mutation Res. , 319, str. 205-213.  
12. Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993.), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by anti ­
kinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, str. 519-525.  
13. Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994.), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
str. 9-20.  
14. Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996.), Fluo ­
rescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric 
probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, str. 233- 
245. 
15. Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996.), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 372, 
str. 211-219.  
16. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003.), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, str. 153-163.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 721
 
17. OECD (1997.),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Pariz. Dostupno na: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
18. Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006.), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  
Mutation Res. , 607, str. 13-36.  
19. Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, str. 37-60.
 
20. Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, str. 61-87.  
21. Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, 
K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, str. 88-124.
 
22. Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006.), 
SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, str. 125-152.  
23. Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997.), Detailed data 
on in vitro  MNT and in vitro CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
str. 187-208.  
24. Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997.), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the in vitro 
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
str. 45-59.  
25. Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998.), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, str. 81-116.
 
26. Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999.), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, str. 183-190.  
27. Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999.), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, str. 55- 
71. 
28. von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000.),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells — results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, str. 137-163.
 
29. Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002.), A protocol for the  in 
vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 517, str. 123-134.
 
30. Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999.), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, str. 569-580.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 722
 
31. Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006.), Special Issue: SFTG International colla ­
borative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, str. 1-152.  
32. ECVAM (2006.), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to the  
in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th 
meeting, 16- 17 November, 2006, Dostupno na: [http://ecvam.jrc.it/in ­
dex.htm]  
33. ESAC (2006.), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Dostupno na: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm]  
34. Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008.), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, str. 271-283.  
35. Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, 
T. (1995.), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 
347, str. 105-115.
 
36. Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002.), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, str. 257-260.  
37. Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004.), Use of 
human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, str. 315- 
328.
 
38. Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997.), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
str. 61-70.  
39. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991.), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, str. 147-205.
 
40. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992.), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, str. 297- 
305. 
41. Brusick, D. (1986.), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, str. 789-886.  
42. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985.), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, str. 29-36.  
43. Fenech, M. (1997.), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, str. 11-18.  
44. Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., 
Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001.), HUman Micro ­
Nucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, str. 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 723
 
45. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983.), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, str. 173-215.  
46. Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980.), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 4, 
str. 55-65.
 
47. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., 
Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992.), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, str. 175-177.
 
48. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976.), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activa ­
tion Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. 
(eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, str. 85-88.  
49. Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996.), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, str. 51-59.  
50. UNEP (2001.), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Dostupno na: [http:// 
www.pops.int/]  
51. Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996.), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
str. 247-274.
 
52. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982.), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York, Plenum, str. 91-103.  
53. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983.), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, str. 795-801.
 
54. Fenech, M. (1993.), The cytokinesis-block micronucleus technique: a 
detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, str. 35-44.
 
55. Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002.), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 521, str. 103-112.  
56. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004.), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, str. 97-100.
 
57. Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984.), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, str. 61-65.  
58. Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008.), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, str. 1-3.  
59. Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995.), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
str. 169-184.
 
60. Galloway, S. (2000.), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, str. 191-201.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 724
 
61. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983.), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, str. 241-247.  
62. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983.), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, str. 269-275.
 
63. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983.), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, str. 241-247.  
64. Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003.), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, str. 65-75.  
65. Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003.),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, str. 463-467.  
66. Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the 
Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEZ, SL L 229, 30.4.2004., str. 5.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 725
 
Dodatak 1.  
Definicije  
Aneugen:  svaka tvar ili postupak koji u interakciji s elementima mitoti čkog i 
meiotičkog ciklusa diobe stanice uzrokuje aneuploidiju u stanicama ili 
organizmima.  
Aneuploidija:  odstupanje od normalnog diploidnog (ili haploidnog) broja kromo ­
soma u jednom kromosomu ili više od jednog kromosoma, ali ne u cijeloj 
skupini ili skupinama kromosoma (poliploidija).  
Apoptoza:  programirana smrt stanice koju obilježava niz koraka što vode do 
razgradnje stanica u čestice vezane na membranu, koje se potom odstranjuju 
fagocitozom ili rasipanjem.  
Proliferacija stanica:  povećanje broja stanica kao posljedica mitoti čke diobe 
stanice.  
Centromer:  DNK sekvenca kromosoma gdje su spojena oba kromatida i na kojoj 
su na obje strane pri čvršćena oba kinetohora.  
Klastogen:  svaka tvar ili postupak koji uzrokuje strukturne kromosomske abera ­
cije u populacijama stanica ili organizama.  
Citokineza:  postupak diobe stanice koji slijedi odmah nakon mitoze i kojim 
nastaju dvije stanice k ćeri od kojih svaka sadrži jednu jezgru.  
Indeks proliferacije s blokiranom citokinezom (CBPI):  udio stanica u fazi druge 
diobe u tretiranoj populaciji u odnosu na netretiranu kontrolu (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
 
Citostaza:  sprečavanje rasta stanica (vidjeti Dodatak 2. za formulu).  
Citotoksičnost:  štetni učinci na stani čnu strukturu ili funkciju koji na kraju uzro ­
kuju smrt stanice.  
Genotoksi čnost:  opći izraz koji obuhva ća sve vrste ošte ćenja DNA ili kromosoma 
uključujući lomove, preure đivanje adukata, mutacije, aberacije kromosoma i 
aneuploidiju. Sve vrste genotoksi čnih učinaka ne dovode do mutacija ili 
trajnog ošte ćenja kromosoma.  
Interfazne stanice:  stanice koje nisu u fazi mitoze.  
Kinetohor:  proteinska struktura koja nastaje na centromeru kromosoma na koju 
se tijekom diobe stanice prihva ćaju niti vretena, čime se omogu ćuje pravilno 
kretanje kromosoma k ćeri prema polovima stanica k ćeri. 
Mikronukleusi:  male jezgre, dodatne i odvojene od glavne stani čne jezgre, koje 
nastanu tijekom telofaze mitoze ili mejoze iz zaostalih fragmenata kromosoma ili cijelih kromosoma.
 
Mitoza:  dioba stani čne jezgre koja je obi čno podijeljena na profazu, prometafazu, 
metafazu, anafazu i telofazu.  
Mitotički indeks:  omjer izme đu stanica u metafazi i ukupnog broja stanica 
opaženih u populaciji stanica; pokazatelj stupnja proliferacije stanice te populacije.
 
Mutagen:  uzrokuje nasljednu promjenu sekvence osnovnih parova DNA u 
genima ili strukture kromosoma (kromosomske aberacije).  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 726
 
Nerazdvajanje:  nesposobnost para kromatida da se razdvoji i pravilno odvoji u 
razvijajuće stanice k ćeri, zbog čega nastaju stanice k ćeri s nenormalnim brojem 
kromosoma.  
Poliploidija:  brojčane kromosomske aberacije u stanicama ili organizmima koje 
utječu na cijeli set kromosoma, za razliku od pojedina čnih kromosoma ili više 
kromosoma kod aneuploidije.  
Indeks proliferacije (PI):  metoda mjerenja citotoksi čnosti kada se ne koristi 
citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).  
Relativno pove ćanje broja stanica (RICC):  metoda mjerenja citotoksi čnosti kada 
se ne koristi citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).  
Relativno udvostru čenje populacije (RPD):  metoda mjerenja citotoksi čnosti kada 
se ne koristi citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).  
Indeks ponavljanja (RI):  udio dovršenih ciklusa stani čne diobe u tretiranoj kulturi 
u odnosu na netretiranu kulturu, tijekom razdoblja izloženosti i obnavljanja 
(vidjeti Dodatak 2. za formulu).  
Ispitivana kemikalija (navodi se i kao ispitivana tvar):  svaka tvar ili smjesa koja 
se ispituje ovom ispitnom metodom.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 727
 
Dodatak 2.  
Formule za ocjenjivanje citotoksi čnosti  
1. Kod uporabe citohalazina B  ocjena citotoksi čnosti se temelji na indeksu 
proliferacije s blokiranom citokinezom (CBPI) ili indeksu ponavljanja (RI) (16) (58). CBPI pokazuje prosje čni broj stani čnih ciklusa po stanici tijekom razdoblja 
izloženosti citohalazinu B i može se koristiti za izra čun proliferacije stanica. RI 
pokazuje relativni broj jezgri u tretiranim kulturama u usporedbi s kontrolnim 
kulturama i može se koristiti za izra čun % citostaze:
 
% citostaze = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
i: 
T = kultura tretirana ispitivanom kemikalijom  
C = kontrolna kultura s nosa čem 
pri čemu:  
CBPI ¼ ððbr: mononuklearnih stanica Þ þ ð2 Ü br: binuklearnih stanica Þ þ ð3 Ü br: multinuklearnih stanica ÞÞ 
ðukupni broj stanica Þ 
Stoga, CBPI koji je jednak 1 (sve stanice su mononuklearne) odgovara 100 % 
citostaze.  
Citostaza = 100 – RI  
RI ¼ ððbr: binuklearnih stanica Þ þ ð2 Ü br: multinuklearnih stanica ÞÞ ÷ ðUkupni broj stanica Þ T 
ððbr: binuklearnih stanica Þ þ ð2 Ü br: multinuklearnih stanica ÞÞ ÷ ðUkupni broj stanica Þ C Ü 100 
T = tretirane kulture  
C = kontrolne kulture  
2. Stoga, RI od 53 % zna či da u usporedbi s brojem stanica koje su se 
podijelile u binuklearne i multinuklearne stanice u kontrolnoj kulturi, samo 53 % od tog broja stanica podijelilo se u tretiranoj kulturi, tj. 47 % citostaze.
 
3. Kada se ne koristi citohalazin B , preporu čuje se ocjena citotoksi čnosti na 
temelju relativnog pove ćanja broja stanica (RICC) ili relativnog udvostru čenja 
populacije (RPD) (58), budu ći da obje metode uzimaju u obzir omjer stani čne 
populacije koja se podijelila.  
RICC ¼ ðpovećanje broja stanica u tretiranim kulturama  ðkonačno Ä početnoÞÞ 
ðpovećanje broja stanica u kontrolnim kulturama  ðkonačno Ä početnoÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðbroj udvostru čenja populacije u tretiranim kulturama Þ 
ðbroj udvostru čenja populacije u kontrolnim kulturama Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 728
 
pri čemu:  
udvostručenje populacije = (log (broj stanica nakon tretiranja ÷ po četni broj 
stanica)) ÷ log 2  
4. Stoga, RICC ili RPD od 53 % pokazuje 47 % citotoksi čnosti/citostaze.  
5. Uporabom indeksa proliferacije (PI) citotoksi čnost se može ocijeniti broja ­
njem klonova koji se sastoje od 1 stanice (cl1), 2 stanice (cl2), 3 do 4 stanice (cl4) i 5 do 8 stanica (cl8)
 
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Indeks proliferacije se koristi kao zna čajan i pouzdan parametar citotoksi č­
nosti tako đer i za stani čne linije kultivirane in situ bez citohalazina B (25) (26) 
(27) (28).  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 729
 
Dodatak 3.  
Referentne kemikalije preporu čene za ocjenjivanje u činkovitosti  ( 1 ) 
Kategorija  Kemikalija  Br. CAS  Br. EZ  
1. Klastogeni, aktivni bez metaboli čke aktivacije  
Citozin arabinozid  147-94-4  205-705-9  
Mitomicin C  50-07-7  200-008-6  
2. Klastogeni koji zahtijevaju metaboli čku aktivaciju  
Benzo(a)piren  50-32-8  200-028-5  
Ciklofosfamid  50-18-0  200-015-4  
3. Aneugeni  
Kolhicin  64-86-8  200-598-5  
Vinblastin  143-67-9  205-606-0  
4. Negativne tvari  
Di(2-etilhexil)ftalat  117-81-7  204-211-0  
Nalidiksinska kiselina  389-08-2  206-864-7  
Piren  129-00-0  204-927-3  
Natrijev klorid  7647-14-5  231-598-3  
( 1 ) Referentne kemikalije su preporu čene kemikalije za uporabu. Zamjenske ili dodatne kemikalije se mogu dodati na popis referentnih 
kemikalija, ako je njihovo djelovanje poznato, ako induciraju mikronukleuse istim mehanizmima djelovanja i ako se pokaže da su 
relevantne za kemikalije koje se ispituju postupkom analize mikronukleusa in vitro. Ovisno o namjeni, obrazloženje može uklju čiti 
validacijsku studiju u kojoj je uporabljen široki niz tvari ili studiju usmjerenu na uži spektar koji se temelji na kemijskom r azredu 
ispitivane tvari ili mehanizmu ošte ćenja koji se prou čava. ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 730
 
B.50.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA: DA  
UVOD  
1. Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitne metode EU-a 
periodički se preispituju u svjetlu znanstvenog napretka, promjene regula ­
tornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. Prva ispitna metoda (TM) (B.42) za utvr đivanje preosjetljivosti kože kod miševa, analiza lokalnih 
limfnih čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) je revidi ­
rana (1). Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelovanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Kod LLNA se za mjerenje proli ­
feracije limfocita uporablja radioizotopni timidin ili jod te je, stoga, uporaba 
ove analize ograni čena ako je nabava, uporaba ili odlaganje radioaktivnosti 
problemati čna. LLNA: DA (razvio ju je Daicel Chemical Industries, Ltd) je 
neradioaktivna ina čica LLNA, koja koli činski odre đuje sadržaj 
adenozin-trifosfata (ATP) pomo ću bioluminiscencije kao pokazatelja proli ­
feracije limfocita. Ispitnu metodu LNNA: DA je validirao i pregledao 
međunarodni odbor za stru čnu reviziju koji ju je preporu čio kao korisnu 
za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju preosjetljivost i kemikalija koje ne 
izazivaju preosjetljivost, uz odre đena ograni čenja (10) (11) (12) (13). Svrha 
ove ispitne metode je procjena potencijala kemikalija da senzibiliziraju kožu kod životinja (tvari i smjese). Poglavlje B.6. ovog Priloga i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 koriste testove na zamorcima, konkretnije maksi ­
mizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA ima 
određene prednosti u odnosu na B.6 i Smjernicu za ispitivanje OECD-a 
406 (14). Metoda LLNA (poglavlje B.42 ovog Priloga; Smjernica za ispi ­
tivanje OECD-a 429) i dvije neradioaktivne ina čice, analiza LLNA: DA 
(poglavlje B.50 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 A) i 
LLNA: BrdU-ELISA (poglavlje B.51 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 B), sve imaju prednosti u odnosu na testove na zamorcima iz metode B.6. i Smjernice za ispitivanje OECD-a 406 (14) u smislu manje i 
usavršene uporabe životinja.
 
2. Slično kao i metodom LLNA, LLNA: DA prou čava indukcijsku fazu senzi ­
bilizacije kože i pruža kvantitativne podatke pogodne za procjenjivanje 
reakcije na dozu. Pored toga, sposobnost otkrivanja senzibilizatora kože bez uporabe radioaktivne oznake za DNA isklju čuje mogu ćnost profesio ­
nalne izloženosti radioaktivnosti i pitanja odlaganja otpada. To zauzvrat 
može omogu ćiti povećanu uporabu miševa za otkrivanje senzibilizatora 
kože, čime se može dodatno smanjiti uporaba zamoraca za ispitivanje 
potencijala preosjetljivosti kože (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (14).
 
DEFINICIJE  
3. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
4. Metoda LLNA: DA je ina čica metode LLNA za utvr đivanje kemikalija koje 
imaju potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože uz posebna ograni če­
nja. To nužno ne zna či da u svim slu čajevima metodu LLNA: DA treba 
primijeniti umjesto metode LLNA ili testa sa zamorcima (tj. B.6; Smjernica 
za ispitivanje OECD-a 406) (14), ve ć da je pokus jednakovrijedan i da se 
može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obično nije potrebna daljnja potvrda (10) (11). Ispitni laboratoriji trebaju 
uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari prije provo đenja 
studije. Spomenuti podaci uklju čuju identitet i kemijsku strukturu
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 731
 
ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih  in vitro  
ili in vivo  ispitivanja toksi čnosti i toksikološke podatke o strukturno pove ­
zanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvr đivanja priklad ­
nosti metode LLNA: DA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost određenih vrsta kemikalija s metodom LLNA: DA - vidjeti stavak 5.) i 
pomoći kod odabira doze.
 
5. Metoda LLNA: DA je metoda  in vivo , pa kao takva ne isklju čuje upotrebu 
životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Me đutim, ona 
ima potencijala smanjiti uporabu životinja u tu svrhu u usporedbi s testo ­
vima na zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (14). 
Nadalje, metoda LLNA: DA nudi znatno finiji na čin upotrebe životinja 
(manje boli i patnje) u ispitivanju kontaktne senzibilizacije, budu ći da za 
razliku od B.6 i Smjernice OECD-a 406 nije potrebno izazivati provoka ­
cijski inducirane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Unato č prednostima 
metode LLNA: DA u odnosu na B.6 i Smjernicu OECD-a 406, postoje neka ograni čenja zbog kojih može biti potrebno primijeniti B.6 ili Smjer ­
nicu OECD-a 406 (13) (npr. ispitivanje odre đenih metala, lažni pozitivni 
nalazi kod nekih sredstava s nadražuju ćim djelovanjem na kožu (kao što su 
neke površinski aktivne tvari) (6) (1. i Poglavlje B.42 iz ovog Priloga), topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže funkcionalne skupine za 
koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjuju ći faktori (16) (tj. B.6; 
Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (14)). Preporu čuje se da se ograni ­ 
čenja koja su utvr đena za metodu LLNA (1. i Poglavlje B.42 iz ovog 
Priloga) primjenjuju i na metodu LLNA: DA (10). Pored toga, uporaba 
metode LLNA: DA možda nije primjerena za ispitivanje tvari koje utje ču 
na razine adenozin-trifosfata (ATP) (tj. tvari koje djeluju kao inhibitori ATP-a) ili tvari koje utje ču na precizno mjerenje ATP-a u stanicama 
(npr. prisutnost enzima koji razgra đuju ATP, prisutnost izvanstani čnog 
ATP-a u limfnom čvoru). Pored takvih utvr đenih ograni čenja metoda 
LLNA: DA se može primjenjivati za ispitivanje bilo koje tvari, osim ako ne postoji mogu ćnost da bi njezina svojstva mogla utjecati na to čnost 
metode LLNA: DA. Pored toga, potrebno je uzeti u obzir mogu ćnost 
graničnih pozitivnih rezultata kada se dobiju vrijednosti stimulacijskog 
indeksa (SI) izme đu 1,8 i 2,5 (vidjeti stavke 31–32.). To se temelji na 
bazi podataka za validaciju s 44 tvari s indeksom stimulacije ≥ 1,8 (vidjeti 
stavak 6.), za koje su metodom LLNA: DA pravilno odre đena sva 32 
senzibilizatora pri LLNA, ali su nepravilno odre đene tri od 12 tvari koje 
pri LLNA ne izazivaju preosjetljivost s vrijednostima stimulacijskog indeksa izme đu 1,8 i 2,5 (tj. grani čno pozitivna vrijednost) (10). Me đutim, 
budući da je za odre đivanje vrijednosti stimulacijskog indeksa i izra č
un 
predvidljivih svojstava ispitivanja uporabljen isti set podataka, navedeni 
rezultati mogu precijeniti stvarna predvidljiva svojstva.  
NAČELO ISPITIVANJA  
6. Metoda LLNA: DA po čiva na temeljnom na čelu prema kojem senzibiliza ­
tori induciraju proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime dolazi do 
drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcionalna primi ­
jenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja jednostavan način za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. Proliferacija se 
mjeri usporedbom prosje čne proliferacije svake ispitivane skupine s 
prosječnom proliferacijom u kontrolama tretiranim nosa čem. Odre đuje se 
omjer prosje čne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i proliferacije u
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 732
 
kontrolama s nosa čem, nazvan indeks stimulacije, koji mora biti ≥ 1,8 da bi 
se ispitivana tvar mogla dalje vrednovati kao potencijalni senzibilizator 
kože. Ovdje opisane metode temelje se na mjerenju sadržaja ATP-a biolu ­
miniscencijom (za koju je poznato da je povezana s brojem živu ćih stanica) 
(17), kako bi se pokazao pove ćani broj stanica koje proliferiraju u auriku ­
larnim limfnim čvorovima koji uzrokuju drenažu (18) (19). Metoda biolu ­
miniscencije koristi enzim luciferaze za kataliziranje nastanka svjetlosti iz ATP-a i luciferin u skladu sa sljede ćom reakcijom:
 
ATP + luciferină + O 2
 oxiluciferin ă + AMP  + PP  i + CO  2 + svjetlost  
Emitirani intenzitet svjetlosti je linearno povezan s koncentracijom ATP-a i 
mjeri se luminometrom. Analiza reakcije izme đu luciferina i luciferaze je 
osjetljiva metoda za odre đivanje ATP-a koji se koristi u širokom opsegu 
primjena (20).  
OPIS ANALIZE  
Odabir životinjskih vrsta  
7. Za ovaj test odabrana vrsta su miševi. Validacijske studije za LLNA: DA 
provedene su isklju čivo sa sojem CBA/J, koji se stoga smatra preporu čenim 
sojem (12) (13). Koriste se mlade odrasle ženke koje još nisu imale potom ­
stvo i nisu skotne. Na po četku studije životinje trebaju biti stare izme đu 
osam do 12 tjedana, a odstupanje mase životinja treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. Drugi sojevi i mužjaci mogu se koristiti 
ako postoji dovoljno podataka da u reakciji prema metodi LLNA: DA nema 
značajnih razlika specifi čnih za soj i/ili spol.
 
Uvjeti smještaja i prehrane  
8. Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (21), osim ako se ne dokaže 
prikladna znanstvena utemeljenost za pojedina čni smještaj. Temperatura u 
prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako 
bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prije đe 
70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost 
treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograni ­ 
čenom koli činom vode za pi će.
 
Priprema životinja  
9. Životinje se nasumice biraju, jednozna čno identificiraju (ali ne bilo kojim 
oblikom ozna čavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije 
početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije 
početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da 
nemaju zapaženih lezija kože.  
Priprema ispitnih otopina  
10. Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspen ­
dirati u otapalima/nosa čima i prema potrebi razrijediti. Teku će kemikalije se 
mogu nanijeti čiste ili razrije đene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje 
se obično koriste u medicinskim ure đajima, trebaju se podvrgnuti postupku 
pretjerane ekstrakcije u odgovaraju ćem otapalu kako bi se prije primjene na 
uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se 
pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihva ­
tljivost njihova skladištenja.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 733
 
Provjera pouzdanosti  
11. Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus 
provodi na odgovaraju ći način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom 
preosjetljivoš ću na ispitivanu tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je 
stupanj reakcije to čno utvrđen. Preporu čuje se uvo đenje paralelne pozitivne 
kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku 
analizu i da se omogu ći ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti unutar 
jednog ili izme đu više laboratorija. Odre đena regulatorna tijela zahtijevaju 
pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se, stoga, korisnici pozivaju da prije izvođenja metode LLNA: DA kontaktiraju relevantna tijela. Sukladno tomu, 
potiče se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole kako bi se izbjeglo 
dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu javiti zbog periodi čke uporabe paralelne kontrole (vidjeti stavak 12.). Pozi ­
tivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju na metodu LLNA: DA 
kod razine izlaganja za koju se o čekuje da će dati porast indeksa 
stimulacije (SI) ≥ 1,8 u odnosu na negativnu kontrolnu skupinu. Dozu 
pozitivne kontrole treba odabrati tako da ne uzrokuje prekomjernu nadra ­ 
ženost kože ili sustavnu toksi čnost i da je indukcija ponovljiva, ali ne 
prekomjerna (tj. SI > 10 se smatra pretjeranim). Poželjne pozitivne kontrole 
su 25 %-tni heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) i 25 %-tni eugenol (CAS br. 97-53-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v). Mogu će su okol ­
nosti u kojima se, uz odgovaraju će obrazloženje, mogu koristiti druge pozi ­
tivne kontrole koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
 
12. Iako se preporu čuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u odre ­ 
đenim situacijama periodi čko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) 
pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode 
metodu LLNA: DA (tj. najmanje jednom mjese čno) i imaju povijesnu bazu 
podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laboratorija da dobiva ponovljive i to čne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovaraju ća ospo­
sobljenost za metodu LLNA: DA može se uspješno dokazati dobivanjem 
dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje deset neovi ­
snih ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju (manje od jedne godine).
 
13. Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada do đe 
do proceduralne promjene metode LLNA: DA (zamjena stru čnog osoblja, 
promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, promjena opreme, promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene moraju navesti u 
laboratorijskim izvješ ćima. Potrebno je uzeti u obzir u činak tih promjena na 
primjerenost prethodno uspostavljene baze podataka prilikom utvr đivanja 
potrebe za uspostavom nove baze povijesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
 
14. Istraživa či trebaju biti svjesni da odluka o provo đenju periodi čke umjesto 
paralelne studije pozitivne kontrole utje če na prikladnost i prihvatljivost 
negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju između svake periodi čke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodi ­ 
čkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se 
dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju između posljednje prihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije i 
neprihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije. Kod odlu čivanja o 
uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provo đenju samo periodi čkih pozi­
tivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. Također je potrebno razmotriti mogu ćnost uporabe manjeg broja životinja u 
skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog 
stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka 
dokaže da se može koristiti manje miševa (22).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 734
 
15. Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosa ču za koji je poznato da 
izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim 
regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom 
nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (23). Ako se paralelna 
pozitivna kontrola ispituje u druga čijem nosa ču od ispitivane tvari, potrebno 
je uključiti posebnu kontrolu s nosa čem za paralelnu pozitivnu kontrolu.  
16. U slu čajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili 
raspona reakcija, referentne tvari mogu tako đer biti korisne za dokazivanje 
ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih 
vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljede će 
značajke:  
— strukturnu i funkcionalnu sli čnost s razredom ispitivane tvari,  
— poznata fizikalna/kemijska svojstva,  
— popratne podatke iz LLNA: DA,  
— popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.  
ISPITNI POSTUPAK  
Broj životinja i visine doze  
17. Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje, s najmanje 
tri koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina 
tretirana samo nosa čem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (para ­
lelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimaju ći u 
obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s 
prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim 
skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim skupinama.
 
18. Odabir doze i nosa ča treba se temeljiti na preporukama navedenim u refe ­
rencama (2) i (24). Uzastopne doze se obi čno odabiru iz odgovaraju ćih 
serija koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popra ćen 
odgovaraju ćim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne 
koncentracije treba uzeti u obzir sve postoje će toksikološke podatke (o 
akutnoj toksi čnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske 
podatke o odnosnoj ispitivanoj tvari (i/ili strukturno povezanim tvarima), 
ako su dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo izla ­
ganje, ali istodobno izbjegla sustavna toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno 
nadraživanje kože (24)(25). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti po četno predprobiranje (vidjeti stavke 21.-24.).
 
19. Nosa č ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se 
odabrati na temelju pove ćanja topljivosti s ciljem postizanja što viših 
koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za 
primjenu ispitivane tvari. Kao nosa či preporučuju se aceton: maslinovo ulje 
(4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil sulfoksid (6), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klini čki rele­
vantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar 
prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosa ča 
budu ugra đene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se 
odmah, uklju čivanjem odgovaraju ćih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim 
Pluronic® L92). Zna či, nosače koji su u potpunosti vodeni treba 
izbjegavati.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 735
 
20. Obrada limfnih čvorova pojedina čnih miševa omogu ćuje ocjenjivanje 
promjenljivosti me đu životinjama i statisti čku usporedbu razlika izme đu 
mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosa čem (vidjeti 
stavak 33.). Pored toga, ocjenjivanje mogu ćnosti smanjenja broja miševa 
u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedina čni 
podaci o životinjama (22). Odre đena regulatorna tijela nadalje zahtijevaju 
da se prikupe pojedina čni podaci o životinjama. Redovito prikupljanje poje ­
dinačnih podataka o životinjama osigurava prednosti za dobrobit životinja, 
tako što se izbjegava dvostruko ispitivanje koje bi bilo potrebno, ako bi 
regulatorna tijela kasnije razmatrala rezultate izvorno prikupljene na jedan 
način (npr. preko grupnih podataka o životinjama), zajedno s drugim zahtje ­
vima (npr. pojedina čni podaci o životinjama).  
Predprobiranje  
21. Ako nisu dostupne informacije za odre đivanje najviše doze za ispitivanje 
(vidjeti stavak 18.) potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila 
odgovaraju ća visina doze za ispitivanje u LLNA: DA. Svrha predprobiranja 
je pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj studiji LLNA: DA, ako nisu dostupne informacije o koncentraciji koja uzrokuje sustavnu toksi čnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno lokalno nadraži ­
vanje kože (vidjeti stavak 23.). Najve ća ispitana visina doze je 100 %-tna 
ispitivana tvar za teku ćine ili najve ća moguća koncentracija za krute tvari ili 
suspenzije.
 
22. Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identi čni glavnoj studiji LLNA: 
DA, s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i može se 
koristiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporu čuje se uporaba jedne 
ili dvije životinja po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakodnevno prate s 
ciljem otkrivanja klini čkih znakova sustavne toksi čnosti ili lokalnog nadra ­ 
živanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije ispitivanja i prije završetka (8. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju radi otkrivanja 
eritema i boduju prema tablici 1. (25). Debljina uha se mjeri posebnim 
mjernim instrumentom (pr. digitalnim mikrometrom ili mjera čem debljine 
Peacock Dial) prvi dan (prije doze), tre ći dan (otprilike 48 sati nakon prve 
doze), sedmi dan (24 sata prije završetka) i osmi dan. Pored toga, osmi dan 
se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probi ­
janjem, što se izvodi nakon humanog usmr ćenja. Prekomjerno lokalno 
nadraživanje kože se ozna čuje bodovima za eriteme ≥ 3 i/ili pove ćanjem 
debljine uha za ≥ 25 % na bilo koji dan mjerenja (26) (27). Najviša 
odabrana doza za glavnu studiju LLNA: DA je sljede ća niža doza iz 
serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože.
 
Tablica 1.  
Bodovanje eritema  
Zapažanja  Bodovi  
Bez eritema  0  
Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)  1  
Dobro vidljiv eritem  2  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 736
 
Zapažanja  Bodovi  
Umjeren do jak eritem  3  
Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogu ćuje stupnjevanje 
eritema  4 
23. Pored 25 %-tnog pove ćanja debljine uha (26)(27), statisti čki značajno pove ­ 
ćanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne miševe se, 
također, koristi za odre đivanje nadražuju ćih tvari u LLNA (28) (29) (30) 
(31) (32) (33) (34). Me đutim, iako se statisti čki značajna pove ćanja debljine 
uha mogu javiti, ona se posebno ne povezuju s prekomjernim nadraživa ­
njem kada su manja od 25 % (30) (32) (33) (34).  
24. Sljede ća klinička opažanja mogu ukazivati na sustavnu toksi čnost (35) kada 
se koriste u okviru cjelokupne ocjene te, stoga, mogu nazna čiti najvišu dozu 
za uporabu u glavnoj LLNA: DA: promjene u djelovanju živ čanog sustava 
(npr. piloerekcija, ataksija, tremori i gr čevi); promjene u ponašanju (npr. 
agresivnost, promjene u njezi, zna čajna promjena u stupnju aktivnosti); 
promjene u disanju (npr. promjene u čestalosti i intenziteta disanja kao što 
su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve kliničke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenuta čni, ili gubitak 
težine > 5 % od prvog do osmog dana i smrtnost. Životinje koje su pred 
uginućem ili pokazuju znakove teške boli i patnje trebaju se humano usmr ­
titi (36).
 
Plan pokusa glavne studije  
25. Plan pokusa je sljede ći: 
— Prvi dan: Pojedina čno identificirati životinje i zabilježiti masu svake 
životinje i sva klini čka opažanja. Primijeniti 1 %-tnu vodenu otopinu 
natrijevog laurel sulfata (SLS) na stražnju stranu svakog uha koriste ći 
četkicu umo čenu u otopinu SLS za premaz stražnje strane svakog uha u 
četiri do pet poteza. Sat vremena nakon tretiranja SLS-om primijeniti 25 
μl odgovaraju će otopine ispitivane tvari, samog nosa ča ili pozitivne 
kontrole (paralelna ili nedavno provedena, ovisno o laboratorijskoj poli ­
tici uzimaju ći u obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio svakog uha.  
— Drugi, tre ći i sedmi dan: Ponoviti predtretman 1 %-tnom vodenom 
otopinomu SLS-a i postupak primjene proveden prvog dana.  
— Četvrti, peti i šesti dan: Bez tretiranja.  
— Osmi dan: Zabilježiti masu svake životinje i sva klini čka opažanja. 
Otprilike 24 do 30 sati nakon po četka primjene sedmog dana životinje 
humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz svakog 
uha i staviti odvojeno u pufer PBS za svaku životinju. Pojedinosti i 
sheme za identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se na ći u 
referenci (22). Za daljnje pra ćenje lokalne reakcije kože u glavnoj 
studiji mogu se u protokol studije uklju čiti dodatni parametri kao što 
su ocjenjivanje eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni 
uređajem za mjerenje debljine ili odre đivanjem mase uzorka uha pri 
obdukciji).  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 737
 
Priprema suspenzije stanica  
26. Suspenzija pojedina čnih stanica limfnih čvorova (LNC) svakog miša, 
odstranjenih bilateralno, priprema se tako da se limfni čvorovi stave 
između dva predmetna stakalca koja se lagano pritisnu kako bi se zdrobili 
čvorovi. Nakon provjere da se tkivo raširilo u tanki sloj, stakalca se odva ­
jaju. Tkivo na oba stakalca se suspendira u PBS-u tako da se svako stakalce 
drži pod kutom nad Petrijevom zdjelicom i ispere PBS-om istodobno stru ­
gajući tkivo sa stakalca odgovaraju ćim priborom. Limfni čvorovi životinja u 
negativnoj kontroli su mali te je stoga važno njima pažljivo rukovati da ne dođe do umjetnog u činka na vrijednosti SI. Za ispiranje oba stakalca koristi 
se ukupno 1 ml PBS. Suspenzija iz stanica limfnih čvorova u Petrijevoj 
zdjelici se lagano homogenizira strugalom za stanice. Potom se mikropi ­
petom prikupi 20 μL alikvota suspenzije LNC-a paze ći da se ne pobere 
membrana koja je vidljiva okom, i naknadno se pomiješa s 1,98 ml PBS 
kako bi se dobilo 2 ml uzorka. Istim postupkom se pripremi drugi uzorak 
od 2 ml, tako da za svaku životinju budu pripravljena dva uzorka.
 
Određivanje proliferacije stanica (mjerenje sadržaja ATP-a u limfocitima)  
27. Pove ćanje sadržaja ATP-a u limfnim čvorovima mjeri se metodom lucife ­
rin/luciferaza koriste ći komplet za mjerenje ATP-a, koji mjeri biolumini ­
scenciju u relativnim luminiscentnim jedinicama (RLU). Trajanje analize od trenutka usmr ćenja životinja do mjerenja sadržaja ATP-a za svaku pojedi ­
načnu životinju mora biti jednako, otprilike 30 minuta, budu ći da se smatra 
da sadržaj ATP-a postupno opada po usmr ćenju životinja (12). Stoga se 
serija postupaka od izrezivanja aurikularnih limfnih čvorova do mjerenja 
ATP-a mora dovršiti u 20 minuta prema unaprijed odre đenom rasporedu 
koji je jednak za svaku životinju. Luminiscencija ATP-a se mjeri u svakom 
uzorku od 2 ml tako da se za svaku životinju prikupe dva mjerenja ATP-a. Potom se odre đuje prosje čna luminiscencija ATP-a koja se koristi u dalj ­
njim izračunima (vidjeti stavak 30.).
 
OPAŽANJA  
Klinička opažanja  
28. Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve 
kliničke znakove lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne 
toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe za svaku životinju. Programi 
praćenja uklju čuju kriterije za pravodobno identificiranje miševa koji poka ­
zuju znakove sustavne toksi čnosti, prekomjernog lokalnog nadraživanja 
kože ili korozije kože za eutanaziju (36).  
Tjelesne mase  
29. Kao što je navedeno u stavku 25., pojedina čne tjelesne mase treba mjeriti 
na početku testa i u vrijeme planiranog usmr ćivanja životinja.  
IZRAČUN REZULTATA  
30. Rezultati za svaku tretiranu skupinu su izraženi kao prosje čni indeks 
stimulacije (SI). SI se dobiva dijeljenjem prosje čne RLU po životinji 
unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozitivne kontrolne 
skupine s prosje čnim RLU po životinji za kontrolnu skupinu otopine/no ­
sača. Prosječan SI za kontrolne skupine tretirane nosa čem tada iznosi 1.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 738
 
31. U postupku odlu čivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 1,8 (10). 
Međutim, kod odlu čivanja da se neki grani čni rezultat (tj. vrijednost SI 
između 1,8 i 2,5) proglasi pozitivnim može se, tako đer, koristiti snaga 
učinka na dozu, statisti čki značaj i dosljednost reakcija u otapalu/nosa ču i 
pozitivnoj kontroli (2) (3) (37).  
32. U slu čaju graničnog pozitivnog rezultata s vrijednoš ću SI izme đu 1,8 i 2,5, 
za potvrđivanje pozitivnog rezultata korisnici mogu, pored vrijednosti SI, 
uzeti u obzir i dodatne podatke kao što je odnos izme đu doze i reakcije, 
dokaz sustavne toksi čnosti ili prekomjerne nadraženosti i, prema potrebi, 
statistički značaj (10). Tako đer je potrebno uzeti u obzir razna svojstva 
ispitivane tvari, uklju čujući i to ima li strukturne veze s poznatim senzibi ­
lizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa reakcije na dozu koja je opažena. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (4).
 
33. Prikupljanje podataka na razini pojedina čnog miša omogu ćit će statističku 
analizu prisutnosti i stupnja odnosa izme đu doze i u činka. Svaka statisti čka 
procjena može uklju čiti ocjenu odnosa izme đu doze i u činka te odgovara ­
jući prilagođene usporedbe ispitnih skupina (npr. skupina s doziranjem u 
parovima u odnosu na paralelne kontrolne skupine s otapalom/nosa čem). 
Statističke analize mogu uklju čiti linearnu regresiju ili Williamsov test za 
ocjenu trendova odnosa doza-u činak i Dunnettov test za usporedbe u paro ­
vima. Prilikom odabira prikladne metode statisti čke analize istraživa č treba 
biti svjestan eventualnih razlika izme đu varijanata kao i drugih problema s 
tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna transformacija podataka ili 
neparametarska statisti čka analiza. U svakom slu čaju istraživa č će možda 
morati izvršiti izra čune SI i statisti čke analize sa sigurnim to čkama poda ­
taka (koji se ponekad nazivaju „netipi čne vrijednosti”) i bez njih.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
34. Podatke treba sažeti u tabli čnom obliku koji pokazuje vrijednosti relativne 
luminiscentne jedinice za pojedina čnu životinju, prosje čnu relativnu lumini ­
scentnu jedinicu po životinji za skupinu, s tim povezane pogreške (npr. SD, SEM) i prosje čni SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu 
kontrolnu skupinu s otapalom/nosa čem.
 
Izvješće o ispitivanju  
35. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivane i kontrolne tvari:  
— identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako poznati, podrijetlo, 
čistoća, poznate ne čistoće, broj šarže),  
— fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabil ­
nost, topljivost),  
— ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.  
Otapalo/nosa č: 
— identifikacijski podaci ( čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijeb ­
ljeni volumen),  
— dokaz opravdanosti izbora nosa ča. ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 739
 
Ispitne životinje:  
— podrijetlo miševa CBA,  
— mikrobiološki status životinja, ako je poznat,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podrijetlo, broj šarže i podaci proizvo đača o osiguranju kakvo će/kontroli 
kakvoće za komplet ATP,  
— pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,  
— dokaz opravdanosti odabira doze (uklju čujući rezultate predprobiranja, 
ako je provedeno),  
— koncentracije nosa ča i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna 
količina ispitivane tvari koja je primijenjena,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući vrstu/podrijetlo hrane, 
izvor vode),  
— pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— kriteriji za odre đivanje studija pozitivnima ili negativnima,  
— pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje 
učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,  
Provjera pouzdanosti:  
— sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uklju čujući informa ­
cije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosa ču, 
— podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim 
negativnim kontrolama (s otapalom/nosa čem) za ispitni laboratorij,  
— ako nije uklju čena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko 
izvješće za posljednju periodi čku pozitivnu kontrolu i izvješ će u kojem 
se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se 
opravdava neprovo đenje paralelne pozitivne kontrole,  
Rezultati:  
— pojedina čne mase miševa na po četku doziranja i u vrijeme planiranog 
usmrćenja, srednja i povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene 
pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,  
— vrijeme prve pojave i znakova toksi čnosti, uklju čujući eventualno 
nadraživanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju,  
— vrijeme usmr ćenja životinje i mjerenja ATP-a za svaku životinju,  
— tablica vrijednosti RLU za pojedina čne miševe i vrijednosti SI za svaku 
dozirnu tretiranu skupinu,  
— srednja i povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene pogreške (npr. 
SD, SEM) za RLU/miš za svaku tretiranu skupinu i rezultati analize 
netipičnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu,  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 740
 
— izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir 
promjenljivost izme đu životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim 
skupinama,  
— odnos doza – reakcija,  
— statisti čka analiza, ako je primjereno,  
Rasprava o rezultatima:  
— kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije, i prema potrebi, 
statističke analize, sa zaklju čkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati 
senzibilizatorom kože.  
REFERENCE  
1. OECD (2010.),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno 
na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
2. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, str. 999-1002.  
3. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, str. 985-997.
 
4. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, str. 327-333.  
5. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins.  Toxicol ., 146, str. 49-59.
 
6. ICCVAM (1999.), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dostupno na: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
7. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, str. 258-273.
 
8. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , str. 274-286.
 
9. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, str. 249-257.
 
10. ICCVAM (2010.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 741
 
11. ICCVAM (2009.), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
12. Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008.), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
str. 1-10.
 
13. Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008.), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay 
based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 
58, str. 11-26.
 
14. OECD (1992.),  Skin Sensitisation , Test Guideline No 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
15. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, str. 1896-1904.
 
16. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), 
Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharmacol ., 55, 
str. 90-96.  
17. Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993.), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88.  
18. Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984.), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  J. Immunol. Meth ., 72, str. 127-132.
 
19. Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003.), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial 
cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, str. 27-34.  
20. Lundin A. (2000.), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, str. 346-370.  
21. ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
22. ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]
 
23. McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, str. 71-89.  
24. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, str. 13- 
31. 
25. OECD (2002.),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 742
 
26. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and 
false positive substances.  Toxicologist , 96, str. 235.  
27. ICCVAM (2009.), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
28. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, str. 195-206.
 
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, str. 83-94.
 
30. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, str. 245-256.  
31. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, str. 491-506.  
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, str. 60-68.
 
33. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, str. 721-728.  
34. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007.), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
str. 1023-1028.  
35. ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
36. OECD (2000.),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, 
OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
37. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medica ­
ments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 str. 563-79.
 
38. OECD (2005.),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 743
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Točnost:  stupanj podudarnosti izme đu rezultata ispitne metode i prihva ćenih 
referentnih vrijednosti. To je mjerilo u činkovitosti ispitne metode i jedan od 
aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto „podudarnosti” 
kako bi se ozna čio udio to čnih rezultata ispitne metode (38).  
Referentna tvar:  tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi 
kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati slje ­
deće svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sli č­
nost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske zna čajke; iv. 
popratni podaci o poznatim u čincima; i v. poznata u činkovitost u okviru željene 
reakcije.  
Lažno negativna tvar:  tvar koja je ispitnom metodom neto čno određena kao 
negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna.  
Lažno pozitivna tvar:  tvar koja je ispitivanjem neto čno određena kao pozitivna ili 
aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna.  
Opasnost:  potencijal štetnog u činka na zdravlje ili okoliš. Štetni u činak se javlja 
samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.  
Ponovljivost izme đu laboratorija:  mjera u kojoj razli čiti kvalificirani laboratoriji 
koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvan ­
titativno sli čne rezultate. Ponovljivost izme đu laboratorija se odre đuje prije i 
tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje 
može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, tako đer navedena kao 
međulaboratorijska ponovljivost (38).  
Ponovljivost u laboratoriju:  određivanje u kojoj mjeri stru čno osoblje u okviru 
istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koriste ći određeni protokol u 
različitim trenucima. Tako đer se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost 
(38).  
Netipična vrijednost:  netipična vrijednost je zapažanje koje zna čajno odstupa od 
ostalih vrijednosti u nasumi čnom uzorku populacije.  
Osiguranje kvalitete:  postupak upravljanja pri kojem pojedinci neovisni od osoba 
koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog ispiti ­
vanja, zahtjeve i postupke vo đenja evidencije te to čnost prijenosa podataka.  
Pouzdanost:  mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i izme đu 
laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izra čunava­
njem unutarlaboratorijske i me đulaboratorijske ponovljivosti (38).  
Preosjetljivost kože:  imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac 
lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja 
može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.  
Indeks stimulacije (SI):  izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosje ­
tljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u 
tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosa čem. 
Ispitivana tvar (navodi se tako đer kao i ispitivana kemikalija):  svaka tvar ili 
smjesa koja je ispitana ovom metodom.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 744
 
B.51.  PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH 
ČVOROVA: BrdU-ELISA  
UVOD  
1. Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitnih metoda EU-a se 
periodički preispituju u svjetlu znanstvenog napretka, promjene regulatornih 
potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. Prva ispitna metoda (TM) (B.42) za utvrđivanje preosjetljivosti kože kod miševa, analiza lokalnih limfnih 
čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) je revidirana (1. i 
poglavlje B.42. u ovome Prilogu). Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelovanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Kod LLNA se za mjerenje proliferacije limfocita uporablja radioizotopni timidin 
ili jod te je stoga uporaba ove analize ograni čena ako je nabava, uporaba ili 
odlaganje radioaktivnosti problemati čna. LLNA: BrdU-ELISA (Enzyme- 
Linked Immunosorbent Assay) je neradioaktivna ina čica metode LLNA, u 
kojoj se koristi radioaktivno neozna čeni 5-bromo 2-deoksiuridin (BrdU) 
(CAS br. 59-14-3) u sustavu ispitivanja koji se temelji na ELISA za 
mjerenje proliferacije limfocita. Ispitnu metodu LNNA: BrdU-ELISA je validirao i pregledao me đunarodni nezavisni odbor za stru čnu reviziju 
koji ju je preporu čio kao korisnu za utvr đivanje kemikalija koje izazivaju 
preosjetljivost i kemikalija koje ne izazivaju preosjetljivost, uz odre đena 
ograničenja (10) (11) (12). Svrha ove ispitne metode je procjena potencijala 
kemikalija da senzibiliziraju kožu kod životinja (tvari i smjese). Poglavlje 
B.6. ovog Priloga i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 koriste testove na 
zamorcima, konkretnije maksimizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA (poglavlje B.42 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) i dvije neradioaktivne ina čice, analiza LLNA: BrdU-ELISA 
(poglavlje B.51 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 B) i 
LLNA: DA (poglavlje B.50 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 A), sve imaju prednosti u odnosu na testove na zamorcima iz metode B.6. i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (13) u smislu manje i usavršene 
uporabe životinja.
 
2. Slično kao i metodom LLNA, LLNA: BrdU-ELISA prou čava indukcijsku 
fazu senzibilizacije kože i pruža kvantitativne podatke pogodne za procje ­
njivanje reakcije na dozu. Pored toga, sposobnost otkrivanja senzibilizatora kože bez uporabe radioaktivne oznake za DNA isklju čuje mogu ćnost profe ­
sionalne izloženosti radioaktivnosti i pitanja odlaganja otpada. To zauzvrat 
može omogu ćiti povećanu uporabu miševa za otkrivanje senzibilizatora 
kože, čime se može dodatno smanjiti uporaba zamoraca za ispitivanje 
potencijala preosjetljivosti kože (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13).
 
DEFINICIJE  
3. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
4. Metoda LLNA: BrdU-ELISA je ina čica metode LLNA za utvr đivanje kemi ­
kalija koje imaju potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože uz posebna ograničenja. To nužno ne zna či da u svim slu čajevima metodu LLNA: 
BrdU-ELISA treba primijeniti umjesto metode LLNA ili testa sa zamorcima 
(tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), ve ć da je pokus 
jednakovrijedan i da se može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obi čno nije potrebna daljnja potvrda (10) (11). Ispitni 
laboratoriji trebaju uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari 
prije provo đenja studije. Spomenuti podaci uklju čuju identitet i kemijsku
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 745
 
strukturu ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih  
in vitro  ili in vivo  ispitivanja toksi čnosti i toksikološke podatke o strukturno 
povezanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvr đivanja 
prikladnosti metode LLNA: BrdU-ELISA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost odre đenih vrsta kemikalija s metodom LLNA: 
BrdU-ELISA - vidjeti stavak 5.) i pomo ći kod odabira doze.
 
5. Metoda LLNA: BrdU-ELISA je metoda  in vivo , pa kao takva ne isklju čuje 
uporabu životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Ona, 
međutim, ima potencijala smanjiti uporabu životinja u tu svrhu u usporedbi 
s testovima na zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13). Nadalje, metoda LLNA: BrdU-ELISA nudi znatno finiji na čin uporabe 
životinja u ispitivanju kontaktne senzibilizacije, budu ći da za razliku od 
B.6 i Smjernice OECD-a 406 nije potrebno izazivati provokacijski induci ­
rane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Nadalje, za metodu LLNA: BrdU-ELISA nije potrebno koristiti adjuvans, kao što je to slu čaj s maksi ­
mizacijskim testom sa zamorcima (poglavlje B.6 ovog Priloga, 13). Metoda 
LLNA: BrdU-ELISA smanjuje patnju životinja. Unato č prednostima metode 
LLNA: BrdU-ELISA u odnosu na B.6 i Smjernicu OECD-a 406 (13), postoje neka ograni čenja zbog kojih može biti potrebno primijeniti B.6 ili 
Smjernicu OECD-a 406 (npr. ispitivanje odre đenih metala, lažni pozitivni 
nalazi kod nekih sredstava s nadražuju ćim djelovanjem na kožu (kao što su 
neke površinski aktivne tvari) (6) (1. i poglavlje B.42 iz ovog Priloga), topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže funkcionalne skupine za 
koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjuju ći faktori (15) (tj. B.6; 
Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (13). Preporu čuje se da se ograni čenja 
koja su utvr đena za metodu LLNA) (1. i poglavlje B.42 iz ovog Priloga) 
primjenjuju i na metodu LLNA: BrdU-ELISA (10). Pored takvih utvr đenih 
ograničenja metoda LLNA: BrdU-ELISA se može primjenjivati za ispiti ­
vanje bilo koje kemikalije, osim ako ne postoji mogu ćnost da bi njezina 
svojstva mogla utjecati na to čnost metode LLNA: BrdU-ELISA. Pored toga, 
potrebno je uzeti u obzir mogu ćnost grani čnih pozitivnih rezultata kada se 
dobiju vrijednosti stimulacijskog indeksa (SI) izme đu 1,6 i 1,9 (vidjeti 
stavke 31–32.). To se temelji na bazi podataka za validaciju s 43 tvari s indeksom stimulacije ≥ 1,6 (vidjeti stavak 6.), za koje su metodom LLNA: 
BrdU-ELISA pravilno odre đena sva 32 senzibilizatora pri LLNA, ali su 
nepravilno odre đene dvije od 11 tvari koje pri LLNA ne izazivaju preosje ­
tljivost s vrijednostima stimulacijskog indeksa izme đu 1,6 i 1,9 (tj. grani čno 
pozitivna vrijednost) (10). Me đutim, budu ći da je za odre đivanje vrijednosti 
stimulacijskog indeksa i izra čun predvidljivih svojstava ispitivanja uporab ­
ljen isti set podataka, navedeni rezultati mogu precijeniti stvarna pred ­
vidljiva svojstva.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
6. Metoda LLNA: BrdU-ELISA po čiva na temeljnom na čelu prema kojem 
senzibilizatori induciraju proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime 
dolazi do drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcio ­
nalna primijenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja 
jednostavan na čin za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. 
Proliferacija se mjeri usporedbom prosje čne proliferacije svake ispitivane 
skupine s prosje čnom proliferacijom u kontrolnoj skupini tretiranoj nosa ­ 
čem. Odre đuje se omjer prosje čne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i 
proliferacije u paralelnoj kontrolnoj skupini s nosa čem, nazvan indeks 
stimulacije, koji mora biti ≥ 1,6 da bi se ispitivana tvar mogla dalje  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 746
 
vrednovati kao potencijalni senzibilizator kože. Ovdje opisane metode 
temelje se na mjerenju sadržaja BrdU kako bi se pokazao pove ćani broj 
stanica koje proliferiraju u aurikularnin limfnim čvorovima koji uzrokuju 
drenažu. BrdU je analogan timidinu i sli čno se uklju čuje u proliferiraju će 
stanice DNA. Uklju čivanje BrdU se mjeri testom ELISA koji koristi speci ­
fično protutijelo za BrdU, koje je tako đer označeno peroksidazom. Ako se 
doda supstrat, peroksidaza reagira sa supstratom i nastane obojani produkt koji se koli činski odre đuje pri odre đenoj apsorbanci koriste ći čitač mikro­
titarskih plo čica.
 
OPIS ANALIZE  
Odabir životinjskih vrsta  
7. Za ovaj test odabrana vrsta su miševi. Validacijske studije za LLNA: 
BrdU-ELISA provedene su isklju čivo sa sojem CBA/JN, koji se stoga 
smatra preporu čenim sojem (10) (12). Koriste se mlade odrasle ženke 
koje još nisu imale potomstvo i nisu skotne. Na po četku studije životinje 
trebaju biti stare izme đu osam do 12 tjedana, a odstupanje mase životinja 
treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. Drugi sojevi i 
mužjaci mogu se koristiti ako postoji dovoljno podataka da u reakciji prema metodi LLNA: BrdU-ELISA nema zna čajnih razlika specifi čnih za soj i/ili 
spol.
 
Uvjeti smještaja i prehrane  
8. Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (16), osim ako se ne dokaže 
prikladna znanstvena utemeljenost za pojedina čni smještaj. Temperatura u 
prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako 
bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prije đe 
70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost 
treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za 
hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograni ­ 
čenom koli činom vode za pi će. 
Priprema životinja  
9. Životinje se nasumice biraju, jednozna čno identificiraju (ali ne bilo kojim 
oblikom ozna čavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije 
početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije 
početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da 
nemaju zapaženih lezija kože.  
Priprema ispitnih otopina  
10. Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspen ­
dirati u otapalima/nosa čima i prema potrebi razrijediti. Teku će kemikalije se 
mogu nanijeti čiste ili razrije đene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje 
se obično koriste u medicinskim ure đajima, trebaju se podvrgnuti postupku 
pretjerane ekstrakcije u odgovaraju ćem otapalu kako bi se prije primjene na 
uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihva ­
tljivost njihova skladištenja.
 
Provjera pouzdanosti  
11. Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus 
provodi na odgovaraju ći način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom 
preosjetljivoš ću kao ispitivana tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je 
stupanj reakcije to čno utvrđen. Preporu čuje se uvo đenje paralelne pozitivne 
kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku analizu i da se omogu ći ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti unutar 
jednog ili izme đu više laboratorija. Odre đena regulatorna tijela zahtijevaju 
pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se, stoga, korisnici pozivaju da prije
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 747
 
izvođenja metode LLNA: BrdU-ELISA kontaktiraju relevantna tijela. 
Sukladno tomu, poti če se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole 
kako bi se izbjeglo dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu javiti zbog periodi čke uporabe paralelne kontrole 
(vidjeti stavak 12.). Pozitivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju 
na metodu LLNA: BrdU-ELISA kod razine izlaganja za koju se o čekuje da 
će dati porast indeksa stimulacije (SI) ≥ 1,6 u odnosu na negativnu 
kontrolnu skupinu. Dozu pozitivne kontrole treba odabrati tako da ne uzro ­
kuje prekomjerno nadraživanje kože ili sustavnu toksi čnost i da je indukcija 
ponovljiva, ali ne prekomjerna (tj. SI > 14 se smatra pretjeranim). Poželjne 
pozitivne kontrole su 25 %-tni heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) i 25 %-tni eugenol (CAS br. 97-53-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v). Moguće su okolnosti u kojima se, uz odgovaraju će obrazloženje, mogu 
koristiti druge pozitivne kontrole koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
 
12. Iako se preporu čuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u odre ­ 
đenim situacijama periodi čko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) 
pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode metodu LLNA: BrdU-ELISA (tj. najmanje jednom mjese čno) i imaju povi ­
jesnu bazu podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laborato ­
rija da dobiva ponovljive i to čne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovaraju ća 
osposobljenost za metodu LLNA: BrdU-ELISA može se uspješno dokazati dobivanjem dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje 
deset neovisnih ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju 
(manje od jedne godine).
 
13. Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada do đe 
do proceduralne promjene metode LLNA: BrdU-ELISA (npr. zamjena stručnog osoblja, promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, 
promjena opreme, promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene 
moraju navesti u laboratorijskim izvješ ćima. Potrebno je uzeti u obzir 
učinak tih promjena na primjerenost prethodno uspostavljene povijesne 
baze podataka prilikom utvr đivanja potrebe za uspostavom nove baze povi ­
jesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
 
14. Istraživa či trebaju biti svjesni da odluka o provo đenju periodi čke umjesto 
paralelne studije pozitivne kontrole utje če na prikladnost i prihvatljivost 
negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju između svake periodi čke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodi ­ 
čkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se 
dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju 
između posljednje prihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije i 
neprihvatljive periodi čke pozitivne kontrolne studije. Kod odlu čivanja o 
uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provo đenju samo periodi čkih pozi­
tivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. Također je potrebno razmotriti mogu ćnost uporabe manjeg broja životinja u 
skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog 
stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka 
dokaže da se može koristiti manje miševa (17).
 
15. Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosa ču za koji je poznato da 
izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom 
nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (18). Ako se paralelna 
pozitivna kontrola ispituje u druga čijem nosa ču od ispitivane tvari, potrebno 
je uključiti posebnu kontrolu s nosa čem za paralelnu pozitivnu kontrolu.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 748
 
16. U slu čajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili 
raspona reakcija, referentne tvari mogu tako đer biti korisne za dokazivanje 
ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljede će 
značajke:
 
— strukturnu i funkcionalnu sli čnost s razredom ispitivane tvari,  
— poznata fizikalna/kemijska svojstva,  
— popratne podatke iz LLNA: BrdU-ELISA,  
— popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.  
ISPITNI POSTUPAK  
Broj životinja i visine doze  
17. Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje s najmanje tri 
koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina tretirana samo nosa čem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (para ­
lelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimaju ći u 
obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim 
skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim 
skupinama.
 
18. Odabir doze i nosa ča treba se temeljiti na preporukama navedenim u refe ­
rencama (2) i (19). Uzastopne doze se obi čno odabiru iz odgovaraju ćih 
serija koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popra ćen 
odgovaraju ćim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne 
koncentracije treba uzeti u obzir sve postoje će toksikološke podatke (o 
akutnoj toksi čnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske 
podatke o odnosnoj ispitivanoj tvari (i/ili strukturno povezanim tvarima), ako dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo izlaga ­
nje, ali istodobno izbjegla sustavna toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno 
nadraživanje kože (19) (20 i poglavlje B.4 iz ovog Priloga). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti po četno predprobiranje (vidjeti 
stavke 21.-24.).
 
19. Nosa č ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se 
odabrati na temelju pove ćanja topljivosti s ciljem postizanja što viših 
koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za 
primjenu ispitivane tvari. Kao nosa či preporučuju se aceton: maslinovo ulje 
(4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil sulfoksid (6), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klini čki rele­
vantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar 
prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosa ča 
budu ugra đene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se 
odmah, uklju čivanjem odgovaraju ćih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim 
Pluronic® L92). Zna či, nosače koji su u potpunosti vodeni treba 
izbjegavati.
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 749
 
20. Obrada limfnih čvorova pojedina čnih miševa omogu ćuje ocjenjivanje 
promjenljivosti me đu životinjama i statisti čku usporedbu razlika izme đu 
mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosa čem (vidjeti 
stavak 33.). Pored toga, ocjenjivanje mogu ćnosti smanjenja broja miševa 
u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedina čni 
podaci o životinjama (17). Odre đena regulatorna tijela zahtijevaju da se 
prikupe pojedina čni podaci o životinjama. Redovito prikupljanje pojedi ­
načnih podataka o životinjama osigurava prednosti za dobrobit životinja, 
tako što se izbjegava dvostruko ispitivanje koje bi bilo potrebno, ako bi 
regulatorna tijela kasnije razmatrala rezultate, izvorno prikupljene na jedan 
način (npr. preko grupnih podataka o životinjama), zajedno s drugim zahtje ­
vima (npr. pojedina čni podaci o životinjama).  
Predprobiranje  
21. Ako nisu dostupne informacije za odre đivanje najviše doze za ispitivanje 
(vidjeti stavak 18.) potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila odgovaraju ća visina doze za ispitivanje u LLNA: BrdU-ELISA. Svrha pred ­
probiranja je pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj 
studiji LLNA: BrdU-ELISA, ako nisu dostupne informacije o koncentraciji 
koja uzrokuje sustavnu toksi čnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno 
lokalno nadraživanje kože (vidjeti stavak 23.). Najve ća ispitana visina 
doze je 100 %-tna koncentracija ispitivane tvari za teku ćine ili najve ća 
moguća koncentracija za krute tvari ili suspenzije.
 
22. Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identi čni glavnoj studiji LLNA: 
BrdU-ELISA, s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i 
može se koristiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporu čuje se 
uporaba jedne ili dvije životinje po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakod ­
nevno prate s ciljem otkrivanja klini čkih znakova sustavne toksi čnosti ili 
lokalnog nadraživanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije 
ispitivanja i prije završetka (6. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju 
radi otkrivanja eritema i boduju prema tablici 1. (20 i poglavlje B.4 iz ovog Priloga). Debljina uha se mjeri posebnim mjernim instrumentom (npr. digi ­
talnim mikrometrom ili mjera čem debljine Peacock Dial) prvi dan (prije 
doze), tre ći dan (otprilike 48 sati nakon prve doze) i šesti dan. Pored 
toga, šesti dan se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probijanjem, što se izvodi nakon humanog usmr ćenja. Preko ­
mjerno lokalno nadraživanje kože se ozna čuje bodovima za eriteme ≥ 3 
i/ili povećanjem debljine uha za ≥ 25 % na bilo koji dan mjerenja (21) (22). 
Najviša odabrana doza za glavnu studiju LLNA: BrdU-ELISA je sljede ća 
niža doza iz serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksi čnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje 
kože.
 
Tablica 1.  
Bodovanje eritema  
Zapažanja  Bodovi  
Bez eritema  0  
Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)  1  
Dobro vidljiv eritem  2  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 750
 
Zapažanja  Bodovi  
Umjeren do jak eritem  3  
Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogu ćuje 
stupnjevanje eritema  4 
23. Pored 25 %-tnog pove ćanja debljine uha (21)(22), statisti čki značajno pove ­ 
ćanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne miševe se, 
također, koristi za odre đivanje nadražuju ćih tvari u LLNA (22) (23) (24) 
(25) (26) (27) (28). Me đutim, iako se statisti čki značajna pove ćanja debljine 
uha mogu javiti, ona se posebno ne povezuju s prekomjernim nadraživa ­
njem kada su manja od 25 % (25) (26) (27) (28) (29).  
24. Sljede ća klinička opažanja mogu ukazivati na sustavnu toksi čnost (30) kada 
se koriste u okviru cjelokupne ocjene te stoga mogu nazna čiti najvišu dozu 
za uporabu u glavnoj LLNA: BrdU-ELISA: promjene u djelovanju živ čanog 
sustava (npr. piloerekcija, ataksija, tremori i gr čevi); promjene u ponašanju 
(npr. agresivnost, promjene u njezi, zna čajna promjena u stupnju aktiv ­
nosti); promjene u disanju (npr. promjene u čestalosti i intenziteta disanja 
kao što su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve klini čke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenuta čni, 
ili gubitak težine > 5 % od prvog do šestog dana i smrtnost. Životinje koje 
su pred uginu ćem ili pokazuju znakove teške boli i patnje trebaju se 
humano usmrtiti (31).
 
Plan pokusa glavne studije  
25. Plan pokusa je sljede ći: 
— Prvi dan:  Pojedina čno identificirati životinje i zabilježiti masu svake 
životinje i sva klini čka opažanja. Primijeniti 25 μl odgovaraju će 
otopine ispitivane tvari, samog nosa ča ili pozitivne kontrole (paralelna 
ili nedavno provedena, ovisno o laboratorijskoj politici uzimaju ći u 
obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio svakog uha.  
— Drugi i tre ći dan:  Ponoviti postupak primjene proveden prvog dana.  
— Četvrti dan:  Bez tretiranja.  
— Peti dan:  Intraperitonealno ubrizgavanje 0,5 ml (5 mg/miš) otopine 
BrdU (10 mg/ml).  
— Šesti dan:  Zabilježiti masu svake životinje i sva klini čka opažanja. 
Otprilike 24 sata (24 h) nakon ubrizgavanja BrdU životinje humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz svakog uha i 
staviti odvojeno u pufer PBS za svaku životinju. Pojedinosti i sheme za 
identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se na ći u referenci (17). 
Za daljnje pra ćenje lokalne reakcije kože u glavnoj studiji mogu se u 
protokol studije uklju čiti dodatni parametri kao što su ocjenjivanje 
eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni ure đajem za mjerenje 
debljine ili odre đivanjem mase uzorka uha pri obdukciji).
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 751
 
Priprema suspenzije stanica  
26. Suspenzija pojedina čnih stanica limfnih čvorova (LNC) svakog miša, 
odstranjenih bilateralno, priprema se blagom mehani čkom dezagregacijom 
kroz žičanu mrežu od nehr đajućeg čelika s otvorima od 200 mikrona ili 
drugom prihvatljivom tehnikom za dobivanje suspenzije pojedina čne stanice 
(npr. uporabom plasti čnog tučka za jednokratnu uporabu za drobljenje 
limfnih čvorova, nakon čega slijedi filtriranje kroz najlonsku mrežu s otvo ­
rima od 70 mikrona). Postupak pripreme suspenzije LNC je kriti čan za ovu 
analizu te, stoga, svaki izvo đač mora prethodno ste ći tu vještinu. Limfni 
čvorovi životinja u negativnoj kontroli su mali te je, stoga, s njima važno 
pažljivo rukovati da ne do đe do umjetnog u činka na vrijednosti SI. U 
svakom slu čaju ciljani obujam suspenzije LNC treba se prilagoditi utvr ­ 
đenom optimiziranom obujmu (približno 15 ml). Optimizirani obujam 
temelji se na postizanju prosje čne apsorbance negativne kontrolne skupine 
u rasponu 0,1–0,2.  
Određivanje proliferacije stanica (mjerenje sadržaja BrdU u DNA limfocita)  
27. BrdU se mjeri testom ELISA koriste ći trgovački komplet (npr. Roche 
Applied Science, Mannheim, Njema čka, br. u katalogu 11 647 229 001). 
Ukratko u jažice mikroplo ča s ravnim dnom doda se 100 μL suspenzije 
LNC u tri primjerka. Nakon fiksacije i denaturacije LNC u svaku se jažicu 
dodaje anti-BrdU protutijelo i omogu ći reakcija. Potom se anti-BrdU protu ­
tijelo ukloni ispiranjem, doda se otopina supstrata i omogu ći nastanak 
kromogena. Potom se izmjeri apsorbanca pri 370 nm s referentnom 
valnom duljinom 492 nm. U svakom slu čaju ispitni uvjeti analize moraju 
biti optimizirani (vidjeti stavak 26.).  
OPAŽANJA  
Klinička opažanja  
28. Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve 
kliničke znakove bilo lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne 
toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe za svaku životinju. Programi 
praćenja uklju čuju kriterije za pravodobno identificiranje miševa koji poka ­
zuju znakove sustavne toksi čnosti, prekomjernog lokalnog nadraživanja 
kože ili korozije kože za eutanaziju (31).  
Tjelesne mase  
29. Kao što je navedeno u stavku 25., pojedina čne tjelesne mase treba mjeriti 
na početku testa i u vrijeme planiranog usmr ćivanja životinja.  
IZRAČUN REZULTATA  
30. Rezultati za svaku tretiranu skupinu su izraženi kao prosje čni indeks 
stimulacije (SI). SI se dobiva dijeljenjem prosje čnog indeksa ozna čivanja 
BrdU po životinji unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozi ­
tivne kontrolne skupine s prosje čnim indeksom ozna čivanja BrdU za 
kontrolnu skupinu otopine/nosa ča. Prosječan SI za kontrolne skupine treti ­
rane nosa čem tada iznosi 1.  
Indeks ozna čivanja BrdU se odre đuje kako slijedi:  
indeks ozna čivanja BrdU = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS blank  ref ) 
pri čemu: em = valna duljina emisije; i ref = referentna valna duljina.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 752
 
31. U postupku odlu čivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 1,6 (10). 
Međutim, kod odlu čivanja da se neki grani čni rezultat (tj. vrijednost SI 
između 1,6 i 1,9) proglasi pozitivnim može se tako đer koristiti snaga 
učinka na dozu, statisti čki značaj i dosljednost reakcija u otapalu/nosa ču i 
pozitivnoj kontroli (3 (6) (32).  
32. U slu čaju graničnog pozitivnog rezultata s vrijednoš ću SI izme đu 1,6 i 1,9, 
za potvrđivanje pozitivnog rezultata korisnici mogu, pored vrijednosti SI, 
uzeti u obzir i dodatne podatke kao što je odnos izme đu doze i reakcije, 
dokaz sustavne toksi čnosti ili prekomjerne nadraženosti i, prema potrebi, 
statistički značaj (10). Potrebno je tako đer uzeti u obzir razna svojstva 
ispitivane tvari, uklju čujući i to ima li strukturne veze s poznatim senzibi ­
lizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa opažene reakcije na dozu. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (4).
 
33. Prikupljanje podataka na razini pojedina čnog miša omogu ćit će statističku 
analizu prisutnosti i stupnja odnosa izme đu doze i u činka. Svaka statisti čka 
procjena može uklju čiti ocjenu odnosa izme đu doze i u činka te odgovara ­
jući prilagođene usporedbe ispitnih skupina (npr. skupina s doziranjem u 
parovima u odnosu na paralelne kontrolne skupine s otapalom/nosa čem). 
Statističke analize mogu uklju čiti linearnu regresiju ili Williamsov test za 
ocjenu trendova odnosa doza-u činak i Dunnettov test za usporedbe u paro ­
vima. Prilikom odabira prikladne metode statisti čke analize istraživa č treba 
biti svjestan eventualnih razlika izme đu varijanata kao i drugih problema s 
tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna transformacija podataka ili 
neparametarska statisti čka analiza. U svakom slu čaju istraživa č će možda 
morati izvršiti izra čune SI i statisti čke analize sa i bez sigurnih to čaka 
podataka (koji se ponekad nazivaju „netipi čne vrijednosti”).  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
34. Podatke treba sažeti u tabli čnom obliku koji pokazuje vrijednosti indeksa 
označivanja BrdU za pojedina čnu životinju, prosje čni indeks ozna čivanja 
BrdU po životinji za skupinu, s tim povezane pogreške (npr. SD, SEM) i prosječni SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu 
skupinu s otapalom/nosa čem.
 
Izvješće o ispitivanju  
35. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivane i kontrolne tvari:  
— identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako poznati, podrijetlo, 
čistoća, poznate ne čistoće, broj šarže),  
— fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabil ­
nost, topljivost),  
— ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.  
Otapalo/nosa č: 
— identifikacijski podaci ( čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijeb ­
ljeni volumen),  
— dokaz opravdanosti izbora nosa ča. ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 753
 
Ispitne životinje:  
— podrijetlo miševa CBA,  
— mikrobiološki status životinja, ako je poznat,  
— broj i starost životinja,  
— podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podrijetlo, broj šarže i podaci proizvo đača o osiguranju kakvo će/kontroli 
kakvoće za komplet ELISA (osjetljivost na protutijela i specifi čnost te 
granica opažanja),  
— pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,  
— dokaz opravdanosti odabira doze (uklju čujući rezultate predprobiranja, 
ako je provedeno),  
— koncentracije nosa ča i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna 
količina ispitivane tvari koja je primijenjena,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući vrstu/podrijetlo hrane, 
izvor vode),  
— pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,  
— metode mjerenja toksi čnosti,  
— kriteriji za odre đivanje studija pozitivnima ili negativnima,  
— pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje 
učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,  
Provjera pouzdanosti:  
— sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uklju čujući informa ­
cije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosa ču, 
— podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim 
negativnim kontrolama (s otapalom/nosa čem) za ispitni laboratorij,  
— ako nije uklju čena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko 
izvješće za posljednju periodi čku pozitivnu kontrolu i izvješ će u kojem 
se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se opravdava neprovo đenje paralelne pozitivne kontrole,
 
Rezultati:  
— pojedina čne mase miševa na po četku doziranja i u vrijeme planiranog 
usmrćenja, srednja i povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene 
pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,  
— vrijeme prve pojave i znakova toksi čnosti, uklju čujući eventualno nadra ­ 
živanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju,  
— tablica indeksa ozna čivanja BrdU za pojedina čne miševe i vrijednosti SI 
za svaku tretiranu skupinu,  
— srednja i povezana razlika izme đu stvarne i predvi đene pogreške (npr. 
SD, SEM) za indeks ozna čivanja BrdU/miš za svaku tretiranu skupinu i 
rezultati analize netipi čnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu,  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 754
 
— izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir 
promjenljivost izme đu životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim 
skupinama,  
— odnos doza – reakcija,  
— statisti čka analiza, ako je primjereno,  
Rasprava o rezultatima:  
— kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije, i prema potrebi, 
statističke analize, sa zaklju čkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati 
senzibilizatorom kože.  
REFERENCE  
1. OECD (2010.), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline 
No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
2. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, str. 999-1002.  
3. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, str. 985-997.  
4. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, str. 327-33.  
5. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, str. 49-59.
 
6. ICCVAM (1999.), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dostupno na: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
7. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), str. 258-273.  
8. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 34(3), str. 274-286.
 
9. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), str. 249-257.
 
10. ICCVAM (2010.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No 10-7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 755
 
11. ICCVAM (2009.), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
 
12. Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005.), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxi ­
col., 25, str. 129-134.
 
13. OECD (1992.), Skin Sensitisation, Test Guideline No 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
14. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, str. 1896-1904.
 
15. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), 
Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, str. 90-96.
 
16. ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
17. ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
18. McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, str. 71-89.  
19. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, str. 13- 
31. 
20. OECD (2002.), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
21. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and 
false positive substances. Toxicologist, 96, str. 235.  
22. ICCVAM (2009.), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
23. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in 
female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, str. 195-206.  
24. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, str. 83-94.
 
25. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, str. 245-256.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 756
 
26. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, str. 491-506.  
27. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter- laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 
212, str. 60-68.
 
28. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, str. 721-728.  
29. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007.), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
str. 1023-1028.  
30. ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm].
 
31. OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
32. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. 
(1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medica ­
ments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, str. 563-79.
 
33. OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Envi ­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 757
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Točnost:  stupanj podudarnosti izme đu rezultata ispitne metode i prihva ćenih 
referentnih vrijednosti. To je mjerilo u činkovitosti ispitne metode i jedan od 
aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto „podudarnosti” 
kako bi se ozna čio udio to čnih rezultata ispitne metode (33).  
Referentna tvar:  tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi 
kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati slje ­
deće svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sli č­
nost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske zna čajke; iv. 
popratni podaci o poznatim u čincima; i v. poznata u činkovitost u okviru željene 
reakcije.  
Lažno negativna tvar:  tvar koja je ispitnom metodom neto čno određena kao 
negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna (33).  
Lažno pozitivna tvar:  tvar koja je ispitivanjem neto čno određena kao pozitivna ili 
aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna (33).  
Opasnost:  potencijal štetnog u činka na zdravlje ili okoliš. Štetni u činak se javlja 
samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.  
Ponovljivost izme đu laboratorija:  mjera u kojoj razli čiti kvalificirani laboratoriji 
koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvan ­
titativno sli čne rezultate. Ponovljivost izme đu laboratorija odre đuje se prije i 
tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, tako đer navedena kao 
međulaboratorijska ponovljivost (33).
 
Ponovljivost u laboratoriju:  određivanje u kojoj mjeri stru čno osoblje u okviru 
istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koriste ći određeni protokol u 
različitim trenucima. Tako đer se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost 
(33).  
Netipična vrijednost:  netipična vrijednost je zapažanje koje zna čajno odstupa od 
ostalih vrijednosti u nasumi čnom uzorku populacije.  
Osiguranje kvalitete:  postupak upravljanja pri kojem pojedinci neovisni od osoba 
koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog ispiti ­
vanja, zahtjeve i postupke vo đenja evidencije te to čnost prijenosa podataka.  
Pouzdanost:  mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i izme đu 
laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izra čunava­
njem unutarlaboratorijske i me đulaboratorijske ponovljivosti (33).  
Preosjetljivost kože:  imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac 
lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja 
može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.  
Indeks stimulacije (SI):  izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosje ­
tljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosa čem.
 
Ispitivana tvar (navodi se tako đer kao i ispitivana kemikalija):  svaka tvar ili 
smjesa koja je ispitana ovom metodom.  ▼M3 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 758
 
B.52.  AKUTNA INHALACIJSKA TOKSI ČNOST - METODA AKUTNOG 
TOKSIČNOG RAZREDA  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 
436 (2009.). Prva smjernica o akutnoj inhalaciji TG 403 usvojena je 1981. i 
otada je revidirana (vidjeti Poglavlje B.2 ovog Priloga (1)). Za razvoj 
metode inhalacijskog akutnog toksi čnog razreda (ATC) (2) (3) (4) smatralo 
se prikladnim slijediti usvajanje revidirane oralne metode ATC (Poglavlje B.1 tris ovog Priloga) (5). Utvr đivanje restropektivnog djelovanja ispitne 
metode ATC za akutnu inhalacijsku toksi čnost pokazalo je da je metoda 
prikladna za primjenu u svrhu razvrstavanja i ozna čivanja (6). Ispitna 
metoda inhalacije ATC omogu ćit će primjenu serijskih koraka koncentracija 
ciljane mete za odre đivanje ranga toksi čnosti ispitivane kemikalije. Smrtnost 
se upotrebljava kao kona čni učinak, ali životinje u teškoj patnji ili stresu 
koje ugibaju ili kojima prijeti ugibanje treba humano usmrtiti kako bi se smanjila patnja. Smjernica o humanom usmr ćivanju dostupna je u 
OECD-ovoj Smjernici br. 19. (7).
 
2. Upute za provo đenje i tuma čenje ove ispitne metode mogu se prona ći u 
Smjernici br. 39. za ispitivanje akutne inhalacijske toksi čnosti (GD 39) (8).  
3. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se u 
Dodatku 1. i Smjernici 39. (8).  
4. Ispitna metoda pruža informacije o opasnim svojstvima i omogu ćuje rangi­
ranje i razvrstavanje ispitivane kemikalije u skladu s Uredbom (EZ) br. 1272/2008 za razvrstavanje kemikalija koje uzrokuju akutnu toksi čnost 
(9). U slu čaju da su potrebne po četne procjene vrijednosti LC
 50 ili analize 
reakcije na koncentraciju treba upotrijebiti Pglavlje B.2 ovog Priloga (1) kao 
odgovaraju ću ispitnu metodu. Ostale upute za odabir ispitne metode mogu 
se pronaći u GD 39 (8). Ova ispitna metoda nije specifi čno namijenjena za 
ispitivanje specijaliziranih materijala, poput slabo topljivih izometrijskih ili 
vlaknastih materijala ili proizvedenih nanomaterijala.  
UVODNA RAZMATRANJA  
5. Kako bi se na minimum svela uporaba životinja, prije razmatranja ispiti ­
vanja u skladu s ovom ispitnom metodom laboratorij koji provodi ispitivanje 
u obzir treba uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, uklju ­ 
čujući postojeće studije čiji bi podaci opravdali neprovo đenje dodatnih ispi ­
tivanja. Informacije koje mogu pomo ći u odabiru najprikladnijih vrsta, 
sojeva, spola, na čina izlaganja i prikladnih ispitnih koncentracije obuhva ćaju 
identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemi ­
kalije; rezultate bilo kakvih ispitivanja toksi čnosti  in vitro  ili in vivo ; očeki­
vanu(e) uporabu(e) i potencijal za izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o tvarima srodne strukture. Koncentracije za koje se 
očekuje da izazivaju tešku patnju i stres zbog nagrizaju ćeg (
 1 ) ili ozbiljno 
nadražuju ćeg djelovanja ne treba ispitivati ovom ispitnom metodom [vidjeti 
GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 759  
( 1 ) Vrednovanje nagrizanja može se temeljiti na stru čnoj procjeni uz primjenu dokaza kao 
što su: ljudsko i životinjsko iskustvo, postoje ći podaci (in vitro), npr. Poglavlje B.40 
(10), B.40 bis (11) ovog Priloga ili OECD-ove TG 435 (12), pH vrijednosti, informacije 
dobivene od sli čnih kemikalija ili bilo kakvih drugih primjerenih podataka.
 NAČELO ISPITIVANJA  
6. Načelo je ispitivanja da se na temelju postupka korak po korak prikuplja 
dovoljna koli čina informacija o akutnoj inhalacijskoj toksi čnosti ispitivane 
kemikalije tijekom razdoblja izlaganja od 4 sata kako bi se omogu ćilo 
njezino razvrstavanje. Ostala trajanja izlaganja mogu se primijeniti u speci ­
fične regulatorne svrhe. U svakom od definiranih koraka koncentracije ispi ­
tuju se po tri životinje svakog spola. Ovisno o boležljivosti i/ili stupnju ugibanja životinja mogu biti dovoljna dva koraka za omogu ćenje prosudbe 
o akutnoj toksi čnosti ispitivane kemikalije. Ako postoji dokaz da je jedan 
spol osjetljiviji od drugog, ispitivanje se može nastaviti samo s osjetljivijim spolom. Ishod prethodnog koraka odredit će sljedeći korak da bude kako 
slijedi:
 
(a) Nije potrebno daljnje ispitivanje,  
(b) Ispitivanje triju životinja svakog spola ili  
(c) Ispitivanje sa šest životinja osjetljivijeg spola, tj. procjena najniže 
granice razreda toksi čnosti treba se temeljiti na šest životinja po ispitnoj 
skupini i ispitnoj koncentracije neovisno o spolu.  
7. Životinje koje ugibaju ili životinje koje o čito pate ili pokazuju znakove 
ozbiljnog i trajnog stresa treba humano usmrtiti i u tuma čenju rezultata 
ispitivanja tretirati jednako kao i životinje uginule pri ispitivanju. Kriteriji 
za odlučivanje o usmr ćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate 
te upute o prepoznavanju predvidive ili prijete će smrti predmet su Smjernice 
za humano usmr ćivanje br. 19. OECD-a (7).  
OPIS METODE  
Odabir životinjske vrste  
8. Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle životinje sojeva koji se obi čno 
koriste u laboratorijima. Preferirane vrsta je štakor, a u slu čaju uporabe 
drugih vrsta treba dati obrazloženje.  
Priprema životinja  
9. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. 
Na dan izlaganja životinje moraju biti mlade odrasle jedinke izme đu 8 i 12 
tjedana starosti, srednje vrijednosti tjelesne mase u granicama od ± 20 % za 
svaki spol bilo koje prethodno izložene životinje jednake dobi. Životinje se odabiru nasumice i ozna čavaju radi pojedina čne identifikacije. Životinje se 
drže u kavezima najmanje pet dana prije po četka ispitivanja kako bi im se 
omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete. Životinje tako đer treba 
aklimatizirati na ispitnu aparaturu kratko vrijeme prije ispitivanja jer će se 
tako smanjiti stres izazvan uvo đenjem u novu okolinu.
 
Uzgoj životinja  
10. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 
22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u 
intervalu od 30 do 70 % iako to možda ne će biti mogu će ako se kao 
nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje op ćenito treba 
smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja 
po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju 
na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputa ­
vaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizi čki, 
toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke 
krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 760
 
minutnog volumena. Ako su dostupni generi čki podaci koji pokazuju da se 
takve promjene ne doga đaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna 
prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izlo ­ 
žene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedina čno kako bi se 
spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u 
istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laborato ­
rijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograni čenom 
zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati tame.
 
Komore za inhalaciju  
11. Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemi ­
kalije i cilj ispitivanja. Prednost se daje izlaganju samo nosom (koje uklju ­ 
čuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom op ćenito 
se daje prednost za ispitivanja teku ćih ili krutih aerosola te para koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješ ću 
o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slu čaju primjene 
komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije prema ­ 
šiti 5 % volumena komore. Na čela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim 
tijelom te njihove specifi čne prednosti i nedostaci opisani su u GD 39 (8).
 
UVJETI IZLAGANJA  
Primjene koncentracija  
12. Preporu čuje se fiksno trajanje izlaganja od četiri sata koje ne uklju čuje 
vrijeme uravnoteženja. Druga trajanja mogu biti potrebna radi ispunjavanja 
određenih zahtjeva, me đutim, u izvješ ću o studiji treba pružiti obrazloženje 
[vidjeti GD 39. (8)]. Životinje izložene u komorama za izlaganje čitavim 
tijelom treba smjestiti pojedina čno kako bi se sprije čila apsorpcija ispitivane 
kemikalije zbog njegovanja životinja u istom kavezu. Tijekom izlaganja 
treba obustaviti hranjenje. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja 
čitavim tijelom.  
13. Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili 
njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o 
fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentra ­
ciji i/ili fizikalnom obliku koji je obi čno prisutan tijekom manipulacije 
ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reak ­
tivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija.
 
Distribucija veli čine čestica  
14. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se 
mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogu ćilo izlaganje svih rele ­
vantnih podru čja respiratornog trakta, preporu čuje se aerosol srednjeg aero ­
dinamičkog promjera čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 4 μm s geome ­
trijskom standardnom devijacijom ( σ g ) u rasponu od 1,5 do 3,0 (8) (13) 
(14). Iako treba uložiti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se isti ne mogu posti ći, treba dati stru čno mišljenje. Primjerice, isparine metala 
mogu biti manje od tog standarda, a čestice, vlakna i higroskopni materijali 
pod nabojeme ( čija se veli čina povećava u vlažnom okolišu respiratornog 
trakta) mogu premašiti taj standard.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 761
 
Priprema ispitivane kemikalije u nosa ču 
15. Za stvaranje odgovaraju će koncentracije i veli čine čestica ispitivane kemi ­
kalije u atmosferi može se upotrijebiti nosa č. U pravilu se prednost daje 
vodi. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehani čkim procesima 
kako bi se postigla potrebna distribucija veli čine čestica, no treba paziti 
da se ispitivana kemikalija ne rastavi niti promijeni. U slu čajevima u 
kojima se smatra da su mehani čki procesi promijenili ispitivanu kemikaliju 
(npr. ekstremne temperature uslijed prekomjernog mljevenja zbog trenja) 
treba analiti čki provjeriti sastav ispitivane kemikalije. Treba primijeniti 
dovoljnu razinu opreza da se ne bi kontaminirala ispitivana kemikalija. Nije nužno ispitivati nedrobive granulirane materijale koji su namjerno 
oblikovani tako da se ne mogu inhalirati. Treba primijeniti test atricijom 
kako bi se dokazalo da se tijekom rukovanja granuliranim materijalom ne stvaraju čestice koje se mogu udahnuti. Ako se tijekom testa atricijom stvore 
tvari koje se mogu udahnuti, treba provesti test inhalacijske toksi čnosti.
 
Kontrolne životinje  
16. Nije potrebna paralelna negativna skupina (zrak). U slu čaju primjene drugog 
nosača osim vode pri stvaranju ispitne atmosfere kontrolna skupina nosa ča 
treba se primijeniti samo ako nisu dostupni podaci o povijesnoj inhalacijskoj 
toksičnosti. Ako ispitivanje toksi čnosti ispitivane kemikalije formulirane u 
nosaču ne pokaže nikakvu toksi čnost, znači da nosač nije toksi čan u ispitnoj 
koncentraciji te stoga nema potrebe za kontrolnim nosa čem. 
PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA  
Protok zraka u komori  
17. Protok zraka u komori treba pažljivo kontrolirati, neprestano pratiti te bilje ­ 
žiti najmanje jedanput svakog sata tijekom svakog izlaganja. Pra ćenje 
ispitne koncentracije (ili stabilnosti) u atmosferi sastavno je mjerenje svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih rele ­
vantnih parametara za stvaranje dinami čke atmosfere. Treba posebno obratiti 
pozornost na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom u slu čajevima gdje je protok zraka kroz sustav za izlaganje 
neadekvatan za pružanje dinami čkog protoka atmosfere ispitivane kemika ­
lije. Postoje propisane metodologije koje se mogu primijeniti kako bi se 
pokazalo da u odabranim uvjetima rada ne dolazi do ponovnog udisanja (8) (15). Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja 
da se takvi standardi ne mogu posti ći, treba mjeriti koncentraciju kisika i 
ugljikova dioksida.
 
Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori  
18. Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost 
zraka u zoni gdje životinje dišu, za izlaganja samo nosom i čitavim tijekom, 
treba pratiti i bilježiti najmanje tri puta tijekom izlaganja do četiri sata te 
jedanput svakog sata tijekom kra ćih izlaganja. Relativnu vlažnost zraka 
trebalo bi idealno održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti 
nemoguće (npr. u slu čaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo 
zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomo ću ispitne metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 762
 
Ispitivana kemikalija: nazivna koncentracija  
19. Kad god je to mogu će, treba izra čunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u 
komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena s ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz 
sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izla ­
ganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u u činkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može 
upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
 
Ispitivana kemikalija: stvarna koncentracija  
20. Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije u zoni udisanja 
životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može se dobiti speci ­
fičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, apsorpcijskim ili kemijskim 
reaktivnim metodama te analiti čkom karakterizacijom nakon toga) ili nespe ­
cifičnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. Primjena gravime ­
trijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom kompo ­
nentom u prahu ili aerosole teku ćina niskog stupnja hlapljivosti i treba je 
podržati odgovaraju ćom preliminarnom karakterizacijom specifi čnom za 
ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti i koncen ­
tracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni analiti čki 
podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi zrakom sli čan 
početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, potrebna je ponovna 
analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, pod utjecajem aerosola, 
koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom 
skupljene sve faze. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti ciljanu, nazivnu i 
stvarnu koncentraciju, ali samo se stvarne koncentracije koriste u statisti ­ 
čkim analizama za izra čun vrijednosti smrtonosne koncentracije.
 
21. Ako je mogu će, treba upotrijebiti jednu šaržu ispitivane kemikalije, a ispi ­
tivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova 
čistoća, homogenost i stabilnost. Prije po četka studije treba odrediti svojstva 
ispitivane kemikalije, uklju čujući njezinu čistoću i, ako je tehni čki izvedivo, 
identitet te koli čine identificiranih kontaminiraju ćih tvari i ne čistoća. To se 
može pokazati sljede ćim podacima, ali nije ograni čeno na njih: vrijeme 
zadržavanja i relativno vršno podru čje, molekulska masa iz spektroskopskog 
mjerenja ili kromatografske analize plina ili sli čnih procjena. Iako identitet 
ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za laboratorij 
može biti mudro barem u ograni čenim okvirima potvrditi naru čiteljevu 
karakterizaciju (npr. boju, fizikalnu narav itd.).  
22. Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je to mogu će i 
pratiti neprestano i/ili na mahove, ovisno o metodi analize. Ako se primje ­
njuje uzorkovanje na mahove, uzorke atmosfere u komori treba uzimati najmanje dvaput tijekom ispitivanja od četiri sata. Ako to nije izvedivo 
zbog ograni čenog protoka zraka ili niskih koncentracija, tijekom čitavog 
razdoblja izlaganja može se uzeti jedan uzorak. Ako se pojave ozna čene 
fluktuacije uzorak po uzorak, sljede će ispitne koncentracije moraju upotri ­
jebiti četiri uzorka po izlaganju. Pojedina čni uzorci koncentracije u komori 
ne smiju od srednje koncentracije u komori odstupati za više od ± 10 % za 
plinove i pare i ne za više od ± 20 % za teku ćine ili kruti aerosol. Treba 
izračunati i zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t
 95 ). 
Trajanje izlaganja proteže se kroz vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije, 
a to uzima u obzir vrijeme potrebno za postizanje t95. Smjernica za 
procjenu t  95 može se prona ći u GD 39. (8).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 763
 
23. Za vrlo složene smjese koje se sastoje od plinova/para i aerosole (npr. 
zapaljive atmosfere i ispitivane kemikalije izba čene iz namjenskih proizvo ­
da/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati druk čije u 
komori za inhalaciju tako da treba odabrati najmanje jedan indikator (ana ­
liziranu tvar), obi čno glavnu aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i 
aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analiti čkoj 
koncentraciji ukupne smjese, a ne samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se pronaći u GD 39 (8).
 
Ispitivana kemikalija: distribucija veli čine čestica  
24. Distribuciju veli čine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje dvaput 
tijekom svakog izlaganja od četiri sata uporabom kaskadnog impaktora ili 
alternativnog instrumenta, poput ure đaja za aerodinami čku analizu veli čine 
čestica. Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impak ­
torom ili alternativnim instrumentom ekvivalentni, u cijelom se istraživanju 
može upotrebljavati alternativni instrument. Drugi ure đaj, poput gravimetrij ­
skog filtra ili ure đaja za sudaranje/ure đaja za mjerenje mjehuri ća plina, treba 
upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila u čin­
kovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena 
analizom veli čine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije 
mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (8)]. Ako se ekvivalent ­
nost može dokazati u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja 
kako bi se na minimum sveli nepotpuni podaci koji mogu dovesti do 
potrebe za ponovnim izlaganjem. Odre đivanje veli čine čestica treba provesti 
za pare ako postoji ikakva mogu ćnost da bi kondenzacijom pare mogao 
nastati aerosol ili ako čestice detektirane u atmosferi pare imaju potencijal 
za miješane faze (vidjeti stavak 14.).
 
POSTUPAK  
Glavno ispitivanje  
25. Za svaki se korak upotrebljavaju tri životinje svakog spola ili šest životinja 
osjetljivijeg spola. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego 
druge vrste glodavaca, maksimalna trajanja izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifi čan za vrstu. Visina koncentracije koju 
treba primijeniti kao po četnu dozu odabrana je me đu četiri određene visine, 
a visina po četne koncentracije treba biti ona za koju je najvjerojatnije da će 
izazvati toksi čnost u nekima od doziranih životinja. Sheme ispitivanja za 
plinove, pare i aerosole (obuhva ćene dodacima 2. - 4.) predstavljaju ispiti ­
vanje s obustavljenim vrijednostima kategorija CLP 1 - 4 (9) za plinove 
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (Dodatak 2.), za pare (0,5, 2, 10, 
20 mg/l/4 h) (Dodatak 3.) te za aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (Dodatak 4.). Kategorija 5, koja nije implementirana u Uredbu (EZ) br. 1272/2008 (9) odnosi se na koncentracije više od odgovaraju ćih graničnih koncentracija. 
Za svaku po četnu koncentraciju primjenjuje se odgovaraju ća shema ispitiva ­
nja. Ovisno o broju humano usmr ćenih ili uginulih životinja, postupak 
ispitivanja slijedi nazna čene strelice sve dok se ne omogu ći kategorizacija.
 
26. Vremensko razdoblje izme đu izloženih skupina odre đuje se nastupom, traja ­
njem i ozbiljnoš ću znakova toksi čnosti. Izlaganje životinja sljede ćoj visini 
koncentracije treba odgoditi sve dok postoji opravdana mogu ćnost preživ ­
ljavanja prethodno ispitivanih životinja. Preporu čuje se razdoblje od tri ili 
četiri dana izme đu izlaganja na svakoj visini koncentracije kako bi se 
omogućilo opažanje odgo đene toksi čnosti. Vremenski interval može se 
prilagoditi po potrebi, npr. u slu čaju nepotpunih zaklju čaka. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 764
 
Granični test  
27. Grani čni test primjenjuje se kada se za ispitivanu kemikaliju zna ili o čekuje 
da je zapravo netoksi čna, npr. izvo đenjem toksi čne reakcije samo iznad 
reguliraju će granične koncentracije. Informacije o toksi čnosti ispitivane 
kemikalije mogu se dobiti iz znanja o sli čnim ispitivanim kemikalijama ili 
sličnim smjesama, uzimaju ći u obzir identitet i postotak poznatih kompo ­
nenti za koje se zna da su od toksikološke važnosti. U takvim situacijama, u kojima postoji malo informacija o njezinoj toksi čnosti ili ih uop će nema ili 
se za ispitivanu kemikaliju o čekuje da bude toksi čna, treba provesti glavno 
ispitivanje [ostale upute nalaze se u GD 39. (8)].
 
28. Uz primjenu uobi čajenog postupka tri životinje svakog spola ili šest živo ­
tinja osjetljivijeg spola izložene su koncentracijama od 20 000 ppm za plinove, 20 mg/l za pare i 5 mg/l za prašinu/maglu redom (ako se može postići), što služi kao grani čni test za ovu ispitnu metodu. Kada se ispituje 
aerosol, primarni cilj treba biti postizanje veli čine čestica koja se može 
udahnuti (MMAD 1 - 4 μm). To je s ve ćinom ispitivanih kemikalija 
moguće na koncentraciji od 2 mg/l. Ispitivanje aerosola na koncentraciji 
višoj od 2 mg/l treba pokušati samo ako se može posti ći veličina čestica 
koja se može udisati [vidjeti GD 39. (8)]. Dodatno ispitivanje grani čne 
koncentracije destimulira se radi dobrobiti životinja u skladu s GHS (16). Ispitivanje u kategoriji 5 GHS (16), koje nije implementirano u Uredbi (EZ) br. 1272/2008 (9), treba uzeti u obzir samo ako postoji velika vjerojatno da 
će rezultati takvog ispitivanja biti izravno relevantni za zaštitu ljudskog 
zdravlja te u izvješ ću o studiji treba pružiti obrazloženje. U slu čaju poten ­
cijalno eksplozivnih ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o tome da se 
izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla nepotrebna 
primjena životinja, prije grani čnog testa treba provesti ispitivanje bez živo ­
tinja kako bi se osiguralo da se u komori mogu posti ći uvjeti za grani čni 
test.
 
OPAŽANJA  
29. Životinje treba često klini čki promatrati tijekom razdoblja izlaganja. Nakon 
izlaganje klini čka promatranja treba obavljati najmanje dvaput na dan izla ­
ganja ili češće ako to zahtijeva reakcija životinja na tretman te najmanje 
jedanput dnevno u sljede ćih 14 dana. Duljina razdoblja promatranja nije 
fiksno odre đena, ali treba je odrediti u skladu s prirodom i vremenom 
nastupanja klini čkih znakova i duljinom razdoblja oporavka. Važni su 
trenuci u kojima se pojavljuju i nestaju znakovi toksi čnosti, posebno ako 
postoji tendencija ka kašnjenju znakova toksi čnosti. Sva se opažanja 
sustavno bilježe u pojedina čnoj evidenciji za svaku životinju. Životinje u 
stanju ugibanja te životinje koje pokazuju znakove jake patnje i/ili trajne znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti radi njihove dobrobiti. Pri provođenju ispitivanja radi otkrivanja klini čkih znakova toksi čnosti treba 
paziti na to da se po četno slabo pojavljivanje i prolazne promjene u 
disanju koje su rezultat postupka izlaganja ne zamijene u čincima povezanim 
s tretmanom. U obzir treba uzeti na čela i kriterije rezimirane u Smjernici o 
humanom usmr ćivanju (GD 19.) (7). Ako se životinje usmrte zbog humanih 
razloga ili ih se prona đe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je 
moguće preciznije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 765
 
30. Promatranja u kavezu moraju uklju čivati promjene na koži i krznu, o čima i 
sluznicama te dišnom, cirkulacijskom, autonomnom i središnjem živ čanom 
sustavu te somatomotori čkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Ako je 
moguće, treba zamijetiti razliku izme đu lokalnih i sistemskih u činaka. 
Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, 
letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti 
dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom.
 
Tjelesna masa  
31. Pojedina čnu masu životinja treba zabilježiti jedanput tijekom razdoblja akli ­
matizacije, na dan izlaganja prije samog izlaganja (0. dan), barem 1., 3. i 7. 
dana (i jedanput tjedno nakon toga) te u trenutku ugibanja ili usmr ćenja ako 
nastupe iza 1. dana. Tjelesna masa prepoznaje se kao kriti čni pokazatelj 
toksičnosti pa treba pobliže pratiti životinje u kojih je primije ćen neprekidan 
pad od ≥ 20 % u usporedbi s vrijednostima prije istraživanja. Životinje koje 
prežive važu se i humano usmr ćuju na kraju razdoblja nakon izlaganja.  
Patologija  
32. Sve pokusne životinje, uklju čujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule 
ili usmrćene i uklonjene iz istraživanja radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti 
makroskopskoj obdukciji. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkri ća uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na 
dovoljno niskim temperaturama kako bi se na minimum svela razgradnja. 
Obdukciju treba provesti što je mogu će prije, obi čno u roku od jednog ili 
dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
 
33. Dodatne pretrage,  a priori  obuhvaćene planom ispitivanja, mogu se 
razmotriti radi proširenja interpretacijske vrijednosti istraživanja poput mjerenja mase plu ća preživjelih štakora i/ili pružanja dokaza iritacije 
pomoću mikroskopske pretrage respiratornog trakta. Ispitani organi 
također mogu obuhva ćati organe koji pružaju dokaze o makroskopskoj 
patologiji u životinja koje su preživjele 24 sata ili dulje te organa za koje se zna ili o čekuje da su pogo đeni. Mikroskopska pretraga cijelog respira ­
tornog trakta može pružiti korisne informacije za ispitivane kemikalije koje 
reagiraju s vodom, poput kiselina i higroskopskih ispitivanih kemikalija.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
34. Treba pribaviti pojedina čne podatke o tjelesnoj masi i nalazima obdukcije za 
svaku životinju. Podatke prikupljene klini čkim promatranjem treba sažeti u 
obliku tablice, koja za svaku ispitnu skupinu pokazuje broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje pokazuju specifi čne znakove toksi čnosti, broj 
životinja koje su tijekom ispitivanja prona đene uginule ili su usmr ćene iz 
humanih razloga, vrijeme uginu ća svake životinje, opis i vremenski tijek te 
reverzibilnost toksi čnih učinaka i nalaze obdukcije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 766
 
Izvješće o ispitivanju  
35. Izvješ će o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljede će 
informacije:  
Pokusne životinje i njihov uzgoj  
— opis uvjeta u kavezu, uklju čujući: broj (ili promjenu broja) životinja u 
svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane,
 
— korištenu vrstu/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora,  
— broj, dob i spol životinja,  
— metodu nasumi čnog odabira,  
— detalje o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući i vrstu/podrijetlo prehrane, 
izvor vode),  
— opis kondicioniranja prije ispitivanja, uklju čujući i prehranu, karantenu i 
liječenje bolesti,  
Ispitivana kemikalija  
— Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva 
(uključujući izomerizaciju),  
— Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract 
Services (CAS), ako je poznat,  
Nosač 
— Obrazloženje za uporabu nosa ča i obrazloženje za odabir nosa ča (ako 
nije voda),  
— Povijesni ili odgovaraju ći podaci koji pokazuju da nosa č ne ometa rezul ­
tate istraživanja,  
Komora za inhalaciju  
— Opis komore za inhalaciju, uklju čujući i dimenzije i volumen,  
— Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje 
atmosfere,  
— Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veli čine čestica te stvarne 
koncentracije,  
— Izvor zraka i obrada dovoda/odvoda zraka i sustav korišten za 
kondicioniranje,  
— Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene 
atmosfere za ispitivanje,  
— Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna),  
— Otvori za izlaganje po komori (samo nos), lokacija životinja u sustavu 
(čitavo tijelo),  
— Privremena homogenost/stabilnost atmosfere za ispitivanje,  
— Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmos ­
fere u komori,  
— Brzine protoka zraka, otvor za brzinu protoka zraka po izlaganju (samo 
nos) ili dovod životinja po komori ( čitavo tijelo),  
— Informacije o opremi upotrijebljenoj za mjerenje kisika i ugljikova 
dioksida, ako je primjenjivo,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 767
 
— Vrijeme potrebno za postizanje uravnoteženja u komori za inhalaciju 
(t 95 ), 
— Broj promjena u volumenu po satu,  
— Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo),  
Podaci o izlaganju  
— Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnom istraživanju,  
— Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u 
komori za inhalaciju podijeljena s volumenom zraka koji je prošao kroz 
komoru),  
— Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za 
ispitne smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, 
aerosol) svaka se može analizirati odvojeno,  
— Sve koncentracije zraka moraju se prikazati u jedinicama za masu (npr. 
mg/l, mg/m  3 itd.); jedinice za volumen (npr. ppm, ppb itd.) tako đer se 
mogu prikazati usput,  
— Distribucija veli čine čestica, srednji aerodinami čki promjer 
čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija ( σ g ) uključujući 
metode za njihov izra čun. Treba prijaviti pojedina čne analize veli čine 
čestica,  
Uvjeti ispitivanja  
— Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uklju čujući i detalje o svim 
postupcima korištenima za smanjenje veli čine čestica krutih materijala 
ili za pripremu otopina ispitivane kemikalije. U slu čajevima u kojima su 
mehanički postupci mogli izmijeniti sastav ispitivane kemikalije uklju čiti 
rezultat analiza za utvr đivanje sastava ispitivane tvari,  
— Opis (po mogu ćnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje atmos ­
fere za ispitivanje te izlaganje životinja atmosferi za ispitivanje,  
— Detalji korištene kemijske analiti čke metode i potvrda metode (uklju ču­
jući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorko ­
vanje),  
— Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija,  
Rezultati  
— Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori,  
— Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori,  
— Tablični prikaz podataka o veli čini čestica, uklju čujući i podatke o 
skupljenim analiti čkim uzorcima, distribuciju veli čina čestica te izra čune 
MMAD i σ g , 
— Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku živo ­
tinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksi čnosti uklju čujući 
smrtnost, prirodu, ozbiljnost i trajanje u činaka),  
— Individualne tjelesne mase životinja prikupljene tijekom istraživanja; 
datum i vrijeme uginu ća ako je nastupilo prije programiranog usmr ćenja; 
vremenski tijek nastupanja znakova toksi čnosti te jesu li bili reverzibilni 
za svaku životinju,  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 768
 
— Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su 
dostupni,  
— Razvrstavanje u kategorije CLP i obustavljena vrijednost LC  50 , 
Rasprava i tuma čenje rezultata  
— Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje 
kriterija ove ispitne metode, npr. grani čnu koncentraciju ili veli činu 
čestica,  
— Treba se pozabaviti sposobnoš ću udisanja čestica u svjetlu op ćih nalaza, 
posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veli činu čestica,  
— U opću ocjenu istraživanja treba uklju čiti dosljednost metoda korištenih 
za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne 
koncentracije prema nazivnoj,  
— Treba se pozabaviti vjerojatnim uzrokom smrti i prevladavaju ćim 
načinom djelovanja (sistemski u odnosu na lokalni).  
— U slu čaju humanog usmr ćivanja životinja koje su patile ili pokazivale 
znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju 
kriterija iz Smjernice za humano usmr ćivanje OECD-a (7).  
LITERATURA  
1. Poglavlje B.2 ovog Priloga, Akutna toksi čnost (inhalacijska).  
2. Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. Toxi ­
col. 77: 243-254.  
3. Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
4. Diener W, Kayser D and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: 
Alternatives to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
5. Poglavlje B.1 tris ovog Priloga, Akutna oralna toksi čnost - metoda utvr ­ 
đivanja akutnog toksi čnog razreda.  
6. OECD (2009.). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 105, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/test ­
guidelines]
 
7. OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Dostupno na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]
 
8. OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines]  
9. Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vije ća od 16. prosinca 
2008. za razvrstavanju, ozna čivanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se 
izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju direktive 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te 
izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., 
str. 1.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 769
 
10. Poglavlje B.40 ovog Priloga, Nagrizanje kože  in vitro : test transkutanog 
električnog otpora (TER).  
11. Poglavlje B.40 bis ovog Priloga, Nagrizanje kože  in vitro : test na modelu 
ljudske kože.  
12. OECD (2005.). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.
 
15. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167  
16. UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Dostupno: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welco ­
me_e.html]  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 770
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJA  
Ispitivana kemikalija:  Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 771
 
Dodatak 2.  
Postupak koji treba slijediti za svaku po četnu koncentraciju za plinove 
(ppm/4 h)  
Opće napomene (  1 ) 
Za svaku po četnu koncentraciju odgovaraju će sheme ispitivanja, kao što je obuh ­
vaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.  
Dodatak 2.a: Po četna koncentracija iznosi 100 ppm  
Dodatak 2.b: Po četna koncentracija iznosi 500 ppm  
Dodatak 2.c: Po četna koncentracija iznosi 2 500 ppm  
Dodatak 2.d: Po četna koncentracija iznosi 20 000 ppm  
Ovisno o broju humano usmr ćenih ili uginulih životinja postupak ispitivanja 
slijedi nazna čene strelice.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 772  
( 1 ) Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno uskla đeni sustav za razvrstavanje i ozna či­
vanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slu čaju akutne inha ­
lacijske toksi čnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
 Dodatak 2.a  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 100 ppm/4 h za 
plinove
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 773
 
Dodatak 2.b  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 500 ppm/4 h za 
plinove
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 774
 
Dodatak 2.c  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 2 500 ppm/4 h za 
plinove
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 775
 
Dodatak 2.d  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 20 000 ppm/4 h za plinove
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 776
 
Dodatak 3.  
Postupak koji treba slijediti za svaku po četnu koncentraciju za pare (mg/l/4 h)  
Opće napomene (  1 ) 
Za svaku po četnu koncentraciju odgovaraju će sheme ispitivanja, kao što je obuh ­
vaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.  
Dodatak 3.a: Po četna koncentracija iznosi 0,5 mg/l  
Dodatak 3.b: Po četna koncentracija iznosi 2,0 mg/l  
Dodatak 3.c: Po četna koncentracija iznosi 10 mg/l  
Dodatak 3.d: Po četna koncentracija iznosi 20 mg/l  
Ovisno o broju humano usmr ćenih ili uginulih životinja, postupak ispitivanja 
slijedi nazna čene strelice.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 777  
( 1 ) Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno uskla đeni sustav za razvrstavanje i ozna či­
vanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slu čaju akutne inha ­
lacijske toksi čnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
 Dodatak 3.a  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 0,5 mg/L/4h za pare
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 778
 
Dodatak 3.b  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 2 mg/L/4 h za pare
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 779
 
Dodatak 3.c  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 10 mg/L/4 h za pare
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 780
 
Dodatak 3.d  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 20 mg/L/4 h za pare
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 781
 
Dodatak 4.  
Postupak koji treba slijediti za svaku po četnu koncentraciju za aerosole 
(mg/l/4 h)  
Opće napomene (  1 ) 
Za svaku po četnu koncentraciju odgovaraju će sheme ispitivanja, kao što je obuh ­
vaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.  
Dodatak 4.a: Po četna koncentracija iznosi 0,05 mg/l  
Dodatak 4.b: Po četna koncentracija iznosi 0,5 mg/l  
Dodatak 4.c: Po četna koncentracija iznosi 1 mg/l  
Dodatak 4.d: Po četna koncentracija iznosi 5 mg/l  
Ovisno o broju humano usmr ćenih ili uginulih životinja, postupak ispitivanja 
slijedi nazna čene strelice.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 782  
( 1 ) Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno uskla đeni sustav za razvrstavanje i ozna či­
vanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slu čaju akutne inha ­
lacijske toksi čnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
 Dodatak 4.a  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 0,05 mg/L/4 h za 
pare
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 783
 
Dodatak 4.b  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 0,5 mg/L/4 h za 
aerosole
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 784
 
Dodatak 4.c  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 1 mg/L/4 h za 
aerosole
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 785
 
Dodatak 4.d  
Akutna inhalacijska toksi čnost 
Postupak ispitivanja s po četnom koncentracijom od 5 mg/L/4 h za 
aerosole .
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 786
 
B.53.  STUDIJA RAZVOJNE NEUROTOKSI ČNOSTI  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 426 
(2007). U lipnju 1995. radna skupina OECD-a za reproduktivnu i razvojnu toksičnost raspravljala je u Kopenhagenu o potrebi za ažuriranjem postoje ćih 
smjernica OECD-a za ispitivanje reproduktivne i razvojne toksi čnosti te 
razvojem novih smjernica za krajnje to čke koje još nisu obuhva ćene (1). 
Radna skupina preporu čila je da se smjernica za ispitivanje razvojne neuro ­
toksičnosti sastavi na temelju smjernice Agencije za zaštitu okoliša 
SAD-a (USEPA) koja je od tada revidirana (2). U lipnju 1996. u Kopen ­
hagenu je održano drugo savjetovanje na kojem je tajništvo obaviješteno o nacrtu nove smjernice za ispitivanje razvojne neurotoksi čnosti, uklju čujući 
glavne elemente poput, primjerice, pojedinosti o odabiru životinjskih vrsta, 
razdoblja doziranja, razdoblja ispitivanja, krajnjih to čaka koje treba procije ­
niti i kriterija za vrednovanje rezultata. Ameri čka smjernica za procjenu 
rizika od neurotoksi čnosti objavljena je 1998. (3). U listopadu 2000. 
održani su, jedno za drugim, stru čno savjetovanje OECD-a i radionica Insti ­
tuta za znanost o riziku Me đunarodnog instituta za znanost o životu (ILSI), 
a 2005. u Tokiju je održano stru čno savjetovanje. Ti su sastanci održani 
kako bi se raspravljalo o znanstvenim i tehni čkim pitanjima povezanima s 
postojećom smjernicom za ispitivanje te su kod razvoja ove ispitne metode 
razmotrene preporuke s tih sastanaka (4) (5) (6) (7). Dodatne informacije o 
provedbi, tuma čenju i terminologiji upotrijebljenoj za ovu ispitnu metodu 
nalaze se u Smjernicama OECD-a br. 43„Ispitivanje i procjena reproduk ­
tivne toksi čnosti” (8) i br. 20„Ispitivanje neurotoksi čnosti” (9).
 
UVODNA RAZMATRANJA  
2. Poznato je da brojne kemikalije imaju u činke razvojne neurotoksi čnosti u 
ljudi i drugih vrsta (10) (11) (12) (13). Za procjenu i vrednovanje toksi čnih 
svojstava odre đene kemikalije može biti potrebno utvr đivanje potencijala 
razvojne neurotoksi čnosti. Studije razvojne neurotoksi čnosti namijenjene 
su osiguravanju podataka, uklju čujući karakterizacije doza-reakcija, o 
mogućim funkcionalnim i morfološkim u čincima na živ čani sustav poto ­
maka u razvoju koji mogu nastati zbog izloženosti u maternici i u ranoj 
fazi života.  
3. Studija razvojne neurotoksi čnosti može se provesti kao zasebna studija, kao 
dio studije reproduktivne toksi čnosti i/ili neurotoksi čnosti u odrasloj dobi 
(primjerice, ispitne metode B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16)) ili kao 
dodatak studiji prenatalne razvojne toksi čnosti (primjerice, ispitna metoda 
B.31. (17)). Ako je studija razvojne neurotoksi čnosti dio druge studije ili 
njezin dodatak, klju čno je očuvati cjelovitost obiju vrsta studija. Sva bi 
ispitivanja trebala biti u skladu s primjenjivim zakonodavstvom ili državnim 
i institucionalnim smjernicama za upotrebu laboratorijskih životinja u istra ­ 
živanju (primjerice, 18).  
4. Prije po četka studije ispitni laboratorij trebao bi razmotriti sve dostupne 
informacije o ispitivanoj kemikaliji. Takve će informacije uklju čivati iden ­
titet i kemijsku strukturu kemikalije, njezina fizikalno-kemijska svojstva, 
rezultate svih ostalih ispitivanja toksi čnosti kemikalije in vitro ili in vivo, 
toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama te planiranu upotrebu (planirane upotrebe) kemikalije. Te su informacije nužne kako bi 
se svim zainteresiranim stranama dokazalo da je ispitivanje bitno za zaštitu 
zdravlja ljudi te će pomoći u odabiru odgovaraju će početne doze.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 787
 
NAČELO ISPITNE METODE  
5. Ispitivana kemikalija daje se životinjama tijekom gestacije i laktacije. Ženke 
se ispituju radi procjene u činaka u ženki koje su skotne i koje doje te radi 
mogućih usporednih informacija (ženke u usporedbi s potomcima). Potomci 
se nasumi čno biraju iz legala radi vrednovanja neurotoksi čnosti. Vredno ­
vanje se sastoji od opažanja radi otkrivanja velikih neuroloških abnormal ­
nosti i abnormalnosti u ponašanju, uklju čujući procjenu fizi čkog razvoja, 
bihevioralnu ontogenezu, motori čku aktivnost, motori čke i osjetilne funkcije 
te učenje i pam ćenje te vrednovanja težine mozga i neuropatologije tijekom 
postnatalnog razvoja i u odrasloj dobi.  
6. Ako se ispitna metoda provodi kao zasebna studija, dodatne dostupne živo ­
tinje u svakoj skupini mogle bi se upotrebljavati za posebne neurobihevio ­
ralne, neuropatološke, neurokemijske ili elektrofiziološke postupke kojima 
se mogu dopuniti podaci dobiveni pregledima koji se preporu čuju ovom 
ispitnom metodom (16) (19) (20) (21). Dopunski postupci mogu biti osobito korisni kada empirijsko opažanje, o čekivani u činci ili mehanizam/ 
način funkcioniranja ukazuju na posebnu vrstu neurotoksi čnosti. Ti 
dopunski postupci mogu se upotrebljavati u ženki i u mladunaca. Osim 
toga, mogu se upotrebljavati i postupci ex vivo ili in vitro sve dok ne utječu na cjelovitost postupaka in vivo.
 
PRIPREME ZA ISPITIVANJE  
Odabir životinjskih vrsta  
7. Štakor je poželjna ispitna vrsta. Ostale se vrste mogu upotrebljavati prema 
potrebi. Me đutim, treba uzeti u obzir da su gestacijski i postnatalni dani 
navedeni u ovoj ispitnoj metodi specifi čni za često upotrebljavane sojeve 
štakora te bi u slu čaju upotrebe drugih vrsta ili neuobi čajenog soja trebalo 
odabrati usporedive dane. Upotrebu druge vrste trebalo bi obrazložiti na 
temelju toksikoloških, farmakokineti čkih i/ili ostalih podataka. U obrazlo ­ 
ženju bi trebalo navesti dostupnost postnatalnih neurobihevioralnih i neuro ­
patoloških procjena specifi čnih za vrstu. Ako postoji prethodno ispitivanje 
koje je izazvalo zabrinutost, trebalo bi razmotriti vrstu/soj koji su izazvali 
zabrinutost. Zbog razli čitih atributa u činka razli čitih sojeva štakora trebali bi 
postojati dokazi da soj koji je odabran za upotrebu ima odgovaraju ću plod­
nost i reakciju. Trebalo bi dokumentirati pouzdanost i osjetljivost ostalih vrsta kod utvr đivanja razvojne neurotoksi čnosti.
 
Uvjeti smještaja i hranjenja  
8. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 ± 3 °C. 
Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. 
Svjetlost bi trebala biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati 
tame. Prije parenja i tijekom trajanja studije mogu će je i obrnuti ciklus 
svjetlosti kako bi se procijenile funkcionalne i bihevioralne krajnje to čke 
tijekom razdoblja tame (pod crvenim svjetlom), odnosno tijekom razdoblja 
uobičajene aktivnosti životinja (22). Sve promjene ciklusa svjetlo-tama 
trebale bi uklju čivati odgovaraju će razdoblje prilagodbe kako bi se životinje 
prilagodile na novi ciklus. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencio ­
nalna laboratorijska hrana s neograni čenom koli činom vode za pi će. Trebalo 
bi navesti vrstu hrane i vode te bi ih trebalo analizirati s obzirom na 
kontaminate.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 788
 
9. Životinje se mogu smjestiti odvojeno ili držati u kavezima u malim skupi ­
nama istog spola. Postupci parenja trebali bi se odvijati u kavezima koji 
odgovaraju toj svrsi. Nakon što je o čito da je došlo do kopulacije ili 
najkasnije na 15. dan graviditeta životinje koje su se parile treba smjestiti u posebne kaveze za okot ili materinstvo. Kaveze treba urediti tako da se 
eventualni u činci držanja u kavezu svedu na minimum. Pred termin partu ­
ricije skotnim ženkama treba osigurati odgovaraju ći i utvrđeni materijal za 
pravljenje gnijezda. Poznato je da neodgovaraju će rukovanje ili stres tijekom 
graviditeta može imati nepovoljne ishode, uklju čujući prenatalni gubitak i 
izmijenjeni fetalni i postnatalni razvoj. Radi zaštite od fetalnoga gubitka 
zbog faktora nevezanih uz tretiranje, tijekom graviditeta životinjama treba pažljivo rukovati te treba izbjegavati stres izazvan vanjskim faktorima kao što je prekomjerna buka.
 
Priprema životinja  
10. Treba upotrebljavati zdrave životinje koje su se prilagodile laboratorijskim 
uvjetima i koje ranije nisu bile podvrgavane eksperimentalnim postupcima, 
osim ako je studija dio druge studije (vidjeti stavak 3.). Ispitne životinje 
treba okarakterizirati u pogledu vrste, soja, spola, mase i starosti. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i ozna čiti je njime. 
Životinje u svim ispitnim skupinama trebale bi u najve ćoj mogućoj mjeri 
biti ujedna čene mase i starosti te unutar uobi čajenog raspona vrste i soja koji 
se ispituju. Za svaku visinu doze treba upotrebljavati mlade odrasle ženke koje još nisu imale potomstvo. Potrebno je osigurati izbjegavanje parenja između braće i sestara. Nulti dan gestacije dan je kad se opazi vaginalni čep 
i/ili sperma. Nakon nabave ve ć gravidnih životinja od dobavlja ča treba 
predvidjeti odgovaraju će razdoblje prilagodbe (primjerice 2 do 3 dana). 
Parene ženke treba nasumi čno i u najve ćoj mogućoj mjeri ravnomjerno 
rasporediti u kontrole skupine i skupine za tretiranje (npr., preporu čuje se 
stratificirani nasumi čni postupak kako bi se osigurao ravnomjeran raspored u 
svim skupinama poput postupka na temelju tjelesne mase). Ženke koje je oplodio isti mužjak treba ujedna čeno rasporediti po skupinama.
 
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
11. Svaka ispitna i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj skotnih 
ženki koje treba izložiti ispitivanoj kemikaliji kako bi se osiguralo da se okoti odgovaraju ći broj potomaka za vrednovanje neurotoksi čnosti. Za 
svaku visinu doze preporu čuje se ukupno 20 legala. Dopušteni su ponovljeni 
i postupni planovi doziranja skupinama ako se postigne ukupan broj legala po skupini te ako se u obrazloženju ponavljanja upotrebljavaju odgovaraju ći 
statistički modeli.
 
12. Na 4. postnatalni dan (PND) ili prije njega (dan okota je nulti postnatalni 
dan) veli čina svakog legla trebala bi se prilagoditi uklanjanjem dodatnih 
mladunaca slu čajnim odabirom kako bi se postigla ista veli čina svih 
legala (23). Veli čina legla ne bi trebala premašivati prosje čnu veličinu 
legla za upotrijebljeni soj glodavaca (8–12). Leglo bi po mogu ćnosti, 
trebalo imati jednak broj muških i ženskih mladunaca. Selektivno uklanjanje 
mladunaca, primjerice prema tjelesnoj masi, nije prihvatljivo. Nakon stan ­
dardizacije legala (izdvajanje) i prije daljnjeg ispitivanja funkcionalnih kraj ­
njih točaka pojedina čne mladunce koji su odre đeni za ispitivanje prije ili 
nakon odbijanja od sise trebalo bi jedinstveno identificirati s pomo ću neke 
odgovaraju će humane metode identifikacije mladunaca (primjerice 24).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 789
 
Raspodjela životinja za funkcionalna i bihevioralna ispitivanja, vredno ­
vanje težine mozga i neuropatološko vrednovanje  
13. Ispitnom metodom omogu ćeni su razli čiti pristupi u pogledu raspodjele 
životinja izloženih in utero i laktacijom za funkcionalna i bihevioralna ispi ­
tivanja, spolno sazrijevanje, utvr đivanje težine mozga i neuropatološko vred ­
novanje (25). Ostala ispitivanja neurobihevioralne funkcije (npr. društveno ponašanje), neurokemije ili neuropatologije mogu se dodavati u pojedi ­
načnim slučajevima sve dok nije narušena cjelovitost izvornih nužnih 
ispitivanja.
 
14. Mladunci se biraju iz svake skupine koja je primila odre đenu dozu te se 
raspoređuju za procjene krajnjih to čaka na 4. postnatalni dan ili nakon 
njega. Mladunce po mogu ćnosti, treba birati tako da su oba spola iz 
svakog legla u svakoj skupini koja prima odre đenu dozu jednako zastupljena 
u svim ispitivanjima. Kod ispitivanja motori čke aktivnosti isti par muških i 
ženskih mladunaca treba ispitivati u svim dobima prije odbijanja od sise 
(vidjeti stavak 35.). Pri svim ostalim ispitivanjima isti ili zasebni parovi 
muških i ženskih životinja mogu se rasporediti za razli čita bihevioralna 
ispitivanja. Razli čite mladunce će možda trebati rasporediti za ispitivanja 
kognitivne funkcije u životinja koje se odbijaju od sise i odraslih životinja 
kako bi se izbjeglo miješanje u činaka dobi i ranijeg treninga na te vrijed ­
nosti (26) (27). Nakon odbijanja od sise (21. postnatalni dan) mladunci koji nisu odabrani za ispitivanje mogu se humano usmrtiti. Treba zabilježiti sve promjene u raspodjeli mladunaca. Statisti čka mjerna jedinica trebala bi biti 
leglo (ili ženka), a ne mladunac.
 
15. Postoje razli čiti načini raspodjele mladunaca za preglede prije i nakon odbi ­
janja od sise, kognitivna ispitivanja, patološke preglede itd. (vidjeti sliku 1. za opći plan i Dodatak 1. za primjere raspodjele). Preporu čen je minimalan 
broj životinja u svakoj skupini koja prima odre đenu dozu za preglede prije i 
nakon odbijanja od sise kako slijedi: 
Klinička opažanja i tjelesna masa
 Sve životinje  
Detaljna klini čka opažanja  20/spol (1/spol/leglo)  
Težina mozga (nakon fiksacije) 11–22. 
PND  10/spol (1/leglo)  
Težina mozga (nefiksiranog) ~ 70. PDN  10/spol (1/leglo)  
Neuropatologija (uranjanje ili perfuzijska 
fiksacija) 11–22. PND  10/spol (1/leglo)  
Neuropatologija (perfuzijska fiksacija) 70. 
PND  10/spol (1/leglo)  
Spolno sazrijevanje  20/spol (1/spol/leglo)  
Ostale razvojne posebnosti (opcija)  Sve životinje  
Bihevioralna ontogeneza  20/spol (1/spol/leglo)  
Motorička aktivnost  20/spol (1/spol/leglo)  
Motorička i osjetilna funkcija  20/spol (1/spol/leglo)  
Učenje i pam ćenje 10/spol (  a ) (1/leglo)  
( a ) Trebalo bi razmotriti ispitivanje znatno ve ćeg broja životinja ovisno o osjetljivosti 
ispitivanja kognitivne funkcije, npr. do 1 mužjaka i 1 ženke po leglu (za raspo ­
djelu životinja vidjeti Dodatak 1.) (daljnje smjernice o veli čini uzorka navedene su 
u Smjernici OECD-a 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 790
 
Doziranje  
16. Upotrebljavaju se najmanje tri visine doze i paralelna kontrola. Doze 
različitih visina treba primijeniti u odre đenim vremenskim razmacima 
kako bi se dobila gradacija toksi čkog učinka. Osim u slu čaju ograni čenja 
zbog fizikalno-kemijske prirode ili bioloških svojstava kemikalije, treba 
odabrati najvišu dozu s ciljem izazivanja odre đene toksi čnosti u majke 
(npr. klini čkih znakova, smanjenja porasta tjelesne mase (najviše 10 %) 
i/ili dokaza o toksi čnosti na ciljnom organu zbog koje se mora ograni čiti 
doza). Visoka doza može se ograni čiti na 1 000 mg/kg/dan tjelesne mase, uz 
neke iznimke. Primjerice, o čekivana izloženost ljudi može ukazati na 
potrebu za primjenom više doze. U suprotnom, trebalo bi provesti 
pokusne studije ili preliminarne studije za odre đivanje raspona kako bi se 
utvrdila najviša doza koju treba upotrebljavati koja bi trebala izazvati mini ­
malni stupanj toksi čnosti u majke. Ako je standardnom studijom razvojne 
toksičnosti ili pokusnom studijom dokazano da je ispitivana kemikalija 
razvojno toksi čna, najviša bi doza trebala biti maksimalna doza kojom se 
neće izazvati prekomjerna toksi čnost u potomaka, smrt in utero ili neona ­
talna smrt ili malformacije, dostatna za isklju čivanje smislenog vrednovanja 
neurotoksi čnosti. Najnižom dozom trebalo bi nastojati ne proizvesti nikakav 
dokaz toksi čnosti niti za majku niti za plod u razvoju, uklju čujući neuroto­
ksičnost. Kako bi se predo čile sve reakcije povezane s dozom i doza kod 
koje nije zamije ćen štetni u činak (NOAEL), treba odabrati niz sve nižih 
doza ili doze blizu granice detekcije kojima bi se omogu ćilo utvrđivanje 
referentne doze. Za utvr đivanje sve nižih razina doza često je najbolje doze 
primijeniti u dva do četiri kraća intervala te je često bolje dodati četvrtu 
skupinu koja prima odre đenu dozu nego izme đu dva doziranja imati jako 
dugi interval (npr. gdje je faktor ve ći od 10).  
17. Visine doza treba birati uzimaju ći u obzir sve postoje će podatke o toksi čno­
sti, kao i dodatne informacije o metabolizmu i toksikinetici ispitivane kemi ­
kalije ili srodnih materijala. Te informacije isto tako mogu biti korisne kod 
dokazivanja primjerenosti režima doziranja. Izravno doziranje mladuncima treba razmotriti na temelju informacija o izloženosti i farmakokineti čkih 
informacija (28) (29). Prije provo đenja studija o izravnom doziranju treba 
pažljivo razmotriti koristi i nedostatke (30).
 
18. Usporedna kontrolna skupina treba biti placebo kontrolna skupina ili 
kontrolna skupina tretirana samo nosa čem ako se kod primjene ispitivane 
kemikalije upotrebljava nosa č. Svim životinjama treba obi čno dati isti 
volumen ispitivane kemikalije ili nosa ča na temelju tjelesne mase. Ako se 
radi lakšeg doziranja upotrebljava nosa č ili drugi aditiv, treba uzeti u obzir 
sljedeće karakteristike: u činke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili 
zadržavanje ispitivane kemikalije, u činke na kemijska svojstva ispitivane 
kemikalije koji mogu izmijeniti njezine toksi čne karakteristike te u činke 
na potrošnju hrane i vode ili nutritivno stanje životinja. Nosa č ne bi smio 
dovesti do u činaka koji bi mogli ometati tuma čenje studije i ne bi smio biti 
neurobihevioralno toksi čan te imati u činke na reprodukciju ili razvoj. Pri 
novim nosa čima, osim skupine tretirane nosa čem, treba uklju čiti i kontrolnu 
skupinu tretiranu placebom. Sa životinjama u kontrolnim skupinama treba 
postupati na jednak na čin kao sa životinjama u ispitnoj skupini.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 791
 
Primjena doza  
19. Ispitivana kemikalija ili nosa č trebali bi se primijeniti na na čin koji je 
najsličniji mogu ćoj izloženosti ljudi te na temelju dostupnih informacija o 
metabolizmu i distribuciji pri ispitnim životinjama. Treba op ćenito upotreb ­
ljavati oralni put primjene (npr. sondom, u hrani ili vodi za pi će), ali se 
mogu primijeniti i drugi na čini primjene (npr. dermalno, inhalacijom) ovisno 
o karakteristikama i o čekivanim ili poznatim na činima izloženosti ljudi 
(daljnje smjernice nalaze se u Smjernici 43 (8)). Treba obrazložiti odabrani 
način primjene. Ispitivanu kemikaliju treba primjenjivati svakog dana po 
prilici u isto vrijeme.  
20. Doza koja se daje svakoj životinji u pravilu uobi čajeno bi se trebala temeljiti 
na najnovijem odre đivanju pojedina čne tjelesne mase. Me đutim, pri prila ­
gođavanju doza tijekom posljednjeg tromjese čja graviditeta potreban je 
oprez. Ako se pri tretiranim ženkama opazi previsoka toksi čnost, te životinje 
treba humano usmrtiti.  
21. Ispitivana kemikalija ili nosa č trebali bi se davati barem jednom dnevno 
parenim ženkama od trenutka implantacije (6. dan gestacije) i tijekom lakta ­
cije (21. PND) tako da mladunci budu izloženi ispitivanoj kemikaliji tijekom prenatalnog i postnatalnog neurološkog razvoja. Dob u kojoj po činje dozi­
ranje te trajanje i u čestalost doziranja mogu se prilagoditi ako postoje dokazi 
o planu pokusa koji je relevantniji za izloženost ljudi. Trajanja doziranja trebalo bi prilagoditi za ostale vrste kako bi se osigurala izloženost tijekom svih ranih razdoblja razvoja mozga (odnosno ekvivalentnih prenatalnom i 
ranom postnatalnom rastu ljudskog mozga). Doziranje može zapo četi od 
početka graviditeta (nulti gestacijski dan), iako treba razmotriti potencijal 
ispitivane kemikalije da uzrokuje predimplantacijski gubitak. Po četkom 
primjene na šesti gestacijski dan taj bi se rizik izbjegao, ali se ne bi tretirale 
razvojne faze izme đu nultog i šestoga gestacijskog dana. Ako laboratorij 
kupi već parene životinje, neprakti čno je zapo četi doziranje na nulti gesta ­
cijski dan te bi stoga šesti gestacijski dan bio dobar po četni dan. Ispitni bi 
laboratorij trebao odrediti režim doziranja u skladu s relevantnim informa ­
cijama o u čincima ispitivane kemikalije, ranijim iskustvima i logisti čkim 
aspektima, što može uklju čivati produljenje doziranja nakon odbijanja od 
sise. Doziranje se ne bi trebalo obaviti na dan parturicije u onih životinja u kojih okot potomaka nije dovršen. Op ćenito, pretpostavlja se da će do 
izloženosti mladunaca do ći majčinim mlijekom. Me đutim, izravno doziranje 
mladuncima trebalo bi razmotriti u slu čajevima nepostojanja dokaza o 
stalnoj izloženosti potomaka. Dokazi o stalnoj izloženosti mogu se na ći, 
primjerice, u farmakokineti čkim informacijama, toksi čnosti u potomaka ili 
promjenama u biomarkerima (28).
 
OPAŽANJA  
Opažanja u ženki  
22. Opažanja s obzirom na zdravstveno stanje, uklju čujući pobolijevanje i 
smrtnost, trebala bi se provoditi na svim ženkama najmanje jednom dnevno.  
23. Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi periodi čno provoditi detalj ­
nija klinička opažanja (najmanje dvaput tijekom gestacijskog razdoblja dozi ­
ranja i dvaput tijekom laktacijskog razdoblja doziranja) upotrebom najmanje 
deset ženski po visini doze. Životinje bi izvan kaveza u kojem ina če borave 
trebali promatrati obu čeni tehni čari koji nemaju informacija o tretmanu 
životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažili stres u životinja i pristranost promatra ča te maksimizirala njihova pouzdanost. 
Savjetuje se da, po mogu ćnosti, isti tehni čar provodi opažanja u predmetnoj 
studiji.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 792
 
24. Treba bilježiti pojavu opaženih znakova. Kad god je to mogu će, treba 
zabilježiti i ja činu opaženih znakova. Klini čkim opažanjima treba obuhvatiti, 
ali ne ih ograni čiti na, promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, na 
pojavu iscjedaka i autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija, piloerekcija, veli ­ 
čina zjenica, nepravilnosti u disanju i/ili disanje na usta i svi neuobi čajeni 
znaci uriniranja ili defekacije).  
25. Isto tako treba zabilježiti i sve neuobi čajene reakcije s obzirom na položaj 
tijela, razinu aktivnosti (npr. pove ćana ili smanjena upotreba standardnog 
prostora) i koordinaciju pokreta. Treba zabilježiti i promjene u hodu (npr. 
šepanje, ataksija), držanju (primjerice, zgrbljenost) i reakciju na manipula ­
ciju, postavljanje ili druge podražaje okoline kao i pojavu kloni čnih ili 
toničnih pokreta, konvulzija ili tremora, stereotipnog ponašanja (npr. preko ­
mjerno njegovanje dlake, neobi čni pokreti glave, stalno kretanje u krug) ili 
čudnog ponašanja (npr. griženje ili pretjerano lizanje, samoranjavanje, 
hodanje unatrag, vokalizacija) ili agresiju.  
26. Treba zabilježiti znakove toksi čnosti, uklju čujući početni dan, doba dana, 
stupanj i trajanje.  
27. Životinje bi trebalo izvagati u trenutku doziranja najmanje jednom tjedno 
tijekom studije, na dan okota ili oko njega te na 21. PND (odbijanje od 
sise). Pri studijama u kojima se primjenjuje hranjenje na sondu ženke bi trebalo vagati najmanje dvaput tjedno. Doze bi, prema potrebi, trebalo 
prilagoditi u trenutku svakog utvr đivanja tjelesne mase. Unos hrane 
trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno tijekom gestacije i laktacije. Unos vode trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno ako do izloženosti dolazi opskrbom vodom.
 
Opažanja u potomaka  
28. Svi bi se potomci trebalo pažljivo promatrati najmanje jednom dnevno radi 
znakova toksi čnosti te pobolijevanja i smrtnosti.  
29. Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi provoditi detaljnija klini čka 
opažanja potomaka. Potomke (najmanje jedan mladunac po spolu i po leglu) 
bi trebali promatrati obu čeni tehničari koji nemaju informacija o tretmanu 
životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažila pristra ­
nost te maksimizirala pouzdanost promatra ča. Savjetuje se da, po mogu ćno­
sti, isti tehni čar provodi opažanja. Po potrebi bi trebalo pratiti barem krajnje 
točke opisane u stavcima 24. i 25. za razvojnu fazu koja se promatra.  
30. Treba zabilježiti sve znakove toksi čnosti u potomaka, uklju čujući početni 
dan, doba dana, stupanj i trajanje.  
Fizičke i razvojne posebnosti  
31. Promjene u razvojnim posebnostima prije odbijanja od sise (npr. odvajanje 
uške, otvaranje o čiju, izbijanje sjekuti ća) blisko su povezane s tjelesnom 
masom (30) (31). Tjelesna masa može biti najbolji pokazatelj fizi čkog 
razvoja. Zato se mjerenje razvojnih posebnosti preporu čuje samo kad 
postoje raniji dokazi da će te krajnje to čke pružiti dodatne informacije. 
Trenutak za procjenu tih parametara navodi se u tablici 1. Ovisno o o čeki­
vanim učincima i rezultatima po četnih mjerenja, može se savjetovati doda ­
vanje dodatnih vremenskih to čaka ili obavljanje mjerenja u drugim 
razvojnim fazama.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 793
 
32. Pri procjeni fizi čkog razvoja savjetuje se upotreba postkoitalne dobi umjesto 
postnatalne dobi (33). Ako se mladunci ispituju na dan odbijanja od sise, 
preporučuje se da se ispitivanje obavi prije odbijanja od sise kako bi se 
izbjegao zbunjuju ći učinak stresa povezanog s odbijanjem od sise. Osim 
toga, dva dana nakon odbijanja od sise ne bi trebalo obavljati nikakva 
ispitivanja mladunaca nakon odbijanja od sise.  
Tablica 1.  
Trenutak procjene fizi čkih i razvojnih posebnosti te funkcionalnih/bihevioralnih krajnjih 
točaka ( a ) 
Dob 
Krajnje to čke Prije odbijanja od sise (  b ) Adolescencija (  b ) Mlada odrasla dob (  b ) 
Fizičke i razvojne posebnosti  
Tjelesna masa i 
klinička opažanja  jednom tjedno (  c ) najmanje svaka dva 
tjedna  najmanje svaka dva 
tjedna  
Težina mozga  22. PND (  d ) na završetku  
Neuropatologija  22. PND (  d ) na završetku  
Spolno sazrijevanje  —  prema potrebi  —  
Ostale razvojne 
posebnosti (  f ) prema potrebi  —  —  
Funkcionalne/bihevioralne krajnje to čke 
Bihevioralna ontoge ­
neza Najmanje dvije 
vrijednosti  
Motorička aktivnost 
(uključujući habitua ­
ciju) 1–3 puta (  f ) —  jednom  
Motorička i osjetilna 
funkcija  — jednom  jednom  
Učenje i pam ćenje —  jednom  jednom  
( a ) U ovoj je tablici naveden najmanji broj trenutaka u kojima bi trebalo obaviti mjerenje. Ovisno o 
očekivanim u čincima i rezultatima po četnih mjerenja može biti preporu čljivo dodavanje dodatnih 
vremenskih to čaka (npr. ostarjele životinje) ili obavljanje mjerenja u drugim razvojnim fazama. 
( b ) Preporu čuje se da se mladunci ne ispituju tijekom dva dana od odbijanja od sise (vidjeti stavak 32.). 
Preporučena je dob za ispitivanje tijekom adolescencije: u čenje i pam ćenje = 25. PND ± 2; motori čka i 
osjetilna funkcija = 25. PND ± 2. Preporu čena je dob za ispitivanje mladih odraslih životinja 60. do 70. 
PND. 
( c ) Tjelesna masa trebala bi se mjeriti najmanje dvaput tjedno kod izravnog doziranja mladuncima radi 
prilagodbe doza u vrijeme brzog porasta tjelesne mase. 
( d ) Težina mozga i neuropatologija mogu se prema potrebi procijeniti ranije (npr. 11. PND) (vidjeti stavak 
39.). 
( e ) Ostale razvojne posebnosti osim tjelesne mase (npr. otvaranje o čiju) trebale bi se bilježiti prema potrebi 
(vidjeti stavak 31.). 
( f ) Vidjeti stavak 35.  
33. Trebalo bi utvrditi broj i spol živih mladunaca, npr. vizualnim pregledom ili 
mjerenjem anogenitalnog razmaka (34) (35), a svaki bi se mladunac iz legla 
trebao pojedina čno izvagati pri okotu i ubrzo nakon njega, najmanje jednom 
tjedno tijekom laktacije te najmanje jednom svaka dva tjedna nakon toga. Kod vrednovanja spolnog sazrijevanja za najmanje jednog mužjaka i 
najmanje jednu ženku po leglu trebalo bi utvrditi dob i tjelesnu masu živo ­
tinje kad do đe do vaginalne prohodnosti (36) ili razdvajanja prepucija (37).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 794
 
Bihevioralna ontogeneza  
34. Ontogeneza odabranih ponašanja trebala bi se mjeriti u najmanje jednog 
mladunca po spolu i po leglu tijekom odgovaraju će dobi, pri čemu se isti 
mladunci upotrebljavaju svih dana ispitivanja za sva ponašanja koja se 
procjenjuju. Dani u kojima se obavljaju mjerenja trebali bi biti ravnomjerno 
raspoređeni tijekom tog razdoblja kako bi se utvrdilo uobi čajeno ponašanje 
ili promjena povezana s tretmanom u ontogenezi tog ponašanja (38). U nastavku su navedeni neki primjeri ponašanja čija se ontogeneza mogla 
procijeniti: refleks uspravljanja, negativna geotaksija i motori čka aktivnost 
(38)(39)(40).
 
Motorička aktivnost  
35. Motori čku aktivnost treba pratiti (41) (42) (43) (44) (45) tijekom razdoblja 
prije odbijanja od sise i odrasle dobi. Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od 
sise vidjeti stavak 32. Ispitivanje bi trebalo trajati dovoljno dugo da se pokaže navikavanje tijekom ispitivanja kod netretiranih kontrolnih skupina. Osobito se preporu čuje upotreba motori čke aktivnosti za procjenu bihevio ­
ralne ontogeneze. Ako se ono upotrebljava kao ispitivanje bihevioralne 
ontogeneze, tada bi se za ispitivanje trebale upotrebljavati iste životinje kod svih ispitivanja prije odbijanja od sise. Ispitivanje bi trebalo provoditi dovoljno često kako bi se procijenila ontogeneza habituacije tijekom ispiti ­
vanja (44). To može zna čiti tri vremenska razdoblja ili više njih prije dana 
odbijanja od sise, uklju čujući i taj dan (npr. 13., 17., 21. PND). Ispitivanje 
istih životinja ili članova legla trebalo bi se obaviti i u odrasloj dobi blizu 
završetka studije (npr. 60. do 70. PND). Ispitivanje u dodatnim danima 
može se obaviti prema potrebi. Motori čka aktivnost trebala bi se pratiti 
automatskim aparatom za bilježenje aktivnosti kojim se može utvrditi pove ­ 
ćanje i smanjenje aktivnosti (odnosno osnovna aktivnosti koju ure đaj mjeri 
ne bi smjela biti toliko niska da to sprije či utvrđivanje smanjenja niti toliko 
visoka da to sprije či utvrđivanje pove ćanja aktivnosti). Svaki bi se ure đaj 
trebao ispitati standardnim postupcima kako bi se u najve ćoj mogućoj mjeri 
osigurala pouzdanost rada svih ure đaja i u sve dane. Tretirane skupine bi u 
najvećoj mogućoj mjeri trebalo rasporediti na sve ure đaje. Svaka bi se 
životinja trebala ispitivati pojedina čno. Tretirane skupine trebale bi biti 
raspoređene na sva vremena ispitivanja kako bi se izbjeglo zbunjivanje 
zbog cirkadijurnih ritmova aktivnosti. Trebalo bi nastojati da varijacije ispitnih uvjeta budu minimalne te da nisu sustavno povezane s tretiranjem. 
Među varijablama koje mogu utjecati na brojne vrijednosti ponašanja, uklju ­ 
čujući motoričku aktivnost, nalaze se razina buke, veli čina i oblik ispitnog 
kaveza, temperatura, relativna vlažnost, svjetlosni uvjeti, mirisi, upotreba kaveza u kojem životinje ina če borave ili novog ispitnog kaveza te distrak ­
cije iz okoline.
 
Motorička i osjetilna funkcija  
36. Motori čka i osjetilna funkcija trebala bi se detaljno ispitivati najmanje 
jednom u adolescentnoj dobi te jednom tijekom razdoblja rane odrasle dobi (npr. 60. do 70. PND). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise 
vidjeti stavak 32. Treba provesti dovoljno ispitivanja kako bi se osiguralo 
odgovaraju će količinsko uzorkovanje osjetilnih modaliteta (npr. somatosen ­
zorni, vestibularni) i motori čkih funkcija (npr. snaga, koordinacija). Neki su 
primjeri ispitivanja motori čke i osjetilne funkcije refleks pružanja ekstenzora 
(46), refleks uspravljanja (47) (48), habituacija na iznenadnu buku (40) (49) 
(50) (51) (52) (53) (54) i evocirani potencijali (55).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 795
 
Ispitivanja u čenja i pam ćenja 
37. Trebalo bi provesti ispitivanje asocijativnog u čenja i pam ćenja nakon odbi ­
janja od sise (npr. 25. dan ± 2) i u mladih odraslih životinja (60. PND i starijih). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Ista ili 
zasebna ispitivanja mogu se upotrijebiti u ovim dvjema fazama razvoja. 
Dopušta se odre đena fleksibilnost kod odabira ispitivanja u čenja i pam ćenja 
u štakora koji se odbijaju od sise i odraslih štakora. Me đutim, ispitivanja bi 
trebala biti oblikovana tako da se ispune dva kriterija. Kao prvo, u čenje bi 
se trebalo procjenjivati kao promjena me đu nekoliko ponovljenih postupaka 
učenja ili prilikom ispitivanja koja uklju čuju jedan postupak u čenja s upu ći­
vanjem na uvjet kojim se kontroliraju neasocijativni u činci iskustva u čenja. 
Kao drugo, ispitivanja bi trebala uklju čivati neku vrstu mjerne vrijednosti 
pamćenja (kratkoro čnog ili dugoro čnog) osim izvornog u čenja (stjecanja), 
ali se ona ne može navesti zbog izostanka mjerne vrijednosti stjecanja dobivene istim ispitivanjem. Ako se ispitivanjima u čenja i pam ćenja 
otkrije učinak ispitivane kemikalije, mogu se razmotriti dodatna ispitivanja 
kako bi se isklju čila alternativna tuma čenja na temelju promjena u osjetil ­
nim, motivacijskim i/ili motori čkim sposobnostima. Uz gornja dva kriterija, 
preporučuje se odabir ispitivanja u čenja i pam ćenja na temelju njegove 
dokazane osjetljivosti na klasu opasnosti kemikalije koja se ispituje, ako 
su takve informacije dostupne u literaturi. U izostanku takvih informacija primjeri ispitivanja koja bi mogla ispuniti gornje kriterije uklju čuju pasivno 
izbjegavanje (43) (56) (57), zakašnjeli dolazak na položaj u odraslih štakora 
(58) i u mladih štakora (59), olfaktorno kondicioniranje (43) (60), Morrisov 
vodeni labirint (61) (62) (63), labirint vrste Biel ili Cincinnati (64) (65), labirint s radijalnim kracima (66), labirint u obliku slova T (43) te stjecanje i zadržavanje ponašanja kontroliranog rasporedom (26) (67) (68). Dodatna 
ispitivanja opisana su u literaturi za štakore koji se odbijaju od sise (26) 
(27) i odrasle štakore (19) (20).
 
Pregled post-mortem  
38. Majke se može eutanazirati nakon odbijanja potomaka od sise.  
39. Neuropatološko vrednovanje potomaka obavit će se s pomo ću tkiva živo ­
tinja koje su humano usmr ćene 22. postnatalnog dana ili ranije u razdoblju 
između 11. i 22. postnatalnog dana, kao i nakon završetka studije. U poto ­
maka usmr ćenih do 22. postnatalnog dana trebalo bi vrednovati moždana 
tkiva, a u životinja usmr ćenih po završetku studije tkiva središnjeg i peri ­
fernog živ čanog sustava. Životinje usmr ćene na 22. PND ili ranije mogu se 
fiksirati uranjanjem ili perfuzijom. Životinje usmr ćene nakon završetka 
studije trebale bi se fiksirati perfuzijom. Svi aspekti pripreme uzoraka 
tkiva, od perfuzije životinja, preko disekcije uzoraka tkiva, obrada tkiva te 
bojenje preparata trebali bi se obaviti prema uravnoteženom planu tako da svaka serija uklju čuje reprezentativne uzorke svake skupine koja je primala 
određenu dozu. Dodatne smjernice o neuropatologiji nalaze se u OECD-ovoj 
Smjernici br. 20 (9), vidjeti i (103).
 
Obrada uzoraka tkiva  
40. Treba zabilježiti sve velike abnormalnosti vidljive u trenutku nekropsije. 
Uzeti uzorci tkiva trebali bi predstavljati sve glavne regije živ čanog sustava. 
Uzorci tkiva trebali bi se čuvati u odgovaraju ćem fiksativu i obraditi prema 
standardiziranim objavljenim histološkim protokolima (69) (70) (71) (103). 
Uklapanje u parafin prihvatljivo je za tkiva središnjeg i perifernog živ čanog ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 796
 
sustava, ali upotreba osmija nakon fiksacije, uz uklapanje u epoksi-smolu, 
može biti primjerena ako je potreban viši stupanj rezolucije (npr. za peri ­
ferne živce kad se sumnja na perifernu neuropatiju i/ili za morfometrijsku analizu perifernih živaca). Moždano tkivo prikupljeno za morfometrijsku analizu trebalo bi uklopiti u odgovaraju ći medij na svim visinama doze u 
isto vrijeme kako bi se izbjegli artefakti skupljanja koji mogu biti povezani s 
produljenim stajanjem u fiksativu (6).
 
Neuropatološki pregled  
41. Svrha kvalitativnih pregleda je:  
i. utvrditi regije živ čanog sustava pri kojima su uo čljivi dokazi neuropa ­
toloških promjena;  
ii. utvrditi vrste neuropatoloških promjena koje su posljedica izloženosti 
ispitivanoj kemikaliji;  
iii. utvrditi raspon težine neuropatoloških promjena.  
Odgovaraju će osposobljeni patolog trebao bi mikroskopski pregledati repre ­
zentativne histološke sekcije uzoraka tkiva radi dokazivanja neuropatoloških 
promjena. Svim neuropatološkim promjenama treba dodijeliti subjektivnu 
ocjenu kojom se opisuje njihova težina. Bojenje hematoksilinom i eozinom može biti dostatno za vrednovanje sekcija mozga životinja koje su humano usmr ćene 22. postnatalnog dana ili ranije. Me đutim, bojenje 
mijelina (npr. luxol fast plavom/cresyl ljubi častom) i bojenje srebrom 
(npr. Bielschowskyjevom ili Bodianovom bojom) preporu čuju se kod 
sekcija tkiva središnjeg i perifernog živ čanog sustava životinja usmr ćenih 
nakon završetka studije. U skladu sa stru čnom prosudbom patologa i vrstom 
uočenih promjena druge se boje mogu smatrati primjerenima za identifika ­
ciju i karakterizaciju odre đenih vrsta promjena (npr. glijalni fibrilarni kiseli 
protein (GFAP) ili histokemija lektina za procjenu glijalnih i mikroglijalnih promjena (72), fluoro-žad za utvr đivanje nekroze (73) (74) ili srebrno 
bojenje specifi čno za neuralnu degeneraciju (75)).
 
42. Morfometri čko (količinsko) vrednovanje trebalo bi se obaviti jer ti podaci 
mogu biti korisni kod utvr đivanja učinka koji je povezan s tretiranjem te 
tumačenja razlika povezanih s tretiranjem u težini ili morfologiji mozga (76) 
(77). Uzorci tkiva živ čanog sustava trebaju se uzeti i pripremiti kako bi se 
omogućilo morfometri čko vrednovanje. Morfometri čka vrednovanja mogu 
uključivati npr. linearna ili prostorna mjerenja odre đenih regija mozga (78). 
Za linearna ili prostorna mjerenja potrebna je upotreba homolognih sekcija koje su pažljivo odabrane na temelju pouzdanih mikroskopskih posebnosti (6). Stereologija se može upotrebljavati za identifikaciju u činaka povezanih s 
tretiranjem na parametre poput volumena ili broja stanica za specifi čne 
neuroanatomske regije (79) (80) (81) (82) (83) (84).
 
43. Mozgove treba pregledati radi dokazivanja svih neuropatoloških promjena 
povezanih s tretiranjem te treba uzeti odgovaraju će uzorke iz svih glavnih 
regija mozga (npr. iz olfaktornog bulbusa, cerebralnog korteksa, hipokam ­
pusa, bazalnih ganglija, talamusa, hipotalamusa, srednjeg mozga (krova, tegmentuma i moždanih krakova), mosta, produžene moždine, malog 
mozga) kako bi se osigurao temeljit pregled. Važno je da se sekcije u 
svih životinja uzimaju u istoj ravnini. U odraslih životinja koje su humano usmr ćene nakon završetka studije trebalo bi uzeti uzorak reprezen ­
tativnih sekcija le đne moždine i perifernog živ čanog sustava. Pregledana 
područja trebala bi uklju čivati oko s vidnim živcem i mrežnicu, le đnu 
moždinu na cervikalnom i lumbarnom zadebljanju, dorzalne i ventralne korjenove, proksimalni ishijadi čni živac, proksimalni tibijalni živac (na 
koljenu) i ogranke tibijalnog živca u lisnom miši ću. Sekcije le đne 
moždine i perifernog živca trebale bi obuhvatiti i popre čne ili dijagonalne 
i uzdužne sekcije.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 797
 
44. Neuropatološko vrednovanje trebalo bi uklju čivati pregled radi utvr đivanja 
naznaka razvojnih ošte ćenja živčanog sustava (6) (85) (86) (87) (88) (89), 
uz stanične promjene (npr. neuronska vakuolacija, degeneracija, nekroza) i 
promjene tkiva (npr. glioza, infiltracija leukocita, nastanak cista). U tom je pogledu važno razlikovati u činke povezane s tretiranjem od uobi čajenih 
razvojnih doga đaja za koje je poznato da se odvijaju u razvojnoj fazi koja 
odgovara trenutku usmr ćivanja (90). Primjeri znatnih promjena koje ukazuju 
na razvojni inzult uklju čuju, ali se ne ograni čavaju na:
 
— promjene u veli čini ili obliku olfaktornog bulbusa, mozga ili malog 
mozga,  
— promjene u relativnoj veli čini različitih regija mozga, uklju čujući 
smanjenja ili pove ćanja veličine regija koje su posljedica gubitka ili 
postojanosti uobi čajeno prolaznih populacija stanica ili aksonalnih 
projekcija (npr. vanjski zametni sloj cerebeluma, žuljevito tijelo),  
— promjene u proliferaciji, migraciji i diferencijaciji na što upu ćuju 
područja prekomjerne apoptoze ili nekroze, nakupine ili raspršene popu ­
lacije ektopijskih stanica, dezorijentirani ili malformirani neuroni ili promjene u relativnoj veli čini različitih slojeva kortikalnih struktura,
 
— promjene u uzorcima mijelinacije, uklju čujući ukupno smanjenje veli čine 
ili promijenjeno bojenje mijeliniranih struktura,  
— dokaze hidrocefalusa, osobito pove ćanje klijetki, stenozu cerebralnog 
akvedukta i stanjivanje moždanih polutki.  
Analiza odnosa doza-reakcija neuropatoloških promjena  
45. Sljede ći se fazni postupak preporu čuje za kvalitativnu i kvantitativnu neuro ­
patološku analizu. Kao prvo, sekcije iz skupine koja je primala visoku dozu 
uspoređuju se sa sekcijama kontrolne skupine. Ako nema dokaza o neuro ­
patološkim promjenama u životinja iz skupine koja je primala visoku dozu, nije potrebna daljnja analiza. Ako postoje dokazi o neuropatološkim promje ­
nama u skupini koja je primala visoku dozu, pregledavaju se životinje iz 
skupina koje su primale srednju odnosno nisku dozu. Ako se skupina koja je 
primala visoku dozu uništi zbog smrti ili druge zbunjuju će toksičnosti, 
trebalo bi analizirati skupine koje su primale visoke odnosno srednje doze radi neuropatoloških promjena. Ako je u skupina koje su primale niže doze 
uočena neuropatologija, potrebno je obaviti neuropatološku analizu tih 
skupina. Ako se pri kvalitativnom ili kvantitativnom pregledu utvrde bilo kakve neuropatološke promjene povezane s tretiranjem, na temelju vredno ­
vanja svih životinja iz svih skupina koje su primale odre đenu dozu trebalo 
bi utvrditi ovisnost pojave o dozi, u čestalost i stupanj težine lezija ili morfo ­
metričkih promjena. Tim vrednovanjem treba obuhvatiti sve regije mozga 
kod kojih su uo čeni dokazi o neuropatološkim promjenama. Za svaku vrstu 
lezija treba opisati obilježja koja se upotrebljavaju za utvr đivanje svih stup ­
njeva težine, navode ći svojstva za razlikovanje svakog stupnja. Treba zabi ­
lježiti učestalost pojave svake vrste lezije i njezin stupanj težine te izvršiti 
statističku analizu kako bi se ocijenila priroda odnosa doza-reakcija. Prepo ­
ručuje se upotreba kodiranih mikroskopskih preparata (91).
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
46. Podaci bi se trebali dostavljati pojedina čno i sažeti u tablici navo đenjem za 
svaku ispitnu skupinu vrste promjena i broja ženki, potomaka po spolu te legla kod kojih je uo čena svaka vrsta promjene. Ako je izvršeno izravno 
postnatalno izlaganje potomaka, treba zabilježiti na čin, trajanje i razdoblje 
izloženosti.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 798
 
Vrednovanje i tuma čenje rezultata  
47. Studija razvojne neurotoksi čnosti pružit će informacije o u čincima više ­
kratnog izlaganja kemikaliji tijekom razvoja in utero i ranog postnatalnog razvoja. Kako je naglasak stavljen i na op ću toksičnost i na krajnje to čke 
razvojne neurotoksi čnosti, rezultati studije omogu ćit će razlikovanje neuro ­
razvojnih u činaka koji se javljaju u izostanku op će toksičnosti u majke i 
onih koji se javljaju samo kod doza koje su toksi čne i za majku. Zahva ­
ljujući složenom me đuodnosu dizajna studije, statisti čke analize i biološkog 
značaja podataka odgovaraju će tumačenje podataka o razvojnoj neurotoksi č­
nosti uklju čivat će stručno mišljenje (107) (109). Pri tuma čenju rezultata 
ispitivanja treba upotrebljavati pristup koji se temelji na važnosti dokaza 
(20) (92) (93) (94). Treba raspravljati o uzorcima bihevioralnih ili morfolo ­ 
ških nalaza, ako postoje, kao i dokazima u pogledu doze-reakcije. U tu karakterizaciju treba uklju čiti podatke iz svih studija relevantnih za vredno ­
vanje razvojne neurotoksi čnosti, uklju čujući epidemiološke studije na 
ljudima ili izvješ ća o slučajevima te eksperimentalnih studija na životinjama 
(npr. toksokineti čke podatke, informacije o odnosu strukture i djelovanja, 
podatke iz drugih studija toksi čnosti). To uklju čuje i odnos izme đu doza 
ispitivane kemikalije i prisutnosti ili izostanka, pojave i opsega svih neuro ­
toksičnih učinaka kod svakog spola (20) (95).
 
48. Vrednovanjem podataka treba obuhvatiti i raspravu o biološkoj i statisti čkoj 
značajnosti. Statisti čka analiza trebala bi se smatrati alatom kojim se usmje ­
rava, a ne utvr đuje tumačenje podataka. Izostanak statisti čke značajnosti ne 
bi trebao biti jedini razlog za zaklju čak o izostanku u činka povezanog s 
tretiranjem, kao što ni statisti čka značajnost ne bi trebala biti jedino oprav ­
danje za zaklju čak o učinku povezanom s tretiranjem. Kako bi se sprije čili 
mogući lažno negativni nalazi i inherentne poteško će pri „dokazivanju nega ­
tivnog nalaza”, trebalo bi razmotriti dostupne pozitivne i povijesne kontrolne 
podatke, osobito ako nema u činaka povezanih s tretiranjem (102) (106). 
Vjerojatnost lažno negativnih nalaza trebalo bi razmotriti u smislu ukupnog statisti čkog vrednovanja podataka (96). Vrednovanje bi trebalo 
uključivati odnos, ako postoji, izme đu uočenih neuropatoloških i bihevio ­
ralnih promjena.
 
49. Sve bi rezultate trebalo analizirati s pomo ću statističkih modela koji odgo ­
varaju planu pokusa (108). Odabir parametrijske ili neparametrijske analize treba obrazložiti uzimaju ći u obzir čimbenike poput prirode podataka (trans ­
formirani ili netransformirani) i njihove distribucije, kao i relativne robu ­
snosti odabrane statisti čke analize. Odabir statisti čke analize trebao bi se 
temeljiti na svrsi i dizajnu studije kako bi se pogreške vrste I. (lažno pozi ­
tivni nalazi) i vrste II. (lažno negativni nalazi) svele na najmanju mogu ću 
mjeru (96) (97) (104) (105). Statisti čkim modelom razvojnih studija u 
kojima se upotrebljavaju vrste koje mogu okotiti više mladunaca u kojima 
se ispituje više mladunaca iz legla trebala bi biti obuhva ćena legla kako bi 
se spriječio porast stopa pogrešaka vrste I. (98) (99) (100) (101). Statisti čka 
mjerna jedinica trebala bi biti leglo, a ne mladunac. Pokusi bi se trebali 
provoditi tako da se članovi istog legla ne tretiraju kao neovisna opažanja. 
Sve krajnje to čke koje su višekratno izmjerene kod istog predmeta pokusa 
trebale bi se analizirati s pomo ću statističkih modela kojima se uzima u 
obzir činjenica da te izmjerene vrijednosti nisu neovisne.
 
Izvješće o ispitivanju  
50. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija  
— fizikalna svojstva, i prema potrebi, fiziokemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju, uklju čujući podrijetlo,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 799
 
— čistoća pripravka te poznate i/ili o čekivane ne čistoć., 
Nosač (prema potrebi)  
— obrazloženje za odabir nosa ča, ako nije rije č o vodi ili fiziološkoj 
otopini.  
Pokusne životinje  
— upotrijebljena vrsta i soj te obrazloženje ako se ne radi o štakorima,  
— dobavlja č pokusnih životinja,  
— broj, starost na po četku ispitivanja i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, voda itd.,  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku ispitivanja.  
Uvjeti ispitivanja  
— podloge za odabir visine doze,  
— podloge za na čin doziranja i vremensko razdoblje,  
— specifikacije primijenjenih doza, uklju čujući pojedinosti o nosa ču, volu­
menu i fizi čkom obliku primijenjenog materijala,  
— pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripravku u hrani, posti ­
gnutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti pripravka,  
— metoda za jedinstvenu identifikaciju ženki i potomaka,  
— detaljan opis postupaka slu čajnog odabira za raspodjelu ženki u skupine 
za tretiranje, za odabir mladunaca za izdvajanje te za raspodjelu mladu ­
naca u ispitne skupine,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— način preračunavanja koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za 
piće ili inhalatu (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), prema 
potrebi,  
— okolišni uvjeti,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (npr. iz slavine, destilirana),  
— datum po četka i završetka studije.  
Opažanja i ispitni postupci  
— detaljan opis postupaka upotrijebljenih za standardizaciju opažanja i 
postupaka, kao i operativne definicije za bodovanje opažanja,  
— popis svih upotrijebljenih ispitnih postupaka i obrazloženje za njihovu 
upotrebu,  
— pojedinosti o upotrijebljenim bihevioralnim/funkcionalnim, patološkim, 
neurokemijskim ili elektrofiziološkim postupcima, uklju čujući informa ­
cije i pojedinosti o automatskim ure đajima,  
— postupci za kalibriranje i osiguranje istovjetnosti ure đaja i ujedna čavanje 
skupina za tretiranje u ispitnim postupcima,  
— kratko obrazloženje svih odluka koje uklju čuju stručno mišljenje.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 800
 
Rezultati (pojedina čni i sažeti, uklju čujući srednje vrijednosti i varijance 
prema potrebi)  
— broj životinja na po četku i na završetku studije,  
— broj životinja i legala upotrijebljenih za svaku ispitnu metodu,  
— identifikacijski broj svake životinje i leglo iz kojeg potje če, 
— veličina legla i srednja težina pri okotu i po spolu,  
— tjelesna masa i podaci o promjeni tjelesne mase, uklju čujući tjelesnu 
masu ženki i potomaka kod usmr ćenja,  
— podaci o unosu hrane te, prema potrebi, o unosu vode (npr. ako se 
ispitivana kemikalija daje s vodom),  
— podaci o toksi čnoj reakciji po spolu i visini doze, uklju čujući znakove 
toksičnosti ili smrtnost, uklju čujući vrijeme i uzrok smrti, prema potrebi,  
— priroda, težina, trajanje, dan po četka, doba dana te naknadni tijek 
detaljnih klini čkih opažanja,  
— bodovanje svake razvojne posebnosti (težina, spolno sazrijevanje i bihe ­
vioralna ontogeneza) u svim vremenima opažanja,  
— detaljan opis svih bihevioralnih, funkcionalnih, neuropatoloških, neuro ­
kemijskih i elektrofizioloških nalaza po spolu, uklju čujući povećanja i 
smanjenja u usporedbi s kontrolnim skupinama,  
— nalazi nekropsije,  
— težina mozga,  
— sve dijagnoze postavljene na temelju neuroloških znakova i lezija, uklju ­ 
čujući prirodne bolesti ili stanja,  
— slike egzemplarnih nalaza,  
— mikroskopske slike za procjenu homologije sekcija upotrijebljenih za 
morfometriju,  
— podaci o apsorpciji i metabolizmu, uklju čujući komplementarne podatke 
iz zasebne toksokineti čke studije, ako su dostupni,  
— statisti čka analiza rezultata, uklju čujući statističke modele upotrijebljene 
za analizu podataka te rezultati neovisno o tome jesu li zna čajni ili ne,  
— popis osoblja koje je sudjelovalo u studiji, uklju čujući stručno usavrša ­
vanje.  
Rasprava o rezultatima  
— informacije o dozi-reakciji po spolu i skupini,  
— utjecaj ostalih toksi čnih učinaka na zaklju čak o neurotoksi čnom poten ­
cijalu ispitivane kemikalije po spolu i skupini,  
— utjecaj toksokineti čkih informacija na zaklju čke, 
— sličnosti učinaka s u čincima poznatih neurotoksi čnih tvari,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 801
 
— podaci kojima se potvr đuje pouzdanost i osjetljivost ispitne metode (npr. 
pozitivni i povijesni kontrolni podaci),  
— odnosi, ako postoje, izme đu neuropatoloških i funkcionalnih u činaka,  
— vrijednosti kod kojih nisu zamije ćeni štetni u činci (NOAEL) ili refe ­
rentna doza za ženke i potomke po spolu i skupini.  
Zaključci 
— rasprava o sveukupnom tuma čenju podataka na temelju rezultata, uklju ­ 
čujući zaključak o tome je li razvojna neurotoksi čnost posljedica ispiti ­
vane kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamije ćeni štetni 
učinci (NOAEL).  
LITERATURA  
(1) OECD (1995.). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Danska, od 13. 
do 14. lipnja 1995.  
(2) US EPA (1998.). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239. Dostupno na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].  
(3) US EPA (1998.). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Dostupno na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001.). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79. 91.
 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101. 111.
 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001.). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93. 100.  
(7) OECD (2003.). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., SAD, od 23. 
do 25. listopada 2000.  
(8) OECD (2008.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Pariz. srpanj 2008. Dostupno na: [http://search.oecd.org/officialdo ­
cuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = 
en].
 
(9) OECD (2003.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Pariz, rujan 2003. Dostupno na: 
[http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_ 1_1, 00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990.) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000.) Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002.) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188..197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998.) Handbook of Developmental Neuro ­
toxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
(14) Poglavlje B.34. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksi čnosti na jednoj 
generaciji.  
(15) Poglavlje B.35. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksi čnosti na dvije 
generacije.  
(16) Poglavlje B.43. ovog Priloga, Studija neurotoksi čnosti kod glodavaca.  
(17) Poglavlje B.31. ovog Priloga, Studija prenatalne razvojne toksi čnosti.  
(18) Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o 
zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. SL L 276, 20.10.2010., 
str. 33.  
(19) WHO (1986.) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupno na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
(20) WHO (2001.) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Princi ­
ples and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health 
Organization Publications, Geneva. Dostupno na: [http://www.intox.org/ databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].
 
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995.) Neurotoxicology: Approaches and 
Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997.) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499. 509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997.) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2. 6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977.) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989.) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118. 136.
 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979.) Ontogeny of Learning and Memory. 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987.) Peri ­
natal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.
 
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003.) Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, 
Washington, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005.) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87. 94.  
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999.) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1. 4.  
(31) ICH (1993.) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity 
to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
(32) Lochry, E.A. (1987.) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433. 439.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998.) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449. 457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999.) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383. 390.
 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000.) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, 
but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350. 365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985.) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579. - 586.
 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977.) Preputial sepa ­
ration as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298. 303.
 
(38) Spear, L.P. (1990.) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489. - 95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975.) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896. 920.  
(40) Adams, J. (1986.) Methods in Behavioral Teratology. U: Handbook of 
Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67. 100.
 
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979.) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53. 66.  
(42) Robbins, T.W. (1977.) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, str. 37. 82.
 
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993.) Developmental neuro ­
toxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117. - 129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985.) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247. - 260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991.) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological asses ­
sments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599. 609.  
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997.) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405. 411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998.) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. 
Physiol. Behav., 64:661. 669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977.) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589. 591.  
(49) Davis, M. (1984.) The mammalian startle response. U: Neural Mechanisms 
of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, str. 287. 
351. 
(50) Koch, M. (1999.) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107. 
128. 
(51) Crofton, K.M. (1992.) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. U Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, str. 181. 211.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989.) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199. 211.  
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994.) Solvent-induced ototo ­
xicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25. – 30.
 
(54) Ison, J.R. (1984.) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437. – 445.
 
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992.) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. U: Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. str. 125. 145.
 
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990.) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321. 332.  
(57) Bammer, G. (1982.) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new 
results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247. 296.  
(58) Bushnell, P.J. (1988.) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237. 244.
 
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989.) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98. 105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984.) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465. 479.
 
(61) Morris, R. (1984.) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47. 60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989.) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29. 69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001.) Applications of the Morris water 
maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60. 90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987.) Maze learning in rats: A comparison of perfor ­
mance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different 
doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235. 241.  
(65) Vorhees, C.V. (1997.) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387. 399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988.) Impaired Biel 
and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced 
microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327. 332.  
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983.) Delayed behavioral toxi ­
city of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Phar ­
macol., 71:342. 352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981.) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338. – 341.
 
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000.) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 
122. 131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994.) Laboratory 
Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, str. 84. 107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002.) Theory and Practice of Histological 
Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996.) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291. 304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000.) Fluoro-Jade B: A high affinity 
tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123. 130.
 
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001.) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365. 372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994.) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and 
physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545. 561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005.a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745. 755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005.b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain 
after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417. 432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979.) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129. – 135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998.) Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.
 
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998.) Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305. 
310. 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993.) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262. 268.  
(82) Schmitz, C. (1997.) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707. 710.  
(83) West, M.J. (1999.) Stereological methods for estimating the total number 
of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51. 61.  
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005.) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813. – 831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994.) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113. 121.
 
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995.) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294. 298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998.) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. U: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slik ­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, str. 3. 41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999.) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70. 74.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000.) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056. – 1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989.) Developmental Neuropathology. Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992.) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127. 133.
 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996.) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401. 405.  
(93) US EPA (2005.) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
(94) US EPA (1996.) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274. 56322.  
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995.) Neurotoxicology. 
Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. 
Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984.). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113. 126.  
(97) Gad, S.C. (1989.) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21 27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973.) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329. 335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975.) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165. 172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992.) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221. 228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985.) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587. 90.
 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004.) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345. 352.
 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc 
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006.) A „best practices” approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296. 
313.
 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992.) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205. 210.
 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985.) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295. 301.
 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008.) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. 
Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266. 287.
 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008.) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology 
and Teratology, 30(4):288. 325.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008.) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326. 348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008.) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349. 381.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 808
 
Slika 1.  
Opća shema ispitivanja za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja, neuropatološko vrednovanje 
i težinu mozga. Ovaj se dijagram temelji na opisu iz stavaka 13–15. (PND = postnatalni dan). 
Primjeri raspodjele životinja nalaze su u Dodatku 1.
  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 809
 
Dodatak 1.  
1. Primjeri mogu ćih raspodjela opisani su i prikazani u tablicama u nastavku. 
Ti su primjeri navedeni kako bi se pokazalo da se raspodjela životinja koje 
se upotrebljavaju u studiji razli čitim ispitnim paradigmama može posti ći na 
nekoliko razli čitih načina. 
Primjer 1.  
2. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 
mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne 
ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po 
spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 22. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obra đuju za 
histopatološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju 
se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po 
visini doze.
 
3. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak 
i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja 
nakon odbijanja od sise (detaljna klini čka opažanja, motori čka aktivnost, 
reakcija na iznenadnu buku i ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih životinja) te procjenu dobi spolnog sazrijevanja. Od tih životinja 10 živo ­
tinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) 
anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja i obra đuje za 
neuropatološko vrednovanje.
 
4. Za ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (npr. 60. do 
70. PND) upotrebljava se tre ća skupina od 20 mladunaca po spolu i po 
visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po skupini (1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmr ćuju se 
na završetku studije, a mozak se odstranjuje i važe.
 
5. Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini čuva se za mogu ća dodatna 
ispitivanja.  
Tablica 1.  
Br. mladunca (  a ) Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
1 5  20 m + 20 ž  Bihevioralna ontogeneza  
10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija na 22. PND  
10 m + 10 ž  Težina mozga na 22. PND  
2 6  20 m + 20 ž  Detaljna klini čka opažanja  
20 m + 20 ž  Motori čka aktivnost  
20 m + 20 ž  Spolno sazrijevanje  
20 m + 20 ž  Motori čka i osjetilna funkcija  
20 m + 20 ž  Učenje i pam ćenje (25. PND)  
10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija u mladih odraslih 
životinja ~ 70. PND  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 810
 
Br. mladunca (  a ) 
Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
3 7  20 m + 20 ž  Učenje i pam ćenje (mlade 
odrasle životinje)  
10 m + 10 ž  Težina mozga u mladih odraslih 
životinja ~ 70. PND  
4 8  —  Rezervne životinje kao zamjena 
ili za dodatna ispitivanja  
( a ) U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci 
označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8.  
Primjer 2.  
6. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 
mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmr ćuju 
11. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obra đuju za histo ­
patološko vrednovanje.
 
7. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 
ženka po leglu) upotrebljava se za preglede nakon odbijanja od sise (detaljna klini čka opažanja, motori čka aktivnost, procjena dobi spolnog 
sazrijevanja te motori čka i osjetilna funkcija). Od tih životinja 10 životinja 
po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anestezi ­
raju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja, važe i obra đuje za 
neuropatološko vrednovanje.
 
8. Za ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih i mladih odraslih živo ­
tinja upotrebljava se 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 
mužjak i 1 ženka po leglu). Za ispitivanje kognitivne funkcije na 23. post ­
natalni dan i u mladih odraslih životinja upotrebljavaju se razli čite životinje. 
Na završetku studije 10 životinja po spolu i po skupini koje su ispitivane 
kao odrasle usmr ćuju se, a mozak se odstranjuje i važe.  
9. Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini koje nisu odabrane za ispiti ­
vanje usmr ćuju se i izlu čuju kod odbijanja od sise.  
Tablica 2.  
Br. mladunca (  a ) Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
1 5  20 m + 20 ž  Bihevioralna ontogeneza  
10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija na 11. PND  
2 6  20 m + 20 ž  Detaljna klini čka opažanja  
20 m + 20 ž  Motori čka aktivnost  
20 m + 20 ž  Spolno sazrijevanje  
20 m + 20 ž  Motori čka i osjetilna funkcija  
10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija u mladih odraslih 
životinja ~ 70. PND  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 811
 
Br. mladunca (  a ) 
Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
3 7  10 m + 10 ž (  b ) Učenje i pam ćenje (23. PND)  
3 7  10 m + 10 ž (  b ) Učenje i pam ćenje (mlade 
odrasle životinje)  
Težina mozga u mladih odraslih 
životinja  
4 8  —  Životinje koje su usmr ćene i 
izlučene 21. postnatalnog dana.  
( a ) U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci 
označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8. 
( b ) Različiti se mladunci upotrebljavaju za kognitivna ispitivanja na 23. PND i u 
mladih odraslih životinja (npr. parna/neparna legla od ukupno njih 20).  
Primjer 3.  
10. Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 
mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za procjenu težine mozga i neuropatologije na 11. PND. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i 
po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmr ćuju 
11. postnatalnog dana, a mozgovi se odstranjuju, važu i obra đuju za histo ­
patološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po 
visini doze.
 
11. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak 
i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za bihevioralnu ontogenezu (motori čka 
aktivnost), preglede nakon odbijanja od sise (motori čka aktivnost i procjena 
dobi spolnog sazrijevanja) te ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih 
životinja.  
12. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak 
i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanja motori čke i osjetilne 
funkcije (reakcija na iznenadnu buku) i detaljna klini čka opažanja. Od tih 
životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (pri ­
bližno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ, mozak se uklanja, 
važe i obra đuje za neuropatološko vrednovanje.
 
13. Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze upotrebljava se za 
ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po 
skupini (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmr ćuju se na završetku 
studije, a mozak se odstranjuje i važe.
 
Tablica 3.  
Br. mladunca (  a ) Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
1 5  10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija na 11. PND  
10 m + 10 ž  Težina mozga na 11. PND  
2 6  20 m + 20 ž  Bihevioralna ontogeneza (moto ­
rička aktivnost)  
20 m + 20 ž  Motori čka aktivnost  
20 m + 20 ž  Spolno sazrijevanje  
20 m + 20 ž  Učenje i pam ćenje (27. PND)  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 812
 
Br. mladunca (  a ) 
Broj mladunaca 
raspoređenih za ispitivanje  Pregled/ispitivanje  
m ž  
3 7  20 m + 20 ž  Reakcija na buku (adolescentne 
i mlade odrasle životinje)  
20 m + 20 ž  Detaljna klini čka opažanja  
10 m + 10 ž  Težina mozga/neuropatologija/ 
morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND
 
4 8  20 m + 20 ž  Učenje i pam ćenje (mlade 
odrasle životinje)  
10 m + 10 ž  Težina mozga u mladih odraslih 
životinja  
( a ) U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci 
označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 813
 
Dodatak 2.  
Definicije  
Kemikalija: Tvar ili smjesa  
Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom 
metodom  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 814
 
B.54.  UTEROTROPNI BIOTEST KOD GLODAVACA: KRATKORO ČNI 
TEST PROBIRA NA ESTROGENSKA SVOJSTVA  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 440 
(2007.). OECD je 1998. godine pokrenuo aktivnost visokog prioriteta revi ­
zije postoje ćih i razvoja novih smjernica za probir i ispitivanje potencijalnih 
endokrinih disruptora (1). Jedan je element aktivnosti bio razvoj smjernice za ispitivanje za uterotropni biotest u glodavaca. Uterotropni biotest u 
glodavaca tada je podvrgnut opsežnom programu validacije, uklju čujući 
sastavljanje detaljnog popratnog dokumenta (2) (3) te provo đenje opsežnih 
studija unutar laboratorija i me đu njima, kako bi se pokazala važnost i 
obnovljivost biotesta s potentnim referentnim estrogenom, slabim agoni ­
stima receptora estrogena, jakim antagonistom receptora estrogena i nega ­
tivnom referentnom kemikalijom (4) (5) (6) (7) (8) (9). Ova je ispitna metoda B.54. rezultat iskustva ste čenog tijekom programa validacije ispiti ­
vanja i njegovih rezultata za estrogenske agoniste.
 
2. Uterotropni biotest kratkoro čni je test probira nastao u 1930-ima (27) (28) 
te ga je stru čni odbor prvi put standardizirao za probir 1962. (32) (35). On 
se temelji na pove ćanju mase maternice ili uterotropnoj reakciji (za recen ­
ziju vidjeti 29.). Njime se vrednuje sposobnost kemikalije da potakne biološke aktivnosti konzistentne agonistima i antagonistima prirodnih estro ­
gena (npr. 17ß-estradiol). Me đutim, njegova upotreba za utvr đivanje anta ­
gonista manje je uobi čajena nego za utvr đivanje agonista. Maternica reagira 
na estrogene na dva na čina. Početna je reakcija pove ćanje mase zbog zadr ­ 
žavanja vode. Ta je reakcija pra ćena porastom mase zbog rasta tkiva (30). 
Reakcije maternice u štakora i miševa kvalitativno su usporedive.
 
3. Ovaj biotest služi kao test probira in vivo, a njegova bi se primjena trebala 
promatrati u kontekstu „OECD-ovog konceptualnog okvira za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija” (Dodatak 2.). U tom se konceptualnom okviru uterotropni biotest nalazi na 3. razini kao test in 
vivo koji pruža podatke o jedinstvenom endokrinom mehanizmu, odnosno 
estrogenizaciji.
 
4. Planira se uklju čivanje uterotropnog biotesta u bateriju testova in vitro i in 
vivo radi identifikacije kemikalija s potencijalom za interakciju s endo ­
krinim sustavom, što na kraju dovodi do procjena rizika po ljudsko zdravlje 
i okoliš. U programu validacije OECD-a upotrebljavali su se jaki i slabi 
agonisti estrogena radi vrednovanja u činka testa pri identifikaciji estrogen ­
skih kemikalija (4) (5) (6) (7) (8). Na taj je na čin, uz dobru obnovljivost 
unutar jednog laboratorija i izme đu više njih, dobro predstavljena osjetlji ­
vost ispitnog postupka za agoniste estrogena.  
5. Kad je rije č o negativnim spojevima, samo je jedna „negativna” referentna 
kemikalija, za koju su uterotropni test, kao i vezivanje receptora in vitro i testovi receptora, pokazali negativnu vrijednost, obuhva ćena programom 
validacije, ali su ocijenjeni dodatni podaci o ispitivanju koji nisu povezani 
s programom validacije OECD-a, čime je dodatno potkrijepljena specifi č­
nost uterotropnog biotesta za probir agonista estrogena (16).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 815
 
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
6. Agonisti i antagonisti estrogena djeluju kao ligandi za receptore estrogena α 
i β te mogu aktivirati odnosno inhibirati transkripcijsko djelovanje recep ­
tora. To može dovesti do opasnosti po zdravlje, uklju čujući reproduktivne i 
razvojne u činke. Stoga postoji potreba za brzom procjenom i vrednovanjem 
kemikalije kao mogu ćeg agonista ili antagonista estrogena. Iako informati ­
van, afinitet liganda za receptor estrogena ili transkripcijsku aktivaciju gena izvjestitelja in vitro samo je jedna od nekoliko odrednica mogu će opasnosti. 
Ostale odrednice mogu uklju čivati metaboli čku aktivaciju i deaktivaciju pri 
ulasku u tijelo, distribuciju u ciljna tkiva i uklanjanje iz tijela, barem djelo ­
mično ovisno o na činu primjene i kemikaliji koja se ispituje. To dovodi do 
potrebe za probirom mogu ćeg djelovanja kemikalije in vivo u odgovara ­
jućim uvjetima, osim ako se odgovaraju će informacije ve ć nalaze u karak ­
teristikama kemikalije u pogledu apsorpcije – distribucije – metabolizma – eliminacije (ADME). Tkiva maternice na stimulaciju estrogenima odgova ­
raju brzim i snažnim rastom, posebno u laboratorijskih glodavaca u kojih 
ciklus estrusa traje približno 4 dana. Vrste glodavaca, osobito štakori, u širokoj su upotrebi i u studijama toksi čnosti za karakterizaciju opasnosti. 
Zato je maternica glodavaca odgovaraju ći ciljni organ za probir in vivo 
agonista i antagonista estrogena.
 
7. Ova se metoda temelji na onim protokolima iz OECD-ove validacijske 
studije za koje je dokazano da su pouzdani i ponovljivi u studijama 
unutar laboratorija i izme đu njih (5)(7). Trenuta čno postoje dvije metode, 
odnosno metoda na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici te metoda na nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici. OECD-ovim programom validacije ispitivanja dokazano je da obje 
metode imaju usporedivu osjetljivost i obnovljivost. Me đutim, metoda na 
nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici, s obzirom na to da imaju netaknutu os hipotalamus-hipofiza-gonade (HPG), nešto je manje specifična, ali je njome obuhva ćen veći raspon ispitivanja u usporedbi s 
metodom na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici, zato što može 
reagirati na kemikalije koje djeluju na os HPG, a ne samo na receptor estrogena. Os HPG u štakora funkcionalna je na približno 15. dan starosti. Prije toga pubertet se ne može ubrzati tretmanima poput GnRH. Po četkom 
ulaska u pubertet, prije otvaranja vagine, ženka će imati nekoliko tihih 
ciklusa čije posljedice ne će biti otvaranje vagine ili ovulacija, ali će posto­
jati hormonalne fluktuacije. Ako se kemikalijom izravno ili neizravno stimulira os HPG, posljedice će biti preuranjeni pubertet, rana ovulacija i 
ubrzano otvaranje vagine. Osim kemikalija koje djeluju na os HPG, stimu ­
lacija rasta i ubrzanje otvaranja vagine posljedice su nekih vrsta prehrane s višim razinama metaboliziraju će energije, bez estrogenskih obilježja. Takve 
kemikalije ne bi izazvale uterotropnu reakciju u odraslih životinja kojima su 
odstranjeni jajnici jer njihova os HPG ne funkcionira.
 
8. Radi dobrobiti životinja prednost bi trebalo dati metodi u kojoj se upotreb ­
ljavaju nezreli štakori, uklju čujući kiruršku pripremu životinja i izbjegavanje 
mogućeg neupotrebljavanja onih životinja koje pokazuju znakove ulaska u 
ciklus estrusa (vidjeti stavak 30.).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 816
 
9. Uterotropna reakcija nije posve estrogenskog podrijetla, odnosno kemikalije 
koje nisu agonisti ili antagonisti estrogena isto tako mogu uzrokovati reak ­
ciju. Primjerice, razmjerno visoke doze progesterona, testosterona ili različitih sinteti čkih progestina mogu dovesti do stimulativne reakcije 
(30). Sve reakcije mogu se histološki analizirati u pogledu keratinizacije i 
kornifikacije vagine (30). Neovisno o mogu ćem podrijetlu reakcije, radnje 
radi daljnjeg pojašnjenja obi čno bi se trebale pokrenuti zbog pozitivnog 
ishoda uterotropnog biotesta. Dodatni dokazi estrogenizacije mogli bi se pronaći u testovima in vitro, poput testova vezivanja ER-a i testova tran ­
skripcijske aktivacije, ili u drugim testovima in vivo poput testa ženskog 
puberteta.
 
10. Uzimaju ći u obzir da se uterotropni biotest upotrebljava kao test probira in 
vivo, primijenjeni validacijski pristup bio je u funkciji dobrobiti životinja i stupnjevane strategije ispitivanja. U tu su svrhu napori bili usmjereni na 
strogu validaciju obnovljivosti i osjetljivosti za estrogenizaciju – glavni 
problem za brojne kemikalije, dok su skromni napori bili usmjereni na antiestrogenizacijsku sastavnicu testa. Ispitivan je samo jedan antiestrogen s jakim djelovanjem s obzirom na to da je broj kemikalija s jasnim antie ­
strogenskim profilom (koji ne ometa odre đeno estrogensko djelovanje) vrlo 
ograničen. Zato je ta ispitna metoda ograni čena na estrogenski protokol, dok 
je protokol kojim se opisuje antagonisti čki način testa obuhva ćen Smjer ­
nicom (37). Obnovljivost i osjetljivost testa za kemikalije s isklju čivo antie­
strogenskim djelovanjem bolje će se definirati kasnije, nakon što ispitni 
postupak bude u rutinskoj upotrebi neko vrijeme te nakon identifikacije više kemikalija ovim na činom djelovanja.
 
11. Potvr đuje se da će svi postupci koji se temelje na životinjama biti u skladu 
s lokalnim standardima brige za životinje; opisi brige i postupanja utvr đeni 
u nastavku minimalni su standardi u činka te će biti zamijenjeni lokalnim 
propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 
22. rujna 2010. o zaštiti životinja, koje se koriste u znanstvene svrhe (38). OECD daje daljnje smjernice za humano postupanje sa životinjama (25).
 
12. Kao i u svim testovima u kojima se upotrebljavaju žive životinje, prije 
početka testa klju čno je osigurati da podaci doista budu nužni. Primjerice, 
u dvama uvjetima podaci mogu biti nužni:  
— visok potencijal izloženosti (1. razina konceptualnog okvira, Dodatak 2.) 
ili indikacije za estrogenizaciju (2. razina), za ispitivanje mogu li takvi učinci nastati in vivo,
 
— učinci kojima se ukazuje na estrogenizaciju na 4. ili 5. razini testova in 
vivo radi dokazivanja da su u činci bili povezani s estrogenskim mehan ­
izmom koji je nemogu će razjasniti pomo ću testa in vivo.  
13. Definicije upotrijebljene u ovoj ispitnoj metodi navedene su u Dodatku 1.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 817
 
NAČELO ISPITIVANJA  
14. Osjetljivost uterotropnog biotesta oslanja se na sustav ispitivanja životinja u 
kojem os hipotalamus-hipofiza-jajnici nije funkcionalna, što dovodi do niskih endogenskih razina cirkulacije estrogena. Na taj će se način osigurati 
mala osnovna masa maternice i najve ći raspon reakcije na primijenjene 
estrogene. Dva stanja osjetljivosti na estrogen u ženki glodavaca ispunjavaju ovaj uvjet:
 
i. nezrele ženke nakon odbijanja od sise i prije puberteta; te  
ii. mlade odrasle ženke nakon odstranjivanja jajnika uz dovoljno vremena 
za vraćanje tkiva maternice.  
15. Ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno oralnom sondom ili 
potkožnom injekcijom. Graduirane doze ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje dvije skupine pokusnih životinja za tretiranje (za smjernice 
vidjeti stavak 33.), upotrebom jedne visine doze po skupini u razdoblju 
primjene od tri uzastopna dana za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici, odnosno razdoblju primjene od najmanje tri uzastopna dana za metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. Životinje se 
podvrgavaju nekropsiji približno 24 sata nakon posljednje doze. Za agoniste 
estrogena procjenjuje se srednja masa maternice tretiranih skupina životinja u odnosu na skupinu na kojoj se primjenjuje nosa č radi statisti čki znatnog 
povećanja. Statisti čki znatno pove ćanje srednje mase maternice u ispitnoj 
skupini ukazuje na pozitivnu reakciju u ovom biotestu.
 
OPIS METODE  
Odabir životinjskih vrsta  
16. Mogu se upotrebljavati glodavci koji se obi čno upotrebljavaju u laborato ­
rijima. Primjerice, sojevi štakora Sprague Dawley i Wistar upotrebljavani su 
tijekom validacije. Ne bi se trebali upotrebljavati sojevi za koje se zna ili pretpostavlja da imaju manje osjetljive maternice. Laboratorij bi trebao pokazati osjetljivost upotrebom soja prema opisu iz stavaka 26. i 27.
 
17. Štakor i miš rutinski se upotrebljavaju za uterotropni biotest od 1930-ih. 
OECD-ove validacijske studije provodile su se samo na štakorima, na temelju shva ćanja da se o čekuje da su obje vrste istovjetne te bi zato 
jedna vrsta trebala biti dovoljna za validaciju širom svijeta kako bi se 
sačuvali resursi i životinje. Štakor je odabrana vrsta u ve ćini studija repro ­
duktivne i razvojne toksi čnosti. Uzimaju ći u obzir postojanje velike histo ­
rijske baze podataka za miševe, ograni čena validacijska studija pra ćenja 
provedena je na miševima (16) kako bi se proširio raspon ispitne metode 
uterotropnog biotesta u glodavaca na upotrebu miševa kao ispitne vrste. U skladu s izvornom namjerom o čuvanja resursa i životinja odabran je pove ­
zujući pristup s ograni čenim brojem ispitivanih kemikalija, sudjeluju ćih 
laboratorija i bez kodiranog ispitivanja uzoraka. Tom povezuju ćom valida ­
cijskom studijom utvr đeno je da se, kad je rije č o uterotropnom biotestu na 
mladim odraslim miševima kojima su odstranjeni jajnici, podaci dobiveni za štakore i miševe u velikoj mjeri podudaraju. U slu čajevima kad rezultati 
uterotropnog biotesta mogu prethoditi dugotrajnoj studiji, u obje se studije 
mogu upotrebljavati životinje istog soja i istog podrijetla. Povezuju ći pristup 
bio je ograni čen na odrasle miševe kojima su odstranjeni jajnici pa izvješ će 
ne pruža pouzdan skup podataka za validaciju modela nezrelih životinja 
kojima nisu odstranjeni jajnici, zbog čega se taj model u miševa ne razmatra 
u okviru postoje će ispitne metode.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 818
 
18. Zato se u nekim slu čajevima mogu upotrebljavati miševi umjesto štakora. 
Za tu bi vrstu trebalo navesti obrazloženje na temelju toksikoloških, farma ­
kokinetičkih i/ili drugih kriterija. Za miševe bi mogle biti potrebne izmjene 
protokola. Primjerice, unos hrane u miševa na temelju tjelesne mase ve ći je 
nego u štakora te bi zato udjel fitoestrogena u hrani trebao biti niži u miševa 
nego u štakora (9) (20) (22).  
Uvjeti smještaja i hranjenja  
19. Svi bi postupci trebali biti u skladu s lokalnim standardima brige o labo ­
ratorijskim životinjama. Ti opisi brige i postupanja minimalni su standardi i 
zamijenit će se lokalnim propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog 
parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u 
znanstvene svrhe (38). Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi biti 22 °C (uz približan raspon od ± 3 °C). Relativna 
vlažnost trebala bi biti barem 30 %, a poželjno je da ne prelazi najviših 
70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Ciljna relativna vlažnost trebala bi 
biti od 50–60 %. Svjetlo bi trebalo biti umjetno. Dnevni redoslijed svjetla trebao bi biti 12 sati svjetla, 12 sati tame.
 
20. Laboratorijsku prehranu i vodu za pi će trebalo bi osigurati ad libitum. 
Mlade odrasle životinje mogu se smjestiti pojedina čno ili u kaveze u skupi ­
nama do tri životinje. Zbog mladosti nezrelih životinja preporu čuje se smje ­ 
štaj prema socijalnoj skupini.  
21. Poznato je da visoke razine fitoestrogena u laboratorijskoj prehrani pove ­ 
ćavaju masu maternice u glodavaca do stupnja koji je dostatan za ometanje 
uterotropnog biotesta (13) (14) (15). Visoke razine fitoestrogena i metabo ­
lizirajuće energije u laboratorijskoj prehrani mogu uzrokovati i preuranjeni 
pubertet ako se upotrebljavaju nezrele životinje. Prisutnost fitoestrogena ponajprije je posljedica uklju čivanja soje i alfalfa proizvoda u laboratorijsku 
prehranu, a dokazano je da koncentracije fitoestrogena variraju od serije do 
serije standardne laboratorijske prehrane (23). Tjelesna masa važna je vari ­
jabla s obzirom na to da je koli čina konzumirane hrane povezana s tjele ­
snom masom. Zato stvarne doze fitoestrogena koje se konzumiraju prema 
istoj prehrani mogu varirati izme đu vrsta i prema dobi (9). U nezrelih ženki 
štakora unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno dvostruko veći od unosa mladih odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. U mladih 
odraslih miševa unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno 
četverostruko ve ći od unosa mladih odraslih ženki štakora kojima su odstra ­
njeni jajnici.
 
22. Međutim, rezultati uterotropnog testa (9) (17) (18) (19) ukazuju na to da su 
ograničene količine prehrambenih fitoestrogena prihvatljive te da se njima 
ne umanjuje osjetljivost biotesta. Primjerice, prehrambene razine fitoestro ­
gena ne bi trebale premašiti 350 μg ekvivalenata genisteina po gramu 
laboratorijske prehrane u nezrelih ženki štakora sojeva Sprague Dawley i Wistar (6) (9). Takva bi se prehrana trebala primijeniti i pri ispitivanju mladih odraslih štakora kojima su odstranjeni jajnici jer je unos hrane na 
temelju tjelesne mase manji u mlade odrasle životinje nego u nezrelih 
životinja. Ako treba upotrebljavati miševe kojima su odstranjeni jajnici ili štakore koji su osjetljiviji na fitoestrogen, potrebno je razmotriti razmjerno smanjenje razina prehrambenog fitoestrogena (20). Osim toga, razlike u 
raspoloživoj metaboli čkoj energiji iz razli čitih vrsta prehrane mogu 
dovesti do vremenskih pomaka za po četak puberteta (21) (22).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 819
 
23. Prije studije potreban je pažljiv odabir prehrane bez povišene razine fitoe ­
strogena (za primjer vidjeti (6) (9)) ili metaboliziraju će energije, koji mogu 
poremetiti rezultate (15) (17) (19) (22) (36). Važna je provjera oba nave ­
dena čimbenika osiguranje pravilnog funkcioniranja ispitnog sustava koji 
laboratorij upotrebljava kako je predvi đeno stavcima 26. i 27. Kao zaštitu 
u skladu s dobrom laboratorijskom praksom potrebno je provesti reprezenta ­
tivno uzorkovanje svake serije prehrane koja se primjenjuje tijekom studije radi mogu će analize udjela fitoestrogena (npr. u slu čaju velike kontrolne 
mase maternice u odnosu na historijske kontrole ili neodgovaraju će reakcije 
na referentni estrogen, 17 alfa-etinilestradiol). Alikvote treba analizirati kao 
dio studije ili zamrznuti na – 20 °C, odnosno tako da se sprije či propadanje 
uzorka prije analize.
 
24. Neke vrste stelje mogu sadržavati prirodne estrogenske ili antiestrogenske 
kemikalije (npr. poznato je da klip kukuruza utje če na ciklus štakora pa se 
čini da je antiestrogenski). Odabrana stelja trebala bi sadržavati minimalnu 
razinu fitoestrogena.  
Priprema životinja  
25. Pokusne životinje bez utvr đenih bolesti ili fizi čkih abnormalnosti nasumi čno 
se raspore đuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Kaveze treba 
urediti tako da se eventualni u činci držanja u kavezu svedu na minimum. 
Životinje treba ozna čiti jedinstvenim oznakama. Poželjno je nezrele živo ­
tinje smjestiti u kaveze sa ženkama ili zamjenskim ženkama do odbijanja od sise tijekom aklimatizacije. Razdoblje aklimatizacije prije po četka studije 
trebalo bi trajati približno 5 dana za mlade odrasle životinje te za nezrele 
životinje isporu čene sa ženkama ili zamjenskim ženkama. Ako se nezrele 
životinje nabavljaju kao životinje upravo odbijene od sise bez ženki, kra će 
razdoblje aklimatizacije može biti potrebno jer bi doziranje trebalo zapo četi 
neposredno nakon odbijanja od sise (vidjeti stavak 29.).
 
POSTUPAK  
Provjera osposobljenosti laboratorija  
26. Za provjeru osposobljenosti laboratorija mogu se upotrebljavati dvije 
različite mogućnosti:  
— periodi čna provjera koja se temelji na po četnoj studiji osnovne pozitivne 
kontrole (vidjeti stavak 27.). Najmanje svakih 6 mjeseci i u slu čaju 
svake promjene koja može utjecati na provo đenje testa (npr. nova 
formulacija prehrane, promjena osoblja koje obavlja disekcije, promjene 
soja životinja ili dobavlja ča itd.) treba provjeriti reakciju ispitnog 
sustava (životinjski model) pomo ću odgovaraju će doze (na temelju 
studije osnovne pozitivne kontrole iz stavka 27.) referentnog estrogena 17α-etinilestradiola (CAS br. 57-63-6) (EE),
 
— upotreba usporednih kontrola uklju čivanjem u svaki test skupine kojoj 
se daje odgovaraju ća doza referentnog estrogena.  
Ako sustav ne reagira prema o čekivanjima, eksperimentalne uvjete treba 
ispitati i izmijeniti prema potrebi. Preporu čuje se da doza referentnog estro ­
gena koju treba upotrijebiti u bilo kojem pristupu bude približno ED70 
do 80.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 820
 
27. Studija osnovne pozitivne kontrole – prije nego što laboratorij prvi put 
provodi studiju na temelju ove ispitne metode, potrebno je dokazati 
njegovu osposobljenost ispitivanjem reakcije životinjskog modela utvr điva­
njem doze reakcije referentnog estrogena 17 α-etinilestradiola (CAS br. 57- 
63-6) (EE) pomo ću najmanje četiri doze. Reakcija mase maternice usporedit 
će se s utvr đenim povijesnim podacima (vidjeti referencu (5)). Ako se 
pomoću studije osnovne pozitivne kontrole ne dobiju o čekivani rezultati, 
potrebno je ispitati i izmijeniti eksperimentalne uvjete.  
Broj i stanje životinja  
28. Sve skupine za tretiranje i kontrolne skupine trebale bi se sastojati od 
najmanje šest životinja (u protokolu za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici i metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajni ­
ci).
 
Dob nezrelih životinja  
29. U uterotropnim testovima na nezrelim životinjama potrebno je odrediti dan 
okota. S doziranjem treba zapo četi dovoljno rano kako bi se osiguralo da po 
završetku primjene kemikalije još nije došlo do fiziološkog pove ćanja endo ­
genih estrogena povezanih s pubertetom. S druge strane, postoje dokazi da 
vrlo mlade životinje mogu biti manje osjetljive. U definiranju optimalne dobi svaki bi laboratorij trebao uzeti u obzir vlastite podatke o sazrijevanju.
 
Opće je pravilo da se s doziranjem u štakora može zapo četi neposredno 
nakon ranog odbijanja od sise na 18. postnatalni dan (pri čemu je dan okota 
nulti postnatalni dan). Doziranje u štakora treba okon čati na 21. postnatalni 
dan, a svakako prije 25. postnatalnog dana zato što nakon te dobi os hipotalamus-hipofiza-jajnici postaje funkcionalna, a razine endogenih estro ­
gena mogu po četi rasti uz istodobno pove ćanje osnovne srednje mase 
maternice te standardnih devijacija skupine (2) (3) (10) (11) (12).
 
Postupak odstranjivanja jajnika  
30. U ženki štakora i miševa kojima su odstranjeni jajnici (skupine za tretiranje 
i kontrolne skupine) odstranjivanje jajnika trebalo bi obaviti izme đu šestog i 
osmog tjedna života. Štakorima je potrebno najmanje 14 dana izme đu 
odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene kako bi se maternica vratila na minimalnu, stabilnu osnovu. Miševima je potrebno najmanje sedam dana 
između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene. S obzirom na to da su 
male koli čine tkiva jajnika dovoljne za proizvodnju znatnih cirkuliraju ćih 
razina estrogena (3), životinje bi trebalo ispitati prije upotrebe promatranjem vaginalnih stanica epitela najmanje pet uzastopnih dana (npr. od 10. do 
14. dana od odstranjivanja jajnika u štakora). Ako se kod njih uo če bilo 
kakvi dokazi ulaska u ciklus estrusa, životinje ne bi trebalo upotrebljavati. Osim toga, pri nekropsiji treba pregledati ostatke jajnika radi dokaza o prisutnosti tkiva jajnika. U tom slu čaju životinju ne bi trebalo upotrebljavati 
u izračunima (3).
 
31. Postupak odstranjivanja jajnika zapo činje kad je životinja u ventralnom 
položaju nakon što je odgovaraju će anestezirana. Rez kojim se otvara 
dorsolateralni trbušni zid trebao bi se nalaziti približno 1 cm uzdužno od središnje to čke između kostalnog ruba rebara i zdjeli čne kosti te nekoliko 
milimetara lateralno od lateralnog ruba lumbalnog miši ća. Jajnik treba 
odstraniti iz trbušne šupljine na asepti čnu podlogu. Jajnik treba odvojiti 
na spoju jajovoda i tijela maternice. Nakon potvrde da nema opsežnog krvarenja, trbušni zid treba zatvoriti šavom, a kožu kop čama ili odgovara ­
jućim šavom. To čke podvezivanja shematski su prikazane na slici 1. 
Potrebno je upotrebljavati odgovaraju će postoperativne analgetike prema 
preporuci veterinara s iskustvom u njezi glodavaca.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 821
 
Tjelesna masa  
32. U metodi odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici, tjelesna masa i masa 
maternice nisu povezane zato što na masu maternice utje ču hormoni poput 
estrogena, a ne čimbenici rasta kojima se regulira tjelesna masa. Me đutim, 
tjelesna masa povezana je s masom maternice tijekom sazrijevanja kod 
modela nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici (34). Zato na početku studije variranje tjelesne mase životinja koje se upotrebljavaju u 
modelu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici treba biti što manje 
i ne bi trebalo premašiti ± 20 % srednje vrijednosti mase. To zna či da bi 
uzgajivač trebao standardizirati veli činu legla kako bi osigurao da će se 
potomci razli čitih životinja majki približno jednako hraniti. Životinje bi 
trebalo rasporediti u skupine (kontrolne skupine i skupine za tretman) 
prema slu čajnoj distribuciji mase, tako da se srednja tjelesna masa svake 
skupine statisti čki ne razlikuje od ostalih skupina. Trebalo bi po mogu ćnosti 
izbjegavati raspodjelu članova istog legla u istu skupinu za tretiranje bez 
povećavanja broja legl ā koje treba upotrebljavati za ispitivanje.
 
Doziranje  
33. Kako bi se utvrdilo može li ispitna kemikalija imati estrogensko djelovanje 
in vivo, obi čno su dovoljne dvije skupine kojima se daje odre đena doza pa 
je zato taj dizajn poželjan radi dobrobiti životinja. Ako je svrha dobiti krivulju doza reakcija ili ekstrapolirati niže doze, potrebne su barem tri 
skupine kojima se daje odre đena doza. Ako je potrebno više informacija 
osim estrogenske aktivnosti (poput procjene potencije), treba razmotriti drukčiji režim doziranja. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa živo ­
tinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama 
u ispitnoj skupini. Ako se u primjeni ispitivane kemikalije upotrebljava 
nosač, kontrolna skupina trebala bi primiti jednaku koli činu nosača kao i 
tretirane skupine (ili najve ći volumen koji je primijenjen na ispitne skupine 
ako se on razlikuje me đu skupinama).
 
34. Cilj je u slu čaju uterotropnog biotesta odabrati doze kojima se osigurava 
preživljavanje životinja te koje nisu znatno toksi čne i opasne za životinje 
nakon tri uzastopna dana primjene kemikalije do najve će doze od 1 000 
mg/kg/d. Sve visine doza treba predložiti i odabrati uzimaju ći u obzir sve 
raspoložive podatke o toksi čkim i (toksiko-) kineti čkim svojstvima ispiti ­
vane kemikalije ili srodnih materijala. Najvišom dozom prvo bi trebalo uzeti u obzir LD50 i/ili informacije o akutnoj toksi čnosti kako bi se izbjegla smrt, 
teška patnja ili opasnost za životinje (24) (25) (26). Najviša bi doza trebala 
predstavljati maksimalnu dozu tolerancije (MDT), a prihvatljiva bi bila i 
studija provedena na visini doze kojom je izazvana pozitivna uterotropna reakcija. Veliki intervali (npr. polovi čne log jedinice odgovaraju progresiji 
doze od 3,2 ili čak i više do cjelovitih log jedinica) izme đu doziranja 
općenito su prihvatljivi u svrhu probira. Ako nema odgovaraju ćih podataka, 
može se provesti studija utvr đivanja koli činskog raspona kako bi se lakše 
utvrdile doze koje treba primjenjivati.
 
35. U suprotnom, ako se estrogenski potencijal agonista može procijeniti prema 
podacima in vitro (ili in silico), oni se mogu uzeti u obzir pri odabiru doze. 
Primjerice, koli čina ispitivane kemikalije koja bi potaknula uterotropne 
reakcije jednakovrijedne referentnom agonistu (etinilestradiol) procjenjuje se prema njegovim potencijalima in vitro u odnosu na etinilestradiol. 
Najviša ispitna doza dobila bi se množenjem te jednakovrijedne doze s 
odgovaraju ćim faktorom, npr. 10 ili 100.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 822
 
Razmatranja za utvr đivanje koli činskog raspona  
36. Preliminarna studija utvr đivanja koli činskog raspona može se, prema 
potrebi, provesti na nekoliko životinja. U tom pogledu može se upotrijebiti OECD-ova Smjernica br. 19 (25) kojom su definirani klini čki znakovi 
toksičnosti ili opasnosti za životinje. Ako je tijekom te studije utvr đivanja 
količinskog raspona nakon tri dana primjene to mogu će, maternice se mogu 
odstraniti i izvagati približno 24 sata nakon posljednje doze. Ti bi se podaci potom mogli upotrebljavati u dizajnu glavne studije (za odabir prihvatljivih 
najviših i nižih doza te preporuku broja skupina za doziranje).
 
Primjena doza  
37. Ispitivana kemikalija primjenjuje se oralnom sondom ili potkožnom injek ­
cijom. Pri odabiru primjene u obzir treba uzeti dobrobit životinja, kao i 
toksikološke aspekte poput važnosti na čina na koji su ljudi izloženi kemi ­
kaliji (npr. oralne sonde za gutanje, potkožne injekcije za udisanje ili dermalnu apsorpciju), fizi čka/kemijska svojstva ispitnog materijala, 
osobito postoje ćih toksikoloških informacija i podataka o metabolizmu i 
kinetici (npr. potreba za izbjegavanjem metabolizma prvog prolaska, bolja 
učinkovitost odre đenim načinom primjene).
 
38. Preporuka je da se, kad god je to mogu će, najprije razmotri mogu ćnost 
upotrebe vodene otopine/suspenzije. Ali s obzirom na to da je ve ćina liga­
nada estrogena ili njihovih metaboli čkih prekursora hidrofobna, naj češći je 
pristup upotreba uljne otopine/suspenzije (npr. ulje kukuruza, kikirikija, sezama ili masline). Me đutim, ta ulja imaju razli čite udjele kalorija i 
masti, zbog čega bi nosa č mogao utjecati na unos ukupne metaboliziraju će 
energije (ME), čime bi se mogle izmijeniti izmjerene krajnje to čke poput 
mase maternice, osobito kod metode nezrelih životinja kojima nisu odstra ­
njeni jajnici (33). Zato prije studije treba ispitati sve nosa če koje treba 
upotrebljavati u usporedbi s kontrolama bez nosa ča. Ispitivana kemikalija 
može se otopiti u minimalnoj koli čini 95 %-tnog etanola ili drugih odgo ­
varajućih otapala te razrijediti do kona čne radne koncentracije u ispitivanom 
nosaču. Toksične karakteristike otapala moraju biti poznate te bi ih trebalo 
ispitivati u zasebnoj kontrolnoj skupini samo za otapalo. Ako se ispitivana kemikalija smatra stabilnom, pri njezinom otapanju mogu se upotrebljavati blago zagrijavanje i žustro mehani čko djelovanje. Trebalo bi utvrditi stabil ­
nost ispitivane kemikalije u nosa ču. Ako je ispitivana kemikalija stabilna 
tijekom trajanja studije, tada se može pripremiti jedan po četni alikvot ispi ­
tivane kemikalije, a utvr đene razrije đene doze pripremaju se svakodnevno.
 
39. Tempiranje doziranja ovisit će o upotrijebljenom modelu (vidjeti stavak 29. 
za model nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici i stavak 30. za model odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici). Nezrelim ženkama štakora ispitivana kemikalija dozira se svakodnevno tri uzastopna dana. 
Za ženke štakora kojima su odstranjeni jajnici jednako se tako preporu čuje 
trodnevni tretman, ali uz prihvatljiva dulja izlaganja kojima se može pobolj ­ 
šati otkrivanje kemikalija sa slabim u činkom. Ženkama miševa kojima su 
odstranjeni jajnici trodnevna primjena trebala bi biti dovoljna bez znatnog 
utjecaja produljenja do sedam dana za jake agoniste estrogena. Me đutim, 
takav odnos nije dokazan u validacijskoj studiji za slabe estrogene (16) pa bi doziranje trebalo produljiti do sedam uzastopnih dana u odraslih miševa kojima su odstranjeni jajnici. Doza bi se trebala davati svakog dana u isto 
vrijeme. Doze bi trebalo prilagoditi prema potrebi, kako bi se održala stalna 
visina doze u smislu tjelesne mase životinja (npr. mg ispitivane kemikalije po kg tjelesne mase po danu). Kad je rije č o ispitnom volumenu, njegovu 
varijabilnost na temelju tjelesne mase trebalo bi umanjiti prilago đavanjem 
koncentracije otopine za doziranje kako bi se osigurao stalni volumen na 
temelju tjelesne mase na svim visinama doze i za svaki na čin primjene.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 823
 
40. U slu čaju primjene oralnom intubacijom, ispitivanu kemikaliju treba primi ­
jeniti kao jednu dnevnu dozu pomo ću želučane sonde ili odgovaraju će 
intubacijske kanile. Maksimalan volumen teku ćine koji se može primijeniti 
odjednom ovisi o veli čini pokusne životinje. Treba slijediti lokalne smjer ­
nice o brizi za životinje, ali volumen ne bi trebao premašivati 5 ml/kg 
tjelesne mase, osim u slu čaju vodenih otopina, kada se može upotrijebiti 
10 ml/kg tjelesne mase.  
41. Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje potkožnom injekcijom, to treba 
učiniti u jednoj dnevnoj dozi. Doze bi se trebale primjenjivati u dorzalno ­
skapularnim ili lumbalnim predjelima sterilnom iglom (npr. veli čine 23 ili 
25) ili tuberkulinskom špricom. Brijanje mjesta uboda nije obvezno. Treba 
zabilježiti sve gubitke, curenja na mjestu uboda ili nepotpuno doziranje. Ukupni injektirani volumen po štakoru po danu ne bi trebao premašivati 
5 ml/kg tjelesne mase, raspore đeno na dva mjesta uboda, osim u slu čaju 
vodenih otopina, kada se može upotrijebiti 10 ml/kg tjelesne mase.
 
Opažanja  
Opća i klinička opažanja  
42. Opća klinička opažanja treba provoditi barem jednom dnevno ili češće ako 
se uoče znakovi toksi čnosti. Poželjno je opažanja provoditi svakodnevno u 
isto(-a) doba te uzimaju ći u obzir razdoblje o čekivanih vršnih u činaka 
nakon doziranja. Sve životinje trebalo bi promatrati radi znakova smrti i bolesti te op ćih kliničkih znakova poput promjena u ponašanju, na koži, 
dlaci, očima, sluznicama, pojave iscjedaka i izlu čevina te autonomne aktiv ­
nosti (npr. lakrimacija, piloerekcija, veli čina zjenica, nepravilnosti u disa ­
nju).
 
Tjelesna masa i unos hrane  
43. Sve životinje treba svakodnevno vagati do najbližeg 0,1 g, po čevši nepo ­
sredno prije po četka tretmana, odnosno kad su životinje raspore đene po 
skupinama. Dodatno se može izmjeriti i koli čina hrane unesene tijekom 
razdoblja tretmana po kavezu vaganjem posuda za hranu. Rezultate o unosu hrane treba izraziti u gramima po štakoru po danu.
 
Disekcija i vaganje maternice  
44. Štakori će se humano usmrtiti dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg 
tretmana. U idealnim uvjetima redoslijed nekropsije bit će nasumi čan 
prema skupinama kako bi se izbjegla progresija izravno prema gore ili 
dolje u skupinama za doziranje koja bi mogla suptilno utjecati na podatke. 
Cilj je biotesta izvagati mokru maternicu i maternicu kojoj je višak teku ćine 
uklonjen upijanjem. Masa mokre maternice uklju čuje maternicu i udjel 
luminalne teku ćine. Masa maternice kojoj je višak teku ćine uklonjen upija ­
njem mjeri se nakon izražavanja i uklanjanja luminalnog udjela maternice.  
45. Vagina će se prije disekcije pregledati radi stanja otvorenosti u nezrelih 
životinja. Postupak disekcije zapo činje otvaranjem abdominalnog zida na 
spoju zdjeli čnih kostiju. Potom se rog maternice i jajnici, ako postoje, 
odvajaju od dorsalnog abdominalnog zida. Mokra ćni mjehur i mokra ćovodi 
uklanjaju se s ventralne i lateralne strane maternice i vagine. Fibrozna adhezija izme đu rektuma i vagine odvaja se do spoja vaginalnog otvora i 
može se uo čiti koža potrbušnice. Maternica i vagina odvajaju se od tijela 
incizijom vaginalnog zida neposredno iznad spoja kože potrbušnice kako je 
prikazano na slici 2. Maternicu treba odvojiti od tjelesnog zida nježnim
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 824
 
rezanjem materni čnog mezenterija u to čki spajanja duž cijele duljine dorso ­
lateralnog aspekta svakog roga maternice. Nakon odstranjivanja iz tijela 
rukovanje maternicom treba biti dovoljno brzo radi izbjegavanja sušenja tkiva. Gubitak mase zbog isušivanja postaje važniji za mala tkiva poput materničnih (23). Ako postoje, jajnici se uklanjaju kod jajovoda, izbjegava ­
jući gubitak luminalne teku ćine iz roga maternice. Ako su životinji odstra ­
njeni jajnici, ostatke jajnika treba pregledati radi prisutnosti bilo kakvog tkiva jajnika. Višak masnog i vezivnog tkiva treba obrezati. Vagina se uklanja iz maternice neposredno ispod cerviksa tako da on ostane na 
tijelu maternice kako je prikazano na slici 2.
 
46. Svaku maternicu treba smjestiti u spremnik koji je jedinstveno ozna čen i 
izvagan (npr. u Petrijevu zdjelicu ili plasti čnu posudu za vaganje) uz stalnu 
pažnju radi izbjegavanja sušenja prije vaganja (npr. u spremnik se može 
staviti filtarski papir blago navlažen fiziološkom otopinom). Maternicu s 
luminalnom teku ćinom izvagat će se do najbližeg 0,1 mg (masa mokre 
maternice).  
47. Svaku će se maternicu potom pojedina čno obrađivati kako bi se uklonila 
luminalna teku ćina. Oba će se roga maternice probušiti i popre čno prerezati. 
Maternica će se smjestiti na blago navlaženi filtarski papir (npr. Whatman 
br. 3) i nježno pritisnuti drugim komadom blago navlaženog filtarskog 
papira kako bi se luminalna teku ćina u potpunosti uklonila. Maternica 
bez luminalnog udjela izvagat će se do najbližeg 0,1 mg (masa maternice 
kojoj je višak teku ćine uklonjen upijanjem).  
48. Masa maternice na završetku studije može se upotrebljavati kako bi se 
osiguralo da odgovaraju ća dob nezrelih netaknutih štakora ne bude prema ­ 
šena. Me đutim, u tom su pogledu odlu čujući povijesni podaci soja štakora 
koji laboratorij upotrebljava (vidjeti stavak 56. za tuma čenje rezultata).  
Neobvezna ispitivanja  
49. Nakon vaganja maternicu se može fiksirati u 10 %-tnom neutralnom pufe ­
riranom formalinu radi histolopatološkog pregleda nakon bojanja hemato ­
ksilinom i eosinom (HE). I vaginu se može ispitati na taj na čin (vidjeti 
stavak 9.). Osim toga, morfometrijsko mjerenje endometrijskog epitela može se obaviti radi koli činske usporedbe.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Podaci  
50. Podaci o studiji trebali bi uklju čivati:  
— broj životinja na po četku testa,  
— broj i identitet životinja koje su uginule tijekom testa ili su iz humanih 
razloga usmr ćene te datum i vrijeme smrti ili humanog usmr ćivanja,  
— broj i identitet životinja u kojih su uo čeni znakovi toksi čnosti te opis 
uočenih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme po četka, trajanje i 
težinu svih toksi čnih učinaka, te  
— broj i identitet životinja pri kojima su uo čene lezije te opis vrste lezija.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 825
 
51. Podatke o pojedina čnim životinjama treba zabilježiti u slu čaju tjelesne 
mase, mase mokre maternice i mase maternice kojoj je višak teku ćine 
uklonjen upijanjem. Za utvr đivanje je li statisti čki znatno pove ćanje (p 
< 0,05) mase maternice posljedica primjene ispitivane kemikalije treba upotrebljavati jednostrane statisti čke analize. Treba provesti odgovaraju će 
statističke analize kako bi se ispitale promjene povezane s tretmanom mase 
maternice kojoj je višak teku ćine uklonjen upijanjem i mase mokre mater ­
nice. Primjerice, podaci se mogu vrednovati pomo ću analize pristupa 
kovarijance (ANCOVA) s tjelesnom masom pri nekropsiji kao kovarija ­
blom. Logaritamska transformacija stabiliziranja varijance podataka o 
maternici može se obaviti prije analize podataka. Test Dunnetta i Hsua primjeren je za usporedbu parova svake skupine za doziranje s kontrolama nosača te za izra čun intervala pouzdanosti. Grafovi studentiziranih ostataka 
mogu se upotrebljavati za otkrivanje mogu ćih ekstremnih vrijednosti te za 
procjenu homogenosti varijanci. Ti su se postupci primjenjivali u validacij ­
skom programu OECD-a upotrebom PROC GLM-a u sustavu za statisti čku 
analizu (Institut SAS, Cary, NC), verzija 8 (6) (7).
 
52. Završno izvješ će uključuje: 
Ustanova u kojoj se obavlja ispitivanje  
— odgovorne osobe i njihove odgovornosti tijekom studije,  
— podatke iz testa osnovne pozitivne kontrole i podatke o periodi čkoj 
pozitivnoj kontroli (vidjeti stavke 26. i 27.).  
Ispitivana kemikalija  
— karakterizaciju ispitivane kemikalije,  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,  
— metodu i u čestalost pripreme otopina,  
— sve podatke o stabilnosti,  
— sve analize otopina za doziranje.  
Nosač 
— karakterizaciju ispitnog nosa ča (stanje, dobavlja č i serija),  
— obrazloženje odabira nosa ča (ako nije rije č o vodi).  
Ispitne životinje  
— vrste i soj te obrazloženje njihova odabira,  
— dobavlja ča i njegov posebni objekt,  
— dob u trenutku isporuke i datum okota,  
— za nezrele životinje, podatak jesu li isporu čene sa ženkom ili nadomje ­
snom ženkom i datum odbijanja od sise,  
— pojedinosti o postupku aklimatizacije životinja,  
— broj životinja po kavezu,  
— pojedinost i metodu identifikacije pojedina čne životinje i skupine.  
Uvjeti testa  
— pojedinosti o postupku nasumi čnog odabira, odnosno upotrijebljenoj 
metodi,  
— podloge za odabir visine doze,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 826
 
— pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije, njezinim ostvarenim 
koncentracijama, stabilnosti i homogenosti,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije i podloge za odabir puta 
izlaganja,  
— prehranu (naziv, vrsta, dobavlja č, sastav i razine fitoestrogena ako su 
poznate),  
— izvor vode (npr. voda iz slavine ili filtrirana voda) te opskrba (cjev ­ 
čicom iz ve ćeg spremnika, u bocama itd.),  
— podatke o stelji (naziv, vrsta, dobavlja č, sastav),  
— evidenciju o uvjetima smještaja u kavezima, svjetlosnom intervalu, 
temperaturi prostorije i vlazi, čišćenju prostorije,  
— detaljan opis postupaka nekropsije i vaganja maternice,  
— opis statisti čkih postupaka.  
Rezultati  
Za pojedina čne životinje:  
— sve dnevne pojedina čne tjelesne mase (od raspodjele u skupine do 
nekropsije) (do najbližeg 0,1 g),  
— dob svake životinje (u danima, po čevši od dana okota kao nultog dana) 
na početku primjene ispitivane kemikalije,  
— datum i vrijeme svake primjene doze,  
— izračunani volumen i primjenu doziranja te opažanja o svim gubicima u 
doziranju tijekom ili nakon primjene,  
— dnevnu evidenciju stanja životinje, uklju čujući relevantne simptome i 
opažanja,  
— uzrok smrti na koji se sumnja (ako je tijekom studije životinja bila pred 
uginućem ili je uginula),  
— datum i vrijeme humanog usmr ćivanja s vremenskim intervalom do 
zadnjeg doziranja,  
— masu mokre maternice (do najbližeg 0,1 mg) i sva opažanja gubitaka 
luminalne teku ćine tijekom disekcije i pripreme za vaganje,  
— masu maternice kojoj je višak teku ćine uklonjen upijanjem (do najbližeg 
0,1 mg).  
Za svaku skupinu životinja:  
— srednje dnevne tjelesne mase (do najbližeg 0,1 g) i standardna odstu ­
panja (od raspodjele u skupine do nekropsije),  
— srednje mase mokre maternice i maternice kojoj je višak teku ćine uklo­
njen upijanjem (do najbližeg 0,1 g) i standardna odstupanja,  
— dnevni unos hrane (izražen u gramima unesene hrane po životinji), ako 
se mjeri,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 827
 
— rezultate statisti čkih analiza kojima se uspore đuju mase mokre maternice 
i maternice kojoj je višak teku ćine uklonjen upijanjem tretiranih skupina 
u odnosu na iste vrijednosti kontrolnih skupina nosa ča, 
— rezultate statisti čke analize kojom se uspore đuju ukupna tjelesna masa i 
porast tjelesne mase tretiranih skupina u odnosu na iste vrijednosti 
kontrolnih skupina nosa ča. 
53. Sažetak važnih smjernica ispitne metode  
Štakori  Miševi  
Životinje  
Soj Soj laboratorijskih glodavaca koji se obi čno upotrebljava  
Broj životinja  Najmanje 6 životinja po skupini za doziranje  
Broj skupina  Najmanje 2 ispitne skupine (za primjer vidjeti stavak 33.) i 
negativna kontrolna skupina 
Za primjer pozitivnih kontrolnih skupina vidjeti stavke 26. i 27.  
Uvjeti smještaja i hranjenja  
T o u prostoriji za životinje  22 °C ± 3 °C  
Relativna vlažnost  50–60 % i ne ispod 30 % ili iznad 70 %  
Dnevni redoslijed svjetla  12 sati svjetla, 12 sati tame  
Prehrana i voda za pi će Ad libitum  
Smještaj  Pojedina čno ili u skupinama do tri životinje (za nezrele životinje 
preporučuje se smještaj prema socijalnoj skupini)  
Prehrana i stelja  Preporu čena niska razina fitoestrogena u prehrani i stelji  
Protokol  
Metoda  Metoda nezrelih životinja 
kojima nisu odstranjeni jajnici 
(poželjna) 
Metoda odraslih ženki kojima 
su odstranjeni jajnici  Metoda odraslih ženki kojima 
su odstranjeni jajnici  
Dob doziranja za nezrele 
životinje  Najranije 18. postnatalni dan. 
Doziranje treba dovršiti prije 
25. postnatalnog dana  Nije relevantno u podru čju 
primjene trenuta čne ispitne 
metode  
Dob za odstranjivanje 
jajnika  Između 6. i 8. tjedna starosti.  
Dob doziranja za životinje 
kojima su odstranjeni jajnici
 Treba pro ći najmanje 14 dana 
između odstranjivanja jajnika i 
prvog dana primjene.  Treba pro ći najmanje 7 dana 
između odstranjivanja jajnika i 
prvog dana primjene  
Tjelesna masa  Variranje tjelesne mase treba biti minimalno i ne smije prema ­ 
šivati ± 20 % srednje mase.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 828
 
Štakori  Miševi  
Doziranje  
Put primjene  Oralna sonda ili potkožna injekcija  
Učestalost primjene  Jedna dnevna doza  
Volumen za sondu ili 
injekciju  ≤ 5ml/kg tjelesne mase (ili do 10 ml/kg tjelesne mase u slu čaju 
vodenih otopina) (na dva mjesta uboda pri potkožnom putu)  
Trajanje primjene  3 uzastopna dana u modelu 
nezrelih životinja kojima nisu 
odstranjeni jajnici 
Najmanje 3 uzastopna dana u 
modelu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici
 7 uzastopnih dana u modelu 
odraslih ženki kojima su odstra ­
njeni jajnici  
Vrijeme nekropsije  Približno 24 sata nakon posljednje doze  
Rezultati  
Pozitivna reakcija  Statisti čki znatno pove ćanje srednje mase maternice (mokre i/ili 
one kojoj je višak teku ćine uklonjen upijanjem)  
Referentni estrogen  17 α-etinilestradiol  
SMJERNICE ZA TUMA ČENJE I PRIHVA ĆANJE REZULTATA  
54. Općenito, test estrogenizacije treba smatrati pozitivnim ako postoji stati ­
stički znatno pove ćanje mase maternice (p < 0,05), barem kod visoke 
doze u usporedbi s kontrolnom skupinom za otapalo. Pozitivan rezultat dodatno je potkrijepljen demonstracijom biološki vjerojatnog odnosa 
između doze i opsega reakcije, imaju ći u vidu da preklapaju ća estrogenska 
i antiestrogenska djelovanja ispitivane kemikalije mogu utjecati na oblik krivulje doza – reakcija.
 
55. Potrebno je paziti da se ne premaši maksimalna doza tolerancije kako bi se 
omogućilo smisleno tuma čenje podataka. U tom pogledu treba pomno 
procijeniti smanjenje tjelesne mase, klini čke znakove i ostale nalaze.  
56. Mase maternice kontrolne skupine nosa ča važne su za prihva ćanje podataka 
uterotropnog biotesta. Visoke kontrolne vrijednosti mogu narušiti reakciju biotesta i sposobnost otkrivanja vrlo slabih agonista estrogena. U recenzi ­
jama literature i podacima dobivenim tijekom validacije uterotropnog 
biotesta ukazuje se na to da slu čajevi srednjih vrijednosti visoke kontrole 
nastaju spontano, posebno u nezrelih životinja (2) (3) (6) (9). S obzirom na to da masa maternice nezrelih štakora ovisi o brojnim varijablama poput soja ili tjelesne mase, ne može se navesti krajnja gornja granica mase 
maternice. Primjerice, ako mase maternica kojima je višak teku ćine uklo­
njen upijanjem iznose izme đu 40 i 45 mg, rezultate treba smatrati sumnji ­
vima, a zbog vrijednosti iznad 45 mg test se može ponoviti. Me đutim, to 
treba razmotriti od slu čaja do slu čaja (3) (6) (8). Pri ispitivanju na odraslim 
štakorima zbog nepotpunog odstranjivanja jajnika ostat će tkivo jajnika koje 
može proizvoditi endogeni estrogen te usporiti regresiju mase maternice.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 829
 
57. Čini se da kontrola nosa ča maternice kojoj je višak teku ćine uklonjen 
upijanjem manja od 0,09 % tjelesne mase u nezrelih štakora i manja od 
0,04 % u mladih odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici daju prihva ­
tljive rezultate (vidjeti tablicu 31. (2)). Ako su kontrolne mase maternice veće od navedenih vrijednosti, treba ispitati razne faktore, uklju čujući dob 
životinja, pravilno odstranjivanje jajnika, prehrambene fitoestrogene itd. te 
oprezno upotrebljavati negativan rezultat testa (bez indikacije estrogenskog djelovanja).
 
58. Povijesne podatke za kontrolne skupine nosa ča treba držati u laboratoriju. 
Povijesne podatke za reakcije na pozitivne referentne estrogene, poput 17 α- 
etinilestradiola, jednako tako treba držati u laboratoriju. U laboratorijima se jednako tako može ispitivati reakcija na poznate slabe agoniste estrogena. Svi se ti podaci mogu usporediti s dostupnim podacima (2) (3) (4) (5) (6) 
(7) (8) kako bi se osigurala dovoljna osjetljivost laboratorijskih metoda.
 
59. Tijekom OECD-ove validacijske studije u masa maternica kojima je višak 
tekućine uklonjen upijanjem uo čeno je manje varijabilnosti nego u masa 
mokrih maternica (6)(7). Me đutim, znatna reakcija bilo koje vrijednosti 
ukazivala bi na to da je ispitivana kemikalija pozitivna na estrogensko 
djelovanje.  
60. Uterotropna reakcija nije u potpunosti estrogenskog podrijetla. Me đutim, 
pozitivan rezultat uterotropnog biotesta op ćenito treba tuma čiti kao dokaz 
estrogenskog potencijala in vivo, zbog čega obično treba pokrenuti radnje 
radi daljnjih pojašnjenja (vidjeti stavak 9. i „OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija”, Prilog 2.).
 
Slika 1.  
Shematski dijagram kirurškog odstranjivanja jajnika
  
Postupak po činje otvaranjem dorsolateralnog trbušnog zida u središnjoj 
točki između kostalnog ruba rebara i zdjeli čne kosti te nekoliko milimetara 
lateralno od lateralnog ruba lumbalnog miši ća. Treba utvrditi položaj jajnika 
u trbušnoj šupljini. Potom se jajnici na asepti čnoj podlozi fizi čki odvajaju 
od trbušne šupljine, izme đu jajnika i maternice veže se konac radi kontrole 
krvarenja te se jajnik odvaja incizijom iznad konca na spoju jajovoda i svakog roga maternice. Nakon potvrde da nema znatnog krvarenja, trbušni zid treba zatvoriti šavom, a kožu kop čama ili odgovaraju ćim 
šavom. Životinjama treba omogu ćiti oporavak najmanje 14 dana prije 
upotrebe kako bi se masa maternice vratila.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 830
 
Slika 2.  
Odstranjivanje i priprema tkiva maternice za vaganje.
  
Postupak zapo činje otvaranjem abdominalnog zida na spoju zdjeli čnih kostiju. 
Potom se svaki jajnik, ako postoji, i rog maternice odvajaju od dorsalnog abdo ­
minalnog zida. Mokra ćni mjehur i mokra ćovodi uklanjaju se s ventralne i late ­
ralne strane maternice i vagine. Fibrozna adhezija izme đu rektuma i vagine 
odvaja se do spoja vaginalnog otvora te se može uo čiti koža potrbušnice. Mater ­
nica i vagina odvajaju se od tijela incizijom vaginalnog zida neposredno iznad spoja kože potrbušnice kako je prikazano na slici. Maternicu treba odvojiti od tjelesnog zida nježnim rezanjem materni čnog mezenterija u to čki spajanja duž 
cijele duljine dorsolateralnog aspekta svakog roga maternice. Nakon odstranji ­
vanja iz tijela, višak masnog i vezivnog tkiva treba obrezati. Ako postoje, jajnici se uklanjaju kod jajovoda, izbjegavaju ći gubitak luminalne teku ćine iz roga 
maternice. Ako su životinji odstranjeni jajnici, ostatke jajnika treba pregledati 
radi prisutnosti bilo kakvog tkiva jajnika. Vagina se uklanja iz maternice nepo ­
sredno ispod cerviksa tako da on ostane na tijelu maternice kako je prikazano na slici. Potom se maternica može izvagati.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 831
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Antiestrogenizacija  znači sposobnost kemikalije da suzbije djelovanje estradiola 
17ß u organizmu sisavca.  
Kemikalija  znači tvar ili smjesa.  
Dan okota  je nulti postnatalni dan.  
Doziranje  znači općenit pojam koji obuhva ća dozu, u čestalost primjene doze i 
trajanje doziranja.  
Doza  znači količina primijenjene ispitivane kemikalije. Kod uterotropnog biotesta 
doza je izražena kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitne životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase/dan)
 
Maksimalna doza tolerancije (MDT)  znači najviša koli čina kemikalije koja 
nakon primjene ne uzrokuje smrt ispitnih životinja (izražena u LD0) (IUPAC, 
1993.).  
Estrogenizacija  znači sposobnost kemikalije da djeluje poput estradiola 17ß u 
organizmu sisavca.  
X-ti postnatalni dan  znači X-ti dan života nakon dana okota.  
Osjetljivost  znači udjel svih pozitivnih/aktivnih kemikalija koje su pravilno 
razvrstane primjenom testa. To je mjera to čnosti ispitne metode koja daje kate ­
gorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.  
Specifičnost znači udjel svih negativnih/neaktivnih tvari koje su pravilno 
razvrstane primjenom testa. To je mjera to čnosti ispitne metode koja daje kate ­
gorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.  
Ispitivana kemikalija  znači sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom 
metodom.  
Uterotropni  je pojam kojim se opisuje pozitivan utjecaj na rast tkiva maternice.  
Validacija  znači znanstveni postupak za karakterizaciju operativnih zahtjeva i 
ograničenja ispitne metode te za demonstraciju njezine pouzdanosti i relevant ­
nosti za odre đenu svrhu.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 832
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 833
 ▼M5 
Dodatak 2.
  
VMG mamm: Skupina za upravljanje validacijama ispitivanja i ocjenjivanja na sisavcima
 NAPOMENE UZ OKVIR  
Napomena 1.:  Ulazak na sve razine i izlazak iz njih mogu ći su te ovise o 
prirodi postoje ćih potreba za informacijama za potrebe procjene 
opasnosti i rizika.  
Napomena 2.:  Na 5. razini ekotoksikologija bi trebala uklju čivati krajnje to čke 
kojima se ukazuje na mehanizme štetnih u činaka i mogu ću 
opasnost za stanovništvo.  
Napomena 3.:  Ako je višemodalnim modelom obuhva ćeno nekoliko jedin ­
stvenih testova krajnjih to čaka, tim će se modelom zamijeniti 
njihova upotreba.  
Napomena 4.:  Procjena svake kemikalije trebala bi se temeljiti na pojedi ­
načnim slučajevima, uzimaju ći u obzir sve dostupne informacije 
i imajući u vidu funkciju okvirnih razina.  
Napomena 5.:  U ovom trenutku okvir ne treba smatrati sveobuhvatnim. Na 3., 
4. i 5. razini njime su obuhva ćeni testovi koji su dostupni ili 
koji su u postupku validacije. Kad je rije č o potonjem, oni su 
povremeno obuhva ćeni. Nakon razvoja i validacije oni će se i 
formalno dodati okviru.  
Napomena 6.:  Ne treba smatrati da 5. razina uklju čuje samo kona čne testove. 
Smatra se da testovi na toj razini doprinose op ćoj procjeni 
opasnosti i rizika.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 834
 
LITERATURA  
(1) OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, od 10. do 
11. ožujka 1998., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003.). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioas ­
say: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioas ­
say. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003.)1.
 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002.). Critical Review and Evaluation of the 
Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists 
and Antagonists: In Support of theValidation of the OECD Uterotrophic 
Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445. – 520.  
(4) OECD (2006.). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ 
JM/MONO(2006.)33.
 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001.). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogen icresponses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785. – 94.
 
(6) OECD (2006.). OECD Report of the Validation of the Rodent Utero ­
trophic Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/ 
MONO(2006.)34.
 
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003.). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: PhaseTwo – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530. – 1549
 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003.). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – 
Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550. – 1558.  
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003.). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559. – 1567.
 
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983.). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally 
castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582. – 587.  
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985.). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glandsand age-related effects of 17 β- 
estradiol. Endocrinology 117:2229. – 2237.  
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Flei ­
schmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001.). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10. – 15.
 
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953.). Estrogenic activity in 
a commercial animal ration. Science 118:650. – 651.  
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975.). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425. – 427.  
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998.). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo 
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health 
Perspec.106:369. – 373.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 835
 
(16) OECD (2007.). Additional data supporting the Test Guideline on the 
Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and 
Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002.). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145. – 157.  
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003.). The 
influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. FoodChem. Toxicol. 41:1517. – 1525.
 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002.). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613. – 620.
 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003.). Dietary phytoestrogens accelerate the time of 
vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477. – 485.  
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000.). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343. – 347.  
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002.). Dietary factors affecting uterine weights of imma ­
ture CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381. – 393.  
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987.). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci. 37:596. – 601.
 
(24) OECD (2008.). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(25) OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. OECD Environment, Health and Safety Publications 
Series on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000.)7.  
(26) OECD (2001.). Guidance document on acute oral toxicity. OECD Envi ­
ronment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 24. ENV/JM/MONO(2001.)4.
 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935.). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85:320. – 333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936.). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33. – 41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996.). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288. – 305.
 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973.). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284. – 291.  
(31) OECD (1982.). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariz.  
(32) Dorfman R.I. (1962.). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
(33) Thigpen J. E. et al. (2004.). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401. – 416.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998.). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159. – 184.
 
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960.). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807. – 1808.  
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004.). 
Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using 
in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410. – 1414.  
(37) OECD (2007.). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. 
No. 71.  
(38) Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o 
zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 837
 
B.55.  HERSHBERGEROV BIOTEST NA ŠTAKORIMA: KRAT ­
KOROČNI TEST PROBIRA ZA (ANTI)ANDROGENA SVOJSTVA  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda ekvivalentna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 
441 (2009.). OECD je 1998. godine zapo čeo aktivnost velikog prioriteta 
preispitivanja postoje ćih smjernica i razvoja novih smjernica za probir i 
ispitivanje tvari potencijalnih endokrinih disruptora (1). Jedan element aktivnosti bio je razviti smjernice ispitivanja za Hershbergerov biotest na 
štakorima. Nakon nekoliko desetlje ća korištenja u farmaceutskoj industriji 
ovaj je test 1962. godine prvo standardizirao službeni odbor stru čnjaka kao 
alat probira za androgene kemikalije (2). U razdoblju 2001.–2007. Hersh ­
bergerov biotest na štakorima bio je podvrgnut opsežnom programu valida ­
cije koji je uklju čivao izradu Osnovnog dokumenta za preispitivanje 
(Background Review Document) (23), sastavljanje detaljnog dokumenta o metodama (3), izradu smjernica za disekcije (21) i provo đenje opsežnih 
intralaboratorijskih i interlaboratorijskih studija radi dokazivanja pouzda ­
nosti i obnovljivosti biotesta. Te validacijske studije provedene su 
upotrebom snažnog referentnog androgena (testosteron propionata (TP)), dvaju snažnih sintetskih androgena (trenbolon acetata i metil testosterona), snažnog antiandrogenog lijeka (flutamida), snažnog inhibitora sinteze 
(finasterida) prirodnog androgena (dihidrotestosterona – DHT), nekoliko 
slabo antiandrogenih pesticida (linurona, vinklozolina, procimidona, p,p' DDE), snažnog inhibitora 5 α-reduktaze (finasterida) i dviju poznatih nega ­
tivnih kemikalija (dinitrofenola i nonilfenola) (4) (5) (6) (7) (8). Ova ispitna 
metoda rezultat je dugog povijesnog iskustva s biotestom i iskustva 
stečenog tijekom programa validacije ispitivanja i njime dobivenih rezultata.
 
2. Hershbergerov biotest kratki je in vivo test probira u kojem se koriste 
pomoćna tkiva muškog reproduktivnog trakta. Test je uveden 1930-ih 
godina i izmijenjen 1940-ih godina tako da uklju čuje mišiće koji reagiraju 
na androgene u muškom reproduktivnom traktu (2) (9 – 15). 1960-ih godina ocjenjivano je preko 700 mogu ćih androgena upotrebom standardizirane 
verzije protokola (2) (14) te je 1960-ih godina upotreba testa i za androgene 
i za antiandrogene smatrana standardnom metodom (2) (15). Sadašnji biotest temelji se na promjenama mase pet tkiva ovisnih o androgenima kod kastriranih peripubertalnih mužjaka štakora. Njime se ocjenjuje sposob ­
nost kemikalije da izazove biološko djelovanje koje odgovara agonistima 
androgena, antagonistima androgena ili inhibitorima 5 α-reduktaze. Pet 
ciljnih tkiva ovisnih o androgenima obuhva ćenih ovom ispitnom 
metodom jesu: ventralna prostata (VP), sjemeni vezikul (SV) (uklju čujući 
tekućinu i koaguliraju će žlijezde), levator ani-bulbokavernozni 
mišić (LABC), parne Cowperove žlijezde (COW) i glans penisa (GP). U 
kastriranog peripubertalnog mužjaka štakora svih tih pet tkiva reagira na androgene pove ćanjem apsolutne mase. Kada se ta tkiva stimuliraju na 
povećanje mase primjenom snažnog referentnog androgena, svih tih pet 
tkiva odgovara na antiandrogene smanjenjem apsolutne mase. Primarni model za Hershbergerov biotest kirurški je kastrirani peripubertalni mužjak, koji je validiran u fazama 1., 2. i 3. programa validacije Hersh ­
bergerova biotesta.
 
3. Hershbergerov biotest upotrebljava se kao mehanisti čki in vivo test probira za 
agoniste androgena, antagoniste androgena i inhibitore 5 α-reduktaze te 
njegovu primjenu treba gledati u kontekstu „Konceptualnog okvira 
OECD-a za ispitivanje i ocjenjivanje kemikalija endokrinih disruptora” 
(Dodatak 2.). U tom Konceptualnom okviru Hershbergerov biotest sadržan  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 838
 
je u razini 3. kao in vivo test kojim se dobivaju podaci o jednom endokrinom 
mehanizmu, tj. (anti)androgenosti. Namijenjen je da bude uklju čen u bateriju 
in vitro i in vivo testova za utvr đivanje kemikalija s potencijalom interakcije s 
endokrinim sustavom, što u kona čnici dovodi do ocjene opasnosti i rizika za 
zdravlje ljudi ili za okoliš.  
4. Radi zabrinutosti za dobrobit životinja zbog postupka kastracije, pokušalo 
se upotrijebiti intaktne (nekastrirane) stimulirane mužjake upravo odbijene od sise kao alternativnog modela za Hershbergerov biotest kako bi se 
izbjegla kastracija. Ispitna metoda sa stimuliranim mužjacima upravo odbi ­
jenima od sise validirana je (24); me đutim, tijekom validacijskih studija 
pokazalo se da verzijom Hershbergerova biotesta uz upotrebu mužjaka 
upravo odbijenih od sise nije mogu će konzistentno utvrditi u činke na 
masu organa ovisnih o androgenima uz upotrebu slabih antiandrogena kod ispitivanih doza. Stoga ona nije uklju čena u ovu ispitnu metodu. Me đu­
tim, prepoznavaju ći da njezino korištenje ne pruža samo korist za dobrobit 
životinja, ve ć da može pružiti i informacije o drugim na činima djelovanja, 
dostupna je u Smjernici OECD-a 115 (25).
 
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
5. Agonisti i antagonisti androgena djeluju kao ligandi za androgene receptore 
i mogu aktivirati odnosno inhibirati transkripciju gena koji kontrolira taj 
receptor. Osim toga, neke kemikalije inhibiraju konverziju testosterona u 
snažniji prirodni androgen dihidrotestosteron u nekim ciljnim tkivima za androgene (inhibitori 5 α-reduktaze). Takve kemikalije imaju potencijal 
uzrokovati štetne u činke po zdravlje, uklju čujući reproduktivne i razvojne 
učinke. Stoga postoji regulatorna potreba za brzom ocjenom i vrednovanjem 
kemikalije kao mogu ćeg agonista ili antagonista androgena ili inhibitora 5 α- 
reduktaze. Iako informativan, afinitet liganda za androgeni receptor izmjeren vezanjem na receptor ili transkripcijskom aktivacijom gena izvjestitelja in 
vitro nije jedina determinanta mogu će opasnosti. Druge determinante uklju ­ 
čuju metaboli čku aktivaciju i deaktivaciju nakon ulaska u tijelo, distribuciju 
kemikalije u ciljna tkiva i izlu čivanje iz tijela. Zbog toga se pojavljuje 
potreba probira na mogu će djelovanje kemikalije in vivo pod odgovara ­
jućim uvjetima i izloženosti. In vivo vrednovanje manje je kriti čno ako 
su poznata svojstva kemikalije u pogledu Apsorpcije – Distribucije – Meta ­
bolizma – Uklanjanja (ADME). Tkiva ovisna o androgenima odgovaraju 
brzim i snažnim rastom na stimulaciju androgenima, posebno u kastriranih 
peripubertalnih mužjaka štakora. Glodavci, a osobito štakori, isto se tako široko upotrebljavaju u studijama toksi čnosti za karakterizaciju opasnosti. 
Stoga je verzija testa u kojoj se upotrebljavaju kastrirani peripubertalni 
štakori primjerena za in vivo probir agonista i antagonista androgena i 
inhibitora 5 α-reduktaze.
 
6. Ova ispitna metoda temelji se na protokolima korištenima u validacijskoj 
studiji OECD-a koja se pokazala pouzdanom i ponovljivom u intralabora ­
torijskim i interlaboratorijskim studijama (4) (5) (6) (7) (8). U ovoj ispitnoj metodi prikazani su postupci i s androgenima i s antiandrogenima.
 
7. Iako je bilo odre đenih varijacija u dozi TP-a upotrijebljenoj za utvr đivanje 
antiandrogena u programu validacije Hershbergerova biotesta OECD-a u različitim laboratorijima (0,2 u odnosu na 0,4 mg/kg/dnevno, supkutanom 
injekcijom), postojala je mala razlika izme đu tih dviju varijanata protokola 
u pogledu sposobnosti utvr đivanja slabog ili snažnog antiandrogenog djelo ­
vanja. Me đutim, jasno je da doza TP-a ne smije biti ni previsoka kako ne bi 
blokirala u činke slabih antagonista androgenih receptora (AR) ni tako niska 
da androgena tkiva pokažu slabu reakciju rasta čak i bez istovremene 
primjene antiandrogena.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 839
 
8. Reakcija rasta pojedinih tkiva ovisnih o androgenima nije u potpunosti 
androgenog podrijetla, tj. i druge kemikalije koje nisu agonisti androgena 
mogu uzrokovati promjenu mase odre đenih tkiva. Me đutim, reakcija isto ­
vremenog rasta nekoliko vrsta tkiva potkrepljuje postojanje mehanizma specifičnijeg za androgene. Na primjer, velike doze snažnih estrogena 
mogu pove ćati masu sjemenih vezikula; me đutim, druga tkiva ovisna o 
androgenima u testu ne reagiraju na sli čan način. Antiandrogene kemikalije 
mogu djelovati ili kao antagonisti androgenih receptora ili kao inhibitori 5 α- 
reduktaze. Inhibitori 5 α-reduktaze imaju promjenjiv u činak zbog toga što se 
konverzija u snažniji dihidrotestosteron razlikuje s obzirom na vrstu tkiva. 
Antiandrogeni koji inhibiraju 5 α-reduktazu, kao što je finasterid, imaju 
izraženiji u činak na ventralnu prostatu nego na druga tkiva u usporedbi 
sa snažnim antagonistom AR-a, kao što je flutamid. Ova razlika u reakciji 
tkiva može se upotrebljavati za razlikovanje izme đu načina djelovanja 
posredovanih AR-om i 5 α-reduktazom. Osim toga, androgeni receptor 
evolucijski je povezan s receptorom drugih steroidnih hormona te neki drugi hormoni, kada se primijene u visokim, suprafiziološkim dozama, 
mogu vezati i antagonizirati u činke poticanja rasta TP-a (13). Nadalje, 
vjerojatno je i da bi pove ćani metabolizam steroida i posljedi čno smanjenje 
testosterona u serumu mogli smanjiti rast tkiva ovisan o androgenima. Stoga svaki pozitivan rezultat u Hershbergerovu biotestu treba uobi čajeno vred ­
novati primjenom pristupa mase dokaza, uklju čujući testove in vitro, kao što 
su testovi vezivanja AR-a i estrogenskih receptora (ER) i odgovaraju ći 
testovi transkripcijske aktivacije, ili iz drugih testova in vivo kojima se ispituju sli čna ciljna tkiva za androgene kao što je test na pubertalnim 
mužjacima, 15-dnevni test na intaktnim odraslim mužjacima ili 28-dnevne 
ili 90-dnevne studije s ponovljenim dozama.
 
9. Iskustvo upu ćuje na to da su ksenobiotski androgeni rje đi od ksenobiotskih 
antiandrogena. Stoga je za o čekivati da će se Hershbergerov biotest naj češće 
upotrebljavati za probir antiandrogena. Me đutim, bez obzira na to, postupak 
ispitivanja na androgene mogao bi se preporu čiti za steroidne kemikalije ili 
kemikalije sli čne steroidima ili za kemikalije za koje pretpostavka mogu ćih 
androgenih u činaka proizlazi iz metoda sadržanih u razini 1. ili 2. koncep ­
tualnog okvira (Dodatak 2.). Sli čno tome, štetni u činci povezani s (anti)an ­
drogenim profilima mogu se uo čiti u testovima razine 5., što dovodi do 
potrebe za procjenom djeluje li kemikalija endokrinim na činom djelovanja.  
10. Potvr đeno je da svi postupci u kojima se upotrebljavaju životinje trebaju biti 
sukladni s lokalnim standardima brige o životinjama; opisi brige i tretmana 
navedeni u nastavku minimalni su standardi provedbe i bit će zamijenjeni 
lokalnim propisima kao što je Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene 
svrhe (26). OECD je dao dodatne smjernice o humanom postupanju sa 
životinjama (17).
 
11. Kao i kod svih biotestova u kojima se koriste pokusne životinje, treba 
pomno razmotriti potrebu za provo đenjem ove studije. U osnovi mogu 
postojati dva razloga za takvu odluku:  
— velik potencijal izloženosti (razina 1. konceptualnog okvira) ili indika ­
cije (anti)androgenosti u testovima in vitro (razina 2.) koji podupiru provedbu istraživanja o tome mogu li se takvi u činci pojaviti in vivo,
 
— učinci koji upu ćuju na (anti)androgenost u in vivo testovima razine 4. ili 
5. koji podupiru provedbu istraživanja specifi čnog načina djelovanja, tj. 
kako bi se utvrdilo jesu li u činci posljedica (anti)androgenog 
mehanizma.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 840
 
12. Definicije koje se upotrebljavaju u ovoj ispitnoj metodi navedene su u 
Dodatku 1.  
NAČELO TESTA  
13. Pri Hershbergerovu biotestu osjetljivost se postiže upotrebom mužjaka s 
minimalnom proizvodnjom androgena. To se postiže upotrebom kastriranih 
mužjaka pod uvjetom da je nakon kastracije proteklo dovoljno vremensko 
razdoblje za regresiju ciljnih tkiva na minimalnu i ujedna čenu polaznu 
masu. Tako kod probira potencijalnog androgenog djelovanja postoje 
niske endogene razine cirkuliraju ćih androgena, os hipotalamus – hipofiza 
– gonade nije to u stanju kompenzirati povratnim mehanizmima, sposobnost tkiva na reakciju je maksimizirana te je po četna varijabilnost mase tkiva 
svedena na najmanju mogu ću mjeru. Kod probira potencijalnog antiandro ­
genog djelovanja može se posti ći konzistentniji dobitak na masi tkiva kada 
se tkiva stimuliraju referentnim androgenom. Posljedi čno, za Hershbergerov 
biotest potrebno je samo 6 životinja po skupini koja prima odre đenu dozu 
dok se za druge testove s intaktnim pubertalnim ili odraslim mužjacima 
preporučuje korištenje 15 mužjaka po skupini koja prima odre đenu dozu.
 
14. Kastraciju peripubertalnih mužjaka štakora treba provoditi na odgovaraju ći 
način upotrebom odobrenih anestetika i asepti čnom tehnikom. Prvih neko ­
liko dana nakon operacije treba primijeniti analgetike kako bi se uklonile postoperacijske tegobe. Kastracija pove ćava preciznost testa kod odre đi­
vanja slabih androgena i antiandrogena uklanjanjem kompenzatornih 
povratnih endokrinih mehanizama prisutnih kod intaktnih životinja koji mogu ublažiti u činke primijenjenih androgena i antiandrogena te uklanja ­
njem velike interindividualne varijabilnosti razina testosterona u serumu. 
Stoga se kastracijom smanjuje broj životinja potrebnih za probir na ta 
endokrina djelovanja.
 
15. Pri probiru potencijalnog androgenog djelovanja ispitivana se kemikalija 
primjenjuje svakodnevno oralnom intubacijom ili supkutanom (sc) injek ­
cijom tijekom deset uzastopnih dana. Ispitivane kemikalije primjenjuju se 
na najmanje dvije tretirane skupine pokusnih životinja primjenom jedne 
doze po skupini. Životinje se podvrgavaju nekropsiji oko 24 sata nakon primjene posljednje doze. Statisti čki značajno pove ćanje mase dvaju ili više 
ciljnih organa u skupina tretiranih ispitivanom kemikalijom u usporedbi s 
kontrolnom skupinom koja je primala nosa č upućuje na to da je ispitivana 
kemikalija pozitivna na potencijalno androgeno djelovanje (vidjeti stavak 60.). Androgeni, kao što je trenbolon, koji ne mogu biti reducirani 5α – reduktazom, imaju izraženije u činke na LABC i GP u odnosu na 
TP, ali pove ćani rast treba se prikazati na svim tkivima.
 
16. Pri probiru potencijalnog antiandrogenog djelovanja ispitivana se kemikalija 
primjenjuje svakodnevno oralnom intubacijom ili supkutanom injekcijom tijekom deset uzastopnih dana zajedno s dnevnim dozama TP-a (0,2 ili 0,4 mg/kg/dnevno) sc. injekcijom. U programu validacije utvr đeno je da 
se može koristiti ili 0,2 ili 0,4 mg/kg/dnevno TP-a zbog toga što su obje 
doze bile u činkovite kod utvr đivanja antiandrogena te stoga za korištenje u 
testu treba odabrati samo jednu dozu. Graduirane doze ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje tri tretirane skupine pokusnih životinja 
primjenom jedne doze po skupini. Životinje se podvrgavaju nekropsiji 
oko 24 sata nakon primjene posljednje doze. Statisti čki značajno smanjenje 
mase dvaju ili više ciljnih organa u skupina tretiranih ispitivanom kemika ­
lijom i TP-om u usporedbi s kontrolnom skupinom koja je primala samo TP 
upućuje na to da je ispitivana kemikalija pozitivna na potencijalno antian ­
drogeno djelovanje (vidjeti stavak 61.).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 841
 
OPIS METODE  
Odabir vrste i soja  
17. Od 1930-ih godina štakori se rutinski upotrebljavaju za Hershbergerov 
biotest. Iako je biološki vjerojatno da bi i štakori i miševi imali sli čne 
reakcije, na temelju 70 godina iskustva s modelom štakora, za Hershber ­
gerov biotest štakor je vrsta izbora. Osim toga, s obzirom na to da podaci 
dobiveni Hershbergerovim biotestom mogu biti preliminarni podaci za 
dugoročnu multigeneracijsku studiju, time se omogu ćuje da se u obje 
studije upotrebljavaju životinje iste vrste, soja i podrijetla.  
18. Ovaj protokol omogu ćuje da laboratoriji odaberu soj štakora koji će se 
upotrebljavati za test koji bi u pravilu trebao biti soj koji je laboratorij koji sudjeluje u ispitivanju upotrebljavao u prošlosti. Mogu se upotrebljavati uobičajeno korišteni sojevi laboratorijskih štakora; me đutim, ne bi trebalo 
koristiti sojeve koji sazrijevaju znatno kasnije nakon 42. dana starosti s 
obzirom na to da bi kastracija tih mužjaka u dobi od 42 dana mogla onemogućiti mjerenje glansa penisa, koje se može provesti nakon što se 
prepucij razdvoji od tijela penisa. Tako ne bi trebalo koristiti sojeve dobi ­
vene od štakora Fisher 344, osim u rijetkim slu čajevima. Štakori Fisher 344 
imaju razli čito vrijeme spolnog razvoja u usporedbi s drugim češće upotreb ­
ljavanim sojevima kao što su sojevi Sprague Dawley ili Wistar (16). Ako se upotrebljava takav soj, štakore treba kastrirati u laboratoriju u nešto starijoj 
dobi i laboratorij treba mo ći dokazati osjetljivost upotrebljavanog soja. 
Laboratorij treba dati jasno obrazloženje za odabir soja štakora. Ako bi test probira mogao biti preliminarni test za studiju s oralnom primjenom ponovljenih doza, reproduktivnu ili razvojnu studiju, ili dugoro čnu studiju, 
u svim studijama treba po mogu ćnosti upotrebljavati životinje istog soja i 
podrijetla.
 
Uvjeti smještaja i prehrane  
19. Svi postupci trebali bi biti sukladni s lokalnim standardima brige za labo ­
ratorijske životinje. Ovi opisi brige i tretmana minimalni su standardi provedbe i bit će zamijenjeni strožim lokalnim propisima, kao što je Direk ­
tiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. o zaštiti 
životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (26). Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (unutar raspona od oko ± 3 °C). Relativna vlaga treba biti minimalno 30 %, a poželjno je da ne 
prijeđe 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Cilj bi trebao biti relativna 
vlaga od 50 – 60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno. Dnevni redoslijed svjetla treba biti 12 sati svjetla, 12 sati tame.
 
20. Preporu čljiv je smještaj u skupinama u odnosu na izolaciju zbog mlade dobi 
životinja i činjenice da su štakori društvene životinje. Smještanjem dviju ili 
tri životinja po kavezu izbjegava se prenapu čenost i s njom povezan stres 
koji bi mogao ometati hormonalnu kontrolu razvoja pomo ćnog spolnog 
tkiva. Kaveze treba temeljito o čistiti kako bi se uklonili mogu ći kontami ­
nanti i smjestiti na takav na čin da se mogu ći učinci zbog smještaja kaveza 
svedu na najmanju mogu ću mjeru. Kavezima odgovaraju će veličine (~2 000 
kvadratnih centimetara) spre čava se prenapu čenost.  
21. Svaku životinju treba individualno ozna čiti (npr. oznakom ili markicom na 
uhu) primjenom humane metode. Metodu identifikacije treba zabilježiti.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 842
 
22. Laboratorijsku hranu i vodu za pi će treba osigurati ad libitum. Laboratoriji 
koji provode Hershbergerov biotest trebali bi upotrebljavati laboratorijsku 
prehranu koju uobi čajeno upotrebljavaju kod rada na ispitivanju kemikalija. 
U studijama validacije biotesta nisu uo čeni učinci ili varijacije koje bi se 
mogle pripisati prehrani. Upotrijebljenu prehranu treba zabilježiti i zadržati 
uzorak laboratorijske hrane za mogu ću buduću analizu.  
Kriteriji u činkovitosti za masu organa ovisnih o androgenima  
23. Tijekom validacijske studije nisu postojali dokazi da je smanjenje tjelesne 
mase utjecalo na pove ćanje ili smanjenje rasta mase ciljnih tkiva (tj. to treba 
biti ponderirano u ovoj studiji).  
24. Među različitim sojevima štakora koji su uspješno upotrijebljeni u programu 
validacije, mase organa ovisnih o androgenima bile su ve će u težih sojeva 
štakora nego u lakših sojeva. Stoga kriteriji u činkovitosti Hershbergerova 
biotesta ne obuhva ćaju apsolutne o čekivane mase organa za pozitivne i 
negativne kontrolne skupine.  
25. Budu ći da je koeficijent varijacije (CV) za neko tkivo u obrnuto proporcio ­
nalnom odnosu sa statisti čkom snagom, kriteriji u činkovitosti Hershberge ­
rova biotesta temelje se na maksimalnim vrijednostima CV-a za svako tkivo (tablica 1.). CV-ovi se izvode iz validacijskih studija OECD-a. U slu čaju 
negativnih rezultata laboratoriji bi trebali ispitati CV-ove iz kontrolne 
skupine i skupine koja je tretirana visokom dozom kako bi utvrdili jesu li 
premašeni maksimalni kriteriji u činkovitosti CV-a.
 
26. Studiju treba ponoviti kada: 1. tri ili više od deset mogu ćih pojedina čnih 
CV-ova u kontrolnoj skupini i u skupini koja je tretirana visokom dozom 
premašuje maksimume utvr đene za studije agonista i antagonista u tablici 1. 
i 2. najmanje dva ciljna tkiva bila su marginalno nezna čajna, tj. ρ vrijed­
nosti bile su izme đu 0,05 i 0,10.  
Tablica 1.  
Maksimalni dopušteni CV-ovi odre đeni za ciljna pomo ćna spolna tkiva 
za model kastriranih mužjaka u validacijskim studijama OECD-a  ( 1 ). 
Tkivo  Antiandrogeni u činci Androgeni u činci 
Sjemeni vezikuli  40 %  40 %  
Ventralna prostata  40 %  45 %  
LABC  20 %  30 %  
Cowperove žlijezde  35 %  55 %  
Glans penisa  17 %  22 %  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 843  
( 1 ) Prag CV-a za odre đeno tkivo utvr đen je iz grafikona CV vrijednosti – ure đen sekven ­
cijalno od najmanje do najve će – za sve srednje vrijednosti iz svih pokusa provedenih 
tijekom validacije upotrebom posebnog modela (agonist ili antagonist). Prag CV-a o čitan 
je od točke na kojoj su pove ćanja izme đu sljedećih najvećih CV-ova u seriji dramati čno 
veća od nekoliko prethodnih CV-ova- „prekretnice”. Treba napomenuti da, iako su ovom 
analizom identificirane relativno pouzdane „prekretnice” za model antagonista u testu, 
krivulje CV-a za test agonista pokazale su ujedna čenije pove ćanje zbog čega je identi ­
fikacija praga CV-a ovom metodom donekle proizvoljna.
 POSTUPAK  
Regulatorna sukladnost i laboratorijska verifikacija  
27. Za razliku od uterotrofnog testa (poglavlje B.54. ovog Priloga), za Hersh ­
bergerov test nije potrebno dokazivanje kompetencije laboratorija za zapo ­ 
činjanje studije zbog toga što se pozitivna (testosteron propionat i flutamid) 
i negativna kontrola provode istodobno kao sastavni dio testa.  
Broj i stanje životinja  
28. Svaka tretirana i kontrolna skupina treba obuhva ćati najmanje 6 životinja. 
Ovo se odnosi i na androgene i antiandrogene protokole.  
Kastracija  
29. Treba postojati po četno razdoblje aklimatizacije od nekoliko dana nakon 
primitka životinja kako bi se osiguralo da su životinje zdrave i da napre ­
duju. Budu ći da u životinja koje su kastrirane prije 42. dana života ili 42. 
postnatalnog dana (pnd) ne mora do ći do razdvajanja prepucija, životinje 
treba kastrirati 42. pnd ili kasnije, ne prije. Životinje se kastriraju pod anestezijom zarezivanjem skrotuma i uklanjanjem obaju testisa i epididimisa uz podvezivanje krvnih žila i sjemenovoda. Nakon provjere da nije došlo do 
krvarenja skrotum treba zatvoriti šavovima ili klipsama. Prvih nekoliko 
dana nakon operacije životinjama treba davati analgetike kako bi se ublažile postoperacijske tegobe. Ako se kastrirane životinje kupuju od dobavlja ča, 
dobavljač treba garantirati dob životinja i stupanj spolne zrelosti.
 
Aklimatizacija nakon kastracije  
30. Treba nastaviti aklimatizaciju životinja na laboratorijske uvjete kako bi se 
omogućila regresija mase ciljnih tkiva najmanje sedam dana nakon kastra ­
cije. Životinje treba svakodnevno promatrati te ukloniti sve životinje u kojih se pokažu znakovi bolesti ili fizi čke abnormalnosti. Tako tretman 
primjenom doza (za studiju) može zapo četi već u dobi od 49. pnd, ali ne 
kasnije od 60. pnd. Dob pri nekropsiji ne smije biti ve ća od 70. pnd. Ova 
fleksibilnost omogu ćuje laboratoriju da u činkovito planira eksperimentalni 
rad.
 
Tjelesna masa i randomizacija skupina  
31. Razlike u individualnoj tjelesnoj masi uzrok su varijabilnosti kako unutar 
skupine, tako i me đu skupinama životinja. Pove ćanje varijabilnosti mase 
tkiva ima za posljedicu pove ćani koeficijent varijacije (CV) i smanjuje 
statističku snagu testa (koja se ponekad naziva osjetljivost testa). Stoga 
varijacije tjelesne mase treba kontrolirati i eksperimentalno i statisti čki. 
32. Eksperimentalna kontrola uklju čuje izazivanje malih varijacija tjelesne mase 
unutar i me đu ispitivanim skupinama. Kao prvo, treba izbjegavati neuobi ­ 
čajeno male ili velike životinje i ne uklju čivati ih u ispitivanu kohortu. Na 
početku studije varijacija mase životinja ne bi smjela prelaziti ± 20 % 
srednje mase (npr. 175 g ± 35 g za kastrirane peripubertalne štakore). Kao drugo, životinje treba rasporediti u skupine (kako kontrolne tako i tretirane) randomizacijom distribucije mase, tako da srednja tjelesna masa 
svake skupine ne bude statisti čki različita od bilo koje druge skupine. 
Upotrijebljeni postupak blok randomizacije treba zabilježiti.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 844
 
33. Budu ći da toksi čnost može smanjiti tjelesnu masu tretiranih skupina u 
odnosu na kontrolnu skupinu, tjelesna masa prvog dana primjene ispitivane 
kemikalije može se upotrijebiti kao statisti čka kovarijanta umjesto tjelesne 
mase kod nekropsije.  
Doziranje  
34. Kako bi se utvrdilo može li ispitivana kemikalija imati androgeno djelo ­
vanje in vivo, obi čno su dovoljne dvije skupine koje primaju odre đenu dozu 
ispitivane kemikalije uz pozitivnu skupinu i skupinu koja prima nosa č 
(negativnu skupinu) (vidjeti stavak 43.) te je ovaj oblik poželjan zbog 
razloga dobrobiti životinja. Ako je svrha ili dobiti krivulju doza – reakcija ili ekstrapolirati na niže doze, potrebne su barem tri skupine koje primaju određenu dozu. Ako su potrebne i druge informacije, uz utvr đivanje andro ­
gene aktivnosti (kao što je procjena u činkovitosti), treba razmotriti razli čit 
režim doziranja. Za ispitivanje na antiandrogene ispitivana se kemikalija primjenjuje zajedno s referentnim androgenim agonistom. Treba upotreb ­
ljavati najmanje tri ispitne skupine s razli čitim dozama ispitivane kemikalije 
te pozitivnu i negativnu kontrolu (vidjeti stavak 44.). Osim tretmana ispiti ­
vanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na isti način kao i sa životinjama iz ispitne skupine. Ako se kod primjene 
ispitivane kemikalije upotrebljava nosa č, kontrolna skupina treba primati 
nosač u najvećem volumenu koji se upotrebljava kod ispitnih skupina.
 
35. Sve visine doza treba predlagati i odabirati uzimaju ći u obzir sve postoje će 
dostupne podatke o toksi čnosti i (toksiko-) kineti čke podatke za ispitivanu 
kemikaliju ili srodne materijale. Pri odre đivanju najviše doze treba prvo 
uzeti u obzir LD50 i/ili podatke o akutnoj toksi čnosti kako bi se izbjeglo 
ugibanje, jaka patnja ili stres u životinja (17) (18) (19) (20) te, kao drugo, treba uzeti u obzir dostupne podatke o dozama upotrijebljenima u ispitiva ­
njima subkroni čne i kroni čne toksičnosti. Op ćenito, najviša doza ne smije 
uzrokovati smanjenje kona čne tjelesne mase životinja ve će od 10 % mase 
životinja u kontrolnoj skupini. Najviša doza treba biti ili 1. najviša doza kojom se osigurava preživljavanje životinja i koja nema zna čajnu toksi čnost 
i ne uzrokuje patnju životinja nakon deset uzastopnih dana primjene sve do 
maksimalne doze od 1 000 mg/kg/dnevno (vidjeti stavak 36.) ili 2. doza 
koja izaziva (anti)androgene u činke, ovisno o tome koja je niža. Kao probir, 
prihvatljivi su veliki intervali izme đu doziranja, npr. polovina log jedinice 
(što odgovara progresiji doze od 3,2) ili čak jedna log jedinica. Ako nisu 
dostupni odgovaraju ći podaci, može se provesti studija za utvr đivanje 
raspona (vidjeti stavak 37.) kao pomo ć prilikom odre đivanja doza koje će 
se upotrebljavati.
 
Granična doza  
36. Ako test s grani čnom dozom od 1 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno i niža 
doza uz upotrebu opisanih postupaka za ovu studiju ne uspije uzrokovati statistički značajnu promjenu mase reproduktivnih organa, tada se dodatne 
visine doze mogu smatrati nepotrebnima. Primjenjuje se grani čna doza osim 
kada podaci o izloženosti ljudi ne upu ćuju na potrebu korištenja ve će doze.
 
Razmatranja o utvr đivanju raspona doza  
37. Ako je potrebno, može se provesti preliminarna studija utvr đivanja raspona 
doza s nekoliko životinja kako bi se odabrale odgovaraju će skupine koje će 
primati odre đenu dozu (upotrebom ispitnih metoda akutne toksi čnosti 
(poglavlja B.1.A, B.1.B ovog Priloga (27), OECD TG 425 (19))). U 
slučaju Hershbergerova biotesta cilj je odabrati doze koje osiguravaju 
preživljavanje životinja i koje nemaju zna čajnu toksi čnost i ne izazivaju  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 845
 
patnju životinja nakon deset uzastopnih dana primjene kemikalije do 
granične doze od 1 000 mg/kg/dnevno kako je navedeno u stavcima 35. i 
36. U tom pogledu može se upotrijebiti jedna Smjernica OECD-a (17) u kojoj su definirani klini čki znakovi koji upu ćuju na toksi čnost ili patnju 
životinja. Ako je izvedivo u okviru ove studije za odre đivanje raspona doza 
nakon deset dana primjene kemikalije, ciljni organi mogu se ekscidirati i 
izvagati otprilike 24 sata nakon primjene posljednje doze. Ti se podaci tada mogu upotrebljavati kao pomo ć kod odabira doza za glavnu studiju.
 
Referentne kemikalije i nosa č 
38. Referentni androgeni agonist treba biti testosteron propionat (TP), CAS 
br. 57-82-5. Referentna doza TP-a može biti ili 0,2 mg/kg – tjelesne mase/ dnevno ili 0,4 mg/kg – tjelesne mase/dnevno. Referentni androgeni antago ­
nist treba biti flutamid (FT), CAS br. 1311-84-7. Referentna doza FT-a 
treba biti 3 mg/kg – tjelesne mase/dnevno, a FT treba primijeniti istodobno 
s referentnom dozom TP-a.
 
39. Preporu čuje se, kad god je to mogu će, najprije razmotriti upotrebu vodene 
otopine/suspenzije. Me đutim, s obzirom na to da su brojni androgeni ligandi 
ili njihovi metaboli čki prekursori hidrofobni, najuobi čajeniji pristup 
upotreba je otopine/suspenzije u ulju (npr. kukuruznom, kikirikijevu, seza ­
movu ili maslinovu ulju). Ispitivane kemikalije mogu se otopiti u mini ­
malnoj koli čini od 95 % etanola ili drugih odgovaraju ćih otapala i razrijediti 
do konačne radne koncentracije u ispitnom nosa ču. Toksična svojstva 
otapala trebala bi biti poznata te ih treba ispitati u zasebnoj kontrolnoj 
skupini koja prima samo otapalo. Ako se ispitivana kemikalija smatra stabil ­
nom, može se upotrijebiti lagano zagrijavanje i snažno mehani čko djelo­
vanje kao pomo ć pri otapanju ispitivane kemikalije. Treba utvrditi stabilnost 
ispitivane kemikalije u nosa ču. Ako je ispitivana kemikalija stabilna tijekom 
trajanja studije, tada se može pripremiti jedan po četni alikvot ispitivane 
kemikalije, a specificirana razrje đenja doze mogu se pripremati svaki dan 
pazeći da se izbjegne kontaminacija i kvarenje uzoraka.  
Primjena doza  
40. TP treba primjenjivati supkutanom injekcijom, a FT oralnom intubacijom.  
41. Ispitivana kemikalija primjenjuje se oralnom intubacijom ili supkutanom 
injekcijom. Prilikom odabira na čina primjene treba uzeti u obzir pitanja 
dobrobiti životinja i fizikalna/kemijska svojstva ispitivane kemikalije. 
Osim toga, treba uzeti u obzir toksikološke aspekte kao što je relevantnost za način izloženosti ljudi kemikaliji (npr. oralna intubacija kao model za 
unos na usta, supkutana injekcija kao model za inhalaciju ili apsorpciju 
kožom) te postoje će toksikološke informacije i podatke o metabolizmu i 
kinetici (npr. potrebu za izbjegavanjem metabolizma prvog prolaza, bolju učinkovitost kod odre đenog načina primjene) prije nego što se zapo čne 
opsežno, dugoro čno ispitivanje ako su injekcijom dobiveni pozitivni 
rezultati.
 
42. Životinjama treba davati kemikaliju istim na činom primjene i u isto vrijeme 
deset uzastopnih dana u intervalima od otprilike 24 sata. Visinu doze treba svakodnevno podešavati na temelju istovremenoga svakodnevnog mjerenja tjelesne mase. Volumen doze i vrijeme njezine primjene treba bilježiti za 
svaki dan izlaganja. Treba obratiti pozornost da se ne premaši maksimalna 
doza navedena u stavku 35. kako bi se omogu ćilo smisleno tuma čenje 
rezultata. U tom pogledu treba temeljito procijeniti smanjenje tjelesne mase, klini čke znakove i druge nalaze. Kod oralne intubacije treba koristiti 
želučanu sondu ili odgovaraju ću intubacijsku kanilu. Maksimalni volumen 
tekućine koji se može jednokratno dati ovisi o veli čini pokusne životinje.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 846
 
Treba postupati u skladu s lokalnim smjernicama brige o životinjama, ali 
volumen ne smije premašivati 5 ml/kg tjelesne mase, osim u slu čaju 
vodenih otopina kada se može dati 10 ml/kg tjelesne mase. Kod supkutanih injekcija doze se mogu primjenjivati u dorzoskapularnoj i/ili lumbarnoj regiji sterilnom iglom (npr. profila 23 ili 25) i tuberkulinskom špricom. 
Brijanje mjesta injektiranja je opcionalno. Sve gubitke, curenje na mjestu 
injektiranja ili nepotpuno doziranje treba zabilježiti. Ukupni volumen injek ­
tiran svakom štakoru dnevno ne smije premašiti 0,5 ml/kg tjelesne mase.
 
Specifični postupci za androgene agoniste  
43. Kod ispitivanja androgenih agonista nosa č je negativna kontrola, a skupina 
tretirana TP-om pozitivna je kontrola. Biološka aktivnost koja odgovara 
aktivnosti androgenih agonista ispituje se primjenom ispitivane kemikalije na tretiranim skupinama u odabranim dozama tijekom deset uzastopnih dana. Masa pet pomo ćnih spolnih tkiva iz skupine koja je primala ispitivanu 
kemikaliju uspore đuje se sa skupinom koja je primala nosa č kako bi se 
utvrdilo postoji li statisti čki značajno pove ćanje mase.
 
Specifični postupci za androgene antagoniste i inhibitore 5 α-reduktaze  
44. Kod ispitivanja androgenih antagonista i inhibitora 5 α-reduktaze skupina 
tretirana TP-om negativna je kontrola, a skupina kojoj su istodobno 
davane referentne doze TP-a i FT-a pozitivna je kontrola. Biološka aktiv ­
nost koja odgovara aktivnosti androgenih antagonista i inhibitora 5 α-reduk­
taze ispituje se primjenom referentne doze TP-a i primjenom ispitivane 
kemikalije tijekom deset uzastopnih dana. Masa pet pomo ćnih spolnih 
tkiva iz skupine koja je primala TP zajedno sa skupinama koje su primale ispitivanu kemikaliju uspore đuje se sa skupinom koja je primala 
samo referentne doze TP-a kako bi se utvrdilo postoji li statisti čki značajno 
smanjenje mase.
 
OPAŽANJA  
Klinička opažanja  
45. Opća klinička opažanja treba provoditi barem jednom tjedno te češće kada 
se uoče znakovi toksi čnosti. Opažanja treba po mogu ćnosti provoditi u isto 
vrijeme svaki dan i uzimaju ći u obzir predvi đeno razdoblje vršnih u činaka 
nakon primjene doze. U svih životinja treba opažati pojavu uginu ća, pobola 
i općih kliničkih znakova kao što su promjene ponašanja, promjene na koži, 
krznu, očima, sluznicama, pojavu iscjedaka te izlu čine i aktivnost auto ­
nomnog živ čanog sustava (npr. lakrimaciju, piloerekciju, veli činu zjenica, 
nepravilnosti u disanju).  
46. Sve uginule životinje treba ukloniti i uništiti bez daljnje analize podataka. 
Sve slučajeve uginu ća životinja prije nekropsije treba uklju čiti u izvješ će 
studije zajedno sa svim o čiglednim razlozima uginu ća. Sve umiru će živo­
tinje trebale bi biti humano usmr ćene. Sve umiru će i kasnije eutanazirane 
životinje treba uklju čiti u izvješ će studije s o čiglednim razlozima za pobol.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 847
 
Tjelesna masa i potrošnja hrane  
47. Sve životinje treba vagati svakodnevno s to čnošću od 0,1 g, s po četkom 
neposredno prije zapo činjanja tretmana, tj. prilikom raspore đivanja životinja 
u skupine. Kao opcionalno mjerenje, koli čina hrane potrošene tijekom 
razdoblja tretiranja može se mjeriti po kavezu vaganjem hranilica. Rezultate 
potrošnje hrane treba izraziti u gramima po štakoru dnevno.  
Disekcija i mjerenje mase tkiva i organa  
48. Oko 24 sata nakon posljednje primjene ispitivane kemikalije štakore treba 
eutanazirati i eksangvinirati u skladu s uobi čajenim postupcima laboratorija 
koji provodi ispitivanje te provesti nekropsiju. Metodu humanog usmr ćenja 
treba zabilježiti u laboratorijskom izvješ ću. 
49. U idealnom slu čaju, redoslijed nekropsija trebao bi biti odre đen slučajnim 
odabirom me đu skupinama kako bi se izbjegla progresija izravno od 
skupina koje su primale ve ću dozu prema skupinama koje su primale 
manju dozu ili obratno koja bi mogla utjecati na podatke. Sve nalaze 
nekropsije, tj. patološke promjene/vidljive lezije zabilježiti i unijeti u izvje ­ 
šće. 
50. Treba izmjeriti pet tkiva ovisnih o androgenima (VP, SV, LABC, COW, 
GP). Ta tkiva treba ekscidirati, pažljivo s njih ukloniti okolna tkiva i masno tkivo te odrediti njihovu svježu (nefiksiranu) masu. Sa svakim tkivom treba 
postupati s posebnom pažnjom kako bi se izbjegao gubitak teku ćine i 
izbjeglo isušivanje, što može uzrokovati zna čajne pogreške i varijabilnost 
tako da se zabilježe manje mase. Neka tkiva mogu biti vrlo mala ili teška za disekciju te će to unijeti varijabilnost. Stoga je važno da osobe koje provode 
disekciju pomo ćnih spolnih tkiva budu upoznate sa standardnim postupcima 
disekcije tih tkiva. Priru čnik sa standardnim operativnim postupkom (SOP) 
za disekciju na raspolaganju je u OECD-u (21). Pomnjivom obukom u 
skladu sa smjernicom SOP-a potencijalni uzrok varijacija u studiji smanjit 
će se na najmanju mogu ću mjeru. U idealnom slu čaju ista osoba trebala bi 
biti odgovorna za disekciju odre đenog tkiva kako bi se uklonile interindi ­
vidualne razlike u obradi tkiva. Ako to nije mogu će, nekropsiju treba 
planirati tako da svaka osoba radi disekciju odre đene vrste tkiva iz svih 
tretiranih skupina, a ne da jedna osoba radi disekciju svih tkiva iz kontrolne skupine, dok je druga osoba odgovorna za tretirane skupine. Svako pomoćno spolno tkivo treba izvagati bez bojanja s to čnošću od 0,1 mg te 
zabilježiti masu za svaku životinju.
 
51. Neka tkiva mogu biti vrlo mala ili teška za disekciju te će to unijeti 
varijabilnost. Prethodni radovi upu ćuju na raspon koeficijenta varijacija 
(CVs) za koji se čini da se razlikuje ovisno o kvaliteti rada laboratorija. 
U nekoliko slu čajeva velike razlike u apsolutnoj masi tkiva kao što je VP i 
COWS uo čene su unutar pojedinog laboratorija.  
52. Opcionalno se može mjeriti masa jetara, bubrega u paru i obiju nadbu ­
brežnih žlijezda u paru. I ovdje s tkiva treba ukloniti sve okolno vezivno i masno tkivo. Jetra treba izvagati i zabilježiti masu s to čnošću od 0,1 g, a 
bubrege u paru i nadbubrežne žlijezde u paru treba izvagati i zabilježiti 
masu s to čnošću od 0,1 mg. Na jetra, bubrege i nadbubrežne žlijezde ne 
utječu samo androgeni; oni daju i korisne indicije sustavne toksi čnosti.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 848
 
53. Mjerenje luteiniziraju ćeg hormona (LH) u serumu, folikulostimuliraju ćeg 
hormona (FSH) i testosterona (T) je opcionalno. Razine testosterona u 
serumu korisne su za utvr đivanje uzrokuje li ispitivana kemikalija metabo ­
lizam testosterona u jetrima, smanjuju ći razine u serumu. Bez podataka o 
testosteronu moglo bi se činiti da takav u činak nastaje antiandrogenim 
mehanizmom. Razine LH-a pružaju informacije o sposobnosti odre đenog 
antiandrogena ne samo da smanji masu organa, ve ć i da utje če na funkciju 
hipotalamus – hipofiza, što u dugoro čnim studijama može dovesti do 
tumora testisa. FSH je važan hormon za spermatogenezu. Mjerenja T4 i 
T3 isto su tako opcionalna, a ona bi mogla pružiti dodatne informacije o 
sposobnosti reme ćenja homeostaze hormona štitne žlijezde. Ako se provode 
mjerenja hormona, štakore treba anestezirati prije nekropsije i krv uzeti punkcijom srca, a metodu anestezije treba pažljivo odabrati kako ne bi 
utjecala na mjerenje hormona. Treba zabilježiti metodu pripreme seruma, 
izvor kompleta za radioimunotest ili druga mjerenja, analiti čke postupke te 
rezultate. Razine LH-a treba navesti kao ng po ml seruma, a T treba isto navesti kao ng po ml seruma.
 
54. Disekcija tkiva opisana je kako slijedi s detaljnim smjernicama za disekciju 
s fotografijama objavljenima kao dodatni materijali kao dio programa vali ­
dacije (21). Video s disekcijom isto je tako na raspolaganju na internetskoj stranici Korejske uprave za hranu i lijekove (22).
 
— Pri ventralnoj površini životinje prema gore utvrdite je li se prepucij 
penisa razdvojio od glansa penisa. Ako jest, povucite prepucij i uklonite 
glans penisa, izmjerite ga (s to čnošću od 0,1 mg), i zabilježite masu.  
— Otvorite abdominalnu kožu i stjenku, otkrivaju ću utrobu. Ako se važu 
opcionalni organi, izvadite i izvažite jetra s to čnošću od 0,1 g, uklonite 
želudac i crijeva, izvadite i izvažite bubrege u paru i nadbubrežne 
žlijezde u paru s to čnošću od 0,1 mg. Ovom disekcijom otkriva se 
mokraćni mjehur i zapo činje disekcija ciljnih muških pomo ćnih tkiva.  
— Kako biste disecirali VP, odvojite mokra ćni mjehur od sloja ventralnih 
mišića prerezavši vezivno tkivo po sredini. Odmaknite mokra ćni mjehur 
prema naprijed prema sjemenim vezikulima (SV), otkrivaju ći lijevi i 
desni režanj ventralne prostate (koji je pokriven slojem masnog tkiva). Pažljivo odvojite masno tkivo s desnog i lijevog režnja VP-a. Pažljivo odmaknite desni režanj VP-a od uretre i disecirajte režanj iz uretre. Još 
pridržavaju ći desni režanj VP-a pažljivo odmaknite lijevi režanj VP-a od 
uretre i zatim ga disecirajte; izvažite s to čnošću od 0,1 mg i zabilježite 
masu.
 
— Kako biste disecirali SVCG, odmaknite mokra ćni mjehur kaudalno, 
otkrivajući vas deferens i desni i lijevi režanj sjemenih vezikula 
zajedno s koaguliraju ćim žlijezdama (SVCG). Sprije čite istjecanje teku ­ 
ćine postavljanjem hemostata na bazi SVCG-a, na mjestu na kojem se 
vas deferens spaja na uretru. Pažljivo disecirajte SVCG, uz postavljeni hemostat uklonite masno tkivo i adnekse, stavite ih u tariranu posudicu 
za vaganje, skinite hemostat, izvažite s to čnošću od 0,1 mg i zabilježite 
masu.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 849
 
— Kako biste disecirali levator ani i bulbokavernozne miši će (LABC), 
mišići i baza penisa su otkriveni. Miši ći LA omotani su oko kolona, 
dok su prednji miši ći LA-a i BC-a pri čvršćeni na bulbus penisa. Uklanja 
se koža i adneksi iz perianalne regije koji se prostiru od baze penisa do prednjeg kraja anusa. Miši ći BC-a se postupno diseciraju od bulbusa 
penisa i tkiva. Kolon se prereže na dva dijela te se cijeli LABC može 
disecirati i ukloniti. S LABC-a treba ukloniti masno tkivo i adnekse, izvagati ih s to čnošću od 0,1 mg, i zabilježiti masu.
 
— Nakon što je LABC uklonjen, vidljive su Cowperove ili bulbouretralne 
žlijezde (COW) na bazi, i lagano dorzalno do, bulbusa penisa. Potrebna 
je pažljiva disekcija kako bi se izbjeglo zarezivanje tanke kapsule te 
spriječilo istjecanje teku ćine. Izvažite COW u paru s to čnošću od 0,1 
mg, i zabilježite masu.  
— Osim toga, ako tijekom nekropsije i disekcije do đe do gubitka teku ćine 
iz bilo koje žlijezde, to treba zabilježiti.  
55. Ako ocjenjivanje svake kemikalije zahtijeva nekropsiju više životinja nego 
što je prihvatljivo u jednom danu, zapo činjanje studije može se provesti u 
dva stupnja tijekom dvaju uzastopnih dana, što ima za posljedicu provo ­ 
đenje nekropsije i postupaka povezanih s njom tijekom dva dana. Ako se 
postupak tako stupnjuje, u jednom danu treba obraditi jednu polovinu živo ­
tinja po tretiranoj skupini.  
56. Nakon nekropsije trupla treba uništiti na odgovaraju ći način. 
IZVJEŠĆIVANJE  
Podaci  
57. Podatke treba navesti pojedina čno (tj. tjelesnu masu, masu pomo ćnih 
spolnih tkiva, opcionalna mjerenja i druge reakcije i opažanja) te za 
svaku skupinu životinja (srednju vrijednost i standardne devijacije svih provedenih mjerenja). Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku. 
Podaci trebaju prikazivati broj životinja na po četku testa, broj životinja 
koje su tijekom testa uginule ili pokazivale znakove toksi čnosti, opis 
uočenih znakova toksi čnosti, uklju čujući vrijeme njihove pojave, trajanje i 
masu.
 
58. Kona čno izvješće treba obuhva ćati sljedeće podatke:  
Objekt u kojem se provodi ispitivanje  
— naziv objekta, lokacija,  
— voditelj ispitivanja i drugo osoblje sa zaduženjima,  
— datum po četka i završetka studije, tj. prvi dan primjene ispitivane kemi ­
kalije odnosno zadnji dan nekropsije.  
Ispitivana kemikalija  
— podrijetlo, broj lota/serije, identifikacijski podaci, čistoća, puna adresa 
dobavljača i karakterizacija ispitivane kemikalije ili kemikalija,  
— fizikalna priroda i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,  
— uvjeti skladištenja i metoda i u čestalost pripreme razrje đenja,  
— svi dobiveni podaci o stabilnosti,  
— sve analize dozirnih otopina/suspenzija.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 850
 
Nosač 
— karakterizacija nosa ča (identifikacijski podaci, dobavlja č i broj serije),  
— obrazloženje za odabir nosa ča (ako se ne radi o vodi).  
Pokusne životinje i postupci držanja životinja  
— upotrijebljena vrsta/soj i obrazloženje za odabir,  
— podrijetlo ili dobavlja č životinja, uklju čujući punu adresu,  
— broj i dob isporu čenih životinja,  
— uvjeti držanja (temperatura, osvjetljenje itd.),  
— prehrana (naziv, vrsta, dobavlja č, broj serije, sadržaj ako je poznat, 
sadržaj fitoestrogena),  
— stelja (naziv, vrsta, dobavlja č, sastav),  
— uvjeti držanja u kavezima i broj životinja po kavezu.  
Uvjeti testa  
— dob kod kastracije i trajanje aklimatizacije nakon kastracije,  
— pojedina čna masa životinja na po četku studije (s to čnošću od 0,1 g),  
— postupak randomizacije i evidencija raspodjele u skupne koje primaju 
nosač, referentnu tvar i ispitivanu kemikaliju te raspodjele u kaveze,  
— srednja vrijednost i standardna devijacija tjelesne mase za svaku skupinu 
i svaki dan kada je vršeno vaganje tijekom cijele studije,  
— obrazloženje za odabir doze,  
— način primjene ispitivane kemikalije i obrazloženje za izbor na čina 
izlaganja,  
— ako je provo đen test antiandrogenosti, tretman TP-om (doza i volumen),  
— tretman ispitivanom kemikalijom (doza i volumen),  
— vrijeme doziranja,  
— postupci nekropsije, uklju čujući način eksangvinacije i anestezije,  
— ako su provo đene analize u serumu, treba navesti pojedinosti o metodi. 
Na primjer, ako se koristi RIA, treba navesti postupak RIA, podrijetlo kompleta za RIA, datume isteka valjanosti kompleta, postupak brojanja 
scintilacijskim broja čem i standardizaciju.
 
Rezultati  
— svakodnevna opažanja za svaku životinju tijekom primjene doza, uklju ­ 
čujući: 
— tjelesnu masu (s to čnošću od 0,1 g),  
— kliničke znakove (ako ih je bilo),  
— sva mjerenja ili bilješke o potrošnji hrane,  
— opažanja kod nekropsije za svaku životinju, uklju čujući: ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 851
 
— datum nekropsije,  
— ispitnu skupinu iz koje je životinja,  
— identifikacijske podatke o životinji,  
— osobu koja je obavila disekciju,  
— vrijeme u danu kada je provedena nekropsija i disekcija,  
— dob životinje,  
— konačnu tjelesnu masu kod nekropsije, uz navo đenje svih statisti čki 
značajnih pove ćanja ili smanjenja,  
— redoslijed eksangvinacije i disekcije životinja kod nekropsije,  
— masu pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima:  
— ventralne prostate (s to čnošću od 0,1 mg),  
— sjemenih vezikula uklju čujući koaguliraju će žlijezde, uklju čujući teku­ 
ćinu (u paru, s to čnošću od 0,1 mg),  
— kompleksa levator ani plus bulbokavernozni miši ć (s točnošću od 
0,1 mg),  
— Cowperove žlijezde (svježe izvagane – u paru, s to čnošću od 0,1 mg),  
— glansa penisa (svježe izvagan s to čnošću od 0,1 mg),  
— masu opcionalnih tkiva, ako se mjerenje provodi:  
— jetara (s to čnošću od 0,1 g),  
— bubrega (u paru, s to čnošću od 0,1 mg),  
— nadbubrežnih žlijezda (u paru, s to čnošću od 0,1 mg),  
— opće napomene i komentare,  
— analize hormona u serumu, ako se provode,  
— LH u serumu (opcionalno – ng po ml seruma),  
— T u serumu (opcionalno – ng po ml seruma),  
— opće napomene i komentare.  
Sažeti prikaz podataka  
Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku navode ći veličinu uzorka 
za svaku skupinu, srednju vrijednost i standardnu pogrešku srednje vrijed ­
nosti ili standardnu devijaciju. U tablicama treba biti uklju čena tjelesna 
masa kod nekropsije, promjene tjelesne mase od po četka primjene doza 
do nekropsije, masa ciljnih pomo ćnih spolnih tkiva i sve mase opcionalnih 
organa.  
Diskusija rezultata  
Analiza rezultata  
59. Treba provesti statisti čku analizu tjelesne mase i mase organa kod nekrop ­
sije u pogledu karakteristika kao što je homogenost varijance uz odgovara ­
juću transformaciju podataka po potrebi. Tretirane skupine treba usporediti s 
kontrolnom skupinom upotrebom tehnika kao što je ANOVA nakon koje se 
provodi usporedba u parovima (npr. Dunnettov jednostrani test) i kriterij za statističku razliku, na primjer, p ≤ 0,05. Treba identificirati skupine koje 
postižu statisti čku značajnost. Me đutim, treba izbjegavati „relativne mase 
organa” zbog nevaljanih statisti čkih pretpostavki na kojima se temelji takvo 
manipuliranje podacima.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 852
 
60. Za ispitivanje agonizma androgena kontrola treba biti skupina koja je 
primala samo nosa č. Način karakteristike djelovanja ispitne kemikalije 
može dovesti do razli čitih relativnih reakcija me đu tkivima, na primjer 
trenbolon, koji se ne može reducirati 5 alfa-inhibitorima, ima izraženije učinke na LABC i GP nego TP. Statisti čki značajno pove ćanje (p ≤ 0,05) 
mase bilo koja dva ili više od pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima (VP, 
LABC, GP, CG i SVCG) treba smatrati pozitivnim rezultatom androgenog agonista, a sva ciljna tkiva trebala bi pokazivati odre đeni stupanj pove ćanog 
rasta. Kombinirana procjena reakcije svih tkiva pomo ćnih spolnih 
organa (ASO) može se posti ći upotrebom odgovaraju će multivarijacijske 
analize podataka. To može poboljšati analizu, posebno u slu čajevima 
kada samo jedno tkivo daje statisti čki značajnu reakciju.
 
61. Za ispitivanje antagonizma androgena kontrola treba biti referentna ispitna 
skupina koja je primala androgen (samo testosteron propionat). Na čin 
karakteristike djelovanja ispitne kemikalije može dovesti do razli čitih rela­
tivnih reakcija me đu tkivima, na primjer inhibitori 5 α-reduktaze, kao što je 
finasterid, imaju izrazitije u činke na ventralnu prostatu nego na druga tkiva 
u usporedbi sa snažnim AR antagonistima, kao što je flutamid. Statisti čki 
značajno smanjenje (p ≤ 0,05) mase bilo koja dva ili više od pet ciljnih 
tkiva ovisnih o androgenima (VP, LABC, GP, CG i SVCG) u vezi s tretmanom samo TP-om treba smatrati pozitivnim rezultatom androgenog antagonista, a sva ciljna tkiva trebala bi pokazivati odre đeni stupanj 
smanjenog rasta. Kombinirana procjena reakcije svih ASO tkiva može se 
postići upotrebom odgovaraju će multivarijacijske analize podataka. To 
može poboljšati analizu, posebno u slu čajevima kada samo jedno tkivo 
daje statisti čki značajnu reakciju.
 
62. Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku koji uklju čuje srednju 
vrijednost, standardnu pogrešku srednje vrijednosti (standardna devijacija isto bi bila prihvatljiva) i veli činu uzorka za svaku skupinu. Treba uklju čiti 
i tablice s pojedina čnim podacima. Treba ispitati pojedina čne vrijednosti, 
srednju vrijednost, vrijednosti SE-a (SD-a) i CV-a za kontrolne podatke 
kako bi se utvrdilo zadovoljavaju li kriterije prihvatljivosti za sukladnost s očekivanim povijesnim vrijednostima. Na temelju CV-a koji premašuju 
vrijednosti CV-a navedene u tablici 1. (vidjeti stavke 25. i 26.) za svaku 
masu organa treba utvrditi postoje li pogreške u bilježenju ili unosu poda ­
taka ili postoji li mogu ćnost da laboratorij još nije ovladao preciznom 
disekcijom tkiva ovisnih o androgenima te je potrebna dodatna obuka/pra ­
ksa. Općenito, CV-ovi (standardna devijacija podijeljena sa srednjom 
masom organa) su reproducibilni od laboratorija do laboratorija i od 
studije do studije. Prikazani podaci trebali bi uklju čivati najmanje: ventralnu 
prostatu, sjemeni vezikul, levator ani plus bulbokavernozni miši ć, Cowpe­
rove žlijezde, glans penis, jetra te tjelesnu masu i promjenu tjelesne mase od 
početka primjene doza do nekropsije. Podaci se mogu prikazati i nakon 
podešavanja kovarijance tjelesne mase, ali to ne smije zamijeniti prikazi ­
vanje nepodešenih podataka. Osim toga, ako ne do đe do razdvajanja 
prepucija (PPS) ni u jednoj od skupina, treba zabilježiti u čestalost PPS-a 
i statistički usporediti s kontrolnom skupinom korištenjem Fisherova 
egzaktnog testa.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 853
 
63. Pri provjeri to čnosti računalno unesenih podataka s originalno zapisanim 
podacima treba pažljivo prou čiti vrijednosti mase organa koje nisu biološki 
vjerojatne ili variraju više od tri standardne devijacije od srednjih vrijednosti tretiranih skupina te će ih možda biti potrebno odbaciti, s obzirom na to da 
su to vjerojatno pogreške nastale tijekom bilježenja.
 
64. Usporedba rezultata studije s vrijednostima CV-a OECD-a (u tablici 1.) 
često je važan korak u interpretaciji valjanosti rezultata studije. U labora ­
toriju treba čuvati povijesne podatke za kontrolne skupine koje su primale 
nosač. U laboratoriju treba čuvati i povijesne podatke za reakcije za pozi ­
tivne referentne kemikalije, kao što su TP i FT. Laboratoriji mogu i perio ­
dično ispitivati reakciju na poznate slabe androgene agoniste i antagoniste i 
čuvati te podatke. Ti se podaci mogu usporediti s raspoloživim podacima 
OECD-a kako bi se zajam čilo da metode upotrijebljene u laboratoriju osigu ­
ravaju dovoljnu statisti čku preciznost i snagu.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 854
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Androgen  je termin koji se upotrebljava za opisivanje pozitivnog utjecaja na rast 
tkiva ovisnih o androgenima  
Antiandrogen  znači sposobnost kemikalije da blokira djelovanje TP-a u organ ­
izmu sisavaca.  
Kemikalija  znači tvar ili mješavina.  
Datum okota  znači postnatalni dan 0.  
Doza  znači količina primijenjene ispitivane kemikalije. Kod Hershbergerova 
biotesta doza se izražava kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitivane životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase/dnevno).
 
Doziranje  je općeniti termin koji obuhva ća dozu, u čestalost i trajanje doziranja.  
Na umoru  je termin koji se upotrebljava za opisivanje životinje u stanju ugiba ­
nja, tj. blizu trenutka uginu ća. 
Postnatalni dan X  znači X-ti dan života nakon dana okota.  
Osjetljivost  znači sposobnost ispitne metode da to čno identificira kemikalije koje 
imaju svojstvo na koje se ispituju.  
Specifičnost znači sposobnost ispitne metode da to čno identificira kemikalije 
koje nemaju svojstvo na koje se ispituju.  
Ispitivana kemikalija  znači svaka tvar ili mješavina koja se ispituje upotrebom 
ove ispitne metode.  
Validacija  je znanstveni postupak koji ima za cilj karakterizaciju operativnih 
zahtjeva i ograni čenja ispitne metode te dokazivanja pouzdanosti i relevantnosti 
za određenu svrhu.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 855
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 856
 ▼M5 
Dodatak 2.
  
VMG mamm: Skupina za upravljanje validacijama ispitivanja i ocjenjivanja na sisavcima
 NAPOMENE UZ OKVIR  
Napomena 1.:  Moguć je ulazak na svim razinama i izlazak na svim razinama 
što ovisi o prirodi potreba za postoje ćim informacijama u svrhe 
procjene opasnosti i rizika  
Napomena 2.:  Na Razini 5., ekotoksikologija bi trebala obuhva ćati krajnje 
točke koje upu ćuju na mehanizme štetnih u činaka i potencijalnu 
štetu za populaciju  
Napomena 3.:  Kada multimodalni model obuhva ća nekoliko testova s jednom 
krajnjom to čkom, taj bi model zamijenio upotrebu tih testova s 
jednom krajnjom to čkom 
Napomena 4.:  Ocjenjivanje svake kemikalije trebalo bi se temeljiti na pristupu 
ovisnom o pojedinom slu čaju, uzimaju ći u obzir sve raspoložive 
informacije, imaju ći na umu funkciju razina okvira.  
Napomena 5.:  Okvir trenuta čno ne treba smatrati sveobuhvatnim. Na razinama 
3., 4. i 5. on obuhva ća testove koji su ili na raspolaganju ili za 
koje je validacija u tijeku. U pogledu ovih drugih, oni su uklju ­ 
čeni privremeno. Nakon što budu razvijeni i validirani bit će 
formalno dodani u okvir.  
Napomena 6.:  Ne treba smatrati da razina 5. obuhva ća samo definitivne 
testove. Smatra se da testovi uklju čeni na toj razini doprinose 
općoj procjeni opasnosti i rizika.  
LITERATURA  
(1) OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. ožujka 
1998., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) Dorfman RI (1962.). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005.). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antian ­
drogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.
 
(4) OECD (2006.). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testo ­
sterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental 
Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N  o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008.). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
(6) OECD (2007.). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006.). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265. – 1269.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007.). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671. – 8.
 
(9) Korenchevsky V (1932.). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J 26:413. – 422.  
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932.). The response of 
castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J 
26:1306. – 1314.  
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950.). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38. – 44.  
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949.). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113. – 119.
 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953.). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175. – 180.  
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964.). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman RI (1969.). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151. – 220.
 
(16) Massaro EJ (2002.). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, str. 38.  
(17) OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(18) OECD (1982.). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariz.  
(19) OECD (2008.). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001.). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006.). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265. – 1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http:// rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.
 
(23) OECD (2008.). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
(24) OECD (2008.). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009.). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 858
 
(26) Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vije ća od 22. rujna 2010. 
zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (SL L 276, 20.10.2010., 
str. 33.).  
(27) Sljede ća poglavlja ovog Priloga:  
B.1.A, Akutna oralna toksi čnost – postupak s fiksnom dozom  
B.1.B, Akutna oralna toksi čnost – metoda klase akutne toksi čnosti ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 859
 
B.56.  PRODULJENA STUDIJA REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA 
JEDNOJ GENERACIJI  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 443 
(2012.). Temelji se na prijedlogu Tehni čkog odbora za ocjenu sigurnosti 
poljoprivrednih kemikalija (ACSA) Instituta za znanosti o zdravlju i okolišu (HESI) Me đunarodnog instituta za znanost o životu (ILSI) za 
produljenu studiju reproduktivne toksi čnosti na jednoj generaciji za 
životnu fazu F
 1 kako je objavljena u Cooper et al., 2006. (1). U dizajn 
studije uneseno je nekoliko poboljšanja i pojašnjenja kako bi se osigurala fleksibilnost i naglasila važnost zapo činjanja s postoje ćim spoznajama uz 
upotrebu opažanja uživo radi usmjeravanja i prilagodbe ispitivanja. Ovom 
se ispitnom metodom pruža detaljan opis operativne provedbe produljene 
studije reproduktivne toksi čnosti na jednoj generaciji. Ovom se ispitnom 
metodom opisuju tri kohorte životinja F
 1 : 
1. kohorta: procjenjuju se reproduktivne/razvojne krajnje to čke; ova se 
kohorta može produljiti kako bi uklju čivala generaciju F  2 , 
2. kohorta: procjenjuje se mogu ći učinak izloženosti kemikaliji na živ čani 
sustav u razvoju,  
3. kohorta: procjenjuje se mogu ći učinak izloženosti kemikaliji na imuno ­
loški sustav u razvoju.  
2. Odluke o procjenjivanju druge generacije i ispuštanju kohorte za razvojnu 
neurotoksi čnost i/ili kohorte za razvojnu imunotoksi čnost trebale bi odraža ­
vati postoje će spoznaje o kemikaliji koja se vrednuje, kao i potrebe 
različitih regulatornih tijela. Svrha je ove ispitne metode pružiti informacije 
o načinu na koji se studija može provoditi te na činu na koji treba vrednovati 
svaku kohortu.  
3. Postupak odlu čivanja o internim okida čima za proizvodnju 2. generacije 
opisuje se u OECD-ovoj Smjernici 117 (39) za ona regulatorna tijela 
koja ih upotrebljavaju.  
Početna razmatranja i ciljevi  
4. Glavni je cilj produljene studije reproduktivne toksi čnosti na jednoj genera ­
ciji vrednovanje specifi čnih životnih faza koje nisu obuhva ćene ostalim 
vrstama studija toksi čnosti te ispitivanje u činaka koji mogu nastati kao 
posljedica prenatalne i postnatalne izloženosti kemikaliji. Kod reproduk ­
tivnih krajnjih to čaka za otkrivanje u činaka na reproduktivne organe u 
mužjaka i ženki predvi đa se, kao prvi korak te prema dostupnosti, upotreba 
informacija iz studija s ponovljenim dozama (uklju čujući studije probira 
reproduktivne toksi čnosti, npr. OECD-ova Smjernica za ispitivanje 422 
(32)), ili kratkoro čnih testova probira endokrinih disruptora (npr. uterotropni 
biotest – ispitna metoda B.54. (36) te Hershbergerova testa – ispitna metoda B.55. (37)). To može uklju čivati spermatogenezu (histopatologiju testisa) u 
mužjaka te cikluse estrusa, broj folikula/sazrijevanje jajnih stanica i inte ­
gritet jajnika (histopatologiju) u ženki. Produljena studija reproduktivne 
toksičnosti na jednoj generaciji tada služi kao test za reproduktivne 
krajnje to čke za koje je potrebna interakcija mužjaka i ženki, ženki sa 
zamecima te ženki s potomcima i generacije F
 1 do završetka spolnog sazri ­
jevanja (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 kojom se potvr đuje ova ispitna 
metoda (40)).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 860
 
5. Ova je ispitna metoda namijenjena vrednovanju prenatalnih i postnatalnih 
učinaka kemikalija na razvoj, kao i temeljitom vrednovanju sistemske 
toksičnosti u ženki koje su skotne i koje doje te u mladih i odraslih poto ­
maka. Očekuje se da će se detaljnim pregledom klju čnih razvojnih krajnjih 
točaka, poput preživljavanja potomaka, neonatalnog zdravlja, razvojnog 
statusa pri okotu te fizi čkog i funkcionalnog razvoja do odrasle dobi, utvr ­
diti specifi čni ciljni organi u potomaka. Osim toga, studija će pružiti i/ili 
potvrditi informacije o u čincima ispitivane kemikalije na integritet i funk ­
cioniranje reproduktivnih sustava odraslih mužjaka i ženki. To čnije, ali ne 
isključivo, razmatraju se sljede ći parametri: funkcija gonada, ciklus estrusa, 
sazrijevanje sperme iz epididimisa, ponašanje prilikom parenja, za čeće, 
skotnost, parturicija i laktacija. Nadalje, s pomo ću informacija iz procjena 
razvojne neurotoksi čnosti i razvojne imunotoksi čnosti karakterizirat će se 
mogući učinci u tim sustavima. Podacima iz tih ispitivanja trebalo bi 
omogućiti utvrđivanje visine doze kod koje se ne uo čava štetni 
učinak (NOAEL), visine doze kod koje se uo čava najslabiji 
učinak (LOAEL) i/ili referentnih doza za razli čite krajnje to čke i/ili ih 
treba upotrebljavati za karakterizaciju u činaka otkrivenih u ranijim studi ­
jama s ponovljenim dozama i/ili bi oni trebali služiti kao smjernica za naknadno ispitivanje.
 
6. Shematski prikaz protokola prikazan je na slici 1. Ispitivana kemikalija 
primjenjuje se stalno u graduiranim dozama na nekoliko skupina spolno zrelih mužjaka i ženki. Toj roditeljskoj (P) generaciji doza se daje 
tijekom odre đenog razdoblja prije parenja (odabir na temelju dostupnih 
informacija za ispitivanu kemikaliju, ali najmanje dva tjedna) i tijekom dva tjedna razdoblja parenja. Mužjaci P dalje se tretiraju najmanje do odbi ­
janja od sise generacije F
 1 . Njih treba tretirati najmanje 10 tjedana. Njih je 
moguće i dulje tretirati ako postoji potreba za pojašnjenjem u činaka na 
reprodukciju. Tretman ženki P nastavlja se tijekom graviditeta i laktacije do usmrćenja nakon odbijanja njihovih legala od sise (odnosno 8 – 10 
tjedana tretmana). Potomci F
 1 nastavljaju se tretirati ispitivanom kemika ­
lijom od odbijanja od sise do odrasle dobi. Ako se procjenjuje druga 
generacija (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 117 (39)), potomci F  1 ostat će u 
tretmanu do odbijanja generacije F  2 ili do završetka studije.  
7. Na svim životinjama provode se klini čka opažanja i patološka ispitivanja 
kako bi se utvrdili znakovi toksi čnosti s posebnim naglaskom na integritet i 
funkcioniranje muških i ženskih reproduktivnih sustava kao i zdravlje, rast, 
razvoj i funkciju potomstva. Kod odbijanja od sise odabrani potomci raspo ­
ređuju se u posebne podskupine (kohorte 1. – 3., vidjeti stavke 33. i 34. i 
sliku 1.) radi daljnjih ispitivanja, uklju čujući spolno sazrijevanje, integritet i 
funkcioniranje reproduktivnih organa, neurološke i bihevioralne krajnje 
točke i imunološke funkcije.  
8. Pri provo đenju studije treba slijediti op ća načela i razmatranja navedena u 
OECD-ovoj Smjernici br. 19 o priznavanju, procjeni i korištenju klini čkih 
znakova kao krajnjih to čaka za pokusne životinje koje se upotrebljavaju u 
ocjenama sigurnosti (34).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 861
 
9. Kada za utvr đivanje učinka ovog novog dizajna studije bude dostupan 
dovoljan broj studija, ispitna metoda će se revidirati i, prema potrebi, prila ­
goditi ste čenom iskustvu.  
Slika 1.  
Shema produljene studije reproduktivne toksi čnosti na jednoj generaciji
  
OPIS METODE/PRIPREMA ZA ISPITIVANJE  
Životinje  
Odabir vrsta i soja životinja  
10. Odabir vrste za ispitivanje reproduktivne toksi čnosti treba pomnjivo 
razmotriti s obzirom na sve dostupne podatke. Me đutim, zbog koli čine 
podataka i mogu ćnosti usporedbe s ispitivanjem op će toksičnosti, štakor 
je u pravilu poželjna vrsta te se kriteriji i preporuke u ovoj ispitnoj metodi odnose na tu vrstu. Ako se upotrebljavaju druge vrste, treba navesti obrazloženje, a bit će potrebne i primjerene modifikacije protokola. 
Sojeve slabe plodnosti ili poznate po velikoj u čestalosti spontanih razvojnih 
defekata ne bi trebalo upotrebljavati.
 
Starost, tjelesna masa i kriterij uklju čivanja  
11. Treba upotrebljavati zdrave roditeljske životinje koje nisu sudjelovale u 
ranijim pokusima. Treba prou čavati mužjake i ženke koje još nisu imale 
potomstvo i koje nisu skotne. Životinje P trebale bi biti spolno zrele, 
jednake mase (po spolu) na po četku doziranja, sli čne starosti (približno 
90 dana) kod parenja te bi trebale predstavljati vrstu i soj koji se ispituju. Aklimatizacija životinja treba trajati najmanje 5 dana od dolaska. Životinje se nasumi čno raspore đuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje tako 
da srednje vrijednosti tjelesne mase skupina (npr. ± 20 % srednje vrijedno ­
sti) budu usporedive.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 862
 
Uvjeti smještaja i hranjenja  
12. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C 
(± 3 °C). Relativna vlažnost treba biti izme đu 30 % i 70 %, uz idealni 
raspon od 50 % do 60 %. Raspored umjetnog svjetla treba biti 12 sati 
svjetla, 12 sati tame. Može se primjenjivati standardna hrana za laborato ­
rijske životinje uz neograni čene količine vode za pi će. Treba paziti na udio 
fitoestrogena u prehrani s obzirom na to da visoka razina fitoestrogena u prehrani može utjecati na neke reproduktivne krajnje to čke. Preporu čuje se 
standardizirana prehrana poznate formule sa smanjenim estrogenskim kemi ­
kalijama. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovara ­
juća mješavina ispitivane kemikalije ako se ona daje u hrani. Treba potvrditi 
sadržaj, homogenost i stabilnost ispitivane kemikalije u prehrani. Hranu i 
vodu za pi će treba redovno analizirati s obzirom na kontaminante. Uzorke 
svake serije hrane upotrijebljene tijekom studije treba sa čuvati u odgovara ­
jućim uvjetima (npr. zamrznute na – 20 °C) do dovršetka izvješ ća u slučaju 
da je zbog rezultata potrebna daljnja analiza sastava hrane.
 
13. Životinje treba smjestiti u kaveze u malim skupinama istog spola i skupine 
za tretiranje. Životinje se mogu smjestiti pojedina čno kako bi se izbjegle 
moguće ozljede (npr. mužjaci nakon razdoblja parenja). Postupci parenja 
trebali bi se odvijati u odgovaraju ćim kavezima. Nakon što je došlo do 
kopulacije, ženke koje se smatra skotnima smješta se odvojeno u kaveze 
za okot ili materinstvo gdje im je osiguran odgovaraju ći i utvrđeni materijal 
za pravljenje gnijezda. Legla se smješta s majkama do odbijanja od sise. Životinje F
 1 treba smjestiti u male skupine istog spola i skupine za tretiranje 
od odbijanja od sise do završetka studije. Životinje se mogu zasebno smje ­
stiti ako je to znanstveno opravdano. Razina fitoestrogena u odabranoj stelji treba biti minimalna.
 
Broj i identifikacija životinja  
14. U pravilu bi se u svakoj ispitnoj i kontrolnoj skupini trebao nalaziti dovo ­
ljan broj parova koji će se pariti kako bi se dobilo najmanje 20 skotnih 
ženki po skupini za doziranje. Cilj je dobiti dovoljno skotnih životinja kako bi se osigurala valjana procjena potencijala kemikalije da utje če na plod ­
nost, skotnost i ponašanje majki životinja generacije P te na rast i razvoj 
potomstva F
 1 od začeća do sazrijevanja. Studija nije nužno nevaljana zbog 
neuspjeha u dobivanju željenog broja skotnih životinja, što treba vrednovati od slučaja do slu čaja uzimaju ći u obzir mogu ći uzročno-posljedi čni odnos s 
ispitivanom kemikalijom.
 
15. Prije po četka doziranja svakoj životinji P dodjeljuje se jedinstveni identifi ­
kacijski broj. Ako je iz povijesnih podataka laboratorija vidljivo da je moguće da u znatnog broja ženki nema redovnih ( četverodnevnih ili pete ­
rodnevnih) ciklusa estrusa, prije po četka tretmana preporu čuje se njihova 
procjena. Alternativno, veli čina skupine može se pove ćati kako bi se osigu ­
ralo da na po četku tretmana najmanje 20 ženki u svakoj skupini ima 
redovne ( četverodnevne ili peterodnevne) cikluse estrusa. Svi potomci F
 1 
pri prvom pregledu nultog ili 1. postnatalnog dana dobivaju jedinstvenu 
identifikaciju. Tijekom studije treba voditi evidenciju o leglu podrijetla za 
sve životinje F  1 , a za životinje F  2 prema potrebi.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 863
 
Ispitivana kemikalija  
Dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji  
16. Revizija postoje ćih informacija važna je za donošenje odluke o putu 
primjene, odabiru nosa ča, odabiru životinjske vrste, odabiru doza i 
mogućoj izmjeni rasporeda doziranja. Zato kod planiranja produljene 
studije reproduktivne toksi čnosti na jednoj generaciji treba uzeti u obzir 
sve relevantne dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, odnosno 
fizikalno-kemijska, toksikokineti čka (uklju čujući metabolizam specifi čan 
za vrstu), toksikodinami čka obilježja, odnose izme đu strukture i aktivnosti, 
metaboličke postupke in vitro, rezultate ranijih studija toksi čnosti i rele ­
vantne informacije o strukturalnim analogijama. Privremene informacije o 
apsorpciji, distribuciji, metabolizmu i eliminaciji (ADME) te bioakumulaciji moguće je izvesti iz kemijske strukture, fizikalno-kemijskih podataka, 
raspona vezivanja na proteine plazme ili toksikokineti čkih studija, dok 
rezultati studija toksi čnosti pružaju dodatne informacije, npr. o vrijedno ­
stima pri kojima nisu uo čeni štetni u činci, metabolizmu ili indukciji 
metabolizma.
 
Razmatranje toksikokineti čkih podataka  
17. Iako nisu obvezni, toksikokineti čki podaci iz ranijih studija za odre đivanje 
raspona doze ili ostalih studija iznimno su korisni kod planiranja dizajna 
studije, odabira visina doze i tuma čenja rezultata. Osobito su korisni podaci 
kojima: 1. se provjerava izloženost ispitivanoj kemikaliji (ili relevantnim metabolitima) fetusa u razvoju i mladunaca, 2. se osigurava procjena interne 
dozimetrije te 3. se procjenjuje mogu ća zasićenost kineti čkih postupaka koja 
ovisi o dozi. Treba razmotriti i dodatne toksikokineti čke podatke, poput 
profila metabolita, vremenskih tijekova koncentracije itd., ako su dostupni. Tijekom glavne studije mogu se prikupljati i dopunski toksikokineti čki 
podaci ako se time ne ometa prikupljanje i tuma čenje krajnjih to čaka 
glavne studije.
 
Opća je uputa da bi sljede ći skup toksikokineti čkih podataka bio koristan 
pri planiranju produljene studije reproduktivne toksi čnosti na jednoj 
generaciji:  
— kasni graviditet (npr. 20. gestacijski dan) – krv majke i krv fetusa,  
— središnje razdoblje laktacije (10. PND) – krv majke, krv mladunca i/ili 
mlijeko,  
— rano razdoblje nakon odbijanja od sise (npr. 28. PND) – uzorci krvi 
životinja koje se odbijaju od sise.  
Pri utvrđivanju odre đenih analita (npr. roditeljska kemikalija i/ili metaboliti) 
i sheme uzorkovanja treba biti fleksibilan. Primjerice, broj uzoraka i vrijeme 
prikupljanja u odre đenom danu kad se provodi uzorkovanje ovisit će o putu 
izloženosti i ranijim spoznajama o toksikokineti čkim obilježjima u životinja 
koje nisu skotne. Kod studija u kojima se primjenjuje normalno hranjenje 
dovoljno je jedno uzorkovanje u isto vrijeme svih dana, dok prilikom 
doziranja sondom može biti potrebno više vremena uzorkovanja radi bolje procjene raspona internih doza. Me đutim, nije potrebno generirati cijeli 
vremenski tijek koncentracije bilo kojeg dana uzorkovanja. Po potrebi krv 
je moguće izvaditi po spolu unutar legala radi analiza fetusa i životinja koje 
su tek oko ćene.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 864
 
Put primjene  
18. Odabirom puta primjene treba uzeti u obzir putove koji su najrelevantniji za 
izlaganje ljudi. Iako je dizajniran za primjenu ispitivane kemikalije hranom, protokol se može mijenjati za primjenu drugim putevima (voda za pi će, 
sonda, inhalacija, dermalno) ovisno o karakteristikama kemikalije i 
potrebnih informacija.
 
Odabir nosa ča 
19. Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovara ­
jućem nosaču. Preporu čuje se, po mogu ćnosti, prvo razmotriti upotrebu 
vodene otopine/suspenzije, a zatim otopine/suspenzije u ulju (npr. kuku ­
ruznom ulju). Za sve druge nosa če osim vode treba poznavati toksi čne 
karakteristike nosa ča. Treba izbjegavati upotrebu nosa ča koji mogu biti 
intrinzično toksični (npr. aceton, DMSO). Treba utvrditi stabilnost ispitivane 
kemikalije u nosa ču. Ako se za doziranje upotrebljava nosa č ili drugi aditiv, 
treba uzeti u obzir sljede će karakteristike: u činke na apsorpciju, distribuciju, 
metabolizam ili zadržavanje ispitivane kemikalije, u činke na kemijska svoj ­
stva ispitivane kemikalije koji mogu izmijeniti njezina toksi čna obilježja te 
učinke na unos hrane i vode ili nutritivni status životinja.  
Odabir doze  
20. U pravilu bi studija trebala uklju čivati najmanje tri visine doze i usporednu 
kontrolu. Pri odabiru odgovaraju ćih visina doze istraživa č bi trebao 
razmotriti sve dostupne informacije, uklju čujući informacije o doziranju iz 
ranijih studija, toksikokineti čke podatke o životinjama koje su skotne i koje 
nisu skotne, opseg laktacijskog transfera te procjene o izlaganju ljudi. Ako 
su dostupni toksikokineti čki podaci koji ukazuju na zasi ćenost toksikoki ­
netičkih postupaka koja ovisi o dozi, treba izbjegavati visoke doze kod 
kojih se zasi ćenost jasno uo čava, naravno uz uvjet da se o čekuje da su 
izlaganja ljudi znatno ispod to čke zasićenosti. U takvim bi slu čajevima 
najviša doza za tranziciju u nelinearno toksikokineti čko ponašanje trebala 
biti u točki infleksije ili neznatno iznad nje.  
21. U izostanku relevantnih toksikokineti čkih podataka visine doza trebale bi se 
temeljiti na toksi čnim učincima, osim ako su ograni čene fizičkom ili kemij ­
skom prirodom kemikalije. Ako se visine doza temelje na toksi čnosti, 
najvišu dozu treba odabrati s ciljem izazivanja odre đene sistemske toksi č­
nosti, ali ne smrti ili teške patnje životinja.  
22. Treba odabrati niz sve nižih doza kako bi se dokazali svi u činci povezani s 
dozom te utvrdile vrijednosti kod kojih nisu uo čeni štetni u činci ili doze 
blizu granice otkrivanja s pomo ću kojih bi se izra čunala referentna doza za 
najosjetljivije krajnje to čke. Dvostruki ili četverostruki intervali često su 
optimalni za izbjegavanje velikog raspona doza izme đu vrijednosti kod 
kojih nisu uo čeni štetni u činci i vrijednosti kod kojih je uo čena najniža 
razina štetnog u činka. Često je dodavanje četvrte ispitne skupine poželjnije 
od upotrebe vrlo velikog intervala (npr. ve ćeg od faktora 10) izme đu doza.  
23. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnim 
skupinama postupa se jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ta bi skupina trebala biti netretirana ili placebo kontrolna skupina ili kontrolna skupina tretirana samo nosa čem, ako se kod primjene ispitivane kemikalije 
upotrebljava nosa č. Ako se upotrebljava nosa č, kontrolna bi ga skupina 
trebala primiti u najve ćem volumenu koji je upotrijebljen.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 865
 
Ispitivanje granice  
24. Ako nema dokaza o toksi čnosti kod doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne 
mase/dan u studijama s ponovljenim dozama ili ako toksi čnost ne treba 
očekivati na temelju podataka o kemikalijama koje su strukturno i/ili meta ­
bolički povezane, kojima se ukazuje na sli čnost u metaboli čkim obilježjima 
in vivo/in vitro, nije potrebna studija u kojoj se upotrebljava nekoliko visina doza. U takvim bi se slu čajevima produljena studija reproduktivne toksi č­
nosti na jednoj generaciji mogla provesti s pomo ću kontrolne skupine i 
jedne doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan. Me đutim, ako se 
pri toj ograni čenoj dozi prona đu dokazi reproduktivne ili razvojne toksi č­
nosti, za utvr đivanje vrijednosti kod kojih nisu uo čeni štetni u činci bit će 
potrebne daljnje studije s nižim dozama. Ta se razmatranja u pogledu 
ispitivanja granice primjenjuju samo ako izlaganje ljudi ne ukazuje na potrebu za višom dozom.
 
POSTUPCI  
Izlaganje potomaka  
25. Izlaganje hranom poželjan je na čin primjene. Ako se provode studije u 
kojima se primjenjuje hranjenje na sondu, treba napomenuti da će mladunci 
u pravilu ispitnu kemikaliju primati samo posredno, u mlijeku, sve dok za 
njih ne zapo čne izravno doziranje nakon odbijanja od sise. Kod studija u 
kojima se tvar daje u hrani ili vodi za pi će, mladunci će dodatno primati 
ispitivanu kemikaliju izravno kad sami po čnu jesti tijekom posljednjeg 
tjedna razdoblja laktacije. Izmjene dizajna studije treba razmotriti ako je 
izlučivanje ispitivane kemikalije mlijekom slabo i ako nema dokaza za 
neprekidno izlaganje potomaka. U tim slu čajevima treba razmotriti 
izravno doziranje mladuncima tijekom razdoblja laktacije na temelju 
dostupnih toksikokineti čkih informacija, toksi čnosti u potomaka ili 
promjena u biomarkerima (3)(4). Prije provo đenja studija s izravnim dozi ­
ranjem na mladuncima koji sisaju (5) treba pomnjivo razmotriti koristi i nedostatke.
 
Raspored doziranja i primjena doza  
26. U prethodnim studijama toksi čnosti s ponovljenim dozama odgovaraju ćeg 
trajanja mogu se prona ći neke informacije o ciklusu estrusa, histopatologiji 
reproduktivnog trakta u mužjaka i ženki i analizi sperme iz testisa/epididi ­
misa. Trajanje tretmana prije parenja u ponovljenoj studiji reproduktivne 
toksičnosti na jednoj generaciji zato je usmjereno na otkrivanje u činaka 
na funkcionalne promjene koje mogu ometati ponašanje kod parenja i ferti ­
lizacije. Tretman prije parenja treba trajati dovoljno dugo kako bi se postigli stabilni uvjeti izlaganja u mužjaka i ženki P. U ve ćini se slučajeva dvotjedni 
tretman prije parenja smatra odgovaraju ćim u oba spola. U ženki on uklju ­ 
čuje 3 do 4 cjelovita ciklusa estrusa i trebao bi biti dovoljan za otkrivanje 
svih štetnih u činaka na njih. U mužjaka on je ekvivalentan vremenu potreb ­
nome za prijenos spermija u sazrijevanju iz epididimisa te bi se njime 
trebalo omogu ćiti otkrivanje posttesikularnih u činaka na spermu (tijekom 
posljednjih faza spermijacije i sazrijevanja sperme iz epididimisa) kod pare ­
nja. Po usmr ćenju, kad su na rasporedu testikularna i epididimalna histopa ­
tologija i analiza parametara sperme, mužjaci P i F
 1 bit će izloženi najmanje 
jednom cjelovitom postupku spermatogeneze ((6) (7) (8) (9) i OECD-ova 
Smjernica 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 866
 
27. Izlaganje prije parenja u mužjaka mogu će je prilagoditi ako su testikularna 
toksičnost (ometanje spermatogeneze) ili u činci na integritet i funkcioniranje 
sperme jasno utvr đeni u ranijim studijama. Isto tako, u ženki se razli čiti 
scenariji izlaganja prije parenja mogu obrazložiti poznatim u čincima ispiti ­
vane kemikalije na ciklus estrusa, a time i na seksualnu osjetljivost. U 
posebnim je slu čajevima mogu će prihvatiti da se s tretmanom ženki P 
započelo isklju čivo nakon dobivanja brisa pozitivnog na spermu (vidjeti 
OECD-ovu Smjernicu 151 (40)).  
28. Nakon utvr đivanja razdoblja doziranja prije parenja životinje treba tretirati 
ispitivanom kemikalijom neprekidno svih 7 dana u tjednu do nekropsije. Doziranje se na sve životinje treba primijeniti na isti na čin. Doziranje se 
treba nastaviti tijekom dvotjednog razdoblja parenja, a u ženki P tijekom 
gestacije i laktacije do dana usmr ćenja nakon odbijanja od sise. Mužjake 
treba tretirati na isti na čin do usmr ćenja u vrijeme kad se životinje F
 1 
odbijaju od sise. Kod nekropsije prioritet bi trebale imati ženke na 
kojima nekropsiju treba izvršiti na isti ili sli čan dan laktacije. Nekropsija 
mužjaka može trajati više dana, ovisno o kapacitetima laboratorija. Osim 
ako je pokrenuto tijekom razdoblja laktacije, izravno doziranje odabranim mužjacima i ženkama F
 1 trebalo bi zapo četi kod odbijanja od sise te bi ga 
trebalo nastaviti do planirane nekropsije, ovisno o rasporedu kohorti.  
29. Pri kemikalijama koje se daju u hrani ili vodi za pi će važno je osigurati da 
količine ispitivane kemikalije o kojoj se radi nemaju utjecaja na uobi čajen 
unos hrane ili vode. Ako se ispitivana kemikalija daje u hrani, može se 
upotrebljavati stalna koncentracija u hrani (ppm) ili stalna visina doze s 
obzirom na tjelesnu masu životinje, a odabir treba obrazložiti.  
30. Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje sondom, volumen teku ćine koja se 
jednokratno primjenjuje u pravilu ne bi trebao premašivati 1 ml/100 g 
tjelesne mase (0,4 ml/100 g tjelesne mase maksimum je za ulje poput kukuruzova ulja). Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih kemikalija, za 
koje je normalno da u ve ćim koncentracijama izazivaju intenzivnije 
učinke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem koncentracije 
svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao stalni volumen. Tretman bi trebalo davati svakog dana u isto vrijeme. Dozu za svaku životinju u pravilu treba temeljiti na posljednjoj vrijednosti individualne 
tjelesne mase te prilago đavati najmanje jednom tjedno u odraslih mužjaka 
i odraslih ženki koje nisu skotne te svaka dva tjedna u skotnih ženki i životinja F
 1 ako se primjenjuje ona prije odbijanja od sise i tijekom 2 
tjedna od toga. Ako se u toksikokineti čkim podacima ukazuje na niski 
prijenos ispitivane kemikalije u posteljici, mogu će je da dozu koja se 
primjenjuje sondom tijekom posljednjeg tjedna graviditeta treba prilagoditi kako bi se izbjegla primjena prekomjerno toksi čne doze na ženku. Ženke na 
dan parturicije ne treba tretirati sondom ili bilo kojim tretmanom pri kojem 
je potrebno rukovanje životinjom, a propuštanje primjene ispitivane kemi ­
kalije na taj je dan poželjnije od ometanja postupka okota.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 867
 
Parenje  
31. Svaku ženku P treba smjestiti s jednim nasumi čno odabranim, nepovezanim 
mužjakom iz iste skupine za doziranje (uparivanje 1:1) do kopulacije ili do isteka 2 tjedna. Ako nema dovoljno mužjaka, primjerice zbog smrti mužjaka 
prije uparivanja, tada se mužjaci koji su se ve ć parili mogu upariti (1:1) s 
drugim ženkama tako da su sve ženke uparene. Danom graviditeta 0 smatra se dan kad je potvr đeno parenje (na đen je vaginalni čep ili sperma). Živo ­
tinje treba odvojiti čim prije nakon kopulacije. Ako nakon 2 tjedna nije 
došlo do parenja, životinje treba odvojiti bez daljnje mogu ćnosti parenja. 
Parove koji se pare treba jasno identificirati u podacima.
 
Veličina legla  
32. Četiri dana nakon okota veli čina svakog legla može se prilagoditi nasu ­
mičnim selekcijskim uklanjanjem dodatnih mladunaca tako da se po jednom 
leglu po mogu ćnosti ostavi pet mužjaka i pet ženki. Selektivno uklanjanje 
mladunaca, primjerice prema tjelesnoj masi, nije prihvatljivo. Kad god je broj muških ili ženskih mladunaca takav da nije mogu će imati pet mladu ­
naca svakog spola po leglu, prihvatljivo je djelomi čno prilago đavanje (npr. 
šest mužjaka i četiri ženke).
 
Odabir mladunaca za studije nakon odbijanja od sise (vidjeti sliku 1.)  
33. Pri odbijanju od sise (oko 21. postnatalnog dana) najviše 20 mladunaca iz 
svih raspoloživih legala po dozi i kontrolnoj skupini bira se za daljnja 
ispitivanja te čuva do spolnog sazrijevanja (osim ako je potrebno ranije 
ispitivanje). Mladunci se biraju nasumi čno, a vidljivo patuljaste životinje 
(životinje čija je tjelesna masa više od dvije standardne devijacije ispod 
srednje mase mladunaca iz odgovaraju ćeg legla) ne treba uklju čiti jer nije 
vjerojatno da će one biti reprezentativne za skupinu za tretiranje.  
Na 21. postnatalni dan odabrani mladunci F1 nasumi čno se raspore đuju u 
jednu od tri kohorte životinja kako slijedi:  
1. kohorta (1.A i 1.B) = ispitivanje reproduktivne/razvojne toksi čnosti,  
2. kohorta (2.A i 2.B) = ispitivanje razvojne neurotoksi čnosti,  
3. kohorta = ispitivanje razvojne imunotoksi čnosti.  
1.A kohorta: Jedan mužjak i jedna ženka po leglu po skupini (20 po spolu 
po skupini): primarni odabir za primarnu procjenu u činaka na reproduktivne 
sustave i op će toksičnosti.  
1.B kohorta: Jedan mužjak i jedna ženka po leglu po skupini (20 po spolu 
po skupini): primarni odabir za daljnju procjenu reproduktivnog u činka 
parenjem životinja F  1 kod procjene (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 117 
(39)) te za dobivanje dodatnih histopatoloških podataka u slu čajevima 
sumnje na reproduktivne ili endokrine toksi čne tvari ili ako su rezultati 
1.A kohorte dvosmisleni.  
2.A kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po 
skupini, jedan mužjak ili jedna ženka po leglu) raspore đuje se za neurobi ­
hevioralno ispitivanje, a potom i neurohistopatološku procjenu u odrasloj 
dobi.  
2.B kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po 
skupini, jedan mužjak ili jedna ženka po leglu) raspore đuje se za neurohi ­
stopatološku procjenu kod odbijanja od sise (21. ili 22. prenatalni dan). Ako 
nema dovoljno životinja, poželjno je životinje rasporediti u 2.A kohortu.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 868
 
3. kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po 
skupini, po mogu ćnosti, jedno po leglu). Dodatni mladunci iz kontrolne 
skupine mogu biti potrebni kao pozitivne kontrolne životinje u testu reakcije antitijela ovisnih o T-stanicama (TDAR) na 56. ±3 postnatalni dan.
 
34. Ako u leglu nema dovoljno mladunaca za sve kohorte, 1. kohorta ima 
prioritet jer se može produljiti radi dobivanja generacije F  2 . Dodatni 
mladunci mogu se rasporediti u bilo koju kohortu u posebnom slu čaju, 
npr. ako se sumnja da je kemikalija neurotoksi čna, imunotoksi čna ili repro ­
duktivno toksi čna. Ti se mladunci mogu upotrebljavati za ispitivanja u 
različitim vremenima ili za vrednovanje dopunskih krajnjih to čaka. 
Mladunci koji nisu raspore đeni u kohorte podvrgavaju se klini čkoj bioke ­
miji (stavak 55.) i makroskopskoj nekropsiji (stavak 68.)  
Drugo parenje životinja P  
35. Drugo parenje u pravilu se ne preporu čuje za životinje P jer zbog njega 
dolazi do gubitka važnih informacija o broju mjesta za implantaciju embrija 
(a time i podataka o razdoblju nakon implantacije i perinatalnom gubitku, 
pokazatelja mogu ćeg teratogenog potencijala) za prvo leglo. Potreba za 
provjerom ili pojašnjenjem u činka kod izloženih ženki bolje bi se zadovo ­
ljila produljenjem studije i proširivanjem na parenje generacije F  1 . Među­
tim, drugo parenje mužjaka P s netretiranim ženkama uvijek je mogu ćnost 
za pojašnjavanje dvosmislenih nalaza ili za daljnju karakterizaciju u činaka 
na plodnost uo čenih kod prvog parenja.  
OPAŽANJA UŽIVO  
Klinička opažanja  
36. Pri životinjama P i odabranim životinjama F  1 , opća klinička opažanja obav ­
ljaju se jednom dnevno. U slu čaju doziranja sondom, klini čka opažanja 
treba obavljati prije ili nakon doziranja (radi mogu ćih znakova toksi čnosti 
povezanih s vršnom koncentracijom plazme). Treba bilježiti relevantne 
promjene ponašanja, znakove otežane ili produžene parturicije i sve znakove toksi čnosti. Dvaput dnevno, a tijekom vikenda jednom dnevno, 
obavlja se opažanje svih životinja s obzirom na tešku toksi čnost, morbiditet 
i mortalitet.
 
37. Osim toga, jednom tjedno obavlja se detaljniji pregled svih životinja P i F  1 
(nakon odbijanja od sise) koji se može obaviti pri vaganju životinje, čime se 
umanjuje stres pri rukovanju. Opažanja treba pažljivo obaviti i bilježiti s 
pomoću sustava vrednovanja koje je utvrdio ispitni laboratorij. Treba podu ­
zeti sve što je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima ispitivanja budu minimalna. Znakovi koji se bilježe trebaju uklju čivati, ali 
ne biti ograni čeni na, promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, na pojavu 
iscjedaka, na izlu čine i autonomne aktivnosti (lakrimacija (lu čenje suza), 
piloerekcija, veli čina zjenica, nepravilnosti u disanju). Treba zabilježiti i 
promjene u kretanju, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničnih ili toni čnih kretnji, stereotipa (npr. prekomjerno njegovanje dlake, 
stalno kretanje u krug) ili bizarno ponašanje (npr. samoranjavanje, hodanje 
unatrag).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 869
 
Tjelesna masa i unos hrane/vode  
38. Životinje P važu se prvog dana primjene doze, a zatim najmanje jednom 
tjedno. Osim toga, ženke P važu se tijekom laktacije istih dana kao i mladunci u njihovim leglima (vidjeti stavak 44.) Sve životinje F
 1 važu se 
pojedinačno kod odbijanja od sise (21. PND), a zatim najmanje jednom 
tjedno. Tjelesna masa bilježi se i na dan ulaska u pubertet (dovršetak razdvajanja prepucija ili vaginalna prohodnost). Sve životinje važu se u trenutku usmr ćivanja.
 
39. Tijekom studije unos hrane i vode (u slu čaju primjene ispitivane kemikalije 
u vodi za pi će) bilježi se najmanje jednom tjedno istih dana kao i tjelesne 
mase životinja (osim tijekom kohabitacije). Unos hrane svakog kaveza sa 
životinjama F  1 bilježi se jednom tjedno po čevši od odabira odgovaraju će 
kohorte.  
Ciklusi estrusa  
40. Privremene informacije o u čincima ispitivane kemikalije na ciklus estrusa 
već se mogu prona ći u ranijim studijama toksi čnosti s ponovljenim dozama 
te se mogu upotrebljavati kod dizajniranja protokola specifi čnog za ispiti ­
vanu kemikaliju za produljenu studiju reproduktivne toksi čnosti na jednoj 
generaciji. U pravilu će procjena ciklusa estrusa (s pomo ću vaginalne cito ­
logije) zapo četi na početku razdoblja tretiranja te se nastaviti do parenja ili 
kraja dvotjednog razdoblja parenja. Ako je probir ženki za normalni ciklus 
estrusa obavljen prije tretmana, tada je korisno nastaviti s uzimanjem 
briseva s po četkom tretmana, ali ako postoji dvojba o nespecifi čnim učin­
cima na po četku tretmana (poput po četnog zabilježenog smanjenja unosa 
hrane), mogu će je životinjama dopustiti adaptaciju na tretman do najdulje 
dva tjedna prije po četka dvotjednog razdoblja uzimanja briseva nakon kojeg 
slijedi uparivanje. Ako se na taj na čin produljuje razdoblje tretiranja ženki 
(tj. na četverotjedni tretman prije parenja), tada treba razmotriti nabavu 
mlađih životinja te produljenje razdoblja tretmana mužjaka prije uparivanja. 
Ako se uzimaju vaginalne/cervikalne stanice, treba paziti da se ne poremeti 
mukoza i, kasnije, ne izazove lažna trudno ća (10) (11).  
41. Vaginalne briseve svih ženki F  1 iz 1.A kohorte treba svakodnevno pregle ­
davati nakon po četka vaginalne prohodnosti dok se ne zabilježi prvi korni ­
ficirani bris kako bi se utvrdio vremenski interval izme đu ta dva doga đaja. 
Treba pratiti i cikluse estrusa svih ženki F  1 iz 1.A kohorte u razdoblju od 
dva tjedna, po čevši oko 75. postnatalnog dana. Osim toga, ako je potrebno 
parenje generacije F  1 , vaginalna citologija u 1.B kohorti slijedit će se od 
trenutka uparivanja do parenja.  
Parenje i graviditet  
42. Osim standardnih krajnjih to čaka (npr. tjelesna masa, unos hrane, klini čka 
opažanja uklju čujući provjere mortaliteta/morbiditeta), bilježe se datumi 
uparivanja, datum inseminacije i datum parturicije te se ra čunaju prekoitalni 
interval (od uparivanja do inseminacije) i trajanje graviditeta. Ženke P treba 
pomnjivo pregledati u vrijeme o čekivane parturicije radi znakova distocije. 
Treba zabilježiti sve znakove abnormalnosti pri izradi gnijezda ili dojenja.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 870
 
43. Dan kad do đe do parturicije nulti je dan laktacije za ženku i nulti post ­
natalni dan za potomstvo. Alternativno, sve se usporedbe mogu temeljiti i 
na postkoitalnom vremenu kako bi se izbjeglo miješanje podataka o post ­
natalnom razvoju zbog razlika u trajanju graviditeta. Me đutim, treba zabi ­
lježiti i vrijeme u odnosu na parturiciju. To je osobito važno ako ispitivana 
kemikalija utje če na trajanje graviditeta.  
Parametri potomaka  
44. Svako leglo treba pregledati čim prije nakon parturicije (nulti ili 1. post ­
natalni dan) i utvrditi broj i spol mladunaca, broj mrtvoro đenih, broj živo ­
rođenih te prisutnost velikih anomalija (vidljive abnormalnosti, uklju čujući 
rascjep nepca, potkožna krvarenja, abnormalnu boju ili strukturu kože, pojavu pup čane vrpce, manjak mlijeka u želucu, pojavu suhih sekreta). 
Osim toga, prvi klini čki pregled nakon okota treba uklju čivati kvalitativnu 
procjenu tjelesne temperature, stanja aktivnosti i reakcije na rukovanje. 
Mladunce koji su nultog postnatalnog dana ili kasnije na đeni mrtvi treba 
pregledati s obzirom na mogu će defekte i uzrok smrti. Živi mladunci 
prebrojavaju se i pojedina čno važu nultog ili 1. postnatalnog dana i 
redovno nakon toga, npr. barem 4., 7., 14. i 21. postnatalnog dana. Klini čke 
preglede prema starosti životinja treba ponavljati pri vaganju potomaka ili češće ako su prilikom okota utvr đeni specifi čni nalazi. Zabilježeni znakovi 
mogu uklju čivati, ali ne moraju biti ograni čeni na vanjske abnormalnosti, 
promjene na koži, dlaci, o čima, sluznicama, pojavu iscjedaka i izlu čina i 
autonomnu aktivnost. Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reak ­
cijama na rukovanje, kao i prisutnost kloni čkih ili toni čkih pokreta, stereo ­
tipa ili bilo kakvog neobi čnog ponašanja.
 
45. Treba izmjeriti anogenitalni razmak u svakog mladunca barem jednom od 
nultog do 4. postnatalnog dana. Tjelesnu masu mladunaca treba utvrditi na dan mjerenja anogenitalnog razmaka, a njega treba ujedna čiti prema veli čini 
mladunca (najbolje kubni korijen tjelesne mase (12)). 12. ili 13. post ­
natalnog dana treba provjeriti postojanje bradavica/areola u mužjaka 
mladunaca.
 
46. Sve odabrane životinje F  1 svakodnevno se pregledavaju radi razdvajanja 
prepucija na glavici penisa u mužjaka, odnosno vaginalne prohodnosti u ženki prije o čekivanog dana pojave tih krajnjih to čaka radi utvr đivanja rane 
pojave spolnog sazrijevanja. Treba zabilježiti sve abnormalnosti genitalnih 
organa, poput postojane vaginalne niti, hipospadije ili rascjepa penisa. Spolno sazrijevanje životinja F
 1 uspoređuje se s fizi čkim razvojem utvr ­ 
đivanjem starosti i tjelesne mase kod razdvajanja prepucija na glavici penisa 
u mužjaka, odnosno vaginalne prohodnosti u ženki (13).  
Procjena potencijalne razvojne neurotoksi čnosti (2.A i 2.B kohorta)  
47. Za procjene neurotoksi čnosti treba upotrebljavati 10 mužjaka i 10 ženki iz 
2.A kohorte i 10 mužjaka i 10 ženki iz 2.B kohorte iz svake skupine za 
tretiranje (za svaku kohortu: 1 mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 
mladunac iz svakog legla; nasumi čno odabrani). Životinje iz 2.A kohorte 
treba podvrgnuti iznenadnoj buci, funkcionalno-opservacijskoj bateriji, motoričkoj aktivnosti (vidjeti stavke 48. do 50.) i neuropatološkim procje ­
nama (vidjeti stavke 74. do 75.). Treba nastojati osigurati da varijacije 
ispitnih uvjeta budu minimalne te da nisu sustavno povezane s tretiranjem.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 871
 
Neke varijable koje mogu utjecati na ponašanje jesu razina buke (npr. 
povremena buka), temperatura, vlažnost, rasvjeta, mirisi, doba dana te 
distrakcije iz okoline. Rezultate testova neurotoksi čnosti treba tuma čiti u 
odnosu na odgovaraju će povijesne kontrolne referentne raspone. Kohortu 
2.B treba upotrebljavati za neuropatološku procjenu 21. ili 22. postnatalnog 
dana (vidjeti stavke 74. do 75.).  
48. Ispitivanje reakcije na iznenadnu buku treba provesti 24. postnatalnog dana 
(± 1 dan) na životinjama iz 2.A kohorte. Dan ispitivanja treba ujedna čiti s 
obzirom na skupine za tretiranje i kontrolne skupine. Svaka se sesija sastoji od 50 pokušaja. Kod provo đenja ispitivanja reakcije na iznenadnu buku 
treba odrediti srednju amplitudu reakcije svakog skupa od 10 pokušaja (5 
skupova od 10 pokušaja) uz uvjete ispitivanja koji su optimizirani tako da 
izazovu habituaciju tijekom sesije. Ti bi postupci trebali biti u skladu s ispitnom metodom B.53 (35).
 
49. U odgovaraju ćem trenutku izme đu 63. i 75. postnatalnog dana životinje se 
podvrgavaju funkcionalno-opservacijskoj bateriji i automatskom ispitivanju 
motoričke aktivnosti. Ti bi postupci trebali biti u skladu s ispitnim meto ­
dama B.43 (33) i B.53. (35). Funkcionalno-opservacijska baterija uklju čuje 
detaljan opis izgleda, ponašanja i funkcionalnog integriteta pokusne životi ­
nje. To se procjenjuje opažanjem u kavezu u kojem životinje ina če borave, 
nakon smještaja u standardni prostor radi opažanja (otvoreni prostor) gdje 
se životinja slobodno kre će i manipulativnim ispitivanjima. Ispitivanje treba 
provoditi od najmanje interaktivnog prema najviše interaktivnom. Popis mjera navodi se u Dodatku 1. Opažanja svih životinja trebale bi obavljati 
osposobljene osobe koje nemaju saznanja o statusu tretmana životinja s 
pomoću standardiziranih postupaka kako bi se njihova varijabilnost svela 
na najmanju mogu ću mjeru. Savjetuje se da po mogu ćnosti ista osoba koja 
obavlja opažanja vrednuje životinje u odre đenom ispitivanju. Ako to nije 
moguće, potreban je neki dokaz o pouzdanosti osoba koje obavljaju opaža ­
nje. Za svaki parametar u bihevioralnoj ispitnoj bateriji treba upotrebljavati eksplicitne, operativno definirane raspone i kriterije vrednovanja. Po mogućnosti treba razviti objektivne kvantitativne mjere za opservacijske 
krajnje to čke koje uklju čuju subjektivno rangiranje. Kod motori čke aktiv­
nosti svaka se životinja pojedina čno ispituje. Ispitivanje bi trebalo trajati 
dovoljno dugo da se dokaže habituacija izme đu sesija kod kontrolnih 
skupina. Motori čku aktivnost treba pratiti aparatom za bilježenje automatske 
aktivnosti kojime bi trebalo biti mogu će utvrditi pove ćanja i smanjenja 
aktivnosti (odnosno, osnovna aktivnosti koju ure đaj mjeri ne bi trebala 
biti ni toliko niska da bi se sprije čilo utvrđivanje smanjenja ni toliko 
visoka da bi se sprije čilo utvrđivanje pove ćanja aktivnosti). Svaki ure đaj 
treba ispitati standardnim postupcima kako bi se u najve ćoj mogućoj mjeri 
osigurala pouzdanost rada s obzirom na sve ure đaje i dane. Skupine za 
tretiranje u najve ćoj bi se mogu ćoj mjeri trebale ujedna čiti s obzirom na 
sve uređaje. Skupine za tretiranje trebale bi biti uravnotežene s obzirom na 
vremena ispitivanja kako bi se izbjeglo zbunjivanje zbog cirkadijurnih 
ritmova aktivnosti.  
50. Ako se postoje ćim informacijama ukazuje na potrebu za ostalim funkcio ­
nalnim ispitivanjima (npr. senzorno, socijalno, kognitivno), njih treba uklju ­ 
čiti bez narušavanja cjelovitosti ostalih evaluacija koje se provode studijom. 
Ako se ispitivanje provodi na istim životinjama kao i ispitivanje reakcije na 
iznenadnu buku, funkcionalno-opservacijsku bateriju i ispitivanje motori čke 
aktivnosti treba planirati tako da se rizik od narušavanja cjelovitosti tih ispitivanja svede na najmanju mogu ću mjeru. Dopunski postupci mogu 
biti osobito korisni kada empirijsko opažanje, o čekivani u činci ili mehani ­
zam/način funkcioniranja ukazuju na posebnu vrstu neurotoksi čnosti.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 872
 
Procjena potencijalne razvojne imunotoksi čnosti (3. kohorta)  
51. Na 56. postnatalni dan (± 3 dana) 10 mužjaka i 10 ženki iz 3. kohorte iz 
svake skupine za tretiranje (1 mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 mladunac iz svakog legla; nasumi čno odabrani) treba upotrijebiti u testu 
reakcije antitijela ovisnih o T-stanicama, odnosno prvotnoj reakciji antitijela 
IgM na antigen ovisan o T-stanicama, poput crvenih krvnih stanica ovce (SRBC) ili hemocijanina iz puža priljepka (KLH), u skladu s posto ­
jećim postupcima ispitivanja imunotoksi čnosti (14) (15). Reakciju je 
moguće procijeniti prebrojavanjem specifi čnih stanica koje tvore 
plak (PFC) i slezeni ili utvr đivanjem titra IgM antitijela specifi čnog za 
SRBC ili KLH u serumu ELISA testom na vrhuncu reakcije. Reakcije su 
u pravilu na vrhuncu četiri (reakcija PFC) ili pet (ELISA) dana nakon 
intravenozne imunizacije. Ako se prvotna reakcija antitijela procjenjuje prebrojavanjem stanica koje tvore plak, dopuštena je procjena podskupina životinja u zasebne dane uz uvjet da se imunizacija i usmr ćivanje podsku ­
pine planiraju tako da se stanice koje tvore plak broje na vrhuncu reakcije, 
da podskupine sadržavaju jednaki broj muških i ženskih potomaka iz svih skupina za doziranje, uklju čujući kontrolne, te da se podskupine procjenjuju 
u približno jednakoj postnatalnoj dobi. Izlaganje ispitivanoj kemikaliji 
nastavit će se do dana prikupljanja slezena za reakciju stanica koje tvore 
plak ili seruma za test ELISA.
 
Nastavak procjene potencijalne reproduktivne toksi čnosti (1.B kohorta)  
52. Životinje iz 1.B kohorte prema potrebi se mogu zadržati u tretmanu nakon 
90. postnatalnog dana te uzgajati kako bi se dobila generacija F  2 . Mužjake i 
ženke iz iste skupine za doziranje treba smjestiti zajedno (uz izbjegavanje 
uparivanja bra će i sestara) do najdulje dva tjedna, po čevši od 90. post ­
natalnog dana ili nakon njega, ali ne dulje od 120. postnatalnog dana. Postupci bi trebali biti sli čni onima u životinja P. Me đutim, na temelju 
dokaza, usmr ćivanje legala 4. postnatalnog dana može biti dovoljno, 
umjesto pra ćenja do odbijanja od sise ili nakon njega.
 
ZAVRŠNA OPAŽANJA  
Klinička biokemija/hematologija  
53. U životinja P treba pratiti sustavne u činke. Po usmr ćenju s utvr đenog se 
mjesta uzimaju uzorci krvi deset nasumi čno odabranih mužjaka i ženki P po 
skupini za doziranje koji su postili, pohranjuju u odgovaraju ćim uvjetima i 
podvrgavaju djelomi čnoj ili potpunoj hematologiji, klini čkoj biokemiji, testu 
T4 ili TSH ili drugim pregledima u skladu s poznatim profilom u činka 
ispitivane kemikalije (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)). Treba ispitati 
sljedeće hematološke parametre: hematokrit, koncentraciju hemoglobina, 
broj eritrocita, ukupan i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i vrijeme/potencijal zgrušavanja krvi. Pretrage plazme ili seruma trebale bi uključivati: odre đivanje razine glukoze, ukupnog kolesterola, ureje, kreati ­
nina, ukupnih proteina, albumina i najmanje dva enzima koji su pokazatelji 
hepatocelularnih u činaka (kao što su alanin aminotransferaza, aspartat 
aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i sorbitol dehidrogenaza). Mjerenja dodatnih enzima i žu čnih kiselina mogu u odre ­ 
đenim uvjetima pružiti korisne informacije. Osim toga, svim se životinjama 
krv može izvaditi i pohraniti za mogu ću kasniju analizu radi pojašnjavanja
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 873
 
dvosmislenih u činaka ili dobivanja podataka o internom izlaganju. Ako se 
ne planira drugo parenje životinja P, uzorci krvi uzimaju se neposredno 
prije ili u okviru postupka kod planiranog usmr ćivanja. U slu čaju zadrža ­
vanja životinja uzorke krvi treba prikupiti nekoliko dana prije drugog parenja životinja. Osim ako se postoje ćim podacima iz studija s ponov ­
ljenim dozama ukazuje na to da ispitivana kemikalija ne utje če na parame ­
tar, prije usmr ćenja treba provesti analizu urina i treba procijeniti sljede će 
parametre: izgled, volumen, osmolalnost ili specifi čnu težinu, pH, protein, 
glukozu, krv i krvne stanice, ostatke stanica. Urin se može prikupljati i radi 
praćenja izlučivanja ispitivane kemikalije i/ili metabolita.
 
54. U životinja F  1 treba pratiti i sustavne u činke. Po usmr ćenju s utvr đenog se 
mjesta uzimaju uzorci krvi deset nasumi čno odabranih mužjaka i ženki iz 
1.A kohorte po skupini za doziranje koji su postili, pohranjuju u odgova ­
rajućim uvjetima i podvrgavaju standardnoj klini čkoj biokemiji, uklju čujući 
procjenu razina seruma hormona štitnja če (T4 i TSH), hematologiji (ukupni 
i diferencijalni broj leukocita i broj eritrocita) i procjenama analize urina.  
55. Prekobrojni se mladunci 4. postnatalnog dana podvrgavaju makroskopskoj 
nekropsiji te se razmatra mjerenje koncentracija seruma hormona štitnja če 
(T4). Krv tek oko ćenih životinja (4. PND) može se izvaditi po leglima radi 
biokemijskih analiza ili analiza hormona štitnja če. Za analizu T4 i TSH krv 
se vadi i životinjama koje su upravo odbijene od sise koje se podvrgavaju makroskopskoj nekropsiji 22. postnatalnog dana (mladunci F
 1 ne raspore ­ 
đuju se u kohorte).  
Parametri sperme  
56. Parametre sperme treba mjeriti u svih mužjaka generacije P, osim ako 
postoje podaci kojima se dokazuje da nema utjecaja na parametre sperme 
u studiji koja traje 90 dana. Ispitivanje parametara sperme treba provesti u 
svih mužjaka iz 1.A kohorte.  
57. Po usmr ćenju bilježe se mase testisa i epididimisa svih mužjaka P i F  1 (1.A 
kohorta). Barem jedan testis i jedan epididimis čuvaju se radi histopatolo ­ 
škog pregleda. Preostali epididimisi upotrebljavaju se za prebrojavanje 
zaliha sperme iz repa epididimisa (16)(17). Osim toga, zaliha sperme iz repa epididimisa (ili sjemenovoda) prikuplja se s pomo ću metoda kojima 
se oštećenje za procjenu pokretljivosti i morfologije spreme svodi na 
najmanju mogu ću mjeru (18).
 
58. Pokretljivost sperme može se procijeniti neposredno nakon usmr ćivanja ili 
zabilježiti za daljnju analizu. Postotak progresivno pokretljive sperme može se utvrditi subjektivno ili objektivno s pomo ću računalne analize pokreta 
(19) (20) (21) (22) (23) (24). Kod procjene morfologije sperme uzorak 
sperme iz epididimisa (ili sjemenovoda) treba ispitati kao fiksirane ili 
mokre pripravke (25) te najmanje 200 spermatozoida po uzorku klasificirati kao normalne (glava i tijelo/rep normalnog su izgleda) ili abnormalne. Primjeri morfoloških anomalija spermatozoida obuhva ćaju fuziju, odvojene 
glave i deformirane glave i/ili repove (26). Deformirane ili velike glave 
spermatozoida mogu ukazivati na defekte kod spermijacije.
 
59. Ako se pri nekropsiji zamrzavaju uzorci sperme, fiksiraju brisevi i bilježe 
slike analize mobilnosti sperme (27), naknadna analiza može se ograni čiti 
na kontrolne mužjake i mužjake kojima se daje visoka doza. Me đutim, ako 
se uoče učinci povezani s tretmanom, treba procijeniti i skupine kojima se 
daje niža doza.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 874
 
Makroskopska nekropsija  
60. U vrijeme usmr ćenja ili u slu čaju preuranjene smrti sve životinje P i F  1 
podvrgavaju se nekropsiji i makroskopskom pregledu radi otkrivanja svih 
strukturnih abnormalnosti ili patoloških promjena. Posebnu pozornost treba 
obratiti na organe reproduktivnog sustava. Mladunce koji su humano usmr ­ 
ćeni, na samrti ili mrtvi treba zabilježiti i, ako nisu macerirani, pregledati s 
obzirom na mogu će patološke promjene i/ili uzrok smrti, i konzervirati.  
61. U odraslih ženki P i F  1 vaginalni bris pregledava se na dan nekropsije kako 
bi se utvrdila faza ciklusa estrusa i omogu ćila korelacija s histopatologijom 
reproduktivnih organa. Maternice svih životinja P (po potrebi i ženku F  1 ) 
pregledavaju se s obzirom na postojanje i broj mjesta za implantaciju 
embrija bez narušavanja histopatološke procjene.  
Masa organa i čuvanje tkiva – odrasle životinje P i F  1 
62. Po usmr ćenju utvrđuju se tjelesne mase i mokre mase organa navedenih u 
nastavku svih životinja P i svih odraslih životinja F  1 iz relevantnih kohorti 
(kako se navodi u nastavku) u najkra ćem mogu ćem roku kako bi se izbjeglo 
sušenje. Te organe potom treba čuvati u odgovaraju ćim uvjetima. Osim ako 
je drukčije navedeno, upareni organi mogu se vagati pojedina čno ili zajedno 
u skladu s tipi čnom praksom laboratorija koji provodi ispitivanje.  
— maternica (s jajovodima i cerviksom), jajnici,  
— testisi, epididimisi (cijeli i repovi za uzorke za prebrojavanje sperme),  
— prostata (kombinacija dorsolateralnih i ventralnih dijelova). Pri odva ­
janju prostate treba paziti kako bi se izbjegla punkcija sjemenih vezikula 
ispunjenih teku ćinom. U slu čaju učinka povezanog s tretmanom na 
ukupnu masu prostate dorsolateralne i ventralne segmente treba pažljivo odvojiti nakon fiksiranja i zasebno izvagati,
 
— sjemene vezikule s prednjim režnjem prostate i njihovim fluidima (kao 
jedna cjelina),  
— mozak, jetra, bubrezi, srce, slezena, timus, hipofiza, tiroidna žlijezda 
(nakon fiksiranja), nadbubrežna žlijezda i poznati ciljni organi ili tkiva.  
63. Osim gore navedenih organa, u odgovaraju ćim uvjetima treba čuvati uzorke 
perifernih živaca, miši ća, leđne moždine, oka i opti čkog živca, probavnog 
trakta, mokra ćnog mjehura, plu ća, dušnika (s tiroidnom i paratiroidnom 
žlijezdom), koštane srži, sjemenovoda (u mužjaka), mlije čnih žlijezda (u 
mužjaka i ženki) i vagine.  
64. Svi organi životinja iz 1.A kohorte važu se i čuvaju za histopatologiju.  
65. Radi ispitivanja prenatalnih i postnatalnih imunotoksi čnih učinaka 10 
mužjaka i 10 ženki iz 1.A kohorte iz svake skupine za tretiranje (1 
mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 mladunac iz svakog legla; nasu ­
mično odabrani) po usmr ćenju podvrgnut će se sljede ćem: 
— vaganju limfnih čvorova povezanih s putem izlaganja i udaljenima od 
njega (uz vaganje nadbubrežne žlijezde, timusa i slezene koje je ve ć 
provedeno u svih životinja iz 1.A kohorte),  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 875
 
— analizi subpolulacije limfocita u slezeni (T-limfociti CD4+ i CD8+, 
B-limfociti i prirodno ubojite stanice) na jednoj polovici slezene, dok 
će se druga čuvati za histopatološku procjenu.  
Analizom subpopulacija limfocita u slezeni u necijepljenih životinja (1.A 
kohorta) utvrdit će se je li izlaganje povezano s pomakom u imunološkoj 
stabilnoj distribuciji „pomaga ča” (CD4+) ili citoksi čnih limfocita koje proiz ­
vodi timus (CD8+) ili prirodno ubojite (NK) stanica (brze reakcije na neoplastične stanice i patogene).
 
66. Sljede će organe životinja iz 1.B kohorte treba izvagati, a odgovaraju ća tkiva 
obraditi do faze blokiranja:  
— vagina (neizvagana),  
— maternica s cerviksom,  
— jajnici,  
— testisi (barem jedan),  
— epididimis,  
— sjemene vezukule s prednjim režnjem prostate,  
— prostata,  
— hipofiza,  
— identificirani ciljni organi.  
Histopatologija na 1.B kohorti obavila bi se u slu čaju dvosmislenosti rezul ­
tata 1.A kohorte ili u slu čajevima sumnje na reproduktivne ili endokrine 
toksične tvari.  
67. Kohorte 2.A i 2.B: ispitivanje razvojne neurotoksi čnosti (21. ili 22. PND i 
odrasli potomci). Životinje iz 2.A kohorte usmr ćuju se nakon bihevioralnog 
ispitivanja, bilježi se težina njihovih mozgova te se radi procjene neuroto ­
ksičnosti obavlja potpuna neurohistopatologija. Životinje iz 2.B kohorte 
usmrćuju se 21. ili 22. postnatalnog dana, bilježi se težina njihovih 
mozgova te se radi procjene neurotoksi čnosti obavlja mikroskopski 
pregled mozga. Perfuzijska fiksacija obvezna je u životinja iz 2.A kohorte, 
dok u životinja iz 2.B kohorte nije kako je predvi đeno ispitnom metodom 
B.53 (35).  
Masa organa i čuvanje tkiva – životinje F  1 koje se upravo odbijaju od 
sise 
68. Mladunci koji nisu raspore đeni u kohorte, uklju čujući patuljaste životinje, 
usmrćuju se nakon odbijanja od sise 22. postnatalnog dana, osim ako se 
rezultatima ne ukazuje na potrebu za daljnjim ispitivanjima uživo. Usmr ćeni 
mladunci podvrgavaju se makroskopskoj nekropsiji, uklju čujući procjenu 
reproduktivnih organa kako je opisano u stavcima 62. i 63. Mozak, 
slezenu i timus najviše deset mladunaca po spolu i skupini iz što je više moguće legala treba izvagati i čuvati u odgovaraju ćim uvjetima. Osim toga, 
mliječne žlijezde tih mužjaka i ženki mladunaca mogu se čuvati za daljnju 
mikroskopsku analizu (
 1 ) (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)). 
Makroabnormalnosti i ciljna tkiva treba sa čuvati radi mogu ćeg histološkog 
pregleda.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 876  
( 1 ) Istraživanja su pokazala da su mlije čne žlijezde osjetljiva krajnja to čka za estrogensko 
djelovanje, osobito u njihovoj ranoj dobi. Preporu čuje se uklju čivanje krajnjih to čaka 
kojima su obuhva ćene mlije čne žlijezde obaju spolova u ovu ispitnu metodu nakon 
validacije.
 Histopatologija – životinje P  
69. Potpuna histopatologija organa navedenih u stavcima 62. i 63. obavlja se na 
svim životinjama P iz kontrolne skupine i skupine koja je primala visoku dozu. Treba pregledati i organe svih životinja iz skupina koje su primale 
nižu dozu u kojih su uo čene promjene povezane s tretmanom radi utvr ­ 
đivanja vrijednosti kod kojih nisu uo čeni štetni u činci. Osim toga, reproduk ­
tivne organe svih životinja u kojih se sumnja na smanjenu plodnost, npr. u životinja koje se nisu parile, nisu za čele, proizvele i okotile zdravo potom ­
stvo, ili u kojih je bilo utjecaja na ciklus estrusa ili broj, pokretljivost ili 
morfologiju spermatozoida, kao i sve makrolezije treba histopatološki obraditi.
 
Histopatologija – životinje F  1 
Životinje iz 1. kohorte  
70. Potpuna histopatologija organa navedenih u stavcima 62. i 63. obavlja se na 
svim odraslim životinjama iz 1.A kohorte iz kontrolne skupine i skupine koja je primala visoku dozu. Najmanje jedan mladunac po spolu trebao bi predstavljati svako leglo. Treba pregledati i organe i tkiva svih životinja iz 
skupina koje su primale nižu dozu u kojih su uo čene promjene povezane s 
tretmanom i sve makrolezije radi utvr đivanja vrijednosti kod kojih nisu 
uočeni štetni u činci. Radi procjene prenatalnih i postnatalnih u činaka na 
limfne organe treba procijeniti i histopatologiju na prikupljenim limfnim 
čvorovima i koštanoj srži 10 mužjaka i 10 ženki iz 1.A kohorte uz ve ć 
provedenu histopatološku procjenu timusa, slezene i nadbubrežnih žlijezda u svih životinja iz 1.A kohorte.
 
71. Reproduktivna i endokrina tkiva svih životinja iz 1.B kohorte obra đenih do 
faze blokiranja prema opisu iz stavka 66. treba pregledati radi histopatolo ­
gije u slu čajevima sumnje na reproduktivne ili endokrine toksi čne tvari. 
I 1.B kohortu treba podvrgnuti histološkom pregledu ako su rezultati 1.A kohorte dvosmisleni.
 
72. Jajnici odraslih ženki trebali bi sadržavati primordijalne i folikule u rastu, 
kao i žuta tijela. Zato histopatološki pregled treba usmjeriti na otkrivanje 
kvantitativne procjene primordijalnih folikula i malih folikula u rastu, kao i žutih tijela u ženki F
 1 . Broj životinja, odabir sekcije jajnika i veli čina 
uzorka sekcije trebali bi statisti čki odgovarati upotrijebljenom postupku 
procjene. Prebrojavanje folikula mogu će je prvo obaviti na kontrolnim 
životinjama i životinjama koje su primale visoku dozu, a u slu čaju nepo­
voljnog u činka u potonjih treba razmotriti niže doze. Radi usporedbe treti ­
ranih i kontrolnih jajnika pregled bi trebao obuhvatiti brojanje primordi ­
jalnih folikula, kombinirano s malim folikulima u rastu (vidjeti OECD-ovu 
Smjernicu 151 (40)). Procjenu žutih tijela treba provesti usporedno s ispi ­
tivanjem ciklusa estrusa tako da se kod procjene može uzeti u obzir faza ciklusa. Jajovodi, maternica i vagina pregledavaju se radi odgovaraju ćeg 
razvoja tipi čnog za organe.
 
73. Obavljaju se detaljni histopatološki pregledi testisa na mužjacima F  1 kako 
bi se utvrdili u činci povezani s tretmanom na diferencijaciju i razvoj testisa 
i na spermatogenezu (38). Po mogu ćnosti treba pregledati i sekcije rete 
testisa. Pregledavaju se glava, tijelo i rep epididimisa i sjemenovodi s 
obzirom na odgovaraju ći razvoj tipi čan za organe, kao i na parametre 
potrebne za mužjake P.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 877
 
Životinje iz 2. kohorte  
74. Neurohistopatologija se obavlja u svih životinja koje su primale visoku 
dozu i kontrolnih životinja iz 2.A kohorte po spolu nakon dovršetka neuro ­
bihevioralnog ispitivanja (nakon 75. postnatalnog dana, ali ne dulje od 
90. postnatalnog dana). Histopatologija mozga obavlja se u svih životinja 
koje su primale visoku dozu i kontrolnih životinja iz 2.B kohorte po spolu 21. ili 22. postnatalnog dana. Treba pregledati i organe i tkiva svih životinja iz skupina koje su primale nižu dozu u kojih su uo čene promjene povezane 
s tretmanom radi utvr đivanja vrijednosti kod kojih nisu uo čeni štetni u činci. 
Kod životinja iz 2.A i 2.B kohorte pregledava se više sekcija mozga kako bi se omogu ćio pregled olfaktornog bulbusa, cerebralnog korteksa, hipokam ­
pusa, bazalnih ganglija, talamusa, hipotalamusa, srednjeg mozga (krova, 
tegmentuma i moždanih krakova), moždanog debla i malog mozga. Samo kod 2.A kohorte pregledavaju se i o či (mrežnica i vidni živac) te uzorci 
perifernih živaca. Svi neurohistološki postupci trebali bi biti u skladu s 
ispitnom metodom B.53 (35).
 
75. Morfometri čke (količinske) procjene treba obaviti na reprezentativnim regi ­
jama mozga (homologne sekcije pažljivo odabrane na temelju pouzdanih 
mikroskopskih posebnosti), a one mogu uklju čivati linearna i/ili prostorna 
mjerenja specifi čnih regija mozga. Najmanje tri uzastopne sekcije treba 
uzeti kod svake posebnosti (razine) radi odabira najviše homogene i repre ­
zentativne sekcije za specifi čnu regiju mozga koju treba procijeniti. Neuro ­
patolog bi trebao procijeniti jesu li sekcije pripremljene za mjerenje homo ­
logne u odnosu na ostale u uzorku, a time i prikladne za uklju čivanje s 
obzirom na to da se osobito linearne mjere mogu promijeniti na relativno 
kratkoj udaljenosti (28). Nehomologne sekcije ne treba upotrebljavati. Iako 
je cilj uzorkovati sve životinje predvi đene u tu svrhu (10/spol/visina doze), i 
manje vrijednosti mogu biti odgovaraju će. Međutim, uzorci od manje od 
šest životinja po spolu i visini doze u pravilu se ne bi smatrali dovoljnima 
za potrebe ove ispitne metode. Stereologija se može upotrebljavati za iden ­
tifikaciju u činaka povezanih s tretmanom na parametre poput volumena ili 
broja stanica za posebne neuroanatomske dijelove. Sve aspekte pripreme uzoraka tkiva, od fiksiranja tkiva, preko disekcije uzoraka tkiva, obrada 
tkiva te bojenje preparata treba obaviti prema uravnoteženom planu tako 
da svaka serija uklju čuje reprezentativne uzorke svake skupine koja je 
primila odre đenu dozu. Ako treba koristiti morfometri čke ili stereološke 
analize, tada moždano tkivo treba uklopiti u dogovaraju ći medij istodobno 
na svim visinama doze kako bi se izbjeglo skupljanje artefakata povezanih s produljenim čuvanjem u fiksativu.
 
IZVJEŠĆIVANJE  
Podaci  
76. Podaci se navode pojedina čno i sažeto u obliku tablice. Prema potrebi za 
svaku ispitnu skupinu i svaku generaciju treba navesti sljede će podatke: broj 
životinja na po četku ispitivanja, broj životinja koje su prona đene mrtve 
tijekom ispitivanja ili koje su usmr ćene iz humanih razloga, vrijeme 
svake smrti ili humanog usmr ćivanja, broj plodnih životinja, broj skotnih 
ženki, broj životinja koje su okotile leglo te broj životinja u kojih su uo čeni 
znakovi toksi čnosti. Treba navesti i opis toksi čnosti, uklju čujući vrijeme 
početka, trajanje i težinu.  
77. Numeri čke rezultate treba procijeniti primjerenom i op će prihvaćenom stati ­
stičkom metodom. Statisti čke metode treba birati kod dizajna studije, a 
njima na primjeren na čin treba obuhvatiti nenormalne podatke (npr. 
podatke o broju), cenzurirane podatke (npr. ograni čeno vrijeme opažanja), 
neovisnost (npr. u činci na leglo i ponovljene mjere) te nejednake varijance.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 878
 
Općenitim linearnim miješanim modelima i modelima doza-reakcija obuh ­
vaćena je široka klasa analiti čkih alata koji mogu biti odgovaraju ći za 
podatke dobivene ovom ispitnom metodom. Izvješ će bi trebalo sadržavati 
dovoljno informacija o analiti čkoj metodi i ra čunalnom programu koji je 
upotrijebljen kako bi neovisni revizor/statisti čar mogao procijeniti/ponovno 
procijeniti analizu.  
Vrednovanje rezultata  
78. Nalaze treba vrednovati s obzirom na uo čene učinke, uklju čujući nekropsiju 
i mikroskopske nalaze. Vrednovanje uklju čuje odnos, ili njegov izostanak, 
između doze i postojanja, pojave i težine abnormalnosti, uklju čujući makro­
lezije. Treba vrednovati i ciljne organe, klini čke abnormalnosti, reproduk ­
tivno funkcioniranje i funkcioniranje legla, promjene tjelesne mase, morta ­
litet i sve ostale toksi čne i razvojne u činke. Posebnu pažnju treba posvetiti 
promjenama specifi čnima za spol. Kod vrednovanja rezultata ispitivanja 
treba uzeti u obzir fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije i, ako su dostupni, toksikokineti čke podatke, uklju čujući prijenos u posteljici i 
izlučivanje mlijeka.
 
Izvješće o ispitivanju  
79. Izvješ će o ispitivanju trebalo bi uklju čivati sljede će informacije dobivene u 
postojećoj studiji na životinjama P, F  1 i F 2 (prema potrebi):  
Ispitivana kemikalija  
— sve relevantne dostupne informacije o kemikaliji, toksikokineti čkim i 
toksikodinami čkim obilježjima ispitivane kemikalije,  
— identifikacijski podaci,  
— čistoća. 
Nosač (prema potrebi)  
— obrazloženje za odabir nosa ča, ako nije rije č o vodi.  
Ispitne životinje  
— upotrijebljena vrsta/soj,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, materijal za izradu gnijezda itd.,  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku ispitivanja,  
— podaci o vaginalnom brisu ženki P prije po četka tretmana (ako se 
podaci tada prikupljaju),  
— evidencije uparivanja generacije P uz navo đenje muškog i ženskog part ­
nera kod parenja te uspjeh parenja,  
— evidencije o leglu podrijetla za odrasle životinje generacije F  1 . 
Ispitni uvjeti  
— podloge za odabir visine doze,  
— pojedinosti o sastavu ispitivane kemikalije/pripremi hrane, postignutim 
koncentracijama,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 879
 
— stabilnost i homogenost pripravka u nosa ču ili drugom nosa ču (npr. 
prehrana, voda za pi će), u krvi i/ili mlijeku u uvjetima upotrebe i 
pohranjivanja izme đu upotreba,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— preračunavanje koncentracije (ppm) ispitivane kemikalije u hrani/vodi za 
piće u postignutu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), ako je primjenljivo,  
— pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uklju čujući, po mogu ćnosti, sastav 
hrane),  
— detaljan opis postupaka nasumi čnog odabira mladunaca za izdvajanje te 
za raspodjelu mladunaca u ispitne skupine,  
— okolišni uvjeti,  
— popis osoblja koje je sudjelovalo u studiji, uklju čujući stručno usavrša ­
vanje.  
Rezultati (sažetak i pojedina čni podaci po spolu i dozi)  
— unos hrane, unos vode ako je dostupan, u činkovitost hrane (porast 
tjelesne mase po gramu unesene hrane, osim za razdoblje kohabitacije 
i tijekom laktacije) i unos ispitivane kemikalije (za primjenu hranom/ 
vodom) za životinje P i F  1 , 
— podaci o apsorpciji (ako su dostupni),  
— podaci o tjelesnoj masi životinja P,  
— podaci o tjelesnoj masi odabranih životinja F  1 nakon odbijanja od sise,  
— vrijeme smrti tijekom studije ili preživljavanje životinja do usmr ćenja,  
— karakter, težina i trajanje klini čkih opažanja (jesu li reverzibilna ili ne),  
— hematologija, analiza urina i podaci o klini čkoj kemiji uklju čujući TSH i T4,  
— fenotipska analiza stanica slezene (T-, B-, NK-stanice),  
— celularnost koštane srži,  
— podaci o toksi čnoj reakciji,  
— broj ženki P i F  1 s normalnim i abnormalnim ciklusom estrusa i trajanje 
ciklusa,  
— vrijeme do parenja (interval prije koitusa, broj dana izme đu uparivanja i 
parenja),  
— toksični ili drugi u činci na reprodukciju, uklju čujući brojeve i postotke 
životinja koje su postigle parenje, graviditet, parturiciju i laktaciju, 
mužjaka koji su uzrokovali graviditet, ženki sa znakovima distocije/pro ­
duljene ili otežane parturicije,  
— trajanje graviditeta i parturicije, ako je dostupno,  
— broj implantacija, veli čina legla i postotak muških mladunaca,  
— broj i postotak gubitaka nakon implantacije, živoro đenih i mrtvoro đenih, ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 880
 
— masa legla i podaci o masi mladunaca (mužjaka, ženki i kombinirano), 
broj patuljastih životinja ako je utvr đen, 
— broj mladunaca s makroabnormalnostima,  
— toksični i drugi u činci na potomstvo, postnatalni rast, vitalnost itd.,  
— podaci o fizi čkim posebnostima mladunaca i ostali podaci o post ­
natalnom razvoju,  
— podaci o spolnom sazrijevanju životinja F  1 , 
— podaci o funkcionalnim opažanjima u mladunaca i odraslih životinja, 
ako je primjenljivo,  
— tjelesna masa u trenutku usmr ćenja i podaci o apsolutnoj i relativnoj 
masi organa za životinje P i F  1 , 
— nalazi nekropsije,  
— iscrpan opis svih histopatoloških nalaza,  
— ukupan broj spermatozoida iz repa epididimisa, postotak progresivno 
pokretljivih spermatozoida, postotak morfološki normalnih spermato ­
zoida i postotak spermatozoida po svakoj identificiranoj anomaliji za 
mužjake P i F  1 , 
— broj i faze sazrijevanja folikula iz jajnika ženki P i F  1 , prema potrebi,  
— nabrajanje žutih tijela u jajnicima ženki F  1 , 
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi.  
Parametri 2. kohorte  
— detaljan opis postupaka upotrijebljenih za standardizaciju opažanja i 
postupaka, kao i operativne definicije za bodovanje opažanja,  
— popis svih upotrijebljenih ispitnih postupaka i obrazloženje za njihovu 
upotrebu,  
— pojedinosti o upotrijebljenim bihevioralnim/funkcionalnim, neuropatolo ­ 
škim i morfometri čkim postupcima, uklju čujući informacije i pojedinosti 
o automatskim ure đajima,  
— postupci za kalibriranje i osiguranje istovjetnosti ure đaja i ujedna čavanje 
skupina za tretiranje u ispitnim postupcima,  
— kratko obrazloženje svih odluka koje uklju čuju stručno mišljenje,  
— detaljan opis svih bihevioralnih/funkcionalnih, neuropatoloških i morfo ­
metričkih nalaza po spolu i skupini za doziranje, uklju čujući povećanja i 
smanjenja u usporedbi s kontrolnim skupinama,  
— masa mozga,  
— sve dijagnoze postavljene na temelju neuroloških znakova i lezija, uklju ­ 
čujući prirodne bolesti ili stanja,  
— slike egzemplarnih nalaza,  
— mikroskopske slike za procjenu homologije sekcija upotrijebljenih za 
morfometriju,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 881
 
— statisti čki tretman rezultata, uklju čujući statističke modele upotrijebljene 
za analizu podataka te rezultati neovisno o tome jesu li zna čajni ili ne,  
— utjecaj ostalih toksi čnih učinaka na zaklju čak o neurotoksi čnom poten ­
cijalu ispitivane kemikalije po spolu i skupini za doziranje,  
— utjecaj toksikokineti čkih informacija na zaklju čke, 
— podaci kojima se potvr đuju pouzdanost i osjetljivost ispitne metode 
(npr. pozitivni i povijesni kontrolni podaci),  
— odnosi, ako postoje, izme đu neuropatoloških i funkcionalnih u činaka,  
— vrijednosti kod kojih nisu zamije ćeni štetni u činci (NOAEL) ili refe ­
rentna doza za ženke i potomke po spolu i skupini za doziranje,  
— rasprava o ukupnom tuma čenju podataka na temelju rezultata, uklju ču­
jući zaključak o tome je li razvojna neurotoksi čnost posljedica kemika ­
lije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamije ćeni štetni 
učinci (NOAEL).  
Parametri 3. kohorte  
— titri antitijela iz seruma IgM (senzitizacija na SRBC ili KLH), ili IgM 
PFC jedinice slezenskog IgM (senzitizacija na SRBC),  
— funkcioniranje metode TDAR trebao bi prvi put tijekom postupka opti ­
mizacije potvrditi laboratorij koji je zapo čeo ispitivanje, a potom perio ­
dički (npr. jednom godišnje) svi laboratoriji,  
— rasprava o ukupnom tuma čenju podataka na temelju rezultata, uklju ču­
jući zaključak o tome je li razvojna imunotoksi čnost posljedica ispiti ­
vane kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamije ćeni štetni 
učinci (NOAEL).  
Rasprava o rezultatima  
Zaključci, uklju čujući vrijednosti kod kojih nisu zamije ćeni štetni 
učinci (NOAEL) na roditelje i potomstvo  
Treba dostaviti i sve informacije koje nisu dobivene tijekom studije, ali koje 
su korisne za tuma čenje rezultata (npr. sli čnosti učinaka s bilo kojom 
poznatom toksi čnom tvari.  
Tumačenje rezultata  
80. Produljena studija reproduktivne toksi čnosti na jednoj generaciji pružit će, 
prema potrebi, informacije o u čincima ponavljanog izlaganja nekoj kemi ­
kaliji tijekom svih faza reproduktivnog ciklusa. To čnije, studija pruža infor ­
macije o reproduktivnom sustavu i o razvoju, rastu i funkcionalnim krajnjim točkama potomaka do 90. postnatalnog dana.
 
81. Tuma čenjem rezultata studije treba uzeti u obzir sve dostupne informacije o 
kemikaliji, uklju čujući fizikalno-kemijska, toksikokineti čka i toksikodi ­
namička svojstva, dostupne relevantne informacije o strukturnim analozima 
te rezultate ranije provedenih studija toksi čnosti s ispitivanom kemikalijom 
(npr. studije akutne toksi čnosti, toksi čnosti nakon ponovljene primjene i 
mehanizma te studije kojima se procjenjuje postoje li bitne kvalitativne i 
kvantitativne razlike me đu vrstama s obzirom na metaboli čka svojstva in 
vivo/in vitro). Po mogu ćnosti rezultate makroskopske nekropsije i vaganja 
organa treba procijeniti u kontekstu opažanja iz drugih studija s ponov ­
ljenom dozom. Usporavanja rasta potomaka mogu će je razmotriti u 
odnosu na utjecaj ispitivane kemikalije na sastav mlijeka (29).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 882
 
2. kohorta (razvojna neurotoksi čnost)  
82. Neurobihevioralne i neuropatološke rezultate treba tuma čiti u kontekstu svih 
nalaza na temelju dokaza i stru čne prosudbe. Treba raspravljati o uzorcima 
bihevioralnih i morfoloških nalaza, ako postoje te dokazima u pogledu 
doze-reakcije. U tu karakterizaciju treba uklju čiti procjenu razvojne neuro ­
toksičnosti, uklju čujući epidemiološke studije na ljudima ili izvješ ća o 
slučajevima te eksperimentalne studije na životinjama (npr. toksikokineti čki 
podaci, informacije o strukturnoj aktivnosti, podaci iz ostalih studija toksi č­
nosti). Procjenom podataka treba obuhvatiti i raspravu o biološkom i stati ­
stičkom značaju. Procjena bi trebala uklju čivati odnos, ako postoji, izme đu 
uočenih neuropatoloških i bihevioralnih promjena. Za smjernice o tuma ­ 
čenju rezultata razvojne neurotoksi čnosti vidjeti ispitnu metodu B.53 (35) 
i Tyl et al., 2008. (31).  
3. kohorta (razvojna imunotoksi čnost)  
83. Slabljenje ili poboljšanje imunološke funkcije iz procjene TDAR-a (reakcija 
antitijela ovisnih o T-stanicama) treba procijeniti u kontekstu svih obav ­
ljenih opažanja. Zna čaj ishoda TDAR-a mogu će je potvrditi ostalim u čin­
cima na imunološki povezane indikatore (npr. celularnost koštane srži), masa i histopatologija limfnih tkiva, distribucija podsustava limfocita). Učinci utvrđeni TDAR-om mogu biti manje zna čajni u slu čaju ostalih 
uočenih toksi čnosti pri nižim koncentracijama izlaganja.
 
84. Za pomo ć pri tuma čenju reprodukcije i rezultata neurotoksi čnosti (26) treba 
konzultirati OECD-ovu Smjernicu 43.  
LITERATURA  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006.), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology, 
36., 69. – 98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe 
(1999.), Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Labo ­
ratory Animal Diets, Lab. Anim. Sci., 49., 530. – 536.  
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003.), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005.), Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group, International Journal of Toxicology, 24., 87. – 94.
 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999.), Stimulating Research 
to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment, Toxicological Sciences, 
49., 1. – 4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995.), Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey, Journal of the American College of Toxico ­
logists, 14., 293. – 327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003.), Some Aspects Rela ­
ting to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility, Regu ­
latory Toxicology and Pharmacology, 37., 356. – 369.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000.). Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies, Journal of Toxicological Sciences, 25., 1. – 21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003.), Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and 
Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxico ­
logic Pathology, Birth Defects Research, Part B, 68., 408. – 415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007.), The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84. – 97.
 
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979.), Cycles and Seasons, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, 
Cambridge, New York.  
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds 
(1999.), Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anoge ­
nital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383. – 390.
 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977.), Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat, 
Biological Reproduction, 17., 298. – 303.  
(14) Ladics, G.S. (2007.), Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing, Methods, 41., 9. – 19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004.), Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation, Toxicology, 
197., 23. – 35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989.), A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Func ­
tion in the Rat, Fundamental and Applied Toxicology, 12., 92. – 108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978.), Daily Sperm Production 
and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats, Journal of 
Reproduction and Fertility, 54., 103. – 107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991.), The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive 
Toxicology, 5., 39. – 44.  
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996.), 
Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report, Reproductive Toxicology, 10., 237. – 244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. 
Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992.), Methods for Assessing Rat Sperm Motility, Reproductive Toxicology, 6., 267. – 273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992.), Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration, Journal of Andrology, 13., 409. – 421.
 
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991.), Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations, Reproductive Toxicology, 5., 449. 
– 458.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993.), Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. str. 319. – 333.
 
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989.), The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations, 
Journal of Andrology, 10., 401. – 415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992.), Endpoints of 
Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants, Reproductive Toxicology, 6., 491. – 505.  
(26) OECD (2008.), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Pariz.  
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987.), Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility, Journal of Andrology, 8., 330. – 337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006.), A „Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today, Toxicological Pathology, 
34., 296. – 313.
 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006.), Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components, Food Chemicals Toxicology, 44., 8. – 16.
 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, 
G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007.), Variations in Phytoe ­
strogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces 
Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and 
F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats, Environmental health perspectives, 115(12), 1717. – 1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka 
(2008.), Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints, Neurotoxicology 
and Teratology, 30: 349. – 381.
 
(32) OECD (1996.), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Pariz.
 
(33) Poglavlje B.43. ovog Priloga, Studija neurotoksi čnosti u glodavaca  
(34) OECD (2000.), Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ MONO(2000)7, OECD, Pariz.
 
(35) Poglavlje B.53. ovog Priloga, Studija razvojne neurotoksi čnosti.  
(36) Poglavlje B.54. ovog Priloga, Uterotropni biotest na glodavcima: Krat ­
koročni test probira na estrogenska obilježja.  
(37) Poglavlje B.55. ovog Priloga, Hershbergerov biotest na glodavcima Krat ­
koročni test probira na (anti)androgenska svojstva.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 885
 
(38) OECD (2009.), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Pariz.  
(39) OECD (2011.), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Pariz.
 
(40) OECD (2013.), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Pariz.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 886
 
Dodatak 1.  
Vrijednosti i opažanja uklju čeni u funkcionalno-opservacijsku bateriju (kohorta 2.A)  
Kavez u kojem se drže životinje i 
otvoreno podru čje Manipulativni  Fiziološki  
Držanje  Lako ća uklanjanja  Temperatura  
Nevoljni kloni čki i tonički pokreti  Lakoća rukovanja  Tjelesna masa  
Zatvaranje kapaka  Miši ćni tonus  Reakcije zjenica  
Piloerekcija  Reakcija na pristupanje  Veli čina zjenica  
Slinjenje  Reakcija na dodir  
Izlučivanje suza  Reakcija na buku  
Vokalizacije  Reakcija na štipanje repa  
Kretanje unatrag  Reakcija na uspravljanje  
Abnormalnosti u hodu  ,Spuštenost stopala'  
Uzbuđenje Snaga prednjih udova  
Stereotipi  Snaga stražnjih udova  
Neobično ponašanje  
Mrlje  
Respiratorne abnormalnosti  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 887
 
Dodatak 2.  
DEFINICIJE  
Kemikalija:  Tvar ili smjesa.  
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom 
metodom.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 888
 
B.57.  TEST STEROIDOGENEZE H295R  
UVOD  
1. Ova je ispitna metoda istovjetna Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 456 
(2011.). OECD je u 1998. pokrenuo aktivnost visokog prioriteta revizije 
postojećih i razvoja novih smjernica za ispitivanje za probir i ispitivanje 
potencijalnih endokrino disruptivnih kemikalija. OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija iz 2002. sastoji se od pet razina, pri čemu svaka razina odgovara drugoj razini 
biološke složenosti (1). U testu steroidogeneze H295R in vitro koji se 
opisuje ovom ispitnom metodom upotrebljava se stani čna linija humanog 
adrenokarcinoma (stanice NCI-H295R), a on predstavlja 2. liniju „testa in vitro kojim se dobivaju mehani čki podaci” koje treba upotrebljavati kod 
probira i rangiranja. Razvoj i standardizacija testa kao probira za kemijske 
učinke steroidogeneze, osobito na proizvodnju 17 β-estradiola (E2) i 
testosterona (T), provedeni su u nekoliko faza. Test H295R optimiziran je i validiran (2) (3) (4) (5).
 
2. Cilj je testa steroidogeneze H295R otkriti kemikalije koje utje ču na proiz ­
vodnju hormona E2 i T. Test H295R namijenjen je otkrivanju ksenobiotika čija su ciljna mjesta endogene komponente koje predstavljaju me đustanični 
biokemijski put koji po činje od niza reakcija od kolesterola do proizvodnje 
hormona E2 i/ili T. Test H295R nije namijenjen otkrivanju kemikalija koje 
utječu na steroidogenezu zbog u činaka na os hipotalamus-hipofiza-gonada. 
Cilj je testa pružiti odgovor DA/NE s obzirom na potencijal kemikalije da potakne ili sprije či proizvodnju hormona T i E2. Me đutim, u nekim je 
slučajevima mogu će dobiti kvantitativne rezultate. Rezultati testa izražavaju 
se kao relativne promjene u proizvodnji hormona u usporedbi s kontrolama otapala. Cilj testa nije pružanje specifi čnih mehani čkih podataka o interak ­
ciji ispitivane kemikalije i endokrinog sustava. Istraživanja su provedena 
upotrebom stani čne linije za utvr đivanje učinaka na specifi čne enzime i 
hormone posrednike poput progesterona (2).
 
3. Definicije i kratice upotrijebljene u ovoj ispitnoj metodi opisuju se u Doda ­
tku. Detaljan protokol, uklju čujući upute za pripremanje otopina, kultivi ­
ranje stanica i provo đenje raznih aspekata ispitivanja, dostupan je kao 
dodaci I–III. OECD-ova dokumenta,Višelaboratorijska validacija testa steroidogeneze H295R radi utvr đivanja modulatora proizvodnje testosterona 
i estradiola (4).
 
POČETNA RAZMATRANJA I OGRANI ČENJA  
4. Pet razli čitih enzima koji kataliziraju šest razli čitih reakcija uklju čeno je u 
biosintezu spolnog steroidnog hormona. Enzimatska konverzija kolesterola 
u pregnenolon s pomo ću enzima odvajanja bo čnog lanca kolesterola 
(CYP11A) citokroma P450 (CYP) predstavlja prvi korak u nizu biokemij ­
skih reakcija čiji je vrhunac sinteza steroidnih krajnjih proizvoda. Ovisno o 
redu sljede će dvije reakcije, steroidogenski put dijeli se na dva puta, put Δ 5 - 
hidroksisteroida i put Δ 4 -ketosteroida koji se približavaju kod proizvodnje 
androstendiona (slika 1.).  
5. Androstendion se pretvara u testosteron (T) s pomo ću 17β-hidroksisteroid- 
dehidrogenaze (17 β-HSD). Testosteron je i hormon posrednik i krajnji 
hormonom. U mužjaka se može pretvoriti u dihidrotestosteron (DHT) s 
pomoću 5α-reduktaze, koja se nalazi u stani čnim membranama, jezgrenoj 
ovojnici i endoplazmatskom retikulumu ciljnih tkiva androgenskog djelo ­
vanja poput prostate i sjemenih vezikula. DHT je znatno potentniji kao 
androgen u usporedbi s testosteronom te se smatra i krajnjim hormonom. 
Testom H295R ne mjeri se DHT (vidjeti stavak 10.).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 889
 
6. Aromataza (CYP19) jest enzim na steroidogenskom putu kojim se andro ­
genske kemikalije pretvaraju u estrogenske. Njome se testosteron pretvara u 
17β-estradiol (E2), a androstendion u estron. Hormoni E2 i T smatraju se 
krajnjim hormonima steroidogenskog puta.  
7. Specifi čnost djelovanja liaze aromataze CYP17 razlikuje se za supstrate 
posrednike me đu vrstama. U ljudi enzim favorizira supstrate puta Δ 5 -hidro­
ksisteroida (pregnenolon), dok su u štakora poželjniji supstrati na putu Δ 4 - 
ketosteroida (progesteron) (19). Takvim razlikama u aktivnosti liaze aroma ­
taze CYP17 mogu se objasniti neke razlike u reakciji na kemikalije kojima se mijenja steroidogeneza in vivo prema vrstama (6). Dokazano je da su 
stanice H295 najsli čnije adrenalnoj ekspresiji enzima i uzorku proizvodnje 
steroida u odraslih ljudi (20), ali je poznato da one izražavaju enzime za putove Δ
 5 -hidroksisteroida i Δ 4 -ketosteroida za sintezu androgena (7) (11) 
(13) (15).  
Slika 1.  
Steroidogenski put u stanicama H295R
  
Napomena:  
Enzimi su u kurzivu, hormoni su podebljani, a strelice ukazuju na smjer 
sinteze. Siva pozadina predstavlja putove/proizvode kortikosteroida. Putovi/ 
proizvodi spolnih steroida su zaokruženi. CYP = citokrom P450; HSD = hidroksisteroid-dehidrogenaza; DHEA = dehidroepiandrosteron.
 
8. Stani čna linija humanog adrenokarcinoma (H295R) koristan je model in 
vitro za ispitivanje u činaka na sintezu steroidnih hormona (2) (7) (8) (9) 
(10). Stani čna linija H295R izražava gene koji kodiraju sve gore navedene 
ključne enzime za steroidogenezu (11) (15) (slika 1.). To je jedinstveno 
obilježje jer je ekspresija tih gena in vivo specifi čna za tkivo i razvojnu 
fazu, uz u pravilu više tkiva i razvojnih faza koji izražavaju sve gene 
uključene u steroidogenezu (2). Stanice H295R odlikuju se fiziološkim 
karakteristikama zonski nediferenciranih humanih fetalnih adrenalnih stanica (11). Stanice predstavljaju jedinstveni sustav in vitro s obzirom na to da se odlikuju sposobnoš ću proizvodnje svih steroidnih hormona koji se 
nalaze u odraslome adrenalnom korteksu i gonadama, čime se omogu ćava 
ispitivanje u činaka na sintezi kortikosteroida i proizvodnju spolnih 
steroidnih hormona poput androgena i estrogena, iako je test validiran samo za otkrivanje hormona T i E2. Promjene zabilježene ispitnim 
sustavom u obliku promjene u proizvodnji hormona T i E2 mogu biti 
posljedica brojnih interakcija ispitivanih kemikalija i steroidogenih funkcija
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 890
 
izraženih stanicama H295R. One uklju čuju modulaciju ekspresije, sintezu ili 
funkciju enzima uklju čenih i proizvodnju, transformaciju ili eliminaciju 
steroidnih hormona (12) (13) (14). Razlozi inhibicije proizvodnje hormona mogu biti izravno konkurentsko povezivanje s enzimom na putu, učinak na su čimbenike poput NADPH-a (nikotinamid adenin dinu ­
kleotid fosfat) i cAMP-a (cikli čki adenozin monofosfat) i/ili porast metabol ­
izma steroida ili suzbijanje ekspresije gena odre đenih enzima na putu steroi ­
dogeneze. Iako inhibicija može biti funkcija izravnih ili neizravnih postu ­
paka uklju čenih u proizvodnju hormona, indukcija je u pravilu neizravnog 
karaktera, poput utjecaja na su čimbenike poput NADPH-a i cAMP-a (kao u 
slučaju forskolina), smanjenja metabolizma steroida (13) i/ili pospješivanja 
steroidogenske ekspresije gena.
 
9. Test H295R ima nekoliko prednosti:  
— njime se omogu ćava otkrivanje pove ćanja i smanjenja proizvodnje 
hormona T i E2,  
— njime se dopušta izravna procjena potencijalnog u činka kemikalije na 
vitalnost/citotoksi čnost stanice. To je važno obilježje jer se njime 
omogućava razlikovanje u činaka koji su posljedica citotoksi čnosti i 
onih koji su posljedica izravne interakcije kemikalija i steroidogenskih putova, što nije mogu će u sustavima u kojima se upotrebljavaju 
eksplantati tkiva koji se sastoje od brojnih vrsta stanica razli čitih osje­
tljivosti i funkcionalnosti,
 
— za njegovo provo đenje nisu potrebne životinje,  
— stanična linija H295R komercijalno je dostupna.  
10. Načelna su ograni čenja testa kako slijedi:  
— nepoznat je njegov metaboli čki kapacitet, ali je vjerojatno vrlo ograni ­ 
čen. Stoga će kemikalije koje treba metaboli čki aktivirati vjerojatno biti 
izostavljene iz ovog testa.  
— s obzirom na to da nastaje iz adrenalnog tkiva, H295R se dolikuje 
enzimima sposobnima za proizvodnju glukokortikoida i mineralnih kortikoida, kao i spolnih hormona. Stoga bi u činci na proizvodnju 
glukokortikoida i mineralnih kortikoida mogli utjecati na razine 
hormona T i E2 uo čene u testu,
 
— njime se ne mjeri DHT i zato se ne o čekuje da se njime otkriju kemi ­
kalije koje inhibiraju 5 α-reduktazu, za što se može upotrebljavati Hersh ­
bergerov test (16),  
— testom H295R ne će se otkriti kemikalije koje ometaju steroidogenezu 
tako da utje ču na os hipotalamus-hipofiza-gonada jer se nju može ispi ­
tivati samo na netaknutim životinjama.  
NAČELO TESTA  
11. Namjena je testa otkrivanje kemikalija koje utje ču na proizvodnju hormona 
T i E2. Testosteron je i hormon posrednik na putu proizvodnje hormona E2. 
Testom se mogu otkriti kemikalije kojima se u pravilu inhibiraju ili indu ­
ciraju enzimi puta steroidogeneze.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 891
 
12. Test se obi čno provodi u standardnim uvjetima stani čne kulture na plo či­
cama za uzgoj kulture s 24 jažice. Alternativno, za provo đenje testa mogu 
se upotrebljavati i druge veli čine pločica. Međutim, uvjete razmnožavanja i 
pokusa treba odgovaraju će prilagoditi kako bi se kriteriji u činka i dalje 
primjenjivali.  
13. Nakon razdoblja aklimatizacije u trajanju od 24 sata na plo čicama s više ­
strukim jažicama, stranice se 48 sati izlaže sedam koncentracija ispitivane 
kemikalije u najmanje tri primjerka. Otapalo i poznati inhibitor i induktor 
proizvodnje hormona dodaju se u fiksnoj koncentraciji kao negativne i pozitivne kontrole. Na kraju razdoblja izlaganja iz svake se jažice uklanja medij. Vitalnost stanica u svakoj jažici analizira se neposredno nakon ukla ­
njanja medija. Koncentracije hormona u mediju mogu će je izmjeriti raznim 
metodama, uklju čujući komercijalno dostupne komplete za mjerenje 
hormona i/ili instrumentalnim tehnikama poput masene spektrometrije s 
tekućinskom kromatografijom (LC-MS). Podaci su izraženi kao promjena 
omjera u odnosu na kontrolu otapala i najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom (LOEC). Ako je test negativan, najviša ispitivana koncentracija 
navodi se kao koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC). Zaklju čke o 
sposobnosti kemikalije da utje če na steroidogenezu treba temeljiti na 
najmanje dva neovisna ispitivanja. Prvo ispitivanje može služiti za utvr ­ 
đivanje raspona, uz naknadnu prilagodbu koncentracija za drugo i tre će 
ispitivanje ako do đe do problema radi topljivosti ili citotoksi čnosti ili ako 
se čini da je djelovanje kemikalije pri kraju raspona ispitivanih 
koncentracija.
 
POSTUPAK U POGLEDU KULTURA  
Stanična linija  
14. Stanice NCI-H295R mogu se kupiti od centra American Type Culture 
Collections (ATCC) nakon potpisa ugovora o prijenosu materijala (  1 ). 
Uvod  
15. Zbog promjena kapaciteta za proizvodnju hormona E2 stanica zbog stare ­
nja/prolaza (2), stranice prije upotrebe treba kultivirati u skladu s posebnim 
protokolom te treba zabilježiti broj prolaza od odmrzavanja stanica, kao i 
broj prolaza kod zamrzavanja stanica i njihova smještaja u spremnik s tekućim dušikom. Prvi broj odnosi se na stvarni broj stani čnih prolaza, 
dok se drugi odnosi na broj prolaza kod zamrzavanja stanica i njihova 
smještaja u spremnik. Primjerice, stanice koje su smrznute nakon petog 
prolaza i odmrznute te potom podijeljene tri puta ( četiri prolaza, pri čemu 
su svježe odmrznute stanice prvi prolaz) nakon ponovne kultivacije imale bi oznaku prolaz 4,5. Primjer sheme za ozna čivanje brojevima opisuje se u 
Dodatku 1. izvješ ću o validaciji (4).
 
16. Osnovni se medij upotrebljava kao osnova za dopunjene medije i medije za 
zamrzavanje. Dopunjeni je medij nužna komponenta za kultivaciju stanica. Medij za zamrzavanje posebno je namijenjen zamrzavanju stranica bez posljedica radi dugotrajnog čuvanja. Prije upotrebe treba analizirati 
nu-serum (ili usporedivi serum jednakih svojstava za koji je dokazano da 
daje podatke u skladu sa zahtjevima u pogledu provo đenja ispitivanja i 
kontrole kvalitete), koji je sastavni dio dopunjenih medija, radi osnovnih koncentracija hormona T i E2. Priprema tih otopina opisuje se u Dodatku 1. 
izvješću o validaciji (4).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, (http://www.lgcstandards-atcc.org/).
 17. Nakon inicijacije stani čne kulture H295R iz prvotne ATCC-ove serije, 
stanice treba uzgajati za pet prolaza (tj. stanice se dijele 4 puta). Stanice 
petog prolaza potom se zamrzavaju u spremniku s teku ćim dušikom. Prije 
zamrzavanja stanica uzorak prethodnih stanica četvrtog prolaza stavlja se na 
pločicu za kontrolu kvalitete (vidjeti stavke 36. i 37.) kako bi se potvrdilo 
jesu li osnovna proizvodnja hormona i reakcija na pozitivne kontrolne 
kemikalije u skladu s kriterijima kontrole testa kako su definirani u tablici 5.
 
18. Stanice H295R treba kultivirati, zamrznuti i pohraniti u teku ćem dušiku 
kako bi se osiguralo da su one uvijek stanice odgovaraju ćeg prolaza/starosti 
za kultivaciju i upotrebu. Najve ći broj prolaza nakon uzimanja nove (  1 ) ili 
zamrznute (  2 ) serije stanica u kulturu koji je prihvatljiv za upotrebu u testu 
H295R ne smije premašiti deset. Primjerice, prihvatljivi bi prolazi za 
stanične kulture iz serije zamrznute kod petog prolaza bili 4,5 do 10,5. 
Za stanice zapo čete iz tih zamrznutih serija treba slijediti postupak iz 
stavka 19. Te stanice treba kultivirati za najmanje četiri (4) dodatna 
prolaza (prolaz 4,5) prije njihove upotrebe u ispitivanju.  
Započinjanje stanica iz zamrznute zalihe  
19. Postupak za zapo činjanje stanica iz zamrznute zalihe treba upotrebljavati 
kad se nova serija stanica vadi iz spremnika s teku ćim dušikom radi kulti ­
vacije i ispitivanja. Pojedinosti o ovom postupku navedene su u Dodatku III. izvješ ću o validaciji (4). Stanice se vade iz spremnika s teku ćim duši­
kom, ubrzano odmrzavaju, smještaju u dopunjeni medij u kivetu za centri ­
fugiranje, centrifugiraju na sobnoj temperaturi, ponovno suspendiraju u dopunjenom mediju te premještaju u tikvicu s kulturom. Medij treba promi ­
jeniti sljede ćeg dana. Stanice H295R kultiviraju se u inkubatoru na 37 °C s 
5 %-tnim CO
 2 u zraku, a medij se obnavlja 2 do 3 puta tjedno. Kad su 
stanice približno 85 – 90 % konfluentne, treba ih podijeliti. Dijeljenje stanica nužno je radi osiguranja zdravlja i rasta stanica te čuvanja stanica 
za provođenje biotestova. Stanice se tri puta ispiru fiziološkom otopinom s 
fosfatnim pulferom (bez Ca
 2+ Mg 2+ ) i osloba đaju iz tikvice s kulturom 
dodavanjem odgovaraju ćeg enzima za odvajanje, npr. tripsina u fiziološku 
otopinu s fosfatnim pulferom (bez Ca  2+ Mg 2+ ). Neposredno nakon odva ­
janja stanica od tikvice s kulturom treba zaustaviti djelovanje enzima doda ­
vanjem dopunjenog medija u omjeru trostrukog volumena upotrijebljenog 
za tretman enzimom. Stanice se stavljaju u kivetu za centrifugiranje, centri ­
fugiraju se na sobnoj temperaturi, uklanja se supernatant te se stani čni talog 
ponovno suspendira u dopunjenom mediju. Odgovaraju ća količina otopine 
stanica stavlja se u novu tikvicu s kulturom. Koli činu otopine stanica treba 
prilagoditi tako da su stanice konfluentne u roku od 5 do 7 dana. Preporu ­ 
čeni je omjer potkultivacije 1:3 do 1:4. Plo čicu treba pažljivo ozna čiti. 
Stanice su sada spremne za upotrebu u testu, a višak stanica treba zamrznuti 
u tekućem dušiku kako je opisano u stavku 20.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 893  
( 1 ) „Nova serija” odnosi se na svježu seriju stanica dobivenih od ATCC-a. 
( 2 ) „Zamrznuta serija” odnosi se na stanice koje su prije kultivirane i potom zamrznute u 
laboratoriju koji nije ATCC.
 Zamrzavanje stanica H295R (priprema stanica za čuvanje u teku ćem 
dušiku)  
20. Kod pripreme stanica H295R za zamrzavanje treba slijediti gore opisani 
postupak za dijeljenje stanica do koraka za ponovnu suspenziju stani čnog 
taloga s dna kivete za centrifugiranje. Ovdje se stani čni talog ponovno 
suspendira u mediju za zamrzavanje. Otopina se premješta u kriogenu posudu, odgovaraju će označava te 24 sata zamrzava na – 80 °C, nakon 
čega se kriogena posuda stavlja u spremnik s teku ćim dušikom. Pojedinosti 
o ovom postupku navedene su u Dodatku III. izvješ ću o validaciji (4).
 
Nanošenje na plo čice i preinkubacija stanica za ispitivanje  
21. Broj potrebnih plo čica s 24 jažice pripremljenih kako se navodi u stavku 
19. ovisi o broju kemikalija koje treba ispitati i konfluenciji stanica u posudama s kulturom. U pravilu, jedna tikvica s kulturom (75 cm
 2 ) 80 – 
90 % konfluentnih stanica imat će dovoljno stanica za jednu do 1,5 plo čicu 
(24 jažice) ciljne gusto će od 200 000 do 300 000 stanica po ml medija, što 
će dovesti do konfluencije od 50 – 60 % u jažicama u 24 sata (slika 2.). To 
je u pravilu optimalna gusto ća stanica za proizvodnju hormona u testu. Pri 
većim gustoćama mijenjaju se uzorci proizvodnje hormona T i E2. Prije 
prvog provo đenja testa preporu čuje se ispitivanje razli čitih gusto ća razmno ­ 
žavanja izme đu 200 000 i 300 000 stanica po ml te odabir gusto će za 
konfluenciju od 50 – 60 % u jažici tijekom 24 sata.  
Slika 2.  
Fotomikrograf stanica H295R pri gusto ći razmnožavanja od 50 % na plo čici s 24 jažice u 
24 sata zabilježen na rubu (A) i u središtu (B) jažice.
  
22. Medij se pipetom vadi iz tikvice s kulturom, stanice se ispiru tri puta 
sterilnom fiziološkom otopinom s fosfatnim pulferom (bez Ca  2+ Mg 2+ ). 
Otopina enzima (u fiziološkoj otopini s fosfatnim pulferom (bez Ca  2+ 
Mg 2+ ) dodaje se radi odvajanja stanica od tikvice s kulturom. Nakon odgo ­
varajućeg vremenskog razdoblja za odvajanje stanica treba zaustaviti djelo ­
vanje enzima dodavanjem dopunjenog medija u omjeru trostrukog volu ­
mena upotrijebljenog za tretman enzimom. Stanice se stavljaju u kivetu  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 894
 
za centrifugiranje, uklanja se supernatant te se stani čni talog ponovno 
suspendira u dopunjenom mediju. Gusto ća stanica izra čunava se s 
pomoću, primjerice, hemocitometra ili broja ča stanica. Otopinu stanica 
treba razrijediti do željene gusto će za nanošenje na plo čice i temeljito 
promiješati kako bi se osigurala homogenost gusto će stanica. 1 ml 
otopine stanica po jažici treba nanijeti na plo čicu te ozna čiti pločice i 
jažice. Plo čice na koje su nanesene stanice podvrgavaju se inkubaciji u 
trajanju od 24 sata pri 37 °C s 5 %-tnim CO  2 u zraku kako bi se stanice 
mogle pri čvrstiti na jažice.  
ZAHTJEVI U POGLEDU KONTROLE KVALITETE  
23. Klju čno je dodavanje to čnih količina otopina i uzoraka u jažice tijekom 
doziranja jer se na taj na čin utvrđuju koncentracije koje se upotrebljavaju u 
izračunima rezultata testa.  
24. Svaki bi laboratorij prije zapo činjanja stani čne kulture i bilo kakvog 
naknadnog ispitivanja trebao dokazati osjetljivost svog sustava mjerenja 
hormona (stavci 29. do 31.).  
25. Ako se upotrebljavaju testovi mjerenja hormona na temelju antitijela, kemi ­
kalije koje treba ispitati prije prvog ispitivanja treba analizirati s obzirom na njihov potencijal narušavanja sustava mjerenja koji se upotrebljava za 
mjerenje hormona T i E2 kako je navedeno u stavku 32.
 
26. DMSO je preporu čeno otapalo za test. Ako se upotrebljava alternativno 
otapalo, treba utvrditi sljede će: 
— topljivost ispitivane kemikalije, forskolina i prokloraza u otapalu,  
— citotoksi čnost kao funkciju koncentracije otapala.  
Preporučuje se da najve ća dopuštena koncentracija otapala ne premašuje 
deseterostruku najmanju citotoksi čnu koncentraciju otapala.  
27. Prije prvog ispitivanja laboratorij bi trebao provesti kvalifikacijski pokus 
kojim dokazuje svoju sposobnost održavanja i postizanja odgovaraju ćih 
uvjeta u pogledu stani čne kulture i pokusa nužnih za ispitivanje kemikalije 
kako je opisano u stavcima 33. do 35.  
28. Pri pokretanju ispitivanja na novoj seriji kontrolnu plo čicu treba ispitati 
prije upotrebe nove serije kako bi se ocijenio u činak stanica kako je 
opisano u stavcima 36. i 37.  
Učinak sustava mjerenja hormona  
Osjetljivost, to čnost i preciznost metode i unakrsna reaktivnost s matricom 
uzorka  
29. Svaki laboratorij može za analizu proizvodnje hormona T i E2 stanica 
H295R upotrebljavati sustav mjerenja hormona po izboru u skladu s krite ­
rijima učinka, uklju čujući granicu kvantifikacije (LOQ). Nominalno oni 
iznose 100 pg/ml za hormon T i 10 pg/ml za hormon E2, koji se temelje na osnovnim razinama hormona iz validacijskih studija. Me đutim, više ili 
niže razine mogu biti odgovaraju će ovisno o osnovnim razinama hormona 
ostvarenima u laboratoriju koji provodi ispitivanje. Prije prve upotrebe pločice za kontrolu kvalitete i po četka ispitivanja laboratorij bi trebao 
analizom dopunjenog medija s dodatkom interne hormonske kontrole doka ­
zati da se hormonskim testom koji treba upotrebljavati mogu mjeriti 
koncentracije hormona u dopunjenom mediju dovoljno to čno i precizno u 
skladu s kriterijima za kontrolu kvalitete navedenima u tablicama 1. i 5. U dodatni medij treba dodati najmanje tri koncentracije svakog hormona (npr. 
100, 500 i 2 500 pg/ml hormona T, odnosno 10, 50 i 250 pg/ml hormona 
E2; ili je za najniže koncentracije dodatka za hormone T i E2 mogu će
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 895
 
upotrijebiti najniže mogu će koncentracije na temelju grani čnih vrijednosti 
otkrivanja odabranog sustava mjerenja hormona) i analizirati. Izmjerene 
koncentracije hormona neekstrahiranih uzoraka trebale bi biti unutar 30 % nominalnih koncentracija, a varijacije izme đu ponovljenih mjerenja istog 
uzorka ne smiju premašivati 25 % (vidjeti i tablicu 8. za dodatne kriterije 
u pogledu kontrole kvalitete). Ako su ti kriteriji u pogledu kontrole kvalitete 
ispunjeni, pretpostavlja se da je odabrani test mjerenja hormona dovoljno točan, precizan te da nije unakrsno reaktivan s komponentama u mediju 
(matrica uzorka) tako da bi se mogao o čekivati znatan utjecaj na ishod testa. 
U tom slu čaju nije potrebna ekstrakcija uzoraka prije mjerenja hormona.
 
30. U slu čaju da kriteriji u pogledu kontrole kvalitete iz tablica 1. i 8. nisu 
ispunjeni, može do ći do znatnog u činka matrice te treba provesti pokus s 
pomoću ekstrahiranog medija s dodatkom. Primjer postupka ekstrakcije 
opisuje se u Dodatku 2. izvješ ću o validaciji (4). Mjerenja koncentracija 
hormona u ekstrahiranim uzorcima treba provesti u tri primjerka (  1 ). Ako se 
može dokazati da nakon ekstrakcije komponente medija ne ometaju metodu 
otkrivanja hormona kako je definirana kriterijima za kontrolu kvalitete, sva 
daljnja ispitivanja treba provoditi upotrebljavaju ći ekstrahirane uzorke. Ako 
je kriterije za kontrolu kvalitete nemogu će ispuniti nakon ekstrakcije, upotri ­
jebljeni sustav mjerenja hormona ne odgovara svrsi testa steroidogeneze 
H295R te treba upotrijebiti drugu metodu otkrivanja hormona.  
Standardna krivulja  
31. Koncentracije hormona kontrola otapala trebale bi se nalaziti unutar 
linearnog dijela standardne krivulje. Poželjno je da se vrijednosti kontrola otapala nalaze blizu središta linearnog dijela kako bi se osigurala mogu ćnost 
mjerenja indukcije i inhibicije sinteze hormona. Otopine medija (ili ekstra ­
kata) koje treba mjeriti treba odabrati u skladu s tim. Linearni odnos treba utvrditi odgovaraju ćim statisti čkim pristupom.
 
Ispitivanje interferencije kemikalije  
32. Ako će se za mjerenje hormona upotrebljavati testovi na osnovi antitijela 
poput imunoenzimskih testova (ELISA) i radioimunoloških testova (RIA), 
svaku kemikaliju prije po četka stvarnog ispitivanja kemikalija treba ispitati 
radi potencijalne interferencije sa sustavom mjerenja hormona koji treba upotrijebiti (Dodatak III. izvješ ću o validaciji (4)) zato što neke kemikalije 
mogu ometati navedena ispitivanja (17). Ako interferencija iznosi ≥ 20 % 
osnovne proizvodnje hormona T i E2 utvr đene analizom hormona, treba 
provesti ispitivanje interferencije testa hormona kemikalije (kako je opisano
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 896  
( 1 ) Napomena:  Ako je potrebna ekstrakcija. za svaki se ekstrakt obavljaju tri ponovljena 
mjerenja. Svaki će se uzorak ekstrahirati samo jednom.
 u odjeljku 5.0 Dodatka III. izvješ ću o validaciji (4)) na svima osnovnim 
otopinama ispitivane kemikalije kako bi se utvrdila grani čna doza pri kojoj 
dolazi do znatne interferencije ( ≥ 20 %). Ako interferencija iznosi manje od 
30 %, podaci se mogu ispraviti za interferenciju. Ako interferencija iznosi više od 30 %, podaci su nevaže ći te treba odbaciti podatke pri tim koncen ­
tracijama. Ako do znatne interferencije ispitivane kemikalije sa sustavom 
mjerenja hormona do đe kod više necitotoksi čnih koncentracija, treba 
upotrebljavati drugi sustav mjerenja hormona. Kako bi se izbjegla interfe ­
rencija kontaminiraju ćih kemikalija, preporu čuje se ekstrakcija hormona iz 
medija s pomo ću odgovaraju ćeg otapala, a mogu će se metode nalaze u 
izvješću o validaciji (4).
 
Tablica 1.  
Kriteriji u činka za sustave mjerenja hormona  
Parametar  Kriterij  
Osjetljivost mjerne metode  Granica kvantifikacije (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Učinkovitost ekstrakcije hormona 
(samo u slu čaju potrebe)  Prosječna brzina obnavljanja (na 
temelju trostrukih mjera) koli čina 
hormona s dodatkom ne smije se 
razlikovati više od 30 % od dodane količine.
 
Interferencija kemikalije (samo 
sustavi na temelju antitijela)  Ne smije do ći do znatne ( ≥ 30 % 
osnovne proizvodnje hormona odgo ­
varajućeg hormona) unakrsne reak ­
tivnosti niti s jednim hormonom 
koji proizvode stanice (  b ) ( c ) 
( a ) Napomena : Granice mjerne metode temelje se na osnovnim vrijednostima proiz ­
vodnje hormona navedenima u tablici 5. i na u činku. Ako je mogu će postići veću 
osnovnu proizvodnju hormona, granica može biti viša. 
( b ) Neka antitijela hormona T i E2 mogu unakrsno reagirati s androstendionom, 
odnosno estronom, u ve ćem postotku. U takvim slu čajevima nije mogu će točno 
utvrditi učinke na 17 β-HSD. Ipak, podaci mogu pružiti korisne informacije o u čin­
cima na proizvodnju estrogena ili androgena op ćenito. U takvim slu čajevima 
podatke treba izraziti kao reakcije androgena/estrogena, umjesto kao hormone 
E2 i T. 
( c ) To uklju čuje kolesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoksikortisteron, kortiko ­
steron, aldosteron, 17 α-pregnenolon,17 α-progesteron, deoksikortizol, kortizol, 
DHEA, androstenedion, estron.  
Ispitivanje osposobljenosti laboratorija  
33. Prije ispitivanja nepoznatih kemikalija laboratorij bi, provo đenjem ispiti ­
vanja osposobljenosti, trebao dokazati da može posti ći i održati odgovara ­
juću staničnu kulturu i ispitne uvjete nužne za uspješno provo đenje testa. S 
obzirom na to da je provo đenje testa izravno povezano s osobljem labora ­
torija koje ga provodi, te postupke treba djelomi čno ponoviti ako do đe do 
promjene osoblja.  
34. To će se ispitivanje osposobljenosti provesti u jednakim uvjetima navede ­
nima u stavcima 38. do 40. izlaganjem stanica sedam rastu ćih koncentracija 
jakih, umjerenih i slabih induktora i inhibitora, kao i negativnoj kemikaliji (vidjeti tablicu 2.) To čnije, kemikalije koje treba ispitati uklju čuju jaki 
induktor forskolin (br. CAS 66575-29-9), jaki inhibitor prokloraz 
(br. CAS 67747-09-5), umjereni induktor atrazin (br. CAS 1912-24-9), 
umjereni inhibitor aminoglutetimid (br. CAS 125-84-8), slabi induktor
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 897
 
(proizvodnja hormona E2) i slabi inhibitor (proizvodnja hormona T), 
bisfenol A (br. CAS 80-05-7) i negativnu kemikaliju humani korionski 
gonadotropin (HCG) (br CAS 9002-61-3) kako je navedeno u tablici 2. Za sve se kemikalije upotrebljavaju zasebne plo čice s pomo ću formata 
navedenih u tablici 6. Jednu plo čicu za kontrolu kvalitete kemikalija za 
ispitivanje osposobljenosti (tablica 4., stavci 36. i 37.) treba uklju čiti u 
svakodnevno ispitivanje.
 
Tablica 2.  
Kemikalije za ispitivanje osposobljenosti i koncentracije izlaganja  
Kemikalija za ispitivanje 
osposobljenosti  Ispitne koncentracije [ μM] 
Prokloraz  0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10  
Forskolin  0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30  
Atrazin  0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
Aminoglutetimid  0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
Bisfenol A  0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
HCG  0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Kontrola otapala (DMSO) (0), 1 μl DMSO/jažica  
Izlaganje stanica H295R kemikalijama za ispitivanje osposobljenosti treba 
provesti na plo čicama s 24 jažice tijekom ispitivanja osposobljenosti labo ­
ratorija. Doziranje je u μM za sve doze ispitivane kemikalije. Doze treba 
primijeniti u DMSO-u pri 0,1 % v/v po jažici. Sve ispitne koncentracije treba ispitati u trostrukim jažicama (tablica 6.). Za svaku se kemikaliju upotrebljava zasebna plo čica. Jedna plo čica za kontrolu kvalitete uklju čena 
je u svakodnevno ispitivanje.
 
35. Analize vitalnosti stanica i hormona treba provoditi kako je predvi đeno 
stavcima 42. do 46. Grani čnu vrijednost (najniža koncentracija s vidljivim 
učinkom, LOEC) i odluku o klasifikaciji treba prijaviti i usporediti s vrijed ­
nostima u tablici 3. Podaci se smatraju prihvatljivima ako su u skladu s 
LOEC-om i klasifikacijom odluke u tablici 3.  
Tablica 3.  
Granične vrijednosti (LOEC-ovi) i klasifikacije odluke za kemikalije za ispitivanje 
osposobljenosti  
Br. CAS  LOEC [μM] Klasifikacija odluke  
T E2  T  E2  
Prokloraz  67747-09-5  ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a )(inhibicija)  + (inhibicija)  
Forskolin  66575-29-9  ≤ 10 ≤ 0,1 + (indukcija)  + (indukcija)  
Atrazin  1912-24-9  ≤ 100  ≤ 10 + (indukcija)  + (indukcija)  
Aminoglutetimid  125-84-8  ≤ 100  ≤ 100  + (inhibicija)  + (inhibicija)  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 898
 
Br. CAS  LOEC [μM] Klasifikacija odluke  
T E2  T  E2  
Bisfenol A  80-05-7  ≤ 10 ≤ 10 + (inhibicija)  + (indukcija)  
HCG  9002-61-3  Nije 
primje­
njivo  Nije 
primje­
njivo  Negativno  Negativno  
( a ) +, pozitivno 
Nije primjenjivo: Nije primjenjivo jer ne bi trebalo do ći ni do kakvih promjena nakon izlaganja necitoto ­
ksičnim koncentracijama negativne kontrole.  
Pločica za kontrolu kvalitete  
36. Pločica za kontrolu kvalitete upotrebljava se za provjeru u činka stanica 
H295R u standardnim uvjetima kulture te za uspostavu povijesne baze 
podataka koncentracija hormona u kontrolama otapala, pozitivnih i nega ­
tivnih kontrola, kao i ostalih vrijednosti kontrole kvalitete tijekom vremena.  
— Učinak stanica H295R treba procjenjivati s pomo ću pločice za kontrolu 
kvalitete za svaku novu ATCC-ovu seriju ili nakon prve upotrebe pret ­
hodno zamrznute zalihe stanica, osim ako je ispitivanje osposobljenosti 
laboratorija (stavci 32. do 34.) provedeno na toj seriji stanica.  
— Pločica za kontrolu kvalitete pruža cjelovitu procjenu uvjeta testa (npr. 
vitalnost stanica, kontrole otapala, negativne i pozitivne kontrole, kao i 
varijabilnost unutar testa i izme đu testova) kod ispitivanja kemikalija te 
bi trebala biti dijelom svakog ispitivanja.  
37. Ispitivanje kontrole kvalitete provodi se na plo čici s 24 jažice te slijedi 
jednake postupke inkubacije, doziranja, vitalnosti stanica/citotoksi čnosti, 
ekstrakcije i analize hormona opisane u stavcima 38. do 46. za ispitivanje 
kemikalija. Plo čica za kontrolu kvalitete sadržava praznine, kontrole otapala 
i dvije koncentracije poznatog induktora (forskolin, 1, 10 μM) i inhibitor 
(prokloraz, 0,1, 1 μM) sinteze hormona E2 i T. Osim toga, MeOH se 
upotrebljava u odabranim jažicama kao pozitivna kontrola za test vitalnosti/ 
citotoksičnosti. Detaljan opis izgleda plo čice naveden je u tablici 4. Kriteriji 
koje treba ispuniti na plo čici za kontrolu kvalitete navedeni su u tablici 5. 
Minimalnu osnovnu proizvodnju hormona za hormone T i E2 treba posti ći 
u kontroli otapala i praznim jažicama.  
Tablica 4.  
Izgled plo čice za kontrolu kvalitete za ispitivanje u činka neizloženih stanica H295R i 
stanica izloženih poznatim inhibitorima (PRO = prokloraz) i stimulatorima (FOR = 
forskolin) proizvodnje hormona T i E2. Nakon završetka pokusa s izlaganjem i uklanjanja medija, 70 %-tna otopina metanola dodat će se svim jažicama s metanolom 
kako bi služile kao pozitivna kontrola za citotoksi čnost (vidjeti test citotoksi čnosti u 
Dodatku III. izvješ ću o validaciji (4))
 
1 2  3  4  5  6  
A Prazni ­
na (  a ) Prazni­
na (  a ) Prazni­
na (  a ) Praznina (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Praznina (  23 ) 
(+ MeOH) (  b ) Praznina (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 899
 
1 2  3  4  5  6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Stanicama u praznim jažicama dodaje se samo medij (tj. ne dodaje se otapalo). 
( b ) Metanol (MeOH) će se dodati nakon završetka izlaganja i uklanjanja medija iz tih jažica. 
( c ) Kontrola otapala DMSO (1 μl/jažica).  
Tablica 5.  
Kriteriji u činka pločice za kontrolu kvalitete  
T E2  
Osnovna proizvodnja 
hormona u kontroli 
otapala  ≥ 5 puta granica 
kvantifikacije  ≥ 2,5 puta granica 
kvantifikacije  
Indukcija (10 μM 
forskolina)  ≥ 1,5 puta kontrole 
otapala  ≥ 7,5 puta kontrole 
otapala  
Inhibicija (1 μM proklo ­
raza)  ≥ 0,5 puta kontrole 
otapala  ≥ 0,5 puta kontrole 
otapala  
POSTUPAK IZLAGANJA KEMIKALIJI  
38. Preinkubirane stanice uklanjaju se iz inkubatora (stavak 21.) te se prije 
doziranja pod mikroskopom provjerava jesu li u dobrom stanju (prianjanje, morfologija).
 
39. Stanice se stavljaju u kabinet za biološku sigurnost, uklanja se dopunjeni 
medij i dodaje se novi dopunjeni medij (1 ml/jažica). DMSO je poželjno otapalo za ovu ispitnu metodu. Me đutim, ako postoje razlozi za upotrebu 
drugih otapala, treba opisati znanstvenu podlogu. Stanice se izlažu ispiti ­
vanoj kemikaliji dodavanjem 1 μl odgovaraju će osnovne otopine u 
DMSO-u (vidjeti Dodatak II. izvješ ću o validaciji (4)) po 1 ml dopunjenog 
medija (volumen jažice). Posljedica je toga kona čna koncentracija od 0,1 % 
DMSO-a u jažicama. Kako bi se osiguralo odgovaraju će miješanje, u 
pravilu je poželjno miješanje odgovaraju će osnovne otopine ispitivane 
kemikalije u DMSO-u s dopunjenim medijem radi postizanja željene konačne koncentracije za svaku dozu te dodavanje smjese u svaku jažicu 
neposredno nakon uklanjanja starog medija. Ako se upotrebljava ova 
mogućnost, koncentracija u jažicama DMSO-a (0,1 %) trebala bi biti 
jednaka. Jažice s dvije najviše koncentracije vizualno se procjenjuju stereo ­
mikroskopom s obzirom na nastanak taloga ili oblaka kao pokazatelja nedo ­
vršenog otapanja ispitivane kemikalije. Ako se uo če takvi uvjeti (oblaci, 
nastanak taloga), pregledavaju se i jažice sa sljede ćim nižim koncentraci ­
jama itd., a koncentracije koje nisu u potpunosti prešle u otopinu treba isključiti iz daljnje evaluacije i analize. Plo čica se vra ća u inkubator na 
37 °C s 5 %-tnim CO
 2 u zraku na 48 sati. Izgled plo čice s ispitivanom 
kemikalijom naveden je u tablici 6. Zalihe 1. do 7. predstavljaju smještaj 
rastućih doza ispitivane kemikalije.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 900
 
Tablica 6.  
Shema doziranja za izlaganje stanica H295R ispitivanim kemikalijama na plo čici s 24 
jažice  
1 2  3  4  5  6  
A DMSO  DMSO  DMSO  4. zaliha  4. zaliha  4. zaliha  
B 1. zaliha  1. zaliha  1. zaliha  5. zaliha  5. zaliha  5. zaliha  
C 2. zaliha  2. zaliha  2. zaliha  6. zaliha  6. zaliha  6. zaliha  
D 3. zaliha  3. zaliha  3. zaliha  7. zaliha  7. zaliha  7. zaliha  
40. Nakon 48 sati plo čice za izlaganje vade se iz inkubatora te se svaka jažica 
provjerava pod mikroskopom kako bi se utvrdilo stanje stanica (prianjanje, 
morfologija, stupanj konfluencije) i znakovi citotoksi čnosti. Medij iz svake 
jažice dijeli se u dvije jednake koli čine (približno 490 μl svaka) i premješta 
u dvije zasebne, odgovaraju će označene posude (tj. jedan alikvot kao 
rezervni uzorak za svaku jažicu). Kako bi se sprije čilo isušivanje stanica, 
medij se uklanja redak po redak ili stupac po stupac i zamjenjuje medijem 
za test vitalnosti stanica/citotoksi čnost. Ako se vitalnost stanica/citotoksi č­
nost ne mjeri odmah, u svaku se jažicu dodaje 200 μl fiziološke otopine s 
fosfatnim pulferom s Ca  2+ i Mg  2+ . Mediji se zamrzavaju pri – 80 °C do 
daljnje obrade radi analize koncentracija hormona (vidjeti stavke 44. do 46.) 
Iako su hormoni T i E2 koji se čuvaju u mediju pri – 80 °C u pravilu 
stabilni najmanje 3 mjeseca, stabilnost hormona tijekom čuvanja treba 
dokumentirati unutar svakog laboratorija.  
41. Neposredno nakon uklanjanja medija vitalnost stanica/citotoksi čnost utvr ­ 
đuje se za svaku plo čicu za izlaganje.  
Utvrđivanje vitalnosti stanica  
42. Radi utvr đivanja potencijalnog u činka ispitivane kemikalije na vitalnost 
stanica mogu će je upotrijebiti test vitalnost stanica/citotoksi čnosti po 
izboru. Testom bi se trebalo mo ći doći do podataka o pravoj vrijednosti 
postotka vitalnih stanica prisutnih u jažici ili treba dokazati da se on može izravno usporediti s (linearnom funkcijom) testa Live/Dead® (vidjeti Dodatak III. izvješ ću o validaciji (4)). Alternativni test za koji je dokazano 
da je jednako u činkovit test je MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil 
tetrazol bromid] (18). Procjena vitalnosti stanica s pomo ću prethodno nave ­
denih metoda relativna je vrijednost kojom se nužno ne ukazuje na linearne odnose s apsolutnim brojem stanica u jažici. Zato bi analiti čar istodobno 
trebao obaviti subjektivnu procjenu svake jažice i zabilježiti digitalne foto ­
grafije kontrole otapala i dvije najviše necitotoksi čne koncentracije i pohra ­
niti ih za kasniju procjenu stvarne gusto će stanica prema potrebi. Ako se 
vizualnim pregledom utvrdi ili testom vitalnosti stanica/citotoksi čnosti 
dokaže pove ćanje broja stanica, to pove ćanje treba potvrditi. Ako se pove ­ 
ćanje broja stanica potvrdi, to treba navesti u izvješ ću o ispitivanju. Vital ­
nost stanica izrazit će se u odnosu na prosje čnu reakciju u kontrolama 
otapala, što se smatra 100 % vitalnim stanicama te se izra čunava prema 
potrebi za test vitalnost stanica/citotoksi čnosti koji se upotrebljava. Za test 
MTT mogu će je upotrijebiti sljede ću formulu:
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 901
 
% vitalnih stanica = (reakcija u jažici – prosje čna reakcija u jažicama 
tretiranima metanolom (= 100 % mrtve)) ÷ (prosje čna reakcija u jažicama 
s kontrolom otapala – prosje čna reakcija u jažicama tretiranima metanolom 
(= 100 % mrtve))  
43. Stanice čija je vitalnost manja od 80 % u odnosu na prosje čnu vitalnost u 
kontrolama otapala (= 100 % vitalnosti) ne treba uklju čiti u analizu 
konačnih podataka. Inhibiciju steroidogeneze koja se javlja u prisutnosti 
gotovo 20 % citotoksi čnosti treba detaljno procijeniti kako bi se osiguralo 
da citotoksi čnost nije uzrok inhibicije.  
Analiza hormona  
44. Svaki laboratorij za analizu hormona T i E2 može upotrebljavati sustav 
mjerenja hormona po izboru. Rezervne alikvote medija iz svake skupine 
za tretiranje mogu će je upotrijebiti za pripremu otopina kako bi se koncen ­
tracija vratila unutar linearnog dijela standardne krivulje. Kako je navedeno u stavku 29., svaki bi laboratorij trebao dokazati sukladnost svojeg sustava mjerenja hormona (npr. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kriterijima za 
kontrolu kvalitete analizom dopunjenog medija kojem je dodana interna 
kontrola hormona prije provedbe kontrole kvalitete ili ispitivanja kemikalija. Kako bi se osiguralo da sastavni dijelovi ispitnog sustava ne utje ču na 
mjerenje hormona, hormone treba ekstrahirati iz medija prije mjerenja 
(vidjeti stavak 30. za uvjete u kojima ekstrakcija jest ili nije potrebna). 
Preporučuje se da se ekstrakcija obavi nakon postupaka iz Dodatka III. 
izvješću o validaciji (4).
 
45. Ako se za mjerenje proizvodnje hormona upotrebljava komercijalni komplet 
za ispitivanje, analizu hormona treba provesti kako je navedeno u uputama 
koje osigurava proizvo đač kompleta. Ve ćina proizvo đača ima jedinstveni 
postupak za analizu hormona. Otopine uzoraka treba prilagoditi tako da se 
očekivane koncentracije hormona za kontrole otapala nalaze unutar središta 
linearnog raspona standardne krivulje pojedina čnog testa (Dodatak III. 
izvješću o validaciji (4)). Vrijednosti izvan linearnog dijela standardne 
krivulje treba odbaciti.  
46. Kona čne koncentracije hormona izra čunavaju se kako slijedi:  
Primjer: 
Ekstrahirano:  450 μl 
Rekonstruirano u:  250 μl testnog pufera  
Otopina u testu:  1:10 (kako bi se uzorak nalazio unutar 
linearnog raspona standardne krivulje)  
Koncentracija hormona u testu:  150 pg/ml (ve ć prilagođeno koncentra ­
ciji po ml testiranog uzorka)  
Obnavljanje:  89 %  
Konačna koncentracija hormona =  (Koncentracija hormona (po ml) ÷ 
obnavljanje) (faktor razrje đivanja)  
Konačna koncentracija hormona =  (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 902
 
Odabir ispitnih koncentracija  
47. Test treba provesti u dva neovisna pokusa. Osim ako su ranije informacije 
poput informacija o grani čnim vrijednostima topljivosti ili citotoksi čnosti 
osnova za odabir ispitnih koncentracija, preporu čuje se da se ispitne 
koncentracije za po četni pokus rasporede u intervalima log10, pri čemu je 
10-3 M najviša koncentracija. Ako je kemikalija topljiva i nije citotoski čna 
ni kod jedne ispitne koncentracije te ako je prvi pokus bio negativan na sve koncentracije, tada to treba potvrditi u jednom pokusu ili više njih u uvje ­
tima jednakima prvom pokusu (tablica 7.). Ako su rezultati prvog pokusa 
dvosmisleni (tj. promjena omjera statisti čki je značajna iz kontrole otapala 
samo kod jedne koncentracije) ili pozitivni (tj. promjena omjera pri dvije 
susjedne koncentracije ili više njih statisti čki je značajna), ispitivanje treba 
ponoviti kako je navedeno u tablici 7. rafiniranjem odabranih ispitnih koncentracija. Ispitne koncentracije u drugom i tre ćem pokusu (prema 
potrebi) treba prilagoditi na temelju rezultata po četnog pokusa kojima se 
izdvajaju koncentracije kojima je postignut u činak rasporedom koncentracije 
polovičnog logaritma (npr. ako je prvotni pokus od 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 
100, 1 000 μM uzrokovao indukcije pri 1 i 10 μM, koncentracije koje se 
ispituju u drugom pokusu trebale bi biti 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM)), 
osim ako su za postizanje LOEC-a potrebne niže koncentracije. U potonjem 
slučaju u drugom pokusu treba s pomo ću skale polovi čnog logaritma upotri ­
jebiti najmanje pet koncentracija ispod najniže koncentracije ispitivane u prvom pokusu. Ako se prvi pokus ne potvrdi drugim (tj. statisti čki značaj 
ne pojavljuje se kod prethodno pozitivno ispitanoj koncentraciji ± 1 pomak 
koncentracije), treba provesti tre ći pokus u izvornim uvjetima ispitivanja. 
Dvosmisleni rezultati u prvom pokusu smatraju se negativnima ako uo čeni 
učinak nije mogu će potvrditi u bilo kojem od dvaju naknadnih pokusa. 
Dvosmisleni rezultati smatraju se pozitivnim reakcijama (pozitivnim u čin­
kom) ako je reakciju mogu će potvrditi u barem još jednom pokusu unutar 
pomaka koncentracije ± 1 (vidjeti odjeljak 55. za postupak tuma čenja poda ­
taka).
 
Tablica 7.  
Matrica odluke za mogu će scenarije ishoda  
1. pokus  2. pokus  3. pokus  Odluka  
Scenarij  Odluka  Scenarij  Odluka  Scenarij  Pozitivan  Negativan  
Negativan  Potvrditi (  a ) Negativan  Zaustavljanje  X  
Negativan  Potvrditi (  a ) Pozitivan  Rafinirati (  b ) Nega ­
tivan  X 
Dvosmislen (  c ) Rafinirati (  b ) Negativan  Potvrditi (  a ) Nega ­
tivan  X 
Dvosmislen (  c ) Rafinirati (  b ) Negativan  Potvrditi (  a ) Pozitivan  X  
Dvosmislen (  c ) Rafinirati (  b ) Pozitivan  X  
Pozitivan  Rafinirati (  b ) Negativan  Potvrditi (  a ) Pozitivan  X  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 903
 
1. pokus  2. pokus  3. pokus  Odluka  
Scenarij  Odluka  Scenarij  Odluka  Scenarij  Pozitivan  Negativan  
Negativan  Potvrditi (  a ) Pozitivan  Rafinirati (  b ) Pozitivan  X  
Pozitivan  Rafinirati (  b ) Pozitivan  Zaustavljanje  X  
( a ) Potvrditi prethodni pokus jednakim dizajnom pokusa. 
( b ) Ponoviti test pri rasporedu koncentracije polovi čnog logaritma (izdvajanje koncentracije za koju je u prethodnom pokusu 
utvrđeno da je znatno druk čija. 
( c ) Promjena omjera pri jednoj koncentraciji statisti čki je znatno razli čita od SC-a.  
Kontrola kvalitete ispitne plo čice 
48. Osim sukladnosti s kriterijima plo čice za kontrolu kvalitete, treba ispuniti i 
ostale kriterije u pogledu kvalitete navedene u tablici 8. koji se odnose na 
prihvatljivu varijaciju izme đu ponovljenih jažica, ponovljene pokuse, linear ­
nost i osjetljivost sustava mjerenja hormona, varijabilnost izme đu ponov­
ljenih vrijednosti hormona istog uzorka te postotak obnavljanja hormonskih 
dodataka nakon ekstrakcije medija (prema potrebi; vidjeti stavak 30. o 
zahtjevima u pogledu ekstrakcije). Podaci bi se trebali kretati unutar prihva ­
tljivih raspona utvr đenih za svaki parametar da bi se razmatrali za daljnju 
evaluaciju. Ako ti kriteriji nisu ispunjeni, u tabelarni prikaz treba unijeti da 
za predmetni uzorak nisu ispunjeni kriteriji za kontrolu kvalitete te uzorak 
treba ponovno analizirati ili izostaviti iz podataka.  
Tablica 8.  
Prihvatljivi rasponi i/ili varijacije (%) za parametre plo čica testa H295R.  
LOQ: granica kvantifikacije sustava mjerenja hormona. CV: koeficijent varijacije; SC: kontrola 
otapala; DPM: dezintegracije po minuti  
Usporedba izme đu T  E2  
Osnovna proizvodnja 
hormona u kontrolama otapala
 Omjer ve ći od granice 
kvantifikacije  ≥ 5-struko  ≥ 2,5-struko  
Pokusi izlaganja – unutar 
CV-a plo čice za SC-ove 
(ponovljene jažice)  Apsolutne koncentracije  ≤ 30 %  ≤ 30 %  
Pokusi izlaganja – izme đu 
CV-a plo čice za SC-ove 
(ponovljeni pokusi)  Promjena omjera  ≤ 30 %  ≤ 30 %  
Sustav mjerenja hormona – 
osjetljivost  Vidljivo smanjenje omjera 
u odnosu na SC-ove  ≥ 5-struko  ≥ 2,5-struko  
Sustav mjerenja hormona – 
CV ponovljenog mjerenja za SC-ove (
 a ) Apsolutne koncentracije  ≤ 25 %  ≤ 25 %  
Ekstrakcija medija – 
obnavljanje internog stan ­
darda 3H (prema potrebi)  DPM  ≥ 65 % nominalno  
( a ) Odnosi se na ponovljena mjerenja istog uzorka.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 904
 
ANALIZA PODATAKA I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Analiza podataka  
49. Radi evaluacije relativnog pove ćanja/smanjenja kemijski izmijenjene proiz ­
vodnje hormona rezultate treba svesti na srednju vrijednost kontrole otapala svake ispitne plo čice te ih izraziti kao promjene u odnosu na kontrolu 
otapala u svakoj ispitnoj plo čici. Sve podatke treba izraziti kao srednje ± 1 
standardno odstupanje.
 
50. U analizu podataka treba uklju čiti samo podatke o hormonima iz jažica u 
kojima je citotoksi čnost bila manja od 20 %. Relativne promjene treba 
računati kako slijedi:  
Relativna promjena = (koncentracija hormona u svakoj jažici) ÷ (srednja 
koncentracija hormona u svim jažicama kontrole otapala).  
51. Ako se vizualnim pregledom jažice utvrdi ili testom vitalnosti stanica/cito ­
toksičnosti opisanim u stavku 42. dokaže pove ćanje broja stanica, to pove ­ 
ćanje treba potvrditi. Ako se pove ćanje broja stanica potvrdi, to treba 
navesti u izvješ ću o ispitivanju.  
52. Pretpostavke o normalnosti i homogenosti varijanci treba procijeniti prije 
provođenja statisti čkih analiza. Normalnost treba procijeniti s pomo ću ploha 
standardne vjerojatnosti ili druge odgovaraju će statističke metode (npr. 
Shapiro-Wilkov test). Ako podaci (promjene omjera) nisu normalno distri ­
buirani, treba pokušati transformaciju podataka radi približavanja normalnoj 
distribuciji. Ako su podaci normalno distribuirani ili blizu normalnoj distri ­
buciji, razlike izme đu skupina koncentracije kemikalije i kontrola otapala 
treba analizirati s pomo ću parametrijskog testa (npr. Dunnettov test) pri 
čemu je koncentracija neovisna, a reakcija (promjena omjera) ovisna varija ­
bla. Ako podaci nisu normalno distribuirani, treba upotrijebiti neparame ­
tarski test (npr. Kruskal-Wallisov test, Steelov Many-one rank test). Razlike se smatraju bitnima pri p ≤ 0,05. Statisti čke procjene daju se na temelju 
prosječnih vrijednosti za svaku jažicu koja predstavlja neovisne ponovljene 
točke podataka. O čekuje se da zbog velikog razmaka izme đu doza u prvom 
pokusu (skala log10) u brojnim slu čajevima ne će biti mogu će opisati jasne 
odnose izme đu koncentracije i doze kad se dvije najviše doze nalaze na 
linearnom dijelu sigmoidne krivulje. Zato će se za prvi pokus i sve ostale 
komplete podataka u takvom slu čaju (npr. kad nije mogu će procijeniti 
maksimalnu efikasnost) primijeniti gore opisana statistika fiksne varijable vrste I.
 
53. Ako se više od dvije to čke podataka nalaze na linearnom dijelu krivulje i 
ako se maksimalne efikasnosti mogu izra čunati, kao što se predvi đa za neke 
od drugih sljedova koji se provode prema polulogaritamskom razmaku 
koncentracija izlaganja, za izra čun efikasnih koncentracija (npr. EC50 i 
EC20) treba upotrebljavati probit, logit ili drugi odgovaraju ći model 
regresije.  
54. Rezultate treba navesti u grafi čkom (grafikoni sa stupcima koji predstavljaju 
standardno odstupanje ± 1) i tabli čnom (LOEC/NOEC, smjer u činka i jačina 
najveće reakcije koja je dio podataka o dozi-reakciji) obliku (vidjeti sliku 3. 
za primjer). Procjena podataka smatra se valjanom samo ako se temeljila na 
najmanje dvama neovisno provedenim pokusima. Pokus ili neovisni pokus 
smatra se neovisnim ako je proveden drugog datuma i upotrebom novog kompleta otopina i kontrola. Raspon koncentracija u drugom i tre ćem 
pokusu mogu će je prilagoditi na temelju rezultata iz prvog pokusa radi 
boljeg definiranja raspona doza reakcija koji sadržava LOEC (vidjeti 
stavak 47.).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 905
 
Slika 3.  
Primjer prezentacije i evaluacije podataka dobivenih tijekom provo đenja testa H295R u grafi čkom i 
tabličnom obliku.  
(Zvjezdice se odnose na statisti čki značajne razlike od kontrole otapala (p < 0,05). LOEC: najniža koncentracija 
s vidljivim u činkom; najve ća promjena: najve ća jačina uočene reakcije pri bilo kojoj koncentraciji u odnosu na 
prosječnu reakciju kontrole otapala (= 1).)
  
Kemikalija  LOEC  Najve ća promjena  
Forskolin  0,01  0,15-struko  
Letrozol  0,001  29-struko  
Postupak za tuma čenje podataka  
55. Ispitivana kemikalija smatra se pozitivnom ako je indukcija omjera stati ­
stički različita (p ≤ 0,05) od kontrole otapala pri dvije susjedne koncen ­
tracije u najmanje dvama neovisnim pokusima (tablica 7.). Ispitivana kemi ­
kalija smatra se negativnom nakon dvaju neovisnih negativnih pokusa ili 
ako su od tri pokusa dva negativna i jedan dvosmislen ili pozitivan. Ako 
podaci dobiveni trima neovisnim pokusima nisu u skladu s kriterijima za odlučivanje iz tablice 7., rezultati pokusa ne mogu se tuma čiti. Rezultate pri 
koncentracijama koje premašuju granice topljivosti ili pri citotoksi čnim 
koncentracijama ne treba uklju čiti u tuma čenje rezultata.
 
Izvješće o ispitivanju  
56. Izvješ će o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
Ustanova u kojoj se obavlja ispitivanje  
— naziv i lokacija ustanove,  
— voditelj studije i ostalo osoblje i njihovi zadaci,  
— datumi po četka i završetka studije.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 906
 
Ispitivana kemikalija, reagensi i kontrole  
— identitet (naziv/br. CAS prema potrebi), podrijetlo, broj lota/serije, 
čistoća, dobavlja č i karakterizacija ispitivane kemikalije, reagensa i 
kontrola,  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva ispitivane 
kemikalije,  
— uvjeti skladištenja i metoda i u čestalost pripreme ispitivanih kemikalija, 
reagensa i kontrola,  
— stabilnost ispitivane kemikalije.  
Stanice  
— podrijetlo i vrsta stanica,  
— broj prolaza (identifikator prolaza stanica) stanica upotrijebljenih u 
ispitivanju,  
— opis postupaka za održavanje stani čnih kultura.  
Zahtjevi prije ispitivanja (prema potrebi)  
— opis i rezultati ispitivanja interferencije metodom kemijskih hormona  
— opis i rezultati mjerenja efikasnosti ekstrakcije hormona,  
— standardne i kalibracijske krivulje za sve analiti čke testove koje treba 
provesti,  
— granice otkrivanja za odabrane analiti čke testove.  
Ispitni uvjeti  
— sastav medija,  
— koncentracija ispitivane tvari,  
— gustoća stanica (procijenjene ili izmjerene koncentracije stanica nakon 
24 sata i 48 sati)  
— topljivost ispitivane kemikalije (granica topljivosti, ako je utvr đena),  
— vrijeme i uvjeti inkubacije.  
Rezultati ispitivanja  
— sirovi podaci za svaku jažicu za kontrole i ispitivane kemikalije – svaka 
ponovljena vrijednost u obliku izvornih podataka instrumenta upotrijeb ­
ljenog za mjerenje proizvodnje hormona (npr. OD, jedinice fluoroscen ­
cije, DPM itd.),  
— validacija normalnosti ili objašnjenje transformacije podataka,  
— srednje reakcije standardnog odstupanja ± 1 za svaku izmjerenu jažicu,  
— podaci o citotoksi čnosti (ispitne koncentracije koje su uzrokovale cito ­
toksičnost),  
— potvrda sukladnost sa zahtjevima za kontrolu kvalitete,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 907
— relativna promjena u usporedbi s kontrolom otapala ispravljenom zbog 
citotoksičnosti,  
— grafikon sa stupcima kojim se prikazuje relativni (promjena omjera) 
značaj pri svakoj koncentraciji i statisti čki značaj kako je navedeno u 
stavcima 49. do 54.  
Tumačenje podataka  
— primijeni postupak za tuma čenje podataka na rezultate i provedi 
raspravu o nalazima.  
Rasprava  
— postoje li ikakve naznake iz studije o mogu ćnosti da na podatke o 
hormonima T/E2 mogu utjecati neizravni u činci na putove glukokorti ­
koida i mineralnih kortikoida?  
Zaključci 
LITERATURA  
(1) OECD (2002.), OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu 
endokrino disruptivnih kemikalija, Dodatak 2. poglavlju B.54. ovog 
Priloga.  
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006.), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114. – 124.
 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007.), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. 
Env. Sci. Pollut. Res., 14., 23. – 30.
 
(4) OECD (2010.), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Pariz. Dostupno na [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html].
 
(5) OECD (2010.), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ JM/MONO(2010)32, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/ 30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html].
 
(6) Battelle (2005.), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, dostupno na: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05. pdf]
 
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004.), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. 
Sci., 81., 78. – 89.
 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002.), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma 
cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182., 44. – 54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010.), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118.: 265. – 272.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. 
(2010.), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the 
H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137. – 1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990.), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis, Cancer Res., 50., 5488. – 5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010.), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water 
in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578. – 584.
 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005.), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, 
Environ. Sci. Technol., 39:2777. – 2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. 
(2010.), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. 
Res., 17:1137. – 1148.
 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993.), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. 
Endocrinol. Metab., 77., 731. – 737.
 
(16) Poglavlje B55. ovog Priloga: Hershbergerov biotest na glodavcima: Krat ­
koročni test probira na (anti)androgenska obilježja.  
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976.), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2., 222. – 231.
 
(18) Mosmann, T. (1983.), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65., 55. – 63.
 
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999.). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598. – 1606.  
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006.), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484– 
492.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 909
 
Dodatak  
DEFINICIJE:  
Konfluentnost  se odnosi na pokrivenost ili širenje stanica preko medija kulture 
ili kroz njega.  
Kemikalija  je tvar ili smjesa.  
CV (coefficient of variation) se odnosi na koeficijent varijacije te se definira kao 
omjer standardnog odstupanja distribucije od njezine aritmeti čke sredine.  
CYP  je kratica za citokrom P450 monooksigenazu, obitelj gena i od njih proiz ­
vedenih enzima koji sudjeluju u katalizaciji brojnih razli čitih biokemijskih reak ­
cija, uklju čujući sintezu i metabolizam steroidnih hormona.  
DPM  je dezintegracija po minuti. To je broj atoma u odre đenoj količini radioak ­
tivnog materijala koji se dezintegriraju u jednoj minuti.  
E2 je 17β-estradiol, najvažniji estrogen u sustavima sisavaca.  
Stanice  H295R  stanice su humanog adrenokarcinoma koje se odlikuju fiziolo ­ 
škim karakteristikama zonalno nediferenciranih humanih fetalnih adrenalnih stanica i koje izražavaju sve enzime puta steroidogeneze. One se mogu nabaviti 
od ATCC-a.
 
Medij za zamrzavanje upotrebljava  se za zamrzavanje i čuvanje smrznutih 
stanica. On se sastoji od radnog medija s dodatkom nuseruma BD i dimetil sulfoksida.
 
Linearni raspon  je raspon unutar standardne krivulje za sustav mjerenja 
hormona u kojem su rezultati proporcionalni koncentraciji analita koji se nalazi u uzorku.
 
LOQ  (limit of quantification) kratica je za granicu kvantifikacije i odnosi se na 
najnižu koli činu kemikalije koju je mogu će razlikovati od izostanke te kemikalije 
(prazna vrijednost) unutar navedene granice pouzdanosti. Za potrebe ove metode granicu kvantifikacije u pravilu definira proizvo đač sustava ispitivanja, ako nije 
drukčije određeno.
 
LOEC  (lowest observed effect concentration) je najniža koncentracija s vidljivim 
učinkom, odnosno najniža koncentracija pri kojoj je testna reakcija statisti čki 
različita od reakcije kontrole otapala.  
NOEC  (no observed effect concentration) najviša je koncentracija bez vidljivog 
učinka, odnosno najviša koncentracija koja se ispituje ako se testom ne izazove 
pozitivna reakcija.  
Prolaz je broj  kojim se ozna čava količina dijeljenja stanica nakon zapo činjanja 
kulture iz zamrznute zalihe. Prvom prolazu koji je zapo čet iz zamrznute zalihe 
dodjeljuje se broj jedan (1). Stanice koje su se podijelile jednom ozna čavaju se 
oznakom prolaz 2 itd.  
PBS je Dulbeccova fiziološka otopina s fosfatnim pulferom.  
Kontrola kvalitete  odnosi se na vrijednosti nužne za osiguranje valjanih 
podataka.  
Pločica za kontrolu kvalitete  jest pločica s 24 jažice i dvije koncentracije pozi ­
tivnih i negativnih kontrola za pra ćenje učinka nove serije stanica ili za osigu ­
ranje pozitivnih kontrola za test pri ispitivanju kemikalija.  
Pokus  je neovisni pokus koji karakterizira novi komplet otopina i kontrola.  
Osnovni medij  jest osnova za pripremu ostalih reagensa. On se sastoji od smjese 
1:1 Dulbeccova modificiranog Eagleova medija i Hamove F-12 hranjive mješa ­
vine (DMEM/F12) u 15 mM HEPES pufera bez fenol crvene ili natrijeva bikar ­
bonata. Natrijev bikarbonat dodaje se kao pufer, vidjeti Dodatak II. izvješ ću o 
validaciji (4).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 910
 
Dopunjeni medij  sastoji se od radnog medija s dodatkom nuseruma BD i ITS+ 
premium mješavine, vidjeti Dodatak II. izvješ ću o validaciji (4).  
Steroidogeneza  je put sinteze koji vodi od kolesterola do raznih steroidnih 
hormona. Nekoliko hormona posrednika na putu sinteze steroida, poput proge ­
sterona i testosterona, važni su hormoni sami po sebi, ali služe i kao prekursori hormonima u nastavku puta sinteze.
 
T se odnosi na testosteron, jedan od dvaju najvažnijih androgena u sustavima 
sisavaca.  
Ispitivana kemikalija  je bilo koja tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom 
metodom.  
Ispitna plo čica jest pločica na kojoj se stanice H295R izlažu ispitivanoj kemi ­
kaliji. Ona sadržava kontrolu otapala i ispitivana kemikalija pri sedam razina 
koncentracija u tri primjerka.  
Tripsin 1X  razrijeđena je otopina enzima tripsina, serin proteaze guštera če, koji 
se upotrebljava za skidanje stanica s plo čice za kultivaciju stanica, vidjeti 
Dodatak III. izvješ ću o validaciji (4).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 911
 
B.58.  TRANSGENSKE ANALIZE MUTACIJE GENA SOMATSKIH I 
SPOLNIH STANICA GLODAVACA  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 488 
(2013.). Ispitne metode EU-a dostupe su za široki raspon in vitro analiza 
mutacije kojima se mogu otkriti kromosomske i/ili genske mutacije. Postoje ispitne metode za in vivo grani čne vrijednosti (tj. kromosomske aberacije i 
neplanirane sinteze DNK-a); me đutim, njima se ne mogu mjeriti genske 
mutacije. Transgenske analize mutacije u glodavaca zadovoljavaju potrebu 
za praktičnima i široko dostupnima in vivo ispitivanjima mutacija gena.
 
2. Transgenske analize mutacije u glodavaca temeljito su analizirane (24) (33). 
Obuhvaćaju transgenske štakore i miševe koji imaju više primjeraka kromo ­
somski integriranih prijenosnih vektora plazmida ili faga. Transgeni sadrža ­
vaju gene koji daju informacije potrebne za utvr đivanje razli čitih vrsta 
mutacija izazvanih in vivo ispitnim kemikalijama.  
3. Mutacije koje se pojave u glodavca bilježe se regeneriranjem transgena i 
analizom fenotipa gena koji daje informaciju u bakterijskom doma ćinu 
kojem nedostaje gen koji daje informaciju. Transgenskim analizama muta ­
cije gena u glodavaca mjere se mutacije izazvane u genetski neutralnim 
genima regeneriranima iz gotovo bilo kojeg tkiva glodavca. Tim se anali ­
zama stoga izbjegava mnogo postoje ćih ograni čenja koja se vezuju uz 
istraživanje in vivo genetskih mutacija endogenih gena (tj. ograni čena koli­ 
čina tkiva pogodnog za analizu, negativna/pozitivna selekcija prema muta ­
cijama).  
4. Dokazna snaga ukazuje na to da transgeni reagiraju na mutagene na sli čan 
način kao endogeni geni, posebno u pogledu otkrivanja supstitucija, pomaka 
okvira mutacija i manjih brisanja i unošenja baznih parova (24).  
5. Međunarodnim radionicama o ispitivanju genotoksi čnosti (IWGT) podržalo 
se uključivanje transgenskih analiza mutacije gena za in vivo otkrivanje 
genskih mutacija i preporu čuje se protokol za njihovu primjenu (15) (29). 
Ova se ispitna metoda temelji na tim preporukama. Daljnja analiza na osnovu koje se podržava korištenje ovog protokola može se prona ći u (16).
 
6. Očekuje se da će u budu ćnosti biti mogu će spojiti transgensku analizu 
mutacije gena s istraživanjem toksi čnosti nakon ponovljene doze (poglavlje 
B.7. ovog Priloga). Me đutim, potrebni su podaci da bi se osiguralo da na 
osjetljivost transgenske analize mutacije gena ne utje če kraće razdoblje od 
jednog dana izme đu kraja razdoblja primjene i razdoblja uzimanja uzoraka, 
kako se upotrebljava u istraživanju o toksikologiji ponavljanih doza, u usporedbi s tri dana koji se upotrebljavaju u transgenskim analizama muta ­
cije gena. Potrebni su i podaci koji dokazuju da na rezultate analize 
ponavljanih doza negativno ne utje če korištenje transgenskih sojeva gloda ­
vaca umjesto tradicionalnih sojeva glodavaca. Kada su ti podaci dostupni, ova se ispitna metoda ažurira.
 
7. Definicije klju čnih pojmova nalaze se u Dodatku.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 912
 
UVODNA RAZMATRANJA  
8. Transgenske analize mutacija gena u glodavaca za koje su dostupni odgo ­
varajući podaci koji potkrepljuju njihovu upotrebu u ovoj ispitnoj metodi 
su: lacZ bakteriofag miša (MutaäMouse); lacZ plazmid miša; gpt delta (gpt i 
Spi –) miša i štakora; lacI miša i štakora (Big Blue®), kako se provode u 
standardnim uvjetima. K tome, cII analiza pozitivne selekcije može se upotrebljavati za procjenu mutacija u modelima za miševe Big Blue® i Muta™Mouse. Mutagenost u transgenskim analizama mutacije gena u 
glodavaca obi čno se procjenjuje kao u čestalost mutacije; me đutim, ako je 
potrebno, molekularnom analizom mutacija mogu se pribaviti dodatni podaci (vidjeti stavak 24.).
 
9. Ovakva in vivo ispitivanja genskih mutacija na glodavcima posebno su 
relevantna za ocjenjivanje opasnosti od pojave mutagenosti zato što omogu ­ 
ćuju sagledavanje faktora in vivo metabolizma, farmakokinetku i procese 
popravka DNK-a i translezijske sinteze DNK-a, iako oni mogu varirati kod različitih životinjskih vrsta, razli čitih tkiva, kao i kod razli čitih vrsta ošte ­ 
ćenja DNK-a. Analiza in vivo isto je tako korisna za daljnja istraživanja 
mutagenih u činaka otkrivenih s pomo ću određenog sustava in vitro, i za 
praćenje rezultata ispitivanja s pomo ću drugih in vivo grani čnih vrijednosti. 
Osim toga što se neobvezno povezuje s pojavom raka, mutacija gena bitna 
je krajnja to čka za predvi đanje nekancerogenih bolesti temeljenih na muta ­
cijama u somatskim tkivima (12) (13), kao i bolesti koje se prenose zametnom lozom.
 
10. Ako postoje dokazi da ispitivana tvar ili odgovaraju ći metabolit ne će stići ni 
do jednog ciljnog tkiva, nije primjereno primjenjivati transgenske analize 
mutacije gena u glodavaca.  
NAČELO ISPITNE METODE  
11. U analizama opisanima u stavku 8. ciljni je gen bakterijskog ili bakteriofa ­
gnog podrijetla, a regeneracija iz genomskog DNK-a glodavca postiže se 
ugrađivanjem transgena u λ bakteriofagni ili plazmidni prijenosni vektor. 
Postupak uklju čuje ekstrakciju genomskog DNK-a iz ciljnog tkiva glodavca, 
in vitro obradu genomskog DNK-a (tj. pakiranje λ vektora, ili ligaciju i 
elektroporaciju plazmida za regeneraciju prijenosnog vektora), i naknadno 
utvrđivanje mutacija u bakterijskim doma ćinima u odgovaraju ćim uvjetima. 
U analizama se upotrebljavaju neutralni transgeni koji se mogu brzo rege ­
nerirati iz ve ćine tkiva.  
12. Osnovni pokus transgenske analize mutacije gena u glodavaca uklju čuje 
tretiranje glodavca odre đenom kemikalijom tijekom odre đenog vremenskog 
razdoblja. Kemikalije se mogu primjenjivati odgovaraju će, uključujući 
implantaciju (tj. ispitivanje medicinskim napravama). Ukupno razdoblje tijekom kojeg se doza primjenjuje na životinju naziva se razdobljem primjene. Nakon razdoblja primjene slijedi vremensko razdoblje, prije žrtvo ­
vanja, tijekom kojeg se kemikalija ne primjenjuje i tijekom kojeg se nepo ­
pravljene lezije DNK-a pri čvršćuju na stabilne mutacije. U literaturi se to 
razdoblje razli čito naziva kao razdoblje tijekom kojeg dolazi do manifesta ­
cija, razdoblje fiksiranja ili razdoblje izražavanja; kraj tog razdoblja vrijeme 
je uzimanja uzoraka (15) (29). Nakon žrtvovanja životinje genomski se 
DNK izolira iz odre đenog predmetnog tkiva (ili više tkiva) te pro čišćava.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 913
 
13. Podaci u vezi s jednom odre đenom vrstom životinje iz razli čitih pakiranja/ 
ligacija obi čno se agregiraju i u čestalost mutacije op ćenito se procjenjuje 
upotrebom ukupnog broja izme đu 10  5 i 10  7 jedinica koje stvaraju plakove 
ili jedinica koje stvaraju koloniju. Kod upotrebe pozitivnih metoda selekcije ukupni broj jedinica koje stvaraju plakove utvr đuje se s pomo ću odvojenih 
neselektivnih plo ča.
 
14. Metode pozitivne selekcije razvijene su za olakšavanje otkrivanja mutacija u 
genu gpt (delta gpt miša i štakora, fenotip gpt– (20) (22) (28)) i gena lacZ (Muta™Mouse ili lacZ kod plazmidnog miša (3) (10) (11) (30)); dok se 
mutacije gena lacI u životinjama Big Blue® otkrivaju neselektivnom 
metodom kojom se utvr đuju mutanti stvaranjem obojenih (plavih) plakova. 
Metodologija pozitivne selekcije primjenjuje se i da bi se otkrile to čkaste 
mutacije koje nastaju u genu cII u λ bakteriofagnom prijenosnom vektoru 
(Big Blue® miš ili štakor i Muta™Mouse (17)) i brisanje mutacija u λ 
crvenim i gama genima (Spi – selekcija u gpt delta mišu i štakoru (21) (22) (28)). U čestalost mutacije izra čunava se diobom broja plakova/pla ­
zmida koji sadržavaju mutacije u transgenu, ukupnim brojem plakova/pla ­
zmida regeneriranih iz istog uzorka DNK-a. Kod istraživanja transgenskih analiza mutacija gena u glodavaca u čestalost mutacije jest parametar izvje ­ 
šćivanja. K tome, u čestalost mutacije može se odrediti kao udio stanica koje 
nose neovisne mutacije; ovaj izra čun zahtijeva korekcije u vezi s klonalnim 
širenjem, sekvenciranjem regeneriranih mutanata (24).
 
15. Mutacije zabilježene u analizama to čkastih mutacija lacI, lacZ, cII i gpt 
sastoje se primarno od zamijenjenih mutacija baznih parova, pomaka 
okvira mutacija i manjih unošenja/brisanja. Relativni omjer tih vrsta muta ­
cija kod spontanih mutacija sli čan je onome koji je utvr đen kod endogenog 
gena Hprt. Velika brisanja utvr đena su samo kod selekcije Spi – i analiza 
plazmida lacZ (24). Mutacije koje su zanimljive in vivo su mutacije koje se 
pojavljuju u miša i štakora. In vitro i ex vivo mutacije koje se mogu pojaviti 
tijekom regeneriranja faga/plazmida, repliciranja ili popravka, razmjerno su rijetke i mogu se posebno identificirati u nekim sustavima ili izuzeti pozi ­
tivnim selekcijskim sustavom bakterijskog doma ćina.
 
OPIS METODE  
Priprema  
Odabir životinjskih vrsta  
16. Trenuta čno je dostupno više modela utvr đivanja transgenskih mutacija gena 
miša i ti su sustavi upotrijebljeni puno više od transgenskih modela za 
štakore. Ako je štakor o čigledno primjereniji model od miša (tj. kod istra ­ 
živanja mehanizama kancerogeneze tumora primije ćenog isklju čivo u 
štakora, za usporedbu s istraživanjem toksi čnosti štakora ili za slu čajeve 
kada je metabolizam štakora dokazano usporediviji s ljudskim metabol ­
izmom) treba razmotriti upotrebu transgenskih modela štakora.  
Uvjeti smještaja i hranjenja  
17. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi biti 
22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prije đe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi 
trebao biti 50 – 60 %. Svjetlost bi trebala biti umjetna, s tim da je redoslijed 
12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencio ­
nalna laboratorijska hrana s neograni čenom koli činom vode za pi će. Na
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 914
 
izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovaraju ća mješavina 
ispitivane kemikalije ako se ona daje u hrani. Životinje treba držati u 
manjim skupinama (ne više od pet jedinki) istog spola ako se ne o čekuje 
agresivno ponašanje. Ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama.
 
Priprema životinja  
18. Zdrave mlade seksualno zrele odrasle životinje (starosti 8 – 12 tjedana na 
početku tretmana) biraju se nasumce i raspodjeljuju u kontrolne skupine i 
skupine koje će se tretirati. Životinje se ozna čuju jedinstvenim oznakama. 
Životinje se najmanje pet dana prilago đavaju laboratorijskim uvjetima. 
Kaveze treba urediti tako da se eventualni u činci držanja u kavezu svedu 
na minimum. Na po četku studije variranje tjelesne mase životinja treba biti 
što manje i ne smije prelaziti ± 20 % od odgovaraju će srednje vrijednosti 
mase svakog spola.  
Priprema doza  
19. Prije no što se doza daje životinjama, krute ispitivane tvari po potrebi treba 
otopiti ili suspendirati u odgovaraju ćim otapalima ili nosa čima i razrijediti. 
Tekuće ispitivane tvari mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije dozira ­
nja. Za potrebe inhaliranja, kemikalije koje se upotrebljavaju kod ispitivanja mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/teku ćeg aerosola, ovisno 
o njihovim fizi čko-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabil ­
nosti skladištenje nije prihvatljivo, pripravke ispitivane tvari treba koristiti 
svježe.
 
Uvjeti ispitivanja  
Otapalo/nosa č 
20. Pri visinama doza koje se upotrebljavaju, otapalo/nosa č ne smije imati 
toksične učinke i ne smije postojati sumnja da bi mogao kemijski reagirati 
s ispitivanim tvarima. Ako se upotrebljavaju otapala/nosa či koji nisu dobro 
poznati, njihovo uklju čivanje u ispitivanje treba potkrijepiti referentnim 
podacima koji pokazuju njihovu sukladnost. Kad god je to mogu će prepo­
ručuje se najprije razmotriti mogu ćnost primjene vodenog otapala/nosa ča. 
Pozitivna kontrola  
21. Obično treba upotrebljavati paralelne pozitivne kontrolne životinje. Me đu­
tim, za laboratorije koji su dokazali tu sposobnost (vidjeti stavak 23.) i rutinski koriste te analize, DNK-ovi iz prethodnih pozitivnih kontrola treti ­
ranih životinja mogu se uklju čiti sa svakim istraživanjem da bi se potvrdila 
uspješnost metode. Takav DNK iz prethodnih eksperimenata trebao bi se 
dobiti iz iste predmetne vrste i tkiva te bi se trebala primjereno pohraniti (vidjeti stavak 36.). Kod primjene paralelnih pozitivnih kontrola nije neop ­
hodno primjenjivati ih istim putem kao i kemikaliju koja se upotrebljava za 
ispitivanje; me đutim, pozitivne kontrole trebale bi sa sigurnoš ću poticati 
mutacije u jednoj ili više vrsta tkiva na koje se odnosi ta kemikalija. Doze kemikalija pozitivne kontrole trebale bi se odabrati tako da proizvode slabe ili umjerene u činke kojima se kriti čki procjenjuju rezultati i osjetlji ­
vost analize. Primjeri kemikalija pozitivne kontrole i nekih njihovih ciljnih 
tkiva uklju čeni su u tablici 1.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 915
 
Tablica 1.  
Primjeri kemikalija pozitivne kontrole i nekih njihovih ciljnih tkiva  
Kemikalije pozitivne kontrole 
i br. CAS  EINECS naziv i EINECS br.  Karakteristike  Ciljno tkivo mutacije  
Štakor  Miš  
N-etil-N-nitrozourea 
(CAS br. 759-73-9)  N-etil-N-nitrozourea 
(212 -072 -2)  Spoj direktnog 
djelovanja  Jetra, plu ća Koštana srž, debelo 
crijevo, crijevni 
epitel, crijeva, jetra, pluća, slezena, 
bubreg, jajne granu ­
lozne stanice, 
zametne stanice mužjaka
 
etil-karbamat (uretan) 
(CAS br. 51-79-6)  Uretan 
(200 -123 -1)  Mutagen, treba 
metabolizam, no 
proizvodi samo 
slabe učinke Koštana srž, potrbu ­ 
šnica, tanko crijevo, 
jetra, pluća, slezena  
2,4 Diaminotoluen 
(CAS br. 95-80-7)  4-metil-m-fenilendiamin 
(202 -453 -1)  Mutagen, treba 
metabolizam, isto tako pozitivan u analizi Spi-
 Jetra  Jetra  
Benzo[e]piren 
(CAS br. 50-32-8)  benzo[def]krizen 
(200 -028 -5)  Mutagen, treba 
metabolizam  Jetra, 
trbušna 
maramica,  Koštana srž, dojka, 
debelo crijevo, potr ­
bušnica, žljezdani želudac, srce, jetra, pluća, zametne 
stanice mužjaka
 
Negativne kontrole  
22. Negativne kontrole, koje se tretiraju samo otapalom ili nosa čem i koje su 
osim toga tretirane na jednak na čin kao i skupine koje se tretiraju, trebale bi 
biti uklju čene u svako uzorkovanje. U nedostatku povijesnih ili objavljenih 
kontrolnih podataka kojima se dokazuje da odabrano otapalo ili nosa č nema 
štetne i mutagenske u činke, netretirane kontrolne skupine isto bi tako 
trebale biti uklju čene u svakom uzimanju uzoraka da bi se utvrdila prihva ­
tljivost kontrole nosa ča. 
Provjera osposobljenosti laboratorija  
23. Sposobnost primjene ovih analiza trebala bi se utvrditi dokazivanjem 
sposobnosti stvaranja o čekivanih rezultata na temelju objavljenih podataka 
(24) za: 1) u čestalosti pojave mutanata s kemikalijama pozitivne kontrole 
(uključujući one sa slabim u čincima) kao što su one navedene u tablici 1., 
ne-mutagenima, i kontrolama nosa ča; i 2) regeneriranjem transgena iz 
genomskog DNK-a (tj. u činkovitost pakiranja).  
Sekvenciranje mutanata  
24. Za regulatorne primjene sekvenciranje DNK-a mutanata nije neophodno, 
osobito kada se dobije jasan pozitivan ili negativan rezultat. Me đutim, 
podaci o sekvenciranju mogu biti korisni kada se primijete velike varijacije 
između pojedinih jedinki. U tim se slu čajevima sekvenciranje može 
upotrebljavati da bi se isklju čila mogućnost jackpota ili klonalnih manife ­
stacija, identifikacijom omjera jedinstvenih mutanata iz odre đenog tkiva. 
Sekvenciranje otprilike 10 mutanata po tkivu po životinji trebalo bi biti 
dostatno za jednostavno utvr đivanje doprinose li klonalni mutanti  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 916
 
učestalosti mutanata; mogu će je potrebno sekvenciranje i do 25 mutanata da 
bi se matemati čki ispravila u čestalost mutanta u pogledu klonaliteta. 
Sekvenciranje mutanata može se razmatrati i kada se utvrde mala pove ćanja 
učestalosti mutanata (tj. pove ćanja koja prelaze neobra đene kontrolne 
vrijednosti). Razlike u spektru mutanta izme đu kolonija mutanata u 
pogledu tretiranih i netretiranih životinja može potaknuti mutagenski 
učinak (29). Isto tako, spektri mutacija mogu biti korisni za razvoj pretpo ­
stavki o mehanizmima. Kada se sekvenciranje uklju čuje kao dio protokola 
istraživanja, treba pridati posebnu pažnju osmišljavanju takvih istraživanja, 
posebno s obzirom na broj mutanata sekvenciranih po uzorku, da bi se 
ostvarila odgovaraju ća pouzdanost u skladu s korištenim statisti čkim 
modelom (vidjeti stavak 43.).  
POSTUPAK  
Broj i spol životinja  
25. Broj životinja po skupini trebao bi se odrediti unaprijed, da bi se na odgo ­
varajući način osigurala statisti čka valjanost neophodna za utvr đivanje 
barem dvostruke u čestalosti mutanata. Skupine se prema veli čini sastoje 
od najmanje pet životinja; me đutim, ako je statisti čka valjanost nedovoljna, 
broj životinja trebao bi se prema potrebi pove ćati. Obično bi se trebali 
upotrebljavati mužjaci životinja. Može biti slu čajeva kada je opravdano 
ispitivanje i samo na ženkama; na primjer kod ispitivanja lijekova speci ­
fičnih za žene ili kod istraživanja ženskog metabolizma. Ako postoje 
značajne razlike izme đu spolova u pogledu toksi čnosti ili metabolizma, 
tada su potrebni i mužjaci i ženke.  
Razdoblje primjene  
26. Na temelju opažanja prema kojima se mutacije akumuliraju sa svakim 
tretmanom, potreban je režim ponovljenih doza, uz dnevne tretmane tijekom 28 dana. Takva se primjena smatra prihvatljivom za stvaranje odgo ­
varajuće akumulacije mutacije slabih mutagena i za osiguravanje odgova ­
rajućeg razdoblja izloženosti primjerenog za utvr đivanje mutacija u orga ­
nima koji se sporo razmnožavaju. Alternativni postupci tretiranja mogu biti odgovaraju ći za neke procjene i ti alternativni rasporedi doziranja trebali bi 
biti znanstveno opravdani u protokolu. Tretmani ne bi trebali biti kra ći od 
vremenskog razdoblja koje je potrebno za potpuno uvo đenje svih odgova ­
rajućih enzimskih sustava koji sudjeluju u metabolizmu i kra ći bi tretmani 
mogli zahtijevati upotrebu ve ćeg broja uzimanja uzoraka što je odgovara ­
juće za organe s razli čitim stopama razmnožavanja. U svakom slu čaju, svi 
dostupni podaci (tj. o op ćenitoj toksi čnosti ili metabolizmu i farmakoki ­
netici) trebali bi se koristiti kod opravdavanja protokola, posebno kada je prisutno odstupanje od prethodno navedenih standardnih preporuka. Iako mogu pove ćati osjetljivost, razdoblja tretiranja dulja od 8 tjedana treba 
dodatno pojasniti i opravdati jer duga čka razdoblja tretiranja mogu proiz ­
vesti očito povećanje učestalosti mutanata klonalnim širenjem (29).
 
Visine doza  
27. Visine doza trebale bi se temeljiti na rezultatima istraživanja o utvr đivanju 
raspona doze kojom se mjeri op ća toksičnost koja je provedena istim 
načinom izlaganja ili na rezultatima istraživanja ve ć prisutne subakutne 
toksičnosti. Za odre đivanje raspona doza mogu se upotrebljavati 
ne-transgenske životinje istog soja glodavaca. U glavnom ispitivanju, da bi se dobili podaci o odgovoru na dozu, cjelokupno istraživanje trebalo 
bi obuhvatiti negativnu kontrolnu skupinu (vidjeti stavak 22.) i najmanje 
tri odgovaraju će raspore đene razine doza, osim kada se upotrebljava
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 917
 
granična razina doze (vidjeti stavak 28.). Najviša doza trebala bi biti maksi ­
malna tolerirana doza (MTD). MTD se definira kao doza koja uzrokuje 
takve znakove toksi čnosti da je za o čekivati da bi više doze pri istom 
režimu doziranja prouzro čile smrt. Kemikalije s posebnim biološkim aktiv ­
nostima u ne-toksi čnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) i kemika ­
lije koje pokazuju zasi ćenost toksikokineti čkih svojstava mogu se izuzeti iz 
kriterija u pogledu odre đivanja doza i trebale bi se procjenjivati od slu čaja 
do slučaja. Te bi doze trebale obuhvatiti raspon od maksimalne do male ili 
nikakve toksi čnosti.  
Granično ispitivanje  
28. Ako eksperimenti s ciljem odre đivanja raspona doze ili postoje ći podaci iz 
vezanih sojeva glodavaca pokazuju da tretman barem grani čnom dozom 
(vidjeti tekst u nastavku) ne uzrokuje primjetljive toksi čne učinke i ako 
se na temelju podataka o strukturno srodnim kemikalijama ne o čekuje 
genotoksi čnost, potpuna studija uz primjenu tri razine doza ne smatra se 
potrebnom. Za razdoblje primjene od 28 dana (tj. 28 dnevnih primjena) 
granična doza je 1 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno. Za razdoblja primjene 
od 14 dana ili manje, grani čna doza je 2 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno 
(rasporedi doziranja koji se razlikuju od 28 dnevnih tretmana trebali bi se 
znanstveno opravdati u protokolu; vidjeti stavak 26.).  
Primjena doza  
29. Ispitivana se tvar obi čno primjenjuje unošenjem s pomo ću želučane sonde 
ili odgovaraju će intubacijske kanile. Op ćenito, očekivani put ljudske izlo ­ 
ženosti trebao bi se uzeti u obzir kod osmišljavanja analiza. Stoga drugi 
putovi izlaganja (kao što su pitka voda, potkožno, intravenozno, lokalno, 
inhalacije, primjenom u dušnik, unosom hrane ili implantacijom) mogu biti prihvatljivi kada se mogu opravdati. Intraperitonealna injekcija se ne prepo ­
ručuje jer nije fiziološki odgovaraju ći put ljudske izloženosti. Maksimalni 
volumen teku ćine koji se odjednom može primijeniti sondom ili injekcijom 
ovisi o veli čini pokusne životinje. Taj volumen ne smije prije ći 2 ml/100 g 
tjelesne mase. Opravdanost primjene ve ćih volumena od navedenog treba 
dokazati. Osim kod nadražuju ćih i nagrizaju ćih tvari, za koje je normalno 
da u većim koncentracijama izazivaju intenzivnije u činke, variranje ispitnih 
volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao stalni volumen.
 
Vrijeme uzorkovanja  
Somatske stanice  
30. Vrijeme uzimanja uzoraka kriti čna je varijabla jer je odre đuje razdoblje 
potrebno za postojanost mutacija. To razdoblje ovisi o pojedinom tkivu i čini se da je vezano uz vrijeme obrta stani čne populacije, pri čemu koštana 
srž i crijeva najbrže odgovaraju, a jetra je puno sporija. Odgovaraju ći 
kompromis za mjerenje u čestalosti mutacija kod tkiva koja se razmnožavaju 
sporo, odnosno brzo, 28 je uzastopnih dnevnih tretmana (kako je navedeno u stavku 26.) i uzorkovanje tri dana nakon kona čnog tretmana, iako se 
maksimalna u čestalost mutacije može ne pokazati kod tkiva koja se sporo 
razmnožavaju u tim uvjetima. Kada su tkiva koja se sporo razmnožavaju od posebne važnosti, tada bi moglo biti primjerenije kasnije razdoblje uzimanja uzoraka od 28 dana nakon razdoblja primjene od 28 dana (16) (29). U 
takvim slu čajevima, kasnije vrijeme uzorkovanja zamjenjuje trodnevno 
razdoblje uzimanja uzoraka i zahtijeva znanstveno opravdanje.
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 918
 
Zametne stanice  
31. Transgenske analize mutacije u glodavaca primjerene su za istraživanja poti ­
canja mutacije gena u zametnim stanicama mužjaka (7) (8) (27), kod kojih su dobro definirani trenutak i kinetika spermatogeneze (27). Mali brojevi jajnih 
stanica dostupnih za analizu, čak i nakon superovulacije i činjenica da nema 
sinteze DNK-a u jajnim stanicama, ograni čavaju utvr đivanje mutacije 
zametne stanice u ženki upotrebom transgenskih analiza (31).
 
32. Vremena uzimanja uzoraka za muške zametne stanice treba odabrati tako da 
se uzorkuje raspon izloženih vrsta stanica tijekom razvoja zametne stanice te tako da ciljni stupanj tijekom uzimanja uzoraka ostvari dovoljnu izlože ­
nost. Vrijeme potrebno za napredovanje zametne stanice u razvoju iz sper ­
matogonijalne mati čne stanice u zreli spermij koji dolazi do sjemenovoda ili 
repa epididimisa je ~49 dana u miša (36) i ~70 dana u štakora (34) (35). Nakon razdoblja izloženosti od 28 dana uz daljnja tri dana uzorkovanja akumulirana sperma prikupljena iz sjemenovoda ili repa epididimisa (7) 
(8) predstavlja populaciju stanica izloženih tijekom otprilike druge polovine 
spermatogeneze, koja uklju čuje mejotsko i postmejotsko razdoblje no ne i 
spermatogonijalno razdoblje ili razdoblje mati čne stanice. Da bi se na odgo ­
varajući način uzorkovale stanice u sjemenovodu ili repu epididimisa koje 
su bile spermatogonijalne mati čne stanice tijekom razdoblja izloženosti, 
potrebno je dodatno vrijeme uzorkovanja od najmanje sedam tjedana (miševi) ili deset tjedana (štakor) nakon završetka tretmana.
 
33. Stanice koje se istisnu iz sjemenovoda nakon 28 + 3 dnevnog režima 
sastoje se od miješane populacije oboga ćene za sve stupnjeve razvoja 
zametnih stanica (7) (8). Uzorkovanje tih stanica za potrebe utvr đivanja 
genskih mutacija ne osigurava dovoljno preciznu procjenu stupnjeva na 
kojima dolazi do mutacija zametnih stanica kao što se to može dobiti iz 
uzorkovanja spermija iz sjemenovoda ili repa epididimisa (s obzirom na to da postoji niz vrsta zametnih stanica koje su uzorkovane iz sjemenovoda te će isto tako biti prisutne i odre đene somatske stanice koje kontaminiraju tu 
populaciju stanica). Me đutim, uzorkovanje stanica iz sjemenovoda pored 
spermija iz sjemenovoda ili repa epididimisa nakon 28 + 3-dnevnog režima uzorkovanja moglo bi u odre đenom omjeru obuhvatiti stanice izlo ­ 
žene tijekom ve ćine faza razvoja zametne stanice i moglo bi biti korisno za 
utvrđivanje odre đenih mutagena zametnih stanica.
 
Promatranja  
34. Opća klinička opažanja treba provoditi najmanje jednom dnevno, po 
mogućnosti svaki dan u isto vrijeme, vode ći računa o razdoblju najve ćeg 
intenziteta o čekivanih u činaka nakon primjene doze. Zdravstveno stanje 
životinja treba bilježiti. Najmanje dva puta dnevno treba provjeravati ima 
li slučajeva pobolijevanja ili smrti životinja. Sve životinje treba vagati 
barem jednom tjedno i prilikom žrtvovanja. Unos hrane treba mjeriti najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana tvar daje s vodom za pi će, 
treba mjeriti i unos vode, i to barem na tjednoj razini. Životinje koje 
pokazuju nesmrtonosne pokazatelje viška toksi čnosti trebale bi se eutanazi ­
rati prije dovršetka ispitnog razdoblja (23).
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 919
 
Prikupljanje tkiva  
35. Smisao prikupljanja tkiva treba jasno definirati. Budu ći da je mogu će prou­ 
čavati poticanje mutacije u gotovo bilo kojem tkivu, odabir tkiva koje je 
potrebno prikupiti trebao bi se temeljiti na razlogu provo đenja istraživanja i 
bilo kojim postoje ćim podacima o mutagenosti, kancerogenosti ili toksi č­
nosti za kemikaliju koja se istražuje. Važni čimbenici koje treba uzeti u 
obzir trebali bi uklju čivati put primjene (na temelju vjerojatnog ljudskog 
puta izloženosti ili više njih), predvi đeni raspored tkiva i mogu će mehan­
izme djelovanja. U nedostatku bilo kakvih dodatnih podataka treba prikupiti 
nekoliko relevantnih somatskih tkiva. Ona bi trebala predstavljati brzo i sporo razmnožavaju ća tkiva kao i ona tkiva na mjestu dodira. K tome, 
spermiji iz sjemenovoda ili repa epididimisa i zametne stanice u razvoju 
iz sjemenovoda (kako je opisano u stavcima 32. i 33.) trebali bi se prikupiti i pohraniti za slu čaj da bude potrebna budu ća analiza mutagenosti zametnih 
stanica. Treba zabilježiti mase organa, a za ve će organe treba prikupiti isto 
područje od svih životinja.
 
Pohranjivanje tkiva i DNK-a  
36. Tkiva (ili homogenati tkiva) bi se trebala pohraniti na ili ispod – 70 °C i 
upotrebljavati za izoliranje DNK-a u roku od 5 godina. Izolirani DNK, 
pohranjen u hladnjaku na 4 °C u odgovaraju ćem puferu trebao bi se upotri ­
jebiti optimalno za analize mutacija u roku od godinu dana.  
Odabir tkiva za analizu mutacije  
37. Odabir tkiva trebao bi se temeljiti na razmatranjima kao što su: 1) put 
primjene ili mjesto prvog kontakta (tj. žljezdani želudac ako je primjena 
oralna, plu ća ako je primjena obavljena inhalacijom, ili koža ako je upotri ­
jebljena površinska primjena); i 2) farmakokineti čki parametri primije ćeni u 
općim istraživanjima toksi čnosti, koji ukazuju na stanje tkiva, zadržavanje 
ili akumulaciju, ili ciljnih organa u pogledu toksi čnosti. Ako se istraživanja 
obavljaju nakon istraživanja kancerogenosti, treba uzeti u obzir ciljna tkiva 
u pogledu kancerogenosti. Odabir tkiva za analizu trebao bi maksimizirati pronalaženje kemikalija koje djeluju izravno kao in vitro mutageni, bilo da se ubrzano metaboliziraju, lako reagiraju ili se slabo apsorbiraju ili oni za 
koje se ciljno tkivo utvr đuje s pomo ću puta primjene (6).
 
38. U nedostatku osnovnih informacija i uzimaju ći u obzir razmatranja u vezi s 
mjestom kontakta zbog puta primjene, jetra i barem jedno tkivo koje se brzo dijeli (npr. žljezdani želudac, koštana srž) trebali bi se procijeniti u pogledu 
mutagenosti. U ve ćini se slu čajeva navedeni zahtjevi mogu ostvariti s 
pomoću analiza dvaju pomno odabranih tkiva, no u nekim je slu čajevima 
potrebno je tri ili više vrsta. Ako postoje razlozi koji se posebno odnose na učinke mati čnih stanica, uklju čujući i pozitivne odgovore na somatske 
stanice, tkiva zametnih stanica trebala bi se procijeniti u pogledu mutacija.
 
Metode mjerenja  
39. Za preporu čene transgenske modele dostupne su standardne laboratorijske 
ili objavljene metode za otkrivanje mutacija: lacZ lambde bakteriofaga i 
plazmida (30); lacI miša (2) (18); gpt delta miša (22); gpt delta štakora (28); cII (17). Modifikacije bi trebale biti opravdane i odgovaraju će doku­
mentirane. Podaci iz višestrukih pakiranja mogu se agregirati i upotrijebiti 
da bi se postigao odgovaraju ći broj plakova ili kolonija. Me đutim, potreba 
za velikim brojem reakcija pakiranja za postizanje odgovaraju ćeg broja 
plakova može biti pokazatelj slabe kvalitete DNK-a. U takvim slu čajevima 
podaci bi se trebali oprezno razmatrati jer bi mogli biti nepouzdani. 
Optimalni broj plakova ili kolonija po uzroku DNK-a ovisi o statisti čkoj 
vjerojatnosti utvr đivanja odgovaraju ćeg broja mutanata prema odre đenoj
 ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 920
 
spontanoj u čestalosti mutacije. Op ćenito, potreban je minimum od 125 000 
do 300 000 plakova kada je spontana u čestalost mutacije u rangu 3 × 10  –5 
(15). U pogledu analize Big Blue® lacI, važno je dokazati da se cijeli 
raspon mutacije boje fenotipa može utvrditi uklju čivanjem odgovaraju ćih 
kontrola boja paralelno sa svakim plakom. Tkiva i njihovi uzorci (predmeti) 
trebali bi se obraditi i analizirati upotrebom ujedna čenog postupka, u okviru 
kojeg se istodobno obra đuju predmeti iz kontrolne skupine nosa ča/otapala, 
pozitivne kontrolne skupine (ako je upotrijebljena) ili pozitivne kontrolne DNK-a (prema potrebi) i svaka obra đena skupina.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
40. Podatke za pojedina čne životinje treba prikazati u tabli čnom obliku. 
Pokusna jedinica je životinja. Izvješ će bi trebalo uklju čivati ukupni broj 
jedinica koje stvaraju plakove (PFU) ili jedinica koje stvaraju 
koloniju (CFU), broj mutanata i u čestalost mutacija za svako tkivo svake 
životinje. Postoje li višestruke reakcije u vezi s pakiranjem/spašavanjem, treba izvijestiti o broju reakcija po uzorku DNK-a. Dok podatke za svaku pojedinu reakciju treba zadržati, potrebno je izvijestiti o ukupnom pfu-u ili 
cfu-u. Treba izvijestiti o podacima o toksi čnosti i klini čkim znakovima u 
skladu sa stavkom 34. Svi rezultati u vezi sa sekvenciranjem trebali bi se predstaviti za svakog analiziranog mutanta te treba prikazati i vezane izra ­ 
čune o učestalosti mutacije za svaku životinju i tkivo.
 
Statističko vrednovanje i tuma čenje rezultata  
41. Postoji više kriterija za utvr đivanje pozitivnog rezultata, kao na primjer 
povećanje učestalosti mutacije povezano s dozom ili jasno pove ćanje 
učestalosti mutacije utvr đeno kod skupine na koju je primijenjena samo 
jedna doza, u usporedbi s kontrolnom skupinom otapala/nosa ča. Treba 
analizirati barem tri skupine tretirane dozom da bi se prikupili odgovaraju ći 
podaci za analizu doze i odgovora. Dok bi biološki zna čaj rezultata trebao 
biti od primarne važnosti, mogu se upotrebljavati odgovaraju će statističke 
metode kao pomo ć u procjeni rezultata ispitivanja (4) (14) (15) (25) (26). 
Upotrijebljena statisti čka ispitivanja trebala bi obuhva ćati životinju kao 
eksperimentalnu jedinicu.  
42. Ispitivana tvar čija ispitivanja ne ispunjavaju gornje kriterije u ovom se 
sustavu ne smatra mutagenom. Treba zadržati i mogu ćnost negativne 
pričuve. 
43. Za analize sekvenciranja DNK-a dostupno je nekoliko statisti čkih pristupa 
za pomoć u tumačenju rezultata (1) (5) (9) (19).  
44. Razmatranja o tome jesu li primije ćene vrijednosti unutar ili izvan povije ­
snog kontrolnog raspona može pomo ći kod usmjeravanja pri procjeni biolo ­ 
škog značaja odgovora (32).  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 921
 
Izvješće o ispitivanju  
45. Izvješ će o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljede će informacije:  
Ispitivana kemikalija  
— identifikacijski podaci i broj CAS, ako su raspoloživi,  
— izvor, broj lota ako je dostupan,  
— fizikalna priroda i čistoća, 
— fizikalno-kemijska svojstva relevantna za provo đenje istraživanja,  
— stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu, ako je poznata.  
Otapalo/nosa č 
— opravdanost odabira nosa ča, 
— topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu/nosa ču, ako je 
poznata,  
— priprema prehrambenih pripravaka, pitke vode ili inhalacijskih 
pripravaka,  
— analiti čka određivanja pripravaka (tj. stabilnost, homogenost, nominalne 
koncentracije).  
Ispitne životinje  
— vrste i soj te obrazloženje njihova odabira,  
— broj, starost i spol životinja,  
— podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,  
— pojedina čna tjelesna masa životinja na po četku ispitivanja, uklju čujući 
raspon tjelesnih masa, srednje i standardno odstupanje za svaku 
skupinu.  
Ispitni uvjeti  
— podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosa č/otapalo),  
— podaci iz ispitivanja za odre đivanje raspona,  
— podloge za odabir visine doze,  
— pojedinosti o pripremi kemikalija za ispitivanje,  
— pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,  
— podloge za odabir puta primjene,  
— metode mjerenja toksi čnosti životinje, uklju čujući, kada je dostupno, 
histopatološke ili hematološke analize i u čestalost kojom je obavljano 
promatranje i vaganje životinje,  
— metode provjere dosega ispitne kemikalije u ciljno tkivo, ili op ćenite 
cirkulacije, ako se dobiju negativni rezultati,  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 922
 
— stvarna doza (mg/kg tjelesne mase/dan) i faktor za prera čunavanje 
koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za pi će (ppm) u stvarnu 
dozu i prehrana, ako je primjenjivo,  
— podaci o kvaliteti hrane i vode,  
— iscrpni opis tretmana i rasporeda uzimanja uzoraka i opravdanje za 
odabire,  
— metoda eutanazije,  
— postupak izdvajanja i o čuvanja tkiva,  
— metode izoliranja genomskog DNK-a glodavca, spašavanje transgena iz 
genomskog DNK-a i prenošenje transgenskog DNK-a u bakteriju doma ­ 
ćina, 
— izvor i brojevi lota svih stanica, opreme i reagensa (ako je primjenjivo),  
— metode popisivanja mutanata,  
— metode molekularne analize mutanata i upotreba u ispravljanju za 
klonalitet i/ili izra čunavanje u čestalosti mutacija, ako je primjenjivo.  
Rezultati  
— stanje životinje prije i tijekom razdoblja ispitivanja, uklju čujući i 
znakove toksi čnosti,  
— mase tijela i organa prije žrtvovanja,  
— za svako tkivo/životinju, broj mutanata, broj procijenjenih plakova ili 
kolonija, u čestalost mutacije,  
— za svaku skupinu tkiva/životinje, broj reakcija pakiranja po uzorku 
DNK-a, ukupni broj mutanata, prosje čna učestalost mutacije, standardno 
odstupanje,  
— odnos doza i reakcija, ako je mogu će, 
— za svako tkivo/životinju, broj neovisnih mutanata i prosje čna učestalost 
mutacije, kada je provedena molekularna analiza mutacija,  
— paralelni podaci i podaci o negativnim kontrolama iz prijašnjih ispiti ­
vanja s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,  
— podaci paralelne pozitivne kontrole (ili neparalelne pozitivne kontrole 
DNK-a),  
— analiti čka određivanja, ako su dostupna (tj. koncentracije DNK-a koje se 
upotrebljavaju u pakiranju, podaci o sekvenciranju DNK-a),  
— primijenjene statisti čke analize i metode.  
Rasprava o rezultatima  
Zaključak ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 923
 
LITERATURA  
(1) Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987.), Statistical Test for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra, J. Mol. Biol., 194: 391. – 396.  
(2) Bielas, J.H. (2002.), A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement, Mutation Res., 518: 107. – 112.
 
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995.), Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo 
Mutations Nature, 377(6550): 657. – 659.  
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995.), Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246. 
– 255.  
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996.), Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405. – 413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999.), Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens, Mutagenesis, 14(1): 141. – 151.
 
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper 
(1995.), Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced 
by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485. – 7489.
 
(8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997.), Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells, Mutation Res., 388(2. – 3.): 197. – 212.
 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000.), „Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra”, Genetics, 156: 1411. – 1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989.), Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971. – 7975.
 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993.), A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive E. coli Host, Biotechniques, 14(3): 326., 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003.), Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer, Mutation Res., 543.: 125. – 136.  
(13) Erikson, R.P. (2010.), Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update, Mutation Res., 705.: 96. – 106..  
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998.), Statistical Analysis of 
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 13(3): 249. – 255.
 
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000.), In vivo Trans ­
genic Mutation Assays, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253. – 259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003.), Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays, Environ. Mol. Muta ­
gen., 41.: 1. – 6.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996.), Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Muta ­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
93(17): 9073. – 9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990.), The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212. – 218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008.), Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis, Carcinogenesis, 29(4): 772. – 778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996.), A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465. – 470.
 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999.), Spi – Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice, 
Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9. – 15.
 
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000.), Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays, Mutation Res., 455(1. – 
2.): 191. – 215.  
(23) OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N
 o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.  
(24) OECD (2009.), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009.)7, OECD, Pariz.  
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995.), Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231. – 245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997.), Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory 
Study, Mutation. Res., 388(2. – 3.): 249. – 289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006.), Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays, Mutation. Res., 598: 164. – 193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010.), Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers, Toxicol. Sci., 114(1): 71. – 78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003.), In vivo Trans ­
genic Mutation Assays, Mutation Res., 540.: 141. – 151.
 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996.), Bacteriophage λ and Plasmid lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations in vivo in: G. Pfeifer (ed.), Tech ­
nologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum 
Press, New York, NY, USA, str. 391. – 410.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005.), A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells, Mutation Res., 578(1. – 2.): 117. – 123.
 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011.), Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, 
Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
(33) OECD (2011.), Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Pariz.  
(34) Clermont, Y. (1972.), Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52.: 198. – 236.
 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006.), The Epidi ­
dymis, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, str. 1071. – 1148.  
(36) Russell, L.B. (2004.), Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse, 
Genetica, 122: 25. – 36.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 926
 
Dodatak  
DEFINICIJE  
Razdoblje primjene:  ukupno razdoblje tijekom kojeg se doza primjenjuje na 
životinju.  
Supstitucija baznog para:  vrsta mutacije koja uzrokuje zamjenu jedinstvene 
nukleotidne baze DNK-a drugom nukleotidnom bazom DNK-a.  
Kapsid:  omotač od proteina koji obavija česticu virusa.  
Kemikalija:  tvar ili smjesa.  
Klonalno širenje:  proizvodnja više stanica iz jedne (mutirane) stanice.  
Jedinica koja stvara koloniju (CFU):  mjera održivog broja bakterija.  
Konkatamer:  duga neprekinuta biomolekula sastavljena od višestrukih iden ­
tičnih preslika povezanih u seriju.  
Cos site:  12-nukleotidni segment jednolan čanog DNK-a koji postoji na oba kraja 
bakteriofaga dvolan čanoga genoma lambde.  
Brisanje:  mutacija zbog koje genom gubi jedan ili više (slijednih) nukleotida.  
Elektroporacija:  primjena elektri čnih impulsa da bi se pove ćala nepropusnost 
staničnih membrana.  
Endogeni gen:  gen koji je svojstven genomu.  
Ekstrabinomijalna varijacija:  veća varijabilnost u ponovljenim procjenama 
udjela populacije nego što bi se o čekivalo da populacija ima binomijalnu 
distribuciju.  
Pomak okvira mutacija:  genetska mutacija koju uzrokuju unošenja ili brisanja 
određenog broja nukleotida koji nije jednomjerno djeljiv s tri unutar slijeda 
DNK-a koji je kodiran za protein/peptid.  
Unošenje:  dodavanje jednog ili više baznih parova nukleotida u slijed DNK-a.  
Jackpot:  velik broj mutanata koji se pojavljuju kolonijalnim širenjem iz jedin ­
stvene mutacije.  
Velika brisanja:  brisanja u DNK-a više od nekoliko kilobaza (koja se u činkovito 
otkrivaju odabirom Spi – i lacZ plazmidnim analizama.).  
Ligacija:  kovalentno povezivanje dva kraja molekula DNK-a s pomo ću ligacije 
DNK-a.  
Mitogen:  kemikalija koja poti če stanicu na zapo činjanje stani čne podjele te tako 
potiče mitozu (tj. podjelu stanice).  
Neutralni gen:  gen na koji ne utje ču ni pozitivni ni negativni selektivni pritisci.  
Pakiranje:  sinteza infektivnih čestica faga iz pripravka kapsida faga i rubnih 
proteina i konkatamera faga molekule DNK-a. Obi čno se upotrebljava da bi se 
grupirao DNK kloniran na lambda vektor (razdvojena cos sites) u infektivne lambda čestice.
 
Učinkovitost pakiranja:  učinkovitost kojom se pakirani bakteriofazi regeneriraju 
u bakteriji doma ćinu. ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 927
 
Jedinica koja stvara plakove (PFU):  mjera održivog broja bakteriofaga.  
Točkasta mutacija:  općeniti pojam za mutaciju koja utje če samo na manju 
sekvencu DNK-a uklju čujući manja unošenja, brisanja i supstitucije baznih 
parova.  
Pozitivna selekcija:  metoda kojom se omogu ćava preživljavanje samo mutanata.  
Gen koji daje informacije:  gen čiji je proizvod mutantskoga gena jednostavno 
uočljiv. 
Vrijeme uzorkovanja:  kraj vremenskog razdoblja, prije žrtvovanja, tijekom 
kojeg se kemikalija ne primjenjuje i tijekom kojeg se lezije DNK-a pri čvršćuju 
na stabilne mutacije.  
Prijenosni vektor:  vektor konstruiran tako da se može razmnožavati u dvije 
različite vrste doma ćina; u skladu s time, DNK unesen u prijenosni vektor 
može se ispitivati ili se njime može upravljati u dvije razli čite vrste stanica ili 
dva različita organizma.  
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom 
metodom.  
Transgenski:  u vezi s ili koji je organizam čiji je genom promijenjen prijenosom 
gena iz neke druge vrste.  ▼M5 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 928
 
DIO C: METODE ZA ODRE ĐIVANJE EKOTOKSI ČNOSTI  
SADRŽAJ 
C.1. AKUTNA TOKSI ČNOST ZA RIBE  
C.2. TEST AKUTNE IMOBILIZACIJE  DAPHNIA SP.  
C.3. TEST INHIBICIJE RASTA SLATKOVODNIH ALGI I CIJANO ­
BAKTERIJA  
C.4. ODRE ĐIVANJE „LAKE” BIORAZGRADIVOSTI  
I. DIO  OP ĆENITO  
II. DIO  TEST OPADANJA DOC-a (metoda C.4.-A)  
DIO III.  IZMIJENJENI TEST PRETRAŽIVANJA OECD (metoda C.4.-B)  
IV. DIO  TEST RAZVIJANJA CO  2 (metoda C.4.-C)  
V. DIO  MANOMETRIJSKO-RESPIROMETRIJSKI TEST (metoda C.4.- 
D) 
DIO VI.  TEST SA ZATVORENIM BOCAMA (metoda C.4.-E)  
DIO VII.  TEST M.I.T.I. (metoda C.4.-F)  
C.5. RAZGRADNJA – BIOKEMIJSKA POTROŠNJA KISIKA  
C.6. RAZGRADNJA – KEMIJSKA POTROŠNJA KISIKA  
C.7. RAZGRADNJA – ABIOTI ČKA RAZGRADNJA: HIDROLIZA 
KAO FUNKCIJA PH  
C.8. TOKSI ČNOST ZA GUJAVICE  
C.9. BIORAZGRADNJA – ZAHN-WELLENSOV TEST  
C.10.  SIMULACIJSKI TEST AEROBNOG PRO ČIŠĆAVANJA 
OTPADNIH VODA C.10-A: JEDINICE S AKTIVNIM 
MULJEM - C.10-B: BIOFILMOVI  
C.11.  BIORAZGRADNJA – TEST INHIBICIJE DISANJA 
AKTIVNOG MULJA  
C.12.  BIORAZGRADNJA – IZMIJENJENI TEST SCAS  
C.13.  BIOKONCENTRACIJA: TEST S RIBAMA U PROTO ČNOM 
POSTUPKU  
C.14.  TEST RASTA JUVENILNIH RIBA  
C.15.  TEST KRATKOTRAJNE TOKSI ČNOSTI NA RIBAMA U 
STADIJU EMBRIJA I MLA ĐI SA ŽUMANJ ČANOM 
VREĆICOM  
C.16.  MEDONOSNE P ČELE – ISPITIVANJE AKUTNE ORALNE 
TOKSIČNOSTI  
C.17.  MEDONOSNE P ČELE – ISPITIVANJE AKUTNE 
KONTAKTNE TOKSI ČNOSTI  
C.18.  ŠARŽNO ISPITIVANJE ADSORPCIJE/DESORPCIJE U 
RAVNOTEŽI  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 929
 
C.19.  PROCJENA KOEFICIJENTA ADSORPCIJE (K  CO ) NA TLO I 
KANALIZACIJSKI MULJ PRIMJENOM TEKU ĆINSKE 
KROMATOLOGIJE VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPLC)  
C.20.  TEST REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA VRSTI  
DAPHNIA MAGNA  
C.21.  MIKROORGANIZMI KOJI ŽIVE U TLU: TEST PRETVORBE 
DUŠIKA  
C.22.  MIKROORGANIZMI KOJI ŽIVE U TLU: TEST PRETVORBE 
UGLJIKA  
C.23.  AEROBNA I ANAEROBNA PRETVORBA U TLU  
C.24.  AEROBNA I ANAEROBNA PRETVORBA U SUSTAVIMA 
VODENOG SEDIMENTA  
C.25.  AEROBNA MINERALIZACIJA U POVRŠINSKOJ VODI – 
SIMULACIJSKI TEST BIORAZGRADNJE  
C.26.  TEST INHIBICIJE RASTA  LEMNA  SP. 
▼M4 
C.27.  TEST TOKSI ČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U 
VODI IZ SEDIMENTA SA SEDIMENTOM OBRA ĐENIM 
SPIKINGOM  
C.28.  TEST TOKSI ČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U 
VODI IZ SEDIMENTA S VODOM OBRA ĐENOM 
SPIKINGOM  
C.29.  LAKA BIORAZGRADIVOST - CO  2 U ZAČEPLJENIM POSU ­
DAMA (TEST PLINSKOG PROSTORA (HEADSPACE))  
C.30.  BIOAKUMULACIJA U KOPNENIM OLIGOHETIMA  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 930
 
C.1. AKUTNA TOKSI ČNOST ZA RIBE  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Svrha ovog testa je odrediti akutnu letalnu toksi čnost tvari za ribe u 
slatkoj vodi. Kao pomo ć u odabiru najprikladnije ispitne metode 
(statička, polustati čka ili proto čna) poželjno je imati informacije o 
topljivosti u vodi, tlaku pare, kemijskoj stabilnosti, konstantama 
disocijacije i biorazgradivosti tvari, u mjeri u kojoj je to mogu će, 
kako bi se osigurala zadovoljavaju ća stabilnost koncentracija ispiti ­
vane tvari u razdoblju ispitivanja.  
Kod planiranja ispitivanja i tuma čenja rezultata treba uzeti u obzir i 
dodatne informacije (npr. strukturna formula, stupanj čistoće, vrsta i 
postotak zna čajnih nečistoća, prisutnost i koli čine dodataka (aditiva) 
i podjelni koeficijent n-oktanol/voda).  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Akutna toksi čnost je raspoznatljiv štetni u činak izazvana u organ ­
izmu u kratkom vremenu (dani) izlaganja tvari. U ovom se testu 
akutna toksi čnost izražava kao medijan smrtonosne koncentracije 
(LC  50 ), a to je koncentracija u vodi koja ubija 50 % ispitne serije 
riba u neprekinutom vremenu izlaganja koje treba navesti.  
Sve koncentracije ispitivane tvari navode se kao omjer masa/vo ­
lumen (miligrami po litri). One se tako đer mogu izraziti i kao 
maseni udjeli (mg/kg  -1 ). 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Ispitivanjem referentne tvari može se dokazati da se odgovor ispiti ­
vane vrste nije zna čajno promijenio u uvjetima laboratorijskog 
ispitivanja.  
Za ovo ispitivanje nisu utvr đene referentne tvari.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Granično se ispitivanje može provesti sa 100 mg po litri da bi se 
dokazalo da je LC  50 viši od te koncentracije.  
Ribe se tijekom 96 sati izlažu ispitivanoj tvari, koja se dodaje u vodu 
u određenom rasponu koncentracija. Smrtnost se bilježi barem u 
razmacima od 24 sata i, ako je to mogu će, izračunaju se koncen ­
tracije koje ubijaju 50 % riba (LC  SO ) u svakom vremenu 
promatranja.  
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Kriteriji kakvo će vrijede za grani čno ispitivanje i za potpunu ispitnu 
metodu.  
Smrtnost u kontrolama do kraja ispitivanja ne smije biti viša od 
10 % (ili jedna riba ako se koristi manje od deset).  
Koncentracija otopljenog kisika mora stalno biti iznad 60 % vrijed ­
nosti zasi ćenja kisikom.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 931
 
Koncentracije ispitivane tvari se tijekom ukupnog trajanja ispitivanja 
moraju održavati na razini 80 % po četnih koncentracija.  
Za tvari koje se lako otapaju u ispitnom mediju daju ći stabilne 
otopine, tj. tvari koje ne će u značajnoj mjeri ishlapiti, razgraditi se, 
hidrolizirati ili adsorbirati, može se uzeti da je po četna koncentracija 
istovjetna nazivnoj koncentraciji. Treba dokazati da su koncentracije tijekom ispitivanja u svakom trenutku bile na predvi đenoj razini i da 
su zadovoljeni kriteriji kakvo će.
 
Kod tvari koje:  
i. su slabo topljive u ispitnom mediju; ili  
ii. mogu tvoriti stabilne emulzije ili disperzije; ili  
iii. nisu stabilne u vodenim otopinama,  
uzet će se da je po četna koncentracija ona koncentracija koja je 
izmjerena u otopini (odnosno, ako to tehni čki nije izvedivo, u 
vodenom stupcu) na po četku ispitivanja. Koncentracija se odre đuje 
nakon razdoblja uravnoteženja, ali prije uvo đenja ispitnih riba.  
U svakom od ovih slu čajeva treba za vrijeme ispitivanja provesti 
dodatna mjerenja kako bi se potvrdile stvarne koncentracije izlaganja 
odnosno uskla đenost s kriterijima kakvo će. 
Odstupanja pH vrijednosti ne smiju biti viša od 1 jedinice.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Mogu se koristiti tri vrste postupka:  
Statičko ispitivanje:  
ispitivanje toksi čnosti gdje nema protoka ispitne otopine. (Otopine 
ostaju nepromijenjene tijekom ukupnog trajanja ispitivanja.)  
Polustatičko ispitivanje:  
ispitivanje bez protoka ispitne otopine, ali uz redovito obnavljanje 
čitave koli čine ispitne otopine nakon dužih razdoblja (npr. 24 sata).  
Protočno ispitivanje:  
toksikološko ispitivanje gdje se voda u ispitnim komorama stalno 
obnavlja i ispitivana se kemikalija prenosi s vodom koja sa koristi za obnavljanje ispitnog medija.
 
1.6.1.  Reagensi  
1.6.1.1.  Otopine ispitivanih tvari  
Radne otopine potrebne jakosti pripremaju se otapanjem tvari u 
deioniziranoj vodi odnosno vodi u skladu s 1.6.1.2.  
Odabrane ispitne koncentracije pripremaju se razrje đivanjem radne 
otopine. Ako se ispituju visoke koncentracije, tvar se može izravno 
otopiti u vodi za razrje đivanje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 932
 
Tvari u pravilu treba ispitivati samo do granice topljivosti. Kod 
nekih tvari (npr. tvari koje imaju nisku topljivost u vodi ili visoki 
P ow i tvari koje u vodi ne tvore pravu otopinu ve ć stabilnu disper ­
ziju) prihvatljivo je korištenje ispitne koncentracije iznad granice topljivosti kako bi se dobila najviša topljiva/stabilna koncentracija. 
Ipak, važno je da ta koncentracija ina če ne remeti ispitni sustav (npr. 
film tvari na površini vode koji spre čava oksigenaciju vode itd.).
 
Kao pomo ć u pripremi radnih otopina tvari niske topljivosti u vodi 
odnosno da bi se olakšalo dispergiranje tih tvari u ispitnom mediju, može se koristiti ultrazvu čno raspršivanje, organska otapala, emulga ­
tori ili dispergenti. Ako se koriste ovakve pomo ćne tvari, sve ispitne 
koncentracije moraju sadržavati istu koli činu pomo ćne tvari i treba 
uvesti dodatne kontrolne ribe i izložiti ih istoj koncentraciji pomo ćne 
tvari kao ribe u ispitnom nizu. Koncentracija tih pomo ćnih tvari 
treba biti što je mogu će niža, a u svakom slu čaju ne smije prelaziti 
100 mg po litri ispitnog medija.
 
Ispitivanje treba provesti bez podešavanja pH vrijednosti. Ako ima 
naznaka da je došlo do zna čajne promjene pH, savjetuje se da se 
ispitivanje ponovi uz podešavanje pH i navedu rezultati. U tom 
slučaju pH vrijednost radne otopine treba podesiti na pH vrijednost 
vode za razrje đivanje, osim ako postoje posebni razlozi da se to ne 
učini. Pritom treba po mogu ćnosti koristiti HCl i NaOH. Podešavanje 
pH vrijednosti treba obaviti na na čin da ne do đe do zna čajne 
promjene koncentracije ispitivane tvari u radnoj otopini. Ako pode ­ 
šavanje izazove kemijsku reakciju ili fizi čko taloženje ispitivanog 
spoja, to treba navesti u izvješ ću o ispitivanju.  
1.6.1.2.  Voda za držanje i voda za razrje đivanje  
Može se koristiti teku ća voda za pi će (koja nije one čišćena potenci ­
jalno štetnim koncentracijama klora, teških metala i drugih tvari), 
kvalitetna prirodna voda ili obra đena voda (vidjeti Dodatak 1.). Pred ­
nost se daje vodi ukupne tvrdo će između 10 i 250 mg po litri (kao 
CaCO  3 ) s pH od 6,0 do 8,5.  
1.6.2.  Aparatura  
Sva aparatura mora biti izra đena od kemijski inertnog materijala:  
— automatski sustav razrje đivanja (za proto čno ispitivanje),  
— mjera č kisika,  
— oprema za odre đivanje tvrdo će vode,  
— odgovaraju ći uređaj za regulaciju temperature,  
— mjera č pH vrijednosti.  
1.6.3.  Ispitne ribe  
Ribe trebaju biti zdrave i ne smiju pokazivati vidljive malformacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 933
 
Vrstu treba odabrati na temelju prakti čnih kriterija, kao što su dobra 
raspoloživost tijekom čitave godine, lako ća održavanja, prikladnost 
za ispitivanje, relativna osjetljivost na kemikalije te svi bitni ekonomski, biološki i okolišni čimbenici. Prilikom odabira riblje 
vrste treba tako đer voditi ra čuna o potrebi za usporedivoš ću dobi­
venih podataka i postoje ćem međunarodnom uskla đivanju (1).
 
Popis preporu čenih ribljih vrsta za provedbu ovog testa nalazi se u 
Dodatku 2.; preferirane vrste su zebrica i kalifornijska pastrva.  
1.6.3.1.  Držanje  
Sve ispitne ribe trebaju po mogu ćnosti potjecati iz istog nasada i biti 
slične dužine i dobi. Ribe treba držati najmanje 12 dana u sljede ćim 
uvjetima:  
punjenje:  
ovisno o postupku (recirkulacija ili protok) i ribljoj vrsti,  
voda:  
vidjeti 1.6.1.2.,  
svjetlost:  
osvjetljenje od 12 do 16 sati dnevno,  
koncentracija otopljenog kisika:  
najmanje 80 % vrijednosti zasi ćenja kisikom,  
hranjenje:  
tri puta tjedno ili svakog dana – prestaje 24 sata prije po četka 
ispitivanja.  
1.6.3.2.  Smrtnost  
Smrtnost se bilježi nakon 48-satnog razdoblja prilagodbe, uz 
primjenu sljede ćih kriterija:  
— iznad 10 % populacije u sedam dana:  
čitava serija se odbacuje,  
— između 5 i 10 % populacije:  
razdoblje držanja produžuje se na još sedam dana.  
Ako se nakon tog više ne zabilježi smrtnost, serija je prihvatljiva; 
u protivnome se mora odbaciti,  
— manje od 5 % populacije:  
prihvaćanje serije.  
1.6.4.  Prilagodba  
Sve ribe moraju prije korištenja biti najmanje sedam dana izložene 
vodi iste kakvo će i temperature kakva će se koristiti u ispitivanju.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 934
 
1.6.5.  Ispitni postupak  
Prije glavnog ispitivanja može se provesti preliminarno ispitivanje za 
određivanje raspona kako bi se pribavile informacije o rasponu 
koncentracija koji će se koristiti u glavnom ispitivanju.  
Uz ispitni niz treba provesti jednu kontrolu s vodom za razrje đivanje 
te, prema potrebi, jednu kontrolu s pomo ćnom tvari.  
Ovisno o fizikalnim i kemijskim svojstvima ispitivanog spoja, treba 
odabrati stati čko, polustati čko ili proto čno ispitivanje, kako bi krite ­
riji kakvo će bili zadovoljeni.  
Ribe se izlažu tvari kako je ovdje opisano:  
— trajanje: 96 sati,  
— broj životinja: najmanje sedam po koncentraciji,  
— bazeni: prikladne zapremnine s obzirom na preporu čeno 
punjenje,  
— punjenje: za stati čko i polustati čko ispitivanje preporu čuje se 
maksimalna koli čina punjenja od 1 g po litri; kod proto čnih 
sustava prihvatljiva je i ve ća količina punjenja,  
— ispitna koncentracija: najmanje pet koncentracija koje se 
razlikuju za stalni faktor ne viši od 2,2 i koje u najve ćoj 
mogućoj mjeri obuhva ćaju podru čje od 0 do 100 % smrtnosti,  
— voda: vidjeti 1.6.1.2.,  
— svjetlost: osvjetljenje od 12 do 16 sati dnevno,  
— temperatura: ovisno o vrsti (Dodatak 2.), ali u granicama ± 1 °C 
tijekom jednog ispitivanja,  
— koncentracija otopljenog kisika: najmanje 60 % vrijednosti zasi ­ 
ćenja kisikom pri odabranoj temperaturi,  
— hranjenje: nema.  
Ribe se pregledavaju nakon prva dva do četiri sata te barem u 
razmacima od 24 sata. Ribe se smatraju mrtvima ako ne reagiraju na dodir u podru čju korijena repa i ako nisu vidljivi pokreti disanja. 
Mrtve ribe treba ukloniti čim se uo če i zabilježiti smrtnost. Treba 
voditi evidenciju vidljivih anomalija (npr. gubitak ravnoteže, promjene u na činu plivanja, disanju, pigmentaciji itd.).
 
Mjerenja pH vrijednosti, otopljenog kisika i temperature treba provo ­
diti svakodnevno.  
Granično ispitivanje  
Granično se ispitivanje može provesti sa 100 mg po litri primjenom 
postupaka opisanih u ovoj ispitnoj metodi da bi se dokazalo da je LC
 50 viši od te koncentracije.  
Ako se zbog prirode tvari ne može posti ći koncentracija od 100 mg 
po litri u ispitnoj vodi, grani čno ispitivanje treba provesti s koncen ­
tracijom koja je jednaka topljivosti tvari (ili najvišoj koncentraciji 
koja daje stabilnu disperziju) u mediju koji se koristi (vidjeti 
također točku 1.6.1.1.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 935
 
Granično ispitivanje treba provesti na 7 do 10 riba, uz isti broj riba u 
kontroli odnosno kontrolama. (Prema binomnom pou čku, ako se 
koristi 10 riba s nultom smrtnoš ću, tada je pouzdanost da je LC  50 
viši od koncentracije primijenjene u grani čnom ispitivanju jednaka 
99,9 %. Odustnost smrtnosti kod 7, 8 ili 9 riba ukazuje na to da je 
LC 50 viši od primijenjene koncentracije s pouzdanoš ću od najmanje 
99 %.)  
Kod pojave smrtnosti treba provesti potpuno istraživanje. Treba zabi ­
lježiti sve uo čene subletalne u činke.  
2. PODACI I VREDNOVANJE  
Postotak smrtnosti u svakom vremenu u kojemu se bilježe zapažanja 
(24, 48, 72 i 96 sati) treba prikazati na logaritamskom papiru vjero ­
jatnosti u ovisnosti o koncentraciji i to za svako preporu čeno vrijeme 
izlaganja.  
Kad god je to mogu će, za svako vrijeme promatranja treba procije ­
niti LC  50 i granice pouzdanosti (p = 0,05) primjenom standardnih 
postupaka; te vrijednosti treba zaokružiti na jedno ili najviše dva 
značajna mjesta (primjeri zaokruživanja na dva mjesta: 170 za 
173,5; 0,13 za 0,127; 1,2 za 1,21).  
U slučaju da je nagib krivulje koncentracija/odgovor preoštar za 
izračun LC  50 , dovoljna je grafi čka procjena te vrijednosti.  
Ako dvije uzastopne koncentracije u omjeru 2,2 daju samo 0 i 
100 % smrtnosti, te su dvije vrijednosti dovoljne da se pokaže 
područje u kojemu se nalazi LC  50 . 
Ako je primije ćeno da se stabilnost ili homogenost ispitivane tvari ne 
može održati, to treba navesti u izvješ ću o ispitivanju i rezultate 
tumačiti s oprezom.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će informacije:  
— podaci o ispitnim ribama (znanstveni naziv, soj, dobavlja č, 
moguće prethodne obrade, veli čina i broj riba pri svakoj ispitnoj 
koncentraciji),  
— izvor vode za razrje đivanje i zna čajna kemijska svojstva (pH, 
tvrdoća, temperatura),  
— u slučaju tvari koje su slabo topljive u vodi: metoda pripreme 
radne i ispitnih otopina,  
— koncentracija pomo ćnih tvari,  
— popis korištenih koncentracija i sve raspoložive informacije o 
stabilnosti ispitivane kemikalije u ispitnoj otopini u tim 
koncentracijama,  
— ako se provode kemijske analize, primijenjene metode i dobiveni 
rezultati,  
— rezultati grani čnog ispitivanja, ako se provodi,  
— razlozi za odabir ispitnog postupka i pojedinosti tog postupka 
(npr. stati čki, polustati čki, doziranje, brzina protoka, dozra čiva­
nje, količina punjenja itd.),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 936
 
— opis ispitne opreme,  
— režim rasvjete,  
— koncentracije otopljenog kisika, pH vrijednosti i temperature 
ispitnih otopina svaka 24 sata,  
— dokazi da su ispunjeni kriteriji kakvo će, 
— tablica iz koje je vidljiva kumulativna smrtnost pri svakoj 
koncentraciji i u kontroli (i u kontroli s pomo ćnom tvari, ako 
je potrebna) u svakom preporu čenom vremenu promatranja,  
— graf krivulje koncentracija/odgovor na kraju ispitivanja,  
— po mogu ćnosti, vrijednosti LC  50 u svakom preporu čenom 
vremenu promatranja (s granicama pouzdanosti 95 %),  
— statisti čki postupci primijenjeni za odre đivanje vrijednosti LC  50 , 
— ako se koristi referentna tvar, rezultati koji su dobiveni,  
— najviša ispitna koncentracija koja ne izaziva smrtnost u razdoblju 
ispitivanja,  
— najniža ispitna koncentracija koja je izazvala 100 %-tnu smrtnost 
u razdoblju ispitivanja.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985.  
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  – Static and Flow – Through methods – NFT 
90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish ( Brac­
hydanio rerio  Hamilton-Buchanan-Teleostei, Cyprinidae). Part 
1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
 
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden -Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506- Water -Bepaling van de akute toxiciteit met behulp 
van Poecilia reticulata , 1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.  
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grun ­
dlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltc ­
hemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J. T.and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96,99.
 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3,793-821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 
vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634,1977, 65-84.
 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 938
 
Dodatak 1.  
Obrađena voda  
Primjer prikladne vode za razrje đivanje  
Sve kemikalije moraju biti analiti čki čiste. 
Voda treba biti kvalitetna destilirana voda ili deionizirana voda vodljivosti manje 
od 5 μScm  –1 . 
Aparatura za destilaciju vode ne smije sadržavati bakrene dijelove.  
Radne otopine  
CaCl  2 . 2H  2 O (kalcijev klorid dihidrat): 
otopiti u vodi i nadopuniti vodom do 1 litre.  11,76 g  
MgSO  4 . 7H  2 O (magnezijev sulfat heptahidrat): 
otopiti u vodi i nadopuniti vodom do 1 litre.  4,93 g  
NaHCO  3 (natrijev hidrogenkarbonat): 
otopiti u vodi i nadopuniti vodom do 1 litre.  2,59 g  
KCl (kalijev klorid): 
otopiti u vodi i nadopuniti vodom do 1 litre.  0,23 g  
Obrađena voda za razrje đivanje  
Pomiješati po 25 ml svake od četiri radne otopine i nadopuniti vodom do 1 litre.  
Dozračivati dok koncentracija otopljenog kisika ne dosegne vrijednost zasi ćenja 
kisikom.  
pH treba biti 7,8 ± 0,2.  
pH se prema potrebi podešava uz pomo ć NaOH (natrijev hidroksid) ili HCl 
(klorovodi čna kiselina).  
Ovako pripremljena voda za razrje đivanje ostavi se da stoji 12 sati i ne smije se 
više dozra čivati.  
Zbroj iona Ca i Mg u ovoj otopini je 2,5 mmol po litri. Omjer iona Ca i Mg je 
4:1, a iona Na i K je 10:1. Ukupni alkalitet ove otopine je 0,8 mmol po litri.  
Moguća odstupanja u pripremi vode za razrje đivanje ne smiju promijeniti sastav i 
svojstva vode.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 939
 
Dodatak 2.  
Preporučene riblje vrste za ispitivanje  
Preporučene vrste  Preporučeno 
područje ispitnih 
temperatura (°C)  Preporučena 
ukupna dužina 
ispitne životinje 
(cm) 
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) zebrica  20 do 24  3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) debeloglava gaovica  20 do 24  5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) šaran  20 do 24  6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  
Cyprinodontidae (Tomminck i Schlege 1850) medaka
 20 do 24  3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) gupi  20 do 24  3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarc ­
hidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) plavo ­ 
škrga sun čanica  20 do 24  5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) kalifornijska pastrva  12 do 17  6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
neaus 1758) jez  20 do 24  6,0 ± 2,0  
Skupljanje  
Gore navedene ribe su jednostavne za uzgoj i/ili su široko raspoložive tijekom 
čitave godine. One se mogu uzgajati i kultivirati na ribljim farmama ili u labo ­
ratorijskim uvjetima, uz nadzor bolesti i nametnika, kako bi se dobile zdrave ispitne životinje poznatog podrijetla. Ove su ribe raspoložive u mnogim dijelo ­
vima svijeta.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 940
 
Dodatak 3.  
Primjer krivulje koncentracija – postotak smrtnosti  
Primjer odre đivanja LC  50 uz pomoć logaritamskog papira vjerojatnosti
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 941
 
C.2. TEST AKUTNE IMOBILIZACIJE DAPHNIA SP.  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja akutne imobilizacije istovjetna je smjernici 
OECD TG 202 (2004.).  
1.1. UVOD  
U ovoj je metodi opisan test akutne toksi čnosti za ocjenjivanje 
učinaka kemikalija na dafnije. Postoje će ispitne metode korištene 
su u mjeri u kojoj je to bilo mogu će (1)(2)(3).  
1.2. DEFINICIJE  
U kontekstu ove metode koriste se sljede će definicije:  
EC 50 : procijenjena koncentracija koja izaziva nepokretnost 50 % 
dafnija unutar navedenog vremena izlaganja. Ako se koristi druga 
definicija, treba je navesti zajedno s izvorom.  
Nepokretnost:  smatra se da su životinje nepokretne ako nisu 
sposobne plivati unutar 15 sekundi od nježnog mu ćkanja ispitne 
posude (čak i onda ako još uvijek mogu micati antenama).  
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Mlade dafnije, koje su na po četku ispitivanja mla đe od 24 sata, 
izlažu se nizu koncentracija ispitivane tvari u razdoblju od 48 sati. Nepokretnost se bilježi nakon 24 sata i 48 sati i uspore đuje s 
kontrolnim vrijednostima. Rezultati se analiziraju da bi se izra čunao 
EC
 50 nakon 48 sati (za definicije vidjeti odjeljak 1.2.). Odre đivanje 
EC 50 nakon 24 sata je fakultativno.  
1.4. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Treba biti poznata topljivost u vodi i tlak pare ispitivane tvari i biti 
raspoloživa pouzdana analiti čka metoda za kvantifikaciju tvari u 
ispitnim otopinama s dokumentiranim iskorištenjem i granicom odre ­ 
đivanja. Osim toga, korisno je imati informacije o strukturnoj 
formuli, čistoći tvari, stabilnosti u vodi ili na svjetlosti, P  ow i rezul­
tatima ispitivanja na laku biorazgradivost (vidjeti metodu C.4.).  
Napomena: smjernice za ispitivanje tvari koje se teško ispituju zbog 
svojih fizikalno-kemijskih svojstava navode se u (4).  
1.5. REFERENTNA TVAR  
Ispitivanjem referentne tvari na EC  50 može se provjeriti pouzdanost 
ispitnih uvjeta. Za to se preporu čuju toksikanti koji se koriste u 
međunarodnim prstenastim testovima (1)(5) (  1 ). Test(ove) s refe ­
rentnom tvari trebalo bi provoditi po mogu ćnosti svaki mjesec, a 
najmanje dvaput godišnje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 942  
( 1 ) Prema rezultatima tih me đulaboratorijskih ispitivanja i u skladu s tehni čkim ispravkom 
ISO 6341 EC  50 – 24 h kalijevog dikromata (K  2 Cr 2 O 7 ) nalazi se u podru čju između 
0,6 mg/l i 1,7 mg/l.
 1.6. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Da bi ispitivanje bilo valjano, trebaju biti zadovoljeni sljede ći 
provedbeni kriteriji:  
— u kontrolama, uklju čujući kontrolu sa sredstvom za otapanje, ne 
smije biti nepokretno više od 10 % dafnija,  
— koncentracija otopljenog kisika u kontrolnim i ispitnim posudama 
na kraju ispitivanja treba biti ≥ 3 mg/l.  
Napomena: Da bi bio zadovoljen prvi kriterij, nepokretnost i drugi 
znakovi bolesti odnosno stresa, primjerice promjena boje, neobi čno 
ponašanje kao što je zarobljenost na površini vode, ne bi smjeli biti 
vidljivi kod više od 10 % kontrolnih dafnija.  
1.7. OPIS ISPITNE METODE  
1.7.1.  Aparatura  
Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopi ­
nama treba biti u cijelosti izra đena od stakla ili drugog kemijski 
inertnog materijala. Ispitne posude su u pravilu staklene epruvete ili laboratorijske čaše; njih treba o čistiti prije svake uporabe 
primjenom standardnih laboratorijskih postupaka. Ispitne posude 
treba lagano prekriti kako bi se smanjio gubitak vode uslijed ispa ­
ravanja i sprije čio ulazak prašine u otopine. Hlapljive tvari treba 
ispitivati u potpuno napunjenim zatvorenim posudama koje su 
dovoljno velike da razina kisika ne postane ograni čavajuća 
odnosno preniska (vidjeti odjeljak 1.6. i prvi stavak odjeljka 1.8.3.).
 
Osim toga, treba koristiti sljede ću opremu, djelomi čno ili u cijelosti: 
mjerač kisika (s mikroelektrodom ili drugim prikladnim ure đajem za 
mjerenje otopljenog kisika u uzorcima malog volumena); mjera č pH 
vrijednosti; odgovaraju ći uređaj za regulaciju temperature; oprema za 
određivanje koncentracije ukupnog organskog ugljika (TOC); 
oprema za odre đivanje kemijske potrošnje kisika (KPK); oprema 
za određivanje tvrdo će itd.  
1.7.2.  Ispitni organizam  
Daphnia magna  Straus je preferirana ispitna vrsta, iako se u ovom 
testu mogu koristiti i druge prikladne vrste  Daphnia  (npr.  Daphnia 
pulex ). Na početku ispitivanja životinje trebaju biti mla đe od 24 sata; 
da bi se ograni čila varijabilnost, nikako se ne preporu čuje korištenje 
potomstva iz prvog legla. Dafnije trebaju potjecati iz zdravog nasada (tj. ne smiju pokazivati znakove stresa, kao što je visoka smrtnost, 
prisutnost mužjaka i efipija, zakašnjelo davanje prvog potomstva, 
životinje promijenjene boje itd.). Svi organizmi koji se koriste u određenom ispitivanju trebaju potjecati iz kultura dobivenih iz 
istog nasada dafnija. Mati čne životinje treba držati u uzgojnim uvje ­
tima (svjetlost, temperatura, medij) koji su sli čni uvjetima ispitivanja. 
Ako će se u ispitivanju koristiti uzgojni medij koji se ne koristi u 
uobičajenom uzgoju dafnija, treba predvidjeti razdoblje aklimatiza ­
cije uoči ispitivanja. U tu se svrhu uzgojne dafnije prije po četka 
ispitivanja drže u vodi za razrje đivanje na ispitnoj temperaturi 
najmanje 48 sati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 943
 
1.7.3.  Voda za držanje i voda za razrje đivanje  
Prirodna voda (površinska ili podzemna voda), obra đena voda i 
deklorirana voda iz slavine prihvatljive su kao voda za držanje odnosno voda za razrje đivanje ako dafinije u njima mogu preživjeti 
vrijeme trajanja uzgoja, aklimatizacije i ispitivanja bez znakova 
stresa. Prikladna ispitna voda je svaka voda koja ima kemijska svoj ­
stva prihvatljive vode za razrje đivanje iz Dodatka 1. Kakvo ća vode 
mora ostati nepromijenjena u razdoblju ispitivanja. Obra đena se voda 
može pripremiti dodavanjem odre đenih koli čina reagensa priznate 
analitičke čistoće deioniziranoj ili destiliranoj vodi. Primjeri obra đene 
vode navode se u (1)(6) i u Dodatku 2. Valja napomenuti da kod 
ispitivanja tvari koje sadrže metale treba izbjegavati medije koji 
sadrže poznata kelatna sredstva, kao što su mediji M4 i M7 iz Dodatka 2. pH vrijednost treba biti u podru čju od 6 do 9. Za 
vrstu  Daphnia magna  preporučuje se tvrdo ća između 140 i 250 mg/l 
(kao CaCO
 3 ), dok kod drugih vrsta  Daphnia  može biti prikladna i 
manja tvrdo ća. Voda za razrje đivanje se prije uporabe u ispitivanju 
može dozra čivati dok koncentracija otopljenog kisika ne dosegne 
točku zasićenja.  
Ako se koristi prirodna voda, parametre kakvo će treba mjeriti 
najmanje dvaput godišnje odnosno svaki put kad se posumnja da 
su se ta svojstva zna čajno promijenila (vidjeti prethodni stavak i 
Dodatak 1.). Osim toga, treba obavljati mjerenja teških metala (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Ako se koristi deklorirana voda iz slavine, poželjna je dnevna analiza klora. Ako se voda za razrje đi­
vanje uzima iz izvora površinske ili podzemne vode, treba mjeriti 
vodljivost i ukupni organski ugljik (TOC) odnosno kemijsku potro ­ 
šnju kisika (KPK).
 
1.7.4.  Ispitne otopine  
Ispitne otopine odabranih koncentracija obi čno se pripremaju razrje ­ 
đivanjem radne otopine. Radne otopine treba po mogu ćnosti pripre ­
miti otapanjem ispitivane tvari u vodi za razrje đivanje. Uporabu 
otapala, emulgatora i dispergenata treba što je mogu će više izbjega ­
vati. Ipak, takvi su spojevi u odre đenim slučajevima nužni da bi se 
dobila prikladna koncentracija radne otopine. Smjernice za prikladna otapala, emulgatore i dispergente navode se u (4). U svakom slu čaju, 
ispitivana tvar u ispitnim otopinama ne smije prije ći granicu toplji ­
vosti u vodi za razrje đivanje.
 
Ispitivanje treba provesti bez podešavanja pH vrijednosti. Ako pH ne 
ostane u podru čju 6 – 9, treba provesti drugo ispitivanje i pritom pH 
vrijednost radne otopine podesiti na pH vode za razrje đivanje prije 
dodavanja ispitne tvari. Podešavanje pH treba obaviti na na čin da ne 
dođe do značajne promjene koncentracije radne otopine i da se ne 
izazove kemijska reakcija ili taloženje ispitivane tvari. Prednost se 
daje HCl i NaOH.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 944
 
1.8. POSTUPAK  
1.8.1.  Uvjeti izlaganja  
1.8.1.1.  Ispitne skupine i kontrole  
Ispitne posude se napune odgovaraju ćom količinom vode za razrje ­ 
đivanje i otopina ispitivane tvari. Omjer volumena zraka i vode u 
posudama u ispitnoj i kontrolnoj skupini treba biti jednak. Nakon toga se dafnije stavljaju u ispitne posude. Treba upotrijebiti najmanje 20 životinja po ispitnoj koncentraciji i za kontrole, po mogu ćnosti 
podijeljenih u četiri skupine po pet životinja. Potrebno je najmanje 
2 ml ispitne otopine po životinji (tj. 10 ml za pet dafnija po ispitnoj posudi). Ako koncentracija ispitivane tvari nije stabilna, ispitivanje se može provesti uz pomo ć polustati čkog sustava s obnavljanjem ili 
protočnog sustava.
 
Uz ispitni niz treba ispitati jedan kontrolni niz s vodom za razrje đi­
vanje te, prema potrebi, jedan kontrolni niz sa sredstvom za otapanje.  
1.8.1.2.  Ispitne koncentracije  
Ako nisu raspoloživi podaci o toksi čnosti ispitivane tvari, može se 
provesti preliminarno ispitivanje kako bi se odredio raspon koncen ­
tracija za glavno ispitivanje. U tu se svrhu dafnije izlože nizu koncentracija ispitivane tvari s velikim razmakom izme đu koncen ­
tracija. Svakoj ispitnoj koncentraciji treba izložiti 5 dafnija u trajanju 
od 48 sati ili manje, a ponavljanja nisu potrebna. Vrijeme izlaganja se može skratiti (npr. 24 sata ili manje) ako se prikladni podaci za određivanje raspona mogu dobiti u kra ćem vremenu.
 
Treba koristiti najmanje pet ispitnih koncentracija. Koncentracije 
trebaju biti raspore đene u geometrijskom nizu uz faktor koji po 
mogućnosti nije viši od 2,2. Ako se koristi manje od pet koncen ­
tracija, treba navesti obrazloženje. Poželjno je da se pri najvišoj 
ispitanoj koncentraciji postigne 100 %-tna nepokretnost i da najniža ispitana koncentracija ne pokaže vidljiv u činak.
 
1.8.1.3.  Uvjeti inkubacije  
Temperatura treba biti u podru čju između 18 °C i 22 °C i tijekom 
jednog ispitivanja ne smije odstupati više od ± 1 °C. Preporu čuje se 
ciklus od 16 sati svjetlosti i 8 sati tame. Prihvatljiva je i potpuna 
tama, posebno ako je ispitivana tvar nestabilna na svjetlosti.  
Ispitne posude se tijekom ispitivanja ne smiju dozra čivati. Ispitivanje 
se obavlja bez podešavanja pH. Dafnije se za vrijeme ispitivanja ne 
smiju hraniti.  
1.8.1.4.  Trajanje  
Ispitivanje traje 48 sati.  
1.8.2.  Promatranja  
Svaku ispitnu posudu treba provjeriti na prisutnost nepokretnih 
dafnija 24 i 48 sati nakon po četka ispitivanja (za definicije vidjeti 
odjeljak 1.2.). Osim nepokretnosti, treba navesti svako neuobi čajeno 
ponašanje ili izgled.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 945
 
1.8.3.  Analiti čka mjerenja  
Otopljeni kisik i pH mjere se na po četku i kraju ispitivanja u kontroli 
odnosno kontrolama te u najvišoj koncentraciji ispitivane tvari. Koncentracija otopljenog kisika u kontrolama mora zadovoljavati 
kriterij valjanosti (vidjeti odjeljak 1.6.). U pravilu, pH tijekom 
jednog ispitivanja ne bi smio odstupati više od 1,5 jedinica. Temperatura se obi čno mjeri u kontrolnim posudama ili u 
okolnom zraku i treba je po mogu ćnosti neprekidno bilježiti za 
vrijeme ispitivanja, a barem na po četku i kraju ispitivanja.
 
Koncentraciju ispitivane tvari treba mjeriti barem u najnižoj i 
najvišoj ispitnoj koncentraciji na po četku i kraju ispitivanja (4). 
Preporučuje se da se rezultati temelje na izmjerenim koncentraci ­
jama. Ipak, ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane tvari tijekom ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavaju ći način 
održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene po četne koncen ­
tracije, rezultati se mogu temeljiti i na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima.
 
1.9. GRANI ČNO ISPITIVANJE  
Granično se ispitivanje može provesti sa 100 mg/l ispitivane tvari ili 
do granice topljivosti ispitivane tvari u ispitnom mediju (ovisno o 
tome što je manje) primjenom postupaka opisanih u ovoj metodi da bi se dokazalo da je EC
 50 viši od te koncentracije. Grani čno ispiti­
vanje treba provesti na 20 dafnija (po mogu ćnosti podijeljenih u 
četiri skupine po pet) uz isti broj životinja u kontroli odnosno 
kontrolama. Kod pojave nepokretnosti treba provesti potpuno istra ­ 
živanje. Treba zabilježiti svako uo čeno neuobi čajeno ponašanje.  
2. PODACI  
Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku, navode ći za svaku 
ispitnu skupinu i kontrolu broj dafnija koji je korišten i nepokretnost pri svakom promatranju. Postotak nepokretnih životinja nakon 24 i 48 sati se grafi čki prikaže u ovisnosti o ispitnim koncentracijama. 
Podaci se analiziraju odgovaraju ćim statisti čkim metodama (npr. 
analiza vjerojatnosti itd.) kako bi se mogli izra čunati nagibi krivulja 
i EC
 50 s granicama pouzdanosti 95 % (p = 0,05) (7)(8).  
Ako se na dobivene podatke na mogu primijeniti standardne metode 
za izračunavanje EC  50 , treba koristiti najvišu koncentraciju koja ne 
izaziva nepokretnost i najnižu koncentraciju koja izaziva 100 %-tnu nepokretnost kao aproksimaciju za EC
 50 (koji se smatra geometrij ­
skom sredinom tih dviju koncentracija).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će: 
ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 946
 
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući čistoću. 
Ispitna vrsta:  
— izvor i vrsta  Daphnia , izvorni dobavlja č (ako je poznat) i uvjeti 
uzgoja (uklju čujući izvor, vrstu i koli činu hrane, u čestalost 
hranjenja).  
Ispitni uvjeti:  
— opis ispitnih posuda: vrsta posuda, volumen otopine, broj dafnija 
po ispitnoj posudi, broj ispitnih posuda (ponavljanja) po koncentraciji,
 
— metode pripreme radnih i ispitnih otopina, uklju čujući korištenje 
otapala i dispergenata, upotrijebljene koncentracije,  
— podaci o vodi za razrje đivanje: izvor i zna čajke kakvo će (pH, 
tvrdoća, omjer Ca/Mg, omjer Na/K, alkalitet, vodljivost itd.); 
sastav obra đene vode (ako se koristi),  
— uvjeti inkubacije: temperatura, intenzitet svjetlosti i ciklusi, 
otopljeni kisik, pH itd.  
Rezultati:  
— broj i postotak dafnija koje su postale nepokretne odnosno poka ­
zuju bilo kakve štetne u činke (uklju čujući neuobičajeno ponaša ­
nje) u kontrolama i svim ispitnim skupinama u svakom vremenu promatranja i priroda zapaženih u činaka,
 
— rezultati i datum ispitivanja s referentnom tvari, ako su raspolo ­ 
živi, 
— nazivne ispitne koncentracije i rezultat svih analiza za odre đi­
vanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnim posudama; 
također treba navesti iskorištenje metode i granicu odre đivanja,  
— sva fizikalno-kemijska mjerenja temperature, pH i otopljenog 
kisika tijekom ispitivanja,  
— EC  50 za nepokretnost nakon 48 sati s intervalima pouzdanosti i 
grafovima prilago đenog modela koji je korišten za izra čun, 
nagibi krivulja doza-odgovor i njihova standardna greška; stati ­
stički postupci primijenjeni za odre đivanje EC  50 ; (ove podatke 
treba navesti i za nepokretnost nakon 24 sata, ako se mjeri),  
— objašnjenje svakog odstupanja od ispitne metode i je li ono 
utjecalo na rezultate.  
4. REFERENCE  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No 23. 
Paris 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia.
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American 
Society for Testing and Materials. str. 65-84.
 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 948
 
Dodatak 1.  
NEKA KEMIJSKA SVOJSTVA PRIHVATLJIVE VODE ZA 
RAZRJE ĐIVANJE  
Tvar  Koncentracija  
Lebdeće čestice  < 20 mg/l  
Ukupni organski ugljik  < 2 mg/l  
Neionizirani amonijak  < 1 μg/l 
Rezidualni klor  < 10 μg/l 
Ukupni organofosforni pesticidi  < 50 ng/l  
Ukupni organoklorni pesticidi plus poliklorirani bifenili  < 50 ng/l  
Ukupni organski klor  < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 949
 
Dodatak 2.  
PRIMJERI PRIKLADNE OBRA ĐENE ISPITNE VODE  
Ispitna voda ISO (1)  
Radne otopine (pojedina čna tvar)  Za pripremu obra đene vode u 1 
litru vode (*) treba dodati 
sljedeće količine radnih 
otopina  Tvar  Količina koja se dodaje u 
1 litru vode (*)  
Kalcijev klorid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g  25 ml  
Magnezijev sulfat 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g  25 ml  
Natrijev bikarbonat 
NaHCO  3 2,59 g  25 ml  
Kalijev klorid 
KCl 0,23 g  25 ml  
(*) Voda prikladne čistoće npr. deionizirana, destilirana ili pro čišćena obrnutom osmozom, 
čija vodljivost po mogu ćnosti ne prelazi 10 μS.cm  –1 . 
Medij Elendt M7 i M4  
Aklimatizacija na medij Elendt M7 i M4  
Neki su laboratoriji imali problema s izravnim prenošenjem dafnija u medije M 4 
i M7. Ipak, odre đeni je uspjeh postignut s postupnom aklimatizacijom tj. premje ­ 
štanjem iz vlastitog medija u 30 %-tni Elendt, zatim u 60 %-tni Elendt i zatim u 100 %-tni Elendt. Ponekad je potrebno razdoblje aklimatizacije i do jednog mjeseca.
 
Priprema  
Element u tragovima  
Najprije se pripreme odvojene radne otopine (I) pojedinih elemenata u tragovima 
u vodi prikladne čistoće npr. deionizirana, destilirana ili pro čišćena obrnutom 
osmozom. Iz tih razli čitih radnih otopina (I) pripremi se druga pojedina čna 
radna otopina (II) koja sadrži sve elemente u tragovima (kombinirana otopina) tj.:  
Radna(-e) otopina(-e) I 
(pojedina čna tvar)  Količina koja se dodaje 
u vodu (mg/l)  Koncentracija (u odnosu 
na medij M4)  Za pripremu kombinirane radne otopine II u vodu 
treba dodati sljede ću količinu radne otopine I 
(ml/l)  
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190  20000-struko  1,0  0,25  
MnCl  2 .4H  2 O 7 210  20000-struko  1,0  0,25  
LiCl 6 120  20000-struko  1,0  0,25  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 950
 
Radna(-e) otopina(-e) I 
(pojedina čna tvar)  Količina koja se dodaje 
u vodu (mg/l)  Koncentracija (u odnosu 
na medij M4)  Za pripremu kombinirane radne otopine II u vodu 
treba dodati sljede ću količinu radne otopine I 
(ml/l)  
M4 M7  
RbCl  1 420  20000-struko  1,0  0,25  
SrCl  2 .6H  2 O 3 040  20000-struko  1,0  0,25  
NaBr  320  20000-struko  1,0  0,25  
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230  20000-struko  1,0  0,25  
CuCl  2 .2H  2 O 335  20000-struko  1,0  0,25  
ZnCl  2 260 20000-struko  1,0  1,0  
CoCl  2 .6H  2 O 200  20000-struko  1,0  1,0  
Kl 65  20000-struko  1,0  1,0  
Na 2 SeO  3 43,8 20000-struko  1,0  1,0  
NH  4 VO  3 11,5 20000-struko  1,0  1,0  
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000  2000-struko  —  —  
FeSO  4 .7H  2 O 1 991  2000-struko  —  —  
Otopine Na 2 EDTA i FeSO  4 pripreme se odvojeno, sjedine i odmah obrade u autoklavu.  
Pritom nastaje:  
2 l otopine Fe-EDTA  1000-struko  20,0  5,0  
Medij M4 i M7  
Mediji M4 i M7 pripremaju se pomo ću radne otopine II, makronutrijenata i 
vitamina na sljede ći način: 
Količina koja se dodaje 
u vodu (mg/l)  Koncentracija (u odnosu 
na medij M4)  Količina radne otopine II koja se dodaje kod 
pripreme medija (ml/l)  
M4 M7  
Radna otopina II (kombi ­
nirani elementi u trago ­
vima)  20-struko  50  50  
Radne otopine makronutri ­
jenata (pojedina čna tvar)  
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800  1000-struko  1,0  1,0  
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600  2000-struko  0,5  0,5  
KCl 58 000  10000-struko  0,1  0,1  
NaHCO  3 64 800  1000-struko  1,0  1,0  
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000  5000-struko  0,2  0,2  
NaNO  3 2 740  10000-struko  0,1  0,1  
KH  2 PO 4 1 430  10000-struko  0,1  0,1  
K 2 HPO  4 1 840  10000-struko  0,1  0,1  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 951
 
Količina koja se dodaje 
u vodu (mg/l)  Koncentracija (u odnosu 
na medij M4)  Količina radne otopine II koja se dodaje kod 
pripreme medija (ml/l)  
M4 M7  
Kombinirana vitaminska 
radna otopina  — 10000-struko  0,1  0,1  
Kombinirana vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem 3 vitamina u 1 litru vode, kako je ovdje prikazano:  
Tiamin-hidroklorid  750  10000-struko  
Cijanokobalamin (B  12 ) 10  10000-struko  
Biotin  7,5  10000-struko  
Kombinirana vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima. 
Vitamini se dodaju u medij neposredno prije uporabe.  
N.B.: Da bi se izbjeglo taloženje soli kod pripreme kompletnog medija, 
alikvote radnih otopina treba dodati u oko 500 – 800 ml deionizirane 
vode i zatim nadopuniti do 1 litre.  
N.B.: Medij M4 prvi se puta navodi u Elendt, B. P. (1990). Selenium defi ­
ciency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in  
Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 952
 
C.3. TEST INHIBICIJE RASTA SLATKOVODNIH ALGI I 
CIJANOBAKTERIJA  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 201 (2006.) (1.).  
1.1. UVOD  
Ispitne metode se periodicki preispituju i ažuriraju u svjetlu znan ­
stvenoga napretka. Ispitnu metodu C.3. bilo je potrebno revidirati kako bi se ukljucile još neke vrste i ispunili zahtjevi ocjenjivanja opasnosti i razvrstavanja kemikalija. Revizija je provedena na 
temelju širokog prakticnog iskustva, znanstvenog napretka u 
podrucju toksikoloških istraživanja s algama i široke regulatorne primjene koja je uslijedila nakon njezinoga donošenja.
 
1.2. DEFINICIJE  
Za potrebe ove ispitne metode koriste se sljedece definicije i 
skracenice:  
Biomasa : je suha masa žive tvari u populaciji izražena u odnosu na 
dani volumen; npr. mg algi/l ispitne tekucine. „Biomasa” se obicno 
definira kao masa, ali se u ovom testu izraz „biomasa” odnosi na masu po volumenu. Osim toga, u ovom se testu u pravilu mjere i zamjenski parametri biomase, kao što je broj stanica, fluorescencija 
itd., pa se izraz „biomasa” odnosi i na te zamjenske mjere.
 
Koeficijent varijacije : je bezdimenzionalna mjera varijabilnosti 
parametra, definirana kao omjer standardne devijacije i srednje 
vrijednosti. On se može izraziti i kao postotak. Srednji koeficijent varijacije prosjecne specificne brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura izracunava se na sljedeci nacin:
 
1. Izracuna se postotak koeficijenta varijacije (KV) prosjecne speci ­
ficne brzine rasta iz dnevnih/etapnih brzina rasta za odgovarajuce ponavljanje.
 
2. Izracuna se srednja vrijednost svih izracunanih vrijednosti iz 
tocke 1. kako bi se dobio srednji koeficijent varijacije dnevne/ 
etapne specificne brzine rasta u ponavljanjima kontrolnih kultura.  
EC x : je koncentracija ispitivane tvari otopljene u ispitnom mediju 
koja rezultira x %-tnim (npr. 50 %) smanjenjem rasta ispitnog organ ­
izma unutar navedenoga razdoblja izlaganja (koje treba izricito navesti ako odstupa od punog ili uobicajenog trajanja ispitivanja). Da bi se nedvosmisleno pokazalo je li vrijednost EC dobivena iz 
brzine rasta („growth rate”) ili iz prirasta („yield”) koriste se simboli 
„E
 r C” i „E  y C”. 
Uzgojni medij : je kompletan sinteticki medij kulture u kojemu ispi ­
tivane alge rastu kad se izlože ispitivanoj tvari. Ispitivana se tvar u pravilu otapa u ispitnom mediju.
 
Brzina rasta (prosjecna specificna brzina rasta) : je logaritamsko 
povecanje biomase u razdoblju izlaganja.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 953
 
Najniža koncentracija s vidljivim ucinkom (LOEC) : je najniža 
ispitana koncentracija kod koje je unutar odredenog razdoblja izla ­
ganja zapažen statisticki znacajan negativni ucinak tvari na rast (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom. Ipak, sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili veci štetan ucinak od onoga 
koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova dva uvjeta ne mogu 
zadovoljiti, treba detaljno objasniti kako je odabran LOEC (a prema tomu i NOEC).
 
Najviša koncentracija bez vidljivog ucinka (NOEC) : je ispitna 
koncentracija neposredno ispod LOEC-a.  
Varijabla odgovora : je varijabla za procjenu toksicnosti izvedena iz 
bilo kojeg mjerenog parametra koji opisuje biomasu primjenom 
razlicitih racunskih metoda. Kod ove metode brzina rasta i prirast 
su varijable odgovora dobivene izravnim mjerenjem biomase ili bilo kojeg navedenog zamjenskog parametra.
 
Specificna brzina rasta : je varijabla odgovora definirana kao kvoci ­
jent razlike prirodnih logaritama promatranog parametra (kod ove 
ispitne metode biomasa) i odgovarajuceg vremenskog razdoblja.  
Prirast : je vrijednost mjerne varijable na kraju razdoblja izlaganja 
umanjena za vrijednost mjerne varijable na pocetku razdoblja izlaga ­
nja, kojom se izražava povecanje biomase tijekom ispitivanja.  
1.3. PRIMJENJIVOST TESTA  
Ova se metoda najlakše primijenjuje kod tvari topljivih u vodi za 
koje se može pretpostaviti da ce u ispitnim uvjetima ostati u vodi. Opisani postupak ponekad je potrebno izmijeniti (npr. zatvoreni sustav, kondicioniranje ispitnih posuda) kad se ispituju tvari koje 
su hlapljive, jako adsorptivne, obojene, slabo topljive u vodi i 
tvari koje mogu utjecati na raspoloživost nutrijenata ili minerala u ispitnom mediju. Smjernice za neke izmjene mogu se pronaci u literaturi pod 2., 3. i 4.
 
1.4. NACELO ISPITIVANJA  
Svrha je ispitivanja odrediti ucinke tvari na rast slatkovodnih 
mikroalgi i/ili cijanobakterija. Eksponencijalno rastuci ispitni organ ­
izmi izlažu se ispitivanoj tvari u šaržnim kulturama, u pravilu 
tijekom 72 sata. Unatoc relativno kratkom trajanju ispitivanja mogu se ocijeniti ucinci na nekoliko generacija.
 
Odgovor sustava sastoji se u smanjenju rasta niza kultura algi 
(ispitne jedinice) koje su izložene razlicitim koncentracijama ispiti ­
vane tvari. Odgovor se ocjenjuje kao funkcija koncentracije izlaganja 
u odnosu na prosjecni rast neizloženih kontrolnih kultura. Da bi se u 
punoj mjeri izrazila reakcija sustava na toksicne ucinke (optimalna osjetljivost), kulturama treba prije mjerenja smanjenja specificne brzine rasta ostaviti dovoljno vremena da postignu neograniceni 
eksponencijalni rast, uz dovoljno nutrijenata i neprekidno 
osvjetljenje.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 954
 
Rast i inhibicija rasta kvantificiraju se mjerenjima biomase algi u 
ovisnosti o vremenu. Biomasa algi definirana je kao suha masa po 
volumenu, npr. mg algi/l ispitne otopine. Ipak, suhu je masu teško mjeriti pa se stoga koriste zamjenski parametri. Od zamjenskih para ­
metara najcešce se koristi broj stanica. Ostali zamjenski parametri su 
volumen stanica, fluorescencija, opticka gustoca itd. Mora biti poznat 
faktor pretvorbe za prevodenje izmjerenih zamjenskih parametara u biomasu.
 
Krajnja tocka ispitivanja je inhibicija rasta, izražena kao logari ­
tamsko povecanje biomase (prosjecna specificna brzina rasta) u 
razdoblju izlaganja. Iz prosjecnih specificnih brzina rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina odreduje se koncentracija koja izaziva odre ­
deno x %-tno smanjenje brzine rasta (npr. 50 %), koja se izražava 
kao E
 r C x (npr. E  r C 50 ). 
Da bi se ova ispitna metoda mogla primijeniti unutar regulatornog 
okvira EU-a, izracun rezultata se zbog navedenih u odjeljku 2.2. u 
nastavku mora temeljiti na prosjecnoj specificnoj brzini rasta. U ovoj 
se ispitnoj metodi koristi i dodatna varijabla odgovora, prirast, koja je potrebna da bi se ispunili odredeni regulatorni zahtjevi u nekim državama. Prirast se definira kao biomasa na kraju razdoblja izla ­
ganja umanjena za biomasu na pocetku razdoblja izlaganja. Iz 
prirasta zabilježenog u nizu ispitnih otopina izracunava se koncen ­
tracija koja izaziva odredeno x %-tno smanjenje prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao E
 y C x (npr. E  y C 50 ). 
Osim toga, može se statisticki odrediti najniža koncentracija s 
vidljivim ucinkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog ucinka (NOEC).
 
1.5. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Za odredivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispiti ­
vanoj tvari kao što su strukturna formula, cistoca, stabilnost na svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, svojstva apsorpcije svjet ­
losti, pKa i rezultati istraživanja pretvorbe, ukljucujuci biorazgradi ­
vost u vodi.
 
Treba biti poznata topljivost u vodi, podjelni koeficijent oktanol/voda 
(P ow ) i tlak pare ispitivane tvari te biti raspoloživa validirana metoda 
za kvantifikaciju tvari u ispitnim otopinama s dokumentiranim isko ­
rištenjem i granicom detekcije.  
1.6. REFERENTNA TVAR  
Jedna ili više referentnih tvari (npr. 3,5-diklorfenol korišten u medu ­
narodnom prstenastom testu (4.)) mogu se ispitati za provjeru ispitnog postupka. Kao referentna tvar za zelene alge može se kori ­
stiti i kalijev dikromat. Poželjno je da se referentna tvar ispita 
najmanje dvaput godišnje.
 
1.7. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, ono mora ispuniti sljedece kriterije:  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 955
 
— Biomasa u kontrolnim kulturama mora se eksponencijalno pove ­
cati barem za faktor 16 u razdoblju ispitivanja od 72 sata. To 
odgovara specificnoj brzini rasta od 0,92 dan  –1 . Kod vrsta koje 
se najcešce koriste brzina rasta je uglavnom znatno viša (vidi Dodatak 1.). Ovaj kriterij možda nece biti zadovoljen ako se 
koriste vrste koje rastu sporije od onih koje su navedene u 
Dodatku 1. U tom slucaju razdoblje ispitivanja treba produžiti koliko je potrebno da se u kontrolnim kulturama dobije barem 16-struki rast, uz eskponencijalni rast tijekom cjelokupnog 
razdoblja ispitivanja. Razdoblje ispitivanja može se skratiti na 
najmanje 48 sati da bi se održao neograniceni eksponencijalni rast tijekom ispitivanja, pod uvjetom da je postignut minimalni faktor povecanja 16.
 
— Srednji koeficijent varijacije etapnih specificnih brzina rasta (dan 
0 – 1, 1 – 2, 2 – 3, za ispitivanje koje traje 72 sata) u kontrolnim 
kulturama (vidi odjeljak 1.2. „koeficijent varijacije”) ne smije biti viši od 35 %. Za izracunavanje etapne specificne brzine rasta vidi odjeljak 2.2.1. stavak 2. Ovaj kriterij vrijedi za srednju vrijednost 
koeficijenata varijacije izracunanih za ponavljanja kontrolnih 
kultura.
 
— Kod ispitivanja s vrstama  Pseudokirchneriella subcapitata  i 
Desmodesmus subspicatus  koeficijent varijacije prosjecnih speci ­
ficnih brzina rasta u ponavljanjima s kontrolnim kulturama 
tijekom ukupnog razdoblja ispitivanja ne smije biti viši od 
7 %. Kod ostalih ispitnih vrsta koje se rjede koriste ta vrijednost ne smije biti viša od 10 %.
 
1.8. OPIS METODE  
1.8.1.  Aparatura  
Ispitne posude i ostala aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopi ­
nama mora biti u cijelosti izradena od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Aparaturu treba temeljito oprati kako organski i anorganski onecišcivaci ne bi utjecali na rast algi ili na sastav 
ispitnih otopina.
 
Ispitne posude su u pravilu staklene tikvice dovoljnih dimenzija da 
se osigura potreban volumen kulture za mjerenja tijekom ispitivanja i dovoljan prijenos mase CO
 2 iz atmosfere (vidi odjeljak 1.8.9. stavak 
2.). Volumen tekucine mora biti dovoljan za analiticka odredivanja 
(vidi odjeljak 1.8.1.1. stavak 5.).  
Osim toga, potrebna je sljedeca oprema odnosno dijelovi opreme:  
— Inkubator za uzgoj: preporucuje se ormar ili komora u kojoj se 
može održavati odabrana temperatura inkubacije u granicama ± 2 °C.
 
— Instrumenti za mjerenje svjetlosti: važno je napomenuti da 
metoda koja se koristi za mjerenje intenziteta svjetlosti, a 
posebno vrsta prijamnika (senzora), može utjecati na mjernu 
vrijednost. Mjerenja po mogucnosti treba provoditi uz pomoc sfericnog prijamnika (4 p) (koji reagira na izravnu i reflektiranu svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) ili prijam ­
nika 2 p (koji reagira na svjetlost iz svih kutova iznad mjerne 
ravnine).
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 956
 
— Aparatura za odredivanje biomase algi. Broj stanica, najcešce 
korišteni zamjenski parametar za biomasu algi, može se odrediti 
pomocu elektronicnog brojaca cestica, mikroskopa s komorom za brojenje ili protocnog citometra. Ostali se zamjenski parametri za biomasu mogu mjeriti pomocu protocnog citometra, fluorimetra, 
spektrofotometra i kolorimetra. Korisno je izracunati faktor pret ­
vorbe broj stanica – suha masa. Da bi se kod mjerenja spektro ­
fotometrom dobile upotrebive mjerne vrijednosti pri niskim koncentracijama biomase, ponekad je potrebno upotrijebiti 
kivete s putom svjetlosti od najmanje 4 cm.
 
1.8.2.  Ispitni organizmi  
Može se koristiti nekoliko vrsta slobodno plivajucih mikroalgi i 
cijanobakterija. Za sojeve navedene u Dodatku 1. dokazano je da 
su prikladni za ispitni postupak iz ove ispitne metode.  
Ako se koriste druge vrste, treba navesti soj i/ili podrijetlo. Treba se 
uvjeriti da se eksponencijalni rast odabranih ispitnih algi može održati u odgovarajucim ispitnim uvjetima tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja.
 
1.8.3.  Uzgojni medij  
Preporucuju se dva alternativna uzgojna medija, OECD i AAP. 
Sastav tih medija prikazan je u Dodatku 2. Valja napomenuti da ta 
dva medija imaju razlicitu pocetnu pH vrijednost i puferski kapacitet 
(za regulaciju povecanja pH vrijednosti). Stoga se kod ispitivanja mogu dobiti razliciti rezultati ovisno o mediju koji se koristi, posebno kad se ispituju ionizirajuce tvari.
 
U odredenim je slucajevima potrebno izmijeniti uzgojni medij npr. 
kad se ispituju metali i kelatna sredstva ili kad se ispitivanje provodi 
s razlicitim pH vrijednostima. Korištenje izmijenjenog medija treba 
detaljno opisati i obrazložiti (3.) (4.).  
1.8.4.  Pocetna koncentracija biomase  
Pocetna biomasa mora biti jednaka u svim ispitnim kulturama i mora 
biti dovoljno niska da se može postici eksponencijalni rast tijekom citavog razdoblja inkubacije bez bojazni da bi se mogle iscrpiti zalihe nutrijenata. Pocetna biomasa ne smije biti viša od 0,5 mg/l 
suhe mase. Preporucuju se sljedece pocetne koncentracije stanica:  
Pseudokirchneriella subcapitata
 5 × 10  3 –10  4 stanica/ml  
Desmodesmus subspicatus  2 5 × 10  3 stanica/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 stanica/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 stanica/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 stanica/ml  
1.8.5.  Koncentracije ispitivane tvari  
Raspon koncentracija u kojemu se mogu ocekivati ucinci tvari može 
se odrediti na temelju rezultata ispitivanja za odredivanje raspona. Za 
konacno, glavno ispitivanje treba odabrati najmanje pet koncentracija 
rasporedenih u geometrijskom nizu uz faktor do najviše 3,2. Kod ispitivanih tvari cija je krivulja koncentracija-odgovor ravna ponekad je opravdano koristiti viši faktor. Niz koncentracija treba po moguc ­
nosti obuhvatiti podrucje u kojemu se javlja inhibicija rasta algi od 5 
– 75 %.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 957
 
1.8.6.  Ponavljanja i kontrole  
U planu ispitivanja treba predvidjeti po tri ponavljanja pri svakoj 
ispitnoj koncentraciji. Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispi ­
tivanja se može promijeniti tako da se poveca broj koncentracija i 
smanji broj ponavljanja po koncentraciji. Broj kontrolnih ponavljanja 
mora biti najmanje tri, a u idealnom slucaju dvostruko veci od broja ponavljanja za svaku ispitnu koncentraciju.
 
Za analiticka odredivanja koncentracija ispitivane tvar može se 
pripremiti zaseban niz ispitnih otopina (vidi stavke 4. i 6. u odjeljku 1.8.11.).
 
Ako se za otapanje ispitivane tvari koristi otapalo, treba predvidjeti 
dodatne kontrole koje sadrže istu koncentraciju otapala kao ispitne kulture.
 
1.8.7.  Priprema kulture inokuluma  
Kulturu inokuluma u ispitnom mediju treba pripremiti 2 – 4 dana 
prije pocetka ispitivanja kako bi se ispitne alge prilagodile uvjetima 
ispitivanja i bile u fazi eksponencijalnog rasta u trenutku kad se koriste za inokulaciju ispitnih otopina. Biomasu algi treba podesiti tako da kultura inokuluma može eksponencijalno rasti do pocetka 
ispitivanja. Kulturu inokuluma treba inkubirati u istim uvjetima kao 
ispitne kulture. Mjerenjem povecanja biomase u kulturi inokuluma treba se uvjeriti da je rast u granicama normale za ispitivani soj u uvjetima uzgoja. Primjer postupka uzgoja kulture algi opisan je u 
Dodatku 3. Ponekad treba provesti još jedan korak razmnožavanja 
kulture inokuluma da bi se izbjegla istotobna dijeljenja stanica za vrijeme ispitivanja.
 
1.8.8.  Priprema ispitnih otopina  
Sve ispitne otopine moraju sadržavati istu koncentraciju uzgojnog 
medija i istu pocetnu biomasu ispitnih algi. Ispitne otopine odabranih 
koncentracija uglavnom se pripremaju miješanjem radne otopine ispitivane tvari s uzgojnim medijem i kulturom inokuluma. Radne otopine se u pravilu pripremaju otapanjem tvari u ispitnom mediju.
 
Ako je ispitivana tvar slabo topljiva u vodi, kao nosaci za dodavanje 
tvari u ispitni medij mogu se koristiti otapala npr. aceton, t-butil alkohol i dimetilformamid (2.) (3.). Koncentracija otapala ne smije 
biti viša od 100 μm/l i mora biti jednaka u svim kulturama u 
ispitnom nizu (ukljucujuci kontrole).
 
1.8.9.  Inkubacija  
Ispitne se posude zacepe zrakopropusnim cepovima. Posude se 
protresu i stave u inkubator za uzgoj. Alge se tijekom ispitivanja moraju držati u suspenziji kako bi se pospiješio prijenos CO
 2 . To se 
postiže stalnim tresenjem ili miješanjem. Kulture treba držati na 
temperaturi u podrucju od 21 do 24 °C uz toleranciju ± 2 °C. Kod vrsta koje nisu navedene u Dodatku 1., npr. tropske vrste, mogu biti primjerene više temperature, pod uvjetom da se mogu 
ispuniti kriteriji valjanosti. Preporucuje se da se tikvice nasumicno 
rasporede u inkubatoru i svakodnevno razmještaju po inkubatoru.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 958
pH vrijednost kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se 
povecati za više od 1,5 jedinica. Kod metala i spojeva koji djelo ­
micno ioniziraju pri pH vrijednostima oko ispitne vrijednosti ponekad je nužno ograniciti pomak pH vrijednosti kako bi se dobili obnovljivi i dobro definirani rezultati. Pomak od < 0,5 pH 
jedinica je tehnicki izvediv i može se postici osiguravanjem odgo ­
varajuceg prijenosa mase CO
 2 iz okolnog zraka u ispitnu otopinu, 
npr. povecanjem brzine tresenja. Druga je mogucnost da se smanji potrošnja CO
 2 smanjenjem pocetne biomase ili trajanja ispitivanja.  
Na površini gdje se kulture inkubiraju treba osigurati neprekidnu i 
ravnomjernu fluorescentnu rasvjetu npr. tipa „cool white” (hladnobi ­
jela) ili „daylight” (dnevno svjetlo). Razliciti sojevi algi i cijanobak ­
terija imaju razlicite potrebe za svjetlošcu. Intenzitet svjetlosti treba prilagoditi ispitnim organizmima. Intenzitet svjetlosti na razini ispitnih otopina za preporucene vrste zelenih algi treba odabrati 
unutar podrucju od 60 – 120 μE·m
 –2 ·s –1 , mjereno u fotosinteticki 
ucinkovitom spektralnom podrucju od 400 do 700 nm primjenom odgovarajuceg prijemnika. Neke vrste, posebno  Anabena flos-aquae , 
rastu dobro na svjetlosti slabijeg intenziteta i jaka ih svjetlost može 
oštetiti. Kod tih vrsta treba odabrati prosjecni intenzitet svjetlosti u 
podrucju od 40 – 60 μE·m
 –2 ·s –1 . (Kod instrumenata za mjerenje 
intenziteta svjetlosti baždarenih u luksima podrucje od 4 440 – 8 880 lx za „cool white” rasvjetu približno odgovara preporucenom 
intenzitetu svjetlosti od 60 – 120 μE·m
 –2 ·s –1 .) Intenzitet svjetlosti u 
prostoru inkubacije ne smije odstupati više od ± 15 % od prosjecnog intenziteta svjetlosti.
 
1.8.10.  Trajanje ispitivanja  
Ispitivanje u pravilu traje 72 sata. Ipak, ispitivanje može trajati i duže 
ili krace, pod uvjetom da su zadovoljeni svi kriteriji valjanosti iz odjeljka 1.7.
 
1.8.11.  Mjerenja i analiticka odredivanja  
Biomasa algi u svakoj tikvici odreduje se najmanje jedanput dnevno 
tijekom ispitivanja. Ako se mjerenja provode na malom volumenu pipetiranom iz ispitne otopine, izvadenu otopinu ne treba 
nadomjestiti.
 
Mjerenje biomase provodi se rucnim brojenjem stanica pod mikro ­
skopom ili elektronickim brojacem cestica (za broj stanica i/ili biovo ­
lumen). Mogu se koristiti i alternativne tehnike, npr. protocna cito ­
metrija, flourescencija klorofila  in vitro  ili in vivo  (6.) (7.) ili opticka 
gustoca, pod uvjetom da se može dokazati zadovoljavajuca korelacija 
s biomasom unutar podrucja biomasa koje se javljaju u ispitivanju.  
pH vrijednost otopina mjeri se na pocetku i na kraju ispitivanja.  
Ako je raspoloživ analiticki postupak za odredivanje ispitivane tvari 
u rasponu koncentracija koje se koriste u ispitivanju, ispitne otopine 
se analiziraju kako bi se provjerile pocetne koncentracije i ujednace ­
nost koncentracija izlaganja tijekom ispitivanja.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 959
 
Ponekad je dovoljno analizirati koncentraciju ispitivane tvari u jednoj 
niskoj i jednoj visokoj ispitnoj koncentraciji na pocetku i kraju ispi ­
tivanja te koncentraciju oko ocekivane vrijednosti EC  50 , ukoliko se 
ocekuje da ce koncentracije izlaganja tijekom ispitivanja odstupati manje od 20 % od nazivnih vrijednosti. Ako nije vjerojatno da ce 
koncentracije ostati unutar 80 – 120 % nazivne vrijednosti, preporu ­
cuje se analiza svih ispitnih koncentracija na pocetku i na kraju ispitivanja. U slucaju hlapljivih, nestabilnih i jako adsorptivnih ispi ­
tivanih tvari preporucuje se da se tijekom razdoblja izlaganja obave 
dodatna uzorkovanja i analize u razmacima od 24 sata kako bi se 
mogao bolje odrediti gubitak ispitivane tvari. Kod takvih su tvari potrebna dodatna ponavljanja. U svakom slucaju, koncentraciju ispi ­
tivane tvari treba odredivati samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj 
koncentraciji (ili na združenom sadržaju posuda ponavljanja).
 
S ispitnim medijima koji su posebno pripremljeni za analizu koncen ­
tracija izlaganja tijekom ispitivanja treba postupati jednako kao s medijima na kojima se provodi ispitivanje tj. treba ih inokulirati 
algama i inkubirati u jednakim uvjetima. Ponekad je za analizu 
koncentracije otopljene ispitivane tvari potrebno odvojiti alge od medija. Odvajanje se po mogucnosti provodi laganim centrifugira ­
njem gdje je g-sila tek tolika da se postigne taloženje algi.
 
Ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane tvari tijekom 
ukupnog trajanja ispitivanja na zadovoljavajuci nacin održava u grani ­
cama ± 20 % nazivne ili izmjerene pocetne koncentracije, analiza rezultata može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim pocetnim vrijed ­
nostima. Ako je odstupanje od nazivne odnosno izmjerene pocetne 
koncentracije vece od ± 20 %, analiza rezultata se temelji na srednjoj geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji opisuju opadanje koncentracije ispitivane tvari (3.) (8.).
 
Test inhibicije rasta algi je dinamicni ispitni sustav koji je dinamic ­
niji od vecine testova kratkotrajne toksicnosti u vodi. Stoga je ponekad teško odrediti stvarne koncentracije izlaganja, što posebno vrijedi za ispitivanja adsorptivnih tvari u niskim koncentracijama. U 
tom slucaju nestanak tvari iz otopine adsorpcijom na rastucu 
biomasu algi ne znaci gubitak tvari iz ispitnog sustava. Kod analize rezultata ispitivanja treba provjeriti je li smanjenje koncen ­
tracije ispitivane tvari tijekom ispitivanja praceno smanjenjem inhi ­
bicija rasta. Ako je to slucaj, može se razmotriti primjena prikladnog 
modela koji opisuje opadanje koncentracije ispitivane tvari (8.). U protivnom ce možda biti primjereno provesti analizu rezultata na temelju pocetnih (nazivnih ili izmjerenih) koncentracija.
 
1.8.12.  Ostala zapažanja  
Mikroskopskim pregledom treba se uvjeriti u normalan i zdrav izgled 
kulture inokuluma te uociti eventualne promjene u izgledu algi (one 
koje mogu biti posljedica izlaganja ispitivanoj tvari) na kraju 
ispitivanja.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 960
 
1.8.13.  Granicno ispitivanje  
U odredenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje 
na to da ispitivana tvar nema toksicno djelovanje u koncentraciji do 100 mg·l
 –1 ili do granice topljivosti u ispitnom mediju (ovisno o 
tomu što je manje), može se provesti granicno ispitivanje za uspo ­
redbu odgovora kontrolne skupine s jednom ispitnom skupinom (100 mg·l
 –1 ili koncentracija koja odgovara granici topljivosti). 
Preporucuje se da se uz granicno ispitivanje svakako provede 
analiza koncentracije izlaganja. Za granicno ispitivanje vrijede svi 
gore spomenuti ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da broj ponavljanja u ispitnoj skupini ne smije biti manji od šest. Varijable 
odgovora u kontrolnoj i ispitnoj skupini mogu se analizirati statisti ­
ckim testom za usporedbu srednjih vrijednosti npr. Studentov t-test. Ako su varijance dviju skupina nejednake, treba provesti prilagodeni t-test za nejednake varijance.
 
1.8.14.  Varijanta za jako obojene tvari  
Zracenje (intenzitet svjetlosti) treba biti u gornjem dijelu pojasa 
propisanog za ovu ispitnu metodu tj. 120 μE m  –2 s –1 ili više.  
Put svjetlosti treba skratiti smanjenjem volumena ispitnih otopina (u 
rasponu od 5 – 25 ml).  
Treba osigurati dostatno muckanje (primjerice umjerenim tresenjem) 
kako bi se osigurala visoka ucestalost izlaganja algi visokom 
zracenju na površini kulture.  
2. PODACI  
2.1. GRAFICKI PRIKAZ KRIVULJA RASTA  
Biomasa u ispitnim posudama može se izraziti u jedinicama 
mjerenog zamjenskog parametra (npr. broj stanica, fluorescencija).  
Da bi se dobio graficki prikaz krivulja rasta, treba izraditi tablicu 
procijenjenih koncentracija biomase u ispitnim i kontrolnim kultu ­
rama, zajedno s koncentracijama ispitivanog materijala, koje se bilježe s razlucljivošcu od najmanje jednog cijelog sata, i vremenima 
mjerenja. U ovoj prvoj fazi mogu biti korisne i logaritamske i 
linearne skale; medutim, logaritamske su skale obvezatne i opcenito daju bolji prikaz promjena uzorka rasta u razdoblju ispitivanja. Kad se eksponencijalni rast prikaže na logaritamskoj skali, kao rezultat se 
dobije pravac, a nagib pravca pokazuje specificnu brzinu rasta.
 
Na grafickim prikazima treba provjeriti rastu li kontrolne kulture 
tijekom ispitivanja eksponencijalno i ocekivanom brzinom. Treba kriticki preispitati sve tocke podataka i izgled grafova te provjeriti sirove podatke i postupke kako bi se utvrdile eventualne greške. 
Posebno treba provjeriti one tocke podataka kod kojih se cini da 
su odstupanja posljedica sustavne greške. Ako je ocito i/ili vrlo vjerojatno da se radi o greškama u postupku, odgovarajucu tocku treba oznaciti kao stršecu vrijednost i iskljuciti iz kasnije statisticke 
analize. (Nulta koncentracija algi u jednoj od dvije ili tri posude 
ponavljanja može ukazivati na to da posuda nije pravilno inokulirana ili da nije bila dobro ocišcena). U izvješcu o ispitivanju treba jasno navesti zašto je odredena tocka odbacena kao stršeca vrijednost. 
Prihvatljivi razlozi su samo (rijetke) greške u postupku, ali ne i 
loša preciznost. Statisticki postupci za utvrdivanje stršecih vrijednosti imaju kod ove vrste problema ogranicenu primjenu i ne mogu zami ­
jeniti strucnu prosudbu. Stršece vrijednosti (koje su oznacene kao 
takve) treba po mogucnosti zadržati medu tockama podataka u 
kasnijim grafickim odnosno tablicnim prikazima podataka.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 961
 
2.2. VARIJABLE ODGOVORA  
Svrha ispitivanja je utvrditi ucinke ispitivane tvari na rast algi. U 
ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, buduci da države clanice imaju razlicite preferencije i regulatorne zahtjeve. Da 
bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim državama clanicama, 
ucinke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli opisanih u nastavku pod (a) i (b).
 
(a) Prosjecna specificna brzina rasta: ova se varijabla odgovora 
izacunava na temelju logaritamskog povecanja biomase u razdoblju ispitivanja, izraženog po danu.
 
(b) Prirast: ova varijabla odgovora predstavlja razliku izmedu 
biomase na kraju ispitivanja i pocetne biomase.  
Iz razloga navedenih u nastavku, izracun rezultata za potrebe 
primjene ove metode unutar regulatornog okvira EU-a treba temeljiti 
na prosjecnoj specificnoj brzini rasta. Valja napomenuti da vrijed ­
nosti toksicnosti izracunane primjenom tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti u obzir kod korištenja rezul ­
tata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni uvjeti ove metode, vrijed ­
nosti EC
 x na temelju prosjecne specificne brzine rasta (E  r C x ) opce­
nito su više od rezultata na temelju prirasta (E  y C x ) zbog razlike u 
matematickoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne treba tumaciti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, vec naprosto prihvatiti 
da su te vrijednosti matematicki razlicite. Pojam prosjecne specificne 
brzine rasta temelji se na opcenitom obrascu eksponencijalnog rasta algi u neogranicenim kulturama, gdje se toksicnost procjenjuje na 
temelju ucinaka na brzinu rasta neovisno o apsolutnoj vrijednosti 
specificne brzine rasta u kontrolnoj skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor i trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora „prirast” ovise o 
svim tim drugim varijablama. E
 y C x ovisi o specificnoj brzini rasta 
vrsta algi koje se koriste u ispitivanju i o maksimalnoj specificnoj brzini rasta, koja se može razlikovati izmedu vrsta, pa cak i izmedu sojeva algi. Ovu varijablu odgovora ne treba koristiti za usporedbu 
osjetljivosti na toksine medu vrstama, pa cak ni medu sojevima algi. 
Iako se, sa znanstvenog stajališta, procjeni toksicnosti na temelju procjecne specificne brzine rasta daje prednost, u ovu su ispitnu metodu ukljucene i procjene na temelju prirasta kako bi se zadovo ­
ljili trenutacni regulatorni zahtjevi u nekim državama.
 
2.2.1.  Prosjecna brzina rasta  
Prosjecna specificna brzina rasta u odredenom razdoblju izracunava 
se kao logaritamsko povecanje biomase za svaku kontrolnu i ispitnu posudu primjenom sljedece jednadžbe:
 
μ iÄj ¼ lnX j Ä lnX i 
t j Ä t i ðdan Ä1 Þ 
gdje je:  
μ i-j : prosjecna specificna brzina rasta od vremena i do vremena j;  
X i : biomasa u vremenu i;  
X j : biomasa u vremenu j.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 962
 
Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu treba izracunati srednju vrijed ­
nost brzine rasta s procjenom varijance.  
Izracuna se prosjecna specificna brzina rasta za ukupno vrijeme 
ispitivanja (obicno dan 0 – 3); pritom se umjesto izmjerene pocetne vrijednosti kao pocetna vrijednost uzima nazivna inokulirana biomasa, jer se na taj nacin u pravilu postiže veca preciznost. Ako 
oprema koja se koristi za mjerenje biomase dopušta dovoljno prec ­
izno odredivanje biomase i kod male biomase inokuluma (npr. protocni citometar), može se koristiti izmjerena pocetna koncentracija biomase. Osim toga, treba odrediti etapnu brzinu rasta, koja se izra ­
cunava kao specificna brzina rasta za svaki dan ispitivanja (dan 0 – 
1, 1 – 2 i 2 – 3), i provjeriti je li kontrolna brzina rasta stalna (vidi kriterije valjanosti, odjeljak 1.7.). Ako je specificna brzina rasta prvoga dana znatno niža od ukupne prosjecne specificne brzine, to 
može ukazivati na fazu prilagodbe. Dok se faza prilagodbe u 
kontrolnim kulturama može smanjiti i gotovo eliminirati pravilnim razmnožavanjem pretkulture, kad su u pitanju izložene kulture, faza prilagodbe može biti znak oporavka nakon prvobitnog toksicnog 
šoka ili smanjenog izlaganja zbog gubitka ispitivane tvari (ukljucu ­
juci sorpciju na biomasu algi) nakon pocetnog izlaganja. Stoga se može ocijeniti etapni rast kako bi se ocijenili ucinci ispitivane tvari 
koji se javljaju tijekom razdoblja izlaganja. Znacajne razlike izmedu 
etapne brzine rasta i prosjecne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog eksponencijalnog rasta i zahtijevaju detaljno preispitivanje krivulja rasta.
 
Postotak inhibicije brzine rasta za pojedina ponavljanja u ispitnim 
skupinama izracunava se pomocu sljedece jednadžbe:  
% I r ¼ μ C Ä μ T 
μ C Ü 100  
gdje je:  
%I r : postotak inhibicije prosjecne specificne brzine rasta;  
μ C : srednja vrijednost prosjecne specificne brzine rasta ( μ) u 
kontrolnoj skupini;  
μ T : prosjecna specificna brzina rasta ponavljanja u ispitnoj skupini.  
Ako se za pripremu ispitnih otopina koriste otapala, za izracun 
postotka inhibicije treba koristiti kontrole s otapalom, a ne one bez 
otapala.  
2.2.2.  Prirast  
Prirast se izracunava kao biomasa na kraju ispitivanja umanjena za 
pocetnu biomasu za svaku kontrolnu i ispitnu posudu. Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izracunati srednju vrijednost 
prirasta s procjenom varijance. Postotak inhibicije prirasta (%I
 y ) za 
pojedina ponavljanja u ispitnoj skupini može se izracunati na sljedeci nacin:
 
% I y ¼ ðY C Ä Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 963
 
gdje je:  
%I y : postotak inhibicije prirasta;  
Y C : srednja vrijednost prirasta u kontrolnoj skupini;  
Y T : vrijednost prirasta ponavljanja u ispitnoj skupini.  
2.3. GRAFICKI PRIKAZ KRIVULJE KONCENTRACIJA-ODGOVOR  
Napravi se graficki prikaz postotka inhibicije u odnosu na logaritam 
koncentracije ispitivane tvari i dobiveni graf detaljno pregleda, 
zanemarujuci sve tocke podataka koje su u prvoj fazi izdvojene kao stršece vrijednosti. Tockama podataka se prilagodi glatka krivulja prostim okom ili racunalnom interpolacijom, kako bi se 
dobio prvi dojam odnosa koncentracija-odgovor, i zatim nastavlja 
detaljnijom metodom, po mogucnosti racunalnom statistickom meto ­
dom. Ovisno o predvidenoj uporabi podataka, kakvoci (preciznosti) i kolicini podataka te raspoloživosti analitickih alata za analizu poda ­
taka, može se donijeti odluka (koja je u odredenim slucajevima 
posve opravdana) da se u ovoj fazi prekine analiza podataka i jedno ­
stavno ocitaju kljucne vrijednosti EC
 50 i EC  10 (i/ili EC  20 ) s krivulje 
prilagodene prostim okom (vidi i odjeljak u nastavku o stimulira ­
jucim ucincima). Neki od valjanih razloga za nekorištenje statisticke 
metode su:  
— s obzirom na raspoložive podatke, racunalnim metodama se ne 
mogu dobiti pouzdaniji rezultati od onih koji se mogu dobiti 
strucnom prosudbom – može se dogoditi da neki racunalni 
programi uopce ne daju nikakvo pouzdano rješenje (iteracije ne konvergiraju itd.).
 
— raspoloživi racunalni programi nisu prikladni za obradu ucinaka 
stimulacije rasta (vidi u nastavku).  
2.4. STATISTICKI POSTUPCI  
Cilj je dobiti kvantitativni odnos koncentracija-odgovor regresijskom 
analizom. Ako se provede linearizacijska pretvorba podataka odgo ­
vora – npr. u jedinice probit, logit ili Weibullovog modela (9.) – 
može se provesti ponderirana linearna regresija; ipak, prednost se daje postupcima nelinearne regresije koje se bolje nose s neizbježnim nepravilnostima podataka i odstupanjima od pravilnih razdioba. 
Približavanjem nultoj ili potpunoj inhibiciji te se nepravilnosti 
mogu pretvorbom i dodatno povecati i tako otežati analizu (9.). Valja napomenuti da su standardne metode analize za vrijednosti dobivene pretvorbom (probit, logit ili Weibull) namijenjene kvan ­
talnim podacima (npr. smrtnost ili preživljavanje) i moraju se 
posebno prilagoditi da bi se mogle primijeniti na podatke o rastu i biomasi. Konkretni postupci za odredivanje vrijednosti EC
 x iz konti­
nuiranih podataka mogu se pronaci u literaturi pod 10., 11. i 12. 
Korištenje nelinearne regresijske analize podrobnije je opisano u 
Dodatku 4.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 964
 
Za svaku varijablu odgovora koja se analizira treba izracunati 
procjene tocaka za vrijednosti EC  x na temelju odnosa 
koncentracija-odgovor. Po mogucnosti, za sve procjene treba odrediti granice pouzdanosti 95 %. Valjanost podudaranja podataka odgovora s regresijskim modelom procjenjuje se graficki ili statisticki. Regre ­
sijska analiza se provodi na temelju pojedinacnih odgovora u 
ponavljanjima, a ne na temelju srednjih vrijednosti ispitnih skupina. Ipak, ako je nelinearno prilagodavanje krivulje teško ili nemoguce zbog velike raspršenosti podataka, problem se može zaobici provo ­
denjem regresije na srednjim vrijednostima po skupinama kao prak ­
ticnim nacinom da se smanji utjecaj mogucih stršecih vrijednosti. Ako se koristi ova opcija, to treba navesti u izvješcu o ispitivanju kao odstupanje od uobicajenog postupka uz napomenu da prilagoda ­
vanje krivulje pojedinacnim ponavljanjima nije dalo dobar rezultat.
 
Ako raspoloživi regresijski modeli/metode nisu prikladni za podatke, 
procjene EC  50 i granice pouzdanosti mogu se dobiti i linearnom 
interpolacijom sa samonadopunjavanjem („bootstrapping”) (13.).  
Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, u vezi s ucincima ispitivane 
tvari na brzinu rasta potrebno je usporediti srednje vrijednosti obrada primjenom tehnika analize varijance (ANOVA). Zatim srednju 
vrijednost za svaku koncentraciju treba usporediti s kontrolnom 
srednjom vrijednošcu primjenom odgovarajuce metode višestruke usporedbe ili testa trenda. Ovdje može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (14.) (15.) (16.) (17.) (18.). Treba provjeriti vrijedi 
li pretpostavka homogenosti varijanci ANOVA-e. To se može uciniti 
graficki ili formalnim testom (18.). Prikladni su Leveneov i Bart ­
lettov test. Ako pretpostavka homogenosti varijanci nije zadovoljena, to se ponekad može ispraviti logaritamskom pretvorbom podataka. 
Ako je heterogenost varijance prevelika da bi se mogla ispraviti 
pretvorbom, treba razmotriti mogucnost analize metodama kao što su Jonckheereovi „step-down” testovi trenda. Dodatne smjernice za odredivanje NOEC-a mogu se pronaci u literaturi (12.).
 
Novije znanstvene spoznaje rezultirale su preporukom da se pojam 
NOEC-a napusti i zamijeni procjenama tocaka EC  x dobivenih regre ­
sijom. Za ovaj test s algama nije utvrdena odredena vrijednost x. 
Cini se da je primjereno podrucje od 10 do 20 % (ovisno o 
odabranoj varijabli odgovora), a poželjno je da se navedu obje vrijednosti, EC
 10 i EC  20 . 
2.5. STIMULACIJA RASTA  
Ponekad se pri niskim koncentracijama može zapaziti stimulacija 
rasta (negativna inhibicija). To može biti posljedica hormeze 
(toksicka stimulacija) ili unošenja stimulirajucih faktora rasta s ispi ­
tivanim materijalom u upotrijebljeni minimalni medij. Dodavanje anorganskih nutrijenata ne bi smjelo imati nikakav izravni utjecaj buduci da ispitni medij tijekom ispitivanja treba stalno sadržavati 
višak nutrijenata. Stimulacija pri niskim dozama se u pravilu može 
zanemariti kod izracunavanja EC
 50 osim ako je ona ekstremno 
visoka. U slucaju ektremne stimulacije, ili kad je potrebno izracunati EC
 x za niske vrijednosti x, ponekad je potrebno primijeniti posebne 
postupke. Pojave stimulacije rasta treba kad god je to moguce uklju ­
citi u analizu podataka, a ako raspoloživi softver za prilagodavanje krivulje ne može prihvatiti male vrijednosti stimulacije, može se koristiti linearna interpolacija sa samonadopunjavanjem („bootstrap ­
ping”). U slucaju ekstremne stimulacije može se razmotriti primjena 
modela hormeze (19.).
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 965
 
2.6. NETOKSICKA INHIBICIJA RASTA  
Ispitivani materijal koji apsorbiraju svjetlost mogu izazvati smanjenje 
brzine rasta stvaranjem sjene, koja smanjuje raspoloživu kolicinu svjetlosti. Ove i druge slicne fizikalne ucinke treba odvojiti od 
toksicnih ucinaka izmjenom ispitnih uvjeta i treba ih posebno 
navesti u izvješcu o ispitivanju. Smjernice se mogu pronaci u litera ­
turi pod 2. i 3.
 
3. IZVJEŠCIVANJE  
3.1. IZVJEŠCE O ISPITIVANJU  
Izvješce o ispitivanju sadrži sljedece informacije:  
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva, ukljucu ­
juci granicu topljivosti u vodi,  
— podaci za identifikaciju kemikalije, ukljucujuci cistocu.  
Ispitna vrsta:  
— soj, dobavljac odnosno izvor i uvjeti uzgoja.  
Ispitni uvjeti:  
— datum pocetka i trajanje ispitivanja,  
— plan ispitivanja: ispitne posude, volumeni kulture, gustoca 
biomase na pocetku ispitivanja,  
— sastav medija,  
— ispitne koncentracije i ponavljanja (npr. broj ponavljanja, broj 
ispitnih koncentracija i primijenjena geometrijska progresija),  
— opis pripreme ispitnih otopina, ukljucujuci primjenu otapala itd.,  
— inkubator za uzgoj,  
— intenzitet i kakvoca svjetlosti (izvor, homogenost),  
— temperatura,  
— ispitane koncentracije: nazivne ispitne koncentracije i rezultati 
analiza za odredivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnim 
posudama; treba navesti iskorištenje metode i granicu kvantifika ­
cije u ispitnom matriksu,  
— moguca odstupanja od ispitne metode,  
— metoda odredivanja biomase i dokaz korelacije izmedu izmje ­
renog parametra i suhe mase.  
Rezultati:  
— pH vrijednosti na pocetku i kraju ispitivanja u svim obradama,  
— biomasa svake tikvice u svakoj mjernoj tocki i metoda mjerenja 
biomase,  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 966
 
— krivulje rasta (graficki prikaz biomase u ovisnosti o vremenu),  
— izracunane varijable odgovora za svako ponavljanje u obradama, 
ukljucujuci srednje vrijednosti i koeficijent varijacije za 
ponavljanja,  
— graficki prikaz odnosa koncentracija/ucinak,  
— procjene toksicnosti za varijable odgovora, npr. EC  50 , EC  10 , 
EC 20 i odgovarajuci intervali pouzdanosti; ako se izracunavaju 
LOEC i NOEC, njihove vrijednosti i statisticke metode koje su upotrijebljene za odredivanje,
 
— ako se koristi ANOVA, velicina ucinka koja se može utvrditi 
(npr. najmanja znacajna razlika),  
— eventualna stimulacija rasta u bilo kojoj obradi,  
— svi ostali zapaženi ucinci, npr. morfološke promjene algi,  
— rasprava rezultata, ukljucujuci moguci utjecaj odstupanja od 
ispitne metode na rezultate ispitivanja.  
4. LITERATURA  
1. OECD TG 201 (2006.). Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
2. ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.
 
3. OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.  
4. ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16.  
5. ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
6. Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997.). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.  
7. Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977.), pp.919-925.  
8. Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003.). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079.
 
9. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 967
 
10. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992.): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
11. Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992.). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
12. OECD. (2004.). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
13. Norberg-King T.J. (1988.). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
14. Dunnett, C.W. (1955.). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096-1121  
15. Dunnett, C.W. (1964.). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491.  
16. Williams, D.A. (1971.). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103-117.  
17. Williams, D.A. (1972.). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
18. Draper, N.R. and Smith, H. (1981.). Applied Regression Analy ­
sis, second edition. Wiley, New York.  
19. Brain P. and Cousens R. (1989.). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 968
 
Dodatak 1.  
Sojevi koji su se pokazali prikladnima za ispitivanje  
Zelene alge  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (ranije poznata kao  Selenastrum capricornu ­
tum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (ranije poznata kao  Scenedesmus subspicatus , 
86.81 SAG  
Dijatomeje  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cijanobakterije  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Izvori sojeva  
Preporuceni sojevi raspoloživi su u kulturama jedne vrste algi iz sljedecih zbirki 
(abecednim redom):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
SJEDINJENE AMERICKE DRŽAVE  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UJEDINJENA KRALJEVINA  
SAG: Sammlung Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nicholausberger Weg 18  
3400 Göttingen  
NJEMACKA  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
SAD ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 969
 
Izgled i svojstva prepoucenih vrsta  
P. subcapitata  D. subspicatus  N. pelliculosa  A. flos-aquae  S. leopoliensis  
Izgled  Zakrivljene, 
uvijene pojedinacne 
stanice
 Dugoljaste, 
vecinom pojedinacne 
stanice
 Štapicaste  Lanci 
dugoljastih stanica
 Štapicaste  
Velicina (D × Š) μm 8–14 × 2–3  7–15 × 3–12  7,1 × 3,7  4,5 × 3  6 × 1  
Volumen stanica ( μm 3 /stanica)  40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Suha masa stanica (mg/stanica)  2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Brzina rasta (  3 ) dan  –1 1,5–1,7  1,2–1,5  1,4  1,1–1,4  2,0–2,4  
( 1 ) Mjereno elektronickim brojacem cestica. 
( 2 ) Izracunato iz velicine. 
( 3 ) Najcešce zapažena brzina rasta u mediju OECD pri intenzitetu svjetlosti cca 70 μE·m  –2 ·s –1 i temperaturi 21 °C.  
Posebne preporuke za uzgoj i rukovanje preporucenim ispitnim vrstama  
Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus  
Ove zelene alge opcenito se lako održavaju u razlicitim medijima kulture. Infor ­
macije o prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura. U pravilu se radi o pojedinacnim stanicama i mjerenja gustoce stanica mogu se jednostavno obaviti uz pomoc elektronickog brojaca cestica ili mikroskopa.
 
Anabaena flos-aquae  
Za držanje radne kulture mogu se koristiti razliciti uzgojni mediji. Osobito je 
važno ne dopustiti da šaržna kultura kod obnavljanja ne prode logaritamsku fazu 
rasta jer je tada regeneracija teška.  
Anabaena flos-aquae  tvori nakupine isprepletenih lanaca stanica. Velicina naku ­
pina može biti razlicita, ovisno o uzgojnim uvjetima. Te je nakupine ponekad potrebno razbiti ako se biomasa odreduje brojenjem pod mikroskopom ili elek ­
tronickim brojacem cestica.
 
Da bi se smanjila varijabilnost rezultata brojenja, lanci se mogu razbiti ultraz ­
vucnom obradom poduzoraka. Ultrazvucna obrada ne smije trajati duže nego što 
je potrebno da se lanci razbiju na krace lance, jer se u protivnom stanice mogu uništiti. Intenzitet i trajanje ultrazvucne obrade moraju biti jednaki kod svih 
uzoraka.
 
Na hemocitometru treba izbrojiti dovoljan broj polja (najmanje 400 stanica) da bi 
se mogla ispraviti odstupanja. Time se poboljšava pouzdanost mikroskopskih odredivanja gustoce.
 
Nakon što se lanci stanica razbiju pažljivom ultrazvucnom obradom, za odredi ­
vanje ukupnog volumena stanica  Anabaena  može se koristiti elektronicki brojac 
cestica. Ultrazvucnu energiju treba podesiti tako da se izbjegne oštecenje stanica.  
Da bi se dobila dobro izmiješana i homogena suspenzija algi za inokulaciju 
ispitnih posuda, treba koristiti vortex mješalicu ili slicnu prikladnu metodu.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 970
 
Ispitne posude treba staviti na orbitalnu ili linearnu tresilicu na oko 150 okretaja 
u minuti. Drugi nacin da se smanji tendencija tvorbe gruda kod  Anabaena  je 
periodicno muckanje. Kod pojave gruda treba paziti da se za mjerenje biomase dobiju reprezentativni uzorci. Ponekad je prije uzorkovanja potrebno snažno protresti posude da bi se razbile grude algi.
 
Synechococcus leopoliensis  
Za držanje radne kulture mogu se koristiti razliciti uzgojni mediji. Informacije o 
prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura.  
Synechococcus leopoliensis  raste u obliku pojedinacnih štapicastih stanica. 
Stanice su vrlo malene, što otežava mjerenje biomase brojenjem pod mikrosko ­
pom. Ovdje mogu pomoci elektronicki brojaci cestica opremljeni za brojenje cestica do velicine od cca 1 μm. Osim toga, mogu se koristiti fluorometrijska 
mjerenja  in vitro .
 
Navicula pelliculosa  
Za držanje radne kulture mogu se koristiti razliciti uzgojni mediji. Informacije o 
prikladnim medijima mogu se dobiti u zbirkama kultura. Medij mora sadržavati 
silikat.  
Navicula pelliculosa  može u odredenim uvjetima rasta stvarati nakupine. Stanice 
algi se ponekad znaju nakupljati u površinskoj emulziji zbog tvorbe lipida. U tom slucaju kod uzimanja poduzoraka za odredivanje biomase treba poduzeti posebne 
mjere kako bi se dobili reprezentativni uzorci. Ponekad je nužno i snažno protre ­
sanje npr. uz pomoc vortex mješalice.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 971
 
Dodatak 2.  
Uzgojni mediji  
Može se koristiti jedan od dva uzgojna medija:  
Medij OECD: izvorni medij OECD TG 201, takoder u skladu s normom ISO 
8692  
Medij AAP US. EPA, takoder u skladu s normom ASTM.  
Kod pripreme tih medija treba koristiti reagencijski odnosno analiticki ciste 
kemikalije i deioniziranu vodu.  
Sastav medija AAP (US. EPA) i medija OECD TG 201  
Sastojak  EPA  OECD  
mg/l mM  mg/l  mM  
NaHCO  3 15,0 0,179  50,0  0,595  
NaNO  3 25,5 0,300  
NH  4 Cl 15,0  0,280  
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16  0,0598  12,0  0,0590  
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41  0,0300  18,0  0,122  
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6  0,0592  15,0  0,0609  
K 2 HPO  4 1,044  0,00599  
KH  2 PO 4 1,60 0,00919  
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160  0,000591  0,0640  0,000237  
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300  0,000806  0,100  0,000269 (*)  
H 3 BO 3 0,186  0,00300  0,185  0,00299  
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415  0,00201  0,415  0,00210  
ZnCl  2 0,00327  0,000024  0,00300  0,0000220  
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143  0,000006  0,00150  0,00000630  
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726  0,000030  0,00700  0,0000289  
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012  0,00000007  0,00001  0,00000006  
pH 7,5  8,1  
(*) Molarni omjer EDTA – željezo je nešto veci od jedan. Time se sprecava taloženje željeza i istovremeno 
smanjuje kelatiranje teških metalnih iona.  
Kod ispitivanja s dijatomejom  Navicula pelliculosa  oba medija treba nadopuniti s 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 O tako da se dobije koncentracija od 1,4 mg Si/l.  
pH vrijednost medija odreduje se kad se uspostavi ravnoteža izmedu karbonatnog 
sustava medija i parcijalnog tlaka CO  2 u atmosferskom zraku. Približni odnos 
izmedu pH na 25 °C i molarne koncentracije bikarbonata proizlazi iz sljedece formule:
 
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 972
 
Kod 15 mg NaHCO  3 pH eq = 7,5 (medij U.S. EPA), a kod 50 mg NaHCO  3 /l pH  eq 
= 8,1 (medij OECD).  
Elementarni sastav ispitnih medija  
Element  EPA  OECD  
mg/l mg/l  
C 2,144  7,148  
N 4,202  3,927  
P 0,186  0,285  
K 0,469  0,459  
Na 11,044  13,704  
Ca 1,202  4,905  
Mg 2,909  2,913  
Fe 0,033  0,017  
Mn 0,115  0,115  
Priprema medija OECD  
Nutrijent  Koncentracija u radnoj otopini  
Radna otopina 1: makronutrijenti  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Radna otopina 2: željezo  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Radna otopina 3: elementi u tragovima  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Radna otopina 4: bikarbonat  
NaHCO  3 
NaSiO  3 ·9H  2 O 50 g·l  –1 
Radne se otopine steriliziraju membranskom filtracijom (srednji promjer pora 
0,2 μm) ili obradom u autoklavu (120 °C, 15 min). Otopine se pohrane u 
mraku na temperaturi od 4 °C.  
Radne otopine 2 i 4 ne sterilizaju se u autoklavu vec iskljucivo membranskom 
filtracijom.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 973
 
Uzgojni medij priprema se dodavanjem odgovarajuceg volumena radnih otopina 
1 – 4 u vodu:  
U 500 ml sterilizirane vode doda se:  
— 10 ml radne otopine 1  
— 1 ml radne otopine 2  
— 1 ml radne otopine 3  
— 1 ml radne otopine 4.  
Nadopuni se steriliziranom vodom do 1 000 ml.  
Zatim treba ostaviti dovoljno vremena za uspostavu ravnoteže izmedu medija i 
atmosferskog CO  2 , prema potrebi upuhivanjem sterilnog filtriranog zraka u 
trajanju od nekoliko sati.  
Priprema medija AAP  
A1.1. U približno 900 ml deionizirane ili destilirane vode doda se po 1 ml 
radnih otopina iz A1.2.1. – A1.2.7. i razrijedi do 1 l.  
A1.2. Pripreme se radne otopine s makronutrijentima otapanjem sljedecih 
kolicina tvari u 500 ml deionizirane ili destilirane vode. Reagensi A1.2.1., A1.2.2., A1.2.3. i A1.2.4. mogu se objediniti u jednu radnu otopinu.
 
A1.2.1.  NaNO  3 –12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 ·6H  2 O–6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 ·2H  2 O–2,205 g.  
A1.2.4.  Radna otopina s mikronutrijentima –(vidi A1.3.).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O–7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 –0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 –7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O– vidi napomenu A1.1.  
Napomena A1.1.  – Koristiti samo kod ispitivanja s dijatomejama. Može 
se dodati izravno (202,4 mg) ili putem radne otopine tako da se dobije 
konacna koncentracija 20 mg/l Si u mediju.  
A1.3. Radna otopina s mikronutrijentima priprema se otapanjem sljedecih 
kolicina tvari u 500 ml deionizirane ili destilirane vode:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 –92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O–207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 –1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O–79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O–0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O–3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O–0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O–150,000 mg.  
[dinatrijev (etilendinitrilo) tetraacetat].  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O–0,005 mg, vidi napomenu A1.2.  
Napomena A1.2. – Koristiti samo u mediju za radne kulture s 
dijatomejama.  
A1.4. pH vrijednost se podesi na 7,5 ± 0,1 pomocu 0,1 N ili 1,0 N NaOH ili 
HCl.  
A1.5. Medij se profiltrira u sterilnu posudu kroz membranski filtar 0,22 μm, 
ako se koristi brojac cestica, ili kroz membranski filtar 0,45 μm, ako se 
nece koristiti brojac cestica.  
A1.6. Medij se do uporabe pohrani u mraku na temperaturi od približno 4 °C.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 975
 
Dodatak 3.  
Primjer postupka za uzgoj kulture algi  
Opce napomene  
Uzgoj kultura u skladu s ovim postupkom provodi se radi dobivanja kultura algi 
za toksikološka ispitivanja.  
Treba koristiti prikladne metode kako se kulture algi ne bi inficirale bakterijama. 
Iako su u odredenim slucajevima poželjne aksenicne kulture, u svakom slucaju se 
moraju uspostaviti i koristiti kulture koje sadrže samo jednu vrstu algi.  
Sve postupke treba provoditi u sterilnim uvjetima kako bi se izbjeglo onecišcenje 
bakterijama i drugim algama.  
Oprema i materijali  
Vidi: Ispitna metoda: Aparatura.  
Postupci za dobivanje kultura algi  
Priprema hranjivih otopina (medija):  
Sve se hranjive soli medija pripremaju kao koncentrirane radne otopine i cuvaju 
na tamnom i hladnom mjestu. Otopine se steriliziraju filtracijom ili obradom u 
autoklavu.  
Medij se priprema dodavanjem odgovarajuce kolicine radne otopine u sterilnu 
destiliranu vodu, pazeci da ne dode do infekcije. Kod krutih medija treba dodati 0,8 % agara.
 
Radna kultura:  
Radne kulture su male kulture algi koje se redovito prenose u svježi medij i 
koriste kao polazni ispitni materijal. Ako se kulture ne koriste redovito, one se 
nanose na kosi agar. Kulture se prenose u svježi medij najmanje jedanput u dva 
mjeseca.  
Radne se kulture uzgajaju u stožastim tikvicama koje sadrže odgovarajuci medij 
(oko 100 ml). Kad se alge inkubiraju na 20 °C uz neprekidno osvjetljenje, 
potrebno je tjedno prenošenje.  
Kod prenošenja, odredena kolicina „stare” kulture prenese se sterilnim pipetama 
u tikvicu sa svježim medijem tako da kod brzorastucih vrsta pocetna koncen ­
tracija bude oko 100 puta niža nego u staroj kulturi.  
Brzina rasta vrste može se odrediti iz krivulje rasta. Ako je ona poznata, moguce 
je procijeniti gustocu pri kojoj kulturu treba prenijeti u novi medij. To se mora 
uciniti prije nego što kultura dosegne fazu odumiranja.  
Pretkultura:  
Pretkultura treba dati odredenu kolicinu algi koje su prikladne za inokulaciju 
ispitnih kultura. Pretkultura se inkubira u uvjetima ispitivanja i koristi dok još eksponencijalno raste, u pravilu nakon razdoblja inkubacije od 2 do 4 dana. Kulture algi koje sadrže deformirane ili abnormalne stanice treba odbaciti.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 976
Dodatak 4.  
Analiza podataka nelinearnom regresijom  
Opce napomene  
Kod testova s algama i drugih testova mikrobnog rasta – rast biomase je po 
svojoj prirodi kontinuirana ili metricka varijabla – rezultat je brzina procesa, ako 
se koristi brzina rasta, odnosno njezin vremenski integral, ako je odabrana 
biomasa. Oba se parametra stavljaju u odnos prema odgovarajucem srednjem 
odgovoru ponavljanja neizloženih kontrola koje najjace reagiraju na dane uvjete; u testu s algama glavni cimbenici su svjetlost i temperatura. Sustav je podijeljen ili homogen, a biomasa se može promatrati kao kontinuum bez 
razmatranja pojedinacnih stanica. Razdioba varijance za odgovore kakvi se 
javljaju kod ovakvih sustava ovisi iskljucivo o pokusnim cimbenicima (koji se obicno opisuju putem lognormalnih ili normalnih razdioba greške). To je u suprotnosti s tipicnim odgovorima kod biopokusa s kvantalnim podacima, gdje 
se tolerancija (u pravilu s binomnom razdiobom) pojedinacnih organizama cesto 
smatra dominantnom komponentom varijance. Ovdje su odgovori kontrola nula ili na razini osnovne vrijednosti.
 
U najjednostavnijem slucaju, normirani odnosno relativni odgovor r jednoliko 
opada od 1 (nulta inhibicija) do 0 (stopostotna inhibicija). Valja napomenuti da su svi odgovori povezani s greškom te da se ocite negativne inhibicije mogu izracunati samo kao rezultat slucajne greške.
 
Regresijska analiza  
Modeli  
Cilj regresijske analize je kvantitativno opisati krivulju koncentracija-odgovor u 
obliku matematicke regresijske funkcije Y = f (C), ili cešce F (Z), gdje je Z = log 
C. Inverzna funkcija C = f  –1 (Y) omogucuje izracunavanje vrijednosti EC  x , 
ukljucujuci EC  50 , EC  10 i EC  20 i njihove granice pouzdanosti 95 %. Pokazalo 
se da nekoliko jednostavnih matematickih funkcija uspješno opisuju odnose 
koncentracija-odgovor koji se dobivaju u testovima inhibicije rasta algi. Te funk ­
cije obuhvacaju npr. logisticku jednadžbu, nesimetricnu Weibullovu jednadžbu i funkciju lognormalne razdiobe, koje sve predstavljaju sigmoidne krivulje koje se asimptotski približavaju vrijednosti 1 kod C → 0 i nuli kod C → beskonacno.
 
U zadnje vrijeme, kao alternativa asimptotskim modelima predlaže se korištenje 
modela neprekinute funkcije s pragom (npr. Kooijmanov model „inhibicije rasta populacije” (Kooijman i sur., 1996.). Ovaj model polazi od pretpostavke da u koncentracijama ispod odredenoga praga (EC0+) nema nikakvih ucinaka; EC0+ 
se procjenjuje ekstrapolacijom odnosa koncentracija-odgovor sa sjecištem u osi 
koncentracije primjenom jednostavne neprekinute funkcije koja nije diferencija ­
bilna u polaznoj tocki.
 
Valja napomenuti da se analiza može provesti jednostavnim minimiziranjem 
zbrojeva rezidualnih kvadrata (uz pretpostavku stalne varijance) ili ponderiranih kvadrata, ako se ispravlja heterogenost varijance.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 977
 
Postupak  
Postupak se može ukratko opisati na sljedeci nacin: Odabere se odgovarajuca 
funkcionalna jednadžba, Y = f (C), i prilagodi podacima nelinearnom regresijom. Poželjno je da se umjesto srednjih vrijednosti ponavljanja koriste mjerenja poje ­
dinacnih tikvica kako bi se iz podataka izvuklo što je moguce više informacija. 
Medutim, ako je varijanca visoka, prakticna iskustva pokazuju da srednje vrijed ­
nosti ponavljanja mogu dati pouzdaniju matematicku procjenu uz manji utjecaj sustavnih grešaka podataka nego što je to slucaj kad se zadrže pojedinacne tocke 
podataka.
 
Napravi se graficki prikaz prilagodene krivulje i izmjerenih podataka i provjeri je 
li prilagodavanje ispravno provedeno. Ovdje se posebno korisnom može pokazati 
analiza reziduala. Ako funkcionalni odnos koji je odabran za prilagodavanje 
krivulje koncentracija-odgovor ne opisuje dobro citavu krivulju ili neki njezin bitni dio, npr. odgovor pri niskoj koncentraciji, za prilagodavanje krivulje treba odabrati neku drugu opciju – npr. nesimetricna krivulja Weibullove funkcije 
umjesto simetricne. Negativne inhibicije mogu predstavljati problem npr. kod 
funkcije lognormalne razdiobe i zahtijevati da se upotrijebi i alternativna regre ­
sijska funkcija. Nije preporucljivo da se tim negativnim vrijednostima dodijeli vrijednost nula ili mala pozitivna vrijednost jer se time iskrivljuje razdioba 
grešaka. Ponekad je primjereno napraviti zasebno prilagodavanje odredenih dije ­
lova krivulje, npr. dio krivulje s niskom inhibicijom kako bi se dobila procjena vrijednosti EC
 low x . Iz prilagodene jednadžbe se izracunaju („inverznom procje ­
nom” C = f  –1 (Y)) karakteristicne procjene tocaka EC  x i dokumentira barem EC  50 
i jedna ili dvije procjene EC  low x . Iskustva s prakticnim ispitivanjima pokazuju da 
je test s algama dovoljno precizan da se u pravilu može dobiti dovoljno tocna procjena kod inhibicije od 10 %, pod uvjetom da su tocke podataka dostatne – 
osim ako se pri niskim koncentracija javlja stimulacija rasta kao zbunjujuci 
faktor. Preciznost procjene EC
 20 cesto je znatno veca od EC  10 jer je EC  20 
obicno smješten u približno linearnom dijelu središnje krivulje 
koncentracija-odgovor. Ponekad se EC  10 teško tumaci zbog stimulacije rasta. 
Prema tomu, iako se EC  10 u pravilu može dobiti s dovoljnom tocnošcu, prepo ­
rucuje se da se uz njega uvijek navede i EC  20 . 
Ponderi  
Varijanca pokusa opcenito nije stalna i obicno ukljucuje proporcionalnu kompo ­
nentu; stoga je uvijek dobro provesti ponderiranu regresiju. Kod takve analize obicno se uzima da su ponderi obrnuto proporcionalni varijanci.
 
W i = 1/Var(r  i ) 
Brojni regresijski programi nude mogucnost ponderirane regresijske analize 
primjenom pondera koji su navedeni u tablici. Ponderi se radi jednostavnosti 
normiraju množenjem s n/S w  i (n je broj tocaka podataka) tako da njihov 
zbroj bude 1.  
Normiranje odgovora  
Normiranjem srednjeg odgovora kontrola javljaju se neki temeljni problemi i 
dobiva prilicno komplicirana struktura varijance. Dijeljenjem odgovora sa 
srednjim odgovorom kontrola da bi se dobio postotak inhibicije uvodi se 
dodatna greška koja proizlazi iz greške srednje kontrolne vrijednosti. Osim kad je ta greška zanemarivo mala, ponderi regresije i granice pouzdanosti moraju se ispraviti za kovarijancu s kontrolom (17.). Ovdje je važna preciznost procjene 
srednje vrijednosti kontrolnih odgovora kako bi se smanjila ukupna varijanca 
relativnog odgovora. Ova se varijanca može opisati ovako:
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 978
 
(indeks i se odnosi na koncentraciju i, a indeks 0 na kontrolu)  
Y i = relativni odgovor = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
uz varijancu:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) ﬃ (∂Y i / ∂ r i ) 2 · Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 · Var (r  0 ) 
buduci da je  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 i (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
uz normalnu razdiobu podataka i ponavljanja m  i i m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
ukupna varijanca relativnog odgovora Y  i je prema tomu:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 .σ 2 /r 0 4 m 0 
Greška srednje kontrolne vrijednosti je obrnuto proporcionalna kvadratnom kori ­
jenu broja prosjecnih kontrolnih ponavljanja i stoga je ponekad opravdano uklju ­
citi podatke iz ranijih ispitivanja, cime se može znatno smanjiti greška. Druga je 
mogucnost da se umjesto normiranja podataka i prilagodavanja apsolutnih odgo ­
vora, ukljucujuci podatke o kontrolnim odgovorima, kontrolni odgovor uvede kao dodatni parametar koji se prilagodava linearnom regresijom. Ova metoda 
uz uobicajenu regresijsku jednadžbu s 2 parametra zahtijeva prilagodavanje 3 
parametra, tako da je potrebno više tocaka podataka nego što je to slucaj kod nelinearne regresije podataka normiranih na unaprijed definirani kontrolni odgovor.
 
Obrnuti intervali pouzdanosti  
Izracunavanje intervala pouzdanosti nelinearne regresije inverznom procjenom je 
prilicno složeno i ne predstavlja standardnu opciju u uobicajenim statistickim 
racunalnim programskim paketima. Približne granice pouzdanosti mogu se dobiti standardnim programima nelinearne regresije s reparametrizacijom (Bruce i Versteeg, 1992.), pri cemu se matematicka jednadžba mora preraditi 
tako da se na mjesto parametara za procjenu uvrste željene procjene tocaka, npr. 
EC
 10 i EC  50 . (Ako je funkcija I = f (a, ß, koncentracija), funkciju f (a, ß, 
koncentracija) treba zamijeniti istovjetnom funkcijom g (EC  10 , EC  50 , koncentra ­
cija), koristeci definicijske odnose f (a, ß, EC  10 ) = 0,1 i f (a, ß, EC  50 ) = 0,5.  
Izravniji izracun (Andersen i sur., 1998.) dobije se ako se zadrži izvorna 
jednadžba i upotrijebi Taylorov razvoj oko srednjih vrijednosti r  i i r 0 . 
U posljednje su vrijeme postale popularne metode samonadopunjavanja („boot 
strap” metode). Te metode ukljucuju procjenu empirijske razdiobe varijance na temelju izmjerenih podataka i ucestalog uzorkovanja primjenom generatora slucajnih brojeva.
 
Literatura  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. WaterResearch, 30, 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol.Chem.11, 1485-1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 979
 
C.4. ODRE ĐIVANJE „LAKE” BIORAZGRADIVOSTI  
I. DIO  OPĆENITO  
I.1. UVOD  
Opisano je šest ispitnih metoda koje omogu ćuju pretraživanje kemi ­
kalija na laku biorazgradivost u aerobnom vodenom mediju:  
(a) test opadanja otopljenog organskog ugljika (DOC) (metoda 
C.4.-A);  
(b) izmijenjeni test pretraživanja OECD – opadanje DOC-a (metoda 
C.4.-B);  
(c) test razvijanja ugljikovog dioksida (CO  2 ) (izmijenjeni Sturmov 
test) (metoda C.4.-C);  
(d) manometrijsko-respirometrijski test (metoda C.4.-D);  
(e) test sa zatvorenim bocama (metoda C.4.-E);  
(f) MITI (Ministry of International Trade and Industry – Japan) 
(metoda C.4.-F)  
U dijelu I. metode nalaze se op će napomene za svih šest testova. 
Specifičnosti pojedinih metoda navedene su u dijelovima od II. do 
VII. Dodaci sadrže definicije, formule i smjernice.  
Međulaboratorijsko poredbeno ispitivanje OECD-a iz 1988. pokazalo 
je da metode daju dosljedne rezultate. Ipak, odre đenoj se metodi 
može dati prednost ovisno o fizikalnim svojstvima tvari koja se ispituje.
 
I.2. ODABIR ODGOVARAJU ĆE METODE  
Informacije o topljivosti kemikalije, tlaku pare i adsorpcijskim svoj ­
stvima klju čne su za odabir najprikladnije metode. Za izra čunavanje 
teoretskih vrijednosti i/ili provjeru izmjerenih vrijednosti parametara npr. TPK, ThCO
 2 , DOC, TOC, KPK treba biti poznata kemijska 
struktura ili formula (vidjeti dodatke 1. i 2.).  
Ispitivane kemikalije koje su topljive u vodi do najmanje 100 mg/l 
mogu se ocijeniti svim metodama pod uvjetom da nisu hlapljive i nisu adsorptivne. Prikladne metode za kemikalije koje su slabo topljive u vodi, hlapljive ili adsorptivne navedene su u tablici 1. 
Postupanje s kemikalijama koje su slabo topljive u vodi i hlapljivim 
kemikalijama opisan je u Dodatku 3. Umjereno hlapljive kemikalije mogu se ispitivati metodom opadanja DOC-a ako u ispitnim posu ­
dama (koje moraju biti dobro za čepljene) ima dovoljno plinskog 
prostora. U tom slu čaju treba predvidjeti abioti čku kontrolu da bi 
se mogli uzeti u obzir mogu ći fizički gubici.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 980
 
Tablica 1.:  
Primjenljivost ispitnih metoda  
Test Analiti čka metoda  Prikladnost za tvari koje su:  
slabo topljive  hlapljive  adsorptivne  
Test opadanja DOC-a  Otopljeni organski ugljik  —  —  +/–  
Izmijenjeni test pretraživanja 
OECD  Otopljeni organski ugljik  —  —  +/–  
Test razvijanja CO  2 Respirometrija: razvijanje 
CO 2 + —  +  
Manometrijsko-respirome ­
trijski test  Manometrijska respirome ­
trija: potrošnja kisika  + +/–  +  
Test sa zatvorenim bocama  Respirometrija: otopljeni 
kisik  +/– +  +  
MITI  Respirometrija: potrošnja 
kisika  + +/–  +  
Za tumačenje dobivenih rezultata potrebne su informacije o čistoći ili 
relativnim udjelima glavnih komponenti ispitivane tvari, posebno ako su vrijednosti niske ili grani čne.
 
Informacije o toksi čnosti ispitivane kemikalije za bakterije (Dodatak 
4.) mogu biti vrlo korisne za odabir prikladnih ispitnih koncentracija 
te mogu biti klju čne za pravilno tuma čenje niskih vrijednosti 
biorazgradnje.  
I.3. REFERENTNE TVARI  
Za provjeru postupka koriste se referentne kemikalije koje ispunja ­
vaju kriterije za laku biorazgradivost; prikladnu tikvicu s referentnom tvari treba postaviti paralelno uz obi čni ispitni niz.
 
Prikladne kemikalije su anilin (svježe destiliran), natrijev acetat i 
natrijev benzoat. Sve se te referentne kemikalije razgra đuju u ovim 
postupcima, čak i bez dodavanja inokuluma.  
Predloženo je da se prona đe referentna kemikalija koja je lako 
biorazgradiva, ali ipak zahtijeva dodavanje inokuluma. Predložen je 
kalijev hidrogenftalat; me đutim, da bi on bio prihva ćen kao refe ­
rentna tvar, potrebno je pribaviti još dokaza.  
Spojevi koji sadrže dušik mogu u respirometrijskim ispitivanjima 
utjecati na potrošnju kisika nitrifikacijom (vidjeti dodatke 2. i 5.).  
I.4. NA ČELO ISPITNIH METODA  
Otopina ili suspenzija ispitivane tvari u mineralnom mediju se inoku ­
lira i inkubira u aerobnim uvjetima u mraku ili na difuznoj svjetlosti. Količina DOC-a u ispitnoj otopini koja potje če od inokuluma treba 
biti što manja u odnosu na koli činu DOC-a koja potje če od ispiti ­
vane tvari. Kako bi se uzela u obzir endogena aktivnost inokuluma, izvode se paralelne slijepe probe s inokulumom bez ispitivane tvari, iako endogena aktivnost stanica u prisutnosti tvari ne će točno odgo­
varati aktivnosti u endogenoj kontroli. Paralelno se izvodi ispitivanje 
s referentnom tvari radi provjere postupaka.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 981
 
Općenito, razgradnja se prati odre đivanjem parametara kao što su 
DOC, nastajanje CO  2 i potrošnja kisika, uz provedbu mjerenja u 
dovoljno u čestalim razmacima da se može odrediti po četak i kraj 
biorazgradnje. Automatski spirometri omogu ćuju neprekidno mjere ­
nje. DOC se ponekad mjeri dodatno uz neki drugi parametar, ali se 
to obično čini samo na po četku i na kraju ispitivanja. Za ocjenjivanje 
primarne razgradnje ispitivane tvari i odre đivanje koncentracije 
nastalih intermedijera može se koristiti i specifi čna kemijska 
analiza (obvezatno kod testa MITI).  
Ispitivanje u pravilu traje 28 dana. Ipak, ispitivanje se može završiti i 
prije 28. dana tj. čim krivulja biorazgradnje dosegne plato, na 
temelju najmanje tri odre đivanja. Ispitivanja se mogu nastaviti i 
nakon 28. dana ako krivulja pokazuje da je biorazgradnja zapo čela, 
ali 28. dana nije postignut plato.  
I.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
I.5.1.  Obnovljivost  
Zbog prirode biorazgradnje i miješanih populacija bakterija koje se 
koriste kao inokulumi odre đivanja treba provoditi najmanje 
dvostruko.  
Iskustva pokazuju da što je ve ća koncentracija mikroorganizama koji 
se na po četku dodaju u ispitni medij, to su manje razlike izme đu 
višestrukih odre đivanja. Osim toga, prstenasti testovi su pokazali da 
mogu postojati velike razlike izme đu rezultata razli čitih laboratorija, 
ali se kod spojeva koji se lako biološki razgra đuju uglavnom postiže 
dobra podudarnost.  
I.5.2.  Valjanost ispitivanja  
Ispitivanje se smatra valjanim ako su razlike izme đu krajnjih vrijed ­
nosti višestrukih odre đivanja opadanja ispitivane kemikalije na 
platou, na kraju ispitivanja odnosno na kraju roka od 10 dana 
manje od 20 % i ako je postotak razgradnje referentne tvari do 
14. dana dosegao razinu za laku biorazgradivost. Ako bilo koji od ovih uvjeta nije zadovoljen, ispitivanje treba ponoviti. Zbog strogosti metoda niske vrijednosti ne zna če nužno da ispitivana tvar nije 
biorazgradiva u okolišnim uvjetima, ali ukazuju na to da su za utvr ­ 
đivanje biorazgradivosti potrebna dodatna ispitivanja.
 
Ako je u toksikološkom testu s ispitivanom tvari i referentnom 
kemikalijom razgradnja u 14 dana niža od 35 % (na temelju DOC-a) ili niža od 25 % (na temelju TPK ili ThCO
 2 ), može se 
pretpostaviti da ispitivane kemikalije imaju inhibitorni u činak (vidjeti 
također Dodatak 4.). Niz ispitivanja treba ponoviti, po mogu ćnosti s 
nižom koncentracijom ispitivane kemikalije i/ili višom koncentra ­
cijom inokuluma, ali ne iznad 30 mg krute tvari po litri.  
I.6. OP ĆI POSTUPCI I PRIPREME  
Opći uvjeti ispitivanja sažeto su prikazani u tablici 2. Aparatura i 
drugi pokusni uvjeti koji su specifi čni za pojedine testove opisani su 
u nastavku u pripadaju ćim poglavljima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 982
 
Tablica 2.  
Ispitni uvjeti  
Test Test opadanja 
DOC-a  Test razvijanja 
CO 2 Manometrijsko- 
respirometrijski 
test Izmijenjeni test 
pretraživanja 
OECD  Test sa 
zatvorenim 
bocama  MITI (I)  
Koncentracija 
ispitivane tvari
 
u mg/l  100  2 – 10  100  
mg DOC/l  10 – 40  10 – 20  10 – 40  
mg TPK/l  50 – 100  5 – 10  
Koncentracija 
inokuluma (u stanicama/l, približno)
 ≤ 30 mg/l 
SK ili ≤ 100 ml 
otpadne vode/l 
(10 7 – 10  8 ) 0,5 ml 
sekundarne 
otpadne 
vode/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
otpadne 
vode/l 
(10 4 – 10  6 ) 30 mg/l SK 
(10 7 – 10  8 ) 
Koncentracija 
elemenata u 
mineralnom mediju (u mg/l):
 
P 116  11,6  29  
N 1,3  0,13  1,3  
Na 86  8,6  17,2  
K 122  12,2  36,5  
Mg 2,2  2,2  6,6  
Ca 9,9  9,9  29,7  
Fe 0,05-0,1  0,05-0,1  0,15  
pH 7,4 ±0,2  po mogu ć­
nosti 7,0  
Temperatura  22 ± 2 °C  25 ± 1 °C  
DOC = otopljeni organski ugljik  TPK = teoretska potrošnja 
kisika  SK = suspendirana kruta tvar  
I.6.1.  Voda za razrje đivanje  
Koristi se deionizirana ili destilirana voda koja ne sadrži inhibitorne 
koncentracije toksi čnih tvari (npr. ioni Cu  ++ ). Ona ne smije sadrža ­
vati više od 10 % organskog ugljika uvedenog putem ispitivanog materijala. Visoka čistoća ispitne vode nužna je kako bi se izbjegle 
visoke vrijednosti slijepih proba. One čišćenje može proizlaziti iz 
unutarnjih ne čistoća, ali i ionskih izmjenjiva čkih smola te liziranog 
materijala iz bakterija i algi. Za svaki niz ispitivanja treba koristiti vodu iz iste šarže, koja je prethodno provjerena analizom DOC-a. 
Ova provjera nije nužna kod testa sa zatvorenim bocama, ali potro ­ 
šnja kisika vode mora biti niska.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 983
 
I.6.2.  Radne otopine mineralnih komponenti  
Za pripremu ispitnih otopina potrebno je pripremiti radne otopine s 
odgovaraju ćim koncentracijama mineralnih komponenti. Radne 
otopine u nastavku mogu se koristiti (uz razli čite faktore razrje đenja) 
za test opadanja DOC-a, izmijenjeni test pretraživanja OECD, test 
razvijanja CO  2 , manometrijsko-respirometrijski test i test sa zatvo ­
renim bocama.  
Faktori razrje đenja i posebna priprema mineralnog medija za test 
MITI nalaze se u poglavljima koja se odnose na pojedine testove.  
Radne otopine:  
Pripreme se sljede će radne otopine s analiti čki čistim reagensima. 
(a) monokalijev dihidrogen ortofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g  
dikalijev monohidrogen ortofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g  
dinatrijev monohidrogen ortofosfat dihidrat, 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g  
amonijev klorid, NH  4 Cl 0,50 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre. pH otopine 
treba biti 7,4.  
(b) kalcijev klorid, bezvodni, CaCl  2 27,50 g  
ili kalcijev klorid dihidrat, CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
(c) magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
(d) željezo (III) klorid heksahidrat, FeCl  3 . 6H  2 O 0,25 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
Napomena:  Kako se ova otopina ne bi morala pripremati neposredno 
prije uporabe, može se dodati jedna kap konc. HCl ili 0,4 g dinatri ­
jeve soli etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA) po litri.  
I.6.3.  Radne otopine kemikalija  
Na primjer, ako je topljivost viša od 1 g/l, 1 – 10 g (prema potrebi) 
ispitivane odnosno referentne kemikalije se otopi u deioniziranoj 
vodi i nadopuni do 1 litre. U protivnom se radne otopine pripremaju u mineralnom mediju, ili se kemikalija izravno dodaje u mineralni medij. Za postupanje s manje topljivim tvarima vidjeti Dodatak 3., s 
time da se kod testa MITI (metoda C.4.-F) ne smiju koristiti ni 
otapala ni emulgatori.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 984
 
I.6.4.  Inokulumi  
Inokulum se može dobiti iz razli čitih izvora: aktivni mulj, otpadne 
vode (neklorirane), površinske vode i tla ili iz kombinacije tih izvora. Ako se kod provedbe testa opadanja DOC-a, testa razvijanja CO
 2 ili 
manometrijsko-respirometrijskog testa koristi aktivni mulj, treba ga 
uzeti iz postrojenja za pro čišćavanje ili laboratorijske jedinice u koju 
pretežito ulazi komunalna otpadna voda. Pokazalo se da se korište ­
njem inokuluma iz drugih izvora dobiva ve će raspršenje rezultata. Za 
izmijenjeni test pretraživanja OECD i test sa zatvorenim bocama 
potreban je razrje đeniji inokulum bez pahuljica mulja, po mogu ćnosti 
dobiven iz sekundarne otpadne vode postrojenja ili laboratorijske 
jedinice za pro čišćavanje komunalnih otpadnih voda. Inokulum za 
test MITI dobiva se iz kombinacije izvora, a opisan je u poglavlju koje se odnosi na taj test.
 
I.6.4.1.  Inokulum iz aktivnog mulja  
Uzme se svježi uzorak aktivnog mulja iz aeracijskog bazena postro ­
jenja za pro čišćavanje otpadnih voda ili laboratorijske jedinice koja 
pretežito pro čišćava komunalne otpadne vode. Grube čestice se 
prema potrebi uklone filtriranjem kroz fino sito te se mulj nakon 
tog održava aerobnim.  
Kao druga mogu ćnost, mulj se nakon uklanjanja grubih čestica može 
istaložiti ili centrifugirati (npr. 10 minuta na 100 g). Supernatant se baca. Mulj se može oprati u mineralnom mediju. Koncentrirani se 
mulj suspendira u mineralnom mediju tako da se dobije koncentra ­
cija od 3 – 5 g suspendirane krute tvari/l i dozra čuje do uporabe.
 
Mulj treba uzeti iz ispravnog konvencionalnog ure đaja. Ako se mulj 
mora uzeti iz brzih pro čišćivača ili se sumnja da sadrži inhibitore, 
treba ga oprati. Resuspendirani mulj se nakon temeljitog miješanja 
pusti da se istaloži ili centrifugira, supernatant se baci i oprani mulj ponovno resuspendira u dodatnoj koli čini mineralnog medija. Ovaj 
se postupak ponavlja sve dok u mulju ima viška supstrata ili 
inhibitora.
 
Nakon što se postigne potpuna resuspenzija kao i u slu čaju neobra ­ 
đenog mulja, neposredno prije uporabe treba uzeti uzorak i odrediti 
suhu masu suspendirane krute tvari.  
Još jedna od mogu ćnosti je homogenizacija aktivnog mulja (3 – 5 g 
suspendirane krute tvari/l). Mulj se obradi u mehani čkoj mješalici 
dvije minute na srednjoj brzini. Izmiješani se mulj pusti da se istaloži 30 minuta, prema potrebi i duže, nakon čega se teku ćina koja će se 
koristiti kao inokulum preta če u omjeru 10 ml po litri mineralnog 
medija.
 
I.6.4.2.  Ostali izvori inokuluma  
Inokulum se može dobiti iz sekundarne otpadne vode postrojenja za 
pročišćavanje ili laboratorijske jedinice u koju pretežito ulaze komu ­
nalne otpadne vode. Uzme se svježi uzorak i održava aerobnim tijekom prijenosa. Pusti se da se istaloži 1 sat ili profiltrira kroz grubi filtar-papir i preto čena otpadna voda odnosno filtrat održava 
aerobnim do uporabe. Ova vrsta inokuluma može se koristiti u 
omjeru do 100 ml po litri medija.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 985
 
Jedan od izvora inokuluma je i površinska voda. U tom se slu čaju 
uzorak uzme iz prikladne površinske vode, npr. rijeka, jezero te se 
održava aerobnim do uporabe. Inokulum se prema potrebi može koncentrirati filtracijom ili centrifugiranjem.
 
I.6.5.  Prethodno kondicioniranje inokuluma  
Inokulum se može prethodno kondicionirati radi prilagodbe na 
pokusne uvjete, ali se ne smije prilago đavati na ispitivanu kemika ­
liju. Kondicioniranje se sastoji u dozra čivanju aktivnog mulja u 
mineralnom mediju odnosno sekundarne otpadne vode pet do sedam dana na ispitnoj temperaturi. Kondicioniranje ponekad može 
povećati preciznost ispitnih metoda smanjivanjem vrijednosti slijepih 
proba. Smatra se da je nepotrebno kondicionirati inokulum za test MITI.
 
I.6.6.  Abioti čke kontrole  
Kad je to potrebno, obavlja se provjera abioti čke razgradnje ispiti ­
vane tvari odre đivanjem opadanja DOC-a, potrošnje kisika odnosno 
razvijanja ugljikovog dioksida u sterilnim kontrolama bez inoku ­
luma. Sterilizacija se provodi filtriranjem kroz membranu (0,2 – 
0,45 mikrometara) ili dodavanjem prikladne toksi čne tvari u odgo ­
varajućoj koncentraciji. Ako se koristi membranska filtracija, uzorci 
se uzimaju asepti čki kako bi se održala sterilnost. Ako adsorpcija 
ispitivane kemikalije nije unaprijed isklju čena, u ispitivanja kod 
kojih se biorazgradnja mjeri kao opadanje DOC-a treba uklju čiti 
inokuliranu i otrovanu abioti čku kontrolu, posebno ako se kao 
inokulum koristi aktivni mulj.  
I.6.7.  Broj tikvica  
Broj tikvica u tipi čnom ispitivanju naveden je u poglavljima koja se 
odnose na pojedine testove.  
Mogu se koristiti sljede će vrste tikvica:  
— ispitna suspenzija: sadrži ispitivanu tvar i inokulum,  
— slijepa proba inokuluma: sadrži samo inokulum,  
— kontrola postupka: sadrži referentnu tvar i inokulum,  
— abioti čka sterilna kontrola: sterilna, sadrži ispitivanu tvar (vidjeti 
1.6.6.),  
— kontrola adsorpcije: sadrži ispitivanu tvar, inokulum i sredstvo za 
sterilizaciju,  
— kontrola toksi čnosti: sadrži ispitivanu tvar, referentnu tvar i 
inokulum.  
Određivanje u ispitnoj suspenziji i slijepoj probi inokuluma mora se 
obavezno provoditi paralelno. Preporu čljivo je da se i odre đivanja u 
drugim tikvicama provode paralelno.  
Ipak, to nije uvijek mogu će. Treba voditi ra čuna da se uzme 
dovoljno uzoraka odnosno da se napravi dovoljno o čitavanja kako 
bi se mogao odrediti postotak opadanja unutar roka od 10 dana.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 986
 
I.7. PODACI I VREDNOVANJE  
Za izračunavanje D  t (postotak razgradnje) koriste se srednje vrijed ­
nosti dvostrukog mjerenja parametra u ispitnim posudama i slijepoj probi inokuluma. Formule su navedene u nastavku u odjeljcima koji 
se odnose na pojedine testove. Tijek razgradnje treba prikazati 
grafički i označiti rok od 10 dana. Treba izra čunati i navesti postotak 
opadanja na kraju roka od 10 dana i vrijednost na platou odnosno na kraju ispitivanja, ovisno o slu čaju.
 
Spojevi koji sadrže dušik mogu kod respirometrijskih ispitivanja 
utjecati na potrošnju kisika nitrifikacijom (vidjeti dodatke 2. i 5.).  
I.7.1.  Mjerenje razgradnje putem odre đivanja DOC-a  
Da bi se mogla ocijeniti valjanost ispitivanja (vidjeti I.5.2.), za 
tikvice koje sadrže ispitivanu tvar treba zasebno izra čunati postotak 
razgradnje D  t u svakom vremenu uzorkovanja, koriste ći srednje 
vrijednosti dvostrukog mjerenja DOC-a. On se izra čunava pomo ću 
sljedeće jednadžbe:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î 
Ü 100 
gdje je:  
D t = % razgradnje u vremenu t  
C o = srednja po četna koncentracija DOC-a u inokuliranom mediju 
koji sadrži ispitivanu tvar (mg DOC/l)  
C t = srednja koncentracija DOC-a u inokuliranom mediju koji 
sadrži ispitivanu tvar u vremenu t (mg DOC/l)  
C bo = srednja po četna koncentracija DOC-a u inokuliranom 
mineralnom mediju slijepe probe (mg DOC/l)  
C bt = srednja koncentracija DOC-a u inokuliranom mineralnom 
mediju slijepe probe u vremenu t (mg DOC/l)  
Sve se koncentracije mjere pokusom.  
I.7.2.  Mjerenje razgradnje putem specifi čne analize  
Ako su raspoloživi specifi čni analitički podaci, primarna se bioraz ­
gradnja izra čunava kao:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
gdje je:  
D t = % razgradnje u vremenu t, obi čno 28 dana  
S a = preostala koli čina ispitivane tvari u inokuliranom mediju na 
kraju ispitivanja (mg)  
S b = preostala koli čina ispitivane tvari u slijepoj probi s vodom/me ­
dijem kojemu je dodana samo ispitivana tvar (mg)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 987
 
I.7.3.  Abioti čka razgradnja  
Ako se koristi abioti čka sterilna kontrola, postotak abioti čke razgra ­
dnje izračunava se kao:  
% abioičke razgradnje ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
gdje je:  
C s(o) = koncentracija DOC-a u sterilnoj kontroli na dan 0  
C s(t) = koncentracija DOC-a u sterilnoj kontroli na dan t  
I.8. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će: 
— ispitivana i referentna kemikalija i njihova čistoća, 
— ispitni uvjeti,  
— inokulum: vrsta i mjesto(-a) uzimanja uzoraka, koncentracija i 
prethodno kondicioniranje,  
— udio i vrsta industrijskog otpada koji je prisutan u otpadnoj vodi, 
ako je poznato,  
— trajanje ispitivanja i temperatura,  
— ako se ispituju slabo topljive kemikalije, provedena obrada,  
— primijenjena ispitna metoda; kod svih promjena postupka treba 
navesti znanstvene argumente i objašnjenje,  
— obrazac za dostavu podataka,  
— sve uo čene pojave inhibicije,  
— abioti čka razgradnja (ako je uo čena),  
— podaci iz specifi čne kemijske analize, ako su raspoloživi,  
— analiti čki podaci o intermedijerima, ako su raspoloživi,  
— graf postotka razgradnje u vremenu za ispitivanu i referentnu 
tvar; treba jasno ozna čiti fazu prilagodbe („lag” fazu), fazu 
razgradnje, rok od 10 dana i nagib (Dodatak 1.). Ako je ispiti ­
vanje zadovoljilo kriterije valjanosti, za graf se može koristiti srednja vrijednost postotaka razgradnje tikvica koje sadrže ispi ­
tivanu tvar,
 
— postotak opadanja nakon roka od 10 dana i na platou odnosno na 
kraju ispitivanja.  
II. DIO  TEST OPADANJA DOC-a  (metoda C.4.-A)  
II.1. NA ČELO METODE  
Izmjereni volumen inokuliranog mineralnog medija koji sadrži 
poznatu koncentraciju ispitivane tvari (10 – 40 mg DOC/l) kao 
jedini nominalni izvor organskog ugljika dozra čuje se u mraku ili 
na difuznoj svjetlosti na 22 ± 2 °C.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 988
 
Razgradnja se prati analizom DOC-a, koja se provodi u u čestalim 
razmacima tijekom razdoblja od 28 dana. Stupanj biorazgradnje izra ­ 
čunava se kao opadanje koncentracije DOC-a (ispravljeno za vrijed ­
nost slijepe probe s inokulumom), izraženo u postotku po četne 
koncentracije. Stupanj primarne biorazgradnje može se izra čunati iz 
dopunske kemijske analize u činjene na po četku i kraju inkubacije.  
II.2. OPIS METODE  
II.2.1.  Aparatura  
(a) stožaste tikvice npr. 250 ml do 2 l, ovisno o volumenu koji je 
potreban za analizu DOC-a;  
(b) tresilica za stožaste tikvice s automatskom regulacijom tempera ­
ture, ili smještena u prostoru sa stalnom temperaturom, koja ima 
dovoljnu snagu za održavanje aerobnih uvjeta u svim tikvicama;  
(c) uređaj za filtraciju, s prikladnim membranama;  
(d) analizator DOC-a;  
(e) uređaj za odre đivanje otopljenog kisika;  
(f) centrifuga.  
II.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Za pripremu radnih otopina vidjeti I.6.2.  
Pomiješa se 10 ml otopine (a) s 800 ml vode za razrje đivanje, doda 
1 ml otopina (b) do (d) i nadopuni vodom za razrje đivanje do 1 l.  
II.2.3.  Priprema i prethodno kondicioniranje inokuluma  
Inokulum se može dobiti iz razli čitih izvora: aktivni mulj, otpadne 
vode, površinske vode, tla ili iz kombinacije tih izvora.  
Vidjeti I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.  
II.2.4.  Priprema tikvica  
Na primjer, u stožaste tikvice od 2 l uvede se po 800 ml mineralnog 
medija i doda dovoljna koli čina radne otopine ispitivane odnosno 
referentne tvari da se dobije koncentracija kemikalije koja odgovara 10 – 40 mg DOC/l. Provjere se pH vrijednosti i prema potrebi podese na 7,4. Tikvice se inokuliraju aktivnim muljem ili drugim 
izvorom inokuluma (vidjeti I.6.4.) tako da se dobije kona čna koncen ­
tracija do najviše 30 mg suspendirane krute tvari po litri. Usto se pripreme kontrole s inokulumom u mineralnom mediju bez ispitivane i referentne kemikalije.
 
Jedna se posuda prema potrebi koristi za provjeru mogu ćeg inhibi­
tornog učinka ispitivane kemikalije; u tu se svrhu inokulira otopina 
koja sadrži usporedive koncentracije ispitivane i referentne kemika ­
lije u mineralnom mediju.  
Ako je to potrebno, treba pripremiti još jednu sterilnu tikvicu za 
provjeru abioti čke razgradnje ispitivane kemikalije, koja sadrži 
neinokuliranu otopinu kemikalije (vidjeti I.6.6.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 989
 
Osim toga, ako se sumnja da se ispitivana kemikalija zna čajno adsor ­
bira na staklo, mulj itd., treba provesti preliminarno ispitivanje kako 
bi se odredio vjerojatni obim adsorpcije, a time i prikladnost testa za tu kemikaliju (vidjeti tablicu 1.). Pripremi se tikvica koja sadrži ispitivanu kemikaliju, inokulum i sredstvo za sterilizaciju.
 
Sve se tikvice nadopune mineralnim medijem do 1 l te se nakon 
miješanja iz svake tikvice uzme uzorak za odre đivanje po četne 
koncentracije DOC-a (vidjeti Dodatak 2.4.). Otvori tikvica se 
prekriju npr. aluminijskom folijom na na čin koji omogu ćuje 
slobodnu izmjenu zraka izme đu tikvice i okolnog zraka. Zatim se 
posude stave u tresilicu i zapo činje se s ispitivanjem.  
II.2.5.  Broj tikvica u tipi čnom ispitivanju  
Tikvica 1 i 2: ispitna suspenzija  
Tikvica 3 i 4: slijepa proba inokuluma  
Tikvica 5: kontrola postupka  
po mogućnosti odnosno prema potrebi:  
Tikvica 6: abioti čka sterilna kontrola  
Tikvica 7: kontrola adsorpcije  
Tikvica 8: kontrola toksi čnosti  
Vidjeti tako đer I.6.7.  
II.2.6.  Provo đenje ispitivanja  
Koncentracije DOC-a se tijekom ispitivanja odre đuju dvostruko u 
svim tikvicama u poznatim vremenskim razmacima, koji moraju biti dovoljno u čestali da se može odrediti po četak roka od 10 dana 
i postotak opadanja na kraju roka od 10 dana. Kod svakog odre đi­
vanja treba uzeti samo nužnu koli činu ispitne suspenzije.
 
Prije uzimanja uzorka, u tikvicama se prema potrebi nadoknade 
gubici uslijed isparavanja dodavanjem potrebne koli čine vode za 
razrjeđivanje (I.6.1.). Medij se prije uzimanja uzorka temeljito promi ­
ješa, paze ći da se materijal koji prianja uz stijenke posuda prije 
uzorkovanja otopi odnosno suspendira. Uzorak se odmah nakon 
uzorkovanja filtrira kroz membranski filtar ili centrifugira (vidjeti Dodatak 2.4.). Filtrirane odnosno centrifugirane uzorke treba anali ­
zirati istog dana; u protivnome ih treba pohraniti na temperaturi od 2 
– 4 °C do najviše 48 sati ili, u dužem vremenu, ispod -18 °C.
 
II.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
II.3.1.  Obrada rezultata  
Izračuna se postotak razgradnje u vremenu t, kako je navedeno u 
I.7.1. (odre đivanje DOC-a) i, fakultativno, u I.7.2. (specifi čna anali­
za). 
Svi se rezultati upišu u odgovaraju će obrasce za dostavu podataka.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 990
 
II.3.2.  Valjanost rezultata  
Vidjeti I.5.2.  
II.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
II.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca nalazi se u nastavku.  
TEST OPADANJA DOC-a  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: … mg/l kao kemikalija  
Početna koncentracija u mediju, t  0 : … mg/l kao kemikalija  
4. INOKULUM  
Izvor:  
Obrada:  
Prethodno kondicioniranje, ako se provodi:  
Koncentracija suspendirane krute tvari u reakcijskoj smjesi: mg/l  
5. ODRE ĐIVANJA UGLJIKA  
Analizator ugljika:  
Tikvica br.  DOC nakon n dana (mg/l)  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Ispitivana kemika ­
lija plus inokulum  
1 a 1 
a 2 
a, srednja 
vrijednost 
C a(t) 
2 b1 
b2 
b, srednja 
vrijednost 
C b(t) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 991
 
Tikvica br.  DOC nakon n dana (mg/l)  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Slijepa proba s 
inokulumom bez 
ispitivane kemika ­
lije 3 C 1 
C 2 
C, srednja 
vrijednost C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, srednja 
vrijednost 
C d(t) 
C b1ðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VREDNOVANJE SIROVIH PODATAKA  
Tikvica br.  % razgradnje nakon n dana  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ 1 Ä C aðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C aðoÞ Ä C b1ðoÞ Í Î  
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ 1 Ä C bðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C bðoÞ Ä C b1ðoÞ Í Î  
Ü 100 0 
Srednja 
vrijednost (*)  D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 i D 2 se ne uprosje čuju ako se vrijednosti znatno razlikuju.  
Napomena:  Slični se obrasci mogu koristiti za referentnu kemikaliju i 
kontrolu toksi čnosti.  
7. ABIOTI ČKA KONTROLA  (fakultativno)  
Vrijeme (dani)  
0 t  
Konc. DOC (mg/l) u sterilnoj kontroli  C s(o) C s(t) 
% abioičke razgradnje ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFI ČNA KEMIJSKA ANALIZA  (fakultativno)  
preostala koli čina ispitivane 
kemikalije na kraju ispitivanja 
(mg/l)  % primarne razgradnje  
Sterilna kontrola  S  b ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 992
 
preostala koli čina ispitivane 
kemikalije na kraju ispitivanja 
(mg/l)  % primarne razgradnje  
Inokulirani ispitni medij  S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DIO III.  IZMIJENJENI TEST PRETRAŽIVANJA OECD  
(metoda C.4.-B)  
III.1. NA ČELO METODE  
Izmjereni volumen mineralnog medija koji sadrži poznatu koncen ­
traciju ispitivane tvari (10 – 40 mg DOC/l) kao jedini nominalni 
izvor organskog ugljika inokulira se s 0,5 ml otpadne vode po litri 
medija. Smjesa se dozra čuje u mraku ili na difuznoj svjetlosti na 
22 ± 2 °C.  
Razgradnja se prati analizom DOC-a, koja se provodi u u čestalim 
razmacima tijekom razdoblja od 28 dana. Stupanj biorazgradnje izra ­ 
čunava se kao opadanje koncentracije DOC-a (ispravljeno za vrijed ­
nost slijepe probe s inokulumom), izraženo u postotku po četne 
koncentracije. Stupanj primarne biorazgradnje može se izra čunati iz 
dopunske kemijske analize u činjene na po četku i kraju inkubacije.  
III.2. OPIS METODE  
III.2.1.  Aparatura  
(a) stožaste tikvice npr. od 250 ml do 2 l, ovisno o volumenu koji je 
potreban za analizu DOC-a;  
(b) tresilica – za stožaste tikvice, s automatskom regulacijom 
temperature ili smještena u prostoriji sa stalnom temperaturom, 
koja ima dovoljnu snagu za održavanje aerobnih uvjeta u svim tikvicama;
 
(c) uređaj za filtraciju, s prikladnim membranama;  
(d) analizator DOC-a;  
(e) uređaj za odre đivanje otopljenog kisika;  
(f) centrifuga.  
II.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Za pripremu radnih otopina vidjeti I.6.2.  
Pomiješa se 10 ml otopine (a) s 80 ml vode za razrje đivanje, doda 
1 ml otopina (b) do (d) i nadopuni vodom za razrje đivanje do 1 l.  
Kod ove se metode kao inokulum koristi samo 0,5 ml otpadne vode 
po litri, tako da je medij ponekad potrebno poja čati elementima u 
tragovima i faktorima rasta. To se može u činiti dodavanjem 1 ml 
svake od ovih otopina po litri kona čnog medija:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 993
 
otopina elemenata u tragovima: 
manganov sulfat tetrahidrat, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg  
borna kiselina, H  3 BO 3 57,2 mg  
cinkov sulfat heptahidrat, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg  
amonijev heptamolibdat (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg  
Fe kelat (FeCl  3 etilendiamintetraoctena kiselina)  100,0 mg  
Otopiti u vodi za razrje đivanje i nadopuniti vodom za 
razrjeđivanje do 1 000 ml.  
Vitaminska otopina:  
ekstrakt kvasca  15,0 mg  
Ekstrakt kvasca otopi se u 100 ml vode. Sterilizira se propuštanjem 
kroz membranski filtar od 0,2 mikrona ili svježe pripremi.  
III.2.3.  Priprema i prethodno kondicioniranje inokuluma  
Inokulum se dobiva iz sekundarne otpadne vode postrojenja za 
pročišćavanje ili laboratorijske jedinice u koju pretežito ulaze komu ­
nalne otpadne vode. Vidjeti I.6.4.2. i I.6.5.  
Koristi se 0,5 ml po litri mineralnog medija.  
III.2.4.  Priprema tikvica  
Na primjer, u stožaste tikvice od 2 l uvede se po 800 ml mineralnog 
medija i doda dovoljna koli čina radne otopine ispitivane odnosno 
referentne tvari da se dobije koncentracija kemikalije koja odgovara 10 – 40 mg DOC/l. Provjeri se pH vrijednost i prema potrebi podesi 
na 7,4. Tikvice se inokuliraju otpadnom vodom u omjeru 0,5 ml/l 
(vidjeti I.6.4.2.). Usto se pripreme kontrole s inokulumom u mineralnom mediju bez ispitivane i referentne kemikalije.
 
Jedna se posuda prema potrebi koristi za provjeru mogu ćeg inhibi­
tornog učinka ispitivane kemikalije; u tu se svrhu inokulira otopina 
koja sadrži usporedive koncentracije ispitivane i referentne kemika ­
lije u mineralnom mediju.  
Ako je to potrebno, treba pripremiti još jednu sterilnu tikvicu za 
provjeru abioti čke razgradnje ispitivane kemikalije, koja sadrži 
neinokuliranu otopinu kemikalije (vidjeti I.6.6.).  
Osim toga, ako se sumnja da se ispitivana kemikalija zna čajno adsor ­
bira na staklo, mulj itd., treba provesti preliminarno ispitivanje kako 
bi se odredio vjerojatni obim adsorpcije, a time i prikladnost testa za 
tu kemikaliju (vidjeti tablicu 1.). Pripremi se tikvica koja sadrži ispitivanu kemikaliju, inokulum i sredstvo za sterilizaciju.
 
Sve se tikvice nadopune mineralnim medijem do 1 l te se nakon 
miješanja iz svake tikvice uzme uzorak za odre đivanje po četne 
koncentracije DOC-a (vidjeti Dodatak 2.4.). Otvori tikvica prekriju se npr. aluminijskom folijom na na čin koji omogu ćuje slobodnu 
izmjenu zraka izme đu tikvice i okolnog zraka. Zatim se posude 
stave u tresilicu i zapo činje s ispitivanjem.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 994
 
III.2.5.  Broj tikvica u tipi čnom ispitivanju  
Tikvica 1 i 2: ispitna suspenzija  
Tikvica 3 i 4: slijepa proba inokuluma  
Tikvica 5: kontrola postupka  
te po mogu ćnosti odnosno prema potrebi:  
Tikvica 6: abioti čka sterilna kontrola  
Tikvica 7: kontrola adsorpcije  
Tikvica 8: kontrola toksi čnosti  
Vidjeti tako đer 1.6.7.  
III.2.6.  Provo đenje ispitivanja  
Koncentracije DOC-a se tijekom ispitivanja odre đuju dvostruko u 
svim tikvicama u poznatim vremenskim razmacima, koji moraju 
biti dovoljno u čestali da se može odrediti po četak roka od 10 dana 
i postotak opadanja na kraju roka od 10 dana. Kod svakog odre đi­
vanja treba uzeti samo nužnu koli činu ispitne suspenzije.  
Prije uzimanja uzorka, u tikvicama se prema potrebi nadoknade 
gubici uslijed isparavanja dodavanjem potrebne koli čine vode za 
razrjeđivanje (I.6.1.). Medij se prije uzimanja uzorka temeljito promi ­
ješa, paze ći da se materijal koji prianja uz stijenke posuda prije 
uzorkovanja otopi odnosno suspendira. Uzorak se odmah nakon uzorkovanja filtrira kroz membranski filtar ili centrifugira (vidjeti 
Dodatak 2.4.). Filtrirane odnosno centrifugirane uzorke treba anali ­
zirati istog dana; u protivnome ih treba pohraniti na temperaturi od 2 – 4 °C do najviše 48 sati ili, u dužem vremenu, ispod – 18 °C.
 
III.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
III.3.1.  Obrada rezultata  
Izračuna se postotak razgradnje u vremenu t, kako je navedeno u 
I.7.1. (odre đivanje DOC-a) i, fakultativno, u 1.7.2. (specifi čna anali­
za). 
Svi se rezultati upišu u odgovaraju će obrasce za dostavu podataka.  
III.3.2.  Valjanost rezultata  
Vidjeti I.5.2.  
III.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
III.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca nalazi se u nastavku  
IZMIJENJENI TEST PRETRAŽIVANJA OECD  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 995
 
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: … mg/l kao kemikalija  
Početna koncentracija u mediju, t  0 : … mg/l kao kemikalija  
4. INOKULUM  
Izvor:  
Obrada:  
Prethodno kondicioniranje, ako se provodi:  
Koncentracija suspendirane krute tvari u reakcijskoj smjesi: mg/l  
5. ODRE ĐIVANJA UGLJIKA  
Analizator ugljika:  
Tikvica br.  DOC nakon n dana (mg/l)  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Ispitivana kemika ­
lija plus inokulum  
1 a 1 
a 2 
a, srednja 
vrijednost 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, srednja 
vrijednost 
C b(t) 
Slijepa proba s 
inokulumom bez 
ispitivane kemika ­
lije 3 C 1 
C 2 
C, srednja 
vrijednost C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, srednja 
vrijednost 
C d(t) 
C b1ðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VREDNOVANJE SIROVIH PODATAKA  
Tikvica br.  % razgradnje nakon n dana  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ 1 Ä C aðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C aðoÞ Ä C b1ðoÞ Í Î  
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 996
 
Tikvica br.  % razgradnje nakon n dana  
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ 1 Ä C bðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C bðoÞ Ä C b1ðoÞ Í Î  
Ü 100 0 
Srednja 
vrijednost (*)  D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 i D 2 se ne uprosje čuju ako se vrijednosti znatno razlikuju.  
Napomena:  Slični se obrasci mogu koristiti za referentnu kemikaliju 
i kontrolu toksi čnosti.  
7. ABIOTI ČKA KONTROLA  (fakultativno)  
Vrijeme (dani)  
0 t  
Konc. DOC (mg/l) u sterilnoj kontroli  C s(o) C s(t) 
% abioičke razgradnje ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFI ČNA KEMIJSKA ANALIZA  (fakultativno)  
preostala koli čina ispitivane 
kemikalije na kraju ispitivanja 
(mg/l)  % primarne razgradnje  
Sterilna kontrola  S  b 
Inokulirani ispitni medij  S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
IV. DIO  TEST RAZVIJANJA CO  2 (metoda C.4.-C)  
IV.1. NA ČELO METODE  
Izmjereni volumen inokuliranog mineralnog medija koji sadrži 
poznatu koncentraciju ispitivane kemikalije (10 – 20 mg DOC ili 
TOC/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljika dozra čuje se 
uvođenjem zraka bez ugljikovog dioksida kontroliranom brzinom u 
mraku ili na difuznoj svjetlosti. Razgradnja se prati tijekom 28 dana određivanjem nastalog ugljikovog dioksida koji je vezan u barijevom 
ili natrijevom hidroksidu i koji se mjeri titracijom preostalog hidro ­
ksida ili kao anorganski ugljik. Koli čina ugljikovog dioksida oslo ­
bođena iz ispitivane kemikalije (ispravljena za vrijednost slijepe 
probe inokuluma) izražava se kao postotak ThCO
 2 . Stupanj bioraz ­
gradnje može se izra čunati i iz dopunske analize DOC-a u činjene na 
početku i kraju inkubacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 997
 
IV.2. OPIS METODE  
IV.2.1.  Aparatura  
(a) tikvice 2 – 5 litara s cjev čicom za dozra čivanje koja seže gotovo 
do dna posude i ispustom;  
(b) magnetske mješalice, kod ocjenjivanja slabo topljivih kemikalija;  
(c) boce za apsorpciju plina;  
(d) uređaj za regulaciju i mjerenje protoka zraka;  
(e) uređaj za ispiranje ugljikovog dioksida, za pripremu zraka bez 
ugljikovog dioksida; umjesto tog može se koristiti smjesa kisika 
bez CO  2 i dušika bez CO  2 iz plinskih boca u odgovaraju ćem 
omjeru (20 % O  2 : 80 % N  2 ); 
(f) uređaj za odre đivanje ugljikovog dioksida, bilo titracijom ili 
putem analizatora organskog ugljika;  
(g) uređaj za membransku filtraciju (prema izboru);  
(h) analizator DOC-a (prema izboru).  
IV.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Za pripremu radnih otopina vidjeti I.6.2.  
Pomiješa se 10 ml otopine (a) s 800 ml vode za razrje đivanje, doda 
1 ml otopina (b) do (d) i nadopuni vodom za razrje đivanje do 1 l.  
IV.2.3.  Priprema i prethodno kondicioniranje inokuluma  
Inokulum se može dobiti iz razli čitih izvora: aktivni mulj, otpadne 
vode, površinske vode, tla ili iz kombinacije tih izvora.  
Vidjeti I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.  
IV.2.4.  Priprema tikvica  
Volumeni i mase navedeni u nastavku vrijede za 5-litarske tikvice 
koje sadrže 3 l suspenzije. Ako se koriste manji volumeni, vrijed ­
nosti treba proporcionalno izmijeniti, vode ći računa da se nastali 
ugljikov dioksid mora to čno mjeriti.  
U svaku tikvicu od 5 litara stavi se 2 400 ml mineralnog medija. 
Doda se odgovaraju ći volumen pripremljenog aktivnog mulja (vidjeti 
I.6.4.1. i I.6.5.), tako da se u kona čnoj inokuliranoj smjesi od 3 l 
dobije koncentracija suspendirane krute tvari do najviše 30 mg/l. 
Druga je mogu ćnost da se pripremljeni mulj prvo razrijedi, tako da 
se dobije suspenzija u mineralnom mediju od 500 – 1 000 mg/l, i alikvot doda sadržaju 5-litarske tikvice kako bi se dobila koncentra ­
cija od 30 mg/l; ovo osigurava ve ću preciznost. Mogu se koristiti i 
drugi izvori inokuluma (vidjeti I.6.4.2.).
 
Inokulirane smjese se preko no ći dozračuju zrakom bez CO  2 kako bi 
se sustav o čistio od ugljikovog dioksida.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 998
 
Ispitivana i referentna tvar dodaju se odvojeno u paralelne tikvice 
kao radne otopine poznatog volumena tako da se dobiju koncentra ­
cije dodanih kemikalija od 10 do 20 mg DOC ili TOC/l; nekoliko tikvica bez kemikalija koristi se za kontrolu inokuluma. Slabo topljive ispitivane tvari treba dodati izravno u tikvice na bazi mase 
ili volumena ili s njima postupati kako je opisano u Dodatku 3.
 
Jedna se tikvica prema potrebi koristi za provjeru mogu ćeg inhibi­
tornog učinka ispitivane kemikalije; za to u posudu treba dodati 
ispitivanu i referentnu kemikaliju u koncentracijama koje se koriste u ostalim tikvicama.
 
Ako je to potrebno, jednu sterilnu tikvicu koja sadrži neinokuliranu 
otopinu kemikalije treba upotrijebiti za provjeru abioti čke razgradnje 
ispitivane kemikalije (vidjeti I.6.6.). Sterilizacija se provodi dodava ­
njem toksi čne tvari u odgovaraju ćoj koncentraciji.  
Volumeni suspenzija u svim tikvicama nadopune se do 3 l dodava ­
njem mineralnog medija koji je prethodno dozra čen zrakom bez 
CO 2 . Uzorci se po izboru mogu uzeti za analizu DOC-a (vidjeti 
Dodatak 2.4.) i/ili specifi čnu analizu. Apsorpcijske boce treba 
spojiti na ispuste tikvica.  
Ako se koristi barijev hidroksid, na svaku se 5-litarsku tikvicu spoje 
tri apsorpcijske boce u nizu, od kojih svaka sadrži 100 ml 0,0125 M otopine barijevog hidroksida. Otopina ne smije sadržavati nataloženi 
sulfat i karbonat i njezinu jakost treba odrediti neposredno prije 
uporabe. Ako se koristi natrijev hidroksid, priklju če se dva odvaja ča, 
od kojih drugi služi kao kontrola kako bi se pokazalo da je prvi odvajač apsorbirao sav ugljikov dioksid. Prikladne su apsorpcijske 
boce sa zatvara čem za serumske bo čice. U svaku se bocu doda 
200 ml 0,05 M natrijevog hidroksida, što je dovoljno da se apsorbira čitava koli čina ugljikovog dioksida koja nastaje kod potpune razgra ­
dnje ispitivane kemikalije. Otopina natrijevog dioksida, čak i onda 
ako je svježe pripremljena, sadrži tragove karbonata; stoga je 
potrebno u činiti ispravak oduzimanjem karbonata u slijepoj probi.
 
IV.2.5.  Broj tikvica u tipi čnom ispitivanju  
Tikvica 1 i 2: ispitna suspenzija  
Tikvica 3 i 4: slijepa proba inokuluma  
Tikvica 5: kontrola postupka  
te po mogu ćnosti odnosno prema potrebi:  
Tikvica 6: abioti čka sterilna kontrola  
Tikvica 7: kontrola toksi čnosti  
Vidjeti tako đer I.6.7.  
IV.2.6.  Provo đenje ispitivanja  
Ispitivanje zapo činje propuhivanjem zraka bez CO  2 kroz suspenzije 
brzinom od 30 – 100 ml/min. Uzorci apsorbensa ugljikovog dioksida uzimaju se periodi čki radi analize sadržaja CO
 2 . Preporučuje se da se 
tijekom prvih deset dana analiza provodi svaki drugi ili tre ći dan, a 
nakon toga svaki peti dan sve do 28. dana, kako bi se mogao utvrditi 
rok od 10 dana.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 999
 
28. dana uzmu se uzorci za analizu DOC-a i/ili specifi čnu analizu 
(po izboru), izmjeri se pH suspenzija i u svaku tikvicu doda 1 ml 
koncentrirane klorovodi čne kiseline; tikvice se dozra čuju preko no ći 
kako bi se iz ispitnih suspenzija istjerao ugljikov dioksid. 29. dana se provede zadnja analiza razvijenog ugljikovog dioksida.
 
U dane mjerenja CO  2 apsorber s barijevim hidroksidom najbliži 
tikvici odspoji se i hidroksidna se otopina titrira s HCl 0,05 M, 
koristeći fenolftalein kao indikator. Ostali apsorberi se pomaknu za 
jedno mjesto bliže tikvici i na kraj niza postavi novi apsorber koji sadrži 100 ml svježeg 0,0125 M barijevog hidroksida. Titracija se provodi prema potrebi, npr. kad se uo či znatno taloženje u prvom 
odvajaču, ali prije nego što ono postane vidljivo u drugom odvaja ču, 
a najmanje jedanput tjedno. Druga mogu ćnost, ako se kao apsorbens 
koristi NaOH, je da se u apsorberu bliže tikvici špricom uzme mali 
uzorak (ovisno o svojstvima analizatora ugljika koji se koristi) 
otopine natrijevog hidroksida. Uzorak se uštrca u dio analizatora ugljika za anorganski ugljik i izravno analizira razvijeni ugljikovog dioksid.
 
Sadržaj drugog odvaja ča analizira se samo na kraju ispitivanja, kako 
bi se mogao u činiti ispravak za mogu ći prijenos ugljikovog dioksida.  
IV.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
IV.3.1.  Obrada rezultata  
Količina CO  2 vezana u apsorberu odre đuje se kod titracije kao:  
mgCO  2 ¼ ð100 Ü C B Ä 0,5 Ü V Ü C A Þ Ü 44 
gdje je:  
V = volumen HCl upotrijebljen za titraciju 100 ml u apsorberu 
(ml) 
C B = koncentracija otopine barijevog hidroksida (M)  
C A = koncentracija otopine klorovodi čne kiseline (M)  
ako je C  B 0,0125 M i C  A je 0,05 M, za titraciju 100 ml barijevog 
hidroksida potrebno je 50 ml, a masa CO  2 je: 
0,05 
2 Ü 44 Ü ml titrirane HCl ¼ 1,1 Ü ml HCl  
Dakle, u ovom slu čaju, faktor za pretvorbu volumena HCl upotrijeb ­
ljenog u titraciji u mg CO  2 je 1,1.  
Masa CO  2 oslobođena iz samog inokuluma i masa CO  2 oslobođena 
iz inokuluma s ispitivanom kemikalijom izra čunava se uz pomo ć 
odgovaraju ćih titracijskih vrijednosti, a razlika je masa CO  2 oslobo­ 
đena iz same ispitivane kemikalije.  
Na primjer, ako se titracijom samog inokuluma dobije vrijednost 
48 ml, a inokuluma s ispitivanom kemikalijom 45 ml,  
CO 2 iz inokuluma = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1000
 
CO 2 iz inokuluma s ispitivanom kemikalijom = 1,1 × (50 – 45) = 
5,5 mg  
te je, prema tomu, masa CO  2 oslobođena iz ispitivane kemikalije 
3,3 mg.  
Postotak biorazgradnje izra čunava se kao:  
% razgradnje ¼ mg oslobo đenog CO  2 Ü 100 
ThCO  2 Ü mg dodane ispitivane kemikalije  
ili 
% razgradnje ¼ mg oslobo đenog CO  2 Ü 100 
mg TO dodanog u ispitivanju  Ü 3,67  
pri čemu je 3,67 faktor konverzije (44/12) ugljika u ugljikov dioksid.  
Postotak razgradnje nakon bilo kojeg vremena dobije se zbrajanjem 
postotnih vrijednosti ThCO  2 izračunanih za svaki dan mjerenja do 
tog vremena.  
Kod apsorbera s natrijevim hidroksidom koli čina oslobo đenog uglji ­
kovog dioksida, izražena kao IC (mg), izra čunava se množenjem 
koncentracije IC u apsorbensu volumenom apsorbensa.  
Postotak razgradnje izra čunava se kao:  
% ThCO  2 ¼ mg IC u tikvici Ä mg IC slijepe probe 
MG TOC dodan kao ispitivana kemikalija  Ü 100 
Opadanja DOC-a (fakultativno) izra čunava se kako je opisano u I.7. 
Te i sve druge rezultate treba upisati u odgovaraju će obrasce.  
IV.3.2.  Valjanost rezultata  
Sadržaj IC u suspenziji ispitivane kemikalije u mineralnom mediju 
na početku ispitivanja mora biti ispod 5 % TC, a ukupni CO  2 
razvijen u slijepoj probi inokuluma na kraju ispitivanja u pravilu 
ne bi smio biti viši od 40 mg/l medija. Ako se dobiju vrijednosti iznad 70 mg CO
 2 /l, treba kriti čki preispitati podatke i pokusnu 
tehniku.  
Vidjeti tako đer I.5.2.  
IV.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
IV.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca nalazi se u nastavku.  
TEST RAZVIJANJA UGLJIKOVOG DIOKSIDA  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: … mg/l kao kemikalija  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1001
 
Početna koncentracija u mediju: … mg/l kao kemikalija  
Ukupni C dodan u tikvicu: … mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. INOKULUM  
Izvor:  
Obrada:  
Prethodno kondicioniranje, ako se provodi:  
Koncentracija suspendirane krute tvari u reakcijskoj smjesi: mg/l  
Vrijeme 
(dan)  Oslobođeni CO  2 
Ispitivanje (mg)  Oslobođeni CO  2 
Slijepa proba (mg)  Oslobođeni CO  2 
kumulativno (mg) 
(ispitivanje minus 
slijepa proba, srednja 
vrijednost)  ThCO  2 
kumulativno  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 srednja 
vrijednost  3 
4 srednja 
vrijednost  1 2  1  2  srednja 
vrijednost  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Napomena:  Slični se obrasci mogu koristiti za referentnu kemikaliju 
i kontrolu toksi čnosti.  
6. ANALIZA UGLJIKA  (fakultativno)  
Analizator ugljika:  
Vrijeme (dan)  Slijepa proba mg/l  Ispitivana kemikalija mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*)  C  b(t) C t 
(*) Ili na kraju inkubacije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1002
 
% opadanja DOC Ä a : ¼ ð 1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Þ Ü 100 
7. ABIOTI ČKA RAZGRADNJA  (fakultativno)  
% abioičke razgradnje ¼ tvorba CO  2 u sterilnoj kontroli nakon 28 dana  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
V. DIO  MANOMETRIJSKO-RESPIROMETRIJSKI TEST  
(metoda C.4.-D)  
V.1. NA ČELO METODE  
Izmjereni volumen inokuliranog mineralnog medija koji sadrži 
poznatu koncentraciju ispitivane kemikalije (100 mg/l ispitivane tvari tako da se dobije najmanje 50 – 100 mg TPK/l) kao jedini nominalni izvor organskog ugljika miješa se u zatvorenoj tikvici na 
stalnoj temperaturi (± 1 °C ili manje) do najviše 28 dana. Potrošnja 
kisika odre đuje se mjerenjem koli čine kisika (dobivenog elektroliti ­ 
čki) koja je potrebna za održavanje stalnog volumena plina u respi ­
rometarskoj tikvici ili iz promjene volumena ili tlaka (ili jednog i 
drugog) u aparaturi. Nastali ugljikov dioksid apsorbira se u otopini 
kalijevog hidroksida ili drugom prikladnon apsorbensu. Koli čina 
kisika koju je potrošila ispitivana kemikalija (ispravljena za vrijed ­
nost slijepe probe inokuluma, koja se izvodi paralelno) izražava se 
kao postotak ThCO
 2 ili KPK. Fakultativno se može izra čunati i 
primarna biorazgradnja iz dopunske specifi čne analize u činjene na 
početku i kraju inkubacije te potpuna biorazgradnja analizom 
DOC-a.  
V.2. OPIS METODE  
V.2.1.  Aparatura  
(a) prikladan respirometar;  
(b) termostat koji održava temperaturu na ± 1 °C ili bolji;  
(c) uređaj za membransku filtraciju (fakultativno);  
(d) analizator ugljika (fakultativno).  
V.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Za pripremu radnih otopina vidjeti I.6.2.  
Pomiješa se 10 ml otopine (a) s 800 ml vode za razrje đivanje, doda 
1 ml otopina (b) do (d) i nadopuni vodom za razrje đivanje do 1 l.  
V.2.3.  Priprema i prethodno kondicioniranje inokuluma  
Inokulum se može dobiti iz razli čitih izvora: aktivni mulj, otpadne 
vode, površinske vode i tla ili iz kombinacije tih izvora.  
Vidjeti I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.  
V.2.4.  Priprema tikvica  
Iz radnih otopina se odvojeno pripreme otopine ispitivane i refe ­
rentne kemikalije u mineralnom mediju, u pravilu u koncentraciji 
od 100 mg kemikalije po litri (tako da se dobije najmanje 50 – 
100 mg TPK/l).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1003
 
TPK se izra čunava na temelju tvorbe amonijevih soli, osim ako se 
očekuje nitrifikacija, u kom se slu čaju izračun temelji na tvorbi 
nitrata (vidjeti Dodatak 2.2.).  
Odrede se pH vrijednosti i prema potrebi podese na 7,4 ± 0,2.  
Slabo topljive tvari treba dodati u kasnijoj fazi (vidjeti u nastavku).  
Ako treba odrediti toksi čnost ispitivane kemikalije, pripremi se još 
jedna otopina u mineralnom mediju koja sadrži istu koncentraciju 
ispitivane i referentne kemikalije kao pojedina čne otopine.  
Ako je potrebno mjerenje fizikalno-kemijske potrošnje kisika, 
pripremi se otopina ispitivane kemikalije, u pravilu u koncentraciji 100 mg TPK/l, sterilizirana dodavanjem prikladne toksi čne tvari 
(vidjeti I.6.6.).
 
Potrebne koli čine otopine ispitivane i referentne kemikalije uvode se 
u najmanje po dvije paralelne tikvice. Osim toga, treba pripremiti tikvice koje sadrže samo mineralni medij (za kontrolu inokuluma) te, prema potrebi, miješanu otopinu ispitivane i referentne kemikalije i 
sterilnu otopinu.
 
Ako je ispitivana kemikalija slabo topljiva, ona se u ovoj fazi dodaje 
izravno na bazi mase ili volumena ili se s njom postupa kako je 
opisano u Dodatku 3. U odjeljke apsorbera CO  2 stavi se kalijev 
hidroksid, pelete natronskog vapna ili drugi apsorbens.  
V.2.5.  Broj tikvica u tipi čnom ispitivanju  
Tikvica 1 i 2: ispitna suspenzija  
Tikvica 3 i 4: slijepa proba inokuluma  
Tikvica 5: kontrola postupka  
po mogućnosti odnosno prema potrebi:  
Tikvica 6: sterilna kontrola  
Tikvica 7: kontrola toksi čnosti  
Vidjeti tako đer I.6.7.  
V.2.6.  Provo đenje ispitivanja  
Kada se postigne željena temperatura, posude se inokuliraju priprem ­
ljenim aktivnim muljem ili drugim izvorom inokuluma da se dobije koncentracija suspendirane krute tvari do najviše 30 mg/l. Sastavi se 
oprema, pokrene mješa č i provjeri zrakonepropusnost te zapo čne s 
mjerenjem potrošnje kisika. Nakon toga je obi čno dovoljno obavljati 
redovita o čitavanja i svakodnevno nadzirati temperaturu i miješanje.
 
Potrošnja kisika izra čunava se iz vrijednosti koje se o čitavaju u 
učestalim i redovitim razmacima metodama koje navodi proizvo đač 
opreme. Na kraju inkubacije, u pravilu 28 dana, izmjeri se pH sadr ­ 
žaja tikvica, posebno ako je potrošnja kisika niska ili viša od 
TPKNH  4 (kod spojeva koji sadrže dušik).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1004
 
Ako je to potrebno, na po četku i na kraju se iz respirometarskih 
tikvica uzmu uzorci za analizu DOC-a ili specifi čnu kemijsku 
analizu (vidjeti Dodatak 2.4.). Kod po četnog uzimanja uzorka treba 
voditi računa da u tikvici ostane poznati volumen ispitne suspenzije. 
Ako kisik troši ispitivana tvar koja sadrži dušik, odredi se pove ćanje 
koncentracije nitrita i nitrata u razdoblju od 28 dana i napravi 
ispravak za kisik potrošen nitrifikacijom (Dodatak 5.).  
V.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
V.3.1.  Obrada rezultata  
Potrošnja kisika (mg) ispitivane kemikalije nakon odre đenog 
vremena (ispravljena za vrijednost slijepe probe inokuluma nakon 
istog vremena) podijeli se s upotrijebljenom masom ispitivane kemi ­
kalije. Tako se dobije BPK izražen u mg kisika po mg ispitivane kemikalije tj.:
 
BPK ¼ ðmg potrošnja O  2 ispitivane kemikalije  Ä mg potrošnja O  2 slijepe probeÞ 
ðmg ispitivane kemikalije u tikvici Þ 
= mg O  2 po mg ispitivane kemikalije  
izračuna se postotak biorazgradnje kao:  
% biodegradare ¼ % TPK ¼ % BPKðmg O  2=mg kemikalijeÞ 
TPKðmg O  2 kemikalijeÞ Ü 100 
ili 
% KPK ¼ % BPKðmg O  2=mg kemikalijeÞ 
KPKðmg O  2 kemikalijeÞ Ü 100 
Valja napomenuti da ove dvije metode ne daju nužno isti rezultat; 
prednost se daje prvoj metodi.  
Kod ispitivanih tvari koje sadrže dušik treba koristiti odgovaraju ći 
TPK (NH  4 ili NO  3 ), ovisno o tomu da li se o čekuje pojava nitrifi ­
kacije (Dodatak 2.2.). Ako je došlo do nepotpune nitrifikacije, izra ­ 
čuna se ispravak za kisik potrošen nitrifikacijom iz promjene 
koncentracije nitrita i nitrata (Dodatak 5.).  
Ako se provode fakultativna odre đivanja organskog ugljika i/ili 
specifična kemijska analiza, postotak razgradnje izra čunava se kako 
je opisano u I.7.  
Sve rezultate treba upisati u priložene obrasce za dostavu podataka.  
V.3.2.  Valjanost rezultata  
Potrošnja kisika slijepe probe inokuluma u pravilu iznosi 20 – 30 mg 
O 2 /l i ne bi smjela biti viša od 60 mg/l u 28 dana. Kod vrijednosti 
iznad 60 mg/l potrebno je kriti čki preispitati podatke i pokusne 
tehnike. Ako je pH vrijednost izvan podru čja 6 – 8,5 i ako je potro ­ 
šnja kisika ispitivane kemikalije manja od 60 %, ispitivanje treba 
ponoviti s nižom koncentracijom ispitivane kemikalije.  
Vidjeti tako đer I.5.2.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1005
 
V.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
V.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca za dostavu podataka nalazi se u nastavku.  
MANOMETRIJSKO-RESPIROMETRIJSKI TEST  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: … mg/l  
Početna koncentracija u mediju, C  o : … mg/l  
Volumen u ispitnoj tikvici (V): … ml  
TPK ili KPK: … mg O  2 /mg ispitivane tvari (NH  4 ili NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Izvor:  
Obrada:  
Prethodno kondicioniranje, ako se provodi:  
Koncentracija suspendirane krute tvari u reakcijskoj smjesi: … 
mg/l 
5. POTROŠNJA KISIKA: BIORAZGRADIVOST  
Vrijeme (dani)  
0 7  14  21  28  
Potrošnja O  2 
(mg) ispitivna 
kemikalija  1 
2 
a, srednja 
vrijednost  
Potrošnja O  2 
(mg) slijepa 
proba  3 
4 
b, srednja 
vrijednost  
Ispravljeni 
BPK (mg)  (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BPK po mg 
ispitivane kemikalije
 \displaystyle  
a 1 Ä b 
C o V 
a 2 Ä b 
C o V ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1006
 
Vrijeme (dani)  
0 7  14  21  28  
% razgradnje  
BPK 
TPK Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Srednja 
vrijednost (*)  
V = volumen medija u ispitnoj tikvici 
(*) D  1 i D 2 se ne uprosje čuju ako se vrijednosti znatno razlikuju.  
Napomena:  Slični se obrasci mogu koristiti za referentnu kemikaliju 
i kontrolu toksi čnosti.  
6. ISPRAVAK ZA NITRIFIKACIJU  (vidjeti Prilog V.)  
Dan 0  28  Razlika  
i. Koncentracija nitrata (mg N/l)  (N)  
ii. Ekvivalent kisika (4,57 × N × V) (mg)  —  —  
iii. Koncentracija nitrita (mg N/l)  (N)  
iv. Ekvivalent kisika (3,43 × N × V) (mg)  —  —  
(ii. + iv.) Ukupni ekvivalent kisika  —  —  
7. ANALIZA UGLJIKA  (fakultativno)  
Analizator ugljika:  
Vrijeme (dan)  Slijepa proba mg/l  Ispitivana kemikalija mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*)  (C  blt ) (C  t ) 
(*) Ili na kraju inkubacije.  
% COD eliminat ¼ 1 Ä C t Ä C blðtÞ 
C o Ä C blo Í Î  
Ü 100 
8. SPECIFI ČNA KEMIJSKA ANALIZA  (fakultativno)  
S b = koncentracija u fizikalno-kemijskoj (sterilnoj) kontroli 
nakon 28 dana  
S a = koncentracija u inokuliranoj tikvici nakon 28 dana  
% biorazgradnje ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTI ČKA RAZGRADNJA  (fakultativno)  
a = potrošnja kisika u sterilnim tikvicama nakon 28 dana, (mg)  
potrošnja kisika po mg ispitivane kemikalije  ¼ a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1007
 
(vidjeti odjeljke 1. i 3.)  
% abiotičke razgradnje ¼ a Ü 100 
C o V Ü TPK  
DIO VI.  TEST SA ZATVORENIM BOCAMA  (metoda C.4.-E)  
VI.1. NA ČELO ISPITNE METODE  
Otopina ispitivane kemikalije u mineralnom mediju, obi čno 2 – 
5 mg/l, inokulira se relativno malim brojem mikroorganizama iz miješane populacije i drži u potpuno napunjenim zatvorenim bocama u mraku na stalnoj temperaturi. Razgradnja se prati putem 
analize otopljenog kisika tijekom razdoblja od 28 dana. Potrošnja 
kisika ispitivane kemikalije, ispravljena za potrošnju kisika paralelne slijepe probe inokuluma, izražava se kao postotak TPK ili KPK.
 
VI.2. OPIS METODE  
VI.2.1.  Aparatura  
(a) boce BPK sa staklenim čepovima, npr. 250 – 300 ml;  
(b) vodena kupelj ili inkubator za držanje boca na stalnoj tempera ­
turi (± 1 °C ili bolji) bez pristupa svjetlosti;  
(c) velike staklene boce (2 – 5 litara) za pripremu medija i punjenje 
boca BPK;  
(d) kisikova elektroda i mjera č kisika odnosno oprema i reagensi za 
Winklerovu titraciju.  
VI.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Za pripremu radnih otopina vidjeti I.6.2.  
Promiješa se 1 (jedan) ml otopine (a) do (d) i nadopuni vodom za 
razrjeđivanje do 1 litre.  
VI.2.3.  Priprema inokuluma  
Inokulum se u pravilu dobiva iz sekundarne otpadne vode postro ­
jenja za pro čišćavanje ili laboratorijske jedinice u koju pretežito 
ulaze komunalne otpadne vode. Drugi mogu ći izvor inokuluma je 
površinska voda. Uglavnom se koristi jedna kap (0,05 ml) do 5 ml filtrata po litri medija; ponekad je potrebno izvesti pokuse kako bi se 
utvrdio optimalni volumen za pojedinu otpadnu vodu (vidjeti I.6.4.2. 
i I.6.5.).
 
VI.2.4.  Priprema tikvica  
Mineralni medij se intenzivno dozra čuje najmanje 20 min. Svaki niz 
ispitivanja treba provesti s mineralnim medijem iz iste šarže. Op će­
nito, medij je spreman za uporabu nakon što odstoji 20 sati na ispitnoj temperaturi. Odredi se koncentracija otopljenog kisika u svrhu kontrole; vrijednost bi trebala biti oko 9 mg/l na 20 °C. U 
svim postupcima prijenosa i punjenja zrakom zasi ćenog medija treba 
izbjeći stvaranje mjehuri ća, na primjer uporabom sifona.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1008
 
Pripreme se paralelne skupine boca BPK za odre đivanje BPK ispi ­
tivane i referentne kemikalije u simultanim pokusnim nizovima. 
Postavi se dovoljan broj boca BPK, uklju čujući slijepe probe inoku ­
luma, kako bi se u željenim vremenskim razmacima, npr. nakon 0, 7, 14, 21 i 28 dana, mogla obaviti najmanje dvostruka mjerenja potro ­ 
šnje kisika. Ponekad je za utvr đivanje roka od 10 dana potrebno i 
više boca.
 
Potpuno dozra čeni mineralni medij ulije se u velike boce tako da 
ispuni oko 1/3 njihove zapremnine. Zatim se u boce doda dovoljna količina radne otopine ispitivane ili referentne kemikalije tako da 
konačna koncentracija kemikalija uglavnom ne bude viša od 10 mg/l. 
Kemikalije se ne dodaju u veliku bocu s medijem koji služi kao slijepa proba.
 
Koncentracija otopljenog kisika u bocama BPK ne smije pasti ispod 
0,5 mg/l kako se ne bi ograni čila aktivnost inokuluma. Time je 
koncentracija ispitivane kemikalije ograni čena na otprilike 2 mg/l. 
Ipak, kod slabo razgradivih spojeva i spojeva s niskim TPK može se upotrijebiti i 5 – 10 mg/l. U odre đenim je slu čajevima preporu čljivo 
provesti paralelna ispitivanja s dvije razli čite koncentracije ispitivane 
kemikalije, npr. 2 i 5 mg/l. TPK se u pravilu izra čunava na temelju 
tvorbe amonijevih soli, s time da se u o čekivanim odnosno poznatim 
slučajevima nitrifikacije izra čun temelji na tvorbi nitrata (TPK
 NO3 : 
vidjeti Dodatak 2.2.). Ako nastupi nepotpuna nitrifikacija, treba 
učiniti ispravak za promjene koncentracije nitrita i nitrata utvr đene 
analizom (vidjeti Dodatak 5.).  
Ako se ispituje toksi čnost ispitivane kemikalije (npr. ako je pret ­
hodno utvr đena niska vrijednost biorazgradnje), potreban je još 
jedan niz boca.  
Potrebno je pripremiti još jednu veliku bocu koja sadrži dozra čeni 
mineralni medij (do oko jedne tre ćine zapremnine) s ispitivanom i 
referentnom kemikalijom, čija je kona čna koncentracija u pravilu 
jednaka koncentraciji u drugim velikim bocama.  
Otopine u velikim bocama inokuliraju se sekundarnom otpadnom 
vodom (jedna kap ili oko 0,05 ml do 5 ml/l) ili drugim izvorom, kao što je rje čna voda (vidjeti I.6.4.2.). Otopine se na kraju nado ­
pune dozra čenim mineralnim medijem uz pomo ć crijeva koje seže do 
dna boce kako bi se postiglo potrebno miješanje.
 
VI.2.5.  Broj boca u tipi čnom ispitivanju  
U tipičnom se ispitivanju koriste sljede će boce:  
— najmanje 10 boca koje sadrže ispitivanu kemikaliju i inokulum 
(ispitna suspenzija),  
— najmanje 10 boca koje sadrže samo inokulum (slijepa proba 
inokuluma),  
— najmanje 10 boca koje sadrže referentnu kemikaliju i inokulum 
(kontrola postupka),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1009
 
— prema potrebi, šest boca koje sadrže ispitivanu kemikaliju, refe ­
rentnu kemikaliju i inokulum (kontrola toksi čnosti). Ipak, 
ponekad je za odre đivanje roka od 10 dana potrebno otprilike 
dvostruko više boca.  
VI.2.6.  Provo đenje ispitivanja  
Pripremljene otopine se odmah preto če u odgovaraju će skupine boca 
BPK pomo ću crijeva iz donje četvrtine (ne dna) velikih boca, tako 
da sve boce BPK budu potpuno napunjene. Nježnim kvrckanjem po 
stijenki iz boca se uklone mogu ći mjehuri ći zraka. Boce se odmah 
analiziraju na otopljeni kisik u nultom vremenu Winklerovom metodom ili elektrodom. Sadržaj boca može se konzervirati za 
naknadnu analizu Winklerovom metodom dodavanjem mangan (II) 
sulfata i natrijevog hidroksida (prvi Winklerov reagens). Pažljivo začepljene boce, koje sadrže kisik fiksiran kao sme đi mangan (III) 
hidratizirani oksid, treba do nastavka Winklerovog postupka pohra ­
niti u mraku na 10 – 20 °C do najviše 24 sata. Preostale paralelne 
boce se za čepe, paze ći da u njima ne ostanu zarobljeni mjehuri ći 
zraka, i inkubiraju u mraku na 20 °C. Na svaki ispitni niz dolazi kompletan paralelni niz za odre đivanje vrijednosti slijepe probe 
inokuluma. Tijekom 28-dnevne inkubacije se iz svakog niza u odre ­ 
đenim vremenskim razmacima (najmanje jedanput tjedno) uzimaju 
najmanje po dvije boce radi analize otopljenog kisika.
 
Tjedni uzorci omogu ćuju ocjenu postotka opadanja unutar roka od 
14 dana, dok bi uzorkovanje svaka 3 do 4 dana trebalo omogu ćiti da 
se utvrdi rok od 10 dana, što zahtijeva otprilike dvostruko više boca.  
Kod ispitivanih tvari koje sadrže dušik treba u činiti ispravak za 
potrošnju kisika uslijed nitrifikacije. Za to je potrebno odrediti 
koncentraciju otopljenog kisika uz pomo ć kisikove elektrode i 
nakon tog uzeti uzorak iz boce BPK za analizu nitrita i nitrata. Potrošnja kisika izra čunava se iz pove ćanja koncentracije nitrita i 
nitrata (vidjeti Prilog V.).
 
VI.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
VI.3.1.  Obrada rezultata  
Prvo se izra čuna BPK nakon svakog vremenskog razdoblja oduzi ­
manjem potrošnje kisika (mg O  2 /l) slijepe probe inokuluma od potro ­ 
šnje kisika ispitivane kemikalije. Ispravljena vrijednost potrošnje podijeli se koncentracijom (mg/l) ispitivane kemikalije da bi se dobio specifi čni BPK u mg kisika po mg ispitivane kemikalije. 
Postotak biorazgradivosti izra čuna se tako da se specifi čni BPK 
podijeli specifi čnim TPK (izra čunan u skladu s Dodatkom 2.2.) ili 
KPK (odre đen analizom, vidjeti Dodatak 2.3.). Dakle:
 
BPK ¼ mg potrošnja O  2 ispitivane kemikalije  Ä mg potrošnja O  2 slijepe probe 
mg ispitivane kemikalije u tikvici  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1010
 
= mg O  2 po mg ispitivane kemikalije  
% razgradnje ¼ BPK ðmg O  2=mg ispitvane tvariÞ 
TPKðmg O  2=mg ispitivane tvari Þ Ü 100 
ili 
% razgradnje ¼ BPK ðmg O  2=mg ispitvane tvariÞ 
KPKðmg O  2=mg ispitivane tvari Þ Ü 100 
Valja napomenuti da ove dvije metode ne daju nužno isti rezultat; 
prednost se daje prvoj metodi.  
Kod ispitivanih tvari koje sadrže dušik treba koristiti odgovaraju ći 
TPK (NH  4 ili NO  3 ), ovisno o tomu da li se o čekuje pojava nitrifi ­
kacije (Dodatak 2.2.). Ako je došlo do nepotpune nitrifikacije, izra ­ 
čuna se ispravak za kisik potrošen nitrifikacijom iz promjene 
koncentracije nitrita i nitrata (Dodatak 5.).  
VI.3.2.  Valjanost rezultata  
Potrošnja kisika u slijepoj probi inokuluma ne bi smjela biti viša od 
1,5 mg otopljenog kisika po litri nakon 28 dana. Kod viših vrijed ­
nosti treba preispitati pokusne tehnike. Preostala koncentracija kisika u ispitnim bocama niti u jednom trenutku ne smije pasti ispod 
0,5 mg/l. Tako niske koncentracije kisika dopuštene su samo ako 
se primjenjuje metoda odre đivanja otopljenog kisika kojom se mogu 
točno mjeriti takve vrijednosti.
 
Vidjeti tako đer I.5.2.  
VI.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
VI.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca za dostavu podataka nalazi se u nastavku.  
TEST SA ZATVORENIM BOCAMA  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: … mg/l  
Početna koncentracija u boci: … mg/l  
TPK ili KPK: … mg O  2 /mg ispitivane tvari  
4. INOKULUM  
Izvor:  
Obrada:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1011
 
Prethodno kondicioniranje, ako se provodi:  
Koncentracija u reakcijskoj smjesi: … mg/l  
5. ODREĐIVANJE DO  
Metoda: Winkler/elektroda  
Analize tikvica  
Vrijeme inkubacije (d)  DO (mg/l)  
0 n  1 n 2 
Slijepa proba (bez 
kemikalije)  1 C  1 
2 C  2 
Srednja vrijednost  
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Ispitivana kemikalija  1  a  1 
2 a  2 
Srednja vrijednost  
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Napomena:  Sličan obrazac se može koristiti za referentnu kemikaliju 
i kontrolu toksi čnosti.  
6. ISPRAVAK ZA NITRIFIKACIJU  (vidjeti Prilog V.)  
Vrijeme inkubacije (d)  0  n  1 n 2 n 3 
i. Koncentracija nitrata (mg N/l)  
ii. Promjena koncentracije nitrata (mg N/l)  —  
iii. Ekvivalent kisika (mg/l)  —  
iv. Koncentracija nitrita (mg N/l)  
v. Promjena koncentracije nitrita (mg N/l)  —  
vi. Ekvivalent kisika (mg/l)  —  
(iii. + vi.) Ukupni ekvivalent kisika (mg/l)  —  
7. POTROŠNJA DO: % RAZGRADNJE  
Potrošnja nakon n dana (mg/l)  
n 1 n 2 n 3 
TIKVICA 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
TIKVICA 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1012
 
Potrošnja nakon n dana (mg/l)  
n 1 n 2 n 3 
TIKVICA 1: 
%D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
ispitna konc : Ü TPK kemikalije  
TIKVICA 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
ispitna konc : Ü TPK kemikalije  
% D srednja vrijednost (*) =  D 1 · D 2 
2 
(*) Srednja se vrijednost ne primjenjuje u slu čaju velikih razlika izme đu ponavljanja.  
m to = vrijednost u tikvici u vremenu 0  
m tx = vrijednost u tikvici u vremenu x  
m bo = srednja vrijednost slijepe probe u vremenu 0  
m bx = srednja vrijednost slijepe probe u vremenu x  
Treba primijeniti i ispravak za nitrifikaciju iz iii. + vi. u odjeljku 6.  
8. POTROŠNJA DO U SLIJEPOJ PROBI  
Potrošnja kisika slijepe probe: (m  bo – m  b28 ) mg/l. Ova je potro ­ 
šnja važna za valjanost ispitivanja. Ona treba biti niža od 
1,5 mg/l.  
DIO VII.  TEST M.I.T.I.  (metoda C.4.-F)  
VII.1. NA ČELO METODE  
Potrošnja kisika otopine ili suspenzije ispitivane kemikalije u 
mineralnom mediju, inokuliranom posebno uzgojenim neprilago ­ 
đenim mikroorganizmima, mjeri se automatski tijekom 28 dana u 
zamračenom zatvorenom respirometru na 25 ± 1 °C, uz stalno mije ­ 
šanje. Nastali ugljikov dioksid apsorbira natronsko vapno. Bioraz ­
gradivost se izražava kao postotak potrošnje kisika (ispravljen za vrijednost slijepe probe) u odnosu na teoretsku potrošnju (TPK). Osim toga, postotak primarne biorazgradivosti izra čunava se iz 
dopunske specifi čne kemijske analize u činjene na po četku i kraju 
inkubacije te, fakultativno, analizom DOC-a.
 
VII.2. OPIS METODE  
VII.2.1.  Aparatura  
(a) automatski elektroliti čki mjerač BPK ili respirometar, u pravilu 
opremljen sa šest boca po 300 ml s čašama za apsorbens CO  2 ; ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1013
 
(b) prostor sa stalnom temperaturom i/ili vodena kupelj 25 ± 1 °C ili 
bolja;  
(c) uređaj za membransku filtraciju (fakultativno);  
(d) analizator ugljika (fakultativno).  
VII.2.2.  Priprema mineralnog medija  
Pripreme se sljede će radne otopine s analiti čki čistim reagensima i 
vodom (I.6.1.); 
(a) monokalijev dihidrogen ortofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g  
dikalijev monohidrogen ortofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g  
dinatrijev monohidrogen ortofosfat dodekahidrat 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g  
amonijev klorid, NH  4 Cl 1,70 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
pH vrijednost otopine treba biti 7,2.  
(b) magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
(c) kalcijev klorid bezvodni, CaCl  2 27,50 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
(d) Željezo (III) klorid heksahidrat, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g  
Otopiti u vodi i nadopuniti do 1 litre.  
Uzme se po 3 ml otopine (a), (b), (c) i (d) i nadopuni do 1 litre.  
VII.2.3.  Priprema inokuluma  
Treba prikupiti svježe uzorke s najmanje deset mjesta, uglavnom s 
područja gdje se koriste i ispuštaju razli čite kemikalije. Uzmu se 1- 
litarski uzorci mulja, površinskog tla, vode itd. s mjesta kao što su 
postrojenja za pro čišćavanje komunalnih i industrijskih otpadnih 
voda, rijeke, jezera, mora i sve zajedno dobro izmiješa. Nakon ukla ­
njanja plutaju ćih čestica smjesa se pusti da odstoji i supernatat 
podesi na pH 7 ± 1 pomo ću natrijevog hidroksida ili fosforne 
kiseline.  
Posuda za aktivni mulj sa sistemom punjenja i pražnjenja napuni se 
odgovaraju ćom količinom filtriranog supernatata i teku ćina dozra čuje 
oko 23 ½ sata. 30 minuta nakon prekida dozra čivanja baci se otpri ­
like jedna tre ćina ukupnog volumena supernatanta i istaloženom 
materijalu doda isti volumen otopine (pH 7) koja sadrži po 0,1 % glukoze, peptona i monokalijevog ortofosfata te ponovno zapo čne s 
dozračivanjem. Ovaj se postupak ponavlja jedanput dnevno. 
Uređajem za mulj treba upravljati u skladu s dobrom praksom: 
voda treba biti bistra, temperaturu treba održavati na 25 ± 2 °C, pH treba biti 7 ± 1, mulj se mora dobro taložiti, treba osigurati dostatno dozra čivanje kako bi smjesa u svakom trenutku bila aero ­
bna, trebaju biti prisutne praživotinje, aktivnost mulja treba provje ­
ravati najmanje jedanput u tri mjeseca uz pomo ć referentne tvari. 
Mulj se može koristiti kao inokulum tek nakon jednog mjeseca rada uređaja te najviše četiri mjeseca od po četka rada. Nakon toga 
treba svaka tri mjeseca, u pravilnim razmacima, uzimati uzorke s 
najmanje 10 mjesta.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1014
 
Da bi se svježi i stari mulj održali na istoj razini aktivnosti, filtrirani 
supernatant aktivnog mulja u uporabi pomiješa se s jednakim volu ­
menom filtriranog supernatanta svježe prikupljene smjese iz deset izvora te se dobivena kombinirana teku ćina uzgaja na na čin kako 
je opisano gore. Mulj se može upotrijebiti kao inokulum 18 – 24 sata 
nakon punjenja ure đaja.
 
VII.2.4.  Priprema tikvica  
Pripremi se šest tikvica:  
br. 1: ispitivana kemikalija u vodi za razrje đivanje 100 mg/l  
br. 2, 3 i 4: ispitivana kemikalija u mineralnom mediju 100 mg/l  
br. 5: referentna kemikalija (npr. anilin) u mineralnom mediju 
100 mg/l  
br. 6: samo mineralni medij.  
Ispitivane tvari koje su slabo topljive treba izravno dodati u tikvicu 
na bazi mase ili volumena ili s njima postupati kako je opisano u Dodatku 3., s time da se pritom ne smiju koristiti otapala niti emul ­
gatori. Apsorbens CO
 2 treba dodati u sve tikvice u čašama koje su za 
to posebno predvi đene. pH u tikvicama br. 2, 3 i 4 treba podesiti na 
7,0. 
VII.2.5.  Provo đenje ispitivanja  
Tikvice br. 2, 3 i 4 (ispitne suspenzije), br. 5 (kontrola aktivnosti) i 
br. 6 (slijepa proba inokuluma) inokuliraju se malom koli činom 
inokuluma tako da se dobije koncentracija suspendirane krute tvari 
od 30 mg/l. Inokulum se ne dodaje u tikvicu br. 1, koja se koristi 
kao abioti čka kontrola. Sastavi se oprema, provjeri zrakonepropus ­
nost, pokrenu mješa či i započne s mjerenjem potrošnje kisika u 
mraku. Temperaturu, mješa č i kulometrijski detektor potrošnje 
kisika treba provjeravati svakodnevno te bilježiti sve promjene u 
boji sadržaja tikvica. Potrošnju kisika šest tikvica treba izravno o čita­
vati prikladnom metodom, npr. s pisa ča sa 6 ulaza koji daje krivulju 
BPK. Na kraju inkubacije, u pravilu 28 dana, izmjeri se pH sadržaja 
tikvica i odredi koncentracija preostale ispitivane kemikalije i 
mogućih intermedijera te, u slu čaju tvari topljivih u vodi, koncen ­
tracija DOC-a (Dodatak 2.4.). Kod hlapljivih je kemikalija nužan poseban oprez. Ako se o čekuje nitrifikacija, odredi se koncentracija 
nitrata i nitrita, ako je to mogu će.
 
VII.3. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
VII.3.1.  Obrada rezultata  
Potrošnja kisika (mg) ispitivane kemikalije nakon odre đenog 
vremena, ispravljena za vrijednost slijepe probe inokuluma nakon 
istog vremena, podijeli se upotrijebljenom masom ispitivane kemi ­
kalije. Na taj se na čin dobije BPK izražen u mg kisika/mg ispitivane 
kemikalije tj.: 
BPK ¼ ðmg potrošnja O  2 ispitivane kemikalije  Ä mg potrošnja O  2 slijepe probeÞ 
ðmg ispitivane kemikalije u tikvici Þ 
= mg O  2 po mg ispitivane kemikalije  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1015
 
Postotak biorazgradnje se zatim dobije kao: 
% biorazgradnje ¼ % TPK ¼ BPK ðmg O  2=mg kemikalijeÞ 
TPK ðmg O  2=mg kemikalijeÞ Ü 100 
TPK za smjese izra čunava se iz elementarne analize kao kod jedno ­
stavnih spojeva. Pritom se koristi odgovaraju ći TPK (TPK  NH4 ili 
TPK  NO3 ), ovisno o tome je li nitrifikacija izostala ili je nastupila 
potpuna nitrifikacija (Dodatak 2.2.). Ako je došlo do nepotpune nitrifikacije, izra čuna se ispravak za kisik potrošen nitrifikacijom iz 
promjene koncentracija nitrita i nitrata (Dodatak 5.).
 
Postotak primarne biorazgradnje izra čunava se iz gubitka specifi čne 
(polazne) kemikalije (vidjeti I.7.2.).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100%  
Ako je u tikvici br. 1, u kojoj se mjeri fizikalno-kemijska razgradnja, 
došlo do gubitka ispitivane kemikalije, to treba navesti u izvješ ću i 
izračunati postotak biorazgradnje iz koncentracije ispitivane kemika ­
lije (S  b ) u ovoj tikvici nakon 28 dana.  
Ako se odre đuje DOC (fakultativno), postotak potpune biorazgradnje 
izračunava se kao:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î 
Ü 100%  
kako je opisano u to čki I.7.1. Ako je u tikvici br. 1, u kojoj se mjeri 
fizikalno-kemijska razgradnja, došlo do gubitka DOC-a, postotak biorazgradnje izra čunava se iz koncentracije DOC-a u ovoj tikvici.
 
Sve rezultate treba upisati u priložene obrasce za dostavu podataka.  
VII.3.2.  Valjanost rezultata  
Potrošnja kisika slijepe probe inokuluma u pravilu iznosi 20 – 30 mg 
O 2 /l i ne bi smjela biti viša od 60 mg/l u 28 dana. Kod vrijednosti 
iznad 60 mg/l treba kriti čki preispitati podatke i pokusne tehnike. 
Ako je pH vrijednost izvan podru čja 6 – 8,5 i ako je potrošnja kisika 
ispitivane kemikalije manja od 60 %, ispitivanje treba ponoviti s nižom koncentracijom ispitivane kemikalije.
 
Vidjeti tako đer I.5.2.  
Ispitivanje nije valjano ako postotak razgradnje anilina izra čunan iz 
potrošnje kisika nije viši od 40 % nakon 7 dana i nije viši od 65 % nakon 14 dana.
 
VII.3.3.  Izvješ ćivanje  
Vidjeti I.8.  
VII.4. OBRAZAC ZA DOSTAVU PODATAKA  
Primjer obrasca nalazi se u nastavku.  
TEST MITI (I)  
1. LABORATORIJ  
2. DATUM PO ČETKA ISPITIVANJA  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1016
 
3. ISPITIVANA TVAR  
Naziv:  
Koncentracija radne otopine: mg/l kao kemikalija  
Početna koncentracija u mediju, C  o : … mg/l kao kemikalija  
Volumen reakcijske smjese, V: … ml  
TPK: … mg O  2 /l 
4. INOKULUM  
Mjesta uzorkovanja: 
(1) …  (6) …  
(2) …  (7) …  
(3) …  (8) …  
(4) …  (9) …  
(5) …  (10) …  
Koncentracija suspendirane krute tvari u aktivnom mulju nakon 
aklimatizacije sa sinteti čkom otpadnom vodom = … mg/l  
Volumen aktivnog mulja po litri kona čnog medija = … ml  
Koncentracija mulja u kona čnom mediju = … mg/l  
5. POTROŠNJA KISIKA: BIORAZGRADIVOST  
Vrsta respirometra:  
Vrijeme (dani)  
0 7  14  21  28  
Potrošnja O  2 (mg) 
ispitivana kemika ­
lija a 1 
a 2 
a 3 
Potrošnja O  2 (mg) 
slijepa proba  b 
Ispravljeni BPK 
(mg)  (a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
BPK po mg ispi ­
tivane kemikalije ða Ä bÞ 
C o V Tikvica 1  
Tikvica 2  
Tikvica 3  
% razgradnje  
BPK 
TPK Ü 100 1 
2 
3 
Srednja 
vrijednost (*)  
(*) Srednja vrijednost ne primjenjuje se u slu čaju velikih razlika izme đu ponavljanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1017
 
Napomena:  Slični obrasci se mogu koristiti za referentni spoj.  
6. ANALIZA UGLJIKA  (fakultativno)  
Analizator ugljika:  
Tikvica  DOC  
% opadanja DOC-a  Srednja 
vrijednost  Izmjereni  Ispravljeni  
Voda + ispitivana tvar  a  —  —  
Mulj + ispitivana tvar  b  1 b 1 – c 
Mulj + ispitivana tvar  b  2 b 2 – c 
Mulj + ispitivana tvar  b  3 b 3 – c 
Slijepa proba  c  —  —  —  
% opadanja DOC Ä a : ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. PODACI IZ SPECIFI ČNE KEMIJSKE ANALIZE  
Preostala koli čina ispitivane kemikalije 
na kraju ispitivanja  % razgradnje  
slijepa proba s vodom  S  b 
inokulirani medij  S a1 
S a2 
S a3 
% razgradnje ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Izračuna se % razgradnje za tikvicu a  1 odnosno a  3 . 
8. NAPOMENE  
Treba priložiti krivulju BPK u ovisnosti o vremenu, ako je 
raspoloživa.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1018
 
Dodatak 1.  
SKRAĆENICE I DEFINICIJE  
DO (Dissolved Oxygen): Xotopljeni kisik (mg/l) – koncentra ­
cija kisika otopljenog u vodenom 
uzorku.  
BPK: biokemijska potrošnja kisika (g) – 
količina kisika koju potroše mikroor ­
ganizmi za razgradnju ispitivanog 
spoja; izražava se i kao g potrošnje 
kisika po g ispitivanog spoja (vidjeti metodu C.5.).
 
KPK: kemijska potrošnja kisika (g) – koli ­ 
čina kisika koja se potroši za vrijeme 
oksidacije ispitivanog spoja vru ćim 
kiselim dikromatom; ona predstavlja mjeru prisutne koli čine oksidativne 
tvari; izražava se i kao g potrošenog 
kisika po g ispitivanog spoja (vidjeti metodu C.6.).
 
DOC (Dissolved Organic Carbon): otopljeni organski ugljik – organski 
ugljik koji je prisutan u otopini 
odnosno koji prolazi kroz 0,45- mikrometarski filtar ili ostaje u super ­
natantu nakon 15-minutnog centrifu ­
giranja na 40 000 m.s
 –2 (± 4 000 g).  
TPK: Teoretska potrošnja kisika (mg) – 
ukupna koli čina kisika potrebna za 
potpunu oksidaciju kemikalije; izra ­ 
čunava se iz molekulske formule 
(vidjeti Dodatak 2.2.) i izražava se i kao mg potrebnog kisika po mg ispi ­
tivanog spoja.
 
ThCO  2 (Theoretical Carbon Dioxide): teoretski ugljikov dioksid (mg) – 
izračunana koli čina ugljikovog 
dioksida koja se dobije iz poznatog ili izmjerenog sadržaja ugljika ispiti ­
vanog spoja kod potpune mineraliza ­
cije; izražava se i kao mg razvijenog ugljikovog dioksida po mg ispiti ­
vanog spoja.
 
TOC (Total Organic Carbon): ukupni organski ugljik – ukupni 
organski ugljik uzorka je zbroj organ ­
skog ugljika u otopini i suspenziji.  
IC (Inorganic Carbon): anorganski ugljik.  
TC (Total Carbon): ukupni ugljik – zbroj organskog i 
anorganskog ugljika u uzorku.  
Primarna biorazgradnja:  
promjena kemijske strukture tvari nastala uslijed biološkog djelovanja, koja 
dovodi do gubitka odre đenog svojstva tvari.  
Potpuna biorazgradnja (aerobna):  
stupanj razgradnje koji se postigne kad mikroorganizmi u cijelosti potroše ispi ­
tivani spoj, pri čemu nastaje ugljikov dioksid, voda, mineralne soli i novi 
mikrobni stani čni sastojci (biomasa).  
Lako biorazgradiv:  
proizvoljno razvrstavanje kemikalija koje su prošle utvr đene testove pretraživanja 
na potpunu biorazradivost; ti su testovi toliko strogi da se može pretpostaviti da 
će se ti spojevi brzo i potpuno biološki razgraditi u vodnom okolišu u aerobnim 
uvjetima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1019
 
Kojemu je svojstvena biorazgradnja:  
razvrstavanje kemikalija čija je biorazgradnja (primarna ili potpuna) nedvojbeno 
dokazana bilo kojim priznatim testom biorazgradivosti.  
Pročistivost:  
svojstvo koje pokazuju spojevi koji se daju ukloniti tijekom biološkog pro čišća­
vanja otpadnih voda bez štetnog utjecaja na uobi čajeni tijek postupaka pro či­ 
šćavanja. Op ćenito, lako biorazgradivi spojevi su pro čistivi, ali to ne vrijedi za 
sve spojeve kojima je svojstvena biorazgradnja. Ovdje mogu djelovati i abioti čki 
procesi.  
Vrijeme prilagodbe („lag” faza):  
kod testa opadanja, vrijeme od inokulacije do trenutka kad postotak razgradnje 
dosegne najmanje 10 %. Vrijeme prilagodbe je često jako promjenljivo i slabo 
obnovljivo.  
Vrijeme razgradnje:  
vrijeme od kraja vremena prilagodbe do trenutka kad se dosegne 90 % maksi ­
malnog stupnja razgradnje.  
Rok od 10 dana:  
deset dana neposredno nakon što se postigne 10 %-tna razgradnja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1020
 
Dodatak 2.  
IZRAČUNAVANJE I ODRE ĐIVANJE PRIKLADNIH ZBIRNIH 
PARAMETARA  
Potrebni su odre đeni zbirni parametri, ovisno o odabranoj metodi. U nastavku je 
opisano kako se izvode te vrijednosti. Korištenje parametara opisano je u okviru 
pojedinih metoda.  
1. Sadržaj ugljika  
Sadržaj ugljika izra čunava se iz poznatog sastava elemenata ili se odre đuje 
elementarnom analizom ispitivane tvari.  
2. Teoretska potrošnja kisika (TPK)  
Teoretska potrošnja kisika (TPK) može se izra čunati, ako je poznat sastav 
elemenata, ili odrediti elementarnom analizom. Ona je za spoj:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
bez nitrifikacije  
ThOD  NH4 ¼ 16½2c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3nÞ þ 3s þ 5=2p þ 1=2na Ä oâ 
MW mg =mg 
ili s nitrifikacijom  
ThOD  NO3 ¼ 16½2c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2n þ 3s þ 5=2p þ 1=2na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Kemijska potrošnja kisika (KPK)  
Kemijska potrošnja kisika (KPK) odre đuje se u skladu s metodom C.6.  
4. Otopljeni organski ugljik (DOC)  
Otopljeni organski ugljik (DOC) je prema definiciji organski ugljik bilo 
koje kemikalije ili smjese u vodi koji prolazi kroz 0,45-mikrometarski filtar.  
Uzmu se uzorci iz ispitnih posuda i odmah filtriraju u ure đaju za filtraciju 
uz primjenu odgovaraju ćeg membranskog filtra. Prvih 20 ml (koli čina se 
može smanjiti ako se koriste mali filtri) filtrata se baca. Koli čine od 10 – 
20 ml ili manje, u slu čaju ubrizgavanja (volumen ovisi o koli čini potrebnoj 
za analizator ugljika), zadržavaju se za analizu ugljika. Koncentracija 
DOC-a odre đuje se pomo ću analizatora organskog ugljika koji to čno 
mjeri koncentraciju ugljika jednaku ili manju od 10 % po četne koncentra ­
cije DOC-a koja se koristi u ispitivanju.  
Filtrirani uzorci koji se ne mogu analizirati isti radni dan mogu se 48 sati 
čuvati u hladnjaku na 2 – 4 °C ili ispod – 18 °C u dužem vremenu.  
Napomene:  
Membranski se filtri često impregniraju površinski aktivnim tvarima kako 
bi se učinili hidrofilnima. Stoga filtar može sadržavati do nekoliko mg 
topljivog organskog ugljika koji može ometati odre đivanje biorazgradivosti. 
Površinski aktivne tvari i drugi topljivi organski spojevi uklanjaju se iz filtra iskuhavanjem u deioniziranoj vodi tri puta po jedan sat. Filtri se zatim mogu pohraniti u vodi jedan tjedan. Ako se koriste jednokratni 
filtarski ulošci, kod svake se serije treba uvjeriti da ulošci ne otpuštaju 
topljivi organski ugljik.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1021
 
Kod nekih vrsta membranskih filtra može do ći do adsorpcije ispitivane 
kemikalije. Stoga je preporu čljivo uvjeriti se da se ispitivana kemikalija 
ne zadržava na filtru.  
Za razlikovanje TOC-a od DOC-a se umjesto filtriranja može koristiti 15- 
minutno centrifugiranje na 40 000 m.sec  –2 (4 000 g). Ova metoda nije 
pouzdana kod po četne koncentracije od < 10 mg DOC/l jer se tada ne 
uklone sve bakterije ili se ugljik ponovno otopi kao dio bakterijske plazme.  
BIBLIOGRAFIJA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, P 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und 
Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen 
Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1022
 
Dodatak 3.  
OCJENJIVANJE BIORAZGRADIVOSTI SLABO TOPLJIVIH TVARI  
Kod ispitivanja biorazgradivosti slabo topljivih tvari posebnu pozornost treba 
obratiti na sljede će aspekte.  
Dok se kod uzorkovanja homogenih teku ćina rijetko javljaju problemi, kod krutih 
se tvari preporu čuje homogenizacija odgovaraju ćim sredstvima kako bi se 
izbjegle greške zbog nehomogenosti. Posebno treba paziti kad su potrebni repre ­
zentativni uzorci od nekoliko miligrama iz smjesa kemikalija ili tvari s velikim količinama ne čistoća.
 
Tijekom ispitivanja mogu se koristiti razli čiti oblici miješanja. Važno je miješati 
samo onoliko koliko je potrebno da kemikalija ostane dispergirana te izbjegavati pregrijavanje, pretjerano pjenjenje i pretjerane smi čne sile.
 
Može se koristiti emulgator koji tvori stabilnu disperziju kemikalije. On ne smije 
biti toksičan za bakterije i ne smije se biološki razgraditi niti izazivati pjenjenje u 
ispitnim uvjetima.  
Za otapala vrijede isti kriteriji kao za emulgatore.  
Kod krutih se tvari ne preporu čuje uporaba krutih nosa ča, iako oni mogu biti 
prikladni za uljaste tvari.  
Ako se koriste pomo ćne tvari, kao što su emulgatori, otapala i nosa či, treba 
izvesti slijepu probu s pomo ćnom tvari.  
Kod istraživanja biorazgradivosti slabo topljivih spojeva može se koristiti bilo 
koji od tri respirometrijska testa: CO  2 , BPK ili MITI.  
LITERATURA  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P, The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1023
 
Dodatak 4.  
OCJENJIVANJE BIORAZGRADIVOSTI KEMIKALIJA ZA KOJE SE 
SUMNJA DA SU TOKSI ČNE ZA INOKULUM  
Ako se kemikalija podvrgne ispitivanju na laku biorazgradivost i čini se da nije 
biorazgradiva, preporu čuje se da se provede sljede ći postupak, ako se želi utvrditi 
razlika izme đu inhibicije i inertnosti (Reynolds i sur., 1987.).  
Kod toksikoloških testova i testova biorazgradnje treba koristiti sli čne ili isto ­
vjetne inokulume.  
Čini se da je za ocjenjivanje toksi čnosti kemikalija koje se ispituju na laku 
biorazgradivost primjereno koristiti jednu od sljede ćih metoda: test inhibicije 
disanja aktivnog mulja – Direktiva 87/302/EEZ, BPK ili test inhibicije rasta ili kombinaciju tih metoda.
 
Da bi se izbjegla inhibicija zbog toksi čnosti, predlaže se da se kod ispitivanja 
lake biorazgradivosti koriste koncentracije ispitivane tvari ispod 1/10 vrijednosti 
EC 50 (odnosno manje od vrijednosti EC  20 ) dobivenih kod toksikoloških ispitiva ­
nja. Spojevi čija je vrijednost EC  50 viša od 300 mg/l ne bi trebali imati toksi čne 
učinke kod ispitivanja lake biorazgradivosti.  
Vrijednosti EC  50 ispod 20 mg/l mogu stvarati ozbiljne probleme u kasnijem 
tijeku ispitivanja. Treba koristiti niske ispitne koncentracije, koje zahtijevaju 
primjenu strogog i osjetljivog testa sa zatvorenim bocama ili korištenje  14 C 
obilježenog materijala. Aklimatizirani inokulum pruža mogu ćnost korištenja 
viših koncentracija ispitivane tvari. Ipak, u ovom posljednjem slu čaju gubi se 
specifični kriterij lake biorazgradivosti.  
BIBLIOGRAFIJA  
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1024
 
Dodatak 5.  
ISPRAVAK ZA POTROŠNJU KISIKA ZBOG UTJECAJA 
NITRIFIKACIJE  
Ako se kod ocjenjivanja biorazgradivosti na temelju potrošnje kisika ne uzme u 
obzir nitrifikacija, kod ispitivanih tvari koje ne sadrže kisik nastat će tek zanema ­
rive greške (ne više od 5 %), čak i ako je oksidacija amonijskog dušika u mediju 
ispitnih posuda i posuda slijepe probe nepredvidiva. Me đutim, ako ispitivana tvar 
sadrži dušik, mogu nastati ozbiljne greške.  
Ako je došlo do nepotpune nitrifikacije, utvr đena potrošnja kisika reakcijske 
smjese može se ispraviti za koli činu kisika koja je upotrijebljena pri oksidaciji 
amonijaka u nitrit i nitrat, ako se promjene koncentracije nitrita i nitrata tijekom inkubacije odre đuju pomo ću sljedećih jednadžbi: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1)  
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Ukupno:  
2 NH  4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Iz jednadžbe (1) proizlazi da potrošnja kisika kod oksidacije 28 g dušika iz 
amonijevog klorida (NH  4 Cl) u nitrit iznosi 96 g, što odgovara faktoru 3,43 
(96/28). Isto tako, iz jednadžbe (3) proizlazi da je potrošnja kisika kod oksidacije 28 g dušika u nitrat 128 g tj. faktor je 4,57 (128/28).
 
Budući da se radi o slijedu reakcija koje provode razli čite vrste bakterija, koncen ­
tracija nitrita može se pove ćati ili smanjiti; u ovom posljednjem slu čaju nastala bi 
ekvivalentna koncentracija nitrata. Prema tomu, kisik potrošen u tvorbi nitrata iznosi 4,57 puta pove ćanje koncentracije nitrata, dok je kisik povezan s tvorbom 
nitrita 3,43 puta pove ćanje koncentracije nitrita ili, u slu čaju smanjenja koncen ­
tracije, gubitak kisika je – 3,43 puta smanjenje koncentracije.
 
To jest: 
O 2 potrošen u tvorbi nitrata = 4,57 × pove ćanje koncentracije 
nitrata  (4) 
i 
O 2 potrošen u tvorbi nitrata = 3,43 × pove ćanje koncentracije 
nitrita  (5) 
i 
O 2 izgubljen s nestankom nitrita = – 3,43 × smanjenje koncen ­
tracije nitrata  (6) 
tako da je  
potrošnja O  2 uslijed nitrifikacije = ± 3,43 × promjena konc. 
nitrita + 4,57 × pove ćanje konc. nitrata  (7) 
i prema tomu  
potrošnja O  2 uslijed oksidacije C = ukupna utvr đena potrošnja – 
potrošnja uslijed nitrifikacije  (8). 
Ako se umjesto toga odre đuje samo ukupni oksidirani N, može se uzeti da je 
potrošnja kisika uslijed nitrifikacije, kao prva aproksimacija, 4,57 × pove ćanje 
oksidiranog N.  
Vrijednost ispravljena za potrošnju kisika uslijed oksidacije C se zatim uspore ­ 
đuje s TPK NH  3 izračunanim u skladu s Dodatkom 2.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1025
 
C.5 RAZGRADNJA – BIOKEMIJSKA POTROŠNJA KISIKA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Svrha metode je mjerenje biokemijske potrošnje kisika (BPK) krutih 
i tekućih organskih tvari.  
Podaci koji se dobivaju ovim testom vrijede za spojeve topljive u 
vodi; ipak, mogu se, barem na čelno, ispitivati i hlapljivi spojevi i 
spojevi koji su slabo topljivi u vodi.  
Metoda je primjenljiva samo kod organskih tvari koje u koncentraciji 
koja se koristi u ispitivanju nemaju inhibitorni u činak na bakterije. 
Ako ispitivana tvar nije topljiva u ispitnoj koncentraciji, ponekad je potrebno primijeniti posebne mjere, kao što je ultrazvu čno raspršiva ­
nje, kako bi se postigla dobra disperzija ispitivane tvari.
 
Informacije o toksi čnosti kemikalije mogu biti korisne za tuma čenje 
niskih vrijednosti i odabir odgovaraju ćih ispitnih koncentracija.  
1.2. DEFINICIJA I JEDINICE  
BPK je definiran kao masa otopljenog kisika koja je potrebna za 
biokemijsku oksidaciju odre đenog volumena otopine tvari u propi ­
sanim uvjetima.  
Rezultati se izražavaju u gramima BPK po gramu ispitivane tvari.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Poželjno je koristiti prikladnu referentnu tvar za provjeru aktivnosti 
inokuluma.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Unaprijed odre đena količina tvari, otopljena ili dispergirana u dobro 
dozračenom prikladnom mediju, inokulira se mikroorganizmima i 
inkubira u mraku na definiranoj stalnoj temperaturi okolnog zraka.  
BPK se odre đuje na temelju razlike izme đu sadržaja otopljenog 
kisika na po četku i kraju ispitivanja. Ispitivanje traje najmanje 5 i 
najviše 28 dana.  
Paralelno treba izvesti slijepu probu bez ispitivane tvari.  
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Određivanje BPK ne može se smatrati valjanim odre đivanjem bioraz ­
gradivosti tvari. Ovaj se test može smatrati tek testom pretraživanja.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Pripremi se preliminarna otopina ili disperzija tvari tako da se dobije 
koncentracija BPK u skladu s metodom koja se primjenjuje. BPK se 
zatim odredi pomo ću bilo koje prikladne nacionalne ili me đunarodne 
normirane metode.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1026
 
2. PODACI I VREDNOVANJE  
BPK sadržan u preliminarnoj otopini izra čunava se u skladu s 
odabranom standardnom metodom i pretvara u grame BPK po gramu ispitivane tvari.
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Treba navesti primijenjenu metodu.  
Biokemijska potrošnja kisika predstavlja srednju vrijednost najmanje 
tri valjana mjerenja.  
Potrebno je navesti sve podatke i napomene bitne za tuma čenje 
rezultata, posebno u pogledu ne čistoća, fizikalnog stanja, toksi čnih 
učinaka i svojstvenog sastava tvari koji mogu utjecati na rezultate.  
Ako se koristi dodatak za inhibiciju biološke nitrifikacije, to tako đer 
treba navesti.  
4. REFERENCE  
Popis normiranih metoda, npr.:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish 
zuurstofverbruik (BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1027
 
C.6. RAZGRADNJA – KEMIJSKA POTROŠNJA KISIKA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Svrha metode je mjerenje kemijske potrošnje kisika (KPK) krutih i 
tekućih organskih tvari na standardni proizvoljan na čin u definiranim 
laboratorijskim uvjetima.  
Za provedbu ovog testa i tuma čenje dobivenih rezultata korisno je 
imati podatke o formuli tvari (npr. halogene soli, željezove soli 
organskih spojeva, organoklorovi spojevi).  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Kemijska potrošnja kisika je mjera oksidativnosti tvari, izražena kao 
ekvivalentna koli čina kisika iz oksidiraju ćeg reagensa koju potroši 
tvar u definiranim laboratorijskim uvjetima.  
Rezultat se izražava u gramima KPK po gramu ispitivane tvari.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Kod ispitivanja novih tvari nije uvijek potrebno koristiti referentne 
tvari. One prvenstveno služe za povremeno baždarenje metode i trebaju omogu ćiti usporedbu rezultata kod primjene neke druge 
metode.
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Unaprijed odre đena količina tvari, otopljena ili dispergirana u vodi, 
oksidira se kalijevim dikromatom u jakom mediju sumporne kiseline pod refluksom uz primjenu srebrovog sulfata kao katalizatora u trajanju od dva sata. Preostali dikromat odre đuje se titracijom sa 
standardiziranim željezovim amonijevim sulfatom.
 
U slučaju tvari koje sadrže klor dodaje se živin sulfat (  1 ) kako bi se 
smanjo utjecaj klora.  
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Zbog proizvoljnog na čina određivanja KPK je „pokazatelj oksida ­
tivnosti” te se kao takav koristi kao prakti čna metoda mjerenja 
organske tvari.  
Kloridi mogu ometati ovo ispitivanje; anorganska redukcijska i oksi ­
dacijska sredstva mogu tako đer ometati odre đivanje KPK.  
Neki cikli čki spojevi i mnoge hlapljive tvari (npr. niže masne kise ­
line) ne oksidiraju se u potpunosti u ovom testu.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
Pripremi se preliminarna otopina ili disperzija tvari tako da se dobije 
KPK izme đu 250 i 600 mg po litri.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1028  
( 1 ) Otopine koje sadrže živine soli treba nakon uporabe obraditi kako bi se izbjeglo oslo ­
bađanje žive u okoliš.
 Napomene : 
U slučaju slabo topljivih i nedisperzivnih tvari može se izvagati 
određena količina fine praškaste ili teku će tvari koja otprilike odgo ­
vara 5 mg KPK i staviti u pokusnu aparaturu s vodom.  
Kemijska potrošnja kisika (KPK) često se odre đuje pomo ću inačice 
metode tj. u zatvorenom sustavu s izjedna čavanjem tlaka (H. Kelken ­
berg, 1975.), koja je posebno korisna kod slabo topljivih tvari. Ovom se inačicom spojevi koji se teško odre đuju konvencionalnim postup ­
kom, npr. octena kiselina, često uspješno kvantificiraju. Ipak, ni ova 
metoda nije uspješna u slu čaju piridina. Pove ćanjem koncentracije 
kalijevog dikromata na 0,25 N (0,0416 M), kako je propisano u (1), olakšava se izravnu odvagu 5 – 10 mg tvari, što je jako važno kod 
određivanja KPK tvari koje su slabo topljive u vodi (2).
 
U protivnom se KPK odre đuje bilo kojom prikladnom nacionalnom 
ili međunarodnom normiranom metodom.  
2. PODACI I OCJENJIVANJE  
KPK u pokusnoj tikvici izra čunava se pomo ću odabrane standardi ­
zirane metode i pretvara u grame KPK po gramu ispitivane tvari.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Treba navesti primijenjenu metodu.  
Kemijska potrošnja kisika predstavlja srednju vrijednost najmanje tri 
mjerenja. Potrebno je navesti sve informacije i napomene bitne za 
tumačenje rezultata, posebno u pogledu ne čistoća, fizikalnog stanja i 
unutarnjih svojstava tvari (ako su poznata) koja mogu utjecati na rezultate.
 
Ako se koristi živin sulfat za smanjivanje utjecaja klorida, to tako đer 
treba navesti.  
4. REFERENCE  
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13,169.  
Popis normiranih metoda npr.:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1029
 
C.7. RAZGRADNJA – ABIOTI ČKA RAZGRADNJA: HIDROLIZA 
KAO FUNKCIJA PH  
1. METODA  
Ova ispitna metoda istovjetna je smjernici OECD TG 111 (2004.).  
1.1. UVOD  
Kemikalije mogu u ći u površinske vode razli čitim putevima, kao što 
je izravna primjena, rasap, otjecanje, ocje đivanje, odlaganje otpada, 
poljoprivredne, industrijske i komunalne otpadne vode ili atmos ­
fersko taloženje, i u tim vodama sudjelovati u procesima kemijske 
(npr. hidroliza, oksidacija), fotokemijske i/ili mikrobe pretvorbe. Ova smjernica opisuje laboratorijsku ispitnu metodu za ocjenjivanje abio ­
tičkih hidroliti čkih pretvorbi kemikalija u vodenim sustavima pri pH 
vrijednostima koje se obi čno javljaju u okolišu (pH 4 – 9), a temelji 
se na postoje ćim smjernicama (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
Pokusima se odre đuje i. brzina hidrolize ispitivane tvari kao funkcija 
pH i ii. identitet odnosno vrsta i brzina tvorbe i razgradnje proizvoda 
hidrolize kojima organizmi mogu biti izloženi. Ovakva se istraži ­
vanja mogu zahtijevati za kemikalije koje se izravno unose u vodu 
ili koje mogu dospjeti u okoliš nekim drugim od gore navedenih 
puteva.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Vidjeti Dodatak 2.  
1.3. PRIMJENLJIVOST METODE  
Metoda se op ćenito primjenjuje kod kemikalija (neobilježene i 
obilježene) za koje postoji dovoljno to čna i osjetljiva analiti čka 
metoda. Ona se može primijeniti na blago hlapljive i nehlapljive spojeve koji su dovoljno topljivi u vodi. Test ne treba primjenjivati u slučaju kemikalija koje su jako hlapljive iz vode (npr. fumiganti, 
organska otapala) te se stoga ne mogu zadržati u otopini u pokusnim 
uvjetima ovog testa. Provedba ispitivanja može biti otežana ako se ispituju tvari koje su minimalno topljive u vodi (8).
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Sterilne vodene puferske otopine razli čitih pH vrijednosti (pH 4, 7 i 
9) obrade se ispitivanom tvari i inkubiraju u mraku u kontroliranim laboratorijskim uvjetima (pri stalnim temperaturama). Puferske se otopine u odgovaraju ćim vremenskim razmacima analiziraju na ispi ­
tivanu tvar i proizvode hidrolize. Bilancu mase lakše je utvrditi kod 
obilježenih ispitivanih tvari (npr.
 14 C). 
Ova se metoda ispitivanja temelji na višerazinskom pristupu, koji je 
prikazan i objašnjen u Dodatku 1. Svaka razina uvjetovana je rezul ­
tatima prethodne razine.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1030
 
1.5. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Za mjerenje brzine hidrolize mogu se koristiti neobilježene ili obilje ­ 
žene ispitivane tvari. Obilježenom se materijalu op ćenito daje pred ­
nost kod prou čavanja puta hidrolize i odre đivanja bilance mase, iako 
u posebnim slu čajevima ozna čivanje nije bezuvjetno potrebno. 
Preporučuje se  14 C obilježavanje, ali korisna je i primjena drugih 
izotopa kao što su  13 C, 15 N, 3 H. Ako je to mogu će, oznaku treba 
staviti na najstabilni dio odnosno dijelove molekule. Primjerice, ako 
ispitivana tvar sadrži jedan prsten, oznaka se mora staviti na taj 
prsten; ako ispitivana tvar sadrži dva ili više prstenova, ponekad je potrebno provesti posebna istraživanja kako bi se ocijenila sudbina 
svakog obilježenog prstena i dobile potrebne informacije o tvorbi 
proizvoda hidrolize. Čistoća ispitivane tvari treba biti najmanje 
95 %.
 
Prije hidroliti čkog ispitivanja trebaju biti raspoložive sljede će infor­
macije o ispitivanoj tvari:  
(a) topljivost u vodi (ispitna metoda A.6.);  
(b) topljivost u organskim otapalima;  
(c) tlak pare (ispitna metoda A.4.) i/ili konstanta Henryjevog zakona;  
(d) podjelni koeficijent n-oktanol/voda (ispitna metoda A.8.);  
(e) konstanta disocijacije (pK  a ) (smjernica OECD 112) (9);  
(f) brzina izravne i neizravne fotokemijske pretvorbe u vodi, prema 
potrebi.  
Trebaju biti raspoložive analiti čke metode za kvantifikaciju ispitivane 
tvari te, prema potrebi, identificiranje i kvantifikaciju proizvoda 
hidrolize u vodenim otopinama (vidjeti tako đer odjeljak 1.7.2.).  
1.6. REFERENTNE TVARI  
Gdje god je to mogu će, treba koristiti referentne tvari za identifici ­
ranje i kvantifikaciju proizvoda hidrolize spektroskopskim i kroma ­
tografskim metodama ili drugim metodama prikladne osjetljivosti.  
1.7. KRITERIJI KAKVO ĆE 
1.7.1.  Iskorištenje  
Prve naznake ponovljivosti analiti čke metode i uspješnosti jednolike 
primjene ispitivane tvari mogu se dobiti analizom najmanje dvije paralelne puferske otopine ili njihovih ekstrakata neposredno nakon dodavanja ispitivane tvari. Iskorištenje u kasnijim fazama pokusa 
proizlazi iz odgovaraju ćih bilanci mase (ako se koristi obilježeni 
materijal). Iskorištenje bi se kod obilježenih i neobilježenih kemika ­
lija trebalo kretati u podru čju od 90 % do 110 % (7). Ako je ovo 
područje tehnički teško posti ći, kod neobilježenih je kemikalija prih ­
vatljivo iskorištenje od 70 %, ali u tom slu čaju treba navesti odgo ­
varajuće obrazloženje.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1031
 
1.7.2.  Ponovljivost i osjetljivost analiti čke metode  
Ponovljivost analiti čke metode odnosno metoda koje se koriste za 
kvantifikaciju ispitivane tvari i proizvoda hidrolize u kasnijim fazama može se provjeriti dvostrukom analizom istih puferskih 
otopina (ili njihovih ekstrakata) nakon što nastanu dovoljne koli čine 
proizvoda hidrolize za kvantifikaciju.
 
Analitička metoda treba biti dovoljno osjetljiva za kvantifikaciju 
koncentracija ispitivane tvari na razini 10 % ili manje po četne 
koncentracije. Ako je to relevantno, analiti čke metode tako đer 
trebaju biti dovoljno osjetljive za kvantifikaciju svih proizvoda hidro ­
lize koji čine 10 % ili više primijenjene koncentracije (u bilo kom 
trenutku tijekom istraživanja) na razini 25 % ili manje njihove vršne 
koncentracije.  
1.7.3.  Intervali pouzdanosti za kineti čke podatke o hidrolizi  
Intervale pouzdanosti treba izra čunati i prikazati za sve koeficijente 
regresije, konstante brzine, vremena poluraspada i sve duge kineti čke 
parametre (npr. DT50).  
1.8. OPIS ISPITNE METODE  
1.8.1.  Oprema i aparatura  
Istraživanje treba provesti u staklenim posudama (npr. epruvete, male 
tikvice), po potrebi u mraku i u sterilnim uvjetima, osim ako prelimi ­
narni podaci (kao što je podjelni koeficijent n-oktanol/voda) ukazuju na to da ispitivana tvar prianja na staklo. U tom slu čaju treba 
razmisliti o primjeni alternativnih materijala (kao što je teflon). 
Problem prianjanja na staklo se osim toga može ublažiti primjenom 
jedne ili više sljede ćih metoda:
 
— određivanjem mase ispitivane tvari i proizvoda hidrolize sorbi ­
ranih na ispitnu posudu,  
— korištenjem ultrazvu čne kupelji,  
— pranjem svog staklenog posu đa otapalom u svakom intervalu 
uzorkovanja,  
— korišenjem formuliranih proizvoda,  
— korištenjem ve će količine suotapala za dodavanje ispitivane tvari 
u sustav; ako se koristi suotapalo, to treba biti otapalo koje ne hidrolizira ispitivanu tvar.
 
Za inkubaciju razli čitih ispitnih otopina uglavnom su potrebne tresi ­
lice u vodenoj kupelji s regulacijom temperature ili inkubatori s termostatom.
 
Potrebna je standardna laboratorijska oprema, posebno:  
— mjera č pH vrijednosti,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1032
 
— analiti čki instrumenti, kao što su oprema za GC, HPLC, TLC, 
uključujući odgovaraju će detekcijske sustave za analiziranje 
radioaktivno obilježenih i neobilježenih tvari ili inverznu metodu razrje đenja izotopa,
 
— instrumenti za potrebe identifikacije (npr. MS, GC-MS, 
HPLC-MS, NMR itd.),  
— tekućinski scintilacijski broja č, 
— ljevci za odjeljivanje kod ekstrakcije teku će-tekuće, 
— instrumenti za koncentriranje otopina i ekstrakata (npr. rotacijski 
isparivač), 
— uređaj za regulaciju temperature (npr. vodena kupelj).  
Kemijski reagensi, uklju čuju npr.:  
— organska otapala, analiti čki čista, npr. heksan, diklormetan itd.,  
— scintilacijsku teku ćinu, 
— puferske otopine (za pojedinosti vidjeti odjeljak 1.8.3.).  
Svo stakleno posu đe, analitički čista voda i puferske otopine koje se 
koriste kod hidroliti čkih ispitivanja trebaju biti sterilizirani.  
1.8.2.  Primjena ispitivane tvari  
Ispitivana se tvar dodaje u razli čite puferske otopine u obliku vodene 
otopine (vidjeti Dodatak 3.). Ako je to nužno za postizanje dostatnog otapanja, dopuštena je uporaba malih koli čina otapala mješljivih s 
vodom (kao što je acetonitril, aceton, etanol) za primjenu i razdiobu 
ispitivane tvari, ali ona u pravilu ne bi smjela prije ći 1 % v/v. Ako se 
razmatra uporaba više koncentracije otapala (npr. u slu čaju slabo 
topljivih ispitivanih tvari), ona se može dopustiti samo ako se 
dokaže da otapalo nema utjecaja na hidrolizu ispitivane tvari.
 
Korištenje formuliranih proizvoda na čelno se ne preporu čuje, budu ći 
da se ne može isklju čiti utjecaj sastojaka formulacije na proces 
hidrolize. Ipak, u slu čaju ispitivanih tvari koje su slabo topljive u 
vodi i tvari koje prianjaju na staklo (vidjeti odjeljak 1.8.1.) korištenje formuliranog materijala može biti prikladna alternativa.
 
Treba koristiti jednu koncentraciju ispitivane tvari; ona ne smije biti 
viša od 0,01 M ili pola koncentracije zasi ćenja (vidjeti Dodatak 1.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1033
 
1.8.3.  Puferske otopine  
Hidrolitičko ispitivanje treba provoditi pri pH vrijednosti 4, 7 i 9. U 
tu svrhu treba pripremiti puferske otopine s analiti čki čistim kemi ­
kalijama i vodom. Neki korisni puferski sustavi prikazani su u 
Dodatku 3. Valja napomenuti da primijenjeni puferski sustav može 
utjecati na brzinu hidrolize; ako se uo če ovakve pojave, treba primi ­
jeniti alternativni puferski sustav (  1 ). 
pH svake puferske otopine treba provjeriti baždarenim mjera čem pH 
vrijednosti s preciznoš ću od najmanje 0,1 na traženoj temperaturi.  
1.8.4.  Ispitni uvjeti  
1.8.4.1.  Ispitna temperatura  
Hidrolitičke pokuse treba provoditi na stalnoj temperaturi. Za potrebe 
ekstrapolacije važno je održavati temperaturu barem u granicama ± 0,5 °C.
 
Ako je hidroliti čko ponašanje ispitivane tvari nepoznato, treba 
obaviti preliminarno ispitivanje (1. razina) na temperaturi od 
50 °C. Kineti čka ispitivanja više razine treba provoditi na najmanje 
tri temperature (uklju čujući ispitivanje na 50 °C), osim ako je ispi ­
tivanje 1. razine pokazalo da je ispitivana tvar hidroliti čki stabilna. 
Preporučeno temperaturno podru čje je 10 – 70 °C (po mogu ćnosti s 
najmanje jednom temperaturom ispod 25 °C), što obuhva ća tempera ­
turu izvješ ćivanja od 25 °C i ve ćinu temperatura koje se pojavljuju u 
praksi.  
1.8.4.2.  Svjetlost i kisik  
Sva hidroliti čka ispitivanja treba obaviti prikladnim metodama kako 
bi se izbjegli fotoliti čki učinci. Osim toga, treba provesti sve 
prikladne mjere da se izbjegne stvaranje kisika (npr. 5-minutno upuhivanje helija, dušika ili argona prije pripreme otopine).
 
1.8.4.3.  Trajanje ispitivanja  
Preliminarno ispitivanje treba trajati 5 dana, dok ispitivanja više 
razine treba provoditi dok se ne postigne 90 %-tna hidroliza ispiti ­
vane tvari ili 30 dana, ovisno o tome što je kra će. 
1.8.5.  Provo đenje ispitivanja  
1.8.5.1.  Preliminarno ispitivanje (1. razina)  
Preliminarno se ispitivanje provodi na temperaturi 50 ± 0,5 °C i uz 
pH 4,0, 7,0 i 9,0. Ako je nakon 5 dana hidroliza manja od 10 % (t  0,5 
25 °C > 1 godina), ispitivana se tvar smatra hidroliti čki stabilnom i u 
pravilu nije potrebno dodatno ispitivanje. Ako je poznato da je tvar nestabilna na okolišno relevantnim temperaturama (
 2 ), preliminarno 
ispitivanje nije potrebno. Analiti čka metoda mora biti dovoljno prec ­
izna i osjetljiva da može otkriti 10 %-tno smanjenje po četne 
koncentracije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1034  
( 1 ) Mabey i Mill preporu čuju uporabu boratnih ili acetatnih pufera umjesto fosfatnih (11). 
( 2 ) Ove informacije mogu potjecati i iz drugih izvora, kao što su hidroliti čki podaci za 
strukturno sli čne spojeve iz literature ili iz drugih preliminarnih polukvantitativnih hidro ­
litičkih ispitivanja s ispitivanom tvari u ranijoj razvojnoj fazi.
 1.8.5.2.  Hidroliza nestabilnih tvari (2. razina)  
Ispitivanje više razine (napredno ispitivanje) treba provesti s pH 
vrijednostima pri kojima se ispitivana tvar pokazala nestabilnom u preliminarnom ispitivanju. Puferske otopine ispitivane tvari treba 
termostatski održavati na odabranim temperaturama. Kod ispitivanja 
reakcija prvog reda svaku reakcijsku otopinu treba analizirati u vremenskim razmacima koji omogu ćuju da se dobije najmanje šest 
razmaknutih to čaka podataka, u pravilu izme đu 10 % i 90 % hidro ­
lize ispitivane tvari. Treba uzeti paralelne ispitne uzorke (najmanje 
dva uzorka iz odvojenih reakcijskih posuda) i sadržaj analizirati u najmanje šest vremena uzorkovanja (za najmanje dvanaest to čaka 
podataka ponavljanja). Smatra se da nije dovoljno koristiti jedan 
zbirni uzorak iz kojega se vade pojedina čni alikvoti ispitne otopine 
u svakom intervalu uzorkovanja jer u tom slu čaju nije mogu ća 
analiza varijabilnosti podataka, a usto se može pojaviti i problem 
onečišćenja ispitne otopine. Ispitivanja za potvrdu sterilnosti treba 
provesti na kraju ispitivanja više razine (tj. na 90 % hidrolize ili 30 dana). Ipak, ako nije uo čena razgradnja (tj. pretvorba), smatra 
se da ispitivanja sterilnosti nisu potrebna.
 
1.8.5.3.  Identifikacija proizvoda hidrolize (3. razina)  
Odgovaraju ćim analiti čkim metodama treba identificirati sve 
značajne proizvode hidrolize, a barem one koji čine > 10 % primije ­
njene doze.  
1.8.5.4.  Dodatna ispitivanja  
Kod ispitivanja hidroliti čki nestabilnih tvari ponekad je potrebno 
provesti dodatna ispitivanja uz pH vrijednosti razli čite od 4, 7 i 9. 
Primjerice, kod ispitivanja u fiziološke svrhe ponekad su potrebni kiseliji uvjeti (npr. pH 1,2), uz primjenu jedne fiziološki relevantne temperature (37 °C).
 
2. PODACI  
Količine ispitivane tvari i hidroliti čkih proizvoda (ako je to relevan ­
tno) navode se u postocima primijenjene po četne koncentracije te, 
prema potrebi, u mg/l za svaki interval uzorkovanja i za svaki pH i 
ispitnu temperaturu. Osim toga, ako se koristi obilježena ispitivana 
tvar, treba navesti bilancu mase u postotku primijenjene po četne 
koncentracije.  
U izvješću treba dati grafi čki prikaz logaritamski transformiranih 
podataka koncentracija ispitivane tvari u vremenu. Potrebno je iden ­
tificirati sve zna čajne proizvode hidrolize, ili barem one koji čine 
≥ 10 % primijenjene doze te dati grafi čki prikaz njihovih logari ­
tamski transformiranih koncentracija na isti na čin kao za polaznu 
tvar tako da budu vidljive brzine tvorbe i razgradnje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1035
 
2.1. OBRADA REZULTATA  
Točnije određivanje vremena poluraspada i vrijednosti DT  50 trebalo 
bi se posti ći izračunima uz pomo ć odgovaraju ćih kinetičkih modela. 
U izvješću treba navesti vrijeme poluraspada i/ili vrijednosti DT  50 
(uključujući granice pouzdanosti) za svaki pH i temperaturu, 
zajedno s opisom primijenjenog modela, redom kinetike i koefici ­
jentom odre đivanja (r  2 ). Prema potrebi, te izra čune treba provesti i za 
proizvode hidrolize.  
U slučaju istraživanja brzine na razli čitim temperaturama, konstante 
brzine hidrolize pseudo prvog reda (k  obs ) treba opisati kao funkciju 
temperature. Izra čun se temelji na podjeli k  obs na konstante brzine za 
kiselinski kataliziranu, neutralnu i bazi čno kataliziranu hidrolizu (k  H , 
k neutral  i k OH ) i na Arrheniusovoj jednadžbi:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ X  
i¼H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
gdje su A  i i B  i regresijske konstante odsje čka odnosno nagiba 
najboljih pravaca dobivenih linearnom regresijom ln k  i prema reci ­
pročnoj vrijednosti apsolutne temperature u kelvinima (T). 
Primjenom Arhheniusovih odnosa za kiselinski kataliziranu, neutralnu i bazi čno kataliziranu hidrolizu mogu se izra čunati 
konstante brzine pseudo prvog reda, a time i vrijeme poluraspada 
za druge temperature kod kojih nije mogu će izravno odre đivanje 
konstante brzine pokusom (10).
 
2.2. VREDNOVANJE I TUMA ČENJE REZULTATA  
Većina hidroliti čkih reakcija prati prividne brzine reakcije prvog reda 
te je prema tomu vrijeme poluraspada neovisno o koncentraciji (vidjeti jednadžbu 4 u Dodatku 2.). To obi čno omogu ćava primjenu 
laboratorijskih rezultata dobivenih pri 10
 -2 do 10  -3 M na uvjete 
okoliša (≤ 10  -6 M) (10). Mabey i Mill dali su nekoliko primjera 
dobre podudarnosti izme đu brzina hidrolize za razli čite kemikalije 
izmjerenih u čistim i prirodnim vodama (11), ako su izmjereni i pH i 
temperatura.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju sadrži barem sljede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— trivijalni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula (uz 
naznaku položaja oznake, ako se koristi radioaktivno obilježeni 
materijal) i relevantna fizikalno-kemijska svojstva (vidjeti odje ­
ljak 1.5.),  
— čistoća (nečistoće) ispitivane tvari,  
— čistoća oznake obilježene kemikalije i molarna aktivnost (prema 
potrebi).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1036
 
— Puferske otopine:  
— datumi i pojedinosti pripreme,  
— upotrijebljeni puferi i voda,  
— molarnost i pH puferskih otopina.  
Ispitni uvjeti:  
— datumi provo đenja istraživanja,  
— primijenjena koli čina ispitivane tvari,  
— metoda primjene i otapala (vrsta i koli čina) korištena za primjenu 
ispitivane tvari,  
— volumen inkubiranih puferiranih otopina ispitivane tvari,  
— opis korištenog inkubacijskog sustava,  
— pH i temperatura tijekom istraživanja,  
— vremena uzorkovanja,  
— metoda(-e) ekstrakcije,  
— metode kvantifikacije i identifikacije ispitivane tvari i njezinih 
proizvoda hidrolize u puferskim otopinama,  
— broj ponavljanja.  
Rezultati:  
— ponovljivost i osjetljivost primijenjenih analiti čkih metoda,  
— iskorištenje (% za valjano istraživanje navedeni su u odjeljku 
1.7.1.),  
— podaci ponavljanja i srednje vrijednosti u tabli čnom obliku,  
— bilanca mase za vrijeme i na kraju istraživanja (ako se koristi 
obilježena ispitivana tvar),  
— rezultati preliminarnog ispitivanja,  
— rasprava i tuma čenje rezultata,  
— svi izvorni podaci i slike.  
Sljedeće su informacije potrebne samo ako se odre đuje brzina 
hidrolize:  
— grafički prikazi koncentracije u vremenu za ispitivane tvari te, 
prema potrebi, za proizvode hidrolize pri svakoj pH vrijednosti i 
temperaturi,  
— tablice rezultata Arrheniusove jednadžbe za temperaturu 
20 °C/25 °C s pH, konstantom brzine (h  -1 ili dan  -1 ), vremenom 
poluraspada ili DT  50 , temperaturama (°C), uklju čujući granice 
pouzdanosti i koeficijente korelacije (r  2 ) ili usporedive podatke,  
— predloženi put hidrolize.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1037
 
4. REFERENCE  
(1) OECD, (1981) Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals No 111, adopted 12 May 1981.  
(2) US-Environmental Protection Agency, (1982) 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 °C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada, (1987) Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Europska Unija (EU), (1995) Direktiva Komisije 95/36/EZ o 
izmjeni Direktive Vije ća 91/414/EEZ o stavljanju na tržišta 
proizvoda za zaštitu biljaka. Prilog V.: Opstanak i ponašanje u okolišu.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides, (1991) 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(6) BBA, (1980) Merkblatt No 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
(7) SETAC, (1995) Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD, (2000) Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment No 23.
 
(9) OECD, (1993) Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P., (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993).
 
(11) Mabey, W. and Mill, T., (1978) Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, str. 383-415.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1038
 
Dodatak 1.  
Višerazinska shema hidroliti čkog testa
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1039
 
Dodatak 2.  
Definicije i jedinice  
U svim slu čajevima treba koristiti jedinice  Međunarodnog sustava 
jedinica (SI).  
Ispitivana tvar:  bilo koja tvar, bilo da se radi o polaznom spoju ili relevantnim 
proizvodima pretvorbe.  
Proizvodi pretvorbe:  sve tvari koje nastaju u bioti čkim ili abioti čkim reakcijama 
pretvorbe ispitivane tvari.  
Proizvodi hidrolize:  sve tvari koje nastaju u reakcijama hidroliti čke pretvorbe 
ispitivane tvari.  
Hidroliza:  reakcija ispitivane tvari RX s vodom kod koje u središtu reakcije 
dolazi do neto zamjene skupine X s OH: 
RX + HOH → ROH + HX  [1]  
Brzina opadanja koncentracije RX u ovom pojednostavnjenom procesu izražava 
se kao 
brzina = k [H  2 O] [RX]  reakcija drugog reda  
ili 
brzina = k [RX] reakcija prvog reda  ovisno o koraku koji odre đuje brzinu.  
Budući da količina vode obilato premašuje koli činu ispitivane tvari, ova se vrsta 
reakcije obi čno opisuje kao reakcija pseudo prvog reda, gdje se utvr đena 
konstanta brzine izražava kao odnos 
k obs = k [H  2 O] [2]  
i može se odrediti iz izraza (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
gdje je:  
t = vrijeme  
C o , C t = koncentracije RX u vremenu 0 i t.  
Jedinice ove konstante imaju dimenzije (vrijeme)  -1 , a vrijeme poluraspada reak ­
cije (vrijeme potrebno za reakciju 50 % RX) izražava se kao  
t 0,5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Vrijeme poluraspada:  (t 0,5 ) vrijeme potrebno za 50 %-tnu hidrolizu ispitivane 
tvari, ako se reakcija može opisati kinetikom prvog reda; ono je neovisno o 
koncentraciji.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1040  
(*) Ako grafi čki prikaz logaritamski transformiranih podataka u ovisnosti o vremenu ne 
ukazuje na linearnu funkciju (izjedna čeni s brzinom reakcije prvog reda), tada za odre ­ 
đivanje konstante brzine hidrolize ispitivanog spoja nije primjereno koristiti jednadžbu.
 DT 50 (vrijeme nestajanja 50):  vrijeme u kojemu se koncentracija ispitivane 
tvari smanji za 50 %; ono je razli čito od vremena poluraspada t  0,5 ako reakcija 
ne prati kinetiku prvog reda.  
Procjena k na razli čitim temperaturama  
Ako su konstante brzine poznate za dvije temperature, konstante brzine pri 
drugim temperaturama mogu se izra čunati pomo ću Arrheniusove jednadžbe:  
k ¼ A Ü e Ä E 
RÜT sau ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Grafičkim prikazom ln k u ovisnosti o 1/T dobije se pravac s nagibom - E/R  
gdje je:  
k = konstanta brzine, mjerena na razli čitim temperaturama  
E = energija aktivacije [kJ/mol]  
T = apsolutna temperatura [K]  
R = plinska konstanta [8,314 J/mol.K]  
Energija aktivacije izra čunana je regresijskom analizom ili pomo ću sljedeće 
jednadžbe:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
gdje je T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1041
 
Dodatak 3.  
Puferski sustavi  
A. CLARK I LUBS:  
Puferske smjese po Clarku i Lubsu  (*) 
Sastav  pH  
0,2 N HCl i 0,2 N KCl na 20 °C  
47,5 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  1,0  
32,25 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  1,2  
20,75 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  1,4  
13,15 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  1,6  
8,3 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  1,8  
5,3 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  2,0  
3,35 ml HCl + 25 ml KCl razr. do 100 ml  2,2  
0,1 M kalijev biftalat + 0,1 N HCl na 20 °C  
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  2,2  
39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  2,4  
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  2,6  
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  2,8  
20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  3,0  
14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  3,2  
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  3,4  
5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  3,6  
2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat do 100 ml  3,8  
0,1 M kalijev biftalat + 0,1 N NaOH na 20 °C  
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  4,0  
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  4,2  
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  4,4  
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  4,6  
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  4,8  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1042  
(*) pH vrijednosti navedene u ovim tablicama izra čunane su na temelju mjerenja potencijala primjenom Sören ­
senovih standardnih jednadžbi (1909.). Odgovaraju će pH vrijednosti su za 0,04 jedinice više od vrijednosti u 
tablici.
 Sastav  pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  5,0  
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  5,2  
35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  5,4  
39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  5,6  
43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  5,8  
45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat do 100 ml  6,0  
Puferske smjese po Clarku i Lubsu (nastavak) 
0,1 M monokalijev fosfat + 0,1 N NaOH na 20 °C  
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  6,0  
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  6,2  
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  6,4  
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  6,6  
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  6,8  
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  7,0  
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  7,2  
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  7,4  
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  7,6  
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  7,8  
46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat do 100 ml  8,0  
0,1 M H  3 BO  3 u 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH na 20 °C  
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  7,8  
3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  8,0  
5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  8,2  
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  8,4  
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  8,6  
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  8,8  
21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  9,0  
26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  9,2  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  9,4  
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  9,6  
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  9,8  
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borna kiselina do 100 ml  10,0  
B. KALTHOFF I VLEESCHHOUWER:  
Citratni puferi po Kalthoffu i Vleeschhouweru  
Sastav  pH  
0,1 M monokalijev citrat i 0,1 N HCl na 18 °C  (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  2,2  
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  2,4  
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  2,6  
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  2,8  
23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  3,0  
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  3,2  
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  3,4  
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat do 100 ml  3,6  
0,1 M monokalijev citrat i 0,1 N NaOH na 18 °C  (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  3,8  
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  4,0  
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  4,2  
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  4,4  
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  4,6  
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  4,8  
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  5,0  
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  5,2  
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  5,4  
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  5,6  
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  5,8  
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat do 100 ml  6,0  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1044  
(*) Doda se kristali ć timola ili sli čne tvari kako bi se sprije čio rast plijesni.
 C. SÖRENSEN:  
Boratne smjese po Sörensenu  
Sastav  Sörensen 
18 °C  Walbum, pH na  
ml boraks  ml HCl/NaOH  10 °C  40 °C  70 °C  
0,05 M boraks + 0,1 N HCl  
5,25 4,75  7,62  7,64  7,55  7,47  
5,50 4,50  7,94  7,98  7,86  7,76  
5,75 4,25  8,14  8,17  8,06  7,95  
6,00 4,00  8,29  8,32  8,19  8,08  
6,50 3,50  8,51  8,54  8,40  8,28  
7,00 3,00  8,08  8,72  8,56  8,40  
7,50 2,50  8,80  8,84  8,67  8,50  
8,00 2,00  8,91  8,96  8,77  8,59  
8,50 1,50  9,01  9,06  8,86  8,67  
9,00 1,00  9,09  9,14  8,94  8,74  
9,50 0,50  9,17  9,22  9,01  8,80  
10,00  0,00  9,24  9,30  9,08  8,86  
0,05 M boraks + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0  9,24  9,30  9,08  8,86  
9,0 1,0  9,36  9,42  9,18  8,94  
8,0 2,0  9,50  9,57  9,30  9,02  
7,0 3,0  9,68  9,76  9,44  9,12  
6,0 4,0  9,97  10,06  9,67  9,28  
Fosfatne smjese po Sörensenu  
Sastav  pH  
0,0667 M monokalijev fosfat + 0,0667 M dinatrijev fosfat na 20 °C  
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1046
 
C.8. TOKSI ČNOST ZA GUJAVICE  
TEST S UMJETNIM TLOM  
1. METODA  
1.1. UVOD  
U ovom se laboratorijskom testu ispitivana tvar dodaje u umjetno tlo 
i u njemu drže gujavice tijekom 14 dana. Nakon tog vremena (i 
fakultativno nakon sedam dana) provjerava se letalni u činak tvari 
na gujavice. Ovaj test je relativno brz na čin provjere u činka kemi ­
kalija na gujavice kod unosa kroz kožu i putem hrane.  
1.2. DEFINICIJA I JEDINICA  
LC 50 : procijenjena koncentracija tvari koja ubija 50 % ispitanih 
životinja u razdoblju ispitivanja.  
1.3. REFERENTNA TVAR  
Periodičnim korištenjem referentne tvari treba se uvjeriti da se osje ­
tljivost ispitnog sustava nije zna čajno promijenila.  
Preporučena referentna tvar je analiti čki čisti kloracetamid.  
1.4. NA ČELO ISPITIVANJA  
Tlo je promjenljiv medij; stoga se u ovom testu koristi pažljivo 
definirano umjetno ilovasto tlo. Odrasle gujavice vrste  Eisenia 
foetida  (vidjeti napomenu u Dodatku) drže se u definiranom 
umjetnom tlu obra đenom razli čitim koncentracijama ispitivane 
tvari. 14 dana (i fakultativno 7 dana) nakon po četka ispitivanja 
sadržaj spremnika se rasprostre na podložak i prebroje gujavice koje su preživjele pri svakoj koncentraciji.
 
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Plan ispitivanja treba osigurati maksimalnu obnovljivost s obzirom 
na ispitni supstrat i organizam. Da bi ispitivanje bilo valjano, 
smrtnost u kontrolama na kraju ispitivanja ne smije biti viša od 
10 %.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Materijali  
1.6.1.1. O s n o v n i s u p s t r a t  
Kao osnovni ispitni supstrat koristi se definirano umjetno tlo.  
(a) Osnovni supstrat (postoci su na bazi suhe mase)  
— 10 % Sphagnum treseta (što bliže pH podru čju od 5,5 do 6,0, 
bez vidljivih ostataka biljaka i fino usitnjen),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1047
 
— 20 % kaolinitske gline, po mogu ćnosti s više od 50 % 
kaolinita,  
— oko 69 % industrijskog kremenog pijeska (u kojemu prevla ­
dava fini pijesak s više od 50 % čestica veli čine 0,05 do 
0,2 mm). Ako tvar nije dovoljno disperzivna u vodi, 10 g po ispitnom spremniku treba ostaviti za kasnije miješanje s ispi ­
tivanom tvari,
 
— oko 1 % kalcijevog karbonata (CaCO  3 ) u prahu, kemijski 
čistog, dodaje se za podešavanje pH na 6,0 ± 0,5.  
(b) Ispitni supstrat  
Ispitni supstrat sadrži osnovni supstrat, ispitivanu tvar i deioni ­
ziranu vodu.  
Sadržaj vode treba iznositi oko 25 do 42 % suhe mase osnovnog 
supstrata. Sadržaj vode supstrata odre đuje se sušenjem uzorka na 
105 °C dok se ne postigne stalna masa. Klju čni je kriterij da 
umjetno tlo bude dobro natopljeno, ali ne prekriveno vodom. Kod miješanja treba paziti da se postigne ravnomjerna razdioba 
ispitivane tvari i supstrata. U izvješ ću o ispitivanju treba navesti 
kako je ispitivana tvar uvedena u supstrat.
 
(c) Kontrolni supstrat  
Kontrolni supstrat sadrži osnovni supstrat i vodu. Ako se koristi 
dodatak, treba predvidjeti još jedan kontrolni supstrat koji sadrži 
istu količinu dodatka.  
1.6.1.2. I s p i t n i s p r e m n i c i  
Stakleni spremnici zapremnine oko jedne litre (prekriveni odgovara ­
jućim plasti čnim poklopcima, zdjelicama ili plasti čnom folijom s 
rupama za ventilaciju) napunjeni mokrim ispitnim ili kontrolnim supstratom u koli čini koja odgovara 500 g suhe mase supstrata.
 
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Spremnike treba držati u klima komorama na temperaturi od 20 ± 2 °C 
uz neprekidno osvjetljenje. Jakost svjetlosti treba biti 400 do 800 luksa.
 
Razdoblje ispitivanja je 14 dana, ali se smrtnost može fakultativno 
odrediti i sedam dana nakon po četka ispitivanja.  
1.6.3.  Ispitni postupak  
I s p i t n e k o n c e n t r a c i j e  
Koncentracije ispitivane tvari izražavaju se kao masa tvari po suhoj 
masi osnovnog supstrata (mg/kg).  
P r e l i m i n a r n o i s p i t i v a n j e z a o d r e đ i v a n j e r a s p o n a  
Ovim se ispitivanjem može odrediti raspon koncentracija u kojemu 
nastupa smrtnost od 0 do 100 % i tako pribaviti informacije o 
rasponu koncentracija koje treba koristiti u glavnom ispitivanju.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1048
 
Tvar treba ispitati u sljede ćim koncentracijama: 1 000; 100; 10; 1; 
0,1 mg tvari po kilogramu ispitnog supstrata (suha masa).  
Ako će se provesti potpuno glavno ispitivanje, za preliminarno ispi ­
tivanje je dovoljno uzeti po jednu ispitnu seriju po koncentraciji i jednu neobra đenu kontrolnu seriju, svaka po 10 gujavica.
 
G l a v n o i s p i t i v a n j e  
Na temelju rezultata preliminarnog ispitivanja treba odabrati 
najmanje pet koncentracija u geometrijskom nizu koje obuhva ćaju 
područje smrtnosti od 0 do 100 % i koje se razlikuju za stalni faktor 
koji nije viši od 1,8.  
Ispitivanja s tim nizom koncentracija moraju omogu ćiti što precizniju 
procjenu vrijednosti LC  50 i njezinih granica pouzdanosti.  
U glavnom se ispitivanju koriste najmanje četiri ispitne serije po 
koncentraciji i četiri neobra đene kontrolne serije, svaka po 10 guja ­
vica. Rezultati ponavljanja navode se kao srednja vrijednost i stan ­
dardna devijacija.  
Ako dvije uzastopne koncentracije u omjeru 1,8 daju samo 0 % i 
100 % smrtnosti, te su dvije vrijednosti dovoljne da se pokaže 
raspon unutar kojega se nalazi LC  50 . 
S m j e s a o s n o v n o g i s p i t n o g s u p s t r a t a i i s p i t i v a n e 
t v a r i  
Ispitni supstrat bi kad god je to mogu će trebalo pripremiti bez 
ikakvih dodataka, osim vode. Ispitivana tvar emulgirana ili dispergi ­
rana u deioniziranoj vodi ili drugom otapalu se neposredno prije 
početka ispitvanja pomiješa s osnovnim ispitnim supstratom ili 
ravnomjerno poprska finim kromatografskim ili sli čnim raspršiva ­ 
čem. 
Ako je ispitivana tvar netopljiva u vodi, ona se može otopiti u što 
manjoj koli čini prikladnog organskog otapala (npr. heksan, aceton ili 
kloroform).  
Za otapanje, dispergiranje odnosno emulgiranje ispitivane tvari smiju 
se koristiti samo lako hlapljiva sredstva. Ispitni supstrat treba prozra ­ 
čiti prije uporabe. Koli činu isparene vode treba nadomjestiti. 
Kontrolni supstrat mora sadržavati istu koli činu aditiva.  
Ako se ispitivana tvar ne otapa, ne dispergira i ne emulgira u organ ­
skom otapalu, 10 g smjese fino usitnjenog kremenog pijeska i ispi ­
tivane tvari u koli čini koja je potrebna za obradu 500 g suhe mase 
umjetnog tla treba pomiješati s 490 g suhe mase ispitnog supstrata.  
Za svaku se ispitnu seriju pripremi stakleni spremnik s koli činom 
mokrog ispitnog supstrata koja odgovara 500 g suhe mase i na površinu ispitnog supstrata stavi se 10 gujavica, koje su prije toga 
24 sata aklimatizirane u sli čnom mokrom osnovnom supstratu i 
zatim kratko oprane i osušene filtar-papirom.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1049
 
Spremnici se prekriju peforiranim plasti čnim poklopcima, zdjelicama 
ili folijom kako bi se sprije čilo isušivanje supstrata i drže se u 
ispitnim uvjetima 14 dana.  
Ocjenjivanje se provodi 14 dana (i fakultativno 7 dana) nakon 
početka ispitivanja. Supstrat se raširi na plo či od stakla ili nehr đa­
jućeg čelika. Gujavice se pregledaju i odredi broj preživjelih guja ­
vica. Gujavice se smatraju mrtvima ako ne reagiraju na nježni meha ­
nički podražaj na prednjem kraju.  
Ako se obavlja pregled nakon sedam dana, supstrat se vrati u 
spremnik i preživjele se gujavice ponovno stave na isti ispitni 
supstrat.  
1.6.4.  Ispitni organizmi  
Ispitni organizmi su odrasle gujavice  Eisenia foetida  (vidjeti napo ­
menu u Dodatku) (najmanje dva mjeseca stare, s klitelumom) mokre 
mase 300 do 600 mg. (Za na čin uzgoja vidjeti Dodatak).  
2. PODACI  
2.1. OBRADA I VREDNOVANJE REZULTATA  
Navedu se ispitane koncentracije tvari s odgovaraju ćim postocima 
mrtvih gujavica.  
Ako se dobiju odgovaraju ći podaci, treba izra čunati LC  50 i granice 
pouzdanosti (p = 0,05) primjenom standardnih metoda (Litchfield i Wilcoxon, 1949., ili istovjetna metoda). LC
 50 treba navesti u mg 
ispitne tvari po kilogramu ispitnog supstrata (suha masa).  
Ako je nagib krivulje koncentracije prevelik za izra čun LC  50 , 
dovoljna je grafi čka procjena te vrijednosti.  
Ako dvije uzastopne koncentracije u omjeru 1,8 daju samo 0 % i 
100 % smrtnosti, te su dvije vrijednosti dovoljne da se pokaže 
raspon unutar kojega se nalazi LC  50 . 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će informacije:  
— izjavu da je ispitivanje obavljeno u skladu s gore navedenim 
kriterijima kakvo će, 
— vrstu ispitivanja (ispitivanje za odre đivanje raspona i/ili glavno 
ispitivanje),  
— točan opis ispitnih uvjeta ili izjava da je ispitivanje obavljeno u 
skladu s metodom; treba navesti sva odstupanja,  
— točan opis kako je ispitivana tvar uvedena u osnovni ispitni 
supstrat,  
— informacije o ispitnim organizmima (vrsta, dob, srednja masa i 
raspon mase, uvjeti držanja i uzgoja, dobavlja č), ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1050
 
— metoda odre đivanja LC  50 , 
— rezultate ispitivanja, uklju čujući sve korištene podatke,  
— opis uo čenih simptoma i promjena u ponašanju ispitnih 
organizama,  
— smrtnost u kontrolama,  
— LC  50 ili najvišu ispitanu koncentraciju bez smrtnosti i najnižu 
ispitanu koncentraciju sa 100 %-nom smrtnoš ću 14 dana (i fakul ­
tativno 7 dana) nakon po četka ispitivanja,  
— prikaz krivulje koncentracija/odgovor,  
— rezultate dobivene s referentnom tvari, bilo u vezi s ovim ispiti ­
vanjem ili iz ranijih ispitivanja u svrhu kontrole kakvo će. 
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council 
C(81)30 final.  
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, London, str. 331.  
(3) Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Syste ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, str. 
671. 
(4) Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evalua ­
tion dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99.
 
(5) Commission of the European Communities, Development of a 
standardised laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitätstest 
am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden”, in: 
Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1051
 
Dodatak  
Uzgoj i držanje gujavica prije ispitivanja  
30 do 50 odraslih gujavica stavi se u uzgojnu kutiju sa svježim supstratom i 
izvadi nakon 14 dana. Te se životinje mogu koristiti za daljnje uzgojne serije. Gujavice koje se izvale iz kokona koriste se u ispitivanjima kad budu zrele (u propisanim uvjetima nakon dva do tri mjeseca).
 
Uvjeti držanja i uzgoja  
Klima komora: temperatura 20 ± 2 °C, po mogu ćnosti uz neprekidno osvje ­
tljenje (intenzitet 400 do 800 luksa).  
Uzgojne kutije: prikladni plitki spremnici zapremnine od 10 do 20 l.  
Supstrat:  Eisenia foetida  se može uzgajati u razli čitim vrstama životinj ­
skih izlučevina. Preporu čuje se da se kao uzgojni medij koristi 
smjesa koja sadrži 50 % volumnog udjela treseta i 50 % krav ­
ljeg ili konjskoga gnoja. Medij treba imati pH vrijednost oko 6 
do 7 (podešava se kalcijevim karbonatom) i nisku ionsku 
vodljivost (manje od 6 mmho ili 0,5 % koncentracije soli).  
Supstrat treba biti vlažan, ali ne premokar.  
Osim gornje metode mogu se primijeniti i drugi uspješni 
postupci.  
Napomena : Postoje dvije pasmine  Eisenia foetida , koje su neki taksonomi podi ­
jelili u dvije vrste (Bouche, 1972). One su morfološki sli čne, ali jedna od njih,  
Eisenia foetida foetida , ima tipi čne poprečne pruge ili prstenove na segmentima, 
dok ih druga,  Eisenia foetida andrei , nema i prošarana je crvenim pjegama. Ako 
je to mogu će, treba koristiti  Eisenia foetida andrei . Mogu se koristiti i druge 
vrste ako je raspoloživa potrebna metodologija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1052
 
C.9. BIORAZGRADNJA  
ZAHN-WELLENSOV TEST  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Svrha je ove metode ocijeniti potencijalnu potpunu biorazgradivost 
vodotopljivih nehlapljivih organskih tvari kod izlaganja relativno 
visokim koncentracijama mikroorganizama u stati čkom ispitivanju.  
Pritom može do ći do fizikalno-kemijske adsorpcije na suspendiranu 
krutu tvar, što treba uzeti u obzir kod tuma čenja rezultata (vidjeti 
3.2.).  
Ispitivane se tvari koriste u koncentracijama koje odgovaraju vrijed ­
nostima DOC-a u podru čju od 50 do 400 mg/l odnosno vrijedno ­
stima KPK u podru čju od 100 do 1 000 mg/l (DOC = Dissolved 
Organic Oxygen, otopljeni organski ugljik; KPK = kemijska potro ­ 
šnja kisika). Prednost ovih relativno visokih koncentracija je njihova 
analitička pouzdanost. Spojevi s toksi čnim svojstvima mogu odgoditi 
odnosno ko čiti proces razgradnje.  
U ovoj se metodi mjera koncentracije otopljenog organskog ugljika 
odnosno kemijske potrošnje kisika koristi za ocjenjivanje potpune biorazgradivosti.
 
Istovremenom primjenom specifi čne analiti čke metode mogu će je 
ocijeniti i primarnu biorazgradnju tvari (nestajanje polazne kemijske strukture).
 
Metoda se primjenjuje samo na one organske ispitivane tvari koje su 
u koncentraciji koja se koristi u ispitivanju:  
— topljive u vodi u ispitnim uvjetima,  
— imaju zanemariv tlak pare u ispitnim uvjetima,  
— nemaju inhibitorni u činak na bakterije,  
— adsorbiraju se tek u ograni čenoj mjeri unutar ispitnog sustava,  
— ne gube se iz ispitne otopine pjenjenjem.  
Kod tuma čenja dobivenih rezultata korisno je imati informacije o 
relativnim udjelima glavnih komponenti ispitivanog materijala, 
posebno ako su dobivene vrijednosti niske ili grani čne. 
Informacije o toksi čnosti tvari za mikroorganizme poželjne su za 
tumačenje niskih vrijednosti i odabir odgovaraju ćih ispitnih 
koncentracija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1053
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Vrijednost razgradnje dobivena na kraju ispitivanja navodi se kao 
„biorazgradivost iz Zahn-Wellensovog testa”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
gdje je:  
DT = biorazgradnja (%) u vremenu T  
CA = vrijednosti DOC-a (ili KPK) u ispitnoj smjesi izmjerene tri 
sata nakon po četka ispitivanja (mg/l) (DOC = Dissolved 
Organic Oxygen, otopljeni organski ugljik; KPK = kemijska 
potrošnja kisika)  
CT = vrijednosti DOC-a ili KPK u ispitnoj smjesi u vremenu 
uzorkovanja (mg/l)  
CB = vrijednost DOC-a ili KPK slijepe probe u vremenu uzorko ­
vanja (mg/l)  
CBA = vrijednost DOC-a ili KPK slijepe probe izmjerena tri sata 
nakon po četka ispitivanja (mg/l)  
Stupanj razgradnje zaokružuje se na najbliži puni postotak.  
Postotak razgradnje navodi se kao postotak opadanja DOC-a (ili 
KPK) ispitivane tvari.  
Razlika izme đu izmjerene vrijednosti nakon tri sata i izra čunane 
odnosno, po mogu ćnosti, izmjerene po četne vrijednosti može 
pružiti korisne informacije o eliminaciji tvari (vidjeti 3.2. Tuma čenje 
rezultata).  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari mogu biti korisne kod ispitivanja novih tvari; me đu­
tim, još se ne mogu preporu čiti određene referentne tvari.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
U staklenu posudu zapremnine od jedne do četiri litre, opremljenu 
mješalicom i napravom za dozra čivanje, stave se zajedno, u vodenoj 
otopini, aktivni mulj, mineralni nutrijenti i ispitivani materijal kao 
jedini izvor ugljika. Smjesa se miješa i dozra čuje na 20 do 25 °C 
pod difuznim osvjetljenjem ili u mra čnom prostoru do 28 dana. 
Proces razgradnje prati se odre đivanjem vrijednosti DOC-a (ili 
KPK) u filtriranoj otopini u dnevnim ili u drugim odgovaraju ćim 
redovitim vremenskim razmacima. Omjer eliminiranog DOC-a (ili KPK) nakon svakog intervala i vrijednosti tri sata nakon po četka 
ispitivanja izražava se kao postotak biorazgradnje i služi kao mjera 
stupnja razgradnje u tom trenutku. Dobiveni se rezultati grafi čki 
prikazuju u ovisnosti o vremenu kako bi se dobila krivulja razgradnje.
 
Ako se koristi specifi čna analiti čka metoda, mogu se izmjeriti 
promjene koncentracije polazne molekule uslijed biorazgradnje (pri ­
marna biorazgradivost).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1054
 
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
U prstenastom je testu dokazana zadovoljavaju ća obnovljivost ovog 
testa.  
Osjetljivost metode u velikoj je mjeri ovisna o varijabilnosti slijepe 
probe te, u manjoj mjeri, o preciznosti odre đivanja otopljenog organ ­
skog ugljika i koncentraciji ispitivanog spoja u otopini.  
1.6. OPIS ISPITNOG POSTUPKA  
1.6.1.  Priprema  
1.6.1.1. R e a g e n s i  
Ispitna voda: voda za pi će sa sadržajem organskog ugljika < 5 mg/l. 
Koncentracija kalcijevih i magnezijevih iona zajedno ne smije biti viša od 2,7 mmol/l; u protivnome je treba dostatno razrijediti deio ­
niziranom ili destiliranom vodom. 
Sumporna kiselina, analiti čki reagens (A.R.):
 50 g/l  
Otopina natrijevog hidroksida A.R.:  40 g/l  
Mineralna hranjiva otopina: u jednoj litri deionizirane 
vode se otopi:  
amonijev klorid, NH4Cl, A.R.:  38,5 g  
natrijev dihidrogenfosfat, NaH2PO4.2H2O, A.R.:  33,4 g  
kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4, A.R.:  8,5 g  
dikalijev monohidrogenfosfat, K2HPO4, A.R.:  21,75 g  
Smjesa istodobno služi kao nutrijent i kao puferski sustav.  
1.6.1.2. A p a r a t u r a  
Staklene posude zapremnine od jedne do četiri litre (npr. cilindri čne 
posude).  
Mješalica sa staklenim ili metalnim mješa čem na odgovaraju ćoj 
osovini (mješa č se treba vrtiti oko 5 do 10 cm iznad dna posude). 
Umjesto toga može se koristiti magnetska mješalica s polugom dužine od 7 do 10 cm.
 
Staklena cjev čica unutarnjeg promjera od 2 do 4 mm za uvo đenje 
zraka. Otvor cjev čice treba biti oko 1 cm iznad dna posude.  
Centrifuga (oko 3 550 g).  
Mjerač pH vrijednosti.  
Mjerač otopljenog kisika.  
Papirni filtri.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1055
 
Uređaj za membransku filtraciju.  
Membranski filtri, veli čina pora 0,45 μm. Membranski filtri su 
prikladni pod uvjetom da ne otpuštaju ugljik i ne apsorbiraju tvar 
tijekom filtracije.  
Analitička oprema za odre đivanje sadržaja organskog ugljika i 
kemijske potrošnje kisika.  
1.6.1.3. P r i p r e m a i n o k u l u m a  
Aktivni mulj iz postrojenja za biološko pro čišćavanje pere se (više ­
kratnim) centrifugiranjem ili taloženjem s ispitnom vodom (gore).  
Aktivni mulj mora biti u prikladnom stanju. Takav se mulj može 
dobiti iz ispravnog postrojenja za pro čišćavanje otpadnih voda. Da bi 
se dobilo što je mogu će više razli čitih vrsta ili sojeva bakterija mogu 
se pomiješati inokulumi iz razli čitih izvora (npr. razli čita postrojenja 
za pročišćavanje, ekstrakti tla, rje čna voda itd.). Smjesu treba obra ­
diti na na čin kako je gore opisano.  
Za provjeru aktivnosti aktivnog mulja vidjeti odjeljak „Funkcionalna 
kontrola” u nastavku.  
1.6.1.4. P r i p r e m a i s p i t n i h o t o p i n a  
U ispitnu se posudu stavi 500 ml ispitne vode, 2,5 ml/l mineralne 
hranjive otopine i aktivni mulj u koli čini koja odgovara 0,2 do 
1,0 g/l suhe tvari u kona čnoj smjesi. Doda se dovoljna koli čina 
radne otopine ispitivane tvari tako da se u kona čnoj smjesi dobije 
koncentracija DOC-a od 50 do 400 mg/l. Odgovaraju će vrijednosti 
KPK iznose 100 do 1 000 mg/l. Zatim se nadopuni ispitnom vodom do ukupnog volumena od jedne do četiri litre. Ukupni se volumen 
odabire ovisno o broju uzoraka koji će se uzeti za odre đivanje 
DOC-a ili KPK i koli činama koje su potrebne za analiti čki postupak.
 
U pravilu je dovoljan volumen od dvije litre. Na svaki ispitni niz 
dolazi barem po jedna kontrolna posuda (slijepa proba), koja se paralelno ispituje; ona sadrži samo aktivni mulj i mineralnu hranjivu 
otopinu nadopunjenu ispitnom vodom do istog ukupnog volumena 
kao ispitne posude.
 
1.6.2.  Provo đenje ispitivanja  
Ispitne se posude miješaju magnetskim mješalicama ili propelerima 
pod difuznim osvjetljenjem ili u mra čnom prostoru na 20 do 25 °C. 
Dozračivanje se provodi komprimiranim zrakom o čišćenim kroz 
pamučni filtar i, prema potrebi, u boci za pranje plina. Treba 
voditi računa da se mulj ne taloži i da koncentracija kisika ne 
padne ispod 2 mg/l.  
pH vrijednost treba provjeravati u redovitim razmacima (npr. 
dnevno) i prema potrebi podesiti na pH 7 do 8.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1056
 
Gubici uslijed isparavanja nadokna đuju se neposredno prije uzorko ­
vanja odgovaraju ćim količinama deionizirane ili destilirane vode. 
Ispravan postupak je ozna čiti razinu teku ćine na posudi prije 
početka ispitivanja. Nakon svakog se uzorkovanja stavljaju nove 
oznake (bez dozra čivanja i miješanja). Prvi se uzorci uvijek 
uzimaju tri sata nakon po četka ispitivanja kako bi se utvrdila adsorp ­
cija ispitivanog materijala na aktivni mulj.  
Eliminacija ispitivanog materijala prati se odre đivanjem DOC-a 
odnosno KPK u dnevnim ili drugim redovitim razmacima. Uzorci iz ispitne posude i slijepe probe filtriraju se kroz pažljivo oprani papirni filtar. Prvih 5 ml filtrata ispitne se otopine baca. Muljevi 
koji se teško filtriraju mogu se prethodno ukloniti 10-minutnim 
centrifugiranjem. Provode se barem dva paralelna odre đivanja 
DOC-a i KPK. Ispitivanje traje do 28 dana.
 
Napomena:  uzorci koji ostanu mutni filtriraju se kroz membranske 
filtre. Membranski filtri ne smiju otpuštati niti adsorbirati organski 
materijal.  
F u n k c i o n a l n a k o n t r o l a a k t i v n o g m u l j a  
Na svaki ispitni niz dolazi po jedna posuda u kojoj se paralelno 
ispituje poznata tvar za provjeru funkcionalne sposobnosti aktivnog 
mulja. Pokazalo se da je za to prikladan dietilenglikol.  
P r i l a g o d b a  
Ako se analize provode u relativno kratkim razmacima (npr. 
dnevno), prilagodba se može jasno prepoznati iz krivulje razgradnje 
(vidjeti sliku 2.). Ispitivanje stoga ne treba zapo činjati neposredno 
prije vikenda.  
Ako prilagodba nastupi na kraju razdoblja, ispitivanje se može 
produžiti dok se razgradnja ne završi.  
Napomena:  ako je potrebno šire poznavanje ponašanja prilago đenog 
mulja, isti se aktivni mulj još jedanput izloži istom ispitivanom materijalu u skladu sa sljede ćim postupkom:
 
isključi se mješalica i naprava za dozra čivanje i pri čeka da se aktivni 
mulj istaloži. Ukloni se supernatant, nadopuni do dvije litre ispitnom 
vodom, miješa 15 minuta i ponovno pusti da se mulj istaloži. Nakon što se supernatant ponovno ukloni, preostali se mulj koristi za ponovljeno ispitivanje s istim materijalom u skladu s 1.6.1.4. i 
1.6.2. gore. Aktivni mulj se umjesto taloženjem može izolirati i 
centrifugiranjem.
 
Prilagođeni se mulj može pomiješati sa svježim muljem da se dobije 
koncentracija od 0,2 do 1 g suhe mase po litri.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1057
 
S r e d s t v a z a a n a l i z u  
Uzorci se u pravilu filtriraju kroz pažljivo oprani papirni filtar (za 
pranje treba koristiti deioniziranu vodu).  
Uzorci koji ostanu mutni filtriraju se kroz membranske filtre 
(0,45 μm). 
Koncentracija DOC-a u filtratima uzorka odre đuje se dvostruko 
(prvih se 5 ml baca) pomo ću instrumenta za TOC. Ako se filtrat 
ne može analizirati istog dana, treba ga čuvati u hladnjaku do slje ­
dećeg dana. Duže se skladištenje ne preporu čuje. 
Koncentracija KPK u filtratima uzorka odre đuje se analiti čki 
postupkom opisanim u (2) u nastavku.  
2. PODACI I VREDNOVANJE  
Koncentracije DOC-a i/ili KPK u uzorcima odre đuju se barem 
dvostruko u skladu s 1.6.2. gore. Razgradnja u vremenu T izra ču­
nava se pomo ću formule (s definicijama) iz 1.2. gore.  
Stupanj razgradnje zaokružuje se na najbliži puni postotak. Opseg 
razgradnje postignut na kraju ispitivanja navodi se kao „biorazgradi ­
vost iz Zahn-Wellensovog testa”.  
Napomena : Ako se potpuna razgradnja postigne prije isteka pred ­
viđenog vremena ispitivanja i ako taj rezultat potvrdi druga analiza 
sljedećeg dana, ispitivanje se može okon čati. 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će: 
— početnu koncentracija tvari,  
— sve ostale informacije i rezultate pokusa u vezi s ispitivanom 
tvari, referentnom tvari (ako se koristi) i slijepom probom,  
— koncentraciju nakon tri sata,  
— biorazgradnjom: krivulja s opisom,  
— datumom i mjestom skupljanja ispitnih organizama, stanje prila ­
godbe, upotrijebljena koncentracija itd.,  
— znanstveni razlozi mogu ćih izmjena ispitnog postupka.  
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Postupno opadanje DOC-a (KPK) tijekom više dana ili tjedana 
ukazuje na to da se ispitivana tvar biološki razgra đuje. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1058
 
Ipak, u pojedinim slu čajevima može imati utjecaja i 
fizikalno-kemijska adsorpcije, na što ukazuje potpuno ili djelomi čno 
opadanje na samom po četku ispitivanja, unutar prva tri sata, i neo če­
kivano mala razlika izme đu kontrolnog i ispitnog supernatanta.  
Ako je potrebno razlikovati biorazgradnju (ili djelomi čnu biorazgra ­
dnju) od adsorpcije, treba provesti dodatna ispitivanja.  
To se može u činiti na više na čina, ali najpouzdaniji na čin je provesti 
ispitivanje osnovne razine koriste ći supernatant ili mulj kao 
inokulum (po mogu ćnosti respirometrijski test).  
Ispitivane tvari koje u ovom testu pokazuju zna čajno smanjenje 
DOC-a (KPK) koje nije uvjetovano adsorpcijom mogu se smatrati 
potencijalno biorazgradivim. Djelomi čno neadsorptivno opadanje 
ukazuje na to da je kemikalija barem donekle podložna biorazgra ­
dnji. Malo opadanje ili nepromijenjena razina DOC-a (KPK) može biti posljedica inhibitornog u činka ispitivane tvari na mikroorgan ­
izme, što se tako đer može o čitovati razlaganjem i gubitkom mulja 
i zamućenjem supernatanta. Ispitivanje treba ponoviti s nižom 
koncentracijom ispitivane tvari.
 
Primjenom specifi čne analiti čke metode za spoj ili  14 C obilježene 
ispitivane tvari može se pove ćati osjetljivost. U slu čaju 14 C obilje­ 
ženog spoja, pojava biorazgradnje se može potvrditi izdvajanjem  
14 CO 2 . 
Ako se rezultati navode i kao primarna biorazgradnja, treba po 
mogućnosti objasniti promjenu kemijske strukture zbog koje izostaje 
odgovor polazne ispitivane tvari.  
Potrebno je navesti validaciju analiti čke metode zajedno s odgo ­
vorom medija slijepe probe.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) Prilog V C.9 Razgradivost: kemijska potreba za kisikom, Direk ­
tiva Komisije 84/449/EEZ, (SL L 251,19.9.1984., str. 1.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1059
 
Dodatak  
PRIMJER VREDNOVANJA 
Organski spoj:  4-etoksibenzojeva kiselina  
Teoretska ispitna koncentracija:  600 mg/l  
Teoretski DOC:  390 mg/l  
Inokulum:  postrojenje za pro čišćavanje otpadnih voda …  
Koncentracija:  1 gram suhe tvari/l  
Stanje prilagodbe:  nije prilago đen 
Analiza:  odre đivanje DOC-a  
Količina uzorka:  3 ml  
Kontrolna tvar:  dietilenglikol  
Toksičnost spoja:  nema toksi čnih učinaka ispod 1 000 mg/l 
Primijenjeni test:  
Vrijeme 
ispitivanja  Kontrolna tvar  Ispitivana tvar  
Slijepa 
proba 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC neto 
mg/l Razgradnja 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC neto 
mg/l Razgradnja 
% 
0 —  —  300,0  —  —  390,0  —  
3 sata  4,0  298,0  294,0  2  371,6  367,6  6  
1 dan  6,1  288,3  282,2  6  373,3  367,2  6  
2 dana  5,0  281,2  276,2  8  360,0  355,0  9  
5 dana  6,3  270,5  264,2  12  193,8  187,5  52  
6 dana  7,4  253,3  245,9  18  143,9  136,5  65  
7 dana  11,3  212,5  201,2  33  104,5  93,2  76  
8 dana  7,8  142,5  134,7  55  58,9  51,1  87  
9 dana  7,0  35,0  28,0  91  18,1  11,1  97  
10 dana  18,0  37,0  19,0  94  20,0  2,0  99  
( 1 ) Srednje vrijednosti trostrukog odre đivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1060
 
Slika 1.  
Primjeri krivulja biorazgradnje
  
Slika 2.  
Primjeri prilagodbe mulja
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1061
 
C.10.  SIMULACIJSKI TEST AEROBNOG PRO ČIŠĆAVANJA 
OTPADNIH VODA C.10-A: JEDINICE S AKTIVNIM MULJEM - 
C.10-B: BIOFILMOVI  
C.10-A: Jedinice s aktivnim muljem  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 303 
(2001.). Pedesetih godina prošlog stolje ća došlo je do spoznaje da nanovo 
uvedeni surfaktanti izazivaju prekomjerno pjenjenje u postrojenjima za 
pročišćavanje otpadnih voda i u rijekama. Oni se tada nisu u cijelosti ukla ­
njali tijekom aerobnog pro čišćavanja, a u nekim su slu čajevima i ograni ča­
vali opadanje ostalih organskih tvari. To je potaklo brojna istraživanja o načinu na koji bi se surfaktanti mogli ukloniti iz otpadnih voda i jesu li nove 
kemikalije koje se proizvode u industriji prikladne za pro čišćavanje otpadnih 
voda. Da bi se to ostvarilo, koristili su se modeli ure đaja koji su predstav ­
ljali dvije osnovne vrste aerobnog biološkog pro čišćavanja otpadnih voda 
(aktivni mulj i perkolacijska ili kapaju ća filtracija). Bilo bi neprakti čno vrlo 
skupo distribuirati svaku novu kemikaliju i nadzirati postrojenja za pro či­ 
šćavanje velikih razmjera, čak i na lokalnoj razini.
 
POČETNA RAZMATRANJA  
Jedinice s aktivnim muljem  
2. Opisani su modeli jedinica s aktivnim muljem veli čine (u rasponu) od 
300 ml do oko 2 000 ml. Neki su modeli izvrsno oponašali postrojenja velikih razmjera s taložnicama iz kojih se istaloženi mulj crpi natrag u aeracijski bazen, a drugi su bili opremljeni taložnicama, npr. Swisher (1). 
Veličina aparature podliježe kompromisu: s jedne strane, ona mora biti 
dovoljno velika za uspješan mehani čki rad i za osiguravanje dovoljne koli ­ 
čine uzoraka, a da pritom to ne utje če na rad, a s druge strane, ne bi smjela 
biti toliko velika da zahtijeva prekomjerni prostor i materijale.
 
3. Dvije vrste aparature koje su se dosad naširoko i na zadovoljavaju ći način 
primjenjivale su Husmannove jedinice (2) i jedinice s propusnom posudom (3)(4), koje su se prve koristile u studiji surfaktanata i opisuju se u ovoj ispitnoj metodi. Uspješno se primjenjuju i druge jedinice tako đer uspješno 
primjenjuju, npr. Eckenfelder (5). Zbog relativno visokih troškova i velikih 
napora pri primjeni ovog simulacijskog testa istodobno su se istraživali jednostavniji i jeftiniji testovi probira, koji su sada sadržani u poglavlju C.4 AF ovog Priloga (6). Iskustvo s brojnim surfaktantima i drugim kemi ­
kalijama pokazalo je da su se upravo one kemikalije koje su prošle na 
testovima probira (lako biorazgradive) razgra đivale i u ovom simulacijskom 
testu. Neke od kemikalija koje nisu prošle na testovima probira prošle su na testovima inherentne biorazgradivosti (poglavlja C.12 (7) i C.19 (8) ovog 
Priloga), ali su se samo neke od kemikalija iz potonje skupine razgradile u 
simulacijskom testu, dok se one kemikalije koje nisu prošle na testovima kojima inherentne biorazgradivosti nisu razgradile u simulacijskim testovima (9)(10)(11).
 
4. Za neke su svrhe dostatni simulacijski testovi provedeni u jedinstvenom 
skupu radnih uvjeta; njihovi se rezultati izražavaju kao postotak opadanja ispitivane kemikalije ili otopljenog organskog ugljika (DOC). U ovoj ispitnoj metodi naveden je i opis takvog testa. Me đutim, za razliku od 
prethodne verzije ovog poglavlja, u kojoj je opisan samo jedan tip aparature 
kojom se pro čišćavaju sinteti čke otpadne vode na činom rada „s povezanim
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1062
 
jedinicama” relativno grubim metodama izdvajanja mulja, u ovom tekstu 
nudi se cijeli niz varijacija. Opisuju se alternativne vrste aparature, na čin 
rada te uklanjanje iz otpadnih voda i izdvajanje mulja. Ovaj tekst po čiva na 
tekstu norme ISO 11733 (12), koji je temeljito ispitan tijekom svoje pripreme iako sama metoda nije bila podvrgnuta prstenastom testu.
 
5. Za druge je svrhe potrebno preciznije odrediti koncentraciju ispitivane kemi ­
kalije u otpadnoj vodi pa je za to potrebna opsežnija metoda. Tako se, primjerice, svakog dana i tijekom trajanja testa brzina izdvajanja mulja mora preciznije kontrolirati, a jedinice se moraju ispitati na cijelom nizu 
brzina izdvajanja. Za potpuno sveobuhvatnu ispitnu metodu testove bi 
također trebalo provoditi na dvije ili tri razli čite temperature. Tu je 
metodu opisao Birch (13)(14), a u sažetom obliku navedena je u Dodatku 6. Međutim, sadašnje znanje nije dovoljno da se donese odluka o tomu koji 
se kinetički modeli mogu primijeniti na biorazgradnju kemikalija u pro či­ 
šćavanju otpadnih voda i u vodenom okolišu op ćenito. Primjena Monodove 
kinetike, koja je kao primjer navedena u Dodatku 6., ograni čena je na 
kemikalije prisutne u koncentraciji od 1 mg/l i višoj, ali je po mišljenju 
nekih i to tek potrebno dokazati. Testovi na koncentracijama koje bolje 
odražavaju one utvr đene u otpadnim vodama navedeni su u Dodatku 7., 
ali su takvi testovi, kao i oni iz Dodatka 6., uvršteni u dodatke umjesto da se objave kao zasebne ispitne metode.
 
Filtri  
6. Mnogo je manje pažnje posve ćeno modelima perkolacijskih filtara, i to 
možda zbog toga što su oni složeniji i manje kompaktni od modela postro ­
jenja s aktivnim muljem. Gerike i sur. razvili su jedinice s kapaju ćim 
filtrima i radili su s njima u na činu rada „s povezanim jedinicama” (15). 
Ti su filtri bili relativno veliki (visine 2 m; volumena 60 l) i za svaki je bilo 
potrebno i do 2 l/h otpadnih voda. Baumann i sur. (16) simulirali su kapa ­
juće filtre umetanjem traka od poliesterskog „flisa” u cjev čice od 1 m 
(unutarnjeg promjera 14 mm) nakon što bi trake namakali 30 minuta u koncentriranom aktivnom mulju. Ispitivana kemikalija, kao jedini izvor 
ugljika u otopini mineralnih soli, ulila bi se u okomitu cjev čicu te je procje ­
njivana njezina biorazgradnja iz mjerenja DOC-a u otpadnoj vodi i CO
 2 u 
otpadnom plinu.  
7. Biofiltri se simuliraju na druk čiji način (15); u unutarnju površinu rotiraju ćh 
cjevčica, nagnutih pod malim kutom u odnosu na horizontalu, ulijevaju se 
otpadne vode (oko 250 ml/h) s ispitivanom kemikalijom ili bez nje pa se u skupljenoj izlaznoj vodi analizira koli čina DOC-a i/ili specifi čna ispitivana 
kemikalija.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
8. Ova je metoda namijenjena za odre đivanje eliminacije primarne i/ili potpune 
biorazgradnje organskih kemikalija topljivih u vodi pomo ću aerobnih 
mikroorganizama u ispitnom sustavu koji neprekidno radi, simuliraju ći 
tako proces koji se odvija u aktivnom mulju. Lako biorazgradivi organski medij i organska ispitivana kemikalija predstavljaju izvore ugljika i energije 
za te mikroorganizme.
 
9. Dvije ispitne jedinice koje neprekidno rade (postrojenja s aktivnim muljem 
ili propusne posude) pogone se paralelno i u istim uvjetima koji se biraju tako da odgovaraju svrsi testa. Srednje vrijeme hidrauli čkog zadržavanja 
obično iznosi 6 h, a srednja starost mulja (vrijeme zadržavanja mulja) 
iznosi 6 do 10 dana. Mulj se izdvaja jednom od dviju metoda, ispitivana kemikalija obi čno se dodaje u koncentraciji otopljenog organskog 
ugljika (DOC) izme đu 10 mg/l i 20 mg/l ulaznoj vodi (organskom 
mediju) samo jedne jedinice. Druga se jedinica koristi kao kontrolna jedinica 
kako bi se odredila biorazgradnja organskog medija.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1063
 
10. Iz često uzimanih uzoraka izlazne vode odre đuju se, po mogu ćnosti, DOC 
ili kemijska potrošnja kisika (KPK), zajedno s koncentracijom ispitivane 
kemikalije (ako je potrebno), i to specifi čnom analizom izlazne vode iz 
jedinice u koju se dodaje ispitivana kemikalija. Pretpostavlja se da je razlika izme đu koncentracije DOC-a i KPK-a u izlaznoj vodi u ispitnoj i 
kontrolnoj jedinici rezultat ispitivane kemikalije ili njezinih organskih meta ­
bolita. Ta se razlika uspore đuje s koncentracijom DOC-a ili KPK-a u 
ulaznoj vodi koja je rezultat ispitivane kemikalije dodane kako bi se odredila eliminacija ispitivane kemikalije.
 
11. Biorazgradnja se obi čno može razlikovati od bioadsorpcije pomnim ispitiva ­
njem krivulje vremena eliminacije i obi čno se može potvrditi primjenom 
testa biorazgradnje pomo ću aklimatiziranog inokuluma iz jedinice u koju se 
dodaje ispitivana kemikalija.  
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI  
12. Trebali bi biti poznati čistoća, topljivost u vodi, hlapljivost i adsorpcijska 
svojstva ispitivane kemikalije kako bi se omogu ćilo ispravno tuma čenje 
rezultata. Normalno hlapljive i netopljive kemikalije mogu se ispitivati samo ako se poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti Dodatak 5.). 
Također bi trebala biti poznata i kemijska struktura ili barem empirijska 
formula kako bi se izra čunale teorijske vrijednosti i/ili provjerile izmjerene 
vrijednosti parametara, na primjer teoretska potrošnja kisika (TPK), otopljeni organski ugljik (DOC) i kemijska potrošnja kisika (KPK).
 
13. Informacije o toksi čnosti ispitivane kemikalije za mikroorganizme (vidjeti 
Dodatak 4.) mogu biti korisne za odabir odgovaraju ćih ispitnih koncentracija 
te mogu biti klju čne za ispravno tuma čenje niskih vrijednosti biorazgradnje.  
RAZINE PROLAZNOSTI  
14. U prvoj primjeni ovog simulacijskog (potvrdnog) testa na primarnu bioraz ­
gradnju surfaktanata potrebno je opadanje specifi čne kemikalije ve će od 
80 % prije nego što se surfaktant smije staviti na tržište. Ako se ne postigne vrijednost od 80 %, može se primijeniti simulacijski (potvrdni) test, a surfaktant se smije staviti na tržište tek ako specifi čna kemikalija opadne 
za više od 90 %. Kod kemikalija op ćenito nije rije č o pozitivnom ili nega ­
tivnom rezultatu testa, a dobivena vrijednost postotka opadanja može se upotrijebiti u približnim izra čunima vjerojatne koncentracije u okolišu koja 
će se koristiti u procjeni opasnosti koju te kemikalije predstavljaju. Rezultati 
obično odgovaraju pravilu „sve ili ništa”. U nizu studija o čistim kemika ­
lijama dobiveni su rezultati s postotkom opadanja DOC-a > 90 % za više od tri četvrtine kemikalija te > 80 % za više od 90 % kemikalija koje su 
pokazale znatniji stupanj biorazgradivosti.
 
15. Relativno malen broj kemikalija (npr. surfaktanti) prisutan je u otpadnim 
vodama u koncentracijama (oko 10 mg C/l) koje se koriste u ovom testu. Neke kemikalije u tim koncentracijama mogu imati inhibitorni u činak, dok 
se kinetika opadanja nekih drugih kemikalija može razlikovati u niskim 
koncentracijama. Do preciznije procjene razgradnje može se do ći primjenom 
modificiranih metoda kod kojih se upotrebljavaju realisti čno niske koncen ­
tracije ispitivane kemikalije, a prikupljeni bi se podaci mogli koristiti za izračun kinetičkih konstanti. Me đutim, još uvijek nisu potvr đene neophodne 
pokusne tehnike niti su uspostavljeni kineti čki modeli koji opisuju reakcije 
biorazgradnje (vidjeti Dodatak 7.).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1064
 
REFERENTNE KEMIKALIJE  
16. Kako bi se osiguralo ispravno provo đenje pokusnog postupka, korisno je 
povremeno, istodobno s istraživanjem ispitivanih kemikalija, ispitati kemi ­
kalije za koje je poznato kako se ponašaju. Takve kemikalije obuhva ćaju 
adipinsku kiselinu, 2-fenil fenol, 1-naftol, difensku kiselinu, 1-naftolnu kise ­
linu itd. (9)(10)(11).  
MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA  
17. Znatno je manji broj izvješ ća o studijama simulacijskih testova nego testova 
lake biorazgradivosti. Mjerna obnovljivost u (istodobnim) višestrukim odre ­ 
đivanjima je dobra (unutar 10 - 15 %) za ispitivane kemikalije koje se 
razgrađuju za 80 % ili više, ali za slabije razgradive kemikalije ve ća je 
varijabilnost. Isto tako, kod nekih grani čnih kemikalija zabilježeni su 
znatno razli čiti rezultati (npr. 10 %, 90 %) u razli čitim prilikama tijekom 
9 tjedana testa.  
18. Male su razlike prona đene u rezultatima dobivenima s dvije vrste aparature, 
ali su se neke kemikalije razgra đivale bolje i dosljednije u prisustvu komu ­
nalnih otpadnih voda nego sinteti čkih otpadnih voda prema smjernici 
OECD-a.  
OPIS ISPITNE METODE  
Aparatura  
Sustav ispitivanja  
19. Sustav ispitivanja za jednu ispitivanu kemikaliju sastoji se od ispitne jedi ­
nice i kontrolne jedinice, ali kada se provode samo specifi čne analize (pri ­
marna biorazgradnja), potrebna je samo ispitna jedinica. Ista se kontrolna jedinica može koristiti za nekoliko ispitnih jedinica u koje se dodaju iste ili različite ispitivane kemikalije. U slu čaju načina rada „s povezanim jedini ­
cama” (Dodatak 3.) svaka ispitna jedinica mora imati svoju kontrolnu jedi ­
nicu. Sustav ispitivanja može biti model postrojenja s aktivnim muljem, Husmannova jedinica (Dodatak 1., slika 1.) ili propusna posuda (Dodatak 1., slika 2.). U oba su slu čaja potrebne posude, dovoljno velike i za ulaznu i 
za izlaznu vodu, kao i dozirne crpke za ulaznu vodu, pomiješanu s otopinom 
ispitivane kemikalije ili odvojeno.
 
20. Svaka jedinica postrojenja s aktivnim muljem sastoji se od dozra čne posude 
poznatog kapaciteta od 3 oko litre aktivnog mulja i separatora (sekundarni 
pročišćavač) zapremine od oko 1,5 litre; volumeni se u izvjesnoj mjeri mogu 
i mijenjati prilagodbom visine separatora. Dopuštena je primjena posuda različite veličine ako one rade pod usporedivim hidrauli čkim optere ćenjima. 
Ako nije mogu će održavati temperaturu u ispitnoj prostoriji u željenom 
rasponu, preporu čuje se primjena posuda s vodenim omota čem s vodom 
kontrolirane temperature. „Air-lift” crpka ili dozirna crpka koriste se za recirkulaciju aktivnog mulja iz separatora u dozra čnu posudu, neprekidno 
ili s prekidima u redovnim razmacima.
 
21. Sustav s propusnom posudom sastoji se od unutarnjeg, propusnog cilindra 
sa stožastim dnom koji se nalazi u malo ve ćoj posudi istog oblika, ali 
sačinjenoj od nepropusnog plasti čnog materijala. Prikladan materijal za 
propusnu posudu je propusni polietilen maksimalne veli čine pora 90 μm i 
debljine 2 mm. Razdvajanje mulja od pro čišćavanog organskog medija 
odvija se diferencijalnim prolaskom kroz propusnu stjenku. Izlazna se voda skuplja u prstenastom prostoru iz kojih se prelijeva u sabirnu 
posudu. Nema taloženja te stoga nema ni vra ćanja mulja. Cijeli se sustav 
može montirati u vodenoj kupelji kontrolirane temperature. Propusne se
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1065
 
posude za čepljuju i mogu se prelijevati u po četnim etapama. U tom slu čaju 
potrebno je zamijeniti propusno punjenje čistim punjenjem, pri čemu se mulj 
iz posude kroz sifon propusti u čistu kantu, a za čepljeno punjenje izvadi. 
Nakon što se obriše nepropusni vanjski cilindar, umetne se čisto punjenje i 
mulj se vrati u posudu. Sav mulj koji se zalijepi na stjenke za čepljenog 
punjenja tako đer se pažljivo sastruže i prenese. Za čepljene posude čiste se 
prvo blagim mlazom vode kako bi se uklonio preostali mulj, potom nama ­
kanjem u otopini razrije đenog natrijeva hipoklorita, potom u vodi i na kraju 
se temeljito isperu vodom.  
22. Za dozra čivanje mulja u dozra čnim posudama obiju sustava potrebne su 
prikladne tehnike, primjerice sinterirani kamen (zra čni kamen) i komprimi ­
rani zrak. Zrak se pro čišćava, po potrebi, propuštanjem kroz odgovaraju ći 
filtar i pranjem. Kroz sustav mora pro ći dostatna koli čina zraka da bi se 
zadržali aerobni uvjeti i da se pahulje mulja zadrže u suspenziji cijelo 
vrijeme trajanja testa.  
Aparatura za filtraciju ili centrifuga  
23. Uređaj za filtraciju uzoraka pomo ću membranskih filtara prikladne propu ­
snosti (nazivni promjer otvora 0,45 μm) koji adsorbira topljive organske 
kemikalije i ispušta organski ugljik u minimalnoj koli čini. Ako se koriste 
filtri koji ispuštaju organski ugljik, filtri se pažljivo operu vru ćom vodom 
kako bi se uklonio organski ugljik koji curi. Druga je mogu ćnost primjena 
centrifuge koja može proizvesti 40 000 m/s  2 . 
Analitička oprema  
24. Aparatura potrebna za odre đivanje:  
— DOC-a (otopljenog organskog ugljika) i TOC-a (ukupnog organskog 
ugljika) ili KPK-a (kemijske potrošnje kisika),  
— specifi čne kemikalije, ako je potrebno,  
— suspendiranih krutih tvari, pH-a, koncentracije kisika u vodi,  
— temperature, kiselosti i lužnatosti,  
— amonijaka, nitrita i nitrata ako se test provodi u uvjetima nitrifikacije.  
Voda  
25. Voda iz slavine koja sadrži manje od 3 mg/l DOC-a. Odredite lužnatost ako 
već nije poznata.  
26. Deionizirana voda koja sadržava manje od 2 mg/l DOC-a.  
Organski medij  
27. Kao organski medij dopuštene su sinteti čke otpadne vode, komunalne 
otpadne vode ili njihova kombinacija. Pokazalo se (11) (14) da uporaba samo komunalnih otpadnih voda često dovodi do pove ćanog postotka 
opadanja DOC-a pa čak i da omogu ćuje opadanje i biorazgradnju nekih 
kemikalija koje se biološki ne razgra đuju kada se upotrebljavaju sinteti čke 
otpadne vode prema smjernici OECD-a. Isto tako, neprekidno dodavanje ili dodavanje s prekidima komunalnih otpadnih voda često stabilizira aktivni 
mulj, uklju čujući i njegovu klju čnu sposobnost dobrog taloženja. Dakle, 
preporučuje se uporaba komunalnih otpadnih voda. Izmjerite koncentraciju 
DOC-a ili KPK-a u svakoj novoj šarži organskog medija. Trebala bi biti poznate kiselost ili lužnatost organskog medija. Mogu će je da će zbog 
organskog medija biti potrebno dodavanje odgovaraju ćeg pufera (natrijev 
hidrogenkarbonat ili kalijev dihidrogen fosfat) ako je niske kiselosti ili 
lužnatosti kako bi se tijekom testa pH u dozra čnoj posudi održao na oko 
7,5 ± 0,5. O koli čini pufera koju treba dodati te o trenutku dodavanja 
odlučuje se u svakom pojedinom slu čaju. Kada se smjese dodaju neprekidno 
ili s prekidima, DOC (ili KPK) smjese mora se održavati na približno 
konstantnoj vrijednosti, npr. razrje đivanjem vodom.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1066
 
Sintetičke otpadne vode  
28. Po litri vode iz slavine otopi se: pepton, 160 mg; mesni ekstrakt, 110 mg; 
urea, 30 mg; anhidridni dikalijev hidrogen fosfat (K  2 HPO  4 ), 28 mg; natrijev 
klorid (NaCl), 7 mg; kalcijev klorid dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; magne ­
zijev sulfat heptahidrat (Mg  2 SO 4 .7H  2 0), 2 mg. Te sinteti čke otpadne vode 
OECD-a služe samo kao primjer i daju srednju koncentraciju DOC-a u ulaznoj vodi od oko 100 mg/l. Druga je mogu ćnost primjena drugih 
smjesa koje imaju otprilike jednaku koncentraciju DOC-a, a koje su sli čnije 
pravim otpadnim vodama. Ako je potrebna ulazna voda slabije koncentra ­
cije, sinteti čke otpadne vode se razrijede, primjerice u omjeru 1:1, vodom iz 
slavine kako bi se dobila koncentracija od oko 50 mg/l. Takva ulazna voda 
slabije koncentracije omogu ćit će bolji rast nitrifikacijskih organizama, a ta 
modifikacija trebala bi se primjenjivati ako se ispituje simulacija postrojenja za nitrifikaciju otpadnih voda. Te se sinteti čke otpadne vode mogu napraviti 
u destiliranoj vodi u koncentriranom obliku i mogu se čuvati na oko 1 °C do 
tjedan dana. Po potrebi se razrijede vodom iz slavine. (Ovaj medij nije 
zadovoljavaju ći, npr. vrlo je visoka koncentracija dušika, relativno je 
nizak sadržaj ugljika, ali nije predloženo ništa bolje, osim da se doda više fosfata kao pufera i dodatnog peptona).
 
Komunalne otpadne vode  
29. Koristite svježe istaložene otpadne vode koje se skupljaju svakodnevno iz 
postrojenja za pro čišćavanje u koje se pretežno dovode komunalne otpadne 
vode. Njih treba prikupiti prije primarnog taloženja iz preljevnog kanala primarnog taložnika ili iz ulijeva postrojenja s aktivnim muljem te u njima uglavnom ne bi smjelo biti grubih čestica. Te se otpadne vode 
mogu koristiti nekoliko dana nakon skladištenja (op ćenito ne dulje od 
sedam dana) na oko 4 °C ako se dokaže da nije došlo do znatnijeg opadanja DOC-a (ili KPK-a) (npr. za manje od 20 %) tijekom skladištenja. Kako bi se ograničile smetnje u sustavu, trebalo bi prije uporabe prilagoditi DOC (ili 
KPK) svake nove šarže na odgovaraju ću konstantnu vrijednost, npr. razrje ­ 
đivanjem vodom iz slavine.
 
Aktivni mulj  
30. Prikupite aktivni mulj za inokulaciju iz aeracijskog bazena ispravnog postro ­
jenja za pro čišćavanje otpadnih voda ili iz laboratorijske jedinice s aktivnim 
muljem, u kojoj se pretežno pro čišćavaju komunalne otpadne vode.  
Radne otopine ispitivane kemikalije  
31. Za kemikalije odgovaraju će topljivosti pripremite radne otopine prikladnih 
koncentracija (npr. 1 do 5 g/l) u deioniziranoj vodi ili u mineralnom dijelu sintetičkih otpadnih voda (za netopljive i hlapljive kemikalije vidjeti 
Dodatak 5.). Odredite DOC i ukupni organski ugljik (TOC) radne otopine 
pa ponovite mjerenja za svaku novu šaržu. Ako je razlika izme đu DOC-a i 
TOC-a ve ća od 20 %, provjerite topljivost u vodi ispitivane kemikalije. 
Usporedite DOC ili koncentraciju ispitivane kemikalije izmjerene speci ­
fičnom analizom radne otopine s nazivnom vrijednoš ću kako biste utvrdili 
je li oporavak dovoljno dobar (obi čno se može o čekivati > 90 %). Utvrdite, 
posebno za disperzije, može li se ili ne DOC koristiti kao analiti čki para­
metar ili se može koristiti samo jedna analiti čka tehnika specifi čna za ispi ­
tivanu kemikaliju. Za disperziju je potrebna centrifuga uzoraka. Za svaku 
novu šaržu, specifi čnom analizom izmjerite DOC, KPK ili ispitivanu 
kemikaliju.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1067
 
32. Odredite pH radne otopine. Ekstremne vrijednosti upu ćuju na to da doda ­
vanje kemikalije možda utje če na pH aktivnog mulja u sustavu ispitivanja. 
U tom slu čaju malim koli činama anorganske kiseline ili lužine neutralizirajte 
radnu otopinu kako biste dobili pH od 7 ± 0,5, ali izbjegavajte taloženje ispitivane kemikalije.
 
POSTUPAK  
33. Opisan je postupak za jedinice postrojenja s aktivnim muljem koji treba 
malo prilagoditi za sustav s propusnom posudom.  
Priprema inokuluma  
34. Na po četku testa inokulirajte sustav ispitivanja bilo aktivnim muljem bilo 
inokulumom koji sadrži nisku koncentraciju mikroorganizama. Inokulum do 
uporabe treba odzra čivati na sobnoj temperaturi i upotrijebite ga u roku od 
24 h. U prvom slu čaju uzmite uzorak aktivnog mulja iz aeracijskog bazena 
ispravnog postrojenja za pro čišćavanje bioloških otpadnih voda ili laborato ­
rijskog postrojenja za pro čišćavanje u koje se pretežno dovode komunalne 
otpadne vode. Ako treba simulirati uvjete nitrifikacije, uzmite mulj iz postrojenja za pro čišćavanje nitrificiranih otpadnih voda. Odredite koncen ­
traciju suspendiranih krutih tvari te, ako je to potrebno, koncentrirajte mulj 
taloženjem tako da se ispitnom sustavu dodaje minimalna koli čina. Pobrinite 
se da početna koncentracija suhe tvari iznosi oko 2,5 g/l.
 
35. U drugom slu čaju kao inokulum upotrijebite 2 ml/l do 10 ml/l izlazne vode 
iz postrojenja za pro čišćavanje komunalnih bioloških otpadnih voda. Da 
biste dobili što je mogu će veći broj razli čitih vrsta bakterija, može biti 
korisno dodati inokulum iz raznih drugih izvora, primjerice iz površinskih 
voda. U tom će se slučaju aktivni mulj razviti i rasti u sustavu ispitivanja.  
Doziranje organskog medija  
36. Pobrinite se da na po četku i tijekom testa temeljito o čistite spremnike ulazne 
i izlazne vode te cjevovode iz posude ulazne i posude izlazne vode kako 
biste uklonili nakupine mikroba. Sastavite sustav ispitivanja u prostoriji u 
kojoj se kontrolira temperatura (obi čno u rasponu od 20 – 25 °C) ili koristite 
ispitne jedinice s vodenim omota čem. Pripremite dovoljnu koli činu 
potrebnog organskog medija (stavci 27. – 29.). Na po četku napunite 
dozračnu posudu organskim medijem pa dodajte inokulum (stavci 34., 
35.). Zapo čnite dozra čivanje tako da se mulj drži u suspenziji i u aerobnom 
stanju pa zapo čnite doziranje ulazne vode i recirkulaciju istaloženog mulja. 
Organski medij dozirajte iz spremnika u dozra čne posude (stavci 20., 21.) 
ispitne i kontrolne jedinice pa u sli čne spremnike skupite odgovaraju ću 
izlaznu vodu. Kako bi se dobilo normalno vrijeme hidrauli čkog zadržavanja 
od 6 h, organski se medij crpi brzinom od 0,5 l/h. Kako biste potvrdili tu brzinu, izmjerite dnevnu koli činu doziranog organskog medija bilježenjem 
smanjenja volumena medija u spremnicima. Za odre đivanje učinaka ispu ­ 
štanja s prekidima i „udarnog” dodavanja kemikalija bit će potrebni drugi 
načini doziranja.
 
37. Ako se organski medij priprema za uporabu tijekom razdoblja duljeg od 1 
dana, potrebno je hla đenje na otprilike 4 °C ili neke druge prikladne metode 
konzerviranja kako bi se sprije čio nastanak mikrobnih nakupina i biološka 
razgradnja izvan ispitnih jedinica (stavak 29.). Ako se koriste sinteti čke 
otpadne vode, mogu će je pripremiti i uskladištiti na otprilike 4 °C koncen ­
triranu radnu otopinu (npr. koncentracije deset puta ve će od normalne, 
stavak 28.). Ta se radna otopina prije uporabe može dobro miješati s odgo ­
varajućom količinom vode iz slavine; druga je mogu ćnost izravno crpiti 
radnu otopinu dok se odgovaraju ća količina vode iz slavine crpi zasebno.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1068
 
Doziranje ispitivane kemikalije  
38. Dodajte odgovaraju ću količinu radne otopine ispitivane kemikalije (stavak 
31.) u spremnik ulazne vode ili je dozirajte izravno zasebnom crpkom u dozračnu posudu. Uobi čajena srednja ispitna koncentracija ulazne vode 
trebala bi iznositi izme đu 10 mg/l i 20 mg/l DOC-a, a krajnja gornja 
koncentracija ne iznosi više od 50 mg/l. Ako je niska topljivost u vodi ispitivane kemikalije ili ako postoji vjerojatnost pojave toksi čnih učinaka, 
snizite koncentraciju DOC-a na 5 mg/l ili čak i manje, ali samo ako je 
raspoloživa i ako se primjenjuje odgovaraju ća specifična analiti čka metoda 
(dispergirane ispitivane kemikalije koje se slabo tope u vodi mogu se doda ­
vati posebnim tehnikama doziranja, vidjeti Dodatak 5.).
 
39. Zapo čnite s dodavanjem ispitivane kemikalije po isteku razdoblja tijekom 
kojega se sustav stabilizirao i kada u činkovito uklanja DOC organskog 
medija (oko 80 %). Vrlo je važno prije dodavanja ispitivane kemikalije provjeriti rade li sve jedinice podjednako u činkovito; ako to nije slu čaj, 
obično pomaže miješanje pojedinih muljeva i dodavanje jednake koli čine 
u pojedine jedinice. Kada se koristi inokulum od (otprilike) 2,5 g/l (suhe mase) aktivnog mulja, ispitivana kemikalija može se dodavati od samog početka testa jer je prednost izravnog dodavanja sve ve ćih količina od 
početka ta da se aktivni mulj može bolje prilagoditi ispitivanoj kemikaliji. 
Bez obzira na na čin dodavanja ispitivane kemikalije, preporu čuje se da se u 
redovnim razmacima mjere relevantna brzina protoka i/ili koli čine u sprem ­
niku/spremnicima.
 
Rukovanje aktivnim muljem  
40. Koncentracija krutih tvari u aktivnom mulju obi čno se tijekom testa stabi ­
lizira unutar granica, neovisno o vrsti upotrijebljenog inokuluma, u rasponu 
od 1 do 3 g/l (suha masa), ovisno o kakvo ći i koncentraciji organskog 
medija, radnim uvjetima, naravi prisutnih mikroorganizama i utjecaju ispi ­
tivane kemikalije.  
41. Odredite suspendirane krute tvari u dozra čnim posudama najmanje jedanput 
tjedno i izdvojite višak mulja kako biste koncentraciju održali na 1 g/l do 3 g/l (suhe mase) ili održavajte srednju starost mulja na konstantnoj vrijed ­
nosti, obi čno u rasponu od 6 do 10 dana. Ako se odabere, primjerice, 
vrijeme zadržavanja mulja od osam dana, svakodnevno uklonite 1/8 koli čine 
aktivnog mulja iz dozra čne posude i to bacite. Provodite to svakodnevno ili, 
po mogućnosti, pomo ću automatske crpke koja radi s prekidima. Održava ­
njem koncentracije suspendiranih krutih tvari konstantnom ili unutar uskih 
granica ne održavate konstantnim vrijeme zadržavanja mulja (SRT), što je radna varijabla koja odre đuje vrijednost koncentracije ispitivane kemikalije u 
izlaznoj vodi.
 
42. Tijekom cijelog testa najmanje jedanput dnevno uklonite sav mulj koji se 
prilijepi na stjenke dozra čne posude i separatora tako da se ponovno suspen ­
dira. Redovito pregledavajte i čistite sve cijevi i cjevovode kako biste spri ­
ječili razvoj biofilma. Reciklirajte istaloženi mulj iz separatora u dozra čnu 
posudu, po mogu ćnosti crpljenjem s prekidima. U sustavu s propusnom 
posudom nema recikliranja, ali se pobrinite da su čiste unutarnje posude 
umetnute prije nego što koli čina u posudi znatno naraste (stavak 21.).  
43. U Husmannovim jedinicama postrojenja može do ći do slabog taloženja i 
gubitka mulja. To se može popraviti provo đenjem jedne ili ve ćeg broja dolje 
navedenih mjera, istodobno i u ispitnoj i u kontrolnoj jedinici:  
— svježi mulj ili flokulant (primjerice 2 ml/posudi od 50 g/l FeCl  3 ) mogu 
se dodavati u redovitim razmacima, npr. svakog tjedna, ali osigurajte da 
ne dođe do reakcije ili precipitacije ispitivane kemikalije i FeCl  3 ; ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1069
 
— „air-lift” crpka može se zamijeniti peristalti čkom crpkom, omogu ćujući 
tako protok mulja pri recirkulaciji približno jednak protoku ulazne vode 
koji se treba koristiti te omogu ćujući razvoj anaerobne zone u istalo ­ 
ženom mulju (geometrijom „air-lift” crpke minimalna brzina protoka vraćenog mulja ograni čena je na otprilike dvanaestorostruku brzinu 
protoka ulazne vode);
 
— mulj se može crpiti s prekidima iz separatora u dozra čnu posudu 
(npr. 5 min. svakih 2,5 h za recirkulaciju 1 l/h do 1,5 l/h;  
— može se koristiti netoksi čno sredstvo protiv pjenjenja u minimalnoj 
koncentraciji kako bi se sprije čio gubitak pjenjenjem (npr. silikonsko 
ulje);  
— kroz mulj u separatoru može se puštati zrak u kratkim, udarnim 
mlazovima (npr. 10 s svakih sat vremena);  
— organski se medij može dozirati u razmacima u dozra čnu posudu 
(npr. 3 min. do 10 min. svakih sat vremena).  
Uzorkovanje i analiza  
44. U redovnim razmacima izmjerite koncentraciju otopljenog kisika, tempera ­
turu i pH aktivnog mulja u dozra čnim posudama. Pobrinite se da uvijek ima 
dovoljno kisika (> 2 mg/l) i da se temperatura održava u traženom rasponu 
(obično 20 °C do 25 °C). Održavajte pH na 7,5 ± 0,5 doziranjem malih 
količina anorganske lužine ili kiseline u dozra čnu posudu ili u ulaznu vodu 
ili povećanjem puferskog kapaciteta organskog medija (vidjeti stavak 27.). 
Kada dođe do nitrifikacije, nastaje kiselina, a oksidacija 1 mg N proizvodi 
otprilike 7 mg CO  3 –- . Učestalost mjerenja ovisi o parametrima koje treba 
izmjeriti i o stabilnosti sustava, a dnevna i tjedna mjerenja mogu se razlikovati.
 
45. Izmjerite DOC ili KPK u ulaznoj vodi koja se ulijeva u kontrolnu i ispitnu 
posudu. Koncentraciju ispitivane kemikalije u ispitnoj ulaznoj vodi izmjerite 
specifičnom analizom ili je procijenite na temelju koncentracije u radnoj 
otopini (stavak 31.), upotrijebljenog volumena i koli čine otpadnih voda 
koja se dozira u ispitnu jedinicu. Preporu čuje se izra čunati koncentraciju 
ispitivane kemikalije da bi se smanjila varijabilnost podataka o koncentraciji.  
46. Uzmite odgovaraju će uzorke iz skupljene izlazne vode (npr. smjese koje 
stoje 24 h) i filtrirajte ih kroz membranu veli čine pora 0,45 μm ili ih 
centrifugirajte na oko 40 000 m/s  2 otprilike 15 min. Centrifugiranje se 
koristi ako je teško provesti filtraciju. Odredite DOC ili KPK najmanje dvaput za svaki uzorak kako biste izmjerili potpunu biorazgradnju te, ako 
je to potrebno, za primarnu biorazgradnju analizom specifi čnom za ispiti ­
vanu kemikaliju.
 
47. Uporaba KPK-a može izazvati analiti čke probleme na niskim koncentraci ­
jama, stoga se ona preporu čuje jedino ako se koristi dovoljno visoka ispitna 
koncentracija (oko 30 mg/l). Za kemikalije koje dobro adsorbiraju preporu ­ 
čuje se i mjerenje koli čine adsorbirane kemikalije u mulju pomo ću analitičke 
tehnike specifi čne za ispitivanu kemikaliju.  
48. Učestalost uzorkovanja ovisi o o čekivanom trajanju testa. Preporu čuje se 
učestalost tri puta tjedno. Kada jedinice po čnu učinkovito raditi, pri čekajte 
od jednog tjedna do maksimalno šest tjedana nakon dodavanja ispitivane kemikalije za njezinu prilagodbu i postizanje stabilnog stanja. Po mogu ć­
nosti odredite najmanje 15 valjanih vrijednosti u stacionarnoj fazi (stavak 
59.) koja obi čno traje tri tjedna, za evaluaciju rezultata ispitivanja. Test se 
može završiti ako se postigne zadovoljavaju ći stupanj eliminacije (npr. 
> 90 %) i ako je dostupno tih 15 vrijednosti koje predstavljaju analize 
provedene svakog radnog dana tijekom tri tjedna. Obi čno test ne treba 
trajati duže od 12 tjedana nakon dodavanja ispitivane kemikalije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1070
 
49. Ako se mulj nitrificira i ako treba prou čiti utjecaje ispitivane kemikalije na 
nitrifikaciju, analizirajte prisutnost amonijaka i/ili nitrita plus nitrata u uzor ­
cima izlazne vode iz ispitne i kontrolne jedinice najmanje jedanput tjedno.  
50. Sve analize treba provoditi što je prije mogu će, posebno odre đivanja dušika. 
Ako se analize moraju odgoditi, uskladištite uzorke na oko 4 °C na tamnom mjestu u do vrha napunjenim i čvrsto zatvorenim bocama. Ako se uzorci 
moraju skladištiti dulje od 48 h, konzervirajte ih dubokim smrzavanjem, 
acidifikacijom (npr. 10 ml/l otopine sumporne kiseline od 400 g/l) ili doda ­
vanjem odgovaraju će toksične tvari (npr. 20 ml/l otopine merkurijeva (II) 
klorida od 10 g/l). Pobrinite se da tehnika konzerviranja ne utje če na rezul ­
tate analize.
 
Povezivanje ispitnih jedinica  
51. Ako treba primijeniti rad s povezanim jedinicama (Dodatak 3.), svakod ­
nevno zamijenite istu koli činu aktivnog mulja (150 ml do 1 500 ml za 
dozračne posude koje sadržavaju tri litre suspenzije) iz dozra čnih posuda 
ispitne jedinice i njezine kontrolne jedinice. Ako se ispitivana kemikalija jako adsorbira na mulj, promijenite samo supernatant u separatoru. U oba 
slučaja koristite se faktorom korekcije za izra čun rezultata ispitivanja (stavak 
55.).
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
52. Izračunajte postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a ispitivane kemikalije za 
svaku vremenski odre đenu procjenu pomo ću sljedeće jednadžbe:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
gdje je  
D t = % eliminacija DOC-a ili KPK-a u vremenu t  
C s = DOC ili KPK u ulaznoj vodi nastao zbog ispitivane kemikalije, proci ­
jenjen po mogu ćnosti iz radne otopine (mg/l)  
E = izmjerena vrijednost DOC-a ili KPK-a u ispitnoj izlaznoj vodi u 
vremenu t (mg/l)  
E o = izmjerena vrijednost DOC-a ili KPK-a u kontrolnoj izlaznoj vodi u 
vremenu t (mg/l)  
53. Stupanj eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u kontrolnoj jedinici 
korisna je informacija pri procjeni aktivnosti biorazgradnje aktivnog mulja 
tijekom testa. Postotak eliminacije izra čunajte pomo ću jednadžbe:  
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
gdje je  
D B = % eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u kontrolnoj 
jedinici u vremenu t  
C M = DOC ili KPK organskog medija u kontrolnoj ulaznoj vodi (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1071
 
Prema potrebi izra čunajte postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a nastale 
zbog organskog medija plus ispitivane kemikalije u ispitnoj jedinici 
pomoću jednadžbe:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
gdje je  
D T = % eliminacije DOC-a ili KPK-a u ukupnoj ispitnoj ulaznoj vodi  
C T = DOC ili KPK ukupne ispitne ulazne vode ili izra čunato iz radnih 
otopina (mg/l)  
54. Izračunajte opadanje ispitivane kemikalije ako se to mjerilo specifi čnom 
analitičkom metodom u svakom vremenski odre đenom odre đivanju iz 
jednadžbe:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
gdje je  
D ST = % primarne eliminacije ispitivane kemikalije u vremenu t  
S i = izmjerena ili procijenjena koncentracija ispitivane kemikalije u 
ispitnoj ulaznoj vodi (mg/l)  
S e = izmjerena koncentracija ispitivane kemikalije u isptnoj izlaznoj vodi 
u vremenu t (mg/l)  
55. Ako se koristio na čin rada „s povezanim jedinicama”, kompenzirajte 
otapanje ispitivane kemikalije u dozra čnoj posudi zamjenom mulja putem 
faktora korekcije (vidjeti Dodatak 3.). Ako se koristi srednje vrijeme hidrau ­
ličkog zadržavanja od 6 h i zamjena polovine volumena aktivnog mulja u 
dozračnoj posudi, odre đene dnevne vrijednosti eliminacije (D  t , stavak 52.) 
moraju se korigirati kako bi se dobio pravi stupanj eliminacije, D  tc , ispitne 
kemikalije iz jednadžbe:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Izražavanje rezultata ispitivanja  
56. Grafi čki prikažite postotak eliminacije D  t (ili D  tc ) i D  st , ako imate te vrijed ­
nosti, u ovisnosti o vremenu (vidjeti Dodatak 2.). Iz oblika krivulje elimi ­
nacije ispitivane kemikalije ( per se  ili kao DOC) mogu se izvu ći određeni 
zaključci o procesu opadanja.  
Adsorpcija  
57. Ako se od po četka testa zamijeti velika eliminacija DOC-a ispitivane kemi ­
kalije, ispitivana kemikalija se najvjerojatnije eliminira adsorpcijom na krute tvari u aktivnom mulju. To je mogu će i dokazati odre đivanjem adsorbirane 
ispitivane kemikalije specifi čnom analizom. Nije uobi čajeno da eliminacija 
DOC-a kemikalija koje se mogu adsorbirati ostane visoka tijekom cijelog 
testa; obično je u po četku visok stupanj opadanja, ali isti postupno pada do 
neke uravnotežene vrijednosti. Me đutim, ako je ispitivana kemikalija koja se 
može adsorbirati mogla izazvati aklimatizaciju mikrobne populacije na ovaj 
ili onaj na čin, eliminacija DOC-a ispitivane kemikalije naknadno bi porasla i 
postigla visoku vrijednost platoa (stabilno stanje).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1072
 
Faza prilagodbe  
58. Kao i u stati čkim testovima probira, za brojne je ispitivane kemikalije 
potrebna faza prilagodbe prije nego što do đe do potpune biorazgradnje. U 
fazi prilagodbe odvija se aklimatizacija ili prilagodba bakterija koje se 
razgrađuju, pri čemu ispitivana kemikalija gotovo uop će ne opada, a 
potom dolazi do po četnog rasta tih bakterija. Ta faza završava, a smatra 
se da faza razgradnje zapo činje nakon što opadne otprilike 10 % po četne 
količine ispitivane kemikalije (nakon što se odvoji dovoljno vremena za 
adsorpciju, ako se ona doga đa). Faza prilagodbe često je krajnje varijabilna 
i slabo se može mjerno obnoviti.  
Stacionarna faza  
59. Stacionarna faza krivulje eliminacije u neprekidnom testu definira se kao 
faza u kojoj dolazi do maksimalne razgradnje. Stacionarna faza trebala bi trajati najmanje tri tjedna i imati oko 15 izmjerenih valjanih vrijednosti.
 
Srednji stupanj eliminacije ispitivane kemikalije  
60. Izračunajte srednju vrijednost iz vrijednosti eliminacije (D  t ) ispitivane kemi ­
kalije u stacionarnoj fazi. Zaokružite na najbliži cijeli broj (1 %) i dobit ćete 
stupanj eliminacije ispitivane kemikalije. Tako đer se preporu čuje da se izra ­ 
čuna i 95 % intervala pouzdanosti srednje vrijednosti.  
Eliminacija organskog medija  
61. Grafi čki prikažite postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u 
kontrolnoj jedinici (D  B ) u ovisnosti o vremenu. Ozna čite srednji stupanj 
eliminacije na isti na čin kao i za ispitivanu kemikaliju (stavak 60.).  
Navođenje biorazgradnje  
62. Ako se ispitivana kemikalija ne adsorbira znatno na aktivni mulj i ako 
krivulja eliminacije ima tipi čan oblik krivulje biorazgradnje s fazama prila ­
godbe, razgradnje i stacionarnom fazom (stavci 58., 59.), izmjerena elimi ­
nacija može se sa sigurnoš ću pripisati biorazgradnji. Ako do đe do velikog 
početnog opadanja, simulacijskim testom ne mogu se razlikovati procesi 
biološke i abioti čke eliminacije. U takvom slu čaju, ali i u svim drugim 
slučajevima u kojima postoji bilo kakva dvojba o biorazgradnji (npr. ako 
dođe do ljuštenja), analizirajte adsorbiranu ispitivanu kemikaliju ili provedite 
dodatne testove stati čke biorazgradnje na temelju parametara koji jasno 
označuju biološke procese. Takvi su testovi metode utroška kisika (poglavlje 
C.4 D, E i F ovog Priloga (6)) ili test mjerenja proizvodnje ugljikova 
dioksida (poglavlje C.4 C ovog Priloga (6)) ili ISO-ova Headspace metoda (plinski prostor) (18), u kojima se koristi prethodno izloženi inokulum iz simulacijskog testa. Ako se izmjere i opadanje DOC-a i 
opadanje specifi čne kemikalije, znatne razlike (pri čemu je prva vrijednost 
niža od druge) me đu postocima opadanja nazna čuju prisutnost u izlaznoj 
vodi intermedijarnih organskih proizvoda koji se možda teže razgra đuju od 
polazne kemikalije.
 
Valjanost rezultata ispitivanja  
63. Podaci o ponašanju inokuluma pri normalnoj biorazgradnji dobivaju se ako 
se odredi stupanj eliminacije organskog medija (stavak 53.) u kontrolnoj jedinici. Test se može smatrati valjanim ako je stupanj eliminacije DOC-a 
ili KPK-a u kontrolnoj jedinici/jedinicama > 80 % nakon dva tjedna i nema 
neuobičajenih primjedbi.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1073
 
64. Ako se upotrebljavala lako biorazgradiva (referentna) kemikalija, stupanj 
biorazgradnje (D  t , stavak 52.) trebao bi biti > 90 %.  
65. Ako se test provodi u uvjetima nitrifikacije, srednja koncentracija u izlaznoj 
vodi trebala bi biti < 1 mg/l amonija-N i < 2 mg/l nitrita-N.  
66. Ako nisu ispunjeni ti kriteriji (stavci 63. – 65.), ponovite test korištenjem 
inokuluma iz nekog drugog izvora, ispitajte referentnu kemikaliju i revidi ­
rajte sve pokusne postupke.  
Izvješće o ispitivanju  
67. Izvješ će o ispitivanju mora obuhva ćati sljedeće: 
Ispitivana kemikalija:  
— podaci za identifikaciju;  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva.  
Uvjeti ispitivanja:  
— vrsta sustava za ispitivanje; sve modifikacije za ispitivanje netopljivih i 
hlapljivih kemikalija,  
— vrsta organskog medija,  
— udio i narav industrijskih otpadnih voda u otpadnim vodama, ako je 
poznato,  
— inokulum, stanje i mjesto/mjesta uzorkovanja, koncentracija i svaka pret ­
hodna obrada,  
— radna otopina ispitivane kemikalije: sadržaj DOC-a i TOC-a; kako je 
pripremljena, ako je rije č o suspenziji; upotrijebljena ispitna koncentra ­
cija; obrazloženje ako je vanjski raspon 10-20 mg/l DOC-a; metoda 
dodavanja; datum prvog dodavanja, sve promjene,  
— srednja starost mulja i srednje vrijeme hidrauli čkog zadržavanja; metoda 
izdvajanja mulja; metode savladavanja bubrenja, gubitka mulja itd.,  
— primijenjene analiti čke tehnike,  
— ispitna temperatura;  
— kakvo ća bubrenja mulja, indeks volumena mulja (SVI), suspendirane 
tvari iz miješane suspenzije (MLSS);  
— sve devijacije od standardnih postupaka i sve okolnosti koje su možda 
utjecale na rezultate.  
Rezultati ispitivanja:  
— svi izmjereni podaci (DOC, KPK, specifi čne analize, pH, temperatura, 
koncentracija kisika, suspendirane krute tvari, dušikovi spojevi, ako je relevantno,
 
— sve izra čunate vrijednosti D  t (ili D  tc ), D  B , D  St dobivene u tabli čnom 
obliku i krivuljama eliminacije.  
— podaci o fazi prilagodbe i stacionarnoj fazi, trajanju testa, stupnju elimi ­
nacije ispitivane kemikalije i organskog medija u kontrolnoj jedinici, zajedno sa statisti čkim podacima i izjavama o biorazgradivosti i valja ­
nosti testa;
 
— rasprava o rezultatima.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1074
 
LITERATURA  
1. Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, str. 1085.  
2. German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.  
3. Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmen ­
ham, UK.  
4. Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909-915.  
5. Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6. Poglavlje C.4 ovog Priloga, Odre đivanje „lake” biorazgradivosti.  
7. Poglavlje C.12 ovog Priloga, Biorazgradivost - izmijenjeni test SCAS.  
8. Poglavlje C.19 ovog Priloga, Procjena koeficijenta adsorpcije (K  OC ) na tlu i 
na mulju iz otpadnih voda pomo ću visoko djelotvorne teku ćinske 
kromatografije (HPLC).  
9. Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173.
 
10. Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
11. Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. str. 113-138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
12. ISO 11733 (1995; revidirano 2004). Evaluation of the elimination and biode ­
gradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
 
13. Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
14. Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 
340-343.  
15. Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
 
16. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214-220.  
17. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. str. 91-98 
ISBN 011 751661 9.  
18. ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1075
 
Dodatak 1.  
Slika 1.  
Oprema koja se koristi za procjenu biorazgradivosti  
Husmannova jedinica
  
A. Spremnik  
B. Dozirna crpka  
C. Dozra čna komora (zapremine 3 l)  
D. Taložnik  E. „Air-lift” crpka  
F. Sabirna posuda  
G. Dozra čnik 
H. Mjera č protoka zraka  
Slika 2.  
Oprema koja se koristi za procjenu biorazgradivosti  
Propusna posuda
  
A. Spremnik  
B. Dozirna crpka  
C. Propusna dozra čna posuda  
D. Vanjska nepropusna posuda  E. Sabirna posuda  
F. Difuzor  
G. Mjera č protoka zraka  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1076
 
Slika 3.  
Podaci o dozra čnoj posudi propusne posude od 3 litre
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1077
 
Dodatak 2.  
Primjer krivulje eliminacije
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1078
 
Dodatak 3.  
[INFORMATIVNO]  
POVEZIVANJE ISPITNIH JEDINICA  
Da bi se pokušalo ujedna čiti mikrobnu populaciju u muljevima u ispitnoj jedinici, 
u koju se dodaju otpadne vode plus ispitivana kemikalija, te u kontrolnoj jedinici 
u koju se dodaju samo otpadne vode, uvedena je svakodnevna izmjena mulja (1). Taj se postupak naziva povezivanje, a metoda je poznata kao „povezane jedini ­
ce”. Povezivanje se na po četku provodilo pomo ću Husmannovih jedinica s 
aktivnim muljem, ali se provodilo i s jedinicama s propusnom posudom (2)(3). 
Između nepovezanih i povezanih jedinica, bilo Husmannovih jedinica bilo propu ­
snih posuda, nisu prona đene nikakve zna čajnije razlike tako da utrošak vremena i 
energije potreban pri povezivanju jedinica ovdje nema nikakvu prednost.
 
Može se činiti da se izmjenom mulja postiže znatno opadanje jer se sve više 
izjednačuju neke od ispitivanih kemikalija u transferiranju i koncentracijama 
ispitivane kemikalije u ispitnoj i kontrolnoj izlaznoj vodi. Dakle, moraju se primijeniti faktori korekcije, koji ovise o izmijenjenom dijelu i srednjem 
vremenu hidrauli čkog zadržavanja. O tom je izra čunu objavljeno više pojedinosti 
(1).
 
Izračunajte korigirani stupanj eliminacije DOC-a ili KPK-a pomo ću opće 
formule: 
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
gdje je  
D tc = korigirani % eliminacije DOC-a ili KPK-a  
D t = određeni % eliminacije DOC-a ili KPK-a  
a = dio zamijenjenog volumena jedinica s aktivnim muljem  
r = srednje vrijeme hidrauli čkog zadržavanja (h)  
Ako se, primjerice, zamijeni pola volumena aeracijskog bazena (a = 0,5), a 
srednje vrijeme hidrauli čkog zadržavanja 6h, korekcijska formula glasi: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERATURA  
1. Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
 
2. Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. str. 113-138. In: Laboratory Tests for Simula ­
tion of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
3. Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, 
Stevenage, UK.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1079
 
Dodatak 4.  
VREDNOVANJE INHIBICIJE AKTIVNOG MULJA  
Proces pomo ću ispitivanih kemikalija  
1. Kemikalija (ili otpadne vode) ne mogu se razgraditi ni opasti u simulacij ­
skom testu, a mogu imati čak i inhibitorni u činak na mikroorganizme u 
aktivnom mulju. Ostale se kemikalije biorazgra đuju na niskim koncentraci ­
jama, ali u višim koncentracijama (hormeza) imaju inhibitorni u činak. Inhi ­
bitorni se u činci mogu otkriti i u ranijoj fazi ili se mogu odrediti testom 
toksičnosti pomo ću inokuluma sli čnog onomu koji se koristio u simulacij ­
skom testu (1). Te su metode inhibicija potrošnje kisika (poglavlje C.11 ovog Priloga (2) i ISO 8192(3)) ili inhibicija rasta organizama u aktivnom mulju (ISO 15522 (4)).
 
2. U simulacijskom će se testu sve inhibicije o čitovati u razli čitom sadržaju 
otopljenog organskog ugljika (DOC) ili kemijske potrošnje kisika (KPK) u 
izlaznoj vodi iz ispitne posude i izlaznoj vodi iz kontrolne posude, koji je 
veći od DOC-a dodanog u vidu ispitivane kemikalije. Drugim rije čima, 
postotak opadanja DOC-a (i biokemijske potrošnje kisika BPK, kemijske potrošnje kisika KPK, i/ili NH
 + 4 ) organskog medija bit će smanjen tijekom 
pročišćavanja prisustvom ispitivane kemikalije. Ako se to dogodi, test treba 
ponoviti sa smanjenom koncentracijom ispitivane kemikalije sve dok se ne postigne razina na kojoj ne dolazi do inhibicije te možda i daljnjim smanji ­
vanjem koncentracije sve dok se ispitivana kemikalija ne razgradi. Me đutim, 
ako ispitivana kemikalija (ili otpadna voda) imaju štetan u činak na proces 
bez obzira na sve ispitne koncentracije, to je znak da je tu kemikaliju teško, ako ne i nemogu će, biološki pro čistiti, već možda ima više smisla ponoviti 
test aktivnim muljem iz nekog drugog izvora i/ili podvrgnuti mulj postup ­
nijoj aklimatizaciji.
 
3. I obratno: ako se ispitivana kemikalija eliminira biološkim pro čišćavanjem u 
prvom simulacijskom testu, trebalo bi povisivati njezinu koncentraciju ako se mora saznati ima li ta kemikalija inhibitorni u činak.
 
4. U nastojanjima odre đivanja stupnjeva inhibicije treba imati na umu da se 
populacija u aktivnom mulju može promijeniti tako da s vremenom mikroor ­
ganizmi mogu razviti toleranciju na inhibitornu kemikaliju.  
5. Izračun stupnja inhibicije:  
Ukupni postotak opadanja R  o BPK-a, DOC-a, KPK-a itd. za ispitnu i 
kontrolnu jedinicu može se izra čunati iz:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
gdje je:  
I = koncentracija u ulaznoj vodi BPK-a, DOC-a, KPK-a itd. za ispitnu ili 
kontrolnu posudu (mg/l)  
E = odgovaraju će koncentracije u izlaznoj vodi (mg/l).  
I i E moraju se korigirati po pitanju DOC-a nastalog zbog ispitivane kemi ­
kalije u ispitnim jedinicama, u protivnom će izračuni postotka inhibicije biti 
netočni. ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1080
 
Stupanj inhibicije koji izaziva prisustvo ispitivane kemikalije može se izra ­ 
čunati iz:  
% inhibicije ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
gdje je:  
R c = postotak opadanja u kontrolnim posudama  
R t = postotak opadanja u ispitnim posudama  
LITERATURA  
1. Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
2. Poglavlje C.12 ovog Priloga, Biorazgradivost - test inhibicije disanja aktivnog 
mulja.  
3. ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
4. ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1081
 
Dodatak 5.  
Ispitivane kemikalije slabo topljive u vodi - hlapljive kemikalije  
Kemikalije slabo topljive u vodi  
Objavljeno je vrlo malo izvješ ća o podvrgavanju kemikalija slabo topljivih u 
vodi i netopljivih kemikalija testovima koji simuliraju pro čišćavanje otpadnih 
voda (1)(2)(3).  
Nema jedinstvene metode dispergiranja ispitivane kemikalije koja bi se mogla 
primijeniti na sve netopljive kemikalije. Čini se da bi dvije od četiri metode 
opisane u normi ISO 10634 (4) bile prikladne za pokušaj dispergiranja ispitivanih 
kemikalija za simulacijske testove, a to su uporaba emulgatora i/ili ultrazvu čne 
energije. Treba utvrditi stabilnost tako nastale disperzije u razdoblju od najmanje 24 h. Prikladno stabilizirane disperzije, sadržane u spremniku u kojemu se nepre ­
kidno miješaju (stavak 38.), potom se doziraju u aeracijski bazen, a zasebno se 
dodaju komunalne (ili sinteti čke) otpadne vode.
 
Ako su disperzije stabilne, ispitajte na koji se na čin može odrediti ispitivana 
kemikalija u raspršenom obliku. DOC vjerojatno ne će biti prikladan pa bi 
trebalo prona ći specifičnu analiti čku metodu za ispitivanu kemikaliju koja bi se 
mogla primijeniti na otpadne vode, krute tvari iz otpadnih voda i aktivni mulj. Potom se odre đuje sudbina ispitivane kemikalije u simulaciji procesa aktivnog 
mulja, i to u teku ćem i krutom stanju. Potom se utvr đuje „bilanca mase” kako bi 
se odlučilo je li došlo do biorazgradnje ispitivane kemikalije. Me đutim, time bi se 
navela samo primarna biorazgradnja. Trebalo bi pokušati pokazati i potpunu biorazgradnju primjenom respirometrijskog testa lake biorazgradivosti (poglavlje C.4 ovog Priloga (5) C, F ili D) koriste ći kao inokulum mulj izložen ispitivanoj 
kemikaliji u simulacijskom testu.
 
Hlapljive kemikalije  
Primjena simulacija pro čišćavanja otpadnih voda na hlapljive kemikalije 
podložna je raspravi i problemati čna. Kao i sa kemikalijama slabo topljivima u 
vodi, objavljeno je vrlo malo izvješ ća u kojima se opisuju simulacijski testovi u 
kojima se koriste hlapljive kemikalije. Konvencionalni tip aparature za potpuno 
miješanje prilago đava se zatvaranjem aeracijskog bazena i taložnika, mjerenjem i 
kontroliranjem protoka zraka pomo ću mjerača protoka i propuštanjem izlaznog 
plina kroz odvaja če kako bi se skupila hlapljiva organska tvar. U nekim se 
slučajevima koristi i vakuumska crpka za crpljenje izlaznog plina kroz „hladni” 
odvajač ili odvaja č ispiranjem koji sadržava Tenax i silikonski gel za analize 
plinskom kromatografijom. Ispitivana kemikalija prisutna u odvaja ču može se 
analitički odrediti.  
Test se provodi u dva dijela. Jedinice se prvo pogone bez mulja, ali se sinteti čke 
otpadne vode plus ispitivana kemikalija crpe u aeracijski bazen. Nekoliko se dana 
skupljaju ulazna i izlazna voda i izlazni plin i analiziraju se na ispitivanu kemi ­
kaliju. Iz prikupljenih podataka može se izra čunati postotak (R  vs ) kemikalije 
oguljene iz sustava.  
Potom se provodi uobi čajeni biološki test (s muljem) čiji su radni uvjeti identi čni 
onima u studiji ljuštenjem. Mjere se i DOC i KPK da bi se provjerilo rade li 
jedinice ispravno. U prvom se dijelu testa provode i povremene analize da bi se odredila ispitivana kemikalija u ulaznoj vodi, izlaznoj vodi i izlaznom plinu, a nakon aklimatizacije provode se češće analize. I opet se iz podataka u stabilnom 
stanju može izra čunati postotak opadanja ispitivane kemikalije iz teku ćeg stanja 
svim procesima (R
 T ) (fizikalnim i biološkim), kao i udio (R  V ) oguljen iz sustava.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1082
 
Izračun: 
(a) U nebiološkom testu može se izra čunati postotak ((R  VP ) ispitivane tvari 
oguljene iz sustava iz:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
gdje je  
R VP = opadanje ispitivane kemikalije hlapljenjem (%),  
S VP = ispitivana kemikalija skupljena u odvaja ču izražena kao ekvivalentna 
koncentracija u teku ćem stanju (mg/l),  
S IP = koncentracija ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi (mg/l).  
(b) U biološkom testu može se izra čunati postotak (R  V ) ispitivane tvari oguljene 
iz sustava iz:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
gdje je  
R V = opadanje ispitivane kemikalije hlapljenjem u biološkom testu (%),  
S V = ispitivana kemikalija skupljena u odvaja ču u biološkom testu izražena 
kao ekvivalentna koncentracija u teku ćoj ulaznoj vodi (mg/l),  
S I = koncentracija ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi (mg/l).  
(c) U biološkom testu dan je postotak (R  T ) ispitivane kemikalije koja opada u 
svim procesima:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
gdje je  
S E = koncentracija ispitivane kemikalije u (teku ćoj) izlaznoj vodi (mg/l).  
(d) Tako se postotak (R  BA ) koji je opao u biorazgradnji plus adsorpciji može 
izračunati iz:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Trebalo bi provesti zasebne testove da se odredi adsorbira li se ispitivana 
kemikalija; ako je to slu čaj, može se provesti daljnja korekcija.  
(e) Usporedba omjera ispitivane kemikalije oljuštene u sustavima biološkog (R  v ) 
i nebiološkog testa (R  vp ) navodi op ći učinak koji je biološko pro čišćavanje 
imalo na emisiju ispitivane kemikalije u atmosferu.  
Primjer:  Benzen  
Vrijeme zadržavanja mulja = 4 dana  
Sintetičke otpadne vode; vrijeme zadržavanja = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1083
 
Tako je  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % i R  BA = 85 %.  
Pretpostavlja se da se benzen ne adsorbira na mulj.  
LITERATURA  
1. Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
2. Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
3. Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
4. ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment 
of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
5. Poglavlje C.4 ovog Priloga, Odre đivanje „Lake” Biorazgradivosti.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1084
 
Dodatak 6.  
Učinci vremena zadržavanja mulja (SRT) na pro čistivost kemikalija  
UVOD  
1. Metoda opisana u glavnom dijelu teksta namijenjena je da se odredi može li 
se ispitivana kemikalija (obi čno ona kojoj je svojstvena biorazgradivost, ali 
koja se ne biorazgra đuje lako) biorazgraditi unutar ograni čenja nametnutih u 
postrojenjima za pro čišćavanje otpadnih voda. Rezultati se izražavaju u 
kategorijama postotka opadanja i postotka biorazgradnje. Uvjeti rada jedi ­
nica s aktivnim muljem i odabir ulazne vode omogu ćuju prilično velike 
varijacije u koncentraciji ispitivane kemikalije u izlaznoj vodi. Testovi se provode samo na jednoj nazivnoj koncentraciji krutih tvari u mulju ili jednom nazivnom vremenu zadržavanja mulja (SRT), a opisani režimi 
izdvajanja mulja mogu izazvati velike varijacije vrijednosti SRT-a tijekom 
testa, kako u razli čitim danima tako i tijekom istog dana.
 
2. U ovoj se varijanti (1)(2) SRT kontrolira unutar znatno užih ograni čenja 
tijekom razdoblja od 24h (baš kao i u postrojenju velikih razmjera), što 
rezultira konstantnijom koncentracijom u izlaznoj vodi. Preporu čuju se 
komunalne otpadne vode jer one pokazuju dosljedniji i viši postotak opada ­
nja. Isto tako, ispituju se u činci cijelog niza vrijednosti SRT-a, a u još 
detaljnijoj studiji mogu se odrediti i u činci raspona temperatura na koncen ­
traciju u izlaznoj vodi.  
3. Međutim, još uvijek nije postignut op ći dogovor o tome koji kineti čki 
modeli funkcioniraju kada se kemikalije biorazgra đuju u uvjetima postro ­
jenja za pro čišćavanje otpadnih voda. Odabrali smo na prikupljene podatke 
primijeniti Monodov model rasta bakterija i primjene supstrata (1)(2) jer se namjeravalo tu metodu primijeniti samo na kemikalije koje se proizvode u 
velikim koli činama, što rezultira koncentracijama u otpadnim vodama iznad 
1 mg/l. Valjanost ovog pojednostavljenog modela i pretpostavke od kojih se krenulo uveli su se pomo ću niza alkoholnih etoksilata s razli čitim stupnje ­
vima primarne biorazgradivosti (2)(3).
 
Napomena.  Ova varijanta metode po čiva dobrano na tekstu ispitne metode 
C.10-A, a u nastavku teksta navedeno je samo ono u čemu se 
te metode razlikuju.  
NAČELO ISPITIVANJA  
4. Jedinice s propusnom posudom za aktivni mulj, namijenjene za olakšavanje 
(gotovo) neprekidnog izdvajanja miješane suspenzije što omogu ćuje vrlo 
preciznu kontrolu vremena zadržavanja mulja (SRT ili θ s ), pogone se u 
načinu rada ‚s nepovezanim jedinicama’ tijekom nekoliko SRT-a te, proiz ­
voljno, još i na nizu razli čitih temperatura. Vrijeme zadržavanja obi čno 
iznosi 2 do 10 dana, a temperatura izme đu 5 i 20 °C. Otpadne vode, po 
mogućnosti komunalne, i otopina ispitivane kemikalije doziraju se zasebno 
u jedinice onom brzinom koja daje potrebno vrijeme zadržavanja otpadnih 
voda (3 do 6 sati) i potrebnu koncentraciju ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi. Kontrolne jedinice u koje se ne dodaje ispitivana kemikalija pogone se paralelno u poredbene svrhe.
 
5. Mogu se koristiti i druge vrste aparature, ali treba se vladati s krajnjom 
pažnjom kako bi se osiguralo postizanje dobre kontrole SRT-a. Primjerice, kada se koristi postrojenjima, koja sadrže i taložnik, možda će biti potrebno 
predvidjeti gubitak krutih tvari putem izlazne vode iz postrojenja. Nadalje, 
moraju se tako đer poduzeti i posebne mjere opreza kako bi se izbjegle 
greške zbog varijacije koli čine mulja u taložniku.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1085
 
6. Jedinice se pogone u svakom odabranom nizu uvjeta, a kada se postigne 
ravnoteža, tijekom razdoblja od otprilike tri tjedna dobivaju se prosje čne 
koncentracije ispitivane kemikalije i, po odabiru, DOC-a u stabilnom stanju u izlaznoj vodi. Osim što se odre đuje postotak opadanja ispitivane 
kemikalije i, fakultativno, DOC-a, u grafi čkom se obliku izražava i odnos 
između uvjeta rada postrojenja i koncentracije u izlaznoj vodi. Iz tih provi ­
zornih podataka mogu se izra čunati kineti čke konstante, a mogu se pred ­
vidjeti i uvjeti u kojima se ispitivana kemikalija može obra đivati.
 
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI  
7. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 12. i 13.  
RAZINE PROLAZNOSTI  
8. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 14. i 15.  
REFERENTNA ISPITIVANA KEMIKALIJA  
9. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 16.  
MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA  
10. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 17. i 18.  
OPIS METODE  
Aparatura  
11. Prikladna jedinica je modificirani sustav s propusnom posudom (Dodatak 
6.1.). Sastoji se od unutarnje posude (ili punjenja) sa činjene od propusnog 
polietilena debljine 3,2 mm i veli čine pora od približno 90 μm, s tupo 
zavarenim zglobom. (Zbog toga je ova jedinica čvršća od one opisane u 
stavku 21. ovog poglavlja, C.10 A). Punjenje se umetne u vanjsku posudu od nepropusnog polietilena, koja se sastoji od dvaju dijelova: kružnog dna u kojem se probuše provrti za dva zra čna voda i jedan vod za izdvajanje mulja 
i gornjeg cilindra koji se vijcima pri čvrsti za dno i čiji je ispust postavljen 
tako da daje poznati volumen (3 l) u posudu s propusnom posudom. Jedan zračni vod opremljen je difuzor-kamenom, a drugi je vod sa slobodnim 
krajem postavljen pod pravim kutom u odnosu na kamen u posudi. Taj 
sustav stvara turbulenciju potrebnu da se osigura potpuno miješanje sadržaja 
u posudi, te daje koncentracije otopljenog kisika ve će od 2 mg/l.
 
12. Odgovaraju ći broj jedinica održava se na kontroliranim temperaturama u 
rasponu od 5 do 20 °C (± 1 °C), bilo u vodenoj kupelji bilo u prostorijama 
s konstantnom temperaturom. Potrebne su i crpke za doziranje u dozra čne 
posude otopine ispitivane kemikalije i istaloženh otpadnih voda traženom brzinom (0-1,0 ml/min i 0-25 ml/min) te tre ća crpka za odvod otpadnog 
mulja iz dozra čnih posuda. Potrebna, vrlo niska brzina protoka otpadnog 
mulja postiže se primjenom crpke podešene na ve ću brzinu i radom s 
prekidima primjenom broj čanika, npr. rad od 10 sekundi u minuti, brzina 
crpljenja od 3 ml/min, čime se postiže brzina izdvajanja od 0,5 ml/min.
 
Aparatura za filtraciju ili centrifuga  
13. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 23.  
Analitička oprema  
14. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 24.  
Voda  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1086
 
15. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 25. i 26.  
Organski medij  
16. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 27.  
Sintetičke otpadne vode  
17. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 28.  
Komunalne otpadne vode  
18. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 29.  
Aktivni mulj  
19. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 30.  
Radne otopine ispitivane kemikalije  
20. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 31. i 32.  
POSTUPAK  
Priprema inokuluma  
21. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, samo stavak 34. - koristite aktivni mulj 
(oko 2,5 g/l).  
Broj ispitnih jedinica  
22. Za jednostavan test, tj. za mjerenje postotka opadanja, potreban je samo 
jedan SRT, ali za dobivanje podataka neophodnih za izra čun provizornih 
kinetičkih konstanti potrebno je 4-5 vrijednosti SRT-a. Obi čno se biraju 
vrijednosti izme đu dva i deset dana. Prakti čno je zgodno provoditi test 
istodobno na 4 ili 5 SRT-a i pri istoj temperaturi; u proširenim se studijama 
koriste iste vrijednosti SRT-a, ili možda razli čit raspon vrijednosti, pri 
drugim temperaturama unutar raspona od 5 do 20 °C. Za primarnu bioraz ­
gradnju (osnovna uporaba) obi čno je potrebna samo jedna jedinica za svaki 
skup uvjeta. Me đutim, za potpunu biorazgradivost potrebna je i kontrolna 
jedinica za svaki skup uvjeta, u koju se dodaju otpadne vode, ali ne i 
ispitivana kemikalija. Ako se sumnja da je u otpadnim vodama prisutna ispitivana kemikalija, bit će potrebno primijeniti i kontrolnu jedinicu 
prilikom procjene primarne biorazgradnje te poduzeti sve neophodne korek ­
cije u izra čunima.
 
Doza organskog medija i ispitivane kemikalije  
23. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 36. do 39., ali imajte na umu da se 
otopina ispitivane kemikalije dozira zasebno i da se koriste razli čite brzine 
izdvajanja mulja. Isto tako, često pratite i, po potrebi, prilagodite unutar 
± 10 % brzine protoka ulazne vode, izlazne vode i izdvajanja mulja, npr. 
dvaput dnevno. Ako se u analiti čkim metodama kada se koriste komunalne 
otpadne vode suo čite s poteško ćama, provedite test sa sinteti čkim otpadnim 
vodama, ali potrebno je osigurati da razli čiti mediji daju usporedive 
kinetičke podatke.  
Rukovanje jedinicama s aktivnim muljem  
24. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 40. do 43., ali SRT kontrolirajte 
samo ‚konstantnim’ izdvajanjem mulja.  
Uzorkovanje i analiza  
25. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 44. do 50., osim što se treba odrediti 
koncentracija ispitivane kemikalije, a fakultativno se može odrediti i DOC; 
ne smije se upotrebljavati KPK.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1087
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
26. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 52. do 54.  
Izražavanje rezultata ispitivanja  
27. Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 56. do 62.  
Izračun kineti čkih konstanti  
28. Realisti čnije je navesti srednju koncentraciju ispitivane kemikalije u 
stabilnom stanju u izlaznoj vodi i opisati na koji na čin ona varira s 
radnim uvjetima postrojenja nego navesti postotak primarne biorazradnje. To se može posti ći razmatranjem jednadžbe (6) u Dodatku 6.2., koja 
može dati vrijednosti za K
 S , μ m i θ SC , kritično vrijeme zadržavanja mulja.  
(Kao druga mogu ćnost, mogu se dobiti približne vrijednosti K  S i μm 
pomoću jednostavnog ra čunalnog programa kojim bi teoretska krivulja izra ­ 
čunata iz jednadžbe 2 (Dodatak 6.2.) odgovarala dobivenim pokusnim 
vrijednostima. Premda nijedna otopina nije jedinstvena, može se dobiti 
razumna približna vrijednost K  S i μ m .) 
Varijabilnost rezultata  
29. Opće je iskustvo da se za pojedine kemikalije dobivaju varijabilne vrijed ­
nosti kineti čkih parametara. Smatra se da uvjeti u kojima je mulj rastao, kao 
i uvjeti koji pretežu u korištenom testu (kao što je u stavku 5. i u drugim 
testovima), zna čajno utječu na rezultiraju će vrijednosti. O jednom aspektu te 
varijabilnosti raspravljali su Grady i sur. (4), koji su predložili da se nazivi ‚postojeći’ i ‚intrinzi čan’ primijene na dva skupa ekstremnih uvjeta koji 
predstavljaju granice fiziološkog stanja koje neka kultura može posti ći u 
kinetičkom pokusu. Ako nije dopušteno da se tijekom testa promijeni to 
stanje, vrijednosti kineti čkih parametara odražavaju uvjete u okolini iz koje 
su uzeti mikroorganizmi; te se vrijednosti nazivaju ‚postoje će’. Na drugom 
ekstremnom kraju, ako su uvjeti u testu takvi da dopuštaju potpuno 
razvijanje sustava sinteze bjelan čevina, što omogu ćuje maksimalnu 
moguću brzinu rasta, za dobivene kineti čke parametre kaže se da su ‚intrin ­
zični’ te da ovise samo o naravi supstrata i vrstama bakterija u toj kulturi. 
Rukovoditi se treba time da se postoje će vrijednosti dobivaju održavanjem 
niskim omjera koncentracije i supstrata prema kompetentnim mikroorgan ­
izmima (S
 o /X o ), npr. 0,025, a intrinzi čne vrijednosti pojavljuju se kad je taj 
omjer visok, npr. najmanje 20. U oba bi slu čaja S  o trebalo biti jednako ili 
veće od relevantne vrijednosti Ks, konstante poluzasi ćenosti.  
30. O varijabilnost i ostalim aspektima kinetike biorazgradnje raspravljalo se na 
nedavnoj radionici SETAC-a (5). Iz takvih studija, o kojima postoje izvješ ća 
i o kojima su se provodili projekti, trebao bi proizi ći jasniji pogled na 
kinetiku u postrojenjima za pro čišćavanje otpadnih voda kako bi se omogu ­ 
ćilo bolje tuma čenje postoje ćih podataka, kao i da bi se predložili relevant ­
niji planovi za budu će ispitne metode.  
LITERATURA:  
1. Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
2. Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
3. Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1088
 
4. Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
5. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1089
 
Dodatak 6.1.  
Propusna posuda s kontrolom SRT-a
  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1090
 
Dodatak 6.2.  
Izračun kineti čkih konstanti  
1. Pod pretpostavkom da se primjenjuje Monodova kinetika te uzimaju ći u 
obzir bilancu mase aktivnih krutih tvari i supstrata u cijelom sustavu s aktivnim muljem (1), mogu se dobiti sljede ći izrazi:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
ili 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
gdje je  
S 1 = koncentracija supstrata u izlaznoj vodi, (mg/l)  
K S = konstanta poluzasi ćenosti, koncentracija na kojoj je μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = specifi čna brzina rasta (d  –1 ) 
μ m = maksimalna vrijednost μ m (d –1 ) 
K d = specifična brzina raspadanja aktivnih krutih tvari (d  –1 ) 
θ S = srednje vrijeme zadržavanja mulja, SRT (d)  
Ispitivanjem ove jednadžbe dolazi se do sljede ćih zaključaka: 
i. Koncentracija u izlaznoj vodi ne ovisi o koncentraciji u ulaznoj vodi 
(S 0 ); dakle, postotak biorazgradnje varira ovisno o koncentraciji u 
ulaznoj vodi, S  0 . 
ii. Jedini kontrolni parametar u postrojenju koji ima utjecaja na S  1 jest 
vrijeme zadržavanja mulja, θ S . 
iii. Za danu koncentraciju u ulaznoj vodi, S  0 , postojat će kritično vrijeme 
zadržavanja mulja, takvo da je:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
gdje je  
θ SC = kritično vrijeme zadržavanja mulja, ispod kojega će se kompe ­
tentni mikroorganizmi isprati iz postrojenja.  
iv. Budući da su ostali parametri u jednadžbi (2) povezani s kinetikom rasta, 
temperatura će vjerojatno imati utjecaja na razinu supstrata u izlaznoj 
vodi i na kriti čnu starost mulja, tj. vrijeme zadržavanja mulja potrebno 
za dobivanje odre đenog stupnja pro čišćavanja rast će s padom 
temperature.  
2. Iz bilance mase krutih tvari u sustavu s propusnom posudom, a i pod 
pretpostavkom da je koncentracija krutih tvari u izlaznoj vodi u postrojenju, X
 2 , niska u usporedbi s koncentracijom u dozra čnoj posudi, X  1 , vrijeme 
zadržavanja mulja  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1091
 
i 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
gdje je  
V = volumen dozra čne posude (l)  
X 1 = koncentracija krutih tvari u dozra čnoj posudi (mg/l)  
X 2 = koncentracija krutih tvari u izlaznoj vodi (mg/l)  
Q 0 = brzina protoka ulazne vode (l/d)  
Q 1 = brzina protoka otpadnog mulja (l/d)  
Dakle, mogu će je kontrolirati vrijeme zadržavanja mulja na bilo kojoj pret ­
hodno odabranoj vrijednosti kontroliranjem brzine protoka otpadnog mulja, Q
 1 . 
Zaključci 
3. Glavni cilj ovog testa je, dakle, omogu ćiti prognozu koncentracije u izlaznoj 
vodi, a time i razina ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi.  
4. Grafi čkim prikazom S  1 u ovisnosti o θ S , kritično vrijeme zadržavanja mulja, 
θ SC , ponekad se može smjesta procijeniti, npr. krivulja 3 na slici 1. Kad to 
nije mogu će, θ SC se može izra čunati, zajedno s približnim vrijednostima μ m 
i K S , grafičkim prikazom S  1 u ovisnosti o S  1 •θ S . 
Prebacivanjem veli čina u jednadžbi (1) dobivamo  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Ako je K  d malen, tada 1 + θ s · K d ~ 1 i [5] postaje:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Dakle, na grafi čkom prikazu dobit ćemo ravnu crtu (vidjeti sliku 2.) nagiba 
1/μ m a sjecište K  S /μ m ; a i θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1092
 
Slika 1.  
Tri temperature; pet SRT-a
  
Slika 2.  
Regresijska linija SRT · S 1 naspram S  1 na T = 5o C
  
Pojmovnik:  
koncentracija u izlaznoj vodi  
Krivulja  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1093
 
Dodatak 7.  
TEST U RASPONU NISKIH ( μg/l) KONCENTRACIJA  
1. Mnoge su kemikalije obi čno prisutne u vodenom okolišu, čak i u otpadnim 
vodama, u vrlo niskim koncentracijama ( μg/l). U takvim koncentracijama 
one vjerojatno ne služe kao primarni supstrati koji rezultiraju rastom, nego je vjerojatnije da će se razgraditi kao sekundarni supstrati koji ne rastu, 
zajedno s nizom kemikalija koje sadržavaju ugljik, a koje se javljaju u 
prirodi. Stoga, ni razgradnja takvih kemikalija ne će se uklapati u model 
opisan u Dodatku 6. Mogu se primijeniti brojni drugi modeli, a u uvjetima koji prevladavaju u sustavima za pro čišćavanje otpadnih voda moglo bi se 
istodobno primijeniti više od jednog modela. Za rasvjetljavanje te proble ­
matike bit će potrebna brojna istraživanja.
 
2. U me đuvremenu, može se slijediti postupak iz glavnog dijela teksta 
(poglavlje C.10 A), ali samo za primarnu biorazgradivost, gdje se koriste 
prikladno niske koncentracije (< 100 μg/l) i potvr đeni analiti čki postupak. 
Može se izra čunati postotak biorazgradnje (vidjeti stavak 54. Ispitne 
metode) pod uvjetom da se u obzir uzmu abioti čki procesi (adsorpcija, 
hlapljivost itd.). Kao primjer može poslužiti studija autora Nyholma i 
njegovih suradnika (1)(2) u kojoj se koristi ciklus od 4 h u sustavu punjenja 
i pražnjenja. Oni su izvijestili o pseudo konstantama prvog reda za 5 kemi ­
kalija koje su se dodale sinteti čkim otpadnim vodama u koncentraciji od 5 
do 100 μg/l. (Za potpunu biorazgradivost mogu se koristiti  14 C obilježene 
ispitivane kemikalije. Opisivanje tog ciklusa seže onkraj podru čja primjene 
ove Ispitne metode jer dosad ne postoje dogovoreni postupci iako pred ­
ložena metoda za ISO 14592 (3) sadržava smjernice o uporabi  14 C obilje­ 
ženih kemikalija.  
Test SCAS  
3. Kasnije je predložen dvofazni test (4)(5)(6); iza metode aktivnog mulja s 
polukontinuiranim režimom (SCAS) slijedi kratkotrajni kineti čki test na 
uzorcima uzetima iz jedinica SCAS. Sustav SCAS radi s poznatim brzinama izdvajanja mulja (za razliku od izvorne ispitne metode iz C.12), a u njega se ulijevaju izmijenjene sinteti čke otpadne vode OECD-a ili komunalne 
otpadne vode. Sinteti čke otpadne vode izmijenjene su (zbog promjene pH 
vrijednosti i slabog sposobnosti taloženja mulja) dodavanjem fosfata kao pufera, ekstrakta kvasca, željezova (III) klorida i soli elemenata u tragovima, a njihov KPK povišen je na oko 750 mg/l pove ćanjem koncentracije 
peptona i mesnog ekstrakta. Jedinice su pogonjene u ciklusu od 24 h: 
dozračivanje je trajalo 23 h, izdvajanje mulja, taloženje, izvla čenje super ­
natanta (iz izlazne vode) te su se nakon toga dodale sinteti čke otpadne vode 
plus ispitivana kemikalija, do 100 μg/l, (tj. u otprilike istoj koncentraciji kao 
i u kratkotrajnom testu). Jedanput tjedno 10 % ukupnog mulja zamijenilo se 
svježim muljem kako bi se održala uravnotežena mikrobna populacija.
 
4. Mjerile su se koncentracije ispitivane kemikalije na po četku i na kraju 
dozračivanja, a test se nastavio sve dok se nije postiglo konstantno opadanje 
ispitivane kemikalije; to traje od jednog tjedna do nekoliko mjeseci.  
Kratkotrajni test  
5. Primjenjuje se kratkotrajni test (npr. 8 sati) kako bi se odredila (pseudo) 
konstanta kineti čke brzine prvog reda iz raspadanja ispitivane kemikalije u 
aktivnom mulju poznatog, ali razli čitog podrijetla i povijesti. Posebice treba 
napomenuti da su uzorci mulja uzimani iz reaktora SCAS-a - na kraju razdoblja dozra čivanja kad je niska koncentracija organskog supstrata - 
tijekom pokusa aklimatizacije (stavci 3., 4.). Mulj se može uzimati i iz 
paralelne jedinice SCAS koja nije izložena dodavanju ispitivane kemikalije,
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1094
 
za potrebe usporedbe. Dozra čuju se smjese mulja i ispitivane kemikalije 
koja se dodaje u dvjema ili ve ćem broju koncentracija u rasponu od 1-50 
μg/l, bez dodavanja sinteti čkih otpadnih voda ili drugog organskog 
supstrata. Ispitivana kemikalija preostala u otopini odre đuje se u redovitim 
razmacima, npr. svakog sata, ovisno o razgradivosti kemikalije, tijekom 
razdoblja ne duljeg od 24h. Prije prikladne analize uzorci se centrifugiraju.  
Izračuni 
6. Podaci iz jedinica SCAS koriste se za izra čun postotka opadanja ispitivane 
kemikalije (stavak 54.). Isto tako, i konstanta prosje čne brzine, K  1 , (norma­
lizirana za koncentraciju suspendiranih krutih tvari) može se izra čunati iz:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
gdje je  
t = vrijeme dozra čivanja (23h)  
C e = koncentracija na kraju razdoblja dozra čivanja (μg/l) 
C i = koncentracija na po četku razdoblja dozra čivanja (μg/l) 
SS = koncentracija krutih tvari u aktivnom mulju (g/l)  
7. U kratkotrajnom testu grafi čki se prikazuje logaritamski % preostale koncen ­
tracije u ovisnosti o vremenu, a nagib po četnog dijela (10-50 % razgradnje) 
grafičkog prikaza jednak je K  1 , (pseudo) konstanti prvog reda. Ta se 
konstanta normalizira u pogledu koncentracije krutih tvari u mulju dijelje ­
njem nagiba s koncentracijom krutih tvari u mulju. Podaci iz izvješ ća 
moraju obuhva ćati i pojedinosti o po četnim koncentracijama ispitivane 
kemikalije i suspendiranih krutih tvari, vrijeme zadržavanja mulja, punjenje 
i izvor mulja te pojedinosti o prethodnoj izloženosti (ako ona uop će postoji) 
ispitivanoj kemikaliji.  
Varijabilnost rezultata  
8. O varijabilnost i ostalim aspektima kinetike biorazgradnje raspravljalo se na 
nedavnoj radionici SETAC-a (7). Iz takvih studija, o kojima postoje izvješ ća 
i o kojima su se provodili projekti, trebao bi proizi ći jasniji pogled na 
kinetiku u postrojenjima za pro čišćavanje otpadnih voda kako bi se omogu ­ 
ćilo bolje tuma čenje postoje ćih podataka, kao i da bi se predložili relevant ­
niji planovi za budu će ispitne metode.  
LITERATURA  
1. Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.  
2. Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.  
3. ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentra ­
tions in water.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1095
 
4. Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
 
5. Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.  
6. Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
7. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1096
 
C.10-B: Biofilmovi  
UVOD  
1. Simulacijski testovi obi čno se provode s kemikalijama koje nisu prošle test 
pretraživanja na laku biorazgradivost (poglavlje C.4 A do F ovog Priloga (9)), ali su prošle test na biorazgradivost koja im je svojstvena. Iznimno se simulacijski testovi provode i sa svim kemikalijama o kojima se traži više 
informacija, posebice kemikalija u velikim koli činama, a obi čno se primje ­
njuje test aktivnim muljem (C.10 A). Me đutim, u nekim okolnostima traže 
se specifi čni podaci o ponašanju kemikalija prema metodama pro čišćavanja 
otpadnih voda koje obuhva ćaju biofilmove, a posebno perkolacijske ili 
kapajuće filtre, rotiraju će biološke kontaktore, fluidizirane slojeve. Za zado ­
voljavanje te potrebe razvijeni su brojni ure đaji.
 
2. Gerike  et al.  (1) koristili su velike, kapaju će pilot filtre, i to u povezanom 
načinu rada. Ti su filtri zauzimali mnogo prostora i za njih su bili potrebni 
relativno veliki volumeni otpadnih voda ili sinteti čkih otpadnih voda. Trues ­
dale et al.  (2) opisali su manje filtre (promjera 6 ft × 6 in) kroz koje su 
puštane prirodne otpadne vode bez surfaktanta, ali su im i dalje trebali veliki 
volumeni. Čak je 14 tjedana bilo potrebno za razvijanje „zrelih” biofilmova, 
a još 4-8 tjedana nakon što je uveden ispitivani surfaktant po prvi puta da bi se počela odvijati aklimatizacija.
 
3. Baumann  et al.  (3) razvili su znatno manje filtre koji su koristili „flis” od 
poliestera koji je prije toga bio umo čen u aktivni mulj kao inertni medij koji 
podržava biofilm. Ispitivana kemikalija koristila se kao jedini izvor ugljika, 
a biorazgradivost se procjenjivala iz mjerenja otopljenog organskog ugljika (DOC) u ulaznoj vodi i u izlaznoj vodi, a iz koli čine CO
 2 procje­
njivao se izlazni plin.  
4. Posve druk čiji pristup zauzeli su Gloyna  et al.  (4) koji su izumili rotiraju ći 
cijevni reaktor. Na unutarnjoj površini rotiraju će cijevi uzgajan je biofilm na 
poznatoj površini prolaskom ulazne vode koja se dodavala na gornjem vrhu 
cijevi, nagnute pod malim kutom u odnosu na horizntalu. Reaktor se koristio za proučavanje biorazgradivosti surfaktanata (5), kao i za ispitivanje opti ­
malne debljine biofilma i raspršenja kroz taj film (6). Nadalje, potonji su 
autori razvili reaktor, ali su ga i izmijenili kako bi mogli odrediti CO
 2 u 
izlaznom plinu.  
5. Stalni odbor analiti čara ( Standing Committee of Analysts  (UK)) usvojio je 
rotirajući cijevni reaktor kao standardnu metodu za procjenu kako bioraz ­
gradivosti kemikalija (7) tako i pro čistivosti i toksi čnosti otpadih voda (8). 
Prednosti ovdje opisane metode jesu jednostavnost, kompaktnost, mjerna 
obnovljivost i potreba za relativno malim volumenima organskog medija.  
NAČELO ISPITIVANJA  
6. Sinteti čke ili komunalne otpadne vode, i ispitivana kemikalija, u smjesama 
ili samostalno, nanose se na unutarnju površinu nagnute cijevi koja se sporo okreće. Na toj se unutarnjoj površini stvara sloj mikroorganizama, sli čan 
sloju na biofiltru. Odabiru se uvjeti rada reaktora kako bi se postigla 
adekvatna eliminacija organske tvari i, po potrebi, oksidacija amonijaka.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1097
 
7. Skupi se izlazna voda iz cijevi i ona se ili taloži i/ili filtrira prije analize na 
otopljeni organski ugljik (DOC) i/ili na ispitivanu kemikaliju specifi čnom 
metodom. Kontrolne jedinice u koje se ne dodaje ispitivana kemikalija pogone se paralelno u istim uvjetima u poredbene svrhe. Pretpostavlja se da je razlika izme đu koncentracije DOC-a u izlaznoj vodi u ispitnoj i 
kontrolnoj jedinici rezultat ispitivane kemikalije i njezinih organskih meta ­
bolita. Ta se razlika uspore đuje s koncentracijom dodane ispitivane kemi ­
kalije (kao DOC-a) kako bi se izra čunala eliminacija ispitivane kemikalije.
 
8. Biorazgradnja se obi čno može razlikovati od bioadsorpcije pomnim prou ča­
vanjem krivulje eliminacije. Potvrda se obi čno može dobiti primjenom testa 
na laku biorazgradnju (apsorpcija kisika ili proizvodnja ugljikova dioksida) 
pomoću aklimatiziranog inokuluma koji se uzima na kraju testa iz reaktora u 
koje se dodala ispitivana kemikalija.  
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI  
9. Trebali bi biti poznati čistoća, topljivost u vodi, hlapljivost i adsorpcijska 
svojstva ispitivane kemikalije kako bi se omogu ćilo ispravno tuma čenje 
nastalih rezultata.  
10. Obično se hlapljive i slabo topljive kemikalije ne mogu ispitivati ako se ne 
poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti Dodatak 5. poglavlju C.10 A). Također bi trebala biti poznata i kemijska struktura ili barem empirijska 
formula kako bi se izra čunale teoretske vrijednosti i/ili provjerile izmjerene 
vrijednosti parametara, npr. teoretska potrošnja kisika (TPK), DOC.
 
11. Informacije o toksi čnosti ispitivane kemikalije po mikroorganizme (vidjeti 
Dodatak 4. poglavlju C.10 A) mogu biti korisne za odabir odgovaraju ćih 
ispitnih koncentracija te mogu biti klju čne za ispravno tuma čenje niskih 
vrijednosti biorazgradnje.  
RAZINE PROLAZNOSTI  
12. Izvorno je bilo potrebno da primarna biorazgradnja surfaktanata dosegne 
80 % ili više prije nego što bi se kemikalija mogla staviti na tržište. Ako se ne postigne vrijednost od 80 %, može se primijeniti simulacijski (potvr ­
dni) test, a surfaktant se smije staviti na tržište tek ako specifi čna kemikalija 
opadne za više od 90 %. Kod kemikalija op ćenito nije upitna razina (ne)pro ­
laznosti, a vrijednost postotka opadanja može se upotrijebiti u približnim izračunima vjerojatne koncentracije u okolišu koja će se koristiti u procjeni 
opasnosti koju predstavljaju te kemikalije. U nizu studija o čistim kemika ­
lijama došlo je do rezultata da je postotak opadanja DOC-a > 90 % u više 
od tri četvrtine te > 80 % u više od 90 % kemikalija koje su pokazale 
značajniji stupanj biorazgradivosti.
 
REFERENTNE KEMIKALIJE  
13. Kako bi se osiguralo ispravno provo đenje pokusnog postupka, korisno je 
povremeno ispitati referentne kemikalije za koje je poznato kako se ponašaju. Takve kemikalije obuhva ćaju adipinsku kiselinu, 2fenil fenol, 1- 
naftol, difensku kiselinu i 1-naftolnu kiselinu.
 
MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA  
14. Laboratorij u Ujedinjenoj Kraljevini utvrdio je da relativno standardno 
odstupanje u testovima iznosi 3,5 %, a me đu testovima 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1098
 
OPIS METODE  
Aparatura  
Rotirajući cijevni reaktori  
15. Aparatura (vidjeti slike 1. i 2. u Dodatku 8.) sastoji se od svežnja akrilnih 
cijevi duljine 30,5 cm i unutarnjeg promjera 5 cm, koje stoje na kota čima s 
gumenim obru čem u metalnom potpornom okviru. Svaka cijev ima vanjsku 
brtvu, dubine približno 0,5 cm, da bi se zadržala na kota čima, unutarnja 
površina sastruže se grubom ži čanom vunom, a na gornjem vrhu (ulijevu) 
nalazi se unutarnja brtva dubine 0,5 cm koja zadržava teku ćinu. Cijevi su 
nagnute pod kutom od otprilike jednog stupnja u odnosu na horizontalu kako bi se postiglo potrebno vrijeme kontakta kada se medij ulije u čistu 
cijev. Kota če s gumama okre će spori motor varijabilne brzine. Temperaturu 
u cijevima kontrolira instalacija u prostoriji s konstantnom temperaturom.
 
16. Stavljanjem svakog cijevnog reaktora unutar malo ve će, začepljene cijevi i 
osiguravanjem da su spojevi plinonepropusni, izlazni plin CO  2 može se 
skupljati u alkalnu otopinu za naknadno mjerenje (6).  
17. 24-satno punjenje, za svaku cijev, organskog medija u koji je, po potrebi, 
dodana ispitivana kemikalija nalazi se u spremniku od 20 l (A)(vidjeti sliku 
2.). Ako je to potrebno, otopina ispitivane kemikalije može se zasebno dozirati. Blizu dna svakog spremnika postoji ispust spojen odgovaraju ćim 
cjevovodom, npr. silikonskom gumom, putem peristalti čke crpke (B) sa 
staklenom ili akrilnom dovodnom cijevi koja 24 cm ulazi u gornji kraj (ulijev) nagnute cijevi (C). S donjeg kraja nagnute cijevi omogu ćeno je 
kapanje izlazne vode koja se skuplja u drugi spremnik (D). Prije analize 
izlazna se voda taloži ili filtrira.
 
Aparatura za filtriranje-centrifugiranje  
18. Uređaj za filtraciju uzoraka pomo ću membranskih filtara prikladne propu ­
snosti (nazivni promjer otvora 0,45 μm) koji adsorbira organske kemikalije 
ili ispušta organski ugljik u minimalnoj koli čini. Ako se koriste filtri koji 
ispuštaju organski ugljik, pažljivo se operu vru ćom vodom kako bi se 
uklonio organski ugljik koji curi. Druga je mogu ćnost primjena centrifuge 
koja može posti ći 40 000 m/s  2 . 
19. Analiti čka oprema za odre đivanje:  
— DOC-a/ukupnog organskog ugljika (TOC-a), ili kemijske potrošnje 
kisika (KPK-a);  
— specifi čne kemikalije (HPLC (visokodjelotvorna teku ćinska kromatogra ­
fija), GC (plinska kromatografija) itd.) ako je potrebno;  
— pH-a, temperature, kiselosti, lužnatosti;  
— amonijaka, nitrita i nitrata ako se testovi provode u uvjetima nitrifikacije.  
Voda  
20. Voda iz slavine koja sadržava manje od 3 mg/l DOC-a.  
21. Destilirana ili deionizirana voda koja sadržava manje od 2 mg/l DOC-a.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1099
 
Organski medij  
22. Kao organski medij mogu se koristiti sinteti čke otpadne vode, komunalne 
otpadne vode ili njihova kombinacija. Pokazalo se da uporaba samo komu ­
nalnih otpadnih voda često dovodi do pove ćanog postotka opadanja DOC-a 
(u jedinicama s aktivnim muljem), pa čak i da omogu ćuje biorazgradnju 
nekih kemikalija koje se biološki ne razgra đuju kada se upotrebljavaju 
sintetičke otpadne vode OECD-a. Dakle, preporu čuje se uporaba komu ­
nalnih otpadnih voda. Izmjerite koncentraciju DOC-a (ili KPK-a) u svakoj 
novoj šarži organskog medija. Trebale bi biti poznate kiselost ili lužnatost 
organskog medija. Mogu će je da će zbog medija biti potrebno dodavanje 
odgovaraju ćeg pufera (natrijev hidrogenkarbonat ili kalijev dihidrogen 
fosfat) ako je niske kiselosti ili lužnatosti kako bi se pH tijekom testa 
održao na oko 7,5 ± 0,5 u reaktoru. O koli čini pufera te o trenutku doda ­
vanja odlu čuje se u svakom pojedinom slu čaju. 
Sintetičke otpadne vode  
23. Po 1 litri vode iz slavine otopi se: pepton, 160 mg; mesni ekstrakt, 110 mg; 
urea, 30 mg; anhidridni dikalijev hidrogen fosfat (K  2 HPO4), 28 mg; natrijev 
klorid (NaCl), 7 mg; kalcijev klorid dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; magne ­
zijev sulfat heptahidrat (MgSO  4 .7H  2 O), 2 mg. Te sinteti čke otpadne vode 
OECD-a služe samo kao primjer i daju srednju koncentraciju DOC-a u 
ulaznoj vodi od oko 100 mg/l. Druga je mogu ćnost primjena drugih 
smjesa koje imaju otprilike iste koncentracije DOC-a, a koje su sli čnije 
pravim otpadnim vodama. Te se sinteti čke otpadne vode mogu napraviti u 
destiliranoj vodi u koncentriranom obliku i mogu se čuvati na oko 1 °C do 
tjedan dana. Po potrebi se razrijede vodom iz slavine. (Ovaj medij nije 
zadovoljavaju ći, npr. vrlo je visoka koncentracija dušika, relativno je 
nizak sadržaj ugljika, ali nije predloženo ništa bolje, osim da se doda više fosfata kao pufera i dodatnog peptona).
 
Komunalne otpadne vode  
24. Koristite svježe istaložene otpadne vode koje se skupljaju svakodnevno iz 
postrojenja za pro čišćavanje u koje se pretežno dodaju komunalne otpadne 
vode. Njih bi trebalo skupiti iz preljevnog kanala primarnog taložnika ili iz ulijeva postrojenja s aktivnim muljem te u njima uglavnom ne bi smjelo biti 
grubih čestica. Te se otpadne vode mogu koristiti nekoliko dana nakon 
skladištenja na oko 4 °C ako se dokaže da nije došlo do znatnijeg opadanja DOC-a (ili KPK-a) (npr. za manje od 20 %) tijekom skladištenja. Da bi se ograničile smetnje u sustavu, trebalo bi prije uporabe prilagoditi DOC (ili 
KPK) svake nove šarže na odgovaraju ću konstantnu vrijednost, npr. razrje ­ 
đivanjem vodom iz slavine.
 
Sredstvo za podmazivanje  
25. Za podmazivanje valjaka peristalti čke crpke mogu se upotrijebiti glicerol ili 
maslinovo ulje: oboje je prikladno za uporabu na cjevovodu od silikonske 
gume.  
Radne otopine ispitivane kemikalije  
26. Za kemikalije odgovaraju će topljivosti pripremite radne otopine prikladnih 
koncentracija (npr. 1 do 5 g/l) u deioniziranoj vodi ili u mineralnom dijelu sintetičkih otpadnih voda. Za netopljive kemikalije vidjeti Dodatak 5. u 
poglavlju C.10-A. Ta metoda nije prikladna za hlapljive kemikalije ako se 
ne izmijene cijevni reaktori (stavak 16.). Odredite DOC i TOC radne otopine pa ponovite mjerenja za svaku novu šaržu. Ako je razlika izme đu 
DOC-a i TOC-a ve ća od 20 %, provjerite topljivost u vodi ispitivane kemi ­
kalije. Usporedite DOC ili koncentraciju ispitivane kemikalije izmjerene 
specifičnom analizom radne otopine s nazivnom vrijednoš ću kako biste
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1100
 
utvrdili je li obnavljanje dovoljno dobro (obi čno se može o čekivati > 90 %). 
Utvrdite, posebno za disperzije, može li se ili ne može DOC koristiti kao 
analitički parametar ili se može koristiti samo jedna analiti čka tehnika speci ­
fična za ispitivanu kemikaliju. Za disperziju je potrebna centrifuga uzoraka. 
Za svaku novu šaržu izmjerite DOC, KPK ili ispitivanu kemikaliju pomo ću 
specifične analize.  
27. Odredite pH radne otopine. Ekstremne vrijednosti znak su toga da doda ­
vanje kemikalije možda utje če na pH aktivnog mulja u sustavu ispitivanja. 
U tom slu čaju neutralizirajte radnu otopinu kako biste dobili pH od 7 ± 0,5 
s malim koli činama anorganske kiseline ili lužine, ali izbjegavajte precipi ­
taciju (taloženje) ispitivane kemikalije.  
POSTUPAK  
Priprema organskog medija za doziranje  
28. Pobrinite se da na po četku i tijekom testa temeljito o čistite spremnike ulazne 
i izlazne vode te cjevovode iz posude ulazne i posude izlazne vode kako 
biste uklonili nakupine mikroba.  
29. Pripremite sinteti čke otpadne vode (stavak 23.) nanovo svakog dana bilo od 
krutih tvari bilo od koncentrirane radne otopine što se razrije đuju vodom iz 
slavine. Izmjerite potrebnu koli činu u cilindru pa je dodajte u čistu posudu 
za ulaznu vodu. Isto tako, kad je to neophodno, u sinteti čke otpadne vode 
prije razrje đivanja dodajte potrebnu koli činu radne otopine ili referentne 
kemikalije. Ako je zgodnije ili neophodno za izbjegavanje gubitka ispitivane 
kemikalije, pripremite zasebnu razrije đenu otopinu ispitivane kemikalije u 
zasebnom spremniku pa je drugom dozirnom crpkom ulijte u nagnute cijevi.  
30. Druga (i preferirana) mogu ćnost jest korištenje istaložene komunalne 
otpadne vode (stavak 24.) koje, ako je to mogu će, se nanovo skupljaju 
svakoga dana.  
Rad rotiraju ćih cijevnih reaktora  
31. Za procjenu jedne ispitivane kemikalije potrebna su dva identi čna cijevna 
reaktora i oni se sastavljaju u prostoriji s konstantnom temperaturom, obi čno 
na 22 ± 2 °C.  
32. Podesite peristalti čku crpku kako bi crpila 250 ± 25 ml/h organskog medija 
(bez ispitivane kemikalije) u nagnute cijevi, koje se rotiraju brzinom od 18 ± 2 opm. Nanesite sredstvo za podmazivanje (stavak 25.) na cijevi 
crpke, i to na po četku testa i povremeno tijekom testa kako bi se osigurao 
njihov ispravan rad i produljio životni vijek cijevi.
 
33. Podesite kut nagnutosti cijevi u odnosu na horizontalu kako bi se dobilo 
vrijeme djelovanja od 125 ± 12,5 s za ulijevanje u čistu cijev. Procijenite 
vrijeme zadržavanja dodavanjem nebiološkog markera (npr. NaCl, inertno bojilo) u ulijev: smatra se da vrijeme potrebno za postizanje vršne koncen ­
tracije u izlaznoj vodi predstavlja srednje vrijeme zadržavanja (kad postoji 
maksimalni film, vrijeme zadržavanja može se pove ćati do 30 min.).
 
34. Pokazalo se da te stope, brzine i vremena rezultiraju adekvatnim opadanjem 
(> 80 %) DOC-a (ili KPK-a) te da stvaraju nitrificiranu izlaznu vodu. Stopu 
protoka treba izmijeniti ako opadanje nije dostatno ili ako treba simulirati radnu uspješnost to čno određenog postrojenja za pro čišćavanje. U potonjem 
slučaju podešavajte brzinu doziranja organskog medija sve dok radna 
uspješnost reaktora ne bude jednaka radnoj uspješnosti postrojenja za pro či­ 
šćavanje.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1101
 
Inokulacija  
35. Možda će inokulacija zrakom biti dovoljna za po četak rasta mikroorgani ­
zama kada se koriste sinteti čke otpadne vode, ali u protivnom dodajte 1 ml/l 
istaloženih otpadih voda u ulijev za 3 dana.  
Mjerenja  
36. U redovitim razmacima provjeravajte jesu li dozirane koli čine i brzine okre ­
tanja unutar traženih granica. Isto tako, izmjerite i pH izlazne vode, posebno 
ako se očekuje nitrifikacija.  
Uzorkovanje i analiza  
37. Metoda, obrazac i u čestalost uzorkovanja biraju se tako da odgovaraju svrsi 
testa. Primjerice, uzmite brze uzorke ulazne i izlazne vode ili skupljajte 
uzorke tijekom duljeg razdoblja, npr. 36 h. U prvom razdoblju, bez ispiti ­
vane kemikalije, uzimajte uzorke dvaput tjedno. Profiltrirajte uzorke kroz membrane ili ih centrifugirajte na oko 40 000 m/s
 2 otprilike 15 min (stavak 
18.). Možda će biti potrebno pustiti uzorke da se istalože i/ili ih filtrirati 
kroz grubi filtar prije filtracije kroz membranu. Provedite odre đivanja 
DOC-a (ili KPK-a) najmanje dva puta te, ako je potrebno, i BPK-a, amoni ­
jaka i nitrita/nitrata.  
38. Sve analize treba provesti što je mogu će prije nakon skupljanja i pripreme 
uzoraka. Ako se analize moraju odgoditi, uskladištite uzorke na oko 4 °C na 
tamnom mjestu u do vrha napunjenim i čvrsto zatvorenim bocama. Ako se 
uzorci moraju skladištiti dulje od 48 h, konzervirajte ih dubokim smrzava ­
njem, acidifikacijom ili dodavanjem odgovaraju će toksične kemikalije (npr. 
20 ml/l otopine merkurijeva (II) klorida od 10 g/l). Pobrinite se da tehnika 
konzerviranja ne utje če na rezultate analize.  
Faza ustaljenja  
39. U ovoj fazi površinski biofilm naraste do optimalne debljine, što obi čno 
traje oko dva tjedna, a ne bi trebalo premašiti šest tjedana. Opadanje (stavak 44.) DOC-a (ili KPK-a) se pove ćava i doseže vrijednost platoa. Kad se plato 
dosegne na sli čnoj vrijednosti u obje cijevi, jedna se odabire da bude 
kontrolna u ostatku testa, tijekom kojega bi njihova radna uspješnost trebala ostati dosljedna.
 
Uvođenje ispitivane kemikalije  
40. U ovoj fazi dodajte ispitivanu kemikaliju u drugi reaktor u traženoj koncen ­
traciji, obi čno 1020 mg C/l. U kontrolnu se cijev i dalje dodaje samo 
organski medij.  
Faza aklimatizacije  
41. Nastavite s analizama DOC-a (ili KPK-a) dvaput tjedno te, ako treba proci ­
jeniti i primarnu biorazgradivost, izmjerite i koncentraciju ispitivane kemi ­
kalije specifi čnom analizom. Ostavite jedan do šest tjedana (ili dulje u 
posebnim uvjetima) za aklimatizaciju nakon što je ispitivana kemikalija 
uvedena po prvi put. Kada postotak opadanja (stavci 43.-45.) dosegne 
maksimalnu vrijednost, dobivajte 1215 valjanih vrijednosti u fazi platoa tijekom otprilike tri tjedna radi procjene srednjeg postotka opadanja. Smatra se da je test završen kad se postigne dovoljno visok stupanj elimi ­
nacije. Neka trajanje testa ne bude duže od 12 tjedana nakon prvog doda ­
vanja ispitivane kemikalije.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1102
 
Ljuštenje filma  
42. Naglo va đenje većih količina viška filma iz cijevi, ili ljuštenje, odvija se u 
relativno redovitim razmacima. Kako bi se osiguralo da to nema utjecaja na poredbenost rezultata, dajte da testovi obuhvate najmanje dva puna ciklusa 
rasta i ljuštenja.
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
43. Izračunajte postotak eliminacije DOC-a (ili KPK-a) ispitivane kemikalije za 
svaku vremenski odre đenu procjenu pomo ću sljedeće jednadžbe:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
gdje je  
D t = postotak eliminacije DOC-a (ili KPK-a) u vremenu t;  
Cs = koncentracija DOC-a (ili KPK-a) u ulaznoj vodi nastala zbog ispiti ­
vane kemikalije, po mogu ćnosti procijenjene iz koncentracije, i volu ­
mena dodanog u radnu otopinu (mg/l);  
E = izmjereni DOC (ili KPK) u ispitnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l);  
Eo = izmjereni DOC (ili KPK) u kontrolnoj izlaznoj vodi u vremenu t 
(mg/l).  
Ponovite izra čun i za referentnu kemikaliju, ako se ista ispituje.  
Radna uspješnost kontrolnog reaktora  
44. Stupanj eliminacije DOC-a (ili KPK-a) (D  B ) organskog medija u kontrolnom 
reaktoru korisna je informacija pri procjeni aktivnosti biorazgradnje biofilma tijekom testa. Postotak eliminacije izra čunajte pomo ću jednadžbe:
 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
gdje je  
Cm = DOC (ili KPK) organskog medija u kontrolnoj ulaznoj vodi (mg/l).  
45. Izračunajte opadanje (D  ST ) ispitivane kemikalije, ako se ono mjerilo, speci ­
fičnom analiti čkom metodom u svakom vremenski odre đenom odre đivanju 
iz jednadžbe:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
gdje je  
Si = izmjerena ili, po mogu ćnosti, procijenjena koncentracija ispitivane 
kemikalije u ispitnoj ulaznoj vodi (mg/l)  
Se = izmjerena koncentracija ispitivane kemikalije u ispitnoj izlaznoj vodi 
u vremenu t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1103
 
Ako analiti čka metoda rezultira pozitivnom vrijednoš ću u neizmijenjenim 
otpadnim vodama koja je jednaka S  c mg/l, izra čunajte postotak opadanja 
(D SC ) iz: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Izražavanje rezultata ispitivanja  
46. Grafi čki prikažite postotak eliminacije D  t i D ST (ili D  SC ), ako je raspoloživ, 
u ovisnosti o vremenu (vidjeti Dodatak 2. u poglavlju C.10- A). Uzmite 
srednju vrijednost (zaokruženu na najbliži cijeli broj) i standardno odstu ­
panje 12-15 vrijednosti za D  T (i za D  ST , ako je raspoloživ) dobivene u fazi 
platoa kao postotak opadanja ispitivane kemikalije. Iz oblika krivulje elimi ­
nacije mogu se izvu ći izvjesni zaklju čci o procesima opadanja.  
Adsorpcija  
47. Ako se na po četku testa zamijeti velika eliminacija DOC-a ispitivane kemi ­
kalije, ispitivana kemikalija vjerojatno se eliminira adsorpcijom na biofilm. To je mogu će dokazati odre đivanjem adsorbirane ispitivane kemikalije na 
krutim tvarima oljuštenima iz filma. Nije uobi čajeno da eliminacija DOC-a 
kemikalija koje se mogu adsorbirati ostane visoka tijekom cijelog testa; obično je u po četku visok stupanj opadanja koji postupno pada do neke 
uravnotežene vrijednosti. Me đutim, ako je adsorbirana ispitivana kemikalija 
mogla izazvati aklimatizaciju mikrobne populacije, eliminacija DOC-a ispi ­
tivane kemikalije naknadno bi porasla i postigla visoku vrijednost platoa.
 
Faza prilagodbe („lag” faza)  
48. Kao i u stati čkim testovima probira, za brojne je ispitivane kemikalije 
potrebna faza prilagodbe („lag” faza) prije nego što do đe do potpune bioraz ­
gradnje. U fazi prilagodbe odvija se aklimatizacija (ili prilagodba) kompe ­
tentnih bakterija, pri čemu ispitivana kemikalija gotovo uop će ne opada, a 
potom dolazi do po četnog rasta tih bakterija. Ta faza završava, a proizvoljno 
se smatra da faza razgradnje zapo činje nakon što opadne otprilike 10 % 
početne koli čine ispitivane kemikalije (nakon što se odvoji dovoljno 
vremena za adsorpciju, ako se ona doga đa). Faza prilagodbe često je 
krajnje varijabilna i slabo se može mjerno obnoviti.  
Stacionarna faza (faza platoa)  
49. Stacionarna faza (faza platoa) krivulje eliminacije u neprekidnom testu defi ­
nira se kao faza u kojoj dolazi do maksimalne razgradnje. Ta faza trebala bi trajati najmanje tri tjedna i imati oko 1215 izmjerenih valjanih vrijednosti.
 
Srednji stupanj eliminacije ispitivane kemikalije  
50. Izračunajte srednju vrijednost iz vrijednosti eliminacije D  t (i D  st , ako je 
raspoloživ) ispitivane kemikalije u stacionarnoj fazi. Zaokružite na najbliži cijeli broj (1 %) i dobit ćete stupanj eliminacije ispitivane kemikalije. 
Također se preporu čuje da se izra čuna i 95 % intervala pouzdanosti 
srednje vrijednosti. Na sli čan način izračunajte i srednji stupanj (D
 B ) elimi­
nacije organskog medija u kontrolnoj posudi.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1104
 
Navođenje biorazgradnje  
51. Ako se ispitivana kemikalija ne adsorbira zna čajno na biofilm i ako krivulja 
eliminacije ima tipi čan oblik krivulje biorazgradnje s fazama prilagodbe, 
razgradnje i stacionarnom fazom (stavci 48., 49.), izmjerena eliminacija 
može se sa sigurnoš ću pripisati biorazgradnji. Ako do đe do velikog 
početnog opadanja, simulacijskim testom ne mogu se razlikovati procesi 
biološke i abioti čke eliminacije. U takvom slu čaju, ali i u svim drugim 
slučajevima u kojima postoji bilo kakva dvojba o biorazgradnji (npr. ako 
dođe do ljuštenja), analizirajte adsorbiranu ispitivanu kemikaliju na uzor ­
cima filma ili provedite dodatne stati čne testove (testove pretraživanja na) 
biorazgradnju na temelju parametara koji jasno ozna čuju biološke procese. 
Takvi su testovi metode apsorpcije kisika (poglavlje C.4 ovog Priloga D, E i 
F) (9) ili test kojim se mjeri proizvodnja CO  2 (poglavlje C.4-C ovog Priloga 
ili metoda Headspace) (10); kao inokulum upotrijebite prethodno izloženi biofilm iz odgovaraju ćeg reaktora.
 
52. Ako se izmjere i opadanje DOC-a i opadanje specifi čne kemikalije, znatne 
razlike (prethodna vrijednost niža od potonje) me đu postocima opadanja 
naznačuju prisutnost u izlaznoj vodi intermedijarnih organskih proizvoda 
koji se možda teže razgra đuju; njih bi trebalo ispitati.  
Valjanost rezultata ispitivanja  
53. Test možete smatrati valjanim ako je stupanj eliminacije DOC-a (ili KPK-a) 
u kontrolnim jedinicama > 80 % nakon 2 tjedna rada i ako niste primijetili 
ništa neobi čno. 
54. Ako je ispitivana (referentna) kemikalija koja se lako biorazgra đuje, stupanj 
biorazgradnje treba biti > 90 %, a razlika me đu vrijednostima dvostrukog 
određivanja ne smije biti ve ća od 5 %. Ako nisu ispunjena ta dva uvjeta, 
revidirajte pokusni postupak i/ili dobijte komunalne otpadne vode iz nekog drugog izvora.
 
55. Slično tomu, vrijednosti biorazgradnje iz dvostrukih jedinica (ako se koriste) 
u kojima se pro čišćava ispitivana kemikalija ne bi se smjele razlikovati za 
više od 5 %. Ako nije ispunjen taj kriterij, ali je opadanje veliko, nastavite 
provoditi analizu još tri tjedna. Ako je opadanje nisko, istražite inhibitorni učinak ispitivane kemikalije, ako on ve ć nije poznat, pa ponovite test na 
nižoj koncentraciji ispitivane kemikalije, ako je to izvedivo.
 
Izvješće o ispitivanju  
56. Izvješ će o ispitivanju mora obuhva ćati sljedeće: 
Ispitivana kemikalija:  
— podaci za identifikaciju;  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva.  
Uvjeti ispitivanja:  
— sve izmjene sustava ispitivanja, posebno ako se ispituju netopljive ili 
hlapljive tvari;  
— vrsta organskog medija;  
— udio i narav industrijskih otpadnih voda u otpadnim vodama, ako se 
koriste i ako je poznato;  
— metoda inokulacije;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1105
 
— sadržaj DOC-a (otopljenog organskog ugljika) i TOC-a (ukupnog organ ­
skog ugljika) radne otopine ispitivane kemikalije; na čin njezine 
pripreme, ako je rije č o suspenziji; korištena ispitna koncentracija/kon ­
centracije, obrazloženje ako je vanjski raspon DOC-a 1020 mg/l; metoda dodvanja; datum prvog dodavanja; sve promjene koncentracije;
 
— srednje vrijeme hidrauli čkog zadržavanja (bez rasta); brzina okretanja 
cijevi; približni kut nagnutosti, ako je mogu će; 
— pojedinosti o ljuštenju; vrijeme i intenzitet;  
— ispitna temperatura i raspon;  
— primijenjene analiti čke tehnike.  
Rezultati ispitivanja:  
— svi izmjereni podaci DOC, KPK, specifi čne analize, pH, temperatura, N 
kemikalije, ako je relevantno,  
— svi izra čunati podaci D  t (ili D  tc ), D  B , D s dobivene u tabli čnom obliku i 
krivuljama eliminacije,  
— podaci o fazi prilagodbe („lag” fazi) i stacionarnoj fazi (fazi platoa), 
trajanju testa, stupnju eliminacije ispitivane kemikalije, referentne kemi ­
kalije (ako je ispitivana) i organskog medija (u kontrolnoj jedinici), 
zajedno sa statisti čkim podacima i izjavama o biorazgradivosti i valja ­
nosti testa,  
— rasprava o rezultatima.  
LITERATURA  
1. Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758.  
2. Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.  
3. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214-220.  
4. Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
5. Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling 
filter. JAOCS 43: 92-94.  
6. Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
7. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
8. Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of 
chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
9. Poglavlje C.4 ovog Priloga, Odre đivanje „lake” biorazgradivosti A-F.  
10. ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1106
 
Dodatak 8.  
Slika 1.  
Rotirajuće cijevi
  
Pojmovnik:  
Pogled sprijeda  
Pogled A  
Pogled B  
Pogonjeni kota či 
Kotači s praznim hodom  
Pogonski motor  
Mjenjač brzina  
Unutarnja prirubnica  
Mehanizam naginjanja  
Pogonski stožasti zup čanik ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1107
 
Slika 2.  
Dijagram toka
  
A: Spremnik za ulijevanje  
B: Peristalti čka crpka  
C: Rotiraju ća cijev  
D: Posuda za skupljanje izlazne vode  
DEFINICIJE:  
a. Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom Ispitnom metodom.  
b. Kemikalije: „Treba napomenuti da se pojam ‚kemikalija’ koristi u širokom smislu rije či u smislu 
sporazuma UNCED-a (Konferencije Ujedinjenih naroda o okolišu i razvoju) i naknadnih dokume ­
nata te obuhva ća tvari, proizvode, smjese, pripravke ili sve druge pojmove koji se možda koriste u 
postojećim sustavima za ozna čavanje podru čja valjanosti”.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1108
 
C.11.  BIORAZGRADNJA  
TEST INHIBICIJE DISANJA AKTIVNOG MULJA  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Opisanom metodom ocjenjuje se u činak ispitivane tvari na mikroor ­
ganizme mjerenjem stope disanja u definiranim uvjetima u prisut ­
nosti razli čitih koncentracija ispitivane tvari.  
Svrha ove metode je osigurati brzu orijentacijsku metodu kojom se 
mogu utvrditi tvari koje mogu imati štetni u činak na postrojenja za 
pročišćavanje s aerobnim mikroorganizmima te navesti prikladne 
neinhibitorne koncentracije ispitivanih tvari koje se mogu koristiti 
u ispitivanjima biorazgradivosti.  
Prije glavnog ispitivanja može se provesti ispitivanje za odre đivanje 
raspona. Ono pruža informacije o rasponu koncentracija koje će se 
koristiti u glavnom ispitivanju.  
Planom ispitivanja predvi đene su dvije kontrole bez ispitivane tvari, 
jedna na po četku i jedna na kraju ispitnog niza. Osim toga, svaku 
šaržu aktivnog mulja treba provjeriti uz pomo ć referentne tvari.  
Ovu je metodu najlakše primijeniti na tvari kod kojih se na temelju 
topljivosti u vodi i niske hlapljivosti može o čekivati da će ostati u 
vodi.  
Kod tvari ograni čene topljivosti u ispitnom mediju nije uvijek 
moguće odrediti EC  50 . 
Ako je ispitivana tvar sklona rasprezanju oksidativne fosforilacije, iz 
rezultata na temelju potrošnje kisika mogu se izvesti pogrešni 
zaključci. 
Korisne informacije za provedbu ispitivanja:  
— topljivost u vodi,  
— tlak pare,  
— strukturna formula,  
— čistoća ispitivane tvari.  
Preporuka  
Aktivni mulj može sadržavati potencijalno patogene organizme i 
stoga njime treba pažljivo rukovati.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Stopa disanja je potrošnja kisika mikroorganizama otpadnih voda u 
aerobnom mulju, koja se op ćenito izražava u mg O  2 po mg mulja na 
sat. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1109
 
Kod izračunavanja inhibitornog u činka ispitivane tvari pri odre đenoj 
koncentraciji stopa disanja se iskazuje kao postotak srednje vrijed ­
nosti dviju kontrolnih stopa disanja:  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ % inhibicije  
gdje je:  
R s = stopa potrošnje kisika u ispitanoj koncentraciji ispitivane tvari  
R 1 = stopa potrošnje kisika, kontrola 1  
R 2 = stopa potrošnje kisika, kontrola 2.  
EC 50 kod ove metode je koncentracija ispitivane tvari pri kojoj stopa 
disanja iznosi 50 % stope disanja zabilježene u kontroli u uvjetima koji su opisani u ovoj metodi.
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Preporučuje se da se kao referentna tvar koristi 3,5-diklorfenol, kao 
poznati inhibitor disanja, te da se njime ispita EC  50 svake šarže 
aktivnog mulja kako bi se isklju čila neuobi čajena osjetljivost mulja.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Stopa disanja aktivnog mulja koji se hrani standardnom koli činom 
sintetičke otpadne vode mjeri se nakon vremena kontakta od 30 
minuta ili tri sata ili oboje. Osim toga, mjeri se stopa disanja tog istog aktivnog mulja u prisutnosti razli čitih koncentracija ispitivane 
tvari u ina če istovjetnim uvjetima. Inhibitorni u činak ispitivane tvari 
u određenoj koncentraciji izražava se kao postotak srednjih stopa 
disanja dviju kontrola. Vrijednost EC
 50 izračunava se na temelju 
određivanja pri razli čitim koncentracijama.  
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Rezultati ispitivanja su valjani ako:  
— se dvije kontrolne stope disanja ne razlikuju za više od 15 %,  
— se EC  50 (30 minuta i/ili tri sata) 3,5-diklorfenola nalazi u prih ­
vaćenom podru čju od 5 do 30 mg/l.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Reagensi  
1.6.1.1. O t o p i n e i s p i t i v a n e t v a r i  
Otopine ispitivane tvari treba svježe pripremiti na po četku istraži ­
vanja uz pomo ć radne otopine. Ako se slijedi preporu čeni postupak u 
nastavku, prikladna je koncentracija radne otopine od 0,5 g/l.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1110
 
1.6.1.2. O t o p i n a k o n t r o l n e t v a r i  
Otopina 5,5-diklorfenola može se pripremiti npr. na na čin da se 0,5 g 
3,5-diklorfenola otopi u 10 ml 1M NaOH, razrijedi destiliranom vodom na približno 30 ml i uz miješanje dodaje 0,5M H
 2 SO 4 do 
točke početka taloženja – potrebno je približno 8 ml 0,5M H  2 SO 4 – i 
na kraju dobivena smjesa razrijedi destiliranom vodom do jedne litre. pH bi tada trebao biti u podru čju između 7 i 8.
 
1.6.1.3. S i n t e t i č k a o t p a d n a v o d a  
Sintetička otpadna voda priprema se otapanjem sljede ćih količina 
tvari u jednoj litri vode:  
— 16 g peptona,  
— 11 g mesnog ekstrakta,  
— 3 g uree,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Napomena 1.:  Ova sinteti čka otpadna voda predstavlja 100-struki 
koncentrat vode opisane u tehni čkom izvješ ću OECD „Predložena 
metoda za odre đivanje biorazgradivosti surfaktanata koji se koriste u 
sintetičkim deterdžentima” (11. lipnja 1976.) s dodatkom dikalijevog 
hidrogenfosfata.  
Napomena 2.:  Ako se pripremljeni medij ne upotrijebi odmah, treba 
ga čuvati u mraku na 0 do 4 °C do najviše jednog tjedna u uvjetima 
koji neće izazvati promjenu njegovog sastava. Medij se prije skla ­
dištenja može sterilizirati, ili se pepton i mesni ekstrakt mogu dodati neposredno prije ispitivanja. Prije uporabe ga treba temeljito promi ­
ješati i podesiti pH.
 
1.6.2.  Aparatura  
Mjerna aparatura: to čan oblik aparature nije od presudnog zna čaja. 
Ipak, posuda ne smije biti puna i sonda mora to čno pristajati u vrat 
odmjerne tikvice.  
Potrebna je uobi čajena laboratorijska oprema, a posebno:  
— mjerna aparatura,  
— uređaj za dozra čivanje,  
— pH elektroda i mjerna oprema,  
— elektroda O  2 . 
1.6.3.  Priprema inokuluma  
Kao mikrobni inokulum za ispitivanje koristi se aktivni mulj iz 
postrojenja za pro čišćavanje koje pretežito pro čišćava komunalni 
mulj.  
Prema potrebi se grube čestice mogu ukloniti u laboratoriju kratkim 
taloženjem, npr. 15 minuta, i pretakanjem gornjeg sloja koji sadrži 
finije čestice za uporabu. Kao druga mogu ćnost, mulj se može kratko 
promiješati pomo ću mješalice (nekoliko sekundi).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1111
 
Osim toga, ako se sumnja da je prisutan inhibitorni materijal, mulj 
treba oprati vodom iz slavine ili izotoni čnom otopinom. Supernatant 
se nakon centrifugiranja preto či (ovaj se postupak ponavlja tri puta).  
Izvaže se mala koli čina mulja i osuši. Iz rezultata se može izra čunati 
količina mokrog mulja koju treba suspendirati u vodi da se dobije 
aktivni mulj sa sadržajem suspendirane krute tvari u miješanoj 
suspenziji u podru čju između 2 i 4 g/l. Na taj se na čin, ako se 
slijedi preporu čeni postupak u nastavku, dobije koncentracija 
između 0,8 i 1,6 g/l u ispitnom mediju.  
Ako se mulj ne može upotrijebiti istog dana, na svaku litru aktivnog 
mulja pripremljenog na gore opisani na čin treba dodati 50 ml sinte ­
tičke otpadne vode i dozra čivati preko no ći na 20 ± 2 °C. Mulj se 
nastavlja dozra čivati za uporabu tijekom dana. Prije uporabe se 
provjeri pH i prema potrebi podesi na pH od 6 do 8. Suspendirana kruta tvar u miješanoj suspenziji odre đuje se na na čin kako je 
opisano u prethodnom stavku.
 
Ako se ista šarža mulja mora koristiti i sljede ćih dana (najviše četiri 
dana), na kraju svakog radnog dana doda se još 50 ml sinteti čke 
otpadne vode po litri mulja.  
1.6.4.  Provo đenje ispitivanja  
Trajanje/vrijeme kontakta:  30 minuta i/ili tri sata, tijekom kojih se 
provodi dozra čivanje  
Voda:  voda za pi će (prema potrebi deklori ­
rana)  
Dovod zraka:  čisti zrak bez ulja, protok zraka 0,5 do 
1 l/min  
Mjerna aparatura:  tikvica s ravnim dnom, potput tikvice 
BPK  
Mjerač kisika:  prikadna kisikova elektroda s rekor ­
derom  
Hranjiva otopina:  sinteti čka otpadna voda (vidjeti gore)  
Ispitivana tvar:  ispitna otopina se svježe pripremi na 
početku ispitivanja  
Referentna tvar:  npr. 3,5-diklorfenol (najmanje tri 
koncentracije)  
Kontrole:  inokulirani uzorak bez ispitivane tvari  
Temperatura:  20 ± 2 °C  
U nastavku je opisan predloženi pokusni postupak za vrijeme 
kontakta od 3 sata, koji se može primijeniti kako na ispitivanu tako i na referentnu tvar.
 
Koristi se nekoliko posuda (npr. laboratorijske čaše od jedne litre).  
Treba koristiti najmanje pet koncentracija koje se razlikuju za stalni 
faktor, po mogu ćnosti ne viši od 3,2.  
U vremenu „0” se 16 ml sinteti čke otpadne vode nadopuni vodom 
do 300 ml. Doda se 200 ml mikrobnog inokuluma i čitava smjesa 
(500 ml) ulije u prvu posudu (prvi kontrolni uzorak C  1 ). ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1112
 
Ispitne posude treba neprekidno dozra čivati tako da otopljeni O  2 ne 
padne ispod 2,5 mg/l i da koncentracija O  2 neposredno prije 
mjerenja stope disanja bude oko 6,5 mg/l.  
Gornji se postupak ponovi u vremenu „15 minuta” (15 minuta je 
proizvoljan, ali prakti čan interval), ali se pritom u 16 ml sinteti čke 
otpadne vode prvo doda 100 ml radne otopine ispitivane tvari i zatim 
nadopuni vodom do 300 ml i doda mikrobni inokulum da se dobije volumen od 500 ml. Ova se smjesa zatim ulije u drugu posudu i dozračuje kako je opisano gore. Ovaj se postupak ponavlja svakih 15 
minuta s razli čitim volumenima radne otopine ispitivane tvari da se 
dobije niz posuda koje sadrže razli čite koncentracije ispitivane tvari. 
Na kraju se pripremi drugi kontrolni uzorak (C
 2 ). 
Nakon tri sata zabilježi se pH i dobro promiješani uzorak sadržaja 
prve posude ulije se u mjernu aparaturu te se mjeri stopa disanja u 
trajanju do 10 minuta.  
Ovo se odre đivanje ponavlja na sadržaju svake posude u razmacima 
od 15 minuta na na čin da vrijeme kontakta u svakoj posudi bude tri 
sata. 
Ispitivanje s referentnom tvari provodi se na isti na čin na svakoj 
šarži mikrobnog inokuluma.  
Ako se mjerenja provode nakon 30-minutnog kontakta, treba primi ­
jeniti druk čiji režim (npr. više mjera ča kisika).  
Ako je potrebno mjerenje kemijske potrošnje kisika, pripreme se 
dodatne posude s ispitivanom tvari, sinteti čkom otpadnom vodom i 
vodom, ali bez aktivnog mulja. Potrošnja kisika mjeri se i bilježi nakon vremena dozra čivanja od 30 minuta i/ili tri sata (vrijeme 
kontakta).
 
2. PODACI I OCJENJIVANJE  
Stopa disanja izra čunava se iz zapisa rekordera izme đu približno 
6,5 mg O  2 /l i 2,5 mg O  2 /l ili tijekom 10-minutnog razdoblja, ako 
je stopa disanja niska. Dio krivulje disanja u kojemu se mjeri stopa disanja trebao bi biti linearan.
 
Ako je razlika izme đu stopa disanja dviju kontrola viša od 15 %, ili 
ako EC  50 (30 minuta i/ili tri sata) referentne tvari nije unutar prih ­
vaćenog podru čja (od 5 do 30 mg/l za 3,5- diklorfenol), ispitivanje 
nije valjano i treba ga ponoviti.  
Postotak inhibicije izra čunava se za svaku ispitnu koncentraciju 
(vidjeti 1.2.). Postotak inhibicije treba grafi čki prikazati u ovisnosti 
o koncentraciji na obi čnom logaritamskom papiru (ili logaritamskom 
papiru vjerojatnosti) i odrediti EC  50 . 
Granice pouzdanosti 95 % za vrijednosti EC  50 mogu se odrediti 
standardnim postupcima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1113
 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će: 
— ispitivana tvar: podaci za identifikaciju kemikalije,  
— ispitni sustav: izvor, koncentracija i prethodna obrada aktivnog 
mulja,  
— ispitni uvjeti:  
— pH reakcijske smjese prije mjerenja disanja,  
— ispitna temperatura,  
— trajanje ispitivanja,  
— referentna tvar i njezin izmjereni EC  50 , 
— abioti čka potrošnja kisika (ako je prisutna),  
— rezultati:  
— svi mjerni podaci,  
— krivulja inhibicije i metoda izra čuna EC  50 , 
— EC  50 i, po mogu ćnosti, EC  20 i EC  80 s granicama pouzdanosti 
95 %,  
— sva zapažanja i mogu ća odstupanja od ispitne metode koja su 
mogla utjecati na rezultat.  
3.2. TUMA ČENJE PODATAKA  
Vrijednost EC  50 treba gledati samo kao pokazatelj koji ukazuje na 
vjerojatnu toksi čnost ispitivane tvari za aktivni mulj u postupku 
pročišćavanja otpadnih voda ili za mikroorganizme otpadnih voda, 
budući da se složene interakcije koje se odvijaju u okolišu ne mogu 
točno simulirati u laboratorijskom ispitivanju. Osim toga, tvari koje 
imaju inhibitorni u činak na oksidaciju amonijaka mogu dati atipi čne 
krivulje inhibicije. Stoga te krivulje treba tuma čiti s oprezom.  
4. REFERENCE:  
(1) International Standard ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11,1977, str. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, 
str. 245.  
(4) ETAD (Ecological and Tox.icological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also 
described by:  
(5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, str. 80.  
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6,1977, str. 247.  
(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the 
Council C(84) 30 final.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1114
 
C.12.  BIORAZGRADNJA  
IZMIJENJENI TEST SCAS  
1. METODA  
1.1. UVOD  
Svrha metode je ocijeniti potencijalnu potpunu biorazgradivost vodo ­
topljivih nehlapljivih organskih tvari kod izlaganja relativno visokim 
koncentracijama mikroorganizama tijekom dužeg vremenskog 
razdoblja. Mikroorganizmi se u tom razdoblju održavaju na životu svakodnevnim dodavanjem istaložene otpadne vode kao hranjive otopine. (Preko vikenda se otpadna voda može čuvati na 4 °C. 
Kao druga mogu ćnost, može se koristiti sinteti čka otpadna voda iz 
potvrdnog testa OECD.)
 
Kod tuma čenja rezultata treba uzeti u obzir mogu ću 
fizikalno-kemijsku adsorpciju na suspendiranu krutu tvar 
(vidjeti 3.2.).  
Zbog dugog vremena zadržavanja teku će faze (36 sati) i periodi čnog 
dodavanja nutrijenata ispitivanje ne oponaša uvjete koji vladaju u 
postrojenju za pro čišćavanje otpadnih voda. Rezultati dobiveni s 
različitim ispitivanim tvarima ukazuju na to da test ima visok poten ­
cijal biorazgradnje.  
Uvjeti ispitivanja su izrazito povoljni za selekciju i/ili prilagodbu 
mikroorganizama koji imaju sposobnost razgradnje ispitivanog 
spoja. (Postupak se može koristiti i za dobivanje aklimatiziranih inokuluma za druga ispitivanja.)
 
U ovoj se metodi mjera koncentracije otopljenog organskog ugljika 
koristi za ocjenjivanje potpune biorazgradivosti ispitivane tvari. DOC je najbolje odrediti nakon zakiseljavanja i pro čišćavanja, a ne kao 
razliku C
 ukupni  – C  anorganski  . 
Istovremenom primjenom specifi čne analiti čke metode mogu će je 
ocijeniti i primarnu biorazgradnju tvari (nestajanje polazne kemijske strukture).
 
Metoda se primjenjuje samo na one organske ispitivane tvari koje su 
u koncentraciji koja se koristi u ispitivanju:  
— topljive u vodi (najmanje 20 mg otopljenog organskog ugljika/l),  
— imaju zanemariv tlak pare,  
— nemaju inhibitorni u činak na bakterije,  
— ne adsorbiraju se u zna čajnoj mjeri unutar ispitnog sustava,  
— ne gube se iz ispitne otopine pjenjenjem.  
Mora biti poznat sadržaj organskog ugljika ispitivanog materijala.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1115
 
Kod tuma čenja dobivenih rezultata korisno je imati informacije o 
relativnim udjelima glavnih komponenti ispitivanog materijala, 
posebno ako su dobivene vrijednosti niske ili grani čne. 
Informacije o toksi čnosti tvari za mikroorganizme korisne su za 
tumačenje niskih vrijednosti i odabir odgovaraju će ispitne 
koncentracije.  
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
C T = koncentracija ispitivanog spoja kao organski ugljik koji je 
prisutan u istaloženoj otpadnoj vodi ili dodan na po četku 
razdoblja dozra čivanja (mg/l),  
C t = koncentracija otopljenog organskog ugljika u supernatantu 
ispitne jedinice na kraju razdoblja dozra čivanja (mg/l),  
C c = koncentracija otopljenog organskog ugljika u supernatantu 
kontrolne jedinice na kraju razdoblja dozra čivanja (mg/l).  
U ovoj se metodi biorazgradnja definira kao nestajanje organskog 
ugljika. Biorazgradnja se može izraziti kao:  
1. Postotak opadanja (D  da ) količine tvari koja se dnevno dodaje:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C t Ü 100 [1]  
gdje je:  
D da = razgradnja/dnevno dodavanje.  
2. Postotak opadanja (D  ssd ) količine tvari koja je prisutna na po četku 
svakog dana:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2 (a)] 
Ô 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2 (b)]  
gdje je  
D ssd = razgradnja/tvar na po četku dana  
Indeksi i i (i + 1) odnose se na dan mjerenja.  
Jednadžba 2(a) preporu čuje se ako se DOC izlazne otpadne vode 
mijenja iz dana u dan, dok se jednadžba 2(b) može koristiti kad 
DOC izlazne otpadne vode iz dana u dan ostaje relativno stalan.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1116
 
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari mogu biti korisne kod ispitivanja novih tvari; ipak, 
ovdje se ne preporu čuje određena referentna tvar.  
Navedeni su podaci za nekoliko spojeva koji su ocijenjeni u prste ­
nastim testovima (vidjeti Dodatak 1.); oni su prvenstveno predvi đeni 
za povremeno baždarenje metode te za usporedbu rezultata kod primjene neke druge metode.
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Aktivni mulj iz postrojenja za pro čišćavanje otpadnih voda stavi se u 
jedinicu aktivnog mulja s polukontinuiranim režimom (Semi-Conti ­
nuous Activated Sludge unit, SCAS). Doda se ispitivani spoj i ista ­
ložena komunalna otpadna voda i smjesa dozra čuje 23 sata. Dozra ­ 
čivanje se zatim prekida, pusti se da se mulj istaloži i ukloni 
supernatant.  
Mulj koji preostane u komori za dozra čivanje se zatim pomiješa s još 
jednim alikvotom ispitivanog spoja i otpadnom vodom i ciklus 
ponovi.  
Biorazgradnja se utvr đuje određivanjem sadržaja otopljenog organ ­
skog ugljika u supernatantu. Ova se vrijednost uspore đuje s vrijed ­
nošću supernatanta iz kontrolne epruvete koja sadrži samo istaloženu 
otpadnu vodu.  
U slučaju primjene specifi čne analiti čke metode mogu se izmjeriti 
promjene koncentracije polazne molekule uslijed biorazgradnje (pri ­
marna biorazgradivost).  
1.5. KRITERIJI KAKVO ĆE 
Obnovljivost ove metode, koja se temelji na opadanju otopljenog 
organskog ugljika, još nije utvr đena. (Ako se uzme u obzir primarna 
biorazgradnja, dobivaju se vrlo precizni podaci za tvari koje se opsežno razgra đuju.)
 
Osjetljivost metode u velikoj je mjeri ovisna o varijabilnosti slijepe 
probe te, u manjoj mjeri, o preciznosti odre đivanja otopljenog organ ­
skog ugljika i koncentraciji ispitivanog spoja u suspenziji na po četku 
svakog ciklusa.  
1.6. OPIS ISPITNOG POSTUPKA  
1.6.1.  Priprema  
Uzme se dovoljan broj čistih jedinica za dozra čivanje (može se kori ­
stiti i izvorna ispitna jedinica SCAS od 1,5 litara) i postave cijevi za 
dovod zraka (Slika 1.) za svaku ispitivanu tvar i kontrole. Kompri ­
mirani zrak koji se dovodi u ispitne jedinice pro čišćava se kroz 
pamučni filtar; on ne smije sadržavati organski ugljik i treba ga 
prethodno zasititi vodom kako bi se smanjili gubici uslijed 
isparavanja.  
Uzorak miješane suspenzije, koja sadrži od 1 do 4 g suspendirane 
krute tvari po litri, dobiva se iz postrojenja s aktivnim muljem u 
kojemu se pretežito pro čišćava komunalna otpadna voda. Potrebno je 
približno 150 ml suspenzije po jedinici za dozra čivanje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1117
 
Pripreme se radne otopine ispitivane tvari u destiliranoj vodi; u 
pravilu je potrebna koncentracija od 400 mg organskog ugljika po 
litri, čime se dobiva koncentracija ispitivanog spoja od 20 mg ugljika 
po litri na po četku svakog ciklusa dozra čivanja, ako ne dolazi do 
biorazgradnje.  
Ako to dopušta toksi čnost za mikroorganizme, dozvoljene su i više 
koncentracije.  
Izmjeri se sadržaj organskog ugljika radnih otopina.  
1.6.2.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje se provodi na 20 do 25 °C.  
Koristi se visoka koncentracija aerobnih mikroorganizama (od 1 do 
4 g/l suspendirane krute tvari), a efektivno razdoblje zadržavanja 
iznosi 36 sati. Uglji čni materijal u otpadnoj vodi koja se koristi 
kao hranjivi medij se obilato oksidira, u pravilu tijekom osam sati nakon po četka svakog ciklusa dozra čivanja. Nakon toga mulj endo ­
geno diše do kraja razdoblja dozra čivanja, u kom je vremenu ispiti ­
vana tvar jedini raspoloživi supstrat, ako se i ona sama brzo ne 
razgradi. Ove zna čajke, uz svakodnevno ponovno inokuliranje kada 
se kao hranjivi medij koristi komunalna otpadna voda, osiguravaju izrazito povoljne uvjete za aklimatizaciju i visok stupanj 
biorazgradnje.
 
1.6.3.  Provo đenje ispitivanja  
Iz prikladnog postrojenja s aktivnim muljem koje pretežito pro či­ 
šćava komunalne otpadne vode ili laboratorijske jedinice uzme se 
uzorak miješane suspenzije i održava aerobnim do uporabe u labo ­
ratoriju. Sve jedinice za dozra čivanje i kontrolna jedinica napune se 
sa 150 ml miješane suspenzije (ako se koristi izvorna ispitna jedinica SCAS ove koli čine treba pomnožiti s 10) i zapo čne s dozra čivanjem. 
Nakon 23 sata dozra čivanje se prekida i pusti da se mulj istaloži u 
vremenu od 45 minuta. Zatim se otvori slavina i iz svake posude 
ispusti po 100 ml supernatanta. Uzme se svježi uzorak istaložene komunalne otpadne vode neposredno prije uporabe i 100 ml doda u preostali mulj svake jedinice za dozra čivanje. Zatim se ponovno 
započne s dozra čivanjem. U ovoj se fazi ne dodaje ispitivani mate ­
rijal i jedinice se svakodnevno pune isklju čivo komunalnom 
otpadnom vodom dok se nakon taloženja ne dobije bistri supernatant. Za ovo su obi čno potrebna dva tjedna, do kada se otopljeni organski 
ugljik u supernatantu na kraju svakog ciklusa dozra čivanja približi 
stalnoj vrijednosti.
 
Na kraju tog razdoblja se pojedina čni istaloženi muljevi pomiješaju i 
u svaku jedinicu doda 50 ml dobivenog složenog mulja.  
U kontrolne se jedinice doda 95 ml istaložene otpadne vode i 5 ml 
vode, a u ispitne jedinice 95 ml istaložene otpadne vode i 5 ml 
odgovaraju će radne otopine ispitivanog spoja (400 mg/l). Ponovno 
se započne s dozra čivanjem i dozra čuje 23 sata. Zatim se pusti da se 
mulj istaloži 45 minuta, nakon čega se ispusti supernatant i analizira 
na sadržaj otopljenog organskog ugljika.  
Gornji postupak punjenja i pražnjenja ponavlja se svakodnevno za 
vrijeme cjelokupnog trajanja ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1118
 
Prije taloženja se prema potrebi o čiste stijenke jedinica kako bi se 
spriječilo nakupljanje krute tvari iznad razine teku ćine. Kako ne bi 
došlo do unakrsne kontaminacije, za svaku jedinicu treba koristiti zasebni struga č ili četkicu.
 
U idealnom se slu čaju otopljeni organski ugljik u supernatantu odre ­ 
đuje svakodnevno, ali dopuštene su i manje u čestale analize. Suspen ­
zije se prije analize filtriraju kroz oprane membranske filtre 0,45 μm 
ili centrifugiraju. Membranski filtri su prikladni pod uvjetom da ne otpuštaju ugljik i ne apsorbiraju tvar tijekom filtracije. Temperatura uzorka u centrifugi ne smije biti viša od 40 °C.
 
Trajanje ispitivanja kod spojeva koji se slabo biološki razgra đuju ili 
se ne razgra đuju nije odre đeno, ali iskustvo pokazuje da bi ispiti ­
vanje općenito trebalo trajati najmanje 12 tjedana, ali ne duže od 26 
tjedana.  
2. PODACI I OCJENJIVANJE  
Izradi se grafi čki prikaz vrijednosti otopljenog organskog ugljika u 
supernatantu ispitnih i kontrolnih jedinica u ovisnosti vremenu.  
Kad se ostvari biorazgradnja, vrijednosti ispitnih jedinica približit će 
se kontrolnim vrijednostima. Kad razlika izme đu ispitnih i kontrolnih 
vrijednosti ostane na stalnoj razini u tri uzastopna mjerenja, provede 
se još toliko mjerenja koliko je potrebno za statisti čku obradu poda ­
taka i izra čuna postotak biorazgradnje ispitivanog spoja (D  da ili D  ssd , 
vidjeti 1.2.).  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju po mogu ćnosti sadrži sljede će: 
— sve informacije o vrsti otpadne vode, vrsti jedinica koje se 
koriste i rezultatima pokusa za ispitivanu tvar, referentnu tvar (ako se koristi) i slijepu probu,
 
— temperaturu,  
— krivulju opadanja s opisom, na čin izračuna (vidjeti 1.2.),  
— datum i mjesto uzorkovanja aktivnog mulja i otpadne vode, 
stanje prilagodbe, koncentraciju itd.,  
— znanstvene razloge mogu ćih izmjena ispitnog postupka,  
— potpis i datum.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1119
 
3.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Budući da tvari koje se ispituju ovom metodom nisu lako bioraz ­
gradive, svako opadanje DOC-a koje se isklju čivo može pripisati 
biorazgradnji u pravilu će se odvijati postupno tijekom više dana 
ili tjedana, osim ako aklimatizacija nastupi iznenada, što se o čituje 
naglim nestankom DOC-a nakon nekoliko tjedana.  
Međutim, ponekad važnu ulogu može imati i fizikalno-kemijska 
adsorpcija, na što ukazuje potpuno ili djelomi čno nestajanje 
dodanog DOC-a na samom po četku. Daljnji slijed ovisi o čimbeni­
cima kao što su stupanj adsorpcije i koncentracija suspendirane krute tvari u izva đenoj suspenziji. Razlika izme đu koncentracije DOC-a u 
kontrolnom i ispitnom supernatantu obi čno se nakon niske po četne 
vrijednosti postupno pove ćava i zatim ostaje na stalnoj razini do 
kraja pokusa, osim ako nastupi aklimatizacija.
 
Ako je potrebno razlikovati biorazgradnju (ili djelomi čnu biorazgra ­
dnju) od adsorpcije, treba provesti dodatna ispitivanja. To se može učiniti na više na čina, ali najpouzdaniji na čin je provesti ispitivanje 
osnovne razine koriste ći supernatant ili mulj kao inokulum (po 
mogućnosti respirometrijski test).
 
Ispitivane tvari koje u ovom testu pokazuju zna čajno opadanje 
DOC-a koje nije uvjetovano adsorpcijom mogu se smatrati potenci ­
jalno biorazgradivima. Djelomi čno neadsorptivno opadanje ukazuje 
na to da je kemikalija barem donekle podložna biorazgradnji.  
Malo opadanje ili nepromijenjena razina DOC-a može biti posljedica 
inhibitornog u činka ispitivane tvari na mikroorganizme, što se 
također može o čitovati razlaganjem i gubitkom mulja i zamu ćenjem 
supernatanta. Ispitivanje treba ponoviti s nižom koncentracijom ispi ­
tivane tvari.  
Primjenom specifi čne analiti čke metode ili  14 C obilježene ispitivane 
tvari može se pove ćati osjetljivost. U slu čaju 14 C obilježenog spoja, 
pojava biorazgradnje može se potvrditi izdvajanjem  14 CO 2 . 
Ako se rezultati navode i kao primarna biorazgradnja, treba po 
mogućnosti objasniti promjenu kemijske strukture zbog koje izostaje 
odgovor polazne ispitivane tvari.  
Potrebno je navesti validaciju analiti čke metode zajedno s odgo ­
vorom medija slijepe probe.  
4. REFERENCE  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1120
 
Dodatak 1.  
Test SCAS: primjer rezultata  
Tvar  C T 
(mg/l)  C t - C c 
(mg/l)  Postotak 
biorazgradnje 
D da Trajanje 
ispitivanja 
(dani)  
4-acetil aminobenzen sulfonat  17,2  2,0  85  40  
Tetrapropilen benzen sulfonat  17,3  8,4  51,4  40  
4-nitrofenol  16,9  0,8  95,3  40  
Dietilen glikol  16,5  0,2  98,8  40  
Anilin  16,9  1,7  95,9  40  
Ciklopentan tetrakarboksilat  17,9  3,2  81,1  120  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1121
 
Dodatak 2.  
Primjer ispitne aparature  
Slika 1.
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1122
 
C.13  BIOKONCENTRACIJA: TEST S RIBAMA U PROTO ČNOM 
POSTUPKU  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja biokoncentracije odgovara smjernici OECD 
TG 305 (1996.).  
1.1. UVOD  
U ovoj je metodi opisan postupak pomo ću kojega se može opisati 
biokoncentracijski potencijal tvari u ribama u proto čnim uvjetima. 
Iako se proto čnom ispitnom režimu uvelike daje prednost, dopušteni 
su i polustati čki režimi, pod uvjetom da su zadovoljeni kriteriji 
valjanosti.  
Metoda pruža dovoljno detalja za provedbu ispitivanja, ali istodobno 
ostavlja dovoljno slobode za prilago đavanje plana pokusa uvjetima 
pojedinih laboratorija i variranje svojstava ispitivane tvari. Metodu je najprimjerenije koristiti kod stabilnih organskih kemikalija s vrijed ­
nostima log P
 ow između 1,5 i 6,0 (1), ali može se primijeniti i na 
superlipofilne tvari (s log P  ow > 6,0). Prethodna procjena faktora 
biokoncentracije (BCF), koja se ponekad ozna čuje kao K  B , će kod 
takvih superlipofilnih tvari vjerojatno biti viša od o čekivane vrijed ­
nosti faktora biokoncentracije stabilnog stanja (BCF  SS ) iz laboratorij ­
skih pokusa. Prethodne procjene faktora biokoncentracije za organske kemikalije s vrijednostima log P
 ow do oko 9,0 mogu se 
dobiti pomo ću jednadžbe Bintein i sur. (2). Parametri zna čajni za 
biokoncentracijski potencijal su konstanta brzine apsorpcije (k  1 ), 
konstanta brzine izlu čivanja (k  2 ) i BCF  ss . 
Radioaktivno obilježene ispitivane tvari mogu olakšati analizu 
uzoraka vode i ribljih uzoraka te pomo ći u definiranju potrebe za 
identifikacijom i kvantifikacijom proizvoda razgradnje. Ako se mjere ukupni radioaktivni ostaci (npr. izgaranjem ili otapanjem tkiva), BCF se temelji na polaznom spoju, zadržanim metabolitima i asimiliranom 
ugljiku. Vrijednosti BCF na temelju ukupnih radioaktivnih ostataka 
stoga ne moraju biti izravno usporedive s BCF-om dobivenim speci ­
fičnom kemijskom analizom samog polaznog spoja.
 
U istraživanjima s radioaktivno obilježenim tvarima se za odre đi­
vanje BCF-a na temelju polaznog spoja mogu primijeniti postupci pročišćavanja, a prema potrebi se mogu opisati i glavni metaboliti. 
Analizom i identifikacijom ostataka u tkivima mogu se kombinirati 
istraživanja biokoncentracije s istraživanjima ribljeg metabolizma.
 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Biokoncentracija/bioakumulacija je pove ćanje koncentracije ispiti ­
vane tvari u ili na organizmu (navedenim tkivima) s pove ćanjem 
koncentracije ispitivane tvari u okolnom mediju.  
Faktor biokoncentracije (BCF ili K  B ) u bilo kom trenutku u fazi 
apsorpcije ovog akumulacijskog testa je koncentracija ispitivane tvari u/na ribi odnosno njezinim navedenim tkivima (C
 f kao μg/g 
(ppm)) podijeljena koncentracijom kemikalije u okolnom mediju (C  w 
kao μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1123
 
Faktor biokoncentracije stabilnog stanja (BCF  ss ili K  B ) ne mijenja se 
značajno u dužem vremenskom razdoblju, a koncentracija ispitivane 
tvari u okolnom mediju za to vrijeme ostaje stalna.  
Na grafičkom prikazu ispitivane tvari u ribi (C  f ) u ovisnosti o 
vremenu smatra se da je plato odnosno stabilno stanje postignuto 
kad krivulja postane paralelna s vremenskom osi i kad se tri 
uzastopne analize C  f na uzorcima uzetim u razmacima od najmanje 
dva dana razlikuju za najviše ± 20 % odnosno kad nema zna čajnih 
razlika izme đu ta tri vremena uzorkovanja. Kad se analiziraju obje ­
dinjeni uzorci, potrebne su najmanje četiri uzastopne analize. Kod 
ispitivanih tvari koje se sporo apsorbiraju, prikladniji su razmaci od sedam dana.
 
Faktori biokoncentracije koji se izravno izra čunavaju iz kineti čkih 
konstanti brzine (k  1 /k 2 ) nazivaju se kineti čkim faktorima koncentra ­
cije, BCF  K . 
Podjelni koeficijent oktanol-voda (P  ow ) je omjer topljivosti kemika ­
lije u n-oktanolu i vodi u ravnoteži (metoda A.8.), koji se tako đer 
izražava kao K  ow . Logaritam P  ow služi kao pokazatelj biokoncentra ­
cijskog potencijala kemikalije u vodenim organizmima.  
Faza izlaganja ili apsorpcije je vrijeme u kojemu su ribe izložene 
ispitivanoj kemikaliji.  
Konstanta brzine apsorpcije (k  1 ) je numeri čka vrijednost kojom se 
definira brzina pove ćavanja koncentracije ispitivane tvari u/na ispiti ­
vanoj ribi (odnosno njezinim navedenim tkivima) kad je riba izlo ­ 
žena toj kemikaliji (k  1 se iskazuje u danima  -1 ). 
Faza nakon izlaganja ili faza izlu čivanja (gubitka) je vrijeme nakon 
prijenosa ispitivane ribe iz medija koji sadrži ispitivanu tvar u medij bez te tvari, tijekom kojega se prou čava izlučivanje (odnosno neto 
gubitak) tvari iz ispitivane ribe (odnosno njezinog navedenog tkiva).
 
Konstanta brzine izlu čivanja (gubitka) (k  2 ) je numeri čka vrijednost 
kojom se definira brzina smanjivanja koncentracije ispitivane tvari u ispitivanoj ribi (odnosno njezinim navedenim tkivima) nakon prije ­
nosa ispitivane ribe iz medija koji sadrži ispitivanu tvar u medij bez 
te tvari (k
 2 se iskazuje u danima  -1 ). 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Ispitivanje obuhva ća dvije faze: fazu izlaganja (apsorpcije) i fazu 
nakon izlaganja (izlu čivanja). Tijekom faze apsorpcije odvojene 
skupine riba iste vrste izlažu se najmanje dvjema koncentracijama ispitivane tvari. Zatim se prenesu u medij bez ispitivane tvari na fazu 
izlučivanja. Faza izlu čivanja je uvijek nužna, osim ako je apsorpcija 
ispitivane tvari tijekom faze apsorpcije bila bezna čajna (npr. BCF 
manji od 10). Koncentracija ispitivane tvari u/na ribi (odnosno njezinom navedenom tkivu) prati se tijekom obje faze ispitivanja. 
Uz dvije ispitne koncentracije, ispitivanje uklju čuje i kontrolnu 
skupinu riba, koje se drže u istovjetnim uvjetima, ali bez prisutnosti ispitivane tvari, kako bi se mogu ći štetni u činci uočeni kod ispiti ­
vanja biokoncentracije mogli usporediti s odgovaraju ćom kontrolnom 
skupinom te da bi se dobile temeljne vrijednosti koncentracija ispi ­
tivane tvari.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1124
 
Faza apsorpcije traje 28 dana, osim ako se dokaže da je ravnoteža 
uspostavljena prije toga. Trajanje faze apsorpcije i vrijeme potrebno 
da se postigne stabilno stanje može se predvidjeti uz pomo ć 
jednadžbe iz Dodatka 3. Nakon toga slijedi razdoblje izlu čivanja, 
koje zapo činje prijenosom riba u drugu čistu posudu s istim medi ­
jem, ali bez ispitivane tvari. Faktor biokoncentracije se po mogu ć­
nosti izra čunava i kao omjer (BCF  ss ) koncentracije u ribi (C  f ) i vodi 
(C w ) u prividnom stabilnom stanju i kao kineti čki faktor biokoncen ­
tracije BCF  K , tj. omjer konstanti brzine apsorpcije (k  1 ) i brzine izlu ­ 
čivanja (k  2 ) uz pretpostavku kinetike prvog reda. Ako je o čito da ne 
vrijedi kinetika prvog reda, treba primijeniti složenije modele (Dodatak 5.).
 
Ako se u 28 dana ne postigne stabilno stanje, fazu apsorpcije treba 
produžiti dok se ono ne postigne ili 60 dana, ovisno o tome što je kraće; zatim se prelazi na fazu izlu čivanja.
 
Konstanta brzine apsorpcije, konstanta brzine izlu čivanja (gubitka) 
(odnosno konstante, ako se koriste složeniji modeli), faktor biokon ­
centracije te, po mogu ćnosti, granice pouzdanosti svakog od tih 
parametara izra čunavaju se uz pomo ć modela koji najbolje opisuje 
izmjerene koncentracije ispitivane tvari u ribama i vodi.  
BCF se izražava kao funkcija ukupne mokre mase ribe. Ipak, za 
određene se potrebe mogu koristiti odre đena tkiva ili organi (npr. 
mišići, jetra), ako je riba dovoljno velika odnosno ako se može 
podijeliti u jestive (file) i nejestive frakcije (utroba). Budu ći da 
kod mnogih organskih tvari postoji jasna veza izme đu biokoncen ­
tracijskog potencijala i lipofilnosti, isto tako postoji i odgovaraju ća 
povezanost izme đu sadržaja lipida ispitivane ribe i zabilježene 
biokoncentracije tih tvari. Stoga, da bi se umanjio taj izvor varija ­
bilnosti ispitnih rezultata kod visoko lipofilnih tvari (tj. s log P  ow 
> 3), biokoncentraciju treba izraziti i u odnosu prema sadržaju 
lipida, a ne samo prema ukupnoj tjelesnoj masi.  
Ako je to izvedivo, sadržaj lipida treba odrediti na biološkom mate ­
rijalu koji se koristi za odre đivanje koncentracije ispitivane tvari.  
1.4. PODACI O ISPITIVANOJ TVARI  
Prije provedbe ispitivanja biokoncentracije trebaju biti poznati slje ­
deći podaci o ispitivanoj tvari:  
— topljivost u vodi,  
— podjelni koeficijent oktanol-voda P  ow (koji se ozna čava i kao 
K ow , određen metodom HPLC iz A.8.),  
— hidroliza,  
— fotokemijska pretvorba u vodi odre đena u stvarnim ili simuli ­
ranim uvjetima sun čevog zračenja te u uvjetima zra čenja biokon ­
centracijskog testa (3),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1125
 
— površinska napetost (tj. kod tvari gdje se ne može odrediti log 
P ow ), 
— tlak pare,  
— laka biorazgradivost (prema potrebi).  
Osim toga, potrebne su informacije o toksi čnosti za riblju vrstu koja 
će se koristiti u ispitivanju, po mogu ćnosti asimptotski LC  50 (tj. 
neovisan o vremenu). Mora biti raspoloživa odgovaraju ća analitička 
metoda poznate to čnosti, preciznosti i osjetljivosti za kvantifikaciju 
ispitivane tvari u ispitnim otopinama i biološkom materijalu, zajedno 
s podacima o pripremi i čuvanju uzorka. Osim toga, trebaju biti 
poznate analiti čke granice detekcije ispitivane tvari u vodi i ribljim 
tkivima. Ako se koristi  14 C obilježena ispitivana tvar, treba biti 
poznat postotak radioaktivnosti povezan s ne čistoćama.  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, moraju biti zadovoljeni sljede ći uvjeti:  
— promjene temperature ispod ± 2 °C,  
— koncentracija otopljenog kisika ne smije pasti ispod 60 % zasi ­ 
ćenosti,  
— koncentracija ispitivane tvari u komorama održava se u grani ­
cama ± 20 % srednje vrijednosti izmjerene u fazi apsorpcije,  
— smrtnost i drugi štetni u činci/bolest kod kontrolnih i obra đenih 
riba na kraju ispitivanja je ispod 10 %; ako ispitivanje traje više 
tjedana ili mjeseci, smrtnost i drugi štetni u činci u oba skupa riba 
trebaju biti ispod 5 % mjese čno i ukupno ne smiju prije ći 30 %.  
1.6. REFERENTNI SPOJEVI  
Kad je to potrebno, za provjeru pokusnog postupka mogu se koristiti 
referentni spojevi poznatog biokoncentracijskog potencijala. Me đu­
tim, još uvijek se ne mogu preporu čiti određene tvari.  
1.7. OPIS ISPITNE METODE  
1.7.1.  Aparatura  
Treba voditi ra čuna da dijelovi opreme ne sadrže materijale koji se 
mogu otapati, sorbirati ili ispirati i imati štetni u činak na ribe. Mogu 
se koristiti standardni četvrtasti ili cilindri čni bazeni od kemijski 
inertnog materijala, prikladne zapremnine s obzirom na koli činu 
punjenja. Uporabu mekanih plasti čnih cijevi treba svesti na najmanju 
moguću mjeru. Prednost treba dati cijevima od Teflona®, nehr đa­
jućeg čelika i/ili stakla. Iskustvo je pokazalo da tvari s visokim 
koeficijentima adsorpcije, kao što su sinteti čki piretroidi, ponekad 
zahtijevaju korištenje silaniziranog stakla. U tom se slu čaju oprema 
mora baciti nakon uporabe.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1126
 
1.7.2.  Voda  
U testu se op ćenito koristi prirodna voda dobivena iz neone čišćenog 
izvora ujedna čene kakvo će. Kakvo ća vode za razrje đivanje mora 
omogućavati preživljavanje odabrane riblje vrste tijekom razdoblja 
aklimatizacije i ispitivanja bez pojave anomalija u izgledu i 
ponašanju riba. U idealnom slu čaju treba dokazati da ispitna vrsta 
može preživjeti, rasti i razmnožavati se u vodi za razrje đivanje (npr. 
u laboratorijskoj kulturi ili toksikološkom ispitivanju unutar životnog 
ciklusa). Vodu treba opisati barem s obzirom na pH, tvrdo ću, ukupni 
sadržaj krute tvari, ukupni organski ugljik i, po mogu ćnosti, amoni ­
jak, nitrit i alkalitet te, kod morskih vrsta, salinitet. Parametri važni 
za optimalnu dobrobit riba su u cijelosti poznati, ali u Dodatku 1. 
navedne su preporu čene maksimalne koncentracije za niz parametara 
za slatkovodnu i morsku ispitnu vodu.  
Voda u razdoblju ispitivanja mora biti stalne kakvo će. pH vrijednost 
treba biti u podru čju od 6,0 do 8,5, s time da za vrijeme jednog 
ispitivanja ne smije odstupati više od ± 0,5 pH jedinica. Kako voda za razrjeđivanje ne bi neprimjereno utjecala na rezultat ispitivanja 
(npr. kompleksiranjem ispitivane tvari) ili štetno utjecala na riblju 
populaciju, treba u odre đenim razmacima uzimati uzorke na analizu. 
Određivanje teških metala (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), glavnih 
aniona i kationa (npr. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), pesticida (npr. 
ukupni organofosforni i ukupni organoklorni pesticidi), ukupnog 
organskog ugljika i suspendirane krute tvari treba provoditi npr. svaka tri mjeseca ako se zna da je voda za razrje đivanje relativno 
stalne kakvo će. Ako se dokaže da je kakvo ća vode ujedna čena 
tijekom najmanje jedne godine, odre đivanja se mogu prorijediti i 
razmaci pove ćati (npr. svakih šest mjeseci).
 
Prirodni sadržaj čestica i ukupni organski ugljik (TOC) vode za 
razrjeđivanje trebaju biti što niži kako ne bi došlo do adsorpcije 
ispitivane tvari na organsku tvar, što može smanjiti njezinu biora ­
spoloživost (4). Maksimalna prihvatljiva vrijednost je 5 mg/l za 
lebdeće čestice (suha tvar koja ne prolazi kroz filtar od 0,45 μm) i 
2 mg/l za ukupni organski ugljik (vidjeti Dodatak 1.). Voda se prema potrebi filtrira prije uporabe. Doprinos ispitivanih riba (izlu čevine) i 
ostataka hrane sadržaju organskog ugljika treba biti što je mogu će 
manji. Za vrijeme ukupnog trajanja ispitivanja koncentracija organ ­
skog ugljika u ispitnoj posudi ne smije biti više od 10 mg/l (± 20 %) veća od koncentracije organskog ugljika koji potje če od ispitivane 
tvari i sredstva za otapanje (ako se koristi).
 
1.7.3.  Ispitne otopine  
Pripremi se radna otopina koja sadrži prikladnu koncentraciju ispiti ­
vane tvari. Radnu otopinu po mogu ćnosti treba pripremiti jednosta ­
vnim miješanjem ili mu ćkanjem ispitivane tvari u vodi za razrje đi­
vanje. Uporaba otapala i dispergenata (sredstava za otapanje) ne 
preporučuje se, ali su ona u nekim slu čajevima ipak potrebna da 
bi se dobila prikladna koncentracija radne otopine. Otapala koja se mogu koristiti su etanol, metanol, etilen-glikol-monometil eter, etilen-glikol-dimetil eter, dimetilformamid i trietilenglikol. Disper ­
genti koji se mogu koristiti su Cremophor RH40, Tween 80, metil ­
celuloza 0,01 % i HCO-40. Kod primjene lako biorazgradivih sred ­
stava potreban je poseban oprez budu ći da ona u proto čnim ispitiva ­
njima mogu izazvati problem rasta bakterija. Ispitivana tvar može biti 
radioaktivno obilježena i mora biti najviše čistoće (npr. po mogu ć­
nosti > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1127
 
Kod proto čnih je ispitivanja za dopremanje ispitnih koncentracija u 
ispitne komore potreban sustav koji stalno odmjerava i razrje đuje 
radnu otopinu ispitivane tvari (npr. dozirna crpka, proporcionalni razrjeđivač, zasićivač). Poželjno je najmanje pet izmjena volumena 
dnevno u svim komorama. Prednost treba dati proto čnoj metodi, ali 
ako to nije mogu će (npr. u slu čaju štetnog u činka na ispitne organ ­
izme), može se koristiti i polustati čka tehnika, pod uvjetom da su 
zadovoljeni kriteriji valjanosti. Brzinu protoka radnih otopina i vode za razrjeđivanje treba provjeriti 48 sati prije ispitivanja i zatim barem 
jedanput dnevno tijekom ispitvanja. Prilikom te provjere treba odre ­
diti brzinu protoka kroz svaku ispitnu komoru i pobrinuti se da odstupanja unutar jedne komore i izme đu komora ne budu ve ća od 
20 %.
 
1.7.4.  Odabir vrste  
Važan kriterij za odabir vrste je laka dostupnost, raspoloživost u 
praktičnim veličinama i prikladnost za držanje u laboratorijskim 
uvjetima. Ostali kriteriji za odabir ribljih vrsta su njihov rekreacijski, 
trgovački i okolišni zna čaj i usporediva osjetljivost, ranije uspješno 
korištenje itd.  
Preporučene ispitne vrste navedene su u Dodatku 2. Mogu se kori ­
stiti i druge vrste, ali to može zahtijevati prilagodbu ispitnog 
postupka kako bi se osigurali prikladni ispitni uvjeti. U tom 
slučaju treba navesti razloge za odabir vrste i pokusnu metodu.  
1.7.5.  Držanje riba  
Matična riblja populacija aklimatizira se u vodi na ispitnoj tempera ­
turi najmanje dva tjedna i čitavo vrijeme hrani dovoljnom koli činom 
hrane koja će se koristiti kod ispitivanja.  
Nakon vremena prilagodbe od 48 sati bilježi se smrtnost uz primjenu 
sljedećih kriterija:  
— smrtnost iznad 10 % populacije u sedam dana: odbacuje se čitava 
serija,  
— smrtnost izme đu 5 i 10 % populacije u sedam dana: aklimatiza ­
cija se nastavlja još sedam dana,  
— smrtnost ispod 5 % populacije u sedam dana: serija se prihva ća – 
ako je smrtnost tijekom drugih sedam dana iznad 5 %, čitava se 
serija odbacuje.  
Treba se uvjeriti da kod riba koje se koriste u ispitivanjima nema 
vidljivih bolesti i anomalija. Sve bolesne ribe treba odbaciti. Ribe se 
ne smiju lije čiti dva tjedna prije ispitivanja niti tijekom ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1128
 
1.8. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.8.1.  Preliminarno ispitivanje  
Preliminarni pokus može biti koristan za optimizaciju ispitnih uvjeta 
za glavno ispitivanje, npr. odabir koncentracije odnosno koncentra ­
cija ispitivane tvari, trajanje faze apsorpcije i izlu čivanja.  
1.8.2.  Uvjeti izlaganja  
1.8.2.1. T r a j a n j e f a z e a p s o r p c i j e  
Trajanje faze apsorpcije može se predvidjeti na temelju prakti čnog 
iskustva (npr. ranije istraživanje ili akumulacija srodne kemikalije) ili 
na temelju odre đenih empirijskih odnosa, koriste ći saznanja o toplji ­
vosti u vodi ili podjelnom koeficijentu oktanol/voda ispitivane tvari (vidjeti Dodatak 3.).
 
Faza apsorpcije trebala bi trajati 28 dana, osim ako se može dokazati 
da je ravnoteža uspostavljena prije toga. Ako se do 28. dana ne 
postigne stabilno stanje, fazu apsorpcije treba produžiti, uz dodatna mjerenja, do uspostave stabilnog stanja ili 60 dana, ovisno o tome što je kra će.
 
1.8.2.2. T r a j a n j e f a z e i z l u č i v a n j a  
Polovica vremena trajanja faze apsorpcije obi čno je dovoljna za 
potrebno smanjenje (npr. 95 %) tjelesnog optere ćenja tvari (za obja ­ 
šnjenje procjene vidjeti Dodatak 3.). Ako je vrijeme potrebno da se 
postigne 95 % gubitka pretjerano dugo, primjerice ako je dvostruko 
duže od uobi čajenog trajanja faze apsorpcije (tj. duže od 56 dana), 
može se koristiti kra će razdoblje (tj. dok koncentracija ispitivane 
tvari ne padne ispod 10 % koncentracije stabilnog stanja). Ipak, 
kod tvari sa složenijim obrascima apsorpcije i izlu čivanja koji se 
ne mogu predo čiti jednodjelnim modelima riba koji daju kinetiku 
prvog reda, treba predvidjeti duže faze izlu čivanja za odre đivanje 
konstanti brzine gubitka. Me đutim, to vrijeme može biti uvjetovano 
razdobljem tijekom kojega se koncentracija ispitivane tvari u ribama 
zadržava iznad analiti čke granice detekcije.  
1.8.2.3. B r o j i s p i t i v a n i h r i b a  
Odabere se odgovaraju ći broj riba po ispitnoj koncentraciji tako da 
kod svakog uzorkovanja budu raspoložive najmanje četiri ribe po 
uzorku. Ako je potrebna ve ća statistička snaga, bit će potrebno 
više riba po uzorku.  
Ako se koriste odrasle ribe, treba navesti koriste li se u pokusu 
mužjaci ili ženke ili jedni i drugi. Ako se koriste oba spola, razlike u sadržaju lipida izme đu spolova prije po četka izlaganja 
moraju biti dokumentirane kao bezna čajne; prema potrebi treba obje ­
diniti sve mužjake i sve ženke riba.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1129
 
Kod svih ispitivanja treba odabrati ribe sli čne mase, tako da 
najmanja riba ne bude manja od dvije tre ćine mase najve će ribe. 
Sve ribe trebaju biti istoga godišta i istog podrijetla. Kako se čini 
da masa i dob riba ponekad imaju zna čajan utjecaj na vrijednosti 
BCF (1), te podatke treba to čno dokumentirati. Preporu čuje se da se 
prije ispitivanja izvaže poduzorak ribe radi procjene prosje čne mase.  
1.8.2.4. P u n j e n j e  
Koriste se visoki omjeri voda-riba kako bi se smanjenje C  w zbog 
uvođenja riba na po četku ispitivanja svelo na najmanju mogu ću 
mjeru te da bi se sprije čilo opadanje koncentracije otopljenog 
kisika. Važno je da koli čina punjenja bude prilago đena ispitnoj 
vrsti. U svakom slu čaju, obično se preporu čuje količina punjenja 
od 0,1 – 1,0 g ribe (mokre mase) po litri vode po danu. Ve će 
količine punjenja mogu se koristiti ako se dokaže da se tražena 
koncentracija ispitivane tvari može održavati u granicama ± 20 % i da koncentracija otopljenog kisika ne pada ispod 60 % zasi ćenosti.
 
Kod odabira odgovaraju ćeg režima punjenja treba voditi ra čuna o 
uobičajenom staništu riblje vrste. Primjerice, ribe koje žive na dnu 
obično zahtijevaju više podnog prostora u akvariju kod istog volu ­
mena vode nego pelagi čke vrste.  
1.8.2.5. H r a n j e n j e  
Ribe se tijekom razdoblja aklimatizacije i ispitivanja hrane odgova ­
rajućom hranom s poznatnim sadržajem lipida i proteina u koli čini 
koja je dovoljna da ostanu zdrave i zadrže tjelesnu masu. Hrana se tijekom čitavog razdoblja aklimatizacije i ispitivanja ribama daje 
jedanput dnevno u koli čini koja približno odgovara 1 do 2 % tjelesne 
mase po danu; to kod ve ćine ribljih vrsta koncentraciju lipida 
održava na relativno stalnoj razini za vrijeme ispitivanja. Koli činu 
hrane treba prera čunavati npr. jedanput tjedno, kako bi tjelesna masa 
i sadržaj lipida ostali stalni. Za potrebe ovog izra čuna masa riba u 
pojedinoj ispitnoj komori može se procijeniti iz mase posljednjeg 
ribljeg uzorka uzetog iz te komore. Ribe koje ostanu u komori ne važu se.
 
Nepojedena hrana i izmet se svakodnevno ispuštaju iz ispitnih 
komora ubrzo nakon hranjenja (30 minuta do 1 sat). Komore treba 
tijekom ispitivanja održavati što čišćima kako bi koncentracija 
organske tvari bila što je mogu će niža, budu ći da prisutnost organ ­
skog ugljika može ograni čiti bioraspoloživost ispitivane tvari (1).  
Budući da se mnoge vrste hrane dobivaju iz ribljeg brašna, hranu 
treba analizirati na ispitivanu tvar. Hranu je tako đer poželjno anali ­
zirati na pesticide i teške metale.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1130
 
1.8.2.6. S v j e t l o s t i t e m p e r a t u r a  
Fotoperiod je obi čno od 12 do 16 sati, a temperaturu treba prilagoditi 
ispitnoj vrsti (± 2 °C) (vidjeti Dodatak 2.). Vrsta i zna čajke osvje ­
tljenja trebaju biti poznati. Treba uzeti u obzir mogu ćnost fotoke ­
mijske pretvorbe ispitivanih tvari u uvjetima zra čenja istraživanja. 
Treba koristiti odgovaraju će osvjetljenje kako ribe ne bi bile izložene 
neprirodnim fotoproduktima. U nekim je slu čajevima potrebno kori ­
stiti filtar koji ne propušta UV zra čenje ispod 290 nm.  
1.8.2.7. I s p i t n e k o n c e n t r a c i j e  
Ribe se u proto čnim uvjetima izlažu najmanje dvjema koncentraci ­
jama ispitivane tvari u vodi. Obi čno se kao viša (ili najviša) koncen ­
tracija ispitivane tvari uzima koncentracija koja odgovara oko 1 % 
vrijednosti njezinog akutnog asimptotskog LC  50 i koja je najmanje 
deset puta viša od granice detekcije u vodi primijenjene analiti čke 
metode.  
Najviša ispitna koncentracija tako đer se može odrediti dijeljenjem 
akutne vrijednosti LC  50 96 h odgovaraju ćim omjerom akutno/kro ­
nično (omjeri za neke kemikalije mogu biti oko 3 do 100). Druga 
odabrana koncentracija odnosno koncentracije trebaju se od gore 
spomenute koncentracije po mogu ćnosti razlikovati za faktor deset. 
Ako to nije mogu će zbog kriterija 1 % LC  50 i analitičke granice, 
može se koristiti niži faktor od deset ili razmisliti o primjeni  14 C 
obilježene ispitivane tvari. Niti jedna koncentracija ne smije biti viša 
od topljivosti ispitivane tvari.  
Ako se koristi sredstvo za otapanje, njegova koncentracija ne smije 
biti viša od 0,1 ml/l i treba biti ista u svim ispitnim posudama. Njegov doprinos ukupnom sadržaju organskog ugljika u ispitnoj vodi (zajedno s ispitivanom tvari) treba biti poznat. U svakom 
slučaju, treba nastojati izbje ći korištenje takvih materijala gdje god 
je to mogu će.
 
1.8.2.8. K o n t r o l e  
Uz ispitni niz treba provesti jednu kontrolu s vodom za razrje đivanje 
odnosno, prema potrebi, jednu kontrolu sa sredstvom za otapanje, pod uvjetom da je utvr đeno da sredstvo nema u činak na ribe. U 
protivnom, treba postaviti obje kontrole.
 
1.8.3.  Učestalost mjerenja kakvo će vode  
Tijekom ispitivanja treba u svim posudama mjeriti otopljeni kisik, 
TOC, pH i temperaturu. Ukupnu tvrdo ću i salinitet (prema potrebi) 
treba mjeriti u kontrolnim posudama i jednoj posudi s višom 
(odnosno najvišom) koncentracijom. Otopljeni kisik i salinitet (prema potrebi) treba mjeriti barem tri puta – na po četku, oko 
sredine i na kraju razdoblja apsorpcije – te jedanput tjedno u 
razdoblju izlu čivanja. TOC se mjeri na po četku ispitivanja (24 sata 
i 48 sati prije po četka faze apsorpcije) prije uvo đenja riba i najmanje 
jedanput tjedno u fazi apsorpcije i izlu čivanja. Temperatura se mjeri 
svakodnevno, pH na po četku i kraju svakog razdoblja, a tvrdo ća 
jedanput tijekom ispitivanja. Temperaturu po mogu ćnosti treba 
neprekidno pratiti u najmanje jednoj posudi.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1131
 
1.8.4.  Uzorkovanje i analiza riba i vode  
1.8.4.1. R a s p o r e d u z o r k o v a n j a r i b a i v o d e  
Uzorci vode iz ispitnih komora za odre đivanje koncentracije ispiti ­
vane tvari uzimaju se prije uvo đenja riba te tijekom faze apsorpcije i 
izlučivanja. Vodu treba uzorkovati barem u isto vrijeme kad i ribe te 
prije hranjenja. Koncentracije ispitivane tvari u fazi apsorpcije odre ­ 
đuju se radi provjere uskla đenosti s kriterijima valjanosti.  
Ribe se uzorkuju najmanje pet puta u fazi apsorpcije i najmanje četiri 
puta u fazi izlu čivanja. Budu ći da je u pojedinim slu čajevima na 
temelju tog broja uzoraka teško napraviti dovoljno preciznu procjenu vrijednosti BCF, posebno ako ne vrijedi jednostavna kinetika izlu či­
vanja prvog reda, preporu čljivo je da se uzorci uzimaju češće u oba 
razdoblja (vidjeti Dodatak 4.). Dodatne uzorke treba spremiti i anali ­
zirati ih samo ako se pokaže da rezultati prvog kruga analiza nisu dostatni da se BCF izra čuna sa željenom preciznoš ću.
 
Primjer prihvatljivog rasporeda uzorkovanja prikazan je u Dodatku 4. 
Drugi se rasporedi mogu lako izra čunati primjenom drugih pretpo ­
stavljenih vrijednosti P  ow za izračun vremena izlaganja potrebnog za 
95 %-tnu apsorpciju.  
Uzorkovanje se nastavlja tijekom faze apsorpcije dok se ne utvrdi 
stabilno stanje ili 28 dana, ovisno o tome što je kra će. Ako se 
stabilno stanje ne postigne niti 28. dana, uzorkovanje se nastavlja dok se ne postigne stabilno stanje ili 60 dana, ovisno o tome što je 
kraće. Prije po četka faze izlu čivanja ribe treba premjestiti u čiste 
bazene.
 
1.8.4.2. U z o r k o v a n j e i p r i p r e m a u z o r a k a  
Uzorci vode za analizu dobivaju se npr. isisavanjem kroz inertnu 
cijev iz središta ispitne komore. Čini se da se ni filtracijom niti 
centrifugiranjem ne može uvijek posti ći odvajanje bioraspoložive 
frakcije ispitivane tvari od one koja nije bioraspoloživa (posebno kod superlipofilnih kemikalija tj. kemikalija koje imaju log P
 ow 
> 5) (1)(5); stoga uzorke nije potrebno podvrgavati tim postupcima.  
Umjesto toga, treba poduzeti mjere da bazeni budu što čišći te pratiti 
sadržaj organskog ugljika tijekom faze apsorpcije i izlu čivanja.  
U svakom vremenu uzorkovanja se iz ispitnih komora izvadi odgo ­
varajući broj riba (u pravilu najmanje četiri). Ribe se kratko isperu 
vodom, osuše upijaju ćim materijalom i trenuta čno usmrte na napri ­
kladniji i najhumaniji na čin i zatim izvažu.  
Ribe i vodu treba po mogu ćnosti analizirati odmah nakon uzorko ­
vanja kako bi se sprije čila razgradnja i drugi gubici te kako bi se još 
dok ispitivanje traje mogla izra čunati približna brzina apsorpcije i 
izlučivanja. Osim toga, trenuta čnom se analizom izbjegava kašnjenje 
u određivanju platoa.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1132
 
Ako se analiza ne obavi odmah, uzorke treba uskladištiti na 
prikladan na čin. Prije po četka istraživanja treba pribaviti informacije 
o pravilnom na činu skladištenja ispitivane tvari u pitanju – npr. 
duboko zamrzavanje, držanje na 4 °C, trajanje skladištenja, ekstrak ­
cija itd.  
1.8.4.3. K a k v o ć a a n a l i t i č k e m e t o d e  
Budući da čitav postupak uglavnom ovisi o to čnosti, preciznosti i 
osjetljivosti analiti čke metode koja se primjenjuje u odnosu na ispi ­
tivanu tvar, treba pokusima provjeriti jesu li preciznost i obnovljivost 
kemijske analize te izdvajanje ispitivane tvari iz vode i ribe zadovo ­
ljavajući za metodu u pitanju. Tako đer se treba uvjeriti da ispitivana 
tvar nije prisutna u vodi za razrje đivanje.  
Vrijednosti C  w i C f dobivene ispitivanjem treba prema potrebi ispra ­
viti za iskorištenje i temeljne vrijednosti kontrola. Kod rukovanja 
ribama i vodom treba stalno voditi ra čuna da se one čišćenje i 
gubici (npr. uslijed adsorpcije ure đaja za uzorkovanje) svedu na 
najmanju mogu ću mjeru.  
1.8.4.4. A n a l i z a r i b l j e g u z o r k a  
Ako se u ispitivanju koriste radioaktivno obilježeni materijali, uzorci 
se mogu analizirati na ukupnu radioaktivnu oznaku (tj. polazni spoj i metaboliti) ili pro čistiti tako da se polazni spoj može zasebno anali ­
zirati. Osim toga, glavni se metaboliti mogu opisati u stabilnom 
stanju ili na kraju faze apsorpcije, ovisno o tome što je ranije. Ako BCF u odnosu na ukupne radioaktivno obilježene ostatake iznosi ≥ 1 000 %, bilo bi uputno identificirati i kvantificirati proiz ­
vode razgradnje koji čine ≥ 10 % ukupnih ostataka u ribljim tkivima 
u stabilnom stanju; to se u svakom slu čaju preporu čuje kod odre ­ 
đenih kategorija kemikalija kao što su pesticidi. Ako se identificiraju 
i kvantificiraju proizvodi razgradnje koji čine ≥ 10 % ukupnih 
radioaktivno obilježenih ostataka u ribljim tkivima, preporu čuje se 
da se ti proizvodi razgradnje identificiraju i kvantificiraju i u ispitnoj vodi.
 
Koncentraciju ispitivane tvari obi čno treba odrediti za svaku pojedi ­
načnu izvaganu ribu. Ako to nije mogu će, uzorci se mogu kod 
svakog uzorkovanja objediniti, ali treba znati da objedinjavanje ogra ­
ničava mogu ćnosti primjene statisti čkih postupaka na podatke. Ako 
su određeni statisti čki postupak i snaga bitni, u ispitivanje treba 
uključiti dovoljan broj riba, vode ći računa o željenom postupku 
objedinjavanja i snazi (6)(7).  
BCF treba iskazati i kao funkciju ukupne mokre mase i, kod visoko 
lipofilnih tvari, kao funkciju sadržaja lipida. Sadržaj lipida kod riba treba po mogu ćnosti odrediti prilikom svakog uzorkovanja. Kod 
određivanja sadržaja lipida treba primjenjivati prikladne metode 
(reference (8) i (2) u Dodatku 3.). Ekstrakcijski postupak kloroform/ 
metanol može se preporu čiti kao standardna metoda (9). Razli čite 
metode ne daju jednake vrijednosti (10) i stoga je važno navesti podatke o primijenjenoj metodi. Ako je to mogu će, analizu lipida 
treba obaviti na ekstraktu pripremljenom za analizu ispitivane tvari, 
budući da se lipidi često moraju ukloniti iz ekstrakta prije kromato ­
grafske analize. Sadržaj lipida kod riba (kao mg/kg mokre mase) se na kraju pokusa ne bi smio razlikovati više od ± 25 % od sadržaja s 
početka ispitivanja. Tako đer treba navesti postotak krute tvari u tkivu 
kako bi se koncentracija lipida mogla prevesti iz mokre u suhu masu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1133
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Krivulja apsorpcije ispitivane tvari dobije se grafi čkim prikazom 
njezine koncentracije u/na ribi (ili navedenim tkivima) u fazi apsorp ­
cije u ovisnosti o vremenu na aritmeti čkoj skali. Ako krivulja 
dosegne plato tj. postane približno asimptoti čna u odnosu na 
vremensku os, BCF  ss u stabilnom stanju izra čunava se iz:  
C f kao stabilno stanje  ðsrednja vrijednostÞ 
C w kao stabilno stanje  ðsrednja vrijednostÞ 
Ako stabilno stanje nije postignuto, BCF  ss za ocjenu opasnosti 
ponekad se može dovoljno precizno izra čunati iz „stabilnog stanja” 
pri 80 % (1,6/k  2 ) ili 95 % (3,0/k  2 ) ravnoteže.  
Također se odredi faktor koncentracije (BCF  K ) kao omjer dviju 
konstanti kinetike prvog reda k  1 /k 2 . Konstanta brzine izlu čivanja 
(k 2 ) obično se odre đuje iz krivulje izlu čivanja (tj. graf opadanja 
koncentracije ispitivane tvari u ribi u vremenu). Konstanta brzine 
apsorpcije (k  1 ) se zatim izra čunava iz k  2 i vrijednosti C  f , koja se 
izvodi iz krivulje apsorpcije (vidjeti i Dodatak 5.). Kod odre đivanja 
BCF  K i konstanti brzine k  1 i k 2 prednost treba dati ra čunalnim 
metodama nelinearne procjene parametara (11). U protivnom se za 
izračun k  1 i k 2 mogu koristiti grafi čke metode. Ako je o čito da 
krivulja izlu čivanja nije prvog reda, treba primijeniti složenije 
metode (vidjeti reference u Dodatku 3.) i potražiti savjet biostatisti ­ 
čara. 
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Rezultate treba tuma čiti s oprezom ako se izmjerene koncentracije 
ispitnih otopina kre ću u blizini granice detekcije analiti čke metode.  
Jasno definirane krivulje apsorpcije i gubitka znak su dobre kakvo će 
podataka o biokoncentraciji. Odstupanja konstanti apsorpcije/izlu či­
vanja kod dviju ispitnih koncentracija trebala bi biti manja od 20 %. Ako se uo če značajne razlike u brzini apsorpcije/izlu čivanja izme đu 
dvije primijenjene ispitne koncentracije, to treba navesti i dati 
moguća objašnjenja. Op ćenito, granica pouzdanosti BCF
 s kod 
dobro strukturiranih istraživanja je blizu ± 20 %.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
3.1. ISPITIVANA TVAR:  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju kemikalije (uklju čujući sadržaj organskog 
ugljika, prema potrebi),  
— kod radioaktivno obilježenih tvari: to čan položaj obilježenog(-ih) 
atoma i postotak radioaktivnosti povezan s ne čistoćama, ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1134
 
3.2. ISPITNA VRSTA  
— znanstveni naziv, soj, izvor, mogu ća prethodna obrada, aklimati ­
zacija, dob, raspon veli čina itd.  
3.3. ISPITNI UVJETI:  
— ispitni postupak (npr. proto čni ili polustati čki), 
— vrsta i zna čajke osvjetljenja i fotoperiod(i),  
— plan ispitivanja (npr. broj i veli čina ispitnih komora, brzina 
izmjene vode, broj ponavljanja, broj riba po ponavljanju, broj ispitnih koncentracija, trajanje faze apsorpcije i izlu čivanja, 
učestalost uzorkovanja riba i vode,
 
— način pripreme radnih otopina i u čestalost obnavljanja (ako se 
koristi sredstvo za otapanje, treba navesti njegovu koncentraciju i doprinos sadržaju organskog ugljika ispitne vode),
 
— nazivne ispitne koncentracije, srednje izmjerene vrijednosti i 
njihove standardne devijacije u ispitnim posudama te metoda kojom su dobivene,
 
— izvor vode za razrje đivanje, opis mogu ćih prethodnih obrada, 
rezultati svih postupaka kojima se dokazuje da ispitivane ribe mogu živjeti u vodi i svojstva vode: pH, tvrdo ća, temperatura, 
koncentracija otopljenog kisika, rezidualni klor (ako se mjeri), 
ukupni ogranski ugljik, suspendirana kruta tvar, salinitet ispitnog 
medija (prema potrebi) i sva ostala mjerenja,
 
— kakvo ća vode u ispitnim posudama, pH, tvrdo ća, TOC, tempera ­
tura i koncentracija otopljenog kisika,  
— detaljne informacije o hranjenju (npr. vrsta hrane, izvor, sastav – 
po mogućnosti barem sadržaj lipida i proteina, koli čina i učesta­
lost hranjenja),  
— informacije o obradi ribljih uzoraka i uzoraka vode, uklju čujući 
podatke o pripremi, skladištenju, ekstrakciji i analiti čkim postup ­
cima (i preciznosti) za ispitivanu tvar i sadržaj lipida (ako se mjeri),
 
3.4. REZULTATI:  
— rezultati svih preliminarnih istraživanja,  
— smrtnost kontrolnih riba i riba u svakoj komori s ispitivanom 
tvari te sva uo čena neuobi čajena ponašanja,  
— sadržaj lipida kod riba (ako se odre đuje kod ispitivanja),  
— krivulje (uklju čujući sve mjerne podatke) iz kojih je vidljiva 
apsorpcija i izlu čivanje ispitivane kemikalije kod riba, vrijeme 
do stabilnog stanja,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1135
 
— Cf i C  w (sa standardnom devijacijom i rasponom, prema potrebi) 
za svako vrijeme uzorkovanja (Cf izražen u μg/g mokre mase 
(ppm) čitavog tijela ili navedenih tkiva npr. lipid i Cw u μg/ml 
(ppm). Vrijednosti Cw treba navesti i za kontrolni niz (temeljna vrijednost),
 
— faktor biokoncentracije stabilnog stanja (BCF  ss ) i/ili kineti čki 
faktor koncentracije (BCFK) te, prema potrebi, granice pouzda ­
nosti 95 % za konstante brzine apsorpcije i izlu čivanja (gubitka) 
(sve izraženo u odnosu na čitavo tijelo i ukupni sadržaj lipida 
životinje, ako se mjeri, ili navedeno tkivo), granice pouzdanosti i 
standardna devijacija (ako su raspoloživi) i metode izra čunava­
nja/analize podataka za svaku koncentraciju ispitivane tvari,  
— ako se koriste radioaktivno obilježene tvari i ako je to potrebno, 
može se prikazati akumulacija svih utvr đenih metabolita,  
— sve posebnosti ispitivanja, mogu ća odstupanja od ovih postupaka 
i sve druge relevantne informacije,  
rezultate tipa „nije utvr đeno na granici detekcije” treba svesti na 
najmanju mogu ću mjeru razradom metode prije ispitivanja i 
planom pokusa, budu ći da se ti rezultati ne mogu koristiti za 
izračun konstanti brzine.  
4. REFERENCE  
(1) Connell D.W. (1988) Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, str. 117-156.  
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993) Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 
1, str. 29-390.  
(3) OECD, Paris (1996) Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.  
(4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
 
(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 
20852, July 1975.  
(7) US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or 
Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in 
Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) 
Research Triangle Park, N.C. 27711.  
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: 
degradation, toxicity, bioaccumulation” Ch. 2.3, Part II. 
Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, str. 1099-1105.  
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, str. 1431-1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. 
Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. 
Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1137
 
Dodatak 1.  
Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrje đivanje  
Tvar  Grani čna koncentracija  
1 Lebde će čestice  5 mg/l  
2 Ukupni organski ugljik  2 mg/l  
3 Neionizirani amonijak  1 μg/l 
4 Rezidualni klor  10 μg/l 
5 Ukupni organofosforni pesticidi  50 ng/l  
6 Ukupni organoklorni pesticidi plus poliklorirani bifenili  50 ng/l  
7 Ukupni organski klor  25 ng/l  
8 Aluminij  1 μg/l 
9 Arsen  1 μg/l 
10 Krom  1 μg/l 
11 Kobalt  1 μg/l 
12 Bakar  1 μg/l 
13 Željezo  1 μg/l 
14 Olovo  1 μg/l 
15 Nikal  1 μg/l 
16 Cink  1 μg/l 
17 Kadmij  100 ng/l  
18 Živa  100 ng/l  
19 Srebro  100 ng/l  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1138
 
Dodatak 2.  
Preporučene riblje vrste za ispitivanje  
Preporučene vrste  Preporučeno 
područje ispitnih 
temperatura (°C)  Preporučena 
ukupna dužina 
ispitne životinje 
(cm) 
1 Danio rerio  ( 1 ) (Teleostei, Cyprinidae ) (Hamilton- 
Buchanan) zebrica  20 – 25  3,0 ± 0,5  
2 Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae ) (Rafi­
nesque) debeloglava gaovica  20 – 25  5,0 ± 2,0  
3 Cyprinus carpio  (Teleostei, Cyprinidae ) (Linnaeu s) 
šaran  20 – 25  5,0 ± 3,0  
4 Oryzias latipes  (Teleostei, Poeciliidae ) (Temminck i 
Schlegel) medaka  20 – 25  4,0 ± 1,0  
5 Poecilia reticulata  (Teleostei, Poeciliidae ) (Peters) 
gupi 20 – 25  3,0 ± 1,0  
6 Lepomis macrochirus  (Teleostei, Centrarchidae ) 
(Rafinesque) plavoškrga sun čanica  20 – 25  5,0 ± 2,0  
7 Oncorhynchus mykiss  (Teleostei, Salmonidae ) (Wal­
baum) kalifornijska pastrva  13 – 17  8,0 ± 4,0  
8 Gasterosteus aculeatus  (Teleostei, Gasterosteidae ) 
(Linnaeus) koljuška  18 – 20  3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993), Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, str. 231.  
U raznim se zemljama koriste razli čite estuarijske i morske vrste, primjerice: 
Riba iz porodice sjenica  Leiostomus xanthurus  
Ovčjeglava gav čica Cyprinodon variegatus  
Gavun  Menidia beryllina  
Svjetlucavi grge č Cymatogaster aggregata  
Engleski list  Parophrys vetulus  
Tihomorska škrpina  Leptocottus armatus  
Koljuška  Gasterosteus aculeatus  
Lubin  Dicentracus labrax  
Uklija  Alburnus alburnus  
Skupljanje  
Slatkovodne ribe navedene u tablici gore jednostavne su za uzgoj i/ili su široko raspoložive tijekom 
čitave godine, dok je raspoloživost morskih i estuarijskih vrsta djelomi čno ograni čena na pojedine 
zemlje. One se mogu uzgajati i kultivirati na ribljim farmama ili u laboratorijskim uvjetima, uz 
nadzor bolesti i nametnika, kako bi se dobile zdrave ispitne životinje poznatog podrijetla. Ove su ribe raspoložive u mnogim dijelovima svijeta.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1139
 
Dodatak 3.  
Predviđanje trajanja faze apsorpcije i izlu čivanja  
1. Predvi đanje trajanja faze apsorpcije  
Vrijednost k  2 , a time i odre đeni postotak vremena potrebnog da se postigne 
stabilno stanje, može se procijeniti prije provedbe ispitivanja iz empirijskih 
odnosa izme đu k  2 i podjelnog koeficijenta n-oktanol/voda (P  ow ) ili k  2 i 
topljivosti u vodi (s).  
Procjena k  2 (dani  –1 ) može se primjerice izvesti iz sljede ćega empirijskog 
odnosa (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95)  [jednadžba 1]  
Za druge odnose vidjeti literaturu (2).  
Ako podjelni koeficijent (P  ow ) nije poznat, procjena se može napraviti (3) na 
temelju znanja o topljivosti tvari u vodi (s) uz pomo ć sljedeće jednadžbe: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994)  [jednadžba 2]  
gdje je:  
s = topljivost (mol/l): (n = 36)  
Ovi odnosi vrijede samo za kemikalije s vrijednostima log P  ow između 2 i 
6,5 (4).  
Vrijeme potrebno da se postigne odre đeni postotak stabilnog stanja može se 
dobiti iz op će kinetičke jednadžbe koja opisuje apsorpciju i izlu čivanje 
(kinetika prvog reda) primjenom procjene k  2 : 
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
ili, ako je C  w stalan:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ [jednadžba 3]  
Približavanjem stabilnom stanju (t → ∞) jednadžba 3 se može svesti (5)(6) 
na: 
C f ¼ k 1 
k 2: C w sau C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Tada k  1 /k 2 · C w predstavlja približenje koncentraciji u ribama u „stabilnom 
stanju” (C  f,s ). 
Jednadžba 3 može se preurediti u:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ sau C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t [jednadžba 4]  
Primjenom jednadžbe 4, vrijeme potrebno da se postigne odre đeni postotak 
stabilnog stanja može se predvidjeti ako se prije toga procijeni k  2 uz pomoć 
jednadžbe 1 ili 2.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1140
 
Za orijentaciju, statisti čki optimalno trajanje faze apsorpcije za dobivanje 
statistički prihvatljivih podataka (BCF  K ) je vrijeme koje je potrebno da 
logaritamska krivulja koncentracije ispitivane tvari u ribama u ovisnosti o linearnom vremenu dosegne srednju to čku odnosno 1,6/k
 2 ili 80 % stabilnog 
stanja, ali ne više od 3,0/k  2 odnosno 95 % stabilnog stanja (7).  
Vrijeme potrebno da se postigne 80 % stabilnog stanja je (jednadžba 4):  
0,80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 sau t 80 ¼ 1,6 
k 2 [jednadžba 5]  
Slično tomu, 95 % stabilnog stanja je:  
t 95 ¼ 3,0 
k 2 [jednadžba 6]  
Primjerice, trajanje faze apsorpcije (up) za ispitivanu tvar s log P  ow = 4 bilo 
bi (primjenom jednadžbi 1, 5, 6): 
log 10 k 2 = – 0,414. (4) + 1,47  k  2 = 0,652 dana  –1 
up (80 %) = 1,6/0,652 tj. 2,45 dana (59 sati)  
ili up (95 %) = 3,0/0,652 tj. 4,60 dana (110 sati)  
Isto tako, za ispitivanu tvar kod koje je s = 10  –5 mol/l (log(s) = – 5,0) 
trajanje faze apsorpcije bilo bi (primjenom jednadžbi 1, 2, 5, 6):  
log 10 (P ow ) = 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 dana  –1 
up (80 %) = 1,6/0,246 tj. 6,5 dana (156 sati)  
ili up (95 %) = 3,0/0,246 tj. 12,2 dana (293 sata)  
Druga je mogu ćnost da se izraz:  
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (sati)  
upotrijebi za izra čun vremena do uspostave efektivnog stabilnog stanja (4)  
2. Predvi đanje trajanja faze izlu čivanja  
Predviđanje vremena potrebnog da se tjelesno optere ćenje smanji na odre ­ 
đeni postotak po četne koncentracije može se dobiti i iz op će jednadžbe koja 
opisuje apsporpciju i izlu čivanje (kinetika prvog reda) (1)(8).  
Uzima se da je C  w za fazu izlu čivanja jednak nuli. Jednadžba se može svesti 
na: 
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f sau C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1141
 
gdje je C  f,o koncentracija na po četku razdoblja izlu čivanja. 50 %-tno izlu ­ 
čivanje će se tada posti ći u vremenu (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 sau t 50 ¼ 0,693 
k 2 
Isto tako, 95 %-tno izlu čivanje postiže se u:  
t 95 ¼ 3,0 
k 2 
Ako je u prvom razdoblju apsorpcija 80 % (1,6/k  2 ) i ako je u fazi izlu či­
vanja gubitak 95 % (3,0/k  2 ), tada će faza izlu čivanja trajati otprilike 
dvostruko duže od faze apsorpcije.  
Ipak, važno je napomenuti da se procjene temelje na pretpostavci da obrasci 
apsorpcije i izlu čivanja prate kinetiku prvog reda. Ako je o čito da ne vrijedi 
kinetika prvog reda, treba primijeniti složenije modele (npr. (1)).  
Literatura  (za Dodatak 3.)  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, str. 309-320.
 
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF’s 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
 
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
str. 4-10.  
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), str. 701-707.  
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), str. 785-792.  
(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 
243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to esti ­
mate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, 
str. 614-622.  
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, str. 3-19.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1142
 
Dodatak 4.  
Teoretski primjer rasporeda uzorkovanja za ispitivanja biokoncentracije tvari s log P  ow = 4 
Uzorkovanje riba  Vremenski raspored uzorkovanja  
Br. uzoraka vode  Br. riba po uzorku  Minimalna u čestalost 
(dani)  Dodatno uzorkovanje  
Faza apsorpcije  -1 
0 2 (*) 
2 uvesti 45 – 80 riba  
1. 0,3  0,4  2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6  0,9  2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2  1,7  2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4  3,3  2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7  2  6  
Faza izlu čivanja  prenijeti ribe u vodu 
bez ispitivane kemi ­
kalije  
6. 5,0  5,3  4 
(4) 
7. 5,9  7,0  4 
(4) 
8. 9,3  11,2  4 
(4) 
9. 14,0  17,5  6 
(4) 
(*) Vodu uzorkovati nakon dopremanja najmanje 3 „volumena komore”. 
Vrijednosti u zagradama su koli čine uzoraka (voda, riba) koje treba uzeti ako se provodi dodatno uzorkovanje.  
Napomena:  prethodna procjena (prije ispitivanja) k  2 za log P  ow 4,0 je 0,652 dana  -1 . Ukupno trajanje pokusa odre đeno je kao 3 × up = 
3 × 4,6 dana tj. 14 dana. Za procjenu „up” vidjeti Dodatak 3.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1143
 
Dodatak 5.  
Razlikovanje modela  
Polazi se od pretpostavke da se ve ćina podataka o biokoncentraciji može „prili čno” 
dobro opisati jednostavnim dvodjelnim/dvoparametarskim modelom, na što ukazuje pravocrtna krivulja koja se približava to čkama koncentracija u ribama 
tijekom faze izlu čivanja, ako se one prikazuju na polulogaritamskom papiru. 
(Ako se te to čke ne mogu opisati pravocrtnom krivuljom, treba primijeniti složenije 
modele, vidjeti npr. Spacie and Hammelink, referenca (1) u Dodatku 3.).
 
Grafička metoda za odre đivanja konstante brzine izlu čivanja (gubitka) k  2 
Koncentracija ispitivane tvari utvr đena u svakom ribljem uzorku prikaže se na 
polulogaritamskom papiru u ovisnosti o vremenu uzorkovanja. Nagib te crte je k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Treba napomenuti da odstupanja od ravne crte mogu ukazivati na složeniji 
obrazac izlu čivanja od kinetike prvog reda. Grafi čkom se metodom mogu 
razlučiti obrasci izlu čivanja koji odstupaju od kinetike prvog reda.  
Grafička metoda za odre đivanje konstante brzine apsorpcije k  1 
Ako je K  2 zadan, k  1 se izračunava na sljede ći način: 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [jednadžba 1]  
Vrijednost C  f očita se iz srednje to čke glatke krivulje apsorpcije koja se dobije 
grafičkim prikazom log koncentracije u ovisnosti o vremenu (na aritmeti čkoj 
skali).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1144
 
Računalna metoda za izra čun konstanti brzine apsorpcije i izlu čivanja 
(gubitka)  
Kod odre đivanja faktora biokoncentracije i konstante brzine k  1 i k 2 prednost se 
daje računalnim metodama nelinearne procjene parametara. Ti programi 
pronalaze vrijednosti za k  1 i k 2 na temelju zadanog skupa podataka o koncen ­
tracijama u vremenskom slijedu i modela:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c [jednadžba 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þ t > t  c [jednadžba 3]  
gdje je t  c = vrijeme na kraju faze apsorpcije  
Ovaj pristup omogu ćuje procjene standardne devijacije k  1 i k 2 . 
Budući da se k  2 u većini slučajeva može prili čno precizno procijeniti iz krivulje 
izlučivanja i budu ći da postoji snažna korelacija izme đu parametara k  1 i k 2 , ako 
se procjenjuju istodobno, ponekad je možda bolje prvo izra čunati k  2 samo iz 
podataka o izlu čivanju i onda izra čunati k  1 iz podataka o apsorpciji pomo ću 
nelinearne regresije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1145
 
C.14.  TEST RASTA JUVENILNIH RIBA  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja toksi čnih učinaka na rast odgovara smjernici 
OECD TG 215 (2000.).  
1.1. UVOD  
Ovaj je test namijenjen ocjenjivanju u činaka dugotrajnog izlaganja 
kemikalijama na rast juvenilnih riba. On se temelji na metodi za ocjenjivanje u činaka kemikalija na rast juvenilne kalifornijske 
pastrve ( Oncorynchus mykiss ) u protočnim uvjetima, koja je izra đena 
i ispitana u prstenastom testu (1)(2) unutar Europske unije. Mogu se 
koristiti i druge dobro dokumentirane vrste. Primjerice, postoje isku ­
stva s testovima rasta sa zebricom ( Danio rerio ) (
 1 ) (3)(4) i medakom 
(Oryzias latipes ) (5)(6)(7).  
Vidjeti tako đer Opći uvod, dio C.  
1.2. DEFINICIJE  
Najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC):  najniža ispi ­
tana koncentracija kod koje je uo čen značajan učinak ispitivane tvari 
(pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom. Ipak, sve ispitne koncen ­
tracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili ve ći štetan u činak od 
onog koji je zabilježen pri LOEC-u.  
Najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC):  ispitna 
koncentracija neposredno ispod LOEC-a.  
EC x : kod ove ispitne metode, koncentracija ispitivane tvari koja 
izaziva x %-tnu promjenu brzine rasta riba u usporedbi s kontrolama.  
Količina punjenja:  mokra masa ribe po volumenu vode.  
Gustoća nasada:  broj riba po volumenu vode.  
Pojedina čna specifi čna brzina rasta ribe:  brzina rasta jedne 
jedinke na temelju po četne mase.  
Prosječna specifi čna brzina rasta po bazenu:  srednja brzina rasta 
populacije bazena pri odre đenoj koncentraciji.  
Pseudospecifi čna brzina rasta:  brzina rasta pojedine ribe u odnosu 
na početnu srednju masu populacije bazena.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Juvenilne ribe u fazi eksponencijalnog rasta se izvažu, stave u ispitne 
komore i izlože nizu subletalnih koncentracija ispitivane tvari otopljene u vodi, po mogu ćnosti u proto čnim uvjetima ili, ako to 
nije mogu će, u odgovaraju ćim polustati čkim uvjetima (stati čko s 
obnavljanjem vode). Ispitivanje traje 28 dana. Ribe se hrane jedanput dnevno. Koli čina hrane temelji se na po četnoj masi riba i može se 
preračunati nakon 14 dana. Na kraju ispitivanja se ribe ponovno 
izvažu. U činci na brzinu rasta analiziraju se uz pomo ć regresijskog 
modela da bi se dobila procjena koncentracije koja izaziva x %-tnu promjenu brzine rasta tj. EC
 x (npr. EC  10 , EC  20 ili EC  30 ). Druga je 
mogućnost da se podaci usporede s kontrolnim vrijednostima i 
odredi najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC), a time i 
najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC).  
1.4. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Trebaju biti raspoloživi rezultati ispitivanja akutne toksi čnosti (vidjeti 
metodu C.1.), po mogu ćnosti na vrsti odabranoj za ovo ispitivanje. 
To znači da mora biti poznata topljivost u vodi i tlak pare ispitivane 
tvari i da mora biti raspoloživa pouzdana analiti čka metoda za kvan ­
tifikaciju tvari u ispitnim otopinama s poznatom i dokumentiranom 
točnošću i granicom detekcije.  
Osim toga, korisno je imati informacije o strukturnoj formuli, čistoći 
tvari, stabilnosti u vodi i na svjetlosti, pK  a , P ow i rezultate ispitivanja 
na laku biorazgradivost (vidjeti ispitnu metodu C.4.).  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, moraju biti zadovoljeni sljede ći uvjeti:  
— smrtnost u kontrolnoj skupini odnosno skupinama na kraju ispi ­
tivanja ne smije biti viša od 10 %,  
— povećanje srednje mase riba u kontrolnoj skupini odnosno skupi ­
nama mora biti dovoljno veliko da se može utvrditi najmanja promjena brzine rasta koja se smatra zna čajnom. Prstenasti je 
test (2) pokazao da se kod kalifornijske pastrve srednja masa 
riba u kontrolnim skupinama u 28 dana mora pove ćati najmanje 
za pola (tj. 50 %) njihove po četne srednje mase; npr. po četna 
masa: 1 g/riba (= 100 %), kona čna masa nakon 28 dana: ≥ 1,5 
g/riba (≥ 150 %),
 
— u čitavom tijeku ispitivanja koncentracija otopljenog kisika mora 
iznositi barem 60 % vrijednosti zasi ćenja kisikom (ASV),  
— razlike u temperaturi vode izme đu ispitnih komora ne smiju niti 
u jednom trenutku tijekom ispitivanja biti ve će od ± 1 °C; 
temperaturu vode treba održavati unutar utvr đenog podru čja za 
ispitnu vrstu u pitanju (Dodatak 1.) uz maksimalna odstupanja od 2 °C unutar tog podru čja.
 
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Aparatura  
Uobičajena laboratorijska oprema, posebno:  
— mjera či kisika i pH vrijednosti,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1147
 
— oprema za odre đivanje tvrdo će vode i alkaliteta,  
— prikladni ure đaji za regulaciju temperature i po mogu ćnosti 
neprekidno pra ćenje,  
— bazeni izra đeni od kemijski inertnog materijala i prikladne 
zapremnine s obzirom na preporu čeno punjenje i gusto ću 
nasada (vidjeti odjeljak 1.8.5. i Dodatak 1.),  
— vaga prikladne to čnosti (tj. to čnost ± 0,5 %).  
1.6.2.  Voda  
Kao ispitna voda može se koristiti svaka voda koja je prikladna za 
preživljavanje i rast ispitne vrste u dovoljno dugom razdoblju. pH 
vode treba biti u podru čju od 6,5 do 8,5, ali tijekom jednog ispiti ­
vanja ne smije odstupati za više od ± 0,5 pH jedinica. Preporu čuje se 
tvrdoća vode iznad 140 mg/l (kao CaCO  3 ). Kako voda za razrje đi­
vanje ne bi neprimjereno utjecala na rezultat ispitivanja (npr. 
kompleksiranjem ispitivane tvari), potrebno je u odre đenim 
razmacima uzimati uzorke na analizu. Mjerenja teških metala (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), glavnih aniona i kationa (npr. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO
 4 ), pesticida (npr. ukupni organofosforni i ukupni organo ­
klorni pesticidi), ukupnog organskog ugljika i suspendirane krute 
tvari treba obavljati npr. svaka tri mjeseca ako se zna da je voda za razrje đivanje relativno stalne kakvo će. Ako se dokaže da je 
kakvoća vode ujedna čena tijekom najmanje jedne godine, odre đi­
vanja se mogu prorijediti i razmaci pove ćati (npr. svakih šest mjese ­
ci). Neka kemijska svojstva prihvatljive vode za razrje đivanje nave ­
dena su u Dodatku 2.
 
1.6.3.  Ispitne otopine  
Ispitne otopine odabranih koncentracija pripremaju se razrje đivanjem 
radne otopine.  
Radnu otopinu treba po mogu ćnosti pripremiti jednostavnim miješa ­
njem ili mu ćkanjem ispitivane tvari u vodi za razrje đivanje mehani ­ 
čkim sredstvima (npr. mješa č ili ultrazvuk). Da bi se postigla 
prikladna koncentracija radne otopine mogu se koristiti kolone za zasićivanje („kolone za topljivost”).
 
Ponekad je za dobivanje prikladne koncentracije radne otopine 
potrebno koristiti otapala ili dispergente (sredstava za otapanje). 
Primjeri prikladnih otapala su aceton etanol, metanol, dimetilsulfo ­
ksid, dimetilformamid i trietilenglikol. Primjeri prikladnih disperge ­
nata su Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01 % i 
HCO-40. Kod primjene lako biorazgradivih sredstava (npr. aceton) 
i/ili visoko hlapljivih spojeva potreban je poseban oprez budu ći da 
oni kod proto čnih ispitivanja mogu izazvati problem rasta bakterija. 
Ako se koristi sredstvo za otapanje, ono ne smije imati zna čajne 
učinke na riblji rast niti vidljive štetne u činke na juvenilne ribe, 
što mora potvrditi kontrola s otapalom bez ispitivane tvari.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1148
 
Kod proto čnih je ispitivanja za dopremanje niza koncentracija u 
ispitne komore potreban sustav koji stalno odmjerava i razrje đuje 
radnu otopinu ispitivane tvari (npr. dozirna crpka, proporcionalni razrjeđivač, zasićivač). Brzine protoka radnih otopina i vode za 
razrjeđivanje treba provjeravati u odre đenim razmacima tijekom ispi ­
tivanja, po mogu ćnosti jedanput dnevno, i one za vrijeme ukupnog 
trajanja ispitivanja ne smiju odstupati više od 10 %. Prstenasti test (2) je pokazao da je za kalifornijsku pastrvu prihvatljiva dinamika izmjene vode od šest litara/g ribe/dan tijekom ispitivanja (vidjeti 
odjeljak 1.8.2.2.).
 
Kod polustati čkih ispitivanja (s obnavljanjem) u čestalost obnavljanja 
medija ovisi o stabilnosti ispitivane tvari, ali se u svakom slu čaju 
preporučuje dnevno obnavljanje vode. Ako iz preliminarnih ispiti ­
vanja stabilnosti (vidjeti odjeljak 1.4.) proizlazi da koncentracija 
ispitivane tvari nije stabilna u razdoblju obnavljanja medija (tj. 
izvan raspona 80 – 120 % nazivne vrijednosti ili pada ispod 80 % izmjerene po četne koncentracije), treba ramisliti o provedbi 
protočnog ispitivanja.
 
1.6.4.  Odabir vrste  
Preporučena vrsta za ovo ispitivanje je kalifornijska pastrva ( Onco­
rynchus mykiss ), budući da najve ći dio iskustava po čiva na prste ­
nastom testu s tom vrstom (1)(2). Mogu se koristiti i druge dobro 
dokumentirane vrste, ali to može zahtijevati prilagodbu ispitnog postupka kako bi se osigurali prikladni ispitni uvjeti. Na primjer, postoje iskustva sa zebricom ( Danio rerio ) (3)(4) i medakom ( Ory­
zias latipes ) (5)(6)(7). U tom slu čaju treba navesti razloge za odabir 
vrste i pokusnu metodu.
 
1.6.5.  Držanje riba  
Ribe za ispitivanje treba odabrati me đu populacijom iz istog nasada, 
a po mogu ćnosti i iz istog legla, koja je najmanje dva tjedna prije 
ispitivanja držana u uvjetima koji su sli čni ispitnim uvjetima u 
smislu kakvo će vode i osvjetljenja. Koli čina hrane koja se daje 
ribama u ukupnom razdoblju držanja i tijekom ispitivanja iznosi najmanje 2 % tjelesne mase dnevno, a po mogu ćnosti i 4 % tjelesne 
mase dnevno.
 
Nakon vremena prilagodbe od 48 sati bilježi se smrtnost, uz 
primjenu sljede ćih kriterija:  
— smrtnost iznad 10 % populacije u sedam dana: odbacuje se čitava 
serija,  
— smrtnost izme đu 5 i 10 % populacije: aklimatizacija se nastavlja 
još sedam dana; ako je smrtnost tijekom drugih sedam dana viša 
od 5 %, čitava se serija odbacuje,  
— smrtnost ispod 5 % populacije u sedam dana: serija se prihva ća. 
Ribe se ne smiju lije čiti dva tjedna prije ispitivanja niti za vrijeme 
ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1149
 
1.7. PLAN ISPITIVANJA  
„Plan ispitivanja” odnosi se na odabir broja ispitnih koncentracija i 
razmaka me đu koncentracijama, broja bazena za svaku koncentraciju 
i broja riba po bazenu. U idealnom slu čaju plan ispitivanja treba 
odabrati s obzirom na:  
— cilj istraživanja,  
— metodu statisti čke analize koja će se primijeniti,  
— raspoloživost i troškove sredstava potrebnih za pokus.  
U obrazloženju cilja treba po mogu ćnosti navesti s kojom statisti ­ 
čkom snagom treba utvrditi razliku odre đenog reda veli čine (npr. 
brzina rasta) ili, kao druga mogu ćnost, s kojom preciznoš ću treba 
procijeniti EC  x (npr. x = 10, 20 ili 30 i po mogu ćnosti ne manji od 
10). Bez tog se ne može to čno predvidjeti opseg istraživanja.  
Važno je znati da plan ispitivanja koji je optimalan (tj. omogu ćuje 
najbolje iskorištenje sredstava) za jednu metodu statisti čke analize 
nije nužno optimalan za drugu. Stoga će preporu čeni plan za 
procjenu LOEC/NOEC biti razli čit od preporu čenog plana za regre ­
sijsku analizu.  
U većini se slu čajeva regresijskoj analizi daje prednost u odnosu na 
analizu varijance iz razloga koje navode Stephan i Rogers (8). Ipak, 
ako se ne prona đe prikladan regresijski model (r  2 < 0,9) treba kori ­
stiti NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Plan ispitivanja za regresijsku analizu  
Kod planiranja ispitivanja koje će se analizirati regresijskom 
analizom važno je uzeti u obzir sljede će: 
— Ispitne koncentracije moraju obavezno obuhva ćati koncentraciju 
s učinkom (npr. EC  10,20,30  ) i podru čje koncentracija unutar 
kojega je u činak ispitivane tvari od interesa. Najve ća preciznost 
procjene koncentracija s u činkom postiže se kad se koncentracija 
s učinkom nalazi u sredini raspona koncentracija koje se ispituju. 
Preliminarno ispitivanje za odre đivanje raspona može pomo ći u 
odabiru najprikladnijih ispitnih koncentracija.  
— U interesu zadovoljavaju ćeg statisti čkog modeliranja, u ispiti ­
vanje treba uklju čiti najmanje jedan kontrolni bazen i još pet 
bazena s razli čitim koncentracijama. Prema potrebi, kada se 
koristi sredstvo za otapanje, uz ispitni niz treba predvidjeti i 
jednu kontrolu sa sredstvom za otapanje u najvišoj koncentraciji koja se ispituje (vidjeti odjeljak 1.8.3. i 1.8.4.).
 
— Može se koristiti odgovaraju ći geometrijski niz ili logaritamski 
niz (9) (vidjeti Dodatak 3.). Prednost se daje logaritamskom 
razmaku izme đu ispitnih koncentracija.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1150
 
— Ako je raspoloživo više od šest bazena, dodatne bazene treba 
koristiti za ponavljanja ili ih rasporediti unutar raspona koncen ­
tracija tako da se dobiju manji razmaci me đu njima. Obje su 
mjere jednako poželjne.  
1.7.2.  Plan ispitivanja za procjenu NOEC/LOEC primjenom analize 
varijance (ANOVA)  
Poželjno je predvidjeti bazene ponavljanja pri svim koncentracijama; 
statističku analizu treba provesti na razini bazena (10). Bez 
ponavljanja nije mogu će uzeti u obzir varijabilnost me đu bazenima 
osim one koja se može pripisati pojedina čnim ribama. Ipak, iskustvo 
je pokazalo (11) da je, u promatranom slu čaju, varijabilnost me đu 
bazenima bila vrlo malena u odnosu na varijabilnost unutar bazena 
(tj. između riba). Stoga je provedba statisti čke analize na razini 
pojedinačnih riba relativno prihvatljiva alternativa.  
Obično se koristi najmanje pet ispitnih koncentracija u geometrij ­
skom nizu, po mogu ćnosti uz faktor koji nije viši od 3,2.  
Općenito, kad se ispitivanje provodi s ponavljanjima, broj 
ponavljanja kontrolnih bazena, a time i broj riba, treba biti dvostruko 
veći od broja koji se koristi pri pojedinim ispitnim koncentracijama, 
koji mora biti jednak za sve koncentracije. (12)(13)(14). Naprotiv, ako nema ponavljanja, broj riba u kontrolnoj skupini treba biti jednak broju u pojedinim ispitnim koncentracijama.
 
Ako će se ANOVA temeljiti na bazenima, a ne na pojedina čnim 
ribama (što bi povla čilo za sobom pojedina čno obilježavanje riba 
ili korištenje „pseudo” specifi čnih brzina rasta (vidjeti odjeljak 
2.1.2.)), potreban je dovoljan broj ponavljanja bazena da se može 
odrediti standardna devijacija „bazena unutar koncentracija”). To znači da stupnjevi slobode za grešku kod analize varijance trebaju 
biti najmanje 5 (10). Ako se ponavljaju samo kontrole, postoji opas ­
nost da će varijabilnost greške biti pristrana, jer ona može rasti sa 
srednjom vrijednoš ću brzine rasta u pitanju. Budu ći da brzina rasta 
uglavnom opada s pove ćanjem koncentracije, varijabilnost može biti 
precijenjena.
 
1.8. POSTUPAK  
1.8.1.  Odabir i vaganje riba za ispitivanje  
Važno je da razlike u masi riba na po četku ispitivanja budu što 
manje. Prikladni rasponi veli čina za razli čite vrste preporu čene za 
ovo ispitivanje navedeni su u Dodatku 1. U idealnom slu čaju, pojedi ­
načne mase riba u čitavoj seriji koja se koristi u ispitivanju trebale bi 
se na početku ispitivanja nalaziti u granicama ± 10 % aritmeti čke 
srednje mase, a u svakom slu čaju ne bi smjele prelaziti 25 %. Prepo ­
ručuje se da se prije po četka ispitivanja izvaže poduzorak riba radi 
procjene srednje mase.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1151
 
Matičnoj populaciji treba uskratiti hranu 24 sata prije po četka ispi­
tivanja. Nakon toga ribe treba nasumi čno odabrati. Koriste ći opći 
anestetik (npr. vodena otopina 100 mg/l trikain- metansulfonata (MS 222) neutraliziranog dodavanjem dva dijela natrijevog bikarbo ­
nata po dijelu MS 222), ribe (osušene upijaju ćim materijalom) treba 
pojedinačno izvagati da bi se odredila mokra masa s preciznoš ću 
navedenom u Dodatku 1. Ribe čija se masa nalazi unutar pred ­
viđenog raspona treba zadržati i nasumi čno ih rasporediti po ispitnim 
posudama. Treba zabilježiti ukupnu mokru masu riba u svakoj 
ispitnoj posudi. Uporaba anestetika i rukovanje (uklju čujući sušenje 
i vaganje) može kod juvenilnih riba izazvati stres i ozljede, posebno kod vrsta koje su malog rasta. Stoga juvenilnim ribama treba krajnje oprezno rukovati kako bi se izbjegao stres i ozljede životinja.
 
Ribe se ponovno važu 28. dana ispitivanja (vidjeti odjeljak 1.8.6.). 
Ipak, ako se smatra da je potrebno prera čunati koli činu hrane, ribe se 
mogu ponovno izvagati 14. dana ispitivanja (vidjeti odjeljak 
1.8.2.3.). Za odre đivanje promjena veli čine riba za potrebe prila ­
godbe koli čine hrane mogu se koristiti i druge metode, kao što je 
fotografska metoda.  
1.8.2.  Uvjeti izlaganja  
1.8.2.1.  Trajanje  
Vrijeme ispitivanja je ≥ 28 dana.  
1.8.2.2.  Koli čine punjenja i gusto će nasada  
Važno je da koli čina punjenja i gusto ća nasada bude prilago đena 
ispitnoj vrsti (vidjeti Dodatak 1.). Ako je gusto ća nasada previsoka, 
dolazi do stresa uslijed prenapu čenosti, što dovodi do smanjenja 
brzina rasta pa čak i bolesti. Preniska gusto ća nasada može potaknuti 
teritorijalno ponašanje, što tako đer može utjecati na rast. U svakom 
slučaju, količina punjenja treba biti dovoljno niska da se koncentra ­
cija otopljenog kisika može održati barem na razini 60 % ASV bez 
dozračivanja. Prstenasti je test (2) pokazao da je za kalifornijsku 
pastrvu prihvatljiva koli čina punjenja od 16 pastrva od 3 – 5 g na 
40 litara. Preporu čena dinamika izmjene vode tijekom ispitivanja je 6 
litara/g ribe/dan.  
1.8.2.3.  Hranjenje  
Ribe treba hraniti odgovaraju ćom hranom (Dodatak 1.), u dovoljnoj 
količini da se dobije prihvatljiva brzina rasta. Treba paziti da ne do đe 
do rasta mikroba i zamu ćenja vode. Kod kalifornijske pastrve te bi 
uvjete trebala zadovoljiti dnevna koli čina hrane od 4 % njihove 
tjelesne mase (2)(15)(16)(17). Dnevna se koli čina hrane može podi ­
jeliti u dva jednaka dijela i dati ribama u dva hranjenja na dan u razmaku od najmanje 5 sati. Koli čina se hrane temelji na po četnoj 
ukupnoj masi riba u svakoj ispitnoj posudi. Ako se ribe ponovno 
važu 14. dana, koli čina se hrane može prera čunati. Ribama treba 
uskratiti hranu 24 sata prije vaganja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1152
 
Nepojedena hrana i izmet se svakodnevno uklanjaju iz ispitnih 
posuda opreznim usisavanjem dna bazena.  
1.8.2.4.  Svjetlost i temperatura  
Fotoperiod i temperaturu vode treba prilagoditi ribljoj vrsti (Dodatak 1.).  
1.8.3.  Ispitne koncentracije  
U pravilu je potrebno pet koncentracija ispitivane tvari, bez obzira na 
plan ispitivanja (vidjeti odjeljak 1.7.2.). U odabiru odgovaraju ćih 
ispitnih koncentracija može pomo ći prethodno znanje o toksi čnosti 
ispitivane tvari (npr. iz ispitivanja akutne toksi čnosti i/ili istraživanja 
za određivanje raspona). Ako se koristi manje od pet koncentracija, 
treba navesti obrazloženje. Najviša ispitivana koncentracija ne smije 
biti viša od granice topljivosti tvari u vodi.  
Ako se kao pomo ć u pripremi radne otopine koristi sredstvo za 
otapanje, njegova kona čna koncentracija ne smije biti viša od 0,1 ml/l 
i treba po mogu ćnosti biti jednaka u svim ispitnim posudama (vidjeti 
odjeljak 1.6.3.). Ipak, treba nastojati izbje ći korištenje takvih mate ­
rijala gdje god je to mogu će. 
1.8.4.  Kontrole  
Broj kontrola s vodom za razrje đivanje ovisi o planu ispitivanja 
(vidjeti odjeljke 1.7. – 1.7.2.). Ako se koristi sredstvo za otapanje, 
u ispitivanje treba uklju čiti isti broj kontrola sa sredstvom za 
otapanje.  
1.8.5.  Učestalost analiti čkog odre đivanja i mjerenja  
Koncentracije ispitivane tvari odre đuju se u redovitim razmacima 
tijekom ispitivanja (vidjeti dolje).  
Kod proto čnih ispitivanja brzine protoka sredstva za razrje đivanje i 
radne otopine toksikanta treba provjeravati u odre đenim razmacima, 
po mogućnosti jedanput dnevno; one tijekom ispitivanja ne bi smjele 
odstupati više od 10 %. Ako se o čekuje da će koncentracije ispiti ­
vane tvari biti u granicama ± 20 % nazivnih vrijednosti (tj. unutar 
područja 80 – 120 %; vidjeti odjeljke 1.6.2. i 1.6.3.), preporu čuje se 
da se na po četku ispitivanja, i zatim u tjednim razmacima, analiziraju 
barem najviše i najniže ispitne koncentracije. Kod ispitivanja gdje se ne očekuje da će koncentracija ispitivane tvari ostati u granicama 
± 20 % nazivne vrijednosti (na temelju podataka o stabilnosti ispi ­
tivane tvari), potrebno je prema istom režimu analizirati sve ispitne koncentracije.
 
U slučaju polustati čkih ispitivanja (s obnavljanjem), ako se o čekuje 
da će koncentracija ispitivane tvari ostati u granicama ± 20 % nazi ­
vnih vrijednosti, preporu čuje se da se na po četku istraživanja odmah 
nakon pripreme otopine i neposredno prije obnavljanja te u tjednim 
razmacima nakon tog analiziraju barem najviše i najniže ispitne koncentracije. Ako se ne o čekuje da će koncentracija ispitivane 
tvari ostati u granicama ± 20 % nazivne vrijednosti, treba analizirati 
sve ispitne koncentracije prema istom režimu kao kod stabilnijih 
tvari.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1153
 
Preporučuje se da se rezultati temelje na izmjerenim koncentraci ­
jama. Ipak, ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane 
tvari u otopini u čitavom tijeku ispitivanja na zadovoljavaju ći 
način održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene po četne 
koncentracije, rezultati se mogu temeljiti na nazivnim ili izmjerenim 
vrijednostima.  
U pojedinim je slu čajevima uzorke potrebno filtrirati (npr. uz 
primjenu veli čine pora 0,45 μm) ili centrifugirati. Centrifugiranje je 
preporučeni postupak. Ipak, ako se ispitivani materijal ne adsorbira 
na filtre, prihvatljivo je i filtriranje.  
Otopljeni kisik, pH i temperaturu treba mjeriti u svim ispitnim posu ­
dama tijekom ispitivanja. Ukupnu tvrdo ću, alkalitet i salinitet (prema 
potrebi) treba mjeriti u kontrolnim posudama i jednoj posudi s najvišom koncentracijom. Otopljeni kisik i salinitet (prema potrebi) 
treba mjeriti barem tri puta (na po četku, u sredini i na kraju ispitiva ­
nja). Kod polustati čkih se ispitivanja preporu čuje češće mjerenje 
otopljenog kisika, po mogu ćnosti prije i nakon svakog obnavljanja 
vode ili barem jedanput tjedno. pH kod stati čkog ispitivanja s 
obnavljanjem treba mjeriti na po četku i na kraju svakog obnavljanja 
vode, a kod proto čnih ispitivanja barem jedanput tjedno. Tvrdo ću i 
alkalitet treba mjeriti jedanput kod svakog ispitivanja. Temperaturu po mogu ćnosti treba neprekidno pratiti u najmanje jednoj ispitnoj 
posudi.
 
1.8.6.  Promatranja  
Masa: na kraju ispitivanja treba izvagati sve preživjele ribe na bazi 
mokre mase (osušene upijaju ćim materijalom) bilo u skupinama po 
ispitnoj posudi ili pojedina čno. Vaganju životinja po ispitnim posu ­
dama daje se prednost u odnosu na pojedina čno vaganje, kod kojega 
je potrebno ribe pojedina čno obilježiti. U slu čaju mjerenja pojedi ­
načne mase radi odre đivanja pojedina čne specifi čne brzine rasta ribe, 
treba odabrati tehniku obilježavanja koja ne izaziva stres kod živo ­
tinja (mogu se razmotriti sredstva obilježavanja razli čita od ledenog 
biljega npr. uporaba obojene tanke ribolovne strune).  
U razdoblju ispitivanja ribe treba svakodnevno pregledavati i zabi ­
lježiti sve vanjske anomalije (kao što su krvarenje, promjena boje) i neuobičajena ponašanja. Treba evidentirati smrtnost i što prije uklo ­
niti mrtve ribe. Mrtve se ribe ne nadomještaju jer su koli čina 
punjenja i gusto ća nasada dovoljni da se izbjegnu u činci na rast 
uslijed promjena broja riba po bazenima. Ipak, potrebno je prilago ­
diti količinu hrane.
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Preporučuje se da se u planiranje ispitivanja i analizu rezultata 
uključi statističar, budući da ova ispitna metoda pruža široke mogu ć­
nosti variranja koncepcije pokusa npr. u odnosu na broj ispitnih komora, broj ispitnih koncentracija, broj riba itd. S obzirom na 
raspoložive opcije u okviru plana ispitivanja, ovdje se ne navode 
posebne smjernice za statisti čki postupak.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1154
 
Za ispitne posude gdje je smrtnost ve ća od 10 % ne treba ra čunati 
brzine rasta. Ipak, stopu smrtnosti treba navesti za sve ispitne 
koncentracije.  
Neovisno o tome koja se metoda koristi za analizu podataka, 
središnji pojam je specifi čna brzina rasta r izme đu vremena t  1 i t 2 . 
Ona se može definirati na više na čina, ovisno o tome obilježavaju li 
se ribe pojedina čno ili ne i je li potreban prosjek bazena.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
gdje je:  
r 1 = pojedina čna specifi čna brzina rasta ribe  
r 2 = prosječna specifi čna brzina rasta po bazenu  
r 3 = „pseudo” specifi čna brzina rasta  
w 1 , w 2 = masa odre đene ribe u vremenu t  1 odnosno t  2 
log e w 1 = logaritam mase pojedina čne ribe na po četku razdoblja 
istraživanja  
log e w 2 = logaritam mase pojedina čne ribe na kraju razdoblja istra ­ 
živanja  
log e w 1 = prosjek logaritama vrijednosti w  1 za ribe u bazenu na 
početku razdoblja istraživanja  
log e w 2 = prosjek logaritama vrijednosti w  2 za ribe u bazenu na 
kraju razdoblja istraživanja  
t 1 , t 2 = vrijeme (dani) na po četku i kraju razdoblja istraživanja  
r 1 , r 2 , r 3 mogu se izra čunati za razdoblje od 0. – 28. dana te, prema 
potrebi (tj. ako je provedeno mjerenje 14. dana) za razdoblja od 0. – 14. i 14. – 28. dana.
 
2.1.1.  Regresijska analiza rezultata (modeliranje 
koncentracija-odgovor)  
Ova analiti čka metoda uspostavlja prikladan matemati čki odnos 
između specifi čne brzine rasta i koncentracije i tako omogu ćuje 
procjenu „EC  x ” tj. svih potrebnih vrijednosti EC. Primjenom ove 
metode nije potrebno izra čunavati r za pojedina čnu ribu (r  1 ), već 
se umjesto toga analiza može temeljiti na prosje čnoj vrijednosti r 
po bazenima (r  2 ). Ovoj posljednjoj metodi se daje prednost. Ona je 
također primjerenija kad se koriste najsitnije vrste.  
Za provjeru odnosa koncentracija-odgovor treba izraditi grafi čki 
prikaz specifi čnih brzina rasta po bazenima (r  2 ) u ovisnosti o 
koncentraciji.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1155
 
Treba odabrati prikladan model za izražavanje odnosa izme đu r 2 i 
koncentracije i izbor potkrijepiti odgovaraju ćim argumentima.  
Ako je broj preživjelih riba po bazenima razli čit, postupak prilago ­ 
đavanja modela, bilo da je jednostavan ili nelinearan, treba ponderi ­
rati kako bi se uzela u obzir nejednakost u veli činama skupina.  
Metoda prilago đavanja modela mora omogu ćiti procjenu npr. EC  20 i 
njegovog raspršenja (bilo standardna greška ili interval pouzdanosti). Graf prilago đenog modela treba prikazati u odnosu prema podacima 
tako da bude vidljiva valjanost podudaranja (8)(18)(19)(20).
 
2.1.2.  Analiza rezultata za procjenu LOEC-a  
Ako ispitivanje uklju čuje bazene ponavljanja pri svim koncentraci ­
jama, procjena LOEC-a može se temeljiti na analizi 
varijance (ANOVA) prosje čne specifi čne brzine rasta po bazenima 
(vidjeti odjeljak 2.1.), nakon čega se uz pomo ć prikladne metode 
(npr. Dunnettov ili Williamsov test (12)(13)(14)(21)) prosje čni r za 
svaku koncentraciju uspore đuje s prosje čnim r kontrola kako bi se 
odredila najniža koncentracija za koju je ta razlika zna čajna na razini 
vjerojatnosti 0,05. Ako nisu zadovoljene tražene pretpostavke za parametarske metode – nenormalna distribucija (npr. 
Shapiro-Wilkov test) ili heterogena varijanca (Bartlettov test), treba 
razmotriti mogu ćnost da se prije provedbe ANOVA-e podaci preo ­
blikuju radi homogenizacije varijanci ili provesti ponderiranu ANOVA-u.
 
Ako ispitivanje ne uklju čuje ponavljanja pri svim koncentracijama, 
ANOVA na temelju bazena će biti neosjetljiva ili uop će neće biti 
moguća. U tom se slu čaju, kao prihvatljivo kompromisno rješenje, 
ANOVA može temeljiti na „pseudo” specifi čnoj brzini rasta r  3 za 
pojedinačne ribe.  
Prosječni r  3 za svaku ispitnu koncentraciju se tada može usporediti s 
prosječnim r  3 kontrola. LOEC se zatim može odrediti kako je 
opisano gore. Treba imati na umu da ova metoda ne uzima u obzir 
nikakvu drugu varijabilnost izme đu bazena osim one koja se može 
pripisati pojedina čnim ribama niti pruža bilo kakvu zaštitu od te 
varijabilnosti. Ipak, iskustvo je pokazalo (8) da je varijabilnost među bazenima vrlo malena u odnosu na varijabilnost unutar 
bazena (tj. izme đu riba). Ako u analizu nisu uklju čene pojedina čne 
ribe, treba navesti metodu koja je korištena za odre đivanje strše ćih 
vrijednosti i obrazložiti njezin odabir.
 
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Rezultate treba tuma čiti s oprezom ako se izmjerene koncentracije 
toksikanta u ispitnim otopinama nalaze u blizini granice detekcije 
analitičke metode odnosno, kod poluststati čkih ispitivanja, ako se 
koncentracija ispitivane tvari smanji u vremenu izme đu pripreme 
otopine i obnavljanja.  
2.3. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1156
 
2.3.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući čistoću i anali ­
tičku metodu za kvantifikaciju ispitivane tvari, prema potrebi.  
2.3.2.  Ispitne vrste:  
— znanstveni naziv (po mogu ćnosti),  
— soj, veli čina, dobavlja č, moguća prethodna obrada itd.  
2.3.3.  Ispitni uvjeti  
— ispitni postupak (npr. polustati čki/obnavljanje, proto čni, punjenje, 
gustoća nasada itd.),  
— plan ispitivanja (npr. broj ispitnih posuda, ispitnih koncentracija i 
ponavljanja, broj riba po posudi),  
— način pripreme radnih otopina i u čestalost obnavljanja (ako se 
koristi sredstvo za otapanje, treba ga navesti zajedno s koncen ­
tracijom),  
— nazivne ispitne koncentracije, srednje izmjerene vrijednosti i 
njihove standardne devijacije u ispitnim posudama i metoda kojom su dobivene, dokazi da se mjerenja odnose na koncentra ­
cije ispitivane tvari u pravoj otopini,
 
— svojstva vode za razrje đivanje: pH, tvrdo ća, alkalitet, tempera ­
tura, koncentracija otopljenog kisika, rezidualni klor (ako se 
mjeri), ukupni ogranski ugljik, suspendirana kruta tvar, salinitet 
ispitnog medija (ako se mjeri) i ostala mjerenja,  
— kakvo ća vode unutar ispitnih posuda: pH, tvrdo ća, temperatura i 
koncentracija otopljenog kisika,  
— detaljne informacije o hranjenju (npr. vrsta(-e) hrane, izvor, koli ­ 
čina hrane i u čestalost hranjenja).  
2.3.4.  Rezultati:  
— dokazi da kontrole zadovoljavaju kriterij valjanosti za preživlja ­
vanje i podaci o smrtnosti u svim ispitnim koncentracijama,  
— primijenjene statisti čko-analiti čke tehnike, statistika na bazi 
ponavljanja ili riba, obrada podataka i obrazloženje primijenjenih 
tehnika,  
— tablični podaci o pojedina čnim i srednjim masama riba 0., 14. 
(ako se mjeri) i 28. dana, vrijednosti prosje čnih specifi čnih brzina 
rasta po bazenima odnosno pseudospecifi čnih brzina rasta (ovisno 
o slučaju) za razdoblje od 0. – 28. odnosno od 0. – 14. i 14. – 
28. dana,  
— rezultati statisti čke analize (tj. regresijska analiza ili ANOVA), po 
mogućnosti u tabli čnom i grafi čkom obliku, te LOEC (p = 0,05) i 
NOEC odnosno EC  x , po mogu ćnosti sa standardnim greškama,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1157
 
— pojavnost neobi čnih reakcija riba i svi vidljivi u činci ispitivane 
tvari.  
3. REFERENCE  
(1) Solbe J.F. de LG (1987) Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.
 
(2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J., (1990) EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals 
on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland N.O. (1985) A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, str. 1855-1870.  
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B.B., (1991) Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish ( Brac­
hydanio rerio ): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, str. 157-164.
 
(5) Yamamoto, Tokio., (1975) Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku 
Publish. Tokio, Japan.  
(6) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, 
E.N. and Johnson, R.D., (1995) Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Oryzias latipes ).Arch. 
Environ. Conta. Toxicol. 28, str. 287-297.
 
(7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L., (1991) 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series 
EPA-600/3-91-063. U.S. Environmental Protection Agency, 
Duluth, Minesota.
 
(8) Stephan C.E. and Rogers J.W., (1985) Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity 
tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth 
Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, str. 328-338.
 
(9) Environment Canada, (1992) Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or Atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, str. 81.
 
(10) Cox D.R., (1958) Planning of experiments. Wiley Edt.  
(11) Pack S., (1991) Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991.
 
(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, str. 1096-1121.  
(13) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, str. 482-491.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1158
 
(14) Williams D.A., (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, str. 103-117.  
(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T., (1994) A tech ­
nique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncor­
hynchus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 120, str. 
123-133.
 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R.W., (1990) The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, str. 33-41.
 
(17) Post, G., (1987) Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. str. 288.
 
(18) Bruce, R.D. and Versteeg D.J., (1992) A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, str. 1485-1494.  
(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O., (1989) Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
 
(20) Norbert-King T.J., (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. str. 12.
 
(21) Williams D.A., (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, str. 510-531.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1159
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1160
 ▼B 
Dodatak 1.  
PREPORU ČENE RIBLJE VRSTE ZA ISPITIVANJE I PRIKLADNI ISPITNI UVJETI  
Vrste  Preporučni raspon 
temperatura 
(°C) Fotoperiod 
(sati)  Preporučeni raspon 
početnih masa riba 
(g) Potrebna preciznost 
mjerenja  Količna punjenja 
(g/l) Gustoća nasada 
(po litri)  Hrana  Trajanje ispitivanja 
(dani)  
Preporučene vrste:  
Oncorhynchus mykiss  
kalifornijska pastrva  12,5–16,0  12–16  1–5  na najbližih 
100 g  1,2–2,0  4  Suha gotova hrana za mla đ 
salmonida  ≥ 28 
Druge dobro dokumentirane 
vrste:  
Danio rerio  
zebrica  21–25  12–16  0,050–0,100  na najbliži 1 mg  0,2–1,0  5–10  Živa hrana ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28 
Oryzias latipes  (Medaka) 
medaka  21–25  12–16  0,050–0,100  na najbliži 1 mg  0,2–1,0  5–20  Živa hrana ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28
Dodatak 2.  
NEKA KEMIJSKA SVOJSTVA PRIHVATLJIVE VODE ZA 
RAZRJE ĐIVANJE  
Tvar  Koncentracije  
Lebdeće čestice  < 20 mg/l  
Ukupni organski ugljik  < 2 mg/l  
Neionizirani amonijak  < 1 μg/l 
Rezidualni klor  < 10 μg/l 
Ukupni organofosforni pesticidi  < 50 ng/l  
Ukupni organoklorni pesticidi plus poliklorirani bifenili  < 50 ng/l  
Ukupni organski klor  < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1161
 
Dodatak 3.  
Logaritamski niz prikladnih koncentracija za toksikološko ispitivanje (9)  
Stupac (broj koncentracija izme đu 100 i 10 ili izme đu 10 i 1) (*)  
1 2  3  4  5  6  7  
100 100  100  100  100  100  100  
32 46  56  63  68  72  75  
10 22  32  40  46  52  56  
3,2 10  18  25  32  37  42  
1,0 4,6  10  16  22  27  32  
2,2 5,6  10  15  19  24  
1,0 3,2  6,3  10  14  18  
1,8 4,0  6,8  10  13  
1,0 2,5  4,6  7,2  10  
1,6 3,2  5,2  7,5  
1,0 2,2  3,7  5,6  
1,5 2,7  4,2  
1,0 1,9  3,2  
1,4 2,4  
1,0 1,8  
1,3 
1,0 
(*) Iz stupca se može odabrati niz od pet (ili više) uzastopnih koncentracija. Srednje to čke između koncentracija u stupcu (x) nalaze se 
u stupcu (2x + 1). Navedene vrijednosti koncentracija mogu predstavljati volumne ili masene postotke (mg/l ili μg/l). Vrijednosti se 
prema potrebi mogu množiti ili dijeliti bilo kojom potencijom broja 10. Stupac 1 može se koristiti ako postoji velika nesigurno st u 
pogledu razine toksi čnosti. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1162
 
C.15.  TEST KRATKOTRAJNE TOKSI ČNOSTI NA RIBAMA U 
STADIJU EMBRIJA I MLA ĐI SA ŽUMANJ ČANOM 
VREĆICOM  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja kratkotrajne toksi čnosti odgovara smjernici 
OECD TG 212 (1998.).  
1.1. UVOD  
Ovaj test kratkotrajne toksi čnosti na stadiju ribljeg embrija i mla đi sa 
žumanjčanom vre ćicom je kratkotrajni test kojemu se podvrgavaju 
svježe oplo đena jaja do kraja stadija sa žumanj čanom vre ćicom. Za 
vrijeme ispitivanja embrija i mla đi sa žumanj čanom vre ćicom nije 
predviđeno hranjenje i stoga ispitivanje treba prekinuti dok se mla đ 
još hrani iz žumanj čane vrećice. 
Test je namijenjem utvr đivanju letalnih, a u ograni čenoj mjeri i 
subletalnih u činaka kemikalija na ispitivane stadije i vrstu. On bi 
mogao pružiti korisne informacije utoliko što bi (a) mogao poslužiti 
kao most izme đu letalnih i subletalnih ispitivanja, (b) se mogao 
koristiti kao test pretraživanja za provedbu potpunog ispitivanja ranog životnog stadija ili ispitivanja kroni čne toksičnosti i (c) se 
mogao koristiti za ispitivanje vrsta gdje uzgojne tehnike još nisu 
dovoljno napredne da obuhvate razdoblje prijelaza s endogenog na egzogeno hranjenje.
 
Treba imati na umu da op ćenito samo ispitivanja koja uklju čuju sve 
stadije životnog ciklusa riba mogu dati to čnu procjenu kroni čne 
toksičnosti kemikalija za ribe i da svako skra ćeno izlaganje u 
smislu životnih stadija može smanjiti osjetljivost i tako potcijeniti 
kroničnu toksičnost. Stoga se o čekuje da će ispitivanje provedeno 
na ribama u embrionalnom stadiju i stadiju žumanj čane vrećice biti 
manje osjetljivo od potpunog ispitivanja ranih životnih stadija, posebno u slu čaju kemikalija visoke lipofilnosti (log P
 ow > 4) i 
kemikalija sa specifi čnim toksi čnim djelovanjem. Ipak, kod kemika ­
lija s nespecifi čnim narkoti čkim djelovanjem mogu se o čekivati 
manje razlike u osjetljivosti izme đu te dvije vrste ispitivanja (1).  
Prije objave ovog testa najviše iskustava s ispitvanjem embrionalnog 
stadija i stadija žumanj čane vrećice bilo je vezano uz slatkovodnu 
ribu Danio rerio  Hamilton-Buchanan ( Telostei, Cyprinidae  – 
narodno ime zebrica). Zbog tog su u Dodatku 1. navedene detaljnije 
smjernice za provo đenje ispitivanja na toj vrsti. To ne isklju čuje 
korištenje ostalih vrsta s kojima tako đer postoje iskustva (Tablica 1.).  
1.2. DEFINICIJE  
Najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC):  najniža ispi ­
tana koncentracija kod koje je uo čen značajan učinak ispitivane tvari 
(pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom. Ipak, sve ispitne koncen ­
tracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili ve ći štetan u činak od 
onog koji je zabilježen pri LOEC-u.  
Najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC):  ispitna 
koncentracija neposredno ispod LOEC-a.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1163
 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Riblji embriji i mla đ sa žumanj čanom vre ćicom izlažu se nizu 
koncentracija ispitivane tvari otopljene u vodi. U okviru protokola postoji mogu ćnost izbora polustati čkog ili proto čnog postupka. Izbor 
ovisi o vrsti ispitivane tvari. Ispitivanje po činje polaganjem oplo ­ 
đenih jaja u ispitne komore i prestaje neposredno prije nego što 
ijedna ličinka u bilo kojoj ispitnoj komori u potpunosti apsorbira 
svoju žumanj čanu vrećicu odnosno prije nego što se u kontrolama 
zabilježi smrtnost zbog izgladnjelosti. Ocjenjuju se letalni i subletalni 
učinci i uspore đuju s kontrolnim vrijednostima kako bi se utvrdila 
najniža koncentracija s vidljivim u činkom, a time i najviša koncen ­
tracija bez vidljivog u činka. Oni se umjesto toga mogu analizirati i 
uz pomoć regresijskog modela radi procjene koncentracije koja bi 
izazvala u činak u odre đenom postotku (tj. LC/ECx gdje je x 
definirani % u činka).
 
1.4. PODACI O ISPITIVANOJ TVARI  
Trebaju biti raspoloživi rezultati ispitivanja akutne toksi čnosti (vidjeti 
metodu C.1.), po mogu ćnosti provedenog na vrsti odabranoj za ovo 
ispitivanje. Ti rezultati mogu biti korisni za odabir odgovaraju ćeg 
raspona ispitnih koncentracija kod ispitivanja ranih životnih stadija. 
Treba biti poznata topljivost u vodi (uklju čujući topljivost u ispitnoj 
vodi) i tlak pare ispitivane tvari. Osim toga, treba biti raspoloživa 
pouzdana analiti čka metoda za kvantifikaciju tvari u ispitnim otopi ­
nama s poznatom i dokumentiranom to čnošću i granicom detekcije.  
Informacije o ispitivanoj tvari koje mogu biti korisne kod odre đi­
vanja ispitnih uvjeta su strukturna formula, čistoća tvari, stabilnost na 
svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, pKa, P  ow i rezultati ispi ­
tivanja na laku biorazgradivost (vidjeti metodu C.4.).  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, moraju biti zadovoljeni sljede ći uvjeti:  
— ukupno preživljavanje oplo đenih jaja u kontrolama i posudama s 
otapalom bez ispitivane tvari (prema potrebi) mora biti ve ća ili 
jednaka grani čnim vrijednostima definiranim u dodacima 2. i 3.,  
— u čitavom tijeku ispitivanja koncentracija otopljenog kisika mora 
biti između 60 i 100 % vrijednosti zasi ćenja kisikom (ASV),  
— razlike u temperaturi vode izme đu ispitnih komora odnosno 
između uzastopnih dana ne smiju niti u jednom trenutku 
tijekom ispitivanja biti ve će od ± 1,5 °C i trebaju biti unutar 
temperaturnih podru čja utvrđenih za ispitnu vrstu u pitanju 
(dodaci 2. i 3.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1164
 
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Ispitne komore  
Mogu se koristiti bilo kakve staklene ili druge kemijski inertne 
posude. Posude trebaju biti dovoljno velike da se mogu zadovoljiti količne punjenja (vidjeti odjeljak 1.7.1.2.). Preporu čuje se da se 
ispitne posude nasumi čno smjeste unutar ispitnog prostora. Ako u 
laboratoriju postoje sustavni u činci koji se mogu kontrolirati formira ­
njem blokova, slu čajnom bloknom rasporedu gdje su sve obrade 
prisutne u svim blokovima treba dati prednost u odnosu na potpuno slu čajni raspored. Ako se primjenjuje blokni raspored, to 
treba uzeti u obzir kod kasnije analize podataka. Ispitne posude 
treba zaštititi od neželjenog uznemiravanja.
 
1.6.2.  Odabir ribljih vrsta  
Preporučene riblje vrste navedene su u tablici 1.A. To ne isklju čuje 
druge vrste (primjeri su navedeni u tablici 1.B), ali njihovo korištenje 
može zahtijevati prilagodbu ispitnog postupka kako bi se osigurali 
prikladni ispitni uvjeti. U tom slu čaju treba navesti razloge za odabir 
vrste i pokusnu metodu.  
1.6.3.  Držanje uzgojnih riba  
Podaci o prikladnim uvjetima za držanje uzgojnog jata mogu se na ći 
u smjernici OECD TG 210 (  1 ) i u referencama (2)(3)(4)(5)(6).  
1.6.4.  Rukovanje embrijima i li činkama  
Kod izlaganja ispitnoj otopini embriji i li činke se mogu položiti u 
manje posude smještene unutar glavne posude, koje imaju mrežaste 
stranice odnosno krajeve koji omogu ćuju protok otopine kroz 
posudu. Neturbulentno strujanje kroz male posude može se posti ći 
na način da se posude objese o polugu koja posude njiše gore-dolje, 
ali tako da ispitni organizmi ostanu čitavo vrijeme uronjeni; može se 
koristiti i sustav sifonskog ispiranja. Oplo đena jaja salmonida mogu 
se položiti na stalke ili mreže s otvorima koji su dovoljno veliki da ličinke nakon što se izvale mogu kroz njih propasti. Kod polustati ­ 
čkih ispitivanja sa svakodnevnim potpunim obnavljanjem medija 
(vidjeti stavak 1.6.6.) se za uklanjanje embrija i li činki mogu koristiti 
Pasteurove pipete.
 
Ako se za držanje jaja unutar glavne ispitne posude koriste spremnici 
za jaja, rešetke ili mreže, njih treba ukloniti nakon što se li činke 
izvale (  1 ), osim mreža, koje treba zadržati kako bi se onemogu ćio 
bijeg riba. Ako li činke treba premjestiti, one se ne smiju izložiti 
zraku; ribe se iz spremnika za jaja ne smiju vaditi mrežicom 
(takav oprez nije nužan kod nekih manje osjetljivih vrsta, kao što 
je šaran). Vrijeme prijenosa je razli čito ovisno o vrsti, s time da 
prijenos nije uvijek niti potreban. Kod polustati čkog se postupka 
mogu koristiti laboratorijske čaše ili plitki spremnici koji prema 
potrebi mogu biti opremljeni sitom blago izdignutim iznad dna čaše. Ako je zapremnina tih spremnika dovoljna da se zadovolje 
zahtjevi punjenja (vidjeti 1.7.1.2.), li činke i embrije nije nužno 
premještati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1165  
( 1 ) OECD. Paris, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test”.
 1.6.5.  Voda  
Prikladna ispitna voda je svaka voda koja ima kemijska svojstva 
prihvatljive vode za razrje đivanje, kako je navedeno u Dodatku 4., 
i u kojoj je kontrolna vrijednost preživljavanja ispitne vrste barem na 
razini kako je navedeno u dodacima 2. i 3. Ona treba biti stalne 
kakvoće tijekom razdoblja ispitivanja. pH treba održavati unutar 
područja ± 0,5 pH jedinica. Kako voda za razrje đivanje ne bi nepri ­
mjereno utjecala na rezultat ispitivanja (npr. kompleksiranjem ispiti ­
vane tvari) ili imala negativan utjecaj na uspješnost uzgojnog jata, 
potrebno je u odre đenim razmacima uzimati uzorke na analizu. 
Mjerenja teških metala (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), glavnih 
aniona i kationa (npr. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO  4 ), pesticida (npr. 
ukupni organofosforni i ukupni organoklorni pesticidi), ukupnog organskog ugljika i suspendirane krute tvari treba obavljati npr. svaka tri mjeseca ako se zna da je voda za razrje đivanje relativno 
stalne kakvo će. Ako se dokaže da je kakvo ća vode ujedna čena 
tijekom najmanje jedne godine, odre đivanja se mogu prorijediti i 
razmaci pove ćati (npr. svakih šest mjeseci).
 
1.6.6.  Ispitne otopine  
Ispitne otopine odabranih koncentracija pripremaju se razrje đivanjem 
radne otopine.  
Radnu otopinu treba po mogu ćnosti pripremiti jednostavnim miješa ­
njem ili mu ćkanjem ispitivane tvari u vodi za razrje đivanje mehani ­ 
čkim sredstvima (npr. mješa č ili ultrazvuk). Za postizanje prikladne 
koncentracije radne otopine mogu se koristiti kolone za zasi ćivanje 
(„kolone za topljivost”). Uporabu otapala i dispergenata (sredstava za 
otapanje) treba što je mogu će više izbjegavati; ipak, ti su spojevi u 
nekim slu čajevima nužni da bi se dobila radna otopina prikladne 
koncentracije. Primjeri prikladnih otapala su aceton, etanol, metanol, 
dimetilformamid i trietilenglikol. Primjeri prikladnih dispergenata su 
Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01 % i HCO-40. Kod primjene lako biorazgradivih sredstava (npr. aceton) i/ili visoko hlapljivih spojeva potreban je poseban oprez budu ći da oni kod 
protočnih ispitivanja mogu izazvati problem rasta bakterija. Ako se 
koristi sredstvo za otapanje, ono ne smije imati zna čajan učinak na 
preživljavanje niti vidljiv štetni u činak na rane životne stadije, što 
mora potvrditi kontrola s otapalom bez ispitivane tvari. Ipak, treba 
nastojati izbje ći korištenje takvih materijala gdje god je to mogu će.
 
Kod polustati čkog postupka mogu se koristiti dva razli čita postupka 
obnavljanja: i. pripreme se nove ispitne otopine u čistim posudama i 
preživjela jaja i li činke se nježno prenesu u nove posude u maloj 
količini stare otopine, izbjegavaju ći izlaganje zraku, ili ii. ispitni 
organizmi se zadrže u posudama dok se dio ispitne vode (najmanje tri četvrtine) mijenja. U čestalost obnavljanja medija ovisi o stabil ­
nosti ispitivane tvari, ali se u svakom slu čaju preporu čuje dnevno 
obnavljanje vode. Ako iz preliminarnih ispitivanja stabilnosti (vidjeti 
odjeljak 1.4.) proizlazi da koncentracija ispitivane tvari nije stabilna u razdoblju obnavljanja medija (tj. izvan raspona 80 – 120 % nazivne ili pada ispod 80 % izmjerene po četne koncentracije), treba ramisliti 
o provedbi proto čnog ispitivanja. U svakom slu čaju treba paziti da se 
tijekom postupka obnavljanja vode li činke ne izlože stresu.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1166
 
Kod proto čnih je ispitivanja za dopremanje niza koncentracija u 
ispitne komore potreban sustav koji stalno odmjerava i razrje đuje 
radnu otopinu ispitivane tvari (npr. dozirna crpka, proporcionalni razrjeđivač, zasićivač). Brzine protoka radnih otopina i vode za 
razrjeđivanje treba provjeravati u odre đenim razmacima, po mogu ć­
nosti jedanput dnevno, i one za vrijeme ukupnog trajanja ispitivanja 
ne bi smjele odstupati više od 10 %. Pokazalo se da je prikladna brzina protoka koja odgovara barem peterostrukom volumenu ispitne komore u 24 sata (2).
 
1.7. POSTUPAK  
Korisne informacije o provedbi toksikoloških ispitivanja na ribljim 
embrijima i mla đi sa žumanj čanom vre ćicom mogu se prona ći u 
literaturi, a neki od primjera nalaze se na popisu literature za ovaj 
tekst (7)(8)(9).  
1.7.1.  Uvjeti izlaganja  
1.7.1.1.  Trajanje  
Ispitivanje treba po mogu ćnosti početi u roku 30 minuta nakon oplo ­
dnje jaja. Embriji se uranjaju u ispitnu otopinu prije ili što brže 
nakon po četka stadija cijepanja blastodiska, a u svakom slu čaju 
prije ulaska u stadij gastrule. Ako se jaja nabavljaju od trgovca, ispitivanje ponekad nije mogu će započeti odmah nakon oplodnje. 
Budući da odgoda po četka ispitivanja može ozbiljno utjecati na osje ­
tljivost ispitivanja, ispitivanje se mora zapo četi u roku osam sati od 
oplodnje. S obzirom da se li činke ne hrane u razdoblju izlaganja, 
ispitivanje treba prekinuti prije nego što ijedna li činka u bilo kojoj 
ispitnoj komori u potpunosti apsorbira svoju žumanj čanu vrećicu 
odnosno prije nego što se u kontrolama zabilježi smrtnost zbog izgladnjelosti. Trajanje ovisi o vrsti koja se koristi. U dodacima 2. i 3. navedena su neka preporu čena trajanja ispitivanja.
 
1.7.1.2.  Punjenje  
Broj oplo đenih jaja na po četku ispitivanja treba biti dovoljan da se 
zadovolje statisti čki zahtjevi. Jaja treba nasumi čno podijeliti po obra ­
dama koriste ći najmanje 30 oplo đenih jaja po koncentraciji, ravno ­
mjerno raspore đenih (odnosno što ravnomjernije, budu ći da je kod 
nekih vrsta teško dobiti jednake serije) u najmanje tri paralelne ispitne komore (ponavljanja). Koli čna punjenja (biomasa po volu ­
menu ispitne otopine) treba biti dovoljno niska da se koncentracija 
otopljenog kisika može održati barem na razini 60 % ASV-a bez dozračivanja. Preporu čena količna punjenja kod proto čnih ispitivanja 
iznosi najviše 0,5 g/l u 24 sata i najviše 5 g/l otopine u bilo kojem 
trenutku (2).
 
1.7.1.3.  Svjetlost i temperatura  
Fotoperiod i temperaturu ispitne vode treba prilagoditi ispitnoj vrsti 
(dodaci 2. i 3.). Prema potrebi treba dodati jednu ispitnu posudu za 
praćenje temperature.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1167
 
1.7.2.  Ispitne koncentracije  
U pravilu je potrebno pet koncentracija ispitivane tvari koje se 
razlikuju za stalni faktor ne viši od 3,2. Pri odabiru raspona ispitnih koncentracija treba uzeti u obzir krivulju ovisnosti LC
 50 o vremenu 
izlaganja kod istraživanja akutne toksi čnosti. U pojedinim se slu ča­
jevima može koristiti manje od pet koncentracija, primjerice kod graničnih ispitivanja, i uži interval koncentracija. Ako se koristi 
manje od pet koncentracija, treba navesti obrazloženje. Ne treba 
ispitivati koncentracije tvari iznad LC
 50 nakon 96 sati ili 100 mg/l, 
ovisno o tome što je manje. Tvari ne treba ispitivati iznad granice topljivosti u ispitnoj vodi.
 
Ako se kao pomo ć u pripremi ispitnih otopina koristi sredstvo za 
otapanje (vidjeti odjeljak 1.6.6.), njegova kona čna koncentracija u 
ispitnim posudama ne smije biti viša od 0,1 ml/l i mora biti 
jednaka u svim ispitnim posudama.  
1.7.3.  Kontrole  
Uz ispitni niz treba provesti jednu kontrolu s vodom za razrje đivanje 
(s ponavljanjima prema potrebi) i, ako se koristi sredstvo za otapanje, 
jednu kontrolu sa sredstvom za otapanje (s ponavljanjima prema 
potrebi).  
1.7.4.  Učestalost analiti čkih određivanja i mjerenja  
Koncentracije ispitivane tvari odre đuju se u redovitim razmacima za 
vrijeme ispitivanja.  
U slučaju polustati čkih ispitivanja, ako se o čekuje da će koncentra ­
cija ispitivane tvari ostati u granicama ± 20 % nazivnih vrijednosti 
(tj. u rasponu 80 – 120 %; vidjeti odjeljke 1.4. i 1.6.6.), preporu čuje 
se da se u pravilnim razmacima najmanje tri puta tijekom ispitivanja analiziraju barem najviša i najniža ispitna koncentracija, i to odmah 
nakon pripreme i neposredno prije obnavljanja (tj. analize treba 
napraviti na uzorku iz iste otopine – odmah nakon pripreme i kod obnavljanja).
 
Kod ispitivanja gdje se ne o čekuje da će koncentracija ispitivane 
tvari ostati u granicama ± 20 % nazivne vrijednosti (na temelju podataka o stabilnosti ispitivane tvari), potrebno je analizirati sve ispitne koncentracije odmah nakon pripreme i prije obnavljanja 
prema istom režimu (tj. najmanje tri puta tijekom ispitivanja u 
pravilnim razmacima). Odre đivanje koncentracija ispitivane tvari 
prije obnavljanja treba provesti samo na jednoj posudi po ispitnoj koncentraciji. Izme đu dva odre đivanja ne smije pro ći više od sedam 
dana. Preporu čuje se da se rezultati temelje na izmjerenim koncen ­
tracijama. Ipak, ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane tvari u otopini u čitavom tijeku ispitivanja na zadovoljavaju ći način 
održava u granicama ± 20 % nazivne ili izmjerene po četne koncen ­
tracije, rezultati se mogu temeljiti na nazivnim ili izmjerenim početnim vrijednostima.
 
Kod proto čnih ispitivanja treba koristiti sli čan režim uzorkovanja kao 
što je opisano za polustati čka ispitivanja (s time da u ovom slu čaju 
ne vrijedi mjerenje „starih” otopina). Ipak, ako ispitivanje traje duže od sedam dana, dobro je pove ćati broj uzorkovanja u prvom tjednu 
(npr. tri seta mjerenja) kako bi se provjerila stabilnost ispitnih 
koncentracija.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1168
 
Uzorci se ponekad moraju centrifugirati ili filtrirati (npr. uz primjenu 
veličine pora 0,45 μm). Ipak, čini se da se ni filtracijom niti centri ­
fugiranjem ne može uvijek posti ći odvajanje bioraspoložive frakcije 
ispitivane tvari od one koja nije bioraspoloživa; stoga uzorke nije potrebno podvrgavati tim postupcima.
 
Otopljeni kisik, pH i temperaturu treba mjeriti u svim ispitnim posu ­
dama tijekom ispitivanja. Ukupnu tvrdo ću i salinitet (prema potrebi) 
treba mjeriti u kontrolnim posudama i jednoj posudi s najvišom koncentracijom. Otopljeni kisik i salinitet (prema potrebi) treba 
mjeriti barem tri puta (na po četku, u sredini i na kraju ispitivanja). 
Kod polustati čkih se ispitivanja preporu čuje češće mjerenje 
otopljenog kisika, po mogu ćnosti prije i nakon svakog obnavljanja 
vode ili barem jedanput tjedno. pH kod polustati čkog ispitivanja 
treba mjeriti na po četku i na kraju svakog obnavljanja vode, a kod 
protočnih ispitivanja barem jedanput tjedno. Tvrdo ću treba mjeriti 
jedanput kod svakog ispitivanja. Temperaturu treba mjeriti dnevno i po mogu ćnosti neprekidno pratiti u najmanje jednoj ispitnoj posudi.
 
1.7.5.  Promatranja  
1.7.5.1.  Stadij embrionalnog razvoja  
Embrionalni stadij (tj. stadij gastrule) na po četku izlaganja ispitivanoj 
tvari treba što preciznije provjeriti. To se može u činiti pomo ću repre­
zentativnog uzorka jajašaca koja su na prikladan na čin konzervirana i 
očišćena. Opis i prikaz embrionalnog stadija može se pogledati i u 
literaturi (2)(5)(10)(11).  
1.7.5.2.  Valjenje i preživljavanje  
Valjenje i preživljavanje treba promatrati najmanje jedanput dnevno i 
relevantne brojke dokumentirati. Na po četku ispitivanja poželjna su i 
češća promatranja (npr. svakih 30 minuta tijekom prva tri sata), 
budući da u nekim slu čajevima vremena preživljavanja mogu biti 
značajnija od samog broja smrti (npr. u slu čaju akutnih toksi čnih 
učinaka). Mrtve embrije i li činke treba ukloniti čim se uo če, 
budući da se oni mogu brzo raspasti. Kod uklanjanja mrtvih 
jedinki nužan je krajnji oprez kako bi se izbjegli udarci i fizi čko 
ozljeđivanje susjednih jaja/li činki, koji su izuzetno nježni i osjetljivi. 
Kriteriji za utvr đivanje smrti razlikuju se ovisno o životnom stadiju:  
— kod jajašaca:  posebno u ranim stadijima, vidan gubitak prozir ­
nosti i promjena boje zbog koagulacije i/ili taloženja proteina, što rezultira bijelkasto-mutnim izgledom,
 
— kod embrija:  odsutnost kretanja tijela i/ili odsutnost bila i/ili 
mutno obojenje kod vrsta čiji su embriji ina če prozirni,  
— kod ličinki:  nepomičnost i/ili odsutnost pokreta disanja i/ili 
odsutnost bila i/ili bijela mutna boja središnjeg živ čanog 
sustava i/ili izostanak reakcije na mehani čke podražaje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1169
 
1.7.5.3.  Neuobi čajeni izgled  
Broj ličinki kod kojih su vidljive anomalije u obliku tijela i/ili 
pigmentacija kao i stadij apsorpcije žumanj čane vrećice treba bilježiti 
u primjerenim razmacima, ovisno o trajanju ispitivanja i vrsti opisane 
anomalije. Važno je napomenuti da je pojava abnormalnih embrija i 
ličinki prirodna i da ih kod nekih vrsta u kontroli odnosno kontro ­
lama može biti i više postotaka. Abnormalne životinje treba ukloniti iz ispitnih posuda tek nakon smrti.
 
1.7.5.4.  Neuobi čajeno ponašanje  
Anomalije, npr. hiperventilacija, nekoordinirano plivanje i atipi čna 
mirnoća, treba bilježiti u primjerenim razmacima, ovisno o trajanju 
ispitivanja. Ako se uo če takvi u činci, oni mogu, iako ih je teško 
kvantificirati, pomo ći u tumačenju podataka o smrtnosti, tj. pružiti 
informacije o na činu toksičnog djelovanja tvari.  
1.7.5.5.  Dužina  
Preporučuje se da se na kraju ispitivanja izmjere pojedina čne dužine; 
može se koristiti standardna, vili čna ili ukupna dužina. Me đutim, u 
slučaju truleži repne peraje ili erozije peraje treba koristiti standardne 
dužine. Op ćenito, kod dobro provedenih ispitivanja koeficijent vari ­
jacije dužine me đu ponavljanjima u kontrolama trebao bi biti 
≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Masa  
Na kraju ispitivanja mogu se izmjeriti pojedina čne mase; suhoj masi 
(24 sata na 60 °C) se daje prednost u odnosu na mokru masu (osu ­ 
šeno upijaju ćim materijalom). Op ćenito, kod dobro provedenih ispi ­
tivanja koeficijent varijacije mase me đu ponavljanjima u kontrolama 
trebao bi biti ≤ 20 %.  
Na temelju tih zapažanja mogu se dobiti svi ili neki od sljede ćih 
podataka koji se koriste u statisti čkoj analizi:  
— kumulativna smrtnost,  
— broj zdravih li činki na kraju ispitivanja,  
— vrijeme do po četka valjenja i kraja valjenja (tj. 90 % valjenja u 
svakom ponavljanju),  
— broj izvaljenih li činki svakog dana,  
— dužina (i masa) preživjelih životinja na kraju ispitivanja,  
— broj deformiranih li činki odnosno broj li činki neuobi čajenog 
izgleda,  
— broj li činki koje pokazuju neuobi čajeno ponašanje.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1170
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Preporučuje se da se u planiranje ispitivanja i analizu rezultata 
uključi statističar, budući da ova metoda pruža široke mogu ćnosti 
variranja koncepcije pokusa npr. u odnosu na broj ispitnih komora, broj ispitnih koncentracija, po četni broj oplo đenih jaja i mjerene 
parametre. S obzirom na raspoložive opcije u okviru plana ispitiva ­
nja, ovdje se ne navode posebne smjernice u pogledu statisti čkih 
postupaka.
 
Ako se procjenjuje LOEC/NOEC, potrebno je analizirati varijacije 
unutar svakog seta ponavljanja primjenom analize 
varijance (ANOVA) ili tablica kontingencije. Za višestruku uspo ­
redbu rezultata pojedina čnih koncentracija i kontrola može biti 
korisna Dunnettova metoda (12)(13). Postoje i drugi korisni primjeri (14)(15). Potrebno je izra čunati i navesti veli činu učinka koja se 
može utvrditi primjenom ANOVA-e ili drugih postupaka (tj. snaga 
testa). Valja napomenuti da zapažanja navedena u odjeljku 1.7.5.6. nisu sva prikladna za statisti čku analizu uz pomo ć ANOVA-e. 
Primjerice, kumulativna smrtnost i brojevi zdravih li činki na kraju 
ispitivanja mogu se analizirati metodama vjerojatnosti.
 
Ako se procjenjuju LC/EC  x , relevantnim podacima treba prilagoditi 
odgovaraju ću krivulju odnosno krivulje, npr. logisti čku krivulju, 
primjenom statisti čke metode kao što je metoda najmanjih kvadrata 
ili nelinearna metoda najmanjih kvadrata. Krivulja(-e) treba parame ­
trizirati tako da se relevantni LC/EC  x i njegova standardna greška 
može izravno procijeniti. To u velikoj mjeri olakšava izra čun granica 
pouzdanosti oko LC/EC  x . Treba navesti dvostranu pouzdanost na 
razini 95 %, osim ako postoje dobri razlozi za primjenu drugih 
razina pouzdanosti. Poželjno je da postupak prilago đavanja obuhva ća 
metodu za ocjenjivanje zna čajnosti nepodudaranja („lack of fit”). 
Mogu se koristiti grafi čke metode prilago đavanja krivulje. Regre ­
sijska analiza prikladna je za sva zapažanja navedena u odjeljku 
1.7.5.6.  
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Rezultate treba tuma čiti s oprezom ako se izmjerene koncentracije 
toksikanta u ispitnim otopinama nalaze u blizini granice detekcije analitičke metode. Oprez je nužan i kod tuma čenja rezultata za 
koncentracije iznad topljivosti tvari u vodi.
 
2.3. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
2.3.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući čistoću i anali ­
tičku metodu za kvantifikaciju ispitivane tvari (prema potrebi).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1171
 
2.3.2.  Ispitne vrste:  
— znanstveni naziv, soj, broj roditeljskih riba (tj. koliko je ženki 
upotrijebljeno kako bi se osigurao potreban broj jajašaca za ispi ­
tivanje), izvor i metoda skupljanja oplo đenih jaja i kasnije 
rukovanje.  
2.3.3.  Ispitni uvjeti  
— ispitni postupak (npr. polustati čki ili proto čni, vrijeme od oplo ­
dnje do po četka ispitivanja, punjenje itd.),  
— fotoperiod(i),  
— plan ispitivanja (npr. broj ispitnih komora i ponavljanja, broj 
embrija po ponavljanju),  
— način pripreme radnih otopina i u čestalost obnavljanja (ako se 
koristi sredstvo za otapanje, treba ga navesti zajedno s koncen ­
tracijom),  
— nazivne ispitne koncentracije, izmjerene vrijednosti, njihove 
srednje vrijednosti i standardne devijacije u ispitnim posudama 
te metoda kojom su dobivene; ako je ispitivana tvar topljiva u vodi u koncentracijama ispod ispitanih, treba pružiti dokaz da se mjerenja odnose na koncentracije ispitivane tvari u otopini,
 
— svojstva vode za razrje đivanje: pH, tvrdo ća, temperatura, koncen ­
tracija otopljenog kisika, rezidualni klor (ako se mjeri), ukupni organski ugljik, suspendirana kruta tvar, salinitet ispitnog medija 
(ako se mjeri) i ostala provedena mjerenja,
 
— kakvo ća vode u ispitnim posudama: pH, tvrdo ća, temperatura i 
koncentracija otopljenog kisika.  
2.3.4.  Rezultati:  
— rezultati preliminarnih istraživanja stabilnosti ispitivane tvari,  
— dokaz da kontrole zadovoljavaju op ći standard prihvatljivosti 
stopa preživljavanja za ispitnu vrstu (dodaci 2. i 3.),  
— podaci o smrtnosti/preživljavanju u embrionalnom stadiju i 
stadiju ličinke i ukupna smrtnost/preživljavanje,  
— broj dana do valjenja i broj izvaljenih životinja,  
— podaci o dužini (i masi),  
— pojavnost i opis morfoloških anomalija, ako ih ima,  
— pojavnost i opis u činaka na ponašanje, ako ih ima,  
— statisti čka analiza i obrada podataka,  
— kod ispitivanja koja se analiziraju pomo ću ANOVA-e, najniža 
koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC) pri p = 0,05 i 
najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC) za svaki 
ocijenjeni odgovor, uklju čujući opis primijenjenih statisti čkih 
postupaka i naznaku koju je veli činu učinka bilo mogu će utvrditi,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1172
 
— kod ispitivanja koja se analiziraju regresijskim tehnikama, 
LC/EC  x i intervali pouzdanosti te graf prilago đenog modela 
koji je korišten za izra čun, 
— obrazloženje svih odstupanja od ove ispitne metode.  
3. REFERENCE  
(1) Kristensen P., (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, str. 60. June 1990.
 
(2) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting Early Life-Stage 
Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. str. 26
 
(3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A., (1975) Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
(4) Brungs W.A. and Jones B.R., (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio ) in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, str. 121-173.  
(6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brac­
hydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, str. 328-330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B. 
and Viktor T., (1987) Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish ( Brachydanio rerio ) Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 
6, str. 61-71.
 
(8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G., (1985) Short-term 
Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the 
Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating 
Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, str. 807-821.
 
(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri ). J. Aquatic Toxicology, 9, str. 129-145.
 
(10) Kirchen R.V. and W. R. West (1969) Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen R.V. and W. R. West (1976) The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply 
Company, North Carolina. str. 36.  
(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, str. 482-491.  
(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G., (1980) Stati ­
stical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Procee ­
dings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phila ­
delphia.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J., (1990) 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, str. 321-334.  
(16) Environment Canada., (1992) Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, str. 81.
 
(17) Dave G. and Xiu R., (1991) Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio . Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, str. 126-134.  
(18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G., (1993) The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system in 
developmental biology — an invitation to the comperative 
methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 
231-236.  
(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P., 
(1995) Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and 
Environmental Safety 32, str. 19-28.
 
(20) US EPA, (1991) Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes . EPA report EPA/600/3-91/064, 
Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991) Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., Poccocic T.L., 
Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D., (1991) Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow 
(Pimephales promelas ) larval survival and growth test: an 
intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, str. 1189-1203.
 
(23) Calow P., (1993) Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.  
(24) Balon E.K., (1985) Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, str. 280.
 
(25) Blaxter J.H.S., (1988) Pattern and variety in development, In: 
W.S. Hoar and D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, 
Academic press, str. 1-58.  
Tablica 1.A  
Preporučene riblje vrste za ispitivanje  
SLATKOVODNE  
Oncorhynchus mykiss  
Kalifornijska pastrva (9)(16)  
Danio rerio  
Zebrica (7)(17)(18)  
Cyprinus caprio  
Šaran (8)(19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20)(21)  
Pimephales promelas  
Debeloglava gaovica (8)(22)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1174
 
Tablica 1.B  
Primjeri drugih dobro dokumentiranih vrsta koje su tako đer korištene  
SLATKOVODNE  MORSKE  
Carassius auratus  
Zlatna ribica (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23)(24)(25)  
Lepomis macrochirus  
Plavoškrga sun čanica (8)  Clupea harengus  
Haringa (24)(25)  
Gadus morhua  
Bakalar (24)(25)  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow (23)(24)(25)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1175
 
Dodatak 1.  
SMJERNICE ZA PROVO ĐENJE TOKSIKOLOŠKOG ISPITIVANJA NA 
EMBRIJIMA I MLA ĐI SA ŽUMANJ ČANOM VRE ĆICOM ZEBRICE 
(BRACHIDANYIO RERIO ) 
UVOD  
Zebrica potje če s obale Coromandel u Indiji, gdje nastanjuje brzace. To je raspro ­
stranjena akvarijska riba iz porodice šarana i informacije o njezinom održavanju i 
uzgoju mogu se na ći u standardnim priru čnicima o tropskim ribama. O njezinoj 
biologiju i uporabi u ribarstvenim istraživanjima govori Laale (1).  
Ova riba rijetko prelazi dužinu od 45 mm. Tijelo joj je cilindri čno sa 7 – 9 
tamnoplavih vodoravnih srebrenkastih pruga. Te se pruge protežu do repne i podrepne peraje. Le đa su joj maslinastozelena. Mužjaci su vitkiji od ženki. 
Kod ženki je srebrena boja izraženija i trbuh im je nadut, posebno prije mrije ­ 
štenja.
 
Odrasle ribe mogu podnijeti velike fluktuacije u temperaturi, pH i tvrdo ći. Među­
tim, da bi se dobile zdrave ribe koje daju kvalitetna jaja, treba osigurati optimalne uvjete.
 
Kod mriještenja mužjak snubi ženku i nasr će na nju, a čim ona izbaci jaja, on ih 
oplođava. Jaja, koja su prozirna i neljepljiva, padaju na dno, gdje ih mogu pojesti 
roditelji. Na mriještenje utje če svjetlost. Ako je jutarnja svjetlost dostatna, ribe se 
obično mrijeste u ranim jutarnjim satima nakon svitanja.  
Ženka može proizvesti serije od po nekoliko stotina jaja u tjednim razmacima.  
UVJETI ZA RODITELJSKE RIBE, REPRODUKCIJU I RANE ŽIVOTNE 
STADIJE  
Odabere se odgovaraju ći broj zdravih riba i drži u prikladnoj vodi (npr. Prilog 4.) 
najmanje dva tjedna prije planiranog mriještenja. Skupinu riba treba pustiti da se 
barem jedanput omrijesti prije nego što daju jaja koja će se koristiti za ispitivanje. 
Gustoća riba u tom razdoblju ne smije prije ći 1 gram ribe po litri. Ako se voda 
redovito mijenja odnosno ako se koriste sustavi za pro čišćavanje, gusto ća može 
biti i veća. Temperaturu u bazenima treba održavati na 25 ± 2 °C. Ribama treba 
osigurati raznovrsnu ishranu, koja se može sastojati npr. od odgovaraju će suhe 
industrijske hrane, živih novoizvaljenih artemija, trzalaca, dafnija, bijelih crvi (Enchytraeidae ).
 
U nastavku su opisana dva postupka, koji su u praksi dali dostatne serije zdravih 
oplođenih jaja za provedbu ispitivanja:  
i. 8 ženki i 16 mužjaka stavi se u bazen s 50 litara vode za razrje đivanje, 
zakloni od izravne svjetlosti i ostavi tako najmanje 48 sati, izbjegavaju ći 
svako uznemiravanje. U poslijepodnevnim satima na dan prije po četka ispiti ­
vanja na dno se akvarija stavi podložak za polijeganje jaja. Podložak za 
polijeganje jaja sastoji se od okvira (od pleksi-stakla ili drugog prikladnog materijala) visine 5 – 7 cm na čiji je vrh pri čvršćena gruba mreža 2 – 5 mm, 
dok se na dnu nalazi fina mreža 10 – 30 μm. Određeni broj „stabala za 
mriještenje”, koja se sastoje od nesukanog najlonskog užeta, pri čvrsti se na 
grubu mrežu na okviru. Ribe se ostave u mraku 12 sati, nakon čega se uklju či 
slabo svjetlo koje poti če mriještenje. Dva do četiri sata nakon mriještenja 
ukloni se podložak i skupe jaja. Podložak za polijeganje jaja spre čava ribe 
da pojedu jaja i istodobno olakšava skupljanje jaja. Skupina riba mora imati 
barem jedan mrijest prije mrijesta koji se koristi u ispitivanju.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1176
 
ii. 5 do 10 mužjaka i ženki drži se pojedina čno najmanje dva tjedna prije pred ­
viđenog mriještenja. Nakon 5 – 10 dana trbusi ženki se napuhnu i njihove 
genitalne papile postanu vidljive. Mužjaci nemaju papile. Mriještenje se provodi u mrijesnim bazenima koji imaju lažno mrežasto dno (kao gore). Bazen se napuni vodom za razrje đivanje, tako da dubina vode iznad mreže 
bude 5 – 10 cm. U bazen se stavi jedna ženka i dva mužjaka dan prije 
predviđenog mriještenja. Temperatura vode se postupno povisi za jedan 
stupanj iznad temperature aklimatizacije. Isklju či se svjetlo i bazen ostavi 
što je mogu će više u miru. Ujutro se uklju či slabo svjetlo koje poti če mrije­ 
štenje. Nakon dva do četiri sata ribe se uklone i skupe se jaja. Ako su 
potrebne ve će serije jaja koje se ne mogu dobiti od jedne ženke, može se 
postaviti dovoljan broj paralelnih mrijesnih bazena. Bilježenjem pojedina čne 
reproduktivne uspješnosti ženki prije ispitivanja (veli čina serije i kakvo ća) 
mogu se za uzgoj odabrati ženke koje su reproduktivno najuspješnije.
 
Jaja se prenose u ispitne posude pomo ću staklenih cjev čica (čiji unutanji promjer 
ne smije biti manji od 4 mm) koje su opremljene fleksibilnom pumpicom. Koli ­ 
čina vode koja se prenosi s jajima treba biti što manja. Jaja su teža od vode i 
propadaju kroz cjev čicu. Treba paziti da jaja (i li činke) ne do đu u dodir sa 
zrakom. Mikroskopskim pregledom uzor(a)ka serije odnosno serija treba se uvje ­
riti da u prvim razvojnim stadijima nema nepravilnosti. Dezifinciranje jaja nije dopušteno.
 
Stopa smrtnosti jaja najviša je unutar prva 24 sata nakon oplodnje. U tom se 
razdoblju često može uo čiti smrtnost 5 – 40 %. Do degeneracije jaja dolazi zbog 
neuspješne oplodnje ili grešaka u razvoju. Čini se da kakvo ća serije jaja ovisi o 
ženki, budu ći da neke ženke stalno poliježu jaja dobre kakvo će, a druge nikada. 
Osim toga, brzina razvoja i stopa valjenja razlikuju se od serije do serije. Uspješno oplo đena jaja i li činke sa žumanj čanom vre ćicom dobro preživljavaju, 
uglavnom iznad 90 %. Na 25 °C do valjenja dolazi tri do pet dana nakon 
oplodnje, a žumanj čana se vre ćica apsorbira približno 13 dana nakon oplodnje.
 
Embrionalni razvoj su dobro definirali Hisaoka i Battle (2). Zahvaljuju ći prozir­
nosti jaja i li činki može se pratiti razvoj riba i uo čiti prisutnost malformacija. 
Neoplođena se jaja mogu razlikovati od oplo đenih oko četiri sata nakon mrije ­ 
štenja (3). Za ovaj pregled jaja i li činke treba staviti u ispitne posude male 
zapremnine i prou čiti pod mikroskopom.  
Ispitni uvjeti koji se odnose na rane životne stadije navedeni su u Dodatku 2. 
Optimalne vrijednosti pH i tvrdo će vode za razrje đivanje su 7,8 odnosno 250 mg 
CaCO  3 /l. 
IZRAČUNI I STATISTIKA  
Preporučuje se pristup u dvije faze. Prvo se provede statisti čka analiza podataka 
o smrtnosti, razvojnim anomalijama i vremenu valjenja. Zatim se statisti čki 
ocijeni dužina tijela za koncentracije kod kojih nisu otkriveni štetni u činci niti 
na jedan od ovih parametara. Ovaj je pristup preporu čljiv, budu ći da toksikant 
može selektivno ubijati manje ribe, odgoditi vrijeme valjenja i izazvati grube malformacije i tako dovesti do pristranosti u mjerenjima dužine. Nadalje, 
potrebno je izmjeriti približno isti broj riba u svakoj obradi kako bi se osigurala 
valjanost statistike ispitivanja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1177
 
ODREĐIVANJE LC  50 I EC  50 
Izračuna se postotak preživjelih jaja i li činki i ispravi za smrtnost u kontroli u 
skladu s Abbottovom formulom (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
gdje je:  
P = ispravljeni % preživljavanja  
P’ = % preživljavanja u ispitnoj koncentraciji  
C = % preživljavanja u kontroli  
Ako je to mogu će, LC  50 se određuje prikladnom metodom na kraju ispitivanja.  
Ako se u statistiku EC  50 žele uklju čiti morfološke anomalije, odgovaraju će se 
smjernice mogu prona ći kod Stephana (5).  
PROCJENA LOEC-a I NOEC-a  
Cilj ispitivanja jaja i mla đi sa žumanj čanom vre ćicom je usporediti koncentracije 
s učinkom s kontrolom tj. odrediti LOEC. Stoga je potrebno primijeniti postupke 
višestruke usporedbe (6)(7)(8)(9)(10).  
REFERENCE  
(1) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, str. 
121-173.  
(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I., (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, str. 
311. 
(3) Nagel R., (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, str. 173-181.  
(4) Finney D.J., (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, str. 1-333.  
(5) Stephan C.E., (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, str. 69-81.
 
(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096- 
1121.  
(7) Dunnett C.W., (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, str. 482-491.  
(8) Williams D.A., (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, str. 103-117.  
(9) Williams D.A., (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, str. 519-531.  
(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J., (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1178
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1179
 ▼B 
Dodatak 2.  
ISPITNI UVJETI, TRAJANJE I KRITERIJI PREŽIVLJAVANJA ZA PREPORU ČENE VRSTE  
Vrste  Temp. 
(°C) Salinitet 
(0/00)  Fotoperiod 
(sati)  Trajanje stadija 
(dani)  Tipično trajanje ispitivanja  Preživljavanje u kontroli 
(najmanje %)  
Embrij  Žumanjčana 
vrećica Uspješnost 
valjenja  Nakon valjenja  
SLATKOVODNE  
Brachydanio rerio  
Zebrica  25 ± 1  —  12 – 16  3 – 5  8 – 10  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 5 dana nakon valjenja (8 – 
10 dana)  80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Kalifornijska pastrva  10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30 – 35  25 – 30  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 20 dana nakon valjenja (50 – 
55 dana)  66 70  
Cyprinus caprio  
Šaran  21 – 25  —  12 – 16  5  > 4  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 4 dana nakon valjenja (8 – 9 
dana)  80 75  
Oryzias latipes  
Medaka  24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12 – 16  8 – 11  4 – 8  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 5 dana nakon valjenja (13 – 16 dana)
 80 80  
Pimephales promelas  
Debeloglava gaovica  25 ± 2  —  16  4 – 5  5  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 4 dana nakon valjenja (8 – 9 dana)
 60 70  
( 1 ) Za embrije. 
( 2 ) Za ličinke. 
( a ) Tama za embrije i li činke do jednog tjedna nakon valjenja, osim kod pregledavanja. Zatim prigušeno svjetlo u čitavom tijeku ispitivaja.
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1180
 ▼B 
Dodatak 3.  
Ispitni uvjeti, trajanje i kriteriji preživljavanja za ostale dobro dokumentirane vrste  
Vrste  Temp. (°C)  Salinitet (0/00)  Fotoperiod (sati)  Trajanje stadija (dani)  
Tipično trajanje ispitivanja na embrijima i mla đi sa 
žumanjčanom vre ćicom  Preživljavanje u kontroli 
(najmanje %)  
Embrij  Žumanjčana 
vrećica Uspješnost 
valjenja  Nakon valjenja  
SLATKOVODNE  
Carassius auratus  
Zlatna ribica  24 ± 1  —  —  3 – 4  > 4  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 4 dana nakon valjenja (7 dana)  — 80  
Lepomis macrochirus  
Plavoškrga sun čanica  21 ± 1  —  16  3  > 4  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 4 dana nakon valjenja (7 dana)  — 75  
MORSKE  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside  22 – 25  15 – 22  12  1,5  10  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 5 dana nakon valjenja (6 – 7 
dana)  80 60  
Clupea harengus  
Haringa  10 ± 1  8 – 15  12  20 – 25  3 – 5  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 3 dana nakon valjenja (23 – 
27 dana)  60 80  
Gadus morhua  
Bakalar  5 ± 1  5 – 30  12  14 – 16  3 – 5  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 3 dana nakon valjenja (18 
dana)  60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow  25 ± 21  15 – 30  12  —  —  Što prije nakon oplodnje (rani stadij 
gastrule) do 4/7 dana nakon valjenja (28 dana)
 > 75  80
Dodatak 4.  
NEKA KEMIJSKA SVOJSTVA PRIHVATLJIVE VODE ZA 
RAZRJE ĐIVANJE  
Tvar  Koncentracije  
Lebdeće čestice  < 20 mg/l  
Ukupni organski ugljik  < 2 mg/l  
Neionizirani amonijak  < 1 μg/l 
Rezidualni klor  < 10 μg/l 
Ukupni organofosforni pesticidi  < 50 ng/l  
Ukupni organoklorni pesticidi plus poliklorirani bifenili  < 50 ng/l  
Ukupni organski klor  < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1181
 
C.16.  MEDONOSNE P ČELE – ISPITIVANJE AKUTNE ORALNE 
TOKSIČNOSTI  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja akutne toksi čnosti odgovara smjernici OECD 
TG 213 (1998.).  
1.1. UVOD  
Ovaj toksikološki test je laboratorijska metoda namijenjena ocjenji ­
vanju akutne oralne toksi čnosti sredstava za zaštitu bilja i drugih 
kemikalija za odrasle medonosne p čele radilice.  
Prilikom ocjenjivanja toksi čnih svojstava tvari ponekad je potrebno 
odrediti akutnu oralnu toksi čnost na medonosnim p čelama, npr. kad 
je vjerojatno izlaganje p čela kemikaliji. Test akutne oralne toksi č­
nosti provodi se kako bi se odredila svojstvena toksi čnost pesticida i 
drugih kemikalija za p čele. Na temelju rezultata ovog testa treba 
definirati potrebu za daljnjim ocjenjivanjem. Ova se metoda može koristiti posebno u stupnjevitim programima za ocjenjivanje opasnosti pesticida za p čele, koji se temelje na postupnom prijelazu 
s laboratorijskih toksikoloških ispitivanja na poluterenske i terenske 
pokuse (1). Pesticidi se mogu ispitivati kao aktivne tvari (a.s.) ili kao formulirani proizvodi.
 
Za provjeru osjetljivosti p čela i preciznosti ispitnog postupka treba 
koristiti toksi čni standard.  
1.2. DEFINICIJE  
Akutna oralna toksi čnost:  štetni učinak koji nastupa unutar najviše 
96 sati nakon oralne primjene jedne doze ispitivane tvari.  
Doza:  unesena koli čina ispitivane tvari. Doza se izražava kao masa 
(μg) ispitivane tvari po ispitnoj životinji ( μg/pčela). Stvarna doza za 
svaku pojedinu p čelu ne može se izra čunati budu ći da se pčele hrane 
skupno, ali se može procijeniti prosje čna doza (ukupno unesena 
ispitivana tvar/broj ispitivanih p čela u jednom kavezu).  
Oralni LD  50 (medijan letalne doze):  statistički izvedena pojedi ­
načna doza tvari koja može izazvati smrt 50 % životinja kod 
primjene oralnim putem. Vrijednost LD  50 izražava se u μg ispitivane 
tvari po p čeli. Kod pesticida ispitivana tvar može biti aktivna tvar 
(a.s.) ili formulirani proizvod koji sadrži jednu ili više aktivnih tvari.  
Smrtnost:  životinja se bilježi kao mrtva kad je potpuno nepomi čna. 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Odrasle medonosne p čele radilice ( Apis mellifera ) izlažu se nizu 
doza ispitivane tvari dispergirane u še ćernoj otopini. P čele se zatim 
hrane istom hranom bez ispitivane tvari. Smrtnost se bilježi dnevno 
tijekom najmanje 48 sati i uspore đuje s kontrolnim vrijednostima. 
Ako se stopa smrtnosti pove ća između 24 i 48 sati, a kontrolna 
smrtnost ostane na prihva ćenoj razini tj. ≤ 10 %, vrijeme ispitivanja 
treba produžiti na najviše 96 sati. Rezultati se analiziraju kako bi se 
izračunao LD  50 nakon 24 i 48 sati te, u slu čaju produžetka istraživa ­
nja, nakon 72 i 96 sati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1182
 
1.4. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, treba zadovoljiti sljede će uvjete:  
— prosje čna smrtnost u ukupnom broju kontrola na kraju ispitivanja 
ne smije biti viša od 10 %,  
— LD  50 toksičnog standarda odgovara utvr đenom podru čju. 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Skupljanje p čela 
Treba koristiti mlade odrasle p čele radilice iste pasmine tj. p čele iste 
dobi, stanja uhranjenosti itd. P čele trebaju potjecati iz dobro hranje ­
nih, zdravih zajednica s maticom, u kojima nema pojava bolesti (u mjeri u kojoj je to mogu će) i čija je povijest i fiziološki status 
poznat. Treba ih skupiti u jutro uporabe ili ve čer prije ispitivanja i 
držati u ispitnim uvjetima do sljede ćeg dana. Prikladne su p čele 
skupljene s okvira bez legla. Skupljanje u rano prolje će i kasnu 
jesen treba izbjegavati budu ći da pčele u tom razdoblju imaju promi ­
jenjenu fiziologiju. Ako se ispitivanja moraju provoditi u rano 
proljeće ili kasnu jesen, p čele se mogu pustiti da se izlegu u inku ­
batoru i jedan tjedan uzgajati na „p čelinjoj hrani” (pelud prikupljena 
iz saća) i šećernoj otopini. P čele liječene kemikalijama kao što su 
antibiotici, sredstva protiv varooze itd. ne smiju se koristiti u toksi ­
kološkim ispitivanjima četiri tjedna nakon prestanka zadnjeg lije če­
nja.
 
1.5.2.  Uvjeti smještaja i hranjenja  
Koriste se dobro zra čeni kavezi koji se lako čiste. Mogu se koristiti 
svi prikladni materijali npr. nehr đajući čelik, žičana mreža, plasti čni 
ili jednokratni drveni kavezi itd. Poželjno je koristiti skupine od 10 pčela po kavezu. Veli čina ispitnih kaveza treba biti prilago đena broju 
pčela tj. treba im osiguravati dovoljno prostora.
 
Pčele se u pokusnoj prostoriji drže u mraku na temperaturi od 
25 ± 2 °C. Za vrijeme ukupnog trajanja ispitivanja treba bilježiti 
relativnu vlažnost, u pravilu oko 50 – 70 %. Svi postupci, uklju ču­
jući obradu i promatranja, mogu se provoditi na (dnevnom) svjetlu. 
Kao hrana se koristi še ćerna otopina u vodi s kona čnom koncen ­
tracijom 500 g/l (50 % w/v). Nakon primjene ispitnih doza hranu 
treba davati  ad libitum . Sustav hranjenja treba omogu ćivati bilježenje 
unosa hrane za svaki kavez (vidjeti odjeljak 1.6.3.1.). Može se kori ­
stiti staklena cjev čica (oko 50 mm dužine i 10 mm širine čiji je 
otvoreni kraj sužen na oko 2 mm promjera).  
1.5.3.  Priprema p čela 
Skupljene se p čele nasumi čno rasporede u ispitne kaveze, koji su 
nasumično smješteni u pokusnoj prostoriji.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1183
 
Pčele se mogu izgladnjivati najviše 2 sata prije po četka ispitivanja. 
Preporučuje se da se p čelama uskrati hrana prije obrade kako bi sve 
pčele imale jednak crijevni sadržaj na po četku ispitivanja. Prije 
početka ispitivanja moribundne p čele treba odbaciti i zamijeniti 
zdravim p čelama.  
1.5.4.  Priprema doza  
Ako je ispitivana tvar mješljiva s vodom, ona se može izravno 
dispergirati u 50 %-tnoj še ćernoj otopini. U slu čaju tehničkih proiz­
voda i tvari koje su slabo topljive u vodi mogu se koristiti nosa či, 
kao što je organsko otapalo, emulgatori ili dispergenti niske toksi č­
nosti za p čele (npr. aceton, dimetilformamid, dimetilsulfoksid). 
Koncentracija nosa ča ovisi o topljivosti ispitivane tvari i treba biti 
jednaka u svim ispitnim koncentracijama. Ipak, koncentracija nosa ča 
od 1 % je op ćenito primjerena i ne bi se smjela prekora čiti. 
Treba pripremiti odgovaraju će kontrolne otopine, tj. ako se za 
otapanje ispitivane tvari koristi otapalo ili dispergent, treba koristiti 
dvije odvojene kontrolne skupine: otopina u vodi i še ćerna otopina s 
otapalom/nosa čem u koncentraciji koja se koristi u otopinama za 
doziranje.  
1.6. POSTUPAK  
1.6.1.  Ispitne i kontrolne skupine  
Broj doza i ponavljanja treba zadovoljavati statisti čke zahtjeve za 
određivanje LD  50 s granicama pouzdanosti 95 %. U pravilu je za 
test potrebno pet doza u geometrijskom nizu s faktorom do najviše 
2,2, koje obuva ćaju podru čje LD  50 . Ipak, faktor razrje đenja i broj 
koncentracija za doziranje treba odrediti s obzirom na nagib krivulje toksičnosti (doza – smrtnost) i vode ći računa o statisti čkoj metodi 
odabranoj za analizu rezultata. Ispitivanje za odre đivanje raspona 
omogućuje odabir odgovaraju ćih koncentracija za doziranje.
 
Svakoj ispitnoj koncentraciji treba izložiti najmanje tri paralelne 
ispitne skupine od po 10 p čela. Uz ispitni niz potrebne su još 
najmanje tri kontrolne serije, svaka po 10 p čela. Za primijenjena 
otapala/nosa če treba predvidjeti dodatne kontrolne serije (vidjeti 
odjeljak 1.5.4).  
1.6.2.  Toksi čni standard  
U ispitne nizove treba uklju čiti toksični standard. Treba odabrati 
barem tri doze koje obuhva ćaju očekivanu vrijednost LD  50 . Potrebna 
su najmanje tri paralelna kaveza s po 10 p čela po ispitnoj dozi. 
Poželjno je da se kao toksi čni standard koristi dimetoat, čiji se utvr ­ 
đeni oralni LD  50 za 24 sata kre će u podru čju 0,10 – 0,35 μg a.s. po 
pčeli (2). Ipak, prihvatljivi su i drugi toksi čni standardi ako se može 
osigurati dovoljno podataka za provjeru o čekivanog odgovora na 
dozu (npr. paration).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1184
 
1.6.3.  Izlaganje  
1.6.3.1.  Primjena doza  
Svakoj ispitnoj skupini p čela treba dati 100 – 200 μl 50 %-tne 
šećerne otopine u vodi koja sadrži odgovaraju ću koncentraciju ispi ­
tivane tvari. Kod proizvoda niske topljivosti, niske toksi čnosti ili 
niske koncentracije u formulaciji potrebna je ve ća količina jer se 
moraju koristiti ve ći udjeli u še ćernoj otopini. Treba pratiti koli činu 
unosa obra đene hrane po skupinama. Kad se hrana potroši (obi čno 
unutar 3 – 4 sata) hranilica se uklanja iz kaveza i zamjenjuje hrani ­
licom koja sadrži samo še ćernu otopinu. Še ćerne otopine se zatim 
daju ad libitum . Kod nekih se spojeva kod ve ćih koncentracija može 
dogoditi da zbog odbijanja ispitne doze do đe do slabog unosa hrane 
ili potpunog izostanka unosa. Nakon najviše 6 sati nepotrošenu obra ­ 
đenu hranu treba zamijeniti čistom šećernom otopinom. Treba proci ­
jeniti unesenu koli činu obrađene hrane (npr. mjerenje volumena/mase 
preostale obra đene hrane).  
1.6.3.2.  Trajanje  
Ispitivanje po mogu ćnosti treba trajati 48 sati nakon što se ispitna 
otopina zamijeni čistom šećernom otopinom. Ako smrtnost nastavi 
rasti više od 10 % nakon prva 24 sata, vrijeme ispitivanje treba produžiti do najviše 96 sati, pod uvjetom da kontrolna smrtnost 
nije viša od 10 %.
 
1.6.4.  Promatranja  
Smrtnost se bilježi 4 sata nakon po četka ispitivanja i zatim nakon 24 
i 48 sati (tj. nakon davanja doze). Ako je potrebno duže razdoblje 
promatranja, ocjenjivanje se nastavlja u razmacima od 24 sati do 
najviše 96 sati, pod uvjetom da kontrolna smrtnost ne prelazi 10 %.  
Treba procijeniti koli činu unosa hrane po skupinama. Usporedbom 
količine unosa obra đene i neobra đene hrane unutar predvi đenih 6 sati 
mogu se dobiti informacije o ukusnosti obra đene hrane.  
Tijekom razdoblja ispitivanja treba bilježiti sva uo čena neuobi čajena 
ponašanja.  
1.6.5.  Grani čno ispitivanje  
U pojedinim se slu čajevima (npr. kad se o čekuje da ispitivana tvar 
ima nisku toksi čnost) može provesti grani čno ispitivanje uz primjenu 
100 μg a.s. po p čeli kako bi se dokazalo da je LD  50 viši od te 
vrijednosti. Treba primijeniti isti postupak, uklju čujući tri paralelne 
ispitne skupine po ispitnoj dozi, relevantne kontrole, procjenu koli ­ 
čine unosa obra đene hrane i korištenje toksi čnog standarda. Ako se 
pojavi smrtnost, treba provesti potpuno istraživanje. Treba zabilježiti 
sve uočene subletalne u činke (vidjeti odjeljak 1.6.4.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1185
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku, navode ći za svaku 
ispitnu i kontrolnu skupinu kao i skupinu toksi čnog standarda broj 
pčela i smrtnost u svakom vremenu promatranja te broj p čela promi ­
jenjenog ponašanja. Podaci o smrtnosti analiziraju se prikladnim 
statističkim metodama (npr. analiza vjerojatnosti, pomi čni prosjek, 
binomna vjerojatnost) (3)(4). Izrade se krivulje doza-odgovor u svakom preporu čenom vremenu promatranja i izra čunaju nagibi 
krivulja te medijan letalnih doza (LD
 50 ) s granicama pouzdanosti 
95 %. Ispravci s obzirom na kontrolnu smrtnost mogu se u činiti 
pomoću Abbottove korekcije (4)(5). Ako obra đena hrana nije u cije ­
losti potrošena, treba odrediti unesenu dozu ispitivane tvari po skupi ­
nama. LD  50 treba izraziti u μg ispitivane tvari po p čeli. 
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva (npr. 
stabilnost u vodi, tlak pare),  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući strukturnu 
formulu, čistoću (tj. za pesticide: identitet i koncentraciju aktiv ­
ne(-ih) tvari).  
2.2.2.  Ispitna vrsta:  
— znanstveni naziv, pasmina, približna dob (u tjednima), na čin 
skupljanja, datum skupljanja,  
— informacije o zajednicama iz kojih potje ču ispitne p čele, uklju ­ 
čujući zdravstveno stanje, eventualne bolesti odraslih i prethodne 
obrade itd.  
2.2.3.  Ispitni uvjeti  
— temperatura i relativna vlažnost pokusne prostorije,  
— uvjeti smještaja, uklju čujući vrstu, veli činu i materijal kaveza,  
— način pripreme radnih i ispitnih otopina (ako se koristi otapalo, 
otapalo i koncentracija),  
— plan ispitivanja, npr. broj i ispitne koncentracije, broj kontrola; za 
svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu: broj paralelnih kaveza i broj pčela po kavezu,
 
— datum ispitivanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1186
 
2.3.4.  Rezultati:  
— rezultati preliminarnog istraživanja za odre đivanje raspona, ako 
se provodi,  
— sirovi podaci: smrtnost pri svakoj ispitanoj dozi u svakom 
vremenu promatranja,  
— graf krivulja doza-odgovor na kraju ispitivanja,  
— vrijednosti LD  50 s granicama pouzdanosti 95 % u svakom prepo ­
ručenom vremenu promatranja, za ispitivanu tvar i toksi čni 
standard,  
— statisti čki postupci primijenjeni za odre đivanje LD  50 , 
— smrtnost u kontrolama,  
— drugi zapaženi ili izmjereni biološki u činci npr. neuobi čajeno 
ponašanje p čela (uklju čujući odbijanje ispitne doze), koli čina 
unosa hrane u obra đenim i neobra đenim skupinama,  
— sva odstupanja od ovdje opisanih ispitnih postupaka i sve druge 
relevantne informacije.  
3. REFERENCE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 
1993.  
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, str. 119-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, str. 99-113.
 
(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, str. 265-267.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1187
 
C.17.  MEDONOSNE P ČELE – ISPITIVANJE AKUTNE 
KONTAKTNE TOKSI ČNOSTI  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja akutne toksi čnosti odgovara smjernici OECD 
TG 214 (1998.).  
1.1. UVOD  
Ovaj toksikološki test je laboratorijska metoda namijenjena ocjenji ­
vanju akutne kontaktne toksi čnosti sredstava za zaštitu bilja i drugih 
kemikalija za odrasle medonosne p čele radilice.  
Prilikom ocjenjivanja toksi čnih svojstava tvari ponekad je potrebno 
odrediti akutnu kontaktnu toksi čnost kod medonosnih p čela, npr. kad 
je vjerojatno izlaganje p čela kemikaliji. Test akutne kontaktne toksi č­
nosti provodi se kako bi se odredila svojstvena toksi čnost pesticida i 
drugih kemikalija za p čele. Na temelju rezultata ovog testa treba 
definirati potrebu za daljnjim ocjenjivanjem. Ova se metoda može koristiti posebno u stupnjevitim programima za ocjenjivanje opasnosti pesticida za p čele, koji se temelje na postupnom prijelazu 
s laboratorijskih toksikoloških ispitivanja na poluterenske i terenske 
pokuse (1). Pesticidi se mogu ispitivati kao aktivne tvari (a.s.) ili kao formulirani proizvodi.
 
Za provjeru osjetljivosti p čela i preciznosti ispitnog postupka treba 
koristiti toksi čni standard.  
1.2. DEFINICIJE  
Akutna kontaktna toksi čnost:  štetni učinci koji nastupaju unutar 
najviše 96 sati nakon topikalne primjene jedne doze tvari.  
Doza:  primijenjena koli čina ispitivane tvari. Doza se izražava kao 
masa (μg) ispitivane tvari po ispitnoj životinji ( μg/pčela). 
Kontaktni LD  50 (medijan letalne doze): statisti čki izvedena pojedi ­
načna doza tvari koja može izazvati smrt 50 % životinja kod 
kontaktne primjene. Vrijednost LD  50 izražava se u μg ispitivane 
tvari po p čeli. Kod pesticida ispitivana tvar može biti aktivna tvar 
(a.s.) ili formulirani proizvod koji sadrži jednu ili više aktivnih tvari.  
Smrtnost:  životinja se bilježi kao mrtva kad je potpuno nepomi čna. 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Odrasle medonosne p čele radilice ( Apis mellifera ) izlažu se nizu 
doza ispitivane tvari otopljene u odgovaraju ćem nosaču izravnim 
nanošenjem na prsni koš (kapljice). Ispitivanje traje 48 sati. Ako 
se stopa smrtnosti pove ćava izme đu 24. i 48. sata, a kontrolna 
smrtnost ostane na prihva ćenoj razini tj. ≤ 10 %, vrijeme ispitivanja 
treba produžiti na najviše 96 sati. Smrtnost se bilježi dnevno i uspo ­
ređuje s kontrolnim vrijednostima. Rezultati se analiziraju kako bi se 
izračunao LD  50 nakon 24 i 48 sati te, u slu čaju produžetka istraživa ­
nja, nakon 72 i 96 sati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1188
 
1.4. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, treba zadovoljiti sljede će uvjete:  
— prosje čna smrtnost u ukupnom broju kontrola na kraju ispitivanja 
ne smije biti viša od 10 %,  
— LD  50 toksičnog standarda odgovara utvr đenom podru čju. 
1.5. OPIS ISPITNE METODE  
1.5.1.  Skupljanje p čela 
Treba koristiti mlade odrasle p čele radilice tj. p čele iste dobi, stanja 
uhranjenosti, pasmine itd. P čele trebaju potjecati iz dobro hranjenih, 
zdravih zajednica s maticom, u kojima nema pojava bolesti (u mjeri u kojoj je to mogu će) i čija je povijest i fiziološki status poznat. 
Treba ih skupiti u jutro uporabe ili ve čer prije ispitivanja i držati u 
ispitnim uvjetima do sljede ćeg dana. Prikladne su p čele skupljene s 
okvira bez legla. Skupljanje u rano prolje će i kasnu jesen treba 
izbjegavati budu ći da pčele u tom razdoblju imaju promijenjenu 
fiziologiju. Ako se ispitivanja moraju provoditi u rano prolje će ili 
kasnu jesen, p čele se mogu pustiti da se izlegu i jedan tjedan uzgajati 
na „pčelinjoj hrani” (pelud prikupljena iz sa ća) i šećernoj otopini. 
Pčele liječene kemikalijama kao što su antibiotici, sredstva protiv 
varooze itd. ne smiju se koristiti u toksikološkim ispitivanjima 
četiri tjedna nakon prestanka zadnjeg lije čenja.
 
1.5.2.  Uvjeti smještaja i hranjenja  
Koriste se dobro zra čeni kavezi koji se lako čiste. Mogu se koristiti 
svi prikladni materijali npr. nehr đajući čelik, žičana mreža, plasti čni, 
jednokratni drveni kavezi itd. Veli čina ispitnih kaveza treba biti 
prilagođena broju p čela tj. treba im osiguravati dovoljno prostora. 
Poželjno je koristiti skupine od 10 p čela po kavezu.  
Pčele se u pokusnoj prostoriji drže u mraku na temperaturi od 
25 ± 2 °C. Za vrijeme ukupnog trajanja ispitivanja treba bilježiti 
relativnu vlažnost, u pravilu oko 50 – 70 %. Svi postupci, uklju ču­
jući obradu i promatranje, mogu se provoditi na (dnevnom) svjetlu. 
Kao hrana se koristi še ćerna otopina u vodi s kona čnom koncen ­
tracijom 500 g/l (50 % w/v), koju treba davati  ad libitum  tijekom 
razdoblja ispitivanja putem hranilice za p čele. To može biti staklena 
cjevčica (približno 50 mm dužine i 10 mm širine čiji je otvoreni kraj 
sužen na oko 2 mm promjera).  
1.5.3.  Priprema p čela 
Skupljene p čele se prije primjene ispitivane tvari mogu anestetizirati 
ugljikovim dioksidom ili dušikom. Koli činu anestetika i vrijeme 
izlaganja treba svesti na najmanju mogu ću mjeru. Prije po četka ispi­
tivanja moribundne p čele treba odbaciti i zamijeniti zdravim 
pčelama.  
1.5.4.  Priprema doza  
Ispitivana se tvar primjenjuje kao otopina u nosa ču tj. organskom 
otapalu ili vodenoj otopini sa sredstvom za vlaženje. Poželjno je da se kao organsko otapalo koristi aceton, ali mogu se koristiti i druga 
organska otapala niske toksi čnosti za p čele (npr. dimetilformamid, 
dimetilsulfoksid). U slu čaju formuliranih proizvoda dispergiranih u 
vodi i jako polarnih organskih tvari koje nisu topljive u organskim otapalima, primjena otopina može se olakšati pripremom u slaboj 
otopini komercijalnog sredstva za vlaženje (npr. Agral, Cittowett, 
Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1189
 
Treba pripremiti odgovaraju će kontrolne otopine tj. ako se za 
otapanje ispitivane tvari koristi otapalo ili dispergent, treba koristiti 
dvije odvojene kontrolne skupine, jednu obra đenu vodom i jednu 
obrađenu otapalom/dispergentom.  
1.6. POSTUPAK  
1.6.1.  Ispitne i kontrolne skupine  
Broj doza i ponavljanja treba zadovoljavati statisti čke zahtjeve za 
određivanje LD  50 s granicama pouzdanosti 95 %. U pravilu je za 
test potrebno pet doza u geometrijskom nizu s faktorom do najviše 
2,2, koje obuva ćaju podru čje LD  50 . Ipak, broj doza treba odrediti s 
obzirom na nagib krivulje toksi čnosti (doza – smrtnost) i vode ći 
računa o statisti čkoj metodi odabranoj za analizu rezultata. Ispiti ­
vanje za odre đivanje raspona omogu ćuje odabir odgovaraju ćih doza.  
Svakom ispitnom koncentracijom treba dozirati najmanje tri para ­
lelne ispitne skupine od po 10 p čela. 
Uz ispitni niz potrebne su još najmanje tri kontrolne serije, svaka po 
10 pčela. Ako se koristi organsko otapalo ili sredstvo za vlaženje, 
treba uvesti tri dodatne kontrolne serije s po 10 p čela za otapalo 
odnosno sredstvo za vlaženje.  
1.6.2.  Toksi čni standard  
U ispitne nizove treba uklju čiti toksični standard. Treba odabrati 
barem tri doze koje obuhva ćaju očekivanu vrijednost LD  50 . Potrebna 
su najmanje tri paralelna kaveza s po 10 p čela po ispitnoj dozi. 
Poželjno je da se kao toksi čni standard koristi dimetoat, čiji se utvr ­ 
đeni oralni LD  50 za 24 sata kre će u podru čju 0,10 – 0,30 μg a.s. po 
pčeli (2). Ipak, prihvatljivi su i drugi toksi čni standardi ako se može 
osigurati dovoljno podataka za provjeru o čekivanog odgovora na 
dozu (npr. paration).  
1.6.3.  Izlaganje  
1.6.3.1.  Primjena doza  
Anestetizirane se p čele obrađuju pojedina čno topikalnom primjenom. 
Pčele se nasumi čno raspore đuju po ispitnim dozama i kontrolama. 1 
μl otopine koja sadrži odgovaraju ću koncentraciju ispitivane tvari 
treba primijeniti na stražnju stranu prsnog koša svake p čele 
pomoću mikroaplikatora. U opravdanom se slu čaju mogu koristiti i 
drugi volumeni. Nakon toga se p čele rasporede po ispitnim kavezima 
i daje im se še ćerna otopina.  
1.6.3.2.  Trajanje  
Ispitivanje po mogu ćnosti traje 48 sati. Ako se izme đu 24. i 48. sata 
smrtnost pove ća za više od 10 %, vrijeme ispitivanja treba produžiti 
do najviše 96 sati, pod uvjetom da kontrolna smrtnost nije viša od 
10 %.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1190
 
1.6.4.  Promatranja  
Smrtnost se bilježi 4 sata nakon doziranja i zatim nakon 24 i 48 sati. 
Ako je potrebno duže razdoblje promatranja, ocjenjivanje se nastavlja u razmacima od 24 sati do najviše 96 sati, pod uvjetom 
da kontrolna smrtnost ne prelazi 10 %.
 
Tijekom razdoblja ispitivanja treba bilježiti sva uo čena neuobi čajena 
ponašanja.  
1.6.5.  Grani čno ispitivanje  
U pojedinim se slu čajevima (npr. kad se o čekuje da ispitivana tvar 
ima nisku toksi čnost) može provesti grani čno ispitivanje uz primjenu 
100 μg a.s. po p čeli kako bi se dokazalo da je LD  50 viši od te 
vrijednosti. Treba primijeniti isti postupak, uklju čujući tri paralelne 
ispitne skupine po ispitnoj dozi, relevantne kontrole i korištenje 
toksičnog standarda. Ako se pojavi smrtnost, treba provesti 
potpuno istraživanje. Treba zabilježiti sve uo čene subletalne u činke 
(vidjeti odjeljak 1.6.4.).  
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. PODACI  
Podatke treba sažeto prikazati u tabli čnom obliku, navode ći za svaku 
ispitnu i kontrolnu skupinu kao i skupinu toksi čnog standarda broj 
pčela i smrtnost u svakom vremenu promatranja te broj p čela promi ­
jenjenog ponašanja. Podaci o smrtnosti analiziraju se prikladnim 
statističkim metodama (npr. analiza vjerojatnosti, pomi čni prosjek, 
binomna vjerojatnost) (3)(4). Izrade se krivulje doza-odgovor u 
svakom preporu čenom vremenu promatranja (tj. 24 sata, 48 sati i, 
prema potrebi, 72 i 96 sati) i izra čunaju nagibi krivulja te medijan 
letalnih doza (LD  50 ) s granicama pouzdanosti 95 %. Ispravci s 
obzirom na kontrolnu smrtnost mogu se u činiti pomo ću Abbottove 
korekcije (4)(5). LD  50 treba izraziti u μg ispitivane tvari po p čeli. 
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva (npr. 
stabilnost u vodi, tlak pare),  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući strukturnu 
formulu, čistoću (tj. za pesticide: identitet i koncentraciju aktiv ­
ne(-ih) tvari).  
2.2.2.  Ispitna vrsta:  
— znanstveni naziv, pasmina, približna dob (u tjednima), na čin 
skupljanja, datum skupljanja,  
— informacije o zajednicama iz kojih potje ču ispitne p čele, uklju ­ 
čujući zdravstveno stanje, eventualne bolesti odraslih i prethodne 
obrade itd.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1191
 
2.2.3.  Ispitni uvjeti  
— temperatura i relativna vlažnost pokusne prostorije,  
— uvjeti smještaja, uklju čujući vrstu, veli činu i materijal kaveza,  
— način primjene ispitivane tvari npr. otapalo nosa č, volumen 
ispitne otopine, primijenjeni anestetici,  
— plan ispitivanja, npr. broj i ispitne doze, broj kontrola; za svaku 
ispitnu dozu i kontrolu: broj paralelnih kaveza i broj p čela po 
kavezu,  
— datum ispitivanja.  
2.2.4.  Rezultati:  
— rezultati preliminarnog istraživanja za odre đivanje raspona, ako 
se provodi,  
— sirovi podaci: smrtnost pri svakoj ispitanoj koncentraciji u 
svakom vremenu promatranja,  
— graf krivulja doza-odgovor na kraju ispitivanja,  
— vrijednosti LD  50 s granicama pouzdanosti 95 % u svakom prepo ­
ručenom vremenu promatranja, za ispitivanu tvar i toksi čni 
standard;  
— statisti čki postupci primijenjeni za odre đivanje LD  50 , 
— smrtnost u kontrolama,  
— drugi zapaženi ili izmjereni biološki u činci i svi neuobi čajeni 
odgovori p čela, 
— sva odstupanja od ovdje opisanih ispitnih postupaka i sve druge 
relevantne informacije.  
3. REFERENCE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, str. 151-165. March, 
1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, str. 119-125.
 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, str. 99-113.
 
(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, str. 265-267.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1192
 
C.18.  ŠARŽNO ISPITIVANJE ADSORPCIJE/DESORPCIJE U 
RAVNOTEŽI  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 106 za odre đivanje 
adsorpcije/desorpcije u tlu metodom šaržnog ispitivanja u ravnoteži.  
1.1. UVOD  
Ova metoda uzima u obzir prstenasti test i radionicu o odabiru tala 
za izradu adsorpcijskog testa (1)(2)(3)(4) kao i postoje će smjernice 
na nacionalnoj razini (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).  
Istraživanja adsorpcije/desorpcije korisna su za dobivanje potrebnih 
informacija o pokretljivosti kemikalija i njihovoj razdiobi u zemnim, vodnim i zra čnim segmentima biosfere (12)(13)(14)(15)(16) 
(17)(18)(19)(20)(21). Te se informacije mogu koristiti za predvi đanje 
odnosno procjenu npr. raspoloživosti kemikalije za razgradnju (22)(23), pretvorbe i unosa u organizme (24), ispiranja kroz profil tla (16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28), hlapljivosti iz tla (21)(29)(30), 
otjecanja s kompnenih površina u prirodne vode (18)(31)(32). Podaci 
o adsorpciji mogu se koristiti u poredbene svrhe i za modeliranje (19)(33)(34)(35).
 
Razdioba kemikalije izme đu faze tla i vodene faze je složen proces 
koji ovisi o nizu razli čitih faktora: kemijska svojstva tvari (12)(36) 
(37)(38)(39)(40), svojstva tla (4)(12)(13)(14)(41)(42) (43)(44)(45) 
(46)(47)(48)(49) i klimatski faktori kao što su padaline, temperatura, sunčeva svjetlost i vjetar. Stoga se brojne pojave i mehanizmi koji 
sudjeluju u procesu adsorpcije kemikalije na tlo ne mogu u potpu ­
nosti definirati pojednostavnjenim laboratorijskim modelom kao što 
je ova metoda. Ipak, čak i ako ovaj pokušaj ne može obuhvatiti sve 
moguće slučajeve u okolišu, on daje vrijedne informacije o okolišnoj 
relevantnosti adsorpcije kemikalije.
 
Vidjeti tako đer Opći uvod.  
1.2. PODRU ČJE PRIMJENE  
Svrha ove metode je procijeniti adsorpcijsko/desorpcijsko ponašanje 
tvari na tlima. Cilj je dobiti sorpcijsku vrijednost koja se može kori ­
stiti za predvi đanje razdiobe u razli čitim uvjetima okoliša; u tu se 
svrhu ravnotežni koeficijenti adsorpcije za kemikaliju na razli čitim 
tlima odre đuju kao funkcija svojstava tla (npr. sadržaj organskog 
ugljika, sadržaj gline, tekstura tla i pH). Treba koristiti razli čite 
vrste tla kako bi se što šire obuhvatile interakcije pojedine tvari s 
tlima koja se pojavljuju u prirodi.  
U ovoj metodi adsorpcija predstavlja proces vezanja kemikalije na 
površinu tla; ona ne razlikuje razli čite adsorpcijske procese (fizikalna 
i kemijska adsorpcija) i procese kao što su površinski katalizirana razgradnja, slojna adsorpcija ili kemijska reakcija. Osim toga, ona ne 
uzima u obzir adsorpciju koja se javlja na koloidnim česticama 
(promjera < 0,2 μm) koje stvara tlo.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1193
 
Smatra se da su najvažniji parametri tla za adsorpciju sadržaj organ ­
skog ugljika (3)(4)(12)(13)(14)(41)(43)(44)(45)(46)(47)(48), sadržaj 
gline i tekstura tla (3)(4)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48) te pH za ioniziraju će spojeve (3)(4)(42). Ostali parametri tla koji mogu imati 
utjecaja na adsorpciju/desorpciju odre đene tvari su efektivni kapacitet 
izmjene kationa (ECEC), sadržaj amorfnog željeza i aluminijevih 
oksida, posebno kod vulkanskih i tropskih tala (4) kao i specifi čna 
površina (49).
 
Test je namijenjen ocjenjivanju adsorpcije kemikalije na razli čitim 
vrstama tla s razli čitim sadržajem organskog ugljika i gline i 
različitom teksturom tla i pH. On obuhva ća tri razine:  
1. razina:  preliminarno istraživanje za odre đivanje:  
— omjera tlo/otopina,  
— ravnotežnog vremena za adsorpciju i koli čine ispiti­
vane tvari koja je adsorbirana u ravnoteži,  
— adsorpcije ispitivane tvari na površinama ispitnih 
posuda i stabilnosti ispitivane tvari u razdoblju 
ispitivanja.  
2. razina:  test pretraživanja: prou čavanje adsorpcije na pet razli čitih 
vrsta tla pri jednoj koncentraciji uz pomo ć kinetike 
adsorpcije i odre đivanja koeficijenta razdiobe K  d i K  oc. 
3. razina:  određivanje Freundlichovih adsorpcijskih izotermi u 
svrhu odre đivanja utjecaja koncentracije na obim adsorp ­
cije na tlo.  
Proučavanje desorpcije uz pomo ć kinetike desorpcije/ 
Freundlichovih desorpcijskih izotermi (Dodatak 1.).  
1.3. DEFINICIJE I JEDINICE  
Symbol  Definicija  Jedinice  
A t i postotak adsorpcije u vremenu t  i % 
A eq postotak adsorpcije u adsorpcijskoj ravnoteži  %  
m ads 
s ðt i Þ masa ispitivane tvari adsorbirana na tlo u vremenu t  i μg 
m ads 
s ðΔt i Þ masa ispitivane tvari adsorbirana na tlo u vremenskom 
intervalu Δt i μg 
m ads 
s ðecÞ masa ispitivane tvari adsorbirana na tlo u adsorpcijskoj 
ravnoteži  μg 
m 0 masa ispitivane tvari u epruveti na po četku adsorpcijskog 
testa μg 
m ads 
m ðt i Þ masa ispitivane tvari izmjerena u alikvotu  v A 
a u vremenu t  i μg 
m ads 
ap ðecÞ masa tvari u otopini u adsorpcijskoj ravnoteži  μg 
m soil količina faze tla, izražena u suhoj masi tla  g  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1194
 
Symbol  Definicija  Jedinice  
C st masena koncentracija radne otopine tvari  μg cm  -3 
C 0 početna masena koncentracija ispitne otopine u dodiru s 
tlom μg cm  -3 
C ads 
ap ðt i Þ masena koncentracija tvari u vodenoj fazi u vremenu t  i u 
kojemu se provodi analiza  μg cm  -3 
C ads 
s ðecÞ sadržaj tvari adsorbiran na tlo u adsorpcijskoj ravnoteži  μg g  -1 
C ads 
ap ðecÞ masena koncentracija tvari u vodenoj fazi u adsorpcijskoj 
ravnoteži  μg cm  -3 
V 0 početni volumen vodene faze u dodiru s tlom tijekom 
adsorpcijskog testa  cm 3 
v A 
a volumen alikvota u kojemu se mjeri ispitivana tvar  cm  3 
K d koeficijent razdiobe za adsorpciju  cm  3 g -1 
K oc koeficijent adsorpcije normiran na organski ugljik  cm  3 g -1 
K so koeficijent razdiobe normiran na organsku tvar  cm  3 g -1 
K ads 
F Freundlichov koeficijent adsorpcije  μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlichov eksponent  
D t i postotak desorpcije u vremenu t  i % 
D Δt i postotak desorpcije u vremenskom intervalu Δt i % 
K des prividni koeficijent desorpcije  cm  3 g -1 
K des 
F Freundlichov koeficijent desorpcije  μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m des 
ap ðt i Þ masa ispitivane tvari desorbirana iz tla u vremenu t  i μg 
m des 
m ðΔt i Þ masa ispitivane tvari desorbirana iz tla u intervalu Δt i μg 
m des 
m ðecÞ masa tvari odre đena analiti čki u vodenoj fazi u desorpcij ­
skoj ravnoteži  μg 
m des 
ap ðecÞ ukupna masa ispitivane tvari desorbirana u desorpcijskoj 
ravnoteži  μg 
m des 
s ðΔt i Þ masa tvari koja ostaje adsorbirana na tlu nakon vremen ­
skog intervala Δt i μg 
m A 
ap masa tvari preostala nakon uspostave adsorpcijske ravno ­
teže zbog nepotpune zamjene volumena  μg 
C des 
s ðecÞ sadržaj ispitivane tvari koji ostaje adsorbiran na tlu u 
desorpcijskoj ravnoteži  μg g -1 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1195
 
Symbol  Definicija  Jedinice  
C des 
ap ðecÞ masena koncentracija ispitivane tvari u vodenoj fazi u 
desorpcijskoj ravnoteži  μg cm  -3 
V T ukupni volumen vodene faze u dodiru s tlom tijekom 
pokusa s kinetikom desorpcije koji se izvodi serijskom metodom
 cm 3 
V R volumen supernatanta uklonjen iz epruvete nakon uspo ­
stave adsorpcijske ravnoteže i zamijenjen istim volumenom 
otopine 0,01 M CaCl  2 cm 3 
v D 
a volumen alikvota uzetog na analizu od vremena (i) tijekom 
pokusa s kinetikom desorpcije koji se izvodi serijskom metodom
 cm 3 
V ra i D volumen otopine uzet iz epruvete (i) u svrhu mjerenja 
ispitivane tvari u pokusu s kinetikom desorpcije (paralelna metoda)
 cm 3 
V F 
r volumen otopine uzet iz epruvete u svrhu mjerenja ispiti ­
vane tvari u desorpcijskoj ravnoteži  cm 3 
MB bilanca mase  %  
m E ukupna masa ispitivane tvari ekstrahirana iz tla i sa stijenki 
ispitne posude u dva koraka  μg 
V rec volumen supernatanta dobiven nakon adsorpcijske ravno ­
teže cm 3 
P ow podjelni koeficijent oktanol/voda  
pKa konstanta disocijacije  
S w topljivost u vodi  g l  -1 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Poznati volumeni otopina ispitivane tvari (koja može biti neobilje ­ 
žena ili radioaktivno obilježena) u 0,01 M CaCl  2 u poznatoj koncen ­
traciji dodaju se uzorcima tla poznate suhe mase koji su prethodno ekvilibrirani u 0,01 M CaCl
 2 . Smjesa se trese koliko je potrebno. 
Suspenzije tla se zatim odvoje centrifugiranjem i, po želji, filtracijom 
te se analizira vodena faza. Koli čina ispitivane tvari adsorbirana na 
uzorku tla izra čunava se kao razlika izme đu količine ispitivane tvari 
koja je prvobitno bila prisutna u otopini i koli čine preostale na kraju 
pokusa (neizravna metoda).  
Osim toga, adsorbirana koli čina ispitivane tvari može se odrediti i 
izravno analizom tla (izravna metoda). Ovaj postupak, koji uklju čuje 
postupnu ekstrakciju iz tla odgovaraju ćim otapalom, preporu čuje se u 
slučajevima kad se razlika koncentracije tvari u otopini ne može 
točno odrediti. Primjeri takvih slu čajeva su: adsorpcija ispitivane 
tvari na površini ispitnih posuda, nestabilnost ispitivane tvari u 
vremenskom okviru pokusa, slaba adsorpcija koja rezultira tek neznatnom promjenom koncentracije otopine i jaka adsorpcija kojom se dobiva niska koncentracija koja se ne može to čno odrediti. 
Ako se koristi radioaktivno obilježena tvar, ekstrakcija iz tla može se 
izbjeći analizom faze tla izgaranjem i brojenjem metodom teku ćinske 
scintilacije. Me đutim, brojenje metodom teku ćinske scintilacije je 
nespecifična tehnika koja ne razlikuje polazne proizvode od proiz ­
voda pretvorbe; stoga ga treba koristiti samo ako je ispitivana kemi ­
kalija stabilna u razdoblju ispitivanja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1196
 
1.5. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Kemijski reagensi trebaju biti analiti čki čisti. Preporu čuje se uporaba 
neobilježenih ispitivanih tvari poznatog sastava i po mogu ćnosti 
barem 95 %-tne čistoće ili radioaktivno obilježenih ispitivanih tvari 
poznatog sastava i radioaktivne čistoće. U slu čaju obilježiva ča s 
kratkim vremenom poluraspada, treba primijeniti korekcije za raspadanje.
 
Prije provedbe ispitivanja adsorpcije/desorpcije trebaju biti raspolo ­ 
žive sljede će informacije o ispitivanoj tvari:  
(a) topljivost u vodi (A.6.);  
(b) tlak pare (A.4.) i/ili konstanta Henryjevog zakona;  
(c) abioti čka razgradnja: hidroliza kao funkcija pH (C.7.);  
(d) podjelni koeficijent (A.8.);  
(e) laka biorazgradivost (C.4.) ili aerobna i anaerobna pretvorba u 
tlu; 
(f) pKa ioniziraju ćih tvari;  
(g) izravna fotoliza u vodi (tj. apsorpcijski spektar UV-VIS u vodi, 
kvantni prinos) i fotokemijska razgradnja na tlu.  
1.6. PRIMJENLJIVOST TESTA  
Test se može primijeniti kod kemikalija za koje je raspoloživa 
dovoljno to čna analiti čka metoda. Važan parametar koji može utje ­
cati na pouzdanost rezultata, posebno ako se primjenjuje neizravna metoda, je stabilnost ispitivane tvari u vremenskom okviru ispitiva ­
nja. Prema tomu, treba obavezno provjeriti stabilnost tvari u prelimi ­
narnom istraživanju; ako je unutar vremenskog okvira ispitivanja 
uočena pretvorba, preporu čuje se da se u glavnom istraživanju anali ­
zira i faza tla i teku ća faza.
 
Poteškoće u provedbi ovog ispitivanja mogu se javiti kod ispitivanih 
tvari koje su slabo topljive u vodi (S  w < 10  -4 g l -1 ) kao i kod tvari 
visokog naboja jer se koncentracija u vodenoj fazi ne može analiti čki 
izmjeriti s dovoljnom to čnošću. U tom slu čaju treba poduzeti 
dodatne korake. Smjernice za prevladavanje tih problema mogu se 
naći u odgovaraju ćim odjeljcima ove metode.  
Kod ispitivanja hlapljivih tvari treba voditi ra čuna da se izbjegnu 
gubici tijekom istraživanja.  
1.7. OPIS METODE  
1.7.1.  Aparatura i kemijski reagensi  
Standardna laboratorijska oprema, posebno:  
(a) epruvete odnosno posude za izvo đenje pokusa. Važno je da se te 
epruvete odnosno posude  
— mogu izravno umetnuti u ure đaj za centrifugiranje kako bi se 
greške kod rukovanja i prijenosa svele na najmanju mogu ću 
mjeru,  
— budu izra đene od inertnog materijala, kako bi se u najve ćoj 
mogućoj mjeri smanjila adsorpcija ispitivane tvari na 
njihovoj površini;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1197
 
(b) naprava za tresenje: rotacijska tresilica ili istovjetna oprema; 
naprava za tresenje treba za vrijeme tresenja održavati tlo u 
suspenziji;  
(c) centrifuga: po mogu ćnosti velike brzine, npr. centrifugalne sile > 
3 000 g, s regulacijom temperature, koja iz vodene otopine može 
ukloniti čestice promjera ve ćeg od 0,2 μm. Za vrijeme miješanja 
i centrifugiranja posude trebaju biti poklopljene kako bi se izbjeglo hlapljenje i gubici vode; da bi se smanjila adsorpcija, treba koristiti inaktivirane poklopce kao što su poklopci s 
navojem obloženi teflonom;
 
(d) fakultativno: naprava za filtriranje; filtri poroznosti 0,2 μm, 
sterilni, jednokratni. Kod filtara posebnu pažnju treba posvetiti izboru materijala kako bi se izbjegli gubici ispitivane tvari na 
filtru; kod slabo topljivih ispitivanih tvari ne preporu čuju se filtri 
od organskog materijala;
 
(e) analiti čki instrumenti prikladni za mjerenje koncentracije ispiti ­
vane kemikalije;  
(f) laboratorijski sušionik koja može održavati temperaturu od 
103 °C do 110 °C.  
1.7.2.  Opisivanje i odabir tala  
Tla treba opisati pomo ću tri parametra koji se smatraju najve ćim 
dijelom odgovornima za adsorpcijsku sposobnost: organski ugljik, sadržaj gline i tekstura tla te pH. Kao što je ve ć spomenuto (vidjeti 
Područje primjene), i druga fizikalno-kemijska svojstva tla mogu 
imati utjecaja na adsorpciju/desorpciju odre đene tvari pa ih treba 
uzeti u obzir prema potrebi.
 
Vrlo je važno koje će se metode koristiti za opisivanje tla jer one 
mogu imati zna čajan utjecaj na rezultate. Stoga se preporu čuje da se 
pH tla mjeri u otopini 0,01 M CaCl  2 (to je otopina koja se koristi 
kod ispitivanja adsorpcije/desorpcije) u skladu s odgovaraju ćom 
metodom ISO (ISO-10390-1). Preporu čuje se da se odrede i druga 
relevantna svojstva tla u skladu sa standardnim metodama (primje ­
rice ISO „Handbook of Soil Analysis”); to omogu ćuje da se analiza 
podataka o sorpciji temelji na jedinstvenim me đunarodnim parame ­
trima tla. Neke smjernice za postoje će standardne analiti čke metode i 
opisivanja tla navedene su u literaturi (50-52). Za baždarenje metoda 
za ispitivanje tla preporu čuje se korištenje referentnih tala.  
Smjernice za odabir tala za adsorpcijske/desorpcijske pokuse nalaze 
se u tablici 1. Sedam odabranih tala obuhva ćaju vrste tla koje se 
susreću u umjerenim geografskim zonama. U slu čaju ioniziraju ćih 
ispitivanih tvari, odabrana tla trebaju obuhva ćati širok raspon pH 
vrijednosti kako bi se mogla ocijeniti adsorpcija tvari u njezinom ioniziranom i neioniziranom obliku. Smjernice za broj tala koji 
treba koristiti u razli čitim fazama ispitivanja nalaze se u odjeljku 
1.9. „Provo đenje ispitivanja”.
 
Ako se ipak koriste druge vrste tla, ona se moraju opisati na temelju 
istih parametara i trebaju imati sli čan raspon svojstava kao tla 
opisana u tablici 1., čak i onda ako u potpunosti ne ispunjavaju 
kriterije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1198
 
Tablica 1.:  
Smjernice za odabir uzoraka tla za ispitivanje adsorpcije/desorpcije  
Vrsta tla  Područje pH (u 0,01 
M CaCl  2 ) Sadržaj organskog 
ugljika (%)  Sadržaj gline (%)  Tekstura tla (  1 ) 
1 4,5 – 5,5  1,0 – 2,0  65 – 80  glina  
2 > 7,5  3,5 – 5,0  20 – 40  glinasta ilova ča 
3 5,5 – 7,0  1,5 – 3,0  15 – 25  praškasta ilova ča 
4 4,0 – 5,5  3,0 – 4,0  15 – 30  ilova ča 
5 < 4,0 – 6,0 (  2 ) < 0,5 – 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10 – 15 (  2 ) ilovasti pijesak  
6 > 7,0  < 0,5 – 1, 0 (  2 ) ( 3 ) 40 – 65  glinasta ilova ča/ 
glina  
7 < 4,5  > 10  < 10  pijesak/ilovasti 
pijesak  
( 1 ) U skladu sa sustavom FAO i ameri čkim sustavom (85). 
( 2 ) Vrijedosti varijabli trebaju se po mogu ćnosti nalaziti unutar zadanog podru čja. Ipak, ako pronalaženje odgovaraju ćeg 
materijala predstavlja problem, prihva ćaju se i vrijednosti ispod navedenog minimuma. 
( 3 ) Tla s manje od 0,3 % organskog ugljika mogu poremetiti korelaciju izme đu organskog sadržaja i adsorpcije. Stoga se 
preporučuje koristiti tla sa sadržajem organskog ugljika od najmanje 0,3 %.  
1.7.3.  Skupljanje i čuvanje uzoraka tla  
1.7.3.1.  Skupljanje  
Ne postoje preporu čene tehnike niti alati za uzorkovanje: tehnika 
uzorkovanja ovisi o svrsi istraživanja (53)(54)(55)(56)(57)(58).  
Treba uzeti u obzir sljede će: 
(a) potrebne su detaljne informacije o povijesti lokaliteta, uklju ču­
jući mjesto, vegetacijski pokrov, tretiranje pesticidima i/ili gnoji ­
vima, biološke dodatke i slu čajna onečišćenja. Treba poštovati 
preporuke standarda ISO za uzorkovanje tla (ISO 10381-6) s 
obzirom na opis mjesta uzorkovanja;  
(b) mjesto uzorkovanja mora biti definirano UTM-om (univerzalna 
poprečna Mercatorova projekcija/European Horizontal Datum) ili 
geografskim koordinatama; to omogu ćuje ponovno skupljanje 
određenog tla u budu ćnosti i može pomo ći da se tlo definira u 
okviru razli čitih sustava razvrstavanja koji se koriste u razli čitim 
zemljama. Osim toga, treba skupljati samo horizont A do dubine 
od najviše 20 cm. Ako je kao dio tla prisutan horizont O  h , njega 
treba uklju čiti u uzorak, posebno kod vrste tla pod br. 7.  
Uzorke tla treba prenositi u spremnicima u temperaturnim uvjetima 
koji jamče da se po četna svojstva tla ne će značajno promijeniti.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1199
 
1.7.3.2.  Skladištenje  
Poželjno je koristiti tla koja su svježe skupljena na terenu. Samo ako 
to nije mogu će, tlo se može skladištiti na okolnoj temperaturi i treba 
ga održavati zrakosuhim. Ne postoji preporu čeno ograni čenje 
vremena skladištenja, ali tla koja se skladište duže od tri godine 
treba prije uporabe ponovno analizirati s obzirom na sadržaj organ ­
skog ugljika, pH i kapacitet izmjene kationa.  
1.7.3.3.  Rukovanje i priprema uzoraka tla za ispitivanje  
Tla se suše na zraku na okolnoj temperaturi (po mogu ćnosti izme đu 
20 – 25 °C). Rahljenje treba obaviti uz minimalnu primjenu sile kako bi se što bolje sa čuvala izvorna tekstura tla. Tla se prosijavaju 
na veličinu čestica ≤ 2 mm; što se ti če postupka prosijavanja, treba 
poštovati preporuke standarda ISO za uzorkovanje tla (ISO 10381-6). 
Preporučuje se pažljiva homogenizacija jer to pove ćava obnovljivost 
rezultata. Sadržaj vlage pojedinog tla odre đuje se na tri alikvota uz 
zagrijavanje na 105 °C do trenutka kad više nema zna čajnih 
promjena mase (približno 12 sati). Masa tla se kod svih izra čuna 
odnosi na suhu masu nakon sušenja u sušioniku tj. masa tla isprav ­
ljena za sadržaj vlage.
 
1.7.4.  Priprema ispitivane tvari za primjenu na tlo  
Ispitivana tvar se otopi u otopini 0,01 M CaCl  2 u destiliranoj ili 
deioniziranoj vodi; otopina CaCl  2 se koristi kao faza vodenog 
otapala radi poboljšanja centrifugiranja i smanjenja izmjene kationa. Poželjno je da koncentracija radne otopine bude tri reda veli čine viša 
od granice detekcije primijenjene analiti čke metode. Ovaj prag jam či 
točna mjerenja s obzirom na metodologiju koja se primjenjuje kod 
ove metode; osim toga, koncentracija radne otopine treba biti niža od topljivosti ispitivane tvari u vodi.
 
Radnu otopinu po mogu ćnosti treba pripremiti neposredno prije 
primjene na uzorke tla i treba je držati zatvorenu u mraku na 4 °C. Vrijeme skladištenja ovisi o stabilnosti ispitivane tvari i njezinoj koncentraciji u otopini.
 
Ako se ispitivana tvar teško otapa, ponekad je potrebno primijeniti 
sredstvo za otapanje, ali samo u slu čaju slabo topljivih tvari 
(S w < 10  -4 g l -1 ). To sredstvo za otapanje: (a) treba biti mješljivo s 
vodom, npr. metanol ili acetonitril; (b) njegova koncentracija ne smije biti viša od 1 % ukupnog volumena radne otopine i treba biti manja od toga u otopini ispitivane tvari koja dolazi u dodir s 
tlom (po mogu ćnosti manja od 0,1 %); i (c) ne smije biti površinski 
aktivna tvar niti ulaziti u solvoliti čke reakcije s ispitivanom kemika ­
lijom. Uporabu sredstva za otapanje treba navesti zajedno s ostalim podacima i obrazložiti.
 
Druga mogu ćnost kod slabo topljivih tvari je dodavanje ispitivane 
tvari u ispitni sustav spikingom: ispitivana se tvar otopi u organskom otapalu i alikvot doda u sustav tla i otopine 0,01 M CaCl
 2 u destili­
ranoj ili deioniziranoj vodi. Treba nastojati da sadržaj organskog 
otapala u vodenoj fazi bude što niži, u pravilu ne viši od 0,1 %. Kod spikinga iz organske otopine može se pojaviti problem neob ­
novljivosti volumena. To može rezultirati dodatnom greškom budu ći 
da koncentracija ispitivane tvari i pomo ćnog otapala ne će biti 
jednaka kod svih ispitivanja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1200
 
1.8. PREDUVJETI ZA PROVO ĐENJE ISPITIVANJA ADSORPCIJE/ 
DESORPCIJE  
1.8.1.  Analiti čka metoda  
Ključni parametri koji mogu utjecati na to čnost sorpcijskih mjerenja 
su točnost analiti čke metode kod analiziranja faze otopine i adsorbi ­
ranih faza, stabilnost i čistoća ispitivane tvari, uspostava sorpcijske 
ravnoteže, veli čina promjene koncentracije otopine, omjer tlo/otopina 
i promjene u strukturi tla tijekom postupka za uspostavljanje ravno ­
teže (35)(59-62). Neki primjeri vezani uz problematiku to čnosti 
navedeni su u Dodatku 2.  
Pouzdanost analiti čke metode treba provjeriti u rasponu koncentra ­
cija koji se o čekuje tijekom ispitivanja. Izvo đaču pokusa ostavljena 
je sloboda da sam izradi prikladnu metodu koja ima potrebnu točnost, preciznost, obnovljivost, granice detekcije i iskorištenje. 
Određene smjernice za provo đenje takvog ispitivanja daje pokus u 
nastavku.
 
Prikladan volumen 0,01 M CaCl  2 , npr. 100 cm  3 , trese se s odre ­ 
đenom masom jako adsorptivnog tla (tj. s visokim sadržajem organ ­
skog ugljika i gline), npr. 20 g, u vremenu od 4 sata; te mase i 
volumeni mogu biti razli čiti ovisno o analiti čkim potrebama, s time 
da se kao prakti čno polazište može uzeti omjer tlo/otopina 1:5. 
Smjesa se centrifugira, a vodena faza se može i filtrirati. U vodenu se fazu doda odre đeni volumen radne otopine ispitivane 
tvari kako bi se postigla nazivna koncentracija unutar o čekivanog 
raspona koncentracija tijekom ispitivanja. Taj volumen ne smije biti viši od 10 % kona čnog volumena vodene faze kako bi se 
promjene svojstava otopine prije uspostave ravnoteže svele na 
najmanju mogu ću mjeru. Otopina se analizira.
 
U ispitivanje treba uklju čiti jednu slijepu probu sa sustavom tlo + 
otopina CaCl  2 (bez ispitivane tvari) radi otkrivanja mogu ćih artefa­
kata u analiti čkoj metodi i utjecaja matriksa koji potje ču od tla.  
Analitičke metode koje se mogu koristiti za sorpcijska mjerenja 
uključuju plinsko-teku ćinsku kromatografiju (GLC), teku ćinsku 
kromatografiju visoke djelotvornosti (HPLC), spektrometriju (npr. GC/spektrometrija masa, HPLC/spektrometrija masa) i brojenje metodom teku ćinske scintilacije (za radioaktivno obilježene tvari). 
Analitička metoda se smatra prikladnom ako se iskorištenje kre će 
između 90 % i 110 % nazivne vrijednosti, neovisno o tome koja 
se analitička metoda koristi. Da bi se omogu ćila detekcija i ocjenji ­
vanje nakon razdiobe, granice detekcije analiti čke metode moraju biti 
barem dva reda veli čine niže od nazivne koncentracije.
 
Kod provo đenja adsorpcijskih istraživanja svojstva i granice detek ­
cije raspoložive analiti čke metode igraju važnu ulogu u definiranju 
ispitnih uvjeta i op ćenito provo đenju čitavog postupka ispitivanja. 
Ova metoda zacrtava op ći okvir pokusnog postupka te donosi prepo ­
ruke i smjernice u pogledu alternativnih rješenja u slu čaju ograni ­ 
čenja analiti čke metode ili laboratorijskih sredstava.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1201
 
1.8.2.  Odabir optimalnih omjera tlo/otopina  
Odabir omjera tlo/otopina za sorpcijska istraživanja ovisi o koefici ­
jentu razdiobe K  d i željenom relativnom stupnju adsorpcije. S 
obzirom na oblik jednadžbe adsorpcije i ograni čenja analiti čke meto­
dologije vezana uz odre đivanje koncentracije kemikalije u otopini, 
promjena koncentracije tvari u otopini odre đuje statisti čku točnost 
mjerenja. Stoga je u praksi op ćenito korisno odabrati nekoliko 
fiksnih omjera kod kojih je postotak adsorpcije viši od 20 %, a po 
mogućnosti i viši od 50 % (62), paze ći da koncentracija ispitivane 
tvari u vodenoj fazi ostane dovoljno visoka da se može to čno izmje­
riti. Ovo je posebno važno u slu čaju visokih postotaka adsorpcije.  
Praktičan pristup odabiru omjera tlo/otopina je pristup utemeljen na 
procjeni vrijednosti K  d , koja se može procijeniti u preliminarnom 
istraživanju ili putem prihva ćenih tehnika procjene (Dodatak 3.). 
Prikladan omjer se zatim može odabrati na temelju grafi čkog 
prikaza omjera tlo/otopina u ovisnosti o K  d za fiksne postotke 
adsorpcije (Slika 1.). Pretpostavka ovoga grafi čkog prikaza je da je 
jednadžba adsorpcije linearna (  1 ). Primjenljivi se odnos dobije preu ­
ređivanjem jednadžbe (4) K  d u obliku jednadžbe (1):  
V 0 
m soil ¼ m 0 
m ads s ðecÞ Ä 1 Í Î  
K d (1) 
ili u njezinom logaritamskom obliku uz pretpostavku da je 
R = m  soil /V 0 and A ec %=100 ¼ m ads 
s ðecÞ 
m 0 
log R ¼ Älog K  d þ log " 
ðA ec %=100Þ 
ð1 Ä A ec %=100Þ # (2)
 
Slika 1.  Odnos izme đu omjera tlo/otopina i K  d pri različitim postocima adsorpcije 
ispitivane tvari  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1202  
( 1 ) C ads 
s ðecÞ ¼ K d · C ads 
ap ðecÞ:
 Na slici 1. prikazani su potrebni omjeri tlo/otopina kao funkcija K  d 
za različite razine adsorpcije. Primjerice, ako je omjer tlo/otopina 1:5 
i K d je 20, dobije se adsorpcija od približno 80 %. Da bi se dobila 
50 %-tna adsorpcija, za isti K  d , treba koristiti omjer 1:25. Ovaj 
pristup istraživa ču pruža slobodu da odabere omjer tlo/otopina u 
skladu s potrebama pokusa.  
Nešto ve ći problem predstavlja situacija kad se kemikalija jako ili 
tek neznatno adsorbira. U slu čaju niske adsorpcije, preporu čuje se 
omjer tlo/otopina 1:1, iako su kod nekih vrsta izrazito organskih tala 
potrebni manji omjeri da bi se dobila kaša. Analiti čka metodologija 
mora omogu ćivati mjerenje malih promjena koncentracije otopine; u 
protivnom će mjerenje adsorpcije biti neto čno. S druge strane, kod 
jako visokih koeficijenata razdiobe K  d mogu se uzeti i omjeri tlo/ 
otopina do čak 1:100, kako bi u otopini ostala zna čajna količina 
kemikalije. Me đutim, treba voditi ra čuna da se postigne dobro mije ­ 
šanje i ostaviti dovoljno vremena za uspostavu ravnoteže u sustavu. 
Alternativni pristup u ovim ekstremnim slu čajevima kada ne postoji 
odgovaraju ća analitička metodologija je predvi đanje vrijednosti K  d 
primjenom tehnika procjene npr. na temelju vrijednosti P  ow (Dodatak 
3.). To može biti korisno posebno kod slabo apsorbiranih/polarnih 
kemikalija s P  ow < 20 i kod lipofilnih/visoko sorptivnih kemikalija s 
P ow > 10  4 . 
1.9. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.9.1.  Ispitni uvjeti  
Svi se pokusi provode na okolnoj temperaturi i to po mogu ćnosti na 
stalnoj temperaturi izme đu 20 °C i 25 °C.  
Uvjeti centrifugiranja trebaju omogu ćivati uklanjanje čestica većih od 
0,2 μm iz otopine. Ta vrijednost predstavlja veli činu najsitnije čestice 
koja se smatra krutom česticom i čini granicu izme đu krutih i 
koloidnih čestica. Smjernice za odre đivanje uvjeta centrifugiranja 
dane su u Dodatku 4.  
Ako naprave za centrifugiranje ne mogu zajam čiti uklanjanje čestica 
većih od 0,2 μm, treba primjenjivati kombinaciju centrifugiranja i 
filtriranja s filtrima od 0,2 μm. Ti filtri trebaju biti izra đeni od 
prikladnog inertnog materijala kako bi se izbjegli gubici ispitivane tvari na njima. U svakom slu čaju, treba dokazati da tijekom filtri ­
ranja ne dolazi do gubitaka ispitivane tvari.
 
1.9.2.  1. razina – preliminarno istraživanje  
Svrha provedbe preliminarnog istraživanja ve ć je navedena u 
odjeljku Podru čje primjene. Smjernice za postavljanje takvih ispiti ­
vanja nalaze se u prijedlogu pokusa u nastavku.  
1.9.2.1.  Odabir optimalnih omjera tlo/otopina  
Koriste se dvije vrste tla i tri omjera tlo/otopina (šest pokusa). Jedna 
vrsta tla ima visok sadržaj organskog ugljika i nizak sadržaj gline, a druga ima nizak sadržaj organskog ugljika i visok sadržaj gline. Predlažu se sljede ći omjeri tla i otopine:
 
— 50 g tla i 50 cm  3 vodene otopine ispitivane tvari (omjer 1/1),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1203
 
— 10 g tla i 50 cm  3 vodene otopine ispitivane tvari (omjer 1/5),  
— 2 g tla i 50 cm  3 vodene otopine ispitivane tvari (omjer 1/25).  
Najmanja koli čina tla na kojoj se može izvesti pokus ovisi o labo ­
ratorijskim sredstvima i u činkovitosti analiti čkih metoda koje se 
primjenjuju. Ipak, preporu čuje se korištenje najmanje 1 g, a po 
mogućnosti i 2 g, kako bi se ispitivanjem dobili pouzdani rezultati.  
Jedan kontrolni uzorak koji sadrži samo ispitivanu tvar u otopini 
0,01 M CaCl  2 (bez tla) podvrgava se potpuno istim postupcima 
kao ispitni sustavi kako bi se provjerila stabilnost ispitivane tvari u 
otopini CaCl  2 i njezina mogu ća adsorpcija na površinu ispitnih 
posuda.  
Istom ispitnom postupku podvrgava se po jednu slijepu probu za 
svako tlo s istom koli činom tla i ukupnim volumenom otopine 
0,01 M CaCl  2 od 50 cm  3 (bez ispitivane tvari). Ona kod analize 
služi kao temeljna kontrola za utvr đivanje interferiraju ćih tvari i 
onečišćenih tala.  
Sve pokuse, uklju čujući kontrole i slijepe probe, treba provoditi 
barem u dva ponavljanja. Ukupni broj uzoraka koje je potrebno 
pripremiti za istraživanje može se izra čunati s obzirom na metodo ­
logiju koja se primjenjuje.  
Metode za preliminarno i glavno istraživanje su op ćenito iste, a 
izuzeci se navode tamo gdje se primjenjuju.  
Zrakom sušeni uzorci tla se u no ći prije pokusa (12 sati) ekvilibriraju 
tresenjem s najmanje 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 . Zatim se doda koli čina 
radne otopine ispitivane tvari potrebna da se dobije kona čni volumen 
od 50 cm  3 . Volumen radne otopine koji se dodaje (a) ne smije biti 
viši od 10 % kona čnog volumena vodene faze od 50 cm  3 , kako bi se 
promjene svojstava otopine prije uspostave ravnoteže svele na najmanju mogu ću mjeru; i (b) treba omogu ćiti da početna koncen ­
tracije ispitivane tvari u dodiru s tlom (C
 0 ) bude najmanje dva reda 
veličine viša od granice detekcije analiti čke metode; ovaj prag osigu ­
rava provedbu to čnih mjerenja čak i u slu čaju snažne adsorpcije 
(> 90 %), a kasnije i odre đivanje adsorpcijskih izotermi. Tako đer 
se preporu čuje da po četna koncentracija tvari (C  0 ) po mogu ćnosti ne 
bude viša od polovice njezine granice topljivosti.  
U nastavku se nalazi primjer izra čuna koncentracije radne otopine 
(C st ). Pretpostavlja se granica detekcije 0,01 μg cm  -3 i 90 %-tna 
adsorpcija; prema tomu, bilo bi poželjno da po četna koncentracija 
ispitivane tvari u dodiru s tlom bude 1 μg cm  -3 (dva reda veli čine 
viša od granice detekcije). Ako se doda najviši preporu čeni volumen 
radne otopine tj. od 5 do 45 cm  3 ekvilibracijske otopine 0,01 M 
CaCl  2 (= 10 % radne otopine na ukupni volumen vodene faze od 
50 cm  3 ), koncentracija radne otopine trebala bi biti 10 μg cm  -3 ; to je 
tri reda veli čine više od granice detekcije analiti čke metode.  
pH vodene faze treba izmjeriti prije i nakon dodira s tlom, budu ći da 
on igra važnu ulogu u čitavom procesu adsorpcije, posebno kod 
ioniziraju ćih tvari.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1204
 
Smjesa se trese dok se ne postigne adsorpcijska ravnoteža. Ravno ­
težno vrijeme je vrlo promjenljivo, ovisno o kemikaliji i tlu; op ćenito 
je dostatno vrijeme od 24 sata (77). U preliminarnom istraživanju uzorci se mogu uzimati u odre đenom slijedu u razdoblju miješanja 
od 48 sati (primjerice nakon 4, 8, 24, 48 sati). Ipak, vremena analize 
treba odrediti fleksibilno, ovisno o radnom rasporedu laboratorija.
 
Za analiziranje ispitivane tvari u vodenoj otopini raspoložive su dvije 
mogućnosti: (a) paralelna metoda i (b) serijska metoda. Treba nagla ­
siti da je paralelna metoda doduše sporija u pokusnom dijelu, ali je matematička obrada rezultata jednostavnija (Dodatak 5.). Ipak, izbor 
metodologije ovisi o izvo đaču pokusa, koji mora uzeti u obzir raspo ­
loživa laboratorijska sredstva i resurse.
 
(a) Paralelna metoda: pripremi se potreban broj uzoraka s jednakim 
omjerom tlo/otopina, koji odgovara broju vremenskih intervala u kojima se želi prou čavati kinetika adsorpcije. Nakon centrifugi ­
ranja i, po želji, filtriranja treba što potpunije povratiti vodenu 
fazu iz prve epruvete i izmjeriti nakon npr. 4 sata; vodena faza iz 
druge epruvete mjeri se nakon 8 sati, tre ću nakon 24 sata itd.
 
(b) Serijska metoda: pripreme se samo po dva uzorka za svaki omjer 
tlo/otopina. Smjesa se u definiranim vremenskim razmacima centrifugira radi odvajanja faza. Mali alikvot vodene faze se 
odmah analizira na ispitivanu tvar; pokus se zatim nastavlja s 
prvobitnom smjesom. Ako se nakon centrifugiranja primjenjuje filtracija, laboratrij mora imati opremu za filtriranje malih vodenih alikvota. Preporu čuje se da ukupni volumen alikvota 
ne bude viši od 1 % ukupnog volumena otopine, kako ne bi 
došlo do zna čajne promjene omjera tlo/otopina i kako se ne bi 
smanjila masa otopljene tvari raspoloživa za adsorpciju tijekom ispitivanja.
 
Izračuna se postotak adsorpcije  ðA t i Þ u svakom vremenu (t  i ) na 
temelju po četne nazivne koncentracije i izmjerene koncentracije u 
vremenu uzorkovanja (t  i ), ispravljen za vrijednost slijepe probe. 
Izrade se grafi čki prikazi ðA t i Þ u ovisnosti o vremenu (Dodatak 5. 
Slika 1.) kako bi se mogla procijeniti uspostava ravnotežnog platoa (
 1 ). Također se izra čuna vrijednost K  d u ravnoteži. Na 
temelju te vrijednosti K  d se iz slike 1. odaberu odgovaraju ći 
omjeri tlo/otopina tako da postotak adsorpcije bude viši od 20 %, a po mogu ćnosti i > 50 % (61). Sve primjenljive jednadžbe i na čela 
grafičkog prikazivanja navedeni su u odjeljku Podaci i izvješ ćivanje i 
u Dodatku 5.
 
1.9.2.2.  Odre đivanje vremena do uspostavljanja adsorpcijske ravnoteže i 
količine ispitivane tvari adsorbirane u ravnoteži  
Kao što je ve ć spomenuto, grafi čki prikazi  A t i ili ðC ads 
aq Þ u vremenu 
omogućuju procjenu uspostave adsorpcijske ravnoteže i koli čine ispi­
tivane tvar adsorbirane u ravnoteži. Primjeri takvih grafi čkih prikaza 
su slika 1. i 2. u Dodatku 5. Vrijeme do uspostavljanja ravnoteže je 
vrijeme potrebno da sustav dosegne plato.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1205  
( 1 ) Za procjenu uspostave ravnotežnog platoa tako đer se mogu koristiti grafi čki prikazi 
koncentracije ispitivane tvari u vodenoj fazi  ðC ads 
ap Þ u ovisnosti o vremenu (vidjeti 
Dodatak 5. Sliku 2.).
 Ako se kod odre đenog tla ne može utvrditi plato, ve ć je vidljivo 
stalno pove ćanje, to može biti zbog otežavaju ćih čimbenika, kao što 
je biorazgradnja ili spora difuzija. Biorazgradnja se može dokazati ponavljanjem pokusa sa steriliziranim uzorkom tla. Ako se ni u tom slučaju ne dosegne plato, izvo đač pokusa treba potražiti druge speci ­
fične pojave koje bi mogle biti prisutne u njegovom istraživanju; to 
se može u činiti odgovaraju ćim izmjenama pokusnih uvjeta (tempera ­
tura, vrijeme tresenja, omjeri tlo/otopina). Odluka o nastavku ispitnog postupka unato č eventualnom izostanku ravnoteže prepu ­ 
štena je izvo đaču pokusa.
 
1.9.2.3.  Adsorpcija na površini ispitne posude i stabilnost ispitivane tvari  
Neke informacije o adsorpciji ispitivane tvari na površini ispitnih 
posuda i njezinoj stabilnosti mogu se dobiti analizom kontrolnih 
uzoraka. Ako se uo či gubitak viši od standardne greške analiti čke 
metode, to može zna čiti da je došlo do abioti čke razgradnje i/ili 
adsorpcije na površinu ispitne posude. Razlika izme đu tih dviju 
pojava može se utvrditi temeljitim pranjem stijenki posude poznatim 
volumenom prikladnog otapala i analiziranjem otopine od pranja na ispitivanu tvar. Ako nije uo čena adsorpcija na površini ispitnih 
posuda, gubitak ukazuje na abioti čku nestabilnost ispitivane tvari. 
Ako se utvrdi adsorpcija, treba promijeniti materijal ispitnih 
posuda. Ipak, podaci o adsorpciji na površinu ispitnih posuda dobi ­
veni ovim pokusom ne mogu se izravno ekstrapolirati na pokus tlo/otopina. Na ovu adsorpciju će utjecati prisutnost tla.
 
Dodatne informacije o stabilnosti ispitivane tvari mogu se dobiti 
određivanjem bilance mase polazne tvari u vremenu. To podrazumi ­
jeva analizu vodene faze, ekstrakata tla i stijenki ispitne posude na ispitivanu tvar. Razlika izme đu upotrijebljene mase ispitivane kemi ­
kalije i zbroja masa ispitivane kemikalije u vodenoj fazi, ekstraktima 
tla i stijenki ispitne posude jednaka je razgra đenoj i/ili ishlapjeloj i/ili 
neekstrahiranoj masi. Da bi se odredila bilanca mase, u razdoblju pokusa mora biti postignuta adsorpcijska ravnoteža.
 
Bilanca mase odre đuje se na oba tla za jedan omjer tlo/otopina po tlu 
koji u ravnoteži pokazuje gubitak iznad 20 %, a po mogu ćnosti i 
> 50 %. Po završetku pokusa za odre đivanje omjera analizom 
zadnjeg uzorka vodene faze nakon 48 sati faze se odvajaju centrifu ­
giranjem te, po želji, filtriranjem. Vodena faza se što je mogu će više 
povrati i tlu doda prikladno ekstrakcijsko otapalo (koeficijent 
ekstrakcije najmanje 95 %) za ekstrakciju ispitivane tvari. Preporu ­ 
čuju se najmanje dvije uzastopne ekstrakcije. Zatim se odredi koli ­ 
čina ispitivane tvari u ekstraktima tla i ispitnih posuda i izra čuna 
bilanca mase (jednadžba 10, Podaci i izvješ ćivanje). Ako je ona 
manja od 90 %, smatra se da je ispitivana tvar nestabilna u vremen ­
skom okviru ispitivanja. Istraživanje se unato č tomu može nastaviti, 
ali pritom treba uzeti u obzir nestabilnost ispitivane tvari; u tom se 
slučaju preporu čuje da se u sklopu glavnog istraživanja analiziraju 
obje faze.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1206
 
1.9.3.  2. razina – kinetika adsorpcije s jednom koncentracijom ispitivane 
tvari  
Koristi se pet tala odabranih iz tablice 1. Ovdje je dobro uklju čiti 
neka ili sva tla koja su korištena u preliminarnom istraživanju, ako je 
to primjereno. U tom slu čaju nije potrebno ponavljati 2. razinu za tla 
koja su korištena u preliminarnom istraživanju.  
Vrijeme do uspostavljanja ravnoteže, omjer tlo/otopina, masa uzorka 
tla, volumen vodene faze u dodiru s tlom i koncentracija ispitivane 
tvari u otopini odabiru se na temelju rezultata preliminarnog istraži ­
vanja. Analizu treba po mogu ćnosti provesti nakon vremena kontakta 
od približno 2, 4, 6, 8 (eventualno i 10) te 24 sata; vrijeme tresenja 
može se produžiti na najviše 48 sati u slu čaju kemikalija koje zahti ­
jevaju duže vrijeme do uspostavljanja ravnoteže, na temelju rezultata određivanja omjera. Ipak, vremena analize mogu se odrediti 
fleksibilno.
 
Svaki pokus (jedno tlo i jedna otopina) izvodi se najmanje u dva 
ponavljanja kako bi se mogla procijeniti varijanca rezultata. U svaki pokus treba uklju čiti po jednu slijepu probu. Ona se sastoji od tla i 
otopine 0,01 M CaCl
 2 (bez ispitivane tvari) jednake mase odnosno 
volumena kao u pokusu. Kontrolni uzorak koji sadrži samo ispiti ­
vanu tvar u otopini 0,01 M CaCl  2 (bez tla) treba podvrgnuti istom 
ispitnom postupku radi zaštite u slu čaju neočekivanih ishoda.  
Postotak adsorpcije izra čunava se u svakom vremenu  A  t i i/ili 
vremenskom intervalu  A Δt i (ovisno o potrebi) i treba ga grafi čki 
prikazati u ovisnosti o vremenu. Osim toga, izra čunava se i koefici ­
jent razdiobe K  d u ravnoteži kao i koeficijent adsorpcije normiran na 
organski ugljik K  oc (za nepolarne organske kemikalije).  
Rezultati ispitivanja kinetike adsorpcije  
Linearna vrijednost K  d općenito točno opisuje sorpcijsko ponašanje u 
tlu (35)(78) i predstavlja izraz svojstvene pokretljivosti kemikalije u tlu. Primjerice, kemikalije s K
 d ≤ 1 cm  3 g -1 općenito se smatraju 
kvalitativno pokretljivima. MacCall i sur. (16) izradili su sli čan 
sustav razvrstavanja prema pokretljivosti na temelju vrijednosti 
K oc . Osim toga, postoje i sustavi razvrstavanja s obzirom na ispiranje 
na temelju odnosa izme đu K  oc i DT-50 (  1 ) (32)(79).  
Istraživanja u kojima je provedena analiza pogrešaka (61) pokazala 
su da se vrijednosti K  d ispod 0,3 cm  3 g -1 ne mogu to čno procijeniti 
iz smanjenja koncentracije u vodenoj fazi, čak i ako se primijeni 
najpovoljniji (s gledišta to čnosti) omjer tlo/otopina tj. 1:1. U tom 
slučaju se preporu čuje analiza obiju faza, tla i otopine.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1207  
( 1 ) DT-50: vrijeme razgradnje 50 % ispitivane tvari.
 Uzimajući u obzir gornje napomene, preporu čuje se da se istraži ­
vanje adsorpcijskog ponašanja kemikalije u tlu i njezinog potencijala 
pokretljivosti nastavi odre đivanjem Freundlichovih adsorpcijskih 
izotermi za ove sustave kod kojih je mogu će točno odrediti K  d u 
skladu s pokusnim protokolom ove ispitne metode. To čno je odre ­ 
đivanje mogu će ako je vrijednost koja se dobije množenjem K  d s 
omjerom tlo/otopina > 0,3, ako se mjerenja temelje na smanjenju koncentracije u vodenoj fazi (neizravna metoda), ili > 0,1, ako se analiziraju obje faze (izravna metoda) (61).
 
1.9.4.  3. razina – adsorpcijske izoterme i kinetika desorpcije/desorpcijske 
izoterme  
1.9.4.1. A d s o r p c i j s k e i z o t e r m e  
Koristi se pet koncentracija ispitivane tvari, koje po mogu ćnosti 
obuhvaćaju dva reda veli čine; kod izbora tih koncentracija treba 
uzeti u obzir topljivost u vodi i ravnotežne koncentracije u vodi 
koje iz tog proizlaze. Omjer tlo/otopina po tlu ne smije se promijeniti 
tijekom istraživanja. Ispitivanje adsorpcije provodi se na na čin kako 
je gore opisano, uz jedinu razliku što se vodena faza analizira samo jedanput u vremenu koje je potrebno da se postigne ravnoteža, kako 
je određeno gore u 2. razini. Odrede se ravnotežne koncentracije u 
otopini i izra čuna adsorbirana koli čina na temelju gubitaka ispitivane 
tvari u otopini ili izravnom metodom. Adsorbirana masa po jedinici mase tla grafi čki se prikaže kao funkcija ravnotežne koncentracije 
ispitvane tvari (vidjeti Podaci i izvješ ćivanje).
 
Rezultati pokusa s adsorpcijskim izotermama  
Freundlichova izoterma je model koji se od svih do sada predloženih 
matematičkih modela adsorpcije naj češće koristi za opisivanje 
adsorpcijskih procesa. Detaljnije informacije o tuma čenju i važnosti 
modela adsorpcije mogu se na ći u referencama (41)(45)(80)(81)(82).  
Napomena:  Valja spomenuti da je usporedba vrijednosti K  F (Freun­
dlichov koeficijent adsorpcije) za razli čite tvari mogu ća samo ako su 
vrijednosti K  F izražene u istim jedinicama (83).  
1.9.4.2. K i n e t i k a d e s o r p c i j e  
Svrha ovog pokusa je utvrditi je li adsorpcija kemikalije na tlo 
reverzibilna ili ireverzibilna. Ovaj je podatak važan jer proces desorpcije tako đer igra važnu ulogu u ponašanju kemikalije u tlu. 
Osim toga, podaci o desorpciji korisni su kod ra čunalnog modeli ­
ranja ispiranja i simulacije otjecanja otopljenih tvari. Ako se želi provesti istraživanje desorpcije, preporu čuje se da se niže opisano 
istraživanje provede na svakom sustavu za koji je bilo mogu će točno 
odrediti K
 d u prethodnom pokusu s kinetikom adsorpcije.  
Kao kod istraživanja kinetike adsorpcije, postoje dvije mogu ćnosti 
izvođenja pokusa s kinetikom desorpcije: (a) paralelna metoda i (b) 
serijska metoda. Izbor metodologije prepušten je izvo đaču pokusa, 
koji treba uzeti u obzir raspoloživa laboratorijska sredstva i resurse.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1208
 
(a) Paralelna metoda: za svako odabrano tlo na kojemu će se 
provesti istraživanje desorpcije pripremi se potreban broj 
uzoraka s jednakim omjerom tlo/otopina koji odgovara broju vremenskih intervala u kojima će se prou čavati kinetika desorp ­
cije. Po mogu ćnosti treba koristiti iste vremenske intervale kao 
kod pokusa s kinetikom adsorpcije; ipak, ukupno se vrijeme 
može prema potrebi produžiti kako bi sustav postigao desorp ­
cijsku ravnotežu. U svaki pokus (jedno tlo, jedna otopina) treba uključiti po jednu slijepu probu. Ona se sastoji od tla i otopine 
0,01 M CaCl
 2 , bez ispitivane tvari, jednake mase i volumena kao 
u pokusu. Kontrolni uzorak s ispitivanom tvari u otopini 0,01 M CaCl
 2 (bez tla) podvrgava se istom ispitnom postupku. Sve 
smjese tla i otopine tresu se dok se ne postigne adsorpcijska 
ravnoteža (kako je odre đeno gore u 2. razini). Zatim se faze 
odvoje centrifugiranjem i vodene faze se što je mogu će više 
uklone. Volumen uklonjene otopine zamijeni se jednakim volu ­
menom 0,01 M CaCl  2 bez ispitivane tvari i nove se smjese 
ponovno tresu. Vodena faza iz prve epruvete se što potpunije 
povrati i izmjeri nakon npr. 2 sata, vodena faza iz druge epruvete mjeri se nakon 4 sata, tre će nakon 6 sati itd. dok se ne postigne 
desorpcijska ravnoteža.
 
(b) Serijska metoda: smjesa se nakon pokusa s kinetikom adsorpcije 
centrifugira i vodena faza se što je mogu će više ukloni. Volumen 
uklonjene otopine zamijeni se jednakim volumenom 0,01 M 
CaCl  2 bez ispitivane tvari. Nova se smjesa trese do uspostave 
desorpcijske ravnoteže. Za to se vrijeme smjesa u definiranim 
vremenskim razmacima centrifugira radi odvajanja faza. Mali 
alikvot vodene faze se odmah analizira na ispitivanu tvar; zatim se pokus nastavlja s izvornom smjesom. Volumen pojedi ­
načnih alikvota treba biti manji od 1 % ukupnog volumena. 
Smjesi se doda ista koli čina svježe otopine 0,01 M CaCl
 2 radi 
održavanja omjera tla i otopine te se nastavi s tresenjem do sljedećeg intervala.
 
Postotak desorpcije izra čuna se u svakom vremenu  ðD t i Þ i/ili 
vremenskom intervalu  ðD Δt i Þ (ovisno o potrebama istraživanja) i 
grafički se prikaže u ovisnosti o vremenu. Osim toga, izra čuna se 
i koeficijent desorpcije K  des u ravnoteži. Sve primjenljive jednadžbe 
navedene su u odjeljku Podaci i izvješ ćivanje i Dodatku 5.  
Rezultati pokusa s kinetikom desorpcije  
Zajednički grafički prikaz postotka desorpcije  D t i i adsorpcije  A t i u 
ovisnosti o vremenu omogu ćuje procjenu reverzibilnosti procesa 
adsorpcije. Ako se postigne desorpcijska ravnoteža, makar i u dvostruko dužem vremenu u odnosu na adsorpcijske ravnoteže, i 
ako je ukupna desorpcija viša od 75 % adsorbirane koli čine, adsorp ­
cija se smatra reverzibilnom.
 
1.9.4.3. D e s o r p c i j s k e i z o t e r m e  
Freundlichove desorpcijske izoterme odre đuju se na tlima koja su 
korištena u pokusu za odre đivanje adsorpcijskih izotermi. Ispitivanje 
desorpcije provodi se na na čin kako je opisano u odjeljku „Kinetika 
desorpcije”, s jedinom razlikom što se vodena faza analizira samo 
jedanput – u desorpcijskoj ravnoteži. Izra čuna se desorbirana koli ­ 
čina ispitivane tvari. Sadržaj ispitivane tvari koji ostane adsorbiran 
na tlu u desorpcijskoj ravnoteži grafi čki se prikazuje kao funkcija 
ravnotežne koncentracije ispitivane tvari u otopini (vidjeti odjeljak 
Podaci i izvješ ćivanje i Dodatak 5.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1209
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Analitički se podaci prikažu u tabli čnom obliku (vidjeti Dodatak 6.). 
Navedu se pojedina čna mjerenja i izra čunane prosje čne vrijednosti. 
Prilože se grafi čki prikazi adsorpcijskih izotermi. Izra čuni se provode 
na način kako je opisano u nastavku.  
Za potrebe ovog ispitivanja smatra se da je masa 1 cm  3 vodene 
otopine 1 g. Omjer tlo/otopina može se izraziti u jedinicama w/w ili w/v na istom grafu.
 
2.1. ADSORPCIJA  
Adsorpcija  A t i definirana je kao postotak tvari adsorbiran na tlo u 
ispitnim uvjetima u odnosu na koli činu koja je bila prisutna na 
početku ispitivanja. Ako je ispitivana tvar stabilna i ne adsorbira 
se značajno na stijenki posude,  A t i u svakom vremenu t  i izračunava 
se pomoću sljedeće jednadžbe:  
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3)  
gdje je:  
A t i = postotak adsorpcije u vremenu t  i (%); 
m ads 
s ðt i Þ = masa ispitivane tvari adsorbirana na tlo u vremenu t  i (μg); 
m 0 = masa ispitivane tvari u epruveti na po četku ispitivanja 
(μg). 
Detaljne informacije za izra čunavanje postotka adsorpcije  A  t i za 
paralelnu i serijsku metodu nalaze se u Dodatku 5.  
Koeficijent razdiobe K  d je omjer sadržaja tvari u fazi tla i masene 
koncentracije tvari u vodenoj otopini u ispitnim uvjetima kad se 
postigne adsorpcijska ravnoteža.  
K d ¼ C ads 
s ðecÞ 
C ads 
ap ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ 
m ads 
ap ðecÞ · V 0 
m sol (cm  3 g -1 ) (4) 
gdje je:  
C ads 
s ðecÞ = sadržaj tvari adsorbiran na tlo u adsorpcijskoj ravnoteži 
(μg g  -1 ) 
C ads 
ap ðecÞ = masena koncentracija tvari u vodenoj fazi u adsorpcijskoj 
ravnoteži ( μg cm  -3 ). Ova se koncentracija odre đuje anali­
tički, uzimaju ći u obzir vrijednosti slijepih proba  
m ads 
s ðecÞ = masa tvari adsorbirana na tlo u adsorpcijskoj ravnoteži 
(μg) 
m ads 
ap ðecÞ = masa tvari u otopini u adsorpcijskoj ravnoteži ( μg) 
m soil = količina faze tla, izražena u suhoj masi tla (g)  
V 0 = početni volumen vodene faze u dodiru s tlom (cm  3 ) 
Odnos izme đu A  eq i K d iskazuje se kao:  
K d ¼ A ec 
100 Ä A ec · V 0 
m sol (cm  3 g -1 ) (5)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1210
 
gdje je:  
A eq = postotak adsorpcije u adsorpcijskoj ravnoteži (%)  
Koeficijent adsorpcije normiran na organski ugljik K  oc uspostavlja 
odnos izme đu koeficijenta razdiobe K  d i sadržaja organskog ugljika 
u uzorku tla:  
K oc ¼ K d · 100 
%CO  (cm  3 g -1 ) (6)  
gdje je:  
%OC = postotak organskog ugljika u uzorku tla (g g  -1 ) 
Koeficijent K  oc je pojedina čna vrijednost koja opisuje razdiobu 
uglavnom nepolarnih organskih kemikalija izme đu organskog 
ugljika u tlu ili sedimentu i vode. Adsorpcija tih kemikalija stavlja se u korelaciju s organskim sadržajem sorbiraju će krute tvari (7); 
prema tomu, vrijednosti K
 oc ovise o specifi čnim svojstvima humin ­
skih frakcija koje se zna čajno razlikuju po sorpcijskoj sposobnosti 
zbog razlika u podrijetlu, genezi itd.  
2.1.1.  Adsorpcijske izoterme  
Jednadžba Freundlichovih adsorpcijskih izotermi uspostavlja odnos 
između adsorbirane koli čine ispitivane tvari i koncentracije ispitivane 
tvari u otopini u ravnoteži (jednadžba (8)).  
Podaci se obrade kako je prikazano u odjeljku „Adsorpcija” i za 
svaku se epruvetu izra čuna sadržaj ispitivane tvari adsorbiran na 
tlo nakon adsorpcijskog testa  C ads 
s ðecÞ, koji se drugdje ozna čava 
kao x/m). Pretpostavlja se da je ravnoteža uspostavljena i da  
C ads 
s ðecÞ predstavlja ravnotežnu vrijednost:  
C ads 
s ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ 
m sol ¼ C 0 Ä C ads 
ap ðecÞ h i
:V 0 
m sol (μg g  -1 ) (7)  
Freundlichova adsorpcijska jednadžba prikazana je u (8):  
C ads 
s ðecÞ ¼ K ads 
F:C ads 
ap ðecÞ 1=n (μg g  -1 ) (8)  
ili u linearnom obliku:  
logC  ads 
s ðecÞ ¼ logK  ads 
F þ 1=n · logC  ads 
ap ðecÞ (9)  
gdje je:  
K ads 
F = Freundlichov koeficijent adsorpcije; njegova je dimenzija 
cm 3 g -1 , ali samo ako je 1/n = 1; u svim drugim slu čajevima 
u dimenziju K ads 
F uvodi se nagib 1/n ( μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ) 
n = regresijska konstanta; 1/n se obi čno kreće u podru čju od 0,7 
– 1,0 i ukazuje na to da su podaci o sorpciji često blago 
nelinearni  
Jednadžbe (8) i (9) prikažu se grafi čki te se izra čunaju vrijednosti  
K ads 
F i 1/n regresijskom analizom pomo ću jednadžbe (9). Tako đer se 
izračuna koeficijent korelacije r  2 logaritamske jednadžbe. Primjer 
takvoga grafa prikazan je na slici 2.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1211
 
Slika 2.  Freundlichov graf adsorpcije, obi čni i linearizirani  
2.1.2.  Bilanca mase  
Bilanca mase (MB) definirana je kao postotak tvari koji se može 
analitički izdvojiti nakon adsorpcijskog testa u odnosu na nazivnu 
količinu tvari na po četku ispitivanja.  
Obrada podataka razlikuje se ovisno o tomu je li otapalo u potpu ­
nosti mješljivo s vodom ili ne. U slu čaju otapala mješljivih s vodom, 
za određivanje koli čine tvari izdvojene putem ekstrakcije otapalom 
može se primijeniti obrada podataka opisana u odjeljku „Desorpcija”. Ako je otapalo manje mješljivo s vodom, potrebno je odrediti izdvo ­
jenu količinu.
 
Bilanca mase MB za adsoprciju izra čunava se kako je opisano u 
nastavku; polazi se od pretpostavke da izraz (m  E ) odgovara zbroju 
masa ispitivane kemikalije ekstrahiranih iz tla i s površine ispitne 
posude organskim otapalom:  
MB ¼ ðV rec · C ads 
aq ðeqÞ þ m E Þ · 100 
V 0 · C 0 ð%Þ (10) 
gdje je:  
MB = bilanca mase (%)  
m E = ukupna masa ispitivane tvari ekstrahirana iz tla i sa stijenki 
ispitne posude u dva koraka ( μg) 
C 0 = početna masena koncentracija ispitne otopine u dodiru s 
tlom (μg cm  -3 ) 
V rec = volumen supernatanta dobiven nakon adsorpcijske ravno ­
teže (cm  -3 ) 
2.2. DESORPCIJA  
Desorpcija (D) se definira kao postotak ispitivane tvari desorbiran u 
ispitnim uvjetima u odnosu na koli činu tvari koja je prethodno 
adsorbirana:  
D t i ¼ m des 
ap ðt i Þ 
m ads 
s ðecÞ · 100ð%Þ (11)  
gdje je:  
D t i = postotak desorpcije u vremenu t  i (%) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1212
 
m des 
ap ðt i Þ = masa ispitivane tvari desorbirana iz tla u vremenu t  i (μg) 
m ads 
s ðecÞ = masa ispitivane tvari adsorbirana na tlu u adsorpcijskoj 
ravnoteži ( μg) 
Detaljne informacije za izra čunavanje postotka desorpcije  D t i za 
paralelnu i serijsku metodu nalaze se u Dodatku 5.  
Prividni koeficijent desorpcije (K  des ) u ispitnim uvjetima je omjer 
sadržaja tvari koji je ostao u fazi tla i masene koncentracije desor ­
birane tvari u vodenoj otopini kad je postignuta desorpcijska ravno ­
teža: 
K des ¼ m ads 
s ðecÞ Ä m des 
aq ðecÞ 
m des ap ðecÞ V T 
m sol (cm  3 g -1 ) (12)  
gdje je:  
K des = koeficijent desorpcije (cm  3 g -1 ) 
m des 
ap ðecÞ = ukupna masa ispitivane tvari desorbirana iz tla u desorp ­
cijskoj ravnoteži ( μg) 
V T = ukupni volumen vodene faze u dodiru s tlom tijekom 
ispitivanja kinetike desorpcije (cm  3 ) 
Smjernice za izra čun m des 
ap ðecÞ navedene su u Dodatku 5. u rubrici 
„Desorpcija”.  
Napomena:  
Ako je prethodno ispitivanje adsorpcije provedeno paralelnom meto ­
dom, smatra se da je volumen V  T u jednadžbi (12) jednak V  0 . 
2.2.1.  Desorpcijske izoterme  
Jednadžba Freundlichovih desorpcijskih izotermi uspostavlja odnos 
između sadržaja ispitivane tvari koji ostaje adsorbiran na tlu i 
koncentracije ispitivane tvari u otopini u desorpcijskoj ravnoteži 
(jednadžba (16)).  
Sadržaj tvari koji ostaje adsorbiran na tlu u desorpcijskoj ravnoteži 
izračunava se za svaku epruvetu na sljede ći način: 
C des 
s ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ Ä m des 
ap ðecÞ 
m sol (μg g  -1 ) (13)  
m des 
ap ðecÞ je definiran kao:  
m des 
ap ðecÞ ¼ m des 
m ðecÞ · V 0 
V F r Ä m A 
ap ðμgÞ (14)  
gdje je:  
C des 
s ðecÞ = sadržaj ispitivane tvari koji ostaje adsorbiran na tlu u 
desorpcijskoj ravnoteži ( μg g  -1 ) 
m des 
m ðecÞ = masa tvari odre đena analiti čki u vodenoj fazi u desorp ­
cijskoj ravnoteži ( μg) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1213
 
m A 
ap = masa ispitivane tvari preostala nakon adsorpcijske ravno ­
teže zbog nepotpune zamjene volumena ( μg) 
m des 
ap ðecÞ = masa tvari u otopini u adsorpcijskoj ravnoteži ( μg) 
m A 
ap ¼ m ads 
ap ðecÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(15) 
V F 
r = volumen otopine uzet iz epruvete u svrhu mjerenja ispitivane 
tvari u desorpcijskoj ravnoteži (cm  3 ) 
V R = volumen supernatanta uklonjen iz epruvete nakon uspostave 
adsorpcijske ravnoteže i zamijenjen istim volumenom otopine 
0,01 M CaCl  2 (cm  3 ) 
Freundlichova jednadžba desorpcije prikazana je u (16):  
C des 
s ðecÞ ¼ K des 
F · C des 
ap ðecÞ 1=n ðμgg Ä 1 Þ (16)  
ili u linearnom obliku:  
logC  des 
s ðecÞ ¼ logK  des 
F þ 1=n · logC  des 
ap ðecÞ (17)  
gdje je:  
K des 
F = Freundlichov koeficijent desorpcije  
n = regresijska konstanta  
C des 
ap ðecÞ = masena koncentracija tvari u vodenoj fazi u desorpcij ­
skoj ravnoteži ( μg cm  -3 ) 
Jednadžbe (16) i (17) mogu se prikazati grafi čki, a vrijednosti  K des 
F i 
1/n izračunavaju se regresijskom analizom uz pomo ć jednadžbe (17).  
Napomena:  
Ako je Freundlichov eksponent adsorpcije ili desorpcije 1/n jednak 
1, tada će Freundlichova adsorpcijska odnosno desorpcijska 
konstanta vezanja ( K ads 
F i K des 
F ) biti jednaka konstanti adsorpcijske 
odnosno desorpcijske ravnoteže (K  d i K des ) i grafovi C  s u ovisnosti o 
C aq bit će linearni. Ako eksponenti nisu jednaki 1, grafovi C  s u 
ovisnosti o C  aq bit će nelinearni i konstante adsorpcije i desorpcije 
će varirati duž izotermi.  
2.2.2.  Izvješ će o ispitivanju  
Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljede će informacije:  
— potpune podatke o uzorcima tla, uklju čujući: 
— geografske koordinate lokaliteta (širina, dužina),  
— datum uzorkovanja,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1214
 
— način korištenja (npr. poljoprivredno zemljište, šuma itd.),  
— dubinu uzorkovanja,  
— sadržaj pijeska/praha/gline,  
— pH vrijednosti (u 0,01 M CaCl2),  
— sadržaj organskog ugljika,  
— sadržaj organske tvari,  
— sadržaj dušika,  
— omjer C/N,  
— kapacitet izmjene kationa (mmol/kg),  
— sve informacije vezane uz skupljanje i skladištenje uzoraka tla,  
— prema potrebi, sve relevantne informacije za tuma čenje adsorp ­
cije – desorpcije ispitivane tvari,  
— uputu na metode korištene za odre đivanje pojedinih parametara,  
— podatke o ispitivanoj tvari, prema potrebi,  
— temperaturu pokusa,  
— uvjete centrifugiranja,  
— analiti čki postupak primijenjen za analizu ispitivane tvari,  
— obrazloženje primjene sredstva za otapanje u pripremi radne 
otopine ispitivane tvari,  
— objašnjenje korekcija izra čuna, prema potrebi,  
— podatke iz obrasca za dostavu podataka (Dodatak 6.) i grafi čke 
prikaze,  
— sve informacije i zapažanja korisna za tuma čenje rezultata 
ispitivanja.  
3. REFERENCE  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987) Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02 045, Part II.  
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987) Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.
 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 
18-20 January 1995 (June 1995).  
(5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1215
 
(6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides 
and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, 
Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guideli ­
nes, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/De ­
sorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.  
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): 
Application for registration of a pesticide. Section G. Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
 
(11) BBA (1990) Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agricul ­
ture and Forestry, Braunschweig, Germany.  
(12) Calvet R., (1989) „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour 
in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena” in 
Interactions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), Academic Press, London, str. 83-122.
 
(14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science 
Society of America (S.S.S.A), Special Publication No 22, str. 31-44.
 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974) „An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous 
media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), str. 29-35.  
(16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger 
H.J., (1981) „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analy ­
sis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement 
of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
 
(17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965) 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. 
Weeds, 13, str. 185-190.  
(18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determi ­
nation of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. J.Agric.Food Chem., 18, str. 524-528.
 
(19) Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of 
Agrochemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John 
Wiley & Sons Ltd.  
(20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk 
J.W. and Holland P.T., (1988) „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
str. 901-932.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1216
 
(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976) „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, str. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967) „Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Food Agric., 18, str. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981) „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. 
Pestic. Sci. 12, str. 45-52.
 
(24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977) „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, str. 961-971.
 
(25) Osgerby J.M., (1973) „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, str. 247-258.  
(26) Guth J.A., (1972) „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, str. 143-154.  
(27) Hamaker J.W., (1975) „The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), str. 135-172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C.S., (1971) „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, str. 732-210.  
(29) Hamaker J.W., (1972) „Diffusion and volatilization” in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring 
and J.W. Hamaker eds), Vol. I, str. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981) „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, str. 37-44.
 
(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984) „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, str. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D.I., (1989) „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), str. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976) „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, str. 340-350.  
(34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980) „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, str. 389-395.
 
(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990) „Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series No 2, str. 80-101,
 
(36) Lambert S.M., (1967) „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
str. 572-576.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1217
 
(37) Hance R.J., (1969) „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, str. 667-668.  
(38) Briggs G.G. (1969) „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, str. 1288.  
(39) Briggs G.G. (1981) „Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050-1059.
 
(40) Sabljic A., (1984) „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, str. 243-246.  
(41) Bailey G.W., and White J.L., (1970) „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, str. 29-92.
 
(42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968) „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32, str. 222-234.
 
(43) Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, str. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989) „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, str. 1-17.  
(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972) „Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49-143.
 
(46) Deli J., and Warren G.F., 1971 „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19, str. 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975) „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, str. 454-457.
 
(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, str. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980) „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documenta ­
tion, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982) 11th edition.  
(52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark 
F.E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indu ­
strial sites.  
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the 
laboratory.  
(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide 
adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353-354.  
(60) Grover R., and Hance R.J. (1970) „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., str. 109-138.
 
(61) Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, str. 31-41.  
(62) Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106” Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980) „Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique”. Weed Res. 21, str. 227-231.  
(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981) „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), str. 382-386.  
(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983) „Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil 
organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), str. 
227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984) „Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), str. 297-312.
 
(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), str. 109-116.
 
(68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990) Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980) „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic Toxicology 
(eds J.G. Eaton, et al.), str. 78-115, ASTM STP 707, Phila ­
delphia.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1219
 
(70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979) „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds”. Science, Vol. 206, str. 831-832.  
(71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981) 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, str. 38-42.
 
(72) Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. 
Chemosphere, Vol. 10(8), str. 833-846.  
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité”. 
Revue de l’Agric., 34 (4), str. 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W. (1996) „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil”. Chemosphere, 32(12), str. 2493-2504.  
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995) „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), str. 1373- 1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – comparison of different stationary phases”. Chemosp ­
here 27 (12), str. 2341-2352.  
(77) Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Research, Vol. 7, str. 29-36.
 
(78) Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str. 297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C.H., (1970) „Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, str. 14-32.
 
(81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960) „Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc., str. 3973-93.
 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980) „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l’adsorption”. Ann. Agron. 31, str. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996) „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.  
(84) Guth, J.A., (1985) „Adsorption/desorption”, in Joint Inter ­
national Symposium, Physicochemical Properties and their 
Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canter ­
bury, UK.  
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26, str. 305 (1962).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1220
 
Dodatak 1.  
Plan ispitivanja
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1221
 
Dodatak 2.  
UTJECAJ TO ČNOSTI ANALITI ČKE METODE I PROMJENE 
KONCENTRACIJE NA TO ČNOST REZULTATA ADSORPCIJE  
Iz tablice u nastavku (84) vidljivo je da u slu čaju kad je razlika izme đu početne 
mase (m  0 = 110 μg) i ravnotežne mase [ m ads 
aq ðeqÞ = 100 μg] ispitivane tvari u 
otopini vrlo mala, 5 %-tna greška u mjerenju ravnotežne koncentracije rezultira 50 %-tnom greškom u izra čunu mase tvari adsorbirane u tlu [
m ads 
s ðeqÞ] i 52,4 %- 
tnom greškom u izra čunu K  d . 
Količina tla  m  soil = 10 g  
Volumen otopine  V  0 = 100 cm  3 
m ads 
aq ðeqÞ 
(μg) C ads 
aq ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m ads 
s ðeqÞä 
(μg) C ads 
s ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
ZA A = 9 %
 m0 ¼ 110μgili 
C0 ¼ 1; 100μg=cm3 100 1,000  istinita 
vrijednost  10 1,00  istinita 
vrijednost  1 
101 1,010  1 %  9  0,90  10 %  0,891  10,9 %  
105 1,050  5 %  5  0,50  50 %  0,476  52,4 %  
109 1,090  9 %  1  0,10  90 %  0,092  90,8 %  
ZA A = 55 %
 m0 ¼ 110μgili 
C0 ¼ 1; 100μg=cm3 50,0 0,500  istinita 
vrijednost  60,0 6,00  istinita 
vrijednost  12,00  
50,5 0,505  1 %  59,5  5,95  0,8 %  11,78  1,8 %  
52,5 0,525  5 %  57,5  5,75  4,0 %  10,95  8,8 %  
55,0 0,550  10 %  55,0  5,50  8,3 %  10,00  16,7 %  
ZA A = 99 %
 m0 ¼ 110μgili 
C0 ¼ 1; 100μg=cm3 1,100  0,011  istinita 
vrijednost  108,9  10,89  istinita 
vrijednost  990 
1,111  0,01111  1 %  108,889  10,8889  0,01 %  980  1,0 %  
1,155  0,01155  5 %  108,845  10,8845  0,05 %  942  4,8 %  
1,21 0,0121  10 %  108,790  10,8790  0,10  899  9,2 % 
äm ads 
s ðeqÞ = m 0 Ä m ads 
aq ðeqÞ; C ads 
s ðeqÞ ¼ C 0 Ä C ads 
aq ðeqÞ h i  
V 0 
m estimat  · Kd ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads aq ðeqÞ V 0 
m estimat  
m ads 
s ðeqÞ = masa ispitivane tvari u fazi tla u ravnoteži, μg 
m ads 
aq ðeqÞ = masa ispitivane tvari u vodenoj fazi u ravnoteži, μg 
C ads 
s ðeqÞ = sadržaj ispitivane tvari u fazi tla u ravnoteži, μg g -1 
C ads 
aq ðeqÞ = masena koncentracija ispitivane tvari u vodenoj fazi u ravnoteži, μg cm  -3 
R = analiti čka greška u odre đivanju m ads 
aq ðeqÞ; 
R‡ = ra čunska greška zbog analiti čke greške R  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1222
 
Dodatak 3.  
TEHNIKE PROCJENE ZA K  D 
1. Tehnike procjene omogu ćuju predvi đanje K  d na temelju korelacija npr. s 
vrijednostima P  ow (12)(39)(63-68), podacima o topljivosti u vodi 
(12)(19)(21)(39)(68-73), podacima o polaritetu dobivenim primjenom 
HPLC-a na obrnutu fazu (74-76). K  oc odnosno K  om izračunavaju se iz 
jednadžbi kako je prikazano u tablicama 1. i 2., a zatim posredno i K  d 
iz jednadžbi: 
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1,724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Koncept tih korelacija temelji se na dvije pretpostavke: (1) na adsorpciju 
tvari prvenstveno utje če organska tvar u tlu; i (2) interakcije koje pritom 
nastaju uglavnom su nepolarne prirode. Prema tomu, ove korelacije: (1) ne mogu se primijeniti ili se mogu samo djelomi čno primijeniti na polarne 
tvari i (2) nisu primjenljive u slu čajevima kad je sadržaj organske tvari u tlu 
vrlo malen (12). Osim toga, iako su prona đene zadovoljavaju će korelacije 
između P
 ow i adsorpcije (19), to ne vrijedi i za odnos izme đu topljivosti u 
vodi i obima adsorpcije (19)(21); zasada su istraživanja vrlo kontradiktorna.  
3. U tablicama 1. i 2. dani su neki primjeri korelacija izme đu koeficijenta 
adsorpcije i podjelnog koeficijenta oktanol-voda te topljivosti u vodi.  
Tablica 1.  
Primjer korelacija izme đu adsorpcijskog koeficijenta razdiobe i podjelnog koefiijenta oktanol-voda; za 
dodatne primjere vidjeti (12) (68).  
Tvari  Korelacije  Autori  
Supstituirane uree  log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981.) (39)  
Aromatske klorirane tvari  log K  oc = – 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou i sur. (1983.) (65)  
Razni pesticidi  log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl i Mingelgrin (1984.) (66)  
Aromatski ugljikovodici  log K  oc = – 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles i Mantoura (1987.) (67)  
Tablica 2.  
Primjeri korelacija izme đu adsorpcijskog koeficijenta razdiobe i topljivosti u vodi; za dodatne primjere 
vidjeti (68) (69).  
Spojevi  Korelacije  Autori  
Razni pesticidi  log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl i Mingelgrin (1984.) (66)  
Alifatske, aromatske klori ­
rane tvari  log K  om = (4,040 +/– 0,038) – (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou i sur. (1979.) (70)  
α-naftol  logK  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset i sur. (1981.) (71)  
Cikličke, alifatske aromatske 
tvari logK  oc = – 1,405 – 0,921 log S  w – 
0,00953 (mp – 25)  Karickhoff (1981.) (72)  
Razni spojevi  log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982.) (73)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1223
 
Dodatak 4.  
IZRAČUNI ZA DEFINIRANJE UVJETA CENTRIFUGIRANJA  
1. Vrijeme centrifugiranja proizlazi iz sljede će formule, uz pretpostavku 
sferičnih čestica:  
t ¼ 9 
2 " 
η 
ω 2 rp 2 ðρ s Ä ρ ap Þ # 
ln ðR b=R t Þ (1)  
U interesu jednostavnosti svi su parametri opisani u jedinicama razli čitim 
od SI jedinica (g, cm).  
gdje je:  
ω = brzina rotacije (= 2 π rpm/60), rad s  -1 
rpm = okretaji u minuti (o/min)  
η = viskozitet otopine g s  -1 cm -1 
r p = polumjer čestica, cm  
ρ s = gustoća tla, g cm  -3 
ρ aq = gustoća otopine, g cm  -3 
R t = udaljenost od središta rotora centrifuge do vrha otopine u epruveti 
za centrifugiranje, cm  
R b = udaljenost od središta rotora centrifuge do dna epruvete za centri ­
fugiranje, cm  
R b -R t = dužina smjese tlo/otopina u epruveti za centrifugiranje, cm  
U praksi se op ćenito primjenjuju dva puta duža vremena od izra čunanih 
kako bi se zajam čilo potpuno odvajanje.  
2. Jednadžba (1) može se dodatno pojednostavniti ako pretpostavimo da su 
viskozitet ( η) i gustoća (ρ aq ) otopine jednaki viskozitetu i gusto ći vode na 
25 °C; prema tomu, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 i ρ aq = 1,0 g. cm  -3 . 
Tada vrijeme centrifugiranja proizlazi iz jednadžbe (2):  
t ¼ 3:7 
ðrpmÞ 2 · r p 2 ðρ s Ä 1Þ ln Rb 
Rt (2) 
3. Iz jednadžbe (2) vidljivo je da su za definiranje uvjeta centrifugiranja tj. 
vremena (t) i brzine (rpm tj. o/min), kako bi se postiglo odvajanje čestica 
određene veličine (u našem slu čaju polumjera 0,1 μm), važna dva parame ­
tra: (1) gusto ća tla i (2) dužina smjese u epruveti za centrifugiranje (R  b -R t ) 
tj. udaljenost koju čestica tla prelazi od vrha otopine do dna epruvete; o čito 
je da u slu čaju definiranog volumena dužina smjese u epruveti ovisi o 
kvadratu polumjera epruvete.  
4. Na slici 1. prikazane su promjene vremena centrifugiranja (t) u ovisnosti o 
brzini centrifugiranja (rpm tj. o/min) za razli čite gustoće tla (ρ s ) (Slika 1.a) i 
različite dužine smjese u epruvetama za centrifugiranje (Slika 2.a). Iz slike 
1.a jasno je vidljiv utjecaj gusto će tla; primjerice, kod klasi čnog centrifu ­
giranja na 3 000 o/min vrijeme centrifugiranja kod gusto će tla od 1,2 g cm  3 
je približno 240 minuta, dok kod gusto će tla od 2,0 g cm  3 ono iznosi samo 
50 minuta. Isto tako, iz slike 1.b vidljivo je da je kod klasi čnog centrifu ­
giranja na 3 000 o/min vrijeme centrifugiranja za dužinu smjese od 10 cm približno 50 minuta, dok za dužinu od 1 cm ono iznosi samo 7 minuta. Ipak, važno je prona ći optimalan odnos izme đu centrifugiranja, koje zahti ­
jeva što manju dužinu, i jednostavnosti rukovanja za izvo đača pokusa 
prilikom odvajanja faza nakon centrifugiranja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1224
 
5. Povrh toga, kod definiranja pokusnih uvjeta za odvajanje faza tlo/otopina 
važno je uzeti u obzir mogu ću prisutnost tre će „pseudo” faze tj. koloida. 
Ove čestice veli čine ispod 0,2 μm mogu imati važan utjecaj na čitav 
mehanizam adsorpcije tvari u suspenziji tla. Kad se centrifugiranje provodi na na čin kako je gore opisano, koloidi ostaju u vodenoj fazi i 
analiziraju se zajedno s vodenom fazom. Time se gube informacije o 
njihovom utjecaju.
 
Ako laboratorij ima opremu za ultracentrifugiranje ili ultrafiltraciju, adsorp ­
cija/desorpcija tvari u tlu može se podrobnije ispitati, uklju čujući adsorpciju 
tvari na koloide. U tom slu čaju treba primijeniti ultracentrifugiranje na 
60 000 o/min/min ili ultrafiltraciju uz poroznost filtara od 100 000 
daltona kako bi se odijelile sve tri faze: tlo, koloidi i otopina. Ispitni 
protokol treba u skladu s tim izmijeniti kako bi sve tri faze bile podvrgnute analizi tvari.
 
Slika 1.a
  
Promjene vremena centrifugiranja (t) u ovisnosti o brzini centrifugiranja 
(o/min) za razli čite gustoće tla (ρ s ). R  t = 10 cm, R  b – R  t = 10 cm, η = 
8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 i ρ aq = 1,0 g. cm  -3 na 25 °C.  
Slika 1.b
  
Promjene vremena centrifugiranja (t) u ovisnosti o brzini centrifugiranja 
(o/min) za razli čite dužine smjese u epruveti za centrifugiranje (R  b – R  t ) 
= L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g. cm  -3 na 25 °C i ρ s 
= 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1225
 
Dodatak 5.  
IZRAČUN ADSOPRCIJE A (%) I DESORPCIJE D (%)  
Vremenska shema postupka je:
  
Kod svih se izra čuna polazi od pretpostavke da je ispitivana tvar stabilna i da se 
ne adsorbira u zna čajnoj mjeri na stijenkama posude.  
ADSORPCIJA A (A %)  
(a) Paralelna metoda  
Postotak adsorpcije izra čunava se za svaku epruvetu (i) u svakom vremenu 
(t i ) prema sljede ćoj jednadžbi:  
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1)  
Izrazi iz ove jednadžbe mogu se izra čunati ovako: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m ads 
s ðt i Þ ¼ m 0 Ä C ads 
aq ðt i Þ · V 0 (μg) (3)  
gdje je:  
A t i = postotak adsorpcije (%) u vremenu t  i 
m ads 
s ðt i Þ = masa ispitivane tvari na tlu u vremenu t  i u kojemu se provodi 
analiza (μg) 
m 0 = masa ispitivane tvari u epruveti na po četku ispitivanja ( μg) 
C 0 = početna masena koncentracija ispitne otopine u dodiru s tlom 
(μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1226
 
C ads 
aq ðt i Þ = masena koncentracija tvari u vodenoj fazi u vremenu t  i u 
kojemu se provodi analiza ( μg cm  -3 ); ova se koncentracija 
određuje analiti čki, uzimaju ći u obzir vrijednosti slijepih proba  
V 0 = početni volumen ispitne otopine u dodiru s tlom (cm  3 ) 
Vrijednosti postotaka adsorpcije A  ti odnosno  C ads 
aq ðt i Þ prikažu se grafi čki u 
ovisnosti o vremenu i odredi vrijeme nakon kojega je postignuta sorpcijska 
ravnoteža. Primjeri takvih grafova prikazani se na slikama 1. i 2.
  
Slika 1.  
Graf adsorpcijske ravnoteže
  
Slika 2.  
Masena koncentracija ispitivane tvari u vodenoj fazi (C  aq ) u ovisnosti o 
vremenu  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1227
 
(b) Serijska metoda  
Kod jednadžbi u nastavku uzeto je u obzir da se postupak ispitivanja 
adsorpcije provodi mjerenjima ispitivane tvari u malim alikvotima vodene faze u odre đenim vremenskim intervalima.
 
Količina tvari adsorbirana na tlo izra čunava se u svakom vremenskom 
intervalu na sljede ći način: 
— za prvi vremenski interval Δt 1 = t 1 – t 0 
m ads 
s ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A 
a Í Î  
(4) 
— za drugi vremenski interval Δt 2 = t 2 – t 1 
m ads 
s ðΔt 2 Þ ¼ m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 2 Þ · V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î  
(5) 
— za tre ći vremenski interval Δt 3 = t 3 – t 2 
m ads 
s ðΔt 3 Þ ¼ m ads 
m ðt 2 Þ · V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 3 Þ · V 0 Ä 2 · v A 
a 
v A a Í Î  
(6) 
— za n-ti vremenski interval Δt n = t n – t n – 1 
m ads 
s ðΔt n Þ ¼ m ads 
m ðt nÄ1 Þ · V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v A 
a 
v A a Í Î  
Ä m ads 
m ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v A 
a 
v A a Í Î  
(7) 
Postotak adsorpcije u svakom vremenskom intervalu  A Δt i izračunava se 
pomoću sljedeće jednadžbe:  
A Δt i ¼ m ads 
s ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8)  
dok postotak adsorpcije ( A t i ) u vremenu t  i proizlazi iz sljede će jednadžbe:  
A t i ¼ X  Δt i 
j¼Δt 1 m ads 
s ðjÞ 
m 0 · 100ð%Þ (9)  
Vrijednosti asorpcije  A t i odnosno  A Δt i (ovisno o potrebama istraživanja) 
prikažu se grafi čki u ovisnosti o vremenu i odredi se vrijeme nakon kojega 
je uspostavljena sorpcijska ravnoteža.  
U ravnotežnom vremenu t  eq : 
— masa ispitivane tvari adsorbirana na tlo je:  
m ads 
s ðeqÞ ¼ X  n 
Δt i ¼1 m ads 
s ðΔt i Þ (10)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1228
 
— masa ispitivane tvari u otopini je:  
m ads 
aq ðeqÞ ¼ m 0 Ä X  n 
Δt i ¼1 m ads 
s ðΔt i Þ (11)  
— postotak adsorpcije u ravnoteži je:  
A eq ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12)  
Gornji parametri definirani su kao:  
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = masa tvari adsorbirana na tlo u 
vremenskim intervalima Δ t1 , Δ t2 , 
…, Δ tn (μg) 
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = masa tvari izmjerena u alikvotu  
v A 
a u vremenu t  1 , t 2 , …., t  n (μg) 
m ads 
s ðeqÞ = masa tvari adsorbirana na tlo u 
adsorpcijskoj ravnoteži ( μg) 
m ads 
aq ðeqÞ = masa tvari u otopini u adsorpcij ­
skoj ravnoteži ( μg) 
v A 
a = volumen alikvota u kojemu se 
mjeri ispitivana tvar (cm  3 ) 
Α Δti = postotak adsorpcije koji odgovara 
vremenskom intervalu Δ ti (%) 
A eq = postotak adsorpcije u adsorpcij ­
skoj ravnoteži (%)  
DESORPCIJA D (A %)  
Vremenom po četka pokusa s kinetikom desorpcije (t  0 ) smatra se trenutak kad se 
maksimalni dobiveni volumen otopine ispitivane tvari (nakon uspostave adsorp ­
cijske ravnoteže) zamijeni jednakim volumenom otopine 0,01 M CaCl  2 . 
(a) Paralelna metoda  
U vremenu t  i izmjeri se masa ispitivane tvari u vodenoj fazi uzetoj iz 
epruvete i ( V i 
r ) i izračuna desorbirana masa prema sljede ćoj jednadžbi:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · V 0 
v i r Í Î 
Ä m A 
aq (13) 
U desorpcijskoj ravnoteži t  i = t eq te je prema tomu m des 
aq ðt i Þ m des 
aq ðeqÞ 
Masa ispitivane tvari desorbirana u vremenskom intervalu ( Δt i ) proizlazi iz 
sljedeće jednadžbe:  
m des 
aq ðΔt i Þ ¼ m des 
aq ðt i Þ Ä X  i¼1 
j¼1 m des 
aq ðjÞ (14)  
Postotak desorpcije izra čunava se:  
u vremenu t  i pomoću jednadžbe:  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1229
 
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads s ðeqÞ · 100ð%Þ (15) 
a u vremenskom intervalu ( Δt i ) pomoću jednadžbe:  
D Δt i ¼ m des 
aq ðΔt i Þ 
m ads s ðeqÞ · 100ð%Þ (16)  
gdje je:  
D t i = postotak desorpcije u vremenu t  i (%) 
D Δt i = postotak desorpcije koji odgovara vremenskom intervalu Δt i 
(%) 
m des 
aq ðt 1 Þ = masa ispitivane tvari desorbirana u vremenu t  i (μg) 
m des 
aq ðΔt 1 Þ = masa ispitivane tvari desorbirana u vremenskom intervalu Δt i 
(μg) 
m des 
m ðt i Þ = masa ispitivane tvari izmjerena analiti čki u vremenu t  i u 
volumenu otopine  V i 
r koji se uzima na analizu ( μg) 
m A 
aq = masa ispitivane tvari preostala nakon adsorpcijske ravnoteže 
zbog nepotpune zamjene volumena ( μg) 
m A 
aq ¼ m ads 
aq ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m ads 
aq ðeqÞ = masa ispitivane tvari u otopini u adsorpcijskoj ravnoteži ( μg) 
V R = volumen supernatanta uklonjen iz epruvete nakon uspostave 
adsorpcijske ravnoteže i zamijenjen istim volumenom otopine 0,01 M CaCl
 2 (cm  3 ) 
V i 
r = volumen otopine uzet iz epruvete (i) u svrhu mjerenja ispiti ­
vane tvari u pokusu s kinetikom desorpcije (cm  3 ) 
Vrijednosti desorpcije D  ti odnosno D  Δti (ovisno o potrebama istraživanja) 
prikažu se grafi čki u ovisnosti o vremenu i odredi vrijeme nakon kojega je 
postignuta desorpcijska ravnoteža.  
(b) Serijska metoda  
Kod jednadžbi u nastavku uzeto je u obzir da je prethodni postupak ispi ­
tivanja adsorpcije proveden mjerenjem ispitivane tvari u malim alikvotima  
ðv A 
a Þ vodene faze (serijska metoda u odjeljku 1.9. „Provo đenje ispitiva ­
nja”). Polazi se od pretpostavke da: (a) je volumen supernatanta uklonjen 
iz epruvete nakon pokusa s kinetikom adsorpcije zamijenjen istim volu ­
menom otopine 0,01 M CaCl  2 (V R ) i (b) ukupni volumen vodene faze u 
dodiru s tlom (V  T ) tijekom pokusa s kinetikom desorpcije ostaje nepromi ­
jenjen; on proizlazi iz sljede će jednadžbe:  
V T ¼ V 0 Ä X  n 
i¼1 v A 
a ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1230
 
U vremenu t  i : 
— izmjeri se masa ispitivane tvari u malom alikvotu  ðv D 
a Þ i izračuna 
desorbirana masa prema jednadžbi:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · V T 
v D a Í Î 
Ä m A 
aq · V T Ä ði Ä 1Þ · v D 
a 
V T Í Î  
(19) 
— u desorpcijskoj ravnoteži t  i = t eq te je prema tomu. m des 
aq ðt i Þ = m des 
aq ðeqÞ 
— postotak desorpcije D  ti izračunava se pomo ću sljedeće jednadžbe:  
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads s ðeqÞ · 100 ð%Þ (20)  
U vremenskom intervalu ( Δt i ): 
u svakom vremenskom intervalu izra čuna se desorbirana koli čina tvari na 
sljedeći način: 
— za prvi vremenski interval Δt 1 = t 1 – t 0 
m des 
aq ðΔt 1 Þ ¼ m des 
m ðt 1 Þ · V T 
v D a Í Î 
Ä m A 
aq and m des 
s ðt 1 Þ ¼ m aq 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðΔt 1 Þ (21)  
— za drugi vremenski interval Δt 2 = t 2 – t 1 
m des 
aq ðΔt 2 Þ ¼ m des 
m ðt 2 Þ · V T 
v D a Í Î 
Ä m des 
aq ðΔt 1 Þ · V T Ä v D 
a 
V T Í Î 
Ä m A 
aq · V T Ä v D 
a 
V T Í Î  
i 
m des 
s ðt 2 Þ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m  des 
aq ðΔt 1 Þ þ m des 
aq ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— za n-ti interval Δt n = t n – t n-1 
m des 
aq ðΔt n Þ ¼ " 
m des 
m ðt n Þ · V T 
v D a Í Î 
Ä m A 
aq · ðV T Ä ðn Ä 1Þ · v D 
a Þ 
V T Í Î  
Ä X  nÄ1 
i¼1;n6¼1 V T Ä ðn Ä iÞ · v D 
a Ä Ö  
V T · m des 
aq Δt i ð Þ Í Î # 
and 
m des 
s ðt n Þ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä X  n 
i¼1;n6¼1 m des 
aq ðΔt i Þ (23) 
Na kraju se izra čuna postotak desorpcije u svakom vremenskom intervalu 
D Δti prema sljede ćoj jednadžbi:  
D Δt i ¼ m des 
aq ðΔt i Þ 
m ads s ðeqÞ · 100ð%Þ (24)  
dok postotak desorpcije  D t i u vremenu t  i proizlazi iz sljede će jednadžbe:  
D t i ¼ X  Δt i 
j¼Δt 1 m des 
aq ðjÞ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100ð%Þ (25)  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1231
 
gdje su gornji parametri definirani kao:  
m des 
s ðΔt 1 Þm des 
s ðΔt 2 Þ; … ;m des 
s ðΔt n Þ = masa tvari koja ostaje adsorbirana 
na tlu nakon vremenskih intervala 
Δt 1 , Δt 2 , …, Δt n (μg) 
m des 
aq ðΔt 1 Þm des 
aq ðΔt 2 Þ; … ;m des 
aq ðΔt n Þ = masa ispitivane tvari desorbirana u 
vremenskim intervalima Δt 1 , Δt 2 , 
…, Δt n (μg) 
m des 
s ðt 1 Þm des 
s ðt 2 Þ; … ;m des 
s ðt n Þ = masa tvari izmjerena u alikvotu  
ðv D 
a Þ u vremenu t  1 , t 2 , …, t  n (μg) 
V T = ukupni volumen vodene faze u 
dodiru s tlom tijekom pokusa s kinetikom desorpcije izvedenog 
serijskom metodom (cm
 3 ) 
m A 
aq = masa ispitivane tvari preostala 
nakon adsorpcijske ravnoteže zbog nepotpune zamjene volumena ( μg) 
m
 A 
aq ¼ Í 
V 0 Ä X  n 
i¼1 v A 
a ðiÞ Î 
Ä V R 
Í 
V 0 Ä X  n 
i¼1 v A 
a ðiÞ Î 0 
B B B B @ 1 
C C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volumen supernatanta uklonjen iz 
epruvete nakon uspostave adsorp ­
cijske ravnoteže i zamijenjen 
istom koli činom otopine 0,01 M 
CaCl  2 (cm  3 ) 
v D 
a = volumen alikvota uzetog na analizu 
iz epruvete (i) tijekom pokusa s 
kinetikom desorpcije izvedenog 
serijskom metodom (cm  3 ) 
v D 
a Ï 0,02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1232
 
Dodatak 6.  
ADSORPCIJA/DESORPCIJA U TLIMA: OBRASCI ZA DOSTAVU PODATAKA  
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C  
Prikladnost analiti čke metode  
Izvagana masa tla  g  
Tlo: suha masa  g  
Volumen otopine CaCl  2 cm 3 
Nazivna konc. kona čne otopine  μg cm  -3 
Analitička konc. kona čne otopine  μg cm  -3 
Načelo analiti čke metode:  
Baždarenje analiti čke metode:  
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 sati): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C 
Primijenjena analiti čka metodologija:  Neizravna  □ Paralelna  □ Serijska  □ 
Izravna  □ 
Adsorpcijski test: ispitni uzorci  
Simbol  Jedinice  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  
Epruveta br.  
Izvagana masa tla  —  g  
Tlo: suha masa  m  soil g 
Volumen vode u izvaganoj masi 
tla (izračunani)  V WS cm 3 
Volumen otopine 0,01 M CaCl  2 
za ekvilibraciju tla  cm 3 
Volumen radne otopine  cm  3 
Ukupni volumen vodene faze u 
dodiru s tlom  V 0 cm 3 
Početna koncentracija ispitne 
otopine  C 0 μg cm  -3 
Masa ispitivane tvari na po četku 
ispitivanja  m 0 μg ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1233
 
Simbol  Jedinice  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  Vrijeme do 
uspostavljanja 
ravnoteže  
Nakon tresenja i centrifugiranja  
NEIZRAVNA METODA  
Paralelna metoda  
Koncentracija ispitivane tvari u 
vodenoj fazi, uklj. ispravak za 
vrijednost slijepe probe  C ads 
ap ðt i Þ μg cm  -3 
Serijska metoda  
Izmjerena masa ispitivane tvari 
u alikvotu  V A 
a m ads 
m ðt i Þ μg 
IZRAVNA METODA  
Masa ispitivane tvari adsorbi ­
rana na tlo  m ads 
s ðt i Þ μg 
Izračun adsorpcije  
Adsorpcija  A  t i % 
A Δt i % 
Srednje vrijednosti  
Koeficijent adsorpcije  K  d cm 3 g -1 
Srednje vrijednosti  
Koeficijent adsorpcije  K  co cm 3 g -1 
Srednje vrijednosti  
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 sati): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C  
Adsorpcijski test: slijepe probe i kontrola  
Simbol  Jedinice  Slijepa proba  Slijepa proba  Kontrola  
Epruveta br.  
Izvagana masa tla  g  0  0  
Količina vode u izvaganoj masi tla 
(izračunana)  cm 3 — —  
Dodani volumen otopine 0,01 M 
CaCl  2 cm 3 
Dodani volumen radne otopine ispiti ­
vane tvari  cm 3 0 0  
Ukupni volumen vodene faze (izra ču­
nani)  cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1234
 
Simbol  Jedinice  Slijepa proba  Slijepa proba  Kontrola  
Početna koncentracija ispitivane tvari 
u vodenoj fazi  μg cm  -3 
Nakon tresenja i centrifugiranja  
Koncentracija u vodenoj fazi  μg cm  -3 
Napomena: prema potrebi dodati stupce  
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 sati): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C  
Bilanca mase  
Simbol  Jedinice  
Epruveta br.  
Izvagana masa tla  —  g  
Tlo: suha masa  ms  oil g 
Volumen vode u izvaganoj masi tla 
(izračunani)  V WS ml 
Volumen otopine 0,01 M CaCl  2 za 
ekvilibraciju tla  ml 
Volumen radne otopine  cm  3 
Ukupni volumen vodene faze u dodiru s 
tlom V 0 cm 3 
Početna koncentracija ispitne otopine  C  0 μg cm  -3 
Vrijeme do uspostavljanja ravnoteže  —  h  
Nakon tresenja i centrifugiranja  
Koncentracija ispitivane tvari u vodenoj 
fazi u adsorpcijskoj ravnoteži, uklj. ispravak za vrijednost slijepe probe
 C ads 
ap ðecÞ μg cm  -3 
Vrijeme do uspostavljanja ravnoteže  t  eq h 
1. razrjeđivanje otapalom  
Uklonjeni volumen vodene faze  V  rec cm 3 
Dodani volumen otapala  ΔV cm  3 
1. ekstrakcija otapalom  
Signal analiziran u otapalu  S  E1 var. 
Konc. ispitivane tvari u otapalu  C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1235
 
Simbol  Jedinice  
Masa tvari ekstrahirana iz tla i sa stijenki 
posude  m E1 μg 
2. razrjeđivanje otapalom  
Uklonjeni volumen otapala  ΔV s cm 3 
Dodani volumen otapala  ΔV’ cm  3 
2. ekstrakcija otapalom  
Signal analiziran u fazi otapala  S  E2 var. 
Konc. ispitivane tvari u otapalu  C  E2 μg cm  -3 
Masa tvari ekstrahirana iz tla i sa stijenki 
posude  m E2 μg 
Ukupna masa ispitivane tvari ekstrahi ­
rana u dva koraka  m E μg 
Bilanca mase  MB  %  
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 sati): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C  
Adsorpcijske izoterme  
Simbol  Jedinice  
Epruveta br.  
Izvagana masa tla  —  g  
Tlo: suha masa  E  g  
Volumen vode u izvaganoj masi 
tla (izračunani)  V WS cm 3 
Volumen otopine 0,01 M CaCl  2 
za ekvilibraciju tla  cm 3 
Dodani volumen radne otopine  cm  3 
Ukupni volumen vodene faze u 
dodiru s tlom (izra čunani)  V 0 cm 3 
Koncentracija otopine  C  0 μg cm  -3 
Vrijeme do uspostavljanja 
ravnoteže  — h  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1236
 
Simbol  Jedinice  
Nakon tresenja i centrifugiranja  
Koncentracija tvari u vodenoj 
fazi, uklj. ispravak za vrijednost slijepe probe
 C ads 
ap ðecÞ μg cm  -3 
Temperatura  °C  
Adsorbirana masa po jedinici tla  C  ads 
s ðecÞ μg g  -1 
Regresijska analiza:  
K F ads vrijednost:  
vrijednost 1/n:  
regresijski koeficijent r  2 : 
Ispitivana tvar:  
Ispitivano tlo:  
Sadržaj suhe mase tla (105 °C, 12 sati): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ° C 
Primijenjena analiti čka metodologija:  Neizravna  □ Paralelna  □ Serijska  □ 
Desorpcijski test  
Simbol  Jedinice  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  
Broj epruvete iz adsorpcijskog koraka  
Masa tvari adsorbirana na tlo u adsorp ­
cijskoj ravnoteži  m ads 
s ðecÞ μg 
Uklonjeni volumen vodene faze zamije ­
njen s 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Ukupni volumen vodene 
faze u dodiru s tlom  PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masa ispitivane tvari preostala nakon 
adsorpcijske ravnoteže zbog nepotpune zamjene volumena
 m A 
ap μg 
Kinetika desorpcije  
Izmjerena masa tvari desorbirana iz tla u 
vremenu t  i m des 
m ðt i Þ μg 
Volumen otopine uzet iz 
epruvete (i) u svrhu 
mjerenja ispitivane tvari  PM V  r i cm 3 
SM V  a D cm 3 
Masa tvari desorbirana iz tla u vremenu t  i 
(izračunana)  m des 
aq ðt i Þ μg 
Masa tvari desorbirana iz tla u vremen ­
skom intervalu Δt i (izračunana)  m des 
aq ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1237
 
Simbol  Jedinice  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  Vremenski 
interval  
Postotak desorpcije  
Desorpcija u vremenu t  i D ti % 
Desorpcija u vremenskom intervalu Δt i D Δt i % 
Prividni koeficijent desorpcije  K  des 
PM: paralelna metoda  
SM: serijska metoda  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1238
 
C.19.  PROCJENA KOEFICIJENTA ADSORPCIJE (K  oc ) NA TLO I 
KANALIZACIJSKI MULJ PRIMJENOM TEKU ĆINSKE 
KROMATOLOGIJE VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPLC)  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG121 (2001.).  
1.1. UVOD  
Sorpcijsko ponašanje tvari u tlu i kanalizacijskom mulju može se 
opisati parametrima koji se odre đuju pokusima u skladu s ispitnom 
metodom C.18. Važan parametar je koeficijent adsorpcije, koji se 
definira kao omjer koncentracije tvari u tlu/mulju i koncentracije tvari u vodenoj fazi u adsorpcijskoj ravnoteži. Koeficijent adsorpcije normiran na sadržaj organskog ugljika tla K
 oc koristan je pokazatelj 
sposobnosti vezanja kemikalije na organsku tvar u tlu i kanalizacij ­
skom mulju i omogu ćuje usporedbe izme đu različitih kemikalija. 
Ovaj se parametar može procijeniti korelacijama s topljivoš ću u 
vodi i podjelnim koeficijentom n-oktanol/voda (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).  
HPLC se u pokusnoj metodi iz ovog testa koristi za procjenu koefi ­
cijenta adsorpcije K  oc u tlu i kanalizacijskom mulju (8). Procjene 
pokazuju ve ću pouzdanost od onih koje se dobiju izra čunima 
QSAR (9). Kao metoda procjene on ne može u potpunosti zamijeniti šaržne pokuse u ravnoteži koji se koriste u ispitnoj metodi C.18. Ipak, procijenjeni K
 oc može biti koristan za odabir ispitnih parame ­
tara za istraživanja adsorpcije/desorpcije u skladu s ispitnom 
metodom C.18. primjenom jednadžbe (3) za izra čuavanje K  d (koefi­
cijent razdiobe) ili K  f (Freundlichov koeficijent adsorpcije) (vidjeti 
odjeljak 1.2.).  
1.2. DEFINICIJE  
K d : koeficijent razdiobe definiran je kao omjer ravnotežnih koncen ­
tracija C ispitivane tvari otopljene u dvofaznom sustavu koji se sastoji od sorbensa (tlo ili kanalizacijski mulj) i vodene faze; to je 
bezdimenzionalna vrijednost ako se koncentracije u obje faze izra ­ 
žavaju kao omjer masa/masa. Ako se koncentracija u vodenoj fazi izražava kao omjer masa/volumen, jedinice su ml · g
 -1 . K d može biti 
različit ovisno o svojstvima sorbensa i može ovisiti o koncentraciji.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C ap (1) 
gdje je:  
C soil = koncentracija ispitivane tvari u tlu u ravnoteži ( μg· g -1 ) 
C sludge  = koncentracija ispitivane tvari u mulju u ravnoteži ( μg· g -1 ) 
C aq = koncentracija ispitivane tvari u vodenoj razi u ravnoteži 
(μg· g -1 , μg· ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1239
 
K f : Freundlichov koeficijent adsorpcije definiran je kao koncentra ­
cija ispitivane tvari u tlu odnosno kanalizacijskom mulju (x/m) kad 
je ravnotežna koncentracija C  aq u vodenoj fazi jednaka jedan; jedi ­
nice su μg·g -1 sorbensa. Vrijednost se može razlikovati ovisno o 
svojstvima sorbensa.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n · logC  ap (2) 
gdje je:  
x/m = koli čina ispitivane tvari x ( μg) adsorbirana na koli činu 
sorbensa m (g) u ravnoteži  
1/n = nagib Freundlichove adsorpcijske izoterme  
C aq = koncentracija ispitivane tvari u vodenoj fazi u ravnoteži ( μg· 
ml- 1 ) 
At C  ap ¼ 1; log K  f ¼ log x 
m 
K oc : koeficijent razdiobe (K  d ) ili Freundlichov koeficijent adsorpcije 
(K f ) normiran na sadržaj organskog ugljika (f  oc ) sorbensa; on je, 
posebno kod neioniziranih kemikalija, približni pokazatelj obima 
adsorpcije izme đu tvari i sorbensa i omogu ćuje usporedbe izme đu 
različitih kemikalija. Ovisno o dimenzijama K  d i K  f , K oc može biti 
bezdimenzionalan ili se izražavati u jedinicama ml · g -1 ili μg· g -1 
organske tvari.  
K co ¼ Kd 
fco bezdimenzionalni ili ml · g Ä1 Ä Ö  ili Kf 
fco μg · g Ä1 Ä Ö  
(3) 
Odnos izme đu K  oc i K  d nije uvijek linearan, tako da se vrijednosti 
K oc mogu razlikovati ovisno o vrsti tla, ali je njihova varijabilnost 
znatno smanjena u odnosu na vrijednosti K  d i K f . 
Koeficijent adsorpcije (K  oc ) izvodi se iz faktora kapaciteta (k’) uz 
pomoć baždarnoga grafa log k’ u ovisnosti o log K  oc odabranih 
referentnih spojeva.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
gdje je:  
t R = vrijeme zadržavanja ispitivane i referentne tvari iz HPLC-a 
(minute)  
t 0 = mrtvo vrijeme HPLC-a (minute) (vidjeti odjeljak 1.8.2.)  
P ow : Podjelni koeficijent oktanol-voda definiran je kao omjer 
koncentracija tvari otopljene u n-oktanolu i vodi; to je bezdimenzio ­
nalna vrijednost.  
Pow ¼ Coctanol 
Cap ð¼ KowÞ (5)  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Prije primjene metode treba biti poznata strukturna formula, čistoća i 
konstanta disocijacije (prema potrebi). Tako đer su korisne informa ­
cije o topljivosti u vodi i organskim otapalima, podjelnom koefici ­
jentu oktanol-voda i hidroliti čkim svojstvima.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1240
 
Za uspostavu korelacije izme đu izmjerenih podataka o zadržavanju 
ispitivane tvari iz HPLC-a i njezinog koeficijenta adsorpcije K  oc 
treba izraditi baždarni graf log K  oc u ovisnosti o log k’. Potrebno 
je najmanje šest referentnih to čaka, od čega najmanje jedna iznad i 
jedna ispod o čekivane vrijednosti za ispitivanu tvar. To čnost metode 
se značajno poboljšava ako su referentne tvari strukturno srodne s 
ispitivanom tvari. Ako ti podaci nisu raspoloživi, korisnik sam treba odabrati odgovaraju će baždarne tvari. U tom slu čaju treba odabrati 
općenitiji skup strukturno heterogenih tvari. Tvari i vrijednosti K
 oc 
koje se mogu koristiti navedene su u Dodatku, i to u tablici 1. za 
kanalizacijski mulj i u tablici 3. za tlo. Ako se koriste druge baždarne tvari, treba navesti obrazloženje.
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
HPLC se provodi na analiti čkim kolonama koje su napunjene komer ­
cijalno dostupnom krutom fazom cijanopropila koja sadrži lipofilne i polarne dijelove. Koristi se umjereno polarna nepokretna faza sa silika matricom: 
— O — Si
 — CH  2 — CH  2 — CH  2 — CN  
silika  nepolarna razmaknica  polarni dio  
Načelo ispitne metode sli čno je kao kod ispitne metode A.8. 
(podjelni koeficijent, metoda HPLC). Dok ispitivana tvar prolazi kroz kolonu s pokretnom fazom dolazi do interakcije izme đu ispiti­
vane tvari i nepokretne faze. Uslijed podjele izme đu pokretne i 
nepokretne faze ispitivana tvar zaostaje. Dvojni sastav nepokretne faze, s polarnim i nepolarnim mjestima, omogu ćuje interakciju 
polarnih i nepolarnih skupina molekule na sli čan način kao što je 
to slučaj kod organske tvari u matricama tla ili kanalizacijskog 
mulja. To omogu ćuje utvrđivanje odnosa izme đu vremena zadrža ­
vanja na koloni i koeficijenta adsorpcije na organsku tvar.
 
pH ima zna čajan utjecaj na sorpcijsko ponašanje, posebno kod 
polarnih tvari. Kod poljoprivrednih tala i spremnika postrojenja za 
pročišćivanje otpadnih voda pH se obi čno kreće između 5,5 i 7,5. 
Kod ioniziraju ćih tvari treba provesti dva ispitivanja, s ioniziranim i 
neioniziranim oblikom u odgovaraju ćim puferskim otopinama, ali 
samo u slu čajevima kad najmanje 10 % ispitivanog spoja disocira 
u području pH 5,5 do 7,5.  
Budući da se za ocjenjivanje koristi samo odnos izme đu zadržavanja 
na koloni HPLC i koeficijenta adsorpcije, nije potrebna kvantitativna analitička metoda, ve ć samo treba odrediti vrijeme zadržavanja. Ako 
je raspoloživ prikladan skup referentnih tvari i ako se mogu primi ­
jeniti standardni pokusni uvjeti, ova metoda omogu ćuje brzu i u čin­
kovitu procjenu koeficijenta adsorpcije K
 oc . 
1.5. PRIMJENLJIVOST TESTA  
Metoda HPLC može se primijeniti na kemikalije (neobilježene i 
obilježene) za koje je raspoloživ odgovaraju ći detekcijski sustav 
(npr. spektrofotometar, detektor radioaktivnosti) i koje su dovoljno stabilne u vremenu trajanja pokusa. Ona posebno može biti korisna u slučaju kemikalija koje se teško ispituju u drugim pokusnim susta ­
vima (tj. hlapljive tvari, tvari koje nisu topljive u vodi u koncentraciji 
koja se može analiti čki mjeriti, tvari s visokim afinitetom prema 
površini inkubacijskih sustava). Metoda se može koristiti u slu čaju 
smjesa koje daju nerazlu čljive eluacijske pikove. U tom slu čaju treba 
navesti gornje i donje granice vrijednosti log K
 oc spojeva ispitne 
smjese.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1241
 
Nečistoće ponekad mogu stvarati poteško će kod tuma čenja rezultata 
HPLC-a, ali one nisu posebno zna čajne dok god se ispitivana tvar 
može analiti čki jasno identificirati i odijeliti od ne čistoća. 
Ova je metoda validirana za tvari iz tablice 1. u Dodatku, a korištena 
je i kod raznih drugih kemikalija iz sljede ćih razreda kemikalija:  
— aromatski amini (npr. trifluralin, 4-kloranilin, 3,5-dinitroanilin, 4- 
metilanilin, N-metilanilin, 1-naftilamin),  
— aromatski esteri karboksilne kiseline (npr. metilni ester benzojeve 
kiseline, etilni ester 3,5-dinitrobenzojeve kiseline),  
— aromatski ugljikovodici (npr. toluen, ksilen, etilbenzen, nitroben ­
zen),  
— esteri ariloksifenoksipropionske kiseline (npr. diklofop-metil, 
fenoksaprop-etil, fenoksaprop-P-etil),  
— fungicidi iz skupine benzimidazola i imidazola (npr. karbenda ­
zim, fuberidazol, triazoksid),  
— amidi karboksilne kiseline (npr. 2-klorobenzamid, N,N-dimetil ­
benzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metilbenzamid, 2-nitrobenza ­
mid, 3-nitrobenzamid),  
— klorirani ugljikovodici (npr. endosulfan, DDT, heksaklorbenzen, 
kvintozen, 1,2,3-triklorbenzen),  
— organofosforni insekticidi (npr. azinfos-metil, disulfoton, fenami ­
fos, izofenfos, pirazofos, sulprofos, triazofos),  
— fenoli (npr. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklorfenol, 
2,4,6-triklorfenol, 1-naftol),  
— derivati feniluree (npr. izoproturon, monolinuron, pencikuron),  
— pigmentna bojila (npr. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81),  
— poliaromatski ugljikovodici (npr. acenaftalen, naftalen),  
— 1,3,5-triazinski herbicidi (npr. prometrin, propazin, simazin, 
terbutrin),  
— derivati triazola (npr. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, tria ­
pentenol).  
Metoda se ne može primijeniti kod tvari koje reagiraju s eluentom ili 
nepokretnom fazom. Osim toga, nije primjenljiva niti na tvari kod kojih se javljaju specifi čne interakcije s anorganskim komponentama 
(npr. stvaranje „klaster” kompleksa s mineralima glina). Ona se 
također može pokazati nedjelotvornom kod površinski aktivnih 
tvari, anorganskih spojeva i umjerenih ili jakih organskih kiselina i baza. Mogu se odrediti vrijednosti log K
 oc u području od 1,5 do 5,0. 
Ioniziraju će se tvari moraju mjeriti pomo ću puferirane pokretne faze, 
ali treba paziti da ne do đe do taloženja puferskih komponenti i 
ispitivane tvari.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1242
 
1.6. KRITERIJI KAKVO ĆE 
1.6.1.  To čnost 
Koeficijent adsorpcije ispitivane tvari se u pravilu može procijeniti u 
granicama +/- 0,5 log jedinica vrijednosti odre đene metodom šaržnog 
ispitivanja u ravnoteži (vidjeti tablicu 1. u Dodatku). Ve ća se točnost 
može posti ći korištenjem referentnih tvari koje su strukturno srodne s 
ispitivanom tvari.  
1.6.2.  Ponovljivost  
Potrebna su barem dvostruka odre đivanja. Vrijednosti log K  oc izve­
dene iz pojedinih mjerenja moraju se kretati unutar podru čja od 0,25 
log jedinica.  
1.6.3.  Obnovljivost  
Dosadašnja iskustva s primjenom metode podupiru njezinu valjanost. 
Ispitivanjem metode HPLC uz primjenu 48 tvari (ve ćinom pesticidi) 
za koje su bili raspoloživi pouzdani podaci o K  oc na tlo dobiven je 
koeficijent korelacije R = 0,95 (10)(11).  
U svrhu poboljšanja i validacije metode provedeno je me đulabora­
torijsko poredbeno ispitivanje u kojemu je sudjelovalo 11 laborato ­
rija (12). Rezultati su navedeni u tablici 2. u Dodatku.  
1.7. OPIS ISPITNE METODE  
1.7.1.  Preliminarna procjena koeficijenta adsorpcije  
Podjelni koeficijent oktanol-voda P  ow (= K  ow ) i, u odre đenoj mjeri, 
topljivost u vodi mogu poslužiti kao pokazatelji obima adsorpcije, posebno kod neioniziranih tvari, te se stoga mogu koristiti za preli ­
minarno odre đivanje raspona. Objavljene su razli čite korisne korela ­
cije za nekoliko skupina kemikalija (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
1.7.2.  Aparatura  
Potreban je teku ćinski kromatograf opremljen bespulsnom pumpom i 
prikladnim detektorom. Preporu čuje se korištenje ventila za ubrizga ­
vanje s injekcijskom petljom. Treba koristiti komercijalne kemijski vezane cijanopropilne smole na bazi silike (npr. Hypersil i Zorbax CN). Izme đu sustava za ubrizgavanje i analiti čke kolone može se 
postaviti predkolona od istog materijala. Kolone razli čitih dobavlja ča 
mogu se zna čajno razlikovati prema u činkovitosti odvajanja. Za 
orijentaciju, kad se kao pokretna faza koristi metanol/voda 55/45 %, treba posti ći sljedeće faktore kapaciteta k’: log k’ > 0,0 za log K
 oc = 
3,0 i log k’ > — 0,4 za log K  oc = 2,0.  
1.7.3.  Pokretne faze  
Ispitano je više pokretnih faza, a preporu čuju se ove dvije:  
— metanol/voda (55/45 % v/v),  
— metanol/0,01 M citratni pufer pH 6,0 (55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1243
 
Za pripremu eluacijskog otapala koristi se metanol kromatografske 
čistoće (HPLC) i destilirana voda ili citratni pufer. Smjesa se prije 
uporabe otplini. Treba primijeniti izokrati čku eluaciju. Ako smjese 
metanol/voda nisu prikladne, mogu se iskušati druge smjese organsko otapalo/voda, npr. etanol/voda ili acetonitril/voda. Kod 
ioniziraju ćih se tvari preporu čuje korištenje puferske otopine za 
stabilizaciju pH. Treba paziti da ne do đe do taloženja soli i propa ­
danja kolone, što se može dogoditi kod nekih smjesa organska faza/ pufer.
 
Ne smiju se koristi dodaci kao što su reagensi s ionskim parovima 
jer oni mogu utjecati na sorpcijska svojstva nepokretne faze. Takve promjene nepokretne faze mogu biti ireverzibilne. Stoga se pokusi u 
kojima se koriste dodaci moraju obvezatno provoditi na zasebnim 
kolonama.
 
1.7.4.  Otopljene tvari  
Ispitivane i referentne tvari treba otopiti u pokretnoj fazi.  
1.8. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.8.1.  Ispitni uvjeti  
Tijekom mjerenja treba bilježiti temperaturu. Preporu čuje se kori ­ 
štenje ure đaja s termostatiranom dijelom za kolone kako bi se zajam ­ 
čili stalni uvjeti za vrijeme baždarenja, procjena i mjerenja ispitivane 
tvari.  
1.8.2.  Odre đivanje mrtvog vremena t  o 
Za određivanje mrtvog vremena t  o mogu se koristiti dvije razli čite 
metode (vidjeti i odjeljak 1.2.).  
1.8.2.1.  Odre đivanje mrtvog vremena t  o putem homolognog niza  
Pokazalo se da ovaj postupak daje pouzdane i standardizirane vrijed ­
nosti t  o . Za detalje vidjeti ispitnu metodu A.8.: Podjelni koeficijent 
(n-oktanol/voda), metoda HPLC.  
1.8.2.2.  Odre đivanje mrtvog vremena pomo ću inertnih tvari koje kolona ne 
zadržava  
Ova se tehnika temelji na ubrizgavanju otopina formamida, uree ili 
natrijevog nitrata. Potrebna su barem dvostruka mjerenja.  
1.8.3.  Odre đivanje vremena zadržavanja tR  
Referentne tvari treba odabrati na na čin kako je opisano u odjeljku 
1.3. One se za potrebe odre đivanja vremena zadržavanja mogu ubriz ­
gati kao miješani standard, ako je potvr đeno da na vrijeme zadrža ­
vanja pojedina čnih referentnih standarda ne utje če prisutnost drugih 
referentnih standarda. Baždarenje treba provoditi najmanje dvaput 
dnevno u redovitim razmacima, kako bi se mogle objasniti neo čeki­
vane promjene u radu kolone. Baždarna ubrizgavanja je najbolje provoditi prije i nakon ubrizgavanja ispitivane tvari, kako bi se isključili pomaci u vremenu zadržavanja. Ispitivane se tvari ubrizgaju 
odvojeno u što manjim koli činama (kako bi se izbjeglo preoptere ­ 
ćenje kolone) te se odrede njihova vremena zadržavanja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1244
 
Da bi se pove ćala pouzdanost mjerenja, treba provoditi barem 
dvostruka odre đivanja. Vrijednosti log K  oc izvedene iz pojedinih 
mjerenja moraju se kretati unutar podru čja od 0,25 log jedinica.  
1.8.4.  Ocjenjivanje  
Faktori kapaciteta k’ izra čunavaju se iz mrtvog vremena t  o i vremena 
zadržavanja t  R odabranih referentnih tvari pomo ću jednadžbe 4 
(vidjeti odjeljak 1.2.). Zatim se podaci log k’ referentnih tvari prikažu grafi čki u odnosu prema vrijednostima log K
 oc iz šaržnih 
pokusa u ravnoteži, koje su navedene u tablici 1. i 3. u Dodatku. 
Nakon toga se uz pomo ć dobivenoga grafa vrijednost log K  oc odre­ 
đuje iz vrijednosti log k’ ispitivane tvari. Ako stvarni rezultati poka ­
zuju da se log K  oc ispitivane tvari nalazi izvan baždarnog podru čja, 
ispitivanje treba ponoviti koriste ći druge, primjerenije referentne 
tvari.  
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
— identitet i čistoću ispitivanih i referentnih tvari te, prema potrebi, 
vrijednosti pK  a , 
— opis opreme i radnih uvjeta, npr. tip i dimenzije analiti čke kolone 
(i predkolone), detekcijsko sredstvo, pokretnu fazu (omjer 
komponenti i pH), temperaturno podru čje tijekom mjerenja,  
— mrtvo vrijeme i metodu pomo ću koje je odre đeno, 
— količine ispitivanih i referentnih tvari uvedene u kolonu,  
— vremena zadržavanja referentnih spojeva koji su korišteni za 
baždarenje,  
— podatke o prilago đenom regresijskom pravcu (log k’/log K  oc ) i 
graf regresijskog pravca,  
— prosje čne podatke o zadržavanju i procijenjenu vrijednost d log 
K oc za ispitivani spoj,  
— kromatograme.  
3. REFERENCE  
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed), (1990) Hand ­
book of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N.A. Williams, (1988) The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, str. 167.  
(3) G.G. Briggs, (1981) Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. 
J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050-1059.
 
(4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding, (1983) Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227-231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984) Sorption of organic substances 
by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297- 
312. ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1245
 
(6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed, (1979) A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, str. 831-832.  
(7) S.W. Karickhoff, (1981) Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann, (1997) Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128.
 
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996) Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), str. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993) HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), str. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991) Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995) HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1246
 
Dodatak  
Tablica 1.  
Usporedba vrijednosti K  oc za tla i kanalizacijske muljeve i vrijednosti izra čunanih pomo ću orijentacijske 
(„screening”) metode HPLC  ( 1 ) ( 2 ) 
tvar CAS br.  log K  oc 
kanaliza­
cijski 
muljevi  log K  oc 
HPLC  Δ log K  oc tla log K  oc 
HPLC  Δ 
Atrazin  1912-24-9  1,66  2,14  0,48  1,81  2,20  0,39  
Linuron  330-55-2  2,43  2,96  0,53  2,59  2,89  0,30  
Fention  55-38-9  3,75  3,58  0,17  3,31  3,40  0,09  
Monuron  150-68-5  1,46  2,21  0,75  1,99  2,26  0,27  
Fenantren  85-01-8  4,35  3,72  0,63  4,09  3,52  0,57  
Fenilester benzojeve kiseline  93-99-2  3,26  3,03  0,23  2,87  2,94  0,07  
Benzamid  55-21-0  1,60  1,00  0,60  1,26  1,25  0,01  
4-nitrobenzamid  619-80-7  1,52  1,49  0,03  1,93  1,66  0,27  
Acetanilid  103-84-4  1,52  1,53  0,01  1,26  1,69  0,08  
Anilin  62-53-3  1,74  1,47  0,27  2,07  1,64  0,43  
2,5-dikloranilin  95-82-9  2,45  2,59  0,14  2,55  2,58  0,03  
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann, (1997) Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke, (1997) Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), str. 107-119.  
Tablica 2.  
Rezultati me đulaboratorijskog poredbenog ispitivanja (uz sudjelovanje 11 laboratorija) provedenog u svrhu 
poboljšanja i validacije metode HPLC  ( 1 ) 
tvar CAS br.  log K  oc K oc log K  oc 
[OECD 106]  [metoda HPLC]  
Atrazin  1912-24-9  1,81  78 ± 16  1,89  
Monuron  150-68-5  1,99  100 ± 8  2,00  
Triapentenol  77608-88-3  2,37  292 ± 58  2,47  
Linuron  330-55-2  2,59  465 ± 62  2,67  
Fention  55-38-9  3,31  2062 ± 648  3,31  
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-r esults 
of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1247
 
Tablica 3.  
Preporučene referentne tvari za orijentacijsku („screening”) metodu HPLC na temelju podataka o adsorpciji na tlo  
Referentna tvar  CAS br.  srednje 
vrijednosti log 
K oc iz šaržnog 
ispitivanja u 
ravnoteži  broj podataka 
K oc log S.D.  izvor  
Acetanilid  103-84-4  1,25  4  0,48  (  a ) 
Fenol  108-95-2  1,32  4  0,70  (  a ) 
2-nitrobenzamid  610-15-1  1,45  3  0,90  (  b ) 
N.N-dimetilbenzamid  611-74-5  1,52  2  0,45  (  a ) 
4-metilbenzamid  619-55-6  1,78  3  1,76  (  a ) 
Metilbenzoat  93-58-3  1,80  4  1,08  (  a ) 
Atrazin  1912-24-9  1,81  3  1,08  (  c ) 
Izoproturon  34123-59-6  1,86  5  1,53  (  c ) 
3-nitrobenzamid  645-09-0  1,95  3  1,31  (  b ) 
Anilin  62-53-3  2,07  4  1,73  (  a ) 
3,5-dinitrobenzamid  121-81-3  2,31  3  1,27  (  b ) 
Karbendazim  10605-21-7  2,35  3  1,37  (  c ) 
Triadimenol  55219-65-3  2,40  3  1,85  (  c ) 
Triazoksid  72459-58-6  2,44  3  1,66  (  c ) 
Triazofos  24017-47-8  2,55  3  1,78  (  c ) 
Linuron  330-55-2  2,59  3  1,97  (  c ) 
Naftalen  91-20-3  2,75  4  2,20  (  a ) 
Endosulfan-diol  2157-19-9  3,02  5  2,29  (  c ) 
Metiokarb  2032-65-7  3,10  4  2,39  (  c ) 
Acid Yellow 219  63405-85-6  3,16  4  2,83  (  a ) 
1,2,3-triklorbenzen  87-61-6  3,16  4  1,40  (  a ) 
γ-HCH  58-89-9  3,23  5  2,94  (  a ) 
Fention  55-38-9  3,31  3  2,49  (  c ) 
Direct Red 81  2610-11-9  3,43  4  2,68  (  a ) 
Pirazofos  13457-18-6  3,65  3  2,70  (  c ) 
α-endosulfan  959-98-8  4,09  5  3,74  (  c ) 
Diklofop-metil  51338-27-3  4,20  3  3,77  (  c ) 
Fenantren  85-01-8  4,09  4  3,83  (  a ) 
Basic Blue 41 (smjesa)  26850-47-5 
12270-13-2  4,89 4  4,46  (  a ) 
DDT  50-29-3  5,63  1  —  (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No. 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein., (1991) Chemosphere, 22, str. 285-304. 
( c ) Podaci iz industrije.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1248
 
C.20  TEST REPRODUKTIVNE TOKSI ČNOSTI NA VRSTI  DAPHNIA 
MAGNA  
1. METODA  
Ova metoda ispitivanja reproduktivne toksi čnosti odgovara smjernici 
OECD TG 211 (1998.).  
1.1. UVOD  
Primarni cilj ovog testa je ocijeniti u činak kemikalija na reproduk ­
cijsku uspješnost vrste  Daphnia magna . 
1.2. DEFINICIJE I JEDINICE  
Roditeljska životinja:  ženke  Daphnia  koje su prisutne na po četku 
ispitivanja i čija je reprodukcijska uspješnost predmet istraživanja.  
Potomstvo:  mlade dafnije dobivene od roditeljskih životinja u tijeku 
ispitivanja.  
Najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC):  najniža ispi ­
tana koncentracija kod koje je unutar navedenog razdoblja izlaganja 
zabilježen statisti čki značajan učinak tvari na reprodukciju i rodi ­
teljsku smrtnost (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom. Ipak, sve ispitne koncentracije iznad LOEC-a moraju imati jednak ili ve ći 
štetan učinak od onog koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova 
dva uvjeta ne mogu zadovoljiti, treba detaljno objasniti kako je 
odabran LOEC (a prema tomu i NOEC).
 
Najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC) : ispitna 
koncentracija neposredno ispod LOEC-a koja unutar navedenog 
razdoblja izlaganja nema statisti čki značajan učinak (p < 0,05) u 
usporedbi s kontrolom.  
EC x : koncentracija ispitivane tvari otopljene u vodi koja rezultira 
x %-tnim smanjenjem reprodukcije  Daphnia magna  unutar nave ­
denog razdoblja izlaganja.  
Prirodni prirast:  mjera rasta populacije koja objedinjuje reproduk ­
cijsku uspješnost i dobno specifi čnu smrtnost (20)(21)(22). On će 
kod populacija u stabilnom stanju biti jednak nuli. Kod rastu ćih 
populacija bit će pozitivan, a kod populacija koje se smanjuju nega ­
tivan. Jasno je da ova posljednja situacija nije održiva i vodi ka izumiranju.
 
Granica detekcije:  najniža koncentracija koja se može utvrditi, ali 
ne i kvantificirati.  
Granica odre đivanja:  najniža koncentracija koja se može kvantita ­
tivno izmjeriti.  
Smrtnost:  životinja se bilježi kao mrtva kad je nepomi čna tj. kad ne 
može plivati odnosno ako nema vidljivih kretnji privjesaka ili postabdomena unutar 15 sekundi nakon nježnog mu ćkanja ispitnog 
spremnika. (Ako se koristi druga definicija, treba je navesti zajedno s 
izvorom.)
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1249
 
1.3. NA ČELO ISPITNE METODE  
Mlade ženke  Daphnia  (roditeljske životinje), koje su na po četku 
ispitivanja mla đe od 24 sata, izlažu se ispitivanoj tvari dodanoj u 
vodu u odre đenom rasponu koncentracija. Ispitivanje traje 21 dan. 
Na kraju ispitivanja ocjenjuje se ukupni broj živih potomaka po 
roditeljskoj životinji koja je živa na kraju ispitivanja. To zna či da 
se potomci odraslih životinja koje uginu tijekom ispitivanja izuzima iz obračuna. Reprodukcijska uspješnost roditeljskih životinja može se 
izraziti i na druge na čine (npr. broj živih potomaka po životinji i 
danu od prvog dana kad je zabilježeno potomstvo), ali to treba navesti dodatno uz ukupni broj mladih po roditeljskoj životinji 
koja je živa na kraju ispitivanja. Reprodukcijska uspješnost životinja 
izloženih ispitivanoj tvari uspore đuje se s kontrolom odnosno kontro ­
lama da bi se odredila najniža koncentracija s vidljivim učinkom (LOEC), a time i najviša koncentracija bez vidljivog 
učinka (NOEC). Ako je to mogu će, ti se podaci analiziraju i uz 
pomoć regresijskog modela radi procjene koncentracije koja bi izaz ­
vala x %-tno smanjenje reprodukcijske uspješnosti (tj. EC
 50 , EC  20 
odnosno EC  10 ). 
Osim toga, potrebno je navesti preživljavanje roditeljskih životinja i 
vrijeme do pojave prvog legla. Mogu se ispitati i drugi u činci tvari 
na parametre kao što je rast (npr. dužina) i eventualno prirodni 
prirast.  
1.4. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Trebaju biti raspoloživi rezultati ispitivanja akutne toksi čnosti (vidjeti 
metodu C.2. dio I.) provedenog na vrsti  Daphnia magna . Taj rezultat 
može biti koristan za odabir odgovaraju ćeg raspona ispitnih koncen ­
tracija u ispitivanjima reproduktivne toksi čnosti. Treba biti poznata 
topljivost u vodi i tlak pare ispitivane tvari i biti raspoloživa pouz ­
dana analiti čka metoda za kvantifikaciju tvari u ispitnim otopinama s 
dokumentiranim iskorištenjem i granicom odre đivanja.  
Informacije o ispitivanoj tvari koje mogu biti korisne kod odre đi­
vanja ispitnih uvjeta su strukturna formula, čistoća tvari, stabilnost na 
svjetlosti, stabilnost u uvjetima ispitivanja, pKa, P  ow i rezultati ispi ­
tivanja na laku biorazgradivost (vidjeti metodu C.4.).  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, kontrole moraju zadovoljavati sljede će 
provedbene kriterije:  
— smrtnost roditeljskih životinja (ženke  Daphnia ) na kraju ispiti ­
vanja ne smije biti viša od 20 %,  
— prosje čni broj živih potomaka po roditeljskoj životinji koja je 
živa na kraju ispitivanja je ≥ 60. 
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Aparatura  
Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u dodir s ispitnim otopi ­
nama mora biti u cijelosti izra đena od stakla ili drugog kemijski 
inertnog materijala. Ispitne posude su u pravilu staklene laborato ­
rijske čaše. 
Osim toga, potrebna je sljede ća oprema (djelomi čno ili u cijelosti):  
— mjera č kisika (s mikroelektrodom ili drugom prikladnim 
uređajem za mjerenje otopljenog kisika u uzorcima malog volu ­
mena),  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1250
 
— odgovaraju ći uređaj za regulaciju temperature,  
— mjera č pH vrijednosti,  
— oprema za odre đivanje tvrdo će vode,  
— oprema za odre đivanje koncentracije ukupnog organskog 
ugljika (TOC) u vodi ili oprema za odre đivanje kemijske potro ­ 
šnje kisika (KPK),  
— odgovaraju ći uređaji za regulaciju režima rasvjete i mjerenje 
intenziteta svjetlosti.  
1.6.2.  Ispitni organizmi  
U testu se koristi vrsta  Daphnia magna  Straus. Mogu se koristiti i 
druge vrste  Daphnia  pod uvjetom da zadovoljavaju odgovaraju će 
kriterije valjanosti (kriterij valjanosti koji se odnosi na reproduk ­
cijsku uspješnost u kontrolama treba biti zna čajan za vrstu). Ako 
se koriste druge vrste dafnija, njih treba jasno identificirati i obra ­
zložiti njihovo korištenje.  
Poželjno je da klon bude identificiran genotipizacijom. Istraživanja 
(1) su pokazala da reprodukcijska uspješnost klona A (koji je 
potekao od IRCHA u Francuskoj) (3) redovito zadovoljava uvjet valjanosti od prosje čno ≥ 60 potomaka po preživjeloj roditeljskoj 
životinji ako se uzgaja u uvjetima opisanim u ovoj metodi. Ipak, 
prihvatljivi su i drugi klonovi ako se dokaže da kultura dafnija 
zadovoljava kriterije valjanosti ispitivanja.
 
Na početku ispitivanja životinje moraju biti mla đe od 24 sata i ne 
smiju biti potomstvo iz prvog legla. One trebaju potjecati iz zdravog 
nasada (tj. ne smiju pokazivati znakove stresa, kao što je visoka smrtnost, prisutnost mužjaka i efipija, zakašnjelo davanje prvog potomstva, životinje promijenjene boje itd.). Mati čne životinje 
treba držati u uzgojnim uvjetima (svjetlost, temperatura, medij, 
hranjenje i broj životinja po jedinici volumena) koji su sli čini uvje­
tima ispitivanja. Ako će se u ispitivanju koristiti uzgojni medij koji 
se ne koristi u uobi čajenom uzgoju dafnija, treba predvidjeti 
razdoblje aklimatizacije uo či ispitivanja, u pravilu od oko tri tjedna 
(tj. jedna generacija), kako roditeljske životinje ne bi bile izložene stresu.
 
1.6.3.  Ispitni medij  
Preporučuje se da se kod ovog ispitivanja koristi potpuno definirani 
medij. Time se može izbje ći korištenje dodataka (npr. morske trave, 
ekstrakt tla itd.) koje je teško opisati i tako poboljšati izgledi za standardizaciju izme đu laboratorija. Pokazalo se da su za to prikladni 
mediji Elendt M4 (4) i M7 (vidjeti Dodatak 1.). Ipak, prihvatljivi su i 
drugi mediji (npr. (5)(6)) pod uvjetom da se dokaže da zna čajke 
kulture dafnija zadovoljavaju kriterije valjanosti ispitivanja.
 
Ako se koriste mediji koji sadrže nedefinirane dodatke, te dodatke 
treba jasno specificirati i u izvješ ću o ispitivanju navesti podatke o 
sastavu, posebno s obzirom na sadržaj ugljika budu ći da on može 
sudjelovati u ishrani. Preporu čuje se da se odredi ukupni organski 
ugljik (TOC) i/ili kemijska potrošnja kisika (KPK) radnog pripravka organskog dodatka i napravi procjena doprinosa TOC-u/KPK-u u 
ispitnom mediju. Preporu čuje se da razine TOC-a u mediju (tj. 
prije dodavanja algi) budu ispod 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1251
 
Kod ispitivanja tvari koje sadrže metale treba imati na umu da svoj ­
stva ispitnog medija (npr. tvrdo ća, sposobnost kelatiranja) mogu 
utjecati na toksi čnost ispitivane tvari. Iz tog je razloga poželjno 
koristiti potpuno definirani medij. Me đutim, trenuta čno su jedini 
poznati potpuno definirani mediji koji su prikladni za dugoro čni 
uzgoj  Daphnia magna  Elendt M4 i M7. Oba medija sadrže 
kelatno sredstvo EDTA. Ispitivanja su pokazala (2) da je „prividna toksičnost” kadmija op ćenito niža kad se ispitivanje reproduktivne 
toksičnosti provodi u mediju M4 i M7 nego u medijima koji ne 
sadrže EDTA. Stoga se M4 i M7 ne preporu čuju za ispitivanje 
tvari koje sadrže metale, a treba izbjegavati i druge medije koji sadrže poznata kelatna sredstva. Kod tvari koje sadrže metale možda bi bilo uputno koristiti alternativni medij, kao što je npr. 
obrađena tvrda slatka voda po ASTM-u (7) s dodatkom ekstrakta 
morskih trava koja ne sadrži EDTA (8). Ova kombinacija obra đene 
tvrde slatke vode po ASTM-u i ekstrakta morskih trava prikladna je i za dugoro čni uzgoj i ispitivanje  Daphnia magna  (2), iako još uvijek 
pokazuje blago kelatno djelovanje zbog organske komponente u 
dodanom ekstraktu morskih trava.
 
Na početku i tijekom ispitivanja koncentracija otopljenog kisika treba 
biti iznad 3 mg/l. pH vrijednost treba biti u podru čju 6 – 9 i u 
pravilu ne bi smjela odstupati više od 1,5 jedinica tijekom jednog ispitivanja. Preporu čuje se tvrdo ća iznad 140 mg/l (kao CaCO
 3 ). Kod 
ispitivanja s ovim i višim vrijednostima postignuta je reproduktivna 
uspješnost u skladu s kriterijima valjanosti (9)(10).  
1.6.4.  Ispitne otopine  
Ispitne otopine odabranih koncentracija obi čno se pripremaju razrje ­ 
đivanjem radne otopine. Poželjno je da se radne otopine pripreme 
otapanjem tvari u ispitnom mediju.  
U pojedinim je slu čajevima potrebno koristiti organska otapala i 
dispergente da bi se dobila prikladna koncentracija radne otopine; ipak, treba na sve na čine nastojati izbje ći korištenje tih materijala. 
Primjeri prikladnih otapala su aceton, etanol, metanol, dimetilfor ­
mamid i trietilenglikol. Primjeri prikladnih dispergenata su Cremophor RH40, metilceluloza 0,01 % i HCO-40. U svakom slučaju, ispitivana tvar u ispitnim otopinama ne smije prije ći 
granicu topljivosti u ispitnom mediju.
 
Otapala se koriste za dobivanje radne otopine koja se može to čno 
dozirati u vodu. U preporu čenoj koncentraciji otapala u kona čnom 
ispitnom mediju (tj. ≤ 0,1 ml/l) gore navedena otapala ne će biti 
toksična i neće povećati vodotopljivost tvari.  
Dispergenti mogu pomo ći da se postigne to čno doziranje i disperzija. 
U preporu čenoj koncentraciji u kona čnom ispitnom mediju (tj. 
≤ 0,1 ml/l) gore navedeni dispergenti ne će biti toksi čni i neće pove­ 
ćati vodotopljivost tvari.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1252
 
1.7. PLAN ISPITIVANJA  
Nakon što se obrade podijele po ispitnim posudama svako postu ­
panje s ispitnim posudama treba se odvijati na slu čajan način. U 
protivnome se može javiti pristranost koja bi se mogla tuma čiti 
kao učinak koncentracije. Konkretno, ako se pokusnim jedinicama 
rukuje po redu obrade odnosno koncentracije, neki vremenski utje ­
caj, kao što je zamor ispitiva ča ili neka druga greška, može dovesti 
do većih učinaka pri višim koncentracijama. Nadalje, ako bi na 
rezultate ispitivanja mogao utjecati neki po četni uvjet ili uvjet 
okoline, kao što je položaj u laboratoriju, treba ramisliti o formiranju blokova.
 
1.8. POSTUPAK  
1.8.1.  Uvjeti izlaganja  
1.8.1.1.  Trajanje  
Ispitivanje traje 21 dan.  
1.8.1.2.  Punjenje  
Roditeljske se životinje drže pojedina čno tj. po jedna u svakoj 
ispitnoj posudi s 50-100 ml medija.  
Ponekad su potrebni i ve ći volumeni da bi se ispunili zahtjevi anali ­
tičkog postupka koji se koristi za odre đivanje koncentracije ispiti ­
vane tvari, iako je za kemijsku analizu dopušteno i objedinjavanje 
ponavljanja. Ako se koriste volumeni iznad 100 ml, treba pove ćati 
količinu hrane koja se daje dafnijama da bi se osigurala primjerena 
raspoloživost hrane i uskla đenost s kriterijima valjanosti. Kod 
protočnih ispitivanja mogu se iz tehni čkih razloga razmotriti i alter ­
nativne koncepcije (npr. četiri skupine po 10 životinja u ve ćem 
volumenu), s time da sve promjene plana ispitivanja treba dokumentirati.
 
1.8.1.3.  Broj životinja  
Kod polustati čkih ispitivanja treba pojedina čno držati najmanje 10 
životinja po ispitnoj koncentraciji i još najmanje 10 životinja u kontrolnim nizovima.
 
Pokazalo se da je kod proto čnih ispitivanja prikladno koristiti 40 
životinja podijeljenih u četiri skupine po 10 životinja pri svakoj 
ispitnoj koncentraciji (1). Može se koristiti i manji broj ispitnih 
organizama, a preporu čuje se najmanje 20 životinja po koncentraciji, 
podijeljenih u dva ili više ponavljanja s jednakim brojem životinja (npr. četiri ponavljanja s po pet dafnija). Treba napomenuti da u 
slučaju ispitivanja gdje se životinje drže u skupinama reprodukcijsku 
uspješnost nije mogu će izraziti kao ukupni broj živih potomaka po 
roditeljskoj životinji koja je živa na kraju ispitivanja ako do đe do 
uginuća roditeljskih životinja. U tom slu čaju reprodukcijsku uspješ ­
nost treba izraziti kao „ukupni broj živih potomaka po roditeljskoj 
životinji koja je prisutna na po četku ispitivanja”.
 
1.8.1.4.  Hranjenje  
Poželjno je da se kod polustati čkih ispitivanja hranjenje obavlja 
svakodnevno, a najmanje triput tjedno (tj. u skladu s promjenama 
medija). Svako odstupanje (npr. kod proto čnih ispitivanja) treba 
dokumentirati.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1253
 
Ishrana roditeljskih životinja tijekom ispitivanja treba se po mogu ć­
nosti sastojati od živih stanica algi jedne ili više od sljede ćih vrsta:  
Chlorella  sp, Selenastrum capricornutum  (sada  Pseudokirchneriella 
subcapitata  (11)) i  Scenedesmus subspicatus . Ishranu treba temeljiti 
na količini organskog ugljika (C) koja se osigurava svakoj roditelj ­
skoj životinji. Istraživanja (12) su pokazala da su za vrstu  Daphnia 
magna  količine hrane izme đu 0,1 i 0,2 mg C/dafnija/dan dovoljne da 
se postigne broj potomaka koji je potreban da se ispune kriteriji valjanosti ispitivanja. Koli čina hrane može biti ujedna čena tijekom 
čitavog razdoblja ispitivanja ili se, po želji, na po četku može davati 
manja koli čina i zatim pove ćavati tijekom ispitivanja, uzimaju ći u 
obzir rast roditeljskih životinja. Ipak, i u tom slu čaju količina hrane 
treba u svakom trenutku biti unutar preporu čenog raspona od 0,1 – 
0,2 mg C/dafnija/dan.
 
Ako se za odre đivanje potrebne koli čine hrane koriste zamjenske 
mjere, kao što je broj stanica algi ili apsorbancija svjetlosti (iz prak ­
tičnih razloga, jer mjerenje sadržaja ugljika zahtijeva dosta vremena), 
svaki laboratorij mora izraditi vlastiti nomogram odnosa zamjenske mjere i sadržaja ugljika u kulturi algi (za savjet u pogledu izrade 
nomograma vidjeti Dodatak 2.). Nomograme treba provjeravati 
najmanje jedanput godišnje odnosno češće ako je došlo do promjene 
uvjeta u uzgoju kulture algi. Pokazalo se da je apsorbancija svjetlosti bolja zamjena za sadržaj ugljika od broja stanica (13).
 
Dafnije treba hraniti koncentriranom suspenzijom algi kako bi 
volumen medija kulture algi koji se prenosi u ispitne posude bio 
što manji. Koncentracija algi može se posti ći centrifugiranjem i resu ­
spendiranjem u destiliranoj vodi, deioniziranoj vodi ili uzgojnom mediju za dafnije.
 
1.8.1.5.  Svjetlost  
16-satno osvjetljenje intenziteta do najviše 15 – 20 μΕ· m -2 ·s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
Temperatura ispitnog medija treba biti unutar podru čja 18–22 °C. 
Ipak, odstupanja temperature tijekom jednog ispitivanja ne bi smjela biti viša od 2 °C unutar tih granica (npr. 18–20, 19–21 ili 20–22 °C). Ponekad je potrebno uvesti dodatnu ispitnu posudu za pra ćenje 
temperature.
 
1.8.1.7.  Dozra čivanje  
Ispitne posude se tijekom ispitivanja ne smiju dozra čivati.  
1.8.2.  Ispitna koncentracija  
U pravilu treba biti najmanje pet ispitnih koncentracija raspore đenih 
u geometrijskom nizu uz faktor koji po mogu ćnosti nije viši od 3,2. 
te treba koristiti odgovaraju ći broj ponavljanja za svaku ispitnu 
koncentraciju (vidjeti odjeljak 1.8.1.3.). Ako se koristi manje od 
pet koncentracija, treba navesti obrazloženje. Tvari se ne smiju ispi ­
tivati iznad granice topljivosti u ispitnom mediju.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1254
 
Kod odre đivanja raspona koncentracija treba voditi ra čuna o sljede ­ 
ćemu:  
Ako je cilj dobiti LOEC/NOEC, najniža ispitna koncentracija 
mora biti dovoljno niska da plodnost pri toj koncentraciji ne bude zna čajno niža od kontrolne. Ako to nije slu čaj, ispitivanje 
se mora ponoviti sa sniženom najnižom koncentracijom.
 
Ako je cilj dobiti LOEC/NOEC, najviša ispitna koncentracija 
mora biti dovoljno visoka da plodnost pri toj koncentraciji 
bude zna čajno niža od kontrolne. Ako to nije slu čaj, ispitivanje 
se mora ponoviti s povišenom najvišom koncentracijom.  
Ako se procjenjuje EC  x za učinke na reprodukciju, preporu čljivo 
je koristiti dovoljne koncentracije kako bi se EC  x mogao defini ­
rati s potrebnom razinom pouzdanosti. Ako se procjenjuje EC  50 
za učinke na reprodukciju, preporu čljivo je da najviša ispitna 
koncentracija bude viša od tog EC  50 . U protivnome će interval 
pouzdanosti za EC  50 biti vrlo širok (iako će se još uvijek mo ći 
procijeniti) pa možda ne će biti mogu će na zadovoljavaju ći način 
ocijeniti prikladnost prilago đenog modela.  
Raspon ispitnih koncentracija po mogu ćnosti ne bi smio obuh ­
vaćati koncentracije koje imaju statisti čki značajan učinak na 
preživljavanje odraslih životinja jer bi se time jednostavni test reproduktivne toksi čnosti pretvorio u kombinirani test reproduk ­
tivne toksi čnosti i smrtnosti, koji zahtijeva mnogo složeniju stati ­
stičku analizu.
 
Prethodno znanje o toksi čnosti ispitivane tvari (npr. iz ispitivanja 
akutne toksi čnosti i/ili istraživanja za odre đivanje raspona) trebalo 
bi pomoći u odabiru odgovaraju ćih ispitnih koncentracija.  
Ako se kao pomo ć u pripremi ispitnih otopina koristi otapalo ili 
dispergent (vidjeti odjeljak 1.6.4.), njegova kona čna koncentracija 
u ispitnim posudama ne smije biti viša od 0,1 ml/l i treba biti 
jednaka u svim ispitnim posudama.  
1.8.3.  Kontrole  
Uz ispitni niz potreban je jedan kontrolni niz s isptinim medijem te, 
prema potrebi, jedan kontrolni niz koji sadrži otapalo ili dispergent. Ako se koristi otapalo ili dispergent, njihova koncentracija treba biti 
ista kao u posudama koje sadrže ispitivanu tvar. Treba koristiti 
odgovaraju ći broj ponavljanja (vidjeti odjeljak 1.8.1.3.).
 
Općenito, kod dobro provedenog ispitivanja koeficijent varijacije oko 
srednje vrijednosti broja živih potomaka po roditeljskoj životinji u 
kontroli odnosno kontrolama treba biti ≤ 25 % i to treba dokumen ­
tirati kod planova ispitivanja gdje se životinje drže pojedina čno. 
1.8.4.  Obnavljanje ispitnog medija  
Učestalost obnavljanja medija ovisi o stabilnosti ispitivane tvari, ali 
ga u svakom slu čaju treba obnoviti najmanje tri puta tjedno. Ako su 
preliminarna ispitivanja stabilnosti (vidjeti odjeljak 1.4.) pokazala da 
koncentracija ispitivane tvari nije stabilna (tj. izvan podru čja 
80–120 % nazivne koncentracije ili pada ispod 80 % izmjerene početne koncentracije) u najdužem roku obnavljanja (tj. 3 dana), 
treba razmotriti mogu ćnost češćeg obnavljanja medija ili primjene 
protočnog ispitivanja.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1255
 
Kod obnavljanja medija u polustati čkim ispitivanjima treba pripre ­
miti drugi niz ispitnih posuda i u njih premjestiti roditeljske životi ­
nje, primjerice staklenom pipetom prikladnog promjera. Volumen medija koji se prenosi s dafnijama treba biti što je mogu će manji.
 
1.8.5.  Promatranja  
Rezultate promatranja tijekom ispitivanja treba upisati u obrasce za 
dostavu podataka (vidjeti primjere u dodacima 3. i 4.). Ako su 
potrebna druga mjerenja (vidjeti 1.3. i 1.8.8.), možda će biti potrebna 
i dodatna promatranja.  
1.8.6.  Potomstvo  
Potomke svake roditeljske životinje treba po mogu ćnosti uklanjati i 
brojiti svakog dana nakon pojave prvog legla kako ne bi potrošili 
hranu namijenjenu odrasloj životinji. Kod ove se metode broje samo živi potomci, ali treba zabilježiti i prisutnost propalih jajašaca i mrtvih potomaka.
 
1.8.7.  Smrtnost  
Poželjno je da se smrtnost roditeljskih životinja bilježi svakodnevno, 
a najmanje u vrijeme brojenja potomstva.  
1.8.8.  Ostali parametri  
Iako je ova metoda prvenstveno namijenjena ocjenjivanju u činaka na 
reprodukciju, ponekad se i drugi u činci mogu dovoljno dobro kvan ­
tificirati za statisti čku analizu. Mjerenja rasta su vrlo poželjna jer ona 
pružaju informacije o mogu ćim subletalnim u čincima, što može biti 
korisnije od samih mjerenja reprodukcije; preporu čuje se da se na 
kraju ispitivanja izmjeri dužina roditeljskih životinja (tj. dužina tijela 
bez analne bodlje). Ostali parametri koji se mogu mjeriti ili izra ču­
nati su vrijeme do pojave prvog legla (i kasnijih legla), broj i veli ­ 
čina legla po životinji, broj propalih legla, prisutnost mužjaka ili 
efipija i prirodni prirast populacije.  
1.8.9.  Učestalost analiti čkih određivanja i mjerenja  
Koncentraciju kisika, temperaturu, tvrdo ću i pH vrijednost treba 
mjeriti najmanje jedanput tjedno u svježem i starom mediju, u kontroli odnosno kontrolama i u najvišoj koncentraciji ispitivane 
tvari.
 
Koncentracije ispitivane tvari treba odre đivati u redovitim razmacima 
tijekom ispitivanja.  
U slučaju polustati čkih ispitivanja, ako se o čekuje da će koncentra ­
cija ispitivane tvari ostati u granicama ± 20 % nazivnih vrijednosti 
(tj. u rasponu 80–120 % – vidjeti 1.4. i 1.8.4.), preporu čuje se da se 
u prvom tjednu ispitivanja barem najviša i najniža ispitna koncen ­
tracija analiziraju jedanput odmah nakon pripreme i kod obnavljanja (tj. analize treba napraviti na uzorku iz iste otopine – odmah nakon 
pripreme i kod obnavljanja). Ova odre đivanja zatim treba ponavljati 
barem u tjednim razmacima.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1256
 
Kod ispitivanja gdje se ne o čekuje da će koncentracija ispitivane 
tvari ostati u granicama ± 20 % nazivne vrijednosti potrebno je 
analizirati sve ispitne koncentracije odmah nakon pripreme i kod obnavljanja. Ipak, kod ispitivanja gdje izmjerena po četna koncentra ­
cija ispitivane tvari nije u granicama ± 20 % nazivne koncentracije, 
ali ima dovoljno dokaza da su po četne koncentracije ponovljive i 
stabilne (tj. unutar podru čja 80–120 % po četnih koncentracija), 
kemijska odre đivanja se u 2. i 3. tjednu ispitivanja mogu ograni čiti 
na najvišu i najnižu ispitnu koncentraciju. U svakom slu čaju, odre­ 
đivanje koncentracija ispitivane tvari prije obnavljanja treba provesti 
samo na jednoj posudi po ispitnoj koncentraciji.
 
Kod proto čnih ispitivanja treba koristiti sli čan režim uzorkovanja kao 
što je opisano za polustati čko ispitivanje (s time da u ovom slu čaju 
ne vrijedi mjerenje „starih” otopina). Ipak, možda bi bilo dobro 
povećati broj uzorkovanja u prvom tjednu (npr. tri seta mjerenja) 
kako bi se provjerila stabilnost ispitnih koncentracija. Kod ovakvih ispitivanja treba svakodnevno provjeravati brzinu protoka sredstva za 
razrjeđivanje i ispitivane tvari.
 
Ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane tvari u čitavom 
tijeku ispitivanja na zadovoljavaju ći način održava u granicama 
± 20 % nazivne ili izmjerene po četne koncentracije, rezultati se 
mogu temeljiti na nazivnim ili izmjerenim po četnim vrijednostima. 
Ako je odstupanje od nazivne ili izmjerene po četne koncentracije 
više od ± 20 %, rezultate treba izraziti kao vremenski ponderiranu 
sredinu (vidjeti Dodatak 5.).  
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. OBRADA PODATAKA  
Svrha ovog testa je odrediti u činak ispitivane tvari na ukupan broj 
živih potomaka po roditeljskoj životinji koja je živa na kraju ispiti ­
vanja. Ukupni broj potomaka po roditeljskoj životinji treba izra čunati 
za svaku ispitnu posudu (tj. ponavljanje). Ako u bilo kojem ponavljanju roditeljska životinja ugine tijekom ispitivanja ili se 
pokaže da je mužjak, to ponavljanje se isklju čuje iz analize. U 
tom se slu čaju analiza temelji na smanjenom broju ponavljanja.
 
Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, u vezi s u čincima kemikalije 
na reprodukcijsku uspješnost, potrebno je izra čunati srednju repro ­
dukcijsku uspješnost po ponavljanjima za svaku koncentraciju i obje ­
dinjenu standardnu devijaciju reziduala, što se može u činiti uz 
pomoć analize varijance (ANOVA). Zatim srednju vrijednost za 
svaku koncentraciju treba usporediti s kontrolnom srednjom vrijed ­
nošću primjenom odgovaraju će metode višestruke usporedbe. Ovdje 
može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (14)(15)(16)(17). Treba provjeriti vrijedi li pretpostavka homogenosti varijance ANOVA-e. Ovo je bolje u činiti grafi čki nego formalnim testom 
značajnosti (18); druga prikladna mogu ćnost je provedba Bartlet ­
tovog testa. Ako ta pretpostavka ne vrijedi, treba razmotriti mogu ć­
nost da se prije provedbe ANOVA-e podaci preoblikuju radi homo ­
genizacije varijanci ili provesti ponderiranu ANOVA-u. Potrebno je 
izračunati i navesti veli činu učinka koja se može utvrditi primjenom 
ANOVA-e (tj. najmanju zna čajnu razliku).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1257
 
Za procjenu koncentracije koja bi izazvala 50 %-tno smanjenje 
reprodukcijske uspješnosti (tj. EC  50 ) podacima treba prilagoditi 
odgovaraju ću krivulju, npr. logisti čku krivulju, primjenom statisti čke 
metode, kao što je metoda najmanjih kvadrata. Krivulju treba para ­
metrizirati tako da se EC  50 i njegova standardna greška mogu 
izravno procijeniti. To bi u velikoj mjeri olakšalo izra čun granica 
pouzdanosti oko EC  50 . Treba navesti dvostrane granice pouzdanosti 
95 %, osim ako postoje dobri razlozi za primjenu drugih razina pouzdanosti. Poželjno je da postupak prilago đavanja obuhva ća 
metodu za ocjenjivanje zna čajnosti nepodudaranja („lack of fit”). 
To se može u činiti grafi čki ili podjelom zbroja kvadrata reziduala 
na „nepodudaranje” i „ čiste komponente greške” i provedbom testa 
značajnosti nepodudaranja. Budu ći da će obrade koje daju visoku 
plodnost vjerojatno imati ve ću varijancu u broju mladih životinja 
nego obrade s niskom plodnoš ću, treba razmisliti o ponderiranju 
utvrđenih vrijednosti kako bi se uzele u obzir razli čite varijance u 
skupinama podvrgnutim razli čitim obradama (za temeljne informa ­
cije vidjeti referencu (18)).
 
Kod analize podataka iz kona čnog prstenastog testa (2) logisti čka 
krivulja je prilago đena uz pomo ć sljedećega modela, iako se mogu 
se koristiti i drugi prikladni modeli:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
gdje je:  
Y = ukupni broj mladih po roditeljskoj životinji koja je živa na 
kraju ispitivanja (izra čunano za svaku posudu)  
x = koncentracija tvari  
c = očekivani broj mladih ako je x = 0  
x 0 = EC  50 u populaciji  
b = parametar nagiba  
Ovaj će se model vjerojatno pokazati prikladnim u velikom broju 
situacija, ali će uvijek biti ispitivanja gdje ne će biti primjenljiv. 
Valjanost modela treba provjeriti kako je predloženo gore. U poje ­
dinim se slu čajevima može koristiti model hormeze, u kojemu niske 
koncentracije daju pove ćane učinke (19).  
Mogu se procijeniti i druge koncentracije s u činkom, kao što je EC  10 
ili EC  20 , iako bi možda bilo bolje koristiti druk čiju parametrizaciju 
modela od one koja se koristi za procjenu EC  50 . 
2.2. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će: 
2.2.1.  Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1258
 
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući čistoću. 
2.2.2.  Ispitne vrste:  
— klon (je li genetski tipiziran), dobavlja č odnosno izvor (ako je 
poznat) i uvjeti uzgoja. Ako se koristi vrsta razli čita od  Daphnia 
magna , to treba navesti i obrazložiti.  
2.2.3.  Ispitni uvjeti:  
— ispitni postupak koji se primjenjuje (npr. polustati čki ili proto čni, 
volumen, koli čina punjenja kao broj dafnija po litri),  
— fotoperiod i intenzitet svjetlosti,  
— plan ispitivanja (npr. broj ponavljanja, broj roditeljskih životinja 
po ponavljanju),  
— podaci o uzgojnom mediju,  
— dodaci organskog materijala (ako se koriste), uklju čujući sastav, 
izvor, na čin pripreme, TOC/KPK radnih pripravaka, procjenu 
TOC/KPK u ispitnom mediju,  
— detaljne informacije o hranjenju, uklju čujući količinu (u mg 
C/dafnija/dan) i raspored (npr. vrsta(-e) hrane, u slu čaju algi 
također: specifi čni naziv (vrsta) te, ako je poznato, soj, uvjeti 
uzgoja kulture),  
— način pripreme radnih otopina i u čestalost obnavljanja (ako se 
koristi otapalo ili dispergent, treba ih navesti zajedno s koncen ­
tracijom).  
2.2.4.  Rezultati:  
— rezultati svih preliminarnih istraživanja stabilnosti ispitivane 
tvari,  
— nazivne ispitne koncentracije i rezultati svih analiza za odre đi­
vanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnim posudama (vidjeti primjere obrazaca za dostavu podataka u Dodatku 4.); tako đer 
treba navesti iskorištenje metode i granicu odre đivanja,
 
— kakvo ća vode u ispitnim posudama (tj. pH, temperatura i koncen ­
tracija otopljenog kisika, TOC i/ili KPK i tvrdo ća, prema potrebi) 
(vidjeti primjer obrasca za dostavu podataka u Dodatku 3.),  
— potpuna evidencija živih potomaka za svaku roditeljsku životinju 
(vidjeti primjer obrasca za dostavu podataka u Dodatku 3.),  
— broj smrti me đu roditeljskim životinjama i dan kad je smrt nastu ­
pila (vidjeti primjer obrasca za dostavu podataka u Dodatku 3.),  
— koeficijent varijacije za kontrolnu plodnost (na temelju ukupnog 
broja živih potomaka po roditeljskoj životinji koja je živa na kraju ispitivanja),
 
— grafički prikaz ukupnog broja živih potomaka po roditeljskoj 
životinji (za svako ponavljanje) koja je živa na kraju ispitivanja u ovisnosti o koncentraciji ispitivane tvari,
 
— najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC) za reproduk ­
ciju, uklju čujući opis primijenjenih statisti čkih postupaka i 
naznaku koju je veli činu učinka bilo mogu će utvrditi, i najviša 
koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC) za reprodukciju; 
prema potrebi treba navesti LOEC/NOEC za smrtnost roditeljskih 
životinja,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1259
 
— prema potrebi, EC  x za reprodukciju i intervali pouzdanosti te graf 
prilagođenog modela koji je korišten za izra čun, nagib krivulje 
doza-odgovor i njezina standardna greška,  
— drugi uo čeni biološki u činci i mjerenja: treba navesti sve druge 
uočene ili izmjerene biološke u činke (npr. rast roditeljskih živo ­
tinja), uklju čujući sva potrebna obrazloženja,  
— objašnjenje svih odstupanja od ispitne metode.  
3. REFERENCE  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No6. Report of the Final Ring Test 
of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991) A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, str. 257-265.
 
(4) Elendt B.P., (1990) Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.  
(5) EPA (1993) Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber 
(ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.  
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, str. 775-782.  
(7) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. str. 20.
 
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P., (1989) The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) str. 144-148.
 
(9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P., (1981) Reprodu ­
cibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, str. 1-8.  
(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P., (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990)  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, 
F-1990. Biologice Prace, 36, str. 209.  
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D., (1993) Toward a stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, str. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1260
 
(13) Sims I., (1993) Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459- 466.
 
(14) Dunnett C.W., (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, str. 1096-1121.  
(15) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, str. 482-491.  
(16) Williams D.A., (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, str. 103-117.  
(17) Williams D.A., (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510-531.  
(18) Draper N.R. and Smith H., (1981) Applied Regression Analy ­
sis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R., (1989) An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, str. 93-96.  
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H., (1971) A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R.W., (1974) An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, str. 
532. 
(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S., 
(1986) Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1261
 
Dodatak 1.  
PRIPREMA POTPUNO DEFINIRANIH MEDIJA ELENDT M7 I M4  
Aklimatizacija na medij Elendt M7 i M4  
Neki su laboratoriji imali problema s izravnim prenošenjem dafnija u medije M 4 
(1) i M7. Ipak, odre đeni je uspjeh postignut s postupnom aklimatizacijom tj. 
premještanjem iz vlastitog medija u 30 %-tni Elendt, zatim u 60 %-tni Elendt 
i zatim u 100 %-tni Elendt. Ponekad je potrebno razdoblje aklimatizacije i do 
jednog mjeseca.  
PRIPREMA  
Elementi u tragovima  
Najprije se pripreme odvojene radne otopine (I) pojedinih elemenata u tragovima 
u vodi prikladne čistoće npr. deionizirana, destilirana ili pro čišćena obrnutom 
osmozom. Iz tih razli čitih radnih otopina (I) pripremi se druga pojedina čna 
radna otopina (II) koja sadrži sve elemente u tragovima (kombinirana otopina) tj.:  
Radne otopine I 
(pojedina čna tvar)  Količina koja se 
dodaje u vodu 
mg/l Koncentracija (u 
odnosu na medij 
M4) 
struko  Za pripremu kombinirane radne otopine 
II u vodu treba dodati sljede ću količinu 
radne otopine I 
ml/l 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190  20 000  1,0  0,25  
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210  20 000  1,0  0,25  
LiCl 6 120  20 000  1,0  0,25  
RbCl  1 420  20 000  1,0  0,25  
SrCl  2 * 6 H  2 O 3 040  20 000  1,0  0,25  
NaBr  320  20 000  1,0  0,25  
Na 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260  20 000  1,0  0,25  
CuCl  2 * 2 H  2 O 335  20 000  1,0  0,25  
ZnCl  2 260 20 000  1,0  1,0  
CoCl  2 * 6 H  2 O 200  20 000  1,0  1,0  
KI 65  20 000  1,0  1,0  
Na 2 SeO  3 43,8 20 000  1,0  1,0  
NH  4 VO  3 11,5 20 000  1,0  1,0  
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000  2 000  —  —  
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991  2 000  —  —  
Otopine Na  2 EDTA i FeSO  4 pripreme se odvojeno, sjedine i odmah obrade u autoklavu. Pritom nastaje:  
Otopina 21 Fe-EDTA  1000-struko  20,0  5,0  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1262
 
Medij M4 i M7  
Mediji M4 i M7 pripremaju se pomo ću radne otopine II, makronutrijenata i 
vitamina na sljede ći način: 
Količina koja se 
dodaje u vodu 
mg/l Koncentracija (u 
odnosu na medij 
M4) 
struko  Količina radne otopine koja se dodaje 
kod pripreme medija 
ml/l 
M 4 M 7  
Radna otopina II kombinirani elementi u 
tragovima  20 50  50  
Radna otopina makronutrijenata (pojedina čna tvar)  
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800  1 000  1,0  1,0  
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600  2 000  0,5  0,5  
KCl 58 000  10 000  0,1  0,1  
NaHCO  3 64 800  1 000  1,0  1,0  
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000  5 000  0,2  0,2  
NaNO  3 2 740  10 000  0,1  0,1  
KH  2 PO 4 1 430  10 000  0,1  0,1  
K 2 HPO  4 1 840  10 000  0,1  0,1  
Kombinirana vitaminska radna otopina  —  10 000  0,1  0,1  
Kombinirana vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem 3 vitamina u 1 litru vode kako je ovdje prikazano:  
Tiamin-hidroklorid  750  10 000  —  —  
Cijanokobalamin (B  12 ) 10  10 000  —  —  
Biotin  7,5  10 000  —  —  
Kombinirana vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima. Vitamini se dodaju u medij neposredno prije uporabe.  
N.B.:  Da bi se izbjeglo taloženje soli kod pripreme kompletnog medija, alikvote radnih otopina treba dodati u oko 500 – 800 ml 
deionizirane vode i zatim nadopuniti do 1 litre.  
N.N.B.:  Medij M4 prvi se puta navodi u Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal 
damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1263
 
Dodatak 2.  
ANALIZA UKUPNOG ORGANSKOG UGLJIKA (TOC) I IZRADA 
NOMOGRAMA SADRŽAJA TOC-a U HRANI OD ALGI  
U pravilu se ne o čekuje da se sadržaj ugljika u hrani od algi mjeri izravno, ve ć iz 
korelacija (tj. nomograma) sa zamjenskim mjerama, kao što je broj stanica algi i 
apsorbancija svjetlosti).  
TOC treba mjeriti visokotemperaturnom oksidacijom, a ne UV metodom ili 
metodom persulfata (vidjeti: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 
49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Za izradu nomograma alge treba odvojiti od uzgojnog medija centrifugiranjem i 
resuspenidranjem u destiliranoj vodi. U svakom uzorku treba triput izmjeriti zamjenski parametar i koncentraciju TOC-a. Treba analizirati slijepe probe s 
destiliranom vodom i oduzeti kocentraciju TOC-a od koncentracije TOC-a u 
uzorku algi.
 
Nomogram treba biti linearan unutar traženog raspona koncentracija ugljika. 
Primjeri su prikazani u nastavku.  
N.B.:  Ovi se primjeri ne smiju koristiti za prera čunavanje; važno je da laboratoriji 
izrade vlastite nomograme.
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1264
 
▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1265
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1266
 ▼B 
Dodatak 3.  
PRIMJER OBRASCA ZA DOSTAVU PODATAKA O OBNAVLJANJU MEDIJA, FIZIKALNO-KEMIJSKOM PRA ĆENJU, HRANJENJU, REPRODUKCIJI DAFNIJA I SMRTNOSTI 
ODRASLIH ŽIVOTINJA  
Pokus br.:  Datum po četka:  Klon:  Medij:  Vrsta hrane:  Ispitivana tvar:  Nazivna konc.:  
Dan 0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  
Obnavljanje medija 
(staviti kva čicu) 
PH (  1 ) novi 
stari 
O 2 mg/l (  1 ) novi 
stari 
Temp. (°C) (  1 ) novi 
stari 
Hranjenje (staviti 
kvačicu) 
Br. živih 
potomaka (  2 ) Ukupno  
Posuda 1  
2 
3 
4 
5
 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1267
 ▼B 
Pokus br.:  Datum po četka:  Klon:  Medij:  Vrsta hrane:  Ispitivana tvar:  Nazivna konc.:  
Dan 0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  
6 
7 
8 
9 
10 
Ukupno  
Kumulativna smrtnost 
odraslih životinja (  3 ) 
( 1 ) Navesti koja je posuda korištena za pokus. 
( 2 ) Upisati smrtnost odraslih životinja u odgovaraju ću kućicu kao „M”. 
( 3 ) Upisati propala legla u odgovaraju ću kućicu kao „AB”.
 Dodatak 4.  
PRIMJER OBRASCA ZA DOSTAVU PODATAKA O REZULTATIMA KEMIJSKE ANALIZE  
(a) Izmjerene koncentracije  
Nazivna konc.  Uzorak 1. tjedan  Uzorak 2. tjedan  Uzorak 3. tjedan  
Svježe  Staro  Svježe  Staro  Svježe  Staro  
(b) Izmjerene koncentracije kao postotak nazivne koncentracije  
Nazivna konc.  Uzorak 1. tjedan  Uzorak 2. tjedan  Uzorak 3. tjedan  
Svježe  Staro  Svježe  Staro  Svježe  Staro  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1268
 
Dodatak 5.  
IZRAČUN VREMENSKI PONDERIRANE SREDINE  
Vremenski ponderirana sredina  
Budući da koncentracija ispitivane tvari može pasti u vremenu izme đu 
obnavljanja medija, treba razmisliti koja će se koncentracija uzeti kao reprezenta ­
tivna za raspon koncentracija kojima su izložene dafnije roditelji. Odabir se treba 
temeljiti kako na biološkim tako i na statisti čkim čimbenicima. Primjerice, ako se 
smatra da na razmnožavanje najviše utje če vršna koncentracija, treba koristiti 
maksimalnu koncentraciju. Me đutim, ako se smatra da je važniji akumulirani 
ili dugoro čniji učinak toksi čne tvari, tada je relevantnija prosje čna koncentracija. 
Prosječna koncentracija koja se u tom slu čaju koristi je vremenski ponderirana 
srednja koncentracija, budu ći da ona uzima u obzir kolebanje trenutne koncen ­
tracije u vremenu.  
Slika 1.: Primjer vremenski ponderirane sredine
  
Na slici 1. prikazan je primjer (pojednostavnjenog) ispitivanja u trajanju od 
sedam dana s obnavljanjem medija 0., 2. i 4. dana.  
— Tanka cik-cak crta predstavlja koncentraciju u bilo kojoj to čki u vremenu. 
Polazi se od pretpostavke da opadanje koncentracije slijedi eksponencijalni 
proces raspadanja.  
— Šest ucrtanih to čaka predstavljaju utvr đene koncentracije izmjerene na 
početku i kraju svakog razdoblja obnavljanja.  
— Masno otisnuta crta ozna čava položaj vremenski ponderirane sredine.  
Vremenski ponderirana sredina izra čunava se tako da prostor ispod vremenski 
ponderirane sredine bude jednak prostoru ispod krivulje koncentracije. Izra čun za 
gornji primjer prikazan je u tablici 1.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1269
 
Tablica 1.:  
izračun vremenski ponderirane sredine  
Obnavljanje br.  Dani  Konc0  Konc1  Ln(Konc0)  Ln(Konc1)  Prostor  
1 2  10,000  4,493  2,303  1,503  13,767  
2 2  11,000  6,037  2,398  1,798  16,544  
3 3  10,000  4,066  2,303  1,403  19,781  
Ukupno dana: 7  Ukupni 
prostor  50,091  
VP sredina  7,156  
Dani  su broj dana u razdoblju obnavljanja.  
Konc0  je izmjerena koncentracija na po četku svakog razdoblja obnavljanja.  
Konc1  je izmjerena koncentracija na kraju svakog razdoblja obnavljanja.  
Ln(Konc0)  je prirodni logaritam Konc0.  
Ln(Konc1)  je prirodni logaritam Konc1.  
Prostor  je prostor ispod eksponencijalne krivulje za svako razdoblje obnavljanja. Izra čunava se kao:  
prostor ¼ Konc  0 Ä Konc  1 
LnðKonc  0Þ Ä LnðKonc  1Þ Ü dani 
Vremenski ponderirana sredina (VP sredina) je  ukupni prostor  podijeljen  
ukupnim danima . 
Naravno, kod ispitivanja reproduktivne toksi čnosti za dafnije tablicu bi trebalo 
proširiti na 21 dan.  
Jasno je da u slu čaju kad se promatranja obavljaju samo na po četku i na kraju 
svakog razdoblja obnavljanja nije mogu će potvrditi da je proces raspadanja doista 
eksponencijalan. Druk čija krivulja rezultirala bi druk čijim izračunom za prostor. 
Ipak, eksponencijalni proces raspadanja se čini uvjerljivim pa je u nedostatku 
drugih informacija vjerojatno najbolje koristiti ovu krivulju.  
Ipak, treba biti oprezan ako se kemijskom analizom na kraju razdoblja 
obnavljanja ne utvrdi prisutnost tvari. Ako se ne može procijeniti koliko je 
brzo tvar nestala iz otopine, bit će nemogu će dobiti realan prostor ispod krivulje, 
a time i smislenu vremenski ponderiranu sredinu.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1270
 
C.21.  MIKROORGANIZMI KOJI ŽIVE U TLU: TEST PRETVORBE 
DUŠIKA  
1. METODA  
Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD TG 216 (2000.).  
1.1. UVOD  
U ovoj ispitnoj metodi opisana je laboratorijska metoda za ispitivanje 
dugotrajnih u činaka kemikalija na aktivnost pretvorbe dušika 
mikoorganizama koji žive u tlu nakon jednokratnog izlaganja. Test 
se prvenstveno temelji na preporukama Europske i mediteranske organizacije za zaštitu bilja (1). Ipak, uzete su u obzir i druge smjer ­
nice, uklju čujući smjernice njema čke Biologische Bundesanstalt (2), 
Američke agencije za zaštitu okoliša (3), SETAC-a (4) i Me đu­
narodne organizacije za normizaciju (5). Na radionici OECD-a o odabiru tala/sedimenata održanoj u talijanskom Belgiratu 1995. (6) dogovoreni su broj i vrste tla koje će se koristiti u ovom testu. 
Preporuke za skupljanje, rukovanje i skladištenje uzoraka tla 
temelje se na smjernici ISO (7) i preporukama radionice iz Belgirata. Kod ocjenjivanja i vrednovanja toksi čnih svojstava ispitivanih tvari 
ponekad je potrebno odrediti u činke na mikrobnu aktivnost tla, npr. 
ako su potrebni podaci o mogu ćim nuspojavama sredstava za zaštitu 
bilja u mikroflori tla ili, kod drugih kemikalija, ako se o čekuje 
izlaganje mikroorganizama kemikaliji. Test pretvorbe dušika provodi se u svrhu odre đivanja učinaka tih kemikalija na mikrofloru 
tla. Ako se ispituju agrokemikalije (npr. sredstva za zaštitu bilja, 
gnojiva, kemikalije koje se koriste u šumarstvu), provodi se i test pretvorbe dušika i test pretvorbe ugljika. Ako se ispituju druge kemi ­
kalije, dovoljno je provesti test pretvorbe dušika. Ipak, ako se testom 
pretvorbe dušika kod tih kemikalija dobiju vrijednosti EC
 50 unutar 
područja utvrđenog za komercijalno dostupne inhibitore nitrifikacije 
(npr. nitrapirin), može se provesti i test pretvorbe ugljika kako bi se dobile dodatne informacije.
 
Tla se sastoje od živih i neživih komponenti koje se javljaju u 
složenim i heterogenim mješavinama. Mikroorganizmi igraju važnu 
ulogu u razlaganju i pretvorbi organske tvari u plodnim tlima, a njihove brojne vrste doprinose razli čitim aspektima plodnosti tla. 
Bilo kakvo dugotrajno uplitanje u te biokemijske procese može utje ­
cati na kruženje nutrijenata i tako promijeniti plodnost tla. Pretvorba 
ugljika i dušika odvija se u svim plodnim tlima. Iako su u razli čitim 
tlima za te procese odgovorne razli čite mikrobne zajednice, putevi 
pretvorbe su uglavnom isti.
 
Opisana ispitna metoda namijenjena je utvr đivanju dugotrajnih 
štetnih učinaka tvari na proces pretvorbe dušika u aerobnim površin ­
skim tlima. Ona tako đer omogu ćuje procjenu u činaka tvari na pret ­
vorbu ugljika koju obavlja mikroflora tla. Tvorba nitrata odvija se nakon raspadanja uglji čno-dušičnih veza. Stoga, ako se u obra đenim 
i kontrolnim tlima utvrde jednake stope proizvodnje nitrata, velika je 
vjerojatnost da su glavni putevi razgradnje ugljika netaknuti i u 
funkciji. Supstrat odabran za ovaj test (lucernino brašno u prahu) ima povoljan omjer ugljika i dušika (obi čno između 12/1 i 16/1). 
Zahvaljuju ći tomu, smanjen je nedostatak ugljika tijekom ispitivanja 
tako da se mikrobne zajednice koje ošteti kemikalija mogu se opora ­
viti u roku 100 dana.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1271
 
Testovi iz kojih je izvedena ova ispitna metoda bili su prvenstveno 
namijenjeni tvarima kod kojih se može predvidjeti koli čina koja će 
dospjeti u tlo. To je primjerice slu čaj kod sredstava za zaštitu bilja 
kod kojih je poznata koli čina primjene u polju. Kod agrokemikalija 
je dovoljno ispitati dvije relevantne doze s obzirom na o čekivanu 
odnosno predvi đenu količinu primjene. Agrokemikalije se mogu ispi ­
tivati kao aktivne tvari (a.i.) ili kao formulirani proizvodi. Ipak, test nije ograni čen na agrokemikalije. Promjenom koli čina ispitivane 
tvari koje se primijenjuju na tlo i na čina vrednovanja podataka test 
se može koristiti i kod kemikalija kod kojih nije poznata o čekivana 
količina tvari koja će dospjeti u tlo. Tako se kod kemikalija razli čitih 
od agrokemikalija odre đuju učinci niza koncentracija na pretvorbu 
dušika. Podaci iz tih ispitivanja koriste se za izradu krivulje 
doza-odgovor i izra čunavanje vrijednosti EC
 x , gdje je x 
definirani % u činka.  
1.2. DEFINICIJE  
Pretvorba dušika:  potpuna razgradnja organske tvari koja sadrži 
dušik djelovanjem mikroorganizama u procesu amonifikacije i nitri ­
fikacije u odgovaraju ći anorganski krajnji proizvod, nitrat.  
EC x (učinkovita koncentracija):  koncentracija ispitivane tvari u tlu 
koja rezultira x-postotnom inhibicijom pretvorbe dušika u nitrat.  
EC 50 (medijan u činkovite koncentracije):  koncentracija ispitivane 
tvari u tlu koja rezultira 50-postotnom (50 %) inhibicijom pretvorbe 
dušika u nitrat.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema.  
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Prosijano se tlo obogati biljnim brašnom u prahu i obradi ispiti ­
vanom tvari ili ostavi neobra đeno (kontrola). Ako se ispituju agro ­
kemikalije, preporu čuju se najmanje dvije ispitne koncentracije, koje 
treba odabrati s obzirom na najvišu o čekivanu koncentraciju u polju. 
Nakon 0, 7, 14 i 28 dana inkubacije uzorci obra đenih i kontrolnih 
tala ekstrahiraju se odgovaraju ćim otapalom te se odrede koli čine 
nitrata u ekstraktima. Stopa tvorbe nitrata obra đenih uzoraka uspo ­
redi se sa stopom kontrolnih uzoraka i izra čuna se postotak odstu ­
panja obra đenih uzoraka od kontrolne vrijednosti. Sva ispitivanja 
traju najmanje 28 dana. Ako su 28. dana razlike izme đu obrađenih 
i neobrađenih tala jednake ili ve će od 25 %, mjerenja se nastavljaju 
do najviše 100 dana. Ako se ispituju kemikalije razli čite od agroke ­
mikalija, uzorcima tla doda se niz koncentracija ispitivane tvari i 
nakon 28 dana inkubacije izmjere se koli čine nitrata nastale u obra ­ 
đenim i kontrolnim uzorcima. Rezultati ispitivanja s više koncentra ­
cija analiziraju se pomo ću regresijskog modela i izra čunaju vrijed ­
nosti EC  x (tj. EC  50 , EC  25 i/ili EC  10 ). Vidjeti definicije.  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Vrednovanja rezultata ispitivanja s agrokemikalijama temelje se na 
relativno malim razlikama (tj. prosje čna vrijednost ± 25 %) izme đu 
koncentracija nitrata u kontrolnim i obra đenim uzorcima tla, tako da 
velike razlike u kontrolama mogu dovesti do pogrešnih rezultata. 
Stoga razlike izme đu ponavljanja u kontroli trebaju biti manje od 
± 15 %.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1272
 
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Aparatura  
Koriste se ispitne posude izra đene od kemijski inertnog materijala. 
Njihova zapremnina treba biti prikladna za postupak koji se primje ­
njuje kod inkubacije tla tj. inkubacija zbirnog uzorka ili inkubacija niza pojedina čnih uzoraka tla (vidjeti odjeljak 1.7.1.2.). Treba paziti 
da se gubitak vode svede na najmanju mogu ću mjeru i da se 
omogući izmjena plinova za vrijeme ispitivanja (npr. ispitne se 
posude mogu prekriti perforiranom polietilenskom folijom). Ako se ispituju hlapljive tvari, treba koristiti plinonepropusne posude koje se 
mogu hermeti čki zatvoriti. Njihova veli čina treba biti takva da 
uzorak tla ispuni približno jednu četvrtinu njihove zapremnine.
 
Koristi se standardna laboratorijska oprema, uklju čujući: 
— uređaj za tresenje: mehani čka tresilica ili istovjetna oprema,  
— centrifugu (3 000 g) ili ure đaj za filtriranje (s filtar-papirom bez 
nitrata),  
— instrument odgovaraju će osjetljivosti i obnovljivosti za analizu 
nitrata.  
1.6.2.  Odabir i broj tala  
Koristi se jedno tlo. Preporu čena svojstva tla su:  
— sadržaj pijeska: najmanje 50 % i najviše 75 %,  
— pH: 5,5–7,5,  
— sadržaj organskog ugljika: 0,5–1,5 %,  
— treba izmjeriti mikrobnu biomasu (8)(9) i njezin sadržaj ugljika 
treba iznositi najmanje 1 % ukupnog organskog ugljika tla.  
U većini slučajeva tlo s ovakvim svojstvima predstavlja najgori 
mogući slučaj, budući da je adsorpcija ispitivane kemikalije mini ­
malna i njezina raspoloživost za mikrofloru maksimalna. Stoga op će­
nito nisu potrebna ispitivanja s drugim tlima. Ipak, pod odre đenim 
okolnostima, npr. ako se o čekuje da će se ispitivana tvar uglavnom 
koristiti u odre đenim vrstama tla, kao što su kisela šumska tla, ili 
kod elektrostati čki nabijenih kemikalija ponekad je potrebno upotri ­
jebiti dodatno tlo.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1273
 
1.6.3.  Skupljanje i skladištenje uzoraka tla  
1.6.3.1.  Skupljanje  
Trebaju biti raspoložive detaljne informacije o povijesti lokaliteta 
gdje se uzima tlo za ispitivanje. To uklju čuje točno mjesto, vegeta ­
cijski pokrov, datume tretiranja sredstvima za zaštitu bilja i organ ­
skim i anorganskim gnojivima, dodatke biološkog materijala i 
slučajna onečišćenja. Mjesto odabrano za uzimanje tla treba biti 
prikladno za dugotrajno korištenje. Prikladni su trajni pašnjaci, polja s godišnjim kulturama žitarica (osim kukuruza) ili gusto posi ­
janom zelenom gnojidbom. Odabrano mjesto ne smije biti tretirano 
sredstvima za zaštitu bilja najmanje jednu godinu prije uzimanja 
uzorka. Osim toga, organska gnojiva se ne smiju primjenjivati najmanje šest mjeseci prije uzorkovanja. Uporaba mineralnih gnojiva prihvatljiva je samo ako je to u skladu sa zahtjevima kulture, 
a uzorci tla ne smiju se uzimati najmanje tri mjeseca nakon primjene 
gnojiva. Treba izbjegavati korištenje tla tretiranoga gnojivima s poznatim biocidnim u čincima (npr. kalcijev cijanamid).
 
Treba izbjegavati uzorkovanje tijekom ili neposredno nakon dugih 
razdoblja suše (duže od 30 dana) ili poplave. Kod oranih tala uzorke treba uzeti na dubini od 0 do 20 cm. Kod travnatih površina (pašnjaka) i drugih tala koja se ne oru u dužim razdobljima (naj ­
manje jedna sezona) maksimalna dubina uzorkovanja može biti malo 
veća od 20 cm (npr. do 25 cm).
 
Uzorke tla treba prenositi u spremnicima u temperaturnim uvjetima 
koji jamče da se po četna svojstva tla ne će značajno promijeniti.  
1.6.3.2.  Skladištenje  
Poželjno je koristiti tla koja su svježe skupljena na terenu. Ako se ne 
može izbje ći skladištenje u laboratoriju, tla se mogu skladištiti u 
mraku na 4 ± 2 °C najviše tri mjeseca. Za vrijeme skladištenja tla treba osigurati aerobne uvjete. Ako se uzorci tla uzimaju s površina koje su zamrznute najmanje tri mjeseca godišnje, može do ći u obzir i 
skladištenje na minus 18 °C do minus 22 °C u trajanju od šest 
mjeseci. Mikrobna biomasa uskladištenih tala mjeri se prije svakog pokusa, a sadržaj ugljika u biomasi treba iznositi najmanje 1 % ukupnog sadržaja organskog ugljika tla (vidjeti odjeljak 1.6.2.).
 
1.6.4.  Rukovanje i priprema tla za ispitivanje  
1.6.4.1.  Predinkubacija  
Ako je tlo bilo uskladišteno (vidjeti odjeljak 1.6.3.2.), preporu čuje se 
predinkubacija u trajanju izme đu 2 i 28 dana. Temperatura i sadržaj 
vlage tla tijekom predinkubacije trebaju biti sli čni temperaturi i sadr ­ 
žaju vlage kod ispitivanja (vidjeti odjeljak 1.6.4.2. i 1.7.1.3.).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1274
 
1.6.4.2.  Fizikalno-kemijska svojstva  
Tlo se ru čno očisti od krupnih predmeta (npr. kamenje, dijelovi 
biljaka itd.) i zatim se vlažno prosije bez pretjeranog isušivanja na veličinu čestica do najviše 2 mm. Sadržaj vlage uzorka tla treba 
podesiti pomo ću destilirane ili deionizirane vode na vrijednost 
između 40 % i 60 % maksimalnog vodnog kapaciteta.
 
1.6.4.3.  Oboga ćivanje organskim supstratom  
Tlo treba obogatiti prikladnim organskim supstratom npr. travnato ­
zelenim brašnom lucerne u prahu (glavni sastojak:  Medicago sativa ) 
s omjerom C/N izme đu 12/1 i 16/1. Preporu čeni omjer lucerna – tlo 
je 5 g lucerne na kilogram tla (suhe mase).  
1.6.5.  Priprema ispitivane tvari za primjenu na tlo  
Ispitivana se tvar u pravilu primjenjuje pomo ću nosača. Nosač može 
biti voda (kod tvari topljivih u vodi) ili inertna kruta tvar, kao što je sitni kremeni pijesak (veli čina čestica: 0,1–0,5 mm). Treba izbjega ­
vati sve teku će nosače osim vode (npr. organska otapala kao što je 
aceton, kloroform) jer oni mogu oštetiti mikrofloru. Ako se kao 
nosač koristi pijesak, on se može obložiti ispitivanom tvari 
otopljenom ili suspendiranom u odgovaraju ćem otapalu. U tom 
slučaju otapalo treba ukloniti isparavanjem prije miješanja s tlom. 
Za optimalnu razdiobu ispitivane tvari u tlu preporu čuje se omjer od 
10 g pijeska po kilogramu tla (suhe mase). Kontrolni se uzorci obrađuju samo odgovaraju ćom količinom vode i/ili kremenog 
pijeska.
 
Kod ispitivanja hlapljivih kemikalija treba izbjegavati gubitke 
tijekom obrade, u mjeri u kojoj je to mogu će, te nastojati osigurati 
homogenu razdiobu u tlu (npr. ispitivanu tvar treba ubrizgati u tlo na 
nekoliko mjesta).  
1.6.6.  Ispitne koncentracije  
Ako se ispituju agrokemikalije, treba koristiti najmanje dvije koncen ­
tracije. Niža koncentracija ne smije biti manja od o čekivane maksi ­
malne koli čine koja će dospjeti u tlo u stvarnim uvjetima primjene, 
dok viša koncentracija treba biti višekratnik niže koncentracije. Koncentracije ispitivane tvari koje se dodaju u tlo izra čunavaju se 
uz pretpostavku jednolikog ulaganja do dubine od 5 cm i nasipne 
gustoće tla od 1,5. Kod agrokemikalija koje se izravno primjenjuju 
na tlo i kod kemikalija kod kojih se može predvidjeti koli čina koja 
će dospjeti u tlo preporu čene ispitne koncentracije su maksimalna 
predviđena koncentracija u okolišu (Predicted Environmental 
Concentraction, PEC) i njezina peterostruka vrijednost. Tvari kod kojih se o čekuje više primjena u jednoj sezoni treba ispitati u 
koncentracijama koje se dobiju množenjem PEC-a maksimalnim 
očekivanim brojem primjena. Ipak, gornja koncentracija koja se ispi ­
tuje smije biti najviše 10 puta ve ća od maksimalne koli čine jedne 
primjene. Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, 
koristi se geometrijski niz od najmanje pet koncentracija. Ispitne 
koncentracije trebaju obuhva ćati podru čje potrebno za odre đivanje 
vrijednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1275
 
1.7. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.7.1.  Uvjeti izlaganja  
1.7.1.1.  Obrada i kontrola  
Ako se ispituju agrokemikalije, tlo se podijeli u tri dijela jednake 
mase. Dva se dijela pomiješaju s nosa čem koji sadrži proizvod, a 
treći se pomiješa s nosa čem bez proizvoda (kontrola). Preporu čuju se 
najmanje po tri ponavljanja, kako kod obra đenog tako i kod neobra ­ 
đenog tla. Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, tlo 
se podijeli u šest dijelova jednake mase. Pet se uzoraka pomiješa s 
nosačem koji sadrži ispitivanu tvar, a šesti se pomiješa s nosa čem 
bez kemikalije. Preporu čuju se po tri ponavljanja za obra đene uzorke 
i kontrolu. Treba paziti da se osigura homogena razdioba ispitivane 
tvari u obra đenim uzorcima tla. Kod miješanja treba izbjegavati 
zbijanje i grudanje tla.  
1.7.1.2.  Inkubacija uzoraka tla  
Inkubacija uzoraka tla može se provesti na dva na čina: u zbirnim 
uzorcima svakog obra đenog i neobra đenog tla ili kao niz pojedi ­
načnih poduzoraka jednake veli čine svakog obra đenog i neobra đenog 
tla. Ipak, ako se ispituju hlapljive tvari, ispitivanje se uvijek provodi s nizom pojedina čnih poduzoraka. Ako se tla inkubiraju zbirno, 
pripreme se velike koli čine svakog obra đenog i neobra đenog tla i 
tijekom ispitivanja uzimaju poduzorci za analizu prema potrebi. Početna koli čina koju treba pripremiti za sve obrade i kontrolu 
ovisi o veli čini poduzoraka, broju ponavljanja koja se koriste u 
analizi i o čekivanom maksimalnom broju uzorkovanja. Tla koja se 
inkubiraju zbirno treba dobro promiješati prije uzimanja poduzoraka. Ako se tla inkubiraju kao niz pojedina čnih uzoraka tla, svako se 
obrađeno i neobra đeno zbirno tlo podijeli u potreban broj poduzo ­
raka, koji se koriste prema potrebi. Kod pokusa gdje se o čekuje više 
od dva vremena uzorkovanja treba pripremiti dovoljno poduzoraka za sva ponavljanja i sva vremena uzorkovanja. Treba inkubirati najmanje tri paralelna uzorka ispitivanog tla u aerobnim uvjetima 
(vidjeti odjeljak 1.7.1.1.). Kod svih ispitivanja treba koristiti 
prikladne posude s dovoljno plinskog prostora kako ne bi nastali anaerobni uvjeti. Ako se ispituju hlapljive tvari, ispitivanje se uvijek provodi s nizom pojedina čnih poduzoraka.
 
1.7.1.3.  Ispitni uvjeti i trajanje  
Ispitivanje se provodi u mraku na sobnoj temperaturi od 20 ± 2 C°. 
Sadržaj vlage u uzorcima tla za vrijeme ispitivanja treba održavati između 40 % i 60 % maksimalnog vodnog kapaciteta tla (vidjeti 
odjeljak 1.6.4.2.) uz toleranciju od ± 5 %. Prema potrebi se može 
dodati destilirana ili deionizirana voda.
 
Ispitivanje traje najmanje 28 dana. Ako se ispituju agrokemikalije, 
uspoređuju se stope tvorbe nitrata u obra đenim i kontrolnim uzor ­
cima. Ako se one 28. dana razlikuju za više od 25 %, ispitivanje se nastavlja dok se ne dobije razlika od 25 % ili manja ili najviše 100 dana, ovisno o tome što je kra će. Kod ostalih se kemikalija ispiti ­
vanje prekida nakon 28 dana. 28. dana se odrede koli čine nitrata u 
obrađenim i kontrolnim uzorcima tla i izra čunaju vrijednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1276
 
1.7.2.  Uzorkovanje i analiziranje tala  
1.7.2.1.  Raspored uzorkovanja tla  
Ako se ispituju agrokemikalije, uzorci tla se analiziraju na nitrat 0., 
7., 14. i 28. dana. Ako je potrebno duže ispitivanje, daljnja mjerenja nakon 28. dana treba obavljati u razmacima od 14 dana.
 
Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, koristi se 
najmanje pet ispitnih koncentracija i uzorci tla se analiziraju na 
nitrat na po četku (0. dan) i kraju razdoblja izlaganja (28 dana). 
Prema potrebi se može dodati i me đumjerenje, npr. 7. dana. 
Podaci dobiveni 28. dana koriste se za odre đivanje vrijednosti EC  x 
kemikalije. Podaci kontrolnih uzoraka 0. dana mogu se, po želji, 
navesti u izvješ ću kao po četna količina nitrata u tlu.  
1.7.2.2.  Analiza uzoraka tla  
Nastala koli čina nitrata u svakom obra đenom i kontrolnom uzorku 
određuje se u svakom vremenu uzorkovanja. Nitrat se ekstrahira iz 
tla tresenjem uzoraka s odgovaraju ćim ekstrakcijskim otapalom npr. 
otopina 0,1 M kalijevog klorida. Preporu čuje se omjer 5 ml otopine 
KCl na gram ekvivalenta suhe mase tla. Da bi se postigla optimalna 
ekstrakcija, posude u kojima se nalazi tlo i ekstrakcijska otopina smiju biti napunjene najviše do pola. Smjese se tresu 60 minuta na 150 o/min. Smjese se centrifugiraju ili filtriraju i teku će faze 
analiziraju na nitrat. Teku ći ekstrakti bez čestica mogu se prije 
analize pohraniti na minus 20 ± 5 °C do najviše šest mjeseci.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Kod ispitivanja s agrokemikalijama treba zabilježiti nastalu koli činu 
nitrata u svakom uzorku tla i u tabli čnom obliku navesti srednje 
vrijednosti svih ponavljanja. Stope pretvorbe dušika treba ocijeniti odgovaraju ćim opće prihvaćenim statisti čkim metodama (npr. F test, 
razina zna čajnosti 5 %). Nastale koli čine nitrata izražavaju se u mg 
nitrata po kg suhe mase tla po danu. Stope tvorbe nitrata u svakoj 
obradi usporede se s kontrolom i izra čuna se postotak odstupanja od 
kontrolne vrijednosti.
 
Ako se ispitivanja provode s kemikalijama razli čitim od agrokemi ­
kalija, odredi se nastala koli čina nitrata u svakom ponavljanju i izradi 
krivulja doza-odgovor za procjenu vrijednosti EC  x . Količine nitrata 
(tj. mg nitrata/kg suhe mase tla) utvr đene u obra đenim uzorcima 
nakon 28 dana usporede se s kontrolom. Iz tih se podataka izra ču­
naju postoci inhibicije za svaku ispitnu koncentraciju. Ti se postoci 
grafički prikažu u ovisnosti o koncentraciji i primijene statisti čki 
postupci za izra čun vrijednosti EC  x . Granice pouzdanosti (p = 
0,95) za izra čunani EC  x također se odre đuju primjenom standardnih 
postupaka (10)(11)(12).  
Ispitivane tvari koje sadrže velike koli čine dušika mogu doprinijeti 
tvorbi nitrata tijekom ispitivanja. Ako se te tvari ispituju u visokoj koncentraciji (npr. kemikalije kod kojih se o čekuju ponovljene 
primjene) u ispitivanje treba uklju čiti odgovaraju će kontrole (tj. tlo 
s ispitivanom tvari, ali bez biljnog brašna). Podatke tih kontrola treba 
uzeti u obzir kod izra čuna EC
 x . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1277
 
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Ako se kod vrednovanja rezultata ispitivanja s agrokemikalijama 
pokaže da je u bilo kojem vremenu uzorkovanja nakon 28. dana razlika u stopama tvorbe nitrata izme đu niže obrade (tj. maksimalne 
predviđene koncentracije) i kontrole jednaka ili manja od 25 %, 
može se ocijeniti da proizvod nema dugotrajni utjecaj na pretvorbu dušika u tlu. Kad se vrednuju rezultati ispitivanja s drugim kemika ­
lijama koriste se vrijednosti EC
 50 , EC  25 i/ili EC  10 . 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
potpune podatke o upotrijebljenom tlu, uklju čujući: 
— geografske koordinate lokaliteta (širina, dužina),  
— informacije o povijesti lokaliteta (npr. vegetacijski pokrov, treti ­
ranje sredstvima za zaštitu bilja, tretiranje gnojivima, slu čajno 
onečišćenje itd.),  
— način korištenja (npr. poljoprivredno zemljište, šuma itd.),  
— dubinu uzorkovanja (cm),  
— sadržaj pijeska/praha/gline (% suhe mase),  
— pH (u vodi),  
— sadržaj organskog ugljika (% suhe mase),  
— sadržaj dušika (% suhe mase),  
— početnu koncentraciju nitrata (mg nitrata/kg suhe mase),  
— kapacitet izmjene kationa (mmol/kg),  
— mikrobnu biomasu u postotku ukupnog organskog ugljika,  
— uputu na metode korištene za odre đivanje pojedinih parametara,  
— sve informacije vezane uz skupljanje i skladištenje uzoraka tla,  
— podatke o predinkubaciji tla (prema potrebi).  
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući, prema potrebi, 
strukturnu formulu, čistoću (kod sredstava za zaštitu bilja 
postotak aktivne tvari), sadržaj dušika.  
Supstrat:  
— podrijetlo supstrata,  
— sastav (tj. brašno lucerne, travnatozeleno brašno lucerne),  
— sadržaj ugljika, dušika (% suhe mase),  
— veličina sita (mm).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1278
 
Uvjeti ispitivanja:  
— podaci o oboga ćivanju tla organskim supstratom,  
— broj koncentracija ispitivane kemikalije i, prema potrebi, obrazlo ­ 
ženje odabranih koncentracija,  
— podaci o primjeni ispitivane tvari na tlo,  
— temperatura inkubacije,  
— sadržaj vlage u tlu na po četku i za vrijeme ispitivanja,  
— metoda inkubacije tla (tj. zbirni uzorak ili niz pojedina čnih podu­
zoraka),  
— broj ponavljanja,  
— vremena uzorkovanja,  
— metoda ekstrakcije nitrata iz tla.  
Rezultati:  
— analiti čki postupak i oprema korištena za analizu nitrata,  
— tablični podaci, uklju čujući pojedina čne i srednje vrijednosti 
mjerenja nitrata,  
— odstupanje izme đu ponavljanja kod obra đenih i kontrolnih 
uzoraka,  
— obrazloženje korekcija izra čuna, prema potrebi,  
— postotak odstupanja stopa tvorbe nitrata u svakom vremenu uzor ­
kovanja odnosno, prema potrebi, vrijednost EC  50 s granicom 
pouzdanosti 95 %, drugi EC  x (tj. EC  25 ili EC  10 ) s intervalima 
pouzdanosti i graf krivulje doza-odgovor,  
— statisti čka obrada rezultata,  
— sve informacije i zapažanja korisna za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
 
(5) ISO/DIS 14238 (1995) Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality – Biological 
Methods .
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1279
 
(6) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993) Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1, (1997) Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2, (1997) Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F., (1949) A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, str. 99-113.  
(11) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(12) Finney, D.J., (1978) Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1280
 
C.22.  MIKROORGANIZMI KOJI ŽIVE U TLU: TEST PRETVORBE 
UGLJIKA  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 217 (2000.).  
1.1. UVOD  
U ovoj ispitnoj metodi opisana je laboratorijska metoda za ispitivanje 
potencijalnih dugotrajnih u činaka sredstava za zaštitu bilja i mogu ćih 
drugih kemikalija na aktivnost pretvorbe ugljika mikoorganizama 
koji žive u tlu kod jednokratnog izlaganja. Test se prvenstveno temelji na preporukama Europske i mediteranske organizacije za zaštitu bilja (1). Ipak, uzete su u obzir i druge smjernice, uklju čujući 
smjernice njema čke Biologische Bundesanstalt (2), Ameri čke agen­
cije za zaštitu okoliša (3) i SETAC-a (4). Na radionici OECD-a o odabiru tala/sedimenata održanoj u talijanskom Belgiratu 1995. (5) dogovoreni su broj i vrste tla koje će se koristiti u ovom testu. 
Preporuke za skupljanje, rukovanje i skladištenje uzoraka tla 
temelje se na smjernici ISO (6) i preporukama radionice iz Belgirata.
 
Kod ocjenjivanja i vrednovanja toksi čnih svojstava ispitivanih tvari 
ponekad je potrebno odrediti u činke na mikrobnu aktivnost tla, npr. 
ako su potrebni podaci o mogu ćim nuspojavama sredstava za zaštitu 
bilja u mikroflori tla ili, kod drugih kemikalija, ako se o čekuje 
izlaganje mikroorganizama kemikaliji. Test pretvorbe ugljika provodi se u svrhu odre đivanja učinaka tih kemikalija na mikrofloru 
tla. Ako se ispituju agrokemikalije (npr. sredstva za zaštitu bilja, 
gnojiva, kemikalije koje se koriste u šumarstvu), provodi se i test 
pretvorbe ugljika i test pretvorbe dušika. Ako se ispituju druge kemi ­
kalije, dovoljno je provesti test pretvorbe dušika. Ipak, ako se testom pretvorbe dušika kod tih kemikalija dobiju vrijednosti EC
 50 unutar 
područja utvrđenog za komercijalno dostupne inhibitore nitrifikacije 
(npr. nitrapirin), može se provesti i test pretvorbe ugljika kako bi se dobile dodatne informacije.
 
Tla se sastoje od živih i neživih komponenti koje se javljaju u 
složenim i heterogenim mješavinama. Mikroorganizmi igraju važnu ulogu u razlaganju i pretvorbi organske tvari u plodnim tlima, a 
njihove brojne vrste doprinose razli čitim aspektima plodnosti tla. 
Bilo kakvo dugotrajno uplitanje u te biokemijske procese može ometati kruženje nutrijenata i tako promijeniti plodnost tla. Pretvorba ugljika i dušika odvija se u svim plodnim tlima. Iako su u razli čitim 
tlima za te procese odgovorne razli čite mikrobne zajednice, putevi 
pretvorbe su uglavnom isti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1281
 
Ova ispitna metoda namijenjena je utvr đivanju dugotrajnih štetnih 
učinaka tvari na proces pretvorbe ugljika u aerobnim površinskim 
tlima. Test je osjetljiv na promjene veli čine i aktivnosti mikrobnih 
zajednica odgovornih za pretvorbu ugljika budu ći da ih on istodobno 
izlaže kemijskom stresu i nedostatku ugljika. Koristi se pjeskovito tlo 
siromašno organskim tvarima. Tlo se obra đuje ispitivanom tvari i 
inkubira u uvjetima koji omogu ćuju brzi mikrobni metabolizam. U 
tim se uvjetima izvori lako dostupnog ugljika brzo troše. Uslijed toga dolazi do pomanjkanja ugljika, što ubija stanice mikroorganizama i 
izaziva dormanciju i/ili sporulaciju. Ako ispitivanje traje više od 28 
dana, zbroj tih reakcija može se izmjeriti u kontrolama (s neobra ­ 
đenim tlom) kao progresivni gubitak metaboli čki aktivne mikrobne 
biomase (7). Ako u ispitnim uvjetima na biomasu tla koje je izloženo 
ugljičnom stresu utje če i prisutnost kemikalije, ona se možda ne će 
vratiti na istu razinu kao u kontroli. Stoga poreme ćaji koje izazove 
ispitivana tvar u bilo kom trenutku za vrijeme ispitivanja često traju 
do kraja ispitivanja.
 
Testovi iz kojih je izvedena ova ispitna metoda bili su prvenstveno 
namijenjeni tvarima kod kojih se može predvidjeti koli čina koja će 
dospjeti u tlo. To je primjerice slu čaj kod sredstava za zaštitu bilja 
kod kojih je poznata koli čina primjene u polju. Kod agrokemikalija 
je dovoljno ispitati dvije relevantne doze s obzirom na o čekivanu 
odnosno predvi đenu količinu primjene. Agrokemikalije se mogu ispi ­
tivati kao aktivne tvari (a.i.) ili kao formulirani proizvodi. Ipak, test 
nije ograni čen na kemikalije s predvidivim koncentracijama u 
okolišu. Promjenom koli čina ispitivane tvari koje se primijenjuju 
na tlo i na čina vrednovanja podataka test se može koristiti i kod 
kemikalija kod kojih nije poznata o čekivana koli čina tvari koja će 
dospjeti u tlo. Tako se kod kemikalija razli čitih od agrokemikalija 
određuju učinci niza koncentracija na pretvorbu ugljika. Podaci iz tih 
ispitivanja koriste se za izradu krivulje doza-odgovor i izra čunavanje 
vrijednosti EC  x , gdje je x definirani % u činka.  
1.2. DEFINICIJE  
Pretvorba ugljika:  razgradnja organske tvari djelovanjem mikroor ­
ganizama pri kojoj nastaje anorganski krajnji proizvod, ugljikov dioksid.
 
EC x (učinkovita koncentracija):  koncentracija ispitivane tvari u tlu 
koja rezultira x %-tnom inhibicijom pretvorbe ugljika u ugljikov 
dioksid.  
EC 50 (medijan u činkovite koncentracije):  koncentracija ispitivane 
tvari u tlu koja rezultira 50 %-tnom inhibicijom pretvorbe ugljika u 
ugljikov dioksid.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Nema.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1282
 
1.4. NA ČELO ISPITNE METODE  
Prosijano se tlo obradi ispitivanom tvari ili ostavi neobra đeno (kon­
trola). Ako se ispituju agrokemikalije, preporu čuju se najmanje dvije 
ispitne koncentracije, koje treba odabrati s obzirom na najvišu o čeki­
vanu koncentraciju u polju. Nakon 0, 7, 14 i 28 dana inkubacije 
uzorci obra đenih i kontrolnih tala pomiješaju se s glukozom i mjere 
se stope disanja induciranoga glukozom tijekom 12 uzastopnih sati. Stope disanja izražavaju se kao oslobo đeni ugljikov dioksid (mg 
ugljikovog dioksida/kg suhog tla/h) ili potrošeni kisik (mg kisika/kg 
suhog tla/h). Srednja stopa disanja obra đenih uzoraka tla usporedi se 
s kontrolom i izra čuna se postotak odstupanja obra đenih uzoraka od 
kontrolne vrijednosti. Sva ispitivanja traju najmanje 28 dana. Ako su 
28. dana razlike izme đu obrađenih i neobra đenih tala jednake ili ve će 
od 25 %, mjerenja se nastavljaju u razmacima od 14 dana do najviše 100 dana. Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, 
uzorcima tla doda se niz koncentracija ispitivane tvari i nakon 28 
dana izmjere se stope disanja induciranoga glukozom (tj. srednja vrijednost koli čina nastalog ugljikovog dioksida odnosno potrošenog 
kisika). Rezultati ispitivanja s nizom koncentracija analiziraju se 
pomoću regresijskog modela i izra čunaju se vrijednosti EC
 x (tj. 
EC 50 , EC  25 i/ili EC  10 ). Vidjeti definicije.  
1.5. VALJANOST ISPITIVANJA  
Vrednovanja rezultata ispitivanja s agrokemikalijama temelje se na 
relativno malim razlikama (tj. prosje čna vrijednost ± 25 %) izme đu 
količina oslobo đenog ugljikovog dioksida odnosno potrošenog kisika 
u kontrolnim i obra đenim uzorcima tla, tako da velike razlike u 
kontrolama mogu dovesti do pogrešnih rezultata. Stoga razlike 
između ponavljanja u kontroli trebaju biti manje od ± 15 %.  
1.6. OPIS ISPITNE METODE  
1.6.1.  Aparatura  
Koriste se ispitne posude izra đene od kemijski inertnog materijala. 
Njihova zapremnina treba biti prikladna za postupak koji se primje ­
njuje kod inkubacije tla tj. inkubacija zbirnog uzorka ili inkubacija 
niza pojedina čnih uzoraka tla (vidjeti odjeljak 1.7.1.2.). Treba paziti 
da se gubitak vode svede na najmanju mogu ću mjeru i da se 
omogući izmjena plinova za vrijeme ispitivanja (npr. ispitne se 
posude mogu prekriti perforiranom polietilenskom folijom). Ako se 
ispituju hlapljive tvari, treba koristiti plinonepropusne posude koje se 
mogu hermeti čki zatvoriti. Njihova veli čina treba biti takva da 
uzorak tla ispuni približno jednu četvrtinu njihove zapremnine.  
Za određivanje disanja induciranoga glukozom potrebni su inkuba ­
cijski sustavi i instrumenti za mjerenje proizvodnje ugljikovog dioksida ili potrošnje kisika. Primjeri takvih sustava i instrumenata 
mogu se prona ći u literaturi (8)(9)(10)(11).
 
1.6.2.  Odabir i broj tala  
Koristi se jedno tlo. Preporu čena svojstva tla su:  
— sadržaj pijeska: najmanje 50 % i najviše 75 %,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5,  
— sadržaj organskog ugljika: 0,5–1,5 %,  
— treba izmjeriti mikrobnu biomasu (12)(13) i njezin sadržaj ugljika 
treba iznositi najmanje 1 % ukupnog organskog ugljika tla.  
U većini slučajeva tlo s ovakvim svojstvima predstavlja najgori 
mogući slučaj, budući da je adsorpcija ispitivane kemikalije mini ­
malna i njezina raspoloživost za mikrofloru maksimalna. Stoga op će­
nito nisu potrebna ispitivanja s drugim tlima. Ipak, pod odre đenim 
okolnostima, npr. ako je predvi đeno da se ispitivana tvar uglavnom 
koristi u odre đenim vrstama tla, kao što su kisela šumska tla, ili kod 
elektrostati čki nabijenih kemikalija ponekad je potrebno upotrijebiti 
dodatno tlo.  
1.6.3.  Skupljanje i skladištenje uzoraka tla  
1.6.3.1.  Skupljanje  
Trebaju biti raspoložive detaljne informacije o povijesti lokaliteta 
gdje se uzima tlo za ispitivanje. To uklju čuje točno mjesto, vegeta ­
cijski pokrov, datume tretiranja sredstvima za zaštitu bilja i organ ­
skim i anorganskim gnojivima, dodatke biološkog materijala i 
slučajna onečišćenja. Mjesto odabrano za uzimanje tla treba biti 
prikladno za dugotrajno korištenje. Prikladni su trajni pašnjaci, polja s godišnjim kulturama žitarica (osim kukuruza) ili gusto posi ­
janom zelenom gnojidbom. Odabrano mjesto ne smije biti tretirano 
sredstvima za zaštitu bilja najmanje jednu godinu prije uzimanja uzorka. Osim toga, organska gnojiva ne smiju se primjenjivati najmanje šest mjeseci prije uzorkovanja. Uporaba mineralnih 
gnojiva prihvatljiva je samo ako je to u skladu sa zahtjevima kulture, 
a uzorci tla ne smiju se uzimati najmanje tri mjeseca nakon primjene gnojiva. Treba izbjegavati korištenje tla tretiranoga gnojivima s poznatim biocidnim u čincima (npr. kalcijev cijanamid).
 
Treba izbjegavati uzorkovanje tijekom ili neposredno nakon dugih 
razdoblja suše (duže od 30 dana) ili poplave. Kod oranih tala uzorke treba uzeti na dubini od 0 do 20 cm. Kod travnatih površina 
(pašnjaka) i drugih tala koja se ne oru u dužim razdobljima (naj ­
manje jedna sezona) maksimalna dubina uzorkovanja može biti malo veća od 20 cm (npr. do 25 cm). Uzorke tla treba prenositi u sprem ­
nicima u temperaturnim uvjetima koji jam če da se po četna svojstva 
tla neće značajno promijeniti.
 
1.6.3.2.  Skladištenje  
Poželjno je koristiti tla koja su svježe skupljena na terenu. Ako se ne 
može izbje ći skladištenje u laboratoriju, tla se mogu skladištiti u 
mraku na 4 ± 2 °C najviše tri mjeseca. Za vrijeme skladištenja tla 
treba osigurati aerobne uvjete. Ako se uzorci tla uzimaju s površina 
koje su zamrznute najmanje tri mjeseca godišnje, može do ći u obzir i 
skladištenje na minus 18 °C u trajanju od šest mjeseci. Mikrobna biomasa uskladištenih tala mjeri se prije svakog pokusa, a sadržaj 
ugljika u biomasi treba iznositi najmanje 1 % ukupnog sadržaja 
organskog ugljika tla (vidjeti odjeljak 1.6.2.).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1284
 
1.6.4.  Rukovanje i priprema tla za ispitivanje  
1.6.4.1.  Predinkubacija  
Ako je tlo bilo uskladišteno (vidjeti odjeljak 1.6.3.2. i 1.7.1.3.), 
preporučuje se predinkubacija u trajanju izme đu 2 i 28 dana. 
Temperatura i sadržaj vlage tla tijekom predinkubacije trebaju biti slični temperaturi i sadržaju vlage kod ispitivanja (vidjeti odjeljak 
1.6.4.2. i 1.7.1.3.).
 
1.6.4.2.  Fizikalno-kemijska svojstva  
Tlo se ru čno očisti od krupnih predmeta (npr. kamenje, dijelovi 
biljaka itd.) i zatim se vlažno prosije bez pretjeranog isušivanja na veličinu čestica do najviše 2 mm. Sadržaj vlage uzorka tla treba 
podesiti pomo ću destilirane ili deionizirane vode na vrijednost 
između 40 % i 60 % maksimalnog vodnog kapaciteta.
 
1.6.5.  Priprema ispitivane tvari za primjenu na tlo  
Ispitivana se tvar u pravilu primjenjuje pomo ću nosača. Nosač može 
biti voda (kod tvari topljivih u vodi) ili inertna kruta tvar, kao što je sitni kremeni pijesak (veli čina čestica: 0,1–0,5 mm). Treba izbjega ­
vati sve teku će nosače osim vode (npr. organska otapala kao što je 
aceton, kloroform) jer oni mogu oštetiti mikrofloru. Ako se kao 
nosač koristi pijesak, on se može obložiti ispitivanom tvari 
otopljenom ili suspendiranom u odgovaraju ćem otapalu. U tom 
slučaju otapalo treba ukloniti isparavanjem prije miješanja s tlom. 
Za optimalnu razdiobu ispitivane tvari u tlu preporu čuje se omjer od 
10 g pijeska po kilogramu tla (suhe mase). Kontrolni se uzorci obrađuju samo odgovaraju ćom količinom vode i/ili kremenog 
pijeska.
 
Kod ispitivanja hlapljivih kemikalija treba izbjegavati gubitke 
tijekom obrade te nastojati osigurati homogenu razdiobu u tlu (npr. ispitivanu tvar treba ubrizgati u tlo na nekoliko mjesta).
 
1.6.6.  Ispitne koncentracije  
Ako se ispituju sredstva za zaštitu bilja ili druge kemikalije s pred ­
vidivim koncentracijama u okolišu, treba koristiti najmanje dvije 
koncentracije. Niža koncentracija ne smije biti manja od o čekivane 
maksimalne koli čine koja će dospjeti u tlo u stvarnim uvjetima 
primjene, dok viša koncentracija treba biti višekratnik niže koncen ­
tracije. Koncentracije ispitivane tvari koje se dodaju u tlo izra ču­
navaju se uz pretpostavku jednolikog ulaganja do dubine od 5 cm 
i nasipne gusto će tla od 1,5. Kod agrokemikalija koje se izravno 
primjenjuju na tlo i kod kemikalija kod kojih se može predvidjeti količina koja će dospjeti u tlo preporu čene ispitne koncentracije su 
maksimalna predvidiva koncentracija u okolišu (Predictable Environ ­
mental Concentraction, PEC) i njezina peterostruka vrijednost. Tvari kod kojih se o čekuje više primjena u jednoj sezoni treba ispitati u 
koncentracijama koje se dobiju množenjem PEC-a maksimalnim 
očekivanim brojem primjena. Ipak, gornja koncentracija koja se ispi ­
tuje smije biti najviše 10 puta ve ća od maksimalne koli čine jedne 
primjene.
 
Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, koristi se 
geometrijski niz od najmanje pet koncentracija. Ispitne koncentracije 
trebaju obuhva ćati područje potrebno za odre đivanje vrijednosti EC  x . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1285
 
1.7. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.7.1.  Uvjeti izlaganja  
1.7.1.1.  Obrada i kontrola  
Ako se ispituju agrokemikalije, tlo se podijeli u tri dijela jednake 
mase. Dva se dijela pomiješaju s nosa čem koji sadrži proizvod, a 
treći se pomiješa s nosa čem bez proizvoda (kontrola). Preporu čuju se 
najmanje po tri ponavljanja, kako kod obra đenog tako i kod neobra ­ 
đenog tla. Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, tlo 
se podijeli u šest dijelova jednake mase. Pet se uzoraka pomiješa s 
nosačem koji sadrži ispitivanu tvar, a šesti se pomiješa s nosa čem 
bez kemikalije. Preporu čuju se po tri ponavljanja za obra đene uzorke 
i kontrolu. Treba paziti da se osigura homogena razdioba ispitivane 
tvari u obra đenim uzorcima tla. Kod miješanja treba izbjegavati 
zbijanje i grudanje tla.  
1.7.1.2.  Inkubacija uzoraka tla  
Inkubacija uzoraka tla može se provesti na dva na čina: u zbirnim 
uzorcima svakog obra đenog i neobra đenog tla ili kao niz pojedi ­
načnih poduzoraka jednake veli čine svakog obra đenog i neobra đenog 
tla. Ipak, ako se ispituju hlapljive tvari, ispitivanje se uvijek provodi s nizom pojedina čnih poduzoraka. Ako se tla inkubiraju zbirno, 
pripreme se velike koli čine svakog obra đenog i neobra đenog tla i 
tijekom ispitivanja uzimaju poduzorci za analizu prema potrebi. Početna koli čina koju treba pripremiti za sve obrade i kontrolu 
ovisi o veli čini poduzoraka, broju ponavljanja koja se koriste u 
analizi i o čekivanom maksimalnom broju uzorkovanja. Tla koja se 
inkubiraju zbirno treba dobro promiješati prije uzimanja poduzoraka. Ako se tla inkubiraju kao niz pojedina čnih uzoraka tla, svako se 
obrađeno i neobra đeno zbirno tlo podijeli u potreban broj poduzo ­
raka, koji se koriste prema potrebi. Kod pokusa gdje se o čekuje više 
od dva vremena uzorkovanja treba pripremiti dovoljno poduzoraka za sva ponavljanja i sva vremena uzorkovanja. Treba inkubirati 
najmanje tri paralelna uzorka ispitivanog tla u aerobnim uvjetima 
(vidjeti odjeljak 1.7.1.1.). Kod svih ispitivanja treba koristiti prikladne posude s dovoljno plinskog prostora kako ne bi nastali anaerobni uvjeti. Ako se ispituju hlapljive tvari, ispitivanje se 
uvijek provodi s nizom pojedina čnih poduzoraka.
 
1.7.1.3.  Ispitni uvjeti i trajanje  
Ispitivanje se provodi u mraku na sobnoj temperaturi od 20 ± 2 C°. 
Sadržaj vlage u uzorcima tla za vrijeme ispitivanja treba održavati 
između 40 % i 60 % maksimalnog vodnog kapaciteta tla (vidjeti 
odjeljak 1.6.4.2.) uz toleranciju od ± 5 %. Prema potrebi se može dodati destilirana ili deionizirana voda.
 
Ispitivanje traje najmanje 28 dana. Ako se ispituju agrokemikalije, 
usporede se koli čine oslobo đenog ugljikovog dioksida odnosno 
potrošenog kisika u obra đenim i kontrolnim uzorcima. Ako se one 
28. dana razlikuju za više od 25 %, ispitivanje se nastavlja dok se ne 
dobije razlika od 25 % ili manja ili najviše 100 dana, ovisno o tome što je kra će. Kod ostalih se kemikalija ispitivanje prekida nakon 28 
dana. 28. dana se odrede koli čine oslobo đenog ugljikovog dioksida 
odnosno potrošenog kisika u obra đenim i kontrolnim uzorcima tla i 
izračunaju vrijednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1286
 
1.7.2.  Uzorkovanje i analiziranje tala  
1.7.2.1.  Raspored uzorkovanja tla  
Ako se ispituju agrokemikalije, uzorci se tla analiziraju s obzirom na 
stope disanja induciranoga glukozom 0., 7., 14. i 28. dana. Ako je potrebno duže ispitivanje, daljnja mjerenja nakon 28. dana treba obavljati u razmacima od 14 dana.
 
Ako se ispituju kemikalije razli čite od agrokemikalija, koristi se 
najmanje pet ispitnih koncentracija i uzorci tla analiziraju se na 
disanje inducirano glukozom na po četku (0. dan) i kraju razdoblja 
izlaganja (28 dana). Prema potrebi može se dodati i me đumjerenje, 
npr. 7. dana. Podaci dobiveni 28. dana koriste se za odre đivanje 
vrijednosti EC  x kemikalije. Podaci kontrolnih uzoraka 0. dana 
mogu se, po želji, upotrijebiti za procjenu po četnih koli čina metabo ­
lički aktivne mikrobne biomase u tlu (12).  
1.7.2.2.  Mjerenje stopa disanja induciranoga glukozom  
Stopa disanja induciranoga glukozom odre đuje se u svakom vremenu 
uzorkovanja u svim obra đenim i kontrolnim uzorcima. Uzorci tla 
pomiješaju se s dovoljnom koli činom glukoze da se trenuta čno 
postigne maksimalni respiratorni odgovor. Koli čina glukoze potrebna 
da se postigne maksimalni respiratorni odgovor pojedinog tla može 
se odrediti u preliminarnom ispitivanju s nizom koncentracija 
glukoze (14). Ipak, kod pjeskovitih tala s 0,5–1,5 % organskog ugljika obi čno je dovoljno 2 000 mg do 4 000 mg glukoze po kg 
suhe mase tla. Glukoza se može samljeti u prah s čistim kremenim 
pijeskom (10 g pijeska/kg suhe mase tla) i homogeno pomiješati s 
tlom.
 
Uzorci tla oboga ćeni glukozom inkubiraju se na 20 ± 2 °C u 
prikladnoj aparaturi u kojoj se stope disanja mjere neprekidno, svakog sata ili svaka dva sata (vidjeti odjeljak 1.6.1.). Oslobo đeni 
ugljikov dioksid odnosno potrošeni kisik mjeri se tijekom 12 
uzastopnih sati; mjerenja treba zapo četi što prije tj. u roku jednog 
do dva sata nakon dodavanja glukoze. Izmjere se ukupne koli čine 
ugljikovog dioksida koji je oslobo đen ili kisika koji je potrošen 
tijekom 12 sati i odrede srednje stope disanja.
 
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Kod ispitivanja s agrokemikalijama treba zabilježiti koli činu oslobo ­ 
đenog ugljikovog dioksida odnosno potrošenog kisika za svaki 
uzorak tla i u tabli čnom obliku navesti srednje vrijednosti svih 
ponavljanja. Rezultate treba vrednovati odgovaraju ćim opće prihva­
tljivim statisti čkim metodama (npr. F test, razina zna čajnosti 5 %). 
Stope disanja induciranoga glukozom izražavaju se u mg ugljikovog dioksida/kg suhe mase tla/h odnosno mg kisika/suha masa tla/h. Srednja stopa tvorbe ugljikovog dioksida odnosno srednja stopa 
potrošnje kisika u svakoj obradi usporedi se s kontrolom i izra čuna 
se postotak odstupanja od kontrolne vrijednosti.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1287
 
Ako se ispitivanja provode s kemikalijama razli čitim od agrokemi ­
kalija, odrede se koli čine oslobo đenog ugljikovog dioksida odnosno 
potrošenog kisika u svakom ponavljanju i izradi krivulja doza-odgovor za procjenu vrijednosti EC
 x . Stope disanja inducira ­
noga glukozom (tj. mg ugljikovog dioksida/kg suhe mase tla/h 
odnosno mg kisika/suha masa tla/h) utvr đene u obra đenim uzorcima 
nakon 28 dana usporede se s kontrolom. Iz tih se podataka izra ču­
naju postoci inhibicije za svaku ispitnu koncentraciju. Ti se postoci grafički prikažu u ovisnosti o koncentraciji i primijene se statisti čki 
postupci za izra čun vrijednosti EC
 x . Granice pouzdanosti (p = 0,95) 
za izračunani EC  x također se odre đuju primjenom standardnih postu ­
paka (15)(16)(17).  
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Ako se kod vrednovanja rezultata ispitivanja s agrokemikalijama 
pokaže da je u bilo kojem vremenu uzorkovanja nakon 28. dana razlika u stopama disanja izme đu niže obrade (tj. maksimalne pred ­
viđene koncentracije) i kontrole jednaka ili manja od 25 %, može se 
ocijeniti da proizvod nema dugotrajni utjecaj na pretvorbu ugljika u tlu. Kad se vrednuju rezultati ispitivanja s drugim kemikalijama 
koriste se vrijednosti EC
 50 , EC  25 i/ili EC  10 . 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati sljede će informacije:  
potpuni podaci o upotrijebljenom tlu, uklju čujući: 
— geografske koordinate lokaliteta (širina, dužina),  
— informacije o povijesti lokaliteta (npr. vegetacijski pokrov, treti ­
ranje sredstvima za zaštitu bilja, tretiranje gnojivima, slu čajno 
onečišćenje itd.),  
— način korištenja (npr. poljoprivredno zemljište, šuma itd.),  
— dubinu uzorkovanja (cm),  
— sadržaj pijeska/praha/gline (% suhe mase),  
— pH (u vodi),  
— sadržaj organskog ugljika (% suhe mase),  
— sadržaj dušika (% suhe mase),  
— kapacitet izmjene kationa (mmol/kg),  
— početnu mikrobnu biomasu u postotku ukupnog organskog 
ugljika,  
— uputu na metode korištene za odre đivanje pojedinih parametara,  
— sve informacije vezane uz skupljanje i skladištenje uzoraka tla,  
— podatke o predinkubaciji tla (prema potrebi).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1288
 
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,  
— podaci za identifikaciju kemikalije, uklju čujući, prema potrebi, 
strukturnu formulu, čistoću (kod sredstava za zaštitu bilja 
postotak aktivne tvari), sadržaj dušika.  
Uvjeti ispitivanja:  
— podaci o oboga ćivanju tla organskim supstratom,  
— broj koncentracija ispitivane tvari i, prema potrebi, obrazloženje 
odabranih koncentracija,  
— podaci o primjeni ispitivane tvari na tlo,  
— temperatura inkubacije,  
— sadržaj vlage u tlu na po četku i za vrijeme ispitivanja,  
— metoda inkubacije tla (tj. zbirni uzorak ili niz pojedina čnih podu­
zoraka),  
— broj ponavljanja,  
— vremena uzorkovanja.  
Rezultati:  
— metoda i oprema koja se koristi za mjerenje stopa disanja,  
— tablični podaci, uklju čujući pojedina čne i srednje vrijednosti koli ­ 
čina ugljikovog dioksida odnosno kisika,  
— odstupanje izme đu ponavljanja kod obra đenih i kontrolnih 
uzoraka,  
— obrazloženje korekcija izra čuna, prema potrebi,  
— postotak odstupanja stopa disanja induciranoga glukozom u 
svakom vremenu uzorkovanja odnosno, prema potrebi, EC  50 s 
granicom pouzdanosti 95 %, drugi EC  x (tj. EC  25 ili EC  10 ) s 
intervalima pouzdanosti i graf krivulje doza-odgovor,  
— statisti čka obrada rezultata, prema potrebi,  
— sve informacije i zapažanja korisna za tuma čenje rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA, (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1289
 
(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(6) ISO 10381-6, (1993) Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E., (1987) Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E., (1982) Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. 
Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
 
(9) ISO 11266-1, (1993) Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239, (1997E) Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralisation of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeye r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G., 
(1989) Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77-81.  
(12) ISO 14240-1, (1997) Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(13) ISO 14240-2, (1997) Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P., (1986) Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Inf ­
luence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbi ­
cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., 
Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 
(16) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(17) Finney D.J., (1978) Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1290
 
C.23.  AEROBNA I ANAEROBNA PRETVORBA U TLU  
1. METODA  
Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD TG 307 (2002)  
1.1. UVOD  
Ova se ispitna metoda temelji na postoje ćim smjernicama 
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Postupak opisan u ovoj ispitnoj metodi 
namijenjen je ocjenjivanju aerobne i anaerobne pretvorbe kemikalija u tlu. Pokusi se izvode u svrhu odre đivanja i. brzine pretvorbe 
ispitivane tvari te ii. vrste i brzine tvorbe i razgradnje proizvoda 
pretvorbe kojima mogu biti izložene biljke i organizmi koji žive u tlu. Ova su istraživanja potrebna kod kemikalija koje se izravno primjenjuju na tlo i kemikalija koje mogu dospjeti u zemni okoliš. 
Rezultati tih laboratorijskih istraživanja mogu se koristiti i za izradu 
protokola uzorkovanja i analize za srodna terenska istraživanja.
 
Za ocjenjivanje puteva pretvorbe (8)(10)(11) uglavnom su dovoljna 
aerobna i anaerobna istraživanja s jednom vrstom tla. Brzine pret ­
vorbe treba odrediti u još najmanje tri tla. (8)(10).  
Na radionici OECD-a o odabiru tala i sedimenata održanoj u talijan ­
skom Belgiratu 1995. (10) posebno su dogovoreni broj i vrste tla 
koja će se koristiti u ovom testu. Vrste tla koje se ispituju trebaju biti 
reprezentativne za uvjete okoliša u kojima će se tvar koristiti 
odnosno ispuštati. Primjerice, kemikalije koje bi se mogle ispuštati 
u suptropskim do tropskim klimama treba ispitivati s ferasolima ili 
nitosolima (sustav FAO). Na radionici su tako đer dane preporuke u 
vezi sa skupljanjem, rukovanjem i skladištenjem uzoraka tla na temelju smjernice ISO (15). Ova metoda tako đer uzima u obzir 
uporabu tala rižišta.
 
1.2. DEFINICIJE  
Ispitivana tvar:  bilo koja tvar, bilo polazni spoj ili relevantni proiz ­
vodi pretvorbe.  
Proizvodi pretvorbe:  sve tvari koje nastaju u bioti čkim ili abioti ­ 
čkim reakcijama pretvorbe ispitivane tvari, uklju čujući CO  2 i proiz­
vode u vezanim ostacima.  
Vezani ostaci:  „vezani ostaci” predstavljaju spojeve u tlu, biljki ili 
životinji koji nakon ekstrakcije ostaju u matrici u obliku polazne tvari ili njezinog/ih metabolita/proizvoda pretvorbe. Metoda ekstrak ­
cije ne smije znatno promijeniti same spojeve niti strukturu matrice. 
Vrsta veze može se djelomi čno razjasniti ekstrakcijskim metodama 
koje mijenjaju matricu i sofisticiranim analiti čkim tehnikama. Do 
sada su na taj na čin utvrđene npr. kovalentne ionske i sorpcijske 
veze te uklapanja. Op ćenito, tvorba vezanih ostataka zna čajno 
smanjuje biodostupnost i bioraspoloživost (12) [prilago đeno na 
temelju IUPAC 1984 (13)].
 
Aerobna pretvorba:  reakcije koje se odvijaju u prisutnosti moleku ­
larnog kisika (14).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1291
 
Anaerobna pretvorba:  reakcije koje se odvijaju bez pristupa mole ­
kularnog kisika (14).  
Tlo: mješavina mineralnih sastojaka i organsko-kemijskih sastojaka 
koji sadrže spojeve velike molekulske mase s visokim sadržajem 
ugljika i dušika, oživljena sitnim (uglavnom mikro) organizmima. Tlom se može rukovati u dva stanja:
 
(a) neporeme ćeno: onako kako je nastalo s vremenom, s karakteri ­
stičnim slojevima razli čitih vrsta tla;  
(b) poreme ćeno: kakvo se obi čno nalazi na poljoprivrednim zemlji ­ 
štima odnosno kakvo je u ovoj metodi prisutno u uzorcima koji 
se uzimaju kopanjem (14).  
Mineralizacija:  potpuna razgradnja organskog spoja u CO  2 i H 2 O u 
aerobnim uvjetima i CH  4 , CO  2 i H  2 O u anaerobnim uvjetima. Ako 
se u kontekstu ove ispitne metode koristi  14 C obilježeni spoj, minera ­
lizacija zna či opsežnu razgradnju tijekom koje obilježeni atom 
ugljika oksidira uz otpuštanje odgovaraju će količine 14 CO 2 (14).  
Vrijeme poluraspada:  t 0,5 je vrijeme koje je potrebno za 50 %-tnu 
pretvorbu ispitivane tvari, ako se pretvorba može opisati kinetikom prvog reda; ono je neovisno o koncentraciji.
 
DT 50 (vrijeme nestajanja 50):  vrijeme u kojemu se koncentracija 
ispitivane tvari smanji za 50 %; ono se razlikuje od vremena polura ­
spada t  0,5 ako pretvorba ne prati kinetiku prvog reda.  
DT 75 (vrijeme nestajanja 75):  vrijeme u kojemu se koncentracija 
ispitivane tvari smanji za 75 %.  
DT 90 (vrijeme nestajanja 90):  vrijeme u kojemu se koncentracija 
ispitivane tvari smanji za 90 %.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari treba koristiti za opisivanje i/ili identificiranje proiz ­
voda pretvorbe spektroskopskim i kromatografskim metodama.  
1.4. PRIMJENJIVOST TESTA  
Metoda se može primijeniti na sve kemikalije (neobilježene i 
radioaktivno obilježene) za koje je raspoloživa dovoljno to čna i osje­
tljiva analiti čka metoda. Ona se može primijeniti na blago hlapljive i 
nehlapljive spojeve kao i na vodotopljive spojeve i spojeve neto ­
pljive u vodi. Test ne treba primjenjivati u slu čaju kemikalija koje 
su jako hlapljive iz tla (npr. fumiganti, organska otapala) te se stoga 
ne mogu zadržati u tlu u pokusnim uvjetima ovog testa.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1292
 
1.5. INFORMACIJE O TVARI  
Za mjerenje brzine pretvorbe mogu se koristiti neobilježene i obilje ­ 
žene ispitivane tvari. Za prou čavanje puta pretvorbe i utvr đivanje 
bilance mase potreban je obilježeni materijal. Preporu čuje se  14 C 
obilježavanje, ali korisna je i primjena drugih izotopa, kao što su  
13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Ako je to mogu će, oznaku treba staviti na najsta ­
bilni dio odnosno dijelove molekule (  1 ). Čistoća ispitivane tvari treba 
biti najmanje 95 %.  
Prije provedbe testa aerobne i anaerobne pretvorbe u tlu trebaju biti 
raspoložive sljede će informacije o ispitivanoj tvari:  
(a) topljivost u vodi (metoda A.6.)  
(b) topljivost u organskim otapalima;  
(c) tlak pare (metoda A.4.) i konstanta Henryjevog zakona;  
(d) podjelni koeficijent n-oktanol/voda (metoda A.8.);  
(e) kemijska stabilnost u mraku (hidroliza) (metoda C.7.);  
(f) pK  a , ako je molekula sklona protonaciji ili deprotonaciji [smjer ­
nica OECD 112] (16).  
Osim toga, korisno je imati podatke o toksi čnosti ispitivane tvari za 
mikroorganizme koji žive u tlu [ispitne metode C.21. i C 22.] (16).  
Trebaju biti raspoložive analiti čke metode (uklju čujući metodu 
ekstrakcije i pro čišćavanja) za kvantifikaciju i identifikaciju ispiti ­
vane tvari i njezinih proizvoda pretvorbe.  
1.6. NA ČELO ISPITNE METODE  
Uzorci tla se obrade ispitivanom tvari i inkubiraju u mraku u tikvi ­
cama biometarskog tipa ili proto čnim sustavima u kontroliranim 
laboratorijskim uvjetima (stalna temperatura i vlažnost tla). Uzorci tla se u odgovaraju ćim vremenskim razmacima ekstrahiraju i anali ­
ziraju na polaznu tvar i proizvode pretvorbe. Hlapljivi se proizvodi 
također skupljaju za analizu pomo ću odgovaraju ćih apsorpcijskih 
uređaja. Primjenom
 14 C obilježenog materijala mogu se izmjeriti 
različite brzine mineralizacije ispitivane tvari odvajanjem razvijenog  
14 CO 2 i utvrditi bilanca mase, uklju čujući tvorbu vezanih ostataka u 
tlu. 
1.7. KRITERIJI KAKVO ĆE 
1.7.1.  Iskorištenje  
Prve naznake ponovljivosti analiti čke metode i uspješnosti jednolike 
primjene ispitivane tvari mogu se dobiti ekstrakcijom i analizom najmanje dva paralelna uzorka tla neposredno nakon dodavanja ispi ­
tivane tvari. Iskorištenja u kasnijim fazama pokusa proizlaze iz odgo ­
varajućih bilanci mase. Iskorištenje se treba kretati u podru čju od 
90 % do 110 % kod obilježenih kemikalija (8) i od 70 % do 110 % kod neobilježenih kemikalija (3).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1293  
( 1 ) Primjerice, ako ispitivana tvar sadrži jedan prsten, oznaka se mora staviti na taj prsten; 
ako ispitivana tvar sadrži dva ili više prstenova, ponekad je potrebno provesti posebna 
istraživanja kako bi se ocijenila sudbina svakog obilježenog prstena i dobile potrebne 
informacije o nastajanju proizvoda pretvorbe.
 1.7.2.  Ponovljivost i osjetljivost analiti čke metode  
Ponovljivost analiti čke metode (bez po četne učinkovitosti ekstrak ­
cije) kod kvantifikacije ispitivane tvari i proizvoda pretvorbe može se provjeriti dvostrukom analizom istog ekstrakta tla koje je inkubi ­
rano dovoljno dugo da nastanu proizvodi pretvorbe.
 
Granica detekcije (limit of detection, LOD) analiti čke metode za 
ispitivanu tvar i proizvode pretvorbe treba biti najmanje 0,01 mg · 
kg -1 tla (kao ispitivana tvar) ili 1 % primijenjene doze, ovisno o 
tome što je manje. Tako đer je potrebno navesti granicu kvantifikacije 
(limit of quantification, LOQ).  
1.7.3.  To čnost podataka o pretvorbi  
Regresijska analiza koncentracija ispitivane tvari kao funkcije 
vremena daje odgovaraju će informacije o pouzdanosti krivulje pret ­
vorbe i omogu ćuje izračun granica pouzdanosti za vremena polura ­
spada (u slu čaju kinetike pseudoprvog reda) odnosno vrijednosti 
DT 50 i, prema potrebi, DT  75 i DT  90 . 
1.8. OPIS METODE  
1.8.1.  Oprema i kemijski reagensi  
Inkubacijski sustavi se sastoje od stati čkih zatvorenih sustava ili 
prikladnih proto čnih sustava (7)(17). Primjeri prikladne proto čne 
aparature za inkubaciju tla i tikvice biometarskog tipa prikazani su 
na slici 1. i 2. Obje vrste inkubacijskih sustava imaju prednosti i 
ograničenja (7)(17).  
Potrebna je standardna laboratorijska oprema, posebno:  
— analiti čki instrumenti, kao što su oprema za GLC, HPLC, TLC, 
uključujući odgovaraju će detekcijske sustave za analiziranje 
radioaktivno obilježenih i neobilježenih tvari ili inverznu metodu razrje đenja izotopa,
 
— instrumenti za potrebe identifikacije (npr. MS, GC-MS, 
HPLC-MS, NMR itd.),  
— tekućinski scintilacijski broja č, 
— oksidator za izgaranje radioakivnog materijala,  
— centrifuga,  
— aparatura za ekstrakciju (npr. epruvete za centrifugiranje za 
hladnu ekstrakciju i aparatura po Soxhletu za kontinuiranu ekstrakciju pod refluksom),
 
— instrumenti za koncentriranje otopina i ekstrakata (npr. rotacijski 
isparivač), 
— vodena kupelj,  
— mehani čki uređaj za miješanje (npr. ure đaj za gnjetenje, rota ­
cijska mješalica).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1294
 
Kemijski reagensi koji se koriste su npr.:  
— NaOH, analiti čki čist, 2 mol · dm  -3 ili druga odgovaraju ća baza 
(npr. KOH, etanolamin),  
— H  2 SO 4 , analitički čista, 0,05 mol · dm  -3 , 
— etilen-glikol, analiti čki čist, 
— kruti apsorpcijski materijali, kao što je natronsko vapno i poliu ­
retanski čepovi.  
— organska otapala, analiti čki čista, kao što je aceton, metanol itd.,  
— scintilacijska teku ćina. 
1.8.2.  Primjena ispitivane tvari  
Da bi se olakšalo uvo đenje ispitivane tvari u tlo i njezina razdioba u 
tlu, ispitivana tvar se može otopiti u vodi (deionizirana ili destilirana) ili, prema potrebi, u minimalnoj koli čini acetona ili drugog organ ­
skog otapala (6) u kojemu je ispitivana tvar dovoljno topljiva i 
stabilna. Ipak, koli čina odabranog otapala ne smije imati zna čajan 
utjecaj na mikrobnu aktivnost tla (vidjeti odjeljak 1.5. i 1.9.2. – 1.9.3.). Treba izbjegavati uporabu otapala koja inhibiraju mikrobnu aktivnost, kao što je kloroform, diklormetan i druga halogenirana 
otapala.
 
Ispitivana tvar se može dodati i u krutom stanju npr. umiješana u 
kremeni pijesak (6) ili u malom poduzorku ispitivanog tla koji je prethodno osušen na zraku i steriliziran. Ako se ispitivana tvar dodaje uz pomo ć otapala, otapalo treba pustiti da ispari prije doda ­
vanja obra đenog poduzorka izvornom nesterilnom uzorku tla.
 
U slučaju kemikalija u op ćoj uporabi čiji su glavni putevi ulaska u 
tlo kanalizacijski mulj/primjena u poljoprivredi, ispitivanu tvar treba prvo dodati u mulj i zatim mulj uvesti u uzorak tla (vidjeti odjeljak 1.9.2. i 1.9.3.).
 
U pravilu se ne preporu čuje uporaba formuliranih proizvoda. Ipak, 
uporaba formuliranog materijala može biti prikladna alternativa npr. 
kod slabo topljivih ispitivanih tvari.  
1.8.3.  Tla  
1.8.1.3.  Odabir tla  
Za određivanje puta pretvorbe treba koristiti reprezentativno tlo; 
preporučuje se pjeskovita ilova ča ili praškasta ilova ča ili ilova ča ili 
ilovasti pijesak (prema klasifikaciji FAO i USDA (18)) s pH 5,5 – 8,0, sadržajem organskog ugljika 0,5 – 2,5 % i mikrobnom biomasom od najmanje 1 % ukupnog organskog ugljika (10).
 
%Kod istraživanja brzine pretvorbe treba koristiti još najmanje tri tla 
koja predstavljaju podru čje relevantnih tala. Tla trebaju imati razli čiti 
sadržaj organskog ugljika, pH, sadržaj gline i mikrobnu biomasu (10).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1295
 
Sva tla treba opisati barem s obzirom na teksturu (% pijeska, % 
praha, % gline) [prema klasifikaciji FAO i USDA (18)], pH, kapa ­
citet izmjene kationa, organski ugljik, nasipnu gusto ću, svojstvo 
zadržavanja vode (  1 ) i mikrobnu biomasu (samo kod aerobnih istra ­ 
živanja). Za tuma čenje rezultata mogu biti korisne i druge informa ­
cije o svojstvima tla. Za odre đivanje svojstava tla mogu se koristiti 
metode preporu čene u literaturi (19)(20)(21)(22)(23). Mikrobna 
biomasa se može odrediti metodom disanja induciranog supstratom (substrate-induced respiration, SIR) (25)(26) ili alternativnim meto ­
dama (20).
 
1.8.3.2.  Skupljanje, rukovanje i skladištenje tala  
Trebaju biti raspoložive detaljne informacije o povijesti lokaliteta 
gdje se uzima tlo za ispitivanje. To uklju čuje točno mjesto, vegeta ­
cijski pokrov, tretiranja kemikalijama, tretiranja organskim i anorgan ­
skim gnojivima, dodatke biološkog materijala i druga one čišćenja. 
Tla koja su u prethodne četiri godine tretirana ispitivanom tvari ili 
njezinim strukturnim analozima ne smiju se koristiti u istraživanjima pretvorbe (10)(15).
 
Treba uzeti svježe tlo s polja (iz horizonta A ili gornjeg sloja od 
20 cm) čiji je sadržaj vode povoljan za prosijavanje. Treba izbjega ­
vati uzimanje uzoraka tijekom ili neposredno nakon dugih razdoblja 
(> 30 dana) suše, smrzavanja ili poplave (14), osim u slu čaju tala s 
rižišta. Uzorke tla treba prenositi tako da promjene sadržaja vode budu što manje i treba ih po mogu ćnosti držati u mraku uz slobodan 
pristup zraka. Za to je op ćenito prikladna labavo povezana polieti ­
lenska vre ća.
 
Tlo treba obraditi što prije nakon uzorkovanja. Prije prosijavanja tla 
kroz 2-milimetarsko sito koje uklanja sitno kamenje, faunu i biljne 
ostatke treba ukloniti vegetaciju, krupniju faunu i kamenje. Treba izbjegavati pretjerano isušivanje i drobljenje tla prije prosijavanja (15).
 
Ako je zimi otežano uzorkovanje na terenu (tlo zamrznuto ili prekri ­
veno slojevima snijega), uzorak se može uzeti iz tla pohranjenog u 
stakleniku ispod biljnog pokrova (npr. trava ili mješavina trave i 
djeteline). Prednost se u svakom slu čaju daje tlima koja su svježe 
uzeta na terenu, ali ako se ve ć skupljeno i obra đeno tlo mora uskla ­
dištiti prije po četka istraživanja, treba osigurati prikladne uvjete i 
ograničiti vrijeme skladištenja (4 ± 2 °C najduže tri mjeseca) kako 
bi se održala mikrobna aktivnost (  2 ). Detaljne upute za skupljanje, 
rukovanje i skladištenje tala koja se koriste u pokusima biološke pretvorbe mogu se na ći u (8)(10 (15)(26)(27).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1296  
( 1 ) Svojstvo zadržavanja vode tla može se mjeriti kao poljski kapacitet, kao vodni kapacitet 
ili kao napon vlažnosti (pF). Za objašnjenje vidjeti Dodatak 1. U izvješ ću o ispitivanju 
treba navesti jesu li svojstvo zadržavanja vode i nasipna gusto ća tala odre đeni na nepo ­
remećenim uzrocima s polja ili na poreme ćenim (obra đenim) uzorcima. 
( 2 ) Noviji rezultati istraživanja pokazuju da se tla iz umjerenih zona mogu skladištiti na 
– 20 °C i duže od tri mjeseca (28) (29) bez zna čajnih gubitaka mikrobne aktivnosti.
 Obrađeno tlo treba prije uporabe u ovom testu predinkubirati kako bi 
se omogu ćilo klijanje i uklanjanje sjemenja te kako bi se povratila 
ravnoteža mikrobnog metabolizma nakon prelaska s uvjeta uzorko ­
vanja odnosno skladištenja na uvjete inkubacije. Uglavnom je dovoljno razdoblje predinkubacije izme đu 2 i 28 dana u uvjetima 
temperature i vlage koji približno odgovaraju ispitnim uvjetima (15). 
Ukupno vrijeme skladištenja i predinkubacije zajedno ne smije biti duže od tri mjeseca.
 
1.9. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.9.1.  Ispitni uvjeti  
1.9.1.1.  Ispitna temperatura  
Tijekom cjelokupnog razdoblja ispitivanja tla treba inkubirati u 
mraku na stalnoj temperaturi koja je reprezentativna za klimatske 
uvjete u kojima će se tvar koristiti odnosno ispuštati. Za sve ispiti ­
vane tvari koje mogu dospjeti u tlo u umjerenim klimama preporu ­ 
čuje se temperatura od 20 ± 2 °C. Temperaturu treba nadzirati.  
Kod kemikalija koje se primjenjuju ili ispuštaju u hladnijim klimama 
(npr. u sjevernim krajevima, u jesenskom/zimskom razdoblju) treba inkubirati dodatne uzorke tla, ali na nižoj temperaturi (npr. 
10 ± 2 °C).
 
1.9.1.2.  Sadržaj vlage  
Kod testova pretvorbe u aerobnim uvjetima sadržaj vlage u tlu (  1 ) 
treba podesiti i održavati na pF izme đu 2,0 i 2,5 (3). Sadržaj vlage u 
tlu izražava se kao masa vode po masi suhog tla; sadržaj vlage treba redovito kontrolirati (npr. u razmacima od 2 tjedna) vaganjem inku ­
bacijskih tikvica i gubitke vode nadoknaditi dodavanjem vode (po 
mogućnosti sterilno filtrirana voda iz slavine). Kod dodavanja vlage 
treba paziti da se gubici ispitivane tvari i/ili proizvoda pretvorbe ishlapljivanjem i/ili eventualnom fotokemijskom razgradnjom izbjegnu odnosno svedu na najmanju mogu ću mjeru.
 
Kod testova pretvorbe u anaerobnim uvjetima i uvjetima rižinog 
polja tlo treba zasititi vodom plavljenjem.  
1.9.1.3.  Aerobni uvjeti inkubacije  
U protočnim se sustavima aerobni uvjeti održavaju periodi čnim ispi­
ranjem ili neprekidnim zra čenjem vlažnim zrakom. U biometarskim 
tikvicama osigurana je izmjena zraka difuzijom.  
1.9.1.4.  Sterilni aerobni uvjeti  
Da bi se dobile informacije o relevantnosti abioti čke pretvorbe ispi ­
tivane tvari, uzorci tla se mogu sterilizirati (za metode sterilizacije 
vidjeti (16) i (29)), obraditi sterilnom ispitivanom tvari (npr. doda ­
vanje otopine kroz sterilni filtar) i dozra čivati vlažnim sterilnim 
zrakom, kako je opisano u odjeljku 1.9.1.3. U slu čaju tala rižišta, 
tlo i vodu treba sterilizirati i provesti inkubaciju kako je opisano u 
odjeljku 1.9.1.6.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1297  
( 1 ) Tlo ne smije biti premokro niti presuho kako bi se osiguralo dostatno dozra čivanje i 
hranjenje mikroflore. Preporu čeni sadržaj vlage za optimalni mikrobni rast kre će se u 
području od 40 – 60 % vodnog kapaciteta (WHC) i od 0,1 – 0,33 bar (6). Ovo posljednje 
područje istovjetno je podru čju pF 2,0 – 2,5. Tipi čni sadržaji vlage za razli čite vrste tla 
navedeni su u Dodatku 2.
 1.9.1.5.  Anaerobni uvjeti inkubacije  
Da bi se uspostavili i održali anaerobni uvjeti, tlo obra đeno ispiti ­
vanom tvari i inkubirano u aerobnim uvjetima u trajanju od 30 dana ili jednom vremenu poluraspada ili DT
 50 (ovisno o tome što je kra će) 
se preplavi vodom (sloj vode 1 – 3 cm) i inkubacijski sustav ispire 
inertnim plinom (npr. dušik ili argon) (  1 ). Ispitni sustav mora omogu ­ 
ćavati mjerenja npr. pH, koncentracije kisika i redoks potencijala i 
biti opremljen ure đajima za odvajanje hlapljivih proizvoda. Biome ­
tarski sustav mora biti zatvoren kako bi se sprije čio ulazak zraka 
difuzijom.  
1.9.1.6.  Inkubacija u uvjetima rižinog polja  
Kod istraživanja pretvorbe tvari u tlima rižišta tlo se naplavi slojem 
vode od oko 1 – 5 cm i ispitivana tvar primijeni na vodenu fazu (9). Preporučuje se dubina tla od najmanje 5 cm. Sustav se prozra čuje 
zrakom kao u aerobnim uvjetima. Treba pratiti i dokumentirati pH, 
koncentraciju kisika i redoks potencijal vodenog sloja. Prije po četka 
istraživanja pretvorbe potrebno je razdoblje preinkubacije od najmanje dva tjedna (vidjeti odjeljak 1.8.3.2.).
 
1.9.1.7.  Trajanje ispitivanja  
Istraživanje brzine i puta pretvorbe u pravilu ne bi trebalo trajati 
duže od 120 dana (  2 ) (3)(6)(8), budu ći da se nakon tog može o čeki­
vati postupno smanjenje mikrobne aktivnosti tla u umjetnom labora ­
torijskom sustavu odsje čenom od prirodnih procesa obnavljanja. 
Istraživanje može trajati i duže (npr. 6 ili 12 mjeseci), ako je to potrebno za opisivanje razgradnje ispitivane tvari i tvorbe i razgra ­
dnje glavnih proizvoda pretvorbe (8). Duža razdoblja inkubacije 
treba obrazložiti u izvješ ću o ispitivanju i navesti mjerenja biomase 
za vrijeme i na kraju tih razdoblja.
 
1.9.2.  Provo đenje ispitivanja  
U svaku se inkubacijsku tikvicu stavi oko 50 do 200 g tla (na bazi 
suhe mase) (vidjeti sliku 1. i 2. u Dodatku 3.) i tlo obradi ispiti ­
vanom tvari jednom od metoda opisanih u odjeljku 1.8.2. Ako se za 
primjenu ispitivane tvari koriste organska otapala, njih treba ukloniti 
iz tla isparavanjem. Tlo se zatim dobro promiješa spatulom i/ili tresenjem tikvice. Ako se istraživanje provodi u uvjetima rižinog polja, tlo i vodu treba temeljito promiješati nakon primjene ispitivane 
tvari. Male alikvote obra đenog tla (npr. 1 g) treba analizirati na 
ispitivanu tvar radi provjere jednolike razdiobe tvari. Za alternativnu metodu vidjeti dolje.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1298  
( 1 ) Aerobni uvjeti vladaju u površinskim tlima, pa čak i u dubljim slojevima tla, kako je 
pokazao istraživa čki projekt pod pokroviteljstvom EU-a [K. Takagi et al. (1992). Micro ­
bial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil 
temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides 
Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Anaerobni uvjeti se javljaju 
tek povremeno kod plavljenja tla nakon obilnih kiša ili kad se u rižištu uspostave uvjeti 
rižinog polja. 
( 2 ) Aerobna se istraživanja mogu prekinuti znatno prije 120. dana pod uvjetom da je jasno 
utvrđen konačni put pretvorbe i potpuna mineralizacija. Ispitivanje se može prekinuti 
nakon 120 dana, ili kad se postigne pretvorba najmanje 90 % ispitivane tvari, ali samo 
ako je stvoreno najmanje 5 % CO  2 .
 Ispitna koncentracija treba odgovarati maksimalnoj preporu čenoj 
količini primjene sredstva za zaštitu bilja iz uputa za uporabu i 
ravnomjernom ulaganju do odgovaraju će dubine u polju (npr. 
gornji sloj od 10 cm) (  1 ). Primjerice, u slu čaju kemikalija koje se 
primjenjuju na liš će ili tlo bez ulaganja, primjerena dubina za izra čun 
količine kemikalije koju treba dodati u tikvicu je 2,5 cm. Primjerena 
dubina za kemikalije koje se ulažu u tlo je dubina ulaganja navedena u uputama za uporabu. Kod kemikalija u op ćoj uporabi koli činu 
primjene treba procijeniti na temelju najrelevantijeg puta unosa; 
primjerice, ako je glavni put unosa u tlo kanalizacijski mulj, kemi ­
kaliju treba dozirati u mulj u koncentraciji koja odgovara o čekivanoj 
koncentraciji u mulju, a koli čina mulja dodana u tlo treba odgovarati 
uobičajenoj koli čini mulja u poljoprivrednim zemljištima. Ako ova 
koncentracija nije dovoljno visoka za identifikaciju glavnih proiz ­
voda pretvorbe, ponekad je korisno inkubirati zasebne uzorke tla koji sadrže ve će količine, ali treba izbjegavati pretjerane koli čine 
koje utječu na mikrobne funkcije tla (vidjeti odjeljak 1.5. i 1.8.2.).
 
Druga je mogu ćnost da se ve ća šarža tla (tj. 1 do 2 kg) obradi 
ispitivanom tvari, pažljivo promiješa u odgovaraju ćoj mješalici, podi ­
jeli u male dijelove od 50 do 200 g i prenese u inkubacijske tikvice (primjerice uz pomo ć razdjeljiva ča uzoraka). Male alikvote obra ­ 
đenog tla (npr. 1 g) treba analizirati na ispitivanu tvar radi provjere 
jednolike razdiobe tvari. Ovom se postupku daje prednost budu ći da 
omogućuje ravnomjerniju razdiobu ispitivane tvari u tlu.
 
Neobrađene uzorke tla treba inkubirati u istim uvjetima (aerobni) kao 
uzorke obra đene ispitivanom tvari. Ti se uzorci koriste za mjerenja 
biomase tijekom i na kraju istraživanja.  
Ako se ispitivana tvar primjenjuje na tlo otopljena u organskom 
otapalu odnosno otapalima, uzorci tla obra đeni istom koli činom 
otapala inkubiraju se u istim uvjetima (aerobni) kao uzorci obra đeni 
ispitivanom tvari. Ti se uzorci koriste za mjerenja biomase na po če­
tku, tijekom i na kraju istraživanja radi provjere u činaka otapala na 
mikrobnu biomasu.  
Tikvice koje sadrže obra đeno tlo se priklju čuju na proto čni sustav 
opisan na slici 1. ili se zatvore apsorpcijskom kolonom prikazanom na slici 2. (vidjeti Dodatak 3.).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1299  
( 1 ) Izračun početne koncentracije na bazi površine uz pomo ć jednadžbe:  
C soil ½mg =kg soil â ¼ A½kg=haâ · 10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ · 10 4 ½m 2=haâ · d½kg soil=m 3 â 
C soil = početna koncentracija u tlu [mg ·kg -1 ] 
A = koli čina primjene [kg · ha -1 ]; 1 = debljina sloja tla u polju [m]; d = suha nasipna 
gustoća tla [kg ·m -3 ] 
Iskustveno pravilo kaže da koli čina primjene od 1 kg · ha -1 rezultira koncen ­
tracijom u tlu od približno 1 mg · kg -1 u sloju od 10 cm (uz pretpostavku 
nasipne gusto će od 1 g· cm  -3 ).
 1.9.3.  Uzorkovanje i mjerenje  
U odgovaraju ćim vremenskim razmacima vade se po dvije paralelne 
tikvice i uzorci tla ekstrahiraju odgovaraju ćim otapalima razli čitog 
polariteta i analiziraju na ispitivanu tvar i/ili proizvode pretvorbe. 
Dobar plan istraživanja predvi đa dovoljan broj tikvica da se prilikom 
svakog uzorkovanja mogu žrtvovati po dvije tikvice. Osim toga, apsorpcijske otopine odnosno kruti apsorpcijski materijali se u različitim vremenskim razmacima (razmaci od 7 dana u prvom 
mjesecu, nakon prvog mjeseca u razmacima od 17 dana) tijekom 
inkubacije i na kraju inkubacije svakog uzorka tla uklanjaju i anali ­
ziraju na hlapljive proizvode. Uz uzorak tla koji se uzima nepo ­
sredno nakon primjene (uzorak 0. dana) treba predvidjeti još 
najmanje pet vremena uzorkovanja. Vremenske razmake treba odabrati na na čin da se mogu utvrditi obrasci razgradnje ispitivane 
tvari i obrasci tvorbe i razgradnje proizvoda pretvorbe (npr. 0, 1, 3, 7 
dana; 2, 3 tjedna, 1, 2, 3 mjeseca itd.).
 
Ako se koristi  14 C obilježena ispitivana tvar, neizlu čljiva radioak ­
tivnost se kvantificira izgaranjem i izra čuna bilanca mase za svaki 
interval uzorkovanja.  
U slučaju anaerobne inkubacije i inkubacije u uvjetima rižinog polja, 
faza tla i vodena faza se zajedno analiziraju na ispitivanu tvar i 
proizvode pretvorbe, ili se prije ekstrakcije i analize odvoje filtrira ­
njem ili centrifugiranjem.  
1.9.4.  Fakultativna ispitivanja  
Aerobna nesterilna istraživanja pri dodatnim temperaturama i vlažno ­
stima tla mogu biti korisna za procjenu utjecaja temperature i vlaž ­
nosti tla na brzinu pretvorbe ispitivane tvari i/ili njezinih proizvoda pretvorbe u tlu.
 
Neizlučljiva radioaktivnost može se pokušati detaljnije opisati npr. 
putem ekstrakcije superkriti čnim fluidima.  
2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Količine ispitivane tvari, proizvoda pretvorbe, hlapljivih tvari (samo 
u %) i neizlu čljivih tvari treba navesti u % primijenjene po četne 
koncentracije te, prema potrebi, u mg · kg -1 tla (na bazi suhe mase 
tla) za svaki interval uzorkovanja. Bilancu mase treba prikazati u postotku primijenjene po četne koncentracije za svaki interval uzor ­
kovanja. Grafi čki prikaz koncentracija ispitivane tvari u vremenu 
omogućit će procjenu vremena poluraspada pretvorbe odnosno 
DT
 50 . Potrebno je identificirati glavne proizvode pretvorbe i izraditi 
grafički prikaz njihovih koncentracija u ovisnosti o vremenu tako da 
bude vidljiva brzina njihove tvorbe i razgradnje. Glavni proizvod 
pretvorbe je bilo koji proizvod koji u bilo kojem trenutku tijekom istraživanja čini ≥ 10 % primijenjene doze.
 
Odvojeni hlapljivi proizvodi daju odre đeni uvid u potencijal hlaplji ­
vosti ispitivane tvari i njezinih proizvoda pretvorbe iz tla.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1300
 
Točnije određivanje vremena poluraspada odnosno vrijednosti DT  50 
i, prema potrebi, DT  75 i DT  90 trebalo bi se posti ći izračunima uz 
pomoć odgovaraju ćih kineti čkih modela. Vrijeme poluraspada i 
vrijednost DT  50 treba navesti zajedno s opisom primijenjenog 
modela, redom kinetike i koeficijentom determinacije (r  2 ). Prednost 
se daje kinetici prvog reda, osim ako je r  2 < 0,7. Te izra čune treba 
prema potrebi primijeniti i na glavne proizvode pretvorbe. Primjeri odgovaraju ćih modela opisani su u (31) do (35).
 
Ako se istraživanja za odre đivanje brzine provode na razli čitim 
temperaturama, brzine pretvorbe treba opisati kao funkciju tempera ­
ture unutar temperaturnog podru čja pokusa primjenom Arrheniu ­
sovog odnosa u obliku:  
k ¼ A · e ÄB=T sau lnk ¼ 1nA Ä B 
T 
gdje su ln A i B regresijske konstante odsje čka odnosno nagiba 
najboljeg pravca dobivenog linearnom regresijom ln k prema 1/T, k je konstanta brzine na temperaturi T i T je temperatura u kelvi ­
nima. Ako je pretvorba uvjetovana mikrobnom aktivnoš ću, treba 
voditi računa o ograni čenom temperaturnom podru čju u kojemu 
vrijedi Arrheniusov odnos.
 
2.2. VREDNOVANJE I TUMA ČENJE REZULTATA  
Iako se istraživanja provode u umjetnom laboratorijskom sustavu, 
rezultati omogu ćuju procjenu brzine pretvorbe ispitivane tvari te 
brzine tvorbe i razgradnje proizvoda pretvorbe u stvarnim uvjetima 
na terenu (36)(37).  
Istraživanje puta pretvorbe ispitivane tvari pruža informacije o 
načinu na koji se primijenjena tvar strukturno mijenja u tlu kemij ­
skim i mikrobnim reakcijama.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izvješće o ispitivanju mora sadržavati:  
ispitivana tvar:  
— uobičajeni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula 
(uz naznaku mjesta oznake odnosno oznaka ako se koristi radioaktivno obilježeni materijal) i relevantna fizikalno-kemijska svojstva,
 
— čistoća (nečistoće) ispitivane tvari,  
— radiokemijska čistoća obilježene kemikalije i molarna aktivnost 
(prema potrebi).  
Referentne tvari:  
— kemijski naziv i struktura referentnih tvari koje se koriste za 
opisivanje i/ili identifikaciju proizvoda pretvorbe.  
Ispitivana tla:  
— podaci o mjestu skupljanja,  
— datum i postupak uzorkovanja tla,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1301
 
— svojstva tla, kao što je pH, sadržaj organskog ugljika, tekstura (% 
pijeska, % praha, % gline), kapacitet izmjene kationa, nasipna 
gustoća, svojstvo zadržavanja vode i mikrobna biomasa,  
— vrijeme skladištenja tla i uvjeti skladištenja (ako se skladišti).  
Ispitni uvjeti:  
— datumi provedbe istraživanja,  
— primijenjena koli čina ispitivane tvari,  
— otapala i metoda primjene ispitivane tvari,  
— masa tla koja je obra đena na po četku istraživanja i koja je uzeta 
na analizu u svakom vremenu uzorkovanja,  
— opis primijenjenog inkubacijskog sustava,  
— brzine protoka zraka (samo kod proto čnih sustava),  
— pokusna temperatura,  
— sadržaj vlage u tlu za vrijeme inkubacije,  
— mikrobna biomasa na po četku, za vrijeme i na kraju aerobnih 
istraživanja,  
— pH, koncentracija kisika i redoks potencijal na po četku, za 
vrijeme i na kraju anaerobnih istraživanja i istraživanja u uvje ­
tima rižinog polja,  
— metoda(-e) ekstrakcije,  
— metode kvantifikacije i identifikacije ispitivane tvari i glavnih 
proizvoda pretvorbe u tlu i apsorpcijskim materijalima,  
— broj ponavljanja i broj kontrola.  
Rezultati:  
— rezultat odre đivanja mikrobne aktivnosti,  
— ponovljivost i osjetljivost primijenjenih analiti čkih metoda,  
— stope iskorištenja (postoci za valjano istraživanje navedeni su u 
odjeljku 1.7.1.),  
— tablice rezultata izraženih u % primijenjene po četne doze te, 
prema potrebi, u mg• kg  -1 tla (na bazi suhe mase),  
— bilanca mase za vrijeme i na kraju istraživanja,  
— opis neizlu čljive (vezane) radioaktivnosti odnosno ostataka u tlu,  
— kvantifikacija oslobo đenog CO  2 i drugih hlapljivih spojeva,  
— grafički prikazi koncentracija u tlu u ovisnosti o vremenu za 
ispitivanu tvar i, prema potrebi, za glavne proizvode pretvorbe,  
— vrijeme poluraspada odnosno DT  50 , DT  75 i DT  90 za ispitivanu 
tvar i, prema potrebi, za glavne proizvode pretvorbe, uklju čujući 
granice pouzdanosti,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1302
 
— procjena brzine abioti čke razgradnje u sterilnim uvjetima,  
— ocjena kinetike pretvorbe za ispitivanu tvar i, prema potrebi, za 
glavne proizvode pretvorbe,  
— predloženi putevi pretvorbe, prema potrebi.  
— rasprava i tuma čenje rezultata,  
4. REFERENCE  
(1) US – Environmental Protection Agency, (1982) Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(2) Agriculture Canada, (1987) Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) Europska Unija (EU), (1995) Direktiva Komisije 95/36/EZ od 
14. srpnja 1995. o izmjeni Direktive Vije ća 91/414/EEZ o stav ­
ljanju na tržište proizvoda za zaštitu biljaka Prilog II., Dio A i 
Prilog III., Dio A: Opstanak i ponašanje u okolišu.  
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides, (1995) Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA, (1986) Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
 
(6) ISO/DIS 11266-1, (1994) Soil Quality – Guidance on labora ­
tory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
 
(7) ISO 14239, (1997) Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralisation of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(8) SETAC, (1995) Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
(10) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(11) Guth, J.A., (1980) The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic 
Press, str. 123-157.  
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993) Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(16) Dodatak V. Direktivi 67/548/EEZ.  
(17) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986) Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(20) Methods of Soil Analysis (1982) Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994) Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
(22) Mückenhausen, E., (1975) Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P., (1975) Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H., (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial 
biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, str. 215-221.  
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997) Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method.  
(26) Anderson, J.P.E., (1987) Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.  
(27) Kato, Yasuhiro. (1998) Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Sympo ­
sium on Environmental Science of Pesticide, str. 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E., (1996) Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996) Effect of freeze and cold 
storage of soil on microbial activities and biomass. In Pestici ­
des, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Euro ­
pe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R., (1987) Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, str. 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975) Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, str. 141-146.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W., (1976) The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, str. 181-199.
 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W., (1975) Principles of pesticide degradation in soil. In 
„Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. 
Freed, Eds., str. 135-172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V., (1986) Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 
39, str. 188-204.
 
(35) Timme, G., Frehse, H., (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, str. 
47-60.  
(36) Gustafson D.I., Holden L.R., (1990) Non-linear pesticide 
dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, str. 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A., (1980) Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, str. 83-122.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1305
 
Dodatak 1.  
VODNI TLAK, POLJSKI KAPACITET (FC) I VODNI KAPACITET (WHC)  ( 1 ) 
Visina vodenog stupca 
[cm]  pF (  a ) bar (  b ) Napomene  
10 7 7 10  4 suho tlo  
1,6 · 10 4 4,2 16  to čka venuća 
10 4 4 10  
10 3 3 1  
6 · 10 2 2,8 0,6  
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
područje poljskog kapaciteta (  d ) 10 2 2 0,1  
60 1,8  0,06  
33 1,5  9 
>> > > > > > > > = 
>> > > > > > > > ; 0,033
 
10 1  0,01  WHC (aproksimacija)  
1 0  0,001  tlo zasi ćeno vodom  
( a ) pF = log cm vodenog stupca. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Odgovara približnom sadržaju vode od 10 % u pijesku, 35 % u ilova či i 45 % u glini. 
( d ) Poljski kapacitet nije stalan i kre će se izme đu pF 1,5 i 2,5 ovisno o vrsti tla.  
Vodni tlak  mjeri se u cm vodenog stupca ili barima. Zbog širokog raspona napona vlažnosti 
izražava se jednostavno kao vrijednost pF koja je istovjetna logaritmu cm vodenog stupca.  
Poljski kapacitet  definira se kao koli čina vode koju može pohraniti prirodno tlo protiv gravitacije 
dva dana nakon dužeg kišnog razdoblja ili nakon dostatnog navodnjavanja. Odre đuje se u nepore ­
mećenim tlima  in situ  u polju. Dakle, mjerenje nije primjenljivo u slu čaju poreme ćenih laboratorij ­
skih uzoraka tla. Vrijednosti FC odre đene u poreme ćenim tlima mogu pokazivati velike sustavne 
varijance.  
Vodni kapacitet  (WHC) odre đuje se u laboratoriju na neporeme ćenom i poreme ćenom tlu zasi će­
njem stupca tla vodom kapilarnim transportom. Posebno je koristan kod poreme ćenih tala i može 
biti i do 30 % viši od poljskog kapaciteta (1). Osim toga, pokusom ga je lakše odrediti nego 
pouzdane vrijednosti FC.  
Napomene:  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1306
 
Dodatak 2.  
SADRŽAJI VLAGE (g vode na 100 g suhog tla) U RAZLI ČITIM VRSTAMA TLA IZ 
RAZLIČITIH ZEMALJA  
Vrsta tla  Zemlja  Sadržaj vlage tla pri  
WHC (  1 ) pF = 1,8  pF = 2,5  
Pijesak  Njema čka 28,7  8,8  3,9  
Ilovasti pijesak  Njema čka 50,4  17,9  12,1  
Ilovasti pijesak  Švicarska  44,0  35,3  9,2  
Praškasta ilova ča Švicarska  72,8  56,6  28,4  
Glinasta ilova ča Brazil  69,7  38,4  27,3  
Glinasta ilova ča Japan  74,4  57,8  31,4  
Pjeskasta ilova ča Japan  82,4  59,2  36,0  
Praškasta ilova ča SAD  47,2  33,2  18,8  
Pjeskasta ilova ča SAD  40,4  25,2  13,3  
( 1 ) Vodni kapacitet.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1307
 
Dodatak 3.  
Slika 1.  
Primjer proto čne aparature za prou čavanje pretvorbe kemikalija u tlu  ( 1 ) ( 2 )
 
Slika 2.  
Primjer tikvice biometarskog tipa za prou čavanje pretvorbe kemikalija u tlu  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A., (1980) The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, str. 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, str. 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E., (1975) Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, str. 141-146.
 C.24.  AEROBNA I ANAEROBNA PRETVORBA U SUSTAVIMA 
VODENOG SEDIMENT A 
1. METODA  
Ova ispitna metoda odgovara smjernici OECD TG 308 (2002.).  
1.1. UVOD  
Kemikalije mogu u ći u plitke i duboke površinske vode razli čitim 
putevima, kao što je izravna primjena, rasap, otjecanje, ocje đivanje, 
odlaganje otpada, industrijske, komunalne i poljoprivredne otpadne vode ili atmosfersko taloženje. U ovoj ispitnoj metodi opisana je 
laboratorijska metoda za ocjenjivanje aerobne i anaerobne pretvorbe 
organskih kemikalija u sustavima vodenog sedimenta. Ona se temelji na postoje ćim smjernicama (1)(2)(3)(4)(5)(6). Na radionici OECD-a 
o odabiru tala/sedimenata održanoj u talijanskom Belgiratu 1995. (7) 
posebno su dogovoreni broj i vrste sedimenata koje će se koristiti u 
ovom testu. Osim toga, dane su preporuke u vezi sa skupljanjem, rukovanjem i skladištenjem uzoraka sedimenta na temelju smjernice ISO (8). Ovakva su istraživanja potrebna u slu čaju kemikalija koje se 
izravno primjenjuju u vodu odnosno koje bi mogle dospjeti u vodni 
okoliš gore navedenim putevima.
 
Uvjeti u prirodnim sustavima vodenog sedimenta često su aerobni u 
gornjoj vodenoj fazi. Površinski sloj sedimenta može biti aeroban ili 
anaeroban, dok je dublji sediment obi čno anaeroban. Kako bi se 
obuhvatile sve te mogu ćnosti, u ovom su dokumentu opisani 
aerobni i anaerobni testovi. Aerobni test simulira aerobni vodeni stupac iznad aerobnog sloja sedimenta koji je podložen anaerobnm 
gradijentom. Anaerobni test simulira potpuno anaerobni sustav 
voda-sediment. Ako okolnosti zahtijevaju da se zna čajno odstupi 
od tih preporuka, primjerice korištenjem netaknutih sedimentnih jezgri ili sedimenata koji su možda ve ć bili izloženi ispitivanoj 
tvari, za to su raspoložive druge metode (9).
 
1.2. DEFINICIJE  
U svakom slu čaju treba koristiti jedinice Me đunarodnog sustava 
jedinica (SI).  
Ispitivana tvar: bilo koja tvar, bilo polazni spoj ili relevantni proiz ­
vodi pretvorbe.  
Proizvodi pretvorbe: sve tvari koje nastaju u bioti čkim i abioti čkim 
reakcijama pretvorbe ispitivane tvari, uklju čujući CO  2 i vezane 
ostatke.  
Vezani ostaci: „vezani ostaci” predstavljaju spojeve u tlu, biljki ili 
životinji koji nakon ekstrakcija ostaju u matrici u obliku polazne tvari ili njezinog(-ih) metabolita. Metoda ekstrakcije ne smije znatno promijeniti same spojeve niti strukturu matrice. Vrsta veze 
može se djelomi čno razjasniti ekstrakcijskim metodama koje mije ­
njaju matricu i sofisticiranim analiti čkim tehnikama. Do sada su na 
taj način utvrđene npr. kovalentne ionske i sorpcijske veze te ukla ­
panja. Op ćenito, tvorba vezanih ostataka zna čajno smanjuje biodo ­
stupnost i bioraspoloživost (10) (prilago đeno na temelju IUPAC-a 
1984. (11)).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1309
 
Aerobna pretvorba: (oksidacijska): reakcije koje se odvijaju u prisut ­
nosti molekularnog kisika (12).  
Anaerobna pretvorba: (redukcijska): reakcije koje se odvijaju bez 
pristupa molekularnog kisika (12).  
Prirodne vode: površinske vode dobivene iz jezeraca, rijeka, potoka 
itd. 
Sediment: mješavina mineralnih sastojaka i organsko-kemijskih 
sastojaka koji sadrže spojeve velike molekulske mase s visokim sadržajem ugljika i dušika. Nastaje taloženjem iz vode i čini 
sučelje s vodom.
 
Mineralizacija: potpuna razgradnja organskog spoja u CO  2 i H 2 O u 
aerobnim uvjetima i CH  4 , CO  2 i H  2 O u anaerobnim uvjetima. Ako 
se u kontekstu ove ispitne metode koristi radioaktivno obilježeni 
spoj, mineralizacija zna či opsežnu razgradnju molekule tijekom 
koje se obilježeni atom ugljika kvantitativno oksidira ili reducira uz otpuštanje odgovaraju će količine
 14 CO 2 odnosno  14 CH 4 . 
Vrijeme poluraspada, t  0,5 : vrijeme koje je potrebno za 50 %-tnu 
pretvorbu ispitivane tvari, ako se pretvorba može opisati kinetikom 
prvog reda; ono je neovisno o po četnoj koncentraciji.  
DT 50 (vrijeme nestajanja 50): vrijeme u kojemu se po četna koncen ­
tracija ispitivane tvari smanji za 50 %.  
DT 75 (VRIJEME NESTAJANJA 75): VRIJEME U KOJEMU SE 
POČETNA KONCENTRACIJA ISPITIVANE TVARI SMANJI 
ZA 75 %.  
DT 90 (vrijeme nestajanja 90): vrijeme u kojemu se po četna koncen ­
tracija ispitivane tvari smanji za 90 %.  
1.3. REFERENTNE TVARI  
Referentne tvari treba koristiti za identifikaciju i kvantifikaciju proiz ­
voda pretvorbe spektroskopskim i kromatografskim metodama.  
1.4. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Za mjerenje brzine pretvorbe mogu se koristiti neobilježene ispiti ­
vane tvari i ispitivane tvari obilježene radioaktivnim izotopom, s time da se prednost daje obilježenom materijalu. Za prou čavanje 
puta pretvorbe i utvr đivanje bilance mase potreban je obilježeni 
materijal. Preporu čuje se
 14 C obilježavanje, ali korisna je i primjena 
drugih izotopa, kao što su  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Ako je to mogu će, 
oznaku treba staviti na najstabilni dio odnosno dijelove molekule (  1 ). 
Kemijska i/ili radiokemijska čistoća ispitivane tvari treba biti 
najmanje 95 %.  
Prije ispitivanja trebaju biti raspoložive sljede će informacije o ispi ­
tivanoj tvari:  
(a) topljivost u vodi (metoda A.6.);  
(b) topljivost u organskim otapalima;  
(c) tlak pare (metoda A.4.) i konstanta Henryjevog zakona;  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1310  
( 1 ) Primjerice, ako tvar sadrži jedan prsten, oznaka se mora staviti na taj prsten; ako ispi ­
tivana tvar sadrži dva ili više prstenova, ponekad je potrebno provesti posebna istraži ­
vanja kako bi se ocijenila sudbina svakog obilježenog prstena i dobile potrebne infor ­
macije o nastajanju proizvoda pretvorbe.
 (d) podjelni koeficijent n-oktanol/voda (metoda A.8.);  
(e) koeficijent adsorpcije (K  d , K  f ili K  oc, prema potrebi) (metoda 
C.18.);  
(f) hidroliza (metoda C.7.);  
(g) konstanta disocijacije (pK  a ) (smjernica OECD 112) (13);  
(h) kemijska struktura ispitivane tvari i položaj izotopne oznake 
odnosno oznaka (prema potrebi).  
Napomena:  treba navesti temperaturu na kojoj su provedena ta 
mjerenja.  
Osim toga, korisno je imati podatke o toksi čnosti ispitivane tvari za 
mikroorganizme, podatke o lakoj i/ili svojstvenoj biorazgradivosti i 
podatke o aerobnoj i anaerobnoj pretvorbi u tlu.  
Trebaju biti raspoložive analiti čke metode (uklju čujući metodu 
ekstrakcije i pro čišćavanja) za identifikaciju i kvantifikaciju ispiti ­
vane tvari i njezinih proizvoda pretvorbe u vodi i sedimentu (vidjeti odjeljak 1.7.2.).
 
1.5. NA ČELO ISPITNE METODE  
U metodi koja je ovdje opisana koristi se sustav aerobnog i anae ­
robnog vodenog sedimenta (vidjeti Dodatak 1.) koji omogu ćuje: 
mjerenje brzine pretvorbe ispitivane tvari u sustavu voda-sediment,  
mjerenje brzine pretvorbe ispitivane tvari u sedimentu,  
mjerenje brzine mineralizacije ispitivane tvari i/ili proizvoda pret ­
vorbe (ako se koristi  14 C obilježena ispitivana tvar),  
identifikaciju i kvantifikaciju proizvoda pretvorbe u vodenoj i sedi ­
mentnoj fazi, uklju čujući bilancu mase (ako se koristi obilježena 
ispitivana tvar),  
mjerenje razdiobe ispitivane tvari i njezinih proizvoda pretvorbe 
između dviju faza u razdoblju inkubacije u mraku (npr. kako bi se 
izbjeglo cvjetanje algi) na stalnoj temperaturi. Ako podaci na to upućuju, odre đuju se vremena poluraspada, vrijednosti DT
 50 , DT  75 
i DT  90 , ali se ne smiju ekstrapolirati daleko izvan pokusnog 
razdoblja (vidjeti odjeljak 1.2.).  
Potrebna su najmanje dva sedimenta i pripadaju ća voda, kako za 
aerobna tako i za anaerobna istraživanja (7). Ipak, ponekad je potrebno koristiti više od dva vodena sedimenta, primjerice kod 
kemikalija koje mogu biti prisutne u slatkovodnoj i/ili morskoj 
sredini.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1311
 
1.6. PRIMJENLJIVOST TESTA  
Metoda se op ćenito može primijeniti na sve kemikalije (neobilježene 
i obilježene) za koje je raspoloživa dovoljno to čna i osjetljiva anali ­
tička metoda. Ona se može primijeniti na blago hlapljive i nehla ­
pljive spojeve kao i na vodotopljive spojeve i spojeve koji su slabo 
topljivi u vodi. Ovaj test ne treba primjenjivati u slu čaju kemikalija 
koje su jako hlapljive iz vode (npr. fumiganti, organska otapala) te se stoga ne mogu zadržati u vodi i/ili sedimentu u pokusnim uvjetima 
ovog testa.
 
Metoda je do sada korištena za prou čavanje pretvorbe kemikalija u 
slatkim vodama i sedimentima, ali se u na čelu može primijeniti i na 
estuarijske/morske sustave. Nije prikladna za simulaciju uvjeta u tekućicama (npr. rijeke) ili otvorenom moru.
 
1.7. KRITERIJI KAKVO ĆE 
1.7.1.  Iskorištenje  
Prve naznake ponovljivosti analiti čke metode i uspješnosti jednolike 
primjene ispitivane tvari mogu se dobiti ekstrakcijom i analizom 
najmanje dva paralelna uzorka vode i sedimenta neposredno nakon 
dodavanja ispitivane tvari. Iskorištenja u kasnijim fazama pokusa proizlaze iz odgovaraju ćih bilanci mase (ako se koristi obilježeni 
materijal). Iskorištenje se treba kretati u podru čju od 90 % do 
110 % kod obilježenih kemikalija (6) i od 70 % do 110 % kod 
neobilježenih kemikalija.
 
1.7.2.  Ponovljivost i osjetljivost analiti čke metode  
Ponovljivost analiti čke metode (bez po četne učinkovitosti ekstrak ­
cije) kod kvantifikacije ispitivane tvari i proizvoda pretvorbe može 
se provjeriti dvostrukom analizom istog ekstrakta uzoraka vode 
odnosno sedimenta koji su inkubirani dovoljno dugo da nastanu proizvodi pretvorbe.
 
Granica detekcije (limit of detection, LOD) analiti čke metode za 
ispitivanu tvar i proizvode pretvorbe treba biti najmanje 0,01 mg· kg
 -1 u vodi odnosno sedimentu (kao ispitivana tvar) ili 1 % 
početne količine primijenjene na ispitni sustav, ovisno o tome što 
je manje. Tako đer je potrebno navesti granicu kvantifikacije (limit of 
quantification, LOQ).  
1.7.3.  To čnost podataka o pretvorbi  
Regresijska analiza koncentracija ispitivane tvari kao funkcije 
vremena daje odgovaraju će informacije o to čnosti krivulje pretvorbe 
i omogućuje izračun granica pouzdanosti za vremena poluraspada (u 
slučaju primjene kinetike pseudoprvog reda) odnosno vrijednosti 
DT 50 i, prema potrebi, DT  75 i DT  90 . 
1.8. OPIS METODE  
1.8.1.  Ispitni sustav i aparatura  
Istraživanje se provodi u staklenim posudama (npr. boce, epruvete za 
centrifugiranje), osim ako preliminarne informacije (kao što je 
podjelni koeficijent n-oktanol-voda, podaci o sorpciji itd.) ukazuju na to da ispitivana tvar prianja na staklo, u kom slu čaju treba 
razmisliti o alternativnom materijalu (kao što je teflon). Ako je 
poznato da ispitivana tvar prianja na staklo, problem se može ublažiti 
primjenom jedne ili više sljede ćih metoda:
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1312
 
— određivanje mase ispitivane tvari i proizvoda pretvorbe sorbiranih 
na staklo,  
— pranje svog staklenog posu đa otapalom na kraju ispitivanja,  
— korištenje formuliranih proizvoda (vidjeti i odjeljak 1.9.2.),  
— korištenje ve će količine pomo ćnog otapala za dodavanje ispiti ­
vane tvari u sustav; ako se koristi pomo ćno otapalo, to treba biti 
otapalo koje ne solvolizira ispitivanu tvar.  
Primjeri tipi čne ispitne aparature tj. plinski proto čni sustav i sustav 
biometarskog tipa prikazani su u Dodatku 2. odnosno 3. (14). Drugi 
korisni inkubacijski sustavi opisani su u literaturi (15). Pokusna aparatura treba omogu ćavati izmjenu zraka odnosno dušika i odva ­
janje hlapljivih proizvoda. Dimenzije aparature moraju zadovoljavati 
zahtjeve ispitivanja (vidjeti odjeljak 1.9.1.). Zra čenje se može posti ći 
nježnim upuhivanjem ili prevo đenjem zraka odnosno dušika preko 
površine vode. U ovom posljednjem slu čaju preporu čuje se nježno 
miješati vodu odozgora radi bolje razdiobe kisika odnosno dušika u 
vodi. Ne smije se koristiti zrak bez CO
 2 jer on može dovesti do 
povećanja pH vrijednosti vode. U svakom slu čaju, reme ćenje sedi­
menta nepoželjno je i treba ga što je mogu će više izbjegavati. Blago 
hlapljive kemikalije treba ispitati u sustavu biometarskog tipa uz 
nježno miješanje vodene površine. Mogu se koristiti i zatvorene 
posude u kojima je prostor iznad uzroka ispunjen atmosferskim zrakom ili dušikom, unutar kojih su smještene bo čice za odvajanje 
hlapljivih proizvoda (16). Kod aerobnog ispitivanja potrebno je 
osigurati redovitu izmjenu plina iznad uzorka kako bi se kompenzi ­
rala potrošnja kisika biomase.
 
Prikladni odvaja či za skupljanje hlapljivih proizvoda pretvorbe su, 
između ostaloga, otopine kalijevog hidroksida ili natrijevog hidro ­
ksida (1 mol · dm  -3 ) za ugljikov dioksid (  1 ) i etilenglikol, etanolamin 
ili 2 %-tni parafin u ksilenu za organske spojeve. Hlapljive tvari koje nastaju u anaerobnim uvjetima, kao što je metan, mogu se primjerice skupljati na molekulskim sitima. Te se hlapljive tvari mogu npr. 
sagorjeti u CO
 2 provođenjem plina kroz kremenu cjev čicu napunjenu 
CuO na temperaturi od 900 °C i odvajanjem nastalog CO  2 u apsor­
beru s lužinom (17).  
Potrebni su laboratorijski instrumenti za kemijsku analizu ispitivane 
tvari i proizvoda pretvorbe (npr. plinsko-teku ćinska 
kromatografija (GLC), teku ćinska kromatografija visoke 
djelotvornosti (HPLC), tankoslojna kromatografija (TLC), spektro ­
skopija masa (MS), plinska kromatografija – spektroskopija masa 
(GC-MS), teku ćinska kromatografija – spektrometrija masa (LC- 
MS), nuklearna magnetska rezonanca (NMR) itd.), uklju čujući odgo­
varajuće detektcijske sustave za radioaktivno obilježene i neobilje ­ 
žene kemikalije. Ako se koristi radioaktivno obilježeni materijal, 
također je potreban teku ćinski scintilacijski broja č i oksidacijsko 
sredstvo (za izgaranje uzoraka sedimenta prije analize radioaktiv ­
nosti).  
Prema potrebi treba koristiti i drugu standardnu laboratorijsku 
opremu za fizikalno-kemijska i biološka odre đivanja (vidjeti odjeljak 
1.8.2.2. tablicu 1.), stakleno posu đe, kemikalije i reagense.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1313  
( 1 ) Budući da ove lužnate apsorpcijske otopine tako đer apsorbiraju ugljikov dioksid iz 
ventilacijskog zraka kao i ugljikov dioksid nastao disanjem u aerobnim pokusima, one 
se moraju redovito mijenjati kako bi se izbjeglo zasi ćenje, a time i gubitak njihove 
apsorpcijske sposobnosti.
 1.8.2.  Odabir i broj vodenih sedimenata  
Mjesta uzorkovanja treba odabrati u skladu sa svrhom ispitivanja. 
Kod odabira mjesta uzorkovanja treba uzeti u obzir mogu ću povijest 
unosa materijala iz poljoprivrede, industrije i ku ćnanstava u sliv i 
vode uzvodno. Sedimenti se ne smiju koristiti ako su u posljednje 
četiri godine one čišćeni ispitivanom tvari ili njezinim strukturnim 
analozima.  
1.8.1.2.  Odabir sedimenata  
Kod aerobnih se istraživanja uglavnom koriste dva sedimenta (7). 
Dva odabrana sedimenta trebaju biti razli čita s obzirom na sadržaj 
organskog ugljika i teksturu. Jedan sediment treba imati visok 
sadržaj organskog ugljika (2,5–7,5 %) i finu teksturu, a drugi sedi ­
ment treba imati nizak sadržaj organskog ugljika (0,5–2,5 %) i grubu 
teksturu. Razlika u sadržaju organskog ugljika u pravilu treba biti 
najmanje 2 %. „Fina tekstura” je definirana kao sadržaj (glina + prah) (
 1 ) > 50 %, a „gruba tekstura” kao sadržaj (glina + prah) 
< 50 %. Razlika u sadržaju (glina + prah) izme đu dva sedimenta 
treba u pravilu biti najmanje 20 %. Ako kemikalija može dospjeti 
i u morske vode, barem jedan sustav voda-sediment treba biti morskog podrijetla.
 
Kod strogo anaerobnog istraživanja treba uzeti dva uzorka sedimenta 
(uključujući pripadaju ću vodu) iz anaerobnih zona površinskih 
vodnih cjelina (7). Sedimentnom i vodenom fazom treba pažljivo rukovati i pažljivo ih prenositi bez pristupa kisika.
 
Za odabir sedimenata mogu biti važni i drugi parametri, koje treba 
uzeti u obzir ovisno o slu čaju. Primjerice, podru čje pH vrijednosti 
sedimenata važno je kod ispitivanja kemikalija kod kojih pretvorba i/ili sorpcija ovisi o pH. Ovisnost sorpcije o pH može se o čitovati u 
vrijednosti pK
 a ispitivane tvari.  
1.8.2.2.  Opisivanje uzoraka voda-sediment  
Pregled klju čnih parametara za vodu i sediment koje treba mjeriti i 
navesti u izvješ ću (s uputom na primijenjenu metodu) dan je u tablici 
u nastavku zajedno s fazom ispitivanja u kojoj se ti parametri odre ­ 
đuju. Informacije o metodama za odre đivanje tih parametara mogu se 
pronaći u referencama (18)(19)(20)(21).  
Osim toga, u pojedinim je slu čajevima potrebno izmjeriti i navesti i 
druge parametre (npr. za slatke vode: čestice, alkalitet, tvrdo ća, 
vodljivost, NO  3 /PO  4 (omjer i pojedina čne vrijednosti); za sedimente: 
kapacitet izmjene kationa, vodni kapacitet, karbonat, ukupni dušik i 
fosfor; za morske sustave: salinitet). Kod ocjenjivanja redoks uvjeta, posebno kod anaerobne pretvorbe, tako đer je korisno napraviti 
analizu sedimenata i vode na nitrat, sulfat, bioraspoloživo željezo i 
moguće druge akceptore elektrona.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1314  
( 1 ) (Glina + prah) je mineralna frakcija sedimenta veli čine čestica < 50 μm.
 Mjerenje parametara za opisivanje uzoraka voda-sediment (7)(22)(23)  
Parametar  Faza ispitnog postupka  
uzorkovanje 
na terenu  rukovanje  početak 
aklimatiza ­
cije početak 
ispitivanja  tijekom 
ispitivanja  kraj ispiti ­
vanja  
Voda  
Podrijetlo/izvor  x  
Temperatura  x  
pH x  x  x  x  x  
TOC  x  x  x  
Koncentracija O  2 * x  x  x  x  x  
Redoks potencijal*  x  x  x  x  
Sediment  
Podrijetlo/izvor  x  
Dubina sloja  x  
pH x  x  x  x  x  
Razdioba veli čina čestica  x  
TOC  x  x  x  x  
Mikrobna biomasa (*)  x  x  x  
Redoks potencijal (**)  Proma ­
tranje 
(boja/ 
miris)  x x  x  x  
(*) Metoda stope mikrobnog disanja (26), metoda fumigacije (27) ili brojenje na plo čama (npr. bakterije, aktinomicete, 
gljivice i ukupne kolonije) kod aerobnih istraživanja; brzina metanogeneze kod anaerobnih istraživanja. 
(**) Noviji rezultati istraživanja pokazuju da mjerenja koncentracije kisika u vodi i redoks potencijala nemaju mehani ­
stičku niti prognosti čku vrijednost za rast i razvoj mikrobnih populacija u površinskim vodama (24)(25). Odre đivanje 
biokemijske potrošnje kisika (BPK) (kod uzorkovanja na terenu, na po četku i kraju ispitivanja) i koncentracija mikro/ 
makronutrijenata Ca, Mg i Mn (na po četku i kraju ispitivanja) u vodi te mjerenje ukupnog N i ukupnog P u 
sedimentima (kod uzorkovanja na terenu i na kraju ispitivanja) mogu biti bolji alati za tuma čenje i ocjenjivanje 
brzina i puteva aerobne biološke pretvorbe.  
1.8.3.  Skupljanje, rukovanje i skladištenje  
1.8.3.1.  Skupljanje  
Kod uzorkovanja sedimenta treba koristiti nacrt smjernice ISO o 
uzorkovanju sedimenta s dna (8). Uzorke sedimenata treba uzeti iz čitavoga gornjeg sloja sedimenta debljine od 5 do 10 cm. Pripada ­
juću vodu treba uzeti na istoj lokaciji odnosno mjestu i u isto vrijeme 
kad i sediment. Kod anaerobnih istraživanja sedimente i pripadaju ću 
vodu treba uzorkovati i prenositi bez pristupa kisika (28) (vidjeti odjeljak 1.8.2.1.). Neki ure đaji za uzorkovanje opisani su u literaturi 
(8)(23).
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1315
 
1.8.3.2.  Rukovanje  
Sediment se odvoji od vode filtriranjem i mokro prosije kroz 2- 
milimetarsko sito koriste ći višak vode s mjesta uzorkovanja, koja 
se nakon tog baca. Zatim se poznate koli čine sedimenata i vode 
pomiješaju u željenom omjeru (vidjeti odjeljak 1.9.1.) u inkubacij ­
skim tikvicama i pripreme za aklimatizaciju (vidjeti odjeljak 1.8.4.). Kod anaerobnih istraživanja sva se rukovanja trebaju odvijati bez pristupa kisika (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3.  Skladištenje  
U svakom se slu čaju preporu čuje korištenje svježe skupljenih 
uzoraka sedimenta i vode; me đutim, ako je skladištenje nužno, sedi ­
ment i vodu treba prosijati na na čin kako je opisano gore i zajedno 
uskladištiti (sediment mora biti natopljen vodom, sloj vode 6–10 cm) 
u mraku na 4 ± 2 °C  4 najduže četiri tjedna (7)(8)(23). Uzorke koji se 
koriste u aerobnim istraživanjima treba pohraniti uz slobodan dotok zraka (npr. u otvorenim spremnicima), dok se uzorci za anaerobna istraživanja skladište bez pristupa kisika. Sediment i voda se tijekom 
prijenosa i skladištenja ne smiju zamrznuti i ne smije do ći do isuši ­
vanja sedimenta.
 
1.8.4.  Priprema uzoraka sediment/voda za ispitivanje  
Prije dodavanja ispitivane tvari treba provesti aklimatizaciju, pri 
čemu svaki uzorak sediment/voda treba smjestiti u inkubacijsku 
posudu koja će se koristiti u glavnom ispitivanju; aklimatizacija se 
mora odvijati u potpuno istim uvjetima kao inkubacija za vrijeme 
ispitivanja (vidjeti odjeljak 1.9.1.). Razdoblje aklimatizacije je vrijeme potrebno da se postigne potrebna stabilnost sustava, na što ukazuje pH, koncentracija kisika u vodi, redoks potencijal sedimenta 
i vode i makroskopsko odvajanje faza. Razdoblje aklimatizacije u 
pravilu treba trajati izme đu jednog i dva tjedna i ne smije biti duže 
od četiri tjedna. Rezultate odre đivanja provedenih u tom razdoblju 
treba navesti u izvješ ću o ispitivanju.
 
1.9. PROVO ĐENJE ISPITIVANJA  
1.9.1.  Ispitni uvjeti  
Ispitivanje se provodi u aparaturi za inkubaciju (vidjeti odjeljak 
1.8.1.) uz omjer volumena vode i sedimenta izme đu 3:1 i 4:1 i 
sloj sedimenta od 2,5 cm (± 0,5 cm). (  1 ) Preporu čuje se korištenje 
najmanje 50 g sedimenta (na bazi suhe mase) po inkubacijskoj posudi.
 
Ispitivanje se provodi u mraku na stalnoj temperaturi u podru čju od 
10 do 30 C°. Prikladna je temperatura (20 ± 2)°C. U pojedinim slučajevima, ovisno o informacijama koje treba pribaviti ispitiva ­
njem, može se uvesti još jedna, niža temperatura (npr. 10 C°). 
Temperaturu inkubacije treba pratiti i dokumentirati.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1316  
( 1 ) Novija istraživanja pokazuju da skladištenje na 4 °C može dovesti do smanjenja sadržaja 
organskog ugljika u sedimentu, što može rezultirati smanjenjem mikrobne aktivnosti 
(34).
 1.9.2.  Obrada i primjena ispitivane tvari  
Koristi se jedna ispitna kocentracija kemikalije (  1 ). U slučaju sred­
stava za zaštitu bilja koja se primjenjuju izravno u vodne cjeline, treba koristiti najvišu dozu navedenu na etiketi kao maksimalnu 
količinu primjene, koju treba prera čunati s obzirom na površinu 
vode u ispitnoj posudi. U svim drugim slu čajevima treba koristiti 
koncentraciju na temelju predvi đanja iz emisija u okoliš. Treba voditi 
računa da koncentracija ispitivane tvari bude dovoljna za opisivanje 
puta pretvorbe i tvorbe i razgradnje proizvoda pretvorbe. Ponekad je 
potrebno primijeniti i više doze (npr. 10 puta više), ako se na početku istraživanja koncentracije ispitivane tvari nalaze u blizini 
granica detekcije i/ili ako se glavni proizvodi pretvorbe koji čine 
10 % koli čine primjene ispitivane tvari teško utvr đuju. Ipak, ako 
se koriste više ispitne koncentracije, one ne smiju imati zna čajan 
štetni učinak na mikrobnu aktivnost sustava voda-sediment. Da bi 
se postigla stalna koncentracija ispitivane tvari u posudama razli čitih 
dimenzija, u pojedinim je slu čajevima preporu čljivo prilagoditi koli ­ 
činu tvari na temelju dubine vodenog stupca u posudi u odnosu na 
dubinu vode na terenu (za koju se uzima da iznosi 100 cm, ali mogu 
se koristiti i druge dubine). Za primjer izra čuna vidjeti Dodatak 4.
 
U idealnom slu čaju ispitivanu tvar treba dodati u vodenu fazu 
ispitnog sustava u obliku vodene otopine. Uporaba malih koli čina 
otapala mješljivih s vodom (kao što je aceton, etanol) dopuštena je 
ako je to nužno za primjenu i razdiobu ispitivane tvari, ali njihova koncentracija ne smije biti viša od 1 % v/v i ona ne smiju imati štetni učinak na mikrobnu aktivnost ispitnog sustava. Vodenu 
otopinu ispitivane tvari treba pažljivo pripremiti – u odgovaraju ćim 
slučajevima treba razmisliti o korištenju generatorskih kolona ili 
prethodnom miješanju kako bi se osigurala potpuna homogenost. Nakon dodavanja vodene otopine u ispitni sustav preporu čuje se 
nježno miješanje vodene faze uz što manje reme ćenja sedimenta.
 
Uporaba formuliranih proizvoda se u pravilu ne preporu čuje, budu ći 
da sastojci formulacije mogu utjecati na razdiobu ispitivane tvari i/ili 
proizvoda pretvorbe izme đu vodene i sedimentne faze. Ipak, kod 
ispitivanih tvari koje su slabo topljive u vodi uporaba formuliranog materijala može biti prikladna alternativa.
 
Broj inkubacijskih posuda ovisi o broju vremena uzorkovanja (vidjeti 
odjeljak 1.9.3.). Treba predvidjeti dovoljan broj ispitnih sustava kako bi se kod svakog uzorkovanja mogla žrtvovati po dva sustava. Ako se koriste kontrolne jedinice za svaki vodeni sediment, one se ne 
obrađuju ispitivanom tvari. Kontrolne jedinice mogu se koristiti za 
određivanje mikrobne biomase sedimenta i ukupnog organskog 
ugljika vode i sedimenta na kraju istraživanja. Dvije kontrolne jedi ­
nice (tj. po jedna za svaki vodeni sediment) mogu se koristiti za 
praćenje traženih parametara u sedimentu i vodi u razdoblju aklima ­
tizacije (vidjeti tablicu u odjeljku 1.8.2.2.). Ako se ispitivana tvar primjenjuje uz pomo ć otapala, potrebno je uvesti dvije dodatne 
kontrolne jedinice za mjerenje štetnih u činaka na mikrobnu aktivnost 
ispitnog sustava.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1317  
( 1 ) Ispitivanje s drugom koncentracijom može biti korisno kod kemikalija koje dospijevaju u 
površinske vode razli čitim putevima te zbog nastaju zna čajne razlike u koncentracijama, 
ali samo ako se donja koncentracija može analizirati s dostatnom to čnošću.
 1.9.3.  Trajanje ispitivanja i uzorkovanje  
Pokus u pravilu ne bi smio trajati duže od 100 dana (6), a treba ga 
provoditi dok se ne utvrdi put razgradnje i obrazac razdiobe voda/ sediment odnosno dok se 90 % ispitivane tvari ne izgubi pretvorbom 
i/ili hlapljenjem. Treba predvidjeti najmanje šest vremena uzorko ­
vanja (uklju čujući nulto vrijeme), a fakultativno se može provesti i 
preliminarno istraživanje (vidjeti odjeljak 1.9.4.) radi utvr đivanja 
odgovaraju ćeg režima uzorkovanja i trajanja ispitivanja, osim ako 
o ispitivanoj tvari ve ć ima dovoljno podataka iz ranijih istraživanja. 
Kod ispitivanja hidrofobnih tvari ponekad je potrebno uvesti dodatna uzorkovanja u po četnoj fazi istraživanja kako bi se odredila stopa 
razdiobe izme đu vodene faze i faze sedimenta.
 
U odgovaraju ćim vremenima uzorkovanja uzimaju se na analizu 
čitave inkubacijske posude (s ponavljanjima). Sediment i voda 
iznad sedimenta analiziraju se odvojeno (  1 ). Površinsku vodu treba 
pažljivo ukloniti uz minimalno reme ćenje sedimenta. Prilikom 
ekstrakcije i opisivanja ispitivane tvari i proizvoda pretvorbe treba primjenjivati odgovaraju će analitičke postupke. Osim toga, treba 
paziti da se ukloni materijal adsorbiran na inkubacijsku posudu ili 
spojne cijevi koje služe za hvatanje hlapljivih tvari.
 
1.9.4.  Fakultativno preliminarno ispitivanje  
Ako se trajanje i režim uzorkovanja ne mogu procijeniti na temelju 
drugih relevantnih istraživanja o ispitivanoj tvari, treba razmisliti o 
provedbi fakultativnog preliminarnog ispitivanja, koje se provodi u 
istim ispitnim uvjetima kao glavno istraživanje. Ako se provodi preliminarno ispitivanje, treba ukratko navesti odgovaraju će 
pokusne uvjete i rezultate ispitivanja.
 
1.9.5.  Mjerenja i analiza  
Kod svakog uzorkovanja treba izmjeriti i navesti koncentraciju ispi ­
tivane tvari i proizvoda pretvorbe u vodi i sedimentu (kao koncen ­
tracija i kao postotak primijenjene doze). Op ćenito, treba identifici ­
rati proizvode pretvorbe koji u bilo kojem vremenu uzorkovanja 
pokazuju ≥ 10 % primijenjene radioaktivnosti u čitavom sustavu 
voda-sediment, osim ako postoje opravdani razlozi da se to ne učini. Tako đer treba razmisliti o identifikaciji proizvoda pretvorbe 
čije se koncentracije stalno pove ćavaju tijekom istraživanja, čak i 
ako njihove koncentracije ne prelaze gore spomenute granice, 
budući da to može ukazivati na njihovu postojanost. O tome treba 
odlučiti ovisno o slu čaju i u izvješ ću navesti odgovaraju će obrazlo ­ 
ženje.
 
Potrebno je navesti rezultate iz sustava za odvajanje plinova/hla ­
pljivih tvari (CO  2 i drugi tj. hlapljivi organski spojevi) u svakom 
vremenu uzorkovanja. Treba navesti brzine mineralizacije. Osim 
toga, treba navesti neizlu čljive (vezane) ostatke u svakom vremenu 
uzorkovanja.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1318  
( 1 ) U slučajevima kad može do ći do brze reoksidacije proizvoda anaerobne pretvorbe, za 
vrijeme uzorkovanja i analize treba održavati anaerobne uvjete.
 2. PODACI  
2.1. OBRADA REZULTATA  
Za svako vrijeme uzorkovanja treba izra čunati ukupnu bilancu mase 
ili iskorištenje (vidjeti odjeljak 1.7.1.) dodane radioaktivnosti. Rezul ­
tate treba navesti kao postotak dodane radioaktivnosti. Osim toga, treba navesti razdiobu radioaktivnosti izme đu vode i sedimenta kao 
koncentraciju i postotak u svakom vremenu uzorkovanja.
 
Treba izra čunati vrijeme poluraspada, DT  50 te, prema potrebi, DT  75 i 
DT 90 ispitivane tvari, zajedno s granicama pouzdanosti (vidjeti odje ­
ljak 1.7.3.). Podaci o gubicima ispitivane tvari u vodi i sedimentu mogu se dobiti primjenom odgovaraju ćih alata za ocjenjivanje. Ti 
alati mogu biti vrlo razli čiti, od kinetike pseudoprvog reda i tehnika 
empirijskog prilago đavanja krivulje uz primjenu grafi čkih i numeri ­ 
čkih rješenja do složenijih prora čuna npr. uz primjenu jednodjelnih i 
višedjelnih modela. Dodatne informacije mogu se prona ći u rele­
vantnoj literaturi (35)(36)(37).
 
Svi pristupi imaju prednosti i nedostatke i znatno se razlikuju prema 
složenosti. Pretpostavka kinetike prvog reda može zna čiti pretjerano 
pojednostavnjivanje procesa razgradnje i razdiobe, ali tamo gdje je moguća daje vrijednost (konstanta brzine ili vrijeme poluraspada) 
koja je lako razumljiva i od zna čaja za simulacijsko modeliranje i 
izračune predvi đenih koncentracija u okolišu. Empirijskim pristu ­
pima i linearnim transformacijama može se posti ći bolje prilago đa­
vanje krivulja podacima, a time i bolja procjena vremena polura ­
spada, vrijednosti DT
 50 te, prema potrebi, DT  75 i DT  90 . Ipak, 
primjena tih izvedenih konstanti ograni čena je. Modeli s odjeljcima 
mogu dati niz korisnih konstanti zna čajnjih za ocjenjivanje rizika 
koje opisuju brzinu razgradnje u razli čitim odjeljcima i razdiobu 
kemikalije. Njih tako đer treba koristiti za procjenu konstanti brzine 
tvorbe i razgradnje glavnih proizvoda pretvorbe. U svakom slu čaju, 
odabranu metodu treba obrazložiti i izvo đač pokusa treba grafi čki 
i/ili statisti čki dokazati valjanost podudaranja.  
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće mora sadržavati sljede će informacije:  
ispitivana tvar:  
— uobičajeni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula 
(uz naznaku mjesta oznake odnosno oznaka ako se koristi 
radioaktivno obilježeni materijal) i relevantna fizikalno-kemijska 
svojstva,  
— čistoća (nečistoće) ispitivane tvari,  
— radiokemijska čistoća obilježene kemikalije i molarna aktivnost 
(prema potrebi).  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1319
 
Referentne tvari:  
— kemijski naziv i struktura referentnih tvari koje se koriste za 
opisivanje i/ili identifikaciju proizvoda pretvorbe.  
Ispitni sedimenti i voda:  
— lokacija i opis mjesta uzorkovanja vodenog sedimenta, po 
mogućnosti uklju čujući povijest one čišćenja,  
— sve informacije o skupljanju, skladištenju (prema potrebi) i akli ­
matizaciji sustava voda-sediment,  
— svojstva uzoraka voda-sediment navedena u tablici u odjeljku 
1.8.2.2.  
Ispitni uvjeti:  
— primijenjeni sustav ispitivanja (npr. proto čni, biometar, na čin 
prozračivanja, metoda miješanja, volumen vode, masa sedimenta, 
debljina sloja vode i sedimenta, dimenzije ispitnih posuda itd.),  
— primjena ispitivane tvari na ispitni sustav: ispitna koncentracija, 
broj ponavljanja i kontrolnih uzoraka, na čin primjene ispitivane 
tvari (npr. uporaba otapala) itd.,  
— temperatura inkubacije,  
— vremena uzorkovanja,  
— ekstrakcijske metode i u činkovitost ekstrakcije, analiti čke metode 
i granice detekcije,  
— metode opisivanja/identifikacije proizvoda pretvorbe,  
— odstupanja od ispitnog protokola ili ispitnih uvjeta tijekom istra ­ 
živanja.  
Rezultati:  
— sirovi podaci iz reprezentativnih analiza (sve sirove podatke treba 
pohraniti u arhivi DLP),  
— ponovljivost i osjetljivost primijenjenih analiti čkih metoda,  
— stope iskorištenja (postoci za valjano istraživanje navedeni su u 
odjeljku 1.7.1.),  
— tablice rezultata izraženih u % primijenjene doze i u mg · kg -1 u 
vodi, sedimentu i cjelokupnom sustavu (samo %) za ispitivanu 
tvar te, prema potrebi, za proizvode pretvorbe i neizlu čljivu 
radioaktivnost,  
— bilanca mase za vrijeme i na kraju istraživanja,  
— grafički prikaz pretvorbe u vodenoj i sedimentnoj frakciji i u 
cjelokupnom sustavu (uklju čujući mineralizaciju),  
— brzine mineralizacije,  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1320
 
— vrijeme poluraspada, vrijednost DT  50 i, prema potrebi, DT  75 i 
DT 90 za ispitivanu tvar te, prema potrebi, za glavne proizvode 
pretvorbe, uklju čujući granice pouzdanosti u vodi, sedimentu i 
cjelokupnom sustavu,  
— ocjena kinetike pretvorbe ispitivane tvari i, prema potrebi, 
glavnih proizvoda pretvorbe,  
— predloženi put pretvorbe (prema potrebi),  
— rasprava rezultata.  
4. REFERENCE  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process., (1990) Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for regi ­
stration of a pesticide., (1991) Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). 
The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate., (1992) Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate., (1987) 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic 
(Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. str. 35-37.  
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982) Section 162-3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication., (1995) Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr. Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
 
(7) OECD Test Guidelines Programme., (1995) Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18-20 January 1995.  
(8) ISO/DIS 5667-12., (1994) Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a) Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
 
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, str. 149-158.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1321
 
(15) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997) Effects of bacterial inocula ­
tion and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 
str. 631-637.  
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987) The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, str. 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989) Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17  th edition). American Public Health Associa ­
tion, American Water Works Association and Water Pollution 
Control Federation, Washington D.C.  
(20) Rowell, D.L. (1994) Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S., (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, str. 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991) Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993) Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and 
marine environments. From the Workshop on Sediment Toxi ­
city Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997) Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, str. 2858-2868.
 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999) 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, str. 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985) Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations 
under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, str. 197-203.  
(27) ISO-14240-2., (1997) Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen., (1990), The Kinetics of 
the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic 
Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), str. 
13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984) General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, str. 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989) Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, str. 1527-1550.
 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993) Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, str. 1499- 
1509.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W., (1986) A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, str. 3597-3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997) Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, str. 961-968.
 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, str. 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, str. 47-60.
 
(37) Carlton, R.R., and Allen, R., (1994) The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, str. 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1323
 
Dodatak 1.  
SMJERNICE ZA AEROBNE I ANAEROBNE ISPITNE SUSTAVE  
Aerobni ispitni sustav  
Aerobni ispitni sustav opisan u ovoj ispitnoj metodi sastoji se od aerobnog 
vodenog sloja (tipi čni raspon koncentracija kisika od 7 do 10 mg ·l –1 ) i sedi­
mentnog sloja, koji je aeroban na površini i anaeroban ispod površine (tipi čni 
prosječni redoks potencijali (E  h ) u anaerobnoj zoni sedimenta kre ću se u 
području između – 80 i – 190 mV). Ovlaženi zrak prevodi se preko površine 
vode u svakoj inkubacijskoj jedinici kako bi se osigurala dovoljna koli čina kisika 
u prostoru iznad uzorka.  
Anaerobni ispitni sustav  
Kod anaerobnog ispitnog sustava ispitni postupak je uglavnom isti kao kod 
aerobnog sustava, ali se u svakoj inkubacijskoj jedinici preko površine vode 
prevodi ovlaženi dušik radi osiguravanja potrebnog dušika u prostoru iznad 
uzorka. Sediment i voda smatraju se anaerobnim kad je redoks potencijal (E  h ) 
niži od – 100 mV.  
Kod anaerobnog ispitivanja ocjenjivanje mineralizacije uklju čuje mjerenje 
razvijenog ugljikovog dioksida i metana.  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1324
 
Dodatak 2.  
PRIMJER PLINSKE PROTO ČNE APARATURE
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1325
 
Dodatak 3.  
PRIMJER BIOMETARSKE APARATURE
  ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1326
 
Dodatak 4.  
PRIMJER IZRA ČUNA DOZE PRIMJENE ZA ISPITNE POSUDE  
Unutarnji promjer cilindra:  = 8 cm  
Dubina vodenog stupca bez sedimenta:  = 12 cm  
Površina: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Količina primjene: 500 g ispitivane tvari/ha 
odgovara 5 μg/cm  2 
Ukupno μg: 5 × 50,3  = 251,5 μg 
Prilagođavanje koli čine u odnosu na dubinu od 
100 cm:  
12 × 251,5 ÷ 100  = 30,18 μg 
Volumen vodenog stupca: 50,3 × 12  = 603 ml  
Koncentracija u vodi: 30,18 ÷ 603  = 0,050 μg/ml ili 50 μg/l ▼B 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1327
 
C.25.  AEROBNA MINERALIZACIJA U POVRŠINSKOJ VODI – 
SIMULACIJSKI TEST BIORAZGRADNJE  
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 309 (2004) (1.).  
1.1. UVOD  
Svrha je ovog testa izmjeriti vremenski tijek biorazgradnje ispitivane 
tvari koja je prisutna u aerobnoj prirodnoj vodi u niskoj koncentraciji i kvantificirati zapažanja u obliku izraza za kineti čku brzinu. Ovaj 
simulacijski test je laboratorijski šaržni test protresanjem u tikvici 
kojim se odre đuju brzine aerobne biorazgradnje organskih tvari u 
uzorcima prirodne površinske vode (slatka, bo čata ili morska). 
Temelji se na ISO/DIS 14592-1 (2.), a sadrži i elemente ispitnih metoda C.23. i C.24. (3.) (4.). U slu čaju dužih vremena ispitivanja, 
šaržni postupak može se fakultativno zamijeniti polukontinuiranim 
kako se ne bi narušio ispitni mikrokozmos. Glavni cilj simulacijskog testa je odre đivanje mineralizacije ispitivane tvari u površinskoj vodi, 
koja čini osnovu za opisivanje kinetike razgradnje. Me đutim, ispiti ­
vanje ima i fakultativni sekundarni cilj – dobivanje informacija o 
primarnoj razgradnji i tvorbi zna čajnih proizvoda razgradnje. Utvr ­ 
đivanje proizvoda pretvorbe i, po mogu ćnosti, kvantificiranje 
njihovih koncentracija posebno je važno kod tvari koje se vrlo 
sporo mineraliziraju (npr. kad vrijeme poluraspada ukupnog preo ­
stalog
 14 C iznosi više od 60 dana). Zbog analiti čkih ograni čenja, 
za identifikaciju i kvantifikaciju zna čajnih proizvoda pretvorbe u 
pravilu treba koristiti više koncentracije ispitivane tvari (npr. > 100 
μg/l). 
U okviru ovog testa, niska koncentracija je koncentracija koja je 
dovoljno niska (npr. manje od 1 μg/l do 100 μg/l) da se prilikom 
ispitivanja postigne kinetika biorazgradnje kakva se može o čekivati u 
okolišu. Uzimaju ći u obzir ukupnu masu biorazgradivih uglji čnih 
supstrata u prirodnoj vodi koja se koristi u ispitivanju, nisko koncen ­
trirana ispitivana tvar služi kao sekundarni supstrat. To zna či da je 
očekivana kinetika biorazgradnje kinetika prvog reda (kinetika „bez 
rasta”) i da se ispitivana tvar može razgraditi „kometabolizmom”. Kinetika prvog reda podrazumijeva da je brzina razgradnje (mg/l/ 
dan) razmjerna koncentraciji supstrata, koja opada s vremenom. 
Kod prave kinetike prvog reda konstanta specifi čne brzine razgradnje 
(k) je neovisna o vremenu i koncentraciji. Prema tomu, k se ne mijenja zna čajnije tijekom jednog pokusa, ali ni s pove ćanjem 
koncentracije izme đu pokusa. Prema definiciji, konstanta specifi čne 
brzine razgradnje jednaka je relativnoj promjeni koncentracije po jedinici vremena: k = (1/C) · (dC/dt). Iako se u propisanim uvjetima 
u pravilu o čekuje kinetika prvog reda, u odre đenim su okolnostima 
možda primjerenije druge vrste kinetike. Odstupanja od kinetike 
prvog reda mogu se primjerice zapaziti kad brzinu biorazgradnje više ograni čava pojava prijenosa mase, npr. brzina difuzije, nego 
brzina biološke reakcije. Ipak, podaci se gotovo uvijek mogu 
opisati kinetikom pseudoprvog reda, ako se prihvati konstanta 
brzine ovisna o koncentraciji.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1328
 
Prije ispitivanja trebale bi biti raspoložive informacije o biorazgradi ­
vosti ispitivane tvari pri višim koncentracijama (npr. iz standardnih 
testova pretraživanja) kao i podaci o abioti čkoj razgradivosti, proiz ­
vodima pretvorbe i relevantnim fizikalno-kemijskim svojstvima koji mogu pomo ći kod planiranja pokusa i tuma čenja rezultata. Sposob ­
nost potpune biorazgradnje može se odrediti primjenom
 14 C obilje­ 
žene ispitivane tvari i odre đivanjem fazne razdiobe  14 C na kraju 
ispitivanja. Ako se koristi neobilježena ispitivana tvar, kona čna 
biorazgradnja se može procijeniti samo ako se ispituje viša koncen ­
tracija i ako su poznati svi zna čajni proizvodi razgradnje.  
1.2. DEFINICIJE  
Primarna biorazgradnja : Promjena strukture kemikalije (pretvorba) 
djelovanjem mikroorganizama koja rezultira gubitkom kemijskog 
identiteta.  
Funkcionalna biorazgradnja : Promjena strukture kemikalije (pret ­
vorba) djelovanjem mikroorganizama koja rezultira gubitkom odre ­ 
đenog svojstva.  
Potpuna aerobna biorazgradnja : Razgradnja kemikalije djelova ­
njem mikroorganizama u prisutnosti kisika na ugljikov dioksid, 
vodu i mineralne soli drugih prisutnih elemenata (mineralizacija) i 
stvaranje nove biomase i organskih proizvoda mikrobne biosinteze.  
Mineralizacija : Razgradnja kemikalije odnosno organske tvari djelo ­
vanjem mikroorganizama u prisutnosti kisika na ugljikov dioksid, vodu i mineralne soli drugih prisutnih elemenata.
 
Faza prilagodbe  („lag” faza): Vrijeme koje je potrebno da se 
mikroorganizmi koji obavljaju razgradnju prilagode i stupanj bioraz ­
gradnje kemikalije odnosno organske tvari dosegne razinu detekcije (npr. 10 % maksimalne teoretske biorazgradnje ili manje, ovisno o točnosti mjerne tehnike), ra čunajući od početka ispitivanja.
 
Maksimalna biorazgradnja : Stupanj biorazgradnje kemikalije ili 
organske tvari u okviru ispitivanja, izražen u postotku, iznad 
kojega se kemikalija odnosno tvar biološki ne razgra đuje tijekom 
ispitivanja.  
Primarni supstrat : Spoj prirodnog ugljika i izvora energije koji 
osiguravaju rast i održavanje mikrobne biomase.  
Sekundarni supstrat : Komponenta supstrata koja je prisutna u tako 
niskoj koncentraciji da njezinom razgradnjom relevantni mikroorgan ­
izmi primaju tek neznatne koli čine ugljika i energije u odnosu na 
ugljik i energiju koja se osigurava razgradnjom glavnih komponenti supstrata (primarni supstrati).
 
Konstanta brzine razgradnje : Konstanta brzine kinetike prvog reda 
ili pseudoprvog reda k (d  -1 ) kojom se ozna čava brzina procesa 
razgradnje. U slu čaju šaržnih pokusa k se procjenjuje iz po četnog 
dijela krivulje razgradnje dobivene po završetku faze prilagodbe.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1329
 
Vrijeme poluraspada, t  1/2 (d): Izraz koji se koristi za opisivanje 
brzine reakcije prvog reda. To je vremenski interval koji odgovara 
smanjenju koncentracije za faktor 2. Odnos izme đu vremena polura ­
spada i konstante brzine razgradnje opisan je jednadžbom t  1/2 = 
ln2/k.  
Vrijeme polurazgradnje, DT  50 (d): Izraz koji se koristi za kvanti ­
fikaciju rezultata ispitivanja biorazagradnje. To je vrijeme koje je 
potrebno da se dosegne 50 %-tna biorazgradnja, uklju čujući fazu 
prilagodbe.  
Granica detekcije (Limit of Detection, LOD) i granica kvantifi ­
kacije (Limit of Quantification, LOQ) : Granica detekcije (LOD) je 
koncentracija tvari ispod koje se tvar više ne može razlikovati od 
analitičkih artefakata. Granica kvantifikacije (LOQ) je koncentracija 
tvari ispod koje se koncentracija ne može odrediti s prihvatljivom točnošću.
 
Otopljeni organski ugljik (DOC) : Dio organskog ugljika u uzorku 
vode koji se ne može ukloniti predvi đenim odjeljivanjem faza, npr. 
15-minutnim centrifugiranjem na 40 000 ms  -2 ili membranskom 
filtracijom s membranama veli čine pora 0,2 μm – 0,45 μm. 
Ukupna aktivnost organskog  14 C (Total Organic  14 C Activity, 
TOA) : Ukupna aktivnost  14 C povezana s organskim ugljikom.  
Aktivnost otopljenog organskog  14 C (Dissolved Organic  14 C Acti­
vity, DOA) : Ukupna aktivnost  14 C povezana s otopljenim organskim 
ugljikom.  
Aktivnost čestičnog organskog  14 C (Particulate Organic  14 C Acti­
vity, POA) : Ukupna aktivnost  14 C povezana s organskim ugljikom u 
česticama.  
1.3. PRIMJENJIVOST TESTA  
Simulacijski test primjenjiv je u slu čaju nehlapljivih i blago 
hlapljivih organskih tvari koje se ispituju pri niskim koncentracijama. Ako se korise tikvice otvorene prema atmosferi (npr. za čepljene 
vatom), tvari s konstantom Henryjevog zakona ispod cca 1 
Pa·m
 3 /mol (cca 10  –5 atm·m 3 /mol) mogu se u praksi smatrati nehla ­
pljivima. Ako se koriste zatvorene tikvice sa zra čnim prostorom, 
mogu se ispitivati i blago hlapljive tvari (s konstantama Henryjevog zakona < 100 Pa ·m
 3 /mol ili < 10  –3 atm·m 3 /mol) bez gubitaka iz 
ispitnog sustava. Kod stripiranja CO  2 može doći do gubitaka  14 C 
obilježenih tvari ako se ne provedu odgovaraju će mjere predostrož ­
nosti. U takvim je slu čajevima ponekad potrebno odvajati CO  2 na 
unutarnjem alkalijskom apsorberu ili koristiti vanjski apsorberski 
sustav CO  2 (izravno odre đivanje  14 CO 2 ; vidi Dodatak 3.). Za odre ­ 
đivanje kinetike biorazgradnje koncentracije ispitivane tvari moraju 
biti ispod topljivosti u vodi. Ipak, treba imati na umu da vrijednosti 
topljivosti u vodi koje se navode u literaturi mogu biti znatno više od 
topljivosti ispitivane tvari u prirodnim vodama. Topljivost izrazito slabo topljivih ispitivanih tvari može se prema želji utvrditi pomo ću 
prirodnih voda koje će se koristiti u ispitivanju.
 
Metoda se može koristiti za simulaciju biorazgradnje u površinskoj 
vodi bez grubih čestica (pelagi čki test) ili u mutnoj površinskoj vodi 
kakva se npr. može prona ći u blizini su čelja voda/sediment (test sa 
suspendiranim sedimentom).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1330
 
1.4. NA ČELO ISPITIVANJA  
Ispitivanje se provodi u šaržnom postupku inkubiranjem ispitivane 
tvari s površinskom vodom (pelagi čki test) ili s površinskom vodom 
kojoj je dodana suspendirana kruta tvar/sediment u koncentraciji od 
0,01 do 1 g/l suhe mase (test sa suspendiranim sedimentom) radi 
simulacije vodne cjeline sa suspendiranom krutom tvari ili resuspen ­
diranim sedimentom. Koncentracija suspendirane krute tvari/sedi ­
menta u donjem segmentu ovog podru čja reprezentativna je za 
većinu površinskih voda. Ispitne se tikvice inkubiraju u mraku na 
temperaturi okoliša u aerobnim uvjetima, uz mu ćkanje. Za odre đi­
vanje kinetike razgradnje koriste se najmanje dvije koncentracije 
ispitivane tvari. Koncentracije se moraju razlikovati za faktor 5 do 
10 i trebaju predstavljati o čekivani raspon koncentracija u okolišu. 
Maksimalna koncentracija ispitivane tvari ne smije biti viša od 100 μg/l, a poželjno je da maksimalne ispitne koncentracije budu i niže 
od 10 μg/l kako bi se zajam čila biorazgradnja u skladu s kinetikom 
prvog reda. Najniža koncentracija ne smije biti viša od 10 μg/l, a 
prednost treba dati ispitnim koncentracijama od 1 – 2 μg/l ili čak 
ispod 1 μg/l. U pravilu se i tako niske koncentracije mogu dovoljno 
dobro analizirati primjenom
 14 C obilježenih tvari koje su dostupne 
na tržištu. Ako se ispitivana tvar primjenjuje u koncentraciji ≤ 100 
μg/l, njezinu koncentraciju često nije mogu će izmjeriti s potrebnom 
točnošću zbog analiti čkih ograni čenja (vidi odjeljak 1.7.2. stavak 2.). 
Više koncentracije ispitivane tvari (> 100 μg/l, a ponekad i 1 mg/l) 
mogu se koristiti za identifikaciju i kvantifikaciju zna čajnih proiz ­
voda pretvorbe te u slu čajevima kad nije raspoloživa specifi čna 
analitička metoda s niskom granicom detekcije. Ako se ispituju 
visoke koncentracije ispitivane tvari, ponekad nije mogu će procijeniti 
konstantu razgradnje prvog reda i vrijeme poluraspada na temelju dobivenih rezultata budu ći da razgradnja vjerojatno ne će slijediti 
kinetiku prvog reda.
 
Razgradnja se prati mjerenjem preostalog  14 C ili preostale koncen ­
tracije ispitivane tvari, ako se provodi specifi čna kemijska analiza, u 
odgovaraju ćim vremenskim razmacima.  14 C obilježavanjem najsta ­
bilnijeg dijela molekule može se odrediti ukupna mineralizacija, dok se
 14 C obilježavanjem manje stabilnog dijela molekule i 
primjenom specifi čne analize može odrediti samo primarna bioraz ­
gradnja. Ipak, najstabilniji dio ne mora nužno uklju čivati relevantni 
funkcionalni dio molekule (koji je povezan sa specifi čnim svojstvom, 
kao što je toksi čnost, bioakumulacija itd.). U tom je slu čaju kod 
ispitivanja možda primjerenije koristiti tvar s  14 C oznakom u funk ­
cionalnom dijelu kako bi se moglo pratiti nestajanje specifi čnog 
svojstva.  
1.5. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Za ovaj se test mogu koristiti radioaktivno obilježene i neobilježene 
tvari.  14 C obilježavanje je preporu čeni postupak, a oznaka se u 
pravilu treba nalaziti na najstabilnijem dijelu ili dijelovima molekule 
(vidi tako đer odjeljak 1.4.). Kod tvari koje sadrže više od jednog 
aromatskog prstena treba po mogu ćnosti obilježiti jedan ili više 
ugljika u svakom prstenu. Osim toga, poželjno je obilježiti jedan 
ili više ugljika s obje strane lako razgradivih veza. Kemijska i/ili 
radioaktivna čistoća ispitivane tvari treba biti > 95 %. Kod radioak ­
tivno obilježenih tvari poželjna je specifi čna aktivnost od približno 
50 μCi/mg (1,85 MBq) ili više da bi se olakšala mjerenja  14 C kod 
ispitivanja s niskim po četnim koncentracijama. Trebaju biti raspolo ­ 
žive sljede će informacije o ispitivanoj tvari:  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1331
 
— topljivost u vodi (metoda A.6.),  
— topljivost u organskom otapalu ili otapalima (ako se tvar primje ­
njuje pomo ću otapala ili ima nisku topljivost u vodi),  
— konstanta disocijacije (pKa), ako je tvar sklona protonaciji ili 
deprotonaciji (OECD TG 112) (5.),  
— tlak pare (metoda A.4.) i konstanta Henryjevog zakona,  
— kemijska stabilnost u vodi i u mraku (hidroliza) (metoda C.7.).  
Ako se tvari koje su slabo topljive u vodi ispituju u morskoj vodi, 
korisno je znati konstantu isoljivanja (ili „Setschenowu konstantu”) 
K s , koja se definira izrazom: log (S/S') = K  s C m , gdje su S i S' 
topljivost tvari u slatkoj i morskoj vodi i C  m je molarna koncentra ­
cija soli.  
Ako se ispitivanje provodi kao „test sa suspendiranim sedimentom”, 
moraju biti raspoložive i ove informacije:  
— podjelni koeficijent n-oktanol/voda (metoda A.8.),  
— koeficijent adsorpcije (metoda C.18.).  
Ostale korisne informacije su:  
— koncentracija u okolišu, ako je poznata ili procijenjena,  
— toksičnost ispitivane tvari za mikroorganizme (metoda C.11.),  
— laka i/ili svojstvena biorazgradivost (metoda C.4. A-F, C.12., 
C.9, OECD TG 302 (5.)),  
— aerobna ili anaerobna biorazgradivost u tlu i studije pretvorbe u 
sedimentu/vodi (metoda C.23., C.24.).  
1.6. REFERENTNE TVARI  
Kao referentnu tvar treba koristiti tvar koja se u pravilu lako razgra ­ 
đuje u aerobnim uvjetima (npr. anilin ili natrijev benzoat). O čeki­
vano vrijeme razgradnje anilina i natrijevog benzoata uglavnom je kraće od 2 tjedna. Svrha korištenja referentnih tvari je uvjeriti se da 
se mikrobna aktivnost ispitne vode kre će unutar odre đenih granica, 
tj. da voda sadrži aktivnu mikrobnu populaciju.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1332
 
1.7. KRITERIJI KAKVO ĆE 
1.7.1.  Iskorištenje  
Svaka po četna ispitna koncentracija provjerava se odmah nakon 
dodavanja ispitivane tvari u najmanje dva uzorka mjerenjem aktiv ­
nosti  14 C ili, u slu čaju neobilježenih tvari, kemijskom analizom. 
Time se dobivaju informacije o primjenjivosti i ponovljivosti 
metode analize i homogenosti razdiobe ispitivane tvari. Kod kasnijih 
analiza podataka u pravilu se ne koristi nazivna koncentracija ve ć 
izmjerena po četna aktivnost  14 C odnosno izmjerena koncentracija 
ispitivane tvari, jer se time ispravljaju gubici zbog sorpcije i 
greške u doziranju. Kod  14 C obilježenih tvari iskorištenje na kraju 
pokusa proizlazi iz bilance mase (vidi zadnji stavak odjeljka 1.8.9.4.). U idealnom slu čaju bilanca mase radioaktivno obilježene 
tvari trebala bi se kretati u podru čju od 90 % do 110 %, dok bi 
analitička točnost kod neobilježenih tvari trebala biti takva da se 
dobije po četno iskorištenje u podru čju od 70 % do 110 %. Ta 
područja treba shvatiti kao ciljne vrijednosti, a ne kao kriterij za 
prihvaćanje ispitivanja. Analiti čka točnost može se fakultativno odre ­
diti pri koncentraciji ispitivane tvari koja je niža od po četne kao i za 
značajne proizvode pretvorbe.
 
1.7.2.  Ponovljivost i osjetljivost metode analize  
Ponovljivost metode analize (uklju čujući učinkovitost po četne 
ekstrakcije) za kvantifikaciju ispitivane tvari i proizvoda pretvorbe 
(prema potrebi) treba provjeriti peterostrukom analizom pojedina čnih 
ekstrakata površinske vode.  
Granica detekcije (LOD) metode analize za ispitivanu tvar i proiz ­
vode pretvorbe treba po mogu ćnosti biti najmanje 1 % po četne 
količine koja je primijenjena na ispitni sustav. Granica 
kvantifikacije (LOQ) treba biti jednaka ili manja od 10 % primije ­
njene koncentracije. Za kemijsku analiza brojnih organskih tvari i 
njihovih proizvoda pretvorbe često su potrebne relativno visoke 
koncentracije ispitivane tvari tj. > 100 μg/l. 
1.8. OPIS ISPITNE METODE  
1.8.1.  Oprema  
Ispitivanje se može provesti u stožastim ili cilindri čnim tikvicama 
odgovaraju će zapremine (npr. 0,5 ili 1,0 l) sa silikonskim ili 
gumenim čepovima ili u serumskim bocama s poklopcima koji ne 
propuštaju CO  2 (npr. sa zatvara čem od butilne gume). Druga je 
mogućnost da se upotrijebi ve ći broj tikvica i u svakom vremenu 
uzorkovanja uzimaju čitave tikvice, najmanje po dvije, (vidi zadnji 
stavak odjeljka 1.8.9.1.). Kod nehlapljivih ispitivanih tvari koje nisu 
radioaktivno obilježene nisu potrebni plinonepropusni čepovi i 
poklopci; dovoljno ih je za čepiti vatom koja spre čava onečišćenje 
iz zraka (vidi stavak 2. odjeljka 1.8.9.1.). Blago hlapljive tvari treba ispitati u sustavu biometarskog tipa uz nježno miješanje po površini 
vode. Da bi se izbjeglo one čišćenje bakterijama, posude se mogu 
prije uporabe sterilizirati zagrijavanjem ili obradom u autoklavu. Osim toga, koristi se sljede ća standardna laboratorijska oprema:
 
— tresilica ili magnetski mješa či za neprekidno mu ćkanje ispitnih 
posuda,  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1333
 
— centrifuga,  
— mjera č pH vrijednosti,  
— turbidimetar za nefelometrijska mjerenja mutno će, 
— peć ili mikrovalna pe ć za određivanje suhe mase,  
— uređaj za membransku filtraciju,  
— autoklav ili pe ć za toplinsku sterilizaciju staklene opreme,  
— oprema za rukovanje  14 C obilježenim tvarima,  
— oprema za kvantifikaciju aktivnosti  14 C u uzorcima iz otopina za 
odvajanje CO  2 i, prema potrebi, iz uzoraka sedimenta,  
— analiti čka oprema za odre đivanje ispitivane (i referentne) tvari, 
ako se koristi specifi čna kemijska analiza (npr. plinski kromato ­
graf, visokotla čni tekućinski kromatograf).  
1.8.2.  Radne otopine ispitivane tvari  
Za pripremu radnih otopina ispitivanih i referentnih tvari treba kori ­
stiti deioniziranu vodu (vidi odjeljak 1.8.7. stavak 1.). U deionizi ­
ranoj vodi ne smije biti tvari koje bi mogle biti toksi čne za mikroor ­
ganizme, a udio otopljenog organskog ugljika (DOC) ne smije biti viši od 1 mg/l (6.).
 
1.8.3.  Skupljanje i prijevoz površinske vode  
Mjesto za uzorkovanje površinske vode treba odabrati u skladu sa 
svrhom ispitivanja. Kod odabira mjesta treba uzeti u obzir mogu ću 
povijest unosa materijala iz poljoprivrede, industrije i ku ćanstava. 
Voda za ispitivanje ne smije se skupljati na mjestima za koja se 
zna da su u prethodne četiri godine one čišćena ispitivanom tvari ili 
njezinim strukturnim analozima, osim ako je svrha istraživanja ispi ­
tati brzinu razgradnje na one čišćenim lokacijama. Na mjestu uzorko ­
vanja treba izmjeriti pH vrijednost i temperaturu vode. Osim toga, 
treba zabilježiti dubinu uzorkovanja i izgled vodenog uzorka (npr. boja i mutno ća) (vidi odjeljak 3.). Da bi se dokazali aerobni uvjeti, 
treba izmjeriti koncentraciju kisika i/ili redoks potencijal u vodi i 
površinskom sloju sedimenta, osim ako je to nedvojbeno s 
obzirom na izgled i ranija iskustva s lokacijom. Površinsku vodu treba prenositi u temeljito o čišćenim spremnicima. Za to vrijeme 
temperatura uzorka ne smije biti zna čajno viša od ispitne tempera ­
ture. Ako prijevoz traje dulje od 2 do 3 sata, preporu čuje se hla đenje 
na 4 °C. Vodeni uzorak ne smije biti zamrznut.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1334
 
1.8.4.  Skladištenje i priprema površinske vode  
Ispitivanje po mogu ćnosti treba zapo četi u roku od jednoga dana od 
uzimanja uzorka. Skladištenje vode, ako je ono potrebno, treba svesti na najmanju mogu ću mjeru, a u svakom slu čaju ne smije trajati duže 
od 4 tjedna. Vodeni uzorak treba do uporabe držati na temperaturi od 
4 °C uz dozra čivanje. Prije uporabe treba ukloniti krupne čestice npr. 
filtriranjem kroz najlonski filtar veli čine otvora 100 μm ili kroz grubi 
filtar-papir ili taloženjem.
 
1.8.5.  Priprema vode sa sedimentom (fakultativno)  
Kod testa sa suspendiranim sedimentom treba pripremiti suspenziju 
dodavanjem površinskog sedimenta u tikvice koje sadrže prirodnu 
vodu (koja je prethodno filtrirana radi uklanjanja krupnih čestica, 
kako je opisano u odjeljku 1.8.4.); koncentracija suspendirane krute tvari treba biti izme đu 0,01 i 1 g/l. Površinski sediment 
mora potjecati s istog mjesta kao vodeni uzorak. Ovisno o 
vodnom okolišu, površinski sediment može imati visok sadržaj 
organskog ugljika (2,5 – 7,5 %) i finu teksturu ili nizak sadržaj organskog ugljika (0,5 – 2,5 %) i grubu teksturu (3.). Površinski se sediment može pripremiti na sljede ći način: uz pomo ć prozirne 
plastične cjevčice izvuče se nekoliko sedimentnih jezgri; odmah 
nakon uzorkovanja odrežu se gornji aerobni slojevi (od površine do dubine od najviše 5 mm) i združe. Dobiveni uzorak sedimenta prenosi se u posudi s velikim zra čnim prostorom kako bi se osigurali 
aerobni uvjeti (uz hla đenje na 4 °C ako prijevoz traje više od 2 – 3 
sata). Uzorak sedimenta se suspendira u ispitnoj vodi u omjeru 1: 10 i drži do uporabe na temperaturi od 4 °C uz dozra čivanje. Skladiš ­
tenje sedimenta, ako je ono potrebno, treba svesti na najmanju 
moguću mjeru, a u svakom slu čaju ne smije trajati duže od 4 tjedna.
 
1.8.6.  Polukontinuirani postupak (fakultativno)  
Inkubaciju je ponekad potrebno produžiti (na nekoliko mjeseci) ako 
se značajna razgradnja ispitivane tvari izmjeri tek nakon dugog 
vremena prilagodbe. Ako je to poznato iz ranijeg ispitivanja tvari, 
ispitivanje se može zapo četi polukontinuiranim postupkom, koji 
omogućuje periodi čko obnavljanje dijela ispitne vode odnosno 
suspenzije (vidi Dodatak 2.). Druga je mogu ćnost da se uobi čajeni 
šaržni test pretvori u polukontinuirani ako tijekom približno 60 dana 
ispitivanja šaržnim postupkom nije došlo do razgradnje ispitivane tvari (vidi odjeljak 1.8.8.3. stavak 2.).
 
1.8.7.  Dodavanje ispitivane (ili referentne) tvari  
U slučaju tvari visoke topljivosti u vodi (> 1 mg/l) i niske hlaplji ­
vosti (konstanta Henryjevog zakona < 1 Pa ·m 3 /mol ili < 10  –5 
atm·m 3 /mol), može se pripremiti radna otopina u deioniziranoj 
vodi (vidi odjeljak 1.8.2.); u ispitne se posude doda odgovaraju ći 
volumen radne otopine da bi se dobila željena koncentracija. 
Volumen radne otopine koja se dodaje u posudu treba svesti na najmanju mogu ću mjeru (po mogu ćnosti < 10 % kona čnog volu ­
mena teku ćine). Druga mogu ćnost je da se ispitivana tvar otopi u 
većem volumenu ispitne vode, što se može smatrati zamjenom za 
korištenje organskih otapala.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1335
 
Ako kod pripreme radnih otopina nehlapljivih tvari koje su slabo 
topljive u vodi nije mogu će izbjeći primjenu otapala, treba koristiti 
hlapljiva organska otapala, s time da koli čina otapala koja se unosi u 
ispitni sustav ne smije biti viša od 1 % v/v i ne smije imati štetni učinak na mikrobnu aktivnost. Otapalo ne smije utjecati na stabilnost 
ispitivane tvari u vodi. Otapalo treba stripirati na najmanju mogu ću 
količinu kako ne bi došlo do zna čajnog pove ćanja koncentracije 
DOC-a u ispitnoj vodi odnosno suspenziji. To treba provjeriti speci ­
fičnom analizom tvari odnosno, ukoliko je to mogu će, analizom 
DOC-a (6.). Treba paziti da se prenesena koli čina otapala svede na 
nužnu mjeru i uvjeriti se da se prisutna koli čina ispitivane tvari može 
otopiti u kona čnom volumenu ispitne vode. Mogu se koristiti i druge 
tehnike za uvo đenje ispitivane tvari u ispitne posude, kako je 
opisano u (7.) i (8.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristi 
organsko otapalo, treba uvesti kontrole s otapalom koje sadrže ispitnu vodu (bez dodataka) i ispitnu vodu s referentnom tvari i s njima postupati na sli čan način kao s aktivnim ispitnim posudama u 
koje je dodana ispitivana tvar u otapalu kao nosa ču. Svrha kontrola s 
otapalom je ispitati mogu će štetne u činke otapala na mikrobnu popu ­
laciju na temelju razgradnje referentne tvari.
 
1.8.8.  Ispitni uvjeti  
1.8.8.1.  Ispitna temperatura  
Inkubacija se provodi u mraku (poželjno) ili pod difuznom rasvjetom 
na kontroliranoj temperaturi (± 2 °C), koja može odgovarati tempera ­
turi na terenu ili standardnoj temperaturi od 20 – 25 °C. Temperatura 
na terenu može biti stvarna temperatura uzorka u trenutku uzorko ­
vanja ili prosje čna temperatura na mjestu uzorkovanja.  
1.8.8.2.  Mućkanje  
Čestice i mikroorganizme treba držati u suspenziji neprekidnim 
mućkanjem tj. tresenjem ili miješanjem. Mu ćkanjem se tako đer 
olakšava prijenos kisika iz zra čnog prostora u teku ćinu i tako osigu ­
ravaju potrebni aerobni uvjeti. Tikvice se stave na tresilicu (cca 100 o/min) ili se koristi magnetska mješalica. Mu ćkanje se ne smije 
prekidati. Tresenje odnosno miješanje mora biti što je mogu će njež­
nije, ali istovremeno treba voditi ra čuna da se održi homogenost 
suspenzije.
 
1.8.8.3.  Trajanje ispitivanja  
Ispitivanje uglavnom ne bi smjelo trajati duže od 60 dana, osim ako 
se primjenjuje polukontinuirani postupak s periodi čkim obnavljanjem 
ispitne suspenzije (vidi odjeljak 1.8.6. i Dodatak 2.). Ipak, vrijeme 
ispitivanja se i kod primjene šaržnog postupka može produžiti do 
najviše 90 dana ako je razgradnja ispitivane tvari zapo čela unutar 
prvih 60 dana. Razgradnja se prati u odgovaraju ćim vremenskim 
razmacima odre đivanjem preostale aktivnosti  14 C odnosno nastalog  
14 CO 2 (vidi odjeljak 1.8.9.4.) i/ili kemijskom analizom (odjeljak 
1.8.9.5.). Vrijeme inkubacije mora biti dovoljno dugo da se ocijeni proces razgradnje. Poželjno je da stupanj razgradnje bude viši od 50 %; kod tvari koje se sporo razgra đuju stupanj razgradnje mora 
biti dovoljan (u pravilu iznad 20 %) da se može procijeniti konstanta 
kinetičke brzine razgradnje.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1336
 
Provode se periodi čka mjerenja pH vrijednosti i koncentracije kisika 
u ispitnom sustavu, osim ako zahvaljuju ći ranijim iskustvima s uzor ­
cima vode i sedimenta s iste lokacije u sli čnim ispitivanjima takva 
mjerenja nisu potrebna. U odre đenim uvjetima zbog metabolizma 
primarnih supstrata, koji mogu biti prisutni u vodi ili sedimentu u 
znatno višim koncentracijama, može do ći do stvaranja pove ćanih 
količina CO  2 i povećane potrošnje kisika, što može izazvati zna čajne 
promjene pokusnih uvjeta tijekom ispitivanja.  
1.8.9.  Postupak  
1.8.9.1.  Priprema tikvica za pelagi čki test  
U ispitne se tikvice stavi prikladna koli čina ispitivane tvari koja je 
otprilike dovoljna da se ispuni jedna tre ćina zapremine tikvice, ali ne 
manje od cca 100 ml. I ako se koristi ve ći broj tikvica (kako bi se u 
svakom vremenu uzorkovanja mogle uzimati čitave tikvice), 
potrebno je oko 100 ml ispitne vode, budu ći da male veli čine 
uzorka mogu utjecati na duljinu faze prilagodbe. Ispitivana se tvar dodaje putem radne otopine kako je opisano u odjeljku 1.8.2. i 1.8.7. Da bi se mogla odrediti kinetika razgradnje i izra čunati konstanta 
kinetičke brzine razgradnje, potrebne su najmanje dvije koncentracije 
ispitivane tvari koje se razlikuju za faktor 5 do 10. Obje odabrane koncentracije moraju biti manje od 100 μg/l, a poželjno je da budu u 
rasponu od < 1 – 10 μg/l.
 
Tikvice se zatvore čepovima ili poklopcima koji propuštaju zrak i 
CO 2 . Ako se ispituju nehlapljive kemikalije koje nisu radioaktivno 
obilježene, posude se mogu za čepiti vatom koja spre čava onečišćenje 
iz zraka (vidi odjeljak 1.8.1.), pod uvjetom da se zna da su svi 
značajni proizvodi razgradnje nehlapljivi i primjenjuje se neizravno 
određivanje CO  2 (vidi Dodatak 3.).  
Tikvice se inkubiraju na odabranoj temperaturi (vidi odjeljak 
1.8.8.1.). Uzorci se uzimaju na kemijsku analizu ili mjerenje  14 C 
na početku ispitivanja (tj. prije nego što zapo čne razgradnja; vidi 
odjeljak 1.7.1.) i u odgovaraju ćim vremenskim razmacima tijekom 
ispitivanja. Uzorkovanje se može obaviti izvla čenjem poduzoraka 
(npr. alikvoti od 5 ml) iz svakog ponavljanja ili uzimanjem čitavih 
tikvica u svakom vremenu uzorkovanja. Mineralizacija ispitivane 
tvari može se odrediti neizravno ili izravno (vidi Dodatak 3.). Obično je za pouzdanu procjenu konstante brzine potrebno najmanje 
pet točaka uzorkovanja u fazi razgradnje (tj. nakon završetka faze 
prilagodbe), osim u slu čaju brzo razgradivih tvari, kada se uz odgo ­
varajuće obrazloženje mogu dopustiti i tri to čke uzorkovanja. Kod 
tvari koje nisu brzo razgradive, u fazi razgradnje se bez problema može obaviti više mjerenja i stoga za procjenu k treba koristiti više 
točaka podataka. Nije mogu će navesti to čan vremenski raspored 
uzorkovanja budu ći da su brzine biorazgradnje razli čite; ipak, prepo ­
ručuje se da se u slu čaju spore razgradnje uzorkovanje provodi 
jedanput tjedno. Ako se ispitivana tvar brzo razgra đuje, uzorkovanje 
treba obavljati jedanput dnevno u prva tri dana, a zatim svaki drugi 
ili treći dan. U odre đenim okolnostima, npr. kod tvari koje vrlo brzo 
hidroliziraju, ponekad je potrebno uzimati uzorke svaki sat. Prepo ­
ručuje se da se prije ispitivanja provede preliminarno istraživanje 
kako bi se odredili prikladni intervali uzorkovanja. Ako se uzorci 
moraju sa čuvati za daljnju specifi čnu analizu, preporu čljivo je uzeti 
više uzoraka i zatim na kraju pokusa odabrati one koji će se anali ­
zirati obrnutim redoslijedom tj. prvo se analiziraju uzorci koji su 
uzeti zadnji (za smjernice o stabilnosti uzoraka tijekom skladištenja 
vidi odjeljak 1.8.9.5. stavak 2.).
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1337
 
1.8.9.2.  Broj tikvica i uzoraka  
Pripremi se dovoljan broj ispitnih tikvica tako da se dobije:  
— ispitne tikvice; najmanje dvije tikvice za svaku koncentraciju 
ispitivane tvari (poželjno je najmanje 3) ili ve ći broj ispitnih 
tikvica po koncentraciji, ako se u svakom vremenu uzorkovanja uzimaju čitave tikvice (ozna čene kao F
 T ); 
— ispitne tikvice za izra čunavanje bilance mase; najmanje dvije 
tikvice za svaku ispitnu koncentraciju (ozna čene kao F  M ); 
— slijepa proba, bez ispitivane tvari; najmanje jedna tikvica za 
slijepu probu koja sadrži samo ispitnu vodu (ozna čena kao F  B ); 
— kontrola s referentnom tvari; dvije tikvice s referentnom tvari 
(npr. anilin ili natrijev benzoat, 10 μg/l) (ozna čene kao F  C ). 
Svrha kontrole s referentnom tvari je potvrditi minimalnu 
mikrobnu aktivnost. Ako je to prakti čno, može se koristiti 
radioaktivno obilježena referentna tvar, tako đer i onda kad se 
razgradnja ispitivane tvari prati kemijskim analizama;  
— sterilna kontrola; jedna ili dvije tikvice koje sadrže steriliziranu 
ispitnu vodu radi provjere mogu će abiotičke razgradnje ili drugog 
nebiološkog uklanjanja ispitivane tvari (ozna čene kao F  S ). 
Biološka se aktivnost može prekinuti obradom ispitne vode u 
autoklavu (121 °C; 20 min), dodavanjem toksi čne tvari (npr. 
natrijev azid (NaN  3 ) u koncentraciji 10 – 20 g/l, živin klorid 
(HgCl  2 ) u koncentraciji 100 mg/l ili formalin u koncentraciji 
100 mg/l) ili gama zra čenjem. Ako se koristi HgCl  2 , on se 
mora zbrinuti kao toksi čni otpad. U vodi u koju je dodana 
velika koli čina sedimenta nije lako posti ći sterilne uvjete; u 
tom se slu čaju preporu čuje višekratna obrada u autoklavu (npr. 
tri puta). Treba uzeti u obzir da se sorpcijska svojstva sedimenta 
mogu promijeniti obradom u autoklavu;  
— kontrole s otapalom, koje sadrže ispitnu vodu i ispitnu vodu s 
referentnom tvari; po dvije tikvice koje su obra đene istom koli ­ 
činom otapala uz primjenu istog postupka kao u slu čaju ispiti­
vane tvari. Svrha ove kontrole je ispitati mogu će štetne u činke 
otapala odre đivanjem razgradnje referentne tvari.  
Kod planiranja ispitivanja treba uzeti u obzir relativnu važnost pove ­ 
ćanog broja ponavljanja u odnosu na pove ćani broj uzorkovanja. 
Točan broj tikvica ovisi o metodi mjerenja razgradnje (vidi odjeljak 
1.8.9.1. stavak 3., odjeljak 1.8.9.4. i Dodatak 3.).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1338
 
U svakom vremenu uzorkovanja treba iz svake ispitne tikvice uzeti 
po dva poduzorka (npr. alikvoti od 5 ml). Ako se koristi ve ći broj 
tikvica radi uzorkovanja čitavih tikvica, u svakom vremenu uzorko ­
vanja treba uzeti najmanje dvije tikvice (vidi odjeljak 1.8.9.1. stavak 1.).
 
1.8.9.3.  Priprema tikvica za test sa suspendiranim sedimentom (fakultativno)  
U ispitne se posude dodaju potrebni volumeni ispitne vode i sedi ­
menta (prema potrebi, vidi odjeljak 1.8.5.). Priprema tikvica za test 
sa suspendiranim sedimentom je ista kao kod pelagi čkog testa (vidi 
odjeljke 1.8.9.1. i 1.8.9.2.). Poželjno je koristiti serumske boce ili tikvice sli čnog oblika. Zatvorene tikvice polažu se vodoravno na 
tresilicu. Naravno, otvorene tikvice za nehlapljive tvari koje nisu 
radioaktivno obilježene treba staviti u uspravan položaj; u ovom se slučaju preporu čuje korištenje magnetske mješalice s mješa čima 
obloženim staklom. Boce prema potrebi treba dozra čivati kako bi 
se održali porebni aerobni uvjeti.
 
1.8.9.4.  Radiokemijska odre đivanja  
Nastali  14 CO 2 mjeri se neizravno i izravno (vidi Dodatak 3.). Neiz ­
ravno odre đivanje  14 CO 2 temelji se na razlici izme đu početne aktiv ­
nosti  14 C u ispitnoj vodi odnosno suspenziji i ukupne preostale 
aktivnosti u vremenu uzorkovanja, koja se mjeri nakon zakiselja ­
vanja uzorka na pH 2 – 3 i stripiranja CO  2 . Time je anorganski 
ugljik uklonjen i preostala izmjerena aktivnost potje če od organskog 
materijala. Neizravno odre đivanje  14 CO 2 ne treba koristiti ako pret ­
vorbom ispitivane tvari nastaju zna čajni hlapljivi proizvodi (vidi 
Dodatak 3.). Nastajanje  14 CO 2 treba po mogu ćnosti izravno mjeriti 
(vidi Dodatak 3.) u najmanje jednoj ispitnoj tikvici u svakom vremenu uzorkovanja; taj postupak omogu ćuje da se provjeri i 
bilanca mase i proces biorazgradnje, ali je ograni čen na ispitivanja 
koja se provode sa zatvorenim tikvicama.
 
Ako se nastali  14 CO 2 izravno mjeri tijekom ispitivanja, na po četku 
ispitivanja treba pripremiti ve ći broj tikvica. Izravno odre đivanje  
14 CO 2 preporučuje se ako pretvorbom ispitivane tvari nastaju 
značajni hlapljivi proizvodi. Dodatne ispitne tikvice se u svakoj 
točki mjerenja zakisele na pH 2 – 3 i  14 CO 2 skuplja na unutarnjem 
ili vanjskom apsorberu (vidi Dodatak 3.).  
Koncentracije  14 C obilježene ispitivane tvari i zna čajnih proizvoda 
pretvorbe mogu se fakultativno odrediti primjenom radiokromatogra ­
fije (npr. tankoslojna kromatografija, RAD-TLC) ili HPLC-a s radio ­
kemijskom detekcijom.  
Isto tako, može se odrediti fazna razdioba preostale radioaktivnosti 
(vidi Dodatak 1.) te preostala ispitivana tvar i proizvodi pretvorbe.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1339
 
Na kraju ispitivanja treba odrediti bilancu mase izravnim mjerenjem  
14 CO 2 na zasebnim ispitnim tikvicama iz kojih se ne uzimaju uzorci 
tijekom ispitivanja (vidi Dodatak 3.).  
1.8.9.5.  Specifi čna kemijska analiza  
Ako je raspoloživa osjetljiva metoda za specifi čnu kemijsku analizu, 
primarna biorazgradnja može se ocijeniti bez radioaktivnog obilježa ­
vanja mjerenjem ukupne preostale koncentracije ispitivane tvari. Ako 
se koristi radioaktivno obilježena ispitivana tvar (za mjerenje ukupne mineralizacije), specifi čna kemijska analiza se može paralelno provo ­
diti da bi se dobile dodatne informacije i provjerio postupak. Osim 
toga, specifi čnom kemijskom analizom mogu se mjeriti proizvodi 
pretvorbe nastali razgradnjom ispitivane tvari, a to se u svakom slučaju preporu čuje u slučaju tvari koje se mineraliziraju s vremenom 
poluraspada iznad 60 dana. U svakom vremenu uzorkovanja treba 
izmjeriti i dokumentirati koncentraciju ispitivane tvari i proizvode 
pretvorbe (kao koncentraciju i kao postotak primijenjene koncentra ­
cije). U pravilu je u svakom vremenu uzorkovanja potrebno identi ­
ficirati proizvode pretvorbe koji su utvr đeni na razini ≥ 10 % primi ­
jenjene koncentracije, osim ako postoje opravdani razlozi da se to ne 
učini. Tako đer treba razmisliti o identifikaciji proizvoda pretvorbe 
čije se koncentracije stalno pove ćavaju tijekom istraživanja, čak i 
ako njihove koncentracije ne prelaze gore spomenuti prag, jer to 
može ukazivati na postojanost. Ako se smatra da bi moglo do ći do 
brze abioti čke pretvorbe ispitivane tvari (npr. hidroliza), treba 
razmisliti o analiziranju proizvoda pretvorbe u sterilnim kontrolama. O kvantifikaciji i identifikaciji proizvoda pretvorbe treba odlu čiti za 
svaki slučaj posebno i u izvješ ću navesti odgovaraju će obrazloženje. 
Postupci ekstrakcije organskim otapalom primjenjuju se u skladu s uputama danim u odgovaraju ćoj analitičkoj metodi.
 
Sve uzorke treba skladištiti na temperaturi od 2 do 4 °C bez pristupa 
zraka, ako će se analiza obaviti u roku od 24 sata (poželjno). Kod 
dužeg skladištenja uzorke treba zamrznuti ispod – 18 °C ili kemijski konzervirati. Konzerviranje uzoraka zakiseljavanjem se ne preporu ­ 
čuje jer zakiseljeni uzorci mogu biti nestabilni. Ako se uzorci ne će 
analizirati u roku od 24 sata i moraju se duže skladištiti, treba provesti istraživanje stabilnosti u uvjetima skladištenja kako bi se dokazala stabilnost kemikalija u pitanju na temperaturama ispod – 
18 °C odnosno u uvjetima konzerviranja. Ako analiti čka metoda 
uključuje ekstrakciju otapalom ili ekstrakciju krute faze (SPE), 
ekstrakciju treba obaviti neposredno nakon uzorkovanja ili nakon hladnog skladištenja u trajanju od najviše 24 sata.
 
Ovisno o osjetljivosti metode analize, ponekad su potrebni ve ći 
volumeni uzoraka od onih koji su navedeni u odjeljku 1.8.1. Ispiti ­
vanje se bez problema može obaviti s ispitnim volumenima od jedne 
litre u tikvicama od 2 – 3 litre, što omogu ćuje uzimanje uzoraka od 
cca 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1340
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. OBRADA REZULTATA  
2.1.1.  Grafi čki prikaz podataka  
Vremena uzorkovanja treba zaokružiti na cijeli broj sati (osim ako se 
tvar značajno razgra đuje u nekoliko minuta ili sati), ali ne i na cijeli 
broj dana. Napravi se linearni i polulogaritamski prikaz procijenjenih vrijednosti preostale aktivnosti ispitivane tvari (za
 14 C obilježene 
tvari) odnosno preostale koncentracije (za neobilježene tvari) u 
ovisnosti o vremenu (vidi sliku 1.a i 1.b). Ako je došlo do razgra ­
dnje, rezultati tikvica F  T se usporede s rezultatima tikvica F  S . Ako se 
srednje vrijednosti rezultata tikvica s ispitivanom tvari (F  T ) i sterilnih 
tikvica (F  S ) razlikuju za manje od 10 %, može se pretpostaviti da je 
zapažena razgradnja pretežito abioti čka. Ako je razgradnja u tikvi ­
cama F  S manja, dobivene brojke se mogu upotrijebiti za ispravak 
rezultata tikvica F  T (oduzimanjem) i procjenu stupnja biorazgradnje. 
Ako se provode fakultativne analize zna čajnih proizvoda pretvorbe, 
osim grafi čkog prikaza opadanja ispitivane tvari treba prikazati 
tvorbu i opadanje proizvoda pretvorbe.  
Trajanje faze prilagodbe t  L procijeni se iz krivulje razgradnje (polu ­
logaritamski prikaz) ekstrapolacijom linearnog dijela krivulje do 
nulte razgradnje ili, kao druga mogu ćnost, odre đivanjem vremena 
koje je potrebno da se postigne približno 10 %-tna razgradnja (vidi sliku 1.a i 1.b). Iz polulogaritamskoga grafa procijeni se 
konstanta brzine prvog reda k i njezina standardna greška linearnom 
regresijom ln (preostala aktivnost
 14 C ili koncentracija ispitivane 
tvari) u ovisnosti o vremenu. Posebice kad su u pitanju mjerenja  
14 C treba koristiti samo podatke iz po četnog linearnog dijela krivulje 
po završetku faze prilagodbe; pritom treba radije odabrati manje 
reprezentativnih podataka nego ve ći broj nesigurnijih podataka. U 
ovom smislu nesigurnost uklju čuje i greške vezane uz preporu čeno 
izravno korištenje izmjerenih vrijednosti preostale aktivnosti  14 C 
(vidi u nastavku). Ponekad je relevantno izra čunati dvije razli čite 
konstante brzine ako se razgradnja odvija u dvije faze. Za to je potrebno definirati dvije razli čite faze krivulje razgradnje. Ako se 
uzimaju uzorci iz iste tikvice, konstantu brzine k i vrijeme polura ­
spada t
 1/2 = ln2/k treba izra čunati za svaku pojedina čnu tikvicu, dok 
se u slučaju uzorkovanja čitavih tikvica za izra čun koriste prosje čne 
vrijednosti (vidi zadnji stavak odjeljka 1.8.9.2.). Ako se koristi prvi postupak, konstantu brzine i vrijeme poluraspada treba navesti 
zasebno za svaku pojedina čnu tikvicu i kao prosje čnu vrijednost sa 
standardnom greškom. Ako se koriste visoke koncentracije ispitivane tvari, krivulja razgradnje može znatno odstupati od pravca (polulo ­
garitamski graf) i možda ne će vrijediti kinetika prvog reda. U tom 
slučaju nema smisla odre đivati vrijeme poluraspada. Me đutim, za 
ograničeni raspon podataka mogu će je primijeniti kinetiku pseudo ­
prvog reda i procijeniti vrijeme polurazgradnje DT
 50 (vrijeme 
potrebno da se postigne 50 %-tna razgradnja). Pritom ipak treba 
imati na umu da na temelju tog DT  50 nije mogu će predvidjeti 
vremenski tijek razgradnje izvan odabranog raspona podataka jer se radi o vrijednosti koja opisuje samo odre đeni skup podataka. 
Analitički alati koji olakšavaju statisti čke izračune i prilago đavanje 
krivulja su lako dostupni te se stoga preporu čuje korištenje takvog 
softvera.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1341
 
Ako se provode specifi čne kemijske analize, treba procijeniti 
konstante brzine i vremena poluraspada za primarnu razgradnju na 
način kako je je gore opisano za ukupnu mineralizaciju. Ako je 
primarna razgradnja ograni čavajući proces, ponekad se mogu koristiti 
točke podataka iz čitavog tijeka razgradnje. To je stoga što se ovdje 
provode izravna mjerenja za razliku od mjerenja aktivnosti  14 C. 
Ako se koriste  14 C obilježene tvari, bilancu mase treba izraziti u 
postotku primijenjene po četne koncentracije barem na kraju 
ispitivanja.  
2.1.2.  Preostala aktivnost  
Kad se  14 C obilježeni dio organske tvari biološki razgra đuje, najve ći 
dio 14 C pretvara se u  14 CO 2 , dok se drugi dio troši na rast biomase 
i/ili sintezu izvanstani čnih metabolita. Prema tomu, „potpuna” 
biorazgradnja tvari ne rezultira 100 %-tnom pretvorbom njezinog ugljika u
 14 CO 2 . 14 C ugrađen u proizvode biosinteze kasnije se 
polako osloba đa kao  14 CO 2 zbog „sekundarne mineralizacije”. Iz 
tog su razloga na grafi čkim prikazima preostale aktivnosti organskog  
14 C (izmjerene nakon stripiranja CO  2 ) odnosno nastalog  14 CO 2 u 
ovisnosti o vremenu vidljivi „repovi” po završetku razgradnje. To komplicira kineti čko tuma čenje podataka i stoga za procjenu 
konstante brzine razgradnje u pravilu treba koristiti samo po četni 
dio krivulje (po završetku faze prilagodbe, a prije nego što se postigne približno 50 %-tna razgradnja). Ako se ispitivana tvar razgrađuje, ukupna preostala aktivnost organskog
 14 C je uvijek 
viša od aktivnosti  14 C povezane s preostalom nepromijenjenom ispi ­
tivanom tvari. Ako se ispitivana tvar razgra đuje reakcijom prvog 
reda i ako se stalni udio ( α) mineralizira u CO  2 , početni nagib 
krivulje nestajanja  14 C (ukupni organski  14 C u vremenu) je α puta 
nagib odgovaraju će krivulje za koncentraciju ispitivane tvari (ili 
točnije  14 C obilježenog dijela ispitivane tvari). Prema tomu, 
primjenom neispravljenih vrijednosti mjerenja ukupne aktivnosti 
organskog  14 C dobiva se konzervativna procjena konstante brzine 
razgradnje. Postupci za procjenu koncentracija ispitivane tvari iz izmjerene radiokemijske aktivnosti na temelju razli čitih pojednostav ­
ljujućih pretpostavki opisani su u literaturi pod 2., 9., 10. i 11. Ti se 
postupci najlakše primjenjuju kod brzo razgradivih tvari.
 
2.2. TUMA ČENJE REZULTATA  
Ako se utvrdi da je k neovisan o pove ćanju koncentracije (tj. ako je 
izračunani k približno jednak pri razli čitim koncentracijama ispiti ­
vane tvari), može se po ći od pretpostavke da je konstanta brzine 
prvog reda reprezentativna za primijenjene ispitne uvjete tj. za ispi ­
tivanu tvar, vodeni uzorak i ispitnu temperaturu. U kojoj se mjeri rezultati mogu uop ćiti odnosno ekstrapolirati na druge sustave treba 
ocijeniti stru čnom prosudbom. Ako se koristi visoka koncentracija 
ispitivane tvari i razgradnja stoga ne slijedi kinetiku prvog reda, 
podaci se ne će moći koristiti za izravnu procjenu konstante brzine 
prvog reda odnosno odgovaraju ćeg vremena poluraspada. Ipak, 
podaci dobiveni u ispitivanju s visokom koncentracijom ispitivane 
tvari mogu se iskoristiti za procjenu stupnja ukupne mineralizacije 
i/ili utvrđivanje i kvantifikaciju proizvoda pretvorbe.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1342
 
Ako su poznati gubici u procesima razli čitim od biorazgradnje (npr. 
hidroliza ili isparavanje), oni se mogu oduzeti od neto gubitaka utvr ­ 
đenih tijekom ispitivanja kako bi se dobila približna procjena bioraz ­
gradnje. Podaci o hidrolizi mogu se dobiti npr. pomo ću sterilne 
kontrole ili iz paralelnog ispitivanja s višom koncentracijom ispiti ­
vane tvari.  
Neizravno i izravno odre đivanje  14 CO 2 (odjeljak 1.8.9.4. i Dodatak 
3.) može se koristiti samo za mjerenje stupnja mineralizacije ispiti ­
vane tvari u CO  2 . Radiokromatografija (RAD-TLC) i HPLC mogu se 
koristiti za analizu koncentracija  14 C obilježene ispitivane tvari i 
tvorbe zna čajnih proizvoda pretvorbe (odjeljak 1.8.9.4. stavak 3.). 
Izravna procjena vremena poluraspada mogu ća je samo ako nisu 
prisutni zna čajni proizvodi pretvorbe (definirani kao ≥ 10 % primije ­
njene koli čine ispitivane tvari). Ako su prisutni zna čajni proizvodi 
pretvorbe u smislu ove definicije, potrebno je detaljno vrednovanje podataka. To može uklju čivati ponovljeno ispitivanje i/ili utvr đivanje 
proizvoda pretvorbe (vidi odjeljak 1.8.9.5. prvi stavak), osim ako se 
sudbina proizvoda pretvorbe može prili čno dobro odrediti na temelju 
iskustva (npr. informacije o putu razgradnje). Budu ći da udio ugljika 
ispitivane tvari koji prelazi u CO
 2 nije uvijek jednak (što u velikoj 
mjeri ovisi o koncentraiji ispitivane tvari i drugih raspoloživih 
supstrata, ispitnim uvjetima i mikrobnoj zajednici), ovaj test ne omogućuje izravnu procjenu potpune biorazgradnje kao što je to 
slučaj kod testa opadanja DOC-a, ali rezultat je sli čan onomu koji 
se dobije respirometrijskim testom. Stupanj mineralizacije će, prema 
tomu biti manji ili jednak minimalnom stupnju potpune biorazgra ­
dnje. Da bi se dobila cjelovitija slika potpune biorazgradnje (minera ­
lizacija i ugradnja u biomasu), na kraju ispitivanja treba provesti 
analizu fazne razdiobe
 14 C (vidi Dodatak 1.). Čestični 14 C sastojat 
će se od  14 C ugrađenog u bakterijsku biomasu i  14 C sorbiranog na 
organske čestice.  
2.3. VALJANOST ISPITIVANJA  
Ako se referentna tvar ne razgradi u o čekivanom vremenskom 
razdoblju (za anilin i natrijev benzoat u pravilu manje od dva tjedna), treba posumnjati u valjanost ispitivanja i ispitivanje podvrgnuti dodatnim provjerama, ili ga ponoviti s novim vodenim uzorkom. 
U ISO prstenastom testu ove metode u kojemu je sudjelovalo 
sedam laboratorija iz raznih dijelova Europe, prilago đene konstante 
brzine razgradnje za anilin kretale su se izme đu 0,3 i 1,7 dan
 –1 , 
prosječno 0,8 dan  –1 , pri temperaturi od 20 °C uz standardnu 
grešku od ± 0,4 d  –1 (t 1/2 = 0,9 dana). Uobi čajena vremena prilagodbe 
bila su izme đu 1 i 7 dana. Kod ispitanih voda zabilježena je bakte ­
rijska biomasa od 10  3 do 10  4 jedinica koje tvore kolonije (Colony 
Forming Units, CFU) po ml. Brzine razgradnje u srednjoeuropskim 
vodama koje su bogate nutrijentima bile su više nego u nordijskim 
oligotrofnim vodama, što može biti posljedica razlike u trofi čkom 
stanju ili ranijeg izlaganja kemikalijama.  
Kod radioaktivno obilježenih tvari ukupno iskorištenje (bilanca 
mase) na kraju pokusa trebalo bi iznositi izme đu 90 % i 110 %, 
dok bi kod neobilježenih tvari po četno iskorištenje na po četku 
pokusa trebalo biti izme đu 70 % i 110 %. Ipak, navedena podru čja 
treba shvatiti kao ciljne vrijednosti i ne treba ih koristiti kao kriterij 
za prihva ćanje ispitivanja.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1343
 
3. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
U izvješću o ispitivanju treba biti jasno navedena vrsta ispitivanja 
koje se provodi – pelagi čki test ili test sa suspendiranim sedimentom; 
osim toga, izvješ će o ispitivanju mora sadržavati barem sljede će 
informacije:  
Ispitivana tvar i referentna(-e) tvar(i):  
— uobičajeni nazivi, kemijski nazivi (po mogu ćnosti naziv IUPAC 
i/ili CAS), CAS brojevi, strukturne formule (uz naznaku položaja  
14 C, ako se koristi radioaktivno obilježena tvar) i relevantna 
fizikalno-kemijska svojstva ispitivane i referentne tvari (vidi odjeljke 1.5. i 1.6.),
 
— kemijski nazivi, CAS brojevi, strukturne formule (uz naznaku 
položaja  14 C, ako se koristi radioaktivno obilježena tvar) i rele ­
vantna fizikalno-kemijska svojstva tvari koje se koriste kao stan ­
dardi za identifikaciju i kvantifikaciju proizvoda pretvorbe,  
— čistoća (nečistoće) ispitivanih i referentnih tvari,  
— radiokemijska čistoća obilježene kemikalije i specifi čna aktivnost 
(prema potrebi).  
Površinska voda:  
Za vodeni uzorak treba navesti barem sljede će podatke:  
— lokacija i opis mjesta uzorkovanja uklju čujući, po mogu ćnosti, 
povijest one čišćenja,  
— datum i vrijeme uzimanja uzorka,  
— nutrijenti (ukupni N, amonij, nitrit, nitrat, ukupni P, otopljeni 
ortofosfat),  
— dubina uzorkovanja,  
— izgled uzorka (npr. boja, mutno ća), 
— DOC i TOC,  
— BPK,  
— temperatura i pH na mjestu uzorkovanja u vrijeme uzorkovanja,  
— kisik ili redoks potencijal (obvezno samo ako aerobni uvjeti nisu 
očiti), 
— salinitet ili provodljivost (u slu čaju morske i bo čate vode),  
— suspendirana kruta tvar (u slu čaju mutnog uzorka),  
— po mogu ćnosti i druge relevantne informacije o mjestu uzorko ­
vanja u trenutku uzorkovanja (npr. aktualni ili povijesni podaci o 
brzini protoka rijeka ili morskih struja, zna čajnija ispuštanja 
otpadnih voda u blizini i vrsta otpadnih voda, vremenski uvjeti prije uzorkovanja),
 
i fakultativno:  
— mikrobna biomasa (npr. izravno brojenje tehnikom bojenja akri ­
dinskom bojama ili jedinice koje tvore kolonije),  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1344
 
— anorganski ugljik,  
— koncentracija klorofila kao specifi čna procjena biomase algi.  
Ako se provodi test sa suspendiranim sedimentom, treba navesti i 
sljedeće podatke o sedimentu:  
— dubina uzorkovanja sedimenta,  
— izgled sedimenta (npr. obojen, muljevit, praškast, pjeskovit),  
— tekstura (npr. % krupnog pijeska, finog pijeska, praha i ilova če), 
— suha masa u g/l suspendirane krute tvari, koncentracija TOC-a ili 
gubitak mase nakon zapaljenja kao mjera sadržaja organske tvari,  
— pH,  
— kisik ili redoks potencijal (obvezno samo ako aerobni uvjeti nisu 
očiti). 
Ispitni uvjeti:  
— vremenski razmak izme đu uzorkovanja i uporabe u laboratorij ­
skom ispitivanju, skladištenje uzorka i prethodna obrada uzorka, datumi provedbe istraživanja,
 
— primijenjena koli čina ispitivane tvari, ispitna koncentracija i refe ­
rentna tvar,  
— način primjene ispitivane tvari, uklju čujući uporabu otapala 
(prema potrebi),  
— volumen upotrijebljene površinske vode i sedimenta (ako se kori ­
sti) i volumen uzorka koji se uzima na analizu u svakom 
vremenu uzorkovanja,  
— opis ispitnog sustava koji se koristi.  
Ako se ispitivanje ne može provesti u mraku, informacije o uvjetima 
„difuzne rasvjete”:  
— informacije o metodi(-ama) koje su upotrijebljene za pripremu 
sterilnih kontrola (npr. temperatura, vrijeme i broj obrada u auto ­
klavu),  
— temperatura inkubacije,  
— informacije o analiti čkim tehnikama i metodi(-ama) koje se 
koriste za radiokemijska mjerenja i provjeru bilance mase te 
mjerenja fazne razdiobe (ako se provode),  
— broj ponavljanja.  
Rezultati:  
— postotak iskorištenja (vidi odjeljak 1.7.1.),  
— ponovljivost i osjetljivost primijenjenih analiti čkih metoda, uklju ­ 
čujući granicu detekcije (LOD) i granicu kvantifikacije (LOQ) 
(vidi odjeljak 1.7.2.),  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1345
 
— prikaz svih izmjerenih podataka (uklju čujući vremena uzorkova ­
nja) i izra čunanih vrijednosti u tabli čnom obliku i krivulje razgra ­
dnje; za svaku ispitnu koncentraciju i svako ponavljanje treba navesti koeficijent linearne korelacije za nagib logaritamskoga grafa, procijenjenu fazu prilagodbe i konstantu brzine prvog 
reda ili pseudoprvog reda (po mogu ćnosti) te odgovaraju će 
vrijeme polurazgradnje (odnosno vrijeme poluraspada t
 50 ), 
— prosjeci rezultata pojedina čnih ponavljanja za odgovaraju će 
vrijednosti, npr. dužina faze prilagodbe, konstanta brzine razgra ­
dnje i vrijeme polurazgradnje (ili t  50 ), 
— kategorizirati sustav kao neprilago đeni sustav ili prilago đeni 
sustav s obzirom na izgled krivulje razgradnje i mogu ći utjecaj 
ispitne koncentracije,  
— rezultati završne provjere bilance mase i rezultati mjerenja fazne 
razdiobe (prema potrebi),  
— udio mineraliziranog  14 C i, ako se koriste specifi čne analize, 
konačna razina primarne razgradnje,  
— utvrđivanje, molarna koncentracija i postotak primijenjene 
koncentracije i zna čajnih proizvoda pretvorbe (prema potrebi) 
(vidi odjeljak 1.8.9.5. prvi stavak),  
— predloženi put pretvorbe, prema potrebi,  
— rasprava rezultata.  
4. LITERATURA  
1. OECD TG 309 (2004.) Aerobic Mineralisation in surface water 
– Simulation Biodegradation Test.  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999.) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
3. Ispitna metoda C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
4. Ispitna metoda C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
5. OECD (1993.). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999.). Water quality – Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC).
 
7. ISO 10634 (1995.). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous 
medium.
 
8. OECD (2000.). Guidance Document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No 22.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984.). Models for mineralisa ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394-401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000.). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999.). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/sedi ­
ment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1347
 
Dodatak 1.  
Fazna razdioba  14 C 
U svrhu provjere postupka, rutinska mjerenja aktivnosti preostalog ukupnog 
organskog  14 C (TOA) treba nadopuniti mjerenjima bilance mase s izravnim 
određivanjem nastalog  14 CO 2 koji se skuplja u apsorberu (vidi Dodatak 3.). 
Potvrda tvorbe  14 CO 2 sama je po sebi izravan dokaz biorazgradnje, za razliku 
od abiotičke razgradnje i drugih mehanizama gubitaka, kao što je isparavanje ili 
sorpcija. Dodatne informacije koje mogu biti korisne za opisivanje procesa 
biorazgradnje mogu se dobiti mjerenjem razdiobe TOA izme đu otopljenog 
stanja (aktivnost otopljenog organskog  14 C, DOA) i čestičnog stanja (aktivnost 
čestičnog organskog  14 C, POA) nakon odvajanja čestica membranskom filtra ­
cijom ili centrifugiranjem. POA se sastoji od ispitivane tvari sorbirane na 
mikrobnu biomasu i druge čestice te od ugljika sadržanog u ispitivanoj tvari 
koji se koristi za sintezu novog stani čnog materijala i tako ugra đuje u čestičnu 
frakciju biomase. Tvorba otopljenog organskog  14 C materijala može se procijeniti 
kao DOA na kraju biorazgradnje (plato krivulje razgradnje u ovisnosti o vreme ­
nu). 
Faznu razdiobu preostalog  14 C u odabranim uzorcima treba procijeniti filtrira ­
njem uzoraka na membranskom filtru 0,22 μm ili 0,45 μm izrađenom od mate ­
rijala koji ne adsorbira zna čajne koli čine ispitivane tvari (npr. polikarbonatni 
filteri). Ako dolazi do znatne sorpcije ispitivane tvari na filter koja se ne može 
zanemariti (ovo treba provjeriti prije pokusa), umjesto filtriranja se može koristiti centrifugiranje pri velikoj brzini (2 000 g; 10 min).
 
S filtratom odnosno centrifugatom se postupa kao s nefiltriranim uzorcima iz 
Dodatka 3. Membranski se filteri otope u prikladnoj scintilacijskoj teku ćini i broji 
na uobičajeni način, u pravilu uz ispravak gašenja („quenching”) primjenom 
vanjskog standarda („external standard ratio method”), ili se upotrijebi oksida ­
cijsko sredstvo za uzorak. Ako se koristi centrifugiranje, nastalu peletu čestične 
frakcije treba resuspendirati u 1 – 2 ml destilirane vode i prenijeti u scintilacijsku 
bočicu. Zatim se posuda dvaput ispere s 1 ml destilirane vode i voda od pranja 
prenese u bo čicu. Suspenzija se prije brojenja metodom teku ćinske scintilacije 
može prema potrebi obložiti gelom.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1348
 
Dodatak 2.  
Polukontinuirani postupak  
U slučaju postojanih tvari ponekad je potrebno produžiti vrijeme inkubacije i do 
nekoliko mjeseci da bi se postigla dostatna razgradnja. Ispitivanje u pravilu ne bi 
smjelo trajati duže od 60 dana, osim ako se ispitna suspenzija obnavlja kako bi se 
održala izvorna svojstva vodenog uzorka. Ipak, trajanje ispitivanja se može produžiti do najviše 90 dana i bez obnavljanja ispitne suspenzije ako je razgra ­
dnja ispitivane tvari zapo čela unutar prvih 60 dana.
 
Kod dugotrajnije inkubacije raznolikost mikrobne zajednice može se smanjiti 
zbog razli čitih mehanizama gubitaka i mogu ćeg iscrpljenja zaliha esencijalnih 
nutrijenata i primarnih uglji čnih supstrata u vodenom uzorku. Stoga se kod 
tvari koje se sporo razgra đuju preporu čuje primjena polukontinuiranog postupka 
kako bi se mogla pravilno odrediti brzina razgradnje. Ispitivanje treba zapo četi u 
polukontinuiranom postupku ako se na temelju ranijih iskustava o čekuje da će za 
20 %-tnu razgradnju tvari biti potrebno razdoblje inkubacije od tri mjeseca. Druga je mogu ćnost da se uobi čajeni šaržni test pretvori u polukontinuirani 
ako tijekom približno 60 dana ispitivanja šaržnim postupkom nije došlo do 
razgradnje ispitivane tvari. Polukontinuirani postupak se može prekinuti i ispiti ­
vanje nastaviti šaržnim postupkom kad se zabilježi zna čajna razgradnja (npr. 
> 20 %).
 
U polukontinuiranom postupku se svaka dva tjedna otprilike jedna tre ćina volu­
mena ispitne suspenzije zamjenjuje svježe prikupljenom vodom u koju je dodana 
ispitivana tvar u po četnoj koncentraciji. Ako se koristi fakultativni test sa suspen ­
diranim sedimentom, zamjenskoj vodi treba dodati i sediment u po četnoj koncen ­
traciji (izme đu 0,01 i 1 g/l). Važno je naglasiti da se u slu čaju provedbe testa sa 
suspendiranim česticama sedimenta sustav mora održavati u potpunoj suspenziji i 
tijekom obnavljanja vode te da vrijeme zadržavanja mora biti jednako za krute tvari i vodu, jer se u protivnome gubi predvi đena sličnost s homogenim vodenim 
sustavom bez čvrstih faza. Stoga je kod primjene polukontinuiranog postupka 
poželjno da se po četna koncentracija suspendiranog sedimenta odabere iz donjeg 
segmenta utvr đenog podru čja.
 
Ispitivana se tvar mora dodavati tako da kod djelomi čnog obnavljanja ispitne 
suspenzije ne do đe do prekora čenja početne koncentracije ispitivane tvari kako bi 
se izbjegla prilagodba koja se često javlja pri visokim koncentracijama ispitivane 
tvari. Budu ći da postupak uklju čuje i ponovnu inokulaciju i nadokna đivanje 
potrošenih nutrijenata i primarnih supstrata, izvorna mikrobna raznolikost se ponovno uspostavlja i ispitivanje se teoretski može nastavljati beskona čno. 
Kod polukontinuiranog postupka važno je napomenuti da se preostala koncen ­
tracija ispitivane tvari mora ispraviti s obzirom na koli čine ispitivane tvari koje se 
dodaju i uklanjaju u svakom postupku obnavljanja. Ukupna koncentracija ispiti ­
vane tvari i koncentracija otopljene ispitivane tvari mogu se naizmjeni čno kori­
stiti u slu čaju spojeva kod kojih se ne dolazi do znatnije sorpcije. Sorpcija je u 
utvrđenim uvjetima (0,1 – 1 g krute tvari/l) bezna čajna (< 5 %) kod tvari s log 
Kow < 3 (vrijedi za neutralne, lipofilne spojeve). To se može vidjeti i na ra čun­
skom primjeru u nastavku. 0,1 g/l krute tvari otprilike odgovara 10 mg ugljika po 
litri (udio ugljika f
 C = 0,01). Pretpostavimo da je:  
Log K  ow (ispitivane tvari) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
podjelni koeficijent K  d = f C × K  oc 
tada je otopljena frakcija ukupne koncentracije (C-voda (C  w )/C-ukupni (C  t )): 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  -3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1349
 
Dodatak 3.  
Određivanje  14 CO  2 
Neizravno odre đivanje  14 CO  2 
Neizravna metoda kod rutinskih mjerenja u pravilu zahtijeva manje vremena, a 
usto je i najpreciznija u slu čaju tvari koje nisu hlapljive i ne prelaze u hlapljive 
proizvode. Nefiltrirani uzorci od npr. 5 ml jednostavno se prenesu u scintilacijske 
bočice. Prikladna po četna aktivnost u uzorcima je 5 000 dpm – 10 000 dpm (80 – 
170 Bq), a minimalna po četna aktivnost iznosi oko 1 000 dpm. CO  2 se stripira 
nakon zakiseljavanja na pH 2 – 3 s 1 – 2 kapi koncentrirane H  3 PO 4 ili HCl. 
Stripiranje CO  2 može se provesti upuhivanjem mjehuri ća zraka oko ½ do 1 sata. 
Kao druga mogu ćnost, bočice se snažno protresaju 1 – 2 sata (npr. na tresilici s 
mikropločama) ili se uz lakše protresanje ostave na tresilici preko no ći. Učinko­
vitost postupka odvajanja CO  2 treba provjeriti (produženjem vremena dozra či­
vanja ili tresenja). Zatim se doda scintilacijska teku ćina prikladna za brojenje 
vodenih uzoraka, uzorak se homogenizira na vrtložnoj mješalici i odredi radioak ­
tivnost brojenjem metodom teku ćinske scintilacije te oduzme osnovna aktivnost 
utvrđena u slijepim probama (F  B ). Ako ispitna voda nije jako obojena i ne sadrži 
visoku koncentraciju čestica, uzorci će u pravilu pokazivati ujedna čeno gašenje 
(„quenching”) i bit će dovoljno provesti ispravke za gašenje primjenom vanjskog 
standarda. Ako je ispitna voda jako obojena, ispravak za gašenje se ponekad mora provesti dodavanjem unutarnjeg standarda. U slu čaju visoke koncentracije 
čestica nije uvijek mogu će dobiti homogenu otopinu odnosno gel, ili se mogu 
javiti velike razlike u gašenju me đu uzorcima. U tom se slu čaju na ispitni mulj 
može primijeniti metoda brojenja opisana u nastavku. Ako se koristi test sa suspendiranim sedimentom, mjerenje
 14 CO 2 može se provesti neizravno tako 
da se uzme homogeni uzorak ispitne vode/suspenzije od 10 ml i faze odvoje 
centrifugiranjem na prikladnoj brzini (npr. 15 minuta na 40 000 m/s  2 ). Zatim se s 
vodenom fazom postupa kako je gore opisano. Aktivnost  14 C u čestičnoj 
fazi (POA) odre đuje se tako da se sediment resuspendira u malom volumenu 
destilirane vode, prenese u scintilacijske bo čice i zatim doda scintilacijska teku ­ 
ćina da bi se dobio gel (za ovo su predvi đene posebne scintilacijske teku ćine). 
Ovisno o vrsti čestica (npr. sadržaj organskog materijala), uzorak se eventualno 
može ostaviti preko no ći da se otopi u sredstvu za otapanje tkiva, zatim homo ­
genizirati na vrtložnoj mješalici i onda dodati scintilacijsku teku ćinu. Druga je 
mogućnost da se POA odredi sagorijevanjem viška kisika pomo ću oksidacijskog 
sredstva. Kod brojenja treba uvijek uklju čiti unutarnje standarde, a ispravke za 
gašenje ponekad je potrebno napraviti dodavanjem unutarnjeg standarda u svaki pojedini uzorak.
 
Izravno odre đivanje  14 CO  2 
Ako se nastali  14 CO 2 mjeri izravno, na po četku ispitivanja treba pripremiti više 
ispitnih tikvica i u svakoj mjernoj to čki uzimati čitave tikvice, zakiseliti na pH 2 
– 3 i skupljati  14 CO 2 u unutarnjem apsorberu (koji se stavlja u svaku ispitnu 
tikvicu na po četku ispitivanja) ili vanjskom apsorberu. Kao apsorpcijsko sredstvo 
može se koristiti alkalijska tvar (npr. otopina 1 N NaOH ili peleta NaOH), 
etanolamin ili apsorberi na bazi etanolamina koji su dostupni na tržištu. Kod 
izravnog mjerenja  14 CO 2 tikvice moraju biti zatvorene npr. zatvara čima od 
butilne gume.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1350
 
Slika 1.a  
Primjer aritmeti čkog prikaza podataka (preostala aktivnost u ovisnosti o vremenu)
  
Slika 1.b  
Primjer polulogaritamskog prikaza podataka (ln preostale aktivnosti u ovisnosti o vremenu)
  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1351
 
C.26.  TEST INHIBICIJE RASTA  LEMNA  SP. 
1. METODA  
Ova metoda odgovara smjernici OECD TG 221 (2006) (1.). Me đu 
tijelima EU-a postoji op ćenita suglasnost da je u slu čaju jako 
obojenih tvari test  Lemna  sp. prikladna alternativa testu s algama 
(2.) (3.).  
1.1. UVOD  
Ova ispitna metoda namijenjena je ocjenjivanju toksi čnosti tvari za 
slatkovodne biljke roda  Lemna  (vodena le ća). Ona se temelji na 
postojećim smjernicama (4.) (5.) (6.) (7.) (8.) (9.), ali uklju čuje 
neke izmjene tih metoda u svjetlu posljednjih istraživanja i savjeto ­
vanja o nizu klju čnih pitanja. Predložena metoda validirana je me đu­
narodnim prstenastim testom (10.).  
U ovoj su ispitnoj metodi opisana toksikološka ispitivanja s vrstama  
Lemna gibba  i Lemna minor  koje su do sada ve ć znatno prou čavane 
i predmet su gore spomenutih standarda. Taksonomija  Lemna  spp. 
složena je zbog velikog broja razli čitih fenotipa. Iako se u odgovoru 
na toksično djelovanje kod vrsta  Lemna  može javiti odre đena 
genetska varijabilnost, trenuta čno nema dovoljno podataka o tom 
izvoru varijabilnosti da bi se mogao preporu čiti neki odre đeni klon 
za ovu ispitnu metodu. Valja napomenuti da se ispitivanje ne 
provodi akseni čno, ali se u pojedinim fazama ispitnog postupka 
poduzimaju koraci kako bi se one čišćenje drugim organizmima 
svelo na najmanju mogu ću mjeru.  
Opisani su detalji ispitivanja s obnavljanjem (polustati čko i proto čno) 
i bez obnavljanja (stati čko) ispitne otopine. Ovisno o ciljevima ispi ­
tivanja i regulatornim zahtjevima, preporu čuje se da se ispita mogu ć­
nost primjene polustati čkih i proto čnih metoda (npr. kod tvari koje se 
brzo gube iz otopine zbog isparavanja, fotokemijske razgradnje, talo ­ 
ženja ili biorazgradnje). Dodatne smjernice mogu se prona ći u lite­
raturi (11.).  
1.2. DEFINICIJE  
Za potrebe ove ispitne metode primjenjuju se sljede će definicije i 
skraćenice:  
Biomasa  je suha masa žive tvari u populaciji. U ovoj se metodi u 
pravilu mjere zamjenski parametri biomase, kao što je broj listova i 
lisna površina, pa se izraz „biomasa” odnosi i na te zamjenske mjere.  
Kloroza  je žućenje lisnog tkiva.  
Klon  je organizam ili stanica nastala od jedne jedinke nespolnim 
razmnožavanjem. Prema tomu, jedinke potekle od istog klona su genetski istovjetne.
 
Kolonija  su svi listovi majke i k ćeri (obično 2 do 4) koji su me đu­
sobno spojeni. Ponekad se se naziva i biljkom.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1352
 
EC x je koncentracija ispitivane tvari otopljene u ispitnom mediju 
koja rezultira x %-tnim (npr. 50 %) smanjenjem rasta  Lemna  
unutar odre đenog razdoblja izlaganja (koje treba izri čito navesti 
ako je razli čito od punog odnosno uobi čajenog trajanja ispitivanja). 
Da bi se nedvosmisleno pokazalo je li vrijednost EC dobivena iz 
brzine rasta ili iz prirasta, koristi se simbol „E  r C” za brzinu rasta 
(„growth rate”) i „E  y C” za prirast („yield”), iza čega se navodi 
mjerna varijabla npr. E  r C (broj listova).  
Protočno ispitivanje  je ispitivanje gdje se ispitne otopine stalno 
zamjenjuju.  
List je zasebna/pojedina čna „listasta” struktura vodene le će. To je 
najmanja reproduktivno sposobna jedinica odnosno jedinka.  
Nabreklina  su grbavi ili nabrekli listovi.  
Rast  je povećanje mjerne varijable, npr. broj listova, suha masa, 
mokra masa ili lisna površina, u razdoblju ispitivanja.  
Brzina rasta (prosje čna specifi čna brzina rasta)  je logaritamsko 
povećanje biomase tijekom razdoblja izlaganja.  
Najniža koncentracija s vidljivim u činkom (LOEC)  je najniža 
ispitana koncentracija kod koje je uo čen statisti čki značajan uspora ­
vajući učinak na rast (pri p < 0,05) u usporedbi s kontrolom u 
određenom razdoblju izlaganja. Ipak, sve ispitne koncentracije 
iznad LOEC-a moraju imati jednak ili ve ći štetan u činak od onoga 
koji je zabilježen pri LOEC-u. Ako se ova dva uvjeta ne mogu ispuniti, treba navesti detaljno obrazloženje za odabir LOEC-a (a time i NOEC-a).
 
Mjerna varijabla  je bilo koja varijabla koja se mjeri kako bi se 
izrazila krajnja to čka ispitivanja primjenom jedne ili više varijabli 
odgovora. Mjerne varijable kod ove metode su broj listova, lisna površina, svježa masa i suha masa.
 
Monokultura  je kultura koja sadrži jednu biljnu vrstu.  
Nekroza  je mrtvo (tj. bijelo ili vodom natopljeno) lisno tkivo.  
Najviša koncentracija bez vidljivog u činka (NOEC)  je ispitna 
koncentracija neposredno ispod LOEC-a.  
Fenotip  su vidljive zna čajke organizma odre đene interakcijom gena i 
okoliša.  
Varijabla odgovora  je varijabla za procjenu toksi čnosti izvedena iz 
bilo koje mjerene varijable koja opisuje biomasu primjenom 
različitih računskih metoda. Kod ove metode brzine rasta i prirast 
su varijable odgovora izvedene iz mjernih varijabli kao što su broj listova, lisna površina, svježa masa i suha masa.
 
Polustati čko ispitivanje (ispitivanje s obnavljanjem)  je ispitivanje 
gdje se ispitna otopina zamjenjuje periodi čki, u odre đenim 
razmacima, tijekom ispitivanja.  
Statičko ispitivanje  je ispitna metoda gdje se ispitna otopina ne 
obnavlja tijekom ispitivanja.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1353
 
Krajnja to čka ispitivanja  je opći faktor koji se mijenja u odnosu na 
kontrolu zbog djelovanja ispitivane tvari kao cilj ispitivanja. Kod ove 
metode krajnja to čka ispitivanja je inhibicija rasta koja se može 
izraziti razli čitim varijablama odgovora koje se temelje na jednoj 
ili više mjernih varijabli.  
Ispitni medij  je cjelokupni sinteti čki uzgojni medij u kojem ispitne 
biljke rastu kad se izlože ispitivanoj tvari. Ispitivana se tvar u pravilu 
otapa u ispitnom mediju.  
Prirast  je vrijednost mjerne varijable kojom se izražava razlika 
između biomase na kraju razdoblja izlaganja i mjerne varijable na 
početku razdoblja izlaganja.  
1.3. NA ČELO ISPITIVANJA  
Eksponencijalno rastu će biljne kulture roda  Lemna  puste se da rastu 
kao monokulture u razli čitim koncentracijama ispitivane tvari u 
razdoblju od sedam dana. Cilj ispitivanja je kvantificirati u činke 
tvari na vegetativni rast tijekom toga razdoblja ocjenjivanjem odabranih mjernih varijabli. Broj listova je primarna mjerna varija ­
bla. Osim toga, mjeri se barem još jedna mjerna varijabla (ukupna 
lisna površina, suha masa ili svježa masa), budu ći da neke tvari 
znatno više utje ču na neke druge mjerne varijable nego na broj 
listova. Da bi se kvantificirali u činci tvari, rast u ispitnim otopinama 
uspoređuje se s rastom u kontrolama i odre đuje koncentracija koja 
izaziva odre đeni postotak (x %) inhibicije rasta (npr. 50 %), koja se 
izražava kao EC
 x (npr. EC  50 ). 
Krajnja to čka ispitivanja je inhibicija rasta koja se izražava kao 
logaritamsko pove ćanje mjerne varijable (prosje čna specifi čna 
brzina rasta) u razdoblju izlaganja. Iz prosje čnih specifi čnih brzina 
rasta zabilježenih u nizu ispitnih otopina odre đuje se koncentracija 
koja izaziva odre đeni postotak (x %) inhibicije brzine rasta (npr. 
50 %) koja se izražava kao E  r C x (npr. E  r C 50 ). 
U ovoj se ispitnoj metodi koristi i prirast kao dodatna varijabla 
odgovora koja je potrebna da bi se ispunili odre đeni regulatorni 
zahtjevi u nekim državama. On je definiran kao razlika izme đu 
mjernih varijabli na kraju razdoblja izlaganja i mjernih varijabli na 
početku razdoblja izlaganja. Iz prirasta zabilježenog u nizu ispitnih 
otopina izra čunava se koncentracija koja izaziva odre đeni postotak 
(x %) inhibicije prirasta (npr. 50 %), koja se izražava kao E  y C x (npr. 
E y C 50 ). 
Osim toga, može se statisti čki odrediti najniža koncentracija s 
vidljivim u činkom (LOEC) i najviša koncentracija bez vidljivog 
učinka (NOEC).  
1.4. INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
Mora biti raspoloživa analiti čka metoda odgovaraju će osjetljivosti za 
kvanitifikaciju tvari u ispitnom mediju.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1354
 
Za određivanje ispitnih uvjeta korisno je imati informacije o ispiti ­
vanoj tvari kao što su strukturna formula, čistoća, topljivost u vodi, 
stabilnost u vodi i na svjetlosti, pK  a , K ow , tlak pare i biorazgradivost. 
Topljivost u vodi i tlak pare mogu se upotrijebiti za izra čunavanje 
konstante Henryjevog zakona, iz koje se može zaklju čiti treba li u 
razdoblju ispitivanja o čekivati zna čajne gubitke ispitivane tvari. Na 
taj se način prema potrebi mogu poduzeti odre đene mjere za nadzor 
tih gubitaka. Ako su informacije o topljivosti i stabilnosti ispitivane tvari nesigurne, preporu čuje se da se topljivost i stabilnost ispitivane 
tvari ocijene u uvjetima ispitivanja tj. uzgojni medij, temperatura, 
režim rasvjete koji će se koristi tijekom ispitivanja.
 
U slučajevima kad je nadziranje pH vrijednosti ispitnog medija 
posebno važno, npr. kod ispitivanja metala ili tvari koje su hidroli ­
tički nestabilne, preporu čuje se da se u uzgojni medij doda pufer 
(vidi odjeljak 1.7.4. prvi stavak). Dodatne smjernice za ispitivanje 
tvari čija fizikalno-kemijska svojstva otežavaju ispitivanje nalaze se u 
literaturi pod 11.  
1.5. REFERENTNA TVAR  
Jedna ili više referentnih tvari, kao što je 3,5-diklorfenol koji je 
korišten u me đulaboratorijskom ispitivanju (10.), mogu se ispitati 
radi provjere postupka. Preporu čljivo je da se referentna tvar ispita 
barem dvaput godišnje ili, ako se ispitivanje provodi rje đe, istovre ­
meno s odre đivanjem toksi čnosti ispitivane tvari.  
1.6. VALJANOST ISPITIVANJA  
Da bi ispitivanje bilo valjano, vrijeme potrebno da se broj listova u 
kontrolnom uzorku udvostru či mora biti kra će od 2,5 dana (60 sati), 
što približno odgovara sedmorostrukom pove ćanju u sedam dana i 
prosječnoj specifi čnoj brzini rasta od 0,275 d  -1 . Uz medije i ispitne 
uvjete opisane u metodi, taj se kriterij može zadovoljiti primjenom statičkog režima ispitivanja (8.). Tako đer se očekuje da će se taj 
kriterij mo ći ispuniti u polustati čkim i proto čnim uvjetima ispitiva ­
nja. Izračunavanje vremena potrebnog za udvostru čenje prikazano je 
u odjeljku 2.1.
 
1.7. OPIS METODE  
1.7.1.  Aparatura  
Sva oprema koja dolazi u dodir s ispitnim medijima mora biti izra ­ 
đena od stakla ili drugog kemijski inertnog materijala. Staklena 
oprema koja se koristi za uzgoj i ispitivanje mora biti sterilna i 
treba je o čistiti od kemijskih one čišćivača koji bi mogli dospjeti u 
ispitni medij. Ispitne posude trebaju biti dovoljno široke da listovi različitih kolonija u kontrolnim posudama mogu rasti tako da na 
kraju ispitivanja ne do đe do preklapanja me đu listovima. Ne smeta 
ako korijenje dodiruje dno ispitne posude, ali preporu čuje se da sve 
posude imaju dubinu od najmanje 20 mm i volumen od najmanje 100 ml. Vrsta ispitnih posuda nije važna sve dok su ti zahtjevi 
ispunjeni. Prikladnima su se pokazale staklene čaše, zdjelice za 
kristalizaciju i staklene petrijevke odgovaraju ćih dimenzija. Ispitne 
posude treba prekriti kako bi se smanjilo isparavanje i slu čajna 
onečišćenja, ali pritom treba omogu ćiti nužan protok zraka. Ispitne 
posude, a posebno poklopci, ne smiju stvarati sjenu niti izazivati 
promjene u spektralnim osobinama svjetlosti.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1355
 
Kulture i ispitne posude se ne smiju držati zajedno. To je najlakše 
postići ako se koriste odvojene uzgojne komore, inkubatori odnosno 
prostorije. Osvjetljenje i temperaturu treba nadzirati i održavati na stalnoj razini (vidi odjeljak 1.7.8.).
 
1.7.2.  Ispitni organizam  
Organizmi koji se koriste za potrebe ovog testa su  Lemna gibba  ili 
Lemna minor . Kratki opis vrsta vodenih le ća koje se koriste u toksi ­
kološkim ispitivanjima nalazi se u Dodatku 1. Biljni se materijal 
može nabaviti u zbirkama kultura, od drugog laboratorija ili prikupiti 
na terenu. Ako se materijal prikuplja na terenu, biljke treba držati u kulturi u mediju kakav će se koristiti u ispitivanju najmanje osam 
tjedana prije uporabe. Mjesta na kojima se prikupljaju polazne 
kulture ne smiju biti one čišćena očitim izvorima one čišćenja. Ako 
se kulture nabavljaju od drugog laboratorija ili iz zbirke kultura, treba ih držati u sli čnim uvjetima najmanje tri tjedna. Izvor biljnog 
materijala te vrstu i klon (ako je poznat) koji se koriste kod ispiti ­
vanja treba svaki puta dokumentirati.
 
Koriste se monokulture kod kojih nisu prisutna vidljiva one čišćenja 
drugim organizmima kao što su alge i praživotinje. Zdrave biljke  L. 
minor  sastoje se od kolonija koje sadrže izme đu dva i pet listova, 
dok zdrave kolonije  L. gibba  mogu imati i do sedam listova.  
Biljke treba pažljivo odabrati jer kakvo ća i jednolikost biljaka koje 
se koriste u ispitivanju imaju zna čajan utjecaj na rezultate ispitivanja. 
Treba koristiti mlade, brzo rastu će biljke bez vidljivih ošte ćenja i 
promjena boje (kloroza). Osobina kvalitetnih kultura je visok udio 
kolonija koje sadrže najmanje dva lista. Veliki broj kolonija s jednim 
listom ukazuje na okolišni stres (npr. ograni čeni nutrijenti) pa biljni 
materijal iz takvih kultura ne treba koristiti kod ispitivanja.  
1.7.3.  Uzgoj kulture  
Da bi se smanjili zahtjevi održavanja (npr. kad odre đeno vrijeme 
nisu planirana ispitivanja s vodenom le ćom), kulture se mogu 
držati pod smanjenim osvjetljenjem i na nižoj temperaturi (4 – 
10 °C). Informacije o uzgoju nalaze su u Dodatku 2. U slu čaju 
očitih znakova one čišćenja algama i drugim organizmima, poduzorak 
listova  Lemna  treba podvrgnuti površinskoj sterilizaciji i prenijeti ga 
u svježi medij (vidi Dodatak 2.). U ovom slu čaju ostatak one čišćene 
kulture treba baciti.  
Najmanje sedam dana prije ispitivanja dovoljno kolonija treba asep ­
tički prenijeti u svježi sterilni medij i uzgajati 7 – 10 dana u uvjetima 
ispitivanja.  
1.7.4.  Ispitni medij  
Za vrste  Lemna minor  i Lemna gibba  preporučuju se razli čiti mediji, 
kako je opisano u nastavku. Ako se sumnja da bi pH pufer (MOPS 
(4-morfolinpropan-sulfonska kiselina, CAS br. 1132-61-2, EINECS 
br. 214-478-5) za medij  L. minor  i NaHCO  3 za medij  L. gibba ) 
mogao reagirati s ispitivanom tvari i utjecati na o čitovanje njezinih 
toksičnih svojstava, treba dobro razmisliti prije nego što se pufer 
doda u ispitni medij. Prihvatljiv je i medij Steinberg (12.) pod 
uvjetom da su zadovoljeni kriteriji valjanosti.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1356
 
Za uzgoj kulture i ispitivanje s  L. minor  preporučuje se izmijenjena 
varijanta uzgojnog medija  Lemna  prema švedskoj normi (SIS). 
Sastav medija naveden je u Dodatku 3.  
Uzgojni medij 20X – AAP, opisan u Dodatku 3., preporu čuje se za 
uzgoj kulture i ispitivanja s  L. gibba . 
Medij Steinberg koji je opisan u Dodatku 3. tako đer je prikladan za  
L. minor , ali se može koristiti i za  L. gibba  pod uvjetom da su 
zadovoljeni kriteriji valjanosti.  
1.7.5.  Ispitne otopine  
Ispitne se otopine obi čno pripremaju razrje đivanjem radne otopine. 
Radne otopine ispitivane tvari se, u pravilu, pripremaju otapanjem 
tvari u uzgojnom mediju.  
Najviša ispitna koncentracija ispitivane tvari u pravilu ne smije biti 
viša od topljivosti tvari u vodi u ispitnim uvjetima. Ipak, valja 
napomenuti da  Lemna  spp. plutaju na površini i mogu biti izložene 
tvarima koje se skupljaju u su čelju voda-zrak (npr. tvari koje su 
slabo topljive u vodi, hidrofobne tvari, površinski aktivne tvari). U 
tim uvjetima organizmi su izloženi materijalu koji se nalazi izvan 
otopine i ispitne koncentracije mogu, ovisno o svojstvima ispitivane tvari, biti više od topljivosti u vodi. Kod ispitivanih tvari niske topljivosti u vodi ponekad je potrebno pripremiti koncentriranu 
radnu otopinu ili disperziju tvari koriste ći organsko otapalo ili disper ­
gent kako bi se olakšalo dodavanje to čnih količina ispitivane tvari u 
ispitni medij i pospiješilo njezino dispergiranje i otapanje. U svakom slučaju, treba nastojati izbje ći korištenje takvih materijala kad god je 
to moguće. Upotrijebljena pomo ćna otapala odnosno dispergenti ne 
bi smjeli imati fitotoksi čno djelovanje. Primjeri otapala u širokoj 
uporabi koja nemaju fitotoksi čno djelovanje u koncentracijama do 
100 μl·l
 –1 su aceton i dimetilformamid. Ako se koristi otapalo ili 
dispergent, treba navesti njegovu kona čnu koncentraciju, koju u 
svakom slu čaju treba svesti na najmanju mogu ću mjeru ( ≤ 100 
μl·l —1 ) i voditi ra čuna da sve obrade i kontrole sadrže istu koncen ­
traciju otapala odnosno dispergenta. Dodatne smjernice o uporabi 
dispergenata navedene su u literaturi pod (11.).  
1.7.6.  Ispitne i kontrolne skupine  
Prethodna saznanja o toksi čnosti ispitivane tvari za vodenu le ću, npr. 
na temelju ispitivanja za odre đivanje raspona, mogu pomo ći u 
odabiru prikladnih ispitnih koncentracija. Kod glavnog ispitivanja 
toksičnosti u pravilu je potrebno najmanje pet ispitnih koncentracija 
raspoređenih u geometrijskom nizu. Ispitne koncentracije se po 
mogućnosti ne bi smjele razlikovati za faktor viši od 3,2, ali može 
se koristiti i viša vrijednost ako je krivulja koncentracija-odgovor 
ravna. Ako se koristi manje od pet koncentracija, treba dati obra ­
zloženje. Pri svakoj je koncentraciji potrebno najmanje tri ponavljanja.
 
Kod odre đivanja raspona ispitnih koncentracija (za ispitivanje za 
određivanje raspona i/ili glavno ispitivanje toksi čnosti) treba uzeti 
u obzir sljede će: ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1357
 
— da bi se kod odre đivanja EC  x osigurala potrebna razina pouzda ­
nosti, vrijednost EC  x mora se nalaziti izme đu najviše i najniže 
ispitne koncentracije. Primjerice, ako se procjenjuje EC  50 , najviša 
ispitna koncentracija treba biti viša od EC  50 . Ako se vrijednost 
EC 50 nalazi izvan raspona ispitnih koncentracija, pripadaju ći 
intervali pouzdanosti bit će veliki i možda ne će biti mogu će 
ispravno ocijeniti statisti čku prikladnost modela;  
— ako je cilj procijeniti LOEC/NOEC, najniža ispitna koncentracija 
mora biti dovoljno niska da rast ne bude zna čajno niži od rasta u 
kontrolnoj skupini. Isto tako, najviša ispitna koncentracija treba 
biti dovoljno visoka da rast bude zna čajno niži nego u kontrolnoj 
skupini. Ako to nije slu čaj, ispitivanje treba ponoviti s drugim 
rasponom koncentracija (osim ako je najviša koncentracija na 
granici topljivosti ili jednaka maksimalnoj predvi đenoj grani čnoj 
koncentraciji, npr. 100 mg ·l –1 ). 
Svako ispitivanje uklju čuje kontrole s istim hranjivim medijem, istim 
brojem listova i kolonija, okolnim uvjetima i postupcima kao kod 
ispitnih posuda, ali bez ispitivane tvari. Ako se koristi pomo ćno 
otapalo ili dispergent, potrebna je dodatna kontrola koja sadrži istu koncentraciju otapala/dispergenta kao posude s ispitivanom tvari. 
Broj ponavljanja kontrolnih posuda (i posuda s otapalom, ako se 
ono koristi) treba biti barem jednak broju posuda koje se koriste za svaku ispitnu koncentraciju, a po mogu ćnosti i dvostruko ve ći.
 
Ako nije potrebno odrediti NOEC, plan ispitivanja može se izmije ­
niti tako da se pove ća broj koncentracija i smanji broj ponavljanja po 
koncentraciji. Ipak, broj kontrolnih ponavljanja mora biti najmanje tri.
 
1.7.7.  Izlaganje  
Kolonije koje se sastoje od 2 do 4 vidljiva lista prenesu se iz kulutre 
inokuluma i nasumi čno raspodijele po ispitnim posudama u asepti ­ 
čkim uvjetima. Svaka ispitna posuda treba sadržavati ukupno 9 do 
12 listova. Broj listova i kolonija mora biti jednak u svim ispitnim 
posudama. Iskustva s ovom metodom i podaci iz me đulaboratorij ­
skog ispitivanja pokazuju da je dovoljno koristiti tri ponavljanja po obradi, od kojih svako u po četku sadrži 9 do 12 listova, da se 
između obrada utvrde razlike u rastu na razini inhibicije od približno 
4 do 7 %, izra čunano na temelju brzine rasta (10 do 15 % izra ču­
nano na temelju prirasta) (10.).
 
Ispitne posude treba nasumi čno rasporediti po inkubatoru kako bi se 
smanjio utjecaj prostornih razlika u svjetlosti i temperaturi. Osim 
toga, kod promatranja treba primijeniti blokni raspored ili slu čajno 
razmještanje posuda (ili češće razmještanje).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1358
 
Ako preliminarno ispitivanje stabilnosti pokaže da se koncentracija 
ispitivane tvari ne može održati (tj. izmjerena koncentracija padne 
ispod 80 % izmjerene po četne koncentracije) tijekom razdoblja ispi ­
tivanja (7 dana), preporu čuje se polustati čki ispitni režim. U tom 
slučaju kolonije treba izložiti svježe pripremljenim ispitnim i 
kontrolnim otopinama najmanje dvaput tijekom ispitivanja (npr. 3. 
i 5. dan). U čestalost izlaganja svježem mediju ovisit će o stabilnosti 
ispitivane tvari; u slu čaju jako nestabilnih i hlapljivih tvari potrebno 
je češće izlaganje svježem mediju da bi se održale približno stalne 
koncentracije. U odre đenim okolnostima može biti potrebna primjena 
protočnog postupka (11.) (13.).  
Ova ispitna metoda ne uklju čuje scenarij izlaganja kod folijarne 
primjene (sprej) (vidi literaturu (14.).  
1.7.8.  Uvjeti inkubacije  
Potrebna je neprekidna topla ili hladnobijela fluorescentna rasvjeta 
čiji intenzitet treba odabrati unutar podru čja od 85 – 135 μE·m –2 ·s –1 , 
mjereno u podru čju fotosinteti čki aktivnog zra čenja (400 – 700 nm) 
u točkama koje su jednako udaljene od izvora svjetlosti i listova  
Lemna  (što odgovara 6 500 - 10 000 lx). Odstupanja od odabranog 
intenziteta svjetlosti u ispitnom prostoru ne smiju biti viša od 
± 15 %. Metoda detekcije i mjerenja svjetlosti, posebno vrsta senzora, utje ču na izmjerenu vrijednost. Sferi čnim senzorima (koji 
reagiraju na svjetlost iz svih kutova iznad i ispod mjerne ravnine) i 
„kosinusnim” senzorima (koji reagiraju na svjetlost iz svih kutova 
iznad mjerne ravnine) daje se prednost u odnosu na usmjerene senzore jer daju više mjerne vrijednosti kod višeto čkastog izvora 
svjetlosti kakav je ovdje opisan.
 
Temperatura u ispitnim posudama treba biti 24 ± 2 °C. pH vrijednost 
kontrolnog medija tijekom ispitivanja ne smije se pove ćati za više od 
1,5 jedinica. Ipak, odstupanje za više od 1,5 jedinica ne dovodi u pitanje valjanost ispitivanja ako se može dokazati da su zadovoljeni 
kriteriji valjanosti. Pomak pH vrijednosti ipak u nekim posebnim 
slučajevima zahtijeva pove ćanu pozornost, npr. kad se ispituju nesta ­
bilne tvari i metali. Za dodatne smjernice vidi (11.).
 
1.7.9.  Trajanje  
Ispitivanje se prekida 7 dana nakon što se biljke prenesu u ispitne 
posude.  
1.7.10.  Mjerenja i analiti čka određivanja  
Na početku ispitivanja se izbroje listovi u svim ispitnim posudama i 
zabilježi broj listova, paze ći da se uzmu u obzir svi istureni, jasno 
vidljivi listovi. Broj listova normalnog i promijenjenog izgleda odre ­ 
đuje se na po četku ispitivanja, najmanje jedanput svaka 3 dana u 
razdoblju izlaganja (tj. najmanje 2 puta u razdoblju od 7 dana) i po 
završetku ispitivanja. Treba zabilježiti sve promjene u razvoju biljaka 
npr. veličina listova, izgled, naznake nekroze, kloroze ili nabrekline, 
raspadanje kolonija, gubitak sposobnosti plivanja te promjene dužine i izgleda korijenja. Tako đer treba zabilježiti zna čajne osobine 
ispitnog medija (npr. prisutnost neotopljenog materijala, rast algi u 
ispitnoj posudi).
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1359
 
Osim odre đivanja broja listova tijekom ispitivanja, potrebno je ocije ­
niti učinke ispitivane tvari na jednu (ili više) sljede ćih mjernih vari ­
jabli:  
i. ukupna lisna površina;  
ii. suha masa;  
iii. svježa masa.  
Određivanje ukupne lisne površine ima prednost da se može odrediti 
za svaku ispitnu i kontrolnu posudu na po četku, za vrijeme i na kraju 
ispitivanja. Suha odnosno svježa masa odre đuje se na po četku ispi­
tivanja – na uzorku kulture inokuluma koja je reprezentativna za materijal koji se koristi na po četku ispitivanja, i na kraju ispitivanja 
– na biljnom materijalu iz svake ispitne i kontrolne posude. Ako se 
ne mjeri lisna površina, suhoj se masi daje prednost u odnosu na 
svježu masu.
 
Ukupna lisna površina, suha masa i svježa masa mogu se odrediti na 
sljedeći način: 
i. Ukupna lisna površina : Ukupna lisna površina svih kolonija 
može se odrediti slikovnom analizom. Obris ispitne posude i biljaka snimi se video-kamerom (npr. posuda se položi na 
rasvjetnu kutiju) i dobivena slika digitalizira. Ukupna lisna povr ­ 
šina u ispitnoj posudi može se zatim odrediti kalibracijom s plošnim oblicima poznate površine. Pritom treba voditi ra čuna 
da se isklju či utjecaj ruba ispitne posude. Drugi, nešto zamorniji 
postupak je da se ispitne posude i biljke fotokopiraju, dobiveni 
obris kolonija izreže i odredi površina uz pomo ć analizatora lisne 
površine ili milimetarskog papira. Mogu biti prikladne i druge tehnike (npr. omjer papirne mase izme đu površine obrisa kolo ­
nija i jedini čne površine).
 
ii. Suha masa : Izvade se sve kolonije iz ispitnih posuda i isperu 
destiliranom ili deioniziranom vodom. Višak vode upije se 
papirom i kolonije suše na 60 °C dok se ne postigne stalna 
masa. Treba uklju čiti sve ostatke korijenja. Suhu masu treba 
izraziti s to čnošću od najmanje 0,1 mg.  
iii. Svježa masa : Sve se kolonije prenesu u prethodno izvagane poli ­
stirenske epruvete (ili epruvete od drugog inertnog materijala) 
koje u zaobljenom dnu imaju sitne rupice (1 mm). Epruvete se zatim 10 minuta centrifugiraju na 3 000 o/min pri sobnoj temperaturi. Epruvete, koje sada sadrže osušene kolonije, 
ponovno se izvažu i izra čuna se svježa masa oduzimanjem 
mase prazne epruvete.
 
1.7.10.1.  Učestalost mjerenja i analiti čkih određivanja  
Ako se primjenjuje stati čki postupak, pH vrijednost mjeri se u svakoj 
obradi na po četku i na kraju ispitivanja. U slu čaju polustati čkog 
postupka pH treba izmjeriti u svakoj šarži „svježe” ispitne otopine 
prije svakog obnavljanja te u odgovaraju ćim „potrošenim” 
otopinama.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1360
 
Intenzitet svjetlosti mjeri se u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno 
prostoriji u to čkama koje su jednako udaljene od izvora svjetlosti i 
listova vodene le će. Mjerenja se provode najmanje jedanput tijekom 
ispitivanja. Osim toga, najmanje jedanput dnevno treba bilježiti temperaturu medija u jednoj zamjenskoj („surogat”) posudi koja se 
drži u istim uvjetima u uzgojnoj komori, inkubatoru odnosno 
prostoriji.
 
Koncentracije ispitivane tvari odre đuju se u prikladnim razmacima 
tijekom ispitivanja. Kod stati čkog ispitivanja koncentracije se moraju 
odrediti barem na po četku i kraju ispitivanja.  
Ako se u slu čaju polustati čkog ispitivanja pretpostavlja da koncen ­
tracija ispitivane tvari ne će ostati u granicama ± 20 % nazivne 
koncentracije, potrebno je analizirati sve svježe pripremljene ispitne otopine i zatim ponoviti analizu kod svakog obnavljanja (vidi odje ­
ljak 1.7.7. tre ći stavak). Ipak, kod ispitivanja gdje izmjerena po četna 
koncentracija ispitivane tvari nije u granicama ± 20 % nazivne koncentracije, ali ima dovoljno dokaza da su po četne koncentracije 
ponovljive i stabilne (tj. unutar podru čja 80 – 120 % po četne 
koncentracije), kemijska se odre đivanja mogu provoditi samo na 
najvišoj i najnižoj ispitnoj koncentraciji. U svakom slu čaju, određi­
vanje koncentracija ispitivane tvari prije obnavljanja treba provesti samo na jednoj posudi u svakoj ispitnoj koncentraciji (ili na zdru ­ 
ženom sadržaju posuda ponavljanja).
 
Ako se primjenjuje proto čni postupak, koristi se sli čan režim uzor ­
kovanja poput onoga koji je opisan za polustati čka ispitivanja, uklju ­ 
čujući analizu na po četku, u sredini i na kraju ispitivanja, s time da 
ovdje nema mjerenja „potrošene” otopine. Kod ovakvih ispitivanja treba svakodnevno provjeravati brzinu protoka vode za razrje đivanje 
i ispitivane tvari odnosno radne otopine ispitivane tvari.
 
Ako se može dokazati da se koncentracija ispitivane tvari u čitavom 
tijeku ispitivanja na zadovoljavaju ći način održava u granicama 
± 20 % nazivne ili izmjerene po četne koncentracije, analiza rezultata 
može se temeljiti na nazivnim ili izmjerenim po četnim vrijednostima. 
Ako je odstupanje od nazivne odnosno izmjerene po četne koncen ­
tracije ve će od ± 20 %, analiza rezultata temelji se na srednjoj 
geometrijskoj koncentraciji tijekom izlaganja ili modelima koji 
opisuju opadanje koncentracije ispitivane tvari (11.).  
1.7.11.  Grani čno ispitivanje  
U određenim okolnostima, npr. kad preliminarno ispitivanje ukazuje 
na to da ispitivana tvar nema toksi čno djelovanje u koncentracijama 
do 100 mg ·l -1 ili do njezine granice topljivosti u ispitnom mediju 
(ovisno o tome što je manje), mogu će je provesti grani čno ispitivanje 
kako bi se odgovor ispitne skupine (100 mg ·l -1 ili koncentracija 
jednaka granici topljivosti) usporedio s kontrolnom skupinom. Prepo ­
ručuje se da se uz grani čno ispitivanje svakako napravi analiza 
koncentracije izlaganja. Za grani čno ispitivanje vrijede svi gore 
spomenuti ispitni uvjeti i kriteriji valjanosti, s time da broj ponavljanja u ispitnoj skupini treba udvostru čiti. Rast u kontrolnoj 
i ispitnoj skupini može se analizirati statisti čkim testom za usporedbu 
srednjih vrijednosti, npr. Studentov t-test.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1361
 
2. PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
2.1. VRIJEME UDVOSTRU ČENJA  
Da bi se odredilo vrijeme koje je potrebno da se broj listova udvo ­
struči (T  d ) i utvrdilo ispunjava li istraživanje ovaj kriterij valjanosti 
(odjeljak 1.6.), dobivene podatke za kontrolne posude treba uvrstiti u sljedeću formulu:
 
T d = ln 2/μ 
gdje je μ prosječna specifi čna brzina rasta odre đena na na čin kako je 
opisano u prvom i drugom stavku odjeljka 2.2.1.  
2.2. VARIJABLE ODGOVORA  
Svrha ispitivanja je odrediti u činke ispitivane tvari na vegetativni rast  
Lemna . U ovoj su ispitnoj metodi opisane dvije varijable odgovora, 
budući da države članice imaju razli čite preferencije i regulatorne 
zahtjeve. Da bi rezultati ispitivanja bili prihvatljivi u svim državama članicama, u činke treba ocijeniti primjenom obiju varijabli opisanih u 
nastavku pod to čkama (a) i (b).
 
(a) Prosje čna specifi čna brzina rasta: ova se varijabla odgovora izra ­ 
čunava na temelju promjena logaritama broja listova i, osim toga, 
na temelju promjena logaritama nekog drugog mjernog parametra (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u vremenu (izraženo po danu) u kontrolama i svim ispitnim skupinama. Ona 
se ponekad naziva i relativna brzina rasta (15.).
 
(b) Prirast: ova se varijabla odgovora izra čunava na temelju 
promjena broja listova i, osim toga, na temelju promjena 
nekog drugog mjernog parametra (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u kontrolama i svim ispitnim skupinama do kraja ispitivanja.
 
Valja napomenuti da vrijednosti toksi čnosti izra čunane primjenom 
tih dviju varijabli odgovora nisu usporedive i tu razliku treba uzeti 
u obzir kod korištenja rezultata ispitivanja. Ako su ispoštovani ispitni 
uvjeti ove metode, vrijednosti EC  x na temelju prosje čne specifi čne 
brzine rasta (E  r C x ) općenito su više od rezultata na temelju prirasta 
(E y C x ) zbog razlike u matemati čkoj osnovi tih dvaju pristupa. To ne 
treba tuma čiti kao razliku u osjetljivosti dviju varijabli odgovora, ve ć 
naprosto prihvatiti da su te vrijednosti matemati čki različite. Pojam 
prosječne specifi čne brzine rasta temelji se na op ćenitom obrascu 
eksponencijalnog rasta vodene le će u neograni čenim kulturama, 
gdje se toksi čnost procjenjuje na temelju u činaka na brzinu rasta 
neovisno o apsolutnoj vrijednosti specifi čne brzine rasta u kontrolnoj 
skupini, nagibu krivulje koncentracija-odgovor i trajanju ispitivanja. Za razliku od toga, rezultati koji se temelje na varijabli odgovora 
„prirast” ovise o svim tim drugim varijablama. E
 y C x ovisi o speci ­
fičnoj brzini rasta vrsta vodene le će koje se koriste u ispitivanju i o 
maksimalnoj specifi čnoj brzini rasta, koja se može razlikovati me đu 
vrstama, pa čak i klonovima. Ovu varijablu odgovora ne treba kori ­
stiti za usporedbu osjetljivosti na toksine me đu vrstama vodene le će, 
pa čak ni me đu klonovima. Iako se, sa znanstvenog stajališta, 
procjeni toksi čnosti na temelju procje čne specifi čne brzine rasta 
daje prednost, u ovu su ispitnu metodu uklju čene i procjene na 
temelju prirasta kako bi se zadovoljili trenuta čni regulatorni zahtjevi 
u nekim državama.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1362
 
Procjene toksi čnosti treba temeljiti na broju listova i jednoj dodatnoj 
mjernoj varijabli (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) 
budući da neke tvari znatno više utje ču na neke druge mjerne vari ­
jable nego na broj listova. Taj bi utjecaj ostao neotkriven kad bi se samo računao broj listova.
 
Broj listova kao i sve druge dokumentirane mjerne varijable, tj. 
ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa, treba uvrstiti u tablicu, zajedno s koncentracijama ispitivane tvari pri svakom mjere ­
nju. Kasnija analiza podataka, npr. za procjenu vrijednosti LOEC, 
NOEC ili EC
 x , treba se temeljiti na vrijednostima pojedina čnih 
ponavljanja, a ne na izra čunanim srednjim vrijednostima po ispitnim 
skupinama.  
2.2.1.  Prosje čna specifi čna brzina rasta  
Prosječna specifi čna brzina rasta za odre đeno razdoblje izra čunava se 
kao logaritamsko pove ćanje varijabli rasta – broj listova i još jedna 
mjerna varijabla (ukupna lisna površina suha masa ili svježa masa) – primjenom formule u nastavku za svako ponavljanje u kontrolama i 
obradama:
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ Ä lnðN i Þ 
t 
gdje je:  
— μ i-j : prosječna specifi čna brzina rasta od vremena i do j  
— N  i : mjerna varijabla u ispitnoj ili kontrolnoj posudi u vremenu i  
— N  j : mjerna varijabla u ispitnoj ili kontrolnoj posudi u vremenu j  
— t: vremensko razdoblje od i do j  
Za svaku ispitnu i kontrolnu skupinu izra čuna se srednja vrijednost 
brzine rasta s procjenama varijance.  
Prosječnu specifi čnu brzinu rasta treba izra čunati za čitavo razdoblje 
ispitivanja (vrijeme „i” u gornjoj formuli je po četak ispitivanja, a 
vrijeme „j” je kraj ispitivanja). Izra čuna se srednja vrijednost 
prosječne specifi čne brzine rasta s procjenom varijance za svaku 
ispitnu koncentraciju i kontrolu. Osim toga, odredi se etapna 
brzina rasta kako bi se mogli ocijeniti u činci ispitivane tvari koji 
se javljaju tijekom razdoblja izlaganja (npr. pregledom logaritamski transformiranih krivulja rasta). Zna čajne razlike izme đu etapne brzine 
rasta i prosje čne brzine rasta ukazuju na odstupanje od stalnog 
eksponencijalnog rasta i u tom slu čaju treba temeljito preispitati 
krivulju rasta. Konzervativniji pristup u ovakvim slu čajevima bio 
bi usporediti specifi čne brzine rasta obra đenih kultura u razdoblju 
maksimalne inhibicije sa specifi čnim brzinama rasta kontrolnih 
kultura tijekom istog razdoblja.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1363
 
Postotak inhibicije brzine rasta (I  r ) tada se može izra čunati za svaku 
ispitnu koncentraciju (ispitnu skupinu) prema sljede ćoj formuli:  
% I r ¼ μ C Ä μ T 
μ C Ü 100 
gdje je:  
— % I  r : postotak inhibicije prosje čne specifi čne brzine rasta  
— μ C : srednja vrijednost μ u kontroli  
— μ T : srednja vrijednost μ u ispitnoj skupini  
2.2.2.  Prirast  
Učinci na prirast odre đuju se na temelju dviju mjernih varijabli, broja 
listova i još jedne mjerne varijable (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa) u svakoj ispitnoj posudi na po četku i na 
kraju ispitivanja. Po četna biomasa za suhu i svježu masu odre đuje 
se na temelju uzorka listova uzetog iz šarže koja se koristi za inoku ­
laciju ispitnih posuda (vidi odjeljak 1.7.3. drugi stavak). Za svaku ispitnu koncentraciju i kontrolu treba izra čunati srednju vrijednost 
prirasta s procjenama varijance. Srednji postotak inhibicije prirasta 
(% I
 y ) za svaku ispitnu skupinu može se izra čunati na sljede ći način: 
% I y ¼ b C Ä b T 
b C Ü 100 
gdje je:  
— % I  y : postotak smanjenja prirasta  
— b  C : konačna biomasa umanjena za po četnu biomasu 
kontrolne skupine  
— b  T : kona čna biomasa umanjena za po četnu biomasu ispitne 
skupine  
2.2.3.  Prikaz krivulja koncentracija-odgovor  
Treba prikazati krivulje koncentracija-odgovor iz kojih je vidljiv 
odnos srednjeg postotka inhibicije varijable odgovora (I  r ili I  y , izra­ 
čunan kako je prikazano u zadnjem stavku odjeljka 2.2.1. ili u 
odjeljku 2.2.2.) i logaritamske koncentracije ispitivane tvari.  
2.2.4.  Procjena EC  x 
Procjene EC  x (npr. EC  50 ) potrebno je izra čunati i na temelju 
prosječne specifi čne brzine rasta (E  r C x ) i na temelju prirasta 
(E y C x ), a njih opet na temelju broja listova i još jedne mjerne vari ­
jable (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa). To je stoga 
što neke ispitivane tvari ne utje ču jednako na broj listova i na druge 
mjerne varijable. Traženi parametri toksi čnosti su stoga četiri vrijed ­
nosti EC  x za svaku izra čunanu razinu inhibicije x: E  r C x (broj listo ­
va); E  r C x (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa masa); E  y C x 
(broj listova); E  y C x (ukupna lisna površina, suha masa ili svježa 
masa).  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1364
 
2.3. STATISTI ČKI POSTUPCI  
Cilj je dobiti kvantitativni odnos koncentracija-odgovor regresijskom 
analizom. Ako se provede linearizacijska pretvorba podataka odgo ­
vora – npr. u jedinice probit, logit ili Weibullovog modela (16.) – 
može se provesti ponderirana linearna regresija; ipak, prednost se 
daje postupcima nelinearne regresije koje se bolje nose s neizbježnim nepravilnostima podataka i odstupanjima od pravilnih razdioba. S približavanjem nultoj ili potpunoj inhibiciji te se nepravilnosti 
mogu pretvorbom i dodatno pove ćati i tako otežati analizu (16.). 
Valja napomenuti da su standardne metode analize za vrijednosti dobivene pretvorbom (probit, logit ili Weibull) namijenjene kvan ­
talnim podacima (npr. smrtnost ili preživljavanje) i moraju se 
posebno prilagoditi da bi se mogle primijeniti na podatke o brzini rasta i prirastu. Posebni postupci za odre đivanje vrijednosti EC
 x iz 
kontinuiranih podataka mogu se prona ći u literaturi pod 17., 18. i 19.  
Za svaku varijablu odgovora koja se analizira treba izra čunati 
procjene to čaka za vrijednosti EC  x na temelju odnosa 
koncentracija-odgovor. Po mogu ćnosti, za sve procjene treba odrediti 
granice pouzdanosti 95 %. Valjanost podudaranja podataka odgovora s regresijskim modelom procjenjuje se grafi čki ili statisti čki. Regre ­
sijska analiza se provodi na temelju pojedina čnih odgovora u 
ponavljanjima, a ne na temelju srednjih vrijednosti ispitnih skupina.
 
Ako raspoloživi regresijski modeli/metode nisu prikladni za podatke, 
procjene EC  50 i granice pouzdanosti mogu se dobiti i linearnom 
interpolacijom sa samonadopunjavanjem („bootstrapping”) (20.).  
Za procjenu LOEC-a, a time i NOEC-a, potrebno je usporediti 
srednje vrijednosti obrada primjenom tehnika analize varijance (ANOVA). Zatim srednju vrijednost za svaku koncentraciju 
treba usporediti s kontrolnom srednjom vrijednoš ću primjenom 
odgovaraju će metode višestruke usporedbe ili testa trenda. Ovdje 
može biti koristan Dunnettov ili Williamsov test (21.) (22.) (23.) (24.). Treba provjeriti vrijedi li pretpostavka homogenosti varijanci 
ANOVA-e. To se može u činiti grafi čki ili formalnim testom (25.). 
Prikladni su Leveneov i Bartlettov test. Ako pretpostavka homoge ­
nosti varijanci nije zadovoljena, to se ponekad može ispraviti loga ­
ritamskom pretvorbom podataka. Ako je heterogenost varijance 
prevelika da bi se mogla ispraviti pretvorbom, treba razmotriti 
mogućnost analize metodama kao što su Jonckheereovi „step- 
down” testovi trenda. Dodatne smjernice za odre đivanje NOEC-a 
mogu se prona ći u literaturi (19.).
 
Novije znanstvene spoznaje rezultirale su preporukom da se pojam 
NOEC-a napusti i zamijeni procjenama to čaka EC  x dobivenih regre ­
sijom. Za ovaj test  Lemna  sp. nije utvr đena određena vrijednost x. 
Ipak, čini se da je primjereno podru čje od 10 do 20 % (ovisno o 
odabranoj varijabli odgovora), a poželjno je da se navedu obje 
vrijednosti, EC  10 i EC  20 . 
3. IZVJEŠ ĆIVANJE  
3.1. IZVJEŠ ĆE O ISPITIVANJU  
Izvješće o ispitivanju sadrži sljede će informacije:  
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i fizikalno-kemijska svojstva, uklju čujući granicu 
topljivosti u vodi,  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1365
 
— podaci za identifikaciju kemikalije (npr. CAS broj), uklju čujući 
čistoću. 
Ispitna vrsta:  
— znanstveni naziv, klon (ako je poznat) i izvor.  
Ispitni uvjeti:  
— ispitni postupak (stati čki, polustati čki ili proto čni) 
— datum po četka ispitivanja i trajanje,  
— ispitni medij,  
— plan pokusa: ispitne posude i pokrovi, volumeni otopina, broj 
kolonija i listova po ispitnoj posudi na po četku ispitivanja,  
— ispitne koncentracije (nazivne odnosno izmjerene, ovisno o 
slučaju) i broj ponavljanja po koncentraciji,  
— način pripreme radnih i ispitnih otopina, uklju čujući korištenje 
otapala odnosno dispergenata (prema potrebi),  
— temperatura tijekom ispitivanja,  
— izvor svjetlosti, intenzitet svjetlosti i homogenost,  
— pH vrijednosti ispitnih i kontrolnih medija,  
— koncentracije ispitivane tvari i analiti čka metoda s odgovaraju ćim 
podacima za ocjenu kakvo će (validacijska istraživanja, stan ­
dardne devijacije ili granice pouzdanosti analiza),  
— metode odre đivanja broja listova i drugih mjernih varijabli, npr. 
suha masa, svježa masa ili lisna površina.  
— eventualna odstupanja od ispitne metode.  
Rezultati:  
— sirovi podaci: broj listova i druge mjerne varijable u svakoj 
ispitnoj i kontrolnoj posudi kod svakog promatranja i analize,  
— srednje vrijednosti i standardne devijacije svih mjernih varijabli,  
— krivulje rasta za svaku koncentraciju (po mogu ćnosti s logari ­
tamski transformiranom mjernom varijablom, vidi odjeljak 
2.2.1. drugi stavak),  
— vrijeme udvostru čenja/brzina rasta u kontroli na temelju broja 
listova,  
— izračunane varijable odgovora za svako ponavljanje u ispitnim 
skupinama, uklju čujući srednje vrijednosti i koeficijente varijacije 
ponavljanja,  
— grafički prikaz odnosa koncentracija/u činak,  
— procjene krajnjih to čaka toksi čnosti za varijable odgovora, npr. 
EC 50 , EC  10 , EC  20 , i pripadaju ći intervali pouzdanosti; ako se 
izračunavaju LOEC i NOEC, njihove vrijednosti i statisti čke 
metode koje su upotrijebljene za odre đivanje,  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1366
 
— ako se koristi ANOVA, veli čina učinka koja se može utvrditi 
(npr. najmanja zna čajna razlika),  
— eventualna stimulacija rasta u bilo kojoj obradi,  
— svi vidljivi znakovi fitotoksi čnosti i zapažanja u ispitnim 
otopinama,  
— rasprava rezultata, uklju čujući mogući utjecaj odstupanja od 
ispitne metode na rezultate ispitivanja.  
4. LITERATURA  
1. OECD TG 221 (2006.) Lemna Sp. Growth Inhibition Test.  
2. Primjena istraživanja  Lemna  kod obojenih tvari podrobnije je 
opisana u odjeljku 13.5.3. Priru čnika odluka EU-a („EU 
Manual of Decisions”) iz lipnja 2006.: http://ecb.jrc.ec.euro ­
pa.eu/new-chemicals  
3. Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, dostupno na:
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/informa ­
tion_requirements_en.htm?time= 1234958685#A  
4. ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
5. USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996.). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.
 
6. AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp.  
7. SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , 
duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (na švedskom).  
8. Environment Canada. (1999.). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 pp.
 
9. Environment Canada. (1993.) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
10. Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999.). The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.
 
11. OECD (2000.). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 23.
 
12. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1367
 
13. Walbridge C. T. (1977.). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.
 
14. Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989.). Bioas ­
says with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.  
15. Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993.). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, 481-483.  
16. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984.): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  
17. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992.): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.
 
18. Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992.). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
19. OECD. (2004.). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
20. Norberg-King T.J. (1988.). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
21. Dunnett, C.W. (1955.). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121.  
22. Dunnett, C.W. (1964.). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
23. Williams, D.A. (1971.). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117.  
24. Williams, D.A. (1972.). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
25. Brain P. and Cousens R. (1989.). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1368
 
Dodatak 1.  
Opis  Lemna  spp.  
Vodena biljka poznata pod nazivom vodena le ća, Lemna  spp., pripada porodici  
Lemnaceae , u koju se ubrajaju razli čite vrste diljem svijeta koje su podijeljene u 
četiri roda. Njihov izgled i taksonomija su iscrpno opisani (1.) (2.). Vrste  Lemna 
gibba  i L. minor  reprezentativne su vrste umjerenih pojasa i vrlo se često koriste u 
toksikološkim ispitivanjima. Obje vrste imaju plivaju ću ili uronjenu diskoidnu stab ­
ljiku (list) i vrlo tanak korijen koji izbija iz sredine nali čja lista.  Lemna  spp. rijetko 
daju cvjetove, a biljke se vegetativno razmnožavaju stvaranjem novih listova (3.). 
Mlađe biljke su uglavnom blje đe od starijih biljaka, imaju kra će korijenje i sastoje se 
od dva do tri lista razli čite veličine. Biljke iz ovog roda vrlo su pogodne za labora ­
torijsko ispitivanje zahvaljuju ći maloj veli čini, jednostavnoj gra đi, nespolnom 
razmnožavanju i kratkom generacijskom vremenu (4.) (5.).  
Zbog vjerojatnih razlika u osjetljivosti me đu vrstama valjane su samo usporedbe 
osjetljivosti unutar iste vrste.  
Primjeri vrsta  Lemna  koje su korištene u ispitivanjima: referentni popis  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996.). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
 
Lemna major : Clark, N. A. (1925.). The rate of reproduction of  Lemna major  as 
a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). 
(1996.). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., 
„Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996.). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995.). Water quality – Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (na šved ­
skom).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003.). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 
733-742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996.). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96-156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981.).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981.). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993.). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975.). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Izvori vrsta  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel.: +1-416-978-3641  
Faks: +1-416-978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
SJEDINJENE AMERI ČKE DRŽAVE  
Tel.: 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 Stockholm  
ŠVEDSKA  
Tel.: +46 86747240  
Faks: +46 86747636  
Umweltbundesamt (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
NJEMAČKA 
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatura  
1. Hillman, W.S. (1961.). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
2. Landolt, E. (1986.). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
3. Björndahl, G. (1982.). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricul ­
tural Research Council of Norway, University of Oslo.  
4. Wang, W. (1986.). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
5. Wang, W. (1990.). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1370
 
Dodatak 2.  
Întreținerea culturii mam ă 
Radne se kulture na nižoj temperaturi (4 – 10 °C) mogu duže vrijeme držati bez 
presađivanja. Kao uzgojni medij za radne kulture  Lemna  može se koristiti medij 
koji se koristi u ispitivanju, ali mogu će je koristiti i druge medije bogate 
nutrijentima.  
Određeni broj mladih svjetlozelenih biljaka povremeno se premješta u nove 
uzgojne posude sa svježim medijem primjenom asepti čkih postupaka. U hlad ­
nijim uvjetima, kakvi se ovdje preporu čuju, presa đivanje se može provoditi u 
razmacima do tri mjeseca.  
Koriste se kemijski čiste (očišćene kiselinom) i sterilne staklene uzgojne posude, 
a kod rukovanja se primjenjuju asepti čki postupci. Ako do đe do one čišćenja 
radne kulture npr. algama ili gljivicama, treba poduzeti potrebne mjere za ukla ­
njanje one čišćujućih organizama. U slu čaju algi i ve ćine drugih one čišćujućih 
organizama to se može posti ći površinskom sterilizacijom. Uzme se uzorak 
onečišćenog biljnog materijala i odreže korijenje. Materijal se zatim snažno 
protrese u čistoj vodi i uroni u 0,5 %-tnu (v/v) otopinu natrijevog hipoklorita 
između 30 sekundi i 5 minuta. Biljni se materijal zatim ispere sterilnom vodom i 
prenese u više šarži u uzgojne posude koje sadrže svježi uzgojni medij. U ovom će postupku mnogi listovi uginuti, posebno kod dužeg vremena izlaganja, ali bi 
barem neki od preživjelih trebali biti čisti. Oni se zatim ponovno mogu koristiti 
za inokuliranje novih kultura.
 ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1371
 
Dodatak 3.  
Mediji  
Za vrste  L. minor  i L. gibba  preporučuju se razli čiti uzgojni mediji. Za  L. minor  
se preporu čuje prilago đena varijanta medija prema švedskoj normi (SIS), a za  L. 
gibba  medij 20X – AAP. Sastav ta dva medija naveden je u nastavku. Kod 
pripreme medija treba koristiti reagencijski odnosno analiti čki čiste kemikalije i 
deioniziranu vodu.  
Uzgojni medij  Lemna  prema švedskoj normi (SIS)  
— radne otopine I. – V. steriliziraju se obradom u autoklavu (120 °C, 15 
minuta) ili membranskom filtracijom (veli čina pora cca 0,2 μm), 
— otopina VI. (i fakultativno VII.) steriliziraju se isklju čivo membranskom 
filtracijom; one se ne smiju obra đivati u autoklavu,  
— sterilne radne otopine pohrane se na hladnom i mra čnom mjestu. Radne 
otopine I. – V. treba baciti nakon šest mjeseci, dok otopine VI. (i fakultativno VII.) imaju rok uporabe 1 mjesec.
 
Radna otopina 
br. Tvar  Koncentracija u 
radnoj otopini 
(g·l –1 ) Koncentracija u 
pripremljenom 
mediju (mg ·l –1 ) Pripremljeni medij  
Element  Koncentracija 
(mg·l –1 ) 
I. NaNO  3 
KH  2 PO 4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P  32; 14 
6,0; 2,4  
II. MgSO  4 · 7H  2 O 15 75  Mg; S  7,4; 9,8  
III. CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36  Ca; Cl  9,8; 17,5  
IV. Na 2 CO 3 4,0 20  C  2,3  
V. H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010
 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010
 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu Co
 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 0,0020
 
VI. FeCl  3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H 2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII. MOPS (pufer)  490 490  —  —  
— da bi se dobila jedna litra medija SIS, u 900 ml deionizirane vode doda se:  
— 10 ml radne otopine I.  
— 5 ml radne otopine II.  
— 5 ml radne otopine III.  
— 5 ml radne otopine IV.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1372
 
— 1 ml radne otopine V.  
— 5 ml radne otopine VI.  
— 1 ml radne otopine VII. (fakultativno)  
Napomena:  Kod nekih je tvari potrebna još jedna radna otopina VII. (pufer 
MOPS) (vidi zadnji stavak u odjeljku 1.4.).  
— pH vrijednost podesi se na 6,5 ± 0,2 pomo ću 0,1 ili 1 mol HCl ili NaOH i 
nadopuni deioniziranom vodom do volumena od jedne litre.  
Uzgojni medij 20X AAP  
Radne otopine pripremaju se u sterilnoj destiliranoj ili deioniziranoj vodi.  
Sterilne radne otopine čuvaju se na hladnom i mra čnom mjestu. U tim će uvje­
tima radne otopine imati rok uporabe najmanje 6 – 8 tjedana.  
Za medij 20X – AAP treba pripremiti pet radnih otopina s nutrijentima (A1, A2, 
A3, B i C) koriste ći reagencijski čiste kemikalije. Uzgojni medij dobije se tako 
da se u približno 850 ml deionizirane vode doda po 20 ml svake od radnih otopina s nutrijentima. pH vrijednost podesi se na 7,5 ± 0,1 pomo ću 0,1 ili 1 
mol HCl ili NaOH i nadopuni deioniziranom vodom do volumena od jedne litre. 
Zatim se medij profiltrira u sterilnu posudu kroz membranski filter 0,2 μm (pri­
bližno).
 
Uzgojni medij za ispitivanje treba pripremiti 1 – 2 dana prije uporabe kako bi se 
stabilizirala pH vrijednost. pH vrijednost uzgojnog medija treba provjeriti prije 
uporabe i prema potrebi podesiti dodavanjem 0,1 ili 1 M NaOH ili HCl, kako je navedeno gore.
 
Radna otopina 
br. Tvar  Koncentracija u 
radnoj otopini 
(g·l –1 ) (*) Koncentracija u 
pripremljenom 
mediju (mg ·l –1 ) (*) Pripremljeni medij  
Element  Koncentracija 
(mg·l –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H 2 O 
CaCl  2 ·2H 2 O 26 
12 4,4
 510 
240 90
 Na; N 
Mg Ca
 190; 84 
58,08 24,04
 
A2 MgSO  4 ·7H 2 O 15 290  S  38,22  
A3 K 2 HPO  4 ·3H 2 O 1,4 30  K; P  9,4;3,7  
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H 2 O 
FeCl  3 ·6H 2 O 
Na 2 EDTA·2H 2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H 2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H 2 O 
CuCl  2 ·2H 2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l –1 
7,3 mg·l –1 
0,012 mg ·l –1 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn Fe 
— 
Zn Co 
Mo 
Cu
 0,65 
2,3 0,66 
— 
31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300  Na; C  220; 43  
(*) Ako nije navedeno druk čije. ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1373
 
Bilješka:  Teoretski prikladna kona čna koncentracija bikarbonata (kojom se izbje ­
gavaju zna čajnija podešavanja pH vrijednosti) je 15 mg/l, a ne 300 mg/l. 
Međutim, prethodna iskustva s uporabom medija 20X-AAP, uklju čujući 
međulaboratorijsko ispitivanje za ovu metodu, temelje se na 300 mg/l. 
(Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999.) The OECD  Lemna  Growth 
Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test 
Guideline. R & D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency).
 
Medij STEINBERG (prema ISO 20079)  
Koncentracije i radne otopine  
— prilago đeni medij Steinberg je u ISO 20079 predvi đen samo za  Lemna minor  
(budući da je ondje jedino i dopuštena  Lemna minor ), ali ispitivanja su 
pokazala da se i s vrstom  Lemna gibba  mogu posti ći dobri rezultati,  
— kod pripreme medija treba koristiti reagencijski odnosno analiti čki čiste kemi­
kalije i deioniziranu vodu,  
— hranjivi se medij priprema iz radnih otopina ili 10-struko koncentriranog 
medija kako bi se dobila najviša koncentracija medija koja se može posti ći 
bez taloženja.  
Tablica 1.  
pH stabilizirani medij STEINBERG (varijanta prema Altenburgeru)  
Tvar  Hranjivi medij  
Makroelementi  molarna masa  mg/l  mmol/l  
KNO  3 101,12  350,00  3,46  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15  295,00  1,25  
KH  2 PO 4 136,09  90,00  0,66  
K 2 HPO  4 174,18  12,60  0,072  
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37  100,00  0,41  
Mikroelementi  molarna masa  μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83  120,00  1,94  
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43  180,00  0,63  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92  44,00  0,18  
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84  180,00  0,91  
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21  760,00  2,81  
EDTA dinatrijev dihidrat  372,24  1 500,00  4,03  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1374
 
Tablica 2.  
Radne otopine (makroelementi)  
1. Makroelementi (50-struko koncentrirano)  g/l  
Radna otopina 1:  
KNO  3 17,50  
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Radna otopina 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Radna otopina 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tablica 3.  
Radne otopine (mikroelementi)  
2. Mikroelementi (1 000-struko koncentrirano)  mg/l  
Radna otopina 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Radna otopina 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Radna otopina 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Radna otopina 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Radna otopina 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00  
EDTA dinatrijev dihidrat  1 500,00  
— radne otopine 2 i 3 mogu se objediniti, kao i radne otopine 4 do 7 (uzimaju ći 
u obzir tražene koncentracije),  
— za duži rok uporabe radne otopine treba obraditi u autoklavu 20 minuta na 
temperaturi od 121 °C ili provesti sterilnu filtraciju (0,2 μm). Za radnu 
otopinu 8 se u svakom slu čaju preporu čuje sterilna filtracija (0,2 μm). 
Priprema kona čne koncentracija medija STEINBERG (varijanta)  
— 20 ml radnih otopina 1, 2 i 3 (vidi tablicu 2.) doda se u cca 900 ml deio ­
nizirane vode kako bi se izbjeglo taloženje,  
— doda se 1,0 ml radnih otopina 4, 5, 6, 7 i 8 (vidi tablicu 3.),  
— pH vrijednost treba biti 5,5 ± 0,2 (podesiti dodavanjem minimalnog volu ­
mena otopine NaOH ili HCl),  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1375
 
— nadopuni se vodom do 1 000 ml,  
— ako su radne otopine sterilizirane i koristi se prikladna voda, nije potrebna 
dodatna sterilizacija. Ako se sterilizacija provodi na kona čnom mediju, radnu 
otopinu 8 treba dodati nakon obrade u autoklavu (20 minuta na 121 °C).  
Priprema 10-struko koncentriranog medija STEINBER (varijanta) za me đu­
skladištenje  
— 20 ml radnih otopina 1, 2 i 3 (vidi tablicu 2.) doda se u cca 30 ml vode kako 
bi se izbjeglo taloženje,  
— doda se 1,0 ml radnih otopina 4, 5, 6, 7 i 8 (vidi tablicu 3.). Nadopuni se 
vodom do 100 ml,  
— ako su radne otopine sterilizirane i koristi se prikladna voda, nije potrebna 
dodatna sterilizacija. Ako se sterilizacija provodi na kona čnom mediju, radnu 
otopinu 8 treba dodati nakon obrade u autoklavu (20 minuta na 121 °C),  
— pH vrijednost medija (kona čna koncentracija) treba biti 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1376
 
C.27  TEST TOKSI ČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI 
IZ SEDIMENTA SA SEDIMENTOM OBRA ĐENIM SPIKINGOM  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 218 
(2004). Ova ispitna metoda namijenjena je procjeni u činaka produljenog 
izlaganja kemikalija li činkama iz sedimenta vrste slatkovodnih dvokrilaca 
(diptera)  Chironomus  sp. Temelji se na postupcima postoje ćih testova 
toksičnosti za  Chironomus riparius  i Chironomus tentans  koji su razvijeni 
u Europi (1)(2)(3) i Sjevernoj Americi (4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prste ­
nastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima 
postoji dobra dokumentacija, npr.  Chironomus yoshimatsui  (10)(11).  
2. Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest oboga ćivanje 
sedimenta ispitnom tvari spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja 
ovisi o cilju provo đenja testa. Cilj scenarija oboga ćivanja sedimenta 
spikingom jest simulirati akumulirane razine kemikalija koje postoje u sedi ­
mentu. Ovaj sustav izlaganja obuhva ća spiking sedimenta iz ispitnog sustava 
sediment/voda.  
3. Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obi čno u njemu 
opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na 
razne načine. Relativna važnost svakog na čina izlaganja i vrijeme potrebno 
da bi svaki od tih na čina pridonio op ćim učincima toksi čnosti ovise o 
fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log K
 ow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kova ­
lentnim vezama, zna čajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane 
hrane. Kako se ne bi podcijenila toksi čnost jako lipofilnih tvari, može se u 
obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane 
tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni na čini izlaganja, ova se ispitna 
metoda usredoto čuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 
28 dana za  C. riparius  i C. yoshimatsui , te 28 - 65 dana za  C. tentans . Ako 
su za neku specifi čnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi 
istraživanja u činaka neke nestabilne kemikalije, višestruka odre đivanja 
mogu se ukinuti nakon deset dana.  
4. Izmjereni kona čni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u 
vrijeme preobrazbe. Preporu čuje se da se preživljavanje i rast li činki mjere 
tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to pomoću dodatnih višestrukih odre đivanja, ako je to prikladno.
 
5. Preporu čuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima 
nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima:  
— pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu „standar ­
diziranu matricu” te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontami ­
niranih i čistih izvora sedimenta;  
— testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suo čava sa 
sezonskom varijabilnoš ću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za 
prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja uro đene faune; uporaba 
formuliranog sedimenta tako đer snižava troškove povezane s terenskim 
prikupljanjem dovoljnih koli čina sedimenta za rutinsko testiranje;  
— uporaba formuliranog sedimenta omogu ćuje usporedbe toksi čnosti i 
razvrstavanje tvari sukladno tome.  
6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1377
 
NAČELO ISPITIVANJA  
7. Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija 
ispitne kemikalije u sustavima sediment/voda. Ispitna tvar dodaje se u sedi ­
ment, a nakon toga se li činke u prvom stadiju razvoja uvode u ispitne 
laboratorijske čaše, u kojima su ve ć stabilizirane koncentracije sedimenta i 
vode. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. Tako đer 
se mogu mjeriti i preživljavanje i masa li činki nakon deset dana, ako je to 
potrebno (pomo ću dodatnih višestrukih odre đivanja, ako je primjereno). Ti 
se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem odre đivanja 
koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preobrazbi ili preživalja ­
vanju i rastu li činki (npr. EC  15 , EC  50 itd.) bilo statisti čkim hipotetskim 
testiranjem s ciljem odre đivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje je potrebna 
usporedba vrijednosti u činka s kontrolnim vrijednostima pomo ću statističkih 
testova.  
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
8. Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, 
izmjerena ili izra čunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. 
Treba biti dostupna pouzdana analiti čka metoda kvantifikacije ispitivane 
tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznoš ću i granicama detekcije. Korisne informacije obuh ­
vaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je 
još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abioti čka i bioti čka 
razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su 
fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12).
 
REFERENTNE KEMIKALIJE  
9. Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodi čno kako bi se osigurala 
pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksi čnih 
tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studi ­
jama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev 
klorid (1)(2)(5)(6)(13).  
VALJANOST ISPITIVANJA  
10. Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljede ći uvjeti:  
— postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi 
najmanje 70 %. (1)(6);  
— preobrazba vrsti C. riparius i C. yoshimatsui u odrasle životinje u 
kontrolnim posudama treba se odviti izme đu 12. i 23. dana nakon 
njihova umetanja u posude; za vrstu  C. tentans  potrebno je razdoblje 
od 20 do 65 dana.  
— na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju 
otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 posto vrijednosti zasi ćenosti kisikom (ASV) na odre đenoj temperaturi, 
a pH vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim 
posudama;
 
— temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. 
Temperatura vode može se kontrolirati izotermi čkom sobom i u tom 
slučaju temperatura u prostoriji treba se potvr đivati u odgovaraju ćim 
vremenskim razmacima.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1378
 
OPIS METODE  
Ispitne posude  
11. Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 
8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajam čiti da je i u njima 
prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj li činki bude 2 do 3 cm
 2 površine. 
Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. 
Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja treba biti na činjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog 
materijala (npr. teflona).
 
Odabir vrste  
12. Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogu ćnosti je  Chironomus ripa ­
rius. I vrsta  Chironomus tentans  također je prikladna, ali je njome teže 
rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i vrsta  Chironomus yohimatsui . Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se 
u Dodatku 2. za vrstu  Chironomus riparius . Podaci o uvjetima uzgoja 
kulture dostupni su tako đer i za druge vrste, tj.  Chironomus tentans  (4) i  
Chironomus yoshimatsui  (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije 
ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju.
 
Sediment  
13. Po mogu ćnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obra ­ 
đeni, umjetni ili sinteti čki sediment). Me đutim, ako se koristi prirodni sedi ­
ment, on se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i odre đivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i 
granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nika ­
kvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Tako đer se 
preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksi čnosti trza ­
laca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporu čuje se sljede ći 
formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), 
(1)(15)(16):
 
(a) 4-5 % (suhe mase) treseta: što je mogu će bliže pH od 5,5 do 6,0; važno 
je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veli čine čestica 
≤ 1 mm) i isklju čivo sušen na zraku.  
(b) 20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogu ćnosti 
iznad 30 %).  
(c) 75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevla ­
davati s više od 50 posto čestica izme đu 50 i 200 μm). 
(d) Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobio sadržaj vlage kona čne 
smjese u rasponu od 30 - 50 %.  
(e) Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvo će (CaCO  3 ) kako bi se 
pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5. Sadržaj organskog 
ugljika kona čne smjese trebao bi iznositi 2 % (± 0,5 %) i treba se 
prilagoditi dodavanjem odgovaraju ćih količina treseta i pijeska prema 
(a) i (c).  
14. Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti 
nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, 
organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formu ­
liranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka tako đer 
je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne 
dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da 
su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1379
 
Voda  
15. Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prih ­
vatljive vode za razrje đivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda 
za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna 
voda (površinske ili podzemne vode), obra đena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili 
deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja 
kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na po četku 
testa pH ispitne vode treba biti izme đu 6 i 9, a ukupna tvrdo ća ne viša od 
400 mg/l kao CaCO  3 . Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije 
između iona tvrdo će i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje 
tvrdoće (samim time, u toj se situaciji ne smije koristiti medij Elendt 
M4). Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje 
dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvo će vode navedena 
u Dodatku 4. zna čajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva.  
Radne otopine - sedimenti obra đeni spikingom  
16. Sedimenti obra đeni spikingom odabrane koncentracije obi čno se pripremaju 
dodavanjem otopine ispitivane tvari izravno u sediment. Radna otopina 
ispitivane tvari otopljena u deioniziranoj vodi miješa se s formuliranim sedimentom valjkastim mlinom, miješalicom hrane ili ru čnim miješanjem. 
Ako je ispitivana tvar slabo topljiva u vodi, može se otopiti u što je mogu će 
manjem volumenu prikladnog organskog otapala (npr. heksan, aceton ili 
klorofor). Ta se otopina potom miješa s 10 g finog kremenog pijeska za jednu ispitnu posudu. Otapalo se pusti da ispari i mora se u cijelosti ukloniti iz pijeska; potom se pijesak miješa s prikladnom koli činom sedimenta po 
ispitnoj laboratorijskoj čaši. Samo lako hlapljiva sredstva mogu se koristiti 
za otapanje, dispergiranje ili emulgiranje ispitivane tvari. Treba imati na umu da se pijesak koji nastane miješanjem ispitivane tvari i pijeska mora uzeti u obzir prilikom pripreme sedimenta (tj. sediment stoga treba pripre ­
miti s manje pijeska). Treba se pobrinuti da se ispitivana tvar koja se dodaje 
u sediment temeljito i ravnomjerno rasprši u sedimentu. Ako je potrebno, mogu se analizirati i poduzorci kako bi se odredio stupanj homogenosti.
 
PLAN ISPITIVANJA  
17. Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, 
na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj li činki po posudi. Opisani 
su planovi za procjenu to čke koncentracije s u činkom (EC), za procjenu 
najviše koncentracije bez vidljivog u činka (NOEC) i za provo đenje 
graničnog ispitivanja.  
Plan za regresijsku analizu  
18. Koncentracija s u činkom (npr. EC  15 , EC  50 ) i raspon koncentracije, iznad 
kojega je u činak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhva ćati koncentra ­
cije uklju čene u ispitivanje. Op ćenito, preciznost, a posebno valjanost, s 
kojom se mogu procijeniti koncentracije s u činkom (EC  x ), poboljšavaju se 
kad se koncentracija s u činkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija. 
Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za odre đivanje 
raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti 
(vidjeti stavak 27.).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1380
 
19. Ako treba procijeniti EC  x , treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri 
višestruka odre đivanja. U svakom se slu čaju savjetuje korištenje dovoljnog 
broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti ve ći od dva (iznimka se može u činiti u 
slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj više ­
strukih odre đivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se pove ća broj 
ispitnih koncentracija razli čitog odgovora. Pove ćanjem broja višestrukih 
određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obi čno 
dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka odre đivanja 
potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast li činki.
 
Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a  
20. Ako treba procijeniti LOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim u činkom) i 
NOEC (najvišu koncentraciju bez vidljivog u činka), treba koristiti pet 
ispitnih koncentracija u najmanje četiri višestruka odre đivanja, a faktor 
između koncentracija ne bi smio biti ve ći od dva. Broj višestrukih odre đi­
vanja trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statisti čku snagu kojom 
će otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini zna čajnosti od 5 % (p 
= 0,05). Kod brzine razvoja obi čno je prikladna analiza 
varijance (ANOVA), kao što su Dunnettov test i Williamsov test 
(17)(18)(19)(20). Kod omjera preobrazbe mogu se koristiti 
Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test.
 
Granično ispitivanje  
21. Može se provesti grani čno ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i 
kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za odre đivanje raspona 
ne vide nikakvi u činci. Svrha grani čnog ispitivanja jest provesti ispitivanje 
na koncentracijama dovoljno visokim da omogu ći donositeljima odluke da 
isključe moguće toksične učinke ispitivane tvari, a granica se postavlja na 
koncentraciju za koju se ne o čekuje da će se pojaviti u bilo kojoj situaciji. 
Preporučuje se 1 000 mg/kg (suha masa). Obi čno je potrebno najmanje šest 
višestrukih odre đivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba pokazati 
adekvatnu statisti čku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne 
posude pri razini zna čajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metri čkog odgovora 
(brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statisti čka metoda ako podaci 
zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili nepa ­
rametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera 
preobrazbe prikladan je Fisherov test.
 
POSTUPAK  
Uvjeti izlaganja  
Priprema sustava sediment/voda spikingom  
22. Postupak spikinga opisan u ispitnoj metodi C.8: Toksi čnost za gujavice 
preporučuje se za primjenu ispitivane tvari (14). Sedimenti obra đeni 
spikingom stavljaju se u posude pa se dodaje voda iznad sedimenta, i to 
u omjeru sedimenta i vode 1:4 (vidjeti stavke 11. i 15.). Dubina sloja 
sedimenta trebala bi se kretati u rasponu od 1,5 - 3 cm. Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti 
plastičnim diskom dok se na njega lijeva voda, a disk se mi če odmah 
nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi predmeti.
 
23. Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim plo čama). Ako je 
potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode 
kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomo ću 
destilirane ili deionizirane vode kako bi se sprije čilo stvaranje soli.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1381
 
Stabilizacija  
24. Kad se pripremi sediment postupkom spikinga s vodom iznad sedimenta, 
poželjno je dopustiti razdiobu ispitivane tvari iz teku ćeg stanja u sediment 
(3)(4)(6)(13). To bi se po mogu ćnosti trebalo u činiti u uvjetima temperature 
i dozračivanja koji se koriste u ispitivanju. Prikladno vrijeme uravnoteženja 
specifično je za svaki sediment i kemikaliju, a može se kretati od nekoliko 
sati pa sve do nekoliko dana, pa čak u rijetkim slu čajevima i do nekoliko 
tjedana (4-5 tjedana). Budu ći da je time ostavljeno dovoljno vremena za 
razgradnju brojnih kemikalija, ne čeka se uravnoteženje, ali se preporu čuje 
vrijeme uravnoteženja od 48 sati. Na kraju tog dodatnog vremena uravno ­
teženja treba izmjeriti koncentraciju ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, 
pornoj vodi i u sedimentu, barem u najvišoj koncentraciji i u jednoj nižoj 
(vidjeti stavak 38.). Ta analiti čka određivanja ispitivane tvari omogu ćuju 
izračun bilance mase i izražavanje rezultata na temelju izmjerenih 
koncentracija.  
Dodavanje ispitnih organizama  
25. Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, 
mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u 
hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz mati čne kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za 
uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture 
treba dodati manju koli činu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica 
suspenzije fino usitnjenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje li činki obično počinje 
nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za  Chironomus ripa ­
rius na 20 °C i 1 do 4 dana za  Chironomus tentans  na 23 °C i za  Chiro­
nomus yoshimatui  na 25 °C), a li činke se razvijaju u četiri stadija razvoja, 
od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti li činke iz prvog 
stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica mogu će je 
provjeriti pomo ću širine kapsule glave (6).
 
26. Dvadeset li činki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku 
ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obra đen spikingom, i to 
pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozra čivanje vode tijekom dodavanja 
ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja 
ličinki (vidjeti stavke 25. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja 
(vidjeti stavke 19. i 20.) broj li činki po koncentraciji iznosi najmanje 60 
za procjenu to čke EC-a i 80 za odre đivanje NOEC-a.  
Ispitne koncentracije  
27. Ispitivanje za odre đivanje raspona može biti korisno za odre đivanje raspona 
koncentracija za kona čno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko 
razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gusto ća 
površine po trzalcu, koja će se koristiti i u kona čnom ispitivanju, trzalci 
se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogu ­ 
ćuje procjenu odgovaraju ćih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna više ­
struka odre đivanja.  
28. O ispitnim koncentracijama za kona čno ispitivanje odlu čuje se na temelju 
rezultata ispitivanja za odre đivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati 
najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1382
 
Kontrolne posude  
29. U ispitivanje bi, s odgovaraju ćim brojem višestrukih odre đivanja, trebalo 
uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti 
stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti 
stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta.  
Sustav ispitivanja  
30. Koriste se stati čki sustavi. Polustati čni ili proto čni sustavi sa stalnim ili 
isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u 
iznimnim slu čajevima, na primjer ako specifikacije kakvo će vode postanu 
neprikladne za ispitni organizam ili ako utje ču na uravnoteženje kemikalije 
(npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlu čivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji 
utječu na pH i/ili tvrdo ću vode). Me đutim, obi čno su dostatne i daje se 
prednost drugim metodama poboljšanja kakvo će vode iznad sedimenta, 
kao što je dozra čivanje.
 
Hrana  
31. Potrebno je hraniti li činke, po mogu ćnosti svakodnevno ili najmanje triput 
tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino usitnjene hrane, npr. 
Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u koli čini od 
0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za  C. yoshimatui ) dnevno po li činki prikladna za 
mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više 
hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po li činki trebalo bi biti dostatno za ostatak 
ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne 
može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako 
adsorptive tvari (npr. čiji je log K
 ow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne 
veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije može dodati koli čina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i 
prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora kori ­
stiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog lišća npr. velike koprive ( Urtica dioica ), duda ( Morus alba ), bijele djeteline 
(Trifolium repens ), špinata ( Spinacia oleracea ) ili nekog drugog biljnog 
materijala ( Cerophyl  ili alfa-celuloze).
 
Uvjeti za inkubaciju  
32. Blago dozra čivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se 
po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja li činki i traje tako tijekom cijelog 
ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne 
ispod 60 posto ASV-a). Dozra čivanje se vrši putem staklene pasterove 
pipete pri čvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehuri ­ 
ća/s). Pri ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozra ­ 
čuje sustav sediment/voda.  
33. Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za  C. 
tentans  i C. yoshimatui  preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C 
(± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a ja čina svjetlosti treba biti 500 do 
1 000 luksa.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1383
 
Trajanje izlaganja  
34. Izlaganje po činje dodavanjem li činki u posude sa sedimentom obra đenim 
spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za  
C. riparius  i C. yoshimatsui , a 65 dana za  C. tentans . Ako se li činke prije 
preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana 
nakon što se i zadnja li činka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu živo ­
tinju.  
Promatranja  
Preobrazba  
35. Odre đuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su 
se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima.
 
36. Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno 
procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuo ­
bičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja 
očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. 
Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase jajašaca položene prije prekida ispitivanja te iste treba izvaditi kako bi se 
spriječilo ponovno uvo đenje ličinki u sediment. Tako đer se bilježi i broj 
vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju preobrazbe navedene su u Dodatku 5.
 
Rast i preživljavanje  
37. Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu li činki, na 
samom po četku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno 
koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm 
kako bi se zadržale li činke. Kriteriji za smrt jesu nepomi čnost ili izostanak 
reakcije na mehani čke podražaje. I neoporavljene li činke treba prebrojati kao 
mrtve (možda su mikrobi ve ć razgradili li činke koje su uginule na po četku 
ispitivanja). Odre đuje se suha masa (bez pepela) preživjelih li činki po svakoj 
ispitnoj posudi pa se izra čunava srednja pojedina čna suha masa po posudi. 
Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele li činke; za to 
se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake li činke.  
Analitička mjerenja  
Koncentracija ispitivane tvari  
38. Prije po četka ispitivanja (tj. dodavanja li činki) vade se uzorci cjelovitog 
sedimenta iz najmanje jedne posude po tretmanu radi analiti čkog odre đi­
vanja koncentracije ispitivane tvari u sedimentu. Preporu čuje se da se na 
početku (vidjeti stavak 24.) i na kraju ispitivanja analiziraju, kao minimum, 
uzorci vode iznad sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncen ­
traciji i u nekoj nižoj. Ta odre đivanja koncentracije ispitivane tvari daju 
informacije o ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment.  
39. Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu 
potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to pritom ne utje če na sustav ispitivanja, analiti čka određivanja treba provoditi 
na uzorcima iz dodatnih ispitnih posuda koje se tretiraju na isti na čin 
(uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za 
biološka promatranja.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1384
 
40. Preporu čeni postupak za izoliranje me đuprostorne vode jest centrifugiranje 
na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Me đutim, ako se pokaže da se 
ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U nekim slu čajevima možda ne će biti mogu će analizirati koncentracije u 
pornoj vodi jer je uzorak premalen.
 
Fizikalno-kemijski parametri  
41. Na odgovaraju ći način treba izmjeriti pH i temperaturu u ispitnim posudama 
(vidjeti stavak 10.). Tvrdo ću i amonijak treba mjeriti u kontrolnim posu ­
dama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj koncentraciji na po četku i na 
kraju ispitivanja.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
42. Cilj ovog ispitivanja jest odrediti u činak ispitivane tvari na brzinu razvoja i 
ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slu čaju 10- 
dnevnog ispitivanja, u činke na preživljavanje i masu li činki. Ako ne postoje 
naznake statisti čki različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki 
mogu se ujediniti radi statisti čke analize. Razlike u osjetljivosti spolova 
mogu se statisti čki prosuditi, npr. tabli čnim testom χ 2 -r × 2. Preživljavanje 
ličinki i njihova srednja pojedina čna suha masa po posudi moraju se odrediti 
nakon deset dana kada je to potrebno.  
43. Koncentracije s u činkom izražene i utemeljene na suhoj masi izra čunavaju 
se po mogu ćnosti na temelju koncentracija u sedimentu izmjerenih na 
početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.).  
44. Za izra čun procjene to čke EC  50 ili bilo koje druge EC  x kao dodatna 
ponovna odre đivanja mogu se koristiti statisti čki podaci dobiveni za svaku 
posudu. U izra čunu intervala pouzdanosti za bilo koji EC  x u obzir treba 
uzeti varijabilnost izme đu posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost 
toliko neznatna da se može ignorirati. Kad se model prilago đava metodi 
najmanjih kvadrata, na statisti čke podatke za svaku posudu treba primijeniti 
transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Me đutim, vrijed ­
nosti EC  x trebale bi se izra čunati tek nakon što se odgovor transformira 
natrag u izvornu vrijednost.  
45. Kada je cilj statisti čke analize odre đivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem 
hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost me đu posudama, npr. ugnijež ­ 
đenom ANOVA-om. Kao druga mogu ćnost, u situacijama kada se pobiju 
pretpostavke uobi čajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispiti ­
vanja (21).  
Omjer preobrazbe  
46. Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati 
Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po korak kada se o čekuje odgovor na monotoni čnu dozu i kad se ti podaci 
slažu s tim o čekivanjem. Ako to nije slu čaj, mogu se koristiti Fisherov test 
ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilago đenim 
p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još ve ću varijabilnost izme đu više­
strukih odre đivanja u istoj koncentraciji nego što bi to nazna čila binomijalna 
raspodjela ( često zvana i „ekstra-binomijalna” varijacija), treba primijeniti 
robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21).
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1385
Određuje se broj mušica preobraženih po posudi, n  e , koji se onda dijeli 
brojem uvedenih li činki, na:  
ER ¼ n e 
n a 
gdje je:  
ER = omjer preobrazbe  
n e = broj preobraženih mušica po posudi  
n a = broj uvedenih li činki po posudi  
47. Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna 
varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primi ­
jeniti postupke poput Williamovog testa kada se o čekuje odgovor na mono ­
toničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio 
prikladan gdje nema monotoni čnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao 
broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica ve ći od pet, i to na 
osnovi ponovljenog odre đivanja (posude).  
48. Za primjenu vrijednosti ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo trans ­
formirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili Freeman-Tukeyovom 
transformacijom kako bi se dobila približna normalna raspodjela i ujedna čile 
varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primjenjuje se tako što se uzme 
inverzni sinus (sin
 –1 ) drugog korijena ER-a.  
49. Za omjere preobrazbe vrijednosti EC  x računaju se regresijskom analizom (ili 
npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako 
regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomi čna 
odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomi čni 
prosjek ili jednostavna interpolacija.  
Brzina razvoja  
50. Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena izme đu uvođenja 
ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. 
(Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost li činki u 
trenutku uvo đenja). Brzina razvoja recipro čna je vremenu razvoja (jedinica: 
1/dan) i predstavlja dio razvoja li činki koji se odvija tijekom jednog dana. 
Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksi čnosti sedimenta 
jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti mo ćni postupci 
parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. 
Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti 
EC
 x regresijskom analizom (npr. (23), (24)).  
51. Za sljede će statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamije ćen 
na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu izme đu 
dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obi čno 1 dan). 
Srednja brzina razvoja po posudi ( x) računa se prema:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1386
 
gdje je:  
x: srednja brzina razvoja po posudi  
i: indeks intervala pregleda  
m: maksimalni broj intervala pregleda  
ƒ i : broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i  
n e : ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (=  P ƒ i ) 
x i : brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i  
x i ¼ 1 
day  i Ä 1 i 
2 Í Î  
gdje je:  
day  i : dan pregleda (dani od primjene)  
l i : trajanje intervala pregleda i (dani, obi čno 1 dan)  
Izvješće o ispitivanju  
52. Izvješ će o ispitivanju mora sadržavati barem sljede će podatke:  
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (toplji ­
vost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako 
postoji), stabilnost u vodi itd.);  
— podaci za identifikaciju kemikalije (op ći naziv, kemijski naziv, CAS broj 
itd.), uklju čujući i čistoću i analiti čku metodu kvantifikacije ispitivane 
tvari.  
Ispitne vrste:  
— korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i 
uvjeti uzgoja;  
— podaci o rukovanju masama jajašaca i li činkama;  
— starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude.  
Uvjeti ispitivanja:  
— korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment;  
— za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uklju ­ 
čujući, po mogu ćnosti, povijest one čišćenja, svojstva: pH, sadržaj organ ­
skog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno);  
— priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog 
ugljika, pH, vlaga itd. na po četku ispitivanja);  
— priprema ispitne vode (ako se koristi obra đena voda) i svojstva (koncen ­
tracija kisika, pH, provodljivost, tvrdo ća itd. na po četku ispitivanja);  
— dubina sedimenta i vode iznad sedimenta;  
— volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa 
i bez porne vode;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1387
 
— ispitne posude (materijal i veli čina); 
— metoda obra đivanja sedimenta spikingom: korištene ispitne koncentra ­
cije, broj višestrukih odre đivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten;  
— faza stabilizacijskog uravnoteženja sustava sediment/voda obra đenog 
spikingom: trajanje i uvjeti;  
— uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i ja čina svjetlosti, dozra čivanje 
(učestalost i intenzitet);  
— detaljni podaci o hranjenju, uklju čujući i vrstu hrane, pripremu, koli činu 
i režim hranjenja.  
Rezultati:  
— nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati 
svih analiza za odre đivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj 
posudi;  
— kakvo ća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, 
tvrdoća i amonijak;  
— nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo;  
— broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu;  
— broj li činki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi;  
— srednja pojedina čna suha masa li činki po posudi i po stadiju razvoja, ako 
je to primjereno;  
— postotak preobrazbe po odre đivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i 
ženske mušice zajedno);  
— srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po odre đivanju i 
brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno);  
— procjena toksi čnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani inter ­
vali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statisti čke metode korištene za 
njihovo odre đivanje;  
— rasprava o rezultatima, uklju čujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja 
nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode.  
LITERATURA  
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
 
2. Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1388
 
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Ispitna metoda C.8 ovog Priloga, Toksi čnost za gujavice.  
15. Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
16. Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291- 3303.
 
17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.  
18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491.  
19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103-117.  
20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.  
22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.  
24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1389
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Za potrebe ove ispitne metode koriste se sljede će definicije:  
Formulirani sediment  ili obrađeni, umjetni ili sinteti čki sediment je smjesa tvari 
koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta.  
Voda iznad sedimenta  je voda koja se ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta.  
Međuprostorna voda  ili porna voda je voda u prostoru izme đu sedimenta i 
čestica tla.  
Sediment obra đen spikingom  je sediment u koji je dodana ispitivana tvar.  
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom 
metodom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1390
 
Dodatak 2.  
Preporuke za uzgoj kulture  Chironomus riparius  
1. Ličinke vrste  Chironomus  mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili 
velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Tako đer se pokazalo da je dijatomejska 
zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od 
svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. 
Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgub ­
ljena isparavanjem i sprije čilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadoli ­
jevati. Treba osigurati blago dozra čivanje. Posude za uzgoj li činki trebale bi 
se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih 
životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda ne će doći do kopulacije (minimalno oko 
30 × 30 × 30 cm).
 
2. Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim 
okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (ja čine oko 
1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješ ća saznajemo da vlažnost zraka 
ispod 60 % RV može sprije čiti razmnožavanje.  
Voda za razrje đivanje  
3. Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sinteti čka voda. Obi čno se 
koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. 
mediji Elendt „M4” ili „M7”, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije 
uporabe mora dozra čiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može 
se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjev čice s ličinkama.
 
Hranjenje li činki 
4. Ličinke vrste  Chironomus  treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® ili neka druga sli čna robna marka riblje hrane), i to 
otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode 
za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može 
dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane.
 
5. Hranjenje se prilago đava kakvo ći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj 
kultura postane „mutna”, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja li činki prema 
vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do pove ćane aktivnosti mikroba 
i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta.
 
6. Tako đer se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr.  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ) kada se postavljaju nove posude za uzgoj 
kultura.  
Hranjenje preobraženih odraslih životinja  
7. Neki izvo đači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namo čen u zasi ­ 
ćenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle 
životinje.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1391
 
Preobrazba  
8. Na 20 ± 2 °C li činke se po činju preobražavati u odrasle životinje iz posuda 
za uzgoj li činki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po 
svojim dlakavim ticalima.  
Mase jajašaca  
9. Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za 
uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih 
masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih 
prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksi čnosti.
 
10. Valjenje li činki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana.  
Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture  
11. Kad se kulture razviju, trebalo bi biti mogu će postaviti novu posudu za 
uzgoj kulture jedanput tjedno ili rje đe, ovisno o potrebama ispitivanja, i 
ukloniti starije posude nakon što se li činke preobraze u odrasle mušice. 
Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih 
životinja.  
Priprema ispitnih otopina „M4” i „M7”  
12. Elendt (1990.) je opisao medij „M4”. Medij „M7” priprema se kao medij 
„M4”, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u 
„M7” od onih u „M4”. Publikacija o mediju „M7” trenuta čno se priprema 
(Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu 
i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H  2 O, NaNO3, KH2PO4 i 
K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne.  
Priprema medija „M7”  
13. Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna 
otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija „M7” miješa se pedeset ml kombinirane radne 
otopine (II) i koli čine svake radne otopine makronutrijenata navedene u 
tablici 2. do ukupno 1 litre deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je naznačeno u tablici 3., a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine 
dodaje se kona čnom mediju „M7” tik prije uporabe. (Vitaminska radna 
otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima). Medij se dozra či i 
stabilizira.
 
LITERATURA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1392
 
Tablica 1.  
Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7  
Radne otopine (I)  Količina (mg) od 
koje se umiješa 
do 1 litre 
deionizirane vode  Za pripremu kombinirane radne 
otopine (II): pomiješajte sljede će 
količine (mg) radnih otopina (I) u do 
1 litre deionizirane vode  Konačne koncentracije u ispitnim 
otopinama (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190  1,0  0,25  2,86  0,715  
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210  1,0  0,25  0,361  0,090  
LiCl (  1 ) 6 120  1,0  0,25  0,306  0,077  
RbCl (  1 ) 1 420  1,0  0,25  0,071  0,018  
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040  1,0  0,25  0,152  0,038  
NaBr (  1 ) 320  1,0  0,25  0,016  0,004  
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260  1,0  0,25  0,063  0,016  
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335  1,0  0,25  0,017  0,004  
ZnCl  2 260 1,0  1,0  0,013  0,013  
CaCl  2 · 6 H  2 O 200  1,0  1,0  0,010  0,010  
KI 65  1,0  1,0  0,0033  0,0033  
Na 2 SeO  3 43,8 1,0  1,0  0,0022  0,0022  
NH  4 VO  3 11,5 1,0  1,0  0,00058  0,00058  
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000  20,0  5,0  2,5  0,625  
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991  20,0  5,0  1,0  0,249  
( 1 ) Ove se tvari razlikuju u M4 i M7, kao što je nazna čeno gore. 
( 2 ) Ove se otopine pripremaju odvojeno, a potom se sjedine i odmah obrade u autoklavu.  
Tablica 2.  
Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7  
Količina od koje se 
umiješa do 1 litre 
deionizirane vode 
(mg)  Količina radnih otopina 
makronutrijenata koja se 
dodaje za pripremu medija 
M4 i M7 
(ml/l)  Konačne koncentracije 
u ispitnim otopinama 
M4 i M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800  1,0  293,8  
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600  0,5  123,3  
KC1  58 000  0,1  5,8  
NaHCO  3 64 800  1,0  64,8  
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000  0,2  10,0  
NaNO  3 2 740  0,1  0,274  
KH  2 PO 4 1 430  0,1  0,143  
K 2 HPO  4 1 840  0,1  0,184  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1393
 
Tablica 3.  
Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7. Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u 
jednu vitaminsku radnu otopinu.  
Količina od koje se 
umiješa do 1 litre 
deionizirane vode 
(mg)  Količina vitaminske radne 
otopine koja se dodaje za 
pripremu medija M4 i M7 
(ml/l)  Konačne koncentracije u 
ispitnim otopinama M4 i 
M7 
(mg/l)  
Tiamin-hidroklorid  750  0,1  0,075  
Cijanokobalamin (B12)  10  0,1  0,0010  
Biotin  7,5  0,1  0,00075  
LITERATURA  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  Cultured in 
Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on 
Life History Parameters of  D. magna . Water Research  24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1394
 
Dodatak 3.  
PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA  
Sastav sedimenta  
Formulirani sediment trebao bi imati sljede ći sastav:  
Sastojak  Svojstva  % sedimenta 
suha masa  
Treset  Sphagnum moss treset, što 
bliže pH podru čju od 5,5- 
6,0, bez vidljivih ostataka 
biljaka, fino usitnjen (veli čina 
čestica ≤ 1 mm) i sušen na 
zraku  4 - 5  
Kremeni pijesak  Veli čina zrna: > 50 % čestica 
trebalo bi biti u rasponu od 
50-200 μm 75 - 76  
Kaolinitska glina  Sadržaj kaolinita ≥ 30 %  20  
Organski ugljik  Prilago đava se dodavanjem 
treseta i pijeska  2 (± 0,5)  
Kalcijev karbonat  CaCO  3 , u prahu, kemijski 
čist 0,05 (- 0,1)  
Voda  Provodljivost ≤ 10 μS/cm  30 (- 50)  
Priprema  
Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne 
količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomo ću uređaja za homogenizaciju 
visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u podru čju od 5,5 ± 0,5 
pomoću CaCO  3 . Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem 
na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna kompo ­
nenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija 
treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deionizi ­
ranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u podru čju 
od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH kona čne smjese i 
podešava na 6,5 do 7,5 pomo ću CaCO  3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci 
sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksi čnosti trzalaca, 
priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom 
ispitivanju.
 
Skladištenje  
Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i 
hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi 
trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu.
 
LITERATURA  
Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksi čnost za gujavice.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1395
 
Dodatak 4.  
Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrje đivanje  
Tvar  Koncentracije  
Lebdeće čestice  < 20 mg/l  
Ukupni organski ugljik  < 2 mg/l  
Neionizirani amonijak  < 1 μg/l 
Tvrdoća kao CaCO  3 < 400 mg/l (*)  
Rezidualni klor  < 10 μg/l 
Ukupni organofosforni pesticidi  < 50 ng/l  
Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bife ­
nili < 50 ng/l  
Ukupni organski klor  < 25 ng/l  
(*) Međutim, treba imati na umu da, ako se sumnja u postojanje interakcije izme đu iona 
tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdo će (u toj se situaciji stoga 
ne smije koristiti medij Elendt M4).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1396
 
Dodatak 5.  
Smjernice za pra ćenje preobrazbe li činki trzalaca  
U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su 
zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih zamki:
 
A: najlonski zaslon  
B: obrnute plasti čne čaše 
C: laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika  D: priklju čci na zaslonu za promjenu vode  
E: voda  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1397
 
C. 28.  TEST TOKSI ČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI 
IZ SEDIMENTA S VODOM OBRA ĐENOM SPIKINGOM  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara OECD TG 219 (2004.). Ova je ispitna metoda 
namijenjena procjeni u činaka produljenog izlaganja kemikalija li činkama 
slatkovodnih dvokrilaca trzalaza ( Chironomus  sp) koje borave u sedimentu. 
Uglavnom se temelji na smjernici BBA u kojoj se koristi sustav ispitivanja sediment/voda s umjetnim tlom i scenarij izlaganja u vodenom stupcu (1). 
Ona tako đer uzima u obzir i postoje će protokole testova toksi čnosti za  
Chironomus riparius  i Chironomus tentans  koji su razvijeni u Europi i 
Sjevernoj Americi (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prstenastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima postoji dobra 
dokumentacija, npr.  Chironomus yoshimatsui  (10)(11).
 
2. Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest obra đivanje vode 
spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja ovisi o cilju provo đenja 
testa. Cilj scenarija izlaganja u vodi, uklju čujući i obrade vodenog stupca 
spikingom, jest simulirati rasap pesticida, a obuhva ća i početne vršne 
koncentracije u pornoj vodi. Koristan je i za druge vrste izlaganja (uklju ­ 
čujući i izlijevanja kemikalija), osim procesa akumulacije koji traju dulje od 
razdoblja ispitivanja.  
3. Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obi čno u njemu 
opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na 
razne načine. Relativna važnost svakog na čina izlaganja i vrijeme potrebno 
da bi svaki od tih na čina pridonio op ćim učincima toksi čnosti ovise o 
fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log K
 ow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kova ­
lentnim vezama zna čajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane 
hrane. Kako se ne bi podcijenila toksi čnost jako lipofilnih tvari, može se u 
obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni na čini izlaganja, ova se ispitna 
metoda usredoto čuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 
28 dana za  C. riparius  i C. yoshimatsui , a 28 - 65 dana za  C. tentans . Ako 
su za neku specifi čnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi 
istraživanja u činaka nestabilnih kemikalija, višestruka odre đivanja mogu se 
ukinuti nakon deset dana.
 
4. Izmjereni kona čni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u 
vrijeme preobrazbe. Preporu čuje se da se preživljavanje i rast li činki mjere 
tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to 
pomoću dodatnih višestrukih odre đivanja, ako je to prikladno.  
5. Preporu čuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima 
nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima:  
— pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu „standar ­
diziranu matricu” te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontami ­
niranih i čistih izvora sedimenta;  
— testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suo čava sa 
sezonskom varijabilnoš ću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za 
prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja uro đene faune; uporaba 
formuliranog sedimenta tako đer snižava troškove povezane s terenskim 
prikupljanjem dovoljnih koli čina sedimenta za rutinsko testiranje;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1398
 
— uporaba formuliranog sedimenta omogu ćuje usporedbu toksi čnosti i 
razvrstavanje tvari u skladu s tim: podaci o toksi čnosti iz testova s 
prirodnim i umjetnim sedimentom mogli su se usporediti za nekoliko kemikalija (2).
 
6. Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.  
NAČELO ISPITIVANJA  
7. Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija 
ispitivane tvari u sustavima sediment/voda. Ispitivanje po činje stavljanjem 
ličinki u prvom stadiju razvoja u ispitne laboratorijske čaše u kojima se 
nalazi sustav sediment/voda i naknadnom obradom ispitivane tvari u vodi spikingom. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. 
Također se mogu mjeriti i preživljavanje i masa li činki nakon deset dana, 
ako je to potrebno (pomo ću dodatnih višestrukih odre đivanja, ako je to 
primjereno). Ti se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem odre đivanja koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preo ­
brazbi, preživljavanju ili rastu li činki (npr. EC
 15 , EC  50 itd.) bilo statisti čkim 
hipotetskim testiranjem s ciljem odre đivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje 
je potrebna usporedba vrijednosti u činka s kontrolnim vrijednostima pomo ću 
statističkih testova.  
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI  
8. Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, 
izmjerena ili izra čunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. 
Treba biti dostupna pouzdana analiti čka metoda kvantifikacije ispitivane 
tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznoš ću i granicama detekcije. Korisne informacije obuh ­
vaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je 
još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abioti čka i bioti čka 
razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su 
fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12).
 
REFERENTNE KEMIKALIJE  
9. Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodi čno kako bi se osigurala 
pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksi čnih 
tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studi ­
jama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev 
klorid. (1)(2)(5)(6)(13).  
VALJANOST ISPITIVANJA  
10. Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljede ći uvjeti:  
— postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi 
najmanje 70 %. (1)(6);  
— preobrazba vrsti  C. riparius  i C. yoshimatsui  u odrasle životinje u 
kontrolnim posudama treba se odviti izme đu 12. i 23. dana nakon 
njihova umetanja u posude; za vrstu  C. tentans  potrebno je razdoblje 
od 20 do 65 dana.  
— na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju 
otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 % vrijednosti zasi ćenosti kisikom (ASV) na odre đenoj temperaturi, a pH 
vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim 
posudama;
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1399
 
— temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. 
Temperatura vode može se kontrolirati izotermi čkom sobom i u tom 
slučaju temperatura u prostoriji treba se potvr đivati u odgovaraju ćim 
vremenskim razmacima.  
OPIS METODE  
Ispitne posude  
11. Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 
8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajam čiti da je i u njima 
prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj li činki bude 2 do 3 cm
 2 površine. 
Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. 
Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja 
treba biti na činjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog 
materijala (npr. teflona).  
Odabir vrste  
12. Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogu ćnosti je  Chironomus ripa ­
rius. I vrsta  Chironomus tentans  također je prikladna, ali je njome teže 
rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i 
vrsta  Chironomus yohimatsui.  Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se 
u Dodatku 2. za vrstu  Chironomus riparius.  Podaci o uvjetima uzgoja 
kulture dostupni su tako đer i za druge vrste, tj.  Chironomus tentans  (4) i  
Chironomus yoshimatsui  (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije 
ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi 
potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju.  
Sediment  
13. Po mogu ćnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obra ­ 
đeni, umjetni ili sinteti čki sediment). Me đutim, ako se koristi prirodni sedi ­
ment, isti se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i odre đivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i 
granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nika ­
kvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Tako đer se 
preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksi čnosti trza ­
laca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u 
narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporu čuje se sljede ći 
formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), (1)(15)(16):
 
(a) 4-5 % (suhe mase) treseta: što je mogu će bliže pH od 5,5 do 6,0; važno 
je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veli čine čestica 
≤ 1 mm) i isklju čivo sušen na zraku.  
(b) 20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogu ćnosti 
iznad 30 %).  
(c) 75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevla ­
davati s više od 50 % čestica izme đu 50 i 200 μm). 
(d) Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobila vlaga kona čne smjese u 
rasponu od 30 - 50 %.  
(e) Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvo će (CaCO  3 ) kako bi se 
pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5.  
(f) Sadržaj organskog ugljika kona čne smjese trebao bi iznositi 2 % 
(± 0,5 %) i treba se prilagoditi dodavanjem odgovaraju ćih količina 
treseta i pijeska prema (a) i (c).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1400
 
14. Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti 
nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, 
organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formu ­
liranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka tako đer 
je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne 
dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da 
su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni.  
Voda  
15. Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prih ­
vatljive vode za razrje đivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda 
za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna voda (površinske ili podzemne vode), obra đena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili 
deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja 
kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na po četku 
testa pH ispitne vode treba biti izme đu 6 i 9, a ukupna tvrdo ća ne viša od 
400 mg/l kao CaCO
 3 . Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije 
između iona tvrdo će i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje 
tvrdoće (u toj se situaciji stoga ne smije koristiti medij Elendt M4). 
Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvo će vode navedena u 
Dodatku 4. zna čajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva.
 
Radne otopine - voda obra đena spikingom  
16. Ispitne koncentracije izra čunavaju se na temelju koncentracija u vodenom 
stupcu, tj. u vodi iznad sedimenta. Ispitne otopine u odabranoj koncentraciji 
pripremaju se razrje đivanjem radne otopine. Radne otopine trebalo bi, po 
mogućnosti, pripremiti otapanjem ispitivane tvari u ispitnom mediju. Možda 
će u nekim slu čajevima biti potrebno upotrijebiti otapala ili dispergente kako 
bi se dobila prikladno koncentrirana radna otopina. Primjeri prikladnih otapala jesu: aceton, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamid i trietilen glikol. Dispergenti koji se 
mogu koristiti jesu Cremophor RH40, Tween 80, metil-celuloza 0,01 % i 
HCO-40. Koncentracija otapaju ćeg sredstva u kona čnom ispitnom mediju 
trebala bi biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) i trebala bi biti ista u svim tretma ­
nima. Kada se koristi otapaju će sredstvo, ono ne smije imati nikakve 
značajne učinke na preživljavanje ili nikakav vidljiv negativan u činak na 
ličinke trzalaca, što se otkriva kontrolom samo s otapalom. Me đutim, treba 
uložiti sve napore da se izbjegne uporaba takvih tvari.
 
PLAN ISPITIVANJA  
17. Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, 
na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj li činki po posudi. Opisani 
su planovi za procjenu to čke koncentracije s u činkom (EC), za procjenu 
najviše koncentracije bez vidljivog u činka (NOEC) i za provo đenje 
graničnog ispitivanja. Regresijskoj se analizi daje prednost nad pristupom 
testiranja hipoteze.  
Plan za regresijsku analizu  
18. Koncentracija s u činkom (npr. EC  15 , EC  50 ) i raspon koncentracije, iznad 
kojega je u činak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhva ćati koncentra ­
cije uklju čene u ispitivanje. Op ćenito, preciznost, a posebno valjanost, s 
kojom se mogu procijeniti koncentracije s u činkom (EC  x ), poboljšavaju se 
kad se koncentracija s u činkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1401
 
Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili 
iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za odre đivanje 
raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti 
(vidjeti stavak 27.).  
19. Ako treba procijeniti EC  x , treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri 
višestruka odre đivanja. U svakom se slu čaju savjetuje korištenje dovoljnog 
broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti ve ći od dva (iznimka se može u činiti u 
slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj više ­
strukih odre đivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se pove ća broj 
ispitnih koncentracija razli čitog odgovora. Pove ćanjem broja višestrukih 
određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obi čno 
dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka odre đivanja 
potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast li činki.
 
Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a  
20. Ako treba procijeniti LOEC/NOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim u čin­
kom/najvišu koncentraciju bez vidljivog u činka), treba koristiti pet ispitnih 
koncentracija u najmanje četiri višestruka odre đivanja, a faktor izme đu 
koncentracija ne bi smio biti ve ći od dva. Broj višestrukih odre đivanja 
trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statisti čku snagu kojom će se 
otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini zna čajnosti od 5 % (p = 
0,05). Kod brzine razvoja obi čno je prikladna analiza varijance (ANOVA), 
kao što su Dunnettov test i Williamsov test (17)(18)(19)(20). Kod omjera 
preobrazbe mogu se koristiti Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s 
Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test.  
Granično ispitivanje  
21. Može se provesti grani čno ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i 
kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za odre đivanje raspona 
ne vide nikakvi u činci. Cilj grani čnog ispitivanja jest nazna čiti da je vrijed ­
nost toksi čnosti ispitivane tvari ve ća od ispitivane grani čne koncentracije. U 
ovoj se ispitnoj metodi ne mogu dati nikakvi prijedlozi preporu čene koncen ­
tracije; to se prepušta prosudbi zakonodavca. Obi čno je potrebno najmanje 
šest višestrukih odre đivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba poka ­
zati adekvatnu statisti čku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od 
kontrolne posude pri razini zna čajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metri čkog 
odgovora (brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statisti čka metoda ako 
podaci zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). 
Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili 
neparametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera preobrazbe prikladan je Fisherov test.
 
POSTUPAK  
Uvjeti izlaganja  
Priprema sustava voda/sediment obra đenog spikingom  
22. Odgovaraju će količine formuliranog sedimenta (vidjeti stavke 13.-14. i 
Dodatak 3.) dodaju se u ispitne posude gdje tvore sloj debljine najmanje 
1,5 cm. Voda se nadolijeva do 6 cm (vidjeti stavak 15.). Omjer debljine sloja sa sedimentom i dubine vode ne bi smio premašivati 1:4, a sloj sa sedimentom ne bi trebao biti deblji od 3 cm. Sustav sediment/voda treba 
blago dozra čivati sedam dana prije dodavanja ispitnih organizama (vidjeti 
stavak 14. i Dodatak 3.). Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti plasti čnim diskom dok se na njega lijeva 
voda, a disk se mi če odmah nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi 
predmeti.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1402
 
23. Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim plo čama). Ako je 
potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode 
kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomo ću 
destilirane ili deionizirane vode kako bi se sprije čilo stvaranje soli.  
Dodavanje ispitnih organizama  
24. Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, 
mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u 
hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz mati čne kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za 
uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture 
treba dodati manju koli činu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica 
suspenzije fino mljevenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje li činki obično počinje 
nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za  Chironomus ripa ­
rius na 20 °C i 1 do 4 dana za  Chironomus tentans  na 23 °C i za  Chiro­
nomus yoshimatui  na 25 °C), a li činke se razvijaju u četiri stadija razvoja, 
od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti li činke iz prvog 
stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica mogu će je 
provjeriti pomo ću širine kapsule glave (6).
 
25. Dvadeset li činki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku 
ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obra đen spikingom, i to 
pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozra čivanje vode tijekom dodavanja 
ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja 
ličinki (vidjeti stavke 24. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja 
(vidjeti stavke 19. i 20.) broj li činki po koncentraciji iznosi najmanje 60 
za procjenu to čke EC-a i 80 za odre đivanje NOEC-a.  
26. Dvadeset i četiri sata nakon dodavanja li činki ispitivana tvar dodaje se 
spikingom u vodeni stupac iznad sedimenta i ponovno se osigura blago 
dozračivanje. Male koli čine otopina ispitivane tvari stavljaju se ispod povr ­ 
šine vode pipetom. Voda iznad sedimenta trebala bi se potom pažljivo promiješati kako se sediment ne bi umiješao.
 
Ispitne koncentracije  
27. Ispitivanje za odre đivanje raspona može biti korisno za odre đivanje raspona 
koncentracija za kona čno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko 
razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gusto ća 
površine po trzalcu, koja će se koristiti i u kona čnom ispitivanju, trzalci 
se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogu ­ 
ćuje procjenu odgovaraju ćih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna više ­
struka odre đivanja.  
28. O ispitnim koncentracijama za kona čno ispitivanje odlu čuje se na temelju 
rezultata ispitivanja za odre đivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati 
najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20.  
Kontrolne posude  
29. U ispitivanje bi, s odgovaraju ćim brojem višestrukih odre đivanja, trebalo 
uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti 
stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti 
stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1403
 
Sustav ispitivanja  
30. Koriste se stati čki sustavi. Polustati čni ili proto čni sustavi sa stalnim ili 
isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u iznimnim slu čajevima, na primjer ako specifikacije kakvo će vode postanu 
neprikladne za ispitni organizam ili ako utje ču na uravnoteženje kemikalije 
(npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlu čivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji 
utječu na pH i/ili tvrdo ću vode). Me đutim, obi čno su dostatne i daje se 
prednost drugim metodama poboljšanja kakvo će vode iznad sedimenta, 
kao što je dozra čivanje.
 
Hrana  
31. Potrebno je hraniti li činke, po mogu ćnosti svakodnevno ili najmanje triput 
tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino mljevene hrane, 
npr. Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u koli čini od 
0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za  C. yoshimatui ) dnevno po li činki prikladna za 
mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više 
hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po li činki trebalo bi biti dostatno za ostatak 
ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati 
rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako adsorptive tvari (npr. čiji je log K
 ow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne 
veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije 
može dodati koli čina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i 
prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora kori ­
stiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog 
lišća npr. velike koprive ( Urtica dioica ), duda ( Morus alba ), bijele djeteline 
(Trifolium repens ), špinata ( Spinacia oleracea ) ili nekog drugog biljnog 
materijala ( Cerophyl  ili alfa-celuloze).  
Uvjeti za inkubaciju  
32. Blago dozra čivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se 
po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja li činki i traje tako tijekom cijelog 
ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne ispod 60 % ASV-a). Dozra čivanje se vrši putem staklene pasterove pipete 
pričvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehuri ća/s). Pri 
ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozra čuje sustav 
sediment/voda.
 
33. Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za  C. 
tentans  i C. yoshimatui  preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C 
(± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a ja čina svjetlosti treba biti 500 do 
1 000 luksa.  
Trajanje izlaganja  
34. Izlaganje po činje dodavanjem li činki u posude sa sedimentom obra đenim 
spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za  
C. riparius  i C. yoshimatsui , a 65 dana za  C. tentans . Ako se li činke prije 
preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana nakon što se i zadnja li činka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu živo ­
tinju.
 
PROMATRANJA  
Preobrazba  
35. Odre đuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su 
se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim 
ticalima.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1404
 
36. Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno 
procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuo ­
bičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja 
očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. 
Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. 
Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase 
jajašaca položene prije prekida ispitivanja te ih treba izvaditi kako bi se spriječilo ponovno uvo đenje ličinki u sediment. Tako đer se bilježi i broj 
vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju 
preobrazbe navedene su u Dodatku 5.
 
Rast i preživljavanje  
37. Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu li činki, na 
samom po četku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno 
koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm 
kako bi se zadržale li činke. Kriteriji za smrt jesu nepomi čnost ili izostanak 
reakcije na mehani čke podražaje. I neoporavljene li činke treba prebrojati kao 
mrtve (možda su mikrobi ve ć razgradili li činke koje su uginule na po četku 
ispitivanja). Odre đuje se suha masa (bez pepela) preživjelih li činki po svakoj 
ispitnoj posudi pa se izra čunava srednja pojedina čna suha masa po posudi. 
Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele li činke; za to 
se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake li činke.  
Analitička mjerenja  
Koncentracija ispitivane tvari  
38. Kao minimum, na po četku (po mogu ćnosti sat vremena poslije dodavanja 
ispitivane tvari) i na kraju ispitivanja moraju se analizirati uzorci vode iznad 
sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncentraciji i u nekoj nižoj. Ta odre đivanja koncentracije ispitivane tvari daju informacije o 
ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment. Uzorkovanje 
sedimenta na po četku ispitivanja može utjecati na sustav ispitivanja (npr. 
uklanjanje ispitnih li činki) pa bi stoga trebalo koristiti dodatne ispitne 
posude za provo đenje analiti čkih određivanja na po četku i tijekom ispitiva ­
nja, po potrebi (vidjeti stavak 39.). Možda ne će biti potrebno provoditi 
mjerenja u sedimentu ako je razdioba ispitivane tvari i izme đu vode i 
sedimenta jasno odre đena u studiji vode/sedimenta u poredbenim uvjetima 
(npr. omjer sedimenta i vode, vrsta primjene, sadržaj organskog ugljika u sedimentu).
 
39. Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu 
potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to 
pritom ne utje če na sustav ispitivanja, analiti čka određivanja treba provoditi 
na uzorcima iz dodatnih ispiinih posuda koje se tretiraju na isti na čin 
(uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za 
biološka promatranja.  
40. Preporu čeni postupak za izoliranje me đuprostorne vode jest centrifugiranje 
na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Me đutim, ako se pokaže da se 
ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U 
nekim slu čajevima možda ne će biti mogu će analizirati koncentracije u 
pornoj vodi jer je uzorak premalen.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1405
 
Fizikalno-kemijski parametri  
41. Na odgovaraju ći način treba izmjeriti pH, otopljeni kisik u ispitnoj vodi i 
temperaturu u ispitnim posudama (vidjeti stavak 10.). Tvrdo ću i amonijak 
treba mjeriti u kontrolnim posudama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj 
koncentraciji na po četku i na kraju ispitivanja.  
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
42. Cilj ovog ispitivanja jest odrediti u činak ispitivane tvari na brzinu razvoja i 
ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slu čaju 10- 
dnevnog ispitivanja, u činke na preživljavanje i masu li činki. Ako ne postoje 
naznake statisti čki različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki 
mogu se ujediniti radi statisti čke analize. Razlike u osjetljivosti spolova 
mogu se statisti čki prosuditi, npr. tabli čnim testom χ 2 -r × 2. Preživljavanje 
ličinki i njihova srednja pojedina čna suha masa po posudi moraju se odrediti 
nakon 10 dana kada je to potrebno.  
43. Koncentracije s u činkom izražene kao koncentracije u vodi iznad sedimenta 
izračunavaju se po mogu ćnosti na temelju koncentracija izmjerenih na 
početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.).  
44. Za izra čun procjene to čke EC  50 ili bilo koje druge EC  x kao dodatna 
ponovna odre đivanja mogu se koristiti statisti čki podaci dobiveni za svaku 
posudu. U izra čunu intervala pouzdanosti za bilo koji EC  x u obzir treba 
uzeti varijabilnost izme đu posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost 
toliko neznatna da se može ignorirati. Kada se model prilago đava metodi 
najmanjih kvadrata, na statisti čke podatke za svaku posudu treba primijeniti 
transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Me đutim, vrijed ­
nosti EC  x trebale bi se izra čunati tek nakon što se odgovor transformira 
natrag u izvornu vrijednost.  
45. Kada je cilj statisti čke analize odre đivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem 
hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost me đu posudama, npr. ugnijež ­ 
đenom ANOVA-om. Kao druga mogu ćnost, u situacijama kada se pobiju 
pretpostavke uobi čajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispiti ­
vanja (21).  
Omjer preobrazbe  
46. Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati 
Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po 
korak kada se o čekuje odgovor na monotoni čnu dozu i kad se ti podaci 
slažu s tim o čekivanjem. Ako to nije slu čaj, mogu se koristiti Fisherov test 
ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilago đenim 
p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još ve ću varijabilnost izme đu više­
strukih odre đivanja u istoj koncentraciji nego što bi to nazna čila binomijalna 
raspodjela ( često zvana i „ekstra-binomijalna” varijacija), treba primijeniti 
robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21).  
47. Odre đuje se broj mušica preobraženih po posudi, n  e , koji se onda dijeli 
brojem uvedenih li činki, na:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1406
 
gdje je:  
ER = omjer preobrazbe  
n e = broj preobraženih mušica po posudi  
n a = broj uvedenih li činki po posudi  
48. Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna 
varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primi ­
jeniti postupke poput Williamovog testa kada se o čekuje odgovor na mono ­
toničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio 
prikladan gdje nema monotoni čnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao 
broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica ve ći od pet, i to na 
osnovi ponovljenog odre đivanja (posude).  
49. Za primjenu vrijednosti metode ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo 
transformirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili 
Freeman-Tukeyovom transformacijom kako bi se dobila približna normalna 
raspodjela i ujedna čile varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu 
se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primje ­
njuje se tako što se uzme inverzni sinus (sin
 –1 ) drugog korijena ER-a.  
50. Za omjere preobrazbe vrijednosti EC  x računaju se regresijskom analizom (ili 
npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako 
regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomi čna 
odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomi čni 
prosjek ili jednostavna interpolacija.  
Brzina razvoja  
51. Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena izme đu uvođenja 
ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. 
(Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost li činki u 
trenutku uvo đenja). Brzina razvoja recipro čna je vremenu razvoja (jedinica: 
1/dan) i predstavlja dio razvoja li činki koji se odvija tijekom jednog dana. 
Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksi čnosti sedimenta 
jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u 
usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti mo ćni postupci 
parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti 
EC
 x regresijskom analizom (npr. (23), (24)).  
52. Za sljede će statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamije ćen 
na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu izme đu 
dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obi čno 1 dan). 
Srednja brzina razvoja po posudi x ra čuna se prema:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
gdje je:  
x: srednja brzina razvoja po posudi  
i: indeks intervala pregleda  
m: maksimalni broj intervala pregleda  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1407
 
ƒ i : broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i  
n e : ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (=  P ƒ i ) 
x i : brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i  
x i ¼ 1= day  i Ä l i 
2 Í Î  
gdje je:  
day  i : dan pregleda (dani od primjene)  
l i : trajanje intervala pregleda i (dani, obi čno 1 dan)  
Izvješće o ispitivanju  
53. Izvješ će o ispitivanju mora sadržavati barem sljede će podatke:  
Ispitivana tvar:  
— fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (toplji ­
vost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako 
postoji), stabilnost u vodi itd.);  
— podaci za identifikaciju kemikalije (op ći naziv, kemijski naziv, CAS broj 
itd.), uklju čujući i čistoću i analiti čku metodu kvantifikacije ispitivane 
tvari.  
Ispitne vrste:  
— korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i 
uvjeti uzgoja;  
— podaci o rukovanju masama jajašaca i li činkama;  
— starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude.  
Uvjeti ispitivanja:  
— korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment;  
— za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uklju ­ 
čujući, po mogu ćnosti, povijest one čišćenja, svojstva: pH, sadržaj organ ­
skog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno).  
— priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog 
ugljika, pH, vlaga itd. na po četku ispitivanja);  
— priprema ispitne vode (ako se koristi obra đena voda) i svojstva (koncen ­
tracija kisika, pH, provodljivost, tvrdo ća itd. na po četku ispitivanja);  
— dubina sedimenta i vode iznad sedimenta;  
— volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa 
i bez porne vode;  
— ispitne posude (materijal i veli čina); 
— metoda pripreme radnih otopina i ispitnih koncentracija;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1408
 
— uporaba ispitivane tvari: korištene ispitne koncentracije, broj višestrukih 
određivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten;  
— uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i ja čina svjetlosti, dozra čivanje 
(učestalost i intenzitet);  
— detaljni podaci o hranjenju, uklju čujući i vrstu hrane, pripremu, koli činu 
i režim hranjenja.  
Rezultati:  
— nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati 
svih analiza za odre đivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj 
posudi;  
— kakvo ća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, 
tvrdoća i amonijak;  
— nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo;  
— broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu;  
— broj li činki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi;  
— srednja pojedina čna suha masa li činki po posudi i po stadiju razvoja, ako 
je to primjereno;  
— postotak preobrazbe po odre đivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i 
ženske mušice zajedno);  
— srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po odre đivanju i 
brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno);  
— procjena toksi čnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani inter ­
vali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statisti čke metode korištene za 
njihovo odre đivanje;  
— rasprava o rezultatima, uklju čujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja 
nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode.  
LITERATURA  
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
2. Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop 
held in the Netherlands.  
4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated 
June 1994.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1409
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inverte ­
brates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides  
in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Poglavlje C.8 ovog Priloga, Toksi čnost za gujavice,  
15. Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
16. Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chiro ­
nomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.  
17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.  
18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491.  
19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
 
20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose 
control. Biometrics 28: 510-531.  
21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data. Biometrics 48:577-585.  
22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.  
24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1410
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Za potrebe ove metode koriste se sljede će definicije:  
Formulirani sediment  ili obrađeni, umjetni ili sinteti čki sediment je smjesa tvari 
koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta.  
Voda iznad sedimenta  je voda koja se u ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta.  
Međuprostorna voda  ili porna voda je voda u prostoru izme đu sedimenta i 
čestica tla.  
Voda obra đena spikingom  je voda u koju je dodana ispitivana tvar.  
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom 
metodom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1411
 
Dodatak 2.  
Preporuke za uzgoj kulture  Chironomus riparius  
1. Ličinke vrste  Chironomus  mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili 
velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Tako đer se pokazalo da je dijatomejska 
zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od 
svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. 
Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgub ­
ljena isparavanjem i sprije čilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadoli ­
jevati. Treba osigurati blago dozra čivanje. Posude za uzgoj li činki trebale bi 
se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih 
životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda ne će doći do kopulacije (minimalno oko 30 
x 30 x 30 cm).
 
2. Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim 
okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (ja čine oko 
1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješ ća saznajemo da vlažnost zraka 
ispod 60 % RV može sprije čiti razmnožavanje.  
Voda za razrje đivanje  
3. Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sinteti čka voda. Obi čno se 
koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. 
mediji Elendt ‚M4’ ili ‚M7’, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije 
uporabe mora dozra čiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može 
se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjev čice s ličinkama.
 
Hranjenje li činki 
4. Ličinke vrste  Chironomus  treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® ili neka druga sli čna robna marka riblje hrane), i to 
otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode 
za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može 
dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane.
 
5. Hranjenje se prilago đava kakvo ći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj 
kultura postane ‚mutna’, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja li činki 
prema vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do pove ćane aktivnosti 
mikroba i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta.
 
6. Tako đer se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr.  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ) kada se postavljaju nove posude za uzgoj 
kultura.  
Hranjenje preobraženih odraslih životinja  
7. Neki izvo đači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namo čen u zasi ­ 
ćenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle 
životinje.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1412
 
Preobrazba  
8. Na 20 ± 2 °C li činke se po činju preobražavati u odrasle životinje iz posuda 
za uzgoj li činki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po 
svojim dlakavim ticalima.  
Mase jajašaca  
9. Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za 
uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih 
masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 
mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksi čnosti.
 
10. Valjenje li činki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana.  
Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture  
11. Kad se kulture razviju, trebalo bi biti mogu će postaviti novu posudu za 
uzgoj kulture jedanput tjedno ili rje đe, ovisno o potrebama ispitivanja, i 
ukloniti starije posude nakon što se li činke preobraze u odrasle mušice. 
Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih 
životinja.  
Priprema ispitnih otopina ‚M4’ i ‚M7’  
12. Elendt (1990.) je opisao medij ‚M4’. Medij ‚M7’ priprema se kao medij 
‚M4’, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u 
‚M7’ od onih u ‚M4’. Publikacija o mediju ‚M7’ trenuta čno se priprema 
(Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu 
i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H  2 O, NaNO3, KH2PO4 i 
K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne.  
Priprema medija ‚M7’  
13. Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna 
otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija ‚M7’ miješa se 50 ml kombinirane radne otopine (II) i količine svake radne otopine makronutrijenata navedene u tablici 2. do 
ukupno 1 l deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se doda ­
vanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je nazna čeno u tablici 3., 
a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine dodaje se kona čnom mediju 
‚M7’ tik prije uporabe. (Vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u 
malim alikvotima). Medij se dozra či i stabilizira.
 
Tablica 1.  
Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7  
Radne otopine (I)  Količina (mg) od 
koje se umiješa 
do 1 litre 
deionizirane vode  Za pripremu kombinirane radne 
otopine (II): pomiješajte sljede će 
količine (mg) radnih otopina (I) u do 
1 litre deionizirane vode  Konačne koncentracije 
u ispitnim otopinama (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190  1,0  0,25  2,86  0,715  
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210  1,0  0,25  0,361  0,090  
LiCl (  1 ) 6 120  1,0  0,25  0,306  0,077  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1413
 
Radne otopine (I)  Količina (mg) od 
koje se umiješa 
do 1 litre 
deionizirane vode  Za pripremu kombinirane radne 
otopine (II): pomiješajte sljede će 
količine (mg) radnih otopina (I) u do 
1 litre deionizirane vode  Konačne koncentracije 
u ispitnim otopinama (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
RbCl (  1 ) 1 420  1,0  0,25  0,071  0,018  
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040  1,0  0,25  0,152  0,038  
NaBr (  1 ) 320  1,0  0,25  0,016  0,004  
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260  1,0  0,25  0,063  0,016  
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335  1,0  0,25  0,017  0,004  
ZnCl  2 260 1,0  1,0  0,013  0,013  
CaCl  2 · 6 H  2 O 200  1,0  1,0  0,010  0,010  
KI 65  1,0  1,0  0,0033  0,0033  
Na 2 SeO  3 43,8 1,0  1,0  0,0022  0,0022  
NH  4 VO  3 11,5 1,0  1,0  0,00058  0,00058  
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000  20,0  5,0  2,5  0,625  
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991  20,0  5,0  1,0  0,249  
( 1 ) Ove se tvari razlikuju u M4 i M7, kao što je nazna čeno gore. 
( 2 ) Ove se otopine pripremaju odvojeno, a potom se sjedine i odmah obrade u autoklavu.  
Tablica 2.  
Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7  
Količina od koje se 
umiješa do 1 litre 
deionizirane vode 
(mg)  Količina radnih otopina 
makronutrijenata koja se 
dodaje za pripremu medija 
M4 i M7 
(ml/l)  Konačne koncentracije 
u ispitnim otopinama 
M4 i M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800  1,0  293,8  
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600  0,5  123,3  
KC1  58 000  0,1  5,8  
NaHCO  3 64 800  1,0  64,8  
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000  0,2  10,0  
NaNO  3 2 740  0,1  0,274  
KH  2 PO 4 1 430  0,1  0,143  
K 2 HPO  4 1 840  0,1  0,184  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1414
 
Tablica 3.  
Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7  
Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u jednu vitaminsku radnu otopinu.  
Količina od koje se 
umiješa do 1 litre 
deionizirane vode 
(mg)  Količina vitaminske radne 
otopine koja se dodaje za 
pripremu medija M4 i M7 
(ml/l)  Konačne koncentracije u 
ispitnim otopinama M4 i 
M7 
(mg/l)  
Tiamin-hidroklorid  750  0,1  0,075  
Cijanokobalamin (B12)  10  0,1  0,0010  
Biotin  7,5  0,1  0,00075  
LITERATURA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1415
 
Dodatak 3.  
PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA  
Sastav sedimenta  
Formulirani sediment trebao bi imati sljede ći sastav:  
Sastojak  Svojstva  % sedimenta 
suha masa  
Treset  Sphagnum moss treset, što 
bliže pH podru čju od 5,5- 
6,0, bez vidljivih ostataka 
biljaka, fino usitnjen (veli čina 
čestica ≤ 1 mm) i sušen na 
zraku  4-5 
Kremeni pijesak  Veli čina zrna: > 50 % čestica 
trebalo bi biti u rasponu od 
50-200 μm 75-76  
Kaolinitska glina  Sadržaj kaolinita ≥ 30 %  20  
Organski ugljik  Prilago đava se dodavanjem 
treseta i pijeska  2 (± 0,5)  
Kalcijev karbonat  CaCO  3 , u prahu, kemijski 
čist 0,05 (- 0,1)  
Voda  Provodljivost ≤ 10 μS/cm  30 (- 50)  
Priprema  
Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne 
količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomo ću uređaja za homogenizaciju 
visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u podru čju od 5,5 ± 0,5 
pomoću CaCO  3 . Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem 
na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna kompo ­
nenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija 
treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deionizi ­
ranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u podru čju 
od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH kona čne smjese i 
podešava na 6,5 do 7,5 pomo ću CaCO  3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci 
sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksi čnosti trzalaca, 
priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom 
ispitivanju.
 
Skladištenje  
Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i 
hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi 
trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon 
razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu.  
LITERATURA:  
Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksi čnost za gujavice.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1416
 
Dodatak 4.  
Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrje đivanje  
Tvar  Koncentracije  
Lebdeće čestice  < 20 mg/l  
Ukupni organski ugljik  < 2 mg/l  
Neionizirani amonijak  < 1 μg/l 
Tvrdoća kao CaCO  3 < 400 mg/l (*)  
Rezidualni klor  < 10 μg/l 
Ukupni organofosforni pesticidi  < 50 ng/l  
Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bife ­
nili < 50 ng/l  
Ukupni organski klor  < 25 ng/l  
(*) Međutim, treba imati na umu da, ako se sumnja u postojanje interakcije izme đu iona 
tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdo će (u toj se situaciji stoga 
ne smije koristiti medij Elendt M4).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1417
 
Dodatak 5.  
Smjernice za pra ćenje preobrazbe li činki trzalaca  
U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su 
zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih 
zamki:
  
A: najlonski zaslon  
B: obrnute plasti čne čaše 
C: laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika  D: priklju čci na zaslonu za promjenu vode  
E: voda  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1418
 
C.29.  LAKA BIORAZGRADIVOST - CO  2 U ZAČEPLJENIM 
POSUDAMA (TEST PLINSKOG PROSTORA (HEADSPACE))  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 310 
(2006.). Ova ispitna metoda je metoda probira za evaluaciju lake bioraz ­
gradivosti kemikalija, a informacije sadržane u njoj sli čne su informacijama 
o šest metoda opisanih u poglavlju C.4 Priloga A do F. Dakle, kemikalija koja pokazuje pozitivne rezultate u ovoj ispitnoj metodi može se smatrati 
lako biorazgradivom te, slijedom toga, i brzo razgradivom u okolišu.
 
2. Poznata metoda za odre đivanje ugljikovog dioksida (CO  2 ) (1), utemeljena 
na Sturmovom izvornom testu (2) za procjenu biorazgradivosti organskih 
kemikalija, obi čno je, zbog mjerenja ugljikova dioksida koji nastaje djelo ­
vanjem mikroba, prvi izbor za ispitivanje slabo topljivih kemikalija i jako 
adsorptivnih kemikalija. Tako đer se odabire i za topljive (ali nehlapljive) 
kemikalije jer mnogi smatraju da je nastajanje ugljikova dioksida jedini nedvosmisleni dokaz djelovanja mikroba. Na opadanje otopljenog organskog ugljika mogu utjecati fizikalno-kemijski procesi - adsorpcija, hlapljenje, 
precipitacija (taloženje), hidroliza - kao i djelovanje mikroba, a i u 
mnogim nebiološkim reakcijama troši se kisik; rijetko kad CO
 2 nastaje od 
organskih kemikalija abioti čki. U izvornom i izmijenjenom Sturmovom testu 
(1)(2) do opadanja CO  2 dolazi u teku ćem stanju u apsorpcijske posude 
propuhivanjem (tj. tretiranjem mjehuri ća zraka da uklanjaju CO  2 iz 
tekućeg medija), dok se u Larsonovoj verziji (3)(4) CO  2 transferira iz reak ­
cijske posude do apsorbera propuštanjem zraka bez CO  2 kroz plinski prostor 
te naknadnim neprestanim protresanjem ispitne posude. Samo se u Larso ­
novoj izmijenjenoj verziji protresa reakcijska posuda; miješanje se nalaže 
samo za netopljive tvari u ISO 9439 (5) i u izvornoj verziji iz SAD-a (6), a u objema se nalaže prije propuhivanje negoli zamjena koli čine u plinskom 
prostoru. U drugoj službenoj ameri čkoj EPA metodi (7), koja se temelji na 
Gledhillovoj metodi (8), protresena reakcijska posuda zatvara se, a nastali 
CO
 2 skuplja se u unutarnji alkalni odvaja č izravno iz plinovitog stanja, kao i 
u klasičnim Warburg/Barcroftovim respirometrijskim tikvicama.  
3. Međutim, pokazalo se da se anorganski ugljik (IC) akumulira u mediju 
tijekom primjene standardnog, izmijenjenog Sturmova testa na čitav niz 
kemikalija (9). Prona đena je koncentracija IC-a od čak 8 mg/l tijekom 
razgradnje 20 mg C/l anilina. Dakle, skupljanje CO  2 u alkalnim odvaja čima 
nije dobro odrazilo pravu koli činu CO  2 koja nastaje djelovanjem mikroba u 
različitim trenucima tijekom razgradnje. Kao rezultat toga, specifikacija da 
se > 60 % teoretskog maksimuma CO  2 (ThCO  2 ) mora skupiti u „roku od 10 
dana” (10 dana neposredno nakon postizanja 10 % biorazgradnje) da bi se ispitivana kemikalija razvrstala kao lako biorazgradiva ne će biti ispunjena za 
neke kemikalije koje bi se tako razvrstale opadanjem otopljenog organskog 
ugljika (DOC).
 
4. Kada je postotak razgradnje niža vrijednost od o čekivane, mogu će je da se 
IC akumulira u ispitnoj otopini. Tada se razgradivost može procijeniti nekim 
drugim testovima biorazgradivosti.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1419
 
5. Ostali nedostaci Sturmove metodologije (nespretna, vremenski zahtjevna, 
podložnija pokusnoj greški i neprimjenjiva na hlapljive kemikalije) davno 
su potaknuli potragu za tehnikom za čepljenih posuda druk čijom od Gled ­
hillove, radije nego protoku plina (10)(11). Boatman i sur. (12) revidirali su ranije metode i usvojili sustav zatvorenog plinskog prostora u kojemu se 
CO
 2 ispušta u plinski prostor na kraju inkubacije acidifikacijom medija. CO  2 
se mjerio analizom plinskom kromatografijom (GC)/IC u automatski 
uzimanim uzorcima plinskog prostora, ali se u obzir nije uzimao otopljeni anorganski ugljik (DIC) u teku ćem stanju. Isto tako, i korištene su posude 
bile vrlo male (20 ml), a sadržavale su svega 10 ml medija, što je izazvalo 
poteškoće, npr. pri dodavanju vrlo malih koli čina netopljivih ispitivanih 
kemikalija, i/ili možda mikroorganizmi nisu u dovoljnoj mjeri ili uop će 
prisutni u inokuliranom mediju da bi mogli razgraditi ispitivane kemikalije.
 
6. Te su poteško će nadvladane u neovisnim studijama autora Strujisa i Stol ­
tenkampa (13) te Bircha i Fletchera (14), od kojih su potonji bili nadahnuti svojim iskustvom s aparaturom korištenom u testu anaerobne biorazgradnje 
(15). U prethodnoj se metodi (13) CO
 2 mjeri u plinskom prostoru nakon 
acidifikacije i uravnoteženja, dok se u potonjoj metodi (14) mjeri DIC i u plinovitom i u teku ćem stanju, bez tretmana; u teku ćem je stanju bilo 
prisutno više od 90 % nastalog IC-a. Prednost obiju metoda nad Sturmovim 
testom jest u tome da je sustav ispitivanja kompaktniji i lakši za upravljanje, 
mogu se ispitivati i nehlapljive kemikalije, a izbjegava se i vjerojatnost odgode u mjerenju nastalog CO
 2 . 
7. Oba ta pristupa kombinirana su u normi ISO Headspace CO  2 (16), koja je 
ispitana u prstenastom testu (17), a upravo se na toj normi i temelji ova ispitna metoda. Sli čno tomu, ta su dva pristupa korištena i u ameri čkoj EPA 
metodi (18). Preporu čuju se dvije metode mjerenja CO
 2 , naime, CO  2 u 
plinskom prostoru nakon acidifikacije (13) i IC u teku ćem stanju nakon 
dodavanja viška lužina. Potonju je metodu uveo Peterson tijekom CONCAWE prstenastog testa (19) ove metode mjerenja u plinskom prostoru 
koja je izmijenjena kako bi se mjerila svojstvena biorazgradivost. Izmjene 
načinjene u reviziji ove metode iz 1992. godine (20) iz poglavlja C.4 ovog 
Priloga za laku biorazgradivost obuhva ćene su ovom ispitnom metodom pa 
su uvjeti (medij, trajanje itd.) i ina če jednaki onima iz revidiranog Sturmova 
testa (20). Birch i Fletcher (14) pokazali su da se ovim testom plinskog 
prostora dobivaju rezultati vrlo sli čni onima koji se dobiju prstenastim 
testom OECD-a istih kemikalija (21) revidiranih ispitnih metoda.
 
NAČELO ISPITIVANJA  
8. Ispitivana kemikalija, obi čno u koncentraciji od 20 mg C/l, kao jedini izvor 
ugljika i energije, inkubira se u puferskom mediju s mineralnim solima koji je inokuliran miješanom populacijom mikroorganizama. Test se provodi u začepljenim bocama u kojima se u plinskom prostoru nalazi zrak, koji 
predstavlja zalihu kisika za aerobnu biorazgradnju. Razvijanje CO
 2 koje 
nastaje kao rezultat kona čne aerobne biorazgradnje ispitivane kemikalije 
određuje se mjerenjem viška IC-a nastalog u ispitnim bocama u usporedbi 
s onim nastalim u posudama sa slijepim probama koje sadržavaju samo 
inokulirani medij. Stupanj biorazgradnje izražava se kao postotak teoretskog 
maksimuma proizvodnje IC-a (ThIC), i to na temelju koli čine ispitivane 
kemikalije (kao organskog ugljika) koja se dodala na po četku.  
9. Tako đer se mogu mjeriti i opadanje DOC-a i/ili stupanj primarne biorazgra ­
dnje ispitivane kemikalije (20).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1420
 
INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI  
10. Sadržaj organskog ugljika (% w/w) ispitivane kemikalije mora biti poznat 
bilo iz njezine kemijske strukture bilo mjerenjem kako bi se mogao izra ču­
nati postotak razgradnje. Za hlapljive ispitivane kemikalije izmjerena ili 
izračunata konstanta Henryjevog zakona pomaže u odre đivanju odgovara ­
jućeg omjera volumena plinskog prostora i teku ćine. Podaci o toksi čnosti 
ispitivane kemikalije na mikroorganizme pomažu u odabiru odgovaraju će 
ispitne koncentracije i tuma čenju rezultata koji pokazuju slabu biorazgradi ­
vost: preporu čuje se da se ubaci i kontrola inhibicije, osim ako ve ć nije 
poznato da ispitivana kemikalija nema inhibitorni u činak na djelovanje 
mikroba (vidjeti stavak 24.).  
PRIMJENJIVOST METODE  
11. Ovaj se test može primijeniti na ispitivane kemikalije topljive u vodi i 
netopljive premda treba osigurati dobro dispergiranje ispitivane kemikalije. Pomoću preporu čenog omjera volumena plinskog prostora i teku ćine od 1:2 
mogu se ispitivati hlapljive kemikalije s konstantom Henryjeva zakona do 
50 Pa.m
 3 .mol  –1 pošto udio ispitivane kemikalije u plinskom prostoru ne će 
biti veći od 1 % (13). Manji volumen plinskog prostora može se koristiti pri 
ispitivanju kemikalija koje su hlapljivije, ali je mogu će da je ograni čavajuća 
njihova biodostupnost, posebno ako su one slabo topljive u vodi. Me đutim, 
korisnici moraju osigurati da omjer volumena plinskog prostora i teku ćine, 
kao i koncentracija ispitivane kemikalije, budu takvi da je dostupno dovoljno kisika za potpunu aerobnu biorazgradnju (npr. izbjegavati 
uporabu visoke koncentracije supstrata i malog volumena plinskog prostora). 
Smjernice o tome nalaze se u (13)(23).
 
REFERENTNE KEMIKALIJE  
12. Kako bi se provjerio postupak ispitivanja, paralelno treba ispitivati refe ­
rentnu kemikaliju čija je biorazgradivost ve ć poznata. U tu se svrhu mogu 
koristiti anilin, natrijev benzoat ili etilen-glikol za ispitivanje ispitivanih kemikalija topljivih u vodi te 1-oktanol za slabo topljive ispitivane kemika ­
lije (13). Biorazgradnja tih kemikalija mora u roku od 14 dana dose ći 
> 60 % ThIC-a.
 
MJERNA OBNOVLJIVOST  
13. U ISO prstenastom testu ove metode (17) dobiveni su sljede ći rezultati u 
preporučenim uvjetima, uklju čujući i 20 mg C ispitivane kemikalije/l.  
Ispitivana kemika ­
lija Srednja vrijednost 
postotka 
biorazgradnje 
(28d)  Koeficijent 
varijacije 
(%) Broj laboratorija  
Anilin  90  16  17  
1-oktanol  85  12  14  
Varijabilnost unutar testa (mjerna obnovljivost) je, pomo ću anilina, bila 
niska, a koeficijent varijabilnosti nije bio ve ći od 5 % u gotovo svim 
ispitnim nizovima. U dva slu čaja u kojima je mjerna obnovljivost bila 
lošija, ve ća varijabilnost je vjerojatno bila rezultat velike proizvodnje IC-a 
u slijepim probama. Mjerna obnovljivost je bila gora s 1-oktanolom, ali je još uvijek bila manja od 10 % za 79 % ispitnih nizova. Ta je ve ća varija­
bilnost unutar testa vjerojatno bila rezultat grešaka u doziranju jer se mala 
količina (3 do 4 μl) 1-oktanola morala ubrizgati u za čepljene ispitne boce. 
Veći bi koeficijenti varijacije rezultirali nižim koncentracijama ispitivane 
kemikalije od onih korištenih, posebno na koncentracijama ispod 10 mg 
C/l. To bi se moglo djelomice nadvladati snižavanjem koncentracije 
ukupnog anorganskog ugljika (TIC) u inokulumu.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1421
 
14. U prstenastom testu EU-a (24), u kojemu je ispitivano pet surfaktanata 
dodanih u koncentraciji od 10 mg C/l, dobiveni su sljede ći rezultati:  
Ispitivana kemikalija  Srednja vrijednost 
postotka biorazgra ­
dnje 
(28d)  Koeficijent 
varijacije 
(%) Broj laborato ­
rija 
Tetrapropilen 
Benzen sulfonat  17 45  10  
Di-izo-oktilsulfo- 
sukcinat 
(anionski)  72 22  9  
Heksadecil-trimetil (*) 
Amonijak klorid 
(kationski)  75 13  10  
Izo-nonilfenol-(etoksi ­
lat) 9 
(neionski)  41 32  10  
Koko-amid-propil 
Dimetilhidroksi 
Sulfobetain 
(amfoterni)  60 23  11  
(*) Dodan je SiO  2 radi neutralizacije toksi čnosti.  
Rezultati pokazuju da je, op ćenito, varijabilnost bila ve ća za slabije razgra ­ 
đene surfaktante. Varijabilnost unutar testa bila je manja od 15 % za više od 
90 % slu čajeva, a najviša je bila od 30-40 %.  
NAPOMENA: Ve ćina surfaktanata ne sadrže samo jednu molekulu, nego su 
mješavina izomera, homologa itd., koji se razgra đuju po 
isteku razli čitih karakteristi čnih razdoblja odgode i razli čitim 
kinetičkim brzinama, što rezultira „zamu ćenim”, izlomljenim 
krivuljama, tako da je mogu će da se prolazna vrijednost od 
60 % ne će doseći u „roku od 10 dana” premda bi svaka 
pojedinačna molekularna vrsta dosegla > 60 % u roku od 10 
dana da je sama ispitivana. To se primje ćuje i kod drugih 
kompleksnih smjesa.  
OPIS METODE  
Aparatura  
15. Uobi čajena laboratorijska aparatura i:  
(a) Staklene serum boce, za čepljene čepovima od butilnog kau čuka i alumi ­
nijskim brtvama na navrtanje. Preporu čena veličina je „125 ml” s 
ukupnim volumenom od oko 160 ml (u tom bi slu čaju volumen 
svake boce trebao biti poznat i iznositi 160 ± 1 ml). Manja veli čina 
posuda može se koristiti ako rezultati ispunjavaju uvjete opisane u stavcima 66. i 67.;
 
(b) Analizator ugljika ili neki drugi instrument (npr. plinski kromatograf) za 
mjerenje anorganskog ugljika;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1422
 
(c) Šprice velike preciznosti za uzorke plina i teku ćine; 
(d) Orbitalna miješalica u okruženju s kontroliranom temperaturom;  
(e) Dovod zraka bez CO  2 - to se može pripremiti propuštanjem zraka kroz 
granule natronskog vapna ili korištenjem smjese plina u omjeru 80 % N
 2 /20 % 0  2 (opcijski) (vidjeti stavak 28.);  
(f) Uređaj za membransku filtraciju propusnosti od 0,20 - 0,45 μm (fakulta ­
tivno),  
(g) Analizator organskog ugljika (fakultativno).  
Reagensi  
16. Tijekom cijelog testa koristite reagense analiti čke čistoće. 
Voda  
17. Treba koristiti destiliranu ili deioniziranu vodu koja sadržava ≤ 1 mg/l 
ukupnog organskog ugljika. To predstavlja ≤ 5 % početnog sadržaja organ ­
skog ugljika koji je uveden na preporu čenu dozu ispitivane kemikalije.  
Radne otopine za medij s mineralnim solima  
18. Radne otopine i medij s mineralnim solima sli čni su testovima iz norme ISO 
14593 (16) i poglavlja C.4 „Laka biorazgradivost” (20). Uporaba više koncentracije amonijakova klorida (2,0 g/l umjesto 0,5 g/l) potrebna je samo u vrlo iznimnim slu čajevima, npr. kad je koncentracija ispitivane 
kemikalije > 40 mg C/l. Radne otopine treba čuvati u hladnjaku i baciti 
ih nakon šest mjeseci ili ranije ako ima dokaza precipitacije ili rasta mikroba. Pripremiti sljede će radne otopine:
 
(a) Kalijev dihidrogen fosfat (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Dikalijev hidrogen fosfat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
Dinatrijev hidrogen fosfat dihidrat (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
Amonijakov klorid (NH  4 Cl) 0,50 g  
Otopiti u vodi i na činiti 1 litru. pH te otopine treba iznositi 7,4 (± 0,2). 
Ako to nije slu čaj, pripremiti novu otopinu.  
(b) Kalcijev klorid dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Otopiti u vodi i na činiti 1 litru.  
(c) Magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Otopiti u vodi i na činiti 1 litru.  
(d) Željezov (III) klorid heksahidrat (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25g  
Otopiti u vodi i na činiti 1 litru pa dodati kapljicu koncentrata.  
Priprema mineralnog medija  
19. Pomiješati 10 ml otopine (a) s približno 800 ml vode (stavak 17.), potom 
dodati 1 ml otopina (b), (c) i (d) te na činiti 1 litru pomo ću vode (stavak 
17.). 
Ostali reagensi  
20. Koncentrirana orto-fosforna kiselina (H  3 PO 4 ) (> 85 % mase po volumenu).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1423
 
Otopina s natrijevim hidroksidom 7M  
21. Otopiti 280 g natrijeva hidroksida (NaOH) u 1 litri vode (stavak 17.). 
Odrediti koncentraciju DIC-a te otopine i u obzir uzeti tu vrijednost pri izračunu rezultata testa (vidjeti stavke 55. i 61.), posebno u svjetlu validacij ­
skog kriterija iz stavka 66. to čke (b). Pripremiti svježu otopinu ako je 
previsoka koncentracija DIC-a.
 
Ispitivana kemikalija  
22. Pripremiti u vodi radnu otopinu ispitivane kemikalije koja je dovoljno 
topljiva u vodi (stavak 17.) ili u ispitnom mediju (stavak 19.) na koncen ­
traciji po mogu ćnosti 100-struko ve ćoj od kona čne koncentracije koja će se 
koristiti u testu; možda će biti neophodno podesiti pH radne otopine. Radnu 
otopinu treba dodati mineralnom mediju da se postigne kona čna koncen ­
tracija organskog ugljika od 2 do 4 mg C/l, po mogu ćnosti 20 mg C/l. Ako 
se koriste niže koncentracije, možda će biti narušena dobivena preciznost. U 
posude se mogu dodavati i topljive i netopljive teku će kemikalije, i to 
izravno pomo ću šprica velike preciznosti. Možda će slabo topljive i neto ­
pljive ispitivane kemikalije trebati posebno tretirati (25). Na izboru stoje:  
(a) izravno dodavanje poznatih vaganih koli čina; 
(b) ultrazvu čno dispergiranje prije dodavanja;  
(c) dispergiranje pomo ću emulgatora potrebnih da bi se utvrdilo imaju li 
ikakav inhibitorni ili stimulacijski u činak na djelovanje mikroba prije 
dodavanja;  
(d) adsorpcija teku ćih ispitivanih kemikalija ili otopina u prikladno 
hlapljivom otapalu na neki inertni medij ili nosa č (npr. filtar od 
staklenih vlakana), a potom i isparavanje otapala i izravno dodavanje poznatih koli čina;
 
(e) dodavanje poznatog volumena otopine ispitivane kemikalije u lako 
hlapljivom otapalu u praznu ispitnu posudu, a potom i isparavanje 
otapala.  
Sredstva ili otapala korišteni u to čkama (c), (d) i (e) moraju biti ispitana na 
stimulacijski ili inhibitorni u činak na djelovanje mikroba (vidjeti stavak 42. 
točku (b)).  
Referentna kemikalija  
23. Pripremiti radnu otopinu (topljive) referentne kemikalije u vodi (stavak 17.) 
u koncentraciji po mogu ćnosti 100 puta ve ćoj od kona čne koncentracije koja 
će se koristiti (20 mg C/l) u testu.  
Provjera inhibicije  
24. Ispitivane kemikalije obi čno ne pokazuju zna čajnije znakove razgradnje u 
uvjetima korištenima u procjena lake biorazgradivosti. Jedan od mogu ćih 
uzroka jest taj da ispitivana kemikalija ima inhibitorni u činak na inokulum 
na koncentraciji korištenoj u testu. U plan ispitivanja može se stoga uklju čiti 
i provjera inhibicije kako bi se olakšala identifikacija (retrospektivno) inhi ­
bicije kao mogu ćeg uzroka ili čimbenika koji pridnosi tom u činku. Kao 
druga mogu ćnost, provjerom inhibicije mogu se isklju čiti takve interferen ­
cije i može se pokazati da se nulta ili slaba razgradnja mogu pripisati 
isključivo nepodložnosti na napad mikroba u uvjetima testa. Da bi se 
dobili podaci o toksi čnosti ispitivane kemikalije na (aerobne) mikroorgan ­
izme, pripremiti otopinu u ispitnom mediju koji sadržava ispitivanu kemi ­
kaliju i referentnu kemikaliju (stavak 19.), od kojih je svaka u istoj koncen ­
traciji kao i pri dodavanju (vidjeti stavke 22. i 23.).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum se može izvesti iz niza izvora: aktivnog mulja, izlaznih otpadnih 
voda (bez klora), površinskih voda i tala ili iz kombinacije tih izvora (20). Biorazgradivo djelovanje izvora treba provjeriti pomo ću referentne kemika ­
lije. Bez obzira na to koji je izvor, ne bi trebalo koristiti mikroorganizme 
koji su prethodno izlagani ispitivanoj kemikaliji ako se postupkom želi ispitati laka biorazgradivost.
 
Upozorenje: Aktivni mulj, otpadne vode i izlazna voda nakon pro čišćavanja 
otpadnih voda sadržavaju patogene organizme i s njima se mora rukovati oprezno.
 
26. Iskustvo pokazuje da je optimalni volumen za inokulum onaj koji:  
— je dostatan za poticanje odgovaraju ćeg biorazgradivog djelovanja;  
— razgra đuje referentnu kemikaliju u propisanom postotku (vidjeti stavak 
66.), 
— proizvodi 10  2 do 10  5 jedinica koje tvore kolonije po mililitru u kona čnoj 
smjesi;  
— obično proizvodi koncentraciju od 4 mg/l suspendiranih krutih tvari u 
konačnoj smjesi kada se koristi aktivni mulj, mogu se koristiti koncen ­
tracije do 30 mg/l, ali one mogu zna čajno pove ćati proizvodnju CO  2 u 
slijepim probama (26);  
— pridonosi s manje od 10 % po četne koncentracije organskog ugljika koji 
je uvela ispitivana kemikalija;  
— općenito predstavlja 1-10 ml inokuluma na 1 litru ispitne otopine.  
Aktivni mulj  
27. Aktivni se mulj nanovo skuplja iz aeracijskog bazena postrojenja za pro či­ 
šćavanje otpadnih voda ili iz dozra čne posude laboratorijske jedinice u 
kojima se pro čišćavaju pretežno komunalne otpadne vode. Ako je to potre ­
bno, treba ukloniti grube čestice prosijavanjem (npr. primjenom sita veli čine 
mrežice od 1 mm  2 ), a mulj treba održavati u aerobnom stanju do uporabe.  
28. Kao druga mogu ćnost, nakon uklanjanja svih grubih čestica treba pustiti da 
se mulj istaloži ili ga centrifugirati (npr. 1 100 × g na 10 minuta). Baciti 
tekući supernatant. Mulj se može prati u mineralnoj otopini. Suspendirati 
koncentrirani mulj u mineralnom mediju kako bi se dobila koncentracija od 
3-5 g suspendirane krute tvari/l. Potom dozra čivati do uporabe.  
29. Mulj treba uzeti iz ispravnog konvencionalnog postrojenja za pro čišćavanje. 
Ako se mulj treba uzeti iz postrojenja za pro čišćavanje velikih brzina ili ako 
se smatra da mulj sadržava inhibitore, treba ga oprati. Pustiti da se resu ­
spendirani mulj istaloži ili ga centrifugirati nakon temeljitog miješanja, 
baciti teku ći supernatant pa ponovno suspendirati oprani mulj u još jednoj 
količini mineralnog medija. Ponavljati taj postupak sve dok se ne bude 
smatralo da u mulju više nema viška supstrata ili inhibitora.  
30. Nakon potpunog resuspendiranja ili kod neobra đenog mulja uzeti uzorak 
neposredno prije uporabe za odre đivanje suhe mase suspendiranih krutih 
tvari.  
31. Još jedna mogu ćnost jest homogenizirati aktivni mulj (3-5 g suspendirane 
krute tvari/l). Tretirati mulj u Waring miješalici dvije minute na srednjoj brzini. Pustiti 30 minuta da se izmiješani mulj istaloži, ili dulje ako je 
potrebno, pa izliti teku ćinu za uporabu u vidu inokuluma brzinom od oko 
10 mg/l mineralnog medija.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1425
 
32. Daljnje smanjenje proizvodnje CO  2 u slijepim probama može se posti ći 
dozračivanjem mulja preko no ći zrakom bez CO  2 . Upotrijebiti 4 mg/l 
krute tvari aktivnog mulja kao koncentraciju inokuluma u ovom testu (13).  
Sekundarne otpadne vode  
33. Druga mogu ćnost je da se inokulum dobije iz sekundarnih otpadnih voda iz 
postrojenja za pro čišćavanje ili laboratorijske jedinice u koje se pretežno 
dodaju komunalne otpadne vode. Održavati uzorak u aerobnim uvjetima i upotrijebiti ga na dan skupljanja ili ga, po potrebi, prethodno kondicionirati. Otpadne vode treba filtrirati kroz grubi filtar kako bi se uklonile grube 
lebdeće čestice, a potom se mjeri pH vrijednost.
 
34. Za smanjenje sadržaja IC-a filtrat se 1 h propuhuje zrakom bez CO  2 (stavak 
15. točka (e)) dok se pH održava na 6,5 pomo ću ortofosforne kiseline 
(stavak 20.). pH vrijednost vra ća se na po četnu vrijednost pomo ću natrijeva 
hidroksida (stavak 21.), a nakon taloženja od oko 1 h za inokulaciju se uzima prikladna koli čina supernatanta. Tim se postupkom propuhivanja 
smanjuje sadržaj IC-a u inokulumu. Primjerice, ako se kao inokulum kori ­
stila maksimalna preporu čena količina filtriranih propuhanih otpadnih voda 
(100 ml) po litri, koli čina IC-a prisutna u posudama s kontrolnom slijepom 
probom kretala se u rasponu od 0,4 do 1,3 mg/l (14), što predstavlja 2- 
6,5 % ispitivane kemikalije C na 20 mg C/l i 4-13 % na 10 mg C/l.
 
Površinske vode  
35. Treba uzeti uzorak prikladnih površinskih voda. Njega treba čuvati u 
aerobnim uvjetima i upotrijebiti ga na dan uzimanja. Uzorak treba biti 
koncentriran, ako je to potrebno, filtriranjem ili centrifugiranjem. Koli čina 
inokuluma koja će se upotrijebiti u svakoj ispitnoj posudi treba ispunjavati 
kriterije iz stavka 26.  
Tla 
36. Treba uzeti uzorak prikladnog tla, koji se uzima na dubini do 20 cm ispod 
površine tla. Iz uzorka tla treba odstraniti kamen čiće, ostatke biljaka i 
beskralježnjake prije nego što se on prosije kroz mrežicu veli čine 2 mm 
(ako je uzorak premokar da bi ga se smjesta moglo prosijati, djelomice ga 
osušiti na zraku kako bi se olakšalo prosijavanje). Treba ga držati u aerobnim uvjetima i upotrijebiti na dan uzimanja (ako se uzorak prenosi u labavo vezanoj vre ćici od crnog polietilena, može se držati na 2 do 4 °C u 
toj vrećici do mjesec dana).
 
Prethodno kondicioniranje inokuluma  
37. Inokulum se može prethodno kondicionirati na uvjete pokusa, ali se ne smije 
prethodno prilagoditi ispitivanoj kemikaliji. Prethodno kondicioniranje može 
smanjiti stvaranje CO  2 u slijepim probama. Prethodno se kondicioniranje 
sastoji od dozra čivanja aktivnog mulja nakon razrje đivanja u ispitnom 
mediju do 30 mg/l vlažnim zrakom bez CO  2 od 5-7 dana na ispitnoj 
temperaturi.  
POSTUPAK ISPITIVANJA  
Broj boca  
38. Broj boca (stavak 15. to čka (a)) potrebnih za ispitivanje ovisit će o učesta­
losti analiza i trajanju ispitivanja.  
39. Preporu čuje se da se analiziraju tri boce nakon dovoljnog broja vremenskih 
razmaka takvih da se može identificirati rok od 10 dana. Isto tako, na kraju ispitivanja analizira se najmanje pet boca (stavak 15. to čka (a)) iz setova (a), 
(b) i (c) (vidjeti stavak 42.) kako bi se omogu ćilo da se izra čuna 95 % 
intervala pouzdanosti za srednju vrijednost postotka biorazgradnje.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1426
 
Inokulirani medij  
40. Inokulum se koristi na koncentraciji od 4 mg/l suhe tvari aktivnog mulja. 
Neposredno prije uporabe pripremiti dovoljnu koli činu inokuliranog medija 
dodavanjem, primjerice, 2 ml prikladno tretiranog aktivnog mulja (stavci 27. 
do 32.) na 2 000 mg/l u 1 litru medija s mineralnim solima (stavak 19.). 
Ako se trebaju koristiti sekundarne otpadne vode, dodaje se do 100 ml otpadnih voda (stavak 33.) u 900 ml medija s mineralnim solima (stavak 19.) i razrijedi se medijem u 1 litru.
 
Priprema boca  
41. Alikvoti inokuliranog medija stavljaju se u boce za višestruka odre đivanja 
kako bi se dobio omjer plinskog prostora i teku ćine od 1:2 (npr. dodati 
107 ml u boce zapremine od 160 ml). Mogu se koristiti i drugi omjeri, ali vidjeti upozorenja u stavku 11. Kada se koristi neka druga vrsta inokuluma, mora se pobrinuti da se inokulirani medij propisno promiješa kako bi se 
osiguralo da je ravnomjerno raspore đen u ispitnim bocama.
 
42. Pripremaju se setovi boca (stavak 15. to čka (a)) koje sadržavaju:  
(a) Ispitne boce (obilježene s F  T ) koje sadržavaju ispitivanu kemikaliju;  
(b) Kontrole sa slijepim probama (obilježene s F  B ) koje sadržavaju samo 
ispitni medij plus inokulum; tako đer se moraju dodati i sve kemikalije, 
otapala, sredstva ili filtri od staklenih vlakana koji su se koristili za 
uvođenje ispitivane kemikalije u ispitne posude;  
(c) Posude (obilježene s F  C ) za provjeru postupka koje sadržavaju refe ­
rentnu kemikaliju;  
(d) Ako je to potrebno, posude (obilježene s F  I ) za provjeru mogu ćeg 
inhibitornog u činka ispitivane kemikalije koje sadržavaju i ispitivanu 
kemikaliju i referentnu kemikaliju u istim koncentracijama (stavak 
24.) kao i u bocama F  T i F C ; 
(e) Posude (obilježene s F  S ) za provjeru mogu će abiotičke razgradnje kao 
(a) plus 50 mg/l HgCl  2 ili sterilizirane na neki drugi na čin (npr. u 
autoklavu).  
43. Ispitivane i referentne kemikalije topljive u vodi dodaju se kao vodene radne 
otopine (stavci 22., 23. i 24.) kako bi se dobila koncentracija od 10 do 
20 mg C/l.  
44. Netopljive ispitivane kemikalije i netopljive referentne kemikalije dodaju se 
u boce na niz na čina (vidjeti stavak 22. to čke (a) do (e)) ovisno o naravi 
ispitivane kemikalije, bilo prije bilo poslije dodavanja inokuliranog medija, 
ovisno o metodi obrade ispitivane kemikalije. Ako se koristi jedan od postupaka iz stavka 22. to čaka (a) do (e), boce sa slijepim probama F
 B 
(stavak 42. to čka (b)) treba tretirati na sli čan način, ali bez ispitivane kemi ­
kalije ili referentne kemikalije.  
45. Hlapljive ispitivane kemikalije treba ubrizgati u za čepljene bode (stavak 47.) 
pomoću mikrošprice. Doza se izra čunava iz ubrizgane koli čine i gusto će 
ispitivane kemikalije.  
46. U posude treba dodati vodu, ako je to potrebno, kako bi u svakoj posudi bio 
isti volumen teku ćine. Mora se osigurati da omjer plinskog prostora i teku ­ 
ćine (obično 1:2) i koncentracija ispitivane kemikalije budu takvi da u 
plinskom prostoru ima dovoljno kisika za potpunu biorazgradnju.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1427
 
47. Potom se sve boce za čepljuju, primjerice čepovima od butilnog kau čuka i 
aluminija. U ovoj fazi treba dodati hlapljive ispitivane kemikalije (stavak 
45.). Ako treba pratiti pad koncentracije DOC-a u ispitnoj otopini kao i za provedbu analize u nultom vremenu za po četnu koncentraciju IC-a (sterilne 
kontrole, stavak 42. to čka (e)) ili druge determinante, iz ispitne posude 
uzima se odgovaraju ći uzorak. Potom se ispitna posuda i njezin sadržaj 
bacaju.
 
48. Začepljene bode stavljaju se na kružnu mu ćkalicu (stavak 15. to čka (d)), a 
brzina mu ćkanja mora biti dovoljna da sadržaj boce bude dobro promiješan i 
u suspenziji (npr. 150 do 200 opm), te se inkubiraju u mraku na 20 °C, a 
temperatura se mora održavati na ± 1 °C.  
Uzorkovanje  
49. Režim uzorkovanja ovisit će o fazi prilagodbe i kineti čkoj brzini biorazgra ­
dnje ispitivane kemikalije. Boce se žrtvuju za analizu na dan uzorkovanja, što bi se trebalo doga đati najmanje jedanput tjedno ili češće (npr. dvaput 
tjedno) ako je potrebna krivulja potpune razgradnje. Potrebni broj boca za 
višestruko odre đivanje uzima se iz mu ćkalice i predstavljaju F
 T , F B i F C te, 
ako se koriste, i F  I i F S (vidjeti stavak 42.). Test se obi čno provodi 28 dana. 
Ako krivulja biorazgradnje nazna čuje da je plato postignut prije 28 dana, 
test se može završiti i ranije. Za analizu uzeti uzorke iz pet boca rezerviranih 
za 28. dan testa te rezultate iskoristiti za izra čun granica pouzdanosti ili 
koeficijenta varijacije postotka biorazgradnje. Boce koje predstavljaju provjere inhibicije i abioti čke razgradnje ne trebaju se uzorkovati toliko 
često kao druge boce; dovoljno ih je uzorkovati 1. i 28. dana.
 
Analiza anorganskog ugljika (IC)  
50. Proizvodnja CO  2 u bocama odre đuje se mjerenjem porasta koncentracije 
anorganskog ugljika (IC) tijekom inkubacije. Na raspolaganju su dvije preporučene metode za mjerenje koli čine IC-a proizvedene u testu, a 
slijedi njihov opis. Budu ći da te metode mogu dati malo razli čite rezultate, 
u ispitnom nizu treba koristiti samo jednu.
 
51. Metoda (a) preporu čuje se ako je vjerojatno da medij sadržava ostatke, 
primjerice, papira filtra od staklenih vlakana i/ili netopljive ispitivane kemi ­
kalije. Ta se analiza može provoditi plinskim kromatografom ako nije 
dostupan analizator ugljika. Važno je da boce budu na ili blizu ispitne 
temperature kad se analizira plin u plinskom prostoru. Metoda (b) može biti lakša za laboratorije koji se koriste analizatorom ugljika za mjerenje IC-a. Važno je da se otopina natrijeva hidroksida (stavak 21.) upotrijebljena 
za pretvaranje CO
 2 u karbonat ili svježe pripremi ili da bude poznat njezin 
sadržaj IC-a kako bi se to moglo uzeti u obzir pri izra čunu rezultata testa 
(vidjeti stavak 66. to čku (b)).  
Metoda (a): acidifikacija na pH < 3  
52. Prije svake serije analiza kalibrira se analizator IC-a primjenom odgovara ­
jućeg standarda IC-a (npr. 1 % w/w CO  2 u N  2 ). Koncentrirana ortofosforna 
kiselina (stavak 20.) ubrizgava se kroz septum svake uzorkovane boce radi 
snižavanja pH-a medija na < 3 (npr. dodati 1 ml u 107 ml ispitnog medija). Boce se ponovno vra ćaju na mu ćkalicu. Nakon mu ćkanja od sat vremena na 
ispitnoj temperaturi boce se skidaju s mu ćkalice, iz plinskog prostora svake 
boce uzimaju se alikvoti (npr. 1 ml) plina i isti se ubrizgavaju u analizator 
IC-a. Izmjerene koncentracije IC-a bilježe se kao mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1428
 
53. Načelo ove metode jest da, nakon acidifikacije na pH < 3 i uravnoteženja na 
20 °C, konstanta uravnoteženja za raspodjelu CO  2 između tekućeg i plino ­
vitog stanja u ispitnim bocama iznosi 1,0 kada se mjeri kao koncentracija (13). To bi se trebalo pokazati za sustav ispitivanja najmanje jedanput na sljedeći način:
 
Postaviti boce koje sadržavaju 5 i 10 mg/l kao IC uporabom otopine anhi ­
dridnog natrijeva karbonata (Na  2 CO 3 ) u vodi bez CO  2 koja se priprema 
acidifikacijom vode na pH 6,5 koncentriranom ortofosfornom kiselinom 
(stavak 20.), propuhivanjem preko no ći zrakom bez CO  2 te podizanjem 
pH lužinama do neutralnosti. Osigurati da omjer volumena plinskog prostora i volumena teku ćine bude isti kao i u testu (npr. 1:2). Acidificirati i uravno ­
težiti na na čin opisan u stavku 52., potom izmjeriti koncentracije IC-a i 
plinovitog (plinski prostor) i teku ćeg stanja. Provjeriti jesu li te dvije 
koncentracije jednake unutar pokusne greške. Ako to nije slu čaj, operater 
treba revidirati postupke. Ta provjera raspodjele IC-a izme đu tekućeg i 
plinovitog stanja ne treba se provoditi svaki put kad se provodi test; ista 
se vjerojatno može provesti pri kalibraciji.
 
54. Ako treba izmjeriti opadanje DOC-a (samo ispitivane kemikalije topljive u 
vodi), treba uzeti uzorke u teku ćem stanju iz zasebnih (neacidificiraniih) 
boca, filtrirati ih kroz membranu i ubrizgati ih u analizator DOC-a. Te se 
boce mogu, po potrebi, koristiti i za druge analize kako bi se izmjerila primarna biorazgradnja.
 
Metoda (b): pretvaranje CO  2 u karbonat  
55. Prije svake serije analiza kalibrira se analizator IC-a primjenom odgovara ­
jućeg standarda, primjerice, otopine natrijeva bikarbonata (NaHCO  3 ) u vodi 
bez CO  2 (vidjeti stavak 53.) u rasponu od 0 do 20 mg/l kao IC. Otopina 
natrijeva hidroksida (7M, stavak 21.) (npr. 1 ml u 107 ml medija) ubrizgava se kroz septum svake uzorkovane boce, a boce se mu ćkaju 1 h na ispitnoj 
temperaturi. Koristiti istu otopinu NaOH na svim bocama žrtvovanima odre ­ 
đenog dana, ali ne nužno u svim prilikama za uzorkovanje tijekom testa. 
Ako su u svim prilikama za uzorkovanje potrebne apsolutne vrijednosti IC-a u slijepim probama, trebat će odrediti IC otopine NaOH svaki put kad se 
ista koristi. Boce se skidaju s mu ćkalice i puštaju se da se istalože. Špricom 
se izvlače prikladne koli čine (npr. 50 do 1 000 μl) u tekućem stanju iz svake 
posude. Uzorci se ubrizgavaju u analizator IC-a i bilježe se koncentracije IC-a. Treba osigurati da je korišteni analizator propisno opremljen kako bi 
mogao analizirati lužnate uzorke koji nastaju u ovoj metodi.
 
56. Načelo ove metode jest da je, nakon dodavanja lužina i mu ćkanja, zanema ­
riva koncentracija IC-a u plinskom prostoru. To treba provjeriti za sustav ispitivanja najmanje jedanput korištenjem standarda IC-a, dodavanjem lužina 
i uravnoteživanjem te mjerenjem koncentracije IC-a i u plinskom prostoru i 
u tekućem stanju (vidjeti stavak 53.). Koncentracija u plinskom prostoru 
treba biti blizu nule. Ta provjera virtualno potpune apsorpcije CO
 2 ne 
mora se provoditi svaki put kad se provodi test.  
57. Ako treba izmjeriti opadanje DOC-a (samo ispitivane kemikalije topljive u 
vodi), treba uzeti uzorke u teku ćem stanju iz zasebnih boca (koje ne sadr ­ 
žavaju dodane lužine), filtrirati ih kroz membranu i ubrizgati ih u analizator 
DOC-a. Te se boce mogu, po potrebi, koristiti i za druge analize kako bi se 
izmjerila primarna biorazgradivost.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1429
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Izračun rezultata  
58. Pod pretpostavkom 100 %-tne mineralizacije ispitivane kemikalije u CO  2 , 
višak ThIC-a proizvedenog u kontrolnim slijepim probama jednak je TOC-u koji se na po četku testa dodaje u svaku ispitnu bocu, to jest:
 
ThIC ¼ TOC  
Ukupna masa (mg) anorganskog ugljika (TIC) u svakoj boci jest: 
TIC ¼ ðmg C u teku ćini þ mg C u plinskom prostoru Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Jednadžba [1]  
gdje je:  
V L = volumen teku ćine u boci (litra),  
CL = koncentracija IC-a u teku ćini (mg/l kao ugljika),  
VH = volumen plinskog prostora (litra),  
CH = koncentracija IC-a u plinskom prostoru (mg/l kao ugljika).  
Izračuni TIC-a za ove dvije analiti čke metode koje se koriste za mjerenje 
IC-a u ovom testu opisane su u nastavku teksta u stavcima 60. i 61. 
Postotak biorazgradnje ( % D ) u svakom slu čaju dobiva se ovako: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Jednadžba [2]  
gdje je:  
TIC  t = mg TIC-a u ispitnoj boci u vrijeme t,  
TIC  b = srednja vrijednost mg TIC-a u bocama sa slijepim probama u 
vrijeme t,  
TOC = mg TOC-a dodanih na po četnu u ispitnu posudu.  
Izračunava se postotak biorazgradnje % D za ispitnu bocu (F  T ), referentnu 
bocu (F  C ) i, ako je i to obuhva ćeno, za kontrolne boce za pra ćenje inhibicije 
(F I ) iz odgovaraju ćih količina TIC-a proizvedenih do svakog trenutka 
uzorkovanja.  
59. Ako je došlo do zna čajnog porasta sadržaja TIC-a u sterilnim kontrolama 
(F S ) tijekom trajanja testa, može se zaklju čiti da je došlo do abioti čke 
razgradnje ispitivane kemikalije i to se mora uzeti u obzir u izra čunu D u 
jednadžbi [2].  
Acidifikacija na pH < 3  
60. Budu ći da acidifikacija na pH < 3 i uravnoteženje rezultiraju ujedna čenjem 
koncentracije TIC-a u teku ćem i plinovitom stanju, treba mjeriti samo 
koncentraciju IC-a u plinovitom stanju. Dakle, iz jednadžbe [1]  
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , gdje je V  B = volumen serum boce.  
Pretvaranje CO  2 u karbonat  
61. U ovoj se metodi izra čuni provode kao u jednadžbi [1], ali se ignorira 
zanemariva koli čina IC-a u plinovitom stanju, to jest  V  H Ü C H ¼ 0, i 
TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1430
 
Izražavanje rezultata  
62. Krivulja biorazgradnje dobiva se grafi čkim prikazom postotka biorazgradnje 
D u ovisnosti o vremenu inkubacije i, ako je to mogu će, naznačuju se faza 
prilagodbe, faza biorazgradnje, rok od 10 dana i faza platoa, to jest faza u 
kojoj je postignuta maksimalna razgradnja i u kojoj se izravnala krivulja 
biorazgradnje. Ako se za paralelne ispitne posude dobiju poredbeni rezultati F
 T (< 20 % razlike), grafi čki se prikazuje srednja vrijednost krivulje (vidjeti 
Dodatak 2., slika 1.); a ako ne, krivulje se grafi čki prikazuju za svaku 
posudu. Odre đuje se srednja vrijednost postotka biorazgradnje u fazi 
platoa ili se procjenjuje najviša vrijednost (npr. kad krivulja opada u fazi platoa), ali je vrlo važno ocijeniti da u potonjem slu čaju ta vrijednost ne 
bude netipi čna. Nazna čiti maksimalnu razinu biorazgradnje kao „stupanj 
biorazgradnje ispitivane kemikalije” u izvješ ću o ispitivanju. Ako broj 
ispitnih posuda nije bio dovoljan za naznaku faze platoa, za izra čun 
srednje vrijednosti koriste se podaci izmjereni posljednjeg dana testa. Ta 
posljednja vrijednost, srednja vrijednost pet višestrukih odre đivanja, služi 
kao naznaka preciznosti kojom je odre đen postotak biorazgradnje. Isto 
tako, treba izvijestiti i o vrijednosti dobivenoj po isteku roka od 10 dana.
 
63. Na isti se taj na čin grafički prikazuje krivulja za referentnu kemikaliju, F  C , 
te, ako je i to obuhva ćeno, i za provjeru abioti čke eliminacije, F  S, i za 
kontrolu inhibicije, F  I . 
64. Bilježe se koli čine TIC-a u kontrolama sa slijepim probama (F  B ), kao i one 
u tikvicama F  S (abiotička provjera) ako su te posude bile obuhva ćene 
testom.  
65. Izračunati D za posude F  I , i to na temelju prinosa teoretskog IC-a o čeki­
vanog samo iz referentne komponente te smjese. Ako je, 28. dana [(D  FC ( 1 ) 
– D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, može se pretpostaviti da je ispitivana kemi ­
kalija inhibirala djelovanje inokuluma, a to može biti zaslužno za niske 
vrijednosti D  FT dobivene u uvjetima testa. U tom se slu čaju test može 
ponoviti s nižom ispitnom koncentracijom te, po mogu ćnosti, smanjenjem 
DIC-a u inokulumu i TIC-a nastalog u kontrolama sa slijepim probama jer će niže koncentracije u protivnom smanjiti preciznost ove metode. Druga je 
mogućnost uporaba drugog inokuluma. Ako se u tikvici F
 S (abiotička) 
zamijeti zna čajan porast (> 10 %) koli čine TIC-a, možda je došlo do 
procesa abioti čke razgradnje.  
Valjanost rezultata  
66. Test se smatra valjanim ako:  
a) je srednja vrijednost postotka razgradnje u posudama F  C koje sadržavaju 
referentnu kemikaliju > 60 % do 14. dana inkubacije i ako  
b) je srednja vrijednost koli čine TIC-a prisutna u kontrolama sa slijepim 
probama F  B na kraju testa > 3 mg C/l.  
Ako nisu ispunjena ta ograni čenja, test treba ponoviti s inokulumom iz 
drugog izvora i/ili treba revidirati korištene postupke. Primjerice, ako je 
problem u visokoj proizvodnji IC-a u slijepim probama, treba slijediti postupak iz stavaka 27. do 32.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1431  
( 1 ) Postotak razgradnje u posudama F  C koje sadržavaju referentnu tvar. 
( 2 ) Postotak razgradnje u posudama F  I .
 67. Ako ispitivana kemikalija ne dosegne 60 % ThIC-a te ako se pokaže da ona 
nema inhibitorni u činak (stavak 65.), test se može ponoviti s povišenom 
koncentracijom inokuluma (do 30 mg/l aktivnog mulja i 100 ml otpadnih voda/l) ili s inokulumima iz drugih izvora, poglavito ako se razgradnja kretala u rasponu od 20 do 60 %.
 
Tumačenje rezultata  
68. Biorazgradnja > 60 % ThIC-a u roku od 10 dana u ovom testu pokazuje da 
je ispitivana kemikalija lako biorazgradiva u aerobnim uvjetima.  
69. Ako se ne postigne prolazna vrijednost od 60 %, odrediti pH vrijednost 
medija u bocama koji nije u činjen ni kiselim niti lužnatim; vrijednost niža 
od 6,5 mogla bi biti znak nitrifikacije. U takvom slu čaju ponoviti test s 
puferskom otopinom više koncentracije.  
Izvješće o ispitivanju  
70. Sastaviti tablicu % D za svaku ispitnu bocu (F  T ), referentnu bocu (F  C ) i, ako 
je obuhva ćena, kontrolnu bocu za provjeru inhibicije (F  I ) za svaki dan 
uzorkovanja. Ako se za boce za višestruko odre đivanje dobiju poredbeni 
rezultati, grafi čki prikazati krivulju srednje vrijednosti % D u ovisnosti o 
vremenu. Zabilježiti koli činu TIC-a u kontrolama sa slijepim probama (F  B ) i 
u sterilnim kontrolama (F  S ), DOC-a i/ili drugih determinanti te postotak 
njihova opadanja.  
71. Odrediti srednju vrijednost % D u fazi platoa ili koristiti najvišu vrijednost 
ako krivulja biorazgradnje opadne u fazi platoa, a to prijaviti kao „stupanj biorazgradnje ispitivane kemikalije”. Važno je osigurati da u potonjem 
slučaju najviša vrijednost ne bude netipi čna.
 
72. Izvješ će o ispitivanju mora obuhva ćati sljedeće podatke:  
Ispitivana kemikalija:  
— uobičajeni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula i rele ­
vantna fizikalno-kemijska svojstva;  
— čistoća (nečistoće) ispitivane kemikalije.  
Uvjeti ispitivanja:  
— upućivanje na ovu ispitnu metodu;  
— opis korištenog sustava ispitivanja (npr. zapremina posude, omjer plin ­
skog prostora i teku ćine, metoda miješanja itd.);  
— primjena ispitivane kemikalije i referentne kemikalije na sustav ispitiva ­
nja: korištena ispitna koncentracija i koli čina ugljika dozirana u svaku 
ispitnu bocu, uporaba otapala;  
— pojedinosti o korištenom inokulumu, sve prethodne obrade i prethodno 
kondicioniranje;  
— temperatura inkubacije;  
— validacija na čela analize IC-a;  
— osnovna svojstva korištenog analizatora IC-a (i sve ostale korištene 
analitičke metode);  
— broj odre đivanja.  
Rezultati:  
— sirovi podaci i izra čunate vrijednosti biorazgradivosti u obliku tablice;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1432
 
— grafikon postotka razgradnje u ovisnosti o vremenu za ispitivane i refe ­
rentnim kemikalijama, fazi prilagodbe, fazi razgradnje, roku od 10 dana i 
nagibu;  
— postotak opadanja na platou na kraju testa i po isteku roka od 10 dana;  
— obrazloženje odbijanja rezultata ispitivanja;  
— sve ostale činjenice relevantne za postupak koji se slijedio;  
— rasprava o rezultatima.  
LITERATURA  
1. Poglavlje C.4 ovog Priloga Odre đivanje „lake” biorazgradivosti - test 
razvijanja CO  2 (metoda C.4-C).  
2. Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening 
test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167.
 
3. Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
4. Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
5. ISO 9439 (1990; revidirano 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
6. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
 
7. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
8. Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
9. Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon 
dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801- 
812. 
10. Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
11. Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
12. Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233- 243.
 
13. Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 
204-211.  
14. Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507-524.  
15. Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegrada ­
tion. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1433
 
16. ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
17. Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemosp ­
here 34: 1813-1822.  
18. US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel 
carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substance, Washington, DC.  
19. Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235.
 
20. Poglavlje C.4 ovog Priloga, Odre đivanje „lake” biorazgradivosti.  
21. OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Pariz.
 
22. Poglavlje C.11 ovog Priloga, Test inhibicije disanja aktivnog mulja.  
23. Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319-327.  
24. EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research 
Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
25. ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1434
 
Dodatak 1.  
KRATICE I DEFINICIJE  
IC: Anorganski ugljik  
ThCO  2 : Teoretski ugljikov dioksid (mg) je izra čunata koli čina ugljikova 
dioksida koja će nastati iz poznatog i izmjerenog sadržaja ugljika ispitivane 
kemikalije nakon njezine potpune mineralizacije; tako đer se izražava i kao mg 
ugljikova dioksida koji nastane po mg ispitivane kemikalije.  
DOC:  Otopljeni organski ugljik je organski ugljik prisutan u otopini ili onaj koji 
prolazi kroz filtar veli čine 0,45 mikrometara ili ostaci u supernatantu nakon 
centrifugiranja na približno 4 000 g (oko 40 000 m sec  -2 ) tijekom 15 min.  
DIC:  Otopljeni anorganski ugljik  
ThIC:  Teoretski anorganski ugljik  
TIC:  Ukupni anorganski ugljik  
Lako biorazgradivo:  Proizvoljno razvrstavanje kemikalija koje su prošle odre ­ 
đene specificirane testove pretraživanja na kona čnu biorazgradivost; ti su testovi 
toliko strogi da se pretpostavlja da će se takve kemikalije brzo i potpuno bioraz ­
graditi u vodenom okolišu u aerobnim uvjetima.  
Rok od 10 dana:  10 dana neposredno poslije postizanja 10 % biorazgradnje.  
Svojstvena biorazgradivost:  Razvrstavanje kemikalija za koje postoje nedvo ­
smisleni dokazi biorazgradnje (primarne ili kona čne) u bilo kojem ispitivanju 
biorazgradivosti.  
Konačna aerobna biorazgradnja:  Razina biorazgradnje koja se postigne kad 
mikroorganizmi u cijelosti prožmu ispitivanu kemikaliju, što rezultira proizvo ­
dnjom ugljikova dioksida, vode, mineralnih soli i novim mikrobnim stani čnim 
sastojcima (biomasom).  
Mineralizacija:  Mineralizacija je potpuna biorazgradnja neke organske kemika ­
lije u CO  2 i H  2 O u aerobnim uvjetima te u CH  4 , CO  2 i H  2 O u anaerobnim 
uvjetima.  
Faza prilagodbe (‚lag’ faza):  Vrijeme od po četka testa do postizanja aklimati ­
zacije i/ili prilagodbe razgra đujućih mikroorganizama i do porasta stupnja bioraz ­
gradnje ispitivane kemikalije ili organske tvari do zamjetne razine (npr. 10 % maksimalne teoretske biorazgradnje ili niže, ovisno o preciznosti tehnike mjere ­
nja).
 
Faza razgradnje:  Vrijeme od završetka faze prilagodbe do trenutka kad se 
postigne 90 % maksimalne razine razgradnje.  
Stacionarna faza (faza platoa):  Faza platoa je faza u kojoj je postignuta maksi ­
malna razgradnja i u kojoj se izravnala krivulja biorazgradnje.  
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom 
metodom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1435
 
Dodatak 2.  
Primjer krivulje biorazgradnje  
Slika 1.  
Biorazgradnja 1-oktanola u ispitivanju CO  2 u plinskom prostoru
  
Pojmovnik  
Biorazgradnja  
Faza razgradnje  
Maksimalna razina biorazgradnje  
Stacionarna faza (faza platoa)  
Rok od 10 dana  
Trajanje ispitivanja (dana)  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1436
 
C. 30.  BIOAKUMULACIJA U KOPNENIM OLIGOHETIMA  
UVOD  
1. Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 317 
(2010). Od ispitnih metoda koje se odnose na sudbinu u okolišu, Biokon ­
centracija: Test s ribama u proto čnom postupku (poglavlje C.13 ovog 
Priloga (49)) objavljena je 1996., a Bioakumulacija u benti čkim oligohetima 
iz sedimenta (53) objavljena je 2008. Ekstrapolacija podataka o vodenoj bioakumulaciji kod kopnenih organizama, poput gujavica, je teška, ako ne 
i nemogu ća. Modeli izra čuna utemeljenih na lipofilnosti ispitivane kemika ­
lije, npr. (14) (37), trenuta čno se koriste za procjenu bioakumulacije kemi ­
kalija u tlu, kao npr. u dokumentu EU-a o tehni čkim smjernicama (19). Ve ć 
je obrađena potreba za ispitnom metodom specifi čnom za ovo podru čje, npr. 
(55). Takva je metoda poglavito važna za procjenu sekundarnog otrovanja u 
kopnenim prehrambenim lancima (4). Nekoliko se nacionalnih ispitinih metoda bavilo pitanjem bioakumulacije u drugim organizmima osim riba, npr. (2) i (72). Metodu mjerenja bioakumulacije iz one čišćenih tala u guja ­
vicama (Eisenia fetida, Savigny) i crvima razvilo je Ameri čko društvo za 
testiranje i materijale ( American Society for Testing and Materials ) (3). 
Međunarodno prihva ćena metoda za odre đivanje bioakumulacije u tlu obra ­ 
đenom spikingom poboljšat će procjenu rizika kemikalija u kopnenim 
ekosustavima, npr. (25) (29).
 
2. Beskralježnjaci koji konzumiraju tlo izloženi su kemikalijama vezanim za 
tlo. Među tim životinjama kopneni oligoheti igraju važnu ulogu u strukturi i 
funkciji tala (15) (20). Kopneni oligoheti žive u tlu, a djelomice i na povr ­ 
šini tla (poglavito u sloju legla); oni često predstavljaju vrstu koja najviše 
obiluje biomasom (54). Bioturbacijom tla te služenjem kao plijen, ove živo ­
tinje mogu snažno utjecati na bioraspoloživost kemikalija drugim organ ­
izmima, poput beskralježnjaka (npr. grabežljivih grinja i kornjaša; npr. (64) ili kralježnjaka grabežljivaca (npr. lisica i galebova) (18) (62). Neke vrste kopnenih oligoheta koje se trenuta čno koriste u ispitivanjima ekoto ­
ksičnosti opisane su u Dodatku 5.
 
3. Standardni vodi č za provo đenje laboratorijskog ispitivanja toksi čnosti ili 
bioakumulacije tla Ameri čkog društva za testiranje i materijale (ASTM 
Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumula ­
tion Tests) s gujavicom Eisenia fetida i bijelim crvom Enchytraeus albidus (3) donosi brojne klju čne i korisne pojedinosti za provedbu ove ispitne 
metode bioakumulacije u tlu. Daljnji dokumenti na koje se upu ćuje u 
ovoj ispitnoj metodi jesu poglavlje C.13 ovog Priloga, Biokoncentracija: Test s ribama u proto čnom postupku (49) i OECD TG 315: Bioakumulacija 
u bentičkim oligohetima iz sedimenta (53). Prakti čna iskustva sa studijama o 
bioakumulaciji u tlu i publikacijama iz literature, npr. (1) (5) (11) (12) (28) 
(40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), tako đer su glavni izvori informacija 
za ovu ispitnu metodu.
 
4. Ova se ispitna metoda uglavnom može primijeniti na stabilne, neutralne 
organske kemikalije, koje naginju adsorpciji na tla. Ovom ispitnom metodom mogu će je testiranje na bioakumulaciju stabilnih metaloorganskih 
spojeva koji se vežu za tlo. Tako đer se može primijeniti i na metale i druge 
elemente u tragovima.
 
PREDUVJETI  
5. Testovi za mjerenje bioakumulacije kemikalije u kopnenim oligohetima 
provođeni su s teškim metalima (vidjeti npr. (63)) i s postojanim, organskim 
kemikalijama niskih log Kow vrijednosti izme đu 3,0 i 6,0, npr. (40). Takvi 
se testovi primjenjuju i na:  
— Kemikalije s vrijednostima log K  ow većima od 6,0 (superhidrofobne 
kemikalije);  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1437
 
— Kemikalije koje pripadaju razredu organskih kemikalija za koje je 
poznato da imaju bioakumulacijski potencijal u živim organizmima, 
npr. površinski aktivne ili jako adsorptivne kemikalije;  
— Kemikalije koje nazna čuju bioakumulacijski potencijal zbog strukturnih 
svojstava, npr. analogoni kemikalija s poznatim bioakumulacijskim 
potencijalom; i  
— Metale.  
6. Podaci o ispitivanoj kemikaliji, kao što su uobi čajeni naziv, kemijski naziv 
(po mogu ćnosti IUPAC naziv), strukturna formula, CAS registarski broj, 
čistoća, mjere opreza, ispravni uvjeti skladištenja i analiti čke metode 
trebaju se dobiti prije po četka studije. Osim toga, trebaju biti poznati i 
sljedeći podaci:  
(a) topljivost u vodi;  
(b) podjelni koeficijent oktanol/voda, K  ow; 
(c) podjelni koeficijent tlo/voda, izražen kao K  oc, 
(d) tlak pare;  
(e) razgradivost (npr. u tlu, vodi);  
(f) poznati metaboliti.  
7. Mogu se koristiti radioaktivno obilježene i radioaktivno neobilježene ispiti ­
vane kemikalije. Me đutim, radi olakšavanja analize preporu čuje se kori ­ 
štenje radioaktivno obilježenih ispitivanih kemikalija. Odluka o tomu 
donosi se na temelju otkrivanja ograni čenja ili traženja mjerenja polazne 
ispitivane kemikalije i metabolita. Ako se koristi radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija i mjere ukupni radioaktivni ostaci, važno je karakteri ­
zirati radioaktivno obilježene ostatke i u tlu i u ispitnim organizmima, i to 
po pitanju postotka polazne ispitivane kemikalije i radioaktivno obilježene nepolazne kemikalije, npr. u uzorcima uzetima u stabilnom stanju ili na kraju faze apsorpcije kako bi se omogu ćio izračun faktora 
bioakumulacije (BAF) za polaznu ispitivanu kemikaliju i predmetne meta ­
bolite tla (vidjeti stavak 50.). Možda će se ovdje opisana metoda morati 
izmijeniti kako bi se npr. omogu ćilo dovoljno biomase za mjerenje radioak ­
tivno neobilježene organske ispitivane kemikalije ili metala. Kada se mjere 
ukupni radioaktivni ostaci (teku ćinskim scintilacijskim brojenjem nakon 
ekstrakcije, izgaranja ili otapanja tkiva), faktor bioakumulacije temelji se na polaznoj ispitivanoj kemikaliji i metabolitima. Izra čun BAF-a trebao bi 
se, po mogu ćnosti, temeljiti na koncentraciji polazne ispitivane kemikalije u 
organizmima i ukupnim radioaktivnim ostacima. Nakon toga iz BAF-a treba 
izračunati faktor akumulacije u biota tlu (BSAF), normaliziran na sadržaj 
lipida u crvu i sadržaj organskog ugljika (OC), radi usporedbe rezultata različitih ispitivanja bioakumulacije.
 
8. Trebala bi biti poznata toksi čnost ispitivane kemikalije na vrste korištene u 
testu, npr. koncentracija s u činkom (ECx) ili smrtonosna koncentracija 
(LCx) za vrijeme trajanja faze apsorpcije (npr. (19)). Odabrana koncentracija ispitivane kemikalije trebala bi, po mogu ćnosti, iznositi oko 1 % njezina 
akutnog asimptotskog LC
 50 te biti najmanje desetostruko ve ća od svojih 
granica detekcije u tlu korištenom analiti čkom metodom. Ako su dostupne, 
prednost treba dati vrijednostima toksi čnosti dobivenima iz dugotrajnih 
studija o subletalnim kona čnim učincima (51) (52). Ako takvi podaci nisu 
dostupni, test akutne toksi čnosti dat će korisne informacije (vidjeti npr. 
(23)).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1438
 
9. Treba biti dostupna prikladna analiti čka metoda poznate to čnosti, preciznosti 
i osjetljivosti na kvantifikaciju kemikalije u ispitnim otopinama, u tlu i u 
biološkom materijalu, zajedno s pojedinostima o pripremi i skladištenju uzoraka, kao i sigurnosno-tehni čkim listovima za materijale. Tako đer 
trebaju biti poznate i analiti čke granice detekcije ispitivane tvari u tlu i u 
tkivu crva. Ako se koristi 14C obilježena ispitivana kemikalija, trebaju biti 
poznati specifi čna radioakitvnost (tj. Bq mol-1) i postotak radioaktivnosti 
povezan s ne čistoćama. Specifi čna radioaktivnost ispitivane kemikalije treba 
biti dovoljno velika da olakša analizu, a upotrijebljene ispitne koncentracije 
ne smiju izazivati toksi čne učinke.
 
10. Ispitivanje se može provoditi s umjetnim tlom ili s prirodnim tlima. Prije 
početka ispitivanja trebaju biti poznati podaci o svojstvima korištenog 
prirodnog tla, npr. podrijetlo tla ili njegovih sastojaka, pH, sadržaj organ ­
skog ugljika, raspodjela veli čine čestica (postotak pijeska, praha i gline) te 
vodni kapacitet (WHC) (3) (48).  
NAČELO ISPITIVANJA  
11. Parametri koji karakteriziraju bioakumulaciju ispitivane kemikalije obuhva ­ 
ćaju i faktor bioakumulacije (BAF), konstantu brzine apsorpcije (k  s ) i 
konstantu brzine eliminacije (k  e ). Definicije su navedene u Dodatku 1.  
12. Ispitivanje se sastoji od dviju faza: faze apsorpcije (faze izlaganja) i faze 
eliminacije (faze nakon izlaganja). Tijekom faze apsorpcije skupine crva u 
višestrukim odre đivanjima izlažu se tlu, koje je spikingom obra đeno ispiti ­
vanom kemikalijom. Osim ispitnih životinja, kontrolne skupine crva drže se u istim uvjetima, samo bez ispitivane kemikalije. Mjere se suha masa i sadržaj lipida ispitnih organizama. To se može u činiti i s crvima iz kontrolne 
skupine. Analiti čke pozadinske vrijednosti (slijepe probe) mogu se dobiti 
analizom uzoraka kontrolnih crva i tla. Za fazu eliminacije crvi se prenose u tlo u kojemu nema ispitivane kemikalije. Faza eliminacije uvijek je potre ­
bna, osim ako je apsorpcija ispitivane kemikalije bila neznatna tijekom faze 
izlaganja. Faza eliminacije donosi podatke o brzini kojom ispitni organizmi 
izlučuju ispitivanu kemikaliju (npr. (27)). Ako se tijekom faze apsorpcije ne 
postigne stabilno stanje, odre đivanje kineti čkih parametara - faktora 
kinetičke bioakumulacije BAFk, konstante brzine apsorpcije i eliminacije - 
u pravilu bi se trebalo temeljiti na istodobnom uskla đivanju rezultata faze 
apsorpcije i faze eliminacije. Koncentracija ispitivane kemikalije u/na crvima prati se tijekom obje faze ispitivanja.
 
13. Tijekom faze apsorpcije mjerenja se vrše u vremenima uzorkovanja od 14 
dana (enhitreji) ili od 21 dana (gujavice) sve dok se ne postigne stabilno stanje (11) (12) (67). Stabilno je stanje postignuto kad je grafi čki prikaz 
koncentracije u crvima u ovisnosti o vremenu paralelan s vremenskom osi te 
kada tri uzastopne analize koncentracije u uzorcima uzetima u vremenskim 
razmacima od najmanje dva dana ne variraju više od ± 20 % jedna od druge na temelju statisti čkih usporedbi (npr. analiza varijance, regresijska analiza).
 
14. Faza eliminacije sastoji se od prijenosa ispitnih organizama u posude koje 
sadržavaju isti supstrat, samo bez ispitivane kemikalije. Tijekom faze elimi ­
nacije mjerenja se vrše u vremenima uzorkovanja tijekom 14 dana (enhitreji) ili 21 dana (gujavice), osim ako prethodno analiti čko određivanje nije poka ­
zalo 90 % smanjenja ostataka ispitivane kemikalije u crvima. Koncentracija 
ispitivane kemikalije u crvima na kraju faze eliminacije prijavljuje se kao
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1439
 
neeliminirani ostaci. Faktor bioakumulacije stabilnog stanja (BAFss) ra čuna 
se, po mogu ćnosti, i kao omjer koncentracije u crvima (Ca) i u tlu (Cs) u 
očito stabilnom stanju i kao faktor kineti čke bioakumulacije, BAFK, kao 
omjer konstante brzine apsorpcije iz tla (ks) i konstante brzine eliminacije (ke) (za definicije vidjeti Dodatak 1.), pod pretpostavkom kinetike prvog 
reda (za izra čune vidjeti Dodatak 2.). Ako je o čito da se ne može primijeniti 
kinetika prvog reda, treba se koristiti drugim modelima.
 
15. Konstanta brzine apsorpcije, konstanta (ili konstante kada su obuhva ćeni i 
drugi modeli) brzine eliminacije, faktor kineti čke bioakumulacije (BAFK) te, 
kad je mogu će, granice pouzdanosti svih tih parametara izra čunavaju se iz 
jednadžbi kompjutoriziranog modela (za smjernice vidjeti Dodatak 2.). 
Ispravnost uskla đenosti bilo kojeg modela može se odrediti, npr. iz koefi ­
cijenta korelacije ili koeficijenta odre đivanja (koeficijenti blizu jedinice znak 
su dobre uskla đenosti) ili hi-kvadratom. Isto tako, i veli čina standardne 
pogreške ili granica pouzdanosti blizu procijenjenih parametara mogu biti 
znak ispravne uskla đenosti modela.  
16. Da bi se smanjila varijabilnost rezultata ispitivanja za ispitivane kemikalije 
visoke lipofilnosti, faktori bioakumulacije trebali bi se izražavati u odnosu na sadržaj lipida i sadržaj organskog ugljika (kg organskog ugljika u tlu (OC) kg-1 sadržaja lipida u crvima). Taj se pristup temelji na činjenici 
da za neke razrede kemikalija postoji jasna veza izme đu bioakumulacijskog 
potencijala i lipofilnosti; to je dobro utvr đeno za ribe (47). Postoji veza 
između sadržaja lipida u ribama i bioakumulacije takvih kemikalija. Sli čne 
su korelacije prona đene i za benti čke organizme, npr. (30) (44). Sli čno 
tomu, ta je korelacija pokazana i za kopnene oligohete, npr. (5) (6) (7) (14). Ako je na raspolaganju dovoljno tkiva crva, sadržaj lipida ispitnih životinja može se odrediti na istom biološkom materijalu koji se koristio 
za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije. Druga je mogu ćnost 
uporaba kontrolnih životinja za mjerenje sadržaja lipida.
 
VALJANOST ISPITIVANJA  
17. Da bi ispitivanje bilo valjano, moraju biti ispunjeni sljede ći kriteriji i za 
kontrolne i za ispitne posude:  
— Na kraju ispitivanja ukupna smrtnost tijekom faze apsorpcije i faze 
eliminacije ne bi trebala biti ve ća od 10 % (gujavice) ili 20 % (enhitreji) 
od ukupnog broja uvedenih crva.  
— Za  Eisenia fetida i Eisenia andrei  srednja vrijednost gubitka mase izmje ­
rena na kraju faze apsorpcije i na kraju faze eliminacije ne bi trebala 
premašivati 20 % u usporedbi s po četnom svježom masom (f.w.) na 
početku svake faze.  
OPIS METODE  
Ispitne vrste  
18. Za ispitivanje bioakumulacije preporu čuje se nekoliko vrsta kopnenih oligo ­
heta. Naj češće korištene vrste  Eisenia fetida  ili Eisenia andrei  (Lumbrici ­
dae), ili  Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus,  ili Enchytraeus luxu ­
riosus  (Enchytraeidae) opisane su u Dodatku 5.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1440
 
Aparatura  
19. Treba se pobrinuti da se izbjegava uporaba materijala, za sve dijelove 
opreme, koji se mogu otapati, adsorbirati ispitivanu kemikaliju ili propuštati druge kemikalije te onih koji imaju negativan u činak na ispitne životinje. 
Standardne pravokutne ili cilindri čne posude, na činjene od kemijski inertnog 
materijala i prikladne zapremine, mogu se koristiti u skladu s brzinom punjenja, tj. brojem ispitnih crva. Plemeniti čelik, plastika ili staklo mogu 
se koristiti za svu opremu koja dolazi u doticaj s ispitnim medijem. Ispitne 
posude treba prikladno zatvoriti kako bi se izbjegao bijeg crva te ujedno 
omogućio dovoljan dotok zraka. Za kemikalije s visokim koeficijentima 
adsorpcije, kao što su sinteti čki piretroidi, možda će biti potrebno silanizi ­
rano staklo. U tim će se situacijama oprema morati baciti nakon uporabe 
(49). Treba sprije čiti izlazak radioaktivno obilježenih ispitivanih kemikalija i 
hlapljivih kemikalija. Treba koristiti zamke (npr. staklene posude za pranje plinova) koje sadržavaju odgovaraju će apsorbente kako bi se zadržali svi 
ostaci koji isparavaju iz ispitnih posuda.
 
Tlo 
20. Kakvo ća ispitnog tla treba omogu ćiti preživljavanje i, po mogu ćnosti, 
razmnožavanje ispitnih organizama za trajanja aklimatizacije i razdoblja 
ispitivanja, a da pritom oni ne pokazuju nikakvo neuobi čajeno ponašanje 
ili izgled. Crvi bi trebali rovati u tlu.  
21. Kao supstrat u ispitivanjima, preporu čuje se uporaba umjetnog tla opisanog 
u poglavlju C.8 ovog Priloga (48). Priprema umjetnog tla za uporabu u 
ispitivanjima bioakumulacije te preporuke za skladištenje umjetnog tla 
nalaze se u Dodatku 4. Umjetno tlo sušeno na zraku može se skladištiti na sobnoj temperaturi do uporabe.
 
22. Međutim, prirodna tla s neone čišćenih mjesta mogu poslužiti kao ispitno tlo 
i/ili tlo za uzgoj kultura. Za prirodna tla treba biti svojstveno podrijetlo 
(mjesto skupljanja), pH, sadržaj organskog ugljika, raspodjela veli čine 
čestica (postotak pijeska, praha i gline), maksimalni vodni kapacitet 
(WHCmax) te postotak sadržaja vode. Analiza tla ili njegovih sastojaka na mikroone čišćivače prije uporabe trebala bi dati korisne informacije. 
Ako se koristi tlo s poljoprivrednog zemljišta, isto ne smije biti tretirano 
proizvodima za zaštitu usjeva niti balegom tretiranih životinja kao gnojivom najmanje godinu dana ranije, a organskim gnojivima najmanje šest mjeseci prije uzorkovanja (50). Postupci manipulacije prirodnih tala prije njihove 
uporabe u ispitivanjima ekotoksi čnosti s oligohetima u laboratoriju opisani 
su u (3). Vrijeme skladištenja prirodnih tala u laboratoriju treba biti što je moguće kraće.
 
Primjena ispitivane kemikalije  
23. Ispitna se kemikalija inkorporira u tlo. U obzir treba uzeti fizikalno-kemijska 
svojstva ispitivane kemikalije. Ispitivana kemikalija topljiva u vodi treba se potpuno otopiti u vodi prije miješanja s tlom. Preporu čeni postupak spikinga 
za ispitivane kemikalije slabo topljive u vodi obuhva ća premazivanje jednog 
ili većeg broja sastojaka (umjetnog) tla ispitivanom kemikalijom. Primjerice, 
kremeni pijesak ili njegov dio mogu se namo čiti u otopini ispitivane kemi ­
kalije u prikladnom organskom otapalu, koji onda polako isparava dok ne 
ostavi suhi pijesak. Premazani dio potom se može umiješati u vlažno tlo. 
Glavna prednost ovog postupka jest ta da se u tlo ne uvodi otapalo. Kada se
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1441
 
koristi prirodno tlo, ispitivana kemikalija može se dodati postupkom 
spikinga dijela tla sušenog na zraku na gore opisani na čin za umjetno tlo 
ili miješanjem ispitivane kemikalije u vlažno tlo, uz naknadnu fazu ispara ­
vanja ako se koristi otapaju će sredstvo. Op ćenito, što je mogu će više treba 
izbjegavati doticaj vlažnog tla s otapalima. U obzir treba uzeti sljede će (3):  
— Ako se koristi neko drugo otapalo osim vode, ono treba biti mješljivo s 
vodom i/ili treba izi ći (primjerice, ispariti) i ostaviti samo ispitivanu 
kemikaliju na tlu.  
— Ako se koristi kontrola s otapalom, nema potrebe za negativnom kontro ­
lom. Kontrola s otapalom trebala bi sadržavati najvišu koncentraciju 
otapala koja se dodaju tlu i u njoj se treba koristiti otapalo iz iste šarže koja se koristila za radnu otopinu. Glavni kriteriji za odabir odgo ­
varajućeg otapaju ćeg sredstva trebali bi biti toksi čnost i hlapljivost 
otapala, topljivost ispitivane kemikalije u odabranom otapalu.
 
24. Za kemikalije koje su slabo topljive u vodi i u organskim otapalima 2,0 - 
2,5 g fino usitnjenog kremenog pijeska po ispitnoj posudi može se pomije ­ 
šati s koli činom ispitivane kemikalije, npr. uporabom žbuke i tucanog pije ­
ska, za dobivanje željene ispitne koncentracije. Ta se smjesa kremenog pijeska i ispitivane kemikalije dodaje prethodno navlaženom tlu i temeljito 
se izmiješa s odgovaraju ćom količinom deionizirane vode da bi se dobio 
potrebni sadržaj vlage. Kona čna se smjesa podijeli na ispitne posude. Taj se 
postupak ponavlja za svaku ispitnu koncentraciju, a pripremi se tako đer i 
prikladn akontrola s 2,0 - 2,5 g fino usitnjenog kremenog pijeska po ispitnoj 
posudi.
 
25. Koncentracija ispitivane kemikalije u tlu treba se odrediti nakon postupka 
spikinga. Homogena raspodjela ispitivane kemikalije u tlu treba se provjeriti 
prije uvođenja ispitnih organizama. Treba izvijestiti o metodi koja se kori ­
stila za spiking te o razlozima za odabir specifi čnog postupka spikinga.  
26. Izme đu tla i faze porne vode, u idealnom slu čaju, trebala bi se uspostaviti 
ravnoteža prije dodavanja organizama; preporu čuje se vremensko razdoblje 
od četiri dana na 20 °C. Za mnoge organske kemikalije slabo topljive u vodi 
vrijeme potrebno za postizanje prave ravnoteže izme đu adsorbiranih i 
otopljenih dijelova može biti nekoliko dana ili nekoliko mjeseci. Ovisno o cilju studije, primjerice kada treba oponašati uvjete u okolišu, tlo obra đeno 
postupkom spikinga može se ostaviti dulje vrijeme da „stari”, npr. za metale 
to su tri tjedna na 20 °C (22).
 
Uzgoj kulture ispitnih organizama  
27. Crve, po mogu ćnosti, treba držati u trajnoj laboratorijskoj kulturi. Smjernice 
o metodama uzgoja laboratorijskih kultura za Eisenia fetida i Eisenia andrei 
te za vrstu Enchytraeidae navedene su u Dodatku 5. (vidjeti još i (48) (51) 
(52)).  
28. Crvi koji se koriste u ispitivanju ne smiju imati zamjetnih bolesti, abnor ­
malnosti i parazita.  
PROVEDBA ISPITIVANJA  
29. Ispitni organizmi izlažu se ispitivanoj kemikaliji tijekom faze apsorpcije. 
Faza apsorpcije treba trajati 14 dana (enhitreji) ili 21 dan (gujavice), osim 
ako se ne pokaže da je postignuto stabilno stanje.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1442
 
30. Za fazu eliminacije crvi se prenose u tlo u kojemu nema ispitivane kemi ­
kalije. Prvi uzorak treba uzeti 4 - 24 h nakon po četka faze eliminacije. 
Primjeri rasporeda uzorkovanja za fazi apsorpcije od 21 dana i fazu elimi ­
nacije od 21 dana nalaze se u Dodatku 3.  
Ispitni organizmi  
31. Za mnoge vrste kopnenih enhitreja vrlo je mala pojedina čna masa (npr. 5- 
10 mg mokre mase po jedinci  Enchytraeus albidus , a još manje za  Enchy­
traeus crypticus  ili Enchytraeus luxuriosus ); da bi se provelo mjerenja mase 
i kemijska analiza, možda će biti neophodno pridružiti i crve iz ispitnih 
posuda za višestruka odre đivanja (tj. svi će se crvi iz posuda za višestruka 
određivanja iskoristiti za dobivanje jednog rezultata analize tkiva). 20 
jedinki enhitreja dodaje se u posude za višestruka odre đivanja, a treba biti 
najmanje tri posude za višestruka odre đivanja. Ako je granica analiti čke 
detekcije ispitivane kemikalije visoka, možda će biti potrebno još više 
crva. Za ispitne vrste ve će pojedina čne mase ( Eisenia fetida  i Eisenia 
andrei ) mogu se koristiti posude za višestruka odre đivanja koje sadržavaju 
samo jednu jedinku.  
32. Gujavice koje se koriste u ispitivanju trebale bi biti sli čne mase (npr.  
Eisenia fetida  i Eisenia andrei  trebale bi imati pojedina čnu masu od 250 
– 600 mg). Enhitreji (npr.  Enchytraeus albidus ) trebaju biti duga čki otprilike 
1 cm. Svi crvi koji se koriste u odre đenom ispitivanju trebaju dolaziti iz 
istog izvora i to trebaju biti odrasle životinje s pojasom žljezdanog epitela (klitelum) (vidjeti Dodatak 5.). Budu ći da masa i starost životinja mogu 
utjecati na vrijednosti BAF-a (npr. zbog variraju ćeg sadržaja lipida i/ili 
prisustva jajašaca), te parametre treba to čno zabilježiti i u obzir uzeti pri 
tumačenju rezultata. Osim toga, kokoni se mogu polagati i tijekom razdoblja 
izlaganja, što će također imati utjecaja na vrijednosti BAF-a. Preporu čuje se 
da se poduzorak ispitnih crva izvaže prije ispitivanja kako bi se procijenila 
srednja vrijednost mokre i suhe mase.
 
33. Treba koristiti visoki omjer tla i crva da bi se na minimum sveo pad 
koncentracije ispitivane kemikalije u tlu tijekom faze apsorpcije. Za vrste  
Eisenia fetida  i Eisenia andrei  preporučuje se minimalna koli čina od 50 g 
suhe mase (d.w.) tla po crvu, a za enhitreje minimalno 10-20 g d.w. tla po 
ispitnoj posudi. Posude trebaju sadržavati sloj tla debljine 2-3 cm (enhitreji) 
ili 4-5 cm (gujavice).  
34. Crvi koji se koriste u ispitivanju vade se iz kulture (npr. enhitreji pomo ću 
draguljarske pincete). Odrasle se životinje prenose u neobra đeno ispitno tlo 
radi aklimatizacije i hrane se (vidjeti stavak 36.). Ako se uvjeti ispitivanja razlikuju od uvjeta uzgoja kulture, faza aklimatizacije od 24-72 h trebala bi 
biti dovoljna da se crvi prilagode uvjetima ispitivanja. Nakon aklimatizacije 
gujavice se ispiru prenošenjem u staklene posude (npr. petri zdjelice) koje sadržavaju čistu vodu te se naknadno važu prije nego što se dodaju ispitnom 
tlu. Prije vaganja iz crva treba odstraniti višak vode blagim pritiskanjem 
crva o stijenku posude ili pažljivim tapkanjem crva blago navlaženim papir ­
natim ručnikom.
 
35. Treba promatrati i bilježiti ponašanje ispitnih organizama pri rovanju. U 
ispitivanjima s gujavicama te životinje (kontrolne i ispitne) obi čno rovare 
u tlu u roku od par sati; to treba provjeriti najkasnije 24 h nakon dodavanja crva u ispitne posude. Ako gujavice ne rovu u tlu (npr. više od 10 % 
tijekom više od polovice trajanja faze apsorpcije), to je znak da ili uvjeti 
ispitivanja nisu prikladni ili ispitni organizmi nisu zdravi. U takvim bi se
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1443
 
slučajevima ispitivanje trebalo prekinuti i ponoviti. Enhitreji uglavnom žive 
u međuprostornim porama tla pa je mogu će da je njihova koža samo djelo ­
mice u doticaju sa supstratom koji je okružuje; pretpostavlja se da je jednako izlaganje enhitreja koji rovu i onih koji ne rovu te da izostanak rovanja kod enhitreja ne mora nužno zna čiti i potrebu za ponavljanjem 
ispitivanja.
 
Hranjenje  
36. Hranjenje treba planirati kad se koristi tlo s niskim sadržajem organskog 
ugljika. Kad se koristi umjetno tlo, za gujavice se preporu čuje tjedna brzina 
hranjenja (tj. crve treba hraniti jedanput tjedno) od 7 mg suhog gnojiva na g suhe mase tla, a za enhitreje preporu čuje se tjedna brzina od 2-2,5 mg 
usitnjenih zobenih pahuljica na g suhe mase tla (11). Prva porcija hrane 
treba se izmiješati s tlom neposredno prije dodavanja ispitnih organizama. 
Po mogućnosti treba koristiti istu vrstu hrane kao i u uzgoju kultura (vidjeti 
Dodatak 5.).
 
Svjetlo i temperatura  
37. Ispitivanja treba provoditi u kontroliranom ciklusu svjetla i mraka od 16/8 
sati, po mogu ćnosti 400 do 800 luksa u podru čju ispitnih posuda (3). Ispitna 
temperatura cijelo vrijeme trajanja ispitivanja treba iznositi 20 ± 2 °C.  
Ispitne koncentracije  
38. Koristi se samo jedna koncentracija. Treba obrazložiti situacije u kojima 
je/su potrebna(-e) dodatna(-e) koncentracija(-e). Ako je toksi čnost (ECx) 
ispitivane kemikalije blizu granice analiti čke detekcije, preporu čuje se 
uporaba radioaktivno obilježene ispitivane kemikalije visoke specifi čne 
radioaktivnosti. Za metale bi koncentracija trebala biti viša od razine u 
tkivu i tlu.  
Višestruka odre đivanja  
39. Za kineti čka mjerenja (fazu apsorpcije i fazu eliminacije) minimalni broj 
ispitnih posuda višestrukog odre đivanja treba biti tri po mjestu uzorkovanja. 
Ukupni broj pripremljenih posuda višestrukog odre đivanja treba biti dovo ­
ljan da obuhvati sva vremena uzorkovanja tijekom faze apsorpcije i faze 
eliminacije.  
40. Za biološka promatranja i mjerenja (npr. omjer suhe i mokre mase, sadržaj 
lipida) te za analizu pozadinskih koncentracija u crvima i u tlu treba osigu ­
rati najmanje 12 posuda za višestruko odre đivanje iz negativne kontrole 
(četiri se uzorkuju na po četku, četiri na kraju apsorpcije i četiri na kraju 
eliminacije) ako se ne koristi nikakvo drugo otapalo osim vode. Ako se za primjenu ispitivane kemikalije koristi otapaju će sredstvo, paralelno s ispi ­
tinim posudama za višestruko odre đivanje treba provoditi i ispitivanje 
kontrolnih posuda s otapalom ( četiri posude za višestruko odre đivanje uzor ­
kuju se na po četku, četiri na kraju faze apsorpcije i četiri na kraju faze 
eliminacije) koje sadržavaju sve sastojke osim ispitivane kemikalije. U tom slučaju mogu se pripremiti i četiri dodatne posude za višestruko odre ­ 
đivanje iz negativne kontrole (bez otapala) za fakultativno uzorkovanje na 
kraju faze apsorpcije. Te posude za višestruko odre đivanje mogu se biološki 
usporediti s kontrolama s otapalom da bi se dobile informacije o mogu ćem 
utjecaju otapala na ispitne organizme. Preporu čuje se da se pripremi dovo ­
ljan broj dodatnih posuda za višestruko odre đivanje (npr. osam) za ispitne i 
kontrolnu/kontrolne posude.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1444
 
Učestalost mjerenja kakvo će tla  
41. pH tla, sadržaj vlage u tlu i temperatura (neprekidno) u ispitnoj prostoriji 
trebaju se mjeriti na po četku i na kraju faze apsorpcije i faze eliminacije. 
Jedanput tjedno treba prekontrolirati sadržaj vlage u tlu vaganjem ispitnih 
posuda i usporedbom stvarnih masa s po četnim masama na po četku ispiti ­
vanja. Gubitke vode treba kompenzirati dodavanjem deionizirane vode.  
Uzorkovanje i analiza crva i tla  
42. Primjer rasporeda faze apsorpcije i faze eliminacije u ispitivanjima bioaku ­
mulacije kod gujavica i enhitreja naveden je u Dodatku 3.  
43. Tlo se uzorkuje iz ispitnih posuda za odre đivanje koncentracije ispitivane 
kemikalije prije umetanja crva te tijekom faze apsorpcije i faze eliminacije. 
Tijekom ispitivanja odre đuju se koncentracije ispitivane kemikalije u crvima 
i u tlu. Op ćenito, mjere se ukupne koncentracije u tlu. Kao druga mogu ć­
nost, mogu se mjeriti koncentracije i u pornoj vodi; u takvom slu čaju treba 
navesti obrazloženje i metode prije zapo činjanja studije te ih treba obuhvatiti 
u izvješću. 
44. Crvi i tlo uzorkuju se najmanje u šest prigoda tijekom faze apsorpcije i faze 
eliminacije. Ako se pokazala stabilnost ispitivane kemikalije, može se smanjiti broj analiza tla. Preporu čuje se da se analiziraju najmanje tri 
posude iz višestrukih odre đivanja na po četku i na kraju faze apsorpcije. 
Ako koncentracija izmjerena na kraju faze apsorpcije odstupa od po četne 
koncentracije za više od 30 %, treba analizirati i uzorke tla koji su se uzeli drugih dana.
 
45. U svakom trenutku uzorkovanja ukloniti crve iz tla predmetne posude za 
višestruko odre đivanje (npr. rasuti tlo iz posude za višestruko odre đivanje na 
pliticu i izvaditi crve mekanom draguljarskom pincetom), brzo ih isprati 
vodom u plitkoj staklenoj ili čeličnoj posudi. Ukloniti višak vode (vidjeti 
stavak 34.). Pažljivo prenijeti crve u prethodno izvaganu posudu, smjesta ih izvagati, uklju čujući i sadržaj crijeva.
 
46. Gujavice ( Eisenia sp .) treba potom pustiti da isprazne crijeva tijekom no ći, 
npr. na vlažnom filtarskom papiru u zatvorenoj petri zdjelici (vidjeti stavak 
34.). Nakon pražnjenja crijeva treba odrediti masu crva kako bi se procijenio 
eventualno pad biomase tijekom ispitivanja (vidjeti validacijske kriterije u stavku 17.). Vaganje i analiza tkiva enhitreja provode se bez pražnjenja crijeva jer je to tehni čki teško izvedivo zbog male veli čine tih crva. 
Nakon kona čnog određivanja mase crve treba odmah usmrtiti, i to najpri ­
kladnijom metodom (npr. pomo ću tekućeg dušika ili njihovim zamrzava ­
njem na temperaturama ispod -18 °C).
 
47. Tijekom faze eliminacije crvi zamjenjuju one čišćeni sadržaj crijeva čistim 
tlom. To zna či da mjerenja crva koji nisu ispraznili crijeva (u ovom 
kontekstu enhitreja) uzorkovanih neposredno prije faze eliminacije uklju čuje 
i onečišćeno tlo iz crijeva. Za vodene oligohete pretpostavlja se da se, nakon 
početnih 4 – 24 h faze eliminacije, ve ćina onečišćenog sadržaja crijeva 
zamijeni čistim sedimentom, npr. (46). Do sli čnih spoznaja se došlo i za 
gujavice u studijama akumulacije radioaktivno obilježenih kadmija i cinka 
(78). U enhitrejima koji nisu ispraznili crijeva koncentracija prvog uzorka 
faze eliminacije može se uzeti u obzir kao koncentracija u tkivu nakon pražnjenja crijeva. Kako bi se u obzir uzelo i razrje đivanje koncentracije 
ispitivane kemikalije u neone čišćenom tlu tijekom faze eliminacije, masa 
sadržaja crijeva može se procijeniti iz omjera mokre mase crva/mase 
praha crva ili iz suhe mase crva/mase praha crva.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1445
 
48. Uzorke tla i crva treba, po mogu ćnosti, analizirati neposredno nakon njihova 
vađenja (tj. u roku od 1-2 dana) kako bi se sprije čila razgradnja ili drugi 
gubici, a preporu čuje se i izra čun približnih brzina apsorpcije i eliminacije 
tijekom nastavka ispitivanja. Ako se analiza odgodi, uzorke treba uskladištiti prikladnom metodom, npr. dubokim smrzavanjem ( ≤ -18 °C).
 
49. Treba provjeriti jesu li za odre đenu metodu zadovoljavaju će preciznost i 
mjerna obnovljivost kemijske analize, kao i vra ćanje ispitivane kemikalije 
iz uzoraka tla i crva; treba izvijestiti i o u činkovitosti ekstrakcije, granici 
detekcije (LOD) i granici kvantifikacije (LOQ). Sli čno tomu, treba provjeriti 
može li se ispitivana kemikalija detektirati u kontrolnim posudama u koncentracijama višima od pozadinske. Kad je koncentracija ispitivane kemikalije u pokusnom organizmu Ca > 0 u kontrolnim crvima, to treba 
uzeti u obzir pri izra čunu kineti čkih parametara (vidjeti Dodatak 2.). Sa 
svim uzorcima treba tijekom ispitivanja postupati tako da se na minimum svedu one čišćenja i gubici (npr. nastali kao rezultat adsorpcije ispitivane 
kemikalije na ure đaj za uzorkovanje).
 
50. Pri radu s radioaktivno obilježeimn ispitnim kemikalijama mogu će je anali ­
zirati i polazne kemikalije i njihove metabolite. Korisne informacije donosi kvantifikacija polazne ispitivane kemikalije i metabolita u stabilnom stanju 
ili na kraju faze apsorpcije. Potom bi uzorke trebalo „o čistiti” kako bi se 
polazna ispitivana kemikalija mogla zasebno kvantitativno odrediti. Ako pojedinačni metaboliti premašuju 10 % ukupne radioaktivnosti u analizira ­
nom(-im) uzorku(-cima), preporu čuje se identifikacija tih metabolita.
 
51. Treba zabilježiti i u izvješ će uključiti i ukupni oporavak te oporavak ispi ­
tivane kemikalije u crvima, tlu te, ako se koriste, u zamkama koje sadrža ­
vaju apsorbente radi zadržavanja isparene ispitivane kemikalije.  
52. Spajanje jedinki uzorkovanih iz odre đene ispitne posude prihvatljivo je za 
crve enhitreja koji su manji od gujavica. Ako spajanje obuhva ća smanjenje 
broja posuda za višestruko odre đivanje, to ograni čava statisti čki postupak 
koji se može primijeniti na podatke. Ako se traže specifi čni statisti čki 
postupak i snaga, u ispitivanje treba uklju čiti odgovaraju ći broj posuda za 
višekratno odre đivanje kako bi se omogu ćilo željeno spajanje, postupak i 
snaga.  
53. Preporu čuje se da se BAF izražava i kao funkcija ukupne suhe mase i, kad 
je to potrebno (tj. za jako hidrofobne kemikalije), kao funkcija sadržaja 
lipida. Treba koristiti prikladne metode za odre đivanje sadržaja lipida 
(neke postoje će metode, npr. (31) (58), treba prilagoditi u tu svrhu). U 
tim se metodama koristi tehnika ekstrakcije klorofora/metanola. Me đutim, 
radi izbjegavanja uporabe kloriranih otapala, treba koristiti izmijenjenu 
metodu Bligha i Dyera (9) kao što je opisano u (17). Budu ći da razne 
metode možda ne će dati identi čne vrijednosti, vrlo je važno navesti pojedi ­
nosti korištene metode. Kad je to mogu će, tj. ako postoji dovoljno tkiva 
crva, analizu lipida treba, po mogu ćnosti, provoditi na istom uzorku ili 
ekstraktu kao i u analizi ispitivane kemikalije jer se lipidi često moraju 
ukloniti iz ekstrakta prije nego što se on može kromatografski analizirati (49). Druga je mogu ćnost da se upotrijebe kontrolne životinje za mjerenje 
sadržaja lipida, što se potom može iskoristiti za normalizaciju vrijednosti 
BAF-a. Tim se potonjim pristupom umanjuje one čišćenost opreme ispiti ­
vanom kemikalijom.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1446
 
PODACI I IZVJEŠ ĆIVANJE  
Obrada rezultata  
54. Krivulja apsorpcije ispitivane kemikalije dobiva se grafi čkim prikazom 
koncentracije u/na crvima tijekom faze apsorpcije u ovisnosti o vremenu na aritmeti čkoj ljestvici. Kada krivulja dosegne plato ili stabilno stanje 
(vidjeti definicije u Dodatku 1.), faktor bioakumulacije stabilnog stanja 
BAFss izra čunava se iz:
 
C a u stabilnom stanju ili na kraju faze apsorpcije  ðsrednja vrijednostÞ 
C s stabilnom stanju ili na kraju faze apsorpcije  ðsrednja vrijednostÞ 
C a je koncentracija ispitivane kemikalije u pokusnom organizmu  
C s je koncentracija ispitivane kemikalije u tlu  
55. Ako se ne postigne stabilno stanje, umjesto BAFss treba odrediti BAFK, na 
temelju konstanti brzine, i to na sljede ći način: 
— Odrediti faktor akumulacije (BAF  K ) kao omjer k  s /k e . 
— Brzina apsorpcije i brzina eliminacije se, po mogu ćnosti, izra čunavaju 
istodobno (vidjeti jednadžbu 11. u Dodatku 2.).  
— Konstanta brzine eliminacije (k  e ) obično se odre đuje iz krivulje elimi ­
nacije (tj. grafi čkog prikaza koncentracije ispitivane tvari u crvima 
tijekom faze eliminacije). Konstanta brzine apsorpcije k  s izračunava se 
potom na temelju vrijednosti k  e i C a koje se dobiju iz krivulje apsorpcije 
– za opis tih metoda vidjeti Dodatak 2. Za dobivanje BAF  K i konstanti 
brzine, k  s , i k  e , prednost se daje metodama uporabe procjene nelinearnih 
parametara na ra čunalu. Ako eliminacija nije o čito prvog reda, treba 
primijeniti kompleksnije modele.  
Izvješće o ispitivanju  
56. Izvješ će o ispitivanju treba obuhva ćati sljedeće podatke:  
Ispitivana kemikalija:  
— svi dostupni podaci o akutnoj ili dugotrajnoj toksi čnosti (npr. EC  x , LC  x ” 
NOEC) ispitivane kemikalije na oligohete iz tla;  
— čistoća, fizikalna narav i fizikalno-kemijska svojstva, npr. log K  ow , 
topljivost u vodi;  
— podaci za identifikaciju kemikalije, izvor ispitivane tvari, identitet i 
koncentracija upotrijebljenog otapala;  
— ako se koristi radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija, precizan 
položaj obilježenih atoma, specifi čna radioaktivnost i radioaktivno 
kemijska čistoća. 
Ispitne vrste:  
— znanstveni naziv, soj, izvor, sve vrste prethodne obrade, aklimatizacija, 
starost, red veli čina itd.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1447
 
Uvjeti ispitivanja:  
— primijenjeni postupak ispitivanja;  
— vrsta i svojstva korištene rasvjete i fotoperiod/fotoperiodi;  
— plan ispitivanja npr. broj i veli čina ispitnih posuda, masa tla i visina 
sloja tla, broj posuda za višestruko odre đivanje, broj crva u svakoj 
posudi za višestruko odre đivanje, broj ispitnih koncentracija, trajanje 
faze apsorpcije i faze eliminacije, u čestalost uzorkovanja);  
— obrazloženje odabira materijala ispitne posude;  
— metoda pripreme i primjene ispitivane tvari, kao i obrazloženje odabira 
specifične metode;  
— nazivne ispitne koncentracije, srednje vrijednosti izmjerenih vrijednosti i 
njihove standardne devijacije u ispitnim posudama te metoda kojom su 
dobivene te vrijednosti;  
— izvor sastojaka umjetnog tla ili – ako se koriste prirodni mediji – podri ­
jetlo tla, opis svake prethodne obrade, rezultati iz kontrola (preživljava ­
nje, razvoj biomase, razmnožavanje), svojstva tla (pH, sadržaj ukupnog 
organskog ugljika, raspodjela veli čine čestica (postotak pijeska, praha i 
gline), WHC  max , postotak sadržaja vode na po četku i na kraju ispitivanja 
i sva ostala provedena mjerenja);  
— detaljni podaci o obradi uzoraka tla i crva, uklju čujući i pojedinosti o 
pripremi, skladištenju, postupcima spikinga, ekstrakciji i analiti čkim 
postupcima (i preciznosti) za ispitivanu tvar u crvima i u tlu, te sadržaj lipida (ako je izmjeren) i oporavak ispitivane tvari.
 
Rezultati:  
— smrtnost crva iz kontrola i crva u svakoj ispitnoj posudi te svako 
opaženo neuobi čajeno ponašanje (npr. izbjegavanje tla, nedostatak 
razmnožavanja u ispitivanjima bioakumulacije s enhitrejima);  
— omjer suhe mase i mokre mase tla i pokusnih organizama (korisno za 
normalizaciju);  
— mokra masa crva u svakom trenutku uzorkovanja; za gujavice mokra 
masa na po četku ispitivanja i u svakom trenutku uzorkovanja prije i 
poslije pražnjenja crijeva;  
— sadržaj lipida pokusnih organzama (ako je odre đen); 
— krivulje koje pokazuju kinetiku apsorpcije i eliminacije ispitivane kemi ­
kalije u crva i vrijeme do stabilnog stanja;  
— C  a i C s (sa standardnom devijacijom i rasponom, ako je to primjereno) 
za sve trenutke uzorkovanja (C  a izraženo u g kg  –1 mokre i suhe mase 
cijelog tijela, C  s izražen u g kg  –1 mokre i suhe mase tla). Ako se traži i 
faktor bioakumulacije biota tla (BSAF) (npr. radi usporedbe rezultata dvaju ili ve ćeg broja ispitivanja provedenih sa životinjama razli čitog 
sadržaja lipida), dodatno se može izraziti C
 a kao g kg  –1 sadržaja lipida 
u organizmu, a C  s se može izraziti kao g kg  –1 organskog ugljika (OC) u 
tlu; 
— BAF (izražen u kg tla ·kg –1 crva), konstanta brzine apsorpcije tla k  s 
(izražena u g tla kg  –1 crva na dan  –1 ) i konstanta brzine eliminacije k  e 
(izražena u dana  –1 ); BSAF (izražen u kg tla OC kg  –1 sadržaja lipida u 
crvima) može se prijaviti naknadno;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1448
 
— ako su mjereni: postoci polazne kemikalije, metaboliti i vezani ostaci (tj. 
postotak ispitivane kemikalije koja se ne može ekstrahirati uobi čajenim 
metodama ekstrakcije) detektirani u tlu i pokusnim životinjama;  
— metode korištene za statisti čke analize podataka.  
Vrednovanje rezultata:  
— sukladnost rezultata s validacijskim kriterijima navedenima u stavku 17.;  
— neočekivani ili neobi čni rezultati, npr. nepotpuna eliminacija ispitivane 
kemikalije iz pokusnih životinja.  
LITERATURA  
1. Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
2. ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688-00a.  
3. ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Internatio ­
nal, E1676-04: str. 26.  
4. Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The 
Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): 
Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
 
5. Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.  
6. Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens 
J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms 
(Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.  
7. Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Eisenia 
andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.  
8. Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.  
9. Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.  
10. Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, 
Annales de Zoologie-Ecologie animale, Pariz, str. 671.  
11. Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestri ­
schen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
 
12. Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchytraeus 
luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). 
Hydrobiologia 463: 185-196.  
13. Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13-20.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1449
 
14. Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.  
15. Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
16. Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, str. 555-576.  
17. De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
 
18. Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
 
19. Uredba (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vije ća od 18. prosinca 
2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograni čavanju 
kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe 
Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive 
Vijeća 76/769/EEZ i Direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ 
i 2000/21/EZ, SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
 
20. Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, str. 426.  
21. OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Pariz  
22. Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten 
Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to 
the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: str. 149. Može se preuzeti s interneta na adresi: 
http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
23. Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: str. 57.
 
24. Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25. EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
 
26. Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.  
27. Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501-1514.  
28. Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexach ­
lorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlor ­
prop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbricidae). 
Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1450
 
29. Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78-84.  
30. Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.  
31. Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.  
32. Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
 
33. Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15-20.  
34. Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxiko ­
logische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.  
35. ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
36. Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6-8.  
37. Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080-2090.  
38. Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.  
39. Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) in 
field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 
767-775.  
40. Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.  
41. Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 20: 305-312.  
42. Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.  
43. Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, str. 137.  
44. Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.  
45. Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumu ­
lation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.  
46. Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1451
 
47. Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumula ­
tion in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48. Poglavlje C.8 ovog Priloga, Toksi čnost za gujavice  
49. Poglavlje C.13 ovog Priloga, Biokoncentracija: test proto čnosti na ribama.  
50. Poglavlje C.21 ovog Priloga, Mikroorganizmi iz tla: test transformacije 
dušika.  
51. OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz . 
52. Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), 
Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Pariz.  
53. OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz.
 
54. Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
55. Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 
1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.  
56. Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- 
Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.  
57. Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  
Eisenia fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58. Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of 
selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.  
59. Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60. Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: str. 373.
 
61. Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.  
62. Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secon ­
dary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: 
Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.  
63. Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
 
64. Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
 
65. Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93-100.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1452
 
66. Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67. Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
 
68. Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.  
69. Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins 
RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. 
S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, 
Pensacola, 67-81.
 
70. Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxicol. 
Chemistry 22: 1167-1171.
 
71. UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72. US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, 
Duluth, MN, March 2000.  
73. Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277-285.  
74. Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity 
of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
75. Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023-1033.  
76. Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioa ­
vailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebra ­
tes. Environmental Pollution 136: 409-417.  
77. Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.  
78. Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
 
79. Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1453
 
Dodatak 1.  
DEFINICIJE  
Bioakumulacija  je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organizmu 
u odnosu na koncentraciju ispitivane kemikalije u mediju koji je okružuje. Bioa ­
kumulacija nastaje i iz procesa biokoncentracije i iz procesa biomagnifikacije (vidjeti u nastavku teksta).
 
Biokoncentracija  je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organ ­
izmu, koja nastaje kao rezultat apsorpcije kemikalije isklju čivo iz medija koji je 
okružuje (tj. putem tjelesne površine i konzumiranog tla), u odnosu na koncen ­
traciju ispitivane kemikalije u mediju koji je okružuje.  
Biomagnifikacija  je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organ ­
izmu, koja nastaje uglavnom kao rezultat apsorpcije iz one čišćene hrane ili 
plijena, u odnosu na koncentraciju ispitivane kemikalije u hrani ili plijenu. 
Biomagnifikacija može dovesti do prijenosa akumulacije ispitivane tvari unutar 
mreža hrane.  
Eliminacija  ispitivane kemikalije je gubitak te kemikalije iz tkiva pokusnog 
organizma aktivnim ili pasivnim procesima koji se odvijaju neovisno o prisustvu ili odsustvu ispitivane tvari u mediju koji je okružuje.
 
Faktor bioakumulacije  (BAF) u bilo kojem trenutku tijekom faze apsorpcije 
ovog ispitivanja bioakumulacije je koncentracija ispitivane kemikalije u/na poku ­
snom organizmu (C  a u g·kg -1 suhe mase crva) podijeljena s koncentracijom te 
kemikalije u mediju koji je okružuje (C  s kao g·kg -1 suhe mase tla); jedinica za 
BAF je kg tla ·kg -1 crva.  
Faktor bioakumulacije stabilnog stanja  (BAF  ss ) je BAF u stabilnom stanju i ne 
mijenja se zna čajno tijekom duljeg razdoblja, a koncentracija ispitivane kemika ­
lije u mediju koji je okružuje (C  s kao g.kg  -1 suhe mase tla) konstantna je tijekom 
tog razdoblja.  
Faktori bioakumulacije  izračunati izravno iz omjera konstante brzine apsorpcije 
tla i konstante brzine eliminacije tla (k  s i k e , vidjeti u nastavku teksta) nazivaju se 
faktorom kineti čke bioakumulacije (BAF  K ). 
Faktor akumulacije biota tla  (BSAF) je koncentracija ispitivane kemikalije u/na 
pokusnom organizmu, normalizirana lipidima, podijeljena s koncentracijom ispi ­
tivane kemikalije u tlu, normaliziranom organskim ugljikom, u stabilnom stanju. Tada se C
 a izražava kao g ·kg -1 sadržaja lipida organizma, a C  s kao g·kg -1 sadr­ 
žaja organskog ugljika tla; jedinica za BSAF je kg OC ·kg -1 lipida.  
Plato  ili stabilno stanje  definira se kao uravnoteženje izme đu procesa apsorpcije 
i eliminacije koji se odvijaju istodobno tijekom faze izlaganja. Stabilno se stanje 
postiže na grafi čkom prikazu BAF-a u ovisnosti o vremenu kada krivulja postane 
paralelna s vremenskom osi i kad se rezultati tri uzastopne analize BAF-a prove ­
dene na uzorcima koji se uzimaju u razmacima od najmanje dva dana nalaze unutar 20 % jedni od drugih te kad ne postoje statisti čki značajne razlike me đu 
trima razdobljima uzorkovanja. Za ispitivane kemikalije koje se sporo apsorbiraju 
prikladniji bi vremenski razmak bio sedam dana (49).
 
Podjelni koeficijent organski ugljik-voda  (K  oc ) je omjer koncentracije kemika ­
lije u/na dijelu tla s organskim ugljikom i koncentracije kemikalije u vodi u ravnoteži.
 
Podjelni koeficijent oktanol-voda  (K  ow ) je omjer topljivosti kemikalije u 
n-oktanolu i vodi u ravnoteži, ponekad se izražava i kao P  ow . Logaritam K  ow 
(log K  ow ) koristi se kao znak bioakumulacijskog potencijala kemikalije kod 
vodenih organizama.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1454
 
Faza apsorpcije ili izlaganja  je vrijeme tijekom kojega pokusni organizmi 
bivaju izloženi ispitivanoj kemikaliji.  
Konstanta brzine apsorpcije tla  (k s ) je brojčana vrijednost koja definira brzinu 
porasta koncentracije ispitivane tvari u/na pokusnom organizmu, a koja nastaje kao rezultat apsorpcije iz faze tla. k
 s se izražava kao g tla kg  -1 crva d  -1 . 
Faza eliminacije  je vrijeme, nakon prijenosa pokusnih organizama iz one či­ 
šćenog medija u medij bez ispitivane tvari, tijekom kojega se prou čava elimi ­
nacija (ili neto gubitak) kemikalije iz pokusnih organizama.  
Konstanta brzine eliminacije  (k e ) je brojčana vrijednost koja definira brzinu 
opadanja koncentracije ispitivane tvari u/na pokusnim organizmima, nakon prije ­
nosa pokusnih organizama iz medija koji sadržava ispitivanu tvar u medij bez te 
kemikalije; k  e se izražava u d  -1 . 
Ispitivana kemikalija:  Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom Ispitnom 
metodom.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1455
 
Dodatak 2.  
Izračun parametara apsorpcije i eliminacije  
Osnovni kona čni učinak ispitivanja bioakumulacije je faktor bioakumulacije, 
BAF. Izmjereni BAF može se izra čunati dijeljenjem koncentracije u pokusnom 
organizmu, C  a , a koncentracijom u tlu, C  s , u stabilnom stanju. Ako se stabilno 
stanje ne postigne tijekom faze apsorpcije, BAF  K se, umjesto BAFss, izra čunava 
iz konstanti brzine. Me đutim, ipak treba primijetiti temelji li se BAF na koncen ­
tracijama u stabilnom stanju ili ne.  
Najčešći način dobivanja faktora kineti čke bioakumulacije (BAF  K ), konstante 
brzine apsorpcije tla (k  s ) i konstante brzine eliminacije (k  e ) jest uporaba 
metoda procjene nelinearnih parametara na ra čunalu, npr., na temelju modela 
opisanih u (68). Kad je zadan niz podataka o koncentracijama u sekvencijalnim vremenima i modeli jednadžbi: 
C
 a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [jednadžba 1]  
ili 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [jednadžba 2]  
gdje je  
C a = koncentracija kemikalije u crvima [g kg-1 mokre ili suhe mase]  
k s = konstanta brzine apsorpcije u tkivu [g tla kg-1 crva d-1]  
C s = koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]  
k e = konstanta brzine eliminacije [d-1]  
t c = vrijeme na kraju faze apsorpcije,  
ti računalni programi izra čunavaju vrijednosti BAF  K , k s i k e . 
Kad se pozadinska koncentracija u neizloženim crvima, npr. na dan 0, zna čajno 
razlikuje od nule (to može biti slu čaj, npr. za metale), pozadinsku koncentraciju 
(C a,0 ) treba obuhvatiti tim jednadžbama pa bi one glasile: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [jednadžba 3]  
i 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [jednadžba 4]  
U slučajevima kad se opazi zna čajan pad koncentracije ispitivane kemikalije u tlu 
tijekom razdoblja trajanja faze apsorpcije, mogu se primijeniti sljede ći modeli, 
npr. (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [jednadžba 5]  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1456
 
gdje je  
C s = koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]  
k 0 = konstanta brzine razgradnje u tlu [d-1]  
C 0 = početna koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [jednadžba 6]  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [jednadžba 7]  
gdje je  
C a = koncentracija kemikalije u crvima [g kg-1 mokre ili suhe mase]  
k s = konstanta brzine apsorpcije u tkivu [g tla kg-1 crva d-1]  
k 0 = konstanta brzine razgradnje u tlu [d-1]  
k e = konstanta brzine eliminacije [d-1]  
t c = vrijeme na kraju faze apsorpcije.  
Kad se tijekom faze apsorpcije postigne stabilno stanje (tj. t = ∞), jednadžba 1  
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [jednadžba 1]  
može se skratiti na:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
ili 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [jednadžba 8]  
Tada je k  s /k e x C  s pristup koncentraciji ispitivane tvari u tkivu crva u stabilnom 
stanju (C  a,ss ). 
Faktor akumulacije biota tla (BSAF) može se izra čunati na sljede ći način: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [jednadžba 9]  
gdje je f  oc udio organskog ugljika u tlu, a f  lip udio lipida u crvu, a obje te 
vrijednosti, po mogu ćnosti, se odre đuju na uzorcima uzetima iz ispitivanja, a 
temelje se jedna na suhoj masi, a druga na mokroj masi.  
Može se izraditi model kinetike eliminacije pomo ću podataka iz faze eliminacije 
te primjenom sljede ćeg modela jednadžbe i ra čunalno utemeljene metode 
procjene nelinearnih parametara. Ako podaci na grafi čkom prikazu u ovisnosti 
o vremenu nazna čuju konstantni eksponencijalni pad koncentracije ispitivane 
tvari u životinjama, model s jednim odjelom (jednadžba 9) može se upotrijebiti 
za opis trajanja eliminacije.  
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [jednadžba 10]  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1457
 
Ponekad se čini da su procesi eliminacije dvofazni i da u njima dolazi do 
rapidnog pada C  a tijekom po četnih faza, a to se pretvara u sporiji gubitak ispi ­
tivanih tvari u kasnijim fazama eliminacije, npr. (27) (68). Te se dvije faze mogu protumačiti pretpstavkom da u organizmu postoje dva odjela iz kojih se gubi 
ispitivana kemikalija, i to razli čitom brzinom. U tim bi slu čajevima trebalo prou ­ 
čiti specifi čnu literaturu, npr. (38) (39) (40) (78).
 
Putem gore navedenog modela jednadžbe mogu se u istom ispitivanju izra čunati i 
kinetički parametri (k  s i k e ) primjenom kineti čkog modela prvog reda istodobno 
na sve podatke, kako iz faze apsorpcije tako i iz faze eliminacije. Za opis metode koja bi omogu ćila takav kombinirani izra čun konstanti brzine apsorpcije i elimi ­
nacije mogu se konzultirati reference (181), (213) i (210). 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[jednadžba 11]  
Napomena:  Kad se istodobno procjenjuju parametri apsorpcije i eliminacije iz 
kombiniranih podataka o apsorpciji i eliminaciji, „m” iz jednadžbe 11 je deskriptor koji ra čunalnom programu omogu ćuje da dodijeli 
podpojmove jednadžbe nizovima podataka iz odgovaraju će faze te 
da se vrednovanje propisno provede (m = 1 za fazu apsorpcije; m = 2 za fazu eliminacije).
 
Unatoč tomu, ove modele jednadžbi treba koristiti s oprezom, poglavito kada 
tijekom ispitivanja do đe do promjena bioraspoloživosti ili (bio)razgradnje ispiti ­
vane kemikalije (vidjeti npr. (79)).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1458
 
Dodatak 3.  
PRIMJERI PLANOVA ISPITIVANJA BIOAKUMULACIJE TLA  
Ispitivanje s gujavicama  
(a) Faza apsorpcije s osam datuma uzorkovanja korištenih za izra čun kinetike  
Dan Djelatnost  
– 6 Kondicioniranje pripremljenog tla 48 h;  
– 4 Obrada dijela tla spikingom s otopinom ispitivane kemikalije; 
isparavanje eventualnih otapala; miješanje sastojaka tla; raspo ­
djela tla u ispitne posude; uravnoteženje u uvjetima ispitivanja 
četiri dana (tri tjedna za tlo obra đeno spikingom s metalima);  
– 3 do – 1  Va đenje pokusnih organizama iz uzgojene kulture radi aklimati ­
zacije; priprema i vlaženje sastojaka tla;  
0 Mjerenje temperature i pH tla; va đenje uzoraka tla iz ispitnih 
posuda i kontrola s otapalom radi odre đivanja koncentracije ispi ­
tivane kemikalije; dodavanje porcije hrane; vaganje i nasumi čno 
raspoređivanje crva u ispitne posude; zadržavanje dovoljnog 
broja poduzoraka crva za odre đivanje analiti čkih pozadinskih 
vrijednosti, mokre i suhe mase te sadržaja lipida; vaganje svih ispitnih posuda radi kontrole vlažnosti tla; kontrola dovoda zraka ako se koristi zatvoreni sustav ispitivanja;
 
1 Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; 
uzimanje uzoraka tla i crva za odre đivanje koncentracije ispiti ­
vane tvari;  
2 Isto kao i 1. dan;  
3 Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;  
4 Isto kao i 1. dan;  
5 - 6  Isto kao i 3. dan;  
7 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla 
ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
 
8 - 9  Isto kao i 3. dan;  
10 Isto kao i 1. dan;  
11 - 13  Isto kao i 3. dan;  
14 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla 
ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
 
15 - 16  Isto kao i 3. dan;  
17 Isto kao i 1. dan;  
18 - 20  Isto kao i 3. dan;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1459
 
Dan Djelatnost  
21 Isto kao i 1. dan; mjerenje temperature i pH tla; kontrola vlaž ­
nosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda; kraj faze apsorp ­
cije; prijenos crva iz preostalih izloženih posuda za višestruko 
određivanje u posude koje sadržavaju čisto tlo za fazu eliminacije 
(bez pražnjenja crijeva); uzorkovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.
 
Djelatnosti prethodnog izlaganja (fazu uravnoteženja) treba plani ­
rati uzimaju ći u obzir svojstva ispitivane kemikalije.  
Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem 
za radnih dana).  
(b) Faza eliminacije  
Dan Djelatnost  
– 6 Priprema i vlaženje sastojaka tla; kondicioniranje pripremljenog 
tla 48 h;  
– 4 Miješanje sastojaka tla; podjela tla na ispitne posude; inkubacija 
u uvjetima ispitivanja 4 dana;  
0 (kraj faze apsorp ­
cije) Mjerenje temperature i pH tla; vaganje i nasumi čna raspodjela 
crva na ispitne posude; dodavanje porcije hrane; prijenos crva iz preostalih izloženih posuda za višestruko odre đivanje u posude 
koje sadržavaju čisto tlo; uzimanje uzoraka tla i crva nakon 4 - 6 
dana za odre đivanje koncentracije ispitivane kemikalije;
 
1 Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; 
uzimanje uzoraka tla i crva za odre đivanje koncentracije ispiti ­
vane kemikalije;  
2 Isto kao i 1. dan;  
3 Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;  
4 Isto kao i 1. dan;  
5 - 6  Isto kao i 3. dan;  
7 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla 
ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
 
8 - 9  Isto kao i 3. dan;  
10 Isto kao i 1. dan;  
11 - 13  Isto kao i 3. dan;  
14 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla 
ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene 
vode;  
15 - 16  Isto kao i 3. dan;  
17 Isto kao i 1. dan;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1460
 
Dan Djelatnost  
18 - 20  Isto kao i 3. dan;  
21 Isto kao i 1. dan; mjerenje temperature i pH tla; kontrola vlaž ­
nosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda; uzorkovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.
 
Pripremu tla prije po četka faze eliminacije treba obaviti na isti 
način kao i prije faze apsorpcije.  
Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem 
za radnih dana).  
Ispitivanje s enhitrejima  
(a) Faza apsorpcije s osam datuma uzorkovanja korištenih za izra čun kinetike  
Dan Djelatnost  
– 6 Kondicioniranje pripremljenog tla 48 h;  
– 4 Obrada dijela tla spikingom s otopinom ispitivane kemikalije; 
isparavanje eventualnih otapala; miješanje sastojaka tla; raspo ­
djela tla u ispitne posude; uravnoteženje u uvjetima ispitivanja 
četiri dana (tri tjedna za tlo obra đeno spikingom s metalima);  
– 3 do – 1  Va đenje pokusnih organizama iz uzgojene kulture radi aklimati ­
zacije; priprema i vlaženje sastojaka tla;  
0 Mjerenje temperature i pH tla; va đenje uzoraka tla iz ispitnih 
posuda i kontrola s otapalom radi odre đivanja koncentracije ispi ­
tivane kemikalije; dodavanje porcije hrane u tlo; vaganje i nasu ­
mično raspore đivanje crva u ispitne posude; zadržavanje 
dovoljnog broja poduzoraka crva za odre đivanje analiti čkih poza­
dinskih vrijednosti, mokre i suhe mase te sadržaja lipida; vaganje svih ispitnih posuda radi kontrole vlažnosti tla; kontrola dovoda 
zraka ako se koristi zatvoreni sustav ispitivanja;
 
1 Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; 
uzimanje uzoraka tla i crva za odre đivanje koncentracije ispiti ­
vane tvari;  
2 Isto kao i 1. dan;  
3 Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;  
4 Isto kao i 1. dan;  
5 - 6  Isto kao i 3. dan;  
7 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane u tlo; kontrola vlaž ­
nosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
 
9 Isto kao i 1. dan;  
10 Isto kao i 3. dan;  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1461
 
Dan Djelatnost  
11 Isto kao i 1. dan;  
12 - 13  Isto kao i 3. dan;  
14 Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane u tlo; mjerenje 
temperature i pH tla; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem 
ispitnih posuda; kraj faze apsorpcije; prijenos crva iz preostalih 
izloženih posuda za višestruko odre đivanje u posude koje sadr ­ 
žavaju čisto tlo za fazu eliminacije (bez pražnjenja crijeva); uzor ­
kovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.  
Djelatnosti prethodnog izlaganja (fazu uravnoteženja) treba plani ­
rati uzimaju ći u obzir svojstva ispitivane kemikalije.  
Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem 
za radnih dana).  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1462
 
Dodatak 4.  
Umjetno tlo – preporuke za pripremu i skladištenje  
Budući da je mogu će da tijekom cijele godine ne će biti dostupna prirodna tla iz 
određenog izvora, a da priro đeni organizmi kao i prisustvo mikroone čišćivača 
mogu utjecati na ispitivanje, za uporabu u ovom ispitivanju preporu čuje se 
umjetni supstrat, umjetno tlo prema poglavlju C.8 ovog Priloga, Toksi čnost za 
gujavice (48). U tom tlu može preživjeti, narasti i razmnožavati se nekoliko 
pokusnih vrsta, a omogu ćeni su i maksimalna standardizacija, kao i intra- i 
interlaboratorijska poredbenost uvjeta ispitivanja i uzgoja.  
Sastojci tla 
Treset:  10 %  Sphagnum treset, u skladu sa Smjernicom 
OECD-a 207 (48),  
Kremeni pijesak:  70 %  Industrijski kremeni pijesak (sušen na 
zraku); veli čina zrna: više od 50 % čestica 
treba biti u rasponu od 50-200 μm, ali sve 
čestice trebaju biti ≤ 2 mm,  
Kaolinitska glina:  20 %  Sadržaj kaolinita ≥ 30 %,  
Kalcijev karbonat:  ≤ 1 %  CaCO  3 , u prahu, kemijski čist. 
Kao druga mogu ćnost, može se smanjiti sadržaj organskog ugljika u umjetnom 
tlu, npr. smanjenjem sadržaja treseta na 4-5 % suhog tla i sukladnim pove ćanjem 
sadržaja pijeska. Takvim smanjenjem sadržaja organskog ugljika može se 
smanjiti mogu ćnost adsorpcije ispitivane kemikalije u tlo (organski ugljik), a 
može se pove ćati dostupnost ispitivane kemikalije crvima (74). Pokazalo se da 
vrste  Enchytraeus albidus  i Eisenia fetida  ispunjavaju validacijske kriterije o 
razmnožavanju kada se ispituju u tlima nižeg sadržaja organskog ugljika, npr. 2,7 % (33), (201), a iskustvo pokazuje da se to može posti ći i s umjetnim tlom s 
5 % treseta.
 
Priprema  
Suhi sastojci tla temeljito se izmiješaju (npr. u velikoj laboratorijskoj miješalici). 
To treba u činiti otprilike tjedan dana prije po četka ispitivanja. Izmiješane suhe 
sastojke tla treba navlažiti deioniziranom vodom najmanje 48 h prije primjene ispitivane tvari kako bi se uravnotežila/stabilizirala kiselost. Za odre đivanje pH 
koristi se smjesa tla i otopina 1 M KCl u omjeru 1:5. Ako se pH vrijednost ne 
kreće unutar raspona (6,0 ± 0,5), tlu se dodaje dovoljna koli čina CaCO
 3 ili se 
pripremi nova šarža tla.  
Maksimalni vodni kapacitet (WHC) umjetnog tla odre đuje se prema ISO 11268-2 
(35). Najmanje dva dana prije po četka ispitivanja vlaži se suho umjetno tlo 
dodavanjem dovoljno deionizirane ili obra đene vode da bi se dobilo otprilike 
pola kona čnog sadržaja vode. Kona čni sadržaj vode treba iznositi 40 % do 60 % 
maksimalnog WHC-a. Na po četku ispitivanja prethodno navlaženo tlo dijeli se u 
onoliko šarži koliko ima ispitnih koncentracija i kontrola koje se koriste za 
ispitivanje, a sadržaj vlage se podešava na od 40 - 60 % WHC  max pomoću 
otopine ispitivane tvari i/ili dodavanjem deionizirane ili obra đene vode. Sadržaj 
vlage odre đuje se na po četku i na kraju ispitivanja (na 105 °C). On bi trebao biti 
optimalan za zahtjeve vrsta (sadržaj vlage može se provjeriti i na sljede ći način: 
kad se tlo blago zgnje či rukom, me đu prstima bi se trebale pojaviti sitne kaplji ­
ce). ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1463
 
Skladištenje  
Suhi sastojci umjetnog tla mogu se skladištiti na sobnoj temperaturi do uporabe. 
Pripremljeno, prethodno navlaženo tlo može se skladištiti na hladnom mjestu do 
tri dana prije spikinga; treba se pobrinuti da se isparavanje vode svede na mini ­
mum. Tlo obra đeno spikingom s ispitivanom tvari treba se iskoristiti odmah, 
osim ako ne postoje podaci koji nazna čuju da bi se to odre đeno tlo moglo 
skladištiti, a da to nema utjecaja na toksi čnost i bioraspoloživost ispitivane 
tvari. Onda se uzorci spikingom obra đenog tla mogu skladištiti do analize u 
uvjetima preporu čenima za odre đenu ispitivanu tvar.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1464
 
Dodatak 5.  
Vrste kopnenih oligoheta preporu čene za ispitivanje bioakumulacije iz tla  
Gujavice  
Preporučuje se pokusna vrsta  Eisenia fetida  (Savigny 1826), koja pripada obitelji 
Lumbricidae. Od 1972. godine ona se dijeli na dvije podvrste ( Eisenia fetida  i 
Eisenia andrei  (10)). Po Jaenikeu (36) to su prave, zasebne vrste.  Eisenia fetida  
lako se raspoznaje po svojim svijetlim žutim trakama izme đu članaka, dok je  
Eisenia andrei  jednoobrazne, tamno-crvene boje. Obje vrste podrijetlo vuku 
najvjerojatnije iz podru čja Crnog mora, ali su danas raširene po cijelom svijetu, 
poglavito u antropogenski izmijenjenim staništima, poput gomila komposta. Obje 
se mogu koristiti i za ispitivanja ekotoksi čnosti i za ispitivanja bioakumulacije.  
Eisenia fetida  i Eisenia andrei  dostupne su i u trgovinama, npr. kao mamac za 
ribe. U usporedbi s ostalim gujavicama iz obitelji Lumbricidae te dvije vrste 
imaju kratak životni ciklus, a zrelost postižu u roku od 2-3 mjeseca (na sobnoj temperaturi). Njihova optimalna temperatura iznosi otprilike 20 – 24 °C. Prednost daju relativno vlažnim supstratima čija je pH gotovo neutralna i koji imaju visok 
sadržaj organskih tvari. Budu ći da se te vrste naširoko koriste u standardiziranim 
ispitivanjima ekotoksi čnosti već 25 godina, njihov uzgoj ima dugu tradiciju (48) 
(77).
 
Obje se vrste mogu uzgajati u širokom rasponu životinjskog otpada. Medij za 
uzgoj koji preporu čuje ISO (35) je mješavina konjskog ili govedskog izmeta i 
treseta u omjeru 50:50. pH vrijednost tog medija treba biti oko 6 do 7 (regulira se 
kalcijevim karbonatom), treba imati nisku ionsku provodlljivost (manje od 6 
mS/cm ili manje od 0,5 % koncentracije soli) i ne smije biti prekomjerno one či­ 
šćen amonijakom ili životinjskim urinom. Isto tako, mogu se koristiti tlo za 
vrtove iz trgovina koje ne sadržava aditive ili umjetno tlo prema OECD-u (48) 
ili njihova mješavina u omjeru 50:50. Supstrat bi trebao biti vlažan, ali ne previše 
mokar. Prikladne su kutije za uzgoj volumena od 10 do 50 litara.  
Da bi se dobili crvi standardne starosti i mase, najbolje je uzgoj zapo četi s 
kokonima. Dakle, odrasli se crvi dodaju u kutiju za uzgoj koja sadržava svježi supstrat kako bi nastali kokoni. Prakti čno iskustvo pokazuje da gusto ća naselje­
nosti od otprilike 100 odraslih crva na kg supstrata (mokre mase) vodi do dobrih 
brzina razmnožavanja. Nakon 28 dana odrasli se crvi vade. Gujavice koje se 
izvale iz kokona koriste se a ispitivanje kad sazriju nakon najmanje dva mjeseca, ali kraće od 12 mjeseci.
 
Može se smatrati da su crvi gore opisanih vrsta zdravi ako se kre ću kroz supstrat, 
ne pokušavaju izi ći iz supstrata i ako se neprekidno razmnožavaju. Sporo 
kretanje ili stražnji dio žute boje (u slu čaju Eisenia fetida ) znak su iscrpljenosti 
supstrata. U tom se slu čaju preporu čuju svježi supstrat i/ili manji broj životinja 
po kutiji.  
Dodatne odabrane reference  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. 
Landwirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. str. 331-338.
 
Enhitreji  
Preporučena pokusna vrsta je  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (bijeli crvi).  
Enchytraeus albidus  jedna je od najve ćih (do 15 mm) vrsta koluti ćavih oligoheta 
iz obitelji Enchytraeidae i distribuira se diljem svijeta, npr. (8).  Enchytraeus 
albidus  može se na ći u morskim, limni čkim i kopnenim staništima, uglavnom 
u organskoj tvari u raspadu (morska trava, kompost), a rijetko na livadama (42). 
Ta velika ekološka tolerancija i neke morfološke varijacije znak su da je mogu će 
da postoji više podvrsta ove vrste.  
Enchytraeus albidus  dostupna je u trgovinama, gdje se prodaje kao hrana za ribe. 
Treba provjeriti je li kultura one čišćena drugom, obi čno manjom vrstom (60). 
Ako dođe do onečišćenja, sve crve treba oprati vodom u petri zdjelici. Potom se 
veliki primjerci vrste  Enchytraeus albidus  biraju (stereomikroskopom) za po četak 
nove kulture. Svi se ostali crvi bacaju. Oni imaju kratak životni ciklus kako se 
zrelost postiže ve ć od 33. dana (na 18 °C) i 74. dana (na 12 °C). Za ispitivanje 
treba koristiti samo kulture koje su najmanje 5 tjedana (jedan naraštaj) držane u laboratoriju bez problema.
 
Prikladne su i druge vrste iz roda  Enchytraeus,  poglavito  Enchytraeus luxuriosus.  
Ta je vrsta pravi stanovnik tla, koje smo opisali u (65). Ako se koriste druge vrste  Enchytraeus , treba ih jasno identificirati i u izvješ ću treba navesti obrazlo ­ 
ženje za odabir te vrste.
 
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) je vrsta koja spada u istu 
skupinu kao i  Enchytraeus luxuriosus . Nije dokazano da ona sa sigurnoš ću 
nastanjuje polja, samo je opisana za uzgoj kulture crva i gomile komposta (Römbke 2003). Stoga nisu poznati njezini izvorni ekološki zahtjevi. Me đutim, 
skorašnje laboratorijske studije razli čitih tala iz polja potvrdile su da ova vrsta 
ima veliku toleranciju na svojstva tla, poput pH i teksture (Jänsch i sur. 2005). U novije se vrijeme upravo ta vrsta često koristila u studijama ekotoksi čnosti, i to 
radi jednostavnosti njezina uzgoja i ispitivanja, npr. Kuperman i sur. 2003). 
Međutim, ona je malena (3 – 12 mm; u prosjeku 7 mm (Westheide & Müller 
1996), a zbog toga je rukovanje njome znatno teže u usporedbi s  Enchytraeus 
albidus . Kad se koristi neka druga vrsta umjesto  Enchytraeus albidus , ispitna 
posuda može, ali i ne mora biti manja. Osim toga, treba uzeti u obzir i to da se 
ova vrsta rapidno razmnožava, a naraštaji se smjenjuju brže od svakih 20 dana na 
20 ± 2 °C (Achazi i sur. 1999), a na višim temperaturama čak i brže.
 
Enhitreji iz vrste  Enchytraeus albidus  (kao i iz ostalih vrsta  Enchytraeus ) mogu 
se uzgajati velikim plasti čnim kutijama (npr. 30 × 60 × 10 cm ili 20 × 12 × 
8 cm, što je prikladno za uzgoj crva male veli čine) napunjenima mješavinom 
umjetnog tla i neone čišćenog vrtnog tla bez aditiva koje se može kupiti u trgovi ­
nama. Treba izbjegavati kompost jer on može sadržavati toksi čne kemikalije 
poput teških metala. Prije uporabe iz tla za uzgoj treba odstraniti faunu 
dubokim smrzavanjem u tri navrata. Može se koristiti i čisto umjetno tlo, ali 
je moguće da će brzina razmnožavanja biti manja u usporedbi s onom koja se 
razvija kod miješanih supstrata. pH supstrata treba iznositi 6,0 ± 0,5. Kultura se drži u inkubatoru na temperaturi od 15 ± 2 °C bez svjetla. U svakom slu čaju 
treba izbjegavati temperature iznad 23 °C. Umjetno/prirodno tlo treba biti vlažno, 
ali ne mokro. Kad se tlo blago stisne rukama, trebaju se pojaviti samo sitne kapljice vode. U svakom slu čaju treba izbjegavati anoksi čne uvjete (npr. ako 
se koristi poklopac, mora postojati dovoljno otvora na poklopcu za dostatnu 
razmjenu zraka). Tlo za uzgoj treba dozra čivati pažljivim miješanjem jedanput 
tjedno.
 ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1466
 
Crve treba hraniti najmanje jedanput tjedno ad libitum usitnjenom zobi koja se 
stavlja u šupljinu na površini tla i prekriva tlom. Ako u spremniku ostane hrana 
preostala od posljednjeg hranjenja, sukladno tome treba prilagoditi koli činu nove 
hrane. Ako na preostaloj hrani narastu gljivice, hranu treba zamijeniti novom količinom usitnjene zobi. Da bi se pospješilo razmnožavanje, usitnjena se zob 
može svaka dva tjedna zamijeniti proteinskim prahom modificiranim vitaminima, 
dostupnim u trgovinama. Nakon tri mjeseca životinje se prenose u svježe pripremljenu kulturu ili supstrat za uzgoj. Usitnjenu zob, koja se mora čuvati u 
zatvorenim posudama, treba obraditi u autoklavu ili je treba zagrijati prije 
uporabe kako bi se izbjegle infekcije grinjama iz brašna (npr.  Glyzyphagus sp. , 
Astigmata, Acarina) ili grabežljive grinje (npr.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , 
Gamasida, Acarina). Nakon dezinfekcije hrana se usitnjava da bi se mogla lakše rasuti po površini tla. Još jedan mogu ći izvor je pekarski kvasac ili riblja hrana 
TetraMin
 ® . 
Općenito gledano, uvjeti uzgoja su povoljni ako crvi ne pokušavaju izi ći iz 
supstrata, ako se brzo kre ću kroz tlo, imaju sjajnu vanjsku površinu na koju se 
ne lijepe čestice tla, više-manje su bijele boje i ako se vide crvi razli čite starosti. 
Zapravo, može se smatrati da su crvi zdravi ako se neprekidno razmnožavaju.  
Dodatne odabrane reference  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51-83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oli­
gochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — HR — 24.08.2014 — 005.002 — 1467